KR101615935B1 - 인간 ｎｋｇ2ｄ에 대한 항체 및 그것의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 인간에서 치료 용도로서 유용한 분리된 항-인간 NKG2D 모노클로날 항체를 제공한다. 전형적으로, 상기 항체는 환자에 투여되었을 때 항체에 대한 면역반응의 위험을 최소화하기 위한 완전 인간 항체이거나 인간화된 항체이다. 바람직한 항체는 인간 모노클로날 항체 MS 및 21F2를포함한다. 여기 설명된 대로, 항원-결합 항체 단편, 항체 유도체, 및 다중-특이적 분자와 같은 다른 항원-결합 분자들도 이러한 항체로부터 설계되거나 유래될 수 있다.

Description

인간 ＮＫＧ2Ｄ에 대한 항체 및 그것의 용도{ANTIBODIES AGAINST HUMAN NKG2D AND USES THEREOF}
본 발명은 인간 NKG2D(hNKG2D)에 대한 항체 및 인간 환자의 질환 및 장애의 치료 또는 예방에서 이들의 용도에 관한 것이다.
면역수용체인 NKG2D는 일반적으로 인간 CD8+ T 세포 및 NK 세포에서 발현된다. 전-활성화된 CD8+ 세포에서는 인간 NKG2D(hNKG2D) 호모다이머 수용체가 DAP10 회합을 통해 TCR 및 CD28+ TCR 신호화의 보조-자극인자로서 기능하지만, NK 세포에서는 직접 활성인자로서 기능한다. MHC 부류 I-관련 리간드 MICA 및 MICB, UL16-결합 단백질(ULBP) 패밀리, 및 레티노산 조기 전사체-1(RAET1) 패밀리를 포함하는 hNKG2D의 다양한 리간드가 확인되어 특성화되었다.
류마티스성 관절염과 같은 만성 자가면역 질환에서는 hNKG2D가 CD4+ CD28- T 세포의 서브셋트에서 발현되어 이들의 증식 및 IFNγ 생산의 자극에 연루되고, MIC 발현이 하향 조절된다(Groh et al., PNAS 2003;100:9452). 또, 크론병에서는 CD4+ hNKG2D-발현 T 세포가 MICA 상호작용을 통해 염증 및 세포독성 반응을 매개하는 것으로 밝혀졌다(Allez et al., Gastroenterology 2007; 132:2346-2358). 자가면역 염증에서 NKG2D가 필수적인 추진인자라는 초기 제안은 뮤린 NKG2D(CX5)와 결합하여 차단하는 모노크로날 항체(mAb)에 의한 뮤린 당뇨병 모델(NOD 마우스)에서의 당뇨병에 따른 염증의 예방 및 치료에서 유래했는데(Ogasawara et al, Immunity 2004; 20:757-767), 이것은 항-NKG2D 항체의 치료상의 용도를 시사한다. 이러한 용도는, 예를 들어 US20050158307, WO2005097160, WO2005115517, 및 WO2006024367에 설명되었다. 인간 NKG2D에 대한 뮤린 mAb가 설명되었고(예를 들어, Pende et al., Eur J Immunol 2001; 31:1076-86, WO02068615; Bauer et al., Science 1999; 285:727-9; Castriconi et al., PNAS 2003; 100:4120-25; 및 Andre et al., Eur J Immunol 2004; 34:1-11), 또는 상업적으로 입수할 수도 있지만(예를 들어, R&D Systems(MN, USA)의 항체 149810, Beckman Coulter Inc.의 ON72), 이들은 면역원성이다. 전하는 바에 의하면 문헌에 설명된 유일한 완전한 인간 항-NKG2D mAb는 NKG2D 신호화에 대해 작용 효과와 길항 효과를 모두 가지며(Kwong et al., J Mol Biol 2008; 384: 1143-1156), 따라서 염증 및/또는 자가면역 장애의 치료제로서 덜 적합하다.
따라서, 염증 및/또는 자가면역 질환 및 장애의 치료 용도로서 최적 특성을 가진 항-hNKG2D mAb가 필요하다. 본 발명은 이들 및 다른 필요성을 다루며, 본 서류의 나머지 부분에서 설명될 몇 가지 추가적 이점을 제공한다.
본 발명은 인간에서 치료상의 용도로서 유용한 분리된 항-hNKG2D 모노클로날 항체를 제공한다. 전형적으로, 항체는 환자에게 투여되었을 때 항체에 대한 면역반응의 위험이 최소화된 완전한 인간 항체 또는 인간화된 항체이다. 여기 설명된 대로, 다른 항원-결합 분자, 예를 들어 항원-결합 항체 단편, 항체 유도체, 및 다중-특이적 분자들도 이러한 항체로부터 디자인되거나 유래될 수 있다.
한 양태로서, 항체는 하나 이상의 기능 특성, 또는 기능 특성들의 조합을 특징으로 한다. 전형적인 특성은, 예를 들어 hNKG2D-발현 NK 또는 T 세포의 hNKG2D-매개 활성화의 방지; hNKG2D와의 결합에서 적어도 하나의 천연 hNKG2D 리간드, 또는 몇 개 리간드와의 경합; hNKG2D-발현 NK 또는 T 세포의 표면에서 hNKG2D의 양의 감소; 사이노몰거스 및/또는 레서스 NKG2D와 결합; hNKG2D 다이머 당 오직 하나의 항체 분자와만 결합; hNKG2D-발현 NK 및/또는 T 세포에 첨가되었을 때 2개 이하의 hNKG2D 다이머를 가교-결합; 결합시 hNKG2D 신호화에 대해 유의하지 않은 작용 효과 보유; 및/또는 1nM 이하의 해리 상수(KD)로 hNKG2D와 결합을 포함한다. 또한, 또는 다른 면으로, 본 발명의 어떤 항-hNKG2D 항체는 항체 MS 및 21F2를 비롯하여 여기 설명된 하나 이상의 특정 인간 항-hNKG2D 항체와 경합하거나, 이들과 동일한 에피토프와 필수적으로 결합하거나, 또는 이들과 동일한 또는 더 높은 친화성으로 결합할 수 있다. 예를 들어, 한 구체예에서, 항체는 또한, 또는 다른 면으로, 공지된 뮤린 항-hNKG2D 항체들(예를 들어, 상기 설명된 것들)보다 MS 및/또는 21F2의 hNKG2D-결합을 차단하거나 더 경합할 수 있다. 한 구체예에서, 항체는 MS 및/또는 21F2와 동일한 hNKG2D 에피토프와 결합한다. 다른 구체예에서, 항체는 또한, 또는 다른 면으로, MS와 동일한 에피토프와 결합한다. 다른 구체예에서, 항체는 또한, 또는 다른 면으로, 21F2와 동일한 에피토프와 결합한다. 당업자는 본 발명의 구체예에 의해 제공된 및/또는 거기서 사용된 항체가 상기 언급된 특징들 중 3개, 4개 또는 그 이상을 나타낼 수 있다는 것을 이해할 것이다.
다른 양태로서, 항체는 또한, 또는 다른 면으로, 여기 설명된 MS 또는 21F2 파라토프 및/또는 항원-결합 서열과 동일한 또는 유사한 하나 이상의 파라토프 및/또는 항원-결합 서열을 포함한다.
다른 양태로서, 본 발명은 본 발명의 항체를 암호화하는 핵산, 이러한 핵산을 포함하는 발현 벡터, 이러한 핵산을 포함하는 숙주 세포, 본 발명의 항체를 생산하는 숙주 세포, 그리고 적합한 조건에서 이러한 숙주 세포를 배양함으로써 항-hNKG2D 항체를 생산하는 방법을 제공한다.
또, 이러한 항체의 항체-결합 단편뿐만 아니라, 조작된 항체 단편, 항체 유도체, 이중-특이적 항체 및 다른 다중-특이적 분자들을 포함하여 이러한 항체-결합 단편을 포함하는 분자들이 제공된다.
또, 이러한 항체 또는 다른 분자들을 포함하는 제약 조성물 및 키트 또는 다른 물품이 제공된다.
또, hNKG2D 활성화, hNKG2D-신호화, 또는 hNKG2D-발현 NK 또는 T 세포의 활성화를 감소 또는 억제하는 방법, 및 이러한 항체, 분자, 및 조성물을 사용하여 자가면역 및/또는 염증 질환 또는 장애를 치료 또는 예방하는 방법이 제공되며, 이러한 질환 또는 장애에는, 제한되지는 않지만, 류마티스성 관절염, 크론병 및 궤양성 대장염을 비롯한 염증성 장질환(IBD), 전신 홍반성 루푸스(SLE), 건선, 건선성 관절염, 다발성 경화증, 만성 소화기 질환, 바이러스성 질환(예를 들어, 바이러스성 간염), 및 여러 장기 및 조직의 이식거부(제한되지는 않지만, 심장 및 골수가 포함된다)가 포함된다.
도 1은 KM 마우스™ 혈통의 hNKG2D-면역화 마우스로부터 예시적인 혈청 분석을 나타낸다. 다양한 시점에서 NKG2D-발현 BAF/3 세포 또는 대조군 세포(BAF/3 세포)에 대한 유세포분석에서 혈청 1㎕에서 KNG2D-선택적 결합과 함께 항체의 역가가 증가한다는 것이 드러났다(a). 6차 면역화 후 채취한 혈청(1㎕)과의 예비 인큐베이션은 NKG2D와의 MICA-Fc-결합을 방지할 수 있는 항체를 함유했다.
도 2는 NKG2D 발현 세포(A)에는 특이적으로 결합되지만 NKG2D를 발현하지 않는 동일한 셀라인(B)에는 결합되지 않는 하이브리도마 상청액 형태의 인간 항체의 예를 나타낸다. 항체는 하이브리도마 상청액 형태로 세포에 첨가되었다. 직접 표지된 양성 대조군인 뮤린 항-NKG2D 항체 149810와 NKG2D 발현 세포(C) 및 비-발현 세포(D)의 결합도 도시된다. 검은색 윤곽은 바탕 염색, 실선 피크는 특이적 염색을 표시한다.
도 3은 상업용 뮤린 항체(ON72 및 149810)와 비교하여 재조합 발현되어 정제된 완전한 인간 IgG4 항체(16F16, 16F31, MS, 및 21F2)에서 NKG2D-발현 세포와의 NKG2D-결합의 용량-반응을 나타낸다.
도 4는 가변 영역(볼드체)과 CDR 영역(밑줄)이 강조된, 인간 항-hNKG2D 항체 16F16, 및 16F31(a)와 IgG4 이소타입의 MS 및 21F2(b)의 중쇄(H) 및 경쇄(L)의 아미노산 서열을 나타낸다. 아미노산 서열 및 여러 강조된 부분에 상응하는 서열 식별번호는 표 1에 제공된다.
도 5는 상응하는 재조합된 점라인 서열을 가진 VH과 VL 서열의 정렬을 나타낸다. CDR 영역은 볼드체 Kabat 번호로 표시되고, 체세포 과돌연변이는 볼드체 밑줄 문자로 표시된다. (a) 16F16 IgG4 H 사슬; (b) 16F16 IgG4 L 사슬; (c) 16F31 IgG4 H 사슬; (d) 16F31 IgG4 L 사슬; (e) MS IgG4 H 사슬; (f) MS IgG4 L 사슬; (g) 21F2 IgG4 H 사슬; (h) 21F2 IgG4 L 사슬. SEQ ID NOS:27-30는 각각 재조합된 VH3_21/D3-9/JH4, VKI_L15/JK2, VH3_20/D3-10/JH6, 및 VKIII_A27/JK3에 해당하고, SEQ ID NOS:60-63는 재조합된 VH4_59//JH3, VKIII_A27/JK1, VH5_51/D3_10_R3/JH4, 및 VKIII_L6/JK1에 해당한다.
도 6은 하이브리도마 상청액 중의 항체와의 예비-인큐베이션에 의한 리간드 결합의 봉쇄에 의해 증명된, 예시적인 인간 항-NKG2D 항체에 의한 리간드(MICA-)-결합의 봉쇄를 나타낸다. 윤곽은 바탕값, 회색은 예비-인큐베이션이 없을 때의 리간드 결합, 검은색 점선은 예비-인큐베이션이 있을 때의 리간드 결합을 표시한다.
도 7은 재조합 발현되어 정제된 완전한 인간 항-hNKG2D 항체(16F16, 16F31, MS, 및 21F2; IgG4 이소타입)의 다양한 농도를 분석했을 때 얻어진 용량-반응 곡선을 나타내며, IC50 및 1㎍ MICA-mFc 결합을 완전히 봉쇄하는데 필요한 용량이 주어진다.
도 8은 NKG2D와 ON72의 NKG2D-결합이 16F16을 함유하는 하이브리도마 상청액과의 예비-인큐베이션에 의해 완전히 방지된 것을 나타낸다. 윤곽은 바탕값, 회색은 예비-인큐베이션이 없을 때의 ON72-결합, 검은색 점선은 예비-인큐베이션이 있을 때의 ON72-결합을 표시한다.
도 9는 NKG2D와 뮤린 항-hNKG2D 항체의 후속 결합을 차단하는, 또는 그 반대의 경우에 대한 완전한 인간 항-hNKG2D 항체의 능력을 나타낸다. (a) 16F16: 재조합 발현되어 정제된 16F16(0.3㎍; IgG4 이소타입)과의 예비-인큐베이션은 ON72(0.3㎍)이 NKG2D와 결합하는 것을 방지했다. 인큐베이션 순서를 바꾼 경우, ON72(0.3㎍)와의 예비-인큐베이션은 IgG4 이소타입의 재조합 발현되어 정제된 16F16(0.3㎍)의 결합을 단지 85%만 방지했으며, 이는 NKG2D의 일부 분획이 완전한 인간 항체에 의한 결합에 이용될 수 있도록 남아 있다는 것을 나타내고, 이것은 ON72에 의해 결합된 것과는 적어도 부분적으로 상이한 에피토프임을 시사한다. 항체 149810은 항체 농도를 149810 대 16F16를 1:1(0.3㎍, 0.3㎍) 및 3:1(1㎍, 0.3㎍)로 하여 각각 시험했을 때 재조합 발현되어 정제된 16F16(IgG4 이소타입)을 대략 50%만 교차 억제하는 것으로 나타났으며, 이는 마찬가지로 NKG2D에 대한 결합 에피토프의 차이를 나타낸다. 다음의 인큐베이션과 검출 조합이 사용되었다: 16F16F 예비-인큐베이션을 안 한 경우(a) 또는 한 경우(b)에 ON72의 검출; ON72 예비-인큐베이션을 안 한 경우(c) 또는 한 경우(d)에 16F16의 검출; 16F16 예비-인큐베이션(0.3㎍)을 안 한 경우(e) 또는 한 경우(f)에 149810(0.3㎍)의 검출; 149810 예비-인큐베이션(0.3㎍)을 안 한 경우(g) 또는 한 경우(h)에 16F16의 검출; 16F16F 예비-인큐베이션(0.3㎍)을 안 한 경우(i) 또는 한 경우(j)에 149810(1㎍)의 검출; 149810 예비-인큐베이션(1㎍)을 안 한 경우(k) 또는 한 경우(l)에 16F16(0.3㎍)의 검출; 16F16의 검출 (0.3㎍). (b) MS: MS 항체 0.1㎍과의 예비-인큐베이션을 하거나 하지 않거나 하여 0.1㎍ 뮤린 항-hNKG2D 항체를 인큐베이션한 다음, 유세포분석을 사용하여 항-마우스 항체를 검출했다. MS와의 예비-인큐베이션이 없을 때는 0.1㎍ ON72, 1D11, 또는 149810과의 인큐베이션이 100%로 정규화되었고, 이것을 각각 (a), (c), 및 (e)로 나타낸다. 30분간 0.1㎍ MS와 인큐베이션한 다음, ON72, 1D11, 또는 149810과 인큐베이션하여 검출한 것은 각각 (b), (d), 및 (f)에 나타낸다. MS와의 예비-인큐베이션은 ON72, 1D11 및 149810의 NKG2D-결합을 각각 98%, 88%, 및 96.5% 억제했으며, 이는 항체의 적어도 일부가 유사한 에피토프임을 시사한다. (c) 21F2: 21F2와의 예비-인큐베이션을 한 경우(a) 또는 안 한 경우(b)에 ON72 결합의 검출; 21F2와의 예비-인큐베이션을 한 경우(c) 또는 안 한 경우(d)에 1D11의 검출; 및 21F2와의 예비-인큐베이션을 한 경우(e) 또는 안 한 경우(f)에 149810의 검출(항체는 모두 0.1㎍).
도 10은 원 하이브리도마로부터 정제된 ON72 및 16F16 항체를 사용한 레서스 또는 사이노몰거스(cyno) 세포의 염색을 나타낸다. (A) cyno NK 세포, (B) cyno CD8+ T 세포, (C) 레서스 NK 세포, 및 (D) 레서스 CD8+ T 세포. 나타낸 값들은 결합의 평균 형광 강도(MFI)이며, 이때 이차 항체만의 결합의 MFI는 뺀 것이다. 두 종에서 CD4+ T 세포와의 결합은 관찰되지 않았다.
도 11은 상이한 항체 농도에서 말초혈 단핵구 세포(PBMC)에서 인간 또는 사이노몰거스 CD8-양성 세포와 인간 항체 MS의 결합을 나타내며, 이는 인간과 사이노몰거스 NKG2D에 대한 친화성이 유사함을 증명한다.
도 12는 리간드-차단 항체(ON72 또는 재조합 발현되어 정제된 16F16(IgG4 이소타입))의 첨가가 51Cr-방출 분석에서 용량-의존적 방식으로 MICA-발현 표적 세포의 NK-매개 사멸을 차단한 것을 나타낸다.
도 13은 재조합 발현되어 정제된 16F16 및 16F31(모두 IgG4 이소타입)이 용량-의존적 방식으로 NK-92 세포에 의해 MICA(A)와 ULBP3(B) 보유 표적 세포(BaF/3)의 사멸을 억제할 수 있음을 나타내며, 16F16에 의해서는 두 리간드에 대해 0.8㎍에서 거의 전체적 봉쇄가 이루어지고, 16F31에 의해서는 두 리간드에 대해 최고 수준의 시험 용량인 20㎍/mL에서 부분적 봉쇄가 이루어진다.
도 14는 재조합 발현되어 정제된 MS, 21F2, 및 16F16(모두 IgG4 이소타입)이 리간드-발현 표적 세포의 NK-매개 사멸을 억제할 수 있음을 나타낸다. (a) MS 또는 21F2에 의한 ULBP3-BaF/3 세포의 NK-92 세포 사멸의 억제. (b) MS 또는 16F16에 의한 BaF/3-MICA 세포의 NKL 세포 사멸의 억제.
도 15는 NKG2D 및 DAP10으로 트랜스펙션된 BaF/3 세포를 사용한, 세포-표면 NKG2D의 항체-유도 감소를 나타낸다. 이 도면은 대조군(항-NKG2D 항체 없이 하룻밤 인큐베이션한 후의 세포 표면 NKG2D 수용체 = 100%)과 비교하여, ON72(1㎍) 또는 재조합 발현되어 정제된 인간 항체 16F16(1㎍; IgG4 이소타입) 또는 16F31(3㎍; IgG4 이소타입)과 함께 하룻밤 인큐베이션한 후 세포 표면에 남은 NKG2D 수용체의 퍼센트를 나타낸다.
도 16은 NKG2D 및 DAP10으로 트랜스펙션된 BaF/3 세포(도 15에서와 마찬가지로 수행됨)(a), 또는 말초혈로부터 신선하게 제조된 인간 NK 세포(b)를 사용한, 세포-표면 NKG2D의 MS 항체-유도 감소를 나타낸다. (b)에서는 인간 NK 세포가 인간 혈청의 존재하에 하룻밤 인큐베이션되었고, IgG가 존재하는 혈액 중의 상황을 의태하며, MS 항체의 농도는 가변적이다. 최저 농도에서도 최대 하향 조절이 달성되었으며, 이는 NKG2D+ NK 세포에 대해 유사한 조건의 결합 분석에서 측정된 약 60% 수용체 포화에 상응한다.
도 17은 나타낸 21F2 항체 농도에서 하룻밤 인큐베이션한 후 인간 NK 세포에서 세포-표면 NKG2D의 감소 퍼센트를 나타낸다.
도 18은 나타낸 시점에서 인간 혈액 샘플 중의 상이한 타입의 세포에서 표면-출현 NKG2D에 대한 ON72, MS, 및 21F2의 효과를 나타낸다. 각 항체의 농도는 0.1㎍/mL였다. 이론에 제한되는 것은 아니지만, 이 실험에서 표면-출현 NkG2D의 감소는 NKG2D의 내재화를 나타내는 듯하다. 도 (A) 내지 (C)는 각각 NKG2D-발현 NK 세포, CD8+ T 세포, 및 δγ T 세포의 항체-유도 NKG2D 내재화를 나타낸다. MS 및 21F2는 ON72보다 표면-회합 NKG2D를 덜 감소시켰다.
도 19는 동시-자극을 허용하고자 CD3을 두 상이한 최적 이하 용량으로 사용한, T 세포 증식에 대한 고정된 MS 및 ON72의 작용 효과에 대해 시험한 분석 결과를 나타낸다. (a) [CD3] = 0.1ng/ml; (b) [CD3] = 0.3ng/ml. T 세포 증식은 3일간 나타낸 고정 항체로 자극한 다음, 4일간 IL-2로 자극한 PBMC 집단 중에서 CFSE 희석에 의해서 평가되었다. CD28 자극이 동시-자극의 양성 대조군으로 포함된다. MS에 대해서는 유의한 작용 효과가 검출되지 않았지만, ON72는 T 세포 증식에 대해 낮지만 유의한 효과를 가졌다.
도 20은 항-NKG2D 항체의 Fab-단편(들)(MS 또는 hzON72) 또는 MICA 리간드와 복합체를 형성한 hNKG2D 다이머의 3-차원 중첩 화상을 묘사한다. hNKG2D 호모다이머('NKG2D')는 표면 화상으로 도시되며, 모노머 중 하나는 다른 것들보다 더 어두운 색이다. Fab 단편(각각 'MS' 및 'hzON72')은 검은색 관 스타일로 표시되는 반면, MICA('MICA')는 밝은 색의 모형 2차 구조 화상 스타일로 표시된다. (a), (b) hNKG2D/MS Fab와 hNKG2D/MICA 결정 복합체 구조의 중첩(Li et al., Nat Immunol 2001; 2:443-451; PDB-코드 1 HYR, 주형으로서 공통 hNKG2D 분자의 C-알파-원자 사용). MICA와 MS가 모두 비대칭 방식으로 NKG2D 다이머와 결합함에 따라서, (a)와 (b)는 NKG2D-다이머와 결합되었을 때 두 리간드 분자의 두 가능한 상대적 결합 배향을 나타낸다. 두 배향에 대하여 hNKG2D와의 중첩 계산에서 MICA와 MS Fab는 상당히 중첩되었으며, 이는 MICA가 hNKG2D 수용체와 결합되는 것을 차단하는 MS Fab의 능력을 나타낸다. 실시예 11 참조. (c) hNKG2D/hzON72 Fab와 hNKG2D/MICA 복합체 결정 구조의 중첩. hNKG2D의 각 모노머가 hzON72 Fab에 의해서 결합되었다. hNKG2D와의 중첩 계산에서 hzON72 항체도 역시 MICA 결합 부위와 상당히 중첩되었으며, 이는 hzON72가 MICA와 hNKG2D의 결합을 차단할 수 있음을 나타낸다. 실시예 12 참조.
도 21은 두 hNKG2D 모노머 단위의 서열(SEQ ID NO:2)에서 MS Fab(A), hzON72 Fab(B) 및 MICA 분자(C)에 대한 hNKG2D 다이머의 각 NKG2D 모노머 단위의 서열(SEQ ID NO:2)의 에피토프 잔기를 나타낸다. 결정 구조 리간드 원자로부터 4.0 A 거리 내에 있는 NKG2D 잔기는 결합 에티토프의 일부인 것으로 간주되었고, 밑줄로 표시된다. 이중 밑줄친 잔기들은 리간드와의 수소-결합에 포함되었다. (A) hNKG2D 다이머에서 hNKG2D 모노머 단위 1 및 2 상의 단일 MS Fab에 대한 결합 에피토프. 결정학적 모노머 N과 C는 NKG2D 모노머 단위 1과 조합되고, 결정학적 모노머 M과 D는 NkG2D 모노머 단위 2와 조합되었다. 모노머 단위 2에서는 Lys 150 측쇄 원자 Nζ만이 두 결정학적으로 독립적인 복합체 중 하나에서 수소-결합에 유일하게 포함되었다. 표 9-12 참조. (B) hNKG2D 모노머 단위 1 및 2에 동시 결합된 2개 hzON72 Fab에 대한 각 결합 에피토프. Trp 166이 결정학적으로 독립적인 분자 복합체 중 하나에서 수소-결합에 포함되었지만(1개의 hNKG2D 모노머를 가진 복합체에서 1개의 hzON72 Fab 분자), 나머지와는 수소-결합하기에 거리가 너무 멀었다. 표 14-15 참조. (C) hNKG2D 모노머 단위 1 및 2 상의 MICA 분자에 대한 결합 에피토프. MICA는 hNKG2D 다이머와 비대칭 결합을 나타냈고, 따라서 MS-Fab에 비하여 두 배향에서 결합할 수 있다. MICA의 2차 배향은 2개 모노머 단위의 화상을 서로 교환하면 간단히 얻어질 수 있다.
도 22는 표면 화상의 hNKG2D 분자를 나타내며, 모노머 중 하나가 다른 것들보다 약간 더 어둡다. 이들의 각 결정 구조 MS/hzON72/MICA Fab 원자로부터 4.0 A 거리 내에 있는 NKG2D 원자는 검은색이고, MS Fab(A), 2개 hzON72 Fab(B) 및 MICA (C) 및 (D)에 대해 도시된다. MICA와 MS Fab가 모두 비대칭 방식으로 NKG2D 다이머와 결합하기 때문에 NKG2D에 대한 상대적 결합 배향이 다를 수 있다. 이것은 MS에 대한 (C) 및 (D)의 MICA의 두 가능한 상대적 결합 배향을 나타낸 도면에 제시된다. 표 9-12 및 14-15 참조.
정의
문맥상 달리 언급되거나 모순되지 않는다면, 본원에서 사용된, "hNKG2D" 및 용어 "NKG2D," 또는 "NKG2-D," "CD314," "D12S2489E," "KLRK1," "킬러 세포 렉틴-유사 수용체 서브패밀리 K, 멤버 1", 및 "KLRK1"은 인간 킬러 세포 활성화 수용체 유전자, 그것의 mRNA(예를 들어, NCBI RefSeq NM_007360; SEQ ID NO:1) 및 그것의 유전자 산물(NCBI RefSeq NP_031386; SEQ ID NO:2), 또는 이들의 자연발생 변이체를 말한다. NK 및 T 세포에서 hNKG2D 수용체의 리간드-결합 형태는 호모다이머이다(Li et al., Nat Immunol 2001; 2:443-451). hNKG2D 수용체는 전형적으로 DAP10과의 복합체의 표면에 출현하며(Wu et al., J Exp Med 2000; 192: 1059 et seq.; NCBI Accession No. AAG29425, AAD50293), 더 높은 차수의 복합체도 형성한다고 제안되었다. 또, hNKG2D로 인한 어떤 활성, 예를 들어 세포 활성화, 항체 인식 등도 역시 DAP10 및/또는 다른 성분과의 복합체 또는 고-차수 복합체의 형태인 hNKG2D로 인한 것일 수 있다.
문맥상 달리 언급되거나 모순되지 않는다면, 본원에서 용어 "항체"는 광의의 의미로 사용되며, 구체적으로는 전장 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 및 항원-결합 단편, 항체 변이체, 및 그것의 다중-특이적 분자를 포함하고, 단 이들은 원하는 생물학적 활성을 나타내야 한다. 일반적으로, 전장 항체는 이황화 결합에 의해 서로 연결된 적어도 2개의 중쇄(H)와 2개의 경쇄(L)를 포함하는 당단백질, 또는 그것의 항원 결합 부분이다. 각 중쇄는 중쇄 가변 영역(VH로 약칭)과 중쇄 불변 영역으로 이루어진다. 중쇄 불변 영역은 CH1, CH2 및 CH3의 3개 도메인으로 이루어진다. 각 경쇄는 경쇄 가변 영역(VL로 약칭)과 경쇄 불변 영역으로 이루어진다. 경쇄 불변 영역은 1개 CL 도메인으로 이루어진다. VH와 VL은 프레임워크 영역(FR)이라고 하는 더 보존성인 영역들이 산재된, 상보성 결정 영역(CDR)이라고 하는 초가변성의 영역들로 더 세분될 수 있다. 각 VH와 VL은 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4의 순서로 아미노-말단에서부터 카르복시-말단 쪽으로 배치된, 3개의 CDR과 4개의 FR로 이루어진다. 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 항원과 상호작용하는 결합 도메인을 함유한다. 항체 분자 구조의 일반 원리 및 항체 제조와 관련된 기술들이, 예를 들어 Harlow and Lane, ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (1988)에서 제공된다.
항체의 "항원-결합 단편"은, 전형적으로 적어도 VH 영역의 하나 이상의 부분을 포함하는, 항원과 검출 가능하게 결합할 수 있는 전장 항체의 일부분을 포함하는 분자이다. 항원-결합 단편은 항체의 1, 2, 3, 또는 그 이상의 항원-결합 부분을 포함하는 다가 분자, 및 VL 및 VH 영역, 또는 이들의 선택된 부분이 합성 링커 또는 재조합 방법에 의해 연결되어 기능적 항원-결합 분자를 형성한 단일-사슬 구성물을 포함한다. 항체의 어떤 항원-결합 단편은 큰 항체 분자를 실제로 단편화하여(예를 들어, 효소 절단) 얻어질 수도 있지만, 대부분은 전형적으로 재조합 기술에 의해 생성된다. 용어 "항체 유도체" 및 "면역콘쥬게이트"는 본원에서 호환하여 사용되며, 하나 이상의 아미노산이, 예를 들어 항체와 제 2 분자와의 연결을 위해, 예를 들어 알킬화, PEG화, 아실화, 에스테르 형성 또는 아미드 형성 등에 의해 화학적으로 변형된 전장 항체 또는 그것의 항원-결합 단편을 포함하는 분자를 나타낸다. 예시적인 변형은 PEG화(예를 들어, 시스테인-PEG화), 바이오틴화, 방사선 표지, 및 제 2 제제(세포독성제 등)와의 콘쥬게이션을 포함한다.
"다중-특이적 분자"는 적어도 하나의 다른 기능적 분자(예를 들어, 또 다른 펩티드 또는 단백질, 예를 들어 또 다른 항체 또는 수용체의 리간드)와 회합되거나 연결됨으로써 적어도 2개의 상이한 결합 부위나 표적 분자와 결합하는 분자를 형성한 항체, 또는 그것의 항원-결합 단편을 포함한다. 예시적인 다중-특이적 분자는 이중-특이적 항체 및 가용성 수용체 단편 또는 리간드에 연결된 항체를 포함한다.
본원에서 사용된 용어 "인간 항체"는 프레임워크와 CDR 영역이 모두 인간 점라인 면역글로불린 서열로부터 유래된(즉, 동일하거나 본질적으로 동일한) 가변 영역을 가진 항체를 포함하도록 의도된다. 또, 항체가 불변 영역을 함유한다면, 불변 영역도 역시 인간 점라인 면역글로불린 서열"로부터 유래된다". 본 발명의 인간 항체는 인간 점라인 면역글로불린 서열에 의해 암호화되지 않는 아미노산 잔기를 포함할 수 있다(예를 들어, 시험관내 무작위 또는 부위-특정 돌연변이유발 또는 생체내 체세포 돌연변이에 의해 도입된 돌연변이). 그러나, 본원에서 사용된 용어 "인간 항체"는 마우스와 같은 다른 포유류 종의 점라인으로부터 유래된 CDR 서열이 인간 프레임워크 서열 위에 접목된 항체를 포함하도록 의도되지는 않는다.
"인간화된" 항체는 비-인간 면역글로불린으로부터 유래된 서열을 최소한 함유하는 인간/비-인간 키메라 항체이다. 대부분 인간화된 항체는 수여자의 초가변 영역의 잔기가 마우스, 래트, 토끼, 또는 비-인간 영장류 같은 원하는 특이성, 친화성, 및 능력을 가진 비-인간 종(공여자 항체)의 초가변 영역의 잔기로 치환된 인간 면역글로불린(수여자 항체)이다. 어떤 예에서, 인간 면역글로불린의 FR 잔기가 상응하는 비-인간 잔기로 치환된다. 또한, 인간화된 항체는 수여자 항체나 공여자 항체에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이런 변형은 항체 성능을 더 한정하기 위해 이루어진다. 일반적으로, 인간화된 항체는 모든 또는 실질적으로 모든 초가변 루프가 비-인간 면역글로불린의 것들에 해당하고, 모든 또는 실질적으로 모든 FR 잔기가 인간 면역글로불린 서열의 것들인 적어도 1개, 전형적으로는 2개의 가변 도메인을 실질적으로 전부 포함한다. 또한, 인간화된 항체는 선택적으로 면역글로불린 불변 영역(Fc), 전형적으로는 인간 면역글로불린의 불변 영역의 적어도 일부를 포함할 수 있다. 더 상세한 내용은, 예를 들어 Jones et al., Nature 321: 522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); 및 Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992), WO 92/02190, US 특허출원 20060073137, 및 US 특허 6750325, 6632927, 6639055, 6548640, 6407213, 6180370, 6054297, 5929 212, 5895205, 5886152, 5877293, 5869619, 5821337, 5821123, 5770196, 5777085, 5766886, 5714350, 5693762, 5693761 , 5530101 , 5585089, 및 5225539를 참조한다.
용어 "초가변 영역"은 본원에서 항원 결합을 초래하는 항체의 아미노산 잔기를 말한다. 초가변 영역은 일반적으로 "상보성-결정 영역" 또는 "CDR"(경쇄 가변 도메인의 잔기 24-34(L1), 50-56(L2) 및 89-97(L3)과 중쇄 가변 도메인의 잔기 31-35(H1), 50-65(H2) 및 95-102(H3); Kabat et al.,(1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242)로부터의 아미노산 잔기 및/또는 "초가변 루프"(경쇄 가변 도메인의 잔기 26-32(L1), 50-52(L2) 및 91-96(L3)과 중쇄 가변 도메인의 잔기 26-32(H1), 53-55(H2) 및 96-101(H3); Chothia & Lesk, J Mol Biol 1987; 196:901-917)로부터의 잔기를 포함한다. 전형적으로, 이 영역에서 아미노산 잔기의 넘버링은 Kabat et al.(상동)에 설명된 방법에 의해 수행된다. "Kabat 위치", "Kabat와 같은 가변 도메인 잔기 넘버링" 및 "Kabat에 따른" 등의 문구는 본원에서 이 넘버링 시스템을 중쇄 가변 도메인 또는 경쇄 가변 도메인에 적용한 것을 말한다. Kabat 넘버링 시스템을 사용하면, 펩티드의 실제 선형 아미노산 서열은 가변 도메인의 FR 또는 CDR의 단축, 또는 그것에의 삽입에 상응하여 더 적거나 추가된 아미노산을 함유할 수 있다. 예를 들어, 중쇄 가변 도메인은 CDR H2의 잔기 52 뒤에 단일 아미노산 삽입(Kabat에 따르면 잔기 52a)과 중쇄 FR 잔기 82 뒤에 삽입된 잔기들(예를 들어, Kabat에 따르면 잔기 82a, 82b, 및 82c 등)을 포함할 수 있다. 잔기들의 Kabat 넘버링은 "표준" Kabat 넘버링을 가진 서열과 항체의 서열의 상동성 영역에서 정렬함으로써 주어진 항체에 따라 결정될 수 있다.
"프레임워크 영역" 또는 "FR" 잔기는 여기 정의된 CDR 이외의 다른 VH 또는 VL 잔기이다.
"에피토프" 또는 "결합 부위"는 항원-결합 펩티드(항체 등)가 특이적으로 결합하는 항원 상의 장소 또는 영역이다. 단백질 에피토프는 결합에 직접 연루되는 아미노산 잔기(에피토프의 면역우성 성분이라고도 한다) 및 결합에 직접 연루되지 않는 다른 아미노산 잔기, 예를 들어 특이적 항원 결합 펩티드에 의해 효과적으로 차단되는 아미노산 잔기(다시 말해서, 아미노산 잔기가 특이적 항원 결합 펩티드의 "용매-배제 표면" 및/또는 "족문" 내에 있다)를 포함할 수 있다. 달리 언급되지 않는다면, 본원에서 용어 "에피토프"는 항-hNKG2D 항체, 또는 본 발명에 따른 다른 hNKG2D-특이적 제제와 특이적으로 결합하는 hNKG2D의 어떤 특정 영역에 두 가지 타입의 아미노산 결합 부위를 모두 포함한다(예를 들어, 어떤 문맥에서 본 발명은 특정 아미노산 잔기에 직접 결합하는 항체에 관한 것이다). NKG2D는 다수의 상이한 에피토프를 포함할 수 있으며, 이들은 제한되지는 않지만 (1) 선형 펩티드 항원 결정소; (2) 성숙 NKG2D 입체형태에서 서로의 근처에 위치된 하나 이상의 비연속 아미노산으로 구성된 입체형태적 항원 결정소; 및 (3) 탄수화물 기와 같은, NKG2D에 공유 부착된 분자 구조로 전체적으로 또는 부분적으로 구성된 후-번역 항원 결정소를 포함할 수 있다. 문맥상 달리 특정되거나 모순되지 않는다면, 입체형태적 항원 결정소는 항원-결합 펩티드의 원자로부터 약 4 A의 거리 내에 있는 NKG2D 아미노산 잔기를 포함한다.
"용매-배제 표면"은, 예를 들어 분자와 리간드의 결합 때문에 컴퓨터 계산에서 어떤 물 분자에 의해서도 도달될 수 없는 분자의 영역이다(Lee and Richards, J Mol Biol 1971; 55:379-400, 본원에 참고자료로 포함된다).
관심의 항체(예를 들어, MS 또는 21F2)"와 본질적으로 동일한 에피토프 또는 결정소와 결합한다"라는 문구는 관심의 항체가 특이적으로 결합하는 NKG2D 분자에 대하여 어떤 항체가 관심의 항체와 "경합한다"라는 의미이다.
"파라토프"는 항원과 특이적으로 결합하는 항체의 항원-결합 부분의 장소 또는 영역이다. 문맥상 달리 언급되거나 명백히 모순되지 않는다면, 파라토프는 그 중 몇 개는 전형적으로 CDR 내에 있는 에피토프 결합에 직접 연루되는 아미노산 잔기 및 결합에 직접 연루되지 않는 다른 아미노산 잔기, 예를 들어 특이적 항원 결합 펩티드에 의해 효과적으로 차단되는 아미노산 잔기(다시 말해서, 아미노산 잔기가 특이적 항원 결합 펩티드의 "용매-배제 표면" 및/또는 "족문" 내에 있다)를 포함할 수 있다.
NKG2D 분자와 천연 NKG2D-리간드(예를 들어, MICA)의 결합을 "차단"하는 항-NKG2D 항체의 능력은 가용성 또는 세포-표면 회합된 NKG2D 및 리간드 분자를 이용한 분석에서 항체가 용량-의존적 방식으로 NKG2D-분자와 리간드의 결합을 검출 가능하게 감소시킬 수 있다는 의미이며, 이때 NKG2D 분자는 항체의 부재하에는 리간드에 검출 가능하게 결합한다. 항-NKG2D 항체가 MICA-결합을 차단할 수 있는지의 여부를 결정하기 위한 예시적인 분석이 실시예 3에 제공된다. 동일한 분석을 다른 NKG2D 리간드의 항체-매개 차단을 시험하는데 사용할 수도 있다.
폴리펩티드의 "변이체"는 기준 폴리펩티드, 전형적으로는 자생 또는 "모" 폴리펩티드와 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 가진 폴리펩티드를 말한다. 폴리펩티드 변이체는 자생 아미노산 서열 내의 어떤 위치에 하나 이상의 아미노산 치환, 결실 및/또는 삽입, 및/또는 한쪽 또는 양쪽 말단에 부가를 지닐 수 있다.
두 아미노산 서열의 문맥에서 용어 "실질적으로 동일한"은 디폴트 갭 가중치를 사용하는 프로그램 GAP 또는 BEST-FIT에 의해 최적 정렬되었을 때 서열들이 적어도 약 50% 서열 동일성을 공유한다는 의미이다. 전형적으로, 실질적으로 동일한 서열은 적어도 약 60, 적어도 약 70, 적어도 약 80, 적어도 약 90, 적어도 약 95, 적어도 약 98, 또는 적어도 약 99% 서열 동일성을 나타낼 것이다.
실질적으로 동일한 두 아미노산 서열에서 "상응하는" 아미노산 위치는 여기 언급된 단백질 분석 소프트웨어 중 어느 것에 의해 정렬된 것들이다.
핵산 서열(또는 요소)는 또 다른 핵산 서열(또는 요소)과 "작동 가능하게 연결되며", 이때 그것은 나머지 핵산 서열과 기능적 관계로 위치된 것이다. 예를 들어, 프레-서열 또는 분비 리더의 DNA가 폴리펩티드의 DNA(즉, 폴리펩티드의 발현을 코딩하는 DNA)에 작동 가능하게 연결된다면, 그것은 폴리펩티드의 분비에 참여하는 프레-단백질로서 발현된다; 프로모터 또는 인핸서가 코딩 서열에 작동 가능하게 연결된다면, 그것은 서열의 전사에 영향을 미친다; 또는 리보솜-결합 부위가 코딩 서열에 작동 가능하게 연결된다면, 그것은 번역을 촉진할 수 있도록 위치된다. 일반적으로, "작동 가능하게 연결된"은 연결된 DNA 서열이 연속적이며, 분비 리더의 경우 연속적이고 리딩 페이즈 내에 있다는 의미이다. 그러나, 인핸서 같은 일부 요소는 작동 가능하게 연결되기 위해서는 코딩 서열과 연속되지 않아야 한다. 연결은 전형적으로 편리한 제한 부위에서의 라이게이션에 의해 달성된다. 만일 이러한 부위가 존재하지 않는다면, 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터나 링커나 종래의 관례에 따라서 사용될 수 있다.
"분리된" 분자는 조성물 중에서 주종인 분자로서, 그것이 속하는 분자의 부류와 관련하여 발견된다(즉, 그것은 조성물 중의 분자 타입의 적어도 약 50%를 구성하며, 전형적으로는 조성물 중의 펩티드와 같은 분자 종의 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 또는 그 이상을 구성할 것이다). 흔히 항체 분자의 조성물은 조성물에 존재하는 모든 펩티드 종들의 환경에서, 또는 제안된 사용 환경에서 실질적으로 활성인 펩티드 종들과 적어도 관련하여 항체 분자에 대해 98%, 98% 또는 99% 상동성을 나타낼 것이다.
문맥상 모순되지 않는다면, 본 발명의 문맥에서, "치료" 또는 "치료하는"은 질환 또는 장애의 하나 이상의 증상 또는 임상 관련 징후의 예방, 완화, 관리, 치유 또는 감소를 말한다. 예를 들어, 질환 또는 장애의 증상이나 임상 관련 징후가 아직 확인되지 않은 환자의 "치료"는 방어적 또는 예방적 요법인 반면, 질환 또는 장애의 증상이나 임상 관련 징후가 확인된 환자의 임상, 치유, 또는 완화를 위한 "치료"는 방어적 또는 예방적 "요법"을 구성하지 않는다. 각 치료 용어는 본 발명의 별개의 양태로 고려될 수 있다.
발명의 설명
본 발명은 NKG2D-관련 상태, 예를 들어 자가면역 및 염증 질환 및 장애에 걸린 인간 환자를 치료하는데 적합한 특성을 가진 항-NKG2D 항체에 일부 기초한다. 본 발명의 항체는 전형적으로 환자 자신의 면역계에 의한 항체에 대한 면역반응 위험을 최소화시킨 완전 인간 항체이거나 인간화된 항체이며, 세포의 표면에서 활성 형태로, 즉 DAP10과 회합된 호모다이머로 hNKG2D에 결합한다.
본 발명의 항체는 전형적으로 NKG2D 활성이 감소되어야 하는 상태의 치료에 유용하다. 이러한 항체는, 예를 들어 NKG2D와의 결합에 대해 하나 이상의 내인성 NKG2D-리간드와 경합하거나 차단함으로써, 결합시 세포-표면 NKG2D의 양을 하향 조정하거나 감소시킴으로써, 및/또는 세포에 대한 ADCC 또는 CDC 반응을 도출함으로써 NKG2D-발현 NK 및/또는 T 세포의 활성화를 감소 또는 억제할 수 있다.
한 양태에서, 본 발명의 항체는 길항제이며, 인간 NKG2D와의 결합에서 MICA와 같은 하나 이상의 천연 리간드와 경합함으로써 리간드-유도 NKG2D-활성화를 감소시킨다. MICA 분자는 분명히 염증 질환에 연루되었고, 실시예 3에 나타낸 대로 몇 개의 인간 항체, 특히 MS 및 21F2가 세포-표면 NKG2D와의 MICA-결합을 차단하는데 효과적이었으며, 에피토프 결정은 MS Fab가 MICA의 결합을 방해했다는 것을 나타냈다(실시예 11, 도 20). 또, MS와 21F2는 모두 NK-세포 매개 세포독성을 차단하는데 있어서 매우 효과적이었다(실시예 6). 따라서, 이들 결과는 본 발명이 이러한 특성을 가진 항체를 제공한다는 것을 증명한다.
더 특정한 양태로서, 본 발명의 항체는 효과적인 길항제인 한편, hNKG2D 신호화에 대한 작용 효과는 유의하지 않아서, NKG2D-유도 염증에는 기여하지 않는다. 예를 들어, 도 19에 나타낸 대로, PBMC의 CD3-촉발 증식에 대한 고정 MS의 동시-자극은 검출할 수 없었지만, 고정 ON72는 적긴 하지만 유의한 동시-자극을 초래했다. 이론에 결부되지는 않지만, 이런 차이는 적어도 일부는 도 20-22에 나타낸 에피토프의 차이 때문일 수 있다. 2가 항체의 항원-결합 부분은 hNKG2D 다이머 복합체에 있는 한 모노머와는 강하게 결합하지만, 제 2 MS 항체(또는 같은 항체의 제 2 항원-결합 부분)와 제 2 모노머와의 결합은 차단한다. 반대로, 2가 hzON72 항체의 항원-결합 부분이 hNKG2D 다이머에서 제 1 모노머와 결합한 때, 그것은 제 2 hzON72 항체(또는 같은 항체의 제 2 항원-결합 부분)와 제 2 모노머의 결합을 차단하지 않는다.
한 구체예에서, 본 발명은 인간 항-NKG2D 항체 또는 인간화된 항-NKG2D 항체를 제공하며, 이것은 NKG2D-발현 NK 세포 또는 T 세포에 첨가되었을 때 2개 이하의 hNKG2D 다이머와 가교 결합된다. 바람직하게, 이러한 항체는 2가이다. 항원-결합 부분과 NKG2D 모노머 단위의 결합이 제 2 NKG2D 모노머 단위와의 추가 결합을 차단하는 2가 항체(예를 들어, MS)는 최대 2개의 hNKG2D 다이머와만 가교 결합할 수 있다. 반대로, hNKG2D 다이머의 제 2 NKG2D 모노머 단위와의 결합을 차단하지 않고 hNKG2D 다이머의 NKG2D 모노머 단위와 결합할 수 있는 2가 항체는 다수의 hNKG2D 다이머와 가교 결합할 수 있다. 표면 수용체들의 클러스터화가 수용체 활성화시에 흔히 발생한다.
한 구체예에서, 본 발명은 인간 항-NKG2D 항체 또는 인간화된 항-NKG2D 항체를 제공하며, 이것은 NKG2D-발현 NK 세포 또는 T 세포에 첨가되었을 때 hNKG2D 다이머 복합체에 있는 한 모노머와만 강하게 결합한다. 이론과 결부되지는 않지만, 다이머의 두 모노머 모두와의 강한 결합은 NKG2D-수용체의 활성화에 있어 필요조건일 수 있다. MICA와 hzON72는 hNKG2D 다이머에 있는 두 모노머 단위 모두와 강하게 결합한다. 그러나, hNKG2D 다이머와 MS의 결합은 모노머 단위 중 하나와의 결합이 우세하며, 제 2 모노머 단위와의 결합은 약하거나 비특이적이고, 이때는 제 2 hNKG2D 모노머 상의 용매-배제 표면적이 작다(실시예 11). 별개의 특정한 바람직한 구체예에서, 본 발명의 항체의 결합에 의한 제 1 및 제 2 NKG2D 모노머 단위로부터 용매-배제 표면적의 비는 약 1:1 이상, 적어도 약 2:1, 또는 적어도 약 3:1이다.
한 구체예에서, 본 발명은 MS와 동일한 에피토프를 필수적으로 결합하는 인간 또는 인간화된 항-NKG2D 항체를 제공한다. 이론과 결부되지는 않지만, hNKG2D 다이머 상의 특정 잔기, 또는 잔기 조합과 리간드의 상호작용이 작용제 활성을 없애거나 최소화할 수 있었다. 별개의 특정한 구체예에서, 본 발명의 항체의 에피토프는 hNKG2D(SEQ ID NO:2)의 Lys 150, Ser 151, Tyr 152, Thr 180, Ile 181, Ile 182, Glu 183, Met 184, Gln 185, Leu 191, Lys 197, Tyr 199, Glu 201, Thr 205, Pro 206, Asn 207 및 Thr 208로 구성되는 군으로부터 선택된 적어도 1개 잔기, 적어도 3개 잔기, 적어도 5개 잔기, 적어도 8개 잔기, 적어도 10개 잔기, 적어도 12개 잔기, 또는 잔기 전부를 포함한다.
한 양태에서, 본 발명은 hNKG2D-발현 NK 또는 T 세포의 NKG2D-매개 세포독성을 효과적으로 방지하고; hNKG2D와의 결합에서 적어도 MICA와 경합하고; 예를 들어 hNKG2D의 하향 조정의 자극, hNKG2D의 내재화 및/또는 hNKG2D의 출현의 방지에 의하여 결합시 세포-표면 hNKG2D의 양을 감소시키고; 10nM 이하의 hNKG2D에 대한 친화성을 가지고; 사이노몰거스 및/또는 레서스 NKG2D와 교차-반응하고; 그리고 예를 들어 IgG4 이소타입을 가짐으로써 고갈되지 않는, 완전 인간 항체 또는 그것의 항원-결합 단편을 제공한다. 특정 구체예에서, 항체는 IgG4 이소타입의 비-고갈 완전 인간 항체로서, hNKG2D에 대한 친화성이 1nM 이하, 바람직하게는 300pM 이하이고, 내인성 hNKG2D-리간드 결합의 적어도 50%, 적어도 70%, 또는 적어도 90%를 차단하며, 세포-표면 hNKG2D의 양을 적어도 10%, 적어도 30%, 또는 적어도 50%로 감소시킨다. 다른 특정 구체예에서, 항체는 IgG4 이소타입의 2가 비-고갈 완전 인간 항체로서, 친화성은 100pM 이하이고, MICA-Fc의 완전 포화 용량과 세포-표면 회합된 NKG2D의 결합을 차단하는데 있어서 EC50 농도가 0.01ng/mL 이하이고, 결합시 세포-표면 NKG2D의 양을 적어도 75%로 감소시킬 수 있으며, 선택적으로 리간드-유도 NK 세포 세포독성의 감소에서 EC50 농도가 세포-표면 회합된 NKG2D와의 결합에 필요한 EC50 농도 보다 더 낮다. 또한, 항체는 MKG2D-발현 세포를 사용한 분석에서 hNKG2D 수용체의 포화(즉, 포화 용량)를 달성하기 위해 필요한 것보다 낮은 농도에서 최대 수준의 hNKG2D 하향 조정을 달성할 수 있다.
hNKG2D와 특이적으로 결합하고 이들 특성 중 일부 또는 전부를 가진 항체의 제조, 특성화, 및 용도가 실시예를 포함한 하기 단락들에 더 상세히 설명된다.
항- NKG2D 항체
본 발명의 항체는 특정한 기능적 및/또는 구조적 특징 또는 특성들을 특징으로 한다. 항-hNKG2D 항체의 기능적 활성을 평가하기 위한 분석은 실시예에 상세히 설명되고, 아미노산 서열 등의 구조적 특성이 아래 설명된다.
