CN104302171B - 表达ph敏感性免疫球蛋白序列的非人动物 - Google Patents

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Abstract

本申请提供了基因修饰的非人动物，所述动物表达包括至少一个组氨酸的免疫球蛋白可变结构域，其中所述至少一个组氨酸由在所述动物的种系中针对非组氨酸密码子的组氨酸密码子取代，或者在种系免疫球蛋白核酸序列中插入的组氨酸密码子所编码。本申请还提供了免疫球蛋白基因，所述免疫球蛋白基因在一个或多个CDR中、在N‑末端区中和/或在环4区中含有组氨酸。免疫球蛋白可变结构域包括一个或多个组氨酸(例如组氨酸簇)取代非抗原结合的非组氨酸残基。本申请还提供了非人动物，所述非人动物是包括经修饰的重链可变基因座(V、D、J区段)，经修饰的轻链可变基因座(V、J区段)和重排的种系轻链基因(VJ序列)的动物的后代。本申请提供了非人动物，所述非人动物产生以pH敏感的方式结合抗原的免疫球蛋白结构域。

Description

表达PH敏感性免疫球蛋白序列的非人动物
发明领域
一种基因修饰的非人动物，所述非人动物表达能够以pH依赖的方式与抗原结合的抗体。基因修饰的非人动物，所述非人动物包括免疫球蛋白基因座，所述免疫球蛋白基因座被修饰以含有至少一个编码能够质子化的氨基酸的密码子的取代或插入。基因修饰的非人动物，所述非人动物包括免疫球蛋白基因座，所述免疫球蛋白基因座被修饰以便在免疫球蛋白重链V、D或J基因区段，或轻链V或J区段，或其重排的重链VDJ区或其重排的轻链VJ区含有至少一个组氨酸取代和/或至少一个组氨酸插入。基因修饰的非人动物，所述非人动物表达在抗原结合中显示出pH敏感性的免疫球蛋白。基因修饰的动物，所述动物包含B细胞群，所述B细胞群富含包含至少一个组氨酸的免疫球蛋白可变结构域。基因修饰的非人动物，所述非人动物包含在免疫球蛋白重链V、D和/或J基因区段，和或轻链V和/或J基因区段，和/或其重排的重链VDJ序列或重排的轻链VJ序列中以插入和/或取代形式存在的两个或多个组氨酸的簇。
非人动物的基因修饰的免疫球蛋白基因座，所述免疫球蛋白基因座包含未经重排的人源重链可变区核苷酸序列，其中所述未经重排的人源重链可变区核苷酸序列包含至少一个组氨酸密码子的插入或至少一个组氨酸密码子对内源性非组氨酸密码子的取代。非人动物，包括啮齿动物，例如小鼠和大鼠，所述非人动物在其基因组中包含基因修饰的免疫球蛋白基因座，所述基因座包含未经重排的人源重链可变区核苷酸序列，其中所述未经重排的人源重链可变区核苷酸序列包含加入至少一个组氨酸密码子或使用组氨酸密码子取代至少一个内源性非组氨酸密码子。能够表达抗原结合蛋白的基因工程改造的非人动物，所述抗原结合蛋白的特征为pH依赖性抗原结合、循环利用提高和/或血清半衰期增加。
背景技术
治疗用途的免疫球蛋白结合结构域具有各种各样的形式，包括具有与同源轻链结合的同源二聚体免疫球蛋白重链的传统抗体形式。多种这些形式，包括传统形式，显示出由于各种各样的因素导致的在体内的药代动力学性质不理想。在最近的几十年中，已尝试了不同方法以改善药代动力学。这些包括例如通过与聚合物缀合增加流体力学半径以降低肾脏清除率(例如PEG；参见例如Duncan,R.(2006)Polymer conjugates as anticancernanomedicines(作为抗癌纳米药物的聚合物缀合物),Nat.Rev.Cancer 6:688-701)；N-聚糖的唾液酸化(参见例如Stork,R.等，N-glycosylation as novel strategy to improvepharmacokinetic properties of bispecific single-chain diabodies(作为改善双特异性单链双体药代动力学性质的新策略的N-糖基化),J.Biol.Chem.283(12):7804-7812)；用于促进在中性pH下Fc-FcRn结合而在内涵体pH下促进释放并与血清白蛋白结合的Fc修饰(参见例如Chuang等，(2002)Pharmaceutical Strategies Utilizing Recombinant SerumAlbumin(利用重组血清白蛋白的制药策略),Pharm.Res.19(5):569-577)。在适当的应用中和使用适当形式时，这些方法中的每一种均可以提供一些益处。
然而，在本领域中仍需要改善治疗效果和生物制药的模式，包括但不限于操纵免疫球蛋白可变结构域的结构以工程改造显示出pH依赖性结合的可变结构域。需要用于多种形式的抗原结合蛋白中的可变结构域，其中针对与靶抗原或受体的结合所述可变结构域(或其抗原结合片段)赋予了所述抗原结合蛋白pH敏感性。在本领域中还需要用于生成pH依赖性免疫球蛋白可变结构域及其抗原结合片段的系统和方法。需要能够产生具有广泛的多样性的免疫球蛋白可变结构域的生物系统，其中所述广泛的多样性富含可滴定的氨基酸，所述可滴定的氨基酸是可以赋予所述可变结构域pH敏感性，例如能够在一个pH下(例如中性的或较高的pH)与靶抗原或表位结合，而在另一个pH下(例如较低的或内涵体pH)释放靶抗原或表位。
特定形式的免疫球蛋白轻链提出了特殊挑战。抗体通常包含同型二聚体的重链组分，其中各重链单体均与相同的轻链结合。具有异二聚体重链组分(例如双特异性抗体)的抗体是理想的治疗性抗体。但是制备具有能够令人满意地与双特异性抗体的各个重链结合的适宜轻链组分的双特异性抗体已被证明是有问题的。
在一种方法中，可以通过调查所有轻链可变结构域使用情况的统计数据，鉴定在人源抗体中使用频率最高的轻链并且在体外将轻链与具有不同特异性的两条重链配对来选择轻链。
在另一种方法中，可以通过观察噬菌体展示文库(例如含有人源轻链可变区序列的噬菌体展示文库，例如人源scFv文库)中的轻链序列并从该文库中选择最常用的轻链可变区来选择轻链。然后可以在两条不同的目的重链上对所述轻链进行检测。
在另一种方法中，可以通过使用两条目的重链的重链可变序列作为探针检测轻链可变序列的噬菌体展示文库来选择轻链。可以选择与两条重链可变序列均结合的轻链作为所述重链的轻链。
在另一种方法中，可以将候选轻链与所述重链的同源轻链比对，并且在所述轻链中进行修饰以便更加紧密地匹配与两条重链的同源轻链共有的序列特征。如果需要将免疫源性的可能最小化，则所述修饰优选地生成存在于已知的人源轻链序列中的序列，以使得蛋白水解加工根据用于评估免疫源性可能性的本领域公知的参数和方法(即在硅胶和湿分析法中)不可能生成T细胞表位。
依赖于体外方法的所有此类方法包含多种先天缺陷，例如序列一致性，与特定预先选定的重链的结合能力等。现有技术中需要不依赖于体外条件操纵，取而代之的是使用在生物学上更为明智的方法以制备包含常见轻链的人源表位结合蛋白的组合物和方法。
此外，治疗性抗体例如双特异性治疗性抗体具有一些局限性，因为其通常需要较高剂量以达到所需的疗效。这部分是由于抗体-抗原复合物被内化进入内涵体，并且在一个称为靶介导的清除过程中被作为溶酶体降解的靶点。因此，在现有技术中需要导致更有效的抗体循环例如双特异性抗体循环并通过促进在内涵体隔室中抗体-抗原复合物的解离但不影响抗体与抗原的特异性和亲和性的阻止抗体降解的方法和组合物。
施用到体内的药物，包括治疗性单克隆抗体，受到多种消除机制的影响，包括肾小球滤过(例如进入尿液)、分泌(例如进入胆汁)和通过细胞的分解代谢。尽管小分子通过肾脏的滤过从机体中清除，但大多数的分泌抗体(例如IgG，因过大而无法通过肾小球被滤过)主要通过细胞介导的分解代谢从机体中除去，例如流体相的内吞作用(吞噬作用)或受体介导的内吞作用。例如，具有若干重复表位的可溶性分子与多个循环抗体结合，并且所得到的较大的抗原-抗体复合物被迅速地吞噬进入细胞降解。另一方面，与抗体结合的细胞表面靶受体(即受体-抗体复合物)以剂量依赖性的方式经历靶向介导的内吞作用，从而在细胞内形成最终被溶酶体降解的内涵体。在一些情况下，细胞内吞受体-抗体复合物以pH依赖性的方式在内涵体内结合新生儿Fc受体(FcRn)并且再返回细胞表面，并当暴露于细胞外的中性pH(例如pH 7.0-7.4)下时释放进入血浆或细胞间液。
在本领域中需要生产具有可滴定的残基的抗原结合蛋白的系统，例如非人动物、细胞和基因组的基因座，例如基因修饰的基因座，所述基因座重排免疫球蛋白基因区段以生产响应pH的改变的重链可变结构域，例如其提供或接受质子并且例如根据质子化状态不同其具有不同的结合特性。
在本领域中还需要能够通过促进抗原结合蛋白从受体抗原结合蛋白复合物中解离或通过在酸性内涵体隔室中增加抗原结合蛋白对FcRn的亲和性进一步增加细胞内吞的抗原结合蛋白的再循环效率但不影响所述抗原结合蛋白对目的抗原的特异性和亲和性的方法和组合物。
发明概述
本申请提供了用于制备基因修饰的动物的组合物和方法，所述组合物和方法生成包含由非人动物的种系的修饰编码的至少一个组氨酸残基的免疫球蛋白可变结构域，其中所述种系的修饰包含至少一个组氨酸密码子插入重链V、D或J区段，至少一个组氨酸密码子插入轻链V或J区段，至少一个组氨酸密码子插入重排的轻链VJ基因，在重链V、D或J区段中使用至少一个组氨酸密码子取代非组氨酸密码子，在轻链V或J区段中使用至少一个组氨酸密码子取代非组氨酸密码子，在重排的轻链VJ序列中使用至少一个组氨酸密码子取代非组氨酸密码子。
本申请还提供了用于在非人动物的种系免疫球蛋白序列中引入组氨酸密码子簇的组合物和方法。
本申请还提供了在免疫球蛋白基因的N末端编码区、免疫球蛋白基因的环4编码区、免疫球蛋白基因的CDR编码区(例如重排的V(D)J序列或V(D)J基因区段)中引入组氨酸插入或使用组氨酸密码子取代非组氨酸密码子的组合物和方法。
本申请提供了用于制备非人动物后代的组合物和方法，所述组合物和方法包含在两个免疫球蛋白重链基因座和在免疫球蛋白轻链基因座中插入组氨酸密码子和/或使用组氨酸密码子取代非组氨酸密码子。
在一个方面，本申请提供了一种基因修饰的非人动物，所述非人动物在其种系中包含免疫球蛋白基因座，所述免疫球蛋白基因座在免疫球蛋白可变基因座中包含使用组氨酸密码子取代至少一个非组氨酸密码子或插入组氨酸密码子。在一个实施方式中，所述可变基因座(例如未经重排的V(D)J区段基因座)包含至少一部分人源可变(V(D)J区段)基因座。
在一个实施方式中，所述经基因修饰的非人动物在其种系中包含第一可变基因座(例如未经重排的免疫球蛋白重链V(D)J区段基因座)和第二可变基因座(例如未经重排的免疫球蛋白轻链V、J区段基因座；或重排的免疫球蛋白轻链VJ序列)。
在一个实施方式中，所述非人动物包含第一和第二可变基因座，其中至少所述第一或第二可变基因座包含插入至少一个组氨酸密码子或用组氨酸密码子取代至少一个非组氨酸密码。
在一个实施方式中，所述第一和第二可变基因座均包含用组氨酸密码子取代至少一个非组氨酸密码子或插入组氨酸密码子。
在一个实施方式中，所述第一可变基因座包含至少一部分具有功能的未经重排的重链可变基因座(未经重排的V、D、J区段)。
在一个实施方式中，所述未经重排的重链可变基因座包含至少一部分人源基因座(未经重排的V、D、J区段)。
在一个实施方式中，所述未经重排的重链基因座是人源基因座，所述人源基因座包含未经重排的V区段、包含接头的合成的D区段和人源J区段。在一个实施方式中，所述合成的D区段包含至少一个组氨酸密码子。
在一个实施方式中，所述第二可变基因座包含至少一部分具有功能的未经重排的轻链可变基因座(未经重排的V、J区段)。
在一个实施方式中，所述第二可变基因座包含重排的免疫球蛋白轻链可变基因序列(重排的VJ序列)。
在一个实施方式中，使用组氨酸密码子取代非组氨酸密码子和/或插入组氨酸密码子是在编码可变结构域的核酸序列中并且所述组氨酸在选自下述的区域中：免疫球蛋白链的N-末端区、免疫球蛋白链的环4区、重链的CDR1、重链的CDR2、重链的CDR3、轻链的CDR1、轻链的CDR2、轻链的CDR3及以上区域的组合。
在一个实施方式中，所述第一可变基因座或第二可变基因座中的至少一个与在内源性非人源免疫球蛋白基因座的内源性非人源恒定区核酸序列可操作地连接。
在一个实施方式中，所述第一可变基因座(未经重排的人源V、D、J区段)与内源性非人源免疫球蛋白重链恒定区核酸序列可操作地连接。
在一个实施方式中，所述第一可变基因座(未经重排的人源V、D、J区段)在内源性非人源免疫球蛋白基因座与内源性非人源免疫球蛋白重链恒定区核酸序列可操作地连接。
在一个实施方式中，所述第二可变基因座(未经重排的V、J区段)与内源性非人源免疫球蛋白轻链恒定区序列可操作地连接。
在一个实施方式中，所述内源性非人源免疫球蛋白轻链恒定区序列在内源性非人源免疫球蛋白基因座。
在一个实施方式中，所述可变区序列包含2、3、4或5个组氨酸的簇，所述组氨酸的簇是使用组氨酸密码子取代非组氨酸密码子和/或插入组氨酸密码子。
在一个实施方式中，所述未经重排的重链基因座包含D基因区段，所述D基因区段与所述重链基因座的方向是相反的。在一个实施方式中，所述反向的D基因区段在亲水性阅读框架中。
在一个方面，本申请提供了一种基因修饰的非人动物，所述非人动物包含与恒定区基因序列可操作地连接的至少一部分未经重排的人源免疫球蛋白重链可变区核酸序列(未经重排的V、D、J区段)，其中一个或多个所述V、D和J基因区段包含至少一个针对非组氨酸密码子的组氨酸密码子取代，或者至少一个组氨酸密码子的插入；与恒定区基因序列可操作地连接的至少一部分未经重排的人源免疫球蛋白轻链可变区核酸序列(未经重排的V、J区段)的，其中一个或多个所述V和J基因区段包含至少一个针对非组氨酸密码子的组氨酸密码子的取代，或者至少一个组氨酸密码子的插入；其中所述非人动物表达包含来源于所述小鼠种系中的组氨酸取代或组氨酸插入的免疫球蛋白重链可变结构域和/或免疫球蛋白轻链可变结构域。
在一个实施方式中，所述非人动物是哺乳动物。在一个实施方式中，所述哺乳动物是啮齿动物。在一个实施方式中，所述啮齿动物选自下组：小鼠、大鼠和仓鼠。
在一个实施方式中，所述未经重排的人源免疫球蛋白重链可变区核酸序列与非人源恒定区序列可操作地连接。
在一个实施方式中，与所述未经重排的人源免疫球蛋白重链可变区核酸序列可操作地连接的所述非人源恒定区核酸序列在所述非人动物种系中的内源性非人源免疫球蛋白基因座中。
在一个实施方式中，与所述未经重排的人源免疫球蛋白轻链可变区核酸序列可操作地连接的所述非人源恒定区核酸序列在所述非人动物种系中的内源性非人源免疫球蛋白基因座中。
在一个方面，本申请提供了一种基因修饰的非人动物，所述非人动物包含可与恒定区基因序列可操作地连接的至少一部分未经重排的人源免疫球蛋白重链可变区核酸序列(未经重排的V、D、J区段)，其中一个或多个所述未经重排的V、D和J基因区段包含至少一个针对非组氨酸密码子的组氨酸密码子取代，或者至少一个组氨酸密码子的插入；与轻链恒定区基因序列可操作地连接的重排的人源免疫球蛋白轻链可变区核酸序列(重排的VJ序列)，其中所述重排的VJ序列包括至少一个针对非组氨酸密码子的组氨酸密码子取代，或者至少一个组氨酸密码子的插入；其中所述非人动物表达包含来源于所述小鼠种系中的组氨酸取代或组氨酸插入的免疫球蛋白重链可变结构域和/或免疫球蛋白轻链可变结构域。
在一个实施方式中，所述基因修饰的非人动物是哺乳动物。在一个实施方式中，所述哺乳动物是啮齿动物。在一个实施方式中，所述啮齿动物选自下组：小鼠、大鼠和仓鼠。
在一个实施方式中，所述人源未经重排的免疫球蛋白重链可变区核酸序列与非人源恒定区序列可操作地连接。在一个实施方式中，与所述未经重排的人源免疫球蛋白重链可变区核酸序列可操作地连接的所述非人源恒定区序列是在所述非人动物种系中的内源性非人源免疫球蛋白基因座中。在一个实施方式中，与所述重排的人源免疫球蛋白轻链可变区核酸序列可操作地连接的所述非人源恒定区序列是在所述非人动物种系中的内源性非人源免疫球蛋白基因座中。
在一个方面，本申请提供了一种基因修饰的非人动物，其中所述非人动物包含B细胞群，所述B细胞群的特征为与野生型非人动物相比所述B细胞群的免疫球蛋白重链和轻链中组氨酸残基增加。在一个实施方式中，所述增加约2-4倍。在一个实施方式中，所述增加约2-10倍。
在一个方面，本申请提供了一种基因修饰的非人动物，所述非人动物表达包含由在所述非人动物的种系免疫球蛋白序列中通过取代和/或插入编码的组氨酸的免疫球蛋白的轻链和重链。
在一个方面，本申请提供了一种用于制备非人动物的方法，所述非人动物产生具有由种系组氨酸密码子编码的组氨酸的抗体可变结构域，所述方法包括：在其种系中修饰所述非人动物以便在未经重排的免疫球蛋白重链可变(未经重排的V、D、J区段)基因座中包含至少一个针对非组氨酸密码子的组氨酸密码子取代，或者组氨酸密码子插入；以及在其种系中修饰所述非人动物以使得在未经重排的免疫球蛋白轻链可变(未经重排的V、J区段)基因座中包含至少一个针对非组氨酸密码子的组氨酸密码子取代，或者组氨酸密码子插入。
在一个实施方式中，所述方法包括基因修饰所述小鼠的种系以包含至少一部分未经重排的人源免疫球蛋白重链可变(V、D、J区段)基因座，并且在所述未经重排的人源免疫球蛋白重链可变(未经重排的V、D、J区段)基因座中制备组氨酸取代或插入。
在一个实施方式中，所述方法包括基因修饰所述小鼠的种系以包含至少一部分未经重排的人源免疫球蛋白轻链(未经重排的V、J区段)基因座，并且在所述未经重排的人源免疫球蛋白轻链基因座中制备组氨酸取代或插入。
在所述方法的一个实施方式中，所述非人动物是啮齿动物。在一个实施方式中，所述啮齿动物选自小鼠、大鼠和仓鼠。
在一个方面，本申请提供了一种用于制备非人动物的方法，所述非人动物产生具有由种系组氨酸密码子编码的组氨酸的抗体可变结构域，所述方法包括：修饰所述非人动物以使得在未经重排的免疫球蛋白重链可变(未经重排的V、D、J区段)基因座中包含至少一个针对非组氨酸密码子的组氨酸密码子取代，或者组氨酸密码子插入；以及修饰所述非人动物以使得在种系中的重排的免疫球蛋白轻链可变序列(重排的VJ序列)中包含至少一个针对非组氨酸密码子的组氨酸密码子取代，或者组氨酸密码子插入。
在所述方法的一个实施方式中，所述非人动物是啮齿动物。在一个实施方式中，所述啮齿动物选自小鼠、大鼠和仓鼠。
在不同的方面和实施方式中，所述非人动物是通过基因修饰多能性或全能性细胞(例如胚胎干(ES)细胞)基因修饰的，并且使用所述基因修饰的细胞作为供体细胞与宿主胚胎在代孕母体中妊娠来源于所述经基因修饰的供体细胞的动物。在不同的方面和实施方式中，通过本领域公知的任意其他方法对所述非人动物进行基因修饰。
本申请提供了用于制备显示出pH依赖性抗原结合的抗体可变结构域的方法和组合物。本申请提供了经修饰的抗原结合蛋白以及用于制备其的组合物和方法，所述抗原结合蛋白在较低(例如内涵体)pH下以较低的亲和性结合靶抗原，在更高的(例如细胞外)或中性pH下以较高的亲和性结合相同的靶抗原。
在一个方面，本申请提供了一种用于制备显示出pH依赖性结合的抗体的方法，所述方法包括修饰抗体可变结构域的序列以加入组氨酸残基，或使用组氨酸残基取代已有的残基，以形成组氨酸修饰的可变结构域。在一个实施方式中，所述取代不是结合抗原关键性的残基(例如在中性或细胞外pH)。
在一个实施方式中，2、3、4、5或6个或者更多个残基被组氨酸取代。在一个实施方式中，所述2、3、4、5或6个或者更多个被组氨酸取代的残基在一簇中。在一个实施方式中，所述簇包含两个或多个连续的组氨酸取代。在一个实施方式中，所述簇包含两个或更多个被一个或多个非组氨酸残基分隔的组氨酸取代。在一个实施方式中，所述簇的长度为2、3、4、5、6、7、8、9或10个残基，以及针对结合抗原不是关键性的所有残基(例如在中性或细胞外pH下)被修饰为组氨酸。
在一个实施方式中，所述可变结构域是轻链可变结构域(例如κ或λ)。在一个实施方式中，所述可变结构域在重链可变结构域中。在一个实施方式中，所述轻链可变结构域和重链可变结构域的序列被修饰。
在一个实施方式中，所述可变结构域的序列是CDR序列。在一个实施方式中，所述CDR序列是重链的CDR序列。在一个实施方式中，所述CDR序列是轻链的CDR序列。在一个实施方式中，所述CDR序列是重链的CDR序列和轻链的CDR序列。
在一个实施方式中，所述CDR序列是CDR3序列。在一个实施方式中，所述CDR序列是CDR2序列。在一个实施方式中，所述CDR序列是CDR3序列。
在一个实施方式中，所述CDR序列是轻链的CDR1、CDR2和/或CDR3序列。在一个实施方式中，所述CDR序列是重链的CDR1、CDR2和/或CDR3序列。
在一个实施方式中，所述抗体可变结构域的序列是环4序列。在一个实施方式中，所述环4序列是重链环4序列。在一个实施方式中，所述环4序列是轻链环4序列。
在一个实施方式中，所述抗体可变结构域的序列是N-末端序列。在一个实施方式中，所述N-末端序列是重链N-末端序列。在一个实施方式中，所述N-末端序列是轻链N-末端序列。
在一个实施方式中，所述抗体可变结构域的序列选自重链的CDR序列、轻链的CDR序列、重链的环4序列、轻链的环4序列、重链的N-末端序列、轻链的N-末端序列及其组合。
在一个实施方式中，所述可变结构域来自重链，并且所述可变结构域的序列包含第一CDR序列和选自下述的序列：N-末端序列、环4序列、第二CDR序列、第三CDR序列及其组合。在一个特定的实施方式中，所述第一CDR序列是CDR3，并且所述可变结构域的序列还包含选自下述的序列：N-末端序列、环4序列、CDR2序列、CDR1序列及其组合。
在一个实施方式中，所述组氨酸修饰的可变结构域来自重链，并且所述组氨酸修饰在环4序列和选自下述的序列中：CDR1或CDR2或CDR3、N-末端序列及其组合。在一个特定的实施方式中，所述组氨酸修饰在环4序列和CDR3序列中。在一个特定的实施方式中，所述组氨酸修饰在环4序列和CDR3序列和N-末端序列中。在一个特定的实施方式中，所述组氨酸修饰在环4序列和N-末端序列中。
在一个方面，本申请提供了如本申请所述的组氨酸修饰的免疫球蛋白可变结构域，其中所述组氨酸修饰的免疫球蛋白可变结构域在pH低于6时不与目的抗原结合或者以第一亲和性与目的抗原结合；在pH约7或更高时以第二亲和性与相同的目的抗原结合。在一个实施方式中，所述第一pH低于5.5，或低于5。在一个实施方式中，所述第一pH是5.75，在一个实施方式中，所述第二pH是约7或更高。在一个实施方式中，所述第二pH是人的细胞外pH。在一个实施方式中，所述第二pH是7.2至7.4。在一个特定的实施方式中，所述第二pH是7.2。
在一个实施方式中，所述组氨酸修饰的可变结构域在选自CDR、N-末端、环4及其组合的序列中包含1、2、3、4、5或6个或更多个组氨酸取代。在一个特定的实施方式中，所述组氨酸修饰的可变结构域包含在CDR3中的修饰。在一个实施方式中，所述组氨酸修饰的可变结构域包含选自在重链中的CDR3的修饰、在轻链中的CDR3的修饰及其组合。在一个实施方式中，所述组氨酸修饰的可变结构域包含在CDR(例如CDR3)中的至少一个取代和在选自N-末端、环4及其组合的序列中的至少一个取代。
在一个实施方式中，所述CDR选自下组：重链CDR1、重链CDR2、重链CDR3、轻链CDR1、轻链CDR2、轻链CDR3及其组合。
在一个实施方式中，所述至少一个CDR包含轻链CDR3。在一个实施方式中，所述至少一个CDR包含轻链CDR3和重链CDR3。
在一个实施方式中，所述组氨酸修饰的免疫球蛋白可变结构域在中性或碱性pH(例如pH 7-7.4)下以约10-6或更低(例如10-7、10-8、10-9、10-10、10-11、10-12)的KD结合目的抗原，其中所述组氨酸修饰的免疫球蛋白可变结构域包含：CDR1，其中全部非抗原结合的氨基酸残基被组氨酸取代，或者其中所述CDR1包含组氨酸取代的簇。在一个实施方式中，所述可变结构域在酸性pH下(例如pH 5-6，在一个实施方式中，pH 6)不与目的抗原集合或者与目的抗原结合弱102-106倍。
在一个实施方式中，所述组氨酸修饰的免疫球蛋白可变结构域在中性或碱性pH(例如pH 7-7.4)下以约10-6或更低(例如10-7、10-8、10-9、10-10、10-11、10-12)的KD结合目的抗原，其中所述组氨酸修饰的免疫球蛋白可变结构域包含CDR2，其中全部非抗原结合的氨基酸残基被组氨酸取代，或者其中所述CDR2包含组氨酸取代的簇。在一个实施方式中，所述可变结构域在酸性pH下(例如pH 5-6，在一个实施方式中，pH 6)不与目的抗原集合或者与目的抗原结合弱102-106倍。
在一个实施方式中，所述组氨酸修饰的免疫球蛋白可变结构域在中性或碱性pH(例如pH 7-7.4)下以约10-6或更低(例如10-7、10-8、10-9、10-10、10-11、10-12)的KD结合目的抗原，其中所述组氨酸修饰的免疫球蛋白可变结构域包含CDR3，其中全部非抗原结合的氨基酸残基被组氨酸取代，或者其中所述CDR3包含组氨酸取代的簇。在一个实施方式中，所述可变结构域在酸性pH下(例如pH 5-6，在一个实施方式中，pH 6)不与目的抗原集合或者与目的抗原结合弱102-106倍。
在一个方面，本申请提供了一种制备包含组氨酸修饰的结构域的人源抗原结合多肽的方法，所述方法包括修饰如本申请所述的免疫球蛋白可变结构域核苷酸序列以使其编码一个或多个组氨酸，以形成编码组氨酸修饰的结构域的核酸序列，并且将编码所述组氨酸修饰的结构域的核酸序列与人源免疫球蛋白序列融合(直接或使用接头)。
在一个实施方式中，所述人源免疫球蛋白序列是免疫球蛋白恒定结构域序列。在一个特定的实施方式中，所述人源免疫球蛋白恒定结构域序列编码选自下组的氨基酸序列：CH1、铰链、CH2、CH3及其组合。
在一个方面，本申请提供了表达组氨酸修饰的可变结构域的细胞，其中所述组氨酸修饰的可变结构域被如上文所述修饰。在一个实施方式中，所述细胞是哺乳动物细胞。在一个实施方式中，所述细胞选自HeLa细胞、DU145细胞、Lncap细胞、MCF-7细胞、MDA-MB-438细胞、PC3细胞、T47D细胞、THP-1细胞、U87细胞、SHSY5Y(人神经母细胞瘤)细胞、Saos-2细胞、Vero细胞、CHO细胞、GH3细胞、PC12细胞、人视网膜细胞(例如PERC.6TM细胞)和MC3T3细胞。在一个特定的实施方式中，所述细胞是CHO细胞。
在一个方面，本申请提供了一种如上文所述的组氨酸修饰的免疫球蛋白可变结构域，其中所述组氨酸修饰的免疫球蛋白可变结构域在pH 5-6(例如5.75)下不与目的抗原结合或以第一亲和性与目的抗原结合并且在pH 7-7.4(例如7.2)下以第二亲和性与相同的目的抗原结合，其中至少一个CDR包含两个或多个组氨酸取代，并且至少一个非CDR序列包含一个或多个组氨酸取代，其中所述至少一个非CDR序列选自N-末端序列，环4序列及其组合。
在一个实施方式中，所述第一亲和性的特征为不结合或KD为10-6或更高(例如10-3)，所述第二亲和性的特征为比第一亲和性高至少2倍、至少5倍、至少10倍、至少102倍、至少103倍、至少104倍、至少105倍或至少106倍。
在一个实施方式中，所述非CDR序列与所述至少一个CDR序列在相同的多肽上。在一个实施方式中，所述非CDR序列与所述至少一个CDR序列在不同的多肽上。
在一个实施方式中，所述至少一个CDR是重链和/或轻链的CDR3，并且所述CDR3包含至少一半的非抗原结合氨基酸残基被组氨酸取代。在一个特定的实施方式中，所述CDR3全部的非抗原结合氨基酸残基被组氨酸取代。
在一个实施方式中，所述至少一个CDR是重链和/或轻链的CDR3，并且所述CDR3包含三个或更多个非抗原结合氨基酸残基被组氨酸取代。在一个实施方式中，四个或更多个非抗原结合氨基酸残基被组氨酸取代。
在一个实施方式中，所述至少一个CDR是重链和/或轻链的CDR3，并且所述CDR3包含两个或更多个相邻的非抗原结合氨基酸残基被组氨酸取代。在一个实施方式中，所述CDR3包含三个或更多个相邻的非抗原结合氨基酸残基被组氨酸取代。
在一个实施方式中，所述至少一个CDR是轻链和/或重链的CDR3，并且还包含选自下述的CDR：轻链CDR1、轻链CDR2及其组合。
在一个实施方式中，所述至少一个CDR是轻链和/或重链的CDR3,，并且还包含选自下述的CDR：重链CDR1、重链CDR2及其组合。
在一个实施方式中，所述CDR选自下组：重链CDR1、重链CDR2、重链CDR3、轻链CDR1、轻链CDR2、轻链CDR3及其组合。
在一个实施方式中，所述至少一个CDR包含轻链CDR3。在一个实施方式中，所示至少一个CDR包含轻链CDR3和重链CDR3。
在一个实施方式中，所述至少一个CDR是轻链和/或重链CDR3，并且所述至少一个非CDR序列是环4序列，其中所述环4序列包含一个或多个组氨酸取代。
在一个实施方式中，所述至少一个CDR是轻链和/或重链CDR3，并且所述至少一个非CDR序列是N-末端序列，其中所述N-末端序列包含一个或多个组氨酸取代。
在一个实施方式中，所述至少一个CDR是轻链CDR3，所述至少一个非CDR序列包含具有一个或多个组氨酸取代的N-末端序列和具有一个或多个组氨酸取代的环4序列。
在一个实施方式中，所述至少一个CDR是重链CDR3，所述至少一个非CDR序列包含具有一个或多个组氨酸取代的N-末端序列和具有一个或多个组氨酸取代的环4序列。
在一个实施方式中，所述组氨酸修饰的免疫球蛋白可变结构域在pH 7-7.4(例如pH 7.2)下以约10-7或更低(例如10-8、10-9、10-10、10-11、10-12)的KD结合目的抗原，其中所述组氨酸修饰的免疫球蛋白可变结构域包含CDR1，其中全部的非抗原结合氨基酸残基被组氨酸取代。
在一个实施方式中，所述组氨酸修饰的免疫球蛋白可变结构域在pH 7-7.4(例如pH 7.2)下以约10-7或更低(例如10-8、10-9、10-10、10-11、10-12)的KD结合目的抗原，其中所述组氨酸修饰的免疫球蛋白可变结构域包含CDR2，其中全部的非抗原结合氨基酸残基被组氨酸取代。
在一个实施方式中，所述组氨酸修饰的免疫球蛋白可变结构域在pH 7-7.4(例如pH 7.2)下以约10-7或更低(例如10-8、10-9、10-10、10-11、10-12)的KD结合目的抗原，其中所述组氨酸修饰的免疫球蛋白可变结构域包含CDR3，其中全部的非抗原结合氨基酸残基被组氨酸取代。
在一个方面，本申请提供了使用如本申请所述的方法在制备用于治疗人类疾病或病症的药物中的用途。在一个实施方式中，所述药物是抗体。在一个特定的实施方式中，所述抗体是人源抗体。
在一个方面，本申请提供了使用如本申请所述的组氨酸修饰的可变结构域在制备用于治疗人类疾病或病症的药物中的用途。在一个实施方式中，所述药物是抗体。在一个特定的实施方式中，所述抗体是人源抗体。
在一个方面，本申请提供了使用如本申请所述的方法或组氨酸修饰的可变结构域在制备用于治疗人类疾病或病症的药物中的用途，其中所述药物包含选自下述的抗原结合蛋白：抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)、scFv、双特异性scFv、双体、三体、四体、V-NAR、VHH、VL、F(ab)、F(ab)2、DVD(即双可变结构域抗原结合蛋白)、SVD(即单可变结构域抗原结合蛋白)或双特异性T-细胞衔接器(即BiTE)。
在一个方面，使用如本申请所述的方法以生成用于制备人源抗原结合蛋白的重链和κ或λ轻链可变区序列，所述方法还包含将重链和/或轻链组氨酸修饰的可变区序列与人源重链和轻链恒定区序列融合以形成融合的序列(直接或通过接头)，在细胞中表达所述融合的序列，并且回收所表达的包含所述融合的序列的抗原结合蛋白。在各种实施方式中，所述人源重链恒定区选自IgM、IgD、IgA、IgE和IgG。在各种特定的实施方式中，所述IgG选自IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。在各种实施方式中，所述人源重链恒定区选自包含CH1、铰链、CH2、CH3、CH4及其组合的序列。在特定的实施方式中，所述组合是CH1、铰链、CH2和CH3。在特定的实施方式中，所述组合是CH1、CH2和CH3。在特定的实施方式中，所述组合是铰链、CH2和CH3。在特定的实施方式中，所述组合是铰链、CH2和CH3。
在一个方面，本发明提供了一种用于生成抗体或抗体可变结构域的生物系统，所述抗体或抗体可变结构域在中性pH下结合靶抗原但是在酸性pH下(例如pH 5.0-6.0)显示出与相同抗原的结合降低。所述生物系统包含非人动物，例如啮齿动物(例如小鼠或大鼠)，所述非人动物具有包含一个或多个组氨酸修饰的重排的轻链序列(例如重排的V-J)。在各种方面，所述一个或多个组氨酸修饰在轻链CDR3密码子中。在各种方面，所述非人动物包含人源或人源化的重链免疫球蛋白基因座。在各种方面，所述非人动物包含内源性非人源重链可变基因区段被一个或多个人源重链VH、DH和JH区段取代，其中所述人源区段与非人源免疫球蛋白恒定区可操作地连接。在各种方面，本申请提供了具有通用轻链的非人动物，所述轻链含有具有非组氨酸残基被组氨酸残基的取代的轻链可变结构域。在各种方面，这些具有组氨酸修饰的通用轻链的非人动物(例如啮齿动物，例如小鼠)被称为组氨酸通用轻链小鼠、组氨酸-ULC小鼠或HULC小鼠。
因此，在一个方面，本申请提供了基因修饰的非人动物，所述非人动物在其种系中含有免疫球蛋白轻链基因座，所述基因座包含含有人源VL和JL区段序列的单一重排的人源免疫球蛋白轻链可变区基因序列，其中所述单一重排的人源免疫球蛋白轻链可变区基因序列含有至少一个非组氨酸密码子被组氨酸密码子的取代。在一个实施方式中，所述单一重排的人源免疫球蛋白可变区序列与免疫球蛋白轻链恒定区基因序列可操作地连接。在一个实施方式中，所述免疫球蛋白轻链恒定区基因序列是非人源免疫球蛋白轻链恒定区基因序列。在一个实施方式中，所述非人源免疫球蛋白轻链恒定区基因序列是内源性免疫球蛋白轻链恒定区基因序列。在一个实施方式中，所述非人动物缺乏具有功能的未经重排的免疫球蛋白轻链可变区。在一个实施方式中，所述免疫球蛋白轻链基因座在内源性非人源免疫球蛋白轻链基因座。
在一个实施方式中，所述动物在其种系中还含有免疫球蛋白重链基因座，所述基因座包含未经重排的免疫球蛋白重链可变区基因序列，所述序列含有与免疫球蛋白重链恒定区基因序列可操作地连接的人源VH、DH和JH区段。在一个实施方式中，所述免疫球蛋白重链恒定区基因序列是非人源重链恒定区基因序列。在一个实施方式中，所述非人源重链恒定区基因序列是内源性免疫球蛋白重链恒定区基因序列。在一个实施方式中，所述免疫球蛋白重链基因座在内源性源免疫球蛋白重链基因座。
在一个实施方式中，所述至少一个非组氨酸密码子被组氨酸密码子的取代在编码互补性决定区(CDR)的核苷酸序列中。在一个实施方式中，所述至少一个非组氨酸密码子被组氨酸密码子的取代在编码CDR3的核苷酸序列中。在一个实施方式中，所述取代是针对一个、两个、三个、四个或更多CDR3密码子的取代。在一个方面，包含在免疫球蛋白轻链基因座中的所述单一重排的人源免疫球蛋白轻链可变区序列来源于人源Vκ1-39或Vκ3-20基因区段。在一个实施方式中，所述单一重排的人源免疫球蛋白轻链可变区来源于重排的Vκ1-39/Jκ5或Vκ3-20/Jκ1基因区段。在一个实施方式中，所述单一重排的人源免疫球蛋白轻链可变区来源于重排的Vκ1-39/Jκ5基因序列，并且所述Vκ1-39/Jκ5基因序列包含设计为至少一个非组氨酸密码子被组氨酸密码子取代以便在选自105、106、108、111及其组合的位置上表达组氨酸。在另一个实施方式中，所述单一重排的人源免疫球蛋白轻链可变区来源于重排的Vκ3-20/Jκ1基因序列，并且所述Vκ3-20/Jκ1基因序列包含设计为至少一个非组氨酸密码子被组氨酸密码子取代以便在选自105、106、107、109及其组合的位置上表达组氨酸。
