JP2014240426A - Ｎｋ細胞増強化合物を使用する治療抗体の有効性を増大させる方法および組成物 - Google Patents

Abstract

【課題】 治療抗体の有効性を増大させるための方法および組成物を提供すること。【解決手段】 有効性は、ＡＤＣＣ機序の増大により増強されることを見いだした。【選択図】図３

Description

技術分野
本発明は、一般に、治療抗体の有効性を増大させるための方法および組成物に関し、より詳しくは、本発明は、阻害性受容体を遮断し、またはナチュラルキラー細胞の活性化受容体を刺激し、それによって哺乳動物対象におけるナチュラルキラー細胞の細胞毒性の増強を可能にし、ヒト対象における治療の有効性を、特にＡＤＣＣ機序の増大を通じて増強する化合物と組合わせた治療抗体の使用に関する。

背景技術
ヒトにおけるさまざまな治療法は治療抗体の使用に基づく。これらには、例えば、標的細胞、特にウイルス感染細胞、腫瘍細胞、または他の病原細胞など疾患細胞を枯渇させるように開発された治療抗体の使用を含む。かかる抗体は通常、ヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ３Ｆｃ部分を伴うＩｇＧ種のモノクローナル抗体である。これらの抗体は、天然または組換え抗体でありうるが、しばしば「ヒト化」マウス抗体である（すなわち、さまざまな種の機能的ドメイン、通常、ヒトまたはヒト以外の霊長類起源のＦｃタンパク質、およびマウス起源の可変領域または相補性決定領域（ＣＤＲ）を含んで成る）。あるいは、モノクローナル抗体は、ヒトＩｇ遺伝子座を有するトランスジェニックマウスにおける免疫付与による、またはヒト細胞由来のｃＤＮＡライブラリーにより得られる完全にヒトのものでありうる。

かかる治療抗体の特定の例がリツキシマブ（ｒｉｔｕｘｉｍａｂ）（マブテラ（Ｍａｂｔｈｅｒａ）（登録商標）、リツキサン（Ｒｉｔｕｘａｎ）（登録商標））であり、これはＣＤ２０を特異的に与えるマウス可変ドメインにつながっているヒトγ１およびκ定常領域により（したがって、ヒトＩｇＧ１Ｆｃタンパク質により）生成されるキメラ抗ＣＤ２０モノクローナル抗体である。過去数年間に、リツキシマブは、Ｂリンパ球増殖性悪性腫瘍、特に非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）に対する治療法を大幅に変えた。ヒト化ＩｇＧ１抗体の他の例としては、Ｂ細胞悪性腫瘍の治療に使用されるアレムツズマブ（ａｌｅｍｔｕｚｕｍａｂ）（キャンパス（Ｃａｍｐａｔｈ）−１Ｈ（登録商標））、および乳癌の治療に使用されるトラスツズマブ（ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ）（ヘルセプチン（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）（登録商標））が挙げられる。開発中の治療抗体のさらなる例は、当該分野において開示されている。

治療抗体の作用機序は依然として議論の余地がある。抗体の注入は、抗体によって特異的に認識される抗原を有する細胞の枯渇をもたらす。この枯渇は、少なくとも３つの機序、すなわち、抗体介在細胞の細胞毒性（ＡＤＣＣ）、補体依存性溶解、および抗体によって標的化される抗原を介して示されるシグナルによる腫瘍成長の直接抗腫瘍阻害によって介在されうる。

これらの抗体は、特に腫瘍の治療のために、ヒト治療の新たなかつ有効な方法を示すが、つねに強力な効果を示すわけではない。例えば、リツキシマブは、単独または化学療法と併用して、低〜中間悪性度と高悪性度ＮＨＬの治療において有効であることが示されたが、低悪性度ＮＨＬ患者の３０％〜５０％はリツキシマブに対する臨床反応を示さない。リンパ種細胞でのＣＤ２０発現のレベル、治療時の高い全身腫瘍組織量の存在、または低い血清リツキシマブ濃度により、一部の患者におけるリツキシマブの有効性の欠如が説明されうることが示されている。それでもなお、治療の失敗の実際の原因は、大部分が未知のままである。

さらに、治療抗体の使用は、その投与が原因の副作用によって制限されうる。例えば、発熱、頭痛、悪心、低血圧、喘鳴、発疹、感染、およびその他多くのものなど副作用が患者には出現し、抗体が投与されうる可能な量または頻度を潜在的に制限しうる。

したがって、治療抗体の有効性を増大させ、または副作用を誘発しにくい抗体の削減量を用いて治療効果を達成できることがきわめて興味深いと言える。本発明はこれらおよび他の必要に対処する。

発明の開示
本発明は、治療抗体の有効性を増強する新たな方法を開示する。以下の理論によって限定されることなく、本方法を用いて達成された驚くべき結果は、治療抗体が注入されるとインビボでＡＤＣＣ機序を増強するその能力に由来すると考えられる。実際に、本発明は、治療抗体の有効性に関係した現在の問題を克服する新たな組成物および方法を提供する。本発明において、個体からのＮＫ細胞は、例えば、ＮＫ細胞での阻害性受容体の阻害によって、ＮＫ細胞の活性化の欠如による乏しい治療ｍＡｂ（モノクローナル抗体）介在ＡＤＣＣを有することが示されている。好ましくは、ＡＤＣＣ機序の増大が、ナチュラルキラー細胞での阻害性受容体を遮断し、または活性化受容体を刺激する化合物の投与によって達成され、それによって哺乳動物対象におけるナチュラルキラー細胞の細胞毒性の増強を促進する。好ましくは、化合物は抗体またはそのフラグメントである。

前記抗体または他の化合物は、ＮＫ細胞の阻害性受容体、例えば、キラー阻害性受容体（ＫＩＲまたはＮＫＧ２Ａ／Ｃ）分子、または活性化受容体、例えば、ＮＫ細胞でのＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、またはＮＫｐ４６などＮＣＲと反応し、それによって細胞の阻害を中和し、かつそのＡＤＣＣ活性を増大させうる。

より具体的には、本発明は、ＮＫ細胞の阻害性受容体を遮断し、または活性化受容体を刺激する化合物、好ましくは、抗体、またはそのフラグメントが治療抗体とともに対象に同時投与される対象の治療方法を開示する。本発明者らは、ここで治療抗体の有効性が、かかる化合物、好ましくは、例えば、ＮＫ細胞の阻害性受容体を遮断し、または活性化受容体を刺激することによって、ＮＫ細胞の阻害を克服する抗体またはそのフラグメントの同時投与、例えば、同時注入によって大幅に増強されうることを明らかにする。

本発明は、治療抗体および化合物、好ましくは、ＮＫ細胞の阻害性受容体を遮断し、または活性化受容体を刺激する抗体またはそのフラグメントを含んで成る医薬組成物にも関する。本発明は、治療抗体および化合物、好ましくは、ＮＫ細胞の阻害性受容体を遮断し、または活性化受容体を刺激する抗体またはそのフラグメントを含んで成るキットにも関する。

本発明は、治療抗体による治療の有効性を増大させ、または治療抗体による治療にかけられる対象におけるＡＤＣＣを増大させるために、ＮＫ細胞の阻害性受容体を遮断し、または活性化受容体を刺激する化合物、好ましくは、抗体またはそのフラグメントの使用にも関する。

本発明は、ＮＫ細胞の阻害性受容体を遮断し、または活性化受容体を刺激する化合物、好ましくは、抗体またはそのフラグメント、および疾患を治療するための薬剤の調製のための治療抗体の使用にも関する。より詳しくは、疾患の治療は、標的細胞、好ましくは、ウイルス感染細胞、腫瘍細胞、または他の病原細胞など疾患細胞の枯渇を必要とする。好ましくは、疾患は癌、感染性または免疫疾患である。より好ましくは、疾患は、癌、自己免疫疾患、炎症性疾患、およびウイルス疾患より成る群から選択される。疾患は、移植片拒絶、より詳しくは、同種移植片拒絶、および移植片対宿主疾患（ＧＶＨＤ）にも関する。

本発明は、治療抗体、例えば、Ｆｃγ受容体、好ましくは、ＣＤ１６（ＦｃγＲＩＩＩａ）によって結合される抗体の投与量を削減する方法をも含んで成る。例えば、ＮＫ細胞の阻害性受容体を遮断し、または活性化受容体を刺激する治療抗体および化合物の同時投与は、使用される治療抗体の低い用量を可能にする。かかる抗体は、化合物の非存在下の推奨量の２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、もしくはより低い用量で使用されうる。

また、本発明は、治療抗体、例えば、ＣＤ１６によって結合される抗体の治療有効削減量を決定するための方法を提供し、この方法は、ｉ）第１の濃度の治療抗体を、標的細胞およびＮＫ細胞と、かつＮＫ細胞での阻害性受容体を遮断し、または活性化受容体を刺激する化合物の非存在下に同時インキュベートする工程と、ｉｉ）第２の低濃度の治療抗体を標的細胞、ＮＫ細胞と、ＮＫ細胞で阻害性受容体を遮断し、または活性化受容体を刺激する化合物の存在下に同時インキュベートする工程と、ｉｉｉ）工程ｉｉ）において確認された標的細胞の枯渇が、工程ｉ）において確認された枯渇と同程度であるか決定する工程とを含んで成る。工程ｉｉ）が工程ｉ）と同じく有効であることが確認される場合は、化合物および治療抗体の相対濃度が変動され、枯渇が確認され、所定の患者における使用に適する異なる条件、例えば、標的細胞枯渇の最大化、治療抗体の削減量、または化合物の削減量を、患者の特定の必要に応じて特定することができる。

特定の態様においては、本発明はそれを必要とするヒト対象における疾患の治療方法を提供し、これはａ）ＮＫ細胞の阻害性受容体を遮断し、または活性化受容体を刺激する化合物を前記対象に投与する工程と、ｂ）ＣＤ１６によって結合されうる治療抗体を前記対象に投与する工程とを含んで成る。

一実施形態においては、治療抗体および化合物は同時に対象に投与される。別の実施形態においては、化合物は治療抗体の投与の１週間以内、４日以内、３日以内、または同日（例えば、約２４時間以内）に対象に投与される。別の実施形態においては、疾患は癌、感染性または免疫疾患である。

一実施形態においては、方法はさらに、対象におけるＮＫ細胞の活性または数が化合物の投与の前後に評価されるさらなる工程を含んで成る。別の実施形態においては、さらなる工程は、ｉ）投与前に対象からＮＫ細胞を得る工程と、ｉｉ）化合物の存在または非存在下に治療抗体によって認識される１つもしくはそれ以上の標的細胞の存在下にＮＫ細胞をインキュベートする工程と、ｉｉｉ）標的細胞を枯渇させるＮＫ細胞の能力に対する化合物の効果を評価する工程とを含み、化合物が標的細胞を枯渇させるＮＫ細胞の能力を増強させる検出が、化合物が方法における使用に適切であり、方法が対象との使用に適切であることを示す。

別の態様においては、本発明は、例えば、ＣＤ１６によって結合されうる治療抗体、ＮＫ細胞の阻害性受容体を遮断し、または活性化受容体を刺激する化合物、および医薬的に許容可能な担体を含んで成る医薬組成物を提供する。別の態様においては、本発明は、例えば、ＣＤ１６によって結合されうる治療抗体、およびＮＫ細胞の阻害性受容体を遮断し、または活性化受容体を刺激する１つもしくはそれ以上の化合物を含んで成るキットを提供する。

上記の方法、組成物、またはキットのいずれかについて、一実施形態においては、治療抗体はヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ３Ｆｃ部分を有する。別の実施形態においては、化合物は抗体またはそのフラグメントである。別の実施形態においては、化合物はモノクローナル抗体またはそのフラグメントである。別の実施形態においては、治療抗体は放射性または毒性部分と抱合されていない。別の実施形態においては、化合物はＮＫ細胞の阻害性受容体を阻害する。別の実施形態においては、化合物はＮＫ細胞の活性化受容体を刺激する。別の実施形態においては、化合物はヒト、ヒト化、もしくはキメラ抗体、またはそのフラグメントである。一実施形態においては、治療抗体または化合物は、とりわけ、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’２フラグメント、ＣＤＲ、およびＳｃＦｖなど抗体フラグメントまたはその誘導体でありうる。

一実施形態においては、治療抗体はヒト、ヒト化もしくはキメラ抗体、またはそのフラグメントである。別の実施形態においては、治療抗体はリツキシマブまたはキャンパスである。別の実施形態においては、抗体はリツキシマブであり、前記抗体は１週間に３７５ｍｇ／ｍ^２未満の投与量で投与される。別の実施形態においては、抗体はキャンパスであり、抗体は１週間に９０ｍｇ未満の投与量で投与される。

一実施形態においては、化合物は、ＮＫＧ２、ＫＩＲ２ＤＬ、またはＫＩＲ３ＤＬヒト受容体の少なくとも１つに結合し、ＮＫ細胞の細胞毒性の関連ＮＫＧ２、ＫＩＲ２ＤＬ−、またはＫＩＲ３ＤＬ介在阻害を阻害する。別の実施形態においては、化合物は、ＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ２ＤＬ２／３、ＫＩＲ２ＤＬ４、ＫＩＲ２ＤＬ５Ａ、ＫＩＲ２ＤＬ５Ｂ、ＫＩＲ３ＤＬ１、ＫＩＲ３ＤＬ２、ＫＩＲ３ＤＬ３、ＬＩＬＲＢ１、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｃ ＮＫＧ２Ｅ、およびＬＩＬＲＢ５より成る群から選択されるＮＫ細胞の阻害性受容体を遮断する。別の実施形態においては、化合物は、ＫＩＲ２ＤＬヒト受容体の共通の決定基に結合し、かつＮＫ細胞の細胞毒性のＫＩＲ２ＤＬ介在阻害を阻害する。別の実施形態においては、化合物は、ＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ２ＤＬ２、およびＫＩＲ２ＤＬ３ヒト受容体の共通の決定基に結合し、かつＮＫ細胞の細胞毒性のＫＩＲ２ＤＬ１−、ＫＩＲ２ＤＬ２−、およびＫＩＲ２ＤＬ３介在阻害を阻害する。別の実施形態においては、化合物は、８０位でＬｙｓ残基を有するＨＬＡ−Ｃ対立遺伝子分子のヒトＫＩＲ２ＤＬ１受容体への結合、および８０位にＡｓｎ残基を有するＨＬＡ−Ｃ対立遺伝子分子のヒトＫＩＲ２ＤＬ２およびＫＩＲ２ＤＬ３受容体への結合を阻害する。別の実施形態においては、化合物は、ハイブリドーマＤＦ２００によって生成されるモノクローナル抗体ＤＦ２００と同じエピトープに結合する。別の実施形態においては、化合物は、ヒトＮＫ細胞の表面でＫＩＲ受容体に結合するために、ハイブリドーマＤＦ２００によって生成されるモノクローナル抗体ＤＦ２００と競合する。別の実施形態においては、化合物は、ハイブリドーマＤＦ２００またはそのフラグメントによって生成されるモノクローナル抗体ＤＦ２００である。

一実施形態においては、化合物は、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、およびＮＫＧ２Ｄより成る群から選択される受容体に結合する。別の実施形態においては、化合物は、ＡＺ２０、Ａ７６、Ｚ２５、Ｚ２３１、およびＢＡＢ２８１より成る群から選択されるモノクローナル抗体に由来するかまたはモノクローナル抗体に競合する。

別の態様においては、本発明は、治療抗体とともに投与するための化合物を選択する方法を提供し、前記方法は、ｉ）ＮＫ細胞の阻害性受容体を阻害し、または活性化受容体を刺激する試験化合物を提供する工程と、ｉｉ）ＮＫ細胞の存在下、および試験化合物の存在または非存在下に、治療抗体によって特異的に認識される標的細胞で治療抗体をインキュベートする工程と、ｉｉｉ）標的細胞を枯渇させるＮＫ細胞の能力に対する化合物の効果を評価する工程とを含んで成り、化合物が標的細胞を枯渇させるＮＫ細胞の能力を増強させるという検出が、方法における使用に適切であることを示す。

一実施形態においては、化合物は、標的細胞を５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２００％、３００％、４００％、５００％もしくはそれ以上破壊する治療抗体の能力を増強する。別の実施形態においては、化合物は、抗体、抗体フラグメント、モノクローナル抗体、モノクローナル抗体のフラグメント、ヒト化抗体、キメラ抗体、およびヒト抗体より成る群から選択される。別の実施形態においては、標的細胞は、癌細胞、ウイルス感染細胞、または自己免疫疾患の基礎を成す細胞である。別の実施形態においては、治療抗体はリツキシマブまたはキャンパスである。

