NO337619B1

NO337619B1 - Sammensetning for å øke effektiviteten til terapeutiske antistoffer ved anvendelse av NK-cellepotensierende sammensetninger

Info

Publication number: NO337619B1
Application number: NO20056049A
Authority: NO
Inventors: Andrea Verlardi; Francois Romagne
Original assignee: Innate Pharma; Univ Degli Studi Di Perugia
Priority date: 2003-07-24
Filing date: 2005-12-19
Publication date: 2016-05-09
Also published as: RU2006105642A; NO341586B1; CA2532547C; CN104645327A; CN102772798B; DK1648507T3; US7803376B2; AU2004258747A1; KR101299599B1; PL1648507T3; US9090876B2; BRPI0412890B8; JP2014240426A; US20150299319A1; CA2532547A1; JP2012051889A; CN1829530A; AU2004258747B2; LT1648507T; SI1648507T1

Description

Oppfinnelsens fagfelt.

Den foreliggende oppfinnelsen vedrører en sammensetning for anvendelse i behandling av en sykdom i et humant individ, en farmasøytisk sammensetning, anvendelse av et anti-NK cellereseptor (NKR) antistoff eller et antigenbindende fragment derav. Nærmere bestemt vedrører oppfinnelsen bruk av et terapeutisk antistoff i kombinasjon med en forbindelse som blokkerer en inhiberende reseptor, eller som stimulerer en aktiverende reseptor til naturlige drepe-celler, og derved tillater potensiering av naturlig drepecelle cytotoksisitet i pattedyr-subjekter for å øke effektiviteten på behandling i humane subjekter, særlig gjennom en økning i ADCC mekanismen.

Oppfinnelsens bakgrunn.

Forskjellige terapeutiske strategier for mennesker er basert på bruk av terapeutiske antistoffer. Disse inkluderer for eksempel bruk av terapeutiske antistoffer utviklet for å utarme målceller, og da særlig syke celler så som virus infiserte celler, kreftceller og andre patogeniske celler. Slike anti stoffer er typisk monoklonale antistoffer, av IgG typer, typisk med humane lgG1 eller lgG3 Fc deler. Disse antistoffene kan være opprinnelige eller rekombinerte antistoffer, og er ofte "humaniserte" museantistoffer. (for eksempel omfattende funksjonelle domener fra ulike arter, ofte en Fc del av human eller ikke human primat opprinnelse, og med en variabel del eller en komplementært bestemmende del (CDR) av museopprinnelse). Alternativt kan det monoklonale antistoffet være bare humant fra immunisering av transgeniske mus som har det humane lg lokuset, eller det kan være oppnådd gjennom cDNA bibliotek derivert fra humane celler.

Et eksempel på slike terapeutiske antistoffer er rituximab (Mabthera®, Rituxan®), som er et kimerisk anti-CD20 monoklonalt antistoff laget med humane y1 og k konstante regioner (derfor med en human lgG1 Fc del) som er koblet til variable musedomener som gir CD20 spesifisitet. I løpet av de siste par årene har rituximab betraktelig forandret den terapeutiske strategien brukt mot B-lymfeproliferative krefttyper, særlig ikke-Hodgkin's lymfomer(NHL). Andre eksempler på humaniserte lgG1 antistoffer inkluderer alemtuzumab (Campath-1 H®), som er brukt i behandlingen av B-celle krefttyper, og trastuzumab (Herceptin®), som er brukt i behandlingen av brystkreft. Andre eksempler på terapeutiske antistoffer under utvikling er fremlagt på feltet.

Virkningsmekanismen til terapeutiske antistoffer er fremdeles under debatt. Injeksjon av antistoffer fører til utarming av celler som bærer antigener som er spesifikt gjenkjent av antistoffet. Denne utarmingen kan være forårsaket av minst tre forskjellige mekanismer: antistofformidlet cellulær cytotoksisitet (ADCC), komplementær avhengighetslysing, og direkte anti-tumor inhibering av tumorvekst gjennom signaler gitt via antigenet som antistoffet var rettet mot.

Selv om disse antistoffene representerer en ny og effektiv humanterapi, særlig for behandling av tumorer, utviser de ikke alltid sterk virkning. For eksempel, selv om rituximab alene eller i kombinasjon av kjemoterapi var kjent for å være effektiv i behandling av både lav til middels og høy gradert NHL, viste 30 % til 50 % av pasientene med lavgradert NHL ingen klinisk respons til retuximab. Det er blitt foreslått at nivået på CD20 uttrykking i lymfome celler, tilstedeværelse av en høy tumorbelastning ved tidspunktet for behandlingen, eller lave serum rituximab konsentrasjoner, kan forklare mangelen på virkning av retuximab i noen pasienter. Men allikevel er de faktiske grunnene til mislykket behandling fremdeles hovedsakelig ukjent.

Videre kan bruken av terapeutiske antistoffer begrenses av deres bieffekter forårsaket av deres administrering. Foreksempel kan bieffekter så som feber, hodepine, kvalme, lavt blodtrykk, pesing, utslett, infeksjoner og et antall andre oppstå i pasienter, og potensielt begrense den mulige mengden av eller hvor ofte slike antistoffer kan administreres.

Det ville derfor være svært interessant å øke virkningen til terapeutiske antistoffer, eller å kunne oppnå en terapeutisk virkning ved bruk av reduserte doseringer av antistoffer, som er mindre sannsynlige å produsere bieffekter. Den foreliggende oppfinnelsen vedrører disse og andre behov.

Sammendrag av oppfinnelsen.

Den foreliggende oppfinnelse vedrører i et første aspekt en_sammensetning for anvendelse i behandling av en sykdom i et humant individ, kjennetegnet ved at den omfatter: a. et anti-naturlig drepe cellereseptor (NKR) antistoff eller antigenbindende fragment derav som binder til og inhiberer aktiviteten av en inhiberende KIR2DL-reseptortil en naturlig drepe(NK)-celle; hvor nevnte anti-NKR antistoff eller antigenbindende fragment derav binder til en felles determinant av KIR2DL1, KIR2DL2 og KIR2DL3 humane reseptorer og inhiberer

KIR2DL1-, KIR2DL2- og KIR2DL3-mediert inhibering av NK cellecotytoksisitet; og

b. et terapeutisk antistoff som kan bindes av CD16 gjennom dets Fc-region og som reduserer målceller med antistoff-avhengig cellemediert cytotoksisitet (ADCC), hvor nevnte anti-NKR antistoff øker virkeevnen av nevnte terapeutiske antistoff ved å forsterke ADCC.

I en utførelse har nevnte terapeutiske antistoff en IgG eller en lgG3 Fc-del.

I en utførelse omfatter nevnte anti-NKR antistoff et antigenbindende fragment.

I en utførelse er nevnte terapeutiske antistoff et monoklonalt antistoff.

I en utførelse er nevnte terapeutisk antistoff ikke konjugert med en radioaktiv eller toksisk enhet.

I en utførelse er nevnte anti-NKR antistoff et humant antistoff, et humanisert antistoff eller et kimerisk antistoff, eller omfatter et antigenbindende fragment derav.

I en utførelse er nevnte terapeutiske antistoff et humant antistoff, et humanisert antistoff eller et kimerisk antistoff.

I en utførelse er nevnte terapeutiske antistoff rituximab eller alemtuzumab.

I en utførelse er nevnte terapeutiske antistoff rituximab, og nevnte terapeutiske antistoff blir administrert i en dosering på mindre enn 375 mg/m<2>pr uke.

I en utførelse er nevnte terapeutiske antistoff alemtuzumab, og nevnte terapeutiske antistoff blir administrert i en dosering på mindre enn 90 mg pr uke.

I en utførelse er nevnte anti-NKR antistoff eller antigenbindende fragment derav binder til den samme epitopen som monoklonalt antistoff DF200, produsert av hybridom DF200, deponert som registrering nr. CBCM I-3224.

I en utførelse er nevnte anti-NKR antistoff eller antigenbindende fragment derav konkurrerer med monoklonalt antistoff DF200 produsert av hybridom DF200, deponert som registrering nr. CBCM I-3224 for binding til en KIR2DL-reseptor på overflaten av en human NK-celle.

I en utførelse er nevnte anti-NKR antistoff eller antigenbindende fragment derav monoklonalt antistoff DF200 produsert av hybridom DF200, deponert som registrering nr. CBCM 1-3224, eller et fragment eller et derivat derav.

I en utførelse er nevnte anti-NKR antistoff et intakt antistoff.

I en utførelse administreres nevnte terapeutiske antistoff og nevnte anti-NKR antistoff eller antigenbindende fragment derav samtidig til nevnte individ.

I en utførelse blir nevnte anti-NKR antistoff eller antigenbindende fragment derav administrert til nevnte subjekt innen en uke etter administreringen av nevnte terapeutiske antistoff.

I en utførelse er nevnte sykdom en krefttype, infeksjonssykdom eller immunsykdom.

I et andre aspekt vedrører foreliggende oppfinnelse en farmasøytisk sammensetning, kjennetegnet ved at den omfatter: (a) et terapeutisk antistoff som kan bli bundet av CD16, (b) en anti-NK cellereseptor (NKR) antistoff eller antigenbindene fragment derav som binder til og aktiverer en inhiberende KIR2DL-reseptor til en NK-celle, hvor nevnte anti-NKR antistoff eller antigenbindende fragment derav binder til en felles determinant av KIR2DL1, KIR2DL2 og KIR2DL3 humane reseptorer og inhiberer KlR2DL1-, KIR2DL2- og KIR2DL3-mediert inhibering av NK cellecotytoksisitet; og (c) en farmasøytisk akseptabel bærer.

I en utførelse har nevnte terapeutiske antistoff en human eller en ikke-human primat lgG1 eller lgG3 Fedel.

I en utførelse er nevnte forbindelse et antistoff eller omfatter et antigenbindende fragment derav.

I en utførelse er nevnte anti-NKR antistoff eller antigenbindende fragment derav er et monoklonalt antistoff eller omfatter et antigenbindende fragment derav.

I en utførelse er nevnte anti-NKR antistoff eller antigenbindende fragment derav et humant antistoff, et humanisert antistoff eller et kimerisk antistoff eller omfatter et antigenbindende fragment derav.

I en utførelse er nevnte terapeutiske antistoff et monoklonalt antistoff.

I en utførelse er nevnte terapeutiske antistoff er et humant, humanisert eller kimerisk antistoff.

I en utførelse er nevnte terapeutiske antistoff ikke konjugert med en radioaktiv eller toksisk enhet.

I en utførelse er nevnte terapeutiske antistoff rituximab eller alemtuzumab.

I en utførelse er nevnte anti-NKR antistoff eller antigenbindende fragment derav binder til den samme epitopen som monoklonalt antistoff DF200, deponert som registrering nr. CBCM 1-3224.

I en utførelse konkurrerer nevnte anti-NKR antistoff eller antigenbindende fragment derav med monoklonalt antistoff DF200, produsert av hybridom DF200, deponert som registrering nr. CBCM 1-3224, for binding til en KIR2DLreseptor på overflaten av en human NK-celle.

I en utførelse er nevnte anti-NKR antistoff eller antigenbindende fragment derav er monoklonalt antistoff DF200 produsert av hybridom DF200, deponert som registrering nr. CBCM 1-3224, eller et fragment eller derivat derav.

I et tredje aspekt vedrører foreliggende oppfinnelse anvendelse av et anti-NK cellereseptor (NKR) antistoff eller et antigenbindende fragment derav som binder til og inhiberer aktiviteten av en inhibitorisk KIR2DL-reseptor av en NK-celle, hvor nevnte anti-NKR antistoff eller antigenbindende fragment derav binder til en felles determinant av KIR2DL1, KIR2DL2 og KIR2DL3 humane reseptorer og inhiberer KIR2DL1-, KIR2DL2- og KIR2DL3-mediert inhibering av NK cellecotytoksisitet, for fremstilling av et medikament for å øke virkeevnen av en behandling som involverer administrering til et individ av et terapeutisk antistoff som bindes av CD16 gjennom dets Fc-region og som utarmer målceller i nevnte individ med ADCC, hvor nevnte terapeutiske antistoff administreres til nevnte individ før, samtidig med, eller etter en terapeutisk effektiv mengde av nevnte anti-NKR-antistoff og hvor nevnte anti-NKR antistoff øker virkeevnen av nevnte terapeutiske antistoff ved å forsterke ADCC i individet.

I en utførelse har nevnte terapeutiske antistoff en human lgG1 eller lgG3 Fc-porsjon.

I en utførelse forsterker nevnte anti-NKR antistoff evnen av nevnte terapeutiske antistoff til å utarme målceller med minst 30%.

I et aspekt vedrører foreliggende oppfinnelse en sammensetning i samsvar med ethvert av kravene 1-17, hvor nevnte anti-NKR antistoff forsterker evnen av nevnte terapeutiske antistoff til å utarme målceller med minst 50%.

I et aspekt vedrører foreliggende oppfinnelse en sammensetning for anvendelse i samsvar med ethvert av kravene 18-29, hvor nevnte anti-NKR antistoff forsterker evnen av nevnte terapeutiske antistoff til å utarme målceller med minst 30%.

I et aspekt vedrører foreliggende oppfinnelse en sammensetning for anvendelse i samsvar med ethvert av kravene 18-29, hvor nevnte anti-NKR antistoff forsterker evnen av nevnte terapeutiske antistoff til å utarme målceller med minst 50%.

I en utførelse omfatter anvendelsen å undersøke aktiviteten eller antallet NK-celler i nevnte individ før eller påfølgende administreringen av nevnte anti-NKR-antistoff.

I en utførelse omfatter nevnte undersøking av aktiviteten eller antallet NK-celler; (i) inkubere NK-celler opptatt fra nevnte individ før nevnte administrering i nærvær av én eller flere målceller som gjenkjennes av nevnte terapeutiske antistoff, in nærvær eller fravær av nevnte anti-NKR-antistoff; og (ii) undersøke effekten av nevnte anti-NKR-antistoff med hensyn til evnen av nevnte NK-celler til å redusere nevnte målceller;

hvor en deteksjon av at nevnte anti-NKR-antistoff forsterker evnen av nevnte NK-celler til å redusere nevnte målceller indikerer at nevnte anti-NKR-antistoff er egnet for anvendelse i nevnte fremgangsmåte og at nevnte fremgangsmåte er egent for anvendelse i nevnte individ.

Figurtekster.

Figurl:

Monoklonalt antistoff DF200 binder en felles determinant av forskjellige humane KIR2DL reseptorer.

Figur 2:

Rekonstituering av lysing med anti-KIR2DL mAb (monoklonalt antistoff på C1R Cw4 mål ved et frembringer/ målforhold på 4/1. Monoklonalt antistoff DF200 inhiberer KIR2DL positiv NK-cellecytotoksisitet (rekonstutiv lysering) på Cw4 positive målceller.