在一个方面，本申请所述的非人动物包含对目的抗原生成应答的B细胞群，所述B细胞群富含抗体，所述抗体在酸性pH下的解离半衰期(t1/2)与在中性pH下的相比降低至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约10倍、至少约15倍、至少约20倍、至少约25倍或至少约30倍。在一个实施方式中，与在中性pH下相比在酸性pH下t1/2的降低约30倍或更多。
在一个实施方式中，所述动物表达含有人源免疫球蛋白轻链可变结构域的抗体，所述结构域在由免疫球蛋白轻链可变区基因序列中的至少一个被取代的密码子编码的氨基酸位置上具有至少一个非组氨酸残基被组氨酸的取代。在一个实施方式中，所述动物表达尽管存在体细胞高突变但是在所表达的人源免疫球蛋白轻链可变结构域中保留了至少一个非组氨酸残基被组氨酸残基的取代的抗体。
在一个实施方式中，所述非人动物是哺乳动物。在一个实施方式中，所述哺乳动物是啮齿动物，例如大鼠或小鼠。在一个实施方式中，所述非人动物是小鼠。因此，在一个方面，本申请还提供了一种基因修饰的小鼠，所述小鼠在其种系中含有免疫球蛋白轻链基因座，所述基因座包含含有人源VL和JL区段序列的单一重排的人源免疫球蛋白轻链可变区基因序列，其中所述单一重排的人源免疫球蛋白轻链可变区基因序列含有至少一个非组氨酸密码子被组氨酸密码子的取代。在一个实施方式中，所述小鼠缺乏具有功能的未经重排的免疫球蛋白轻链可变区。
在一个实施方式中，在所述小鼠种系中的所述单一重排的免疫球蛋白轻链可变区基因序列与免疫球蛋白轻链恒定区基因序列可操作地连接。在一个实施方式中，所述免疫球蛋白轻链恒定区基因序列选自大鼠或小鼠的免疫球蛋白轻链恒定区基因序列。在一个实施方式中，所述免疫球蛋白轻链恒定区基因序列是小鼠序列。在一个实施方式中，所述免疫球蛋白轻链基因座在内源性小鼠免疫球蛋白轻链基因座。
在又一个实施方式中，所述小鼠在其种系中还包含免疫球蛋白重链基因座，所述基因座包含未经重排的免疫球蛋白重链可变区序列，所述序列含有与免疫球蛋白重链恒定区基因序列可操作地连接的人源VH、DH和JH区段。在一个方面，所述免疫球蛋白重链恒定区基因序列是大鼠或小鼠重链恒定区基因序列。在一个实施方式中，所述免疫球蛋白重链恒定区基因序列是小鼠序列。在一个实施方式中，所述免疫球蛋白重链基因座在内源性小鼠免疫球蛋白重链基因座。
在一个方面，所述小鼠包含至少一个非组氨酸密码子被组氨酸密码子的取代，其中所述取代在编码CDR的核苷酸序列中。在一个实施方式中，所述取代在CDR3密码子中，例如在一个、两个、三个、四个或更多个CDR3密码子中。在一个实施方式中，所述小鼠的免疫球蛋白轻链基因座包含来源于人源Vκ1-39或Vκ3-20基因区段的单一重排的人源免疫球蛋白轻链可变区序列，例如所述单一重排的免疫球蛋白轻链可变区序列来源于重排的Vκ1-39/Jκ5或Vκ3-20/Jκ1基因序列。在一个实施方式中，所述单一重排的免疫球蛋白轻链可变区来源于重排的Vκ1-39/Jκ5基因序列，并且所述Vκ1-39/Jκ5基因序列包含设计为至少一个非组氨酸密码子被组氨酸密码子取代以便在选自105、106、108、111及其组合的位置上表达组氨酸。在一个实施方式中，这种取代被设计为在位置105、106、108和111取代为组氨酸。在另一个实施方式中，这种取代被设计为在位置106、108和111取代为组氨酸。
在另一个实施方式中，所述单一重排的免疫球蛋白轻链可变区序列来源于重排的Vκ3-20/Jκ1基因序列，并且所述Vκ3-20/Jκ1序列包含设计为至少一个非组氨酸密码子被组氨酸密码子取代以便在选自105、106、107、109及其组合的位置上表达组氨酸。在一个实施方式中，这种取代被设计为在位置105、106、107和109取代为组氨酸。在另一个实施方式中，这种取代被设计为在位置105、106和109取代为组氨酸。
在一个实施方式中，本申请所述的小鼠包含对目的抗原生成应答的B细胞群，所述B细胞群富含抗体，所述抗体在酸性pH下的解离半衰期(t1/2)与在中性pH下的相比降低至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约10倍、至少约15倍、至少约20倍、至少约25倍或至少约30倍。在一个实施方式中，与在中性pH下相比在酸性pH下t1/2的降低是约30倍或更多。
在一个实施方式中，本申请所述的小鼠表达对目的抗原生成应答的抗原特异性抗体群，其中所有抗体包含：(a)免疫球蛋白轻链可变结构域，所述结构域来源于同一单一重排的人源轻链可变区基因序列，所述序列含有至少一个非组氨酸密码子被组氨酸密码子的取代，和(b)免疫球蛋白重链，所述重链含有来源于人源重链V、D和J区段库的人源重链可变结构域。
本申请还提供了一种非人源基因座例如小鼠基因座，所述基因座包含单一重排的人源免疫球蛋白轻链可变区基因序列，所述序列含有人源VL和JL区段序列，其中所述单一重排的人源免疫球蛋白轻链可变区基因序列包含至少一个非组氨酸密码子被组氨酸密码子的取代。在一个实施方式中，所述基因座包含在非人动物的种系中。在一个实施方式中，所述基因座包含来源于人源Vκ1-39或Vκ3-20基因区段的单一重排的人源免疫球蛋白轻链可变区基因序列，例如来源于重排的Vκ1-39/Jκ5或Vκ3-20/Jκ1基因序列。在一个实施方式中，其中在所述基因座中存在的单一重排的人源免疫球蛋白轻链可变区基因序列来源于重排的Vκ1-39/Jκ5序列，所述至少一个非组氨酸密码子被组氨酸密码子的取代被设计为在选自105、106、108、111及其组合的位置表达组氨酸。在另一个实施方式中，其中在所述基因座中存在的单一重排的人源免疫球蛋白轻链可变区基因序列来源于重排的Vκ3-20/Jκ1序列，至少一个非组氨酸密码子被组氨酸密码子取代被设计为在选自105、106、108、111及其组合的位置表达组氨酸。在各种实施方式中，可以使用下文所述的用于制备基因修饰的非人动物的方法生成本申请所述的非人源基因座。
在又一个方面，本申请提供了一种用于制备非人动物的方法，所述非人动物在其种系中包含基因修饰的免疫球蛋白轻链基因座，其中所述方法包括修饰非人动物的基因组，以便在免疫球蛋白轻链基因座中缺失内源性免疫球蛋白轻链V和J区段或使得内源性免疫球蛋白轻链V和J区段不具有功能，并且在所述基因组中放置单一重排的人源轻链可变区基因序列，所述序列含有至少一个非组氨酸密码子被组氨酸密码子取代。在一个实施方式中，这种方法生成基因修饰的非人动物，所述非人动物包含富含对目的抗原表现出pH依赖性结合的抗体的B细胞群。在一个实施方式中，位于基因组中的所述单一重排的人源免疫球蛋白轻链可变区序列来源于人源Vκ1-39或Vκ3-20，例如重排的Vκ1-39/Jκ5或Vκ3-20/Jκ1基因序列。因此，在所述实施方式中，其中所述单一重排的人源免疫球蛋白轻链可变区序列来源于重排的Vκ1-39/Jκ5，至少一个非组氨酸密码子被组氨酸密码子取代被设计为在选自105、106、108、111及其组合的位置表达组氨酸。在一个实施方式中，其中所述单一重排的人源免疫球蛋白轻链可变区序列来源于重排的Vκ3-20/Jκ1，至少一个非组氨酸密码子被组氨酸密码子取代被设计为在选自105、106、107、109及其组合的位置表达组氨酸。
在另一个方面，本申请提供了一种生成与目的抗原以pH依赖性方式结合的抗体的方法，所述方法包括：(a)生成如本申请所述的小鼠(例如在其种系中包含免疫球蛋白轻链基因座的小鼠，所述基因座包含单一重排的人源免疫球蛋白轻链可变区序列，所述序列含有人源VL和JL区段序列和在其重排的轻链可变区序列中具有至少一个非组氨酸密码子被组氨酸密码子的取代)，(b)使用目的抗原免疫所述小鼠，和(c)选择在中性pH下以所需的亲和性与目的抗原结合而在酸性pH下与目的抗原结合降低的抗体。在一个实施方式中，所述方法生成的抗体在酸性pH和37℃下显示出的t1/2为约2分钟或更短。在一个实施方式中，所述方法生成的抗体在酸性pH下的解离半衰期(t1/2)与在中性pH下的相比显示出降低至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约10倍、至少约15倍、至少约20倍、至少约25倍或至少约30倍。
在其他方面，本申请提供了生成与目的抗原以pH依赖性方式结合的抗体的其他方法。一个这种方法包括(a)选择与目的抗原以所需的亲和性结合的第一抗体，(b)修饰所述第一抗体的免疫球蛋白轻链核苷酸序列以包含至少一个非组氨酸密码子被组氨酸密码子的取代，(c)在细胞中表达所述第一抗体的免疫球蛋白重链和所述经修饰的免疫球蛋白轻链，并且(d)选择在所述细胞中表达的第二抗体，所述抗体在中性pH下针对目的抗原保留了所需的亲和性并且在酸性pH下针对目的抗原的结合降低。在一个实施方式中，所述第一抗体的免疫球蛋白轻链核苷酸序列包含单一重排的人源免疫球蛋白轻链可变区序列。在一个实施方式中，在非人动物例如小鼠中生成的所述第一抗体含有来源于单一重排的人源免疫球蛋白轻链可变区序列的免疫球蛋白轻链序列，并且所述免疫球蛋白轻链的修饰在所述单一重排的人源免疫球蛋白可变区序列中制备。在一个实施方式中，在非人动物例如小鼠中生成的所述第一抗体还含有来源于人源VH、DH和JH区段库的免疫球蛋白重链序列。在一个实施方式中，所述单一重排的人源免疫球蛋白轻链可变区序列选自Vκ1-39/Jκ5和Vκ3-20/Jκ1基因序列。在一个实施方式中，其中所述单一重排的人源免疫球蛋白轻链可变区序列是Vκ1-39/Jκ5，在所述第一抗体免疫球蛋白轻链核苷酸序列中的修饰在选自105、106、108、111及其组合的位置的CDR3密码子中制备。在一个实施方式中，其中所述单一重排的人源免疫球蛋白轻链可变区序列是Vκ3-20/Jκ1，在所述第一抗体免疫球蛋白轻链核苷酸序列中的修饰在选自105、106、107、109及其组合的位置的CDR3密码子中制备。
在一个实施方式中，生成显示出以pH依赖的方式与目的抗原结合的抗体的如本申请所示的所述方法所得到的抗体在酸性pH下的解离半衰期(t1/2)与在中性pH下的相比显示出降低至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约10倍、至少约15倍、至少约20倍、至少约25倍或至少约30倍。在一个实施方式中，生成所述抗体的所述方法所得到的抗体在酸性pH和37℃下显示出的t1/2为约2分钟或更短。
本申请提供了在非人动物种系基因组中的基因修饰的免疫球蛋白重链基因座，其中所述免疫球蛋白重链基因座包含基因修饰的未经重排的重链可变区核苷酸序列(例如一个或多个基因修饰的人源VH、D和/或JH基因区段)，其中所述未经重排的重链可变区核苷酸序列包含加入至少一个组氨酸密码子或使用组氨酸密码子取代至少一个内源性非组氨酸密码子。在各种实施方式中，所述基因修饰的未经重排的重链可变区核苷酸序列包含在编码免疫球蛋白重链可变结构域的至少一个阅读框架中的至少一个组氨酸密码子。在各种实施方式中，所述包含至少一个组氨酸密码子的未经重排的重链可变区核苷酸序列与人源或非人源重链恒定区核苷酸序列(例如编码选自IgM、IgD、IgA、IgE和IgG的免疫球蛋白同种型的重链恒定区核苷酸序列)可操作地连接。
本申请提供了非人动物(哺乳动物，例如啮齿动物，如小鼠、大鼠或仓鼠)，所述非人动物经基因工程改造以便在其种系基因组中含有免疫球蛋白重链基因组基因座，其中所述基因组基因座包含未经重排的重链可变区核苷酸序列(例如一个或多个基因修饰的人源VH、D和/或JH基因区段)，其中所述未经重排的重链可变区核苷酸序列包含加入至少一个组氨酸密码子或使用组氨酸密码子取代至少一个内源性非组氨酸密码子。在各种实施方式中，所述非人动物的基因组包含修饰(i)使全部或基本上全部内源性免疫球蛋白VH、D和/或JH基因区段缺失或使其不具有功能(例如通过在所述免疫球蛋白基因座插入核苷酸序列例如外源性核苷酸序列或通过使内源性VH、D和/或JH基因区段产生不具有功能的重排或反转)；以及(ii)引入未经重排的人源重链可变区核苷酸序列(例如基因修饰的人源VH、D或JH基因区段)，其中所述未经重排的重链可变区核苷酸序列包含加入至少一个组氨酸密码子或使用组氨酸密码子取代至少一个内源性非组氨酸密码子。在各种实施方式中，所述未经重排的重链可变区核苷酸序列存在于内源性基因座(即所述未经重排的重链可变区核苷酸序列位于野生型非人动物中)或存在于异位(即在不同于其基因组中的内源性免疫球蛋白重链基因座的基因座)或在其内源性基因座中(例如在免疫球蛋白可变基因座内，其中所述内源性基因座位于或移至基因组中的不同位置)。在各种实施方式中，所述免疫球蛋白重链可变区核苷酸序列与人源或非人源重链恒定区核苷酸序列(例如编码选自IgM、IgD、IgA、IgE和IgG的免疫球蛋白同种型的重链恒定区核苷酸序列)可操作地连接。
本申请提供了基因修饰的非人动物，所述非人动物能够表达包含一个或多个组氨酸的基因修饰的免疫球蛋白重链可变结构域，其中所述一个或多个组氨酸不是由与野生型非人动物对应的种系基因区段编码。
本申请提供了基因修饰的非人动物，所述非人动物包含B细胞群，所述B细胞群的特征为具有编码具有一个或多个组氨酸的免疫球蛋白重链可变结构域的重排的免疫球蛋白重链可变基因，所述一个或多个组氨酸不是由与野生型非人动物对应的种系基因区段编码。
本申请提供了用于制备非人动物的方法和组合物，所述非人动物包含基因修饰的免疫球蛋白重链可变基因座，所述基因座包含未经重排的人源重链可变区核苷酸序列，所述核苷酸序列在编码重链可变结构域的至少一个阅读框架中含有一个或多个组氨酸密码子。
本申请提供了用于非人动物的方法和组合物，所述方法和组合物生成显示出pH依赖性抗原结合的抗原结合蛋白。本申请提供了用于制备非人动物的方法和组合物，所述非人动物具有B细胞群或抗体群，其富含pH依赖性的抗原结合蛋白(与相应的野生型动物相比)，例如特别是重链可变结构域和/或其抗原结合片段。
在一个方面，本申请提供了在非人动物的种系基因组中的基因修饰的免疫球蛋白基因座，所述免疫球蛋白基因座包含未经重排的人源重链可变区核苷酸序列，其中所述未经重排的重链可变区核苷酸序列包含加入至少一个组氨酸密码子或使用组氨酸密码子取代至少一个内源性非组氨酸密码子。
在一个实施方式中，所述非人动物是哺乳动物，包括啮齿动物，例如小鼠、大鼠或仓鼠。
在一个实施方式中，所述组氨酸密码子的加入或取代存在于选自下述的免疫球蛋白重链基因区段中：人源VH基因区段、人源D基因区段、人源JH基因区段及其组合。在一个实施方式中，所述免疫球蛋白重链基因区段选自人源种系VH基因区段、人源种系D基因区段、人源种系JH基因区段及其组合。
在一个实施方式中，所述人源V基因区段(VH)选自下组：VH1-2、VH1-3、VH1-8、VH1-18、VH1-24、VH1-45、VH1-46、VH1-58、VH1-69、VH2-5、VH2-26、VH2-70、VH3-7、VH3-9、VH3-11、VH3-13、VH3-15、VH3-16、VH3-20、VH3-21、VH3-23、VH3-30、VH3-30-3、VH3-30-5、VH3-33、VH3-35、VH3-38、VH3-43、VH3-48、VH3-49、VH3-53、VH3-64、VH3-66、VH3-72、VH3-73、VH3-74、VH4-4、VH4-28、VH4-30-1、VH4-30-2、VH4-30-4、VH4-31、VH4-34、VH4-39、VH4-59、VH4-61、VH5-51、VH6-1、VH7-4-1、VH7-81及其组合。
在一个实施方式中，所述人源D基因区段选自下组：D1-1、D1-7、D1-14、D1-20、D1-26、D2-2、D2-8、D2-15、D2-21、D3-3、D3-9、D3-10、D3-16、D3-22、D4-4、D4-11、D4-17、D4-23、D5-12、D5-5、D5-18、D5-24、D6-6、D6-13、D6-19、D6-25、D7-27及其组合。
在一个实施方式中，所述人源J基因区段选自下组：JH1、JH2、JH3、JH4、JH5、JH6及其组合。
在一个实施方式中，所述加入或取代的组氨酸密码子存在于编码N-末端区、环4区、CDR1、CDR2、CDR3及其组合的未经重排的重链可变区核苷酸序列中。
在一个实施方式中，所述未经重排的重链可变区核苷酸序列包含2个或更多个、3个或更多个、4个或更多个、5个或更多个、6个或更多个、7个或更多个、8个或更多个、9个或更多个、10个或更多个、11个或更多个、12个或更多个、13个或更多个、14个或更多个、15个或更多个、16个或更多个、17个或更多个、18个或更多个、19个或更多个、20个或更多个、21个或更多个、22个或更多个、23个或更多个、24个或更多个、25个或更多个、26个或更多个、27个或更多个、28个或更多个、29个或更多个、30个或更多个、31个或更多个、32个或更多个、33个或更多个、34个或更多个、35个或更多个、36个或更多个、37个或更多个、38个或更多个、39个或更多个、40个或更多个、41个或更多个、42个或更多个、43个或更多个、44个或更多个、45个或更多个、46个或更多个、47个或更多个、48个或更多个、49个或更多个、50个或更多个、51个或更多个、52个或更多个、53个或更多个、54个或更多个、55个或更多个、56个或更多个、57个或更多个、58个或更多个、59个或更多个、60个或更多个或者61个或更多个组氨酸密码子。
在一个实施方式中，所述未经重排的重链可变区核苷酸序列与编码选自IgM、IgD、IgG、IgE和IgA的免疫球蛋白同种型的人源或非人源重链恒定区核苷酸序列可操作地连接。
在一个实施方式中，所述人源未经重排的免疫球蛋白重链可变区核苷酸序列与选自CH1、铰链、CH2、CH3及其组合的人源或非人源重链恒定区核苷酸序列可操作地连接。在一个实施方式中，所述重链恒定区核苷酸序列含有CH1、铰链、CH2和CH3(CH1-铰链-CH2-CH3)。
在一个实施方式中，重链恒定区核苷酸序列在内源性基因座(即所述核苷酸序列位于野生型非人动物中)或存在于异位(即在其基因组的不同于内源性免疫球蛋白链基因座的位置，或在其内源性基因座中，例如在免疫球蛋白可变基因座中，其中所述内源性基因座位于或被移至基因组中的不同位置)。
在一个实施方式中，所述重链恒定区核苷酸序列含有在CH2或CH3中的修饰，其中所述修饰在酸性环境中(例如在内涵体中，其pH范围约5.5至约6.0)增加所述重链恒定区氨基酸序列与FcRn的亲和性。
在一个实施方式中，所述重链恒定区核苷酸序列编码人源重链恒定区氨基酸序列，所述氨基酸序列包含在位置250(例如E或Q)；250和428(例如L或F)；252(例如L/Y/F/W或T)、254(例如S或T)和256(例如S/R/Q/E/D或T)的修饰；或在位置428和/或433(例如L/R/S/P/Q或K)和/或434(例如H/F或Y)的修饰；或在位置250和/或428的修饰；或在位置307或308(例如308F、V308F)和434的修饰。在一个实施方式中，所述修饰包含428L(例如M428L)和434S(例如N434S)修饰；428L、259I(例如V259I)和308F(例如V308F)修饰；433K(例如H433K)和434(例如434Y)修饰；252、254和256(例如252Y、254T和256E)修饰；250Q和428L修饰(例如T250Q和M428L)以及307和/或308修饰(例如308F或308P)，其中所述修饰在酸性环境中(例如在内涵体中，其pH范围约5.5至约6.0)增加所述重链恒定区氨基酸序列对FcRn的亲和性。
在一个实施方式中，所述重链恒定区核苷酸序列编码人源CH2氨基酸序列，所述氨基酸序列包含在位置252和257的氨基酸残基之间的至少一个修饰，其中所述修饰在酸性环境中(例如在内涵体中，其pH范围约5.5至约6.0)增加所述人源CH2氨基酸序列对FcRn的亲和性。
在一个实施方式中，所述重链恒定区核苷酸序列编码人源CH2氨基酸序列，所述氨基酸序列包含在位置307和311的氨基酸残基之间的至少一个修饰，其中所述修饰在酸性环境中(例如在内涵体中，其pH范围约5.5至约6.0)增加所述CH2氨基酸序列对FcRn的亲和性。
在一个实施方式中，所述重链恒定区核苷酸序列编码人源CH3氨基酸序列，所述氨基酸序列包含在位置433和436的氨基酸残基之间的至少一个修饰，其中所述修饰在酸性环境中(例如在内涵体中，其pH范围约5.5至约6.0)增加所述CH3氨基酸序列对FcRn的亲和性。
在一个实施方式中，所述重链恒定区核苷酸序列编码人源重链恒定区氨基酸序列，所述氨基酸序列包含选自下组的突变：M428L、N434S及其组合。
在一个实施方式中，所述重链恒定区核苷酸序列编码人源重链恒定区氨基酸序列，所述氨基酸序列包含选自下组的突变：M428L、V259I、V308F及其组合。
在一个实施方式中，所述重链恒定区核苷酸序列编码人源重链恒定区氨基酸序列，所述氨基酸序列包含N434A突变。
在一个实施方式中，所述重链恒定区核苷酸序列编码人源重链恒定区氨基酸序列，所述氨基酸序列包含选自下组的突变：M252Y、S254T、T256E及其组合。
在一个实施方式中，所述重链恒定区核苷酸序列编码人源重链恒定区氨基酸序列，所述氨基酸序列包含选自下组的突变：T250Q、M248L或这两者。
在一个实施方式中，所述重链恒定区核苷酸序列编码人源重链恒定区氨基酸序列，所述氨基酸序列包含选自下组的突变：H433K、N434Y或这两者。
在一个实施方式中，所述基因修饰的免疫球蛋白基因座包含：(1)第一等位基因，其中如上文所述的未经重排的人源免疫球蛋白重链可变区核苷酸序列与第一重链恒定区核苷酸序列可操作地连接，所述第一重链恒定区核苷酸序列编码选自IgG1、IgG2、IgG4及其组合的人源IgG的第一CH3氨基酸序列；和(2)第二等位基因，其中如本申请所述的未经重排的人源免疫球蛋白重链可变区核苷酸序列与第二重链恒定区核苷酸序列可操作地连接，所述第二重链恒定区核苷酸序列编码选自IgG1、IgG2、IgG4及其组合的人源IgG的第二CH3氨基酸序列，并且其中所述第二CH3氨基酸序列包含使所述第二CH3氨基酸序列与蛋白A的结合降低或消除的修饰(参见例如US 2010/0331527A1)。
在一个实施方式中，所述第二CH3氨基酸序列包含H95R修饰(根据IMGT外显子编号；根据EU编号为H435R)。在一个实施方式中，所述第二CH3氨基酸序列还包含Y96F修饰(根据IMGT外显子编号；根据EU编号为H436F)。在另一个实施方式中，所述第二CH3氨基酸序列包含H95R修饰(根据IMGT外显子编号；根据EU编号为H435R)和Y96F修饰(根据IMGT外显子编号；根据EU编号为H436F)这两者。
在一个实施方式中，所述第二CH3氨基酸序列来自经修饰的人源IgG1并且还包含选自下组的突变：D16E、L18M、N44S、K52N、V57M和V82I(IMGT；根据EU编号为D356E、L38M、N384S、K392N、V397M和V422I)。
在一个实施方式中，所述第二CH3氨基酸序列来自经修饰的人源IgG2并且还包含选自下组的突变：N44S、K52N和V82I(IMGT；根据EU编号为N384S、K392N和V422I)。
在一个实施方式中，所述第二CH3氨基酸序列来自经修饰的人源IgG4并且还包含选自下组的突变：Q15R、N44S、K52N、V57M、R69K、E79Q和V82I(IMGT；根据EU编号为Q355R、N384S、K392N、V397M、R409K、E419Q和V422I)。
在一个实施方式中，所述重链恒定区氨基酸序列是非人源恒定区氨基酸序列，并且所述重链恒定区氨基酸序列包含上文所述任意类型的修饰中的一种或多种。
在一个实施方式中，所述重链恒定区核苷酸序列是人源重链恒定区氨基酸序列，并且所述人源重链恒定区氨基酸序列包含上文所述任意类型的修饰中的一种或多种。
在一个实施方式中，全部或基本上全部内源性的VH、D和JH基因区段从免疫球蛋白重链基因座中缺失或者使其不具有功能(例如通过在免疫球蛋白基因座中插入核苷酸序列(例如外源性的核苷酸序列)或者通过使内源性VH、D、JH区段进行不具有功能的重排或反转)。在一个实施方式中，例如，约80％或更多的、约85％或更多的、约90％或更多的、约95％或更多的、约96％或更多的、约97％或更多的、约98％或更多的或者约99％或更多的全部的内源性VH、D或JH基因区段被缺失或使其不具有功能。在一个实施方式中，例如，至少95％、96％、97％、98％或99％的内源性具有功能的V、D或J基因区段被缺失或使其不具有功能。
在一个实施方式中，所述基因修饰的免疫球蛋白重链基因座包含使全部或基本上全部的内源性VH、D和JH基因区段缺失或使其不具有功能的修饰；并且所述基因修饰的基因座包含未经重排的重链可变区核苷酸序列，所述核苷酸序列含有具有一个或多个组氨酸密码子的一个或多个人源VH、D和/或JH基因区段，其中所述未经重排的重链可变区核苷酸序列存在于内源性位置(即所述核苷酸序列位于野生型非人动物中)或存在于异位(即在其基因组的不同于内源性免疫球蛋白链基因座的位置，或在其内源性基因座中，例如在免疫球蛋白可变基因座中，其中所述内源性基因座位于或被移至基因组中的不同位置)。
在一个实施方式中，所述基因修饰的免疫球蛋白基因座包含内源性Adam6a基因、Adam6b基因或者这两者，并且所述基因修饰不会影响所述内源性Adam6a基因、Adam6b基因或者这两者的表达和/或功能。
在一个实施方式中，所述基因修饰的免疫球蛋白基因座包含异位存在的Adam6a基因、Adam6b基因或者这两者。在一个实施方式中，所述Adam6a基因是非人源Adam6a基因。在一个实施方式中，所述Adam6a基因是人源Adam6a基因。在一个实施方式中，所述Adam6b基因是非人源Adam6b基因。在一个实施方式中，所述Adam6b基因是人源Adam6b基因。
在一个实施方式中，所述基因修饰的免疫球蛋白基因座还包含人源化的、未经重排的λ和/或κ轻链可变基因序列。在一个实施方式中，所述人源化的、未经重排的λ和/或κ轻链可变基因序列与免疫球蛋白轻链恒定区核苷酸序列可操作地连接，所述轻链恒定区核苷酸序列选自λ轻链恒定区核苷酸序列和κ轻链恒定区核苷酸序列。在一个实施方式中，所述人源化的、未经重排的λ轻链可变区核苷酸序列与λ轻链恒定区核苷酸序列可操作地连接。在一个实施方式中，所述λ轻链恒定区核苷酸序列是小鼠、大鼠或人源序列。在一个实施方式中，所述人源化的、未经重排的κ轻链可变区核苷酸序列与κ轻链恒定区核苷酸序列可操作地连接。在一个实施方式中，所述κ轻链恒定区核苷酸序列是小鼠、大鼠或人源序列。
在一个实施方式中，所述基因修饰的免疫球蛋白基因座包含未经重排的轻链可变基因序列，所述未经重排的轻链可变基因序列含有在编码轻链可变结构域的至少一个阅读框架中引入至少一个组氨酸密码子的至少一个修饰。在一个实施方式中，所述基因修饰的免疫球蛋白基因座包含重排的序列(例如重排的λ或κV/J序列)，所述序列在轻链CDR中含有1个、2个、3个或4个组氨酸密码子。在一个实施方式中，所述CDR选自CDR1、CDR2、CDR3及其组合。在一个实施方式中，所述未经重排的或重排的轻链可变区核苷酸序列是未经重排的或重排的人源λ或κ轻链可变区核苷酸序列。在一个实施方式中，所述未经重排的或重排的人源λ或κ轻链可变区核苷酸序列存在于内源性小鼠免疫球蛋白轻链基因座。在一个实施方式中，所述小鼠免疫球蛋白轻链基因座是小鼠κ基因座。在一个实施方式中，所述小鼠免疫球蛋白轻链基因座是小鼠λ基因座。
在一个实施方式中，如本申请所述的基因修饰的免疫球蛋白基因座存在于小鼠的免疫球蛋白重链基因座中。在一个实施方式中，所述基因修饰的免疫球蛋白基因座存在于小鼠中的人源化的免疫球蛋白重链基因座中。
在一个实施方式中，由如本申请所述的基因修饰的免疫球蛋白重链基因座表达的含有重链可变结构域的抗原结合蛋白与不具有基因修饰的相应野生型重链可变结构域相比在酸性环境中(例如在约5.5至约6.0的pH下)显示出更弱的抗原结合。
在一个实施方式中，由如本申请所述的基因修饰的免疫球蛋白重链基因座表达的含有重链可变结构域的抗原结合蛋白在25℃下在酸性pH下(例如pH约5.5至约6.0)具有的解离半衰期(t1/2)短于2min。在一个实施方式中，由如本申请所述的经基因修饰的免疫球蛋白重链基因座表达的含有重链可变结构域的抗原结合蛋白在37℃下在酸性pH下(例如pH约5.5至约6.0)具有的解离半衰期(t1/2)短于2min。在一个实施方式中，由如本申请所述的经基因修饰的免疫球蛋白重链基因座表达的含有重链可变结构域的抗原结合蛋白在25℃下在酸性pH下(例如pH约5.5至约6.0)具有的解离半衰期(t1/2)短于1min。在一个实施方式中，由如本申请所述的经基因修饰的免疫球蛋白重链基因座表达的含有重链可变结构域的抗原结合蛋白在37℃下在酸性pH下(例如pH约5.5至约6.0)具有的解离半衰期(t1/2)短于1min。在一个实施方式中，由如本申请所述的经基因修饰的免疫球蛋白重链基因座表达的含有重链可变结构域的抗原结合蛋白在酸性pH下(例如pH约5.5至约6.0)的解离半衰期(t1/2)比所述抗原结合蛋白在中性pH下(例如pH约7.0至约7.4)的解离半衰期(t1/2)降低至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约10倍、至少约15倍、至少约20倍、至少约25倍或至少约30倍。
在一个实施方式中，本申请所述的基因修饰的免疫球蛋白基因座包含B细胞群，所述B细胞群经目的抗原刺激后能够产生抗原结合蛋白例如抗体，所述抗原结合蛋白含有具有一个或多个组氨酸残基的重链可变结构域。如本申请所述的抗原结合蛋白，当向受试者施用时，与相应的野生型抗原结合蛋白相比显示出增加的血清半衰期，所述野生型抗原结合蛋白具有相似的或足够相似的编码重链可变结构域的氨基酸序列，但是在所述重链可变结构域中不包含组氨酸残基。在一些实施方式中，本申请所述的抗原结合蛋白显示出增加的血清半衰期，其与相应的野生型抗原结合蛋白相比高至少约2倍、至少约5倍、至少约10倍、至少约15倍、至少约20倍，所述野生型抗原结合蛋白具有相似的或足够相似的编码重链可变结构域的氨基酸序列，但是在所述重链可变结构域中不包含组氨酸残基。
在一个实施方式中，由如本申请所述的基因修饰的免疫球蛋白基因座表达的含有重链可变结构域的抗原结合蛋白与不含本申请所述的基因修饰的野生型抗原结合蛋白相比具有的特征为pH依赖性循环改善、血清半衰期增加或两者兼而有之。
在一个方面，本申请提供了一种在非人动物的种系基因组中的基因修饰的免疫球蛋白基因座，所述基因修饰的免疫球蛋白基因座含有未经重排的人源重链可变区核苷酸序列，其中所述人源未经重排的重链可变区核苷酸序列包含使用组氨酸密码子取代至少一个内源性非组氨酸密码子。
在一个实施方式中，所述非人动物是哺乳动物，包括啮齿动物，例如小鼠、大鼠或仓鼠。
在一个实施方式中，2个或更多个、3个或更多个、4个或更多个、5个或更多个、6个或更多个、7个或更多个、8个或更多个、9个或更多个、10个或更多个、11个或更多个、12个或更多个、13个或更多个、14个或更多个、15个或更多个、16个或更多个、17个或更多个、18个或更多个、19个或更多个、20个或更多个、21个或更多个、22个或更多个、23个或更多个、24个或更多个、25个或更多个、26个或更多个、27个或更多个、28个或更多个、29个或更多个、30个或更多个、31个或更多个、32个或更多个、33个或更多个、34个或更多个、35个或更多个、36个或更多个、37个或更多个、38个或更多个、39个或更多个、40个或更多个、41个或更多个、42个或更多个、43个或更多个、44个或更多个、45个或更多个、46个或更多个、47个或更多个、48个或更多个、49个或更多个、50个或更多个、51个或更多个、52个或更多个、53个或更多个、54个或更多个、55个或更多个、56个或更多个、57个或更多个、58个或更多个、59个或更多个、60个或更多个或者61个或更多个内源性非组氨酸密码子被组氨酸密码子取代。
在一个实施方式中，所述内源性非组氨酸密码子编码选自下述的氨基酸：Y、N、D、Q、S、W和R。
在一个实施方式中，被组氨酸密码子取代的所述内源性非组氨酸密码子存在于未经重排的重链可变区核苷酸序列中，所述未经重排的重链可变区核苷酸序列编码选自下组的免疫球蛋白可变结构域：N-末端区、环4区、CDR1、CDR2、CDR3及其组合。
在一个实施方式中，所述取代的组氨酸密码子存在于未经重排的重链可变区核苷酸序列中，所述未经重排的重链可变区核苷酸序列编码选自下述的互补性决定区(CDR)：CDR1、CDR2、CDR3及其组合。
在一个实施方式中，所述取代的组氨酸密码子存在于未经重排的重链可变区核苷酸序列中，所述未经重排的重链可变区核苷酸序列编码选自下述的框架区(FR)：FR1、FR2、FR3、FR4及其组合。
在一个实施方式中，所述未经重排的重链可变区核苷酸序列包含基因修饰的人源VH基因区段，其中所述人源VH基因区段的至少一个阅读框架中的一个或多个内源性非组氨酸密码子被组氨酸密码子取代。
在一个实施方式中，所述人源未经重排的重链可变区核苷酸序列包含使用组氨酸密码子取代人源VH基因区段的至少一个内源性非组氨酸密码子的修饰，其中所述人源VH基因区段选自下组：VH1-2、VH1-3、VH1-8、VH1-18、VH1-24、VH1-45、VH1-46、VH1-58、VH1-69、VH2-5、VH2-26、VH2-70、VH3-7、VH3-9、VH3-11、VH3-13、VH3-15、VH3-16、VH3-20、VH3-21、VH3-23、VH3-30、VH3-30-3、VH3-30-5、VH3-33、VH3-35、VH3-38、VH3-43、VH3-48、VH3-49、VH3-53、VH3-64、VH3-66、VH3-72、VH3-73、VH3-74、VH4-4、VH4-28、VH4-30-1、VH4-30-2、VH4-30-4、VH4-31、VH4-34、VH4-39、VH4-59、VH4-61、VH5-51、VH6-1、VH7-4-1、VH7-81及其组合。
在一个实施方式中，所述人源未经重排的重链可变区核苷酸序列包含基因修饰的人源JH基因区段，其中所述人源JH基因区段的至少一个阅读框架中的一个或多个内源性非组氨酸密码子被组氨酸密码子取代。
在一个实施方式中，所述人源未经重排的重链可变区核苷酸序列包含修饰，所述修饰是使用组氨酸密码子取代人源JH区段的至少一个内源性非组氨酸密码子，其中所述人源JH基因区段选自下组：JH1、JH2、JH3、JH4、JH5、JH6及其组合。
在一个实施方式中，所述取代的组氨酸密码子存在于编码CDR3的一部分的重链可变区核苷酸序列中。在一个实施方式中，所述CDR3的一部分包含来源于基因修饰的人源D基因区段的阅读框架的氨基酸序列，所述基因修饰的D基因区段含有使用组氨酸密码子取代在阅读框架中的至少一个内源性非组氨酸密码子的修饰。
在一个实施方式中，所述被组氨酸密码子取代的内源性非组氨酸密码子编码选自下述的氨基酸：Y、N、D、Q、S、W和R。
