CN107438622A - 选择结合抗原的轻链可变区的非人动物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了非人动物，细胞，用于制备以及使用所述非人动物、细胞的方法和组合物，其中所述非人动物和细胞包含包括未重排人免疫球蛋白轻链基因区段的免疫球蛋白重链基因座，和包括单重排人轻链可变区核苷酸序列的免疫球蛋白轻链基因座。未重排人轻链基因区段可以可操作地连接至重链恒定区核苷酸序列并且重排人免疫球蛋白轻链可变区核苷酸序列可以可操作地连接至轻链恒定区核苷酸序列。本发明还提供了用于获得核酸序列的方法，所述核酸序列编码免疫球蛋白轻链可变结构域，所述免疫球蛋白轻链可变结构域能够在不存在同源可变结构域的情况下结合抗原，并且在宿主细胞中表达此类核酸序列，例如，以生成多特异性抗原结合蛋白。

Description

选择结合抗原的轻链可变区的非人动物
相关申请的交叉引用
本申请根据35U.S.C.§119(e)要求2015年3月19日提交的美国临时专利申请序列号62/135,419的权益，该专利申请以引用形式并入本文。
序列表
序列表的正式副本经由EFS-网以ASCII格式序列表形式以电子格式同时提交，其中文件名为2016-03-18-1150WO01-SEQ-LIST_ST25.txt，创建日期为2016年3月18日，并且大小为约8.62千字节。该ASCII格式文档中所含的序列表是本说明书的一部分，并且全文以引用的方式并入本文。
技术领域
本文提供了免疫球蛋白轻链可变(VL/CHxULC)结构域，其源于与通用轻链同源的免疫球蛋白杂交链，并且可独立于(例如不存在)通用轻链的同源可变结构域来结合抗原，表达VL/CHxULC结构域的经遗传修饰的非人动物和细胞、编码VL/CHxULC结构域的核酸、包含一个或多个VL/CHxULC结构域的抗原结合蛋白(例如多特异性抗原结合蛋白)，以及生成包含一个或多个VL/CHxULC结构域的抗原结合蛋白(例如多特异性抗原结合蛋白)体外方法。
背景技术
多种有前景的新型诊断和治疗是生物制剂，其通常基于传统的抗体形式。然而，传统的基于抗体的设计可受限制，因为抗原结合通常需要抗体分子，所述抗体分子包含四个多肽：两个相同的免疫球蛋白重链和两个相同的免疫球蛋白轻链。本发明包括如下认识：仍然需要基于免疫球蛋白的治疗设计的改善和多样化。
发明内容
本发明提供用于开发、制备和/或使用基于免疫球蛋白形式的抗原结合蛋白的改善的技术。本发明包括如下认识：常规基于抗体的形式对所述技术施加特定限制。例如，本发明认识到要求抗原结合位点由重链和轻链可变结构域构成可限制可相对于一些抗原决定簇实现的可用亲和力和/或特异性。
本发明提供解决这些问题的技术。此外，本发明提供基因工程化非人动物，所述非人动物表达“通用”或“共用”免疫球蛋白轻链可变结构域并且可用于例如开发和/或制备新型抗原结合蛋白形式。另外，本发明令人惊奇地展示使用此类表达通用免疫球蛋白轻链的动物可指导配偶体免疫球蛋白链的选择，所述配偶体免疫球蛋白链的可变结构域结合特征可在抗原结合位点内成为主导，即使在配偶体(或同源)免疫球蛋白链的可变结构域为轻链可变结构域时。因此，与本领域的预期相反，本发明展示可能开发免疫球蛋白轻链可变区，其确定或控制它们参与其中(例如，当与通用轻链可变结构域缔合时和/或在不存在(即独立于)同源通用轻链可变结构域的情况下结合抗原)的抗原结合位点的特异性和/或亲和力。
因此，在一些实施方案中，本发明提供抗原结合蛋白，包括多特异性抗原结合蛋白，其包含一个或多个免疫球蛋白轻链可变结构域，所述免疫球蛋白轻链可变结构域在与通用轻链可变结构域缔合时和/或独立于同源通用轻链可变结构域时结合抗原。本发明还提供了用于开发、生产和/或使用此类免疫球蛋白轻链可变结构域序列的技术，例如非人动物和体外重组方法，其中抗原特异性和亲和力仅仅或主要由免疫球蛋白轻链可变结构域多样性导致，和/或仅仅或主要存在于免疫球蛋白轻链可变结构域多样性中。
本文所述的各个方面和实施方案部分基于以下令人惊讶的发现：表达包含可操作地连接至重链恒定区的免疫球蛋白轻链可变结构域和由重排轻链可变区基因序列(例如，重排轻链VLJL序列)编码的免疫球蛋白轻链可变结构域的结合蛋白的经遗传修饰的非人动物可解决本文认识到的各种问题和/或可提供令人惊讶的结果。其基因组包括下列的非人动物可将抗体多样化的机制集中于可操作地连接至重链恒定区的未重排(即，多样化的)的免疫球蛋白轻链可变基因区段：(i)杂交免疫球蛋白链基因座，其包含例如在内源性重链基因座处可操作地连接至重链恒定区序列的未重排人轻链基因区段(例如，VL和JL基因区段)，和(ii)免疫球蛋白轻链基因座，其包含可操作地连接至轻链恒定基因的重排免疫球蛋白轻链可变序列(例如，单重排免疫球蛋白轻链可变区序列，例如通用轻链可变区序列)。在重排时，未重排人轻链基因区段形成轻链可变区基因序列，所述轻链可变区基因序列可操作地连接至重链恒定区基因序列以形成编码免疫球蛋白杂交链的序列，即免疫球蛋白多肽包含与重链恒定区融合的轻链可变结构域。具有本文所述的基因组的非人动物能够生成抗原结合蛋白，所述抗原结合蛋白包含二聚体免疫球蛋白杂交链，其各自以典型的四聚体抗体形式与同源通用轻链缔合，其中免疫球蛋白杂交链包含轻链可变结构域，所述轻链可变结构域与通用轻链的轻链可变结构域(例如，VL/CHxULC可变结构域)同源。
如本文所示，源于免疫球蛋白杂交链(例如，由编码免疫球蛋白杂交链的可变结构域的VL/JL基因序列编码)且与通用轻链可变结构域同源的轻链可变VL/CHxULC结构域能够在存在或不存在同源通用轻链可变结构域的情况下结合感兴趣的抗原。VL/CHxULC结构域源于其的免疫球蛋白杂交链优选体细胞超突变并且不是单结构域抗体，例如优选具有重链恒定区，所述重链恒定区具有选自IgD、IgG、IgE和IgA的同种型并且包含功能性CH1结构域。在与特异性针对不同表位的第二非同源可变结构域缔合时，并且不考虑可变VL/CHxULC结构域可操作地融合至重链恒定区还是轻链恒定区，此类可变VL/CHxULC结构域也能够结合抗原。
因此，本文提供了抗原结合蛋白，所述抗原结合蛋白包含至少第一结合组分，所述第一结合组分包含免疫球蛋白轻链可变结构域，例如轻链可变VL/CHxULC结构域，其中所述VL/CHxULC结构域：(1)源于由可操作地连接至一个或多个重链恒定区基因(例如Igμ、Igδ、Igγ、Igα和/或Igε)的轻链序列编码的免疫球蛋白杂交链，所述重链恒定区基因中的每一个包含编码功能性CH1结构域的核苷酸序列，和(2)与由可操作地连接至轻链恒定区基因的重排轻链序列编码的通用轻链同源。
在一些实施方案中，轻链可变VL/CHxULC结构域为VκOHxULC结构域，例如源于和/或由κ轻链可变区核苷酸序列编码，例如，人κ轻链可变区核苷酸序列，例如Vκ1-5、Vκ1-6、Vκ1-8、Vκ1-9、Vκ1-12、Vκ1-13、Vκ1-16、Vκ1-17、Vκ1-22、Vκ1-27、Vκ1-32、Vκ1-33、Vκ1-35、Vκ1-37、Vκ1-39、Vκ1D-8、Vκ1D-12、Vκ1D-13、Vκ1D-16、Vκ1D-17、Vκ1D-22、Vκ1D-27、Vκ1D-32、Vκ1D-33、Vκ1D-35、Vκ1D-37、Vκ1D-39、Vκ1D-42、Vκ1D-43、Vκ1-NL1、Vκ2-4、Vκ2-10、Vκ2-14、Vκ2-18、Vκ2-19、Vκ2-23、Vκ2-24、Vκ2-26、Vκ2-28、Vκ2-29、Vκ2-30、Vκ2-36、Vκ2-38、Vκ2-40、Vκ2D-10、Vκ2D-14、Vκ2D-18、Vκ2D-19、Vκ2D-23、Vκ2D-24、Vκ2D-26、Vκ2D-28、Vκ2D-29、Vκ2D-30、Vκ2D-36、Vκ2D-38、Vκ2D-40、Vκ3-7、Vκ3-11、Vκ3-15、Vκ3-20、Vκ3-25、Vκ3-31、Vκ3-34、Vκ3D-7、Vκ3D-7、Vκ3D-11、Vκ3D-15、Vκ3D-15、Vκ3D-20、Vκ3D-25、Vκ3D-31、Vκ3D-34、Vκ3-NL1、Vκ3-NL2、Vκ3-NL3、Vκ3-NL4、Vκ3-NL5、Vκ4-1、Vκ5-2、Vκ6-21、Vκ6D-21、Vκ6D-41、或Vκ7-3基因区段序列，其可与(人)Jκ1、Jκ2、Jκ3、Jκ4、或Jκ5基因区段重排，或它们的体细胞超突变变体。在一些实施方案中，轻链可变VL/CHxULC结构域为VλOHxULC结构域，例如源于和/或由λ轻链可变区核苷酸序列编码，例如，人λ轻链可变区核苷酸序列，例如Vλ3-1、Vλ4-3、Vλ2-8、Vλ3-9、Vλ3-10、Vλ2-11、Vλ3-12、Vλ2-14、Vλ3-16、Vλ2-18、Vλ3-19、Vλ3-21、Vλ3-22、Vλ2-23、Vλ3-25、Vλ3-27、Vλ1-36、Vλ5-37、Vλ5-39、Vλ1-40、Vλ7-43、Vλ1-44、Vλ5-45、Vλ7-46、Vλ1-47、Vλ9-49、Vλ1-51、Vλ5-52、Vλ6-57、Vλ4-60、Vλ8-61或Vλ4-69基因区段序列，其可与(人)Jλ1、Jλ2、Jλ3或Jλ7基因区段序列重排，或它们的体细胞超突变变体。
值得注意的是，未重排免疫球蛋白VL和JL基因区段的杂交免疫球蛋白基因座中的重排可产生重排免疫球蛋白轻链可变VL/CHxULC结构域，其编码包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个N加成物的基因序列。在一个实施方案中，在编码VL/CHxULC结构域的重排免疫球蛋白轻链基因中观察到的N加成物和/或体细胞突变体比在内源性轻链基因座处重排的重排轻链可变序列(源于相同的VL基因片段和相同的JL基因片段)中观察到的N加成物和/或体细胞突变体数多1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍或至少5倍。与由内源性轻链基因座处重组的VL/JL基因序列编码的轻链可变VL结构域相比，VL/CHxULC编码基因序列中的增加的N加成物可编码CDR3中具有更多氨基酸的轻链可变VL/CHxULC结构域。因此，在一些实施方案中，本文所提供的抗原结合蛋白包含免疫球蛋白轻链可变VL/CHxULC结构域，其中所述可变VL/CHxULC结构域包含具有9、10、11、12或更多个氨基酸长度的CDR3。在一些实施方案中，VL/CHxULC结构域包含长度为9个氨基酸的CDR3。在一些实施方案中，VL/CHxULC结构域包含长度为10个氨基酸的CDR3。在一些实施方案中，VL/CHxULC结构域包含长度为11个氨基酸的CDR3。在一些实施方案中，VL/CHxULC结构域包含长度为12个氨基酸的CDR3。
在优选的实施方案中，如本文所述的抗原结合蛋白不是单结构域结合蛋白，例如不是仅重链结合蛋白。因此，在一些实施方案中，如本文所述的第一结合组分包含轻链可变VL/CHxULC结构域，其融合至恒定区，例如包含至少功能性CH1结构域或轻链恒定结构域的重链恒定区，其中可变VL/CHxULC结构域源于免疫球蛋白杂交链，所述免疫球蛋白杂交链(1)包含功能性CH1结构域和(2)与通用轻链同源，例如，其中所述免疫球蛋白轻链可变VL/CHxULC结构域为可操作地连接至编码至少功能性CH1结构域的重链恒定区基因序列并且因此可包含长度为9、10、11、12或更多个氨基酸的CDR3的VκOHxULC或VλOHxULC结构域(分别由重排的(人)Vκ/Jκ或Vλ/Jλ序列编码)。
因此，在一些实施方案中，如本文所述的抗原结合蛋白包含至少第一结合组分，所述第一结合组分包含融合至重链恒定区的免疫球蛋白轻链可变VL/CHxULC结构域，所述重链恒定区包含至少功能性CH1结构域(例如，免疫球蛋白轻链VL/CHxULC结构域融合至能够与轻链恒定区形成二硫键的CH1结构域)并且任选地还包含铰链区、CH2结构域、CH3结构域、CH4结构域或它们的组合。在一些实施方案中，重链恒定区为包含至少功能性CH1结构域的非人重链恒定区。在一些实施方案中，非人重链恒定区为包含至少功能性CH1结构域的啮齿动物(例如，大鼠或小鼠)或鸡重链恒定区。在一些实施方案中，重链恒定区为包含至少功能性CH1结构域的人重链恒定区。在一些实施方案中，重链恒定区(或CH1结构域)具有选自IgM、IgD、IgG、IgE和IgA的同种型。在一些实施方案中，可变VL/CHxULC结构域融合至具有选自IgG1、IgG2、IgG3和IgG4的亚类的IgG重链恒定区(或CH1结构域)。在一些实施方案中，可变VL/CHxULC结构域融合至包含CH3结构域的人突变IgG1、IgG2或IgG4重链恒定区(或CH1结构域)，其中突变处于IgG1、IgG2或IgG4的CH3结构域中并且减少或消除CH3结构域对蛋白质A的结合，例如，其中突变选自IMGT编号系统中的(a)95R、和(b)95R和96F，或者EU编号系统中的(a')435R、和(b')435R和436F。在一些实施方案中，人突变重链恒定区为人突变IgG1恒定区，并且除了(a)95R或(b)95R和96F突变(在IMGT编号系统中)之外，还包含一至五个选自下列的修饰：IMGT外显子编号系统中的16E、18M、44S、52N、57M和82I，或EU编号系统中的356E、358M、384S、392N、397M和422I。在一些实施方案中，人重链恒定区为人IgG2恒定区，并且除了(a)95R或(b)95R和96F突变(在IMGT编号系统中)之外，还包含一或两个选自下列的修饰：IMGT外显子编号系统中的44S、52N、82I，或EU编号系统中的348S、392N和422I。在其它实施方案中，人重链恒定区为人IgG4恒定区，并且除了(a)95R或(b)95R和96F突变(在IMGT编号系统中)之外，还包含一至七个选自下列的修饰：IMGT外显子编号系统中的15R、44S、52N、57M、69K、79Q和82I，或EU编号系统中的355R、384S、392N、397M、409K、419Q和422I和/或IMGT外显子编号系统中的修饰105P或EU编号系统中的445P。
此外，在一些实施方案中，如本文所述的抗原结合蛋白包含至少第一结合组分，其包含融合至轻链恒定结构域的免疫球蛋白轻链可变VL/CHxULC结构域。在一些实施方案中，轻链恒定结构域为非人轻链恒定结构域。在一些实施方案中，非人轻链恒定区为啮齿动物(例如，大鼠或小鼠)或鸡轻链恒定结构域。在一些实施方案中，轻链恒定结构域为人轻链恒定结构域。在一些实施方案中，轻链恒定结构域为轻链κ恒定结构域。在一些实施方案中，轻链恒定结构域为轻链λ恒定结构域。
在一些实施方案中，如本文所述的免疫球蛋白轻链可变VL/CHxULC(例如，VκOHxULC或VλOHxULC)结构域在不存在同源通用轻链的情况下结合感兴趣的抗原。因此，如本文所述的第一结合组分可基本上由或由免疫球蛋白轻链可变VL/CHxULC结构域或融合至恒定区(例如包含至少功能性CH1结构域的重链恒定区或轻链恒定区)的免疫球蛋白轻链可变VL/CHxULC结构域组成，其中可变VL/CHxULC结构域源于免疫球蛋白杂交链，所述免疫球蛋白杂交链与通用轻链同源，例如，所述免疫球蛋白轻链可变VL/CHxULC结构域由重排(人)Vκ/Jκ或Vλ/Jλ序列编码，所述序列可操作地连接至重链恒定区基因序列，并且因此可包含长度为9、10、11、12或更多个氨基酸的CDR3。
在其它实施方案中，第一结合组分还包含与免疫球蛋白轻链VL/CHxULC可变结构域缔合的同源通用轻链可变结构域，其中所述可变VL/CHxULC结构域源于免疫球蛋白杂交链(例如，免疫球蛋白轻链可变VL/CHxULC结构域由重排(人)Vκ/Jκ或Vλ/Jλ序列编码，所述序列可操作地连接至重链恒定区基因序列，并且因此可包含长度为9、10、11、12或更多个氨基酸的CDR3)，并且其中所述免疫球蛋白杂交链与由重排VL/JL基因序列编码的通用轻链同源，并且其中所述通用轻链可变结构域由重排VL/JL基因序列或其体细胞超突变变体编码。
在一些实施方案中，通用轻链可变结构域由κ序列编码或源于κ序列，例如，人κ序列，例如Vκ1-5、Vκ1-6、Vκ1-8、Vκ1-9、Vκ1-12、Vκ1-13、Vκ1-16、Vκ1-17、Vκ1-22、Vκ1-27、Vκ1-32、Vκ1-33、Vκ1-35、Vκ1-37、Vκ1-39、Vκ1D-8、Vκ1D-12、Vκ1D-13、Vκ1D-16、Vκ1D-17、Vκ1D-22、Vκ1D-27、Vκ1D-32、Vκ1D-33、Vκ1D-35、Vκ1D-37、Vκ1D-39、Vκ1D-42、Vκ1D-43、Vκ1-NL1、Vκ2-4、Vκ2-10、Vκ2-14、Vκ2-18、Vκ2-19、Vκ2-23、Vκ2-24、Vκ2-26、Vκ2-28、Vκ2-29、Vκ2-30、Vκ2-36、Vκ2-38、Vκ2-40、Vκ2D-10、Vκ2D-14、Vκ2D-18、Vκ2D-19、Vκ2D-23、Vκ2D-24、Vκ2D-26、Vκ2D-28、Vκ2D-29、Vκ2D-30、Vκ2D-36、Vκ2D-38、Vκ2D-40、Vκ3-7、Vκ3-11、Vκ3-15、Vκ3-20、Vκ3-25、Vκ3-31、Vκ3-34、Vκ3D-7、Vκ3D-7、Vκ3D-11、Vκ3D-15、Vκ3D-15、Vκ3D-20、Vκ3D-25、Vκ3D-31、Vκ3D-34、Vκ3-NL1、Vκ3-NL2、Vκ3-NL3、Vκ3-NL4、Vκ3-NL5、Vκ4-1、Vκ5-2、Vκ6-21、Vκ6D-21、Vκ6D-41、或Vκ7-3基因区段序列，所述基因区段序列与(人)Jκ1、Jκ2、Jκ3、Jκ4、或Jκ5基因区段序列重排，或它们的体细胞超突变变体。在一些实施方案中，通用轻链可变结构域由核苷酸序列编码或源于核苷酸序列，所述核苷酸序列包含与人Jκ5基因区段序列重排的人Vκ1-39基因区段序列，或它们的体细胞超突变变体。在一些实施方案中，通用轻链可变结构域由核苷酸序列编码或源于核苷酸序列，所述核苷酸序列包含与人Jκ1基因区段序列重排的人Vκ3-20基因区段序列，或它们的体细胞超突变变体。在一些实施方案中，通用轻链可变结构域由λ序列编码或源于λ序列，例如人Vλ3-1、Vλ4-3、Vλ2-8、Vλ3-9、Vλ3-10、Vλ2-11、Vλ3-12、Vλ2-14、Vλ3-16、Vλ2-18、Vλ3-19、Vλ3-21、Vλ3-22、Vλ2-23、Vλ3-25、Vλ3-27、Vλ1-36、Vλ5-37、Vλ5-39、Vλ1-40、Vλ7-43、Vλ1-44、Vλ5-45、Vλ7-46、Vλ1-47、Vλ9-49、Vλ1-51、Vλ5-52、Vλ6-57、Vλ4-60、Vλ8-61或Vλ4-69基因区段序列，所述基因区段序列与(人)Jλ1、Jλ2、Jλ3或Jλ7基因区段序列重排，或它们的体细胞超突变变体。在一些实施方案中，通用轻链可变结构域由核苷酸序列编码或源于核苷酸序列，所述核苷酸序列包含与Jλ3基因区段序列重排的Vλ2-14基因区段序列，或它们的体细胞超突变变体。在一些实施方案中，通用轻链可变结构域由核苷酸序列编码或源于核苷酸序列，所述核苷酸序列包含与Jλ7基因区段序列重排的Vλ2-14基因区段序列，或它们的体细胞超突变变体。
如本文所述的第一结合组分可包含免疫球蛋白轻链可变VL/CHxULC(例如，VκOHxULC或VλOHxULC)结构域和缔合的同源通用轻链可变结构域，其例如通过二硫键或肽接头连接。在一些实施方案中，如本文所述的第一结合组分包含VL/CHxULC可变结构域，所述VL/CHxULC可变结构域例如以scFv-型形式经由肽接头连接到同源通用轻链可变结构域。在一些实施方案中，如本文所用的第一结合组分包含：(i)融合至包含至少功能性CH1结构域的重链恒定区的免疫球蛋白轻链可变VL/CHxULC(例如，VκOHxULC或VλOHxULC)结构域，例如融合至功能性CH1结构域的免疫球蛋白轻链可变VL/CHxULC(例如，VκOHxULC或VλOHxULC)结构域，和(ii)融合至轻链恒定结构域的通用轻链可变结构域，其中所述CH1结构域通过二硫键或肽接头连接到轻链恒定结构域。在一个实施方案中，VL/CHxULC可变结构域融合至包含至少功能性CH1结构域(并且任选地还包含铰链区、CH2结构域、CH3结构域、CH4结构域或它们的组合)的重链恒定区，通用轻链可变结构域融合至轻链恒定结构域，并且功能性CH1结构域通过二硫键连接到轻链恒定结构域。在另一个实施方案中，第一结合组分呈scFab形式，例如，VL/CHxULC可变结构域融合至包含至少功能性CH1结构域的重链恒定区，通用轻链可变结构域融合至轻链恒定结构域，并且功能性CH1结构域通过肽接头连接到轻链恒定结构域。
在一些实施方案中，第一结合组分包含人VL/CHxULC(例如，人VκOHxULC或人VλOHxULC)结构域，其任选地与包含CH1结构域或人轻链恒定结构域的人重链融合。在一些实施方案中，本文提供的抗原结合蛋白基本上由或仅由如本文所述的第一结合组分组成，其中所述第一结合组分结合感兴趣的抗原。
本发明还提供抗原结合蛋白，除了包含含有如本文所述的VL/CHxULC(例如，VκOHxULC或VλOHxULC)可变结构域的第一结合组分之外，所述抗原结合蛋白还包含第二结合组分，所述第二结合组分包含源于重链或杂交链的第二免疫球蛋白可变结构域，其中第一组分的VL/CHxULC可变结构域和第二结合组分的第二可变结构域可以，并且优选与通用轻链可变结构域同源，所述通用轻链可变结构域源于相同的重排轻链可变区基因序列，例如由所述相同的重排轻链可变区基因序列编码。因此，VL/CHxULC和第二可变结构域分别与其同源的通用轻链可变结构域中的任何差异均是由于体细胞超突变，例如，可被确定由体细胞超突变或亲和力成熟过程产生。
如本文所提供的抗原结合蛋白可包括如本文所述的第一和第二结合组分，其中所述第一和第二结合组分包含相同的VL/CHxULC可变结构域，并且其中抗原结合蛋白是单特异性的，例如可特异性结合感兴趣的单个表位。
在一些实施方案中，第一和第二结合组分是不相同的，例如结合不同表位，所述表位可在相同抗原上或可在不同抗原上。因此，如本文所述的抗原结合蛋白可以为多特异性抗原结合蛋白并且包含(i)第一结合组分，所述第一结合组分包含特异性针对第一表位的第一可变结构域，例如VL/CHxULC结构域(例如，VκOHxULC或VλOHxULC)；和(ii)第二结合组分，所述第二结合组分包含特异性针对第二表位的第二可变结构域，其中所述第二可变结构域为第二VL/CHxULC结构域或VHxULC结构域(源于重链的重链可变结构域，所述重链由可操作地连接至重链恒定区基因的VHDJH基因序列编码，其中所述重链可变结构域与通用轻链可变结构域同源)，其中所述第一和第二表位不相同，并且其中所述第一和第二可变结构域各自与通用轻链可变结构域同源，所述通用轻链可变结构域源于相同的单重排轻链可变区基因序列，并因此，是相同的或是体细胞超突变的变体，例如仅通过体细胞超突变在氨基酸序列方面不同。在一些实施方案中，第二可变结构域为结合不同于第一表位的第二表位的第二VL/CHxULC(例如，VκOHxULC或VλOHxULC)，尽管第一和第二可变VL/CHxULC结构域与源于相同单重排轻链可变区基因序列的通用轻链可变结构域同源，并因此是相同的或体细胞超突变的变体。在一些实施方案中，第二可变结构域为结合不同于第一表位的第二表位的免疫球蛋白重链可变(VHxULC)结构域，其中所述第一结合组分的VL/CHxULC可变结构域和第二结合组分的VHxULC可变结构域与源于相同单重排轻链可变区基因序列的通用轻链可变结构域同源，并且因此是相同的或体细胞超突变的变体。包含不相同的第一和第二结合组分的本文提供的多特异性抗原结合蛋白可特异性结合多于一个的感兴趣的表位。
在一些实施方案中，其中第二结合组分包含为VHxULC结构域的第二可变结构域，VH结构域由重链可变区核苷酸序列编码，例如人重链可变区核苷酸序列，例如存在于人谱系中的任何人VH、D和JH基因区段序列，例如，IMGT数据库(www.imgt.org)中所述的任何人重链可变基因区段，或它们的体细胞超突变变体。
另外，第一结合组分和第二结合组分可通过一个或多个肽接头、一个或多个二硫键和/或一个或多个亮氨酸拉链缔合，使得本文提供的多特异性抗原结合蛋白呈选自下列的形式：Fab状结构、Fab状结构、双体抗体状结构、scFv-状结构、scFv-Fc状结构、scFv-拉链状结构、类似于包括同源通用轻链的典型抗体的四聚体结构。因此，在一些实施方案中，VL/CHxULC(例如，VκOHxULC或VλOHxULC)和第二可变结构域中的任一种或两种可以或可以不融合至恒定区(例如包含功能性CH1结构域或轻链恒定结构域的重链恒定区)和/或可以或可以不与同源通用轻链可变结构域缔合。
在一些实施方案中，第一组分的可变VL/CHxULC(例如，VκOHxULC或VλOHxULC)结构域通过肽接头连接到第二结合组分的第二可变(VL/CHxULC或VHxULC)结构域，使得抗原结合蛋白可具有双体抗体状结构、scFv-状结构、scFv-Fc状结构、或scFv-拉链状结构。在一些实施方案中，(1)(a)第一组分的VL/CHxULC可变结构域或(b)第二结合组分的第二可变结构域中的至少一个融合至(非人或人)重链恒定区，所述重链恒定区包含至少功能性CH1结构域(并且任选地还包含铰链区、CH2结构域、CH3结构域、CH4结构域或它们的组合)，和(2)(a)第一组分的VL/CHxULC可变结构域或(b)第二结合组分的第二可变结构域中的另一个融合至(非人或人)轻链恒定(CL)结构域，其中所述CH1结构域通过二硫键连接到CL结构域，使得抗原结合蛋白具有Fab状结构，或其中CH1结构域通过肽接头连接到CL结构域使得抗原结合蛋白可具有scFab状结构。
在一些实施方案中，第一VL/CHxULC(VκOHxULC或VλOHxULC)和第二(VL/CHxULC或VHxULC)可变结构域两者分别融合至第一和第二重链恒定区，其中所述第一和第二重链恒定区中的每一个分别包含第一功能性CH1结构域和第二功能性CH1结构域(每个重链恒定区任选地还包含铰链区、CH2结构域、CH3结构域、CH4结构域或它们的组合)，并且其中第一和第二重链恒定区例如通过二硫键或肽接头连接。在一些实施方案中，重链恒定区中的至少一个(或两个)为非人重链恒定区，例如，啮齿动物(例如，大鼠或小鼠)或鸡重链恒定区。在一些实施方案中，重链恒定区中的至少一个(或两个)为人重链恒定区。在一些实施方案中，重链恒定区中的至少一个(或两个)具有选自IgM、IgD、IgG、IgE和IgA的同种型。在一些实施方案中，第一VL/CHxULC和第二可变结构域中的至少一个(或两个)融合至具有选自IgG1、IgG2、IgG3和IgG4的亚类的IgG重链恒定区。在一些实施方案中，第一可变VL/CHxULC和第二可变结构域融合至具有相同同种型和/或亚类的重链恒定区，但是任选地，其中重链恒定区在其对蛋白质A的亲和力方面不同。在一些实施方案中，其中第一可变VL/CHxULC和第二可变结构域两者均融合至人IgG1、IgG2或IgG4重链恒定区，仅第一可变VL/CHxULC和第二可变结构域中的一个融合至人IgG1、IgG2或IgG4重链恒定区，所述重链恒定区包含减少或消除CH3结构域对蛋白质A的结合的CH3结构域的突变，例如选自下列的突变：IMGT编号系统中的(a)95R、和(b)95R和96F，或者EU编号系统中的(a')435R、和(b')435R和436F。在一些实施方案中，人重链恒定区为人IgG1恒定区，并且还包含一至五个选自下列的修饰：IMGT外显子编号系统中的16E、18M、44S、52N、57M和82I，或EU编号系统中的356E、358M、384S、392N、397M和422I。在一些实施方案中，人重链恒定区为人IgG2恒定区，并且还包含一或两个选自下列的修饰：IMGT外显子编号系统中的44S、52N、82I，或EU编号系统中的348S、392N和422I。在其它实施方案中，人重链恒定区为人IgG4恒定区，并且还包含一至七个选自下列的修饰：IMGT外显子编号系统中的15R、44S、52N、57M、69K、79Q和82I，或EU编号系统中的355R、384S、392N、397M、409K、419Q和422I和/或IMGT外显子编号系统中的修饰105P或EU编号系统中的445P。
在一些实施方案中，第一和第二结合组分还可各自分别包含分别融合至第一和第二轻链恒定(CL)结构域的第一和第二通用轻链可变结构域，其中所述第一和第二CL结构域分别例如通过二硫键连接到第一和第二重链恒定区的第一和第二CH1结构域，其中所述第一和第二通用轻链可变结构域源于相同的单重排轻链可变区基因序列，并且因此是相同的或体细胞超突变的变体。
在一些实施方案中，如本文所述的抗原结合蛋白包含第一结合组分，所述第一结合组分包含任选地与包含至少CH1结构域的人重链或人轻链恒定结构融合的人VL/CHxULC(VκOHxULC或VλOHxULC)结构域，第二结合组分，所述第二结合组分包含任选地与包含CH1结构域的人重链或人轻链恒定结构域融合的第二人VL/CHxULC或人VHxULC结构域，以及任选地人通用轻链，所述人通用轻链包含与人轻链恒定结构域融合的人通用轻链可变结构域。
非人动物包括例如哺乳动物，并且在具体实施方案中，啮齿动物(例如，小鼠、大鼠或仓鼠)。在一些实施方案中，非人动物包括鸟类，例如鸡。本发明提供非人动物，其被工程化以包含(例如，在其种系基因组中和/在其B细胞的基因组中)如本文所述的核酸序列和/或表达如本文所述的抗原结合蛋白(例如，免疫球蛋白链和/或抗体)。
在一些实施方案中，本发明具体地包括以下认识：期望工程化非人动物以提供用于产生免疫球蛋白轻链结构域的改善的体内系统，其中抗原特异性和亲和力由免疫球蛋白轻链可变结构域多样性占主导(例如仅由或主要由此产生，和/或仅存在于或主要存在于其中)。在一些实施方案中，本发明包括以下认识：期望工程化非人动物以允许对独立于免疫球蛋白重链可变结构域结合抗原的免疫球蛋白轻链可变结构域的改善的体内亲和力成熟和/或选择。在一些实施方案中，本发明包括以下认识：期望非人动物例如用于选择具有前述特征中的一些或全部的免疫球蛋白轻链可变结构域(VκOHxULC或VλOHxULC)，所述非人动物的基因组包括可操作地连接至重链恒定区的未重排人轻链可变区基因区段和重排人轻链可变区核酸序列。
在一些实施方案中，本发明提供能够产生VL/CHxULC可变结构域的非人动物，其中所述非人动物在其种系基因组中包含：(a)第一杂交免疫球蛋白基因座，例如在内源性非人重链基因座处，其包含未重排(人)免疫球蛋白轻链(VL和JL)基因区段，所述基因区段能够重排以形成可操作地连接至免疫球蛋白重链恒定区核酸序列的重排(人)VL/JL基因序列，所述免疫球蛋白重链恒定区核酸序列包含一个或多个重链恒定区基因，所述一个或多个重链恒定区基因各自包含编码功能性CH1结构域的序列，例如完整的Igμ基因以及完整的Igδ基因、完整的Igγ基因、完整的Igε基因和完整的Igα基因中的至少一种，其中可操作地连接至免疫球蛋白重链恒定区核酸序列的重排人VL/JL基因序列编码杂交免疫球蛋白链；和(b)第二轻链免疫球蛋白基因座，例如在内源性非人重链基因座处，其包含可操作地连接至免疫球蛋白轻链恒定区核酸序列的重排人免疫球蛋白轻链可变区核苷酸序列，其中所述可操作地连接至免疫球蛋白轻链恒定区核酸序列的重排人免疫球蛋白轻链可变区核苷酸序列编码通用轻链，并且其中所述非人动物能够产生或确实产生表达抗原结合蛋白的细胞，例如淋巴细胞，例如B细胞，所述抗原结合蛋白包含免疫球蛋白链和通用轻链，并且其中免疫球蛋白杂交链的免疫球蛋白轻链可变结构域为VL/CHxULC结构域。在一些实施方案中，非人动物为哺乳动物或鸟。在一些特定实施方案中，所述鸟为鸡。在一些特定实施方案中，所述哺乳动物为啮齿动物。在一些实施方案中，啮齿动物选自小鼠、大鼠和仓鼠。
在一些实施方案中，本发明的非人动物对于重排人免疫球蛋白轻链可变区核苷酸序列是纯合的。在一些实施方案中，本发明的非人动物对于重排人免疫球蛋白轻链可变区核苷酸序列是杂合的。在一些实施方案中，本发明的非人动物对于杂交免疫球蛋白基因座是纯合的。在一些实施方案中，本发明的非人动物对于杂交免疫球蛋白基因座是杂合的。在一些实施方案中，未重排的(人)免疫球蛋白轻链可变基因区段可操作地连接至非人重链恒定区核酸序列，所述非人重链恒定区核酸序列包含一个或多个重链恒定区基因，所述一个或多个重链恒定区基因各自包含编码功能性CH1结构域的序列，例如，完整的Igμ基因以及完整的Igδ基因、完整的Igγ基因、完整的Igε基因和完整的Igα基因中的至少一种。在一些实施方案中，非人重链恒定区核酸序列为小鼠、大鼠或鸡重链恒定区核酸序列，其包含一个或多个重链恒定区基因，所述一个或多个重链恒定区基因各自包含编码功能性CH1结构域的序列，例如，完整的Igμ基因以及完整的Igδ基因、完整的Igγ基因、完整的Igε基因和完整的Igα基因中的至少一种。在一些实施方案中，非人动物为啮齿动物，并且未重排人免疫球蛋白轻链可变基因区段可操作地连接至人重链恒定区核酸序列，所述人重链恒定区核酸序列包含一个或多个重链恒定区基因，所述一个或多个重链恒定区基因各自包含编码功能性CH1结构域的序列，例如，完整的Igμ基因以及完整的Igδ基因、完整的Igγ基因、完整的Igε基因和完整的Igα基因中的至少一种。
在一些实施方案中，重排人免疫球蛋白轻链可变区核苷酸序列可操作地连接至非人轻链恒定区核酸序列。在一些特定实施方案中，非人轻链恒定区核酸序列为小鼠或大鼠轻链恒定区核酸序列。在一些实施方案中，非人动物为啮齿动物，并且重排人免疫球蛋白轻链可变区核苷酸序列可操作地连接至人轻链恒定区核酸序列。
在一些特定实施方案中，轻链恒定区核酸序列为κ序列。在一些特定实施方案中，轻链恒定区核酸序列为λ序列。
在一些实施方案中，第二免疫球蛋白基因座为轻链κ基因座。在一些实施方案中，第二免疫球蛋白基因座为轻链λ基因座。
在一些实施方案中，未重排人免疫球蛋白VL和JL基因区段为Vκ和Jκ基因区段。在一些实施方案中，未重排人免疫球蛋白VL和JL基因区段为Vλ和Jλ基因区段。
在一些实施方案中，重排人免疫球蛋白轻链可变区核苷酸序列包括人κ轻链可变区核苷酸序列。在一些实施方案中，重排人免疫球蛋白轻链可变区核苷酸序列包括人λ轻链可变区核苷酸序列。
在一些实施方案中，第一基因座包含一个或多个未重排人免疫球蛋白VL基因区段，所述基因区段选自Vκ1-5、Vκ1-6、Vκ1-8、Vκ1-9、Vκ1-12、Vκ1-13、Vκ1-16、Vκ1-17、Vκ1-22、Vκ1-27、Vκ1-32、Vκ1-33、Vκ1-35、Vκ1-37、Vκ1-39、Vκ1D-8、Vκ1D-12、Vκ1D-13、Vκ1D-16、Vκ1D-17、Vκ1D-22、Vκ1D-27、Vκ1D-32、Vκ1D-33、Vκ1D-35、Vκ1D-37、Vκ1D-39、Vκ1D-42、Vκ1D-43、Vκ1-NL1、Vκ2-4、Vκ2-10、Vκ2-14、Vκ2-18、Vκ2-19、Vκ2-23、Vκ2-24、Vκ2-26、Vκ2-28、Vκ2-29、Vκ2-30、Vκ2-36、Vκ2-38、Vκ2-40、Vκ2D-10、Vκ2D-14、Vκ2D-18、Vκ2D-19、Vκ2D-23、Vκ2D-24、Vκ2D-26、Vκ2D-28、Vκ2D-29、Vκ2D-30、Vκ2D-36、Vκ2D-38、Vκ2D-40、Vκ3-7、Vκ3-11、Vκ3-15、Vκ3-20、Vκ3-25、Vκ3-31、Vκ3-34、Vκ3D-7、Vκ3D-7、Vκ3D-11、Vκ3D-15、Vκ3D-15、Vκ3D-20、Vκ3D-25、Vκ3D-31、Vκ3D-34、Vκ3-NL1、Vκ3-NL2、Vκ3-NL3、Vκ3-NL4、Vκ3-NL5、Vκ4-1、Vκ5-2、Vκ6-21、Vκ6D-21、Vκ6D-41、和Vκ7-3。在一些实施方案中，第一基因座包含未重排人免疫球蛋白JL基因区段，所述基因区段包括Jκ1、Jκ2、Jκ3、Jκ4、和Jκ5。
在一些实施方案中，重排人免疫球蛋白轻链可变区核苷酸序列中的Vκ基因区段为(人种系)Vκ基因区段，所述基因区段选自Vκ1-5、Vκ1-6、Vκ1-8、Vκ1-9、Vκ1-12、Vκ1-13、Vκ1-16、Vκ1-17、Vκ1-22、Vκ1-27、Vκ1-32、Vκ1-33、Vκ1-35、Vκ1-37、Vκ1-39、Vκ1D-8、Vκ1D-12、Vκ1D-13、Vκ1D-16、Vκ1D-17、Vκ1D-22、Vκ1D-27、Vκ1D-32、Vκ1D-33、Vκ1D-35、Vκ1D-37、Vκ1D-39、Vκ1D-42、Vκ1D-43、Vκ1-NL1、Vκ2-4、Vκ2-10、Vκ2-14、Vκ2-18、Vκ2-19、Vκ2-23、Vκ2-24、Vκ2-26、Vκ2-28、Vκ2-29、Vκ2-30、Vκ2-36、Vκ2-38、Vκ2-40、Vκ2D-10、Vκ2D-14、Vκ2D-18、Vκ2D-19、Vκ2D-23、Vκ2D-24、Vκ2D-26、Vκ2D-28、Vκ2D-29、Vκ2D-30、Vκ2D-36、Vκ2D-38、Vκ2D-40、Vκ3-7、Vκ3-11、Vκ3-15、Vκ3-20、Vκ3-25、Vκ3-31、Vκ3-34、Vκ3D-7、Vκ3D-7、Vκ3D-11、Vκ3D-15、Vκ3D-15、Vκ3D-20、Vκ3D-25、Vκ3D-31、Vκ3D-34、Vκ3-NL1、Vκ3-NL2、Vκ3-NL3、Vκ3-NL4、Vκ3-NL5、Vκ4-1、Vκ5-2、Vκ6-21、Vκ6D-21、Vκ6D-41、和Vκ7-3。在一些特定实施方案中，VL基因区段选自Vκ1-39和Vκ3-20。在一些实施方案中，Vκ基因区段选自人种系Vκ1-39基因区段和人种系Vκ3-20基因区段。
在一些实施方案中，重排人免疫球蛋白轻链可变区核苷酸序列中的JL基因区段选自Jκ1、Jκ2、Jκ3、Jκ4和Jκ5，例如，人种系Jκ1基因区段、人种系Jκ2基因区段、人种系Jκ3基因区段、人种系Jκ4基因区段和人种系Jκ5基因区段。
在一些特定实施方案中，重排人免疫球蛋白轻链可变区核苷酸序列包含Vκ1-39和Jκ5。在一些特定实施方案中，Vκ1-39与Jκ5重排。在一些实施方案中，重排人免疫球蛋白轻链可变区核苷酸序列示为SEQ ID NO:1。在一些特定实施方案中，重排人免疫球蛋白轻链可变区核苷酸序列包含Vκ3-20和Jκ1。在一些特定实施方案中，Vκ3-20与Jκ1重排。在一些实施方案中，重排人免疫球蛋白轻链可变区核苷酸序列示为SEQ ID NO:2。
在一些实施方案中，非人动物为啮齿动物，并且其中轻链恒定区核酸序列为大鼠或小鼠Cκ恒定区核酸序列。
在一些实施方案中，非人动物为啮齿动物，并且其中所述重链恒定区核酸序列为选自下列的大鼠或小鼠恒定区序列：Igμ、Igδ、Igγ、Igε、Igα，它们中的每一个编码功能性CH1结构域。
