CN105001333B - 抗人nkg2d抗体及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供用于人体治疗应用的分离的抗人NKG2D单克隆抗体。所述抗体通常是完整人或人源化抗体，当给予患者时，会使针对所述抗体的免疫应答风险降到最低。优选的抗体包括人单克隆抗体MS和21F2。如本文所述，其它抗原结合分子，例如抗原结合抗体片段、抗体衍生物和多特异性分子可以设计自或来源于这类抗体。

Description

抗人NKG2D抗体及其用途
本申请为分案申请，原申请的申请日为2008年12月15日，申请号为200880127171.3(PCT/EP2008/067499)，发明名称为“抗人NKG2D抗体及其用途”。
发明背景
本发明涉及抗人NKG2D抗体(hNKG2D)及其在治疗或预防人类患者的疾病及病症中的用途。
发明背景
免疫受体NKG2D通常在人CD8+T细胞和NK细胞上表达。在活化前的CD8+细胞中，人NKG2D(hNKG2D)同二聚体受体通过其DAP10缔合而作为TCR和CD28+TCR信号转导的共激活剂起作用，而在NK细胞中，则作为直接激活剂起作用。已经鉴定并表征了hNKG2D的各种配体，包括MHCI类相关配体MICA和MICB、UL16结合蛋白(ULBP)家族和视黄酸早期转录物-1(retinoic acid early transcript，RAET1)家族。
在慢性自身免疫病例如类风湿性关节炎中，hNKG2D在CD4+CD28-T细胞亚型上表达，并参与刺激其增殖和IFNγ产生，并且MIC表达被上调(Groh等，PNAS 2003；100：9452)。研究还表明，在克罗恩病(Crohn’s disease)中的表达hNKG2D的CD4+T细胞通过MICA相互作用介导炎症反应和细胞毒反应(Allez等，Gastroenterology2007；132：2346-2358)。NKG2D是自身免疫炎症的主要推动力的初步推测来自在糖尿病鼠模型(NOD小鼠)中通过结合并阻断鼠NKG2D(CX5)的单克隆抗体(mAb)来预防和治疗导致糖尿病的炎症(Ogasawara等，Immunity2004；20：757-767)，这表明了抗NKG2D抗体的治疗应用。这类应用参见例如US20050158307、WO2005097160、WO2005115517和WO2006024367。
虽然抗人NKG2D的鼠mAb已有记载(参见例如Pende等，Eur J Immunol 2001；31：1076-86；WO02068615；Bauer等，Science1999：285：727-9；Castriconi等，PNAS 2003；100：4120-25；以及André等，Eur J Immunol 2004；34：1-11)或者是市售的(例如得自R&DSystems，MN，USA的抗体149810和得自Beckman Coulter Inc.的ON72)，但是它们具有免疫原性。据报道，文献中披露的唯一完整人抗NKG2D mAb对NKG2D信号转导同时具有激动作用和拮抗作用(Kwong等，J Mol Biol 2008；384：1143-1156)，使其较不适于作为炎症性疾病和/或自身免疫病的治疗剂。
因此，存在对在炎症性疾病和病症和/或自身免疫疾病和病症的治疗用途中具有最优性质的抗hNKG2D mAb的需求。本发明满足这些需要和其它需求，并且提供若干将在本文其余部分中描述的另外的益处。
发明概述
本发明提供用于人体治疗应用的分离抗hNKG2D单克隆抗体。所述抗体通常是完整人或人源化抗体，当给予患者时，会使针对抗体的免疫应答风险降到最低。如本文所述，其它抗原结合分子，例如抗原结合抗体片段、抗体衍生物和多特异性分子可以设计自或来源于这类抗体。
在一个方面，抗体的特征在于一种或多种功能性质或者功能性质的组合。示例性的特征包括例如防止hNKG2D介导的表达hNKG2D的NK细胞或T细胞的活化；与至少一种天然hNKG2D配体或与若干种配体竞争结合hNKG2D；降低表达hNKG2D的NK细胞或T细胞表面上的hNKG2D的量；还结合食蟹猴(cynomolgous)NKG2D和/或猕猴(rhesus)NKG2D；每个hNKG2D二聚体只结合一个抗体分子；当加入表达hNKG2D的NK细胞和/或T细胞中时，使不超过2个的hNKG2D二聚体交联；结合时对hNKG2D信号转导的激动剂效应不明显；和/或与hNKG2D结合的解离常数(KD)为1nM以下。本发明的某些抗hNKG2D抗体进一步或者备选地可与一种或多种本文所述的 特定人抗hNKG2D抗体(包括抗体MS和21F2)竞争；与所述抗体结合基本相同的表位；或者以与所述抗体相同或更高的亲和力结合。例如，在一个实施方案中，与已知的鼠抗hNKG2D抗体(例如上述抗体)相比，所述抗体进一步或者备选地更能竞争或者阻断hNKG2D与MS和/或21F2的结合。在一个实施方案中，所述抗体与MS和/或21F2结合相同的hNKG2D表位。在另一个实施方案中，所述抗体进一步或者备选地与MS结合相同的表位。在另一个实施方案中，所述抗体进一步或者备选地与21F2结合相同的表位。技术人员应理解的是，由本发明的实施方案提供的抗体和/或用于本发明实施方案的抗体可具有3、4或更多个的上述性质。
在另一个方面，所述抗体进一步或者备选地包含一个或多个与本文所述的MS或21F2抗原互补位和/或抗原结合序列相同或相似的抗原互补位和/或抗原结合序列。
在其它方面，本发明提供编码本发明抗体的核酸、包含这类核酸的表达载体、包含这类核酸的宿主细胞、产生本发明抗体的宿主细胞以及通过在适当条件下培养这类宿主细胞以产生抗hNKG2D抗体的方法。
本发明还提供这类抗体的抗体结合片段以及包含这类抗原结合片段的分子，包括工程改造的抗体片段、抗体衍生物、双特异性抗体和其它多特异性分子。
本发明还提供包含这类抗体或其它分子的药物组合物和药盒或其它制品。
本发明还提供使用这类抗体、分子和组合物来降低或抑制hNKG2D活化、hNKG2D信号转导或者表达hNKG2D的NK细胞或T细胞活化的方法，或减轻炎症的方法，以及治疗或预防自身免疫疾病或病症和/或炎症性疾病或病症的方法，包括但不限于类风湿性关节炎、包括克罗恩病和溃疡性结肠炎在内的炎性肠病(IBD)、系统性红斑狼疮(systemicerythromatosis lupus、SLE)、银屑病、银屑病性关节炎、 多发性硬化、乳糜泻、病毒性疾病(例如病毒性肝炎)以及各种器官和组织(包括但不限于心脏和骨髓)的移植排斥反应。
附图简述
图1表示对来自KM mouseTM品系的经hNKG2D免疫接种的小鼠的示例性血清进行的分析。在各个时间点上对表达NKG2D的BAF/3细胞或对照细胞(BAF/3细胞)的流式细胞术分析揭示1μl血清中抗体与NKG2D选择性结合的效价升高(A)。与第6次免疫接种后所采集的血清(1μl)的预孵育物含有能够阻止MICA-Fc与NKG2D结合的抗体(B)。
图2表示与表达NKG2D的细胞(A)特异性结合但不与不表达NKG2D的同一细胞系(B)特异性结合的杂交瘤上清液形式的人抗体的实例。将抗体以杂交瘤上清液的形式加入细胞中。还显示了直接标记的阳性对照鼠抗NKG2D抗体149810与表达NKG2D的细胞(C)和不表达NKG2D的细胞(D)的结合。黑色轮廓代表背景染色，实心峰代表特异性染色。
图3表明与市售鼠抗体(ON72和149810)相比，重组表达并纯化的完整人IgG4抗体(16F16、16F31、MS和21F2)的NKG2D结合表达NKG2D的细胞的剂量反应。
图4表示人抗hNKG2D抗体16F16和16F31(A)以及IgG4同种型的MS和21F2(B)的重链(H)和轻链(L)的氨基酸序列，突出显示可变区(粗体字)和CDR区(下划线)，其中SEQ ID NO:7为16F16重链(IgG4)序列，SEQ ID NO:8为16F16轻链序列，SEQ ID NO:9为16F31重链(IgG4)序列，SEQ ID NO:10为16F31轻链序列，SEQ ID NO:40为MS重链(IgG4)序列，SEQ IDNO:41为MS轻链序列，SEQ ID NO:42为21F2重链(IgG4)序列，SEQ ID NO:43为21F2轻链序列。表1提供氨基酸序列的相应序列标识符和各种突出显示的部分。
图5表示VH和VL序列与相应重组种系序列的比对。CDR区用粗体字Kabat编号注明，体细胞高变用粗体字下划线文本注明。(A)16F16 IgG4H链；(B)16F16 IgG4L链；(C)16F31IgG4H链；(D)16F31IgG4L链；(E)MS IgG4H链；(F)MS IgG4L链；(G)21F2 IgG4H链；(H)21F2IgG4 L链。SEQ ID NOS：27-30分别对应于重组 VH3_21/D3-9/JH4、VKI_L15/JK2、VH3_20/D3-10/JH6和VKIII_A27/JK3，SEQ ID NOS 60-63分别对应于重组VH4_59//JH3、VKIII_A27/JK1、VH5_51/D3_10_R3/JH4和VKIII_L6/JK1。
图6表示通过由杂交瘤上清液中的抗体预孵育所致配体结合的阻断，证实了示例性人抗NKG2D抗体对配体(MICA-)结合的阻断。轮廓图代表背景，灰色代表没有预孵育的配体结合，黑色虚线代表有预孵育的配体结合。
图7表示对重组表达并纯化的完整人抗hNKG2D抗体(16F16、16F31、MS和21F2；IgG4同种型)的各种浓度进行分析时所得到的剂量反应曲线，给出了IC50和完全阻断1μg MICA-mFc结合所需要的剂量。
图8表示与含有16F16的杂交瘤上清液预孵育完全阻止ON72对NKG2D的NKG2D结合。轮廓代表背景，灰色代表没有预孵育的ON72结合，黑色虚线代表有预孵育的ON72结合。
图9表示完整人抗hNKG2D抗体阻断鼠抗hNKG2D抗体随后与NKG2D结合的能力，反之亦然。(A)16F16：与重组表达并纯化的16F16(0.3μg；IgG4同种型)预孵育阻止ON72(0.3μg)与NKG2D结合。颠倒孵育顺序显示，与ON72(0.3μg)预孵育只阻止85％重组表达并纯化的IgG4同种型(0.3μg)16F16的结合，说明一部分NKG2D依然可被完整人抗体结合，这就表明至少部分表位与ON72结合的表位不同。抗体149810只显示对重组表达并纯化的16F16(IgG4同种型)有约50％的交叉抑制，当149810与16F16分别按1∶1(0.3μg，0.3μg)和按3∶1(1μg，0.3μg)的抗体浓度进行试验时，很可能再次说明NKG2D上结合表位的差异。采用下列孵育和检测组合：没有(a)或有(b)16F16预孵育的ON72的检测；没有(c)或有(d)ON72预孵育的16F16的检测；没有(e)或有(f)16F16预孵育(0.3μg)的149810(0.3μg)的检测；没有(g)或有(h)149810预孵育(0.3μg)的16F16的检测；没有(i)或有(i)16F16预孵育(0.3μg)的149810(1μg)的检测；没有(k)或有(l)149810预孵育 (1μg)的16F16(0.3μg)的检测；16F16检测(0.3μg)。(B)MS：将0.1μg鼠抗hNKG2D抗体在有或没有与0.1μg MS抗体预孵育的情况下进行孵育，接着采用流式细胞术用抗小鼠抗体进行检测。在没有与MS预孵育的情况下，将与0，1μgON72、1D11或149810的孵育标准化为100％，分别见(a)、(c)和(e)。与0.1μg MS孵育30分钟，接着分别对ON72、1D11或149810进行的孵育和检测，见(b)、(d)和(f)。与MS预孵育分别抑制NKG2D与ON72、1D11和149810结合的98％、88％和96.5％，这就表明至少一些抗体的表位相似。(C)21F2：在有(a)或没有(b)与21F2预孵育的情况下检测ON72结合；在有(c)或没有(d)与21F2预孵育的情况下检测1D11结合；以及在有(e)或没有(f)21F2的情况下检测149810结合(所有抗体为0.1μg)。
图10表示猕猴或食蟹猴(cyno)细胞与ON72和自原始杂交瘤纯化的16F16抗体的染色。(A)食蟹猴NK细胞，(B)食蟹猴CD8+T细胞，(C)猕猴NK细胞，和(D)猕猴CD8+T细胞。值用结合的平均荧光强度(MFI)表示，其中减去了仅与第二抗体结合的MFI。在两种物种中都未观察与CD4+T细胞的结合。
图11表示人抗体MS以不同抗体浓度与外周血单核细胞(PBMC)的人或食蟹猴CD8阳性细胞的结合，证实了与人和食蟹猴NKG2D的亲和力相似。
图12表示在51Cr释放测定法中，加入阻断配体的抗体(ON72或重组表达并纯化的16F16(IgG4同种型))，以剂量依赖性方式阻断NK介导的杀死表达MICA的靶细胞。
图13表示重组表达并纯化的16F16和16F31(均为IgG4同种型)能够以剂量依赖性的方式抑制带有MICA(A)和ULBP3(B)两者的靶细胞(BaF/3)被NK-92细胞杀死，其中两种配体被0.8μg/ml的16F16几乎完全阻断，两种配体被20μg/ml最高试验剂量的16F31部分阻断。
图14表示重组表达并纯化的MS、21F2和16F16(均为IgG4同种型)能够抑制NK介导的杀死表达配体的靶细胞。(A)通过MS或21F2 抑制NK-92细胞杀死ULBP3-BaF/3细胞。(B)通过MS或16F16抑制NKL细胞杀死BaF/3-MICA细胞。
图15表示使用用NKG2D和DAP10转染的BaF/3细胞时，抗体诱导的细胞表面NKG2D的减少。该图表示与对照相比(在没有抗NKG2D抗体过夜孵育后的细胞表面NKG2D受体＝100％)，在与ON72(1μg)或重组表达并纯化的人抗体16F16(1μg；IgG4同种型)或16F31(3μg；IgG4同种型)过夜孵育后，余留在细胞表面上NKG2D受体的百分比。
图16表示使用用NKG2D和DAP10转染的BaF/3细胞(按图15进行)(A)或从外周血新鲜制备的人NK细胞(B)时，MS抗体诱导的细胞表面NKG2D的减少。在(B)中，将人NK细胞在人血清(模拟血中有IgG存在的情况)存在下，与不同浓度的MS抗体孵育过夜。甚至在最底浓度下也达到最大的下调，相当于在NKG2D+NK细胞上的相似条件下，在结合测定法中测量的受体饱和状态的约60％。
图17表示在与规定的21F2抗体浓度过夜孵育后人NK细胞上细胞表面NKG2D减少的百分比。
图18表示在规定的时间点上，在人血样中不同类型的细胞中，ON72、MS和21F2对表面存在的NKG2D的作用。各抗体的浓度为0.1μg/ml。在不受理论的束缚下，实验中表面存在的NKG2D的减少可能代表NKG2D内化。图(A)-(C)分别表示抗体诱导的表达NKG2D的NK细胞、CD8+T细胞和δγT细胞的NKG2D内化。MS和21F2导致表面缔合的NKG2D的减少比ON72的低。
图19表示使用两种不同的低于最佳剂量的CD3以提供共刺激，用于测定固定化MS和ON72对T细胞增殖的激动作用的试验结果。(A)[CD3]＝0.1ng/ml；(B)[CD3]＝0.3ng/ml。在按规定用固定化抗体刺激3天接着IL-2刺激4天的PBMC群中，通过CFSE稀释评价了T细胞增殖。所包括的CD28刺激作为共刺激的阳性对照。对于MS未能检测到显著的激动作用，而ON72则对T细胞增殖具有低却显著的 作用。
图20表示与抗NKG2D抗体(MS或hzON72)的Fab片段或与MICA配体复合的hNKG2D二聚体的三维叠加图。hNKG2D同二聚体(‘NKG2D’)以表面图像表示，一个单体的颜色比另一个的深。Fab片段(分别为‘MS’和‘hzON72’)用黑色管状形式表示，而MICA(‘MICA’)用浅色示意性二级结构图像形式表示。(A)、(B)重叠的hNKG2D/MS Fab和hNKG2D/MICA晶体复合体结构(Li等，Nat Immunol2001；2：443-451；PDB代码1HYR，使用共同hNKG2D分子的C-α-原子作为模板)。由于MICA和MS两者以不对称方式与NKG2D二聚体结合，因此(A)和(B)表示当与NKG2D-二聚体结合时，两个配体分子的两种可能的相对结合方向。在对hNKG2D的重叠计算法中，对于两种方向在MICA和MS Fab之间存在相当大的重叠，表明了MS Fab阻断MICA与hNKG2D受体结合的能力。参见实施例11。(C)hNKG2D/hzON72Fab和hNKG2D/MICA复合体晶体结构的重叠。hNKG2D的每个单体被hzON72Fab结合。在对hNKG2D的重叠计算中，hzON72抗体同样与MICA结合位点有相当大的重叠，表明了hzON72可以阻断MICA与hNKG2D结合。参见实施例12。
图21表示在两个hNKG2D单体单元的序列(SEQ ID NO：2)中用于MS Fab(A)、hzON72Fab(B)和MICA分子(C)的hNKG2D二聚体中各个NKG2D单体单元序列(SEQ ID NO：2)中的表位残基。与晶体结构配体原子相距以内的NKG2D残基视为结合表位的组成部分并标有下划线。双下划线残基参与与配体的氢结合。(A)hNKG2D二聚体中hNKG2D单体单元1和2上单一MS Fab的结合表位。在NKG2D单体单元1中晶体单体N和C结合，在NKG2D单体单元2中晶体单体M和D结合。在单体单元2中，Lys 150侧链原子Nζ只参与两个晶体学上独立的复合体之一的氢结合。亦见表9-12。(B)两个hzON72Fab同时与hNKG2D单体单元1和2结合的相应的结合表位。Trp 166参与晶体学上独立的分子复合体(一个hzON72Fab分子与一个hNKG2D单体复合)之一的氢结合，但是对于另一个的氢结合则距离太远。参见表14-15。(C)hNKG2D单体单元1和2上MICA分子的结合表位。MICA显示与hNKG2D二聚体不对称结合，因此可能以相对于MS-Fab的两个方向结合。只是2个单体单元图像的互换便可获得MICA的第二种取向。
图22表示表面图像的hNKG2D分子，其中一个单体比另一个略微较深。图中显示与其相应晶体结构MS/hzON72/MICA Fab原子相距 以内的NKG2D原子的颜色为黑色，(A)对应于MS Fab、(B)对应于2个hzON72Fab，(C)和(D)对应于MICA。由于MICA和MS Fab两者均以不对称的方式与NKG2D二聚体结合，因此对NKG2D的相关结合方向可能有所不同。图中作出说明，在(C)和(D)中表示MICA相对于MS的两种可能的结合方向。亦见表9-12和14-15。
定义
除非另有说明或与本文内容相抵触，否则本文使用的“hNKG2D”和术语“NKG2D”亦称“NKG2-D”、“CD314”、“D12S2489E”、“KLRK1”、“杀伤细胞凝集素样受体亚家族K成员1”和“KLRK1”，是指人杀伤细胞激活性受体基因，其mRNA(例如NCBI RefSeq NM_007360；SEQ IDNO：1)及其基因产物(NCBI RefSeq NP_031386；SEQ ID NO：2)或其天然存在的变体。在NK细胞和T细胞中，配体结合形式的hNKG2D受体是同二聚体(Li等，Nat Immunol 2001；2：443-451)。HNKG2D受体通常存在于表面，与DAP10复合(Wu等，J Exp Med 2000；192：1059参照以下；NCBI检索号AAG29425、AAD50293)，研究表明还形成更高级的复合体。本文中由hNKG2D提供的任何活性，例如细胞活化、抗体识别等，也可由与DAP10和/或其它组分的复合体或更高级复合体形式中的hNKG2D提供。
除非另有说明或与本文内容相抵触，否则本文中以最广义和具体使用的术语“抗体”包括全长单克隆抗体、多克隆抗体和抗原结合片段、 抗体变体、及其多特异性分子，只要它们具有所需要的生物活性即可。全长抗体一般是包含通过二硫键相互连接的至少两条重(H)链和两条轻(L)链的糖蛋白或其抗原结合部分。每条重链由重链可变区(本文简称VH)和重链恒定区组成。重链恒定区由CH1、CH2和CH3三个结构域组成。每条轻链由轻链可变区(本文简称VL)和轻链恒定区组成。轻链恒定区由一个CL结构域组成。VH区和VL区还可进一步细分成超变性区，称为互补决定区(CDR)，散布在称为构架区(FR)的较保守的区域内。VH和VL各由3个CDR和4个FR组成，按下列顺序从氨基端到羧基端排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。抗体分子结构和各种与产生抗体相关的技术的通用原理可参见例如Harlow和Lane，ANTIBODIES：ALABORATORY MANUAL，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，(1988)。
抗体的“抗原结合片段”是包含能够可检测地与抗原结合的全长抗体的一部分的分子，其通常包含至少VH区的一个或多个部分。抗原结合片段包括多价分子和单链构建体，所述多价分子包含1、2、3个或更多个抗体的抗原结合部分，所述单链构建体中VL区和VH区或其选定部分通过合成接头或通过重组方法连接形成功能性的抗原结合分子。虽然一些抗体的抗原结合片段可以通过较大抗体分子的实际断裂(例如酶促切割)来获得，但是大多数通常由重组技术产生。
术语“抗体衍生物”和“免疫缀合物”在本文中可互换使用，是指包含全长抗体或其抗原结合片段的分子，其中一个或多个氨基酸是经化学修饰的，例如通过烷基化、聚乙二醇化、酰化、酯形成或酰胺形成等，例如以将抗体连接至第二分子。示例性修饰包括聚乙二醇化(例如半胱氨酸-聚乙二醇化)、生物素化、放射性标记和与第二种药剂(例如细胞毒剂)缀合。
“多特异性分子”包括抗体或其抗原结合片段，其与至少一种其它的功能性分子(例如另一种肽或蛋白质，例如另一种抗体或受体的配体) 缔合或连接，从而形成与至少两个不同结合位点或靶分子结合的分子。示例性多特异性分子包括双特异性抗体和与可溶性受体片段或配体连接的抗体。
本文所使用的术语“人抗体”旨在包括具有其中构架区和CDR区两者都来源于人种系免疫球蛋白序列(即与之相同或基本相同)的可变区的抗体。此外，如果抗体含有恒定区，则恒定区同样“来源于”人种系免疫球蛋白序列。本发明的人抗体可以包括不是由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如通过体外随机诱变或位点专一诱变或通过体内体细胞突变所引入的突变)。然而，本文所使用的术语“人抗体”不包括其中将来源于其它哺乳动物物种(例如小鼠)种系的CDR序列植入人构架序列的抗体。
“人源化”抗体是含有来源于非人类免疫球蛋白的最小序列的人/非人类嵌合抗体。就大部分而言，人源化抗体是人免疫球蛋白(受体抗体)，其中受体超变区的残基置换成来自具有所需要的特异性、亲和力和能力的非人类物种(供体抗体)超变区的残基，所述非人类物种例如小鼠、大鼠、兔或非人类灵长类。在一些情况下，人免疫球蛋白的FR残基被相应的非人类残基置换。此外，人源化抗体可包含不存在于受体抗体或供体抗体的残基。这些修饰使抗体性能进一步完善。一般来讲，人源化抗体可包含至少一个、通常两个基本全部的可变结构域，其中全部或基本上全部的超变环对应于非人类免疫球蛋白的超变环，且全部或基本上全部的FR残基是人免疫球蛋白序列的FR残基。人源化抗体任选还可包含免疫球蛋白恒定区(通常为人免疫球蛋白恒定区)的至少一部分(Fc)。更多详情参见例如Jones等，Nature 321：522-525(1986)；Riechmann等，Nature 332：323-329(1988)；以及Presta，Curr.Op.Struct.Biol.2：593-596(1992)；WO 92/02190；美国专利申请20060073137以及美国专利6750325、6632927、6639055、6548640、6407213、6180370、6054297、5929212、5895205、5886152、5877293、5869619、5821337、5821123、5770196、5777085、5766886、5714350、 5693762、5693761、5530101、5585089和5225539。
术语“超变区”当用于本文时是指负责抗原结合的抗体的氨基酸残基。超变区一般包含来自“互补决定区”即“CDR”的氨基酸残基(轻链可变结构域中的残基24-34(L1)、50-56(L2)和89-97(L3)以及重链可变结构域中的31-35(H1)、50-65(H2)和95-102(H3)；(Kabat等(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，U.S.Department ofHealth and Human Services，NIH Publication No.91-3242(美国卫生与公共事务部国立卫生研究院颁布号91-3242))和/或来自“超变环”的那些残基(轻链可变结构域中的残基26-32(L1)、50-52(L2)和91-96(L3)以及重链可变结构域中的26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3)；Chothia和Lesk，J.Mol.Biol1987；196：901-917)。通常，该区中氨基酸残基的编号通过Kabat等人(出处同上)所述方法进行。短语例如“Kabat位”、“可变结构域残基编号同Kabat”和“按照Kabat”在本文中是指该用于重链可变结构域或轻链可变结构域的编号系统。采用Kabat编号系统，肽的实线性氨基酸序列可含有与可变结构域FR或CDR缩短或插入相应的较少或添加的氨基酸。例如，重链可变结构域在CDR H2的残基52之后可包括单个氨基酸插入(按照Kabat的残基52a)，在重链FR残基82之后可包括插入残基(例如按照Kabat的残基82a、82b和82c等)。对于给定抗体，残基的Kabat编号由通过该抗体序列与“标准”Kabat编号的序列在同源区进行比对来确定。
“构架区”或“FR”残基是除本文定义的CDR以外的VH或VL残基。
“表位”或“结合位点”是指抗原上的区域或区，抗原结合肽(例如抗体)与之特异性结合。蛋白质表位可包含直接参与结合的氨基酸残基(亦称表位的免疫显性组分)和不直接参与结合的其它氨基酸残基，例如被特异性抗原结合肽有效阻断的氨基酸残基(换句话说，氨基酸残基在特异性抗原结合肽的“溶剂排斥表面(solvent-excluded surface)”和/或“足迹(footprint)”内)。本文中的术语表位包括hNKG2D任何特定区域 中的两种类型的氨基酸结合位点，其特异性结合抗hNKG2D抗体或本发明的另一种hNKG2D特异性药剂(hNKG2D-specific agent)，除非另有说明(例如在某些情况下本发明涉及与特定氨基酸残基直接结合的抗体)。NKG2D可包含多种不同的表位，其可包括而不限于(1)线性肽抗原决定簇，(2)构象抗原决定簇，其由成熟NKG2D构象中的一个或多个彼此位置接近的非连续氨基酸组成；以及(3)翻译后抗原决定簇，全部或部分由与NKG2D共价连接的分子结构组成，例如糖基。除非另有说明或与本文内容相抵触，否则构象抗原决定簇包含与抗原结合肽的原子相距约范围内的NKG2D氨基酸残基。
“溶剂排斥表面”是某一分子的区域，在计算机计算中，任何水分子都无法达到(例如由于所述分子与配体结合所致)所述区域(Lee和Richards，J Mol Biol 1971；55：379-400，该文献通过引用结合到本文中)。
短语“结合与目标抗体(例如MS或21F2)基本相同的表位或决定簇”是指某一抗体与目标抗体“竞争”目标抗体所特异性结合的NKG2D分子。
“抗原互补位”是特异性结合抗原的某一抗体的抗原结合部分的某一区域或区。除非另有说明或显然与本文内容相抵触，否则抗原互补位可包括直接参与表位结合的氨基酸残基(其中若干个通常在CDR中)和不直接参与结合表位结合的其它氨基酸残基，例如被特异性结合的抗原有效阻断的氨基酸残基(换句话说，所述氨基酸残基在特异性结合的抗原的“溶剂排斥表面”和/或“足迹”内)。
抗NKG2D抗体“阻断”NKG2D分子与天然NKG2D配体(例如MICA)结合的能力，是指在使用可溶性或细胞表面缔合的NKG2D和配体分子的试验中，抗体以剂量依赖性方式可检测地减少NKG2D分子与配体的结合，而在抗体不存在时NKG2D分子则可检测地与配体结合。测定抗NKG2D抗体是否能够阻断MICA结合的示例性试验见实施例3。同一试验可用于测定抗体介导的对其它NKG2D配体的阻断。
多肽的“变体”是指具有与通常为天然或“亲本”多肽的参比多肽基本相同的氨基酸序列的多肽。多肽变体可在天然氨基酸序列内某些位置上具有一个或多个氨基酸取代、缺失和/或插入和/或在一端或两端具有氨基酸添加。
在文中，术语两个氨基酸序列“基本相同”是指例如通过采用默认空位权重(default gap weight)的程序GAP或BEST-FIT进行最佳比对时，序列共有至少约50％序列同一性。作为基本相同的序列通常可具有至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约98％或至少约99％序列同一性。
在两个基本相同的氨基酸序列中“相应的”氨基酸位置是经过本文所提及的任何蛋白质分析软件比对的氨基酸位置。
核酸序列(或元件)当被放置在与另一核酸序列有功能关系的位置上时，与另一核酸序列(或元件)“有效连接”。例如，如果某一多肽作为参与所述多肽分泌的前蛋白表达，则前序列或分泌前导序列的DNA与所述多肽的DNA(即编码多肽表达的DNA)有效连接；如果启动子或增强子影响编码序列的转录，则其与所述序列有效连接；或者如果将核糖体结合位点置于促进翻译的位置，则所述核糖体结合位点与编码序列有效连接。一般而言，“有效连接”是指所连接的DNA序列是邻接的，在分泌前导序列的情况中，是邻接且位于读相(reading phase)内。然而，一些元件，例如增强子，不必与编码序列邻接便可有效连接。连接通常通过在适宜的限制位点上连接来完成。如果这类位点不存在，则可按照常规做法使用合成的寡核苷酸衔接子或接头。
“分离的”分子是在组成成分中相对于其所属的分子类别而言是主要种类的分子(即在组成成分中该分子类型构成至少约50％，通常可构成该分子种类(例如组成成分中的肽)的至少约70％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％以上)。通常，对于抗体分子，在组成成分的所有本发明的肽类的情况下，或者在所给出用途的情况下至少相对于主要活性肽类而言，抗体分子的组成成分可具有98％、 98％或99％同质性。
在本发明的情况下，“治疗(treatment/treating)”是指预防、缓解、控制、治愈或减轻一种或多种症状或者疾病或病症的临床相关表现，除非与本文内容相抵触。例如对确定为无症状或者疾病和病症的临床相关表现的患者进行“治疗”是防治性或预防性治疗，而对已确定具有症状或者疾病和病症的临床相关表现的患者的临床性、治疗性或治标性“治疗”一般不构成防治性或预防性治疗。各种治疗形式可视为本发明的独特方面。
发明详述
本发明部分基于具有适于治疗患有NKG2D相关病症(例如自身免疫疾病和病症和炎症性疾病和病症)的人类患者的性质的抗NKG2D抗体。本发明的抗体通常是完整人或人源化抗体以使得由患者自身免疫系统对抗体产生的免疫应答风险降到最低，并且以其活性形式即位于细胞表面并与DAP10缔合的同二聚体与hNKG2D结合。
本发明的抗体通常用于治疗其中应降低NKG2D活性的疾病。这类抗体可以减少或抑制表达NKG2D的NK和/或T细胞的活性，通过例如与一种或多种内源性NKG2D配体竞争结合NKG2D或者阻断一种或多种内源性NKG2D配体结合NKG2D、下调或减少结合时细胞表面NKG2D的量、和/或引发针对细胞的ADCC或CDC反应。
在一个方面，本发明的抗体是拮抗剂并且与一种或多种天然配体例如MICA竞争结合人NKG2D，从而降低配体诱导的NKG2D活化。MICA分子无疑涉及炎症性疾病，而且，如实施例3中所述，若干人抗体、特别是与MS和21F2有效阻断MICA与细胞表面NKG2D的结合，表位测定表明MS Fab阻碍MICA结合(实施例11，图20)。MS和21F2两者也都在阻断NK细胞介导的细胞毒性中十分有效(实施例6)。因此，这些结果证实本发明提供具有这类性质的抗体。
在一个更具体的方面，本发明的抗体是有效的拮抗剂，但对 hNKG2D信号转导却也没有显著的激动作用，因此不会导致产生NKG2D驱动的炎症。例如，如图19所示，未能检测到固定化MS对CD3触发的PBMC增殖的共刺激，但是固定化ON72引起小却显著的共刺激。在不受理论的束缚下，这种差异可能至少部分是由于表位上的差异所引起，见图20-22。二价MS抗体的抗原结合部分与hNKG2D二聚体复合体中的一个单体牢固结合，但却阻断第二MS抗体(或同一抗体的第二个抗原结合部分)与第二个单体结合。相比之下，当二价hzON72抗体的抗原结合部分与hNKG2D二聚体中的第一个单体结合时，这不阻断第二个hzON72抗体(或同一抗体的第二抗原结合部分)与第二个单体的结合。
在一个实施方案中，本发明提供人或人源化的抗NKG2D抗体，该抗体当加入表达NKG2D的NK细胞或T细胞中时，使不超过二个hNKG2D二聚体交联。这类抗体优选是二价的。其抗原结合部分与NKG2D单体单元的结合阻断进一步结合第二NKG2D单体单元的二价抗体(例如MS)至多仅可使二个hNKG2D二聚体交联。相比之下，可结合hNKG2D二聚体中的一个NKG2D单体单元而不会阻断结合hNKG2D二聚体中的第二NKG2D单体单元的二价抗体可以引起任何数目的hNKG2D二聚体发生交联。在受体活化时通常出现表面受体的聚簇。
在一个实施方案中，本发明提供人或人源化抗NKG2D抗体，该抗体当加入表达NKG2D的NK细胞或T细胞中时，仅与hNKG2D二聚体复合体中的一个单体牢固结合。在不受理论的束缚下，与二聚体的两个单体牢固结合可为NKG2D受体活化的前提条件。MICA和hzON72与hNKG2D二聚体中的两个单体单元牢固结合。然而，MS与hNKG2D二聚体的结合以结合单体单元之一占优势，而与第二单体单元的结合弱且无特异性，而且在第二hNKG2D单体上具有较小的溶剂排斥表面积(实施例11)。在单独和特定的优选实施方案中，被本发明抗体结合的第一和第二NKG2D单体单元的溶剂排斥表面积之比大 于约1∶1，至少约2∶1，或至少约3∶1。
在一个实施方案中，本发明提供与MS结合基本上相同表位的人或人源化抗NKG2D抗体。在不受理论的束缚下，在hNKG2D二聚体上配体与特定残基或残基组合的相互作用可能避免或最小化激动剂活性。在独立和具体的实施方案中，本发明抗体的表位包含至少1个残基选自、至少3个残基选自、至少5个残基选自、至少8个残基选自、至少10个残基选自、至少12个残基选自或所有残基都选自hNKG2D(SEQ ID NO：2)的Lys 150、Ser 151、Tyr 152、Thr 180、Ile 181、Ile 182、Glu 183、Met 184、Gln 185、Leu 191、Lys 197、Tyr 199、Glu201、Thr 205、Pro 206、Asn 207和Thr 208。
在一个方面，本发明提供完整人抗体或其抗原结合片段，其有效防止表达hNKG2D的NK细胞或T细胞的NKG2D介导的细胞毒性，在结合hNKG2D时至少与MICA竞争；结合时通过例如刺激hNKG2D的下调、hNKG2D的内化和/或防止hNKG2D的再现，来减少细胞表面hNKG2D的量；与hNKG2D的亲和力为10nM以下，与食蟹猴和/或猕猴NKG2D交叉反应；以及例如因具有IgG4同种型而为非耗尽性的(non-depleting)。在一个具体的实施方案中，抗体是IgG4同种型的非耗尽性完整人抗体，与hNKG2D的亲和力为1nM以下，优选300pM以下，它阻断至少50％、至少70％或至少90％的内源性hNKG2D配体结合，以及减少细胞表面hNKG2D的量达至少10％、至少30％或至少50％。在另一个具体的实施方案中，抗体是二价非耗尽性IgG4同种型的完整人抗体，其亲和力低于100pM，阻断完全饱和剂量的MICA-Fc与细胞表面缔合的NKG2D结合的EC50浓度低于0.01ng/ml，结合时能够减少细胞表面NKG2D的量达至少75％，并且任选，降低配体诱导的NK细胞的细胞毒性的EC50浓度小于结合细胞表面缔合的NKG2D所必需的EC50浓度。在使用表达NKG2D的细胞的试验中，抗体还能够以低于获得饱和的hNKG2D受体所必需的浓度(即饱和剂量)，达到其hNKG2D下调的最大水平。
