KR20210124959A - 항체 제제 - Google Patents

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다비트 사테인
릭 라데마커르
파울 파런
우구어 자힌
프리데리크케 기제케
알렉산더 무이크
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젠맵 에이/에스
비온테크 에스이
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Abstract

본 발명은 결합제의 제약 제제 및 의약에서의 그의 용도에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 인간 PD-L1에 결합하고 인간 CD137에 결합하는 결합제, 예컨대 이중특이적 항체의 제약 제제에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 본 발명의 제약 제제의 용도 및 제약 제제의 제조 방법에 관한 것이다.

Description

항체 제제
본 발명은 PD-L1 및 CD137 (4-1BB)에 결합하는 이중특이적 항체에 관한 것이다. 본 발명은 항체를 포함하는 제약 조성물 및 치료를 위한 제제의 용도를 제공한다.
CD137 (4-1BB, TNFRSF9)는 종양 괴사 인자 (TNF) 수용체 (TNFR) 패밀리의 구성원이다. CD137은 CD8+ 및 CD4+ T 세포, 조절 T 세포 (Treg), 자연 킬러 (NK) 및 NKT 세포, B 세포 및 호중구 상의 공동-자극 분자이다. T 세포 상에서, CD137은 구성적으로 발현되는 것이 아니라 T-세포 수용체 (TCR)-활성화시에 유도된다. 그의 천연 리간드 4-1BBL 또는 효능제 항체를 통한 자극은 어댑터로서 TNFR-연관 인자 (TRAF)-2 및 TRAF-1을 사용하는 신호전달을 유도한다. CD137에 의한 초기 신호전달은 K-63 폴리-유비퀴틴화 반응을 수반하며 이는 궁극적으로 핵 인자 (NF)-κB 및 미토겐-활성화 단백질 (MAP)-키나제 경로의 활성화를 유발한다. 신호전달은 증가된 T 세포 공동-자극, 증식, 시토카인 생산, 성숙 및 연장된 CD8+ T-세포 생존을 유도한다. CD137에 대한 효능작용 항체는 다양한 전임상 모델에서 T 세포에 의한 항종양 제어를 촉진하는 것으로 나타났다 (Murillo et al. 2008 Clin. Cancer Res. 14(21): 6895-6906). CD137을 자극하는 항체는 T 세포의 생존 및 증식을 유도하여, 항종양 면역 반응을 증진시킬 수 있다. CD137을 자극하는 항체는 선행 기술에 개시되었고, 인간 IgG4 항체인 우렐루맙 (WO2005035584) 및 인간 IgG2 항체인 우토밀루맙 (Fisher et al. 2012 Cancer Immunol. Immunother. 61: 1721-1733)을 포함한다.
프로그램화된 사멸 리간드 1 (PD-L1, PDL1, CD274, B7H1)은 33 kDa의 단일-통과 유형 I 막 단백질이다. 선택적 스플라이싱에 기초하여 PD-L1의 3종의 이소형이 기재되었다. PD-L1은 이뮤노글로불린 (Ig) 슈퍼패밀리에 속하고, 하나의 Ig-유사 C2-유형 도메인 및 하나의 Ig-유사 V-유형 도메인을 함유한다. 새로 단리된 T 및 B 세포는 무시할만한 양의 PD-L1을 발현하고, 소정 분율 (약 16%)의 CD14+ 단핵구는 PD-L1을 구성적으로 발현한다. 그러나, 인터페론-γ (IFNγ)가 종양 세포 상에서 PD-L1을 상향조절하는 것으로 공지되어 있다.
PD-L1은 1) 활성화된 T 세포 상의 그의 수용체인 프로그램화된 세포 사멸 단백질 1 (PD-1) (CD279)에 결합하여 종양-반응성 T 세포를 관용화하고; 2) 종양 세포-발현된 PD-L1을 통한 PD-1 신호전달에 의해 종양 세포를 CD8+ T 세포 및 Fas 리간드-매개 용해에 대해 저항성을 갖도록 하고; 3) T 세포-발현된 CD80 (B7.1)을 통한 역 신호전달에 의해 T 세포를 관용화하고; 4) 유도된 T 조절 세포의 발생 및 유지를 촉진함으로써 항종양 면역을 방해한다. PD-L1은 흑색종, 난소암, 폐암 및 결장암을 포함한 많은 인간 암에서 발현된다 (Latchman et al., 2004 Proc Natl Acad Sci USA 101, 10691-6).
PD-L1 차단 항체는 PD-L1을 과다발현하는 것으로 공지된 여러 암 (흑색종, NSCLC 포함)에서 임상 활성을 나타냈다. 예를 들어, 아테졸리주맙은 PD-L1에 대한 인간화 IgG1 모노클로날 항체이다. 이는 현재 다양한 유형의 고형 종양을 포함한 여러 적응증에 대한 면역요법으로서 임상 시험 중이고 (예를 들어 문헌 [Rittmeyer et al., 2017 Lancet 389:255-265] 참조), 비소세포 폐암 및 방광암 적응증에 대해 승인되어 있다. PD-L1 항체인 아벨루맙 (Kaufman et al. Lancet Oncol. 2016;17(10):1374-1385)은 전이성 메르켈 세포 암종을 갖는 성인 및 12세 이상의 소아 환자의 치료에 대해 FDA에 의해 승인되었고, 현재 방광암, 위암, 두경부암, 중피종, NSCLC, 난소암 및 신암을 포함한 여러 암 적응증에 대해 임상 시험 중이다. PD-L1 항체인 두르발루맙은 국부 진행성 또는 전이성 요로상피 암종 적응증에 대해 승인되어 있고, 다수의 고형 종양 및 혈액 암에 대해 임상 개발 중이다 (예를 들어 문헌 [Massard et al., 2016 J Clin Oncol. 34(26):3119-25] 참조). 추가의 항-PD-L1 항체는 WO2004004771, WO2007005874, WO2010036959, WO2010077634, WO2013079174, WO2013164694, WO2013173223 및 WO2014022758에 기재되었다.
문헌 [Horton et al. (J Immunother Cancer. 2015; 3(Suppl 2): O10)]은 효능작용 4-1BB 항체와 중화 PD-L1 항체의 조합을 개시한다.
우토밀루맙과 아벨루맙의 조합 요법이 현재 임상 시험 중이다 (문헌 [Chen et al., J Clin Oncol 35, 2017 suppl; abstr TPS7575], 및 임상 시험 NCT02554812).
그러나, 관련 기술분야의 진보에도 불구하고, PD-L1 및 CD137 둘 다에 결합할 수 있는 다중특이적 항체 및 그의 제약 제제에 대한 필요가 존재한다.
본 발명의 목적은
a. 인간 CD137 (4-1BB)에 결합하는 제1 항원-결합 영역 및 인간 PD-L1 (CD274)에 결합하는 제2 항원-결합 영역을 포함하는 결합제이며,
- 제1 항원 결합 영역은 서열식별번호: 15에 제시된 아미노산 서열 내에 존재하는 3개의 상보성 결정 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 제1 중쇄 가변 영역 (VH), 및 서열식별번호: 16에 제시된 아미노산 서열 내에 존재하는 3개의 상보성 결정 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 제1 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함하고,
- 제2 항원-결합 영역은 서열식별번호: 17에 제시된 아미노산 서열 내에 존재하는 3개의 상보성 결정 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 제2 중쇄 가변 영역 (VH), 및 서열식별번호: 21에 제시된 아미노산 서열 내에 존재하는 3개의 상보성 결정 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 제2 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함하는 것인 결합제,
b. 히스티딘 완충제,
c. 약 100 내지 약 400 mM의 당, 및
d. 약 0.001 내지 약 0.1% (w/v) 비-이온성 계면활성제
를 포함하고;
pH 약 4.5 내지 약 6.5를 갖는 제약 제제를 제공하는 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 의약으로서 사용하기 위한 상기 정의된 바와 같은 제약 제제에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 암의 치료에 사용하기 위한 상기 정의된 바와 같은 제약 제제에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 질환의 치료를 필요로 하는 대상체에게 유효량의 상기 정의된 바와 같은 제약 제제를 투여하는 것을 포함하는, 질환의 치료 방법에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 세포 사멸의 유도 또는 PD-L1을 발현하는 종양 세포의 성장 및/또는 증식의 억제를 필요로 하고/거나 상기 종양 세포를 보유하는 대상체에게 유효량의 상기 정의된 바와 같은 제약 제제를 투여하는 것을 포함하는, 세포 사멸을 유도하거나 또는 PD-L1을 발현하는 종양 세포의 성장 및/또는 증식을 억제하는 방법에 관한 것이다.
의약, 예컨대 암, 예를 들어 고형 종양의 존재를 특징으로 하는 암 또는 흑색종, 난소암, 폐암, 결장암 및 두경부암으로 이루어진 군으로부터 선택된 암의 치료를 위한 의약의 제조를 위한 상기 정의된 제약 제제의 용도를 제공하는 것이 또한 본 발명의 범주 내에 있다.
최종적으로, 본 발명은 본원에 정의된 바와 같은 결합제를 제공하는 단계 및 이를 pH 약 4.5 내지 약 6.5에서
a. 히스티딘 완충제,
b. 약 100 내지 약 400 mM의 당, 및
c. 약 0.001 내지 약 0.1% (w/v) 비-이온성 계면활성제
와 합하는 단계를 포함하는, 본 발명의 제약 제제를 제조하는 방법을 제공한다.
도 1: 인간, 아프리카 코끼리 및 멧돼지 CD137에 대한 서열 정렬. 인간 서열에서의 아미노산과 상이한 아프리카 코끼리 및 멧돼지 CD137에서의 아미노산은 흑색으로 강조되어 있다.
도 2: 아프리카 코끼리 (셔플 5) 또는 멧돼지 (셔플 1-4, 6) CD137 도메인을 함유하는 CD137 셔플 구축물.
도 3: HEK293-T17 세포 상의 CD137 셔플 구축물의 발현. HEK293-T17 세포를 CD137 셔플 구축물로 형질감염시켰다. 인간, 멧돼지 및 아프리카 코끼리 CD137을 인식하는 폴리클로날 항-CD137 항체를 사용하여 유동 세포측정법에 의해 구축물의 세포 표면 발현을 측정하였다.
도 4: HEK293-T17 세포 상에서 발현된 CD137 셔플 구축물에 대한 항체 CD137-009의 결합. HEK293-T17 세포를 CD137 셔플 구축물, 및 인간 CD137 (hCD137 wt), 아프리카 코끼리 또는 멧돼지 CD137으로 형질감염시켰다. HEK293-T17 세포 상에서 발현된 이들 구축물에 대한 항체 CD137-009의 결합을 유동 세포측정법에 의해 측정하였다. 폴리클로날 항-CD137 항체를 사용한 염색은 대조군으로서 제시된다.
도 5: PD-1/PD-L1 상호작용에 대한 1가 항체 b12-FEALxPD-L1-547-FEAR의 효과. PD-1/PD-L1 억제 생물검정에서 b12-FEALxPD-L1-547-FEAR의 효과를 결정하였다. 제시된 데이터는 하나의 대표적인 실험에 대한 대조군 (항체 첨가 부재) 대비 배수 유도였다.
도 6: CD137xPD-L1 이중특이적 항체의 예상되는 작용 방식의 개략적 표현. (A) PD-L1은 항원-제시 세포 (APC) 뿐만 아니라 종양 세포 상에서 발현된다. 음성 조절 분자 PD-1을 발현하는 T 세포에 대한 PD-L1 결합은 T 세포 활성화 신호를 효과적으로 중단시키고, 결국 T 세포 억제를 유도한다. (B) CD137xPD-L1 이중특이적 항체의 첨가시에, 억제 PD-1:PD-L1 상호작용은 PD-L1-특이적 아암을 통해 차단되고, 동시에 이중특이적 항체는 세포-세포 상호작용을 통해 T 세포 상에서 발현된 CD137에 효능작용 신호전달을 제공하여 강한 T 세포 공동자극을 유발한다.
도 7: 활성 PD-1/PD-L1 축을 갖는 항원-특이적 T 세포 검정에서 CD137-009-FEALxPD-L1-547-FEAR에 의한 PD-1/PD-L1-매개 T 세포 억제 및 CD8+ T 세포 증식의 추가의 공동-자극의 공개. 클라우딘-6-특이적 TCR- 및 PD-1-시험관내 번역된 (IVT)-RNA가 전기천공으로 도입된 CFSE-표지된 T 세포를 5일 동안 0.1 μg/mL 및 0.02 μg/mL CD137-009-FEALxPD-L1-547-FEAR, b12-FEALxPD-L1-547-FEAR 또는 b12 대조군 항체의 존재 하에 클라우딘-6-IVT-RNA-전기천공된 미성숙 수지상 세포와 함께 인큐베이션하였다. CD8+ T 세포 증식을 유동 세포측정법에 의해 측정하였다. 제시된 데이터는 (A 및 C) 2종의 상이한 공여자로부터의 대표적인 CFSE 히스토그램 및 (B 및 D) 플로우조(FlowJo) 소프트웨어를 사용하여 계산된, 상응하는 분열 세포 백분율 및 증식 지수이다. (B)는 (A)에 대표적으로 제시된 공여자 1로부터의 데이터의 분석을 보여준다. (D)는 (C)에 대표적으로 제시된 공여자 2로부터의 데이터의 분석을 보여준다. 오차 막대 (SD)는 실험 (1종의 공여자로부터의 세포를 사용하는 3회의 반복실험) 내의 변동을 나타낸다.
도 8: 활성 PD1/PD-L1 축을 갖는 항원-특이적 T 세포 검정에서 이중특이적 항체 CD137-009-FEALxPD-L1-547-FEAR의 EC50 값의 분석. 클라우딘-6-특이적 TCR- 및 PD-1-IVT-RNA가 전기천공으로 도입된 CFSE-표지된 T 세포를 5일 동안 CD137-009-FEALxPD-L1-547-FEAR (1 내지 0.00015 μg/mL의 3배 연속 희석물)의 존재 하에 클라우딘-6-IVT-RNA-전기천공된 미성숙 수지상 세포와 함께 인큐베이션하였다. CD8+ T 세포 증식을 유동 세포측정법에 의해 측정하였다. 제시된 데이터는 항체 농도의 함수로서의 분열 세포 백분율 (빈 다이아몬드) 및 증식 지수 (채워진 삼각형)이다. 오차 막대 (SD)는 실험 (1종의 공여자로부터의 세포를 사용하는 6회의 반복실험) 내의 변동을 나타낸다. 비선형 회귀에 의해 곡선을 피팅시키고, 그래프패드 프리즘 소프트웨어를 사용하여 EC50 값을 결정하였다.
도 9: 활성 PD1/PD-L1 축을 갖는 항원-특이적 T 세포 검정에서 2종의 1가 결합 CD137 항체의 조합 (CD137-009-FEALxb12-FEAR + b12-FEALxPD-L1-547-FEAR) 또는 2종의 모 항체의 조합 (CD137-009 + PD-L1-547)과의 CD137-009-FEALxPD-L1-547-FEAR의 비교. 클라우딘-6-특이적 TCR- 및 PD1-IVT-RNA가 전기천공으로 도입된 CFSE-표지된 T 세포를 5일 동안 0.25 μg/mL (i) CD137-009-FEALxPD-L1-547-FEAR, (ii) CD137-009-FEALxb12 + b12-FEALxPD-L1-547-FEAR, (iii) CD137-009-FEALxb12, (iv) b12-FEALxPD-L1-547-FEAR, (v) CD137-009 + PD-L1-547, (vi) CD137-009, (vii) PD-L1-547, 또는 (viii) b12 대조군 항체의 존재 하에 클라우딘-6-IVT-RNA 전기천공된 미성숙 수지상 세포와 함께 인큐베이션하였다. CD8+ T 세포 증식을 유동 세포측정법에 의해 측정하였다. 제시된 데이터는 (A) 대표적인 CFSE 히스토그램 및 (B 및 C) 플로우조 소프트웨어를 사용하여 계산된, 상응하는 분열 세포 퍼센트 및 증식 지수의 평균 값이다. 오차 막대 (SD)는 실험 (1종의 공여자로부터의 세포를 사용하는 3회의 반복실험) 내의 변동을 나타낸다.
도 10: CD137-009-FEALxPD-L1-547-FEAR에 의한 인간 비소세포 폐암 조직 절제물로부터의 종양 침윤 림프구 (TIL)의 생체외 확장. 절제된 조직으로부터의 종양 조각을 10 U/mL IL-2 및 나타낸 농도의 CD137-009-FEALxPD-L1-547-FEAR과 함께 배양하였다. 10일의 배양 후, 세포를 수거하고, 유동 세포측정법에 의해 분석하였다. (A) 비처리 대조군과 비교한 배수 확장으로서의 TIL 수, (B) 비처리 대조군과 비교한 배수 확장으로서의 CD3+CD8+ T 세포 수, (C) 비처리 대조군과 비교한 배수 확장으로서의 CD3+CD4+ T 세포 수, (D) 비처리 대조군과 비교한 배수 확장으로서의 CD3-CD56+ NK 세포 수. 막대는 출발 물질로서 웰당 2개의 종양 조각을 갖는 n=5 개별 웰의 평균 ± SD를 나타낸다.
도 11: OT-I 입양 세포 전달 설정에서 항원-특이적 T 세포 증식에 대한 mCD137-3H3xmPD-L1-MPDL3280A 마우스 대용 항체의 효과. 공여자 마우스로부터 단리된 오브알부민 (OVA) 특이적 OT1+Thy1.1+ 이중 양성 세포독성 T 세포를 나이브 C57BL/6 수용자 마우스 내에 안와후로 (r.o.) 주사하였다. 입양 세포 전달 다음 날, 수용자 마우스에게 항원 자극으로서 100 μg OVA를 r.o. 주사하고, 이어서 마우스당 100 μg 또는 20 μg mCD137-3H3xmPD-L1-MPDL3280A, mCD137-3H3xb12 또는 mPD-L1-MPDL3280Axb12 항체를 r.o. 주사하였다. PBS의 주사 (도면에서 OVA 단독으로 나타냄)를 기준선 참조로서 사용하고, 비처리 동물을 음성 대조군으로서 사용하였다. 6일 후, 100 μL 혈액을 r.o. 경로를 통해 채취하고, Thy1.1+CD8+ T 세포에 대해 분석하였다. 제시된 데이터는 (A) OT-I 입양 세포 전달 실험 윤곽의 개략적 표현, 및 (B) 제6일에서 각각의 처리군에 대한 Thy1.1+CD8+ T 세포 빈도이다. 사각형은 개별 동물을 나타내고, 오차 막대 (SD)는 실험 내의 변동을 나타낸다 (군당 n=5 마우스). 일원 Anova와 터키 다중 비교 검정을 사용하여 통계적 분석을 수행하였다; ns = 군들 사이의 유의차 부재, *** = P< 0.001.
도 12: 피하 동계 CT26 마우스 종양 모델에서 mCD137-3H3xmPD-L1-MPDL3280A 마우스 대용 항체의 항종양 효능. 피하 CT26 종양을 보유하는 암컷 BALB/c 마우스를 종양이 부피 ≥ 30 mm3에 도달한 후에 마우스당 20 μg (i) mCD137-3H3xmPD-L1-MPDL3280A, (ii) mCD137-3H3xb12 또는 (iii) mPD-L1-MPDL3280Axb12 항체, 또는 (iv) PBS의 복강내 주사로 처리하였다. 투여 스케줄은 다음과 같았다: 처음 8회의 주사의 경우 2-3일마다, 이어서 실험 종료시까지 7일마다 주사. 제29일에, 100 μL 혈액을 r.o. 경로를 통해 채취하고, gp70-특이적 CD8+ T 세포에 대해 분석하였다. 제시된 데이터는 (A) 각각의 선이 단일 마우스를 나타내는 종양 성장 곡선, (B) 생성된 카플란-마이어 생존 분석, 및 (C) 이식후 제29일에서 각각의 처리군에 대한 gp70-특이적 CD8+ T-세포 빈도이다. PFS = 무진행 생존.
도 13: 종양 세포에 대한 단일특이적 2가 PD-L1 항체 및 1가 b12xPD-L1 항체의 결합. MDA-MB-231 (A), PC-3 (B) 및 SK-MES-1 (C) 세포에 대한 PD-L1-547 및 b12-FEALxPD-L1-547-FEAR의 결합. 제시된 데이터는 유동 세포측정법에 의해 결정된 평균 형광 강도 (MFI)이다. 단일특이적 2가 b12 항체를 음성 대조군으로서 포함시켰다.
도 14: 비-항원-특이적 T-세포 증식 검정에서 2종의 1가 대조군의 조합 (b12-FEALxCD137-009-HC7LC2-FEAR + b12-FEALxPD-L1-547-FEAR) 또는 2종의 모 항체의 조합 (CD137-009-HC7LC2-FEAR + PD-L1-547-FEAR)과의 PD-L1-547-FEALxCD137-009-HC7LC2-FEAR의 비교. CFSE-표지된 PBMC를 준최적 농도의 항-CD3 항체 (0.03 μg/mL 및 0.1 μg/mL)와 함께 또는 항-CD3 항체 없이 (T-세포 활성화에 대한 음성 대조군으로서) 인큐베이션하고, 4일 동안 0.2 μg/mL i) PD-L1-547-FEALxCD137-009-HC7LC2-FEAR, ii) b12-FEALxCD137-009-HC7LC2-FEAR + b12-FEALxPD-L1-547-FEAR 각각, iii) b12-FEALxCD137-009-HC7LC2-FEAR, iv) b12-FEALxPD-L1-547-FEAR, v) CD137-009-HC7LC2-FEAR + PD-L1-547-FEAR 각각, vi) CD137-009-HC7LC2-FEAR, vii) PD-L1-547-FEAR, 또는 viii) b12-IgG-FEAL 대조군 항체의 존재 하에 배양하였다. CD4+ (A) 및 CD8+ (B) T-세포 증식을 유동 세포측정법에 의해 측정하였다. 플로우조 v10.4 소프트웨어를 사용하여 계산된 3회의 반복실험의 평균 확장 지수로서 3종의 공여자로부터의 데이터가 제시된다. 오차 막대 (SD)는 실험 (1종의 공여자로부터의 세포를 사용하는 3회의 반복실험) 내의 변동을 나타낸다.
도 15: 비-항원-특이적 T-세포 증식 검정에서 PD-L1-547-FEALxCD137-009-HC7LC2-FEARx에 의한 T-세포 증식 유도에 대한 EC50 값의 결정. CFSE-표지된 PBMC를 4일 동안 준최적 농도의 항-CD3 항체 및 PD-L1-547-FEALxCD137-009-HC7LC2-FEAR의 연속 희석물 (1 - 0.00015 μg/mL) 또는 대조군 항체로서의 1 μg/mL b12 IgG와 함께 인큐베이션하였다. 2종의 대표적인 공여자로부터의 데이터가 제시되며; 공여자 1로부터의 PBMC를 0.03 μg/mL 항-CD3으로 자극하고 (A, B) 및 공여자 2로부터의 PBMC를 0.09 μg/mL 항-CD3으로 자극하였다 (C, D). CD4+ (A 및 C) 및 CD8+ (B 및 D) T-세포 증식을 유동 세포측정법에 의해 측정하였다. 제시된 데이터는 플로우조 v10.4 소프트웨어를 사용하여 계산되고 4 파라미터 로그 피트로 피팅된, 3회의 반복실험의 평균 확장 지수 값이다. 오차 막대 (SD)는 실험 (1종의 공여자로부터의 세포를 사용하는 3회의 반복실험) 내의 변동을 나타낸다.
도 16: T 세포 내로의 PD-1 전기천공이 존재 또는 부재하는 항원-특이적 T-세포 검정에서 10종의 염증유발 시토카인의 분비에 대한 PD-L1-547-FEALxCD137-009-HC7LC2-FEAR의 효과. CLDN6-특이적 TCR-IVT-RNA가 전기천공으로 도입되고, 2 μg PD1-IVT-RNA가 전기천공으로 도입되거나 또는 도입되지 않은 T 세포를 상이한 농도의 CD137-009-HC7LC2-FEALxPD-L1-547-FEAR (3배 연속 희석물; 1 μg/mL 내지 0.00015 μg/mL 범위) 또는 b12 대조군 항체 b12-IgG-FEAL의 존재 하에 CLDN6-IVT-RNA-전기천공된 iDC와 함께 인큐베이션하였다. MSD V-플렉스 인간 염증유발 패널 1 (10-플렉스) 키트를 사용하는 멀티플렉스 샌드위치 면역검정에 의해 항체 첨가 48시간 후 상청액의 시토카인 수준을 결정하였다. 각각의 데이터 포인트는 3개의 개별 웰의 평균 ± SD를 나타낸다.
도 17: 항원-비특이적 T-세포 검정에서 10종의 염증유발 시토카인의 분비에 대한 PD-L1-547-FEALxCD137-009-HC7LC2-FEAR의 효과. 인간 PBMC를 상이한 농도의 PD-L1-547-FEALxCD137-009-HC7LC2-FEAR (3배 연속 희석물; 1 μg/mL 내지 0.00015 μg/mL 범위) 또는 b12 대조군 항체 b12-IgG-FEAL의 존재 하에 항-CD3 항체를 사용하여 준최적으로 자극하였다. MSD V-플렉스 인간 염증유발 패널 1 (10-플렉스) 키트를 사용하는 멀티플렉스 샌드위치 면역검정에 의해 항체 첨가 48시간 후 상청액 중 시토카인 수준을 결정하였다. 각각의 데이터 포인트는 3개의 개별 웰의 평균 ± SD를 나타낸다.
정의
본 발명의 문맥에서 용어 "결합제"는 목적하는 항원에 결합할 수 있는 임의의 작용제를 지칭한다. 본 발명의 특정 실시양태에서, 결합제는 항체, 항체 단편 또는 그의 구축물이다. 결합제는 또한 합성, 변형 또는 비-자연 발생 모이어티, 특히 비-펩티드 모이어티를 포함할 수 있다. 이러한 모이어티는, 예를 들어 목적하는 항원-결합 관능기 또는 영역, 예컨대 항체 또는 항체 단편을 연결할 수 있다. 한 실시양태에서, 결합제는 항원-결합 CDR 또는 가변 영역을 포함하는 합성 구축물이다.
용어 "이뮤노글로불린"은 1쌍의 저분자량 경쇄 (L) 및 1쌍의 중쇄 (H)의 2쌍의 폴리펩티드 쇄로 이루어지고, 4개 모두 디술피드 결합에 의해 상호연결된, 구조적으로 관련된 당단백질의 부류를 지칭한다. 이뮤노글로불린의 구조는 잘 특징화되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Fundamental Immunology Ch. 7 (Paul, W., ed., 2nd ed. Raven Press, N.Y. (1989))]을 참조한다. 간략하게, 각각의 중쇄는 전형적으로, 중쇄 가변 영역 (본원에서 VH 또는 VH로 약칭됨) 및 중쇄 불변 영역 (본원에서 CH 또는 CH로 약칭됨)으로 구성된다. 중쇄 불변 영역은 전형적으로 3개의 도메인 CH1, CH2 및 CH3으로 구성된다. 힌지 영역은 중쇄의 CH1과 CH2 도메인 사이의 영역이고, 고도로 가요성이다. 힌지 영역 내의 디술피드 결합은 IgG 분자 내의 2개의 중쇄 사이의 상호작용의 일부이다. 각각의 경쇄는 전형적으로, 경쇄 가변 영역 (본원에서 VL 또는 VL로 약칭됨) 및 경쇄 불변 영역 (본원에서 CL 또는 CL로 약칭됨)으로 구성된다. 경쇄 불변 영역은 전형적으로 1개의 도메인 CL로 구성된다. VH 및 VL 영역은 프레임워크 영역 (FR)으로 지칭되는 보다 보존된 영역들 사이에 삽입된, 상보성 결정 영역 (CDR)으로도 지칭되는 초가변성의 영역 (또는 구조적으로 규정된 루프의 서열 및/또는 형태가 초가변일 수 있는 초가변 영역)으로 추가로 세분될 수 있다. 각각의 VH 및 VL은 전형적으로 아미노-말단에서 카르복시-말단으로 하기 순서로 배열된 3개의 CDR 및 4개의 FR로 구성된다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4 (또한, 문헌 [Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196, 901-917 (1987)] 참조). 달리 언급되지 않거나 또는 문맥에 의해 모순되지 않는 한, 본원에서의 CDR 서열은 도메인갭얼라인(DomainGapAlign)을 사용하여 IMGT 규칙에 따라 확인된다 (문헌 [Lefranc MP., Nucleic Acids Research 1999;27:209-212 및 Ehrenmann F., Kaas Q. and Lefranc M.-P. Nucleic Acids Res., 38, D301-307 (2010)]; 또한 인터넷 http 주소 www.imgt.org/ 참조). 달리 언급되지 않거나 또는 문맥에 의해 모순되지 않는 한, 본 발명에서 불변 영역 내의 아미노산 위치에 대한 언급은 EU-넘버링에 따른 것이다 (Edelman et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 1969 May;63(1):78-85; Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition. 1991 NIH Publication No. 91-3242).
본원에 사용된 용어 "이소형"은 중쇄 불변 영역 유전자에 의해 코딩되는 이뮤노글로불린 부류 (예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgD, IgA, IgE 또는 IgM) 또는 그의 임의의 동종이형, 예컨대 IgG1m(za) 및 IgG1m(f)을 지칭한다. 추가로, 각각의 중쇄 이소형은 카파 (κ) 또는 람다 (λ) 경쇄와 조합될 수 있다.
본 발명의 문맥에서 용어 "항체" (Ab)는 이뮤노글로불린 분자, 이뮤노글로불린 분자의 단편, 또는 이들 중 어느 하나의 유도체를 지칭하고, 이는 전형적인 생리학적 조건 하에서 유의한 기간의 반감기, 예컨대 적어도 약 30분, 적어도 약 45분, 적어도 약 1시간, 적어도 약 2시간, 적어도 약 4시간, 적어도 약 8시간, 적어도 약 12시간, 약 24시간 또는 그 초과, 약 48시간 또는 그 초과, 약 3, 4, 5, 6, 7일 또는 그 초과 등, 또는 임의의 다른 관련된 기능적으로 정의된 기간 (예컨대 항원에 대한 항체 결합과 연관된 생리학적 반응을 유도, 촉진, 증진 및/또는 조정하는데 충분한 시간 및/또는 항체가 이펙터 활성을 동원하는데 충분한 시간)으로 항원에 특이적으로 결합하는 능력을 갖는다. 이뮤노글로불린 분자의 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 항원과 상호작용하는 결합 도메인을 함유한다. 본원에 사용된 용어 "항원-결합 영역"은 항원과 상호작용하고 VH 영역 및 VL 영역 둘 다를 포함하는 영역을 지칭한다. 본원에 사용된 경우의 용어 항체는 단일특이적 항체, 뿐만 아니라 다수의, 예컨대 2개 이상, 예를 들어 3개 이상의 상이한 항원-결합 영역을 포함하는 다중특이적 항체를 포함한다. 항체 (Ab)의 불변 영역은 면역계의 다양한 세포 (예컨대 이펙터 세포) 및 보체계의 성분, 예컨대 보체 활성화의 전형적 경로에서의 제1 성분인 C1q를 포함한 숙주 조직 또는 인자에 대한 이뮤노글로불린의 결합을 매개할 수 있다. 상기 나타낸 바와 같이, 본원의 용어 항체는 달리 언급되지 않거나 또는 문맥에 의해 명백하게 모순되지 않는 한, 항원-결합 단편인, 즉 항원에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 항체의 단편을 포함한다. 항체의 항원-결합 기능은 전장 항체의 단편에 의해 수행될 수 있는 것으로 나타났다. 용어 "항체" 내에 포괄되는 항원-결합 단편의 예는 (i) VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 이루어진 1가 단편 또는 WO2007059782 (젠맙(Genmab))에 기재된 바와 같은 1가 항체인 Fab' 또는 Fab 단편; (ii) 힌지 영역에서 디술피드 가교에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편인 F(ab')2 단편; (iii) VH 및 CH1 도메인으로 본질적으로 이루어진 Fd 단편; (iv) 항체의 단일 아암의 VL 및 VH 도메인으로 본질적으로 이루어진 Fv 단편; (v) VH 도메인으로 본질적으로 이루어지고 또한 도메인 항체 (Holt et al.; Trends Biotechnol. 2003 Nov;21(11):484-90)로 불리는 dAb 단편 (Ward et al., Nature 341, 544-546 (1989)); (vi) 낙타류 또는 나노바디 분자 (Revets et al.; Expert Opin Biol Ther. 2005 Jan;5(1):111-24) 및 (vii) 단리된 상보성 결정 영역 (CDR)을 포함한다. 또한, Fv 단편의 2개의 도메인인 VL 및 VH가 개별 유전자에 의해 코딩되지만, 이들은 VL 및 VH 영역이 쌍형성하여 1가 분자 (단일 쇄 항체 또는 단일 쇄 Fv (scFv)로 공지됨, 예를 들어 문헌 [Bird et al., Science 242, 423-426 (1988) 및 Huston et al., PNAS USA 85, 5879-5883 (1988)] 참조)를 형성하는 단일 단백질 쇄로서 제조될 수 있게 하는 합성 링커에 의해 재조합 방법을 사용하여 연결될 수 있다. 이러한 단일 쇄 항체는 달리 언급되지 않거나 또는 문맥에 의해 명백하게 나타내지 않는 한 용어 항체 내에 포괄된다. 이러한 단편은 일반적으로 항체의 의미 내에 포함되지만, 이들은 집합적으로 및 각각 독립적으로 상이한 생물학적 특성 및 유용성을 나타내는 본 발명의 고유한 특색이다. 본 발명의 문맥에서 이들 및 다른 유용한 항체 단편, 뿐만 아니라 이러한 단편의 이중특이적 포맷이 본원에 추가로 논의된다. 또한, 달리 명시되지 않는 한, 용어 항체는 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체 (mAb), 항체-유사 폴리펩티드, 예컨대 키메라 항체 및 인간화 항체, 및 임의의 공지된 기술, 예컨대 효소적 절단, 펩티드 합성 및 재조합 기술에 의해 제공되는, 항원에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 항체 단편 (항원-결합 단편)을 또한 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 생성된 항체는 임의의 이소형을 가질 수 있다. 본원에 사용된 용어 "이소형"은 중쇄 불변 영역 유전자에 의해 코딩되는 이뮤노글로불린 부류 (예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgD, IgA, IgE 또는 IgM)를 지칭한다. 특정한 이소형, 예를 들어 IgG1이 본원에서 언급되는 경우, 용어는 특정 이소형 서열, 예를 들어 특정한 IgG1 서열에 제한되는 것이 아니라, 항체가 다른 이소형보다 그 이소형, 예를 들어 IgG1에 대해 서열상 더 밀접하다는 것을 나타내는데 사용된다. 따라서, 예를 들어 본 발명의 IgG1 항체는 불변 영역의 변이를 포함한, 자연 발생 IgG1 항체의 서열 변이체일 수 있다.