在一个实施方式中，所述取代的组氨酸密码子存在于在人源化免疫球蛋白小鼠中最常见的人源D基因区段的至少一个阅读框架中。
在一个实施方式中，编码CDR3的一部分的所述基因修饰的人源D基因区段的阅读框架选自疏水性框架、终止框架和亲水性框架。
在一个实施方式中，所述阅读框架是人源D基因区段的疏水性框架。
在一个实施方式中，所述人源D基因区段的疏水性框架包含编码选自下组的氨基酸序列的核苷酸序列：D1-1(GTTGT；SEQ ID NO:88)、D1-7(GITGT；SEQ ID NO:89)、D1-20(GITGT；SEQ ID NO:89)和D1-26(GIVGAT；SEQ ID NO:90)，并且所述人源D基因区段还包含使用组氨酸密码子取代在所述核苷酸序列中的至少一个内源性非组氨酸密码子的修饰。
在一个实施方式中，所述人源D基因区段的疏水性框架包含编码选自下组的氨基酸序列的核苷酸序列：D2-2(DIVVVPAAI；SEQ ID NO:92)、D2-8(DIVLMVYAI；SEQ ID NO:94)、D2-15(DIVVVVAAT；SEQ ID NO:95)和D2-21(HIVVVTAI；SEQ ID NO:97)，并且所述人源D基因区段还包含使用组氨酸密码子取代在所述核苷酸序列中的至少一个内源性非组氨酸密码子的修饰。
在一个实施方式中，所述人源D基因区段的疏水性框架包含编码选自下组的氨基酸序列的核苷酸序列：D3-3(ITIFGVVII；SEQ ID NO:98)、D3-9(ITIF*LVII；SEQ ID NO:99,SEQ ID NO:100)、D3-10(ITMVRGVII；SEQ ID NO:101)、D3-16(IMITFGGVIVI；SEQ ID NO:102)和D3-22(ITMIVVVIT；SEQ ID NO:103)，并且所述人源D基因区段还包含使用组氨酸密码子取代在所述核苷酸序列中的至少一个内源性密码子的修饰。
在一个实施方式中，所述人源D基因区段的疏水性框架包含编码选自下组的氨基酸序列的核苷酸序列：D4-4(TTVT；SEQ ID NO:105)、D4-11(TTVT；SEQ ID NO:105)、D4-17(TTVT；SEQ ID NO:105)、D4-23(TTVVT；SEQ ID NO:106)，并且所述人源D基因区段还包含使用组氨酸密码子取代在所述核苷酸序列中的至少一个内源性非组氨酸密码子的修饰。
在一个实施方式中，所述人源D基因区段的疏水性框架包含编码选自下组的氨基酸序列的核苷酸序列：D5-5(VDTAMV；SEQ ID NO:107)、D5-12(VDIVATI；SEQ ID NO:108)、D5-18(VDTAMV；SEQ ID NO:107)和D5-24(VEMATI；SEQ ID NO:109)，并且所述人源D基因区段还包含使用组氨酸密码子取代在所述核苷酸序列中的至少一个内源性非组氨酸密码子的修饰。
在一个实施方式中，所述人源D基因区段的疏水性框架包含编码选自下组的氨基酸序列的核苷酸序列：D6-6(SIAAR；SEQ ID NO:111)、D6-13(GIAAAG；SEQ ID NO:113)和D6-19(GIAVAG；SEQ ID NO:115)，并且所述人源D基因区段还包含使用组氨酸密码子取代在所述核苷酸序列中的至少一个内源性非组氨酸密码子的修饰。
在一个实施方式中，所述疏水性框架包含编码人源D7-27(LTG)的核苷酸序列，并且所述人源D基因区段还包含使用组氨酸密码子取代在所述核苷酸序列中的至少一个内源性非组氨酸密码子的修饰。
在一个实施方式中，所述阅读框架是人源D基因区段的终止阅读框架。
在一个实施方式中，所述人源D基因区段的终止阅读框架包含编码选自下组的氨基酸序列的核苷酸序列：D1-1(VQLER；SEQ ID NO:8)、D1-7(V*LEL)、D1-20(V*LER)、D1-26(V*WELL；SEQ ID NO:12)，并且所述人源D基因区段还包含使用组氨酸密码子取代在所述核苷酸序列中的至少一个内源性非组氨酸密码子的修饰。
在一个实施方式中，所述人源D基因区段的终止阅读框架包含编码选自下组的氨基酸序列的核苷酸序列：D2-2(RIL**YQLLY；SEQ ID NO:14)、D2-8(RILY*WCMLY；SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:17)、D2-15(RIL*WW*LLL)和D2-21(SILWW*LLF；SEQ ID NO:19)，并且所述人源D基因区段还包含使用组氨酸密码子取代在所述核苷酸序列中的至少一个内源性非组氨酸密码子的修饰。
在一个实施方式中，所述人源D基因区段的终止阅读框架包含编码选自下组的氨基酸序列的核苷酸序列：D3-3(VLRFLEWLLY；SEQ ID NO:21)、D3-9(VLRYFDWLL*；SEQ ID NO:23)、D3-10(VLLWFGELL*；SEQ ID NO:25)、D3-16(VL*LRLGELSLY；SEQ ID NO:27)和D3-22(VLL***WLLL；SEQ ID NO:29)，并且所述人源D基因区段包含使用组氨酸密码子取代在所述核苷酸序列中的至少一个内源性非组氨酸密码子的修饰。
在一个实施方式中，所述人源D基因区段的终止阅读框架包含编码选自下组的氨基酸序列的核苷酸序列：D4-4(*LQ*L)、D4-11(*LQ*L)、D4-17(*LR*L)和D4-23(*LRW*L)，并且所述人源D基因区段包含使用组氨酸密码子取代在所述核苷酸序列中的至少一个内源性非组氨酸密码子的修饰。
在一个实施方式中，所述人源D基因区段的终止阅读框架包含编码选自下组的氨基酸序列的核苷酸序列：D5-5(WIQLWL；SEQ ID NO:35)；D5-12(WI*WLRL；SEQ ID NO:37)、D5-18(WIQLWL；SEQ ID NO:35)和D5-24(*RWLQL；SEQ ID NO:39)，并且所述人源D基因区段包含使用组氨酸密码子取代在所述核苷酸序列中的至少一个内源性非组氨酸密码子的修饰。
在一个实施方式中，所述人源D基因区段的终止阅读框架包含编码选自下组的氨基酸序列的核苷酸序列：D6-6(V*QLV)、D6-13(V*QQLV；SEQ ID NO:41)和D6-19(V*QWLV；SEQID NO:43)，并且所述人源D基因区段还包含使用组氨酸密码子取代在所述核苷酸序列中的至少一个内源性非组氨酸密码子的修饰。
在一个实施方式中，所述人源D基因区段的终止阅读框架包含编码D7-27(*LG)的核苷酸序列，并且所述人源D基因区段还包含使用组氨酸密码子取代在所述核苷酸序列中的至少一个内源性非组氨酸密码子的修饰。
在一个实施方式中，所述阅读框架是人源D基因区段的亲水性框架。
在一个实施方式中，所述人源D基因区段的亲水性框架包含编码选自下组的氨基酸序列的核苷酸序列：D1-1(YNWND；SEQ ID NO:45)、D1-7(YNWNY；SEQ ID NO:47)、D1-20(YNWND；SEQ ID NO:45)和D1-26(YSGSYY；SEQ ID NO:49)，并且所述人源D基因区段还包含使用组氨酸密码子取代在所述核苷酸序列中的至少一个内源性密码子的修饰。在一个实施方式中，所述亲水性框架包含编码选自下组的氨基酸序列的核苷酸序列：SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:50及其组合。
在一个实施方式中，所述人源D基因区段的亲水性框架包含编码选自下组的氨基酸序列的核苷酸序列：D2-2(GYCSSTSCYT；SEQ ID NO:51)、D2-8(GYCTNGVCYT；SEQ ID NO:53)、D2-15(GYCSGGSCYS；SEQ ID NO:55)和D2-21(AYCGGDCYS；SEQ ID NO:57)，并且所述人源D基因区段还包含使用组氨酸密码子取代在所述核苷酸序列中的至少一个内源性密码子的修饰。在一个实施方式中，所述亲水性框架包含编码选自下组的氨基酸序列的核苷酸序列：SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:58及其组合。
在一个实施方式中，所述人源D基因区段的亲水性框架包含编码选自下组的氨基酸序列的核苷酸序列：D3-3(YYDFWSGYYT；SEQ ID NO:59)、D3-9(YYDILTGYYN；SEQ ID NO:61)、D3-10(YYYGSGSYYN；SEQ ID NO:63)、D3-16(YYDYVWGSYRYT；SEQ ID NO:65)和D3-22(YYYDSSGYYY；SEQ ID NO:67)，并且所述人源D基因区段还包含使用组氨酸密码子取代在所述核苷酸序列中的至少一个内源性密码子的修饰。在一个实施方式中，所述亲水性框架包含编码选自下组的氨基酸序列的核苷酸序列：SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:68及其组合。
在一个实施方式中，所述人源D基因区段的亲水性框架包含编码选自下组的氨基酸序列的核苷酸序列：D4-4(DYSNY；SEQ ID NO:69)、D4-11(DYSNY；SEQ ID NO:69)、D4-17(DYGDY；SEQ ID NO:71)和D4-23(DYGGNS；SEQ ID NO:73)，并且所述人源D基因区段包含使用组氨酸密码子取代在所述核苷酸序列中的至少一个内源性密码子的修饰。在一个实施方式中，所述亲水性框架包含编码选自下组的氨基酸序列的核苷酸序列：SEQ ID NO:70、SEQID NO:72、SEQ ID NO:74及其组合。
在一个实施方式中，所述人源D基因区段的亲水性框架包含编码选自下组的氨基酸序列的核苷酸序列：D5-5(GYSYGY；SEQ ID NO:75)、D5-12(GYSGYDY；SEQ ID NO:77)、D5-18(GYSYGY；SEQ ID NO:75)和D5-24(RDGYNY；SEQ ID NO:79)，并且所述人源D基因区段还包含使用组氨酸密码子取代在所述核苷酸序列中的至少一个内源性密码子的修饰。在一个实施方式中，所述亲水性框架包含编码选自下组的氨基酸序列的核苷酸序列：SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:80及其组合。
在一个实施方式中，所述人源D基因区段的亲水性框架包含编码选自下组的氨基酸序列的核苷酸序列：D6-6(EYSSSS；SEQ ID NO:81)、D6-13(GYSSSWY；SEQ ID NO:83)和D6-19(GYSSGWY；SEQ ID NO:85)，并且所述人源D基因区段还包含使用组氨酸密码子取代在所述核苷酸序列中的至少一个内源性密码子的修饰。在一个实施方式中，所述亲水性框架包含编码选自下组的氨基酸序列的核苷酸序列：SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:76及其组合。
在一个实施方式中，所述人源D基因区段的亲水性框架包含编码D7-27(NWG)的核苷酸序列，并且所述人源D基因区段还包含使用组氨酸密码子取代在所述核苷酸序列中的至少一个内源性密码子的修饰。
在一个实施方式中，所述人源D基因区段的亲水性框架包含选自下组的编码氨基酸序列的核苷酸序列：SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:52、SEQ IDNO:54、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:64、SEQ IDNO:66、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:76、SEQ IDNO:78、SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:86及其组合。
在一个实施方式中，所述人源未经重排的免疫球蛋白重链可变区核苷酸序列可操作地与选自下述的人源或非人源重链恒定区核苷酸序列连接：CH1、铰链、CH2、CH3及其组合。在一个实施方式中，所述重链恒定区核苷酸序列包含CH1、铰链、CH2和CH3(CH1-铰链-CH2-CH3)。
在一个实施方式中，重链恒定区核苷酸序列存在于内源性基因座(例如所述核苷酸序列位于野生型非人动物中)或存在于异位(即在其基因组的不同于内源性免疫球蛋白链基因座的位置，或在其内源性基因座中，例如在免疫球蛋白可变基因座中，其中所述内源性基因座位于或被移至基因组中的不同位置)。
在一个实施方式中，所述重链恒定区核苷酸序列包含在CH2或CH3中的修饰，其中所述修饰在酸性环境中(例如，在内涵体中，其pH范围约5.5至约6.0)增加所述重链恒定区氨基酸序列对FcRn的亲和性。
在一个实施方式中，编码人源重链恒定区氨基酸序列的所述重链恒定区核苷酸序列包含在位置250(例如E或Q)；250和428(例如L或F)的修饰；252(例如L/Y/F/W或T)、254(例如S或T)和256(例如S/R/Q/E/D或T)的修饰；或在位置428和/或433(例如L/R/S/P/Q或K)和/或434(例如H/F或Y)的修饰；或在位置250和/或428的修饰；或在位置307或308(例如308F、V308F)和434的修饰。在一个实施方式中，所述修饰包含428L(例如M428L)和434S(例如N434S)修饰；428L、259I(例如V259I)和308F(例如V308F)修饰；433K(例如H433K)和434(例如434Y)修饰；252、254和256(例如252Y、254T和256E)修饰；250Q和428L修饰(例如T250Q和M428L)以及307和/或308修饰(例如308F或308P)，其中所述修饰在酸性环境中(例如在内涵体中，其pH范围约5.5至约6.0)增加所述重链恒定区氨基酸序列对FcRn的亲和性。
在一个实施方式中，所述重链恒定区核苷酸序列编码人源CH2氨基酸序列，所述氨基酸序列包含在位置252和257的氨基酸残基之间的至少一个修饰，其中所述修饰在酸性环境中(例如在内涵体中，其pH范围约5.5至约6.0)增加所述人源CH2氨基酸序列对FcRn的亲和性。
在一个实施方式中，所述重链恒定区核苷酸序列编码人源CH2氨基酸序列，所述氨基酸序列包含在位置307和311的氨基酸残基之间的至少一个修饰，其中所述修饰在酸性环境中(例如在内涵体中，其pH范围约5.5至约6.0)增加所述CH2氨基酸序列对FcRn的亲和性。
在一个实施方式中，所述重链恒定区核苷酸序列编码人源CH3氨基酸序列，所述氨基酸序列包含在位置433和436的氨基酸残基之间的至少一个修饰，其中所述修饰在酸性环境中(例如在内涵体中，其pH范围约5.5至约6.0)增加所述CH3氨基酸序列对FcRn的亲和性。
在一个实施方式中，所述重链恒定区核苷酸序列编码人源重链恒定区氨基酸序列，所述氨基酸序列包含选自下组的突变：M428L、N434S及其组合。
在一个实施方式中，所述重链恒定区核苷酸序列编码人源重链恒定区氨基酸序列，所述氨基酸序列包含选自下组的突变：M428L、V259I、V308F及其组合。
在一个实施方式中，所述重链恒定区核苷酸序列编码人源重链恒定区氨基酸序列，所述氨基酸序列包含N434A突变。
在一个实施方式中，所述重链恒定区核苷酸序列编码人源重链恒定区氨基酸序列，所述氨基酸序列包含选自下组的突变：M252Y、S254T、T256E及其组合。
在一个实施方式中，所述重链恒定区核苷酸序列编码人源重链恒定区氨基酸序列，所述氨基酸序列包含选自下组的突变：T250Q、M248L或这两者。
在一个实施方式中，所述重链恒定区核苷酸序列编码人源重链恒定区氨基酸序列，所述氨基酸序列包含选自下组的突变：H433K、N434Y或这两者。
在一个实施方式中，所述基因修饰的免疫球蛋白基因座包含：(1)第一等位基因，其中如上文所述的未经重排的人源免疫球蛋白重链可变区核苷酸序列与第一重链恒定区核苷酸序列可操作地连接，所述第一重链恒定区核苷酸序列编码选自IgG1、IgG2、IgG4及其组合的人源IgG的第一CH3氨基酸序列；和(2)第二等位基因，其中如本申请所述的未经重排的人源免疫球蛋白重链可变区核苷酸序列与第二重链恒定区核苷酸序列可操作地连接，所述第二重链恒定区核苷酸序列编码选自IgG1、IgG2、IgG4及其组合的人源IgG的第二CH3氨基酸序列，并且其中所述第二CH3氨基酸序列包含使所述第二CH3氨基酸序列与蛋白A的结合降低或消除的修饰(参见例如US 2010/0331527A1)。
在一个实施方式中，所述第二CH3氨基酸序列包含H95R修饰(根据IMGT外显子编号；根据EU编号为H435R)。在一个实施方式中，所述第二CH3氨基酸序列还包含Y96F修饰(根据IMGT外显子编号；根据EU编号为H436F)。在另一个实施方式中，所述第二CH3氨基酸序列同时包含H95R修饰(根据IMGT外显子编号；根据EU编号为H435R)和Y96F修饰(根据IMGT外显子编号；根据EU编号为H436F)。
在一个实施方式中，所述第二CH3氨基酸序列来自经修饰的人源IgG1并且还包含选自下组的突变：D16E、L18M、N44S、K52N、V57M和V82I(IMGT；根据EU编号为D356E、L38M、N384S、K392N、V397M和V422I)。
在一个实施方式中，所述第二CH3氨基酸序列来自经修饰的人源IgG2并且还包含选自下组的突变：N44S、K52N和V82I(IMGT；根据EU编号为N384S、K392N和V422I)。
在一个实施方式中，所述第二CH3氨基酸序列来自经修饰的人源IgG4并且还包含选自下组的突变：Q15R、N44S、K52N、V57M、R69K、E79Q和V82I(IMGT；根据EU编号为Q355R、N384S、K392N、V397M、R409K、E419Q和V422I)。
在一个实施方式中，所述重链恒定区氨基酸序列是非人源恒定区氨基酸序列，并且所述重链恒定区氨基酸序列包含上文所述任意类型的修饰中的一种或多种。
在一个实施方式中，所述重链恒定区核苷酸序列是人源重链恒定区氨基酸序列，并且所述人源重链恒定区氨基酸序列包含上文所述任意类型的修饰中的一种或多种。
在一个实施方式中，全部或基本上全部内源性的VH、D和JH基因区段从免疫球蛋白重链基因座中缺失或者使其不具有功能(例如通过在免疫球蛋白基因座中插入核苷酸序列(例如外源性的核苷酸序列)或者通过使内源性VH、D、JH区段进行不具有功能的重排或反转)。在一个实施方式中，例如，约80％或更多的、约85％或更多的、约90％或更多的、约95％或更多的、约96％或更多的、约97％或更多的、约98％或更多的或者约99％或更多的全部的内源性VH、D或JH基因区段被缺失或使其不具有功能。在一个实施方式中，例如，至少95％、96％、97％、98％或99％的内源性具有功能的V、D或J基因区段被缺失或使其不具有功能。
在一个实施方式中，所述基因修饰的基因座包含使全部或基本上全部的内源性VH、D和JH基因区段缺失或使其不具有功能的修饰；并且所述基因组的基因座包含基因修饰的、未经重排的人源重链可变区核苷酸序列，所述核苷酸序列含有在至少一个阅读框架中使用组氨酸密码子取代至少一个内源性非组氨酸密码子。在一个实施方式中，所述基因修饰的、未经重排的免疫球蛋白重链可变区基因序列存在于内源性位置(即所述核苷酸序列位于野生型非人动物中)或存在于异位(即在其基因组的不同于内源性免疫球蛋白链基因座的位置，或在其内源性基因座中，例如在免疫球蛋白可变基因座中，其中所述内源性基因座位于或被移至基因组中的不同位置)。
在一个实施方式中，所述基因修饰的免疫球蛋白基因座包含内源性Adam6a基因、Adam6b基因或者这两者，并且所述基因修饰不会影响所述内源性Adam6a基因、Adam6b基因或者这两者的表达和/或功能。
在一个实施方式中，所述基因修饰的免疫球蛋白基因座包含异位存在的Adam6a基因、Adam6b基因或者这两者。在一个实施方式中，所述Adam6a基因是非人源Adam6a基因。在一个实施方式中，所述Adam6a基因是小鼠Adam6a基因。在一个实施方式中，所述Adam6a基因是人源Adam6a基因。在一个实施方式中，所述Adam6b基因是非人源Adam6b基因。在一个实施方式中，所述Adam6b基因是小鼠Adam6b基因。在一个实施方式中，所述Adam6b基因是人源Adam6b基因。
在一个实施方式中，所述基因修饰的免疫球蛋白基因座还包含人源化的、未经重排的λ和/或κ轻链可变基因序列。在一个实施方式中，所述人源化的、未经重排的λ和/或κ轻链可变基因序列与免疫球蛋白轻链恒定区核苷酸序列可操作地连接，所述轻链恒定区核苷酸序列选自λ轻链恒定区核苷酸序列和κ轻链恒定区核苷酸序列。在一个实施方式中，所述人源化的、未经重排的λ轻链可变区核苷酸序列与λ轻链恒定区核苷酸序列可操作地连接。在一个实施方式中，所述λ轻链恒定区核苷酸序列是小鼠、大鼠或人源序列。在一个实施方式中，所述人源化的、未经重排的κ轻链可变区核苷酸序列与κ轻链恒定区核苷酸序列可操作地连接。在一个实施方式中，所述κ轻链恒定区核苷酸序列是小鼠、大鼠或人源序列。
在一个实施方式中，所述基因修饰的免疫球蛋白基因座包含未经重排的轻链可变基因序列，所述未经重排的轻链可变基因序列含有在编码轻链可变结构域的至少一个阅读框架中引入至少一个组氨酸密码子的至少一个修饰。在一个实施方式中，所述基因修饰的免疫球蛋白基因座包含重排的序列(例如重排的λ或κV/J序列)，所述序列在轻链CDR中含有1个、2个、3个或4个组氨酸密码子。在一个实施方式中，所述CDR选自CDR1、CDR2、CDR3及其组合。在一个实施方式中，所述未经重排的或重排的轻链可变区核苷酸序列是未经重排的或重排的人源λ或κ轻链可变区核苷酸序列。在一个实施方式中，所述未经重排的或重排的人源λ或κ轻链可变区核苷酸序列存在于内源性小鼠免疫球蛋白轻链基因座。在一个实施方式中，所述小鼠免疫球蛋白轻链基因座是小鼠κ基因座。在一个实施方式中，所述小鼠免疫球蛋白轻链基因座是小鼠λ基因座。
在一个实施方式中，如本申请所述的基因修饰的免疫球蛋白基因座存在于小鼠的免疫球蛋白重链基因座中。在一个实施方式中，所述基因修饰的免疫球蛋白基因座存在于小鼠中的人源化的免疫球蛋白重链基因座中。
在一个实施方式中，由如本申请所述的基因修饰的免疫球蛋白重链基因座表达的含有重链可变结构域的抗原结合蛋白与如本申请所述的不含基因修饰的相应野生型重链可变结构域相比在酸性环境中(例如在约5.5至约6.0的pH下)显示出更弱的抗原结合。
在一个实施方式中，由如本申请所述的基因修饰的免疫球蛋白重链基因座表达的含有重链可变结构域的抗原结合蛋白在25℃下在酸性pH下(例如pH约5.5至约6.0)具有的解离半衰期(t1/2)短于2min。在一个实施方式中，由如本申请所述的基因修饰的免疫球蛋白重链基因座表达的含有重链可变结构域的抗原结合蛋白在37℃下在酸性pH下(例如pH约5.5至约6.0)具有的解离半衰期(t1/2)少于2min。在一个实施方式中，由如本申请所述的经基因修饰的免疫球蛋白重链基因座表达的含有重链可变结构域的抗原结合蛋白在25℃下在酸性pH下(例如pH约5.5至约6.0)具有的解离半衰期(t1/2)少于1min。在一个实施方式中，由如本申请所述的经基因修饰的免疫球蛋白重链基因座表达的含有重链可变结构域的抗原结合蛋白在37℃下在酸性pH下(例如pH约5.5至约6.0)具有的解离半衰期(t1/2)少于1min。在一个实施方式中，由如本申请所述的基因修饰的免疫球蛋白重链基因座表达的含有重链可变结构域的抗原结合蛋白在酸性pH下(例如pH约5.5至约6.0)的解离半衰期(t1/2)比所述抗原结合蛋白在中性pH下(例如pH约7.0至约7.4)的解离半衰期(t1/2)降低至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约10倍、至少约15倍、至少约20倍、至少约25倍或至少约30倍。
在一个实施方式中，由如本申请所述的基因修饰的免疫球蛋白基因座表达的含有重链可变结构域的抗原结合蛋白与不含基因修饰的野生型抗原结合蛋白相比具有的特征为pH依赖性循环改善、血清半衰期增加或两者兼而有之。
在一个实施方式中，本申请所述的基因修饰的免疫球蛋白基因座包含B细胞群，所述B细胞群经目的抗原刺激后能够产生抗原结合蛋白例如抗体，所述抗原结合蛋白含有具有一个或多个组氨酸残基的重链可变结构域。当如本申请所述的抗原结合蛋白向受试者施用时，与相应的野生型抗原结合蛋白相比显示出增加的血清半衰期，所述野生型抗原结合蛋白具有相似的或足够相似的编码重链可变结构域的氨基酸序列，但是在所述重链可变结构域中不包含组氨酸残基。在一些实施方式中，本申请所述的抗原结合蛋白显示出增加的血清半衰期，其与相应的野生型抗原结合蛋白相比高至少约2倍、至少约5倍、至少约10倍、至少约15倍、至少约20倍，所述野生型抗原结合蛋白具有相似的或足够相似的编码重链可变结构域的氨基酸序列，但是在所述重链可变结构域中不包含组氨酸残基。
在一个方面，本申请提供了一种非人动物的基因修饰的免疫球蛋白基因座，所述免疫球蛋白基因座包含人源VH、D和JH基因区段，其中所述至少一个人源D基因区段相对于相应的野生序列从5’至3’反转，并且其中所述反转的人源D基因区段的至少一个阅读框架包含组氨酸密码子。
在一个实施方式中，所述非人动物是哺乳动物，包括啮齿动物，例如小鼠、大鼠或仓鼠。
在一个实施方式中，所述基因修饰的免疫球蛋白基因座存在于种系基因组中。
在一个实施方式中，所述基因修饰的免疫球蛋白基因座编码免疫球蛋白重链可变结构域，所述免疫球蛋白重链可变结构域含有1个或更多个、2个或更多个、3个或更多个、4个或更多个、5个或更多个、6个或更多个、7个或更多个、8个或更多个、9个或更多个、10个或更多个、11个或更多个、12个或更多个、13个或更多个、14个或更多个、15个或更多个、16个或更多个、17个或更多个、18个或更多个、19个或更多个、20个或更多个、21个或更多个、22个或更多个、23个或更多个、24个或更多个、25个或更多个、26个或更多个、27个或更多个、28个或更多个、29个或更多个、30个或更多个、31个或更多个、32个或更多个、33个或更多个或者34个或更多个组氨酸残基。
在一个实施方式中，至少两个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个、至少24个或者全部或基本上全部的具有功能的人源D基因区段相对于野生型序列是反向的。
在一个实施方式中，全部或基本上全部的内源性免疫球蛋白VH、D、JH基因区段从所述免疫球蛋白重链基因座中缺失或使其不具有功能(例如通过在所述免疫球蛋白基因座插入核苷酸序列例如外源性核苷酸序列或通过使全部或基本上全部的内源性VH、D、JH基因区段产生不具有功能的重排或反转)，并且所述基因修饰的免疫球蛋白基因座包含人源VH、D和JH基因区段，其中所述至少一个人源D基因区段以相对于野生型序列相反的方向存在，并且其中在反转的D基因区段中的至少一个阅读框架包含至少一个组氨酸密码子。
在一个实施方式中，所述反转的人源D基因区段与人源VH基因区段和/或人源JH基因区段可操作地连接。
在一个实施方式中，所述人源D基因区段以相对于选自下组的相应的野生型序列相反的方向存在：D1-1、D1-7、D1-20、D1-26、D2-2、D2-8、D2-15、D2-21、D3-3、D3-9、D3-10、D3-16、D3-22、D4-4、D4-11、D4-17、D4-23、D5-5、D5-12、D5-18、D5-24、D6-6、D6-13、D6-19、D7-27及其组合。
在一个实施方式中，以与相应的野生型序列相反的方向存在的所述人源D基因区段是选自下组的D1基因区段：D1-1、D1-7、D1-20、D1-26及其组合。
在一个实施方式中，以与相应的野生型序列相反的方向存在的所述人源D基因区段是选自下组的D2基因区段：D2-2、D2-8、D2-15、D2-21及其组合。
在一个实施方式中，以与相应的野生型序列相反的方向存在的所述人源D基因区段是选自下组的D3基因区段：D3-3、D3-9、D3-10、D3-16、D3-22及其组合。
在一个实施方式中，以与相应的野生型序列相反的方向存在的所述人源D基因区段是选自下组的D4基因区段：D4-4、D4-11、D4-17、D4-23及其组合。
在一个实施方式中，以与相应的野生型序列相反的方向存在的所述人源D基因区段是选自下组的D5基因区段：D5-5、D5-12、D5-18、D5-24及其组合。
在一个实施方式中，以与相应的野生型序列相反的方向存在的所述人源D基因区段是选自下组的D6基因区段：D6-6、D6-13、D6-19及其组合。
在一个实施方式中，以与相应的野生型序列相反的方向存在的所述人源D基因区段是D7-27。
在一个实施方式中，所述人源D基因区段的阅读框架选自终止阅读框架、亲水性阅读框架和疏水性阅读框架，以及所述反转的人源D基因区段的至少一个阅读框架包含组氨酸密码子。
在一个实施方式中，所述未经重排的重链可变区核苷酸序列包含与编码选自IgM、IgD、IgG、IgE和IgA的免疫球蛋白同种型的人源或非人源重链恒定区核苷酸序列可操作地连接的所述反转的人源D基因区段。
在一个实施方式中，所述未经重排的重链可变区核苷酸序列包含与编码选自IgM、IgD、IgG、IgE和IgA的免疫球蛋白同种型的人源或非人源重链恒定区核苷酸序列可操作地连接的所述反转的人源D基因区段。
在一个实施方式中，所述人源未经重排的免疫球蛋白重链可变区核苷酸序列与选自下述的人源或非人源重链恒定区核苷酸序列可操作地连接：CH1、铰链、CH2、CH3及其组合。在一个实施方式中，所述重链恒定区核苷酸序列包含CH1、铰链、CH2和CH3(CH1-铰链-CH2-CH3)。
在一个实施方式中，重链恒定区核苷酸序列存在于内源性基因座(即所述核苷酸序列位于野生型非人动物中)或存在于异位(即在其基因组中的不同于内源性免疫球蛋白链基因座的基因座，或在其内源性基因座中，例如在免疫球蛋白可变基因座内，其中所述内源性基因座位于或被移至基因组中的不同位置)。
在一个实施方式中，所述重链恒定区核苷酸序列包含在CH2或CH3中的修饰，其中所述修饰在酸性环境中(例如，在内涵体中，其pH范围约5.5至约6.0)增加所述重链恒定区氨基酸序列对FcRn的亲和性。
在一个实施方式中，编码人源重链恒定区氨基酸序列的所述重链恒定区核苷酸序列包含在位置250(例如E或Q)；250和428(例如L或F)；252(例如L/Y/F/W或T)、254(例如S或T)和256(例如S/R/Q/E/D或T)的修饰；或在位置428和/或433(例如L/R/S/P/Q或K)和/或434(例如H/F或Y)的修饰；或在位置250和/或428的修饰；或在位置307或308(例如308F、V308F)和434的修饰。在一个实施方式中，所述修饰包含428L(例如M428L)和434S(例如N434S)修饰；428L、259I(例如V259I)和308F(例如V308F)修饰；433K(例如H433K)和434(例如434Y)修饰；252、254和256(例如252Y、254T和256E)修饰；250Q和428L修饰(例如T250Q和M428L)以及307和/或308修饰(例如308F或308P)，其中所述修饰在酸性环境中(例如在内涵体中，其pH范围约5.5至约6.0)增加所述重链恒定区氨基酸序列对FcRn的亲和性。
在一个实施方式中，所述重链恒定区核苷酸序列编码人源CH2氨基酸序列，所述氨基酸序列包含在位置252和257的氨基酸残基之间的至少一个修饰，其中所述修饰在酸性环境中(例如在内涵体中，其pH范围约5.5至约6.0)增加所述人源CH2氨基酸序列对FcRn的亲和性。
在一个实施方式中，所述重链恒定区核苷酸序列编码人源CH2氨基酸序列，所述氨基酸序列包含在位置307和311的氨基酸残基之间的至少一个修饰，其中所述修饰在酸性环境中(例如在内涵体中，其pH范围约5.5至约6.0)增加所述CH2氨基酸序列对FcRn的亲和性。
在一个实施方式中，所述重链恒定区核苷酸序列编码人源CH3氨基酸序列，所述氨基酸序列包含在位置433和436的氨基酸残基之间的至少一个修饰，其中所述修饰在酸性环境中(例如在内涵体中，其pH范围约5.5至约6.0)增加所述CH3氨基酸序列对FcRn的亲和性。
在一个实施方式中，所述重链恒定区核苷酸序列编码人源重链恒定区氨基酸序列，所述氨基酸序列包含选自下组的突变：M428L、N434S及其组合。
在一个实施方式中，所述重链恒定区核苷酸序列编码人源重链恒定区氨基酸序列，所述氨基酸序列包含选自下组的突变：M428L、V259I、V308F及其组合。
在一个实施方式中，所述重链恒定区核苷酸序列编码人源重链恒定区氨基酸序列，所述氨基酸序列包含N434A突变。
在一个实施方式中，所述重链恒定区核苷酸序列编码人源重链恒定区氨基酸序列，所述氨基酸序列包含选自下组的突变：M252Y、S254T、T256E及其组合。
在一个实施方式中，所述重链恒定区核苷酸序列编码人源重链恒定区氨基酸序列，所述氨基酸序列包含选自下组的突变：T250Q、M248L或这两者。
在一个实施方式中，所述重链恒定区核苷酸序列编码人源重链恒定区氨基酸序列，所述氨基酸序列包含选自下组的突变：H433K、N434Y或这两者。
在一个实施方式中，所述基因修饰的免疫球蛋白基因座包含：(1)第一等位基因，其中如上文所述的未经重排的人源免疫球蛋白重链可变区核苷酸序列与第一重链恒定区核苷酸序列可操作地连接，所述第一重链恒定区核苷酸序列编码选自IgG1、IgG2、IgG4及其组合的人源IgG的第一CH3氨基酸序列；和(2)第二等位基因，其中如本申请所述的未经重排的人源免疫球蛋白重链可变区核苷酸序列与第二重链恒定区核苷酸序列可操作地连接，所述第二重链恒定区核苷酸序列编码选自IgG1、IgG2、IgG4及其组合的人源IgG的第二CH3氨基酸序列，并且其中所述第二CH3氨基酸序列包含使所述第二CH3氨基酸序列与蛋白A的结合降低或消除的修饰(参见例如US 2010/0331527A1)。
在一个实施方式中，所述第二CH3氨基酸序列包含95R修饰(根据IMGT外显子编号；根据EU编号为H435R)。在一个实施方式中，所述第二CH3氨基酸序列还包含Y96F修饰(根据IMGT外显子编号；根据EU编号为H436F)。在另一个实施方式中，所述第二CH3氨基酸序列包含H95R修饰(根据IMGT外显子编号；根据EU编号为H435R)和Y96F修饰(根据IMGT外显子编号；根据EU编号为H436F)这两者。
在一个实施方式中，所述第二CH3氨基酸序列来自经修饰的人源IgG1并且还包含选自下组的突变：D16E、L18M、N44S、K52N、V57M和V82I(IMGT；根据EU编号为D356E、L38M、N384S、K392N、V397M和V422I)。
在一个实施方式中，所述第二CH3氨基酸序列来自经修饰的人源IgG2并且还包含选自下组的突变：N44S、K52N和V82I(IMGT；根据EU编号为N384S、K392N和V422I)。
在一个实施方式中，所述第二CH3氨基酸序列来自经修饰的人源IgG4并且还包含选自下组的突变：Q15R、N44S、K52N、V57M、R69K、E79Q和V82I(IMGT；根据EU编号为Q355R、N384S、K392N、V397M、R409K、E419Q和V422I)。.