在包括实施例在内的下列各部分中，将更详细地描述特异性结合hNKG2D和具有这些性质的一些或全部的抗体的产生、表征和用途。
抗NKG2D抗体
本发明抗体的特征在于特殊功能和/或结构特征或性质。在实施例中详细描述了评价抗hNKG2D抗体的功能活性的试验，下面将描述结构性质，例如氨基酸序列。
功能性质
本发明的抗体与hNKG2D结合。在一个实施方案中，本发明的抗体以高亲和力与hNKG2D结合，例如KD为10-7M以下，KD为10-8M以下，KD为1nM以下，KD为0.3nM以下，KD为0.2nM以下，0.1nM以下，0.05nM以下或0.01nM以下。在一个具体的实施方案中，抗体以0.1nM以下的亲和力与hNKG2D结合。
在一个方面，本发明提供还与猴例如食蟹猴(Macaca fascicularis，NCBI检索号AJ426429)和猕猴(Macaca mulatta，NCBI检索号AJ554302)的一种或多种NKG2D直向同源物结合和/或与hNKG2D同二聚体、正确折叠的单体全长hNKG2D、包含hNKG2D的胞外部分的hNKG2D片段、变性hNKG2D或与前述NKG2D形式的任何组合结合的抗体。例如，如实施例5中所证实的一样，按照相应的EC50(即最大有效浓度的一半)值，人抗体21F2和MS与特定食蟹猴细胞类型的结合分别比其与同一人细胞类型的结合多约65％和约75％。因此，在一个实施方案中，本发明的抗体与食蟹猴和/或猕猴NKG2D的结合具有与其结合hNKG2D相似的亲和力或功效。例如，抗体可与表达NKG2D的食蟹猴或猕猴NK细胞或T细胞结合，其EC50为表达NKG2D的人NK细胞或T细胞相应群体的相应EC50的约50％以上、约65％以上或约75％以上。此外或者备选地，抗体可与食蟹猴或猕猴NKG2D结合的亲和力是对hNKG2D的亲和力的约30％以上，约50％ 以上，约65％以上或约75％以上，约80％以上，约85％以上或约90％以上。这类抗体具有优势，可供在用于人体前在大多数合适动物模型(或多个模型)中进行毒性试验。
在一个具体的方面，本发明的抗体还结合已知鼠抗hNKG2D抗体(例如ON72)不结合的NKG2D形式。确切地讲，如实施例3中所述，与ON72预孵育只阻断约82％的随后加入的人16F16抗体与hNKG2D结合，而与16F16预孵育则阻断约95％的随后加入的ON72与hNKG2D结合。
此外，本发明的抗体可以降低或抑制hNKG2D介导的NK细胞或T细胞的活化，即拮抗hNKG2D受体。这可在例如本文所述的或本领域已知的一个或多个细胞毒性测定法中验证。例如，与在任何抗hNKG2D抗体不存在时或与在非特异性对照抗体存在时的靶细胞杀死相比，如果抗体抑制NK细胞或T细胞介导的杀死表达NKG2D配体的靶细胞达至少10％，更优选达至少30％，甚至更优选达至少40％，至少50％，至少60％，至少70％，至少80％或至少90％，则抗体抑制hNKG2D介导的NK细胞或T细胞的活化。
作为hNKG2D拮抗剂的本发明抗体可能无激动剂活性或激动剂活性低下。这类抗体优选是人或人源化抗体。以本文所述试验之一或本领域已知试验测定激动剂活性。例如，一种试验类型是共刺激试验，测定在固定化抗NKG2D抗体存在或不存在时，低水平CD3刺激的外周血淋巴细胞(PBMC)的增殖(参见实施例10)。在这类试验中，与抗体不存在时相比，在本发明的抗体存在时增殖至多30％、至多20％、至多10％、至多5％或不明显更高。优选在本发明的抗体存在时增殖不显著高于抗体不存在时。在另外的或备选的实施方案中，在激动剂试验中，本发明抗体的hNKG2D激动剂活性至多30％，至多20％，至多10％，至多5％或不明显高于对照值。对照优选为阴性对照，例如，在抗体不存在时，在细胞或另一试剂不存在时，和/或在无关抗体存在时。本发明抗体的激动剂活性优选不明显高于对照值。
在另一个方面，本发明提供了抗体，所述抗体的阻断配体诱导的细胞毒性的EC50浓度比结合NK细胞或T细胞的细胞表面NKG2D的EC50浓度更低、优选低得多。例如，对于ON72，结合在BaF/3细胞上表达的细胞表面NKG2D的EC50浓度(0.062μg/ml)近似于阻断NK细胞介导的杀死表达配体(ULBP3)的靶细胞的EC50浓度(0.065μg/ml)，而与结合细胞表面NKG2D的EC50(21F2：0.033μg/ml；MS：0.032g/ml)相比，21F2的阻断细胞毒性的EC50较低而MS明显较低(21F2：0.021μg/ml；MS：0.012μg/ml)(参见实施例6和实施例9)。另外，与21F2和16F16(其浓度相当于饱和浓度或更高，图3)相比，MS以较低浓度(浓度仅相当于细胞缔合的NKG2D受体的饱和约80％，图3)达到细胞毒性的最大阻断。因此，在一个实施方案中，本发明提供了抗体，优选人或人源化抗体，所述抗体的阻断配体诱导的细胞毒性的EC50浓度比结合NK细胞或T细胞的细胞表面NKG2D的EC50浓度更低。阻断某一细胞系或其它合适的制备物的NK细胞或T细胞的细胞毒性的EC50可以是结合同一细胞系或制备物的细胞表面NKG2D的EC50的例如约95％以下，约90％以下，约85％以下，约80％以下，约70％以下，约50％以下或约40％以下。用于测试的示例性的细胞系包括NK-92和NKL细胞。
在另一个实施方案中，本发明提供以浓度低于使有效hNKG2D受体饱和所必需的浓度实现NK细胞的细胞毒性的最大阻断的抗体。在一个具体的实施方案中，抗体还与MS竞争结合hNKG2D。在另一个具体的实施方案中，这类抗体与MS结合基本相同的hNKG2D表位。
抗体可通过例如干扰hNKG2D结合一个或多个内源hNKG2D配体，来降低或抑制NKG2D介导的活化。例如，抗体可例如通过降低或抑制MICA的hNKG2D结合；或MICA和MICB的hNKG2D结合；或MICA和ULBP3的hNKG2D结合；或MICA、MICB和ULBP3的hNKG2D结合；或MICA、MICB和所有ULBP1、ULBP2、ULBP3和ULBP4的hNKG2D结合；或MICA、MICB和一个或多个RAET1家族成员的hNKG2D结合，来降低或抑制MICA、MICB、ULBP1、ULBP2、ULBP4和/或RAET1家族成员的hNKG2D结合。可以采用本文所述的结合测定法或竞争测定法，评价抗体抑制内源性NKG2D配体的hNKG2D结合的能力。在一个实施方案中，本发明的抗体能够抑制至少30％的配体结合，或至少50％的配体结合，或至少70％的配体结合，或至少80％或至少90％的配体结合。在另一个实施方案中，本发明的抗体抑制1μg MICA-mFc的hNKG2D结合的IC50为1nM以下，0.5nM以下，0.2nM以下，0.1nM以下，0.05nM以下或0.02nM以下，0.01nM以下，0.005以下或0.002以下。在另一个实施方案中，实现1μg MICA-mFc结合的完全阻断的抗体浓度为5nM以下，1nM以下，0.7nM以下，0.5nM以下或0.2nM以下，0.1nM以下，0.05nM以下或约0.02nM以下。在一个实施方案中，本发明提供与ON72、BAT221、5C6、1D11、ECM217和149810的任一种相比，在减少或抑制配体hNKG2D结合(例如MICA与hNKG2D结合)方面一样有效或更有效的抗体，尤其人抗体。
此外或者备选地，本发明的抗hNKG2D抗体在结合时(即在结合后)能够减少细胞表面hNKG2D的量。在抗体结合时减少细胞表面缔合的hNKG2D可能是有利性质，因为它减少可供配体结合和随后活化的hNKG2D受体的数目。在不受理论的束缚下，这种减少可能是由NKG2D下调、内化或其它机制引起的。如本文所示，具有人Fc区的抗hNKG2D抗体，例如人抗体，能够有效地减少细胞表面hNKG2D的量。例如，人抗hNKG2D抗体16F16、MS和21F2全都在血清不存在时经过夜孵育之后减少细胞表面hNKG2D的量约75％以上，其中MS最有效，在低浓度下达到75-90％下调(图15-17)。此外，在血清存在时，对应于小于表达hNKG2D的BaF/3细胞上的饱和浓度的MS浓度可达到最大的下调(图16B)。因此，在一个实施方案中，本发明提供结合hNKG2D的抗体，所述抗体以低于饱和浓度就能够达到最大hNKG2D下调。在另一个实施方案中，这类抗体还与MS竞争结合 hNKG2D。在另一个实施方案中，这类抗体还与MS结合基本相同的hNKG2D表位。与在抗hNKG2D抗体不存在时或在非特异性对照抗体存在时的细胞表面hNKG2D相比，本发明的抗体能够减少细胞表面hNKG2D达至少10％、至少20％、至少30％、至少50％、至少70％或至少90％。优选在不引起NKG2D受体信号转导活化或者NKG2D受体信号转导活化最低、即无激动剂活性或激动剂活性最低的同时，抗体实现细胞表面NKG2D的减少。本文描述了用于评价细胞表面hNKG2D和抗hNKG2D抗体的激动剂活性的示例性试验。在一个实施方案中，本发明提供了抗体，特别是人抗体，所述抗体能够比选自ON72、BAT221、5C6、1D11、ECM217和149810的对照抗体更高程度地进行减量调节。在另一个实施方案中，本发明的抗hNKG2D抗体能够以低于饱和浓度的浓度实现由细胞或细胞系表达的细胞表面NKG2D的最大下调。
在另一个实施方案中，本发明提供与16F16、16F31、MS和/或21F2、更优选与MS和/或21F2竞争和/或与16F16、16F31、MS和/或21F2、更优选与MS和/或21F2结合hNKG2D上的相同表位的抗体。在如本文所述的标准hNKG2D结合测定法中，这类抗体可根据其与16F16、16F31、MS或21F2交叉竞争的能力来鉴定。试验抗体抑制16F16、16F31、MS或21F2与hNKG2D结合的能力表明，试验抗体可与16F16、16F31、MS或21F2竞争结合hNKG2D，因此可与16F16、16F31、MS或21F2结合hNKG2D上的相同表位。在一个优选的实施方案中，与16F16、16F31、MS或21F2结合hNKG2D上的相同表位的抗体是人单克隆抗体。这类人单克隆抗体可以按照实施例中所述来制备和分离。
在另一个优选的实施方案中，与小鼠单克隆抗体ON72、BAT221、5C6、1D11、ECM217和149810的任一种相比，所述抗体结合不同的表位，比起所列举的小鼠单克隆抗体的任一种，更多地与16F16、16F31、MS或21F2交叉竞争。
在一个实施方案中，本发明抗体的表位包含一个或多个选自hNKG2D(SEQ ID NO：2)的以下残基：Lys 150、Ser 151、Tyr 152、Thr180、Ile 181、Ile 182、Glu 183、Met 184、Gln 185、Leu 191、Lys 197、Tyr 199、Glu 201、Thr 205、Pro 206、Asn 207和Thr 208。在一个实施方案中，本发明抗体的表位包含5个以上选自hNKG2D(SEQ ID NO：2)的以下残基：Lys150、Ser 151、Tyr 152、Thr 180、Ile 181、Ile 182、Glu 183、Met 184、Gln 185、Leu 191、Lys 197、Tyr 199、Glu 201、Thr 205、Pro 206、Asn 207和Thr 208。在一个实施方案中，本发明抗体的表位包含8、10、12个以上选自hNKG2D(SEQ ID NO：2)的以下残基：Lys 150、Ser151、Tyr 152、Thr 180、Ile 181、Ile 182、Glu 183、Met 184、Gln 185、Leu 191、Lys 197、Tyr 199、Glu 201、Thr 205、Pro 206、Asn 207和Thr 208。在一个实施方案中，本发明抗体的表位包含hNKG2D(SEQ ID NO：2)的残基Lys 150、Ser 151、Tyr 152、Thr180、Ile 181、Ile182、Glu 183、Met 184、Gln 185、Leu 191、Lys 197、Tyr 199、Glu 201、Thr 205、Pro 206、Asn 207和Thr 208。在一个实施方案中，本发明抗体的表位基本由hNKG2D(SEQ ID NO：2)的以下残基组成：Lys 150、Ser 151、Tyr 152、Thr 180、Ile 181、Ile 182、Glu 183、Met 184、Gln 185、Leu 191、Lys 197、Tyr 199、Glu 201、Thr 205、Pro 206、Asn 207和Thr 208。在一个实施方案中，本发明抗体的表位由一个或多个选自hNKG2D(SEQ ID NO：2)的以下残基组成：Lys 150、Ser 151、Tyr 152、Thr 180、Ile 181、Ile 182、Glu 183、Met 184、Gln 185、Leu 191、Lys 197、Tyr 199、Glu 201、Thr 205、Pro 206、Asn 207和Thr 208。在一个实施方案中，本发明抗体的表位由hNKG2D(SEQ ID NO：2)的以下残基组成：Lys 150、Ser 151、Tyr152、Thr 180、Ile 181、Ile 182、Glu 183、Met 184、Gln 185、Leu 191、Lys 197、Tyr199、Glu 201、Thr 205、Pro 206、Asn 207和Thr 208。
在一个实施方案中，本发明抗体的表位包含一个或多个参与氢结合的选自hNKG2D(SEQ ID NO：2)的以下残基：Lys 150、Ser 151、Tyr 152、Ile 181、Met 184、Gln 185、Lys197、Thr 205和Asn 207。在一个实施方案中，本发明抗体的表位包含5以上参与氢结合的选自hNKG2D(SEQ ID NO：2)的以下残基：Lys 150、Ser 151、Tyr 152、Ile181、Met 184、Gln185、Lys 197、Thr 205和Asn 207。在一个实施方案中，本发明抗体的表位包含hNKG2D(SEQID NO：2)的Lys 150、Ser 151、Tyr 152、Ile 181、Met 184、Gln 185、Lys 197、Thr 205和Asn 207。
优选的本发明抗体具有下列性质的至少一种，更优选两种、三种、四种、五种以上：(a)防止NKG2D介导的表达NKG2D的NK细胞或T细胞的活化，任选降低配体诱导的细胞毒性的EC50低于结合细胞的EC50；(b)与至少一种NKG2D配体竞争结合NKG2D，优选与至少MICA和ULBP3竞争；(c)减少表达NKG2D的NK细胞或T细胞表面的NKG2D的量，优选达至少75％；(d)与食蟹猴和/或猕猴NKG2D结合，优选亲和力为其与hNKG2D结合的亲和力的不低于50％；(e)与不止一种形式或构象的NKG2D结合；(f)结合NKG2D的Kd为1nM以下，优选0.1nM以下；(g)与16F16、16F31、MS或21F2中的一种或多种竞争结合hNKG2D，(h)在与hNKG2D结合方面，与ON72、BAT221、5C6、1D11、ECM217和149810中的任一种相比，更多地与16F16、16F31、MS或21F2竞争；(i)阻断超过90％的16F16、MS或21F2与细胞表面hNKG2D结合；(j)具有不显著的激动剂活性，和(k)与16F16、16F31、MS和/或21F2中的任一种结合基本相同的表位，优选与MS和/或21F2结合基本相同的表位。本发明的抗体可具有上述功能特征的任何组合和/或实施例中所述的功能特征。
结构性质
优选的本发明抗体是按实施例中所述来产生、分离和进行结构和功能表征的人单克隆抗体16F16、16F31、MS和21F2。这些抗体的全长序列、可变序列和CDR序列见表1。
表1
16F16、16F31、MS和21F2的全长、可变和CDR氨基酸序列
抗体部分 SEQ ID NO： 抗体部分 SEQ ID NO：
16F16IgG4H链 7 MS IgG4H链 40
16F16L链 8 MS L链 41
16F31IgG4H链 9 21F2IgG4H链 42
16F16L链 10 21F2L链 43
16F16VH区 11 MS VH区 44
16F16VL区 12 MS VL区 45
16F31VH区 13 21F2VH区 46
16F31VL区 14 21F2VL区 47
16F16VH CDR1 15 MS VH CDR1 48
16F16VH CDR2 16 MS VH CDR2 49
16F16VH CDR3 17 MS VH CDR3 50
16F16VL CDR1 18 MS VL CDR1 51
16F16VL CDR2 19 MS VL CDR2 52
16F16VL CDR3 20 MS VL CDR3 53
16F31VH CDR1 21 21F2VH CDR1 54
16F31VH CDR2 22 21F2VH CDR2 55
16F31VH CDR3 23 21F2VH CDR3 56
16F31VL CDR1 24 21F2VL CDR1 57
16F31VL CDR2 25 21F2VL CDR2 58
16F31VL CDR3 26 21F2VL CDR3 59
某些本发明的抗NKG2D抗体具有与MS相同或类似的抗原互补位。在一个实施方案中，抗体具有包含以下残基的抗原互补位，所述残基对应于MS L链(SEQ ID NO：41)的Tyr33和Trp 97中的一个或多个，和/或对应于MS H链(SEQ ID NO：40)的Gln 1、Asp 26、Asp27、Ser 30、Ser 31、Tyr 32、Tyr 33、His 50、Ser 52、Tyr 53、Ser 54、Ser56、Ala 57、Asn58、Trp 98和Asp 99中的一个或多个。在一个实施方案中，抗体具有包含以下残基的抗原互补位，所述残基对应于MS L链(SEQ ID NO：41)的Tyr 33和Trp 97和/或MS H链(SEQ ID NO：40)的Gln 1、Asp 26、Asp 27、Ser 30、Ser 31、Tyr 32、Tyr 33、His 50、Ser 52、Tyr 53、Ser54、Ser 56、Ala 57、Asn 58、Trp 98和Asp 99中 的3、5、7、10个以上。在一个实施方案中，抗体具有包含以下残基的抗原互补位，所述残基对应于MS L链(SEQ ID NO：41)的Tyr 33和Trp 97以及MS H链(SEQ ID NO：40)的Gln 1、Asp 26、Asp 27、Ser 30、Ser 31、Tyr 32、Tyr33、His 50、Ser 52、Tyr 53、Ser 54、Ser 56、Ala57、Asn 58、Trp 98和Asp 99。在一个实施方案中，抗体具有由以下残基组成的抗原互补位，所述残基对应于MS L链(SEQ ID NO：41)的Tyr 33和Trp 97以及MS H链(SEQ ID NO：40)的Gln 1、Asp 26、Asp27、Ser 30、Ser 31、Tyr 32、Tyr 33、His 50、Ser 52、Tyr 53、Ser 54、Ser 56、Ala 57、Asn 58、Trp 98和Asp99。在一个实施方案中，抗体具有由以下残基组成的抗原互补位，所述残基对应于MS L链(SEQ ID NO：41)的Tyr 33和Trp 97以及MS H链(SEQ ID NO：40)的Gln 1、Asp26、Asp 27、Ser 30、Ser 31、Tyr 32、Tyr 33、His 50、Ser 52、Tyr 53、Ser 54、Ser 56、Ala 57、Asn 58、Trp 98和Asp 99。
假定16F16、16F31、21F2和MS全部都可与hNKG2D结合，则有可能使这些抗体相应的VH和VL序列“混合和匹配”以产生本发明的其它抗hNKG2D结合分子。可以采用本文所述的结合测定法(例如流式细胞术、Biacore、ELISA)和/或采用按照本文所述的细胞毒性测定法，来测定这类“混合和匹配的”抗体的HNKG2D结合。当VH和VL链被混合和匹配时，特定VH/VL配对的VH序列优选被结构上类似的VH序列置换。同样，特定VH/VL配对的VL序列优选被结构上类似的VL序列置换。
因此，在一个方面，本发明提供分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含：(a)包含选自SEQ ID NO：11、13、44和46的氨基酸序列的VH区，和(b)包含选自SEQ ID NO：12、14、45和47的氨基酸序列的VL区；其中抗体结合hNKG2D。优选的重链和轻链组合包括：(a)包含SEQ ID NO：11的氨基酸序列的VH区；以及(b)包含SEQ ID NO：12的氨基酸序列的轻链可变区；(a)包含SEQ ID NO：13的氨基酸序列的重链可变区；以及(b)包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列的 轻链可变区；(a)包含SEQ ID NO：44的氨基酸序列的VH区；以及(b)包含SEQ IDNO：46的氨基酸序列的轻链可变区；或(a)包含SEQ ID NO：45的氨基酸序列的重链可变区；以及(b)包含SEQ ID NO：47的氨基酸序列的轻链可变区。
在另一个方面，本发明提供包含16F16、16F31、MS或21F2的重链和轻链CDR1、CDR2和/或CDR3或其组合的抗体。CDR区采用Kabat系统描述(Kabat等(1991)Sequences ofProteins of Immunological Interest，第5版，美国卫生与公共事务部，国立卫生研究院颁布号91-3242)。参见例如图4和图5。假定这些抗体的每一个都与hNKG2D结合，而且抗原结合特异性主要由CDR1、CDR2和CDR3区提供，则可将VH CDR1、CDR2和CDR3序列和VL CDR1、CDR2和CDR3序列“混合和匹配”(即来自不同抗体的CDR可以混合和匹配，尽管各抗体可含有VH CDR1、CDR2和CDR3及VL CDR1、CDR2和CDR3)以产生本发明的其它抗hNKG2D结合分子。可采用上述的和实施例中的结合测定法(例如流式细胞术、Biacore或ELISA)，测定这类“混合和匹配”抗体与HNKG2D的结合。当VH CDR序列混合和匹配时，来自特定VH序列的CDR1、CDR2和/或CDR3序列优选被结构上类似的CDR序列置换。同样，当VL CDR序列混合和匹配时，特定VL序列的CDR1、CDR2和/或CDR3序列优选被结构上类似的CDR序列置换。例如，16F16、16F31、MS和21F2的VL CDR1和CDR3以及MS和21F2的VL CDR2序列都共有某种结构相似性，因此易于混合和匹配。对普通技术人员将是显而易见的是，可用来自本文公开的单克隆抗体16F16、16F31、MS和21F2的CDR序列的结构上相似的序列取代一个或多个VH和/或VL CDR区序列，来产生新的VH和VL序列。
因此，在另一个方面，本发明提供分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含：(a)包含选自SEQ ID NO：15、21、48和54的氨基酸序列的VH CDR1；(b)包含选自SEQ ID NO：16、22、49和55的氨 基酸序列的VH CDR2；(c)包含选自SEQ ID NO：17、23、50和56的氨基酸序列的VH CDR3；(d)包含选自SEQ ID NO：18、24、51和57的氨基酸序列的VL CDR1；(e)包含选自SEQ ID NO：19、25、52和57的氨基酸序列的VL CDR2；以及(f)包含选自SEQ ID NO：20、26、53和59的氨基酸序列的VL CDR3；其中抗体与hNKG2D结合。
在一个优选的实施方案中，所述抗体包含：(a)包含SEQ ID NO：15的VH CDR1；(b)包含SEQ ID NO：16的VH CDR2；(c)包含SEQ ID NO：17的VH CDR3；(d)包含SEQ ID NO：18的VL CDR1；(e)包含SEQ ID NO：19的VL CDR2；以及(f)包含SEQ ID NO：20的VL CDR3。
在另一个优选的实施方案中，所述抗体包含：(a)包含SEQ ID NO：21的VH CDR1；(b)包含SEQ ID NO：22的VH CDR2；(c)包含SEQ ID NO：23的VH CDR3；(d)包含SEQ ID NO：24的VL区CDR1；(e)包含SEQ ID NO：25的VL CDR2；以及(f)包含SEQ ID NO：26的VL CDR3。
在另一个优选的实施方案中，所述抗体包含：(a)包含SEQ ID NO：48的VH CDR1；(b)包含SEQ ID NO：49的VH CDR2；(c)包含SEQ ID NO：50的VH CDR3；(d)包含SEQ ID NO：51的VL区CDR1；(e)包含SEQ ID NO：52的VL CDR2；以及(f)包含SEQ ID NO：53的VL CDR3。
在另一个优选的实施方案中，所述抗体包含：(a)包含SEQ ID NO：54的VH CDR1；(b)包含SEQ ID NO：55的VH CDR2；(c)包含SEQ ID NO：56的VH CDR3；(d)包含SEQ ID NO：57的VL区CDR1；(e)包含SEQ ID NO：58的VL CDR2；以及(f)包含SEQ ID NO：59的VL CDR3。
在另一个优选的实施方案中，所述抗体包含：(a)由SEQ ID NO：15组成的VH CDR1；(b)由SEQ ID NO：16组成的VH CDR2；(c)由SEQ ID NO：17组成的VH CDR3；(d)由SEQ ID NO：18组成的VL CDR1；(e)由SEQ ID NO：19组成的VL CDR2；以及(f)由SEQ ID NO：20组成 的VLCDR3。
在另一个优选的实施方案中，抗体包含：(a)由SEQ ID NO：21组成的VH CDR1；(b)由SEQ ID NO：22组成的VH CDR2；(c)由SEQ ID NO：23组成的VH CDR3；(d)由SEQ ID NO：24组成的VL区CDR1；(e)由SEQ ID NO：25组成的VL CDR2；以及(f)由SEQ ID NO：26组成的VLCDR3。
在另一个优选的实施方案中，所述抗体包含：(a)由SEQ ID NO：48组成的VH CDR1；(b)由SEQ ID NO：49组成的VH CDR2；(c)由SEQ ID NO：50组成的VH CDR3；(d)由SEQ ID NO：51组成的VL区CDR1；(e)由SEQ ID NO：52组成的VL CDR2；以及(f)由SEQ ID NO：53组成的VLCDR3。
在另一个优选的实施方案中，所述抗体包含：(a)由SEQ ID NO：48组成的VH CDR1；(b)由SEQ ID NO：49组成的VH CDR2；(c)由SEQ ID NO：50组成的VH CDR3；(d)由SEQ ID NO：51组成的VL区CDR1；(e)由SEQ ID NO：52组成的VL CDR2；以及(f)由SEQ ID NO：53组成的VLCDR3，以及对应于MS H链(SEQ ID NO：40)的Gln 1、Asp 26和Asp 27中的1个、2个或全部的残基。
在另一个优选的实施方案中，所述抗体包含：(a)由SEQ ID NO：54组成的VH CDR1；(b)由SEQ ID NO：55组成的VH CDR2；(c)由SEQ ID NO：56组成的VH CDR3；(d)由SEQ ID NO：57组成的VL区CDR1；(e)由SEQ ID NO：58组成的VL CDR2；以及(f)由SEQ ID NO：59组成的VLCDR3。
在某些实施方案中，本发明的抗体包含特定种系H链免疫球蛋白基因的VH区，或特定种系H链免疫球蛋白基因的组合；和/或特定种系L链免疫球蛋白基因的VL区，或特定种系L链免疫球蛋白基因的组合。这类组合可通过例如体内B细胞的体细胞重组获得。
例如，在一个实施方案中，本发明提供分离的抗hNKG2D抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体：(a)包含来自与人D3-9、D3-10或 D3_10_R3基因以及JH3、JH4或JH6基因重组的人VH3_21、VH3_20、VH4_59或VH5_51基因的VH区，(b)包含来源于与人JK1、JK2或JK3基因重组的人VKI_L15或VKIII_A27或VKIII_L6基因的VL区或，和(c)所述抗体与hNKG2D结合。
在另一个实施方案中，本发明提供分离的抗hNKG2D抗体或其抗原结合片段，包含通过人VH3_21、D3-9和JH4基因重组获得的VH区及通过人VKI_L15和JK2基因重组获得的VL区。
在另一个实施方案中，本发明提供分离的抗hNKG2D抗体或其抗原结合片段，包含由人VH3_20、D3-10和JH6基因重组获得的VH区及由人VKIII_A27和JK3基因重组获得的VL区。
在另一个实施方案中，本发明提供分离的抗hNKG2D抗体或其抗原结合片段，包含由人VH4_59、D基因和JH3基因重组获得的VH区及由人VKIII_A27和JK1基因重组获得的VL区。
在另一个实施方案中，本发明提供分离的抗hNKG2D抗体或其抗原结合片段，包含由人VH5_51、D3_10_R3和JH4基因重组获得的VH区及由人VKIII_L6和JK1基因重组获得的VL区。
在独立和具体的实施方案中，本发明提供通过在上述抗hNKG2D抗体的VH和/或VL区中导入1、2、3、4个以上氨基酸取代和/或体细胞高变获得的分离抗NKG2D抗体。
本文所使用的一样，如果抗体的可变区获自使用人种系免疫球蛋白基因的系统(如下所述)，则人抗体包含特定种系序列“的”重链可变区或轻链可变区，或“来源于”特定种系序列的重链可变区或轻链可变区，或作为特定种系序列“的产物”的重链可变区或轻链可变区。这类“系统”包括用目标抗原使携带人免疫球蛋白基因的转基因小鼠免疫，或者用目标抗原筛选展示在噬菌体上的人免疫球蛋白基因文库。因此，可以通过将人抗体的氨基酸序列与人种系免疫球蛋白的氨基酸序列进行比较，并选择在序列中与人抗体的序列最接近(即最大百分比同一性)的人种系免疫球蛋白序列，来鉴定人种系免疫球蛋白序列“的”人抗体，或“来源于”人种系免疫球蛋白序列的人抗体，或作为种系免疫球蛋白序列“的产物”的人抗体。当与种系序列比较时，由于例如天然存在的体细胞突变或特意引入的位点定向突变(可为选择性取代)所致，特定人种系免疫球蛋白序列“的”人抗体，或“来源于”特定人种系免疫球蛋白序列的人抗体，或作为特定人种系免疫球蛋白序列“的产物”的人抗体可含有氨基酸差异。
然而，人抗体通常与由重组种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸序列有至少90％氨基酸序列同一性，并且当与其它物种的种系免疫球蛋白氨基酸序列(例如鼠种系序列)相比时，通常可鉴定为人的氨基酸序列。在某些情况下，人抗体可与由重组种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列具有至少95％或甚至至少96％、97％、98％或99％氨基酸序列同一性。
通常，与由人种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列相比，来源于特定人种系序列的人抗体可显示不超过10个氨基酸差异。在某些情况下，与由重组种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列相比，人抗体可显示不超过8个、不超过5个、或甚至不超过4、3、2、或1个氨基酸差异，或无氨基酸差异。
在又一个实施方案中，本发明的抗体包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区和轻链可变区包含与本文所述的优选抗体的氨基酸序列同源的氨基酸序列，而且其中抗体保留所需要的本发明抗hNKG2D抗体的功能性质。例如，本发明提供包含重链可变区和轻链可变区的分离的抗体或其抗原结合部分，其中：(a)VH区包含与选自SEQ ID NO：11、13、44和46的氨基酸序列有至少80％同一性的氨基酸序列；(b)VL区包含与选自SEQ ID NO：12、14、45和47的氨基酸序列有至少80％同一性的氨基酸序列；(c)所述抗体与hNKG2D结合并具有本文所述的至少一种功能性质，优选具有若干本文所述的功能性质。
在其它实施方案中，VH和/或VL氨基酸序列可与上文所示序列 有85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性。具有与上文所示序列VH区和VL区有高度(即80％以上)同一性的VH区和VL区的抗体，可通过对编码SEQ ID NO：11-14或44-47的核酸分子的诱变(例如位点定向诱变或PCR介导的诱变)而获得，接着采用本文所述的功能试验，测定经改变的编码抗体所保留的功能(例如hNKG2D结合亲和力、hNKG2D配体阻断、hNKG2D下调或NKG2D介导的NK细胞或T细胞的活性降低)。
两个序列间的同一性百分比是序列所共有的相同位置的数目的函数(即％同一性＝相同位置数/位置总数x 100)，要考虑空位数和各空位的长度，这需要引入两个序列的最佳比对。序列的比较和两个序列之间的同一性百分比的确定可应用序列分析软件中的数学算法完成。蛋白质分析软件应用指定包括保守氨基酸取代在内的各种取代、缺失和其它修饰相似性的度量法，使相似序列相匹配。
两个氨基酸序列间的同一性百分比可例如采用整合到GCG软件包(可获自http：//www.gcg.com)的GAP程序中的Needleman和Wunsch(J.Mol.Biol.48：444-453(1970))算法确定，采用Blossum 62矩阵或PAM250矩阵，以及16、14、12、10、8、6或4的空位权重，和1、2、3、4、5、或6的长度权重。
多肽序列也可应用默认参数或推荐参数，用FASTA进行比较。GCG 6.1.版的程序FASTA(例如FASTA2和FASTA3)提供比对以及询问序列(query sequence)和检索序列(search sequence)之间最佳重叠区域的序列同一性百分比(Pearson，MethodsEnzymol.1990；183：63-98；Pearson，Methods Mol.Biol.2000；132：185-219)。
两个氨基酸序列间的同一性百分比还可应用整合到ALIGN程序(2.0版)中的E.Meyers和W.Miller的算法(Comput.Appl.Biosci.，1988；11-17)确定，采用PAM120权重残基表，空位长度罚分为12，空位罚分为4。
用于比较一序列与数据库中包括的另一序列的另一种算法是采 用默认参数的计算机程序BLAST，尤其blastp。参见例如Altschul等，J.Mol.Biol.1990；215：403-410；Altschul等，Nucleic Acids Res.1997；25：3389-402(1997)；各文献通过引用结合到本文中。本发明的蛋白质序列在本文中可作为“询问序列”，针对公共数据库进行检索，以例如鉴定相关序列。这类检索可以应用Altschul等，1990(出处同上)的XBLAST程序(2.0版)进行。BLAST蛋白质检索可用XBLAST程序进行，分值＝50，字长＝3，以获得与本发明的抗体分子同源的氨基酸序列。为了获得出于比较目的的空位化比对(gapped alignment)，可按照Altschul等人(1997，出处同上)所述，利用Gapped BLAST。当应用BLAST和Gapped BLAST程序时，可以采用相应程序(例如XBLAST和NBLAST)的默认参数。参见http：//www.ncbi.nlm.nih.gov。