본원에 사용되는 경우에, 용어 "아암", "Fab-아암" 및 "절반 분자"는 1개의 중쇄-경쇄 쌍을 지칭한다. 이중특이적 항체가 제1 항체"로부터 유래된" 절반-분자 항체 및 제2 항체"로부터 유래된" 절반-분자 항체를 포함하는 것으로 기재된 경우, 용어 "로부터 유래된"은 이중특이적 항체가 임의의 공지된 방법에 의해 상기 제1 및 제2 항체 각각으로부터의 상기 절반-분자를 이중특이적 항체로 재조합함으로써 생성되었다는 것을 나타낸다. 이와 관련하여, "재조합"은 임의의 특정한 재조합 방법에 의해 제한되는 것으로 의도되지 않고, 따라서 예를 들어 절반-분자 교환에 의한 재조합뿐만 아니라 핵산 수준에서의 재조합에 의해 및/또는 동일한 세포 내의 2종의 절반-분자의 공동-발현을 통해서를 비롯하여, 하기 본원에 기재된 이중특이적 항체의 생산 방법 모두를 포함한다.
본원에 사용된 용어 "항원-결합 영역" 또는 "결합 영역"은 항원에 결합할 수 있는 항체의 영역을 지칭한다. 항원은, 예를 들어 세포, 박테리아 또는 비리온 상에 존재하는 임의의 분자, 예컨대 폴리펩티드일 수 있다. 문맥상 모순되지 않는 한, 용어 "항원-결합 영역" 및 "항원-결합 부위"는 본 발명의 문맥에서 상호교환가능하게 사용될 수 있다.
문맥상 모순되지 않는 한, 용어 "항원" 및 "표적"은 본 발명의 문맥에서 상호교환가능하게 사용될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "결합"은 항체를 리간드로 및 항원을 분석물로 사용하여 생물층 간섭측정법에 의해 결정되는 경우에, 전형적으로는 1E-6 M 이하, 예를 들어 5E-7 M 이하, 1E-7 M 이하, 예컨대 5E-8 M 이하, 예컨대 1E-8 M 이하, 예컨대 5E-9 M 이하, 또는 예컨대 1E-9 M 이하의 KD에 상응하는 결합 친화도로, 항체가 미리 결정된 항원 또는 표적에 결합하는 것을 지칭하고, 미리 결정된 항원 또는 밀접하게 관련된 항원 이외의 다른 비-특이적 항원 (예를 들어, BSA, 카세인)에의 결합에 대한 그의 친화도보다 적어도 10배 더 낮은, 예컨대 적어도 100배 더 낮은, 예를 들어 적어도 1,000배 더 낮은, 예컨대 적어도 10,000배 더 낮은, 예를 들어 적어도 100,000배 더 낮은 KD에 상응하는 친화도로 미리 결정된 항원에 결합한다.
본원에 사용된 용어 "KD" (M)는 특정한 항체-항원 상호작용의 해리 평형 상수를 지칭하고, kd를 ka로 나눔으로써 수득된다.
본원에 사용된 용어 "kd" (sec-1)는 특정한 항체-항원 상호작용의 해리율 상수를 지칭한다. 상기 값은 koff 값 또는 오프-레이트로도 지칭된다.
본원에 사용된 용어 "ka" (M-1 x sec-1)는 특정한 항체-항원 상호작용의 회합률 상수를 지칭한다. 상기 값은 kon 값 또는 온-레이트로도 지칭된다.
본원에 사용된 경우 용어 "PD-L1"은 프로그램화된 사멸-리간드 1 단백질을 지칭한다. PD-L1은 인간 및 다른 종에서 발견되고, 따라서 용어 "PD-L1"은 문맥상 모순되지 않는 한 인간 PD-L1에 제한되지 않는다. 인간, 마카크 (시노몰구스 원숭이), 아프리카 코끼리, 멧돼지 및 마우스 PD-L1 서열은 각각 진뱅크(Genbank) 수탁 번호 NP_054862.1, XP_005581836, XP_003413533, XP_005665023 및 NP_068693을 통해 확인할 수 있다. 인간 PD-L1의 서열은 또한 서열식별번호: 28에 제시되며, 여기서 아미노산 1-18은 신호 펩티드일 것으로 예측된다. 마카크 (시노몰구스 원숭이) PD-L1의 서열은 또한 서열식별번호: 29에 제시되며, 여기서 아미노산 1-18은 신호 펩티드일 것으로 예측된다.
본원에 사용된 용어 "CD137"은 인간 분화 클러스터 137 단백질을 지칭한다. TNFRSF9로도 지칭되는 CD137 (4-1BB)은 리간드 TNFSF9/4-1BBL에 대한 수용체이다. CD137은 T 세포 활성화에 관여하는 것으로 여겨진다. 한 실시양태에서, CD137은 유니프롯(UniProt) 수탁 번호 Q07011을 갖는 인간 CD137이다. 인간 CD137의 서열은 또한 서열식별번호: 30에 제시되며, 여기서 아미노산 1-23은 신호 펩티드일 것으로 예측된다. 한 실시양태에서, CD137은 유니프롯 수탁 번호 A9YYE7-1을 갖는 시노몰구스 원숭이 (마카카 파시쿨라리스(Macaca fascicularis)) CD137이다. 시노몰구스 원숭이 CD137의 서열은 서열식별번호: 31에 제시되며, 여기서 아미노산 1-23은 aa 신호 펩티드일 것으로 예측된다. 멧돼지 (수스 스크로파(Sus scrofa)) CD137은 서열식별번호: 38에 제시되며, 여기서 아미노산 1-23은 aa 신호 펩티드일 것으로 예측된다. 아프리카 코끼리 (록소돈타 아프리카나(Loxodonta africana)) CD137은 서열식별번호: 39에 제시되며, 여기서 아미노산 1-23은 aa 신호 펩티드일 것으로 예측된다.
"PD-L1 항체" 또는 "항-PD-L1 항체"는 항원 PD-L1, 특히 인간 PD-L1에 특이적으로 결합하는 상기 기재된 바와 같은 항체이다.
"CD137 항체" 또는 "항-CD137 항체"는 항원 CD137에 특이적으로 결합하는 상기 기재된 바와 같은 항체이다.
"CD137xPD-L1 항체", "항-CD137xPD-L1 항체", "PD-L1xCD137 항체" 또는 "항-PD-L1xCD137 항체"는 2개의 상이한 항원-결합 영역을 포함하는 이중특이적 항체이며, 이 중 하나는 항원 PD-L1에 특이적으로 결합하고 이 중 하나는 CD137에 특이적으로 결합한다.
용어 "이중특이적 항체"는 적어도 2개의 상이한, 전형적으로 비-중첩 에피토프에 대해 특이성을 갖는 항체를 지칭한다. 이러한 에피토프는 동일한 또는 상이한 표적 상에 존재할 수 있다. 본 발명의 경우, 에피토프는 동일한 표적, 즉 PD-L1 및 4-1BB 상에 있다. Fc 영역을 포함하는 이중특이적 항체의 상이한 부류의 예는 비대칭 이중특이적 분자, 예를 들어 상보적 CH3 도메인을 갖는 IgG-유사 분자; 및 대칭 이중특이적 분자, 예를 들어 분자의 각각의 항원-결합 영역이 적어도 2개의 상이한 에피토프에 결합하는 것인 재조합 IgG-유사 이중 표적화 분자를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
이중특이적 분자의 예는 트리오맙(Triomab)® (트리온 파마(Trion Pharma)/프레제니우스 바이오테크(Fresenius Biotech), WO/ 2002/020039), 노브-인투-홀 (제넨테크(Genentech), WO 1998/50431), 크로스맙 (로슈(Roche), WO 2009/080251, WO 2009/080252, WO 2009/080253), 정전기적으로-매칭된 Fc-이종이량체 분자 (암젠(Amgen), EP1870459 및 WO2009089004; 츄가이(Chugai), US201000155133; 온코메드(Oncomed), WO 2010/129304), LUZ-Y (제넨테크), DIG-바디, PIG-바디 및 TIG-바디 (파맙신(Pharmabcine)), 가닥 교환 조작된 도메인 바디 (시드바디) (이엠디 세로노(EMD Serono), WO2007110205), 이중특이적 IgG1 및 IgG2 (화이자(Pfizer)/리나트(Rinat), WO 2011/143545), 아지메트릭 스캐폴드 (자임웍스(Zymeworks)/머크(Merck), WO2012058768), mAb-Fv (젠코르(Xencor), WO 2011/028952), XmAb (젠코르), 2가 이중특이적 항체 (로슈, WO 2009/080254), 이중특이적 IgG (일라이 릴리(Eli Lilly)), 듀오바디(DuoBody)® 분자 (젠맙 A/S, WO 2011/131746), 듀엣맙 (메드이뮨(Medimmune), US2014/0348839), 비클로닉스 (메루스(Merus), WO 2013/157953), 노브이뮨(NovImmune) (κλ바디, WO 2012/023053), FcΔAdp (레게네론(Regeneron), WO 2010/151792), (DT)-Ig (GSK/도만티스(Domantis)), 투-인-원 항체 또는 이중 작용 Fab (제넨테크, 아디맙), mAb2 (에프-스타(F-Star), WO 2008/003116), 지바디(Zybody)™ 분자 (진제니아(Zyngenia)), CovX-바디 (CovX/화이자), 피노맙 (코바겐(Covagen)/얀센 실라그(Janssen Cilag)), 듀타맙 (두탈리스(Dutalys)/로슈), iMab (메드이뮨), 이중 가변 도메인 (DVD)-Ig™ (애보트(Abbott)), 이중 도메인 이중 머리 항체 (유니레버(Unilever); 사노피 아벤티스(Sanofi Aventis), WO 2010/0226923), Ts2Ab (메드이뮨/AZ), BsAb (지모제네틱스(Zymogenetics)), 허큘레스 (비오젠 아이덱(Biogen Idec), US 7,951,918), scFv-융합체 (제넨테크/로슈, 노파르티스(Novartis), 이뮤노메딕스(Immunomedics), 창저우 아담 바이오테크 인크(Changzhou Adam Biotech Inc), CN 102250246), TvAb (로슈, WO2012/025525, WO2012/025530), ScFv/Fc 융합체, 스콜피온 (에멀전트 바이오솔루션즈(Emergent BioSolutions)/트루비온(Trubion), 지모제네틱스/BMS), 인터셉터 (에멀전트), 이중 친화도 재표적화 기술 (Fc-DART)™ (마크로제닉스(MacroGenics), WO2008/157379, WO2010/080538), BEAT (글렌마크(Glenmark)), 디-디아바디 (임클론(Imclone)/일라이 릴리) 및 화학적으로 가교된 mAb (카르마노스 캔서 센터(Karmanos Cancer Center)), 및 공유적으로 융합된 mAb (아임 테라퓨틱스(AIMM therapeutics))를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 문맥에서, 용어 "1가 항체"는 단지 1개의 항원 결합 도메인 (예를 들어, 1개의 Fab 아암)으로 항원 상의 특이적 에피토프와 상호작용할 수 있는 항체 분자를 지칭한다. 이중특이적 항체와 관련하여, "1가 항체 결합"은 이중특이적 항체가 단지 1개의 항원 결합 도메인 (예를 들어, 1개의 Fab 아암)으로 항원 상의 1개의 특이적 에피토프에 결합하는 것을 지칭한다.
본 발명의 문맥에서 용어 "단일특이적 항체"는 단지 1개의 에피토프에 대한 결합 특이성을 갖는 항체를 지칭한다. 이러한 항체는 단일특이적 1가 항체 (즉, 단지 1개의 항원 결합 영역을 보유함) 또는 단일특이적 2가 항체 (즉, 2개의 동일한 항원 결합 영역을 갖는 항체)일 수 있다.
용어 "이중특이적 항체"는 2개의 동일하지 않은 항원 결합 도메인, 예를 들어 2개의 동일하지 않은 Fab-아암 또는 동일하지 않은 CDR 영역을 갖는 2개의 Fab-아암을 갖는 항체를 지칭한다. 본 발명의 문맥에서, 이중특이적 항체는 적어도 2개의 상이한 에피토프에 대한 특이성을 갖는다. 이러한 에피토프는 동일한 또는 상이한 항원 또는 표적 상에 있을 수 있다. 에피토프가 상이한 항원 상에 있는 경우, 이러한 항원은 동일한 세포 또는 상이한 세포, 세포 유형 또는 구조물, 예컨대 세포외 매트릭스 또는 소포 및 가용성 단백질 상에 있을 수 있다. 따라서 이중특이적 항체는 다중 항원, 예를 들어 2개의 상이한 세포를 가교시킬 수 있다.
용어 "2가 항체"는 1 또는 2개의 표적 또는 항원 상의 에피토프에 결합하거나 또는 동일한 항원 상의 1 또는 2개의 에피토프에 결합하는 2개의 항원 결합 영역을 갖는 항체를 지칭한다. 따라서, 2가 항체는 단일특이적 2가 항체 또는 이중특이적 2가 항체일 수 있다.
본원에 사용된 용어 "모노클로날 항체", "모노클로날 Ab", "모노클로날 항체 조성물", "mAb" 등은 단일 분자 조성의 항체 분자의 제제를 지칭한다. 모노클로날 항체 조성물은 특정한 에피토프에 대한 단일 결합 특이성 및 친화도를 나타낸다. 따라서, 용어 "인간 모노클로날 항체"는 인간 배선 이뮤노글로불린 서열로부터 유래된 가변 및 불변 영역을 갖는 단일 결합 특이성을 나타내는 항체를 지칭한다. 인간 모노클로날 항체는 불멸화 세포에 융합된, 인간 중쇄 트랜스진 및 경쇄 트랜스진을 포함하는 게놈을 갖는 트랜스제닉 또는 트랜스크로모소말 비-인간 동물, 예컨대 트랜스제닉 마우스로부터 수득된 B 세포를 포함하는 하이브리도마에 의해 생산될 수 있다. 모노클로날 항체는 또한 재조합적으로 변형된 숙주 세포, 또는 항체를 코딩하는 핵산 서열의 시험관내 전사 및/또는 번역을 지원하는 세포 추출물을 사용하는 시스템으로부터 생산될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "전장 항체"는 각각 그 이소형의 야생형 항체의 중쇄-경쇄 쌍에서 정상적으로 발견되는 모든 중쇄 및 경쇄 불변 및 가변 도메인을 함유하는, 1 또는 2개의 중쇄 및 경쇄 쌍을 포함하는 항체 (예를 들어, 모 또는 변이체 항체)를 지칭한다. 전장 변이체 항체에서, 중쇄 및 경쇄 불변 및 가변 도메인은 특히 전장 모 또는 야생형 항체와 비교하였을 때 항체의 기능적 특성을 개선시키는 아미노산 치환을 함유할 수 있다. 본 발명에 따른 전장 항체는 (i) CDR 서열을 완전한 중쇄 서열 및 완전한 경쇄 서열을 포함하는 적합한 벡터 내로 클로닝하는 단계, 및 (ii) 완전한 중쇄 및 경쇄 서열을 적합한 발현 시스템에서 발현시키는 단계를 포함하는 방법에 의해 생산될 수 있다. CDR 서열 또는 전체 가변 영역 서열로부터 시작하여 전장 항체를 생산하는 것은 관련 기술분야의 통상의 기술자의 지식 내에 있다. 따라서, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 본 발명에 따른 전장 항체를 생성하는 방법을 알 것이다.
본원에 사용된 용어 "키메라 항체"는 가변 영역이 비-인간 종으로부터 유래되고 (예를 들어 설치류로부터 유래되고) 불변 영역이 상이한 종, 예컨대 인간으로부터 유래된 것인 항체를 지칭한다. 치료 용도를 위한 키메라 모노클로날 항체는 항체 면역원성을 감소시키도록 개발된다.
본원에 사용된 용어 "인간 항체"는 인간 배선 이뮤노글로불린 서열로부터 유래된 가변 및 프레임워크 영역 및 인간 이뮤노글로불린 불변 도메인을 갖는 항체를 포함하는 것으로 의도된다. 본 발명의 인간 항체는 인간 배선 이뮤노글로불린 서열에 의해 코딩되지 않는 아미노산 잔기 (예를 들어, 시험관내 무작위 또는 부위-특이적 돌연변이유발에 의해 또는 생체내 체세포 돌연변이에 의해 도입된 돌연변이, 삽입 또는 결실)를 포함할 수 있다. 그러나, 본원에 사용된 용어 "인간 항체"는 또 다른 비-인간 종, 예컨대 마우스의 배선으로부터 유래된 CDR 서열이 인간 프레임워크 서열 상에 그라프팅된 항체를 포함하는 것으로 의도되지 않는다.
본원에 사용된 용어 "인간화 항체"는 인간 항체 불변 도메인 및 인간 가변 도메인에 대해 높은 수준의 서열 상동성을 함유하도록 변형된 비-인간 가변 도메인을 함유하는 유전자 조작된 비-인간 항체를 지칭한다. 이는, 함께 항원 결합 부위를 형성하는 6개의 비-인간 항체 상보성 결정 영역 (CDR)을 상동 인간 수용자 프레임워크 영역 (FR) 상으로 그라프팅함으로써 달성될 수 있다 (WO92/22653 및 EP0629240 참조). 모 항체의 결합 친화도 및 특이성을 완전히 재구성하기 위해, 모 항체 (즉, 비-인간 항체)로부터의 프레임워크 잔기의 인간 프레임워크 영역 내로의 치환 (복귀-돌연변이)이 요구될 수 있다. 구조적 상동성 모델링은 항체의 결합 특성에 중요한 프레임워크 영역 내의 아미노산 잔기를 확인하는 것을 도울 수 있다. 따라서, 인간화 항체는 비-인간 CDR 서열, 주로 비-인간 아미노산 서열로의 1개 이상의 아미노산 복귀-돌연변이를 임의로 포함하는 인간 프레임워크 영역, 및 완전 인간 불변 영역을 포함할 수 있다. 임의로, 바람직한 특징, 예컨대 친화도 및 생화학적 특성을 갖는 인간화 항체를 수득하기 위해, 반드시 복귀-돌연변이일 필요는 없는 추가의 아미노산 변형이 적용될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "Fc 영역"은 항체의 N-말단에서 C-말단 방향으로 적어도 힌지 영역, CH2 영역 및 CH3 영역을 포함하는 영역을 지칭한다. 항체의 Fc 영역은 면역계의 다양한 세포 (예컨대 이펙터 세포) 및 보체계의 성분을 포함한 숙주 조직 또는 인자에 대한 이뮤노글로불린의 결합을 매개할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "힌지 영역"은 이뮤노글로불린 중쇄의 힌지 영역을 지칭한다. 따라서, 예를 들어 인간 IgG1 항체의 힌지 영역은 카바트(Kabat)의 문헌 [Kabat, E.A. et al., Sequences of proteins of immunological interest. 5th Edition - US Department of Health and Human Services, NIH publication No. 91-3242, pp 662,680,689 (1991)]에 제시된 바와 같은 Eu 넘버링에 따른 아미노산 216-230에 상응한다. 그러나, 힌지 영역은 또한 본원에 기재된 바와 같은 임의의 다른 하위유형일 수 있다.
본원에 사용된 용어 "CH1 영역" 또는 "CH1 도메인"은 이뮤노글로불린 중쇄의 CH1 영역을 지칭한다. 따라서, 예를 들어 인간 IgG1 항체의 CH1 영역은 카바트 (상기 동일 문헌)에 제시된 바와 같은 Eu 넘버링에 따른 아미노산 118-215에 상응한다. 그러나, CH1 영역은 또한 본원에 기재된 바와 같은 임의의 다른 하위유형일 수 있다.
본원에 사용된 용어 "CH2 영역" 또는 "CH2 도메인"은 이뮤노글로불린 중쇄의 CH2 영역을 지칭한다. 따라서, 예를 들어 인간 IgG1 항체의 CH2 영역은 카바트 (상기 동일 문헌)에 제시된 바와 같은 Eu 넘버링에 따른 아미노산 231-340에 상응한다. 그러나, CH2 영역은 또한 본원에 기재된 바와 같은 임의의 다른 하위유형일 수 있다.
본원에 사용된 용어 "CH3 영역" 또는 "CH3 도메인"은 이뮤노글로불린 중쇄의 CH3 영역을 지칭한다. 따라서, 예를 들어 인간 IgG1 항체의 CH3 영역은 카바트 (상기 동일 문헌)에 제시된 바와 같은 Eu 넘버링에 따른 아미노산 341-447에 상응한다. 그러나, CH3 영역은 또한 본원에 기재된 바와 같은 임의의 다른 하위유형일 수 있다.
용어 "에피토프"는 항체의 항원-결합 영역 ("파라토프")에 결합할 수 있는 단백질 결정기를 의미한다. 에피토프는 통상적으로 아미노산 또는 당 측쇄와 같은 분자의 표면 집단으로 이루어지고, 통상적으로 특이적 3차원 구조적 특징뿐만 아니라 특이적 전하 특징을 갖는다. 입체형태적 및 비-입체형태적 에피토프는 변성 용매의 존재 하에 전자에 대한 결합은 상실되지만 후자에 대한 결합은 상실되지 않는다는 점에서 구별된다. 에피토프 맵핑 기술은 "구조적 에피토프" 또는 "기능적 에피토프"를 결정할 수 있다. 구조적 에피토프는 항체와 직접 접촉하는 구조 내의 잔기로서 정의되고, 예를 들어 구조-기반 방법, 예컨대 X선 결정학에 의해 평가될 수 있다. 구조적 에피토프는 항체의 결합에 직접 관여하는 아미노산 잔기뿐만 아니라 결합에 직접 관여하지 않는 다른 아미노산 잔기, 예컨대 항체에 의해 효과적으로 차단되거나 커버되는 아미노산 잔기 (다시 말해서, 아미노산 잔기는 항체의 영향범위 내에 있음)를 포함할 수 있다. 기능적 에피토프는 항원-항체 결합 상호작용에 대한 강력한 기여를 하는 잔기로서 정의되고, 예를 들어 부위-지정 돌연변이유발, 예컨대 알라닌 스캐닝에 의해 평가될 수 있다 (Cunningham, B. C., & Wells, J. A. (1993) Journal of Molecular Biology; Clackson, T., & Wells, J. (1995) Science, 267(5196), 383-386). 기능적 에피토프는 항체의 결합에 직접 관여하는 아미노산 잔기뿐만 아니라 결합에 직접 관여하지 않는 다른 아미노산 잔기, 예컨대 직접 상호작용에 관여하는 잔기의 위치에 대한 입체형태적 변화를 유발하는 아미노산 잔기를 포함할 수 있다 (Greenspan, N. S., & Di Cera, E. (1999) Nature Biotechnology, 17(10), 936-937). 항체-항원 상호작용의 경우에, 기능적 에피토프는 항체 분자를 서로 구별하는데 사용될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "Fc 이펙터 기능" 또는" Fc-매개 이펙터 기능"은 폴리펩티드 또는 항체가 세포 막 상의 그의 표적, 예컨대 항원에 결합하고 후속적으로 IgG Fc 도메인과 선천성 면역계의 분자 (예를 들어, 가용성 분자 또는 막-결합된 분자)와 상호작용한 결과인 기능을 지칭하는 것으로 의도된다. Fc 이펙터 기능의 예는 (i) C1q-결합, (ii) 보체 활성화, (iii) 보체-의존성 세포독성 (CDC), (iv) 항체-의존성 세포-매개 세포독성 (ADCC), (v) Fc-감마 수용체-결합, (vi) 항체-의존성 세포성 식세포작용 (ADCP), (vii) 보체-의존성 세포성 세포독성 (CDCC), (viii) 보체-증진된 세포독성, (ix) 항체에 의해 매개되는 옵소닌화 항체의 보체 수용체에 대한 결합, (x) 옵소닌화, 및 (xi) (i) 내지 (x) 중 임의의 것의 조합을 포함한다.
용어 "아미노산" 및 "아미노산 잔기"는 본원에서 상호교환가능하게 사용될 수 있고, 제한적인 것으로 이해되지 않아야 한다. 아미노산은 각각의 아미노산에 대해 특이적인 측쇄 (R 기)와 함께 아민 (-NH2) 및 카르복실 (-COOH) 관능기를 함유하는 유기 화합물이다. 본 발명의 문맥에서, 아미노산은 구조 및 화학적 특징에 기초하여 분류될 수 있다. 따라서, 아미노산의 부류는 하기 표 중 하나 또는 둘 다에 반영될 수 있다:
R 기의 구조 및 일반적인 화학적 특징화에 기초한 주요 분류
Figure pct00001
아미노산 잔기의 대안적인 물리적 및 기능적 분류
Figure pct00002
한 아미노산이 또 다른 아미노산으로 치환되는 것은 보존적 또는 비-보존적 치환으로 분류될 수 있다. 본 발명의 문맥에서, "보존적 치환"은 한 아미노산이 유사한 구조 및/또는 화학적 특징을 갖는 또 다른 아미노산으로 치환되는 것, 예컨대 한 아미노산 잔기가 상기 2개의 표 중 임의의 것에 정의된 바와 같은 동일한 부류의 또 다른 아미노산 잔기로 치환되는 것이다: 예를 들어, 류신이 이소류신으로 치환될 수 있으며, 이는 이들이 둘 다 지방족 분지형 소수성 물질이기 때문이다. 유사하게, 아스파르트산이 글루탐산으로 치환될 수 있으며, 이는 이들이 둘 다 음으로 하전된 소형 잔기이기 때문이다.
본 발명의 문맥에서, 항체에서의 치환은 다음과 같이 나타내어진다:
원래 아미노산 - 위치 - 치환된 아미노산;
아미노산에 대한 널리 인식된 명명법을 참조하면, 임의의 아미노산 잔기를 나타내기 위해 코드 "Xaa" 또는 "X"를 포함한 3문자 코드 또는 1문자 코드가 사용된다. 따라서, Xaa 또는 X는 전형적으로 20개의 자연 발생 아미노산 중 임의의 것을 나타낼 수 있다. 본원에 사용된 용어 "자연 발생"은 하기 아미노산 잔기 중 어느 1개를 지칭한다: 글리신, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 세린, 트레오닌, 리신, 아르기닌, 히스티딘, 아스파르트산, 아스파라긴, 글루탐산, 글루타민, 프롤린, 트립토판, 페닐알라닌, 티로신, 메티오닌 및 시스테인. 따라서, 표기법 "K409R" 또는 "Lys409Arg"는 항체가 아미노산 위치 409에서 리신의 아르기닌으로의 치환을 포함한다는 것을 의미한다.
주어진 위치에서의 아미노산의 임의의 다른 아미노산으로의 치환은 다음과 같이 지칭된다:
원래 아미노산 - 위치; 또는 예를 들어 "K409"
원래 아미노산(들) 및/또는 치환된 아미노산(들)이 1개 초과의, 그러나 모두는 아닌 아미노산(들)을 포함할 수 있는 경우의 변형에 대해, 1개 초과의 아미노산은 "," 또는 "/"에 의해 분리될 수 있다. 예를 들어, 위치 409에서 리신이 아르기닌, 알라닌 또는 페닐알라닌으로 치환되는 것은 다음과 같다:
"Lys409Arg,Ala,Phe" 또는 "Lys409Arg/Ala/Phe" 또는 "K409R,A,F" 또는 "K409R/A/F" 또는 "K409에서 R, A, 또는 F로"이다.
이러한 지정은 본 발명의 문맥에서 상호교환가능하게 사용될 수 있지만, 동일한 의미 및 목적을 갖는다.
추가로, 용어 "치환"은 어느 1개 또는 다른 19개의 천연 아미노산으로의 치환, 또는 다른 아미노산, 예컨대 비-천연 아미노산으로의 치환을 포괄한다. 예를 들어, 위치 409에서의 아미노산 K의 치환은 각각의 하기 치환을 포함한다: 409A, 409C, 409D, 409E, 409F, 409G, 409H, 409I, 409L, 409M, 409N, 409Q, 409R, 409S, 409T, 409V, 409W, 409P 및 409Y. 그런데, 이는 지정 409X와 동등하며, 여기서 X는 원래 아미노산 이외의 다른 임의의 아미노산을 지정한다. 이들 치환은 또한 K409A, K409C 등 또는 K409A,C 등 또는 K409A/C/등으로 지정될 수 있다. 본원에서 이러한 치환 중 어느 1개를 구체적으로 포함하기 위해, 본원에 언급된 각각의 및 모든 위치에 대해 유추에 의해 동일한 것이 적용된다.
본 발명에 따른 항체는 또한 아미노산 잔기의 결실을 포함할 수 있다. 이러한 결실은 "del"로 나타내어질 수 있고, 예를 들어 K409del로의 기록을 포함한다. 따라서, 이러한 실시양태에서, 위치 409에서의 리신은 아미노산 서열로부터 결실되었다.
본 발명의 목적상, 2개의 아미노산 서열 사이의 "서열 동일성"은 EMBOSS 패키지 (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277), 바람직하게는 버전 5.0.0 이상의 니들(Needle) 프로그램에서 실행되는 바와 같은 니들만-분쉬(Needleman-Wunsch) 알고리즘 (Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453)을 사용하여 결정된다. 사용된 파라미터는 갭 개방 페널티 10, 갭 연장 페널티 0.5, 및 EBLOSUM62 (BLOSUM62의 EMBOSS 버전) 치환 매트릭스이다. 니들 라벨링된 "최장 동일성" (-노브리프 옵션을 사용하여 수득됨)의 결과가 퍼센트 동일성으로서 사용되고, 하기와 같이 계산된다:
(동일한 잔기 x 100)/(정렬의 길이 - 정렬 내 갭의 총수)
유사한 잔기의 보유는 또한 또는 대안적으로 BLAST 프로그램 (예를 들어, 표준 설정 BLOSUM62, 개방 갭=11 및 연장된 갭=1을 사용하여 NCBI를 통해 이용가능한 BLAST 2.2.8)의 사용에 의해 결정된 바와 같은 유사성 점수에 의해 측정될 수 있다. 적합한 변이체는 전형적으로 모 서열에 대해 적어도 약 45%, 예컨대 적어도 약 55%, 적어도 약 65%, 적어도 약 75%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95% 또는 그 초과 (예를 들어, 약 99%)의 유사성을 나타낸다.
본 발명의 문맥에서, "PD-1에 대한 PD-L1 결합의 억제"는 PD-L1에 결합할 수 있는 항체의 존재 하에 PD-1에 대한 PD-L1의 결합의 임의의 검출가능하게 유의한 감소를 지칭한다. 전형적으로, 억제는 항-PD-L1 항체의 존재에 의해 야기되는, PD-L1과 PD-1 사이의 결합의 적어도 약 10% 감소, 예컨대 적어도 약 15%, 예를 들어 적어도 약 20%, 예컨대 적어도 40% 감소를 의미한다. PD-1에 대한 PD-L1 결합의 억제는 임의의 적합한 기술에 의해 결정될 수 있다. 한 실시양태에서, 억제는 본원 실시예 6에 기재된 바와 같이 결정된다.
용어 "치료"는 증상 또는 질환 상태를 경감, 호전, 정지 또는 근절 (치유)시킬 목적으로 유효량의 본 발명의 제약 조성물을 투여하는 것을 지칭한다.
용어 "유효량" 또는 "치료 유효량"은 목적하는 치료 결과를 달성하기 위한, 필요한 투여량 및 기간 동안의 유효한 양을 지칭한다. 결합제, 예컨대 항체, 특히 이중특이적 항체의 치료 유효량은 개체의 질환 상태, 연령, 성별 및 체중, 및 개체에서 목적하는 반응을 도출할 수 있는 결합제의 능력과 같은 인자에 따라 달라질 수 있다. 또한, 치료 유효량은 치료상 유익한 효과가 항체 또는 항체 부분의 임의의 독성 또는 유해 효과를 능가하는 양이다.
제1 측면에서, 본 발명은
a. 인간 CD137 (4-1BB)에 결합하는 제1 항원-결합 영역 및 인간 PD-L1 (CD274)에 결합하는 제2 항원-결합 영역을 포함하는 결합제이며,
- 제1 항원 결합 영역은 서열식별번호: 15에 제시된 아미노산 서열 내에 존재하는 3개의 상보성 결정 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 제1 중쇄 가변 영역 (VH), 및 서열식별번호: 16에 제시된 아미노산 서열 내에 존재하는 3개의 상보성 결정 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 제1 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함하고,
- 제2 항원-결합 영역은 서열식별번호: 17에 제시된 아미노산 서열 내에 존재하는 3개의 상보성 결정 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 제2 중쇄 가변 영역 (VH), 및 서열식별번호: 21에 제시된 아미노산 서열 내에 존재하는 3개의 상보성 결정 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 제2 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함하는 것인 결합제,
b. 히스티딘 완충제,
c. 약 100 내지 약 400 mM의 당, 및
d. 약 0.001 내지 약 0.1% (w/v) 비-이온성 계면활성제
를 포함하고;
pH 약 4.5 내지 약 6.5를 갖는 제약 제제에 관한 것이다.
본 발명에 따른 제약 제제에 포함된 결합제는 한 세포에서 CD137에 결합함과 동시에 또 다른 세포 상의 PD-L1에 결합함으로써 활성화 및/또는 증식을 유도할 수 있다. 인간에서, CD137은 활성화된 T 세포, 예컨대 CD8+ T 세포 및 CD4+ T 세포 상에서 발현되고, 반면 PD-L1은 항원-제시 세포 (APC), 예컨대 수지상 세포 또는 종양 세포 상에서 우세하게 발현된다. 따라서, CD137 및 PD-L1 둘 다에 결합할 수 있는 본 발명에 따른 결합제, 예컨대 이중특이적 항체는 T 세포 및 APC 또는 T 세포 및 종양 세포에 동시에 결합할 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 제제 내의 결합제는 세포 상의 PD-L1 및 CD137의 동시 결합에 의해 APC와 T 세포 사이의 세포-대-세포 상호작용을 매개할 수 있다. 따라서, 이는 항원-특이적 T 세포의 증식을 유도할 수 있다. 추가로, 본 발명에 따른 제제에 존재하는 결합제는 종양 세포 상의 PD-L1 및 T 세포 상의 CD137의 동시 결합에 의해 종양 세포와 T 세포 사이의 세포-대-세포 상호작용을 매개할 수 있다. 따라서, 이는 T 세포 상의 CD137의 결합에 의해 종양 세포의 존재 하의 T 세포의 추가 활성화를 유도할 수 있고, 한편 종양 세포 상의 PD-L1의 결합은 T 세포와 종양 세포를 근접하게 가져온다. 따라서, 종양 세포의 존재 하의 T 세포의 활성화는 T 세포에 의한 종양 세포의 증진된 사멸을 유도할 수 있다. 추가로, 본 발명에 따른 제제 내의 결합제의 PD-L1 항원-결합 영역이 종양 세포 상의 PD-L1과 T 세포 상의 PD-1과의 결합을 억제하는 능력은, 종양 세포가 T 세포 억제를 유도하여 활성화된 T 세포의 항종양 효과에서 벗어날 수 있는 것을 방지한다.