別の態様においては、本発明は、対象におけるＣＤ１６によって結合されうる治療抗体の投与を含む治療の有効性を増大させる方法を提供し、前記方法は、前記治療抗体の投与前、投与と同時、または投与後に、ＮＫ細胞の阻害性受容体を遮断し、または活性化受容体を刺激する化合物の治療有効量を前記対象に投与する工程を含んで成る。一実施形態においては、化合物は、前記対象におけるＡＤＣＣを増強させることによって治療の有効性を増大させる。

本発明は、治療抗体の有効性を増大させるための方法を提供する。本発明は、より具体的には、化合物、好ましくは、ＮＫ細胞の阻害性受容体を遮断し、または活性化受容体を活性化することによって、ＮＫ細胞を増強しうる、好ましくは、抗体またはそのフラグメントの使用が、治療抗体の有効性を顕著に増大させうることを開示する。実際に、本発明者らは、複数の治療抗体の有効性が、ＮＫ細胞受容体、例えば、阻害性受容体に対する抗体の同時投与によって大きく増強されうることを明らかにする。

したがって、本発明は、それを必要とする対象における疾患の治療方法に関し、
ａ）化合物、好ましくは、ＮＫ細胞の阻害性受容体を遮断し、または活性化受容体を刺激する抗体またはそのフラグメントを前記対象に投与する工程と、
ｂ）前記対象に治療抗体を投与する工程と
を含んで成る。

前記治療抗体は、ＮＫ細胞のＣＤ１６によって、好ましくは、そのＦｃ領域により結合されうる。

好ましくは、前記治療抗体は、ヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ３Ｆｃ部分、特にモノクローナル抗体またはそのフラグメント、さらに好ましくは、ヒト化、ヒトもしくはキメラ抗体またはそのフラグメント、例えばリツキシマブを有する。

ＮＫ細胞の阻害性受容体を遮断する化合物、好ましくは、抗体またはそのフラグメントは、治療抗体の投与の前、投与と同時に、または投与の後に対象に投与されうることが意図されている。異なる抗体の投与の方法は、そのバイオアベイラビリティおよび薬物動態によって決まる。好ましくは、治療抗体は、ＮＫ細胞の阻害性受容体を遮断する化合物、好ましくは、抗体またはそのフラグメントの投与の１週間以内、より好ましくは、５もしくは２日間以内に投与される。好ましくは、治療抗体は、ＮＫ細胞の阻害性受容体を遮断する化合物、好ましくは、抗体またはそのフラグメントの前またはこれと同時に投与される。

別の態様においては、本発明は、治療抗体治療を受ける対象におけるＡＤＣＣを増大させる方法に関し、前記方法は、ＮＫ細胞の阻害性受容体を遮断する化合物、好ましくは、抗体またはそのフラグメントのＡＤＣＣを増大させるのに十分な量を前記治療抗体の投与の前、投与と同時に、または投与の後に前記対象に投与する工程を含んで成る。前記治療抗体は、ＮＫ細胞でＣＤ１６によって、好ましくは、そのＦｃ領域によって結合されうる。好ましくは、前記治療抗体は、ヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ３Ｆｃ部分、特にモノクローナル抗体またはそのフラグメント、さらに好ましくは、ヒト、ヒト化もしくはキメラ抗体またはそのフラグメント、例えばリツキシマブを有する。

別の態様においては、本発明は、対象における治療抗体治療の有効性を増大させる方法に関し、前記方法は、前記治療抗体の有効性を増大させるのに十分なＮＫ細胞の阻害性受容体を遮断する化合物、好ましくは、抗体またはそのフラグメントの量を前記治療抗体の投与の前、投与と同時に、または投与の後に前記対象に投与する工程を含んで成る。前記治療抗体は、ＣＤ１６によって、好ましくは、そのＦｃ領域によって結合されうる。好ましくは、前記治療抗体は、ヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ３Ｆｃ部分、特にモノクローナル抗体またはそのフラグメント、さらに好ましくは、ヒト、ヒト化もしくはキメラ抗体またはそのフラグメント、例えばリツキシマブを有する。

定義
本明細書で使用される以下の用語は、別段の規定がない限り、それらに割り当てられた意味を有する。

本明細書で使用される、「ＮＫ」細胞は、非従来的な免疫に関与するリンパ球の下位集団を指す。ＮＫ細胞は、ＣＤ１６、ＣＤ５６および／またはＣＤ５７を含む特異的表面抗原の発現、細胞表面でのアルファ／ベータまたはガンマ／デルタＴＣＲ複合体の非存在、特異的細胞溶解酵素の活性化によって「自己」ＭＨＣ／ＨＬＡ抗原を発現できない細胞に結合し、かつこれを殺傷する能力、ＮＫ活性化受容体のリガンドを発現する腫瘍細胞または他の疾患を殺傷する能力、および免疫応答を刺激または阻害するサイトカインと呼ばれるタンパク質分子を放出する能力など一部の特性および生物学的特性に基づいて同定されうる。これらの特性および活性のいずれかを使用し、当該分野において公知の方法を使用してＮＫ細胞を同定することができる。

本明細書で使用される「抗体」という用語は、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体を指す。重鎖における定常ドメインの種類によって、抗体は５つの主要なクラス、すなわち、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭの１つに割り当てられる。これらの一部はさらに、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４などのサブクラスまたはアイソタイプに分割される。典型的な免疫グロブリン（抗体）の構造単位は四量体を含んで成る。四量体は、２つの同一ペアのポリペプチド鎖から成り、各ペアは１つの「軽」鎖（約２５ｋＤａ）および１つの「重」鎖（約５０−７０ｋＤａ）を有する。各鎖のＮ末端は、主に抗原認識に関与する約１００〜１１０もしくはそれ以上のアミノ酸の可変領域を規定する。可変軽鎖（Ｖ_Ｌ）および可変重鎖（Ｖ_Ｈ）という用語は、それぞれこれらの軽鎖および重鎖を指す。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれ「アルファ」、「デルタ」、「エプシロン」、「ガンマ」、および「ミュー」と呼ばれる。免疫グロブリンの異なるクラスのサブユニット構造および三次元構成は公知である。ＩｇＧおよび／またはＩｇＭは本発明において使用される抗体の好ましいクラスであり、ＩｇＧが特に好ましいが、これらそれらが生理学的状況下に最も共通の抗体であるためであり、それらは実験室状況下で最も容易に作られるためであり、かつＩｇＧはＦｃガンマ受容体によって特異的に認識されるためである。好ましくは、本発明の抗体はモノクローナル抗体である。特に好ましいのは、ヒト化、キメラ、ヒト、または他のヒトに適切な抗体である。

本発明の枠内で、「治療抗体または抗体」という用語は、より具体的には、患者における標的細胞を枯渇させる働きをする抗体を指す。特に、治療抗体は、標的細胞の表面上に存在する抗原、例えば、腫瘍細胞上に主に、またはのみに存在する腫瘍特異的抗原に特異的に結合する。好ましくは、治療抗体はヒトＦｃタンパク質を含み、またはヒトＦｃ受容体と相互作用する能力がある。治療抗体は、例えば、ＡＤＣＣまたはその他の手段によって細胞を標的にすることができ、かつ「ネイキッド」すなわち抱合部分なしであり、または放射性ラベルまたは毒素などの化合物と抱合されうる。

「特異的に結合する」という用語は、抗体が、好ましくは、競合結合アッセイにおいて、結合パートナー、例えば、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、またはＮＫｐ４６など活性化ＮＫ受容体、もしくはヒトＦｃガンマ受容体に結合しうることを意味するが、これはタンパク質の組換え形態、その中のエピトープ、または単離ＮＫもしくは関連標的細胞の表面上に存在する天然タンパク質のいずれかを使用して評価される。特異的結合を測定するための競合結合アッセイおよび他の方法は、さらに以下に記載されており、当該分野において公知である。

「ヒトに適切な」抗体は、例えば、本明細書に記載された治療方法のためにヒトにおいて安全に使用されうる抗体、誘導体化抗体、または抗体フラグメントを指す。ヒトに適切な抗体としては、抗体の少なくとも一部がヒト由来であり、またはその他の場合に天然のヒト以外の抗体が使用される場合に誘発される免疫応答を回避するために修飾される、すべての種類のヒト化、キメラ、もしくは完全にヒト抗体、または任意の抗体が挙げられる。

「免疫原性フラグメント」によって、本明細書では、（ｉ）前記フラグメントに結合する抗体および／または膜結合受容体およびそれに由来する突然変異体を含む前記フラグメントを含んで成る分子の形態に結合する抗体の生成、（ｉｉ）ＭＨＣ分子および前記フラグメント由来のペプチドを含んで成る二分子複合体に反応するＴ細胞を含むＴ細胞反応の刺激、（ｉｉｉ）哺乳動物の免疫グロブリンをコード化する遺伝子を発現するバクテリオファージまたは細菌などトランスフェクト媒体の結合などの免疫応答を引き出すポリペプチドまたはペプチドフラグメントが意味される。あるいは、免疫原性フラグメントは、共有結合によって担体タンパク質に抱合されたペプチドフラグメント、そのアミノ酸配列に前記ペプチドフラグメントを含んで成るキメラ組換えポリペプチド構成物など上記の免疫応答を引き出す能力がある構成物も指し、かつ具体的には、その配列が前記フラグメントをコード化するタンパク質を含んで成るｃＤＮＡでトランスフェクトされた細胞を含む。

本発明において、「ヒト化」抗体は、１つもしくはそれ以上のヒト免疫グロブリンの定常および可変枠組み領域が結合領域、例えば、動物の免疫グロブリンのＣＤＲと融合される抗体を指す。かかるヒト化抗体は、結合領域がそれに由来するヒト以外の抗体の結合特異性を維持するが、ヒト以外の抗体に対する免疫反応を回避するようにデザインされている。

「キメラ抗体」は、（ａ）定常領域、またはそのタンパク質が変化、置換、または交換され、抗原結合部位（可変領域）が異なるまたは変化クラスの定常領域、エフェクター機能および／または種、またはキメラ抗体に新しい特性を与える完全に異なる分子、例えば、酵素、毒素、ホルモン、成長因子、薬剤等につながり、または（ｂ）可変領域、またはそのタンパク質が、異なるまたは変化抗原特異性を有する可変領域で変化、置換、または交換されている抗体分子である。本発明の好ましい実施形態においては、キメラ抗体は、いずれにせよ免疫グロブリンのＦｃ領域、好ましくはヒトＦｃ領域を維持し、それによって標的細胞の表面上でヒトＦｃ受容体との相互作用を可能にする。

本発明の枠内で、「増強」、「活性」、または「活性化」ＮＫ細胞は、生物学的に活性のＮＫ細胞、より詳しくは、標的細胞を溶解する能力を有するＮＫ細胞を指す。例えば、「活性」ＮＫ細胞は、ＮＫ活性化受容体リガンドを発現し、「自己」ＭＨＣ／ＨＬＡ抗原（ＫＩＲ不適合細胞）を発現できない細胞を殺傷することができる。リダイレクト・キリング・アッセイ（ｒｅｄｉｒｅｃｔｅｄ ｋｉｌｌｉｎｇ ａｓｓａｙ）における使用に適した標的細胞の例は、Ｐ８１５細胞およびＫ５６２細胞であるが、多くの細胞型のいずれかを使用することができ、これらは当該分野において公知である（例えば、シボリ（Ｓｉｖｏｒｉ）ら（１９９７年）、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８６、ｐ．１１２９−１１３６、ビターレ（Ｖｉｔａｌｅ）ら（１９９８年）、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８７、ｐ．２０６５−２０７２、ペッシーノ（Ｐｅｓｓｉｎｏ）ら（１９９８年）、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８８、ｐ．９５３−９６０、ネリ（Ｎｅｒｉ）ら（２００１年）、Ｃｌｉｎ．Ｄｉａｇ．Ｌａｂ．Ｉｍｍｕｎ．８、ｐ．１１３１−１１３５を参照）。「増強」、「活性」、または「活性化」細胞は、遊離細胞内カルシウムレベルにおけるサイトカイン（例えば、ＩＮＦ−γおよびＴＮＦ−α）産生など、ＮＫ活性と関係がある当該分野において周知の他の特性または活性によっても同定されうる。本発明において、「増強」、「活性」、または「活性化」ＮＫ細胞は、特に、阻害性受容体の刺激によって阻害されない、またはかかる阻害が、例えば、活性化受容体の刺激によって克服されているインビボでのＮＫ細胞を指す。

本明細書で使用される、「活性化ＮＫ受容体」という用語は、刺激されると、遊離細胞内カルシウムレベルにおけるサイトカイン（例えば、ＩＮＦ−γおよびＴＮＦ−α）産生などＮＫ活性と関係がある当該分野において周知の他の特性または活性の測定可能な増大を引き起こし、かつ遊離細胞内カルシウムレベル、例えば、本明細書で別記されているリダイレクト・キリング・アッセイにおいて細胞に標的する能力、またはＮＫ細胞増殖を刺激する能力を上げるＮＫ細胞の表面上の分子を指す。「活性化ＫＩＲ受容体」という用語は、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＮＫＧ２Ｄ、ＩＬ−１２Ｒ、ＩＬ−１５Ｒ、ＩＬ−１８Ｒ、およびＩＬ−２１Ｒを含むが、これらに限定されない。本明細書で使用される「活性化ＮＫ受容体」という用語は、ＩＬ−２受容体（ＩＬ−２Ｒ）を除外する。ＮＫ細胞が活性か、または増殖性であるかどうかを判定する方法は、以下にさらに詳しく述べられており、当業者には公知である。

本明細書で使用される、「阻害する」または「阻害」ＮＫ受容体」という用語は、刺激されると、サイトカイン（例えば、ＩＮＦ−γおよびＴＮＦ−α）産生などＮＫ活性と関係がある当該分野において周知の他の特性または活性の測定可能な減少を引き起こし、かつ遊離細胞内カルシウムレベル、または例えば、本明細書で別記されているリダイレクト・キリング・アッセイにおいて標的細胞を溶解する能力を上げるＮＫ細胞の表面上の分子を指す。かかる受容体の例としては、ＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ２ＤＬ２／３、ＫＩＲ２ＤＬ４、ＫＩＲ２ＤＬ５Ａ、ＫＩＲ２ＤＬ５Ｂ、ＫＩＲ３ＤＬ１、ＫＩＲ３ＤＬ２、ＫＩＲ３ＤＬ３、ＬＩＬＲＢ１、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｃ ＮＫＧ２Ｅ、およびＬＩＬＲＢ５が挙げられる。ＮＫ細胞が活性かどうかを判定する方法は、以下にさらに詳しく述べられており、当業者には公知である。

本発明において「ＮＫ細胞の阻害性受容体を遮断し、または活性化受容体を刺激する」という用語は、好ましくは、少なくとも１つの阻害または活性化ＮＫ細胞受容体、例えば、ＫＩＲ、ＮＫＧ２Ａ／Ｃ、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、および本明細書でリストアップされている他のものと直接相互作用し、かつ受容体の阻害シグナルを中和し（阻害性受容体の場合）、または受容体からのシグナル伝達を刺激する（活性化受容体の場合）一部の化合物、好ましくは、抗体、そのフラグメント、または誘導体の能力を指す。阻害性受容体により、好ましくは化合物、好ましくは抗体またはそのフラグメントが、ＨＬＡと受容体との間の相互作用を遮断することができる。化合物が抗体である場合、抗体はポリクローナル、または、好ましくは、モノクローナルでありうる。それらは、ハイブリドーマによって、または所望の可変または定常ドメインを発現するように改変された組換え細胞によって生成されうる。抗体は単鎖抗体、または抗原特異性および低ヒンジ領域またはその変形、例えばＦａｂフラグメント、Ｆａｂ’２フラグメント、ＣＤＲ、およびＳｃＦｖなどを保持する他の抗体誘導体でありうる。これらは、多機能抗体、組換え抗体、ヒト化抗体、またはその変形でありうる。

本発明の枠内で、「共通の決定基」は、関連受容体の群、例えば、ヒトＫＩＲ２ＤＬ受容体群の一部のメンバーによって共有される決定基またはエピトープを指す。決定基またはエピトープは、前記メンバーによって共有されるペプチドフラグメントまたは立体構造エピトープを示しうる。特定の実施形態において、共通の決定基は、モノクローナル抗体ＤＦ２００、ＮＫＶＳＦ１、またはＥＢ６によって認識されるエピトープを含んで成る。

本発明の枠内で、共通の決定基に「結合する」抗体という用語は、特異性および／または親和性を有する前記決定基に結合し、例えば、実質的に、高い親和性または特異性で、ヒトＮＫ細胞の表面において他の無関係のモチーフもしくは決定基または構造には結合することはない抗体を指す。より詳しくは、本発明によるモノクローナル抗体の前記決定基への結合は、前記抗体の別のエピトープまたは決定基への結合と区別されうる。