在某些实施方案中，本发明的抗体包含VH区和VL区，所述VH区包含CDR1、CDR2和CDR3序列，所述VL区包含CDR1、CDR2和CDR3序列，其中这些CDR序列中的一个或多个包含基于本文所述优选抗体16F16、16F31、MS或21F2的指定氨基酸序列；其中一个或多个CDR任选含有一个或多个保守氨基酸修饰，并且其中抗体保留所需要的本发明的抗hNKG2D抗体的功能性质。因此，本发明提供包含重链可变区和轻链可变区的分离抗体或其抗原结合片段，所述重链可变区包含CDR1、CDR2和CDR3序列，所述轻链可变区包含CDR1、CDR2和CDR3序列，其中：(a)VH区CDR3序列包含选自氨基酸序列SEQ ID NO：17、23、50和56的氨基酸序列；(b)VL区CDR3序列包含选自氨基酸序列SEQ ID NO：20、26、53和59的氨基酸序列；(c)一个或多个CDR任选含有一个或多个保守氨基酸修饰，和(d)所述抗体与hNKG2D结合，并且具有至少一种本文所述的功能性质，更优选具有若干种本文所述的功能性质。
在进一步的实施方案中，VH区CDR2序列包含选自氨基酸序列SEQ ID NO：16、22、49和55的氨基酸序列；VL区CDR2序列包含选自氨基酸序列SEQ ID NO：19、25、52和58的氨基酸序列，其中一 个或多个CDR任选含有一个或多个保守氨基酸修饰。
在再进一步的实施方案中，VH区CDR1序列包含选自氨基酸序列SEQ ID NO：15、21、48和54的氨基酸序列及其保守修饰；VL区CDR1序列包含选自氨基酸序列SEQ ID NO：18、24、51和57的氨基酸序列，其中一个或多个CDR任选含有一个或多个保守氨基酸修饰。
本文所使用的术语“保守氨基酸修饰”是指不会显著影响或改变含有氨基酸序列的抗体的结合特征的氨基酸修饰。这类保守修饰包括氨基酸取代、添加和缺失。可通过本领域已知的标准技术将修饰引入本发明的抗体，例如位点定向诱变和PCR介导的诱变。包含氨基酸修饰的抗体序列当与亲本抗体比较时，通常与亲本的相应氨基酸序列有至少90％、优选至少95％、98％或99％同一性，和/或当与亲本抗体序列比较时包含至多10个、优选至多5、4、3、2个氨基酸修饰。
“保守”氨基酸取代通常是其中氨基酸残基被带有理化性质相似的侧链的氨基酸残基置换的氨基酸取代。本领域已对具有相似侧链的氨基酸残基家族作出规定。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、具有酸性侧链的氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)、具有不带电荷的极性侧链的氨基酸(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、具有非极性侧链的氨基酸(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、具有β-支链侧链的氨基酸(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和具有芳族侧链的氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。
因此，本发明抗体的CDR区内的一个或多个氨基酸残基可被同一侧链家族的其它氨基酸残基置换，而且可采用本文所述的功能试验，测定已改变的抗体所保留的功能(即上述(c)、(d)和(e)中所述的功能)。
抗原结合片段
可作为全长抗体或其抗原结合片段来制备本发明的抗hNKG2D抗体。抗原结合片段的实例包括Fab、Fab′、F(ab)2、F(ab’)2、F(ab)3、Fv(通常为抗体单臂的VL和VH结构域)、单链Fv(scFv；参见例如Bird等，Science 1988；242：423-426；以及Huston等，PNAS1988；85：5879-5883)、dsFv、Fd(通常为VH和CH1结构域)和dAb(通常为VH结构域)片段；VH、VL、VhH和V-NAR结构域；包含单一VH和单一VL链的一价分子；微型抗体(minibodies)、双链抗体(diabodies)、三链抗体(triabodies)、四链抗体(tetrabodies)和κ抗体(kappa bodies)(参见例如Ill等，Protein Eng 1997；10：949-57)；骆驼IgG；IgNAR；以及一个或多个分离CDR或功能性抗原互补位，其中分离的CDR或抗原结合残基或多肽可以缔合或连接在一起形成功能性抗体片段。有关各种抗体片段类型的描述或综述参见例如Holliger和Hudson，NatBiotechnol 2005；23：1126-1136；WO2005040219以及已公布的美国专利申请20050238646和20020161201。
抗体片段可采用常规重组或蛋白质工程技术获得，可以按照与完整抗体相同的方法针对抗原结合功能或其它功能来筛选片段。
已经开发出产生抗体片段的各种技术。传统上，通过全长抗体的蛋白水解消化而得到这些片段(参见例如Morimoto等，Journal of Biochemical and BiophysicalMethods，24：107-117(1992)；以及Brennan等，Science，229：81(1985))。然而，这些片段目前可以通过重组宿主细胞直接产生。或者，Fab′-SH片段可直接从大肠杆菌(E.coli)回收，并且经化学偶联形成F(ab′)2片段(Carter等，Bio/Technology，10：163-167(1992))。按照另一种方法，可从重组宿主细胞培养物中直接分离F(ab′)2片段。在其它实施方案中，所选的抗体是单链Fv片段(scFv)。参见WO 1993/16185；美国专利第5,571,894号；以及美国专利第5,587,458号。抗体片段还可以是“线性抗体”，例如参见美国专利第5,641,870号。这类线性抗体片段可以是单特异性或双特异性的。
多特异性分子
在另一个方面，本发明的特征在于包含本发明的抗hNKG2D抗体或其抗原片段的多特异性分子。这类多特异性分子包括包含至少一个对hNKG2D的第一结合特异性和对第二靶表位的第二结合特异性的双特异性分子。
双特异性分子的一种类型是双特异性抗体。双特异性抗体是对至少两种不同表位具有结合特异性的抗体。用于制备双特异性抗体的方法是本领域已知的，而且全长双特异性抗体的传统制备常常基于两个免疫球蛋白重链-轻链对的共表达，其中两条链具有不同的特异性(Millstein等，Nature，305：537-539(1983))。双特异性抗体可制成全长抗体或抗体片段(例如F(ab′)2双特异性抗体)或本文所述的任何其它抗原结合片段。
在本发明的双特异性抗体中，至少一个结合表位位于hNKG2D蛋白上。抗NKG2D结合部分可与结合促炎白细胞上的分子(例如T细胞受体分子，例如CD2、CD3、CD4或CD8)的第二部分组合，以便使细胞防御机制集中在表达hNKG2D的促炎细胞。在该实施方案中，双特异性抗体可用来例如将细胞毒剂靶向表达NKG2D的促炎细胞，或者使ADCC/CDC攻击表达NKG2D的促炎细胞。细胞毒剂可以是例如肥皂草毒蛋白、抗干扰素-α药物、长春花属生物碱、蓖麻毒蛋白A链、甲氨蝶呤或放射性同位素。
在另一个实施方案中，第二部分与细胞相关靶标结合，所述细胞相关靶标存在于与通常由效应淋巴细胞调节的疾病有关的细胞上或由所述细胞表达，所述疾病例如癌症、病毒性感染等。因此，例如，典型靶标可以是细胞应激相关分子，例如MIC分子(例如MIC-A或MIC-B)或ULBP(例如Rae-1、H-60、ULBP2、ULBP3、HCMV UL18或Rae-1β)或病原体相关分子例如病毒血凝素。
其它多特异性分子包括由hNKG2D结合抗体部分与一种或多种 其它非抗体蛋白融合产生的分子。本领域记载了这类多特异性蛋白及如何构建这些蛋白。参见例如Dreier等(Bioconjug.Chem.9(4)：482-489(1998))；美国专利6,046,310；美国专利公布号20030103984；欧洲专利申请1 413 316；美国专利公布号20040038339；von Strandmann等，Blood(2006；107：1955-1962)和WO 2004056873。按照本发明，非抗体蛋白可为例如在前一部分中描述的任何“第二部分”的抗原的合适配体；例如T细胞或Fc受体的配体，或细胞应激分子例如MIC-A、MIC-B、ULBP，或病原体相关分子例如病毒血凝素。
还包括了具有两价以上的多特异性分子。例如，可以制备三特异性抗体。Tutt等，J.Immunol，147：60(1991)。
本发明的多特异性分子可采用本领域已知方法，通过使组分结合特异性缀合来制备。例如，可单独产生多特异性分子的各个结合特异性，然后使其彼此缀合。当结合特异性为蛋白质或肽时，各种偶联剂或交联剂可用于共价缀合。交联剂的实例包括A蛋白、碳二亚胺、N-琥珀酰亚胺基-S-乙酰基-硫基乙酸酯(SATA)、5，5′-联硫基双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)、邻亚苯基二马来酰亚胺(oPDM)、N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基联硫基)丙酸酯(SPDP)和4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-甲酸磺基琥珀酰亚胺基酯(磺基-SMCC)(参见例如Karpovsky等(1984)J.Exp.Med.160：1686；Liu，MA等(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA82：8648)。其它方法包括以下文献所披露的方法：Paulus(1985)Behring Ins.Mitt.No.78，118-132；Brennan等(1985)Science 229：81-83)和Glennie等(1987)J.Immunol.139：2367-2375)。优选的缀合剂(conjugating agent)为SATA和磺基-SMCC，两者可获自Pierce Chemical Co.(Rockford，IL)。
当结合特异性是抗体时，可以通过两条重链的C端铰链区的巯基键合而缀合。在一个特别优选的实施方案中，在缀合之前，铰链区经过修饰含有奇数的巯基残基，优选1个。
或者，两种结合特异性可以在同一载体中编码，并在同一宿主细 胞中表达和装配。当双特异性分子是mAb x mAb、mAb x Fab、Fab x F(ab′)2或配体x Fab融合蛋白时，该方法特别有用。本发明的双特异性分子可以是包含一个单链抗体和结合决定簇的单链分子，或包含两个结合决定簇的单链双特异性分子。双特异性分子可包含至少两个单链分子。用于制备双特异性分子的方法的描述或综述参见例如美国专利第5,260,203号、美国专利第5,455,030号、美国专利第4,881,175号、美国专利第5,132,405号、美国专利第5,091,513号、美国专利第5,476,786号、美国专利第5,013,653号、美国专利第5,258,498号、美国专利第5,482,858号、美国专利申请公布号20030078385；Kontermann等(2005)ActaPharmacological Sinica 26(1)：1-9；Kostelny等(1992)J.Immunol.148(5)：1547-1553；Hollinger等(1993)PNAS(USA)90：6444-6448；以及Gruber等(1994)J.Immunol.152：5368。
抗体变体
还可使用具有本文公开的一个或多个VH和/或VL序列的抗体作为起始原料工程改造修饰的抗体或抗体“变体”，来制备本发明的抗体，其中修饰抗体可能具有相对于亲本抗体改变的性质。可以在一个或两个可变区(即VH和/或VL)内，例如在一个或多个CDR区内和/或在一个或多个构架区内，通过修饰一个或多个残基，来改造抗体。此外或者备选地，可通过修饰恒定区内的残基，来改造抗体，例如改变抗体的效应子功能。另外，可由抗体的抗原结合部分，制备其它构建体例如抗原结合片段、抗体衍生物、免疫缀合物和多特异性分子。
可应用标准分子生物学技术来制备和表达经改变的抗体序列。
虽然与“亲本”抗体相比，抗体变体或衍生物通常具有至少一种已发生改变的性质，但是抗体变体或衍生物可以保留本文所述抗hNKG2D抗体的一种、一些或大部功能性质，所述功能性质包括但不限于：(a)防止NKG2D介导的表达NKG2D的NK细胞或T细胞的活化，任选降低配体诱导的细胞毒性的EC50低于结合细胞的EC50；(b) 与至少一种NKG2D配体竞争结合NKG2D，优选与至少MICA和ULBP3竞争；(c)减少表达NKG2D的NK细胞或T细胞表面上的NKG2D的量，优选达至少75％；(d)与食蟹猴和/或猕猴NKG2D结合，优选具有基本类似的功效或亲和力；(e)与不止一种形式或构象的NKG2D结合；(f)结合NKG2D的Kd为1nM以下，优选0.1nM以下；(g)与16F16、16F31、MS或21F2中的一个或多个竞争，(h)在与hNKG2D结合方面，与ON72、BAT221、5C6、1D11、ECM217和149810中的任一种相比，更多地与16F16、16F31、MS或21F2竞争；(i)阻断超过90％的16F16、MS或21F2与细胞表面hNKG2D结合；(j)与ON72、BAT221、5C6、1D11、ECM217和149810中的任一种相比，对hNKG2D具有较低的激动剂活性。本发明的抗体可能具有上述功能特征的任何组合，和/或实施例中所述的功能特征。
可以采用本领域可利用的和/或本文所述的标准试验，评价抗体变体和衍生物的功能性质。例如，可采用标准结合测定法确定抗体结合hNKG2D的能力，例如实施例中所示的结合测定法(例如Biacore、流式细胞术或ELISA)。
可变区修饰
可以进行的可变区工程改造的一个类型是CDR移植。抗体主要通过位于6个重链和轻链互补决定区(CDR)的氨基酸残基与靶抗原相互作用。为此，各种抗体间CDR内的氨基酸序列比CDR外的序列更具多样性。因为CDR序列负责大部分抗体-抗原相互作用，所以有可能通过构建表达载体，表达模拟特定的天然存在的抗体性质的重组抗体，所述表达载体包括将特定的天然存在的抗体CDR序列移植到具有不同性质的不同抗体的构架序列中(参见例如Riechmann，L.等(1998)Nature 332：323-327；Jones，P.等(1986)Nature 321：522-525；Queen，C.等(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.86：10029-10033；Winter的美国专利第5,225,539号；以及Queen等人的美国专利第5,530,101、 5,585,089、5,693,762和6,180,370号)。因此，本发明的另一个实施方案涉及分离抗体或其抗原结合部分，其包含VH区和VL区：VH区包含分别具有选自SEQ ID NO：15、21、48和54；SEQ ID NO：16、22、49和55；及SEQ IDNO：17、23、50和56的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3序列；VL区包含分别具有选自SEQ IDNO：18、24、51和57；SEQ ID NO：19、25、52和58；及SEQ ID NO：20、26、53和59的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3序列。因此，这类抗体含有抗体16F16、16F31、MS或21F2的VH和VL CDR序列，但仍可含有不同于这些抗体的构架序列。
本发明还提供嵌合或人源化形式的与hNKG2D结合的鼠抗hNKG2D单克隆抗体或其抗原结合片段，以及这类抗体的用途(例如在哺乳动物宿主中调节hNKG2D介导的生理学过程)。在一个实施方案中，鼠抗体是ON72、BAT221、5C6、1D11、149810和ECM217之一。在另一个实施方案中，鼠抗体不是ON72、BAT221、5C6、1D11、149810和ECM217之一。因此，这类抗体含有ON72、BAT221、5C6、1D11、149810或ECM217的VH和VL CDR序列；或不同于ON72、BAT221、5C6、1D11、149810、ECM217的鼠单克隆抗体；不同于这些抗体的构架序列。在一个实施方案中，人源化抗体是ON72的人源化形式，分别包含例如SEQ ID NO：70和71重链和轻链的氨基酸序列。
这类构架序列可获自公共DNA数据库或已发表的包括种系抗体基因序列的参考文献。例如，用于人重链可变区和轻链可变区基因的种系DNA序列可见于“dBase”人种系序列数据库(可获自因特网www.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase)，以及Kabat，E.A.等(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，美国卫生与公共事务部，国立卫生研究院颁布号91-3242；Tomlinson，I.M.等(1992)，“The Repertoire of HumanGermline VH Sequences Reveals about Fifty Groups of VH Segments withDifferent Hypervariable Loops(人种系VH序列库揭示约55组具有不同超变环的VH区段)”J.Mol.Biol.227：776-798； 以及Cox，J.P.L.等(1994)“A Directory of Human Germ-line VH Segments Reveals a Strong Bias in their Usage(人种系VH区段手册揭示在其使用中的严重偏见)”Eur.J.Immunol.24：827-836；各文献的内容都通过引用明确结合到本文中。
用于本发明抗体的优选的构架序列是结构上类似于本发明选定抗体所用的构架序列的构架序列，例如，类似于16F16、16F31、MS和21F2抗体所用的VH3_21、D3-9、JH4、VKI_L15和JK2，或VH3_20、D3-10、JH6、VKIII_A27和JK3，或VH4_59、JH3、VKIII_A27和JK1，或VH5_51、D3_10_R3、JH4、VKIII_L6和JK1的构架序列。可将16F16、16F31、MS或21F2的VH CDR1、CDR2和CDR3序列，以及16F6、16F31、MS或21F2的VL CDR1、CDR2和CDR3序列移植到构架区，所述构架区与存在于所述构架序列所来源的种系免疫球蛋白基因中的构架区具有相同的序列；或者可将CDR序列移植到与所述种系序列相比含有一个或多个突变的构架区中。例如，研究发现，在某些情况下使构架区内的残基突变以维持或提高抗体的抗原结合能力是有益的(参见例如Queen等人的美国专利第5,530,101、5,585,089、5,693,762和6,180,370号)。
在本发明的另一个方面，本发明抗hNKG2D抗体(例如16F16和16F31)的结构特征被用来产生结构上相关的保留本发明抗体的至少一种功能性质(例如与hNKG2D结合)的抗hNKG2D抗体。例如，16F16或16F31的一个或多个CDR区或其变体，可以重组方法与已知的构架区和/或其它CDR组合产生其它重组改造的本发明的抗hNKG2D抗体。用于工程改造方法的起始原料是本文提供的一个或多个VH序列和/或VL序列，或者一个或多个其CDR区。为了产生工程改造抗体，不必实际制备(即表达成为蛋白质)具有本文所提供的一个或多个VH序列和/或VL序列或者一个或多个其CDR区的抗体。更确切地说，包含在序列中的信息被用作起始原料以产生来源于原始序列的“第二代”序列，然后制备“第二代”序列并表达成蛋白质。
因此，在另一个实施方案中，本发明提供用于制备抗hNKG2D抗体的方法，所述方法包括：(a)提供：(i)重链可变区抗体序列，其包含选自SEQ ID NO：15、21、48和54的CDR1序列，选自SEQ ID NO：16、22、49和55的CDR2序列，和/或选自SEQ ID NO：17、23、50和56的CDR3序列；以及(ii)轻链可变区抗体序列，其包含选自SEQ ID NO：18、24、51和57的CDR1序列，选自SEQ ID NO：19、25、53和59的CDR2序列，和/或选自SEQ ID NO：20、26、53和59的CDR3序列；(b)改变第一抗体序列和/或第二抗体序列内的至少一个氨基酸残基以产生至少一种经改变的抗体序列；以及(c)制备经改变的抗体序列；以及(d)将经改变的抗体序列表达为蛋白质。
可变区修饰的另一类型是使VH和/或VL CDR1、CDR2和/或CDR3区内的氨基酸残基突变，从而改进目标抗体的一种或多种结合性质(例如亲和力)。可以进行位点定向诱变或PCR介导的诱变以引入突变，并且可按照本文所述的和实施例提供的体外或体内试验，评价对抗体结合的影响或其它目标功能性质。优选引入保守修饰(如上文中的论述)。突变可以是氨基酸取代、添加或缺失。此外，单一CDR区内的改变通常不超过8个、更通常不超过5个残基。
因此，在另一个实施方案中，本发明提供包含重链可变区的分离的抗hNKG2D抗体，所述重链可变区包含：(a)VH CDR1区，其包含选自SEQ ID NO：15、21、48和54的氨基酸序列或与选自SEQ ID NO：15、21、48和54的氨基酸序列相比具有1、2、3、4、5、6、7或8个氨基酸取代、缺失或添加的氨基酸序列；(b)VH CDR2区，其包含选自SEQ ID NO：16、22、49和55的氨基酸序列或与选自SEQ ID NO：16、22、49和55的氨基酸序列相比具有1、2、3、4、5、6、7或8个氨基酸取代、缺失或添加的氨基酸序列；(c)VH CDR3区，其包含选自SEQ ID NO：17、23、50和56的氨基酸序列或与选自SEQ ID NO：17、23、50和56的氨基酸序列相比具有1、2、3、4、5、6、7或8个氨基酸取代、缺失或添加的氨基酸序列；(d)VL CDR1区，其包含 选自SEQ ID NO：18、24、51和57的氨基酸序列或与选自SEQ ID NO：18、24、51和57的氨基酸序列相比具有1、2、3、4、5、6、7或8个氨基酸取代、缺失或添加的氨基酸序列；(e)VL CDR2区，其包含选自SEQ ID NO：19、25、52和58的氨基酸序列或与选自SEQ ID NO：19、25、52和58的氨基酸序列相比具有1、2、3、4、5、6、7或8个氨基酸取代、缺失或添加的氨基酸序列；以及(f) VL CDR3区，其包含选自SEQ ID NO：20、26、53和59的氨基酸序列或与选自SEQ ID NO：20、26、53和59的氨基酸序列相比具有1、2、3、4、5、6、7或8个氨基酸取代、缺失或添加的氨基酸序列。
本发明的工程改造抗体包括其中对VH和/或VL内的构架残基进行修饰例如以改进抗体性质的抗体。通常进行这类构架修饰以降低抗体的免疫原性。例如，一种方法是使一个或多个构架残基“回复突变”成相应的种系序列。更准确地讲，经历体细胞突变的抗体可含有不同于所述抗体所来源的种系序列的构架残基。这类残基可通过将抗体构架序列与所述抗体所来源的种系序列相比较来鉴定。
例如，对于16F16，VH的氨基酸残基R111(Kabat残基103；在FR4内)是精氨酸，而在相应种系序列中的该残基是色氨酸(参见图5A)。为了将该构架区序列恢复到其种系构型，可通过例如位点定向诱变或PCR介导的诱变使一些或所有的体细胞突变“回复突变”成所述种系序列(例如16F16VH的残基111可从苏氨酸“回复突变”成丙氨酸)。作为另一个实例，对于16F31，VH区的氨基酸残基Y95(在FR3内)是酪氨酸，而在相应种系序列中该残基是组氨酸(参见图5C)。为了将该构架区序列恢复到其种系构型，可进行由酪氨酸“回复突变”成组氨酸的体细胞突变。作为另一个实例，对于MS，VH区的Kabat残基3、6和7分别是组氨酸(H)、天冬氨酸(D)和D，而在相应的种系序列中这些残基分别是谷氨酰胺(Q)、甘氨酸(G)和G(参见图5E)。对于21F2，Kabat残基13、24、76和93分别是谷氨酸(E)、天冬酰胺(N)、N和G，而在相应种系序列中这些残基分别是赖氨酸(K)、G、丝氨酸 (S)和丙氨酸(A)。为了将该构架区序列恢复到其种系构型，体细胞突变可进行类似的“回复突变”。本发明还包括这类“经回复突变的”抗体。
另一种类型的构架修饰包括对构架区内，或甚至一个或多个CDR区内的一个或多个残基进行突变，以去除T细胞表位，从而降低潜在的抗体免疫原性。该方法亦称“去免疫原性(deimmunization)”，更多详情可参见Carr等人的美国专利公布号20030153043。
Fc修饰
除了在构架区或CDR区内进行修饰以外，或者作为在所述区内进行修饰的备选，可对本发明的抗体进行工程改造以在Fc区内包括修饰，通常改变抗体的一种或多种功能性质，例如血清半寿期、补体结合、Fc受体结合、蛋白质稳定性和/或抗原依赖性细胞毒性或其缺乏。此外，本发明的抗体可以化学方法修饰(例如可将一个或多个化学部分与抗体连接)，或者经修饰以改变其糖基化，以便再一次改变抗体的一种或多种功能性质。这些实施方案中每个的更多详情见下文。Fc区的残基按照Kabat编号。
如有需要，抗体类别可以通过已知技术“转换(switched)”。这类技术包括例如直接重组技术(参见例如美国专利4816397)和细胞-细胞融合技术(参见例如美国专利5916771)的应用。例如，最初作为IgM分子产生的抗体可以转换类别成IgG抗体。类别转换技术也可用来将一种IgG亚类转化成另一种亚类，例如由IgG1到IgG2。因此，本发明抗体的效应子功能可以通过同种型转换而变成例如用于各种治疗用途的IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgD、IgA、IgE或IgM抗体。通过例如GenBank(可通过NCBI和其它公共网站登录)可获得恒定区的示例性cDNA序列(其每一个都通过引用以其全部结合)如下：
人IgG1恒定重链区：GenBank登记号：J00228；
人IgG2恒定重链区：GenBank登记号：J00230；
人IgG3恒定重链区：GenBank登记号：X04646；
人IgG4恒定重链区：GenBank登记号：K01316；和
人κ轻链恒定区：GenBank登记号：J00241。
在一个实施方案中，对CH1的铰链区进行修饰使得铰链区内半胱氨酸残基的数目发生改变，例如增加或减少。Bodmer等人的美国专利第5677425号进一步描述了该方法。例如，改变CH1铰链区的半胱氨酸残基数目，以促进轻链和重链的装配，或者提高或降低抗体的稳定性。
在另一个实施方案中，使抗体的Fc铰链区突变以缩短抗体的生物半衰期。更准确地讲，将一个或多个氨基酸突变引入Fc-铰链片段的CH2-CH3结构域界面区，使得抗体的葡萄球菌A蛋白(SpA)结合相对于天然Fc-铰链结构域SpA结合受损。Ward等人的美国专利第6165745号更详细地描述了该方法。在另一个实施方案中，抗体经修饰以延长其生物半衰期。各种方法都是可行的。例如，可引入一个或多个下列突变：T252L、T254S和T256F，参见Ward的美国专利第6277375号。或者，为了延长生物半衰期，可以在CH1或CL区内改变抗体，以使其含有补救受体结合表位，所述表位得自IgG Fc区的CH2结构域的两个环，参见Presta等人的美国专利第5869046和6121022号。在还有的其它实施方案中，通过用不同氨基酸残基置换至少一个氨基酸残基来改变Fc区，以改变抗体的效应子功能。例如，一个或多个选自氨基酸残基234、235、236、237、297、318、320和322的氨基酸可被不同的氨基酸残基置换，使得抗体对效应子配体的亲和力发生改变，但却保留亲本抗体的抗原结合能力。其亲和力发生改变的效应子配体可以是例如Fc受体或补体的C1组分。同属Winter等人的美国专利第5624821和5648260号详细描述了该方法。在另一个实例中，一个或多个选自氨基酸残基329、331和322的氨基酸可被不同的氨基酸残基置换，使得抗体的C1q结合发生改变和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)降低或消除。Idusogie等人的美国专利第6194551号更详细地描述了该方法。在另一个实例中，氨基酸位置231和239 内的一个或多个氨基酸残基发生改变，从而改变抗体结合补体能力。Bodmer等人的PCT公开文本WO 94/29351进一步描述了该方法。在又一个实例中，通过修饰一个或多个下列位置上的氨基酸，对Fc区进行修饰以提高抗体介导抗体依赖性细胞毒性(ADCC)的能力和/或增加抗体对Fcy受体的亲和力：238、239、248、249、252、254、255、256、258、265、267、268、269、270、272、276、278、280、283、285、286、289、290、292、293、294、295、296、298、301、303、305、307、309、312、315、320、322、324、326、327、329、330、331、333、334、335、337、338、340、360、373、376、378、382、388、389、398、414、416、419、430、434、435、437、438或439。Presta的PCT公开文本WO 00/42072进一步描述了该方法。此外，对于FcyRl、FcyRII、FcyRIII和FcRn，人IgG1上的结合位点已经过作图，并且具有改进的结合的变体已有描述(参见Shields，R.L.等(2001)J.Biol.Chem.276：6591-6604)。研究显示位置256、290、298、333、334和339的特定突变改进与FcRIII的结合。另外，研究显示下列组合突变体改进FcyRIII结合：T256A/S298A、S298A/E333A、S298A/K224A和S298A/E333A/K334A。
恒定区可被进一步修饰以使抗体稳定，例如，降低二价抗体分成两个一价VH-VL片段的风险。例如，在IgG4恒定区中，残基S241可被突变成脯氨酸(P)残基，以便在铰链上形成完全二硫键(参见例如Angal等，Mol Immunol.1993；30：105-8)。
糖基化修饰
在另外又一个实施方案中，对糖基化的抗体进行修饰。例如，可以制备无糖基化抗体(即抗体缺乏糖基化)。可以改变糖基化以例如提高抗体对抗原的亲和力。例如，可通过改变抗体序列内一个或多个糖基化位点，来实现这类糖修饰。例如，可以进行一个或多个氨基酸取代，以消除一个或多个可变区构架糖基化位点，从而消除该位点上的 糖基化。这类糖基化可以提高抗体对抗原的亲和力。Co等人的美国专利第5714350和6350861号更详细地描述了这类方法。此外或者备选地，可以制备糖基化类型发生改变的抗体，例如岩藻糖残基(fucosyl residue)的量减少的低岩藻糖基化(hypofucosylated)抗体或二等分(bisecting)GlcNac结构增加的抗体。已证实这类经改变的糖基化形式提高了抗体的ADCC能力。通过例如在宿主细胞中用已改变的糖基化“机器”表达抗体，来完成这类糖修饰。本领域描述了具有这类改变的细胞，而且这类细胞可以用作宿主细胞，其中表达本发明的重组抗体从而产生具有糖基化发生改变的抗体。例如Hanai等人的EP1176195描述了具有功能受破坏的FUT8基因的细胞系，该基因编码岩藻糖基转移酶，使得在这类细胞系中表达的抗体呈低岩藻糖基化。Presta的PCT公开文本WO 03/035835描述了变体CHO细胞系Lec13细胞，其使岩藻糖与Asn(297)联糖连接的能力降低，还导致在该宿主细胞中表达的抗体呈低岩藻糖基化(亦见Shields，R.L.等(2002)J.Biol.Chem.277：26733-26740)。Umana等人的PCT公开文本WO 99/54342描述了经工程改造成表达糖蛋白修饰的岩藻糖基转移酶(例如β(1，4)-N-乙酰葡萄糖胺转移酶III(GnTIII))的细胞系，使得在经工程改造的细胞系中表达的抗体的二等分GlcNac结构增加，这引起抗体的ADCC活性升高(亦见Umana等(1999)Nat.Biotech.7：176180)。
在某些对本发明抗体进行工程改造的方法的实施方案中，可沿抗hNKG2D抗体编码序列(例如16F16、16F31、MS或21F2编码序列)的全部或部分，随机或选择性地引入突变，并可按照本文所述方法针对结合活性和/或其它功能性质筛选所得到的修饰抗体。突变方法在本领域中已有记载。例如，Short的PCT公开文本WO 02/092780描述了通过采用饱和诱变、合成连接装配或其组合以产生和筛选抗体突变的方法。
或者，Lazar等人的PCT公开文本WO 03/074679描述了应用计算筛选方法使抗体的生理化学性质最优化的方法。
抗体衍生物
本发明范围内的抗体衍生物(或免疫缀合物)包括与第二种药物缀合或共价结合的抗hNKG2D抗体。
例如，在一个方面，本发明提供包含与细胞毒剂缀合或共价键合的抗体的免疫缀合物。本文所使用的术语“细胞毒剂”是能够杀伤在其细胞表面带有hNKG2D受体的细胞的分子。任何类型的具有细胞毒性作用或细胞抑制作用的部分都可与本发明抗体缀合形成本发明的细胞毒性缀合物，并且抑制或杀伤特定的NK受体表达细胞，包括治疗性放射性同位素、毒性蛋白、毒性小分子，例如药物、毒素、免疫调节剂、激素、激素拮抗剂、酶、寡核苷酸、酶抑制剂、治疗性放射性核素、血管生成抑制剂、化疗药物、长春花属生物碱、蒽环类、表鬼臼毒素、紫杉烷类(taxane)、抗代谢药、烷化剂、抗生素、COX-2抑制剂、SN-38、抗有丝分裂药、抗血管生成药和调亡药(apoptotoic agent)，特别是多柔比星、甲氨蝶呤、泰素、CPT-11、喜树碱类、氮芥类、吉西他滨、烷基磺酸盐类、亚硝基脲类、三氮烯类、叶酸类似物、嘧啶类似物、嘌呤类似物、铂配位络合物、假单胞菌属(Pseudomonas)外毒素、蓖麻毒蛋白、相思豆毒蛋白、5-氟尿苷、核糖核酸酶(RNase)、脱氧核糖核酸酶I、葡萄球菌肠毒素-A、商陆抗病毒蛋白、多花白树毒蛋白、白喉毒素、假单胞菌属外毒素和假单胞菌属内毒素等(参见例如Remington’s Pharmaceutical Sciences，第19版(Mack Publishing Co.1995)；Goodmanand Gilman’s The Pharmacological Basis of Therapeutics(McGraw Hill，2001)；Pastan等(1986)Cell 47：641；Goldenberg(1994)Cancer Journal for Clinicians 44：43；美国专利第6,077,499号；所述文献的公开内容均通过引用结合到本文中)。应当了解的是，毒素可以是动物、植物、真菌或微生物来源的，或可以通过化学合成法从头制备。