기능적 특성
본 발명의 항체는 hNKG2D와 결합한다. 한 구체예에서, 본 발명의 항체는 높은 친화성으로, 예를 들어 10-7M 이하의 KD, 10-8M 이하의 KD, 1nM 이하의 KD, 0.3nM 이하의 KD, 0.2nM 이하의 KD, 0.1nM 이하, 0.05nM 이하, 또는 0.01nM 이하의 KD로 hNKG2D와 결합한다. 특정 구체예에서, 항체는 0.1nM 이하의 친화성으로 hNKG2D와 결합한다.
한 양태에서, 본 발명은 사이노몰거스 원숭이(Macaca fascicularis, NCBI 수탁번호 AJ426429)) 및 레서스 원숭이(Macaca mulatta, NCBI 수탁번호 AJ554302)와 같은 원숭이에 있는 하나 이상의 NKG2D 오르토로그, 및/또는 hNKG2D 호모다이머, 정확하게 폴딩된 모노머 전장 hNKG2D, hNKG2D의 세포외 부분을 포함하는 hNKG2D 단편, 변성 hNKG2D, 또는 전술한 NKG2D 형태들의 어떤 조합과도 결합하는 항체를 제공한다. 예를 들어, 실시예 5에서 증명된 대로, 인간 항체 21F2 및 MS와 특정 사이노몰거스 세포 타입의 결합은 상응하는 EC50(즉, 반 최대 유효 농도) 값에 대해 각각 동일한 인간 세포 타입과의 결합의 약 65% 및 약 75% 이상이었다. 따라서, 한 구체예에서, 본 발명의 항체는 hNKG2D와 결합하는 것과 유사한 친화성 또는 효율로 사이노몰거스 및/또는 레서스 NKG2D와 결합한다. 예를 들어, 항체는 NKG2D-발현 인간 NK 또는 T 세포의 상응하는 집단에 대한 상응하는 EC50의 약 50% 이상, 약 65% 이상, 또는 약 75% 이상의 EC50으로 NKG2D-발현 사이노몰거스 또는 레서스 NK 또는 T 세포와 결합할 수 있다. 추가로 또는 달리, 항체는 hNKG2D에 대한 친화성의 약 30% 이상, 약 50% 이상, 약 65% 이상, 또는 약 75% 이상, 약 80% 이상, 약 85% 이상, 또는 약 90% 이상의 친화성으로 사이노몰거스 또는 레서스 NKG2D와 결합할 수 있다. 이러한 항체는 인간에서 사용하기 전에 대부분의 적합한 동물 모델(또는 모델들)에서 독성 시험을 할 수 있다는 이점을 가진다.
한 특정 양태에서, 본 발명의 항체는 또한 ON72 같은 공지된 뮤린 항-hNKG2D 항체는 결합하지 않는 NKG2D의 형태와도 결합한다. 구체적으로, 실시예 3에 설명된 대로, ON72와의 예비-인큐베이션은 hNKG2D와의 결합에 대해 이어서 첨가된 인간 16F16 항체의 약 82%만을 차단했지만, 16F16과의 예비-인큐베이션은 hNKG2D와의 결합에 대해 이어서 첨가된 ON72의 약 95%를 차단했다.
또한, 본 발명의 항체는 NK 또는 T 세포의 hNKG2D-매개 활성화를 감소 또는 억제할 수 있으며, 즉 hNKG2D 수용체를 길항작용할 수 있다. 이것은 예를 들어 여기 설명되거나 본 분야에 공지된 하나 이상의 세포독성 분석에서 시험될 수 있다. 예를 들어, 항체는 만일 그것이 NKG2D-리간드-발현 표적 세포의 NK- 또는 T 세포-매개 사멸을 어떤 항-hNKG2D 항체의 부재하 또는 비-특이적 대조군 항체의 존재하에서의 표적 세포 사멸과 비교하여 적어도 10%, 더 바람직하게 적어도 30%, 더욱더 바람직하게 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80% 또는 적어도 90%까지 억제한다면 NK 또는 T 세포의 hNKG2D-매개 활성화를 억제한다고 한다.
hNKG2D 길항제인 본 발명의 항체는 작용제 활성은 전혀 없거나 약간 가질 수 있다. 바람직하게, 이러한 항체는 인간 항체 또는 인간화된 항체이다. 작용제 활성은 여기 설명된 분석, 또는 본 분야에 공지된 분석 중 하나에 의해 시험될 수 있다. 예를 들어, 한 분석 타입은 고정된 항-NKG2D 항체의 존재 또는 부재하에 낮은 수준의 CD3로 자극된 말초혈 림프구(PBMC)의 증식을 측정하는 동시-자극 분석이다(실시예 10 참조). 이러한 분석에서, 본 발명 항체가 존재할 때의 증식은 항체가 부재할 때보다 30% 이하, 20% 이하, 10% 이하, 5% 이하이거나, 또는 그보다 유의하게는 높지 않다. 바람직하게, 본 발명 항체가 존재할 때의 증식은 항체가 부재할 때보다 유의하게 높지 않다. 추가로 또는 다른 구체예에서, 작용제 분석에서 본 발명의 항체의 hNKG2D 작용제 활성은 대조군 값보다 30% 이하, 20% 이하, 10% 이하, 5% 이하이거나, 또는 그보다 유의하게 높지 않다. 대조군은 바람직하게 음성 대조군, 예를 들어 항체의 부재, 세포 또는 다른 시약의 부재, 및/또는 무관한 항체의 존재이다. 바람직하게, 본 발명의 항체의 작용제 활성은 대조군 값보다 유의하게 높지 않다.
다른 양태로서, 본 발명은 NK 또는 T 세포의 세포-표면 NKG2D와의 결합에 대한 것보다 리간드-유도 세포독성의 차단에 대해 EC50 농도가 더 낮은, 바람직하게는 실질적으로 더 낮은 항체를 제공한다. 예를 들어, ON72에서 BaF/3 세포(0.062㎍/mL)에서 발현된 세포-표면 NKG2D와의 결합에 대한 EC50 농도가 리간드(ULBP3-)-발현 표적 세포(0.065㎍/mL)의 NK-세포 매개 사멸의 차단에 대한 EC50 농도와 유사했지만, 21F2는 세포-표면 NKG2D와의 결합(21F2: 0.033㎍/mL; MS: 0.032g/mL)에 대한 것보다 세포독성 차단(21F2: 0.021㎍/mL; MS: 0.012㎍/mL)에 대한 EC50이 더 낮았고, MS에서는 실질적으로 더 낮았다(실시예 6 및 9 참조). 또한, MS에서는 21F2와 16F16(이들은 포화 농도에 해당하는 농도 또는 그보다 높은 농도를 가졌다, 도 3)보다 낮은 농도(세포-회합된 NKG2D-수용체의 단지 약 80% 포화에 해당하는 농도, 도 3)에서 최대 세포독성 차단이 달성되었다. 따라서, 한 구체예에서, 본 발명은 NK 또는 T 세포의 세포-표면 NKG2D와의 결합에 대한 것보다 라간드-유도 세포독성의 차단에 대한 EC50이 더 낮은 항체, 바람직하게는 인간 항체 또는 인간화된 항체를 제공한다. 셀라인 또는 다른 적합한 제제에서 NK 또는 T 세포의 세포독성을 차단하는데 대한 EC50은, 예를 들어 동일한 셀라인 또는 집단의 세포-표면 NKG2D와의 결합에 대한 EC50의 약 95% 이하, 약 90% 이하, 약 85% 이하, 약 80% 이하, 약 70% 이하, 약 50% 이하, 또는 약 40% 이하일 수 있다. 시험을 위한 예시적인 셀라인은 NK-92 및 NKL 세포를 포함한다.
다른 구체예에서, 본 발명은 이용가능한 hNKG2D-수용체를 포화시키는데 필요한 농도보다 낮은 농도에서 NK 세포 세포독성의 최대 차단을 달성하는 항체를 제공한다. 특정 구체예에서, 항체는 또한 hNKG2D와의 결합에서 MS와 경합한다. 다른 특정 구체예에서, 이러한 항체는 MS와 동일한 hNKG2D 에피토프에 필수적으로 결합한다.
항체는, 예를 들어 하나 이상의 내인성 hNKG2D-리간드의 hNKG2D-결합을 방해함으로써 NKG2D-매개 활성화를 감소 또는 억제할 수 있다. 예를 들어, 항체는 예를 들어 MICA; 또는 MICA 및 MICB; 또는 MICA 및 ULBP3; 또는 MICA, MICB, 및 ULBP3; 또는 MICA, MICB, 및 모든 ULBP1, -2, -3, 및 4; 또는 MICA, MICB, 및 하나 이상의 RAET1 패밀리 멤버의 hNKG2D-결합을 감소 또는 억제함에 의해, MICA; MICB; ULBP1; ULBP2; ULBP4; 및/또는 RAET1-패밀리 멤버들의 hNKG2D-결합을 감소 또는 억제할 수 있다. 내인성 NKG2D-리간드의 hNKG2D-결합을 억제하는 항체의 능력은 여기 설명된 결합 또는 경합 분석을 사용하여 평가될 수 있다. 한 구체예에서, 본 발명의 항체는 리간드 결합의 적어도 30%, 또는 리간드 결합의 적어도 50%, 또는 리간드 결합의 적어도 70%, 또는 리간드 결합의 적어도 80%, 또는 적어도 90%를 억제할 수 있다. 다른 구체예에서, 1㎍ MICA-mFc의 hNKG2D-결합을 억제하는 본 발명의 항체의 IC50은 1nM 이하, 0.5nM 이하, 0.2nM 이하, 0.1nM 이하, 0.05nM 이하, 또는 0.02nM 이하, 0.01nM 이하, 0.005 이하, 또는 0.002 이하이다. 또 다른 구체예에서, 1㎍ MICA-mFc 결합의 완전한 차단이 5nM 이하, 1nM 이하, 0.7nM 이하, 0.5nM 이하 또는 0.2nM 이하, 0.1nM 이하, 0.05nM 이하, 또는 약 0.02nM 이하의 항체 농도에서 달성된다. 한 구체예에서, 본 발명은 ON72, BAT221, 5C6, 1D11, ECM217 및 149810 중 어느 것보다, 예를 들어 hNKG2D와의 MICA 결합 등의 리간드 hNKG2D-결합을 감소 또는 억제하는데 있어서 효과적인 또는 더 효과적인 항체, 특히 인간 항체를 제공한다.
추가로 또는 달리, 본 발명의 항-hNKG2D 항체는 결합시(즉, 결합 후) 세포-표면 hNKG2D의 양을 감소시킬 수 있다. 항체 결합에 의한 세포-표면 회합된 hNKG2D의 감소는 리간드 결합과 후속 활성화에 이용가능한 hNKG2D 수용체의 수를 감소시키므로 유리한 특징일 수 있다. 이론과 결부되지는 않지만, 이런 감소는 NKG2D 하향 조정, 내재화, 또는 다른 기전에 의해 야기될 수 있다. 여기 나타낸 대로, 인간 항체와 같은, 인간 Fc-영역을 가진 항-hNKG2D 항체는 세포-표면 hNKG2G의 양을 효과적으로 감소시킬 수 있다. 예를 들어, 인간 항-hNKG2D 항체인 16F16, MS, 및 21F2는 모두 혈청의 부재하에 하룻밤 인큐베이션한 후 세포-표면 hNKG2D의 양을 약 75% 이상으로 감소시켰고, 낮은 농도에서 75-90% 하향 조정을 달성한 MS가 가장 효과적이었다(도 15-17). 또, 혈청의 존재하에서 hNKG2D-발현 BaF/3 세포에 대한 포화 농도보다 낮은 농도에 해당하는 MS 농도가 최대 하향 조정을 달성했다(도 16B). 따라서, 한 구체예에서, 본 발명은 포화 농도보다 낮은 농도에서 hNKG2D의 최대 하향 조정을 달성할 수 있는 hNKG2D와 결합하는 항체를 제공한다. 다른 구체예에서, 이러한 항체는 또한 hNKG2D와의 결합에서 MS와 경합한다. 다른 구체예에서, 이러한 항체는 또한 MS와 동일한 hNKG2D 에피토프에 필수적으로 결합한다. 본 발명의 항체는 항-hNKG2D 항체의 부재하 또는 비-특이적 대조군 항체의 존재하에서의 세포-표면 hNKG2D와 비교하여 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 50%, 적어도 70%, 또는 적어도 90%까지 세포-표면 hNKG2D를 감소시킬 수 있다. 바람직하게, 항체는 NKG2D-수용체 신호화의 활성화를 야기하지 않거나 최소화하면서, 즉 작용제 활성을 나타내지 않거나 최소화하면서 세포-표면 NKG2D의 감소를 달성한다. 세포-표면 hNKG2D와 항-hNKG2D 항체의 작용제 활성을 평가하는 예시적인 분석이 여기 설명된다. 한 구체예에서, 본 발명은 ON72, BAT221, 5C6, 1D11, ECM217, 및 149810로부터 선택된 대조군 항체보다 더 높은 정도의 하향 조정을 달성할 수 있는 항체, 특히 인간 항체를 제공한다. 다른 구체예에서, 본 발명의 항-hNKG2D 항체는 포화 농도보다 낮은 농도에서 세포 또는 셀라인에 의해 발현된 세포-표면 NKG2D의 최대 하향 조정을 달성할 수 있다.
다른 구체예에서, 본 발명은 16F16, 16F31, MS, 및/또는 21F2, 더 바람직하게 MS 및/또는 21F2와 동일한 hNKG2D 상의 에피토프와 경합하고 및/또는 결합하는 항체를 제공한다. 이러한 항체는 여기 설명된 표준 hNKG2D 결합 분석에서 16F16, 16F31, MS, 또는 21F2와 상호 경합하는 능력에 기초하여 확인될 수 있다. hnkG2D와 16F16, 16F31, MS, 또는 21F2의 결합을 억제하는 시험 항체의 능력은 시험 항체가 hNKG2D와의 결합에 대해 16F16, 16F31, MS, 또는 21F2와 경합할 수 있고, 이로써 16F16, 16F31, MS, 또는 21F2와 동일한 hNKG2D 상의 에피토프와 결합할 수 있다는 것을 증명한다. 바람직한 구체예에서, 16F16, 16F31, MS, 또는 21F2와 동일한 hNKG2D 상의 에피토프와 결합하는 항체는 인간 모노클로날 항체이다. 이러한 인간 모노클로날 항체는 실시예에 설명된 대로 제조되고 분리될 수 있다.
다른 바람직한 구체예에서, 항체는 마우스 모노클로날 항체인 ON72, BAT221, 5C6, 1D11, ECM217, 및 149810 중 어느 것과는 다른 에피토프에 결합하고, 열거된 마우스 모노클로날 항체 중 어느 것보다 16F16, 16F31, MS, 또는 21F2와 더 잘 상호 경합한다.
한 구체예에서, 본 발명의 항체의 에피토프는 hNKG2D(SEQ ID NO:2)의 Lys 150, Ser 151, Tyr 152, Thr 180, ILe 181, Ile 182, Glu 183, Met 184, Gln 185, Leu 191, Lys 197, Tyr 199, Glu 201, Thr 205, Pro 206, Asn 207 및 Thr 208로부터 선택된 하나 이상의 잔기를 포함한다. 한 구체예에서, 본 발명의 항체의 에피토프는 hNKG2D(SEQ ID NO:2)의 Lys 150, Ser 151, Tyr 152, Thr 180, Ile 181, Ile 182, Glu 183, Met 184, Gln 185, Leu 191, Lys 197, Tyr 199, Glu 201, Thr 205, Pro 206, Asn 207 및 Thr 208로부터 선택된 5개 이상의 잔기를 포함한다. 한 구체예에서, 본 발명의 항체의 에피토프는 hNKG2D(SEQ ID NO:2)의 Lys 150, Ser 151, Tyr 152, Thr 180, Ile 181, Ile 182, Glu 183, Met 184, Gln 185, Leu 191, Lys 197, Tyr 199, Glu 201, Thr 205, Pro 206, Asn 207 및 Thr 208로부터 선택된 8, 10, 12, 또는 그 이상의 잔기를 포함한다. 한 구체예에서, 본 발명의 항체의 에피토프는 hNKG2D(SEQ ID NO:2)의 잔기 Lys 150, Ser 151, Tyr 152, Thr 180, Ile 181, Ile 182, Glu 183, Met 184, Gln 185, Leu 191, Lys 197, Tyr 199, Glu 201, Thr 205, Pro 206, Asn 207 및 Thr 208를 포함한다. 한 구체예에서, 본 발명의 항체의 에피토프는 hNKG2D(SEQ ID NO:2)의 잔기 Lys 150, Ser 151, Tyr 152, Thr 180, Ile 181, Ile 182, Glu 183, Met 184, Gln 185, Leu 191, Lys 197, Tyr 199, Glu 201, Thr 205, Pro 206, Asn 207 및 Thr 208로 필수적으로 구성된다. 한 구체예에서, 본 발명의 항체의 에피토프는 hNKG2D(SEQ ID NO:2)의 Lys 150, Ser 151, Tyr 152, Thr 180, Ile 181, Ile 182, Glu 183, Met 184, Gln 185, Leu 191, Lys 197, Tyr 199, Glu 201, Thr 205, Pro 206, Asn 207 및 Thr 208로부터 선택된 하나 이상의 잔기로 구성된다. 한 구체예에서, 본 발명의 항체의 에피토프는 hNKG2D(SEQ ID NO:2)의 잔기 Lys 150, Ser 151, Tyr 152, Thr 180, Ile 181, Ile 182, Glu 183, Met 184, Gln 185, Leu 191, Lys 197, Tyr 199, Glu 201, Thr 205, Pro 206, Asn 207 및 Thr 208로 구성된다.
한 구체예에서, 본 발명의 항체의 에피토프는 hNKG2D(SEQ ID NO:2)의 Lys 150, Ser 151, Tyr 152, Ile 181, Met 184, Gln 185, Lys 197, Thr 205 및 Asn 207로부터 선택된 수소-결합에 포함되는 하나 이상의 잔기를 포함한다. 한 구체예에서, 본 발명의 항체의 에피토프는 hNKG2D(SEQ ID NO:2)의 Lys 150, Ser 151, Tyr 152, Ile 181, Met 184, Gln 185, Lys 197, Thr 205 및 Asn 207로부터 선택된 수소-결합에 포함되는 5개 이상의 잔기를 포함한다. 한 구체예에서, 본 발명의 항체의 에피토프는 hNKG2D(SEQ ID NO:2)의 Lys 150, Ser 151, Tyr 152, Ile 181, Met 184, Gln 185, Lys 197, Thr 205 및 Asn 207을 포함한다.
본 발명의 바람직한 항체는 다음의 특성들 중 적어도 하나, 더 바람직하게 2개, 3개, 4개, 5개 또는 그 이상을 나타내며, 특성들은 다음과 같다: (a) NKG2D-발현 NK 또는 T 세포의 NKG2D-매개 활성화 방지, 선택적으로 리간드-유도 세포독성의 감소에 대한 EC50이 세포 결합에 대한 EC50보다 낮다; (b) NKG2D와의 결합에서 적어도 하나의 NKG2D 리간드, 바람직하게 적어도 MICA 및 ULBP3과 경합; (c) NKG2D-발현 NK 또는 T 세포 표면의 NKG2D의 양을 바람직하게 적어도 75%로 감소; (d) 사이노몰거스 및/또는 레서스 NKG2D와 결합, 바람직하게는 그것이 hNKG2D와 결합하는 친화성의 50% 이상의 친화성으로; (e) NKG2D의 하나 이상의 형태 또는 입체형태와 결합; (f) 1nM 이하, 바람직하게는 0.1nM 이하의 Kd로 NKG2D와 결합; (g) hNKG2D와의 결합에서 16F16, 16F31, MS 또는 21F2 중 하나 이상과 결합; (h) hNKG2D와의 결합에서 ON72, BAT221, 5C6, 1D11, ECM217 및 149810 중 어느 것보다 16F16, 16F31, MS 또는 21F2과 더 잘 경합; (i) 세포-표면 hNKG2D와 16F16, MS 또는 21F2 결합의 90% 이상을 차단; (j) 작용제 활성이 유의하지 않음; 그리고 (k) 16F16, 16F31, MS 및/또는 21F2 중 어느 것과 동일한 에피토프, 바람직하게는 본질적으로 MS 및/또는 21F2와 동일한 에피토프와 필수적으로 결합. 상기 설명된 기능적 특징들, 및/또는 실시예에 설명된 기능적 특징들의 어떤 조합도 본 발명의 항체에 의해서 나타날 수 있다.
구조적 특성
본 발명의 바람직한 항체는 실시예에 설명된 대로 제조되고, 분리되고, 구조적으로 그리고 기능적으로 특성화된 인간 모노클로날 항체인 16F16, 16F31, MS, 및 21F2이다. 이들 항체의 전장, 가변, 및 CDR 서열이 표 1에 제시된다.
Figure 112010041741204-pct00001
본 발명의 어떤 항-NKG2D 항체들은 MS와 동일하거나 유사한 파라토프를 가진다. 한 구체예에서, 항체는 MS L 사슬(SEQ ID NO:41)의 Tyr 33 및 Trp 97 중 하나 이상, 및/또는 MS H 사슬(SEQ ID NO:40)의 Gln 1, Asp 26, Asp 27, Ser 30, Ser 31, Tyr 32, Tyr 33, His 50, Ser 52, Tyr 53, Ser 54, Ser 56, Ala 57, Asn 58, Trp 98 및 Asp 99 중 하나 이상에 해당하는 잔기를 포함하는 파라토프를 가진다. 한 구체예에서, 항체는 MS L 사슬(SEQ ID NO:41)의 Tyr 33 및 Trp 97, 및/또는 MS H 사슬(SEQ ID NO:40)의 Gln 1, Asp 26, Asp 27, Ser 30, Ser 31, Tyr 32, Tyr 33, His 50, Ser 52, Tyr 53, Ser 54, Ser 56, Ala 57, Asn 58, Trp 98 및 Asp 99 중 3, 5, 7, 10 또는 그 이상에 해당하는 잔기를 포함하는 파라토프를 가진다. 한 구체예에서, 항체는 MS L 사슬(SEQ ID NO:41)의 Tyr 33 및 Trp 97, 및 MS H 사슬(SEQ ID NO:40)의 Gln 1, Asp 26, Asp 27, Ser 30, Ser 31, Tyr 32, Tyr 33, His 50, Ser 52, Tyr 53, Ser 54, Ser 56, Ala 57, Asn 58, Trp 98 및 Asp 99에 해당하는 잔기를 포함하는 파라토프를 가진다. 한 구체예에서, 항체는 MS L 사슬(SEQ ID NO:41)의 Tyr 33 및 Trp 97, 및 MS H 사슬(SEQ ID NO:40)의 Gln 1, Asp 26, Asp 27, Ser 30, Ser 31, Tyr 32, Tyr 33, His 50, Ser 52, Tyr 53, Ser 54, Ser 56, Ala 57, Asn 58, Trp 98 및 Asp 99에 해당하는 잔기로 필수적으로 구성된 파라토프를 가진다. 한 구체예에서, 항체는 MS L 사슬(SEQ ID NO:41)의 Tyr 33 및 Trp 97, 및 MS H 사슬(SEQ ID NO:40)의 Gln 1, Asp 26, Asp 27, Ser 30, Ser 31, Tyr 32, Tyr 33, His 50, Ser 52, Tyr 53, Ser 54, Ser 56, Ala 57, Asn 58, Trp 98 및 Asp 99에 해당하는 잔기로 구성된 파라토프를 가진다.
16F16, 16F31, 21F2, 및 MS가 모두 hNKG2D와 결합할 수 있다면, 이들 항체의 각 VH 및 VL 서열을 "믹스 앤 매치"하는 것이 가능할 수 있으며, 이로써 본 발명의 다른 항-hNKG2D 결합 분자들이 만들어진다. 이러한 "믹스 앤 매치" 항체의 hNKG2D 결합은 여기 설명된 결합 분석(예를 들어, 유세포분석, Biacore, ELISA)을 이용하여 및/또는 여기 설명된 세포독성 분석을 이용하여 시험될 수 있다. VH와 VL 사슬이 믹스 앤 매치될 때, 특정 VH/VL 쌍으로부터의 VH 서열은 구조적으로 유사한 VH 서열로 치환되는 것이 바람직하다. 마찬가지로, 특정 VH/VL 쌍으로부터의 VL 서열은 구조적으로 유사한 VL 서열로 치환되는 것이 바람직하다.
따라서, 한 양태로서, 본 발명은 (a) SEQ ID NO: 11, 13, 44 및 46으로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역, 및 (b) SEQ ID NO: 12, 14, 45 및 47로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역을 포함하며, hNKG2D와 결합하는, 분리된 모노클로날 항체, 또는 그것의 항원-결합 부분을 제공한다. 바람직한 중쇄와 경쇄 조합은 (a) SEQ ID NO:11의 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역과 (b) SEQ ID NO:12의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역; (a) SEQ ID NO:13의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역과 (b) SEQ ID NO:14의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역; (a) SEQ ID NO:44의 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역과 (b) SEQ ID NO:46의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역; 또는 (a) SEQ ID NO:45의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역과 (b) SEQ ID NO:47의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 16F16, 16F31, MS, 또는 21F2의 중쇄 및 경쇄 CDR1, CDR2 및/또는 CDR3, 또는 이들의 조합을 포함하는 항체를 제공한다. CDR 영역은 Kabat 시스템(Kabat et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242)을 사용하여 묘사된다. 예를 들어 도 4 및 5 참조. 이들 각 항체가 hNKG2D와 결합할 수 있고, 항원-결합 특이성이 CDR1, 2 및 3 영역에 의해 주로 제공된다면, VH CDR1, 2 및 3 서열과 VL CDR1, 2 및 3 서열이 "믹스 앤 매치"될 수 있으며(즉, 각 항체가 VH CDR1, 2 및 3과 VL CDR1, 2 및 3을 함유할 수 있지만, 상이한 항체로부터의 CDR들이 믹스 앤 매치될 수 있다), 이로써 본 발명의 다른 항-hNKG2D 결합 분자들이 만들어질 수 있다. 이러한 "믹스 앤 매치" 항체의 hNKG2D-결합은 상기 설명된 결합 분석을 이용하여 그리고 실시예에서 시험될 수 있다(예를 들어, 유세포분석, Biacore, 또는 ELISA). VH CDR 서열이 믹스 앤 매치될 경우, 바람직하게는 특정 VH 서열로부터의 CDR1, CDR2 및/또는 CDR3 서열은 구조적으로 유사한 CDR 서열(들)로 치환된다. 마찬가지로, VL CDR 서열이 믹스 앤 매치될 경우, 바람직하게는 특정 VL 서열로부터의 CDR1, CDR2 및/또는 CDR3 서열은 구조적으로 유사한 CDR 서열(들)로 치환된다. 예를 들어, 16F16, 16F31, MS 및 21F2의 VL CDR1 및 CDR3와 MS 및 21F2의 VL CDR2는 어떤 구조적 유사성을 공유하며, 따라서 믹스 앤 매치될 수 있다. 하나 이상의 VH 및/또는 VL CDR 영역 서열을 모노클로날 항체 16F16, 16F31, MS 및 21F2에 대해 여기 개시된 CDR 서열의 구조적으로 유사한 서열로 치환함으로써 새로운 VH 및 VL 서열을 만들 수 있다는 것이 당업자에게는 자명할 것이다.
따라서, 또 다른 양태로서, 본 발명은 (a) SEQ ID NO:15, 21, 48 및 54로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1; (b) SEQ ID NO:16, 22, 49 및 55로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2; (c) SEQ ID NO:17, 23, 50 및 56으로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3; (d) SEQ ID NO:18, 24, 51 및 57로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1; (e) SEQ ID NO:19, 25, 52 및 57로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2; 및 (f) SEQ ID NO:20, 26, 53 및 59로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3를 포함하고, hNKG2D와 결합하는, 분리된 모노클로날 항체, 또는 그것의 항원-결합 부분을 제공한다.
바람직한 구체예에서는, 항체가 (a) SEQ ID NO:15를 포함하는 VH CDR1; (b) SEQ ID NO:16을 포함하는 VH CDR2; (c) SEQ ID NO:17을 포함하는 VH CDR3; (d) SEQ ID NO:18을 포함하는 VL CDR1; (e) SEQ ID NO:19를 포함하는 VL CDR2; 및 (f) SEQ ID NO:20을 포함하는 VL CDR3을 포함한다.
다른 바람직한 구체예에서는, 항체가 (a) SEQ ID NO:21을 포함하는 VH CDR1; (b) SEQ ID NO:22을 포함하는 VH CDR2; (c) SEQ ID NO:23을 포함하는 VH CDR3; (d) SEQ ID NO:24을 포함하는 VL 영역 CDR1; (e) SEQ ID NO:25을 포함하는 VL CDR2; 및 (f) SEQ ID NO:26을 포함하는 VL CDR3을 포함한다.
다른 바람직한 구체예에서는, 항체가 (a) SEQ ID NO:48을 포함하는 VH CDR1; (b) SEQ ID NO:49을 포함하는 VH CDR2; (c) SEQ ID NO:50을 포함하는 VH CDR3; (d) SEQ ID NO:51을 포함하는 VL 영역 CDR1; (e) SEQ ID NO:52을 포함하는 VL CDR2; 및 (f) SEQ ID NO:53을 포함하는 VL CDR3을 포함한다.
다른 바람직한 구체예에서는, 항체가 (a) SEQ ID NO:54을 포함하는 VH CDR1; (b) SEQ ID NO:55을 포함하는 VH CDR2; (c) SEQ ID NO:56을 포함하는 VH CDR3; (d) SEQ ID NO:57을 포함하는 VL 영역 CDR1; (e) SEQ ID NO:58을 포함하는 VL CDR2; 및 (f) SEQ ID NO:59을 포함하는 VL CDR3을 포함한다.
바람직한 구체예에서는, 항체가 (a) SEQ ID NO:15로 구성되는 VH CDR1; (b) SEQ ID NO:16로 구성되는 VH CDR2; (c) SEQ ID NO:17로 구성되는 VH CDR3; (d) SEQ ID NO:18로 구성되는 VL CDR1; (e) SEQ ID NO:19로 구성되는 VL CDR2; 및 (f) SEQ ID NO:20로 구성되는 VL CDR3을 포함한다.
다른 바람직한 구체예에서는, 항체가 (a) SEQ ID NO:21로 구성되는 VH CDR1; (b) SEQ ID NO:22로 구성되는 VH CDR2; (c) SEQ ID NO:23로 구성되는 VH CDR3; (d) SEQ ID NO:24로 구성되는 VL 영역 CDR1; (e) SEQ ID NO:25로 구성되는 VL CDR2; 및 (f) SEQ ID NO:26로 구성되는 VL CDR3을 포함한다.
다른 바람직한 구체예에서는, 항체가 (a) SEQ ID NO:48로 구성되는 VH CDR1; (b) SEQ ID NO:49로 구성되는 VH CDR2; (c) SEQ ID NO:50로 구성되는 VH CDR3; (d) SEQ ID NO:51로 구성되는 VL 영역 CDR1; (e) SEQ ID NO:52로 구성되는 VL CDR2; 및 (f) SEQ ID NO:53로 구성되는 VL CDR3을 포함한다.
다른 바람직한 구체예에서는, 항체가 (a) SEQ ID NO:48로 구성되는 VH CDR1; (b) SEQ ID NO:49로 구성되는 VH CDR2; (c) SEQ ID NO:50로 구성되는 VH CDR3; (d) SEQ ID NO:51로 구성되는 VL 영역 CDR1; (e) SEQ ID NO:52로 구성되는 VL CDR2; 및 (f) SEQ ID NO:53로 구성되는 VL CDR3, 및 MS H 사슬(SEQ ID NO:40)의 Gln 1, Asp 26 및 Asp 27 중 1개, 2개 또는 전부에 해당하는 잔기를 포함한다.
다른 바람직한 구체예에서는, 항체가 (a) SEQ ID NO:54로 구성되는 VH CDR1; (b) SEQ ID NO:55로 구성되는 VH CDR2; (c) SEQ ID NO:56로 구성되는 VH CDR3; (d) SEQ ID NO:57로 구성되는 VL 영역 CDR1; (e) SEQ ID NO:58로 구성되는 VL CDR2; 및 (f) SEQ ID NO:59로 구성되는 VL CDR3을 포함한다.
어떤 구체예에서, 본 발명의 항체는 특정 점라인 H 사슬 면역글로불린 유전자, 또는 특정 점라인 H 사슬 면역글로불린 유전자들의 조합으로부터 VH 영역; 및/또는 특정 점라인 L 사슬 면역글로불린 유전자, 또는 특정 점라인 L 사슬 면역글로불린 유전자들의 조합으로부터 VL 영역을 포함한다. 이러한 조합은, 예를 들어 B 세포에서 체세포 재조합에 의해 생체내 획득될 수 있다.
예를 들어, 한 구체예에서, 본 발명은 (a) 인간 D3-9, D3-10, 또는 D3_10_R3 유전자 및 JH3, JH4 또는 JH6 유전자와 재조합된 인간 VH3_21, VH3_20, VH4_59, 또는 VH5_51 유전자로부터 유래된 VH 영역을 포함하고, (b) 인간 JK1 , JK2 또는 JK3 유전자와 재조합된 인간 VKI_L15 또는 VKIII_A27 또는 VKIII_L6 유전자로부터 유래된 VL 영역을 포함하고, (c) hNKG2D와 결합하는, 분리된 항-hNKG2D 항체, 또는 그것의 항원-결합 단편을 제공한다.
다른 구체예에서, 본 발명은 인간 VH3_21, D3-9 및 JH4 유전자의 재조합에 의해 얻어진 VH 영역과 인간 VKI_L15 및 JK2 유전자의 재조합에 의해 얻어진 VL 영역을 포함하는, 분리된 항-hNKG2D 항체, 또는 그것의 항원-결합 단편을 제공한다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 인간 VH3_20, D3-10 및 JH6 유전자의 재조합에 의해 얻어진 VH 영역과 인간 VKIII_A27 및 JK3 유전자의 재조합에 의해 얻어진 VL 영역을 포함하는, 분리된 항-hNKG2D 항체, 또는 그것의 항원-결합 단편을 제공한다.
다른 구체예에서, 본 발명은 인간 VH4_59, D 유전자 및 JH3 유전자의 재조합에 의해 얻어진 VH 영역과 인간 VKIII_A27 및 JK1 유전자의 재조합에 의해 얻어진 VL 영역을 포함하는, 분리된 항-hNKG2D 항체, 또는 그것의 항원-결합 단편을 제공한다.
다른 구체예에서, 본 발명은 인간 VH5_51, D3_10_R3 및 JH4 유전자의 재조합에 의해 얻어진 VH 영역과 인간 VKIII_L6 및 JK1 유전자의 재조합에 의해 얻어진 VL 영역을 포함하는, 분리된 항-hNKG2D 항체, 또는 그것의 항원-결합 단편을 제공한다.
별개의 특정 구체예에서, 본 발명은 상기 설명된 항-hNKG2D 항체의 VH 및/또는 VL 영역에 1, 2, 3, 4 또는 그 이상의 아미노산 치환 및/또는 체세포 과돌연변이를 도입함으로써 얻어진 분리된 항-NKG2D 항체를 제공한다.
항체의 가변 영역이 인간 점라인 면역글로불린 유전자를 이용한 시스템(하기 설명된)에 의해 얻어진다면, 본원에서 사용된 인간 항체는 특정 점라인 서열"의", "로부터 유래된" 또는 "의 산물"인 중쇄 또는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 이러한 "시스템"은 관심의 항원으로 인간 면역글로불린 유전자를 보유한 트랜스제닉 마우스를 면역화하는 것이나, 또는 관심의 항원으로 파지에 나타난 인간 면역글로불린 유전자 라이브러리를 스크리닝하는 것을 포함한다. 인간 점라인 면역글로불린 서열"의" 또는 "로부터 유래된" 또는 "의 산물"인 인간 항체는 인간 항체의 아미노산 서열과 인간 점라인 면역글로불린의 아미노산 서열을 비교하고, 인간 항체의 서열과 서열이 가장 근접한(즉, 최대 동일성 %) 인간 점라인 면역글로불린 서열을 선택함으로써 확인될 수 있다. 특정 인간 점라인 면역글로불린 서열"의" 또는 "로부터 유래된" 또는 "의 산물"인 인간 항체는, 예를 들어 자연발생 체세포 돌연변이 또는 부위-지정 돌연변이(들)(이것은 선택된 치환일 수 있다)의 의도적 도입으로 인하여 점라인 서열과 비교하여 아미노산 차이를 함유할 수 있다.
그러나, 인간 항체는 전형적으로 재조합된 점라인 면역글로불린 서열에 의해 암호화된 아미노산 서열과 아미노산 서열이 적어도 90% 동일하며, 일반적으로 다른 종의 점라인 면역글로불린 아미노산 서열(예를 들어, 뮤린 점라인 서열)과 비교했을 때 인간으로서 확인될 수 있다. 어떤 경우, 인간 항체는 재조합된 점라인 면역글로불린 유전자에 의해서 암호화된 아미노산 서열과 아미노산 서열이 적어도 95%, 또는 심지어 적어도 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일할 수 있다.
전형적으로, 특정 인간 점라인 서열로부터 유래된 인간 항체는 이 인간 점라인 면역글로불린 유전자에 의해서 암호화된 아미노산 서열과 10개 이하의 아미노산 차이를 나타낼 것이다. 어떤 경우, 인간 항체는 재조합된 점라인 면역글로불린 유전자에 의해서 암호화된 아미노산 서열과 8개 이하, 5개 이하, 또는 심지어 4, 3, 2, 또는 1 이하의 아미노산 차이를 나타낼 수 있다.
또 다른 구체예에서, 본 발명의 항체는 여기 설명된 바람직한 항체의 아미노산 서열과 상동성인 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 포함하며, 이때 항체는 본 발명의 항-hNKG2D 항체의 바람직한 기능적 특성을 보유한다. 예를 들어, 본 발명은 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 분리된 항체, 또는 그것의 항원-결합 부분을 제공하는데, 여기서 (a) VH 영역은 SEQ ID NO:11, 13, 44 및 46으로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하고; (b) VL 영역은 SEQ ID NO:12, 14, 45 및 47로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하고; (c) 항체는 hNKG2D와 결합하며, 여기 설명된 기능적 특성들 중 적어도 하나, 바람직하게는 여기 설명된 기능적 특성들 중 몇 가지를 나타낸다.
또 다른 구체예에서, VH 및/또는 VL 아미노산 서열은 상기 제시된 서열들과 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일할 수 있다. 상기 제시된 서열들의 VH 및 VL 영역과의 동일성이 높은(즉, 80% 이상) VH 및 VL 영역을 가진 항체는 SEQ ID NO:11-14 또는 44-47을 암호화하는 핵산 분자를 돌연변이유발(예를 들어, 부위-지정 또는 PCE-매개 돌연변이유발)하고, 이어서 여기 설명된 기능 분석을 사용하여 보유된 기능(예를 들어, hNKG2D 결합 친화성, nHKG2D-리간드 차단, hNKG2D 하향 조정, 또는 NK 또는 T 세포의 NKG2D-매개 활성화의 감소)에 대해 암호화된 변경된 항체를 시험함으로써 얻어질 수 있다.
두 서열의 동일성 퍼센트는 이 서열들에 의해 공유된 동일한 위치의 수의 함수이며(즉, 동일성 % = 동일한 위치의 수/총 위치 수 x 100), 이때 두 서열의 최적 정렬을 위해 도입되어야 하는 갭의 수와 각 갭의 길이를 고려한다. 두 서열의 서열 비교와 동일성 % 결정은 서열-분석 소프트웨어의 수학 알고리즘을 이용하여 달성될 수 있다. 단백질 분석 소프트웨어는 보존성 아미노산 치환을 포함하여 다양한 치환, 결실 및 다른 변형들에 할당된 유사성 값을 사용하여 유사한 서열들을 일치시킨다.
두 아미노산 서열의 동일성 퍼센트는, 예를 들어 Needleman과 Wunsch(J Mol Biol 48:444-453 (1970))의 알고리즘을 사용하여 결정될 수 있으며, 이 알고리즘은 GCG 소프트웨어 패키지의 GAP 프로그램에 포함되어 있고(http://www.gcg.com에서 이용 가능), Blossum 62 매트릭스 또는 PAM250 매트릭스와 16, 14, 12, 10, 8, 6, 또는 4의 갭 가중치 그리고 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6의 길이 가중치를 사용한다.
또, 폴리펩티드 서열은 디폴트 파라미터나 권장 파라미터를 적용하여 FASTA를 사용하여 비교될 수 있다. GCG 버전 6.1. FASTA(예를 들어, FASTA2 및 FASTA3)의 프로그램은 쿼리 서열과 서치 서열 사이의 최적 중첩된 영역의 정렬 및 서열 동일성 퍼센트를 제공한다(Pearson, Methods Enzymol. 1990; 183:63-98; Pearson, Methods Mol Biol 2000; 132:185-219).
또한, 두 아미노산 서열의 동일성 퍼센트는 E. Meyers와 W. Miller(Comput. Appl. Biosci., 1988; 11-17)의 알고리즘을 사용하여 결정될 수 있으며, 이것은 ALIGN 프로그램(버전 2.0)에 포함되어 있고, PAM120 가중치 잔기표, 갭 길이 패널티 12 및 갭 패널티 4를 사용한다.
데이터베이스에 함유된 한 서열과 다른 서열을 비교하기 위한 또 다른 알고리즘은 디폴트 파라미터를 사용하는 컴퓨터 프로그램 BLAST, 특히 blastp이다. 예를 들어, 본원에 참고자료로 포함된 Altschul et al., J Mol Biol 1990; 215:403-410; Altschul et al., Nucleic Acids Res. 1997; 25:3389-402 (1997)를 참조한다. 본 발명의 단백질 서열은, 예를 들어 관련 서열들을 확인하기 위하여 공용 데이터베이스를 서치하는 "쿼리 서열"로 사용될 수 있다. 이러한 서치는 XBLAST 프로그램(버전 2.0)(Altschul et al., 1990 (상동))을 사용하여 수행될 수 있다. BLAST 단백질 서치는 XBLAST 프로그램, 점수 = 50, 단어길이 = 3에서 수행될 수 있으며, 이로써 본 발명의 항체 분자와 상동성인 아미노산 서열이 얻어진다. 비교 목적을 위한 갭이 있는 정렬을 달성하기 위해서는 Gapped BLAST가 Altschul et al., 1997 (상동)에 설명된 대로 이용될 수 있다. BLAST와 Gapped BLAST 프로그램을 이용할 때는 각 프로그램(예를 들어, XBLAST 및 NBLAST)의 디폴트 파라미터가 사용될 수 있다. http://www.ncbi.nlm.nih.gov. 참조.
어떤 구체예에서, 본 발명의 항체는 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 VH 영역과 CDR1, CDR2 및 CDR3를 포함하는 VL 영역을 포함하며, 이때 이들 CDR 서열 중 하나 이상은 여기 설명된 바람직한 항체 16F16, 16F31, MS, 또는 21F2에 기초한 특정 아미노산 서열을 포함하고, 하나 이상의 CDR은 선택적으로 하나 이상의 보존성 아미노산 변형을 함유하며, 항체는 본 발명의 항-hNKG2D 항체의 바람직한 기능적 특성을 보유한다. 따라서, 본 발명은 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역과 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 분리된 항체, 또는 그것의 항원-결합 단편을 제공하며, 여기서 (a) VH 영역 CDR3 서열은 SEQ ID NO:17, 23, 50 및 56의 아미노산 서열로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하고; (b) VL 영역 CDR3 서열은 SEQ ID NO:20, 26, 53 및 59의 아미노산 서열로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하고; (c) 하나 이상의 CDR은 선택적으로 하나 이상의 보존성 아미노산 변형을 함유하고; 그리고 (d) 항체는 hNKG2D와 결합하며, 여기 설명된 기능적 특성들 중 적어도 하나, 더 바람직하게는 여기 설명된 기능적 특성들 중 몇 가지를 나타낸다.
추가 구체예에서, VH 영역 CDR2 서열은 SEQ ID NO:16, 22, 49 및 55의 아미노산 서열로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하고, VL 영역 CDR2 서열은 SEQ ID NO:19, 25, 52 및 58의 아미노산 서열로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하며, 하나 이상의 CDR은 선택적으로 하나 이상의 보존성 아미노산 변형을 함유한다.
또 추가 구체예에서, VH 영역 CDR1 서열은 SEQ ID NO:15, 21, 48 및 54의 아미노산 서열로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 서열, 및 그것의 보존성 변형을 포함하고, VL 영역 CDR1 서열은 SEQ ID NO:18, 24, 51 및 57의 아미노산 서열로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하고, 하나 이상의 CDR은 선택적으로 하나 이상의 보존성 아미노산 변형을 함유한다.
본원에서 사용된, 용어 "보존성 아미노산 변형"은 그 아미노산 서열을 항체의 결합 특성을 유의하게 영향을 미치거나 변경시키지 않는 아미노산 변형을 말하도록 의도된다. 이러한 보존성 변형은 아미노산 치환, 부가 및 결실을 포함한다. 변형은 본 분야에 공지된 표준 기술, 예를 들어 부위-지정 돌연변이유발 및 PCR-매개 돌연변이유발에 의해서 본 발명의 항체에 도입될 수 있다. 모 항체와 비교하여 아미노산 변형을 포함하는 항체 서열은 전형적으로 모 항체의 상응하는 아미노산 서열과 적어도 90%, 바람직하게는 적어도 95%, 98% 또는 99% 동일하고, 및/또는 모 항체 서열과 비교하여 최대 10개, 바람직하게 최대 5, 4, 3, 2개의 아미노산 변형을 포함한다.
전형적으로, "보존성" 아미노산 치환은 아미노산 잔기가 유사한 물리화학적 성질의 측쇄를 가진 아미노산 잔기로 치환된 것들이다. 유사한 측쇄를 가진 아미노산 잔기의 패밀리들이 본 분야에 정의되어 있다. 이들 패밀리는 염기성 측쇄(예를 들어, 리신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄(예를 들어, 아스파르트산, 글루탐산), 비하전 극성 측쇄(예를 들어, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인, 트립토판), 비극성 측쇄(예를 들어, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌), 베타-분지 측쇄(예를 들어, 트레오닌, 발린, 이소류신) 및 방향족 측쇄(예를 들어, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)을 가진 아미노산을 포함한다.
따라서, 본 발명의 항체의 CDR 영역 내의 하나 이상의 아미노산 잔기가 동일한 측쇄 패밀리에 속한 다른 아미노산 잔기로 치환될 수 있으며, 변경된 항체는 여기 설명된 기능 분석을 사용하여 보유된 기능(즉, 상기 (c), (d) 및 (e)에 제시된 기능들)에 대해 시험될 수 있다.
항원-결합 단편
본 발명의 항-hNKG2D 항체는 전장 항체 또는 그것의 항원-결합 단편으로 제조될 수 있다. 항원-결합 단편의 예는 Fab, Fab', F(ab)2, F(ab')2, F(ab)3, Fv(전형적으로 항체의 단일 팔의 VL 및 VH 도메인), 단쇄 Fv(scFv; 예를 들어, Bird et al., Science 1988; 242:423-426; 및 Huston et al., PNAS 1988; 85:5879-5883 참조), dsFv, Fd(전형적으로 VH 및 CH1 도메인) 및 dAb(전형적으로 VH 도메인) 단편; VH, VL, VhH 및 V-NAR 도메인; 단쇄 VH와 단쇄 VL를 포함하는 1가 분자; 미니바디, 디아바디, 트리아바디, 테트라바디 및 카파 바디(예를 들어, Ill et al., Protein Eng 1997; 10:949-57 참조); camel IgG; IgNAR; 그리고 하나 이상의 분리된 CDR 또는 기능적 파라토프를 포함하며, 이 경우 분리된 CDR 또는 항원-결합 잔기 또는 폴리펩티드들이 함께 회합되거나 연결되어 기능적 항원 단편이 형성될 수 있다. 다양한 타입의 항체 단편이, 예를 들어 Holliger and Hudson, Nat Biotechnol 2005; 23:1126-1136; WO 2005040219, 및 공개 U.S. 특허출원 20050238646 및 20020161201에서 설명되거나 검토되었다.
항체 단편은 종래의 재조합 또는 단백질 조작 기술을 사용하여 얻어질 수 있으며, 단편은 무손상 항체에 대한 것과 동일한 방식으로 항원-결합이나 다른 기능에 대해 스크리닝될 수 있다.
항체 단편을 제조하는 다양한 기술들이 개발되었다. 전통적으로 이들 단편은 전장 항체의 단백질 가수분해 효소절단에 의해 유래되었다(예를 들어, Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods, 24:107-117 (1992); 및 Brennan et al., Science, 229:81 (1985)). 그러나, 이들 단편은 이제 재조합 숙주 세포에 의해 직접 생산될 수 있다. 또는 달리, Fab'-SH 단편이 E. coli로부터 직접 회수된 다음, 화학적으로 커플링되어 F(ab'2) 단편을 형성할 수 있다(Carter et al., Bio/Technology, 10:163-167 (1992)). 다른 접근법에 따르면, F(ab')2 단편은 재조합 숙주 세포 배양물로부터 직접 분리될 수 있다. 다른 구체예에서, 선택된 항체는 단쇄 Fv 단편(scFv)이다. WO 1993/16185; U.S. Pat. No. 5,571 894; 및 U.S. Pat. No. 5,587,458 참조. 또한, 항체 단편은 "선형 항체"일 수 있으며, 이것은 예를 들어 U.S. Pat. No. 5,641,870에 설명된다. 이러한 선형 항체 단편은 단일-특이적 또는 이중-특이적일 수 있다.
다중-특이적 분자
또 다른 양태에서, 본 발명은 본 발명의 항-hNKG2D 항체, 또는 그것의 항원-단편을 포함하는 다중-특이적 분자를 특징으로 한다. 이러한 다중-특이적 분자는 hNKG2D에 대한 적어도 하나의 제 1 결합 특이성과 제 2 표적 에피토프에 대한 제 2 결합 특이성을 포함하는 이중-특이적 분자를 포함한다.
이중-특이적 분자의 한 가지 타입은 이중-특이적 항체이다. 이중-특이적 항체는 적어도 2개의 상이한 에피토프에 대해 결합 특이성을 가진 항체이다. 이중-특이적 분자를 제조하는 방법은 본 분야에 공지되어 있으며, 종래의 전장 이중-특이적 항체의 제조는 일반적으로 2개의 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍들의 동시-발현에 기초하며, 이때 2개의 사슬은 상이한 특이성을 가진다(Millstein et al., Nature, 305:537-539 (1983)). 이중-특이적 항체는 전장 항체 또는 항체 단편(예를 들어, F(ab')2 이중-특이적 항체) 또는 여기 설명된 어떤 다른 항원-결합 단편으로서 제조될 수 있다.
본 발명의 이중-특이적 항체에서 적어도 하나의 결합 에피토프는 hNKG2D 단백질 상에 있다. 항-NKG2D-결합 부분이 전-염증성 백혈구 상의 분자, 예를 들어 T 세포 수용체 분자(예를 들어, CD2, CD3, CD4 또는 CD8)와 결합하는 제 2 부분과 조합될 수 있고, 이로써 전-염증성 hNKG2D-발현 세포에 대한 세포 방어기전에 초점이 맞춰진다. 이 구체예에서, 이중-특이적 항체는, 예를 들어 NKG2D를 발현하는 전-염증성 세포로 세포독성제를 데려가거나, 또는 이들 세포에 대한 ADCC/CDC 공격을 지시하는데 사용된다. 세포독성제는, 예를 들어 사포린, 항-인터페론-알파 제제, 빈카 알칼로이드, 리신 A 사슬, 메토트렉세이트, 또는 방사선 활성 동위원소일 수 있다.
다른 구체예에서, 제 2 부분은 암, 바이러스성 감염 등과 같은 이펙터 림프구에 의해 일반적으로 조절되는 질환 상태와 관련된 세포 상에 출현되거나 이들 세포에 의해 발현되는 세포-관련 표적과 결합한다. 따라서, 예를 들어 전형적인 표적은 세포 스트레스-관련 분자들, 예를 들어 MIC 분자(예를 들어, MIC-A 또는 MIC-B) 또는 ULBP(예를 들어, Rae-1, H-60, ULBP2, ULBP3, HCMV UL18, 또는 Rae-1β) 또는 바이러스성 헤마글루티닌 같은 병원체-관련 분자일 수 있다.