在一些实施方案中，第一基因座包含一个或多个未重排人免疫球蛋白VL基因区段，所述基因区段选自Vλ3-1、Vλ4-3、Vλ2-8、Vλ3-9、Vλ3-10、Vλ2-11、Vλ3-12、Vλ2-14、Vλ3-16、Vλ2-18、Vλ3-19、Vλ3-21、Vλ3-22、Vλ2-23、Vλ3-25、Vλ3-27、Vλ1-36、Vλ5-37、Vλ5-39、Vλ1-40、Vλ7-43、Vλ1-44、Vλ5-45、Vλ7-46、Vλ1-47、Vλ9-49、Vλ1-51、Vλ5-52、Vλ6-57、Vλ4-60、Vλ8-61和Vλ4-69。在一些实施方案中，第一基因座包含未重排人免疫球蛋白JL基因区段，所述基因区段包括Jλ1、Jλ2、Jλ3和Jλ7。
在一些实施方案中，重排人免疫球蛋白轻链可变区核苷酸序列中的VL基因区段为(人种系)Vλ基因区段，所述基因区段选自Vλ3-1、Vλ4-3、Vλ2-8、Vλ3-9、Vλ3-10、Vλ2-11、Vλ3-12、Vλ2-14、Vλ3-16、Vλ2-18、Vλ3-19、Vλ3-21、Vλ3-22、Vλ2-23、Vλ3-25、Vλ3-27、Vλ1-36、Vλ5-37、Vλ5-39、Vλ1-40、Vλ7-43、Vλ1-44、Vλ5-45、Vλ7-46、Vλ1-47、Vλ9-49、Vλ1-51、Vλ5-52、Vλ6-57、Vλ4-60、Vλ8-61和Vλ4-69。在一些特定实施方案中，所述VL基因区段为Vλ2-14，例如人种系Vλ2-14基因区段。
在一些实施方案中，重排人免疫球蛋白轻链可变区核苷酸序列中的JL基因区段选自Jλ1、Jλ2、Jλ3和Jλ7。
在一些特定实施方案中，重排人免疫球蛋白轻链可变区核苷酸序列包含Vλ2-14Jλ1。在一些特定实施方案中，重排人免疫球蛋白轻链可变区核苷酸序列为Vλ2-14Jλ2。在一些特定实施方案中，重排人免疫球蛋白轻链可变区核苷酸序列为Vλ2-14Jλ3。在一些特定实施方案中，重排人免疫球蛋白轻链可变区核苷酸序列为Vλ2-14Jλ7。在一些实施方案中，非人动物为啮齿动物，并且其中轻链恒定区核酸序列为大鼠或小鼠Cλ恒定区核酸序列。
在一些实施方案中，非人动物为啮齿动物，并且其中所述重链恒定区核酸序列为选自下列的大鼠或小鼠恒定区序列：Igμ、Igδ、Igγ、Igε、Igα、和它们的组合，它们中的每一个编码功能性CH1结构域。
在一些实施方案中，基本上全部内源性功能性可变重链VH、D和JH基因区段均从非人动物的内源性免疫球蛋白重链基因座中删除，或呈现非功能性。在一些实施方案中，基本上全部内源性功能性轻链VL和JL基因区段均从非人动物的内源性免疫球蛋白轻链基因座中删除，或呈现非功能性。
在一些实施方案中，非人动物包含整合的Adam6a基因、Adam6b基因或上述两者。在一些实施方案中，非人动物包含功能性异位小鼠Adam6基因。
在一些实施方案中，第一免疫球蛋白基因座包含重排人免疫球蛋白轻链可变核苷酸序列的多个拷贝。
在一些实施方案中，本发明提供制备非人动物的方法，所述方法一般包括修饰非人动物的种系基因组以包含(i)可操作地连接至免疫球蛋白轻链恒定区核酸序列的重排人免疫球蛋白轻链可变区核苷酸序列；和(ii)能够重排以形成可操作地连接至免疫球蛋白重链恒定区核酸序列的重排人VL/JL基因序列的未重排人免疫球蛋白轻链可变区基因区段(VL和JL)。在一些实施方案中，所述方法包括：(a)修饰非人动物的基因组以删除全部或基本上全部的(i)内源性功能性免疫球蛋白重链VH、D、和JH基因区段和(ii)内源性功能性轻链VL和JL基因区段，或使其呈现非功能化：；(b)在基因组中设置未重排人免疫球蛋白VL和JL基因区段使得未重排轻链可变基因区段可操作地连接至重链恒定区核酸序列；以及(c)在基因组中设置重排人免疫球蛋白轻链可变区核苷酸序列使得重排人免疫球蛋白轻链可变区核苷酸序列可操作地连接至轻链恒定区核酸序列。在一些实施方案中，所述方法包括：(a)用未重排人免疫球蛋白VL和JL基因区段替换内源性重链基因座处的全部内源性功能性免疫球蛋白重链VH、D和JH基因区段，使得未重排轻链可变基因区段可操作地连接至内源性重链恒定区核酸序列，和(b)用重排人免疫球蛋白轻链可变区核苷酸序列替换内源性轻链基因座处的全部内源性功能性轻链VL和JL基因区段，使得重排人免疫球蛋白轻链可变区核苷酸序列可操作地连接至内源性轻链恒定区核酸序列。
在一些实施方案中，非人动物为哺乳动物或鸟。在一些特定实施方案中，所述鸟为鸡。在一些特定实施方案中，所述哺乳动物为啮齿动物。在一些实施方案中，啮齿动物选自小鼠、大鼠和仓鼠。
在一些实施方案中，未重排人免疫球蛋白VL和JL基因区段可操作地连接至非人免疫球蛋白重链恒定区核酸序列。在一些实施方案中，非人免疫球蛋白重链恒定区核酸序列为小鼠或大鼠免疫球蛋白重链恒定区核酸序列。在一些实施方案中，非人动物为啮齿动物，并且未重排人免疫球蛋白轻链可变VL和JL基因区段可操作地连接至人重链恒定区核酸序列。
在一些实施方案中，重排人免疫球蛋白轻链可变区核苷酸序列可操作地连接至非人轻链恒定区核酸序列。在一些实施方案中，非人轻链恒定区核酸序列为小鼠或大鼠轻链恒定区核酸序列。在一些实施方案中，非人动物为啮齿动物，并且重排人免疫球蛋白轻链可变区核苷酸序列可操作地连接至人轻链恒定区核酸序列。在一些特定实施方案中，轻链恒定区核酸序列为κ序列。在一些特定实施方案中，轻链恒定区核酸序列为λ序列。在一些实施方案中，重排人免疫球蛋白轻链可变区核苷酸序列置于κ轻链基因座中。在一些特定实施方案中，重排人免疫球蛋白轻链可变区核苷酸序列置于λ轻链基因座中。
在一些特定实施方案中，未重排人免疫球蛋白VL和JL基因区段为Vκ和Jκ基因区段。在一些特定实施方案中，未重排人免疫球蛋白VL和JL基因区段为Vλ和Jλ基因区段。
在一些实施方案中，重排人免疫球蛋白轻链可变区核苷酸序列包括人κ轻链可变区核苷酸序列。在一些实施方案中，重排人免疫球蛋白轻链可变区核苷酸序列包括人λ轻链可变区核苷酸序列。
在一些实施方案中，未重排人免疫球蛋白VL基因区段包括下列中的一个或多个：Vκ1-5、Vκ1-6、Vκ1-8、Vκ1-9、Vκ1-12、Vκ1-13、Vκ1-16、Vκ1-17、Vκ1-22、Vκ1-27、Vκ1-32、Vκ1-33、Vκ1-35、Vκ1-37、Vκ1-39、Vκ1D-8、Vκ1D-12、Vκ1D-13、Vκ1D-16、Vκ1D-17、Vκ1D-22、Vκ1D-27、Vκ1D-32、Vκ1D-33、Vκ1D-35、Vκ1D-37、Vκ1D-39、Vκ1D-42、Vκ1D-43、Vκ1-NL1、Vκ2-4、Vκ2-10、Vκ2-14、Vκ2-18、Vκ2-19、Vκ2-23、Vκ2-24、Vκ2-26、Vκ2-28、Vκ2-29、Vκ2-30、Vκ2-36、Vκ2-38、Vκ2-40、Vκ2D-10、Vκ2D-14、Vκ2D-18、Vκ2D-19、Vκ2D-23、Vκ2D-24、Vκ2D-26、Vκ2D-28、Vκ2D-29、Vκ2D-30、Vκ2D-36、Vκ2D-38、Vκ2D-40、Vκ3-7、Vκ3-11、Vκ3-15、Vκ3-20、Vκ3-25、Vκ3-31、Vκ3-34、Vκ3D-7、Vκ3D-7、Vκ3D-11、Vκ3D-15、Vκ3D-15、Vκ3D-20、Vκ3D-25、Vκ3D-31、Vκ3D-34、Vκ3-NL1、Vκ3-NL2、Vκ3-NL3、Vκ3-NL4、Vκ3-NL5、Vκ4-1、Vκ5-2、Vκ6-21、Vκ6D-21、Vκ6D-41和Vκ7-3。在一些实施方案中，未重排人免疫球蛋白JL基因区段包括Jκ1、Jκ2、Jκ3、Jκ4、和Jκ5。
在一些实施方案中，重排人免疫球蛋白轻链可变区核苷酸序列包含VL和JL基因区段。在一些实施方案中，重排人免疫球蛋白轻链可变区中的VL基因区段为(人种系)Vκ基因区段，所述基因区段选自：Vκ1-5、Vκ1-6、Vκ1-8、Vκ1-9、Vκ1-12、Vκ1-13、Vκ1-16、Vκ1-17、Vκ1-22、Vκ1-27、Vκ1-32、Vκ1-33、Vκ1-35、Vκ1-37、Vκ1-39、Vκ1D-8、Vκ1D-12、Vκ1D-13、Vκ1D-16、Vκ1D-17、Vκ1D-22、Vκ1D-27、Vκ1D-32、Vκ1D-33、Vκ1D-35、Vκ1D-37、Vκ1D-39、Vκ1D-42、Vκ1D-43、Vκ1-NL1、Vκ2-4、Vκ2-10、Vκ2-14、Vκ2-18、Vκ2-19、Vκ2-23、Vκ2-24、Vκ2-26、Vκ2-28、Vκ2-29、Vκ2-30、Vκ2-36、Vκ2-38、Vκ2-40、Vκ2D-10、Vκ2D-14、Vκ2D-18、Vκ2D-19、Vκ2D-23、Vκ2D-24、Vκ2D-26、Vκ2D-28、Vκ2D-29、Vκ2D-30、Vκ2D-36、Vκ2D-38、Vκ2D-40、Vκ3-7、Vκ3-11、Vκ3-15、Vκ3-20、Vκ3-25、Vκ3-31、Vκ3-34、Vκ3D-7、Vκ3D-7、Vκ3D-11、Vκ3D-15、Vκ3D-15、Vκ3D-20、Vκ3D-25、Vκ3D-31、Vκ3D-34、Vκ3-NL1、Vκ3-NL2、Vκ3-NL3、Vκ3-NL4、Vκ3-NL5、Vκ4-1、Vκ5-2、Vκ6-21、Vκ6D-21、Vκ6D-41和Vκ7-3。在一些特定实施方案中，VL基因区段选自Vκ1-39和Vκ3-20。在一些实施方案中，Vκ基因区段为人种系Vκ基因区段，例如人种系Vκ1-39基因区段或人种系Vκ3-20基因区段。在一些实施方案中，JL基因区段选自Jκ1、Jκ2、Jκ3、Jκ4和Jκ5，例如，人种系Jκ1基因区段、人种系Jκ2基因区段、人种系Jκ3基因区段、人种系Jκ4基因区段和人种系Jκ5基因区段。在一些特定实施方案中，重排人免疫球蛋白轻链可变核苷酸序列包含Vκ1-39和Jκ5(例如，Vκ1-39与Jκ5重排)。在一些实施方案中，重排免疫球蛋白轻链可变区核苷酸序列包含示为SEQ ID NO:1的序列。在一些特定实施方案中，重排人免疫球蛋白轻链可变区核苷酸序列包含Vκ3-20和Jκ1(例如，Vκ3-20与Jκ1重排)。在一些实施方案中，重排人免疫球蛋白轻链可变区核苷酸序列包含示为SEQ ID NO:2的序列。
在一些实施方案中，非人动物为啮齿动物，并且其中轻链恒定区核酸序列为大鼠或小鼠Cκ恒定区核酸序列。在一些实施方案中，非人动物为啮齿动物，并且其中所述重链恒定区核酸序列为选自下列的大鼠或小鼠恒定区序列：Igμ、Igδ、Igγ、Igε、Igα、和它们的组合，它们中的每一个各自编码功能性CH1结构域。
在一些实施方案中，非人动物包括一个或多个未重排人免疫球蛋白VL基因区段，所述基因区段选自Vλ3-1、Vλ4-3、Vλ2-8、Vλ3-9、Vλ3-10、Vλ2-11、Vλ3-12、Vλ2-14、Vλ3-16、Vλ2-18、Vλ3-19、Vλ3-21、Vλ3-22、Vλ2-23、Vλ3-25、Vλ3-27、Vλ1-36、Vλ5-37、Vλ5-39、Vλ1-40、Vλ7-43、Vλ1-44、Vλ5-45、Vλ7-46、Vλ1-47、Vλ9-49、Vλ1-51、Vλ5-52、Vλ6-57、Vλ4-60、Vλ8-61和Vλ4-69。在一些实施方案中，非人动物包含未重排人免疫球蛋白JL基因区段，所述基因区段包括Jλ1、Jλ2、Jλ3和Jλ7。
在一些实施方案中，重排人免疫球蛋白轻链可变区核苷酸序列中的VL基因区段为(人种系)Vλ基因区段，所述基因区段选自Vλ3-1、Vλ4-3、Vλ2-8、Vλ3-9、Vλ3-10、Vλ2-11、Vλ3-12、Vλ2-14、Vλ3-16、Vλ2-18、Vλ3-19、Vλ3-21、Vλ3-22、Vλ2-23、Vλ3-25、Vλ3-27、Vλ1-36、Vλ5-37、Vλ5-39、Vλ1-40、Vλ7-43、Vλ1-44、Vλ5-45、Vλ7-46、Vλ1-47、Vλ9-49、Vλ1-51、Vλ5-52、Vλ6-57、Vλ4-60、Vλ8-61和Vλ4-69。在一些特定实施方案中，所述VL基因区段为Vλ2-14，例如人种系Vλ2-14基因区段。在一些实施方案中，重排人免疫球蛋白轻链可变区核苷酸序列中的JL基因区段选自Jλ1、Jλ2、Jλ3和Jλ7。在一些特定实施方案中，重排人免疫球蛋白轻链可变区核苷酸序列为Vλ2-14Jλ1。在一些特定实施方案中，重排人免疫球蛋白轻链可变区核苷酸序列包含Vλ2-14Jλ2。在一些特定实施方案中，重排人免疫球蛋白轻链可变区核苷酸序列包含Vλ2-14Jλ3。在一些特定实施方案中，重排人免疫球蛋白轻链可变区核苷酸序列包含Vλ2-14Jλ7。
在一些实施方案中，非人动物为啮齿动物，并且其中轻链恒定区核酸序列为大鼠或小鼠Cλ恒定区核酸序列。
在一些实施方案中，非人动物为啮齿动物，并且其中所述重链恒定区核酸序列为选自下列的大鼠或小鼠恒定区序列：Igμ、Igδ、Igγ、Igε、Igα、和它们的组合，它们中的每一个编码功能性CH1结构域。
在一些实施方案中，将重排人免疫球蛋白轻链可变区核苷酸序列置于基因组中的内源性免疫球蛋白轻链基因座处。在一些实施方案中，重排人免疫球蛋白轻链可变区核苷酸序列存在于非人动物的种系基因组中。在一些实施方案中，将重排人免疫球蛋白轻链可变区核苷酸序列置于基因组中的异位基因座处。在一些实施方案中，非人动物包含重排人免疫球蛋白轻链可变区核苷酸序列的多个拷贝。
在一些实施方案中，非人动物包含Adam6a基因、Adam6b基因或上述两者。在一些实施方案中，非人动物包含功能性异位小鼠Adam6基因。
在一些实施方案中，编码通用轻链的核酸序列包含一个或多个组氨酸密码子，所述组氨酸密码子不由相应的人种系轻链可变基因区段编码。
在一些实施方案中，本发明提供使用本文提供的或根据本文所公开的方法制备的经遗传修饰的非人动物的方法，其中所述方法一般包括从非人动物中分离表达杂交免疫球蛋白链的细胞，例如淋巴细胞，例如B细胞，所述杂交免疫球蛋白链包含融合至重链恒定区的VL/CHxULC结构域，其中所述杂交免疫球蛋白链与通用轻链同源，和/或从细胞获得编码杂交免疫球蛋白链的VL/CHxULC结构域的核酸。在一些实施方案中，用于获得编码免疫球蛋白轻链可变VL/CHxULC结构域的核酸序列的方法，所述方法包括：(a)任选用包含表位或其免疫原性部分的抗原对非人动物进行免疫，其中所述非人动物在其基因组中包含(i)可操作地连接至免疫球蛋白轻链恒定区核酸序列的重排人免疫球蛋白轻链可变区核苷酸序列，和(ii)可操作地连接至免疫球蛋白重链恒定区核酸序列的未重排人免疫球蛋白轻链可变区基因区段(VL和JL)，使得非人动物产生免疫应答；并且从免疫的非人动物中分离细胞，所述细胞表达编码可结合抗原的轻链可变VL/CHxULC结构域的核酸序列，和/或编码可结合抗原的轻链可变VL/CHxULC结构域的核酸序列。
在一些实施方案中，编码可结合抗原的轻链可变VL/CHxULC结构域的核酸序列源于可操作地连接至重链恒定区核酸序列的未重排人免疫球蛋白轻链可变区基因区段(VL和JL)。
在一些实施方案中，分离步骤经由荧光激活细胞分选术(FACS)或流式细胞术进行。在一些实施方案中，分离步骤包括从免疫的非人动物获得细胞并从所述细胞获得编码可结合抗原的轻链VL/CHxULC结构域的核酸序列，并且其中所述细胞是淋巴细胞。在一些特定实施方案中，淋巴细胞包含天然杀伤细胞、T细胞或B细胞。
在一些实施方案中，所述方法还包括将淋巴细胞与癌症细胞融合以形成杂交瘤。在一些特定实施方案中，癌症细胞是骨髓瘤细胞。
在一些实施方案中，分离的核酸序列与编码免疫球蛋白恒定区核酸序列的核酸序列融合。
在一些实施方案中，非人动物为哺乳动物或鸟。在一些特定实施方案中，所述鸟为鸡。在一些特定实施方案中，所述哺乳动物为啮齿动物。在一些实施方案中，啮齿动物选自小鼠、大鼠和仓鼠。
在一些实施方案中，未重排人免疫球蛋白轻链可变VL和JL基因区段可操作地连接至非人免疫球蛋白重链恒定区核酸序列。在一些实施方案中，非人免疫球蛋白重链恒定区核酸序列为小鼠或大鼠免疫球蛋白重链恒定区核酸序列，其例如包含一个或多个重链恒定区基因，所述一个或多个重链恒定区基因各自包含编码功能性CH1结构域的序列，例如，包含至少完整的Igμ基因以及完整的Igδ基因、完整的Igγ基因、完整的Igε基因和完整的Igα基因中的至少一种。
在一些实施方案中，非人动物为啮齿动物，并且未重排人免疫球蛋白轻链可变VL和JL基因区段可操作地连接至人重链恒定区核酸序列，所述人重链恒定区核酸序列例如包含一个或多个重链恒定区基因，所述一个或多个重链恒定区基因各自包含编码功能性CH1结构域的序列，例如，包括至少完整的Igμ基因以及完整的Igδ基因、完整的Igγ基因、完整的Igε基因和完整的Igα基因中的至少一种。
在一些实施方案中，重排人免疫球蛋白轻链可变区核苷酸序列可操作地连接至非人轻链恒定区核酸序列。在一些实施方案中，非人轻链恒定区核酸序列为小鼠或大鼠轻链恒定区核酸序列。
在一些实施方案中，非人动物为啮齿动物，并且重排人免疫球蛋白轻链可变区核苷酸序列可操作地连接至人轻链恒定区核酸序列。在一些特定实施方案中，轻链恒定区核酸序列为κ序列。在一些特定实施方案中，轻链恒定区核酸序列为λ序列。
在一些实施方案中，未重排人免疫球蛋白VL和JL基因区段为人Vκ和Jκ基因区段。在一些实施方案中，未重排人免疫球蛋白VL和JL基因区段为人Vλ和Jλ基因区段。
在一些实施方案中，重排人免疫球蛋白轻链可变区核苷酸序列包括人κ轻链可变区核苷酸序列。在一些实施方案中，重排人免疫球蛋白轻链可变区核苷酸序列包括人λ轻链可变区核苷酸序列。
在一些实施方案中，未重排人免疫球蛋白VL基因区段包括下列中的一个或多个：Vκ1-5、Vκ1-6、Vκ1-8、Vκ1-9、Vκ1-12、Vκ1-13、Vκ1-16、Vκ1-17、Vκ1-22、Vκ1-27、Vκ1-32、Vκ1-33、Vκ1-35、Vκ1-37、Vκ1-39、Vκ1D-8、Vκ1D-12、Vκ1D-13、Vκ1D-16、Vκ1D-17、Vκ1D-22、Vκ1D-27、Vκ1D-32、Vκ1D-33、Vκ1D-35、Vκ1D-37、Vκ1D-39、Vκ1D-42、Vκ1D-43、Vκ1-NL1、Vκ2-4、Vκ2-10、Vκ2-14、Vκ2-18、Vκ2-19、Vκ2-23、Vκ2-24、Vκ2-26、Vκ2-28、Vκ2-29、Vκ2-30、Vκ2-36、Vκ2-38、Vκ2-40、Vκ2D-10、Vκ2D-14、Vκ2D-18、Vκ2D-19、Vκ2D-23、Vκ2D-24、Vκ2D-26、Vκ2D-28、Vκ2D-29、Vκ2D-30、Vκ2D-36、Vκ2D-38、Vκ2D-40、Vκ3-7、Vκ3-11、Vκ3-15、Vκ3-20、Vκ3-25、Vκ3-31、Vκ3-34、Vκ3D-7、Vκ3D-7、Vκ3D-11、Vκ3D-15、Vκ3D-15、Vκ3D-20、Vκ3D-25、Vκ3D-31、Vκ3D-34、Vκ3-NL1、Vκ3-NL2、Vκ3-NL3、Vκ3-NL4、Vκ3-NL5、Vκ4-1、Vκ5-2、Vκ6-21、Vκ6D-21、Vκ6D-41和Vκ7-3。在一些实施方案中，未重排人免疫球蛋白JL基因区段包括下列中的一个或多个：Jκ1、Jκ2、Jκ3、Jκ4、和Jκ5。
在一些实施方案中，重排人免疫球蛋白轻链可变区中的VL基因区段为(人种系)Vκ基因区段，所述基因区段选自：Vκ1-5、Vκ1-6、Vκ1-8、Vκ1-9、Vκ1-12、Vκ1-13、Vκ1-16、Vκ1-17、Vκ1-22、Vκ1-27、Vκ1-32、Vκ1-33、Vκ1-35、Vκ1-37、Vκ1-39、Vκ1D-8、Vκ1D-12、Vκ1D-13、Vκ1D-16、Vκ1D-17、Vκ1D-22、Vκ1D-27、Vκ1D-32、Vκ1D-33、Vκ1D-35、Vκ1D-37、Vκ1D-39、Vκ1D-42、Vκ1D-43、Vκ1-NL1、Vκ2-4、Vκ2-10、Vκ2-14、Vκ2-18、Vκ2-19、Vκ2-23、Vκ2-24、Vκ2-26、Vκ2-28、Vκ2-29、Vκ2-30、Vκ2-36、Vκ2-38、Vκ2-40、Vκ2D-10、Vκ2D-14、Vκ2D-18、Vκ2D-19、Vκ2D-23、Vκ2D-24、Vκ2D-26、Vκ2D-28、Vκ2D-29、Vκ2D-30、Vκ2D-36、Vκ2D-38、Vκ2D-40、Vκ3-7、Vκ3-11、Vκ3-15、Vκ3-20、Vκ3-25、Vκ3-31、Vκ3-34、Vκ3D-7、Vκ3D-7、Vκ3D-11、Vκ3D-15、Vκ3D-15、Vκ3D-20、Vκ3D-25、Vκ3D-31、Vκ3D-34、Vκ3-NL1、Vκ3-NL2、Vκ3-NL3、Vκ3-NL4、Vκ3-NL5、Vκ4-1、Vκ5-2、Vκ6-21、Vκ6D-21、Vκ6D-41和Vκ7-3。在一些特定实施方案中，VL基因区段选自Vκ1-39(例如，人种系Vκ1-39基因区段)和Vκ3-20(例如，人种系Vκ3-20基因区段)。在一些实施方案中，JL基因区段选自Jκ1(例如，人种系Jκ1基因区段)、Jκ2(例如，人种系Jκ2基因区段)、Jκ3(例如，人种系Jκ3基因区段)、Jκ4(例如，人种系Jκ4基因区段)和Jκ5(例如，人种系Jκ5基因区段)。在一些特定实施方案中，重排人免疫球蛋白轻链可变核苷酸序列包含Vκ1-39和Jκ5(例如，Vκ1-39与Jκ5重排，例如人种系Vκ1-38基因区段与人种系Jκ5基因区段重排)。在一些实施方案中，重排人免疫球蛋白轻链可变区核苷酸序列包含示为SEQ ID NO:1的序列。在一些特定实施方案中，重排人免疫球蛋白轻链可变核苷酸序列包含Vκ3-20和Jκ1(例如，Vκ3-20与Jκ1重排，例如人种系Vκ3-20基因区段与人种系Jκ1基因区段重排)。在一些实施方案中，重排人免疫球蛋白轻链可变区核苷酸序列包含示为SEQ ID NO:2的序列。在一些实施方案中，非人动物为啮齿动物，并且其中轻链恒定区核酸序列为大鼠或小鼠Cκ恒定区核酸序列。
在一些实施方案中，非人动物为啮齿动物，并且其中所述重链恒定区核酸序列为选自下列的大鼠或小鼠恒定区序列：Igμ、Igδ、Igγ、Igε、Igα、和它们的组合，它们中的每一个编码功能性CH1结构域。
在一些实施方案中，未重排人免疫球蛋白VL基因区段包括下列中的一个或多个：Vλ3-1、Vλ4-3、Vλ2-8、Vλ3-9、Vλ3-10、Vλ2-11、Vλ3-12、Vλ2-14、Vλ3-16、Vλ2-18、Vλ3-19、Vλ3-21、Vλ3-22、Vλ2-23、Vλ3-25、Vλ3-27、Vλ1-36、Vλ5-37、Vλ5-39、Vλ1-40、Vλ7-43、Vλ1-44、Vλ5-45、Vλ7-46、Vλ1-47、Vλ9-49、Vλ1-51、Vλ5-52、Vλ6-57、Vλ4-60、Vλ8-61和Vλ4-69。在一些实施方案中，非人动物包含未重排人免疫球蛋白JL基因区段，所述基因区段包括Jλ1、Jλ2、Jλ3和Jλ7。
在一些实施方案中，重排人免疫球蛋白轻链可变区核苷酸序列中的VL基因区段为(人种系)Vλ基因区段，所述基因区段选自Vλ3-1、Vλ4-3、Vλ2-8、Vλ3-9、Vλ3-10、Vλ2-11、Vλ3-12、Vλ2-14、Vλ3-16、Vλ2-18、Vλ3-19、Vλ3-21、Vλ3-22、Vλ2-23、Vλ3-25、Vλ3-27、Vλ1-36、Vλ5-37、Vλ5-39、Vλ1-40、Vλ7-43、Vλ1-44、Vλ5-45、Vλ7-46、Vλ1-47、Vλ9-49、Vλ1-51、Vλ5-52、Vλ6-57、Vλ4-60、Vλ8-61和Vλ4-69。在一些特定实施方案中，所述VL基因区段为Vλ2-14，例如人种系Vλ2-14基因区段。在一些实施方案中，重排人免疫球蛋白轻链可变区核苷酸序列中的JL基因区段选自Jλ1、Jλ2、Jλ3和Jλ7。在一些特定实施方案中，重排人免疫球蛋白轻链可变区核苷酸序列包含Vλ2-14Jλ1。在一些特定实施方案中，重排人免疫球蛋白轻链可变区核苷酸序列包含Vλ2-14Jλ2。在一些特定实施方案中，重排人免疫球蛋白轻链可变区核苷酸序列包含Vλ2-14Jλ3。在一些特定实施方案中，重排人免疫球蛋白轻链可变区核苷酸序列包含Vλ2-14Jλ7。在一些实施方案中，非人动物为啮齿动物，并且轻链恒定区核酸序列为大鼠或小鼠Cλ恒定区核酸序列。
在一些实施方案中，非人动物为啮齿动物，并且其中所述重链恒定区核酸序列为选自下列的大鼠或小鼠恒定区序列：Igμ、Igδ、Igγ、Igε、Igα、和它们的组合，它们中的每一个编码功能性CH1结构域。
在一些实施方案中，重排人免疫球蛋白轻链可变区核苷酸序列处于基因组中的内源性免疫球蛋白轻链基因座处。在一些实施方案中，重排人免疫球蛋白轻链可变区核苷酸序列存在于非人动物的种系基因组中。在一些实施方案中，将重排人免疫球蛋白轻链可变区核苷酸序列整合到基因组中的转录活性基因座中。在一些实施方案中，非人动物包含重排人免疫球蛋白轻链可变区核苷酸序列的多个拷贝。
在一些实施方案中，非人动物包含整合的Adam6a基因、Adam6b基因或上述两者。在一些实施方案中，非人动物包含功能性异位小鼠Adam6基因。
在一些实施方案中，编码通用轻链的核酸序列包含一个或多个组氨酸密码子，所述组氨酸密码子不由相应的人种系轻链可变基因区段编码。
在一些实施方案中，本发明提供一种用于制备包含VL/CHxULC(VκOHxULC或VλOHxULC)结构域的抗原结合蛋白的方法，所述方法一般包括在宿主细胞中表达第一核酸，所述第一核酸包括核酸序列，所述核酸序列编码VL/CHxULC结构域，所述结构域任选地与包含功能性CH1结构域编码序列的重链恒定区基因或轻链恒定区基因可操作地连接，其中所述VL/CHxULC结构域与通用轻链可变结构域同源，并且其中所述抗原结合蛋白不是单结构域抗原结合蛋白。在一些实施方案中，编码VL/CHxULC结构域的核酸序列从非人动物分离，所述非人动物在其基因组中包含：(i)可操作地连接至免疫球蛋白轻链恒定区核酸序列的重排人免疫球蛋白轻链可变区核苷酸序列；和(ii)可操作地连接至免疫球蛋白重链恒定区核酸序列的未重排人免疫球蛋白轻链可变区基因区段(VL和JL)，其中所述编码VL/CHxULC结构域的核酸序列源于可操作地连接至免疫球蛋白重链恒定区核酸序列的未重排人免疫球蛋白轻链可变区基因区段(VL和JL)，所述免疫球蛋白重链恒定区核酸序列例如包含一个或多个重链恒定区基因，所述一个或多个重链恒定区基因各自包含编码功能性CH1结构域的序列，例如，包含至少完整的Igμ基因以及完整的Igδ基因、完整的Igγ基因、完整的Igε基因、和完整的Igα基因中的至少一种。在一些实施方案中，所述方法还包括：(a)任选地用包含表位或其免疫原性部分的抗原对非人动物进行免疫，其中所述非人动物在其基因组中包含：(i)可操作地连接至免疫球蛋白轻链恒定区核酸序列的重排人免疫球蛋白轻链可变区核苷酸序列；和(ii)能够重排以形成可操作地连接至免疫球蛋白重链恒定区核酸序列的重排VL/JL基因序列的未重排人免疫球蛋白轻链可变区基因区段(VL和JL)，使得非人动物对表位或其免疫原性部分产生免疫应答，然后(b)从非人动物中分离核酸序列，所述核酸序列编码轻链可变结构域，所述轻链可变结构域特异性结合表位或其免疫原性部分，且源于重排VL/JL基因序列，所述VL/JL基因序列可操作地连接至免疫球蛋白重链恒定区核酸。附加的实施方案包括以下方法，所述方法包括(c)在任选地可操作地连接至人免疫球蛋白恒定区核酸序列的表达构建体中采用分离的核酸序列；然后(d)在生产细胞系(例如宿主细胞)中表达核酸序列或包含所述核酸序列的表达构建体，以获得抗原结合蛋白。
在一些实施方案中，用于制备包含VL/CHxULC结构域的抗原结合蛋白的方法，所述方法包括在宿主细胞中共表达(i)第一核酸，所述第一核酸包含编码第一结合组分的核酸序列，所述第一结合组分包含第一可变结构域，例如，VL/CHxULC结构域，所述结构域特异性针对第一表位，所述第一表位任选地与包含功能性CH1结构域编码序列的第一重链恒定区基因或第一轻链恒定区基因可操作地连接，和(ii)第二核酸，所述第二核酸编码包含第二可变结构域的第二组分，所述第二可变结构域特异性针对第二表位，其中所述第二可变结构域为第二VL/CHxULC结构域或VHxULC结构域，其中所述第一和第二表位不相同，并且其中所述第一和第二可变结构域各自与通用轻链可变结构域同源，所述通用轻链可变结构域源于相同的单重排轻链可变区基因序列，从而是相同的或者为体细胞超突变的变体，例如仅通过体细胞超突变在氨基酸序列方面不同。
因此，在一些实施方案中，所述方法包括：(a)用抗原对第二非人动物进行免疫，所述抗原包含表位或其免疫原性部分，其中所述第二非人动物在其基因组中包含：(i)可操作地连接至免疫球蛋白轻链恒定区核酸序列的重排人免疫球蛋白轻链可变区核苷酸序列；和(ii)能够重排以形成重排VL/JL基因序列(其编码第二结合组分的第二VL/CHxULC结构域)的未重排人免疫球蛋白轻链可变区基因区段(VL和JL)或能够重排以形成可操作地连接至免疫球蛋白重链恒定区核酸序列的重排VH/D/JH基因序列(其编码第二结合组分的VHxULC结构域)的未重排人免疫球蛋白重链可变区基因区段(VH、D和JH)，使得非人动物对表位或其免疫原性部分产生免疫应答，然后(b)从非人动物中分离第二核酸序列，所述第二核酸序列编码特异性结合第二表位或其免疫原性部分的第二VL/CHxULC或VHxULC结构域。附加的实施方案包括以下方法，所述方法包括(c)在任选地可操作地连接至人免疫球蛋白恒定区核酸序列的表达构建体中采用分离的第二核酸序列；然后(d)在生产细胞系(例如宿主细胞)中表达第一和第二核酸序列或包含所述核酸序列的表达构建体，以获得抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白不是单结构域抗原结合蛋白。
在附加实施方案中，所述方法还包括在生产宿主细胞中共表达编码第一VL/CHxULC结构域(或包含所述结构域的表达构建体)的第一核酸，任选地编码第二VL/CHxULC结构域或VHxULC结构域(或包含所述结构域的表达构建体)的第二核酸，和核苷酸序列，所述核苷酸序列包含重排VL/JL基因序列，所述基因序列编码与VL/CHxULC结构域和任选的第二VL/CHxULC结构域或VHxULC结构域同源的人通用轻链可变结构域，或其体细胞超突变的变体。在一些实施方案中，核苷酸序列编码融合至人轻链恒定结构域的通用轻链可变结构域。
可在相同或不同表达构建体中采用第一核酸序列、和第二核酸序列以及核苷酸序列(其包含编码人通用轻链可变结构域的重排VL/JL基因序列)中的任一种或两种，其中一个或多个表达构建体表达抗原结合蛋白，例如，第一结合组分，和第二结合组分或通用轻链中的任一者或两者，其呈选自下列的形式：Fab状结构、scFab状结构、双体抗体状结构、scFv状结构、scFv-Fc状结构、scFv-拉链状结构、和类似于典型抗体并且包括同源通用轻链的四聚体结构。因此，在一些实施方案中，第一和第二核酸序列中的任一者或两者可分别编码融合或不融合至恒定区例如包含功能性CH1结构域或(人)轻链恒定结构域的(人)重链恒定区的第一可变VL/CHxULC和第二可变(VL/CHxULC或VHxULC)结构域。
在一些实施方案中，第一和第二核酸序列中的任一者或两者包含重链恒定区核酸，所述重链恒定区核酸编码具有选自下列的同种型的人重链恒定区：IgM、IgD、IgG、IgE和IgA，例如，IgG重链恒定区具有选自下列的亚类：IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。在一些实施方案中，第一和第二核酸序列编码第一可变VL/CHxULC和第二可变(VL/CHxULC或VHxULC)结构域，所述结构域融合至具有相同同种型和/或亚类的重链恒定区，但任选地其中重链恒定区在其对蛋白质A的亲和力方面不同。在一些实施方案中，其中第一可变VL/CHxULC和第二可变(VL/CHxULC或VHxULC)结构域两者均融合至人IgG1、IgG2或IgG4重链恒定区，仅第一可变VL/CHxULC和第二可变(VL/CHxULC或VHxULC)结构域中的一个融合至人IgG1、IgG2或IgG4重链恒定区，所述重链恒定区包含减少或消除CH3结构域对蛋白质A的结合的CH3结构域的突变，例如选自下列的突变：IMGT编号系统中的(a)95R、和(b)95R和96F，或者EU编号系统中的(a')435R、和(b')435R和436F。在一些实施方案中，人重链恒定区为人IgG1恒定区并且还包含一至五个选自下列的修饰：IMGT外显子编号系统中的16E、18M、44S、52N、57M和82I，或EU编号系统中的356E、358M、384S、392N、397M和422I。在一些实施方案中，人重链恒定区为人IgG2恒定区并且还包含一或两个选自下列的修饰：IMGT外显子编号系统中的44S、52N、82I，或EU编号系统中的348S、392N和422I。在其它实施方案中，人重链恒定区为人IgG4恒定区并且还包含一至七个选自下列的修饰：IMGT外显子编号系统中的15R、44S、52N、57M、69K、79Q和82I，或EU编号系统中的355R、384S、392N、397M、409K、419Q和422I和/或IMGT外显子编号系统中的修饰105P或EU编号系统中的445P。
在一些实施方案中，未重排人免疫球蛋白轻链VL或JL基因区段中的至少一个编码一个或多个组氨酸残基，所述组氨酸残基不由相应的人种系轻链可变基因区段编码。
在一些实施方案中，第一和/或第二核酸序列源于其的第一和/或第二非人动物为哺乳动物或鸟。在一些特定实施方案中，所述鸟为鸡。在一些特定实施方案中，所述哺乳动物为啮齿动物。在一些实施方案中，啮齿动物选自小鼠、大鼠和仓鼠。
在一些实施方案中，人免疫球蛋白轻链可变VL和JL基因区段可操作地连接至非人免疫球蛋白重链恒定区核酸序列，所述重链恒定区核酸序列例如包含一个或多个重链恒定区基因，所述一个或多个重链恒定区基因各自包含编码功能性CH1结构域的序列，例如，包含至少完整的Igμ基因以及完整的Igδ基因、完整的Igγ基因、完整的Igε基因和完整的Igα基因中的至少一种。在一些实施方案中，非人免疫球蛋白重链恒定区核酸序列为小鼠或大鼠免疫球蛋白重链恒定区核酸序列，所述重链恒定区核酸序列例如包含一个或多个重链恒定区基因，所述一个或多个重链恒定区基因各自包含编码功能性CH1结构域的序列，例如，包含至少完整的Igμ基因以及完整的Igδ基因、完整的Igγ基因、完整的Igε基因和完整的Igα基因中的至少一种。在一些实施方案中，非人动物为啮齿动物，并且人免疫球蛋白轻链可变VL和JL基因区段可操作地连接至人重链恒定区核酸序列，所述人重链恒定区核酸序列例如包含一个或多个重链恒定区基因，所述一个或多个重链恒定区基因各自包含编码功能性CH1结构域的序列，例如，包含至少完整的Igμ基因以及完整的Igδ基因、完整的Igγ基因、完整的Igε基因和完整的Igα基因中的至少一种。
在一些实施方案中，重链恒定区核酸序列包含编码CH1、铰链、CH2、CH3、或它们的组合的核苷酸序列。在一些实施方案中，重链恒定区核酸序列包含编码功能性CH1结构域的序列。
在一些实施方案中，重排人免疫球蛋白轻链可变区核苷酸序列可操作地连接至非人轻链恒定区核酸序列。在一些实施方案中，非人轻链恒定区核酸序列为小鼠或大鼠轻链恒定区核酸序列。在一些实施方案中，非人动物为啮齿动物，并且重排人免疫球蛋白轻链可变区核苷酸序列可操作地连接至人轻链恒定区核酸序列。在一些特定实施方案中，轻链恒定区核酸序列为κ序列。在一些特定实施方案中，轻链恒定区核酸序列为λ序列。
在一些实施方案中，未重排人免疫球蛋白轻链可变VL和JL基因区段为Vκ和Jκ基因区段。在一些实施方案中，未重排人免疫球蛋白轻链可变VL和JL基因区段为Vλ和Jλ基因区段。
在一些实施方案中，重排人免疫球蛋白轻链可变区核苷酸序列包括人κ轻链可变区核苷酸序列。在一些实施方案中，重排人免疫球蛋白轻链可变区核苷酸序列包括人λ轻链可变结构域基因序列。
在一些实施方案中，未重排人免疫球蛋白VL基因区段包括下列中的一个或多个：Vκ1-5、Vκ1-6、Vκ1-8、Vκ1-9、Vκ1-12、Vκ1-13、Vκ1-16、Vκ1-17、Vκ1-22、Vκ1-27、Vκ1-32、Vκ1-33、Vκ1-35、Vκ1-37、Vκ1-39、Vκ1D-8、Vκ1D-12、Vκ1D-13、Vκ1D-16、Vκ1D-17、Vκ1D-22、Vκ1D-27、Vκ1D-32、Vκ1D-33、Vκ1D-35、Vκ1D-37、Vκ1D-39、Vκ1D-42、Vκ1D-43、Vκ1-NL1、Vκ2-4、Vκ2-10、Vκ2-14、Vκ2-18、Vκ2-19、Vκ2-23、Vκ2-24、Vκ2-26、Vκ2-28、Vκ2-29、Vκ2-30、Vκ2-36、Vκ2-38、Vκ2-40、Vκ2D-10、Vκ2D-14、Vκ2D-18、Vκ2D-19、Vκ2D-23、Vκ2D-24、Vκ2D-26、Vκ2D-28、Vκ2D-29、Vκ2D-30、Vκ2D-36、Vκ2D-38、Vκ2D-40、Vκ3-7、Vκ3-11、Vκ3-15、Vκ3-20、Vκ3-25、Vκ3-31、Vκ3-34、Vκ3D-7、Vκ3D-7、Vκ3D-11、Vκ3D-15、Vκ3D-15、Vκ3D-20、Vκ3D-25、Vκ3D-31、Vκ3D-34、Vκ3-NL1、Vκ3-NL2、Vκ3-NL3、Vκ3-NL4、Vκ3-NL5、Vκ4-1、Vκ5-2、Vκ6-21、Vκ6D-21、Vκ6D-41和Vκ7-3。在一些实施方案中，未重排人免疫球蛋白JL基因区段包括Jκ1、Jκ2、Jκ3、Jκ4、和Jκ5。
在一些实施方案中，重排人免疫球蛋白轻链可变区核苷酸序列包含VL和JL基因区段。在一些实施方案中，重排人免疫球蛋白轻链可变区中的VL基因区段为(人种系)Vκ基因区段，所述基因区段选自：Vκ1-5、Vκ1-6、Vκ1-8、Vκ1-9、Vκ1-12、Vκ1-13、Vκ1-16、Vκ1-17、Vκ1-22、Vκ1-27、Vκ1-32、Vκ1-33、Vκ1-35、Vκ1-37、Vκ1-39、Vκ1D-8、Vκ1D-12、Vκ1D-13、Vκ1D-16、Vκ1D-17、Vκ1D-22、Vκ1D-27、Vκ1D-32、Vκ1D-33、Vκ1D-35、Vκ1D-37、Vκ1D-39、Vκ1D-42、Vκ1D-43、Vκ1-NL1、Vκ2-4、Vκ2-10、Vκ2-14、Vκ2-18、Vκ2-19、Vκ2-23、Vκ2-24、Vκ2-26、Vκ2-28、Vκ2-29、Vκ2-30、Vκ2-36、Vκ2-38、Vκ2-40、Vκ2D-10、Vκ2D-14、Vκ2D-18、Vκ2D-19、Vκ2D-23、Vκ2D-24、Vκ2D-26、Vκ2D-28、Vκ2D-29、Vκ2D-30、Vκ2D-36、Vκ2D-38、Vκ2D-40、Vκ3-7、Vκ3-11、Vκ3-15、Vκ3-20、Vκ3-25、Vκ3-31、Vκ3-34、Vκ3D-7、Vκ3D-7、Vκ3D-11、Vκ3D-15、Vκ3D-15、Vκ3D-20、Vκ3D-25、Vκ3D-31、Vκ3D-34、Vκ3-NL1、Vκ3-NL2、Vκ3-NL3、Vκ3-NL4、Vκ3-NL5、Vκ4-1、Vκ5-2、Vκ6-21、Vκ6D-21、Vκ6D-41和Vκ7-3。在一些特定实施方案中，VL基因区段选自Vκ1-39(例如，人种系Vκ1-39基因区段)和Vκ3-20(例如，人种系Vκ3-20基因区段)。在一些实施方案中，JL基因区段选自Jκ1、Jκ2、Jκ3、Jκ4、和Jκ5。在一些特定实施方案中，重排人免疫球蛋白轻链可变核苷酸序列包含Vκ1-39和Jκ5(例如，Vκ1-39与Jκ5重排，例如人种系Vκ1-39基因区段与人种系Jκ5基因区段重排)。在一些实施方案中，重排人免疫球蛋白轻链可变区基因序列包含示为SEQ ID NO:1的序列。在一些特定实施方案中，重排人免疫球蛋白轻链可变核苷酸序列包含Vκ3-20和Jκ1(例如，Vκ3-20与Jκ1重排，例如人种系Vκ3-20基因区段与人种系Jκ1基因区段重排)。在一些实施方案中，重排人免疫球蛋白轻链可变区核苷酸序列包含示为SEQID NO:2的序列。
