PT1648507T - Métodos e composições para aumentar a eficácia de anticorpos terapêuticos utilizando compostos potenciadores de células nk - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO

MÉTODOS Ξ COMPOSIÇÕES PARA AUMENTAR A EFICÁCIA DE ANTICORPOS TERAPÊUTICOS UTILIZANDO COMPOSTOS POTENCIADORES

DE CÉLULAS NK

Campo da Invenção A presente invenção refereÃse, em geral, a métodos e a composições para aumentar a eficácia de anticorpos terapêuticos. Mais particularmente, a invenção refereÃse à utilização de um anticorpo terapêutico em combinação com um composto que bloqueia um recetor inibitório ou estimula um recetor ativador de células natural killer (NK), permitindo deste modo um potenciamento da citotoxicidade de células NK em indivíduos mamíferos de modo a potenciar a eficácia do tratamento em indivíduos humanos, particularmente através de um aumento do mecanismo de ADCC.

Antecedentes da Invenção Várias estratégias terapêuticas em seres humano são baseadas na utilização de anticorpos terapêuticos. Estas incluem, por exemplo, a utilização de anticorpos terapêuticos desenvolvidos para esgotarem células alvo, particularmente células doentes tais como células infetadas por vírus, células tumorais ou outras células patogénicas. Tais anticorpos são tipicamente anticorpos monoclonais, de espécies IgG, tipicamente com porções Fc de IgGl ou de IgG3. Estes anticorpos podem ser anticorpos nativos ou recombinantes, e são frequentemente anticorpos de ratinho ÕhumanizadosÕ (isto é, compreendendo domínios funcionais a partir de várias espécies, tipicamente uma porção Fc de origem de primata não humano ou humano, e com uma região variável ou região determinante de complementaridade (CDR) de origem de ratinho). Alternativamente, o anticorpo monoclonal pode ser totalmente humano por meio de imunização em ratinhos transgénicos tendo o locus Ig humano, ou obtido através de bibliotecas de ADNc derivadas a partir de células humanas.

Um exemplo específico de tais anticorpos terapêuticos é rituximab (Mabthera*, Rituxan®) , que é um anticorpo monoclonal quimérico antiÃCD20 preparado com regiões constantes κ e yl humanas (como tal com porção Fc de IgGl humana) ligadas a domínios variáveis de ratinho conferindo especificidade para CD20. Nos últimos anos, o rituximab tem modificado consideravelmente a estratégia terapêutica contra malignidades linfoproliferativas B, particularmente linfornas de nãoÃHodgkin (NHL). Outros exemplos de anticorpos IgGl humanizados incluem alentuzumab (Campathà 1H°), que é utilizado no tratamento de malignidades de células B, e trastuzumab (HerceptinD), que é utilizado no tratamento de cancro de mama. São descritos exemplos adicionais de anticorpos terapêuticos em desenvolvimento na técnica. 0 mecanismo de ação de anticorpos terapêuticos ainda é um tema em debate. A injeção de anticorpos leva ao esgotamento de células portando o antigénio especificamente reconhecido pelo anticorpo. Esta esgotamento pode ser mediada por meio de pelo menos três mecanismos: citotoxicidade celular mediada por anticorpo (ADCC), lise dependente de complemento, e inibição anti tumoral direta de crescimento tumoral por meio de sinais proporcionados por meio do antigénio visado pelo anticorpo.

Embora estes anticorpos representem uma abordagem nova e eficaz para a terapêutica humana, particularmente para o tratamento de tumores, nem sempre exibem uma eficácia forte. Por exemplo, embora o rituximab, por si só ou em combinação com quimioterapia, se tenha mostrado eficaz no tratamento de NHL de grau tanto alto quanto baixoà intermédio, 30% a 50% dos pacientes com NHL de grau baixo não apresentam resposta clínica ao rituximab. Foi sugerido que o nível de expressão de CD20 sobre células de linfoma, a presença de carga tumoral elevada no momento do tratamento, ou concentrações em soro baixas de rituximab podem explicar a falta de eficácia do rituximab nalguns pacientes. Contudo, as causas reais de falha de tratamento permanecem grandemente desconhecidos.

Adicionalmente, a utilização de anticorpos terapêuticos pode ser limitada por efeitos secundários causados pela sua administração. Por exemplo, podem aparecer efeitos secundários tais como febre, cefaleias, náuseas, hipotensão, respiração ofegante, erupção cutânea, infeções, e vários outros em pacientes potencialmente limitando a quantidade ou frequência possível com que os anticorpos podem ser administrados.

Consequentemente, seria muito interessante aumentar a eficácia de anticorpos terapêuticos, ou a capacidade de alcançar eficácia terapêutica utilizando doses reduzidas dos antibióticos que são menos propensos a produzir efeitos secundários. A presente invenção soluciona estas e outras necessidades. fíiiTríâT'! π Ha i nvPfirSn

vUalw \Ã Ce KB V ΰ··γ U A presente invenção refereÃse ao assunto em questão das reivindicações. 0 presente pedido descreve novas abordagens para potenciar a eficácia de anticorpos terapêuticos. Sem ser limitado pela seguinte teoria, é acreditado que os resultados surpreendentes alcançados utilizando os presentes métodos derivam da sua capacidade de potenciar o mecanismo de ADCC in vivo, quando são injetados anticorpos terapêuticos. De facto, a presente invenção proporciona composições e métodos novos que superam a dificuldade atual relacionada com a eficácia de anticorpos terapêuticos. É mostrado no presente pedido que as células NK de um indivíduo podem ter ADCC mediada por mAb (anticorpo monoclonal) terapêutico insatisfatória por causa da ausência de ativação das células NK, por exemplo, por uma inibição de recetores inibitórios sobre as células NK. Preferentemente, é obtido um aumento do mecanismo de ADCC através da administração de compostos que bloqueiam um recetor inibitório, sobre células NK, promovendo deste modo um potenciamento da citotoxicidade de células NK em indivíduos mamíferos. Preferentemente, o composto é um anticorpo ou um fragmento do mesmo.

Os ditos anticorpos reagem com um recetor inibitório de células NK, por exemplo, moléculas de recetor inibitório de killer (KIR) sobre células NK, neutralizando como tal a inibição das células e aumentando a sua atividade de ADCC.

Mais especificamente, o pedido descreve métodos de tratamento de um indivíduo no qual é coadministrado um anticorpo ou um fragmento do mesmo, que bloqueia um recetor inibitório de uma célula NK com o anticorpo terapêutico ao indivíduo. 0 pedido demonstra que a eficácia de um anticorpo terapêutico pode ser grandemente potenciada através da coadministração, por exemplo, coÃinjeção, de um tal anticorpo ou um fragmento do mesmo que supera a inibição de células NK, por exemplo através do bloqueio do recetor inibitório de uma célula NK. 0 pedido também divulga composições farmacêuticas compreendendo um anticorpo terapêutico e um anticorpo ou um fragmento do mesmo que bloqueia um recetor inibitório de uma célula NK. 0 pedido também divulga kits compreendendo um anticorpo terapêutico e um anticorpo ou um fragmento do mesmo que bloqueia um recetor inibitório de uma célula NK. 0 pedido também se refere à utilização de um anticorpo ou um fragmento do mesmo que bloqueia um recetor inibitório de uma célula NK para aumentar a eficácia de um tratamento com um anticorpo terapêutico, ou para aumentar ADCC num indivíduo submetido a um tratamento com um anticorpo terapêutico. 0 pedido também divulga a utilização de um anticorpo ou um fragmento do mesmo que bloqueia um recetor inibitório de uma célula NK, e um anticorpo terapêutico para a preparação de um fãrmaco para tratamento de uma doença. Mais particularmente, o tratamento da doença requer a esgotamento das células visadas, preferentemente das células doentes tais como células infetadas por vírus, células tumorais ou outras células patogénicas. Preferentemente, a doença é um cancro, doença infeciosa ou doença imune. Mais preferentemente, a doença é selecionada a partir do grupo consistindo num cancro, uma doença autoimune, uma doença inflamatória, e uma doença viral. A doença também se refere a uma rejeição de enxerto, mais particularmente rejeição de aloenxerto, e doença de enxerto contra hospedeiro (GVHD). 0 presente pedido também divulga um método de reduzir a dose de um anticorpo terapêutico, por exemplo um anticorpo que é ligado por um recetor Fcy, preferentemente CD16 (FcvRIIIa). Por exemplo, a coadministração de um anticorpo terapêutico e de um anticorpo que bloqueia um recetor inibitório sobre células NK permite que seja utilizada uma dose menor do anticorpo terapêutico. Tais anticorpos podem ser utilizados a uma dose de 200 , 300 , 400 , 500 0 $0700 , 800 , 900 , ou menor do que a dose recomendada na aêacia do composto.

Adicionalmente, o presente pedido divulga uma composição farmacêutica compreendendo um anticorpo terapêutico, por exemplo, que pode estar ligado por CD16, um anticorpo que bloqueia um recetor inibitório de células NK, e um portador farmaceuticamente aceitável. Noutro aspeto, o presente pedido divulga um kit compreendendo um anticorpo terapêutico, por exemplo, que pode estar ligado por CD16, e um anticorpo que bloqueia um recetor inibitório de células NK.

Para qualquer dos métodos, composições, ou kits mencionados acima, numa forma de realização o anticorpo terapêutico possui uma porção Fc de IgGl humana ou IgG3 humana. Noutro aspeto, o anticorpo terapêutico é um anticorpo monoclonal ou um fragmento do mesmo. Noutro aspeto, o anticorpo terapêutico não está conjugado com um grupo tóxico ou radioativo. Noutro aspeto, o composto inibe um recetor inibitório de uma célula NK. Num aspeto, os anticorpos ou compostos terapêuticos podem ser fragmentos ou derivados de anticorpo tais como, inter alia, um fragmento Fab, um fragmento Fab'2, uma CDR e um ScFv.

Num aspeto, o anticorpo terapêutico é um anticorpo humano, um anticorpo humanizado, um anticorpo quimérico, ou um fragmento do mesmo. Noutro aspeto, o anticorpo terapêutico é rituximab ou Campath. Noutro aspeto, o anticorpo é rituximab, e o dito anticorpo é administrado a uma dose menor do que 375 mg/m2 por semana. Noutro aspeto, o anticorpo é Campath, e o anticorpo é administrado a uma dose menor do que 90 mg por semana. 0 anticorpo liga a um determinante comum de recetores humanos KIR2DL1, KIR2DL2, e KIR2DL3 e inibe a inibição de citotoxicidade de célula NK mediada por KIR2DL1, KIR2DL2, e KIR2DL3. Noutra forma de realização, o anticorpo liga ao mesmo epítopo que o anticorpo monoclonal DF200 produzido pelo hibridoma DF200. Noutra forma de realização, o composto compete com o anticorpo monoclonal DF200 produzido pelo hibridoma DF200 pela ligação a um recetor KIR na superfície de uma célula NK humana. Noutra forma de realização, o composto é um anticorpo monoclonal DF200 produzido pelo hibridoma DF200 ou um fragmento do mesmo.

Noutro aspeto, o presente pedido proporciona um método de aumentar a eficácia de um tratamento envolvendo a administração de um anticorpo terapêutico que pode ser ligado por CD16 num indivíduo, o dito método compreendendo administrar ao dito indivíduo antes de, simultaneamente com, ou após a administração de dito anticorpo terapêutico, uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto que bloqueia um recetor inibitório de uma célula NK. Num aspeto, o anticorpo aumenta a eficácia do tratamento potenciando ADCC no dito indivíduo.

Legendas das figuras

Figura 1: 0 anticorpo monoclonal DF200 liga um determinante comum de vários recetores KIR2DL humanos. Figura 2: Reconstituição de lise com mAb (anticorpo monoclonal) antiÃKIR2DL sobre alvo C1R Cw4 em razão de efetor/alvo de 4/1. 0 anticorpo monoclonal DF200 inibe a inibição da citotoxicidade de células NK positivas para KIR2DL1 mediada por KIR2DL (lise reconstituída) sobre células alvo positivas para Cw4.

Figura 3: Potenciamento de ADCC mediada por Rituxan de um clone NK positivo para KIR2DL1 sobre uma linha celular EBV positiva para Cw4 através de bloqueio da interação KIR/HLA. É testada a citólise de clones NK portando KIR2DL1 contra uma linha celular alvo (positiva para CD2 0) transformada com EBV positiva para Cw4 em várias razões de efetor/alvo (de 1 a 4) na presença de anticorpo anti CD20 (Rituxan) 5 pg/ml e anticorpo EB6 (anti KIR2DL1) 10 pg/ml; Rituxan por si só; EB6 por si só; ou sem qualquer anticorpo. ADCC é grandemente potenciado na presença de anticorpo anti KIR2DL1(EB6).