Figur 3:

Økning av ADCC fremmet av Rituxan på en KIR2DL1 positiv NK-klone i en Cw4 positiv EBV cellelinje ved blokkering av KIR/HLA interaksjoner. NK-klone cytolysering med KIR2DL1 blir testet mot en Cw4 positiv EBV transformert (CD20 positiv) målcellelinje ved forskjellige fremmer/målforhold (fra 1 til 4) i nærvær av 5 ug/ml anti-CD20 antistoff (Rutixan) og 10 ug/ml EB6 antistoff (anti-KIR2DL1); Rituxan alene; EB6 alene; eller uten noe antistoff. ADCC er svært økt i nærvær av anti-KIR2DL1 antistoff (EB6).

Figur 4:

Økning av ADCC fremmet at Campath til en KIR2DL1 positiv NK-klone i en Cw4 positiv EBV celle-linje ved blokkering av KIR/HLA interaksjon. NK-klone cytolysering i KIR2DL1 er testet mot en Cw4 positiv EBV transformert (CD20 positiv) målcellelinje i nærvær av Campath og 100 ug/ml EB6 antistoff (anti KIR2DL1); Campath alene; EB6 alene; eller uten noen antistoff. ADCC er svært økt i nærvær av KIR2DL1 antistoffet (EB6).

Definisjoner

Som brukt heri har de følgende uttrykkene meninger som gitt til dem dersom noe annet ikke er spesifisert.

Som brukt heri refererer "NK" celler til en subbpopulasjon av lymfocytter som er involvert i ikke- konvensjonell immunitet. NK-celler kan identifiseres ved visse karakteristikker og biologiske egenskaper så som ekspresjon av spesifikke overflate antigener inkludert CD16, CD56, og/eller CD57, og fravær av alfa/ beta eller gamma/delta TCR kompleks på selve celle overflaten, evnen til å binde og drepe celler som ikke uttrykker "selv" MHC/HLA antigener ved aktivering av spesifikke cytolytiske enzymer, evnen til å drepe kreftceller eller andre syke celler som uttrykker en ligand for NK aktiverende reseptorer, og evnen til å frigi protein molekyler kalt cytoksiner som stimulerer eller inhiberer immunresponsen. Enhver av disse karakteristikkene og aktivitetene kan bli brukt for å identifisere NK-celler ved bruk av fremgangsmåter velkjent på fagfeltet.

Uttrykket "antistoff som brukt heri, refererer til polyklonale og monoklonale antistoffer. Avhengig av typen av konstant domene i de tunge kjedene, blir antistoffene tillagt en av de fem hovedklassene: IgA, IgD, IgE, IgG og IgM. Mange av disse er videre delt inn i underklasser eller isotyper så som lgG1, lgG2, lgG3, og lgG4, og lignende. Et eksempel på en immunoglobin (antistoff) strukturell enhet omfatteren tetramer. Hver tetramer omfatter to identiske par av polyppeptid kjeder, der hvert par har en "lett" (omtrent 25 kDa) og en "tung" kjede (omtrent 50-70 kDa). N-terminusen til hver kjede definerer et variabelt område på ca 100-110 eller flere aminosyrer som er hovedsakelig ansvarlige for antigen gjenkjennelse. Uttrykket variabel lett kjede (VL) og variabel (VH) refererer henholdsvis til disse lette og tunge kjedene. De tungkjede konstante domenene som korresponderer med de forskjellige klassene med immunoglobiner er henholdsvis kalt "alfa," "delta," "epsilon", "gamma", og "mu". Under enhetsstrukturene og de tredimensjonale konfigureringene til forskjellige klasser av immunoglobuliner er velkjente. IgG og/eller IgM er de foretrukne klassene av antistoffer anvendt ifølge den foreliggende oppfinnelsen, hvor IgG er særdeles foretrukket, fordi de er de mest vanlige antistoffene i den fysiologiske situasjonen, fordi de er lettest å lage i laboratorier, og fordi lgG'er er spesifikt gjenkjent av Fc gamma reseptorer. Fortrinnsvis er antistoffet ifølge oppfinnelsen et monoklonalt antistoff. Særlig foretrukket er humaniserte, kimeriske, humane eller på andre måter passende for mennesker antistoffer.

Innenfor rammen til den foreliggende oppfinnelsen betyr uttrykket "terapeutisk antistoff eller antistoffer" mer spesifikt et hvert antistoff som virker ved å utarme målceller i en pasient. Mer bestemt binder terapeutiske antistoffer spesifikt til antigener tilstedeværende på overflaten på målceller, for eksempel tumorspesifikke antigener tilstedeværende hovedsakelig eller bare på tumor celler. Fortrinnsvis inkluderer terapeutiske antistoffer humane Fc deler, eller er i stand til å komme i kontakt med humane Fc reseptorer. Terapeutiske antistoffer kan finne målcellene på enhver måte, for eksempel ADCC eller på andre vis, og kan være "nakent", dvs uten konjugerte enheter, eller de kan være konjugerte ved med forbindelser så som radioaktive merker eller toksiner.

Uttrykket "binder spesifikt til" betyr at et antistoff kan binde i en konkurranse- bindetest fortrinnsvis til binde-partneren, for eksempel en aktiverende NK reseptor så om NKp30, NKp44, eller NKp46, eller en human Fc gamma reseptor som bestemt ved bruk av enten rekombinante former av proteinene, epitoper deri eller opprinnelige proteiner tilstedeværende på overflaten av isolerte NK- eller relevante målceller. Konkurranse-bindingstester og andre fremgangsmåter for å bestemme spesifikk binding er videre beskrevet under, og er velkjente på feltet.

Et "humant passende" antistoff refererer til ethvert antistoff, derivatisert antistoff, eller antistoff fragment som kan bli trygt brukt av mennesker for for eksempel de terapeutiske fremgangsmåtene beskrevet heri. Humant passende antistoffer inkluderer alle typer av humaniserte, kimeriske eller fullt humant antistoffer, eller antistoffer hvori minst en del av antistoffet er frembrakt fra mennesker eller på andre måter forandret slik at man unngår immunresponsen som blir fremkalt når opprinnelige ikke humane antistoffer er brukt.

Med " immunogenisk fragment" mener man heri ethvert polypeptidisk eller peptidisk fragment som er i stand til å frembringe en immunrespons så som (i) fremstillingen av antistoffer som binder nevnte fragment og/eller binder enhver form av molekyle som omfatter nevnte fragment, inkludert den membranbundne reseptoren og mutanter derivert derfra, (ii) stimuleringen av en T-celle respons som involverer T-celler som reagerer på det biommolekylære komplekset som omfatter et hvert MHC molekyl og et peptid derivert fra nevnte fragment, (iii) binding av transfekterte vehikler så som bakteriofager eller bakterier som uttrykker gener som koder for mammale imoglobuliner. Alternativt refererer et immunogenisk fragment også til enhver konstruksjon som er i stand til å fremkalle en immunrespons som definert ovenfor, så som et peptid fragment konjugert til ett bærerprotein ved kovalent kobling, et kimerisk rekombinant polypeptid konstrukt som omfatter nevnte peptidiske fragment i dets aminosyrefrekvens, og spesifikt inkluderer celler transfektert med et cDNA hvis sekvens omfatter en del som koder for nevnte fragment.

I forbindelse med den foreliggende oppfinnelsen refererer et "humanisert" antistoff til et antistoff hvori den konstante og variable rammeregionen til ett eller flere humane immunoglobuliner er sammensmeltet med binde området, for eksempel CDR'et til et dyre-immunoglobulin. Slike humaniserte antistoffer er laget slik at de opprettholder bindings-spesifikkiteten til det ikke-humane antistoffet hvorfra bindingsområdene har sin opprinnelse, men for å unngå en immunreaksjon mot det ikke-humane antistoffet.

Et "kimerisk antistoff' er et antistoff molekyl hvori (a) det konstante området eller en del derav er forandret, erstattet eller utbyttet slik at antigen bindingsområdet (det variable området) er koblet til et konstant område tilhørende en forskjellig eller endret klasse, frembringer funksjon og/eller art, eller et fullstendig forskjellig molekyl som formidler nye egenskaper til det kimeriske antistoffet, for eksempel et enzym, toksin, hormon, vekstfaktor, medikament osv; eller (b) det variable området, eller en del derav er forandret, erstattet eller byttet med et variabelt område som har en forskjellig eller endret antigen spesifisitet. I foretrukne utførelser av den foreliggende oppfinnelsen opprettholder det kimeriske antistoffet allikevel Fc området av immunoglobulinet, fortrinnsvis et humant Fc område, noe som tillater interaksjoner med humane Fc reseptorer på overflaten til målcellene.

Innenfor rammen til denne oppfinnelsen betyr "potensiert", "aktiv", eller "aktiverte" NK-celler biologisk aktive NK-celler, mer spesifikt NK-celler som har evnen til å lyse målceller. For eksempel er en "aktiv" NK-celle i stand til å drepe celler som uttrykker en NK aktiverende reseptor legand og ikke uttrykker "selv" MHC/HLA antigener (KIR- ikke kompatible celler). Eksempler på passende målceller for bruk i omdirigerte drepe-tester er P815 og K562 celler, men enhver av et antall celletyper kan bli brukt og er velkjente på feltet (se, feks., Sivori et al. (1997) J. Exp. Med. 186: 1129-1136; Vitale et al. (1998) J. Exp. Med. 187: 2065-2072; Pessino et al. (1998) J. Exp. Med. 188: 953-960; Neri et al. (2001) Clin. Diag. Lab. Immun. 8:1131-1135). "Potensiert", "aktiv" eller "aktiverte" celler kan også identifiseres ved andre egenskaper eller aktiviteter kjent på feltet som assosiert med NK aktivitet, så som cytokin-(for eksempel IFN-y og TNF-a) produksjon av økning i frie intra cellulære kalsium nivåer. For formålet til den foreliggende oppfinnelsen, refererer "potensiert", "aktiv" eller "aktiverte" NK-celler til i særdeleshet NK-celler in vivo som ikke er inhiberte via stimulering av en inhiberende reseptor, eller hvori slik inhibering er blitt opphevd for eksempel via stimulering av en aktiverende reseptor.

Som brukt heri refererer uttrykket "aktiverende NK reseptor" til et hvert molekyl på overflaten til NK-celler som når stimulert fører til en målbar økning i enhver egenskap eller aktivitet kjent på feltet som assosiert med NK aktivitet, så som cytokin (for eksempel IFN-y og TNF-a) produksjon, økning i de intercellulære frie kalsium nivåene, evnen til å rette seg inn mot celler i en omdirigert drepetest som beskrevet, for eksempel andre steder i den foreliggende beskrivelsen, eller evnen til å stimulere NK-celle proliferering. Uttrykket "aktiverende KIR reseptor" inkluderer, men er ikke begrenset til, NKp30, NKp44, NKp46, NKG2D, IL-12R, IL-15R, IL-18R og IL-21R. Utrykket "aktiverende NK reseptor" som brukt heri ekskluderer IL-2 reseptoren (IL-2R). Fremgangsmåter for å bestemme om en NK-celle er aktiv eller prolifererende eller ikke er beskrevet i mer detaljer nedenfor og er velkjente for de med kunnskaper på feltet.

Som brukt heri refererer uttrykket" inhiberende" eller "inhiberende NK-reseptor" til et hvert molekyl på overflaten av NK-celler som når stimulert fører til en målbar senking i enhver egenskap eller aktivitet kjent på feltet som assosiert med NK aktivitet, så som cytokin (for eksempel IFN-y og TNF-a) produksjon, økning i intracellulære frie kalsiumnivåer, eller evnen til å lyse målceller i en omdirigert drepetest som beskrevet, for eksempel andre steder i den foreliggende beskrivelsen. Eksempler på slike reseptorer inkluderer KIR2DL1, KIR2DL2/3, KIR2DL4, KIR2DL5A, KIR2DL5B, KIR3DL1, KIR3DL2, KIR3DL3, LILRB1, NKG2A, NKG2C NKG2E og LILRB5. Fremgangsmåter for å bestemme om en NK-celler er aktiv eller ikke er beskrevet i mer detaljer nedenfor og er velkjente for de med kunnskaper på feltet.

I den foreliggende oppfinnelsen refererer uttrykket "blokkerer en inhiberende reseptor eller stimulerer en aktiverende reseptor til en NK-celle" til evnen til visse forbindelser, fortrinnsvis antistoffer, fragmenter eller derivater derav til å foretrekke å ha direkte kontakt med minst en inhiberende eller aktiverende NK-celle reseptor, foreksempel KIR, NKG2A/C, NKp30, NKp44, NKp46 og andre som opplistet heri, og enten nøytralisere inhiberende signaler til reseptoren (når det gjelder inhiberende reseptorer) eller stimulerer signaler fra reseptoren (når det gjelder aktiverende reseptor). Med inhiberende reseptorer er fortrinnsvis forbindelsen, fortrinnsvis et antistoff eller fragment derav, i stand til å blokkere forbindelsen mellom HLA og reseptoren. Når forbindelsen er et antistoff, kan antistoffene være polyklonale eller fortrinnsvis monoklonale. De kan produseres av hybriddomer eller ved rekombinant celler utviklet for å uttrykke det ønskede variable og konstante domenene. Antistoffene kan være enkelt kjede antistoffer eller andre antistoff derivater som fortsatt har antigen spesifisitet og den lavere hengsle region eller en variant derav så som et Fab fragment, et Fab'2 fragment eller et CDR og en ScFv. Disse kan være flerfunksjonene antistoffer, rekombinante antistoffer, humaniserte antistoffer eller variasjoner derav.

Innenfor rammen til denne oppfinnelsen betyr "felles determinant" en determinant eller et epitop som er delt av flere medlemmer av en gruppe av beslektede reseptorer, for eksempel den humane KIR2DL reseptor gruppen. Determinanten eller epitopen kan representere et peptidfragment eller en konfirmasjonsepitop delt av nevnte medlemmer. I en spesifikk utførelse omfatter den felles determinanten en epitop gjenkjent av monoklonalt antistoff DF200, NKVSF1 eller EB6.

Innenfor rammen til denne oppfinnelsen betyr uttrykket antistoff som "binder" en felles

determinant et antistoff som binder nevnte determinant med spesifisitet og/eller affinitet, for eksempel at det hovedsakelig ikke binder med høy affinitet eller med spesifisitet andre ikke-ubeslektede motiver eller determinanter eller strukturer på overflaten av humane NK-celler. Mer spesifikt kan bindingen av et monoklonalt antistoff ifølge den foreliggende oppfinnelsen til nevnte determinant bli diskriminert fra binding av nevnte antistoff til et annet epitop eller determinant.