在一些实施方案中，非人动物为啮齿动物，并且其中轻链恒定区核酸序列为大鼠或小鼠Cκ恒定区核酸序列。在一些实施方案中，非人动物为啮齿动物，并且其中所述重链恒定区核酸序列为选自下列的大鼠或小鼠恒定区序列：Igμ、Igδ、Igγ、Igε、Igα、和它们的组合，它们中的每一个编码至少功能性CH1结构域。
在一些实施方案中，重排人免疫球蛋白轻链可变区核苷酸序列处于基因组中的内源性免疫球蛋白轻链基因座处。在一些实施方案中，重排人免疫球蛋白轻链可变区核苷酸序列存在于非人动物的种系基因组中。在一些实施方案中，重排人免疫球蛋白轻链可变区核苷酸序列处于基因组中的转录活性基因座处。
在一些实施方案中，非人动物包含重排人免疫球蛋白轻链可变区核苷酸序列的多个拷贝。
在一些实施方案中，非人动物包含Adam6a基因、Adam6b基因或上述两者。在一些实施方案中，非人动物包含功能性异位小鼠Adam6基因。
在一些实施方案中，本发明提供非人动物，所述非人动物的基因组包含(a)第一免疫球蛋白基因座，所述第一免疫球蛋白基因座包含可操作地连接至免疫球蛋白重链恒定区核酸序列的未重排人免疫球蛋白轻链可变VL和JL基因区段；和(b)第二免疫球蛋白基因座，所述第二免疫球蛋白基因座包含可操作地连接至免疫球蛋白轻链恒定区核酸序列的重排非人免疫球蛋白轻链可变区核苷酸序列。
在一些实施方案中，非人动物为哺乳动物或鸟。在一些特定实施方案中，所述鸟为鸡。在一些特定实施方案中，所述哺乳动物为啮齿动物。在一些实施方案中，啮齿动物选自小鼠、大鼠和仓鼠。
在一些实施方案中，重排非人免疫球蛋白轻链可变区核苷酸序列包含啮齿动物免疫球蛋白Vκ和Jκ基因区段。在一些特定实施方案中，啮齿动物免疫球蛋白Vκ和Jκ基因区段为小鼠基因区段。在一些特定实施方案中，啮齿动物免疫球蛋白Vκ和Jκ基因区段为大鼠基因区段。
在一些实施方案中，本发明提供制备非人动物的方法，所述方法包括：(a)修饰非人动物的基因组以删除全部或基本上全部的(i)内源性功能性免疫球蛋白重链VH、D、和JH基因区段和(ii)内源性功能性轻链VL和JL基因区段，或使其呈现非功能化；(b)在基因组中设置未重排人免疫球蛋白轻链可变VL和JL基因区段，使得未重排轻链可变基因区段可操作地连接至重链恒定区核酸序列；以及(c)在基因组中设置重排非人免疫球蛋白轻链可变区核苷酸序列，使得重排人免疫球蛋白轻链可变区核苷酸序列可操作地连接至轻链恒定区核酸序列。
在一些实施方案中，本发明提供用于获得编码免疫球蛋白轻链可变结构域(VL)的核酸序列的方法，所述免疫球蛋白轻链可变结构域能够独立于重链可变结构域结合抗原，所述方法包括：(a)用包含表位或其免疫原性部分的抗原对非人动物进行免疫，其中所述非人动物在其基因组中包含(i)可操作地连接至免疫球蛋白轻链恒定区核酸序列的重排非人免疫球蛋白轻链可变区核苷酸序列，和(ii)可操作地连接至免疫球蛋白重链恒定区核酸序列的未重排人免疫球蛋白轻链可变区基因区段(VL和JL)；(b)使得非人动物产生免疫应答；并且(c)从免疫的非人动物获得核酸序列，所述核酸序列编码可结合抗原的轻链可变结构域(VL结构域)。
在一些实施方案中，本发明提供了一种用于制备抗原结合蛋白的方法，所述抗原结合蛋白包含免疫球蛋白轻链可变结构域，所述免疫球蛋白轻链可变结构域可独立于重链可变结构域结合抗原，所述方法包括(a)用包含表位或其免疫原性部分的抗原对非人动物进行免疫，其中所述非人动物在其基因组中包含(i)可操作地连接至免疫球蛋白轻链恒定区核酸序列的重排非人免疫球蛋白轻链可变区核苷酸序列；和(ii)可操作地连接至免疫球蛋白重链恒定区核酸序列的未重排人免疫球蛋白轻链可变区基因区段(VL和JL)；(b)使得非人动物对第一表位或其免疫原性部分产生免疫应答；(c)从非人动物获得核酸序列，所述核酸序列编码特异性结合表位或其免疫原性部分的轻链可变结构域；(d)在表达构建体中采用(c)的核酸序列，所述表达构建体融合至人免疫球蛋白恒定区核酸序列；和(e)在生产细胞系中表达(c)的核酸序列以形成抗原结合蛋白，所述抗原结合蛋白的轻链由(c)的核酸编码并且独立于重链结合表位或其免疫原性部分。
在一些实施方案中，本发明提供非人动物，所述非人动物在其基因组中包含(a)杂交免疫球蛋白链基因座，所述杂交免疫球蛋白链基因座包含可操作地连接至重链恒定区核酸序列的未重排人免疫球蛋白轻链可变VL和JL基因区段；和(b)免疫球蛋白轻链基因座，所述免疫球蛋白轻链基因座包含两个或更多个但少于野生型数的可操作地连接至免疫球蛋白轻链恒定区核酸序列的人免疫球蛋白轻链可变区基因区段。
在一些实施方案中，非人动物为哺乳动物或鸟。在一些特定实施方案中，所述鸟为鸡。在一些特定实施方案中，所述哺乳动物为啮齿动物。在一些实施方案中，啮齿动物选自小鼠、大鼠和仓鼠。
在一些实施方案中，非人动物对于可操作地连接至免疫球蛋白轻链恒定区核酸序列的两个或更多个但少于野生型数的人免疫球蛋白轻链可变区基因区段是纯合的。
在一些实施方案中，未重排人免疫球蛋白轻链可变基因区段可操作地连接至非人重链恒定区核酸序列。在一些特定实施方案中，非人重链恒定区核酸序列为小鼠或大鼠重链恒定区核酸序列。在一些实施方案中，非人动物为啮齿动物，并且未重排人免疫球蛋白轻链可变基因区段可操作地连接至人重链恒定区核酸序列。在一些实施方案中，重链恒定区核酸序列包含编码CH1、铰链、CH2、CH3或它们的组合的核苷酸序列。
在一些实施方案中，两个或更多个但少于野生型数的人免疫球蛋白轻链可变区基因区段可操作地连接至非人轻链恒定区核酸序列。在一些实施方案中，非人轻链恒定区核酸序列为小鼠或大鼠轻链恒定区核酸序列。
在一些实施方案中，非人动物为啮齿动物并且两个或更多个但少于野生型数的人免疫球蛋白轻链可变区基因区段可操作地连接至人轻链恒定区核酸序列。在一些实施方案中，轻链恒定区核酸序列为κ序列。在一些实施方案中，轻链恒定区核酸序列为λ序列。在一些实施方案中，免疫球蛋白轻链基因座为κ基因座。在一些实施方案中，免疫球蛋白轻链基因座为λ基因座。
在一些实施方案中，未重排人免疫球蛋白VL和JL基因区段为人Vκ和Jκ基因区段。在一些实施方案中，未重排人免疫球蛋白VL和JL基因区段为人Vλ和Jλ基因区段。
在一些实施方案中，两个或更多个但少于野生型数的人免疫球蛋白轻链可变区基因区段包含人κ轻链可变区核苷酸序列。在一些实施方案中，两个或更多个但少于野生型数的人免疫球蛋白轻链可变区基因区段包含人λ轻链可变区核苷酸序列。
在一些实施方案中，未重排人免疫球蛋白轻链可变VL基因区段选自：Vκ1-5、Vκ1-6、Vκ1-8、Vκ1-9、Vκ1-12、Vκ1-13、Vκ1-16、Vκ1-17、Vκ1-22、Vκ1-27、Vκ1-32、Vκ1-33、Vκ1-35、Vκ1-37、Vκ1-39、Vκ1D-8、Vκ1D-12、Vκ1D-13、Vκ1D-16、Vκ1D-17、Vκ1D-22、Vκ1D-27、Vκ1D-32、Vκ1D-33、Vκ1D-35、Vκ1D-37、Vκ1D-39、Vκ1D-42、Vκ1D-43、Vκ1-NL1、Vκ2-4、Vκ2-10、Vκ2-14、Vκ2-18、Vκ2-19、Vκ2-23、Vκ2-24、Vκ2-26、Vκ2-28、Vκ2-29、Vκ2-30、Vκ2-36、Vκ2-38、Vκ2-40、Vκ2D-10、Vκ2D-14、Vκ2D-18、Vκ2D-19、Vκ2D-23、Vκ2D-24、Vκ2D-26、Vκ2D-28、Vκ2D-29、Vκ2D-30、Vκ2D-36、Vκ2D-38、Vκ2D-40、Vκ3-7、Vκ3-11、Vκ3-15、Vκ3-20、Vκ3-25、Vκ3-31、Vκ3-34、Vκ3D-7、Vκ3D-7、Vκ3D-11、Vκ3D-15、Vκ3D-15、Vκ3D-20、Vκ3D-25、Vκ3D-31、Vκ3D-34、Vκ3-NL1、Vκ3-NL2、Vκ3-NL3、Vκ3-NL4、Vκ3-NL5、Vκ4-1、Vκ5-2、Vκ6-21、Vκ6D-21、Vκ6D-41和Vκ7-3。在一些实施方案中，未重排人免疫球蛋白轻链可变JL基因区段选自Jκ1、Jκ2、Jκ3、Jκ4和Jκ5。
在一些实施方案中，两个或更多个但少于野生型数的人免疫球蛋白轻链可变区基因区段包含VL和JL基因区段。
在一些实施方案中，两个或更多个可变区基因区段的VL基因区段选自：Vκ1-5、Vκ1-6、Vκ1-8、Vκ1-9、Vκ1-12、Vκ1-13、Vκ1-16、Vκ1-17、Vκ1-22、Vκ1-27、Vκ1-32、Vκ1-33、Vκ1-35、Vκ1-37、Vκ1-39、Vκ1D-8、Vκ1D-12、Vκ1D-13、Vκ1D-16、Vκ1D-17、Vκ1D-22、Vκ1D-27、Vκ1D-32、Vκ1D-33、Vκ1D-35、Vκ1D-37、Vκ1D-39、Vκ1D-42、Vκ1D-43、Vκ1-NL1、Vκ2-4、Vκ2-10、Vκ2-14、Vκ2-18、Vκ2-19、Vκ2-23、Vκ2-24、Vκ2-26、Vκ2-28、Vκ2-29、Vκ2-30、Vκ2-36、Vκ2-38、Vκ2-40、Vκ2D-10、Vκ2D-14、Vκ2D-18、Vκ2D-19、Vκ2D-23、Vκ2D-24、Vκ2D-26、Vκ2D-28、Vκ2D-29、Vκ2D-30、Vκ2D-36、Vκ2D-38、Vκ2D-40、Vκ3-7、Vκ3-11、Vκ3-15、Vκ3-20、Vκ3-25、Vκ3-31、Vκ3-34、Vκ3D-7、Vκ3D-7、Vκ3D-11、Vκ3D-15、Vκ3D-15、Vκ3D-20、Vκ3D-25、Vκ3D-31、Vκ3D-34、Vκ3-NL1、Vκ3-NL2、Vκ3-NL3、Vκ3-NL4、Vκ3-NL5、Vκ4-1、Vκ5-2、Vκ6-21、Vκ6D-21、Vκ6D-41和Vκ7-3。在一些特定实施方案中，VL基因区段选自Vκ1-39、Vκ3-20、以及它们的组合。在一些实施方案中，JL基因区段选自Jκ1、Jκ2、Jκ3、Jκ4、Jκ5、以及它们的组合。
在一些实施方案中，两个或更多个但少于野生型数的人免疫球蛋白轻链可变区基因区段包含两个或更多个但少于野生型数的人VL基因区段和一个或多个人JL基因区段。在一些特定实施方案中，两个或更多个但少于野生型数的VL基因区段包含Vκ1-39和Vκ3-20基因区段，并且一个或多个JL基因区段包含Jκ1、Jκ2、Jκ3、Jκ4、Jκ5、或它们的组合。
在一些实施方案中，非人动物为啮齿动物，并且其中轻链恒定区核酸序列为大鼠或小鼠Cκ恒定区核酸序列。
在一些实施方案中，非人动物为啮齿动物，并且其中所述重链恒定区核酸序列为选自下列的大鼠或小鼠恒定区序列：Igμ、Igδ、Igγ、Igε、Igα、和它们的组合，它们中的每一个编码功能性CH1结构域。
在一些实施方案中，基本上全部内源性可变重链VH、D和JH基因区段均从非人动物的免疫球蛋白重链基因座中删除，或呈现非功能性。
在一些实施方案中，基本上全部内源性轻链VL和JL基因区段均从非人动物的免疫球蛋白轻链基因座中删除，或呈现非功能性。
在一些实施方案中，非人动物包含Adam6a基因、Adam6b基因或上述两者。在一些实施方案中，非人动物包含功能性异位小鼠Adam6基因。
在一些实施方案中，免疫球蛋白轻链基因座包含两个或更多个但少于野生型数的人免疫球蛋白轻链可变区基因区段(VL和JL)的多个拷贝。
在一些实施方案中，本发明提供制备非人动物的方法，所述方法包括：(a)修饰非人动物的基因组以删除全部或基本上全部的(i)内源性免疫球蛋白重链VH、D、和JH基因区段和(ii)内源性轻链VL和JL基因区段，或使其呈现非功能化；(b)在基因组中设置未重排人免疫球蛋白轻链可变VL和JL基因区段使得未重排轻链可变基因区段可操作地连接至重链恒定区核酸序列；以及(c)在基因组中设置两个或更多个但少于野生型数的人免疫球蛋白轻链可变区基因区段，使得人免疫球蛋白轻链可变区基因区段可操作地连接至轻链恒定区核酸序列。
在一些实施方案中，非人动物为哺乳动物或鸟。在一些特定实施方案中，所述鸟为鸡。在一些特定实施方案中，所述哺乳动物为啮齿动物。在一些实施方案中，啮齿动物选自小鼠、大鼠和仓鼠。
在一些实施方案中，未重排人免疫球蛋白轻链可变VL和JL基因区段可操作地连接至非人免疫球蛋白重链恒定区核酸序列。在一些特定实施方案中，非人免疫球蛋白重链恒定区核酸序列为小鼠或大鼠免疫球蛋白重链恒定区核酸序列。
在一些实施方案中，非人动物为啮齿动物，并且未重排人免疫球蛋白轻链可变VL和JL基因区段可操作地连接至人重链恒定区核酸序列。在一些实施方案中，重链恒定区核酸序列包含编码CH1、铰链、CH2、CH3、或它们的组合的核苷酸序列。在一些实施方案中，重链恒定区核酸序列包含编码功能性CH1结构域的核苷酸序列。
在一些实施方案中，两个或更多个但少于野生型数的人免疫球蛋白轻链可变区基因区段可操作地连接至非人轻链恒定区核酸序列。在一些实施方案中，非人轻链恒定区核酸序列为小鼠或大鼠轻链恒定区核酸序列。
在一些实施方案中，非人动物为啮齿动物并且两个或更多个但少于野生型数的人免疫球蛋白轻链可变区基因区段可操作地连接至人轻链恒定区核酸序列。在一些实施方案中，轻链恒定区核酸序列为κ序列。在一些实施方案中，轻链恒定区核酸序列为λ序列。
在一些实施方案中，两个或更多个但少于野生型数的人免疫球蛋白轻链可变区基因区段置于κ轻链基因座中。在一些实施方案中，两个或更多个但少于野生型数的人免疫球蛋白轻链可变区基因区段置于λ轻链基因座中。
在一些实施方案中，未重排人免疫球蛋白VL和JL基因区段为人Vκ和Jκ基因区段。在一些实施方案中，未重排人免疫球蛋白VL和JL基因区段为人Vλ和Jλ基因区段。
在一些实施方案中，两个或更多个但少于野生型数的人免疫球蛋白轻链可变区基因区段包含人κ轻链可变区核苷酸序列。在一些实施方案中，两个或更多个但少于野生型数的人免疫球蛋白轻链可变区基因区段包含人λ轻链可变区核苷酸序列。
在一些实施方案中，未重排人免疫球蛋白轻链可变VL基因区段选自：Vκ1-5、Vκ1-6、Vκ1-8、Vκ1-9、Vκ1-12、Vκ1-13、Vκ1-16、Vκ1-17、Vκ1-22、Vκ1-27、Vκ1-32、Vκ1-33、Vκ1-35、Vκ1-37、Vκ1-39、Vκ1D-8、Vκ1D-12、Vκ1D-13、Vκ1D-16、Vκ1D-17、Vκ1D-22、Vκ1D-27、Vκ1D-32、Vκ1D-33、Vκ1D-35、Vκ1D-37、Vκ1D-39、Vκ1D-42、Vκ1D-43、Vκ1-NL1、Vκ2-4、Vκ2-10、Vκ2-14、Vκ2-18、Vκ2-19、Vκ2-23、Vκ2-24、Vκ2-26、Vκ2-28、Vκ2-29、Vκ2-30、Vκ2-36、Vκ2-38、Vκ2-40、Vκ2D-10、Vκ2D-14、Vκ2D-18、Vκ2D-19、Vκ2D-23、Vκ2D-24、Vκ2D-26、Vκ2D-28、Vκ2D-29、Vκ2D-30、Vκ2D-36、Vκ2D-38、Vκ2D-40、Vκ3-7、Vκ3-11、Vκ3-15、Vκ3-20、Vκ3-25、Vκ3-31、Vκ3-34、Vκ3D-7、Vκ3D-7、Vκ3D-11、Vκ3D-15、Vκ3D-15、Vκ3D-20、Vκ3D-25、Vκ3D-31、Vκ3D-34、Vκ3-NL1、Vκ3-NL2、Vκ3-NL3、Vκ3-NL4、Vκ3-NL5、Vκ4-1、Vκ5-2、Vκ6-21、Vκ6D-21、Vκ6D-41和Vκ7-3。在一些实施方案中，未重排人免疫球蛋白JL基因区段选自Jκ1、Jκ2、Jκ3、Jκ4和Jκ5。
在一些实施方案中，两个或更多个但少于野生型数的人免疫球蛋白轻链可变区基因区段包含VL和JL基因区段。
在一些实施方案中，两个或更多个人免疫球蛋白轻链可变区基因区段的VL基因区段选自：Vκ1-5、Vκ1-6、Vκ1-8、Vκ1-9、Vκ1-12、Vκ1-13、Vκ1-16、Vκ1-17、Vκ1-22、Vκ1-27、Vκ1-32、Vκ1-33、Vκ1-35、Vκ1-37、Vκ1-39、Vκ1D-8、Vκ1D-12、Vκ1D-13、Vκ1D-16、Vκ1D-17、Vκ1D-22、Vκ1D-27、Vκ1D-32、Vκ1D-33、Vκ1D-35、Vκ1D-37、Vκ1D-39、Vκ1D-42、Vκ1D-43、Vκ1-NL1、Vκ2-4、Vκ2-10、Vκ2-14、Vκ2-18、Vκ2-19、Vκ2-23、Vκ2-24、Vκ2-26、Vκ2-28、Vκ2-29、Vκ2-30、Vκ2-36、Vκ2-38、Vκ2-40、Vκ2D-10、Vκ2D-14、Vκ2D-18、Vκ2D-19、Vκ2D-23、Vκ2D-24、Vκ2D-26、Vκ2D-28、Vκ2D-29、Vκ2D-30、Vκ2D-36、Vκ2D-38、Vκ2D-40、Vκ3-7、Vκ3-11、Vκ3-15、Vκ3-20、Vκ3-25、Vκ3-31、Vκ3-34、Vκ3D-7、Vκ3D-7、Vκ3D-11、Vκ3D-15、Vκ3D-15、Vκ3D-20、Vκ3D-25、Vκ3D-31、Vκ3D-34、Vκ3-NL1、Vκ3-NL2、Vκ3-NL3、Vκ3-NL4、Vκ3-NL5、Vκ4-1、Vκ5-2、Vκ6-21、Vκ6D-21、Vκ6D-41和Vκ7-3。在一些特定实施方案中，VL基因区段选自Vκ1-39、Vκ3-20、以及它们的组合。在一些实施方案中，JL基因区段选自Jκ1、Jκ2、Jκ3、Jκ4、Jκ5、以及它们的组合。
在一些实施方案中，两个或更多个但少于野生型数的人免疫球蛋白轻链可变区基因区段包含两个或更多个但少于野生型数的人VL基因区段和一个或多个JL基因区段。在一些特定实施方案中，两个或更多个但少于野生型数的人VL基因区段包含Vκ1-29和Vκ3-20基因区段。
在一些实施方案中，非人动物为啮齿动物，并且其中轻链恒定区核酸序列为大鼠或小鼠Cκ恒定区核酸序列。
在一些实施方案中，非人动物为啮齿动物，并且其中所述重链恒定区核酸序列为选自下列的大鼠或小鼠恒定区序列：Igμ、Igδ、Igγ、Igε、Igα，它们中的每一个编码功能性CH1结构域。
在一些实施方案中，两个或更多个但少于野生型数的人免疫球蛋白轻链可变区基因区段置于基因组中的内源性免疫球蛋白轻链基因座处。在一些实施方案中，两个或更多个但少于野生型数的人免疫球蛋白轻链可变区基因区段置于非人动物的种系基因组中。在一些实施方案中，两个或更多个但少于野生型数的人免疫球蛋白轻链可变区基因区段存在于基因组中的异位基因座处。
在一些实施方案中，非人动物包含Adam6a基因、Adam6b基因或上述两者。在一些实施方案中，非人动物包含功能性异位小鼠Adam6基因。
本发明的其它特征结构、主题和优点在以下具体实施方式中是显而易见的。然而，应当理解，虽然指示了本发明的具体实施方案，但所述具体实施方式仅以解释说明的方式而不是限制的方式给出。在本发明范围内的各种改变和修改将由所述具体实施方式而对本领域技术人员变得显而易见。
附图说明
本文所包括的附图(其由以下图组成)仅出于说明的目的但不出于限制的目的。
图1示出了小鼠重链基因座(在上部)的示意图(未按比例)，和人κ轻链基因座(在底部)的示意图(未按比例)。小鼠重链基因座的长度为约3Mb并且包含约200个重链可变(VH)基因区段、13个重链多样性(DH)基因区段和4个重链接合(JH)基因区段以及增强子(Enh)和重链恒定(CH)区域。人κ轻链基因座分别复制到跨越约440kb和600kb的相对极性的远侧和近侧重叠序列中。两个重叠序列之间为约800kb的DNA，据信其不含Vκ基因区段。人κ轻链基因座包含约76个Vκ基因区段、5个Jκ基因区段、和基因内增强子(Enh)以及单个恒定区(Cκ)。
图2示出将40个人Vκ基因区段和5个人Jκ基因区段逐渐插入小鼠重链基因座中的靶向策略。示出具有重组酶识别位点(R1、R2等)的潮霉素(hyg)和新霉素(neo)选择盒。在底部示出经修饰的小鼠重链基因座，例如，包含可操作地连接至小鼠CH区域的人Vκ和Jκ基因区段的杂交免疫球蛋白基因座。
图3示出将人Vλ基因区段和人Jλ基因区段(或四个人Jλ基因区段)逐渐插入小鼠重链基因座中的示例性靶向策略。示出具有重组酶识别位点(R1、R2等)的潮霉素(hyg)和新霉素(neo)选择盒。在底部示出经修饰的小鼠重链基因座，例如包含可操作地连接至小鼠CH区域的人Vλ和Jλ基因区段(一个或四个)的杂交免疫球蛋白基因座。
图4示出用重排人VL/JL序列取代内源性小鼠免疫球蛋白κ轻链可变区基因区段的示例性靶向策略。
图5示出用重排人Vκ1-39Jκ5序列(MAID 1633；SEQ ID NO:1)或重排人Vκ3-20Jκ1序列(MAID 1635；SEQ ID NO:2)取代内源性小鼠免疫球蛋白轻链Vκ和Jκ基因区段的两种示例性靶向载体。
图6示出经修饰小鼠重链基因座，例如包含可操作地连接至小鼠CH区的人Vκ和Jκ基因区段的杂交免疫球蛋白基因座和包含重排人VκJκ序列的经修饰的小鼠κ轻链基因座。在一个具体实施方案中，通过育种“KOH”小鼠和“ULC”小鼠产生如本文所示的具有经修饰的重链基因座和经修饰的κ轻链基因座的小鼠(KOH×ULC)。
图7示出来自以下小鼠的对B和T细胞染色(顶行，分别为CD19+和CD3+)的骨髓和对CD19+门控并且对ckit+和CD43+染色(底行)的骨髓的代表性等高线图：小鼠(VI3)，对重链基因座处的未重排人免疫球蛋白轻链可变Vκ和Jκ基因区段是纯合的，对轻链基因作处的未重排人免疫球蛋白Vκ和Jκ基因区段κ和整合的Adam6基因是纯合的小鼠(“KOH”小鼠；1994HO 1242HO)，和对κ轻链基因座(VK3-20JK1或VK1-39JK5)处的重排轻链可变区核苷酸序列是纯合的，并且对重链基因座处的未重排人免疫球蛋白Vκ和Jκ基因区段和整合的Adam6基因是纯合的小鼠(对VK3-20JK1而言为1994HO1635HO；对VK1-39JK5而言为1994HO 1633HO；“KOH×ULC”小鼠)。在等高线图中记录了Pro和Pre B细胞。示出了每个门控区内的细胞百分比。
图8示出从KOH×ULC小鼠(1994HO 1633HO:Vκ1-39Jκ5；1994HO 1635HO:Vκ3-20Jκ1)、KOH小鼠(1994HO 1242HO)和人源化小鼠(VI3)的股骨中分离的骨髓中的细胞总数(左上)、B(CD19+)细胞总数(右上)、Pro B细胞(CD19+CD43+ckit+)数和PreB细胞(CD19+CD43–ckit–)数。
图9示出对来自KOH×ULC小鼠(1994HO 1633HO、1994HO 1635HO)、KOH小鼠(1994HO1242HO)和人源化小鼠(VI3)的免疫球蛋白M(IgM)和B220染色的单管进行门控的骨髓的代表性等高线图(顶行)。在等高线图中的每一个上记录了未成熟细胞、成熟细胞和pro/pre B细胞。示出每个门控区内的细胞百分比；底行示出从KOH×ULC小鼠(1994HO 1633HO：Vκ1-39Jκ5；1994HO 1635HO：Vκ3-20Jκ1)、KOH小鼠(1994HO 1242HO)和人源化小鼠(VI3)的股骨分离的骨髓中的未成熟B细胞(左，IgM+B220int)细胞和成熟B细胞(IgM+B220hi)总数。
图10示出对来自KOH×ULC小鼠(1994HO 1633HO、1994HO 1635HO)、KOH小鼠(1994HO 1242HO)和人源化小鼠(VI3)的免疫球蛋白M(IgM)和B220染色的单管进行门控的骨髓的代表性等高线图(左列)。等高线图中的每一个上均记录了未成熟B细胞、成熟B细胞和pro/pre B细胞；右边两列示出对从KOH×ULC小鼠(1994HO 1633HO:Vκ1-39Jκ5；1994HO 1635HO:Vκ3-20Jκ1)、KOH小鼠(1994HO 1242HO)和人源化小鼠(VI3)的股骨分离的Igκ和Igλ表达染色的未成熟B细胞(左，IgM+B220int)和成熟B细胞(右，IgM+B220hi)进行门控的骨髓的代表性等高线图。示出了每个门控区内的细胞百分比。
图11示出了对来自KOH×ULC小鼠(1994HO 1633HO:Vκ1-39Jκ5；1994HO 1635HO:Vκ3-20Jκ1)、KOH小鼠(1994HO 1242HO)和人源化小鼠(VI3)的B和T细胞(顶行；分别为CD19+和CD3+)染色的脾细胞和对CD19+进行门控并对Igκ+和Igλ+表达染色的脾细胞的代表性等高线图。示出了每个门控区内的细胞百分比。
图12示出了由KOH×ULC小鼠(1994HO 1633HO:Vκ1-39Jκ5；1994HO 1635HO:Vκ3-20Jκ1)、KOH小鼠(1994HO 1242HO)和人源化小鼠(VI3)获得的脾脏中的B细胞(CD19+)、Igκ+B细胞(CD19+κ+)和Igλ+B细胞(CD19+λ+)的总数。
图13示出来自KOH×ULC小鼠(1994HO 1633HO:Vκ1-39Jκ5；1994HO 1635HO:Vκ3-20Jκ1)、KOH小鼠(1994HO 1242HO)和人源化小鼠(VI3)的对CD19+门控并对免疫球蛋白D(IgD)和免疫球蛋白M(IgM)染色的脾细胞的代表性等高线图。示出了每个门控区内的细胞百分比。在每个等高线图中记录了成熟(CD19+IgMloIgDhi)和过渡/未成熟(CD19+IgDintIgMh)B细胞。示出了每个门控区内的细胞百分比。
图14示出了由KOH×ULC小鼠(1994HO 1633HO:Vκ1-39Jκ5；1994HO 1635HO:Vκ3-20Jκ1)、KOH小鼠(1994HO 1242HO)和人源化小鼠(VI3)获得的脾脏中的脾细胞(左上)的绝对数，B细胞(右上；CD19+)、过渡B细胞(左下；CD19+IgDloIgMhi)和成熟B细胞(CD19+IgDhiIgMlo)的总数。
图15示出KOH×ULC小鼠(1994HO 1633HO:Vκ1-39Jκ5；1994HO 1635HO:Vκ3-20Jκ1)、KOH小鼠(1994HO 1242HO)和人源化小鼠(VI3)的外周B细胞发育的代表性等高线图。等高线图的第一列(左)示出对CD19+进行门控的CD93+和B220+脾细胞，其指示不成熟和成熟B细胞。等高线图的第二列(中)示出不成熟B细胞中的IgM+和CD23+表达，其指示T1(IgD-IgM+CD21loCD23-)、T2(IgDhiIgMhiCD21midCD23+)和T3B细胞群。等高线图的第三列(右)示出成熟B细胞的CD21+(CD35+)和IgM+表达，其指示产生边缘区B细胞的更小的第一群和产生滤泡(FO)B细胞的第二群。示出了每个门控区内的细胞百分比。
图16示出了免疫、休止阶段和促进方案之后，不同KOH×ULC小鼠中的抗-抗原1抗体滴度。KOH×ULC小鼠在休止阶段和附加促进之后产生相当于VI3和ULC小鼠的强、高滴度的抗原特异性抗体应答。小鼠通过足垫路径免疫。在六次促进之后第2次放血；在四次附加促进之后第3次放血。小鼠在第2次放血之后休止4.5周。抗原1为载体蛋白质。VI3小鼠公开于美国专利8,642,835中，其以引用方式并入本文。1633为具有Vκ1-39的ULC小鼠。1635为具有Vκ3-20的ULC小鼠。
图17示出由KOH×ULC小鼠构建的抗原特异性结合蛋白Fab的示意图。在利用免疫原抗原2的免疫方案之后，从两个KOH×ULC小鼠中分选抗原阳性B细胞。将阳性KOH可变结构域克隆到Fab质粒中。将KOH可变结构域克隆到重链恒定区中。进行瞬时转染以产生蛋白质用于通过ELISA进行抗原阳性筛选。用人Vκ3-20种系(GL)ULC转染KOH-CH1Fab。通过ELISA和BIACORETM分析Fab对抗原2，细胞表面蛋白的粘结。通过ELISA和BIACORETM分析来鉴定多个抗原特异性结合物。如通过ELISA确定的，十四(14)种样品在中性pH下结合抗原2。通过BIACORETM确定14种ELISA结合物中13种结合。
图18示出具有当将来自抗体的VHxULC结构域与不相关酶，抗-抗原3抗体配对时，保持与抗原2的结合的代表性VL结构域的BIACORETM结合数据的表。所述数据示出来自KOH×ULC小鼠的结合蛋白仅在单VL结构域中具有特异性。
图19示出不同多特异性抗原结合蛋白形式的示意图。(A)示出生成多特异性抗原结合蛋白的示意图，所述多特异性抗原结合蛋白包含(1)第一重链，所述第一重链具有与人重链恒定区融合的人Vκ(hVκ/CHxULC)，所述hVκ/CHxULC与第一通用轻链可变结构域同源并且能够结合第一抗原A(Ag A)，和(2)第二重链，所述第二重链具有与第二人重链恒定区融合的人VH(hVHxULC)结构域，所述hVHxULC结构域与第二通用轻链可变结构域同源并且能够结合第二抗原B(Ag B)，所述重链中的每一个与相同的通用轻链配对，所述通用轻链包含与人轻链恒定区融合的第三通用轻链可变结构域，其中所述第三通用轻链由第一和第二通用轻链源于其的重排VL/JL基因序列编码。最终多特异性抗原结合蛋白的hVκ/CHxULC结构域源于在KOH×ULC小鼠中针对抗原A产生的抗原结合蛋白，其生成hVκ/CHxULC结构域，所述hVκ/CHxULC结构域融合至小鼠重链恒定区并且与通用轻链配对，所述通用轻链包含与小鼠轻链恒定结构域融合的人通用轻链可变结构域。最终多特异性抗原结合蛋白的hVHxULC结构域源于在ULC小鼠中针对抗原B产生的抗原结合蛋白，其生成hVHxULC结构域，所述hVHxULC结构域融合至小鼠重链恒定区并且与通用轻链配对，所述通用轻链包含与小鼠轻链恒定结构域融合的人通用轻链可变结构域。(B)示出生成多特异性抗原结合蛋白的示意图，所述多特异性抗原结合蛋白包含(1)第一重链，所述第一重链具有与人重链恒定区融合的第一人Vκ(hVκ/CHxULC)，所述第一hVκ/CHxULC与第一通用轻链可变结构域同源并且能够结合第一抗原A(Ag A)，和(2)第二重链，所述第二重链具有与第二人重链恒定区融合的第二人Vκ(hVκ/CHxULC)结构域，所述第二Vκ(hVκ/CHxULC)结构域与第二通用轻链可变结构域同源并且能够结合第二抗原B(Ag B)，所述重链中的每一个与相同的通用轻链配对，所述通用轻链包含与人轻链恒定区融合的第三通用轻链可变结构域，其中所述第三通用轻链由第一和第二通用轻链源于其的重排VL/JL基因序列编码。最终多特异性抗原结合蛋白的第一hVκ/CHxULC结构域源于在KOH×ULC小鼠中针对抗原A产生的抗原结合蛋白，其生成第一hVκ/CHxULC结构域，所述hVκ/CHxULC结构域融合至小鼠重链恒定区并且与通用轻链配对，所述通用轻链包含与小鼠轻链恒定结构域融合的人通用轻链可变结构域。最终多特异性抗原结合蛋白的第二hVκ/CHxULC结构域源于在KOH×ULC小鼠(例如，第二KOH×ULC小鼠)中针对抗原B产生的抗原结合蛋白，其生成第二hVκ/CHxULC结构域，所述hVκ/CHxULC结构域融合至小鼠重链恒定区并且与通用轻链配对，所述通用轻链包含与小鼠轻链恒定结构域融合的人通用轻链可变结构域。
图20示出具有代表性抗原结合蛋白的BIACORETM结合数据的表，所示抗原结合蛋白具有图19A(B1-B3)中所示的结构。还包括对照抗体(CKOH1-CKOH2、CVH、CI和C)的结合数据。NT＝未测试，NA＝不适用，NB＝未结合。
定义
本发明不限于所述的具体方法和实验条件，因为此类方法和条件可变化。还应当理解，本文所用的术语仅出于描述具体实施方案的目的，并且不旨在是限制性的，因为本发明的范围由权利要求限定。
除非另有定义，本文所用的全部术语和短语均包括所述术语和短语在本领域中已经获得的含义，除非相反含义被清楚地指明或由所述术语或短语用于其中的上下文显而易见。尽管与本文所述的那些类似或等同的任何方法和材料可用于本发明的实践或测试中，但现在描述具体的方法和材料。所提及的全部公布均以引用方式并入本文。
如本文所用，术语“抗体”包括包含四条多肽链的免疫球蛋白分子，其中两条重(H)链和两条轻(L)链通过二硫键相互连接。每条重链包含重链可变结构域和重链恒定区(CH)。重链恒定区包含若干结构域，例如CH1、铰链区、CH2、CH3、和任选地CH4。每条轻链包含轻链可变结构域和轻链恒定区(CL)。重链可变结构域和轻链可变结构域可进一步细分为超可变区，称为互补性决定区(CDR)，该超可变区散布在更保守的区域(称为骨架区(FR))内。每个重链可变结构域和轻链可变结构域包括三个CDR和四个FR，它们按下列顺序从氨基末端排列至羧基末端：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4(重链CDR可简写为HCDR1、HCDR2和HCDR3；轻链CDR可简写为LCDR1、LCDR2和LCDR3)。术语“高亲和性”抗体是指对靶表位的KD为约10-9M或更低(例如，约1×10-9M、1×10-10M、1×10-11M或约1×10-12M)的抗体。在一些实施方案中，KD通过表面等离子体共振例如BIACORETM来测量；在另一个实施方案中，KD通过ELISA来测量。
如本文所用，术语“生物活性”包括在生物体系、体外或体内(例如，在生物体中)具有活性的任何试剂的特性。例如，当存在于生物体中时，认为在该生物体内具有生物效应的试剂是生物活性的。在具体实施方案中，在蛋白质或多肽具有生物活性的情况下，共享蛋白质或多肽的至少一种生物活性的蛋白质或多肽的一部分通常被称为“生物活性”部分。
术语“抗原结合蛋白”包括分别和选择性结合一个、两个或更多个抗原决定簇的单特异性、双特异性或更高级抗原结合蛋白。双特异性抗原结合蛋白通常包含两个不相同的结合组分，其中每个结合组分在两个不同分子上(例如两个不同免疫原上的不同表位)或在相同分子上(例如，相同免疫原上的不同表位)特异性结合不同的表位。如果双特异性抗原结合蛋白能够选择性结合两个不同表位(第一表位和第二表位)，则第一结合组分对第一表位的亲和性将通常比第一结合组分对第二表位的亲和性低至少一个至两个或三个或四个或更多个数量级，反之亦然。被双特异性抗原结合蛋白特异性结合的表位可在相同或不同的靶标上(例如，在相同或不同的蛋白上)。示例性双特异性抗原结合蛋白包括具有特异性针对肿瘤抗原的第一结合组分和特异性针对细胞毒性标志物(例如，Fc受体(例如FcγRI、FcγRII、FcγRIII等)或T细胞标志物(例如CD3、CD28等))的第二结合组分的那些。另外，第二结合组分可由具有不同的期望的特异性的结合组分取代。例如，具有特异性针对肿瘤抗原的第一结合组分和特异性针对毒素的第二结合组分的双特异性抗原结合蛋白可被配对以便将毒素(例如皂草素、长春花生物碱等)递送到肿瘤细胞。其它示例性双特异性抗原结合蛋白包括具有特异性针对活化性受体(例如，B细胞受体、FcγRI、FcγRIIA、FcγRIIIA、FcγRI、FcεRI、T细胞受体等)的第一结合组分和特异性针对抑制性受体(例如FcγRIIB、CD5、CD22、CD72、CD300a等)的第二结合组分的那些。此类双特异性抗原结合蛋白可被构建用于与细胞活化相关的治疗条件(例如过敏和哮喘)。双特异性抗原结合蛋白可例如通过将识别同一免疫原不同表位的结合组分进行组合来制备。例如，编码识别同一免疫原不同表位的结合组分的核酸序列(例如，轻链或重链可变序列)可融合至编码相同或不同重链恒定区、相同或不同轻链、或分别编码重链恒定区和轻链恒定区的核酸序列，并且此类序列可在细胞中以一定形式表达为多特异性抗原结合蛋白，所述形式类似于Fab结构、scFab结构、双抗体结构、scFv结构、scFv-Fc结构、scFv-拉链状结构、或类似于包括同源通用轻链的典型抗体的四聚体结构。示例性双特异性抗原结合蛋白具有两条重链，每条重链具有三个轻链CDR，然后是(从N端至C端)CH1结构域、铰链、CH2结构域和CH3结构域，以及免疫球蛋白轻链，所述轻链不具有表位结合特异性但能与每条轻链缔合，或者可与每条轻链缔合并且可结合一个或多个被轻链表位结合区结合的表位，或者可与每条轻链缔合并且能够使得一条或两条轻链结合到一个或两个表位。类似地，术语“三特异性抗体”包括能够选择性结合三个或更多个表位的抗原结合蛋白。
短语“互补性决定区”或术语“CDR”包括由生物体的免疫球蛋白基因的核酸序列编码的氨基酸序列，所述核酸序列通常(即在野生型动物中)出现在免疫球蛋白分子(例如，抗体或T细胞受体)的轻链或重链可变区中的两个骨架区之间。CDR可由例如种系序列或重排或未重排序列，和例如通过原初或成熟B细胞或T细胞来编码。CDR可以是体细胞突变的(例如，不同于动物的种系中编码的序列)、人源化的和/或通过氨基酸取代、增添或缺失进行修饰的。在一些情况下(例如对于CDR3而言)，例如由于剪接或连接序列(例如，重组V-D-J以形成重链CDR3)，CDR可由两个或更多个(例如在未重排的核酸序列中)不连续的序列(例如种系序列)，但在B细胞核酸序列中连续的序列编码。
如本文所用，术语“相当”包括可能彼此不同但足够相似以允许两者之间的比较使得基于观察到的差异性或相似性可合理地得出结论的两种或更多种试剂、实体、情况、条件集合等。本领域技术人员应当理解，在上下文中，在任何给定环境下，被认为相当所需要的两种或更多种此类试剂、实体、情况、或条件集合的同一性程度。
如本文用于描述保守氨基酸取代时，术语“保守”包括用侧链R基团的化学性质(例如电荷或疏水性)相似的另一个氨基酸残基取代某个氨基酸残基。通常，保守氨基酸取代不会实质性改变蛋白质的感兴趣的功能特性，例如受体结合到配体的能力。具有带相似化学特性的侧链的氨基酸组的示例包括脂肪族侧链诸如甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；脂肪族-羟基侧链诸如丝氨酸和苏氨酸；含酰胺的侧链诸如天冬酰胺和谷氨酰胺；芳香族侧链诸如苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸诸如碱性侧链如赖氨酸、精氨酸和组氨酸；酸性侧链诸如天冬氨酸和谷氨酸；和含硫侧链诸如半胱氨酸和甲硫氨酸。保守氨基酸取代基团包括，例如缬氨酸/亮氨酸/异亮氨酸、苯丙氨酸/酪氨酸、赖氨酸/精氨酸、丙氨酸/缬氨酸、谷氨酸/天冬氨酸和天冬酰胺/谷氨酰胺。在一些实施方案中，保守氨基酸取代可以是用丙氨酸取代蛋白质中的任何天然残基，例如在丙氨酸扫描诱变中所用。在一些实施方案中，保守取代是具有Gonnet等人在(1992)Exhaustive Matching of the Entire ProteinSequence Database，Science 256:1443-45中所公开的PAM250对数似然矩阵中的正值的保守取代，所述文献以引用方式并入本文。在一些实施方案中，如果其具有PAM250对数似然矩阵中的非负值，则确定取代为“中等保守”。