在一个实施方式中，所述重链恒定区氨基酸序列是非人源恒定区氨基酸序列，并且所述重链恒定区氨基酸序列包含上文所述任意类型的修饰中的一种或多种。
在一个实施方式中，所述重链恒定区核苷酸序列是人源重链恒定区氨基酸序列，并且所述人源重链恒定区氨基酸序列包含上文所述任意类型的修饰中的一种或多种。
在一个实施方式中，全部或基本上全部内源性的VH、D和JH基因区段从免疫球蛋白重链基因座中缺失或者使其不具有功能(例如通过在免疫球蛋白基因座中插入核苷酸序列(例如外源性的核苷酸序列)或者通过使内源性VH、D、JH区段进行不具有功能的重排或反转)。在一个实施方式中，例如，约80％或更多的、约85％或更多的、约90％或更多的、约95％或更多的、约96％或更多的、约97％或更多的、约98％或更多的或者约99％或更多的全部的内源性VH、D或JH基因区段被缺失或使其不具有功能。在一个实施方式中，例如，至少95％、96％、97％、98％或99％的内源性具有功能的V、D或J基因区段被缺失或使其不具有功能。
在一个实施方式中，所述基因修饰的免疫球蛋白重链基因座包含使全部或基本上全部的内源性VH、D和JH基因区段缺失或使其不具有功能的修饰；并且所述基因修饰的基因座包含未经重排的重链可变区核苷酸序列，所述核苷酸序列含有如上文所述的至少一个反转的人源D基因区段，其中所述未经重排的重链可变区核苷酸序列存在于内源性位置(即所述核苷酸序列位于野生型非人动物中)或存在于异位(即在其基因组的不同于内源性免疫球蛋白链基因座的位置，或在其内源性基因座中，例如在免疫球蛋白可变基因座中，其中所述内源性基因座位于或被移至基因组中的不同位置)。
在一个实施方式中，所述基因修饰的免疫球蛋白基因座包含内源性Adam6a基因、Adam6b基因或者这两者，并且所述基因修饰不会影响所述内源性Adam6a基因、Adam6b基因或者这两者的表达和/或功能。
在一个实施方式中，所述基因修饰的免疫球蛋白基因座包含异位存在的Adam6a基因、Adam6b基因或者这两者。在一个实施方式中，所述Adam6a基因是非人源Adam6a基因。在一个实施方式中，所述Adam6a基因是小鼠Adam6a基因。在一个实施方式中，所述Adam6a基因是人源Adam6a基因。在一个实施方式中，所述Adam6b基因是非人源Adam6b基因。在一个实施方式中，所述Adam6b基因是小鼠Adam6b基因。在一个实施方式中，所述Adam6b基因是人源Adam6b基因。
在一个实施方式中，所述基因修饰的免疫球蛋白基因座还包含人源化的、未经重排的λ和/或κ轻链可变基因序列。在一个实施方式中，所述人源化的、未经重排的λ和/或κ轻链可变基因序列与免疫球蛋白轻链恒定区核苷酸序列可操作地连接，所述轻链恒定区核苷酸序列选自λ轻链恒定区核苷酸序列和κ轻链恒定区核苷酸序列。在一个实施方式中，所述人源化的、未经重排的λ轻链可变区核苷酸序列与λ轻链恒定区核苷酸序列可操作地连接。在一个实施方式中，所述λ轻链恒定区核苷酸序列是小鼠、大鼠或人源序列。在一个实施方式中，所述人源化的、未经重排的κ轻链可变区核苷酸序列与κ轻链恒定区核苷酸序列可操作地连接。在一个实施方式中，所述κ轻链恒定区核苷酸序列是小鼠、大鼠或人源序列。
在一个实施方式中，所述基因修饰的免疫球蛋白基因座包含未经重排的轻链可变基因序列，所述未经重排的轻链可变基因序列含有在编码轻链可变结构域的至少一个阅读框架中引入至少一个组氨酸密码子的至少一个修饰。在一个实施方式中，所述基因修饰的免疫球蛋白基因座包含重排的序列(例如重排的λ或κV/J序列)，所述序列在轻链CDR中含有1个、2个、3个或4个组氨酸密码子。在一个实施方式中，所述CDR选自CDR1、CDR2、CDR3及其组合。在一个实施方式中，所述未经重排的或重排的轻链可变区核苷酸序列是未经重排的或重排的人源λ或κ轻链可变区核苷酸序列。在一个实施方式中，所述未经重排的或重排的人源λ或κ轻链可变区核苷酸序列存在于内源性小鼠免疫球蛋白轻链基因座。在一个实施方式中，所述小鼠免疫球蛋白轻链基因座是小鼠κ基因座。在一个实施方式中，所述小鼠免疫球蛋白轻链基因座是小鼠λ基因座。
在一个实施方式中，如本申请所述的基因修饰的免疫球蛋白基因座存在于小鼠的免疫球蛋白重链基因座中。在一个实施方式中，所述基因修饰的免疫球蛋白基因座存在于小鼠中的人源化的免疫球蛋白重链基因座中。
在一个实施方式中，由如本申请所述的基因修饰的免疫球蛋白重链基因座表达的含有重链可变结构域的抗原结合蛋白与不含基因修饰的相应野生型重链可变结构域相比在酸性环境中(例如在约5.5至约6.0的pH下)显示出更弱的抗原结合。
在一个实施方式中，由如本申请所述的基因修饰的免疫球蛋白重链基因座表达的含有重链可变结构域的抗原结合蛋白在25℃下在酸性pH下(例如pH约5.5至约6.0)具有的解离半衰期(t1/2)短于2min。在一个实施方式中，由如本申请所述的基因修饰的免疫球蛋白重链基因座表达的含有重链可变结构域的抗原结合蛋白在37℃下在酸性pH下(例如pH约5.5至约6.0)具有的解离半衰期(t1/2)短于2min。在一个实施方式中，由如本申请所述的基因修饰的免疫球蛋白重链基因座表达的含有重链可变结构域的抗原结合蛋白在25℃下在酸性pH下(例如pH约5.5至约6.0)具有的解离半衰期(t1/2)短于1min。在一个实施方式中，由如本申请所述的基因修饰的免疫球蛋白重链基因座表达的含有重链可变结构域的抗原结合蛋白在37℃下在酸性pH下(例如pH约5.5至约6.0)具有的解离半衰期(t1/2)短于1min。在一个实施方式中，由如本申请所述的基因修饰的免疫球蛋白重链基因座表达的含有重链可变结构域的抗原结合蛋白在酸性pH下(例如pH约5.5至约6.0)的解离半衰期(t1/2)比所述抗原结合蛋白在中性pH下(例如pH约7.0至约7.4)的解离半衰期(t1/2)降低至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约10倍、至少约15倍、至少约20倍、至少约25倍或至少约30倍。
在一个实施方式中，由如本申请所述的基因修饰的免疫球蛋白基因座表达的含有重链可变结构域的抗原结合蛋白与不含本申请所述的基因修饰的野生型抗原结合蛋白相比具有的特征为pH依赖性循环改善、血清半衰期增加或两者兼而有之。
在一个实施方式中，本申请所述的基因修饰的免疫球蛋白基因座包含B细胞群，所述B细胞群经目的抗原刺激后能够产生抗原结合蛋白例如抗体，所述抗原结合蛋白含有具有一个或多个组氨酸残基的重链可变结构域。当如本申请所述的抗原结合蛋白向受试者施用时，与相应的野生型抗原结合蛋白相比显示出增加的血清半衰期，所述野生型抗原结合蛋白具有相似的或足够相似的编码重链可变结构域的氨基酸序列，但是在所述重链可变结构域中不包含组氨酸残基。在一些实施方式中，本申请所述的抗原结合蛋白显示出增加的血清半衰期，其与相应的野生型抗原结合蛋白相比高至少约2倍、至少约5倍、至少约10倍、至少约15倍、至少约20倍，所述野生型抗原结合蛋白具有相似的或足够相似的编码重链可变结构域的氨基酸序列，但是在所述重链可变结构域中不包含组氨酸残基。
在一个方面，本申请提供了一种在非人动物的种系基因组中的基因修饰的免疫球蛋白基因座，所述经基因修饰的免疫球蛋白基因座含有未经重排的人源重链可变区核苷酸序列，其中所述未经重排的重链可变区核苷酸序列包含加入至少一个组氨酸密码子或使用组氨酸密码子取代至少一个内源性非组氨酸密码子。
在一个实施方式中，所述非人动物是哺乳动物，包括啮齿动物，例如小鼠、大鼠或仓鼠。
在一个实施方式中，所述加入或取代的组氨酸密码子存在于选自下述的免疫球蛋白重链基因区段：人源VH基因区段、人源D基因区段、人源JH基因区段及其组合。在一个实施方式中，所述免疫球蛋白重链基因区段选自人源种系VH基因区段、人源种系D基因区段、人源种系JH基因区段及其组合。
在一个实施方式中，所述人源VH基因区段选自下组：VH1-2、VH1-3、VH1-8、VH1-18、VH1-24、VH1-45、VH1-46、VH1-58、VH1-69、VH2-5、VH2-26、VH2-70、VH3-7、VH3-9、VH3-11、VH3-13、VH3-15、VH3-16、VH3-20、VH3-21、VH3-23、VH3-30、VH3-30-3、VH3-30-5、VH3-33、VH3-35、VH3-38、VH3-43、VH3-48、VH3-49、VH3-53、VH3-64、VH3-66、VH3-72、VH3-73、VH3-74、VH4-4、VH4-28、VH4-30-1、VH4-30-2、VH4-30-4、VH4-31、VH4-34、VH4-39、VH4-59、VH4-61、VH5-51、VH6-1、VH7-4-1、VH7-81及其组合。
在一个实施方式中，所述人源D基因区段选自下组：D1-1、D1-7、D1-14、D1-20、D1-26、D2-2、D2-8、D2-15、D2-21、D3-3、D3-9、D3-10、D3-16、D3-22、D4-4、D4-11、D4-17、D4-23、D5-12、D5-5、D5-18、D5-24、D6-6、D6-13、D6-19、D6-25、D7-27及其组合。
在一个实施方式中，所述人源JH基因区段选自下组：JH1、JH2、JH3、JH4、JH5、JH6及其组合。
在一个实施方式中，所述加入或取代的组氨酸密码子存在于编码N-末端区、环4区、CDR1、CDR2、CDR3及其组合的未经重排的重链可变区核苷酸序列中。
在一个实施方式中，所述未经重排的重链可变区核苷酸序列包含2个或更多个、3个或更多个、4个或更多个、5个或更多个、6个或更多个、7个或更多个、8个或更多个、9个或更多个、10个或更多个、11个或更多个、12个或更多个、13个或更多个、14个或更多个、15个或更多个、16个或更多个、17个或更多个、18个或更多个、19个或更多个、20个或更多个、21个或更多个、22个或更多个、23个或更多个、24个或更多个、25个或更多个、26个或更多个、27个或更多个、28个或更多个、29个或更多个、30个或更多个、31个或更多个、32个或更多个、33个或更多个、34个或更多个、35个或更多个、36个或更多个、37个或更多个、38个或更多个、39个或更多个、40个或更多个、41个或更多个、42个或更多个、43个或更多个、44个或更多个、45个或更多个、46个或更多个、47个或更多个、48个或更多个、49个或更多个、50个或更多个、51个或更多个、52个或更多个、53个或更多个、54个或更多个、55个或更多个、56个或更多个、57个或更多个、58个或更多个、59个或更多个、60个或更多个或者61个或更多个组氨酸密码子。
在一个实施方式中，所述未经重排的重链可变区核苷酸序列包含与编码选自IgM、IgD、IgG、IgE和IgA的免疫球蛋白同种型的人源或非人源重链恒定区核苷酸序列可操作地连接的所述反转的人源D基因区段。
在一个实施方式中，所述人源未经重排的免疫球蛋白重链可变区核苷酸序列与选自CH1、铰链、CH2、CH3及其组合的人源或非人源重链恒定区核苷酸序列可操作地连接。在一个实施方式中，所述重链恒定区核苷酸序列含有CH1、铰链、CH2和CH3(CH1-铰链-CH2-CH3)。
在一个实施方式中，重链恒定区核苷酸序列存在于内源性基因座(即所述核苷酸序列位于野生型非人动物中)或存在于异位(即在其基因组的不同于内源性免疫球蛋白链基因座的位置，或在其内源性基因座中，例如在免疫球蛋白可变基因座中，其中所述内源性基因座位于或被移至基因组中的不同位置)。
在一个实施方式中，所述重链恒定区核苷酸序列含有在CH2或CH3中的修饰，其中所述修饰在酸性环境中(例如在内涵体中，其pH范围约5.5至约6.0)增加所述重链恒定区氨基酸序列与FcRn的亲和性。
在一个实施方式中，编码人源重链恒定区氨基酸序列的所述重链恒定区核苷酸序列包含在位置250(例如E或Q)；250和428(例如L或F)；252(例如L/Y/F/W或T)、254(例如S或T)和256(例如S/R/Q/E/D或T)的修饰；或在位置428和/或433(例如L/R/S/P/Q或K)和/或434(例如H/F或Y)的修饰；或在位置250和/或428的修饰；或在位置307或308(例如308F、V308F)和434的修饰。在一个实施方式中，所述修饰包含428L(例如M428L)和434S(例如N434S)修饰；428L、259I(例如V259I)和308F(例如V308F)修饰；433K(例如H433K)和434(例如434Y)修饰；252、254和256(例如252Y、254T和256E)修饰；250Q和428L修饰(例如T250Q和M428L)以及307和/或308修饰(例如308F或308P)，其中所述修饰在酸性环境中(例如在内涵体中，其pH范围约5.5至约6.0)增加所述重链恒定区氨基酸序列对FcRn的亲和性。
在一个实施方式中，所述重链恒定区核苷酸序列编码人源CH2氨基酸序列，所述氨基酸序列包含在位置252和257的氨基酸残基之间的至少一个修饰，其中所述修饰在酸性环境中(例如在内涵体中，其pH范围约5.5至约6.0)增加所述人源CH2氨基酸序列对FcRn的亲和性。
在一个实施方式中，所述重链恒定区核苷酸序列编码人源CH2氨基酸序列，所述氨基酸序列包含在位置307和311的氨基酸残基之间的至少一个修饰，其中所述修饰在酸性环境中(例如在内涵体中，其pH范围约5.5至约6.0)增加所述CH2氨基酸序列对FcRn的亲和性。
在一个实施方式中，所述重链恒定区核苷酸序列编码人源CH3氨基酸序列，所述氨基酸序列包含在位置433和436的氨基酸残基之间的至少一个修饰，其中所述修饰在酸性环境中(例如在内涵体中，其pH范围约5.5至约6.0)增加所述CH3氨基酸序列对FcRn的亲和性。
在一个实施方式中，所述重链恒定区核苷酸序列编码人源重链恒定区氨基酸序列，所述氨基酸序列包含选自下组的突变：M428L、N434S及其组合。
在一个实施方式中，所述重链恒定区核苷酸序列编码人源重链恒定区氨基酸序列，所述氨基酸序列包含选自下组的突变：M428L、V259I、V308F及其组合。
在一个实施方式中，所述重链恒定区核苷酸序列编码人源重链恒定区氨基酸序列，所述氨基酸序列包含N434A突变。
在一个实施方式中，所述重链恒定区核苷酸序列编码人源重链恒定区氨基酸序列，所述氨基酸序列包含选自下组的突变：M252Y、S254T、T256E及其组合。
在一个实施方式中，所述重链恒定区核苷酸序列编码人源重链恒定区氨基酸序列，所述氨基酸序列包含选自下组的突变：T250Q、M248L或这两者。
在一个实施方式中，所述重链恒定区核苷酸序列编码人源重链恒定区氨基酸序列，所述氨基酸序列包含选自下组的突变：H433K、N434Y或这两者。
在一个实施方式中，所述基因修饰的免疫球蛋白基因座包含：(1)第一等位基因，其中如上文所述的未经重排的人源免疫球蛋白重链可变区核苷酸序列与第一重链恒定区核苷酸序列可操作地连接，所述第一重链恒定区核苷酸序列编码选自IgG1、IgG2、IgG4及其组合的人源IgG的第一CH3氨基酸序列；和(2)第二等位基因，其中如本申请所述的未经重排的人源免疫球蛋白重链可变区核苷酸序列与第二重链恒定区核苷酸序列可操作地连接，所述第二重链恒定区核苷酸序列编码选自IgG1、IgG2、IgG4及其组合的人源IgG的第二CH3氨基酸序列，并且其中所述第二CH3氨基酸序列包含使所述第二CH3氨基酸序列与蛋白A的结合降低或消除的修饰(参见例如US 2010/0331527A1)。
在一个实施方式中，所述第二CH3氨基酸序列包含H95R修饰(根据IMGT外显子编号；根据EU编号为H435R)。在一个实施方式中，所述第二CH3氨基酸序列还包含Y96F修饰(根据IMGT外显子编号；根据EU编号为H436F)。在另一个实施方式中，所述第二CH3氨基酸序列包含H95R修饰(根据IMGT外显子编号；根据EU编号为H435R)和Y96F修饰(根据IMGT外显子编号；根据EU编号为H436F)这两者。
在一个实施方式中，所述第二CH3氨基酸序列来自经修饰的人源IgG1并且还包含选自下组的突变：D16E、L18M、N44S、K52N、V57M和V82I(IMGT；根据EU编号为D356E、L38M、N384S、K392N、V397M和V422I)。
在一个实施方式中，所述第二CH3氨基酸序列来自经修饰的人源IgG2并且还包含选自下组的突变：N44S、K52N和V82I(IMGT；根据EU编号为N384S、K392N和V422I)。
在一个实施方式中，所述第二CH3氨基酸序列来自经修饰的人源IgG4并且还包含选自下组的突变：Q15R、N44S、K52N、V57M、R69K、E79Q和V82I(IMGT；根据EU编号为Q355R、N384S、K392N、V397M、R409K、E419Q和V422I)。
在一个实施方式中，所述重链恒定区氨基酸序列是非人源恒定区氨基酸序列，并且所述重链恒定区氨基酸序列包含上文所述任意类型的修饰中的一种或多种。
在一个实施方式中，所述重链恒定区核苷酸序列是人源重链恒定区氨基酸序列，并且所述人源重链恒定区氨基酸序列包含上文所述任意类型的修饰中的一种或多种。
在一个实施方式中，全部或基本上全部内源性的VH、D和JH基因区段从免疫球蛋白重链基因座中缺失或者使其不具有功能(例如通过在免疫球蛋白基因座中插入核苷酸序列(例如外源性的核苷酸序列)或者通过使内源性VH、D、JH区段进行不具有功能的重排或反转)。在一个实施方式中，例如，约80％或更多的、约85％或更多的、约90％或更多的、约95％或更多的、约96％或更多的、约97％或更多的、约98％或更多的或者约99％或更多的全部的内源性VH、D或JH基因区段被缺失或使其不具有功能。在一个实施方式中，例如，至少95％、96％、97％、98％或99％的内源性具有功能的V、D或J基因区段被缺失或使其不具有功能。
在一个实施方式中，所述基因修饰的免疫球蛋白重链基因座包含使全部或基本上全部的内源性VH、D和JH基因区段缺失或使其不具有功能的修饰；并且所述基因修饰的基因座包含未经重排的重链可变区核苷酸序列，所述核苷酸序列含有具有一个或多个组氨酸密码子的一个或多个人源VH、D和/或JH基因区段，其中所述未经重排的重链可变区核苷酸序列存在于内源性位置(即所述核苷酸序列位于野生型非人动物中)或存在于异位(即在其基因组的不同于内源性免疫球蛋白链基因座的位置，或在其内源性基因座中，例如在免疫球蛋白可变基因座中，其中所述内源性基因座位于或被移至基因组中的不同位置)。
在一个实施方式中，所述基因修饰的免疫球蛋白基因座包含内源性Adam6a基因、Adam6b基因或者这两者，并且所述基因修饰不会影响所述内源性Adam6a基因、Adam6b基因或者这两者的表达和/或功能。
在一个实施方式中，所述基因修饰的免疫球蛋白基因座包含异位存在的Adam6a基因、Adam6b基因或者这两者。在一个实施方式中，所述Adam6a基因是非人源Adam6a基因。在一个实施方式中，所述Adam6a基因是人源Adam6a基因。在一个实施方式中，所述Adam6b基因是非人源Adam6b基因。在一个实施方式中，所述Adam6b基因是人源Adam6b基因。
在一个实施方式中，所述基因修饰的免疫球蛋白基因座还包含人源化的、未经重排的λ和/或κ轻链可变基因序列。在一个实施方式中，所述人源化的、未经重排的λ和/或κ轻链可变基因序列与免疫球蛋白轻链恒定区核苷酸序列可操作地连接，所述轻链恒定区核苷酸序列选自λ轻链恒定区核苷酸序列和κ轻链恒定区核苷酸序列。在一个实施方式中，所述人源化的、未经重排的λ轻链可变区核苷酸序列与λ轻链恒定区核苷酸序列可操作地连接。在一个实施方式中，所述λ轻链恒定区核苷酸序列是小鼠、大鼠或人源序列。在一个实施方式中，所述人源化的、未经重排的κ轻链可变区核苷酸序列与κ轻链恒定区核苷酸序列可操作地连接。在一个实施方式中，所述κ轻链恒定区核苷酸序列是小鼠、大鼠或人源序列。
在一个实施方式中，所述基因修饰的免疫球蛋白基因座包含未经重排的轻链可变基因序列，所述未经重排的轻链可变基因序列含有在编码轻链可变结构域的至少一个阅读框架中引入至少一个组氨酸密码子的至少一个修饰。在一个实施方式中，所述基因修饰的免疫球蛋白基因座包含重排的序列(例如重排的λ或κV/J序列)，所述序列在轻链CDR中含有1个、2个、3个或4个组氨酸密码子。在一个实施方式中，所述CDR选自CDR1、CDR2、CDR3及其组合。在一个实施方式中，所述未经重排的或重排的轻链可变区核苷酸序列是未经重排的或重排的人源λ或κ轻链可变区核苷酸序列。在一个实施方式中，所述未经重排的或重排的人源λ或κ轻链可变区核苷酸序列存在于内源性小鼠免疫球蛋白轻链基因座。在一个实施方式中，所述小鼠免疫球蛋白轻链基因座是小鼠κ基因座。在一个实施方式中，所述小鼠免疫球蛋白轻链基因座是小鼠λ基因座。
在一个实施方式中，如本申请所述的基因修饰的免疫球蛋白基因座存在于小鼠的免疫球蛋白重链基因座中。在一个实施方式中，所述基因修饰的免疫球蛋白基因座存在于小鼠中的人源化的免疫球蛋白重链基因座中。
在一个实施方式中，所述非人源动物是针对基因修饰的免疫球蛋白重链基因座的杂合子，并且所述非人动物能够表达人源免疫球蛋白重链可变结构域，所述人源免疫球蛋白重链可变结构域包含主要来源于如本申请所述的基因修饰的免疫球蛋白重链基因座的至少一个组氨酸残基。
在一个实施方式中，由如本申请所述的基因修饰的免疫球蛋白重链基因座表达的含有重链可变结构域的抗原结合蛋白与不含基因修饰的相应野生型重链可变结构域相比在酸性环境中(例如在约5.5至约6.0的pH下)显示出更弱的抗原结合。
在一个实施方式中，由如本申请所述的基因修饰的免疫球蛋白重链基因座表达的含有重链可变结构域的抗原结合蛋白在25℃下在酸性pH下(例如pH约5.5至约6.0)具有的解离半衰期(t1/2)短于2min。在一个实施方式中，由如本申请所述的经基因修饰的免疫球蛋白重链基因座表达的含有重链可变结构域的抗原结合蛋白在37℃下在酸性pH下(例如pH约5.5至约6.0)具有的解离半衰期(t1/2)短于2min。在一个实施方式中，由如本申请所述的经基因修饰的免疫球蛋白重链基因座表达的含有重链可变结构域的抗原结合蛋白在25℃下在酸性pH下(例如pH约5.5至约6.0)具有的解离半衰期(t1/2)短于1min。在一个实施方式中，由如本申请所述的经基因修饰的免疫球蛋白重链基因座表达的含有重链可变结构域的抗原结合蛋白在37℃下在酸性pH下(例如pH约5.5至约6.0)具有的解离半衰期(t1/2)短于1min。在一个实施方式中，由如本申请所述的基因修饰的免疫球蛋白重链基因座表达的含有重链可变结构域的抗原结合蛋白在酸性pH下(例如pH约5.5至约6.0)的解离半衰期(t1/2)比所述抗原结合蛋白在中性pH下(例如pH约7.0至约7.4)的解离半衰期(t1/2)降低至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约10倍、至少约15倍、至少约20倍、至少约25倍或至少约30倍。
在一个实施方式中，由如本申请所述的基因修饰的免疫球蛋白基因座表达的含有重链可变结构域的抗原结合蛋白与不含基因修饰的野生型抗原结合蛋白相比具有的特征为pH依赖性循环改善、血清半衰期增加或两者兼而有之。
在一个实施方式中，本申请所述的基因修饰的免疫球蛋白基因座包含B细胞群，所述B细胞群经目的抗原刺激后能够产生抗原结合蛋白例如抗体，所述抗原结合蛋白含有具有一个或多个组氨酸残基的重链可变结构域。当如本申请所述的抗原结合蛋白向受试者施用时，与相应的野生型抗原结合蛋白相比显示出增加的血清半衰期，所述野生型抗原结合蛋白具有相似的或足够相似的编码重链可变结构域的氨基酸序列，但是在所述重链可变结构域中不包含组氨酸残基。在一些实施方式中，本申请所述的抗原结合蛋白显示出增加的血清半衰期，其与相应的野生型抗原结合蛋白相比高至少约2倍、至少约5倍、至少约10倍、至少约15倍、至少约20倍，所述野生型抗原结合蛋白具有相似的或足够相似的编码重链可变结构域的氨基酸序列，但是在所述重链可变结构域中不包含组氨酸残基。
在一个方面，本申请提供了一种包含基因修饰的免疫球蛋白基因座的非人动物，其中所述基因修饰的免疫球蛋白基因座含有未经重排的人源重链可变区核苷酸序列，其中所述人源未经重排的重链可变区核苷酸序列包含使用组氨酸密码子对至少一个内源性非组氨酸密码子的取代。
在一个实施方式中，所述非人动物是哺乳动物，包括啮齿动物，例如小鼠、大鼠或仓鼠。
在一个实施方式中，2个或更多个、3个或更多个、4个或更多个、5个或更多个、6个或更多个、7个或更多个、8个或更多个、9个或更多个、10个或更多个、11个或更多个、12个或更多个、13个或更多个、14个或更多个、15个或更多个、16个或更多个、17个或更多个、18个或更多个、19个或更多个、20个或更多个、21个或更多个、22个或更多个、23个或更多个、24个或更多个、25个或更多个、26个或更多个、27个或更多个、28个或更多个、29个或更多个、30个或更多个、31个或更多个、32个或更多个、33个或更多个、34个或更多个、35个或更多个、36个或更多个、37个或更多个、38个或更多个、39个或更多个、40个或更多个、41个或更多个、42个或更多个、43个或更多个、44个或更多个、45个或更多个、46个或更多个、47个或更多个、48个或更多个、49个或更多个、50个或更多个、51个或更多个、52个或更多个、53个或更多个、54个或更多个、55个或更多个、56个或更多个、57个或更多个、58个或更多个、59个或更多个、60个或更多个或者61个或更多个内源性非组氨酸密码子被组氨酸密码子取代。
在一个实施方式中，所述内源性非组氨酸密码子编码选自下述的氨基酸：Y、N、D、Q、S、W和R。
在一个实施方式中，所述取代的组氨酸密码子存在于未经重排的重链可变区核苷酸序列中，所述未经重排的重链可变区核苷酸序列编码选自下组的免疫球蛋白可变结构域：N-末端区、环4区、CDR1、CDR2、CDR3及其组合。
在一个实施方式中，所述取代的组氨酸密码子存在于未经重排的重链可变区核苷酸序列中，所述未经重排的重链可变区核苷酸序列编码选自下述的互补性决定区(CDR)：CDR1、CDR2、CDR3及其组合。
在一个实施方式中，所述取代的组氨酸密码子存在于未经重排的重链可变区核苷酸序列中，所述未经重排的重链可变区核苷酸序列编码选自下述的框架区(FR)：FR1、FR2、FR3、FR4及其组合。
在一个实施方式中，所述未经重排的重链可变区核苷酸序列包含基因修饰的人源VH基因区段，其中所述人源VH基因区段的至少一个阅读框架中的一个或多个内源性非组氨酸密码子被组氨酸密码子取代。
在一个实施方式中，所述人源未经重排的重链可变区核苷酸序列包含使用组氨酸密码子取代人源VH基因区段的至少一个内源性非组氨酸密码子的修饰，其中所述人源VH基因区段选自下组：VH1-2、VH1-3、VH1-8、VH1-18、VH1-24、VH1-45、VH1-46、VH1-58、VH1-69、VH2-5、VH2-26、VH2-70、VH3-7、VH3-9、VH3-11、VH3-13、VH3-15、VH3-16、VH3-20、VH3-21、VH3-23、VH3-30、VH3-30-3、VH3-30-5、VH3-33、VH3-35、VH3-38、VH3-43、VH3-48、VH3-49、VH3-53、VH3-64、VH3-66、VH3-72、VH3-73、VH3-74、VH4-4、VH4-28、VH4-30-1、VH4-30-2、VH4-30-4、VH4-31、VH4-34、VH4-39、VH4-59、VH4-61、VH5-51、VH6-1、VH7-4-1、VH7-81及其组合。
在一个实施方式中，所述人源未经重排的重链可变区核苷酸序列包含经基因修饰的人源JH基因区段，其中所述人源JH基因区段的至少一个阅读框架中的一个或多个内源性非组氨酸密码子被组氨酸密码子取代。
在一个实施方式中，所述人源未经重排的重链可变区核苷酸序列包含修饰，所述修饰是使用组氨酸密码子取代人源JH区段的至少一个内源性非组氨酸密码子，其中所述人源JH基因区段选自下组：JH1、JH2、JH3、JH4、JH5、JH6及其组合。
在一个实施方式中，所述取代的组氨酸密码子存在于编码CDR3的一部分的重链可变区核苷酸序列中。在一个实施方式中，所述CDR3的一部分包含来源于基因修饰的人源D基因区段的阅读框架的氨基酸序列，所述基因修饰的D基因区段含有使用组氨酸密码子取代在阅读框架中的至少一个内源性非组氨酸密码子的修饰。
在一个实施方式中，所述被组氨酸密码子取代的内源性非组氨酸密码子编码选自下述的氨基酸：Y、N、D、Q、S、W和R。
在一个实施方式中，所述取代的组氨酸密码子存在于在人源化免疫球蛋白小鼠中最常见的人源D基因区段的至少一个阅读框架中。
在一个实施方式中，编码CDR3的一部分的所述基因修饰的人源D基因区段的阅读框架选自疏水性框架、终止框架和亲水性框架。
在一个实施方式中，所述阅读框架是人源D基因区段的疏水性框架。
在一个实施方式中，所述人源D基因区段的疏水性框架包含编码选自下组的氨基酸序列的核苷酸序列：D1-1(GTTGT；SEQ ID NO:88)、D1-7(GITGT；SEQ ID NO:89)、D1-20(GITGT；SEQ ID NO:89)和D1-26(GIVGAT；SEQ ID NO:90)，并且所述人源D基因区段还包含使用组氨酸密码子取代在所述核苷酸序列中的至少一个内源性非组氨酸密码子的修饰。
在一个实施方式中，所述人源D基因区段的疏水性框架包含编码选自下组的氨基酸序列的核苷酸序列：D2-2(DIVVVPAAI；SEQ ID NO:92)、D2-8(DIVLMVYAI；SEQ ID NO:94)、D2-15(DIVVVVAAT；SEQ ID NO:95)和D2-21(HIVVVTAI；SEQ ID NO:97)，并且所述人源D基因区段还包含使用组氨酸密码子取代在所述核苷酸序列中的至少一个内源性非组氨酸密码子的修饰。
在一个实施方式中，所述人源D基因区段的疏水性框架包含编码选自下组的氨基酸序列的核苷酸序列：D3-3(ITIFGVVII；SEQ ID NO:98)、D3-9(ITIF*LVII；SEQ ID NO:99,SEQ ID NO:100)、D3-10(ITMVRGVII；SEQ ID NO:101)、D3-16(IMITFGGVIVI；SEQ ID NO:102)和D3-22(ITMIVVVIT；SEQ ID NO:103)，并且所述人源D基因区段还包含使用组氨酸密码子取代在所述核苷酸序列中的至少一个内源性密码子的修饰。
在一个实施方式中，所述人源D基因区段的疏水性框架包含编码选自下组的氨基酸序列的核苷酸序列：D4-4(TTVT；SEQ ID NO:105)、D4-11(TTVT；SEQ ID NO:105)、D4-17(TTVT；SEQ ID NO:105)、D4-23(TTVVT；SEQ ID NO:106)，并且所述人源D基因区段还包含使用组氨酸密码子取代在所述核苷酸序列中的至少一个内源性非组氨酸密码子的修饰。
在一个实施方式中，所述人源D基因区段的疏水性框架包含编码选自下组的氨基酸序列的核苷酸序列：D5-5(VDTAMV；SEQ ID NO:107)、D5-12(VDIVATI；SEQ ID NO:108)、D5-18(VDTAMV；SEQ ID NO:107)和D5-24(VEMATI；SEQ ID NO:109)，并且所述人源D基因区段还包含使用组氨酸密码子取代在所述核苷酸序列中的至少一个内源性非组氨酸密码子的修饰。
在一个实施方式中，所述人源D基因区段的疏水性框架包含编码选自下组的氨基酸序列的核苷酸序列：D6-6(SIAAR；SEQ ID NO:111)、D6-13(GIAAAG；SEQ ID NO:113)和D6-19(GIAVAG；SEQ ID NO:115)，并且所述人源D基因区段还包含使用组氨酸密码子取代在所述核苷酸序列中的至少一个内源性非组氨酸密码子的修饰。
在一个实施方式中，所述疏水性框架包含编码人源D7-27(LTG)的核苷酸序列，并且所述人源D基因区段还包含使用组氨酸密码子取代在所述核苷酸序列中的至少一个内源性非组氨酸密码子的修饰。
在一个实施方式中，所述阅读框架是人源D基因区段的终止阅读框架。
在一个实施方式中，所述人源D基因区段的终止阅读框架包含编码选自下组的氨基酸序列的核苷酸序列：D1-1(VQLER；SEQ ID NO:8)、D1-7(V*LEL)、D1-20(V*LER)、D1-26(V*WELL；SEQ ID NO:12)，并且所述人源D基因区段还包含使用组氨酸密码子取代在所述核苷酸序列中的至少一个内源性非组氨酸密码子的修饰。
在一个实施方式中，所述人源D基因区段的终止阅读框架包含编码选自下组的氨基酸序列的核苷酸序列：D2-2(RIL**YQLLY；SEQ ID NO:14)、D2-8(RILY*WCMLY；SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:17)、D2-15(RIL*WW*LLL)和D2-21(SILWW*LLF；SEQ ID NO:19)，并且所述人源D基因区段还包含使用组氨酸密码子取代在所述核苷酸序列中的至少一个内源性非组氨酸密码子的修饰。
在一个实施方式中，所述人源D基因区段的终止阅读框架包含编码选自下组的氨基酸序列的核苷酸序列：D3-3(VLRFLEWLLY；SEQ ID NO:21)、D3-9(VLRYFDWLL*；SEQ ID NO:23)、D3-10(VLLWFGELL*；SEQ ID NO:25)、D3-16(VL*LRLGELSLY；SEQ ID NO:27)和D3-22(VLL***WLLL；SEQ ID NO:29)，并且所述人源D基因区段包含使用组氨酸密码子取代在所述核苷酸序列中的至少一个内源性非组氨酸密码子的修饰。
在一个实施方式中，所述人源D基因区段的终止阅读框架包含编码选自下组的氨基酸序列的核苷酸序列：D4-4(*LQ*L)、D4-11(*LQ*L)、D4-17(*LR*L)和D4-23(*LRW*L)，并且所述人源D基因区段包含使用组氨酸密码子取代在所述核苷酸序列中的至少一个内源性非组氨酸密码子的修饰。
在一个实施方式中，所述人源D基因区段的终止阅读框架包含编码选自下组的氨基酸序列的核苷酸序列：D5-5(WIQLWL；SEQ ID NO:35)；D5-12(WI*WLRL；SEQ ID NO:37)、D5-18(WIQLWL；SEQ ID NO:35)和D5-24(*RWLQL；SEQ ID NO:39)，并且所述人源D基因区段包含使用组氨酸密码子取代在所述核苷酸序列中的至少一个内源性非组氨酸密码子的修饰。
在一个实施方式中，所述人源D基因区段的终止阅读框架包含编码选自下组的氨基酸序列的核苷酸序列：D6-6(V*QLV)、D6-13(V*QQLV；SEQ ID NO:41)和D6-19(V*QWLV；SEQID NO:43)，并且所述人源D基因区段还包含使用组氨酸密码子取代在所述核苷酸序列中的至少一个内源性非组氨酸密码子的修饰。
在一个实施方式中，所述人源D基因区段的终止阅读框架包含编码D7-27(*LG)的核苷酸序列，并且所述人源D基因区段还包含使用组氨酸密码子取代在所述核苷酸序列中的至少一个内源性非组氨酸密码子的修饰。
在一个实施方式中，所述阅读框架是人源D基因区段的亲水性框架。
在一个实施方式中，所述人源D基因区段的亲水性框架包含编码选自下组的氨基酸序列的核苷酸序列：D1-1(YNWND；SEQ ID NO:45)、D1-7(YNWNY；SEQ ID NO:47)、D1-20(YNWND；SEQ ID NO:45)和D1-26(YSGSYY；SEQ ID NO:49)，并且所述人源D基因区段还包含使用组氨酸密码子取代在所述核苷酸序列中的至少一个内源性密码子的修饰。在一个实施方式中，所述亲水性框架包含编码选自下组的氨基酸序列的核苷酸序列：SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:50及其组合。
在一个实施方式中，所述人源D基因区段的亲水性框架包含编码选自下组的氨基酸序列的核苷酸序列：D2-2(GYCSSTSCYT；SEQ ID NO:51)、D2-8(GYCTNGVCYT；SEQ ID NO:53)、D2-15(GYCSGGSCYS；SEQ ID NO:55)和D2-21(AYCGGDCYS；SEQ ID NO:57)，并且所述人源D基因区段还包含使用组氨酸密码子取代在所述核苷酸序列中的至少一个内源性密码子的修饰。在一个实施方式中，所述亲水性框架包含编码选自下组的氨基酸序列的核苷酸序列：SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:58及其组合。
在一个实施方式中，所述人源D基因区段的亲水性框架包含编码选自下组的氨基酸序列的核苷酸序列：D3-3(YYDFWSGYYT；SEQ ID NO:59)、D3-9(YYDILTGYYN；SEQ ID NO:61)、D3-10(YYYGSGSYYN；SEQ ID NO:63)、D3-16(YYDYVWGSYRYT；SEQ ID NO:65)和D3-22(YYYDSSGYYY；SEQ ID NO:67)，并且所述人源D基因区段还包含使用组氨酸密码子取代在所述核苷酸序列中的至少一个内源性密码子的修饰。在一个实施方式中，所述亲水性框架包含编码选自下组的氨基酸序列的核苷酸序列：SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:68及其组合。
在一个实施方式中，所述人源D基因区段的亲水性框架包含编码选自下组的氨基酸序列的核苷酸序列：D4-4(DYSNY；SEQ ID NO:69)、D4-11(DYSNY；SEQ ID NO:69)、D4-17(DYGDY；SEQ ID NO:71)和D4-23(DYGGNS；SEQ ID NO:73)，并且所述人源D基因区段包含使用组氨酸密码子取代在所述核苷酸序列中的至少一个内源性密码子的修饰。在一个实施方式中，所述亲水性框架包含编码选自下组的氨基酸序列的核苷酸序列：SEQ ID NO:70、SEQID NO:72、SEQ ID NO:74及其组合。
在一个实施方式中，所述人源D基因区段的亲水性框架包含编码选自下组的氨基酸序列的核苷酸序列：D5-5(GYSYGY；SEQ ID NO:75)、D5-12(GYSGYDY；SEQ ID NO:77)、D5-18(GYSYGY；SEQ ID NO:75)和D5-24(RDGYNY；SEQ ID NO:79)，并且所述人源D基因区段还包含使用组氨酸密码子取代在所述核苷酸序列中的至少一个内源性密码子的修饰。在一个实施方式中，所述亲水性框架包含编码选自下组的氨基酸序列的核苷酸序列：SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:80及其组合。
在一个实施方式中，所述人源D基因区段的亲水性框架包含编码选自下组的氨基酸序列的核苷酸序列：D6-6(EYSSSS；SEQ ID NO:81)、D6-13(GYSSSWY；SEQ ID NO:83)和D6-19(GYSSGWY；SEQ ID NO:85)，并且所述人源D基因区段还包含使用组氨酸密码子取代在所述核苷酸序列中的至少一个内源性密码子的修饰。在一个实施方式中，所述亲水性框架包含编码选自下组的氨基酸序列的核苷酸序列：SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:76及其组合。
在一个实施方式中，所述人源D基因区段的亲水性框架包含编码D7-27(NWG)的核苷酸序列，并且所述人源D基因区段还包含使用组氨酸密码子取代在所述核苷酸序列中的至少一个内源性密码子的修饰。
在一个实施方式中，所述人源D基因区段的亲水性框架包含编码选自下组的氨基酸序列的核苷酸序列：SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:52、SEQ IDNO:54、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:64、SEQ IDNO:66、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:76、SEQ IDNO:78、SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:86及其组合。
在一个实施方式中，所述未经重排的重链可变区核苷酸序列包含与编码选自IgM、IgD、IgG、IgE和IgA的免疫球蛋白同种型的人源或非人源重链恒定区核苷酸序列可操作地连接所述反转的人源D基因区段。
在一个实施方式中，所述人源未经重排的免疫球蛋白重链可变区核苷酸序列可操作地与选自下述的人源或非人源重链恒定区核苷酸序列连接：CH1、铰链、CH2、CH3及其组合。在一个实施方式中，所述重链恒定区核苷酸序列包含CH1、铰链、CH2和CH3(CH1-铰链-CH2-CH3)。
在一个实施方式中，重链恒定区核苷酸序列存在于内源性基因座(例如所述核苷酸序列位于野生型非人动物中)或存在于异位(即在其基因组的不同于内源性免疫球蛋白链基因座的位置，或在其内源性基因座中，例如在免疫球蛋白可变基因座中，其中所述内源性基因座位于或被移至基因组中的不同位置)。
在一个实施方式中，所述重链恒定区核苷酸序列包含在CH2或CH3中的修饰，其中所述修饰在酸性环境中(例如，在内涵体中，其pH范围约5.5至约6.0)增加所述重链恒定区氨基酸序列对FcRn的亲和性。