ＮＫ細胞阻害性受容体に結合し、その刺激を防ぐことが可能な化合物、好ましくは抗体は、したがって「中和」または「阻害」化合物、好ましくは、それらが、少なくとも部分的に、ＮＫ細胞阻害性受容体、すなわち、ＫＩＲまたはＮＫＧ２Ａ／Ｃ受容体によって介在される阻害シグナル伝達経路を遮断するという意味で、好ましくは抗体である。さらに重要なことには、この阻害活性は一部の種類のＫＩＲまたはＮＫＧ２Ａ／Ｃ受容体に関して表示されうるため、これらの化合物、好ましくは抗体は、さまざまな対象において高い効果とともに使用されうる。

例えば、細胞、もしくは核酸、タンパク質、またはベクターに関連して使用される場合の「組換え」という用語は、細胞、核酸、タンパク質、またはベクターが異種の核酸もしくはタンパク質の導入、または天然の核酸またはタンパク質の変化によって修飾されていること、または細胞がこうして修飾された細胞由来であることを示す。したがって、例えば、組換え細胞は、細胞の天然の（非組換え）形態内には存在しない遺伝子を発現し、または、その他の場合には異常に発現し、過少発現し、またはまったく発現しない天然の遺伝子を発現する。

本発明の枠内で、対象または患者は、哺乳動物の対象または患者、より好ましくは、ヒトの対象または患者を含む。

治療抗体
本発明は、治療抗体とともにＮＫ細胞増強化合物の使用に関する。多種多様の治療抗体を本発明において使用することができる。基本的に、「ネイキッド」または放射標識、毒素、もしくは他の部分で抱合されているかどうか、フラグメントか完全長であるかどうか、あるいは天然の抗体もしくは抗体の修飾誘導体であるかどうかに関係なくいかなる治療抗体も使用されうる。好ましくは、方法は、ＮＫ細胞活性が―必ずしも限定的ではないが―投与される治療抗体の有効性において役割を果たす治療の有効性を増強するために使用され、かつ好ましくは、抗体またはフラグメントは当然、ヒトＦｃ領域、または、ヒトＦｃ受容体、例えば、Ｆｃガンマ受容体によって抗体の特異的認識を可能にする他のドメインを含み、または含むように修飾もされる。

本化合物を使用し、治療抗体によって特異的に認識される抗原を発現する標的細胞を枯渇させる治療抗体の能力を増強させることができる。したがって、治療抗体によって標的されうる細胞によって少なくとも部分的に引き起こされ、または悪化される疾患または状態は、本明細書に記載された方法を使用することによって治療されうる。標的細胞の具体的な例としては、アレルギー、自己免疫疾患、同種反応等に関与する腫瘍細胞、ウイルス感染細胞、同種細胞、病的免疫担当細胞（例えば、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球、抗原提示細胞等）、あるいは健康な細胞（例えば、抗血管新生治療法における内皮細胞）が挙げられる。本発明の枠内での最も好ましい標的細胞は、腫瘍細胞およびウイルス感染細胞である。治療抗体は、例えば、細胞毒性効果または細胞溶解を、特に抗体依存細胞介在細胞毒性（ＡＤＣＣ）によって介在しうる。

ＡＤＣＣは、その機能が、ＩｇＧ感作抗原をＦｃγＲ保有細胞毒性細胞につなげ、かつ細胞活性化機構を始動させるＩｇＧのＦｃタンパク質（ＦｃγＲ）のための白血球受容体を必要とする。したがって、治療抗体は免疫複合体を形成する能力がある。例えば、免疫複合体は、治療抗体によってカバーされる腫瘍標的でありうる。より詳しくは、抗体はＣＤ１６によって、好ましくは、そのＦｃ領域により結合されうる。治療抗体がＣＤ１６などＦｃγ受容体に結合するかどうかの判定は、適切なやり方によって、例えば、場合により支持体に固定される、組換え（ｒｅｃｏｍｂａｎｔｌｙ）に生成されるＣＤ１６ポリペプチドまたはそのフラグメントへの結合を判定することによって、または例えば、ＣＤ１６を発現することが知られ、または疑われる細胞への治療抗体の結合を判定することによって評価されうる。

治療抗体はポリクローナル、または、好ましくは、モノクローナルでありうる。それらはハイブリドーマによって、または所望の可変およびは定常ドメインを発現するように改変された組換え細胞によって生成されうる。抗体は単鎖抗体、または抗原特異性および低ヒンジ領域またはその変形を保持する他の抗体誘導体でありうる。これらは多機能抗体、組換え抗体、ヒト化抗体、そのフラグメントまたは変形でありうる。前記フラグメントまたはその誘導体は、好ましくは、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’２フラグメント、ＣＤＲ、およびＳｃＦｖから選択される。好ましくは、フラグメントは抗原結合フラグメントである。抗体フラグメントを含んで成る治療抗体としては、二重特異性抗体も挙げられるがこれに限定されず、適切な二重特異性抗体の一例は、ＣＤ１６に特異的な抗原結合領域および腫瘍抗原に特異的な抗原結合領域を含んで成る。フラグメントを含んで成る他の抗体フォーマットとしては、単一ポリペプチド鎖上の２つの異なる抗体の結合領域を結合する組換え二重特異的抗体誘導体が挙げられ、これはＢｉＴＥ（商標）とも呼ばれる（クファー（Ｋｕｆｅｒ）Ｐら、ＴＲＥＮＤＳ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２００４年、２２（５）、ｐ．２３８−２４４、およびボイエル（Ｂａｅｕｅｒｌｅ）ら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒｐｅｉｔｃｓ ２００３年、５（４）、ｐ．４１３−４１９、その開示は参照することにより本明細書に組込まれる）。

治療抗体は一般に表面抗原、例えば、膜抗原に特異的である。最も好ましい治療抗体は、ＣＤ２０、ＣＤ５２、ＥｒｂＢ２（またはＨＥＲ２／Ｎｅｕ）、ＣＤ３３、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＭＵＣ−１、ＣＥＡ、ＫＤＲ、αＶβ３等、特にリンパ腫抗原（例えば、ＣＤ２０）など腫瘍抗原（例えば、腫瘍細胞によって特異的に発現される分子）に特異的である。治療抗体は、好ましくは、ヒトまたはヒト以外の霊長類のＩｇＧ１またはＩｇＧ３Ｆｃ部分を有し、より好ましくは、ヒトＩｇＧ１部分を有する。

一実施形態においては、抗体はＡＤＣＣ中にＮＫ細胞と抗体の相互作用を増強するそのＦｃタンパク質における修飾を含みうる。かかる修飾治療抗体（「改変抗体」）は一般に、好ましくは、１つもしくはそれ以上のＦｃγＲとの抗体の結合親和性を修飾するＦｃ領域における修飾を含んで成る。１つもしくはそれ以上のＦｃγＲとの修飾結合による抗体を修飾するための方法は当該分野において周知であり、例えば、その各々が参照することにより本明細書にその全体が組込まれる、ＰＣＴ公開国際公開第２００４／０１６７５０号パンフレット（国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２００３／０２５３９９号明細書）、国際公開第９９／１５８５７２号パンフレット、国際公開第９９／１５１６４２号パンフレット、国際公開第９８／１２３２８９号パンフレット、国際公開第８９／１０７１４２号パンフレット、国際公開第８８／１０７０８９号パンフレット、および米国特許第５，８４３，５９７号明細書、および同第５，６４２，８２１号明細書を参照。

関節リウマチを治療するために使用される、Ｄ２Ｅ７（ケンブリッジ・アンティボディ・テクノロジー・グループ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｇｒｏｕｐ）、ｐｌｃ（英国（ＵＫ）、ケンブリッジ／ＢＡＳＦ（ドイツ、ルートビヒスハーフェン（Ｌｕｄｗｉｇｓｈａｆｅｎ））、またはインフリキシマブ（Ｉｎｆｌｉｘｉｍａｂ）（セントコール社（Ｃｅｎｔｏｃｏｒ，Ｉｎｃ．）、ペンシルバニア州（ＰＡ）、マルバーン（Ｍａｌｖｅｒｎ）、クローン病および関節リウマチの治療に使用）など本明細書で識別された治療抗体、または国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２００３／０２５３９９号明細書（参照することにより本明細書にその全体が組込まれる）に開示された抗体は、上記および下記の出願において開示されているように修飾され、かかる抗体が通常使用される疾患の治療に使用されうる。一部の実施形態においては、本発明は、活性化ＦｃγＲ、例えば、ＦｃγＲＩＩＩに対する改変親和性、高低いずれかの親和性を有する改変抗体を提供する。一部の好ましい実施形態においては、ＦｃγＲに対する高い親和性を有する改変抗体が提供される。好ましくは、かかる修飾は改変Ｆｃ介在エフェクター機能も有する。

Ｆｃ介在エフェクター機能に影響を及ぼす修飾は当該分野において公知である（例えば、参照することにより本明細書にその全体が組込まれる、米国特許第６，１９４，３５１号明細書を参照）。修飾されうるアミノ酸としては、プロリン３２９、プロリン３３１、およびリジン３２２が挙げられるが、これらに限定されない。プロリン３２９および／または３３１およびリジン３２２は、好ましくは、アラニンで差し替えられうるが、他のアミノ酸による代替も考えられる。参照することにより本明細書にその全体が組込まれる、国際公開第００／１４２０７２号パンフレットおよび米国特許第６，１９４，５５１号明細書を参照。

したがって、Ｆｃ領域の修飾は、抗体Ｆｃ領域に存在するアミノ酸への１つもしくはそれ以上の改変を含んで成りうる。かかる改変は結果として改変抗体介在エフェクター機能、他のＦｃ受容体（例えば、Ｆｃ活性化受容体）への改変結合、改変ＡＤＣＣ活性、改変Ｃｌｑ結合活性、改変補体依存細胞毒性活性、またはその組合せを有する抗体が生じうる。

一実施形態においては、抗体は、ＦＣＧＲ３Ａ（ＣＤ１６、ＦＣＧＲ３、免疫グロブリンＧ Ｆｃ受容体ＩＩＩ；ＩＧＦＲ３、ＩｇＧのＦｃフラグメントの受容体、低親和性ＩＩＩａとも呼ばれる；例えば、ＯＭＩＭ１４６７４０を参照）、ＦＣＧＲ２Ａ（ＣＤ３２、ＣＤｗ３２、ＩｇＧのＦｃフラグメントの受容体、低親和性ＩＩａ、ＦＣＧ２、免疫グロブリンＧ Ｆｃ受容体ＩＩとも呼ばれる；例えば、ＯＭＩＭ１４６７９０を参照）；ＦＣＧＲ２Ｂ（ＣＤ３２、ＩｇＧのＦｃフラグメントの受容体、低親和性ＩＩｂ；ＦＣＧＲ２Ｂ、ＦＣ−γ−ＲＩＩＢとも呼ばれる；例えば、ＯＭＩＭ６０４５９０を参照）、ＦＣＧ１ＲＡ（ＣＤ６４；ＩｇＧのＦｃフラグメントの受容体、高親和性Ｉａ；ＩＧＦＲ１とも呼ばれる；例えば、ＯＭＩＭ１４６７６０を参照）；ＩｇＧのＦＣＧＲ１フラグメント、高親和性Ｉｃ、免疫グロブリンＧ Ｆｃ受容体ＩＣ、ＩＧＦＲＣ；例えば、ＯＭＩＭ６０１５０３を参照）；またはＦＣＧＲ１Ｂ（ＣＤ６４、ＩｇＧのＦｃフラグメントの受容体、高親和性Ｉｂ；免疫グロブリンＧ Ｆｃ受容体ＩＢ；ＩＧＦＲＢとも呼ばれる；例えば、ＯＭＩＭ６０１５０２を参照）などのＦｃガンマ受容体によって特異的に認識される。

本発明の治療抗体の代表的な例は、リツキシマブ、アレムツズマブ、およびトラスツズマブである。かかる抗体は、ヒト対象における使用に承認されている臨床プロトコールに従って使用されうる。治療抗体のさらなる具体例としては、例えば、エプラツズマブ、バシリキシマブ、ダクリズマブ、セツキシマブ、ラベッツズマブ、セビルマブ、ツブリマブ、パリビズマブ、インフリキシマブ、オマリズマブ、エファリズマブ、ナタリズマブ、クレノリキシマブ等が挙げられる。場合により、ＮＫ細胞活性化受容体を刺激する化合物がサイトカインである場合、治療抗体はリツキシマブまたはヘルセプチン以外の抗体であり、または場合により抗ＣＤ２０もしくは抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ抗体以外の抗体である。本発明による使用に好ましい治療抗体の他の例としては、抗フェリティン抗体（米国特許公開第２００２/０１０６３２４号明細書）、抗ｐ１４０および抗ｓｃ５抗体（国際公開第０２／５０１２２号パンフレット）、および抗ＫＩＲ（キラー阻害性受容体）抗体が挙げられ（ＫＩＲ受容体は、キャリントン（Ｃａｒｒｉｎｇｔｏｎ）およびノーマン（Ｎｏｒｍａｎ）、ＫＩＲ遺伝子クラスター（Ｔｈｅ ＫＩＲ Ｇｅｎｅ Ｃｌｕｓｔｅｒ）、２００３年５月３日、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｏｏｋｓで入手可能）、上記の文献の各々の開示は参照することにより本明細書に組込まれている。治療抗体の他の例は以下の表にリストアップされており、そのいずれか（およびその他）を本方法において使用されうる。それらが以下の表にリストアップされているか、本明細書で別記されているかどうかに関係なく、好ましくは、ＡＤＣＣによって標的細胞を枯渇させうる抗体は、本方法から恩恵を受けることができ、以下の表１は、表中にリストアップされた抗体に関しても、リストアップされている抗体の標的または適応に関しても非網羅的であることが理解されるであろう。

ＮＫ細胞活性調節化合物
ＮＫ細胞活性は、刺激および阻害シグナルを含む複雑な機序によって調節される。したがって、有効なＮＫ細胞介在療法は、これらの細胞の刺激または阻害シグナルの中和によって達成されうる。ＮＫ細胞の阻害性受容体を遮断し、阻害し、または減少させる効果、またはＮＫ細胞の活性化受容体の活性または発現を活性化し、または刺激し、またはさもなければ促進する効果を有する化合物が使用されうることが理解されるであろう。これにはＮＫ細胞受容体に結合し、それらを直接阻害し、または刺激しうるサイトカインのほか、小分子、ポリペプチド、および抗体などの化合物が含まれる。受容体が遮断され、または刺激される機序は、本発明によって提供される利点には重要ではないことも理解されるであろう。例えば、化合物は活性化受容体の発現を増大させ、または阻害性受容体の発現を阻害し、化合物はリガンドと阻害性受容体との相互作用を阻止し、またはリガンドと活性化受容体との相互作用を増強し、または化合物は受容体に直接結合し、それらを阻害し（阻害性受容体の場合）、またはそれらを活性化し（活性化受容体の場合）うる。重要なパラメータは、化合物がインビボでその標的細胞を枯渇させる治療抗体の能力に対して有する効果である。

ＮＫ細胞の表面上の阻害性受容体は、本化合物によって標的されうる。ＮＫ細胞は主要組織適合複合体（ＭＨＣ）クラスＩ特異的阻害性受容体によってネガティブに調節される（ケレ（Ｋａｅｒｒｅ）ら、１９８６年、エーレン（Ｏｅｈｌｅｎ）ら、１９８９年、その開示は参照することにより本明細書に組込まれる）。これら特異的な受容体は、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）クラスＩ分子またはＨＬＡの多形決定基に結合し、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞溶解を阻害する。ヒトにおいては、キラーＩｇ様受容体（ＫＩＲ）と呼ばれる受容体のファミリーがＨＬＡクラスＩ対立遺伝子を認識する。