따라서, 본 발명의 결합제, 예컨대 이중특이적 항체는 T 세포의 재활성화로부터 이익을 얻을 수 있는 질환, 예컨대 암의 치료를 위해 사용될 수 있다.
제약 제제는 1 내지 100 mM 히스티딘, 예컨대 5 내지 100 mM, 10 내지 100 mM, 15 내지 100 mM, 5 내지 90 mM, 5 내지 80 mM, 5 내지 70 mM, 5 내지 60 mM, 5 내지 50 mM, 5 내지 40 mM, 5 내지 30 mM, 10 내지 90 mM, 10 내지 80 mM, 10 내지 70 mM, 10 내지 60 mM, 10 내지 50 mM, 10 내지 40 mM, 10 내지 30 mM, 15 내지 90 mM, 15 내지 80 mM, 15 내지 70 mM, 15 내지 60 mM, 15 내지 50 mM, 15 내지 40 mM, 15 내지 30 mM 또는 15 내지 20 mM 히스티딘을 포함할 수 있다.
제약 제제는 특히 약 20 mM 히스티딘, 예컨대 20 mM 히스티딘을 포함할 수 있다.
제약 제제는 100 내지 400 mM 당, 예컨대 125 내지 400 mM, 150 내지 400 mM, 150 내지 400 mM, 175 내지 400 mM, 200 내지 400 mM, 225 내지 400 mM, 100 내지 375 mM, 100 내지 350 mM, 100 내지 325 mM, 100 내지 300 mM, 125 내지 375 mM, 125 내지 350 mM, 125 내지 325 mM, 125 내지 300 mM, 125 내지 275 mM, 150 내지 375 mM, 150 내지 350 mM, 150 내지 325 mM, 150 내지 300 mM, 150 내지 275 mM, 175 내지 375 mM, 175 내지 350 mM, 175 내지 325 mM, 175 내지 300 mM, 175 내지 275 mM, 200 내지 375 mM 1, 200 내지 350 mM 1, 200 내지 325 mM, 200 내지 300 mM, 200 내지 275 mM, 225 내지 375 mM, 225 내지 350 mM, 225 내지 325 mM, 225 내지 300 mM, 또는 예컨대 225 내지 275 mM 당을 포함할 수 있다.
특히, 제약 제제는 약 250 mM 당, 예컨대 250 mM 당을 포함할 수 있다. 예시적인 당은 글루코스, 갈락토스, 수크로스 및 트레할로스 탈수화물을 포함한다. 당은 특히 수크로스일 수 있다.
본원에 개시된 바와 같은 제약 제제는 0.005 내지 0.1% (w/v) 비-이온성 계면활성제, 예컨대 0.01 내지 0.1% (w/v), 0.015 내지 0.1% (w/v), 0.001 내지 0.09% (w/v), 0.001 내지 0.08% (w/v), 0.001 내지 0.07% (w/v), 0.001 내지 0.06% (w/v), 0.001 내지 0.05% (w/v), 0.001 내지 0.04% (w/v), 0.001 내지 0.02% (w/v), 0.005 내지 0.1% (w/v), 0.005 내지 0.09% (w/v), 0.005 내지 0.08% (w/v), 0.005 내지 0.07% (w/v), 0.005 내지 0.06% (w/v), 0.005 내지 0.05% (w/v), 0.005 내지 0.04% (w/v), 0.005 내지 0.03% (w/v), 0.005 내지 0.02% (w/v), 0.01 내지 0.09% (w/v), 0.01 내지 0.08% (w/v), 0.01 내지 0.07% (w/v), 0.01 내지 0.06% (w/v), 0.01 내지 0.05% (w/v), 0.01 내지 0.04% (w/v), 0.01 내지 0.03% (w/v), 0.01 내지 0.02% (w/v), 0.015 내지 0.09% (w/v), 0.015 내지 0.08% (w/v), 0.015 내지 0.07% (w/v), 0.015 내지 0.06% (w/v), 0.015 내지 0.05% (w/v), 0.015 내지 0.04% (w/v), 0.015 내지 0.03% (w/v), 또는 예컨대 0.015 내지 0.02% (w/v) 비-이온성 계면활성제를 포함할 수 있다.
특히, 제약 제제는 약 0.02% (w/v) 비-이온성 계면활성제, 예컨대 0.02% (w/v) 비-이온성 계면활성제를 포함할 수 있다.
비-이온성 계면활성제는 2-[2-[3,4-비스(2-히드록시에톡시)옥솔란-2-일]-2-(2-히드록시에톡시)에톡시]에틸 (E)-옥타데스-9-에노에이트 (폴리옥시에틸렌 (20) 소르비탄 모노올레에이트; 폴리소르베이트 80) 또는 2-[2-[3,4-비스(2-히드록시에톡시)옥솔란-2-일]-2-(2-히드록시에톡시)에톡시]에틸 도데카노에이트 (폴리옥시에틸렌 (20) 소르비탄 모노라우레이트; 폴리소르베이트 20)로부터 선택될 수 있다.
제약 제제는 pH 4.5 내지 6.5, 예컨대 4.7 내지 6.5, 예를 들어 4.9 내지 6.5, 5.1 내지 6.5, 5.3 내지 6.5, 4.5 내지 6.3, 4.7 내지 6.1, 4.7 내지 5.9, 4.7 내지 5.7, 5.1 내지 6.3, 4.7 내지 6.1, 4.7 내지 5.9, 4.7 내지 5.7, 4.9 내지 6.3, 4.9 내지 6.1, 4.9 내지 5.9, 4.9 내지 5.7, 5.1 내지 6.3, 5.1 내지 6.1, 5.1 내지 5.9, 5.1 내지 5.7, 5.3 내지 6.3, 5.3 내지 6.1, 5.3 내지 5.9, 예컨대 5.3 내지 5.7을 가질 수 있다.
현재 바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 제약 제제는 pH 약 5.5, 예컨대 pH 5.5를 갖는다.
제약 제제는 5 내지 200 mg/mL의 결합제, 예컨대 10 내지 200 mg/mL, 20 내지 200 mg/mL, 40 내지 200 mg/mL, 60 내지 200 mg/mL, 80 내지 200 mg/mL, 100 내지 200 mg/mL, 120 내지 200 mg/mL, 150 내지 200 mg/mL, 5 내지 150 mg/mL, 10 내지 150 mg/mL, 20 내지 150 mg/mL, 40 내지 150 mg/mL, 60 내지 150 mg/mL, 80 내지 150 mg/mL, 100 내지 150 mg/mL, 5 내지 130 mg/mL, 10 내지 130 mg/mL, 20 내지 130 mg/mL, 40 내지 130 mg/mL, 60 내지 130 mg/mL, 80 내지 130 mg/mL, 100 내지 130 mg/mL, 5 내지 100 mg/mL의 결합제, 10 내지 100 mg/mL, 15 내지 100 mg/mL, 20 내지 100 mg/mL, 30 내지 100 mg/mL, 40 내지 100 mg/mL, 50 내지 100 mg/mL, 60 내지 100 mg/mL, 5 내지 80 mg/mL, 5 내지 60 mg/mL, 5 내지 50 mg/mL, 5 내지 40 mg/mL, 5 내지 30 mg/mL, 5 내지 20 mg/mL, 10 내지 80 mg/mL, 10 내지 60 mg/mL, 10 내지 50 mg/mL, 10 내지 40 mg/mL, 10 내지 30 mg/mL, 15 내지 80 mg/mL, 15 내지 60 mg/mL, 15 내지 40 mg/mL, 또는 예컨대 15 내지 25 mg/mL의 결합제를 포함할 수 있다.
선행 청구항 중 어느 한 항에 따른 제약 제제에 있어서, 제제는
i) 약 20 mg/mL, 예컨대 약 40 mg/mL, 약 60 mg/mL, 약 80 mg/mL, 약 100 mg/mL, 약 120 mg/mL 또는 약 140 mg/mL의 결합제, 및
ii) 약 20 mM 히스티딘, 약 250 mM 당 및 약 0.02% (w/v) 비-이온성 계면활성제를 포함하고, pH 약 5.5를 갖는다.
특히, 본원에 제공된 제약 제제는 약 20 mg/mL의 결합제, 예컨대 20 mg/mL의 결합제를 포함할 수 있다.
제제는 특히 약 20 mg/mL의 결합제, 약 20 mM 히스티딘, 약 250 mM 당 및 약 0.02% (w/v) 비-이온성 계면활성제를 포함할 수 있고, pH 약 5.5를 갖는다.
제약 제제는
i) 20 mg/mL, 예컨대 40 mg/mL, 60 mg/mL, 80 mg/mL, 100 mg/mL, 120 mg/mL 또는 140 mg/mL의 결합제, 및
ii) 20 mM 히스티딘, 250 mM 당 및 0.02% (w/v) 비-이온성 계면활성제를 포함할 수 있고, pH 5.5를 갖는다.
현재 바람직한 한 실시양태에서, 본 발명에 따른 제약 제제는 20 mg/mL의 결합제, 20 mM 히스티딘, 250 mM 당 및 0.02% (w/v) 비-이온성 계면활성제를 포함하고, pH 5.5를 갖는다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 제약 제제는, -65℃에서 12시간 동안의 동결에 이어서 25℃에서 12시간 동안의 해동으로 이루어진 5회의 동결-해동 사이클에 적용된 후에, 2000 내지 3750 룩스의 강도의 조명에서 흑색 배경에 대해 및 백색 배경에 대해 수행된 가시적 입자 카운트에 의해 결정시, 가시적 입자가 본질적으로 없다.
제약 제제에 포함된 결합제는 특히 항체, 예컨대 이중특이적 항체일 수 있다.
상기 정의된 각각의 가변 영역은 3개의 상보성 결정 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3 및 4개의 프레임워크 영역 FR1, FR2, FR3 및 FR4를 포함할 수 있다.
제약 제제에서, 상기 상보성 결정 영역 및 상기 프레임워크 영역은 아미노-말단에서 카르복시-말단으로 하기 순서로 배열된다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4.
본 발명의 한 실시양태에서, 특히 항체, 예컨대 이중특이적 항체 형태의 결합제는 중쇄 가변 영역을 포함하고, 여기서 상보성 결정 영역 및 프레임워크 영역은 아미노-말단에서 카르복시-말단으로 하기 순서로 배열된다: HFR1, HCDR1, HFR2, HCDR2, HFR3, HCDR3, HFR4.
본 발명의 한 실시양태에서, 특히 항체, 예컨대 이중특이적 항체 형태의 결합제는 경쇄 가변 영역을 포함하고, 여기서 상보성 결정 영역 및 프레임워크 영역은 아미노-말단에서 카르복시-말단으로 하기 순서로 배열된다: LFR1, LCDR1, LFR2, LCDR2, LFR3, LCDR3, LFR4.
제약 제제에서,
- 제1 항원 결합 영역은 각각 서열식별번호: 9, 10, 11에 제시된 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 제1 중쇄 가변 영역 (VH), 및 각각 서열식별번호: 13, GAS 및 서열식별번호: 14에 제시된 바와 같은 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 제1 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함할 수 있고,
- 제2 항원-결합 영역은 각각 서열식별번호: 18, 19 및 20에 제시된 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 제2 중쇄 가변 영역 (VH), 및 각각 서열식별번호: 22, DDN 및 서열식별번호: 23에 제시된 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 제2 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함할 수 있다.
본 발명은 또한 항체가 본 출원의 실시예에 개시된 바와 같은 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 것인 제제를 제공한다. 또한, 실시예에 개시된 VL 영역, VH 영역의 기능적 변이체를 포함하는 항체의 제제가 제공된다. 항체와 관련하여 사용되는 VL 또는 VH의 기능적 변이체는 여전히 항체가 "참조" 또는 "모" 항체의 친화도 및/또는 특이성/선택성을 적어도 실질적인 비율 (적어도 약 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 그 초과)로 보유하도록 하고, 일부 경우에 이러한 항체는 모 항체보다 더 큰 친화도, 선택성 및/또는 특이성과 연관될 수 있다. 이러한 기능적 변이체는 전형적으로 모 항체에 대한 유의한 서열 동일성을 보유한다.
따라서, 본 발명에 따른 제약 제제는
- 제1 항원 결합 영역이 서열식별번호: 15에 제시된 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 제1 중쇄 가변 영역 (VH); 및 서열식별번호: 16에 제시된 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 제1 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함하고;
- 제2 항원-결합 영역이 서열식별번호 17에 제시된 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 제2 중쇄 가변 영역 (VH); 및 서열식별번호 21에 제시된 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 제2 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함하는 것일 수 있다.
추가로, 본 개시내용에 따른 제약 제제는
- 제1 항원 결합 영역이 각각 서열식별번호: 9, 10 및 11에 제시된 바와 같은 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하고, 서열식별번호: 15에 제시된 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 제1 중쇄 가변 영역 (VH); 및 각각 서열식별번호: 13, GAS 및 서열식별번호: 14에 제시된 바와 같은 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하고, 서열식별번호: 16에 제시된 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 제1 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함하고,
- 제2 항원-결합 영역이 각각 서열식별번호: 18, 19 및 20에 제시된 바와 같은 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하고, 서열식별번호: 17에 제시된 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 제2 중쇄 가변 영역 (VH); 및 각각 서열식별번호: 22, DDN, 23에 제시된 바와 같은 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하고, 서열식별번호: 21에 제시된 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 제2 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함하는 것일 수 있다.
본 발명에 따른 제약 제제는
a. 인간 CD137에 결합하는 상기 제1 항원-결합 영역이
- 서열식별번호: 15에 제시된 서열 또는 서열식별번호: 15에 제시된 서열과 비교하여 20개 이하의 아미노산 잔기, 예컨대 19개 이하, 18개 이하, 17개 이하, 16개 이하, 15개 이하, 14개 이하, 13개 이하, 12개 이하, 11개 이하, 10개 이하, 9개 이하, 8개 이하, 7개 이하, 6개 이하, 5개 이하, 4개 이하, 3개 이하, 2개 이하, 1개 이하의 아미노산 잔기가 변형된 서열을 포함하고, 각각 서열식별번호: 9, 10 및 11에 제시된 바와 같은 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 제1 중쇄 가변 영역 (VH); 및
- 서열식별번호: 16에 제시된 서열 또는 서열식별번호: 16에 제시된 서열과 비교하여 20개 이하의 아미노산 잔기, 예컨대 19개 이하, 18개 이하, 17개 이하, 16개 이하, 15개 이하, 14개 이하, 13개 이하, 12개 이하, 11개 이하, 10개 이하, 9개 이하, 8개 이하, 7개 이하, 6개 이하, 5개 이하, 4개 이하, 3개 이하, 2개 이하, 1개 이하의 아미노산 잔기가 변형된 서열을 포함하고, 각각 서열식별번호: 13, GAS 및 서열식별번호: 14에 제시된 바와 같은 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 제1 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함하고;
b. 인간 PD-L1에 결합하는 상기 제2 항원-결합 영역이
- 서열식별번호: 17에 제시된 서열 또는 서열식별번호: 17에 제시된 서열과 비교하여 20개 이하의 아미노산 잔기, 예컨대 19개 이하, 18개 이하, 17개 이하, 16개 이하, 15개 이하, 14개 이하, 13개 이하, 12개 이하, 11개 이하, 10개 이하, 9개 이하, 8개 이하, 7개 이하, 6개 이하, 5개 이하, 4개 이하, 3개 이하, 2개 이하, 1개 이하의 아미노산 잔기가 변형된 서열을 포함하고, 각각 서열식별번호: 18, 19 및 20에 제시된 바와 같은 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 제2 중쇄 가변 영역 (VH); 및
- 서열식별번호: 21에 제시된 서열 또는 서열식별번호: 21에 제시된 서열과 비교하여 20개 이하의 아미노산 잔기, 예컨대 19개 이하, 18개 이하, 17개 이하, 16개 이하, 15개 이하, 14개 이하, 13개 이하, 12개 이하, 11개 이하, 10개 이하, 9개 이하, 8개 이하, 7개 이하, 6개 이하, 5개 이하, 4개 이하, 3개 이하, 2개 이하, 1개 이하의 아미노산 잔기가 변형된 서열을 포함하고, 각각 서열식별번호: 22, DDN 및 서열식별번호: 23에 제시된 바와 같은 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 제2 경쇄 가변 영역 (VH)을 포함하는 것일 수 있다.
특정한 실시양태에서, 상기 언급된 아미노산 잔기의 변형(들)은 아미노산 치환, 예컨대 보존적 아미노산 치환일 수 있다. 본 개시내용에 포함된 아미노산 잔기의 다른 변형은 1개 이상의 아미노산의 결실뿐만 아니라 1개 이상의 아미노산 잔기의 부가 및/또는 삽입을 포함한다.
본 개시내용은 추가로 제약 제제를 제공하며, 여기서 상기 결합제는 (i) 상기 제1 중쇄 가변 영역 (VH)을 포함하고 제1 중쇄 불변 영역 (CH)을 추가로 포함하는 폴리펩티드 및 (ii) 상기 제2 중쇄 가변 영역 (VH)을 포함하고 제2 중쇄 불변 영역 (CH)을 추가로 포함하는 폴리펩티드를 포함한다.
본원에 개시된 바와 같은 제약 조성물은 (i) 상기 제1 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함하고 제1 경쇄 불변 영역 (CL)을 추가로 포함하는 폴리펩티드 및 (ii) 상기 제2 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함하고 제2 경쇄 불변 영역 (CL)을 추가로 포함하는 폴리펩티드를 포함할 수 있다.
제약 제제는 제1 결합 아암 및 제2 결합 아암을 포함하는 결합제, 예컨대 항체를 포함할 수 있으며, 여기서
a. 제1 결합 아암은 i) 상기 제1 중쇄 가변 영역 (VH) 및 상기 제1 중쇄 불변 영역 (CH)을 포함하는 폴리펩티드 및 ii) 상기 제1 경쇄 가변 영역 (VL) 및 상기 제1 경쇄 불변 영역 (CL)을 포함하는 폴리펩티드를 포함하고;
b. 제2 결합 아암은 i) 상기 제2 중쇄 가변 영역 (VH) 및 상기 제2 중쇄 불변 영역 (CH)을 포함하는 폴리펩티드 및 ii) 상기 제2 경쇄 가변 영역 (VL) 및 상기 제2 경쇄 불변 영역 (CL)을 포함하는 폴리펩티드를 포함한다.
본 발명의 특정한 실시양태에서, 제1 항원-결합 영역은 서열식별번호: 30에 제시된 바와 같은 인간 CD137 또는 그의 성숙 폴리펩티드에 결합한다.
제1 항원-결합 영역은 또한 서열식별번호: 31에 제시된 바와 같은 시노몰구스 원숭이 (마카카 파시쿨라리스) CD137 또는 그의 성숙 폴리펩티드에 결합할 수 있다. 인간 및 시노몰구스 원숭이 CD137 둘 다에 대해 교차-특이적인 항원 결합 영역으로 인해 제약 제제 중의 결합제가 시노몰구스 원숭이에서의 전임상 시험에 적합하게 된다.
본 개시내용에 따른 제약 제제에서, 제2 항원-결합 영역은 바람직하게는 서열식별번호: 28에 제시된 바와 같은 인간 PD-L1 또는 그의 성숙 폴리펩티드에 결합한다.
제2 항원-결합 영역은 또한 서열식별번호: 29에 제시된 바와 같은 시노몰구스 원숭이 (마카카 파시쿨라리스) PD-L1 또는 그의 성숙 폴리펩티드에 결합할 수 있다.
추가로, 제2 항원-결합 영역은 인간 PD-1에 대한 인간 PD-L1의 결합을 억제할 수 있다. 이는 결합제가 PD-L1이 PD-1을 통해 항종양 면역을 방해하는 것을 방지할 수 있기 때문에 관심대상이다. 따라서, 결합제는 T 세포가 PD-1/PD-L1 상호작용을 통해 억제 신호를 받는 것을 방지하면서, CD137 분자에 대한 결합을 통해 활성화 신호를 받아 T 세포 증식, 활성화, 이펙터 및 기억 기능을 강화시키는 신호전달을 유발할 수 있다.
결합제는 전장 항체 또는 항체 단편의 포맷일 수 있다.
특히, 결합제, 예컨대 항체는 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4로 이루어진 군으로부터 선택된 이소형의 것일 수 있다.
본 개시내용에 따르면, 결합제는 전장 IgG1 항체이다.
다양한 실시양태에서, 항체는 IgG1 항체, 보다 특히 IgG1, 카파 또는 IgG1, 람다 이소형 (즉 IgG1, κ, λ), IgG2a 항체 (예를 들어 IgG2a, κ, λ), IgG2b 항체 (예를 들어 IgG2b, κ, λ), IgG3 항체 (예를 들어 IgG3, κ, λ) 또는 IgG4 항체 (예를 들어 IgG4, κ, λ)이다.
본 개시내용에 따른 제약 제제에서,
a. CD137에 결합하는 제1 항원-결합 영역은 키메라 항체로부터 유래될 수 있고/거나,
b. 인간 PD-L1에 결합하는 제2 항원-결합 영역은 키메라 항체로부터 유래될 수 있다.
대안적으로, 상기 개시내용에 따른 제약 제제에서,
a. CD137에 결합하는 제1 항원-결합 영역은 인간화 항체로부터 유래될 수 있고/거나,
b. 인간 PD-L1에 결합하는 제2 항원-결합 영역은 인간화 항체로부터 유래될 수 있다.
또 다른 대안으로서,
a. 인간 CD137에 결합하는 제1 항원-결합 영역은 인간 항체로부터 유래될 수 있고/거나,
b. 인간 PD-L1에 결합하는 제2 항원-결합 영역은 인간 항체로부터 유래될 수 있다.
추가의 대안에서,
a. 인간 CD137에 결합하는 제1 항원-결합 영역은 인간화 항체로부터 유래될 수 있고/거나,
b. 인간 PD-L1에 결합하는 제2 항원-결합 영역은 인간 항체로부터 유래될 수 있다.
제1 항원-결합 영역은 특히 토끼 항체로부터 유래될 수 있다. 제1 항원-결합 영역은 추가로 인간화 항체로부터 유래될 수 있다. 또한, 제1 결합 아암은 전장 항체로부터 유래될 수 있다. 본 발명의 한 실시양태에서, 제1 결합 아암은 모노클로날 항체로부터 유래된다. 제1 결합 아암은 전장 IgG1, λ (람다) 또는 IgG1, κ (카파) 항체로부터 유래될 수 있다.
제2 항원-결합 영역은 래트 항체로부터 유래될 수 있다. 본 발명의 한 실시양태에서, 제2 항원-결합 영역은 인간이다. 대안적으로, 제2 항원-결합 영역은 인간화 항체로부터 유래될 수 있다. 또한, 제2 결합 아암은 전장 항체로부터 유래될 수 있다. 본 발명의 한 실시양태에서, 제2 결합 아암은 모노클로날 항체로부터 유래된다. 본 발명의 한 실시양태에서, 제2 결합 아암은 전장 IgG1, λ (람다) 또는 IgG1, κ (카파) 항체로부터 유래된다. 제1 및 제2 항원-결합 영역은 인간화 항체로부터 유래될 수 있다. 제1 및 제2 항원-결합 영역은 인간 항체일 수 있다. 제1 및 제2 결합 아암은 전장 항체, 예컨대 전장 IgG1, λ (람다) 또는 IgG1, κ (카파) 항체로부터 유래될 수 있다. 제1 및 제2 결합 아암은 모노클로날 항체로부터 유래될 수 있다.
본 발명의 한 실시양태에서, 제1 항원 결합 영역은 IgG1 람다로부터 유래되고, 제2 항원 결합 영역은 IgG1 카파로부터 유래된다.
이중특이적 항체의 많은 상이한 포맷 및 용도가 관련 기술분야에 공지되어 있고, 문헌 [Kontermann; Drug Discov Today, 2015 Jul;20(7):838-47 및; MAbs, 2012 Mar-Apr;4(2):182-97]에서 검토되었다.
결합제가 이중특이적 항체인 본 발명의 실시양태에서, 본 개시내용은 임의의 특정한 이중특이적 포맷 또는 그의 생산 방법에 제한되지 않는다.
본 발명에 사용될 수 있는 이중특이적 항체 분자의 예는 (i) 상이한 항원-결합 영역을 포함하는 2개의 아암을 갖는 단일 항체; (ii) 예를 들어 여분의 펩티드 링커에 의해 탠덤으로 연결된 2개의 scFv를 통해 2개의 상이한 에피토프에 대한 특이성을 갖는 단일 쇄 항체; (iii) 각각의 경쇄 및 중쇄가 짧은 펩티드 연결을 통해 탠덤으로 2개의 가변 도메인을 함유하는 것인 이중-가변-도메인 항체 (DVD-Ig) (Wu et al., Generation and Characterization of a Dual Variable Domain Immunoglobulin (DVD-Ig™) Molecule, In: Antibody Engineering, Springer Berlin Heidelberg (2010)); (iv) 화학적으로-연결된 이중특이적 (Fab')2 단편; (v) 각각의 표적 항원에 대한 2개의 결합 부위를 갖는 4가 이중특이적 항체를 생성하는 2개의 단일 쇄 디아바디의 융합체인 탠드ab; (vi) 다가 분자를 생성하는 디아바디와 scFv의 조합인 플렉시바디; (vii) Fab에 적용될 때 상이한 Fab 단편에 연결된 2개의 동일한 Fab 단편으로 이루어진 3가 이중특이적 결합 단백질을 생성할 수 있는, 단백질 키나제 A에서의 "이량체화 및 도킹 도메인"에 기초한 소위 "독 앤 락" 분자; (viii) 예를 들어 인간 Fab-아암의 두 말단에 융합된 2개의 scFv를 포함하는 소위 스콜피온 분자; 및 (ix) 디아바디를 포함한다.
본 발명의 결합제는, 예를 들어 디아바디 또는 크로스-바디일 수 있다.
한 실시양태에서, 본 발명의 결합제는 제어된 Fab-아암 교환을 통해 수득된 이중특이적 항체이다 (예컨대 WO2011131746 (젠맙)에 기재된 바와 같음).
본 발명의 내용에 적용가능할 수 있는 결합제의 상이한 부류의 예는 하기를 포함하나 이에 제한되지는 않는다: (i) 이종이량체화를 강제하는 상보적 CH3 도메인을 갖는 IgG-유사 분자; (ii) 트리오맙/쿼드로마 분자 (트리온 파마/프레제니우스 바이오테크; 로슈, WO2011069104), 소위 노브-인투-홀 분자 (제넨테크, WO9850431), 크로스맙 (로슈, WO2011117329) 및 정전기적으로-매칭된 분자 (암젠, EP1870459 및 WO2009089004; 츄가이, US201000155133; 온코메드, WO2010129304), LUZ-Y 분자 (제넨테크, 문헌 [Wranik et al. J. Biol. Chem. 2012, 287(52): 43331-9, doi: 10.1074/jbc.M112.397869. Epub 2012 Nov 1]), DIG-바디 및 PIG-바디 분자 (파맙신, WO2010134666, WO2014081202), 가닥 교환 조작된 도메인 바디 (시드바디) 분자 (이엠디 세로노, WO2007110205), 비클로닉스 분자 (메루스, WO2013157953), FcΔAdp 분자 (레게네론, WO201015792), 이중특이적 IgG1 및 IgG2 분자 (화이자/리나트, WO11143545), 아지메트릭 스캐폴드 분자 (자임웍스/머크, WO2012058768), mAb-Fv 분자 (젠코르, WO2011028952), 2가 이중특이적 항체 (WO2009080254) 및 듀오바디® 분자 (젠맙, WO2011131746)를 포함하나 이에 제한되지는 않는 재조합 분자.
재조합 IgG-유사 이중 표적화 분자의 예는 이중 표적화 (DT)-Ig 분자 (WO2009058383), 투-인-원 항체 (제넨테크; 문헌 [Bostrom, et al. 2009. Science 323, 1610-1614.]), 가교된 Mab (카르마노스 캔서 센터), mAb2 (에프-스타, WO2008003116), 지바디 분자 (진제니아; 문헌 [LaFleur et al. MAbs. 2013 Mar-Apr;5(2):208-18]), 공통 경쇄를 사용한 접근법 (크루셀(Crucell)/메루스, US7,262,028), κλ바디 (노브이뮨, WO2012023053) 및 CovX-바디 (CovX/화이자; 문헌 [Doppalapudi, V.R., et al. 2007. Bioorg. Med. Chem. Lett. 17,501-506.])를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
IgG 융합 분자의 예는 이중 가변 도메인 (DVD)-Ig 분자 (애보트, US7,612,181), 이중 도메인 이중 머리 항체 (유니레버; 사노피 아벤티스, WO20100226923), IgG-유사 이중특이적 분자 (임클론/일라이 릴리, 문헌 [Lewis et al. Nat Biotechnol. 2014 Feb;32(2):191-8]), Ts2Ab (메드이뮨/AZ; 문헌 [Dimasi et al. J Mol Biol. 2009 Oct 30;393(3):672-92]) 및 BsAb 분자 (지모제네틱스, WO2010111625), 허큘레스 분자 (비오젠 아이덱, US007951918), scFv 융합 분자 (노파르티스), scFv 융합 분자 (창저우 아담 바이오테크 인크, CN 102250246) 및 TvAb 분자 (로슈, WO2012025525, WO2012025530)를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
Fc 융합 분자의 예는 ScFv/Fc 융합체 (Pearce et al., Biochem Mol Biol Int. 1997 Sep;42(6):1179-88), 스콜피온 분자 (에멀전트 바이오솔루션즈/트루비온, 문헌 [Blankenship JW, et al. AACR 100th Annual meeting 2009 (Abstract # 5465)]; 지모제네틱스/BMS, WO2010111625), 이중 친화도 재표적화 기술 (Fc-DART) 분자 (마크로제닉스, WO2008157379, WO2010080538) 및 이중(ScFv)2-Fab 분자 (국립 항체 의약 연구 센터 - 중국)를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
Fab 융합 이중특이적 항체의 예는 F(ab)2 분자 (메다렉스(Medarex)/암젠; 문헌 [Deo et al. J Immunol. 1998 Feb 15;160(4):1677-86.]), 이중-작용 또는 비스-Fab 분자 (제넨테크, 문헌 [Bostrom, et al. 2009. Science 323, 1610-1614.]), 독-앤-락 (DNL) 분자 (이뮤노메딕스(ImmunoMedics), WO2003074569, WO2005004809), 2가 이중특이적 분자 (바이오테크놀(Biotecnol), 문헌 [Schoonjans, J Immunol. 2000 Dec 15;165(12):7050-7.]) 및 Fab-Fv 분자 (유씨비-셀테크(UCB-Celltech), WO 2009040562 A1)를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
ScFv-, 디아바디-기반 및 도메인 항체의 예는 이중특이적 T 세포 연관체 (BiTE) 분자 (마이크로메트(Micromet), WO2005061547), 탠덤 디아바디 분자 (탠드Ab) (아피메드(Affimed), 문헌 [Le Gall et al., Protein Eng Des Sel. 2004 Apr;17(4):357-66.]), 이중 친화도 재표적화 기술 (DART) 분자 (마크로제닉스, WO2008157379, WO2010080538), 단일-쇄 디아바디 분자 (로렌스(Lawrence), 문헌 [FEBS Lett. 1998 Apr 3;425(3):479-84]), TCR-유사 항체 (AIT, 리셉터로직스(ReceptorLogics)), 인간 혈청 알부민 ScFv 융합체 (메리맥(Merrimack), WO2010059315) 및 콤바디(COMBODY) 분자 (에피겐 바이오테크(Epigen Biotech), 문헌 [Zhu et al. Immunol Cell Biol. 2010 Aug;88(6):667-75.]), 이중 표적화 나노바디 (아블링스(Ablynx), 문헌 [Hmila et al., FASEB J. 2010]), 및 이중 표적화 중쇄 단독 도메인 항체를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
각각의 제1 및 제2 중쇄 불변 영역 (CH)은 불변 영역 도메인 1 영역 (CH1 영역), 힌지 영역, CH2 영역 및 CH3 영역, 바람직하게는 적어도 힌지 영역, CH2 영역 및 CH3 영역 중 1개 이상을 포함할 수 있다.
본 개시내용의 결합제, 예컨대 이중특이적 항체는 제1 CH3 영역을 포함하는 제1 Fc 서열 및 제2 CH3 영역을 포함하는 제2 Fc 서열을 포함할 수 있으며, 여기서 제1 및 제2 CH3 영역의 서열은 상이하고, 상기 제1 및 제2 CH3 영역 사이의 이종이량체 상호작용이 상기 제1 및 제2 CH3 영역의 각각의 동종이량체 상호작용보다 더 강하도록 한다. 이들 상호작용 및 이를 달성할 수 있는 방법에 관한 보다 상세한 사항은 본원에 참조로 포함되는 WO2011131746 및 WO2013060867 (젠맙)에 제공된다.
본원에 추가로 기재된 바와 같이, 안정한 이중특이적 PD-L1xCD137 항체는 CH3 영역 내에 단지 소수의 보존적인 비대칭 돌연변이를 함유하는 하나의 동종이량체 출발 PD-L1 항체와 하나의 동종이량체 출발 CD137 항체를 기초로 한 특정한 방법을 사용하여 고수율로 수득될 수 있다. 비대칭 돌연변이는 상기 제1 및 제2 CH3 영역의 서열이 동일하지 않은 위치에서의 아미노산 치환을 함유하는 것을 의미한다.
따라서, 본 발명의 한 실시양태에서, 각각의 제1 및 제2 중쇄 불변 영역 (CH)은 CH3 영역을 포함하고, 2개의 CH3 영역은 비대칭 돌연변이를 포함한다.
본 개시내용에 따른 제약 제제에서, 상기 제1 중쇄 불변 영역 (CH)에서 EU 넘버링에 따른 인간 IgG1 중쇄 내의 T366, L368, K370, D399, F405, Y407 및 K409로 이루어진 군으로부터 선택된 위치에 상응하는 위치에서의 아미노산 중 적어도 1개가 치환되고, 상기 제2 중쇄 불변 영역 (CH)에서 EU 넘버링에 따른 인간 IgG1 중쇄 내의 T366, L368, K370, D399, F405, Y407 및 K409로 이루어진 군으로부터 선택된 위치에 상응하는 위치에서의 아미노산 중 적어도 1개가 치환되고, 상기 제1 및 상기 제2 중쇄가 동일한 위치에서 치환되지는 않는 것인 결합제를 포함할 수 있다.