在一个实施方式中，编码人源重链恒定区氨基酸序列的所述重链恒定区核苷酸序列包含在位置250(例如E或Q)；250和428(例如L或F)；252(例如L/Y/F/W或T)、254(例如S或T)和256(例如S/R/Q/E/D或T)的修饰；或在位置428和/或433(例如L/R/S/P/Q或K)和/或434(例如H/F或Y)的修饰；或在位置250和/或428的修饰；或在位置307或308(例如308F、V308F)和434的修饰。在一个实施方式中，所述修饰包含428L(例如M428L)和434S(例如N434S)修饰；428L、259I(例如V259I)和308F(例如V308F)修饰；433K(例如H433K)和434(例如434Y)修饰；252、254和256(例如252Y、254T和256E)修饰；250Q和428L修饰(例如T250Q和M428L)以及307和/或308修饰(例如308F或308P)，其中所述修饰在酸性环境中(例如在内涵体中，其pH范围约5.5至约6.0)增加所述重链恒定区氨基酸序列对FcRn的亲和性。
在一个实施方式中，所述重链恒定区核苷酸序列编码人源CH2氨基酸序列，所述氨基酸序列包含在位置252和257的氨基酸残基之间的至少一个修饰，其中所述修饰在酸性环境中(例如在内涵体中，其pH范围约5.5至约6.0)增加所述人源CH2氨基酸序列对FcRn的亲和性。
在一个实施方式中，所述重链恒定区核苷酸序列编码人源CH2氨基酸序列，所述氨基酸序列包含在位置307和311的氨基酸残基之间的至少一个修饰，其中所述修饰在酸性环境中(例如在内涵体中，其pH范围约5.5至约6.0)增加所述CH2氨基酸序列对FcRn的亲和性。
在一个实施方式中，所述重链恒定区核苷酸序列编码人源CH3氨基酸序列，所述氨基酸序列包含在位置433和436的氨基酸残基之间的至少一个修饰，其中所述修饰在酸性环境中(例如在内涵体中，其pH范围约5.5至约6.0)增加所述CH3氨基酸序列对FcRn的亲和性。
在一个实施方式中，所述重链恒定区核苷酸序列编码人源重链恒定区氨基酸序列，所述氨基酸序列包含选自下组的突变：M428L、N434S及其组合。
在一个实施方式中，所述重链恒定区核苷酸序列编码人源重链恒定区氨基酸序列，所述氨基酸序列包含选自下组的突变：M428L、V259I、V308F及其组合。
在一个实施方式中，所述重链恒定区核苷酸序列编码人源重链恒定区氨基酸序列，所述氨基酸序列包含N434A突变。
在一个实施方式中，所述重链恒定区核苷酸序列编码人源重链恒定区氨基酸序列，所述氨基酸序列包含选自下组的突变：M252Y、S254T、T256E及其组合。
在一个实施方式中，所述重链恒定区核苷酸序列编码人源重链恒定区氨基酸序列，所述氨基酸序列包含选自下组的突变：T250Q、M248L或这两者。
在一个实施方式中，所述重链恒定区核苷酸序列编码人源重链恒定区氨基酸序列，所述氨基酸序列包含选自下组的突变：H433K、N434Y或这两者。
在一个实施方式中，所述基因修饰的免疫球蛋白基因座包含：(1)第一等位基因，其中如上文所述的未经重排的人源免疫球蛋白重链可变区核苷酸序列与第一重链恒定区核苷酸序列可操作地连接，所述第一重链恒定区核苷酸序列编码选自IgG1、IgG2、IgG4及其组合的人源IgG的第一CH3氨基酸序列；和(2)第二等位基因，其中如本申请所述的未经重排的人源免疫球蛋白重链可变区核苷酸序列与第二重链恒定区核苷酸序列可操作地连接，所述第二重链恒定区核苷酸序列编码选自IgG1、IgG2、IgG4及其组合的人源IgG的第二CH3氨基酸序列，并且其中所述第二CH3氨基酸序列包含使所述第二CH3氨基酸序列与蛋白A的结合降低或消除的修饰(参见例如US 2010/0331527A1)。
在一个实施方式中，所述第二CH3氨基酸序列包含H95R修饰(根据IMGT外显子编号；根据EU编号为H435R)。在一个实施方式中，所述第二CH3氨基酸序列还包含Y96F修饰(根据IMGT外显子编号；根据EU编号为H436F)。在另一个实施方式中，所述第二CH3氨基酸序列包含H95R修饰(根据IMGT外显子编号；根据EU编号为H435R)和Y96F修饰(根据IMGT外显子编号；根据EU编号为H436F)这两者。
在一个实施方式中，所述第二CH3氨基酸序列来自经修饰的人源IgG1并且还包含选自下组的突变：D16E、L18M、N44S、K52N、V57M和V82I(IMGT；根据EU编号为D356E、L38M、N384S、K392N、V397M和V422I)。
在一个实施方式中，所述第二CH3氨基酸序列来自经修饰的人源IgG2并且还包含选自下组的突变：N44S、K52N和V82I(IMGT；根据EU编号为N384S、K392N和V422I)。
在一个实施方式中，所述第二CH3氨基酸序列来自经修饰的人源IgG4并且还包含选自下组的突变：Q15R、N44S、K52N、V57M、R69K、E79Q和V82I(IMGT；根据EU编号为Q355R、N384S、K392N、V397M、R409K、E419Q和V422I)。
在一个实施方式中，所述重链恒定区氨基酸序列是非人源恒定区氨基酸序列，并且所述重链恒定区氨基酸序列包含上文所述任意类型的修饰中的一种或多种。
在一个实施方式中，所述重链恒定区核苷酸序列是人源重链恒定区氨基酸序列，并且所述人源重链恒定区氨基酸序列包含上文所述任意类型的修饰中的一种或多种。
在一个实施方式中，全部或基本上全部内源性的VH、D和JH基因区段从免疫球蛋白重链基因座中缺失或者使其不具有功能(例如通过在免疫球蛋白基因座中插入核苷酸序列(例如外源性的核苷酸序列)或者通过使内源性VH、D、JH区段进行不具有功能的重排或反转)。在一个实施方式中，例如，约80％或更多的、约85％或更多的、约90％或更多的、约95％或更多的、约96％或更多的、约97％或更多的、约98％或更多的或者约99％或更多的全部的内源性VH、D或JH基因区段被缺失或使其不具有功能。在一个实施方式中，例如，至少95％、96％、97％、98％或99％的内源性具有功能的V、D或J基因区段被缺失或使其不具有功能。
在一个实施方式中，所述基因修饰的免疫球蛋白重链基因座包含使全部或基本上全部的内源性VH、D和JH基因区段缺失或使其不具有功能的修饰；并且所述基因组基因座包含基因修饰的、未经重排的人源重链可变区核苷酸序列，所述核苷酸序列含有在至少一个阅读框架中使用组氨酸密码子取代至少一个内源性非组氨酸密码子。在一个实施方式中，所述基因修饰的、未经重排的免疫球蛋白重链可变基因序列存在于内源性位置(即所述核苷酸序列位于野生型非人动物中)或存在于异位(即在其基因组的内源性免疫球蛋白链基因座的不同位置，或在其内源性基因座中，例如在免疫球蛋白可变基因座中，其中所述内源性基因座位于或被移至基因组中的不同位置)。
在一个实施方式中，所述经基因修饰的基因座包含内源性Adam6a基因、Adam6b基因或者这两者，并且所述基因修饰不会影响所述内源性Adam6a基因、Adam6b基因或者这两者的表达和/或功能。
在一个实施方式中，所述经基因修饰的基因座包含异位存在的Adam6a基因、Adam6b基因或者这两者。在一个实施方式中，所述Adam6a基因是非人源Adam6a基因。在一个实施方式中，所述Adam6a基因是小鼠Adam6a基因。在一个实施方式中，所述Adam6a基因是人源Adam6a基因。在一个实施方式中，所述Adam6b基因是非人源Adam6b基因。在一个实施方式中，所述Adam6b基因是小鼠Adam6b基因。在一个实施方式中，所述Adam6b基因是人源Adam6b基因。
在一个实施方式中，所述基因修饰的免疫球蛋白基因座还包含人源化的、未经重排的λ和/或κ轻链可变基因序列。在一个实施方式中，所述人源化的、未经重排的λ和/或κ轻链可变基因序列与免疫球蛋白轻链恒定区核苷酸序列可操作地连接，所述轻链恒定区核苷酸序列选自λ轻链恒定区核苷酸序列和κ轻链恒定区核苷酸序列。在一个实施方式中，所述人源化的、未经重排的λ轻链可变区核苷酸序列与λ轻链恒定区核苷酸序列可操作地连接。在一个实施方式中，所述λ轻链恒定区核苷酸序列是小鼠、大鼠或人源序列。在一个实施方式中，所述人源化的、未经重排的κ轻链可变区核苷酸序列与κ轻链恒定区核苷酸序列可操作地连接。在一个实施方式中，所述κ轻链恒定区核苷酸序列是小鼠、大鼠或人源序列。
在一个实施方式中，所述基因修饰的免疫球蛋白基因座包含未经重排的轻链可变基因序列，所述未经重排的轻链可变基因序列含有在编码轻链可变结构域的至少一个阅读框架中引入至少一个组氨酸密码子的至少一个修饰。在一个实施方式中，所述基因修饰的免疫球蛋白基因座包含重排的序列(例如重排的λ或κV/J序列)，所述序列在轻链CDR中含有1个、2个、3个或4个组氨酸密码子。在一个实施方式中，所述CDR选自CDR1、CDR2、CDR3及其组合。在一个实施方式中，所述未经重排的或重排的轻链可变区核苷酸序列是未经重排的或重排的人源λ或κ轻链可变区核苷酸序列。在一个实施方式中，所述未经重排的或重排的人源λ或κ轻链可变区核苷酸序列存在于内源性小鼠免疫球蛋白轻链基因座。在一个实施方式中，所述小鼠免疫球蛋白轻链基因座是小鼠κ基因座。在一个实施方式中，所述小鼠免疫球蛋白轻链基因座是小鼠λ基因座。
在一个实施方式中，如本申请所述的基因修饰的免疫球蛋白基因座存在于小鼠的免疫球蛋白重链基因座中。在一个实施方式中，所述基因修饰的免疫球蛋白基因座存在于小鼠中的人源化的免疫球蛋白重链基因座中。
在一个实施方式中，由如本申请所述的基因修饰的免疫球蛋白重链基因座表达的含有重链可变结构域的抗原结合蛋白与不含基因修饰的相应野生型重链可变结构域相比在酸性环境中(例如在约5.5至约6.0的pH下)显示出更弱的抗原结合。
在一个实施方式中，由如本申请所述的经基因修饰的免疫球蛋白重链基因座表达的含有重链可变结构域的抗原结合蛋白在25℃下在酸性pH下(例如pH约5.5至约6.0)具有的解离半衰期(t1/2)短于2min。在一个实施方式中，由如本申请所述的经基因修饰的免疫球蛋白重链基因座表达的含有重链可变结构域的抗原结合蛋白在37℃下在酸性pH下(例如pH约5.5至约6.0)具有的解离半衰期(t1/2)短于2min。在一个实施方式中，由如本申请所述的经基因修饰的免疫球蛋白重链基因座表达的含有重链可变结构域的抗原结合蛋白在25℃下在酸性pH下(例如pH约5.5至约6.0)具有的解离半衰期(t1/2)短于1min。在一个实施方式中，由如本申请所述的经基因修饰的免疫球蛋白重链基因座表达的含有重链可变结构域的抗原结合蛋白在37℃下在酸性pH下(例如pH约5.5至约6.0)具有的解离半衰期(t1/2)短于1min。在一个实施方式中，由如本申请所述的经基因修饰的免疫球蛋白重链基因座表达的含有重链可变结构域的抗原结合蛋白在酸性pH下(例如pH约5.5至约6.0)的解离半衰期(t1/2)比所述抗原结合蛋白在中性pH下(例如pH约7.0至约7.4)的解离半衰期(t1/2)降低至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约10倍、至少约15倍、至少约20倍、至少约25倍或至少约30倍。
在一个实施方式中，由如本申请所述的基因修饰的免疫球蛋白基因座表达的含有重链可变结构域的抗原结合蛋白与不含本申请所述的基因修饰的野生型抗原结合蛋白相比具有的特征为pH依赖性循环改善、血清半衰期增加或两者兼而有之。
在一个实施方式中，本申请所述的经基因修饰的免疫球蛋白基因座包含B细胞群，所述B细胞群经目的抗原刺激后能够产生抗原结合蛋白例如抗体，所述抗原结合蛋白含有具有一个或多个组氨酸残基的重链可变结构域。当如本申请所述的抗原结合蛋白向受试者施用时，与相应的野生型抗原结合蛋白相比显示出增加的血清半衰期，所述野生型抗原结合蛋白具有相似的或足够相似的编码重链可变结构域的氨基酸序列，但是在所述重链可变结构域中不包含组氨酸残基。在一些实施方式中，本申请所述的抗原结合蛋白显示出的血清半衰期增加与相应的野生型抗原结合蛋白相比高至少约2倍、至少约5倍、至少约10倍、至少约15倍、至少约20倍，所述野生型抗原结合蛋白具有相似的或足够相似的编码重链可变结构域的氨基酸序列，但是在所述重链可变结构域中不包含组氨酸残基。
在一个实施方式中，所述非人源动物是针对基因修饰的免疫球蛋白重链基因座的杂合子，并且所述非人动物能够表达人源免疫球蛋白重链可变结构域，所述人源免疫球蛋白重链可变结构域包含主要来源于如本申请所述的经基因修饰的免疫球蛋白重链基因座的至少一个组氨酸残基。
在一个方面，本申请提供了一种非人动物，所述非人动物包含经基因修饰的免疫球蛋白基因座，所述免疫球蛋白基因座包含人源VH、D和JH基因区段，其中所述至少一个人源D基因区段相对于相应的野生型序列从5’至3’反转，并且其中所述反转的人源D基因区段的至少一个阅读框架包含组氨酸密码子。
在一个实施方式中，所述非人动物是哺乳动物，包括啮齿动物，例如小鼠、大鼠或仓鼠。
在一个实施方式中，所述经基因修饰的免疫球蛋白基因座存在于种系基因组中。
在一个实施方式中，其中所述反转的人源D基因区段的阅读框架包含1个或更多个、2个或更多个、3个或更多个、4个或更多个、5个或更多个、6个或更多个、7个或更多个、8个或更多个、9个或更多个、10个或更多个、11个或更多个、12个或更多个、13个或更多个、14个或更多个、15个或更多个、16个或更多个、17个或更多个、18个或更多个、19个或更多个、20个或更多个、21个或更多个、22个或更多个、23个或更多个、24个或更多个、25个或更多个、26个或更多个、27个或更多个、28个或更多个、29个或更多个、30个或更多个、31个或更多个、32个或更多个、33个或更多个或者34个或更多个组氨酸密码子。
在一个实施方式中，至少两个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个、至少24个或者全部或基本上全部的具有功能的人源D基因区段相对于野生型序列是反向的。
在一个实施方式中，全部或基本上全部的内源性免疫球蛋白VH、D、JH基因区段从所述免疫球蛋白重链基因座中缺失或使其不具有功能(例如通过在所述免疫球蛋白基因座插入核苷酸序列例如外源性核苷酸序列或通过使全部或基本上全部的内源性VH、D、JH基因区段产生不具有功能的重排或反转)，并且所述经基因修饰的免疫球蛋白基因座包含人源VH、D和JH基因区段，其中所述至少一个人源D基因区段以相对于野生型序列相反的方向存在，并且其中在反转的D基因区段中的至少一个阅读框架包含至少一个组氨酸密码子。
在一个实施方式中，所述反转的人源D基因区段与人源VH基因区段和/或人源JH基因区段可操作地连接。
在一个实施方式中，所述人源D基因区段以相对于选自下组的相应的野生型序列相反的方向存在：D1-1、D1-7、D1-20、D1-26、D2-2、D2-8、D2-15、D2-21、D3-3、D3-9、D3-10、D3-16、D3-22、D4-4、D4-11、D4-17、D4-23、D5-5、D5-12、D5-18、D5-24、D6-6、D6-13、D6-19、D7-27及其组合。
在一个实施方式中，以与相应的野生型序列相反的方向存在的所述人源D基因区段是选自下组的D1基因区段：D1-1、D1-7、D1-20、D1-26及其组合。
在一个实施方式中，以与相应的野生型序列相反的方向存在的所述人源D基因区段是选自下组的D2基因区段：D2-2、D2-8、D2-15、D2-21及其组合。
在一个实施方式中，以与相应的野生型序列相反的方向存在的所述人源D基因区段是选自下组的D3基因区段：D3-3、D3-9、D3-10、D3-16、D3-22及其组合。
在一个实施方式中，以与相应的野生型序列相反的方向存在的所述人源D基因区段是选自下组的D4基因区段：D4-4、D4-11、D4-17、D4-23及其组合。
在一个实施方式中，以与相应的野生型序列相反的方向存在的所述人源D基因区段是选自下组的D5基因区段：D5-5、D5-12、D5-18、D5-24及其组合。
在一个实施方式中，以与相应的野生型序列相反的方向存在的所述人源D基因区段是选自下组的D6基因区段：D6-6、D6-13、D6-19及其组合。
在一个实施方式中，以与相应的野生型序列相反的方向存在的所述人源D基因区段是D7-27。
在一个实施方式中，所述人源D基因区段的阅读框架选自终止阅读框架、亲水性阅读框架和疏水性阅读框架及其组合，其中所述反转的人源D基因区段的至少一个阅读框架包含组氨酸密码子。
在一个实施方式中，所述未经重排的重链可变区核苷酸序列包含与编码选自IgM、IgD、IgG、IgE和IgA的免疫球蛋白同种型的人源或非人源重链恒定区核苷酸序列可操作地连接的所述反转的人源D基因区段。
在一个实施方式中，所述人源未经重排的免疫球蛋白重链可变区核苷酸序列与选自下述的人源或非人源重链恒定区核苷酸序列可操作地连接：CH1、铰链、CH2、CH3及其组合。在一个实施方式中，所述重链恒定区核苷酸序列包含CH1、铰链、CH2和CH3(CH1-铰链-CH2-CH3)。
在一个实施方式中，重链恒定区核苷酸序列存在于内源性基因座(例如所述核苷酸序列位于野生型非人动物中)或存在于异位(即在其基因组的不同于内源性免疫球蛋白链基因座的基因座，或在其内源性基因座中，例如在免疫球蛋白可变基因座中，其中所述内源性基因座位于或被移至基因组中的不同位置)。
在一个实施方式中，所述重链恒定区核苷酸序列包含在CH2或CH3中的修饰，其中所述修饰在酸性环境中(例如，在内涵体中，其pH范围约5.5至约6.0)增加所述重链恒定区氨基酸序列对FcRn的亲和性。
在一个实施方式中，编码人源重链恒定区氨基酸序列的所述重链恒定区核苷酸序列包含在位置250(例如E或Q)；250和428(例如L或F)；252(例如L/Y/F/W或T)、254(例如S或T)和256(例如S/R/Q/E/D或T)的修饰；或在位置428和/或433(例如L/R/S/P/Q或K)和/或434(例如H/F或Y)的修饰；或在位置250和/或428的修饰；或在位置307或308(例如308F、V308F)和434的修饰。在一个实施方式中，所述修饰包含428L(例如M428L)和434S(例如N434S)修饰；428L、259I(例如V259I)和308F(例如V308F)修饰；433K(例如H433K)和434(例如434Y)修饰；252、254和256(例如252Y、254T和256E)修饰；250Q和428L修饰(例如T250Q和M428L)以及307和/或308修饰(例如308F或308P)，其中所述修饰在酸性环境中(例如在内涵体中，其pH范围约5.5至约6.0)增加所述重链恒定区氨基酸序列对FcRn的亲和性。
在一个实施方式中，所述重链恒定区核苷酸序列编码人源CH2氨基酸序列，所述氨基酸序列包含在位置252和257的氨基酸残基之间的至少一个修饰，其中所述修饰在酸性环境中(例如在内涵体中，其pH范围约5.5至约6.0)增加所述人源CH2氨基酸序列对FcRn的亲和性。
在一个实施方式中，所述重链恒定区核苷酸序列编码人源CH2氨基酸序列，所述氨基酸序列包含在位置307和311的氨基酸残基之间的至少一个修饰，其中所述修饰在酸性环境中(例如在内涵体中，其pH范围约5.5至约6.0)增加所述CH2氨基酸序列对FcRn的亲和性。
在一个实施方式中，所述重链恒定区核苷酸序列编码人源CH3氨基酸序列，所述氨基酸序列包含在位置433和436的氨基酸残基之间的至少一个修饰，其中所述修饰在酸性环境中(例如在内涵体中，其pH范围约5.5至约6.0)增加所述CH3氨基酸序列对FcRn的亲和性。
在一个实施方式中，所述重链恒定区核苷酸序列编码人源重链恒定区氨基酸序列，所述氨基酸序列包含选自下组的突变：M428L、N434S及其组合。
在一个实施方式中，所述重链恒定区核苷酸序列编码人源重链恒定区氨基酸序列，所述氨基酸序列包含选自下组的突变：M428L、V259I、V308F及其组合。
在一个实施方式中，所述重链恒定区核苷酸序列编码人源重链恒定区氨基酸序列，所述氨基酸序列包含N434A突变。
在一个实施方式中，所述重链恒定区核苷酸序列编码人源重链恒定区氨基酸序列，所述氨基酸序列包含选自下组的突变：M252Y、S254T、T256E及其组合。
在一个实施方式中，所述重链恒定区核苷酸序列编码人源重链恒定区氨基酸序列，所述氨基酸序列包含选自下组的突变：T250Q、M248L或这两者。
在一个实施方式中，所述重链恒定区核苷酸序列编码人源重链恒定区氨基酸序列，所述氨基酸序列包含选自下组的突变：H433K、N434Y或这两者。
在一个实施方式中，所述经基因修饰的免疫球蛋白基因座包含：(1)第一等位基因，其中如上文所述的未经重排的人源免疫球蛋白重链可变区核苷酸序列与第一重链恒定区核苷酸序列可操作地连接，所述第一重链恒定区核苷酸序列编码选自IgG1、IgG2、IgG4及其组合的人源IgG的第一CH3氨基酸序列；和(2)第二等位基因，其中如本申请所述的未经重排的人源免疫球蛋白重链可变区核苷酸序列与第二重链恒定区核苷酸序列可操作地连接，所述第二重链恒定区核苷酸序列编码选自IgG1、IgG2、IgG4及其组合的人源IgG的第二CH3氨基酸序列，并且其中所述第二CH3氨基酸序列包含使所述第二CH3氨基酸序列与蛋白A的结合降低或消除的修饰(参见例如US 2010/0331527A1)。
在一个实施方式中，所述第二CH3氨基酸序列包含H95R修饰(根据IMGT外显子编号；根据EU编号为H435R)。在一个实施方式中，所述第二CH3氨基酸序列还包含Y96F修饰(根据IMGT外显子编号；根据EU编号为H436F)。在另一个实施方式中，所述第二CH3氨基酸序列包含H95R修饰(根据IMGT外显子编号；根据EU编号为H435R)和Y96F修饰(根据IMGT外显子编号；根据EU编号为H436F)这两者。
在一个实施方式中，所述第二CH3氨基酸序列来自经修饰的人源IgG1并且还包含选自下组的突变：D16E、L18M、N44S、K52N、V57M和V82I(IMGT；根据EU编号为D356E、L38M、N384S、K392N、V397M和V422I)。
在一个实施方式中，所述第二CH3氨基酸序列来自经修饰的人源IgG2并且还包含选自下组的突变：N44S、K52N和V82I(IMGT；根据EU编号为N384S、K392N和V422I)。
在一个实施方式中，所述第二CH3氨基酸序列来自经修饰的人源IgG4并且还包含选自下组的突变：Q15R、N44S、K52N、V57M、R69K、E79Q和V82I(IMGT；根据EU编号为Q355R、N384S、K392N、V397M、R409K、E419Q和V422I)。
在一个实施方式中，所述重链恒定区氨基酸序列是非人源恒定区氨基酸序列，并且所述重链恒定区氨基酸序列包含上文所述任意类型的修饰中的一种或多种。
在一个实施方式中，所述重链恒定区核苷酸序列是人源重链恒定区氨基酸序列，并且所述人源重链恒定区氨基酸序列包含上文所述任意类型的修饰中的一种或多种。
在一个实施方式中，全部或基本上全部内源性的VH、D和JH基因区段从免疫球蛋白重链基因座中缺失或者使其不具有功能(例如通过在免疫球蛋白基因座中插入核苷酸序列(例如外源性的核苷酸序列)或者通过使内源性VH、D、JH区段进行不具有功能的重排或反转)。在一个实施方式中，例如，约80％或更多的、约85％或更多的、约90％或更多的、约95％或更多的、约96％或更多的、约97％或更多的、约98％或更多的或者约99％或更多的全部的内源性VH、D或JH基因区段被缺失或使其不具有功能。在一个实施方式中，例如，至少95％、96％、97％、98％或99％的内源性具有功能的V、D或J基因区段被缺失或使其不具有功能。
在一个实施方式中，所述基因修饰的免疫球蛋白重链基因座包含使全部或基本上全部的内源性VH、D和JH基因区段缺失或使其不具有功能的修饰；并且所述经基因修饰的基因座包含未经重排的重链可变区核苷酸序列，所述核苷酸序列含有如本申请所述的至少一个反转的人源D基因区段，其中所述未经重排的重链可变区核苷酸序列存在于内源性位置(即所述核苷酸序列位于野生型非人动物中)或存在于异位(即在其基因组的不同于内源性免疫球蛋白链基因座的基因座，或在其内源性基因座中，例如在免疫球蛋白可变基因座中，其中所述内源性基因座位于或被移至基因组中的不同位置)。
在一个实施方式中，所述经基因修饰的免疫球蛋白基因座包含内源性Adam6a基因、Adam6b基因或者这两者，并且所述基因修饰不会影响所述内源性Adam6a基因、Adam6b基因或者这两者的表达和/或功能。
在一个实施方式中，所述经基因修饰的免疫球蛋白基因座包含异位存在的Adam6a基因、Adam6b基因或者这两者。在一个实施方式中，所述Adam6a基因是非人源Adam6a基因。在一个实施方式中，所述Adam6a基因是小鼠Adam6a基因。在一个实施方式中，所述Adam6a基因是人源Adam6a基因。在一个实施方式中，所述Adam6b基因是非人源Adam6b基因。在一个实施方式中，所述Adam6b基因是小鼠Adam6b基因。在一个实施方式中，所述Adam6b基因是人源Adam6b基因。
在一个实施方式中，所述基因修饰的免疫球蛋白基因座还包含人源化的、未经重排的λ和/或κ轻链可变基因序列。在一个实施方式中，所述人源化的、未经重排的λ和/或κ轻链可变基因序列与免疫球蛋白轻链恒定区核苷酸序列可操作地连接，所述轻链恒定区核苷酸序列选自λ轻链恒定区核苷酸序列和κ轻链恒定区核苷酸序列。在一个实施方式中，所述人源化的、未经重排的λ轻链可变区核苷酸序列与λ轻链恒定区核苷酸序列可操作地连接。在一个实施方式中，所述λ轻链恒定区核苷酸序列是小鼠、大鼠或人源序列。在一个实施方式中，所述人源化的、未经重排的κ轻链可变区核苷酸序列与κ轻链恒定区核苷酸序列可操作地连接。在一个实施方式中，所述κ轻链恒定区核苷酸序列是小鼠、大鼠或人源序列。
在一个实施方式中，所述基因修饰的免疫球蛋白基因座包含未经重排的轻链可变基因序列，所述未经重排的轻链可变基因序列含有在编码轻链可变结构域的至少一个阅读框架中引入至少一个组氨酸密码子的至少一个修饰。在一个实施方式中，所述基因修饰的免疫球蛋白基因座包含重排的序列(例如重排的λ或κV/J序列)，所述序列在轻链CDR中含有1个、2个、3个或4个组氨酸密码子。在一个实施方式中，所述CDR选自CDR1、CDR2、CDR3及其组合。在一个实施方式中，所述未经重排的或重排的轻链可变区核苷酸序列是未经重排的或重排的人源λ或κ轻链可变区核苷酸序列。在一个实施方式中，所述未经重排的或重排的人源λ或κ轻链可变区核苷酸序列存在于内源性小鼠免疫球蛋白轻链基因座。在一个实施方式中，所述小鼠免疫球蛋白轻链基因座是小鼠κ基因座。在一个实施方式中，所述小鼠免疫球蛋白轻链基因座是小鼠λ基因座。
在一个实施方式中，如本申请所述的基因修饰的免疫球蛋白基因座存在于小鼠的免疫球蛋白重链基因座中。在一个实施方式中，所述基因修饰的免疫球蛋白基因座存在于小鼠中的人源化的免疫球蛋白重链基因座中。
在一个实施方式中，所述非人源动物是针对经基因修饰的免疫球蛋白重链基因座的杂合子，并且所述非人动物能够表达人源免疫球蛋白重链可变结构域，所述人源免疫球蛋白重链可变结构域包含主要来源于如本申请所述的经基因修饰的免疫球蛋白重链基因座的至少一个组氨酸残基。
在一个实施方式中，由如本申请所述的基因修饰的免疫球蛋白重链基因座表达的含有重链可变结构域的抗原结合蛋白与不含基因修饰的相应野生型重链可变结构域相比在酸性环境中(例如在约5.5至约6.0的pH下)显示出更弱的抗原结合。
在一个实施方式中，由如本申请所述的基因修饰的免疫球蛋白重链基因座表达的含有重链可变结构域的抗原结合蛋白在25℃下在酸性pH下(例如pH约5.5至约6.0)具有的解离半衰期(t1/2)短于2min。在一个实施方式中，由如本申请所述的基因修饰的免疫球蛋白重链基因座表达的含有重链可变结构域的抗原结合蛋白在37℃下在酸性pH下(例如pH约5.5至约6.0)具有的解离半衰期(t1/2)短于2min。在一个实施方式中，由如本申请所述的经基因修饰的免疫球蛋白重链基因座表达的含有重链可变结构域的抗原结合蛋白在25℃下在酸性pH下(例如pH约5.5至约6.0)具有的解离半衰期(t1/2)短于1min。在一个实施方式中，由如本申请所述的基因修饰的免疫球蛋白重链基因座表达的含有重链可变结构域的抗原结合蛋白在37℃下在酸性pH下(例如pH约5.5至约6.0)具有的解离半衰期(t1/2)短于1min。在一个实施方式中，由如本申请所述的基因修饰的免疫球蛋白重链基因座表达的含有重链可变结构域的抗原结合蛋白在酸性pH下(例如pH约5.5至约6.0)的解离半衰期(t1/2)比所述抗原结合蛋白在中性pH下(例如pH约7.0至约7.4)的解离半衰期(t1/2)降低至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约10倍、至少约15倍、至少约20倍、至少约25倍或至少约30倍。
在一个实施方式中，由如本申请所述的基因修饰的免疫球蛋白基因座表达的含有重链可变结构域的抗原结合蛋白与不含本申请所述的基因修饰的野生型抗原结合蛋白相比具有的特征为pH依赖性循环改善、血清半衰期增加或两者兼而有之。
在一个实施方式中，本申请所述的经基因修饰的免疫球蛋白基因座包含B细胞群，所述B细胞群经目的抗原刺激后能够产生抗原结合蛋白例如抗体，所述抗原结合蛋白含有具有一个或多个组氨酸残基的重链可变结构域。如本申请所述的抗原结合蛋白当向受试者施用时，与相应的野生型抗原结合蛋白相比显示出增加的血清半衰期，所述野生型抗原结合蛋白具有相似的或足够相似的编码重链可变结构域的氨基酸序列，但是在所述重链可变结构域中不包含组氨酸残基。在一些实施方式中，本申请所述的抗原结合蛋白显示出的血清半衰期增加与相应的野生型抗原结合蛋白相比高至少约2倍、至少约5倍、至少约10倍、至少约15倍、至少约20倍，所述野生型抗原结合蛋白具有相似的或足够相似的编码重链可变结构域的氨基酸序列，但是在所述重链可变结构域中不包含组氨酸残基。
在一个方面，本申请提供了一种非人动物，所述非人动物能够表达具有增强的pH依赖性再循环和/或增加的血清半衰期的抗原结合蛋白，其中所述非人动物在其种系基因组中包含未经重排的人源免疫球蛋白重链可变区核苷酸序列，其中所述未经重排的重链可变区核苷酸序列包含如上文所述的加入至少一个组氨酸密码子或使用组氨酸密码子取代至少一个内源性非组氨酸密码子。
在一个实施方式中，由如本申请所述的基因修饰的免疫球蛋白重链基因座表达的含有重链可变结构域的抗原结合蛋白与不含基因修饰的相应野生型重链可变结构域相比在酸性环境中(例如在约5.5至约6.0的pH下)显示出更弱的抗原结合。
在一个实施方式中，由如本申请所述的基因修饰的免疫球蛋白重链基因座表达的含有重链可变结构域的抗原结合蛋白在25℃下在酸性pH下(例如pH约5.5至约6.0)具有的解离半衰期(t1/2)短于2min。在一个实施方式中，由如本申请所述的基因修饰的免疫球蛋白重链基因座表达的含有重链可变结构域的抗原结合蛋白在37℃下在酸性pH下(例如pH约5.5至约6.0)具有的解离半衰期(t1/2)短于2min。在一个实施方式中，由如本申请所述的基因修饰的免疫球蛋白重链基因座表达的含有重链可变结构域的抗原结合蛋白在25℃下在酸性pH下(例如pH约5.5至约6.0)具有的解离半衰期(t1/2)短于1min。在一个实施方式中，由如本申请所述的基因修饰的免疫球蛋白重链基因座表达的含有重链可变结构域的抗原结合蛋白在37℃下在酸性pH下(例如pH约5.5至约6.0)具有的解离半衰期(t1/2)短于1min。在一个实施方式中，由如本申请所述的基因修饰的免疫球蛋白重链基因座表达的含有重链可变结构域的抗原结合蛋白在酸性pH下(例如pH约5.5至约6.0)的解离半衰期(t1/2)比所述抗原结合蛋白在中性pH下(例如pH约7.0至约7.4)的解离半衰期(t1/2)降低至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约10倍、至少约15倍、至少约20倍、至少约25倍或至少约30倍。
在一个实施方式中，由如本申请所述的基因修饰的免疫球蛋白基因座表达的含有重链可变结构域的抗原结合蛋白与不含本申请所述的基因修饰的野生型抗原结合蛋白相比具有的特征为pH依赖性循环改善、血清半衰期增加或两者兼而有之。
在一个实施方式中，本申请所述的经基因修饰的免疫球蛋白基因座包含B细胞群，所述B细胞群经目的抗原刺激后能够产生抗原结合蛋白例如抗体，所述抗原结合蛋白含有具有一个或多个组氨酸残基的重链可变结构域。当如本申请所述的抗原结合蛋白向受试者施用时，与相应的野生型抗原结合蛋白相比显示出增加的血清半衰期，所述野生型抗原结合蛋白具有相似的或足够相似的编码重链可变结构域的氨基酸序列，但是在所述重链可变结构域中不包含组氨酸残基。在一些实施方式中，本申请所述的抗原结合蛋白显示出的血清半衰期增加与相应的野生型抗原结合蛋白相比高至少约2倍、至少约5倍、至少约10倍、至少约15倍、至少约20倍，所述野生型抗原结合蛋白具有相似的或足够相似的编码重链可变结构域的氨基酸序列，但是在所述重链可变结构域中不包含组氨酸残基。
在一个方面，本申请提供了一种靶向构建体，所述靶向构建体包含与非人动物的基因组D区或者基因组V和J区具有同源性的5’和3’靶向臂，其中至少一个VH、D或JH基因区段包含如上文所述的任意修饰，例如加入至少一个组氨酸密码子、使用组氨酸密码子取代至少一个内源性非组氨酸密码子和/或相应于相应的野生型序列反转至少一个具有功能的D基因区段。
在一个方面，本申请提供了一种杂交瘤或四价体杂交瘤，所述杂交瘤或四价体杂交瘤来源于如本申请所述的任意非人动物的细胞。在一个实施方式中，所述非人动物是啮齿动物，例如小鼠、大鼠或仓鼠。
在一个方面，本申请提供了来源于非人动物的多能干细胞、诱导性多能干细胞或全能干细胞，所述非人动物包含本申请所述的多种基因组修饰。在一个特定的实施方式中，所述多能干细胞、诱导性多能干细胞或全能干细胞是小鼠或大鼠胚胎干(ES)细胞。在一个实施方式中，所述多能干细胞、诱导性多能干细胞或全能干细胞具有XX染色体核型或XY染色体核型。在一个实施方式中，所述多能干细胞或诱导性多能干细胞是造血干细胞。
在一个方面，本申请还提供了细胞，所述细胞含有包含如本申请所述的基因修饰的细胞核，例如通过原核显微注射引入细胞的修饰。在一个实施方式中，所述多能干细胞、诱导性多能干细胞或全能干细胞包含基因修饰的免疫球蛋白基因组基因座，其中所述基因组基因座从5’至3’包含(1)FRT重组位点，(2)人源VH基因区段，(3)小鼠adam6基因，(4)loxP重组位点，(5)组氨酸取代的人源D基因区段，(6)人源JH基因区段，随后为(7)小鼠Ei(内含子增强子)和(8)小鼠IgM恒定区核苷酸序列。
在一个方面，本申请提供了一种淋巴细胞，所述淋巴细胞分离自如本申请所述的基因修饰的非人动物。在一个实施方式中，所述淋巴细胞是B细胞，其中所述B细胞包含免疫球蛋白基因组基因座，所述基因座含有未经重排的重链可变区核苷酸序列，其中所述未经重排的重链可变基因序列包含插入至少一个组氨酸密码子或使用组氨酸密码子取代至少一个内源性非组氨酸密码子。
在一个方面，本申请提供了一种淋巴细胞，所述淋巴细胞分离自如本申请所述的经基因修饰的非人动物。在一个实施方式中，所述淋巴细胞是B细胞，其中所述B细胞包含免疫球蛋白基因座，所述基因座含有人源V、D和J基因区段，其中相对于野生型序列至少一个所述人源D基因区段已被从5’至3’反转，并且其中所述反转的人源D基因区段的至少一个阅读框架编码至少一个组氨酸残基。在一个实施方式中，所述B细胞能够产生抗原结合蛋白，所述抗原结合蛋白包含如本申请所述的基因修饰的重链可变结构域。在一个实施方式中，如本申请所述的基因修饰的重链可变结构域与重链恒定区氨基酸序列可操作地连接。
在一个方面，本申请提供了一种B细胞群，所述B细胞群能够表达抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白在重链可变结构域中包含至少一个组氨酸残基，其中所述B细胞群包含如上文所述的任意基因修饰。在一个实施方式中，所述至少一个组氨酸残基存在于重链CDR中。在一个实施方式中，所述CDR选自CDR1、CDR2、CDR3及其组合。在一个实施方式中，所述至少一个组氨酸残基存在于CDR3中。
在一个方面，本申请提供了一种B细胞群，所述B细胞群能够表达具有增加的血清半衰期和/或增强的pH依赖性再循环的抗原结合蛋白，其中所述B细胞群包含如本申请所述的任意基因修饰。
在一个方面，本申请提供了一种制备非人动物的方法，所述非人动物包括基因修饰的免疫球蛋白重链可变基因座，所述方法包括：(a)修饰非人动物的基因组以缺失或使内源性免疫球蛋白重链V、D和J基因区段不具有功能(例如通过在免疫球蛋白基因座中插入核苷酸序列例如外源性核苷酸序列或通过使内源性VH、D、JH区段产生不具有功能的重排或反转)；和(b)在基因组中放置未经重排的重链可变区核苷酸序列，其中所述未经重排的重链可变区核苷酸序列包含如上文所述加入至少一个组氨酸密码子或使用组氨酸密码子取代至少一个内源性非组氨酸密码子。
在一个实施方式中，所述非人动物是哺乳动物，包括啮齿动物，例如小鼠、大鼠或仓鼠。
在一个实施方式中，2个或更多个、3个或更多个、4个或更多个、5个或更多个、6个或更多个、7个或更多个、8个或更多个、9个或更多个、10个或更多个、11个或更多个、12个或更多个、13个或更多个、14个或更多个、15个或更多个、16个或更多个、17个或更多个、18个或更多个、19个或更多个、20个或更多个、21个或更多个、22个或更多个、23个或更多个、24个或更多个、25个或更多个、26个或更多个、27个或更多个、28个或更多个、29个或更多个、30个或更多个、31个或更多个、32个或更多个、33个或更多个、34个或更多个、35个或更多个、36个或更多个、37个或更多个、38个或更多个、39个或更多个、40个或更多个、41个或更多个、42个或更多个、43个或更多个、44个或更多个、45个或更多个、46个或更多个、47个或更多个、48个或更多个、49个或更多个、50个或更多个、51个或更多个、52个或更多个、53个或更多个、54个或更多个、55个或更多个、56个或更多个、57个或更多个、58个或更多个、59个或更多个、60个或更多个或者61个或更多个内源性非组氨酸密码子被组氨酸密码子取代。
在一个实施方式中，所述内源性非组氨酸密码子编码选自下述的氨基酸：Y、N、D、Q、S、W和R。
在一个实施方式中，所述加入或取代的组氨酸密码子存在于未经重排的重链可变区核苷酸序列中，所述未经重排的重链可变区核苷酸序列编码选自下组的免疫球蛋白可变结构域：N-末端区、环4区、CDR1、CDR2、CDR3及其组合。
在一个实施方式中，所述加入或取代的组氨酸密码子存在于未经重排的重链可变区核苷酸序列中，所述未经重排的重链可变区核苷酸序列编码选自下述的互补性决定区(CDR)：CDR1、CDR2、CDR3及其组合。
在一个实施方式中，所述加入或取代的组氨酸密码子存在于未经重排的重链可变区核苷酸序列中，所述未经重排的重链可变区核苷酸序列编码选自下述的框架区(FR)：FR1、FR2、FR3、FR4及其组合。
在一个实施方式中，所述未经重排的重链可变区核苷酸序列包含基因修饰的人源VH基因区段，其中所述人源VH基因区段的至少一个阅读框架中的一个或多个内源性非组氨酸密码子被组氨酸密码子取代。
在一个实施方式中，所述人源未经重排的重链可变区核苷酸序列包含使用组氨酸密码子取代人源VH基因区段的至少一个内源性非组氨酸密码子的修饰，其中所述人源VH基因区段选自下组：VH1-2、VH1-3、VH1-8、VH1-18、VH1-24、VH1-45、VH1-46、VH1-58、VH1-69、VH2-5、VH2-26、VH2-70、VH3-7、VH3-9、VH3-11、VH3-13、VH3-15、VH3-16、VH3-20、VH3-21、VH3-23、VH3-30、VH3-30-3、VH3-30-5、VH3-33、VH3-35、VH3-38、VH3-43、VH3-48、VH3-49、VH3-53、VH3-64、VH3-66、VH3-72、VH3-73、VH3-74、VH4-4、VH4-28、VH4-30-1、VH4-30-2、VH4-30-4、VH4-31、VH4-34、VH4-39、VH4-59、VH4-61、VH5-51、VH6-1、VH7-4-1、VH7-81及其组合。
在一个实施方式中，所述人源未经重排的重链可变区核苷酸序列包含基因修饰的人源JH基因区段，其中所述人源JH基因区段的至少一个阅读框架中的一个或多个内源性非组氨酸密码子被组氨酸密码子取代。
所述人源未经重排的重链可变区核苷酸序列包含修饰，所述修饰是使用组氨酸密码子取代人源JH区段的至少一个内源性非组氨酸密码子，其中所述人源JH基因区段选自下组：JH1、JH2、JH3、JH4、JH5、JH6及其组合。
在一个实施方式中，所述加入或取代的组氨酸密码子存在于编码CDR3的一部分的重链可变区核苷酸序列中。在一个实施方式中，所述CDR3的一部分包含来源于基因修饰的人源D基因区段的阅读框架的氨基酸序列，所述基因修饰的D基因区段含有使用组氨酸密码子取代在阅读框架中的至少一个内源性非组氨酸密码子的修饰。
在一个实施方式中，所述被组氨酸密码子取代的内源性非组氨酸密码子编码选自下述的氨基酸：Y、N、D、Q、S、W和R。
在一个实施方式中，所述附加的或取代的组氨酸密码子存在于在人源化免疫球蛋白小鼠中最常见的人源D基因区段的至少一个阅读框架中。
在一个实施方式中，编码CDR3的一部分的所述经基因修饰的人源D基因区段的阅读框架选自疏水性框架、终止框架和亲水性框架。
在一个实施方式中，所述阅读框架是人源D基因区段的疏水性框架。
在一个实施方式中，所述人源D基因区段的疏水性框架包含编码选自下组的氨基酸序列的核苷酸序列：D1-1(GTTGT；SEQ ID NO:88)、D1-7(GITGT；SEQ ID NO:89)、D1-20(GITGT；SEQ ID NO:89)和D1-26(GIVGAT；SEQ ID NO:90)，并且所述人源D基因区段还包含使用组氨酸密码子取代在所述核苷酸序列中的至少一个内源性非组氨酸密码子的修饰。