Forbindelser, fortrinnsvis antistoffer, som er i stand til å binde NK-celle inhiberende reseptorer og derved unngå deres stimulering er derfor "nøytraliserende" eller "inhiberende"

forbindelser, fortrinnsvis antistoffer, i den betydning at de blokkerer i det minste delvis den inhiberende signalveien fremmet av en NK-celles inhiberende reseptor, for eksempel KIR eller NKG2A/C reseptorer. Det er viktig at denne inhiberende aktiviteten kan utvises i forhold til flere typer KIR eller NKG2A/C reseptorer, slik at disse forbindelsene, fortrinnsvis antistoffene kan brukes i forskjellige subjekter med høy effektivitet.

Uttrykket "rekombinant" når brukt med referanse til for eksempel en celle eller en nukleinsyre, et protein, eller en vektor, indikerer at cellen, nukleinsyren, proteinet eller vektoren er blitt endret av introduksjonen av en heterolog nukleinsyre eller protein eller endringen av et opprinnelig nukleinsyre eller protein, eller at cellen har opphav i en celle som er endret på denne måten. Derfor kan for eksempel rekombinante celler uttrykke gener som ikke finnes i den opprinnelige (ikke rekombinante) formen av cellen, eller uttrykker opprinnelige gener som er på andre måter unormalt uttrykt, for lite uttrykt eller ikke uttrykt i det hele tatt.

Innenfor rammen av den foreliggende oppfinnelsen kan et subjekt eller en pasient inkludere ethvert pattedyrsubjekt eller pasient, mer fortrinnsvis et humant subjekt eller pasient.

Terapeutiske antistoffer.

Den foreliggende oppfinnelsen angår bruk av NK-celle potensierende forbindelser i forbindelse med terapeutiske antistoffer. Enhver av en stor mengde terapeutiske antistoffer kan bli brukt i den foreliggende oppfinnelsen. Med andre ord kan ethvert terapeutisk antistoff, om det så er "nakent" eller konjugert med ett radiomerke, toksin eller en annen enhet, eller om det er full lengde eller et fragment, eller om det er et ekte antistoff eller et endret derivat av et antistoff bli bruk. Fortrinnsvis er fremgangsmåtene brukt for å øke virkningen av terapeutiske midler hvori NK-celle aktivitet har en rolle - ikke nødvendigvis en eksklusiv rolle- i virkningen av administrerte terapeutiske antistoffer, og også fortrinnsvis vil antistoffene eller fragmentene naturlig inkludere eller vil bli endret til å inkludere, et humant Fc område eller annet domene som tillater spesifikk gjenkjennelse av antistoffet av humane Fc reseptorer, for eksempel Fc gamma reseptorer.

De foreliggende forbindelsene kan bli brukt for å øke evnen til terapeutiske antistoffer til å utarme målceller som uttrykker et antigen som er spesifikt gjenkjent av terapeutiske antistoffer. I så måte kan enhver sykdom eller tilstand som er forårsaket av eller gjort verre av minst delvis celler som kan bli målrettet av et terapeutisk antistoff bli behandlet ved bruk av de heri beskrevne fremgangsmåtene. Spesifikke eksempler på målceller inkluderer tumorceller, virusinfiserte celler, allogeniske celler, patologiske immunokompetente celler (for eksempel B-lymfocytter, T-lymfocytter, antigen fremvisende celler osv) involvert i allergi, autoimmune sykdommer, allogeniske reaksjoner osv, eller til og med friske celler (for eksempel endotheliske celler i en antiangiogenisk terapeutisk strategi). Mest foretrukne målceller innenfor rammen til denne oppfinnelsen er tumorceller og virusinfiserte celler. De terapeutiske antistoffene kan for eksempel frembringe en cytotoksisk effekt eller cellelysing, særlig ved antistoffavhengig cellemediert cytoksisitet (ADCC).

ADCC krever leukositt reseptorer for Fc delen av IgG (FcyR), hvilken funksjon det er å koble de IgG- sensitiviserte antigenene til FcyR-bærende cytokoksiske celler, og å sette i gang celle aktivasjons maskineriet. Derfor er det terapeutiske antistoffet i stand til å forme et immunkompleks. For eksempel kan et immunkompleks være et tumormål dekket av terapeutiske antistoffer. Mer fortrinnsvis kan antistoffet være bundet av CD16, fortrinnsvis gjennom dets Fc område. Bestemmelse av om et terapeutisk antistoff binder en Fc gamma reseptor så som CD16 kan gjøres ved enhver passende måte, for eksempel ved å bestemme bindig til en rekombinant produsert CD16 polypeptid eller fragment derav, valgfritt immobilisert på en støtte, eller for eksempel ved å bestemme bindig av det terapeutiske antistoffet til en celle som er kjent eller mistenkt for å uttrykke CD16.

De terapeutiske antistoffene kan være polyklonale eller fortrinnsvis monoklonale. De kan produseres av hybriddomer eller ved rekombinante celler fremstilt for å uttrykke den ønskede variable konstante domene. Antistoffene kan være enkeltkjede antistoffer eller andre antistoffderivater som fremdeles har antigenspesifisitet, og det lavere hengslede område eller en variant derav. Disse kan være flerfunksjonene antistoffer, rekombinante antistoffer, humaniserte antistoffer, fragmenter eller varianter derav. Nevnte fragment eller derivat derav er fortrinnsvis valgt fra et Fab fragment, et Fab'2 fragment, et CDR og en ScFv. Fortrinnsvis er et fragment et antigenbindende fragment. Terapeutiske antistoffer som omfatter et antistoff fragment kan også inkludere, men er ikke begrenset til, bi-spesifikke antistoffer; et eksempel på passende bispesifikke antistoffer omfatter et antigen bindende område spesifikt for CD16, og et antigenbindende område spesifikt for et tumorantigen. Andre antistoff formater omfatter fragmenter inkluderer rekombinante bispesifikke antistoff derivater som kombinerer bindeområdene til to forskjellige antistoffer på en enkel polypeptidkjede, også referert til som BiTE™ (Kufer P, et al TRENDS in Biotechnology 2004; 22 (5): 238-244; and Baeuerle et al, Current Opinion in Molecular Therapeutics 2003; 5(4): 413-419.

Terapeutiske antistoffer er generelt spesifikke for overflate antigener, for eksempel membran antigener. De fleste foretrukne terapeutiske antistoffer er spesifikke for tumor antigener (for eksempel molekyler spesifikt uttrykt av tumor celler) så som CD20, CD52, ErbB2 (or HER2/Neu), CD33, CD22, CD25, MUC-1, CEA, KDR, aVB3, osv, særlig lymfoma antigener (for eksempel CD20). De terapeutiske antistoffene har fortrinnsvis humane eller ikke humane primat lgG1 eller lgG3 Fc deler, mer fortrinnsvis humant IgGl

I følge en utførelse vil antistoffene inkludere endringer i deres Fc del som øker interaksjonen til antistoffet med NK-celler i løpet av ADCC. Slike modifiserte terapeutiske antistoffer ("endrede antistoffer") omfatter generelt modifikasjoner fortrinnsvis i Fc områdene som endrer bindingsaffiniteten til antistoffet til en eller flere FcyR. Fremgangsmåter for å endre antistoffene med endret bindig til en eller flere FcyR er kjente på feltet, se for eksempel PCT Publication Nos. WO 2004/016750 (International Application PCT/US2003/025399), WO 99/158572, WO 99/151642, WO 98/123289, WO 89/107142, WO 88/107089, og U.S. Patent Nos. 5,843,597 og 5,642,821.

Terapeutiske antistoffer som identifisert heri, så som D2E7 (Cambridge Antibody Technology Group, plc (Cambridge, UK)/BASF (Ludwigshafen, Germany)) brukt for å behandle reumatisk artritt, eller or Infliximab (Centocor, Inc., Malvern, PA brukt for å behandle Chron's sykdom og reumatisk artritt) eller antistoffene beskrevet i internasjonal patentsøknad PCT/US2003/025399 kan modifiseres som vist ovenfor og i nedenfor identifiserte søknader er brukt for behandling av sykdommer som slike antistoffer typisk er brukt for. I noen utførelser frembringer oppfinnelsen endrede antistoffer som har en endret affinitet, enten høyere eller lavere affinitet, foren aktiverende FcyR foreksempel FcyRIII. I visse foretrukne utførelser er det frembrakt endrede antistoffer som har høyere affinitet for FcyR. Fortrinnsvis har slike endringer også en endret Fc fremmet effektor funksjon.

Endringer som påvirker Fc fremmet fremmerfunksjon er velkjente på feltet, (se for eksempel US 6,194,351) Aminosyrene som kan endres, inkluderer men er ikke begrenset til, prolin 329, prolin 331, og lysin 322. Prolin 329 og/eller 331 og lysin 322 kan fortrinnsvis bli erstattet med allanin, men substitusjoner med enhver annen aminosyre kan også tenkes. Se WO 00/142072 og U.S. 6,194,551.

Derved kan endringer i Fc området omfatte en eller flere endringer til aminosyrene i antistoff Fc området. Slike endringer kan resultere i et antistoff med en endret antistoff fremmed effektorfunksjon, en endret bindig til andre Fc reseptorer (for eksempel Fc aktivering reseptorer), en endret ADCC aktivitet, en endret Clq bindingsaktivitet, en endret komplimentær avhengig cytotoksisitets aktivitet, eller en hver kombinasjon derav.

I en utførelse er antistoffet spesifikt gjenkjent av en Fc gamma reseptor så som FCGR3A (også kallt CD16, FCGR3, immunoglobulin G Fc reseptor III; IGFR3, reseptor for Fc fragment til IgG, lav affinitets Illa; se, f.eks. OMIM 146740), FCGR2A (også kalt CD32, CDw32, reseptor for Fc fragment av IgG, lav affinitet Ila, FCG2, immunoglobulin G Fc reseptor II; se, f.eks. OMIM 146790); FCGR2B (også kalt CD32, reseptor for Fc fragment av IgG, lav affinitet Nb; FCGR2B, FC-gamma-RIIB; se, f.eks. OMIM 604590), FCG1RA (også kalt CD64; reseptor for Fc fragment av IgG, høy affinitet la; IGFR1; se, f.eks. OMIM 146760); FCGR1 fragment av IgG, høy affinitet le, immunoglobulin G Fc reseptor IC, IGFRC; se, f.eks., OMIM 601503); eller FCGR1B (også kalt CD64, reseptor for Fc fragment av IgG, høy affinitet Ib; Immunoglobulin G Fc reseptor IB, IGFRB; se, foreksempel OMIM 601502).

Typiske eksempler på terapeutiske antistoffer ifølge denne oppfinnelsen er rituximab, alemtuzumab og trastuzumab. Slike antistoffer kan bli brukt ifølge de kliniske protokollene som er blitt autorisert for bruk i humane subjekter. Ytterligere spesifikke eksempler på terapeutiske antistoffer inkluderer for eksempel epratuzumab, basiliximab, daclizumab, cetuximab, labetuzumab, sevirumab, tuvurimab, palivizumab, infliximab, omalizumab, efalizumab, natalizumab, clenoliximab, osv. Når en forbindelse som stimulerer en aktiverende reseptor av en NK-celle er et cytokin, er valgfritt det terapeutiske antistoffet et antistoff annet enn rituximab eller herceptin, eller valgfritt annet enn et anti-CD20 eller anti-HER2/neu antistoff. Andre eksempler på foretrukne terapeutiske antistoffer for bruk i følge oppfinnelsen inkluderer anti-ferritin antistoffer (US patentsøknad nr. 2002/0106324), anti-p140 og anti-sc5 antistoffer (WO 02/50122), oganti-KIR (drepe inhiberend reseptor) antistoffer ( KIR reseptorene er beskrevet i Carrington og Norman, The KIR Gene Cluster, Mai 3, 2003, tilgjengelig ved: http:// www. ncbi. nlm. nih. gov/ books Andre eksempler på terapeutiske antistoffer er opplistet i den følgende tabellen, et hvert hvorav (og andre) kan bli bruk i følge de foreliggende fremgangsmåtene. Det vil bli satt pris på at uavhengig av om eller ikke de er opplistet i den følgende tabellen eller beskrevet andre plasser i foreliggende beskrivelsen, kan ethvert antistoff som kan utarme målceller, fortrinnsvis ved ADCC, dra fordel av de foreliggende fremgangsmåtene, og at den følgende tabell 1 ikke viser alt, verken når det gjelder antistoffer opplistet deri eller når det gjelder mål eller indikasjoner på antistoffene som er opplistet.

Forbindelser som regulerer NK-celle aktivitet.

NK-celle aktivitet er regulert av en kompleks mekanisme som involverer både stimulerende og inhiberende signaler. Derved kan en effektiv NK-celle fremmet terapi bli oppnådd ved både stimulering av disse cellene eller nøytralisering av inhiberende signaler. Det vil bli satt pris på at enhver forbindelse som har den effekten at den blokkerer, inhiberer eller på andre måter nedregulerer en inhiberende reseptor av en NK-celle, eller av aktiverende, stimulerende eller på andre måter fremmer aktiviteten eller ekspresjon av en aktiverende reseptor til en NK-celle kan anvendes. Dette inkluderer forbindelser så som cytokiner, så vel som små molekyler, polypeptider og antistoffer som kan binde NK-celle reseptorer og direkte inhibere eller stimulere dem. Det vil også bli satt pris på at mekanismen hvorved reseptorene er blokkert eller stimulert ikke er kritisk til fordelene frembrakt av oppfinnelsen. For eksempel kan forbindelsene øke uttrykking av en aktiverende reseptor, eller inhibere ekspresjon av en inhiberende reseptor, forbindelser kan forebygge interaksjon mellom en legand og en inhiberende reseptor eller øke interaksjonen mellom en legand og en aktiverende reseptor, eller forbindelsene kan binde direkte til reseptorene og inhibere dem (i tilfeller av inhiberende reseptorer) eller aktivere dem (i tilfeller av aktiverende reseptorer). Den kritiske parameteren er effekten som forbindelsen har på evnen til terapeutiske antistoffer til å utarme deres målceller in vivo.

Enhver inhiberende reseptor på overflaten til en NK-celle kan bli målrettet av de foreliggende forbindelsene. NK-celler er negativt regulert ved det hovedsakelig histokompatibilitets komplekset (MHC) klasse 1 spesifikke inhiberende reseptorene (Karre et al 1986; Ohlén et al, 1989;). Disse spesifikke reseptorene binder til polymorfiske determinanter til histokompabilitetskomplekset (MHC) klasse 1 molekylene eller HLA og inhiberer naturlige drepe- (NK) celle lysing. I mennesker gjenkjenner en familie reseptorer kalt draps -lg-lignende reseptorer (KIR'er) grupper av HLA klassel alleler.