Figura 4: Potenciamento de ADCC mediada por Campath de um clone NK positivo para KIR2DL1 sobre uma linha celular EBV positiva para Cw4 através de bloqueio da interação KIR/HLA. É testada a citólise de clone NK portando KIR2DL1 contra uma linha celular alvo (positiva para CD20) transformada com EBV positiva para Cw4 na presença de Campath e de anticorpo EB6 (anti KIR2DL1) 100 pg/ml; Campath por si só; EB6 por si só; ou sem qualquer anticorpo. ADCC é grandemente potenciado na presença de anticorpo anti KIR2DL1 (EB6).

Descrição detalhada da invenção 0 presente pedido divulga um método para aumentar a eficácia de anticorpos terapêuticos. 0 pedido divulga mais especificamente que a utilização de um anticorpo ou de um fragmento do mesmo que potência células NK através do bloqueio de um recetor inibitório de uma célula NK pode aumentar significativamente a eficácia de anticorpos terapêuticos. De facto, os inventores demonstram que a eficácia de múltiplos anticorpos terapêuticos pode ser grandemente potenciada pela coadministração de um anticorpo direcionado contra um recetor inibitório de células NK,

Como tal, o pedido divulga um método de tratamento de uma doença num indivíduo com necessidade do mesmo compreendendo: a) administrar ao dito indivíduo anticorpo ou um fragmento do mesmo que bloqueia um recetor inibitório de uma célula NK; e b) administrar ao dito indivíduo um anticorpo terapêutico. 0 dito anticorpo terapêutico pode ser ligado por CD16 de células NK preferentemente por meio da sua região Fc,

Preferentemente, o dito anticorpo terapêutico tem uma porção Fc de IgGl ou de IgG3 humana, particularmente um anticorpo monoclonal ou um fragmento do mesmo adicionalmente preferentemente um anticorpo humanizado, um anticorpo humano, um anticorpo quimérico ou um fragmento do mesmo, por exemplo rituximab. É pretendido que os anticorpos ou um fragmento do mesmo que bloqueiam o recetor inibitório de uma célula NK possam ser administrados ao indivíduo antes, simultaneamente com ou após a administração do anticorpo terapêutico. 0 modo de administração dos diferentes anticorpos depende da sua biodisponibilidade e farmacocinética. Preferentemente, o anticorpo terapêutico é administrado no prazo de uma semana de administração dos anticorpos ou um fragmento dos mesmos que bloqueiam o recetor inibitório de uma célula NK, mais preferentemente no prazo de 2 dias ou 5 dias. Preferentemente, o anticorpo terapêutico é administrado antes ou simultaneamente com os anticorpos ou um fragmento dos mesmos, que bloqueiam o recetor inibitório de uma célula NK.

Num aspeto adicional, o pedido divulga um método de aumentar ADCC num indivíduo recebendo um tratamento com anticorpo terapêutico, o dito método compreendendo administrar ao dito indivíduo antes de, simultaneamente com, ou após a administração de dito anticorpo terapêutico uma quantidade suficiente para aumentar ADCC de um anticorpo ou um fragmento do mesmo que bloqueia o recetor inibitório de uma célula NK. 0 dito anticorpo terapêutico pode ser ligado por CD16 sobre células NK, preferentemente por meio da sua região Fc. Preferentemente, o dito anticorpo terapêutico tem uma porção Fc de uma IgGl humana ou IgG3 humana, particularmente um anticorpo monoclonal ou um fragmento do mesmo, adicionalmente preferentemente um anticorpo humano, um anticorpo humanizado, um anticorpo quimérico ou um fragmento do mesmo, por exemplo rituximab.

Num aspeto adicional, o pedido divulga um método de aumentar a eficácia de um tratamento com anticorpo terapêutico num indivíduo, o dito método compreendendo administrar ao dito indivíduo antes de, simultaneamente com ou após a administração do dito anticorpo terapêutico uma quantidade de um anticorpo ou um fragmento do mesmo que bloqueia o recetor inibitório de uma célula NK, suficiente para aumentar a eficácia de dito anticorpo terapêutico. 0 dito anticorpo terapêutico pode ser ligado por CD16, preferentemente por meio da sua região Fc. Preferentemente, o dito anticorpo terapêutico tem uma porção Fc de uma IgGl humana ou IgG3 humana, particularmente um anticorpo monoclonal ou um fragmento do mesmo, adicionalmente preferentemente um anticorpo humano, um anticorpo humanizado, um anticorpo quimérico ou um fragmento do mesmo, por exemplo rituximab.

DEFINIÇÕES

Conforme utilizados no presente documento, os seguintes termos têm os significados atribuídos aos mesmos a menos que especificados de outro modo.

Conforme utilizado no presente documento, células ÕNKÕ refereAse a uma subpopulaçao de linfócitos que esta envolvida em imunidade não convencional. As células NK podem ser identificadas em virtude de determinadas características e propriedades biológicas, tais como a expressão de antigénios de superfície específicos incluindo CD16, CD56 e/ou CD57, a ausência do complexo TCR alfa/beta ou gama/delta sobre a superfície celular, a capacidade de ligar a e de matar células que não expressam ÕautoÕÃ antigénios MHC/HLA através da ativação de enzimas citolíticas específicas, a capacidade de matar células tumorais ou outras células doentes que expressam um ligante para recetores ativadores de NK, e a capacidade de libertar moléculas proteicas denominadas citoquinas que estimulam ou inibem a resposta imune. Qualquer uma destas características e atividades pode ser utilizada para identificar células NK utilizando métodos bem conhecidos na técnica. 0 termo ÕanticorpoÕ, conforme utilizado no presente documento, refereÃse a anticorpos monoclonais e policlonais. Dependendo do tipo de domínio constante nas cadeias pesadas, os anticorpos são atribuídos a uma de cinco classes principais: IgA, IgD, IgE, IgG, e IgM. Várias destas são adicionalmente divididas em subclasses ou isótipos, tais como IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, e semelhantes. Uma unidade estrutural de imunoglobulina (anticorpo) exemplar compreende um tetrâmero. Cada tetrâmero é composto por dois pares idênticos de cadeias de polipéptido, cada par possuindo uma cadeia ÕleveÕ (cerca de 25 kDa) e uma cadeia ÒpesadaÕ (cerca de 50Ã70 kDa). 0 terminal N de cada cadeia define uma região variável de cerca de 100 a 110 ou mais aminoácidos que é primariamente responsável pelo reconhecimento de antigénios. Os termos cadeia leve variável (VL) e cadeia pesada variável (VH) referemÃse a estas cadeias leve e pesada respetivamente. Os domínios constantes de cadeia pesada que correspondem às classes diferentes de imunoglobulinas são denominados ÔalfaÒ, ÕdeltaÕ, ÕépsilonÕ, ÕgamaÕ e ÕmuÕ, respetivamente. As estruturas de subunidade e as configurações tridimensionais de classes diferentes de imunoglobulinas são bem conhecidas. IgG e/ou IgM são as classes preferidas de anticorpos empregues nesta invenção, com IgG sendo particularmente preferida, dado que são os anticorpos mais comuns na situação fisiológica, dado que são mais facilmente preparados num ambiente de laboratório, e dado que as IgGs são especificamente reconhecidas pelos recetores Fc gama. Preferentemente, o anticorpo desta invenção é um anticorpo monoclonal. São particularmente preferidos anticorpos humanizados, quiméricos, humanos, ou de outra forma adequados para seres humanos.

Dentro do contexto desta invenção, o termo Õanticorpo ou anticorpos terapêutico(s)Õ designa mais especificamente qualquer anticorpo que funciona para esgotar células alvo num paciente. Em particular, os anticorpos terapêuticos ligam especificamente a antigénios presentes sobre a superfície de células alvo, por exemplo antigénios específicos de tumor presentes predominantemente ou exclusivamente sobre células tumorais. Preferentemente, os anticorpos terapêuticos incluem porções Fc humanas, ou são capazes de interatuar com recetores Fc humanos. Os anticorpos terapêuticos podem selecionar células por qualquer meio, por exemplo ADCC ou de outra forma, e podem estar ÕnusÕ, isto é, sem grupos conjugados, ou podem estar conjugados com compostos tais como toxinas ou marcadores radioativos. 0 termo Õ liga especificamente aõ significa que um anticorpo pode ligar preferentemente num ensaio de ligação competitiva ao parceiro de ligação, por exemplo um recetor de NK ativador tal como NKp30, NKp44, ou NKp46, ou um recetor Fc gama humano, conforme avaliado utilizando qualquer das formas recombinantes das proteínas, epítopos das mesmas, ou proteínas nativas presentes sobre a superfície de células alvo relevantes ou NK isoladas. São adicionalmente descritos abaixo ensaios de ligação competitiva e outros métodos para determinar ligação específica e são bem conhecidos na técnica.

Um anticorpo ÕhumanoÃadequadoÕ refereÃse a qualquer anticorpo, anticorpo derivado, ou fragmento de anticorpo que pode ser seguramente utilizado em seres humanos para, por exemplo, os métodos terapêuticos descritos no presente documento. Anticorpos adequados para seres humanos incluem todos os tipos de anticorpos humanizados, quiméricos, ou totalmente humanos, ou quaisquer anticorpos nos quais pelo menos uma porção dos anticorpos é derivada a partir de humanos ou de outra forma modificada de modo a evitar a resposta imune que é provocada quando são utilizados anticorpos nativos não humanos. ÕFragmento imunogénicoõ, significa no presente documento qualquer fragmento peptídico ou polipeptídico que é capaz de gerar uma resposta imune tal como (i) a geração de anticorpos ligando o dito fragmento e/ou ligando qualquer forma da molécula compreendendo o dito fragmento, incluindo o recetor ligado em membrana e mutantes derivados a partir do mesmo, (ii) a estimulação de uma resposta de célula T envolvendo células T reagindo ao complexo bimolecular compreendendo qualquer molécula de MHC e um peptídeo derivado a partir do dito fragmento, e (iii) a ligação de veículos transfetados tais como bacteriófagos ou bactérias expressando genes codificando imunoglobulinas de mamífero. Alternativamente, um fragmento imunogénico também se refere a qualquer construção capaz de gerar uma resposta imune conforme definido acima, tal como um fragmento peptídico conjugado a uma proteína transportadora através de acoplamento covalente, uma construção de polipéptido recombinante quimérico compreendendo o dito fragmento peptídico na sua sequência de aminoãcidos, e inclui especificamente células transfetadas com um ADNc cuja sequência compreende uma porção codificadora do dito fragmento.

Para os propósitos da presente invenção, um anticorpo ÕhumanizadoÕ refereÃse a um anticorpo no qual a região estrutural variável e constante de uma ou mais imunoglobulinas humanas está fusionada com a região de ligação, por exemplo a CDR, de uma imunoglobulina animal. Tais anticorpos humanizados são desenhados para manter a especificidade de ligação do anticorpo não humano a partir do qual as regiões de ligação são derivadas, mas para evitar uma reação imune contra o anticorpo não humano.

Um Õanticorpo quiméricoõ é uma molécula de anticorpo na qual (a) a região constante, ou uma porção da mesma, é alterada, substituída, ou permutada de modo a que o sítio de ligação a antigénio (região variável) seja ligado a uma região constante de uma classe, função efetora e/ou espécie alterada diferente, ou de uma molécula totalmente diferente que confere propriedades novas ao anticorpo quimérico, por exemplo, uma enzima, toxina, hormona, fator de crescimento, fármaco, etc.; ou (b) a região variável, ou uma porção da mesma, é alterada substituída ou permutada com uma região variável tendo especificidade para antigénio diferente ou alterada. Em formas de realização preferidas da presente invenção, o anticorpo quimérico contudo mantém a região Fc da imunoglobulina, preferentemente uma região Fc humana, permitindo como tal interações com recetores Fc humanos sobre a superfície de células alvo.