在一个实施方式中，所述人源D基因区段的疏水性框架包含编码选自下组的氨基酸序列的核苷酸序列：D2-2(DIVVVPAAI；SEQ ID NO:92)、D2-8(DIVLMVYAI；SEQ ID NO:94)、D2-15(DIVVVVAAT；SEQ ID NO:95)和D2-21(HIVVVTAI；SEQ ID NO:97)，并且所述人源D基因区段还包含使用组氨酸密码子取代在所述核苷酸序列中的至少一个内源性非组氨酸密码子的修饰。
在一个实施方式中，所述人源D基因区段的疏水性框架包含编码选自下组的氨基酸序列的核苷酸序列：D3-3(ITIFGVVII；SEQ ID NO:98)、D3-9(ITIF*LVII；SEQ ID NO:99,SEQ ID NO:100)、D3-10(ITMVRGVII；SEQ ID NO:101)、D3-16(IMITFGGVIVI；SEQ ID NO:102)和D3-22(ITMIVVVIT；SEQ ID NO:103)，并且所述人源D基因区段还包含使用组氨酸密码子取代在所述核苷酸序列中的至少一个内源性密码子的修饰。
在一个实施方式中，所述人源D基因区段的疏水性框架包含编码选自下组的氨基酸序列的核苷酸序列：D4-4(TTVT；SEQ ID NO:105)、D4-11(TTVT；SEQ ID NO:105)、D4-17(TTVT；SEQ ID NO:105)、D4-23(TTVVT；SEQ ID NO:106)，并且所述人源D基因区段还包含使用组氨酸密码子取代在所述核苷酸序列中的至少一个内源性非组氨酸密码子的修饰。
在一个实施方式中，所述人源D基因区段的疏水性框架包含编码选自下组的氨基酸序列的核苷酸序列：D5-5(VDTAMV；SEQ ID NO:107)、D5-12(VDIVATI；SEQ ID NO:108)、D5-18(VDTAMV；SEQ ID NO:107)和D5-24(VEMATI；SEQ ID NO:109)，并且所述人源D基因区段还包含使用组氨酸密码子取代在所述核苷酸序列中的至少一个内源性非组氨酸密码子的修饰。
在一个实施方式中，所述人源D基因区段的疏水性框架包含编码选自下组的氨基酸序列的核苷酸序列：D6-6(SIAAR；SEQ ID NO:111)、D6-13(GIAAAG；SEQ ID NO:113)和D6-19(GIAVAG；SEQ ID NO:115)，并且所述人源D基因区段还包含使用组氨酸密码子取代在所述核苷酸序列中的至少一个内源性非组氨酸密码子的修饰。
在一个实施方式中，所述疏水性框架包含编码人源D7-27(LTG)的核苷酸序列，并且所述人源D基因区段还包含使用组氨酸密码子取代在所述核苷酸序列中的至少一个内源性非组氨酸密码子的修饰。
在一个实施方式中，所述阅读框架是人源D基因区段的终止阅读框架。
在一个实施方式中，所述人源D基因区段的终止阅读框架包含编码选自下组的氨基酸序列的核苷酸序列：D1-1(VQLER；SEQ ID NO:8)、D1-7(V*LEL)、D1-20(V*LER)、D1-26(V*WELL；SEQ ID NO:12)，并且所述人源D基因区段还包含使用组氨酸密码子取代在所述核苷酸序列中的至少一个内源性非组氨酸密码子的修饰。
在一个实施方式中，所述人源D基因区段的终止阅读框架包含编码选自下组的氨基酸序列的核苷酸序列：D2-2(RIL**YQLLY；SEQ ID NO:14)、D2-8(RILY*WCMLY；SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:17)、D2-15(RIL*WW*LLL)和D2-21(SILWW*LLF；SEQ ID NO:19)，并且所述人源D基因区段还包含使用组氨酸密码子取代在所述核苷酸序列中的至少一个内源性非组氨酸密码子的修饰。
在一个实施方式中，所述人源D基因区段的终止阅读框架包含编码选自下组的氨基酸序列的核苷酸序列：D3-3(VLRFLEWLLY；SEQ ID NO:21)、D3-9(VLRYFDWLL*；SEQ ID NO:23)、D3-10(VLLWFGELL*；SEQ ID NO:25)、D3-16(VL*LRLGELSLY；SEQ ID NO:27)和D3-22(VLL***WLLL；SEQ ID NO:29)，并且所述人源D基因区段包含使用组氨酸密码子取代在所述核苷酸序列中的至少一个内源性非组氨酸密码子的修饰。
在一个实施方式中，所述人源D基因区段的终止阅读框架包含编码选自下组的氨基酸序列的核苷酸序列：D4-4(*LQ*L)、D4-11(*LQ*L)、D4-17(*LR*L)和D4-23(*LRW*L)，并且所述人源D基因区段包含使用组氨酸密码子取代在所述核苷酸序列中的至少一个内源性非组氨酸密码子的修饰。
在一个实施方式中，所述人源D基因区段的终止阅读框架包含编码选自下组的氨基酸序列的核苷酸序列：D5-5(WIQLWL；SEQ ID NO:35)；D5-12(WI*WLRL；SEQ ID NO:37)、D5-18(WIQLWL；SEQ ID NO:35)和D5-24(*RWLQL；SEQ ID NO:39)，并且所述人源D基因区段包含使用组氨酸密码子取代在所述核苷酸序列中的至少一个内源性非组氨酸密码子的修饰。
在一个实施方式中，所述人源D基因区段的终止阅读框架包含编码选自下组的氨基酸序列的核苷酸序列：D6-6(V*QLV)、D6-13(V*QQLV；SEQ ID NO:41)和D6-19(V*QWLV；SEQID NO:43)，并且所述人源D基因区段还包含使用组氨酸密码子取代在所述核苷酸序列中的至少一个内源性非组氨酸密码子的修饰。
在一个实施方式中，所述人源D基因区段的终止阅读框架包含编码D7-27(*LG)的核苷酸序列，并且所述人源D基因区段还包含使用组氨酸密码子取代在所述核苷酸序列中的至少一个内源性非组氨酸密码子的修饰。
在一个实施方式中，所述阅读框架是人源D基因区段的亲水性框架。
在一个实施方式中，所述人源D基因区段的亲水性框架包含编码选自下组的氨基酸序列的核苷酸序列：D1-1(YNWND；SEQ ID NO:45)、D1-7(YNWNY；SEQ ID NO:47)、D1-20(YNWND；SEQ ID NO:45)和D1-26(YSGSYY；SEQ ID NO:49)，并且所述人源D基因区段还包含使用组氨酸密码子取代在所述核苷酸序列中的至少一个内源性密码子的修饰。在一个实施方式中，所述亲水性框架包含编码选自下组的氨基酸序列的核苷酸序列：SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:50及其组合。
在一个实施方式中，所述人源D基因区段的亲水性框架包含编码选自下组的氨基酸序列的核苷酸序列：D2-2(GYCSSTSCYT；SEQ ID NO:51)、D2-8(GYCTNGVCYT；SEQ ID NO:53)、D2-15(GYCSGGSCYS；SEQ ID NO:55)和D2-21(AYCGGDCYS；SEQ ID NO:57)，并且所述人源D基因区段还包含使用组氨酸密码子取代在所述核苷酸序列中的至少一个内源性密码子的修饰。在一个实施方式中，所述亲水性框架包含编码选自下组的氨基酸序列的核苷酸序列：SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:58及其组合。
在一个实施方式中，所述人源D基因区段的亲水性框架包含编码选自下组的氨基酸序列的核苷酸序列：D3-3(YYDFWSGYYT；SEQ ID NO:59)、D3-9(YYDILTGYYN；SEQ ID NO:61)、D3-10(YYYGSGSYYN；SEQ ID NO:63)、D3-16(YYDYVWGSYRYT；SEQ ID NO:65)和D3-22(YYYDSSGYYY；SEQ ID NO:67)，并且所述人源D基因区段还包含使用组氨酸密码子取代在所述核苷酸序列中的至少一个内源性密码子的修饰。在一个实施方式中，所述亲水性框架包含编码选自下组的氨基酸序列的核苷酸序列：SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:68及其组合。
在一个实施方式中，所述人源D基因区段的亲水性框架包含编码选自下组的氨基酸序列的核苷酸序列：D4-4(DYSNY；SEQ ID NO:69)、D4-11(DYSNY；SEQ ID NO:69)、D4-17(DYGDY；SEQ ID NO:71)和D4-23(DYGGNS；SEQ ID NO:73)，并且所述人源D基因区段包含使用组氨酸密码子取代在所述核苷酸序列中的至少一个内源性密码子的修饰。在一个实施方式中，所述亲水性框架包含编码选自下组的氨基酸序列的核苷酸序列：SEQ ID NO:70、SEQID NO:72、SEQ ID NO:74及其组合。
在一个实施方式中，所述人源D基因区段的亲水性框架包含编码选自下组的氨基酸序列的核苷酸序列：D5-5(GYSYGY；SEQ ID NO:75)、D5-12(GYSGYDY；SEQ ID NO:77)、D5-18(GYSYGY；SEQ ID NO:75)和D5-24(RDGYNY；SEQ ID NO:79)，并且所述人源D基因区段还包含使用组氨酸密码子取代在所述核苷酸序列中的至少一个内源性密码子的修饰。在一个实施方式中，所述亲水性框架包含编码选自下组的氨基酸序列的核苷酸序列：SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:80及其组合。
在一个实施方式中，所述人源D基因区段的亲水性框架包含编码选自下组的氨基酸序列的核苷酸序列：D6-6(EYSSSS；SEQ ID NO:81)、D6-13(GYSSSWY；SEQ ID NO:83)和D6-19(GYSSGWY；SEQ ID NO:85)，并且所述人源D基因区段还包含使用组氨酸密码子取代在所述核苷酸序列中的至少一个内源性密码子的修饰。在一个实施方式中，所述亲水性框架包含编码选自下组的氨基酸序列的核苷酸序列：SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:76及其组合。
在一个实施方式中，所述人源D基因区段的亲水性框架包含编码D7-27(NWG)的核苷酸序列，并且所述人源D基因区段还包含使用组氨酸密码子取代在所述核苷酸序列中的至少一个内源性密码子的修饰。
在一个实施方式中，所述人源D基因区段的亲水性框架包含选自下组的编码氨基酸序列的核苷酸序列：SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:52、SEQ IDNO:54、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:64、SEQ IDNO:66、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:76、SEQ IDNO:78、SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:86及其组合。
在一个实施方式中，所述未经重排的重链可变区核苷酸序列包含与编码选自IgM、IgD、IgG、IgE和IgA的免疫球蛋白同种型的人源或非人源重链恒定区核苷酸序列可操作地连接的反转的人源D基因区段。
在一个实施方式中，所述人源未经重排的免疫球蛋白重链可变区核苷酸序列可操作地与选自下述的人源或非人源重链恒定区核苷酸序列连接：CH1、铰链、CH2、CH3及其组合。在一个实施方式中，所述重链恒定区核苷酸序列包含CH1、铰链、CH2和CH3(CH1-铰链-CH2-CH3)。
在一个实施方式中，重链恒定区核苷酸序列存在于内源性基因座(例如所述核苷酸序列位于野生型非人动物中)或存在于异位(即在其基因组的不同于内源性免疫球蛋白链基因座的基因座，或在其内源性基因座中，例如在免疫球蛋白可变基因座中，其中所述内源性基因座位于或被移至基因组中的不同位置)。
在一个实施方式中，所述重链恒定区核苷酸序列包含在CH2或CH3中的修饰，其中所述修饰在酸性环境中(例如，在内涵体中，其pH范围约5.5至约6.0)增加所述重链恒定区氨基酸序列对FcRn的亲和性。
在一个实施方式中，编码人源重链恒定区氨基酸序列的所述重链恒定区核苷酸序列包含在位置250(例如E或Q)；250和428(例如L或F)；252(例如L/Y/F/W或T)、254(例如S或T)和256(例如S/R/Q/E/D或T)的修饰；或在位置428和/或433(例如L/R/S/P/Q或K)和/或434(例如H/F或Y)的修饰；或在位置250和/或428的修饰；或在位置307或308(例如308F、V308F)和434的修饰。在一个实施方式中，所述修饰包含428L(例如M428L)和434S(例如N434S)修饰；428L、259I(例如V259I)和308F(例如V308F)修饰；433K(例如H433K)和434(例如434Y)修饰；252、254和256(例如252Y、254T和256E)修饰；250Q和428L修饰(例如T250Q和M428L)以及307和/或308修饰(例如308F或308P)，其中所述修饰在酸性环境中(例如在内涵体中，其pH范围约5.5至约6.0)增加所述重链恒定区氨基酸序列对FcRn的亲和性。
在一个实施方式中，所述重链恒定区核苷酸序列编码人源CH2氨基酸序列，所述氨基酸序列包含在位置252和257的氨基酸残基之间的至少一个修饰，其中所述修饰在酸性环境中(例如在内涵体中，其pH范围约5.5至约6.0)增加所述人源CH2氨基酸序列对FcRn的亲和性。
在一个实施方式中，所述重链恒定区核苷酸序列编码人源CH2氨基酸序列，所述氨基酸序列包含在位置307和311的氨基酸残基之间的至少一个修饰，其中所述修饰在酸性环境中(例如在内涵体中，其pH范围约5.5至约6.0)增加所述CH2氨基酸序列对FcRn的亲和性。
在一个实施方式中，所述重链恒定区核苷酸序列编码人源CH3氨基酸序列，所述氨基酸序列包含在位置433和436的氨基酸残基之间的至少一个修饰，其中所述修饰在酸性环境中(例如在内涵体中，其pH范围约5.5至约6.0)增加所述CH3氨基酸序列对FcRn的亲和性
在一个实施方式中，所述重链恒定区核苷酸序列编码人源重链恒定区氨基酸序列，所述氨基酸序列包含选自下组的突变：M428L、N434S及其组合。
在一个实施方式中，所述重链恒定区核苷酸序列编码人源重链恒定区氨基酸序列，所述氨基酸序列包含选自下组的突变：M428L、V259I、V308F及其组合。
在一个实施方式中，所述重链恒定区核苷酸序列编码人源重链恒定区氨基酸序列，所述氨基酸序列包含N434A突变。
在一个实施方式中，所述重链恒定区核苷酸序列编码人源重链恒定区氨基酸序列，所述氨基酸序列包含选自下组的突变：M252Y、S254T、T256E及其组合。
在一个实施方式中，所述重链恒定区核苷酸序列编码人源重链恒定区氨基酸序列，所述氨基酸序列包含选自下组的突变：T250Q、M248L或这两者。
在一个实施方式中，所述重链恒定区核苷酸序列编码人源重链恒定区氨基酸序列，所述氨基酸序列包含选自下组的突变：H433K、N434Y或这两者。
在一个实施方式中，所述基因修饰的免疫球蛋白基因座包含：(1)第一等位基因，其中如上文所述的未经重排的人源免疫球蛋白重链可变区核苷酸序列与第一重链恒定区核苷酸序列可操作地连接，所述第一重链恒定区核苷酸序列编码选自IgG1、IgG2、IgG4及其组合的人源IgG的第一CH3氨基酸序列；和(2)第二等位基因，其中如本申请所述的未经重排的人源免疫球蛋白重链可变区核苷酸序列与第二重链恒定区核苷酸序列可操作地连接，所述第二重链恒定区核苷酸序列编码选自IgG1、IgG2、IgG4及其组合的人源IgG的第二CH3氨基酸序列，并且其中所述第二CH3氨基酸序列包含使所述第二CH3氨基酸序列与蛋白A的结合降低或消除的修饰(参见例如US 2010/0331527A1)。
在一个实施方式中，所述第二CH3氨基酸序列包含H95R修饰(根据IMGT外显子编号；根据EU编号为H435R)。在一个实施方式中，所述第二CH3氨基酸序列还包含Y96F修饰(根据IMGT外显子编号；根据EU编号为H436F)。在另一个实施方式中，所述第二CH3氨基酸序列包含H95R修饰(根据IMGT外显子编号；根据EU编号为H435R)和Y96F修饰(根据IMGT外显子编号；根据EU编号为H436F)这两者。
在一个实施方式中，所述第二CH3氨基酸序列来自经修饰的人源IgG1并且还包含选自下组的突变：D16E、L18M、N44S、K52N、V57M和V82I(IMGT；根据EU编号为D356E、L38M、N384S、K392N、V397M和V422I)。
在一个实施方式中，所述第二CH3氨基酸序列来自经修饰的人源IgG2并且还包含选自下组的突变：N44S、K52N和V82I(IMGT；根据EU编号为N384S、K392N和V422I)。
在一个实施方式中，所述第二CH3氨基酸序列来自经修饰的人源IgG4并且还包含选自下组的突变：Q15R、N44S、K52N、V57M、R69K、E79Q和V82I(IMGT；根据EU编号为Q355R、N384S、K392N、V397M、R409K、E419Q和V422I)。
在一个实施方式中，所述重链恒定区氨基酸序列是非人源恒定区氨基酸序列，并且所述重链恒定区氨基酸序列包含上文所述任意类型的修饰中的一种或多种。
在一个实施方式中，所述重链恒定区核苷酸序列是人源重链恒定区氨基酸序列，并且所述人源重链恒定区氨基酸序列包含上文所述任意类型的修饰中的一种或多种。
在一个实施方式中，全部或基本上全部内源性的VH、D和JH基因区段从免疫球蛋白重链基因座中缺失或者使其不具有功能(例如通过在免疫球蛋白基因座中插入核苷酸序列(例如外源性的核苷酸序列)或者通过使内源性VH、D、JH区段进行不具有功能的重排或反转)。在一个实施方式中，例如，约80％或更多的、约85％或更多的、约90％或更多的、约95％或更多的、约96％或更多的、约97％或更多的、约98％或更多的或者约99％或更多的全部的内源性VH、D或JH基因区段被缺失或使其不具有功能。在一个实施方式中，例如，至少95％、96％、97％、98％或99％的内源性具有功能的V、D或J基因区段被缺失或使其不具有功能。
在一个实施方式中，所述基因修饰的基因座包含使全部或基本上全部的内源性VH、D和JH基因区段缺失或使其不具有功能的修饰；并且所述基因组的基因座包含基因修饰的、未经重排的人源重链可变区核苷酸序列，所述核苷酸序列含有在至少一个阅读框架中使用组氨酸密码子取代至少一个内源性非组氨酸密码子。在一个实施方式中，所述基因修饰的、未经重排的免疫球蛋白重链可变区基因序列存在于内源性位置(即所述核苷酸序列位于野生型非人动物中)或存在于异位(即在其基因组的不同于内源性免疫球蛋白链基因座的基因座，或在其内源性基因座中，例如在免疫球蛋白可变基因座中，其中所述内源性基因座位于或被移至基因组中的不同位置)。
在一个实施方式中，所述基因修饰的免疫球蛋白基因座包含内源性Adam6a基因、Adam6b基因或者这两者，并且所述基因修饰不会影响所述内源性Adam6a基因、Adam6b基因或者这两者的表达和/或功能。
在一个实施方式中，所述基因修饰的免疫球蛋白基因座包含异位存在的Adam6a基因、Adam6b基因或者这两者。在一个实施方式中，所述Adam6a基因是非人源Adam6a基因。在一个实施方式中，所述Adam6a基因是小鼠Adam6a基因。在一个实施方式中，所述Adam6a基因是人源Adam6a基因。在一个实施方式中，所述Adam6b基因是非人源Adam6b基因。在一个实施方式中，所述Adam6b基因是小鼠Adam6b基因。在一个实施方式中，所述Adam6b基因是人源Adam6b基因。
在一个实施方式中，所述基因修饰的免疫球蛋白基因座还包含人源化的、未经重排的λ和/或κ轻链可变基因序列。在一个实施方式中，所述人源化的、未经重排的λ和/或κ轻链可变基因序列与免疫球蛋白轻链恒定区核苷酸序列可操作地连接，所述轻链恒定区核苷酸序列选自λ轻链恒定区核苷酸序列和κ轻链恒定区核苷酸序列。在一个实施方式中，所述人源化的、未经重排的λ轻链可变区核苷酸序列与λ轻链恒定区核苷酸序列可操作地连接。在一个实施方式中，所述λ轻链恒定区核苷酸序列是小鼠、大鼠或人源序列。在一个实施方式中，所述人源化的、未经重排的κ轻链可变区核苷酸序列与κ轻链恒定区核苷酸序列可操作地连接。在一个实施方式中，所述κ轻链恒定区核苷酸序列是小鼠、大鼠或人源序列。
在一个实施方式中，所述基因修饰的免疫球蛋白基因座包含未经重排的轻链可变基因序列，所述未经重排的轻链可变基因序列含有在编码轻链可变结构域的至少一个阅读框架中引入至少一个组氨酸密码子的至少一个修饰。在一个实施方式中，所述基因修饰的免疫球蛋白基因座包含重排的序列(例如重排的λ或κV/J序列)，所述序列在轻链CDR中含有1个、2个、3个或4个组氨酸密码子。在一个实施方式中，所述CDR选自CDR1、CDR2、CDR3及其组合。在一个实施方式中，所述未经重排的或重排的轻链可变区核苷酸序列是未经重排的或重排的人源λ或κ轻链可变区核苷酸序列。在一个实施方式中，所述未经重排的或重排的人源λ或κ轻链可变区核苷酸序列存在于内源性小鼠免疫球蛋白轻链基因座。在一个实施方式中，所述小鼠免疫球蛋白轻链基因座是小鼠κ基因座。在一个实施方式中，所述小鼠免疫球蛋白轻链基因座是小鼠λ基因座。
在一个实施方式中，如本申请所述的基因修饰的免疫球蛋白基因座存在于小鼠的免疫球蛋白重链基因座中。在一个实施方式中，所述经基因修饰的免疫球蛋白基因座存在于小鼠中的人源化的免疫球蛋白重链基因座中。
在一个实施方式中，由如本申请所述的基因修饰的免疫球蛋白重链基因座表达的含有重链可变结构域的抗原结合蛋白与不含基因修饰的相应野生型重链可变结构域相比在酸性环境中(例如在约5.5至约6.0的pH下)显示出更弱的抗原结合。
在一个实施方式中，由如本申请所述的基因修饰的免疫球蛋白重链基因座表达的含有重链可变结构域的抗原结合蛋白在25℃下在酸性pH下(例如pH约5.5至约6.0)具有的解离半衰期(t1/2)短于2min。在一个实施方式中，由如本申请所述的基因修饰的免疫球蛋白重链基因座表达的含有重链可变结构域的抗原结合蛋白在37℃下在酸性pH下(例如pH约5.5至约6.0)具有的解离半衰期(t1/2)短于2min。在一个实施方式中，由如本申请所述的基因修饰的免疫球蛋白重链基因座表达的含有重链可变结构域的抗原结合蛋白在25℃下在酸性pH下(例如pH约5.5至约6.0)具有的解离半衰期(t1/2)短于1min。在一个实施方式中，由如本申请所述的经基因修饰的免疫球蛋白重链基因座表达的含有重链可变结构域的抗原结合蛋白在37℃下在酸性pH下(例如pH约5.5至约6.0)具有的解离半衰期(t1/2)短于1min。在一个实施方式中，由如本申请所述的基因修饰的免疫球蛋白重链基因座表达的含有重链可变结构域的抗原结合蛋白在酸性pH下(例如pH约5.5至约6.0)的解离半衰期(t1/2)比所述抗原结合蛋白在中性pH下(例如pH约7.0至约7.4)的解离半衰期(t1/2)降低至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约10倍、至少约15倍、至少约20倍、至少约25倍或至少约30倍。
在一个实施方式中，由如本申请所述的基因修饰的免疫球蛋白基因座表达的含有重链可变结构域的抗原结合蛋白与不含本申请所述的基因修饰的野生型抗原结合蛋白相比具有的特征为pH依赖性循环改善、血清半衰期增加或两者兼而有之。
在一个实施方式中，本申请所述的基因修饰的免疫球蛋白基因座包含B细胞群，所述B细胞群经目的抗原刺激后能够产生抗原结合蛋白例如抗体，当所述抗原结合蛋白含有具有一个或多个组氨酸残基的重链可变结构域。如本申请所述的抗原结合蛋白向受试者施用时，与相应的野生型抗原结合蛋白相比显示出增加的血清半衰期，所述野生型抗原结合蛋白具有相似的或足够相似的编码重链可变结构域的氨基酸序列，但是在所述重链可变结构域中不包含组氨酸残基。在一些实施方式中，本申请所述的抗原结合蛋白显示出的血清半衰期增加与相应的野生型抗原结合蛋白相比高至少约2倍、至少约5倍、至少约10倍、至少约15倍、至少约20倍，所述野生型抗原结合蛋白具有相似的或足够相似的编码重链可变结构域的氨基酸序列，但是在所述重链可变结构域中不包含组氨酸残基。
在一个方面，本申请提供了一种制备非人动物的方法，所述非人动物包括经基因修饰的免疫球蛋白重链可变基因座，所述方法包括：(a)修饰非人动物的基因组以缺失或使内源性免疫球蛋白重链V、D和J基因区段不具有功能(例如通过在免疫球蛋白基因座中插入核苷酸序列例如外源性核苷酸序列或通过使内源性VH、D、JH区段产生不具有功能的重排或反转)；和(b)在基因组中放置人源VH、D和JH基因区段，其中至少一个人源D基因区段相对于相应的野生型序列被从5’至3’反转，并且其中所述反转的人源D基因区段的至少一个阅读框架包含组氨酸密码子。
在一个实施方式中，所述非人动物是哺乳动物，包括啮齿动物，例如小鼠、大鼠或仓鼠。
在一个实施方式中，所述基因修饰的免疫球蛋白基因座存在于种系基因组中。
在一个实施方式中，所述基因修饰的免疫球蛋白基因座编码免疫球蛋白重链可变结构域，所述免疫球蛋白重链可变结构域含有1个或更多个、2个或更多个、3个或更多个、4个或更多个、5个或更多个、6个或更多个、7个或更多个、8个或更多个、9个或更多个、10个或更多个、11个或更多个、12个或更多个、13个或更多个、14个或更多个、15个或更多个、16个或更多个、17个或更多个、18个或更多个、19个或更多个、20个或更多个、21个或更多个、22个或更多个、23个或更多个、24个或更多个、25个或更多个、26个或更多个、27个或更多个、28个或更多个、29个或更多个、30个或更多个、31个或更多个、32个或更多个、33个或更多个或者34个或更多个组氨酸残基。
在一个实施方式中，至少两个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个、至少24个或者全部或基本上全部的具有功能的人源D基因区段相对于野生型序列是反向的。
在一个实施方式中，全部或基本上全部的内源性免疫球蛋白VH、D、JH基因区段从所述免疫球蛋白重链基因座中缺失或使其不具有功能(例如通过在所述免疫球蛋白基因座插入核苷酸序列例如外源性核苷酸序列或通过使全部或基本上全部的内源性VH、D、JH基因区段产生不具有功能的重排或反转)，并且所述经基因修饰的免疫球蛋白基因座包含人源VH、D和JH基因区段，其中所述至少一个人源D基因区段以相对于野生型序列相反的方向存在，并且其中在反转的D基因区段中的至少一个阅读框架包含至少一个组氨酸密码子。
在一个实施方式中，所述反转的人源D基因区段与人源VH基因区段和/或人源JH基因区段可操作地连接。
在一个实施方式中，所述人源D基因区段以相对于选自下组的相应的野生型序列相反的方向存在：D1-1、D1-7、D1-20、D1-26、D2-2、D2-8、D2-15、D2-21、D3-3、D3-9、D3-10、D3-16、D3-22、D4-4、D4-11、D4-17、D4-23、D5-5、D5-12、D5-18、D5-24、D6-6、D6-13、D6-19、D7-27及其组合。
在一个实施方式中，以与相应的野生型序列相反的方向存在的所述人源D基因区段是选自下组的D1基因区段：D1-1、D1-7、D1-20、D1-26及其组合。
在一个实施方式中，以与相应的野生型序列相反的方向存在的所述人源D基因区段是选自下组的D2基因区段：D2-2、D2-8、D2-15、D2-21及其组合。
在一个实施方式中，以与相应的野生型序列相反的方向存在的所述人源D基因区段是选自下组的D3基因区段：D3-3、D3-9、D3-10、D3-16、D3-22及其组合。
在一个实施方式中，以与相应的野生型序列相反的方向存在的所述人源D基因区段是选自下组的D4基因区段：D4-4、D4-11、D4-17、D4-23及其组合。
在一个实施方式中，以与相应的野生型序列相反的方向存在的所述人源D基因区段是选自下组的D5基因区段：D5-5、D5-12、D5-18、D5-24及其组合。
在一个实施方式中，以与相应的野生型序列相反的方向存在的所述人源D基因区段是选自下组的D6基因区段：D6-6、D6-13、D6-19及其组合。
在一个实施方式中，以与相应的野生型序列相反的方向存在的所述人源D基因区段是D7-27。
在一个实施方式中，所述人源D基因区段的阅读框架选自终止阅读框架、亲水性阅读框架和疏水性阅读框架及其组合。
在一个实施方式中，所述未经重排的重链可变区核苷酸序列包含与编码选自IgM、IgD、IgG、IgE和IgA的免疫球蛋白同种型的人源或非人源重链恒定区核苷酸序列可操作地连接的所述反转的人源D基因区段。
在一个实施方式中，所述人源未经重排的免疫球蛋白重链可变区核苷酸序列与选自下述的人源或非人源重链恒定区核苷酸序列可操作地连接：CH1、铰链、CH2、CH3及其组合。在一个实施方式中，所述重链恒定区核苷酸序列包含CH1、铰链、CH2和CH3(CH1-铰链-CH2-CH3)。
在一个实施方式中，重链恒定区核苷酸序列存在于内源性基因座(例如所述核苷酸序列位于野生型非人动物中)或存在于异位(即在其基因组的不同于内源性免疫球蛋白链基因座的基因座，或在其内源性基因座中，例如在免疫球蛋白可变基因座中，其中所述内源性基因座位于或被移至基因组中的不同位置)。
在一个实施方式中，所述重链恒定区核苷酸序列包含在CH2或CH3中的修饰，其中所述修饰在酸性环境中(例如，在内涵体中，其pH范围约5.5至约6.0)增加所述重链恒定区氨基酸序列对FcRn的亲和性。
在一个实施方式中，编码人源重链恒定区氨基酸序列的所述重链恒定区核苷酸序列包含在位置250(例如E或Q)；250和428(例如L或F)；252(例如L/Y/F/W或T)、254(例如S或T)和256(例如S/R/Q/E/D或T)的修饰；或在位置428和/或433(例如L/R/S/P/Q或K)和/或434(例如H/F或Y)的修饰；或在位置250和/或428的修饰；或在位置307或308(例如308F、V308F)和434的修饰。在一个实施方式中，所述修饰包含428L(例如M428L)和434S(例如N434S)修饰；428L、259I(例如V259I)和308F(例如V308F)修饰；433K(例如H433K)和434(例如434Y)修饰；252、254和256(例如252Y、254T和256E)修饰；250Q和428L修饰(例如T250Q和M428L)以及307和/或308修饰(例如308F或308P)，其中所述修饰在酸性环境中(例如在内涵体中，其pH范围约5.5至约6.0)增加所述重链恒定区氨基酸序列对FcRn的亲和性。
在一个实施方式中，所述重链恒定区核苷酸序列编码人源CH2氨基酸序列，所述氨基酸序列包含在位置252和257的氨基酸残基之间的至少一个修饰，其中所述修饰在酸性环境中(例如在内涵体中，其pH范围约5.5至约6.0)增加所述人源CH2氨基酸序列对FcRn的亲和性。
在一个实施方式中，所述重链恒定区核苷酸序列编码人源CH2氨基酸序列，所述氨基酸序列包含在位置307和311的氨基酸残基之间的至少一个修饰，其中所述修饰在酸性环境中(例如在内涵体中，其pH范围约5.5至约6.0)增加所述CH2氨基酸序列对FcRn的亲和性。
在一个实施方式中，所述重链恒定区核苷酸序列编码人源CH3氨基酸序列，所述氨基酸序列包含在位置433和436的氨基酸残基之间的至少一个修饰，其中所述修饰在酸性环境中(例如在内涵体中，其pH范围约5.5至约6.0)增加所述CH3氨基酸序列对FcRn的亲和性。
在一个实施方式中，所述重链恒定区核苷酸序列编码人源重链恒定区氨基酸序列，所述氨基酸序列包含选自下组的突变：M428L、N434S及其组合。
在一个实施方式中，所述重链恒定区核苷酸序列编码人源重链恒定区氨基酸序列，所述氨基酸序列包含选自下组的突变：M428L、V259I、V308F及其组合。
在一个实施方式中，所述重链恒定区核苷酸序列编码人源重链恒定区氨基酸序列，所述氨基酸序列包含N434A突变。
在一个实施方式中，所述重链恒定区核苷酸序列编码人源重链恒定区氨基酸序列，所述氨基酸序列包含选自下组的突变：M252Y、S254T、T256E及其组合。
在一个实施方式中，所述重链恒定区核苷酸序列编码人源重链恒定区氨基酸序列，所述氨基酸序列包含选自下组的突变：T250Q、M248L或这两者。
在一个实施方式中，所述重链恒定区核苷酸序列编码人源重链恒定区氨基酸序列，所述氨基酸序列包含选自下组的突变：H433K、N434Y或这两者。
在一个实施方式中，所述基因修饰的免疫球蛋白基因座包含：(1)第一等位基因，其中如上文所述的未经重排的人源免疫球蛋白重链可变区核苷酸序列与第一重链恒定区核苷酸序列可操作地连接，所述第一重链恒定区核苷酸序列编码选自IgG1、IgG2、IgG4及其组合的人源IgG的第一CH3氨基酸序列；和(2)第二等位基因，其中如本申请所述的未经重排的人源免疫球蛋白重链可变区核苷酸序列与第二重链恒定区核苷酸序列可操作地连接，所述第二重链恒定区核苷酸序列编码选自IgG1、IgG2、IgG4及其组合的人源IgG的第二CH3氨基酸序列，并且其中所述第二CH3氨基酸序列包含使所述第二CH3氨基酸序列与蛋白A的结合降低或消除的修饰(参见例如US 2010/0331527A1)。
在一个实施方式中，所述第二CH3氨基酸序列包含H95R修饰(根据IMGT外显子编号；根据EU编号为H435R)。在一个实施方式中，所述第二CH3氨基酸序列还包含Y96F修饰(根据IMGT外显子编号；根据EU编号为H436F)。在另一个实施方式中，所述第二CH3氨基酸序列包含H95R修饰(根据IMGT外显子编号；根据EU编号为H435R)和Y96F修饰(根据IMGT外显子编号；根据EU编号为H436F)这两者。
在一个实施方式中，所述第二CH3氨基酸序列来自经修饰的人源IgG1并且还包含选自下组的突变：D16E、L18M、N44S、K52N、V57M和V82I(IMGT；根据EU编号为D356E、L38M、N384S、K392N、V397M和V422I)。
在一个实施方式中，所述第二CH3氨基酸序列来自经修饰的人源IgG2并且还包含选自下组的突变：N44S、K52N和V82I(IMGT；根据EU编号为N384S、K392N和V422I)。
在一个实施方式中，所述第二CH3氨基酸序列来自经修饰的人源IgG4并且还包含选自下组的突变：Q15R、N44S、K52N、V57M、R69K、E79Q和V82I(IMGT；根据EU编号为Q355R、N384S、K392N、V397M、R409K、E419Q和V422I)。
在一个实施方式中，所述重链恒定区氨基酸序列是非人源恒定区氨基酸序列，并且所述重链恒定区氨基酸序列包含上文所述任意类型的修饰中的一种或多种。
在一个实施方式中，所述重链恒定区核苷酸序列是人源重链恒定区氨基酸序列，并且所述人源重链恒定区氨基酸序列包含上文所述任意类型的修饰中的一种或多种。
在一个实施方式中，全部或基本上全部内源性的VH、D和JH基因区段从免疫球蛋白重链基因座中缺失或者使其不具有功能(例如通过在免疫球蛋白基因座中插入核苷酸序列(例如外源性的核苷酸序列)或者通过使内源性VH、D、JH区段进行不具有功能的重排或反转)。在一个实施方式中，例如，约80％或更多的、约85％或更多的、约90％或更多的、约95％或更多的、约96％或更多的、约97％或更多的、约98％或更多的或者约99％或更多的全部的内源性VH、D或JH基因区段被缺失或使其不具有功能。在一个实施方式中，例如，至少95％、96％、97％、98％或99％的内源性具有功能的V、D或J基因区段被缺失或使其不具有功能。
在一个实施方式中，所述基因修饰的基因座包含使全部或基本上全部的内源性VH、D和JH基因区段缺失或使其不具有功能的修饰；并且所述基因修饰的基因座包含未经重排的重链可变区核苷酸序列，所述核苷酸序列含有如在此所述的反向人源D基因区段，其中所述未经重排的重链可变区核苷酸序列存在于内源性位置(即所述核苷酸序列位于野生型非人动物中)或存在于异位(即在其基因组的不同于内源性免疫球蛋白链基因座的基因座，或在其内源性基因座中，例如在免疫球蛋白可变基因座中，其中所述内源性基因座位于或被移至基因组中的不同位置)。
在一个实施方式中，所述基因修饰的免疫球蛋白基因座包含内源性Adam6a基因、Adam6b基因或者这两者，并且所述基因修饰不会影响所述内源性Adam6a基因、Adam6b基因或者这两者的表达和/或功能。
在一个实施方式中，所述基因修饰的免疫球蛋白基因座包含异位存在的Adam6a基因、Adam6b基因或者这两者。在一个实施方式中，所述Adam6a基因是非人源Adam6a基因。在一个实施方式中，所述Adam6a基因是小鼠Adam6a基因。在一个实施方式中，所述Adam6a基因是人源Adam6a基因。在一个实施方式中，所述Adam6b基因是非人源Adam6b基因。在一个实施方式中，所述Adam6b基因是小鼠Adam6b基因。在一个实施方式中，所述Adam6b基因是人源Adam6b基因。
在一个实施方式中，所述基因修饰的免疫球蛋白基因座还包含人源化的、未经重排的λ和/或κ轻链可变基因序列。在一个实施方式中，所述人源化的、未经重排的λ和/或κ轻链可变基因序列与免疫球蛋白轻链恒定区核苷酸序列可操作地连接，所述轻链恒定区核苷酸序列选自λ轻链恒定区核苷酸序列和κ轻链恒定区核苷酸序列。在一个实施方式中，所述人源化的、未经重排的λ轻链可变区核苷酸序列与λ轻链恒定区核苷酸序列可操作地连接。在一个实施方式中，所述λ轻链恒定区核苷酸序列是小鼠、大鼠或人源序列。在一个实施方式中，所述人源化的、未经重排的κ轻链可变区核苷酸序列与κ轻链恒定区核苷酸序列可操作地连接。在一个实施方式中，所述κ轻链恒定区核苷酸序列是小鼠、大鼠或人源序列。
在一个实施方式中，所述基因修饰的免疫球蛋白基因座包含未经重排的轻链可变基因序列，所述未经重排的轻链可变基因序列含有在编码轻链可变结构域的至少一个阅读框架中引入至少一个组氨酸密码子的至少一个修饰。在一个实施方式中，所述基因修饰的免疫球蛋白基因座包含重排的序列(例如重排的λ或κV/J序列)，所述序列在轻链CDR中含有1个、2个、3个或4个组氨酸密码子。在一个实施方式中，所述CDR选自CDR1、CDR2、CDR3及其组合。在一个实施方式中，所述未经重排的或重排的轻链可变区核苷酸序列是未经重排的或重排的人源λ或κ轻链可变区核苷酸序列。在一个实施方式中，所述未经重排的或重排的人源λ或κ轻链可变区核苷酸序列存在于内源性小鼠免疫球蛋白轻链基因座。在一个实施方式中，所述小鼠免疫球蛋白轻链基因座是小鼠κ基因座。在一个实施方式中，所述小鼠免疫球蛋白轻链基因座是小鼠λ基因座。
在一个实施方式中，如本申请所述的基因修饰的免疫球蛋白基因座存在于小鼠的免疫球蛋白重链基因座中。在一个实施方式中，所述基因修饰的免疫球蛋白基因座存在于小鼠中的人源化的免疫球蛋白重链基因座中。
在一个实施方式中，由如本申请所述的基因修饰的免疫球蛋白重链基因座表达的含有重链可变结构域的抗原结合蛋白与不含基因修饰的相应野生型重链可变结构域相比在酸性环境中(例如在约5.5至约6.0的pH下)显示出更弱的抗原结合。
在一个实施方式中，由如本申请所述的基因修饰的免疫球蛋白重链基因座表达的含有重链可变结构域的抗原结合蛋白在25℃下在酸性pH下(例如pH约5.5至约6.0)具有的解离半衰期(t1/2)短于2min。在一个实施方式中，由如本申请所述的基因修饰的免疫球蛋白重链基因座表达的含有重链可变结构域的抗原结合蛋白在37℃下在酸性pH下(例如pH约5.5至约6.0)具有的解离半衰期(t1/2)短于2min。在一个实施方式中，由如本申请所述的基因修饰的免疫球蛋白重链基因座表达的含有重链可变结构域的抗原结合蛋白在25℃下在酸性pH下(例如pH约5.5至约6.0)具有的解离半衰期(t1/2)短于1min。在一个实施方式中，由如本申请所述的基因修饰的免疫球蛋白重链基因座表达的含有重链可变结构域的抗原结合蛋白在37℃下在酸性pH下(例如pH约5.5至约6.0)具有的解离半衰期(t1/2)短于1min。在一个实施方式中，由如本申请所述的经基因修饰的免疫球蛋白重链基因座表达的含有重链可变结构域的抗原结合蛋白在酸性pH下(例如pH约5.5至约6.0)的解离半衰期(t1/2)比所述抗原结合蛋白在中性pH下(例如pH约7.0至约7.4)的解离半衰期(t1/2)降低至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约10倍、至少约15倍、至少约20倍、至少约25倍或至少约30倍。
在一个实施方式中，由如本申请所述的基因修饰的免疫球蛋白基因座表达的含有重链可变结构域的抗原结合蛋白与不含本申请所述的基因修饰的野生型抗原结合蛋白相比具有的特征为pH依赖性循环改善、血清半衰期增加或两者兼而有之。
在一个实施方式中，本申请所述的经基因修饰的免疫球蛋白基因座包含B细胞群，所述B细胞群经目的抗原刺激后能够产生抗原结合蛋白例如抗体，所述抗原结合蛋白含有具有一个或多个组氨酸残基的重链可变结构域。当如本申请所述的抗原结合蛋白向受试者施用时，与相应的野生型抗原结合蛋白相比显示出增加的血清半衰期，所述野生型抗原结合蛋白具有相似的或足够相似的编码重链可变结构域的氨基酸序列，但是在所述重链可变结构域中不包含组氨酸残基。在一些实施方式中，本申请所述的抗原结合蛋白显示出的血清半衰期增加与相应的野生型抗原结合蛋白相比高至少约2倍、至少约5倍、至少约10倍、至少约15倍、至少约20倍，所述野生型抗原结合蛋白具有相似的或足够相似的编码重链可变结构域的氨基酸序列，但是在所述重链可变结构域中不包含组氨酸残基。