在一些实施方案中，免疫球蛋白轻链或重链中的残基位置不同之处在于一个或多个保守氨基酸取代。在一些实施方案中，免疫球蛋白轻链或其功能性片段(例如，允许例如从B细胞表达和分泌的片段)中的残基位置与其氨基酸序列列于本文中的轻链不同，但不同之处在于一个或多个保守氨基酸取代。
如本文所用，术语“破坏”包括中断(例如，经由同源重组)DNA的事件的结果。在一些实施方案中，破坏可实现或代表一个或多个DNA序列的删除、插入、倒置、修饰、置换、取代或它们的任何组合。在一些实施方案中，破坏可实现或代表在DNA的一个或多个编码序列中引入突变，诸如错义、无义或移码突变或它们的任何组合。在一些实施方案中，破坏可在细胞内源性的基因或基因座中发生。在一些实施方案中，插入可包括将整个基因或基因的片段，例如外显子，插入细胞或基因组的内源性位点中。在一些实施方案中，插入可引入具有不同于其插入于其中的内源性序列的源的序列。在一些实施方案中，破坏可增加基因或基因产物(例如，由基因编码的蛋白质)的表达和/或活性。在一些实施方案中，破坏可增加基因或基因产物的表达和/或活性。在一些实施方案中，破坏可改变基因或基因产物(例如，编码的蛋白质)的序列。在一些实施方案中，破坏可截短或分裂基因或基因产物(例如编码的蛋白质)。在一些实施方案中，破坏可延伸基因或基因产物；在一些此类实施方案中，破坏可以实现融合蛋白的组装。在一些实施方案中，破坏可影响基因或基因产物的含量但不影响其活性。在一些实施方案中，破坏可影响基因或基因产物的活性但不影响其含量。在一些实施方案中，破坏对基因或基因产物的含量可不具有显著影响。在一些实施方案中，破坏对基因或基因产物的活性可不具有显著影响。在一些实施方案中，破坏对基因或基因产物的含量或活性可不具有显著影响。
如本文所用，术语“内源性基因座”或“内源性基因”包括在引入破坏(例如，如本文所述的删除、插入、倒置、修饰、置换、取代或它们的组合)之前，存在于亲代或参考生物体中的遗传基因座。在一些实施方案中，内源性基因座具有存在于自然界中的序列。在一些实施方案中，内源性基因座为野生型。在一些实施方案中，包含如本文所述的内源性基因座的参考生物体是野生型生物体。在一些实施方案中，包含如本文所述的内源性基因座的参考生物体是工程化生物体。在一些实施方案中，包含如本文所述的内源性基因座的参考生物体是实验室培育的生物体(无论是野生型还是工程化的)
术语“内源性启动子”包括例如，在野生型生物体中，与内源性基因天然缔合的启动子。
短语“表位结合蛋白”包括具有至少一个CDR并且能够选择性识别表位，例如能够以至少一微摩尔或更低的KD(例如，为约1×10-6M、1×10-7M、1×10-8M、1×10-9M、1×10-10M、1×10-11M或约1×10-12M的KD)结合表位的蛋白质。治疗性表位结合蛋白(例如，治疗性抗体)通常需要纳摩尔级或皮摩尔级的KD。
如本文所用，例如有关功能多肽的“功能”包括保持正常情况下与天然蛋白相关的至少一种生物学活性的多肽。在另一种情况下，功能性免疫球蛋白基因区段可包括能够有效重排以生成重排的免疫球蛋白基因序列的可变基因区段。
术语“功能片段”包括能够表达、分泌和以微摩尔级、纳摩尔级或皮摩尔级的KD特异性结合到表位的表位结合蛋白的片段。特异性识别包括具有至少在微摩尔级、纳摩尔级或皮摩尔级的KD。
关于免疫球蛋白核酸序列的术语“种系”包括可传给子代的核酸序列。
如本文所用，术语“异源”包括来自不同源的试剂或实体。例如，当关于特定细胞或生物体中的多肽、基因或基因产物使用时，所述术语澄清了相关的多肽、基因或基因产物：1)由人手工程化；2)通过人手(例如，经由遗传工程)引入细胞或生物体(或其前体)中；和/或3)不由相关细胞或生物体(例如，相关细胞类型或生物体类型)天然产生或存在于所述相关细胞或生物体中。
如本文所用，术语“宿主细胞”包括已经引入异源(例如，外源性)核酸或蛋白质的细胞。技术人员在阅读本公开时将理解，此类术语不仅是指具体受试细胞，而且还用于指该细胞的后代。因为由于突变或环境影响，特定修饰可存在于后代中，所以此类后代实际上可与亲代细胞不相同，但本领域技术人员仍然理解其包括在如本文所用的术语“宿主细胞”的范围内。在一些实施方案中，宿主细胞为或包含原核或真核细胞。一般来讲，宿主细胞为适用于接收和/或产生异源核酸或蛋白质的任何细胞，不考虑指定的细胞的存在。根据本公开可用作宿主细胞的示例性细胞包括下列的那些宿主细胞：原核生物和真核生物(单细胞或多细胞)、细菌细胞(例如大肠杆菌(E.coli)、芽孢杆菌属(Bacillus spp.)、链霉菌属(Streptomyces spp.)等品系)、分支杆菌细胞、真菌细胞、酵母细胞(例如酿酒酵母(S.cerevisiae)、裂殖酵母(S.pombe)、毕赤酵母(P.pastoris)、嗜甲醇毕赤酵母(P.methanolica)等)、植物细胞、昆虫细胞(例如SF-9、SF-21、杆状病毒感染的昆虫细胞、粉纹夜蛾等)、非人动物细胞、人细胞或细胞融合物，诸如杂交瘤细胞或细胞杂交瘤。在一些实施方案中，该细胞为人、猴、大猩猩、仓鼠、大鼠或小鼠细胞。在一些实施方案中，细胞是真核的并且选自以下细胞：CHO(例如，CHO K、DXB-11CHO、Veggie-CHO)、COS(例如COS-7)、视网膜细胞、Vero、CV1、肾细胞(例如，HEK293、293 EBNA、MSR 293、MDCK、HaK、BHK)、HeLa、HepG2、WI38、MRC5、Colo205、HB8065、HL-60(例如BHK21)、Jurkat、Daudi、A431(表皮)、CV-1、U937,3T3、L细胞、C127细胞、SP2/0、NS-0、MMT 060562、塞尔托利细胞、BRL 3A细胞、HT1080细胞、骨髓瘤细胞、肿瘤细胞和源自上述细胞的细胞系。在一些实施方案中，该细胞包含一个或多个病毒基因，例如，表达病毒基因的视网膜细胞(例如PER.C6TM细胞)。在一些实施方案中，宿主细胞为或包含分离的细胞。在一些实施方案中，宿主细胞是组织的一部分。在一些实施方案中，宿主细胞是生物体的一部分。
术语“人源化”根据其本领域理解的含义用于本文，并且包括核酸或蛋白质，所述核酸或蛋白质的结构(即，核苷酸或氨基酸序列)包括与天然存在于非人动物中的相关核酸或蛋白质的型式基本上或明确对应，并且可区别于天然存在于人类中的相应型式的部分，并且还包括其结构与存在于非人动物型式中的那些结构不同，且反而更接近对应于存在于人型式中的相当结构的部分。在一些实施方案中，“人源化”基因为编码具有与人多肽(例如，人蛋白质或其部分(例如其特征部分))基本上相同的氨基酸序列的多肽的基因。作为一个示例，在膜受体的情况下，“人源化”基因可编码具有细胞外部分的多肽，所述细胞外部分的氨基酸序列与人细胞外部分相同或基本上相同，并且所述细胞外部分的剩余序列与非人(例如，小鼠)多肽的序列相同或基本上相同。在一些实施方案中，人源化基因包括人基因的DNA序列的至少一部分。在一些实施方案中，人源化基因包括存在于人基因中的整个DNA序列。在一些实施方案中，人源化蛋白质具有包括在人蛋白质中出现的一部分的氨基酸序列。在一些实施方案中，人源化蛋白质具有其整个序列均存在于人蛋白质中的氨基酸序列。在一些实施方案中(包括，例如，其中人源化蛋白质具有其全部序列存在于人蛋白质中的氨基酸序列的一些实施方案)，人源化蛋白质由非人动物的内源性基因座表达，所述内源性基因座对应于编码蛋白质的相关人基因的同系物或直系同源物。
当结合比较序列使用时，术语“同一性”包括由本领域已知的可用于测量核苷酸和/或氨基酸序列同一性的多种不同算法中任一种所确定的同一性。在一些实施方案中，如本文所述的同一性使用ClustalW v.1.83(慢)比对法进行确定，该比对法采用10.0的开放空位罚分、0.1的扩展空位罚分，并使用Gonnet相似矩阵(MacVector公司的MacVectorTM10.0.2，2008年(MACVECTORTM10.0.2,MacVector Inc.,2008))。如本文所用，术语“同一性”是指聚合物分子，例如核酸分子(例如，DNA分子和/或RNA分子)之间，和/或多肽分子之间的整体相关性。在一些实施方案中，如果聚合物分子序列是至少25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％相同的，则认为它们彼此“基本上相同”。如本领域的技术人员将理解的，多种算法是可用的，其允许序列比较以便确定它们的同源性程度，包括通过在考虑不同序列中哪些残基彼此“对应”时，允许一个序列相对于另一序列的指定长度的空位。例如出于最佳比较目的，可通过比对两个序列来进行两个核酸序列之间的百分比同一性的计算(例如，可在第一和第二核酸序列的一者或两者中引入空位用于最佳比对并且出于比较目的可忽略不对应的序列)。在特定实施方案中，出于比较目的进行比对的序列长度为参考序列长度的至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或基本上100％。然后比较在相应核苷酸位置处的核苷酸。当第一序列中的位置被与第二序列中的相应位置相同的核苷酸占据时，则该位置处的分子是相同的。两个序列之间的百分比同一性是考虑空位数和每个空位的长度，由序列共享的相同位置数的函数，所述空位需要被引入以用于两个序列的最佳比对。可用于确定两个核苷酸序列的百分比同一性的代表性算法和计算机程序包括，例如Meyers和Miller的算法(CABIOS，1989，4：11-17)，其已经并入ALIGN程序(版本2.0)中，使用PAM120权重残值表，空位长度罚分为12，并且空位罚分为4。另选地，例如，可使用GCG软件包中的GAP程序(其使用NWSgapdna.CMP矩阵)来确定两个核苷酸序列之间的百分比同一性。
如本文所用的，术语“分离的”包括物质和/或实体，所述物质和/或实体已经(1)在最初产生时(无论是在自然界中还是在实验环境中)，与其所缔合的组分中的至少一些分离，和/或(2)由人手设计、生产、制备和/或制造。分离的物质和/或实体可与其最初缔合的其它组分的约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或多于约99％分离。在一些实施方案中，分离的试剂的纯度为约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或多于约99％。如本文所用，如果其基本上不含其它组分，则物质是“纯的”。在一些实施方案中，如本领域技术人员将理解的，在与特定的其它组分，例如一种或多种载体或赋形剂(例如，缓冲液、溶剂、水等)混合之后，物质仍然可被认为是“分离的”或甚至是“纯的”；在此类实施方案中，在不包括此类载体或赋形剂的情况下，计算物质的分离百分比或纯度。作为一个示例，在一些实施方案中，当以下情况时，认为自然界中出现的生物聚合物诸如多肽或多核苷酸是“分离的”：a)由于其源或来源与自然界中以其原生态与其相伴的一些或全部组分无关；b)基本上不含与自然界中产生其的物质相同的物质的其它多肽或核酸；c)由不是自然界中生产其的物种的细胞或其它表达体系中的组分表达或以它方式与所述组分相关。因此，例如，在一些实施方案中，认为与自然界中生产其不同的，是化学合成或在细胞体系中合成的多肽是“分离的”多肽。另选地或除此之外，在一些实施方案中，可认为已经经受了一种或多种纯化技术到已经与其它组分分离的程度的多肽是“分离的”多肽，所述其它组分a)是自然界中其缔合的，和/或b)当其初始产生时与其缔合的。
短语“轻链”包括来自任何生物体的免疫球蛋白轻链序列，并且除非另外指明，否则包括人κ和λ轻链及VpreB以及替代轻链。除非另外指明，否则轻链可变结构域通常包括三个轻链CDR和四个骨架区(FR)。一般来讲，全长轻链从氨基端到羧基端包括含有FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4的可变结构域，以及轻链恒定区。轻链可变结构域由轻链可变区基因序列编码，其一般包含VL和JL区段，这些区段来源于存在于种系中的V和J区段组库。多个生物体中V和J轻链区段的序列、位置和命名可在IMGT数据库，www.imgt.org中查询。轻链包括例如不选择性地结合第一表位或第二表位的那些轻链，所述第一表位或第二表位由在其中呈现这些表位的表位结合蛋白选择性结合。轻链还包括结合并识别一个或多个表位或者帮助重链或其它轻链结合并识别一个或多个表位的那些轻链，所述一个或多个表位由在其中呈现这些表位的表位结合蛋白选择性结合。共用或通用的轻链包括源于人Vκ1-39Jκ基因或人Vκ3-20Jκ基因的那些，并且包括所述基因的体细胞突变的(例如，亲和力成熟的)型式。示例性人VL区段包括人Vκ1-39基因区段、人Vκ3-20基因区段、人Vλ1-40基因区段、人Vλ1-44基因区段、人Vλ2-8基因区段、人Vλ2-14基因区段、和人Vλ3-21基因区段，并且包括所述基因的体细胞突变的(例如，亲和力成熟的)型式。可形成轻链，所述轻链包含来自一个生物体(例如，人或啮齿动物，例如大鼠或小鼠；或鸟类，例如鸡)的可变结构域，和来自相同或不同生物体(例如，人或啮齿动物，例如，大鼠或小鼠；或鸟类，例如鸡)的恒定区。
“中性pH”包括约7.0至约8.0之间的pH，例如约7.0至约7.4之间的pH，例如约7.2和约7.4之间的pH，例如生理pH。“酸性pH”包括6.0或更低的pH，例如约5.0和约6.0之间的pH，约5.75和约6.0之间的pH，例如核内体或溶酶体腔的pH。
如本文所用，短语“非人动物”包括不是人的脊椎动物生物体。在一些实施方案中，非人动物是圆口纲脊椎动物、硬骨鱼、软骨鱼(例如鲨鱼或鳐形目鱼)、两栖动物、爬行动物、哺乳动物(例如，啮齿动物，例如小鼠或大鼠)或鸟类(例如鸡)。在一些实施方案中，非人动物为灵长类动物、山羊、绵羊、猪、狗、牛或啮齿动物。在一些实施方案中，非人动物为啮齿动物，诸如大鼠或小鼠。
如本文所使用，短语“可操作地连接的”包括彼此直接或间接相互作用，或以其它方式彼此配合以参与生物事件的组分或元件的物理并置(例如，在三维空间内)，所述并置实现或允许此类相互作用和/或配合。作为一个示例，当其相对于编码序列定位使得其存在或缺失影响编码序列的表达和/或活性时，认为核酸中的控制序列(例如，表达控制序列)“可操作地连接”到编码序列。在许多实施方案中，“可操作地连接”涉及相关组分或元件彼此的共价连接。然而，本领域技术人员将容易地意识到，在一些实施方案中，不需要共价连接来实现有效的可操作连接。例如，在一些实施方案中，与其控制的编码序列可操作地连接的核酸控制序列与感兴趣的基因邻接。另选地或除此之外，在一些实施方案中，一个或多个此类控制序列以反式或以一定距离作用以控制感兴趣的编码序列。在一些实施方案中，如本文所用，术语“表达控制序列”是指必须和/或足以影响其所连接的编码序列的表达和处理的多核苷酸序列。在一些实施方案中，表达控制序列可以是或包含适当的转录起始、终止、启动子和/或增强子序列；高效RNA处理信号，诸如剪接和多腺苷酸化信号；稳定细胞质mRNA的序列；提高翻译效率的序列(例如，Kozak共有序列)；增强蛋白质稳定性的序列；和/或在一些实施方案中，增强蛋白质分泌的序列。在一些实施方案中，一个或多个控制序列在特定宿主细胞或生物体或其类型中优先活化的或唯一活化的。作为一个示例，在原核生物中，控制序列通常包括启动子、核糖体结合位点和转录终止序列；在真核生物中，在许多实施方案中，控制序列通常包括启动子、增强子和/或转录终止序列。本领域普通技术人员将由上下文理解，在许多实施方案中，术语“控制序列”是指它的存在对于表达和处理是必需的组分，并且在一些实施方案中包括它的存在对于表达是有利的组分(包括，例如，先导序列、靶序列和/或融合配偶体序列)。
如本文所用，术语“重组体”包括多肽(例如，如本文所述的B细胞活化因子蛋白质)，其通过重组方式设计、工程化、制备、表达、创建或分离，诸如使用转染到宿主细胞中的重组表达载体表达的多肽，从重组体中分离的多肽，组合人多肽库(Hoogenboom H.R.,(1997)TIB Tech.15:62-70；Azzazy H.和Highsmith W.E.，(2002)Clin.Biochem.35:425-445；Gavilondo J.V.和Larrick J.W.(2002)BioTechniques 29:128-145；Hoogenboom H.和Chames P.(2000)Immunology Today 21:371-378)，从对于人免疫球蛋白基因转基因的动物(例如，小鼠)分离的抗体(参见例如，Taylor,L.D.等人(1992)Nucl.Acids Res.20:6287-6295；Kellermann S-A.和Green L.L.(2002)Current Opinion in Biotechnology13:593-597；Little M.等人(2000)Immunology Today 21:364-370)，或由涉及将所选择的序列元件彼此剪接的任何其它方式制备、表达、创建或分离的多肽。在一些实施方案中，此类选择的序列元件中的一个或多个存在于自然界中。在一些实施方案中，此类选择的序列元件中的一个或多个由电脑设计。在一些实施方案中，一个或多个此类选择的序列元件由例如来自天然源或合成源的已知序列元件的诱变(例如，体内或体外)获得。例如，在一些实施方案中，重组多肽由存在于感兴趣的源生物体(例如，人，小鼠等)的基因组中的序列组成。在一些实施方案中，重组多肽具有由诱变(例如，在体外或体内，例如在非人动物中)获得的氨基酸序列，使得重组多肽的氨基酸序列是虽然起源于并和多肽序列相关，但可不天然存在于非人动物体内的基因组内的序列。
如本文所用，术语“置换”包括通过其从该基因座中移除存在于宿主基因座中(例如，在基因组中)的“取代的”核酸序列(例如，基因)，并且使不同的“置换”核酸位于适当位置的方法。在一些实施方案中，取代的核酸序列和置换核酸序列彼此相当，因为例如它们是彼此同源的和/或包含相应的元件(例如蛋白质编码元件、调控元件等)。在一些实施方案中，取代的核酸序列包括下列中的一个或多个：启动子、增强子、剪接供体位点、剪接受体位点、内含子、外显子、非翻译区(UTR)；在一些实施方案中，置换核酸序列包括一个或多个编码序列。在一些实施方案中，置换核酸序列是取代核酸序列的同系物。在一些实施方案中，置换核酸序列是取代序列的直系同源物。在一些实施方案中，置换核酸序列是或包括人核酸序列。在一些实施方案中，包括置换核酸序列是或包含人核酸序列，取代的核酸序列是或包含啮齿动物序列(例如小鼠序列)的情况。如此设置的核酸序列可包括一个或多个调控序列，其是用于获得如此设置的序列的源核酸序列的一部分(例如，启动子、增强子、5'-或3'-非翻译区等)。例如，在各种实施方案中，置换是用异源序列取代内源性序列，其导致由如此设置的核酸序列(包含异源序列)产生基因产物，但不表达内源序列；置换具有内源性基因组序列，所述内源基因组序列具有核酸序列，所述核酸序列编码具有与由内源性序列编码的蛋白质相似的功能的蛋白质(例如，内源基因组序列编码可变结构域，并且DNA片段编码一个或多个人可变结构域)。在各种实施方案中，用相应的人基因或其片段取代内源性基因或其片段。相应的人基因或其片段是为被取代的内源性基因或其片段的直系同源物，或在结构和/或功能上基本与所述基因或片段相似或相同的人基因或片段。
术语“仅重链抗体”、“仅重链抗原结合蛋白”、“单结构域抗原结合蛋白”、“单结构域结合蛋白”等是指包含免疫球蛋白样链的单体或同型二聚体免疫球蛋白分子，其包含可操作地连接至重链恒定区的可变结构域，其不能与轻链缔合，因为重链恒定区通常缺少功能性CH1结构域。因此，术语“仅重链抗体”、“仅重链抗原结合蛋白”、“单结构域抗原结合蛋白”、“单结构域结合蛋白”等包括(i)单体单结构域抗原结合蛋白，其包含一个免疫球蛋白样链，所述免疫球蛋白样链包括可操作地连接至缺少功能性CH1结构域的重链恒定区的可变结构域，或(ii)同型二聚体单结构域抗原结合蛋白，其包括两个免疫球蛋白样链，所述免疫球蛋白样链中的每一个包含可操作地连接至缺少功能性CH1结构域的重链恒定区的可变结构域。在各个方面，同型二聚体单结构域抗原结合蛋白包含两个相同的免疫球蛋白样链，它们中的每一个包含可操作地连接至缺少功能性CH1结构域的相同重链恒定区的相同可变结构域。此外，单结构域抗原结合蛋白的每个免疫球蛋白样链包含可变结构域，其可源于重链可变区基因区段(例如VH、DH、JH)、轻链基因区段(例如VL、JL)或它们的组合，连接到重链恒定区(CH)基因序列，所述基因序列包含在重链恒定区基因(例如，IgG、IgA、IgE、IgD或它们的组合)的CH1编码序列(和任选地，铰链区)中的缺失或失活突变。包含源于重链基因区段的可变结构域的单结构域抗原结合蛋白可被称为“VH-单结构域抗体”或“VH-单结构域抗原结合蛋白”，参见例如，美国专利8,754,287、美国专利公布20140289876、20150197553、20150197554、20150197555、20150196015、20150197556和20150197557，所述专利各自以引用方式全文并入本文。包含源于轻链基因区段的可变结构域的单结构域抗原结合蛋白可被称为“VL单结构域抗原结合蛋白”，参见例如，美国专利公布20150289489，所述专利以引用方式全文并入本文。
“体细胞突变”包括关于来自亲和力成熟的B细胞的核酸或氨基酸序列，其是与非亲和力成熟的B细胞中的相应免疫球蛋白可变区序列(即，种系细胞基因组中的序列)不相同的。短语“体细胞突变”还包括关于在B细胞暴露于感兴趣的表位之后，来自B细胞的免疫球蛋白可变区核酸或氨基酸序列，其中所述核酸或氨基酸序列与B细胞暴露于感兴趣的表位之前的相应核酸或氨基酸序列不同。短语“体细胞突变”是指结合蛋白的序列，其已经在动物(例如具有人免疫球蛋白可变区核酸序列的小鼠)中产生，其响应于免疫原攻击，并且得自此类动物中固有操作的选择过程。
如本文所用，术语“基本上”包括表现出感兴趣的特性或性质的全部或近似全部的范围或程度的定性条件。生物学领域的普通技术人员将理解，生物和化学现象很少(如果有的话)达到完整和/或持续以获得完整性或实现或避免绝对结果。因此，术语“基本上”用于本文以捕集许多生物和化学现象中固有的潜在完整性缺失。
如本文所用，术语“基本上同源”包括氨基酸或核酸序列之间的比较结果。如本领域普通技术人员将理解的，如果两个序列在相应位置包含同源残基，则其通常被认为是“基本上同源的”。同源残基可以是相同的残基。另选地，同源残基可以是不相同的残基，其将具有大致相似的结构和/或功能特征。例如，如本领域普通技术人员所熟知的，特定氨基酸通常被分类为“疏水性”或“亲水性”氨基酸，和/或具有“极性”或“非极性”侧链。将一个氨基酸取代为相同类型的另一个氨基酸通常可被认为是“同源”取代。如本领域所熟知的，可以使用各种算法中的任一种来比较氨基酸或核酸序列，包括在商业计算机程序中可用的那些，诸如用于核苷酸序列的BLASTN和用于氨基酸序列的BLASTP、gapped BLAST和PSI-BLAST。示例性的此类程序描述于Altschul等人，Basic local alignment search tool，J.Mol.Biol.，215(3)：403-410,1990；Altschul等人，Methods in Enzymology；Altschul等人，“Gapped BLAST and PSI-BLAST:a new generation of protein database searchprograms”，Nucleic Acids Res.25：3389-3402，1997；Baxevanis等人，Bioinformatics：APractical Guide to the Analysis of Genes and Proteins，Wiley，1998；和Misener等人(编辑)，Bioinformatics Methods and Protocols(Methods in Molecular Biology，第132卷)，Humana Press，1999中。除了鉴定同源序列之外，上述程序通常提供同源性程度的指示。在一些实施方案中，如果其相应残基的至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多在残基的相关延伸范围内是同源的，则认为两个序列是基本上同源的。在一些实施方案中，相关延伸是完整的序列。在一些实施方案中，相关延伸是至少9、10、11、12、13、14、15、16、17或更多个残基。在一些实施方案中，相关延伸包括沿完整序列的连续残基。在一些实施方案中，相关延伸包括沿完整序列的不连续残基。在一些实施方案中，相关延伸是至少10、15、20、25、30、35、40、45、50或更多个残基。
如本文所用，术语“基本同一性”包括氨基酸或核酸序列之间的比较结果。如本领域普通技术人员将理解的，如果两个序列在相应位置包含相同的残基，则其通常被认为是“基本上相同的”。如本领域所熟知的，可以使用各种算法中的任一种来比较氨基酸或核酸序列，包括在商业计算机程序中可用的那些，诸如用于核苷酸序列的BLASTN和用于氨基酸序列的BLASTP、gapped BLAST和PSI-BLAST。示例性的此类程序描述于Altschul等人，Basiclocal alignment search tool，J.Mol.Biol.，215(3)：403-410，1990；Altschul等人，Methods in Enzymology；Altschul等人，Nucleic Acids Res.25：3389-3402，1997；Baxevanis等人，Bioinformatics：A Practical Guide to the Analysis of Genes andProteins，Wiley，1998；和Misener等人(编辑)，Bioinformatics Methods and Protocols(Methods in Molecular Biology，第132卷)，Humana Press，1999中。除了鉴定相同序列之外，上述程序通常提供同一性程度的指示。在一些实施方案中，如果其相应残基的至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多在残基的相关延伸范围内是相同的，则认为两个序列是基本上相同的。在一些实施方案中，相关延伸是完整的序列。在一些实施方案中，相关延伸是至少10、15、20、25、30、35、40、45、50或更多个残基。
如本文所用，短语“靶向载体”或“靶向构建体”包括包含靶向区的多核苷酸分子。靶向区包含以下序列，所述序列与靶细胞、组织或动物中的序列相同或基本相同，并且通过同源重组，将靶向构建体整合到细胞、组织或动物基因组内的位置中。还包括使用位点特异性重组酶识别位点(例如，loxP或Frt位点)靶向的靶向区。在一些实施方案中，本发明的靶向构建体还包含特别感兴趣的核酸序列或基因、选择性标记物、控制和/或调控序列，允许通过外源性加入有助于或促进涉及这种序列的重组的蛋白质来介导重组的其它核酸序列。在一些实施方案中，本发明的靶向构建体还包括全部或部分感兴趣的基因，其中感兴趣的基因是异源基因，所述异源基因编码全部或部分的蛋白质，其具有与由内源性序列编码的蛋白质相似的功能。
关于核酸序列的术语“未重排的”包括存在于例如野生型种系的动物细胞中的核酸序列。
短语“可变结构域”包括以从N端到C端的顺序(除非另有说明)，包含以下氨基酸区域的免疫球蛋白轻链或重链(根据需要修饰)的氨基酸序列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。
如本文所用，术语“变体”包括与参考实体相比，示出与参考实体的显著结构同一性，但在一个或多个化学基团的存在或水平下，与参考实体在结构上不同的实体。在许多实施方案中，变体与其参考实体还在功能上不同。一般来讲，特定实体是否被适当地认为是参考实体的“变体”是基于其与参考实体的结构同一性的程度。如本领域技术人员将理解的，任何生物或化学参考实体均具有特定特征结构元件。根据定义，变体为共享一个或多个此类特征结构元件的独特的化学实体。作为一些示例，小分子可具有特征性芯结构元件(例如，大环芯)和/或一个或多个特征性侧基部分，使得小分子的变体是共享芯结构元件和特征性侧基部分但其它侧基部分和/或存在于芯内的键类型(单键相对于双键，E相对于Z等)不同的变体，多肽可具有由多个氨基酸组成的特征序列元件，所述氨基酸具有在线性或三维空间中相对于彼此的指定位置和/或有助于特定生物学功能，核酸可具有特征序列元件，所述特征序列元件由多个核苷酸残基组成，所述核苷酸残基具有在线性或三维空间中相对于彼此的指定位置。例如，由于氨基酸序列的一个或多个差异和/或共价连接到多肽主链的化学部分(例如，碳水化合物，脂质等)的一个或多个差异，变体多肽可与参考多肽不同。在一些实施方案中，变体多肽示出与参考多肽的至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％或99％的总体序列同一性。另选地或除此之外，在一些实施方案中，变体多肽不与参考多肽共享至少一个特征性序列元件。在一些实施方案中，参考多肽具有一种或多种生物活性。在一些实施方案中，变体多肽共享参考多肽的生物活性中的一种或多种。在一些实施方案中，变体多肽缺乏参考多肽的生物活性中的一种或多种。在一些实施方案中，变体多肽示出与参考多肽相比，减少的一种或多种生物活性的水平。在一些实施方案中，如果感兴趣的多肽具有与亲代相同的氨基酸序列，但是在特定位置处具有少量序列改变，则认为感兴趣的多肽是亲代多肽或参考多肽的“变体”。通常，与亲代相比，少于20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％的变体中的残基被取代。在一些实施方案中，与亲代相比，变体具有10、9、8、7、6、5、4、3、2、1个取代残基。通常，变体具有非常少量(例如，少于5、4、3、2或1)数的取代的功能残基(即，参与特定生物活性的残基)。此外，与亲代相比，变体通常具有不多于5、4、3、2或1个添加或删除，并且通常不具有添加或删除。另外，任何添加或删除通常少于约25、约20、约19、约18、约17、约16、约15、约14、约13、约10、约9、约8、约7、约6，并且通常少于约5、约4、约3、或约2个残基。在一些实施方案中，亲代或参考多肽是存在于自然界中的多肽。如本领域普通技术人员所理解的，感兴趣的特定多肽的多个变体可通常存在于自然界中，特别是当感兴趣的多肽是感染性多肽时。
如本文所用的，术语“载体”包括能够转运与其缔合的另一核酸的核酸分子。在一些实施方案中，载体能够在宿主细胞诸如真核细胞和/或原核细胞中，染色体外复制和/或表达其所连接的核酸。能够指导可操作地连接的基因的表达的载体在本文中被称为“表达载体”。
如本文所用的，术语“野生型”包括具有如以“正常”(与突变的、患病的、改变的等相比)状态或环境存在于自然界中的结构和/或活性的实体。本领域普通技术人员将理解野生型基因和多肽通常以多种不同形式(例如，等位基因)存在。
具体实施方式
本发明提供了改善的和/或工程化的非人动物，其具有编码轻链可变结构域的人遗传物质(例如，VL区)。在某些实施方案中，此类非人动物可用于例如产生和分离独立地结合抗原的(人)VL结构域。设想此类非人类动物提供人VL结构域的产生和亲和力成熟的新型体内体系，所述人VL结构域表现出独特的抗原结合特征。因此，本发明尤其可用于开发非人动物中的独特的抗原结合蛋白。具体地讲，本发明包括啮齿动物免疫球蛋白基因座的人源化，其导致结构上类似于天然存在的免疫球蛋白但结合特征上不同的抗原结合蛋白的表达，并且导致所述抗原结合蛋白在非人动物的细胞膜表面上的表达。此类抗原结合蛋白具有识别外源抗原的能力，所述外源抗原可在生成由抗原结合蛋白提供的独特结合表面时避开天然免疫球蛋白。在一些实施方案中，本发明的非人动物能够生成(人)VL/CHxULC结构域，所述结构域独立于同源可变结构域(例如，重链可变结构域)结合到抗原；在一些实施方案中，此类非人动物开发和/或具有B细胞群，所述B细胞群表达在结构上类似于免疫球蛋白但缺乏任何重链可变序列的结合蛋白。在一些实施方案中，由此类非人动物表达的抗原结合蛋白的特征在于抗原结合部分仅由(人)VLxULC结构域组成。在一些实施方案中，本发明的非人动物包含内源免疫球蛋白重链基因座，所述内源免疫球蛋白重链基因座包含来自非人动物和异源物种(例如，人)的遗传物质，并且包含内源性免疫球蛋白轻链基因座，所述内源性免疫球蛋白轻链基因座包含来自非人类动物和异源物种(例如，人)的遗传物质。在一些实施方案中，本发明的非人动物包含杂交免疫球蛋白链基因座，所述杂交免疫球蛋白链基因座包括可操作地连接至重链恒定区编码序列的未重排人VL和JL基因区段，和免疫球蛋白轻链基因座，所述免疫球蛋白轻链基因座包括单重排的人或非人VLJL序列。在一些实施方案中，抗原结合蛋白的表达受非人免疫球蛋白遗传物质(例如，非人免疫球蛋白启动子和/或增强子)的控制。
以下部分详细描述本发明的各个方面。各部分的使用并不意味着限制本发明。每个部分可适用于本发明的任何方面。
包含高多样性的含未重排轻链可变区基因区段的杂交链基因座和低多样性的含 重排轻链可变区序列的轻链基因座的非人动物
生成具有独立于同源链可变区结合到抗原的能力的轻链可变区可用于制备用于抗原结合分子的轻链可变结构域(VLs)。
产生可独立于同源链可变区结合到抗原的此类轻链可变结构域的一种方法是对编码轻链的可变区或结构域(VL)的核苷酸序列施加选择性压力以产生具有更多样化的抗原结合谱的轻链CDR3。如本文所公开的，这可通过产生经遗传修饰的非人动物来实现，所述经遗传修饰的非人动物在其基因组中包含免疫球蛋白杂交链基因座，所述免疫球蛋白杂交链基因座包含高多样性的未排列轻链基因区段，参见例如，美国专利公布20120096572，其通过引用并入本文，和具有低多样性的免疫球蛋白轻链基因座，因为该基因座包含单重排人免疫球蛋白轻链可变区核苷酸序列。另选地，在一些实施方案中，如本文所述的非人动物包含免疫球蛋白轻链基因座，所述免疫球蛋白轻链基因座具有低多样性，因为该基因座包含两个或更多个但是少于野生型数的未重排人VL基因区段(例如，2、3或4个)。由于免疫球蛋白轻链基因座处的轻链序列(或有限数的VL基因区段)被限制于这些动物的共同或通用(即相同或非常相似的)序列中，所以杂交基因座的未重排的轻链可变区核苷酸序列(即基因)将被迫形成具有更加多样化和有效的抗原结合性质的轻链CDR3，其可以独立于同源可变区结合抗原决定簇。此外，如本文所公开的，种系可变区基因区段的精确置换(例如通过同源重组介导的基因靶向)允许形成具有部分人免疫球蛋白基因座的动物(例如，小鼠、大鼠或鸡)。因为通常，部分人免疫球蛋白基因座重排、高突变和体细胞突变(例如，类别转换)，所以部分人免疫球蛋白基因座在动物中生成包含人可变结构域(即人VL结构域)的结合蛋白。这些动物表现出与野生型动物基本上相似的体液免疫系统，并显示正常细胞群体和正常淋巴器官结构-即使在动物缺乏人可变区基因区段(在免疫球蛋白轻链基因座处)的完整谱系的情况下也是如此。对这些动物(例如，小鼠、大鼠或鸡)进行免疫导致稳健的体液应答，其显示出轻链可变基因区段使用的广泛多样性。可鉴定并克隆编码可变区的核苷酸序列，然后与选择的任一种序列融合(例如，在体外系统中)，例如适用于特定用途的任何免疫球蛋白同种型，从而产生完全源自人序列的抗体或抗原结合蛋白。
此外，通过利用具有受限制的(有限的)免疫球蛋白轻链基因座，例如包含重排轻链可变区核苷酸序列的受限制的免疫球蛋白轻链基因座(例如通用轻链或“ULC”，美国专利申请公布2011-0195454 A1、US 2012-0021409A1、US 2012-0192300A1、US 2013-0045492A1、US 2013-0185821A1和US 2013-0302836A1，据此全文以引用方式并入)或受限制的(有限的)免疫球蛋白轻链可变区基因区段谱系(例如，包含两个或多更多个但少于野生型数的人VL基因区段的受限制的免疫球蛋白轻链可变区段谱系；例如，双轻链，或“DLC”，美国专利申请公布US-2013-0198880-A1，其全文以引用方式并入本文)与包含上文所述的未重排轻链可变区基因区段的高多样性杂交免疫球蛋白链基因座的组合，可产生在不存在重链可变结构域的情况下结合抗原的免疫球蛋白轻链可变(VL/CHxULC)结构域。此外，通过，例如经由添加一个或多个组氨酸密码子或用组氨酸密码子取代一个或多个非组氨酸密码子将组氨酸密码子引入本文所述的非人动物的基因组中的重排轻链可变区核苷酸序列中(或受限制的VL基因区段中)，可生成可对抗原结合蛋白赋予改善的pH依赖性可再循环能力的轻链可变区氨基酸序列。
在一些实施方案中，如本文所述的经遗传修饰的非人动物提供更大的结合蛋白产量，同时限制多样性，从而增加由独立于同源可变结构域结合抗原的结合基因座成功产生轻链可变结构域的可能性。在一些实施方案中，轻链本身可表现出抗原结合特性。在一些实施方案中，可诱导非人动物以产生表现出存在于其轻链中的抗原特异性的抗原结合蛋白(例如，通过限制小鼠或大鼠的免疫球蛋白轻链谱系并使免疫球蛋白杂交链谱系最大化；例如，通过产生杂交免疫球蛋白链谱系，例如通过用包含高多样性的未重排的人VL和JL基因区段的基因座取代小鼠或大鼠重链可变区基因座，并用单重排人免疫球蛋白轻链可变区核苷酸序列取代小鼠或大鼠轻链可变区基因座)。在一些实施方案中，通过其轻链结合，在此类动物中产生的抗原结合蛋白(例如，抗体)将对特定表位(例如，效应物抗原、细胞毒性分子、Fc受体、毒素、活化或抑制性受体、T细胞标记物、免疫球蛋白转运蛋白等)具有特异性。
在各个方面，提供了一种非人动物，所述非人动物在其种系基因组中包含杂交免疫球蛋白链基因座，所述杂交免疫球蛋白链基因座包含与重链恒定区编码序列可操作地连接的未重排的(人)VL和JL基因区段，和免疫球蛋白轻链基因座，所述免疫球蛋白轻链基因座包括未重排的人或非人免疫球蛋白轻链可变区核苷酸序列(即重排的轻链VJ序列)。在一些实施方案中，未重排的(人)VL和JL基因区段可操作地连接至包含一个或多个重链恒定区基因的人或非人重链恒定区序列，所述一个或多个重链恒定区基因中的每一个编码至少功能性CH1结构域，并且重排的(人)免疫球蛋白轻链可变区核苷酸序列可操作地连接至人或非人轻链恒定区序列。在一些实施方案中，由重排的轻链可变区核苷酸序列编码的免疫球蛋白轻链可变结构域对于非人动物不是免疫原性的。在一些实施方案中，非人类动物被该改性成包含编码可操作地连接至轻链恒定结构域的重排轻链可变结构域的两个拷贝、三个拷贝、四个拷贝或更多个拷贝的核苷酸序列。在一些实施方案中，核苷酸序列编码重排的(人)免疫球蛋白轻链可变区核苷酸序列的多个拷贝。例如，核苷酸序列可编码重排的人免疫球蛋白轻链可变区核苷酸序列的至少一个、两个、三个、四个、五个拷贝。在一些实施方案中，核苷酸序列编码重排的(人)免疫球蛋白轻链可变区核苷酸序列的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个拷贝。在一些实施方案中，免疫球蛋白轻链基因座包含可操作地连接至轻链恒定区基因序列的重排的(人)免疫球蛋白轻链可变区核苷酸序列的多个拷贝。