본원에 개시된 제약 제제는 (i) EU 넘버링에 따른 인간 IgG1 중쇄 내의 F405에 상응하는 위치에서의 아미노산이 상기 제1 중쇄 불변 영역 (CH)에서 L이고, EU 넘버링에 따른 인간 IgG1 중쇄 내의 K409에 상응하는 위치에서의 아미노산이 상기 제2 중쇄 불변 영역 (CH)에서 R이거나, 또는 (ii) EU 넘버링에 따른 인간 IgG1 중쇄 내의 K409에 상응하는 위치에서의 아미노산이 상기 제1 중쇄에서 R이고, EU 넘버링에 따른 인간 IgG1 중쇄 내의 F405에 상응하는 위치에서의 아미노산이 상기 제2 중쇄에서 L인 결합제를 포함할 수 있다.
본원에 개시된 이중특이적 항체는 인간 IgG1 중쇄 내의 위치 366에서의 아미노산 치환을 갖는 제1 CH3 영역 및 인간 IgG1 중쇄 내의 368, 370, 399, 405, 407 및 409로 이루어진 군으로부터 선택된 위치에서의 아미노산 치환을 갖는 제2 CH3 영역을 포함할 수 있다. 인간 IgG1 중쇄 내의 위치 366에서의 아미노산은 Ala, Asp, Glu, His, Asn, Val 또는 Gln으로부터 선택될 수 있다.
본원에 개시된 이중특이적 항체는 인간 IgG1 중쇄 내의 위치 368에서의 아미노산 치환을 갖는 제1 CH3 영역 및 인간 IgG1 중쇄 내의 366, 370, 399, 405, 407 및 409로 이루어진 군으로부터 선택된 위치에서의 아미노산 치환을 갖는 제2 CH3 영역을 포함할 수 있다.
본원에 개시된 이중특이적 항체는 인간 IgG1 중쇄 내의 위치 370에서의 아미노산 치환을 갖는 제1 CH3 영역 및 인간 IgG1 중쇄 내의 366, 368, 399, 405, 407 및 409로 이루어진 군으로부터 선택된 위치에서의 아미노산 치환을 갖는 제2 CH3 영역을 포함할 수 있다.
본원에 개시된 이중특이적 항체는 인간 IgG1 중쇄 내의 위치 399에서의 아미노산 치환을 갖는 제1 CH3 영역 및 인간 IgG1 중쇄 내의 366, 368, 370, 405, 407 및 409로 이루어진 군으로부터 선택된 위치에서의 아미노산 치환을 갖는 제2 CH3 영역을 포함할 수 있다.
본원에 개시된 이중특이적 항체는 인간 IgG1 중쇄 내의 위치 405에서의 아미노산 치환을 갖는 제1 CH3 영역 및 인간 IgG1 중쇄 내의 366, 368, 370, 399, 407 및 409로 이루어진 군으로부터 선택된 위치에서의 아미노산 치환을 갖는 제2 CH3 영역을 포함할 수 있다.
본원에 개시된 이중특이적 항체는 인간 IgG1 중쇄 내의 위치 407에서의 아미노산 치환을 갖는 제1 CH3 영역 및 인간 IgG1 중쇄 내의 366, 368, 370, 399, 405 및 409로 이루어진 군으로부터 선택된 위치에서의 아미노산 치환을 갖는 제2 CH3 영역을 포함할 수 있다.
본원에 개시된 이중특이적 항체는 인간 IgG1 중쇄 내의 위치 409에서의 아미노산 치환을 갖는 제1 CH3 영역 및 인간 IgG1 중쇄 내의 366, 368, 370, 399, 405 및 407로 이루어진 군으로부터 선택된 위치에서의 아미노산 치환을 갖는 제2 CH3 영역을 포함할 수 있다.
따라서, 본원에 개시된 이중특이적 항체는 상기 제1 및 제2 CH3 영역의 서열을 포함할 수 있고, 이는 비대칭 돌연변이, 즉 2개의 CH3 영역 내의 상이한 위치에서의 돌연변이, 예를 들어 CH3 영역 중 하나 내의 위치 405에서의 돌연변이 및 다른 CH3 영역 내의 위치 409에서의 돌연변이를 함유한다.
본원에 개시된 이중특이적 항체는 제1 CH3 영역이 위치 409에서 Lys, Leu 또는 Met 이외의 다른 아미노산, 예를 들어 Gly, Ala, Val, Ile, Ser, Thr, Phe, Arg, His, Asp, Asn, Glu, Gln, Pro, Trp, Tyr 또는 Cys를 갖고, 상기 제2 CH3 영역이 366, 368, 370, 399, 405 및 407로 이루어진 군으로부터 선택된 위치에서의 아미노산 치환을 갖는 것인 항체일 수 있다. 제1 CH3 영역은 위치 409에서 Lys, Leu 또는 Met 이외의 다른 아미노산, 예를 들어 Gly, Ala, Val, Ile, Ser, Thr, Phe, Arg, His, Asp, Asn, Glu, Gln, Pro, Trp, Tyr 또는 Cys를 가질 수 있고, 상기 제2 CH3 영역은 위치 405에서 Phe 이외의 다른 아미노산, 예를 들어 Gly, Ala, Val, Ile, Ser, Thr, Lys, Arg, His, Asp, Asn, Glu, Gln, Pro, Trp, Tyr, Cys, Lys 또는 Leu를 가질 수 있다. 그의 추가 실시양태에서, 상기 제1 CH3 영역은 위치 409에서 Lys, Leu 또는 Met 이외의 다른 아미노산, 예를 들어 Gly, Ala, Val, Ile, Ser, Thr, Phe, Arg, His, Asp, Asn, Glu, Gln, Pro, Trp, Tyr 또는 Cys를 가질 수 있고, 상기 제2 CH3 영역은 위치 405에서 Phe, Arg 또는 Gly 이외의 다른 아미노산, 예를 들어 Leu, Ala, Val, Ile, Ser, Thr, Met, Lys, His, Asp, Asn, Glu, Gln, Pro, Trp, Tyr 또는 Cys를 가질 수 있다.
본원에 개시된 이중특이적 항체는 상기 제1 CH3 영역이 위치 405에서 Phe 및 위치 409에서 Lys, Leu 또는 Met 이외의 다른 아미노산, 예를 들어 Gly, Ala, Val, Ile, Ser, Thr, Phe, Arg, His, Asp, Asn, Glu, Gln, Pro, Trp, Tyr 또는 Cys를 포함하고, 상기 제2 CH3 영역이 위치 405에서 Phe 이외의 다른 아미노산, 예를 들어 Gly, Ala, Val, Ile, Ser, Thr, Lys, Arg, His, Asp, Asn, Glu, Gln, Pro, Trp, Tyr, Leu, Met 또는 Cys 및 위치 409에서 Lys를 포함하는 것인 항체일 수 있다. 제1 CH3 영역은 위치 405에서 Phe 및 위치 409에서 Lys, Leu 또는 Met 이외의 다른 아미노산, 예를 들어 Gly, Ala, Val, Ile, Ser, Thr, Phe, Arg, His, Asp, Asn, Glu, Gln, Pro, Trp, Tyr 또는 Cys를 포함할 수 있고, 제2 CH3 영역은 위치 405에서 Phe, Arg 또는 Gly 이외의 다른 아미노산, 예를 들어 Leu, Ala, Val, Ile, Ser, Thr, Met, Lys, His, Asp, Asn, Glu, Gln, Pro, Trp, Tyr 또는 Cys 및 위치 409에서 Lys를 포함할 수 있다.
본원에 개시된 이중특이적 항체는 상기 제1 CH3 영역이 위치 405에서 Phe 및 위치 409에서 Lys, Leu 또는 Met 이외의 다른 아미노산, 예를 들어 Gly, Ala, Val, Ile, Ser, Thr, Phe, Arg, His, Asp, Asn, Glu, Gln, Pro, Trp, Tyr 또는 Cys를 포함하고, 상기 제2 CH3 영역이 위치 405에서 Leu 및 위치 409에서 Lys를 포함하는 것인 항체일 수 있다. 제1 CH3 영역은 위치 405에서 Phe 및 위치 409에서 Arg를 포함할 수 있고, 상기 제2 CH3 영역은 위치 405에서 Phe, Arg 또는 Gly 이외의 다른 아미노산, 예를 들어 Leu, Ala, Val, Ile, Ser, Thr, Lys, Met, His, Asp, Asn, Glu, Gln, Pro, Trp, Tyr 또는 Cys 및 위치 409에서 Lys를 포함한다. 제1 CH3 영역은 위치 405에서 Phe 및 위치 409에서 Arg를 포함할 수 있고, 상기 제2 CH3 영역은 위치 405에서 Leu 및 위치 409에서 Lys를 포함한다.
본원에 개시된 이중특이적 항체는 상기 제1 CH3 영역이 위치 409에서 Lys, Leu 또는 Met 이외의 다른 아미노산, 예를 들어 Gly, Ala, Val, Ile, Ser, Thr, Phe, Arg, His, Asp, Asn, Glu, Gln, Pro, Trp, Tyr 또는 Cys를 포함하고, 상기 제2 CH3 영역이 위치 409에서 Lys, 위치 370에서 Thr 및 위치 405에서 Leu를 포함하는 것인 항체일 수 있다. 제1 CH3 영역은 위치 409에서 Arg를 포함할 수 있고, 상기 제2 CH3 영역은 위치 409에서 Lys, 위치 370에서 Thr 및 위치 405에서 Leu를 포함할 수 있다.
본원에 개시된 이중특이적 항체는 상기 제1 CH3 영역이 위치 370에서 Lys, 위치 405에서 Phe 및 위치 409에서 Arg를 포함하고, 상기 제2 CH3 영역이 위치 409에서 Lys, 위치 370에서 Thr 및 위치 405에서 Leu를 포함하는 것인 항체일 수 있다.
본원에 개시된 이중특이적 항체는 상기 제1 CH3 영역이 위치 409에서 Lys, Leu 또는 Met 이외의 다른 아미노산, 예를 들어 Gly, Ala, Val, Ile, Ser, Thr, Phe, Arg, His, Asp, Asn, Glu, Gln, Pro, Trp, Tyr 또는 Cys를 포함하고, 상기 제2 CH3 영역이 위치 409에서 Lys 및 a) 위치 350에서 Ile 및 위치 405에서 Leu 또는 b) 위치 370에서 Thr 및 위치 405에서 Leu를 포함하는 것인 항체일 수 있다.
본원에 개시된 이중특이적 항체는 상기 제1 CH3 영역이 위치 409에서 Arg를 포함하고, 상기 제2 CH3 영역이 위치 409에서 Lys 및 a) 위치 350에서 Ile 및 위치 405에서 Leu 또는 b) 위치 370에서 Thr 및 위치 405에서 Leu를 포함하는 것인 항체일 수 있다.
본원에 개시된 이중특이적 항체는 상기 제1 CH3 영역이 위치 350에서 Thr, 위치 370에서 Lys, 위치 405에서 Phe 및 위치 409에서 Arg를 포함하고, 상기 제2 CH3 영역이 위치 409에서 Lys 및 a) 위치 350에서 Ile 및 위치 405에서 Leu 또는 b) 위치 370에서 Thr 및 위치 405에서 Leu를 포함하는 것인 항체일 수 있다.
본원에 개시된 이중특이적 항체는 상기 제1 CH3 영역이 위치 350에서 Thr, 위치 370에서 Lys, 위치 405에서 Phe 및 위치 409에서 Arg를 포함하고, 상기 제2 CH3 영역이 위치 350에서 Ile, 위치 370에서 Thr, 위치 405에서 Leu 및 위치 409에서 Lys를 포함하는 것인 항체일 수 있다.
본원에 개시된 이중특이적 항체는 상기 제1 CH3 영역이 위치 409에서 Lys, Leu 또는 Met 이외의 다른 아미노산을 갖고, 상기 제2 CH3 영역이 위치 405에서 Phe 이외의 다른, 예컨대 위치 405에서 Phe, Arg 또는 Gly 이외의 다른 아미노산을 갖거나; 또는 상기 제1 CH3 영역이 위치 409에서 Lys, Leu 또는 Met 이외의 다른 아미노산을 갖고, 상기 제2 CH3 영역이 위치 407에서 Tyr, Asp, Glu, Phe, Lys, Gln, Arg, Ser 또는 Thr 이외의 다른 아미노산을 갖는 것인 항체일 수 있다.
본원에 개시된 이중특이적 항체는 위치 409에서 Lys, Leu 또는 Met 이외의 다른 아미노산을 갖는 제1 CH3 영역 및 위치 407에서 Tyr, Asp, Glu, Phe, Lys, Gln, Arg, Ser 또는 Thr 이외의 다른 아미노산을 갖는 제2 CH3 영역을 포함할 수 있다.
본원에 개시된 이중특이적 항체는 위치 407에서 Tyr 및 위치 409에서 Lys, Leu 또는 Met 이외의 다른 아미노산을 갖는 제1 CH3 영역 및 위치 407에서 Tyr, Asp, Glu, Phe, Lys, Gln, Arg, Ser 또는 Thr 이외의 다른 아미노산 및 위치 409에서 Lys를 갖는 제2 CH3 영역을 포함할 수 있다.
본원에 개시된 이중특이적 항체는 위치 407에서 Tyr 및 위치 409에서 Arg를 갖는 제1 CH3 영역 및 위치 407에서 Tyr, Asp, Glu, Phe, Lys, Gln, Arg, Ser 또는 Thr 이외의 다른 아미노산 및 위치 409에서 Lys를 갖는 제2 CH3 영역을 포함할 수 있다.
상기 제1 CH3 영역은 위치 409에서 Lys, Leu 또는 Met 이외의 다른 아미노산, 예를 들어 Gly, Ala, Val, Ile, Ser, Thr, Phe, Arg, His, Asp, Asn, Glu, Gln, Pro, Trp, Tyr 또는 Cys를 가질 수 있고, 상기 제2 CH3 영역은 위치 407에서 Tyr, Asp, Glu, Phe, Lys, Gln, Arg, Ser 또는 Thr 이외의 다른 아미노산, 예를 들어 Leu, Met, Gly, Ala, Val, Ile, His, Asn, Pro, Trp 또는 Cys를 가질 수 있다. 상기 제1 CH3 영역은 위치 409에서 Lys, Leu 또는 Met 이외의 다른 아미노산, 예를 들어 Gly, Ala, Val, Ile, Ser, Thr, Phe, Arg, His, Asp, Asn, Glu, Gln, Pro, Trp, Tyr 또는 Cys를 가질 수 있고, 상기 제2 CH3 영역은 위치 407에서 Ala, Gly, His, Ile, Leu, Met, Asn, Val 또는 Trp를 가질 수 있다.
본원에 개시된 이중특이적 항체는 상기 제1 CH3 영역이 위치 409에서 Lys, Leu 또는 Met 이외의 다른 아미노산, 예를 들어 Gly, Ala, Val, Ile, Ser, Thr, Phe, Arg, His, Asp, Asn, Glu, Gln, Pro, Trp, Tyr 또는 Cys를 갖고, 상기 제2 CH3 영역이 위치 407에서 Gly, Leu, Met, Asn 또는 Trp를 갖는 것인 항체일 수 있다.
본원에 개시된 이중특이적 항체는 상기 제1 CH3 영역이 위치 407에서 Tyr 및 위치 409에서 Lys, Leu 또는 Met 이외의 다른 아미노산, 예를 들어 Gly, Ala, Val, Ile, Ser, Thr, Phe, Arg, His, Asp, Asn, Glu, Gln, Pro, Trp, Tyr 또는 Cys를 갖고, 상기 제2 CH3 영역이 위치 407에서 Tyr, Asp, Glu, Phe, Lys, Gln, Arg, Ser 또는 Thr 이외의 다른 아미노산, 예를 들어 Leu, Met, Gly, Ala, Val, Ile, His, Asn, Pro, Trp 또는 Cys 및 위치 409에서 Lys를 갖는 것인 항체일 수 있다.
본원에 개시된 이중특이적 항체는 상기 제1 CH3 영역이 위치 407에서 Tyr 및 위치 409에서 Lys, Leu 또는 Met 이외의 다른 아미노산, 예를 들어 Gly, Ala, Val, Ile, Ser, Thr, Phe, Arg, His, Asp, Asn, Glu, Gln, Pro, Trp, Tyr 또는 Cys를 갖고, 상기 제2 CH3 영역이 위치 407에서 Ala, Gly, His, Ile, Leu, Met, Asn, Val 또는 Trp 및 위치 409에서 Lys를 갖는 것인 항체일 수 있다.
본원에 개시된 이중특이적 항체는 상기 제1 CH3 영역이 위치 407에서 Tyr 및 위치 409에서 Lys, Leu 또는 Met 이외의 다른 아미노산, 예를 들어 Gly, Ala, Val, Ile, Ser, Thr, Phe, Arg, His, Asp, Asn, Glu, Gln, Pro, Trp, Tyr 또는 Cys를 갖고, 상기 제2 CH3 영역이 위치 407에서 Gly, Leu, Met, Asn 또는 Trp 및 위치 409에서 Lys를 갖는 것인 항체일 수 있다.
본원에 개시된 이중특이적 항체는 상기 제1 CH3 영역이 위치 407에서 Tyr 및 위치 409에서 Arg를 갖고, 상기 제2 CH3 영역이 위치 407에서 Tyr, Asp, Glu, Phe, Lys, Gln, Arg, Ser 또는 Thr 이외의 다른 아미노산, 예를 들어 Leu, Met, Gly, Ala, Val, Ile, His, Asn, Pro, Trp 또는 Cys 및 위치 409에서 Lys를 갖는 것인 항체일 수 있다.
본원에 개시된 이중특이적 항체는 상기 제1 CH3 영역이 위치 407에서 Tyr 및 위치 409에서 Arg를 갖고, 상기 제2 CH3 영역이 위치 407에서 Ala, Gly, His, Ile, Leu, Met, Asn, Val 또는 Trp 및 위치 409에서 Lys를 갖는 것인 항체일 수 있다.
본원에 개시된 이중특이적 항체는 상기 제1 CH3 영역이 위치 407에서 Tyr 및 위치 409에서 Arg를 갖고, 상기 제2 CH3 영역이 위치 407에서 Gly, Leu, Met, Asn 또는 Trp 및 위치 409에서 Lys를 갖는 것인 항체일 수 있다.
본원에 개시된 이중특이적 항체는 제1 CH3 영역이 위치 409에서 Lys, Leu 또는 Met 이외의 다른 아미노산, 예를 들어 Gly, Ala, Val, Ile, Ser, Thr, Phe, Arg, His, Asp, Asn, Glu, Gln, Pro, Trp, Tyr 또는 Cys를 갖고, 제2 CH3 영역이 하기를 가질 수 있는 것인 항체일 수 있다:
(i) 위치 368에서 Phe, Leu 및 Met 이외의 다른 아미노산, 예를 들어 Gly, Ala, Val, Ile, Ser, Thr, Lys, Arg, His, Asp, Asn, Glu, Gln, Pro, Trp, Tyr 또는 Cys, 또는
(ii) 위치 370에서 Trp, 또는
(iii) 위치 399에서 Asp, Cys, Pro, Glu 또는 Gln 이외의 다른 아미노산, 예를 들어 Phe, Leu, Met, Gly, Ala, Val, Ile, Ser, Thr, Lys, Arg, His, Asn, Trp, Tyr 또는 Cys, 또는
(iv) 위치 366에서 Lys, Arg, Ser, Thr 또는 Trp 이외의 다른 아미노산, 예를 들어 Phe, Leu, Met, Ala, Val, Gly, Ile, Asn, His, Asp, Glu, Gln, Pro, Tyr 또는 Cys.
제1 CH3 영역은 위치 409에서 Arg, Ala, His 또는 Gly를 가질 수 있고, 제2 CH3 영역은 하기를 가질 수 있다:
(i) 위치 368에서 Lys, Gln, Ala, Asp, Glu, Gly, His, Ile, Asn, Arg, Ser, Thr, Val 또는 Trp, 또는
(ii) 위치 370에서 Trp, 또는
(iii) 위치 399에서 Ala, Gly, Ile, Leu, Met, Asn, Ser, Thr, Trp, Phe, His, Lys, Arg 또는 Tyr, 또는
(iv) 위치 366에서 Ala, Asp, Glu, His, Asn, Val, Gln, Phe, Gly, Ile, Leu, Met 또는 Tyr.
제1 CH3 영역은 위치 409에서 Arg를 가질 수 있고, 제2 CH3 영역은 하기를 가질 수 있다:
(i) 위치 368에서 Asp, Glu, Gly, Asn, Arg, Ser, Thr, Val 또는 Trp, 또는
(ii) 위치 370에서 Trp, 또는
(iii) 위치 399에서 Phe, His, Lys, Arg 또는 Tyr, 또는
(iv) 위치 366에서 Ala, Asp, Glu, His, Asn, Val, Gln.
이중특이적 항체는 제1 및 제2 중쇄를 포함할 수 있고, 여기서 각각의 상기 제1 및 제2 중쇄는 적어도 힌지 영역, CH2 및 CH3 영역을 포함하고, 여기서 (i) 인간 IgG1 중쇄 내의 F405에 상응하는 위치에서의 아미노산은 상기 제1 중쇄에서 L이고, 인간 IgG1 중쇄의 K409에 상응하는 위치에서의 아미노산은 상기 제2 중쇄에서 R이거나, 또는 (ii) 인간 IgG1 중쇄의 K409에 상응하는 위치에서의 아미노산은 상기 제1 중쇄에서 R이고, 인간 IgG1 중쇄의 F405에 상응하는 위치에서의 아미노산은 상기 제2 중쇄에서 L이다.
상기 명시된 아미노산 치환에 추가로, 상기 제1 및 제2 중쇄는 야생형 중쇄 서열에 비해 추가의 아미노산 치환, 결실 또는 삽입을 함유할 수 있다.
본 개시내용의 한 실시양태에서, 상기 제1 및 상기 제2 Fc 서열은 둘 다 (코어) 힌지 영역에 Cys-Pro-Ser-Cys 서열을 포함하지 않는다. 대안적 실시양태에서, 상기 제1 및 상기 제2 Fc 서열은 둘 다 (코어) 힌지 영역에 Cys-Pro-Pro-Cys 서열을 포함한다.
바람직하게는, 본 발명의 제약 제제에 포함된 항체는 동일한 제1 및 제2 항원 결합 영역 및 인간 IgG1 힌지, CH2 및 CH3 영역을 포함하는 2개의 중쇄 불변 영역 (CH)을 포함하는 또 다른 항체와 비교하여 더 적은 정도로 Fc-매개 이펙터 기능을 유도한다.
상기 제1 및 제2 중쇄 불변 영역 (CH)은 변형되어, 항체가 비-변형된 제1 및 제2 중쇄 불변 영역 (CH)을 포함하는 것을 제외하고는 동일한 항체와 비교하여 더 적은 정도로 Fc-매개 이펙터 기능을 유도하도록 할 수 있다.
상기 Fc-매개 이펙터 기능은 바람직하게는 Fcγ 수용체에 대한 결합, C1q에 대한 결합, 또는 Fcγ 수용체의 Fc-매개 가교의 유도에 의해 측정된다.
특히, Fc-매개 이펙터 기능은 C1q에 대한 결합에 의해 측정된다.
상기 제1 및 제2 중쇄 불변 영역은 상기 항체에 대한 C1q의 결합이 야생형 항체와 비교하여 감소되도록, 바람직하게는 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97% 또는 100%만큼 감소되도록 변형될 수 있으며, 여기서 C1q 결합은 바람직하게는 ELISA에 의해 결정된다.
제약 제제에 포함된 결합제는 상기 제1 및 제2 중쇄 불변 영역 (CH) 중 적어도 하나에서 EU 넘버링에 따른 인간 IgG1 중쇄 내의 위치 L234, L235, D265, N297 및 P331에 상응하는 위치에서의 1개 이상의 아미노산이 각각 L, L, D, N 및 P가 아닌 것일 수 있다.
제약 제제의 결합제에서, EU 넘버링에 따른 인간 IgG1 중쇄 내의 위치 L234 및 L235에 상응하는 위치는 상기 제1 및 제2 중쇄에서 각각 F 및 E일 수 있다.
제약 제제의 결합제에서, EU 넘버링에 따른 인간 IgG1 중쇄 내의 위치 L234, L235 및 D265에 상응하는 위치는 상기 제1 및 제2 중쇄 불변 영역 (HC)에서 각각 F, E 및 A일 수 있다.
제약 제제는 제1 및 제2 중쇄 불변 영역 둘 다의 EU 넘버링에 따른 인간 IgG1 중쇄 내의 위치 L234, L235 및 D265에 상응하는 위치가 각각 F, E 및 A이고, (i) 제1 중쇄 불변 영역의 EU 넘버링에 따른 인간 IgG1 중쇄 내의 F405에 상응하는 위치가 L이고, 제2 중쇄 불변 영역의 EU 넘버링에 따른 인간 IgG1 중쇄 내의 K409에 상응하는 위치가 R이거나, 또는 (ii) 제1 중쇄의 EU 넘버링에 따른 인간 IgG1 중쇄 내의 K409에 상응하는 위치가 R이고, 제2 중쇄의 EU 넘버링에 따른 인간 IgG1 중쇄 내의 F405에 상응하는 위치가 L인 결합제를 포함할 수 있다.
제약 제제는 제1 및 제2 중쇄 불변 영역 둘 다의 EU 넘버링에 따른 인간 IgG1 중쇄 내의 위치 L234 및 L235에 상응하는 위치가 각각 F 및 E이고, (i) 제1 중쇄 불변 영역의 EU 넘버링에 따른 인간 IgG1 중쇄 내의 F405에 상응하는 위치가 L이고, 제2 중쇄의 EU 넘버링에 따른 인간 IgG1 중쇄 내의 K409에 상응하는 위치가 R이거나, 또는 (ii) 제1 중쇄 불변 영역의 EU 넘버링에 따른 인간 IgG1 중쇄 내의 K409에 상응하는 위치가 R이고, 제2 중쇄의 EU 넘버링에 따른 인간 IgG1 중쇄 내의 F405에 상응하는 위치가 L인 결합제를 포함할 수 있다.
특정한 실시양태에서, 제1 결합 아암은 카파 (κ) 경쇄, 예컨대 서열식별번호: 26에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 카파 경쇄를 포함할 수 있고, 상기 제2 결합 아암은 람다 (λ) 경쇄, 예컨대 서열식별번호: 27에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 람다 경쇄를 포함한다.
다른 실시양태에서, 제1 결합 아암은 람다 (λ) 경쇄, 예컨대 서열식별번호: 27에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 람다 경쇄를 포함하고, 상기 제2 결합 아암은 카파 (κ) 경쇄, 예컨대 서열식별번호: 26에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 카파 경쇄를 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 제1 결합 아암 및 제2 결합 아암은 둘 다 람다 (λ) 경쇄, 예컨대 서열식별번호: 27에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 람다 경쇄를 포함한다.
추가 실시양태에서, 제1 결합 아암 및 제2 결합 아암은 둘 다 카파 (κ) 경쇄, 예컨대 서열식별번호: 26에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 카파 경쇄를 포함한다.
결합제는 제1 결합 아암이 서열식별번호: 24에 제시된 아미노산 서열을 포함하고 제2 결합 아암이 서열식별번호: 25에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다.
대안적으로, 결합제는 제1 결합 아암이 서열식별번호: 25에 제시된 아미노산 서열을 포함하고 제2 결합 아암이 서열식별번호: 24에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 것이다.
결합제는 T 세포의 증식을 유도 및/또는 증진시키는 것일 수 있다.
특히, 상기 T 세포는 CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포일 수 있다.
본 발명에 따른 제약 제제에서, 결합제는 제2 항원-결합 영역이 PD-L1에 결합하는 경우에만 CD137 신호전달을 활성화시키는 것일 수 있다.
T 세포의 증식은 특이적 T-세포 수용체 (TCR)를 발현하는 T-세포를 TCR에 의해 인식되는 주요 조직적합성 복합체 상의 상응하는 항원을 제시하는 수지상 세포 (DC)와 공동-배양함으로써 측정될 수 있다.
한 실시양태에서, T 세포의 증식의 상기 유도 또는 증진은 항원-특이적 검정에 의해 결정되고, 여기서 DC는 클라우딘-6 항원으로 형질감염되고, T 세포는 DC 상의 HLA-A2에 제시된 클라우딘-6-유래 에피토프를 인식하는 TCR로 형질감염된다. 이 검정은 실시예 7에 기재되어 있다.
본 발명의 결합제는 인간 종양 조직의 생체외 배양에서 종양-침윤 림프구 (TIL)의 확장을 매개할 수 있다. TIL의 확장은 1.5배 이상, 2배 이상, 3배 이상, 4배 이상, 5배 이상, 6배 이상, 7배 이상, 8배 이상, 9배 이상 또는 10배 이상일 수 있다. CD3-CD56+ 자연 킬러 (NK) 세포의 확장은 적어도 10배, 예컨대 적어도 20배, 적어도 30배, 적어도 40배 또는 예컨대 적어도 50배일 수 있다. CD3+CD8+ 세포독성 T-림프구 (CTL)의 확장은 적어도 2배, 적어도 3배, 적어도 4배, 적어도 5배, 적어도 6배 또는 예컨대 적어도 7배일 수 있다. 바람직하게는, TIL의 확장은 0.01, 0.1 및 1 μg/mL에 상응하는 농도의 이중특이적 결합제와의 인큐베이션에 반응한, 예컨대 0.1 μg/mL에 상응하는 농도의 이중특이적 결합제와의 인큐베이션에 반응한 인간 비소세포 폐 암종 조직 시편으로부터의 TIL 확장으로서 결정된다.
TIL의 확장은 하기 단계를 포함하는 검정에서 결정될 수 있다:
i) 종양 조직의 절제 시편, 예컨대 신선한 절제 시편을 제공하고, 시편을 조혈 세포 배지에서 세척하는 단계,
ii) 종양 조직을 1-2 mm의 직경을 갖는 조각으로 절단하고, 2개의 종양 조직 조각을 함유하는 샘플을 제공하는 단계,
iii) 샘플을 조직 배양 플레이트의 웰에서 10% 인간 혈청 알부민, 항생제 및 프로류킨(Proleukin)®S (재조합 인간 IL-2 유사체; 서열식별번호: 56)이 존재하는 조혈 세포 배지, 예컨대 론자(Lonza)™ X-VIVO™ 15 중 0.1 μg/ml의 농도의 본 발명의 이중특이적 결합제와 함께 37℃, 5% CO2에서 72시간 동안 인큐베이션하는 단계이며; 여기서 25개 초과의 TIL 마이크로클러스터가 샘플에서 관찰되는 경우에는, 상기 샘플 내의 세포를 6개의 샘플 또는 조직 배양 플레이트 내의 6개의 웰로 분할하여 옮기는 것인 단계,
iv) 10-14일의 총 인큐베이션 기간 후에 TIL을 수거하고, 이들을 인간 CD3, 인간 CD4, 인간 CD56 및 인간 CD8에 대한 표지된 항체를 사용한 염색 및 비-생존 세포를 염색하는 염료, 예컨대 아미노악티노마이신 D를 사용한 염색에 적용하는 단계, 및
v) 각각의 샘플을 유동 세포측정법에 의해 분석하는 단계.
본 발명의 결합제는 특히 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)의 집단에서 CD40+ 및 CD8+ T-세포의 확장을 유도할 수 있고, 여기서 T-세포는 바람직하게는 0.03 내지 0.1 μg/mL의 농도의 항-CD3 항체, 예컨대 클론 UCHT1과의 인큐베이션에 의해 활성화, 예컨대 준최적으로 활성화되고, 바람직하게는 0.2 μg/mL에 상응하는 농도의 본 발명에 따른 이중특이적 결합제와 함께 인큐베이션된다. 특히, T-세포 확장을 결정하는 방법은 하기 단계를 포함할 수 있다:
i) 건강한 공여자의 백혈구 연층으로부터, 예컨대 피콜 구배의 단리에 의해 PBMC를 수득하는 단계,
ii) PBS 중 카르복시플루오레세인 숙신이미딜 에스테르 (CFSE)로 PBMC를 표지하는 단계,
iii) 75000 CFSE-표지된 PBMC를 포함하는 샘플을 제공하고, 샘플을 글루타민이 존재하고 인간 AB 혈청이 보충된 이스코브 변형 둘베코 배지에서, 바람직하게는 각각의 공여자에 대해 준최적 T-세포 증식을 유도하는 농도인 것으로 미리 결정된 0.03 내지 0.1 μg/mL 농도의 항-CD3 항체와 함께 및 0.2 μg/mL 농도의 본 발명의 이중특이적 결합제와 함께 37℃, 5% CO2에서 4일 동안 인큐베이션하는 단계,
iv) PBMC를 인간 CD4, 인간 CD8, 인간 CD56에 대한 표지된 항체를 사용한 염색 및 비-생존 세포를 염색하는 염료, 예컨대 7-아미노악티노마이신 D를 사용한 염색에 적용하는 단계, 및
v) 샘플 내 상이한 하위집단 (CD4+ 및 CD8+ T-세포)에서의 CSFE를 유동 세포측정법에 의해 분석하는 단계.
전통적인 방법, 예컨대 하이브리드 하이브리도마 및 화학적 접합 방법 (Marvin and Zhu (2005) Acta Pharmacol Sin 26:649)이 본 발명의 문맥에 개시된 결합제의 제조에 사용될 수 있다. 상이한 중쇄 및 경쇄로 이루어진 2종의 항체의 숙주 세포에서의 공동-발현은 목적하는 이중특이적 결합제 이외에 가능한 항체 생성물의 혼합물을 생성하고, 이는 이어서, 예를 들어 친화성 크로마토그래피 또는 유사한 방법에 의해 단리될 수 있다.