在另一个实施方案中，抗体用放射性同位素衍生化，例如治疗性 放射性核素或适于检测目的的放射性核素。可以使用多种合适放射性同位素中的任一种，包括但不限于I-131、铟-111、镥-171、铋-212、铋-213、砹-211、铜-62、铜-64、铜-67、钇-90、碘-125、碘-131、磷-32、磷-33、钪-47、银-111、镓-67、镨-142、钐-153、铽-161、镝-166、钬-166、铼-186、铼-188、铼-189、铅-212、镭-223、锕-225、铁-59、硒-75、砷-77、锶-89、钼-99、铑-105、钯-109、镨-143、钷-149、铒-169、铱-194、金-198、金-199和铅-211。一般来讲，放射性核素衰变能的范围优选为20-6,000keV，Auger发射体的优选范围为60-200kev，β发射体为100-2,500kev，α发射体为4,000-6,000kev。还优选为基本上随α-粒子的产生而衰变的放射性核素。
本发明的抗体缀合物可用来更改既定的生物应答，其中药物部分不得解释为限于常规化学治疗剂。例如，药物部分可以是具有所需生物活性的蛋白质或多肽。这类蛋白质可以包括例如有酶活性的毒素或其活性片段，例如相思豆毒蛋白、蓖麻毒蛋白A、假单胞菌属外毒素或白喉毒素；蛋白质例如肿瘤坏死因子或干扰素-y；或者生物反应调节剂，例如淋巴因子，白介素-1(“IL-1”)、白介素-2(“IL-2”)、白介素-6(“IL-6”)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(“GM-CSF”)、粒细胞集落刺激因子(“G-CSF”)或其它生长因子。
可以采用多种有效方法中的任一种，使第二种药物与抗体直接或间接连接。例如，可以使用交联剂例如N-琥珀酰3-(2-吡啶基联硫基)丙酸酯(SPDP)通过二硫键形成，或通过抗体Fc区的糖部分，使药物在经还原的抗体组分的铰链区连接(参见例如Yu等(1994)Int.J.Cancer 56：244；Wong，Chemistry of Protein Conjugation and Cross-linking(CRC Press 1991)；Upeslacis等，“Modification of Antibodies by Chemical Methods(通过化学方法的抗体修饰)”，载于Monoclonal antibodies：principles andapplications，Birch等(主编)，第187-230页(Wiley-Liss，Inc.1995)；Price，“Productionand Characterization of Synthetic Peptide-Deriyed Antibodies(合成肽衍生的 抗体的产生和表征)”，载于Monoclonal antibodies：Production，engineering andclinical application，Ritter等(主编)，第60-84页(Cambridge University Press1995)；Cattel等(1989)Chemistry today 7：51-58；Delprino等(1993)J.Pharm.Sci 82：699-704；Arpicco等(1997)Bioconjugate Chernistry 8：3；Reisfeld等(1989)Antihody，Immunicon.Radiopharrn.2：217；所述各文献的全部内容均通过引用结合到本文中)。同样参见例如Arnon等，“Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In CancerTherapy(癌症疗法中用于药物免疫寻靶的单克隆抗体)，载于Monoclonal Antibodies AndCancer Therapy，Reisfeld等(主编)，第243-56页(Alan R.Liss，Inc.1985)；Hellstrom等，“Antibodies For Drug Delivery(用于药物递送的抗体)”，载于Controlled DrugDelivery(第2版)，Robinson等(主编)，第623-53页(Marcel Dekker，Inc.1987)；Thorpe，“Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy：A Review(癌症疗法中细胞毒剂的抗体载体的综述)，载于Monoclonal Antibodies′84：Biological AndClinical Applications，Pinchera等(主编)，第475-506页(1985)；“Analysis，Results，And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody InCancer Therapy(癌症疗法中放射性标记的抗体治疗用途的分析、结果及未来展望)”，载于Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy，Baldwin等(主编)，第303-16页(Academic Press1985)以及Thorpe等，“The Preparation And CytotoxicProperties Of Antibody-Toxin Conjugates(抗体-毒素缀合物的制备和细胞毒性质)”，Immunol.Rev.，62：119-58(1982)。
有关细胞毒素的类型、用于使治疗剂与抗体缀合的接头和方法的进一步论述还可参见Saito，G.等(2003)Adv.Drug Deliv.Rev.55：199-215；Trail，P.A.等(2003)CancerImmunol.Immunother.52：328-337；Payne，G.(2003)Cancer Cell 3：207-212；Allen，T.M.(2002)Nat.Rev.Cancer 2：750-763；Pastan，I.和Kreitman，R.J.(2002)Curr.Opin.Investig.Drugs 3：1089-1091；Senter，P.D.和Springer，C.J.(2001)Adv.DrugDeliv.Rev.53：247-264。
在其它实施方案中，第二种药物是可检测部分，其是在数量或质量上可以观察或测量的任何分子。可用于本发明缀合抗体的可检测标记的实例为放射性同位素、荧光染料或互补结合对(complementary binding pair)的成员，例如以下任一对的成员：抗原/抗体(除抗NKG2D抗体以外)、凝集素/糖、抗生物素蛋白/生物素、受体/配体或分子印迹聚合物(molecularly imprinted polymer)/印迹分子系统(print molecule system)。
此外或被选地，第二种药物可为旨在例如延长抗体循环半寿期的聚合物。将这类聚合物与肽连接的示例性聚合物和方法可参见例如美国专利第4766106、4179337、4495285和4609546号。另外的示例性聚合物包括聚氧乙烯化多元醇和聚乙二醇(PEG)部分。本文所使用的术语“聚乙二醇”旨在包括用于衍生其它蛋白质的任何PEG形式，例如一(C1-C10)烷氧基-聚乙二醇或芳氧基-聚乙二醇或聚乙二醇-马来酰亚胺。例如，全长抗体或抗体片段可与分子量介于约1,000和约40,000之间、例如介于约2000和约20,000之间、例如约3,000-12,000的一个或多个PEG分子缀合。为了使抗体或其片段聚乙二醇化，通常在其中一个或多个PEG基团与抗体或抗体片段连接的条件下，使抗体或片段与聚乙二醇(PEG)例如PEG的反应性酯或醛衍生物反应。优选通过酰化反应或烷基化反应用反应性PEG分子(或类似的反应性水溶性聚合物)进行聚乙二醇化。在某些实施方案中，待聚乙二醇化的抗体是无糖基化的抗体。用于使蛋白质聚乙二醇化的方法是本领域已知的，并且可应用于本发明的抗体。参见例如Nishimura等人的EP154316、国际专利申请PCT/US04/11494和Ishikawa等人的EP401384。
核酸
本发明的另一个方面涉及编码本发明抗体的核酸分子。核酸可存 在于完整细胞中，存在于细胞裂解物中，或以部分纯化或基本纯的形式存在。当通过标准技术，包括碱/SDS处理、CsCI显带、柱色谱法、琼脂糖凝胶电泳和本领域众所周知的其它方法，使核酸从其它细胞组分或其它污染物(例如其它细胞核酸或蛋白质)中纯化出来时，则该核酸是“分离的”或“呈基本纯的”。参见F.Ausubel等人主编(1987)Current Protocols in MolecularBiology，Greene Publishing and Wiley Interscience，New York。本发明的核酸可以是例如DNA或RNA，并且可含有或可不含内含子序列。在一个优选的实施方案中，核酸是cDNA分子。虽然下列段落是指DNA序列或其用途，但是同样的方法或原理一般也可适用于mRNA序列。
本发明的核酸可以应用标准分子生物学技术获得。对于由杂交瘤(例如按照下面进一步的描述由携带人免疫球蛋白基因的转基因小鼠制备的杂交瘤)表达的抗体，通过杂交瘤制备的编码抗体轻链和重链的cDNA，可以通过标准PCR扩增或cDNA克隆技术获得。对于由免疫球蛋白基因文库获得的抗体(例如应用噬菌体展示技术)，可从文库中回收编码抗体的核酸。
本发明优选的核酸分子是编码IgG4同种型16F16、16F31、MS或21F2抗体的H和L链序列(或包含编码IgG4同种型16F16、16F31、MS或21F2抗体的H和L链序列的核酸序列)的核酸分子。编码16F16VH和VL序列的DNA序列分别如SEQ ID NO：3和4所示。编码16F31VH和VL序列的DNA序列分别见SEQ ID NO：5和6。编码MS VH和VL序列的DNA序列是分别编码SEQ IDNO：44和45的DNA序列。编码21F2VH和VL序列的DNA序列分别是编码SEQ ID NO：46和47的DNA序列。
一旦获得编码VH和VL区段的DNA片段，则可通过标准重组DNA技术对这些DNA片段进一步操作，例如将可变区基因转化成全长抗体链基因、转化成Fab片段基因或转化成scFv基因。在这些操作中，使编码VL的DNA片段或编码VH的DNA片段与编码另一种蛋 白质(例如抗体恒定区或柔性接头)的DNA片段有效连接。本文所使用的术语“有效连接”，是指将两个DNA片段连接起来使得由两个DNA片段编码的氨基酸序列保持在读框内。
通过使编码VH的DNA与另一个编码重链恒定区(CH1、CH2和CH3)的DNA分子有效连接，可以将编码VH区的分离的DNA转化成全长重链基因。人重链恒定区基因的序列是本领域已知的(参见例如Kabat，E.A.等(1991)Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest，第5版，美国卫生与公共事务部，国立卫生研究院颁布号91-3242)，而且包括这些区的DNA片段可通过标准PCR扩增获得。重链恒定区可以是IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM或IgD恒定区，但是最优选为IgG4恒定区。对于Fab片段重链基因，编码VH的DNA可与另一个只编码重链CH1恒定区的DNA分子有效连接。
通过使编码VL的DNA与另一个编码轻链恒定区CL的DNA分子有效连接，可以使编码VL区的分离DNA转化成全长轻链基因(以及Fab轻链基因)。人轻链恒定区基因的序列是本领域已知的(参见例如Kabat，E.A.，等(1991)Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest，第5版，美国卫生与公共事务部，国立卫生研究院颁布号91-3242)，而且包括这些区的DNA片段可以通过标准PCR扩增获得。轻链恒定区可以是κ或λ恒定区，但是最优选为κ恒定区。
为了产生scFv基因，使编码VH和编码VL的DNA片段与另一个编码柔性接头(例如编码氨基酸序列(Gly4-Ser)3)的片段有效连接，使得VH和VL序列可作为邻接的单链蛋白质表达，其中VL区和VH区通过柔性接头连接(参见例如Bird等(1988)Science 242：423-426；Huston等(1988)Proc.Nafl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883；McCafferty等(1990)Nature348：552-554)。
抗体产生
本发明的单克隆抗体(mAb)可通过各种技术产生，包括常规的单 克隆抗体方法，例如Kohler和Milstein(1975)Nature 256：495的标准体细胞杂交技术。尽管原则上优选体细胞杂交方法，但是也可采用用于产生单克隆抗体的其它技术，例如B淋巴细胞的病毒或致癌性转化。
一种用于制备杂交瘤的优选的动物系统是鼠系统。分离经免疫的脾细胞用于融合的免疫方案和技术是本领域已知的，融合配偶体(例如鼠骨髓瘤细胞)和融合方法也同样是已知的。还可以采用已确立的技术，根据鼠单克隆抗体的序列，制备本发明的嵌合抗体或人源化抗体。例如，可应用标准分子生物学技术，从目标鼠杂交瘤中获得编码重链和轻链免疫球蛋白的DNA，并且可经工程改造成含有非鼠(例如人)免疫球蛋白序列。例如，为了产生嵌合抗体，可采用本领域已知方法，将鼠可变区与人恒定区连接(参见例如Cabilly等人的美国专利第4816567号)。为了产生人源化抗体，可采用本领域已知方法，将鼠CDR区插入人构架(参见例如Winter的美国专利第5225539号，以及Queen等人的美国专利第5530101、5585089、5693762和6180370号)。
在一个优选的实施方案中，本发明的抗体是人单克隆抗体。可以使用携带人免疫系统部分而不是小鼠系统部分的转基因小鼠或转染色体小鼠(transchromosomic mice)，产生这类针对hNKG2D的人单克隆抗体。这些转基因小鼠和转染色体小鼠包括本文分别称为HuMAb小鼠和KM小鼠的小鼠，在本文中统称为“人Ig小鼠”。HuMAb小鼠(Medarex，Inc.)含有编码未重排的人重链(p和y)和K轻链免疫球蛋白序列的人免疫球蛋白基因小基因座(miniloci)，连同使内源u和K链基因座失活的被靶定的突变(参见例如Lonberg等(1994)Nature 368：856-859)。因此，小鼠显示小鼠IgM或K表达减少，并且在响应免疫接种时，所导入的人重链和轻链转基因经过类别转换和体细胞突变以产生高亲和力人IgGK单克隆(Lonberg，N.等(1994)，出处同上；有关综述见Lonberg，N.(1994)Handbook ofExperimental Pharmacology113：49-101；Lonberg，N.和Huszar，D.(1995)Intern.Rev.Immunol.13：65-93；以及Harding，F.和Lonberg，N.(1995)Ann.N.Y.Acad.Sci.764：536-546)。以下文献进一步描述了HuMab小鼠的制备和用途，以及这类小鼠所具有的基因组修饰：Taylor，L.等(1992)Nucleic Acids Research 20：6287-6295；Chen，J.等(1993)International Immunology 5：647-656；Tuaillon等(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：3720-3724；Choi等(1993)Nature Genetics 4：117-123；Chen，J.等(1993)EMBO J.12：821-830；Tuaillon等(1994)J.Immunol.152：29122920；Taylor，L.等(1994)Internationalimmunology 6：579-591；以及Fishwild，D.等(1996)Nature Biotechnology 14：845-851，所有这些文献的内容均通过引用以其全部结合到本文中。另参见全部属于Lonberg和Kay的美国专利第5545806、5569825、5625126、5633425、5789650、5877397、5661016、5814318、5874299和5770429号；Surani等人的美国专利第5545807号；全部属于Lonberg和Kay的PCT公开文本号WO 92/03918、WO93/12227、WO 94/25585、WO 97/13852、WO 98/24884和WO 99/45962；以及Korman等人的PCT公开文本号WO 01/14424。在另一个实施方案中，可使用在转基因和转染色体上携带人免疫球蛋白序列的小鼠产生本发明的人抗体，例如携带人重链转基因和人轻链转染色体的小鼠。Ishida等人的PCT公开文本WO 02/43478中详细地描述了这类小鼠，本文亦称“KM小鼠”。再者，本领域可获得表达人免疫球蛋白基因的替代性转基因动物系统，该系统可用来产生本发明的抗hNKG2D抗体。例如，可以使用亦称为Xeno小鼠(Abgenix，Inc.)的替代性转基因系统；这类小鼠参见例如Kucherlapati等人的美国专利第5939598、6075181、6114598、6150584和6162963号。此外，本领域可获得表达人免疫球蛋白基因的替代性转染色体动物系统，该系统可用来产生本发明的抗hNKG2D抗体。例如，可以使用同时携带人重链转染色体和人轻链转染色体的小鼠，亦称为“TC小鼠”；这类小鼠参见Tomizuka等(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97：722-727。此外，本领域描述了携带人重链和轻链转染色体的牛(Kuroiwa等(2002)Nature Biotechnology 20：889-894)，其可用来产生本发明的抗hNKG2D抗体。
本发明的人单克隆抗体还可以采用用于筛选人免疫球蛋白基因文库的噬菌体展示方法制备。用于分离人抗体的这类噬菌体展示方法是本领域已确立的。参见例如Ladner等人的美国专利第5223409、5403484和5571698号；Dower等人的美国专利第5427908和5580717号；McCafferty等人的美国专利第5969108和6172197号；以及Griffiths等人的美国专利第5885793、6521404、6544731、6555313、6582915和6593081号。还可使用向其中重新构建人免疫细胞致使在免疫时可以产生人抗体应答的SCID小鼠，来制备本发明的人单克隆抗体。这类小鼠参见例如Wilson等人的美国专利第5476996和5698767号。
当使用人Ig小鼠来产生本发明的人抗体时，这类小鼠用经纯化或富集的hNKG2D抗原制备物和/或表达hNKG2D的细胞免疫接种，参见Lonberg，N.等(1994)Nature 368(6474)：856-859；Fishwild，D.等(1996)NatureBiotechnolo，gy 14：845-851；以及PCT公开文本WO98/24884和WO 01/14424。小鼠优选在第一次输注时为6-16周龄。例如，可以使用经纯化或富集的hNKG2D抗原制备物(5-50μg)经腹膜内免疫接种人Ig小鼠。在使用经纯化或经富集的hNKG2D抗原制备物的免疫接种不产生抗体的情况下，小鼠还可以用表达hNKG2D的细胞(例如人NK或T细胞系，或表达含有或不含DAP10的重组hNKG2D的哺乳动物细胞)免疫接种，以促进免疫应答。
产生完整人单克隆抗hNKG2D抗体的详细方法参见下面的实施例1。按照本领域已确立的方法，所给予的抗原的形式(例如hNKG2D多肽或表达hNKG2D的细胞)和量，以及给药方案和可能使用的佐剂例如完全弗氏佐剂或不完全弗氏佐剂，通常针对各抗原-小鼠系统进行最优化。
可以在用经眶后采血获取的血浆样品进行免疫方案的进程中，监测免疫应答，并且可以通过ELISA(如下所述)筛选血浆或血清，而具有足够效价的抗hNKG2D人免疫球蛋白的小鼠可以用于融合。小鼠可用抗原经静脉内加强免疫后3天处死，取出脾脏。预期每次免疫接种 可能需要进行2-3次融合。
为了制备产生本发明的人单克隆抗体的杂交瘤，可对来自免疫接种小鼠的脾细胞和/或淋巴结细胞进行分离并融合合适的永生化的细胞系，例如小鼠骨髓瘤细胞系。可以针对产生抗原特异性抗体情况对所得杂交瘤进行筛选。例如，可用50％PEG将来自免疫小鼠脾淋巴细胞的单细胞悬液与1/6数目的P3X63-Ag8.653非分泌性小鼠骨髓瘤细胞(ATCC，CRL1580)融合。或者，细胞可通过电融合进行融合。将大约2x 105个细胞接种到平底微量滴定板中，接着在选择培养基中孵育两周，培养基中含有20％胎克隆血清(fetal CloneSerum)、18％“653”条件培养基、5％origen(IGEN)、4mM L-谷氨酰胺、1mM丙酮酸钠、5mMHEPES、0.055mM 2-巯基乙醇、50单位/ml青霉素、50mg/ml链霉素、50mg/ml庆大霉素和1XHAT(Sigma；融合后24小时加入HAT)。大致两周后，将细胞在其中用HT代替HAT的培养基中培养。然后可通过ELISA筛选各孔的人单克隆IgM和IgG抗体。一旦出现大量杂交瘤生长，常常在10-14天后便可观察培养基。可以重新接种分泌抗体的杂交瘤，再次筛选，如果仍是人IgG阳性，则可以通过有限稀释对单克隆抗体进行亚克隆至少两次。然后将稳定的亚克隆在组织培养基进行体外培养以产生少量的抗体用于表征。为了纯化人单克隆抗体，使选出的杂交瘤在2升摇瓶中生长，用于单克隆抗体纯化。可将上清液过滤并浓缩，然后用蛋白A-琼脂糖凝胶(Pharmacia，Piscataway，N.J.)进行亲和层析。洗脱的IgG通过凝胶电泳和高效液相色谱法检查以确保纯度。将缓冲液更换成PBS，通过分光术测定浓度。将单克隆抗体分等份并保存在-80℃下。
还可以采用例如本领域熟知的重组DNA技术和基因转染方法的组合，在宿主细胞转染瘤中产生本发明的抗体(例如Morrison，S.(1985)Science 229：1202)。
例如，为了表达抗体，可以通过标准分子生物学技术(例如使用表达目标抗体的杂交瘤进行的PCR扩增或cDNA克隆)，获得编码部 分或全长轻链和重链的DNA，并可将所述DNA插入表达载体中，使基因与转录和翻译调控序列有效连接，并且可执行调节抗体基因转录和翻译的预期功能。
选择与所使用的表达宿主细胞相容的表达载体和表达调控序列。可将抗体轻链基因和抗体重链基因插入单独的载体中，或者更通常将两个基因插入同一表达载体中。将抗体基因通过标准方法插入表达载体中(例如抗体基因片段和载体上互补的限制位点的连接，或者如果不存在限制位点则进行平端连接)。可将本文所述抗体的轻链和重链可变区插入已编码所需同种型的重链恒定区和轻链恒定区的表达载体中，使得VH区段与载体内的CH区段有效连接，并使VL区段与载体内的CL区段有效连接，来产生任何抗体同种型的全长抗体基因。此外或者备选地，重组表达载体可以编码有利于抗体链从宿主细胞中分泌的信号肽。可将抗体链基因克隆到载体中，使得信号肽与抗体链基因的氨基端符合读框地连接。信号肽可以是免疫球蛋白信号肽或异源信号肽(即来自非免疫球蛋白的蛋白质的信号肽)。
除了抗体链基因外，本发明的重组表达载体还携带控制抗体链基因在宿主细胞中表达的调节序列。术语“调节序列”旨在包括启动子、增强子和控制抗体链基因转录或翻译的其它表达调节元件(例如聚腺苷酸化信号)。这类调节序列参见例如Goeddel(GeneExpression Technology.Methods in Enzymology 185，Academic Press，San Diego，CA(1990))。
本领域技术人员应当理解的是，包括调节序列的选择在内的表达载体的设计可取决于诸如待转化宿主细胞的选择、所需蛋白的表达水平等因素。用于哺乳动物宿主细胞表达的优选的调节序列包括指导在哺乳动物细胞中表达高水平蛋白的病毒元件，例如来源于巨细胞病毒(CMV)、猿病毒40(SV40)、腺病毒(例如腺病毒主要晚期启动子(AdMLP)和多瘤病毒(polyoma)的启动子和/或增强子。或者，可以使用非病毒调节序列，例如泛蛋白启动子或p-珠蛋白启动子。再者，调节 元件由来自不同来源的序列组成，例如SRa启动子系统，其含有来自SV40早期启动子和人T细胞白血病病毒1型的长末端重复序列的序列(Takebe，Y.等(1988)Mol.Cell.Biol.8：466-472)。
除抗体链基因和调节序列之外，本发明的重组表达载体可携带另外的序列，例如调节载体在宿主细胞中进行复制的序列(例如复制起点)和选择标记基因。选择标记基因有利于选择导入了载体的宿主细胞(参见例如全部属于Axel等人的美国专利第4399216、4634665和5179017号)。例如，通常选择标记基因为导入了载体的宿主细胞提供药物抗性，例如G418、潮霉素或甲氨蝶呤抗性。优选的选择标记基因包括二氢叶酸还原酶(DHFR)基因(用于用甲氨蝶呤选择/扩增dhfr-宿主细胞)和neo基因(用于G418选择)。
对于轻链和重链的表达，通过标准技术将编码重链和轻链的表达载体转染到宿主细胞中。术语“转染”的各种形式旨在包括通常用于将外源DNA导入原核或真核宿主细胞的各种技术，例如电穿孔、磷酸钙沉淀法、DEAE-葡聚糖转染等。尽管从理论上讲在原核或真核宿主细胞中表达本发明的抗体都是可行的，但是在真核细胞(最优选哺乳动物宿主细胞)中表达抗体是最优选的，因为比起原核细胞，这类真核细胞，特别是哺乳动物细胞更可能装配和分泌适当折叠和有免疫活性的抗体。据报道，抗体基因的原核表达无法有效产生高产量的活性抗体(Boss，M.A.和Wood，C.R.(1985)Immunology Today 6：12-13)。
用于表达本发明的重组抗体的优选哺乳动物宿主细胞包括中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)(包括dhfr-CHO细胞，参见Urlaub和Chasin，(1980)Proc.Nail.Acad.Sci.USA77：4216-4220，与DHFR选择标记一起使用，例如参见R.J.Kaufman和P.A.Sharp(1982)Mol.Biol.159：601-621)、NSO骨髓瘤细胞、COS细胞和SP2细胞。特别是与NSO骨髓瘤细胞同时使用，另一个优选的表达系统是公开于WO87/04462、WO 89/01036和EP 338,841的GS基因表达系统。当将编码抗体的重组表达载体基因导入哺乳动物宿主细胞时，通过将宿主细 胞培养足以使抗体在宿主细胞表达或者更优选使抗体分泌到宿主细胞所生长的培养基中的一段时间，来产生抗体。可采用标准蛋白质纯化方法从培养基中回收抗体。
抗体表征
在产生或纯化后，或作为筛选或选择步骤的组成部分，可对本发明的抗hNKG2D抗体的功能性质进行分析。目标功能性质包括例如抗体对hNKG2D的结合特异性、抗体与hNKG2D配体竞争、抗体与参比抗体(例如16F16、16F31、MS和21F2)竞争、抗体所结合的表位、抗体-抗原相互作用的亲和力以及抗体的拮抗剂/激动剂性质。
下面是用于抗体表征的示例性试验的简述。某些内容将在随后部分中作进一步描述和/或在实施例中进行描述。
(1)通过证实单克隆抗体(或作为动物筛选步骤的组成部分，含有多克隆抗体的血清)结合表达NKG2D的细胞但不结合NKG2D阴性细胞，可以评价对hNKG2D的抗体特异性。将具有或没有NKG2D的细胞系与抗体孵育，接着与直接标记的第二抗体孵育，并通过例如流式细胞术进行观测。
(2)可以通过在有或没有抗体或杂交瘤上清液时孵育表达NKG2D的细胞，接着与配体-mFc蛋白和对该配体有特异性的第二抗体孵育，并通过流式细胞术测定配体结合及其阻断的水平，来评价配体结合的阻断。阻断可用有预孵育的配体结合与无预孵育的配体结合相比的百分比计算，在预孵育时观察到较低结合。
(3)对被一种或多种参比抗NKG2D抗体所利用的结合位点的竞争，可按类似方式评价，不同之处在于可用本发明的抗体或参比抗体(例如ON72或149810)进行预孵育，接着用随后加入的抗体孵育并对其检测。
(4)包括抗体的结合速率和解离速率在内的亲和力参数，可在Biacore机上进行测定。例如，可以把hNKG2D-Fc蛋白在芯片上固定 化，使抗体通过芯片，测定结合速率和解离速率，并计算KD。
(5)通过在有或没有抗体时孵育表达NKG2D的细胞过夜，接着再加入抗体后，在流式细胞仪中检测NKG2D的水平(即结合抗体的水平)，来测量由抗体诱导的NKG2D内化。
(6)可以使用例如NK细胞系NK92或NKL作为杀死表达NKG2D配体(MICA、MICB或ULBP1-4)的荷载51Cr的靶细胞的效应子细胞，来评价抗体阻断hNKG2D配体介导的杀伤的能力。
(7)可以在将猴和人PBMC与hNKG2D抗体和第二抗体，连同PBMC中不同细胞类型的标记一起孵育，并且对各种亚群的NKG2D染色进行分析后，通过流式细胞术，来证实人抗NKG2D抗体与猴NK和CD8+T细胞而非CD4+T细胞(同样在人体中)的交叉反应性。
(8)在有或没有预刺激(例如通过TCR、CD28和IL-2或IL-15)时，在通过T细胞受体CD28和/或NKG2D刺激时，作为PBMC群中CD8+细胞的细胞增殖的诱导，测定在抗体结合时NKG2D的活化。
结合测定法
本发明提供结合hNKG2D的抗体及其抗原结合片段和免疫缀合物。众多种试验中的任一种都可用来评价抗体与hNKG2D的结合。尤其基于ELISA、放射免疫测定法、蛋白质印迹法、BIACORE和其它竞争测定法的方案都适用于本领域并且是本领域熟知的。另外，实施例中描述了若干结合测定法，包括竞争测定法。
例如，可应用简单的结合测定法，其中在靶蛋白或靶表位(例如NKG2D或其部分)存在下孵育试验抗体，洗去未结合的抗体，并应用例如放射性标记、物理方法例如质谱法，或者使用例如细胞荧光测定分析(例如FACScan)检测的直接或间接荧光标记，来评价结合抗体的存在。这类方法为本领域技术人员所熟知。任何结合量超过用对照非特异性抗体观察到的量，都表明抗体与靶标特异性结合。
在这类测定法中，可对试验抗体结合靶细胞或人NKG2D的能力 与(阴性)对照蛋白结合同一靶标的能力进行比较，对照蛋白例如为针对结构上不相关的抗原所产生的抗体或非Ig肽或非Ig蛋白。应用任何合适的试验，结合靶细胞或NKG2D的亲和力与对照蛋白相比提高25％、50％、100％、200％、1000％或更高的抗体或片段，被称为“与靶标特异性结合”或“与靶标特异性相互作用”，并且优选用于下述治疗方法。还对试验抗体影响抗NKG2D的(阳性)对照抗体例如16F16、16F31、MS或21F2结合的能力进行了评价。
在一个方面，本发明提供与16F16、16F31、MS或21F2有共同的生物学特征和/或基本的VH序列和/或VL序列同一性的抗hNKG2D抗体。一个示例性生物学特征是与16F16、16F31、MS或21F2表位(即16F16、16F31、MS或21F2抗体所结合的hNKG2D胞外结构域中的相应区)结合。为了筛选与16F16、16F31、MS或21F2表位结合的抗体，可以进行常规交叉阻断测定法(cross-blocking assay)，例如参见Antibodies，A Laboratory Manual，Cold SpringHarbor Laboratory，Harlow和David Lane主编(1988)。
在示例性交叉阻断测定法或竞争测定法中，将16F16、16F31、MS或21F2(对照)抗体和试验抗体混合(或预吸附)，并加入含有NKG2D的样品中。在某些实施方案中，可将对照抗体与不同量的试验抗体(例如1∶10或1∶100)预混合一段时间后，加到含有NKG2D的样品中。在其它实施方案中，在与抗原/靶样品接触期间，可使对照和不同量的试验抗体简单混合。只要能够将结合与游离抗体相区别(例如通过使用分离或洗涤技术以除去未结合的抗体)和将对照抗体与试验抗体相区别(例如通过使用物种特异性第二抗体或同种型特异性第二抗体，通过用可检测标记对对照抗体进行特异性标记，或通过应用物理方法例如质谱法以区分不同的化合物)，便能够测定试验抗体是否减少对照抗体与抗原的结合，从而表明试验抗体基本上识别与对照相同的表位。在该测定法中，在完全不相关抗体的存在下(标记的)对照抗体的结合是对照高值。通过使标记的(阳性)对照抗体与未标记的对照抗 体一起孵育而获得对照低值，其中竞争可能引起或减少标记的抗体的结合。
在一项试验性测定中，在试验抗体存在下标记抗体反应性的显著降低表示试验抗体识别同一表位，即试验抗体与标记的对照抗体“交叉反应”。在对照：试验抗体或化合物介于约1∶10和约1∶100的任何比率下，减少标记对照与抗原/靶标结合至少50％以上、优选70％的任何试验抗体或化合物，都被视为结合与对照基本相同的表位或决定簇的抗体或化合物。这类试验抗体或化合物优选将减少对照与抗原/靶标的结合达至少90％。尽管如此，减少对照抗体或化合物的结合至任何可测量的程度的任何化合物或抗体都可用于本发明。
在一个实施方案中，竞争可以用流式细胞术试验来评价。首先将带有hNKG2D的细胞与已知特异性结合受体的对照抗体(例如表达hNKG2D的T细胞或NK细胞或重组表达hNKG2D的BaF/3细胞，及16F16、16F31、MS或21F2抗体)一起孵育，然后与可用例如荧光染料或生物素标记的试验抗体孵育。如果与饱和量的对照抗体预孵育所得到的结合是没有与对照预孵育的抗体所获得的结合(荧光的平均值)的80％，优选50％、40％以下，则试验抗体被称为与对照竞争。或者，如果用与饱和量的抗体预孵育的细胞上的标记对照(通过荧光染料或生物素)所获得的结合是没有与抗体预孵育所获得的结合的80％，优选50％、40％以下，则试验抗体被称为与对照竞争。有关示例性抗体竞争测定法参见实施例5。
还可采用类似的交叉阻断试验评价试验(人源化)抗体是否影响人NKG2D的天然配体例如MICA、MICB、ULBP1、ULBP2、ULBP3、ULBP4或RAET1家族成员的结合，仅仅通过以合适形式的hNKG2D配体交换16F16、16F31、MS或21F2。实施例所述的一种合适的形式是配体(例如MICA)与抗体的Fc-部分的融合蛋白。使配体与Fc区缀合，使得能够通过Fc区所来源的动物物种有特异性的抗体检测融合蛋白，例如使用山羊抗小鼠抗体检测鼠Fc区。
在一个实施方案中，采用细胞测定法，其中将表达hNKG2D的细胞，例如来自类风湿性关节炎患者的CD4+CD28-细胞(或来自其它自身免疫病或炎症性疾病的等同细胞)与NKG2D配体例如MICA、MICB或ULBP蛋白，例如以Fc-融合蛋白的形式，或表达这些配体任一种的细胞一起孵育，来评价抗NKG2D抗体或其它分子阻断细胞活化的能力。在备选的测定法中，在配体不存在时获得NKG2D受体活性的基线水平，并且检测抗体或化合物引起基线活性水平下降的能力。在一个类型的实施方案中，采用高通量筛选方法鉴定能够阻断受体活化或对其下调的化合物。有关示例性配体竞争测定法参见实施例3。
识别NKG2D表位的单克隆抗体优选可与存在于患者(例如类风湿性关节炎患者)的相当比例的CD4+T细胞，特别是CD4+CD28-T细胞上的表位起反应，但是基本上不与其它细胞(即不表达NKG2D的免疫细胞或非免疫细胞)起反应。因此，一旦抗体特异性识别NK细胞或T细胞上的hNKG2D，便可测定其与自患有自身免疫病或炎症性疾病(例如类风湿性关节炎)的患者采集的T细胞结合的能力。应当了解的是，本发明可用于治疗其中NKG2D活性与疾病病理关联的任何疾病，而不论表达受体的细胞类型(例如CD4+T细胞、CD8+T细胞、NK细胞等)如何，并且可测定抗体结合在与特定疾病相关的任何细胞类型上的受体的能力。例如，如果观察到特定疾病与表达NKG2D的NK细胞的活性或增殖过量有关，则可使用表达同一受体的NK细胞开发抗体并进行测定。