在一个方面，本申请提供了一种制备非人动物的方法，所述非人动物能够生成具有增加的血清半衰期和/或增强的pH依赖性再循环的免疫球蛋白重链可变结构域，所述方法包括(a)修饰非人动物的基因组以缺失或使内源性免疫球蛋白重链V、D和J基因区段不具有功能(例如通过在免疫球蛋白基因座中插入核苷酸序列(例如外源性的核苷酸序列)或者通过使内源性VH、D、JH区段进行不具有功能的重排或反转)；和(b)在基因组中放置未经重排的人源重链可变区核苷酸序列，其中所述未经重排的重链可变区核苷酸序列包含加入至少一个组氨酸密码子或使用组氨酸密码子取代至少一个内源性非组氨酸密码子，并且其中由所述非人动物生成的包含所述免疫球蛋白重链可变结构域的抗原结合蛋白与野生型免疫球蛋白重链结构域相比显示出增加的血清半衰期和/或增强的pH依赖性再循环。
在一个实施方式中，所述非人动物在与抗原接触后能够产生富集的B细胞群的库，所述B细胞群的库表达具有增加的血清半衰期和/或增强的pH依赖性再循环的抗原结合蛋白，其中所述富集的B细胞群包含如本申请所述的任意基因修饰。
在一个实施方式中，由基因修饰的非人动物生成的抗原结合蛋白的特征为在中性pH下(例如pH约7.0至约7.4)对目的抗原具有足够的亲和性，在低于中性pH的pH下(例如在内涵体pH下，例如pH约5.5至6.0)所述抗体从抗原-抗原结合蛋白复合物中的解离增强。
在一个实施方式中，由如本申请所述的基因修饰的免疫球蛋白重链基因座表达的含有重链可变结构域的抗原结合蛋白在25℃下在酸性pH下(例如pH约5.5至约6.0)具有的解离半衰期(t1/2)短于2min。在一个实施方式中，由如本申请所述的基因修饰的免疫球蛋白重链基因座表达的含有重链可变结构域的抗原结合蛋白在37℃下在酸性pH下(例如pH约5.5至约6.0)具有的解离半衰期(t1/2)短于2min。在一个实施方式中，由如本申请所述的基因修饰的免疫球蛋白重链基因座表达的含有重链可变结构域的抗原结合蛋白在25℃下在酸性pH下(例如pH约5.5至约6.0)具有的解离半衰期(t1/2)短于1min。在一个实施方式中，由如本申请所述的经基因修饰的免疫球蛋白重链基因座表达的含有重链可变结构域的抗原结合蛋白在37℃下在酸性pH下(例如pH约5.5至约6.0)具有的解离半衰期(t1/2)短于1min。在一个实施方式中，由如本申请所述的基因修饰的免疫球蛋白重链基因座表达的含有重链可变结构域的抗原结合蛋白在酸性pH下(例如pH约5.5至约6.0)的解离半衰期(t1/2)比所述抗原结合蛋白在中性pH下(例如pH约7.0至约7.4)的解离半衰期(t1/2)降低至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约10倍、至少约15倍、至少约20倍、至少约25倍或至少约30倍。
在一个实施方式中，由如本申请所述的基因修饰的免疫球蛋白基因座表达的含有重链可变结构域的抗原结合蛋白与不含本申请所述的基因修饰的野生型抗原结合蛋白相比具有的特征为pH依赖性循环改善、血清半衰期增加或两者兼而有之。
在一个实施方式中，本申请所述的基因修饰的免疫球蛋白基因座包含B细胞群，所述B细胞群经目的抗原刺激后能够产生抗原结合蛋白例如抗体，所述抗原结合蛋白含有具有一个或多个组氨酸残基的重链可变结构域。当如本申请所述的抗原结合蛋白向受试者施用时，与相应的野生型抗原结合蛋白相比显示出增加的血清半衰期，所述野生型抗原结合蛋白具有相似的或足够相似的编码重链可变结构域的氨基酸序列，但是在所述重链可变结构域中不包含组氨酸残基。在一些实施方式中，本申请所述的抗原结合蛋白显示出的血清半衰期增加与相应的野生型抗原结合蛋白相比高至少约2倍、至少约5倍、至少约10倍、至少约15倍、至少约20倍，所述野生型抗原结合蛋白具有相似的或足够相似的编码重链可变结构域的氨基酸序列，但是在所述重链可变结构域中不包含组氨酸残基。
在一个实施方式中，所述抗原-抗体结合蛋白包含免疫球蛋白重链可变结构域，所述免疫球蛋白重链可变结构域在中性pH(pH约7.0至约7.4)下能够以低于10-6、10-7、10-8、10-9、10-10、10-11和10-12的亲和性(KD)特异性地与目的抗原结合。
在一个方面，本申请提供了一种获得具有增强的再循环和/或改善的血清半衰期的抗原结合蛋白的方法，所述方法包括：免疫如本申请所述的具有基因修饰的免疫球蛋白基因座的非人动物，其中所述非人动物包含未经重排的人源重链可变区核苷酸序列，所述核苷酸序列含有加入至少一个组氨酸密码子或使用组氨酸密码子取代至少一个内源性非组氨酸密码子；(b)使所述非人动物产生免疫应答；(c)从免疫的非人动物中收集淋巴细胞(例如B细胞)；(d)将所述淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合以形成杂交瘤细胞，和(e)获得由所述杂交瘤细胞生产的抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白显示出增强的再循环和/或血清稳定性。
在一个方面，本申请提供了一种基因修饰的免疫球蛋白重链基因座，所述免疫球蛋白重链基因座由如本申请所述的任意方法获得。
在一个方面，本申请提供了一种基因修饰的非人动物，所述非人动物由如本申请所述的任意方法获得。
在各种实施方式中，所述非人动物是哺乳动物。在一个实施方式中，所述哺乳动物是啮齿动物，例如小鼠、大鼠或仓鼠。
在各种实施方式中，如本申请所述的基因修饰的免疫球蛋白基因座存在于非人动物的种系基因组中，例如哺乳动物，例如啮齿动物，例如小鼠、大鼠或仓鼠。
附图的简要说明
图1A和1B显示了由人源D基因区段(D)的三个阅读框架(即终止、亲水性、疏水性阅读框架)编码的氨基酸序列和由组氨酸取代的人源D基因区段(HD)的三个阅读框架编码的氨基酸序列。在亲水性阅读框架中引入组氨酸密码子(以粗体表示)还将终止阅读框架中的多个终止密码子改变为Ser密码子(以粗体表示)但是在疏水性阅读框架中引入了极少的改变。“*”符号表示终止密码子，在两个SEQ ID NO之间的逗号表示其为由终止密码子分隔的两条氨基酸序列。
图2显示了将含有大观霉素选择性表达盒的pLMa0174靶向至MAID 1116的5’末端的示意图(步骤1.BHR(Spec))。在步骤1中，将均位于hVH6-1上游的氯霉素选择性表达盒、新霉素选择性表达盒、loxP位点、两个VH基因区段(hVH1-3和hVH1-2)、人源Adam6基因从所述克隆中缺失并使用大观霉素表达盒取代以产生VI433克隆。在步骤2(BHR(Hyg+Spec))中，将翼侧为FRT位点的含有潮霉素表达盒的pNTu0002靶向至含有人源免疫球蛋白D基因区段的区域。通过步骤2，将全部的人源D基因区段从VI433中缺失并使用潮霉素表达盒取代以产生MAID6011VI 434(克隆1)。
图3显示了通过顺序连接组装组氨酸取代的人源D基因区段的示意图。
图4显示了通过酶介导的消化(PI-SceI和I-CeuI)和连接将含有新霉素表达盒的预组装的组氨酸取代的人源D基因区段引入D-近端VH基因区段(VH6-1)和D-近端JH基因区段(JH1)之间的区域。这一过程从MAID 6011VI434中除去潮霉素表达盒并将预组装的人源组氨酸取代的D基因区段引入该克隆。根据对新霉素和大观霉素二者的抗性选择包含成功靶向的克隆的细菌细胞。所得到的克隆(MAID6012VI469)从5’至3’包含(1)大观霉素选择性表达盒，(2)包含人源VH基因区段(VH6-1)的50kb臂，(3)翼侧为loxP位点的新霉素表达盒，(4)人源D基因区段，所述区段含有组氨酸取代(HD 1.1-6.6(9586bp；SEQ ID NO:1)、HD 1.7-6.13(9268bp；SEQ ID NO:2)、HD 1.14-6.19(9441bp；SEQ ID NO:3)和HD 1.20-6.25,1.26(11592bp；SEQ ID NO:4))，(5)含有人源JH基因区段的约25kb的基因组区域，(6)小鼠Ei序列(SEQ ID NO:5；在发育的B细胞中促进VH向DJH重排的内含子增强子)和(7)小鼠IgM恒定区核苷酸序列(mIgM外显子1；SEQ ID NO:7)。
图5显示了通过在MAID 6011VI434中使用潮霉素选择性表达盒靶向来源于129品系的MAID 1460het染色体从MAID 1460杂合子ES细胞中缺失人源免疫球蛋白重链D基因区段的示意图。
图6显示了在鉴定MAID 6011的筛选试验中用于确定等位基因丢失(LOA)、等位基因获得(GOA)或母本等位基因(母本)的引物和探针列表。
图7显示了通过使用MAID 6012VI469靶向MAID 6011杂合子构建MAID 6012het的示意图。通过电穿孔使MAID 6012VI469构建体进入MAID 6011杂合子ES细胞产生MAID 6012杂合子ES细胞，在所述ES细胞中129品系来源的染色体被修饰以使其从5’至3’方向含有FRT位点、人源VH基因区段、含有adam6基因的小鼠基因组区、翼侧为LoxP(floxed)的新霉素选择性表达盒、人源D基因区段，其含有组氨酸取代(HD 1.1-6.6(9586bp；SEQ ID NO:1)、HD1.7-6.13(9268bp；SEQ ID NO:2)、HD 1.14-6.19(9441bp；SEQ ID NO:3)和HD 1.20-6.25,1.26(11592bp；SEQ ID NO:4))、人源JH基因区段、小鼠Ei序列(SEQ ID NO:5；在发育的B细胞中促进VH向DJH重排的内含子增强子)和小鼠IgM恒定区核苷酸序列(mIgM外显子1；SEQ IDNO:7)。
图8显示了在鉴定MAID 6012的筛选试验中用于确定等位基因丢失(LOA)、等位基因获得(GOA)或母本等位基因(母本)的引物和探针列表。
图9显示了用于从MAID 6012杂合子ES细胞中除去新霉素表达盒的示意图。将Cre-表达质粒电穿孔进入MAID 6012ES细胞以重组和缺失翼侧为LoxP(floxed)的新霉素表达盒，以产生MAID 6013杂合子ES细胞。
图10A-10E显示了人源D基因区段核苷酸序列，以及六个阅读框架的翻译，即三个5’至3’方向的阅读框架和三个相反方向(3’至5’)方向的阅读框架。“*”符号表示终止密码子，在两个SEQ ID NO之间的逗号表示其为由终止密码子分隔的两条氨基酸序列。
图11-13显示了由6013F0杂合子小鼠表达的mRNA序列及其编码的蛋白序列，在其129品系来源的染色体的免疫球蛋白重链基因座中包含组氨酸取代的人源D基因区段(HD1.1-6.6(9586bp；SEQ ID NO:1)、HD 1.7-6.13(9268bp；SEQ ID NO:2)、HD 1.14-6.19(9441bp；SEQ ID NO:3)和HD 1.20-6.25,1.26(11592bp；SEQ ID NO:4))。各图中框中的序列表示在来源于包含组氨酸取代的人源D基因区段的基因修饰的免疫球蛋白重链基因座的CDR3序列中存在的组氨酸密码子。FWR表示框架区，CDR表示互补性决定区。在比对中，点“.”表示与查询序列相同的序列，连接线“-”表示序列中的间隙。
图14显示了在免疫球蛋白重链CDR3序列中组氨酸的插入频率。X轴表示在各CDR3序列中出现的组氨酸密码子的数量，Y轴表示相应的读取比例。“6013F0het”表示由含有组氨酸取代的D基因区段的6013杂合子小鼠表示的CDR3序列。“VI3-Adam6”表示来自对照小鼠的CDR3序列，所述对照小鼠含有人源VH、D和JH基因区段，不含如本申请所述的组氨酸修饰。“ASAP”表示来自瑞恩泽(Regeneron)抗体数据库的CDR3序列，将其作为另一个对照。
图15显示了来自各种抗原特异性抗体(A-K抗体)的人源Vκ1-39来源的轻链的氨基酸比对。位于各条轻链序列中的组氨酸(H)残基以粗体标示。在比对的上方显示出了不同的轻链区(框架和CDR)。
图16显示了在人源Vκ1-39-来源的轻链的CDR3区中通过诱变工程改造的组氨酸残基的组合和位置。包括了相应的核酸序列。通过诱变引入的组氨酸残基和相应的核酸残基以粗体表示。氨基酸位置(105、106等)基于Lefranc等，(2003)Dev.Comp.Immunol.27:55-77中描述的独特的编号，并且其也可见于www.imgt.org。
图17显示了以ng/mL计的在CHO细胞上清液中检测到的抗体表达的水平，所述CHO细胞经过编码五条不同重链(1-5)和具有在CDR3中的所示位置(见Y轴)经工程改造的组氨酸残基的Vκ1-39-来源的轻链的核酸转染。
图18是显示在CHO细胞上清液中含有经组氨酸工程改造的轻链的所选定的抗原特异性人源抗体的表达情况的western印迹。
图19A-19J显示了在中性(7.4)和酸性(5.5)pH下来自抗原特异性抗体的选定重链与各种组氨酸工程改造的轻链配对的结合动力学。
图20A-20E显示了在中性(7.4)和酸性(5.75)pH下来自抗原特异性抗体的选定的重链(1-5)与多种组氨酸工程改造的轻链配对的结合动力学。显示了多种动力学参数，包括ka、kd、KD和t1/2。NB＝未结合。
图21显示了包含母体通用轻链或组氨酸修饰的通用轻链与所示重链(2、3和6)配对的抗体的动力学参数(KD和t1/2)。在一些抗体中组氨酸取代导致较强的pH依赖性。在CDR3中的组氨酸取代将序列105QQSYSTP111(SEQ ID NO:3)转化为105HHSYSTH111(SEQ ID NO:329)。注意NB＝未检测到结合(KD>10微摩)。
图22显示了在将经工程改造的组氨酸残基引入重排的人源Vκ1-39/Jκ5轻链序列的CDR3中使用的选定的诱变引物的序列和性质(％GC含量，N，错配％，Tm)。在序列表中使用的这些引物的SEQ ID NO包括在下表中。F＝正向引物，R＝反向引物。
图23A-23B显示了用于将工程改造的组氨酸残基引入来源于Vκ1-39/Jκ5可变区的重排的人源轻链可变区序列以制备表达含有经修饰的人源轻链的抗体的经基因修饰的小鼠的靶向载体构建的一般策略。图23C-23D显示了将针对ULC-H105/106/108/111取代的靶向载体引入ES细胞并使用其生成杂合子小鼠；而图23E-23F显示了将针对ULC-H106/108/111取代的靶向载体引入ES细胞并使用其生成杂合子小鼠。该图并未按照比例显示。除非另有明示，实心图形和实线表示小鼠序列，空心图形和双线表示人序列。
图24显示了针对来自针对组氨酸通用轻链(HULC)的小鼠杂合子(具有4个His取代-HULC 1927小鼠；具有3个取代-HULC 1930小鼠)和野生型小鼠在第二次取血的免疫原的抗血清效价。
图25是对来自HULC(1927vs 1930)和WT小鼠的杂交瘤融合的抗原阳性克隆总数和显示出pH敏感性抗原结合的抗原阳性克隆数的比较。对于各种小鼠类型图中均包括两只小鼠的数据(“小鼠1”和“小鼠2”)。
图26A-26C显示了来自表面等离子体共振结合实验的传感图，在实验中使来自杂合子HULC或WT小鼠的单克隆抗体(AA、BB、CC、DD、HH、GG、NN和OO)在中性pH(pH 7.4)下与免疫原结合，随后转移至pH 7.4或6.0的缓冲液中进行解离相。在各图中的各条线表示不同浓度的各抗体的结合应答。所有实验均在25℃进行。解离半衰期值(t1/2)标注于各传感图的上方，t1/2的变化倍数列于各传感图的右侧。抗体AA、BB、CC、DD、HH和GG来自于使用His取代轻链的HULC 1927小鼠，NN来自于使用WT轻链的HULC 1927小鼠和OO来自于WT小鼠(详见表5)。
图27显示了在人源Vκ3-20-来源的轻链的CDR3区中通过诱变工程化的组氨酸残基的位置。通过诱变引入的组氨酸残基和相应的核酸残基以粗体表示。氨基酸位置(105、106等)基于Lefranc等，(2003)Dev.Comp.Immunol.27:55-77中描述的独特的编号，并且其也可见于www.imgt.org。
图28显示了在将经工程改造的组氨酸残基引入重排的人源Vκ3-20/Jκ1轻链序列的CDR3中使用的选定的诱变引物的序列和性质(％GC含量，N，错配％，Tm)。在序列表中使用的这些引物的SEQ ID NO包括在下表中。F＝正向引物，R＝反向引物。
图29A-29B显示了用于将工程改造的组氨酸残基引入来源于Vκ3-20/Jκ1可变区的重排的人源轻链可变区序列以制备表达含有经修饰的人源轻链的抗体的经基因修饰的小鼠的靶向载体构建的一般策略。图29C显示了将针对ULC-Q105H/Q106H/Y107H/S109H取代的靶向载体引入ES细胞并使用其生成杂合子小鼠；而图29D显示了将针对ULC-Q105H/Q106H/S109H取代的靶向载体引入ES细胞并使用其生成杂合子小鼠。该图并未按照比例显示。除非另有明示，实心图形和实线表示小鼠序列，空心图形和双线表示人序列。
发明详述
本发明不限于所述的特定方法和实验条件，因为这种方法和条件可以改变。还应理解本申请使用的术语仅用于描述特定实施方式的目的，并不旨在限定，因为本发明的保护范围是由权利要求定义的。
除非另有定义，否则本申请使用的所有术语和短语包括所述术语和短语在本领域中所具有的含义，除非有相反的明确说明或根据使用所述术语或短语的上下文是显而易见的。尽管在本发明的实施或检测中可以使用与本申请所述的那些类似或等效的任意方法和材料，但是现在描述特定的方法和材料。
定义
在本申请中使用的术语“抗体”包含免疫球蛋白分子，所述免疫球蛋白分子含有四条多肽链，两条重链(H)和互相之间通过二硫键连接的两条轻链(L)。各条重链包含重链可变结构域和重链恒定区(CH)。所述重链恒定区包含三个结构域CH1、CH2和CH3。各条轻链包含轻链可变结构域和轻链恒定区(CL)。所述重链和轻链可变结构域可以进一步细分为高变区，称为互补性决定区(CDR)，其散布在更为保守的称为框架区(FR)的区域中。各条重链和轻链可变结构域包含三个CDR和四个FR，其从氨基末端到羧基末端以下述顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4(重链CDR可以缩写为HCDR1、HCDR2和HCDR3；轻链CDR可以缩写为LCDR1、LCDR2和LCDR3)。术语“高亲和性”抗体指针对其靶向表位具有约10-9M或更低(例如约1x10-9M、1x10-10M、1x10-11M或约1x10-12M)的KD的抗体。在一个实施方式中，KD通过表面等离子体共振测定，例如BIACORETM；在另一个实施方式中，KD通过ELISA测定。
短语“双特异性抗体”包括能够选择性地结合两个或更多表位的抗体。双特异性抗体通常包含两条不同的重链，各条重链特异性地结合不同的表位——在两个不同的分子上(例如在两个不同的免疫原上的不同表位)或在同一分子上(例如在同一免疫原上的不同表位)。如果双特异性抗体能够选择性地结合两个不同的表位(第一表位和第二表位)，则第一重链针对所述第一表位的亲和性将通常比第一重链针对所述第二表位的亲和性低至少1至2或3或4或更多个数量级，反之亦然。双特异性抗体特异性结合的表位可以在相同或不同的靶点上(例如在相同或不同的蛋白上)。示例性的双特异性抗体包括具有特异性针对肿瘤抗原的第一重链和特异性针对细胞毒性标记物例如Fc受体(例如FcγRI、FcγRII、FcγRIII等)或T细胞标记物(例如CD3、CD28等)的第二重链的那些。而且，所述第二重链可变结构域可以被具有不同的所需特异性的重链可变结构域取代。例如，可以将具有特异性针对肿瘤抗原的第一重链和特异性针对毒素的第二重链的双特异性抗体配对，以便将毒素(例如皂草素、长春花碱等)递送至肿瘤细胞。其他示例性的双特异性抗体包括具有特异性针对活化受体(例如B细胞受体、FcγRI、FcγRIIA、FcγRIIIA、FcαRI、T细胞受体等)的第一重链和特异性针对抑制受体(例如FcγRIIB、CD5、CD22、CD72、CD300a等)的第二重链的那些。可以构建这种双特异性抗体用于治疗与细胞活化相关的状况(例如变态反应和哮喘)。可以通过例如将识别同一免疫原上不同表位的重链组合制备双特异性抗体。例如，可以将编码识别同一免疫原的不同表位的重链可变序列的核酸序列与编码相同或不同的重链恒定区的核酸序列融合，并且可以在表达免疫球蛋白轻链的细胞中表达这种序列。典型的双特异性抗体具有两条重链，其均具有三个重链CDR，后接(N-末端至C-末端)CH1结构域、铰链、CH2结构域和CH3结构域，以及免疫球蛋白轻链，该免疫球蛋白轻链不具有表位结合特异性但是能够与各重链结合，或者能够与各重链结合并且能够结合与重链表位结合区结合的一个或多个表位，或者能够与各重链结合并且能够结合与一个或全部两个表位结合的一条或全部两条重链。
术语“细胞”包括适于表达重组核酸序列的任何细胞。细胞包括那些原核生物和真核生物(单细胞或多细胞)、细菌细胞(例如大肠杆菌(E.coli)、芽孢杆菌属(Bacillus)、链霉菌属(Streptomyces)等的菌株)、分枝杆菌细胞、真菌细胞、酵母细胞(例如酿酒酵母(S.cerevisiae)、粟酒裂殖酵母(S.pombe)、巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)、甲醇毕赤酵母(P.methanolica)等)、植物细胞、昆虫细胞(例如SF-9、SF-21、杆状病毒感染的昆虫细胞、粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)等)、非人动物细胞、人细胞或细胞融合例如杂交瘤或四价体杂交瘤。在一些实施方式中，所述细胞是人、猴、猿、仓鼠、大鼠或小鼠细胞。在一些实施方式中，所述细胞是真核细胞并且选自下述细胞：CHO(例如CHO K1、DXB-11CHO、Veggie-CHO)、COS(例如COS-7)、视网膜细胞、Vero、CV1、肾(例如HEK293、293EBNA、MSR 293、MDCK、HaK、BHK)、HeLa、HepG2、WI38、MRC 5、Colo205、HB 8065、HL-60、(例如BHK21)、Jurkat、Daudi、A431(表皮)、CV-1、U937、3T3、L细胞、C127细胞、SP2/0、NS-0、MMT 060562、睾丸支持(Sertoli)细胞、BRL 3A细胞、HT1080细胞、骨髓瘤细胞、肿瘤细胞和来源于前述细胞的细胞系。在一些实施方式中，所述细胞包括一种或多种病毒基因，例如表达病毒基因的视网膜细胞(例如PER.C6TM细胞)。
术语“互补性决定区”或“CDR”包括由生物体免疫球蛋白基因的核酸序列编码的氨基酸序列，所述免疫球蛋白基因通常(即在野生型动物中)出现在免疫球蛋白分子(例如抗体或T细胞受体)的轻链或重链可变区中的两个框架区之间。CDR可以由例如种系序列或者重排的序列，以及例如由初始B细胞或者成熟的B细胞或T细胞来编码。CDR可以是体细胞突变的(例如不同于在动物种系中的编码序列)、人源化的和/或使用氨基酸取代、插入或缺失修饰的。在一些情况下(例如针对CDR3)，CDR可由两条或更多条序列(例如种系序列)编码，所述序列(例如在未经重排的核酸序列中)不是邻近的，但是在B细胞核酸序列中是邻近的，例如作为所述序列剪接或连接的结果(例如V-D-J重组以形成重链CDR3)。
当用于描述保守的氨基酸取代时，术语“保守的”包括氨基酸残基被另一个具有带有相似化学性质(例如电荷或疏水性)的侧链R基的氨基酸残基取代。在通常情况下，保守的氨基酸取代将基本上不会改变目的蛋白的功能性性质，例如可变区以所需的亲和性特异性结合靶向表位的能力。具有带有相似化学性质的侧链的氨基酸基团的例子包括脂肪族侧链如甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；脂肪族-羟基侧链如丝氨酸和苏氨酸；含有酰胺的侧链如天冬酰胺和谷胺酰胺；芳香侧链如苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；碱性侧链如赖氨酸、精氨酸和组氨酸；酸性侧链如天冬氨酸和谷氨酸；和含硫侧链如半胱氨酸和甲硫氨酸。保守的氨基酸取代基团包括例如缬氨酸/亮氨酸/异亮氨酸、苯丙氨酸/酪氨酸、赖氨酸/精氨酸、丙氨酸/缬氨酸、谷氨酸/天冬氨酸和天冬酰胺/谷氨酰胺。在一些实施方式中，保守的氨基酸取代可以是蛋白中的任意天然残基被丙氨酸取代，例如用于丙氨酸扫描诱变。在一些实施方式中，制备在PAM250对数-似然性矩阵中具有正值的保守取代，如Gonnet等，(1992)Exhaustive Matching of the Entire Protein Sequence Database(整个蛋白序列数据库的详尽匹配),Science 256:1443-45所公开的。在一些实施方式中，所述取代是适度的保守取代，其中所述取代在PAM250对数-似然性矩阵中具有非负值。
在一些实施方式中，在免疫球蛋白轻链或重链中的残基位置相差一个或多个保守的氨基酸取代。在一些实施方式中，在免疫球蛋白轻链或其功能性片段(例如能够由例如B细胞表达和分泌的片段)中的残基位置不等同于在本申请中列出氨基酸序列的轻链，但是仅相差一个或多个保守的氨基酸取代。
在本申请中使用的术语“解离半衰期”或“t1/2”指由下述公式计算的值：t1/2(min)＝(ln2/kd)/60，其中kd表示解离速率常数。
短语“表位结合蛋白”包括具有至少一个CDR并且能够选择性地识别表位的蛋白，例如能够以约1微摩或更低的KD(例如KD为约1x10-6M、1x10-7M、1x10-9M、1x10-9M、1x10-10M、1x10-11M或约1x10-12M)结合表位。治疗性表位结合蛋白(例如治疗性抗体)通常要求KD在纳摩或皮摩范围内。
在本申请中使用的术语“功能性”例如在涉及功能性多肽时，包括保留了至少一个与天然蛋白相关的正常的生物活性的多肽。在另一个例子中，功能性免疫球蛋白基因区段可以包括能够产生重排以生成重排的免疫球蛋白基因序列的可变基因区段。
短语“功能性片段”包括能够表达、分泌和以在微摩、纳摩或皮摩范围内的KD特异性与表位结合的表位结合蛋白的片段。特异性识别包括具有至少在微摩范围、纳摩范围或皮摩范围内的KD。
在本申请中使用的术语“种系”涉及免疫球蛋白核酸序列时包括能够传递给后代的核酸序列。
短语“重链”或“免疫球蛋白重链”包括免疫球蛋白重链序列，其包括来自任意生物体的免疫球蛋白重链恒定区序列。除非另有明示，重链可变结构域包括三个重链CDR和四个FR区。重链的片段包括CDR、CDR和FR及其组合。典型的重链具有下述可变结构域(从N-末端到C-末端)：CH1结构域、铰链、CH2结构域和CH3结构域。重链的功能性片段包括能够特异性识别表位(例如以在微摩、纳摩或皮摩范围内的KD识别所述表位)，能够由细胞表达和分泌并且包含至少一个CDR的片段。重链可变结构域由可变区核苷酸序列编码，其通常包含来源于在种系中存在的VH、DH和JH区段库的VH、DH和JH区段。各种生物体V、D和J重链区段的序列、位置和命名可见于IMGT数据库，可以通过在URL“imgt.org.”登录万维网(www)对其进行访问。
术语“一致性”当与序列一起使用时包括由本领域公知的能够用于测定核苷酸和/或氨基酸序列一致性的多种不同算法确定的一致性。在本申请所述的一些实施方式中，使用open gap罚分为10.0和extend gap罚分为0.1的ClustalW v.1.83(slow)比对和使用Gonnet相似性矩阵(MACVECTORTM 10.0.2,MacVector Inc.,2008)确定一致性。用于序列一致性比较的序列的长度取决于特定的序列，但是在轻链恒定结构域的情况下，所述长度应包含折叠进入轻链恒定结构域的足够长度的序列，其能够自结合以形成典型的轻链恒定结构域，例如能够形成两个含有β链的β片层并且能够与人源或小鼠的至少一个CH1结构域相互作用。在CH1结构域的情况下，所述序列的长度应含有折叠进入CH1结构域的足够长度的序列，其包含两个含有β链的β片层并且能够与人源或小鼠的至少一个轻链恒定结构域相互作用。
短语“免疫球蛋白分子”包括两条免疫球蛋白重链和两条免疫球蛋白轻链。所述重链可以是相同的或不同的，所述轻链可以是相同的或不同的。
短语“轻链”包括来自任何生物体的免疫球蛋白轻链，并且除了另有明示包括人源κ和λ轻链和VpreB，以及替代轻链。除非另有明示，轻链可变结构域通常包括三个轻链CDR和四个框架(FR)区。在通常情况下，全长的轻链从氨基末端到羧基末端包括包含FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4的可变结构域和轻链恒定区氨基酸序列。轻链可变结构域由轻链可变区核苷酸序列编码，其通常包含来源于种系中存在的轻链V和J区段库的轻链VL和轻链JL区段。各种生物体轻链V和J基因区段的序列、位置和命名可见于IMGT数据库，其可以通过在URL“imgt.org.”登录万维网(www)对其进行访问。轻链包括那些例如不选择性结合第一或第二表位的轻链，而所述第一或第二表位被包含该轻链的表位结合蛋白选择性结合。轻链还包括结合和识别，或者辅助重链结合和识别一个或多个表位的那些轻链，所述一个或多个表位选择性地被包含该轻链的表位结合蛋白结合。轻链还包括结合和识别，或者辅助重链结合和识别一个或多个表位的那些，所述一个或多个表位选择性地被包含该轻链的表位结合蛋白结合。共有的或通用轻链包括来源于人源Vκ1-39Jκ5基因或人源Vκ3-20Jκ1基因的那些，并且包括其体细胞突变(例如亲和性成熟)的版本。
短语“微摩范围”旨在表示1-999微摩；短语“纳摩范围”旨在表示1-999纳摩；短语“皮摩范围”旨在表示1-999皮摩。
“中性pH”包括在约7.0和约8.0之间的pH，例如在约7.0和约7.4之间的pH，例如在约7.2和约7.4之间，例如在例如小鼠或人中的生理pH。“酸性pH”包括6.0或更低的pH，例如在约5.0和约6.0之间的pH，在约5.75和约6.0之间的pH，例如内涵体和溶酶体隔室的pH。
术语“可操作地连接”指关系，其中所述组件以预期的方式可操作地连接功能。在一个例子中，编码蛋白的核酸序列可以与调节序列(例如启动子、增强子、沉默子序列等)可操作地连接，以保持适宜的转录调节。在一个例子中，免疫球蛋白可变区(或V(D)J区段)核酸序列可以与免疫球蛋白恒定区的核酸序列可操作地连接以使得在所述序列之间适宜的重组进入免疫球蛋白重链或轻链序列。
在本申请中使用的短语“体细胞突变的”包括指来自B细胞的已经历过类别转换的核酸序列，其中在经过类别转换的B细胞中的免疫球蛋白可变区例如重链可变区的核酸序列(例如重链可变结构域或包括重链CDR或FR序列)不等同于类别转换前在B细胞中的核酸序列，例如未经过类别转换的B细胞与已经过类别转换的B细胞之间在CDR或框架核酸序列中存在差异。短语“体细胞突变的”包括指来自亲和性成熟的B细胞的核酸序列，其不等同于在未经过亲和性成熟的B细胞中相应的免疫球蛋白可变区序列(即，在种系细胞基因组中的序列)。短语“体细胞成熟的”还包括指将B细胞与目的抗原接触后来自B细胞的免疫球蛋白可变区核酸序列，其中所述核酸序列不同于在将所述B细胞与目的抗原接触前相应的核酸序列。短语“体细胞突变的”还指来自在具有人源免疫球蛋白可变区核酸序列的动物例如小鼠中针对免疫原刺激生成的抗体的序列，并且这些是来自于在这种动物中固有的有效的选择过程。
术语“未经重排的”涉及核酸序列时包括在动物细胞种系中存在的核酸序列。
短语“可变结构域”包括免疫球蛋白轻链或重链(根据需要进行了修饰)的氨基酸序列，其包含下述氨基酸区域，从序列的N-末端至C-末端(除非另有明示)：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。
短语“可操作地连接”指相邻位置，其中所述组件处于允许其以预期方式实现功能的关系。在一个例子中，编码蛋白的核酸序列可以与调节序列(例如启动子、增强子、沉默子序列等)可操作地连接，以保持适宜的转录调节。在一个例子中，免疫球蛋白可变区(或V(D)J区段)核酸序列可以与免疫球蛋白恒定区的核酸序列可操作地连接以使得在所述序列之间适宜的重组进入免疫球蛋白重链或轻链序列。
术语“取代”涉及基因取代时指在内源性基因座放置外源性遗传物质，以便使用直系同源的或同源的核酸序列取代全部或部分内源性基因。
在本申请中使用的术语“功能性”例如涉及功能性多肽时包括保持至少一种正常与天然蛋白相关的生物活性的多肽。在另一个例子中，功能性免疫球蛋白基因区段可以包括能够产生有成效的重排以生成重排的免疫球蛋白基因序列的可变基因区段。
具有组氨酸取代的可变结构域
对基于人免疫球蛋白的疗法的设计已被广泛地研究，但是在建立具有最佳特性的这种疗法中仍存在一些没有解决的问题，例如延长这种疗法的血清半衰期或者另外改善每个治疗分子与更多靶点结合的能力。在过去的几十年旨在阐明血清免疫球蛋白周转的大部分工作均集中在如何通过修饰抗体的结构提高治疗性重要抗体或基于免疫球蛋白的疗法的血清半衰期。在大多数情况下，这种修饰工作集中在抗体的恒定结构域与新生儿Fc受体(FcRn)的相互作用上。在细胞外表面上的新生儿Fc受体通过其Fc区与循环抗体结合以形成抗体-FcRn复合物，所述复合物掺入或内吞进入细胞，在所述细胞中配体与抗体分离并且抗体FcRn复合物经历循环过程，这使得抗体和FcRn返回细胞表面，抗体在细胞表面被释放并且能够再结合新的靶向分子。在受体循环的一般机制被发现以后，抗体-FcRn复合物的循环成为非常热门的领域。
受体循环能够通过多种机制进行。受体介导的内吞作用提供了用于调节细胞表面受体及(在一些情况下，例如FcRn)其配体再循环的内涵体途径。(胞饮作用的分子另外通常经过内涵体途径穿梭，该内涵体途径终止于降解。)受体介导的内吞作用机制的发现和关注膜受体再循环的工作为详细了解在通常情况下受体-配体的周转提供了框架(详情参见例如Brown,M.S.,Anderson,R.G.W.和Goldstein,J.L.(1983)Recycling Receptors:TheRound-Trip Itinerary of Migrant Membrane Proteins(再循环受体：迁移膜蛋白的往返行程)，Cell 32:663-667；亦参见Goldstein,J.L.和Brown,M.S.(2009)The LDL Receptor(LDL受体),Arterioscler.Thromb.Vasc.Biol.29:431-438；Basu,S.K.(1984)Receptor-mediated endocytosis:An overview of a dynamic process(受体介导的内吞作用：动态过程概述),J.Biosci.6(4):535-542)。对内涵体分选的其他工作有助于正确认识循环免疫球蛋白的结局和免疫球蛋白受体再循环的现象以及抗体药物药代动力学的大致问题。该工作揭示了复杂的抗体-FcRn复合物的循环过程似乎主要负责使IgG分子在血清中具有相对较长的半衰期。事实上，甚至在这一领域相当早期的工作已经确定了内涵体是体内FcRn最丰富的来源(参见Roberts,D.M.等，(1990)Isolation and Characterization of the FcReceptor from the Fetal Yolk Sac of the Rat(来自大鼠胎儿卵黄囊的Fc受体的分离和表征),J.Cell.Biol.111:1867-1876)。并且早就观察到受体-阳性组分大部分不会走向溶酶体降解(参见例如Brown,M.S.等，(1983)Recycling Receptors:The Round-TripItinerary of Migrant Membrane Proteins(再循环受体：迁移膜蛋白的往返行程),Cell32:663-667；参见例如von Figura等，(1984)Antibody to mannos 6-phosphate specificreceptor induces receptor deficiency in human fibroblasts(甘露糖6-磷酸特异性受体的抗体在人成纤维细胞中诱导受体缺陷),EMBO J.3(6):1281-1286)，不存在聚集(参见例如Dunn,K.W.等，(1989)Iterative Fractionation of Recycling Receptors fromLysosomally Destined Ligands in an Early Sorting Endosome(从早期分选内涵体中的溶酶体预定配体对再循环受体的反复分提),J.Cell.Biol.109(6):3303-3314)。正是这种参与循环过程的内涵体系统确保了在酸性条件下抗体(例如人源IgG1抗体)在血清中长时间地与FcRn良好结合。
根据一些报道，含有FcRn的内涵体的再循环机制是新的和不常见的；其不涉及泛素依赖性的完整细胞器融合而是类似于由肾小管扩展介导的不完全融合，这与kiss-and-linger模型更加相似(Gan,Z.等，(2009)Analyses of the recycling receptor,FcRn,inlive cells reveal novel pathways for lysosomal delivery(对肝细胞中揭示溶酶体递送新途径的再循环受体FcRn的分析),Traffic 10(5):600；参见例如Tzaban,S.等，(2009)The recycling and transcytotic pathways for IgG transport by FcRn aredistinct and display an inherent polarity(通过FcRn用于IgG转运的再循环和转胞途径是不同的并显示出固有的极性),J.Cell Biol.185(4):673-684)。因此，所述抗体-FcRn循环模型似乎是与其他内涵体途径截然不同的。
所述抗体-FcRn内涵体循环机制确保了与FcRn结合良好的抗体能够通过或多或少的持续性的FcRn保护性过程在血清中维持长时间的存在，该过程将抗体隔离地结合在内涵体隔室中，在该隔室中保持了抗体与FcRn的结合，阻止了与FcRn结合的抗体的溶酶体降解。通常地，循环抗体分子与FcRn在细胞表面上结合。作为持续内吞过程的结果抗体-FcRn复合物出现在内涵体中。在酸性内涵体隔室中FcRn结合分子(例如抗体或Fc融合蛋白)通过酸性稳定的Fc-FcRn相互作用保持与FcRn的结合。不与内涵体表面结合的分子(通过例如FcRn或另一种受体)穿梭至溶酶体途径并被降解，而当内涵体与质膜融合时受体结合的分子再循环至质膜。在与质膜融合后，将酸稳定的Fc-FcRn相互作用暴露于接近中性的细胞外pH时，Fc易于与FcRn解离。与FcRn的差异性热稳定性偶联的Fc的pH结合差异随着质子化状态而改变，据信其主要负责某些Fc通过结合FcRn维持血清浓度的能力。内涵体循环机制的关键是在酸性内涵体隔室中通过受体将配体释放(例如Brown,M.S.等(1983)的综述)。
在pH 6.0至约6.5时IgG1Fc部分以较高的亲和性与FcRn结合；在pH 7.0至约pH7.5时的结合约减弱两个数量级，这大概是由于在与FcRn结合的Fc区域附近组氨酸残基(残基310-433)的滴度和由质子化状态介导的FcRn分子内热稳定性差异导致的(Raghaven,M.等，(1995)Analysis of the pH dependence of the neonatal Fc receptor/immunoglobulin G interaction using antibody and receptor variants(使用抗体和受体变体对新生儿Fc受体/免疫球蛋白G相互作用的pH依赖性的分析),Biochemistry 34:14649-14657；Vaughn,D.E.和Bjorkman,P.J.(1998)Structural basis of pH-dependentantibody binding by the neonatal Fc receptor(通过新生儿Fc受体的pH依赖性抗体结合的结构基础),Structure 6:63-73)；已证实与pH 8.0相比在pH 6.0下大鼠FcRn显示出更好的热稳定性谱(Raghavan,M.等，(1993)The class I MHC-related Fc receptor showspH dependent stability differences correlating with immunoglobulin bindingand release(I类MHC相关Fc受体显示出与免疫球蛋白的结合和释放相关的pH依赖性稳定性差异),Biochemistry 32:8654-8660)。
尽管Fc结构的性质导致其结合FcRn的差异，但是通过对Fc进行工程改变的科学设计产生的Fc结构结果以更高的滴度与FcRn结合，并且据推测其具有更长的血清半衰期。设计和检测了多种此类结构，在本申请中远不胜枚举，其成功程度不同。将免疫球蛋白恒定区序列突变通过修饰FcRn的结合特性以促进抗体的再循环具有悠久的历史。到目前为止，大多数(如果不是全部的话)鉴定突变的努力均集中在据信在与FcRn的结合或相互作用中起关键作用的残基上，即修饰影响Fc对FcRn的亲和性的残基。