다른 다중-특이적 분자는 hNKG2D-결합 항체 부분과 하나 이상의 다른 비-항체 단백질의 융합으로 생긴 것들을 포함한다. 이러한 다중-특이적 단백질과 이들을 구성하는 방법이 본 분야에 설명되었다. 예를 들어, Dreier et al.(Bioconjug. Chem. 9(4):482-489 (1998)); US 특허 6,046,310; US 특허공보 No. 20030103984; 유럽특허출원 1 413 316; US 특허공보 No. 20040038339; von Strandmann et al., Blood (2006; 107:1955-1962.), 및 WO 2004056873을 참조한다. 본 발명에 따라서, 비-항체 단백질은, 예를 들어 앞의 단락에서 설명된 "제 2 부분"의 항원 중 어느 것에 대한 적합한 리간드, 예를 들어 T 세포 또는 Fc 수용체의 리간드, 또는 세포 스트레스 분자, 예를 들어 MIC-A, MIC-B, ULBP, 또는 바이러스성 헤마글루티닌 같은 병원체-관련 분자일 수 있다. 또한, 2를 넘는 원자가를 가진 다중-특이적 분자도 고려된다. 예를 들어, 삼중-특이적 항체가 제조될 수 있다. Tutt et al., J Immunol 147:60 (1991).
본 발명의 다중-특이적 분자는 본 분야에 공지된 방법을 사용하여 구성요소 결합 특이성을 콘쥬게이션함으로써 제조될 수 있다. 예를 들어, 다중-특이적 분자의 각 결합 특이성이 각기 생성된 다음, 서로 콘쥬게이션될 수 있다. 결합 특이성이 단백질 또는 펩티드인 경우, 다양한 커플링제 또는 가교제가 공유 콘쥬게이션에 사용될 수 있다. 가교제의 예는 단백질 A, 카르보디이미드, N-숙신이미딜-S-아세틸-티오아세테이트(SATA), 5,5'-디티오비스(2-니트로벤조산)(DTNB), o-페닐렌디말레이미드(oPDM), N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트(SPDP), 및 술포숙신이미딜 4-(N-말레이미도메틸)시클로헥산-1-카르복실레이트(술포-SMCC)를 포함한다(예를 들어, Karpovsky et al., (1984) J Exp Med 160:1686; Liu, MA et al., (1985) Proc Natl Acad Sci USA 82:8648 참조). 다른 방법으로는 Paulus (1985) Behring Ins Mitt No. 78,118-132; Brennan et al., (1985) Science 229:81-83, 및 Glennie et al., (1987) J Immunol 139: 2367-2375에 설명된 것들이 포함된다. 바람직한 콘쥬게이션 제제는 SATA와 술포-SMCC이며, 이들 모두 Pierce Chemical Co. (Rockford, IL)에서 입수 가능하다.
결합 특이성이 항체인 경우, 이들은 두 개의 중쇄의 C-말단 힌지 영역의 술프히드릴 결합을 통해 콘쥬게이션될 수 있다. 특히 바람직한 구체예에서, 힌지 영역은 콘쥬게이션 전에 홀수의 술프히드릴 잔기, 바람직하게는 1개의 잔기를 함유하도록 변형된다.
또는 달리, 두 결합 특이성이 동일한 벡터에서 모두 암호화될 수 있으며, 동일한 숙주 세포에서 발현되어 조립될 수 있다. 이 방법은 이중-특이적 분자가 mAb x mAb, mAb x Fab, Fab x F(ab')2 또는 리간드 x Fab 융합 단백질인 경우 특히 유용하다. 본 발명의 이중-특이적 분자는 하나의 단쇄 항체와 결합 결정소를 포함하는 단쇄 분자, 또는 2개의 결합 결정소를 포함하는 단쇄 이중-특이적 분자일 수 있다. 이중-특이적 분자는 적어도 2개의 단쇄 분자를 포함할 수 있다. 이중-특이적 분자의 제조 방법은, 예를 들어 US 특허 No. 5,260,203; US 특허 No. 5,455,030; US 특허 No. 4,881,175; US 특허 No. 5,132,405; US 특허 No. 5,091,513; US 특허 No. 5,476,786; US 특허 No. 5,013,653; US 특허 No. 5,258,498; US 특허 No. 5,482,858; US 특허출원 공보 No. 20030078385, Kontermann et al., (2005) Acta Pharmacological Sinica 26(1):1-9; Kostelny et al., (1992) J. Immunol. 148(5): 1547-1553; Hollinger et al., (1993) PNAS(USA) 90:6444-6448; 및 Gruber et al., (1994) J. Immunol. 152:5368에서 설명되거나 검토된다.
항체 변이체
또한, 본 발명의 항체는 변형된 항체 또는 항체 "변이체"로 조작하기 위하여 출발 물질로서 여기 개시된 VH 및/또는 VL 서열 중 하나 이상을 가진 항체를 사용하여 제조될 수 있으며, 이런 변형된 항체는 모 항체로부터의 변경된 특성을 가질 수 있다. 항체는 한쪽 또는 양쪽 가변 영역(즉, VH 및/또는 VL) 내의, 예를 들어 하나 이상의 CDR 영역 및/또는 하나 이상의 프레임워크 영역 내의 하나 이상의 잔기를 변형함으로써 조작될 수 있다. 추가로 또는 달리, 항체는 불변 영역(들) 내의 잔기를 변형함으로써, 예를 들어 항체의 이펙터 기능(들)을 변경함으로써 조작될 수 있다. 추가로, 항체의 항원-결합 부분으로부터, 항원-결합 단편, 항체 유도체, 면역-콘쥬게이트, 및 다중-특이적 분자와 같은 다른 구성물들이 제조될 수 있다.
표준 분자생물학 기술들을 사용하여 변경된 항체 서열을 제조하고 발현할 수 있다.
항체 변이체 또는 유도체는 전형적으로 "모" 항체와 비교하여 적어도 하나의 변경된 특성을 가지기는 하지만, 항체 변이체나 유도체는 여기 설명된 항-hNKG2D 항체들의 기능적 특성들 중 하나, 일부 또는 대부분을 보유할 수 있으며, 이런 기능적 특성들에는, 제한되지는 않지만, (a) NKG2D-발현 NK 또는 T 세포의 NKG2D-매개 활성화 방지, 선택적으로 리간드-유도 세포독성의 감소에 대한 EC50이 세포 결합에 대한 EC50보다 낮다; (b) NKG2D와의 결합에서 적어도 하나의 NKG2D 리간드, 바람직하게 적어도 MICA 및 ULBP3과 경합; (c) NKG2D-발현 NK 또는 T 세포 표면의 NKG2D의 양을 바람직하게 적어도 75%로 감소; (d) 사이노몰거스 및/또는 레서스 NKG2D와 결합, 바람직하게는 실질적으로 유사한 효율 또는 친화성으로; (e) NKG2D의 하나 이상의 형태 또는 입체형태와 결합; (f) 1nM 이하, 바람직하게는 0.1nM 이하의 Kd로 NKG2D와 결합; (g) 16F16, 16F31, MS 또는 21F2 중 하나 이상과 결합; (h) hNKG2D와의 결합에서 ON72, BAT221, 5C6, 1D11, ECM217 및 149810 중 어느 것보다 16F16, 16F31, MS 또는 21F2과 더 잘 경합; (i) 세포-표면 hNKG2D와 16F16, MS 또는 21F2 결합의 90% 이상을 차단; (j) ON72, BAT221, 5C6, 1D11, ECM217 및 149810 중 어느 것보다 hNKG2D에 대한 작용제 활성이 낮음. 상기 설명된 기능적 특성들의 어떤 조합, 및/또는 실시예에 설명된 기능적 특성들도 본 발명의 항체에 의해 나타날 수 있다.
항체 변이체 및 유도체의 기능적 특성들은 본 분야에서 이용할 수 있고 및/또는 여기 설명된 표준 분석을 이용하여 평가될 수 있다. 예를 들어, hNKG2D와 결합하는 항체의 능력은 실시예에 제시된 것들과 같은 표준 결합 분석을 사용하여 결정될 수 있다(예를 들어, Biacore, 유세포분석, 또는 ELISA).
가변 영역 변형
수행될 수 있는 가변 영역 조작의 한 가지 타입은 CDR 접목이다. 항체는 6개의 중쇄 및 경쇄 상보성 결정 영역(CDR)에 위치된 아미노산 잔기를 통해 표적 항원과 우세하게 상호작용한다. 이 때문에 CDR 내의 아미노산 서열은 CDR 밖의 서열보다 각 항체별로 더욱 다양하다. CDR 서열이 대부분의 항체-항원 상호작용을 초래하기 때문에, 상이한 특성을 가진 상이한 항체로부터의 프레임워크 서열에 접목된 특정 자연발생 항체로부터의 CDR 서열을 포함하는 발현 벡터를 구성함으로써 특정 자연발생 항체의 특성을 의태하는 재조합 항체를 발현시키는 것이 가능하다(예를 들어, Riechmann L. et al.(1998) Nature 332:323-327; Jones P. et al.(1986) Nature 321:522-525; Queen C. et al.(1989) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86: 10029-10033; U.S. 특허 No. 5,225,539(Winter), 및 U.S. 특허 No. 5,530,101; 5,585,089; 5,693,762 및 6,180,370(Queen et al.) 참조). 따라서, 본 발명의 또 다른 구체예는 각각 SEQ ID NO:15, 21, 48 및 54, SEQ ID NO: 16, 22, 49 및 55, 및 SEQ ID NO:17, 23, 50 및 56으로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 VH 영역, 및 각각 SEQ ID NO:18, 24, 51 및 57, SEQ ID NO:19, 25, 52 및 58, 및 SEQ ID NO:20, 26, 53 및 59로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 VL 영역을 포함하는 분리된 항체, 또는 그것의 항원-결합 부분에 관한 것이다. 따라서, 이러한 항체는 16F16, 16F31, MS 또는 21F2 항체의 VH 및 VL CDR 서열을 함유하고, 또한 이들 항체와는 상이한 프레임워크 서열을 함유할 수 있다.
또한, 본 발명은 hNKG2D와 결합하는 키메라 또는 인간화된 버전의 뮤린 항-hNKG2D 모노클로날 항체, 또는 그것의 항원-결합 단편, 및 이러한 항체의 용도(즉, 포유류 숙주에서 hNKG2D-매개 생리학적 과정의 조정에서)를 제공한다. 한 구체예에서, 뮤린 항체는 ON72, BAT221, 5C6, 1D11, 149810, 및 ECM217 중 하나이다. 다른 구체예에서, 뮤린 항체는 ON72, BAT221, 5C6, 1D11, 149810, 및 ECM217 중 하나가 아니다. 따라서, 이러한 항체는 ON72, BAT221, 5C6, 1D11, 149810 또는 ECM217, 또는 ON72, BAT221, 5C6, 1D11, 149810, ECM217과 상이한 뮤린 모노클로날 항체의 VH 및 VL CDR 서열, 이들 항체와 상이한 프레임워크 서열을 함유한다. 한 구체예에서, 인간화된 항체는, 예를 들어 각각 SEQ ID NO:70 및 71 중쇄 및 경쇄의 아미노산 서열을 포함하는 ON72의 인간화된 버전이다.
이러한 프레임워크 서열은 점라인 항체 유전자 서열을 포함하는 공용 DNA 데이터베이스나 공개된 참고자료로부터 얻을 수 있다. 예를 들어, 인간 중쇄 및 경쇄 가변 영역 유전자에 대한 점라인 DNA 서열은 "dBase" 인간 점라인 서열 데이터베이스(www.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase에서 이용가능), 뿐만 아니라 Kabat E. A. et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242; Tomlinson I. M. et al., (1992) "The Repertoire of Human Germline VH Sequences Reveals about Fifty Groups of VH Segments with Different Hypervariable Loops" J. Mol. Biol. 227:776-798; Cox J. P. L. et al., (1994) "A Directory of Human Germline VH Segments Reveals a Strong Bias in their Usage" Eur. J. Immunol. 24:827-836에서 찾을 수 있으며, 이들의 내용은 본원에 참고자료로 포함된다.
본 발명의 항체에서 사용되는 바람직한 프레임워크 서열은 본 발명의 선택된 항체에 의해 사용된 프레임워크 서열과 구조적으로 유사한 것들, 예를 들어 16F16, 16F31, MS, 및 21F2 항체에 의해 사용된 VH3_21, D3-9, JH4, VKIJ.15 및 JK2, 또는 VH3_20, D3-10, JH6, VKIII_A27 및 JK3, 또는 VH4_59, JH3, VKIII_A27 및 JK1, 또는 VH5_51, D3_10_R3, JH4, VKIII_L6 및 JK1 프레임워크 서열과 유사한 것들이다. 16F16, 16F31, MS, 또는 21F2의 VH CDR1, 2 및 3 서열과 16F16, 16F31, MS, 또는 21F2의 VL CDR1, 2 및 3 서열이 프레임워크 서열이 유래된 점라인 면역글로불린 유전자에서 발견된 것과 동일한 서열을 가진 프레임워크 영역에 접목되거나, 아니면 CDR 서열들은 점라인 서열과 비교하여 하나 이상의 돌연변이를 함유하는 프레임워크 영역에 접목될 수도 있다. 예를 들어, 어떤 경우에는 항체의 항원 결합 능력이 유지되거나 증진되도록 프레임워크 영역 내의 잔기에 돌연변이를 만드는 것이 유리한 것으로 밝혀졌다(예를 들어, U.S. 특허 No. 5,530,101; 5,585,089; 5,693,762 및 6,180,370(Queen et al.) 참조).
본 발명의 다른 양태로서, 본 발명의 항-hNKG2D 항체, 예를 들어 16F16 및 16F31의 구조적 특징을 사용하여 hNKG2D와의 결합 등, 본 발명의 항체의 적어도 하나의 기능적 특성을 보유한 구조적으로 관련된 항-hNKG2D 항체들을 만들 수 있다. 예를 들어, 16F16 또는 16F31, 또는 그것의 변이체의 하나 이상의 CDR 영역을 공지된 프레임워크 영역 및/또는 다른 CDR과 재조합하여 추가의 본 발명의 재조합-조작된 항-hNKG2D 항체들을 만들 수 있다. 이런 조작 방법의 출발 재료는 여기 제공된 VH 및/또는 VL 서열 중 하나 이상이거나, 또는 그것의 하나 이상의 CDR 영역이다. 조작된 항체를 만들기 위해서 여기 제공된 VH 및/또는 VL 서열 중 하나 이상, 또는 그것의 하나 이상의 CDR 영역을 가진 항체를 반드시 실제 제조할 필요는 없다(즉, 단백질로서 발현시킬 필요는 없다). 그보다는 서열(들)에 함유된 정보를 출발 재료로 사용하여 원 서열(들)로부터 유래된 "제 2 세대" 서열(들)을 만든 다음, "제 2 세대" 서열(들)을 단백질로서 제조하고 발현시킨다.
따라서, 또 다른 구체예에서, 본 발명은 항-hNKG2D 항체의 제조 방법을 제공하며, 이 방법은
(a) (i) SEQ ID NO:15, 21, 48, 및 54로부터 선택된 CDR1 서열, SEQ ID NO: 16, 22, 49, 및 55로부터 선택된 CDR2 서열, 및/또는 SEQ ID NO:17, 23, 50, 및 56로부터 선택된 CDR3 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 항체 서열; 및 (ii) SEQ ID NO:18, 24, 51, 및 57로부터 선택된 CDR1 서열, SEQ ID NO:19, 25, 53, 및 59로부터 선택된 CDR2 서열, 및/또는 SEQ ID NO:20, 26, 53, 및 59로부터 선택된 CDR3 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 항체 서열을 제공하는 단계; (b) 제 1 항체 서열 및/또는 제 2 항체 서열 내의 적어도 하나의 아미노산 잔기를 변경하여 적어도 하나의 변경된 항체 서열을 만드는 단계; (c) 변경된 항체 서열을 제조하는 단계; 및 (d) 변경된 항체 서열을 단백질로서 발현시키는 단계를 포함한다.
또 다른 타입의 가변 영역 변형은 관심의 항체의 하나 이상의 결합 특성(예를 들어, 친화성)이 개선되도록 VH 및/또는 VL CDR1, CDR2 및/또는 CDR3 영역 내의 아미노산 잔기에 돌연변이를 만드는 것이다. 돌연변이(들)를 도입하기 위해 부위-지정 돌연변이유발 또는 PCR-매개 돌연변이유발이 수행될 수 있고, 항체 결합, 또는 관심의 다른 기능적 특성에 대한 효과가 여기 설명되고 실시예에 제공된 시험관내 또는 생체내 분석에 의해 평가될 수 있다. 바람직하게, 보존성 변형(상기 논의된)이 도입된다. 돌연변이는 아미노산 치환, 부가 또는 결실일 수 있다. 더욱이, 전형적으로 8개 이하, 더 전형적으로 5개 이하의 잔기가 단일 CDR 영역 내에서 변경된다.
따라서, 다른 구체예에서, 본 발명은 (a) SEQ ID NO:15, 21, 48 및 54로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 SEQ ID NO:15, 21, 48 및 54로부터 선택된 아미노산 서열과 비교하여 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8개의 아미노산 치환, 결실 또는 부가를 가진 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1 영역; (b) SEQ ID NO:16, 22, 49 및 55로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 SEQ ID NO:16, 22, 49 및 55로부터 선택된 아미노산 서열과 비교하여 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8개의 아미노산 치환, 결실 또는 부가를 가진 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2 영역; (c) SEQ ID NO:17, 23, 50 및 56으로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 SEQ ID NO:17, 23, 50 및 56으로부터 선택된 아미노산 서열과 비교하여 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8개의 아미노산 치환, 결실 또는 부가를 가진 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3 영역; (d) SEQ ID NO:18, 24, 51 및 57로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 SEQ ID NO:18, 24, 51 및 57로부터 선택된 아미노산 서열과 비교하여 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8개의 아미노산 치환, 결실 또는 부가를 가진 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1 영역; (e) SEQ ID NO:19, 25, 52 및 58로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 SEQ ID NO:19, 25, 52 및 58로부터 선택된 아미노산 서열과 비교하여 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8개의 아미노산 치환, 결실 또는 부가를 가진 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2 영역; 및 (f) SEQ ID NO:20, 26, 53 및 59로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 SEQ ID NO:20, 26, 53 및 59로부터 선택된 아미노산 서열과 비교하여 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8개의 아미노산 치환, 결실 또는 부가를 가진 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3 영역을 포함하는 분리된 항-hNKG2D 항체를 제공한다.
본 발명의 조작된 항체는, 예를 들어 항체의 특성이 개선되도록 VH 및/또는 VL 내의 프레임워크 잔기에 변형이 이루어진 것들을 포함한다. 전형적으로, 이러한 프레임워크 변형은 항체의 면역원성을 감소시키기 위해서 만들어진다. 예를 들어, 한 접근법은 상응하는 점라인 서열로 하나 이상의 프레임워크 잔기를 "역돌연변이"시키는 것이다. 더 구체적으로, 체세포 돌연변이를 겪은 항체는 항체가 유래된 점라인 서열과는 상이한 프레임워크 잔기를 함유할 수 있다. 이러한 잔기는 항체 프레임워크 서열과 항체가 유래된 점라인 서열을 비교함으로써 확인될 수 있다.
예를 들어, 16F16에 대해서, VH의 아미노산 잔기 R111(Kabat 잔기 103; FR4 내)은 아르기닌이지만, 상응하는 점라인 서열에서는 이 잔기가 트립토판이다(도 5A 참조). 프레임워크 영역 서열을 그것의 점라인 형태로 되돌리기 위해서 체세포 돌연변이의 일부 또는 전부가, 예를 들어 부위-지정 돌연변이유발 또는 PCR-매개 돌연변이유발에 의해 점라인 서열로 "역돌연변이"될 수 있다(예를 들어, 16F16의 VH의 잔기 111이 트레오닌에서 알라닌으로 "역돌연변이"될 수 있다). 다른 예로서, 16F31에 대해서, VH 영역의 아미노산 잔기 Y95(FR3 내)는 티로신이지만, 상응하는 점라인 서열에서는 이 잔기가 히스티딘이다(도 5C 참조). 프레임워크 영역 서열을 그것의 점라인 형태로 되돌리기 위해서 체세포 돌연변이가 티로신에서 히스티딘으로 "역돌연변이"될 수 있다. 다른 예로서, MS에 대해서, VH 영역의 Kabat 잔기 3, 6 및 7은 각각 히스티딘(H), 아스파르트산(D) 및 D이지만, 상응하는 점라인 서열에서는 이들 잔기가 각각 글루타민(Q), 글리신(G) 및 G이다(도 5E 참조). 21F2에 대해서는 Kabat 잔기 13, 24, 76 및 93이 각각 글루탐산(E), 아스파라긴(N), N, 및 G이지만, 상응하는 점라인 서열에서는 이들 잔기가 각각 리신(K), G, 세린(S) 및 알라닌(A)이다. 프레임워크 영역 서열을 그것의 점라인 형태로 되돌리기 위해서 체세포 돌연변이가 유사하게 "역돌연변이"될 수 있다. 이러한 "역돌연변이"된 항체들도 역시 본 발명에 포함되도록 의도된다.
프레임워크 변형의 또 다른 타입은 T 세포 에피토프가 제거되어 항체의 잠재적 면역원성이 감소되도록 프레임워크 영역 내의, 또는 하나 이상의 CDR 영역 내의 하나 이상의 잔기에 돌연변이를 만드는 것을 포함한다. 이 접근법은 "탈면역화"라고도 하며, U.S. 특허 공개 No. 20030153043(Carr et al.)에 더 상세히 설명된다.
Fc 변형
프레임워크 또는 CDR 영역 내에 이루어진 변형에 더하여, 또는 그것 대신으로서, 본 발명의 항체는, 전형적으로 혈청 반감기, 보체 고정, Fc 수용체 결합, 단백질 안정성 및/또는 항원-의존성 세포 세포독성과 같은 항체의 하나 이상의 기능적 특성을 변경하거나 또는 이들을 결여시키기 위해서 Fc 영역 내에 변형을 포함하도록 조작될 수 있다. 또, 본 발명의 항체는 역시 항체의 하나 이상의 기능적 특성을 변경하기 위해서 화학적으로 변형되거나(즉, 하나 이상의 화학적 부분이 항체에 부착될 수 있다), 또는 글리코실화가 변경되도록 변형될 수 있다. 이러한 구체예들은 각각 아래에 더 상세히 설명된다. Fc 영역의 잔기는 Kabat에 따라서 넘버링된다.
바람직한 경우, 항체의 부류가 공지된 기술에 의해 "전환"될 수 있다. 이러한 기술은, 예를 들어 직접 재조합 기술(예를 들어, US 특허 4816397 참조) 및 세포-세포 융합 기술(예를 들어, US 특허 5916771)의 사용을 포함한다. 예를 들어, 본래 IgM 분자로서 생성된 항체는 IgG 항체로 전환된 부류일 수 있다. 또한, 부류 전환 기술을 사용하여 한 IgG 하위부류를 다른 하위부류로 전환할 수 있는데, 예를 들어 IgG1으로부터 IgG2로 전환할 수 있다. 따라서, 본 발명의 항체의 이펙터 기능이, 예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgD, IgA, IgE, 또는 IgM 항체로의 이소타입 전환에 의해 다양한 치료상의 용도에 맞게 변화될 수 있다. 불변 영역의 예시적인 cDNA 서열은, 예를 들어 GenBank(NCBI 및 다른 공용 웹사이트에서 접근 가능함)로부터 입수 가능하며, 이들은 각각 본원에 참고자료로 포함되고, 다음과 같다:
인간 IgG1 불변 중쇄 영역: GenBank 수탁번호: J00228;
인간 IgG2 불변 중쇄 영역: GenBank 수탁번호: J00230;
인간 IgG3 불변 중쇄 영역: GenBank 수탁번호: X04646;
인간 IgG4 불변 중쇄 영역: GenBank 수탁번호: K01316; 및
인간 kappa 경쇄 불변 영역: GenBank 수탁번호: J00241.
한 구체예에서, CH1의 힌지 영역은 힌지 영역의 시스테인 잔기의 수가 변경되도록, 예를 들어 증가되거나 감소되도록 변형된다. 이 접근법은 U.S. 특허 No. 5677425(Bodmer et al.)에 더 설명된다. CH1의 힌지 영역에 있는 시스테인 잔기의 수가, 예를 들어 경쇄 및 중쇄의 조립이 용이하게 되도록 또는 항체의 안정성이 증가 또는 감소되도록 변경된다.
다른 구체예에서, 항체의 생물학적 반감기가 감소되도록 항체의 Fc 힌지 영역이 돌연변이된다. 더 구체적으로, 자생 Fc-힌지 도메인 SpA 결합에 비하여 항체의 Staphylococcyl 단백질 A(SpA) 결합이 손상되도록 하나 이상의 아미노산 돌연변이가 Fc-힌지 단편의 CH2-CH3 도메인 계면 영역에 도입된다. 이 접근법은 U.S. 특허 No. 6165745(Ward et al.)에 더 상세히 설명된다. 다른 구체예에서, 항체는 항체의 생물학적 반감기가 증가되도록 변형된다. 다양한 접근법이 가능하다. 예를 들어, U.S. 특허 No. 6277375(Ward)에 설명된 대로 다음 돌연변이 T252L, T254S 및 T256F 중 하나 이상이 도입될 수 있다. 또는 달리, 생물학적 반감기를 증가시키기 위해서는 IgG의 Fc 영역의 CH1 도메인의 2개 루프로부터 취해진 구제 수용체 결합 에피토프를 함유하도록 항체가 CH1 또는 CL 영역 내에서 변경될 수 있으며, 이것은 U.S. 특허 No. 5869046과 6121022(Presta et al.)에 설명된다. 또 다른 구체예에서, 항체의 이펙터 기능(들)이 변경되도록 적어도 하나의 아미노산 잔기를 상이한 아미노산 잔기로 치환함으로써 Fc 영역이 변경된다. 예를 들어, 아미노산 잔기 234, 235, 236, 237, 297, 318, 320 및 322로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 잔기가 항체의 이펙터 리간드 친화성은 변경되지만 모 항체의 항원-결합 능력은 보유하도록 하는 상이한 아미노산 잔기로 치환될 수 있다. 친화성이 변경된 이펙터 리간드는, 예를 들어 Fc 수용체 또는 보체의 C1 성분일 수 있다. 이 접근법은 U.S. 특허 No. 5624821과 5648260(Winter et al.)에 더 상세히 설명된다. 또 다른 예에서, 아미노산 잔기 329, 331 및 322로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 잔기가 항체의 C1q 결합이 변경되고 및/또는 보체-의존성 세포독성(CDC)이 감소되거나 제거되도록 하는 상이한 아미노산 잔기로 치환될 수 있다. 이 접근법은 U.S. 특허 No. 6194551(Idusogie et al.)에 더 상세히 설명된다. 다른 예에서는, 아미노산 위치 231 및 239 내의 하나 이상의 아미노산 잔기가 변경됨으로써 보체를 고정하는 항체의 능력이 변경된다. 이 접근법은 PCT 공보 WO 94/29351(Bodmer et al.)에 더 상세히 설명된다. 또 다른 예로서, 항체-의존성 세포 세포독성(ADCC)을 매개하는 항체의 능력이 증가되고 및/또는 Fey 수용체에 대한 항체의 친화성이 증가되도록 Fc 영역이 변형되는데, 이것은 다음 위치 238, 239, 248, 249, 252, 254, 255, 256, 258, 265, 267, 268, 269, 270, 272, 276, 278, 280, 283, 285, 286, 289, 290, 292, 293, 294, 295, 296, 298, 301, 303, 305, 307, 309, 312, 315, 320, 322, 324, 326, 327, 329, 330, 331, 333, 334, 335, 337, 338, 340, 360, 373, 376, 378, 382, 388, 389, 398, 414, 416, 419, 430, 434, 435, 437, 438 또는 439에 있는 하나 이상의 아미노산을 변형함으로써 이루어진다. 이 접근법은 PCT 공보 WO 00/42072(Presta)에 더 상세히 설명된다. 또한, FcyRI, FcyRII, FcyRIII 및 FcRn에 대한 인간 IgG1 상의 결합 부위가 지도화되었고, 결합이 개선된 변이체들이 설명되었다(Shields R.L. et al., (2001) J. Biol. Chem. 276:6591-6604 참조). 위치 256, 290, 298, 333, 334 및 339에 있는 특정 돌연변이는 FcRIII와의 결합을 개선하는 것으로 나타났다. 추가로, 다음 돌연변이 조합 T256A/S298A, S298A/E333A, S298A/K224A 및 S298A/E333A/K334A은 FcyRIII 결합을 개선하는 것으로 나타났다.
또, 항체가 안정화되도록, 예를 들어 2가 항체가 2개의 1가 VH-VL 단편으로 분리될 위험이 감소되도록 불변 영역이 변형될 수도 있다. 예를 들어, IgG4 불변 영역에서 잔기 S241이 프롤린(P) 잔기로 돌연변이되어 힌지에서 완전한 이황화 다리가 형성될 수 있게 된다(예를 들어, Angal et al., Mol. Immunol. 1993; 30:105-8 참조).
글리코실화 변형
또 다른 구체예에서, 항체의 글리코실화가 변형된다. 예를 들어, 글리코실화되지 않은 항체가 제조될 수 있다(즉, 항체가 글리코실화를 결여한다). 글리코실화는, 예를 들어 항원에 대한 항체의 친화성이 증가되도록 변경될 수 있다. 이러한 탄수화물 변형은, 예를 들어 항체 서열 내의 하나 이상의 글리코실화 부위를 변경함으로써 달성될 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 가변 영역 프레임워크 글리코실화 부위의 제거를 가져오는 하나 이상의 아미노산 치환이 만들어질 수 있으며, 이로써 해당 부위에서 글리코실화가 제거된다. 이러한 비글리코실화는 항원에 대한 항체의 친화성을 증가시킬 수 있다. 이러한 접근법은 U.S. 특허 No. 5714350 및 6350861(Co et al.)에 상세히 설명된다. 추가로 또는 달리, 푸코실 잔기의 양이 감소된 저푸코실화된 항체 또는 2분할 GlcNac 구조가 증가된 항체와 같은 변경된 타입의 글리코실화를 가진 항체가 제조될 수 있다. 이러한 변경된 글리코실화 패턴은 항체의 ADCC 능력을 증가시키는 것으로 증명되었다. 이러한 탄수화물 변형은, 예를 들어 변경된 글리코실화 "기전"을 가진 숙주 세포에서 항체를 발현시킴으로써 달성될 수 있다. 이러한 변경을 가진 세포가 본 분야에서 설명되었으며, 본 발명의 재조합 항체를 발현시키기 위한 숙주 세포로서 사용될 수 있고, 이로써 변경된 글리코실화를 가진 항체를 생성할 수 있다. 예를 들어, EP 1176195(Hanai et al.)는 푸코실 트랜스페라제를 암호화하는 기능적으로 파괴된 FUT8 유전자를 가진 셀라인을 설명하는데, 이러한 셀라인에서 발현된 항체는 저푸코실화를 나타내게 된다. PCT 공보 WO 03/035835(Presta)는 Asn(297)-연결된 탄수화물에 푸코오스가 부착되는 능력이 감소된 변이체 CHO 셀라인 Lec13 세포를 설명하며, 이것 역시 이 숙주세포에서 발현된 항체의 저푸코실화를 유도한다(Shields R.L. et al., (2002) J. Biol. Chem. 277:26733-26740). PCT 공보 WO 99/54342(Umana et al.)는 당단백질-변형 글리코실 트랜스페라제(예를 들어, 베타(1,4)-N-아세틸글루코사미닐트랜스페라제 III(GnTIII))를 발현하도록 조작된 셀라인을 설명하며, 이 조작된 셀라인에서 발현된 항체는 2분할 GlcNac 구조의 증가를 나타내게 되고, 이것은 항체의 ADCC 활성을 증가시킨다(Umana et al., (1999) Nat. Biotech. 7:176-180 참조).
본 발명의 항체를 조작하는 방법의 어떤 구체예에서, 항-hNKG2D 항체 코딩 서열(예를 들어, 16F16, 16F31, MS 또는 21F2 코딩 서열)의 전부나 일부를 따라서 돌연변이가 무작위로 또는 선택적으로 도입될 수 있고, 얻어진 변형된 항체가 여기 설명된 대로 결합 활성 및/또는 다른 기능적 특성에 대해 스크리닝될 수 있다. 돌연변이 방법은 본 분야에서 설명되었다. 예를 들어, PCT 공보 WO 02/092780(Short)은 포화 돌연변이유발, 합성 라이게이션 조립, 또는 이들의 조합을 사용하여 항체 돌연변이를 만들고 스크리닝하는 방법을 설명한다.
또는 달리, PCT 공보 WO 03/074679(Lazar et al.)는 컴퓨터 스크리닝 방법을 사용하여 항체의 물리화학적 특성을 최적화하는 방법을 설명한다.
항체 유도체
본 발명의 범위 내의 항체 유도체(또는 면역콘쥬게이트)는 제 2 제제에 콘쥬게이트되거나 공유 결합된 항-hNKG2D 항체를 포함한다.
예를 들어, 한 양태에서, 본 발명은 세포독성제에 콘쥬게이트되거나 공유 결합된 항체를 포함하는 면역콘쥬게이트를 제공한다. 본원에서 사용된 용어 "세포독성제"는 세포 표면 상에서 hNKG2D 수용체를 보유한 세포를 죽일 수 있는 분자이다. 세포독성 또는 세포억제 효과를 가진 부분의 어떤 타입도 본 발명의 항체에 콘쥬게이트될 수 있고, 이로써 본 발명의 세포독성 콘쥬게이트가 형성되거나 또는 특이적 NK 수용체 발현 세포를 죽일 수 있으며, 이들은 치료용 방사선 동위원소, 독성 단백질, 독성 소 분자, 예를 들어 약물, 독소, 면역조정제, 호르몬, 호르몬 길항제, 효소, 올리고뉴클레오티드, 효소 억제제, 치료용 방사선핵종, 혈관형성 억제제, 화학치료약물, 빈카 알칼로이드, 안트라시클린, 에피도필로톡신, 탁산, 항대사산물, 알킬화제, 항생제, COX-2 억제제, SN-38, 안티미토틱, 혈관형성방지제 및 세포자멸제, 특히 독소루비신, 메토트렉세이트, 탁솔, CPT-11, 캄프토테칸, 질소 머스타드, 젬시타빈, 알킬 술포네이트, 니트로소유레아, 트리아젠, 엽산 유사체, 피리미딘 유사체, 퓨린 유사체, 백금 배위 착물, 슈도모나스 엑소톡신, 리신, 아브린, 5-플루오로유리딘, 리보뉴클레아제(RNase), DNaseI, 스타필로코칼 엔테로톡신-A, 포케위드 항바이러스 단백질, 겔로닌, 디프테린 독소, 슈도모나스 엑소톡신, 슈도모나스 엔도톡신, 및 기타 여러 가지를 포함한다(예를 들어, Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th Ed., (Mack Publishing Co., 1995); Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics (McGraw Hill, 2001); Pastan et al., (1986) Cell 47:641; Goldenberg, (1994) Cancer Journal for Clinicians 44:43; U.S. Pat. No. 6,077,499; 이들의 내용은 전부 본원에 참고자료로 포함된다). 독소는 동물, 식물, 진균 또는 미생물 기원일 수 있거나, 아니면 화학 합성에 의해서 새로 만들어질 수 있다는 것이 인정될 수 있다.
다른 구체예에서, 항체는 치료용 방사선핵종이나 검출 목적에 적합한 방사선핵종과 같은 방사선 활성 동위원소로 유도체화된다. 많은 수의 적합한 방사선 활성 동위원소가 사용될 수 있고, 제한되지는 않지만, I-131, 인듐-111, 루테늄-171, 비스무스-212, 비스무스-213, 아스타틴-211, 구리-62, 구리-64, 구리-67, 이트륨-90, 요오드-125, 요오드-131, 인-32, 인-33, 스칸듐-47, 은-111, 갈륨-67, 프라세오디늄-142, 사마륨-153, 테르븀-161, 디스프로슘-166, 홀뮴-166, 레늄-186, 레늄--188, 레늄-189, 납-212, 라듐-223, 액티늄-225, 철-59, 셀레늄-75, 비소-77, 스트론튬-89, 몰리브데늄-99, 로듐-105, 팔라듐-109, 프라세오디늄-143, 프로메튬-149, 에르븀-169, 이리듐-194, 금-198, 금-199, 및 납-211을 포함한다. 일반적으로, 방사선핵종은 바람직하게 Auger 에미터에서 20 내지 6,000 keV의 범위, 바람직하게는 60 내지 200 keV의 범위, 베타 에미터에서 100-2,500 keV, 그리고 알파 에미터에서 4,000-6,000 keV의 붕괴 에너지를 가진다. 또한, 실질적으로 알파 입자를 생성하면서 붕괴하는 방사선핵종이 바람직하다.
본 발명의 항체 콘쥬게이트는 주어진 생물학적 반응을 변형하는데 사용될 수 있으며, 이 경우 약물 부분은 고전적 화학 치료제에만 제한되지 않는다. 예를 들어, 약물 부분은 원하는 생물학적 활성을 보유한 단백질 또는 폴리펩티드일 수 있다. 이러한 단백질은, 예를 들어 효소 활성 독소 또는 그것의 활성 단편, 예를 들어 아브린, 리신 A, 슈도모나스 엑소톡신, 또는 디프테리아 독소; 종양괴사인자 또는 인터페론-y와 같은 단백질; 또는 생물학적 반응 변형제, 예를 들어 림포카인, 인터류킨-1("IL-1"), 인터류킨-2("IL- 2"), 인터류킨-6("IL-6"), 과립구 대식세포 콜로니 자극인자("GM-CSF"), 과립구 콜로니 자극인자("G-CSF"), 또는 다른 성장인자들을 포함할 수 있다.
제 2 제제는 많은 이용가능한 방법 중 어느 것을 사용하여 항체에 직접 또는 간접적으로 연결될 수 있다. 예를 들어, 제제는 N-숙시닐 3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트(SPDP)와 같은 가교제에 의한 이황화 결합 형성을 통하여, 또는 항체의 Fc 영역에 있는 탄수화물 부분을 통하여 환원된 항체 성분의 힌지 영역에서 부착될 수 있다(예를 들어, Yu et al., (1994) Int. J. Cancer 56:244; Wong, "단백질 콘쥬게이션 및 가교결합의 화학"(CRC Press 1991); Upeslacis et al., "화학적 방법에 의한 항체 변형", Monoclonal antibodies: principles and applications, Birch et al. (eds.), pages 187-230(Wiley-Liss, Inc. 1995); Price, "합성 펩티드-유도된 항체의 생산 및 특성화", Monoclonal antibodies: Production, engineering and clinical application, Ritter et al., (eds.) pages 60-84(Cambridge University Press 1995), Cattel et al., (1989) Chemistry today 7:51-58, Delprino et al., (1993) J. Pharm. Sci 82:699-704; Arpicco et al, (1997) Bioconjugate Chemistry 8:3; Reisfeld et al., (1989) Antibody, Immunicon. Radiopharrn. 2:217 참조; 이들의 내용은 전부 본원에 참고자료로 포함된다). 또한, 예를 들어 Arnon et al., "암치료에서 약물의 면역-표적화를 위한 모노클로날 항체", Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al., (eds.), pp. 243-56(Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom et al., "약물의 송달을 위한 항체", Controlled Drug Delivery (2nd Ed.), Robinson et al., (eds.), pp. 623-53(Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, "암치료에서 세포독성제의 항체 담체: 리뷰", Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al., (eds.), pp. 475-506 (1985); "암치료에서 방사선 표지된 항체의 치료 용도에 관한 분석, 결과 및 향후 전망", Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al, (eds.), pp. 303-16 (Academic Press 1985), 및 Thorpe et al., "항체-독소 콘쥬게이트의 제조 및 세포독성 특성", Immunol. Rev., 62:119-58 (1982)을 참조한다.
세포독소 타입, 링커 및 치료제와 항체의 콘쥬게이션 방법에 대한 더 이상의 논의는, Saito, G. et al., (2003) Adv. Drug DeNv. Rev. 55:199-215; Trail, P.A. et al, (2003) Cancer Immunol. Immunother. 52:328-337; Payne, G. (2003) Cancer Cell 3:207-212; Allen, T.M. (2002) Nat. Rev. Cancer 2:750-763; Pastan, I. and Kreitman, R. J. (2002) Curr. Opin. Investig. Drugs 3:1089-1091; Senter, P.D. and Springer, C.J. (2001) Adv. Drug DeNv. Rev. 53:247-264를 참조한다.
다른 구체예에서, 제 2 제제는 검출가능한 부분으로서, 정량적으로 또는 정성적으로 관찰되거나 측정될 수 있는 어떤 분자일 수 있다. 본 발명의 콘쥬게이트된 항체에서 유용한 검출가능한 마커의 예는 방사선 동위원소, 형광 염료, 또는 항원/항체(NKG2D에 대한 항체 이외의 다른 항체), 렉틴/탄수화물; 아비딘/바이오틴; 수용체/리간드; 또는 분자 임프린트 폴리머/프린트 분자 시스템 중 어느 하나의 일원과 같은 상보성 결합쌍의 일원이다.
제 2 제제는 또한, 또는 다른 면에서, 예를 들어 항체의 순환 반감기를 증가시키도록 의도된 폴리머일 수 있다. 예시적인 폴리머와 이러한 폴리머를 펩티드에 부착하는 방법은, 예를 들어 U.S. Pat. No. 4766106; 4179337; 4495285; 4609546에 예시된다. 추가의 예시적인 폴리머는 폴리옥시에틸화 폴리올 및 폴리에틸렌글리콜 (PEG) 부분을 포함한다. 본원에서 사용된, 용어 "폴리에틸렌 글리콜"은 모노(C1-C10) 알콕시- 또는 아릴옥시-폴리에틸렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜-말레이미드와 같은, 다른 단백질을 유도체화하는데 사용되는 어떤 형태의 PEG라도 포함하도록 의도된다. 예를 들어, 전장 항체 또는 항체 단편이 약 1,000 내지 약 40,000, 예를 들어 약 2000 내지 약 20,000, 예를 들어 약 3,000-12,000의 분자량을 가진 하나 이상의 PEG 분자와 콘쥬게이트될 수 있다. 항체 또는 그것의 단편의 PEG화를 위하여, 항체 또는 단편은 전형적으로 하나 이상의 PEG 기가 항체 또는 항체 단편에 부착되는 조건에서 PEG의 반응성 에스테르 또는 알데히드 유도체와 같은 폴리에틸렌 글리콜(PEG)과 반응된다. 바람직하게, PEG화는 반응성 PEG 분자(또는 유사한 반응성 수용성 폴리머)와의 아실화 반응이나 알킬화 반응을 통해 수행된다. 어떤 구체예에서, PEG화될 항체는 글리코실화되지 않은 항체이다. 단백질을 PEG화하는 방법은 본 분야에 공지되어 있고, 본 발명의 항체에 적용될 수 있다. 예를 들어, EP 154316(Nishimura et al.), 국제특허출원 PCT/US04/11494, EP 401384(Ishikawa et al.)를 참조한다.
핵산
본 발명의 다른 양태는 본 발명의 항체를 암호화하는 핵산 분자에 관한 것이다. 핵산은 전체 세포, 세포 용해물, 또는 부분적으로 정제되거나 실질적으로 순수한 형태에 존재할 수 있다. 핵산은 알칼리성/SDS 처리, CsCl 밴딩, 칼럼 크로마토그래피, 아가로스 겔 전기영동 및 본 분야에 잘 공지된 다른 기술들을 포함하는 표준 기술에 의해서 다른 세포 성분이나 다른 오염물질, 예를 들어 다른 세포 핵산이나 단백질로부터 정제되었을 때 "분리"되거나 "실실적으로 순수하게 된다". F. Ausubel et al., ed. (1987) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York. 본 발명의 핵산은, 예를 들어 DNA 또는 RNA일 수 있으며, 인트론 서열을 함유할 수도 있고 함유하지 않을 수도 있다. 바람직한 구체예에서, 핵산은 cDNA 분자이다. 다음 문단은 DNA 서열 또는 그것의 용도에 관한 것이지만, 같은 방법이나 원리가 mRNA 서열에도 일반적으로 적용될 수 있다.
본 발명의 핵산은 표준 분자생물학 기술을 사용하여 얻어질 수 있다. 하이브리도마(예를 들어, 아래 더 설명된 인간 면역글로불린 유전자를 지닌 트랜스제닉 마우스로부터 제조된 하이브리도마)에 의해 발현된 항체에 대하여, 하이브리도마에 의해 만들어진 항체의 경쇄 및 중쇄를 암호화하는 cDNA는 표준 PCR 증폭 또는 cDNA 클로닝 기술에 의해 얻어질 수 있다. 면역글로불린 유전자 라이브러리(예를 들어, 파지 디스플레이 기술을 이용한)로부터 얻어진 항체에 대해서는, 항체를 암호화하는 핵산이 라이브러리로부터 회수될 수 있다.
본 발명의 바람직한 핵산 분자는 IgG4 이소타입의 16F16, 16F31, MS, 또는 21F2의 H 및 L 사슬 서열을 암호화하는(또는 이들을 암호화하는 핵산을 포함하는) 것들이다. 16F16 VH 및 VL 서열을 암호화하는 DNA 서열은 각각 SEQ ID NO:3 및 4에 나타낸다. 16F31 VH 및 VL 서열을 암호화하는 DNA 서열은 각각 SEQ ID NO:5 및 6에 나타낸다. MS VH 및 VL 서열을 암호화하는 DNA 서열은 각각 SEQ ID NO:44 및 45를 암호화하는 것들이다. 21F2 VH 및 VL 서열을 암호화하는 DNA 서열은 각각 SEQ ID NO:46 및 47을 암호화하는 것들이다.
일단 VH 및 VL 세그먼트를 암호화하는 DNA 단편이 얻어지면, 이들 DNA 단편은 표준 재조합 DNA 기술에 의해 더 조작될 수 있는데, 예를 들어 가변 영역 유전자를 전장 항체 사슬 유전자, Fab 단편 유전자 또는 scFv 유전자로 전환할 수 있다. 이러한 조작에서, VL- 또는 VH-암호화 DNA 단편은 항체 불변 영역이나 가요성 링커와 같은 다른 단백질을 암호화하는 다른 DNA 단편에 작동 가능하게 연결된다. 본 문맥에서 사용된, 용어 "작동 가능하게 연결된"은 두 DNA 단편에 의해 암호화되는 아미노산 서열이 프레임 내에 보유되도록 두 DNA 단편이 연결되는 것을 의미한다.
VH 영역을 암호화하는 분리된 DNA는 VH-암호화 DNA와 중쇄 불변 영역(CH1, CH2 및 CH3)을 암호화하는 다른 DNA 분자를 작동 가능하게 연결함으로써 전장 중쇄 유전자로 전환될 수 있다. 인간 중쇄 불변 영역 유전자의 서열은 본 분야에 잘 알려져 있으며(예를 들어, Kabat E. A. et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242 참조), 표준 PCR 증폭에 의해 이들 영역을 포함하는 DNA 단편이 얻어질 수 있다. 중쇄 불변 영역은 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM 또는 IgD 불변 영역일 수 있으며, IgG4 불변 영역이 가장 바람직하다. Fab 단편 중쇄 유전자에 대하여, VH-암호화 DNA는 중쇄 CH1 불변 영역만을 암호화하는 다른 DNA 분자에 작동 가능하게 연결될 수 있다.
VL 영역을 암호화하는 분리된 DNA는 VL-암호화 DNA와 경쇄 불변 영역 CL을 암호화하는 다른 DNA 분자를 작동 가능하게 연결함으로써 전장 경쇄 유전자(뿐만 아니라 Fab 경쇄 유전자)로 전환될 수 있다. 인간 경쇄 불변 영역 유전자의 서열은 본 분야에 잘 알려져 있으며(예를 들어, Kabat E. A. et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242 참조), 표준 PCR 증폭에 의해 이들 영역을 포함하는 DNA 단편이 얻어질 수 있다. 경쇄 불변 영역은 kappa 또는 lambda 불변 영역일 수 있으며, kappa 불변 영역이 가장 바람직하다.
scFv 유전자를 만들기 위해서는 VH- 및 VL-암호화 DNA 단편이 가요성 링커를 암호화하는, 예를 들어 아미노산 서열 (Gly4-Ser)3을 암호화하는 다른 단편에 작동 가능하게 연결되며, 이로써 VL과 VH 영역이 가요성 링커에 의해 연결된 연속 단쇄 단백질로 VH과 VL 서열이 발현될 수 있다(예를 들어, Bird et al., (1988) Science 242:423-426; Huston et al., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; McCafferty et al., (1990) Nature 348:552-554 참조).
항체 생산
본 발명의 모노클로날 항체(mAb)는 종래의 모노클로날 항체 방법, 예를 들어 Kohler and Milstein (1975) Nature 256:495의 표준 체세포 세포 혼성화 기술을 포함하는 다양한 기술에 의해 생산될 수 있다. 원칙대로는 체세포 세포 혼성화 과정이 바람직하지만, B 림프구의 바이러스 또는 암유전자 형질전환과 같은 모노클로날 항체를 생산하는 다른 기술도 사용될 수 있다.
하이브리도마를 제조하는 한 바람직한 동물 시스템은 뮤린 시스템이다. 면역화 프로토콜 및 융합을 위한 면역화된 비장세포의 분리 기술이 융합 파트너(예를 들어, 뮤린 골수종 세포) 및 융합 과정과 함께 본 분야에 공지되어 있다. 또한, 본 발명의 키메라 또는 인간화된 항체가 확립된 기술을 사용하여 뮤린 단클론성 항체의 서열에 기초하여 제조될 수 있다. 예를 들어, 중쇄 및 경쇄 면역글로불린을 암호화하는 DNA가 관심의 뮤린 하이브리도마로부터 얻어질 수 있고, 표준 분자생물학 기술을 사용하여 비-뮤린(예를 들어, 인간) 면역글로불린 서열을 함유하도록 조작될 수 있다. 예를 들어, 키메라 항체를 만들기 위해서, 뮤린 가변 영역이 본 분야에 공지된 방법을 사용하여 인간 불변 영역에 연결될 수 있다(예를 들어, U.S. 특허 No. 4816567(Cabilly et al.) 참조). 뮤린 CDR 영역을 본 분야에 공지된 방법을 사용하여 인간 프레임워크에 삽입하면 인간화된 항체를 만들 수 있다(예를 들어, U.S. 특허 No. 5225539(Winter) 및 U.S. 특허 Nos. 5530101; 5585089; 5693762 및 6180370(Queen et al.) 참조).