在各个方面，本文所述的非人动物的免疫球蛋白轻链基因座包含单重排的人免疫球蛋白轻链可变区核苷酸序列，例如重排的人VLJL序列，其可操作地连接至非人轻链恒定区核苷酸序列(例如，非人轻链恒定区核酸序列)。因此，本发明提供经遗传修饰的非人动物，所述非人动物在其基因组中包含：(i)杂交免疫球蛋白链基因座，其包含可操作地连接至人或非人重链恒定区核酸序列的未重排人VL和JL基因区段；和(ii)免疫球蛋白轻链基因座，其包含可操作地连接至轻链恒定区核酸序列的重排的人轻链可变区核苷酸序列。在一些实施方案中，轻链恒定区为大鼠或小鼠恒定区，例如大鼠或小鼠Cκ恒定区。在一些实施方案中，在免疫球蛋白重链基因座(例如，杂交免疫球蛋白链基因座)处的人VL和JL基因区段以多个基因区段(多于一个人VL基因区段和多于一个人JL基因区段)的形式存在并且能够在抗体的重链恒定区的环境中重排和编码人VL结构域，并且非人动物不包含内源性VH和/或VL基因区段。在一些实施方案中，非人动物包含在免疫球蛋白重链基因座(例如杂交免疫球蛋白链基因座)处的六个、16个、30个、40个或更多个未重排的人Vκ基因区段。在一些实施方案中，非人动物包含在免疫球蛋白重链基因座(例如杂交免疫球蛋白链基因座)处的五个未重排的人Jκ基因区段，例如Jκ1、Jκ2、Jκ3、Jκ4和Jκ5基因区段。在一些实施方案中，非人动物包含在免疫球蛋白重链基因座(例如杂交免疫球蛋白链基因座)处的12个、28个、40个或更多个未重排的人Vλ基因区段。在一些实施方案中，非人动物包含在免疫球蛋白重链基因座(例如杂交免疫球蛋白链基因座)处的1、2、3、4或更多个未重排的人Jλ基因区段，例如Jλ1、Jλ2、Jλ3、Jλ7等。
在一些实施方案中，本文所述的非人动物的免疫球蛋白轻链基因座包含重排的人VκJκ核苷酸序列。在一些实施方案中，免疫球蛋白轻链基因座包含重排的人VλJλ核苷酸序列。在一些实施方案中，重排的人VκJκ核苷酸序列或重排的人VλJλ核苷酸序列存在于内源性轻链基因座处，例如存在于内源性κ轻链基因座处。在一些实施方案中，小鼠包括功能性λ轻链基因座。在一些实施方案中，小鼠包括非功能性λ轻链基因座。在一些实施方案中，免疫球蛋白重链基因座处的一个或多个人VL基因区段和一个或多个JL基因区段可操作地连接至小鼠或大鼠重链恒定区序列(例如，在杂交免疫球蛋白链基因座中)。在一些实施方案中，重排的人VκJκ核苷酸序列为重排的人Vκ1-39Jκ核苷酸序列，例如Vκ1-39Jκ5序列(例如，以SEQID NO:1示出)。在一些实施方案中，重排的人VκJκ核苷酸序列为重排的人Vκ3-20Jκ核苷酸序列，例如Vκ3-20Jκ1序列(例如，以SEQ ID NO:2示出)。在一些实施方案中，重排的人VλJλ核苷酸序列为重排的人Vλ2-14Jλ1核苷酸序列。技术人员将认识到可以在重排的轻链序列中使用其它JL序列。
在各个方面，本文所述的非人动物的免疫球蛋白轻链基因座包括免疫球蛋白轻链可变基因片段的有限谱系，例如一个或多个但小于野生型数量的人VL基因区段；和可操作地连接至非人轻链恒定区核苷酸序列的一个或多个人JL基因区段。因此，本发明提供经遗传修饰的非人动物，所述非人动物在其基因组中包含：(i)免疫球蛋白重链基因座(例如，杂交免疫球蛋白链基因座)，其包含可操作地连接至人或非人重链恒定区核酸序列(例如，编码CH1、铰链、CH2、CH3、CH4或它们的组合，例如，CH1，铰链、CH2和CH3的非人重链恒定区核酸序列)的人VL和JL基因区段；和(ii)免疫球蛋白轻链基因座，其包含可操作地连接至轻链恒定区核酸序列的两个或更多个但少于野生型数的人免疫球蛋白VL和JL基因区段。在一些实施方案中，轻链恒定区为大鼠或小鼠恒定区，例如大鼠或小鼠Cκ恒定区。在一些实施方案中，在免疫球蛋白重链基因座(例如，杂交免疫球蛋白链基因座)处的人VL和JL基因区段以多个基因区段(多于一个人VL基因区段和多于一个人JL基因区段)的形式存在并且能够在抗体的重链恒定区的环境中重排和编码人VL结构域，并且非人动物不包含内源性VH和/或VL基因区段。在一些实施方案中，非人动物包含在免疫球蛋白重链基因座(例如杂交免疫球蛋白链基因座)处的六个、16个、30个、40个或更多个未重排的人Vκ基因区段。在一些实施方案中，非人动物包含在免疫球蛋白重链基因座(例如杂交免疫球蛋白链基因座)处的五个未重排的人Jκ基因区段，例如Jκ1、Jκ2、Jκ3、Jκ4和Jκ5基因区段。在一些实施方案中，非人动物包含在免疫球蛋白重链基因座(例如杂交免疫球蛋白链基因座)处的12个、28个、40个或更多个未重排的人Vλ基因区段。在一些实施方案中，非人动物包含在免疫球蛋白重链基因座(例如杂交免疫球蛋白链基因座)处的1、2、3、4或更多个未重排的人Jλ基因区段，例如Jλ1、Jλ2、Jλ3、Jλ7等。在一些实施方案中，非人动物包含在免疫球蛋白轻链基因座处的两个未重排的人Vκ基因区段。在一些实施方案中，非人动物包含在免疫球蛋白轻链基因座处的两个未重排的人Vλ基因区段。
在一些实施方案中，在其基因组中包含以下物质的经遗传修饰的小鼠：(i)免疫球蛋白重链基因座(例如，杂交免疫球蛋白链基因座)，其包含可操作地连接至人或非人重链恒定区核酸序列的未重排人VL和JL基因区段；和(ii)免疫球蛋白轻链基因座，其包含可操作地连接至轻链恒定区核酸序列的重排的人轻链可变区核酸序列，展示基本上与野生型小鼠或包含其免疫球蛋白基因座的其它修饰的小鼠(即，经遗传修饰的对照小鼠；例如，人源化小鼠，其中，小鼠的体液免疫系统的功能类似于野生型小鼠的功能)中观察到的数量基本上相同的CD19+B细胞数和成熟的B细胞数。在一些实施方案中，此类小鼠还展示脾B细胞中内源性λ轻链的功能性沉默。在一些实施方案中，小鼠表现出骨髓和脾中的正常或几乎正常的B细胞发育。在一些实施方案中，与经遗传修饰的对照小鼠相比，此类小鼠表现出缺乏可检测的λ轻链的表达和/或使用(或功能性沉默)。
在另一方面，本发明提供非人动物，其包含(a)经遗传修饰的免疫球蛋白重链基因座，所述免疫球蛋白重链基因座包含：编码轻链可变结构域的第一核苷酸序列(例如，其中第一核苷酸序列包含未重排的人免疫球蛋白轻链可变区基因区段)，其中第一核苷酸序列可操作地连接至包含一个或多个重链恒定区基因的重链恒定区基因序列，所述一个或多个重链恒定区基因各自包含编码功能性CH1结构域的序列，例如包含至少完整的Igμ基因以及完整的Igδ基因、完整的Igγ基因、完整的Igε基因、和完整的Igα基因中的至少一种(因此，产生例如，杂交免疫球蛋白链基因座)；和(b)经遗传修饰的免疫球蛋白轻链基因座，所述免疫球蛋白轻链基因座包含第二核苷酸序列，所述第二核苷酸序列编码人轻链可变结构域(例如，其中第二核苷酸序列为重排人免疫球蛋白轻链可变区核苷酸序列，或其中第二核苷酸序列包含有限数的人VL基因区段；例如，两个或更多个但少于野生型数的人VL基因区段)，其中第二核苷酸序列可操作地连接至轻链恒定区基因序列。例如，在一些实施方案中，来自预设计的VJ区的重排轻链(即，重排的人免疫球蛋白轻链可变区核苷酸序列；即，共同或通用轻链序列)或有限数的人VL基因区段(例如，两个或更多个但少于野生型数的人VL基因区段)可通过将重排轻链序列靶向到小鼠轻链基因座，κ或λ中而可操作地连接至轻链恒定区基因序列。因此，如在其它实施方案中，这种基因工程化的免疫球蛋白轻链基因座可存在于非人动物的种系基因组中。包含与重链恒定区基因序列可操作连接的未重排人免疫球蛋白轻链可变区核苷酸序列的经遗传修饰的非人动物描述在美国专利申请公布2002-0096572A1中，其以引用方式并入本文。在一些实施方案中，编码人轻链可变结构域的第二核苷酸序列可操作地连接至κ轻链恒定(即，Cκ)区基因序列。在一些实施方案中，编码人轻链可变结构域的第二核苷酸序列可操作地连接至小鼠或大鼠Cκ区基因序列。在一些实施方案中，编码轻链可变结构域的第二核苷酸序列可操作地连接至人Cκ区基因序列。在一些实施方案中，编码人轻链可变结构域的第二核苷酸序列可操作地连接至Cλ区基因序列。在一些实施方案中，编码人轻链可变结构域的第二核苷酸序列可操作地连接至小鼠或大鼠Cλ区基因序列。在一些实施方案中，编码人链可变结构域的第二核苷酸序列可操作地连接至人Cλ区基因序列。
在一些实施方案中，非人动物为哺乳动物。尽管在小鼠中(即，具有包含重排人免疫球蛋白轻链可变区核苷酸序列(或有限数的人VL基因区段)的免疫球蛋白轻链基因座和包含未重排人轻链可变区基因区段的免疫球蛋白重链基因座(例如，杂交免疫球蛋白链基因座)的小鼠)中利用重排人轻链可变区(或有限数的人VL基因区段)和未重排人轻链可变区基因区段的实施方案广泛讨论于本文中，但还提供包含如本文所述的经遗传修饰的免疫球蛋白重链和轻链基因座的其它非人动物。此类非人动物包括可被遗传修饰以表达如本文所公开的重排人免疫球蛋白轻链可变区核苷酸序列(或来自有限数的人VL基因区段的人轻链可变结构域)的那些动物中的任一种，包括例如，哺乳动物，例如小鼠、大鼠、兔、猪、牛(例如奶牛、公牛、水牛)、鹿、绵羊、山羊、鸡、猫、狗、白鼬、灵长类动物(例如狨猴、恒河猴)等。例如，对于合适的遗传修饰的ES细胞不易获得的那些非人动物，使用其它方法来制备包含遗传修饰的非人动物。此类方法包括，例如对非ES细胞基因组(例如，成纤维细胞或诱导多能细胞)进行修饰并采用体细胞核移植(SCNT)将经遗传修饰的基因组转移到合适的细胞，例如无核的卵母细胞，并且在合适的条件下在非人动物中孕育经修饰的细胞(例如，经修饰的卵母细胞)以形成胚胎。用于修饰非人动物基因组(例如，猪、奶牛、啮齿动物、鸡等基因组)的方法包括，例如，利用锌指核酸酶(ZFN)或转录激活子样效应子核酸酶(TALEN)修饰基因组以包括免疫球蛋白轻链基因座，所述免疫球蛋白轻链基因座包含重排的人免疫球蛋白轻链可变区核苷酸序列(或有限数的人VL基因区段，例如两个或更多个但小于野生型数量的人VL基因区段)和包含未重排的人轻链可变区基因区段的免疫球蛋白重链基因座(例如，杂交免疫球蛋白链基因座)。
在一些实施方案中，非人动物为例如跳鼠总科(Dipodoidea)或鼠总科(Muroidea)的小型哺乳动物。在一些实施方案中，经遗传修饰的动物是啮齿动物。在一些实施方案中，啮齿动物选自小鼠、大鼠和仓鼠。在一些实施方案中，啮齿动物选自鼠总科。在一些实施方案中，遗传修饰的动物来自选自下列的科：丽仓鼠科(Calomyscidae)(例如，丽仓鼠)、仓鼠科(Cricetidae)(例如，仓鼠、新世界鼠、田鼠)、鼠科(Muridae)(真小鼠和大鼠(true miceand rats)、沙鼠、非洲刺毛鼠、冠鼠)、马岛鼠科(Nesomyidae)(攀鼠、岩鼠、白尾鼠、马岛鼠(Malagasy rats and mice))、刺睡鼠科(Platacanthomyidae)(例如，刺睡鼠)以及鼹形鼠科(Spalacidae)(例如，鼹形鼠、竹鼠和鼢鼠)。在一个具体实施方案中，经遗传修饰的啮齿动物选自真小鼠或大鼠(鼠科)、沙鼠、非洲刺毛鼠和冠鼠。在一些实施方案中，经遗传修饰的小鼠来自鼠科的成员。在一些实施方案中，动物为啮齿动物。在具体实施方案中，啮齿动物选自小鼠和大鼠。在一些实施方案中，非人动物为小鼠。
在一些实施方案中，非人动物是啮齿动物，为C57BL品系小鼠，其选自C57BL/A、C57BL/An、C57BL/GrFa、C57BL/KaLwN、C57BL/6、C57BL/6J、C57BL/6ByJ、C57BL/6N、C57BL/6NJ、C57BL/10、C57BL/10ScSn、C57BL/10Cr和C57BL/Ola。在另一个实施方案中，所述小鼠为129品系。在一些实施方案中，所述129品系选自129P1、129P2、129P3、129X1、129S1(例如，129S1/SV、129S1/SvIm)、129S2、129S4、129S5、129S9/SvEvH、129S6(129/SvEvTac)、129S7、129S8、129T1、129T2(参见例如，Festing等人(1999)Revised nomenclature for strain129 mice,Mammalian Genome 10:836，还参见，Auerbach等人(2000)Establishment andChimera Analysis of 129/SvEv-and C57BL/6-Derived Mouse Embryonic Stem CellLines)。在一些实施方案中，经遗传修饰的小鼠为上述129品系与上述C57BL品系(例如，C57BL/6品系)的混合型。在另一个实施方案中，小鼠为上述129品系的混合型，或上述C57BL/6品系的混合型。在一些实施方案中，该混合型的129品系为129S6(129/SvEvTac)品系。在另一个实施方案中，小鼠为129/SvEv-和C57BL/6-衍生的品系的混合型。在一个具体实施方案中，小鼠为129/SvEv-和C57BL/6-衍生的品系的混合型，如描述于Auerbach等人2000BioTechniques 29:1024-1032中。在另一个实施方案中，小鼠为BALB品系，例如BALB/c品系。在另一个实施方案中，小鼠为BALB品系(例如，BALB/c品系)和另一种上述品系的混合型。
在一些实施方案中，非人动物为大鼠。在一些实施方案中，大鼠选自Wistar大鼠、LEA品系、Sprague Dawley品系、Fischer品系、F344、F6、ACI和Dark Agouti(DA)。在一些实施方案中，大鼠品系为选自Wistar、LEA、Sprague Dawley、Fischer、F344、F6、ACI和DarkAgouti(DA)的品系中两种或更多种的混合型。
在一些实施方案中，此类经遗传修饰的小鼠以λ基因序列在野生型中所用频率的一半或小于一半的频率来使用λ基因序列。
在各种实施方案中，如本文所述，重排轻链可变结构域源于人VL和JL基因序列或区段。在其它实施方案中，重排轻链可变结构域源于非人VL和JL基因序列或区段。在一些实施方案中，重排轻链可变结构域源于人种系VL区段和人种系JL区段。在一些实施方案中，人VL区段对应于人群中所观察到的变体。
在各种实施方案中，如本文所述，重排轻链可变区核苷酸序列的人VL基因区段为人Vκ基因区段。在一些实施方案中，人Vκ基因区段选自Vκ4-1、Vκ5-2、Vκ7-3、Vκ2-4、Vκ1-5、Vκ1-6Vκ3-7、Vκ1-8、Vκ1-9、Vκ2-10、Vκ3-11、Vκ1-12、Vκ1-13、Vκ2-14、Vκ3-15、Vκ1-16、Vκ1-17、Vκ2-18、Vκ2-19、Vκ3-20、Vκ6-21、Vκ1-22、Vκ1-23、Vκ2-24、Vκ3-25、Vκ2-26、Vκ1-27、Vκ2-28、Vκ2-29、Vκ2-30、Vκ3-31、Vκ1-32、Vκ1-33、Vκ3-34、Vκ1-35、Vκ2-36、Vκ1-37、Vκ2-38、Vκ1-39、Vκ2-40、以及它们的多态变体。在一些实施方案中，人Vκ区段为Vκ1-39或它们的多态变体。在一些实施方案中，人Vκ区段为Vκ3-20。
在各种实施方案中，如本文所述，受限制(有限的)免疫球蛋白轻链可变区基因区段谱系的人VL基因区段(例如，包含两个或更多个但少于野生型数量的人VL基因区段的受限免疫球蛋白轻链可变区段谱系)为人Vκ基因区段。在一些实施方案中，人Vκ基因区段选自本文所述的人Vκ基因区段。在一些特定实施方案中，受限制的(有限的)免疫球蛋白轻链可变区基因区段谱系的人Vκ基因区段包括人Vκ1-39基因区段和人Vκ3-20基因区段。在非人动物的受限制的(有限的)免疫球蛋白轻链可变基因区段的各种实施方案中，受限制的轻链可变基因区段(例如，人Vκ1-39基因区段和人Vκ3-20基因区段)可操作地连接至一个、两个、三个、四个、或更多个人JL基因区段；使得受限制的免疫球蛋白轻链可变基因区段与所述一个或两个或三个或四个或更多个人JL基因区段中的一个(即，Jκ基因区段)重组以形成重排VκJκ轻链可变基因。
在各种实施方案中，如本文所述，重排轻链可变区核苷酸序列的人VL基因区段为人Vλ基因区段。在一些实施方案中，人Vλ基因区段选自Vλ3-1、Vλ4-3、Vλ2-8、Vλ3-9、Vλ3-10、Vλ2-11、Vλ3-12、Vλ2-14、Vλ3-16、Vλ2-18、Vλ3-19、Vλ3-21、Vλ3-22、Vλ2-23、Vλ3-25、Vλ3-27、Vλ1-36、Vλ5-37、Vλ5-39、Vλ1-40、Vλ7-43、Vλ1-44、Vλ5-45、Vλ7-46、Vλ1-47、Vλ9-49、Vλ1-51、Vλ5-52、Vλ6-57、Vλ4-60、Vλ8-61、Vλ4-69以及它们的多态变体。在一些实施方案中，人Vλ区段为Vλ2-14。
在各种实施方案中，如本文所述，受限制(有限的)免疫球蛋白轻链可变区基因区段谱系(例如，包含两个或更多个但少于野生型数量的人VL基因区段的受限免疫球蛋白轻链可变区段谱系)的人VL基因区段为人Vλ基因区段。在一些实施方案中，人Vλ基因区段选自本文所述的人Vλ基因区段。在一些特定实施方案中，受限制的(有限的)免疫球蛋白轻链可变区基因区段谱系的人Vλ基因区段包括人Vλ2-14基因区段。
在各种实施方案中，如本文所述，重排轻链可变区核苷酸序列的人JL基因区段选自Jκ1、Jκ2、Jκ3、Jκ4、Jκ5、Jλ1、Jλ2、Jλ3、Jλ7、以及它们的多态变体。
在各种实施方案中，如本文所述，受限制(有限的)免疫球蛋白轻链可变区基因区段谱系的人JL基因区段包括人Jκ1、Jκ2、Jκ3、Jκ4、Jκ5、以及它们的多态变体。在各种实施方案中，如本文所述，受限制(有限的)免疫球蛋白轻链可变区基因区段谱系的人JL基因区段包括人Jλ1、Jλ2、Jλ3、Jλ7、以及它们的多态变体。
在一些实施方案中，人或非人动物轻链恒定区序列包含选自Cκ和Cλ区域的序列。
各种实施方案利用或包括源于人源化小鼠的特征结构或序列信息。人源化小鼠包含在内源性基因座处，用相应人免疫球蛋白可变区精确的大规模置换小鼠免疫球蛋白重链(IgH)和免疫球蛋白轻链(例如，κ轻链，Igκ)的种系可变区(参见例如，US 6,596,541和US 8,502,018，其整体内容以引用方式并入本文)。小鼠基因座的总共约6兆碱基用人基因组序列的约1.5兆碱基取代。这种精确的置换导致具有杂交免疫球蛋白基因座的小鼠，所述杂交免疫球蛋白基因座形成具有人可变区和小鼠恒定区的重链和轻链。小鼠VH-D-JH和Vκ-Jκ区段的精确置换使侧接的小鼠序列在杂交免疫球蛋白基因座处保留完整和功能性。小鼠的体液免疫系统功能类似于野生型小鼠。B细胞发育在任何重要方面是不受阻碍的，并且在抗原攻击时在小鼠中产生人可变区的丰富多样性。另外，人源化小鼠显示基本上正常的野生型免疫应答，其仅在一个重要方面与野生型小鼠不同-响应于免疫产生的可变区完全是人的。人源化小鼠是可能的，因为免疫球蛋白基因区段的重链和κ轻链重排在人和小鼠中类似。尽管基因座不相同，但其足够相似，使得重链可变基因座的人源化可通过用基本上覆盖来自人免疫球蛋白基因座的等同序列的连续人基因组序列的约一兆碱基取代包含全部VH、D和JH基因区段的连续小鼠序列的约三兆碱基对来实现。
在具体实施方案中，提供人源化小鼠，其包含含有未重排人轻链可变区基因区段的免疫球蛋白重链基因座(即，包含含有未重排人免疫球蛋白VL和JL基因区段的免疫球蛋白重链基因座)。如此修饰的人源化小鼠包括用未重排人免疫球蛋白轻链可变区基因区段(例如，在内源性重链基因座处的未重排VL和JL基因)置换小鼠免疫球蛋白重链可变基因区段，和用重排人VLJL核苷酸序列置换小鼠免疫球蛋白轻链可变基因区段，或用受限制(有限的)免疫球蛋白轻链可变区基因区段谱系(例如，两个或更多个但少于野生型数的人VL基因区段)置换小鼠免疫球蛋白轻链可变基因区段。
在一些实施方案中，如此修饰的小鼠包括用至少40个未重排人Vκ基因区段和五个未重排人Jκ基因区段置换小鼠免疫球蛋白重链可变区基因区段。在一些实施方案中，未重排人Vκ基因区段选自Vκ1-5、Vκ1-6、Vκ1-8、Vκ1-9、Vκ1-12、Vκ1-13、Vκ1-16、Vκ1-17、Vκ1-22、Vκ1-27、Vκ1-32、Vκ1-33、Vκ1-35、Vκ1-37、Vκ1-39、Vκ1D-8、Vκ1D-12、Vκ1D-13、Vκ1D-16、Vκ1D-17、Vκ1D-22、Vκ1D-27、Vκ1D-32、Vκ1D-33、Vκ1D-35、Vκ1D-37、Vκ1D-39、Vκ1D-42、Vκ1D-43、Vκ1-NL1、Vκ2-4、Vκ2-10、Vκ2-14、Vκ2-18、Vκ2-19、Vκ2-23、Vκ2-24、Vκ2-26、Vκ2-28、Vκ2-29、Vκ2-30、Vκ2-36、Vκ2-38、Vκ2-40、Vκ2D-10、Vκ2D-14、Vκ2D-18、Vκ2D-19、Vκ2D-23、Vκ2D-24、Vκ2D-26、Vκ2D-28、Vκ2D-29、Vκ2D-30、Vκ2D-36、Vκ2D-38、Vκ2D-40、Vκ3-7、Vκ3-11、Vκ3-15、Vκ3-20、Vκ3-25、Vκ3-31、Vκ3-34、Vκ3D-7、Vκ3D-7、Vκ3D-11、Vκ3D-15、Vκ3D-15、Vκ3D-20、Vκ3D-25、Vκ3D-31、Vκ3D-34、Vκ3-NL1、Vκ3-NL2、Vκ3-NL3、Vκ3-NL4、Vκ3-NL5、Vκ4-1、Vκ5-2、Vκ6-21、Vκ6D-21、Vκ6D-41、和Vκ7-3。在一些实施方案中，人Vκ基因区段包括Vκ4-1、Vκ5-2、Vκ7-3、Vκ2-4、Vκ1-5和Vκ1-6。在一个实施方案中，Vκ基因区段包括Vκ3-7、Vκ1-8、Vκ1-9、Vκ2-10、Vκ3-11、Vκ1-12、Vκ1-13、Vκ2-14、Vκ3-15和Vκ1-16。在一些实施方案中，人Vκ基因区段包括Vκ1-17、Vκ2-18、Vκ2-19、Vκ3-20、Vκ6-21、Vκ1-22、Vκ1-23、Vκ2-24、Vκ3-25、Vκ2-26、Vκ1-27、Vκ2-28、Vκ2-29和Vκ2-30。在一些实施方案中，人Vκ基因区段包括Vκ3-31、Vκ1-32、Vκ1-33、Vκ3-34、Vκ1-35、Vκ2-36、Vκ1-37、Vκ2-38、Vκ1-39和Vκ2-40。在具体实施方案中，Vκ基因区段包括从Vκ4-1至Vκ2-40跨越人免疫球蛋白κ轻链基因座的连续人免疫球蛋白κ基因区段，并且Jκ基因区段包括从Jκ1至Jκ5跨越人免疫球蛋白κ轻链基因座的连续基因区段。在一些实施方案中，重排的人轻链可变区核苷酸序列(即，重排的人VκJκ核苷酸序列)可操作地连接至小鼠轻链恒定区序列(例如，Cκ序列)。包含编码人轻链可变结构域的免疫球蛋白重链基因座(即，包含含有未重排人免疫球蛋白轻链可变区基因区段的免疫球蛋白重链基因座)的人源化小鼠可用于本文所述的方面、实施方案、方法等中的任一个中。
在一些实施方案中，如此修饰的小鼠包括用至少40个未重排人Vλ基因区段和一个或多个未重排人Jλ基因区段；在一些特定实施方案中，至少40个未重排人Vλ基因区段和四个未重排人Jλ基因区段置换小鼠免疫球蛋白重链可变区基因区段。在一些实施方案中，未重排的人Vκ基因区段选自Vλ3-1、Vλ4-3、Vλ2-8、Vλ3-9、Vλ3-10、Vλ2-11、Vλ3-12、Vλ2-14、Vλ3-16、Vλ2-18、Vλ3-19、Vλ3-21、Vλ3-22、Vλ2-23、Vλ3-25、Vλ3-27、Vλ1-36、Vλ5-37、Vλ5-39、Vλ1-40、Vλ7-43、Vλ1-44、Vλ5-45、Vλ7-46、Vλ1-47、Vλ9-49、Vλ1-51、Vλ5-52、Vλ6-57、Vλ4-60、Vλ8-61、Vλ4-69以及它们的多态变体。在一些实施方案中，未重排的人Vλ区段区段包括Vλ3-1、Vλ4-3、Vλ2-8、Vλ3-9、Vλ3-10、Vλ2-11和Vλ3-12。在一些实施方案中，未重排的人Vλ区段区段包括V Vλ2-14、Vλ3-16、Vλ2-18、Vλ3-19、Vλ3-21、Vλ3-22、Vλ2-23、Vλ3-25和Vλ3-27。在一些实施方案中，未重排的人Vλ区段区段包括V Vλ1-36、Vλ5-37、Vλ5-39、Vλ1-40、Vλ7-43、Vλ1-44、Vλ5-45、Vλ7-46、Vλ1-47、Vλ9-49、Vλ1-51、Vλ5-52、Vλ6-57、Vλ4-60、Vλ8-61和Vλ4-69。在具体实施方案中，Vλ基因区段包括从Vλ3-1至Vλ3-12跨越人免疫球蛋白λ轻链基因座的连续人免疫球蛋白λ基因区段，并且Jλ基因区段包括Jλ1。在具体实施方案中，Vλ基因区段包括从Vλ3-12至Jλ1跨越人免疫球蛋白λ轻链基因座的连续人免疫球蛋白λ基因区段。在具体实施方案中，Vλ基因区段包括从Vλ3-1至Vλ3-12跨越人免疫球蛋白λ轻链基因座的连续人免疫球蛋白λ基因区段，并且Jλ基因区段包括Jλ1、Jλ2、Jλ3和Jλ7。在具体实施方案中，Vλ基因区段包括从Vλ3-12至Vλ3-27跨越人免疫球蛋白λ轻链基因座的连续人免疫球蛋白λ基因区段，并且Jλ基因区段包括Jλ1或Jλ1、Jλ2、Jλ3和Jλ7。在具体实施方案中，Vλ基因区段包括从Vλ1-40至Vλ5-52跨越人免疫球蛋白λ轻链基因座的连续人免疫球蛋白λ基因区段，并且Jλ基因区段包括Jλ1或Jλ1、Jλ2、Jλ3和Jλ7。在一些实施方案中，重排的人轻链可变区核苷酸序列为重排的人VλJλ核苷酸序列，并且可操作地连接至小鼠轻链恒定区序列(例如，Cλ序列)。包含编码人轻链可变结构域的免疫球蛋白重链基因座(即，包含含有未重排人免疫球蛋白轻链可变区基因区段的免疫球蛋白重链基因座)的人源化小鼠可用于本文所述的方面、实施方案、方法等中的任一个中。
在各种实施方案中，未重排人免疫球蛋白轻链可变区基因区段可操作地连接至人或小鼠重链恒定区基因序列(例如，编码选自IgM、IgD、IgA、IgE、IgG、以及它们的组合的免疫球蛋白同种型的重链恒定区基因序列，其中每个重链恒定区基因编码功能性CH1结构域)。例如，本发明提供经遗传修饰的非人动物，其包含：(a)免疫球蛋白重链基因座(例如，杂交免疫球蛋白链基因座)，所述免疫球蛋白重链基因座包含第一核苷酸序列，所述第一核苷酸序列包含未重排人轻链可变区基因区段(即，其中第一核苷酸序列包含至少40个人Vκ基因区段和5个人Jκ基因区段)，其中所述第一核苷酸序列可操作地连接至人或非人重链恒定区基因序列；和(b)免疫球蛋白轻链基因座，所述免疫球蛋白轻链基因座包含第二核苷酸序列，所述第二核苷酸序列编码轻链可变结构域(即，其中第二核苷酸序列为重排的人免疫球蛋白轻链可变区核苷酸序列或其中第二核苷酸序列包含有限数的人VL基因区段；例如，两个或更多个但少于野生型数的人VL基因区段)，其中所述第二核苷酸序列可操作地连接至包含一个或多个重链恒定区基因的人或非人轻链恒定区基因序列，所述一个或多个重链恒定区基因各自包含编码功能性CH1结构域的序列，例如包含至少完整的Igμ基因以及完整的Igδ基因、完整的Igγ基因、完整的Igε基因、和完整的Igα基因中的至少一种。在一些实施方案中，人重链恒定区基因还编码铰链、CH2、CH3、以及它们的组合。在一些实施方案中，小鼠重链恒定区基因还编码铰链、CH2、CH3、以及它们的组合。在一些实施方案中，用人基因序列进一步置换特定非人动物恒定区基因序列(例如，用人CH1序列置换小鼠CH1序列，并用人CL序列置换小鼠CL序列)导致具有嵌合(和杂交)免疫球蛋白基因座的经遗传修饰的非人动物，所述嵌合(和杂交)免疫球蛋白基因座形成具有人可变区和部分人恒定区的抗体，其适用于例如形成完全人抗体片段，例如完全人Fab。在一些实施方案中，未重排人轻链可变区基因区段可操作地连接至包含一个或多个重链恒定区基因的大鼠重链恒定区基因序列，所述一个或多个重链恒定区基因各自包含编码功能性CH1结构域的序列，例如包含至少完整的Igμ基因以及完整的Igδ基因、完整的Igγ基因、完整的Igε基因、和完整的Igα基因中的至少一种。在一些实施方案中，大鼠重链恒定区基因还编码CH2、CH3、以及它们的组合。在一些实施方案中，重排的人免疫球蛋白轻链可变区核苷酸序列(或有限数的人VL基因区段)与人Cκ区序列可操作地连接。在一些实施方案中，重排的人免疫球蛋白轻链可变区核苷酸序列(或有限数的人VL基因区段)与小鼠或大鼠Cκ区序列可操作地连接。在各种实施方案中，非人动物的经遗传修饰的免疫球蛋白轻链基因座包含可操作地连接至轻链恒定区基因序列的重排人免疫球蛋白轻链可变区核苷酸序列的两个拷贝、三个拷贝、四个拷贝或更多个拷贝。在特定实施方案中，免疫球蛋白轻链基因座包含可操作地连接至轻链恒定区基因序列的重排人免疫球蛋白轻链可变区核苷酸序列的多个拷贝。
在各种实施方案中，(人)IgG1、IgG2或IgG4重链恒定区基因(例如，在表达载体中在内源性基因座处克隆的)等包含基因的CH3编码序列中的一个或多个修饰，其中所述修饰减少或消除由经修饰的编码序列编码的CH3结构域对蛋白质A的亲和力(参见，例如，美国专利8,586,713，其全文以引用方式并入本文)。此类修饰包括但不限于选自下列的突变：IMGT编号系统中的(a)95R，和(b)95R和96F，或者EU编号系统中的(a')435R，和(b')435R和436F。在一些实施方案中，(人和)突变的重链恒定区为(人和)突变的IgG1恒定区，并且除了(a)95R或(b)95R和96F突变(在IMGT编号系统中)之外，还包含一至五个选自下列的修饰：IMGT外显子编号系统中的16E、18M、44S、52N、57M和82I，或EU编号系统中的356E、358M、384S、392N、397M和422I。在一些实施方案中，重链恒定基因为(人)IgG2恒定基因，并且除了(a)95R或(b)95R和96F突变(在IMGT编号系统中)之外，还包含选自下列的一个或两个修饰：IMGT外显子编号系统中的44S、52N、82I，或EU编号系统中的348S、392N和422I。在其它实施方案中，(人)重链恒定基因为(人)IgG4恒定基因，并且除了(a)95R或(b)95R和96F突变(在IMGT编号系统中)之外，还包含选自下列的一至七个修饰：IMGT外显子编号系统中的15R、44S、52N、57M、69K、79Q和82I，或EU编号系统中的355R、384S、392N、397M、409K、419Q和422I和/或IMGT外显子编号系统中的修饰105P或EU编号系统中的445P。
在各种实施方案中，重链恒定区核苷酸序列包含CH2或CH3中的修饰，其中所述修饰增加酸性环境中(例如在pH范围为约5.5至约6.0的核内体中)重链恒定区氨基酸序列对FcRn的亲和力。在一些实施方案中，重链恒定区核苷酸序列编码包括在以下位置处的修饰的人重链恒定区氨基酸序列：由EU编号的250(由Kabat编号的263)(例如，E或Q)；由EU编号的250(由Kabat编号的263)和由EU编号的428(由Kabat编号的459)(例如，L或F)；由EU编号的252(由Kabat编号的265)(例如，L/Y/F/W或T)、由EU编号的254(由Kabat编号的267)(例如，S或T)、和由EU编号的256(由Kabat编号的269)(例如，S/R/Q/E/D或T)；或在以下位置处的修饰：由EU编号的428(由Kabat编号的459)和/或由EU编号的433(由Kabat编号的464)(例如，L/R/S/P/Q或K)和/或由EU编号的434(由Kabat编号的465)(例如，H/F或Y)；或者在以下位置处的修饰：由EU编号的250(由Kabat编号的263)和/或由EU编号的428(由Kabat编号的459)；或在以下位置处的修饰：由EU编号的307(由Kabat编号的326)或由EU编号的308(由Kabat编号的327)(例如，308F、V308F)和由EU编号的434(由Kabat编号的465)。在一个实施方案中，修饰包括由EU编号的428L(例如，M428L)和434S(例如，N434S)修饰(459，例如，由Kabat编号的M459L、和465S(例如，N465S)修饰)；由EU编号的428L、259I(例如，V259I)和308F(例如，V308F)修饰(由Kabat编码的459L、272I(例如，V272I)和327F(例如，V327F)修饰；由EU编号的433K(例如，H433K)和434(例如，434Y)修饰(由Kabat编码的464K(例如，H464K)和465(例如，465Y)修饰；由EU编号的252、254和256(例如，252Y、254T和256E)修饰(由Kabat编号的265、267、269(例如，265Y、267T和269E)修饰；由EU编号的250Q和428L修饰(例如，T250Q和M428L)(由Kabat编码的263Q和459L修饰，例如，T263Q和M459L)；和由EU编号的307和/或308修饰(例如，307F或308P)(由Kabat修饰的326和/或327修饰，例如，326F或308P)，其中所述修饰增加酸性环境中(例如在其中pH范围为约5.5至约6.0的核内体中)重链恒定区氨基酸序列对FcRn的亲和力。在一些实施方案中，重链恒定区核苷酸序列编码人CH2氨基酸序列，所述氨基酸序列包含在由EU编号的位置252和257处的氨基酸残基之间的至少一个修饰(即，在由Kabat编号的氨基酸位置265和270之间的至少一个修饰)，其中所述修饰增加酸性环境中(例如在其中pH范围为约5.5至约6.0的核内体中)人CH2氨基酸序列对FcRn的亲和力。在一些实施方案中，重链恒定区核苷酸序列编码人CH2氨基酸序列，所述氨基酸序列包含在位置307和311处的氨基酸残基之间的至少一个修饰(即，在由Kabat编号的氨基酸位置326和330之间的至少一个修饰)，其中所述修饰增加酸性环境中(例如在其中pH范围为约5.5至约6.0的核内体中)CH2氨基酸序列对FcRn的亲和力。在一些实施方案中，重链恒定区核苷酸序列编码人CH3氨基酸序列，其中所述CH3氨基酸序列包含在由EU编号的位置433和436处的氨基酸残基之间的至少一个修饰(即，在由Kabat编号的位置464和467处的氨基酸残基之间的至少一个修饰)，其中所述修饰增加酸性环境中(例如在其中pH范围为约5.5至约6.0的核内体中)CH3氨基酸序列对FcRn的亲和力。在一些实施方案中，重链恒定区核苷酸序列编码包含选自下列的突变的人重链恒定区氨基酸序列：EU编号的M428L(由Kabat编号的459)、由EU编号的N434S(由Kabat编号的465)、以及它们的组合。在一些实施方案中，重链恒定区核苷酸序列编码包含选自下列的突变的人重链恒定区氨基酸序列：由EU编号的M428L(由Kabat编号的459)、由EU编号的V259I(由Kabat编号的V272I)、由EU编号的V308F(由Kabat编号的V327)、以及它们的组合。在一些实施方案中，重链恒定区核苷酸序列编码人重链恒定区氨基酸序列，所述氨基酸序列包含由EU编号的N434A突变(由Kabat编号的N465A突变)。在一些实施方案中，重链恒定区核苷酸序列编码包含选自下列的突变的人重链恒定区氨基酸序列：由EU编号的M252Y(由Kabat编号的M265Y)、由EU编号的S254T(由Kabat编号的S267T)、由EU编号的T256E(由Kabat编号的T269E)、以及它们的组合。在一些实施方案中，重链恒定区核苷酸序列编码包含选自下列的突变的人重链恒定区氨基酸序列：由EU编号的T250Q(由Kabat编号的T263Q)、由EU编号的M428L(由Kabat编号的M459L)、以及它们的组合。在一些实施方案中，重链恒定区核苷酸序列编码包含选自下列的突变的人重链恒定区氨基酸序列：由EU编号的H433K(由Kabat编号的H464K)、由EU编号的N434Y(由Kabat编号的N465Y)、以及它们的组合。
在各种实施方案中，如本文所述的非人动物用感兴趣的抗原免疫，并且鉴定表达特异性结合感兴趣的抗原的抗原结合蛋白的B细胞，并且鉴定并测定B细胞的核酸序列，所述核酸序列编码包含重链恒定区的多肽中的轻链可变结构域。在合适的细胞中并使用合适的表达载体，表达轻链可变结构域的核酸序列，其中重链恒定核酸序列包含一个、两个、三个或更多个修饰。在一些实施方案中，轻链可变区为人，并且重链序列为人。在一些实施方案中，重链恒定区核苷酸序列包含CH2或CH3中的修饰，其中所述修饰增加酸性环境中(例如在pH范围为约5.5至约6.0的核内体中)重链恒定区氨基酸序列对FcRn的亲和力。在一些实施方案中，重链恒定区核苷酸序列编码包括在以下位置处的修饰的人重链恒定区氨基酸序列：由EU编号的250(由Kabat编号的263)(例如，E或Q)；由EU编号的250(由Kabat编号的263)和由EU编号的428(由Kabat编号的459)(例如，L或F)；由EU编号的252(由Kabat编号的265)(例如，L/Y/F/W或T)、由EU编号的254(由Kabat编号的267)(例如，S或T)、和由EU编号的256(由Kabat编号的269)(例如，S/R/Q/E/D或T)；或在以下位置处的修饰：由EU编号的428(由Kabat编号的459)和/或由EU编号的433(由Kabat编号的464)(例如，L/R/S/P/Q或K)和/或由EU编号的434(由Kabat编号的465)(例如，H/F或Y)；或者在以下位置处的修饰：由EU编号的250(由Kabat编号的263)和/或由EU编号的428(由Kabat编号的459)；或在以下位置处的修饰：由EU编号的307(由Kabat编号的326)或由EU编号的308(由Kabat编号的327)(例如，308F、V308F)和由EU编号的434(由Kabat编号的465)。在一个实施方案中，修饰包括由EU编号的428L(例如，M428L)和434S(例如，N434S)修饰(459，例如，由Kabat编号的M459L、和465S(例如，N465S)修饰)；由EU编号的428L、259I(例如，V259I)和308F(例如，V308F)修饰(由Kabat编码的459L、272I(例如，V272I)和327F(例如，V327F)修饰；由EU编号的433K(例如，H433K)和434(例如，434Y)修饰(由Kabat编码的464K(例如，H464K)和465(例如，465Y)修饰；由EU编号的252、254和256(例如，252Y、254T和256E)修饰(由Kabat编号的265、267、269(例如，265Y、267T和269E)修饰；由EU编号的250Q和428L修饰(例如，T250Q和M428L)(由Kabat编码的263Q和459L修饰，例如，T263Q和M459L)；和由EU编号的307和/或308修饰(例如，307F或308P)(由Kabat修饰的326和/或327修饰，例如，326F或308P)，其中所述修饰增加酸性环境中(例如，在其中pH范围为约5.5至约6.0的核内体中)重链恒定区氨基酸序列对FcRn的亲和力。在一些实施方案中，重链恒定区核苷酸序列编码人CH2氨基酸序列，所述氨基酸序列包含在由EU编号的位置252和257处的氨基酸残基之间的至少一个修饰(即，在由Kabat编号的氨基酸位置265和270之间的至少一个修饰)，其中所述修饰增加酸性环境中(例如在其中pH范围为约5.5至约6.0的核内体中)人CH2氨基酸序列对FcRn的亲和力。在一些实施方案中，重链恒定区核苷酸序列编码人CH2氨基酸序列，所述氨基酸序列包含在位置307和311处的氨基酸残基之间的至少一个修饰(即，在由Kabat编号的氨基酸位置326和330之间的至少一个修饰)，其中所述修饰增加酸性环境中(例如在其中pH范围为约5.5至约6.0的核内体中)CH2氨基酸序列对FcRn的亲和力。在一些实施方案中，重链恒定区核苷酸序列编码人CH3氨基酸序列，其中所述CH3氨基酸序列包含在由EU编号的位置433和436处的氨基酸残基之间的至少一个修饰(即，在由Kabat编号的位置464和467处的氨基酸残基之间的至少一个修饰)，其中所述修饰增加酸性环境中(例如在其中pH范围为约5.5至约6.0的核内体中)CH3氨基酸序列对FcRn的亲和力。在一些实施方案中，重链恒定区核苷酸序列编码包含选自下列的突变的人重链恒定区氨基酸序列：EU编号的M428L(由Kabat编号的459)、由EU编号的N434S(由Kabat编号的465)、以及它们的组合。在一些实施方案中，重链恒定区核苷酸序列编码包含选自下列的突变的人重链恒定区氨基酸序列：由EU编号的M428L(由Kabat编号的459)、由EU编号的V259I(由Kabat编号的V272I)、由EU编号的V308F(由Kabat编号的V327)、以及它们的组合。在一些实施方案中，重链恒定区核苷酸序列编码人重链恒定区氨基酸序列，所述氨基酸序列包含由EU编号的N434A突变(由Kabat编号的N465A突变)。在一些实施方案中，重链恒定区核苷酸序列编码包含选自下列的突变的人重链恒定区氨基酸序列：由EU编号的M252Y(由Kabat编号的M265Y)、由EU编号的S254T(由Kabat编号的S267T)、由EU编号的T256E(由Kabat编号的T269E)、以及它们的组合。在一些实施方案中，重链恒定区核苷酸序列编码包含选自下列的突变的人重链恒定区氨基酸序列：由EU编号的T250Q(由Kabat编号的T263Q)、由EU编号的M428L(由Kabat编号的M459L)、以及它们的组合。在一些实施方案中，重链恒定区核苷酸序列编码包含选自下列的突变的人重链恒定区氨基酸序列：由EU编号的H433K(由Kabat编号的H464K)、由EU编号的N434Y(由Kabat编号的N465Y)、以及它们的组合。