在一个实施方案中，抗体在测定其与表达NKG2D的细胞(例如自类风湿性关节炎患者采集的CD4+CD28-T细胞)结合的能力的免疫测定中证实有效。例如，从多名患者中采集外周血淋巴细胞(PBL)，例如通过流式细胞术使用相关抗体，从PBL中富集CD4+细胞，优选CD4+CD28-细胞。然后，应用本领域众所周知的标准方法，评价给定抗体结合细胞的能力。研究发现，与来自相当比例的患者(例如5％、 10％、20％、30％、40％、50％以上)的相当比例(例如20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％以上)的已知表达NKG2D的细胞(例如来自RA患者等的NK细胞、CD8T细胞、CD4T细胞)结合的抗体，可被认为适用于本发明，用于确定NKG2D受体在患者细胞中表达的诊断目的或用于本文所述的治疗方法，例如用作适用于人的阻断抗体或者细胞毒性抗体。为了评价抗体与细胞的结合，可对抗体进行直接或间接标记。当间接标记时，通常加入第二标记抗体。然后，可应用例如细胞荧光测定分析(例如FACS)，检测抗体与细胞的结合。这类方法是本领域熟知的。
在本发明的一些方面，例如，当不需要杀死表达NKG2D的细胞时，本发明的抗体优选不显示对Fc受体有显著的特异性结合。这类抗体可包含已知结合Fc受体的各种重链恒定区。一个这样的实施例是IgG4恒定区。或者，可使用不含恒定区的抗体片段，例如Fab或F(ab’)2片段，以避免Fc受体结合。可按照本领域已知方法评价Fc受体结合，包括例如在BIACORE测定法中测定抗体与Fc受体蛋白的结合。同样，可以使用任何其它抗体类型，其中Fc部分经过修饰使得与Fc受体的结合最小化或得以消除(参见例如WO03101485，其内容通过引用结合到本文中)。评价Fc受体结合的试验例如基于细胞的试验是本领域熟知的，可参见例如WO03101485。
功能测定法
反映NKG2D活性的任何适当的生理上的变化都可用来评价试验化合物或抗体的功效。例如，可以在例如基于细胞的测定法中测定各种作用，例如基因表达的改变、细胞因子产生、信号转导分子磷酸化、细胞生长、细胞增殖、pH、胞内第二信使(例如Ca2+、IP3、cGMP或cAMP)或者活性例如细胞毒性活性或激活其它T细胞的能力。例如，受体的活性可以通过检测NKG2D-反应性基因(例如CD25、IFN-γ或TNF-α)的表达来评价(参见例如Groh等(2003)PNAS 100：9452-9457； André等(2004)Eur.J.Immunol 34：1-11)。或者，在配体或激活性抗NKG2D抗体，以及抗CD3抗体的存在下，孵育CD4+CD28-NKG2D+细胞以评价化合物或试验抗体抑制由T细胞释放的TNF-α或IFN-γ的能力，来评价NKG2D活性。或者，可以在配体(例如MICA、MICB、ULBP-1、ULBP-2、ULBP-3等)或产生配体的细胞(例如自体MIC+RA滑膜细胞)的存在下，对CD4+CD28-NKG2D+T细胞进行孵育，并且评价试验抗体或化合物抑制细胞因子产生(例如IFN-γ或TNF-α)或T细胞增殖的能力。
体外试验可以任选使用从自身免疫疾病或炎症性疾病(例如RA)患者采集的细胞，例如从RA患者采集的表达NKG2D的CD4+CD28细胞(或从中衍生的细胞系)，但一般可以使用任何表达NKG2D的细胞。例如，非RA免疫细胞系(如T细胞系)可以用编码NKG2D的转基因转染并且用于本发明的测定法中，只要受体的表达将以可检测的方式改变细胞活性例如使其可被NKG2D配体激活即可。例如，可以使用来自RA患者的CD4+CD28-NKG2D+细胞(例如自滑液组织分离的PBL或T细胞)建立细胞系。可以在IL-15的存在下培养这类细胞以确保NKG2D的持续表达(参见例如Groh等(2003)PNAS 100：9452-9457，其整个内容都通过引用结合到本文中)。
如果抗hNKG2D抗体降低或阻断NKG2D与其配体的一种或多种进行相互作用，或与已知阻断hNKG2D配体相互作用的抗体竞争，则可用于降低NKG2D介导的NK细胞或T细胞的活化。这可通过特有的细胞毒性测定法进行评价。实施例6描述了示例性细胞毒性测定法，NKG2D配体介导的杀死靶细胞。在此，抗hNKG2D抗体降低或抑制NK细胞介导的杀死MICA转染的BaF/3的能力通过测定靶细胞释放51Cr来评价。
在其它方面，可能需要确保本发明的抗体缺乏相当的激动剂活性。几项试验可用于此目的，包括下列试验。
一项试验可用可溶性或板结合的抗体，与来自健康志愿者或IBD 患者的PBMC的抗CD3和/或抗CD28抗体组合，在活化后评价增殖和细胞因子产生。在该方法中，PBMC通过常规方法由健康受试者或炎性肠病(IBD)患者中纯化。细胞用CFSE(来自Molecular probes，目录号C34554)染色。向107个细胞(0.5ml PBS与2％FCS)中加入1μlCFSE(0.5mM)，将细胞在37℃下孵育10分钟。然后，加入2ml FCS，将混合物在室温下放置1分钟。然后细胞用RPMI-1640培养基(12ml)通过离心洗涤3次。洗涤后，将细胞悬浮于1ml含2％FCS的培养基(例如RPMI-1640)中。
在室温下用30μl抗小鼠Fc(Jackson-Immuno Resarch115-006-008)包被96孔板2小时，然后用PBS洗涤。按照下列方案加入抗体(抗CD3Biosceince目录号14-0037-82，抗CD28目录号348046Becton Dickison)，并置于孔中：
仅细胞
CD30.1ng/ml或0.3ng/ml
CD30.1ng/ml或0.3ng/ml+CD280.2μg/ml
CD30.1ng/ml或0.3ng/ml+CD280.2μg/ml+抗NKG2D 0.2μg/ml
CD30.1ng/ml或0.3ng/ml+抗NKG2D 0.2μg/ml
然后，加入100.000个CFSE标记的PBMC后放置3天。然后收集上清液用于细胞因子分析，并按照用于增殖的用抗CD56、抗CD4、抗CD8和CFSE标记的淋巴细胞类型，通过流式细胞术对PBMC进行分析。
在另一试验中，测定了CD8+T细胞的细胞毒性潜力对缺乏NKG2D配体的靶细胞的作用。如果结合强化细胞的细胞毒性潜力，则存在激动剂活性。简单地说，将健康受试者的IL-2刺激的PBMC与表达MICA的p815细胞，或与未转染的p815细胞和抗CD3抗体(这将通过结合p815细胞上的Fc受体导致再引导的杀死)及CD8细胞毒性T细胞一起孵育。然后分析没有与p815细胞结合的抗NKG2D抗体(例如人IgG4同种型的抗体)是否阻断MICA-NKG2D引导的结合和 /或抗体是否加强CD3-p815再引导的结合。按这种方式可以说明，CD8+T细胞的活性不因p815细胞与抗CD3抗体和另外的抗NKG2D抗体一起孵育而提高，而通过证实在同一PBMC群中，同一抗NKG2D抗体阻断NK-MICA对p815诱导的杀死的相互作用，从而表明同一抗NKG2D抗体具有功能。
在另一试验中，可以研究NKG2D信号转导途径和NKG2D信号转导分子是否通过加入一种或多种抗NKG2D抗体而被激活。可以使用从外周血分离的NK细胞系(例如NKL细胞或NK-92细胞)或人NK或CD8+T细胞。例如，可将NKL细胞与溶液中的人抗NKG2D抗体或结合在板中的人抗NKG2D抗体，与作为对照的例如表达Fc-MICA或受辐照的MICA的细胞一起孵育。孵育适当时间(例如5分钟、10分钟、30分钟)后，将细胞在蛋白酶和磷酸酶抑制剂的存在下在冰上裂解，并通过标准蛋白质印迹法技术，分析一种或多种已知为NKG2D刺激下游(例如Pi3K、Akt和vav)的磷酸化信号转导分子的水平。
在基于动物的试验中，可以利用动物体内细胞中NKG2D活化的任何生理或病理结果，来评价抗体或试验化合物活性。
例如，可以在共同给予或不共同给予产生配体的细胞(例如产生MICA的滑膜细胞)时，将CD4+CD28-NKG2D+细胞注入动物模型关节，并评价炎症或组织损害。然后可引入试验化合物或抗体，检测其抑制、减慢、逆转或以任何方式影响炎症或组织损害的能力。
还可以进行类风湿性关节炎(RA)滑液移植物实验以研究阻断NKG2D对促炎细胞因子的自发释放的作用(参见例如Brennan等，Lancet 1989；2(8657)；244-247)。在这类试验中，将人或人源化抗hNKG2D抗体在RA滑液膜培养物中进行试验，并在显示有助于阻断配体结合和NKG2D功能的浓度下与例如鼠抗hNKG2D抗体进行比较。在抗NKG2D抗体或同种型对照抗体存在或不存在时，将RA滑液细胞培养48小时。可使用已知的抗炎药作为阳性对照。最初以高达30μg/ml的浓度在6份RA滑液膜中测试抗NKG2D抗体的作用。 在染色活细胞试验(例如MTT试验)中分析细胞的存活力，以确定所加入的试剂是否具有任何细胞毒性。然后采用ELISA以检测培养上清液中诸如TNFα、IL-1β和IL-6等细胞因子的水平。
或者，可以在例如银屑病或溃疡性结肠炎实验模型中，测定本发明的抗体。可将银屑病皮肤样品与患者本身的PBMC一起移植到SCID小鼠中，并且可以检测引入试验化合物的作用及其抑制、减慢、逆转或以任何方式影响炎症或组织损害的能力。Kjellev等(Eur JImmunol2008；37：1397-1406)和Ito等(Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol2008；294：G199-G207)描述了用于评价使用抗鼠NKG2D抗体治疗溃疡性结肠炎的实验模型。
药物制剂
在一个实施方案中，本发明提供包含本文所述的抗hNKG2D抗体以及一种或多种载体的药物组合物或制剂。
因此，本发明的一个示例性方面是包含这类抗体的药物制剂，其存在浓度为1mg/ml～500mg/ml，其中所述制剂的pH从2.0到10.0不等。制剂还可包含缓冲系统、防腐剂、张度剂、螯合剂、稳定剂和/或表面活性剂。在一个实施方案中，药物制剂为含水制剂，即包含水的制剂。这类制剂通常是溶液剂或混悬剂。在进一步的实施方案中，药物制剂是水溶液剂。术语“含水制剂”定义为制剂包含至少50％(重量/重量)水。同样，术语“水溶液剂”定义为包含至少50％(重量/重量)水的溶液剂，术语“含水混悬剂”定义为包含至少50％(重量/重量)水的混悬剂。
在另一个实施方案中，药物制剂是冻干制剂，医师或患者可在给药之前向其中加入溶剂和/或稀释剂。
在另一个实施方案中，药物制剂是无需任何提前的溶解随时可用的干燥制剂(例如冷冻干燥或喷雾干燥)。
在进一步的方面，药物制剂包括这类抗体的水溶液剂和缓冲剂， 其中抗体存在的浓度为1mg/ml以上，其中所述制剂的pH从约2.0至约10.0不等。
在另一个实施方案中，制剂的pH范围选自约2.0～约10.0、约3.0～约9.0、约4.0～约8.5、约5.0～约8.0和约5.5～约7.5。
在进一步的实施方案中，制剂包括缓冲剂，其选自乙酸钠、碳酸钠、柠檬酸盐、甘氨酰甘氨酸、组氨酸、甘氨酸、赖氨酸、精氨酸、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、磷酸钠和三(羟甲基)-氨基甲烷、N-二(羟乙基)甘氨酸、N-二(羟乙基)甲基甘氨酸、苹果酸、琥珀酸盐、马来酸、富马酸、酒石酸、天冬氨酸或其混合物。这些具体缓冲剂的每一种均构成本发明的备选实施方案。
在进一步的实施方案中，制剂进一步或者备选地包含药学上可接受的防腐剂。防腐剂可选自例如苯酚、邻甲酚、间甲酚、对甲酚、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、2-苯氧乙醇、对羟基苯甲酸丁酯、2-苯基乙醇、苯甲醇、三氯叔丁醇和硫柳汞、溴硝丙二醇、苯甲酸、咪脲、氯己定(chlorohexidine)、脱氢醋酸钠、氯甲酚、对羟基苯甲酸乙酯、苄索氯铵、氯苯甘醚(chlorphenesine)(3对苯氧基丙烷-1，2-二醇)或其混合物。防腐剂可存在的浓度为例如0.1mg/ml～20mg/ml、0.1mg/ml～5mg/ml、5mg/mi～10mg/ml或10mg/ml～20mg/ml。这些具体防腐剂的每一种都构成本发明的备选实施方案。药物组合物中防腐剂的用途为本领域技术人员所熟知。为方便起见，可参见Remington：The Science and Practice ofPharmacy，第19版，1995。
在进一步的实施方案中，制剂进一步或者备选地包含等渗剂。等渗剂可选自例如盐(例如氯化钠)、糖或糖醇、氨基酸(例如L-甘氨酸、L-组氨酸、精氨酸、赖氨酸、异亮氨酸、天冬氨酸、色氨酸、苏氨酸)、糖醇(例如甘油(丙三醇)、1，2-丙二醇(propanediol/propyleneglycol)、1，3-丙二醇、1，3-丁二醇)、聚乙二醇(例如PEG400)或其混合物。可以使用任何糖例如单糖、双糖或多糖或者水溶性葡聚糖，包括例如果糖、葡萄糖、甘露糖、山梨糖、木糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖、海藻糖、葡聚 糖、普鲁兰多糖(pullulan)、糊精、环糊精、可溶性淀粉、羟乙基淀粉和羧甲基纤维素钠。在一个实施方案中，添加的糖是蔗糖。糖醇的定义为具有至少一个-OH基团的C4-C8烃，包括例如甘露醇、山梨醇、肌醇、半乳糖醇、卫矛醇、木糖醇和阿拉伯糖醇。在一个实施方案中，添加的糖醇是甘露醇。上文提及的糖或糖醇可以个别或组合使用。对于用量，没有固定的极限值，只要糖或糖醇溶于液体制剂，并且不会不利地影响应用本发明的方法所达到的稳定效果即可。糖或糖醇浓度例如可介于约1mg/ml和约150mg/ml之间。等渗剂可存在的浓度为例如1mg/ml～50mg/ml、1mg/ml～7mg/ml、8mg/ml～24mg/ml或25mg/ml～50mg/ml。这些具体等渗剂中的每一种都构成本发明的备选实施方案。药物组合物中等渗剂的用途为本领域技术人员所熟知。为方便起见，可参见Remington：TheScience and Practice of Pharmacy，第19版，1995。
在进一步的实施方案中，制剂进一步或者备选地包含螯合剂。螯合剂可选自例如乙二胺四乙酸(EDTA)、柠檬酸和天冬氨酸的盐及其混合物。螯合剂可存在的浓度例如0.1mg/ml～5mg/ml、0.1mg/ml～2mg/ml或2mg/ml～5mg/ml。这些具体螯合剂的每一种都构成本发明的备选实施方案。药物组合物中螯合剂的用途为本领域技术人员所熟知。为方便起见，可参见Remington：The Science and Practice of Pharmacy，第19版，1995。
在本发明进一步的实施方案中，制剂进一步或者备选地包含稳定剂。药物组合物中稳定剂的用途为本领域技术人员所熟知。为方便起见，可参见Remington：The Scienceand Practice of Pharmacy，第19版，1995。更准确地说，本发明的组合物可为稳定的液体药物组合物，其治疗上的活性组分包括在液体药物制剂保存期间可能出现聚集体形成的多肽。所谓“聚集体形成”是指多肽分子间导致寡聚体形成的物理相互作用，它可保持可溶性，或从溶液中沉淀出众多可见的聚集体。所谓“保存期间”是指液体药物组合物或制剂一旦制备完成，不会立即 给予受治疗者。更确切地说，在制备以后，将其以液体形式、以冷冻状态或以干燥形式包装好用于贮存，以备稍后复溶成液体形式或适于给予受治疗者的其它形式。所谓“干燥形式”是指液体药物组合物或制剂通过以下方式进行干燥：冷冻干燥(即冻干；参见例如Williams和Polli(1984)J.Parenteral Sci.Technol.38：48-59)、喷雾干燥(参见Masters(1991)，载于Spray-Drying Handbook(第五版；Longman Scientific andTechnical，Essez，U.K.)，第491-676页；Broadhead等(1992)Drug Devel.Ind.Pharm.18：1169-1206；以及Mumenthaler等(1994)Pharm.Res.11：12-20)或风干(Carpenter和Crowe(1988)Cryobiology 25：459-470；以及Roser(1991)Biopharm.4：47-53)。在液体药物组合物的保存期间由多肽所致的聚集体形成可不利地影响该多肽的生物活性，导致药物组合物的治疗功效丧失。此外，聚集体形成可引起其它问题，例如当使用输注系统给予含有多肽的药物组合物时会阻塞管、膜或泵。
本发明的药物组合物可进一步或备选地包含在组合物保存期间足以减少由多肽引起聚集体形成的一定量的氨基酸碱。所谓的“氨基酸碱”是指当任何指定氨基酸以其游离碱形式或以其盐形式存在时氨基酸或氨基酸的组合。当使用氨基酸的组合时，则所有氨基酸可以其游离碱形式存在，所有均可以其盐形式存在，或一些可以其游离碱形式存在，而另一些则以其盐形式存在。在一个实施方案中，用于制备本发明组合物的氨基酸是具有带电荷侧链的氨基酸，例如精氨酸、赖氨酸、天冬氨酸和谷氨酸。具体氨基酸(例如甲硫氨酸、组氨酸、咪唑、精氨酸、赖氨酸、异亮氨酸、天冬氨酸、色氨酸、苏氨酸和其混合物)的任何立体异构体(即L、D或其混合物)或这些立体异构体的组合，都可以存在于本发明的药物组合物中，只要具体氨基酸以其游离碱形式或其盐形式存在即可。在一个实施方案中，使用L-立体异构体。本发明的组合物还可用这些氨基酸的类似物配制。所谓的“氨基酸类似物”是指天然存在的氨基酸的衍生物，可产生减少在本发明的液体药物组合物保存期间由多肽所致聚集体形成的所需作用。合适的精氨酸类 似物包括例如氨基胍、鸟氨酸和N-单乙基L-精氨酸，合适的甲硫氨酸类似物包括乙硫氨酸和buthionine，合适的半胱氨酸类似物包括S-甲基-L半胱氨酸。至于其它氨基酸，将氨基酸类似物以其游离碱形式或其盐形式掺入组合物中。在本发明进一步的实施方案中，所使用的氨基酸或氨基酸类似物的浓度足以防止或延迟蛋白质的聚集。
在本发明进一步的实施方案中，当用作治疗剂的多肽是包含至少一个易受氧化的甲硫氨酸残基的多肽时，可以加入甲硫氨酸(或其它含硫氨基酸或氨基酸类似物)以抑制甲硫氨酸残基氧化成甲硫氨酸亚砜。在这种情况下，术语“抑制”是指甲硫氨酸氧化类物质随时间变化发生的最小积聚。抑制甲硫氨酸氧化导致多肽更多保留其适当的分子形式。可以使用甲硫氨酸的任何立体异构体(L或D)或其组合。所加入的量应是足以抑制甲硫氨酸残基氧化的量，使得甲硫氨酸亚砜的量是管理机构可接受的。通常，这是指组合物含有不超过约10％～约30％甲硫氨酸亚砜。这一般可通过加入甲硫氨酸，使得所加入的甲硫氨酸与甲硫氨酸残基之比的范围为约1∶1～约1000∶1、例如10∶1～约100∶1来实现。
在进一步的实施方案中，制剂进一步或备选地包含选自高分子量聚合物或低分子化合物的稳定剂。在本发明进一步的实施方案中，稳定剂选自聚乙二醇(例如PEG 3350)、聚乙烯醇(PVA)、聚乙烯吡咯烷酮、羧基纤维素、羟基纤维素或其衍生物(例如HPC、HPC-SL、HPC-L和HPMC)、环糊精、含硫物质如单巯基甘油、巯基乙酸和2-甲基硫基乙醇和不同的盐(例如氯化钠)。这些具体稳定剂的每一种都构成本发明的备选实施方案。
药物组合物进一步或备选地包含另外的稳定剂，其进一步提高本文有治疗活性的多肽的稳定性。本发明特定的目标稳定剂包括但不限于保护多肽免于甲硫氨酸氧化的甲硫氨酸和EDTA，以及保护多肽免于与冻融或机械剪切有关的聚集的非离子表面活性剂。
在进一步的实施方案中，制剂进一步或备选地包含表面活性剂。 表面活性剂例如可选自洗涤剂；乙氧基化蓖麻油；聚乙二醇化甘油酯；乙酰化单甘油酯；失水山梨糖醇脂肪酸酯；聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段聚合物(例如泊洛沙姆例如F68；泊洛沙姆188和407；曲通X-100)；聚氧乙烯失水山梨糖醇脂肪酸酯；聚氧乙烯和聚乙烯衍生物例如烷基化和烷氧基化衍生物(吐温类，例如吐温-20、吐温-40、吐温-80和苄泽-35)；单甘油酯或其乙氧基化衍生物；二甘油酯或其聚氧乙烯衍生物；醇；甘油；凝集素和磷脂(例如磷脂酰丝氨酸、磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇、二磷脂酰甘油和鞘磷脂)；磷脂衍生物(例如二棕榈酰基磷脂酸)和溶血磷脂(例如棕榈酰基溶血磷脂酰-L-丝氨酸和乙醇胺、胆碱、丝氨酸或苏氨酸的1-酰基-sn-甘油-3-磷酸酯)和溶血磷脂酰和磷脂酰胆碱的烷基；烷氧基(烷基酯)；烷氧基(烷基醚)衍生物，例如溶血磷脂酰胆碱的月桂酰基和肉豆蔻酰基衍生物；二棕榈酰基磷脂酰胆碱及极性头基团(polar head group)的修饰，极性头基团即胆碱；乙醇胺；磷脂酸；丝氨酸；苏氨酸；甘油；肌醇和带正电的DODAC；DOTMA；DCP；BISHOP；溶血磷脂酰丝氨酸和溶血磷脂酰苏氨酸及甘油磷脂(例如脑磷脂)；甘油糖脂(例如吡喃半乳糖苷)；鞘糖脂(sphingoglycolipid)(例如神经酰胺、神经节糖苷)；十二烷基磷酸胆碱；鸡蛋溶血磷脂酰胆碱；梭链孢酸衍生物(例如牛磺酸二氢梭链孢酸钠等)；C6-C12长链脂肪酸及其盐(例如油酸和辛酸)；酰基肉碱和衍生物；赖氨酸、精氨酸或组氨酸的Nα-酰化衍生物或者赖氨酸或精氨酸的侧链酰化衍生物；包含赖氨酸、精氨酸或组氨酸和中性或酸性氨基酸的任何组合的二肽的Nα-酰化衍生物、包含中性氨基酸和两个带电荷的氨基酸的任何组合的三肽的Nα-酰化衍生物、DSS(多库酯钠，CAS登记号[577-11-7])；多库酯钙，CAS登记号[128-49-4])；多库酯钾，CAS登记号[7491-09-0])；SDS(十二烷基硫酸钠或月桂基硫酸钠)；辛酸钠；胆酸或其衍生物；胆汁酸及其盐和甘氨酸或牛磺酸缀合物；乌索脱氧胆酸；胆酸钠；脱氧胆酸钠；牛磺胆酸钠；甘胆酸钠；N-十六烷基-N，N-二甲基-3-铵基-1-丙烷磺酸盐；阴离子(烷基-芳基-磺酸盐)一价表面活 性剂；两性离子表面活性剂(例如N-烷基-N，N-二甲基铵基-1-丙烷磺酸盐、3-胆酰胺-1-丙基二甲基铵基-1-丙烷磺酸盐)；阳离子表面活性剂(季铵碱)(例如鲸蜡基-三甲基溴化铵、鲸蜡基氯化吡啶鎓)；非离子表面活性剂(例如十二烷基β-D-吡喃葡糖苷)；poloxamines(例如Tetronic’s)，这是由将环氧丙烷和环氧乙烷依次加入乙二胺中衍生的四功能嵌段共聚物，或表面活性剂可以选自咪唑啉衍生物或其混合物。这些具体表面活性剂的每一种都构成本发明的备选实施方案。
药物组合物中表面活性剂的用途为本领域技术人员所熟知。为方便起见，可参见Remington：The Science and Practice of Pharmacy，第19版，1995。
在进一步的实施方案中，制剂进一步或备选地包含蛋白酶抑制剂，例如EDTA(乙二胺四乙酸)和苯甲脒HCl，但是还可以使用其它市售的蛋白酶抑制剂。蛋白酶抑制剂的用途是特别用于包含蛋白酶的酶原的药物组合物中以抑制自身催化。
其它成分可进一步或备选地存在于本发明的肽药物制剂中也是可行的。这类另外的成分可包括润湿剂、乳化剂、抗氧化剂、填充剂、张力调节剂(tonicity modifier)、螯合剂、金属离子、油性溶媒、蛋白质(例如人血清白蛋白、明胶或蛋白质)和两性离子(例如氨基酸，例如甜菜碱、牛磺酸、精氨酸、甘氨酸、赖氨酸和组氨酸)。当然，这类另外的成分不应不利地影响本发明药物制剂的整体稳定性。
可以在若干部位给予需要这类治疗的患者含有本发明抗体的药物组合物，例如局部部位，例如皮肤和粘膜部位；绕过吸收的部位，例如在动脉中给药、在静脉中给药、在心脏中给药；以及涉及吸收的部位，例如在皮肤中给药、在皮肤下给药、在肌肉中给药或在腹部给药。
可以通过若干给药途径给予需要这类治疗的患者本发明的药物组合物，例如舌、舌下、口腔、口内、口服、胃肠、经鼻、经肺(例如通过细支气管和肺泡或其组合)、表皮、真皮、经皮、阴道、直肠、眼 (例如通过结膜)、输尿管和胃肠外。
可以若干剂型给予本发明的组合物，例如作为溶液剂、混悬剂、乳剂、微乳剂、复合型乳剂、泡沫剂、油膏剂、糊剂、药用硬膏剂(plasters)、软膏剂、片剂、糖衣片、嗽洗剂、胶囊剂(例如硬质明胶胶囊剂和软质明胶胶囊剂)、栓剂、直肠胶囊剂、滴剂、凝胶剂、喷雾剂、散剂、气雾剂、吸入剂、滴眼剂、眼用软膏剂、眼用冲洗剂、阴道栓剂、阴道冲洗剂、阴道软膏剂、注射溶液剂、原位转化溶液剂(in situ transforming solution)(例如原位胶凝、原位沉降、原位沉淀、原位结晶)、输注溶液剂和植入。
本发明的组合物还可以通过例如共价、疏水和静电相互作用进一步与药物载体、递药系统和高级递药系统复合或连接，进一步提高抗体的稳定性，提高生物利用度，提高溶解度，降低不利作用，实现本领域众所周知的择时治疗法，并增加患者顺应性或其任何组合。载体、递药系统和高级递药系统的实例包括但不限于聚合物例如纤维素和衍生物、多糖例如葡聚糖和衍生物、淀粉和衍生物、聚(乙烯醇)、丙烯酸酯和甲基丙烯酸酯聚合物、聚乳酸和聚乙醇酸及其嵌段共聚物、聚乙二醇、载体蛋白例如白蛋白、凝胶剂例如热胶凝系统、例如本领域众所周知的嵌段共聚物系统、微团、脂质体、微球、纳米粒、液体晶体及其分散体、本领域众所周知的在脂质-水系统中的相特性的L2相(L2 phase)及其分散体、聚合物胶束、自乳化、自微乳化的复合型乳剂、环糊精及其衍生物以及树状聚体。
使用为本领域众所周知的装置，例如定量吸入器、干粉吸入器和喷雾器，本发明的组合物可用于以用于抗体经肺给药的固体剂、半固体剂、散剂和溶液剂的制剂。
本发明的组合物特别用于控制、延缓、延长、延迟和减慢释放的递药系统的制剂。更具体地讲，但不限于，组合物可用于本领域众所周知的胃肠外控释系统和缓释系统(两个系统均导致给药数达许多倍的减少)的制剂。甚至更优选为皮下给药的控释和缓释系统。在不限制 本发明的范围下，有用的控释系统和组合物的实例为水凝胶、油性凝胶、液体晶体、聚合物胶束、微球、纳米粒。
用于本发明组合物的产生控释系统方法包括但不限于结晶、缩合、共结晶、沉淀、共沉淀、乳化、分散、高压匀浆、包胶、喷雾干燥、微囊包封、凝聚、相分离、溶剂蒸发产生微球、挤出和超临界流体法。一般可参见Handbook of Pharmaceutical Controlled Release(Wise，D.L.主编，Marcel Dekker，New York，2000)和Drug and the PharmaceuticalSciences，第99卷：Protein Formulation and Delivery(MacNally，E.J.主编，MarcelDekker，New York，2000)。
胃肠外给药可以用注射器(任选笔状注射器)，通过皮下、肌内、腹膜内或静脉内注射进行。或者，胃肠外给药可以用输注泵进行。另外的选择是以经鼻或经肺喷雾剂的形式给予抗体化合物的溶液剂或混悬剂的组合物。作为又一个选择，含有本发明抗体的药物组合物还可适于经皮给药例如通过无针注射或由贴剂、任选离子导入贴剂，或经黏膜(例如口腔)给药。
抗体在溶媒或载体中作为溶液剂、混悬剂或干粉剂可使用适于经肺药物递送的任何已知类型的装置，经肺途径给予。这类的实例包括但不限于产生气雾用于经肺药物递送的三种普通类型，可包括喷射式或超声波雾化器、定量吸入器或干粉吸入器(参见Yu J，Chien YW.Pulmonary drug delivery：Physiologic and mechanistic aspects(经肺药物递送：生理与机械方面).Crit Rev Ther Drug Carr Sys 14(4)(1997)395-453)。
根据标准化测定方法，颗粒的空气动力学直径(da)定义为单位密度(1g/em3)的参比标准球状颗粒的几何当量直径。在最简单的情况下，对于球状粒子，da与参比直径(d)相关，是密度比平方根的函数，表示为：
对于非球状粒子，对该关系式进行修改(参见Edwards DA，Ben-Jebria A，LangerR.Recent advances in pulmonary drug delivery using large，porous inhaledparticles(在经肺递药中使用大的多孔吸入粒子的最新进展).J Appl Physiol84(2)(1998)379-385)。术语“MMAD”和“MMEAD”已有大量记载并且是本领域已知的(参见EdwardsDA，Ben-Jebria A，Langer R and represents a measure of the median value of anaerodynamic particle size distribution.Recent advances in pulmonary drugdelivery using large，porous inhaled particles(和表示空气动力学粒径分布的中位值的量度。在经肺递药中使用大的多孔吸入粒子的最新进展).J Appl Physiol 84(2)(1998)379-385)。质量中值空气动力学直径(Mass median aerodynamic diameter，MMAD)和质量中值有效空气动力学直径(MMEAD)可互换使用，是统计学参数，凭经验描述了气溶胶粒子的大小独立于实际形状、大小或密度与其沉积在肺中的潜力的关系(参见Edwards DA，Ben-Jebria A，Langer R.Recent advances in pulmonary drug delivery using large，porous inhaled particles(在经肺递药中使用大的多孔吸入粒子的最新进展).J ApplPhysiol 84(2)(1998)379-385)。一般由使用冲击器这种测量颗粒在空气中的惯性行为的仪器测得的测量值来计算MMAD。
在进一步的实施方案中，制剂可以通过任何已知的雾化技术雾化，例如喷雾，以获得气溶胶粒子小于10μm的MMAD，更优选介于1-5μm，最优选介于1-3μm。优选的粒径以将药物递送到肺深处最有效的大小为基础，蛋白质在该处达到最佳吸收(参见Edwards DA，Ben-Jebria A，Langer R.Recent advances in pulmonary drug deLivery using large，porous inhaled particles(在经肺递药中使用大的多孔吸入粒子的最新进展).J ApplPhysiol 84(2)(1998)379-385)。
包含抗体的肺部用制剂在肺深处的沉积可任选进一步通过采用改进的吸入技术使之最优化，例如但不限于：慢的吸入流(例如30L/分钟)、屏气和驱动时机。
术语“稳定化制剂”是指物理稳定性提高、化学稳定性提高或理化 稳定性提高的制剂。
本文所使用的蛋白质制剂的“物理稳定性”这一术语是指由于抗体暴露于热机械性应力和/或与破坏稳定的界面和表面(例如疏水表面和界面)相互作用，而使抗体形成生物学上无活性和/或不溶性聚集体的倾向。通过将装入合适容器(例如针筒或小瓶)中的制剂在不同时间不同温度下暴露于机械性/物理性应力(例如搅拌)后，进行目测和/或浊度测量来评价含水抗体制剂的物理稳定性。制剂的目测在带有深色背景的强聚焦光下进行。制剂浊度的特征在于浑浊度的目视分值等级例如以0～3的标度(显示无浊度的制剂对应于目视分值0，在日光下目测显示混浊的对应于目视分值3)。当在日光中目视制剂显示混浊时，就抗体聚集而言该制剂被归类为物理上不稳定的。或者，可以通过技术人员熟知的简单浊度测量法评价制剂的浊度。还可利用抗体构象状态的光谱剂(spectroscopic agent)或光谱探针评价含水抗体制剂的物理稳定性。探针优选是优先与抗体的非天然构象异构体结合的小分子。蛋白质结构的小分子光谱探针的一个实例是硫黄素T。硫黄素T是广泛用于检测淀粉状蛋白原纤维的荧光染料。在原纤维以及或许其它蛋白质构型存在下，硫黄素T当与原纤维蛋白形式结合时，便在450nm附近产生新的最大激发，在482nm附近产生增强发射。未结合的硫黄素T在所述波长下基本上无荧光。
可以使用其它小分子作为蛋白质结构从天然到非天然状态变化的探针。例如优先与显露的蛋白质疏水斑结合的“疏水斑(hydrophobic patch)”探针。疏水斑一般埋在蛋白质在其天然状态中的四级结构内，但是因为蛋白质开始解折叠或变性而暴露。这些小分子光谱探针的实例是芳族疏水染料，例如蒽、吖啶、菲咯啉等。其它光谱探针是金属-氨基酸复合体，例如苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸和缬氨酸等疏水氨基酸的钴金属复合体。
本文所使用的抗体制剂的“化学稳定性”这一术语是指导致形成化学降解产物的抗体结构的化学共价变化，所述降解产物与天然抗体 结构相比，生物学功效可能降低和/或免疫原性性质可能提高。可根据天然抗体的类型和性质及抗体所暴露的环境，形成各种化学降解产物。非常有可能无法完全避免化学降解，抗体制剂保存和使用期间常常观察到化学降解产物量的增加，正如本领域技术人员所熟知的一样。大多数蛋白质易于脱酰胺基化，这是一个其中谷氨酰胺酰残基或天冬酰胺酰残基的侧链酰胺基团水解形成游离羧酸的过程。其它降解途径包括高分子量转化产物的形成，其中两个或更多个蛋白质分子通过转酰氨基作用和/或二硫键相互作用彼此共价结合，导致共价结合的二聚体、寡聚体和聚合物降解产物的形成(Stability of Protein Pharmaceuticals(蛋白质药物的稳定性)，Ahern.T.J.&Manning M.C.，Plenum Press，New York 1992)。作为化学降解的另一种变化可提及(例如甲硫氨酸残基的)氧化。通过暴露在不同环境条件下之后，在各个时间点上测定化学降解产物的量，来评价抗体制剂的化学稳定性(例如常可通过温度升高加速降解产物的形成)。通常可应用各种层析技术(例如SEC-HPLC和/或RP-HPLC)，根据分子大小和/或电荷分离降解产物，以确定各个降解产物各自的量。
因此，如上所述，“稳定化制剂”是指物理稳定性提高、化学稳定性提高或理化稳定性提高的制剂。一般来讲，制剂在使用和贮存期间必需是稳定的(遵守所建议的使用和贮存条件)直到达到有效期。
在本发明的一个实施方案中，包含抗体的药物制剂使用6周以上并保存3年以上保持稳定。
在本发明的另一个实施方案中，包含抗体的药物制剂使用4周以上并保存3年以上保持稳定。
在本发明进一步的实施方案中，包含抗体的药物制剂使用4周以上并保存2年以上保持稳定。
在本发明更进一步的实施方案中，包含抗体的药物制剂使用2周以上并保存2年以上保持稳定。
还可以通过分析使用其它已开发的治疗性单克隆抗体的经验，来 确定合适的抗体制剂。研究表明若干单克隆抗体在临床情况下是有效的，可与本发明的抗体一起使用，例如美罗华(利妥昔单抗)、赫赛汀(曲妥珠单抗)、Xolair(奥马珠单抗)、贝克萨(托西莫单抗)、肯巴斯(阿仑珠单抗)、Zevalin、Oncolym、Humira和类似制剂。例如，单克隆抗体可按10mg/mL的浓度以100mg(10mL)或500mg(50mL)以一次用小瓶提供，在9.0mg/mL氯化钠、7.35mg/mL柠檬酸钠二水合物、0.7mg/mL聚山梨酯80和注射用无菌水中配制用于静脉内给药。调节pH至6.5。或者，抗体还可以在包含组氨酸(histidin)、蔗糖和聚山梨酯80的溶液中配制。
诊断应用
本发明的hNKG2D-抗体还具有非治疗用途。例如，抗hNKG2D抗体也可用于NKG2D蛋白的诊断性试验，例如检测其在特定细胞、组织或血清中的表达。例如抗hNKG2D抗体可用于选择用抗hNKG2D治疗的患者的试验中。为此，抗hNKG2D抗体可用于分析血清或组织样品中hNKG2D的存在，测定表达NKG2D的CD4+T细胞的存在或促进表达NKG2D的细胞(例如NK或CD4+或CD8+T细胞)的疾病的存在。这类分析可与分析测定例如血液中可溶性MICA的水平结合(参见例如Spies等人的WO2003089616)。
对于诊断应用，通常可用可检测部分标记抗体。可以获得一般可分成下列类别的多种标记：
(a)放射性同位素，例如35S、14C、125I、3H和131I。抗体可以采用文献披露的技术用放射性同位素标记：Current Protocols in Immunology，第1和2卷，Coligen等主编，Wiley-Interscience，New York，N.Y.，Pubs.(1991)，例如，可利用闪烁计数法测量放射性。