ＫＩＲ２ＤＬ、ＫＩＲ２ＤＳ、ＫＩＲ３ＤＬ、およびＫＩＲ３ＤＳを含むＫＩＲ受容体のいくつかの群がある。２つのＩｇドメイン（ＫＩＲ２Ｄ）を有するＫＩＲ受容体は、ＨＬＡ−Ｃアロタイプを識別する。すなわち、ＫＩＲ２ＤＬ２（以前はｐ５８．１と呼ばれる）または密接に関係した遺伝子産物ＫＩＲ２ＤＬ３は群２ＨＬＡ−Ｃアロタイプ（Ｃｗ１、３、７、および８）によって共有されるエピトープを認識するが、ＫＩＲ２ＤＬ１（ｐ５８．２）は相互群１ＨＬＡ−Ｃアロタイプ（Ｃｗ２、４、５、および６）によって共有されるエピトープを認識する。ＫＩＲ２ＤＬ１による認識は、ＨＬＡ−Ｃ対立遺伝子の８０位でのＬｙｓ残基の存在によって決定される。ＫＩＲ２ＤＬ２およびＫＩＲ２ＤＬ３認識は、８０位でのＡｓｎ残基の存在によって決定される。重要なことには、ＨＬＡ−Ｃ対立遺伝子の大多数は、８０位でＡｓｎまたはＬｙｓ残基のいずれかを有する。３つのＩｇドメイン、ＫＩＲ３ＤＬ１（ｐ７０）を有する１つのＫＩＲは、ＨＬＡ−Ｂｗ４対立遺伝子によって共有されるエピトープを認識する。結局、３つのＩｇドメインＫＩＲ３ＤＬ２（ｐ１４０）を有する分子のホモ二量体は、ＨＬＡ−Ａ３および−Ａ１１を認識する。

ＫＩＲおよび他のクラスＩ阻害性受容体（モレッタ（Ｍｏｒｅｔｔａ）ら、１９９７年、バリアンテ（Ｖａｌｉａｎｔｅ）ら、１９９７年、ラニエール（Ｌａｎｉｅｒ）、１９９８年、その開示は参照することにより本明細書に組込まれる）はＮＫ細胞によって、所定の個別のＮＫレパートリーにおいて同時発現されうるが、単一のＫＩＲを発現する細胞があり、したがって、対応するＮＫ細胞は特異的クラスＩ対立遺伝子群を発現する細胞によってのみ遮断される。したがって、下記のとおり、阻害性受容体が標的される場合、本方法はしばしば複数の阻害性受容体を標的する化合物の投与を含み、それによって最大範囲のＮＫ細胞に達する広範囲にわたる効果を確実にする。

一部の実施形態においては、化合物、好ましくは、抗体またはそのフラグメントがＮＫ細胞の阻害性受容体を遮断し、ＫＩＲ２ＤＬ２、ＫＩＲ２ＤＬ３、ＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ３ＤＬ１、ＫＩＲ３ＤＬ２、ＮＫＧ２Ａ、およびＮＫＧ２Ｃより成る群から選択される少なくとも１つの阻害性受容体の阻害シグナルを中和する。より好ましくは、ＮＫ細胞の阻害性受容体を遮断する化合物、抗体またはそのフラグメントは、好ましくは、ＫＩＲ２ＤＬ２、ＫＩＲ２ＤＬ３、および／またはＫＩＲ２ＤＬ１の阻害シグナルを中和する化合物、好ましくは、抗体またはそのフラグメントである。

本発明は、ＮＫ細胞の異なる阻害性受容体を遮断する一部の化合物、好ましくは、抗体またはそのフラグメントの組合せの使用にも関する。好ましくは、ＮＫ細胞の阻害性受容体を遮断する化合物、好ましくは、抗体またはそのフラグメントは、ＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ２ＤＬ２、ＫＩＲ２ＤＬ３、ＫＩＲ３ＤＬ１、ＫＩＲ３ＤＬ２、ＮＫＧ２Ａ、およびＮＫＧ２Ｃから選択される阻害性受容体に特異的であり、ＮＫ細胞の細胞毒性の関連ＫＩＲ−またはＮＫＧ２Ａ／Ｃ介在阻害を阻害することができる。例えば、ＮＫ細胞の阻害性受容体を遮断する化合物は、ＫＩＲ２ＤＬ１に特異性を有する抗体、およびＫＩＲ２ＤＬ２および／またはＫＩＲ２ＤＬ３に特異性を有する別の抗体を含んで成りうる。より好ましくは、ＮＫ細胞の阻害性受容体を遮断する化合物の組合せは、ＮＫ細胞の細胞毒性のＫＩＲ２ＤＬ１−、ＫＩＲ２ＤＬ２−、およびＫＩＲ２ＤＬ３介在阻害を阻害することができる。他の実施形態においては、１つもしくはそれ以上の阻害性受容体を標的する１つもしくはそれ以上の化合物、および１つもしくはそれ以上の活性化受容体を標的する１つもしくはそれ以上の化合物の混合物を投与する。

例えば、ＫＩＲ２ＤＬ１に特異的なモノクローナル抗体は、ＫＩＲ２ＤＬ１Ｃｗ４（または同様のもの）対立遺伝子を遮断することが示されている（モレッタら、１９９３年、その開示は参照することにより本明細書に組込まれる）。他の例では、ＫＩＲ２ＤＬ２／３に対するモノクローナル抗体もＫＩＲ２ＤＬ２／３ＨＬＡＣｗ３（または同様のもの）対立遺伝子を遮断することが記載されている（モレッタら、１９９３年）。抗ＮＫＧ２Ａ抗体は、ＮＫＧ２ＡとＨＬＡ−Ｅとの阻害相互作用を遮断することが示されている。

所望により、抗体は、ＧＬ１８３（ＫＩＲ２ＤＬ２、Ｌ３、イムノテック（Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈ）（フランス）、およびベクトン・ディッキンソン（Ｂｅｃｋｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）（米国）から入手可能）、ＥＢ６（ＫＩＲ２ＤＬ１、イムノテック（フランス）、およびベクトン・ディッキンソン（米国）から入手可能）、ＡＺ１３８（ＫＩＲ３ＤＬ１、モレッタら、ジェノバ大学（Ｕｎｉｖ．Ｇｅｎｏｖａ）（イタリア）から入手可能）、Ｑ６６（ＫＩＲ３ＤＬ２、イムノテック（フランス）から入手可能）、Ｚ２７０（ＮＫＧ２Ａ、イムノテック（フランス）から入手可能）、Ｐ２５（ＮＫＧ２Ａ／Ｃ、モレッタら、ジェノバ大学（イタリア）から入手可能）、およびＤＸ９、Ｚ２７（ＫＩＲ３ＤＬ１、イムノテック（フランス）、およびベクトン・ディッキンソン（米国）から入手可能）より成る群から選択されうる。

好ましい態様においては、本発明は、モノクローナル抗体、ならびにそのフラグメントおよび誘導体を使用し、前記抗体、フラグメント、または誘導体は、ＮＫ細胞の表面で一部のＫＩＲまたはＮＫＧ２Ａ／Ｃ受容体と交差反応し、その阻害シグナルを中和する。

一実施形態においては、本発明は、ヒトＫＩＲ２ＤＬ受容体の共通の決定基に結合し、かつ対応する阻害経路を阻害するモノクローナル抗体を使用する。好ましくは、本発明は、ヒトＮＫ細胞の表面でＫＩＲ２ＤＬ１およびＫＩＲ２ＤＬ２／３受容体に結合し、かつＮＫ細胞の細胞毒性のＫＩＲ２ＤＬ１−およびＫＩＲ２ＤＬ２／３介在阻害を阻害するモノクローナル抗体を使用する。抗体は、ＨＬＡ−ｃ分子のＫＩＲ２ＤＬ１およびＫＩＲ２ＤＬ２／３受容体への結合を特異的に阻害する。より好ましくは、抗体は、インビボでＮＫ細胞活性を促進する。ＫＩＲ２ＤＬ１およびＫＩＤ２ＤＬ３（またはＫＩＲ２ＤＬ２）は、ＨＬＡ−Ｃアロタイプ、それぞれ群１ＨＬＡ−Ｃアロタイプおよび群２ＨＬＡ−Ｃアロタイプの大部分をカバーするために十分であるため、かかる抗体を使用し、大部分のヒト個体、通常、ヒト個体の約９０％もしくはそれ以上において治療抗体の有効性を増大させることができる。かかる実施形態においては、２００４年７月１日出願の「ＮＫ細胞活性を調節するための組成物および方法（Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ ＮＫ ｃｅｌｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ）」という名称のＰＣＴ特許出願第ＰＣＴ／ＦＲ０４／０１７０２号明細書に記載された抗体のいずれかを本発明に従って使用されうるが、その開示は参照することにより本明細書に組込まれる。

本発明の特定の目的において、ＮＫ細胞の阻害性受容体を遮断する抗体はモノクローナル抗体であり、ここで前記抗体はＫＩＲ２ＤＬヒト受容体の共通の決定基に結合し、ＮＫ細胞の細胞毒性のＫＩＲ２ＤＬ介在阻害を阻害する。抗体は、より具体的には、それぞれハイブリドーマＤＦ２００およびＮＫＶＳＦ１によって生成されるモノクローナル抗体ＤＦ２００またはＮＫＶＳＦ１と同じエピトープに結合し、かつ／またはヒトＮＫ細胞の表面でＫＩＲ受容体に結合するために、それぞれハイブリドーマＤＦ２００およびＮＫＶＳＦ１によって生成されるモノクローナル抗体ＤＦ２００またはＮＫＶＳＦ１と競合する。先に述べたように、抗体が前記抗体と結合のために競合するかどうかを判定する抗体、機能的アッセイ、およびアッセイの例は、ＰＣＴ特許出願第ＰＣＴ／ＦＲ０４／０１７０２号明細書に記載されている。

具体的な実施形態において、モノクローナル抗体はハイブリドーマＤＦ２００によって生成されるモノクローナル抗体ＤＦ２００である。別の実施形態においては、モノクローナル抗体はＥＢ６であり、または抗体はモノクローナルＥＢ６と同じエピトープに結合し、またはモノクローナル抗体ＥＢ６と結合のために競合する。他の実施形態においては、抗体は、抗体ＤＦ２００またはＥＢ６のいずれかのフラグメントまたは誘導体である。抗体ＤＦ２００を生成するハイブリドーマは、識別番号「ＤＦ２００」、登録番号ＣＮＣＭＩ−３２２４、登録日２００４年６月１０日（Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｎａｔｉｏｎａｌｅ ｄｅ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｄｅ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ、パスツール研究所（Ｉｎｓｔｉｔｕｔ Ｐａｓｔｅｕｒ）、２５、Ｒｕｅ ｄｕ Ｄｏｃｔｅｕｒ Ｒｏｕｘ、Ｆ−７５７２４ Ｐａｒｉｓ Ｃｅｄｅｘ １５（フランス））のＣＮＣＭ菌株保存機関で寄託されている。抗体ＮＫＶＳＦ１は、セロテック（Ｓｅｒｏｔｅｃ）（セルジー・サン・クリストフ（Ｃｅｒｇｙ Ｓａｉｎｔｅ−Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅ）（フランス））（カタログ参照番号ＭＣＡ２２４３）から入手可能である。

本発明の別の実施形態においては、治療抗体の有効性を増強するために使用される化合物は、ＮＫ細胞の活性化受容体を刺激する。任意の活性化受容体、例えば、ＮＫｐ３０（例えば、その開示が参照することによりその全体が本明細書に組込まれる、ＰＣＴ国際公開第０１／３６６３０号パンフレットを参照）、ＮＫｐ４４（例えば、その開示が参照することによりその全体が本明細書に組込まれる、ビターレら（１９９８年）、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８７、ｐ．２０６５−２０７２を参照）、ＮＫｐ４６（例えば、その開示が参照することによりその全体が本明細書に組込まれる、シボリら（１９９７年）、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８６、ｐ．１１２９−１１３６、ペッシーノら（１９９８年）、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８８、ｐ．９５３−９６０を参照）、ＮＫＧ２Ｄ（例えば、ＯＭＩＭ６０２８９３を参照）、ＩＬ−１２Ｒ、ＩＬ−１５Ｒ、ＩＬ−１８Ｒ、ＩＬ−２１Ｒ、または活性化ＫＩＲ受容体、例えば、ＫＩＲ２ＤＳ４受容体（キャリントンおよびノーマン、ＫＩＲ遺伝子クラスター（Ｔｈｅ ＫＩＲ Ｇｅｎｅ Ｃｌｕｓｔｅｒ）、２００３年５月３日、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｏｏｋｓで入手可能）、またはＮＫ細胞の実質的なフラクションに存在する他の受容体を使用することができ、その活性化は、好ましくは、細胞が以前に阻害ＫＩＲ受容体など阻害性受容体によって阻害されている場合でも、細胞の活性化または増殖をもたらす。化合物は、ポリペプチド、小分子、および抗体を含む分子的実体でありうる。典型的な化合物としては、活性化受容体と相互作用する天然、組換え、または合成リガンドを含むリガンドが挙げられる。例えば、ＮＫ細胞の活性化受容体を刺激する化合物は、ＩＬ−１２受容体（ＩＬ−１２Ｒ）と相互作用するＩＬ−１２、ＩＬ−１５受容体（ＩＬ−１５Ｒ）と相互作用するＩＬ−１５、ＩＬ−１８受容体（ＩＬ−１８Ｒ）と相互作用するＩＬ−１８、ＩＬ−２１受容体（ＩＬ−２１Ｒ）と相互作用するＩＬ−２１などのサイトカインでありうる。かかる化合物は、例えば、ＩＬ−１２（リサーチ・ダイアグノスティックス（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）、ニュージャージー州（ＮＪ）、ＤＩ−２１２）、ＩＬ−１５（リサーチ・ダイアグノスティックス、ニュージャージー州（ＮＪ）、ＲＤＩ−２１５）、ＩＬ−２１（アサノ（Ａｓａｎｏ）ら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．２００２年、５２８、ｐ．７０−７６）から周知である。好ましくは、ＮＫ細胞の活性化受容体を刺激する化合物は、ＩＬ−２以外の化合物である。ＮＫ細胞の活性化受容体を刺激する他の典型的な化合物は、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＮＫＧ２Ｄ、ＫＩＲ２ＤＳ４、および他の活性化ＫＩＲ受容体より成る群から選択されるＮＫ細胞受容体に結合する抗体を含む。

一部の好ましい実施形態においては、活性化受容体は、ＮＫ細胞に存在する天然細胞毒性受容体（ＮＣＲ）、好ましくは、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、またはＮＫｐ４６より成る群から選択されるＮＣＲであり、かつ活性化受容体を刺激する化合物は、同じエピトープに結合し、またはＡＺ２０、Ａ７６、Ｚ２５、Ｚ２３１、およびＢＡＢ２８１より成る群から選択されるモノクローナル抗体のいずれかと結合のために競合する。

本明細書に記載されたＮＫ細胞受容体のいずれかへの化合物の結合は、さまざまな標準方法のいずれかを使用して検出されうる。例えば、比色ＥＬＩＳＡ型アッセイを、免疫沈降およびラジオイムノアッセイと同様に使用することができる。競合アッセイは、例えば、試験化合物をＮＫ細胞受容体に結合することが周知の化合物と比較するために使用されうるが、ここで対照（例えば、ＮＫｐ４６に特異的に結合するＢＡＢ２８１）および試験化合物は混合（または予備吸着）され、エピトープ含有タンパク質、例えば、ＢＡＢ２８の場合には、ＮＫｐ４６を含有する試料に適用される。ＥＬＩＳＡ、ラジオイムノアッセイ、ウェスタンブロット法、およびＢＩＡＣＯＲＥの使用に基づくプロトコールが、かかる単純な競合における使用に適しており、当該分野において公知である。

ＮＫ細胞の細胞毒性のＫＩＲ−またはＮＫＧ２Ａ／Ｃ介在阻害の阻害、またはＮＫ細胞のＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、またはＮＫＧ２Ｄ介在活性化の刺激は、さまざまなアッセイまたは試験、例えば結合、細胞毒性、もしくは他の分子または細胞アッセイによって評価されうる。

具体的な変形においては、阻害活性は、前記化合物、好ましくは、抗体の、それぞれＨＬＡ−ＣまたはＨＬＡ−Ｅ陽性標的でのＫＩＲまたはＮＫＧ２Ａ／Ｃ陽性ＮＫクローンの溶解を再構成する能力によって示される。別の具体的な実施形態においては、化合物、好ましくは、抗体は、ＨＬＡ−Ｃ分子のＫＩＲ２ＤＬ１およびＫＩＲ２ＤＬ３（または密接に関係したＫＩＲ２ＤＬ２）受容体への結合を阻害するものとして、さらに好ましくは、Ｃｗ１、Ｃｗ３、Ｃｗ７、およびＣｗ８から選択されるＨＬＡ−Ｃ分子（または８０位でＡｓｎ残基を有するＨＬＡ−ｃ分子）のＫＩＲＳＤＬ２／３への結合、およびＣｗ２、Ｃｗ４、Ｃｗ５、およびＣｗ６から選択されるＨＬＡ−Ｃ分子（または８０位でＬｙｓ残基を有するＨＬＡ−ｃ分子）のＫＩＲ２ＤＬ１への結合を変化させるその能力として規定される。