상이한 항체 구축물의 공동-발현시 기능적 이중특이적 생성물의 형성을 촉진하는 전략, 예를 들어 문헌 [Lindhofer et al. (1995 J Immunol 155:219]에 기재된 방법이 또한 사용될 수 있다. 상이한 항체를 생산하는 래트 및 마우스 하이브리도마의 융합은 우선적 종-제한 중쇄/경쇄 쌍형성 때문에 제한된 개수의 이종이량체 단백질을 생성한다. 동종이량체에 비해 이종이량체의 형성을 촉진하는 또 다른 전략은, 제1 중쇄 폴리펩티드 상에는 돌기를 도입하고 제2 중쇄 폴리펩티드 내에는 상응하는 공동을 도입하여, 이들 2개의 중쇄의 계면에서 돌기가 공동 내에 위치하여 이종이량체 형성을 촉진하고 동종이량체 형성을 방해하도록 할 수 있도록 한 "노브-인투-홀" 전략이다. "돌기"는 제1 폴리펩티드의 계면으로부터의 작은 아미노산 측쇄를 더 큰 측쇄로 대체함으로써 구축된다. 돌기와 동일하거나 유사한 크기의 보상적 "공동"은 큰 아미노산 측쇄를 더 작은 측쇄로 대체함으로써 제2 폴리펩티드의 계면에 생성된다 (미국 특허 5,731,168). EP1870459 (츄가이) 및 WO2009089004 (암젠)는 숙주 세포에서 상이한 항체 도메인의 공동-발현시 이종이량체 형성을 촉진하기 위한 다른 전략을 기재한다. 이들 방법에서, 둘 다의 CH3 도메인 내 CH3-CH3 계면을 구성하는 1개 이상의 잔기는 하전된 아미노산으로 대체되어 동종이량체 형성이 정전기적으로 불리하고 이종이량체화가 정전기적으로 유리하게 된다. WO2007110205 (머크)는 IgA 및 IgG CH3 도메인들 사이의 차이를 이종이량체화 촉진에 이용하는 또 다른 전략을 기재한다.
이중특이적 항체를 생산하는 또 다른 시험관내 방법이 WO2008119353 (젠맙)에 기재되었으며, 여기서 이중특이적 항체는 환원 조건 하에서의 인큐베이션시 2종의 단일특이적 IgG4- 또는 IgG4-유사 항체 사이의 "Fab-아암" 또는 "절반-분자" 교환 (중쇄와 부착된 경쇄의 스와핑)에 의해 형성된다. 생성된 생성물은 상이한 서열을 포함할 수 있는 2개의 Fab 아암을 갖는 이중특이적 항체이다.
본원에 개시된 바와 같은 이중특이적 PD-L1xCD137 결합제를 제조하는 바람직한 방법은 하기 단계를 포함하는, WO2011131746 및 WO2013060867 (젠맙)에 기재된 방법을 포함한다:
a) 제1 CH3 영역을 포함하는 Fc 영역을 포함하는 제1 항체를 제공하는 단계;
b) 제2 CH3 영역을 포함하는 제2 Fc 영역을 포함하는 제2 항체를 제공하는 단계,
여기서 제1 항체는 CD137 항체이고 제2 항체는 PD-L1 항체이거나, 또는 그 반대의 경우이고,
여기서 상기 제1 및 제2 CH3 영역의 서열은 상이하고 상기 제1 및 제2 CH3 영역 사이의 이종이량체 상호작용이 상기 제1 및 제2 CH3 영역의 각각의 동종이량체 상호작용보다 더 강하도록 함;
c) 환원 조건 하에 상기 제1 항체를 상기 제2 항체와 함께 인큐베이션하는 단계; 및
d) 상기 이중특이적 PD-L1xCD137 항체를 수득하는 단계.
유사하게, 하기 단계를 포함하는, 본 발명의 문맥에 개시된 바와 같은 결합제를 제조하는 방법이 제공된다:
a) 본원에 정의된 바와 같은 인간 CD137에 결합할 수 있는 항원-결합 영역을 포함하는 제1 항체를 생산하는 숙주 세포를 배양하고, 배양물로부터 상기 제1 항체를 정제하는 단계;
b) 본원에 정의된 바와 같은 인간 PD-L1에 결합할 수 있는 항원-결합 영역을 포함하는 제2 항체를 생산하는 숙주 세포를 배양하고, 배양물로부터 상기 제2 항체를 정제하는 단계;
c) 힌지 영역 내의 시스테인이 디술피드-결합 이성질화를 겪도록 하기에 충분한 환원 조건 하에 상기 제1 항체를 상기 제2 항체와 함께 인큐베이션하는 단계; 및
d) 상기 이중특이적 항체를 수득하는 단계.
본 발명의 한 실시양태에서, 상기 제1 항체는 상기 제2 항체와 함께, 힌지 영역 내의 시스테인이 디술피드 결합 이성질화를 겪도록 하기에 충분한 환원 조건 하에 인큐베이션되고, 여기서 생성된 이종이량체 항체에서의 상기 제1 및 제2 항체들 사이의 이종이량체 상호작용은 37℃에서 24시간 후 0.5 mM GSH에서 어떠한 Fab-아암 교환도 일어나지 않도록 이루어진다.
이론에 제한되는 것은 아니지만, 단계 c)에서, 모 항체의 힌지 영역 내의 중쇄 디술피드 결합이 환원되고, 이어서 생성된 시스테인이 또 다른 모 항체 분자 (원래 상이한 특이성을 수반함)의 시스테인 잔기와 중쇄간 디술피드 결합을 형성할 수 있다. 상기 방법의 한 실시양태에서, 단계 c)에서의 환원 조건은 환원제, 예를 들어 2-메르캅토에틸아민 (2-MEA), 디티오트레이톨 (DTT), 디티오에리트리톨 (DTE), 글루타티온, 트리스(2-카르복시에틸)포스핀 (TCEP), L-시스테인 및 베타-메르캅토-에탄올로 이루어진 군으로부터 선택된 환원제, 바람직하게는 2-메르캅토에틸아민, 디티오트레이톨 및 트리스(2-카르복시에틸)포스핀으로 이루어진 군으로부터 선택된 환원제의 첨가를 포함한다. 추가 실시양태에서, 단계 c)는, 예를 들어 환원제의 제거에 의해, 예를 들어 탈염에 의해 상기 조건을 비-환원성 또는 덜 환원성이 되도록 회복시키는 것을 포함한다.
이러한 방법을 위해, 제1 및/또는 제2 Fc 영역을 포함하는, 각각 제1 및 제2 CD137 및 PD-L1 항체를 포함한 상기 기재된 임의의 CD137 및 PD-L1 항체가 사용될 수 있다. 이러한 제1 및 제2 Fc 영역의 조합을 포함한 이러한 제1 및 제2 Fc 영역의 예는 상기 기재된 임의의 것을 포함할 수 있다. 특정한 실시양태에서, 각각 제1 및 제2 CD137 및 PD-L1 항체는 본원에 기재된 바와 같은 이중특이적 항체를 수득하도록 선택될 수 있다.
상기 방법의 한 실시양태에서, 상기 제1 및/또는 제2 항체는 전장 항체이다.
제1 및 제2 항체의 Fc 영역은 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4를 포함하나 이에 제한되지는 않는 임의의 이소형일 수 있다. 바람직하게는, 상기 제1 및 상기 제2 항체 둘 다의 Fc 영역은 IgG1 이소형의 것이다. 대안적으로, 상기 항체의 Fc 영역 중 하나는 IgG1 이소형의 것이고, 다른 것은 IgG4 이소형의 것이다. 후자의 경우에서, 생성된 이중특이적 항체는 IgG1의 Fc 서열 및 IgG4의 Fc 서열을 포함하므로, 이펙터 기능의 활성화와 관련하여 흥미로운 중간 특성을 가질 수 있다.
항체 출발 단백질 중의 하나는 단백질 A에 결합하지 않도록 조작되어, 생성물을 단백질 A 칼럼 상에 통과시킴으로써 이종이량체 단백질을 상기 동종이량체 출발 단백질로부터 분리하도록 할 수 있다.
상기 기재된 바와 같이, 동종이량체 출발 항체의 제1 및 제2 CH3 영역의 서열은 상이하고 상기 제1 및 제2 CH3 영역 사이의 이종이량체 상호작용이 상기 제1 및 제2 CH3 영역의 각각의 동종이량체 상호작용보다 더 강하도록 하는 것이다. 이들 상호작용 및 이를 달성할 수 있는 방법에 관한 보다 상세한 사항은 본원에 그 전문이 참조로 포함되는 WO2011131746 및 WO2013060867 (젠맙)에 제공된다.
특히, 안정한 이중특이적 PD-L1xCD137 항체는 각각 CD137 및 PD-L1에 결합하고 CH3 영역에 단지 소수의 보존적인 비대칭 돌연변이를 함유하는 2종의 동종이량체 출발 항체를 기초로 하여 상기 본 발명의 방법을 사용하여 고 수율로 수득될 수 있다. 비대칭 돌연변이는 상기 제1 및 제2 CH3 영역의 서열이 동일하지 않은 위치에서의 아미노산 치환을 함유하는 것을 의미한다.
본원에 개시된 이중특이적 항체는 또한 단일 세포에서 제1 및 제2 폴리펩티드를 코딩하는 구축물의 공동-발현에 의해 수득될 수 있다. 따라서, 추가 측면에서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는, 이중특이적 항체의 생산 방법에 관한 것이다:
a) 제1 항체 중쇄의 제1 Fc 서열 및 제1 항원-결합 영역을 포함하는 제1 폴리펩티드를 코딩하는 제1 핵산 구축물을 제공하며, 상기 제1 Fc 서열은 제1 CH3 영역을 포함하는 것인 단계,
b) 제2 항체 중쇄의 제2 Fc 서열 및 제2 항원-결합 영역을 포함하는 제2 폴리펩티드를 코딩하는 제2 핵산 구축물을 제공하며, 상기 제2 Fc 서열은 제2 CH3 영역을 포함하는 것인 단계,
여기서 상기 제1 및 제2 CH3 영역의 서열은 상이하고 상기 제1 및 제2 CH3 영역 사이의 이종이량체 상호작용이 상기 제1 및 제2 CH3 영역의 각각의 동종이량체 상호작용보다 더 강하도록 하고, 여기서 상기 제1 동종이량체 단백질은 위치 409에서 Lys, Leu 또는 Met 이외의 다른 아미노산을 갖고, 상기 제2 동종이량체 단백질은 366, 368, 370, 399, 405 및 407로 이루어진 군으로부터 선택된 위치에서의 아미노산 치환을 갖고, 임의로 여기서 상기 제1 및 제2 핵산 구축물은 상기 제1 및 제2 항체의 경쇄 서열을 코딩함,
c) 상기 제1 및 제2 핵산 구축물을 숙주 세포에서 공동-발현시키는 단계, 및
d) 상기 이종이량체 단백질을 세포 배양물로부터 수득하는 단계.
본 발명에 따라 제공되는 제약 제제는 바람직하게는 수성 제제이다.
본 발명은 또한 상기 정의된 바와 같은 결합제를 제공하는 단계 및 이를 pH 약 4.5 내지 약 6.5에서
a. 히스티딘 완충제,
b. 약 100 내지 약 400 mM의 당, 및
c. 약 0.001 내지 약 0.1% (w/v) 비-이온성 계면활성제와 합하는 단계를 포함하는, 상기 정의된 바와 같은 제약 제제의 제조 방법을 제공한다.
히스티딘 완충제, 당, 비-이온성 계면활성제 및 pH와 관련하여 상기 제공된 특정사항이 또한 제제의 제조 방법에 적용된다는 것이 이해될 것이다.
추가 측면에서, 본 발명은 의약으로서 사용하기 위한 상기 정의된 바와 같은 제약 제제를 제공한다.
제약 제제는 특히 암의 치료에 사용하기 위한 것일 수 있다.
본 발명은 질환의 치료를 필요로 하는 대상체에게 유효량의 본원에 정의된 바와 같은 제약 제제를 투여하는 것을 포함하는, 질환의 치료 방법을 추가로 제공한다.
질환은 특히 암일 수 있다.
본 발명은 또한 세포 사멸의 유도 또는 PD-L1을 발현하는 종양 세포의 성장 및/또는 증식의 억제를 필요로 하고/거나 상기 종양 세포를 보유하는 대상체에게 유효량의 상기 정의된 바와 같은 제약 제제를 투여하는 것을 포함하는, 세포 사멸을 유도하거나 또는 PD-L1을 발현하는 종양 세포의 성장 및/또는 증식을 억제하는 방법을 제공한다.
상기 제시된 바와 같은 용도를 위한 제약 제제 또는 상기 정의된 방법과 관련하여, 암은 특히 고형 종양의 존재를 특징으로 할 수 있거나 또는 흑색종, 난소암, 폐암, 결장직장암, 두경부암, 위암, 유방암, 신암, 방광암, 식도암, 췌장암, 간암, 흉선종 및 흉선 암종, 뇌암, 신경교종, 부신피질 암종, 갑상선암, 다른 피부암, 육종, 다발성 골수종, 백혈병, 림프종, 골수이형성 증후군, 난소암, 자궁내막증 암, 전립선암, 음경암, 호지킨 림프종, 비-호지킨 림프종, 메르켈 세포 암종 및 중피종으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
암은 특히 비소세포 폐암 (NSCLC)일 수 있다.
본 발명은 추가로 의약, 예컨대 암, 예를 들어 고형 종양의 존재를 특징으로 하는 암 또는 흑색종, 난소암, 폐암, 결장암 및 두경부암으로 이루어진 군으로부터 선택된 암의 치료를 위한 의약의 제조를 위한 상기 정의된 바와 같은 제약 제제의 용도를 제공한다.
폐암은 특히 비소세포 폐암 (NSCLC)일 수 있다.
상기 치료 방법 및 용도에서의 투여 요법은 최적의 목적하는 반응 (예를 들어 치료 반응)을 제공하도록 조정된다. 예를 들어, 단일 볼루스가 투여될 수 있거나, 여러 분할 용량이 시간 경과에 따라 투여될 수 있거나, 용량이 치료 상황의 위급성에 의해 나타나는 바와 비례하여 감소 또는 증가될 수 있다. 비경구 조성물은 투여의 용이성 및 투여량의 균일성을 위해 투여 단위 형태로 제제화될 수 있다.
제약 제제에 대한 효율적인 투여량 및 투여 요법은 치료될 질환 또는 상태에 좌우되고, 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 결정될 수 있다. 본 발명의 화합물의 치료 유효량에 대한 예시적인 비제한적 범위는 약 0.001-10 mg/kg, 예컨대 약 0.001-5 mg/kg, 예를 들어 약 0.001-2 mg/kg, 예컨대 약 0.001-1 mg/kg, 예를 들어 약 0.001, 약 0.01, 약 0.1, 약 1 또는 약 10 mg/kg이다. 본 발명의 결합제 (예를 들어 이중특이적 항체)의 치료 유효량에 대한 또 다른 예시적인 비제한적 범위는 약 0.1-100 mg/kg, 예컨대 약 0.1-50 mg/kg, 예를 들어 약 0.1-20 mg/kg, 예컨대 약 0.1-10 mg/kg, 예를 들어 약 0.5, 약 예컨대 0.3, 약 1, 약 3, 약 5 또는 약 8 mg/kg이다.
관련 기술분야의 통상의 기술을 갖는 의사 또는 수의사는 요구되는 제약 제제의 유효량을 용이하게 결정하고 처방할 수 있다. 예를 들어, 의사 또는 수의사는 제약 조성물에 사용된 결합제 (예를 들어 이중특이적 항체)의 용량을, 목적하는 치료 효과를 달성하는데 필요한 수준보다 더 낮은 수준으로 시작하고, 목적하는 효과가 달성될 때까지 투여량을 점차적으로 증가시킬 수 있다. 일반적으로, 본 발명의 결합제 (예를 들어 이중특이적 항체)의 적합한 1일 용량은 치료 효과를 생성하는데 효과적인 최저 용량인 화합물의 양일 것이다. 투여는, 예를 들어 비경구, 예컨대 정맥내, 근육내 또는 피하 투여일 수 있다. 한 실시양태에서, 결합제 (예를 들어 이중특이적 항체)는 mg/m2에 의해 계산된 매주 투여량으로 주입에 의해 투여될 수 있다. 이러한 투여량은, 예를 들어 하기에 따라 상기 제공된 mg/kg 투여량을 기준으로 할 수 있다: 용량 (mg/kg) x 70:1.8. 이러한 투여는, 예를 들어 1 내지 8회, 예컨대 3 내지 5회 반복될 수 있다. 투여는 2 내지 24시간, 예컨대 2 내지 12시간의 기간에 걸쳐 연속 주입에 의해 수행될 수 있다. 한 실시양태에서, 결합제 (예를 들어 이중특이적 항체)는 독성 부작용을 감소시키기 위해 장기간에 걸쳐, 예컨대 24시간을 초과하여 느린 연속 주입에 의해 투여될 수 있다.
제약 제제는 1주 1회 제공되는 경우에 8회 이하, 예컨대 4 내지 6회 동안 고정 용량으로서 계산된 매주 투여량으로 투여될 수 있다. 이러한 요법은, 예를 들어 6개월 또는 12개월 후에 필요에 따라 1회 이상 반복될 수 있다. 이러한 고정 투여량은, 예를 들어 체중 추정치를 70 kg으로 하여 상기 제공된 mg/kg 투여량을 기준으로 할 수 있다. 투여량은, 예를 들어 생물학적 샘플을 채취하고 본 발명의 항체의 PD-L1 항원-결합 영역을 표적화하는 항-이디오타입 항체를 사용함으로써 투여시 혈액 중 본 발명의 결합제 (예를 들어 이중특이적 항체)의 양을 측정함으로써 결정 또는 조정될 수 있다.
제약 제제는 유지 요법으로서, 예컨대, 예를 들어 6개월 이상의 기간 동안 1주 1회 투여될 수 있다.
제약 제제는 또한 암 발생의 위험을 감소시키고/거나, 암 진행에서 사건 발생의 개시를 지연시키고/거나, 암이 완화 상태인 경우 재발의 위험을 감소시키기 위해 예방적으로 투여될 수 있다.
상기 정의된 바와 같이 사용될 때, 본 발명에 따른 제약 제제는 바람직하게는 정맥내로 투여된다.
상기 정의된 용도 또는 방법은 제약 제제를 1종 이상의 추가의 치료제, 예컨대 화학요법제와 조합하여 사용하는 것을 포함할 수 있다.
본 발명은 하기 실시예에 의해 추가로 예시되며, 이는 본 발명의 범주를 제한하는 것으로 해석되서는 안된다.
서열
표 1
Figure pct00003
Figure pct00004
Figure pct00005
Figure pct00006
Figure pct00007
Figure pct00008
실시예
실시예 1: CD137 항체의 생성
항체 CD137-009를 WO2016/110584의 실시예 1에 기재된 바와 같이 생성하였다. 간략하게, 인간 CD137-Fc 융합 단백질을 함유하는 단백질의 혼합물로 토끼를 면역화시켰다. 혈액으로부터의 단일 B 세포를 분류하고, ELISA 및 유동 세포측정법에 의해 CD137 특이적 항체의 생산에 대해 스크리닝하였다. 스크리닝-양성 B 세포로부터, RNA를 추출하고, 서열분석을 수행하였다. 중쇄 및 경쇄의 가변 영역을 유전자 합성하고, 하기 아미노산 돌연변이: L234F, L235E, D265A 및 F405L (FEAL) 또는 K409R (FEAR) (여기서 아미노산 위치 번호는 EU 넘버링에 따름 (서열식별번호: 25에 상응함))을 함유하는 인간 IgG1 중쇄를 포함하는 인간 IgG1 카파 발현 벡터 또는 인간 IgG1 람다 발현 벡터 내로 클로닝하였다. 키메라 CD137 항체 (CD137-009)의 가변 영역 서열은 본원 서열 목록 서열식별번호: 8 및 서열식별번호: 12에 제시된다.
실시예 2: 토끼 (키메라) CD137 항체의 인간화
안티토프(Antitope) (영국 캠브리지)에서 토끼 항-CD137-009로부터의 인간화 항체 서열을 생성하였다. 배선 인간화 (CDR-그라프팅) 기술을 사용하여 인간화 항체 서열을 생성하였다. 토끼 항체의 VH 및 Vκ 아미노산 서열에 대해 가장 근접한 상동성을 갖는 인간 배선 서열에 기초하여 인간화 V 영역 유전자를 설계하였다. 일련의 7개의 VH 및 3개의 Vκ (VL) 배선 인간화 V-영역 유전자를 설계하였다. 항체의 결합 특성에 중요할 수 있는 V 영역 프레임워크 내의 아미노산을 확인하기 위해 스위스 PDB를 사용하여 비-인간 모 항체 V 영역의 구조 모델을 제조하고 분석하였다. 이들 아미노산을 1종 이상의 변이체 CDR-그라프팅된 항체 내로의 혼입에 대해 주목하였다. 인간화 설계에 대한 기초로서 사용된 배선 서열은 표 2에 제시된다.
표 2: 가장 근접하게 매칭되는 인간 배선 V 절편 및 J 절편 서열.
Figure pct00009
이어서, 안티토프의 독점적 인 실리코 기술인 iTope™ 및 TCED™ (T 세포 에피토프 데이터베이스)를 사용하여 최저 발생률의 잠재적 T 세포 에피토프를 갖는 변이체 서열을 선택하였다 (Perry, L.C.A, Jones, T.D. and Baker, M.P. New Approaches to Prediction of Immune Responses to Therapeutic Proteins during Preclinical Development (2008). Drugs in R&D 9 (6): 385-396; 20 Bryson, C.J., Jones, T.D. and Baker, M.P. Prediction of Immunogenicity of Therapeutic Proteins (2010). Biodrugs 24 (1):1-8). 최종적으로, 설계된 변이체의 뉴클레오티드 서열을 코돈-최적화하였다. 인간화 CD137 항체 (CD137-009-HC7LC2)의 가변 영역 서열은 본원 서열 목록 서열식별번호: 15 및 서열식별번호: 16에 제시된다.
실시예 3: CD137 항체의 결합에 중요한 도메인을 결정하기 위한 멧돼지 CD137 또는 코끼리 CD137과 인간 CD137 사이의 DNA 셔플링
인간 CD137에 대한 CD137 항체의 결합에 중요한 도메인을 결정하기 위해, 인간 CD137과 멧돼지 CD137 (수스 스크로파; XP_005665023) 사이 또는 인간 CD137과 아프리카 코끼리 CD137 (록소돈타 아프리카나; XP_003413533) 사이에서 DNA 셔플링을 수행하였다. 인간 CD137을 코딩하는 DNA로부터 인간 도메인을 멧돼지 도메인으로 대체하여 셔플 구축물 (셔플 구축물 1-4, 6)을 제조하거나 또는 인간 도메인을 코끼리 도메인으로 대체하여 셔플 구축물 (셔플 구축물 5)을 제조하였다. 셔플 구축물의 아미노산 서열은 표 1에 제시된다.
인간 CD137에서의 도메인이 항-CD137 항체의 결합에 중요한 경우, 그러한 도메인을 멧돼지 또는 아프리카 코끼리 도메인으로 교체할 때 결합은 상실될 것이다.
인간 CD137과 멧돼지 CD137 사이의 상동성 및 인간 CD137과 아프리카 코끼리 CD137 사이의 상동성은 각각 70.2 및 74.5%이다. 이들 두 종의 선택을 위한 요건은, 아프리카 코끼리 및 멧돼지에서의 관심 도메인이 미스폴딩 또는 발현 상실의 위험을 최소화하는데 필요한 중요한 구조적 상호작용은 유지하면서 결합 상실을 유발하기에 인간과 비교하여 충분히 상이하다는 것이었다. 도 1은 인간, 멧돼지 및 아프리카 코끼리 CD137의 서열 정렬을 보여준다. 도 2는 나타낸 바와 같이 멧돼지 CD137 또는 아프리카 코끼리 CD137 도메인을 함유하는 인간 CD137에 대한 구축물을 보여준다.
T75 배양 플라스크 (그라이너 바이오-원(Greiner Bio-One), 카탈로그 번호 658175) 내 10% FCS (바이오크롬(Biochrom), 카탈로그 번호 S 0115)를 함유하는 RPMI 1640 글루타맥스 배지 20 mL 중에 3 x 106개의 HEK293T-17 세포를 시딩하였다. 밤새 인큐베이션한 후에, 트랜스IT(TransIT)®-LT1 형질감염 시약, 미루스 바이오(Mirus Bio) (VWR 인터내셔널(VWR International), 카탈로그 번호 731-0029)를 제조업체의 지침에 따라 사용하여 구성적으로 활성인 인간 신장 인자-1 알파 (EF-1 알파) 프로모터의 하류에 셔플 구축물 또는 멧돼지, 아프리카 코끼리 또는 인간 CD137을 코딩하는 발현 벡터를 세포에 일시적으로 형질도입시켰다. 다음 날, 1.5 mL 아큐타제 (시그마 알드리치(Sigma Aldrich), 카탈로그 번호 A6964) (37℃에서 5분 동안 인큐베이션)를 사용하여 세포를 수거하고, 셔플 구축물 및 인간, 아프리카 코끼리 및 멧돼지 CD137의 표면 발현을 측정하기 위해 및 상이한 셔플 구축물에 대한 항체 클론의 결합을 측정하기 위해, 본질적으로 상기 기재된 바와 같이 유동 세포측정법을 수행하였다. 구축물의 세포 표면 발현을 측정하기 위해, 형질도입된 세포를 FACS 완충제 중 1 μg/mL 염소 폴리클로날 항-인간 CD137 (알앤디 시스템즈(R&D Systems), 카탈로그 번호 AF838)과 함께 인큐베이션하고 (4℃, 20분), 이어서 APC-표지된 항-염소 IgG (H+L) (알앤디 시스템즈, 카탈로그 번호 F0108)와 함께 인큐베이션하였다 (4℃, 20분). 형질도입된 세포를 1 μg/mL의 항체 클론과 함께 인큐베이션하고, 이어서 APC-표지된 아피니퓨어 F(ab')2 단편 (1:50 최종 희석물; 잭슨(Jackson), 카탈로그 번호 109-136-127)과 함께 인큐베이션하여 셔플 구축물을 발현하는 세포에 대한 상이한 CD137 항체 클론의 결합을 측정하였다.
모든 CD137 셔플 구축물, 뿐만 아니라 인간, 아프리카 코끼리 및 멧돼지 CD137은 유사한 발현 수준으로 세포 표면 상에서 발현되었다 (도 3).
도 4는 CD137-009가 아프리카 코끼리 및 멧돼지 CD137에 대한 결합의 상실을 나타냈다는 것을 보여준다. CD137-009는 또한 인간 CD137에 대한 결합과 비교하여 셔플 구축물 5에 대한 결합의 상실을 나타냈다.
실시예 4: PD-L1 항체의 생성
알데브론 게엠베하(Aldevron GmbH) (독일 프라이부르크)에서 면역화 및 하이브리도마 생성을 수행하였다. 인간 PD-L1의 아미노산 19-238을 코딩하는 cDNA를 알데브론 독점적 발현 플라스미드 내로 클로닝하였다. 입자-충격용 핸드-헬드 장치 ("유전자 총")를 사용하는 인간 PD-L1 cDNA-코팅된 금-입자의 피내 적용을 사용하여 옴니래트 동물 (완전 인간 이디오타입을 갖는 항체의 다양화된 레퍼토리를 발현하는 트랜스제닉 래트; 리간드 파마슈티칼스 인크.(Ligand Pharmaceuticals Inc.), 미국 샌디에고)을 면역화시킴으로써 항체 PD-L1-547을 생성하였다. 혈청 샘플을 일련의 면역화 후에 수집하고, 인간 PD-L1을 발현하는 상기 언급된 발현 플라스미드에 의해 일시적으로 형질감염된 HEK 세포 상에서 유동 세포측정법으로 시험하였다. 항체-생산 세포를 단리하고, 표준 절차에 따라 마우스 골수종 세포 (Ag8)와 융합시켰다. PD-L1 특이적 항체를 생산하는 하이브리도마로부터의 RNA를 추출하고, 서열분석을 수행하였다. 중쇄 및 경쇄의 가변 영역 (서열식별번호: 17 및 21)을 유전자 합성하고, 하기 아미노산 돌연변이: L234F, L235E, D265A 및 K409R (FEAR) (여기서 아미노산 위치 번호는 EU 넘버링에 따름 (서열식별번호: 24에 상응함))을 함유하는 인간 IgG1 중쇄를 포함하는 인간 IgG1 람다 발현 벡터 내로 클로닝하였다.
실시예 5: 2-MEA-유도된 Fab-아암 교환에 의한 이중특이적 항체의 생성
제어된 환원 조건 하에서 Fab-아암-교환에 의해 이중특이적 IgG1 항체를 생성하였다. 이러한 방법에 대한 기초는 WO2011/131746에 기재된 바와 같은 특정 검정 조건 하에서 이종이량체의 형성을 촉진하는 상보적 CH3 도메인의 사용이다. F405L 및 K409R (EU 넘버링) 돌연변이를 관련 항체 내로 도입하여 상보적 CH3 도메인을 갖는 항체 쌍을 생성하였다.
이중특이적 항체를 생성하기 위해, 2종의 모 상보적 항체를, 각각 0.5 mg/mL의 최종 농도의 항체로, 100 μL PBS의 총 부피 중 75 mM 2-메르캅토에틸아민-HCl (2-MEA)과 함께 31℃에서 5시간 동안 인큐베이션하였다. 스핀 칼럼 (마이크로콘 원심분리 필터, 30k, 밀리포어(Millipore))을 제조업체의 프로토콜에 따라 사용하여 환원제 2-MEA를 제거함으로써 환원 반응을 정지시켰다.
실시예 1 및 4로부터의 하기 항체들을 조합함으로써 이중특이적 항체를 생성하였다:
- PD-L1-547-FEAR 항체와 조합된 CD137-009-FEAL 항체,
- CD137-009-FEAR과 조합된 PD-L1-547-FEAL 항체,
- CD137-009-HC7LC2-FEAR 항체와 조합된 PD-L1-547-FEAL 항체,
- 제1 아암으로서 gp120 특이적 항체인 항체 b12를 사용하여, PD-L1-547-FEAR 항체, CD137-009-FEAR 또는 CD137-009-HC7LC2-FEAR 항체와 조합된 b12-FEAL 항체 (Barbas, CF. J Mol Biol. 1993 Apr 5;230(3):812-23),
- PD-L1-547-FEAL 또는 CD137-009-FEAL와 b12-FEAR 항체.
실시예 6: PD-1/PD-L1 상호작용에 대한 PD-L1 항체의 효과
프로메가(Promega) (미국 매디슨)에 의해 개발된 PD-1/PD-L1 억제 생물검정에서 PD-1 및 PD-L1의 상호작용에 대한 1가 PD-L1 항체 b12-FEALxPD-L1-547-FEAR의 효과를 결정하였다. 이는 다음 2종의 유전자 조작된 세포주로 이루어진 생물발광 세포-기반 검정이다: 인간 PD-1 및 NFAT 반응 요소 (NFAT-RE)에 의해 유도되는 루시페라제 리포터를 발현하는 Jurkat T 세포인 PD-1 이펙터 세포, 및 인간 PD-L1 및 항원-비의존성 방식으로 동족 TCR을 활성화시키도록 설계된 조작된 세포 표면 단백질을 발현하는 CHO-K1 세포인 PD-L1 aAPC/CHO-K1 세포. 2종의 세포 유형이 공동-배양되는 경우, PD-1/PD-L1 상호작용은 TCR 신호전달 및 NFAT-RE-매개 발광을 억제한다. PD-1/PD-L1 상호작용을 차단하는 항체의 첨가는 억제 신호를 방출하고, TCR 활성화 및 NFAT-RE-매개 발광을 유발한다.
PD-L1 aAPC/CHO-K1 세포 (프로메가, 카탈로그 번호 J109A)를 제조업체의 프로토콜에 따라 해동시키고, 10% 태아 소 혈청 (FBS; 프로메가, 카탈로그 번호 J121A)을 함유하는 햄 F12 배지 (프로메가, 카탈로그 번호 J123A) 중에 재현탁시키고, 96 웰 편평 바닥 배양 플레이트 (컬쳐플레이트-96, 퍼킨 엘머(Perkin Elmer), 카탈로그 번호 6005680)에 플레이팅하였다. 플레이트를 37℃, 5% CO2에서 16시간 동안 인큐베이션하였다. 상청액을 제거하고, 항체의 연속 희석물 (5 내지 0.001 μg/mL 범위의 최종 농도; 1% 태아 소 혈청 [FBS; 프로메가, 카탈로그 번호 J121A]을 함유하는 RPMI 1640 [론자, 카탈로그 번호 BE12-115F] 중 4배 희석물)을 첨가하였다. PD-1 이펙터 세포 (프로메가, 카탈로그 번호 J115A; 제조업체의 프로토콜에 따라 해동되고 RPMI/1% FBS 중에 재현탁됨)를 첨가하였다. 플레이트를 37℃, 5% CO2에서 6시간 동안 인큐베이션하였다. 실온으로 평형화시킨 후, 40 μl 바이오-글로 시약 (제조업체의 프로토콜에 따라 바이오-글로 루시페라제 검정 완충제 [프로메가, 카탈로그 번호 G7198] 중에 재구성된 바이오-글로 루시페라제 검정 기질 [프로메가 카탈로그 번호 G720B])을 각각의 웰에 첨가하였다. 플레이트를 실온에서 5-10분 동안 인큐베이션하고, 엔비전 다중표지 판독기 (퍼킨엘머)를 사용하여 발광을 측정하였다. 대조군 (항체 첨가 부재) 대비 PD1-PD-L1 상호작용에 대한 효과를 하기와 같이 계산하였다:
배수 유도 = RLU (유도-배경)/RLU (항체 부재 대조군-배경), RLU는 상대 광 단위이다.
도 5는 1가 항체 b12-FEALxPD-L1-547-FEAR이 PD1-PD-L1 상호작용을 효율적으로 억제하였다는 것을 보여준다.
실시예 7: PD-L1 및 CD137에 결합하는 이중특이적 항체에 의한 효과를 측정하기 위한 항원-특이적 CD8+ T 세포 증식 검정
CD137xPD-L1 이중특이적 항체의 예상되는 작용 방식의 개략적 표현이 도 6에 제시된다.
항원-특이적 검정에서 PD-L1 및 CD137을 표적화하는 이중특이적 항체에 의한 T 세포 증식의 유도를 측정하기 위해, 수지상 세포 (DC)를 클라우딘-6의 시험관내 전사된 RNA (IVT-RNA)로 형질감염시켜 클라우딘-6 항원을 발현시켰다. T 세포를 PD-1 IVT-RNA 및 클라우딘-6-특이적, HLA-A2-제한된 T 세포 수용체 (TCR)로 형질감염시켰다. 이러한 TCR은 DC 상의 HLA-A2에 제시된 클라우딘-6-유래 에피토프를 인식할 수 있다. CD137xPD-L1 이중특이적 항체는 단핵구-유래 수지상 세포 상 또는 종양 세포 상에서 내인성으로 발현된 PD-L1 및 T 세포 상의 CD137을 가교시켜, 억제 PD-1/PD-L1 상호작용의 억제 및 동시에 CD137의 클러스터링을 유도하여, T 세포 증식을 유발할 수 있다. T 세포 상에서 발현된 CD137 수용체의 클러스터링은 CD137 수용체의 활성화를 유도하여, T 세포에 공동-자극 신호를 전달한다.