在各种实施方案中，修饰Fc结构域(在非人动物中；或在表达体系中，所述表达体系在单个多肽中一起表达源于如本文所述的非人动物的重链的轻链可变结构域和重链恒定序列(例如人序列))以具有改变的Fc受体结合，其继而影响效应器功能。在一些实施方案中，包括Fc结构域的工程化重链恒定区(CH)是嵌合的。因此，嵌合CH区将源于多于一种免疫球蛋白同种型的CH结构域组合。例如，嵌合CH区包含源于人IgG1、人IgG2或人IgG4人分子的部分或全部的CH2结构域与源于人IgG1、人IgG2或人IgG4人分子的部分或全部CH3结构域的组合。在一些实施方案中，嵌合CH区包含嵌合铰链区。例如，嵌合铰链可包含源于人IgG1、人IgG2或人IgG4铰链区的“上铰链”氨基酸序列(根据EU编号，从位置216至227的氨基酸残基；根据Kabat编号，从位置226至240的氨基酸残基)，与源于人IgG1、人IgG2或人IgG4铰链区的“下铰链”序列(根据EU编号，从位置228至236的氨基酸残基；根据Kabat编号，从位置241至249的氨基酸位置)的组合。在一些实施方案中，嵌合的铰链区包含源于人IgG1或人IgG4上铰链的氨基酸残基和源于人IgG2下铰链的氨基酸残基。
在一些实施方案中，Fc结构域可被工程化以活化全部、一些正常Fc效应器功能或不活化正常Fc效应器功能，但不影响含Fc蛋白质的(例如抗体的)期望的药代动力学特性。对于包含嵌合的CH区并具有改变的效应器功能的蛋白质的示例，参见2014年1月31日提交的国际专利申请PCT/US2014/14175，其全文以引用方式并入本文。
在各个方面，将非人动物的基因组修饰(i)以删除或使其呈现非功能性(例如，经由在免疫球蛋白基因座中插入核苷酸序列(例如，外源核苷酸序列)，或经由全部或基本上全部的内源性功能性免疫球蛋白VH、D、JH基因区段的非功能性重排或倒置)；和(ii)包含未重排的人免疫球蛋白轻链可变区基因区段，其中基因区段存在于内源性基因座处(即，其中基因区段位于野生型非人动物中)。在一些实施方案中，未重排人免疫球蛋白轻链可变区基因区段整合在基因组中(例如，在不同于其基因组中的内源性免疫球蛋白重链基因座的基因座处，或在其内源性基因座内，例如，在免疫球蛋白可变基因座内，其中将内源性基因座设置或移动到基因组中的不同位置)。在一些实施方案中，例如，全部内源功能性重链V、D、或J基因区段中的约80％或更多、约85％或更多、约90％或更多、约95％或更多、约96％或更多、约97％或更多、约98％或更多、或约99％或更多被删除或使其呈现非功能性。在一些实施方案中，例如，内源性功能性V、D、或J基因区段中的至少95％、96％、97％、98％或99％被删除或呈现非功能性。在一些实施方案中，未重排人免疫球蛋白轻链可变区基因区段可操作地连接至人或非人重链恒定区基因序列。
在一些实施方案中，经遗传修饰的非人动物包含修饰，所述修饰删除或使内源功能性VH、D、和JH重链可变基因区段和内源功能性轻链可变VL和JL基因区段呈现非功能性；并且包含(i)重排的人免疫球蛋白轻链可变区核苷酸序列(或有限数的人VL基因区段，例如，两个或更多个但少于野生型数的人VL基因区段)，和(ii)核苷酸序列，其编码内源性免疫球蛋白基因座处(例如，包含一个或多个重链恒定区基因的内源性免疫球蛋白重链基因座，所述一个或多个重链恒定区基因各自包含编码功能性CH1结构域的序列，例如包含至少完整的Igμ基因以及完整的Igδ基因、完整的Igγ基因、完整的Igε基因、和完整的Igα基因中的至少一种)的未重排人免疫球蛋白轻链V基因区段(VL)和未重排人免疫球蛋白轻链J基因区段(JL)，或者在基因组中的任何位置处整合(例如，在不同于其基因组中的内源性免疫球蛋白基因座的基因座处，例如，在免疫球蛋白可变区基因座内，其中，将内源性基因座设置或移动到基因组中的不同位置)。在一些实施方案中，经遗传修饰的非人动物包含修饰，所述修饰删除或使内源性VH、D、和JH重链可变基因区段和内源功能性轻链可变VL和JL基因区段呈现非功能性；并且包含(i)重排的人免疫球蛋白轻链可变区核苷酸序列(或有限数的人VL基因区段，例如，两个或更多个但少于野生型数的人VL基因区段)，和(ii)在内源性位置(例如，内源性免疫球蛋白重链基因座)处的一个或多个未重排人免疫球蛋白轻链可变区基因区段(VL和JL)，或者在基因组中的任何位置处整合(例如，在不同于其基因组中的内源性免疫球蛋白链基因座的基因座处，例如，在免疫球蛋白可变区基因座内，其中，将内源性基因座设置或移动到基因组中的不同位置)。在一些实施方案中，例如，全部内源功能性重链V、D、或J基因区段中的约80％或更多、约85％或更多、约90％或更多、约95％或更多、约96％或更多、约97％或更多、约98％或更多、或约99％或更多被删除或使其呈现非功能性。在一些实施方案中，例如，内源性功能性V、D、或J基因区段中的至少95％、96％、97％、98％或99％被删除或呈现非功能性。在一些实施方案中，未重排的人免疫球蛋白轻链可变区基因区段可操作地连接至包含一个或多个重链恒定区基因的人或非人重链恒定区基因序列，所述一个或多个重链恒定区基因各自包含编码功能性CH1结构域的序列，例如，包含至少完整的Igμ基因以及完整的Igδ基因、完整的Igγ基因、完整的Igε基因和完整的Igα基因中的至少一种。在一些实施方案中，重排人免疫球蛋白轻链可变区核苷酸序列(或有限数的人VL基因区段，例如，两个或更多个但少于野生型数的人VL基因区段)可操作地连接至人或非人轻链恒定区基因序列，κ或λ。
各种实施方案包括源于由杂交免疫球蛋白基因座编码的免疫球蛋白杂交链的轻链可变结构域。编码轻链可变结构域的核酸序列可用于制备本文所述的经遗传修饰的非人，其可由此类动物表达，和/或可编码存在于由此类动物产生的(或源于多样化的序列的)抗体中的氨基酸。在一些实施方案中，轻链可变结构域为人Vκ结构域。在一些实施方案中，轻链可变结构域为小鼠Vκ结构域。在一些实施方案中，轻链可变结构域为大鼠Vκ结构域。在一些实施方案中，轻链可变结构域为人Vλ结构域。在一些实施方案中，轻链可变结构域为小鼠Vλ结构域。在一些实施方案中，轻链可变结构域为大鼠Vλ结构域。
在各种实施方案中，由本文所述的经遗传修饰的非人动物产生的轻链可变结构域由一个或多个小鼠或人免疫球蛋白κ轻链可变基因区段编码。在一些实施方案中，一个或多个小鼠免疫球蛋白κ轻链可变基因区段包括小鼠免疫球蛋白κ轻链基因座的约三兆碱基。在一些实施方案中，一个或多个小鼠免疫球蛋白κ轻链可变基因区段包含小鼠免疫球蛋白κ轻链基因座的至少137个Vκ基因区段、至少五个Jκ基因区段或它们的组合。在一些实施方案中，一个或多个人免疫球蛋白κ轻链可变基因区段包括人免疫球蛋白κ轻链基因座的约一兆半碱基。在具体实施方案中，一个或多个人免疫球蛋白κ轻链可变基因区段包括人免疫球蛋白κ轻链基因座的近端重复序列(相对于免疫球蛋白κ恒定区)。在一些实施方案中，一个或多个人免疫球蛋白κ轻链可变基因区段包含人免疫球蛋白κ轻链基因座的至少40个Vκ基因区段、至少五个Jκ基因区段或它们的组合。
在特定实施方案中，经基因修饰的非人动物还包括编码未重排的人免疫球蛋白轻链(VL)基因区段和未重排人免疫球蛋白轻链(JL)基因区段的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码未重排的轻链V基因区段和未重排的轻链J基因区段的核苷酸序列可操作地连接至免疫球蛋白重链恒定区基因序列。在一些实施方案中，未重排的人免疫球蛋白轻链V(VL)基因区段和未重排人免疫球蛋白J(JL)基因区段在内源性啮齿动物基因座处可操作地连接至啮齿动物免疫球蛋白重链恒定区基因；例如，IgM或IgG重链恒定区基因，它们中的每一个均编码功能性CH1结构域。
在各种实施方案中，未重排的人可变区基因区段(例如，人Vκ基因区段)能够重排并编码抗体的人可变结构域。在一些实施方案中，非人动物不包含内源性VL基因区段。在一些实施方案中，由非人动物表达的人Vκ基因区段选自：Vκ1-5、Vκ1-6、Vκ1-8、Vκ1-9、Vκ1-12、Vκ1-13、Vκ1-16、Vκ1-17、Vκ1-22、Vκ1-27、Vκ1-32、Vκ1-33、Vκ1-35、Vκ1-37、Vκ1-39、Vκ1D-8、Vκ1D-12、Vκ1D-13、Vκ1D-16、Vκ1D-17、Vκ1D-22、Vκ1D-27、Vκ1D-32、Vκ1D-33、Vκ1D-35、Vκ1D-37、Vκ1D-39、Vκ1D-42、Vκ1D-43、Vκ1-NL1、Vκ2-4、Vκ2-10、Vκ2-14、Vκ2-18、Vκ2-19、Vκ2-23、Vκ2-24、Vκ2-26、Vκ2-28、Vκ2-29、Vκ2-30、Vκ2-36、Vκ2-38、Vκ2-40、Vκ2D-10、Vκ2D-14、Vκ2D-18、Vκ2D-19、Vκ2D-23、Vκ2D-24、Vκ2D-26、Vκ2D-28、Vκ2D-29、Vκ2D-30、Vκ2D-36、Vκ2D-38、Vκ2D-40、Vκ3-7、Vκ3-11、Vκ3-15、Vκ3-20、Vκ3-25、Vκ3-31、Vκ3-34、Vκ3D-7、Vκ3D-7、Vκ3D-11、Vκ3D-15、Vκ3D-15、Vκ3D-20、Vκ3D-25、Vκ3D-31、Vκ3D-34、Vκ3-NL1、Vκ3-NL2、Vκ3-NL3、Vκ3-NL4、Vκ3-NL5、Vκ4-1、Vκ5-2、Vκ6-21、Vκ6D-21、Vκ6D-41、和Vκ7-3。在一些实施方案中，本文所述的经遗传修饰的非人动物表达全部功能性人Vκ基因。在一些实施方案中，人Vκ基因区段包括Vκ4-1、Vκ5-2、Vκ7-3、Vκ2-4、Vκ1-5和Vκ1-6。在一些实施方案中，Vκ基因区段包括Vκ3-7、Vκ1-8、Vκ1-9、Vκ2-10、Vκ3-11、Vκ1-12、Vκ1-13、Vκ2-14、Vκ3-15和Vκ1-16。在一些实施方案中，人Vκ基因区段包括Vκ1-17、Vκ2-18、Vκ2-19、Vκ3-20、Vκ6-21、Vκ1-22、Vκ1-23、Vκ2-24、Vκ3-25、Vκ2-26、Vκ1-27、Vκ2-28、Vκ2-29和Vκ2-30。在一些实施方案中，人Vκ基因区段包括Vκ3-31、Vκ1-32、Vκ1-33、Vκ3-34、Vκ1-35、Vκ2-36、Vκ1-37、Vκ2-38、Vκ1-39和Vκ2-40。在一些实施方案中，非人动物包含五个人Jκ基因区段，例如Jκ1、Jκ2、Jκ3、Jκ4和Jκ5基因区段。在具体实施方案中，Vκ基因区段包括从Vκ4-1至Vκ2-40跨越人免疫球蛋白κ轻链基因座的连续人免疫球蛋白κ基因区段，并且Jκ基因区段包括从Jκ1至Jκ5跨越人免疫球蛋白κ轻链基因座的连续基因区段。在一些实施方案中，非人动物的免疫球蛋白轻链基因座包含两个人VL基因区段，Vκ1-39和Vκ3-20。在一些实施方案中，一个或多个(例如，2、3、4、5或更多个)人VL基因区段和两个或更多个人JL基因区段存在于内源性重链基因座处。在一些实施方案中，经遗传修饰的非人动物为包含功能性λ轻链基因座的小鼠。在其它实施方案中，小鼠包括非功能性λ轻链基因座。
在一些实施方案中，如本文所述的经遗传修饰的非人动物(例如，小鼠或大鼠)表达重排人免疫球蛋白轻链可变区核苷酸序列(即，产生包含重排轻链可变结构域的抗原结合蛋白)和由选自下列的Vκ基因编码的一个或多个、两个或更多个、三个或更多个、四个或更多个、五个或更多个等轻链可变结构域：Vκ1-5、Vκ1-6、Vκ1-8、Vκ1-9、Vκ1-12、Vκ1-13、Vκ1-16、Vκ1-17、Vκ1-22、Vκ1-27、Vκ1-32、Vκ1-33、Vκ1-35、Vκ1-37、Vκ1-39、Vκ1D-8、Vκ1D-12、Vκ1D-13、Vκ1D-16、Vκ1D-17、Vκ1D-22、Vκ1D-27、Vκ1D-32、Vκ1D-33、Vκ1D-35、Vκ1D-37、Vκ1D-39、Vκ1D-42、Vκ1D-43、Vκ1-NL1、Vκ2-4、Vκ2-10、Vκ2-14、Vκ2-18、Vκ2-19、Vκ2-23、Vκ2-24、Vκ2-26、Vκ2-28、Vκ2-29、Vκ2-30、Vκ2-36、Vκ2-38、Vκ2-40、Vκ2D-10、Vκ2D-14、Vκ2D-18、Vκ2D-19、Vκ2D-23、Vκ2D-24、Vκ2D-26、Vκ2D-28、Vκ2D-29、Vκ2D-30、Vκ2D-36、Vκ2D-38、Vκ2D-40、Vκ3-7、Vκ3-11、Vκ3-15、Vκ3-20、Vκ3-25、Vκ3-31、Vκ3-34、Vκ3D-7、Vκ3D-7、Vκ3D-11、Vκ3D-15、Vκ3D-15、Vκ3D-20、Vκ3D-25、Vκ3D-31、Vκ3D-34、Vκ3-NL1、Vκ3-NL2、Vκ3-NL3、Vκ3-NL4、Vκ3-NL5、Vκ4-1、Vκ5-2、Vκ6-21、Vκ6D-21、Vκ6D-41、和Vκ7-3。
在各种实施方案中，重排人轻链可变区核苷酸序列编码不由相应的人种系轻链可变基因区段编码的一个或多个组氨酸密码子。在一些实施方案中，如本文所述的轻链可变结构域表现出与中性pH相比，在酸性pH下，解离半衰期(t1/2)减少至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约10倍、至少约15倍、至少约20倍、至少约25倍、或至少约30倍。在一些实施方案中，与中性pH相比，在酸性pH下，t1/2减少约30倍或更多。在一些实施方案中，重排人轻链可变区核苷酸序列(或有限数的人VL基因区段中的至少一个)包括用组氨酸密码子取代由相应人种系VL基因区段编码的至少一个非组氨酸密码子。在一些实施方案中，取代具有一个、两个、三个或四个密码子(例如，三个或四个密码子)。在一些实施方案中，取代处于一个或多个CDR3密码子中。在一些实施方案中，人VL基因区段为人Vκ1-39或人Vκ3-20基因区段，并且人Vκ1-39或人Vκ3-20基因区段包括用组氨酸密码子取代由相应人种系VL基因区段编码的至少一个组氨酸密码子。在一些实施方案中，人Vκ1-39或人Vκ3-20基因区段包括三个或四个组氨酸密码子的取代。在一些实施方案中，三个或四个取代处于CDR3区中。在一些实施方案中，取代具有人Vκ1-39基因区段的三个非组氨酸密码子，其中取代被设计成在位置106、108和111处表达组氨酸。在一些实施方案中，取代具有人Vκ1-39基因区段的四个非组氨酸密码子，并且所述取代被设计成在位置105、106、108和111处表达组氨酸(参见，例如，美国专利申请公布2013-0247234A1和WO 2013/138680，其以引用方式并入本文)。在一些实施方案中，取代具有人Vκ3-20基因区段的三个非组氨酸密码子，并且所述取代被设计成在位置105、106和109处表达组氨酸。在附加实施方案中，取代具有人Vκ3-20基因区段的四个非组氨酸密码子，并且所述取代被设计成在位置105、106、107和109处表达组氨酸。在一些实施方案中，免疫球蛋白轻链基因座包括重排的人轻链可变区核苷酸序列(或有限数的人VL基因区段，例如两个或更多个但少于野生型数的人VL基因区段)，其中所述核苷酸序列(或有限数的人VL基因区段中的至少一个)包括不由相应的人种系VL基因区段编码的至少一个组氨酸密码子。在各种实施方案中，在被感兴趣的抗原刺激时，包含如本文所述的经遗传修饰的免疫球蛋白基因座的非人动物表达抗原结合蛋白，所述抗原结合蛋白包含源于人VL基因区段的氨基酸序列，其中所述抗原结合蛋白在氨基酸位置处保留至少一个组氨酸残基，所述氨基酸位置由引入重排人轻链可变区核苷酸序列(或有限数的人VL基因区段中的至少一个)中的至少一个组氨酸密码子编码。在一些实施方案中，动物响应于抗原表达抗原结合蛋白群，其中群中的所有抗原结合蛋白包含(a)源于人VL基因区段和JL基因区段的重排的免疫球蛋白轻链可变结构域，和(b)包含由重排的人免疫球蛋白轻链可变区核苷酸序列编码的(或由有限数量的人VL基因区段中的一个编码的)人轻链可变结构域的免疫球蛋白轻链，其中重排人免疫球蛋白轻链可变区核苷酸序列(或有限数的人VL基因区段中的至少一个)编码一个或多个组氨酸密码子，所述组氨酸密码子不由相应的人种系VL基因区段编码。
各种实施方案包括轻链恒定区序列。在一些实施方案中，例如，编码人轻链可变结构域(即，其中第一核苷酸序列包含未重排人免疫球蛋白轻链可变区基因区段)的第一核苷酸序列可操作地连接至重链恒定区基因区段，并且编码人轻链可变结构域的第二核苷酸序列(即，其中所述第二核苷酸序列为重排人免疫球蛋白轻链可变核苷酸序列或其中第二序列包括有限数的人VL基因区段，例如，两个或更多个但少于野生型数的人VL基因区段)可操作地连接至轻链恒定区基因序列。在各种实施方案中，轻链恒定区序列可操作地连接至重排人免疫球蛋白轻链可变区核苷酸序列(或有限数的人VL基因区段)为人κ轻链恒定区序列。在一些实施方案中，轻链恒定区序列可操作地连接至重排轻链可变区核苷酸序列(有限数的人VL基因区段)为小鼠κ轻链恒定区序列。在一些实施方案中，轻链恒定区序列可操作地连接至重排轻链可变区核苷酸序列(有限数的人VL基因区段)为大鼠κ轻链恒定区序列。在一些实施方案中，轻链恒定区序列可操作地连接至重排轻链可变区核苷酸序列(有限数的人VL基因区段)为人λ轻链恒定区序列。在一些实施方案中，轻链恒定区序列可操作地连接至重排轻链可变区核苷酸序列(有限数的人VL基因区段)为小鼠λ轻链恒定区序列。在一些实施方案中，轻链恒定区序列可操作地连接至重排轻链可变区核苷酸序列(有限数的人VL基因区段)为大鼠λ轻链恒定区序列。
在各种方面，本发明提供了非人动物，其包含编码重排轻链可变结构域的经遗传修饰的免疫球蛋白基因座(例如，其中免疫球蛋白基因座包括重排的人免疫球蛋白轻链可变区核苷酸序列或受限(有限)数的人VL基因区段)，其中所述重排轻链可变结构域包括可操作地连接至轻链J区段(JL)序列的轻链可变(VL)序列。在一些实施方案中，重排人免疫球蛋白轻链可变区核苷酸序列(或有限数的人VL基因区段)可操作地连接至非人轻链恒定区基因序列。在一些实施方案中，非人轻链恒定区基因序列为小鼠或大鼠恒定区基因序列。在一些实施方案中，重排人免疫球蛋白轻链可变区核苷酸序列(或有限数的人VL基因区段)可操作地连接至人轻链恒定区基因序列。
在另一方面，本发明提供经遗传修饰的非人动物和用于制备所述动物的方法，其中所述动物包含功能性通用轻链(“ULC”)免疫球蛋白基因座(参见，例如，2011-0195454A1、US 2012-0021409A1、US 2012-0192300A1、US 2013-0045492A1、US 2013-0185821A1和US 2013-0302836A1，其以引用的方式全文并入本文)或功能性双轻链(“DLC”)免疫球蛋白基因座(参见，例如，美国专利申请公布US-2013-0198880-A1，以引用的方式全文并入本文)。在一些实施方案中，此类动物还包括可操作地连接至人或非人重链恒定区基因序列的未重排轻链可变区基因区段(即，人VL和JL基因区段可操作地连接至IgM、IgG等)。如本文所述的实施方案中所用的，ULC或DLC还可用于生成抗体可变链序列，所述抗体可变链序列的多样性主要得自体细胞突变的过程，从而阐明抗体可变链序列，所述抗体可变链序列的抗体结合能力得益于后基因组事件。
制备并使用包含高多样性的含未重排轻链可变区基因区段的杂交链基因座和低 多样性的含重排轻链可变区序列的轻链基因座的非人动物的方法
本发明提供制备和使用本文所述的经遗传修饰的非人动物的方法。本发明提供了用于非人动物的基因组中将重排人轻链可变区核酸序列(或有限数的人VL基因区段，例如两个或更多个但少于野生型数的人VL基因区段)设置成与免疫球蛋白轻链恒定区核酸可操作地连接的方法。在各种实施方案中，恒定区核酸序列为人或非人，并且非人动物为啮齿动物。在各种实施方案中，所述方法包括制成非人动物，所述非人动物还包含可操作地连接至人或非人重链恒定区核酸序列的杂交免疫球蛋白链基因座，例如包含一个或多个人轻链可变区基因区段(例如，40个人Vκ基因区段和五个人Jκ基因区段)的免疫球蛋白基因座。在各种方面，所述方法包括在非人动物(例如啮齿动物)的种系中设置前述序列，其使用例如转基因技术，包括例如使用修饰的多能或全能供体细胞(例如，ES细胞或iPS细胞)与宿主胚胎、生殖细胞(例如，卵母细胞)等等。因此，实施方案包括非人杂交免疫球蛋白链基因座，例如，非人生殖细胞的基因组中的免疫球蛋白链基因座，其包含可操作地连接至重链恒定区基因序列的未重排人免疫球蛋白轻链可变区基因区段，其中所述恒定区基因序列包括非人序列、人序列或它们的组合。在一些实施方案中，重排人免疫球蛋白轻链可变区核苷酸序列(或有限数的人VL基因区段)可操作地连接至内源性非人免疫球蛋白恒定区基因序列。在一些实施方案中，内源性非人免疫球蛋白恒定区基因序列为小鼠或大鼠轻链恒定区基因序列。
在各种方面，本发明提供制备非人动物的方法，所述非人动物包括经遗传修饰的免疫球蛋白基因座，其中所述方法包括：(a)修饰非人动物的基因组以删除或使内源性功能性免疫球蛋白重链V、D和J基因区段呈现非功能性；和(b)在基因组中设置未重排的人免疫球蛋白轻链可变区基因区段。在一个此类方面中，提供制备非人动物的方法，所述非人动物由非人动物的种系中的重排轻链基因序列表达单免疫球蛋白轻链(或由有限数的人VL基因区段，例如两个或更多个但少于野生型数的人VL基因区段表达免疫球蛋白轻链)，所述方法包括以下步骤：遗传修饰非人动物使得其整个抗体表达的成熟B细胞群表达源于下列的轻链：(i)单VL基因区段，和(ii)单JL基因区段，或(iii)有限数的人VL基因区段(例如，两个或更多个但少于野生型数的人VL基因区段)。在一些方面，所述方法包括如本文所述，用单重排的轻链基因(或有限数的人VL基因区段)失活或置换内源性轻链免疫球蛋白可变基因座。
在另一方面中，本发明提供制备非人动物的方法，所述非人动物包括经遗传修饰的免疫球蛋白重链基因座，此类方法包括：(a)修饰非人动物的基因组以删除或使内源性功能性免疫球蛋白重链V、D和J基因区段呈现非功能性；和(b)在基因组中设置未重排的人免疫球蛋白轻链可变区基因区段。在一些实施方案中，基本上全部的内源性功能性VH、D和JH基因区段均从非人动物的免疫球蛋白重链基因座中删除或呈现非功能性(例如，经由插入核苷酸序列(例如，免疫球蛋白基因座中的外源性核苷酸序列)或经由非功能性重排或将内源性VH、D、JH区段倒置)。在一些实施方案中，所述方法包括将未重排的人免疫球蛋白轻链可变区基因区段插入内源性位置(例如，内源性免疫球蛋白重链基因座)中。在一些实施方案中，未重排人免疫球蛋白轻链可变区基因区段存在于基因组中的任何位置处(例如，在不同于其基因组中的内源性免疫球蛋白重链基因座的基因座处，或在其内源性基因座内，例如，在免疫球蛋白可变基因座内，其中将内源性基因座设置或移动到基因组中的不同位置)。在一些实施方案中，例如，全部内源功能性V、D、或J基因区段中的约80％或更多、约85％或更多、约90％或更多、约95％或更多、约96％或更多、约97％或更多、约98％或更多、或约99％或更多被删除或呈现非功能性。在一些实施方案中，例如，内源性功能性V、D、或J基因区段中的至少95％、96％、97％、98％或99％被删除或呈现非功能性。
在另一方面中，本发明提供制备非人动物的方法，所述非人动物包括经遗传修饰的免疫球蛋白基因座，所述方法包括：(a)修饰非人动物的基因组以删除或使内源性功能性免疫球蛋白轻链V和J基因区段呈现非功能性；和(b)在内源性免疫球蛋白轻链基因座中设置重排人或非人免疫球蛋白轻链可变区核苷酸序列(即，编码重排轻链可变结构域的核苷酸序列)或有限数的人或非人VL基因区段(例如，两个或更多个但少于野生型数的人VL基因区段)，其中所述核苷酸序列(或有限数的人或非人VL基因区段)可操作地连接至轻链恒定区基因序列。在一些实施方案中，所述基因工程化免疫球蛋白基因座可存在于非人动物的种系基因组中。在一些实施方案中，重排人或非人免疫球蛋白轻链可变区核苷酸序列(或有限数的人或非人VL基因区段)可操作地连接至κ轻链恒定区基因序列。在一些实施方案中，重排人或非人免疫球蛋白轻链可变区核苷酸序列(或有限数的人或非人VL基因区段)可操作地连接至小鼠或大鼠κ轻链恒定区基因序列。在一些实施方案中，重排人或非人免疫球蛋白轻链可变区核苷酸序列(或有限数的人或非人VL基因区段)可操作地连接至人κ轻链恒定区基因序列。在一些实施方案中，重排人或非人免疫球蛋白轻链可变区核苷酸序列(或有限数的人或非人VL基因区段)可操作地连接至λ轻链恒定区基因序列。在一些实施方案中，重排人或非人免疫球蛋白轻链可变区核苷酸序列(或有限数的人或非人VL基因区段)可操作地连接至小鼠或大鼠λ轻链恒定区基因序列。在一些实施方案中，重排人或非人免疫球蛋白轻链可变区核苷酸序列(或有限数的人或非人VL基因区段)可操作地连接至人λ轻链恒定区基因序列。
在一些实施方案中，有限数的人或非人VL基因区段可操作地连接至一个或多个人或非人JL基因区段。
在另一方面中，本发明提供用于制备非人动物的方法，所述非人动物包含经遗传修饰的免疫球蛋白基因座，所述方法包括：(a)修饰非人动物的基因组以删除下列或使下列呈现非功能性：(i)内源性功能性免疫球蛋白重链V、D和J基因区段，和(ii)内源性功能性免疫球蛋白轻链V和J基因区段；以及(b)在基因组中设置：(i)第一核苷酸序列，其编码重排轻链可变结构域(例如，其中第一核苷酸序列为重排人免疫球蛋白轻链可变区核苷酸序列或其中第一核苷酸序列包含有限数的人VL基因区段，例如两个或更多个但少于野生型数的人VL基因区段)，其中所述第一核苷酸序列可操作地连接至轻链恒定区基因序列，和(ii)第二核苷酸序列，其编码人免疫球蛋白轻链可变结构域(即，其中第二核苷酸序列为未重排人免疫球蛋白轻链可变区核苷酸序列)，其中所述第二核苷酸序列可操作地连接至包含一个或多个重链恒定区基因的重链恒定区基因序列，所述一个或多个重链恒定区基因各自包含编码功能性CH1结构域的序列，例如，包含至少完整的Igμ基因以及完整的Igδ基因、完整的Igγ基因、完整的Igε基因、和完整的Igα基因中的至少一种。在一些实施方案中，所述基因工程化免疫球蛋白基因座可存在于非人动物的种系基因组中。在一些实施方案中，编码重排轻链可变结构域(或包含有限数的人VL基因区段)第一核苷酸序列可操作地连接至κ轻链恒定区基因序列。在一些实施方案中，编码重排轻链可变结构域(或包含有限数的人VL基因区段)第一核苷酸序列可操作地连接至小鼠或大鼠κ轻链恒定区基因序列。在一些实施方案中，编码重排轻链可变结构域(或包含有限数的人VL基因区段)的第一核苷酸序列可操作地连接至人κ轻链恒定区基因序列。在一些实施方案中，编码重排轻链可变结构域(或包含有限数的人VL基因区段)的第一核苷酸序列可操作地连接至λ轻链恒定区基因序列。在一些实施方案中，编码重排轻链可变结构域(或包含有限数的人VL基因区段)的第一核苷酸序列可操作地连接至小鼠或大鼠λ轻链恒定区基因序列。在一些实施方案中，编码重排轻链可变结构域(或包含有限数的人VL基因区段)的第一核苷酸序列可操作地连接至人λ轻链恒定区基因序列。在一些实施方案中，人免疫球蛋白轻链可变结构域为κ轻链可变结构域。因此，在一些实施方案中，第二核苷酸序列为人κ轻链可变区核苷酸序列。在一些实施方案中，人免疫球蛋白轻链可变结构域为λ轻链可变结构域。因此，在一些实施方案中，第二核苷酸序列为人λ轻链可变区核苷酸序列。在一些实施方案中，重链恒定区基因序列为非人免疫球蛋白重链恒定区基因序列。在一些实施方案中，非人免疫球蛋白重链恒定区基因序列为小鼠或大鼠重链恒定区基因序列。在一些实施方案中，非人免疫球蛋白重链恒定区基因序列包含完整的Igμ基因、完整的Igδ基因、完整的Igγ基因、完整的Igα基因、和/或完整的Igε基因。
本发明提供用于制备非人动物的方法，所述方法包括：(a)修饰非人动物的基因组以删除下列或使下列呈现非功能性：(i)内源性免疫球蛋白重链VH、D和/或JH基因区段，和(ii)内源性免疫球蛋白轻链V和J基因区段；以及(b)在轻链基因座处设置(i)重排轻链可变区核苷酸序列(或有限数的人VL基因区段，例如两个或更多个但少于野生型数的人VL基因区段)，其中所述重排轻链可变区核苷酸序列(或有限数的人VL基因区段)包含可操作地连接至轻链J基因区段(JL)序列的轻链V基因区段(VL)序列；和(ii)在重链基因座处设置一个或多个未重排人免疫球蛋白轻链可变区基因区段(例如，40个人Vκ基因区段和至少一个人Jκ基因区段)使得所述基因区段可操作地连接至包含一个或多个重链恒定区基因的人或非人重链恒定区核苷酸序列，所述一个或多个重链恒定区基因各自包含编码功能性CH1结构域的序列，例如，包含完整的Igμ基因、完整的Igδ基因、完整的Igγ基因、完整的Igε基因、和/或完整的Igα基因。在一些实施方案中，重排的轻链可变区核苷酸序列编码不由相应的人种系轻链可变基因区段编码的一个或多个组氨酸密码子。
在一些方面中，本发明提供制备非人动物的方法，所述非人动物包括经遗传修饰的免疫球蛋白基因座，所述方法包括：(a)修饰非人动物的基因组以删除或使内源性免疫球蛋白轻链V和J基因区段呈现非功能性；和(b)在非人动物的基因组中设置可操作地连接至轻链恒定区核苷酸序列的重排人或非人轻链可变区核苷酸序列(或有限数的人或非人VL基因区段)。
在各种实施方案中，非人动物为啮齿动物，诸如小鼠、大鼠或仓鼠。在一些实施方案中，啮齿动物为小鼠。在一些实施方案中，轻链恒定区为大鼠或小鼠恒定区，例如大鼠或小鼠Cκ恒定区。
在另一方面中，本发明提供用于制备非人动物的方法，所述非人动物包含经遗传修饰的免疫球蛋白基因座，所述方法包括：(a)修饰非人动物的基因组以删除下列或使下列呈现非功能性：(i)内源性免疫球蛋白重链V、D和/或J基因区段，和(ii)内源性免疫球蛋白轻链V和J基因区段；以及(b)在非人动物的基因组中设置：(i)第一核苷酸序列，其编码重排轻链可变结构域(例如，其中第一核苷酸序列为重排的人或非人免疫球蛋白轻链可变区核苷酸序列或其中第一核苷酸序列包含有限数的人VL基因区段；例如两个或更多个但少于野生型数的人VL基因区段)，其中所述第一核苷酸序列可操作地连接至轻链恒定区基因序列，和(ii)第二核苷酸序列，其编码人或非人轻链可变结构域(即，其中第二核苷酸序列为未重排人免疫球蛋白轻链可变区核苷酸序列)，其中所述第二核苷酸序列可操作地连接至重链恒定区基因序列。在一些实施方案中，重链恒定区基因序列包含完整的Igμ基因、完整的Igδ基因、完整的Igγ基因、完整的Igα基因、和/或完整的Igε基因。
在各种实施方案中，非人动物为啮齿动物，诸如小鼠、大鼠或仓鼠。在一些实施方案中，啮齿动物为小鼠。在一些实施方案中，轻链恒定区为大鼠或小鼠恒定区，例如大鼠或小鼠Cκ恒定区。在一些实施方案中，第二核苷酸序列可操作地连接至小鼠或大鼠重链恒定区基因序列，所述重链恒定区基因序列包含编码CH1、铰链、CH2、CH3、或它们的组合的核苷酸序列。在一些实施方案中，第二核苷酸序列可操作地连接至人重链恒定区基因序列，所述重链恒定区基因序列包含编码CH1、铰链、CH2、CH3、或它们的组合的核苷酸序列。
在另一方面，本发明提供用于制备非人动物的方法，所述非人动物包含经遗传修饰的免疫球蛋白基因座，所述方法包括：(a)修饰非人动物的基因组以删除下列或使下列呈现非功能性：(i)内源性免疫球蛋白重链V、D和/或J基因区段，和(ii)内源性免疫球蛋白轻链V和J基因区段；以及(b)在非人动物的基因组中设置：(i)第一等位基因，其包含第一核苷酸序列，所述第一核苷酸序列编码可操作地连接至轻链恒定区基因序列的重排轻链可变结构域(例如，其中第一核苷酸序列为重排的人免疫球蛋白轻链可变区核苷酸序列或其中第一核苷酸序列包含有限数的人VL基因区段；例如两个或更多个但少于野生型数的人VL基因区段)，和(ii)第二等位基因，其包含第二核苷酸序列，所述第二核苷酸序列编码可操作地连接至重链恒定区基因序列的轻链可变结构域(即，其中第二核苷酸序列为未重排人免疫球蛋白轻链可变区核苷酸序列)。
在另一方面，提供一种制备非人动物的方法，所述非人动物包括经遗传修饰的免疫球蛋白重链基因座(例如，杂交免疫球蛋白链基因座)和修饰的免疫球蛋白轻链基因座，所述方法包括：(a)修饰非人动物的基因组以删除或使内源性免疫球蛋白重链V、D和/或J基因区段呈现非功能性；(b)在非人动物的内源性重链基因座中设置与重链恒定区可操作连接的未重排人免疫球蛋白轻链可变区基因区段，其中所述未重排人免疫球蛋白轻链可变区基因区段包含人Vκ和人Jκ基因区段；(c)修饰非人动物的基因组以删除或使内源性免疫球蛋白轻链V和/或J基因区段呈现非功能性；并且(d)在非人动物的内源性轻链基因座中设置与轻链恒定区可操作连接的重排人免疫球蛋白轻链可变区核苷酸序列(或有限数的人VL基因区段，例如两个或更多个但少于野生型数的人VL基因区段)，其中重排人免疫球蛋白轻链可变区核苷酸序列(或有限数的人VL基因区段)包括重排人VκJκ序列(或2、3或4个人VL基因区段)。在一些实施方案中，重排的人VκJκ序列为人Vκ1-39Jκ5序列(例如，以SEQ ID NO:1示出)。在一些实施方案中，重排的人VκJκ序列为人Vκ3-20Jκ1序列(例如，以SEQ ID NO:2示出)。在一些实施方案中，有限数的人VL基因区段包括人Vκ1-39基因区段和人Vκ3-20基因区段。在一些实施方案中，重链恒定区基因序列包含完整的Igμ基因、完整的Igδ基因、完整的Igγ基因、完整的Igα基因、和/或完整的Igε基因。
在各种实施方案中，非人动物为啮齿动物，诸如小鼠、大鼠或仓鼠。在一些实施方案中，啮齿动物为小鼠。在一些实施方案中，轻链恒定区为大鼠或小鼠恒定区，例如大鼠或小鼠Cκ恒定区。在一些实施方案中，未重排人轻链可变区基因区段可操作地连接至小鼠或大鼠重链恒定区基因序列，所述重链恒定区基因序列包含编码CH1、铰链、CH2、CH3、或它们的组合的核苷酸序列。在一些实施方案中，未重排轻链可变区基因区段可操作地连接至人重链恒定区基因序列，所述重链恒定区基因序列包含编码CH1、铰链、CH2、CH3、或它们的组合的核苷酸序列。在一些实施方案中，未重排轻链可变区基因区段可操作地连接至人重链恒定区基因序列，所述重链恒定区基因序列包含编码CH1、铰链、CH2和CH3结构域中的每一个的核苷酸序列。
在另一方面中，本发明提供用于制备非人动物的方法，所述非人动物包含经遗传修饰的免疫球蛋白基因座，所述方法包括：(a)修饰非人动物的基因组以删除下列或使下列呈现非功能性：(i)内源性免疫球蛋白重链V、D和/或J基因区段，和(ii)内源性免疫球蛋白轻链V和J基因区段；以及(b)在非人动物的基因组中设置：(i)可操作地连接至轻链恒定区核苷酸序列的重排人免疫球蛋白轻链可变区核苷酸序列(或有限数的人VL基因区段，例如，两个或更多个但少于野生型数的人VL基因区段)；和(ii)可操作地连接至包含一个或多个重链恒定区基因的重链恒定区核酸序列的一个或多个人免疫球蛋白轻链可变VL和JL基因区段，所述一个或多个重链恒定区基因各自包含编码功能性CH1结构域的序列，例如包含完整的Igμ基因、完整的Igδ基因、完整的Igγ基因、完整的Igε基因、和/或完整的Igα基因。
在各种实施方案中，非人动物为啮齿动物，诸如小鼠、大鼠或仓鼠。在一些实施方案中，啮齿动物为小鼠。在一些实施方案中，轻链恒定区为大鼠或小鼠恒定区，例如大鼠或小鼠Cκ恒定区。