本発明の化合物、好ましくは、抗体の阻害または増強活性は、例えば、その開示が参照することにより本明細書に組込まれる、シボリら（１９９７年）、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８６、ｐ．１１２９−１１３６において記載されている細胞内遊離カルシウムに対するその効果によって、多くの方法のいずれかにおいて評価されうる。ＮＫ細胞活性も細胞ベースの細胞毒性アッセイ、例えば、その各々の全体の開示が参照することにより本明細書に組込まれる、シボリら（１９９７年）、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８６、ｐ．１１２９−１１３６、ビターレら（１９９８年）、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８７、ｐ．２０６５−２０７２、ペッシーノら（１９９８年）、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８８、ｐ．９５３−９６０、ネリら（２００１年）、Ｃｌｉｎ．Ｄｉａｇ．Ｌａｂ．Ｉｍｍｕｎ．８、ｐ．１１３１−１１３５、ペンデ（Ｐｅｎｄｅ）ら（１９９９年）、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９０、ｐ．１５０５−１５１６）に開示されている、Ｐ８１５、Ｋ５６２細胞、または適切な腫瘍細胞など標的細胞を殺傷するＮＫ細胞を刺激する抗体の能力を評価するなど、クロム遊離の測定によって評価されうる。適切な細胞毒性アッセイは、本明細書の実施例の部でも示される。好ましい実施形態においては、抗体はＮＫ細胞毒性における少なくとも１０％の増強、好ましくは、ＮＫ細胞毒性における少なくとも４０％または５０％の増強、またはより好ましくは、ＮＫ細胞毒性における少なくとも７０％の増強を引き起こす。

ＮＫ細胞活性もサイトカイン放出アッセイを用いて検討されうるが、ここでＮＫ細胞はＮＫ細胞のサイトカイン産生（例えば、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−α産生）を刺激する抗体でインキュベートされる。典型的なプロトコールにおいては、ＰＢＭＣからのＩＦＮ−γ産生は、細胞表面および細胞質内染色、および培養の４日後のフローサイトメトリーによる分析によって評価される。手短に言えば、ブレフェルジン（Ｂｒｅｆｅｌｄｉｎ）Ａ）（シグマ・アルドリッチ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）が培養の最後の４時間に最終濃度５μｇ／ｍｌで添加される。次いで、細胞は透過化前に抗ＣＤ３および抗ＣＤ５６ｍＡｂでインキュベートし（ＩｎｔｒａＰｒｅｐ）（商標）、ベックマン・コールター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）、ＰＥ抗ＩＦＮ−γまたはＰＥ−ＩｇＧ１（ファルミンゲン（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ））で染色する。ポリクローナル活性化ＮＫ細胞からのＧＭ−ＣＳＦおよびＩＦＮ−γ産生はＥＬＩＳＡを使用して上清において測定される（ＧＭ−ＣＳＦ：ＤｕｏＳｅｔ ＥＬＩＳＡ、Ｒ＆Ｄシステムズ（Ｓｙｓｔｅｍｓ）、ミネソタ州（ＭＮ）、ミネアポリス（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ）、ＩＦＮ−γ：ＯｐｔＥ１Ａセット、ファルミンゲン）。

好ましい実施形態においては、ヒトＮＫ細胞を活性化する抗体の能力が評価されるが、ここで少なくともヒトＮＫ細胞ならびにヒト以外のＮＫ細胞を活性化する能力は、化合物が本発明における使用に適切であることを示す。特に、インビトロまたはインビボでＮＫ細胞による適切な標的細胞の枯渇を方向づける治療抗体の能力を増強する化合物の能力が評価されうる。

本発明の化合物、好ましくは、抗体は、部分的な阻害または刺激活性を示し、例えば、ＮＫ細胞の細胞毒性のＫＩＲ２ＤＬ介在阻害を部分的に削減し、またはＮＣＲまたは他の受容体の任意の刺激レベルによりＮＫ細胞を部分的に活性化しうる。最も好ましい化合物は、例えば、化合物の非存在下に細胞との比較において、細胞毒性アッセイで測定されるように、ＮＫ細胞の活性の少なくとも２０％、好ましくは、少なくとも３０％、４０％、または５０％、もしくはそれ以上、阻害（または、活性化受容体の場合には、刺激）することが可能である。化合物の非存在下に枯渇レベルに対して１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２００％、３００％、４００％、５００％、１０００％、もしくはそれ以上、標的細胞の枯渇の増大を提供しうる化合物も好ましい。あるいは、本発明の好ましい化合物、好ましくは、抗体は、適合もしくはＨＬＡ適合性または自己標的細胞集団、すなわち、前記抗原の非存在下にＮＫ細胞によって有効に溶解される細胞集団の溶解を引き起こすことができる。したがって、本発明の化合物は、インビボでＮＫ細胞活性を促進するものとしても規定されうる。

本発明は、ＮＫ細胞の活性化受容体を刺激し、または好ましくは、その阻害性受容体を遮断する化合物が、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’２フラグメント、ＣＤＲ、およびＳｃＦｖを含むがこれらに限定されない、実質的に同じ抗原特異性を有するかかるモノクローナル抗体のフラグメントである実施形態にも関する。さらに、モノクローナル抗体は、ヒト化、ヒト、またはキメラ（例えば、二重特異的または機能化抗体）でありうる。活性化受容体を刺激する抗体もフラグメントでありうるが、それらは完全長であることが好ましい。例えば、修飾配列もしくは抱合異種官能基または他の化合物を有する誘導体は、本明細書に記載された抗体のいずれかのために使用されうる。

本発明によるＮＫ細胞の阻害性受容体を遮断し、または活性化受容体を刺激する抗体は、当該分野において周知のさまざまな技術によって生成されうる。通常、それらはＫＩＲ、ＮＫＧ２Ａ／Ｃ、ＮＣＲ（例えば、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６）、またはＮＫＧ２Ｄポリペプチド、またはポリペプチドのいずれかの免疫原性フラグメント、および脾細胞の（適切な細胞系との融合によってハイブリドーマを産生する）コレクションを含んで成る免疫原によるヒト以外の動物の免疫付与によって産生される。さまざまな種からモノクローナル抗体を生成する方法は当該分野において公知である（例えば、その開示が参照することにより本明細書に組込まれる、ハーロー（Ｈａｒｌｏｗ）ら、「抗体：実験室マニュアル（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」、ＣＳＨプレス（Ｐｒｅｓｓ）、１９９８年、ゴーディング（Ｇｏｄｉｎｇ）、「モノクローナル抗体：原理と実践（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ）」、アカデミック・プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）、１９８６年を参照）。より具体的には、これらの方法は、ヒト以外の動物を抗原で免疫付与した後、脾細胞を回収し、次いでこれを骨髄腫細胞など不死化細胞と融合する工程を含んで成る。結果として生じるハイブリドーマは、モノクローナル抗体を産生し、限界希釈によって選択され、個々のクローンを単離することができる。抗体は、例えば、その開示が参照することにより本明細書に組込まれる、ワード（Ｗａｒｄ）ら（１９８９年）に開示されている免疫グロブリンのコンビナトリアルライブラリーの選択によっても生成されうる。

本発明によるＮＫ細胞の阻害性受容体を遮断し、または活性化受容体を刺激する好ましい抗体は、活性化または抑制性ＮＫ細胞受容体、例えば、ＫＩＲ２ＤＬポリペプチド、より好ましくは、ヒトＫＩＲ２ＤＬポリペプチドを含んで成る免疫原による免疫付与によって調製される。ＫＩＲ２ＤＬポリペプチドは、ヒトＫＩＲ２ＤＬポリペプチド、またはそのフラグメントもしくは誘導体、通常、免疫原性フラグメント、すなわち、エピトープ、好ましくは、ＴまたはＢ細胞エピトープを含んで成るポリペプチドの一部の完全長配列を含んで成りうる。かかるフラグメントは通常、成熟ポリペプチド配列の少なくとも７連続アミノ酸、より好ましくは、その少なくとも１０連続アミノ酸を含む。それらは実質的に受容体の細胞外ドメイン由来である。好ましい実施形態においては、免疫原は、脂質膜、通常、細胞の表面において野生型のヒトＫＩＲ２ＤＬ、ＮＣＲ、または他のポリペプチドを含んで成る。具体的な実施形態においては、免疫原は、場合により処置または溶解された無傷ＮＫ細胞、特に無傷ヒトＮＫ細胞を含んで成る。

治療抗体は、ＣＤ１６など受容体によるその結合を増大させるために修飾されたＦｃ領域を有しうるが、一部の実施形態においては、ＮＫ細胞増強抗体はＦｃ受容体のためにその親和性を削減するために改変されたＦｃ領域を有し、そのことによって抗体により結合されたＮＫ細胞自体が結合され、かつ溶解される可能性を削減することになる。

ＮＫ細胞のＫＩＲ２ＤＬ受容体を遮断する抗体は、ｉ）ＫＩＲ２ＤＬポリペプチドを含んで成る免疫原でヒト以外の哺乳動物を免疫付与する工程と、ｉｉ）前記免疫付与動物からモノクローナル抗体を調製し、ここで前記モノクローナル抗体が前記ＫＩＲ２ＤＬポリぺプチドに結合する工程と、ｉｉｉ）ＫＩＲ２ＤＬポリペプチドの少なくとも２つの異なる血清型と交差反応する工程ｉｉ）からモノクローナル抗体を選択する工程と、ｉｖ）ＮＫ細胞のＫＩＲ２ＤＬ介在阻害を阻害する（ｃ）のモノクローナル抗体を選択する工程とを含んで成る方法によって生成されうる。

工程（ｉｉｉ）と（ｉｖ）の順序は変更されうる。場合により、方法はさらに、以下で述べるように、モノクローナル抗体のフラグメントまたは誘導体を作るさらなる工程含んで成りうる。

他の変形においては、方法は、ｉ）ライブラリーまたはレパートリーから、ＫＩＲ２ＤＬポリペプチドの少なくとも２つの異なる血清型と交差反応するモノクローナル抗体またはそのフラグメントもしくは誘導体を選択する工程と、ＮＫ細胞のＫＩＲ２ＤＬ介在阻害を阻害する工程ｉ）からの抗体を選択する工程とを含んで成る。

これらの方法のいずれかを使用し、１つもしくはそれ以上のエピトープを共有する（阻害または活性化）ＮＫ細胞受容体のいずれかの群に特異的である任意の抗体または抗体フラグメントを選択することができる。例えば、ＮＫ細胞のＫＩＲ３ＤＬまたはＮＫＧ２Ａ／Ｃ受容体を遮断し、またはＮＫ細胞の活性化受容体を刺激する抗体の調製のために同様の方法を使用することができる。

好ましい実施形態においては、これらの方法で使用され、または本明細書に記載された抗体のいずれかの生成に使用されるヒト以外の動物は、齧歯動物（例えば、マウス、ラット等）、ウシ、ブタ、ウマ、ウサギ、ヤギ、ヒツジ等など哺乳動物である。

また、本明細書に記載された抗体のいずれかは遺伝子組換えされ、またはヒトに適切であるように、例えば、ヒト化、キメラ、またはヒト抗体に改変されうる。抗体をヒト化する方法は当該分野において公知である。一般に、本発明によるヒト化抗体は、元の抗体からそれに導入される１つもしくはそれ以上のアミノ酸残基を有する。これらのマウスまたは他のヒト以外のアミノ酸残基はしばしば「輸入」残基と呼ばれ、通常、「輸入」可変ドメインから取られる。ヒト化は本質的に、ウィンター（Ｗｉｎｔｅｒ）と同僚らの方法に従って実施されうる（ジョーンズ（Ｊｏｎｅｓ）ら（１９８６年）ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ） ３２１、ｐ．５２２、リーヒマン（Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ）ら（１９８８年）ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ） ３３２、ｐ．３２３、ベルホイエン（Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ）ら（１９８８年）サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ） ２３９、ｐ．１５３４（１９８８年））。場合によっては、かかる「ヒト化」抗体はキメラ抗体であり（キャビリー（Ｃａｂｉｌｌｙ）ら、米国特許第４，８１６，５６７号明細書）、実質的に決して無傷とはいえないヒト可変ドメインが元の抗体からの対応する配列によって置換されている。実際には、本発明によるヒト化抗体は通常、一部のＣＤＲ残基およびおそらく一部のＦＲ残基が元の抗体における類似の部位からの残基によって置換されているヒト抗体である。

「ヒト化」モノクローナル抗体を作る別の方法は、免疫付与に使用されるマウスとしてクセノマウス（ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ）（登録商標）（アブゲニックス（Ａｂｇｅｎｉｘ）、カリフォルニア州（ＣＡ）、フレモント（Ｆｒｅｍｏｎｔ））の使用である。クセノマウスは、その免疫グロブリン遺伝子が機能的ヒト免疫グロブリン遺伝子によって置換されたマウス宿主である。したがって、このマウスによって、またはこのマウスのＢ細胞から作られたハイブリドーマにおいて生成された抗体は、すでにヒト化されている。クセノマウスは、米国特許第６，１６２，９６３号明細書に記載されており、これは参照することによりその全体が本明細書に組込まれる。類似の方法はＨｕＭＡｂ−マウス（ＨｕＭＡｂ−Ｍｏｕｓｅ）（商標）（メダレックス（Ｍｅｄａｒｅｘ））を使用して得られうる。

ヒト抗体は、免疫付与のために、さまざまな他の方法に従って、例えば、ヒト抗体レパートリーを発現するように改変されている他のトランスジェニック動物を使用することによって（ヤコボビッツ（Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｚ）ら、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ） ３６２（１９９３年）、ｐ．２５５）、またはファージディスプレイ法を使用するアリの体レパートリーの選択によっても生成されうる。かかる方法は等業者には周知であり、本出願で開示されているモノクローナル抗体から始めて使用されうる。

本発明の抗体は「キメラ」抗体（免疫グロブリン）にも誘導化されうるが、ここで重鎖および／または軽鎖のタンパク質は元の抗体における対応する配列と同一または同種であると同時に、残りの鎖は別の種由来の抗体における対応する配列と同一または同種であり、またはそれらが所望の生物学的活性を示す限り、別の抗体クラスまたはサブクラス、ならびにかかる抗体のフラグメントに属する（キャビリーら、上記を参照、モリソン（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ）ら（１９８４年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８１、ｐ．６８５１）。

ＮＫ細胞の阻害性受容体を遮断し、またはＮＫ細胞の活性化受容体を刺激する化合物が抗体である場合、かかる抗体がポリクローナル、または好ましくは、モノクローナルでありうることも理解されるであろう。抗体は、ハイブリドーマによって、または所望の可変および定常ドメインを発現するように改変された組換え細胞によって生成されうる。抗体は単鎖抗体または抗原特異性および低ヒンジ領域またはその変形を保持する他の抗体誘導体でありうる。抗体は、多機能抗体、組換え抗体、ヒト化抗体、またはそのフラグメントもしくは誘導体でありうる。前記フラグメントまたはその誘導体は、好ましくは、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’２フラグメント、ＣＤＲ、およびＳｃＦｖから選択される。好ましくは、フラグメントは抗原結合フラグメントである。抗体フラグメントを含んで成る抗体は、二重特異的抗体も含むがこれに限定されない。一例は、活性化受容体に特異的な抗原結合領域および腫瘍抗原に特異的な抗原結合領域を含んで成る二重特異的抗体である（その開示が参照することにより本明細書に組込まれる、ＰＣＴ公開国際公開第０１／７１００５号パンフレットを参照）。

組成物および投与
本発明は、ＮＫ細胞の阻害性受容体を遮断し、または活性化受容体を刺激する少なくとも１つの化合物、好ましくは、抗体またはそのフラグメントを含んで成る組成物、および治療抗体、治療抗体により治療される対象におけるＡＤＣＣを増大させるため、または疾患、より詳しくは、標的細胞の枯渇を必要とする疾患、好ましくは、ウイルス感染細胞、腫瘍細胞、または他の病的細胞など疾患細胞を有する対象を治療するための治療抗体の有効性を増大させるための前記組成物の使用に関する。好ましくは、疾患は、癌、自己免疫疾患、炎症性疾患、ウイルス疾患より成る群から選択される。疾患は、移植片拒絶、より詳しくは同種移植拒絶、および移植片対宿主疾患（ＧＶＨＤ）にも関する。

より詳しくは、疾患の治療は、標的細胞、好ましくは、ウイルス感染細胞、腫瘍細胞、または他の病原細胞など疾患細胞の枯渇を必要とする。好ましくは、疾患は、癌、感染性または免疫疾患である。より好ましくは、疾患は、癌、自己免疫疾患、炎症性疾患、ウイルス疾患より成る群から選択される。疾患は、移植片拒絶、より詳しくは同種移植拒絶、および移植片対宿主疾患（ＧＶＨＤ）にも関する。