건강한 공여자로부터 HLA-A2+ 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 수득하였다 (독일 마인츠 소재 대학 병원 수혈센터). 항-CD14 마이크로비드 (밀테니(Miltenyi); 카탈로그 번호 130-050-201)를 제조업체의 지침에 따라 사용하여 자기-활성화 세포 분류 (MACS) 기술에 의해 PBMC로부터 단핵구를 단리하였다. 향후 T-세포 단리를 위해 말초 혈액 림프구 (PBL, CD14-음성 분획)를 동결시켰다. 미성숙 DC (iDC)로의 분화를 위해, 1x106개 단핵구/ml을, 5% 인간 AB 혈청 (시그마-알드리치 케미 게엠베하(Sigma-Aldrich Chemie GmbH), 카탈로그 번호 H4522-100ML), 피루브산나트륨 (라이프 테크놀로지스 게엠베하(Life technologies GmbH), 카탈로그 번호 11360-039), 비-필수 아미노산 (라이프 테크놀로지스 게엠베하, 카탈로그 번호 11140-035), 100 IU/mL 페니실린-스트렙토마이신 (라이프 테크놀로지스 게엠베하, 카탈로그 번호 15140-122), 1000 IU/mL 과립구-대식세포 콜로니-자극 인자 (GM-CSF; 밀테니, 카탈로그 번호 130-093-868) 및 1,000 IU/mL 인터류킨-4 (IL-4; 밀테니, 카탈로그 번호 130-093-924)를 함유하는 RPMI 글루타맥스 (라이프 테크놀로지스 게엠베하, 카탈로그 번호 61870-044) 중에서 5일 동안 배양하였다. 이들 5일 동안, 배지의 절반을 신선한 배지로 대체하였다. 비-부착 세포를 수집함으로써 iDC를 수거하고, 부착 세포를 37℃에서 10분 동안 2mM EDTA를 함유하는 PBS와 함께 인큐베이션함으로써 탈착시켰다. 세척 후에, 향후 항원-특이적 T 세포 검정을 위해 10% v/v DMSO (어플라이켐 게엠베하(AppliChem GmbH), 카탈로그 번호 A3672,0050) + 50% v/v 인간 AB 혈청을 함유하는 RPMI 글루타맥스 중에서 iDC를 동결시켰다.
항원-특이적 CD8+ T 세포 증식 검정을 시작하기 1일 전에, 동일한 공여자로부터의 동결된 PBL 및 iDC를 해동시켰다. 항-CD8 마이크로비드 (밀테니, 카탈로그 번호 130-045-201)를 제조업체의 지침에 따라 사용하여 MACS 기술에 의해 PBL로부터 CD8+ T 세포를 단리하였다. 약 10-15 x 106개의 CD8+ T 세포에 BTX ECM® 830 전기천공 시스템 장치 (BTX; 500 V, 1 x 3 ms 펄스)를 사용하여 4-mm 전기천공 큐벳 (VWR 인터내셔널 게엠베하, 카탈로그 번호 732-0023) 내 250 μL X-Vivo15 (바이오짐 사이언티픽 게엠베하(Biozym Scientific GmbH), 카탈로그 번호 881026) 중에서 클라우딘-6-특이적 뮤린 TCR (HLA-A2-제한; WO 2015150327 A1에 기재됨)의 알파-쇄를 코딩하는 시험관내 번역된 (IVT)-RNA 10 μg 플러스 베타-쇄를 코딩하는 IVT-RNA 10 μg 플러스 PD-1을 코딩하는 IVT-RNA 10 μg을 전기천공으로 도입하였다. 전기천공 직후, 세포를 5% 인간 AB 혈청이 보충된 신선한 IMDM 배지 (라이프 테크놀로지스 게엠베하, 카탈로그 번호 12440-061) 내로 옮기고, 37℃, 5% CO2에서 적어도 1시간 동안 휴지시켰다. PBS 중 1.6 μM 카르복시플루오레세인 숙신이미딜 에스테르 (CFSE; 인비트로젠(Invitrogen), 카탈로그 번호 C34564)를 제조업체의 지침에 따라 사용하여 T 세포를 표지하고, 5% 인간 AB 혈청이 보충된 IMDM 배지 중에서 밤새 인큐베이션하였다.
5 x 106개 이하의 해동된 iDC에 상기 기재된 바와 같은 전기천공 시스템 (300 V, 1x12 ms 펄스)을 사용하여 250 μL X-Vivo15 배지 중에서 전장 클라우딘-6을 코딩하는 IVT-RNA 5 μg을 전기천공으로 도입하고, 5% 인간 AB 혈청이 보충된 IMDM 배지 중에서 밤새 인큐베이션하였다.
다음 날, 세포를 수거하였다. DC 상의 클라우딘-6 및 PD-L1 및 T 세포 상의 TCR 및 PD-1의 세포 표면 발현을 유동 세포측정법에 의해 검사하였다. DC를 알렉사647-접합된 CLDN6-특이적 항체 (비-상업적으로 입수가능함; 사내 생산) 및 항-인간 CD274 항체 (PD-L1, 이바이오사이언스(eBioscience), 카탈로그 번호 12-5983)로 염색하고, T 세포를 항-마우스 TCR β 쇄 항체 (벡톤 디킨슨 게엠베하(Becton Dickinson GmbH), 카탈로그 번호 553174) 및 항-인간 CD279 항체 (PD-1, 이바이오사이언스, 카탈로그 번호 17-2799)로 염색하였다. 5,000개의 전기천공된 DC를 96-웰 둥근 바닥 플레이트 내 5% 인간 AB 혈청이 보충된 IMDM 글루타맥스 중에서 이중특이적 또는 대조군 항체의 존재 하에 50,000개의 전기천공된 CFSE-표지된 T 세포와 함께 인큐베이션하였다. 5일 후 T 세포 증식을 유동 세포측정법에 의해 측정하였다. 플로우조 소프트웨어에 의해 세포 분열을 나타내는 CFSE-피크에 기초한 T 세포 증식의 상세한 분석을 수행하였다. 결과에서, '% 분열 세포'는 분열에 이른 세포의 백분율을 나타내고, '증식 지수'는 분열에 이른 세포의 평균 분열 수를 나타낸다.
1개의 비관련 결합-아암을 갖는 1가 PD-L1-대조군 항체인 b12-FEALxPD-L1-547-FEAR은 b12 (정규 IgG1로서)와의 인큐베이션과 비교하여 특정 정도로 T 세포 증식을 증진시켰고, 이중특이적 항체 CD137-009-FEALxPD-L1-547-FEAR은 CD8+ T 세포의 강한 증식을 유도하였다 (도 7). 이는 분열 세포 백분율의 증가 (도 7B 및 D 좌측 패널), 뿐만 아니라 증식 지수의 증가 (도 7B 및 D 우측 패널) 둘 다에 의해 반영되었다.
추가로, 본 검정에서 CD137-009-FEALxPD-L1-547-FEAR에 대해 EC50 값을 결정하였다. 이를 위해, 이중특이적 항체를 1 내지 0.00015 μg/mL의 3배 연속 희석물로 분석하였다 (도 8). 분열 세포의 백분율 및 증식 지수를 플로우조 소프트웨어에 의해 결정하였다. 그래프패드 프리즘 5 소프트웨어 (그래프패드 소프트웨어, 미국 캘리포니아주 샌디에고)를 사용하여 비-선형 회귀 (가변 기울기를 갖는 S자형 용량-반응)에 의해 곡선을 분석하였다. CD137-009-FEALxPD-L1-547-FEAR의 항원-특이적 T 세포 증식 유도의 EC50 값은 '% 분열 세포'에 대해 0.003492 μg/mL 및 '증식 지수'에 대해 0.005388 μg/mL였다.
실시예 8: 활성 PD1/PD-L1 축을 갖는 항원-특이적 T-세포 검정에서 PD-L1 및 CD137을 표적화하는 이중특이적 항체와 2종의 1가 결합 CD137 및 PD-L1 항체의 조합 또는 2종의 모 항체의 조합 (PD-L1-547 + CD137-009)과의 비교
PD-L1 및 CD137을 표적화하는 이중특이적 항체에 의한 T 세포 증식의 유도를 측정하기 위해, 활성 PD1/PD-L1 축을 갖는 항원-특이적 T 세포 증식 검정을 수행하였다 (실시예 7과 유사한 일반적 검정 설정). 간략하게, 5,000개의 클라우딘-6-IVT-RNA 전기천공된 DC를, 96-웰 둥근 바닥 플레이트 내 5% 인간 AB 혈청이 보충된 IMDM 글루타맥스 중에서 이중특이적 또는 대조군 항체의 존재 하에 50,000개의 클라우딘-6-특이적 TCR- 및 PD1-IVT-RNA 전기천공된 CFSE-표지된 T 세포와 함께 인큐베이션하였다. 5일 후 T 세포 증식을 유동 세포측정법에 의해 측정하였다. 플로우조 소프트웨어를 사용하여 세포 분열을 나타내는 CFSE-피크에 기초한 T 세포 증식의 상세한 분석을 수행하였다. 결과에서, '% 분열 세포'는 분열에 이른 세포의 백분율을 나타내고, '증식 지수'는 분열에 이른 세포의 평균 분열 수를 나타낸다.
1개의 비관련 결합-아암을 갖는 1가 CD137-대조군 항체 CD137-009-FEALxb12-FEAR 및 상응하는 2가 모 항체 CD137-009는 둘 다 IgG1-b12와 비교하였을 때 T 세포 증식에 영향을 미치지 않았다. 대조적으로, 1가 PD-L1-대조군 항체뿐만 아니라 2가 모 항체 (각각 b12-FEALxPD-L1-547-FEAR 및 PD-L1-547)와의 인큐베이션은 IgG1-b12 대조군 항체와의 인큐베이션과 비교하여 중간 정도로 증진된 T-세포 증식을 유도하였다. 조합된 1가 대조군 항체 (CD137-009-FEALxb12-FEAR + b12-FEALxPD-L1-547-FEAR) 및 조합된 상응하는 모 항체 (CD137-009 + PD-L1-547)와의 인큐베이션시 대등한 수준의 T-세포 증식이 검출가능하였다. 대조적으로, 이중특이적 항체 CD137-009-FEALxPD-L1-547-FEAR은 CD8+ T 세포의 강한 증식을 유도하였으며, 이는 조합된 대조군 (1가 및 2가) 둘 다보다 우수하였다 (도 9). 이는 분열 세포 백분율의 증가 (도 9B) 뿐만 아니라 증식 지수의 증가 (도 9C) 둘 다에 의해 반영되었다.
실시예 9: 종양 침윤 림프구에 대한 CD137xPD-L1 이중특이적 항체의 효과를 평가하기 위한 생체외 TIL 확장 검정.
종양 침윤 림프구 (TIL)에 대한 CD137-009-FEALxPD-L1-547-FEAR의 효과를 평가하기 위해, 인간 종양 조직의 생체외 배양을 하기와 같이 수행하였다. 단리된 종양 덩어리를 세척 배지를 함유하는 6-웰 플레이트 (피셔 사이언티픽(Fisher Scientific) 카탈로그 번호 10110151) 내의 한 웰에서 다음 웰로 스패튤라 또는 혈청학적 피펫을 사용하여 옮김으로써 신선한 인간 종양 조직 절제 시편을 3회 세척하였다. 세척 배지는 1% Pen/Strep (써모 피셔(Thermo Fisher), 카탈로그 번호 15140-122) 및 1% 푼기존 (써모 피셔, 카탈로그 번호 15290-026)이 보충된 X-VIVO 15 (바이오짐, 카탈로그 번호 881024)로 구성되었다. 이어서, 수술용 나이프 (브라운/로스(Braun/Roth), 카탈로그 번호 5518091 BA223)를 사용하여 종양을 절개하고, 직경이 약 1-2 mm인 조각으로 절단하였다. 2개의 조각을 각각 1 mL TIL 배지 (X-VIVO 15, 10% 인간 혈청 알부민 (HSA, CSL 베링(CSL Behring), 카탈로그 번호 PZN-6446518), 1% Pen/Strep, 1% 푼기존 및 10 U/mL IL-2 (프로류킨®S, 노파르티스 파마(Novartis Pharma), 카탈로그 번호 02238131)가 보충됨)를 함유하는 24-웰 플레이트 (VWR 인터내셔널, 카탈로그 번호 701605)의 1개의 웰 내에 넣었다. CD137-009-FEALxPD-L1-547-FEAR을 나타낸 최종 농도로 첨가하였다. 배양 플레이트를 37℃ 및 5% CO2에서 인큐베이션하였다. 72시간 후에, 나타낸 농도의 이중특이적 항체를 함유하는 신선한 TIL 배지 1 mL를 각각의 웰에 첨가하였다. 웰을 격일로 TIL 클러스터의 발생에 대해 현미경을 통해 모니터링하였다. 각각의 웰에서 25개 초과의 TIL 마이크로클러스터가 검출되었을 때 웰을 개별적으로 옮겼다. TIL 배양물을 분할하기 위해, 24-웰 플레이트의 웰 내의 세포를 2 mL 배지 중에 재현탁시키고, 6-웰 플레이트의 웰 내로 옮겼다. 각각의 웰을 추가로 또 다른 2 mL의 TIL 배지로 보충하였다.
10-14일의 총 배양 기간 후에, TIL을 수거하고, 유동 세포측정법에 의해 분석하였다. 세포를 염색 완충제 (5% FCS 및 5 mM EDTA를 함유하는 D-PBS) 중에 모두 1:50으로 희석된 하기 시약에 의해 염색하였다: 항-인간 CD4-FITC (밀테니 바이오텍(Miltenyi Biotec), 카탈로그 번호 130-080-501), 항-인간 CD3-PE-Cy7 (비디 파밍겐(BD Pharmingen), 카탈로그 번호 563423), 7-아미노악티노마이신 D (7-AAD, 베크만 쿨터(Beckman Coulter), 카탈로그 번호 A07704), 항-인간 CD56-APC (이바이오사이언스, 카탈로그 번호 17-0567-42), 및 항-인간 CD8-PE (TONBO, 카탈로그 50-0088). 상이한 처리군들 사이에서의 획득된 세포의 정량적 비교를 가능하게 하기 위해, 세포 펠릿을 마지막 세척 단계 후에 비디™ 콤프비즈(CompBeads) (비디 바이오사이언시스(BD biosciences), 카탈로그 번호 51-90-9001291)가 보충된 FACS-완충제 중에 재현탁시켰다. 비디 FACS칸토(FACSCanto)™ II 유동 세포측정기 (벡톤 디킨슨) 상에서 유동 세포측정 분석을 수행하고, 획득된 데이터를 플로우조 7.6.5 소프트웨어를 사용하여 분석하였다. 6-웰 플레이트 내의 상응하는 웰과 상관관계가 있는 1,000개 비드당 상대 생존 TIL 수, CD3+CD8+ T 세포 수, CD3+CD4+ T 세포 수 및 CD3-CD56+ NK 세포 수를 획득된 비드 수에 대한 획득된 7AAD-음성 세포 분획의 정규화에 의해 계산하였다.
도 10은 인간 비소세포 폐 암종 조직 시편으로부터의 TIL 확장의 분석을 보여준다. 여기서, 하기 농도: 0.01, 0.1 및 1 μg/mL의 CD137-009-FEALxPD-L1-547-FEAR을 첨가하였으며; 항체 첨가가 없는 동일한 환자로부터의 조직 시편은 음성 대조군으로서의 역할을 하였다. 10일의 배양 후에, TIL을 수거하고, 유동 세포측정법에 의해 분석하였다. 24-웰 플레이트의 상이한 웰로부터 유래된 각각의 항체 농도에 대한 5개의 샘플 (5개의 원래 웰로부터)을 측정하였다. 이중특이적 항체와 함께 배양된 모든 샘플에서, TIL의 생존 수는 항체가 없는 대조군 샘플과 비교하여 유의하게 증가하였다. 전체적으로, 0.1 μg/mL CD137-009-FEALxPD-L1-547-FEAR을 배양물에 첨가하였을 때, 생존 TIL의 최대 10배 확장이 관찰되었다 (도 10A). CD3+CD4+ T 헬퍼 세포는 단지 약간만 확장되었고 (도 10C; 2.8배 확장), 반면 대조적으로, CD3-CD56+ NK 세포에 대해 가장 두드러진 TIL 확장이 관찰되었다 (도 10D; 대조군에 비해 최대 64배 확장). 또한, CD3+CD8+ 세포독성 T 림프구 (CTL)에 대해 강한 효과가 관찰되었다 (도 10B; 대조군에 비해 7.4배 확장).
실시예 10: OT-I CD8+ 입양 T 세포 전달 후 C57BL/6 마우스에서의 오브알부민 특이적 T 세포 증식에 대한 mPD-L1 및 mCD137에 결합하는 대용 이중특이적 마우스 항체의 효과
제어된 Fab-아암 교환을 기초로 뮤린 이중특이적 항체를 생성하는 방법을 사용하여, 대용 마우스 이중특이적 항체 mCD137-3H3xmPD-L1-MPDL3280A, mCD137-3H3xb12 및 mPD-L1-MPDL3280Axb12를 생성하였다 (Labrijn et al., 2017 Sci Rep. 7(1): 2476 및 WO2016097300).
마우스 4-1BB에 결합하는 모노클로날 항체 3H3을 바이오엑셀(BioXcell) (카탈로그 번호 BE0239)로부터 입수하고, 단백질을 프롯테크(ProtTech)에서 서열분석하였다. 추론된 cDNA 서열을 독점적 방법을 사용하여 제외시켰다. 중쇄 및 경쇄의 가변 영역을 유전자 합성하고, 하기 아미노산 돌연변이: L234A, L235A, F405L 및 R411T를 함유하는 뮤린 IgG2a 불변 영역을 포함하는 마우스 IgG2a 발현 벡터 내로 클로닝하였다. 유사하게, b12의 가변 영역을 이러한 발현 벡터 내로 클로닝하였다.
항체 MPDL3280A (각각 서열식별번호: 50 및 51에 제시된 중쇄 및 경쇄 가변 서열)는 인간 및 마우스 PD-L1 둘 다에 결합하는 것으로 기재되었다. 이 항체의 중쇄 및 경쇄의 가변 영역을 하기 아미노산 돌연변이: L234A, L235A, T370K 및 K409R을 함유하는 뮤린 IgG2a 불변 영역을 포함하는 마우스 IgG2a 발현 벡터 내로 클로닝하였다.
이중특이적 마우스 (본질적으로 래트-인간-마우스 키메라) 항체를 상기 기재된 바와 같이 제어된 환원 조건 하에서 Fab-아암-교환에 의해 생성하였다.
17 내지 24 g의 체중을 갖는 6-8주령의 암컷 C57BL/6JOlaHsd 마우스 (엔비고 RMS 게임베하(Envigo RMS GmbH), 독일 로스도르프)를 연구 등록 전 적어도 6일 동안 동물 시설에 순응시켰다. 이들 마우스를 수용자로서 사용하였다. OT-1 및 Thy1.1 대립유전자 둘 다에 대해 동형접합인 암컷 또는 수컷 C57BL/6 Thy1.1 x C57BL/6J OT-1 마우스를 사내 사육하고 (C57BL/6-Tg(TcraTcrb)1100Mjb/Crl 및 B6.PL-Thy1a/CyJ 마우스로부터 교배-사육), 공여자로서 사용하였다. 마우스는 음식물 (오토클레이브가능한 스니프(ssniff) M-Z, 독일 조스트) 및 멸균수에 자유롭게 접근하였고, 22℃ ± 2℃에서 55% ± 15%의 상대 습도로 12시간 명/암 주기 하에 수용하였다.
연구 시작일에, C57BL/6 Thy1.1 x C57BL/6J OT-1 공여자 마우스를 희생시키고, 비장을 단리하였다. 비장을 기계적으로 해리시키고, 비장세포 펠릿을 적혈구-용해 완충제 (8.25 g/L NH4Cl, 1 g/L KHCO3, 0.1 mM EDTA, pH7)로 재현탁시킴으로써 적혈구를 용해시켰다. 후속적으로, 둘베코 PBS (DPBS)로 비장세포를 세척하고, 마우스 CD8a (Ly-2) 마이크로비드를 오토맥스 프로(autoMACS Pro) 분리기와 조합하여 사용함으로써 (둘 다 독일 베르기슈 글라트바흐 소재 밀테니 바이오텍 게엠베하) CD8+ T 세포를 단리하였다. CD8+/OT-1+/Thy1.1+ T 세포 (2.5-5x105개 세포)를 C57BL/6JOlaHsd 수용자 마우스당 200 μL의 총 부피로 안와후로 주사하였다. 입양 세포 전달 다음 날, 수용자 마우스를 항원 자극으로서 100 μg 오브알부민/200 μL PBS에 의해 안와후로 '백신접종'하였다. 6시간 후, 마우스를 각각의 이중특이적 항체에 의해 안와후로 처리하였다. 상세하게, 마우스당 100 μg 또는 20 μg mCD137-3H3xmPD-L1-MPDL3280A, mCD137-3H3xb12 또는 mPD-L1-MPDL3280Axb12 항체를 주사하였다. 기준선 참조로서 순 PBS 주사를 사용하고, 음성 대조군으로서 비처리 동물 (공여자 세포만을 받은 마우스)을 사용하였다. 6일 후, 100 μL 혈액을 안와후 경로를 통해 채취하고, V500 래트 항-마우스 CD45 (벡톤 디킨슨 게엠베하, 카탈로그 번호 561487), FITC 래트 항-마우스 CD8a (라이프 테크놀로지스, 카탈로그 번호 MCD0801) 및 알렉사 플루오르 647 항-래트 CD90/마우스 CD90.1 (바이오레전드 유럽(BioLegend Europe), 카탈로그 번호 202508) 항체를 사용하여 비디 FACS칸토 II 세포측정기 (벡톤 디킨슨 게엠베하) 상에서 Thy1.1+CD8+ T 세포에 대해 분석하였다. OT-1 특이적 T 세포에 대한 대용물로서 양성 Thy1.1 (CD90.1)을 사용하였다.
도 11A는 OT-1 입양 T-세포 전달 검정 윤곽의 개략적 표현이다. 도 11B는 유동 세포측정법에 의해 결정된 Thy1.1+ CD8+ T-세포 빈도의 분석을 보여준다. 각각의 이중특이적 항체 치료 양식에 대해, n=5 마우스를 사용하였다. 오브알부민 항원 자극 단독은 비처리 동물과 비교하여 Thy1.1+ CD8+ T-세포 빈도의 검출가능한 증가를 유도하였다. 흥미롭게도, 1개의 비관련 b12 결합-아암을 갖는 1가 대조군 항체인 mCD137-3H3-xb12 및 mPD-L1-MPDL3280Axb12는 둘 다 오브알부민만으로 처리된 동물과 비교하여 오브알부민-특이적 OT-1 T-세포 확장을 부스팅할 수 없었다. 대조적으로, 이중특이적 항체 mCD137-3H3xmPD-L1-MPDL3280A는 시험된 두 용량 수준 (20 및 100 μg 항체)에서 10-20% CD8+/OT-1+/Thy1.1+ T-세포 (총 T 세포 집단의 %)의 T-세포 빈도를 나타내는 OT-1 T 세포의 강한 증식을 유도할 수 있었다.
실시예 11: 피하 동계 CT26 마우스 종양 모델에서 종양 성장에 대한 mPD-L1 및 mCD137에 결합하는 대용 이중특이적 마우스 항체 결합의 효과
17 내지 24 g의 체중을 갖는 6-8주령의 암컷 BALB/c Rj 마우스 (장비에(Janvier), 프랑스 제네스트-St.-아일)를 연구 등록 전 적어도 6일 동안 순응시켰다. 마우스는 음식물 (오토클레이브가능한 스니프 M-Z, 독일 조스트) 및 멸균수에 자유롭게 접근하였고, 22℃ ± 2℃에서 55% ± 10%의 상대 습도로 12시간 명/암 주기 하에 수용하였다. CT26 세포를 ATCC® (카탈로그 번호 CRL-2638™)로부터 입수하고, 37℃에서 5% CO2 하에 10% 태아 소 혈청 (FBS) (바이오크롬, 카탈로그 번호 S 0115)이 보충된 로스웰 파크 메모리얼 인스티튜트 배지 (RPMI) 1640 배지인 글루타맥스™ (라이프 테크놀로지스, 카탈로그 번호 61870-044)에서 배양하였다. 세포를 스템프로(StemPro)® 아큐타제(Accutase)® 세포 해리 시약 (라이프 테크놀로지스, 카탈로그 번호 A1110501)을 사용하여 수거하고, DPBS (라이프 테크놀로지스, 카탈로그 번호 14190-169) 중에 재현탁시키고, 마우스당 0.5 x 106개 세포/100 μl를 암컷 BALB/c Rj 마우스의 우측 면도된 측복부 내에 피하로 (SC) 이식하였다. 종양 부피를 2-3일마다 캘리퍼 측정에 의해 평가하고, 하기 식을 사용하여 수직 직경의 곱으로서 표현하였다: a2 x b/2 (여기서 b는 2개의 직경 중 더 긴 것임 (a<b)). 30 mm3의 평균 종양 부피에 도달하였을 때 동물을 4개의 군으로 계층화하였다. 다음 날 mPD-L1 및 mCD137에 결합하는 이중특이적 항체 (mCD137-3H3xmPD-L1-MPDL3280A) 20 μg, 1개의 비관련 결합 아암을 갖는 1가 mCD137- 또는 mPD-L1-대조군 항체 (mCD137-3H3xb12 및 mPD-L1-MPDL3280Axb12), 또는 음성 대조군으로서의 PBS를 복강내 주사하여 처리를 시작하였다. 투여 스케줄은 처음 8회 주사에 대해 2-3일마다, 이어서 실험 종료시까지 7일마다의 주사였다. 종양 세포 접종 후 제29일에, 100 μL 혈액을 안와후 경로를 통해 채취하고, V500 래트 항-마우스 CD45 (벡톤 디킨슨 게엠베하, 카탈로그 번호 561487), FITC 래트 항-마우스 CD8α (라이프 테크놀로지스, 카탈로그 번호 MCD0801) 항체 및 T-셀렉트 H-2Ld MuLV gp70 사량체-SPSYVYHQF-APC (MBL Ltd. Corp., 카탈로그 번호 TS-M521-2)를 사용하여 비디 FACS칸토 II 세포측정기 (벡톤 디킨슨 게엠베하) 상에서 gp70-특이적 CD8+ T 세포 (gp70은 CT26 종양 세포 상에서 발현된 외피 단백질임)에 대해 분석하였다.
도 12A는 단일 종양/마우스를 나타내는 개별 세포주를 사용한 모든 4개의 처리군에 대한 종양 성장 곡선을 보여준다. 각각의 처리군에 대한 무진행 생존 (PFS) 빈도는 각각의 플롯의 하단에 제공된다. 도 12B는 종양 세포 접종 후 제71일에서 실험 종료시까지의 상응하는 카플란-마이어 생존 곡선을 나타낸다. 도 12C는 유동 세포측정법에 의해 결정된 gp70 사량체+ CD8+ T-세포 빈도의 분석을 보여준다. 각각의 치료 양식에 대해, 종양 세포 이식 후 제29일에 여전히 살아있는 모든 마우스를 분석하였다. 요약하면, mPD-L1 및 mCD137에 결합하는 이중특이적 항체 (mCD137-3H3xmPD-L1-MPDL3280A)가 가장 효율적인 종양 제어를 제공하였고 10마리 중 5마리 (즉 50%) 동물이 완전한 종양 퇴행으로 진행되었다. 비교하면, mCD137-3H3xb12 대조군에 대해서는 약간 더 약하지만 여전히 현저한 항종양 효과가 관찰되었고; 처리는 11마리 중 3마리 (즉 27%) 동물이 종양을 거부할 수 있도록 하였다. 두 경우에서, 완전 완화 상태로 진행된 모든 마우스는 실험 종료시까지 무종양 상태로 유지되었다. 현저하게 대조적으로, mPD-L1-MPDL3280Axb12-처리된 코호트뿐만 아니라 PBS 대조군은 둘 다 종양 부담을 제어할 수 없었고, mPD-L1-MPDL3280Axb12-처리는 종양 세포 접종 후 제15일 내지 제30일에 11마리 중 2마리 (즉 18%) 동물에서 적어도 일부 간헐적 종양 성장 억제를 유도하였다. gp70 사량체에 결합할 수 있는 CD8+ T 세포의 빈도를 조사하였을 때, mCD137-3H3xmPD-L1-MPDL3280A 처리된 동물에서 가장 높은 gp70-특이적 CD8+ T-세포 빈도가 검출가능하였다 (2.14% ± 1.52%). 비교하면, mCD137-3H3xb12 (0.90% ± 0.46%), mPD-L1-MPDL3280Axb12 (0.94% ± 1.06%) 및 PBS-처리된 대조군 동물 (0.66% ± 0.49%)에서의 gp70 사량체+ CD8- T-세포 빈도는 상기 3가지 치료 양식 사이에 단지 최소의 차이만을 가지면서 상당히 더 낮았다.
실시예 12: 종양 세포에 대한 PD-L1 항체 또는 b12xPD-L1 이중특이적 항체의 결합
인간 종양 세포주 MDA-MB-231 (유방 선암종; ATCC; 카탈로그 번호 HTB-26), PC-3 (전립선 선암종; ATCC; 카탈로그 번호 CRL-1435) 및 SK-MES-1 (폐 편평 세포 암종; ATCC; 카탈로그 번호 HTB-58)에 대한 PD-L1 항체 및 b12xPD-L1 이중특이적 항체의 결합을 유동 세포측정법에 의해 분석하였다.
세포 (3-5 x 104개 세포/웰)를 폴리스티렌 96-웰 둥근 바닥 플레이트 (그라이너 바이오-원, 카탈로그 번호 650101)에서 50 μL PBS/0.1% BSA/0.02% 아지드 (FACS 완충제) 중 항체의 연속 희석물 (5배 희석 단계로 0.0001 내지 10 μg/mL 범위)과 함께 4℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. FACS 완충제 중에서 2회 세척한 후, 세포를 2차 항체와 함께 4℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 2차 항체로서, 50 μL FACS 완충제 중에 1:500 희석된 R-피코에리트린 (PE)-접합된 염소-항-인간 IgG F(ab')2 (카탈로그 번호 109-116-098, 잭슨 이뮤노리서치 래보러토리즈, 인크.(Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.), 펜실베니아주 웨스트 그로브)를 모든 실험에 사용하였다. 이어서, 세포를 FACS 완충제 중에서 2회 세척하고, 20 μL FACS 완충제 중에 재현탁시키고, iQue 스크리너 (인텔리사이트 코포레이션(Intellicyt Corporation), 미국) 상에서 분석하였다. 그래프패드 프리즘 V75.04 소프트웨어 (그래프패드 소프트웨어, 미국 캘리포니아주 샌디에고)를 사용하여 비-선형 회귀 (가변 기울기를 갖는 S자형 용량-반응)를 사용하여 결합 곡선을 분석하였다.
MDA-MB-231, PC-3 및 SK-MES-1 세포의 형질 막 상의 항원 밀도를 정량화하기 위해 MPDL3280A (각각 서열식별번호: 50 및 51에 제시된 중쇄 및 경쇄 가변 서열)를 사용하여 문헌 [Poncelet and Carayon, 1985, J. Immunol. Meth. 85: 65-74]에 기재된 바와 같이 정량적 유동 세포측정법 (QIFIKIT®, 다코(Dako); 카탈로그 번호 K0078)을 수행하였다. 세포주는 하기 PD-L1 항원 밀도 (ABC, 항체 결합 용량)를 갖는 것으로 결정되었다:
● MDA-MB-231: 대략 21,000개 ABC/세포
● PC-3: 대략 6,000개 ABC/세포
● SK-MES-1: 대략 30,000개 ABC/세포
MDA-MB-231 세포에 대한 결합
도 13 (A)는 MDA-MB-231 세포에 대한 b12-FEALxPD-L1-547-FEAR의 용량-의존성 결합을 보여주며, 이는 단일특이적 2가 PD-L1-547-FEAR보다 더 높은 최대 결합을 갖는다.
PC-3 세포에 대한 결합
도 13 (B)는 PC3 세포에 대한 b12-FEALxPD-L1-547-FEAR의 용량-의존성 결합을 보여주며, 이는 단일특이적 2가 PD-L1-547-FEAR보다 더 높은 최대 결합을 갖는다.
SK-MES-1 세포에 대한 결합
도 13 (C)는 SK-MES-1 세포에 대한 b12-FEALxPD-L1-547-FEAR의 용량-의존성 결합을 보여주며, 이는 단일특이적 2가 PD-L1-547-FEAR보다 더 높은 최대 결합을 갖는다.
실시예 13: PD-L1 및 CD137에 결합하는 이중특이적 항체의 효과를 측정하기 위한 비-항원-특이적 T-세포 증식 검정
PD-L1xCD137 이중특이적 항체의 예상되는 작용 방식의 개략적 표현이 도 6에 제시된다.
폴리클로날로 활성화된 T 세포에서의 T-세포 증식의 유도를 측정하기 위해, PBMC를 준최적 농도의 항-CD3 항체 (클론 UCHT1)와 함께, PD-L1-547-FEALxCD137-009-HC7LC2-FEAR 이중특이적 항체 또는 대조군 항체와 조합하여 인큐베이션함으로써 T 세포를 활성화시켰다. PBMC 집단 내에서, PD-L1을 발현하는 세포는 이중특이적 항체의 PD-L1-특이적 아암에 의해 결합될 수 있고, 반면 상기 집단 내의 T 세포는 CD137-특이적 아암에 의해 결합될 수 있다. 이 검정에서, T-세포 증식은 이중특이적 항체를 통한 PD-L1-발현 세포와의 가교 및 PD-L1:PD-1 상호작용의 차단에 의해 유도되는, CD137-특이적 아암을 통한 T 세포의 트랜스-활성화에 대한 척도이고, T-세포 증식으로서 측정된다.