(b)可获得荧光标记例如稀土元素螯合物(铕螯合物)或荧光素及其衍生物、罗丹明及其衍生物、丹酰、丽丝胺(Lissamine)、藻红蛋白和德克萨斯红。可利用以下文献公开的技术将荧光标记与抗体缀合： 例如Currem Protocols in Immunology，出处同上。可使用荧光计定量测定荧光。
(c)可获得各种酶-底物标记，美国专利第4,275,149号提供在关这类酶-底物标记中的部分综述。酶一般催化可以应用各种技术测定的显色底物的化学改变。例如，酶可催化底物的颜色变化，这可以以分光光度法测量。或者，酶可以改变荧光或底物的化学发光。用于定量测定荧光变化的技术见上文的描述。化学发光底物由于化学反应电子被激发，然后可发出可测量的光(使用例如化学发光计)或将能量供给荧光接纳体。酶标记的实例包括萤光素酶(例如萤火虫萤光素酶和细菌萤光素酶；美国专利第4,737,456号)、萤光素、2，3-二氢酞嗪二酮、苹果酸脱氢酶、脲酶、过氧化物酶例如辣根过氧化物酶(HRPO)、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、溶菌酶、糖氧化酶(例如葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶)、杂环氧化酶(例如脲酸酶和黄嘌呤氧化酶)、乳过氧化物酶、微过氧化物酶等。用于将酶与抗体缀合的技术参见O′Sullivan等，“Methods for the Preparation ofEnzyme-Antibody Conjugates for use in Enzyme Immunoassay(用于酶免疫测定法的酶-抗体缀合物的制备方法)”，载于Methods in Enzym.(Ed.，J.Langone和H.VanVunakis)，Academic Press，New York，73：147-166(1981)。
酶-底物组组合的实例包括例如：
(i)辣根过氧化物酶(HRPO)与作为底物的氢过氧化物酶，其中氢过氧化物酶氧化染料前体(例如邻苯二胺(OPD)或3，3′，5，5′-四甲基联苯胺盐酸盐(TMB))；
(ii)碱性磷酸酶(AP)与作为显色底物的磷酸对硝基苯酯；以及
(iii)β-D-半乳糖苷酶(β-D-Gal)与显色底物(例如对硝基苯基-β-D-半乳糖苷酶)或荧光团底物4-甲基伞形酮-对-β-半乳糖苷酶。
本领域技术人员可获得多种其它酶-底物组合。有关其一般性综述参见美国专利第4,275,149和4,318,980号。
有时，将标记与抗体间接缀合。技术人员应当清楚，要实现这一点的各种技术。例如，抗体可与生物素缀合，上述三大类标记中的任一种都可与抗生物素蛋白缀合，反之亦然。生物素与抗生物素蛋白选择性结合，因此，将标记按这种间接方式与抗体缀合。或者，为了实现标记与抗体的间接缀合，将抗体与小的半抗原(例如地高辛)缀合，并使上述不同类型的标记之一与抗半抗原抗体(例如抗地高辛抗体)缀合。因此，可实现标记与抗体的间接缀合。
在本发明的另一个实施方案中，抗NKG2D抗体不必是标记的，并且其存在可以使用结合NKG2D抗体的标记的第二抗体检测。
本发明的抗体可用于任何已知的试验方法，例如竞争结合测定法、直接和间接夹心测定法及免疫沉淀测定法。Zola，Monoclonal Antibodies：A Manual of Techniques，第147-158页(CRC Press，Inc.1987)。
至于免疫组织化学法，组织样品可以是新鲜的或冷冻的，或者包埋在石蜡中，并用防腐剂(例如福尔马林)固定。
抗体还可用于体内诊断试验。抗体一般通过例如本领域已知的核磁共振或其它方法可检出的放射性核素或非放射性指示剂进行标记。标记优选为放射性标记，例如125I、131I、67Cu、99mTc或111In。将标记的抗体优选通过血流给予宿主，测定宿主中标记抗体的存在和位置。这种成像技术适用于赘生物的检测、分期和治疗。通过任何方法将放射性同位素与蛋白质缀合，包括金属螯合化合物或乳过氧化物酶，或用于碘化的iodogen技术。
为方便起见，本发明的抗体可以药盒提供，即成套的预定量的试剂组合与用于进行诊断试验的说明书。当抗体用酶标记时，药盒可包括酶所需要的底物和辅因子(例如提供可检测发色团或荧光团的底物前体)。另外，可包括其它添加剂，例如稳定剂、缓冲剂(例如封闭缓冲液或裂解缓冲液)等。各种试剂的相对量可大幅变化以提供试剂在溶液中的浓度，使试验灵敏度基本上最优化。试剂特别可以干粉提供， 特别是冻干粉，包括溶解时可提供具有适当浓度的试剂溶液的赋形剂。
治疗应用
本发明还提供使用本文所述的人或人源化抗hNKG2D抗体治疗患者的方法。在一个实施方案中，本发明提供本文所述的人或人源化抗体在制备用于给予人类患者的药物组合物中的用途。通常，患者患有自身免疫或炎症性疾病和病症或者有患自身免疫或炎症性疾病和病症的风险。
例如，在一个方面，本发明提供在有这种需要的患者体内降低或抑制hNKG2D介导的NK细胞或T细胞活化的方法，所述方法包括给予患者人或人源化抗NKG2D抗体的步骤，所述抗体降低或防止配体介导的NKG2D受体的活化。在一个实施方案中，所述方法旨在降低患者体内这类淋巴细胞的活性，所述患者患有其中NK细胞或T细胞活性的升高是有害的疾病，所述疾病涉及影响易受NK细胞或T细胞溶解的细胞或由易受NK细胞或T细胞溶解的细胞引起，或者所述疾病由NK细胞和/或T细胞活性升高引起，或者特征在于NK细胞和/或T细胞活性升高，例如自身免疫疾病和病症或者炎症性病症。在一个方面，本发明提供减轻患者的慢性炎症的方法。
要用本发明的多肽、抗体及其它化合物治疗的示例性病症或障碍包括但不限于系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、青少年慢性关节炎、银屑病性关节炎、骨关节炎、脊椎关节病(关节强硬性脊椎炎)、系统性硬化病(硬皮病)、特发性炎症性肌病(皮肌炎、多肌炎)、斯耶格伦综合征(Sjogren′s syndrome)、血管炎、系统性血管炎、颞动脉炎、动脉粥样硬化、结节病、重症肌无力、自身免疫性溶血性贫血(免疫性各类血细胞减少症(immunepancytopenia)、阵发性睡眠性血红蛋白尿症)、恶性贫血、自身免疫性血小板减少症(特发性血小板减少性紫癜、免疫介导的血小板减少症)、甲状腺炎(格雷夫斯病(Grave′sdisease)、桥本 甲状腺炎(Hashimoto′s thyroiditis)、青少年淋巴细胞性甲状腺炎、萎缩性甲状腺炎)、糖尿病、免疫介导的肾病(肾小球性肾炎、肾小管间质肾炎、自身免疫性卵巢炎)、自身免疫性睾丸炎、自身免疫性眼色素层炎(autoimmune uveitis)、抗磷脂综合征、中枢和外周神经系统的脱髓鞘疾病(例如多发性硬化、特发性脱髓鞘性多神经病或急性热病性多神经炎(Guillain-Barre syndrome)和慢性炎症性脱髓鞘性多神经病)、肝胆疾病(例如传染性肝炎(甲型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎、丁型肝炎、戊型肝炎及其它非嗜肝病毒性肝炎)、自身免疫性慢性活动性肝炎、病毒性肝炎、原发性胆汁性肝硬化、肉芽肿性肝炎、韦格纳肉芽肿病(Wegener’s granulomatosis)、贝赫切特病(Behcet’s disease)和硬化性胆管炎)、炎性肠病(例如溃疡性结肠炎或克罗恩病、乳糜泻、麸胶敏感性肠病(gluten-sensitive enteropathy)和惠普尔病(Whipple′s disease))、自身免疫性或免疫介导的皮肤疾病(包括大疱性皮肤病、多形性红斑和接触性皮炎、疱疹样皮炎、银屑病、寻常性天疱疮、白斑(白斑病))、变应性疾病(例如哮喘、变应性鼻炎、特应性鼻炎、食物过敏反应和荨麻症)、肺部免疫性疾病(例如嗜酸性粒细胞性肺炎、特发性肺纤维变性和超敏反应性肺炎、慢性阻塞性肺病)以及移植相关疾病包括移植排斥反应和移植物抗宿主病。
例如，在一个方面，抗NKG2D抗体与一种或多种其它的抗炎药联用，包括但不限于镇痛药、免疫抑制药(例如B细胞或T细胞拮抗剂例如B细胞清除剂(depletion agent)和T细胞抑制剂；补体抑制剂)、皮质类固醇、抗TNFα药或其它抗细胞因子药剂或抗细胞因子受体药剂以及抗血管生成药。具体实例包括甲氨蝶呤、TSG-6、或其它B细胞疗法、抗IL12(p40)抗体、CTLA4-Fc融合蛋白、IL-1-受体拮抗剂、IL-1抗体、IL-15抗体、IL-18抗体和抗IL6R抗体。联合疗法的更多实例见下文。
当一种或多种其它药剂或方法与本发明的疗法联用时，综合结果无需是当分别进行各个治疗时所观察到的作用的累加。尽管至少一般 最好为累加效应，但是任何NKG2D活性的降低或一种超出单一疗法的其它有益效果都将是有益的。同样，对于联合治疗并没有对协同效应有特殊需要，尽管这无疑是可能的并且是有利的。基于NKG2D的治疗可以在其它治疗之前或之后进行，例如，间隔范围从几分钟到数周和数月不等。还可预期可采用不止给予一种抗NKG2D组合物或其它药剂。药剂可以间隔日或周交替给予；或可以给予一个周期的抗NKG2D治疗，接着一个周期的其它药剂疗法。在任何情况下，整个所需要的是以有效发挥治疗有效作用的综合量递送两种药剂而不论给药次数。
下面描述了某些特定的炎症疾病和病症和/或自身免疫疾病和病症，本发明的抗hNKG2D抗体可用作所述疾病和病症的治疗剂。抗hNKG2D抗体优选是全长二价MS或21F2或者其抗原结合片段、变体或衍生物。
类风湿性关节炎
类风湿性关节炎(RA)是慢性系统性自身免疫性炎症性疾病，主要累及多个关节滑液膜及因此产生的关节软骨的损伤。发病机制是T淋巴细胞依赖性的，并且与类风湿因子、针对自身IgG的自身抗体的产生、及随之而来的在关节液和血液中达到高水平的免疫复合物的形成有关。关节中的这些复合体可引起淋巴细胞和单核细胞显著渗入滑膜，随后引起显著的滑液改变；关节间隙被同样的细胞与额外大量的嗜中性粒细胞渗入。病理性T细胞产生细胞因子及其它可溶性因子，加入到对其它细胞的吸引和活化中，并且破坏组织。受累组织主要是关节，常常是不对称的形式。然而，还发生两种主要形式的关节外疾病。一种形式是关节外病变的发生，伴有持续进行性关节疾病及肺纤维变性、血管炎和皮肤溃疡的典型病变。关节外疾病的第二种形式是所谓的费尔蒂综合征(Felty′s syndrome)，在RA病程晚期发生，有时在关节疾病静息时发生，并涉及中性粒细胞减少、血小板减少症和脾大 的存在。这可伴发多个器官中的血管炎与梗塞的形成、皮肤溃疡和坏疽。患者还常常在受累关节之上的皮下组织中发生类风湿结节；结节晚期具有被混合的炎性细胞浸润物包围的坏死中心。可在RA中出现的其它现象包括：心包炎、胸膜炎、冠状动脉炎、间质性肺炎伴发肺纤维变性、干燥性角膜结膜炎和类风湿结节。
因此，在一个方面，本发明提供用于治疗和/或预防类风湿性关节炎(RA)的方法。所述方法包括给予患有RA或被鉴定/诊断有发生RA重大风险的患者有效量的抗hNKG2D抗体，以治疗或预防RA。在一个方面，已证实抗NKG2D抗体在可接受的RA模型中有效改善RA，例如参见美国专利第6414218号和美国专利公布号20030005469(有关原理和模型参见例如Wooley，P.H.，Animal Models of Arthritis，主编J.H.Klippel和P.A.Dieppe，MosbyPublishers(London)，1998；Erning等，Arthritis Res，4增刊3：S 133-40，2002；Holmdahl等，Ageing Res Rev，1(1)：135-47，2002；Anthony等，Clin Exp Rheumatol，17(2)：240-4，1999；Durie等，Clin Immunol Immunopathol，73(1)：11-8，1994；以及Muller-Ladner等，Drugs Today(Bare)，35(4-5)：379-88，1999)。在进一步的方面，抗体能够可检测地减少配体诱导的表达NKG2D的白细胞的NKG2D活化和/或破坏NKG2D+T细胞或NK细胞的增殖(例如破坏自体反应性CD8+T细胞的增殖和/或功能)(与例如美国专利公布号20040115198描述的至少一些抗体相反)，而不显著减少这类细胞(例如与合适对照相比，引起这类细胞减少约10％以下)。在一个方面，所述方法以同治疗或预防(适当时)RA一致的方式导致一种或多种生物标记的调节(例如血清IL-6、TNF-α、IL-1、VEGF、TIFF R、IL-2R、shed CD4、shed CD8和/或C反应性蛋白质)。在另一个方面，实施所述方法引起患者/宿主外周关节中滑液炎症可检测地减轻。在一个方面，所述方法预防患者或宿主的放射摄影显示的恶化和改善身体功能，例如以下方面所显示的一样：减慢患者或宿主的放射摄影显示的进程，减轻关节肿胀和触痛(按照可接受的分析标准测定)和/或显著改善生命质 量(例如正如通过减小RA健康评估问卷(RA Health Assessment Questionnaire)中的致残分值所确定的一样)。所述抗体可以单用或与一种或多种其它的抗RA药剂联用，例如非甾体抗炎药(NSAID)、COX-2抑制剂、镇痛药、皮质类固醇(例如泼尼松、氢化可的松)、金、免疫抑制药(例如甲氨蝶呤)、B细胞清除剂(例如)、B细胞激动剂(例如)和抗TNFα药剂(例如和 )、抗IL1受体拮抗剂(例如)、抗IL-15抗体或改变病情抗风湿药(DMARD)。
脱髓鞘疾病
中枢和外周神经系统的脱髓鞘疾病，包括多发性硬化(MS)、特发性脱髓鞘性多神经病或急性热病性多神经炎、以及慢性炎症性脱髓鞘性多神经病，被认为具有自身免疫基础，并且是由于直接引起少突神经胶质细胞或髓鞘损伤而导致的神经脱髓鞘。在MS中，有证据表明该疾病的诱导和发展依赖于T淋巴细胞。MS是T淋巴细胞依赖性的脱髓鞘疾病，具有复发缓解型进程或慢性进行性进程。病因未知；然而，病毒性感染、遗传体质、环境和自身免疫均发挥作用。病灶含有主要是T淋巴细胞介导的小神经胶质细胞和浸润性巨噬细胞的浸润物；CD4+T淋巴细胞是病灶处占主要导的细胞类型。
因此，在另一个方面，本发明提供用于治疗和/或预防MS的方法。所述方法包括给予患有MS或被鉴定/诊断有发生MS重大风险的人类患者有效量的抗hNKG2D抗体，以治疗或预防患者或宿主的MS。在一个具体的方面，抗NKG2D单克隆抗体能够可检测地减少配体诱导的表达NKG2D的白细胞的NKG2D活化和/或削弱NKG2D+T细胞或NK细胞的增殖，而不显著减少这类细胞。所述抗体可以单用或与其它抗MS药剂例如联用。
炎性肠病
在肠中的CD8+T细胞内，NKG2D起CD28-细胞的共激活剂的作用(Roberts等，JImmunol 2001；167：5527-30)。此外，在肠炎(乳糜泻)中，NKG2D上调，肠上皮淋巴细胞通过NKG2D刺激以破坏和产生细胞因子(Hüe等，Immunity 2004；21：367-77；Meresse等，Immunity2004；21：357-66)。另外，常常存在于肠炎期间的IL-15，上调肠上皮淋巴细胞上的NKG2D(Roberts等，J Immunology 2001；167：5527-30)。此外，肠炎期间，NKG2D的配体MICA上调(Meresse等，出处同上，Hüe等，出处同上)。NKG2D还在克罗恩病患者的促炎淋巴细胞中上调(Allez等，第16届欧洲免疫学会议(16th European Congress of Immunology，ECI2006)简报，2006年9月6-9日；Paris，France)。
因此，在另一个方面，本发明提供用于治疗和/或预防炎性肠病(IBD)例如克罗恩病或溃疡性结肠炎的方法。如Kjellev等人所述(Eur J Immunol 2008；37：1397-1406)，在结肠炎动物模型SCID小鼠中，通过早期抗体疗法抑制NKG2D受体功能，减轻转移诱发的结肠炎。
治疗炎性肠病的方法包括给予患有IBD或被鉴定/诊断有发生IBD重大风险的人类患者有效量的抗NKG2D抗体，以治疗或预防患者的IBD。在一个具体的方面，本发明的IBD治疗/预防方法通过抗NKG2D单克隆抗体实施，所述抗体能够可检测地减少配体诱导的表达NKG2D的白细胞的NKG2D活化和/或削弱NKG2D+T细月包或NK细胞的增殖，而不显著减少这类细胞。所述抗体可以单用或与其它抗IBD药剂联用，例如含有5-氨基水杨酸的药物(包括柳氮磺吡啶及含有5-氨基水杨酸(5-ASA)的其它药剂，例如奥沙拉秦和巴柳氮)、非甾体抗炎药(NSAID)、镇痛药、皮质类固醇(例如泼尼松、氢化可的松)、TNF-抑制剂(包括阿达木单抗(adilimumab)()、依那西普()和英利昔单抗())、抗IL12抗体、免疫抑制药(例如6-巯基嘌呤、硫唑嘌呤和环孢菌素A)和抗生素。
银屑病
银屑病是T淋巴细胞介导的炎症性疾病。病灶含有T淋巴细胞、巨噬细胞和抗原加工细胞及一些嗜中性粒细胞的浸润物。
因此，在另一个方面，本发明提供用于治疗和/或预防银屑病的方法。所述方法包括给予患有银屑病或被鉴定/诊断有发生银屑病重大风险的人类患者有效量的抗hNKG2D抗体，以治疗或预防患者的银屑病。在一个更具体的方面，所述药剂是抗NKG2D单克隆抗体，所述抗体能够可检测地减少配体诱导的表达NKG2D的白细胞的NKG2D活化和/或削弱NKG2D+T细胞或NK细胞的增殖，而不显著减少这类细胞。所述抗体可以单用或与一种或多种其它的抗银屑病治疗联用，例如光线疗法、局部疗法(例如焦油、局部糖皮质素)或全身疗法(例如甲氨蝶呤、合成维A酸、环孢菌素)、抗TNFα药剂(例如)、T细胞抑制剂(例如)、维生素D类似物、p38促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)抑制剂以及生物制剂例如
银屑病性关节炎
银屑病性关节炎是累及皮肤、关节、腱附着部位、韧带和筋膜的慢性炎症性关节炎病症，通常与银屑病有关(约7％的银屑病患者发生银屑病性关节炎)。大量证据表明，T细胞介导的过程驱动银屑病性关节炎的病理生理。单核细胞也在银屑病性关节炎中起作用，并负责基质金属蛋白酶的产生，该酶可介导银屑病性关节炎患者关节中的破坏性改变。此外，NK细胞还存在于受累关节，这表明在疾病病理中的作用。
因此，在另一个方面，本发明提供用于治疗和/或预防银屑病性关节炎的方法。所述方法包括给予患有银屑病性关节炎或被鉴定/诊断有发生银屑病性关节炎重大风险的银屑病性关节炎的人类患者有效量的抗hNKG2D抗体，以治疗或预防患者的银屑病性关节炎。在 一个更具体的方面，所述药剂是抗NKG2D单克隆抗体，所述抗体能够可检测地减少配体诱导的表达NKG2D的白细胞的NKG2D活化和/或削弱NKG2D+T细胞或NK细胞的增殖，而不显著减少这类细胞。所述抗体可以单用或与一种或多种其它的抗银屑病性关节炎治疗药联用，例如非甾体抗炎药(阿司匹林、布洛芬)、甲氨蝶呤、合成维A酸、环孢菌素、皮质类固醇、抗TNFα药剂(例如 )。
系统性红斑狼疮
在系统性红斑狼疮(SLE)中，疾病的主要介质是产生的抗自身蛋白/组织的自体反应性抗体，以及随后产生的免疫介导的炎症。抗体直接或间接介导组织损伤。研究表明虽然T淋巴细胞不直接参与组织损害，但是T淋巴细胞是自体反应性抗体发生所需要的。因此，疾病的发生是T淋巴细胞依赖性的。临床上观察到累及多个器官和系统，包括肾、肺、肌骨骼系统、粘膜皮肤、眼、中枢神经系统、心血管系统、胃肠道、骨髓和血液。
因此，在另一个方面，本发明提供用于治疗和/或预防SLE的方法。所述方法包括给予患有SLE或被鉴定/诊断有发生SLE重大风险的人类患者有效量的抗hNKG2D抗体，以治疗或预防患者的SLE。在一个更具体的方面，所述药剂是抗NKG2D单克隆抗体，所述抗体能够可检测地减少配体诱导的表达NKG2D的白细胞的NKG2D活化和/或削弱NKG2D+T细胞或NK细胞的增殖，而不显著减少这类细胞。所述抗体可以单用或与其它抗SLE药剂联用，例如非甾体抗炎药(NSAID)、镇痛药、皮质类固醇(例如泼尼松、氢化可的松)、免疫抑制药(例如环磷酰胺、硫唑嘌呤和甲氨蝶呤)、抗疟疾药(例如羟氯喹)和抑制dsDNA抗体产生的生物药物(例如LIP 394)。
糖尿病
I型糖尿病或胰岛素依赖型糖尿病胰岛B细胞受自身免疫破坏；这种破坏是由自身抗体和自体反应性T细胞介导的。抗胰岛素或抗胰岛素受体的抗体还可产生胰岛素无应答的表型。
因此，在另一个方面，在足以治疗或预防患者的疾病的条件下将抗NKG2D抗体按一定量递送给患有或有发生I型糖尿病重大风险的患者。所述抗体可以单用或与其它抗糖尿病药联用，例如胰岛素、或β细胞生长或存活因子、或免疫调节抗体例如抗CD3抗体。
移植
移植相关疾病，包括移植排斥反应和移植物抗宿主病(GVHD)，是T淋巴细胞依赖性的；T淋巴细胞功能的抑制是改善性的。
因此，在另一个方面，本发明提供降低移植排斥反应可能性(或降低严重程度或推迟移植排斥相关病症发生的时间，即延长同种异体移植物存活)的方法。所述方法包括给予将要接受或最近接受组织/器官移植的人类患者有效量的抗hNKG2D抗体，以可检测地降低排斥可能性(例如与对照相比)。在一个具体的方面，抗NKG2D抗体能够可检测地减少配体诱导的表达NKG2D的白细胞的NKG2D活化和/或削弱NKG2D+T细胞或NK细胞的增殖，而不显著减少这类细胞。可以治疗的组织移植的实例包括但不限于肝、肺、肾、心脏、小肠和胰岛细胞，以及骨髓移植和移植物抗宿主病(GVHD)的治疗。所述抗体可以单用或与用于抑制移植排斥反应的其它药剂联用，例如免疫抑制药(例如环孢菌素、硫唑嘌呤、甲泼尼龙、泼尼松龙、泼尼松、麦考酚酸酯、西罗莫司、雷帕霉素、他克莫司)、抗感染药(例如阿昔洛韦、克霉唑、更昔洛韦、制霉菌素、甲氧苄啶-磺胺甲恶唑复方)、利脲药(例如布美他尼、呋塞米、美托拉宗)和溃疡药(例如西咪替丁、法莫替丁(farnotidine)、兰索拉唑、奥美拉唑、雷尼替丁、硫糖铝)。对于造血系统移植，可以给予造血生长因子(例如红细胞生成素、G-CSF、GM-CSF、IL-3、IL-11、血小板生成素等)或抗微生物药物(例如抗生 素、抗病毒药、抗真菌药)作为辅助疗法。
其它自身免疫性疾病或炎症性疾病
在其它各个方面，本发明提供用于治疗和/或预防其它自身免疫或炎症性疾病和病症的方法，所述方法包括给予患有所述疾病和病症或被鉴定/诊断有发生所述疾病和病症重大风险的人类患者有效量的抗hNKG2D抗体，以治疗或预防患者的疾病和病症，其中所述疾病和病症是下述的一种疾病和病症。在一个更具体的方面，所述药剂是抗NKG2D单克隆抗体，所述抗体能够可检测地减少配体诱导的表达NKG2D的白细胞的NKG2D活化和/或削弱NKG2D+T细胞或NK细胞的增殖，而不显著减少这类细胞。所述抗体可以单用或与一种或多种用于治疗所述疾病和病症的其它的治疗剂联用。
青少年慢性关节炎是一种慢性特发性炎症性疾病，它常常始于16岁以前。其表型与RA有某些相似性；类风湿因子阳性的一些患者被归类为青少年类风湿性关节炎。该病被细分为三个主要类别：少关节型、多关节型和全身型。关节炎可以很严重，通常是破坏性的，并导致关节强硬和生长迟缓。其它现象可包括慢性前眼色素层炎和系统性淀粉样变。
脊椎关节病是有一些共同临床特征且与HLA-B27基因产物的表达普遍相关的一类疾病。所述疾病包括：关节强硬性脊椎炎、赖特综合征(Reiter′s syndrome)(反应性关节炎)、炎性肠病相关性关节炎、银屑病相关性脊椎炎、青少年起病脊椎关节病和未分化脊椎关节病。区别性特征包括伴发脊椎炎或未伴发脊椎炎的骶髂关节炎；炎症性不对称性关节炎；与HLA-B27(血清学定义的I类MHC的HLA-B基因座的等位基因)相关；眼炎和与其它类风湿性疾病相关的自身抗体缺乏。作为诱发该疾病的关键，牵涉最多的细胞是CD8+T淋巴细胞，这是一种靶向由I类MHC分子呈递的抗原的细胞。CD8+T细胞可反作用于I类MHC等位基因HLA B27，好像它是由MHC I类分子表达的外 源肽。据假设，HLA-B27的表位可模拟细菌或其它微生物抗原的表位，因此诱导CD8+T细胞应答。
尚未得知系统性硬化病(硬皮病)的病因。该疾病的标志是皮肤硬结；可能这是由活动性炎性过程诱发的。硬皮病可以是局部性或全身性的；常见有血管病变，微脉管系统中内皮细胞损伤是系统性硬化症发展中的早期重要事件；血管损伤可以是免疫介导的。皮肤病变中单核细胞浸润物的存在和许多患者中抗核抗体的存在预示了免疫学基础。在皮肤损害中，成纤维细胞的细胞表面上的ICAM-1常常失调，这表明T细胞与这些细胞相互作用可能在该疾病的发病机制中起作用。所涉及的其它器官包括：胃肠道：导致异常蠕动(peristalsis/motility)的平滑肌萎缩和纤维变性；肾：影响小弓状动脉和叶间动脉随之发生肾皮质血流量减少的向心性内皮下内膜增殖，引起蛋白尿、氮血症和高血压；骨骼肌：萎缩、间质纤维化；炎症；肺：间质性肺炎和间质纤维化；以及心脏：收缩带坏死、形成瘢痕/纤维变性。
特发性炎症性肌病包括皮肌炎、多肌炎等导致肌肉虚弱的慢性肌肉炎症的疾病，病因未知。肌肉损伤/炎症常常是对称和进行性的。自身抗体与大部分形式有关。这些肌炎-特异性自身抗体针对并抑制参与蛋白质合成的组分、蛋白质和RNA的功能。
斯耶格伦综合征是由免疫介导的炎症和随后泪腺和涎腺的功能遭破坏所导致。该疾病可能与炎症性结缔组织疾病有关或伴发炎症性结缔组织疾病。该疾病与针对Ro和La抗原产生的自身抗体，两种抗原均为小RNA-蛋白质复合体。病变导致干燥性角膜结膜炎、口腔干燥、伴有其它现象或联合征，包括胆汁性肝硬化、外周神经病或感觉神经病和可触性紫癜。
系统性血管炎是其中主要病变是炎症并随即发生血管损伤的疾病，所述血管损伤导致由受累血管供应的组织出现局部缺血/坏死/变性，并且在一些情况下导致最终的终末器官功能障碍。血管炎也可作为原发病变或其它免疫性炎症性介导的疾病的后遗症发生，例如类风 湿性关节炎、系统性硬化症等，特别是疾病还与免疫复合物的形成有关。原发性系统性血管炎类的疾病包括：系统性坏死性血管炎：结节性多动脉炎、变应性脉管炎和肉芽肿病、多血管炎；韦格纳肉芽肿病；淋巴瘤样肉芽肿病；以及巨细胞性动脉炎。各种血管炎包括：粘膜皮肤淋巴结综合征(MLNS或川崎病(Kawasaki’s disease))、孤立性中枢神经血管炎、贝赫切特病(Behet′s disease)、血栓闭塞性脉管炎(Buerger疾病)和皮肤坏死性小静脉炎。一般认为发病机制所列举的血管炎的大多数类型主要是由于免疫球蛋白复合体沉积在血管壁上并随后通过ADCC、补体活化或两者而引发炎症性反应所导致。
结节病是病因未知的疾病，以机体几乎任何组织中存在的上皮样肉芽肿为特征；肺的受累情况最为普遍。发病机制包括疾病部位活化巨噬细胞和淋巴样细胞的持续存在，继而由这些细胞类型在局部和全身释放活性产物而导致慢性后遗症。
包括自身免疫性溶血性贫血、免疫性各类血细胞减少症和阵发性睡眠性血红蛋白尿症在内的自身免疫性溶血性贫血是抗体产生的结果，所述抗体与红细胞(且在一些情况下还有其它血液细胞包括血小板)表面表达的抗原反应，并且反映了通过补体介导的溶解和/或ADCC/Fc受体介导的机制排除这些抗体覆盖的细胞。
在其它临床情况下，在包括血小板减少性紫癜和免疫介导的血小板减少症在内的自身免疫性血小板减少症中，由于与血小板连接的抗体或补体相继被补体溶解、ADCC或Fc受体介导的机制排除，而出现血小板破坏/排除。
包括格雷夫斯病、桥本甲状腺炎、青少年淋巴细胞性甲状腺炎和萎缩性甲状腺炎在内的甲状腺炎，是针对甲状腺抗原进行自身免疫应答的结果，其中产生与甲状腺中存在并常常是甲状腺特异性的蛋白质发生反应的抗体。现有试验模型包括自发性模型：大鼠(BUF和BB大鼠)和鸡(肥胖鸡品系)；诱导型模型：用甲状腺球蛋白、甲状腺微粒体抗原(甲状腺过氧化物酶)免疫的动物。
免疫介导的肾病，包括肾小球性肾炎和肾小管间质肾炎，是抗体或T淋巴细胞介导的肾组织损伤的结果，或者直接作为针对肾抗原的自体反应性抗体或T细胞产生的结果，或者间接作为针对其它非肾抗原起反应的抗体和/或免疫复合物沉积在肾中的结果。因此引起免疫-复合物形成的其它免疫介导的疾病还可引发免疫介导的肾病作为间接后遗症。直接和间接的免疫机制两者均导致在肾组织中产生/诱发病变的炎症反应，随之发生器官功能受损，并且在一些情况下发展成肾衰竭。体液和细胞免疫机制两者均可参与病变的发病机制。
包括嗜酸性粒细胞性肺炎在内的炎症性和纤维化肺病、特发性肺纤维变性和超敏反应性肺炎可能涉及免疫性炎症反应失调。抑制这种反应可能具有治疗益处。
包括大疱性皮肤病、多形性红斑和接触性皮炎在内的自身免疫性或免疫介导的皮肤疾病是由自身抗体介导的，其发生是T淋巴细胞依赖性的。
包括哮喘、变应性鼻炎、特应性鼻炎、食物过敏反应以及荨麻症在内的变应性疾病是T淋巴细胞依赖性的。这些疾病主要是由T淋巴细胞诱发的炎症、IgE介导的炎症或两者的组合介导的。
适于用人抗NKG2D抗体治疗的其它疾病有病毒性肝炎，参见WO2007130642和Chen等(Hepatology，第46(3)卷，第706-715页(2007))。
应当了解的是，有效量的NKG2D调节剂，以及整个剂量方案，可以根据疾病和患者的临床状态而改变，其继而可反映在一个或多个临床参数中，例如临床上可接受的疾病分值。例如，对于类风湿性关节炎，疾病的严重程度和/或治疗的结果，可通过监测肿胀关节的数目、疼痛、可动性和/或官方疾病分值ACR 20/50或70来评价。对于1型糖尿病，疾病的严重程度和/或治疗的结果可通过测量血葡萄糖水平或其变化、HbIC水平、所需胰岛素的量等来评价。对于多发性硬化、脑炎可通过脑部扫描来评价。对于造血系统移植排斥反应， 疾病的严重程度(移入失败)和/或治疗的结果可通过长时间中性粒细胞减少、血小板减少症和已进行清髓性预处理的患者中红细胞输入依赖的证据，以及通过在已进行非清髓性预处理的患者中观察不到嵌合性来评价。一般来讲，采用本发明的方法和组合物对治疗结果的可检测作用包括对其它治疗需要的降低(包括例如降低其它药物或治疗的量和/或持续时间)、减少住院次数和/或持续时间、减少由于生病失去的工作日等。还要理解的是，有效量可由本领域普通技术人员通过常规试验、通过构建数值矩阵并测定矩阵中的不同点来确定。
剂量
对于抗体的给药，剂量范围为约0.0001-100mg/kg宿主体重，更常常为0.01-5mg/kg。例如，剂量可为约0.3mg/kg体重、约1mg/kg体重、约3mg/kg体重、约5mg/kg体重或约10mg/kg体重或在1-10mg/kg的范围内。示例性治疗方案需要每周两次、每周一次、每两周一次、每三周一次、每四周一次、一月一次、每三月一次或每3-6个月一次给药。本发明的抗hNKG2D抗体的优选剂量方案包括约1mg/kg、3mg/kg或10mg/kg体重经静脉内给药或皮下注射，采用下列剂量方案给予所述抗体：(i)负荷剂量每1-3周2-4次剂量，然后每两周；月(ii)每四周；(iii)每周，或任何其它最佳剂量。在一些方法中，同时给予两种或更多种具有不同结合特异性的单克隆抗体，在此情况下，所给予的各抗体的剂量落入规定的范围内。抗体常常以多次给予。单剂量间的间隔可为例如一周一次、一月一次、每三月一次或一年一次。间隔也可以是不定期的，如通过测定患者体内抗靶抗原抗体的血液水平所表示的一样。在一些方法中，调整剂量以达到约1-1000μg/ml的血浆抗体浓度，在一些方法中约25-300μg/ml。或者，可以缓释剂型给予抗体，在此情况下，只需要较不频繁的给药。剂量和频率随抗体在患者体内的半寿期而变化。一般来讲，人抗体具有最长的半寿期，接着是人源化抗体、嵌合抗体和非人类抗体。给药的剂量和频率可随 治疗是否是预防性还是非预防性(例如治标性或治愈性)而变化。在预防应用中，在一段长的时间内以相对不频繁的间隔给予相对低的剂量。一些患者在他们生命的其余时间内继续接受治疗。在治标性或治愈性应用中，有时在相对短的间隔内需要相对较高的剂量，直到疾病发展减缓或停止，优选直到患者的疾病症状显示出部分或完全完善。此后，可以给予患者预防性方案。
抗炎药的适当剂量大致可为已应用于临床疗法中的剂量，其中单独或与其它药剂组合给予抗炎药。剂量的改变很可能取决于要治疗的病症。提供治疗的医师将能够确定用于各受治疗者的剂量。
制造品
在本发明的另一个实施方案中，提供含有用于治疗上述疾病的材料的制造品。例如，制造品可包括装有本文所述的人或人源化抗hNKG2D抗体以及说明书的容器，说明书指导使用者用有效量的抗体治疗人的例如自身免疫或炎症性疾病和病症。制造品通常包括容器以及容器中或附在容器上的标签或包装说明书。合适的容器包括例如瓶、小瓶、注射器等。容器可由各种材料例如玻璃或塑料加工成形。容器装有有效治疗疾病的组合物，并且可具有无菌接口(例如容器可以是静脉内溶液袋或小瓶，袋或小瓶上有皮下注射针可刺穿的塞子)。所述组合物中至少一种活性剂是本文的人或人源化抗hNKG2D抗体、或包含这类抗体的抗原结合片段或抗体衍生物(例如免疫缀合物)。标签或包装说明书说明组合物用于治疗特定的疾病，例如类风湿性关节炎。
此外，制造品可包含(a)组合物装在其中的第一容器，其中所述组合物包含本文的人或人源化抗体，和(b)组合物装在其中的第二容器，其中所述组合物包含人或人源化抗体以外的治疗剂。在本发明这个实施方案中的制造品另外还装有包装说明书，说明第一组合物和第二组合物可联用以治疗自身免疫或炎症性疾病和病症。这类治疗剂可以是 前一部分中所描述的辅助疗法中的任一种。或者另外，制造品还可包括装有药学上可接受的缓冲剂的第二(或第三)容器，例如抑菌注射用水(BWFI)、磷酸缓冲盐溶液、林格液和葡萄糖溶液。还可以包括从商业和使用者立场看是需要的其它材料，包括其它缓冲剂、稀释剂、过滤器、针和注射器。
实施例
通过下面的非限制性实施例说明本发明的更多详情。
实施例1：抗hNKG2D人单克隆抗体的产生和初步筛选
材料与方法
抗原。使用可溶性NKG2D-hFc融合蛋白(R&D，目录号：1299-NK)或细胞(NK、BAF或CHO)表面表达的NKG2D作为用于免疫接种的抗原。BAF细胞用全长NKG2D和DAP10共转染。将CHO细胞在无DAP10的条件下用转移到细胞表面的NKG2D点突变体转染(Wu等，Science1999；385：730-2)。NK细胞是天然表达NKG2D的原代NK细胞。
小鼠。在表达人抗体基因的转基因小鼠KM mouseTM品系中产生抗NKG2D的完整人单克隆抗体(Ishida等人的PCT公开文本WO02/43478)。在该小鼠品系中，按照Chen等人((1993)EMBO J.12：811-820)所述方法，将内源性κ轻链基因经纯合破坏，按照PCT公开文本WO 01/09187实施例1中所述的有关Humab小鼠的方法，将内源性小鼠重链经纯合破坏。小鼠品系携带了人κ轻链转基因KC05，参见Fishwild等(1996)Nature Biotechnology 14：845-851。小鼠品系还携带人重链转染色体SC20，参见WO0243478。
免疫接种。在第一系列的免疫中，经腹膜内交替注射NKG2D转染的BAF细胞和NKG2D转染的CHO细胞，或者含有或不含任何佐剂的原代人NK细胞使动物免疫。用5x106个细胞每周或每隔一周经 腹膜内使每只小鼠免疫(共6次)。小鼠处死前3天和2天用5x106个NKG2D转染的BAF细胞静脉内加强免疫，取出脾脏。动物试验遵照丹麦国家研究委员会准则(DanishNational Research Council guidelines)进行。
在第二系列的免疫中，用具有不同佐剂的NKG2D-hFc经腹膜内和在足部(footpath)使动物免疫。用7x 25μgNKG2F-hFc/Ribi/腹膜内/皮下、1x 25μg NKG2D-hFc/CFA/腹膜内/皮下、1x 25μg NKG2D-hFc/IFA/腹膜内/皮下、1x 30μg抗CTLA4+40μg NKG2D-hFc/IFA/腹膜内/皮下、1x 25μg NKG2D-hFc/Ribi/腹膜内/皮下使每只小鼠免疫，处死前3天和2天用2x 30μg/PBS/腹胀内/静脉内加强后，取出脾脏。动物试验遵照美国国家研究委员会准则(American National Research Council guidelines)进行。