前記疾患は、造血細胞の腫瘍性増殖を含む。場合により、前記疾患は、リンパ芽球性白血病、急性または慢性骨髄性白血病、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、骨髄異形成症候群、多発性骨髄腫、および慢性リンパ球性白血病より成る群から選択される。前記疾患は、ＥＮＴ癌、結腸直腸癌、乳癌、上皮癌も含む。前記疾患は、ＣＭＶ感染、およびＢ型肝炎を含む。前記疾患は、クローン病、関節リウマチ、喘息、乾癬、多発性硬化症、または糖尿病を含む。特に、上記の表にリストアップされた疾患が治療されうる。

前記治療抗体は、ＣＤ１６によって、好ましくは、そのＦｃ領域により結合されうる。好ましくは、前記治療抗体は、ヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ３Ｆｃ部分、特にモノクローナル抗体またはそのフラグメント、さらに好ましくは、ヒト、ヒト化もしくはキメラ抗体またはそのフラグメント、例えばリツキシマブを有する。

ＮＫ細胞の阻害性受容体を遮断し、または活性化受容体を刺激する前記化合物、好ましくは、抗体またはそのフラグメントは、ＫＩＲ、ＮＫＧ２Ａ／Ｃ、ＮＣＲ、またはＮＫＧ２Ｄヒト受容体の少なくとも１つに結合し、ＮＫ細胞の細胞毒性の関連ＫＩＲ２ＤＬ、ＫＩＲ３ＤＬ、および／またはＮＫＧ２Ａ／Ｃ介在阻害を阻害し、またはＮＫ細胞の細胞毒性の関連ＮＣＲまたはＮＫＧ２Ｄ介在活性化を刺激する。１つの好ましい実施形態においては、ＫＩＲ２ＤＬヒト受容体、例えば、ＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ２ＤＬ２、ＫＩＲ２ＤＬ３ヒト受容体より成る群から選択される受容体が使用されるか、またはＫＩＲ３ＤＬヒト受容体、例えば、ＫＩＲ３ＤＬ１およびＫＩＲ３ＤＬ２より成る群から選択される受容体が使用される。

１つの好ましい実施形態においては、ＮＫ細胞増強化合物はＫＩＲ２ＤＬヒト受容体の少なくとも１つに結合し、ＮＫ細胞の細胞毒性の関連ＫＩＲ２ＤＬ介在阻害を阻害する。好ましくは、ＫＩＲ２ＤＬヒト受容体は、ＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ２ＤＬ２、ＫＩＲ２ＤＬ３ヒト受容体より成る群から選択される。好ましい実施形態においては、化合物、好ましくは、抗体またはそのフラグメントは、ＫＩＲ２ＤＬヒト受容体の共通の決定基に結合し、かつＮＫ細胞の細胞毒性のＫＩＲ２ＤＬ介在阻害を阻害する。より好ましくは、前記化合物、好ましくは、抗体は、ＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ２ＤＬ２、ＫＩＲ２ＤＬ３ヒト受容体の共通の決定基に結合し、かつＮＫ細胞の細胞毒性のＫＩＲ２ＤＬ１−、ＫＩＲ２ＤＬ２−、ＫＩＲ２ＤＬ３介在阻害を阻害する。特定の実施形態においては、前記化合物、好ましくは、抗体は、８０位でＬｙｓ残基を有するＨＬＡ−Ｃ対立遺伝子分子のヒトＫＩＲ２ＤＬ１受容体への結合、および８０位でＡｓｎ残基を有するＨＬＡ−Ｃ対立遺伝子分子のヒトＫＩＲ２ＤＬ２およびＫＩＲ２ＤＬ３受容体への結合を阻害する。別の特定の実施形態においては、この抗体は、ハイブリドーマＤＦ２００によって生成されるモノクローナル抗体ＤＦ２００と同じエピトープに結合する。場合により、この抗体は、ヒトＮＫ細胞の表面でＫＩＲ受容体への結合のためにハイブリドーマＤＦ２００によって生成されるモノクローナル抗体ＤＦ２００と競合する。１つの好ましい実施形態においては、抗体はハイブリドーマＤＦ２００によって生成されるモノクローナル抗体ＤＦ２００である。別の実施形態においては、抗体は、モノクローナル抗体ＥＢ６と同じエピトープと競合し、またはこれに結合する。

本発明による組成物は、ＮＫ細胞の異なる阻害性受容体を遮断し、および／またはＮＫ細胞の１つもしくはそれ以上の活性化受容体を刺激する一部の化合物、好ましくは、抗体またはそのフラグメントの組合せを含んで成りうる。好ましくは、ＮＫ細胞の阻害性受容体を遮断する化合物、好ましくは、抗体またはそのフラグメントは、ＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ２ＤＬ２、ＫＩＲ２ＤＬ３、ＫＩＲ３ＤＬ１、ＫＩＲ３ＤＬ２、ＮＫＧ２Ａ、およびＮＫＧ２Ｃから選択される阻害性受容体に特異的であり、ＮＫ細胞の細胞毒性の関連ＫＩＲ−またはＮＫＧ２Ａ／Ｃ介在阻害を阻害することができる。より好ましくは、「中和」化合物の組合せは、ＮＫ細胞の細胞毒性のＫＩＲ２ＤＬ１−、ＫＩＲ２ＤＬ２−、およびＫＩＲ２ＤＬ３介在阻害を阻害することができる。化合物の組合せを提供することによって、最大数の異なる阻害性受容体が最大数の患者において遮断されるであろう。また、異なる活性化化合物（または、阻害性受容体と同様に、単一受容体内の異なるエピトープに結合する）を刺激する化合物、例えば、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、およびＮＫＧ２Ｄより成る群から選択される２つもしくはそれ以上の受容体の任意の組合せの活性化を同時にもたらす化合物の組合せも使用することができる。また、阻害性受容体を遮断する１つもしくはそれ以上の化合物、および活性化受容体を刺激する１つもしくはそれ以上の化合物を含んで成る組合せも使用できる。以下で述べるように、好ましい実施形態においては、ＮＫ細胞の試料を本方法の適用前に患者から得ることができ、かつ化合物の異なる組合せに対するＮＫ細胞の応答性を、例えば、標的細胞および治療抗体の存在下に評価することができる。

本発明の組成物は、医薬的に許容可能な担体または賦形剤、通常、緩衝液、等張液、水性懸濁液を含んで成り、場合により、安定剤、保存剤等が補充されうる。一般的な剤形としては、食塩液、場合により、高分子量タンパク質（例えば、ヒト血清アルブミン）など保護または安定化分子を含む。

１つもしくはそれ以上の治療抗体、１つもしくはそれ以上のＮＫ細胞増強化合物、および、好ましくは、その使用説明書の組合せを含んで成るキットも提供される。

本発明の方法および組成物によれば、ＮＫ細胞の阻害性受容体を遮断し、またはＮＫ細胞の活性化受容体を刺激する化合物、好ましくは、抗体またはそのフラグメントおよび治療抗体は、「十分」または「治療有効」量で投与される。

レシピエントに投与される治療抗体の有効量は、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇでありうる。しかし、抗体の有効量は、抗体の形態（全Ｉｇ、またはフラグメント）、ｍＡｂの親和性、および各特定の抗体のために測定されるべき薬物動態パラメータによって決まる。

レシピエントに投与されるＮＫ細胞の阻害性受容体を遮断し、または活性化受容体を刺激する化合物、好ましくは、抗体またはそのフラグメントの有効量は、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇでありうる。しかし、抗体の有効量は、抗体の形態（全Ｉｇ、またはフラグメント）、ｍＡｂの親和性、および各特定の抗体のために測定されるべき薬物動態パラメータによって決まる。

本発明の重要な実施形態においては、本化合物の使用が、治療抗体の削減量で達成される治療効果を可能にしうる。治療抗体の使用（例えば、投与量、投与計画）は、副作用、例えば、リツキシマブの場合、発熱、頭痛、喘鳴、血圧低下、およびその他によって制限されうる。したがって、多くの患者における治療抗体の標準用量は、本明細書に記載されたＮＫ細胞増強化合物（すなわち、他の化合物の非存在下に推奨量）とともに投与され、それによってさらに大きな治療効果を必要とする患者における標準用量の有効性を増強するが、例えば、副作用を重篤に受けた他の患者においては、本化合物の投与は治療抗体の削減量で達成される治療効果を可能にし、それによって副作用を回避する。実際に、熟練した医師は、所定の患者のための治療抗体およびＮＫ細胞増強化合物の理想的な用量および投与計画、例えば、患者の特定のニーズおよび全体的な状態に照らして最も適切であろう治療法を決定する能力がある。治療抗体およびＮＫ細胞増強化合物のための適切な投与量の決定における指針の多くの文献、例えば、レミントン（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ）：薬学の科学と実際（Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ）、ジェナロ（Ｇｅｎｎａｒｏ）編（２００３年）、ＩＳＢＮ：０７８１７５０２５３、グッドマン（Ｇｏｏｄｍａｎ）およびジルマンス（Ｇｉｌｍａｎｓ）、治療薬の薬学的基礎（Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）、ハードマン（Ｈａｒｄｍａｎ）編、リンバード・アンド・ジルマン（Ｌｉｍｂｉｒｄ ＆ Ｇｉｌｍａｎ）（２００１年）、ＩＳＢＮ：００７１３５４６９７、ローリンス（Ｒａｗｌｉｎｓ）Ｅ．Ａ．編「ベントリー薬剤学教科書（Ｂｅｎｔｌｅｙ´」ｓ Ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ）」、ロンドン（Ｌｏｎｄｏｎ）：ベイリール（Ｂａｉｌｌｉｅｒｅ）、チンダル・アンド・コックス（Ｔｉｎｄａｌｌ ａｎｄ Ｃｏｘ）、（１９７７年）、およびその他が入手可能である。

一実施形態においては、医師は、本ＮＫ細胞増強化合物のいずれかの投与とともに投与される治療抗体の量を徐々に削減することができ、投与量または投与頻度のいずれかの点で、治療抗体の有効性をモニタリングし、例えば、ＮＫ細胞活性をモニタリングする、患者における標的細胞の存在をモニタリングする、さまざまな臨床指標をモニタリングする、またはほかの手段によるなど、かつ、モニタリングの結果に照らして、治療抗体および／またはＮＫ増強化合物の相対濃度または投与方法を調節し、治療効果および副作用の制限を最適化することができる。

別の一連の実施形態においては、ＮＫ細胞は治療抗体およびＮＫ細胞増強化合物の投与前に（および、必要に応じて、治療中に）患者から得られ、かつ評価され、最大の効果のために使用される理想的な化合物または一式の化合物を判定する。例えば、ＮＫ細胞に存在する阻害または活性化受容体の識別が判定されうるとともに、最も顕著な受容体を特異的に標的した化合物が投与されうる。あるいは、得られたＮＫ細胞は治療抗体および標的細胞とともにインキュベートされ、標的細胞枯渇を増強する１つもしくはそれ以上の化合物の能力が評価されうる。いずれか、１つもしくはそれ以上の化合物がインビトロで枯渇の増強において最も有効であるものが、本治療方法用に選択される。

化合物および／または治療抗体の適切な用量は、インビトロまたは動物モデルで、例えば、インビトロでは、標的細胞、ＮＫ細胞（好ましくは、ヒトＮＫ細胞）、場合により、他の免疫細胞の存在下にさまざまな濃度の治療抗体、およびさまざまな濃度の１つもしくはそれ以上のＮＫ細胞増強化合物をインキュベートし、かつ標準のアッセイ（例えば、実施例の部で述べる）を使用し、さまざまな条件下に標的細胞枯渇の程度または速度を評価することによっても徐々に判定されうる。あるいは、治療抗体の各種投与量を抗体で治療可能な疾患用の動物モデル（例えば、リツキシマブの場合にはＮＨＬ用の動物モデル）に、本明細書に記載された化合物の各種投与量とともに投与し、動物の治療における抗体の有効性（例えば、適切な臨床、細胞、もしくは分子アッセイ、または基準によって判定）を評価することができる。

本発明による組成物は、対象に直接、通常、静脈内、腹腔内、動脈内、筋内、または経皮経路によって注入されうる。一部のモノクローナル抗体は、リツキサン（リツキシマブ）またはゾレア（Ｘｏｌａｉｒ）（オマリズマブ）など臨床状況で有効であることが示されており、同様の投与計画（すなわち、剤形および／または用量および／または投与プロトコール）を本発明の組成物とともに使用することができる。

さらに、本発明の組成物は、他の活性剤、または化学療法もしくは他の免疫療法など治療プログラムをさらに含んで成り、またはこれらと組合わせて、同時もしくは連続的に使用されうる。

一部の好ましい実施例においては、本発明の方法はさらに、ＮＫ細胞の阻害性受容体を遮断し、または活性化受容体を刺激する２つもしくはそれ以上の化合物の１つもしくはいくつかの注入を含んで成り、これら２つもしくはそれ以上の化合物は組合わせて使用されうる。これは、ＡＤＣＣのさらに大幅な増強および治療抗体の有効性をもたらすために役立ち、かつ／またはＮＫ細胞の阻害性受容体を遮断し、または活性化受容体を刺激する特定の化合物の投与量を削減するために役立ちうる。例えば、ＩＬ−２などの化合物は、増加した用量では毒性であることが知られている。したがって、本発明は、好ましくは、それを必要とする対象における疾患の治療方法であって、ａ）ＮＫ細胞の阻害性受容体を遮断し、または活性化受容体を刺激する少なくとも２つの化合物、好ましくは、抗体またはそのフラグメントを前記対象に投与する工程と、ｂ）前記対象に治療抗体を投与する工程とを含んで成る方法を提供する。例えば、好ましい計画は、前記２つの化合物が、（ｉ）ＮＣＲもしくはＮＫＧ２Ｄ受容体または活性化ＫＩＲ受容体を刺激する抗体、および阻害ＫＩＲ受容体またはＮＫＧ２Ａを遮断する抗体より成る群から選択される第１の化合物と、（ｉｉ）ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、およびＩＬ−２１より成る群から選択される第２の化合物である。したがって、本発明はさらに、それを必要とする対象における疾患の治療方法であって、ａ）ＮＫ細胞の阻害性受容体を遮断し、または活性化受容体を刺激する本発明による化合物、好ましくは、抗体またはそのフラグメントを前記対象に投与する工程と、ｂ）前記対象に治療抗体を投与する工程と、（ｃ）前記対象にＩＬ−２を投与する工程を含んで成る方法を提供する。ＩＬ２は、リサーチ・ダイアグノスティックス、ニュージャージー州（ＮＪ）、ＲＤＩ−２１２）、またはカイロン社（Ｃｈｉｒｏｎ Ｃｏｒｐ．）、カリフォルニア州（ＣＡ）、エメリービル（Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ）から入手可能である。

サイトカインは、適切な投与計画のいずれかに従って投与されうるとともに、ＮＫ細胞の阻害性受容体を遮断し、または活性化受容体を刺激する化合物の投与の前、投与と同時に、および／または投与の後に、あるいは治療抗体の投与の前、投与と同時に、および／または投与の後に投与されうる。代表的な実施例においては、サイトカインは５−１０日間毎日投与され、サイトカインは最初にＮＫ細胞の阻害性受容体を遮断し、または活性化受容体を刺激する化合物の第１回目の注入と同じ日に注入される。前記方法は、好ましくは、皮下経路によってサイトカインの１回もしくは２回の注入／日を含んで成る。

サイトカインの投与量は、治療される患者の状態によって選択される。好ましい実施例では、比較的低い用量のサイトカインが使用されうる。例えば、有効量は通常、サイトカイン含有医薬組成物が毎日の皮下注入用に使用される場合、１００万単位／平方メートル／日サイトカイン未満である。好ましい実施例においては、ＩＬ−２は５〜１０日間、毎日１００万単位／ｍ^２未満の用量で皮下注入される。さらにサイトカインの使用の詳細は、その開示が参照することにより本明細書に組込まれる、「ＮＫ細胞の増殖に対する効果を有する医薬組成物およびその使用の方法（Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ｈａｖｉｎｇ ａｎ ｅｆｆｅｃｔ ｏｎ ｔｈｅ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ＮＫ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ａ ｍｅｔｈｏｄ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ｓａｍｅ）」という名称の国際特許公開第ＰＣＴ／ＥＰ／０３１４７１６号明細書および米国特許出願第６０／４３５，３４４号明細書に記載されている。

治療抗体およびＮＫ細胞増強化合物が同時投与、例えば、同時注入され、または同時であるが異なる剤形で投与され、または独立して投与されうること、例えば、化合物が化合物の投与の数時間、数日、または数週間前または後に投与されることも理解されるであろう。