바람직한 구체예에서, 본 발명의 항체는 인간 모노클로날 항체이다. hNKG2D에 대해 지정된 이러한 인간 모노클로날 항체는 마우스 시스템보다는 오히려 인간 면역계의 일부를 지닌 트랜스제닉 또는 트랜스크로모소믹 마우스를 사용하여 생성될 수 있다. 이러한 트랜스제닉 또는 트랜스크로모소믹 마우스는 HuMAb 마우스 및 KM 마우스라고 본원에서 각기 언급되는 마우스를 포함하며, 전체적으로는 "인간 Ig 마우스"라고 본원에서 언급된다. HuMAb 마우스(Medarex, Inc.)는 내인성 u 및 K 사슬 좌위를 불활성화시키는 표적화된 돌연변이와 함께, 미정렬 인간 중쇄(p 및 y) 및 K 경쇄 면역글로불린 서열을 암호화하는 인간 면역글로불린 유전자 소좌를 함유한다(예를 들어, Lonberg et al., (1994) Nature 368:856-859 참조). 따라서, 마우스는 마우스 IgM 또는 K의 감소된 발현을 나타내고, 면역화에 반응하여, 도입된 인간 중쇄 및 경쇄 트랜스젠은 부류 전환 및 체세포 돌연변이를 겪어서 높은 친화성의 인간 IgGK 모노클로날이 생성된다(Lonberg N. et al., (1994), 상동; Lonberg N. (1994) Handbook of Experimental Pharmacology 113:49-101; Lonberg N. and Huszar D. (1995) Intern. Rev. Immunol. 13:65-93, 및 Harding F. and Lonberg N. (1995) Ann. N. Y. Acad. Sci. 764:536-546에서 검토됨). HuMab 마우스의 제조 및 사용과 이러한 마우스가 보유한 게놈 변형은 Taylor L. et al., (1992) Nucleic Acids Research 20:6287-6295; Chen J. et al., (1993)lnternational Immunology 5:647-656; Tuaillon et al., (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:3720-3724; Choi et al., (1993) Nature Genetics 4:117-123; Chen J. et al., (1993) EMBO J. 12:821-830; Tuaillon et al., (1994) J. Immunol. 152:2912 2920; Taylor L. et al., (1994) International immunology 6:579-591; 및 Fishwild D. et al., (1996) Nature Biotechnology 14:845-851에 더 설명되며, 이들 내용은 전문이 모두 구체적인 부분에서 본원에 참고자료로 포함된다. 또, U.S. 특허 No. 5545806; 5569825; 5625126; 5633425; 5789650; 5877397; 5661016; 5814318; 5874299; 및 5770429(모두 Lonberg와 Kay); U.S. 특허 No. 5545807(Surani et al.); PCT 공보 No. WO 92/ 03918, WO 93/12227, WO 94/25585, WO 97/13852, WO 98/24884 및 WO 99/45962(모두 Lonberg와 Kay); 및 PCT 공보 No. WO 01/14424(Korman et al.)를 참조한다. 다른 구체예에서, 본 발명의 인간 항체는 트랜스젠 및 트랜스크로모솜 상에 인간 면역글로불린 서열을 보유한 마우스, 예를 들어 인간 중쇄 트랜스젠과 인간 경쇄 트랜스크로모솜을 보유한 마우스를 사용하여 생성될 수 있다. 이러한 마우스는 본원에서 "KM 마우스"라고 언급되며, PCT 공보 No. WO 02/43478(Ishida et al.)에 상세히 설명된다. 또, 인간 면역글로불린 유전자를 발현하는 대용 트랜스제닉 동물 시스템도 본 분야에서 이용 가능하고, 본 발명의 항-hNKG2D 항체를 생성하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 제노마우스(Abgenix, Inc.)라고 하는 대용 트랜스제닉 시스템이 사용될 수 있으며, 이러한 마우스는, 예를 들어 U.S. 특허 No. 5939598; 6075181; 6114598; 6150584 및 6162963(Kucherlapati et al.)에 설명된다. 더욱이, 인간 면역글로불린 유전자를 발현하는 대용 트랜스크로모소믹 동물 시스템이 본 분야에서 이용 가능하고, 본 발명의 항-hNKG2D 항체를 생성하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, "TC 마우스"라고 하는 인간 중쇄 트랜스크로모솜과 인간 경쇄 트랜스크로모솜을 모두 보유한 마우스가 사용될 수 있으며, 이러한 마우스는 Tomizuka et al., (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:722-727에서 설명된다. 더욱이, 인간 중쇄 및 경쇄 트랜스크로모솜을 보유한 소가 본 분야에서 설명되었으며(Kuroiwa et al., (2002) Nature Biotechnology 20:889-894), 본 발명의 항-hNKG2D 항체를 생성하는데 사용될 수 있다.
또, 본 발명의 인간 모노클로날 항체는 인간 면역글로불린 유전자의 라이브러리를 스크리닝하는 파지 디스플레이 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 인간 항체를 분리하기 위한 이러한 파지 디스플레이 방법은 본 분야에 확립되어 있다. 예를 들어, U.S. 특허 No. 5223409; 5403484; 및 5571698(Ladner et al.); U.S. 특허 No. 5427908 및 5580717(Dower et al.); U.S. 특허 No. 5969108 및 6172197(Mc Cafferty et al.); U.S. 특허 No. 5885793; 6521404; 6544731; 6555313; 6582915 및 6593081(Griffiths et al.) 참조. 또, 본 발명의 인간 모노클로날 항체는 면역화시 인간 항체 반응이 생성될 수 있도록 인간 면역세포가 제구성된 SCID 마우스를 사용하여 제조될 수 있다. 이러한 마우스는, 예를 들어 U.S. 특허 No. 5476996 및 5698767(Wilson et al.)에 설명된다.
인간 Ig 마우스를 사용하여 본 발명의 인간 항체를 생성할 경우, 이러한 마우스는 hNKG2D 항원 및/또는 hNKG2D를 발현하는 세포의 정제된 또는 부화된 제제로 면역화될 수 있으며, 이에 대해서는 Lonberg N. et al., (1994) Nature 368(6474): 856-859; Fishwild D. et al., (1996) NatureBiotechnolo.gy 14:845-851; 및 PCT 공보 WO 98/24884 및 WO 01/14424에 설명된다. 바람직하게, 마우스는 1차 주입 시기에 6-16주령일 것이다. 예를 들어, hNKG2D 항원의 정제된 또는 부화된 제제(5-50㎍)를 사용하여 인간 Ig 마우스를 복강내 면역화할 수 있다. hNKG2D 항원의 정제된 또는 부화된 제제를 사용한 면역화가 항체를 유도하지 않은 경우, 면역반응을 촉진하기 위해 마우스는 또 hNKG2D를 발현하는 세포, 예를 들어 인간 NK 또는 T 셀라인, 또는 재조합 hNKG2D를 발현하는 포유류 세포로 면역화될 수 있으며, 이 경우 DAP10을 사용할 수도 있고 사용하지 않을 수도 있다.
hNKG2D에 대한 완전 인간 모노클로날 항체를 생성하는 상세한 과정은 실시예 1에 설명된다. 투여 항원(예를 들어, hNKG2D 폴리펩티드 또는 세포 발현 hNKG2D)의 형태와 양뿐만 아니라 투여 일정, 그리고 완전 프레운드 애쥬번트 또는 불완전 프레운드 애쥬번트와 같은 가능한 애쥬번트의 사용은 전형적으로 본 분야에 확립된 방법에 따라서 각 항원-마우스 시스템별로 최적화된다.
안와 뒤에서 채혈한 혈장 샘플을 사용한 면역화 프로토콜의 전 과정에서 면역반응이 모니터될 수 있으며, 혈장이나 혈청이 ELISA에 의해 스크리닝될 수 있고(아래 설명된 대로), 항-hNKG2D 인간 면역글로불린의 충분한 역가를 가진 마우스가 융합에 사용될 수 있다. 마우스에 항원을 정맥내 2차 투여할 수 있으며, 3일 후에 마우스를 죽여서 비장을 제거한다. 각 면역화 당 2-3회 융합이 수행될 필요가 있을 수 있다고 예상된다.
본 발명의 인간 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마를 생성하기 위해서, 면역화된 마우스로부터 비장세포 및/또는 림프절이 분리되고, 마우스 골수종 셀라인과 같은 적절한 불멸화된 셀라인과 융합될 수 있다. 얻어진 하이브리도마는 항원-특이적 항체 생산에 대해 스크리닝될 수 있다. 예를 들어, 면역화된 마우스로부터의 비장 림프구의 단일 세포 현탁액이 50% PEG를 사용하여 P3X63-Ag8.653 비-분비 마우스 골수종 세포(ATCC, CRL 1580) 수의 1/6과 융합될 수 있다. 또는 달리, 세포는 전기융합에 의해 융합될 수 있다. 바닥이 편평한 마이크로타이터 플레이트에 세포가 약 2x105로 평판되고, 20% 태아 클론 혈청, 18% "653" 컨디션 배지, 5% 오리젠(IGEN), 4mM L-글루타민, 1mM 나트륨 피루베이트, 5mM HEPES, 0.055mM 2-메르캅토에탄올, 50 단위/mL 페니실린, 50mg/mL 스트렙토마이신, 50mg/mL 젠타마이신 및 1x HAT(Sigma; HAT는 융합 후 24시간 뒤에 첨가된다)를 함유하는 선택성 배지에서 2주 인큐베이션된다. 약 2주 후에 세포는 HAT를 HT로 교체한 배지에서 배양될 수 있다. 다음에, 각 웰이 ELISA에 의해 인간 모노클로날 IgM 및 IgG 항체에 대해 스크리닝될 수 있다. 일단 광범한 하이브리도마 성장이 일어나면, 일반적으로 10-14일 후에 배지가 관찰될 수 있다. 항체 분비 하이브리도마가 재평판되고, 다시 스크리닝될 수 있으며, 만일 여전히 인간 IgG에 대해 양성이라면, 제한 희석에 의해 모노클로날 항체가 적어도 2번 서브클로닝될 수 있다. 다음에, 안정한 서브클론이 시험관내 배양될 수 있고, 이로써 특성화를 위한 조직 배양 배지 중에 소량의 항체가 생성된다. 인간 모노클로날 항체를 정제하기 위하여 분비된 하이브리도마는 모노클로날 항체 정제를 위해 2L 스피너-플라스크에서 성장될 수 있다. 상청액이 여과되고 농축된 다음, 단백질 A-세파로스(Pharmacia, Piscataway, N. J.)로 친화성 크로마토그래피를 수행할 수 있다. 용출된 IgG는 겔 전기영동 및 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 조사되어 순도를 확정할 수 있다. PBS로 버퍼 용액이 교환될 수 있고, 분광법에 의해 농도가 결정될 수 있다. 모노클로날 항체는 알리쿼트로 나눠져 -80℃에 보관될 수 있다.
또한, 본 발명의 항체는 본 분야에 잘 알려진 대로, 예를 들어 재조합 DNA 기술과 유전자 트랜스펙션 방법의 조합을 이용한 숙주 세포 트랜스펙토마에서 생산될 수 있다(예를 들어, Morrison, S. (1985) Science 229:1202).
예를 들어, 항체를 발현하기 위해서, 부분 또는 전장 경쇄 및 중쇄를 암호화하는 DNA가 표준 분자생물학 기술(예를 들어, 본 발명의 항체를 발현하는 하이브리도마를 이용한 PCR 증폭 또는 cDNA 클로닝)에 의해 얻어질 수 있고, 유전자가 전사 및 번역 제어 서열에 작동 가능하게 연결되고, 항체 유전자의 전사 및 번역을 조절하는 의도한 기능을 발휘할 수 있도록 이 DNA가 발현 벡터에 삽입될 수 있다.
발현 벡터와 발현 제어 서열은 사용된 발현 숙주 세포와 양립되도록 선택된다. 항체 경쇄 유전자와 항체 중쇄 유전자는 별개의 벡터에 삽입될 수 있지만, 더 전형적으로는 두 유전자가 동일한 발현 벡터에 삽입된다. 항체 유전자는 표준 방법(예를 들어, 항체 유전자 단편 또는 벡터 상에 상보성 제한 부위의 라이게이션, 또는 제한 부위가 없을 경우에는 블런트 엔드 라이게이션)에 의해 발현 벡터에 삽입된다. 여기 설명된 항체의 경쇄 및 중쇄 가변 영역을 사용하여, VH 세그먼트가 벡터 내에서 CH 세그먼트(들)에 작동 가능하게 연결되고, VL 세그먼트가 벡터 내에서 CL 세그먼트에 작동 가능하게 연결되도록 원하는 이소타입의 중쇄 불변 영역과 경쇄 불변 영역을 이미 암호화하고 있는 발현 벡터에 이들을 삽입함으로써 어떤 항체 이소타입의 전장 항체 유전자를 만들 수 있다. 추가로 또는 달리, 재조합 발현 벡터는 숙주 세포로부터 항체 사슬의 분비를 촉진하는 신호 펩티드를 암호화할 수 있다. 항체 사슬 유전자는 신호 펩티드가 항체 사슬 유전자의 아미노 말단에 프레임 내 연결되도록 벡터에서 클로닝될 수 있다. 신호 펩티드는 면역글로불린 신호 펩티드이거나, 또는 이종성 신호 펩티드(즉, 비-면역글로불린 단백질로부터의 신호 펩티드)일 수 있다.
항체 사슬 유전자에 더하여, 본 발명의 재조합 발현 벡터는 숙주 세포에서 항체 사슬 유전자의 발현을 제어하는 조절 서열을 보유한다. 용어 "조절 서열"은 항체 사슬 유전자의 전사 또는 번역을 제어하는 프로모터, 인핸서 및 다른 발현 제어 요소(예를 들어, 폴리아데닐화 신호)를 포함하도록 의도된다. 이러한 조절 서열은, 예를 들어 Goeddel(Gene Expression Technology. Methods in Enzymology 185 Academic Press, San Diego, CA (1990))에 설명된다.
조절 서열의 선택을 비롯한 발현 벡터의 설계가 형질전환될 숙주 세포의 선택, 원하는 단백질의 발현 수준 등과 같은 요인들에 의존할 수 있다는 것이 당업자에게 인정될 것이다. 포유류 숙주 세포 발현을 위한 바람직한 조절 서열은 포유류 세포에서 높은 수준의 단백질 발현을 지시하는 바이러스성 요소, 예를 들어 시토메갈로바이러스(CMV), 유인원 바이러스 40(SV40), 아데노바이러스(예를 들어, 아데노바이러스 주요 후기 프로모터(AdMLP)) 및 폴리오마로부터 유래된 프로모터 및/또는 인핸서를 포함한다. 또는 달리, 유비퀴틴 프로모터 또는 p-글로빈 프로모터와 같은 비-바이러스성 조절 서열이 사용될 수 있다. 또한, 조절 요소는 상이한 출처에서 유래하는 서열들로 이루어지는데, 예를 들어 SRa 프로모터 시스템은 SV40 조기 프로모터 및 인간 T 세포 백혈병 바이러스 타입 1의 긴 말단 반복부로부터의 서열을 함유한다(Takebe, Y. et al. (1988) Mol. Cell. Biol. 8:466-472).
항체 사슬 유전자 및 조절 서열에 더하여, 본 발명의 재조합 발현 벡터는 숙주 세포(예를 들어, 복제 기원)에서 벡터의 복제를 조절하는 서열 및 선택성 마커 유전자와 같은, 추가 서열을 보유할 수 있다. 선택성 마커 유전자는 벡터가 도입된 숙주 세포의 선별을 용이하게 한다(예를 들어, U.S. Pat. No. 4399216, 4634665 및 5179017(모두 Axel et al.) 참조). 예를 들어, 전형적으로 선택성 마커 유전자는 벡터가 도입된 숙주 세포에 G418, 히그로마이신 또는 메토트렉세이트와 같은 약물에 대한 내성을 부여한다. 바람직한 선택성 마커 유전자는 디히드로폴레이트 환원효소(DHFR) 유전자(메토트렉세이트 선택/증폭과 함께 dhfr-숙주 세포에서 사용) 및 neo 유전자(G418 선택용)를 포함한다.
경쇄 및 중쇄의 발현을 위해서, 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 발현 벡터(들)가 표준 기술에 의해 숙주 세포에 트랜스펙션된다. 용어 "트랜스펙션"의 다른 형태들이 원핵 또는 진핵 숙주 세포에 외인성 DNA의 도입에 일반적으로 사용되는 광범한 기술을 포함하도록 의도되며, 예를 들어 전기천공, 칼슘-포스페이트 침전, DEAE-덱스트란 트랜스펙션 등이 있다. 원핵이나 진핵 숙주 세포에서 본 발명의 항체를 발현시키는 것이 이론적으로 가능하지만, 진핵 세포, 더 바람직하게 포유류 숙주 세포에서의 항체의 발현이 가장 바람직한데, 그것은 이러한 진핵 세포, 그리고 특히 포유류 세포가 원핵 세포보다 더 잘 적합하게 폴딩되고 면역학적으로 활성인 항체를 조립하고 분비할 수 있기 때문이다. 항체 유전자의 원핵생물 발현은 고 수율의 활성 항체의 생산에는 비효과적인 것으로 보고되었다(Boss, M. A. and Wood, C. R. (1985) Immunology Today 6:12-13).
본 발명의 재조합 항체를 발현시키기 위한 바람직한 포유류 숙주 세포는 중국 햄스터 난소(CHO 세포)(dhfr-CHO 세포 포함, Urlaub and Chasin, (1980) Proc. Nail. Acad. Sci. USA 77:4216-4220에 설명됨, 예를 들어 R. J. Kaufman and P. A. Sharp (1982) Mol. Biol. 159:601-621에 설명된 대로 DHFR 선택성 마커와 함께 사용), NSO 골수종 세포, COS 세포 및 SP2 세포를 포함한다. 특히, NSO 골수종 세포와 함께 사용되는 또 다른 바람직한 발현 시스템은 WO 87/04462, WO 89/01036 및 EP 338,841에 개시된 GS 유전자 발현 시스템이다. 항체 유전자를 암호화하는 재조합 발현 벡터가 포유류 숙주 세포에 도입된 경우, 숙주 세포에서 항체의 발현을 허용하는 충분한 시간 기간 동안, 더 바람직하게는 숙주 세포가 성장되는 배양 배지로 항체가 분비될 수 있는 충분한 시간 기간 동안 숙주 세포를 배양함으로써 항체가 생산된다. 표준 단백질 정제 방법을 사용하여 배양물로부터 항체가 회수될 수 있다.
항체 특성화
생산 또는 정제 후에, 또는 스크리닝 또는 분비 과정의 일환으로서, 본 발명의 항-hNKG2D 항체의 기능적 특성들이 조사될 수 있다. 관심의 기능적 특성들은, 예를 들어 hNKG2D에 대한 항체 결합 특이성, hNKG2D-리간드와의 항체 경합, 기준 항체(예를 들어, 16F16, 16F31, MS, 및 21F2)와의 항체 경합, 항체가 결합하는 에피토프, 항체-항원 상호작용의 친화성, 및 항체의 길항/작용 특성을 포함한다.
다음에 항체 특성화를 위한 예시적인 분석을 간단히 설명한다. 일부는 이후 단락 및/또는 실시예에서 더 설명된다.
(1) hNKG2D에 대한 항체 특이성은 모노클로날 항체(또는 모노클로날 항체를 함유하는 혈청, 동물 스크리닝 과정의 일환으로서)가 NKG2D 발현 세포와는 결합하지만 NKG2D 음성 세포와는 결합하지 않는다는 것을 확인함으로써 평가될 수 있다. NKG2D를 가진 또는 갖지 않은 셀라인이 항체와 함께 인큐베이션된 후, 직접 표지된 2차 항체와 함께 인큐베이션되고, 예를 들어 유세포분석에 의해 시각화된다.
(2) 리간드 결합의 차단은 항체 또는 하이브리도마 상청액과 함께 또는 이들 없이 NKG2D를 발현하는 세포를 인큐베이션한 후, Ngand-mFc 단백질 및 리간드에 특이적인 2차 항체와 함께 인큐베이션하고, 리간드 결합 및 결합 차단의 수준이 유세포분석에 의해 결정된다. 차단은 예비-인큐베이션이 없을 때와 비교하여 예비-인큐베이션이 있을 때의 리간드 결합 %로서 계산될 수 있으며, 예비-인큐베이션이 있을 때는 더 낮은 결합이 보인다.
(3) 하나 이상의 기준 항-NKG2D 항체에 의한 사용된 결합 부위의 경합은 유사한 방식으로 평가될 수 있으며, 단 본 발명의 항체 또는 기준 항체(예를 들어, ON72 또는 149810)와 함께 예비-인큐베이션이 수행된 후, 이어서 추가된 항체와 함께 인큐베이션되고, 추가된 항체가 검출된다.
(4) 항체의 온-레이트 및 오프-레이트를 비롯한 친화성 파라미터는 Biacore 기계에서 결정될 수 있다. 예를 들어, hNKG2D-Fc 단백질이 칩 상에 고정되고, 항체가 칩 위로 통과되고, 온-레이트 및 오프-레이트가 결정되고, KD가 계산될 수 있다.
(5) 항체에 의한 NKG2D 내재화의 유도는 hNKG2D-발현 세포를 항체와 함께 또는 항체 없이 하룻밤 인큐베이션한 후, 항체를 다시 추가하고, NKG2D의 수준(결합된 항체의 수준)을 유세포분석기에서 검출함으로써 측정될 수 있다.
(6) hNKG2D-리간드 매개 사멸을 차단하는 항체의 능력은, 예를 들어 NKG2D 리간드, 즉 MICA, MICB 또는 ULBP1-4를 발현하는 51Cr-로딩된 표적 세포를 죽이는 이펙터 세포로서 NK 셀라인인 NK92 또는 NKL을 사용하여 평가될 수 있다.
(7) CD4+ 세포(인간에서처럼)는 아니고 원숭이 NK 및 CD8+ T 세포와 인간 항-NKG2D 항체의 교차-반응성은 PBMC에서 상이한 세포 타입의 마커와 함께 hNKG2D 항체 및 2차 항체 원숭이 및 인간 PBMC를 인큐베이션한 후 유세포분석을 행하고, 다양한 서브셋의 NKG2D 염색을 분석함으로써 결정될 수 있다.
(8) 항체 결합에 의한 NKG2D의 활성화는 예비 자극(예를 들어, TCR, CD28 및 IL-2 또는 IL-15에 의한)과 함께 또는 예비-자극 없이 T-세포 수용체, CD28 및/또는 NKG2D를 통한 자극시 PBMC 집단에서 CD8+ 세포의 세포-증식의 유도로서 측정될 수 있다.
결합 분석
본 발명은 hNKG2D와 결합하는 항체, 및 그것의 항원-결합 단편 및 면역콘쥬게이트를 제공한다. 다양한 분석 중 어느 것을 사용하여 항체와 hNKG2D의 결합을 평가할 수 있다. ELISA, 방사선 면역분석, 웨스턴 블롯팅, BIACORE, 및 다른 경합 분석에 기초한 프로토콜이 특히 사용하기 적합하며 본 분야에 잘 알려져 있다. 또한, 경합 분석을 비롯한 몇 가지 결합 분석이 실시예에 설명된다.
예를 들어, 시험 항체를 표적 단백질이나 에피토프(예를 들어, NKG2D 또는 그것의 일부분)의 존재하에 인큐베이션하고, 결합되지 않은 항체를 세척하여 제거하고, 예를 들어 방사선 표지, 질량분광기와 같은 물리적 방법, 또는 예를 들어 세포형광분석(예를 들어, FACScan)을 이용하여 검출되는 직접 또는 간접 형광 표지를 사용하여 결합된 항체의 존재를 평가하는 간단한 결합 분석이 사용될 수 있다. 이러한 방법들은 당업자에게 잘 알려져 있다. 대조군인 비-특이적 항체에서 보이는 양을 넘는 결합 양은 항체가 표적과 특이적으로 결합한다는 것을 나타낸다.
이러한 분석에서, 표적 세포 또는 인간 NKG2D에 결합하는 시험 항체의 능력이 대조군 단백질, 예를 들어 구조적으로 관련 없는 항원에 대해 발생된 항체, 또는 비-Ig 펩티드 또는 단백질이 동일한 표적에 결합하는 능력과 비교될 수 있다. 어떤 적합한 분석을 사용하여 대조군 단백질에 비해 25%, 50%, 100%, 200%, 1000% 또는 그 이상으로 증가된 친화성으로 표적 세포 또는 NKG2D와 결합하는 항체 또는 단편을 "표적에 특이적으로 결합"하거나, 또는 "표적과 특이적으로 상호작용"한다라고 하며, 하기 설명된 치료 방법에 사용하는데 바람직하다. 또, 16F16, 16F31, MS 또는 21F2와 같은 NKG2D에 대한 (양성) 대조군 항체의 결합에 영향을 미치는 시험 항체의 능력이 평가될 수 있다.
한 양태에서, 본 발명은 16F16, 16F31, MS, 또는 21F2와 생물학적 특성 및/또는 실질적인 VH 및/또는 VL 서열 동일성을 공유하는 항-hNKG2D 항체를 제공한다. 한 예시적인 생물학적 특성은 16F16, 16F31, MS, 또는 21F2 에피토프, 즉 16F16, 16F31, MS, 또는 21F2 항체가 결합되는 hNKG2D의 세포외 도메인의 각 영역과의 결합이다. 16F16, 16F31, MS, 또는 21F2 에피토프와 결합하는 항체의 스크리닝을 위해 Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lane (1988)에 설명된 것과 같은 통상의 교차-차단 분석이 수행될 수 있다.
예시적인 교차-차단 또는 경합 분석에서는 16F16, 16F31, MS, 또는 21F2(대조군) 항체와 시험 항체가 혼합되고(또는 예비-흡착되고), NKG2D를 함유하는 샘플에 적용된다. 어떤 구체예에서, NKG2D-함유 샘플에 적용하기 전에 일정 시간 동안 대조군 항체와 다양한 양의 시험 항체(예를 들어, 1:10 또는 1:100)를 예비-혼합할 수 있다. 다른 구체예에서, 대조군과 다양한 양의 시험 항체는 간단히 항원/표적 샘플에 노출되는 동안 혼합될 수 있다. 자유 항체로부터 결합된 항체를 구분(예를 들어, 분리 또는 세정 기술을 사용하여 결합되지 않은 항체를 제거함으로써), 시험 항체로부터 대조군 항체를 구분(예를 들어, 종- 또는 이소타입-특이적 2차 항체를 사용하거나, 검출가능한 표지로 대조군 항체를 특이적으로 표지하거나, 또는 상이한 화합물을 구분할 수 있는 질량분광기와 같은 물리적 방법을 사용함으로써)할 수 있는 한, 시험 항체가 항원에 대한 대조군 항체의 결합을 감소시키는 지의 여부가 결정될 것이며, 이는 시험 항체가 대조군과 동일한 에피토프를 실질적으로 인식한다는 것을 의미한다. 이 분석에서, 완전히 무관한 항체의 존재하에 (표지된) 대조군 항체의 결합은 대조군 하이 밸류이다. 대조군 로우 밸류는 표지된 (양성) 대조군 항체와 표지되지 않은 대조군 항체룰 함께 인큐베이션함으로써 얻어지며, 이 경우 경합이 일어나서 표지된 항체의 결합이 감소할 것이다.
시험 분석에서, 시험 항체의 존재하에 표지된 항체 반응성의 유의한 감소는 동일한 에피토프를 인식하는 시험 항체, 즉 표지된 대조군 항체와 "교차반응"하는 것의 표지이다. 약 1:10 내지 약 1:1 사이의 대조군:시험 항체 또는 화합물의 임의의 비에서 적어도 50%, 또는 더 바람직하게 70%까지 항원/표적에 대한 표지된 대조군의 결합을 감소시키는 어떤 시험 항체 또는 화합물이 대조군과 실질적으로 동일한 에피토프 또는 결정소와 결합하는 항체 또는 화합물인 것으로 생각된다. 바람직하게, 이러한 시험 항체 또는 화합물은 적어도 90%까지 항원/표적에 대한 대조군의 결합을 감소시킬 것이다. 그렇지만, 어떤 측정가능한 범위로 대조군 항체 또는 화합물의 결합을 감소시키는 어떤 화합물이나 항체도 본 발명에서 사용될 수 있다.
한 구체예에서, 유세포분석 시험에 의해 경합이 평가될 수 있다. hNKG2D를 보유한 세포가 수용체와 특이적으로 결합한다고 알려진 대조군 항체와 먼저 인큐베이션된 다음(예를 들어, hNKG2D를 발현하는 T 또는 NK 세포 또는 hNKG2D를 발현하는 재조합 BaF/3 세포, 및 16F16, 16F31, MS 또는 21F2 항체), 예를 들어 형광색소나 바이오틴으로 표지될 수 있는 시험 항체와 인큐베이션된다. 포화 양의 대조군 항체와 예비-인큐베이션했을 때 얻어진 결합이 대조군과 예비-인큐베이션하지 않았을 때 항체에 의해 얻어진 결합(형광의 평균)의 80%, 바람직하게 50%, 40% 또는 그 미만인 경우 시험 항체는 대조군과 경합한다고 한다. 또는 달리, 포화 양의 항체와 예비-인큐베이션된 세포에서 표지된 대조군(형광색소 또는 바이오틴에 의해)에 의해 얻어진 결합이 항체와 예비-인큐베이션하지 않았을 때 얻어진 결합의 80%, 바람직하게 50%, 40% 또는 그 미만인 경우, 시험 항체는 대조군과 경합한다고 한다. 예시적인 항체 경합 분석은 실시예 5를 참조한다.
또한, 유사한 교차-차단 분석을 사용하여 시험(인간화된) 항체가 hNKG2D-리간드의 적합한 형태로 16F16, 16F31, MS, 또는 21F2를 간단히 교환함으로써 MICA, MICB, ULBP1, ULBP2, ULBP3, ULBP4와 같은 인간 NKG2D에 대한 천연 리간드, 또는 다수의 RAET1 패밀리의 결합에 영향을 미치는 지의 여부를 평가할 수 있다. 실시예에 설명된 한 적합한 형태는 리간드(예를 들어, MICA)와 항체의 Fc-부분의 융합 단백질이다. Fc-영역과 콘쥬게이트된 리간드는 Fc-영역이 유래된 동물 종에 특이적인 항체에 의해 융합 단백질의 검출을 허용하는데, 예를 들어 염소-항 마우스 항체를 사용하여 뮤린 Fc-영역을 검출할 수 있다.
한 구체예에서, hNKG2D-발현 세포, 예를 들어 류마티스성 관절염 환자로부터의 CD4+CD28 세포(또는 다른 자가면역 또는 염증 장애로부터의 동등한 세포)를, 예를 들어 Fc-융합 단백질 형태의 MICA, MICB 또는 ULBP 단백질과 같은 NKG2D 리간드와 함께 인큐베이션하거나, 또는 이들 리간드 중 어느 것을 발현하는 세포, 및 세포의 활성화를 차단하는 항-NKG2D 항체 또는 다른 분자의 능력을 평가하는 세포 분석이 사용된다. 다른 분석에서는, NKG2D 수용체에 대한 활성의 베이스라인 수준이 리간드의 부재하에 얻어지고, 베이스라인 활성 수준의 감소를 야기하는 항체 또는 화합물의 능력이 검출된다. 한 구체예에서, 고-처리량 스크리닝 접근법을 사용하여 수용체의 활성화를 차단할 수 있는, 또는 그것을 하향 조절할 수 있는 화합물이 확인된다. 예시적인 리간드 경합 분석은 실시예 3을 참조한다.
바람직하게, NKG2D 에피토프를 인식하는 모노클로날 항체는 류마티스 관절염 환자와 같은 환자에서 실질적인 퍼센트의 CD4+ T 세포, 특히 CD4+CD28- T 세포 상에 출현된 에피토프와 반응할 것이지만, 다른 세포, 즉 NKG2D를 발현하지 않는 면역 또는 비-면역 세포와는 유의하지 반응하지 않을 것이다. 따라서, 일단 항체가 NK 또는 T 세포 상의 hNKG2D를 특이적으로 인식한다면, 그것은 류마티스 관절염과 같은 자가면역 또는 염증 장애를 가진 환자로부터 취해진 T 세포와 결합하는 능력에 대해 시험될 수 있다. 수용체를 발현하는 세포 타입(예를 들어, CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, NK 세포 등)과 무관하게, 본 발명이 NKG2D 활성이 장애의 병인과 관련된 어떤 장애의 치료에 사용될 수 있고, 항체가 특정 장애에 관련된 세포 타입 상의 수용체와 결합하는 능력에 대해 시험될 수 있다는 것이 인정될 것이다. 예를 들어, 특정 장애가 NKG2D-발현 NK 세포의 과다한 활성 또는 증식과 관련된다면, 항체는 동일한 수용체를 발현하는 NK 세포를 사용하여 개발되고 시험될 수 있다.
한 구체예에서, 항체는 류마티스 관절염을 가진 환자로부터 취해진 NKG2D-발현 세포, 예를 들어 CD4+CD28- T 세포와 결합하는 능력을 시험하기 위한 면역분석에서 검증된다. 예를 들어, 말초혈액 림프구(PBL)가 다수의 환자로부터 채취되고, 예를 들어 관련 항체를 사용한 유세포분석에 의해서 PBL로부터 CD4+, 바람직하게는 CD4+CD28- 세포가 부화된다. 다음에, 당업자에게 잘 알려진 표준 방법을 사용하여 이 세포와 결합하는 주어진 항체의 능력이 평가된다. 유의한 퍼센트의 환자(예를 들어, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50% 또는 그 이상)로부터, RA 환자 등으로부터의 NKG2D를 발현한다고 알려진 세포, 예를 들어 NK 세포, CD8 T 세포, CD4 T 세포의 실질적인 부분(예를 들어, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 그 이상)과 결합한다고 판명된 항체가 환자의 세포에서 NKG2D 수용체의 발현을 결정하기 위한 진단 목적을 위해, 또는 여기 설명된 치료 방법에서의 용도로서, 예를 들어 인간-적합한 차단제로서, 또는 달리 세포독성 항체로서 본 발명에서 사용되기 적합하다고 생각될 수 있다. 항체와 세포의 결합을 평가하기 위하여, 항체는 직접 또는 간접적으로 표지될 수 있다. 간접적으로 표지되었을 때, 표지된 2차 항체가 전형적으로 첨가된다. 다음에, 항체와 세포의 결합이, 예를 들어 세포형광분석(예를 들어, FACS)을 이용하여 검출될 수 있다. 이러한 방법은 본 분야에 잘 공지되어 있다.
본 발명의 어떤 양태로서, 예를 들어 NKG2D-발현 세포를 죽이는 것이 바람직하지 않은 경우, 본 발명의 항체는 Fc 수용체와의 실질적인 특이적 결합을 나타내지 않는 것이 바람직하다. 이러한 항체는 Fc 수용체와 결합하지 않는다고 알려진 다양한 중쇄의 불변 영역을 포함할 수 있다. 한 이러한 예가 IgG4 불변 영역이다. 또는 달리, Fab 또는 F(ab')2 단편과 같은 불변 영역을 포함하지 않는 항체 단편을 사용하여 Fc 수용체 결합을 피할 수 있다. Fc 수용체 결합은, 예를 들어 BIACOR 분석에서 항체와 Fc 수용체의 결합을 시험하는 것을 포함하여, 본 분야에 공지된 방법에 따라서 평가될 수 있다. 또한, Fc 수용체와의 결합이 최소화되거나 제거되도록 Fc 부분이 변형된 어떤 다른 항체 타입이 사용될 수도 있다(예를 들어, 그 내용이 본원에 참고자료로 포함되는 WO 03101485를 참조한다). Fc 수용체 결합을 평가하기 위한 세포 기반 분석과 같은 분석이 본 분야에 잘 공지되어 있으며, 예를 들어 WO 03101485에 설명된다.
기능 분석
NKG2D 활성을 반영하는 어떤 적합한 생리학적 변화를 이용하여 시험 화합물 또는 항체의 이용을 평가할 수 있다. 예를 들어, 유전자 발현의 변화, 사이토카인 생산, 신호 분자 인산화, 세포 성장, 세포 증식, pH, 세포내 2차 메신저, 예를 들어 Ca2+, IP3, cGMP, 또는 cAMP, 또는 세포독성 활성이나 다른 T 세포를 활성화하는 능력과 같은 활성 등의 다양한 효과들이, 예를 들어 세포-기반 분석에서 측정될 수 있다. 예를 들어, 수용체 활성이 NKG2D-반응성 유전자, 예를 들어 CD25, IFN-감마, 또는 TNF-알파의 발현을 검출함으로써 평가될 수 있다(예를 들어, Groh et al., (2003) PNAS 100:9452-9457; Andre et al., (2004) Eur. J. Immunol 34:1-11 참조). 또는 달리, 리간드의 존재하에 CD4+CD28- NKG2D+ 세포를 인큐베이션하거나 또는 항-NKG2D 항체뿐만 아니라 항-CD3 항체를 활성화함으로써 T 세포에 의한 TNF-알파 또는 IFN-감마의 방출을 억제하는 화합물 또는 시험 항체의 능력을 평가하여 NKG2D 활성을 평가할 수 있다. 또는 달리, 리간드, 예를 들어 MICA, MICB, ULBP-1, ULBP-2, ULBP-3 등, 또는 리간드-생산 세포, 예를 들어 자가분비 MIC+ RA 활막세포의 존재하에 CD4+CD28- NKG2D+ T 세포가 인큐베이션될 수 있고, 사이토카인 생산(예를 들어, IFN-감마 또는 TNF-알파), 또는 T 세포 증식을 억제하는 시험 항체 또는 화합물의 능력이 평가될 수 있다.
시험관내 분석은 선택적으로 RA와 같은 자가면역 또는 염증 장애를 가진 환자로부터 채취한 세포, 예를 들어 RA를 가진 환자로부터 채취한 NKG2D를 발현하는 CD4+CD28- 세포(또는 이로부터 유래된 셀라인)를 사용할 수 있지만, 일반적으로는 어떤 NKG2D-발현 세포라도 사용될 수 있다. 예를 들어, 비-RA 면역 셀라인, 예를 들어 T 셀라인이 NKG2D-암호화 트랜스젠으로 트랜스펙션될 수 있으며, 수용체의 발현이 검출가능한 방식으로 세포의 활성을 변경하지 않는 한, 예를 들어 NKG2D 리간드에 의해서 이들이 활성으로 되지 않는 한, 본 분석에서 사용될 수 있다. 셀라인은, 예를 들어 RA 환자로부터의 CD4+CD28- NKG2D+ 세포, 예를 들어 활막 조직으로부터 분리된 PBL 또는 T 세포를 하용하여 확립될 수 있다. 이러한 세포는 IL-15의 존재하에 배양될 수 있으며, 이로써 NKG2D의 계속적인 발현이 확보된다(예를 들어, 그 내용이 본원에 참고자료로 포함되는 Groh et al., (2003) PNAS 100:9452-9457를 참조한다).
만일 항-hNKG2D 항체가 그것의 리간드 중 하나 이상과 NKG2D 상호작용을 감소 또는 차단하거나, 또는 hNKG2D 리간드 상호작용을 차단한다고 알려진 항체와 경합한다면, 그것은 NK 또는 T 세포의 NKG2D-매개 활성화를 감소시키는데 유용할 수 있다. 이것은 전형적인 세포독성 분석에 의해 평가될 수 있다. 실시예 6은 예시적인 세포독성 분석인 표적 세포의 NKG2D-리간드 매개 사멸을 설명한다. 여기서, MICA-트랜스펙션된 BaF/3의 NK-세포-매개 사멸을 감소 또는 억제하는 항-hNKG2D 항체의 능력은 51Cr의 표적 세포 방출을 측정함으로써 평가된다.
다른 양태로서, 본 발명의 항체가 실질적인 작용제 활성을 결여하도록 보장하는 것이 바람직할 수 있다. 하기 설명된 것을 포함하여 몇 가지 분석이 이 목적을 위해 사용될 수 있다.
한 분석은 건강한 지원자 또는 IBD 환자로부터의 PBMC의, 항-CD3 및/또는 항-CD28 항체와 조합된, 수용성 또는 평판-결합된 항체에 의한 활성화 후 증식 및 사이토카인 생산을 평가할 수 있다. 이 방법에서 PBMC는 건강한 피험자 또는 염증성 장 질환(IBD) 환자로부터 종래의 방법에 의해서 정제된다. 세포가 CFSE(Molecular probes로부터, cat #C34554)로 염색된다. 107 세포(2% FCS를 함유한 0.5mL PBS 중의)에 1㎕ CFSE(0.5mM)가 첨가되고 세포가 37℃에서 10분간 인큐베이션된다. 다음에, 2mL FCS가 첨가되고 혼합물이 실온에서 1시간 방치된다. 다음에, RPMI-1640 배지(12mL)와 함께 원심분리함으로써 세포가 3번 세정된다. 세정 후, 2% FCS를 함유한 1mL 배지(예를 들어, RPMI-1640)에 세포가 다시 현탁된다.
96웰 플레이트가 실온에서 2시간 동안 30㎕ 항-마우스 Fc(Jackson - Immuno Resarch 115-006-008)로 코팅되고 PBS로 세정된다. 항체(항-CD3 Biosceince cat# 14-0037-82, 항-CD28 cat# 348046 Becton Dickison)가 아래 계획에 따라서 첨가되고 웰에서 방치된다:
세포 단독
CD3 0.1 또는 0.3 ng/mL
CD3 0.1 또는 0.3 ng/mL + CD28 0.2 ㎍/mL
CD3 0.1 또는 0.3 ng/mL + CD28 0.2 ㎍/mL + 항-NKG2D 0.2 ㎍/mL
CD3 0.1 또는 0.3 ng/mL + 항-NKG2D 0.2 ㎍/mL
다음에, 100.000 CFSE-표지된 PBMCs가 첨가되고 3일간 방치된다. 사이토카인 분석을 위해 상청액이 수집되고, 증식을 위해 표지한 항-CD56, 항-CD4, 항-CD8 및 CFSE를 가진 림프구의 타입과 관련하여 유세포분석에 의해 PBMC가 분석된다.
다른 분석에서, NKG2D 리간드를 결여한 표적 세포를 향한 CD8+ T 세포의 세포독성 잠재성에 대한 효과가 시험된다. 결합이 세포의 세포독성 잠재성을 강화한 경우에는 작용제 활성이 나타난다. 간단히 말해서, 건강한 피험자로부터의 IL-2 자극된 PBMC가 MICA를 발현하는 p815 세포와 함께, 또는 트랜스펙션되지 않은 p815 세포 및 항-CD3 항체(이것은 p815 세포 상에서 Fc 수용체와 결합함으로써 재지시된 사멸을 가져올 것이다) 및 CD8 세포독성 T 세포와 함께 인큐베이션된다. 다음에, p815 세포와 결합하지 않은 항-NKG2D 항체(예를 들어, 인간 IgG4 이소타입의 항체)가 MICA-NKG2D-지시된 결합을 차단하는 지의 여부 및/또는 항체가 CD3-p815 재지시된 결합을 강화하는 지의 여부가 분석된다. 이 방식에서는, CD8+ T 세포의 활성이 p815 세포와 항-CD3 항체 및 추가의 항-NKG2D 항체를 인큐베이션함으로써 증진되지 않는 것으로 나타날 수 있지만, 동일한 항-NKG2D 항체는 그것이 동일한 PBMC 집단에서 p815-유도된 사멸에 대한 NK-MICA 상호작용을 차단한다는 것을 증명함으로써 기능적인 것으로 나타날 수 있다.
다른 분석에서, NKG2D - 신호화 경로 및 - 분자가 하나 이상의 항-NKG2D 항체의 첨가에 의해 활성화되는 지의 여부가 조사될 수 있다. 말초혈로부터 분리된 NK 셀라인(예를 들어, NKL 세포 또는 NK092 세포), 또는 인간 NK 또는 CD8+ T 세포가 사용될 수 있다. 예를 들면, NKL 세포가 용액 중에서 또는 평판에 결합된 상태로 인간 항-NKG2D 항체와 함께 인큐베이션될 수 있으며, 이때 대조군은, 예를 들어 Fc-MICA 또는 조사된 MICA 발현 세포이다. 적합한 시간(예를 들어, 5, 10, 30분) 동안 인큐베이션한 후, 세포가 얼음 위에서 프로테아제 및 포스파타제 억제제의 존재하에 용해되고, 표준 웨스턴 블롯팅 기술에 의해 NKG2D의 자극의 하류에 있다고 알려진 하나 이상의 인산화된 신호화 분자(예를 들어, Pi3K, Akt, 및 vav)의 수준에 대해 분석된다.
동물-기반 분석에서는, 동물 내에서 세포에서의 NKG2D 활성화의 어떤 생리학적 또는 병리학적 결과를 사용하여 항체 또는 시험 화합물 활성을 평가할 수 있다.
예를 들어, CD4+CD28- NKG2D+ 세포가 MICA-생성 활막세포와 같은 리간드 생성 세포의 동시-투여와 함께 또는 투여 없이 동물 모델의 관절에 도입될 수 있고, 염증 또는 조직 손상이 평가된다. 다음에, 시험 화합물 또는 항체가 도입될 수 있고, 염증 또는 조직 손상을 억제, 지연, 역전시키거나 어떤 식으로든 영향을 미치는 이들의 능력이 검출된다.
또한, 류마티스성 관절염(RA) 활막 외식편을 사용한 실험을 수행하여 전-염증성 사이토카인의 자발적 방출에 대한 NKG2D 차단의 효과가 연구될 수 있다(예를 들어, Brennan et al., Lancet 1989; 2(8657); 244-247 참조). 이러한 분석에서, 인간 또는 인간화된 항-hNKG2D 항체가 RA 활막 배양물에서 시험되고, 리간드 결합 및 NKG2D의 기능을 차단하는데 유용하다고 밝혀진 농도에서, 예를 들어 뮤린 항-hNKG2D 항체와 비교된다. RA 활막 세포가 항-NKG2D 항체 또는 이소타입 대조군 항체의 부재 또는 존재하에 48시간 동안 배양된다. 공지된 항염제가 양성 대조군으로 사용될 수 있다. 항-NKG2D 항체의 효과가 6개의 RA 활막에 대해 30㎍/mL 이하의 농도에서 처음에 시험된다. 살아 있는 세포를 염색하여 첨가된 시약이 어떤 세포독성을 가지는 지의 여부를 결정하는 분석에서 세포 생육성이 분석된다(예를 들어, MTT 분석). 다음에, ELISA를 사용하여, 배양 상청액 중의, 예를 들어 TNFα, IL-1β 및 IL-6과 같은 사이토카인의 수준을 검출한다.
또는 달리, 본 발명의 항체는, 예를 들어 건선 또는 위궤양의 실험 모델에서 시험될 수 있다. 건선에 걸린 피부 샘플이 환자 자신의 PBMC와 함께 SCID 마우스에 이식되고, 시험 화합물의 도입 효과 및 염증 또는 조직 손상을 억제, 지연, 역전시키거나 어떤 식으로든 영향을 미치는 능력이 검출될 수 있다. Kjellev et al. (Eur J Immunol 2008; 37:1397-1406) 및 Ito et al.(Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol 2008; 294:G199-G207)는 항-뮤린 NKG2D 항체를 사용한 위궤양의 치료를 평가하기 위한 실험 모델을 설명한다.
제약 제제
한 구체예에서, 본 발명은 하나 이상의 담체와 함께 여기 설명된 항-hNKG2D 항체를 포함하는 제약 조성물 또는 제제를 제공한다.
따라서, 본 발명의 한 예시적인 양태는 1mg/mL 내지 500mg/mL의 농도로 존재하는 이러한 항체를 포함하는 제약 제제이며, 상기 제제는 2.0 내지 10.0의 pH를 가진다. 상기 제제는 버퍼 시스템, 보존제(들), 장성제(들), 킬레이트제(들), 안정제, 및/또는 계면활성제를 더 포함할 수 있다. 한 구체예에서, 제약 제제는 수성 제제, 즉 물을 포함하는 제제이다. 이러한 제제는 전형적으로 용액이거나 현탁액이다. 다른 구체예에서, 제약 제제는 수성 용액이다. 용어 "수성 제제"는 적어도 50% w/w 물을 포함하는 제제로서 정의된다. 마찬가지로, 용어 "수성 용액"은 적어도 50% w/w 물을 포함하는 용액으로서 정의되고, 용어 "수성 현탁액"은 적어도 50% w/w 물을 포함하는 현탁액으로서 정의된다.
다른 구체예에서, 제약 제제는 동결건조 제제이며, 여기에 의사나 환자가 용매 및/또는 희석제를 투여 전에 첨가할 수 있다.
다른 구체예에서, 제약 제제는 어떤 사전 용해 없이 바로 사용할 수 있는 건조 제제(예를 들어, 동결건조 또는 분무건조)이다.
다른 양태로서, 제약 제제는 이러한 항체의 수성 용액, 및 버퍼를 포함하며, 이때 항체는 1mg/mL 이상의 농도로 존재하고, 상기 제제는 약 2.0 내지 약 10.0의 pH를 가진다.
다른 구체예에서, 제제의 pH는 약 2.0 내지 약 10.0, 약 3.0 내지 약 9.0, 약 4.0 내지 약 8.5, 약 5.0 내지 약 8.0, 및 약 5.5 내지 약 7.5로 구성되는 리스트로부터 선택된 범위이다.
다른 구체예에서, 제제는 나트륨 아세테이트, 나트륨 카보네이트, 시트레이트, 글리실글리신, 히스티딘, 글리신, 리신, 아르기닌, 나트륨 디하이드로겐 포스페이트, 디나트륨 하이드로겐 포스페이트, 나트륨 포스페이트, 및 트리스(히드록시메틸)아미노메탄, 바이신, 트리신, 말산, 숙시네이트, 말레산, 푸마르산, 타르타르산, 아스파르트산 또는 이들의 혼합물로 구성되는 군으로부터 선택된 버퍼를 포함한다. 이들 특정 버퍼의 각각이 본 발명의 대체 구체예를 구성한다.
다른 구체예에서, 제제는 또한, 또는 다른 면에서 제약학적으로 허용되는 보존제를 포함한다. 보존제는, 예를 들어 페놀, o-크레졸, m-크레졸, p-크레졸, 메틸 p-히드록시벤조에이트, 프로필 p-히드록시벤조에이트, 2-페녹시에탄올, 부틸 p-히드록시벤조에이트, 2-페닐에탄올, 벤질알코올, 클로로부탄올, 및 티오메로살, 브로노폴, 벤조산, 이미듀레아, 클로로헥시딘, 나트륨 데히드로아세테이트, 클로로크레졸, 에틸 p-히드록시벤조에이트, 벤제토늄 클로라이드, 클로르페네신(3p-클로르페녹시프로판-1,2-디올) 또는 이들의 혼합물로 구성되는 군으로부터 선택될 수 있다. 보존제는, 예를 들어 0.1 mg/mL 내지 20 mg/mL, 0.1 mg/mL 내지 5 mg/mL, 5 mg/mL 내지 10 mg/mL, 또는 10 mg/mL 내지 20 mg/mL의 농도로 존재할 수 있다. 이들 특정 보존제의 각각은 본 발명의 대체 구체예를 구성한다. 제약 조성물에서 보존제의 사용은 당업자에게 잘 알려져 있다. 편의를 위해 Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19th edition, 1995를 참조한다.
다른 구체예에서, 제제는 또한, 또는 다른 면에서 장성제를 포함한다. 장성제는, 예를 들어 염(예를 들어, 염화나트륨), 당 또는 당 알코올, 아미노산(예를 들어, L-글리신, L-히스티딘, 아르기닌, 리신, 이소류신, 아스파르트산, 트립토판, 트레오닌), 알디톨(예를 들어, 글리세롤(글리세린), 1,2-프로판디올(프로필렌글리콜), 1,3-프로판디올, 1,3-부탄디올), 폴리에틸렌글리콜(예를 들어, PEG400), 또는 이들의 혼합물로 구성되는 군으로부터 선택될 수 있다. 어떤 당, 예를 들어 단당류, 이당류 또는 다당류, 또는 예를 들어 프럭토오스, 글루코오스, 만노스, 소르보스, 자일로스, 말토스, 락토스, 수크로오스, 트레할로스, 덱스트란, 풀룰란, 덱스트린, 시클로덱스트린, 가용성 녹말, 히드록시에틸 녹말 및 카르복실메틸셀룰로오스-Na를 포함하는 수용성 글루칸이 사용될 수 있다. 한 구체예에서, 당 첨가제는 수크로오스이다. 당 알코올은 적어도 1개의 -OH 기를 가진 C4-C8 탄화수소로서 정의되며, 예를 들어 만니톨, 소르비톨, 이노시톨, 갈락티톨, 둘시톨, 자일리톨, 및 아라비톨을 포함한다. 한 구체예에서, 당 알코올 첨가제는 만니톨이다. 상기 언급된 당 또는 당 알코올은 개별적으로 또는 조합하여 사용될 수 있다. 당 또는 당 알코올이 액체 제제에서 가용성이고, 본 발명의 방법을 사용하여 달성되는 안정화 효과에 불리한 영향을 미치지 않는 한, 사용되는 양에 고정적인 제한은 없다. 당 또는 당 알코올 농도는, 예를 들어 약 1 mg/ml 내지 약 150 mg/ml일 수 있다. 장성제는, 예를 들어 1 mg/ml 내지 50 mg/ml, 1 mg/ml 내지 7 mg/ml, 8 mg/ml 내지 24 mg/ml, 또는 25 mg/ml 내지 50 mg/ml의 농도로 존재할 수 있다. 이들 특정 장성제의 각각은 본 발명의 대체 구체예를 구성한다. 제약 조성물에 장성제의 사용은 당업자에게 잘 알려져 있다. 편의를 위해 Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19th edition, 1995를 참조한다.
추가의 구체예에서, 제제는 또한, 또는 다른 면에서 킬레이트제를 포함한다. 킬레이트제는, 예를 들어 에틸렌디아민-테트라아세트산(EDTA), 시트르산, 및 아스파르트산의 염, 및 이들의 혼합물로부터 선택될 수 있다. 킬레이트제는, 예를 들어 0.1 mg/ml 내지 5 mg/ml, 0.1 mg/ml 내지 2 mg/ml 또는 2 mg/ml 내지 5 mg/ml의 농도로 존재할 수 있다. 이들 특정 킬레이트제의 각각은 본 발명의 대체 구체예를 구성한다. 제약 조성물에서 킬레이트제의 사용은 당업자에게 잘 알려져 있다. 편의를 위해 Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19th edition, 1995를 참조한다.