在另一个方面中，本发明提供了编码重排轻链可变结构域的核酸序列。在一些实施方案中，核酸序列源于人Vκ和Jκ基因区段。在一些实施方案中，核酸序列源于人种系Vκ区段和人种系Jκ区段。在一些实施方案中，人Vκ区段对应于人群中所观察到的变体。在给中实施方案中，核酸序列包含选自下列的人Vκ基因：Vκ1-5、Vκ1-6、Vκ1-8、Vκ1-9、Vκ1-12、Vκ1-13、Vκ1-16、Vκ1-17、Vκ1-22、Vκ1-27、Vκ1-32、Vκ1-33、Vκ1-35、Vκ1-37、Vκ1-39、Vκ1D-8、Vκ1D-12、Vκ1D-13、Vκ1D-16、Vκ1D-17、Vκ1D-22、Vκ1D-27、Vκ1D-32、Vκ1D-33、Vκ1D-35、Vκ1D-37、Vκ1D-39、Vκ1D-42、Vκ1D-43、Vκ1-NL1、Vκ2-4、Vκ2-10、Vκ2-14、Vκ2-18、Vκ2-19、Vκ2-23、Vκ2-24、Vκ2-26、Vκ2-28、Vκ2-29、Vκ2-30、Vκ2-36、Vκ2-38、Vκ2-40、Vκ2D-10、Vκ2D-14、Vκ2D-18、Vκ2D-19、Vκ2D-23、Vκ2D-24、Vκ2D-26、Vκ2D-28、Vκ2D-29、Vκ2D-30、Vκ2D-36、Vκ2D-38、Vκ2D-40、Vκ3-7、Vκ3-11、Vκ3-15、Vκ3-20、Vκ3-25、Vκ3-31、Vκ3-34、Vκ3D-7、Vκ3D-7、Vκ3D-11、Vκ3D-15、Vκ3D-15、Vκ3D-20、Vκ3D-25、Vκ3D-31、Vκ3D-34、Vκ3-NL1、Vκ3-NL2、Vκ3-NL3、Vκ3-NL4、Vκ3-NL5、Vκ4-1、Vκ5-2、Vκ6-21、Vκ6D-21、Vκ6D-41、和Vκ7-3、以及它们的多态变体。在一些实施方案中，核酸序列还包括选自编码CH1、铰链、CH2、CH3、或它们的组合的核苷酸序列的人或非人动物重链恒定区基因序列。在具体实施方案中，核酸包括恒定区基因序列，所述恒定区基因序列包括编码CH1、铰链、CH2、CH3、或它们的组合的核苷酸序列。在各种实施方案中，核酸序列包括人Jκ基因区段，其选自Jκ1、Jκ2、Jκ3、Jκ4、Jκ5、以及它们的组合。
在另一方面，提供核酸构建体，其包括如本文所述的未重排人免疫球蛋白轻链可变区核苷酸序列(例如，包含未重排人VL和JL基因区段的核苷酸序列)。在一些实施方案中，以如下方式设计核酸构建体，使得未重排人免疫球蛋白轻链可变区核苷酸序列可操作地连接至包含一个或多个重链恒定区基因的人或非人动物重链恒定区基因序列，所述一个或多个重链恒定区基因各自包含编码功能性CH1结构域的序列，例如，包含完整的Igμ基因、完整的Igδ基因、完整的Igγ基因、完整的Igε基因和/或完整的Igα基因。在一些实施方案中，核酸构建体包含可操作地连接至重链恒定区基因序列的两个、三个、四个、或更多个未重排人免疫球蛋白轻链可变区基因区段。在一些实施方案中，重链恒定区基因序列包含完整的Igμ基因、完整的Igδ基因、完整的Igγ基因、完整的Igα基因、和/或完整的Igε基因。在一些实施方案中，核酸构建体为靶向载体。在一些实施方案中，靶向载体包含Adam6a基因、Adam6b基因、或上述两者，以便抑制与Adam6a/6b基因的缺失相关联的生育问题(参见，例如，美国专利8,642,835，其以引用的方式全文并入本文)。在一些实施方案中，Adam6a和Adam6b基因置于未重排人轻链基因区段的转录单元的5’上游处。在一些实施方案中，靶向载体包括由重组位点侧接的选择盒。在一些实施方案中，靶向载体包括一个或多个位点特异性重组位点(例如，loxP或FRT位点)。
在另一方面，本发明提供获得能够独立于重链可变区氨基酸序列结合抗原的轻链可变区(VL/CHxULC)氨基酸序列的方法，所述方法包括：(a)用感兴趣的抗原对如本文所述的经遗传修饰的非人动物(例如，其基因组包括与重链恒定区基因可操作地连接的未重排人轻链可变区基因区段和与轻链恒定区基因可操作地连接的重排人或非人轻链可变区核苷酸序列(或有限数的人或非人VL基因区段)进行免疫，其中所述非人动物响应抗原产生免疫应答；和(b)获得轻链可变结构域的重排轻链(VJ)核酸序列，其特异性结合来自经遗传修饰的非人动物的细胞(例如，B细胞)的抗原。在各种实施方案中，提供了由此类方法产生的轻链可变区。
在一些方面，用于获得编码免疫球蛋白轻链可变区(VL/CHxULC)结构域的核酸序列的方法包括：(a)任选地用感兴趣的抗原或其免疫原将非人动物进行免疫，其中所述非人动物在其基因组中包含(i)可操作地连接至重链恒定区基因的未重排人轻链可变区基因区段，所述重链恒定区基因包含一个或多个重链恒定区基因，所述重链恒定区基因各自包含编码功能性CH1结构域的序列，例如包含完整的Igμ基因、完整的Igδ基因、完整的Igγ基因、完整的Igε基因、和/或完整的Igα基因，和(ii)可操作地连接至轻链恒定区基因的重排人或非人免疫球蛋白轻链可变区核苷酸序列(或有限数的人或非人VL基因区段)，(b)使得非人动物产生免疫应答，(c)从经免疫的非人动物中分离包含核酸序列的细胞，所述核酸序列编码结合感兴趣的抗原的轻链可变结构域，(d)由所述细胞获得编码结合感兴趣的抗原的轻链可变结构域(VL/CHxULC结构域)的核酸序列。在一些实施方案中，重链恒定区基因序列为小鼠或大鼠重链恒定区基因序列。在一些实施方案中，重链恒定区基因序列为人重链恒定区基因序列。在一些实施方案中，由经遗传修饰的基因座表达的重排轻链可变结构域对非人动物是非自身反应性的，即，非免疫原性的。在一些实施方案中，非人动物在其基因组中包括一个或多个(例如，6、16、30或40个)未重排人VL基因区段和一个或多个(例如，5个)人JL基因区段。在一些特定实施方案中，未重排人VL和JL基因区段为Vκ和Jκ基因区段。在一些实施方案中，分离步骤(c)经由荧光激活细胞分选术(FACS)或流式细胞术进行。在一些实施方案中，包含编码结合感兴趣的抗原的轻链可变结构域的核酸序列的细胞为淋巴细胞。在一些实施方案中，淋巴细胞包含天然杀伤细胞、T细胞或B细胞。在一些实施方案中，所述方法还包括(c)’将淋巴细胞与癌症细胞融合的步骤。在特定实施方案中，癌症细胞是骨髓瘤细胞。
因此，在各个方面，提供用于获得编码能够独立于重链可变结构域结合抗原的免疫球蛋白轻链可变结构域(VL/CHxULC)的核酸序列的方法，所述方法包括：(a)任选地利用感兴趣的抗原或其免疫原对非人动物进行免疫，其中所述非人动物在其基因组中包含(i)可操作地连接至轻链恒定区核酸序列的重排人或非人免疫球蛋白轻链可变区核苷酸序列(或有限数的人或非人VL基因区段)；和(ii)可操作地连接至重链恒定区核苷酸序列的未重排人免疫球蛋白轻链可变区基因区段(VL和JL)；(b)使非人动物产生免疫应答；(c)从经免疫的非人动物中分离包含核酸序列的细胞，所述核酸序列编码可结合抗原的轻链可变结构域；以及(d)由所述细胞获得编码可结合抗原的轻链可变结构域(VL/CHxULC结构域)的核酸序列。
在一些实施方案中，分离步骤(c)经由荧光激活细胞分选术(FACS)或流式细胞术进行。在一些实施方案中，包含编码结合抗原的轻链可变结构域的核酸序列的细胞为淋巴细胞。在特定实施方案中，淋巴细胞包含天然杀伤细胞、T细胞或B细胞。在一些实施方案中，所述方法还包括(c)’将淋巴细胞与癌症细胞融合的步骤。在特定实施方案中，癌症细胞是骨髓瘤细胞。在一些实施方案中，(d)的核酸序列与编码免疫球蛋白恒定区核酸序列的核酸序列融合。在一些实施方案中，轻链恒定区核酸序列为人κ序列或人λ序列。在一些实施方案中，轻链恒定区核酸序列为小鼠κ序列或小鼠λ序列。在一些实施方案中，轻链恒定区核酸序列为大鼠κ序列或大鼠λ序列。在一些实施方案中，重链恒定区核酸序列为包含一个或多个重链恒定区基因的人序列，所述一个或多个重链恒定区基因各自包含编码功能性CH1结构域的序列，例如，包含完整的Igμ基因、完整的Igδ基因、完整的Igγ基因、完整的Igε基因和/或完整的Igα基因。在一些实施方案中，重链恒定区核酸序列为包含一个或多个重链恒定区基因的小鼠或大鼠序列，所述一个或多个重链恒定区基因各自包含编码功能性CH1结构域的序列，例如，包含完整的Igμ基因、完整的Igδ基因、完整的Igγ基因、完整的Igε基因和/或完整的Igα基因。在一些实施方案中，(d)的核酸序列包含源于动物的基因组中的未重排VL基因区段的一个或多个组氨酸密码子取代或插入。
在一些方面，提供用于获得编码免疫球蛋白轻链可变结构域(VL/CHxULC)的核酸序列的方法，所述方法包括：(a)任选地用感兴趣的抗原对包含如本文所述的经遗传修饰的免疫球蛋白基因座的非人动物进行免疫，其中所述非人动物在其基因组中包含可操作地连接至轻链恒定区核酸序列的重排的人免疫球蛋白轻链可变区核酸序列(或有限数的人VL基因区段)，和可操作地连接至包含一个或多个重链恒定区基因的重链恒定区核酸序列的未重排人免疫球蛋白可变区基因区段，所述一个或多个重链恒定区基因各自包含编码功能性CH1结构域的序列，例如包含完整的Igμ基因、完整的Igδ基因、完整的Igγ基因、完整的Igε基因、和/或完整的Igα基因；(b)使非人动物产生免疫应答；(c)由经免疫的非人动物获得淋巴细胞(例如，B细胞)；(d)将淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合以形成杂交瘤细胞；和(e)由杂交瘤细胞获得核酸序列，所述核酸序列编码可结合抗原的轻链可变结构域(VL/CHxULC结构域)。
在另一方面，提供用于获得免疫球蛋白轻链可变区(VL/CHxULC)氨基酸序列的方法，所述方法包括：(a)任选地用感兴趣的抗原对包含如本文所述的经遗传修饰的免疫球蛋白基因座的非人动物进行免疫，其中所述非人动物在其基因组中包含(i)第一核苷酸序列，其编码重排轻链可变解结构域(即，其中第一核苷酸序列为重排人免疫球蛋白轻链可变区核苷酸序列或其中第一核苷酸序列包含有限数的人VL基因区段，例如两个或更多个或少于野生型数的人VL基因区段)，其中所述第一核苷酸序列可操作地连接至轻链恒定区基因序列；和(ii)第二核苷酸序列，其编码人或非人轻链可变结构域(即，其中第二核苷酸序列为未重排人免疫球蛋白轻链可变核苷酸序列)，其中所述第二核苷酸序列可操作地连接至包含一个或多个重链恒定区基因的重链恒定区核酸序列，所述一个或多个重链恒定区基因各自包含编码功能性CH1结构域的序列，例如包含完整的Igμ基因、完整的Igδ基因、完整的Igγ基因、完整的Igε基因、和/或完整的Igα基因；(b)使非人动物产生免疫应答；(c)由经免疫的非人动物获得淋巴细胞(例如，B细胞)；(d)将淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合以形成杂交瘤细胞；和(e)由杂交瘤细胞获得核酸序列，所述核酸序列编码可结合抗原的轻链可变结构域(VL结构域)。
在另一方面，提供用于获得免疫球蛋白杂交链的免疫球蛋白轻链可变区(VL/CHxULC)核酸序列的方法，所述方法包括：(a)任选地用感兴趣的抗原对包含如本文所述的经遗传修饰的免疫球蛋白基因座的非人动物进行免疫，其中所述非人动物在其基因组中包含(i)可操作地连接至轻链恒定区核酸序列的重排人免疫球蛋白轻链可变区核酸序列(或有限数的人VL基因区段，例如两个或更多个或少于野生型数的人VL基因区段)；和(ii)一个或多个(例如，6、16、30、40、或更多个)未重排人免疫球蛋白轻链可变区基因区段(VL和JL)；(b)使非人动物产生免疫应答；(c)鉴定来自表达独立于重链可变区结合抗原的VL/CHxULC氨基酸序列的经免疫非人动物鉴定淋巴细胞(例如，B细胞)；和(d)从(c)的淋巴细胞克隆编码(c)的VL/CHxULC氨基酸序列的核酸序列。
在另外的方面，本发明提供可由如本文所述的方法中的任一种获得的经遗传修饰的免疫球蛋白基因座。在各种实施方案中，本发明还提供由如本文所述的方法产生的轻链可变区和编码此类轻链可变区的核酸序列。
在一些方面，提供非人动物的种系基因组中的免疫球蛋白重链(例如，杂交免疫球蛋白基因座)和亲链基因座，所述轻链基因座包含(1)可操作地连接至轻链恒定区基因序列的重排人免疫球蛋白轻链可变区核苷酸序列(或有限数的人VL基因序列)，并且所述重量基因座(例如杂交免疫球蛋白链基因座)包含(2)可操作地连接至包含一个或多个重链恒定区基因的重链恒定区基因序列的未重排人免疫球蛋白轻链可变区核苷酸序列，所述一个或多个重链恒定区基因各自包含编码功能性CH1结构域的序列，例如包含完整的Igμ基因、完整的Igδ基因、完整的Igγ基因、完整的Igε基因、和/或完整的Igα基因。在一些实施方案中，轻链恒定区基因序列为κ轻链恒定区基因序列。在一些实施方案中，轻链恒定区基因序列为λ轻链恒定区基因序列。在一些实施方案中，轻链恒定区基因序列为小鼠或大鼠轻链恒定区基因序列。在一些实施方案中，重排轻链可变区核苷酸序列为κ轻链可变区基因序列。在一些实施方案中，重排轻链可变区核苷酸序列为λ轻链可变区基因序列。在一些实施方案中，重排轻链可变区核苷酸序列为小鼠或大鼠轻链可变区基因序列。在一些实施方案中，重链恒定区基因序列包含完整的Igμ基因、完整的Igδ基因、完整的Igγ基因、完整的Igα基因、和/或完整的Igε基因。
在各种实施方案中，有限数的人或非人VL基因区段包括两个人或非人JL基因区段。在一些实施方案中，两个人或非人VL基因区段可操作地连接至一个或多个、或五个人或非人JL基因区段。在一些特定实施方案中，有限数的人或非人VL基因区段包括两个Vκ基因区段。在一些特定实施方案中，两个Vκ基因区段可操作地连接至一个或多个、或五个Jκ基因区段。
抗原结合蛋白
另外的方面包括由本文所述的经遗传修饰的非人动物制得的抗原结合蛋白(例如，抗体)。同样，还提供了具有源于或由本文所述的经遗传修饰的非人动物制备(即，由未重排人免疫球蛋白轻链可变区基因区段表达的)的轻链可变区(VL/CHxULC)序列的抗原结合蛋白(例如，重组抗体)。在一些实施方案中，如本文所述的抗原结合蛋白包括可以低于10-6、10-7、10-8、10-9或10-10的亲和力(KD)特异性结合感兴趣的抗原的免疫球蛋白轻链。在一些实施方案中，由所述方法制得的免疫球蛋白轻链能够在不存在重链可变区的情况下以低于10-6、10-7、10-8、10-9或10-10的亲和力(KD)特异性结合感兴趣的抗原。
在各种实施方案中，如本文所述生成的轻链可变结构域特异性结合靶分子(“T”)。在一个实施方案中，靶分子为期望其活性或细胞外浓度衰减、减小或消除的任何蛋白质、多肽或其它大分子。在许多情况下，轻链可变区结合的靶分子为蛋白质或多肽(即，“靶蛋白”)；然而，还提供其中靶分子(“T”)为碳水化合物、糖蛋白、脂质、脂蛋白、脂多糖、或轻链可变区结合的其它非蛋白质聚合物或分子的实施方案。在各种实施方案中，T可以为细胞表面表达的靶蛋白或可溶性靶蛋白。由抗原结合分子进行的靶向结合可在细胞外或细胞表面环境中进行。然而，在特定实施方案中，抗原结合分子结合细胞内，例如细胞内组分(诸如内质网、高尔基体、核内体、溶酶体等)中的靶分子。细胞表面表达的靶分子的示例包括细胞表面表达的受体、膜结合配体、离子通道和具有附接到细胞膜或与细胞膜缔合的细胞外部分的任何其它单体或多聚体多肽组分。
在另一个方面，提供用于制备抗原结合蛋白的方法，所述抗原结合蛋白包括可独立于重链可变结构域结合抗原的免疫球蛋白轻链可变VL/CHxULC结构域。此类方法包括(a)任选地用包含表位或其免疫原性部分的抗原将经遗传修饰的非人动物进行免疫，其中所述非人动物在其基因组中包含：(i)可操作地连接至轻链恒定区核酸序列的重排人轻链可变区核酸序列(或有限数的人VL基因区段，例如两个或更多个但少于野生型数的人VL基因区段)；和(ii)可操作地连接至免疫球蛋白重链恒定区核酸序列的未重排人免疫球蛋白轻链可变区基因区段(VL和JL)；(b)使非人动物对表位或其免疫原性部分产生免疫应答；(c)从非人动物分离包含核酸序列的细胞，所述核酸序列编码特异性结合表位或其免疫原性部分的轻链可变结构域；和/或(d)由(c)的细胞获得核酸序列，所述核酸序列编码特异性结合表位或其免疫原性部分的轻链可变结构域；和(e)在表达构建体中使用(d)的核酸序列，所述表达构建体融合至人免疫球蛋白恒定区核酸序列，例如包含一个或多个重链恒定区基因的人重链恒定区核酸序列，所述一个或多个重链恒定区基因各自包含编码功能性CH1结构域的序列，例如包含完整的Igμ基因、完整的Igδ基因、完整的Igγ基因、完整的Igε基因、和/或完整的Igα基因。
在一些实施方案中，未重排人轻链VL或JL基因区段中的至少一个编码一个或多个组氨酸密码子，所述组氨酸密码子不由相应的人种系轻链可变基因区段编码。在一些实施方案中，重排人轻链可变区核苷酸序列(或有限数的人VL基因区段中的至少一个)编码一个或多个组氨酸密码子，所述组氨酸密码子不由相应的人种系轻链可变基因区段编码。在一些实施方案中，表位源于细胞表面受体。
在一些实施方案中，人轻链VL或JL基因区段中的至少一个编码一个或多个组氨酸密码子，所述组氨酸密码子不由相应的人种系轻链可变基因区段编码。
如整个说明书中将清楚的，在一些实施方案中，提供的蛋白质可变结构域是或包含免疫球蛋白型可变结构域(例如，是或包含免疫球蛋白可变结构域)。在一些实施方案中，提供的蛋白质可变结构域是或包含重链可变结构域；在一些实施方案中，提供的蛋白质可变结构域是或包含轻链可变结构域。
阅读本说明书，本领域技术人员将容易理解，可以利用各种技术中的任一种来产生、生成和/或组装抗原结合蛋白，所述抗原结合蛋白包含可独立于重链可变结构域结合抗原的轻链。在本文所述的一些实施方案中，产生的抗原结合蛋白包括图19所示的抗原结合蛋白。这些抗原结合蛋白包括在本文所述的非人动物中生成的可变结构域，并且包括编码这些可变结构域的序列的核酸序列在细胞系中共表达以产生抗原结合蛋白。
经遗传修饰的非人细胞和胚胎
在各个方面，提供源于包括本文的各种基因组修饰的非人动物的多能细胞、诱导的多能干细胞或全能干细胞。在一些实施方案中，多能细胞或全能细胞源于非人动物。在一些实施方案中，非人动物为啮齿动物，例如小鼠、大鼠或仓鼠。在一些实施方案中，啮齿动物为小鼠。在具体实施方案中，多能细胞为胚胎干(ES)细胞。在一些实施方案中，多能细胞在其基因组中包含：(i)免疫球蛋白轻链基因座，其包含可操作地连接至轻链恒定区核酸序列的重排人或非人轻链可变区核酸序列(或有限数的人或非人VL基因区段，例如，两个或更多个但少于野生型数的人或非人VL基因区段)；和(ii)免疫球蛋白重链基因座(例如，杂交免疫球蛋白链基因座)，其包含可操作地连接至包含一个或多个重链恒定区基因的重链恒定区核酸序列的一个或多个未重排人免疫球蛋白VL和JL基因区段，所述一个或多个重链恒定区基因各自包含编码功能性CH1结构域的序列，例如包含完整的Igμ基因、完整的Igδ基因、完整的Igγ基因、完整的Igε基因、和/或完整的Igα基因。在一些实施方案中，重链恒定区基因序列包含完整的Igμ基因、完整的Igδ基因、完整的Igγ基因、完整的Igα基因、和/或完整的Igε基因。在具体实施方案中，多能干细胞、诱导性多能干细胞或全能干细胞是小鼠或大鼠胚胎干(ES)细胞。在一些实施方案中，多能干细胞、诱导性多能干细胞或全能干细胞具有XX核型或XY核型。
本发明还提供包括包含如本文所述遗传修饰的核的细胞，例如通过原核注射引入细胞的修饰。在另一个方面，本发明提供源于如本文所述的非人动物的细胞的杂交瘤或四价体瘤。在一些实施方案中，非人动物为啮齿动物，诸如小鼠、大鼠或仓鼠。
在另一方面，本发明提供了从如本文所述的经遗传修饰的非人动物分离的淋巴细胞。在一些实施方案中，淋巴细胞是B细胞，其中B细胞包含免疫球蛋白基因座，其包含可操作地连接至人或非人动物(例如，小鼠或大鼠)轻链恒定区基因序列的重排的人或非人免疫球蛋白轻链可变区核苷酸序列(或有限数量的人或非人VL基因区段)。在一些实施方案中，B细胞还包含免疫球蛋白基因座，其包含可操作地连接至包含一个或多个重链恒定区基因的人或非人动物(例如，小鼠或大鼠)重链恒定区基因序列的重排人免疫球蛋白轻链可变区核苷酸序列，所述一个或多个重链恒定区基因各自包含编码功能性CH1结构域的序列，例如，包含完整的Igμ基因、完整的Igδ基因、完整的Igγ基因、完整的Igε基因和/或完整的Igα基因。在一些实施方案中，B细胞能够产生抗体，其中如本文所述的重排轻链可变结构域可操作地连接至重链或轻链恒定结构域。
在另一方面，非人动物胚胎包括细胞，所述细胞的基因组包含：(i)免疫球蛋白重链基因座(例如，杂交免疫球蛋白链基因座)，其包含可操作地连接至包含一个或多个重链恒定区基因的恒定区核酸序列的未重排人轻链可变区基因区段，所述一个或多个重链恒定区基因各自包含编码功能性CH1结构域的序列，例如包含完整的Igμ基因、完整的Igδ基因、完整的Igγ基因、完整的Igε基因、和/或完整的Igα基因；和(ii)免疫球蛋白轻链基因座，其包含可操作地连接至轻链恒定区核酸序列的重排人或非人免疫球蛋白轻链可变区核苷酸序列(或有限数的人或非人VL基因区段)。在一些实施方案中，包括可操作地连接至恒定区核酸序列的未重排人轻链可变区基因区段的杂交免疫球蛋白基因座可操作地连接至重链恒定区核酸序列，并且重链恒定区基因序列包含完整的Igμ基因、完整的Igδ基因、完整的Igγ基因、完整的Igα基因、和/或完整的Igε基因。
在各种实施方案中，经遗传修饰的非人动物表达抗体谱系(例如，IgG谱系)，所述抗体谱系源于编码重排轻链可变结构域的核苷酸序列(或包含有限数的人VL基因区段的核苷酸序列)和多个轻链V区段(和多个轻链J区段)。在一些实施方案中，经遗传修饰的基因座产生抗体群，所述抗体群包含能够以低于10-6、10-7、10-8、10-9或10-10的亲和力(KD)特异性结合感兴趣的抗原的免疫球蛋白轻链。在一些实施方案中，由经遗传修饰的基因座表达的免疫球蛋白轻链能够在不存在重链可变区的情况下以低于10-6、10-7、10-8、10-9或10-10的亲和力(KD)特异性结合感兴趣的抗原。
在各种实施方案中，本文所述的遗传修饰不影响非人动物的生育力(参见，例如，美国专利8,642,835，其全文以引用方式并入)。在一些实施方案中，重链基因座，例如杂交链基因座，包括内源性Adam6a基因、Adam6b基因、或上述两者，并且所述遗传修饰不影响内源性Adam6a基因、Adam6b基因或上述两者的表达和/或功能。在一些实施方案中，经遗传修饰的非人动物的基因组包含Adam6a基因、Adam6b基因或上述两者，其在重链基因座或杂交链基因座外侧的位置处整合到基因组中。在一些实施方案中，将Adam6a和/或Adam6b基因置于未重排的轻链可变区基因区段的5’上游。在一些实施方案中，将Adam6a和/或Adam6b基因置于未重排的轻链可变区基因区段的3’下游。在一些实施方案中，重链基因座包含功能性异位小鼠Adam6基因。
本文所述的经遗传修饰的非人动物对编码轻链可变区或结构域(例如，轻链CDR3)的基因或多核苷酸施加选择性压力的能力可适用于各种可变轻链基因序列。换句话讲，本文所公开的重排轻链可变区核苷酸序列可与重链基因座的一个或多个遗传修饰配对和/或将编码轻链可变结构域的核苷酸序列插入重链基因座中。这可通过例如将本文所述的非人动物(受限于共用或通用轻链可变结构域)与包括一个或多个编码重链的基因座内的遗传修饰的非人动物配对(即，动物与单修饰的交叉育种或互交)。包含具有重排轻链可变区核苷酸序列(或有限数量的人VL基因片段)的免疫球蛋白轻链基因座和一个或多个重链基因座修饰的经遗传修饰的非人动物也可以通过对多个基因座同时或顺序地进行靶向基因置换来产生(例如，通过胚胎干细胞中的顺序重组)。除非特别指出，重链基因座处的修饰的类型和方法均不限制本文所述的实施方案。相反，由本文所述的实施方案促进的选择性压力可适用于实际上任何能够表达并用作重链抗原结合序列的多核苷酸序列，由此驱动拟合抗体可变区的进化。
例如，如本文所述，包含具有重排轻链可变区核苷酸序列(或有限数的人VL基因区段)的免疫球蛋白基因座的经遗传修饰的非人动物还可包括(例如，经由交叉育种或多基因靶向策略)一个或多个修饰，如WO 2011/072204、WO 2011/163311、WO 2011/163314、WO2012/018764、WO 2012/141798、WO 2013/022782、WO 2013/059230、WO 2013/096142、WO2013/116609、WO 2013/187953中所述的；这些公布全文以引用方式并入本文。在特定实施方案中，在轻链基因座中包含重排轻链可变区核酸序列，或有限数的VL基因区段(例如，可操作地连接至人或非人κ轻链恒定区基因序列的重排轻链可变结构域基因序列，或两个VL基因区段)的经遗传修饰的小鼠与包含免疫球蛋白重链基因座(例如，杂交免疫球蛋白链基因座)的经遗传修饰的小鼠杂交，所述免疫球蛋白重链基因座包含人轻链可变区基因区段(例如，插入小鼠重链基因座中的40个人Vκ基因和全部人Jκ基因；参见，例如美国专利申请公布2012-0096572A1，其以引用方式并入本文)。在具体实施方案中，在轻链基因座中包含重排轻链可变区核酸序列，或有限数的VL基因区段(例如，可操作地连接至人或非人κ轻链恒定区基因序列的重排轻链可变区核苷酸序列，或两个VL基因区段)的经遗传修饰小鼠与包含免疫球蛋白重链基因座(例如，杂交免疫球蛋白链基因座)的经遗传修饰的小鼠杂交，所述免疫球蛋白重链基因座包含一个或多个人轻链可变区基因区段。所得的小鼠能够产生具有源于基因组轻链可变序列的可变重链的Igκ+B细胞，因此促进结合到特定靶标的Vκ结构域的鉴定。
实施例
给出以下非限制性实施例以便给本领域的普通技术人员提供如何制备并使用本文所述的非人动物的完整公开和描述并且辅助其理解，而并非旨在限制本发明人视作其发明的范围，也不旨在表示下文的实验是所进行过的所有或仅有的实验。所述实施例不包括可对本领域普通技术人员所熟知的常规方法(分子克隆技术等)的详细描述。已尽量确保所使用的数字(例如量、温度等)的准确性，但应考虑到一些实验误差和偏差。除非另外指明，否则份数是重量份数，分子量是重均分子量，温度以摄氏度计，并且压力是大气压或接近大气压。
实施例1：生成具有经修饰的免疫球蛋白基因座的非人动物
该实施例示出工程化非人动物的免疫球蛋白重链基因座以包含下列物质的示例性方法：(a)免疫球蛋白重链基因座，所述免疫球蛋白重链基因座包含可操作地连接至免疫球蛋白重链恒定区核酸序列(例如，杂交免疫球蛋白链基因座)的未重排人免疫球蛋白轻链可变VL和JL基因区段；和(b)免疫球蛋白轻链基因座，所述免疫球蛋白轻链基因座包含可操作地连接至免疫球蛋白轻链恒定区核酸序列的重排人免疫球蛋白轻链可变区核苷酸序列。
构建具有轻链基因区段的免疫球蛋白重链基因座
野生型小鼠重链和人κ轻链基因座描述于图1中。用于将人轻链V和J基因区段(例如，Vκ和Jκ)插入鼠免疫球蛋白重链基因座中的示例性靶向载体的构建描述于下文。图2示出四种示例性靶向载体，所述靶向载体包含用于使用同源重组插入鼠免疫球蛋白重链基因座中的多个人κ轻链基因区段。
使用基因工程化技术修饰小鼠基因组细菌人造染色体(BAC)库来制备各种靶向构建体(参见，例如，美国专利6,586,251和Valenzuela,D.M.,Murphy,A.J.,Frendewey,D.,Gale,N.W.,Economides,A.N.,Auerbach,W.,Poueymirou,W.T.,Adams,N.C.,Rojas,J.,Yasenchak,J.,Chernomorsky,R.,Boucher,M.,Elsasser,A.L.,Esau,L.,Zheng,J.,Griffiths,J.A.,Wang,X.,Su,H.,Xue,Y.,Dominguez,M.G.,Noguera,I.,Torres,R.,Macdonald,L.E.,Stewart,A.F.,DeChiara,T.M.,Yancopoulos,G.D.(2003).High-throughput engineering of the mouse genome coupled with high-resolution expression analysis.Nat Biotechnol 21,652-659)。可通过同源重组来修饰小鼠BAC DNA以删除内源性VH、DH和JH基因区段，用于未重排的人VL和JL基因区段的后续插入。另选地，内源性VH、DH和JH基因区段可保留完整并且失活，以便抑制形成功能性可变区的内源性基因区段重组(例如，通过基因区段的倒置或破裂)。
经遗传修饰的小鼠，和制备所述经遗传修饰的小鼠的方法描述于美国专利申请公布2012-0096572 A1中，其全文以引用方式并入本文，所述经遗传修饰的小鼠的基因组包含免疫球蛋白杂交链基因座，所述免疫球蛋白杂交链基因座包含可操作地连接至免疫球蛋白重链恒定区核酸序列的未重排人免疫球蛋白轻链VL和JL基因区段。如图2所示，例如在内源性非人轻链基因座处，使用本领域公知的标准分子技术，将四个靶向载体工程化以将40个人Vκ基因区段和五个人Jκ基因区段逐渐插入非人ES细胞中，所述非人ES细胞包含失活的重链基因座(例如，缺失内源性VH、DH和JH基因内区段)和/或轻链基因座，所述轻链基因座包含可操作地连接至轻链恒定区(例如非人轻链恒定区)的单重排人VL/JL基因序列。表1示出包含在每个靶向载体中的人DNA的尺寸，所述靶向载体包含用于插入小鼠免疫球蛋白重链基因座中的各种人κ轻链基因区段。靶向载体中包括任何数的人Vκ和Jκ基因区段。图2中示出的示例性靶向载体包括天然存在于种系人κ轻链基因座的近端重叠群中的人κ轻链基因区段(图1)。在连续插入所有四个靶向载体之后所得的内源性重链基因座示于图2下部中。
表1
使用类似的方案，可构建鼠重链恒定区环境中的人轻链可变结构域的其它组合。附加的轻链可变结构域可源于人Vλ和Jλ基因区段。包括人DNA的示例性靶向载体示于图3中，所述人DNA包括各种数的人Vλ和Jλ基因区段。
人λ轻链基因座延伸超过1,000kb并且包含编码可变(V)或接合(J)区段的超过80个基因。在人λ轻链基因座的70Vλ基因区段中，根据公布的报道，30-38中的任何位置看起来均是功能化基因区段。在三个簇中布置70Vλ序列，其全部均包含不同V基因家族的不同成员(簇A、B和C)。在人λ轻链基因座内，所有观察到的Vλ结构域中超过一半均由基因区段1-40、1-44、2-8、2-14和3-21编码。存在七个Jλ基因区段，其中仅四个被认为是一般工功能化Jλ基因区段δJλ1、Jλ2、Jλ3和Jλ7。在一些等位基因中，第五个Jλ-Cλ基因区段对据报是伪基因(Cλ6)。如本文所述，将多个人Jλ基因区段结合到杂交重链基因座中可通过从头合成来构建。以这种方式，胚系构型中含有多个人Jλ基因区段的基因组片段由多个人Vλ基因区段工程化，并允许在重链恒定区的环境中进行正常的V-J重组。包括多个Jλ基因区段的示例性靶向载体示于图3中(靶向载体1')。
将轻链可变结构域与重链恒定区偶联表示用于在非人动物中生成具有人VL区的独特VL结合蛋白的潜在丰富的多样性源。在小鼠中利用人λ轻链基因座(或如上所述的人κ基因座)的这种多样性导致独特的杂交重链的工程化，并且对经遗传修饰的动物的免疫谱及其作为用于产生治疗物的下一代平台的后续用途产生结合蛋白的另一维度。
使用上述靶向载体将小鼠胚胎干细胞(ES)细胞电穿孔以产生经修饰的ES细胞，以用于产生表达VL结合蛋白(即可操作地连接至小鼠重链恒定区的人轻链基因区段)的嵌合小鼠。包含未重排人轻链基因区段的插入的ES细胞由定量PCR测定法，(Lie和Petropoulos，1998.Curr.Opin.Biotechnology 9:43-48)来鉴定。针对人序列和相关的选择盒的插入，小鼠重链序列的损失，和侧接内源性重链基因座的小鼠序列的保留设计特定引物组和探针。
包含可操作地连接至重链恒定区序列的人轻链基因区段(例如，Vκ和Jκ)的ES细胞可用表达重组酶的构建体转染，以便移除通过插入人轻链基因区段引入的任何不可取的选择盒。任选地，选择盒可通过育种到表达重组酶的小鼠来移除(例如，US 6,774,279)。任选地，选择盒保留在小鼠体内。
上述所靶向的ES细胞用作供体ES细胞，并通过方法被引入8细胞期小鼠胚胎(参见例如，美国专利7,294,754和Poueymirou,W.T.,Auerbach,W.,Frendewey,D.,Hickey,J.F.,Escaravage,J.M.,Esau,L.,Dore,A.T.,Stevens,S.,Adams,N.C.,Dominguez,M.G.,Gale,N.W.,Yancopoulos,G.D.,DeChiara,T.M.,Valenzuela,D.M.(2007).F0generation mice fully derived from gene-targeted embryonic stemcells allowing immediate phenotypic analyses.Nat Biotechnol 25,91-99)。独立地包含小鼠免疫球蛋白重链基因座处的人轻链基因区段的(完全源于供体ES细胞的F0小鼠)使用等位基因测定的修改通过基因分型(Valenzuela等人，同上)来鉴定，所述等位基因测定检测内源性免疫球蛋白重链基因座处独特的人轻链基因区段的存在。对小狗进行基因分型，并选择对经遗传修饰的免疫球蛋白重链基因座是杂合或纯合的小狗来表征含VL重链的表达。
其基因组包含免疫球蛋白重链等位基因的小鼠被称为MAID1713，所述免疫球蛋白重链等位基因包含四十(40)个未重排的人Vκ和五(5)个Jκ基因区段到内源性基因座中的插入，使得所述人Vκ和Jκ基因区段可操作地连接至内源性重链恒定区(参见美国专利申请公布2012-0096572A1，全文以引用方式并入本文)。具有所述免疫球蛋白重链等位基因和另外整合的小鼠Adam6基因的小鼠被称为MAID1994(参见，美国专利申请公布2013-0212719A1，其全文以引用方式并入本文)。
构建具有重排人轻链核苷酸序列的免疫球蛋白轻链基因座
下文描述示例性靶向载体的构建，所述靶向载体用于将单重排的人轻链核苷酸序列(例如，单个人重排的VL/JL核苷酸序列)插入到鼠免疫球蛋白轻链基因座中。图4示出靶向载体，所述靶向载体包含用于使用同源重组插入鼠免疫球蛋白轻链基因座中的单重排人轻链核苷酸序列。
经遗传修饰的小鼠，和制备所述经遗传修饰的小鼠的方法描述于美国专利申请公布US 2011-0195454A1中，其全文以引用方式并入本文，所述经遗传修饰的小鼠的基因组包含免疫球蛋白轻链基因座，所述免疫球蛋白轻链基因座包含可操作地连接至免疫球蛋白轻链恒定区核酸序列的重排人免疫球蛋白轻链可变区核苷酸序列。如图4所示，使用本领域公认的标准分子技术，将靶向载体工程化以包含用于插入ES细胞中的单重排人轻链(即，重排人VL/JL)核苷酸序列，所述ES细胞包含失活的人κ轻链基因座(例如，缺失内源性Vκ和Jκ基因区段)和任选地杂交免疫球蛋白基因座。单重排人轻链核苷酸序列可包括任何人VL和人JL序列。可使用的合适的示例性重排人轻链核苷酸序列包括源于重排的人Vκ1-39Jκ5核苷酸序列(MAID1633，图5)、重排的人Vκ3-20Jκ1核苷酸序列(MAID1635，图5)的那些。
另选地，如上所述，在一些实施方案中，小鼠还可被工程化以包括将人Vλ和Jλ基因区段插入内源性免疫球蛋白重链基因座中，使得所述人Vλ和Jλ基因区段可操作地连接至重链恒定区。在此类实施方案中，为实现插入的人Vλ和Jλ基因区段的最佳表达和使用，本领域技术人员知道可使用重排的序列诸如重排人VλJλ核苷酸序列。此类重排人VλJλ核苷酸序列可提供重链恒定区环境中的重排人VλJλ序列与轻链恒定区环境中的重排人VλJλ序列配对的更好的能力。重链恒定区环境中的重排人VκJκ序列可不能与轻链恒定区环境中的重排VλJλ序列有效缔合(参见US 2012-0096572 A1)。因此，示例性重排的人VλJλ序列包括重排的人Vλ2-14Jλ1核苷酸序列。
上述靶向载体用于将可任选地包含杂交免疫球蛋白基因座的小鼠胚胎干(ES)细胞电穿孔，以形成用于生成嵌合小鼠的经修饰的ES细胞，所述嵌合小鼠表达由单重排人轻链核苷酸序列编码的轻链(即，可操作地连接至小鼠轻链恒定区的单人VL/JL核苷酸序列)。包含单重排人轻链核苷酸序列的插入的ES细胞由定量PCR测定法，(Lie和Petropoulos，1998.Curr.Opin.Biotechnology 9:43-48)来鉴定。设计成针对单重排人轻链核苷酸序列和相关选择盒的插入，小鼠轻链序列的损失，和侧接内源性轻链基因座的小鼠序列的保留设计特定引物组和探针。
包含单重排人轻链核苷酸序列的ES细胞可用表达重组酶的构建体转染，以便移除由插入单重排人轻链核苷酸序列引入的任何不可取的选择盒。任选地，选择盒可通过育种到表达重组酶的小鼠来移除(例如，US 6,774,279)。任选地，选择盒保留在小鼠体内。
上述所靶向的ES细胞用作供体ES细胞，并通过方法被引入8细胞期小鼠胚胎(参见例如，美国专利7,294,754和Poueymirou,W.T.,Auerbach,W.,Frendewey,D.,Hickey,J.F.,Escaravage,J.M.,Esau,L.,Dore,A.T.,Stevens,S.,Adams,N.C.,Dominguez,M.G.,Gale,N.W.,Yancopoulos,G.D.,DeChiara,T.M.,Valenzuela,D.M.(2007).F0generation mice fully derived from gene-targeted embryonic stemcells allowing immediate phenotypic analyses.Nat Biotechnol 25,91-99)。独立地包含小鼠免疫球蛋白轻链基因座处的单重排人轻链核苷酸序列的(完全源于供体ES细胞的F0小鼠)使用等位基因测定的修改通过基因分型(Valenzuela等人，同上)来鉴定，所述等位基因测定检测内源性免疫球蛋白轻链基因座处的独特的重排人轻链核苷酸序列的存在。对小狗进行基因分型，并选择对经遗传修饰的免疫球蛋白轻链基因座是杂合或纯合的小狗来表征单个人轻链的表达。
实施例2：包含单重排人免疫球蛋白轻链核苷酸序列和多个人κ轻链基因区段的小 鼠的表征
如上所述产生包含轻链基因座处的重排轻链可变区核酸序列的小鼠(ULC小鼠：MAID1633，单重排人Vκ1-39/Jκ5或MAID1635，单重排人Vκ3-20Jκ1)。简而言之，在ULC小鼠中，删除所有内源性功能轻链可变基因区段，并用单重排轻链可变区核酸序列(例如，编码人Vκ1-39/Jκ5或人Vκ3-20Jκ1的序列)替换，所述单重排轻链可变区核酸序列可操作地连接至内源性轻链恒定区核酸序列。
如上所述产生包含含有重链基因座中的未重排人免疫球蛋白轻链VL和JL基因区段的经遗传工程化的重链基因座的小鼠(KOH小鼠：MAID1713：40个人Vκ基因区段，和五个人Jκ基因区段；MAID1994：40个人Vκ基因区段，和五个人Jκ基因区段；和整合的Adam6基因)。简而言之，在KOH小鼠中，删除所有内源性功能重链可变基因区段，并用40个未重排人Vκ基因区段和五(5)个未重排人Jκ基因区段取代，所述基因区段可操作地连接至免疫球蛋白重链恒定区核酸序列。
将如上所述的纯合ULC小鼠(MAID1633或MAID 1635)培育成纯合的KOH小鼠(MAID1713或MAID 1994)小鼠，以产生对ULC等位基因和KOH等位基因杂合的小鼠。将由该杂交产生的F1杂合小鼠彼此育种以获得对每个等位基因纯合的小鼠(MAID1713HO 1633HO、MAID1713HO 1635HO、MAID1994HO 1633HO或MAID1994HO 1635HO；“KOH×ULC”)。此类小鼠表达具有类似于免疫球蛋白的结构的VL结合蛋白，但是不同之处在于此类结合蛋白缺乏重链可变结构域。通过使用上述特定探针和引物的TAQMANTM筛选和核型分析证实了免疫球蛋白重链和轻链基因座中存在经遗传修饰的等位基因。纯合的KOH×ULC小鼠包括将如本文所述的未重排人轻链基因区段(例如人Vκ和Jκ)插入其中已经删除所有内源性可变重链VDJ基因区段的小鼠重链基因座中，和将单重排人轻链可变区核苷酸序列(MAID1633：重排人Vκ1-39Jκ5；MAID1635：重排人Vκ3-20Jκ1)插入其中已经删除所有小鼠Vκ和Jκ基因的小鼠κ(κ)轻链基因座中(图6)。在一些实施方案中，KOH×ULC小鼠还包括整合的Adam6基因。