Der er flere grupper av KIR reseptorer inkludert KIR2DL, KIR2DS, KIR3DL og KIR3DS. KIR reseptorer som har to lg domener (KIR2D) identifiserer HLA-C allotypene: KIR2DL2 (tidligere kjent som p58.1) eller det nært beslektede genproduktet KIR2DL3 som gjenkjenner en epitop delt av gruppe 2HLA-C allotyper (Cw1, 3,7 og 8), mens KIR2DL1 (p58.2) gjenkjenner en epitop delt med den resiprokale gruppe 1 HLA-C allotyper (Cw2,4,5 og 6). Gjenkjennelsen av KIR2DL1 er diktert av tilstedeværelsen av en Lys rest i posisjon 80 til HLA-C allelene. KIR2DL2 og KIR2DL3 gjenkjennelse er diktert av tilstedeværelsen av et Asn rest i posisjon 80. Det er viktig at den store majoriteten til av HLA-C alleler har enten et Asn eller en lys rest i posisjon 80. En KIR med tre lg domener; KIR3DL1 (p70) gjenkjenner et epitpo delt av HLA-Bw4 alleler. Til slutt gjenkjenner en homodimer av molekyler med tre lg domener KIR3DL2 (p140) HLA-A3 og -A11.

Selv om KIR'er og andre klasse 1 inhiberende reseptorer (Moretta et al, 1997; Valiante et al, 1997; Lanier, 1998) kan bli samuttrykt av NK-celler, fins der i ethvert gitt individs NK repertoar celler som uttrykker en enkelt KIR og derved er de korresponderende NK-cellene blokkert bare av celler som uttykker en spesifikk klasse 1 allele gruppe. Derved som beskrevet heri, når inhiberende reseptorer er målrettet mot vil de foreliggende fremgangsmåtene ofte involvere administrering av forbindelser som er målrettet mot flere inhiberende reseptorer, derved sikrer det en bred basert effekt som når en maksimum utstrekning av NK-celler.

I visse utførelser blokkerer forbindelsen, fortrinnsvis et antistoff eller fragment derav, en inhiberende reseptor av en NK-celle, og nøytraliserer det inhiberende signalet til minst en inhiberende reseptor valgt fra gruppen som består av KIR2DL2, KIR2DL3, KIR2DL1, KIR3DL1, KIR3DL2, NKG2A og NKG2C. Mer fortrinnsvis er forbindelsen, fortrinnsvis et antistoff eller et fragment derav som blokkerer det inhiberende reseptoren til en NK-celle en forbindelse, fortrinnsvis et antistoff eller et fragment derav, som nøytraliserer det inhiberende signalet til KIR2DL2, KIR2DL 3 og/eller KIR2DL1.

Oppfinnelsen vedrører også bruk av en kombinasjon av flere forbindelser, fortrinnsvis antistoffer eller fragmenter derav som blokkerer forskjellige inhiberende reseptorer til NK-celler. Fortrinnsvis er forbindelsene, fortrinnsvis antistoffer eller fragmenter derav, som blokkerer inhiberende reseptorer til NK-celler spesifikke for en inhiberende reseptor valgt fra KIR2DL1, KIR2DL2, KIR2DL3, KIR3DL1, KIR3DL2, NKG2A og NKG2C og er i stand til å inhibere det beslektede KIR- eller NKG2A/C fremmede inhiberingen av NK-celle cytotoksisitet. Foreksempel kan forbindelser som blokkerer inhiberende reseptorer til NK-celler omfatte et antistoff som har en spesifisitet for KIR2DL1, og andre som har en spesifisitet for KIR2DL2 og/eller KIR2DL3. Mer foretrukket er kombinasjon av forbindelser som blokkerer inhiberende reseptorer til NK-celler i stand til å inhibere KIR2DL1-, KIR2DL2-, og KIR2DL3- fremmet inhibering av NK-celle cytotoksisitet. I andre utførelser vil en blanding av en eller flere forbindelser målrettet mot en eller flere inhiberende reseptorer så vel som en eller flere forbindelser målrettet mot en eller flere aktiverende reseptorer bli administrert.

For eksempel er det blitt vist at monoklonale antistoffer spesifikke for KIR2DL1 blokkerer KIR2DL1Cw4, (eller lignende) alleler (Moretta et al 1993). I et annet eksempel er monoklonale antistoffer mot KIR2DL2/3 også blitt beskrevet som blokkerer KIR2DL2/3 HLACw3 (eller lignende) alleler (Moretta et al., 1993). Anti NKG2A antistoffer som har vist seg å blokkere den inhiberende interaksjonen mellom NKG2A og HLA-E.

Valgfritt kan antistoffet bli valgt fra gruppen som består av GL183 (KIR2DL2, L3, tilgjengelig fra Immunotech, Frankrike og Beckton Dickinson, USA); EB6 (KIR2DL1, tilgjengelig fra Immunotech, Frankrike og Beckton Dickinson, USA); AZ138 (KIR3DL1, tilgjengelig fra Moretta et al, Univ. Genova, Italy); Q66 (KIR3DL2, tilgjengelig fra Immunotech, Frankrike); Z270 (NKG2A, tilgjengelig fra Immunotech, Frankrike); P25 (NKG2A/C, tilgjengelig fra Moretta et al, Univ. Genova, Italia); ogDX9, Z27 (KIR3DL1, tilgjengelig fra Immunotech, Frankrike og Beckton Dickinson, USA).

I en foretrukket utførelse bruker oppfinnelsen monoklonale antistoffer, så vel som fragmenter og derivater derav, hvori nevnte antistoff, fragment eller derivat kryssreagerer med flere KIR'er eller NKG2A/C reseptorer på overflaten til NK-celler og nøytraliserer deres inhiberende signaler.

I en utførelse bruker oppfinnelsen et monoklonalt antistoff som binder en felles determinant av humant KIR2DL2 reseptorer og inhiberer de korresponderende inhiberende signalveien. Fortrinnsvis bruker oppfinnelsen et monoklonalt antistoff som binder KIR2DL1 og KIR2DL2/3 reseptorer på overflaten til humane NK-celler, og inhiberer KIR2DL1- og KIR2DL2/3-fremmet inhibering av NK-celle cytotoksisitet. Antistoffet inhiberer spesifikt binding av HLA-C molekyler til KIR2DL1 og KIR2DL2/3 reseptorer. Mer fortrinnsvis fremmer antistoffet NK-celle aktivitet in vivo. Fordi KIR2DL2 og KIR2DL3 (eller KIR2DL2) er tilstrekkelig for å dekke mest av HLA-C allotypene, henholdsvis gruppe 1 HLA-C allotyper og gruppe 2 HLA-C allotyper, kan slike antistoffer bli brukt for å øke effektiviteten til et terapeutisk antistoff i de fleste humane individer, typisk i om lag 90% av humane individer eller mer. I slik utførelse kan ethvert av antistoffene beskrevet i PCT patent søknad nr PTC/FR 04/01702 innlevert 1. juli 2004, med tittelen "Compositions and methods for regulating NK cell activity" bli anvendt i følge oppfinnelsen.

I en særskilt oppfinnelsesgjenstand ifølge oppfinnelsen, er antistoffet som blokkerer den inhiberende reseptoren til en NK-celle et monoklonalt antistoff, hvori nevnte antistoff binder til et felles determinant av KIR2DL humane reseptorer, og inhiberer klR2DL fremmet inhibering av NK-celle cytotoksisitet. Antistoffet binder mer spesifikt til den samme epitopen som monoklonalt antistoff DF200 eller NKVSF1, produsert av henholdsvis hybriddom DF200 og NKVFS1 og/eller konkurrer med monoklonalt antistoff DF200 eller NKVFS1 produsert henholdsvis av hybriddom DF200 og NKVFS1, for binding til en KIR reseptor på overflaten av en human NK-celle. Som diskutert er eksempler på antistoffer, funksjonelle tester og tester for å bestemme om antistoffene konkurrere for binding med nevnte antistoffer beskrevet i PCT patent søknad nr PCT/FR 04/01702.

I følge en spesifikk utførelse er det monoklonale antistoffet monoklonalt antistoff DF200 produsert av hybriddom DF200. I en annen utførelse er det monoklonale antistoffet EB6, eller antistoffet binder til den samme epitopen som monoklonalt EB6, eller konkurrerer for binding med monoklonalt antistoff EB6.1 andre utførelser er antistoffet et fragment eller derivat av enten antistoffene DF200 eller EB6. Hybridomet som produserer antistoff DF200 har blitt deponert ved CNCM kultur kolleksjonen, som identifiserings nr"DF200" registrerings nr "CNCM I-3224, registrert den 10. juni 2004 ved Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, Institut Pasteur, 25, Rue du Docteur Roux, F-75724 Paris Cedex 15, Frankrike. Antistoff NKVSF1 er tilgjengelig fra Serotec (Cergy Sainte-Christophe, France), Catalog ref no. MCA2243.

I en annen utførelse av den foreliggende oppfinnelsen, stimulerer forbindelsen brukt til å øke virkningen til terapeutiske antistoffer en aktiverende reseptor til en NK-celle. En hver aktiverende reseptor kan bli brukt, for eksempel NKp30 (se for eksempel PCT WO

01/36630), NKp44 (se foreksempel Vitale et al. (1998) j. Exp. Med. 187:2065-2072), NKp46 se foreksempel referansen dertil), NK2 (se for eksempel OMIM 602893), IL-12R, IL-15R, IL-18R, IL-21R, eller en alternativ KIR reseptor, for eksempel en KIR2DS4 reseptor (Carrington og Norman, The KIR Gene Cluster. Mai 3, 2003 , tilgjengelig ved: http:// www. ncbi. nlm. nih. gov/ booksl, eller enhver annen reseptor tilstedeværende på en betydelig andel av NK-celler, og hvis aktivering fører til aktivering eller proliferering av cellen, fortrinnsvis selv om cellen før hadde blitt inhibert via en inhiberende reseptor så som en inhiberende KIR reseptor. Forbindelsen kan være enhver molekylær enhet, inkl polypeptider, små molekyler og antistoffer. Eksempler på forbindelser inkluderer enhver ligand, inkludert naturlige, rekombinante eller syntetiske ligander, som har et samspill med aktiverende reseptorer. For eksempel kan en forbindelse som stimulerer en aktiverende reseptor til en NK-celle være et cytokin så som IL-12, som kobles til IL-12 reseptoren (IL-12R), IL-15 som kobler seg til IL-15 reseptoren (IL-15R), IL-18 som kobler seg til IL-18 reseptoren (IL-18R), IL-21 som kobler seg til IL-21 reseptoren (IL-21 R). Slike forbindelser er kjent fra for eksempel. IL-12 (Research Diagnostics, NJ, DI-212), IL-15 (Research Diagnostics, NJ, RDI-215), IL-21 (Asano et al, FEBS Lett. 2002;528:70-6). Fortrinnsvis er forbindelsen som stimulerer en aktiverende reseptor av en NK-celle en forbindelse annen enn IL-2. Andre eksempler på forbindelser som stimulerer en aktiverende reseptor til en NK-celle inkluderer

antistoffer som binder til en NK-celle reseptor valgt fra gruppen som består av NKp30, NKp44, NKp46, NKG2D, KIR2DS4 og andre aktiverende KIR reseptorer.

I visse foretrukne utførelser er den aktiverende reseptoren en naturlig cytotoksisitets reseptor (NCR) funnet på NK-celler, fortrinnsvis er NCR'en valgt fra gruppen bestående av NKp30, NKp44 eller NKp46, og forbindelsen som stimulerer den aktiverende reseptor er, binder seg til den samme epitopen som, eller konkurrerer for binding med ethvert av de monoklonale antistoffene valgt fra gruppen som består av AZ20, A76, Z25, Z231, og BAB281.

Bindingen av enhver forbindelse til enhver av de heri beskrevne NK reseptorene kan detekteres ved bruk av en variasjon av standard fremgangsmåte. For eksempel kan fargebaserte ELISA-type tester bli brukt, og det kan også immunopresipitering og radioimmunotester. Konkurrerende tester kan bli brukt, for eksempel for å sammenligne bindingen av en prøveforbindelse til en forbindelse kjent for å binde en NK-celle reseptor, hvori kontrollen (foreksempel BAB281 som spesifikt binder NKp46) og prøveforbindelsene er blandet sammen (eller på forhånd absorbert) og påført prøven som inneholder epitopinneholdende protein, for eksempel NKp46 i tilfelle av BAB281. Protokoller basert på ELISAer, radioimmunotester, Western blotting og bruk av BIACORE er passende for bruk i slike enkle konkurranse studier og er velkjente på feltet.

Inhibering av KIR- eller NKG2A/C fremmet inhibering av NK cytotoksisitet, eller stimulering av NKp30, NKp44, NKp46, eller NKG2D-fremmed aktivering av NK-celler, kan bestemmes av forskjellige prøver eller tester, så som binding, cytotoksisitet eller andre molekylære eller cellulære tester.

I en spesifikk utførelse blir den inhiberende aktiviteten illustrert ved evnen til nevnte forbindelse, fortrinnsvis et antistoff til å gjenopprette lysing av henholdsvis KIR eller NKG2A/C positive NK-kloner på HLA-C eller HLA-E positive mål. I en annen spesifikk utførelse blir forbindelsen, fortrinnsvis et antistoff definert som inhiberende av bindingen av HLA-C molekyler til KIR2DL1 og KIR2DL3 (eller den nært beslektede KIR2DL2) reseptorene, og videre fortrinnsvis ved dets kapasitet til å endre bindingen av et HLA-C molekyl valgt fra Cw1, Cw3, Cw7 og Cw8 eller av et HLA-C molekyl som har en Asn rest i posisjon 80) til KIR2DL2/3; og binding av et HLA-C valgt fra Cw2, Cw4, Cw5 og Cw6 (eller av et HLA-c molekyl som haren lys rest i posisjon 80) til KIR2DL1.

Den inhiberende eller potensierende aktiviteten til en forbindelse ifølge oppfinnelsen, fortrinnsvis et antistoff, kan fastsettes ved enhver av et antall måter, for eksempel ved dets effekt på intracellulært fritt kalsium som beskrevet, for eksempel i Sivori et al. (1997) J. Exp. Med. 186:1129-1136. NK-celle aktivitet kan også fastsettes ved bruk av cellebasert cytotoksisitets tester, for eksempel ved å måle kromiumfrigiving, så som å bestemme evnen til antistoffet til å stimulere NK-celler til å drepe målceller så som P815.K562 celler, eller passende tumorceller som vist i Sivori et al. (1997) J. Exp. Med. 186: 1129-1136; Vitale et al.