小鼠血清的筛选。通过流式细胞分析，筛选来自免疫小鼠的有NKG2D特异性的血清，测定选定血清抑制MICA配体结合的能力，参见实施例3。选出产生特异性结合NKG2D并抑制MICA结合的高效价抗体的小鼠用于产生杂交瘤。
杂交瘤的产生。将各个选出的免疫小鼠的脾脏匀浆，脾细胞的单细胞悬液用来与X61Ag8653骨髓瘤细胞(ATCC，CRL 1580)融合。按照之前所述方法(HarloW和Lane，ANTIBODIES：A LABORATORY MANUAL，Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Harbor，N.Y.，(1988))，使用聚乙二醇(PEG)1500进行融合，电融合采用CytoPulseTM CEEF-50电融合系统(Cyto Pulse Sciences，Inc.)进行。
将融合的细胞最初接种在96孔组织培养板上补充了10％FBS和5％origin(杂交瘤克隆因子，BioVeris)的选择性DMEM HAT培养基中。将板孵育10-14天，收获前分别将培养基更换成补充了5％FBS和0.7％origin的DMEM HT培养基1-2次，并筛选上清液。使测定为阳性的克隆增殖，并通过有限稀释进行亚克隆直到形成稳定的克隆。通过FACS分析，继续对选定克隆进行针对抗NKG2D特异性抗体的 存在及其抑制MICA结合的能力的筛选。
杂交瘤上清液的筛选。来自第一系列免疫的杂交瘤上清液的初步筛选采用直接ELISA或流式细胞分析(FACS)进行，以测定抗NKG2D特异性抗体的存在。简单地说，通过将maxisorp板用50μl 0.4μg/ml mFc-NKG2D(包含与鼠Fc融合并在CHO细胞中表达的NKG2D的胞外部分)在PBS中于4℃包被过夜，接着用PBS、0.05％吐温20在室温下封闭15分钟，来进行ELISA。随后将板与50μl杂交瘤上清液一起孵育，并使用特异性山羊抗人IgG-HRP Fcγ片段(Jackson，109-036-098)检测NKG2D特异性抗体。这些孵育在室温下进行1小时，每个步骤之间，将板用PBS、0.05％吐温20洗涤。使用100μl TMB底物(Kem-En-Tec)观测结合的抗体，用4M H3PO4终止。在450nm和620nm下读板。对于FACS，通过将10μl 50000个细胞与90μl杂交瘤上清液在4℃下孵育30分钟，接着用含2％FCS的PBS洗涤，随后与特异性第二山羊抗人IgG-HRP Fcγ片段(Jackson，109-036-098)一起孵育，对与表达NKG2D的BaF/3细胞的结合和与不表达NKG2D的对照BaF/3细胞的结合进行了分析。然后在B&D FACSArray(BDBiosciences)上对细胞进行了分析。仅使表达NKG2D的BaF/3细胞染色但不使对照细胞染色的抗体视为有NKG2D特异性。
对第二系列的免疫的初步筛选是直接EISA以测定抗NKG2D特异性抗体的存在。简单地说，通过将maxisorp板用1-2mg/ml hFc-NKG2D(R&D Systems)在PBS中于4℃包被过夜，接着用PBS、0.05％吐温20、5％鸡血清在室温下封闭30-60分钟，来进行ELISA。随后将板与50μl杂交瘤上清液和50μl封闭缓冲液一起孵育，并使用抗人IgG-HRP(Bethyl，A80-115P)的封闭缓冲液检测NKG2D特异性抗体。这些孵育在室温下进行1小时，每个步骤之间，板用PBS、0.05％吐温20洗涤。使用ABTS底物(Moss Inc，产品：ABTS-1000)，观测结合的抗体。用Molecular Devices软件在415nm下读板。
如上所述，使用FACS对自ELISA初步筛选选出的杂交瘤进行 第二次筛选。
使用市售鼠抗体(149810和ON72)作为对照。
结果
通过NKG2D结合和配体阻断能力，鉴定免疫小鼠的高选择性血清(示例性结果见图1A和图1B)，将选定小鼠用于融合和产生杂交瘤。通过ELISA和流式细胞术筛选出约2500个杂交瘤，并对NKG2D特异性克隆进行了鉴定。图2表示与市售抗体(149810)相比，杂交瘤上清液中的人抗体与表达NKG2D的细胞结合，但不与NKG2D阴性细胞结合。选择来自第一系列免疫的3种杂交瘤的抗体(16F16、16F31和21F2)，和来自第二系列免疫的若干种抗体(包括MS)用于重组体产生和进一步试验。
实施例2：重组体产生和测序
从各轮免疫中获得第二批数百个来自表达人抗体的融合小鼠脾脏的杂交瘤。按照实施例1中所述的同样方法，应用FACS，从中筛选出特异性NKG2D。选择来自一种杂交瘤的抗体MS用于重组体产生和进一步试验。
通过PCR和随后对来自杂交瘤mRNA的分离产物进行测序，鉴定抗体的重链和轻链的可变区。
材料与方法
RNA纯化。按照生产商说明书，使用来自Qiagen的RNeasy，对总RNA进行了纯化，但不同的是从该方法中省略β-巯基乙醇。通过分光术(260/280nm，1.8＜比率＜2.0)检查RNA的品质，偶尔使用生物分析仪(bioanalyser)评价RNA降解。
RT-PCR。通过SMART-RACE(来自Clonetech的试剂盒)，合成了全长cDNA。
PCR。PCR用来自Clonetech的HFII聚合酶进行。使5’引物(具 有EcoRI)退火至在SMART-RACE期间导入的保守序列中。分别设计退火至IgG(VH)和κ链(VL)保守区的两个3’引物。限制位点同样存在于3’引物上(BsiWI(VL)和NheI(VH))。对于所有的VH和VL扩增，都进行一式两份PCR(以检查PCR引起的突变)。如果PCR反应失败，则使用来自Novagen的简并5’引物混合物使VL和VH扩增。
PCR产物纯化。将PCR产物(约550bp)在1％琼脂糖凝胶上分离，切取，在GFX柱(来自Amersham)上纯化，用不含DNA酶的水洗脱。
连接。PCR产物和表达载体(耐氨苄西林)用合适的限制性内切酶切割(VH，EcoRI+NheI，VL，EcoRI+BsiWI)。通过T4-连接酶(Roche)催化使可变结构域连接至同种型-dictating载体(对于NKG2D为IgG4)。所使用的质粒是pTT5(Durocher等，Nucleic AcidsRes 2002；30(2)：e9；Pham等，Biotechnol Bioeng 2003；84(3)：332-42)。
检查表达载体中的插入序列(集落PCR)。用连接混合物转化感受态大肠杆菌(Top10)，对氨苄西林抗药性克隆进行过夜选择。总计挑选出VH和VL的8个阳性集落。通过菌落PCR和凝胶电泳(1％琼脂糖)，检查全部菌落中插入序列是否与预期大小匹配。
测序/小提试剂盒。制备全部阳性菌落PCR的等分样品用于测序(使用ExoSAPit)。对每个克隆总计32种PCR产物进行了测序((8*VH+8*VL)*2(PCR一式两份))。对序列进行了分析(使用VectorNTI)，使对应于已克隆的VH和VL的阳性细菌克隆放大增殖(小提/大提)，将纯化的DNA用于HEK293/6E转染(GFX柱)。如果鉴定出不止一种VH和VL序列，则在HEK293/6E细胞中表达所有可能的VL和VH组合。
重组体产生。将鉴定出的重链可变区和轻链可变区分别插入重链和轻链人IgG4构架中，并在HEK293细胞中从两个载体中以高水平表达。使抗体在A蛋白柱上进行纯化。
HEK293/6E细胞中的抗体表达。使HEK293细胞在来自Gibco的Freestyle293培养基中传代。在转染当天，将细胞稀释至1x 106个 细胞/ml的浓度。对于30ml转染，将15μg重链载体和15μg轻链载体与2ml Opti-MEM和40μl 293fectin混合(然后Freestyle293培养基加至总体积30ml)。孵育6天后，通过离心(1000rpm，10分钟)使细胞沉淀，收获上清液用于A蛋白纯化。
纯化。将人抗体的重组表达的IgG4变体在MabSelectTM SuRe蛋白A柱上纯化。在柱中使用抗体后，用10倍柱体积的PBS缓冲液洗涤柱，抗体用100mM甘氨酸、100mM NaCl缓冲液(pH 3.0)洗脱，接着使用HighTrapTM脱盐柱将缓冲液换成PBS缓冲液。全部操作用来自GEHealthcare Amersham Biosciences AB的系统控制。
纯化抗体典型的浓度范围为10-130mg/l(0.3-3.3mg/30ml)。
结果
编码16F16(IgG4)H链、16F16L链、16F31(IgG4)H链和16F31L链的cDNA序列分别如SEQ ID NO：3-6所示，16F16(IgG4)、16F31(IgG4)、MS(IgG4)和21F2(IgG4)的全长氨基酸序列、可变氨基酸序列和CDR氨基酸序列相应的序列标识符见表1。图4表示IgG4同种型16F16、16F31、MS和21F2的氨基酸序列，突出显示可变区(粗体字)和CDR(粗体字下划线)区。
应用Ohm-Laursen等人(Immunology 2006；119：265-77)描述的IgH连接组成(ioint composition)的JointMLc算法和D分类法，鉴定下列种系序列16F16和16F31的可变区：
16F16VH：VH3_21/D3-9/JH4(分别为SEQ ID NO：31/32/33)
16F16VL：VKI_L15/JK2(分别为SEQ ID NO：34/35)
16F31VH：VH3_20/D3-10/JH6(分别为SEQ ID NO：36/(EL)/37)
16F31VL：VKIII_A27/JK3(分别SEQ ID NO：38/39)
MS VH：VH4_59/D3_27_R3/JH3(分别为SEQ ID NO：64/(NWG)/65)
MS VL：VKIII_A27/JK1(分别为SEQ ID NO：38/66)
21F2VH：VH5_51/D3_10_R3/JH4(分另为SEQ ID NO：67/68/33)
21F2VL：VKIII_L6/JK1(分别为SEQ ID NO：69/66，)
VH和VL序列与表明体细胞高变的相应重组种系序列(SEQ ID NO：27-30分别对应于重组VH3_21/D3-9/JH4、VKI_L15/JK2、VH3_20/D3-10/JH6和VKIII_A27/JK3，SEQ ID NO：60-63分别对应于重组VH4_59/D7_27_3/JH3、VKIII_A27/JK1、VH5_51/D3_10_R3/JH4和VKIII_L6/JK1)的比对参见图5A-5H。
实施例3：MICA阻断试验
材料与方法
流式细胞术测定法-MICA阻断。为了分析配体结合的阻断，将50000个表达NKG2D/DAP10的BaF/3细胞在总计100μl(含2％FBS的PBS(pH7.4))中与变化量的杂交瘤上清液或纯化抗体一起在16℃下孵育1小时，接着与mFc-MICA(对于人抗体)或hFc-MICA(对于ON72)(1μg)在4℃下孵育30分钟。之后洗涤细胞，加入特异性第二山羊抗小鼠IgG-HRP Fcγ片段(Jackson(109-036-151))以检测MICA-mFc的结合。然后将细胞在B&D FACSArray流式细胞仪中进行了分析。对通过预孵育减少MICA结合的程度进行分析，用有预孵育的结合MFI(平均荧光强度)与无预孵育的MICA结合的MFI的百分比表示。
还绘制了更详细的剂量反应曲线，分析了50％抑制(IC50)及完全阻断1μg MICA-mFc结合所需要的重组表达并纯化的抗体的浓度。
结果
分析了抗体阻断配体结合的能力。图6表明与杂交瘤上清液预孵育实际阻断配体MICA的全部结合。使用重组表达的抗体，绘制了剂量反应曲线，显示IC50以及在0.017nM和0.2nM 16F16下与在0.16nM和0.7nM 16F31下，NKG2D与饱和剂量的MICA-mFc(1μg)的结 合被完全阻断(图7)。ON72的相应结果IC50分别为0.02nM和0.24nM，完全阻断为1μg MICA-Fc。详细结果参见下表2。MS和21F2的IC50最低，分别为0.0016nM和0.0048nM。
表2
实施例4：与鼠抗体竞争
材料与方法
流式细胞术测定法-与鼠抗体竞争。为了分析市售鼠抗hNKG2D抗体的阻断，将50000个表达NKG2D的细胞在最终100μl(含2％FBS的PBS(pH7.4))中与杂交瘤上清液或纯化和重组表达的抗体(0.3μg或按规定)一起在16℃下孵育1小时，接着与鼠抗hNKG2D抗体(ON72、149810、1D11或5C6(对于1D11和5C6参见例如Bauer等，Science1999：285：727-9和WO02068615)；0.3μg或按规定)一起在4℃下孵育30分钟。之后洗涤细胞，加入特异性第二山羊抗小鼠IgG-HRP Fcγ片段(Jackson(109-036-151))以检测鼠抗体的结合。在B&DFACSArray上对细胞进行了分析。通过与鼠抗体接着与杂交瘤上清液或纯化的人抗体预孵育，使用用于检测的特异性第二山羊抗人IgG-HRP Fcγ片段(Jackson，109-036-098)，来进行该方案。分析了通过预孵育引起的结合减少的程度，用有预孵育的结合MFI与无预孵育的结合MFI的百分比表示。
结果
细胞与杂交瘤上清液预孵育接着与ON72孵育表明，95％的ON72 结合被阻断(图8)。用重组表达的16F16抗体进行相同类型的试验表明16F16阻断95％的ON72结合，而与ON72预孵育只阻断82％随后的16F16结合(图9A)。同样，对于149810和16F16，观察到两种抗体仅有约50％阻断，与孵育的顺序或相对抗体浓度无关(图9A)。对于其它可获得的鼠抗hNKG2D抗体，表2提供了交叉抑制，表明通过1D11和5C6几乎完全阻断ON72，149810阻断约85％。用重组表达的MS进行相同类型的试验表明，与MS预孵育抑制98％的ON72结合、88％的1D11结合和96.5％的149810结合(图9B)。
表3
实施例5：血细胞结合和与猴NKG2D的交叉反应性
材料与方法
流式细胞术测定法-人和猴PBMC。从人或从食蟹猴或猕猴中分离出外周血单核细胞(PMBC)。全部动物操作都遵照丹麦国家研究委员会准则进行。每个PBMC样品都用不同细胞亚群的标记(NK、CD8+、CD4+和γδT细胞)进行标记，以及对于NKG2D，或用ON72或用重组表达并纯化的16F16标记。细胞经洗涤后，在BD FACSDiva(BD Biosource)上对带有两种抗体的NKG2D的细胞亚群进行了染色分析。计算出各个抗体染色的MFI。
在独立的试验中，通过加入整个剂量范围的MS或21F2，接着用抗人IgG4抗体检测，测定了MS和21F2与PBMC制备物和来自健康志愿者或食蟹猴的全血两者的结合，计算出EC50值。简单地说，与抗体的孵育在4℃下进行30分钟，接着洗涤，然后加入直接标记的第二抗hIgG4抗体，与对各种目标细胞群CD8、CD4、NK和γδ-T细胞有特异性的抗体一起在4℃下孵育30分钟，然后将细胞在含2％FCS 的PBS中洗涤两次，使红细胞裂解。然后通过流式细胞术对细胞进行分析，并评价了与不同细胞群的结合。
结果
16F16和ON72的结果见图10A-10D。所有NK和CD8+T细胞对于NKG2D染色呈阳性，而在食蟹猴或猕猴PMBC中无CD4+T细胞染色阳性。对于平行进行的人PBMC获得了相同的结果。这与参考文献一致，即在人体中，NKG2D在NK细胞和CD8+T细胞上正常表达，但是不在CD4+T细胞上表达。
来自食蟹猴和猕猴的PBMC用ON72或16F16的染色表明，两种抗体与NK细胞和CD8+T细胞有类似的结合，但却不与CD4+T细胞结合。这些结果证实两个猴品系是毒性研究的合适物种。
用市售抗体或16F16或16F31中的任一种均未观察到与小鼠、大鼠、狗或猪NKG2D的交叉反应性。
MS与人和食蟹猴CD8T细胞结合的结果分别见图11A和11B，MS和21F2与PBMC制备物结合的EC50值以及食蟹猴与人细胞的相对EC50值(％)见下表4。这表明了MS和21F2两者对人和食蟹猴NKG2D的亲和力非常相似。
表4
实施例6：生物测定法
为了测定完整人抗体的确阻断NKG2D的活性，开发出NKG2D配体驱动的细胞毒性测定法。采用51Cr释放测定法，其中靶细胞加载了放射性染料，测定其释放作为NK杀死细胞的结果。
材料与方法
NKG2D-MICA相互作用介导的杀死测定法。用于测定NKG2D配体介导的杀死靶细胞的生物测定法适于测定抗NKG2D抗体。NK细胞系NK92或NKL(ATCC编号CRL-2407；Robertson等，Exp Hematol 1996；24：406-15)均以NKG2D依赖性方式杀死MICA转染的BaF/3细胞，并可用作效应子细胞，杀死表达NKG2D配体(MICA、MICB或ULBP1-4任一种)的加载51Cr的靶细胞。
在第一项测定中，在1μg或5μg ON72或重组表达的IgG4同种型16F16存在或不存在时，将NKL细胞以比率10∶1与加载51Cr的表达MICA的BaF/3细胞一起孵育4小时。孵育后，将上清液转移到微量滴定板中，加入闪烁液，在Topcounter(Wallach)中测量释放的51Cr，作为杀死靶细胞的结果。51Cr释放的减少衡量通过加入的抗体对杀死的抑制，计算杀死细胞的百分比。
在第二项测定中，将NK-92细胞与表达51Cr标记的MICA或ULBP3的BaF/3细胞一起孵育，通过加入浓度递增的重组表达并纯化的IgG4同种型的16F16、16F31、MS或21F2使杀死减少。结果用抑制杀死％表示。
结果
使用ON72或16F16，加入配体阻断抗体，以剂量依赖性方式阻断携带MICA的细胞被NKL细胞杀死，用抑制杀死％表示(参见图12)。不表达MICA的对照细胞不被NKL细胞杀死。
16F16也以剂量依赖性的方式抑制携带MICA的BaF/3靶细胞和携带ULBP的BaF/3靶细胞被NK-92细胞杀死(图12A和12B)，用抑制杀死％表示，其中在0.8μg/ml时几乎完全阻断MICA-NKG2D和ULBP-NKG2D两者诱导的杀死。在测定的最大剂量下，16F31(IgG4)阻断约75％的杀死(20μg/ml；图13A和13B)。
如图14A所示，在51Cr释放测定法中，MS和21F2均抑制携带 ULBP3的细胞被K-92细胞杀死。在图14A中，细胞毒性的阻断用抑制％表示，其中0为不加抗体时两种细胞一起孵育，其中MS更为有效。如图14B所示，在51Cr释放测定法中，在极低浓度的MS(0.01μg/ml)下获得携带配体(MICA-)的细胞被NKL细胞杀死的最大抑制，而最高测试浓度的16F16(0.1μg/ml)仅导致约40％抑制。IC50数据概述见表5。
表5
实施例7：抗体诱导的NKG2D下调
当将表达hNKG2D的细胞与抗体一起孵育时，显示以类似于之前小鼠模型中某些抗mNKG2D抗体所示的方式出现下调，例如通过NKG2D的内化。可能导致不同的作用方式和可能较长的抗体作用时间，在此，通过测定在与抗体过夜孵育后降低了多少NKG2D水平，对下调进行了分析。
材料与方法
流式细胞术测定法-下调。在不同类型的表达NKG2D的细胞中，通过与ON72、16F16、16F31、MS或21F2过夜孵育，对抗体介导的NKG2D下调进行了分析。在不受理论的束缚下，下调中的差异可以反映抗原相互作用(例如表位)的差异。人抗体作为IgG4同种型重组表达，该同种型结合Fc受体的亲和力低下。
在第一项测定中，将含有1μgON72或16F16；3μg 16F31；0.1μg MS；或者0.3μg或1μg21F2的1mL，加入表达NKG2D的细胞和表达DAP10的细胞中。
在第二项测定中，在存在10％人血清以模拟全血的情况以及存在对Fc受体具有较高亲和力的IgG下，将新鲜制备的NK细胞与不同量的MS(0μg、0.003μg、0.01μg、0.03μg、0.1μg、0.3μg、1μg)或21F2(0.1μg)一起孵育。
在第三项测定中，将0.1μg/ml MS、ON72或21F2加入含有NK、CD8+和γδT细胞的全血中。孵育后，用已鉴定出与各种亚型结合的抗CD8抗体、抗CD56(NK细胞)抗体、抗γδ抗体和抗人抗体染色。
作为上述试验的对照，使未处理的细胞置于37℃下过夜。次日，将未处理细胞和抗体处理细胞两者与0.1μg预处理抗体孵育，接着与特异性山羊抗小鼠IgG-HRP Fcγ片段(Jackson(109-036-151))一起孵育以检测ON72，或与特异性山羊抗人IgG-HRP Fcγ片段(Jackson(109-036-098))孵育以检测人抗体。然后，细胞经洗涤后，在B&D FACSArray上进行了分析。对未处理和抗体处理的染色水平的染色差异进行了分析，以衡量NKG2D下调，在将预处理与未处理细胞的染色相比较后，计算保留在细胞表面上NKG2D百分比为％染色。
结果
如图15所示，在表达NKG2D的BAF/3细胞中，ON72、16F16和16F31全都诱导NKG2D下调。对于ON72和16F31，观察到约55％下调，相比之下使用16F16约75％下调。这表明了16F16更有效地诱导下调，因为16F16具有类似于ON72的Kd值。在不受理论的束缚下，可能是由不同的结合表位所导致。在与MS孵育后，表面NKG2D降低约95％(图16A)。在血清存在时，在新鲜分离的NK细胞中，只对应于饱和(0.03μg/ml)约60％的MS浓度诱导细胞表面NKG2D的最大内化，在这种情况下，在与抗体过夜孵育后，仅可获得约35％NKG2D用于结合(图16B)。对于21F2，在血清不存在时，1μg/mL的浓度诱导NKG2D 78％(图17)下调。
在全血的3个不同的NKG2D+淋巴细胞群中，在24小时时，观察到MS和21F2约80％内化，而ON72诱导的内化达几乎100％(图 18)。另外，ON72诱导的内化比MS和21F2的快(图18)，在1小时内达到50-75％。
实施例8：非耗尽性IgG4形式的人抗体
血液中抗体交联的细胞可引起结合抗体的细胞耗尽(depletion)。然而，IgG4抗体与活性Fc受体的亲和力与IgG1的相比较低，以致IgG4抗体不会引起消耗。
材料与方法
全血细胞消耗试验。为了证实表达NKG2D的细胞不耗尽，将人全血与1μg IgG4形式的人抗体一起孵育4小时，分析了NKG2D阳性和NKG2D阴性细胞的相对分布，并与在抗体不存在时人全血的孵育相比较。然后可采用实施例4所述分析法进行评价。
实施例9：亲和力测定
在Biacore 1000upgrade仪器(Biacore GE Healthcare；Biacore UpgradeCA0396)上，在25℃下进行了表面等离子共振测量。在所有Biacore试验中，HBS-EP缓冲液(Biacore GE Healthcare；BR-1001-88)用作电泳缓冲液，用Biaevaluation 4.1软件对传感图进行分析。
蛋白质固定化。重组MICA-Fc蛋白从R&D Systems获得，或者经重组产生。重组ULBP-1、ULBP-2、ULBP-3、MICB和NKG2D-Fc购自R&D Systems。将重组NKG2D-Fc蛋白共价固定在传感器芯片CM5(Sensor Chip CM5)(Biacore GE Healthcare；BR-1000-14)的葡聚糖层的羧基上。传感器芯片表面用EDC/NHS(N-乙基-N’-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺(Biacore GE Healthcare；BR-1000-50))激活。将蛋白质在偶联缓冲液(10mM乙酸盐，pH 5.2)中稀释至10μg/ml并注入，直到达到适当的固定化水平(即500-1000RU)。使用100mM乙醇胺(pH 8)(Biacore GE Healthcare；BR-1000-50)，使余留的活化基团钝化。
亲和力测量。将均重组表达成IgG4同种型的人抗体16F16、16F31、MS和21F2，与鼠抗体ON72相比较。对于动力学实验，将连续稀释的可溶性抗体(自0.3到30nM不等)以40μl/分钟的恒定流速，注入含有固定化NKG2D-Fc蛋白(500至1000RU)的葡聚糖层2分钟，并使之解离3分钟后，重新注入500mM NaCl和10mM NaOH缓冲液8秒种。利用Langmuir模型的整体拟合，对所得传感图进行了分析。计算解离常数(KD)为KD＝kd/ka。
位于细胞膜的NKG2D的亲和力。绘制抗体与表达NKG2D的细胞结合的完整剂量反应曲线以分析对天然存在的受体的结合亲和力。
结果
16F16的亲和力测定结果见表6A，在Biacore中，在芯片上两个不同的NKG2D密度表明亲和力高(KD 1.72E-10M)，解离速率慢(kd3.7E-5/s)。ON72类似，其ka＝9.6E5/(M*s)、kd＝1.1E-4/s、KD＝1.7E-10M。然而，MS和21F2两者具有较高的亲和力(KD分别为2.52E-12M和7.79E-11M)，MS的解离速率较慢(kd 1.45E-05/s)(表6B)。
图3表明，采用流式细胞术，与市售鼠抗体(ON72和149810)相比，重组产生并纯化的人抗体16F16、16F31、MS和21F2与表达NKG2D和DAP10的BaF/3细胞呈剂量依赖性NKG2D结合。结合的EC50值见下：
16F16：0.051μg/ml(0.034nM)
16F31：0.31μg/ml(0.21nM)
MS：0.032μg/ml(0.021nM)
21F2：0.033μg/ml(0.023nM)
ON72：0.062μg/ml(0.048nM)
149810：0.063μg/ml(0.042nM)。
表6A
16F16 NKG2D结合的Biacore分析
表6B
MS和21F2NKG2D结合的Biacore分析
实施例10-固定化抗NKG2D抗体的激动剂活性
为了分析抗体激动活性，在固定化抗NKG2D抗体存在或不存在时，使用CD28作为对照，对用低水平CD3刺激的外周血淋巴细胞(PBMC)的增殖进行了评价。刺激在其中已表明NKG2D起共刺激分子作用的情况下进行(Mashoo等，Immunol.2005；174；4480-4484)，据信反映了在促炎细胞因子存在下促发了NKG2D，正如在慢性炎症性病症下一样。在该试验中，用表面结合的抗体刺激PBMC 3天，接着IL-2刺激4天，在所有淋巴细胞、CD8+或CD4+T细胞中通过CFSE稀释对增殖进行了评价。
材料与方法
PBMC增殖试验。通过梯度离心将PBMC纯化。96孔Maxisorp板用抗Fc抗体(Jackson-Immuno Resarch 115-006-008)包被，然后洗涤，接着加入抗CD3(0.1ng/ml或0.3ng/ml，Bioscience目录号14-0037-82)、抗NKG2D(MS或ON72，0.2μg/ml)和/或抗CD28抗体(0.2μg/ml，Becton Dickison目录号348040)。将150000个PBMC加 入各孔中，将细胞在37℃下孵育3天。然后用CFSE(分子探针，目录号C34554)标记细胞。将10x 106个细胞在0.5ml1μM CFSE中于37℃孵育10分钟，接着洗涤，将60孔板中的150.000个PBMC/孔与IL-2(10U/ml)孵育4天。最后，用抗CD8抗体和抗CD4抗体染色细胞，在所有淋巴细胞(汇总于图19)或者CD8+或CD4+T细胞(得到相似结果)中，通过CFSE稀释测量增殖。
结果
如图19所示，在0.1ng/ml或0.3ng/ml CD3刺激下，MS不会显著共刺激淋巴细胞的增殖，而在两种CD3浓度下，ON72引起小但明显的共刺激。参见表7。在两种情况下，对照、抗CD28提供强的共刺激，抗NKG2D不会对之有显著加强。这表示两种抗体的结合方式中存在差异，其中固定化的ON72具有可检测的激动活性，而MS则是较纯粹的拮抗剂。
表7
PBMC增殖试验的结果
实施例11-在与MS-Fab的复合体中可溶性hNKG2D的晶体结构
用X射线晶体学检测，对与人单克隆抗体MS的Fab片段的复合体中hNKG2D的可溶性片段的晶体结构进行了解析并精修(refine)达到分辨率结果证实当抗体与hNKG2D结合时，阻断MICA分子的结合(图20-22)。研究还表明，每个hNKG2D二聚体仅与一个MS Fab片段结合。MS Fab部分主要与两个hNKG2D单体之一(“NKG2D单体单元1”)结合，但是，尽管它只与另一个单体(“NKG2D单体单元2”)发生弱的相互作用，任何更多的MS Fab都由于结合单体单元2而被阻断。
本实施例所提及的系列参考文献见实施例12。
材料与方法
将可溶性hNKG2D(SEQ ID NO：2的残基89-216)和MS Fab(包含对应于SEQ ID NO：41的轻链和对应于SEQ ID NO：40的残基1-213的重链片段)混合，其中hNKG2D的摩尔浓度略微过量，将复合体在凝胶过滤柱上纯化。然后将复合体浓缩至约9.5mg/ml。在17％PEG3350、200mM丙二酸钠和100mM bis-tris-丙烷缓冲液(pH 7.5)中采用悬滴技术使晶体生长。将晶体转移到含有75％沉淀剂溶液和25％甘油的低温溶液(cryo-solution)中。使晶体浸泡约15秒钟。然后将晶体在液氮中速冻，并在通过低温氮气流采集数据期间保持在100K下。收集晶体学数据，分辨率最初在Rigaku 007HF旋转阳极靶(rotating anode source)中为此后，使用新的晶体，在MAX-试验室(MAX--lab，Lund，Sweden)的beam-lineBL911-3(2)下分辨率达到数据的空间群确定、积分和定标用XDS软件包(3)进行。确定同步加速数据的晶胞参数分别为90°、102.62°和90°。应用CCP4套件(7)的MOLREP(4)和PHASER软件程序(5；6)，采用来自PDB保藏的(8)结构1L71(9)的Fab分子与来自保藏的1MPU结构(10)的hNKG2D分子的分子置换测定结构。将Fab分子分成两个结构域， 可变结构域和恒定结构域，对于NKG2D，单体在分子置换计算中用作检索模型(search model)。应用REFMAC5软件程序(11)进行晶体学精修，接着是应用Coot软件程序(12)对电子密度图进行计算机图形检查、模型校正和构建。使该步骤循环直到不能对模型作更多重大改进。利用旋转阳极数据，对C2空间群的结构作初步解释。虽然其同步加速数据XDS(3)表明非中心单斜晶空间群，但仍对空间群P2中的数据积分，稍后变成P21。C中心的斜方晶胞的标度也不高。而且当检验同步加速数据时，POINTLESS软件(13)给出P21作为正确的空间群。利用C2空间群中在第一轮分子置换中建立的初步模型，将PHASER软件程序用于新一轮的分子置换。分子置换成功完成，但是因为在精修期间R值和无R值(试验观察数据与模型计算数据的比较)未如预期一样降低(R值和无R值为0.35和0.43)，尽管电子密度图合理，因此开始进行更多数据研究和精修。测试了不同的空间群，包括P1，但是都未改进精修。反而检查用于形成孪晶(twinning)的数据，并将数据转移至SHELXL精修软件程序(14)。利用(h，k，l)-＞(h，k，-h-l)的孪晶关系，所有数据的R值和无R值分别由0.34和0.40降至0.30和0.34，其精修孪晶因子，BASF，为0.25。用COOT图形软件程序对模型进行手工改动。在SHELXL计算机程序中进行了精修。在手工干预14次循环并且在精修之后，所有数据的最终R值和无R值，无截止值(cut-off)，分别为0.277和0.320，模型具有理想键长为的均方根偏差(RMSD)(表8)。通过SHELXL计算的精修孪晶因子为0.26。
结果
如图20A、图20B、图21A和图21C所示，MS-Fab有效地阻断MICA与hNKG2D二聚体的两个单体结合。然而，虽然MICA分子与NKG2D二聚体的两个单体结合(1)，但MS Fab主要与两个单体之一结合，本文所述“NKG2D单体单元1”(图21A和图21C)。发现MS与NKG2D单体单元2之间的相互作用较少特异性(例如不含氢键或较少氢键)，并且在将MS Fab/NKG2D复合体保持在一起时较不重要。
对于已确定晶体结构的两个独立可溶性hNKG2D/MS-Fab分子复合体，通过CCP4程序套件的软件程序AREAIMOL(7)计算出成对相互作用以外的平均总面积分别为和对于两个独立的复合体，计算出NKG2D单体单元1和MS Fab之间成对相互作用以外的平均面积分别为和另一单体以外(“NKG2D单体单元2”)的面积明显小得多，分别为和
采用MS-Fab和hNKG2D分子间的截距，运行CCP4程序套件的CONTACTS软件(7)，鉴定出hNKG2D和MS Fab间直接接触。两个独立的可溶性hNKG2D/MS-Fab复合体分子的晶体结构的结果见表9-12。对于MS，发现所得hNKG2D表位包含hNKG2D(SEQ ID NO：2)的下列残基：Lys 150、Ser 151、Tyr 152、Thr 180、Ile 181、Ile 182、Glu 183、Met 184、Gln 185、Leu 191、Lys 197、Tyr 199、Glu 201、Thr 205、Pro 206、Asn 207和Thr 208(图21A)。在NKG2D单体单元2中，仅发现5个相互作用，且仅一个残基(Tyr 152)存在于两个晶体学上独立的复合体中。另外，Lys 150侧链原子Nζ仅参与一个复合体的氢结合，其余相互作用具有较弱的极性和疏水型。
MS hNKG2D表位包含位于正好在β链β3’(1)之前和开始时的环中残基Lys 150-Tyr152；在β5’上和在环后的Thr 180-Gln 185；在β5上的Leu 191；在β6上的Lys 197、Tyr 199和Glu 201；以及β7链之前的环中和β7链上的Thr 205-Thr 208。这些接触区与研究中报告为hNKG2D上的MICA结合位点十分吻合(1)。MICA与NKG2D的对称同二聚体不对称地结合(10)。对于与hNKG2D结合的MS Fab，情况也是如此。因此，相对于MICA，MS Fab存在两个可能的与NKG2D的结合方向。正如图20A、图20B和图22中所示，其中清楚可见，MS Fab阻断两种可能的MICA相对结合方向。
hNKG2D的MS抗原互补位包括MS轻(L)链(SEQ ID NO：41，表9-12)的残基Tyr 33和Trp 97以及重(H)链(SEQ ID NO：40，表9-12)的残基Gln 1、Asp 26、Asp 27、Ser 30、Ser31、Tyr 32、Tyr 33、His 50、 Ser 52、Tyr 53、Set 54、Set 56、Ala 57、Asn 58、Trp 98和Asp 99。图21A中hNKG2D的氨基酸序列中还标明了HNKG2D表位和参与氢结合的残基。
实施例12：与hzON72-Fab的复合体中可溶性hNKG2D的晶体结构
与人源化形式的ON72Fab片段(hzON72)的复合体中可溶性hNKG2D的晶体结构进行了解析，并应用X射线晶体学精修至分辨率为结果证实抗体当与hNKG2D结合时，能够阻断MICA分子与hNKG2D的结合(图20-22)。研究还表明，各hNKG2D二聚体可同时与两个hzON72Fab部分结合。
涉及本实施例的系列参考文献参见实施例的结束部分。
材料与方法