Dentro do contexto desta invenção, células NK ÕpotenciadasÕ, ÕativasÕ, ou ÕativadasÕ designam células NK biologicamente ativas, mais particularmente células NK tendo a capacidade de lisar células alvo. Por exemplo, uma célula NK ÕativaÕ é capaz de matar células que expressam um recetorÃligando ativador de NK e não expressam ÕautoÕ antigénios MHC/HLA (células incompatíveis com KIR). Exemplos de células alvo adequadas para utilização em ensaios de morte redirecionada são células P815 e K562, mas pode ser utilizado qualquer de uma série de tipos celulares e são bem conhecidos na técnica (vejaÃse, por exemplo, Sivori et al. (1997) J. Exp. Med. 186: 1129Ã1136; Vitale et al. (1998) J. Exp. Med. 187: 2065Ã2072; Pessino et al. (1998) J. Exp. Med. 188: 953Ã960 ; Neri et al. (2 001) Cl in. Diag. Lab. Immun. 8:113iÃ1135). Também podem ser identificadas células ÕpotenciadasÕ, ÕativasÕ, ou ÕativadasÕ através de qualquer outra propriedade ou atividade conhecida na técnica como associada com atividade NK, tal como produção de citoquinas (por exemplo IFNÃy e TNFÃoO ou aumento dos níveis de cálcio intracelular livre. Para os propósitos da presente invenção, células NK "potenciadas", "ativas", ou "ativadas" referemÃse particularmente a células NK in vivo que não são inibidas através da estimulação de um recetor inibitório, ou nas quais tal inibição foi superada, por exemplo, através de estimulação de um recetor ativador.

Como aqui utilizado, o termo "recetor NK inibidor" ou "inibitório" refereÃse a qualquer molécula sobre a superfície de células NK que, quando estimulada, causa uma diminuição mensurável em qualquer propriedade ou atividade conhecida na técnica como associada com a atividade NK, tal como produção de citoquinas (por exemplo IFNÃy e TNFÃo:) , aumento dos níveis de cálcio intracelular livre, ou a capacidade de lisar células alvo num ensaio de morte redirecionada conforme descrito, por exemplo, noutro ponto da presente memória descritiva. Exemplos de tais recetores incluem KIR2DL1, KIR2DL2/3, KIR2DL4, KIR2DL5A, KIR2DL5B, KIR3DL1, KIR3DL2, KXR3DL3, LILRB1, NKG2A, NKG2C, NKG2E e LILRB5. São descritos métodos de determinar se uma célula NK é ou não ativa com mais detalhe abaixo e são bem conhecidos pelos peritos na especialidade.

Na presente invenção, o termo Õbloquear um recetor inibitório Õ refereÃse à capacidade de determinados compostos, preferentemente anticorpos, fragmentos, ou derivados dos mesmos, de preferentemente interatuar diretamente com pelo menos um recetor inibitório de células NK, por exemplo KIR, NKG2A/C, e outros listados no presente documento, e neutralizar sinais inibitórios do recetor (no caso de recetores inibitórios). Com recetores inibitórios, preferentemente o composto, preferentemente um anticorpo ou um fragmento do mesmo, é capaz de bloquear a interação entre HLA e o recetor. Os anticorpos podem ser policlonais ou, preferentemente, monoclonais. Podem ser produzidos através de hibridomas ou através de células recombinantes manipuladas para expressarem os domínios constantes e variáveis desejados. Os anticorpos podem ser anticorpos de cadeia única ou outros derivados de anticorpo retendo a especificidade para antigénio e a região de dobradiça inferior ou uma variante dos mesmos tal como um fragmento Fab, um fragmento Fab'2, uma CDR, e um ScFv. Estes podem ser anticorpos policlonais, anticorpos recombinantes, anticorpos humanizados, ou variantes dos mesmos.

Dentro do contexto desta divulgação um Õdeterminante comumõ designa um determinante ou epítopo que é partilhado por vários membros de um grupo de recetores relacionados, por exemplo, o grupo de recetores KIR2DL humanos. 0 determinante ou epítopo pode representar um fragmento de péptido ou um epítopo conformacional partilhado pelos ditos membros. Numa forma de realização específica, o determinante comum compreende um epítopo reconhecido por anticorpo monoclonal DF20Q, NKVSF1 ou EB6.

Dentro do contexto desta divulgação, o termo anticorpo que ÒligaÕ a um determinante comum designa um anticorpo que liga ao dito determinante com especificidade e/ou afinidade, por exemplo, que essencialmente não liga com afinidade elevada ou com especificidade a outros motivos ou determinantes ou estruturas não relacionados na superfície de células NK de humanos. Mais particularmente, a ligação de um anticorpo monoclonal de acordo com esta invenção ao dito determinante pode ser discriminada a partir da ligação do dito anticorpo a outro epítopo ou determinante.

Anticorpos capazes de se ligarem a recetores inibitórios de células NK e de prevenirem a sua estimulação são como tal compostos ÕneutralizadoresÕ ou ÕinibitóriosÒ, preferentemente anticorpos, no sentido de que bloqueiam, pelo menos parcialmente, a via de sinalização inibitória mediada por um recetor inibitório de células NK, isto é, recetores KIR ou NKG2A/C. Mais importante, esta atividade inibitória pode ser mostrada com respeito a vários tipos de recetores KIR ou NKG2A/C, de modo que estes compostos, preferentemente anticorpos, podem ser utilizados em vários indivíduos com eficácia elevada. 0 termo ÕrecombinanteÕ quando utilizado com referência, por exemplo, a uma célula, ou ácido nucleico, proteína, ou vetor, indica que a célula, ácido nucleico, proteína ou vetor, foi modificado (a) pela introdução de um ácido nucleico heterõlogo ou proteína heterólogos ou pela alteração de uma proteína ou ácido nucleico nativos, ou que a célula é derivada a partir de uma célula como tal modificada. Consequentemente, por exemplo, células recombinantes expressam genes que não são encontrados dentro da forma nativa (não recombinante) da célula ou expressam genes nativos que são de outra forma anormalmente expressos, subÃexpressos ou nãoÃexpressos em absoluto.

Dentro do contexto da presente invenção, um indivíduo ou paciente inclui qualquer indivíduo ou paciente mamífero, mais particularmente um indivíduo ou paciente humano. ANTICORPOS TERAPÊUTICOS 0 presente pedido proporciona a utilização de compostos potenciadores de células NK em conjunto com anticorpos terapêuticos conforme reivindicado. Pode ser utilizado qualquer de uma grande variedade de anticorpos terapêuticos na presente invenção. Essencialmente, pode ser utilizado qualquer anticorpo terapêutico, quer ÕnuÕ quer conjugado com um marcador radiológico, toxina, ou outra fração, quer de comprimento total quer um fragmento; ou quer um anticorpo verdadeiro quer um derivado modificado de um anticorpo. Preferentemente, os métodos são utilizados para potenciar a eficácia de terapêuticas nas quais a atividade das células NK desempenha um papel à não necessariamente exclusivo à na eficácia de anticorpos terapêuticos administrados, e também preferentemente os anticorpos ou fragmentos incluirão naturalmente, ou serão modificados para incluir, uma região Fc humana ou outro domínio que permita o reconhecimento específico do anticorpo por recetores Fc humanos, por exemplo recetores Fc gama.

Os presentes anticorpos podem ser utilizados para potenciar a capacidade de anticorpos terapêuticos de esgotar células alvo que expressam um antigénio que é especificamente reconhecido pelos anticorpos terapêuticos. Consequentemente, qualquer doença ou condição que seja causada ou exacerbada pelo menos em parte por células que podem ser visadas por um anticorpo terapêutico pode ser tratada utilizando os métodos descritos no presente documento. Exemplos específicos de células alvo incluem células tumorais, células infetadas por vírus, células alogénicas, células imunocompetentes patológicas (por exemplo linfócitos B, linfõcitos T, células apresentadoras de antigénio, etc.) envolvidas em alergias, doenças autoimunes, reações alogénicas, etc. ou inclusive células saudáveis (por exemplo, células endoteliais numa estratégia terapêutica anti angiogénica). Células alvo mais preferidas dentro do contexto desta invenção são células tumorais e células infetadas por vírus. Os anticorpos terapêuticos podem, por exemplo, mediar um efeito citotóxico ou lise celular, particularmente por citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpo (ADCC). A ADCC requer recetores de leucócitos para a porção Fc de IgG (FcyR) , cuja função é ligar os antigénios sensibilizados por IgG a células citotóxicas portando FcyR e disparar a maquinaria de ativação celular. Como tal, o anticorpo terapêutico é capaz de formar um complexo imune. Por exemplo, um complexo imune pode ser um alvo tumoral coberto por anticorpos terapêuticos. Mais particularmente, o anticorpo pode ser ligado por CD16, preferentemente por meio da sua região Fc. A determinação de se um anticorpo terapêutico liga a um recetor Fcy* tal como CD16 pode ser avaliada através de qualquer maneira adequada, por exemplo através da determinação da ligação a um polipéptido de CD16 ou fragmento do mesmo produzido recombinantemente, opcionalmente imobilizado sobre um suporte, ou por exemplo através da determinação da ligação do anticorpo terapêutico a uma célula que é conhecida ou suspeita como expressando CD16 .

Os anticorpos terapêuticos podem ser policlonais ou, preferentemente, monoclonais. Podem ser produzidos por hibridomas ou por células recombinantes manipuladas para expressar os domínios constantes e variáveis desejados. Os anticorpos podem ser anticorpos de cadeia única ou outros derivados de anticorpo retendo a especificidade para antigénio e a região de dobradiça inferior ou uma variante da mesma. Estes podem ser anticorpos polifuncionais, anticorpos recombinantes, anticorpos humanizados, fragmentos ou variantes dos mesmos. 0 dito fragmento ou um derivado do mesmo é preferentemente selecionado a partir de um fragmento Fab, um fragmento Fab' 2, uma CDR e um ScFv. Preferentemente, um fragmento é um fragmento de ligação a antigénio. Os anticorpos terapêuticos que compreendem um fragmento de anticorpo também podem incluir mas não estão limitados a anticorpos biespecíficos; um exemplo de anticorpo biespecífico adequado compreende uma região de ligação a antigénio específica para CD16 e uma região de ligação a antigénio específica para um antigénio tumoral. Outros formatos de anticorpo compreendendo fragmentos incluem derivados de anticorpo biespecífico recombinante combinando as regiões de ligação de dois anticorpos diferentes numa cadeia de polipéptido simples, também referida como BiTE™ (Kufer P. et al. TRENDS in Biotechnology 204; 22(5) : 238Ã244; e Baeuerle et al. Current Opinion on Molecular Therapeutics 2003; 5(4) : 413Ã 419 .

Anticorpos terapêuticos são geralmente específicos para antigénios de superfície, por exemplo, antigénios de membrana. Os anticorpos terapêuticos mais preferidos são específicos para antigénios tumorais (por exemplo, moléculas especificamente expressadas por células tumorais), tais como CD20, CD52, ErbB2 (ou HER2/Neu), CD33, CD22, CD2 5, MUCÃ1, CEA, KDR, aVp3, etc., particularmente antigénios de linfoma (por exemplo CD20). Os anticorpos terapêuticos têm preferentemente porção Fc de IgGl ou de IgG3 humana ou de primata não humano, mais preferentemente de IgGl humana.

Numa forma de realização, os anticorpos incluirão modificações em sua porção Fc que potenciam a interação do anticorpo com células NK durante ADCC. Tais anticorpos terapêuticos modificados (Õanticorpos alteradosõ) compreendem em geral modificações preferentemente, na região Fc, que modificam a afinidade de ligação do anticorpo a um ou mais FcyR. São conhecidos métodos para modificar anticorpos com ligação modificada a um ou mais FcyR na técnica, vejaÃse, por exemplo, as Publicações PCT N.°s WO 2004/016750 (Pedido de Patente Internacional PCT/US2003/025399), WO 99/158572, WO 99/151642, WO 98/123289, WO 89/107142, WO 88/107089, e Patentes U.S. N.°s 5.843.597 e 5.642.821.

Os anticorpos terapêuticos identificados no presente documento, tais como D2E7 (Cambridge Antibody Technology Group, pic (Cambridge, RU) / BASF (Ludwigshafen, Alemanha)) utilizado para tratar artrite reumatoide, ou Infliximab (Centocor, Inc., Malvern, PA; utilizado para tratar doença de Crohn e artrite reumatoide) , ou os anticorpos descritos no Pedido de Patente Internacional WO 2004/016750 podem ser modificados conforme ensinado nos pedidos acima e abaixo identificados e utilizados para o tratamento de doenças para as quais tais anticorpos são topicamente utilizados. Nalgumas formas de realização, a invenção proporciona anticorpos alterados que têm afinidade alterada, afinidade quer maior quer menor, por um FcyR ativador, por exemplo, FcyRIII. Em determinadas formas de realização, são proporcionados anticorpos alterados tendo afinidade maior por FcyR. Preferentemente, tais modificações também possuem uma função efetora mediada por Fc alterada.

Modificações que afetam a função efetora mediada por Fc são bem conhecidas na técnica (vejaÃse por exemplo a Patente U.S. 5.619.351) . Os aminoácidos que podem ser modificados incluem mas não estão limitados a prolina 329, prolina 331, e lisina 322. A prolina 329 e/ou 331 e a lisina 322 podem, preferentemente, ser substituídas por alanina, contudo, a substituição com outro aminoãcido também é contemplada. VejaÃse a Publicação Internacional WO 00/142072 e U.S. 6.194.551.