(1998) J. Exp. Med. 187: 2065-2072; Pessino et al. (1998) J. Exp. Med. 188: 953-960; Neri et al. (2001) Clin. Diag. Lab. Immun. 8:1131-1135); Pende et al. (1999) J. Exp. Med. 190: 1505-1516. Passende cytotoksisitets tester er også frembrakt i eksempeldelen av den foreliggende beskrivelsen. I foretrukket utførelse fører antistoffene til minst en 10% økning i NK-cytotoksisiteten, fortrinnsvis minst en 40% eller 50% økning i NK-cytotoksisiteten, eller mer fortrinnsvis mist en 70% økning i NK-cytotoksisiteten.

NK-celle aktivitet kan også sjekkes ved bruk av cytokinfrigivingstester hvor NK-celler blir innkuberte med et antistoff for å stimulere NK-cellenes cytokin produksjon (for eksempel IFN-y og TNF-a produksjon). I en eksempelvis protokoll blir IFN-y produksjon fra PBMC fastslått på celleoverflaten, og intracytoplasmisk farging og analyse ved gjennomstrømningscytometri etter 4 dager i kultur. Kortfattet blir Brefeldin A (Sigma Aldrich) tilsatt til en endelig konsentrasjon på 5 ug/ml i minst 4 timer av dyrking. Cellene er så innkuberte med anti-CD3 og anti-CD56mAb før permeablisering (IntraPrep™; Beckman Coulter) og farging med PE- anti- IFN-y eller PE-lgG1 (Pharmingen). GM-CSF og IFN-y produksjon fra polyklonale aktiverte NK-celler er målt i supernavntanter ved bruk av ELISA (GM-CSF: DuoSet Elisa, R&D Systems, Minneapolis, MN; IFN-y: OptEIA set, Pharmingen).

I en foretrukket utførelse blir evnen til antistoffet til å aktivere humane NK-celler bestemt, hvor evnen til å aktivere humane NK-celler er minst så sterk som ikke-humane NK-celler indikerer det at forbindelsene er passende for bruk ifølge den foreliggende oppfinnelsen. Særlig kan evnen til forbindelsen til å øke evnen til terapeutiske antistoffer til å påføre utarming av passende målceller av NK-celler in vivo eller vitro bli bestemt.

Forbindelsene ifølge oppfinnelsen , fortrinnsvis antistoffer, kan framvise delvis inhiberende eller stimulerende aktivitet, for eksempel delvis redusere KIR2DL fremmet inhibering av NK-celle cytotoksisitet, eller delvis aktivere en NK-celle gjennom ethvert nivå av stimulering av NCRer eller andre reseptorer. De mest foretrukne forbindelsene er i stand til å inhibere (eller stimulere når det gjelder de aktiverende reseptorene) minst 20%, fortrinnsvis minst 30%, 40% eller 50% eller mer av aktiviteten til NK-cellen, for eksempel som målt i et cellecyto-toksisitetstest, når sammenlignet med celler i fravær av forbindelsen. Også foretrukket kan forbindelsen føre til en økning i utarmingen av målceller på 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500%, 1000%, eller mer relativt til utarmingsnivået i fravær av forbindelsen. Alternativt er de foretrukne forbindelsene ifølge oppfinnelsen, fortrinnsvis antistoffer i stand til å introdusere lysing av tilpassede HLA eller kompatible eller autologene målcelle populasjoner, for eksempel cellepopulasjoner som ikke ville bli effektivt lyset av NK-celler i fravær av nevnte antistoff. Derfor kan forbindelsene ifølge oppfinnelsen også bli definert ved at de fremmer NK-celle aktivitet in vivo.

Oppfinnelsen ser også for seg utførelser hvori forbindelser som stimulerer aktiverende reseptorer eller fortrinnsvis blokkerer inhiberende reseptorer til en NK-celle er fragmenter av slikt monoklonalt antistoff som har hovedsakelig den samme antigen spesifisiteten, inkludert uten begrensninger et Fab fragment, Fab'2 fragment, CDR og en ScFv. Videre kan det monoklonale antistoffet være humanisert, humant, eller kimerisk (for eksempel flere spesifikke deler et funksjonalisert antistoff). Selv om antistoffer som stimulerer aktivering nær reseptorer også kan være fragmenter er de fortrinnsvis av full lengde. Derivater som for eksempel med endrede sekvenser eller med konjugerte heterologe funksjonelle grupper eller andre forbindelser kan bli brukt for ethvert av antistoffene som beskrevet heri.

Antistoffene som blokkerer den inhiberende reseptoren eller stimulerer den aktiverende reseptoren til en NK-celle i følge oppfinnelsen kan bli produsert ved en mengde teknikker kjent på feltet. Typisk er de produsert ved immunisering av et ikke-humant dyr med en immunogen som omfatter KIR, NKG2A/C, NCR feks. NKp30, NKp44, NKp46), eller NKG2D polypeptid eller immuogeniske fragmenter av ethvert av polypeptidene, og innsamling av miltceller (for å produsere hybriddomer ved fusjon med passende cellelinjer). Fremgangsmåter for å produserer monoklonale antistoffer fra forskjellige arter er velkjente på feltet (se for eksempel Harlow et al., "Antibodies: A laboratory Manual," CSH Press, 1988; Goding, "Monoklonal Antibodies: Principles and Practice," Academic Press, 1986). Mer spesifikt omfatter disse fremgangsmåtene å immunisere et ikke-humant dyr med antigener, etterfulgt av innsamling av miltceller som er så fusert med udødeliggjorte celler, så som myelom celler. Det resulterende hybriddomene produserer det monoklonale antistoffene og kan bli valgt ved begrensende utplantninger for å isolere de individuelle klonene. Antistoffer kan også produseres ved seleksjon av kombinasjonsbiblioteker for immunoglobuliner, som beskrevet av for eksempel Ward et at (1989.

Foretrukne antistoffer som blokkerer inhiberende reseptorer eller stimulerer en aktiverende reseptor til en NK-celle ifølge oppfinnelsen blir preparert ved immunisering med ett immunogen som omfatter en aktiverende eller inhiberende NK-celle reseptor, for eksempel et KIR2DL polypeptid, mer fortrinnsvis et humant KIR2DL polypeptid. KIR2DL polypeptider kan omfatte hele lengden av sekvensen til et humant KIR2DL polypeptid, eller fragmenter eller derivater derav, typisk et immunogenisk fragment, for eksempel en del av polypeptidet som omfatter et epitop, fortrinnsvis et T eller B celle epitop. Slike fragmenter inneholder typisk minst syv etterfølgende aminosyrer til den ferdige polypeptidsekvensen, enda mer fortrinnsvis minst 10 etterfølgende aminosyrer derav. De er hovedsakelig frembrakt fra det ekstra cellulære domenet til reseptoren. I en foretrukket utførelse omfatter immunogenet en villtype KIR2DL, NCR, eller andre polypeptider til lipidmembraner, typisk på overflatne til en celle. I en spesifikk utførelse omfatter immunogenet intakte NK-celler, fortrinnsvis intakte humane NK-celler, valgfritt behandlet eller lysert.

Selv om de terapeutiske antistoffene kan ha Fc regioner som er endret slik at de øker bindingen av reseptorer så som CD16, vil i visse utførelser NK-cellepotensierende antistoffer ha Fc områder endret slik at det reduserer deres affinitet for Fc reseptorer, og derved reduserer sjansene for at NK-celler bundet av antistoffene vil i seg selv bli bundet og lysert.

Antistoffer som blokkerer KIR2DL reseptorene til NK-celler kan produseres ved fremgangsmåter omfattende: i) immunisering av et ikke-humant pattedyr med en immunogen som omfatter en KIR2DL polypeptid ; ii) fremstilling av monoklonale antistoffer fra nevnte immuniserte dyr, hvori nevnte monoklonale antistoffer binder nevnte KIR2DL polypeptid; iii) valg av monoklonale antistoffer fra trinn ii) som kryssreagerer med minst to forskjellige serotyper av KIR2DL polypeptider; og iv) valg av monoklonale antistoffer av (c) som inhiberer KIR2DL fremmet inhibering av NK-celler.

Rekkefølgen på trinn (iii) og (iv) kan forandres på. Fortrinnsvis omfatter fremgangsmåten videre tilleggstrinn for å lage fragmenter eller derivater av det monoklonale antistoffet som beskrevet nedenfor.

I en annen utførelse omfatter fremgangsmåten: i) valg av fra et bibliotek eller et repertoar et monoklonalt antistoff eller fragment eller derivat derav som kryssreagerer med minst to forskjellige stereotyper av KIR2DL polypeptider; og valg av et antistoff fra trinn i) som inhiberer KIR2DL fremmet inhibering av NK-celler.

Det vil bli satt pris på at en hvert av disse fremgangsmåtene kan bli brukt for å velge et hvert av antistoffene eller antistoff fragmentene som er spesifikke for enhver gruppe av

(inhiberende eller aktiverende) NK-celle reseptorer som deler en eller flere epitoper. For eksempel kan lignende fremgangsmåter bli brukt for fremstilling av antistoffer som blokkerer en KIR3DL eller en NKG2A/C reseptor for NK-celler, eller stimulerer en aktiverende reseptor av NK-celler.

I en foretrukket utførelse er de ikke humane dyrene brukt i følge disse fremgangsmåtene eller brukt i produksjonen av ethvert av de heri beskrevne antistoffene et pattedyr, så som en gnager (for eksempel en mus, rotte osv), kveg, griser, hest, kanin, geit, sau osv.

Ethvert av de heri beskrevne antistoffene kan også bli genetisk endret eller fremstilt til å bli passende for mennesker, for eksempel humaniserte, kimeriske eller humane antistoffer. Fremgangsmåter for å humanisere antistoffer er velkjente på feltet. Generelt har et humanisert antistoff ifølge den foreliggende oppfinnelsen en eller flere aminosyre rester som er blitt introduserte inn i det fra det originale antistoffet. Disse muse- eller andre ikke humane aminosyre restene er ofte referert til som "import" rester, og er typisk tatt fra et "import" variabelt domene. Humanisering kan hovedsakelig utføres ved å følge framgangsmåten til Winter og medarbeidere (Jones et al. (1986) Nature 321:522; Riechmann et al. (1988) Nature 332:323; Verhoeyen et al. (1988) Science 239:1534 (1988)). I noen tilfeller er slike "humaniserte" antistoffer kimeriske antistoffer (Cabilly et al., U.S. Pat. Nr. 4,816,567), hvori hovedsakelig mindre enn en intakt human variabel domene har blitt erstattet med en korresponderende sekvensen fra det originale antistoffet. I praksis er de humaniserte antistoffene ifølge den foreliggende oppfinnelsen typisk humane antistoffer hvori noen CDR rester og muligens noen FR rester er blitt erstattet av rester fra analoge plasser på den originale antistoffet.

En annen fremgangsmåte for å lage "humaniserte" monoklonale antistoffer er å bruke en XenoMouse® (Abgenix, Fremont, CA) som musen brukt for immunisering. En XenoMouse er en musevert som har hatt dets immunoglobulingener erstattet med funksjonelle humane immunoglobulingener. Derfor er antistoff produsert av denne musen eller hybriddomer laget fra B-celler til denne musen allerede humaniserte. Xenomusen er beskrevet i US patent nr 6,162,963. En analog fremgangsmåte kan bli oppnådd ved bruk av HuMAb-Mouse™

(Medarex).

Humane antistoffer kan også produseres ifølge forskjellige andre teknikker, så som ved å bruke for immunisering andre transgeniske dyr som har blitt fremstilt for å uttrykke et humant antistoff repertoar (Jakobovitz et al., Nature 362 (1993) 255), eller ved valg av antistoffrepertoarer ved bruk av phage visnings fremgangsmåte. Slike teknikker er velkjente for en person med ferdigheter på feltet og kan implementeres ved å starte med monoklonale antistoffer som beskrevet i den foreliggende søknaden.

Antistoffene ifølge den foreliggende oppfinnelsen kan også bli derivatiserte til "kimeriske" antistoffer (immunoglobuliner) hvori en del av den tunge og/eller lette kjeden er identisk med eller homolog med korresponderende sekvenser i det originale antistoffet, mens resten av kjeden(e) er identiske med eller homologe med korresponderende sekvenser i antistoffer derivert fra andre arter eller tilhørende en annen antistoff klasse eller underklasse, så vel som fragmenter fra slike antistoffer, så lenge de utviser den ønskede biologiske aktiviteten (Cabilly et al., supra; Morrison et al. (1984) Proe. Nati. Acad. Sei. 81:6851).

Det vil også bli satt pris på at når forbindelsen som blokkerer den inhiberende reseptoren til en NK-celle eller stimulerer den aktiverende reseptoren til en NK-celle er et antistoff, kan et slikt antistoff være polyklonalt eller fortrinnsvis monoklonalt. Antistoffet kan produseres som et hybriddom eller av en rekombinant celle fremstilt for å uttrykke den ønskede variable og konstante domene. Antistoffet kan være en enslig kjede antistoff eller andre antistoff derivater som opprettholder antigenspesifisiteten, og den lavere hengsleområde eller en variant derav. Antistoffet kan være et polyfunksjonelt antistoff, rekombinant antistoff, humanisert antistoff, eller et fragment eller derivat derav. Nevnte fragment eller derivat derav er fortrinnsvis valgt fra et Fab fragment, et Fab'2 fragment, et CDR eller et ScFv. Fortrinnsvis er et fragment et antigenbindende fragment. Et antistoff som omfatter et antistoff fragment kan også inkludere men er ikke begrenset til bi-spesifikke antistoffer. Et eksempel er et bi-spesifikt antistoff som omfatter et antigenbindende område spesifikt til en aktiverende reseptor og et antigenbindende område spesifikt for et tumorantigen (se PCT publikasjon nr WO 01/71005).

Sammensetning og administrering.

Oppfinnelsen vedrører en sammensetning som omfatter minst en forbindelse, fortrinnsvis et antistoff eller et fragment derav, som blokkerer den inhiberende reseptoren eller stimulerer den aktiverende reseptor eller NK-celle, og et terapeutisk antistoff, anvendelse av nevnte sammensetning for økning av effektiviteten på et terapeutisk antistoff, for økning av ADCC i et subjekt behandlet med et terapeutisk antistoff, eller for behandling av et subjekt som har en sykdom, mer spesifikt en sykdom som krever utarming av målceller, fortrinnsvis sykdomsceller så som virusinfiserte celler, tumor celler eller andre patogeniske celler. Fortrinnsvis er sykdommen valgt fra gruppen som består av kreft, en autoimmun sykdom, en inflammatorisk sykdom, og en virussykdom. Sykdommene vedrører også transplan-tasjonsavstøtning, mer spesifikt avstøtning av transplantasjoner fra andre, og transplant mot vertssykdom (GVHD).