PBMC를 피콜 구배 (VWR, 카탈로그 번호 17-5446-02)를 사용하여 건강한 공여자의 백혈구 연층 (독일 마인츠 소재 대학 병원 수혈센터)으로부터 수득하였다. PBS 중 1.6 μM 카르복시플루오레세인 숙신이미딜 에스테르 (CFSE) (써모 피셔, 카탈로그 번호 C34564)를 제조업체의 지침에 따라 사용하여 PBMC를 표지하였다. 96-웰 둥근 바닥 플레이트 (시그마 알드리치, CLS3799-50EA)에 웰당 75,000개의 CFSE-표지된 PBMC를 시딩하고, 5% 인간 AB 혈청이 보충된 150 μL IMDM 글루타맥스 중에서, 준최적 T 세포 증식을 유도하기 위해 각각의 공여자에 대해 미리 결정된 준최적의 농도의 항-CD3 항체 (알앤디 시스템즈, 클론 UCHT1, 카탈로그 번호 MAB100; 0.03-0.1 μg/mL 최종 농도) 및 이중특이적 또는 대조군 항체와 함께 37℃, 5% CO2에서 4일 동안 인큐베이션하였다. CD4+ 및 CD8+ T 세포의 증식을 본질적으로 상기 기재된 바와 같이 유동 세포측정법에 의해 분석하였다. FACS 완충제 중 PE-표지된 CD4 항체 (비디 바이오사이언시스, 카탈로그 번호 555347; 1:80 최종 희석), PE-Cy7-표지된 CD8α 항체 (클론 RPA-T8, 이바이오사이언스, 카탈로그 번호 25-0088-41; 1:80 최종 희석), APC-표지된 CD56 항체 (이바이오사이언스, 카탈로그 번호 17-0567; 1:80 최종 희석) 및 7-AAD (베크만 쿨터, 카탈로그 번호 A07704; 1:80 최종 희석)를 함유하는 30 μL를 사용하여 세포를 염색하고, CD56+ 자연 킬러 (NK) 세포 및 7-AAD+ 사멸 세포를 분석에서 제외시켰다. 샘플을 비디 FACS칸토 II 유동 세포측정기 (비디 바이오사이언시스) 상에서 증식 판독값으로 측정하였다. 세포 분열을 나타내는 CFSE-피크에 기초한 T-세포 증식의 상세한 분석을 플로우조 10.4 소프트웨어에 의해 수행하고, 나온 확장 지수 값을 사용하여 그래프패드 프리즘 버전 6.04 (그래프패드 소프트웨어, 인크.)에서 용량-반응 곡선에 플롯팅하였다. 확장 지수는 전체 배양물의 배수-확장을 결정하며; 확장 지수 2.0은 세포 수의 배가를 나타내고, 반면 확장 지수 1.0은 전체 세포 수의 변화가 없음을 나타낸다.
자극을 위한 2가지 상이한 항-CD3 농도 및 항-CD3이 없는 대조군을 시험하면서 3명의 상이한 공여자로부터의 PBMC를 분석하였다. 도 14는 이중특이적 항체 PD-L1-547-FEALxCD137-009-HC7LC2-FEAR이 CD4+ 및 CD8+ T 세포 둘 다의 강한 확장을 유도하였다는 것을 보여준다. 1가 CD137-대조군 항체인 하나의 비관련 아암을 갖는 b12-FEALxCD137-009-HC7LC2-FEAR 및 상응하는 2가 모 항체 CD137-009-HC7LC2-FEAR은 이소형 대조군 항체 b12 IgG와의 인큐베이션과 비교하였을 때 CD4+ (A) 또는 CD8+ (B) T-세포 증식에 영향을 미치지 않았다. 1가 PD-L1-대조군 항체뿐만 아니라 2가 모 항체 (각각 b12-FEALxPD-L1-547-FEAR 및 PD-L1-547-FEAR)는, 항-CD3에 의한 PBMC 자극이 이미 강한 T 세포 활성화를 유발하였을 때에만 (배지 단독 대조군에서 더 높은 확장 지수에 의해 관찰된 바와 같이) [공여자 1의 0.1 μg/ml 항-CD3 자극 참조]), b12 IgG와 비교하여 T-세포 증식을 약간 증진시켰다. 또한 조합된 1가 대조군 항체 (b12-FEALxCD137-009-HC7LC2-FEAR + b12-FEALxPD-L1-547-FEAR) 및 조합된 상응하는 모 항체 (CD137-009-HC7LC2-FEAR + PD-L1-547-FEAR)에 대해 1가 및 2가 PD-L1 대조군 항체와 대등한 T-세포 증식의 수준이 검출가능하였다. 그러나, 이중특이적 PD-L1-547-FEALxCD137-009-HC7LC2-FEAR 항체에 의해 유도된 증식의 증진은 조합된 대조군 둘 다 (1가 및 2가)보다 우수하였다 (도 14).
또 다른 독립적 연구에서 0.03 및 0.09 μg/mL 항-CD3에 의해 준최적으로 자극시킨, 2명의 공여자로부터 수득된 PBMC를 사용하여 PD-L1-547-FEALxCD137-009-HC7LC2-FEAR에 대한 EC50 값을 결정하였다. 1 μg/mL에서 시작하여 0.15 ng/mL에서 끝나는 연속 희석물을 사용하여 PD-L1-547-FEALxCD137-009-HC7LC2-FEAR을 검정하고, 이소형 대조군 항체로서 1 μg/mL의 b12-IgG-FEAL을 포함시켰다. CD4+ 및 CD8+ T-세포의 증식에 대해, 용량-반응 곡선을 생성하고 (도 15), CD8+ T-세포 증식에 대해, 표 4에 제시된 바와 같이 EC20, EC50 및 EC90 값을 또한 결정하였다.
표 4. 비-항원-특이적 T-세포 증식 검정에 의해 측정된 CD8+ T-세포 확장 데이터에 기초한, PD-L1-547-FEALxCD137-009-HC7LC2-FEAR의 EC20, EC50 및 EC90-값의 결정. 제시된 데이터는 4 파라미터 로그 피트에 기초하여 계산된 값이다 (도 15).
Figure pct00010
실시예 14: PD-L1 및 CD137에 결합하는 이중특이적 항체에 의해 유도된 시토카인 방출을 측정하기 위한 항원-특이적 CD8+ T-세포 증식 검정
PD-L1 및 CD137을 표적화하는 이중특이적 항체 PD-L1-547-FEALxCD137-009-HC7LC2-FEAR에 의한 시토카인 방출의 유도를 본질적으로 실시예 7에 기재된 바와 같이 수행된 항원-특이적 검정에서 측정하였다.
T 세포에 2 μg의 PD-1-코딩 IVT RNA를 갖거나 갖지 않는 10 μg TCR α 쇄-코딩 RNA 및 10 μg TCR β 쇄-코딩 RNA를 전기천공으로 도입하였다. 전기천공된 T 세포를 CFSE-표지 (상기 기재된 바와 같음)하지 않고, 전기천공 직후, 5% 인간 AB 혈청이 보충된 신선한 IMDM 배지 (라이프 테크놀로지스 게엠베하, 카탈로그 번호 12440-061) 내로 옮겼다. iDC에 상기 기재된 바와 같이 5 μg 클라우딘-6 (CLDN6)-코딩 RNA를 전기천공으로 도입하였다. 밤새 인큐베이션한 후에, 상기 기재된 바와 같이 DC를 알렉사647-접합된 CLDN6-특이적 항체로 염색하고, T 세포를 항-마우스 TCR β 쇄 항체 및 항-인간 CD279 항체로 염색하였다.
5,000개의 전기천공된 DC를 96-웰 둥근 바닥 플레이트 내 5% 인간 AB 혈청이 보충된 IMDM 글루타맥스 중에서 상이한 농도의 PD-L1-547-FEALxCD137-009-HC7LC2-FEAR 이중특이적 항체 또는 대조군 항체 b12xIgG-FEAL의 존재 하에 50,000개의 전기천공된 T 세포와 함께 인큐베이션하였다. 48-시간 인큐베이션 기간 후, 플레이트를 500 x g에서 5분 동안 원심분리하고, 상청액을 각각의 웰로부터 새로운 96-웰 둥근 바닥 플레이트로 조심스럽게 옮기고, MSD® 플랫폼 상에서의 시토카인 분석시까지 -80℃에서 저장하였다. 항원-특이적 증식 검정으로부터 수집된 상청액을 메소 퀵플렉스 SQ 120 기기 (메소 스케일 다이아그노스틱스, 엘엘씨.(Meso Scale Diagnostics, LLC.), 카탈로그 번호 R31QQ-3) 상에서 MSD V-플렉스 인간 염증유발 패널 1 (10-플렉스) 키트 (메소 스케일 다이아그노스틱스, 엘엘씨., 카탈로그 번호 K15049D-2)에 의해 제조업체의 지침에 따라 10종의 상이한 시토카인의 시토카인 수준에 대해 분석하였다.
PD-L1-547-FEALxCD137-009-HC7LC2-FEAR의 첨가는 주로 IFN-γ, TNF-α, IL-13 및 IL-8 분비의 농도-의존성 증가를 일으켰다 (도 16). 모든 다른 시토카인 (IL-10, IL-12p70, IL-1β, IL-2, IL-4, IL-6)의 시토카인 수준은 대조군 항체 b12-IgG-FEAL로 처리된 공동-배양물에 대해 검출된 수준 초과로 상승하지 않았다. T 세포에 PD-1 RNA를 전기천공으로 도입하지 않은 T 세포:DC 공동-배양물을, T 세포에 2 μg PD-1 RNA를 전기천공으로 도입한 것과 비교하였을 때, PD-1 RNA 전기천공이 없는 공동-배양물에 대해 약간 더 높은 시토카인 수준이 검출가능하였다. 이는 PD-L1-547-FEALxCD137-009-FEAR 용량 반응 곡선뿐만 아니라 b12-IgG-FEAL 대조군 항체 값 둘 다에 대해 관찰되었다.
실시예 15: PD-L1 및 CD137에 결합하는 이중특이적 항체에 의해 유도된 시토카인 방출을 측정하기 위한 항원-비특이적 시험관내 T-세포 증식 검정
PD-L1 및 CD137을 표적화하는 이중특이적 항체 PD-L1-547-FEALxCD137-009-HC7LC2-FEAR에 의한 시토카인 방출의 유도를 본질적으로 상기 (실시예 14) 기재된 바와 같이 수행된 항원-비특이적 시험관내 T-세포 증식 검정에서 측정하였다. 항체 첨가 48시간 후에 수집된 상청액의 멀티플렉스 샌드위치 면역검정에 의해, 10종의 염증유발 시토카인 (IFN-γ, TNF-α, IL-13, IL-8, IL-10, IL-12p70, IL-1β, IL-2, IL-4, IL-6)의 시토카인 방출에 대한 트랜스-결합, 즉 각각의 표적에 대한 두 아암의 동시 결합의 효과를 분석하였다.
PBMC를 CSFE 표지 (상기 기재된 바와 같음)하지 않고, 단리 직후 시딩하고, 단지 1가지 농도의 항-CD3 항체 (0.03 μg/mL 최종 농도)를 사용하였다.
48-시간 인큐베이션 기간 후, 세포를 500 x g에서 5분 동안 원심분리에 의해 수집하고, 상청액을 각각의 웰로부터 새로운 96-웰 둥근 바닥 플레이트로 조심스럽게 옮기고, MSD® 플랫폼 상에서의 시토카인 분석시까지 -80℃에서 저장하였다. 수집된 상청액을 메소 퀵플렉스 SQ 120 기기 (메소 스케일 다이아그노스틱스, 엘엘씨., 카탈로그 번호 R31QQ-3) 상에서 MSD V-플렉스 인간 염증유발 패널 1 (10-플렉스) 키트 (메소 스케일 다이아그노스틱스, 엘엘씨., 카탈로그 번호 K15049D-2)에 의해 제조업체의 지침에 따라 10종의 상이한 시토카인의 시토카인 수준에 대해 분석하였다.
PD-L1-547-FEALxCD137-009-HC7LC2-FEAR의 첨가는 주로 IFN-γ, TNF-α, IL-2 및 IL-13 분비의 농도-의존성 증가를 유도하였다 (도 17). 또한 IL-10, IL-12p70 뿐만 아니라 IL-4에 대해서도 단지 약간 상승된 수준을 갖는 용량-반응 곡선이 검출가능하였다. IL-1β, IL-6 및 IL-8의 시토카인 수준은 기준선 수준에서 유지되었고, 따라서 대조군 항체 b12-IgG-FEAL로 처리된 공동-배양물에 대해 검출된 수준과 대등하였다.
실시예 16: 항체 제제.
항체 IgG1-7717-547-FEAL (7717b) 및 IgG1-CD137-009-HC7LC2-FEAR (7729a)을 실시예 5에 기재된 2-MEA-유도된 Fab-아암 교환 과정을 사용하여 듀오바디® BisG1-7717-547-FEAL/CD137-009-HC7LC2-FEAR과 합하였다. 교환 과정 후, 듀오바디를 pH 5.5에서 0.02% PS80 또는 PS20이 첨가된 20mM 히스티딘, 250 mM 수크로스 중에 20 mg/mL로 제제화하였다. 제제의 적합한 특징을 확인하기 위해, pH, 부형제 농도 및 계면활성제 유형의 영향을 평가하는 연구를 수행하였다. 하기 표 5는 3종의 액체 제제 및 1종의 동결건조 제제를 포함한 제조된 제제의 개관을 제공한다.
표 5: 제제
Figure pct00011
제제 안정성 연구를 시작할 때, 각각의 액체 제제를 2개의 워크스트림으로 분할하였다. 한 워크스트림에서, 액체 제제를 -65℃에서 12시간 동안의 동결에 이어서 25℃에서 12시간 동안의 해동으로 이루어진 5회의 동결-해동 사이클에 적용하였다. 5회의 동결/해동 사이클 후에, 시점 0, 1 및 2개월에서 액체 제제의 안정성을 평가하는 제2 워크스트림에 대해 사용되는 것과 동일한 방법으로 샘플을 시험하였다.
가시적 입자
2000 내지 3750 룩스의 최소 강도의 조명에서 흑색 배경에 대해 및 백색 배경에 대해 가시적 입자 카운트를 수행하였다.
모든 제제는 동결-해동 사이클 후 F1 및 F2만을 제외하고 시간 0에서 모두 가시적 입자가 실질적으로 없었다 (0-3개 입자/ml). 따라서, F1 및 F2 제제의 샘플은 가시적 입자 형성과 관련하여 안정하였다. 결과가 표 6에 제시된다.
탁도
탁도계를 사용하여 약전 참조 표준 용액에 대한 측정에 의해 탁도 시험을 수행하였다. 샘플 용액의 결과 (비탁측정 탁도 단위 (NTU))를 가장 가까운 참조 용액의 결과와 비교하였다. 샘플 결과가 각각의 참조 용액의 NTU 값의 [-10% 내지+10%] 내에 있는 경우에, 결과를 참조 용액과 동일한 것으로 보고하였다.
모든 탁도 값은 낮았다. F1은 저장 시 및 스트레스 조건 하에 거의 변화 없이 최저 탁도를 나타냈다. 결과가 표 6에 제시된다.
육안으로 보이지 않는 입자
5회의 동결-해동 주기 후 육안으로 보이지 않는 입자를 HIAC 기기를 사용하여 광 차폐의 원리에 의해 검출하였다. 2, 5, 10 또는 25 마이크로미터 초과의 입자를 카운팅하였다. 결과가 표 6에 제시된다.
모든 시험된 제제는 육안으로 보이지 않는 입자를 소수만, 특히 10 또는 25 마이크로미터 초과의 입자를 소수만 함유하였다.
크기 배제 크로마토그래피 (SEC)
크기 배제 UPLC (SE-UPLC)를 사용하여 샘플에 존재하는 단량체, 고분자량 종 (HMWS / 응집체) 및 저분자량 종 (LMWS / 단편)의 양을 결정하였다. 주요 피크, HMWS 및 LMWS는 상대 피크 면적의 백분율 (%)로서 표현된다. 결과가 표 8에 제시된다.
데이터는 총 HMWS 및 LMWS가 모든 제제에 대해 낮았고, 5회의 동결-해동 사이클 후에 HMWS 및 LMWS의 유의한 증가가 발견되지 않았지만, 스트레스 조건에서 증가된 응집이 관찰되었다는 것을 보여주었다. 제제 사이에 주요한 차이는 없었다. 결과가 표 8에 제시된다.
영상화 모세관 등전 포커싱 (icIEF)
가속 및 스트레스 조건 둘 다에서 주요 이소형의 감소가 관찰되었다. 상실은 산성 및 염기성 변이체 둘 다를 생성하는 것으로 보이고, 또한 pH 의존성이 존재하며, 다른 제제와 비교하여 더 높은 pH에서 더 산성인 변이체가 생성되었다 (F3). 권장 저장 조건에서는 변화가 관찰되지 않았다. 결과가 표 8에 제시된다.
역상 크로마토그래피 (RP-HPLC)
비-환원 조건 하에, 가속 및 스트레스 조건에서 주요 피크 함량의 증가가 존재하였다. 환원 조건에서는 경미한 변화가 관찰되었다. 결과가 표 9에 제시된다.
모세관 전기영동 소듐 도데실 술페이트 (CE-SDS)
안정성 프로파일은 시험된 모든 샘플에 대해 이 파라미터가 매우 강건하였다. 결과가 표 10에 제시된다.
전반적으로 F1 제제가 제약 용도에 적합한 특징을 나타냈다.
표 6: 가시적 입자, 탁도 및 육안으로 보이지 않는 입자의 결정
Figure pct00012
표 7: 오스몰랄농도, pH 및 단백질 함량의 결정
Figure pct00013
표 8: 크기 배제 크로마토그래피 (단량체, 고분자량 종 (HMW/응집체) 및 저분자량 종 (LMW/단편)의 양의 결정); CEX/iCE (다양한 조건 하에 염기성 및 산성 변이체의 외관의 결정); 계면활성제 함량 결정.
Figure pct00014
표 9: 역상-HPLC
Figure pct00015
표 10: 모세관 전기영동-SDS (CE-SDS)에 의한 순도 결정
Figure pct00016
실시예 17: 항체 제제; 안정성 연구.
듀오바디® BisG1-7717-547-FEAL/CD137-009-HC7LC2-FEAR, 배치 6371-16 (생산일: 2018년 5월 18일)에 대해 장기간 (12개월) 안정성 연구를 수행하였다.
듀오바디® BisG1-7717-547-FEAL/CD137-009-HC7LC2-FEAR, 배치 6371-16의 안정성 샘플에 대한 저장 조건 및 시험 간격이 표 11에 나타나 있다.
표 11: 저장 조건 및 풀 간격
Figure pct00017
rH는 "상대 습도"를 의미한다.
듀오바디® BisG1-7717-547-FEAL/CD137-009-HC7LC2-FEAR, 배치 6371-16의 적절한 대표 샘플을 벌크 용기로부터 취하였다. 각각의 저장 조건 및 시간 간격에 대해, 20 mL 듀오바디® BisG1-7717-547-FEAL/CD137-009-HC7LC2-FEAR의 분취물을 표 12에 기재된 바와 같이 저장하여, 수송 및 저장 용기를 모의실험하였다.
표 12: 패키징 물질
Figure pct00018
각각의 풀 포인트 및 저장 조건에 대해, 시험을 수행하기 위해 적절한 저장 챔버로부터 1개의 백을 꺼냈다.
외관 및 색상 (유럽 약전 색상 시각적 액체 색상 척도):
저장 조건 ≤ -65℃ 및 5℃의 경우, 외관 및 색상에 대해서는 어떠한 변화도 관찰되지 않았다. 저장 조건 40℃/75%rH의 경우, 6개월 저장 후 색상은 ≤ BY7에서 ≤ BY5로 변화하였다.
단백광:
탁도계를 사용하여 약전 참조 표준 용액에 대한 측정에 의해 단백광 시험을 수행하였다. 샘플 용액의 결과 (비탁측정 탁도 단위 (NTU))를 가장 가까운 참조 용액의 결과와 비교하였다. 샘플 결과가 각각의 참조 용액의 NTU 값의 [-10% 내지+10%] 내에 있는 경우에, 결과를 참조 용액과 동일한 것으로 보고하였다. 단백광에 대해 유의한 변화는 관찰되지 않았다. 결과는 < 참조 II 내지 < 참조 III의 범위였다.
pH:
pH는 5.4 내지 5.6의 범위였고, 5.2 내지 5.8의 명시된 범위 내에 충분히 속하였다.
UV280에 의한 단백질 농도:
단백질 농도는 저장 조건 ≤ -65℃ 및 5℃의 경우 20.1 내지 20.6 mg/ml 범위였으며, 이는 18.0 내지 22.0 mg/ml의 명시된 범위 내에 충분히 속하였다. 저장 조건의 경우, 40℃/75%rH 결과는 19.5 내지 22.9 mg/ml 범위였다. 단백질 농도의 증가는 용매의 증발에 의해 야기되었을 가능성이 있었다.
크기 배제 크로마토그래피 (SEC)-HPLC에 의한 순도:
저장 조건 40℃/75%rH의 경우, 주요 피크에서 저분자량 (LMW) 및 고분자량 (HMW) 형태로의 이동이 관찰되었다. 6개월 저장 후에, 주요 피크는 99.1%면적에서 71.1%면적으로 감소하였다. 저장 조건 5℃의 경우, 2개월 저장 후에 주요 피크의 경미하지만 유의하지 않은 감소가 관찰되었다. ≤ -65℃의 저장 조건의 경우 12개월 후에 어떠한 유의한 변화도 관찰되지 않았고, 모든 결과는 정의된 규격을 충족시켰다.
소수성 상호작용 크로마토그래피 (HIC)-HPLC에 의한 순도:
항체 순도에서 어떠한 유의한 변화도 관찰되지 않았다. 항체 순도의 변동은 분석 변동을 반영한다. 동종이량체 PD-L1은 검출되지 않았다.
영상화 모세관 등전 포커싱 (icIEF)에 의한 전하 이종성:
저장 조건 40℃/75%rH의 경우 주요 피크에서 산성 종으로의 이동이 관찰되었다. 주요 피크는 6개월 저장 후에 58.3%면적에서 5.7%면적으로 감소하였다. ≤ -65℃ 및 5℃의 저장 조건의 경우 어떠한 유의한 변화도 관찰되지 않았다.
모세관 전기영동 (CE)-SDS에 의한 순도:
40℃/75%rH에서 저장된 샘플 외에는, 모든 샘플이 참조와 대등하였다. 40℃/75%rH의 저장의 경우 환원 및 비-환원 조건 하의 순도에 대해 감소하는 경향이 관찰되었다. 6개월 저장 후에, 비-환원 무손상 IgG는 94.9 cor.%면적에서 77.0 cor.%면적으로 감소하였고, 환원 HC 및 LC의 합계는 99.0 cor.%면적에서 87.4 cor.%면적으로 감소하였다. ≤ -65℃ 및 5℃의 저장 조건의 경우 어떠한 유의한 변화도 관찰되지 않았다.
결론:
안정성 데이터는 듀오바디® BisG1-7717-547-FEAL/CD137-009-HC7LC2-FEAR이 ≤ -65℃에서 저장되는 경우에 12개월 동안 안정하고, 비손상된 원래 패키징으로 5℃에서 저장되는 경우에 2개월 동안 안정하다는 것을 보여주었다. 저장 조건 40℃/75%rH의 경우, SEC-HPLC, icIEF 및 CE-SDS로부터의 결과는 1개월 후에 듀오바디® BisG1-7717-547-FEAL/CD137-009-HC7LC2-FEAR의 유의한 분해를 나타냈다. 듀오바디® BisG1-7717-547-FEAL/CD137-009-HC7LC2-FEAR 배치 6371-16에 대한 안정성 데이터는 물질이 비손상된 원래 패키징으로 ≤ -65℃를 초과하지 않게 저장되는 경우에 365일의 정의된 보관 수명을 갖는다는 것을 확인시켜 주었다.
표 13: 듀오바디® BisG1-7717-547-FEAL/CD137-009-HC7LC2-FEAR, 배치 6371-16, 샘플 저장 조건: ≤ -65℃
Figure pct00019
Figure pct00020
SEQUENCE LISTING <110> Genmab A/S BioNtech SE Alintas, Isil Satijn, David Rademaker, Rik Parren, Paul Sahin, Ugur Gieseke, Friederike Muik, Alexander <120> ANTIBODY FORMULATION <130> P/0142-WO-PCT[2] <150> PCT/EP2018/080369 <151> 2018-11-06 <160> 51 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 127 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 1 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Gln Ala Ser Gly Tyr Arg Phe Ser Asn Phe 20 25 30 Val Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Phe Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Asn Lys Glu Phe Ser Ala Lys Phe 50 55 60 Gln Asp Arg Val Thr Phe Thr Ala Asp Thr Ser Ala Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Val Gly Pro Tyr Ser Trp Asp Asp Ser Pro Gln Asp Asn Tyr 100 105 110 Tyr Met Asp Val Trp Gly Lys Gly Thr Thr Val Ile Val Ser Ser 115 120 125 <210> 2 <211> 8 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 2 Gly Tyr Arg Phe Ser Asn 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(1)..(23) <400> 34 Met Gly Asn Ser Cys Tyr Asn Ile Val Ala Thr Leu Leu Leu Val Leu 1 5 10 15 Asn Phe Glu Arg Thr Arg Ser Leu Gln Asp Pro Cys Ser Asn Cys Pro 20 25 30 Ala Gly Thr Phe Cys Asp Asn Asn Arg Asn Gln Ile Cys Ser Pro Cys 35 40 45 Pro Pro Asn Ser Phe Ser Ser Ala Gly Gly Gln Arg Thr Cys Asp Ile 50 55 60 Cys Arg Gln Cys Lys Gly Val Phe Arg Thr Arg Lys Glu Cys Ser Ser 65 70 75 80 Thr Ser Asn Ala Glu Cys Asp Cys Val Pro Gly Phe Arg Cys Leu Gly 85 90 95 Ala Gly Cys Ala Met Cys Glu Glu Tyr Cys Gln Gln Gly Gln Glu Leu 100 105 110 Thr Gln Lys Gly Cys Lys Asp Cys Cys Phe Gly Thr Phe Asn Asp Gln 115 120 125 Lys Arg Gly Ile Cys Arg Pro Trp Thr Asn Cys Ser Leu Asp Gly Lys 130 135 140 Ser Val Leu Val Asn Gly Thr Lys Glu Arg Asp Val Val Cys Gly Pro 145 150 155 160 Ser Pro Ala Asp Leu Ser Pro Gly Ala Ser Ser Val Thr Pro Pro Ala 165 170 175 Pro Ala Arg Glu Pro Gly His Ser Pro Gln Ile Ile Ser Phe Phe Leu 180 185 190 Ala Leu Thr Ser Thr Ala Leu Leu Phe Leu Leu Phe Phe Leu Thr Leu 195 200 205 Arg Phe Ser Val Val Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe 210 215 220 Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly 225 230 235 240 Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu 245 250 255 <210> 35 <211> 255 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Human-Wild boar chimeric CD137 <220> <221> SIGNAL <222> (1)..(23) <400> 35 Met Gly Asn Ser Cys Tyr Asn Ile Val Ala Thr Leu Leu Leu Val Leu 1 5 10 15 Asn Phe Glu Arg Thr Arg Ser Leu Gln Asp Pro Cys Ser Asn Cys Pro 20 25 30 Ala Gly Thr Phe Cys Asp Asn Asn Arg Asn Gln Ile Cys Ser Pro Cys 35 40 45 Pro Pro Asn Ser Phe Ser Ser Ala Gly Gly Gln Arg Thr Cys Asp Ile 50 55 60 Cys Arg Gln Cys Lys Gly Val Phe Arg Thr Arg Lys Glu Cys Ser Ser 65 70 75 80 Thr Ser Asn Ala Glu Cys Asp Cys Thr Pro Gly Phe His Cys Leu Gly 85 90 95 Ala Gly Cys Ser Met Cys Glu Gln Asp Cys Lys Gln Gly Gln Glu Leu 100 105 110 Thr Lys Glu Gly Cys Lys Asp Cys Ser Phe Gly Thr Phe Asn Asp Glu 115 120 125 Glu His Gly Val Cys Arg Pro Trp Thr Asp Cys Ser Leu Asp Gly Lys 130 135 140 Ser Val Leu Val Asn Gly Thr Lys Glu Arg Asp Val Val Cys Gly Pro 145 150 155 160 Ser Pro Ala Asp Leu Ser Pro Gly Ala Ser Ser Val Thr Pro Pro Ala 165 170 175 Pro Ala Arg Glu Pro Gly His Ser Pro Gln Ile Ile Ser Phe Phe Leu 180 185 190 Ala Leu Thr Ser Thr Ala Leu Leu Phe Leu Leu Phe Phe Leu Thr Leu 195 200 205 Arg Phe Ser Val Val Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe 210 215 220 Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly 225 230 235 240 Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu 245 250 255 <210> 36 <211> 255 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Human-Wild boar chimeric CD137 <220> <221> SIGNAL <222> (1)..(23) <400> 36 Met Gly Asn Ser Cys Tyr Asn Ile Val Ala Thr Leu Leu Leu Val Leu 1 5 10 15 Asn Phe Glu Arg Thr Arg Ser Leu Gln Asp Pro Cys Ser Asn Cys Pro 20 25 30 Ala Gly Thr Phe Cys Asp Asn Asn Arg Asn Gln Ile Cys Ser Pro Cys 35 40 45 Pro Pro Asn Ser Phe Ser Ser Ala Gly Gly Gln Arg Thr Cys Asp Ile 50 55 60 Cys Arg Gln Cys Lys Gly Val Phe Arg Thr Arg Lys Glu Cys Ser Ser 65 70 75 80 Thr Ser Asn Ala Glu Cys Asp Cys Thr Pro Gly Phe His Cys Leu Gly 85 90 95 Ala Gly Cys Ser Met Cys Glu Gln Asp Cys Lys Gln Gly Gln Glu Leu 100 105 110 Thr Lys Lys Gly Cys Lys Asp Cys Cys Phe Gly Thr Phe Asn Asp Gln 115 120 125 Lys Arg Gly Ile Cys Arg Pro Trp Thr Asn Cys Ser Leu Ala Gly Lys 130 135 140 Pro Val Leu Met Asn Gly Thr Lys Ala Arg Asp Val Val Cys Gly Pro 145 150 155 160 Arg Pro Ala Asp Leu Ser Pro Gly Ala Ser Ser Val Thr Pro Pro Ala 165 170 175 Pro Ala Arg Glu Pro Gly His Ser Pro Gln Ile Ile Ser Phe Phe Leu 180 185 190 Ala Leu Thr Ser Thr Ala Leu Leu Phe Leu Leu Phe Phe Leu Thr Leu 195 200 205 Arg Phe Ser Val Val Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe 210 215 220 Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly 225 230 235 240 Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu 245 250 255 <210> 37 <211> 255 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Human-Wild boar chimeric CD137 <220> <221> SIGNAL <222> (1)..(23) <400> 37 Met Gly Asn Ser Cys Tyr Asn Ile Val Ala Thr Leu Leu Leu Val Leu 1 5 10 15 Asn Phe Glu Arg Thr Arg Ser Leu Gln Asp Pro Cys Ser Asn Cys Pro 20 25 30 Ala Gly Thr Phe Cys Asp Asn Asn Arg Asn Gln Ile Cys Ser Pro Cys 35 40 45 Pro Pro Asn Ser Phe Ser Ser Ala Gly Gly Gln Arg Thr Cys Asp Ile 50 55 60 Cys Arg Gln Cys Lys Gly Val Phe Arg Thr Arg Lys Glu Cys Ser Ser 65 70 75 80 Thr Ser Asn Ala Glu Cys Asp Cys Thr Pro Gly Phe His Cys Leu Gly 85 90 95 Ala Gly Cys Ser Met Cys Glu Gln Asp Cys Lys Gln Gly Gln Glu Leu 100 105 110 Thr Lys Lys Gly Cys Lys Asp Cys Cys Phe Gly Thr Phe Asn Asp Gln 115 120 125 Lys Arg Gly Ile Cys Arg Pro Trp Thr Asn Cys Ser Leu Asp Gly Lys 130 135 140 Ser Val Leu Val Asn Gly Thr Lys Glu Arg Asp Val Val Cys Gly Pro 145 150 155 160 Ser Pro Thr Asp Phe Ser Pro Gly Thr Pro Ser Thr Thr Met Pro Val 165 170 175 Pro Gly Gly Glu Pro Gly His Thr Ser His Ile Ile Ser Phe Phe Leu 180 185 190 Ala Leu Thr Ser Thr Ala Leu Leu Phe Leu Leu Phe Phe Leu Thr Leu 195 200 205 Arg Phe Ser Val Val Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe 210 215 220 Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly 225 230 235 240 Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu 245 250 255 <210> 38 <211> 255 <212> PRT <213> Sus Scrofa <220> <221> SIGNAL <222> (1)..(23) <400> 38 Met Gly Asn Gly Tyr Tyr Asn Ile Val Ala Thr Val Leu Leu Val Met 1 5 10 15 Asn Phe Glu Arg Thr Arg Ser Val Pro Asp Pro Cys Ser Asn Cys Ser 20 25 30 Ala Gly Thr Phe Cys Gly Lys Asn Ile Gln Glu Leu Cys Met Pro Cys 35 40 45 Pro Ser Asn Ser Phe Ser Ser Thr Ser Gly Gln Lys Ala Cys Asn Val 50 55 60 Cys Arg Lys Cys Glu Gly Val Phe Arg Thr Lys Lys Glu Cys Ser Ser 65 70 75 80 Thr Ser Asn Ala Val Cys Glu Cys Val Pro Gly Phe Arg Cys Leu Gly 85 90 95 Ala Gly Cys Ala Met Cys Glu Glu Tyr Cys Gln Gln Gly Gln Glu Leu 100 105 110 Thr Gln Glu Gly Cys Lys Asp Cys Ser Phe Gly Thr Phe Asn Asp Glu 115 120 125 Glu His Gly Val Cys Arg Pro Trp Thr Asp Cys Ser Leu Ala Gly Lys 130 135 140 Pro Val Leu Met Asn Gly Thr Lys Ala Arg Asp Val Val Cys Gly Pro 145 150 155 160 Arg Pro Thr Asp Phe Ser Pro Gly Thr Pro Ser Thr Thr Met Pro Val 165 170 175 Pro Gly Gly Glu Pro Gly His Thr Ser His Val Ile Ile Phe Phe Leu 180 185 190 Ala Leu Met Ser Thr Ala Val Phe Val Leu Val Ser Tyr Leu Ala Leu 195 200 205 Arg Phe Ser Val Val Gln Gln Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Val 210 215 220 Lys Gln Pro Phe Leu Lys Pro Ala Gln Thr Val Gln Glu Glu Asp Ala 225 230 235 240 Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Glu Cys Glu Leu 245 250 255 <210> 39 <211> 255 <212> PRT <213> Loxodonta Africana <220> <221> SIGNAL <222> (1)..(23) <400> 39 Met Gly Asn Gly Tyr Tyr Asn Met Val Ala Thr Val Leu Leu Val Met 1 5 10 15 Asn Phe Glu Arg Thr Gly Ala Val Gln Asp Ser Cys Arg Asp Cys Leu 20 25 30 Ala Gly Thr Tyr Cys Val Lys Asn Glu Ser Gln Ile Cys Ser Pro Cys 35 40 45 Pro Leu Asn Ser Phe Ser Ser Thr Gly Gly Gln Met Asn Cys Asp Met 50 55 60 Cys Arg Lys Cys Glu Gly Val Phe Lys Thr Lys Arg Ala Cys Ser Pro 65 70 75 80 Thr Arg Asp Ala Glu Cys Glu Cys Val Ser Gly Phe His Cys Leu Gly 85 90 95 Ala Gly Cys Thr Met Cys Gln Gln Asp Cys Lys Gln Gly Gln Glu Leu 100 105 110 Thr Lys Glu Gly Cys Lys Asp Cys Cys Leu Gly Thr Phe Asn Asp Gln 115 120 125 Lys Asn Gly Ile Cys Arg Pro Trp Thr Asn Cys Ser Leu Glu Gly Lys 130 135 140 Ser Val Leu Ala Asn Gly Thr Lys Lys Arg Asp Val Val Cys Gly Pro 145 150 155 160 Pro Ala Ala Asp Ser Phe Pro Asp Thr Ser Ser Val Thr Val Pro Ala 165 170 175 Pro Glu Arg Lys Pro Asp His His Pro Gln Ile Ile Thr Phe Phe Leu 180 185 190 Ala Leu Ile Ser Ala Ala Leu Leu Phe Leu Val Phe Phe Leu Val Val 195 200 205 Arg Phe Ser Val Ala Lys Trp Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe 210 215 220 Lys Gln Pro Phe Ile Lys Pro Val Gln Thr Ala Gln Glu Glu Asp Gly 225 230 235 240 Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Asp Cys Glu Leu 245 250 255 <210> 40 <211> 41 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 40 Cys Pro Pro Asn Ser Phe Ser Ser Ala Gly Gly Gln Arg Thr Cys Asp 1 5 10 15 Ile Cys Arg Gln Cys Lys Gly Val Phe Arg Thr Arg Lys Glu Cys Ser 20 25 30 Ser Thr Ser Asn Ala Glu Cys Asp Cys 35 40 <210> 41 <211> 232 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 41 Leu Gln Asp Pro Cys Ser Asn Cys Pro Ala Gly Thr Phe Cys Asp Asn 1 5 10 15 Asn Arg Asn Gln Ile Cys Ser Pro Cys Pro Pro Asn Ser Phe Ser Ser 20 25 30 Ala Gly Gly Gln Arg Thr Cys Asp Ile Cys Arg Gln Cys Lys Gly Val 35 40 45 Phe Arg Thr Arg Lys Glu Cys Ser Ser Thr Ser Asn Ala Glu Cys Asp 50 55 60 Cys Thr Pro Gly Phe His Cys Leu Gly Ala Gly Cys Ser Met Cys Glu 65 70 75 80 Gln Asp Cys Lys Gln Gly Gln Glu Leu Thr Lys Lys Gly Cys Lys Asp 85 90 95 Cys Cys Phe Gly Thr Phe Asn Asp Gln Lys Arg Gly Ile Cys Arg Pro 100 105 110 Trp Thr Asn Cys Ser Leu Asp Gly Lys Ser Val Leu Val Asn Gly Thr 115 120 125 Lys Glu Arg Asp Val Val Cys Gly Pro Ser Pro Ala Asp Leu Ser Pro 130 135 140 Gly Ala Ser Ser Val Thr Pro Pro Ala Pro Ala Arg Glu Pro Gly His 145 150 155 160 Ser Pro Gln Ile Ile Ser Phe Phe Leu Ala Leu Thr Ser Thr Ala Leu 165 170 175 Leu Phe Leu Leu Phe Phe Leu Thr Leu Arg Phe Ser Val Val Lys Arg 180 185 190 Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro 195 200 205 Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu 210 215 220 Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu 225 230 <210> 42 <211> 116 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH-CD137 with FEAR substitutions <400> 42 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Arg Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Ser Thr Tyr 20 25 30 Trp Ile Ser Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Lys Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Tyr Thr Asn Tyr Ser Pro Ser Phe 50 55 60 Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Tyr Gly Ile Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser 115 <210> 43 <211> 8 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 43 Gly Tyr Ser Phe Ser Thr Tyr Trp 1 5 <210> 44 <211> 8 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 44 Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Tyr Thr 1 5 <210> 45 <211> 9 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 45 Ala Arg Gly Tyr Gly Ile Phe Asp Tyr 1 5 <210> 46 <211> 108 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 46 Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln 1 5 10 15 Thr Ala Ser Ile Thr Cys Ser Gly Asp Asn Ile Gly Asp Gln Tyr Ala 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Val Leu Val Ile Tyr 35 40 45 Gln Asp Lys Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Met 65 70 75 80 Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Thr Tyr Thr Gly Phe Gly Ser Leu 85 90 95 Ala Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 <210> 47 <211> 6 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 47 Asn Ile Gly Asp Gln Tyr 1 5 <210> 48 <211> 11 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 48 Ala Thr Tyr Thr Gly Phe Gly Ser Leu Ala Val 1 5 10 <210> 49 <211> 153 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Recombinant human interleukin analog <220> <221> SIGNAL <222> (1)..(20) <400> 49 Met Tyr Arg Met Gln Leu Leu Ser Cys Ile Ala Leu Ser Leu Ala Leu 1 5 10 15 Val Thr Asn Ser Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu 20 25 30 Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile 35 40 45 Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe 50 55 60 Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu 65 70 75 80 Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys 85 90 95 Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile 100 105 110 Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Ser Glu Tyr Ala 115 120 125 Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe 130 135 140 Cys Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr 145 150 <210> 50 <211> 118 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 50 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ser 20 25 30 Trp Ile His Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Tyr 35 40 45 Ala Trp Ile Ser Pro Tyr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Arg His Trp Pro Gly Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 51 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 51 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Leu Tyr His Pro Ala 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105

Claims (75)

  1. a. 인간 CD137 (4-1BB)에 결합하는 제1 항원-결합 영역 및 인간 PD-L1 (CD274)에 결합하는 제2 항원-결합 영역을 포함하는 결합제이며,
    - 제1 항원 결합 영역은 서열식별번호: 15에 제시된 아미노산 서열 내에 존재하는 3개의 상보성 결정 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 제1 중쇄 가변 영역 (VH), 및 서열식별번호: 16에 제시된 아미노산 서열 내에 존재하는 3개의 상보성 결정 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 제1 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함하고,
    - 제2 항원-결합 영역은 서열식별번호: 17에 제시된 아미노산 서열 내에 존재하는 3개의 상보성 결정 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 제2 중쇄 가변 영역 (VH), 및 서열식별번호: 21에 제시된 아미노산 서열 내에 존재하는 3개의 상보성 결정 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 제2 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함하는 것인 결합제,
    b. 히스티딘 완충제,
    c. 약 100 내지 약 400 mM의 당, 및
    d. 약 0.001 내지 약 0.1% (w/v) 비-이온성 계면활성제
    를 포함하고; pH 약 4.5 내지 약 6.5를 갖는 제약 제제.