Assim, a modificação da região Fc pode compreender uma ou mais alterações nos aminoácidos encontrados na região Fc de anticorpo. Tais alterações podem resultar num anticorpo com uma função efetora mediada por anticorpo alterada, uma ligação alterada a outros recetores Fc (por exemplo, recetores de ativação de Fc), uma atividade de ADCC alterada, uma atividade de ligaçao a Clq alterada, uma atividade de citotoxicidade dependente de complemento alterada, ou qualquer combinação das mesmas.

Numa forma de realização, o anticorpo é especificamente reconhecido por um recetor Fc gama tal como FCGR3A (também denominado CD16, FCGR3, Receptor III de Fc de Imunoglobulina G; IGFR3, Receptor para Fragmento Fc de IgG, Ilia de Baixa Afinidade; veja, por exemplo o documento OMIM 146740), FCGR2A (também chamado de CD32, CDw32, Receptor para Fragmento Fc de IgG, lia de Baixa Afinidade, FCG2, Receptor II de Fc de Imunoglobulina G; vejaÃse por exemplo o documento OMIM 146790); FCGR2B (também denominado CD32, Receptor para Fragmento Fc de IgG, Ilb de Baixa Afinidade ; FCGR2B, FCÃGamaÃRIIB; vejaÃse por exemplo o documento OMIM 604590), FCG1RA (também denominado CD64; Receptor para Fragmento Fc de IgG, Ia de Alta Afinidade; IGFR1; vejaÃse por exemplo o documento OMIM 146760); Fragmento FCGR1 de IgG, Ic de Alta Afinidade, recetor IC de Fc de Imunoglobulina G, IGFRC; vejaÃse, por exemplo, o documento OMIM 601503); ou FCGR1B (também denominado CD64, Receptor para Fragmento Fc de IgG, Ib de Alta Afinidade; Receptor IB de Fc de Imunoglobulina G,; IGFRB; vejaÃse, por exemplo, o documento OMIM 601502).

Exemplos típicos de anticorpos terapêuticos desta invenção são rituximab, alentuzumab e trastuzumab. Tais anticorpos podem ser utilizados de acordo com protocolos clínicos que foram autorizados para utilização em indivíduos humanos. Exemplos específicos adicionais de anticorpos terapêuticos incluem, por exemplo, epratuzumab, basiliximab, daclizumab, cetuximab, labetuzumab, sevirumab, tuvurimab, palivizumab, infliximab, omalizumab, efalizumab, natalizumab, clenoliximab, etc. Opcionalmente, quando um composto que estimula um recetor ativador de uma célula NK for uma citoquina, o anticorpo terapêutico será um anticorpo para além de rituximab ou herceptina, ou opcionalmente diferente de um anticorpo antiÃCD20 ou antià HER2/neu. Outros exemplos de anticorpos terapêuticos preferidos para utilização de acordo com a invenção incluem anticorpos anti ferritina (Publicação de Patente U.S. N.° 2002/0106324), anticorpos antiÃpl40 e antiÃscS (documento WO 02/50122), e anticorpos antiÃKIR (recetor inibitório de células killer) (os recetores KIR são descritos em

Carrington e Norman, The MR Gene Cluster, 3 de maio, 2003, disponível em: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books). Outros exemplos de anticorpos terapêuticos são listados no seguinte quadro, quaisquer dos quais (e outros) podem ser utilizados nos presentes métodos. Será apreciado que, independentemente de estar ou não listado no quadro seguinte ou descrito noutro ponto da presente memória descritiva, qualquer anticorpo que possa esgotar células alvo, preferentemente por ADCC, pode beneficiar dos presentes métodos, e que o seguinte Quadro 1 não é exaustivo, nem com respeito aos anticorpos listados no mesmo, nem com respeito aos alvos ou indicações dos anticorpos que são listados.

Quadro 1: Anticorpos terapêuticos

COMPOSTOS REGULADORES DA ATIVIDADE DE CÉLULAS NK A atividade de célula NK é regulada por um mecanismo complexo que envolve sinais tanto estimulantes como inibitórios. Consequentemente, pode ser alcançada terapêutica mediada por célula NK eficaz tanto por uma estimulação destas células como por uma neutralização de sinais inibitórios. Também será reconhecido que o mecanismo pelo qual os recetores são bloqueados não é crítico para as vantagens proporcionadas pela invenção. Os anticorpos podem ligar diretamente aos recetores e inibiÃlos (no caso de recetores inibitórios) . 0 parâmetro crítico é o efeito que os compostos têm sobre a capacidade de anticorpos terapêuticos para esgotar as suas células alvo in vivo.

As células NK são negativamente reguladas por recetores inibitórios específicos de complexo de histocompatibilidade principal (MHC) de classe I (Kãrre et al. , 1986, Õhlén et al. , 1989) . Estes recetores específicos ligam a determinantes polimõrficos de moléculas de complexo de histocompatibilidade principal (MHC) de classe I ou HLA e inibem a lise de células natural killer (NK) . Em seres humanos, uma família de recetores denominados recetores de tipo Ig de células killer (KIRs) reconhecem grupos de alelos de HLA de classe I.

Existem vários grupos de recetores KIR, incluindo KIR2DL, KIR2DS, KIR3DL e KIR3DS. Recetores KIR tendo dois domínios Ig (KIR2D) identificam alotipos de HLAÃC: KIR2DL2 (anteriormente designado p58.1) ou o produto de gene estreitamente relacionado KIR2DL3 reconhece um epítopo partilhado pelos alotipos de HLAÃC de grupo 2 (Cwl, 3, 7, e 8), enquanto KIR2DL1 (p58.2) reconhece um epítopo compartilhado pelos alotipos de HLAÃC de grupo 1 (Cw2, 4, 5, e 6). 0 reconhecimento por KIR2DL1 é ditado pela presença de um resíduo de Lys na posição 80 de alelos HLAÃ C. 0 reconhecimento de KIR2DL2 e de KIR2DL3 é ditado pela presença de um resíduo de Asn na posição 80. De forma importante a grande maioria de alelos HLAÃC possui um resíduo ou Asn ou Lys na posição 80. Um KIR com três domínios Ig, KIR3DL1 (p7Q), reconhece um epítopo partilhado pelos alelos de HLAÃBw4. Finalmente, um homodímero de moléculas com três domínios Ig KIR3DL2 (pl40) reconhece HLAÃA3 e ÃA11.

Embora KIRs e outros recetores inibitórios de classe I (Moretta et al., 1997; Valiante et al., 1997; Lanier, 1998) possam ser coÃexpressos por células NK, no repertório NK de qualquer determinado indivíduo, existem células que expressam um único KIR e, como tal, as células NK correspondentes são bloqueadas somente por células expressando um grupo de alelos específicos de classe I. Consequentemente, conforme descrito abaixo no presente documento, quando forem selecionados recetores inibitórios, os presentes métodos envolverão frequentemente a administração de anticorpos que visam recetores inibitórios múltiplos, garantindo como tal um efeito de base ampla que alcança uma variedade máxima de células NK.

Preferentemente, um anticorpo ou um fragmento do mesmo, que bloqueia o recetor inibitório de uma célula NK, é um anticorpo ou um fragmento do mesmo que neutraliza o sinal inibitório de KIR2DL2, KIR2DL3 e/ou KIR2DL1. 0 pedido também divulga a utilização de uma combinação de vários anticorpos ou um fragmento dos mesmos que bloqueiam diferentes recetores inibitórios de células NK. Preferentemente, anticorpos ou um fragmento dos mesmos que bloqueiam recetores inibitórios de células NK são específicos de um recetor inibitório selecionado a partir de KIR2DL1, KIR2DL2, KIR2DL3, KIR3DL1, KIR3DL2, NKG2A e NKG2C e são capazes de inibir a inibição de citotoxicidade de células NK mediada por KIR e/ou NKG2A/C.

Num aspeto preferido, são utilizados anticorpos monoclonais, bem como fragmentos e derivados dos mesmos, nos quais o dito anticorpo, fragmento ou derivado tem reatividade cruzada com vários recetores KIR na superfície de células NK conforme revindicado e neutraliza os seus sinais inibitórios.

Numa forma de realização, é utilizado um anticorpo monoclonal que liga a um determinante comum de recetores KIR2DL humanos conforme reivindicado e inibe a via inibitória correspondente. Numa forma de realização preferida, o anticorpo monoclonal liga a recetores KIR2DL1 e KIR2DL2/3 na superfície de células NK humanas e inibe a inibição de citotoxicidade de células NK mediada por KIR2DL1 e KIR2DL2/3. 0 anticorpo inibe especificamente a ligação de moléculas de HLAÃc a recetores KIR2DL1 e KIR2DL2/3. Mais preferentemente, o anticorpo facilita a atividade de células NK in vivo. Dado que KIR2DL1 e KIR2DL3 (ou KIR2DL2/3) são suficientes para cobrir a maioria dos alotipos de HLAÃC, respetivamente alotipos de HLAÃC de grupo 1 e alotipos de HLAÃC de grupo 2, tais anticorpos podem ser utilizados para aumentar a eficácia de um anticorpo terapêutico na maioria de indivíduos humanos, tipicamente em cerca de 90S dos indivíduos humanosou mais. Numa tal forma de realização, qualquer um dos anticorpos descritos no Pedido de Patente PCT WO 2005/003172 depositado a 1 de julho de 2004, titulado ÕCompositions and methods for regulating NK cell ativityõ podem ser utilizados de acordo com a invenção.

Num aspeto específico desta divulgação, o anticorpo que bloqueia o recetor inibitório de uma célula NK é um anticorpo monoclonal, em que o dito anticorpo liga a um determinante comum de recetores KIR2DL humanos e inibe a inibição de citotoxicidade de célula NK mediada por KIR2DL. 0 anticorpo mais especificamente liga ao mesmo epítopo que o anticorpo monoclonal DF200 produzido por hibridoma b20 ou compete com anticorpo monoclonal DF2G0 produzido por hibridoma DF200 para ligar a um recetor Kl na superfície de uma célula NK humana. Conforme discutido, são descritos exemplos de anticorpos, ensaios funcionais e ensaios para determinar se os anticorpos competem pela ligação aos ditos anticorpos no Pedido de Patente PCT WG 2005/003172.

Num aspeto específico, o anticorpo monoclonal é anticorpo monoclonal DF200 produzido por hibridoma DF2Q0. Noutros aspetos, o anticorpo é um fragmento ou derivado do anticorpo DF200. 0 hibridoma produtor de anticorpo DF200 tem estado depositado na coleção de culturas CNCM, como Número de Identificação ÕDF200Õ, Número de registo CNCM Ià 3224, registrado a 10 de junho de 2004, Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, Institut Pasteur, 25, Rue du Docteur Roux, FÃ75724, Paris Cedex, 15, França. A ligação de qualquer composto a qualquer um dos recetores de célula NK descritos no presente documento pode ser detetada utilizando qualquer de uma variedade de métodos padrão. Por exemplo, podem ser utilizados ensaios colorimétricos do tipo ELISA, bem como ensaios de imunoprecipitação e ensaios radioimunológicos. Podem ser empregues ensaios de competição, por exemplo, para comparar a ligação de um composto de teste a um composto conhecido como ligando a um recetor de células NK, no qual os compostos de controlo (por exemplo, BAB2S1, que especificamente se liga em NKp46) e de teste são misturados (ou préÃadsorvidos) e aplicados a uma amostra contendo a proteína contendo epítopo, por exemplo, NKp46 no caso de BAB281. Protocolos baseados em ELISAs, ensaios radioimunológicos, Western blotting e a utilização de BIACORE são adequados para utilização em tais estudos de competição simples e são bem conhecidos na técnica. A inibição de inibição de citotoxicidade de células NK mediada por KIR ou NKG2A/C, pode ser avaliada através de vários ensaios ou testes, tais como ensaios de ligação, citotoxicidade, ou outros ensaios moleculares ou celulares.

Numa forma de realização específica, a atividade inibitória é ilustrada pela capacidade de o dito anticorpo, reconstituir a lise de clones NK positivos para KIR, sobre alvos positivos para HLAÃC. Em outra forma de realização específica, o um anticorpo, é definido como inibindo a ligação de moléculas de HLAÃC a recetores KIR2DL1 e KIR2DL3 (ou o estreitamente relacionado KIR2DL2), adicionalmente preferentemente como a sua capacidade para alterar a ligação de uma molécula de HLAÃC selecionada a partir de Cwl, Cw3, Cw7, e Cw8 (ou de uma molécula de HLAÃC tendo um resíduo de Asn na posição 80) a KIR2DL2/3; e a ligação de uma molécula de HLAÃC selecionada a partir de Cw2, Cw4, Cw5 e Cw6 (ou de uma molécula de HLAÃC tendo um resíduo de Lys na posição 80) a KIR2DL1.