Mer særdeles krever behandlingen av sykdommen utarming av målceller, fortrinnsvis syke celler så som virusinfiserte celler, tumorceller eller andre patogeniske celler. Fortrinnsvis er sykdommen en kreft, infeksjons eller immunsykdom. Mer fortrinnsvis er sykdommen valgt fra gruppen som består av kreft, en autoimmun sykdom, en inflammatorisk sykdom, en virussykdom. Sykdommen omfatter også transplantasjonssavstøtning, mer særdeles avstøtning av transplantasjoner fra andre, og transplant mot vertssykdom (GVHD).

Slike sykdommer inkluderer neoplastisk proliferering av hematopoetiske celler. Valgfritt er nevnte sykdommer valgt fra gruppen som består av lymfoblastisk leukemi, akutt eller kronisk myelogen leukemi, Hodgkin's lymfoma, ikke Hodgkin's lymfoma, myelodisplastisk syndrom, flerfoldig myelomi, og kronisk lymfosytisk leukemi. Slike sykdommer inkluderer også en T-krefttype, kolonrektale krefttyper, brystkreft, eptiliel kreft. Slike sykdommer inkluderer CMV infeksjon og hepatitt B. Nevnte sykdommer inkluderer Chrons sykdom, reumatisk arteritt, astma, psoriasis, MS eller diabetes. I særdeleshet kan enhver sykdom som er opplistet i

tabellen gitt heri bli behandlet.

Nevnte terapeutiske antistoff kan bli bundet av CD16, fortrinnsvis gjennom dets Fc regionområde. Fortrinnsvis har nevnte terapeutiske antistoff en human lgG1 eller en human lgG3 Fc del, fortrinnsvis en monoklonal antistoff eller fragment derav, videre fortrinnsvis et humant, humanisert eller kimerisk antistoff eller fragment derav, for eksempel rituximab.

Nevnte forbindelse, fortrinnsvis et antistoff eller fragment derav som blokkerer den inhiberende reseptoren eller stimulerer den aktiverende reseptoren til en NK-celle, binder mist en av KIR, NKG2A/C, NCR, eller NKG2D humane reseptorer, og enten inhiberer den beslektede KIR2DL, KIR3DL og/eller NKG2A/C- fremmede inhiberingen av NK-celle cytoksisitet, eller stimulerer den beslektede NCR eller NKG2 D-f rem mede aktiveringen av NK-celle sytoksisitet. I en foretrukket utførelse er KIR2DL humane reseptoren brukt, for eksempel en reseptor valgt fra gruppen bestående av KIR2DL1, KIR2DL2, KIR2DL3 humane reseptorer, eller en KIR3DL human reseptor er anvendt, for eksempel en reseptor valgt fra gruppen bestående av KIR3DL1 og KIR3DL2.

I en foretrukket utførelse binder den NK-celle potensierende forbindelsen minst en av KIR2DL humane reseptorene og inhiberer den beslektede KIR2DL fremmede inhiberingen av NK-celle cytotoksisitet. Mer fortrinnsvis binder nevnte forbindelse, fortrinnsvis et antistoff, en felles determinant av KIR2DL1, KIR2DL2, KIR2DL3 humane reseptorer, og inhiberer KIR2DL1-, KIR2DL2-, KIR2DL3- fremmet inhibering av NK-celle cytotoksisitet. I en utførelse inhiberer nevnte forbindelse, fortrinnsvis et antistoff, inhibering av binding av HLA-C allele molekyler som har en Lys rest i posisjon 80 til en human KIR2DL1 reseptor, og binding av et HLA-C allele molekyl som har en Asn rest i posisjon 80, til humane KIR2DL2 og KIR2DL3 reseptorer. I en annen utførelse binder disse antistoffene seg til de samme epitopene som monoklonalt antistoff DF200 produsert av hybriddom DF200. Valgfritt konkurrerer dette antistoffet med monoklonalt antistoff DF200 produsert av hybriddom DF200 for binding til en KIR reseptor på overflaten av en human NK-celle. I en foretrukket utførelse er antistoffet monoklonalt antistoff DF200 produsert av hybriddom DF200.1 en annen utførelse er, konkurrerer med, eller binder antistoffet den samme epitopen som monoklonalt antistoff EB6.

Sammensetningene ifølge den foreliggende oppfinnelsen kan omfatte en kombinasjon av mange forbindelser, fortrinnsvis antistoffer eller fragmenter derav, som blokkerer forskjellige inhiberende reseptorer til NK-celler, og/eller stimulerer en eller flere aktiverende reseptorer av NK-celler. Fortrinnsvis er forbindelsene, fortrinnsvis antistoffer eller fragmenter derav, som blokkerer inhiberende reseptorer til en NK-celle spesifikke mot en inhiberende reseptor valgt fra KIR2DL1, KIR2DL2, KIR2DL3, KIR3DL1, KIR3DL2, NKG2A og NKG2C,og er i stand til å inhibere den beslektede KIR- eller NKG2A/C fremmede inhiberingen av NK-cellecytotoksisitet. Mer fortrinnsvis er kombinasjonene av "nøytraliserende" forbindelser i stand til å inhibere den KIR2DL1-, KIR2DL2-, KIR2DL3- fremmede inhiberingen av NK-celle cytotoksisiteten. Ved å fremskaffe en kombinasjon av forbindelser vil et maksimalt antall av inhiberende reseptorer bli blokkert i et maksimalt antall pasienter. Kombinasjoner av forbindelser som stimulerer forskjellige aktiverende forbindelser (eller som er tilfelle med inhiberende reseptorer, binder seg til forskjellige epitoper innenfor en eneste reseptor), kan også anvendes, for eksempel forbindelser som i sammen fører til en aktivering av en hver kombinasjon av to eller flere reseptorer valgt fra gruppen som består av NKp30, NKp44, NKp46 og NKG2D. Kombinasjoner som omfatter en eller flere forbindelser som blokkerer en inhiberende reseptor, og en eller flere forbindelser som stimulerer en aktiverende reseptor, kan også anvendes. Som beskrevet nedenfor kan i en foretrukket utførelse en prøve av NK-celler bli fremskaffet fra en pasient før påføring av de foreliggende fremgangsmåtene, og responsiviteten til NK-celler til forskjellige kombinasjoner av forbindelser, foreksempel i nærvær av målceller og de terapeutiske antistoffer, kan bestemmes.

Komposisjoner ifølge oppfinnelsen kan omfatte enhver farmasøytisk akseptabel bærer eller eksipient, typisk buffere, isotoniske oppløsninger, vandige suspensjoner, valgfritt supplementer! med stabiliserende midler, konserveringsmidler osv. Typiske formuleringer inkluderer en salin oppløsning og, valgfritt, et beskyttende eller stabiliserende molekyl, så som et protein av høy molekylær vekt (for eksempel humant serum albumin).

Kitter er også frembrakt som omfatter enhver kombinasjon av en eller flere terapeutiske antistoffer, en eller flere NK-celle potensierende forbindelser, og fortrinnsvis instruksjoner for deres bruk.

Ifølge fremgangsmåten og sammensetningene til den foreliggende oppfinnelsen, kan forbindelser, fortrinnsvis et antistoff eller fragment derav som blokkerer en inhiberende reseptor eller stimulerer en aktiverende reseptor til en NK-celle og terapeutiske antistoffer ble administrert i en "effektiv" eller "terapeutisk effektiv" mengde.

Den effektive mengden av terapeutisk antistoffer administrert til mottakeren kan være mellom om lag 0,1 mg/kg og om lag 20mg/kg. Den effektive mengden på antistoff avhenger av formatet på antistoffet (helt lg eller fragmenter) affiniteten til mAb og farmakokinetiske parametrer som må bestemmes for hvert antistoff.

Den effektive mengden av forbindelser, fortrinnsvis et antistoff eller fragment derav, som blokkerer den inhiberende reseptoren eller stimulerer den aktiverende reseptoren av en NK-celle administrert til mottakeren kan være på mellom om lag 0,1 mg/kg og om lag 20mg/kg. Den effektive mengden av antistoff avhenger av formen på antistoffet (helt lg eller fragmenter), affiniteten til mAb og farmakokinetiske parametre som må bestemmes for hver antistoff.

I en viktig utførelse av oppfinnelsen kan anvendelse av de foreliggende forbindelsene la terapeutisk virkning bli oppnådd med reduserte doseringer av terapeutiske antistoffer. Bruken av (foreksempel doserings, administrerings regimer) av terapeutiske antistoffer kan bli begrenset av side effekter, for eksempel i tilfelle av rituximab, feber, hodepine, hvesing, senkning i blodtrykk, og andre. Derfor vil i mange pasienter en standard dosering av de terapeutiske antistoffene bli administrert i sammenheng med den heri beskrevne NK-celle potensierende forbindelsene (for eksempel den anbefalte doseringen i fravær av andre forbindelser), og derved øke effektiviteten til den standard doseringen i pasienter som trenger en enda større terapeutisk effektivitet, i andre pasienter, for eksempel i de som er svært utsatt for bieffekter vil administrering av de foreliggende forbindelsene tillate at en terapeutisk virkning kan bli oppnådd ved reduserte doseringer av det terapeutiske antistoffer, og derved begrenses bieffektene. I praksis vil en dyktig medisinsk utøver være i stand til å bestemme den ideelle doseringen og administrerings regimet til den terapeutiske antistoffet og NK-celle potensierende forbindelsen til en gitt pasient, foreksempel en terapeutisk strategi som vil være mest fordelaktig tatt i betraktning de spesielle behovene og tilstanden til pasienten. Mnge kilder er tilgjengelige for å hjelpe med bestemmelsen av passende doseringer, for både de terapeutiske antistoffene og NK-celle potensierende forbindelsene, foreksempel., Remington: The Science and Practice of Pharmacy, avGennaro (2003), ISBN: 0781750253; Goodman and Gilmans The Pharmacological Basis of Therapeutics, av Hardman , Limbird & Gilman (2001), ISBN: 0071354697; Rawlins E. A., editor, "Bentley's Textbook of Pharmaceutics", London: Bailliere, Tindall og Cox, (1977); og andre.

I en utførelse kan en medisinsk utøver gradvis sette ned mengden av det terapeutiske antistoffet gitt i sammenheng med administreringen av en av de foreliggende NK-celle potensierende forbindelsene; enten av doseringene eller hyppigheten av administreringen, og følge virkningen av det terapeutiske antistoffet; for eksempel følge NK-celle aktiviteten; følge nærvær av målceller i pasienten, følge forskjellige kliniske indikasjoner eller på andre måter og når man tar resultatene i betraktning endre de relative konsentrasjonene eller administrasjonsmetodene av de terapeutiske antistoffene og/eller NK-potensierende forbindelsene for å optimalisere terapeutisk effekt og begrense bieffektene.

I følge andre utførelser vil NK-celler oppnås fra pasienten før administrering av det terapeutiske antistoffet og NK-celle potensierende forbindelsene (og dersom passende i løpet av behandlingen), og derved bestemmer man den ideelle forbindelsene eller passende forbindelsene som kan anvendes for maksimal virkning. Foreksempel kan identiteten av de inhiberende eller aktiverende reseptorene tilstedeværende på NK-cellene bli fastslått, og forbindelser administrert som spesifikt er målrettet mot de mest prominente reseptorene. Alternativt kan de oppnådde NK-cellene innkuberes med det terapeutiske antistoffet og målceller, og evnen til en eller flere forbindelser til å øke målcelle utarmingen kan bestemmes. De forbindelsene som er mest effektive i å øke utarmingen in vitro kan så bli valgt for bruk i følge de foreliggende behandlings fremgangmåtene.

Passende doseringer av forbindelsene og/eller terapeutiske antistoffer kan også generelt bli bestemt in vitro eller i dyremodeller, for eksempel in vitro ved å innkubere forskjellige konsentrasjoner av terapeutiske antistoff i nærvær av målceller, NK-celler (fortrinnsvis humane NK-celler), valgfritt andre immunceller, og varierende konsentrasjoner av en eller flere NK-celle potensierende forbindelser, og bestemme utstrekningen eller hastigheten på målcelle utarming under forskjellige forutsetninger, ved bruk av standard prøver (for eksempel som beskrevet i eksempeldelen). Alternativt kan varierende doseringer av terapeutiske antistoffer bli gitt til dyremodeller for sykdommene som kan behandles med antistoffene (for eksempel en dyremodell for NHL for rituximab), i sammen med varierende doseringer av de heri beskrevne forbindelsene, og virkningen til antistoffene (for eksempel som bestemt ved enhver passende klinisk, cellulær, eller molekylær test eller kriteria) i behandlingen av dyr kan bestemmes.

Sammensetningen ifølge den foreliggende oppfinnelsen kan bli injisert direkte inn i et subjekt, typisk ved intravenøse, intraperitonale, intraarterielle, intramuskulære eller transdermiske fremgangsmåter. Flere monoklonale antistoffer har blitt vist å være effektive i kliniske situasjoner, så som Rituxan (Rituximab) ellerrXolair (Omalizumab), og lignende administrasjonsregimer (for eksempel formuleringer og/eller doseringer og/eller administreringsprotokoller) kan bli brukt med sammensetningene i følge den foreliggende oppfinnelsen.

Videre kan sammensetningene ifølge den foreliggende oppfinnelsen videre omfatte eller kan bli brukt i kombinasjon med andre aktive agenter eller terapeutiske programmer så som kjemoterapi eller andre immunoterapier, enten samtidig eller etterfølgende.

I et foretrukket eksempel omfatter fremgangsmåten videre en eller flere injeksjoner av to eller flere forbindelser som blokkerer en inhiberende reseptor eller stimulerer en aktiverende reseptor av en NK-celle. Derved kan disse to eller flere forbindelsene bli brukt i kombinasjon. Dette kan brukes for å føre til en enda større augmentering av ADCC og virkning av terapeutisk antistoffer, og/eller kan føre til reduserte doseringer av en spesiell forbindelse som blokkerer en inhiberende reseptor eller stimulerer en aktiverende reseptor av en NK-celle. For eksempel har forbindelser så som IL-2 kjent for ære toksiske ved økte doseringer. Oppfinnelsen kan derfor fortrinnsvis frembringe en fremgangsmåte for behandling av en sykdom i et subjekt som trenger det som omfatter: a) administrering til nevnte subjekt av nevnte minst to forbindelser, fortrinnsvis et antistoff eller fragment derav, som blokkerer en inhiberende reseptor eller stimulerer en aktiverende reseptor av en NK-celle; og b) administrering til nevnte subjekt av et terapeutisk antistoff. For eksempel er et foretrukket regime hvori nevnte to forbindelser er (i) en første forbindelse valgt fra en gruppe som består av et antistoff som stimulerer NCR eller NKG2D reseptor eller aktiverende KIR reseptor, og et antistoff som blokkerer en inhiberende KIR reseptor eller NKG2A, og (ii) en andre forbindelse valgt fra gruppen som består av IL-12, IL-15, IL-18 og IL-21. Oppfinnelsen frembringer derfor videre en fremgangsmåte for behandling av en sykdom i et subjekt som trenger det som omfatter: a) administrering til nevnte subjekt av en forbindelse ifølge oppfinnelsen, fortrinnsvis et antistoff eller fragment derav, som blokkerer en inhiberende reseptor eller stimulerer en aktiverende reseptor av en NK-celle; og b) administrering til nevnte subjekt av et terapeutisk antistoff, og (c) administrering til nevnte subjekt av IL-2. IL2 er tilgjengelig fra Research Diagnostics, NJ, RDI-202, eller Chiron Corp. (Emeryville,

CA).