另选地，为生成包含ULC等位基因和KOH等位基因两者的小鼠，分别用KOH或ULC靶向载体靶向包含ULC修饰的ES细胞或包含KOH修饰的ES细胞。通过方法将ES细胞引入8期小鼠胚胎中并如上文实施例3中所述进行筛选，由包含两个修饰的ES细胞产生小鼠。繁殖F1杂合小鼠以获得纯合小鼠。
所有小鼠在特定无病原体条件下被关在并在Regeneron Pharmaceuticals，Inc培育。将三只KOH(MAID1994HO 1242HO；参见美国专利申请公布US 2013-0212719 A1，以引用方式并入本文)小鼠(～11周龄，雄性)和两组三只KOH×ULC(MAID1994HO 1633HO，～12周龄，雌性；MAID1994HO 1635HO，～11周龄，2只雄性和1只雌性)小鼠处死，并从动物获得脾和骨髓。通过用完全RPMI培养基(补充有胎牛血清、丙酮酸钠、Hepes、2-巯基乙醇、非必需氨基酸和庆大霉素的RPMI培养基)冲洗从股骨收集骨髓。用ACK裂解缓冲液裂解来自脾和骨髓制剂的红细胞，并用完全RPMI培养基洗涤。
流式细胞术
为了检测本文所述的经遗传修饰的纯合“KOH×ULC”(MAID1994HO 1633HO和MAID1994HO 1635HO)小鼠产生源于经遗传修饰的等位基因(例如，源于包含轻链基因座中的重排人轻链核苷酸序列的单个拷贝的等位基因和包含重链基因座中的未重排人Vκ和Jκ基因区段的等位基因)的VL结合蛋白的能力，进行荧光激活细胞分选术(FACS)分析。将包含含有未重排人VL和JL基因区段(1994 HO 1242 HO)的未重排轻链基因座的KOH小鼠，以及包含小鼠重链和轻链基因座上的未重排人重链和轻链基因区段的小鼠分别(VI3)用作对照。
简而言之，在冰上将1×106个细胞与抗小鼠CD16/CD32(克隆2.4G2，BDPharmigen)培育10分钟，然后在冰上用以下抗体混合物标记30分钟：APC-H7偶联的抗小鼠CD19(克隆1D3，BD Pharmigen)，Pacific Blue偶联的抗小鼠CD3(克隆17A2，BioLegend)，FITC偶联的抗小鼠Igκ(克隆187.1，BD Pharmigen)或抗小鼠CD43 1B11，BioLegend)、PE偶联的抗小鼠Igλ(克隆RML-42，BioLegend)或抗小鼠c-kit(克隆2B8，BioLegend)、PerCP-Cy5.5偶联的抗小鼠IgD(BioLegend)、PE-Cy7偶联的抗小鼠IgM(克隆II/41，eBioscience)、APC偶联的抗小鼠B220(克隆RA3-6B2，eBioscience)。染色之后，洗涤细胞并固定在2％甲醛中。数据采集在LSRII流式细胞仪上进行，并用FlowJo(Tree Star，Inc.)进行分析。门控：总B细胞(CD19+CD3-)、Igκ+B细胞(Igκ+Igλ-CD19+CD3-)、Igλ+B细胞(Igκ-Igλ+CD19+CD3-)。骨髓腔的结果示于图7-10中。脾腔的结果示于图11-15中。
仅成熟的B淋巴细胞可进入脾和淋巴结的淋巴滤泡，从而有效参与免疫应答。成熟的、长寿命的B淋巴细胞源于骨髓中生成的短寿命前体。在成熟池中选择是主动的过程并在脾脏中发生。已将两个脾B细胞群鉴定为成熟B细胞的前体。1型(T1)的过渡B细胞是来自骨髓的近期迁移者。其发育成2型(T2)的过渡性B细胞，其仅在脾脏的初级卵泡中循环并发现。成熟B细胞可由T1或T2B细胞产生。Loder,F.等人，J.Exp.Med.,190(1):75-89,1999。
FACS分析(图7-15)表明，KOH×ULC小鼠能够在骨髓腔中产生几乎正常的B细胞群(图7-8)。有意思的是，KOH×ULC小鼠展示骨髓中缺少λ(λ)表达(图10)。
在脾腔中，KOH×ULC小鼠产生几乎正常的B细胞群体(图11、12和14)。如在骨髓腔中的，KOH×ULC小鼠展示在脾中缺乏λ(λ)表达(图11和12)。另外在脾腔中，与(VI3)小鼠相比，KOH×ULC小鼠展示几乎正常的过渡和成熟B细胞群(图13-15)。
总之，这些数据示出由本发明提供的KOH×ULC小鼠，诸如具有实施例1中所述的遗传修饰的那些，是健康的并且展示近野生型B细胞发育。此外，此类小鼠表达结合蛋白，所述结合蛋白的结构类似于天然抗体，但仍缺乏重链可变区序列。
最后，如图16所示，包含本文所述的遗传修饰的小鼠能够在用抗原1(细胞表面受体)进行免疫时生成抗原特异性滴度。
实施例3：来自KOH×ULC小鼠的VL/CHxULC结构域的抗原结合特征
该实施例示出了获得核酸序列的示例性方法，所述核酸序列编码免疫球蛋白轻链可变结构域(VL/CHxULC)，该免疫球蛋白轻链可变结构域(VL/CHxULC)能够独立于同源可变结构域(例如，同源通用轻链可变结构域)可检测地结合抗原。独立于同源可变结构域可检测地结合抗原的示例性VL/CHxULC结构域由经遗传修饰的非人动物(例如，小鼠)获得，所述非人动物的基因组包括免疫球蛋白重链基因座(杂交免疫球蛋白链基因座)，所述免疫球蛋白重链基因座包含可操作地连接至重链恒定区序列的未重排人轻链基因区段(例如，VL和JL基因区段)和免疫球蛋白轻链基因座，所述免疫球蛋白轻链基因座包含可操作地连接至轻链恒定区序列的重排免疫轻链可变序列(即，通用或共用轻链可变区)。此类非人动物表达结合蛋白，所述结合蛋白包含可操作地连接至重链恒定区的免疫球蛋白轻链VL/CHxULC可变结构域，和可操作地连接至轻链恒定区的共用免疫球蛋白轻链可变结构域，其中所述VL/CHxULC轻链源于未重排人轻链基因区段，并且其中所述共用轻链可变结构域由单重排轻链可变区基因序列编码。
制备VL/CHxULC，具体地讲VκOHxULC免疫球蛋白轻链可变结构域，当与不相关的(例如非同源的)人VH结构域配对时，所述结构域保留抗原结合。用细胞表面蛋白(抗原2)对KOH×ULC小鼠进行免疫。从两只KOH×ULC小鼠，MAID1712 1635(KOH×ULC:Vκ3-20Jκ1)分选抗原阳性B细胞。基于抗原2分选细胞，并收集1536个B细胞。如分选期间判断的，由“最佳”小鼠处理384个B细胞。将176个KOH VL结构域(例如Vκ/CHxULC结构域)克隆到Fab质粒中。编码176个KOH VL结构域中的一个的单独序列连同编码人Vκ3-20种系ULC序列一起克隆到Fab质粒中。克隆编码KOH VL(VκOHxULC)结构域的每个序列，所述序列与重链恒定区序列(即CH1)可操作地连接，并克隆ULC序列，所述ULC序列与轻链恒定κ基因序列可操作地连接。进行瞬时转染以产生蛋白质用于Ag+筛选。通过ELISA和BIACORETM测定对抗原2结合的筛选。如通过ELISA确定的，十四(14)种样品在中性pH下结合抗原2，如图17所示。通过BIACORETM确定14种ELISA结合物中13种结合。
随后，选择两个源于KOH的VL(VκOHxULC)结构域，并独立地克隆并与轻链恒定区(即Cκ)重组。重组KOH VL/Cκ链中的每一个与非同源VH结构域独立地配对，所述非同源VH结构域用重链CH格式化以形成典型的抗体结构。值得注意的是，非同源VH结构域小鼠中生成，所述小鼠被遗传修饰以由单重排的重链可变区序列产生所有VH结构域(参见例如，美国专利公布20140245468，其全文以引用方式并入本文)，并用不相关的酶(抗原3)免疫。通过BIACORETM测试重组的VL结构域的抗原2结合。结果示于图18中。
在图18中，抗体A和B各自包含免疫球蛋白轻链，所述免疫球蛋白轻链包含与Cκ恒定结构域融合的不同KOH VL(VκOHxULC)，和免疫球蛋白重链，所述免疫球蛋白重链包含与完整的CH结构域融合的VH结构域。相比之下，虽然抗体C包括与抗体A和B相同的免疫球蛋白重链，抗体C包括免疫球蛋白轻链，所述免疫球蛋白轻链包括与VH结构域同源的VL结构域，所述VH结构域与Cκ结构域融合。
所述结果示出当源于单重排的重链可变区并且针对抗原3产生的VH结构域与同源轻链可变结构域配对时，保持对抗原3的抗原结合(参见，图18；示出如期望的，对抗原3的抗原C结合)。不令人惊讶的是，当相同的VH结构域与非同源KOH VL结构域配对时，抗原3结合是不可检测的(图18)。
相比之下，尽管(1)重组到Cκ结构域上重，和(2)与非同源VH结构域配对，但是对于KOH VL(VκOHxULC)结构域(即，抗体A和B VL结构域)两者均维持抗原2结合。
所述结果表明，从KOH×ULC小鼠分离的KOH抗体可仅通过一个VL结构域(即Vκ结构域)结合抗原。这通过将KOH VL(VκOHxULC)结构域重组到轻链主链(即Cκ区)上来证实并与针对不同抗原产生的VH结构域配对。示出此类分子与抗原保持结合，对所述抗原产生亲代KOH抗体(即VκOHxULC结构域)。
总之，本实施例展示KOH×ULC小鼠提供了稳健的体内体系来选择“抗体样”分子，所述“抗体样”分子仅通过VL/CHxULC结构域(例如，Vκ/CHxULC)，即独立于同源可变结构域来结合抗原。此类小鼠提供了选择在不存在同源可变域的情况下和/或当与非同源可变结构域配对时，结合抗原的VL结构域(Vκ/CHxULC或Vλ/CHxULC)的机会。由本文所述的小鼠表达的VL结合蛋白可对进化成避免常规抗体(例如HIV和流感)的靶标提供新型抗体结合部位或结合表面。
实施例4：制备包含VL/CHxULC结构域的多特异性抗原结合蛋白
该实施例示出制备多特异性抗原结合蛋白的示例性方法，所述多特异性抗原结合蛋白包含源于与通用轻链同源的免疫球蛋白杂交链的轻链可变VL/CHxULC结构域。如实施例3所述，将编码KOH VL结构域，例如Vκ/CHxULC的第一核酸序列与非人动物分离，所述非人动物被遗传修饰以在其基因组中包含：免疫球蛋白杂交链基因座，所述免疫球蛋白杂交链基因座包含可操作地连接至重链恒定区序列的未重排人轻链基因区段(例如，Vκ和Jκ基因区段)和免疫球蛋白轻链基因座，所述免疫球蛋白轻链基因座包含可操作地连接至轻链恒定区序列的重排免疫球蛋白轻链可变序列(即，通用或共用轻链可变区)。将编码第二VL/CHxULC结构域的第二核酸序列与非人动物分离，所述非人动物被遗传修饰以在其基因组中包含：免疫球蛋白杂交链基因座，所述免疫球蛋白杂交链基因座包含可操作地连接至重链恒定区序列的未重排人轻链基因区段(例如，VL和JL基因区段)和免疫球蛋白轻链基因座，所述免疫球蛋白轻链基因座包含可操作地连接至轻链恒定区序列的重排免疫球蛋白轻链可变序列(即，通用或共用轻链可变区)。另选地，可将结合第二抗原并与通用轻链同源的编码重链可变VHxULC结构域的第二核酸与非人动物分离，所述非人动物用下列物质遗传修饰：通用轻链(“ULC”)，参见例如，2011-0195454 A1、US 2012-0021409A1、US 2012-0192300A1、US 2013-0045492A1、US 2013-0185821A1和US 2013-0302836A1，其全文以引用方式并入本文，或限制的(有限的)免疫球蛋白轻链可变区基因区段谱系(例如，受限制的免疫球蛋白轻链可变区段谱系，所述谱系包含两个或更多个但少于野生型数的人VL基因区段；例如，双轻链，或“DLC”，美国专利申请公布US-2013-0198880-A1，其全文以引用方式并入本文)。
由核酸编码的第一结合组分(所述核酸包括编码结合第一抗原的第一VL/CHxULC结构域的第一核酸序列)可与由第二核酸编码的第二结合组分(所述第二核酸包括编码结合第二抗原的第二可变VL/CHxULC结构域或VH/CHxULC结构域的核酸序列)在细胞中共表达，使得所述第一和第二结合组分表达为多特异性，例如双特异性抗原结合蛋白。示例性配对形式包括第一和第二结合组分，其分别以下列形式配对：Fv形式，scFv形式，Fab形式，scFab形式，其中所述第一和第二结合组分各自为包括与通用轻链缔合的功能性CH1结构域的重链的四聚体抗体形式，或其中第一或第二结合组分中的一个为包括功能性CH1结构域并与第一结合组分或第二结合组分中的另一个(如轻链)缔合的重链的四聚体抗体形式。
包括未重排人轻链可变区基因区段的KOH×ULC小鼠用抗原A，多价高分子量蛋白质进行免疫，以形成对抗原A具有特异性的Vκ/CHxULC可变结构域。将包含未重排人重链可变区基因区段的ULC小鼠(如例如2011-0195454 A1、US 2012-0021409A1、US 2012-0192300A1、US 2013-0045492A1、US 2013-0185821A1和US 2013-0302836A1中所述的，其全文以引用方式并入本文)用抗原B，单价低分子量蛋白质进行免疫，以形成对抗原B具有特异性的VHxULC可变结构域。
表达能够结合抗原A或抗原B的抗原结合蛋白的B细胞分别从KOH×ULC或ULC小鼠中分选，如美国专利7,582,298中所述，其以引用方式并入本文。用于该研究的KOH×ULC和ULC小鼠两者均可用ULC遗传修饰，所述UCL由包含与人Jκ1基因区段重排的人Vκ3-20基因区段的重排免疫球蛋白轻链编码。
简而言之，通过裂解移除红细胞，然后将收获的脾细胞造粒。首先将再悬浮的脾细胞与人IgG、FITC-anti-mFc和用生物素标记的抗原A或用生物素标记的抗原B(视情况而定)的混合物温育1小时。将染色的细胞用PBS洗涤两次，然后用人和大鼠IgG、APC-anti-mIgM和SA-PE的混合物染色一小时。用PBS将染色的细胞洗涤一次，并且通过流式细胞术在Reflection(Sony)上分析。将每个IgG阳性、IgM阴性和抗原阳性B细胞分选并铺在384孔板上的单独孔中。根据由wang等人(2000)(J Immunol Methods 244:217-225)所述的方法进行来自这些B细胞的抗体基因的RT-PCR。
简而言之，经由逆转录(RT)合成每个单个B细胞的cDNA。使用对人κ链可变区先导序列具有特异性的5'简并引物和对小鼠重链恒定区具有特异性的3’引物，通过PCR扩增来自经抗原A免疫的KOHxULC小鼠的VκOHxULC区DNA序列，以形成扩增子。然后使用对人κ可变区序列的骨架1具有特异性的5'简并引物和对小鼠重链恒定区具有特异性的嵌入式3'引物，通过PCR再次扩增扩增子。将VKOHXULC PCR产物克隆到包含人IgG1重链恒定区的第一Sap I线性化抗体载体和源于重排Vκ3-20Jκ1的通用轻链的表达盒中。使用对人IgG重链可变区先导序列具有特异性的5'简并引物和对小鼠重链恒定区具有特异性的3’引物，通过PCR扩增来自经抗原B免疫的ULC小鼠的重链可变区DNA序列，以形成扩增子。然后使用对人IgG重链可变区序列的骨架1具有特异性的5'简并引物和对小鼠重链恒定区具有特异性的嵌入式3'引物，通过PCR再次扩增扩增子。将VH/CHxULC PCR产物克隆到包含人IgG1重链恒定区的第二SapI线性化抗体载体中。
将纯化的重组质粒(其具有编码源于可操作地连接至人κ恒定基因的重排Vκ3-20Jκ1序列和与人IgG1恒定区序列可操作地连接的VL/CHxULC序列的通用轻链的重排基因)和纯化的质粒(所述纯化的质粒具有与人IgG1恒定区序列可操作地连接的VH/CHxULC序列)组合并转染到CHO宿主细胞系中。用400μg/ml潮霉素选择12天之后，分离稳定转染的CHO细胞池。CHO细胞池用于产生抗原结合蛋白，如图19A所示。
使用Biacore T200或4000仪器(GE Healthcare)通过SPR(表面等离子体共振)测定所选抗体上清液或纯化抗体的平衡解离常数(KD)。在25℃或37℃下，使用HBS-EP(10mMHepes、150mM NaC1、0.3mM EDTA、0.05％表面活性剂P20，pH7.4)作为运行缓冲液和样品缓冲液两者来获得所有数据。在CM4或CM5传感器芯片表面上从粗上清液样品或纯化的mAb捕集抗体，所述传感器芯片表面使用标准胺偶联化学，利用高密度的抗人Fc抗体预先衍生化。在捕集步骤期间，以10μL/min的流速将上清液或纯化的mAb注射在抗人Fc表面上，并持续总共0.5-2.0分钟。捕集步骤之后，以30μL/min的流速，注射3.125nM-100nM的浓度范围内的运行缓冲液或抗原A并持续1.5-3.0分钟，或者注射0.37nM-90nM的浓度范围内的抗原B并持续3.0分钟。监测抗原与捕集的抗体的解离并持续3.0-5.0分钟。通过短暂注射10mM甘氨酸(pH1.5)移除捕集的抗体。所有传感图通过从分析物传感图减去来自缓冲液注射的传感图来双参考，从而移除由抗体与捕集表面解离而引起的失真。每种抗体的结合数据拟合到具有传质限制的1:1结合模型。
通用轻链抗体的结合亲和力示于图20中，其表现出纳摩尔级的KD值。具体地讲，所有双特异性抗体(B1-B3)包含Vκ/CHxULC结合组分、VHxULC结合组分，并且通用轻链以25℃下6.8至9.6nM范围的亲和力(图20)和37℃下100-140nM范围的亲和力，和小于约1分钟的t1/2值结合到抗原A(数据未示出)。双特异性抗体还以25℃下约5-100nM范围的亲和力(图20)和37℃下174-178nM范围的亲和力结合到抗原B(数据未示出)。
针对抗原A产生并且包括与二价Vκ/CHxULC结构域(所述二价Vκ/CHxULC结构域分别克隆以产生双特异性抗体B1-B3)配对的通用轻链可变结构域的对照单特异性抗体(抗体CKOH1-CKOH3)以25℃下2-8nM范围内的亲和力结合到抗原A，但不是抗原B(图20)。不希望受到理论的约束，与双特异性抗体(B1-B3)相比，对于与二价抗体(CKOH1-CKOH3)相互作用的抗原A观察到的25℃下的t1/2值的差异可能是由于抗原A的多价性质，这可能有助于主要是亲合力驱动的相互作用。不测定37℃下的CKOH1-CKOH3抗体的解离常数(t1/2)。
对照单特异性抗体(抗体CVH)以25℃下5.2nM的亲和力和类似于抗原B与双特异性抗体解离的t1/2值(23-31分钟)的t1/2值(41.1分钟)结合抗原B，所述对照单特异性抗体针对抗原B产生并且包括与二价hVHxULC结构域配对的通用轻链可变结构域，其被克隆以产生双特异性抗体B1-B3中的每一个(图20)。不测试37℃下CVH对抗原B的结合。
同种型对照抗体(CI)不与抗原A或抗原B结合(图。20)。呈典型抗体形式的另一对照抗B抗体(C)(例如具有两条重链，每条重链均包含与CH结构域融合的VH结构域，和两条轻链，每条轻链均具有与CL结构域融合的VL结构域)以1.4nM的亲和力与抗原B结合但不结合抗原A(图20)。
总之，该实施例展示在KOH×ULC非人动物中产生的VL/CHxULC结构域能够以多特异性形式将抗原与对第二不同表位具有特异性的另一可变结构域结合。
等同物
考虑由此描述的本发明的至少一个实施方案的多个方面，本领域技术人员应当理解，各种改变、修改和改进对本领域的技术人员而言将容易想到。此类改变、修改和改进旨在成为本公开的一部分，并且旨在在本发明的实质和范围内。因此，前述说明和附图仅作为示例，并且本发明由所附权利要求书详细描述。
还应当理解，本发明的任何实施方案或方面可从权利要求中明确地排除，而不考虑该具体排除是否在说明书中列举。
本领域技术人员将理解典型的标准偏差或误差属于本文所述的测定或其它方法中获得的值。
本文引用的描述本发明的背景和提供关于其实践的附加细节的出版物、网站和其它参考资料以引用方式并入本文。
序列表
<110> 瑞泽恩制药公司
L·麦克唐纳
A·J·莫菲
C·古雷尔
R·巴布
<120> 选择结合抗原的轻链可变区的非人动物
<150> 62/135,419
<151> 2015-03-19
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 3155
<212> DNA
<213> 合成()
<400> 1
ggcgcgccgt agctttgaat tttaaacatc tatttgacaa gaaatgcata gttccttctc 60
tttaaaataa tgtaatgttt ctttcaagaa taagcttggt ttgatgcctc tctccccaac 120
atgatagaag tgtagcataa atctatgaaa aattccattt ccctgtgcct acaacaacta 180
cctgggattg aaaacttctt cccttgctct agtcctttct tctacaccta cttccacatc 240
atctgtgact caaaacaata cttgtcagga aagatcccgg aaagagcaaa aaagacttcc 300
ttagaggtgt cagagattcc tatgccacta tctgtcatct ctagaagggg ttgtgagtat 360
gaggaagagc agagcttgta aattttctac ttgctttgac ttccactgta tttcctaaca 420
acaacaacca cagcaacacc cataacatca caggacaaac ttctagtact tccaaggctt 480
tagtctcagt aaatcttctc tacctccatc acagcagcta gaaggtttga tactcataca 540
aatagtactg tagctttctg ttcataattg gaaaaataga caagacccaa tgtaatacag 600
gctttccttc agccagttag cgttcagttt ttggatcacc attgcacaca tatacccagc 660
atatgtctaa tatatatgta gaaatccgtg aagcaagagt tataatagct tgtgttttct 720
attgtattgt attttcctct tatatcatct tcttcttcgt tcattaaaaa aaaaccgttc 780
aagtaggtct aaattaatta ttggatcata agtagataaa atattttatt tcataacaca 840
ttgacccgat gaatatgttt ctttgccaga catagtcctc atttccaagg taacaagcct 900
gaaaaaatta tactggagca agtcaacagg taatgatggt agcttttcct tattgtcctg 960
gggcaagaat aagacaaaag ataacagggt agaataaaga ttgtgtaaga aagaaggaca 1020
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aatttggctg cggataaaac attcttggat tagactgaag actcttttct gtgctaagta 1260
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ttaattgccg catacataat gtcctgaata ctattgtaaa tgttttatct tatttccttt 1380
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<211> 3166
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<400> 2
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gcaacaggac atgggaacct tttatagagt aacattttga taatggatga tgagaattaa 1080
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tccaataatg cacttaggga gatgactggg catattgagg ataggaagag agaagtgaaa 1740
acacagcttt ttatattgtt cttaacaggc ttgtgccaaa catcttctgg gtggatttag 1800
gtgattgagg agaagaaaga cacaggagcg aaattctctg agcacaaggg aggagttcta 1860
cactcagact gagccaacag acttttctgg cctgacaacc agggcggcgc aggatgctca 1920
gtgcagagag gaagaagcag gtggtctttg cagctgaaag ctcagctgat ttgcatatgg 1980
agtcattata caacatccca gaattcttta agggcagctg ccaggaagct aagaagcatc 2040
ctctcttcta gctctcagag atggagacag acacactcct gctatgggtg ctgctgctct 2100
gggttccagg tgagggtaca gataagtgtt atgagcaacc tctgtggcca ttatgatgct 2160
ccatgcctct ctgttcttga tcactataat tagggcattt gtcactggtt ttaagtttcc 2220
ccagtcccct gaattttcca ttttctcaga gtgatgtcca aaattattct taaaaattta 2280
aatgaaaagg tcctctgctg tgaaggcttt taaagatata taaaaataat ctttgtgttt 2340
atcattccag gtgccagatg tataccaccg gagaaattgt gttgacgcag tctccaggca 2400
ccctgtcttt gtctccaggg gaaagagcca ccctctcctg cagggccagt cagagtgtta 2460
gcagcagcta cttagcctgg taccagcaga aacctggcca ggctcccagg ctcctcatct 2520
atggtgcatc cagcagggcc actggcatcc cagacaggtt cagtggcagt gggtctggga 2580
cagacttcac tctcaccatc agcagactgg agcctgaaga ttttgcagtg tattactgtc 2640
agcagtatgg tagctcacct tggacgttcg gccaagggac caaggtggaa atcaaacgta 2700
agtaattttt cactattgtc ttctgaaatt tgggtctgat ggccagtatt gacttttaga 2760
ggcttaaata ggagtttggt aaagattggt aaatgagggc atttaagatt tgccatgggt 2820
tgcaaaagtt aaactcagct tcaaaaatgg atttggagaa aaaaagatta aattgctcta 2880
aactgaatga cacaaagtaa aaaaaaaaag tgtaactaaa aaggaaccct tgtatttcta 2940
aggagcaaaa gtaaatttat ttttgttcac tcttgccaaa tattgtattg gttgttgctg 3000
attatgcatg atacagaaaa gtggaaaaat acatttttta gtctttctcc cttttgtttg 3060
ataaattatt ttgtcagaca acaataaaaa tcaatagcac gccctaagat ctagatgcat 3120
gctcgagtgc catttcatta cctctttctc cgcacccgac atagat 3166

Claims (33)

1.一种抗原结合蛋白，其包含第一结合组分，所述第一结合组分包含结合第一表位的第一人轻链可变结构域，
其中所述第一人轻链可变VL/CHxULC结构域与第一免疫球蛋白杂交链的第一人轻链可变结构域相同或源于所述第一免疫球蛋白杂交链的第一人轻链可变结构域，所述第一免疫球蛋白杂交链具有选自IgD、IgG、IgE和IgA的同种型，包含功能性CH1结构域，并且所述第一人轻链可变VL/CHxULC结构域与源于人通用重排VL/JL基因序列的第一通用轻链可变结构域同源，
任选地其中所述第一VL/CHxULC结构域融合至重链恒定结构域或轻链恒定结构域，并且
任选地其中所述第一VL/CHxULC结构域与源于所述人通用重排VL/JL基因序列的第一通用轻链可变结构域缔合。
2.根据权利要求1所述的抗原结合蛋白，其还包含第二结合组分，所述第二结合组分包含结合第二表位的第二人可变结构域，
其中所述第二人可变结构域为
(i)与第二杂交免疫球蛋白链的第二人轻链可变结构域相同或源于所述第二杂交免疫球蛋白链的第二人轻链可变结构域的第二人轻链可变VL/CHxULC结构域，所述第二人轻链可变VL/CHxULC结构域与源于所述人通用重排VL/JL基因序列的第二通用轻链可变结构域同源，或者
(ii)人重链可变VHxULC结构域，其与源于所述人通用重排VL/JL基因序列的第二通用轻链可变结构域同源；
任选地其中所述第二人(VL/CHxULC或VHxULC)可变结构域融合至重链恒定结构域或轻链恒定结构域，并且
任选地其中所述第二人(VL/CHxULC或VHxULC)可变结构域与源于所述人通用重排VL/JL基因序列的第二通用轻链可变结构域缔合。
3.根据权利要求2所述的抗原结合蛋白，其中所述第一可变VL/CHxULC和第二可变结构域通过肽接头连接使得所述第一结合组分和所述第二结合组分以scFv-状形式配对。
4.根据权利要求2所述的抗原结合蛋白，其中所述第一可变VL/CHxULC结构域或所述第二可变结构域中的一个融合至功能性CH1结构域，其中所述第一可变VL/CHxULC结构域或所述第二可变结构域中的另一个融合至轻链恒定(CL)结构域，并且其中所述CH1和CL结构域通过肽接头或二硫键连接使得所述第一结合组分和所述第二结合组分以Fab-状形式或scFab-状形式配对。
5.根据权利要求2所述的抗原结合蛋白，
其中所述第一结合组分包含
(a)融合至第一功能性CH1结构域、第一铰链区、第一CH2结构域、第一CH3结构域、和任选地第一CH4结构域的所述第一可变Vl/CHxULC结构域，和
(b)融合至第一轻链恒定(CL)结构域的所述第一通用轻链可变结构域，
其中所述第一功能性CH1通过二硫键或肽接头连接至所述第一CL结构域，使得(a)和(b)以Fab-状结构配对，
其中所述第二结合组分包含
(a')融合至第二功能性CH1结构域、第二铰链区、第二CH2结构域、第二CH3结构域、和任选地第二CH4结构域的所述第二可变结构域，和
(b')融合至第二轻链恒定(CL)结构域的所述第二通用轻链可变结构域，
其中所述第二功能性CH1通过二硫键或肽接头连接至所述第二轻链恒定结构域，使得(a')和(b')以Fab-状结构配对，
其中所述第一结合组分和所述第二结合组分配对使得所述抗原结合蛋白形成四聚体结合蛋白，并且
任选地其中所述第一CH3结构域和所述第二CH3结构域对蛋白质A具有不同的亲和力。
6.根据权利要求2-5中任一项所述的抗原结合蛋白，其中所述第一结合组分和所述第二结合组分相同。
7.根据权利要求2-5中任一项所述的抗原结合蛋白，其中结合第二表位的所述第二人可变结构域为人重链可变VHxULC结构域。
8.根据权利要求2-5中任一项所述的抗原结合蛋白，其中结合第二表位的所述第二人可变结构域为第二可变VL/CHxULC结构域，并且其中所述第一表位和所述第二表位不相同。
9.根据前述权利要求中任一项所述的抗原结合蛋白，其中所述人通用重排VL/JL基因序列为人通用重排Vκ/Jκ基因序列。
10.根据权利要求9所述的抗原结合蛋白，其中所述人通用重排Vκ/Jκ基因序列为人通用重排Vκ1-39/Jκ基因序列或人通用重排人Vκ3-20/Jκ基因序列。
11.根据权利要求10所述的抗原结合蛋白，其中所述人重排Vκ1-39/Jκ基因序列为重排人Vκ1-39/Jκ5基因序列或其中所述人重排Vκ3-20/Jκ基因序列为重排人Vκ3-20/Jκ1基因序列。
12.根据权利要求1-11中任一项所述的抗原结合蛋白，其中所有重链和轻链恒定区分别为人重链和轻链恒定区。
13.一种可用于生成人VL/CHxULC结构域的非人动物，所述非人动物在其种系基因组中包含：
(i)编码免疫球蛋白杂交链的杂交免疫球蛋白基因座，其中所述杂交免疫球蛋白基因座包含可操作地连接至免疫球蛋白重链恒定区核酸序列的未重排人免疫球蛋白轻链可变区基因区段(VL和JL)，所述免疫球蛋白重链恒定区核酸序列包含一个或多个重链恒定区基因，所述一个或多个重链恒定区基因中的每一个编码至少功能性CH1结构域，其中所述VL和JL基因区段能够重排以形成杂交序列，所述杂交序列包含可操作地连接至所述免疫球蛋白重链恒定区核酸序列的重排人VL/JL基因序列；
(ii)轻链基因座，其编码人通用轻链并且包含可操作地连接至免疫球蛋白轻链恒定区核酸序列的人通用重排轻链可变区核苷酸序列；
其中所述非人动物能够产生抗原结合蛋白，所述抗原结合蛋白包含源于所述杂交基因座的人免疫球蛋白杂交链和源于所述轻链基因座的同源人通用轻链，其中所述人免疫球蛋白杂交链包含融合至包含功能性CH1结构域的重链恒定IgD、IgG、IgE或IgA区的人免疫球蛋白轻链可变(hVL/CHxULC)结构域，并且其中所述人通用轻链包含融合至轻链恒定结构域的人免疫球蛋白轻链。
14.根据权利要求13所述的非人动物，其还包含表达所述抗原结合蛋白的B细胞。
15.一种制备根据权利要求13或权利要求14所述的非人动物的方法，所述方法包括修饰所述非人动物的种系基因组以包含
(i)轻链基因座，其包含可操作地连接至免疫球蛋白轻链恒定区核酸序列的重排人免疫球蛋白轻链可变区核苷酸序列；和
(ii)杂交免疫球蛋白链基因座，其包含未重排人免疫球蛋白轻链可变区基因区段(VL和JL)，所述未重排人免疫球蛋白轻链可变区基因区段能够重排以形成可操作地连接至免疫球蛋白重链恒定区核酸序列的重排人VL/JL基因序列，所述免疫球蛋白重链恒定区核酸序列包含完整的Igμ基因、完整的Igδ基因、完整的Igγ基因、完整的Igα基因、和/或完整的Igε基因。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述修饰所述非人动物的种系基因组包括
(a)用未重排人免疫球蛋白VL和JL基因区段取代内源性重链基因座处的全部内源性功能性免疫球蛋白重链VH、D和JH基因区段，使得所述未重排轻链可变基因区段可操作地连接至内源性重链恒定区核酸序列，以及
(b)用重排人免疫球蛋白轻链可变区核苷酸序列取代内源性轻链基因座处的全部内源性功能性轻链VL和JL基因区段，使得所述重排人免疫球蛋白轻链可变区核苷酸序列可操作地连接至内源性轻链恒定区核酸序列。
17.根据权利要求13或14所述的或者根据权利要求15或权利要求16所述的方法制备的动物，其中所述杂交免疫球蛋白链基因座包含可操作地连接至非人免疫球蛋白重链恒定区核酸序列的未重排人免疫球蛋白轻链可变区(VL和JL)基因区段，并且其中所述轻链基因座包含可操作地连接至非人免疫球蛋白轻链恒定区核酸序列的所述重排人免疫球蛋白轻链可变区核苷酸序列。
18.根据权利要求17所述的动物，其中所述非人动物为啮齿动物。
19.根据权利要求18所述的动物，其中所述啮齿动物为大鼠或小鼠。
20.根据权利要求13-14和17-19中任一项所述的，或者由权利要求15或权利要求16所述的方法制备的非人动物用于分离表达免疫球蛋白轻链可变VL/CHxULC结构域的细胞或编码免疫球蛋白轻链可变VL/CHxULC结构域的核酸的用途。
21.一种编码包含人免疫球蛋白轻链可变VL/CHxULC结构域的结合组分的核酸，其中所述核酸包含与非人或人免疫球蛋白重链恒定基因或者非人或人免疫球蛋白轻链恒定基因可操作地连接的人重排VL/JL基因序列。
22.根据权利要求21所述的核酸，其中所述非人免疫球蛋白重链恒定基因选自完整的啮齿动物Igμ基因、完整的啮齿动物Igδ基因、完整的啮齿动物Igγ基因、完整的啮齿动物Igε基因、完整的啮齿动物Igα基因、以及它们的组合。
23.根据权利要求21所述的核酸，其中所述人免疫球蛋白重链恒定基因选自人Igμ基因、人Igδ基因、人Igγ基因、人Igε基因、人Igα基因、以及它们的组合。
24.根据权利要求23所述的核酸，其中所述人免疫球蛋白重链恒定基因为人Igγ基因。
25.根据权利要求24所述的核酸，其中所述人Igγ基因编码选自IgG1、IgG2和IgG4的IgG亚类。
26.根据权利要求25所述的核酸，其中所述人Igγ基因包含CH3编码序列中的突变，相比于野生型CH3结构域，所述突变降低所述编码的CH3结构域对蛋白质A的结合亲和力。
27.一种编码包含融合至轻链恒定区的人免疫球蛋白轻链可变VL/CHxULC结构域的结合组分的核酸，其中所述核酸包含与非人或人免疫球蛋白轻链恒定基因可操作地连接的人重排VL/JL基因序列。
28.一种包含根据权利要求21-27中任一项所述的核酸的细胞。
29.根据权利要求28所述的细胞，其中所述细胞为淋巴细胞。
30.根据权利要求29所述的细胞，其中所述细胞为宿主细胞。
31.一种制备多特异性抗原结合蛋白的方法，所述方法包括在宿主细胞中共表达下列物质
(i)第一核酸，其包含编码人VL/CHxULC结构域的核酸序列，所述人VL/CHxULC结构域与包含功能性CH1结构域编码序列的第一非人或人重链恒定区基因可操作地连接，其中所述人VL/CHxULC结构域独立于同源可变结构域结合第一表位，
(ii)第二核酸，其包含编码人VHxULC结构域或第二人VL/CHxULC结构域的核酸序列，所述人VHxULC结构域或第二人VL/CHxULC结构域与包含功能性CH1结构域编码序列的第二非人或人重链恒定区基因融合，其中所述VHxULC结构域或第二VL/CHxULC结构域独立于同源可变结构域结合第二表位，
其中所述第一表位和所述第二表位不相同；以及
(iii)第三核酸，其编码融合至非人或人轻链恒定结构域的人通用轻链可变结构域。
32.根据权利要求31所述的方法，其中所述第一重链恒定区基因和所述第二重链恒定区基因为人重链恒定区基因，并且其中所述轻链恒定结构域为人轻链恒定结构域。
33.一种根据权利要求31或32所述的方法制备的抗原结合蛋白。
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