본 발명의 다른 구체예에서, 제제는 또한, 또는 다른 면에서 안정제를 포함한다. 제약 조성물에 안정제의 사용은 당업자에게 잘 알려져 있다. 편의를 위해 Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19th edition, 1995를 참조한다. 더 구체적으로, 본 발명의 조성물은 치료학적 활성 성분이 액체 제약학적 제제 중에서 보관 도중에 응집물 형성을 나타낼 가능성이 있는 폴리펩티드를 포함하는 안정화된 액체 제약학적 조성물일 수 있다. "응집물 형성"은 올리고머의 형성을 가져오는 폴리펩티드 분자들 간의 물리적 상호작용을 의미하며, 이런 올리고머는 여전히 수용성일 수도 있고, 아니면 용액으로부터 커다란 눈에 보이는 덩어리로 침전될 수도 있다. "보관 도중"은 일단 제조된 액체 제약 조성물 또는 제제가 피험자에게 즉시 투여되지 않는 것을 의미한다. 오히려 제조 후에 보관을 위해 액체 형태로, 냉동 상태로, 또는 이후에 액체 형태나 다른 적합한 투여 형태로 복원하기에 알맞은 건조 형태로 포장된다. "건조된 형태"는 액체 제약 조성물 또는 제제가 동결건조(즉, 동결건조; 예를 들어 Williams and Polli (1984) J. Parenteral Sci. Technol 38:48-59 참조), 분무건조(Masters (1991) Spray-Drying Handbook(5th ed; Longman Scientific and Technical, Essez, U.K., PP-491-676; Broadhead et al., (1992) Drug Devel. Ind. Pharm. 18:1169-1206; 및 Mumenthaler et al., (1994) Pharm. Res. 11:12-20), 또는 공기건조(Carpenter and Crowe (1988) Cryobiology 25:459-470; and Roser (1991) Biopharm. 4:47-53)에 의해 건조된 것을 의미한다. 액체 제약 조성물의 보관 도중 폴리펩티드에 의한 응집물 형성은 그 폴리펩티드의 생물학적 활성에 좋지 않은 영향을 미칠 수 있으며, 제약 조성물의 치료 효과의 손실을 가져온다. 또한, 응집물 형성은 폴리펩티드-함유 제약 조성물이 주입 시스템을 통해 투여될 때 관, 막, 또는 펌프 막힘과 같은 다른 문제를 야기할 수도 있다.
또한 또는 다른 면에서, 본 발명의 제약 조성물은 조성물의 보관 도중에 폴리펩티드에 의한 응집물 형성을 감소시키는데 충분한 양의 아미노산 염기를 포함할 수 있다. "아미노산 염기"는 아미노산 또는 아미노산의 조합을 의미하며, 어떤 주어진 아미노산이 자유 염기 형태나 염 형태로 존재한다. 아미노산 조합이 사용되는 경우, 모든 아미노산이 자유 염기 형태로 존재할 수도 있고, 모두 염 형태로 존재할 수도 있고, 아니면 일부는 자유 염기 형태로 존재하고 나머지는 염 형태로 존재할 수도 있다. 한 구체예에서, 본 발명의 조성물을 제조하는데 사용되는 아미노산은 하전된 측쇄, 예를 들어 아르기닌, 리신, 아스파르트산, 및 글루탐산을 보유한 것들이다. 특정 아미노산(예를 들어, 메티오닌, 히스티딘, 이미다졸, 아르기닌, 리신, 이소류신, 아스파르트산, 트립토판, 트레오닌 및 이들의 혼합물)의 어떤 입체이성질체(즉, L, D 또는 이들의 혼합물) 또는 이들 입체이성질체의 조합이 본 발명의 제약 조성물에 존재할 수 있으며, 단 특정 아미노산은 자유 염기 형태 또는 염 형태로 존재해야 한다. 한 구체예에서, L-입체이성질체가 사용된다. 또한, 본 발명의 조성물은 이들 아미노산의 유사체를 사용하여 조제될 수도 있다. "아미노산 유사체"는 본 발명의 액체 제약 조성물의 보관 도중 폴리펩티드에 의한 응집물 형성을 감소시키는 원하는 효과를 야기하는 자연발생 아미노산의 유도체를 의미한다. 적합한 아르기닌 유사체는, 예를 들어 아미노구아니딘, 오르니틴 및 N-모노에틸 L-아르기닌을 포함하고, 적합한 메티오닌 유사체는 에티오닌 및 부티오닌을 포함하고, 적합한 시스테인 유사체는 S-메틸 L-시스테인을 포함한다. 다른 아미노산들과 마찬가지로, 아미노산 유사체도 자유 염기 형태나 염 형태로 조성물에 혼입된다. 본 발명의 다른 구체예에서, 아미노산 또는 아미노산 유사체는 단백질의 응집을 방지하거나 지연시키기에 충분한 농도로 사용된다.
본 발명의 다른 구체예에서, 치료제로서 작용하는 폴리펩티드가 메티오닌 잔기의 메티오닌 술폭시드로의 산화에 민감한 적어도 하나의 메티오닌 잔기를 포함하는 폴리펩티드일 때 이러한 산화를 억제하기 위하여 메티오닌(또는 다른 황 아미노산 또는 아미노산 유사체)이 첨가될 수 있다. 이 문맥에서 용어 "억제하다"는 경시적으로 메티오닌 산화된 종들이 최소 축적되는 것을 의미하도록 의도된다. 메티오닌 산화의 억제는 적절한 분자 형태의 폴리펩티드의 체류를 증가시킨다. 메티오닌의 어떤 입체이성질체(L 또는 D) 또는 이들의 조합이 사용될 수 있다. 첨가량은 메티오닌 술폭시드의 양이 규제 당국에 의해 승인될 만큼 메티오닌 잔기의 산화를 억제하기에 충분한 양이어야 한다. 전형적으로, 이것은 조성물이 약 10% 내지 약 30%보다 많지 않은 메티오닌 술폭시드를 함유한다는 의미이다. 일반적으로, 이것은 메티오닌 잔기에 첨가된 메티오닌의 비율이 약 1:1 내지 약 1000:1, 예를 들어 10:1 내지 약 100:1의 범위가 되도록 메티오닌을 첨가함으로써 달성될 수 있다.
다른 구체예에서, 제제는 또한, 또는 다른 면에서 고분자량 폴리머 또는 저 분자량 화합물의 군으로부터 선택된 안정제를 포함한다. 본 발명의 다른 구체예에서, 안정제는 폴리에틸렌 글리콜(예를 들어, PEG 3350), 폴리비닐 알코올(PVA), 폴리비닐피롤리돈, 카르복시-/히드록시셀룰로오스 또는 그것의 유도체들(예를 들어, HPC, HPC-SL, HPC-L 및 HPMC), 시클로덱스트린, 황-함유 물질, 예를 들어 모노티오글리세롤, 티오글리콜산 및 2-메틸티오에탄올, 및 상이한 염들(예를 들어, 염화나트륨)로부터 선택된다. 이들 특정 안정제의 각각은 본 발명의 대체 구체예를 구성한다.
제약 조성물은 또한, 또는 다른 면에서 조성물 중의 치료 활성 폴리펩티드의 안정성을 더욱 증진시키는 추가 안정제를 포함할 수 있다. 본 발명에서 특히 관심 있는 안정제는, 제한되지는 않지만, 메티오닌 산화에 대해 폴리펩티드를 보호하는 메티오닌 및 EDTA, 및 냉동-해동 또는 기계적 전단과 관련된 응집에 대해 폴리펩티드를 보호하는 비이온성 계면활성제를 포함한다.
추가의 다른 구체예에서, 제제는 또한, 또는 다른 면에서 계면활성제를 포함한다. 계면활성제는, 예를 들어 세제, 에톡시화 피마자유, 폴리글리콜화 글리세리드, 아세틸화 모노글리세리드, 소르비탄 지방산 에스테르, 폴리옥시프로필렌-폴리옥시에틸렌 블록 폴리머(예를 들어, 폴록사머, 예를 들어 Pluronic® F68, 폴록사머 188 및 407, Triton X-100), 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스테르, 폴리옥시에틸렌 및 폴리에틸렌 유도체, 예를 들어 알킬화된 및 알콕시화된 유도체(트윈, 예를 들어 Tween-20, Tween-40, Tween-80 및 Brij-35), 모노글리세리드 또는 그것의 에톡시화 유도체, 디글리세리드 또는 그것의 폴리옥시에틸렌 유도체, 알코올, 글리세롤, 렉틴 및 인지질(예를 들어, 포스파티딜 세린, 포스파티딜 콜린, 포스파티딜 에탄올아민, 포스파티딜 이노시톨, 디포스파티딜 글리세롤 및 스핑고미엘린), 인지질의 유도체(예를 들어, 디팔미토일 포스파티드산) 및 리소인지질(예를 들어, 팔미토일 리소포스파티딜-L-세린 및 에탄올아민, 콜린, 세린 또는 트레오닌의 1-아실-sn-글리세로-3-포스페이트 에스테르) 및 리소포스파티딜 및 포스파티딜콜린의 알킬, 알콕실(알킬에스테르), 알콕시(알킬에테르)-유도체, 예를 들어 리소포스파티딜콜린의 라우로일 및 미리스토일 유도체, 디팔미토일포스파티딜콜린, 및 극성 머리기의 변형, 즉 콜린, 에탄올아민, 포스파티드산, 세린, 트레오닌, 글리세롤, 이노시톨, 및 양으로 하전된 DODAC, DOTMA, DCP, BISHOP, 리소포스파티딜세린 및 리소포스파티딜트레오닌, 및 글리세로인지질(예를 들어, 세팔린), 글리세로글리코지질(예를 들어, 갈락토피라노시드), 스핑고글리코지질(예를 들어, 세라마이드, 강글리오시드), 도데실포스포콜린, 달걀 리소레시틴, 푸시드산 유도체(예를 들어, 나트륨 타우로디히드로푸시데이트 등), C6-C12 장쇄 지방산 및 그 염들(예를 들어, 올레산 및 카프릴산), 아실카르니틴 및 유도체, 리신, 아르기닌 또는 히스티딘의 Nα-아실화 유도체, 또는 리신 또는 아르기닌의 측쇄 아실화 유도체, 리신, 아르기닌 또는 히스티딘과 중성 또는 산성 아미노산의 어떤 조합을 포함하는 디펩티드의 Nα-아실화 유도체, 중성 아미노산과 2개의 하전된 아미노산의 어떤 조합을 포함하는 트리펩티드의 Nα-아실화 유도체, DSS(도쿠세이트 나트륨, CAS 등록 no. [577-11-7]), 도쿠세이트 칼슘(CAS 등록 no. [128-49-4]), 도쿠세이트 칼륨(CAS 등록 no. [7491-09-0]), SDS(나트륨 도데실 술페이트 또는 나트륨 라우릴 술페이트), 나트륨 카프릴레이트, 콜산 또는 그것의 유도체, 담즙산 및 그것의 염 및 글리신 또는 타우린 콘쥬게이트, 우르소데옥시콜산, 나트륨 콜레이트, 나트륨 데옥시콜레이트, 나트륨 타우로콜레이트, 나트륨 글리코콜레이트, N-헥사데실-N,N-디메틸-3-암모니오-1-프로판술포네이트, 음이온성(알킬-아릴-술포네이트) 1가 계면활성제, 양쪽성 계면활성제(예를 들어, N-알킬-N,N-디메틸암모니오-1-프로판술포네이트, 3-콜라미도-1-프로필디메틸암모니오-1-프로판술포네이트, 양이온성 계면활성제(4차 암모늄 염기)(예를 들어, 세틸트리메틸암모늄 브로마이드, 세틸피리디늄 클로라이드), 비이온성 계면활성제(예를 들어, 도데실 β-D-글루코피라노시드), 에틸렌디아민에 프로필렌 옥시드와 에틸렌 옥시드의 연속 부가로부터 유도된 4가 블록 코폴리머인 폴록사민(예를 들어, Tetronic)으로부터 선택될 수 있거나, 또는 계면활성제는 이미다졸린 유도체, 또는 그것의 혼합물의 군으로부터 선택될 수 있다. 이들 특정 계면활성제의 각각은 본 발명의 대체 구체예를 구성한다.
제약 조성물에서 계면활성제의 사용은 당업자에게 잘 알려져 있다. 편의를 위해 Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19th edition, 1995를 참조한다.
다른 구체예에서, 제제는 또한, 또는 다른 면으로 EDTA(에틸렌디아민 테트라아세트산) 및 벤자미딘 HCl과 같은 프로테아제 억제제를 포함하며, 다른 상업적으로 이용가능한 프로테아제 억제제도 사용될 수 있다. 프로테아제 억제제의 사용은 프로테아제의 자이모겐을 포함하는 제약 조성물에서 자기촉매작용을 억제하는데 특히 유용하다.
또한 또는 다른 면에서, 다른 성분들도 본 발명의 펩티드 제약 제제에 존재할 가능성이 있다. 이러한 추가 성분은 습윤제, 유화제, 항산화제, 벌크화제, 장성 조정제, 킬레이트제, 금속 이온, 유성 비히클, 단백질(예를 들어, 인간 혈청 알부민, 젤라틴 또는 단백질) 및 쯔위터 이온(예를 들어, 베타인, 타우린, 아르기닌, 글리신, 리신 및 히스티딘과 같은 아미노산)을 포함할 수 있다. 이러한 추가 성분은 물론 본 발명의 제약 제제의 전체적 안정성에 불리한 영향을 미치지 않아야 한다.
본 발명에 따른 항체를 함유하는 제약 조성물은 치료를 필요로 하는 환자에게 몇몇 부위에서 투여될 수 있으며, 예를 들어 국소 부위, 예를 들어 피부 및 점막 부위, 흡수를 우회하는 부위, 예를 들어 동맥내, 정맥내, 심장내 투여, 그리고 흡수를 포함하는 부위, 예를 들어 피부내, 피부밑, 근육내 또는 복강내 투여에 의해 투여될 수 있다.
본 발명에 따른 제약 조성물의 투여는 몇 가지 투여 경로를 통해, 예를 들어 혀, 혀밑, 협측, 구강내, 경구, 위 및 장내, 코, 폐, 예를 들어 기관지 및 폐포 또는 이들의 조합을 통해, 표피, 진피, 경피, 질, 직장, 안구, 예를 들어 결막을 통해, 요도, 및 비경구 경로를 통해 치료를 필요로 하는 환자에게 투여될 수 있다.
본 발명의 조성물은 몇 가지 제형으로, 예를 들어 용액, 현탁액, 에멀젼, 마이크로에멀젼, 다중 에멀젼, 폼, 고약, 페이스트, 석고, 연고, 정제, 코팅 정제, 린스, 캡슐, 예를 들어 경질 젤라틴 캡슐 및 연질 젤라틴 캡슐, 좌약, 직장 캡슐, 드롭, 젤, 스프레이, 분말, 에어로졸, 흡입제, 점안제, 안과 연고, 안과 린스, 질 페서리, 질 링, 질 연고, 주사 용액, 제자리 변형 용액, 예를 들어 제자리 겔화, 제자리 경화, 제자리 침전, 제자리 결정화, 주입 용액, 및 임플란트로서 투여될 수 있다.
또, 본 발명의 조성물은, 예를 들어 공유, 소수성 및 정전기 상호작용을 통해서 약물 담체, 약물 송달 시스템 및 진보된 약물 송달 시스템에 화합되거나, 부착될 수 있으며, 이로써 항체의 안정성이 더욱 증진되고, 생체이용능이 증가하고, 용해도가 증가하고, 부작용이 감소하고, 당업자에게 잘 알려진 크로노테라피가 달성되고 그리고 환자 순응성이 증가하고, 또는 이들의 어떤 조합이 달성될 수 있다. 담체, 약물 송달 시스템 및 진보된 약물 송달 시스템의 예는, 제한되지는 않지만, 폴리머, 예를 들어 셀룰로오스 및 유도체, 다당류, 예를 들어 덱스트란 및 유도체, 녹말 및 유도체, 폴리비닐알코올, 아크릴레이트 및 메타크릴레이트 폴리머, 폴리락트산 및 폴리글리콜산 및 이들의 블록 코폴리머, 폴리에틸렌 글리콜, 담체 단백질, 예를 들어 알부민, 겔, 예를 들어 열겔화 시스템, 예를 들어 당업자에게 잘 알려진 블록 코폴리머 시스템, 미셸, 리포솜, 마이크로스피어, 나노미립자, 액체 결정 및 이들의 분산물, 액체-물 시스템의 상 거동을 가진 당업자에게 잘 알려진 L2 상 및 이들의 분산물, 폴리머 미셸, 다중 에멀젼, 자기-유화, 자기-마이크로유화, 시클로덱스트린 및 이들의 유도체, 및 덴드리머를 포함한다.
본 발명의 조성물은, 예를 들어 계량 용량 흡입기, 건조 분말 흡입기 및 분무기를 이용하여 항체를 폐에 투여하기 위한 고체, 반고체, 분말 및 용액 제제에서 유용하며, 장치는 모두 당업자에게 잘 알려져 있다.
본 발명의 조성물은 제어, 지속, 연장, 지연 및 서행 방출 약물 송달 시스템의 제제에서 특히 유용하다. 제한되지는 않지만, 더 구체적으로 조성물은 당업자에게 잘 알려진 비경구 제어 방출 및 지속 방출 시스템(두 시스템 모두 투여 회수의 많은 감소를 가져온다)에서 유용하다. 제어 방출 및 지속 방출 시스템은 피하 투여되는 것이 더욱더 바람직하다. 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니지만, 유용한 제어 방출 시스템 및 조성물의 예로는 하이드로겔, 유성 겔, 액체 결정, 폴리머 미셸, 마이크로스피어, 나노입자가 있다.
본 발명의 조성물에 유용한 제어 방출 시스템의 제조 방법은, 제한되지는 않지만, 결정화, 응축, 공-결정화, 침전, 공-침전, 유화, 분산, 고압균질화, 캡슐화, 분무 건조, 마이크로캡슐화, 코아세르베이션, 상 분리, 용매 증발에 의한 마이크로스피어 제조, 추출 및 초임계 유체 과정을 포함한다. Handbook of Pharmaceutical Controlled Release(Wise, D. L., ed. Marcel Dekker, New York, 2000) 및 Drug and the Pharmaceutical Sciences vol. 99: Protein Formulation and Delivery (MacNally, E. J., ed. Marcel Dekker, New York, 2000)를 일반적으로 참조한다.
비경구 투여는 주사기, 선택적으로는 펜-형 주사기에 의한 피하, 근육내, 복강내 또는 정맥내 주사에 의해서 수행될 수 있다. 또는 달리, 비경구 투여는 주입 펌프에 의해서 수행될 수 있다. 추가의 옵션은 코 또는 폐 스프레이 형태로 항체 화합물을 투여하기 위한 용액 또는 현탁액일 수 있는 조성물이다. 또 다른 옵션으로서, 본 발명의 항체를 함유하는 제약 조성물은 또한, 예를 들어 바늘 없는 주사에 의한 또는 패치, 선택적으로 이온-토포레시스 패치로부터의 경피 투여, 또는 경점막, 예를 들어 협측 투여에 적합하게 될 수 있다.
항체는 폐 약물 송달에 적합한 공지된 타입의 장치를 사용하여 용액, 현탁액 또는 건조 분말로서 비히클 중에서 폐 경로에 의해 투여될 수 있다. 이들의 예는, 제한되지는 않지만, 폐 약물 송달을 위한 세 가지 일반적 타입의 에어로졸-생성으로 이루어지며, 제트 또는 초음파 분무기, 계량 용량 흡입기, 또는 건조 분말 흡입기를 포함할 수 있다(Yu J, Chien YW. Pulmonary drug delivery: Physiologic and mechanistic aspects. Crit Rev Ther Drug Carr Sys 14(4) (1997):395-453 참조).
표준화된 시험 방법에 기초하면, 입자의 공기역학 직경(da)은 단위 밀도(1g/㎤)의 기준 표준 구형 입자의 기하 등가 직경으로서 정의된다. 가장 단순한 경우로서, 구형 입자에 대한 da는 아래 설명된 대로 밀도 비의 제곱근의 함수로서 기준 직경(d)과 관련된다:
Figure 112010041741204-pct00002
비-구형 입자에서는 이 관계에 변형이 생긴다(Edwards D.A., Ben-Jebria A., Langer R. "큰 다공성 흡입 입자를 사용한 폐 약물 송달에서의 최근 진보". J Appl Physiol 84(2) (1998):379-385 참조). 용어 "MMAD" 및 "MMEAD"는 본 분야에서 잘 설명되었고 공지되어 있다(Edwards D.A., Ben-Jebria A., Langer R. 참조, 공기역학적 입자 크기 분포의 중앙 값의 측정을 나타낸다; "큰 다공성 흡입 입자를 사용한 폐 약물 송달에서의 최근 진보" J Appl Physiol 84(2) (1998):379-385). 질량 중앙 공기역학 직경(MMAD)과 질량 중앙 유효 공기역학 직경(MMEAD)는 호환하여 사용되며, 통계학적 변수이고, 실제 모양, 크기 또는 밀도와는 무관하게 폐에 침착될 가능성과 관련하여 에어로졸 입자의 크기를 경험적으로 설명한다(Edwards D.A., Ben-Jebria A., Langer R. "큰 다공성 흡입 입자를 사용한 폐 약물 송달에서의 최근 진보" J Appl Physiol 84(2) (1998):379-385 참조). MMAD는 공기 중에서 입자 관성 거동을 측정하는 기기인 임팩터 측정값으로부터 일반적으로 계산된다.
다른 구체예에서, 제제는 분무화 같은 어떤 공지된 에어로졸화 기술에 의해 에어로졸화될 수 있으며, 이로써 10μm 미만, 더 바람직하게 1-5 μm, 가장 바람직하게 1-3μm의 에어로졸 입자의 MMAD가 달성된다. 바람직한 입자 크기는 단백질이 최적으로 흡수되는 폐 깊은 곳까지 약물을 송달하기 위한 가장 효과적인 크기에 기초한다(Edwards D.A., Ben-Jebria A., Langer A., "큰 다공성 흡입 입자를 사용한 폐 약물 송달에서의 최근 진보". J Appl Physiol 84(2) (1998):379-385 참조).
항체를 포함하는 폐 제제의 폐 심부 침착은 선택적으로 흡입 기술의 변형을 사용하여 더 최적화될 수 있는데, 제한되지는 않지만, 이들은 예를 들어 느린 흡입 유속(예를 들어, 30 L/분), 호흡 홀딩 및 액튜에이션 타이밍을 포함한다.
용어 "안정화된 제제"는 증가된 물리적 안정성, 증가된 화학적 안정성 또는 증가된 물리화학적 안정성을 가진 제제를 말한다.
본원에서 사용된 용어 단백질 제제의 "물리적 안정성"은 열-기계 스트레스에 항체가 노출되고 및/또는 소수성 표면 및 계면과 같은 안정하지 않은 계면 및 표면과 상호작용한 결과로서 항체가 생물학적으로 불활성인 및/또는 불용성인 응집물을 형성하려는 경향을 말한다. 수성 항체 제제의 물리적 안정성은 적합한 용기(예를 들어, 카트리지 또는 바이알)에 담은 제제를 다양한 시간 기간 동안 다양한 온도에서 기계/물리적 스트레스(예를 들어, 교반)에 노출한 후 육안조사 및/또는 탁도측정에 의해 평가된다. 제제의 육안조사는 암 배경에서 예리한 초점의 빛에서 수행된다. 제제의 탁도는 탁도의 순위를 매기는 육안 점수에 의해 특정되며, 예를 들어 0 내지 3의 규모이다(탁도를 나타내지 않는 제제는 육안 점수 0에 해당하고, 일광에서 육안 탁도를 나타내는 제제는 육안 점수 3에 해당한다). 제제는 그것이 일광에서 육안 탁도를 나타낼 때 항체 응집과 관련하여 물리적으로 불안정하다고 분류된다. 또는 달리, 제제의 탁도는 당업자에게 잘 알려진 간단한 탁도 측정에 의해 평가될 수 있다. 또한, 수성 항체 제제의 물리적 안정성은 항체의 입체구조적 상태에 대한 분광학적 제제 또는 프로브를 사용하여 평가될 수 있다. 프로브는 항체의 비-자생 컨포머에 우선적으로 결합하는 소 분자인 것이 바람직하다. 단백질 구조에 대한 소 분자 분광학적 프로브의 한 예는 티오플라빈 T이다. 티오플라빈 T는 아밀로이드 피브릴의 검출에 널리 사용되는 형광 염료이다. 피브릴, 및 아마도 또한 다른 단백질 입체구조의 존재하에, 피브릴 단백질 형태와 결합되었을 때 티오플라빈 T는 약 450nm에서 새로운 여기 최대를 일으키고, 약 482nm에서는 증진된 방출을 일으킨다. 결합되지 않은 티오플라빈 T는 이 파장에서 본질적으로 비-형광성이다.
다른 소 분자도 자생 상태에서 비-자생 상태로 단백질 구조 변화에 대한 프로브로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 단백질의 노출된 소수성 패치에 우선적으로 결합하는 "소수성 패치" 프로브가 있다. 소수성 패치는 일반적으로 자생 상태에서는 단백질의 3차 구조 내에 매립되지만, 단백질이 언폴딩되거나 변성되기 시작하면 노출된다. 이들 소 분자, 분광학적 프로브의 예로는 방향족 소수성 염료, 예를 들어 안트라센, 아크리딘, 페난트롤린 등이 있다. 다른 분광학적 프로브는 금속-아미노산 복합체, 예를 들어 페닐알라닌, 류신, 이소류신, 메티오닌 및 발린과 같은 소수성 아미노산의 코발트 금속 복합체 등이다.
여기 사용된 용어 항체 제제의 "화학적 안정성"은 자생 항체 구조와 비교하여 생물학적 효능이 적어지고 및/또는 면역원성 성질이 증가할 가능성을 가진, 화학적 변성 산물의 형성을 유도하는 항체 구조의 화학적 공유 변화를 말한다. 자생 항체의 타입 및 성질과 항체가 노출되는 환경에 따라서 다양한 화학적 변성 산물이 형성될 수 있다. 화학적 변성의 제거는 대부분 아마도 완전히 피할 수는 없으며, 당업자에게 잘 알려진 대로 항체 제제의 보관 및 사용 도중에 화학적 변성 산물의 증가가 주로 보인다. 대부분의 단백질은 글루타미닐 또는 아스파라기닐 잔기의 측쇄 아미드기가 가수분해되어 자유 카르복실산을 형성하는 과정인 탈아미드화의 경향을 나타낸다. 다른 변성 경로는 고 분자량 변형 산물의 형성을 포함하는데, 이 경우 둘 이상의 단백질 분자가 트랜스아미데이션 및/또는 디술피드 상호작용을 통해 서로 공유 결합되어 공유 결합된 다이머, 올리고머 및 폴리머 변성 산물이 형성된다(Stability of Protein Pharmaceuticals, Ahern. T.J. & Manning M. C, Plenum Press, New York 1992). 산화(예를 들어, 메티오닌 잔기의)도 화학적 변성의 다른 변형으로서 언급될 수 있다. 항체 제제의 화학적 안정성은 상이한 환경 조건에 노출한 후 다양한 시점에서 화학적 변성 산물의 양을 측정함으로써 평가될 수 있다(화학적 변성 산물의 형성은, 예를 들어 온도를 증가시킴으로써 주로 가속될 수 있다). 각 변성 산물의 양은 다양한 크로마토그래피 기술(예를 들어, SEC-HPLC 및/또는 RP-HPLC)을 사용하여 분자 크기 및/또는 전하에 따라서 변성 산물을 분리함으로써 주로 결정된다.
상기 개략된 대로 여기서 "안정화된 제제"는 증가된 물리적 안정성, 증가된 화학적 안정성, 또는 증가된 물리화학적 안정성을 가진 제제를 말한다. 일반적으로, 제제는 만료일에 도달할 때까지는 사용 및 보관 도중에 안정해야 한다(권장된 사용 및 보관 조건에 따를 때).
본 발명의 한 구체예에서, 항체를 포함하는 제약 제제는 6주 이상 이용하는 동안, 그리고 3년 이상 보관하는 동안 안정하다.
본 발명의 다른 구체예에서, 항체를 포함하는 제약 제제는 4주 이상 사용하는 동안, 그리고 3년 이상 보관하는 동안 안정하다.
본 발명의 다른 구체예에서, 항체를 포함하는 제약 제제는 4주 이상 사용하는 동안, 그리고 2년 이상 보관하는 동안 안정하다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 항체를 포함하는 제약 제제는 2주 이상 사용하는 동안, 그리고 2년 이상 보관하는 동안 안정하다.
또, 적합한 항체 제제는 다른 이미 개발된 치료용 모노클로날 항체를 사용한 경험을 시험함으로써 결정될 수 있다. 몇 가지 모노클로날 항체가 임상 상황에서 효과적이라고 나타났는데, 예를 들어 Rituxan(Rituximab), Herceptin(Trastuzumab) Xolair(Omalizumab), Bexxar(Tositumomab), Campath(Alemtuzumab), Zevalin, Oncolym, Humira 및 유사한 제제들이 본 발명의 항체와 함께 사용될 수 있다. 예를 들어, 모노클로날 항체는 9.0mg/mL 염화나트륨, 7.35mg/mL 나트륨 시트레이트 2수화물, 0.7mg/mL 폴리소르베이트 80 및 주사용 멸균수 중에서 IV 투여용으로 조제되어, 100mg(10mL) 또는 500mg(50mL) 일회용 바이알 안에 10mg/mL의 농도로 공급될 수 있다. pH는 6.5로 조정된다. 또는 달리, 항체는 히스티딘, 수크로오스 및 폴리소르베이트 80을 포함하는 용액으로 조제될 수 있다.
진단 용도
또한, 본 발명의 hNKG2D-항체는 치료용이 아닌 용도를 가진다. 예를 들어, 항-hNKG2D 항체는 NKG2D 단백질의 진단 분석에서, 예를 들어 특정 세포, 조직 또는 혈청에서의 발현을 검출하는데 또한 유용할 수 있다. 예를 들어, 항-hNKG2D 항체는 항-hNKG2D 치료를 위한 환자를 선택하는 분석에서 사용될 수 있다. 이러한 목적을 위하여, 항-hNKG2D 항체는 혈청 또는 조직 견본에서 hNKG2D의 존재를 분석하거나, NKG2D를 발현하는 CD4+ T 세포의 존재나, 또는 NKG2D를 발현하는 세포(예를 들어, NK 또는 CD4+ 또는 CD8+ T 세포)를 촉진하는 질환의 존재를 검사하는데 사용될 수 있다. 이러한 분석은, 예를 들어 혈중 가용성 MICA의 수준을 시험하는 분석과 조합될 수 있다(예를 들어, WO 2003089616(Spies et al.) 참조).
진단 용도를 위해서 항체는 전형적으로 검출가능한 부분으로 표지될 것이다. 많은 표지가 이용될 수 있으며, 이들은 일반적으로 다음 범주로 분류될 수 있다:
(a) 35S, 14C, 125I, 3H 및 131I 등의 방사선 동위원소. 예를 들어, Current Protocols in Immunology, Vol. 1 and 2, Coligen et al, Ed. Wiley-Interscience, New York, N. Y., Pubs. (1991)에 설명된 기술을 사용하여 방사선 동위원소로 항체가 표지될 수 있고, 섬광 계수를 이용하여 방사선 활성이 측정될 수 있다.
(b) 형광 표지, 예를 들어 희토류 킬레이트(유로퓸 킬레이트) 또는 플루오레세인 및 그것의 유도체, 로다민 및 그것의 유도체, 단실, 리사민, 피코에리트린 및 텍사스 레드가 이용될 수 있다. 예를 들어, Current Protocols in Immunology(상동)에 설명된 기술을 사용하여 형광 표지가 항체에 콘쥬게이트될 수 있다. 형광은 형광계를 사용하여 정량될 수 있다.
(c) 다양한 효소-기질 표지가 이용될 수 있으며, U.S. Pat. No. 4,275,149에서 이들의 일부에 대해 검토한다. 효소는 일반적으로 발색단 기질의 화학적 변경을 촉매하며, 이것은 다양한 기술을 이용하여 측정될 수 있다. 예를 들어, 효소는 기질에서 색 변화를 촉매할 수 있고, 이것은 분광광도계로 측정될 수 있다. 또는 달리, 효소는 기질의 형광이나 발광을 변경시킬 수 있다. 형광의 변화를 정량하는 기술은 상기 설명된다. 발광 기질은 화학 반응에 의해서 전자적으로 여기되고, 그 다음 측정될 수 있는(예를 들어, 발광계를 사용하여) 광이 방출되거나, 또는 형광 어셉터에 에너지가 가해진다. 효소 표지의 예는 루시페라제(예를 들어, 개똥벌레 루시페라제 및 박테리아 루시페라제; U.S. Pat. No. 4,737,456), 루시페린, 2,3-디히드로프탈라진디온, 말레이트 탈수소효소, 유레아제, 퍼옥시다제, 예를 들어 양고추냉이 퍼옥시다제(HRPO), 알칼리성 포스파타제, 베타-갈락토시다제, 글루코아밀라제, 리소자임, 당 옥시다제(예를 들어, 글루코오스 옥시다제, 갈락토오스 옥시다제 및 글루코오스-6-포스페이트 탈수소효소), 이환 옥시다제(예를 들어, 유리카제 및 크산틴 옥시다제), 락토퍼옥시다제, 마이크로퍼옥시다제 등을 포함한다. 효소와 항체를 콘쥬게이션하는 기술은 O'Sullivan et al., "효소 면역분석에서 사용되는 효소-항체 콘쥬게이트의 제조 방법", Methods in Enzym.(Ed., J. Langone & H. Van Vunakis), Academic Press, New York, 73:147-166 (1981)에 설명된다.
효소-기질 조합의 예는, 예를 들어 다음을 포함한다:
(i) 기질로서 수소 퍼옥시다제를 가진 양고추냉이 퍼옥시다제(HRPO), 수소 퍼옥시다제가 염료 전구체(예를 들어, 오르토페닐렌 디아민(OPD) 또는 3,3',5,5'-테트라메틸 벤지딘 염산염(TMB))를 산화시킨다;
(ii) 발색단 기질로서 파라니트로페닐 포스페이트를 가진 알칼리성 포스파타제(AP); 및
(iii) 발색단 기질(예를 들어, p-니트로페닐-베타-D-갈락토시다제)을 가진 베타-D-갈락토시다제(베타-D-Gal) 또는 형광 기질 4-메틸움벨리페릴-p-베타-갈락토시다제
당업자는 많은 다른 효소-기질 조합을 이용할 수 있다. 이들에 대한 일반적인 검토는 U.S. Pat. No. 4,275,149 및 4,318,980을 참조한다.
때로 표지는 항체에 간접적으로 콘쥬게이션된다. 당업자는 이것을 달성하는 다양한 기술을 알고 있을 것이다. 예를 들어, 항체가 바이오틴에 콘쥬게이션될 수 있고, 상기 언급된 세 가지 광범한 표지 범주 중 어느 것이 아비딘과 콘쥬게이션되거나, 또는 그 반대로도 될 수 있다. 바이오틴은 선택적으로 아비딘과 결합하며, 이로써 표지가 이런 간접적인 방식으로 항체와 콘쥬게이션될 수 있다. 또는 달리, 표지와 항체의 간접 콘쥬게이션을 달성하기 위해서, 항체가 작은 합텐(예를 들어, 디곡신)과 콘쥬게이션되고, 상기 언급된 상이한 타입의 표지 중 하나가 항-합텐 항체(예를 들어, 항-디곡신 항체)와 콘쥬게이션된다. 이에 따라, 표지와 항체의 간접 콘쥬게이션이 달성될 수 있다.
본 발명의 다른 구체예에서, 항-NKG2D 항체는 표지될 필요가 없으며, 그것의 존재가 NKG2D 항체와 결합하는 표지된 2차 항체를 사용하여 검출될 수 있다.
본 발명의 항체는 경합-결합 분석, 직접 및 간접 샌드위치 분석, 및 면역침전 분석과 같은 어떤 공지된 분석 방법에서 사용될 수 있다. Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, pp. 147-158(CRC Press, Inc. 1987).
면역조직화학에서는 조직 샘플이 신선하거나 냉동될 수 있으며, 또는 파라핀에 포매되어 포르말린 등의 보존제와 함께 고정될 수도 있다.
항체는 또한 생체내 진단 분석에서도 사용될 수 있다. 일반적으로, 항체는, 예를 들어 핵자기공명이나 본 분야에 공지된 다른 수단에 의해 검출될 수 있는 방사선핵종 또는 비-방사선 활성 지시제로 표지된다. 바람직하게, 표지는 방사선 표지, 예를 들어 125I, 1311, 67Cu, 99mTc, 또는 111In이다. 표지된 항체는, 바람직하게 혈류를 통해 숙주에 투여되고, 숙주에서 표지된 항체의 존재 및 위치가 분석된다. 이런 영상화 기술은 신생물의 검출, 단계결정 및 치료에서 적합하게 사용된다. 방사선 동위원소는 금속-킬레이트 화합물 또는 락토퍼옥시다제, 또는 요오드화를 위한 요오드 발생 기술을 포함하는 어떤 수단에 의해서 단백질에 콘쥬게이션된다.
편의의 문제로서 본 발명의 항체는 키트, 즉 정해진 양의 시약과 진단 분석을 수행하기 위한 설명서의 포장된 조합으로 제공될 수 있다. 항체가 효소로 표지된 경우, 키트는 효소에 필요한 기질 및 보조인자를 포함할 것이다(예를 들어, 검출가능한 발색단 또는 형광단을 제공하는 기질 전구체). 이에 더하여, 안정제, 버퍼(예를 들어, 블록 버퍼 또는 세포용해 버퍼) 등과 같은 다른 첨가제도 포함될 수 있다. 다양한 시약의 상대적 양은 분석 감도를 실질적으로 최적화하는 시약의 용액 중 농도가 제공되도록 광범하게 변화될 수 있다. 특히, 시약은 부형제를 포함하는 건조 분말로서, 일반적으로는 동결건조되어 제공될 수 있으며, 용해시 적합한 농도를 가진 시약 용액을 제공할 것이다.
치료 용도
또, 여기 설명된 인간 또는 인간화된 항-hNKG2D 항체를 사용하여 환자를 치료하는 방법이 본 발명에 의해 제공된다. 한 구체예에서, 본 발명은 인간 환자에 투여하기 위한 제약 조성물의 제조에서 여기 설명된 인간 또는 인간화된 항체의 사용을 제공한다. 전형적으로, 환자는 자가면역 또는 염증 질환이나 장애를 앓고 있거나, 또는 위험을 가지고 있다.
예를 들어, 한 양태로서, 본 발명은 환자에게 인간 또는 인간화된 항-NKG2D 항체를 투여하는 단계를 포함하는, 치료를 필요로 하는 환자에서 NK 또는 T 세포의 hNKG2D-매개 활성화를 감소 또는 억제하는 방법을 제공하며, 이 항체는 NKG2D 수용체의 리간드-매개 활성화를 감소시키거나 방지한다. 한 구체예에서, 상기 방법은 증가된 NK 또는 T 세포 활성이 해로운 질환을 가진 환자에서 이러한 림프구의 활성을 감소시키도록 지시되며, 이러한 질환은 NK 또는 T 세포에 의한 세포용해에 민감한 세포에 의한 영향 또는 세포에 의해 야기된 영향을 수반하거나, 또는 자가면역 질환 또는 장애 또는 염증 상태와 같이, 증가된 NK 및/또는 T 세포 활성에 의해 야기되거나 이러한 것을 특징으로 한다. 한 양태에서, 본 발명은 환자에서 만성 염증을 감소시키는 방법을 제공한다.
본 발명의 폴리펩티드, 항체 및 다른 화합물로 치료될 수 있는 예시적인 조건 또는 장애는, 제한되지는 않지만, 전신 홍반성 루푸스, 류마티스성 관절염, 소아 만성 관절염, 건선성 관절염, 골관절염, 척추관절병증(강직성 척추염), 전신 경화증(경피증), 특발성 염증성 근육병증(피부근염, 다발성근염), 쇼그렌 증후군, 맥관염, 전신 맥관염, 측두동맥염, 죽상경화증, 사르코이드증, 중증 근무력증, 자가면역 용혈성 빈혈(면역 범혈구감소증, 발작성 야간 혈색소뇨증), 악성 빈혈, 자가면역 혈소판감소증(특발성 혈소판 감소성 자반증, 면역-매개 혈소판감소증), 갑상선염(그레이브병, 하시모토 갑상선염, 소아 림프구성 갑상선염, 위축성 갑상선염), 당뇨병, 면역-매개 신장질환(사구체신염, 세뇨관-간질성 신염, 자가면역 난소염), 자가면역 고환염, 자가면역 자궁염, 항인지질 증후군, 중추 및 말초 신경계의 탈수초성 질환, 예를 들어 특발성 탈수초성 다발신경병증 또는 길랑-바레 증후군, 및 만성 염증성 탈수초성 다발신경병증, 간담도계 질환, 예를 들어 감염성 간염(A, B, C, D, E 및 다른 비-간친화성 바이러스성 간염), 자가면역 만성 활성 간염, 바이러스성 간염, 원발성 담도 경화증, 육아종성 간염, 베게너 육아종, 베체트병, 및 경화성 담관염, 염증성 장 질환, 예를 들어 궤양성 대장염 또는 크론병, 셀리악병, 글루텐-과민성 장질환, 및 휘플병, 자가면역 또는 면역-매개 피부 질환, 예를 들어 수포성 피부 질환, 다형 홍반 및 접촉성 피부염, 포진상 피부염, 건선, 심상성 천포창, 백반증(백피증), 알레르기 질환, 예를 들어 천식, 알레르기성 비염, 아토피 피부염, 식품 민감성 및 두드러기, 폐의 면역 질환, 예를 들어 호산구성 폐렴, 특발성 폐 섬유증 및 과민성 폐렴, 만성 폐쇄성 폐질환, 및 이식거부 및 이식편대숙주병을 포함하는 이식 관련 질환을 포함한다.
예를 들어, 한 양태로서, 항-NKG2D 항체는 하나 이상의 다른 항염제와 조합하여 사용되며, 이러한 항염제는, 제한되지는 않지만, 진통제, 면역억제제(예를 들어, B- 또는 T-세포 길항제, 예를 들어 B-세포 고갈제 및 T-세포 억제제; 보체 억제제), 코르티코스테로이드, 및 항-TNF알파 제제 또는 다른 항-사이토카인 또는 항-사이토카인 수용체 제제 및 항-혈관형성 제제를 포함한다. 구체적인 예는 메토트렉세이트, TSG-6, Rituxan® 또는 다른 B-세포 요법, 항-IL12(p40) 항체, CTLA4-Fc 융합 단백질, IL-1-수용체 길항제, IL-1 항체, IL-15 항체, IL-18 항체 및 항-IL6R 항체를 포함한다. 조합 요법의 다른 예들이 아래 제공된다.
하나 이상의 다른 제제 또는 접근법이 본 발명의 치료법과 조합하여 사용될 때, 조합된 결과가 각 치료가 개별적으로 수행되었을 때 관찰된 효과가 부가된 것일 필요는 없다. 적어도 부가적인 효과가 일반적으로 바람직하지만, 단일 요법 중 하나를 능가하는 어떤 NKG2D 활성 감소나 다른 유리한 효과도 이점이 될 수 있다. 또한, 가능하며 유리하기는 할 테지만, 조합된 치료가 상승작용 효과를 나타내야할 필요도 없다. NKG2D-기반 치료는, 예를 들어 수분에서 수주 및 수개월 범위의 간격으로 다른 치료에 앞서서 또는 뒤따라서 일어날 수 있다. 또한, 항-NKG2D 조성물 또는 다른 제제의 1회를 넘는 투여가 이용되는 것도 생각된다. 제제들은 상호 교환하여 매일 교대로 또는 매주 교대로 투여될 수 있거나, 또는 항-NKGD 치료 사이클이 제공된 다음에, 다른 제제 요법의 사이클이 뒤따를 수 있다. 어떤 경우든 전부 필요한 사항은 투여 시간에 관계없이 치료상 유리한 효과를 발휘하는데 효과적인 조합된 양으로 두 제제를 송달하는 것이다.
다음에 본 발명의 항-hNKG2D 항체가 치료제로서 사용될 수 있는 일부 선택된 염증 및/또는 자가면역 질환 또는 장애를 설명한다. 바람직하게, 항-hNKG2D 항체는 전장 2가 MS 또는 21F2, 또는 그것의 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체이다.
류마티스 관절염
류마티스 관절염(RA)은 다-관절의 활막이 주로 포함되는 만성 전신 자가면역 염증 질환이며, 결과적으로 관절 연골이 손상된다. 병인은 T 림프구 의존적이며, 류마티스 인자인 자기 IgG에 대해 지시된 자가 항체의 생산과 관련되고, 결과적으로 관절 유체 및 혈액에 높은 수준에 이르는 면역 복합체가 형성된다. 관절에 존재하는 이러한 복합체는 활막에 림프구 및 단구의 현저한 침윤과 그에 따른 현저한 활막 변화를 유도할 수 있다. 관절 공간도 유사한 세포에 의해 침윤되고, 다수의 호중구가 추가된다. 병리적 T 세포는 다른 세포의 유인 및 활성화와 조직의 파괴에 더하여 사이토카인 및 다른 가용성 인자들을 생산한다. 침범된 조직은 주로 관절이며, 대개는 대칭적인 패턴이다. 그러나, 관절외 질환도 두 가지 주요 형태로 발생한다. 한 형태는 관절 질환이 계속 진행되고 있는 관절외 병소 및 폐 섬유증, 맥관염 및 피부 궤양의 전형적인 병소의 발생이다. 관절외 질환의 두 번째 형태는 소위 펠티 증후군이라고 하는데, 이것은 RA 질환 과정의 후기에, 때로는 관절 질환이 휴지 상태가 된 이후에 발생하고, 호중구감소증, 혈소판감소증 및 비장비대증의 존재를 수반한다. 이것은 다중 장기에서 맥관염을 동반할 수 있으며, 경색증, 피부 궤양 및 괴저가 형성된다. 또한, 환자는 주로 침범된 관절 위에 놓인 피하조직에서 류마티스 마디가 생길 수 있다. 마디 후기 단계는 혼합된 염증 세포 침윤물에 의해 둘러싸인 괴사성 중심을 가진다. RA에서 발생할 수 있는 다른 징후는 심낭염, 늑막염, 관상동맥염, 폐 섬유증을 동반한 간질성 폐렴, 건성 각결막염 및 류마티스 마디를 포함한다.
따라서, 한 양태로서, 본 발명은 류마티스 관절염(RA)의 치료 및/또는 예방 방법을 제공한다. 상기 방법은 RA를 가지거나 또는 RA가 발생할 실질적인 위험이 있다고 확인/진단된 환자에게 항-hNKG2D 항체의 유효량을 송달하는 단계를 포함하며, 이로써 RA가 치료 또는 예방된다. 항 양태에서, 항-NKG2D 항체는 RA의 승인된 모델에서 RA를 완화하는데 효과적인 것으로 나타났는데, 이것은 예를 들어 US 특허 No. 6414218 및 US 특허 공개 No. 20030005469에 설명된다(관련된 원리 및 모델은, 예를 들어 Wooley, P. H., Animal Models of Arthritis, eds. J. H. Klippel and P. A. Dieppe, Mosby Publishers (London), 1998; Erning et al., Arthritis Res, 4 Suppl 3:S133-40, 2002; Holmdahl et al., Ageing Res Rev, 1 (1):135-47, 2002; Anthony et al., Clin Exp Rheumatol, 17(2):240-4, 1999; Durie et al., Clin Immunol Immunopathol, 73(1):11-8, 1994; 및 Muller-Ladner et al., Drugs Today (Bare), 35(4-5):379-88, 1999에 설명된다). 추가 양태로서, 항체는 세포의 유의한 고갈 없이(예를 들어, 적합한 대조군과 비교하여 이러한 세포의 약 10% 이하의 감소를 야기), NKG2D-발현 백혈구의 리간드-유도 NKG2D 활성화를 검출 가능하게 감소시키고 및/또는 NKG2D+ T 세포 또는 NK 세포의 확장을 손상(예를 들어, 자가 반응성 CD8+ T 세포의 확장 및/또는 기능의 손상)시킬 수 있다(예를 들어, US 특허 공개 No. 20040115198에 설명된 적어도 일부의 항체와는 달리). 한 양태로서, 상기 방법은 RA의 치료 또는 예방과 부합되는 방식으로 하나 이상의 생체마커를 조정한다(예를 들어, 혈청 IL-6, TNF-α, IL-1, VEGF, TIFF R, IL-2R, shed CD4, shed CD8, 및/또는 C 반응성 단백질). 또 다른 양태로서, 상기 방법의 실시는 환자/숙주의 말초 관절의 활막 염증을 검출 가능하게 감소시킨다. 한 양태로서, 상기 방법은 환자 또는 숙주에서 방사선촬영 악화를 예방하고 신체 기능을 개선하는데, 이것은 예를 들어 환자 또는 숙주에서 방사선촬영 진행의 감소, 팽윤 및 약화된 관절의 감소(승인된 분석 기준에 의해 결정), 및/또는 유의하게 개선된 삶의 질(예를 들어, RA 건강 평가 질문지 상의 장애 점수의 감소에 의해 결정)에 의해서 나타난다. 항체는 단독으로 또는 하나 이상의 다른 항-RA 제제, 예를 들어 비-스테로이드계 항염제(NSAID), COX-2 억제제, 진통제, 코르티코스테로이드(예를 들어, 프레드니손, 히드로코르티손), 금, 면역억제제(예를 들어, 메토트렉세이트), B-세포 고갈제(예를 들어, Rituxan®), B-세포 작용제(예를 들어, LymphoStat-B®) 및 항-TNF알파 제제(예를 들어, Embrel®, Humira® 및 Remicade®), 항-IL1 수용체 길항제(예를 들어, Kineret®), 항-IL-15 항체, 또는 질환-변형 항류마티스제(DMARD)와 조합하여 사용될 수 있다.
탈수초성 질환
다발성 경화증(MS); 특발성 탈수초성 다발신경병증 또는 길랑-바레 증후군; 및 만성 염증성 탈수초성 다발신경병증을 포함하는 중추 및 말초 신경계의 탈수초성 질환은 자가면역에 기초한다고 생각되며, 올리고덴드로사이트나 미엘린에 직접 야기된 손상의 결과로서 신경 탈수초가 생간다. MS에서는 질환 유도 및 진행이 T 림프구에 의존한다는 것을 뒷받침하는 증거가 있다. MS는 T 림프구-의존성 탈수초성 질환이며, 재발-완화 과정이나 만성 진행 과정을 가진다. 병인은 불명이지만, 바이러스 감염, 유전적 소인, 환경 및 자가면역성이 모두 기여한다. 병소는 지배적으로 T 림프구 매개된, 미세아교세포의 침윤물과 침윤중인 대식세포를 함유하며, CE4+ T 림프구가 병소에서 우세한 세포 타입이다.
따라서, 또 다른 양태에서, 본 발명은 MS의 치료 및/또는 예방 방법을 제공한다. 상기 방법은 MS를 가지거나 MS가 발생할 실질적인 위험이 있다고 확인/진단된 인간 환자에게 항-hNKG2D 항체의 유효량을 송달하는 단계를 포함하며, 이로써 환자 또는 숙주에서 MS가 치료 또는 예방된다. 특정 양태로서, 항-NKG2D 모노클로날 항체는 세포의 유의한 고갈 없이 NKG2D-발현 백혈구의 리간드-유도 NKG2D 활성화를 검출 가능하게 감소시키고 및/또는 NKG2D+ T 세포의 확장을 손상시킬 수 있다. 항체는 단독으로 또는 다른 항-MS 제제, 예를 들어 Tyzabri®와 조합하여 사용될 수 있다.
염증성 장 질환
장에 존재하는 CD8+ T 세포에서 NKG2D는 CD28- 세포의 보조-자극인자로서 작용한다(Roberts et al., J Immunol 2001; 167:5527-30). 또한, 장의 염증(셀리악병)에서 NKG2D는 상향 조절되며, 장 상피 림프구가 NKG2D에 의해서 자극되어 사이토카인을 죽이고 생산한다(Hue et al., Immunity 2004; 21:367-77; Meresse et al, Immunity 2004; 21:357-66). 추가로, 장 염증 동안 주로 발견되는 IL-15는 장 상피 림프구 상의 NKG2D를 상향 조절한다(Roberts et al., J Immunology 2001; 167: 5527-30). 또한, 장 염증 동안 NKG2D의 리간드인 MICA가 상향 조절된다(Meresse et al., 상동, Hue et al., 상동). NKG2D는 또한 크론병을 가진 환자의 전염증성 림프구 상에서 상향 조절된다(Allez et al., 16차 유럽 면역학 회의(ECI2006)에서 발표, 9월 6-9일, 2006; 프랑스 파리).