A atividade inibitória ou potencializadora de um anticorpo pode ser avaliada em qualquer uma de uma série de modos, por exemplo, através do seu efeito sobre cálcio livre intracelular conforme descrito, por exemplo, em Sivori et al. (1997) J. Exp. Med. 186 :1129Ã1136 , A atividade das células NK também pode ser avaliada utilizando um ensaio de citotoxicidade baseado em células, por exemplo, medição da libertação de cromo, tal como avaliação da capacidade do anticorpo de estimular células NK para matar células alvo tais como células P815, K562, ou células tumoral adequadas conforme descrito em Sivori et al. (1997) J. Exp. Med. 186: 1129Ã1136; Vitale et al. (1998) J. Exp. Med. 187: 2065Ã2072; Pessino et al. (1998) J. Exp. Med. 188: 953Ã960; Neri et al. (2001) Clin. Diag.

Lab. Immun. 8:1131Ã1135); Pende et al. (1999) J. Exp. Med. 190: 1505Ã1516). Também são proporcionados ensaios de citotoxicidade adequados na secção de exemplos da presente memória descritiva. Numa forma de realização preferida, os anticorpos causam um aumento de pelo menos 100 da citotoxicidade de NK, preferentemente um aumento de pelo menos 400 ou 500 da citotoxicidade de NK, ou mais preferentemente um aumento de pelo menos 700 da citotoxicidade de NK. A atividade das células NK também pode ser abordada utilizando um ensaio de libertação de citoquinas, no qual células NK são incubadas com o anticorpo para estimular a produção de citoquina por parte das células (por exemplo produção de IFNÃy e TNFÃoO . Num protocolo exemplar, a produção de IFNÃy a partir de PBMC é avaliada através de coloração de superfície celular e intracitoplãsmica e análise por citometria de fluxo após 4 dias em cultura. Brevemente, é adicionada Brefeldina A (Sigma Aldrich) numa concentração final de 5 g/ml durante as últimas 4 horas de cultura. As células são então incubadas com mAb antiÃCD3 e antiÃCD56 antes da permeabilização (IntraPrep™; Beckman Coulter) e coloração com PEÃantiÃIFNÃY ou PEÃIgGl (Pharmingen). A produção de GMÃCSF e a produção de IFNÃy a partir de células NK policlonais ativadas são medidas em sobrenadantes utilizando ELISA (GMÃCSF: DuoSet Elisa, R%D Systems, Mineãpolis, MN; IFNÃy: OptElA set, Pharmingen).

Num aspeto preferido, a capacidade do anticorpo de ativar as células NK de humano é avaliada, onde uma capacidade para ativar células NK humanas bem como de células NK não humanas indica que os compostos são adequados para utilização de acordo com a presente divulgação. Em particular, pode ser avaliada a capacidade do composto para potenciar a capacidade de anticorpos terapêuticos de direcionar a esgotamento de células alvo adequadas por células NK in vitro ou in vivo.

Os anticorpos podem exibir atividade inibitória parcial, por exemplo reduzir parcialmente a inibição da citotoxicidade de células NK mediada por KIR2DL. Os anticorpos mais preferidos são capazes de inibir pelo menos 200 , preferentemente pelo menos 300 , 400 ou 500 maús da atividade das células NK, por exemplo, conforme medida num ensaio de toxicidade celular, em comparação com células na ausência do anticorpo. Também preferido, o anticorpo pode proporcionar um aumento de esgotamento de células alvo em 100 , 200 , 300 , 400 , 500 , 600 , 700 , 800 , 900 2OOE)Q0 , 3000 , 4000 , 5000 , 10000 , ou mais em relação ao hívte esgotamento na ausência do composto. Alternativamente, os anticorpos são capazes de induzir a lise de população de células alvo autõlogas ou compatíveis com HLA ou combinadas, isto é, população de células que não seriam eficazmente lisadas por células NK na ausência do dito anticorpo. Consequentemente, os anticorpos desta divulgação também podem ser definidos como facilitando a atividade de célula NK in vivo. 0 pedido também se refere a aspetos nos quais anticorpos que bloqueiam o recetor inibitório de uma célula NK são fragmentos de um tal anticorpo monoclonal tendo substancialmente a mesma especificidade para antigénio, incluindo, sem limitação um fragmento Fab, um fragmento Fab'2, uma CDR e um ScFv. Adicionalmente, o anticorpo monoclonal pode ser humanizado, humano, ou quimérico (por exemplo, um anticorpo biespecífico ou funcionalizado). Podem ser utilizados derivados, por exemplo, com sequências modificadas ou com grupos funcionais heterólogos conjugados ou outros compostos, para qualquer um dos anticorpos descritos no presente documento.

Os anticorpos que bloqueiam o recetor inibitório de uma célula NK de acordo com a divulgação podem ser produzidos através de uma variedade de técnicas conhecidas na técnica. Tipicamente, são produzidos através de imunização de um animal não humano com um agente imunogénico compreendendo um polipéptido KIR ou fragmento imunogénico do polipéptido, e coleção de células de baço (para produzir hibridomas através de fusão com linhas celulares adequadas). São bem conhecidos métodos de produzir anticorpos monoclonais a partir de várias espécies na técnica (vejaÃse, por exemplo Harlow et al. , ÕAntibodies: A laboratory Manual,Õ CSH Press, 1988; Goding, ÕMonoclonal Antibodies: Principles and Practice,Õ Academic Press, 1986;). Mais especificamente, estes métodos compreendem imunização de um animal não humano com o antigénio, seguido por uma recuperação de células de baço que são então fusionadas com células imortalizadas, tais como células de mieloma. Os hibridomas resultantes produzem anticorpos monoclonais e podem ser selecionados através de diluições limitantes para isolar clones individuais. Também podem ser produzidos anticorpos através da seleção de bibliotecas combinatórias de imunoglobulinas, conforme descrito por exemplo em Ward et ãl. i,1989) .

Os anticorpos preferidos que bloqueiam o recetor inibitório de uma célula NK de acordo com a divulgação são preparados através de imunização com um agente imunogénico compreendendo um recetor inibidor de células NK, por exemplo um polipéptido KIR2DL, mais preferentemente um polipéptido KIR2DL humano. 0 polipéptido KIR2DL pode compreender a sequência de comprimento total de um polipéptido KIR2DL humano, ou um fragmento ou derivado do mesmo, tipicamente um fragmento imunogénico, isto é, uma porção do polipéptido compreendendo um epítopo, preferentemente um epítopo de célula B ou T. Tais fragmentos contêm tipicamente pelo menos 7 aminoácidos consecutivos da sequência de polipéptido madura, ainda mais preferentemente pelo menos 10 aminoácidos consecutivos da mesma. São essencialmente derivados a partir do domínio extracelular do recetor. Numa forma de realização preferida, o agente imunogénico compreende um polipéptido KIR2DL, humano de tipo selvagem numa membrana lipídica, tipicamente na superfície de uma célula. Numa forma de realização específica, o agente imunogénico compreende células NK intactas, particularmente células NK humanas intactas, opcionalmente tratadas ou lisadas.

Embora os anticorpos terapêuticos possam ter regiões Fc modificadas de modo a potenciar a sua ligação por recetores tais como CD16, em determinadas formas de realização os anticorpos potenciadores de células NK terão regiões Fc alteradas de modo a reduzir a sua afinidade por recetores

Fc, reduzindo como tal a possibilidade de que as células NK ligadas pelos anticorpos sejam elas mesmas ligadas e lisadas.

Podem ser produzidos anticorpos que bloqueiam os recetores KIR2DL de células NK através de métodos compreendendo: i) imunizar um mamífero não humano com um agente imunogénico compreendendo um polipéptido KIR2DL; ii) preparar anticorpos monoclonais do dito animal imunizado, em que os ditos anticorpos monoclonais se ligam ao dito polipéptido KIR2DL; iii) selecionar os anticorpos monoclonais a partir da etapa ii) que têm reatividade cruzada com pelo menos dois sorotipos diferentes de polipéptidos KIR2DL; e iv) selecionar anticorpos monoclonais a partir de (iii) que inibem a inibição de células NK mediada por KIR2DL, A ordem das etapas (iii) e (iv) pode ser alterada. Opcionalmente, o método pode compreender adicionalmente etapas adicionais de preparar fragmentos ou derivados do anticorpo monoclonal, conforme descrito abaixo.

Noutra forma de realização, o método compreende: i) selecionar, a partir de uma biblioteca ou repertório, um anticorpo monoclonal ou um fragmento ou derivado do mesmo que tem reatividade cruzada com pelo menos dois serotipos diferentes de polipéptidos KIR2DL; e ii) selecionar um anticorpo a partir da etapa i) que inibe a inibição de células NK mediada por KIR2DL.

Num aspeto preferido, o animal não humano empregue nestes métodos, ou utilizado na produção de quaisquer dos anticorpos descritos no presente documento, é um mamífero, tal como um roedor (por exemplo, ratinho, rato, etc.), bovino, porcino, cavalo, coelho, cabra, ovelha etc.

Igualmente, qualquer um dos anticorpos descritos no presente documento pode ser geneticamente modificado ou manipulado para ser adequado para seres humanos, por exemplo, anticorpos humanizados, quiméricos, ou humanos. Métodos para humanizar anticorpos são bem conhecidos na técnica. Em geral, um anticorpo humanizado de acordo com a presente invenção tem um ou mais resíduos de aminoãcido introduzidos no mesmo a partir do anticorpo original Estes resíduos de aminoãcido de ratinho ou outros não humanos são muitas vezes referidos como resíduos ÕimportadosÕ, que são tipicamente tomados a partir de um domínio variável ÕimportadoÒ. A humanização pode ser essencialmente realizada seguindo o método de Winter e colaboradores (Jones et al. (1986) Nature 321: 522; Riechmann et al. (1988) Nature 332:323; Verhoeyen et al. (1988) Science 239: 1534 (1988)). Nalguns casos, tais anticorpos ÕhumanizadosÕ são anticorpos quiméricos (Cabilly et al., Patente U.S. N.° 4.816.567), nos quais substancialmente menos de um domínio variável de humano intacto foi substituído pela sequência correspondente a partir do anticorpo original. Na prática, anticorpos humanizados de acordo com esta invenção são tipicamente anticorpos humanos nos quais alguns resíduos de CDR e possivelmente alguns resíduos de FR são substituídos por resíduos a partir de sítios análogos no anticorpo original.

Outro método de preparar anticorpos monoclonals ÕhumanizadosÕ é a utilização de um XenoMouse® (Abenix, Fremont, CA) como o ratinho utilizado para imunização. Um XenoMouse é um ratinho hospedeiro que cujos genes de imunoglobulina foram substituídos por genes de imunoglobulina humana funcionais. Consequentemente, anticorpos produzidos por este ratinho ou em hibridomas preparados a partir de célula B deste ratinho, já estão humanizados. 0 XenoMouse está descrito na Patente U.S. N.° 6.162.963. Pode ser realizado um método análogo utilizando um HuMAbÃMouse™ (Medarex).

Também podem ser produzidos anticorpos humanos de acordo com várias outras técnicas, tais como através da utilização, para imunização, de outros animais transgénicos que foram manipulados para expressar um repertório de anticorpos humanos (Jakobovitz et al. , Nature 362 (1993) 255), ou através de seleção de repertórios de anticorpos utilizando métodos de exibição de fago. Tais técnicas são conhecidas para os peritos na especialidade e podem ser implementadas partindo de anticorpos monoclonais conforme descritos no presente pedido.

Os anticorpos do presente pedido também podem ser derivados a partir de anticorpos "quiméricos" (imunoglobulinas) nos quais uma porção da cadeia pesada e/ou leve é idêntica ou homóloga às sequências correspondentes no anticorpo original, enquanto o resto da(s) cadeia(s) é idêntico ou homólogo às sequências correspondentes em anticorpos derivados a partir de outras espécies ou pertencendo a outra classe ou subclasse de anticorpos, bem como fragmentos de tais anticorpos, contanto que exibam a atividade biológica desejada (Cabilly et al. , supra; Morrison et al. , (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 81: 6851) .