Cytokinet kan bli administrert ifølge ethvert passende administreringsregime, og kan administreres før, samtidig og/eller etter administrering av forbindelsen som blokkerer en inhiberende reseptor eller stimulerer en aktiverende reseptor av en NK-celle, og før, samtidig og/eller etter administrering av terapeutisk antistoff. I et typisk eksempel er cytokinet administrert daglig i en periode på 5-10 dager, og cytokin(ene) er først injisert på den samme dagen som den første injeksjonen av forbindelsen som blokkerer en inhiberende reseptor eller stimulerer en aktiverende reseptor av en NK-celle. Nevnte fremgangsmåte omfatter fortrinnsvis en eller to injeksjoner pr dag av cytokin(ene) ved subkutanøs administrering.

Doseringen av cytokinet vil bli valgt avhengig av tilstanden til pasienten som skal behandles. I foretrukne eksempler kan en relativt lag dosering av cytokin bli anvendt. For eksempel er en effektiv dosering typisk mindre enn 1 million deler/kvadratmeter/dag av cytokin(er), når den cytokin inneholdende farmasøytiske komposisjonen er brukt for daglig subkutanøs injeksjon. I et foretrukket eksempel er IL-2 injisert subkutanøst ved daglig doseringer under 1 million deler/ m<2>i 5-10 dager. Videre detaljer for bruken av cytokiner er beskrevet i International Patent publication no. PCT/EP/0314716 og US patent søknad nr 60/435,344 med tittelen "Pharmaceutical compositions håving an effect on the proliferation of NK cells and a method using the same".

Det vil også bli satt pris på at de terapeutiske antistoffene og NK-celle potensierende forbindelsene kan bli samadministrert, for eksempel samtidig injisert, eller kan administreres samtidig men i forskjellige formuleringer eller kan administreres uavhengig, for eksempel forbindelsene kan administreres flere timer, dager eller uker før eller etter administreringen av forbindelsen.

Videre aspekter og fordeler ifølge oppfinnelsen er vist i den følgende eksperimentelle delen, som bør sees på som illustrativ og ikke begrensende til omfanget av søknaden.

EKSEMPLER.

Eksempel 1: Fremstilling av et pan KIR2DL2 antistoff.

Rensing av PBL'er og fremstilling av polyklonale eller klonale NK-cellelinjer.

PBUer ble hentet fra friske donorer ved Ficoll Hypaque gradienter og utarming av plastiske adeherende celler. For å oppnå berikede NK-celler ble PBUene dyrket med anti CD3, anti CD4 og anti HLA-DR mAber (30minutter ved 4 °C), etterfulgt av geite-antimus magnetiske perler (Dynal) (30 minutter ved 4 °C) og immunomagnetisk utvelging ved fremgangmåter kjent på feltet (Pende et al. 1999). DC3-minus, CD4-minus og DR-minus celler ble dyrket på bestrålte matecellerog 100 U/ml Interleukin 2 (Proleukin, Chiron Corporation) og 1.5 ng/ml Phytohemagglutinin A (Gibco BRL) for å oppnå polyklonale NK-celle populasjoner. NK-celler ble klonet ved begrensende utblanding hvor kloner av NK-celler, og erkarakterisert vedgjennomflytningscytometri for ekspresjon av celleoverflate reseptorer.

De følgende klonene ble brukt i denne studien:

CP11, CN15, og CN505 er KlR2DL1-positive kloner og blir farget av EB6 eller XA-141 antistoffer. CN12 og CP502 er KIR2DL3-positive kloner og er farget av GL183 antistoffer.

Gjennomflytnings cytometrianalyse.

mAb'ene som ble bruk ble fremstilt i laboratoriet JT3A (henholdsvis lgG2a, anti-CD3), EB6 og GL183 (lgG1 anti-KIR2DL1 og KIR2DL3), XA-141 IgM anti-KIR2DL1 (samme spesifisiteten som sammenlignet med to EB6, anti CD4 (HP2.6), anti-DR (D1.12, lgG2a). Istedenfor JT3A, HP2.6, og DR1.12, kan kommersielt tilgjengelige mAb'erav de samme spesifisitetene bli brukt, for eksempel fra Beckman coulter Inc, Fullerton, CA. EB6 og GL183 er kommersielt tilgjengelig fra in Beckman Coulter Inc, Fullerton, CA. XA-141 er ikke kommersielt tilgjengelig, men EB6 kan bli brukt for kontroll rekonstituering av lysing som beskrevet i (Moretta et al. 1993).

Gjennomflytings cytometri.

Celler ble farget med passende antistoffer (30 min ved 4 °C) etterfulgt av PE eller FITC konjugert polyklonale anti-mus antistoffer (Southern Biotechnology Associates Inc). Prøver ble analysert ved cytoflyrometrisk analyse på et FACSAN apparat (Becton Dickinson, Mountain View, CA).

Cytotoksisitet eksperimenter.

Den cytolitiske aktiviteten til NK-klonene ble bestemt ved en standard 4 timers 51 Cr frigivings test. Deri ble effekttoren NK-celler testet på Cw3 eller Cw4 positive cellelinjer kjent for deres sensitivitet til NK-celle lysing. Alle målene ble brukt ved 5000 celler pr brønn i mikrotitreringsplater, og effektor på målforholdet er indikert i figurene (vanligvis 4 effektorer pr målcelle). Det cytolytiske testen er utført med eller uten supernatant til tiltenkte monoklonale antistoffer ved en Vz utblanding. Prosedyren er hovedsakelig den samme som beskrevet i (Moretta et al 1993).

Fremstilling av nye mAb'er

MAb'er er blitt generert ved immunisering av 5 uker gamle Balb C mus med aktiverte polyklonale eller monoklonale NK-cellelinjer som beskrevet i (Moretta et al, 1990). Etter forskjellige cellefusjoner ble mAb'ene først valgt for deres evne til å kryssreagere med EB6 og GL183 positive NK-cellelinjer og kloner. Positive monoklonale antistoffer ble videre testet for deres evne til å rekonstituere lysing av EB6 positive eller GL183 positive NK-klonerav henholdsvis Cw4 eller Cw3 positive mål.

DF200, et nytt monoklonalt antistoff mot en felles determinant av KIR2DL humane NK reseptorer.

En av de monoklonale antistoffene, DF200mAb, viste seg å reagere med forskjellige medlemmer av KIR familien inkludert KIR2DL1, KIR2DL2/3. Når det gjelder farging av NK-celler med DF200mAb ble både KIR2DL1+ og KIR2DL2/3+ celler farget sterkt (figur 1). NK-kloner som uttrykker en eller begge (eller til og med begge to) av disse HLA klasse 1 spesifikke inhiberende reseptorene ble brukt som effektorceller mot målceller som uttrykker en eller flere HLA-C alleler. Som forventet viste KIR2DL1+NK-klonene lite eller ingen cytotoksisk aktivitet mot målceller som uttrykker HLA-Cw4 og KIR2DL3+NK-kloner viste liten eller ingen aktivitet på CW3 positive mål. Men i nærvær av DF200 mAb (brukt for å maskere deres KIR2DL reseptorer) ble NK-klonene ute av stand til å gjenkjenne deres HLA-C legander, og viste sterk cytotoksisk aktivitet på Cw3 eller Cw4 mål.

For eksempel ble C1R cellelinjen (Cw4+EBV cellelinjen, ATCC n°CRL 1993) ikke drept av KIR2DL1+NK-kloner (CN5/CN505), men inhiberingen kunne bli effektivt reversert ved bruk av enten DF200 eller en konvensjonell antiKIR2DL1mAb. På den andre siden drepte NK-kloner som uttrykker KIR2DL2/3+ KlR2DL 1-fenotype (CN12) effektivt C1R, og denne drepingen ble ikke påvirket av DF200mAb (figur 2). Lignende resultater ble oppnådd med KIR2DL2- eller KIR2DL3-positive NK-kloner på Cw3 positive mål.

Biacore analyse av DF200mAb/KlR2DL1 og DF200mAb/KlR2DL3 interaksjoner.

Materialer og fremgangsmåter.

Produksjon og rensing av rekombinante proteiner.

De KIR2DL1 og KIR2DL3 rekombinante proteinene ble produsert i E.coli. cDNA som koder for hele det ekstracellulære domenet til KIR2DL1 og KIR2DL3, og ble forsterket ved PCR fra henholdsvis pCDM8 klon 47.11 vektor (Biassoni et al 1993) og RSVS(gpt)183 klon 6 vektor (Wagtman et al 1995)), ved bruk av de følgende primerene: Sens: 5'-GGAATTCCAGGAGGAATTTAAAATGCATGAGGGAGTCCACAG-3'

Anti-sens: 5'-CCCAAGCTTGGGTTATGTGACAGAAACAAGCAGTGG-3'

De ble klonet inn i pML1 ekspressjonsvektoren "in frame" med en sekvens som koder for biotinilerings signalet (Saulquin et al, 2003).

Protein uttrykking ble gjort inn i BL21(DE3) bakterielle stammen (invitrogen). Transfekterte bakterier ble dyrket til OD6oo=0.6 ved 37°C i et medium supplementert med ampicillin (100^g/ml) og indusert med 1mm IPTG.

Proteiner ble gjenvunnet fra inklusjonslegemene ved denaturerings forhold (8M urea). Refolding av rekombinante proteiner ble utført i Tris 20 mM, pH 7.8, NaC1150 mM buffer inneholdende L-arginine (400 mM, Sigma) og B-mercaptoethanol (1 mM), ved rom temperatur, ved å senke urea konsentrasjonen i en 6 trinns dialyse (4, 3, 2, 1, 0,5, og OM urea henholdsvis). Redusert og oksidert gluthaion (henholdsvis 5mm og 0,5mm, sigma) ble tilsatt iløpet av de 0,5 og OM urea dialyse trinnene. Til slutt ble proteinet dialysert uttrykkelig mot Tris 10mm, pH7,5, NaCI 150mm buffer. Løselige gjenfoldede proteiner ble konsentrerte og så renset på en Superdex 200 størrelses ekskluderende kolonne (Pharmacia; AKTA system).

Biacore analyse. Overflate plasmon resonans målinger ble utført på et biacore apparat (Biacore). I alle biacore eksperimentene ble HBS bufferen supplementer! med 0,05% surfaktant P20 som gjennomføringsbuffer.

Protein immobilisering. Rekombinante KIR2DL1 og KIR2DL3 proteiner ble immobiliserte kovalent til karboksylgrupper i dekstran laget op en Sensor Chip CM5 (Biacore). Sensorbrikke overflaten ble aktivert med EDC/HNS (n-etyl-N'-(3-dimetylaminopropyl)karbodiimidhydroklorid og N-hydroksysuccinimid, Biacor). Proteiner i sammenkoblingsbuffer (10mm acetat pH4,5) ble injisert. Deaktivering av de gjenværende aktiverte gruppene ble utført ved bruk av 100mm etanolamin pH8 (Biacore).

Affinitets målinger. For kinetiske målinger ble forskjellige konsentrasjoner av det løselige antistoffet (10<7>til 4x1010 M) påført på den immobiliserte prøven. Målinger ble utført ved en 20^1/min kontinuerlig gjennomflytingsfart. For hver syklus ble overflaten til sensorbrikken regenerert ved 5^.1 injisering av 10mm NaOH pH11. BIAIouge Kinetics Evaluation programmet (BIAevaluation 3.1, Biacore) ble brukt for dataanalyse.

Resultater. Biacore analyse av DF200mAb binding til immobilisert KIR2DL1 og KIR2DL3.

KD:dissosierings konstant.

Den løselige analyttet (40^1 ved forskjellige konsentrasjoner) ble injisert ved en gjennomstrømningshastighet på 20^1/min i en HBS buffer, på dekstran lag inneholdende 500 eller 540 reflektive enheter (RU), og henholdsvis 1000 eller 700 RU av KIR2DL1 og KIR2DL3. Dataene er representative for 6 uavhengige eksperimenter.

Eksempel 2: Økning av ADCC ved bruk av en kombinasjon av rituxan og antiKIRmAb.

Fremstilling av humane NK-kloner.

Monoklonale blodceller utarmet på T-celler ved negativ anti-CD3 immunomagnetisk utvelging (Miltenyi) ble plassert for dyrkning under begrensnings utblandings forhold, aktivert med fytohemagglutinin (PHA) (Biochrom KG, Berlin, Tyskland) og dyrket med interleukin (IL)-2 (Chiron B.V., Amsterdam, Nederland) og bestrålede mateceller.

Kloningseffektivitetene er ekvalente i alle donorer og innenfor et område på mellom 1 og 5 og 1 og 10 plasserte NK-celler. Klonede NK-celler blir testet for reaktivitet mot andre ved standard<51>Crfrigivings sytoksisitets mot Epstein-Barr virus transformert B-lymfoblastoide cellelinjer av kjent HLA type ved en effektor til målforhold på 10:1. Kloner som viser større eller lik 30% lysing ble regnet som reaktive mot andre. Som regel utviste klonene mindre enn 5% eller mer enn 40% lysing.

Økning av ADCC fremmet av Rituxan av en KIR2DL1 positiv NK-celleklone.

Den sytolitiske aktiviteten til en NK-klone ble påvist ved en standard 4 timers 51 CR frigivingstest, hvori effektor NK-celler ble testet på Cw4 eller Cw3 positive EBV celle-linjer (CD20 positive), kjent for deres sensitivitet til NK-celle lysing. Alle målene ble brukt ved 5000 celler pr brønn i mikrotitreringsplater og effektor (NK-celle klon) til mål forholdet er indikert i figur 3. I noen eksperimenter ble den terapeutiske kimeriske anti-CD20 rituximab (Rituxan, Idec) tilsatt ved 5^g/ml til effektor-målblandingen. I visse eksperimenter ble EB6 antistoff (anti KIR2DL1) ved 10 ug/m I tilsatt til effektormålblandingen.

Dette eksperimentet viste at Rituxan alene fører til hovedsakelig ingen ADCC av den KIR2DL1 positive NK-klonen på Cw4 positive mål. ADCC til KIR2DL1 positive kloner er sterkt økt i nærvær av anti KIR2DL1 antistoff.