따라서, 또 다른 양태로서, 본 발명은 크론병 또는 궤양성 대장염과 같은 염증성 장 질환(IBD)의 치료 및/또는 예방 방법을 제공한다. Kjellev et al.(Eur J Immunol 2008;37:1397-1406)에 의해 밝혀진 대로, 조기 항체 요법에 의한 NKG2D-수용체 기능의 억제는 대장염 동물 모델인 SCID 마우스에서 트랜스퍼-유도 대장염을 약화시켰다.
염증성 장 질환의 치료 방법은 IBD를 가지거나 또는 IBD가 발생할 실질적인 위험이 있다고 확인/진단된 인간 환자에게 항-NKG2D 항체의 유효량을 송달하는 단계를 포함하며, 이로써 환자에서 IBD가 치료 또는 예방된다. 특정 양태에서, 본 발명의 IBD 치료/예방 방법은 세포의 유의한 고갈 없이 NKG2D-발현 백혈구의 리간드-유도 NKG2D 활성화를 검출 가능하게 감소시키고 및/또는 NKG2D+ T 세포 또는 NK 세포의 확장을 손상시킬 수 있는 항-NKG2D 모노클로날 항체의 사용에 의해 실행된다. 항체는 단독으로 또는 다른 항-IBD 제제, 예를 들어 메살아민을 함유하는 약물(술파살라진 및 5-아미노살리실산(5-ASA)를 함유하는 다른 제제, 예를 들어 올살라진 및 발살라지드를 포함), 비-스테로이드계 항염제(NSAID), 진통제, 코르티코스테로이드(예를 들어, 프레드니손, 히드로코르티손), TNF-억제제(아딜리뮤맵(Humira®), 에타네르셉트(Enbrel®) 및 인플릭시맵(Remicade®)을 포함), 항-IL12 항체, 면역억제제(예를 들어, 6-메르캅토퓨린, 아자티오프린 및 시클로스포린 A), 및 항생제와 조합하여 사용될 수 있다.
건선
건선은 T 림프구-매개 염증 질환이다. 병소는 T 림프구, 대식세포 및 항원 가공 세포, 및 일부 호중구의 침윤물을 함유한다.
따라서, 다른 양태에서, 본 발명은 건선의 치료 및/또는 예방 방법을 제공한다. 상기 방법은 건선을 가지거나 또는 건선이 발생할 실질적인 위험이 있다고 확인/진단된 인간 환자에게 항-hNKG2D 항체의 유효량을 송달하는 단계를 포함하며, 이로써 환자에서 건선이 치료 또는 예방된다. 더 특정한 양태에서, 제제는 세포의 유의한 고갈 없이 NKG2D-발현 백혈구의 리간드-유도 NKG2D 활성화를 검출 가능하게 감소시킬 수 있고 및/또는 NKG2D+ T 세포 또는 NK 세포의 확장을 손상시킬 수 있는 항-NKG2D 모노클로날 항체이다. 항체는 단독으로 또는 하나 이상의 다른 항-건선 치료, 예를 들어 광요법, 국소요법(예를 들어, 타르, 국소 글루코코르티코이드), 또는 전신 요법(예를 들어, 메토트렉세이트, 합성 레티노이드, 시클로스포린), 항-TNF알파 제제(예를 들어, Embrel®, Humira®, Remicade®), T-세포 억제제(예를 들어, Raptiva®), 비타민 D 유사체, p38 미토겐-활성화 단백질 키나제(MAPK) 억제제, 및 Rituxan®과 같은 생물 제제와 조합하여 사용될 수 있다.
건선성 관절염
건선성 관절염은 피부, 관절, 건, 인대 및 근막 삽입 부위를 침범한 만성 염증성 관절염 상태이며, 일반적으로 건선과 관련된다(건선 환자의 약 7%에서 건선성 관절염이 발생한다). 많은 증거가 T-세포-매개 과정이 건선성 관절염의 병인을 유도한다는 것을 뒷받침한다. 단구도 건선성 관절염에서 역할을 하는데, 건선성 관절염 환자 관절의 파괴적 변화를 매개할 수 있는 바탕질 메탈로프로테이나제의 생성을 초래한다. 또한, NK 세포도 침범된 관절에서 발견되는데, 이는 질환 병인에서의 역할을 시사한다.
따라서, 다른 양태로서, 본 발명은 건선성 관절염의 치료 및/또는 예방 방법을 제공한다. 상기 방법은 건선성 관절염을 가지거나 또는 건선성 관절염이 발생할 실질적인 위험이 있다고 확인/진단된 인간 환자에게 항-hNKG2D 항체의 유효량을 송달하는 단계를 포함하며, 이로써 환자에서 건선성 관절염이 치료 또는 예방된다. 더 특정한 양태에서, 제제는 세포의 유의한 고갈 없이 NKG2D-발현 백혈구의 리간드-유도 NKG2D 활성화를 검출 가능하게 감소시킬 수 있고 및/또는 NKG2D+ T 세포 또는 NK 세포의 확장을 손상시킬 수 있는 항-NKG2D 모노클로날 항체이다. 항체는 하나 이상의 다른 항-건선성 관절염 치료제, 예를 들어 비-스테로이드계 항염제(아스피린, 이부프로펜), 메토트렉세이트, 합성 레티노이드, 시클로스포린, 코르티코스테로이드, 항-TNF알파 제제(예를 들어, Embrel®, Humira®, Remicade®)와 조합하여 또는 단독으로 사용될 수 있다.
전신 홍반성 루프스
전신 홍반성 루프스(SLE)에서 질환의 중심적인 매개인자는 자기 단백질/조직에 대한 자가-반응성 항체의 생산과 그에 따른 면역-매개 염증의 발생이다. 항체는 직접 또는 간접적으로 조직 손상을 매개한다. T 림프구가 조직 손상에 직접 연관된다고 밝혀지지는 않았지만, T 림프구는 자가-반응성 항체의 발생에 필요하다. 따라서, 이 질환의 발생은 T 림프구 의존적이다. 신장, 폐, 근골격계, 점막, 눈, 중추신경계, 심혈관계, 위장관, 골수 및 혈액을 포함하는 다중 장기 및 시스템이 임상적으로 침범된다.
따라서, 다른 양태로서, 본 발명은 SLE의 치료 및/또는 예방 방법을 제공한다. 상기 방법은 SLE를 가지거나 또는 SLE가 발생할 실질적인 위험이 있다고 확인/진단된 인간 환자에게 항-hNKG2D 항체의 유효량을 송달하는 단계를 포함하며, 이로써 환자에서 SLE가 치료 또는 예방된다. 더 특정한 양태에서, 제제는 세포의 유의한 고갈 없이 NKG2D-발현 백혈구의 리간드-유도 NKG2D 활성화를 검출 가능하게 감소시킬 수 있고 및/또는 NKG2D+ T 세포 또는 NK 세포의 확장을 손상시킬 수 있는 항-NKG2D 모노클로날 항체이다. 항체는 단독으로 또는 다른 항-SLE 제제, 예를 들어 비-스테로이드계 항염제(NSAID), 진통제, 코르티코스테로이드(예를 들어, 프레드니손, 히드로코르티손), 면역억제제(예를 들어, 시클로포스파미드, 아자티오프린 및 메토트렉세이트), 항말라리아제(예를 들어, 히드록시클로로퀸) 및 dsDNA 항체의 생산을 억제하는 생물 제제(예를 들어, LIP 394)와 조합하여 사용될 수 있다.
당뇨병
I형 당뇨병 또는 인슐린-의존성 당뇨병은 췌장섬 B 세포의 자가면역 파괴이다. 이런 파괴는 자기-항체 및 자가-반응성 T 세포에 의해 매개된다. 또한, 인슐린 또는 인슐린 수용체에 대한 항체가 인슐린-비-반응성의 표현형을 생성할 수 있다.
따라서, 다른 양태로서, 항-NKG2D 항체가 I형 당뇨병에 걸린 또는 I형 당뇨병이 발생할 실질적인 위험이 있는 환자에게 환자에서 이 상태를 치료 또는 예방하기에 충분한 조건에서 충분한 양으로 송달된다. 항체는 단독으로 또는 다른 항-당뇨병제, 예를 들어 인슐린, 또는 베타 세포 성장 또는 생존 인자, 또는 항-CD3 항체와 같은 면역조정 항체와 조합하여 사용될 수 있다.
이식
이식 거부 및 이식편대숙주병(GVHD)를 포함하는 이식 관련 질환은 T-림프구 의존성이며, T 림프구 기능의 억제가 질환을 완화한다.
따라서, 다른 양태로서, 본 발명은 이식 거부의 가능성을 감소시키는 방법을 제공한다(또는 이식 거부-관련 상태의 중증도를 감소시키거나 또는 개시까지의 시간을 연장하는, 즉 동종이식 생존을 연장하는). 상기 방법은 조직/기관 이식의 수여자가 될 예정이거나 또는 최근에 수여자가 되었던 인간 환자에게 항-hNKG2D 항체의 유효량을 송달하는 단계를 포함하며, 이로써 거부 가능성이 검출 가능하게 감소된다(예를 들어, 대조군과 비교하여). 특정 양태에서, 항-NKG2D 항체는 세포의 유의한 고갈 없이 NKG2D-발현 백혈구의 리간드-유도 NKG2D 활성화를 검출 가능하게 감소시킬 수 있고 및/또는 NKG2D+ T 세포 또는 NK 세포의 확장을 손상시킬 수 있다. 치료될 수 있는 조직 이식의 예는, 제한되지는 않지만, 간, 폐, 신장, 심장, 소장, 및 췌장섬 세포를 포함하며, 골수 이식과 이식편대숙주병(GVHD)의 치료에서도 사용된다. 항체는 단독으로 또는 이식 거부를 억제하기 위한 다른 제제, 예를 들어 면역억제제(예를 들어, 시클로스포린, 아자티오프린, 메틸프레드니솔론, 프레드니솔론, 프레드니손, 미코페놀레이트 모페틸, 시릴리무스, 라파마이신, 타크롤리무스), 항감염제(예를 들어, 아시클로비르, 클로트리마졸, 간시클로비르, 니스타틴, 트리메토프림술파른에톡사졸), 이뇨제(예를 들어, 부메타니드, 푸로세미드, 메톨라존) 및 궤양 약물(예를 들어, 시메티딘, 파모티딘, 란소프라졸, 오메프라졸, 라니티딘, 수크랄페이트)와 조합하여 사용될 수 있다. 조혈 이식에서는 조혈 성장인자(들)(예를 들어, 에리트로포이에틴, G-CSF, GM-CSF, IL-3, IL-11, 트롬보포이에틴 등) 또는 항균제(들)(예를 들어, 항생제, 항바이러스제, 항진균제)가 보조 요법으로서 투여될 수 있다.
기타 자가면역 또는 염증 질환
다른 양태로서, 본 발명은 다른 자가면역 또는 염증 질환 또는 장애의 치료 및/또는 예방 방법을 제공하며, 상기 방법은 이러한 질환 또는 장애를 가지거나 또는 이러한 질환 또는 장애가 발생할 실질적인 위험이 있는 것으로 확인/진단된 인간 환자에게 항-hNKG2D 항체의 유효량을 송달하는 단계를 포함하며, 이로써 환자에서 질환 또는 장애가 치료 또는 예방되며, 이 경우 질환 또는 장애는 하기 설명된 것이다. 더 특정한 양태에서, 제제는 세포의 유의한 고갈 없이 NKG2D-발현 백혈구의 리간드-유도 NKG2D 활성화를 검출 가능하게 감소시키고 및/또는 NKG2D+ T 세포 또는 NK 세포의 확장을 손상시킬 수 있는 항-NKG2D 모노클로날 항체이다. 항체는 단독으로 또는 이러한 질환 또는 장애의 치료에 사용되는 하나 이상의 다른 치료제와 조합하여 사용될 수 있다.
소아 만성 관절염은 16세 미만에서 주로 시작되는 만성 특발성 염증 질환이다. 그것의 표현형은 RA와 일부 유사성을 가지며, 류마티스 인자 양성인 일부 환자는 소아 류마티스 관절염으로 분류된다. 이 질환은 소수관절형, 다수관절형 및 전신형의 세 가지 주요 카테고리로 하위 분류된다. 관절염은 중증일 수 있고, 전형적으로는 파괴적이며, 관절 교착과 성장 지연을 초래한다. 다른 징후는 만성 전포도막염 및 전신 아밀로이드증을 포함할 수 있다.
척추관절병증은 어떤 공통된 임상 특징과 HLA-B27 유전자 산물의 발현에 대해 공통된 관련성을 나타내는 일군의 장애이다. 이러한 장애에는 강직성 척추염, 라이터 증후군(반응성 관절염), 염증성 장 질환과 관련된 관절염, 건선 관련 척추염, 소아 발병 척추관절병증 및 미분화형 척추관절병증을 포함한다. 구별되는 특징은 척추염을 동반하거나 하지 않은 천장골염; 염증성 비대칭 관절염; HLA-B27과의 관련성(I형 MHC의 HLA-B 좌위의 혈청학적으로 정의된 대립형질); 안구 염증, 및 다른 류마티스 질환과 관련된 자가 항체의 부재를 포함한다. 이 질환의 유도에 가장 관련된 핵심 세포는 I형 MHC 분자에 의해 제시되는 항원을 표적으로 하는 세포인 CD8+ T 림프구이다. CD8+ T 세포는 I형 MHC 대립형질 HLA B27에 대해 마치 MHC I형 분자에 의해 발현된 외래 펩티드인 것처럼 반응할 수 있다. HLA-B27의 에피토프가 박테리아 또는 다른 미생물 항원성 에피토프를 의태할 수 있고, 따라서 CD8+ T 세포 반응을 유도한다는 가설이 있다.
전신 경화증(경피증)은 병인이 불명이다. 이 질환의 특이점은 피부의 경화인데, 이것은 활성 염증 과정에 의해 유도되는 듯하다. 경피증은 국소적이거나 전신적일 수 있다. 혈관 병소가 공통적으로 있고, 미세혈관의 내피세포 손상이 전신 경화증의 발생에서 일어나는 초기의 중요한 사건이며, 혈관 손상은 면역 매개될 수 있다. 면역학적 근거는 많은 환자에서 피부 병소의 단핵세포 침윤물의 존재와 항-핵 항체의 존재에 의해 수반된다. ICAM-1은 피부 병소의 섬유아세포의 세포 표면에서 대개 조절되지 않는데, 이는 이들 세포와 T 세포의 상호작용이 이 질환의 발병기전에서 역할을 할 수 있다는 것을 시사한다. 연루되는 다른 장기로는 위장관: 비정상 연동운동/이동을 가져오는 평활근 위축 및 섬유증; 신장: 작은 궁형 및 소엽 동맥에 영향을 미쳐서 신장 피질 혈류를 감소시키고, 단백뇨, 질소혈증 및 고혈압을 가져오는 집중적인 내피하 내막 증식; 골격근: 위축증, 간질 섬유증, 염증; 폐: 간질성 폐렴 및 간질성 섬유증; 및 심장: 수축대 괴사, 상처/섬유증이 있다.
피부근염, 다발근염 및 다른 것들을 포함하는 특발성 염증성 근육병증은 원인 불명의 만성 근육 염증 장애로서, 근육 약화를 가져온다. 근육 손상/염증은 주로 전신적이며 진행성이다. 대부분의 형태에서 자가 항체가 관련된다. 이들 근염-특이적 자가 항체는 단백질 합성에 수반되는 성분, 단백질 및 RNA의 기능에 대해 지시되어 이들을 억제한다.
쇼그렌 증후군은 면역-매개 염증과 뒤따르는 누선 및 땀샘의 기능 파괴로 인한 것이다. 이 질환은 염증성 연결조직 질환과 관련되거나 그에 수반될 수 있다. 이 질환은 작은 RNA-단백질 복합체인 Ro과 La 항원에 대한 자가 항체 생산과 관련된다. 병소는 건성 각결막염, 담즙성 간경변을 포함하는 다른 징후나 관련성을 동반한 구강건조증, 말초 또는 감각 신경병증, 및 촉지성 자반증을 포함한다.
전신 맥관염은 주된 병소가 염증과 뒤따르는 혈관 손상인 질환이며, 결과적으로 침범된 혈관이 공급되는 조직에서 허혈/괴사/변성이 초래되고, 일부 경우에는 결국 말단 장기 기능부전에 이르게 된다. 또한, 맥관염은 류마티스 관절염, 전신 경화증 등의 다른 면역-염증 매개 질환에 대한 2차 병소나 후유증으로서 발생할 수도 있으며, 특히 면역 복합체 형성과 관련된 질환에서 그러하다. 원발성 전신 맥관염 그룹의 질환은 전신 괴사성 맥관염: 결절다발동맥염, 알레르기성 혈관염 및 육아종, 다발혈관염; 베게너 육아종; 림프양 육아종; 및 거대세포 동맥염을 포함한다. 그외 맥관염으로는 점막피부 림프절 증후군(MLNS 또는 가와사키병), 분리된 CNS 맥관염, 베체트병, 폐쇄혈전혈관염(버거씨병) 및 피부 괴사성 맥관염이 있다. 나열된 맥관염 타입들의 대부분에 대한 병리 기전은 혈관벽에 면역글로불린 복합체의 침착과 뒤따르는 ADCC, 보체 활성화, 또는 이 둘 모두에 의한 염증 반응의 유도에 주로 기인한다고 생각된다.
사르코이드증은 신체의 거의 모든 조직에 유상피성 육아종의 존재를 특징으로 하는 원인 불명의 상태로서, 대부분 공통적으로 폐가 연루된다. 발병기전은 질환 부위에 활성화된 대식세포와 림프양 세포의 영속을 포함하며, 이들 세포 타입에 의해 방출된 국소 및 전신적 활성 산물의 방출로 인한 결과로서 만성적인 후유증이 뒤따른다.
자가면역 용혈성 빈혈, 면역 범혈구감소증 및 발작성 야간 혈색소뇨증을 포함하는 자가면역 용혈성 빈혈은 적혈구(그리고 일부 경우에는 혈소판을 포함하는 다른 혈액 세포) 표면에 발현된 항원과 반응하는 항체 생산의 결과이며, 보체 매개 세포용해 및/또는 ADCC/Fc-수용체 매개 기전을 통한 이들 항체 코팅된 세포의 제거를 반영한다.
혈소판감소 자반증, 및 다른 임상 환경의 면역-매개 혈소판감소증을 포함하는 자가면역 혈소판감소증에서는, 혈소판 파괴/제거가 항체 또는 보체가 혈소판에 부착되고, 이어서 보체 세포용해, ADCC 또는 Fc-수용체 매개 기전에 의해 제거되는 결과로서 발생한다.
그레이브병, 하시모토 갑상선염, 소아 림프구성 갑상선염, 및 위축성 갑상선염을 포함하는 갑상선염은 갑상선에 존재하며 주로 갑상선에 특이적인 단백질과 반응하는 항체를 생산하는 갑상선 항원에 대한 자가면역 반응의 결과이다. 자발적 모델: 래트(BUF 및 BB 래트) 및 닭(비만 닭 계통); 유도성 모델: 갑상선 마이크로솜 항원(갑상선 퍼옥시다제)인 티로글루불린에 의한 동물 면역화를 포함하는 실험 모델이 있다.
사구체신염 및 세뇨관 간질성 신염을 포함하는 면역 매개 신장 질환은 직접적으로는 신장 항원에 대한 자가반응 항체 또는 T 세포 생산의 결과로서 또는 간접적으로는 신장에 다른 비-신장 항원과 반응성인 항체 및/또는 면역 복합체의 침착의 결과로서, 신장 조직이 항체 또는 T 림프구 매개 손상된 결과이다. 따라서, 면역 복합체의 형성을 초래하는 다른 면역-매개 질환들도 간접적인 후유증으로서 면역 매개 신장 질환을 유도할 수 있다. 직접 및 간접 면역 기전은 모두 신장 조직에 병소 발생을 야기/유도하는 염증 반응을 초래하며, 그 결과 장기 기능이 손상되고, 일부 경우에는 신부전으로 진행되기도 한다. 체액성과 세포성 면역 기전이 모두 병소의 발병에 관련될 수 있다.
호산구성 폐렴, 특발성 폐 섬유증, 및 과민성 폐렴을 포함하는 염증성 및 섬유성 폐 질환은 조절되지 않는 면역-염증 반응을 수반할 수 있다. 이 반응의 억제가 치료상 이점을 가질 것이다.
수포성 피부 질환, 다형 홍반 및 접촉 피부염을 포함하는 자가면역 또는 면역-매개 피부 질환은 자가 항체에 의해 매개되며, 이 자가 항체의 발생은 T 림프구 의존성이다.
천식, 알레르기성 비염, 아토피 피부염, 음식 과민성, 및 두드러기를 포함하는 알레르기성 질환은 T 세포 의존성이다. 이들 질환은 T 림프구 유도 염증, IgE 매개-염증 또는 이들의 조합에 의해 주로 매개된다.
인간 항-NKG2D 항체에 의한 치료에 적합한 다른 질환은 바이러스 간염이며, 이것은 WO 2007130642 및 Chen et al.(Hepatology, Vol. 46(3) pp. 706-715(2007))에서 설명된다.
NKG2D 조정제의 유효량은 물론 전체 투약량 섭생은 질환 및 환자의 임상 상태에 따라 변할 수 있으며, 임상 승인된 질환 점수와 같은 하나 이상의 임상 변수에 반영될 수 있다는 것이 이해될 것이다. 예를 들어, 류마티스 관절염에서, 질환 중증도 및/또는 치료 성과가 팽윤 관절 수; 통증; 이동성; 및/또는 공식 질환 점수인 ACR 20/50 또는 70을 모니터함으로써 평가될 수 있다. 1형 당뇨병에서는 질환 중증도 및/또는 치료 성과가 혈중 글루코오스 수준 또는 그것의 변형, HbIC 수준, 필요한 인슐린 양 등을 측정함으로써 평가될 수 있다. 다발성 경화증에서는 뇌 염증이 뇌의 스캐닝을 통해 평가될 수 있다. 조혈 이식 거부에서는 질환의 중증도(이식실패) 및/또는 치료 성과가 골수박멸형 전처치를 받은 환자에서는 호중구 감소증, 혈소판 감소증, 및 적혈수 수혈 의존도의 연장에 대한 증거에 의해, 그리고 골수박멸형 전처치를 받지 않은 환자에서는 키메라 현상 관찰 실패에 의해 평가될 수 있다. 일반적으로, 본 발명의 방법 및 조성물을 사용했을 때의 치료 성과에 대한 검출가능한 효과는 다른 치료의 필요성 감소(예를 들어, 다른 약물 또는 치료의 양 및/또는 기간의 감소), 입원 회수 및/또는 기간의 감소, 병으로 인한 근무일 손실의 감소 등을 포함한다. 값들의 행렬을 구성하고, 이 행렬 내의 상이한 지점들을 시험함으로써 당업자에 의해 통상의 실험에 따라 유효량이 결정될 수 있다는 것이 또한 이해될 것이다.
투약량
항체의 투여를 위해서, 투약량은 숙주 체중 kg당 약 0.0001 내지 100 mg/kg, 더 일반적으로는 0.01 내지 5 mg/kg 범위이다. 예를 들어, 투약량은 약 0.3 mg/kg 체중, 약 1 mg/kg 체중, 약 3 mg/kg 체중, 약 5 mg/kg 체중 또는 약 10 mg/kg 체중이거나, 또는 1-10 mg/kg 범위 내일 수 있다. 예시적인 치료 섭생은 매주 2회, 매주 1회, 2주 마다 1회, 3주 마다 1회, 4주 마다 1회, 매월 1회, 3개월 마다 1회 또는 3 내지 6개월 마다 1회의 투여를 수반한다. 본 발명의 항-hNKG2D 항체의 바람직한 투약량 섭생은 정맥내 투여 또는 피하 주사를 통한 약 1, 3 또는 10 mg/kg 체중을 포함하며, 이때 항체는 (i) 2-4 투약량에 대해 1-3주 마다, 그 후 2개월 마다 용량 로딩; (ii) 4주마다; (iii) 매주, 또는 어떤 다른 최적 투약의 투약 일정 중 하나를 사용하여 제공된다. 어떤 방법에서, 상이한 결합 특이성을 가진 둘 이상의 모노클로날 항체가 동시에 투여되며, 이 경우 투여되는 각 항체의 투약량은 나타낸 범위 내이다. 항체는 일반적으로 여러 번 투여된다. 단일 투약량 사이의 간격은, 예를 들어 매주, 매월, 3개월 마다 또는 매년일 수 있다. 또한, 간격은 환자에서 표적 항원에 대한 항체의 혈중 수준을 측정함으로써 지시되는 대로 불규칙할 수 있다. 어떤 방법에서, 투약량은 약 1-1000㎍/mL의 혈장 항체 농도, 어떤 방법에서는 약 25-300 ㎍/mL의 혈장 항체 농도를 달성하도록 조정된다. 또는 달리, 항체는 지속 방출 제제로서 투여될 수 있으며, 이 경우 더 낮은 투여 빈도가 요구된다. 투약량 및 빈도는 환자에서의 항체 반감기에 따라 변한다. 일반적으로, 인간 항체가 가장 긴 반감기를 나타내고, 그 뒤로 인간화된 항체, 키메라 항체 및 미-인간 항체 순서이다. 투약량과 투여 빈도는 치료가 예방적인지 비-예방적인지(예를 들어, 완화적 또는 치유적)인 지의 여부에 따라 변할 수 있다. 예방적 용도에서는 비교적 낮은 투약량이 장기간에 걸쳐 비교적 긴 간격으로 투여된다. 일부 환자는 생존 기간 동안 치료를 계속 받는다. 완화적 또는 치유적 용도에서는 질환의 진행이 감소 또는 종료될 때까지, 아마도 환자가 질환 증상의 부분적 또는 완전한 개선을 나타낼 때까지 때로 비교적 높은 투약량이 비교적 짧은 간격으로 요구된다. 그 후 환자는 예방적 섭생으로 투여될 수 있다.
항염제의 적합한 용량은 임상 요법에서 이미 사용되고 있는 것과 비슷할 것이며, 항염제는 단독으로 다른 제제와 조합하여 투여된다. 치료될 상태에 용량이 변동될 수 있을 것이다. 치료제를 투여하는 의사가 각 환자별로 적합한 용량을 결정할 수 있을 것이다.
제조 물품
본 발명의 다른 구체예에서, 상기 개시된 장애의 치료에 유용한 물질을 함유하는 제조 물품이 제공된다. 예를 들어, 제조 물품은 유효량의 항체로 인간의 자가면역 또는 염증 질환 또는 장애와 같은 장애를 치료할 수 있도록 사용자에게 지시하는 설명서와 함께, 여기 설명된 인간 또는 인간화된 항-hNKG2D 항체를 용기를 포함할 수 있다. 제조 물품은 전형적으로 용기와 용기에 결합된, 또는 용기 위의 라벨이나 패키지 삽입물을 포함한다. 적합한 용기는, 예를 들어 병, 바이알, 주사기 등을 포함한다. 용기는 유리나 플라스틱 같은 여러 가지 재료로 형성될 수 있다. 용기는 상태를 치료하기 위한 효과적인 조성물을 보유하며, 멸균 접근구를 가질 수 있다(예를 들어, 용기는 피하 주사바늘에 의해 뚫릴 수 있는 마개를 가진 정맥내 용액 백 또는 바이알일 수 있다). 조성물 중의 적어도 하나의 활성제는 여기 설명된 인간 또는 인간화된 항-hNKG2D 항체, 또는 이러한 항체를 포함하는 항원-결합 단편 또는 항체 유도체(예를 들어, 면역콘쥬게이트)이다. 라벨이나 패키지 삽입물은 조성물이 류마티스 관절염과 같은 선택된 상태를 치료하는데 사용된다는 것을 나타낸다.
또한, 제조 물품은 (a) 본 발명의 인간 또는 인간화된 항체를 포함하는 조성물이 담긴 제 1 용기, 및 (b) 인간 또는 인간화된 항체 이외의 다른 치료제를 포함하는 조성물이 담긴 제 2 용기를 포함할 수 있다. 본 발명의 이 구체예에서, 제조 물품은 제 1 및 제 2 조성물이 자가면역 또는 염증 질환 또는 장애를 치료하기 위해 조합하여 사용될 수 있음을 나타내는 패키지 삽입물을 더 포함할 수 있다. 이러한 치료제는 앞 단락에 설명된 부가 치료제 중 어느 것일 수 있다. 다른 면에서 또는 추가로, 제조 물품은 주사용 멸균수(BWFI), 포스페이트-완충 식염수, 링거액 및 덱스트로스 용액과 같은 제약학적으로 허용되는 버퍼를 포함하는 제 2(또는 제 3) 용기를 더 포함할 수 있다. 그것은 다른 버퍼, 희석제, 필터, 바늘, 및 주사기를 포함하여, 상업적 및 사용자 관점에서 다른 물체를 더 포함할 수도 있다.
실시예
본 발명의 더 상세한 내용이 다음의 비제한적 실시예에 의해 예시된다.
실시예 1: hNKG2D 에 대한 사람 단일클론 항체의 발생 및 초기 스크리닝
재료 및 방법
항원. 세포(NK, BAF, 또는 CHO)의 표면 상에서 발현되는 가용성 NKG2D-hFc 융합 단백질 (R&D, cat: 1299-NK) 또는 NKG2D를 면역화를 위한 항원으로서 사용하였다. BAF 세포는 전장 NKG2D과 DAP10으로 동시-트랜스펙션되었다. CHO 세포는 DAP10 없이 세포 표면으로 수송되는 NKG2D 점돌연변이로 트랜스펙션되었다 (Wu et al., Science 1999;385:730-2). NK 세포는 자연적으로 NKG2D를 발현하는 1차 NK 세포였다.
마우스. NKG2D에 대한 사람 단일클론 항체는 사람 항체 유전자를 발현하는 트랜스제닉 마우스의 KM mouse™ 균주에서 완전히 생성되었다 (PCT 공보 WO 02/43478, lshida et al.). 이 마우스 균주에서, 내인성 카파 경쇄 유전자는 Chen et al (1993) EMBO J. 12:811-820에 설명된 바와 같이 동종접합으로 분열되었고, 내인성 마우스 중쇄는 PCT 공보 WO 01/09187의 실시예 1에서 Humab 마우스에 대하여 설명된 바와 같이 동종접합으로 분열되었다. 마우스 균주는 Fishwild et al (1996) Nature Biotechnology 14:845-851에 설명된 바와 같이 사람 카파 경쇄 이식유전자, KC05를 보유한다. 마우스 균주는 또한 WO0243478에 설명된 바와 같이 사람 중쇄 트랜스염색체, SC20를 보유한다.
면역화. 제1 면역화 시리즈에서, 동물들은 보조제와 함께 또는 보조제 없이 NKG2D-트랜스펙션된 BAF 세포 및 NKG2D-트랜스펙션된 CHO 세포, 또는 1차 사람 NK 세포의 교대 주입으로 복강내 면역화되었다. 각 마우스는 매주 또는 격주로 5x106 세포로 IP 면역화되었다(총 6회). 마우스는 희생 및 비장 제거 3일 및 2일 전에 5x106 NKG2D-트랜스펙션된 BAF 세포로 정맥으로 부스팅되었다. 덴마크 국가 조사 위원회 가이드 라인에 따라 동물 실험을 행하였다.
제2 면역화 시리즈에서, 동물들은 상이한 보조제와 함께 NKG2D-hFc으로 복강내 및 발 경로로 면역화되었다. 각 마우스는 7 x 25ug NKG2F-hFc/Ribi/ip/sc, 1 x 25ug NKG2D-hFc/CFA/ip/sc, 1 x 25ug NKG2D-hFc/IFA/ip/sc, 1 x 30ug 항-CTLA4 + 40ug NKG2D-hFc/IFA/ip/sc, 1 x 25ug NKG2D- hFc/Ribi/ip/sc 및 부스팅된 2 x 30ug/PBS/ip/iv으로 희생 및 비장 제거 3일 및 2일 전에 면역화된었다. 미국 국가 조사 위원회 가이드라인에 따라 동물 실험을 행하였다.
마우스 혈청의 스크리닝. 실시예 3에 설명된 바와 같이, 면역화된 마우스로부터의 혈청을 NKG2D-특이성에 대하여 유세포 측정 분석에 의해 스크리닝하고, 선택한 혈청을 또한 그들의 MICA 리간드의 결합을 상쇄하는 능력에 대하여 테스트하였다. NKG2D와 특이적으로 결합하고 MICA 결합을 상쇄하는 항체의 높은 역가를 발생시킨 마우스를 하이브리도마 생성을 위해 선택하였다.
하이브리도마의 발생. 각 선택한 면역화된 마우스로부터의 비장을 균질화하고 비장세포의 단일 세포 현탁물을 사용하여 X61 Ag8653 골수종 세포에 융합하였다 (ATCC, CRL 1580). 이전에 설명된 바와 같이 폴리에틸렌글리콜(PEG)을 사용하여 융합을 행하였고 (Harlow and Lane, ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y., (1988)) The Cyto Pulse™ CEEF-50 전기융합 시스템 (Cyto Pulse Sciences, Inc.)을 사용하여 전기융합을 행하였다.
융합된 세포를 10% FBS 및 5% 기원(origin) (하이브리도마 복제 인자, BioVeris)가 보충된 선택적 DMEM HAT 배지에서 96-웰 조직 배양 플레이트에 처음으로 파종하였다. 상청액의 수확 및 스크리닝 전에 플레이트를 10-14일 동안 5% FBS 및 0.7% 기원이 보충된 DMEM HT 배지로 각각 1-2 배지 교환하여 배양하였다. 양성 테스트된 클론을 확장시키고 안정한 클론이 발생할 때까지 희석액을 제한함으로써 서브클로닝하였다. 선택한 클론을 FACS 분석에 의해 항-NKG2D 특이적 항체의 존재에 대하여, 그리고 MICA 결합을 상쇄하는 그들의 능력에 대하여 연속적으로 스크리닝하였다.
하이브리도마 상청액의 스크리닝. 직접 ELISA 또는 유세포 측정 분석 (FACS)을 사용하여 제1 면역화 시리즈로부터의 하이브리도마 상청액의 1차 스크리닝을 행하여 항-NKG2D 특이적 항체의 존재에 대하여 테스트하였다. 간단히 말해서, maxisorp 플레이트를 50 μl 0.4 μg/ml mFc-NKG2D (뮤린 Fc에 융합되고 CHO 세포에서 발현된 NKG2D의 세포외 부분을 포함)로 밤새 PBS에서 4℃에서 코팅한 다음 PBS, 0.05% Tween 20으로 15분 동안 실온에서 블로킹함으로써 ELISA를 행하였다. 이어서 플레이트를 50 μl 하이브리도마 상청액과 함께 인큐베이션하고, 산양-항-사람 IgG-HRP Fcγ 절편 특이적(Jackson, 109-036-098)을 사용하여 NKG2D-특이적 항체를 검출하였다. 이들 인큐베이션을 1시간 동안 실온에서 행하고, 각 단계 사이에 플레이트를 PBS, 0.05% Tween 20으로 세정하였다. 10Oμl TMB 기질 (Kem-En-Tec)을 사용하여 결합된 항체를 시각화하고, 4M H3PO4으로 정지하였다. 플레이트를 450 및 620 nm에서 판독하였다. FACS를 위해서, 50000 세포를 10 μl에서 90 μl 하이브리도마 상청액과 함께 30분 동안 4℃에서 인큐베이션한 후, PBS로 2% FCS와 함께 세정하고, 이어서 2차 산양-항-사람 IgG-HRP Fcγ 절편 특이적(Jackson, 109-036-098)과 함께 인큐베이션하여 NKG2D-발현 BaF/3 세포 및 NKG2D를 발현하지 않는 대조군 BaF/3 세포에 대한 결합을 분석하였다. 그 다음 세포를 B&D FACSArray (BD Biosciences)에서 분석하였다. NKG2D-발현 BaF/3 세포만을 착색하고 대조군 세포는 그렇지 않은 항체를 NKG2D-특이적으로 간주하였다.
제2 면역화 시리즈에 대한 1차 스크린은 항-NKG2D 특이적 항체의 존재에 대하여 테스트하기 위한 직접 ELISA이었다. 간단히 말해서, maxisorp 플레이트를 1-2 mg/ml hFc-NKG2D (R&D Systems)로 밤새 PBS에서 4℃에서 코팅한 다음 PBS, 0.05% Tween 20, 5% 닭의 혈청으로 30-60분 동안 실온에서 블로킹함으로써 ELISA를 행하였다. 이어서 플레이트를 50 μl 하이브리도마 상청액 및 50 μl 블로킹 완충액과 함께 인큐베이션하고, 산양-항-사람 IgG-HRP(Bethyl, A80-115P)를 사용하여 블로킹 완충액에서 NKG2D-특이적 항체를 검출하였다. 이들 인큐베이션을 1시간 동안 실온에서 행하고, 각 단계 사이에 플레이트를 PBS, 0.05% Tween 20으로 세정하였다. ABTS 기질을 사용하여 결합된 항체를 시각화하였다 (Moss Inc, product: ABTS-1000). 플레이트를 415 nm에서 Molecular Devices Software로 판독하였다.
ELISA 1차 스크린으로부터 선택된 하이브리도마를 상기 설명한 바와 같이 FACS를 사용하여 2차 스크린하였다.
시중에서 입수가능한 뮤린 항체 (149810 및 ON72)를 대조군으로서 사용하였다.
결과
면역화된 마우스로부터의 고도 선택적 혈청을 NKG2D-결합 및 리간드 블로킹 능력에 의해 식별하고(예시적 결과를 도 1A 및 1B에 나타냄), 선택한 마우스를 융합 및 하이브리도마 발생에 사용하였다. 약 2500 하이브리도마를 ELISA 및 유세포 분석 및 식별된 NKG2D-특이적 클론에 의해 스크리닝하였다. 도 2는 하이브리도마 상청액 중의 사람 항체가 시중의 항체 (149810)와 비교하여 NKG2D-발현 세포에 결합하였지만 NKG2D-음성 세포에는 그렇지 않았다는 것을 나타낸다. 제1 면역화 시리즈로부터의 3개의 하이브리도마로부터의 항체(16F16, 16F31 및 21F2), 및 제2 면역화 시리즈로부터의 여러 항체(MS 포함)를 재조합체 생성 및 다음 테스트를 위해 선택하였다.
실시예 2: 재조합체 생성 및 서열화
사람 항체를 발현하는 융합 마우스 비장으로부터 수백개의 하이브리도마의 제2 배치를 별도 라운드의 면역화(들)로부터 얻었다. 실시예 1에 설명된 것과 동일한 방식으로 FACS를 사용하여 NKG2D-특이성에 대하여 이들을 스크리닝하였다. 하나의 하이브리도마, MS로부터의 항체를 재조합체 생성 및 다음 테스트를 위해 선택하였다.
하이브리도마로부터의 mRNA의 PCR 및 후속의 분리된 생성물의 서열화에 의해 항체의 중쇄 및 경쇄의 가변 영역을 식별하였다.
재료 및 방법
RNA 정제. Qiagen으로부터의 RNeasy를 사용하여 과정으로부터 β-머르캅토에탄올을 생략한 것을 제외하고 제조자 지시에 따라 전체 RNA를 정제하였다. 광 분광학 (260/280 nm, 1.8 < 비율 <2.0)에 의해 RNA의 품질을 확인하고 때때로 바이오분석을 사용하여 RNA 열화를 평가하였다.
RT-PCR. SMART-RACE (Clonetech로부터의 키트)에 의해 전장 cDNA를 분석하였다.
PCR. Clonetech로부터의 HFII 폴리머라아제로 PCR을 행하였다. 보존 서열에 아닐링된 5' 프라이머 (EcoRI 포함)를 SMART-RACE 동안 도입하였다. 2개의 3' 프라이머는 IgG (VH) 및 카파쇄(VL)의 보존 영역에 각각 아닐링되도록 설계되었다. 또한 3' 프라이머에 제한 부위가 존재하였다(BsiWI(VL) 및 Nhel(VH)). 모든 VH 및 VL 증폭에 대하여 PCR을 중복하여 행하였다(PCR 도입된 돌연변이를 확인하기 위해서). 만약 PCR 반응이 실패하였다면, Novagen으로부터의 열화 5' 프라이머 믹스를 사용하여 VL 및 VH를 증폭하였다.
PCR 생성물 정제. PCR 생성물 (~ 550 bp)을 1% 아가로스 겔 상에서 분리하고, 절단하고, GFX 컬럼(Amersham으로부터) 상에서 정제하고, DNAse 부재 물에서 용리하였다.
라이게이션. PCR 생성물 및 발현 벡터(암피실린 내성)를 적절한 제한 효소 (VH, EcoRI + NheI 및 VL, EcoRI + BsiWI)로 절단하였다. 가변 도메인의 이소형-지시 벡터(NKG2D에 대하여 IgG4)로의 라이게이션은 T4-리가아제(Roche)에 의해 촉매된다. 사용한 플라스미드는 pTT5이었다(Durocher et al., Nucleic Acids Res 2002;30(2):e9; Pham et al., Biotechnol Bioeng 2003;84(3):332-42).
발현 벡터 내 삽입 확인(콜로니 PCR). 적격 E. coli (Top 10)를 라이게이션 믹스로 형질전환하고 암피실린 내성 클론을 밤새 선택하였다. VH 및 VL 모두에 대하여 총 8개 양성 콜로니가 선택되었다. 콜로니 PCR 및 겔 전기영동(1% 아가로스)을 통해서, 모든 콜로니를 예상한 크기에 맞는 삽입을 확인하였다.
서열화/미니프렙. 서열화를 위해 모든 양성 콜로니 PCR로부터의 분액을 제조하였다(ExoSAPit 사용). 각 클론에 대하여 총 32 PCR 생성물을 서열화하였다 ((8*VH+8*VL)*2 (PCR 중복)). 서열을 분석하고 (VectorNTI 사용), 클로닝된 VH 및 VL에 대응하는 양성 박테리아 클론을 스케일 향상시키고(미니/맥시프렙), DNA를 HEK293/6E 트랜스펙션을 위해 정제하였다 (GFX 컬럼). 하나 이상의 VH 및 VL 서열이 식별되면, 모든 가능한 VL과 VH 조합이 HEK293/6E 세포에서 발현되었다.
재조합체 생성. 중쇄 및 경쇄의 식별된 가변 영역을 각각 중쇄 및 경쇄 사람 IgG4 구조로 삽입하였고 HEK293 세포에서 두개의 벡터로부터 높은 수준으로 발현되었다. 항체는 단백질 A 컬럼에서 정제되었다.
HEK293/6E 세포에서의 항체 발현. HEK293 세포를 Gibco로부터의 Freestyle293 배지에서 계대배양하였다. 트랜스펙션 날에 세포를 1백만 세포/ml의 농도로 희석하였다. 30 ml 트랜스펙션을 위해서, 15 μg의 중쇄 벡터 및 15 μg의 경쇄 백터를 2 ml Opti-MEM 및 40 μl 293펙틴과 (그 다음 Freestyle293 배지를 30 ml의 총 부피로) 혼합하였다. 인큐베이션 6일 후, 세포를 원심분리(1000 rpm, 10 분)에 의해 펠릿화하고 상청액을 단백질 A 정제를 위해서 수확하였다.
정제. 사람 항체의 재조합 발현된 IgG4 변이체를 MabSelect™ SuRe 단백질-A 컬럼 상에서 정제하였다. 항체의 컬럼 적용 후, 컬럼을 PBS 완충액의 10 컬럼 부피로 세정하고, 항체를 100 mM 글리신, 100 mM NaCl 완충액, pH 3.0으로 희석한 다음 HighTrap™ Desalting 컬럼을 사용하여 완충액을 PBS 완충액으로 교환하였다. 모든 조작은 GE Healthcare Amersham Biosciences AB로부터의 Aktaxpress 시스템으로 제어하였다.
정제된 항체의 통상적 농도 범위는 10 - 130 mg/l (0.3 - 3.3 mg/30 ml)이었다.
결과
16F16 (IgG4) H 쇄, 16F16 L 쇄, 16F31 (IgG4) H 쇄 및 16F31 L 쇄를 암호화하는 cDNA 서열이 SEQ ID NOS:3-6에 각각 나타나 있고, 16F16 (IgG4), 16F31 (IgG4), MS (IgG4) 및 21F2 (IgG4)의 전장, 가변성, 및 CDR 아미노산 서열의 각 서열 식별자는 표 1에 나타나 있다. 도 4는 IgG4 이소형의 16F16, 16F31, MS, 및 21F2에 대한 아미노산 서열, 하이-라이팅 변수(볼드) 및 CDR(볼드 밑줄) 영역을 나타낸다.
IgH 결합 조성물에 대한 JointMLc 알고리즘 및 Ohm-Laursen et al., (Immunology 2006; 1 19:265-77)에 설명된 D-분류를 사용하여, 가변 영역에 대한 하기 생식계열 서열을 16F16 및 16F31에 대하여 식별하였다:
16F16 VH: VH3_21/D3-9/JH4 (SEQ ID NOS:31/32/33, 각각)
16F16 VL: VKI_L15/JK2 (SEQ ID NOS:34/35, 각각)
16F31 VH: VH3_20/D3-10/JH6 (SEQ ID NOS:36/(EL)/37, 각각)
16F31 VL: VKIII_A27/JK3 (SEQ ID NOS:38/39, 각각)
MS VH: VH4_59/D3_27_R3/JH3 (SEQ ID NOS:64/(NWG)/65, 각각)
MS VL: VKIII_A27/JK1 (SEQ ID NOS:38/66, 각각)
21F2 VH: VH5_51/D3_10_R3/JH4 (SEQ ID NOS:67/68/33, 각각)
21F2 VL: VKIII_L6/JK1 (SEQ ID NOS:69/66, 각각)
체세포 초돌연변이를 나타내는 대응하는 재조합 생식계열 서열(SEQ ID NOS:27-30은 각각 재조합 VH3_21/D3-9/JH4, VKIJ.15/JK2, VH3_20/D3-10/JH6 및 VKIII_A27/JK3에 대응하고, SEQ ID NOS:60-63은 각각 재조합 VH4_59/D7_27_3/JH3, VKIII_A27/JK1, VH5_51/D3_10_R3/JH4, 및 VKIII_L6/JK1에 대응)을 갖는 VH 및 VL 서열의 배열을 도 5A-5H에 나타낸다.
실시예 3: MICA 블로킹 실험
재료 및 방법
유세포 측정 분석 - MICA 차단. 리간드 결합의 차단을 분석하기 위해서, 50000 NKG2D/DAP10-발현 BaF/3 세포를 총 100 μl(2%FBS를 갖는 PBS pH7.4)에서 하이브리도마 상청액 또는 정제된 항체의 양을 변화시키면서 1h 동안 16℃에서 인큐베이션한 다음, mFc-MICA(사람 항체를 위해서) 또는 hFc-MICA (ON72를 위해서) (1μg)와 함께 30분 동안 4℃에서 인큐베이션하였다. 그 후 세포를 세정하고, 2차 산양-항-마우스 IgG-HRP Fcγ 절편 특이적, Jackson (109-036-151)을 MICA-mFc 결합의 검출을 위해 첨가하였다. 그 다음 세포를 B&D FACSArray 유세포 측정기에서 분석하였다. 프리인큐베이션에 의한 MICA 결합의 감소 정도를 프리인큐베이션으로의 결합의 MFI (평균 형광 강도)로서 프리인큐베이션 없이 MICA 결합의 %로 분석하였다.
더욱 상세한 용량-반응 곡선 또한 작성하였고, 1 μg MICA-mFc 결합의 50% 억제 (IC50) 및 완전한 차단에 필요한 재조합 발현되고 정제된 항체의 농도를 분석하였다.
결과
리간드 결합을 블로킹하는 능력에 대하여 항체를 분석하였다. 도 6은 하이브리도마 상청액과의 프리인큐베이션이 리간드, MICA의 모든 결합을 사실상 블로킹하였다는 것을 입증한다. 재조합 발현된 항체를 사용하여 용량-반응 곡선을 작성하였고, 0.017 및 0.2 nM 16F16, 및 0.16 및 0.7 nM 16F31에서 결합하는 MICA-mFc (1 μg)의 NKG2D 포화 용량의 IC50 및 완전 차단을 입증한다(도 7). ON72에 대한 대응 결과는 1 μg MICA- Fc의 IC50 및 전체 차단에 대하여 각각 0.02 및 0.24 nM이었다. 상세한 결과는 하기 표 2에 나타낸다. MS 및 21F2의 IC50가 각각 0.0016 nM 및 0.0048 nM로 가장 낮았다.
Figure 112010041741204-pct00003
실시예 4: 뮤린 항체와의 경쟁
재료 및 방법
유세포 측정 분석 - 뮤린 항체와의 경쟁. 시중에서 입수가능한 뮤린 항-hNKG2D 항체의 차단을 분석하기 위해서, 50000 NKG2D-발현 세포를 100 μl 최종 (2%FBS를 갖는 PBS pH7.4)에서 하이브리도마 상청액 또는 정제되고 재조합 발현 항체(0.3 μg 또는 지시대로)와 함께 1h 동안 16℃에서 인큐베이션한 다음, 뮤린 항-hNKG2D 항체 (ON72, 149810, 1D11 또는 5C6 (1D11 및 5C6에 대하여, 예컨대 Bauer et al., Science 1999:285:727-9 및 WO02068615참조); 0.3μg 또는 지시대로)와 함께 30분 동안 4℃에서 인큐베이션하였다. 그 후 세포를 세정하고, 2차 산양-항-마우스 IgG-HRP Fcγ 절편 특이적, Jackson (109-036-151)을 뮤린 항체의 결합의 검출을 위해 첨가하였다. 세포를 B&D FACSArray에서 분석하였다. 이 설정을 또한 뮤린 항체 다음 하이브리도마 상청액 또는 정제된 사람 항체와 프리인큐베이션에 의해 행하였고, 검출을 위해 2차 산양-항-사람 IgG-HRP Fcγ 절편 특이적 (Jackson, 109-036-098)을 사용하였다. 프리인큐베이션에 의한 결합의 감소의 정도를 프리인큐베이션으로의 결합의 MFI로서 프리인큐베이션이 없는 결합의 %로 분석하였다.
결과
하이브리도마 상청액과 세포의 프리인큐베이션 그 다음 ON72와의 인큐베이션은 ON72-결합의 95%가 차단되었다는 것을 입증한다(도 8). 재조합 발현 16F16 항체로의 분석의 동일한 종류를 행하는 것은 16F16이 ON72 결합의 95%를 차단하지만, ON72과의 프리인큐베이션은 후속의 16F16 결합의 82%만을 차단하였다는 것을 입증하였다 (도 9A). 마찬가지로, 149810 및 16F16에 대하여, 인큐베이션의 순서 또는 상대 항체 농도와 관계없이 오직 약 50% 차단이 항체에 의해 관찰되었다(도 9A). 다른 입수가능한 뮤린 항-hNKG2D 항체에 대하여, 교차 억제를 표 2에 나타내며, 1D11 및 5C6에 의해 ON72의 거의 완전한 차단 및 149810에 의해 대략 85%을 입증한다. 재조합 발현 MS로의 동일한 종류의 분석을 행하는 것은 MS와의 프리인큐베이션이 ON72-결합의 98%, 1D11-결합의 88% 및 149810 결합의 96.5%을 억제하였다는 것을 입증한다 (도 9B).
Figure 112010041741204-pct00004
실시예 5: 원숭이 NKG2D 와의 혈구 결합 및 교차-반응성
재료 및 방법
유세포 측정 분석 - 인간 및 원숭이 PBMC. 사람, 또는 사이노몰구스 또는 리서스 원숭이로부터 말초 혈액 단핵 세포(PMBC)를 분리하였다. 모든 동물 작업은 덴마크 국가 연구 위원회 가이드라인에 따라 행하였다. 각 PBMC 샘플을 상이한 세포 서브세트에 대한 마커로 표지하고(NK, CD8+, CD4+ 및 γδT 세포, NKG2D에 대해서는 ON72 또는 재조합 발현되고 정제된 16F16. 세포를 세정하고 BD FACSDiva (BD Biosource)에서 두개의 항체를 갖는 NKG2D에 대한 세포의 서브세트의 착색에 대하여 분석하였다. 착색의 MFI를 개별 항체에 대하여 계산하였다.