0 anticorpo poderá ser policlonal ou, preferentemente, monoclonal. 0 anticorpo pode ser produzido por um hibridoma ou por uma célula recombinante manipulada para expressar os domínios constantes e variáveis desejados. 0 anticorpo pode ser um anticorpo de cadeia simples ou outro derivado de anticorpo retendo a especificidade para antigénio e a região de dobradiça inferior ou uma variante do mesmo. 0 anticorpo pode ser um anticorpo polifuncional, anticorpo recombinante, anticorpo humanizado, ou um fragmento ou derivado do mesmo. 0 dito fragmento ou um derivado do mesmo é preferentemente selecionado a partir de um fragmento Fab, um fragmento Fab'2, uma CDR ou um ScFc. 0 fragmento é um fragmento de ligação a antigénio. Um anticorpo que compreende um fragmento de anticorpo também pode incluir mas não estar limitado aos anticorpos biespecíficos. COMPOSIÇÃO E ADMINISTRAÇÃO 0 pedido também proporciona uma composição compreendendo pelo menos um anticorpo ou um fragmento do mesmo que bloqueia o recetor inibitório de uma célula NK conforme revindicado e um anticorpo terapêutico, a utilização de dita composição para aumentar a eficácia do anticorpo terapêutico, para aumentar ADCC num indivíduo tratado com um anticorpo terapêutico, ou para tratar um indivíduo tendo uma doença, mais particularmente uma doença requerendo a esgotamento das células alvo, preferentemente células doentes tais como células infetadas por vírus, células tumorais ou outras células patogénicas. Preferentemente, a doença é selecionada a partir do grupo consistindo num cancro, uma doença autoimune, uma doença inflamatória, e uma doença viral. A doença também se refere a uma rejeição de enxerto, mais particularmente rejeição de aloenxerto, e doença de hospedeiro contra enxerto (GVHD).

Mais particularmente, o tratamento da doença requer o esgotamento das células alvo, preferentemente de células doentias tais como células infetadas por vírus, células tumorais ou outras células patogénicas. Preferentemente, a doença é um cancro, doença infeciosa ou doença imune. Mais preferentemente, a doença é selecionada a partir do grupo consistindo num cancro, uma doença autoimune, uma doença inflamatória, e uma doença viral. A doença também se refere a uma rejeição de enxerto, mais particularmente rejeição de aloenxerto, e doença de hospedeiro contra enxerto (GVHD).

As ditas doenças incluem proliferação neoplásica de células hematopoiéticas. Opcionalmente, as ditas doenças são selecionadas a partir do grupo consistindo em leucemia linfoblãstica, leucemia mielogénica aguda ou crónica, linfoma de Hodgkin, linfoma de não Hodgkin, síndrome mielodisplãsica, mieloma múltiplo, e leucemia linfocítica crónica. As ditas doenças também incluem cancros ENT, cancros colorretais, cancro de mama, e cancro epitelial. As ditas doenças incluem infeção por CMV, e hepatite B. As ditas doenças incluem doença de Crohn, artrite reumatoide, asma, psoríase, esclerose múltipla ou diabetes. Em particular, qualquer doença listada no quadro proporcionado acima pode ser tratada. 0 dito anticorpo terapêutico pode ser ligado por CD16, preferentemente por meio da sua região Fc. Preferentemente, o dito anticorpo terapêutico tem uma porção Fc de IgGl ou de IgG3, particularmente um anticorpo monoclonal ou um fragmento do mesmo, adicionalmente preferentemente um anticorpo humano, um anticorpo humanizado, um anticorpo quimérico, ou um fragmento do mesmo, por exemplo rituximab. 0 anticorpo liga um determinante comum dos recetores humanos KIR2DL1, KIR2DL2, e KIR2DL3 e inibe a inibição da citotoxicidade de células NK mediada por KIR2DL1, KIR2DL2, e KIR2DL3. Num aspeto particular, o dito anticorpo inibe a ligação de uma molécula de alelo de HLAÃC tendo um resíduo de Lys na posição 80 a um recetor humano KIR2DL1, e a ligação de uma molécula de alelo de HLAÃC possuindo um resíduo de Asn na posição 80 a recetores humanos KIR2DL2 e KIR2DL3. Noutra forma de realização particular, este anticorpo liga ao mesmo epítopo que o anticorpo monoclonal DF200 produzido pelo hibridoma DF200. Opcionalmente, este anticorpo compete com o anticorpo monoclonal DF200 produzido pelo hibridoma DF200 pela ligação a um recetor KIR na superfície de uma célula NK humana. Numa forma de realização preferida, o anticorpo é um anticorpo monoclonal DF200 produzido pelo hibridoma DF200. A composição de acordo com a presente divulgação pode compreender uma combinação de vários anticorpos ou um fragmento dos mesmos que bloqueiam recetores inibitórios diferentes de células NK. Preferentemente, os anticorpos ou fragmentos dos mesmos que bloqueiam recetores inibitórios em células NK são específicos para um recetor inibitório selecionado a partir de KIR2DL1, KIR2DL2, KIR2DL3, KIR3DL1, KIR3DL2, NKG2A e NKG2C, e são capazes de inibir a inibição de citotoxicidade de células NK mediada por KIR ou NKG2A/C. Mais preferentemente, a combinação de anticorpos ÕneutralizadoresÕ é capaz de inibir a inibição de citotoxicidade de células NK mediada por KIR2DL1, KIR2DL2 e KIR2DL3. Ao proporcionar uma combinação de anticorpos, um número máximo de recetores inibitórios diferentes será bloqueado num número máximo de pacientes. Conforme descrito abaixo, numa forma de realização preferida, pode ser obtida uma amostra de células NK a partir de um paciente antes da aplicação dos presentes métodos, e pode ser avaliada a responsividade das células NK a diferentes combinações de anticorpos, por exemplo na presença de células alvo e do anticorpo terapêutico.

As composições desta invenção podem compreender qualquer excipiente ou portador farmaceuticamente aceitável, tipicamente tampão, soluções isotónicas, suspensão aquosa, opcionalmente suplementada com agentes estabilizantes, conservantes, etc. Formulações típicas incluem uma solução salina e, opcionalmente, uma molécula estabilizante ou protetora, tal como uma proteína de massa molecular elevada (por exemplo, albumina de soro humano).

Também são proporcionados kits compreendendo qualquer combinação de um ou mais anticorpos terapêuticos, um ou mais compostos potenciadores de células NK, e, preferentemente, instruções para a sua utilização.

De acordo com os métodos e as composições da presente divulgação, anticorpos ou um fragmento dos mesmos que bloqueiam um recetor inibitório de uma célula NK e anticorpos terapêuticos são administrados numa quantidade ÕeficazÕ ou Õterapeuticamente eficazõ. A quantidade eficaz de anticorpos terapêuticos administrada ao recipiente pode estar entre cerca de 0,1 mg/kg e cerca de 20 mg/kg. A quantidade eficaz de anticorpo depende, contudo, da forma do anticorpo (Ig inteira ou fragmentos), da afinidade do mAb, e dos parâmetros farmacocinéticos que devem ser determinados para cada anticorpo específico. A quantidade eficaz de anticorpos ou um fragmento dos mesmos que bloqueiam o recetor inibitório de uma célula NK administrada ao recipiente pode estar entre cerca de 0,1 m9/kg e cerca de 20 mg/kg. A quantidade eficaz de anticorpo depende, contudo, da forma do anticorpo (Ig inteira, ou fragmentos), da afinidade do mAb e dos parâmetros farmacocinéticos que devem ser determinados para cada um dos anticorpos específicos.

Num aspeto importante da divulgação, a utilização dos presentes anticorpos pode permitir que seja alcançada eficácia terapêutica com doses reduzidas de anticorpos terapêuticos. A utilização (por exemplo, dosagem, regime de administração) de anticorpos terapêuticos pode ser limitado por efeitos secundários, por exemplo, no caso de rituximab, febre, dores de cabeça, respiração difícil, queda ADN pressão sanguínea, e outros. Consequentemente, enquanto em muitos pacientes será administrada uma dose padrão dos anticorpos terapêuticos conjuntamente com os anticorpos potenciadores de célula NK descritos no presente documento (isto é, a dose recomendada na ausência de quaisquer outros compostos), potenciando como tal a eficácia da dose padrão em pacientes necessitando eficácia terapêutica ainda maior, noutros pacientes, por exemplo, aqueles gravemente afetados por efeitos secundários, a administração dos presentes anticorpos permitirá que seja alcançada eficácia terapêutica a uma dose reduzida de anticorpos terapêuticos, evitando como tal efeitos secundários. Na prática, um profissional médico experiente será capaz de determinar a dose ideal e o regime de administração do anticorpo terapêutico e do anticorpo potenciador de células NK para um dado paciente, por exemplo, a estratégia terapêutica que será mais adequada em vista das necessidades particulares e da condição global do paciente. Estão disponíveis várias referências para guiar a determinação de dosagens apropriadas, tanto para os anticorpos terapêuticos como para os anticorpos potenciadores de células NK, por exemplo, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, por Gennaro (2003), ISBN: 0781750253; Goodman e Gilmans The Pharmacological Basis of Therapeutics, por Hardman, Limbird % Gilman (2001), ISBN: 0071354697; Rawlins E. A., editor, OBentley's Textbook of PharmaceuticsÕ, London: Bailliere, Tindall and Cox, (1977); e outras.

Num aspeto, um profissional médico pode gradualmente diminuir a quantidade do anticorpo terapêutico dada conjuntamente com a administração de qualquer um dos presentes anticorpos potencializadores de células NK; em termos quer de dosagem quer de frequência de administração; e monitorizar a eficácia do anticorpo terapêutico, por exemplo, monitorizar a atividade das células NK; monitorizar a presença de células alvo no paciente, monitorizar várias indicações clínicas, ou por qualquer outro meio, e, em vista dos resultados de monitorização, ajustar as concentrações relativas ou os modos de administração dos anticorpos terapêuticos e/ou do anticorpo potenciador de NK para otimizar a eficácia terapêutica e limitar os efeitos secundários.

Noutro conjunto de aspetos, serão obtidas células NK a partir do paciente antes da administração do anticorpo terapêutico e dos anticorpos potencializadores de células NK (e, se adequado, durante o tratamento), e avaliadas para determinar o anticorpo ou o grupo de anticorpos ideal a ser utilizado para eficácia máxima. Por exemplo, a identidade dos recetores inibitórios ou ativadores presentes sobre as células NK pode ser determinada, e administrados anticorpos que selecionam especificamente os recetores mais proeminentes. Alternativamente, as células NK obtidas podem ser incubadas com o anticorpo terapêutico e células alvo, e a capacidade de um ou mais anticorpos de potenciar a esgotamento de células alvo pode ser avaliada. Podem ser então selecionados para utilização nos presentes métodos de tratamento quaisquer um ou mais anticorpos forem mais eficazes no potenciamento do esgotamento in vitro.

Também podem ser geralmente determinadas doses adequadas dos anticorpos e/ou de anticorpos terapêuticos in vitro ou em modelos animais, por exemplo in vitro através de incubação de várias concentrações de um anticorpo terapêutico na presença de células alvo, células NK (preferentemente células NK humanas) , opcionalmente outras células imunes, e concentrações variadas de um ou mais anticorpos potenciadores de células NK, e avaliando a extensão ou a taxa de esgotamento de célula alvo sob as várias condições, utilizando ensaios padrão (por exemplo, conforme descrito na secção de exemplos). Alternativamente, podem ser dadas doses variadas dos anticorpos terapêuticos a modelos animais para doenças tratáveis com os anticorpos (por exemplo um modelo animal de NHL no caso de rituximab), juntamente com doses variadas dos anticorpos descritos no presente documento, e a eficácia dos anticorpos (por exemplo conforme determinada por qualquer critério ou ensaio molecular, celular ou clínico adequado) no tratamento dos animais pode ser avaliada. A composição de acordo com a presente divulgação pode ser injetada diretamente num indivíduo, tipicamente por via intravenosa, intraperitoneal, intraÃarterial, intramuscular ou transdérmica. Tem sido mostrado que vários anticorpos monoclonais são eficazes em situações clínicas, tais como Rituxan (Rituximab) ou Xolair (Omalizumab), e podem ser utilizados regimes de administração semelhantes (isto é, formulações e/ou doses e/ou protocolos de administração) com a composição desta invenção.

Adicionalmente, as composições desta divulgação podem adicionalmente compreender ou podem ser utilizadas em combinação com outros agentes ativos ou programas terapêuticos, tais como quimioterapia ou outras imunoterapias, quer simultânea quer sequencialmente.