さらに本発明の態様および利点が以下の実験の部で開示されているが、これらは例示としてみなすべきであり、本出願の範囲を限定するものとしてみなしてはならない。

実施例１：ｐａｎ ＫＩＲ２ＤＬ抗体の生成
ＰＢＬの精製およびポリクローナルまたはクローナルＮＫ細胞系の生成。
ＰＢＬをフィコール・ハイパック（Ｆｉｃｏｌｌ Ｈｙｐａｑｕｅ）勾配遠心法および形成接着細胞の枯渇によって健常ドナーから誘導した。強化ＮＫ細胞を得るために、ＰＢＬを抗ＣＤ３、抗ＣＤ４、および抗ＨＬＡ−ＤＲｍＡｂ（４℃下に３０ｍｎｓ）の後、ヤギ抗マウス電磁ビーズ（ダイナル（Ｄｙｎａｌ）（４℃下に３０ｍｎｓ）でインキュベートし、当該分野において周知の方法（ペンデら、１９９９年）によって免疫磁気選択を行った。ＣＤ３マイナス、ＣＤ４マイナスＤＲマイナス細胞を照射支持細胞および１００Ｕ／ｍｌインターロイキン２（プロロイキン（Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ）、カイロン社（Ｃｈｉｒｏｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ））および１．５ｎｇ／ｍｌフィトヘムアグルチニンＡ（ジブコ（Ｇｉｂｃｏ）ＢＲＬ）で培養し、ポリクローナルＮＫ細胞集団を得る。ＮＫ細胞を限界希釈によってクローン化し、ＮＫ細胞のクローンを細胞表面受容体の発現についてフローサイトメトリーによって特徴づける。

以下のクローンをこの試験で使用した。

ＣＰ１１、ＣＮ５、およびＣＮ５０５はＫＩＲ２ＤＬ１陽性クローンであり、ＥＢ６またはＸＡ−１４１抗体によって染色される。ＣＮ１２およびＣＰ５０２は、ＫＩＲ２ＤＬ３陽性クローンであり、ＧＬ１８３抗体によって染色される。

フローサイトメトリー分析
使用したｍＡｂを実験室のＪＴ３Ａ（ＩｇＧ２ａ、抗ＣＤ３）、ＥＢ６およびＧＬ１８３（それぞれ、ＩｇＧ１抗ＫＩＲ２ＤＬ１およびＫＩＲ２ＤＬ３）、ＸＡ−１４１ ＩｇＭ抗ＫＩＲ２ＤＬ１（ＥＢ６、抗ＣＤ４（ＨＰ２．６）、抗ＤＲ（Ｄ１．１２、ＩｇＧ２ａ）と比べて同じ特異性）で生成した。ＪＴ３Ａ、ＨＰ２．６、およびＤＲ１．１２の代わりに、同じ特異性の市販のｍＡｂが、例えば、ベックマン・コールター社（Ｂｅｃｋｍａｎ ｃｏｕｌｔｅｒ Ｉｎｃ）、カリフォルニア州（ＣＡ）、フラートン（Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ）から使用されうる。ＥＢ６およびＧＬ１８３は、ベックマン・コールター社、カリフォルニア州（ＣＡ）、フラートン（Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ）で市販されている。ＸＡ−１４１は市販されていないが、ＥＢ６を（モレッタら、１９９３年）に記載されている溶解の対照再構成のために使用することができる。

フローサイトメトリー
細胞を適切な抗体（４℃下に３０ｍｎｓ）で染色した後、ＰＥまたはＦＩＴＣ抱合ポリクローナル抗マウス抗体（サザン・バイオテクノロジー・アソシエーツ社（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ Ｉｎｃ））で染色した。試料をＦＡＣＳＡＭ装置（ベクトン・ディキンソン（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）、カリフォリニア州（ＣＡ）、マウンテンビュー（Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ））で細胞蛍光分析によって分析した。

細胞毒性実験
ＮＫクローンの細胞溶解活性を標準４時間５１Ｃｒ放出アッセイによって評価した。エフェクターＮＫ細胞をＮＫ細胞溶解に対するその感受性について周知のＣｗ３またはＣｗ４陽性細胞系で試験した。すべての標的をマイクロ滴定プレートのウェル当り５０００の細胞で使用したが、標的比でのエフェクターは数字（通常、標的細胞当り４エフェクター）で示されている。細胞溶解アッセイは、１／２希釈で指示モノクローナル抗体の上清の有無により行われる。手順は実質的に（モレッタら、１９９３年）に記載されているものと同じである。

新しいｍＡｂの生成
ｍＡｂは、５週齢バルブ（Ｂａｌｂ）Ｃマウスを活性化ポリクローナルまたはモノクローナルＮＫ細胞系で（モレッタら、１９９０年、その開示は参照することにより本明細書に組込まれる）に記載されているように免疫付与することによって生成されている。異なる細胞融合の後、ｍＡｂを最初にＥＢ６およびＧＬ１８３陽性ＮＫ細胞系およびクローンと交差反応するその能力について選択した。陽性モノクローナル抗体をさらに、それぞれＣｗ４またはＣｗ３陽性標的のＥＢ６陽性またはＧＬ１８３陽性ＮＫクローンによる溶解を再構成するその能力について検査した。

ＤＦ２００、ＫＩＲ２ＤＬヒトＮＫ受容体の共通の決定基に対する新たなモノクローナル抗体
モノクローナル抗体の１つであるＤＦ２００ｍＡｂは、ＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ２ＤＬ２／３を含むＫＩＲファミリーのさまざまなメンバーと反応することがわかった。ＤＦ２００ｍＡｂによるＮＫ細胞の染色に関して、ＫＩＲ２ＤＬ１＋細胞およびＫＩＲ２ＤＬ２／３＋細胞は明るく染色された（図１）。

これらＨＬＡクラスＩ特異的阻害性受容体の一方または他方（または両方）を発現するＮＫクローンを、１つもしくはそれ以上のＨＬＡ−Ｃ対立遺伝子を発現する標的細胞に対するエフェクター細胞として使用した。予想通り、ＫＩＲ２ＤＬ１＋ＮＫクローンは、Ｃｗ３陽性標的上でほとんどまたはまったく活性を示さなかったＨＬＡ−Ｃｗ４およびＫＩＲ２ＤＬ３＋ＮＫクローンを発現する標的細胞に対する細胞溶解活性を、たとえあったとしても、ほとんど示さなかった。しかし、ＤＦ２００ｍＡｂ（そのＫＩＲ２ＤＬ受容体を隠すために使用）の存在下には、ＮＫクローンはそのＨＬＡ−Ｃリガンドを認識できなくなり、Ｃｗ３またはＣｗ４標的上で強い細胞溶解活性を示した。

例えば、Ｃ１Ｒ細胞系（ＣＷ４＋ＥＢＶ細胞系、ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ１９９３）はＫＩＲ２ＤＬ１＋ＮＫクローン（ＣＮ５／ＣＮ５０５）によって殺傷されなかったが、阻害はＤＦ２００または従来の抗ＫＩＲ２ＤＬ１ｍＡｂのいずれかの使用によって有効に戻されえた。他方、ＫＩＲ２ＤＬ２／３＋ＫＩＲ２ＤＬ１−表現型を発現するＮＫクローン（ＣＮ１２）はＣ１Ｒを有効に殺傷し、この殺傷はＤＦ２００ｍＡｂによって左右されなかった（図２）。同様の結果はＣｗ３陽性標的上でＫＩＲ２ＤＬ２−またはＫＩＲ２ＤＬ３陽性ＮＫクローンで得られうる。

ＤＦ２００ｍＡｂ／ＫＩＲ２ＤＬ１およびＤＦ２００ｍＡｂ／ＫＩＲ２ＤＬ３相互作用のビアコア分析。
材料と方法
組換えタンパク質の生成と精製。ＫＩＲ２ＤＬ１およびＫＩＲ２ＤＬ３組換えタンパク質を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で生成した。ＫＩＲ２ＤＬ１およびＫＩＲ２ＤＬ３の全細胞外ドメインをコード化するｃＤＮＡを、それぞれ、ｐＣＤＭ８クローン（ビアッソーニ（Ｂｉａｓｓｏｎｉ）ら、１９９３年、その開示は参照することにより本明細書に組込まれる）およびＲＳＶＳ（ｇｐｔ）１８３クローン６ベクター（ワグトマン（Ｗａｇｔｍａｎ）ら、１９９５年、その開示は参照することにより本明細書に組込まれる）から以下のプライマーを使用してＰＣＲによって増幅した。
センス：５’−ＧＧＡＡＴＴＣＣＡＧＧＡＧＧＡＡＴＴＴＡＡＡＡＴＧＣＡＴＧＡＧＧＧＡＧＴＣＣＡＣＡＧ−３’
抗センス：５’−ＣＣＣＡＡＧＣＴＴＧＧＧＴＴＡＴＧＴＧＡＣＡＧＡＡＡＣＡＡＧＣＡＧＴＧＧ−３’

それらをビオチン化シグナルをコード化する配列を有するフレームのｐＭＬ１発現ベクターへクローン化した（サウルキン（Ｓａｕｌｑｕｉｎ）ら、２００３年、その開示は参照することにより本明細書に組込まれる）。

タンパク質発現をＢＬ２１（ＤＥ３）細菌株（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））へ行った。トランスフェクト細菌をアンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）を補充し、１ｍＭ ＩＰＴＧを誘導した培地中、３７℃下にＯＤ_６００＝０．６に成長させた。

変性状態（８Ｍ尿素）下に封入体からタンパク質を回収した。組換えタンパク質の再折畳みを、６工程透析で尿素濃度を低下（それぞれ、４、３、２、１、０．５、および０Ｍ尿素）させることによって、室温（ＲＴ）下、Ｌ−アルギニン（４００ｍＭ、シグマ）およびβ−メルカプトエタノール（１ｍＭ）を含有する、トリス２０ｍＭ、ｐＨ７．８、ＮａＣｌ １５０ｍＭ緩衝液中で行った。還元および酸化グルタチオン（それぞれ、５ｍＭおよび０．５ｍＭ、シグマ）を０．５および０Ｍの尿素透析工程中に添加した。最後に、タンパク質をトリス１０ｍＭ、ｐＨ７．５、ＮａＣｌ １５０ｍＭ緩衝液に対して広範囲に透析した。溶解再折畳みタンパク質を濃縮させ、次いでスーパーデックス（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ）２００サイズ排除カラム（ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、ＡＫＴＡシステム（ｓｙｓｔｅｍ））で精製した。

ビアコア分析。表面プラスモン共鳴測定をビアコア装置（ビアコア）で行った。すべてのビアコア実験において、０．０５％サーファクタントＰ２０を補充したＨＢＳ緩衝液をランニングバッファーとして使用した。

タンパク質の固定化。組換えＫＩＲ２ＤＬ１およびＫＩＲ２ＤＬ３タンパク質をセンサーチップ（Ｓｅｎｓｏｒ Ｃｈｉｐ）ＣＭ５（ビアコア）上のデキストラン層におけるカルボキシル基に共有結合で固定化した。センサーチップ表面をＥＤＣ／ＮＨＳ（Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩およびＮ−ヒドロキシスクシニミド、ビアコア）で活性化した。カップリングバッファー（１０ｍＭ酢酸塩ｐＨ４．５）中のタンパク質を注入した。残りの活性化基の不活性化を１００ｍＭエタノールアミンｐＨ８（ビアコア）を使用して行った。

親和性測定。動態測定のために、さまざまな濃度の可溶性抗体（１０^−７〜４×１０^−１０Ｍ）を固定化試料上に加えた。測定を２０μｌ／分の連続流量で行った。各サイクルで、センサーチップの表面を１０ｍＭ ＮａＯＨ ｐＨ１１の５μｌ注入によって再生した。

ビアローグ（ＢＩＡｌｏｇｕｅ）動態評価（Ｋｉｎｅｔｉｃｓ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ）プログラム（ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ３．１、ビアコア）をデータ分析のために使用した。

結果
ＤＦ２００ｍＡｂの固定化ＫＩＲ２ＤＬ１およびＫＩＲ２ＤＬ３への結合のビアコア分析

可溶性分析物（さまざまな濃度で４０μｌ）をＨＢＳ緩衝液中２０μｌ／分の流量で５００または５４０反射率単位（ＲＵ）、および１０００または７００ＲＵのＫＩＲ２ＤＬ１およびＫＩＲ２ＤＬ３をそれぞれ含有するデキストラン層上に注入した。データは６つの独立した実験を代表する。

実施例２：リツキサンと抗ＫＩＲｍＡｂの組合わせを使用することによるＡＤＣＣの増強
ヒトＮＫクローンの調製。陰性抗ＣＤ３免疫磁性選択（ミルテンイ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）によるＴ細胞の枯渇血液単核細胞を限外希釈条件下にプレーティングし、フィトヘムアグルチニン（ＰＨＡ）（バイオクロムＫＧ、ドイツ、ベルリン（Ｂｅｒｌｉｎ））で活性化し、インターロイキン（ＩＬ）−２（カイロンＢ．Ｖ．、オランダ、アムステルダム（Ａｍｓｔｅｒｄａｍ））および照射支持細胞で培養した。クローニング効率はすべてのドナーにおいて同等であり、プレーティングしたＮＫ細胞５個中１個〜１０個中１個の範囲である。クローン化ＮＫ細胞を同種反応性について、エフェクター対標的比１０：１で機知のＨＬＡ型のエプスタイン・バー（Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒ）ウイルス形質転換Ｂリンパ芽細胞系に対する標準^５１Ｃｒ放出細胞毒性によって検査した。３０％以上の溶解を示すクローンを同種反応性と評価した。一般に、クローンは、＜５％または＞４０％のいずれかの溶解を示す。

ＫＩＲ２ＤＬ１陽性ＮＫ細胞クローンによるリツキサンによって介在されるＡＤＣＣの増強
ＮＫクローンの細胞溶解活性を標準４時間５１Ｃｒ放出アッセイによって評価するが、ここでエフェクターＮＫ細胞が、ＮＫ細胞溶解に対する感受性で知られるＣｗ４またはＣｗ３陽性ＥＢＶ細胞系（ＣＤ２０陽性）で試験された。すべての標的をマイクロ滴定プレートのウェル当り５０００の細胞で使用したが、標的に対するエフェクター（ＮＫ細胞クローン）の比は図３に示されている。一部の実験においては、治療キメラ抗ＣＤリツキシマブ（リツキサン、アイデック（Ｉｄｅｃ））を５μｇ／ｍｌでエフェクター標的混合物に添加する。一部の実験においては、ＥＢ６抗体（抗ＫＩＲ２ＤＬ１）を１０μｇ／ｍｌでエフェクター標的混合物に添加する。

この実験は、リツキサン単独では実質的にＣｗ４陽性標的上にＫＩＲ２ＤＬ１陽性ＮＫクローンによるＡＤＣＣを介在しないことを示した。ＫＩＲ２ＤＬ１陽性クローンのＡＤＣＣは、抗ＫＩＲ２ＤＬ１抗体の存在下に大きく増強される。

実施例３−ＫＩＲ２ＤＬ１陽性ＮＫ細胞クローンによるキャンパスによって介在されるＡＤＣＣの増強
実施例２に記載されたものと同様の実験において、自己Ｃｗ４＋ＰＨＡブラストをＮＫ細胞＋アルムツズマブ（キャンパス、ベルレックス（Ｂｅｒｌｅｘ））、ＥＢ６抗体（１００μｇ／ｍｌ）、またはキャンパスおよびＥＢ６の存在下にインキュベートした。図４に示されている結果は、ＥＢ６の存在が自己細胞を枯渇させるＮＫ細胞の能力を劇的に増強させることを示し、標的細胞の約４％がキャンパスのみの存在下に溶解したのに対し、３０％を超える細胞がキャンパス＋ＥＢ６の存在下に溶解した。

文献
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本明細書で引用されたすべての刊行物および特許出願は、各個の刊行物または特許出願が具体的かつ個別に参照することにより組込まれることが示されているように、その全体が参照することにより本明細書に組込まれる。

前記発明は理解の明確さのために説明図および実施例によって詳細に記載されているが、本発明の開示に照らして、添付の特許請求の範囲の精神または範囲を逸脱することなく一部の変更および修正がなされうることが当業者には容易に理解されるであろう。

そのすべて可能な変形における上記要素の組合わせが、本明細書で別段の規定がなく、またはその他の場合に文脈によって明らかに否定されない限り、本発明によって包含される。

冠詞の「ａ」と「ａｎ」と「ｔｈｅ」と本発明を記載する文脈において使用される同様の指示対象は、本明細書で別段の規定がなく、または文脈によって明らかに否定されない限り、単数と複数の両方をカバーすると解釈される。