Eksempel 3: Økning av ADCC fremmet av Campath ved en KIR2DL1 positiv NK- celle klone.

I et lignende eksperiment som det beskrevet i eksempel 2 ble autologe Cw4+PHA blastomer dyrket i nærvær av NK-celler samt alumtuzumab (Campath, Berlex), EB6 antistoff (ved lOO^g/ml), eller Campath og EB6. Resultatene er vist i figur 4, og viser at nærvær av EB6 dramatisk øker evnen til NK-celler til å utarme de autologe cellene: om lag 4% av målcellene ble lyst i nærvær av Campath alene, mens mer enn 30% av cellene ble lyst i nærvær av Campath og EB6.

REFERANSER:

Biassoni R, Verdiani S, Cambiaggi A, Romeo PH, Ferrini S, Moretta L.Human CD3-CD16+ natural killer cells express the hGATA-3 T cell transcription factor and an unrearranged 2.3-kb TcR delta transcript. Eur J Immunol. 1993 Mai;23(5): 1083-7.

Karre K, Ljunggren HG, Piontek G, Kiessling R, (1986) "Selective rejection of H-2-deficient lymphoma variants suggests alternative immune defence strategy" Nature 319:675-8

Lanier LL (1998) « NK cell receptors" Annu Rev Immunol 16:359-93.

Moretta, A., Bottino, C, Pende, D., Tripodi, G., Tambussi, G., Viale, O., Orengo, A., Barbaresi, M., Merli, A., Ciccone, E., og et al. (1990). Identification of four subsets of human CD3-CD16+ natural killer (NK) cells by the expression of clonally distributed functional surface molecules: correlation between subset assignment of NK clones and ability to mediate specific alloantigen recognition. J Exp Med 172, 1589-1598.

Moretta, A., Vitale, M., Bottino, C, Orengo, A. M., Morelli, L., Augugliaro, R., Barbaresi, M., Ciccone, E., og Moretta, L. (1993). P58 molecules as putative receptors for major histocompatibility complex (MHC) dass I molecules in human natural killer (NK) cells. Anti-p58 antibodies reconstitute lysis of MHC class l-protected cells in NK clones displaying different specificities. J Exp Med 178, 597-604.

Moretta A, Moretta L (1997) « HLA class I specific inhibitory receptors" Curr Opin Immunol 9:694-701

Ohlen C, Kling G, Hoglund P, Hansson M, Scangos G, Bieberich C, Jay G, Karre K (1989)" Prevention of allogeneic bone marrow graft rejection by H-2 transgene in donor mice" Science 246:666-8

Pende, D., Parolini, S., Pessino, A., Sivori, S., Augugliaro, R., Morelli, L, Marcenaro, E., Accame, L., Malaspina, A., Biassoni, R., et al. (1999). Identification and molecular characterization of NKp30, a novel triggering receptor involved in natural cytotoxicity mediated by human natural killer cells. J Exp Med 190, 1505-1516.

Ruggeri, L, Capanni, M., Urbani, E., Perruccio, K., Shlomchik, W. D., Tosti, A., Posati, S., Rogaia, D., Frassoni, F., Aversa, F., et al. (2002). Effectiveness of donor natural killer cell alloreactivity in mismatched hematopoietic transplants. Science 295, 2097-2100.

Saulquin X, Gastinel LN, Vivier E.Crystal structure of the human natural killer cell activating receptor KIR2DS2 (CD158j) J Exp Med. 2003 Apr 7;197(7):933-8.

Valiante NM, Lienert K, Shilling HG, Smits BJ, Parham P (1997) « Killer cell receptors: keeping pace with MHC class I evolution" Immunol Rev 155:155-64

Wagtmann N, Biassoni R, Cantoni C, Verdiani S, Malnati MS, Vitale M, Bottino C, Moretta L, Moretta A, Long EO.Molecular clones of the p58 NK cell receptor reveal immunoglobulin-related molecules with diversity in both the extra- and intracellular domains.lmmunity. 1995 May;2(5):439-49.

Ward et al (Nature 341 (1989) 544.

Claims

1. En sammensetning for anvendelse i behandling av en sykdom i et humant individ,karakterisert vedat den omfatter: a. et anti-naturlig drepe cellereseptor (NKR) antistoff eller antigenbindende fragment derav som binder til og inhiberer aktiviteten av en inhiberende KIR2DL-reseptortil en naturlig drepe(NK)-celle; hvor nevnte anti-NKR antistoff eller antigenbindende fragment derav binder til en felles determinant av KIR2DL1, KIR2DL2 og KIR2DL3 humane reseptorer og inhiberer KIR2DL1-, KIR2DL2- og KIR2DL3-mediert inhibering av NK cellecotytoksisitet; og b. et terapeutisk antistoff som kan bindes av CD16 gjennom dets Fc-region og som reduserer målceller med antistoff-avhengig cellemediert cytotoksisitet (ADCC), hvor nevnte anti-NKR antistoff øker virkeevnen av nevnte terapeutiske antistoff ved å forsterke ADCC.

2. Sammensetning for anvendelse i samsvar med krav 1,karakterisert vedat nevnte terapeutiske antistoff har en IgG eller en lgG3 Fc-del.

3. Sammensetning for anvendelse i samsvar med krav 1 og/eller 2,karakterisert vedat nevnte anti-NKR antistoff omfatter et antigenbindende fragment.

4. Sammensetning for anvendelse i samsvar med ett eller flere av krav 1-3,karakterisert vedat nevnte terapeutiske antistoff er et monoklonalt antistoff.

5. Sammensetning for anvendelse i samsvar med ett eller flere av krav 1-4,karakterisert vedat nevnte terapeutisk antistoff ikke er konjugert med en radioaktiv eller toksisk enhet.

6. Sammensetning for anvendelse i samsvar med ett eller flere av krav 1-5,karakterisert vedat nevnte anti-NKR antistoff er et humant antistoff, et humanisert antistoff eller et kimerisk antistoff, eller omfatter et antigenbindende fragment derav.

7. Sammensetning for anvendelse i samsvar med ett eller flere av krav 1-6,karakterisert vedat nevnte terapeutiske antistoff er et humant antistoff, et humanisert antistoff eller et kimerisk antistoff.

8. Sammensetning for anvendelse i samsvar med ett eller flere av krav 1-7,karakterisert vedat nevnte terapeutiske antistoff er rituximab eller alemtuzumab.

9. Sammensetning for anvendelse i samsvar med krav 8,karakterisert vedat nevnte terapeutiske antistoff er rituximab, og nevnte terapeutiske antistoff blir administrert i en dosering på mindre enn 375 mg/m<2>pr uke.

10. Sammensetning for anvendelse i samsvar med krav 8,karakterisert vedat nevnte terapeutiske antistoff er alemtuzumab, og nevnte terapeutiske antistoff blir administrert i en dosering på mindre enn 90 mg pr uke.

11. Sammensetning for anvendelse i samsvar med krav 1,karakterisert vedat nevnte anti-NKR antistoff eller antigenbindende fragment derav binder til den samme epitopen som monoklonalt antistoff DF200, produsert av hybridom DF200, deponert som registrering nr. CBCM I-3224.

12. Sammensetning for anvendelse i samsvar med krav 1, karakterisert vedat nevnte anti-NKR antistoff eller antigenbindende fragment derav konkurrerer med monoklonalt antistoff DF200 produsert av hybridom DF200, deponert som registrering nr. CBCM I-3224 for binding til en KIR2DL-reseptor på overflaten av en human NK-celle.

13. Sammensetning for anvendelse i samsvar med krav 1, karakterisert vedat nevnte anti-NKR antistoff eller antigenbindende fragment derav er monoklonalt antistoff DF200 produsert av hybridom DF200, deponert som registrering nr. CBCM I-3224, eller et fragment eller et derivat derav.

14. Sammensetning for anvendelse i samsvar med krav 1,karakterisert vedat nevnte anti-NKR antistoff er et intakt antistoff.

15. Sammensetning for anvendelse i samsvar med ett eller flere av krav 1-14,karakterisert vedat nevnte terapeutiske antistoff og nevnte anti-NKR antistoff eller antigenbindende fragment derav administreres samtidig til nevnte individ.

16. Sammensetning for anvendelse i samsvar med ett eller flere av krav 1-15,karakterisert vedat nevnte anti-NKR antistoff eller antigenbindende fragment derav blir administrert til nevnte subjekt innen en uke etter administreringen av nevnte terapeutiske antistoff.

17. Sammensetning for anvendelse i samsvar med ett eller flere av krav 1-16,karakterisert vedat nevnte sykdom er en krefttype, infeksjonssykdom eller immunsykdom.

18. En farmasøytisk sammensetning,karakterisert vedat den omfatter: (a) et terapeutisk antistoff som kan bli bundet av CD16, (b) en anti-NK cellereseptor (NKR) antistoff eller antigenbindene fragment derav som binder til og aktiverer en inhiberende KIR2DL-reseptor til en NK-celle, hvor nevnte anti-NKR antistoff eller antigenbindende fragment derav binder til en felles determinant av KIR2DL1, KIR2DL2 og KIR2DL3 humane reseptorer og inhiberer KIR2DL1-, KIR2DL2- og KIR2DL3-mediert inhibering av NK cellecotytoksisitet; og (c) en farmasøytisk akseptabel bærer.

19. Sammensetning i samsvar med krav 18,karakterisert vedat nevnte terapeutiske antistoff har en human eller en ikke-human primat lgG1 eller lgG3 Fc del.

20. Sammensetning i samsvar med krav 18 eller 19,karakterisertved at nevnte forbindelse er et antistoff eller omfatter et antigenbindende fragment derav.

21. Sammensetning i samsvar med krav 18 eller 19,karakterisertved at nevnte anti-NKR antistoff eller antigenbindende fragment derav er et monoklonalt antistoff eller omfatter et antigenbindende fragment derav.

22. Sammensetning i samsvar med ett eller flere av krav 18-21, karakterisert vedat nevnte anti-NKR antistoff eller antigenbindende fragment derav er et humant antistoff, et humanisert antistoff eller et kimerisk antistoff eller omfatter et antigenbindende fragment derav.

23. Sammensetning i samsvar med ett eller flere av krav 18-22,karakterisert vedat nevnte terapeutiske antistoff er et monoklonalt antistoff.

24. Sammensetning i samsvar med krav 23,karakterisert vedat nevnte terapeutiske antistoff er et humant, humanisert eller kimerisk antistoff.

25. Sammensetning i samsvar med krav 23 eller 24,karakterisert vedat nevnte terapeutiske antistoff ikke er konjugert med en radioaktiv eller toksisk enhet.

26. Sammensetning i samsvar med ett eller flere av krav 18-25,karakterisert vedat nevnte terapeutiske antistoff er rituximab eller alemtuzumab.

27. Sammensetning i samsvar med krav 18, karakterisert vedat nevnte anti-NKR antistoff eller antigenbindende fragment derav binder til den samme epitopen som monoklonalt antistoff DF200, deponert som registrering nr. CBCM I-3224.

28. Sammensetning i samsvar med krav 18, karakterisert vedat nevnte anti-NKR antistoff eller antigenbindende fragment derav konkurrerer med monoklonalt antistoff DF200, produsert av hybriddom DF200, deponert som registrering nr. CBCM I-3224, for binding til en KIR2DLreseptor på overflaten av en human NK-celle.

29. Sammensetning i samsvar med krav 18, karakterisert vedat nevnte anti-NKR antistoff eller antigenbindende fragment derav er monoklonalt antistoff DF200 produsert av hybridom DF200, deponert som registrering nr. CBCM I-3224, eller et fragment eller derivat derav.

30. Anvendelse av et anti-NK cellereseptor (NKR) antistoff eller et antigenbindende fragment derav som binder til og inhiberer aktiviteten av en inhibitorisk KIR2DL-reseptor av en NK-celle, hvor nevnte anti-NKR antistoff eller antigenbindende fragment derav binder til en felles determinant av KIR2DL1, KIR2DL2 og KIR2DL3 humane reseptorer og inhiberer KIR2DL1-, KIR2DL2- og KIR2DL3-mediert inhibering av NK cellecotytoksisitet, for fremstilling av et medikament for å øke virkeevnen av en behandling som involverer administrering til et individ av et terapeutisk antistoff som bindes av CD16 gjennom dets Fc-region og som utarmer målceller i nevnte individ med ADCC, hvor nevnte terapeutiske antistoff administreres til nevnte individ før, samtidig med, eller etter en terapeutisk effektiv mengde av nevnte anti-NKR-antistoff og hvor nevnte anti-NKR antistoff øker virkeevnen av nevnte terapeutiske antistoff ved å forsterke ADCC i individet.

31. Anvendelse i samsvar med krav 30, hvor nevnte terapeutiske antistoff har en human lgG1 eller lgG3 Fc-porsjon.

32. Sammensetning for anvendelse i samsvar med ethvert av kravene 1-17, hvor nevnte anti-NKR antistoff forsterker evnen av nevnte terapeutiske antistoff til å utarme målceller med minst 30%.

33. Sammensetning for anvendelse i samsvar med ethvert av kravene 1-17, hvor nevnte anti-NKR antistoff forsterker evnen av nevnte terapeutiske antistoff til å utarme målceller med minst 50%.

34. Sammensetning for anvendelse i samsvar med ethvert av kravene 18-29, hvor nevnte anti-NKR antistoff forsterker evnen av nevnte terapeutiske antistoff til å utarme målceller med minst 30%.

35. Sammensetning for anvendelse i samsvar med ethvert av kravene 18-29, hvor nevnte anti-NKR antistoff forsterker evnen av nevnte terapeutiske antistoff til å utarme målceller med minst 50%.

36. Anvendelse i samsvar med krav 30, hvor anvendelse omfatter å undersøke aktiviteten eller antallet NK-celler i nevnte individ før eller påfølgende administreringen av nevnte anti-NKR-antistoff.

37. Anvendelse i samsvar med krav 36, hvor nevnte undersøking av aktiviteten eller antallet NK-celler omfatter; (i) inkubere NK-celler opptatt fra nevnte individ før nevnte administrering i nærvær av én eller flere målceller som gjenkjennes av nevnte terapeutiske antistoff, in nærvær eller fravær av nevnte anti-NKR-antistoff; og (ii) undersøke effekten av nevnte anti-NKR-antistoff med hensyn til evnen av nevnte NK-celler til å redusere nevnte målceller; hvor en deteksjon av at nevnte anti-NKR-antistoff forsterker evnen av nevnte NK-celler til å redusere nevnte målceller indikerer at nevnte anti-NKR-antistoff er egnet for anvendelse i nevnte fremgangsmåte og at nevnte fremgangsmåte er egent for anvendelse i nevnte individ.