Num determinado exemplo preferido, o método da invenção compreende adicionalmente uma ou mais várias injeções de dois ou mais anticorpos que bloqueiam um recetor inibitório de uma célula NK. Consequentemente, estes dois ou mais anticorpos podem ser utilizados em combinação. Isto pode servir para causar um aumento ainda maior de ADCC e de eficácia de anticorpos terapêuticos, e/ou pode servir para reduzir a dosagem de um anticorpo particular que bloqueia um recetor inibitório de uma célula NK. Por exemplo, compostos tais como ILÃ2 são, como sabido, tóxicos em doses aumentadas. Por exemplo, um regime preferido é aquele no qual os ditos dois compostos são (i) um primeiro composto selecionado do grupo consistindo de um anticorpo que bloqueia um recetor inibitório KIR, e (ii) um segundo composto selecionado a partir do grupo consistindo em ILÃ 12, ILÃ15, ILÃ18 e ILÃ21. A divulgação como tal proporciona adicionalmente um método de tratamento de uma doença num indivíduo com necessidade do mesmo compreendendo: (a) administrar ao dito indivíduo um composto de acordo com a divulgação, um anticorpo ou um fragmento do mesmo, que bloqueia um recetor inibitório de uma célula NK; e (b) administrar ao dito indivíduo um anticorpo terapêutico; e (c) administrar ao dito indivíduo ILÃ2. ILÃ2 está disponível a partir ADN Research Diagnostics, NJ, RDIÃ2Q2, ou Chiron Corp, (Emeryville, CA). A citoquina pode ser administrada de acordo com qualquer regime de administração adequado, e pode ser administrada antes, simultaneamente e/ou após a administração do composto que bloqueia um recetor inibitório ou estimula um recetor ativador de uma célula NK, e antes, simultaneamente, e/ou após a administração de anticorpo terapêutico, num exemplo típico, a citoquina é administrada diariamente durante um período de 5Ã10 dias, a(s) citoquina(s) sendo primeiro injetada(s) no mesmo dia que a primeira injeção de composto que bloqueia um recetor inibitório ou estimula um recetor ativador de uma célula NK. 0 dito método compreende preferentemente uma ou duas injeções/dia de citoquina(s) por via subcutânea. A dosagem de citoquina será eleita dependendo da condição do paciente a ser tratado. Em exemplos preferidos, pode ser utilizada uma dose relativamente baixa de citoquina. Por exemplo, uma dose eficaz é tipicamente menor do que 1 milhão de / metro quadrado/ dia de citoquina (s) , quando a composição farmacêutica contendo citoquinas for utilizada para injeção subcutânea diária. num exemplo preferido, ILÃ2 é injetada por via subcutânea em doses diárias inferiores a 1 milhão de unidades / m2 durante 5 a 10 dias. São descritos detalhes adicionais de utilização de citoquinas na Publicação de Patente Internacional WO 2004/056392 e no Pedido de Patente U.S. 60/435.344 intitulado ÕPharmaceutical compositions having an effect on the proliferation of NK cells and a method using the sarneO.

Também será reconhecido que os anticorpos terapêuticos e os anticorpos potenciadores de células NK podem ser coadministrados, por exemplo, coAinjetados, ou podem ser administrados simultaneamente mas em formulações diferentes, ou podem ser independentemente administrados, por exemplo o composto é administrado horas, dias, ou semanas antes ou após a administração do anticorpo. São descritos aspetos e vantagens adicionais desta invenção na seguinte secção experimental, que deve ser considerada como ilustrativa e não limitante do âmbito deste pedido.

EXEMPLOS

Exemplo 1: Geração de um anticorpo panÃKIR2DL.

Purificação de PBLs e geração de linhas celulares NK clonais ou policlonais

Foram derivados PBLs a partir de dadores saudáveis através de gradientes de Ficoll Hypaque e esgotamento de células aderentes em plástico. Para obter células NK enriquecidas, os PBLs foram incubados com mAbs anti CD3, anti CD4 e anti HLAÃDR (30 min a 4°C) , seguido por microesferas magnéticos de cabra anti ratinho (Dynal) (30 min a 4°C) e seleção imunomagnética através de métodos conhecidos na técnica (Pende et al. 1999). São cultivadas células CD3 negativas, CD4 negativas, DR negativas sobre células de alimentação irradiadas e Interleucina 2 a 100 U/ml (Proleukin, Chiron Corporation) e Fitohemaglutinina A a 1,5 ng/ml (Gibco BRL) para obter populações de células NK policlonais. As células NK são clonadas através de diluição limitante e os clones de células NK são caracterizados através de citometria de fluxo para expressão de recetores de superfície celular.

Foram utilizados os seguintes clones neste estudo: CPU, CN5 e CN505 são clones positivos para KIR2DL1 e são corados por anticorpos EB6 ou XAÃ141, CN12 e CP502 são clones positivos para KIR2DL3 e são corados por anticorpo GL183.

Análise de citometria de fluxo

Os roABs utilizados foram produzidos em laboratório JT3A (IgG2a, anti CD3), EB6 e HL183 (IgGl anti KIR2DL1 e KIR2DL3 respetivamente), XAÃ141 IgM anti KIR2DL1 (mesma especificidade conforme comparado com EB6, anti CD4 (HP2.6) anti DR (Dl. 12, Ig2a) . Em vez de JT3A, HP2.6, e DR1.12, podem ser utilizados mAbs comercialmente disponíveis das mesmas especificidades por exemplo da Beckman Coulter Inc., Fullerton, CA. EB6 e GL183 estão comercialmente disponíveis a partir da Beckman Coulter Inc., Fullerton, CA. XAÃ141 não está comercialmente disponível mas EB6 pode ser utilizado para controlar a reconstituição de lise conforme descrito em (Moretta et al., 1993).

Citometria de fluxo

Foram coradas células com os anticorpos adequados (30 min a 4°C) seguido por anticorpos policlonais conjugados com PE ou FITC anti ratinho (Southern Biotechnology Associates Inc.). As amostras foram analisadas através de análise de citofluorométrica num aparelho FACSAN (Becton Dickinson, Mountain View, CA).

Experimentos de citotoxicidade A atividade citolítica de clones NK foi avaliada através de um ensaio de libertação de 5‘Cr padrão de 4 horas, no qual as células NK efetoras foram testadas sobre linhas celulares Cw3 ou Cw4 positivas conhecidas pela sua sensibilidade à lise por células NK. Todos os alvos são utilizados a 5.000 células por poço em placa de microtitulação e a razão de efetor para alvo é indicada nas figuras (habitualmente 4 efetores por célula alvo). 0 ensaio citolítico é realizado com ou sem sobrenadante de anticorpos monoclonais indicados a uma diluição de 1/2. 0 procedimento é essencialmente o mesmo que o descrito em (Moretta et al., 1993).

Geração de novos mAbs

Foram gerados mAbs através de imunização de ratinhos Balb C de 5 semanas de idade com linhas de células NK monoclonais ou policlonais ativadas conforme descrito em (Moretta et al., 1990). Após fusões de células diferentes, os mAbs foram primeiro selecionados para a sua capacidade de reatividade cruzada com clones e linhas celulares NK positivos para EB6 e GL183. Os anticorpos monoclonais positivos foram adicionalmente rastreados para a sua capacidade de reconstituir lise através de clones NK positivos para EB6 ou positivos para GL183 de alvos para Cw4 ou Cw3 positivos respetivamente.

DF200, um novo anticorpo monoclonal contra um determinante comum de recetores NK humanos KIR2DL

Foi constatado que um dos anticorpos monoclonais mAb, o DF200, reage com vários membros da família KIR incluindo KIR2DL1, e KIR2DL2/3. Com respeito à coloração de células NK com mAh DF2GQ tanto as células KIR2DL1* como KIR2DL2/3* foram brilhantemente coradas (Figura 1).

Foram utilizados clones NK expressando um ou outro (ou inclusive ambos) destes recetores inibitórios específicos para HLA de classe I como células efetoras contra células alvo expressando um ou mais alelos de HLAÃC. Conforme esperado, os clones NK KIR2DL* mostraram pouca, se alguma, atividade citolítica contra células alvo expressando HLAÃ Cw4 e os clones NK KIR2DL3* mostraram pouca ou nenhuma atividade sobre alvos Cw3 positivos. Contudo, na presença de DF200mAb (utilizado para mascarar os seus recetores KIR2DL) os clones NK tornaramÃse incapazes de reconhecer os seus ligandos HLAÃC e mostraram atividade citolítica forte sobre alvos Cw3 ou Cw4.

Por exemplo, a linha celular C1R (linha celular EBV CW4*, ATCC n. 0 CRL 1993) não foi morta pelos clones NK KIR2DL1* (CN5/CN505), mas a inibição pôde ser efetivamente revertida através da utilização quer de DF200 quer de um mAb anti KIR2DL1 convencional. Por outro lado, os clones NK expressando o fenótipo KIR2DL2/3* KIR2DL1Ã (CN12) mataram eficazmente C1R e esta morte não foi afetada pelo DF200mAb (Figura 2) . Podem ser obtidos resultados semelhantes com clones NK positivos para KIR2DL2 ou para KIR2DL3 sobre alvos Cw3 positivos.

Análise Biacore de interações DF2 00 xnAb/KIR2DLl e DF200mAb/KIR2DL3

Materiais e métodos

Produção e purificação de proteínas recombinantes. As proteínas recombinantes KIR2DL1 e KIR2DL3 foram produzidas em E. coli. Foram amplificados ADNc codificando o domínio extracelular inteiro de KIR2DL1 e de KIR2DL3 através de PCR a partir do vetor pCDMS clone 4 7.11 (Biassoni et al. , 1993) e do vetor RSVS(gpt)183 clone 6 (Wagtman et al. , 1995) respetivamente, utilizando os seguintes iniciadores:

Sentido: 5'-GGAATTCCAGGAGGAATTTAAAATGCATGAGGGAGTCCACAG-3'

Anti sentido; 5'-CCCAAGCTTGGGTTATGTGACAGAAACAAGCAGTGG-31

Foram clonados em vetor de expressão pMLl em matriz com uma sequência codificando um sinal de biotinilação (Saulquin et al., 2003).

Foi realizada expressão proteica na estirpe bacteriana BL21(DE3) (Invitrogen) . Foram cultivadas bactérias transfetadas até OD60o=Of6 a 37°C em meio suplementado com ampicilina (100 pg/ml) e induzidas com IPTG 1 mM.

Foram recuperadas proteínas a partir dos corpos de inclusão sob condições desnaturantes (ureia 8 M) . Foi realizado redobramento das proteínas recombinantes em tampão Tris 20 mM, pH 7,8, NaCl 150 mM contendo LAarginina (400 mM, Sigma) e pÃmercaptoÃetanol (1 mM) à temperatura ambiente (TA), através da diminuição da concentração de ureia numa diálise de seis etapas (ureia 4, 3, 2, 1, 0,5 e 0 M, respetivamente). Foram adicionadas glutationa reduzida e oxidada (5 mM e 0,5 mM, respetivamente, Sigma) durante as etapas de diálise com ureia 0,5 M e 0 M. Finalmente, as proteínas foram dialisadas extensivamente contra tampão Tris 10 mM, pH 7,5, NaCl 150 mM. Foram concentradas proteínas redobradas solúveis e posteriormente purificadas numa coluna de exclusão por tamanho Superdex 200 (Pharmacia; AKTA system).

Análise Biacore. Foram realizadas medições de ressonância de plasmão de superfície num aparelho Biacore (Biacore). Em todas as experiências de Biacore tampão HBS suplementado com tensioativo P20 0,050 serviu como tampão de corrida.

Imobilização de proteína. Proteínas recombinantes KIR2DL1 e KIR2DL3 produzidas como descrito acima foram imobilizadas covalentemente em grupos carboxilo na camada de dextrano sobre um Sensor Chip CM5 (Biacore). A superfície do chip sensor foi ativada com EDC/NHS (cloridrato de (NÃetilÃN!Ã(3ÃdimetilÃaminoÃpropil)Ã carbodiimida e NÃhidroxiÃsuccinimida, Biacore). Foram injetadas proteínas, em tampão de acoplamento (acetato 10 mM, pH 4,5). Foi realizada desativação dos grupos ativados restantes utilizando etanolamina 100 mM pH 8 (Biacore).

Medições de afinidade. Para medições cinéticas, foram aplicadas várias concentrações de anticorpo solúvel (10A7 a 4 x 10A1° M) na amostra imobilizada, foram realizadas medições a uma taxa de fluxo contínuo de 2 0 L/min. Para cada ciclo, a superfície do chip sensor foi regenerada através de injeção de 5 01 de NaOH 10 mM, pH 11.