本明細書での値の範囲の列挙は、本明細書で別段の規定がない限り、範囲内に収まる個々の値に個別に言及する簡便な方法として役立つように意図されているにすぎず、個々の値は、それが個別に本明細書で引用されるように明細書に組込まれる。特に指定のない限り、本明細書で示されたすべての正確な値は、対応する近似値を代表する（例えば、特定の因子または測定に関して示されたすべての正確な典型的な値は、必要に応じて「約」で一部変更される対応する近似測定値も示すと考えられうる）。

本明細書に記載されたすべての方法は、本明細書で別段の規定がなく、または文脈によって明らかに否定されない限り、任意の適切な順序で実施されうる。

いずれかおよびすべての実施例の使用、または本明細書で示されている典型的な言葉（例えば「など（ｓｕｃｈ ａｓ）」は、本発明をより良く照らし出すことが意図されているにすぎず、別段の規定がない限り、本発明の範囲に対する制限をもたらすことはない。明細書における言葉は、明確に述べられていない限り、いずれかの要素が本発明の実施にとって絶対必要であることを示していると解釈されるべきではない。

本明細書での特許文書の引用および組込みは、便宜上行われているだけであり、かかる文書の妥当性、特許可能性および／または権利行使可能性の観点を反映することはない。

１つの要素もしくは複数の要素に関して「含んで成る」、「有する」、「含む」、または「含有する」などの用語を使用する本発明の態様または実施形態の本明細書での記述は、別段の規定がなく、または文脈によって明らかに否定されない限り、特定の１つの要素もしくは複数の要素「から成る」、「から本質的に成る」、または「を実質的に含んで成る」、本発明の同様の態様または実施形態の裏づけを提供することが意図されている（例えば、特定の要素を含んで成るとして本明細書に記載された組成物は、別段の規定がなく、または文脈によって明らかに否定されない限り、その要素から成る組成物も述べていると理解すべきである）。

本発明は、適用法によって許容される最大範囲まで本明細書に示された態様または特許請求の範囲で開示された主題のすべての変更例および均等物を含む。

モノクローナル抗体ＤＦ２００はさまざまなヒトＫＩＲ２ＤＬ受容体の共通の決定基に結合する。 エフェクター／標的比４／１でのＣ１ＲＣｗ４標的での抗ＫＩＲ２ＤＬｍＡｂ（モノクローナル抗体）による溶解の再構成。モノクローナル抗体ＤＦ２００は、Ｃｗ４陽性標的細胞でのＫＩＲ２ＤＬ１陽性ＮＫ細胞の細胞毒性（再構成溶解）のＫＩＲ２ＤＬ介在阻害を阻害する。 ＫＩＲ／ＨＬＡ相互作用を遮断することによるＣｗ４陽性ＥＢＶ細胞系でのＫＩＲ２ＤＬ１陽性ＮＫクローンのリツキサンによって介在されたＡＤＣＣの増強。ＫＩＲ２ＤＬ１を有するＮＫクローン細胞融解が、５μｇ／ｍｌの抗ＣＤ２０抗体（ルチキサン（Ｒｕｔｉｘａｎ））および１０μｇ／ｍｌのＥＢ６抗体（抗ＫＩＲ２ＤＬ１）、リツキサンのみ、ＥＢ６のみ、またはいずれの抗体なしの存在下に、さまざまなエフェクター／標的比（１〜４）でＣｗ４陽性ＥＢＶ形質転換（ＣＤ２０陽性）標的細胞系に対して試験される。ＡＤＣＣは、抗ＫＩＲ２ＤＬ１抗体（ＥＢ６）の存在下に大きく増強される。 ＫＩＲ／ＨＬＡ相互作用を遮断することによるＣｗ４陽性ＥＢＶ細胞系でのＫＩＲ２ＤＬ１陽性ＮＫクローンのキャンパスによって介在されたＡＤＣＣの増強。ＫＩＲ２ＤＬ１を有するＮＫクローン細胞融解が、キャンパスおよび１００μｇ／ｍｌのＥＢ６抗体（抗ＫＩＲ２ＤＬ１）、キャンパスのみ、ＥＢ６のみ、またはいずれの抗体なしの存在下にＣｗ４陽性ＥＢＶ形質転換（ＣＤ２０陽性）標的細胞系に対して試験される。ＡＤＣＣは、抗ＫＩＲ２ＤＬ１抗体（ＥＢ６）の存在下に大きく増強される。

Claims (55)

1. それを必要とするヒト対象における疾患の治療方法であって、
   ａ）阻害性受容体を遮断し、またはＮＫ細胞の活性化受容体を刺激する化合物を前記対象に投与する工程と、
   ｂ）ＣＤ１６によって結合されうる治療抗体を前記対象に投与する工程と
   を含んで成る方法。
2. 前記治療抗体がヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ３Ｆｃ部分を有する、請求項１に記載の方法。
3. 前記化合物が抗体であり、またはその抗原結合フラグメントを含んで成る、請求項１または２に記載の方法。
4. 前記治療抗体がモノクローナル抗体であり、またはその抗原結合フラグメントを含んで成る、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
5. 前記治療抗体が放射性または毒性部分と抱合していない、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
6. 前記化合物がＮＫ細胞の阻害性受容体を阻害する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
7. 前記化合物がＮＫ細胞の活性化受容体を刺激する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
8. 前記化合物がヒト、ヒト化、またはキメラ抗体であり、またはその抗原結合フラグメントを含んで成る、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
9. 前記治療抗体がヒト、ヒト化、またはキメラ抗体であり、またはその抗原結合フラグメントを含んで成る、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
10. 前記治療抗体がリツキシマブまたはキャンパスである、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
11. 前記抗体がリツキシマブであり、かつ前記抗体が１週間に３７５ｍｇ／ｍ^２未満の用量で投与される、請求項１０に記載の方法。
12. 前記抗体がキャンパスであり、かつ前記抗体が１週間に９０ｍｇ未満の用量で投与される、請求項１０に記載の方法。
13. 前記化合物が、ＮＫＧ２、ＫＩＲ２ＤＬ、またはＫＩＲ３ＤＬヒト受容体の少なくとも１つに結合し、かつＮＫ細胞の細胞毒の関連性ＮＫＧ２、ＫＩＲ２ＤＬ−、またはＫＩＲ３ＤＬ介在阻害を阻害する、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
14. 前記化合物が、ＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ２ＤＬ２／３、ＫＩＲ２ＤＬ４、ＫＩＲ２ＤＬ５Ａ、ＫＩＲ２ＤＬ５Ｂ、ＫＩＲ３ＤＬ１、ＫＩＲ３ＤＬ２、ＫＩＲ３ＤＬ３、ＬＩＬＲＢ１、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２ＣＮＫＧ２Ｅ、およびＬＩＬＲＢ５より成る群から選択されるＮＫ細胞の阻害性受容体を遮断する、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
15. 前記化合物が、ＫＩＲ２ＤＬヒト受容体の共通の決定基に結合し、かつＮＫ細胞の細胞毒性のＫＩＲ２ＤＬ介在阻害を阻害する、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
16. 前記化合物が、ＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ２ＤＬ２、およびＫＩＲ２ＤＬ３ヒト受容体の共通の決定基に結合し、かつＮＫ細胞の細胞毒性のＫＩＲ２ＤＬ１−、ＫＩＲ２ＤＬ２−、およびＫＩＲ２ＤＬ３介在阻害を阻害する、請求項１５に記載の方法。
17. 前記化合物が、８０位にＬｙｓ残基を有するＨＬＡ−Ｃ対立遺伝子分子のヒトＫＩＲ２ＤＬ１への結合、および８０位でＡｓｎ残基を有するＨＬＡ−Ｃ対立遺伝子分子のヒトＫＩＲ２ＤＬ２、およびＫＩＲ２ＤＬ３受容体への結合を阻害する、請求項１６に記載の方法。
18. 前記化合物が、ハイブリドーマＤＦ２００によって生成されるモノクローナル抗体ＤＦ２００、またはモノクローナル抗体ＥＢ６と同じエピトープに結合する、請求項１３に記載の方法。
19. 前記化合物が、ヒトＮＫ細胞の表面でＫＩＲ受容体に結合するために、ハイブリドーマＤＦ２００によって生成されるモノクローナル抗体ＤＦ２００、またはモノクローナル抗体ＥＢ６と競合する、請求項１３〜１７のいずれか一項に記載の方法。
20. 前記化合物が、ハイブリドーマＤＦ２００もしくはそのフラグメントまたは誘導体、あるいはモノクローナル抗体ＥＢ６もしくはそのフラグメントまたは誘導体である、請求項１３〜１７のいずれか一項に記載の方法。
21. 前記化合物が抗体であり、またはその抗原結合フラグメントを含んで成る、請求項７に記載の方法。
22. 前記化合物が、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、およびＮＫＧ２Ｄより成る群から選択される受容体に結合する、請求項７または２１に記載の方法。
23. 前記化合物が、ＡＺ２０、Ａ７６、Ｚ２５、Ｚ２３１、およびＢＡＢ２８１より成る群から選択されるモノクローナル抗体から誘導され、またはこれらと競合する、請求項２２に記載の方法。
24. 前記治療抗体および前記化合物が、前記対象へ同時に投与される、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の方法。
25. 前記化合物が、前記治療抗体の投与の１週間以内に前記対象に投与される、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の方法。
26. 前記疾患が癌、感染性または免疫疾患である、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の方法。
27. 前記患者におけるＮＫ細胞の活性または数が前記化合物の投与の前またはその後に評価されるさらなる工程を含んで成る、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の方法。
28. 前記さらなる工程が、
    ｉ）前記投与の前に前記対象からＮＫ細胞を得る工程と、
    ｉｉ）前記化合物の存在または非存在下に、前記治療抗体によって認識される１つもしくはそれ以上の標的細胞の存在下に前記ＮＫ細胞をインキュベートする工程と、
    ｉｉｉ）前記標的細胞を枯渇させる前記ＮＫ細胞の能力に対する前記化合物の効果を評価する工程を含み、前記化合物が前記標的細胞を枯渇させる前記ＮＫ細胞の能力を増強させるという検出が、前記化合物が前記方法における使用に適切であり、前記方法が前記対象との使用に適切であることを示す、請求項２７に記載の方法。
29. （ａ）ＣＤ１６によって結合されうる治療抗体と、（ｂ）阻害性受容体を遮断し、またはＮＫ細胞の活性化受容体を刺激する化合物と、（ｃ）医薬的に許容可能な担体と
    を含んで成る医薬組成物。
30. 前記治療抗体がヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ３Ｆｃ部分を有する、請求項２９に記載の組成物。
31. 前記化合物が抗体であり、またはその抗原結合フラグメントを含んで成る、請求項２９または３０に記載の組成物。
32. 前記化合物がモノクローナル抗体であり、またはその抗原結合フラグメントを含んで成る、請求項２９または３０に記載の組成物。
33. 前記化合物がヒト、ヒト化、またはキメラ抗体であり、またはその抗原結合フラグメントを含んで成る、請求項２９〜３２のいずれか一項に記載の組成物。
34. 前記治療抗体がモノクローナル抗体であり、またはその抗原結合フラグメントを含んで成る、請求項２９〜３３のいずれか一項に記載の組成物。
35. 前記治療抗体がヒト、ヒト化、またはキメラ抗体であり、またはその抗原結合フラグメントを含んで成る、請求項３４に記載の組成物。
36. 前記抗体が放射性または毒性部分と抱合していない、請求項３４または３５に記載の組成物。
37. 前記化合物がＮＫ細胞の阻害性受容体を阻害する、請求項２９〜３６のいずれか一項に記載の組成物。
38. 前記化合物がＮＫ細胞の活性化受容体を刺激する、請求項２９〜３６のいずれか一項に記載の組成物。
39. 前記治療抗体がリツキシマブまたはキャンパスである、請求項２９〜３８のいずれか一項に記載の組成物。
40. 前記化合物が、ＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ２ＤＬ２／３、ＫＩＲ２ＤＬ４、ＫＩＲ２ＤＬ５Ａ、ＫＩＲ２ＤＬ５Ｂ、ＫＩＲ３ＤＬ１、ＫＩＲ３ＤＬ２、ＫＩＲ３ＤＬ３、ＬＩＬＲＢ１、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２ＣＮＫＧ２Ｅ、およびＬＩＬＲＢ５より成る群から選択されるＮＫ細胞の阻害性受容体を遮断する、請求項２９〜３７または３９に記載の組成物。
41. 前記化合物が、ＫＩＲ２ＤＬヒト受容体の共通の決定基に結合し、かつＮＫ細胞の細胞毒性のＫＩＲ２ＤＬ介在阻害を阻害する、請求項２９に記載の組成物。
42. 前記化合物が、ＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ２ＤＬ２、およびＫＩＲ２ＤＬ３ヒト受容体の共通の決定基に結合し、かつＮＫ細胞の細胞毒性のＫＩＲ２ＤＬ１−、ＫＩＲ２ＤＬ２−、およびＫＩＲ２ＤＬ３介在阻害を阻害する、請求項４１に記載の組成物。
43. 前記化合物が、８０位にＬｙｓ残基を有するＨＬＡ−Ｃ対立遺伝子分子のヒトＫＩＲ２ＤＬ１への結合、および８０位でＡｓｎ残基を有するＨＬＡ−Ｃ対立遺伝子分子のヒトＫＩＲ２ＤＬ２およびＫＩＲ２ＤＬ３受容体への結合を阻害する、請求項４１に記載の方法。
44. 前記化合物が、ハイブリドーマＤＦ２００によって生成されるモノクローナル抗体ＤＦ２００、モノクローナル抗体ＮＫＶＳＦ１、またはモノクローナル抗体ＥＢ６と同じエピトープに結合する、請求項２９または４０〜４３に記載の組成物。
45. 前記化合物が、ヒトＮＫ細胞の表面でＫＩＲ受容体に結合するために、ハイブリドーマＤＦ２００によって生成されるモノクローナル抗体ＤＦ２００、モノクローナル抗体ＮＫＶＳＦ１、またはモノクローナル抗体ＥＢ６と競合する、請求項２９または４０〜４３のいずれか一項に記載の組成物。
46. 前記化合物が、ハイブリドーマＤＦ２００もしくはそのフラグメントまたは誘導体によって生成されるモノクローナル抗体ＤＦ２００、モノクローナル抗体ＮＫＶＳＦ１もしくはそのフラグメントまたは誘導体、あるいはモノクローナル抗体ＥＢ６もしくはそのフラグメントまたは誘導体である、請求項２９または４０〜４３のいずれか一項に記載の組成物。
47. 前記化合物が、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、およびＮＫＧ２Ｄより成る群から選択される受容体に結合する、請求項３８に記載の組成物。
48. 治療抗体とともに投与するための化合物を選択する方法であって、前記方法が、
    ｉ）阻害性受容体を阻害し、またはＮＫ細胞上の活性化受容体を刺激する試験化合物を提供する工程と、
    ｉｉ）ＮＫ細胞の存在下、および前記試験化合物の存在または非存在下に、前記治療抗体によって特異的に認識される標的細胞で前記治療抗体をインキュベートする工程と、
    ｉｉｉ）前記標的細胞を枯渇させる前記ＮＫ細胞の能力に対する前記化合物の効果を評価する工程を含み、前記化合物が前記標的細胞を枯渇させる前記ＮＫ細胞の能力を増強させるという検出が、前記方法における使用に適切であることを示す方法。
49. 前記化合物が前記標的細胞を破壊する前記治療抗体の能力を３０％増強する、請求項４８に記載の方法。
50. 前記化合物が前記標的細胞を破壊する前記治療抗体の能力を５０％増強する、請求項４８に記載の方法。
51. 前記化合物が、抗体、抗体フラグメント、モノクローナル抗体、モノクローナル抗体のフラグメント、ヒト化抗体、キメラ抗体、およびヒト化抗体より成る群から選択される、請求項４８〜５０のいずれか一項に記載の方法。
52. 前記標的細胞が、癌細胞、ウイルス感染細胞、または自己免疫疾患の基礎を成す細胞である、請求項４８〜５１のいずれか一項に記載の方法。
53. 前記治療抗体がリツキシマブまたはキャンパスである、請求項４８〜５２のいずれか一項に記載の方法。
54. 対象におけるＣＤ１６によって結合されうる治療抗体の投与を含む治療の有効性を増大させる方法であって、前記方法が、前記治療抗体の投与前、投与と同時に、または投与後に、阻害性受容体を遮断し、またはＮＫ細胞の活性化受容体を刺激する化合物の治療有効量を前記対象に投与する工程を含んで成る方法。
55. 前記化合物が前記対象におけるＡＤＣＣを増強することによって前記治療の有効性を増大させることを特徴とする請求項５４に記載の方法。