별도 실험에서, MS 또는 21F2의 완전한 용량 범위 첨가에 이어서 항-사람 IgG4 항체로의 검출에 의해 PBMC 제조물과 건강한 자원자로부터의 전혈 또는 사이노몰구스 원숭이에 대한 MS 및 21F2의 결합을 테스트하고, EC50값을 계산하였다. 간단히 말해서, 항체와의 인큐베이션을 4℃에서 30분 동안 행한 다음 세정하고, 그 후 직접 표지된 2차 항-hlgG4 항체를 첨가하고 30분 동안 4℃에서 대상, CD8, CD4, NK 및 γδ-T 세포의 다양한 세포 집단에 특이적인 항체와 함께 인큐베이션한 다음, 세포를 2%FCS를 갖는 PBS로 2회 세정하고 적혈구를 용해시켰다. 그 다음 세포를 유세포 측정에 의해 분석하고 상이한 세포 집단에 대한 결합을 평가하였다.
결과
16F16 및 ON72에 대한 결과를 도 10A-10D에 나타낸다. 모든 NK 및 CD8+ T 세포는 NKG2D에 대하여 양성으로 착색된 반면, CD4+ T 세포는 사이노몰구스 또는 리서스 PMBC에서 양성으로 착색되지 않았다. 동시에 행한 사람 PBMC에 대하여 동일한 결과가 얻어졌다. 이것은 문헌과 일치하며, 즉 인간에서 NKG2D은 NK 세포 및 CD8+ T 세포에서 정상적으로 발현되었지만 CD4+ T 세포에서는 그렇지 않았다.
ON72 또는 16F16로 사이노몰구스 및 리서스 원숭이로부터의 PBMC를 착색하는 것은 NK 세포 및 CD8+ T 세포에 대한 두 항체의 유사한 결합을 입증하였지만 CD4+ T 세포에 대한 결합은 그렇지 않았다. 이들 결과는 독성 연구에 적절한 종으로서 두 원숭이 균주를 확인하였다.
원숭이, 래트, 개 또는 돼지 NKG2D에 대한 교차-반응성은 시중에서 입수가능한 항체, 또는 16F16 또는 16F31 중 어느 것으로 관찰되지 않았다.
사람 및 사이노몰구스 CD8 T 세포로의 MS 결합에 대한 결과를 도 11A 및 11B에 각각 나타내고, PBMC 제조물로의 MS 및 21F2 결합을 위한 EC50 값을 사람 세포에 대한 사이노몰구스의 상대 EC50 값과 함께 나타낸다(%). 이것은 MS과 21F2 모두 사람 및 사이노몰구스 NKG2D에 대하여 매우 유사한 친화성을 갖는다는 것을 입증한다.
Figure 112010041741204-pct00005
실시예 6: 생물분석
사람 항체가 실제로 NKG2D의 활성을 완전히 차단하였다는 것을 테스트하기 위해서, NKG2D-리간드-유도 세포독성 분석을 개발하였다. 51Cr-방출 분석을 사용하였으며, 이때 타겟 세포를 방사성 염료로 로딩하였고 그것의 방출을 세포의 NK 사멸의 결과로서 측정하였다.
재료 및 방법
NKG2D-MICA 상호작용 매개 사멸 분석. 타겟 세포의 NKG2D-리간드 매개 사멸을 측정하기 위한 생물학적 분석은 항-NKG2D 항체를 테스트하는데 적합하다. NK 셀라인 NK92 또는 NKL (ATCC No. CRL-2407; Robertson et al., Exp Hematol 1996;24:406-15)는 둘다 NKG2D-의존 방식으로 MICA-트랜스펙션 BaF/3 세포를 사멸시키고, NKG2D- 리간드 (MICA, MICB 또는 ULBP1-4)를 발현하는 51Cr-로딩 타겟 세포를 사멸시키는 이펙터 세포로서 사용될 수 있다.
제1 분석에서, NKL 세포를 4h 동안 51Cr-로딩된, MICA-발현 BaF/3 세포와 함께 10:1의 비율로 1 또는 5 μg ON72 또는 IgG4 이소형의 재조합 발현된 16F16의 존재 또는 부재하에서 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 상청액을 마이크로티터 플레이트로 이동시키고, 섬광제를 첨가하고, Topcounter (Wallach)에서 타겟 세포 사멸의 결과로서 51Cr의 방출을 측정하였다. 51Cr 방출 감소는 첨가된 항체에 의한 사멸의 억제의 척도이었고, 사멸된 세포의 퍼센트를 계산하였다.
제2 분석에서, NK-92 세포를 51Cr-표지된 MICA- 또는 ULBP3 발현 BaF/3 세포와 함께 인큐베이션하였고, 증가된 농도의 재조합 발현되고 정제된 IgG4 이소형의 16F16, 16F31, MS, 또는 21F2의 첨가에 의한 사멸 감소. 결과를 사멸의 억제 %로서 나타낸다.
결과
ON72 또는 16F16을 사용하는 리간드 블로킹 항체의 첨가는 용량-의존 방식으로 NKL 세포에 의한 MICA-보유 세포의 사멸을 블로킹하였으며, 사멸의 억제 %로서 나타내어진다(도 12 참조). MICA를 발현하지 않는 대조군 세포는 NKL 세포에 의해 사멸되지 않았다.
16F16 또한 용량 의존 방식으로 NK-92 세포에 의한 두 MICA- 및 ULBP-보유BaF/3 표적 세포의 사멸을 억제하였으며(도 12A 및 12B), 사멸 억제 %로 나타내어지고, 0.8 μg/ml MICA- 및 ULBP-NKG2D 유도 사멸에서 거의 전체 차단되었다. 16F31 (IgG4)은 테스트한 최대 용량에서 사멸의 약 75%를 블로킹하였다(20 μg/ml; 도 13A 및 13B).
도 14A에 나타낸 바와 같이, MS 및 21F2 모두 51Cr-방출 분석에서 NK-92 세포에 의한 ULBP3-보유 세포의 사멸을 억제하였다. 도 14A에서, 세포독성의 블로킹은 억제%로서 나타내어지며, 0은 항체를 첨가하지 않고 함께 인큐베이션한 2개의 세포이고, MS는 보다 효율적이다. 도 14B에 나타낸 바와 같이, 51Cr-방출 분석에서 NKL 세포에 의한 리간드-(MICA-) 보유 세포이 사멸의 최대 억제는 매우 낮은 MS 농도(0.01 μg/ml)에서 얻어졌지만, 16F16의 최대 테스트 농도 (0.1 μg/ml)는 단지 약 40% 억제만을 유도하였다. IC50 데이타의 요약이 표 5에 제공된다.
Figure 112010041741204-pct00006
실시예 7: 항체-유도 NKG2D 하향조절
hNKG2D 발현 세포를 항체와 함께 인큐베이션했을 때, 예컨대 NKG2D의 내재화를 통한 하향-조절이 마우스 모델에서 특정 항-mNKG2D 항체에 대하여 이전에 입증된 것과 유사한 방식으로 발생한다는 것이 나타났다. 이것은 상이한 작용 방식, 그리고 가능하게는 더 긴 항체의 작용-시간을 유도할 것이다. 여기서, 하향-조절은 항체와의 하룻밤 인큐베이션 후 감소한 NKG2D 수준이 얼마나 큰지를 측정함으로써 분석하였다.
재료 및 방법
유세포 측정 분석 - 하향-조절. 상이한 종류의 NKG2D-발현 세포 상에서 ON72, 16F16, 16F31, MS, 또는 21F2와 함께 밤새 인큐베이션에 의해 NKG2D의 항체-매개 다운-조절을 분석하였다. 이론에 제한되지 않고, 하향-조절의 차이는 항원-상호작용, 예컨대 에피토프의 차이를 반영할 수 있다. 사람 항체는 IgG4 이소형으로서 재조합 발현되었고, 이 이소형은 낮은 친화성을 갖는 Fc-수용체와 결합한다.
제1 실험에서, 1 μg ON72 또는 16F16; 3 μg 16F31; 0.1 μg MS, 또는 0.3 또는 1 μg 21F2를 함유하는 1mL를 NKG2D- 및 DAP10-발현 세포에 첨가하였다.
제2 실험에서, 새로 제조한 NK 세포를 상이한 양의 MS (0; 0,003; 0.01 ; 0.03; 0.1 ; 0.3; 1 μg) 또는 21F2 (0.1 μg)와 함께, 전혈에서의 상황을 모의하기 위해서 10% 사람 혈청의 존재하에서, Fc 수용체에 대하여 더 높은 친화성을 갖는 IgG의 존재하에서 인큐베이션하였다.
제3 실험에서, 0.1 μg/ml MS, ON72, 또는 21F2을 NK, CD8+, 및 γδT 세포를 함유하는 전체 혈액에 첨가하였다. 인큐베이션 후, 항-CD8, 항-CD56 (NK 세포), 항-γδ, 및 항-사람 항체로의 착색은 다양한 아형으로의 결합을 식별하였다.
상기 실험에서 대조구로서, 세포를 37℃에서 미처리 상태로 방치하였다. 다음날 미처리된 세포와 항체-처리된 세포를 0.1 μg 전처리 항체와 함께, 그 다음 ON72 검출을 위해서 산양-항-마우스 IgG-HRP Fcγ 절편 특이적, Jackson (109-036-151)와 함께, 또는 사람 항체 검출을 위해서 산양-항-사람 IgG-HRP Fcγ 절편 특이적, Jackson (109-036-098)와 함께 인큐베이션하였다. 그 다음 세포를 세정하고 B&D FACSArray에서 분석하였다. 미처리 착색 수준과 항체-처리 착색 수준 간의 착색 차이를 NKG2D 하향-조절의 척도로서 분석하였고, 남아있는 세포 표면 NKG2D %를 미처리된 세포의 착색과 비교하여 전처리 후 착색 %로서 계산하였다.
결과
도 15에 나타낸 바와 같이, ON72, 16F16 및 16F31 모두 NKG2D-발현 BAF/3 세포에서 NKG2D 하향-조절을 유도하였다. ON72 및 16F31에 대하여, 16F16를 사용하여 약 75% 하향-조절과 비교하여 대략 55% 하향-조절이 관찰되었다. 이것은 16F16가 ON72와 유사한 Kd 값을 가지므로 더욱 효과적으로 하향-조절을 유도한다는 것을 제안한다. 이론에 제한되지 않고, 이것은 상이한 결합 에피토프 때문일 수 있다. MS와의 인큐베이션 후, 표면 NKG2D에서 약 95% 감소가 있었다 (도 16A). 새로 분리된 NK 세포에서, 약 60%의 포화에만 대응하는 MS 농도 (0.03 μg/ml)가 혈청의 존재하에서, 이 경우 결합을 위해 이용가능한 단지 약 35% NKG2D와 함께 항체와의 하룻밤 인큐베이션 후 세포-표면 NKG2D의 최대 내재화가 유도되었다 (도 16B). 21F2에 대하여, 혈청의 부재하에서, 1 μg/mL의 농도가 NKG2D의 78% (도 17) 하향조절을 유도하였다.
전체 혈액 중 NKG2D+ 림프구의 3가지 상이한 집단에서, MS 및 21F2에 대하여 대략 80% 내재화가 24시간에 관찰된 반면, ON72는 거의 100% 내재화를 유도하였다 (도 18). 추가적으로, ON72는 MS 및 21F2 보다 더 빠른 내재화를 유도하였는데 (도 18), 1시간에 50-75%에 도달하였다.
실시예 8: 사람 항체의 비-고갈 IgG4 형태
혈액 중 항체 가교 세포는 항체-결합 세포의 고갈을 유도할 수 있다. 그러나, 활성 Fc-수용체에 대한 IgG4 항체의 친화성은 IgG1에 비하여 매우 낮아서 IgG4 항체가 고갈을 유도하지 않는다.
재료 및 방법
전체 혈액 세포 고갈 분석. NKG2D-발현 세포의 비-고갈을 입증하기 위해서, 전체 사람 혈액을 1 μg 사람 항체의 IgG4-형태와 함께 4시간 동안 인큐베이션하고, NKG2D-양성 및 NKG2D-음성 세포의 상대 분포를 분석하고 항체의 부재하에서 인큐베이션한 전체 사람 혈액과 비교하였다. 그 다음 실시예 4에 설명한 분석을 사용하여 평가할 수 있다.
실시예 9: 친화성 결정
Biacore 1000 업그레이드 장치 (Biacore GE Healthcare; Biacore Upgrade CA0396)에서 25℃에서 표면 플라즈몬 공명 측정을 행하였다. 모든 Biacore 실험에서 HBS-EP 버퍼 (Biacore GE Healthcare; BR-1001-88)가 러닝 버퍼로서 기능하였으며, Biaevaluation 4.1 소프트웨어로 센서그램을 분석하였다.
단백질 고정화. 재조합체 MICA-Fc 단백질을 R&D 시스템으로부터 얻거나 재조합 생성하였다. 재조합체 ULBP-1, 2, 3, MICB 및 NKG2D-Fc을 R&D 시스템으로부터 구매하였다. 재조합체 NKG2D-Fc 단백질을 Sensor Chip CM5 (Biacore GE Healthcare; BR- 1000-14) 상의 덱스트란층에서 카르복실기에 공유적으로 고정화하였다. 센서 칩 표면을 EDC/NHS (N-에틸-N'-(3-디메틸아미노프로필) 카르보디이미드히드로클로라이드 및 N-히드록시숙신이미드 (Biacore GE Healthcare; BR-1000-50))로 활성화하였다. 단백질을 커플링 버퍼 (10 mM 아세테이트, pH 5.2)로 10 μg/ml으로 희석시키고, 적절한 고정화 수준에 도달할 때까지 주입하였다(즉 500 내지 1000 RU). 100 mM 에탄올아민 pH 8 (Biacore GE Healthcare; BR-1000-50)을 사용하여 남아있는 활성화 기의 탈활성화를 행하였다.
친화성 측정. IgG4 이소형으로서 재조합 발현된 사람 항체 16F16, 16F31, MS 및 21F2를 뮤린 항체 ON72와 비교하였다. 키네틱 실험을 위해서, 가용성 항체 (0.3 내지 30 nanoM)의 일련의 희석액을 고정화된 NKG2D-Fc 단백질 (500 내지 1000 RU)을 함유하는 덱스트란층 상에서 40 μl/min의 일정한 유속으로 2분 동안 주입하고, 재생전 500 mM NaCl 및 10 mM NaOH 버퍼의 8초 주입에 의해 3분 동안 분리시켰다. 얻어진 센서그램을 랑뮤어 모델을 사용하여 글로벌 피팅에 의해 분석하였다. 분리 상수 (KD)를 KD = kd/ka로서 계산하였다.
세포막-위치한 NKG2D에 대한 친화성. NKG2D를 발현하는 세포로의 항체 결합에 대한 전체 용량-반응 곡선을 작성하여 자연 발생 수용체에 대한 결합 친화성을 분석하였다.
결과
Biacore에서 칩 상의 두개의 상이한 NKG2D-밀도에서, 16F16에 대한 친화성 결정 결과를 표 6A에 나타내며, 높은 친화성 (KD 1.72 E-10M) 및 느린 분리 속도(kd 3.7 E-5/s)를 입증한다. ON72는 ka=9.6E5/(M*s); kd=1.1 E-4/s; 및 KD=1.7E-10M로 유사하였다. 그러나 MS 및 21F2는 더 높은 친화성 (각각 KD 2.52 E-12M 및 7.79 E-11 M)을 가졌고, MS는 더 느린 분리 속도(kd 1.45 E-05/s)를 가졌다 (표 6B).
도 3은 시중에서 입수가능한 뮤린 항체 (ON72 및 149810)와 비교하여, 재조합 생성되고 정제된 사람 항체 16F16, 16F31, MS 및 21F2의 NKG2D- 및 DAP10- 발현 BaF/3 세포로의 용량-의존 NKG2D 결합을 입증하며, 유세포 분석을 사용하였다. 결합에 대한 EC50 값은 아래와 같다:
16F16: 0.051 μg/ml (0.034 nM)
16F31 : 0.31 μg/ml (0.21 nM)
MS: 0.032 μg/ml (0.021 nM)
21F2: 0.033 μg/ml (0.023 nM)
ON72: 0.062 μg/ml (0.048 nM)
149810: 0.063 μg/ml (0.042 nM).
Figure 112010041741204-pct00007
실시예 10 - 고정화된 항- NKG2D 항체의 작용제 활성
항체 작용제 활성을 분석하기 위해서, 고정화된 항-NKG2D 항체의 존재 또는 부재하에서 낮은 CD3 수준으로 자극된 말초 혈액 림프구 (PBMC)의 증식을 평가하였으며, 대조구로서 CD28을 사용한다. NKG2D가 보조 자극 분자로서 작용하는 것으로 보이는 환경하에서 자극을 행하였고 (Mashoo et al, Immunol. 2005;174;4480-4484), 만성 염증 상태하에서 전구염증 사이토카인의 존재에서 NKG2D의 유발을 반영하는 것으로 생각된다. 이 분석에서, PBMC는 3일 동안 표면 결합된 항체로 자극되었고, 그 다음 4일 동안 IL-2 자극하였고, 모든 림프구, CD8+, 또는 CD4+ T 세포에서 CFSE 희석에 의해 증식을 평가하였다.
재료 및 방법
PBMC 증식 분석. 구배 원심분리에 의해 PBMC를 정제하였다. 96-웰 Maxisorp 플레이트를 항-Fc 항체로 코팅한 다음 (Jackson - lmmuno Resarch 115- 006-008), 세정하고 항-CD3 (0.1 또는 0.3 ng/ml, Bioscience cat#14-0037-82), 항-NKG2D (MS 또는 ON72, 0.2 μg/ml) 및/또는 항-CD28 항체 (0.2 μg/ml, Becton Dickison cat# 348040)를 첨가하였다. 각 웰에 150000 PBMC를 첨가하고, 세포를 37℃에서 3일 동안 인큐베이션하였다. 그 후 세포를 CFSE로 표지하였다 (분자 프로브 cat# C34554). 천만개 세포를 0.5 ml 1 μM CFSE에서 10분 동안 37℃에서 인큐베이션한 다음 세정하고, 60-웰 플레이트에서 웰당 150.000 PBMC를 4일 동안 IL-2 (10 U/ml)와 함께 인큐베이션하였다. 마지막으로, 세포를 항-CD8 및 항-CD4 항체로 착색하고, CFSE 희석에 의해 모든 림프구 (도 19에 나타낸 전체) 또는 CD8+ 또는 CD4+ T 세포에서 증식을 측정하였다 (유사한 결과가 얻어짐)
결과
도 19에 나타낸 바와 같이, MS는 0.1 또는 0.3 ng/ml CD3 자극에서 림프구의 증식을 현저히 보조 자극하지 않은 반면, ON72는 두 CD3 농도에서 작지만 현저한 보조 자극을 야기하였다. 표 7 참조. 두 경우, 대조구, 항-CD28는 강한 보조 자극을 제공하였고, 항-NKG2D는 이것에 현저하게 보조하지 않았다. 이것은 두 항체의 결합 방식 차이가 있으며, 고정화된 ON72는 검출가능한 작용제 활성을 갖는 반면 MS는 더욱 순수한 길항제라는 것을 나타낸다.
Figure 112010041741204-pct00008
실시예 11 - MS - Fab 와의 복합체에서 가용성 hNKG2D 의 결정 구조
사람 단일클론 항체 MS의 Fab 절편과의 복합체에서 hNKG2D의 가용성 절편의 결정 구조를 해석하고 X-선 결정학으로 1.7 Å 해상도로 개선하였다. 결과는 항체가 hNKG2D에 결합했을 때 MICA 분자의 결합을 차단한다는 것을 확인하였다 (도 20-22). 또한 각 hNKG2D 다이머는 오직 하나의 MS Fab 절편에 결합한다는 것을 나타내었다. MS Fab 부분은 주로 두 hNKG2D 모노머 중 하나("NKG2D 모노머 유닛 1")에 결합하였지만, 그러나 다른 모노머("NKG2D 모노머 유닛 2")와 단지 약하게 상호작용하였더라도, 다른 MS Fab이 모노머 유닛 2 결합으로부터 차단되었다.
이 실시예에서 언급된 문헌의 목록이 실시예 12에 제공된다.
재료 및 방법
가용성 hNKG2D (SEQ ID NO:2의 잔기 89-216) 및 MS Fab (SEQ ID NO:41에 대응하는 경쇄 및 SEQ ID NO: 40의 잔기 1-213에 대응하는 중쇄 절편 포함)을 약간의 몰 과량의 hNKG2D와 혼합하고 복합체를 겔-여과 컬럼에서 정제하였다. 그 다음 복합체를 약 9.5 mg/ml으로 농축하였다. 결정을 현적법(hanging drop-technique)으로 17% PEG3350, 200 mM 소듐 말로네이트 및 100 mM 비스-트리스-프로판 버퍼에서 pH 7.5로 성장시켰다. 결정을 75% 침전 용액 및 25% 글리세롤을 함유하는 저온-용액으로 이동시켰다. 결정을 약 15초 동안 잠기게 하였다. 그 다음 결정을 액체 N2에서 급속 냉동시키고 데이타 수집 동안 극저온 N2 가스 흐름에 의해 100K에서 유지하였다. 결정학적 데이타를 MAX-lab, Lund, Sweden에서 최초 2.4 Å 해상도로 Rigaku 007HF 회전 애노드 공급원에서, 그 후 새로운 결정을 사용하여 1.7 Å 해상도로 빔-라인 BL911-3(2)에서 수집하였다. 공간군 결정, 통합 및 데이터의 스케일링은 XDS 소프트웨어 패키지(3)에서 이루어졌다. 싱크로트론 데이타에 대한 셀 파라미터는 각각 82.1, 54.2, 169.4 Å, 90°, 102.62° 및 90°이 되도록 결정하였다. 구조 결정을 위해서 CCP4 스위트(7)의 MOLREP(4) 및 PHASER 소프트웨어 프로그램(5;6)을 사용하는 분자 교체, PDB-기탁된(8) 구조 1L71 (9)로부터의 Fab 분자 및 기탁된 1 MPU 구조(1O)로부터의 hNKG2D 분자를 사용하였다. Fab 분자는 2개의 도메인, 가변 도메인 및 불변 도메인으로 분할되고, NKG2D에 대하여 모노머는 분자 교체 계산에서 조사 모델로서 사용되었다. REFMAC5 소프트웨어 프로그램(11)을 사용하는 결정학적 개선에 이어서 전자 밀도 맵의 컴퓨터 그래픽 검사, 모델 보정 및 Coot 소프트웨어 프로그램(12)을 사용하는 빌딩을 행하였다. 모델에 이루어질 수 있는 더 이상의 현저한 개선이 없을 때까지 이 과정이 순환되었다. 구조는 회전 애노드 데이터를 사용하여 C2 공간군에서 최초 해석되었다. 싱크로트론 데이터로 XDS(3)는 비중심 단사정계 공간군을 나타내었고 데이터는 공간군 P2로 통합되었고, 후에 P21로 변하였다. C-중심 사방정계 셀 또한 높게 기록되었다. 또한 POINTLESS 소프트웨어(13)는 싱크로트론 데이터를 테스트했을 때 정확한 공간군으로서 P21을 제안하였다. PHASER 소프트웨어 프로그램을 분자 교체의 새로운 라운드에 사용하였고, C2 공간군에서의 분자 교체의 제1 라운드에서 제조된 예비 모델을 사용하였다. 분자 교체을 성공적으로 행하였지만, 합당한 전자 밀도 맵에도 불구하고 R- 및 R- 프리 값 (모델로부터 관찰된 실험 데이타를 계산된 데이타와 비교)이 개선 동안 예상한 대로 감소하지 않았기 때문에(0.35 및 0.43의 R- 및 R- 프리), 다음 데이터의 조사 및 개선을 시작하였다. P1을 포함하여 상이한 공간군을 테스트하였지만, 개선이 향상되지 않았다. 대신 데이터를 트위닝에 대하여 검사하였고 데이터를 SHELXL 개선 소프트웨어 프로그램(14)으로 전송하였다. (h,k,l) -> (h,k,-h-l)의 트윈 관계를 사용하여 모든 데이터에 대한 R- 및 R-프리가 0.34 및 0.40으로부터 0.30 및 0.34로 각각 떨어졌고, 0.25의 개선 트위닝 팩터, BASF이었다. COOT 그래픽 소프트웨어 프로그램으로 모델에 대한 수동 변형이 이루어졌다. SHELXL 컴퓨터 프로그램에서 개선을 행하였다. 컷-오프 없이 수동 개입 및 후속 개선의 14 사이클 후 모든 데이터에 대한 최종 R- 및 R-프리는 각각 0.277 및 0.320이었고, 모델은 0.008 Å의 이상적인 결합 길이로부터의 평균 제곱근 편차 (RMSD)를 나타내었다 (표 8). 개선 트위닝 팩터는 SHELXL에 의해 0.26으로 계산되었다.
결과
도 2OA, 2OB, 21A, 및 21C에 나타낸 바와 같이, MS-Fab는 hNKG2D 다이머의 두 모노머에 대한 MICA 결합을 효과적으로 차단한다. 그러나, MICA 분자가 NKG2D 다이머(1)의 두 모노머에 결합하였지만, MS Fab는 주로 두 모노머 중 하나에 결합하였고, 이것은 여기서 "NKG2D 모노머 유닛 1"으로 표시된다 (도 21A 및 21C). MS와 NKG2D 모노머 유닛 2 사이의 상호작용은 덜 특이적이고 (예컨대 수소-결합을 전혀 포함하지 않거나 적게 포함), MS Fab/NKG2D 복합체를 함께 유지하는데 덜 중요한 것으로 발견되었다.
페어-와이즈 상호작용에 배재되는 평균 면적의 CCP4 프로그램 스위트(7)의 소프트웨어 프로그램 AREAIMOL에 의한 계산은 결정된 결정 구조의 두개 독립 가용성 hNKG2D/MS-Fab 분자 복합체에 대하여 각각 총 909 및 876 Å2을 제공하였다. NKG2D 모노머 유닛 1과 MS Fab 사이의 페어-와이즈 상호작용에 배재되는 평균 면적은 두개의 독립 복합체에 대하여 각각 710 및 736 Å2으로 계산되었다. 다른 모노머("NKG2D 모노머 유닛 2")에 대하여 배재되는 면적은 각각 227 및 158 Å2으로 실질적으로 더 작다.
hNKG2D와 MS Fab 사이의 직접 접촉은 MS-Fab와 hNKG2D 분자 사이의 4.0의 컷-오프 거리를 사용하여 CCP4 프로그램 스위트(7)의 CONTACTS 소프트웨어를 실행시킴으로써 식별되었다. 분자 구조의 두개 독립 가용성 hNKG2D/MS-Fab 복합체 분자에 대한 결과를 표 9-12에 나타낸다. MS에 대하여 얻어진 hNKG2D 에피토프는 하기 hNKG2D (SEQ ID NO: 2)의 잔기를 포함하는 것으로 발견되었다: Lys 150, Ser 151, Tyr 152, Thr 180, Ile 181, Ile 182, Glu 183, Met 184, Gln 185, Leu 191, Lys 197, Tyr 199, Glu 201, Thr 205, Pro 206, Asn 207 및 Thr 208 (도 21A). NKG2D 모노머 유닛 2에서, 오직 5 상호작용이 발견되었고, 오직 하나의 잔기 (Tyr 152)가 결정학적 독립 복합체 모두에 존재하였다. 또한, Lys 150 측쇄 원자 Nζ는 오직 착체 중 하나에서 수소-결합에 포함되었고, 나머지 상호작용은 더 약한 극성 및 소수성 종류였다.
MS hNKG2D 에피토프는 β-가닥 β3'(1)의 직전 및 시작의 루프, Lys 150-Tyr 152; β5' 및 루프 이후, Thr 180-Gln 185; β5, Leu 191; β6, Lys 197, Tyr 199 및 Glu 201; 및 루프 이전 및 β7 가닥, Thr 205-Thr 208에 위치한 잔기를 포함하였다. 이들 접촉 면적은 hNKG2D(1) 상에 MICA에 대한 결합 부위로서 보고된 것과 매우 잘 일치하였다. MICA은 NKG2D(10)의 대칭 호모다이머에 비대칭적으로 결합한다. 이것은 또한 hNKG2D에 결합하는 MS Fab에 대한 경우이다. 그러므로, MICA에 비하여 MS Fab에 대해서 NKG2D로의 두개 가능한 결합 방향이 있을 것이다. 이것을 도 20A, B 및 도 22에 나타내며, 여기서 MS Fab가 모든 가능한 MICA 상대 결합 방향을 차단한다는 것이 명확하게 나타난다.
hNKG2D에 대한 MS 파라토프는 MS 경쇄 (L) (SEQ ID NO: 41, 표 9-12)의 잔기 Tyr 33 및 Trp 97, 및 중쇄(H) (SEQ ID NO: 40, 표 9-12)의 잔기 Gln 1, Asp 26, Asp 27, Ser 30, Ser 31, Tyr 32, Tyr 33, His 50, Ser 52, Tyr 53, Ser 54, Ser 56, Ala 57, Asn 58, Trp 98 및 Asp 99를 포함하였다. hNKG2D 에피토프, 및 수소-결합에 포함되는 잔기는 또한 도 21A에서 hNKG2D의 아미노산 서열에 표시된다.
실시예 12: hzON72 - Fab 와의 복합체에서 가용성 hNKG2D 의 결정 구조
ON72 Fab 절편의 인간화된 형태 (hzON72)와의 복합체에서 가용성 hNKG2D의 결정 구조를 해석하고 X선 결정학을 사용하여 3.15 Å 해상도로 개선하였다. 결과는 항체가 hNKG2D에 결합했을 때 hNKG2D에 대한 MICA의 결합을 차단할 수 있을 것이라는 것을 확인하였다 (도 20-22). 이것은 또한 각 hNKG2D 다이머가 두개의 hzON72 Fab 부분에 동시에 결합할 수 있다는 것을 나타내었다.
이 실시예에 언급된 문헌의 목록은 실시예 마지막 부분에 제공된다.
재료 및 방법
가용성 hNKG2D 절편 (SEQ ID NO:2의 잔기 81-216에 대응) 및 hzON72 Fab (SEQ ID NO:70 및 SEQ ID NO: 71, 각각 중쇄 절편 및 경쇄)을 약간의 몰 과량의 hNKG2D와 혼합하고 복합체를 겔-여과 컬럼에서 정제하였다. 그 다음 복합체를 약 7.5 mg/ml으로 농축하였다. 결정을 현적법(hanging drop-technique)으로 1M LiSO4 및 100 mM MES 버퍼에서 pH 6.5로 성장시켰다. 결정을 75% 침전 용액 및 25% 글리세롤을 함유하는 저온-용액으로 이동시켰다. 결정을 약 15초 동안 잠기게 하였다. 그 다음 결정을 액체 N2에서 급속 냉동시키고 데이타 수집 동안 극저온 N2 가스 흐름에 의해 100K에서 유지하였다. 3.15Å 해상도에 대한 결정학적 데이타를 MAX-lab, Lund, Sweden에서 빔-라인 BL911 - 5(2)을 사용하여 수집하였다. 공간군 결정, 통합 및 데이터의 스케일링은 XDS 소프트웨어 패키지(3)에서 이루어졌다. 셀 파라미터는 각각 65.7, 93.3, 128.9 Å, 90°, 93.83° 및 90°이 되도록 결정하였다. 공간군은 비대칭 유닛에서 하나의 NKG2D 다이머 및 두개의 hzON72 Fab 분자에 대한 공간을 갖는 P21가 되는 것으로 결정되었다. CCP4 스위트(7)의 MOLREP(4) 소프트웨어 프로그램 및 PDB-기탁된(8) 구조 1UJ3(15)의 Fab 분자, 및 기탁된 1 MPU 구조(1O)의 hNKG2D 다이머를 사용하는 분자 교체를 구조 결정을 위해 사용하였다. Fab 분자를 먼저 상이한 엘보우 각으로 회전 기능 실행에서 테스트하였고, 가장 높은 점수를 갖는 Fab를 선택하였다. 분자 교체 계산에서 다이머로서 NKG2D를 조사하였다. 두개의 hNKG2D 모노머 사이 및 두개의 Fab 분자 사이의 비-결정학적 억제를 사용하는 결정학적 개선이 CCP4 프로그램 스위트(7)의 REFMAC5 소프트웨어 프로그램(11)에서 이루어졌다. 결정학적 개선에 이어서 전자 밀도 맵의 컴퓨터 그래픽 검사, 모델 보정 및 Coot 소프트웨어 프로그램(12)을 사용하는 빌딩을 행하였다. 모델에 이루어질 수 있는 더 이상의 현저한 개선이 없을 때까지 이 과정이 순환되었다. 모든 데이터에 대한 최종 R- 및 R-프리는 각각 0.216 및 0.268이었고, 모델은 0.012 Å의 이상적 결합 길이로부터의 평균 제곱근 편차 (RMSD)를 나타내었다 (표 13).
결과
MICA 분자는 NKG2D(1)의 두 모노머에 강하게 결합하지만, 두개의 hzON72- Fab 분자는 대신 hNKG2D 모노머 각각에 독립적으로 결합하였고, NKG2D 다이머에 대한 MICA 결합을 효과적으로 차단한다(도 2OC, 21B, C 및 22). 페어-와이즈 상호작용에 배재되는 평균 면적의 CCP4 프로그램 스위트(7)의 소프트웨어 프로그램 AREAIMOL에 의한 계산은 결정된 결정 구조에서 두개의 결정학적 독립 가용성 hNKG2D/hzON72-Fab 분자 복합체 (복합체에서 하나의 hzON72 Fab 분자와 하나의 hNKG2D 모노머)에 총 791 및 801 Å2을 각각 제공하였다. 가용성 hNKG2D 모노머와 hzON72-Fab의 중쇄 사이의 페어-와이즈 상호작용에 배재된 평균 면적을 두개의 결정학적 독립 착체에 대하여 각각 642 및 631 Å2이 되는 것으로 계산되었고, 한편 경쇄에 대해서는 각각 208 및 242 Å2이었다.
hzON72-Fab에 대한 hNKG2D 사이의 직접 접촉이 hzON72-Fab와 hNKG2D 분자 사이의 4.0Å의 컷-오프 거리를 사용하여 CCP4 프로그램의 CONTACTS 소프트웨어를 실행함으로써 확인되었다. 결정 구조의 두개의 독립 가용성 hNKG2D/hzON72-Fab 분자에 대한 결과를 표 14-15에 나타낸다. hzON72에 대한 결과 hNKG2D 에피토프는 hNKG2D (SEQ ID NO: 2)의 하기 잔기를 포함하는 것으로 발견되었다: Ser 165, Trp 166, Leu 174, Ser 175, Pro 176, Asn 177, Leu 179, Thr 180, Ile 181, Ile 182, Glu 183, Met 184, Lys 186, Ala 193, Ser 194, Ser 195, Lys 197 및 Tyr 199. hNKG2D에 대한 hzON72 파라토프는 hzON72 경쇄(L) (SEQ ID NO:71, 표 14-15)의 잔기 Tyr 1, Lys 92, Thr 93 및 Leu 94, 및 hzON72 중쇄(H) (SEQ ID NO:70)의 잔기 Trp 33, Asp 52, Asp 55, Tyr 57, Asn 59, Tyr 60, Tyr 101, Asp 102, Gly 103, Tyr 104, Tyr 105 및 Val 106을 포함하였다. hzON72에 대한 hNKG2D 에피토프 및 수소-결합에 포함되는 잔기는 도 21B에서 hNKG2D의 아미노산 서열에 나타나 있다.
hNKG2D 에피토프는 β-가닥 β4(1)의 시작, Ser 165-Trp 166; β5' 전의 루프, Leu 174-Asn 177; β5' 가닥 및 그 다음 루프, Leu 179-Lys 186; β6 전 루프, Ala 193-Ser 195; 및 β6 가닥, Lys 197 및 Tyr 199에 위치한 잔기를 포함하였다. 이들 접촉 면적은 hNKG2D 상에 MICA에 대한 결합 부위로서 보고된 것과 매우 잘 일치하였고(1), hzON72 항체가 MICA 결합을 차단할 수 있다는 것이 명확하였다. 이것은 도 2OC, 21B, C 및 22에 나타나 있다.
Figure 112010041741204-pct00009
Figure 112010041741204-pct00010
"H" MS-Fab 중쇄 (SEQ ID NO: 40) 및 "L" MS-Fab 경쇄 (SEQ ID NO: 41)와의 hNKG2D 모노머 "N" (SEQ ID NO: 2) 상호작용. 이것은 결정에서 첫번째 결정학적 독립 hNKG2D/MS-Fab 복합체 분자에 대한 것이다. 4.0 Å의 컷-오프를 사용하였다. CCP4 스위트(7)의 CONTACT 컴퓨터 프로그램에 의해 접촉을 확인하였다. 마지막 컬럼 "***"은 CONTACT로 계산했을 때 이 접촉에서 수소 결합에 대한 강한 가능성(거리 < 3.3Å)을 나타내고, "*"은 약한 가능성(거리 > 3.3 Å)을 나타낸다. 공백은 프로그램이 수소 결합의 가능성이 없는 것으로 간주했다는 것을 나타낸다. 수소 결합은 공여체와 수용체 사이에 특이적이고, 통상적으로 강하며, 쉽게 확인가능하다.
hNKG2D MS 거리[Å] 가능한
H-결합
Res. 종류 Res. #
및 쇄		 원자 명칭 Res. 종류
 Res. # 및 쇄 원자 명칭
Lys 150 N CG Ser 31 H CB 3.93
Ser 31 H OG 2.84
Lys 150 N CD Ser 31 H OG 3.11
Lys 150 N CE Ser 31 H OG 3.78
Ser 151 N CA Ser 30 H O 3.73
Ser 31 H O 3.84
Ser 31 H CA 3.79
Ser 151 N CB Ser 30 H O 3.26
Ser 151 N OG Ser 30 H O 2.30 ***
Ser 31 H CA 3.99
Ser 30 H C 3.26
Tyr 152 N CG Tyr 33 H CE2 3.91
Tyr 152 N CD1 Tyr 33 H CE2 3.94
Tyr 152 N CE1 Tyr 33 H CE2 3.77
Tyr 53 H CE2 3.59
Tyr 53 H CD2 3.42
Tyr 152 N CZ Tyr 33 H CE2 3.58
Ser 30 H O 3.88
Tyr 53 H CD2 3.66
Tyr 32 H C 3.84
Tyr 32 H O 3.52
Tyr 33 H CD2 3.67
Tyr 152 N OH Tyr 53 H CD2 3.28
Ser 52 H CA 3.78
Ser 52 H C 3.86
Tyr 53 H N 3.06 ***
Tyr 32 H C 3.38
Tyr 32 H O 2.68 ***
Tyr 33 H N 3.99 *
Tyr 33 H CD2 3.99
Tyr 53 H CB 3.84
Tyr 152 N CE2 Tyr 33 H CE2 3.56
Ser 30 H O 3.93
Tyr 32 H N 3.80
Tyr 32 H CA 3.61
Tyr 32 H C 3.37
Tyr 32 H O 3.49
Tyr 33 H N 3.81
Tyr 33 H CD2 3.40
Tyr 152 N CD2 Tyr 33 H CE2 3.73
Tyr 33 H CD2 3.87
Thr 180 N CG2 Tyr 33 L OH 3.43
Tyr 33 L CE1 3.96
Thr 180 N C Tyr 33 L OH 3.94
Ile 181 N N Tyr 33 L OH 3.46 *
Ile 181 N C Tyr 33 L OH 3.53
Ile 181 N O Tyr 33 L OH 2.65 ***
Tyr 33 L CZ 3.42
Tyr 33 L CE2 3.33
Ile 182 N CD1 Tyr 33 L OH 3.53
Tyr 33 L CZ 3.51
Tyr 33 L CE2 3.65
Glu 183 N O Trp 97 L CH2 3.67
Trp 97 L CZ2 3.09
Met 184 N CE Trp 98 H CD1 3.75
Tyr 33 H CB 3.85
Tyr 33 H CG 3.71
Tyr 33 H CD2 3.75
Met 184 N C Asn 58 H ND2 3.92
Met 184 N O Asn 58 H CB 3.95
Asn 58 H CG 3.86
Asn 58 H ND2 2.94 ***
Trp 97 L CH2 3.62
His 50 H CE1 3.55
His 50 H NE2 3.45 *
Gln 185 N CG Asn 58 H ND2 4.00
Gln 185 N CD Ser 56 H OG 3.04
Ser 56 H O 3.92
Ala 57 H O 3.52
Gln 185 N OE1 Ser 56 H CB 3.77
Ser 56 H OG 2.41 ***
Ala 57 H O 3.95 *
Gln 185 N NE2 Asn 58 H CB 3.55
Ser 56 H OG 2.99 ***
Ser 56 H C 3.70
Ser 56 H O 2.97 ***
Ala 57 H O 2.64 ***
Asn 58 H CA 3.96
Ala 57 H C 3.27
Asn 58 H N 3.78 *
Leu 191 N CD1 Tyr 33 H OH 3.05
Lys 197 N NZ Asp 99 H O 3.13 ***
Tyr 199 N OH Trp 98 H CD1 3.92
Tyr 199 N CD2 Tyr 33 H CE2 3.67
Glu 201 N CG Tyr 33 H CZ 3.92
Tyr 33 H OH 2.80
Glu 201 N CD Tyr 33 H OH 3.29
Ser 56 H OG 3.60
Glu 201 N OE1 Tyr 33 H CZ 3.58
Tyr 33 H OH 3.01 ***
Ser 56 H CB 3.59
Ser 56 H OG 3.14 ***
Ser 56 H O 3.94 *
Tyr 33 H CE1 3.24
Glu 201 N OE2 Ser 56 H CB 3.78
Ser 56 H OG 3.26 ***
Thr 205 N OG1 Ser 56 H CB 3.63
Ser 56 H OG 3.95 *
Thr 205 N CG2 Ser 56 H CB 3.99
Ser 54 H OG 3.18
Pro 206 N O Ser 54 H CB 3.03
Ser 54 H OG 2.87 ***
Asn 207 N OD1 Ser 54 H OG 3.67 *
Thr 208 N N Tyr 53 H OH 3.43 *
Thr 208 N CB Tyr 53 H OH 3.96
Thr 208 N OG1 Tyr 53 H OH 3.57 *
Thr 208 N CG2 Tyr 53 H OH 3.37
"B" MS-Fab 중쇄 (SEQ ID NO: 40) 및 "A" MS-Fab 경쇄 (SEQ ID NO: 41)와의 hNKG2D 모노머 "C" (SEQ ID NO: 2) 상호작용. 이것은 결정에서 두번째 결정학적 독립 hNKG2D/MS-Fab 복합체 분자에 대한 것이다. 4.0 Å의 컷-오프를 사용하였다. CCP4 스위트(7)의 CONTACT 컴퓨터 프로그램에 의해 접촉을 확인하였다. 마지막 컬럼 "***"은 CONTACT로 계산했을 때 이 접촉에서 수소 결합에 대한 강한 가능성(거리 < 3.3Å)을 나타내고, "*"은 약한 가능성(거리 > 3.3 Å)을 나타낸다. 공백은 프로그램이 수소 결합의 가능성이 없는 것으로 간주했다는 것을 나타낸다.
hNKG2D MS 거리 [Å] 가능한 H-결합
Res. 종류 Res. #
및 쇄		 원자 명칭 Res. 종류 Res. # 및 쇄 원자 명칭
Lys 150 C CG Ser 31 B OG 3.54
Lys 150 C CD Asp 27 B OD1 3.96
Ser 31 B OG 3.56
Lys 150 C CE Asp 27 B CG 3.67
Asp 27 B OD1 2.83
Asp 27 B OD2 3.81
Ser 31 B OG 3.30
Lys 150 C NZ Asp 27 B CG 3.30
Asp 27 B OD1 2.76 ***
Asp 27 B OD2 3.46 *
Ser 151 C CA Ser 30 B O 3.46
Ser 31 B O 3.80
Ser 151 C CB Ser 30 B C 3.99
Ser 30 B O 3.00
Ser 151 C OG Ser 30 B CB 3.93
Ser 30 B C 3.58
Ser 30 B O 2.47 ***
Tyr 152 C CD1 Tyr 33 B CE2 3.93
Tyr 152 C CE1 Tyr 53 B CE2 3.54
Tyr 53 B CD2 3.44
Tyr 33 B CE2 3.72
Tyr 152 C CZ Tyr 32 B O 3.62
Tyr 53 B CD2 3.59
Tyr 33 B CE2 3.61
Tyr 33 B CD2 3.68
Tyr 152 C OH Tyr 53 B CB 3.88
Ser 52 B CA 3.64
Ser 52 B CB 3.73
Ser 52 B C 3.75
Tyr 53 B N 2.98 ***
Tyr 32 B C 3.65
Tyr 32 B O 2.92 ***
Tyr 53 B CD2 3.25
Tyr 33 B CD2 3.98
Tyr 152 C CE2 Tyr 32 B N 3.82
Tyr 32 B CA 3.74
Tyr 32 B C 3.42
Tyr 32 B O 3.43
Tyr 33 B N 3.90
Tyr 33 B CE2 3.72
Tyr 33 B CD2 3.52
Ser 30 B O 3.76
Tyr 152 C CD2 Tyr 33 B CE2 3.93
Tyr 33 B CD2 3.99
Thr 180 C CG2 Tyr 33 A OH 3.46
Thr 180 C C Tyr 33 A OH 3.86
Ile 181 C N Tyr 33 A OH 3.37 *
Ile 181 C CA Tyr 33 A OH 3.92
Ile 181 C C Tyr 33 A OH 3.38
Ile 181 C O Tyr 33 A CE2 3.11
Tyr 33 A CZ 3.20
Tyr 33 A OH 2.53 ***
Ile 182 C CG1 Trp 98 B CZ2 3.52
Trp 98 B CH2 3.37
Ile 182 C CD1 Tyr 33 A CE2 3.55
Trp 98 B CZ2 3.93
Tyr 33 A CZ 3.48
Tyr 33 A OH 3.59
Ile 182 C CG2 Trp 98 B CZ2 3.97
Glu 183 C O Trp 97 A CH2 3.27
Trp 97 A CZ2 3.49
Met 184 C CA His 50 B NE2 3.99
Met 184 C CB Tyr 33 B CE1 3.74
Tyr 33 B OH 3.98
Tyr 33 B CZ 3.96
Met 184 C CG Tyr 33 B CD1 3.90
Tyr 33 B CE1 3.52
Tyr 33 B OH 3.95
Tyr 33 B CE2 3.98
Tyr 33 B CZ 3.57
Met 184 C CE Tyr 33 B CB 3.60
Tyr 33 B CG 3.39
Tyr 33 B CD1 3.68
Tyr 33 B CD2 3.74
Met 184 C C His 50 B NE2 3.85
Met 184 C O Asn 58 B ND2 3.02 ***
His 50 B CE1 3.14
His 50 B NE2 2.99 ***
Gln 185 C CD Ala 57 B O 3.73
Asn 58 B CB 3.48
Asn 58 B CG 3.89
Asn 58 B ND2 3.73
Gln 185 C OE1 Asn 58 B CA 3.96
Asn 58 B CB 3.03
Asn 58 B CG 3.53
Asn 58 B ND2 3.23 ***
His 50 B ND1 3.91 *
His 50 B CE1 2.97
His 50 B NE2 3.62 *
Gln 185 C NE2 Ala 57 B C 3.00
Asn 58 B N 3.41 *
Asn 58 B CA 3.59
Ser 56 B OG 3.64 *
Ala 57 B O 2.50 ***
Asn 58 B CB 3.55
Leu 191 C CD1 Tyr 33 B OH 3.20
Lys 197 C CD Trp 98 B CZ3 3.77
Trp 98 B CH2 3.71
Lys 197 C CE Trp 98 B CZ3 3.54
Asp 99 B O 3.86
Lys 197 C NZ Trp 98 B CZ3 3.50
Asp 99 B O 2.73 ***
Asp 99 B OD1 3.56 *
Asp 99 B C 3.74
Tyr 199 C CE1 Trp 98 B CE3 3.87
Trp 98 B CZ3 3.29
Trp 98 B CH2 3.84
Tyr 199 C CZ Trp 98 B CE3 3.64
Trp 98 B CZ3 3.39
Tyr 199 C OH Trp 98 B CE3 3.01
Trp 98 B CZ3 2.80
Tyr 199 C CD2 Tyr 33 B CE2 3.57
Tyr 33 B CD2 3.98
Glu 201 C CG Tyr 33 B OH 2.80
Glu 201 C CD Ser 56 B CB 3.72
Ser 56 B OG 3.32
Tyr 33 B OH 3.32
Glu 201 C OE1 Ser 56 B CB 3.29
Ser 56 B OG 3.04 ***
Tyr 33 B CE1 3.58
Tyr 33 B OH 3.08 ***
Tyr 33 B CZ 3.80
Glu 201 C OE2 Ser 56 B CB 3.49
Ser 56 B OG 2.87 ***
Thr 205 C OG1 Ser 56 B CB 3.83
Ser 56 B OG 3.49 *
Thr 205 C CG2 Ser 56 B N 3.85
Ser 56 B CA 3.99
Ser 56 B CB 3.30
Ser 56 B OG 3.84
Ser 54 B OG 3.93
Pro 206 C CG Ser 54 B O 3.97
Pro 206 C C Ser 54 B OG 3.94
Pro 206 C O Ser 54 B CB 2.96
Ser 54 B OG 2.71 ***
Asn 207 C OD1 Ser 54 B OG 3.78 *
Thr 208 C N Tyr 53 B OH 3.59 *
Thr 208 C OG1 Tyr 53 B OH 3.92 *
Thr 208 C CG2 Tyr 53 B OH 3.59
"H" MS-Fab 중쇄 (SEQ ID NO: 40) 및 "L" MS-Fab 경쇄 (SEQ ID NO: 41)와의 hNKG2D 모노머 "M" (SEQ ID NO: 2) 상호작용. 이것은 결정에서 첫번째 결정학적 독립 hNKG2D/MS-Fab 복합체 분자에 대한 것이다. 4.0 Å의 컷-오프를 사용하였다. CCP4 스위트(7)의 CONTACT 컴퓨터 프로그램에 의해 접촉을 확인하였다. 마지막 컬럼 "***"은 CONTACT로 계산했을 때 이 접촉에서 수소 결합에 대한 강한 가능성(거리 < 3.3Å)을 나타내고, "*"은 약한 가능성(거리 > 3.3 Å)을 나타낸다. 공백은 프로그램이 수소 결합의 가능성이 없는 것으로 간주했다는 것을 나타낸다.
hNKG2D MS 거리[Å] 가능한
H-결합
Res. 종류 Res. #
및 쇄		 원자 명칭 Res. 종류 Res. #
및 쇄		 원자 명칭
Tyr 152 M OH Asp 26 H O 3.66 *
Met 184 M CG Gln 1 H OE1 3.58
Gln 185 M NE2 Gln 1 H OE1 3.92 *
Tyr 199 M OH Asp 26 H OD2 3.87 *
"B" MS-Fab 중쇄 (SEQ ID NO: 40) 및 "A" MS-Fab 경쇄 (SEQ ID NO: 41)와의 hNKG2D 모노머 "D" (SEQ ID NO: 2) 상호작용. 이것은 결정에서 두번째 결정학적 독립 hNKG2D/MS-Fab 복합체 분자에 대한 것이다. 4.0 Å의 컷-오프를 사용하였다. CCP4 스위트(7)의 CONTACT 컴퓨터 프로그램에 의해 접촉을 확인하였다. 마지막 컬럼 "***"은 CONTACT로 계산했을 때 이 접촉에서 수소 결합에 대한 강한 가능성(거리 < 3.3Å)을 나타내고, "*"은 약한 가능성(거리 > 3.3 Å)을 나타낸다. 공백은 프로그램이 수소 결합의 가능성이 없는 것으로 간주했다는 것을 나타낸다.