  2. 제1항에 있어서, 1 내지 100 mM 히스티딘, 예컨대 5 내지 100 mM, 10 내지 100 mM, 15 내지 100 mM, 5 내지 90 mM, 5 내지 80 mM, 5 내지 70 mM, 5 내지 60 mM, 5 내지 50 mM, 5 내지 40 mM, 5 내지 30 mM, 10 내지 90 mM, 10 내지 80 mM, 10 내지 70 mM, 10 내지 60 mM, 10 내지 50 mM, 10 내지 40 mM, 10 내지 30 mM, 15 내지 90 mM, 15 내지 80 mM, 15 내지 70 mM, 15 내지 60 mM, 15 내지 50 mM, 15 내지 40 mM, 15 내지 30 mM 또는 15 내지 20 mM 히스티딘을 포함하는 제약 제제.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 약 20 mM 히스티딘, 예컨대 20 mM 히스티딘을 포함하는 제약 제제.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 100 내지 400 mM 당, 예컨대 125 내지 400 mM, 150 내지 400 mM, 150 내지 400 mM, 175 내지 400 mM, 200 내지 400 mM, 225 내지 400 mM, 100 내지 375 mM, 100 내지 350 mM, 100 내지 325 mM, 100 내지 300 mM, 125 내지 375 mM, 125 내지 350 mM, 125 내지 325 mM, 125 내지 300 mM, 125 내지 275 mM, 150 내지 375 mM, 150 내지 350 mM, 150 내지 325 mM, 150 내지 300 mM, 150 내지 275 mM, 175 내지 375 mM, 175 내지 350 mM, 175 내지 325 mM, 175 내지 300 mM, 175 내지 275 mM, 200 내지 375 mM 1, 200 내지 350 mM 1, 200 내지 325 mM, 200 내지 300 mM, 200 내지 275 mM, 225 내지 375 mM, 225 내지 350 mM, 225 내지 325 mM, 225 내지 300 mM, 또는 예컨대 225 내지 275 mM 당을 포함하는 제약 제제.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 약 250 mM 당, 예컨대 250 mM 당을 포함하는 제약 제제.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 당이 수크로스인 제약 제제.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 0.005 내지 0.1% (w/v) 비-이온성 계면활성제, 예컨대 0.01 내지 0.1% (w/v), 0.015 내지 0.1% (w/v), 0.001 내지 0.09% (w/v), 0.001 내지 0.08% (w/v), 0.001 내지 0.07% (w/v), 0.001 내지 0.06% (w/v), 0.001 내지 0.05% (w/v), 0.001 내지 0.04% (w/v), 0.001 내지 0.02% (w/v), 0.005 내지 0.1% (w/v), 0.005 내지 0.09% (w/v), 0.005 내지 0.08% (w/v), 0.005 내지 0.07% (w/v), 0.005 내지 0.06% (w/v), 0.005 내지 0.05% (w/v), 0.005 내지 0.04% (w/v), 0.005 내지 0.03% (w/v), 0.005 내지 0.02% (w/v), 0.01 내지 0.09% (w/v), 0.01 내지 0.08% (w/v), 0.01 내지 0.07% (w/v), 0.01 내지 0.06% (w/v), 0.01 내지 0.05% (w/v), 0.01 내지 0.04% (w/v), 0.01 내지 0.03% (w/v), 0.01 내지 0.02% (w/v), 0.015 내지 0.09% (w/v), 0.015 내지 0.08% (w/v), 0.015 내지 0.07% (w/v), 0.015 내지 0.06% (w/v), 0.015 내지 0.05% (w/v), 0.015 내지 0.04% (w/v), 0.015 내지 0.03% (w/v), 또는 예컨대 0.015 내지 0.02% (w/v) 비-이온성 계면활성제를 포함하는 제약 제제.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 약 0.02% (w/v) 비-이온성 계면활성제, 예컨대 0.02% (w/v) 비-이온성 계면활성제를 포함하는 제약 제제.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 비-이온성 계면활성제가 2-[2-[3,4-비스(2-히드록시에톡시)옥솔란-2-일]-2-(2-히드록시에톡시)에톡시]에틸 (E)-옥타데스-9-에노에이트 (폴리옥시에틸렌 (20) 소르비탄 모노올레에이트; 폴리소르베이트 80) 또는 2-[2-[3,4-비스(2-히드록시에톡시)옥솔란-2-일]-2-(2-히드록시에톡시)에톡시]에틸 도데카노에이트 (폴리옥시에틸렌 (20) 소르비탄 모노라우레이트; 폴리소르베이트 20)인 제약 제제.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, pH 4.5 내지 6.5, 예컨대 4.7 내지 6.5, 예를 들어 4.9 내지 6.5, 5.1 내지 6.5, 5.3 내지 6.5, 4.5 내지 6.3, 4.7 내지 6.1, 4.7 내지 5.9, 4.7 내지 5.7, 5.1 내지 6.3, 4.7 내지 6.1, 4.7 내지 5.9, 4.7 내지 5.7, 4.9 내지 6.3, 4.9 내지 6.1, 4.9 내지 5.9, 4.9 내지 5.7, 5.1 내지 6.3, 5.1 내지 6.1, 5.1 내지 5.9, 5.1 내지 5.7, 5.3 내지 6.3, 5.3 내지 6.1, 5.3 내지 5.9, 예컨대 5.3 내지 5.7을 갖는 제약 제제.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, pH 약 5.5, 예컨대 pH 5.5를 갖는 제약 제제.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 5 내지 200 mg/mL의 결합제, 예컨대 10 내지 200 mg/mL, 20 내지 200 mg/mL, 40 내지 200 mg/mL, 60 내지 200 mg/mL, 80 내지 200 mg/mL, 100 내지 200 mg/mL, 120 내지 200 mg/mL, 150 내지 200 mg/mL, 5 내지 150 mg/mL, 10 내지 150 mg/mL, 20 내지 150 mg/mL, 40 내지 150 mg/mL, 60 내지 150 mg/mL, 80 내지 150 mg/mL, 100 내지 150 mg/mL, 5 내지 130 mg/mL, 10 내지 130 mg/mL, 20 내지 130 mg/mL, 40 내지 130 mg/mL, 60 내지 130 mg/mL, 80 내지 130 mg/mL, 100 내지 130 mg/mL, 5 내지 100 mg/mL, 10 내지 100 mg/mL, 15 내지 100 mg/mL, 20 내지 100 mg/mL, 30 내지 100 mg/mL, 40 내지 100 mg/mL, 50 내지 100 mg/mL, 60 내지 100 mg/mL, 5 내지 80 mg/mL, 5 내지 60 mg/mL, 5 내지 50 mg/mL, 5 내지 40 mg/mL, 5 내지 30 mg/mL, 5 내지 20 mg/mL, 10 내지 80 mg/mL, 10 내지 60 mg/mL, 10 내지 50 mg/mL, 10 내지 40 mg/mL, 10 내지 30 mg/mL, 15 내지 80 mg/mL, 15 내지 60 mg/mL, 15 내지 40 mg/mL, 또는 예컨대 15 내지 25 mg/mL의 결합제를 포함하는 제약 제제.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 약 20 mg/mL의 결합제, 예컨대 20 mg/mL의 결합제를 포함하는 제약 제제.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
    i) 약 20 mg/mL, 예컨대 약 40 mg/mL, 약 60 mg/mL, 약 80 mg/mL, 약 100 mg/mL, 약 120 mg/mL 또는 약 140 mg/mL의 결합제, 및
    ii) 약 20 mM 히스티딘, 약 250 mM 당 및 약 0.02% (w/v) 비-이온성 계면활성제를 포함하고, pH 약 5.5를 갖는 제약 제제.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서,
    i) 20 mg/mL, 예컨대 40 mg/mL, 60 mg/mL, 80 mg/mL, 100 mg/mL, 120 mg/mL 또는 140 mg/mL의 결합제, 및
    ii) 20 mM 히스티딘, 250 mM 당 및 0.02% (w/v) 비-이온성 계면활성제를 포함하고, pH 5.5를 갖는 제약 제제.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, -65℃에서 12시간 동안의 동결에 이어서 25℃에서 12시간 동안의 해동으로 이루어진 5회의 동결-해동 사이클에 적용된 후에, 2000 내지 3750 룩스의 강도의 조명에서 흑색 배경에 대해 및 백색 배경에 대해 수행된 가시적 입자 카운트에 의해 결정시, 가시적 입자가 본질적으로 없는 제약 제제.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 결합제가 항체, 예컨대 이중특이적 항체인 제약 제제.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 가변 영역이 3개의 상보성 결정 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3 및 4개의 프레임워크 영역 FR1, FR2, FR3 및 FR4를 포함하는 것인 제약 제제.
  19. 제18항에 있어서, 상기 상보성 결정 영역 및 상기 프레임워크 영역이 아미노-말단에서 카르복시-말단으로 하기 순서: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4로 배열되는 것인 제약 제제.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서,
    - 제1 항원 결합 영역이 각각 서열식별번호: 9, 10, 11에 제시된 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 제1 중쇄 가변 영역 (VH), 및 각각 서열식별번호: 13, GAS 및 서열식별번호: 14에 제시된 바와 같은 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 제1 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함하고,
    - 제2 항원-결합 영역이 각각 서열식별번호: 18, 19 및 20에 제시된 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 제2 중쇄 가변 영역 (VH), 및 각각 서열식별번호: 22, DDN 및 서열식별번호: 23에 제시된 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 제2 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함하는 것인 제약 제제.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서,
    - 제1 항원 결합 영역이 서열식별번호: 15에 제시된 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 제1 중쇄 가변 영역 (VH); 및 서열식별번호: 16에 제시된 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 제1 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함하고;
    - 제2 항원-결합 영역이 서열식별번호 17에 제시된 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 제2 중쇄 가변 영역 (VH); 및 서열식별번호 21에 제시된 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 제2 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함하는 것인 제약 제제.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서,
    - 제1 항원 결합 영역이 각각 서열식별번호: 9, 10 및 11에 제시된 바와 같은 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하고, 서열식별번호: 15에 제시된 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 제1 중쇄 가변 영역 (VH); 및 각각 서열식별번호: 13, GAS 및 서열식별번호: 14에 제시된 바와 같은 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하고, 서열식별번호: 16에 제시된 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 제1 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함하고,
    - 제2 항원-결합 영역이 각각 서열식별번호: 18, 19 및 20에 제시된 바와 같은 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하고, 서열식별번호: 17에 제시된 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 제2 중쇄 가변 영역 (VH); 및 각각 서열식별번호: 22, DDN, 23에 제시된 바와 같은 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하고, 서열식별번호: 21에 제시된 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 제2 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함하는 것인 제약 제제.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서,
    a. 인간 CD137에 결합하는 상기 제1 항원-결합 영역이
    - 서열식별번호: 15에 제시된 서열 또는 서열식별번호: 15에 제시된 서열과 비교하여 20개 이하의 아미노산 잔기, 예컨대 19개 이하, 18개 이하, 17개 이하, 16개 이하, 15개 이하, 14개 이하, 13개 이하, 12개 이하, 11개 이하, 10개 이하, 9개 이하, 8개 이하, 7개 이하, 6개 이하, 5개 이하, 4개 이하, 3개 이하, 2개 이하, 1개 이하의 아미노산 잔기가 변형된 서열을 포함하고, 각각 서열식별번호: 9, 10 및 11에 제시된 바와 같은 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 제1 중쇄 가변 영역 (VH); 및
    - 서열식별번호: 16에 제시된 서열 또는 서열식별번호: 16에 제시된 서열과 비교하여 20개 이하의 아미노산 잔기, 예컨대 19개 이하, 18개 이하, 17개 이하, 16개 이하, 15개 이하, 14개 이하, 13개 이하, 12개 이하, 11개 이하, 10개 이하, 9개 이하, 8개 이하, 7개 이하, 6개 이하, 5개 이하, 4개 이하, 3개 이하, 2개 이하, 1개 이하의 아미노산 잔기가 변형된 서열을 포함하고, 각각 서열식별번호: 13, GAS 및 서열식별번호: 14에 제시된 바와 같은 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 제1 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함하고;
    b. 인간 PD-L1에 결합하는 상기 제2 항원-결합 영역이
    - 서열식별번호: 17에 제시된 서열 또는 서열식별번호: 17에 제시된 서열과 비교하여 20개 이하의 아미노산 잔기, 예컨대 19개 이하, 18개 이하, 17개 이하, 16개 이하, 15개 이하, 14개 이하, 13개 이하, 12개 이하, 11개 이하, 10개 이하, 9개 이하, 8개 이하, 7개 이하, 6개 이하, 5개 이하, 4개 이하, 3개 이하, 2개 이하, 1개 이하의 아미노산 잔기가 변형된 서열을 포함하고, 각각 서열식별번호: 18, 19 및 20에 제시된 바와 같은 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 제2 중쇄 가변 영역 (VH); 및
    - 서열식별번호: 21에 제시된 서열 또는 서열식별번호: 21에 제시된 서열과 비교하여 20개 이하의 아미노산 잔기, 예컨대 19개 이하, 18개 이하, 17개 이하, 16개 이하, 15개 이하, 14개 이하, 13개 이하, 12개 이하, 11개 이하, 10개 이하, 9개 이하, 8개 이하, 7개 이하, 6개 이하, 5개 이하, 4개 이하, 3개 이하, 2개 이하, 1개 이하의 아미노산 잔기가 변형된 서열을 포함하고, 각각 서열식별번호: 22, DDN 및 서열식별번호: 23에 제시된 바와 같은 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 제2 경쇄 가변 영역 (VH)을 포함하는 것인 제약 제제.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 결합제가 (i) 상기 제1 중쇄 가변 영역 (VH)을 포함하고 제1 중쇄 불변 영역 (CH)을 추가로 포함하는 폴리펩티드 및 (ii) 상기 제2 중쇄 가변 영역 (VH)을 포함하고 제2 중쇄 불변 영역 (CH)을 추가로 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 것인 제약 제제.
  25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, (i) 상기 제1 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함하고 제1 경쇄 불변 영역 (CL)을 추가로 포함하는 폴리펩티드 및 (ii) 상기 제2 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함하고 제2 경쇄 불변 영역 (CL)을 추가로 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 제약 조성물.
  26. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 제1 결합 아암 및 제2 결합 아암을 포함하며, 여기서
    a. 제1 결합 아암은 i) 상기 제1 중쇄 가변 영역 (VH) 및 상기 제1 중쇄 불변 영역 (CH)을 포함하는 폴리펩티드 및 ii) 상기 제1 경쇄 가변 영역 (VL) 및 상기 제1 경쇄 불변 영역 (CL)을 포함하는 폴리펩티드를 포함하고;
    b. 제2 결합 아암은 i) 상기 제2 중쇄 가변 영역 (VH) 및 상기 제2 중쇄 불변 영역 (CH)을 포함하는 폴리펩티드 및 ii) 상기 제2 경쇄 가변 영역 (VL) 및 상기 제2 경쇄 불변 영역 (CL)을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 것인 제약 제제.
  27. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 항원-결합 영역이 서열식별번호: 30에 제시된 바와 같은 인간 CD137 또는 그의 성숙 폴리펩티드에 결합하는 것인 제약 제제.
  28. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 항원-결합 영역이 서열식별번호: 31에 제시된 바와 같은 시노몰구스 원숭이 (마카카 파시쿨라리스(Macaca fascicularis)) CD137 또는 그의 성숙 폴리펩티드에 결합하는 것인 제약 제제.
  29. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 항원-결합 영역이 서열식별번호: 28에 제시된 바와 같은 인간 PD-L1 또는 그의 성숙 폴리펩티드에 결합하는 것인 제약 제제.
  30. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 항원-결합 영역이 서열식별번호: 29에 제시된 바와 같은 시노몰구스 원숭이 (마카카 파시쿨라리스) PD-L1 또는 그의 성숙 폴리펩티드에 결합하는 것인 제약 제제.
  31. 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 항원-결합 영역이 인간 PD-1에 대한 인간 PD-L1의 결합을 억제하는 것인 제약 제제.
  32. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 결합제가 전장 항체 또는 항체 단편의 포맷인 제약 제제.
  33. 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 결합제가 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4로 이루어진 군으로부터 선택된 이소형의 것인 제약 제제.
  34. 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 결합제가 전장 IgG1 항체인 제약 제제.
  35. 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서,
    a. CD137에 결합하는 제1 항원-결합 영역이 키메라 항체로부터 유래되고/거나,
    b. 인간 PD-L1에 결합하는 제2 항원-결합 영역이 키메라 항체로부터 유래되는 것인 제약 제제.
  36. 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서,
    a. CD137에 결합하는 제1 항원-결합 영역이 인간화 항체로부터 유래되고/거나,
    b. 인간 PD-L1에 결합하는 제2 항원-결합 영역이 인간화 항체로부터 유래되는 것인 제약 제제.
  37. 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서,
    a. 인간 CD137에 결합하는 제1 항원-결합 영역이 인간 항체로부터 유래되고/거나,
    b. 인간 PD-L1에 결합하는 제2 항원-결합 영역이 인간 항체로부터 유래되는 것인 제약 제제.
  38. 제1항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서,
    a. 인간 CD137에 결합하는 제1 항원-결합 영역이 인간화 항체로부터 유래되고/거나,
    b. 인간 PD-L1에 결합하는 제2 항원-결합 영역이 인간 항체로부터 유래되는 것인 결합제.
  39. 제26항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 제1 및 제2 중쇄 불변 영역 (CH)이 불변 영역 도메인 1 영역 (CH1 영역), 힌지 영역, CH2 영역 및 CH3 영역, 바람직하게는 적어도 힌지 영역, CH2 영역 및 CH3 영역 중 1개 이상을 포함하는 것인 제약 제제.
  40. 제39항에 있어서, 각각의 제1 및 제2 중쇄 불변 영역 (CH)이 CH3 영역을 포함하고, 2개의 CH3 영역이 비대칭 돌연변이를 포함하는 것인 제약 제제.
  41. 제25항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 중쇄 불변 영역 (CH)에서 EU 넘버링에 따른 인간 IgG1 중쇄 내의 T366, L368, K370, D399, F405, Y407 및 K409로 이루어진 군으로부터 선택된 위치에 상응하는 위치에서의 아미노산 중 적어도 1개가 치환되고, 상기 제2 중쇄 불변 영역 (CH)에서 EU 넘버링에 따른 인간 IgG1 중쇄 내의 T366, L368, K370, D399, F405, Y407 및 K409로 이루어진 군으로부터 선택된 위치에 상응하는 위치에서의 아미노산 중 적어도 1개가 치환되고, 상기 제1 및 상기 제2 중쇄가 동일한 위치에서 치환되지는 않는 것인 제약 제제.
  42. 제41항에 있어서, (i) EU 넘버링에 따른 인간 IgG1 중쇄 내의 F405에 상응하는 위치에서의 아미노산이 상기 제1 중쇄 불변 영역 (CH)에서 L이고, EU 넘버링에 따른 인간 IgG1 중쇄 내의 K409에 상응하는 위치에서의 아미노산이 상기 제2 중쇄 불변 영역 (CH)에서 R이거나, 또는 (ii) EU 넘버링에 따른 인간 IgG1 중쇄 내의 K409에 상응하는 위치에서의 아미노산이 상기 제1 중쇄에서 R이고, EU 넘버링에 따른 인간 IgG1 중쇄 내의 F405에 상응하는 위치에서의 아미노산이 상기 제2 중쇄에서 L인 제약 제제.
  43. 제1항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 동일한 제1 및 제2 항원 결합 영역 및 인간 IgG1 힌지, CH2 및 CH3 영역을 포함하는 2개의 중쇄 불변 영역 (CH)을 포함하는 또 다른 항체와 비교하여 더 적은 정도로 Fc-매개 이펙터 기능을 유도하는 것인 제약 제제.
  44. 제43항에 있어서, 상기 제1 및 제2 중쇄 불변 영역 (CH)이 변형되어, 항체가 비-변형된 제1 및 제2 중쇄 불변 영역 (CH)을 포함하는 것을 제외하고는 동일한 항체와 비교하여 더 적은 정도로 Fc-매개 이펙터 기능을 유도하도록 하는 것인 제약 제제.
  45. 제43항 또는 제44항에 있어서, 상기 Fc-매개 이펙터 기능이 Fcγ 수용체에 대한 결합, C1q에 대한 결합, 또는 Fcγ 수용체의 Fc-매개 가교의 유도에 의해 측정되는 것인 제약 제제.
  46. 제45항에 있어서, 상기 Fc-매개 이펙터 기능이 C1q에 대한 결합에 의해 측정되는 것인 제약 제제.
  47. 제43항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 및 제2 중쇄 불변 영역이 변형되어, 상기 항체에 대한 C1q의 결합이 야생형 항체와 비교하여 감소되도록, 바람직하게는 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97% 또는 100%만큼 감소되도록 하며, 여기서 C1q 결합은 바람직하게는 ELISA에 의해 결정되는 것인 제약 제제.
  48. 제1항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 및 제2 중쇄 불변 영역 (CH) 중 적어도 하나에서 EU 넘버링에 따른 인간 IgG1 중쇄 내의 위치 L234, L235, D265, N297 및 P331에 상응하는 위치에서의 1개 이상의 아미노산이 각각 L, L, D, N 및 P가 아닌 것인 제약 제제.
  49. 제48항에 있어서, EU 넘버링에 따른 인간 IgG1 중쇄 내의 위치 L234 및 L235에 상응하는 위치가 상기 제1 및 제2 중쇄에서 각각 F 및 E인 제약 제제.
  50. 제48항에 있어서, EU 넘버링에 따른 인간 IgG1 중쇄 내의 위치 L234, L235 및 D265에 상응하는 위치가 상기 제1 및 제2 중쇄 불변 영역 (HC)에서 각각 F, E 및 A인 제약 제제.
  51. 제48항에 있어서, 제1 및 제2 중쇄 불변 영역 둘 다의 EU 넘버링에 따른 인간 IgG1 중쇄 내의 위치 L234, L235 및 D265에 상응하는 위치가 각각 F, E 및 A이고, (i) 제1 중쇄 불변 영역의 EU 넘버링에 따른 인간 IgG1 중쇄 내의 F405에 상응하는 위치가 L이고, 제2 중쇄 불변 영역의 EU 넘버링에 따른 인간 IgG1 중쇄 내의 K409에 상응하는 위치가 R이거나, 또는 (ii) 제1 중쇄의 EU 넘버링에 따른 인간 IgG1 중쇄 내의 K409에 상응하는 위치가 R이고, 제2 중쇄의 EU 넘버링에 따른 인간 IgG1 중쇄 내의 F405에 상응하는 위치가 L인 제약 제제.
  52. 제48항에 있어서, 제1 및 제2 중쇄 불변 영역 둘 다의 EU 넘버링에 따른 인간 IgG1 중쇄 내의 위치 L234 및 L235에 상응하는 위치가 각각 F 및 E이고, (i) 제1 중쇄 불변 영역의 EU 넘버링에 따른 인간 IgG1 중쇄 내의 F405에 상응하는 위치가 L이고, 제2 중쇄의 EU 넘버링에 따른 인간 IgG1 중쇄 내의 K409에 상응하는 위치가 R이거나, 또는 (ii) 제1 중쇄 불변 영역의 EU 넘버링에 따른 인간 IgG1 중쇄 내의 K409에 상응하는 위치가 R이고, 제2 중쇄의 EU 넘버링에 따른 인간 IgG1 중쇄 내의 F405에 상응하는 위치가 L인 제약 제제.
  53. 제26항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 결합 아암이 카파 (κ) 경쇄, 예컨대 서열식별번호: 26에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 카파 경쇄를 포함하고, 상기 제2 결합 아암이 람다 (λ) 경쇄, 예컨대 서열식별번호: 27에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 람다 경쇄를 포함하는 것인 제약 제제.
  54. 제26항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 결합 아암이 람다 (λ) 경쇄, 예컨대 서열식별번호: 27에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 람다 경쇄를 포함하고, 상기 제2 결합 아암이 카파 (κ) 경쇄, 예컨대 서열식별번호: 26에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 카파 경쇄를 포함하는 것인 제약 제제.
  55. 제26항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 결합 아암 및 제2 결합 아암이 둘 다 람다 (λ) 경쇄, 예컨대 서열식별번호: 27에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 람다 경쇄를 포함하는 것인 제약 제제.
  56. 제26항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 결합 아암 및 제2 결합 아암이 둘 다 카파 (κ) 경쇄, 예컨대 서열식별번호: 26에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 카파 경쇄를 포함하는 것인 제약 제제.
  57. 제26항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 결합 아암이 서열식별번호: 24에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 제2 결합 아암이 서열식별번호: 25에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 것인 제약 제제.
  58. 제26항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 결합 아암이 서열식별번호: 25에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 제2 결합 아암이 서열식별번호: 24에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 것인 제약 제제.
  59. 제1항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 결합제가 T 세포의 증식을 유도하고/거나 증진시키는 것인 제약 제제.
  60. 제59항에 있어서, 상기 T 세포가 CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포인 제약 제제.
  61. 제1항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 항원-결합 영역이 PD-L1에 결합하는 경우에만 결합제가 CD137 신호전달을 활성화시키는 것인 제약 제제.
  62. 제59항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, T 세포의 증식이 특이적 T-세포 수용체 (TCR)를 발현하는 T-세포를 TCR에 의해 인식되는 주요 조직적합성 복합체 상의 상응하는 항원을 제시하는 수지상 세포 (DC)와 공동-배양함으로써 측정되는 것인 제약 제제.
  63. 제1항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 수성 제제인 제약 제제.
  64. 제1항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, 의약으로서 사용하기 위한 제약 제제.
  65. 제1항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, 암의 치료에 사용하기 위한 제약 제제.
  66. 질환의 치료를 필요로 하는 대상체에게 유효량의 제1항 내지 제64항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 제약 제제를 투여하는 것을 포함하는, 질환의 치료 방법.
  67. 제66항에 있어서, 질환이 암인 방법.
  68. 제1항 내지 제65항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 결합제를 제공하는 단계 및 이를 pH 약 4.5 내지 약 6.5에서
    a. 히스티딘 완충제,
    b. 약 100 내지 약 400 mM의 당, 및
    c. 약 0.001 내지 약 0.1% (w/v) 비-이온성 계면활성제와 합하는 단계를 포함하는, 제1항 내지 제64항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 제약 제제의 제조 방법.
  69. 세포 사멸의 유도 또는 PD-L1을 발현하는 종양 세포의 성장 및/또는 증식의 억제를 필요로 하고/거나 상기 종양 세포를 보유하는 대상체에게 유효량의 제1항 내지 제64항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 제약 제제를 투여하는 것을 포함하는, 세포 사멸을 유도하거나 또는 PD-L1을 발현하는 종양 세포의 성장 및/또는 증식을 억제하는 방법.
  70. 제65항 또는 제67항에 있어서, 암이 고형 종양의 존재를 특징으로 하거나 또는 흑색종, 난소암, 폐암, 결장암 및 두경부암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 제약 제제 또는 방법.
  71. 제65항, 제67항 및 제68항 중 어느 한 항에 있어서, 암이 비소세포 폐암 (NSCLC)인 제약 제제 또는 방법.
  72. 의약, 예컨대 암, 예를 들어 고형 종양의 존재를 특징으로 하는 암 또는 흑색종, 난소암, 폐암, 결장암 및 두경부암으로 이루어진 군으로부터 선택된 암의 치료를 위한 의약의 제조를 위한 제1항 내지 제64항 중 어느 한 항에 따른 제약 제제의 용도.
  73. 제72항에 있어서, 폐암이 비소세포 폐암 (NSCLC)인 용도.
  74. 제64항 내지 제66항, 제67항, 제69항, 제72항 및 제73항 중 어느 한 항에 있어서, 제약 제제가 정맥내로 투여되는 것인 제약 제제, 용도 또는 방법.
  75. 제64항 내지 제66항, 제67항, 제69항, 제72항 및 제73항 중 어느 한 항에 있어서, 용도 또는 방법이 1종 이상의 추가의 치료제, 예컨대 화학요법제와의 조합을 포함하는 것인 제약 제제, 용도 또는 방법.
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