将可溶性hNKG2D片段(对应于SEQ ID NO：2的残基81-216)和hzON72Fab(分别对应于SEQ ID NO：70和SEQ ID NO：71重链片段和轻链)与摩尔浓度略微过量的hNKG2D混合，将复合体在凝胶过滤柱上纯化。然后将复合体浓缩至约7.5mg/ml。在1M LiSO4和100mM MES缓冲液(pH 6.5)中用悬滴技术使晶体生长。将晶体转移至含有75％沉淀剂溶液和25％甘油的冷冻溶液中。使晶体浸泡约15秒钟。然后将晶体在液氮中速冻，并在通过低温氮气流收集数据期间保持在100K上。在MAX-试验室(MAX-lab，Lund，Sweden)，用beam-line BL911-3(2)收集晶体学数据至分辨率为数据的空间群测定、积分和定标用XDS软件包(3)进行。分别测定晶胞参数为 90°、93.83°和90°。确定空间群为P21，其在不对称单元中具有一个NKG2D二聚体和两个hzON72Fab分子的空间。运用CCP4套件(7)的MOLREP(4)软件程序，对PDB保藏的(8)结构1UJ3(15)的Fab分子和保藏的1MPU结构(10)的hNKG2D二聚体进行的分子置换用于结构测定。挑选最先在旋转函数运行中的Fab分子，所述旋转函数用具有最高标度的Fab不同弯角(elbow angle)运行。搜索在分子 置换计算中作为二聚体的NKG2D。利用两个hNKG2D单体之间和两个Fab分子之间的非晶体学约束，CCP4程序套件(7)的REFMAC5软件程序(11)中进行晶体学精修。晶体学精修之后运用Coot软件程序(12)进行接着电子密度图的计算机图形检查、模型校正和构建。使该步骤循环直到不能对模型作更多重大改进。所有数据最终的R值和无R值分别为0.216和0.268，模型具有理想键长为的均方根偏差(RMSD)(表13)。
结果
MICA分子与NKG2D的两个单体牢固结合(1)，但是两个hzON72-Fab分子反而与hNKG2D单体的一个独立结合，有效阻断MICA与NKG2D二聚体结合(图20C、图21B、图C和图22)。对于已确立的晶体结构中两个晶体学上独立的可溶性hNKG2D/hzON72-Fab分子复合体(一个hzON72Fab分子与一个hNKG2D单体的复合体)，通过CCP4程序套件(7)的软件程序AREAIMOL计算成对相互作用以外的平均总面积，分别得到和对于两个晶体学上独立的复合体，计算可溶性hNKG2D单体与hzON72-Fab重链之间的成对相互作用以外的平均面积分别为和而对于轻链分别为和
采用hzON72-Fab和hNKG2D分子间的截距，运行CCP4程序套件的CONTACTS软件，鉴定出hNKG2D与hzON72-Fab之间的直接接触。该晶体结构的两个独立可溶性hNKG2D/hzON72-Fab分子的结果见表14-15。发现所得到的用于hzON72的hNKG2D表位包含hNKG2D(SEQ ID NO：2)的下列残基：Ser 165、Trp 166、Leu 174、Ser 175、Pro 176、Asn 177、Leu179、Thr 180、Ile 181、Ile 182、Glu183、Met 184、Lys 186、Ala 193、Ser 194、Ser 195、Lys 197和Tyr 199。用于hNKG2D的hzON72抗原互补位包括hzON72轻(L)链(SEQ ID NO：71，表14-15)的残基Tyr 1、Lys 92、Thr 93和Leu 94和hzON72重(H)链(SEQ ID NO：70)的残基Trp 33、Asp 52、Asp 55、Tyr 57、Asn 59、 Tyr 60、Tyr 101、Asp 102、Gly 103、Tyr 104、Tyr 105和Val 106。图21B中hNKG2D的氨基酸序列中还标明了hzON72的NKG2D表位和参与氢结合的残基
HNKG2D表位由位于β链β4(1)起始的残基Ser165-Trp 166；β5’之前环中的Leu174-Asn 177；β5’链中和之后的环中的Leu 179-Lys186；β6之前的环的Ala 193-Ser 195以及β6链中的Lys 197和Tyr 199组成。这些接触区与报告中hNKG2D(1)上的MICA结合位点十分一致，清楚的是hzON72抗体可以阻断MICA结合。可参见见图20C、图21B、图C和图22。
表8.由软件程序SHELXL(14)得到的X射线模型精修到所观察到的NKG2D/MS-Fab复合体数据的结果。
表9
hNKG2D单体“N”(SEQ ID NO：2)与“H”即MS-Fab重链(SEQ ID NO：40)和“L”即MS-Fab轻链(SEQ ID NO：41)相互作用。这用于晶体中的第一种晶体学上独立的hNKG2D/MS-Fab复合体分子。使用的截止值。接触通过CCP4套件(suite)(7)的CONTACT计算机程序鉴定。最后一栏“***”表示经CONTACT计算在此接触处氢键的可能性高(距离＜)，“*”表示可能性低(距离＞)。空白处表示程序视该处无氢键可能性。氢键在供体和接纳体之间是特定的，通常牢固并且易于鉴定。
表10
hNKG2D单体“C”(SEQ ID NO：2)与“B”即MS-Fab重链(SEQ ID NO：40)和“A”即MS-Fab轻链(SEQ ID NO：41)相互作用。这用于晶体中的第二种晶体学上独立的hNKG2D/MS-Fab复合体分子。使用 的截止值。接触通过CCP4套件(7)的CONTACT计算机程序鉴定。最后一栏“***”表示经CONTACT计算，在此接触处氢键的可能性高(距离＜)，“*”表示可能性低(距离＞)。空白处表示程序视该处无氢键可能性。
表11
hNKG2D单体“M”(SEQ ID NO：2)与“H”即MS-Fab重链(SEQ ID NO：40)和“L”即MS-Fab轻链(SEQ ID NO：41)相互作用。这用于晶体 中的第一种晶体学上独立的hNKG2D/MS-Fab复合体分子。使用的截止值。接触通过CCP4套件(7)的CONTACT计算机程序鉴定。最后一栏“***”表示经CONTACT计算在此接触处氢键的可能性高(距离＜)，“*”表示可能性低(距离＞)。空白处表示程序视该处无氢键可能性。
表12
hNKG2D单体“D”(SEQ ID NO：2)与“B”即MS-Fab重链(SEQ ID NO：40)和“A”即MS-Fab轻链(SEQ ID：41)相互作用。这用于晶体中的第二种晶体学上独立的hNKG2D/MS-Fab复合体分子。使用的截止值。接触通过CCP4套件(7)的CONTACT计算机程序鉴定。最后一栏“***”表示经CONTACT计算在此接触处氢键的可能性高(距离＜ )，“*”表示可能性低(距离＞)。空白处表示程序视该处无氢键可能性。
表13.通过REFMAC5软件程序(11)得到的X射线模型精修到hNKG2D/hzON72-Fab复合体观察数据的结果
与hNKG2D单体“N”(SEQ ID NO：2)“H”即hzON72-Fab重链(SEQ ID NO：70)和“L”即hzON72-Fab轻链(SEQ ID NO：71)相互作用。这用于晶体中的第一种晶体学上独立的hNKG2D/hzON72-Fab复合体 分子。使用的截止值。接触通过CCP4套件(7)的CONTACT计算机程序鉴定。最后一栏“***”表示经CONTACT计算在此接触处氢键的可能性高(距离＜)，“*”表示可能性低(距离＞)。空白处表示程序视该处无氢键可能性。
表15
hNKG2D单体“C”(SEQ ID NO：2)与“B”即hzON72-Fab重链(SEQ ID NO：70)和“A”即hzON72-Fab轻链(SEQ ID NO：71)相互作用。这用于晶体中的第二种晶体学上独立的hNKG2D/hzON72-Fab复合体分子。使用的截止值。接触通过CCP4套件(7)的CONTACT计算机程序鉴定。最后一栏“***”表示经CONTACT计算在此接触处氢键的可能性高(距离＜)，“*”表示可能性低(距离＞)。空白处表示程序视该处无氢键可能性。
参考文献一览表
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* * *
示例性实施方案
下面是本发明的示例性实施方案。
1.一种分离的人或人源化单克隆抗体或其抗原结合片段，其结合人NKG2D(hNKG2D)。
2.前述实施方案的抗体或抗原结合片段，其降低hNKG2D介导的表达hNKG2D的NK细胞或T细胞的活化。
3.前述实施方案中任一项的抗体或抗原结合片段，其与至少一种hNKG2D配体竞争结合hNKG2D。
4.前述实施方案的抗体或抗原结合片段，其中所述配体是MICA。
5.前述实施方案中任一项的抗体或抗原结合片段，其降低表达NKG2D的NK细胞或T细胞表面上的NKG2D的量。
6.前述实施方案中任一项的抗体或抗原结合片段，当其固定化时，不会显著共刺激CD3触发的外周血单核细胞(PBMC)的增殖。
7.前述实施方案中任一项的抗体或抗原结合片段，当其固定化时，对hNKG2D介导的表达hNKG2D的NK细胞或T细胞的活化没有显著激动作用。
8.前述实施方案中任一项的抗体或抗原结合片段，其与食蟹猴和猕猴NKG2D结合。
9.前述实施方案中任一项的抗体，其结合hNKG2D的KD为1nM以下。
10.前述实施方案中任一项的抗体，其结合hNKG2D的KD为 0.1nM以下。
11.前述实施方案中任一项的抗体或抗原结合片段，当其加入表达NKG2D的NK细胞或T细胞中时，使不超过两个的hNKG2D二聚体交联。
12.前述实施方案中任一项的抗体或抗原结合片段，其仅与hNKG2D二聚体中的第一hNKG2D单体牢固结合。
13.前述实施方案的抗体或抗原结合片段，当其结合第一hNKG2D单体时，阻断抗体或抗原结合片段与第二hNKG2D单体结合。
14.前述实施方案中任一项的抗体或抗原结合片段，其hNKG2D二聚体中第一和第二hNKG2D单体上的溶剂排斥面积的比率约为2∶1以上。
15.前述实施方案的抗体或抗原结合片段，其中所述比率约为3∶1以上。
16.前述实施方案中任一项的抗体或抗原结合片段，其与参比抗体竞争结合NKG2D，其中参比抗体选自：
(a)包含重链可变区和轻链可变区的抗体，所述重链可变区包含SEQ ID NO：11的序列，所述轻链可变区包含SEQ ID NO：12的序列；
(b)包含重链可变区和轻链可变区的抗体，所述重链可变区包含SEQ ID NO：13的序列，所述轻链可变区包含SEQ ID NO：14的序列；
(c)包含重链可变区和轻链可变区的抗体，所述重链可变区包含SEQ ID NO：44的序列，所述轻链可变区包含SEQ ID NO：45的序列；和
(d)包含重链可变区和轻链可变区的抗体，所述重链可变区包含SEQ ID NO：46的序列，所述轻链可变区包含SEQ ID NO：47的序列。
17.前述实施方案中任一项的抗体或抗原结合片段，其与参比抗体结合相同的NKG2D表位，其中参比抗体选自：
(a)包含重链可变区和轻链可变区的抗体，所述重链可变区包含SEQ ID NO：11的序列，所述轻链可变区包含SEQ ID NO：12的序列；
(b)包含重链可变区和轻链可变区的抗体，所述重链可变区包含SEQ ID NO：13的序列，所述轻链可变区包含SEQ ID NO：14的序列；
(c)包含重链可变区和轻链可变区的抗体，所述重链可变区包含SEQ ID NO：44的序列，所述轻链可变区包含SEQ ID NO：45的序列；和
(d)包含重链可变区和轻链可变区的抗体，所述重链可变区包含SEQ ID NO：46的序列，所述轻链可变区包含SEQ ID NO：47的序列。
18.前述实施方案中任一项的抗体或抗原结合片段，其以与参比抗体基本相同的KD结合NKG2D，其中参比抗体选自：
(a)包含重链可变区和轻链可变区的抗体，所述重链可变区包含SEQ ID NO：11的序列，所述轻链可变区包含SEQ ID NO：12的序列；
(b)包含重链可变区和轻链可变区的抗体，所述重链可变区包含SEQ ID NO：13的序列，所述轻链可变区包含SEQ ID NO：14的序列；
(c)包含重链可变区和轻链可变区的抗体，所述重链可变区包含SEQ ID NO：44的序列，所述轻链可变区包含SEQ ID NO：45的序列；和
(d)包含重链可变区和轻链可变区的抗体，所述重链可变区包含SEQ ID NO：46的序列，所述轻链可变区包含SEQ ID NO：47的序列。
19.实施方案16-18中任一项的抗体或抗原结合片段，其中参比抗体包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含SEQ ID NO：44的序列，轻链可变区包含SEQ ID NO：45的序列。
20.前述实施方案的抗体或抗原结合片段，其结合的表位包含SEQ ID NO：2的Lys150、Ser 151、Tyr 152、Thr 180、Ile 181、Ile182、Glu 183、Met 184、Gln 185、Leu 191、Lys 197、Tyr 199、Glu201、Thr 205、Pro 206、Asn 207和/或Thr 208。
21.前述实施方案的抗体或抗原结合片段，其结合的表位包含5个以上选自SEQ IDNO：2的以下残基：Lys 150、Ser 151、Tyr152、Thr 180、Ile 181、Ile 182、Glu 183、Met184、Gln 185、Leu191、Lys 197、Tyr 199、Glu 201、Thr 205、Pro 206、Asn 207和Thr208。
22.前述实施方案的抗体或抗原结合片段，其结合的表位包含SEQ ID NO：2的Lys150、Ser 151、Tyr 152、Thr 180、Ile 181、Ile182、Glu 183、Met 184、Gln 185、Leu 191、Lys 197、Tyr 199、Glu201、Thr 205、Pro 206、Asn 207和Thr 208。
23.实施方案16-18中任一项的抗体或抗原结合片段，其中参比抗体包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含SEQ ID NO：46的序列，所述轻链可变区包含SEQ IDNO：47的序列。
24.前述实施方案中任一项的抗体或抗原结合片段，其包含作为一组人基因的产物的重链可变区或来源于一组人基因的重链可变区，所述一组人基因包括：
(a)VH3_21、D3-9和JH4基因；
(b)VH3_20、D3-10和JH6基因；
(c)VH4_59、D7_27_R3和JH3基因；或者
(d)VH5_51、D3_10_R3和JH4基因。
25.前述实施方案中任一项的抗体或抗原结合片段，其包含作为一组人基因的产物的轻链可变区或来源于一组人基因的轻链可变 区，所述一组人基因包括
(a)VKI_L15和JK2基因；
(b)VKIII_A27和JK3基因；
(c)VKIII_A27和JK1基因；或者
(d)VKIII_L6和JK1基因。
26.前述实施方案中任一项的抗体或抗原结合片段，其包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区是一组人基因的产物或来源于一组人基因，所述人基因包括VH4_59、D7_27_R3和JH3基因；所述轻链可变区是一组人基因的产物或来源于一组人基因，所述人基因包括VKIII_A27和JK1基因。
27.前述实施方案中任一项的抗体或抗原结合片段，其包含的抗原互补位中包含的残基对应于SEQ ID NO：44的Gln 1、Asp 26、Asp 27、Ser 30、Ser 31、Tyr 32、Tyr 33、His50、Ser 52、Tyr 53、Ser 54、Ser 56、Ala 57、Asn 58、Trp 98或Asp 99或者SEQ ID NO：45的Tyr 33或Trp 97，或其任何组合。
28.前述实施方案的抗体或抗原结合片段，其包含的抗原互补位包含至少5个残基，所述残基选自对应于以下的残基：SEQ ID NO：44的Gln 1、Asp 26、Asp 27、Ser 30、Ser31、Tyr 32、Tyr 33、His50、Ser 52、Tyr 53、Ser 54、Ser 56、Ala 57、Asn 58、Trp 98或Asp99或者SEQ ID NO：45的Tyr 33或Trp 97，或其任何组合。
29.前述实施方案的抗体或抗原结合片段，其包含的抗原互补位中包含的残基对应于SEQ ID NO：44的Gln 1、Asp 26、Asp 27、Ser 30、Ser 31、Tyr 32、Tyr 33、His 50、Ser52、Tyr 53、Ser 54、Ser 56、Ala 57、Asn 58、Trp 98和Asp 99及SEQ ID NO：45的Tyr 33和Trp 97。
30.前述实施方案中任一项的抗体或抗原结合片段，其包含：
(a)包含SEQ ID NO：48的序列的重链可变区CDR1；
(b)包含SEQ ID NO：49的序列的重链可变区CDR2；和
(c)包含SEQ ID NO：50的序列的重链可变区CDR3。
31.前述实施方案的抗体或抗原结合片段，其包含：
(a)包含SEQ ID NO：51的序列的轻链可变区CDR1；
(b)包含SEQ ID NO：52的序列的轻链可变区CDR2；和
(c)包含SEQ ID NO：53的序列的轻链可变区CDR3。
32.前述实施方案中任一项的抗体或抗原结合片段，其包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含SEQ ID NO：44的序列，所述轻链可变区包含SEQ ID NO：45的序列。
33.实施方案1-25中任一项的抗体或抗原结合片段，其包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区是一组人基因的产物或来源于一组人基因，所述人基因包括VH5_51、D3_10_R3和JH4基因；所述轻链可变区是一组人基因的产物或来源于一组人基因，所述人基因包括VKIII_L6和JK1基因。
34.前述实施方案的抗体或抗原结合片段，其包含：
(a)包含SEQ ID NQ：54的序列的重链可变区CDR1；
(b)包含SEQ ID NO：55的序列的重链可变区CDR2；和
(c)包含SEQ ID NO：56的序列的重链可变区CDR3。
35.前述实施方案的抗体或抗原结合片段，其包含：
(a)包含SEQ ID NO：57的序列的轻链可变区CDR1；
(b)包含SEQ ID NO：58的序列的轻链可变区CDR2；和
(c)包含SEQ ID NO：59的序列的轻链可变区CDR3。
36.前述实施方案的抗体或抗原结合片段，其包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含SEQ ID NO：46的序列，所述轻链可变区包含SEQ ID NO：47的序列。
37.实施方案1的抗体或抗原结合片段，其包含：
(a)包含SEQ ID NO：15的序列的重链可变区CDR1；
(b)包含SEQ ID NO：16的序列的重链可变区CDR2；和
(c)包含SEQ ID NO：17的序列的重链可变区CDR3。
38.前述实施方案的抗体或抗原结合片段，其包含：
(a)包含SEQ ID NO：18的序列的轻链可变区CDR1；
(b)包含SEQ ID NO：19的序列的轻链可变区CDR2；和
(c)包含SEQ ID NO：20的序列的轻链可变区CDR3。
39.前述实施方案的抗体或抗原结合片段，其包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含SEQ ID NO：11的序列，所述轻链可变区包含SEQ ID NO：12的序列。
40.实施方案1的抗体或抗原结合片段，其包含：
(a)包含SEQ ID NO：21的序列的重链可变区CDR1；
(b)包含SEQ ID NO：22的序列的重链可变区CDR2；和
(c)包含SEQ ID NO：23的序列的重链可变区CDR3。
41.前述实施方案的抗体或抗原结合片段，其包含：
(a)包含SEQ ID NO：24的序列的轻链可变区CDR1；
(b)包含SEQ ID NO：25的序列的轻链可变区CDR2；和
(c)包含SEQ ID NO：26的序列的轻链可变区CDR3。
42.前述实施方案的抗体或抗原结合片段，其包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含SEQ ID NO：13的序列，所述轻链可变区包含SEQ ID NO：14的序列。
43.实施方案1的抗体或抗原结合片段，其包含：
(a)包含SEQ ID NO：48的序列的重链可变区CDR1；
(b)包含SEQ ID NO：49的序列的重链可变区CDR2；和
(c)包含SEQ ID NO：50的序列的重链可变区CDR3。
44.前述实施方案的抗体或抗原结合片段，其包含：
(a)包含SEQ ID NO：51的序列的轻链可变区CDR1；
(b)包含SEQ ID NO：52的序列的轻链可变区CDR2；和
(c)包含SEQ ID NO：53的序列的轻链可变区CDR3。
45.实施方案1的抗体或抗原结合片段，其包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含SEQ ID NO：44的序列，所述轻链 可变区包含SEQ ID NO：45的序列。
46.实施方案1的抗体或抗原结合片段，其包含：
(a)包含SEQ ID NO：54的序列的重链可变区CDR1；
(b)包含SEQ ID NO：55的序列的重链可变区CDR2；和
(c)包含SEQ ID NO：56的序列的重链可变区CDR3。
47.前述实施方案的抗体或抗原结合片段，其包含：
(a)包含SEQ ID NO：57的序列的轻链可变区CDR1；
(b)包含SEQ ID NO：58的序列的轻链可变区CDR2；和
(c)包含SEQ ID NO：59的序列的轻链可变区CDR3。
48.前述实施方案的抗体或抗原结合片段，其包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含SEQ ID NO：46的序列，所述轻链可变区包含SEQ ID NO：47的序列。
49.实施方案1的抗体或抗原结合片段，具有不超过8个保守氨基酸取代，其包含
(a)包含SEQ ID NO：15、21、48或54的序列的重链可变区CDR1；
(b)包含SEQ ID NO：16、22、49或55的序列的重链可变区CDR2；
(c)包含SEQ ID NO：17、23、50或56的序列的重链可变区CDR3；
(d)包含SEQ ID NO：18、24、51或57的序列的轻链可变区CDR1；
(e)包含SEQ ID NO：19、25、52或58的序列的轻链可变区CDR2；和
(f)包含SEQ ID NO：20、26、53或59的序列的轻链可变区CDR3。
50.前述实施方案的抗体或抗原结合片段，其包含不超过5个氨基酸取代。
51.前述实施方案中任一项的抗体，所述抗体为人抗体。
52.前述实施方案中任一项的抗体或抗原结合片段，其为二价的。
53.前述实施方案的抗体，所述抗体为IgG1、IgG2、IgG3或IgG4抗体。
54.前述实施方案的抗体，所述抗体为IgG4抗体。
55.前述实施方案中任一项的抗体，所述抗体在VH链中包含S241P突变。
56.一种分离抗体，所述抗体包含重链序列和轻链序列，所述重链序列包含SEQ IDNO：7的序列，所述轻链序列包含SEQ ID NO：8的序列。
57.一种分离抗体，所述抗体包含重链序列和轻链序列，所述重链序列包含SEQ IDNO：9的序列，所述轻链序列包含SEQ ID NO：10的序列。
58.一种分离抗体，所述抗体包含重链序列和轻链序列，所述重链序列包含SEQ IDNO：40的序列，所述轻链序列包含SEQ ID NO：41的序列。
59.一种分离抗体，所述抗体包含重链序列和轻链序列，所述重链序列包含SEQ IDNO：42的序列，所述轻链序列包含SEQ ID NO：43的序列。
60.一种分离抗体，所述抗体在与hNKG2D结合中，相比于与16F16、16F31、MS或21F2的竞争，与ON72、BAT221、5C6、1D11、ECM217或149810任一种的竞争更强，并且阻止NKG2D介导的表达NKG2D的NK细胞或T细胞的活化。
61.前述实施方案的分离抗体，所述抗体与MS的竞争比与ON72、BAT221、5C6、1D11、ECM217或149810的竞争更强。
62.实施方案60的分离抗体，所述抗体与21F2的竞争比与ON72、BAT221、5C6、1D11、ECM217或149810的竞争更强。
63.一种分离抗体，所述抗体以第一半数最大有效浓度(EC50)结合NK细胞制备物中的细胞表面缔合的hNKG2D，并且以第二EC50减少由NK细胞制备物介导的杀死表达NKG2D配体的靶细胞，其中第二EC50明显小于第一EC50。
64.前述实施方案的抗体，其中所述NK细胞制备物是NK-92细胞或NKL细胞。
65.前述实施方案的抗体，其中所述配体是ULBP-3或MICA。
66.前述实施方案的抗体，其中第二EC50不超过第一EC50的80％。
67.前述实施方案的抗体，其中第二EC50不超过第一EC50的50％。
68.一种结合hNKG2D的分离抗体，所述抗体以低于基本上使细胞表面缔合的NKG2D饱和的浓度，达到其最大降低NK细胞介导的对表达配体的靶细胞的杀伤。
69.一种分离抗体，所述抗体结合hNKG2D，阻止NKG2D介导的表达NKG2D的NK细胞或T细胞的活化，并且能够下调超过70％的细胞表面缔合的NKG2D。
70.前述实施方案的抗体，所述抗体能够下调低于90％的NK细胞的细胞表面缔合的NKG2D。
71.一种分离抗体，所述抗体结合hNKG2D，并且以类似的亲和力结合人和食蟹猴的表达NKG2D的细胞。
72.前述实施方案的抗体，所述抗体结合PBMC制备物中的食蟹猴CD8+T细胞的EC50是其结合PBMC制备物中的人CD8+T细胞的EC50的至少50％。
73.前述实施方案的抗体，所述抗体结合PBMC制备物中的食蟹猴CD8+T细胞的EC50是其结合PBMC制备物中的人CD8+T细胞的EC50的至少65％。
74.前述实施方案中任一项的分离抗体，所述抗体对人NKG2D 的亲和力不超过0.1nM。
75.前述实施方案中任一项的抗体，所述抗体对人NKG2D的亲和力不超过10pM。
76.实施方案60-75中任一项的抗体，其包含：
(a)包含SEQ ID NO：48或54的序列的重链可变区CDR1；
(b)包含SEQ ID NO：49或55的序列的重链可变区CDR2；和
(c)包含SEQ ID NO：50或56的序列的重链可变区CDR3。
77.前述实施方案的抗体，其包含：
(a)包含SEQ ID NO：51或57的序列的轻链可变区CDR1；
(b)包含SEQ ID NO：52或58的序列的轻链可变区CDR2；和
(c)包含SEQ ID NO：53或59的序列的轻链可变区CDR3。
78.实施方案60-77中任一项的抗体，所述抗体为人抗体。
79.实施方案60-78中任一项的抗体的抗原结合片段。
80.编码前述实施方案中任一项的抗体或抗原结合片段的可变重链或可变轻链的核酸。
81.一种表达载体，所述载体包含前述实施方案的核酸。
82.一种宿主细胞，所述细胞包含前述实施方案的表达载体。
83.一种宿主细胞，所述细胞产生实施方案1-79中任一项的抗体或抗原结合片段。
84.实施方案82和83中任一项的宿主细胞，其中所述细胞是CHO细胞。
85.一种产生抗NKG2D抗体或抗原结合片段的方法，所述方法包括将实施方案82-84中任一项的宿主细胞在合适的条件下培养，并回收所述抗体或其抗原结合片段。
86.一种产生变体抗NKG2D抗体或其抗原结合片段的方法，所述方法包括
(a)提供包含CDR1序列、CDR2序列和CDR3序列的重链可变区，所述CDR1序列选自SEQ ID NO：15、21、48和 54，所述CDR2序列选自SEQ ID NO：16、22、49和55，所述CDR3序列选自SEQ ID NO：17、23、50和56；
(b)提供包含CDR1序列、CDR2序列和CDR3序列的轻链可变区，所述CDR1序列选自SEQ ID NO：18、24、51和57，所述CDR2序列选自SEQ ID NO：19、25、52和58，所述CDR3序列选自SEQ ID NO：20、26、53和59；
(c)改变重链可变区和轻链可变区每一个中的至多8个氨基酸残基以产生经改变的重链可变区和轻链可变区；和
(d)在宿主细胞中表达包含经改变的重链可变区和轻链可变区的变体抗NKG2D抗体。
87.一种包含实施方案1-79中任一项的抗体或抗原结合片段的免疫缀合物，所述免疫缀合物与治疗剂连接。
88.一种多特异性分子，所述多特异性分子包含实施方案1-79中任一项的抗体或抗原结合片段，其与具有不同于所述抗体的结合特异性的第二部分连接。
89.前述实施方案的多特异性分子，其中第二部分是第二抗体或其抗原结合片段。
90.一种组合物，所述组合物包含实施方案1-79中任一项的抗体或抗原结合片段及药学上可接受的载体。
91.一种用于阻止NKG2D介导的表达NKG2D的NK细胞或T细胞的活化的方法，所述方法包括使NK细胞或T细胞与实施方案1-79中任一项的抗体或抗原结合片段接触，其中所述抗体或抗原结合片段与至少一种NKG2D配体竞争结合NKG2D。
92.前述实施方案的方法，其中所述NKG2D配体是MICA。
93.一种用于减少表达NKG2D的NK细胞或T细胞表面NKG2D的量的方法，所述方法包括使NK细胞或T细胞与实施方案1-79中任一项的抗体或抗原结合片段接触，其中所述抗体或抗原结合片段与至少一种NKG2D配体竞争结合人NKG2D。
94.一种用于治疗炎症性疾病或自身免疫疾病的方法，所述方法包括给予患有炎症性疾病或自身免疫疾病或者有炎症性疾病或自身免疫疾病风险的人类受治疗者实施方案90的组合物。
95.前述实施方案的方法，其中所述患者患有自身免疫疾病或者有自身免疫疾病的风险。
96.前述实施方案的方法，其中所述自身免疫疾病是类风湿性关节炎。
97.实施方案95的方法，其中所述疾病是多发性硬化。
98.实施方案95的方法，其中所述疾病是系统性红斑狼疮(SLE)。
99.实施方案95的方法，其中所述疾病是银屑病。
100.实施方案95的方法，其中所述疾病是乳糜泻。
101.实施方案95的方法，其中所述疾病是炎性肠病。
102.前述实施方案的方法，其中所述炎性肠病是溃疡性结肠炎。
103.实施方案101的方法，其中所述炎性肠病是克罗恩病。
104.实施方案94的方法，其中人类受治疗者患有移植排斥反应或移植物抗宿主病或有移植排斥反应或移植物抗宿主病的风险。
105.前述实施方案的方法，其中所述移植是心脏移植或骨髓移植。
106.实施方案94-105中任一项的方法，所述方法还包括给予第二抗炎药。
107.前述实施方案的方法，其中第二抗炎药选自免疫抑制药、镇痛药、抗血管生成药、皮质类固醇、B细胞清除剂、B细胞拮抗剂、T细胞拮抗剂、补体抑制剂、抗细胞因子药剂和抗细胞因子受体药剂及其组合。
108.实施方案106和107中任一项的方法，其中所述第二抗炎药是TNFα活性的拮抗剂。
109.一种用于治疗炎症性疾病或自身免疫疾病的方法，所述方 法包括给予有炎症性疾病或自身免疫疾病风险的人类受治疗者实施方案90的组合物。
110.前述实施方案的方法，其中人类受治疗者有移植排斥反应或移植物抗宿主病的风险。
111.实施方案1-79中任一项的抗体或抗原结合片段在制备治疗人类受治疗者的炎症性疾病或自身免疫疾病的药物中的用途。
112.实施方案1-79中任一项的抗体或抗原结合片段，用于治疗人类受治疗者的炎症性疾病或自身免疫疾病。
本文所引用的所有参考文献，包括出版物、专利申请和专利，都通过引用全部结合到本文中，其程度与每个文献单独而具体指明通过引用结合到本文中并列举在本文中一样。
本文所采用的所有标题和副标题只是出于方便，不得解释为以任何方式限制本发明。
上述要素在其全部可能的变化中的任何组合都包括在本发明中，除非本文另有说明或者明显与本文内容相抵触。
描述本发明内容使用的冠词和类似标示应理解为涵盖了单数和复数，除非本文中另有说明或者明显与本文内容相抵触。
本文列举的值的范围只是用作单独提及落入该范围的每个个别值的简写方法，除非本文另有说明，并且每个独立值结合到本说明书中好像是本文各个引用一样。除非另有说明，否则本文所提供的所有精确值是相应近似值的代表(例如有关具体因子或测量值所提供的所有精确的示例性数值也可被认为是提供相应的近似测量值，如有需要由“约”修饰)。
本文所述的所有方法可以任何适当的顺序进行，除非本文另有说明或者明显与本文内容相抵触。
任何和所有实例的使用，或者本文所用的示例性语言(例如“例如”)，仅仅是为了更好地说明本发明，并不限制本发明的范围，除非另有要求。本说明书中的任何语言都不应理解为规定任何非要求保护 要素是实施本发明所必需的，除非同样有明确说明。
本文对专利文献的引用和结合仅为方便起见，并不影响这些专利文献的有效性、专利性和/或强制性。
本发明任何方面或本发明实施方案就一种或多种成分使用术语例如“包含”、“具有”、“包括”或“含有”的描述时，是给“由具体的一种或多种成分组成”、“基本由具体的一种或多种成分组成”或“基本包含具体的一种或多种成分”的本发明方面或类似方面提供支持，除非另有说明或明显与内容相抵触(例如本文所述包含具体成分的组合物就应理解为也可描述成由该成分组成的组合物，除非另有说明或明显与内容相抵触)。
本发明包括在本文中提供的各方面或权利要求书中所述主题的所有的修改和等同内容至法律允许的最大程度。

Claims (13)

1.一种分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其与人NKG2D (hNKG2D)结合，其包含：
(a) 由SEQ ID NO: 54的序列组成的重链可变区CDR1；
(b) 由SEQ ID NO: 55的序列组成的重链可变区CDR2；和
(c) 由SEQ ID NO: 56的序列组成的重链可变区CDR3；和
(d) 由SEQ ID NO: 57的序列组成的轻链可变区CDR1；
(e) 由SEQ ID NO: 58的序列组成的轻链可变区CDR2；和
(f) 由SEQ ID NO: 59的序列组成的轻链可变区CDR3。
2.权利要求1的抗体或其抗原结合片段，其中所述分离的单克隆抗体为分离的人单克隆抗体。
3.权利要求1的抗体或其抗原结合片段，包含：
包含SEQ ID NO: 46的序列的重链可变区，和包含SEQ ID NO: 47的序列的轻链可变区。
4.权利要求1-3中任一项的抗体或其抗原结合片段，其包含SEQ ID NO:42的重链和SEQID NO:43的轻链序列。
5.权利要求1-3中任一项的抗体或其抗原结合片段，其与人NKG2D (hNKG2D)结合，并且具有一种或多种选自以下的性质
(a) 降低hNKG2D介导的表达hNKG2D的NK细胞或T细胞的活化；
(b) 与MICA竞争结合hNKG2D；
(c) 减少表达NKG2D的NK细胞或T细胞表面上的NKG2D的量；
(d) 当固定化时，不显著共刺激CD3触发的外周血单核细胞(PBMC)的增殖；
(e) 与食蟹猴和猕猴NKG2D结合；和
(f) 结合hNKG2D的KD为1 nM以下。
6.权利要求5的抗体或其抗原结合片段，其具有性质(a)～(d)，并且任选具有性质(e)和/或(f)。
7.一种产生抗NKG2D抗体或其抗原结合片段的方法，所述方法包括将宿主细胞培养在合适的条件下，并且回收所述抗体或其抗原结合片段，所述宿主细胞包含编码权利要求1-6中任一项的抗体或其抗原结合片段的核酸。
8.权利要求1-6中任一项的抗体或其抗原结合片段在制备用于在患有炎症性疾病或自身免疫疾病或者有炎症性疾病或自身免疫疾病风险的人类受治疗者中治疗或预防炎症性疾病或自身免疫疾病的药物中的用途。
9.权利要求8的抗体或其抗原结合片段的用途，其中所述炎症性疾病或自身免疫疾病是类风湿性关节炎、多发性硬化、系统性红斑狼疮(SLE)、银屑病、乳糜泻、溃疡性结肠炎、克罗恩病、移植排斥反应或移植物抗宿主病。
10.一种核酸，其编码权利要求1-6中任一项的抗体或其抗原结合片段。
11.一种表达载体，其包含权利要求10的核酸。
12.一种宿主细胞，其包含权利要求11的表达载体。
13.一种药物组合物，其包含权利要求1-6中任一项的抗体或其抗原结合片段和药学上可接受的载体。
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