Foi utilizado programa BIAlogue Kinetics Evaluation (BIAevaluation 3.1, Biacore) para análise dos dados. Resultados

Análise BIAcore de ligação de DF200 mAb a KIR2DL1 e em KIR2DL3 imobilizadas,

KD: constante de dissociação 0 analito solúvel (40 μΐ em concentrações variadas) foi injetado a uma taxa de fluxo de 2 0 μΐ/min em tampão HBS, sobre camadas de dextrano contendo 500 ou 540 unidades de ref letância (RU), e 1.000 ou 700 RU de KIR2DL1 e de KIR2DL3, respetivamente. Os dados são representativos de 6 experiências independentes.

Exemplo 2: Potenciamento de ADCC através de utilização de uma combinação de Rituxan e mAb anti KIR

Preparação de clones NK humanos. Células mononucleares sanguíneas isentas de células T através de seleção imunomagnética antiÃCD3 negativa (Miltenyi) são colocadas em placas sob condições de diluição limitante, ativadas com fitohemaglutinina (PHA) (Biochrom KG, Berlim, Alemanha), e cultivadas com interleucina (IL)Ã2 (Chiron B. V.,

Amsterdam, PaísesÃBaixos) e células de alimentação irradiadas. As eficácias de clonagem são equivalentes em todos os dadores e variam entre 1 em 5 e 1 em 10 células NK colocadas em placas. As células NK clonadas são rastreadas para alorreatividade através de citotoxicidade de libertação de blCr padrão contra linhas celulares linfoblastoides B transformadas com vírus EpsteinÃBarr de tipo HLA conhecido a uma razão de efetor para alvo de 10:1. Os clones exibindo > 300 de lise foram classificado como alorreativos. Em geral, os clones exibiram ou < 50 ou > 400 de lise.

Potenciamento de ADCC mediado por Rituxan por um clone de célula NK positivo para KIR2DL1 A atividade citolítica de clone NK é avaliada através de um ensaio de libertação de 51Cr padrão, no qual as células NK efetoras foram testadas sobre linhas celulares EBV Cw4 ou Cw3 positivas (CD20 positivas), conhecidas pela sua sensibilidade à lise por células NK. Todos os alvos são utilizados a 5.000 células por poço em placa de microtitulação e a razão de efetor (clone de célula NK) para alvo é indicada na figura 3. Em determinadas experiências, é adicionado o anticorpo terapêutico quimérico rituximab anti CD20 (Rituxan, Idee) a 5 Dg/ml à mistura de efetor/alvo. Em determinadas experiências é adicionado o anticorpo EB6 (anti KIR2DL1) a 10 g/ml à mistura de efetor/alvo.

Esta experiência mostrou que Rituxan por si só não medeia essencialmente ADCC pelo clone NK positivo para KIR2DL1 sobre alvo Cw4 positivo. 0 ADCC de clone positivo para KIR2DL1 é grandemente potenciado na presença de anticorpo anti KIR2DL1.

Exemplo 3 Ã Potenciamento de ADCC mediada por Campath por um clone de célula NK positivo para KIR2DL1

Numa experiência semelhante à descrita no Exemplo 2, foram incubados blastócitos PHA Cw4* autólogos na presença de células NK mais aluntuzumab (Campath, Berlex), e anticorpo EB6 (a 100 Dg/ml), ou Campath e EB6. Os resultados, mostrados na figura 4, mostram que a presença de EB6 potência dramaticamente a capacidade das células NK de esgotarem as células autólogas: aproximadamente 40 das células alvo foram lisadas na presença de Campath por si só, enquanto mais do que 300 das células foram lisdas na presença de Campath mais EB6.

REFERÊNCIAS

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DOCUMENTOS REFERIDOS NA DESCRIÇÃO

Esta lista de documentos referidos pelo autor do presente pedido de patente foi elaborada apenas para informação do leitor. Não é parte integrante do documento de patente europeia. Não obstante o cuidado na sua elaboração, ο IEP não assume qualquer responsabilidade por eventuais erros ou omissões.

Documentos de patente referidos na descrição • WO 2004016750 A [0050] [0051] • US 2003025399 W [0050] • WO 99158572 A [0050] • WO 99151642 A [0050] • WO 98123289 A [0050] • WO 89107142 A [0050] • WO 88107089 A [0050] • US 5843597 A [0050] • US 5642821 A [0050] • US 6194351 B [0052] • WO 00142072 A [0052] • US 6194551 B [0052] • US 20020106324 A [0055] • WO 0250122 A [0055] • WO 2005003172 A [0063] [0064] • US 4816567 A, Cabilly [0081] • US 6162963 A [0082] • WO 2004056392 A [0105] • US 435344 P [0105]

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Binding activities of a repertoire of single immunoglobulin variable domains secreted from Eschericia coli. Nature, 1989, vol. 341, 544Ã546 [0143]

Claims (31)

1. REIVINDICAÇÕES

   1. Utilização de (a) um recetor celular antiÃNK (NKR) que liga a e inibe a atividade de um recetor KIR2DL inibitório de uma célula NK, e (b) um anticorpo terapêutico que pode ser ligado por CD16 através da sua região Fc e que esgota células alvo através de ADCC, para a preparação de um fármaco para tratar uma doença, em que o dito anticorpo antiÃNKR aumenta a eficácia do dito anticorpo através do potenciamento de ADCC, em que o dito anticorpo antiÃNKR liga a um determinante comum dos recetores KIR2DL1, KIR2DL2, e KIR2DL3 humanos e inibe a inibição da citotoxicidade celular de NK mediada por KIR2DL1, KIR2DL2, e KIR2DL3.
2. 2. A utilização de acordo com a reivindicação 1, em que o dito anticorpo terapêutico tem uma porção Fc de IgGl ou IgG3 humana.
3. 3. A utilização de acordo com as reivindicações 1 ou 2, em que o dito anticorpo antiÃNKR compreende um fragmento de ligação a antigénio do mesmo.
4. 4. A utilização de acordo com as reivindicações 1 a 3, em que o dito anticorpo terapêutico é um anticorpo monoclonal ou compreende um fragmento de ligação a antigénio do mesmo.
5. 5. A utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que o dito anticorpo terapêutico não é conjugado com uma fração radioativa ou toxica.
6. 6. A utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que o dito anticorpo antiÃNKR é um anticorpo humano, humanizado ou quimérico ou compreende um fragmento de ligação a antigénio do mesmo.
7. 7. A utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que o dito anticorpo terapêutico é um anticorpo humano, humanizado ou quimérico ou compreende um fragmento de ligação a antigénio do mesmo.
8. 8. A utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que o dito anticorpo terapêutico é rituximab ou alemtuzumab.
9. 9. A utilização de acordo com a reivindicação 8, em que o dito anticorpo terapêutico é rituximab, e é administrado a uma dosagem de menos de 375 mg/rrh por semana.
10. 10. A utilização de acordo com a reivindicação 8, em que o dito anticorpo terapêutico é alemtuzumab, e é administrado a uma dosagem de menos de 90mg por semana.
11. 11. A utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, em que o dito anticorpo antiÃNKR liga ao mesmo epítopo que o anticorpo monoclonal DF200 produzido pelo hibridoma DF200, depositado como n.° registo CNCM IÃ3224.
12. 12. A utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, em que o dito anticorpo antiÃNKR compete com o anticorpo monoclonal DF200 produzido pelo hibridoma DF200, depositado como n.° registo CNCM IÃ3224 para ligar a um recetor KIR na superfície de uma célula NK humana.
13. 13. A utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, em que o dito anticorpo antiÃNKR é o anticorpo monoclonal DF200 produzido pelo hibridoma DF200, depositado como n.° registo CNCM IÃ3224 ou um fragmento ou derivado do mesmo.
14. 14. A utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que o dito anticorpo terapêutico e o dito anticorpo antiÃNKR são administrados simultaneamente ao dito indivíduo.
15. 15. A utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que o dito anticorpo antiÃNKR é administrado ao dito indivíduo no prazo de uma semana após a administração do dito anticorpo terapêutico.
16. 16. A utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a dita doença é um cancro, ou uma doença infeciosa ou imune.
17. 17. A utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, compreendendo adicionalmente avaliar a atividade ou número de células NK no dito indivíduo antes ou subsequentemente à administração do dito anticorpo antiÃNK.
18. 18. A utilização de acordo com a reivindicação 17, em que a dita avaliação da atividade ou número de células NK envolve i) incubar células NK obtidas a partir do dito sujeito anteriormente à dira administração na presença de uma ou mais células alvo que são reconhecidas pelo dito anticorpo terapêutico, na presença ou ausência do dito anticorpo antiÃNKR; e ii) avaliar o efeito do dito anticorpo antiÃNKR sobre a capacidade das ditas células NK de esgotar as ditas células alvo; em que uma deteção de que o dito anticorpo antiÃNKR potência a capacidade das ditas células NK de esgotar as ditas células alvo indica que o dito anticorpo antiÃNKR é adequado para utilização no dito método e o dito método é adequado para utilização com o dito indivíduo,
19. 19. Uma composição farmacêutica que compreende: (a) um anticorpo terapêutico que pode ser ligado por CD16 através da sua região Fc e que esgota células alvo através de ADCC, (b) um recetor celular antiÃNK (NKR) que liga a e inibe a atividade de um recetor KIR2DL inibitório de uma célula NK, e (c) um portador farmaceuticamente aceitável, em que o dito anticorpo antiÃNKR liga a um determinante comum dos recetores KIR2DL1, KIR2DL2, e KIR2DL3 humanos e inibe a inibição da citotoxicidade celular de NK mediada por KIR2DL1, KIR2DL2Ã, e KIR2DL3.
20. 20. A composição de acordo com a reivindicação 19, em que o dito anticorpo terapêutico tem uma porção Fc de IgGi ou IgG3 humana ou não humana primata.
21. 21. A composição de acordo com as reivindicações 19 ou 20, em que o dito anticorpo antiÃNKR compreende um fragmento de ligação a antigénio do mesmo.
22. 22. A composição de acordo com as reivindicações 19 ou 20, em que o dito anticorpo antiÃNKR é um anticorpo monoclonal ou compreende um fragmento de ligação a antigénio do mesmo,
23. 23. A composição de acordo com as reivindicações 19 a 22, em que o dito anticorpo antiÃNKR é um anticorpo humano, humanizado ou quimérico ou compreende um fragmento de ligação a antigénio do mesmo.
24. 24. A composição de acordo com as reivindicações 19 a 23, em que o dito anticorpo terapêutico é um anticorpo monoclonal ou compreende um fragmento de ligação a antigénio do mesmo.
25. 25. A composição de acordo com a reivindicação 24, em que o dito anticorpo terapêutico é um anticorpo humano, humanizado ou quimérico ou compreende um fragmento de ligação a antigénio do mesmo.
26. 26. A composição de acordo com as reivindicações 24 ou 25, em que o dito anticorpo não é conjugado com uma fração radioativa ou tóxica.
27. 27. A composição de acordo com as reivindicações 19 a 26, em que o dito anticorpo terapêutico é rituximab ou alemtuzumab.
28. 28. A composição de acordo com a reivindicação 19, em que o dito anticorpo antiÃNKR liga ao mesmo epítopo que o anticorpo monoclonal DF200 produzido pelo hibridoma DF2Q0, depositado como n.° registo CNCM IÃ3224.
29. 29. A composição de acordo com a reivindicação 19, em que o dito anticorpo antiÃNKR compete com o anticorpo monoclonal DF200 produzido pelo hibridoma DF200, depositado como n.° registo CNCM 1Ã3224 para ligar a um recetor KIR na superfície de uma célula NK humana.
30. 30. A composição de acordo com a reivindicação 19, em que o dito anticorpo antiÃNKR é o anticorpo monoclonal DF200 produzido pelo hibridoma DF200, depositado como n.° registo CNCM 1Ã3224, ou um fragmento ou derivado do mesmo.
31. 31. Utilização de um anticorpo recetor anti células NK (NKR) que bloqueia um recetor KIR2DL inibitório de uma célula NK em que o dito anticorpo antiÃNKR liga a um determinante comum dos recetores KIR2DL1, KIR2DL2, e KIR2DL3 humanos e inibe a inibição da citotoxicidade celular de NK mediada por KIR2DL1, KIR2DL2, e KIR2DL3, para a preparação de um fãrmaco para aumentar a eficácia de um tratamento envolvendo a administração a um indivíduo de um anticorpo terapêutico que pode ser ligado por CD16 através da sua região Fc e que esgota células alvo no dito indivíduo através de ADCC, em que a administração do dito anticorpo terapêutico é administrada ao dito sujeito antes de, simultaneamente com, ou após, uma quantidade terapeuticamente eficaz do dito anticorpo antiÃNKR e em que o dito anticorpo antiÃNKR aumenta a eficácia do dito tratamento ao potenciar ADCC no dito indivíduo.