hNKG2D MS 거리 [Å] 가능한 H-결합
Res. 종류 Res. #
및 쇄		 원자 명칭 Res. 종류 Res. #
및 쇄		 원자 명칭
Lys 150 D CE Tyr 32 B CE1 3.99
Tyr 32 B CZ 3.78
Tyr 32 B OH 2.80
Lys 150 D NZ Tyr 32 B CE1 3.00
Tyr 32 B CZ 3.05
Tyr 32 B OH 2.60 ***
Tyr 152 D OH Asp 26 B O 3.99 *
Gln 1 B CA 3.72
Figure 112010041741204-pct00011
Figure 112010041741204-pct00012
Figure 112010041741204-pct00013
Figure 112010041741204-pct00014
Figure 112010041741204-pct00015
"H", hzON72-Fab 중쇄 (SEQ ID NO: 70) 및 "L", hzON72-Fab 경쇄 (SEQ ID NO: 71)와의 hNKG2D 모노머 "N" (SEQ ID NO: 2) 상호작용. 이것은 결정에서 두번째 결정학적 독립 hNKG2D/hzON72-Fab 복합체 분자에 대한 것이다. 4.0 Å의 컷-오프를 사용하였다. CCP4 스위트(7)의 CONTACT 컴퓨터 프로그램에 의해 접촉을 확인하였다. 마지막 컬럼 "***"은 CONTACT로 계산했을 때 이 접촉에서 수소 결합에 대한 강한 가능성(거리 < 3.3Å)을 나타내고, "*"은 약한 가능성(거리 > 3.3 Å)을 나타낸다. 공백은 프로그램이 수소 결합의 가능성이 없는 것으로 간주했다는 것을 나타낸다.
hNKG2D hzON72 거리[Å] 가능한
H-결합
Res. 종류 Res. #
및 쇄		 원자 명칭 Res. 종류 Res. #
및 쇄		 원자 명칭
Ser 165 N CB Tyr 104 H CE2 3.66
Ser 165 N OG Tyr 104 H CE2 3.53
Tyr 104 H CD2 3.95
Trp 166 N NE1 Tyr 105 H OH 3.38 *
Leu 174 N CG Tyr 104 H CE1 3.94
Leu 174 N CD2 Tyr 104 H CD1 3.78
Tyr 104 H CE1 3.91
Leu 174 N C Tyr 104 H OH 3.97
Leu 174 N O Tyr 104 H CE1 3.61
Tyr 104 H CZ 3.61
Tyr 104 H OH 2.90 ***
Ser 175 N C Tyr 104 H CE1 3.81
Ser 175 N O Tyr 104 H CE1 3.79
Pro 176 N N Tyr 104 H CE1 3.84
Pro 176 N CA Gly 103 H O 3.99
Gly 103 H CA 3.78
Pro 176 N CB Gly 103 H CA 3.81
Asn 177 N N Gly 103 H O 3.29 ***
Tyr 101 H OH 3.79 *
Asn 177 N CA Tyr 101 H OH 3.63
Asn 177 N OD1 Tyr 101 H CE2 3.52
Leu 179 N C Tyr 101 H OH 3.54
Leu 179 N O Gly 103 H O 3.77 *
Tyr 101 H CE1 3.60
Tyr 101 H CZ 3.35
Tyr 101 H OH 2.33 ***
Thr 180 N CA Tyr 104 H O 3.40
Thr 180 N CG2 Trp 33 H CZ2 3.76
Val 106 H CG2 3.60
Trp 33 H NE1 3.77
Tyr 101 H CE1 3.73
Thr 180 N C Tyr 104 H O 3.55
Ile 181 N N Tyr 104 H O 2.78 ***
Ile 181 N CA Tyr 104 H O 3.78
Ile 181 N CB Tyr 104 H O 3.76
Ile 181 N CG2 Tyr 105 H CE1 3.90
Tyr 105 H CZ 3.63
Tyr 105 H OH 3.76
Ile 182 N CD1 Asn 59 H OD1 3.49
Ile 182 N CG2 Asn 59 H CG 3.80
Asn 59 H OD1 3.51
Asn 59 H ND2 3.66
Glu 183 N N Leu 94 L CD1 3.64
Glu 183 N CB Lys 92 L O 3.81
Glu 183 N CG Tyr 105 H OH 3.91
Glu 183 N CD Tyr 105 H CE1 3.87
Tyr 105 H CZ 3.90
Tyr 105 H OH 3.06
Glu 183 N OE1 Lys 92 L CG 3.77
Lys 92 L CD 3.95
Lys 92 L CE 3.20
Thr 93 L CG2 3.94
Tyr 105 H OH 3.64 *
Glu 183 N OE2 Tyr 105 H CE1 3.95
Tyr 105 H CZ 3.54
Tyr 105 H OH 2.39 ***
Glu 183 N C Leu 94 L CD1 3.86
Glu 183 N O Leu 94 L N 3.16 ***
Thr 93 L C 3.86
Leu 94 L CD1 3.45
Thr 93 L CA 3.51
Thr 93 L CB 3.61
Met 184 N CG Leu 94 L CB 3.95
Met 184 N CE Tyr 60 H O 3.39
Asn 59 H CB 3.92
Met 184 N O Tyr 1 L CD2 3.98
Leu 94 L O 3.84 *
Lys 186 N N Tyr 1 L OH 3.90 *
Lys 186 N CB Tyr 1 L OH 3.78
Ala 193 N CB Tyr 57 H CE1 3.84
Ser 194 N O Asp 55 H CG 3.84
Asp 55 H OD1 3.41 *
Asp 55 H OD2 3.47 *
Ser 195 N CA Asp 55 H OD1 3.82
Ser 195 N CB Asp 55 H CG 3.46
Asp 55 H OD1 2.61
Asp 55 H OD2 3.81
Ser 195 N OG Asp 55 H CG 3.74
Asp 55 H OD1 3.07 ***
Ser 195 N O Asp 55 H CG 3.71
Asp 55 H OD1 3.81 *
Asp 55 H OD2 3.23 ***
Lys 197 N CG Tyr 57 H CD1 3.79
Tyr 57 H CE1 3.95
Tyr 57 H CD2 3.99
Tyr 57 H CG 3.82
Lys 197 N CD Tyr 57 H CD1 3.84
Tyr 57 H CG 3.74
Asp 55 H OD2 3.17
Tyr 57 H CB 3.89
Lys 197 N CE Trp 33 H CH2 3.75
Trp 33 H CZ2 3.39
Asp 52 H OD2 3.64
Asp 55 H OD2 3.27
Tyr 57 H CB 3.98
Lys 197 N NZ Asp 55 H CG 3.27
Trp 33 H CZ2 3.68
Asp 52 H CB 3.78
Asp 52 H CG 3.38
Asp 52 H OD2 2.53 ***
Asp 55 H CB 3.57
Asp 55 H OD2 2.36 ***
Tyr 57 H CB 3.77
Tyr 199 N CD1 Tyr 57 H OH 3.64
"B", hzON72-Fab 중쇄 (SEQ ID NO: 70) 및 "A", hzON72-Fab 경쇄 (SEQ ID NO: 71)와의 hNKG2D 모노머 "C" (SEQ ID NO: 2) 상호작용. 이것은 결정에서 두번째 결정학적 독립 hNKG2D/hzON72-Fab 복합체 분자에 대한 것이다. 4.0 Å의 컷-오프를 사용하였다. CCP4 스위트(7)의 CONTACT 컴퓨터 프로그램에 의해 접촉을 확인하였다. 마지막 컬럼 "***"은 CONTACT로 계산했을 때 이 접촉에서 수소 결합에 대한 강한 가능성(거리 < 3.3Å)을 나타내고, "*"은 약한 가능성(거리 > 3.3 Å)을 나타낸다. 공백은 프로그램이 수소 결합의 가능성이 없는 것으로 간주했다는 것을 나타낸다.
hNKG2D hzON72 거리[Å] 가능한 H-결합
Res. 종류 Res. #
및 쇄		 원자 명칭 Res. 종류 Res. #
및 쇄		 원자 명칭
Trp 166 C NE1 Tyr 105 B OH 3.26 ***
Leu 174 C C Tyr 104 B OH 3.78
Leu 174 C O Tyr 104 B CE1 3.62
Tyr 104 B CZ 3.37
Tyr 104 B OH 2.66 ***
Ser 175 C C Tyr 104 B CE1 3.27
Ser 175 C O Tyr 104 B CD1 3.74
Tyr 104 B CE1 3.37
Pro 176 C N Tyr 104 B CD1 3.99
Tyr 104 B CE1 3.13
Tyr 104 B CZ 3.98
Tyr 104 B OH 3.92 *
Pro 176 C CA Gly 103 B CA 3.84
Tyr 104 B CD1 3.70
Tyr 104 B CE1 3.24
Pro 176 C CB Gly 103 B CA 3.76
Tyr 104 B CE1 3.94
Pro 176 C CG Tyr 104 B CE1 3.75
Tyr 104 B OH 3.71
Pro 176 C CD Tyr 104 B CE1 3.77
Tyr 104 B OH 3.68
Asn 177 C N Gly 103 B CA 3.94
Gly 103 B C 3.79
Tyr 101 B OH 3.92 *
Gly 103 B O 3.02 ***
Asn 177 C CA Tyr 101 B OH 3.49
Gly 103 B O 3.66
Asn 177 C OD1 Asp 102 B O 3.70 *
Tyr 101 B CE2 3.41
Leu 179 C C Tyr 101 B OH 3.99
Leu 179 C O Tyr 101 B CZ 3.78
Tyr 101 B CE1 3.82
Tyr 104 B O 3.71 *
Tyr 101 B OH 2.82 ***
Gly 103 B O 3.90 *
Thr 180 C CA Tyr 104 B O 3.36
Thr 180 C CG2 Trp 33 B CZ2 3.99
Val 106 B CG2 3.72
Tyr 101 B CE1 3.84
Thr 180 C C Tyr 104 B O 3.76
Ile 181 C N Tyr 104 B O 3.15 ***
Ile 181 C CB Tyr 105 B CE2 3.99
Tyr 105 B CZ 3.91
Ile 181 C CG2 Tyr 105 B CE1 3.72
Tyr 105 B CZ 3.49
Tyr 105 B OH 3.43
Ile 182 C CD1 Asn 59 B OD1 3.39
Ile 182 C CG2 Leu 94 A CD2 3.97
Asn 59 B CG 3.80
Asn 59 B OD1 3.57
Asn 59 B ND2 3.62
Leu 94 A CD1 3.96
Glu 183 C N Leu 94 A CD1 3.44
Glu 183 C CD Tyr 105 B OH 3.53
Glu 183 C OE1 Lys 92 A CE 3.17
Thr 93 A CG2 3.35
Glu 183 C OE2 Tyr 105 B CZ 3.86
Tyr 105 B OH 2.71 ***
Glu 183 C O Thr 93 A C 3.88
Leu 94 A N 3.06 ***
Leu 94 A CA 3.93
Leu 94 A O 3.37 *
Thr 93 A CA 3.68
Thr 93 A CB 3.54
Leu 94 A CD1 3.94
Met 184 C CA Leu 94 A O 3.78
Met 184 C CE Tyr 60 B O 3.16
Met 184 C O Leu 94 A O 3.72 *
Tyr 1 A CG 3.98
Tyr 1 A CD2 3.93
Lys 186 C N Tyr 1 A OH 3.81 *
Lys 186 C CA Tyr 1 A OH 3.65
Lys 186 C CB Tyr 1 A OH 3.51
Ala 193 C CB Tyr 57 B CE1 3.90
Ser 194 C O Asp 55 B OD1 3.94 *
Asp 55 B OD2 3.84 *
Ser 195 C CB Asp 55 B CG 3.63
Asp 55 B OD1 2.94
Asp 55 B OD2 3.78
Ser 195 C OG Asp 55 B CG 3.81
Asp 55 B OD1 3.25 ***
Ser 195 C O Asp 55 B OD2 3.52 *
Lys 197 C CG Tyr 57 B CZ 3.90
Tyr 57 B CG 3.96
Tyr 57 B CD1 3.80
Tyr 57 B CE1 3.77
Lys 197 C CD Asp 55 B OD2 3.58
Tyr 57 B CG 3.73
Tyr 57 B CD1 3.67
Lys 197 C CE Trp 33 B CZ2 3.56
Asp 52 B OD2 3.96
Asp 55 B OD2 3.49
Trp 33 B CH2 3.83
Lys 197 C NZ Trp 33 B CZ2 3.77
Asp 52 B CG 3.77
Asp 52 B OD2 2.83 ***
Asp 55 B CB 3.88
Asp 55 B CG 3.44
Asp 55 B OD2 2.41 ***
Tyr 57 B CB 3.78
참고문헌
Figure 112010041741204-pct00016
Figure 112010041741204-pct00017
전형적인 구체예
다음은 본 발명의 전형적인 구체예이다.
1. 인간 NKG2D(hNKG2D)와 결합하는 분리된 인간 또는 인간화된 모노클로날 항체, 또는 그것의 항원-결합 단편.
2. hNKG2D-발현 NK 또는 T 세포의 hNKG2D-매개 활성화를 감소시키는, 전술한 구체예의 항체 또는 항원-결합 단편.
3. hNKG2D와의 결합에 있어서 적어도 하나의 hNKG2D 리간드와 경합하는, 어느 전술한 구체예의 항체 또는 항원-결합 단편.
4. 리간드가 MICA인 전술한 구체예의 항체 또는 항원-결합 단편.
5. NKG2D-발현 NK 또는 T 세포 표면 상의 NKG2D의 양을 감소시키는, 어느 전술한 구체예의 항체 또는 항원-결합 단편.
6. 고정되었을 때, 말초혈 단핵세포(PBMC)의 CD3-촉발 증식을 유의하게 동시-자극하지 않는, 어느 전술한 구체예의 항체 또는 항원-결합 단편.
7. 고정되었을 때, hNKG2D-발현 NK 또는 T 세포의 hNKG2D-매개 활성화에 대해 유의한 작용제 효과를 갖지 않는, 어느 전술한 구체예의 항체 또는 항원-결합 단편.
8. 사이노몰거스 및 레서스 NKG2D와 결합하는, 어느 전술한 구체예의 항체 또는 항원-결합 단편.
9. 1nM 이하의 KD로 hNKG2D와 결합하는, 어느 전술한 구체예의 항체.
10. 0.1nM 이하의 KD로 hNKG2D와 결합하는, 어느 전술한 구체예의 항체.
11. NKG2D-발현 NK 세포 또는 T 세포에 첨가되었을 때, 2개 이하의 hNKG2D 다이머를 가교 결합시키는, 어느 전술한 구체예의 항체 또는 항원-결합 단편.
12. hNKG2D 다이머의 제 1 hNKG2D 모노머와만 강하게 결합하는, 어느 전술한 구체예의 항체 또는 항원-결합 단편.
13. 제 1 hNKG2D 모노머와 결합되었을 때, 항체 또는 항원-결합 단편과 제 2 hNKG2D 모노머의 결합을 차단하는, 전술한 구체예의 항체 또는 항원-결합 단편.
14. hNKG2D에서 제 1 및 제 2 hNKG2D 모노머에 대한 용매-배제 면적의 비가 약 2:1 이상인, 어느 전술한 구체예의 항체 또는 항원-결합 단편.
15. 비가 약 3:1 이상인, 전술한 구체예의 항체 또는 항원-결합 단편.
16. NKG2D와의 결합에 있어서 기준 항체와 경합하며, 기준 항체는
(a) SEQ ID NO:11의 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO:12의 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체;
(b) SEQ ID NO:13의 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO:14의 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체;
(c) SEQ ID NO:44의 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO:45의 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체; 및
(d) SEQ ID NO:46의 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO:47의 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체로 구성되는 군으로부터 선택되는, 어느 전술한 구체예의 항체 또는 항원-결합 단편.
17. 기준 항체와 동일한 NKG2D의 에피토프와 결합하며, 기준 항체는
(a) SEQ ID NO:11의 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO:12의 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체;
(b) SEQ ID NO:13의 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO:14의 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체;
(c) SEQ ID NO:44의 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO:45의 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체; 및
(d) SEQ ID NO:46의 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO:47의 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체로 구성되는 군으로부터 선택되는, 어느 전술한 구체예의 항체 또는 항원-결합 단편
18. 기준 항체와 실질적으로 동일한 KD로 NKG2D와 결합하며, 기준 항체는
(a) SEQ ID NO:11의 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO:12의 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체;
(b) SEQ ID NO:13의 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO:14의 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체;
(c) SEQ ID NO:44의 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO:45의 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체; 및
(d) SEQ ID NO:46의 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO:47의 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체로 구성되는 군으로부터 선택되는, 어느 전술한 구체예의 항체 또는 항원-결합 단편.
19. 기준 항체가 SEQ ID NO:44의 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO:45의 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 16-18 중 어느 구체예의 항체 또는 항원-결합 단편.
20. SEQ ID NO:2의 Lys 150, Ser 151, Tyr 152, Thr 180, Ile 181, Ile 182, Glu 183, Met 184, Gln 185, Leu 191, Lys 197, Tyr 199, Glu 201, Thr 205, Pro 206, Asn 207 및/또는 Thr 208을 포함하는 에피토프와 결합하는, 전술한 구체예의 항체 또는 항원-결합 단편.
21. SEQ ID NO:2의 Lys 150, Ser 151, Tyr 152, Thr 180, Ile 181, Ile 182, Glu 183, Met 184, Gln 185, Leu 191, Lys 197, Tyr 199, Glu 201, Thr 205, Pro 206, Asn 207 및/또는 Thr 208로부터 선택된 5개 이상의 잔기를 포함하는 에피토프와 결합하는, 전술한 구체예의 항체 또는 항원-결합 단편.
22. SEQ ID NO:2의 Lys 150, Ser 151, Tyr 152, Thr 180, Ile 181, Ile 182, Glu 183, Met 184, Gln 185, Leu 191, Lys 197, Tyr 199, Glu 201, Thr 205, Pro 206, Asn 207 및 Thr 208를 포함하는 에피토프와 결합하는, 전술한 구체예의 항체 또는 항원-결합 단편.
23. 기준 항체가 SEQ ID NO:46의 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO:47의 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 16-18 중 어느 구체예의 항체 또는 항원-결합 단편.
24. (a) VH3_21, D3-9, 및 JH4 유전자;
(b) VH3_20, D3-10, 및 JH6 유전자;
(c) VH4_59, D7_27_R3, 및 JH3 유전자; 또는
(d) VH5_51, D3_10_R3, 및 JH4 유전자
를 포함하는 일련의 인간 유전자의 산물이거나, 또는 이로부터 유래된 중쇄 가변 영역을 포함하는, 어느 전술한 구체예의 항체 또는 항원-결합 단편.
25. (a) VKI_L15 및 JK2 유전자;
(b) VKIII_A27 및 JK3 유전자;
(c) VKIII_A27 및 JK1 유전자; 또는
(d) VKIII_L6 및 JK1 유전자
를 포함하는 일련의 인간 유전자의 산물이거나, 또는 이로부터 유래된 경쇄 가변 영역을 포함하는, 어느 전술한 구체예의 항체 또는 항원-결합 단편.
26. VH4_59, D7_27_R3, 및 JH3 유전자를 포함하는 일련의 인간 유전자의 산물이거나 또는 이로부터 유래된 중쇄 가변 영역, 및 VKIII_A27 및 JK1 유전자를 포함하는 일련의 인간 유전자의 산물이거나 또는 이로부터 유래된 경쇄 가변 영역을 포함하는, 어느 전술한 구체예의 항체 또는 항원-결합 단편.
27. SEQ ID NO:44의 Gln1, Asp 26, Asp 27, Ser 30, Ser 31, Tyr 32, Tyr 33, His 50, Ser 52, Tyr 53, Ser 54, Ser 56, Ala 57, Asn 58, Trp 98 또는 Asp 99, SEQ ID NO:45의 Tyr33 또는 Trp 97, 또는 이들의 어떤 조합에 상응하는 잔기를 포함하는 파라토프를 포함하는, 어느 전술한 구체예의 항체 또는 항원-결합 단편.
28. SEQ ID NO:44의 Gln1, Asp 26, Asp 27, Ser 30, Ser 31, Tyr 32, Tyr 33, His 50, Ser 52, Tyr 53, Ser 54, Ser 56, Ala 57, Asn 58, Trp 98 또는 Asp 99, SEQ ID NO:45의 Tyr33 또는 Trp 97, 또는 이들의 어떤 조합에 상응하는 잔기로부터 선택된 적어도 5개 잔기를 포함하는 파라토프를 포함하는, 전술한 구체예의 항체 또는 항원-결합 단편.
29. SEQ ID NO:44의 Gln1, Asp 26, Asp 27, Ser 30, Ser 31, Tyr 32, Tyr 33, His 50, Ser 52, Tyr 53, Ser 54, Ser 56, Ala 57, Asn 58, Trp 98 또는 Asp 99 및 SEQ ID NO:45의 Tyr33 또는 Trp 97에 상응하는 잔기를 포함하는 파라토프를 포함하는, 전술한 구체예의 항체 또는 항원-결합 단편.
30. (a) SEQ ID NO:48의 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1;
(b) SEQ ID NO:49의 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2; 및
(c) SEQ ID NO:50의 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3
을 포함하는, 어느 전술한 구체예의 항체 또는 항원-결합 단편.
31. (a) SEQ ID NO:51의 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1;
(b) SEQ ID NO:52의 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2; 및
(c) SEQ ID NO:53의 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3
을 포함하는, 전술한 구체예의 항체 또는 항원-결합 단편.
32. SEQ ID NO:44의 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 SEQ ID NO:45를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 어느 전술한 구체예의 항체 또는 항원-결합 단편.
33. VH5_51, D3_10_R3 및 JH4 유전자를 포함하는 일련의 인간 유전자의 산물이거나 또는 이로부터 유래된 중쇄 가변 영역, 및 VKIII_L6 및 JK1 유전자를 포함하는 일련의 인간 유전자의 산물이거나 또는 이로부터 유래된 경쇄 가변 영역을 포함하는, 1-25 중 어느 구체예의 항체 또는 항원-결합 단편.
34. (a) SEQ ID NO:54의 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1;
(b) SEQ ID NO:55의 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2; 및
(c) SEQ ID NO:56의 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3
을 포함하는, 전술한 구체예의 항체 또는 항원-결합 단편.
35. (a) SEQ ID NO:57의 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1;
(b) SEQ ID NO:58의 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2; 및
(c) SEQ ID NO:59의 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3
을 포함하는, 전술한 구체예의 항체 또는 항원-결합 단편.
36. SEQ ID NO:46의 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 SEQ ID NO:47의 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 전술한 구체예의 항체 또는 항원-결합 단편.
37. (a) SEQ ID NO:15의 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1;
(b) SEQ ID NO:16의 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2; 및
(c) SEQ ID NO:17의 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3
을 포함하는, 구체예 1의 항체 또는 항원-결합 단편.
38. (a) SEQ ID NO:18의 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1;
(b) SEQ ID NO:19의 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2; 및
(c) SEQ ID NO:20의 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3
을 포함하는, 전술한 구체예의 항체 또는 항원-결합 단편.
39. SEQ ID NO:11의 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 SEQ ID NO:12의 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 전술한 구체예의 항체 또는 항원-결합 단편.
40. (a) SEQ ID NO:21의 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1;
(b) SEQ ID NO:22의 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2; 및
(c) SEQ ID NO:23의 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3
을 포함하는, 구체예 1의 항체 또는 항원-결합 단편.
41. (a) SEQ ID NO:24의 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1;
(b) SEQ ID NO:25의 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2; 및
(c) SEQ ID NO:26의 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3
을 포함하는, 전술한 구체예의 항체 또는 항원-결합 단편.
42. SEQ ID NO:13의 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 SEQ ID NO:14의 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 전술한 구체예의 항체 또는 항원-결합 단편.
43. (a) SEQ ID NO:48의 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1;
(b) SEQ ID NO:49의 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2; 및
(c) SEQ ID NO:50의 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3
을 포함하는, 구체예 1의 항체 또는 항원-결합 단편.
44. (a) SEQ ID NO:51의 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1;
(b) SEQ ID NO:52의 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2; 및
(c) SEQ ID NO:53의 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3
을 포함하는, 전술한 구체예의 항체 또는 항원-결합 단편.
45. SEQ ID NO:44의 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 SEQ ID NO:45의 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 구체예 1의 항체 또는 항원-결합 단편.
46. (a) SEQ ID NO:54의 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1;
(b) SEQ ID NO:55의 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2; 및
(c) SEQ ID NO:56의 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3
을 포함하는, 구체예 1의 항체 또는 항원-결합 단편.
47. (a) SEQ ID NO:57의 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1;
(b) SEQ ID NO:58의 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2; 및
(c) SEQ ID NO:59의 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3
을 포함하는, 전술한 구체예의 항체 또는 항원-결합 단편.
48. SEQ ID NO:46의 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 SEQ ID NO:74의 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 전술한 구체예의 항체 또는 항원-결합 단편.
49. (a) SEQ ID NO:15, 21, 48 또는 54의 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1;
(b) SEQ ID NO:16, 22, 49 또는 55의 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2;
(c) SEQ ID NO:17, 23, 50 또는 56의 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3;
(d) SEQ ID NO:18, 24, 51 또는 57의 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1;
(e) SEQ ID NO:19, 25, 52 또는 58의 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2; 및
(f) SEQ ID NO:20, 26, 53 또는 59의 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3
을 포함하며, 8개 이하의 연속 아미노산 치환을 가진, 구체예 1의 항체 또는 항원-결합 단편.
50. 5개 이하의 아미노산 치환을 포함하는, 전술한 구체예의 항체 또는 항원-결합 단편.
51. 인간 항체인 어느 전술한 구체예의 항체.
52. 2가 항체인 어느 전술한 구체예의 항체 또는 항원-결합 단편.
53. IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 항체인 전술한 구체예의 항체.
54. IgG4 항체인 전술한 구체예의 항체.
55. VH 사슬에 S241P 돌연변이를 포함하는, 어느 전술한 구체예의 항체.
56. SEQ ID NO:7의 서열을 포함하는 중쇄 서열 및 SEQ ID NO:8의 서열을 포함하는 경쇄 서열을 포함하는 분리된 항체.
57. SEQ ID NO:9의 서열을 포함하는 중쇄 서열 및 SEQ ID NO:10의 서열을 포함하는 경쇄 서열을 포함하는 분리된 항체.
58. SEQ ID NO:40의 서열을 포함하는 중쇄 서열 및 SEQ ID NO:41의 서열을 포함하는 경쇄 서열을 포함하는 분리된 항체.
59. SEQ ID NO:42의 서열을 포함하는 중쇄 서열 및 SEQ ID NO:43의 서열을 포함하는 경쇄 서열을 포함하는 분리된 항체.
60. hNKG2D와의 결합에서 ON72, BAT221, 5C6, 1D11, ECM217, 또는 149810의 어느 것보다 16F16, 16F31, MS, 또는 21F2와 더 잘 경합하고, NKG2D-발현 NK 또는 T 세포의 NKG2D-매개 활성화를 방지하는 분리된 항체.
61. ON72, BAT221, 5C6, 1D11, ECM217, 또는 149810보다 MS와 더 잘 경합하는 전술한 구체예의 분리된 항체.
62. ON72, BAT221, 5C6, 1D11, ECM217, 또는 149810보다 21F2와 더 잘 경합하는, 구체예 60의 분리된 항체.
63. 제 1의 반 최대 유효 농도(EC50)로 NK-세포 제조물 상의 세포 표면-관련 hNKG2D와 결합하고, 제 2의 EC50으로 NK 세포 제조물에 의해 매개되는 NKG2D-리간드를 발현하는 표적 세포의 사멸을 감소시키며, 제 2의 EC50은 제 1의 EC50보다 실질적으로 더 낮은 분리된 항체.
64. NK-세포 제조물이 NK-92 또는 NKL 세포인, 전술한 구체예의 항체.
65. 리간드가 ULBP-3 또는 MICA인, 전술한 구체예의 항체.
66. 제 2의 EC50이 제 1 EC50의 80% 이하인, 전술한 구체예의 항체.
67. 제 2의 EC50이 제 1 EC50의 50% 이하인, 전술한 구체예의 항체.
68. 항체가 세포-표면 결합된 NKG2D를 실질적으로 포화시키는 농도보다 낮은 농도에서 리간드를 발현하는 표적 세포의 NK-세포 매개 사멸의 최대 감소를 달성하는 hNKG2D와 결합하는 분리된 항체.
69. hNKG2D와 결합하고, NKG2D-발현 NK 또는 T 세포의 NKG2D-매개 활성화를 방지하고, 세포-표면-결합된 NKG2D의 70% 이상 하향 조정할 수 있는 분리된 항체.
70. NK 세포의 세포-표면-결합된 NKG2D의 90% 미만 하향 조정할 수 있는, 전술한 구체예의 항체.
71. hNKG2D와 결합하고, 유사한 친화성으로 인간 및 사이노몰거스 NKG2D-발현 세포와 결합하는 분리된 항체.
72. PBMC 제조물 중의 사이노몰거스 CD8+ T 세포와 결합하는데 대한 EC50이 PBMC 제조물 중의 인간 CD8+ T 세포와 결합하는데 대한 EC50의 적어도 50%인, 전술한 구체예의 항체.
73. PBMC 제조물 중의 사이노몰거스 CD8+ T 세포와 결합하는데 대한 EC50이 PBMC 제조물 중의 인간 CD8+ T 세포와 결합하는데 대한 EC50의 적어도 65%인, 전술한 구체예의 항체.
74. 0.1nM 이하의 인간 NKG2D에 대한 친화성을 가진, 어느 전술한 구체예의 분리된 항체.
75. 10pM 이하의 인간 NKG2D에 대한 친화성을 가진, 어느 전술한 구체예의 분리된 항체.
76. (a) SEQ ID NO:48 또는 54의 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1;
(b) SEQ ID NO:49 또는 55의 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2; 및
(c) SEQ ID NO:50 또는 56의 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1
를 포함하는, 60-75 중 어느 구체예의 항체.
77. (a) SEQ ID NO:51 또는 57의 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1;
(b) SEQ ID NO:52 또는 58의 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1; 및
(c) SEQ ID NO:53 또는 59의 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1
를 포함하는, 전술한 구체예의 항체.
78. 인간 항체인 60-77 중 어느 구체예의 항체.
79. 60-78 중 어느 구체예의 항체의 항원-결합 단편.
80. 어느 전술한 구체예의 항체 또는 항원 결합 단편의 가변 중쇄 또는 가변 경쇄를 암호화하는 핵산.
81. 전술한 구체예의 핵산을 포함하는 발현 벡터.
82. 전술한 구체예의 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포.
83. 1-79 중 어느 구체예의 항체 또는 항원-결합 단편을 생산하는 숙주 세포.
84. CHO 세포인 82-83 중 어느 구체예의 숙주 세포.
85. 적합한 조건에서 82-84 중 어느 구체예의 숙주 세포를 배양하는 단계 및 상기 항체 또는 그것의 항원-결합 단편을 회수하는 단계를 포함하는 항-NKG2D 항체 또는 항원-결합 단편의 제조 방법.
86. (a) SEQ ID NO:15, 21, 48 및 54로부터 선택된 CDR1 서열, SEQ ID NO: 16, 22, 49 및 55로부터 선택된 CDR2 서열, 및 SEQ ID NO:17, 23, 50 및 56으로부터 선택된 CDR3 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 제공하는 단계;
(b) SEQ ID NO:18, 24, 51 및 57로부터 선택된 CDR1 서열, SEQ ID NO:19, 25, 52 및 58로부터 선택된 CDR2 서열, 및 SEQ ID NO:20, 26, 53 및 59로부터 선택된 CDR3 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 제공하는 단계;
(c) 중쇄 및 경쇄 가변 영역에서 각각 8개 이하의 아미노산 잔기를 변경하여 변경된 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 만드는 단계; 및
(d) 숙주 세포에서 변경된 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 변이체 항-NKG2D 항체를 발현하는 단계
를 포함하는, 변이체 항-NKG2D 항체, 또는 그것의 항원 결합 단편의 제조 방법.
87. 치료제에 연결된 1-79 중 어느 구체예의 항체 또는 항원-결합 단편을 포함하는 면역 콘쥬게이트.
88. 항체와 다른 결합 특이성을 가진 제 2 부분에 연결된 1-79 중 어느 구체예의 항체 또는 항원-결합 단편을 포함하는 다중특이성 분자.
89. 제 2 부분이 제 2 항체, 또는 그것의 항원-결합 단편인, 전술한 구체예의 다중 특이적 분자.
90. 1-79 중 어느 구체예의 항체 또는 항원-결합 단편 및 제약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조성물.
91. NK 또는 T 세포를 1-79 중 어느 구체예의 항체 또는 항원-결합 단편과 접촉시키는 단계를 포함하며, 항체 또는 항원-결합 단편이 NKG2D와의 결합에 있어서 적어도 하나의 NKG2D 리간드와 경합하는, NKG2D-발현 NK 또는 T 세포의 NKG2D-매개 활성화를 방지하는 방법.
92. NKG2D 리간드가 MICA인, 전술한 구체예의 방법.
93. NK 또는 T 세포를 1-79 중 어느 구체예의 항체 또는 항원-결합 단편과 접촉시키는 단계를 포함하며, 항체 또는 항원-결합 단편이 인간 NKG2D와의 결합에 있어서 적어도 하나의 NKG2D 리간드와 경합하는, NKG2D-발현 NK 또는 T 세포의 표면에서 NKG2D의 양을 감소시키는 방법.
94. 염증 또는 자가면역 장애를 앓고 있거나 그럴 위험이 있는 인간 피험자에게 투여하는 구체예 90의 조성물을 단계를 포함하는, 염증 또는 자가면역 장애의 치료 방법.
95. 환자가 자가면역 장애를 앓고 있거나 그럴 위험이 있는, 전술한 구체예의 방법.
96. 자가면역 장애가 류마티스 관절염인, 전술한 구체예의 방법.
97. 장애가 다발성 경화증인, 구체예 95의 방법.
98. 장애가 전신 홍반성 루푸스(SLE)인 구체예 95의 방법.
99. 장애가 건선인, 구체예 95의 방법.
100. 장애가 셀리악병인, 구체예 95의 방법.
101. 장애가 염증성 장 질환인, 구체예 95의 방법.
102. 염증성 장 질환인 궤양성 대장염인, 전술한 구체예의 방법.
103. 염증성 장 질환인 크론병인, 구체예 101의 방법.
104. 인간 피험자가 이식 거부 또는 이식편대숙주병을 앓고 있거나 그럴 위험이 있는, 구체예 94의 방법.
105. 이식이 심장 이식 또는 골수 이식인, 전술한 구체예의 방법.
106. 제 2의 항염제를 투여하는 단계를 더 포함하는, 94-105 중 어느 구체예의 방법.
107. 제 2의 항염제가 면역억제제, 진통제, 항혈관형성제, 코르티코스테로이드, B-세포 고갈제, B-세포 길항제, T-세포 길항제, 보체-억제제, 항사이토카인제, 및 항-사이토카인 수용체 제제, 및 이들의 조합으로부터 선택되는, 전술한 구체예의 방법.
108. 제 2의 항염제가 TNK알파 활성의 길항제인, 106-107 중 어느 구체예의 방법.
109. 염증 또는 자가면역 장애의 위험이 있는 인간 피험자에게 구체예 90의 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 염증 또는 자가면역 장애의 치료 방법.
110. 인간 피험자가 이식 거부 또는 이식편대숙주병의 위험이 있는, 전술한 구체예의 방법.
111. 인간 피험자에서 염증 또는 자가면역 장애를 치료하기 위한 의약의 제조에서 1-79 중 어느 구체예의 항체 또는 항원-결합 단편의 사용.
112. 인간 피험자에서 염증 또는 자가면역 장애를 치료하는데 사용되는, 1-79 중 어느 구체예의 항체 또는 항원-결합 단편.
여기 인용된 출판물, 특허출원 및 특허를 포함하는 모든 참고문헌은 각 참고문헌이 참고로서 포함되는 것을 개별적으로 그리고 구체적으로 나타낸 정도까지 그리고 전문으로 제시된 정도까지 본원에 참고자료로서 포함된다.
모든 표제와 부제는 편의를 위해서 사용되며, 어떤 식으로도 본 발명을 제한하지 않는다.
상기 설명된 요소들의 그것의 모든 가능한 변형의 어떤 조합도 본원에 달리 지시되거나 문맥상 분명히 모순되지 않는다면 본 발명에 포함된다.
본 발명을 설명하는 문맥에서 사용된 용어 "한", 및 "그" 및 유사한 단수형은 본원에 달리 지시되거나 문맥상 분명히 모순되지 않는다면 단수 및 복수를 모두 포함한다.
본원에서 달리 지시되지 않는다면 본원에서 수치 범위의 서술은 단순히 범위에 들어가는 각 개별 값을 개별적으로 언급하는 것의 속기 방법으로서만 소용되도록 의도되며, 각 개별 값은 그것이 본원에 개별적으로 인용된 것과 마찬가지로 본 명세서에 포함된다. 달리 말하지 않는다면, 본원에서 제공된 모든 정확한 값들은 상응하는 대략적인 값을 표시한다(예를 들어, 특정 인자 또는 측정과 관련하여 제공된 모든 정확한 예시적인 값들은 적합한 경우, "약"이라는 수식어와 함께 상응하는 대략적인 측정치도 제공하도록 고려될 수 있다).
여기 설명된 모든 방법은 달리 지시되거나 문맥상 분명히 모순되지 않는다면 어떤 적합한 순서로도 수행될 수 있다.
본원에서 제공된 임의의 및 모든 예들, 또는 예시적인 말(예를 들어, "와 같은")의 사용은 단순히 본 발명을 더 잘 예시하려는 의도이며, 달리 언급되지 않는다면 본 발명의 범위를 제한하지 않는다. 본 명세서의 말은 훨씬 명백히 서술되지 않는다면 어떤 요소가 본 발명의 실시에 필수적임을 나타내는 것으로서 구성되지는 않는다.
본원에서 특허 문헌의 인용 및 포함은 편의상 이루어지며, 이러한 특허 문헌의 유효성, 특허성 및/또는 강제성의 어떤 측면을 반영하지 않는다.
요소 또는 요소들과 관련하여 "포함하는", "가지는", "비롯한" 또는 "함유하는"과 같은 용어들을 사용하여 본 발명의 어떤 양태나 구체예를 설명한 것은 달리 언급되거나 문맥상 분명히 모순되지 않는다면 그 특정 요소 또는 요소들"로 구성되는", "로 본질적으로 구성되는" 또는 "실질적으로 포함하는" 본 발명의 유사한 양태나 구체예에 대한 뒷받침을 제공하도록 의도된다(예를 들어, 특정 요소를 포함한다고 설명된 조성물은 달리 언급되거나 문맥상 분명히 모순되지 않는다면 또한 그 요소로 구성되는 조성물을 설명한다고 이해되어야 한다).
본 발명은 이용가능한 법에 의해 허용되는 최대 범위까지 본원에 제시된 양태 또는 청구항들에 인용된 대상의 모든 변형 및 동등물을 포함한다.
SEQUENCE LISTING <110> Novo Nordisk A/S <120> ANTIBODIES AGAINST HUMAN NKG2D AND USES THEREOF <130> 7923.504-WO <160> 71 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1770 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 gaggagtgga ttacatattc caacagttgt tattacattg gtaaggaaag aagaacttgg 60 gaagaaagag tttgctggcc tgtgcttcga agaactctga tctgctttct atagataatg 120 aggaagaaat ggtatgtgtg gggacttccc agttggctgt aagttgccat ttgaactaaa 180 cgaaatagat caggaactga ggacatatct aaattttcta gttttataga aggcttttat 240 ccacaagaat caagatcttc cctctctgag caggaatcct ttgtgcattg aagactttag 300 attcctctct gcggtagacg tgcacttata agtatttgat ggggtggatt cgtggtcgga 360 ggtctcgaca cagctgggag atgagtgaat ttcataatta taacttggat ctgaagaaga 420 gtgatttttc aacacgatgg caaaagcaaa gatgtccagt agtcaaaagc aaatgtagag 480 aaaatgcatc tccatttttt ttctgctgct tcatcgctgt agccatggga atccgtttca 540 ttattatggt agcaatatgg agtgctgtat tcctaaactc attattcaac caagaagttc 600 aaattccctt gaccgaaagt tactgtggcc catgtcctaa aaactggata tgttacaaaa 660 ataactgcta ccaatttttt gatgagagta aaaactggta tgagagccag gcttcttgta 720 tgtctcaaaa tgccagcctt ctgaaagtat acagcaaaga ggaccaggat ttacttaaac 780 tggtgaagtc atatcattgg atgggactag tacacattcc aacaaatgga tcttggcagt 840 gggaagatgg ctccattctc tcacccaacc tactaacaat aattgaaatg cagaagggag 900 actgtgcact ctatgcctcg agctttaaag gctatataga aaactgttca actccaaata 960 catacatctg catgcaaagg actgtgtaaa gatgatcaac catctcaata aaagccagga 1020 acagagaaga gattacacca gcggtaacac tgccaaccga gactaaagga aacaaacaaa 1080 aacaggacaa aatgaccaaa gactgtcaga tttcttagac tccacaggac caaaccatag 1140 aacaatttca ctgcaaacat gcatgattct ccaagacaaa agaagagaga tcctaaaggc 1200 aattcagata tccccaaggc tgcctctccc accacaagcc cagagtggat gggctggggg 1260 aggggtgctg ttttaatttc taaaggtagg accaacaccc aggggatcag tgaaggaaga 1320 gaaggccagc agatcagtga gagtgcaacc ccaccctcca caggaaattg cctcatgggc 1380 agggccacag cagagagaca cagcatgggc agtgccttcc ctgcctgtgg gggtcatgct 1440 gccactttta atgggtcctc cacccaacgg ggtcagggag gtggtgctgc cccagtgggc 1500 catgattatc ttaaaggcat tattctccag ccttaagatc ttaggacgtt tcctttgcta 1560 tgatttgtac ttgcttgagt cccatgactg tttctcttcc tctctttctt ccttttggaa 1620 tagtaatatc catcctatgt ttgtcccact attgtatttt ggaagcacat aacttgtttg 1680 gtttcacagg ttcacagtta agaaggaatt ttgcctctga ataaatagaa tcttgagtct 1740 catgcaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1770 <210> 2 <211> 216 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Gly Trp Ile Arg Gly Arg Arg Ser Arg His Ser Trp Glu Met Ser 1 5 10 15 Glu Phe His Asn Tyr Asn Leu Asp Leu Lys Lys Ser Asp Phe Ser Thr 20 25 30 Arg Trp Gln Lys Gln Arg Cys Pro Val Val Lys Ser Lys Cys Arg Glu 35 40 45 Asn Ala Ser Pro Phe Phe Phe Cys Cys Phe Ile Ala Val Ala Met Gly 50 55 60 Ile Arg Phe Ile Ile Met Val Ala Ile Trp Ser Ala Val Phe Leu Asn 65 70 75 80 Ser Leu Phe Asn Gln Glu Val Gln Ile Pro Leu Thr Glu Ser Tyr Cys 85 90 95 Gly Pro Cys Pro Lys Asn Trp Ile Cys Tyr Lys Asn Asn Cys Tyr Gln 100 105 110 Phe Phe Asp Glu Ser Lys Asn Trp Tyr Glu Ser Gln Ala Ser Cys Met 115 120 125 Ser Gln Asn Ala Ser Leu Leu Lys Val Tyr Ser Lys Glu Asp Gln 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gaccagcggc gtgcacacct tcccggctgt cctacagtcc 540 tcaggactct actccctcag cagcgtggtg accgtgccct ccagcagctt gggcacgaag 600 acctacacct gcaacgtaga tcacaagccc agcaacacca aggtggacaa gagagttgag 660 tccaaatatg gtcccccatg cccaccatgc ccagcacctg agttcctggg gggaccatca 720 gtcttcctgt tccccccaaa acccaaggac actctcatga tctcccggac ccctgaggtc 780 acgtgcgtgg tggtggacgt gagccaggaa gaccccgagg tccagttcaa ctggtacgtg 840 gatggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca aagccgcggg aggagcagtt caacagcacg 900 taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg caccaggact ggctgaacgg caaggagtac 960 aagtgcaagg tctccaacaa aggcctcccg tcctccatcg agaaaaccat ctccaaagcc 1020 aaagggcagc cccgagagcc acaggtgtac accctgcccc catcccagga ggagatgacc 1080 aagaaccagg tcagcctgac ctgcctggtc aaaggcttct accccagcga catcgccgtg 1140 gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac 1200 tccgacggct ccttcttcct ctacagcagg ctaaccgtgg acaagagcag gtggcaggag 1260 gggaatgtct tctcatgctc cgtgatgcat gaggctctgc acaaccacta cacacagaag 1320 agcctctccc tgtctctggg taaa 1344 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ccagggaagg ggctggagtg ggtctctggt attaattgga atggtggtag cacaggttat 180 gcagactctg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa ctccctgtat 240 ctgcaaatga acagtctgag agccgaggac acggccttgt attactgtgc gagagagagg 300 gagttatact actactacta cggtttggac gtctggggcc aagggaccac ggtcaccgtc 360 tcctcagcta gcaccaaggg cccatccgtc ttccccctgg cgccctgctc caggagcacc 420 tccgagagca cagccgccct gggctgcctg gtcaaggact acttccccga accggtgacg 480 gtgtcgtgga actcaggcgc cctgaccagc ggcgtgcaca ccttcccggc tgtcctacag 540 tcctcaggac tctactccct cagcagcgtg gtgaccgtgc cctccagcag cttgggcacg 600 aagacctaca cctgcaacgt agatcacaag cccagcaaca ccaaggtgga caagagagtt 660 gagtccaaat atggtccccc atgcccacca tgcccagcac ctgagttcct ggggggacca 720 tcagtcttcc tgttcccccc aaaacccaag gacactctca tgatctcccg gacccctgag 780 gtcacgtgcg tggtggtgga cgtgagccag gaagaccccg aggtccagtt caactggtac 840 gtggatggcg tggaggtgca taatgccaag acaaagccgc gggaggagca gttcaacagc 900 acgtaccgtg tggtcagcgt cctcaccgtc ctgcaccagg actggctgaa cggcaaggag 960 tacaagtgca aggtctccaa caaaggcctc ccgtcctcca tcgagaaaac catctccaaa 1020 gccaaagggc agccccgaga gccacaggtg tacaccctgc ccccatccca ggaggagatg 1080 accaagaacc aggtcagcct gacctgcctg gtcaaaggct tctaccccag cgacatcgcc 1140 gtggagtggg agagcaatgg gcagccggag aacaactaca agaccacgcc tcccgtgctg 1200 gactccgacg gctccttctt cctctacagc aggctaaccg tggacaagag caggtggcag 1260 gaggggaatg tcttctcatg ctccgtgatg catgaggctc tgcacaacca ctacacacag 1320 aagagcctct ccctgtctct gggtaaa 1347 <210> 6 <211> 645 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 6 gaaattgtgt tgacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60 ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agcagctact tagcctggta ccagcagaaa 120 cctggccagg ctcccaggct cctcatctat ggtgcatcca gcagggccac tggcatccca 180 gacaggttca gtggcagtgg gtctgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag 240 cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagtatggta gctcaccatt cactttcggc 300 cctgggacca aagtggatat caaacgtacg gtggctgcac catctgtctt catcttcccg 360 ccatctgatg agcagttgaa atctggaact gcctctgttg tgtgcctgct gaataacttc 420 tatcccagag aggccaaagt acagtggaag gtggataacg ccctccaatc gggtaactcc 480 caggagagtg tcacagagca ggacagcaag gacagcacct acagcctcag cagcaccctg 540 acgctgagca aagcagacta cgagaaacac aaagtctacg cctgcgaagt cacccatcag 600 ggcctgagct cgcccgtcac aaagagcttc aacaggggag agtgt 645 <210> 7 <211> 448 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Thr Ser Ser Ser Ser Tyr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Arg Arg Tyr Phe Asp Trp Phe Pro Leu Asp Tyr Arg Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser 115 120 125 Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala 130 135 140 Ala Leu Gly 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Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser 20 25 30 Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80 Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro 85 90 95 Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 62 <211> 122 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 62 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe 50 55 60 Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ile Thr Met Val Arg Gly Val Ile Ile Tyr Phe Asp Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 63 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 63 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 64 <211> 97 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 64 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Tyr 20 25 30 Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys 50 55 60 Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu 65 70 75 80 Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg <210> 65 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 65 Asp Ala Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 1 5 10 15 <210> 66 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 66 Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 1 5 10 <210> 67 <211> 98 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 67 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe 50 55 60 Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg <210> 68 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 68 Ile Thr Met Val Arg Gly Val Ile Ile 1 5 <210> 69 <211> 95 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 69 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro 85 90 95 <210> 70 <211> 220 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Humanized sequence <400> 70 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Glu Ile Asp Pro Ser Asp Ile Tyr Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Ile Tyr Asp Gly Tyr Tyr Val Tyr Gly Met Asp Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro 115 120 125 Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr 130 135 140 Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr 145 150 155 160 Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro 165 170 175 Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr 180 185 190 Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp 195 200 205 His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val 210 215 220 <210> 71 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Humanized sequence <400> 71 Tyr Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ser Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Lys Thr Leu Pro Arg 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210

Claims (15)

  1. 인간 NKG2D (hNKG2D)와 결합하는 분리된 인간 모노클로날 항체 또는 그것의 항원-결합 단편으로서,
    I.
    (i) SEQ ID NO:48의 서열로 이루어진 중쇄 가변 영역 CDR1,
    (ii) SEQ ID NO:49의 서열로 이루어진 중쇄 가변 영역 CDR2,
    (iii) SEQ ID NO:50의 서열로 이루어진 중쇄 가변 영역 CDR3,
    및,
    (iv) SEQ ID NO:51의 서열로 이루어진 경쇄 가변 영역 CDR1,
    (v) SEQ ID NO:52의 서열로 이루어진 경쇄 가변 영역 CDR2,
    (vi) SEQ ID NO:53의 서열로 이루어진 경쇄 가변 영역 CDR3; 또는
    II.
    (i) SEQ ID NO:54의 서열로 이루어진 중쇄 가변 영역 CDR1,
    (ii) SEQ ID NO:55의 서열로 이루어진 중쇄 가변 영역 CDR2,
    (iii) SEQ ID NO:56의 서열로 이루어진 중쇄 가변 영역 CDR3,
    및,
    (iv) SEQ ID NO:57의 서열로 이루어진 경쇄 가변 영역 CDR1,
    (v) SEQ ID NO:58의 서열로 이루어진 경쇄 가변 영역 CDR2,
    (vi) SEQ ID NO:59의 서열로 이루어진 경쇄 가변 영역 CDR3
    을 포함하는 항체 또는 그것의 항원-결합 단편.
  2. 제 1 항에 있어서,
    (1) SEQ ID NO:44의 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO:45의 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역; 또는
    (2) SEQ ID NO:46의 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO:47의 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역
    을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 그것의 항원-결합 단편.
  3. 제 1 항에 있어서,
    (a) hNKG2D-발현 NK 또는 T 세포의 hNKG2D-매개 활성화의 감소;
    (b) hNKG2D와의 결합에서 MICA와 경합;
    (c) NKG2D-발현 NK 또는 T 세포의 표면에서 NKG2D 양의 감소; 및
    (d) 고정되었을 때, 말초혈 단핵세포(PBMCs)의 CD3-촉발 증식의 유의한 동시-자극 부재
    로부터 선택된 하나 이상의 특성을 가지는 항체 또는 그것의 항원-결합 단편.
  4. 제 3 항에 있어서, 상기 항체는 추가로
    (e) 사이노몰거스 및 레서스 NKG2D와 결합; 및
    (f) 1nM 이하의 KD로 hNKG2D와 결합
    으로부터 선택된 하나 이상의 특성을 가지는 항체 또는 그것의 항원-결합 단편.
  5. 제 1 항에 있어서, 상기 항체는 NKG2D-발현 NK 또는 T 세포에 첨가되었을 때 hNKG2D와 결합하고 2개 이하의 hNKG2D 다이머와 가교-결합하는 항체 또는 그것의 항원-결합 단편.
  6. 제 5 항에 있어서, hNKG2D 다이머의 제 1 hNKG2D 모노머와 결합되었을 때, 상기 항체가 제 2 hNKG2D 모노머와 항체 또는 항원-결합 단편의 결합을 차단하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 그것의 항원-결합 단편.
  7. 제 6 항에 있어서, hNKG2D 다이머에서 제 1 및 제 2 hNKG2D 모노머 상의 용매-배제 면적의 비가 약 2:1 이상인 것을 특징으로 하는 항체 또는 그것의 항원-결합 단편.
  8. 제 5 항에 있어서, 상기 항체는 인간 항체 또는 인간화된 항체인 것을 특징으로 하는 항체 또는 그것의 항원-결합 단편.
  9. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항의 항체 또는 그것의 항원-결합 단편을 암호화하는 핵산을 포함하는 숙주 세포를 배양하는 단계, 및 상기 항체 또는 그것의 항원-결합 단편을 회수하는 단계를 포함하는, 항-NKG2D 항체, 또는 그것의 항원-결합 단편의 제조 방법.
  10. 삭제
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