但是Fc与FcRn的结合本身就是一件复杂的事情。不同类型的治疗性抗体(人源化、嵌合和小鼠)甚至在同一类型内(例如对不同的人源化抗体之间进行比较，将IgG1同种型抗体之间进行比较等)，显示出针对FcRn的解离常数最多变化约2倍(参见例如Suzuki,T.等，(2010)Importance of Neonatal FcR in Regulating the Serum Half-Life ofTherapeutic Proteins Containing the Fc Domain of Human IgG1:A ComparativeStudy of the Affinity of Monoclonal Antibodies and Fc-Fusion Proteins toHuman Neonatal FcR(新生儿FcRn在调节含有人源IgG1的Fc结构域的治疗性蛋白血清半衰期的重要性：单克隆抗体和Fc-融合蛋白与人源新生儿FcR亲和性的比较性研究),J.Immunol.184:1968-1976)。该观察允许一个推论，即恒定区的一级结构也许没有影响所有的动力学行为。其他人推测保持恒定区一级结构固定的抗体的总等电点(pI)是血清半衰期重要的决定因素——可能通过非特异性的非FcRn依赖性机制(Igawa,T.等，(2010)Reduced elimination of IgG antibodies by engineering the variable region(通过工程改造可变区使IgG抗体的清除降低),Protein Engineering,Design&Selection 23(5):385-392)。根据这种观点，抗体的pI越低，其与FcRn的结合越紧密(Id.)。对于至少一个IgG4同种型抗体而言，pI在9.2至7.2之间改变与半衰期增加2.4倍和清除率降低4.4倍相关(Id.)，这与通过同时修饰重链和轻链可变区的残基能够非特异性降低pI的推论一致，所述修饰能够显著影响药代动力学行为。在该报告中，残基的修饰并没有遵循任何特定模式并且没有残基被组氨酸取代，但是在轻链CDR2中的至少一个残基由组氨酸残基变为谷氨酸残基(Id.，第390页图5)。而且，当将体外FcRn结合与体内药代动力学进行比较时可能得到一个奇怪的矛盾：对于在与FcRn相互作用的Fc区中具有多个取代的至少一个临床重要的IgG1抗体而言，体外FcRn结合不与体内药代动力学行为相关(参见Petkova,S.B.等，(2006)Enhanced half-life of genetically engineered human IgG1antibodies in ahumanized FcRn mouse model:potential application in humorally mediatedautoimmune disease(在人源化FcRn小鼠模型中基因工程人源IgG1抗体具有增加的半衰期：在体液介导的自身免疫性疾病中的潜在应用),Int’l Immunol.18(12):1759-1769)。最后，Fc配体从与质膜融合的FcRn上的释放似乎发生在两相中：机制未知的快速相和延伸相(参见Ober R.J.等，(2004)Exocytosis of IgG as mediated by the receptor FcRn:ananalysis at the single-molecule level(由受体FcRn介导的IgG的胞吐作用：在单分子水平的分析),Proc.Natl Acad.Sci.USA 101:11076-11081)。
最后，延长抗体在血清中的半衰期是增强抗体疗法有效性的一种方法。改善影响靶抗原的FcRn的结合和周转并不能完全解决提高相同抗体或可变结构域结合和消除两个或三个或多个靶分子的效能或可利用性的问题。预计增加Fc与FcRN的亲和性的修饰会增加周转并且因此改善治疗性抗体的药代动力学。抗原-抗体复合物与FcRn紧密地结合，结果使得所述抗原-抗体复合物循环回细胞外空间而非通过溶酶体途径被降解。然而，在这种情况下，抗原或靶点可能在很大程度上保持与抗体的复合并且与抗体一起再循环进入细胞外空间。对于治疗性抗体而言，可能非常不希望出现这种现象。
然而，与抗原相互作用的抗体是pH依赖性的，即经工程改造在内涵体pH下以较低的亲和性与抗原结合的抗体将不会以FcRn依赖性的方式再循环抗原，因为所述抗原-抗体复合物在内涵体隔室中是不稳定的。这是因为在内涵体的酸性环境中，所述抗原将从抗体-FcRn复合物上解离，并且与FcRn结合的抗体将再循环至细胞表面，而解离的游离抗原将穿梭至溶酶体降解途径。通过这种方式，pH依赖性的抗原结合能够在Fc介导的循环(而不是直接依赖于Fc-FcRn相互作用)背景下通过释放循环抗体提供增强的有效性和/或药代动力学，以与抗原结合，与FcRn结合，通过内涵体循环并且再进入细胞外空间以结合更多的抗原并且使更多的抗原穿梭至溶酶体降解途径。
观察发现在内涵体pH下配体将频繁地从其受体上解离，这表明可以对在内涵体pH下有效释放抗原的抗体进行研究寻找以制备某些特异性的多功能分子，所述分子靶向特定的细胞以便将毒素输入细胞并且在内涵体中释放所述毒素(参见例如美国专利号5,599,908和美国专利号No.5,603,931)。但是其并不涉及抗原抗体循环，特别是针对人用疗法的。
为了利用抗体的结构通过溶酶体途径穿梭内涵体使抗原解离同时保持抗原-FcRn复合物的FcRn依赖性循环，已经探索了某些pH依赖性抗原结合的方法。此类方法包括对可变区进行广泛的组氨酸扫描以使用组氨酸取代残基并且检测以确定是否该广泛的组氨酸取代的方法产生了具有所需的pH依赖性抗原结合的抗体(参见例如Igawa,T.等，(2010)Antibody recycling by engineered pH-dependent antigen binding improves theduration of antigen neutralization(通过经工程改造的pH依赖性抗原结合的抗体再循环改善抗体中和作用的持续时间),Nature Biotech.28(11):1203-1208；亦参见美国专利申请公开号2011/0111406 A1)。这种方法的一个可能的缺点是对抗原结合具有重要作用的残基的修饰可能会破坏其在酸性或中性pH下的结合，其能够消除在内涵体隔室和细胞外空间之间的pH差异导致的任何利用。
在各种方面，本申请提供了用于制备一种或多种组氨酸取代的组合物和方法，所述组氨酸取代在抗体可变结构域(重链和/或轻链可变结构域)的一些被谨慎选择的区域中，所述组合物和方法提供了一种用于制备抗体可变结构域的方法，所述抗体可变结构域以pH依赖性的方式与靶抗原结合，例如在中性或碱性或细胞外pH下以第一亲和性与目的抗原结合，而在酸性pH下以第二亲和性与相同目的抗原结合的可变结构域，其中所述第一亲和性较高和其中所述第二亲和性较低。
在各种方面，所述一个或多个组氨酸取代在CDR1、CDR2、CDR3、N-末端和/或环4序列中。
在一些方面，所述一个或多个组氨酸取代在CDR1、CDR2和/或CDR3中。
在一些方面，所述一个或多个组氨酸取代在CDR3和环4序列中。在进一步的实施方式中，所述取代还在N-末端序列中。
在一些方面，所述一个或多个组氨酸取代在CDR3和N-末端序列中。在进一步的实施方式中，所述取代还在环4序列中。
在一些方面，所述一个或多个组氨酸取代在CDR2序列和环4序列中。在进一步的实施方式中，所述取代还在N-末端序列中。
在一些方面，所述环4序列针对λ轻链可变结构域残基83-88；针对κ轻链可变结构域残基83-88和针对重链可变区82-88(IMGT编号)。
在一些方面，针对轻链可变结构域或重链可变结构域的N-末端序列是残基1-26(IMGT编号)。在一个实施方式中，包含一个或多个(例如成簇的)组氨酸取代的N-末端序列是残基1-5，在一个实施方式中是残基1-10，在一个实施方式中是1-15，在一个实施方式中是1-20，在一个实施方式中是1-25，在一个实施方式中是5-10，在一个实施方式中是10-15，在一个实施方式中是15-20，在一个实施方式中是20-25，在一个实施方式中是5-15，在一个实施方式中是10-20，在一个实施方式中是5-20。在一个实施方式中，所述组氨酸取代是两个或多个(例如三个、四个、五个或六个或更多的)，并且在至少两个或多个组氨酸取代在一段N-末端序列中形成，所述N-末端序列是约3个残基、4个残基、5个残基或六个残基或者更多个残基。在一个实施方式中，多个组氨酸取代在N-末端残基中形成，并且所述组氨酸残基包含至少2个、至少3个或至少4个组氨酸取代的簇。在一个实施方式中，所述至少一个组氨酸取代的簇包含由一个或多个非组氨酸取代分隔的组氨酸取代。
在一些方面，所述CDR的一个或多个组氨酸取代是在CDR中的2、3、4、5或6个组氨酸取代。在一个实施方式中，在CDR中针对在中性pH下的结合不是关键性的全部残基均被组氨酸取代。在一个实施方式中，所述2、3、4、5或6个取代是相邻的；在一个实施方式中，所述2、3、4、5或6个取代中的一个或多个存在于簇中，其中所述簇包含至少一个非组氨酸残基；在一个实施方式中，所述簇包含两个非组氨酸残基；在一个实施方式中，所述簇包含3个非组氨酸残基；在一个实施方式中，所述簇包含4个非组氨酸残基。
在一些方面，在N-末端的所述一个或多个组氨酸取代是1、2、3、4、5或6个取代。在一个实施方式中，在N-末端中不会降低在中性pH下抗原结合的全部残基(例如高于1％、2％、3％、4％或5％)均被组氨酸取代。在一个实施方式中，所述2、3、4、5或6个取代是相邻的；在一个实施方式中，所述2、3、4、5或6个取代中的一个或多个存在于簇中，其中所述簇包含至少一个非组氨酸残基；在一个实施方式中，所述簇包含两个非组氨酸残基；在一个实施方式中，所述簇包含3个非组氨酸残基；在一个实施方式中，所述簇包含4个非组氨酸残基。
在一些方面，所述方法包括修饰可变结构域以便在选自下述的区域中包含组氨酸取代的簇(例如如上文所述，相邻的或被一个或多个非组氨酸残基间隔的)，所述区域选自：CDR1、CDR2、CDR3、N-末端、环4及其组合。在一些方面，所述簇是上游与第一组氨酸残基结合和下游与第二组氨酸残基结合的序列，并且所述序列包含在第一和第二组氨酸残基之间的一个或多个残基。在一个实施方式中，在第一和第二组氨酸残基之间的所述一个或多个残基是1、2、3、4、5或6个或更多个非组氨酸残基。在一个实施方式中，在第一或第二组氨酸残基之间的所述一个或多个残基是1、2、3、4、5或6个组氨酸残基。在一个实施方式中，所述簇是3个残基，在一个实施方式中是4个残基，在一个实施方式中是5个残基，在一个实施方式中是6个残基，在一个实施方式中是7个残基，在一个实施方式中是8个残基或更多个残基。
在各种方面，所述方法包括鉴定在抗体可变结构域(重链和/或轻链)中的序列，所述序列对抗原结合是关键的(例如在中性pH下，例如pH 7-7.4，例如pH 7.2，例如在细胞外pH下)，以及将所述序列中的一个或多个残基取代为组氨酸，其中取代为组氨酸不会消除在中性pH下所述可变结构域与靶抗原的结合。在各种方面，对在中性pH下的结合不具有关键作用的两个或更多个、三个或更多个、四个或更多个或者五个或更多个残基的簇被组氨酸残基取代。在各种方面，所述组氨酸残基的簇在CDR、环4、N-末端或其组合中。
在各种方面，将对结合具有关键作用的残基鉴定为当在约中性(或细胞外)pH下使用取代的氨基酸取代时，所述可变结构域的结合降低在一个实施方式中至少5％，在一个实施方式中至少10％，在一个实施方式中至少20％，在一个实施方式中至少30％，在一个实施方式中至少40％，在一个实施方式中至少50％，在一个实施方式中至少60％，在一个实施方式中至少70％，在一个实施方式中至少80％，在一个实施方式中至少90％，在一个实施方式中的结果为检测不到结合。在一个实施方式中，所述取代的氨基酸是组氨酸。在一个实施方式中，所述取代的氨基酸是丙氨酸。
在一个方面，本申请提供了一种用于制备抗体可变结构域的方法，所述可变结构域在酸性pH下与抗原的结合比其在中性或碱性pH下与相同抗原的结合弱，其中所述方法包括使用一个或多个组氨酸残基取代所述可变区的一个或多个氨基酸残基。在一个实施方式中，在酸性pH下的所述结合是可以忽略的或为零。
在一个实施方式中，所述一个或多个氨基酸残基的取代在轻链中。在一个特定的实施方式中，所述一个或多个残基在轻链的N-末端区中。在一个特定的实施方式中，所述N-末端残基选自1-26、1-20、1-15、1-10、1-6或1-5(IMGT编号)。在一个实施方式中，所述一个或多个残基在环3中。在一个特定的实施方式中，所述环4残基是在Vκor Vλ中的83-88和在VH中的82-88(IMGT编号)。
在一个实施方式中，所述一个或多个残基在重链中。在一个特定的实施方式中，所述一个或多个残基在重链的N-末端区中。在一个特定的实施方式中，所述N-末端残基选自1-26、1-20、1-15、1-10、1-6或1-5(IMGT编号)。在一个实施方式中，所述一个或多个残基在环4中。在一个特定的实施方式中，所述环3残基选自(针对Vκ或Vλ)83、84、85、86、87、88及其组合(IMGT编号)；或(针对VH)82、83、84、85、86、87、88及其组合(IMGT编号)以及其组合。
在一个实施方式中，在CDR中的所述一个或多个残基选自CDR1、CDR2和CDR3；所述一个或多个残基当被取代时(例如使用丙氨酸或使用组氨酸)不会导致在中性或碱性pH下与靶抗原的结合降低。在一个特定的实施方式中，作为取代的结果(例如通过丙氨酸或组氨酸取代)在中性或碱性pH下所述靶抗原的结合与未被取代的可变结构域相比降低不超过5％、不超过10％、不超过15％、不超过20％、不超过25％或者不超过30％。
在一些方面，所述组氨酸修饰的可变结构域与靶抗原复合显示出的半衰期在升高的pH下(例如细胞外pH，例如pH 7-7.4，例如pH 7.2)为至少约20分钟，在内涵体pH下或pH为例如pH 5-6，例如pH 5.75显示出的半衰期为低于5分钟、低于4分钟、低于3分钟、低于2分钟或者低于1分钟。在一个实施方式中，所述组氨酸修饰的可变结构域与靶抗原复合显示出的半衰期在升高的pH下为至少约20分钟，在内涵体pH下显示出的半衰期为低于60秒、低于30秒、低于10秒、低于5秒、低于4秒、低于3秒或者低于2秒。在一个实施方式中，所述组氨酸修饰的可变结构域与靶抗原复合显示出的半衰期在升高的pH下(例如pH 7-7.4，例如pH 7.2)为至少约20分钟，并且在内涵体pH下显示出的半衰期低于约1秒、低于0.5秒、低于0.1秒或低于0.05秒。在一个实施方式中，使用BIACORETM检测测定在内涵体pH下的半衰期，在检测中在中性或升高的pH下在BIACORETM芯片的表面上平衡与靶抗原复合的组氨酸修饰的可变结构域，并且在内涵体pH下(或例如pH 5-6，例如pH 5.75)将缓冲液流过所述复合物。
在各种方面，本申请提供了一种用于制备抗体可变结构域的方法，所述抗体可变结构域在细胞外pH下以第一亲和性与靶抗原结合，并且其在内涵体pH下不与靶抗原结合或以第二亲和性与靶抗原结合，其中所述第一亲和性约为所述第二亲和性的约10、102、103、104、105、106、107、108、109、1010、1011或1012倍(或更高倍数)。在一些方面，所述第一亲和性在皮摩或纳摩范围(例如KD为10-12至10-9)，并且所述第二亲和性在微摩或更高范围(例如KD＝10-6或更高，例如10-5、10-4、10-3、10-2、10-1、1或更高)。在一些方面，所述第一亲和性在约KD10-9至约KD 10-12范围内，并且所述第二亲和性在约KD 10-3至约1或更高的范围内。在一个实施方式中，所述第一亲和性在约KD 10-9至约10-12范围内，并且所述第二亲和性的特征为KD>1；在一个特定的实施方式中，所述第二亲和性的特征为KD>>1(例如10、102、103或更高)。在一个特定的实施方式中，所述第一亲和性的特征为KD为约10-9至约10-12，并且所述第二亲和性的特征为在BIACORETM结合检测中的背景下不能检测到结合。
各个方面由特定的例子解释，其中人源轻链可变序列被修饰以便在轻链CDR3中含有一个或多个(包括簇)组氨酸，并且在具有同源性人源重链的CHO细胞中表达所述轻链。与所述组氨酸修饰的抗体结合的抗原的鉴定是不重要的，因为其是轻链可变结构域的特定序列。在实施例中所说明的原理适用于CDR3、CDR2、CDR1、N-末端区或环4。例如，在所引用区域中的残基可以被取代为组氨酸，单独或在2、3、4或5个的簇中，例如将得到的抗体用于检测所pH依赖性抗原结合。
制备经工程改造的能够以pH依赖的方式结合抗原的抗体的方法可以通过在上文所述的轻链序列的一个或多个位置进行免疫球蛋白轻链可变区的修饰实现(例如在CDR3、CDR2、CDR1、环4、N-末端)。在CDR区中是允许存在组氨酸的；轻链通常在可变区序列显示出体细胞高突变，并且在一些情况下，这种突变能够导致在CDR中的组氨酸残基的取代(图15)。
在实施例中，已鉴定出组氨酸取代在轻链CDR3区中的1至4个位置，这些位置位于在中性pH下对结合靶抗原不具有关键作用的残基，从这些位置制备了15个突变构建体。所示的特定轻链(其具有多种不同的但是同源的重链)来源于单一Vκ和单一Jκ区段(Vκ1-39/Jκ5)。当表达这种突变时赋予抗体(与同源的重链结合)pH依赖性抗原结合的性质。所述突变构建体使用抗原特异性抗体可变结构域制备并且在近似中性pH下检测其表达以及抗原的结合和低pH下检测其释放(“捕获和释放”)。在某些实施例中显示四个已鉴定残基的位置(突变成组氨酸的位置对在中性pH下的结合不具有关键作用)是Q105H、Q106H、Y108H和P111H。对于与不同靶抗原结合的抗体或对于包含不同重排的V-J序列的抗体而言，通过鉴定哪个残基对在中性pH下的结合不具有关键作用寻找用于制备pH依赖性可变结构域的可进行组氨酸突变的残基，然后修饰这些残基中的一个或多个(例如在簇中)并且表达包含所述突变的抗体，以及检测在中性pH(例如细胞外pH)和在酸性pH(例如内涵体pH)下的结合(和/或释放时间，例如t1/2)。尽管本申请中所显示的数据是针对Vκ1-39/Jκ5轻链，其他轻链包括来源于Vκ3-20/Jκ1重排的那些，是适用于本申请所述的方法的，在重链中也同样。
在本实验中制备的所有组氨酸工程改造的轻链构建体均能够以与重链结合的方式很好地表达。而且，BIACORETM检测的数据证明了所述抗体与抗原以pH依赖的方式结合，所述数据显示在约中性pH和在酸性pH下特异性识别相同细胞表面抗原的具有5种不同重链的15个突变体与抗原结合(图19A-J)。
所描述的方法以及在本申请的一些实施例和附图中用于解释目的的那些特定方法对于生成抗体的可变区是有用的，所述抗体能够用于制备例如人源治疗性结合蛋白，其通过在CDR3中包含组氨酸的人源免疫球蛋白可变结构域结合其靶点。在较低pH下改变的结合将在一些情况下允许更迅速的周转，因为与细胞表面上的靶点结合的治疗剂将被内化进入内涵体，并且在内涵体中更容易或更迅速地从靶点上解离，以使得治疗剂能被再循环以结合其他的靶分子(例如在其他细胞上或在同一细胞上)。在各种实施方式中，这将导致能够以较低的剂量治疗或者以较少的频率治疗。这对于不希望频繁给药或者给药超过一定剂量会导致安全性或毒性问题的情况是特别有用的。例如，作为结果在受试者血清中的抗体治疗剂的半衰期将是增加的。
因此，在各种实施方式中，在编码重排的人源轻链的基因中的密码子可以在位置105、106、108、111或其组合。例如，位置105与106、108和111中的一个或多个的组合；位置106与105、108和111中的一个或多个的组合；位置108与105、106和111中的一个或多个的组合；位置111与105、106和108中的一个或多个的组合。在其他轻链中的相应位置(即来源于其他V-J重排)包括在各种实施方式中。
表达包含组氨酸残基的免疫球蛋白重链可变结构域的非人动物
所述的发明提供了基因修饰的非人动物，所述非人动物能够产生具有pH依赖性抗原结合性质的抗原结合蛋白。在各种实施方式中，由如本申请所述的基因修饰的非人动物产生的抗原结合蛋白显示出增加的pH依赖性再循环效能和/或增加的血清半衰期。特别地，所述的发明在免疫球蛋白重链基因座中使用基因修饰以便将组氨酸密码子引入人源重链可变区核苷酸序列，并且任选地在编码CH2和/或CH3结构域的恒定区核苷酸序列中引入突变，其增加抗体恒定区与FcRn受体的结合，这促进了抗原结合蛋白的再循环。与细胞外环境中或在细胞表面上(即在生理pH下，例如pH范围约7.0至约7.4)相比含有所述修饰的抗原结合蛋白在酸性细胞内隔室中(例如在内涵体中，其pH范围约5.5至约6.0)可以更加松散地结合其靶点，因为质子化的组氨酸残基位于抗原结合位点中。因此，在靶点介导的内吞作用后，与不包含这种基因修饰的野生型抗原结合蛋白相比，包含如本申请中所述的基因修饰的抗原结合蛋白将能够更加迅速或有效地再循环。而且，由于经修饰的组氨酸残基仅在酸性环境而非中性pH中质子化，因而预计这种修饰将不会影响抗原结合蛋白与目的抗原在生理pH下的结合亲和性和/或特异性。
在各种方面，本申请提供了非人动物，所述非人动物包含免疫球蛋白重链基因座，所述基因座包含未经重排的人源重链可变区核苷酸序列，其中所述未经重排的人源重链可变区核苷酸序列包含加入至少一个组氨酸密码子或使用组氨酸密码子取代至少一个内源性非组氨酸密码子。
在各种方面，本申请还提供了制备和使用非人动物的方法。当使用目的抗原免疫时，所述基因修饰的非人动物能够产生B细胞群，所述B细胞群产生包含具有组氨酸残基的重链可变结构域的抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白显示出增加的pH依赖性再循环和/或增加的血清半衰期。在各种实施方式中，所述非人动物产生B细胞群，所述B细胞群表达人源重链可变结构域以及同源的人源轻链可变结构域。在各种实施方式中，所述基因修饰的免疫球蛋白重链基因座存在于非人动物的种系基因组中。
在各种实施方式中，所述基因修饰的免疫球蛋白重链基因座包含修饰，所述修饰使得全部或基本上全部内源性VH、D和JH基因区段缺失或不具有功能；并且所述基因修饰的基因座包含未经重排的重链可变区核苷酸序列，所述核苷酸序列包含具有一个或多个组氨酸密码子的一个或多个人源VH、D和/或JH基因区段，其中所述未经重排的重链可变区核苷酸序列存在于内源性基因座(即所述核苷酸序列位于野生型非人动物中)或存在于异位(即在其基因组的不同于内源性免疫球蛋白链基因座的位置，或在其内源性基因座中，例如在免疫球蛋白可变基因座中，其中所述内源性基因座位于或被移至基因组中的不同位置)。在一个实施方式中，例如约80％或更多的、约85％或更多的、约90％或更多的、约95％或更多的、约96％或更多的、约97％或更多的、约98％或更多的或者约99％或更多的全部内源性重链V、D或J基因区段缺失或使其不具有功能。在一个实施方式中，例如至少95％、96％、97％、98％或99％的内源性具有功能的重链V、D或J基因区段缺失或使其不具有功能。
在一个实施方式中，所述非人动物是哺乳动物。尽管在本申请中广泛讨论了将组氨酸密码子引入小鼠中未经重排的人源重链可变基因序列的实施方式，但是本申请还提供了其他非人动物，所述非人动物包含基因修饰的免疫球蛋白基因座，所述基因座含有未经重排的人源重链可变区核苷酸序列，所述核苷酸序列含有加入至少一个组氨酸密码子或使用组氨酸密码子取代至少一个内源性非组氨酸密码子。这种非人动物包括能够被基因修饰以表达如本申请所公开的含有组氨酸重链可变结构域的那些中的任意一个，包括例如小鼠、大鼠、家兔、猪、牛(例如奶牛、公牛、水牛)、鹿、绵羊、山羊、鸡、猫、犬、雪貂、灵长类(例如狨猴、恒河猴)等。例如，对于那些适宜的可基因修饰的ES细胞不易获得的非人动物而言，使用其他方法制备包含所述基因修饰的非人动物。此类方法包括例如修饰非ES细胞基因组(例如成纤维细胞或诱导性多能干细胞)并且使用体细胞核转移(SCNT)将经基因修饰的基因组转移至适宜细胞，例如将卵母细胞去核，并在适宜条件下在非人动物中妊娠所述经修饰的细胞(例如所述经修饰的卵母细胞)以形成胚胎。用于修饰非人动物基因组(例如猪、奶牛、啮齿动物、鸡等基因组)的方法包括例如使用锌指核酸酶(ZFN)或转录激活因子样效应器核酸酶(TALEN)修饰基因组以包括。
在一个实施方式中，所述非人动物是小型哺乳动物，例如跳鼠科(Dipodoidea)或鼠科(Muroidea)总科的。在一个实施方式中，所述基因修饰的动物是啮齿动物。在一个实施方式中，所述啮齿动物选自小鼠、大鼠和仓鼠。在一个实施方式中，所述啮齿动物选自鼠科总科。在一个实施方式中，所经基因修饰的动物选自下述的科：丽仓鼠科(Calomyscidae)(例如小鼠样仓鼠)、仓鼠科(Cricetidae)(例如仓鼠、新世界大鼠和小鼠、田鼠)、鼠科(Muridae)(真小鼠和大鼠、沙鼠、多刺鼠、黄冠鼠)、马岛鼠科(Nesomyidae)(攀鼠、岩鼠、白尾大鼠、马达加斯加大鼠和小鼠)、刺山鼠科(Platacanthomyidae)(例如多刺睡鼠)和鼹形鼠科(Spalacidae)(例如鼹鼠、竹鼠和鼢鼠)。在一个特定的实施方式中，所述基因修饰的啮齿动物选自真小鼠或大鼠(鼠科)、沙鼠、多刺小鼠和黄冠鼠。在一个实施方式中，所述基因修饰的小鼠来自鼠科成员。在一个实施方式中，所述动物是啮齿动物。在一个特定的实施方式中，所述啮齿动物选自小鼠和大鼠。在一个实施方式中，所述非人动物是小鼠。
在一个实施方式中，所述非人动物是啮齿动物，所述啮齿动物是选自下述的C57BL品系的小鼠：C57BL/A、C57BL/An、C57BL/GrFa、C57BL/KaLwN、C57BL/6、C57BL/6J、C57BL/6ByJ、C57BL/6N、C57BL/6NJ、C57BL/10、C57BL/10ScSn、C57BL/10Cr和C57BL/Ola。在另一个实施方式中，所述小鼠是129品系。在一个实施方式中，所述129品系选自下组：129P1、129P2、129P3、129X1、129S1(例如129S1/SV、129S1/SvIm)、129S2、129S4、129S5、129S9/SvEvH、129S6(129/SvEvTac)、129S7、129S8、129T1、129T2(参见例如Festing等，(1999)Revised nomenclature for strain 129mice(129小鼠品系经修订的命名法),MammalianGenome 10:836，亦参见Auerbach等，(2000)Establishment and Chimera Analysis of129/SvEv-and C57BL/6-Derived Mouse Embryonic Stem Cell Lines(129/SvEv-和C57BL/6-来源的小鼠胚胎干细胞系的建立和嵌合体分析))。在一个实施方式中，所述基因修饰的小鼠是前述129品系和前述C57BL品系(例如C57BL/6品系)的混合物。在另一个实施方式中，所述小鼠是前述129品系的混合物，或前述C57BL/6品系的混合物。在一个实施方式中，所述混合物中的129品系是129S6(129/SvEvTac)品系。在另一个实施方式中，所述小鼠是129/SvEv-和C57BL/6-来源品系的混合物。在一个特定的实施方式中，所述小鼠是在如Auerbach等2000BioTechniques 29:1024-1032中所述的129/SvEv-和C57BL/6-来源品系的混合物。在另一个实施方式中，所述小鼠是BALB品系，例如BALB/c品系。在另一个实施方式中，所述小鼠是BALB品系(例如BALB/c品系)和另一种前述品系的混合物。
在一个实施方式中，所述非人动物是大鼠。在一个实施方式中，所述大鼠选自Wistar大鼠、LEA品系、Sprague Dawley大鼠、Fischer品系、F344、F6和Dark Agouti。在一个实施方式中，所述大鼠品系是两种或多种选自下组的品系的混合物：Wistar、LEA、SpragueDawley、Fischer、F344、F6和Dark Agouti。
在一个实施方式中，所述非人动物是小鼠。在一个实施方式中，所述小鼠是人源化小鼠。
人源化小鼠(参见例如US 6,596,541、US 7,105,348和US20120322108A1)，其含有使用人源免疫球蛋白可变区在内源性小鼠基因座对小鼠免疫球蛋白可变区的精确取代，其在B细胞发育方面显示出与野生型小鼠令人吃惊的和显著的相似性。人源化小鼠对免疫显示出基本正常的野生型应答，其仅在一个方面与野生型小鼠显著不同——其免疫应答产生的可变区是全人源的。
人源化小鼠含有使用相应的人源免疫球蛋白可变区核苷酸序列在内源性基因座对小鼠免疫球蛋白重链(IgH)和免疫球蛋白轻链(例如κ轻链，Igκ)种系可变区核苷酸序列的精确的、大规模的取代(参见例如US 6,596,541、US 7,105,348、US20120322108A1)。总体而言，约6百万碱基的小鼠基因座被约1.5百万碱基的人源基因组序列取代。该精确的取代使得小鼠具有杂交的免疫球蛋白基因座，其使得重链和轻链具有人源可变区和小鼠恒定区。小鼠VH-D-JH和Vκ-Jκ区段的精确取代在杂交的免疫球蛋白基因组保留了翼侧小鼠序列的完整性和功能。所述小鼠体液免疫系统的功能与野生型小鼠类似。所述小鼠的B细胞发育没有受到任何明显的阻碍并且在抗原攻击后在小鼠中产生丰富的人源可变区多样性。
人源化小鼠是可能的，因为在人和小鼠中用于重链和κ轻链重排的免疫球蛋白基因区段具有相似性，这并不是说其基因座是相同的或甚至几乎如此——显然它们不是。然而，所述基因座足够相似，可以通过使用基本上覆盖人源免疫球蛋白基因座的等效序列的约1百万个碱基的相邻的人源基因组序列取代含有全部VH、D和JH基因区段的约3百万个碱基对的相邻的小鼠序列实现所述重链可变基因座的人源化。
在一些实施方式中，使用人源恒定区核苷酸序列对某些小鼠恒定区核苷酸序列的进一步取代(例如使用人源重链CH1核苷酸序列取代小鼠重链CH1核苷酸序列，和使用人源轻链恒定区核苷酸序列取代小鼠轻链恒定区核苷酸序列)得到具有杂交的免疫球蛋白基因座的小鼠，所述小鼠制备具有人源可变区和部分人源恒定区的抗体，其适于例如制备全人源抗体片段，例如全人源Fab’s。具有杂交的免疫球蛋白基因座的小鼠显示出正常的可变基因区段重排，正常的体细胞高突变频率和正常的类别转换。这些小鼠显示出与野生型小鼠没有区别的体液免疫系统，并且在B细胞发育的所有阶段均显示出正常的细胞群和正常的淋巴器官结构——即使是缺乏完整的人源可变区核苷酸区段库的小鼠。免疫这些小鼠导致显示出具有广泛多样性的可变基因区段的使用的强大的体液应答。
对小鼠种系可变区核苷酸序列的精确取代使得制备得到具有部分人源免疫球蛋白基因座的小鼠。由于部分人源免疫球蛋白基因座正常地重排、高突变和类别转换，因而所述部分人源免疫球蛋白基因座在小鼠中产生包含人源可变区的抗体。编码所述可变区的核苷酸序列能够被鉴定和克隆，然后与所选择的任意序列例如适用于特定用途的任意免疫球蛋白同种型融合(例如在体外系统中)，结果得到全部来源于人源序列的抗体或抗原结合蛋白。
在各种实施方式中，至少一个组氨酸密码子存在于编码N-末端区、环4区、CDR1、CDR2、CDR3或其组合的未经重排的重链可变区核苷酸序列中。
在各种实施方式中，至少一个组氨酸密码子存在于编码选自下组的框架区(FR)的未经重排的重链可变区核苷酸序列中：FR1、FR2、FR3和FR4。
在各种方面，所述基因修饰的免疫球蛋白基因座包含其中至少一个密码子被组氨酸密码子取代的核苷酸序列。
在各种方面，所述基因修饰的免疫球蛋白基因座包含未经重排的人源重链可变区核苷酸序列，所述核苷酸序列包含使用组氨酸密码子取代至少一个内源性非组氨酸密码子。
在一个实施方式中，使用组氨酸密码子取代2个或更多个、3个或更多个、4个或更多个、5个或更多个、6个或更多个、7个或更多个、8个或更多个、9个或更多个、10个或更多个、11个或更多个、12个或更多个、13个或更多个、14个或更多个、15个或更多个、16个或更多个、17个或更多个、18个或更多个、19个或更多个、20个或更多个、21个或更多个、22个或更多个、23个或更多个、24个或更多个、25个或更多个、26个或更多个、27个或更多个、28个或更多个、29个或更多个、30个或更多个、31个或更多个、32个或更多个、33个或更多个、34个或更多个、35个或更多个、36个或更多个、37个或更多个、38个或更多个、39个或更多个、40个或更多个、41个或更多个、42个或更多个、43个或更多个、44个或更多个、45个或更多个、46个或更多个、47个或更多个、48个或更多个、49个或更多个、50个或更多个、51个或更多个、52个或更多个、53个或更多个、54个或更多个、55个或更多个、56个或更多个、57个或更多个、58个或更多个、59个或更多个、60个或更多个或者61个或更多个内源性非组氨酸密码子。
此前对人源免疫球蛋白D基因区段的阅读框架使用情况的研究显示，三个阅读框架(例如终止、疏水性和亲水性阅读框架)中，终止框架的使用非常不频繁。显然，一些终止框架被损坏并导致表达。然而，由于终止阅读框架在用于工程改造组氨酸密码子的目的时其使用的频率如此之低，因而不使用终止阅读框架是更有效的。在亲水性和疏水性阅读框架之间，亲水性阅读框架似乎是优选的。因而，在一个实施方式中，对人源D基因区段的亲水性阅读框架进行工程改造以使其含有一个或多个组氨酸密码子(与终止框架或疏水性框架相比)。
在体外引入突变的方法例如定点诱变是本领域公知的。在所述发明的一些实施方式中，通过在硅片上设计组氨酸取代的人源D基因区段(例如将Y、D和N密码子突变为H密码子，例如CAT、CAC)使其富含组氨酸密码子，使用用于将其再连接在一起的(独特)限制性内切酶位点将其合成(例如化学合成)。使用上游和下游适宜的重组信号序列(RSS)制备所合成的D基因区段。在一个实施方式中，当彼此连接时，所合成的组氨酸取代的D基因区段包括在各人源D基因区段之间出现的基因间序列。
应理解编码所述一个或多个组氨酸的密码子在重排和/或体细胞高突变后可以改变，以使得一个或多个组氨酸变成其他氨基酸。然而，这可能不发生在非人动物中的每次重排中的每个编码组氨酸的密码子上。如果这种改变发生，则所述改变可能发生在一些但不是全部的B细胞上或在一些但不是全部的重链可变序列上。
在各种方面，所述基因修饰的免疫球蛋白基因座包含人源重链V、D和J基因区段，其中至少一个所述人源D基因区段相对于相应的野生型序列已被5’至3’反转，并且其中至少一个反转的人源D基因区段的阅读框架包含组氨酸密码子。
在各种实施方式中，所述核苷酸序列包含1个或更多个、2个或更多个、3个或更多个、4个或更多个、5个或更多个、6个或更多个、7个或更多个、8个或更多个、9个或更多个、10个或更多个、11个或更多个、12个或更多个、13个或更多个、14个或更多个、15个或更多个、16个或更多个、17个或更多个、18个或更多个、19个或更多个、20个或更多个、21个或更多个、22个或更多个、23个或更多个、24个或更多个或者25个或更多个组氨酸密码子。
有25个具有功能的人源D基因区段在6个家族中，每个家族有3-5个成员(有1个家族D7家族具有一个成员)。人源D基因区段的直接重组比反向具有更高的频率，尽管反转阅读框架显示出更多的组氨酸密码子。某些D基因区段和阅读框架比其他的使用更加频繁。针对所有具有功能的D基因区段的全部三个正向阅读框架和全部三个反转阅读框架见图10A-10E。如图10A-10E所示，与正向阅读框架相比，在反转阅读框架中具有更多的组氨酸密码子。更具体地，在反转阅读框架中有34个组氨酸，在正向阅读框架中仅有4个。此外，在4个正向阅读框架中，有三个组氨酸由假基因编码或存在于替代等位基因中。因此，种系人源D基因区段仅有一个正向阅读框架含有组氨酸密码子，更多的组氨酸密码子可能出现在替代等位基因中(可能在人群子集中)。
反转的D重排极为罕见。Tuaillon等(J.Immunol.,154(12):5453-6465)发现反转阅读框架的使用非常罕见(通过有限稀释PCT测定)，即在大多数情况下正向与反向重排的比例为10至1000。就正向与反向重排的比例较低的问题而言，其仅在显示出极低使用情况的那些D区段中观察到。还发现D基因区段家族7，其位于与J1相邻(远离其他D家族成员)主要在胎儿中使用，但是在成人中显示出较低的使用情况(Schroeder等，Immunology 30,2006,119-135)。因此，在一个实施方式中，D家族7序列不是5’至3’反转的。
在一个实施方式中，至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个、至少24个或者全部或基本上全部的人源具有功能的D基因序列相对于相应的野生型序列是5’至3’反转的。
在一个实施方式中，所述人源免疫球蛋白重链可变结构域包含至少一个显示出pH依赖性抗原结合特性的非天然存在的组氨酸残基。例如，包含所述经修饰的免疫球蛋白重链可变结构域的抗体在约中性pH下(例如pH约7.0至约7.4)以充足的亲和性与靶点结合，而在酸性pH下(例如pH约5.5至约6.0)其与相同的靶点不结合或结合减弱。在一个实施方式中，所述酸性pH选自约5.5、约5.6、约5.7、约5.8、约5.9和约6.0。在一个实施方式中，所述中性pH选自约7.0、约7.1、约7.2、约7.3和约7.4。
在一个实施方式中，由如本申请所述的基因修饰的免疫球蛋白重链基因座表达的含有重链可变结构域的抗原结合蛋白在25℃下在酸性pH下(例如pH约5.5至约6.0)具有的解离半衰期(t1/2)短于2min。在一个实施方式中，由如本申请所述的基因修饰的免疫球蛋白重链基因座表达的含有重链可变结构域的抗原结合蛋白在37℃下在酸性pH下(例如pH约5.5至约6.0)具有的解离半衰期(t1/2)短于2min。在一个实施方式中，由如本申请所述的基因修饰的免疫球蛋白重链基因座表达的含有重链可变结构域的抗原结合蛋白在25℃下在酸性pH下(例如pH约5.5至约6.0)具有的解离半衰期(t1/2)短于1min。在一个实施方式中，由如本申请所述的基因修饰的免疫球蛋白重链基因座表达的含有重链可变结构域的抗原结合蛋白在37℃下在酸性pH下(例如pH约5.5至约6.0)具有的解离半衰期(t1/2)短于1min。在一个实施方式中，由如本申请所述的经基因修饰的免疫球蛋白重链基因座表达的含有重链可变结构域的抗原结合蛋白在酸性pH下(例如pH约5.5至约6.0)的解离半衰期(t1/2)比所述抗原结合蛋白在中性pH下(例如pH约7.0至约7.4)的解离半衰期(t1/2)降低至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约10倍、至少约15倍、至少约20倍、至少约25倍或至少约30倍。
在一个实施方式中，包含基因修饰的人源免疫球蛋白重链可变结构域的抗原结合蛋白能够在中性或生理pH下(pH约7.0至约7.4)以低于10-6、10-7、10-8、10-9或10-10、10-11、10-12的亲和性(KD)与目的抗原特异性结合。
在酸性pH下(例如pH约5.5至约6.0)所述免疫球蛋白重链可变结构域改变的结合性质将在一些情况下允许抗体更迅速的周转，因为与细胞表面上的靶点结合的治疗性抗体将被内化进入内涵体，并且在内涵体中更容易或更迅速地从靶点上解离，以使得治疗剂能被再循环以结合在另一个细胞上存在的另一个靶分子。这将导致能够以较低的剂量给予治疗性抗体，或者以较少的频率给予治疗抗体。这对于不希望频繁给予治疗性抗体或者给药超过一定剂量会导致安全性或毒性问题的情况是特别有用的。
在各种实施方式中，如本申请所述的人源免疫球蛋白重链可变区核苷酸序列与人源或非人源重链恒定区核苷酸序列(例如编码选自IgM、IgD、IgG、IgE和IgA的免疫球蛋白同种型的重链恒定区核苷酸序列)可操作地连接。在各种实施方式中，所述人源或非人源重链恒定区核苷酸序列选自下组：CH1、铰链、CH2、CH3及其组合。在一个实施方式中，所述恒定区核苷酸序列包含CH1、铰链、CH2和CH3(例如CH1-铰链-CH2-CH3).
在各种实施方式中，所述重链恒定区核苷酸序列存在于内源性基因座(即所述核苷酸序列位于野生型非人动物中)或存在于异位(例如，在其基因组的不同于内源性免疫球蛋白链基因座的位置，或在其内源性基因座中，例如在免疫球蛋白可变基因座中，其中所述内源性基因座位于或被移至基因组中的不同位置)。
在一个实施方式中，所述重链恒定区核苷酸序列包含在CH2或CH3中的修饰，其中所述修饰增加所述重链恒定区氨基酸序列在酸性环境中(例如在内涵体中，其中pH范围约5.5至约6.0)与FcRn的亲和性。
针对IgG的新生儿Fc受体(FcRn)已在由母体通过胎盘和近端小肠向其胎儿转移的被动体液免疫中被很好地表征(Roopenian,D.和Akilesh,S.,Nat.Rev.Immun.,2007,7:715-725)。FcRn在不同于启动经典的补体活化途径的经典FcγR或补体C1q组分结合位点的位点与IgG的Fc部分结合。更具体地，其表明FcRn结合IgG抗体的CH2-CH3铰链区——通用的Fc区，其还与金黄色葡萄球菌蛋白A、链球菌蛋白G和类风湿因子结合。然而，与其他Fc结合蛋白不同，FcRn以严格的pH依赖性方式与IgG的Fc区结合；在生理条件下的pH 7.4时，FcRn不结合IgG，而在内涵体的酸性pH下(例如pH范围约5.5至约6.0)，FcRn针对IgG的Fc区显示出较低微摩至纳摩的亲和性。已发现这种pH依赖性相互作用由在IgG的CH2-CH3区中组氨酸残基的滴度及其随后与FcRn表面上的酸性残基的相互作用所介导(Roopenian,D.和Akilesh,S.,Nat.Rev.Immun.,2007,7:715-725)。
在IgG的CH2-CH3区中能够增加在酸性pH下Fc区与FcRn的亲和性的多种突变是本领域所公知的。这些包括但不限于在位置250(例如E或Q)；250和428(例如L或F)；252(例如L/Y/F/W或T)、254(例如S或T)和256(例如S/R/Q/E/D或T)的修饰；或在位置428和/或433(例如L/R/S/P/Q或K)和/或434(例如H/F或Y)的修饰；或在位置250和/或428的修饰；或在位置307或308(例如308F、V308F)和434的修饰。在另一个实施例中，所述修饰可以包含428L(例如M428L)和434S(例如N434S)修饰；428L、259I(例如V259I)和308F(例如V308F)修饰；433K(例如H433K)和434(例如434Y)修饰；252、254和256(例如52Y、254T和256E)修饰；250Q和428L修饰或其组合。
在一个实施方式中，所述重链恒定区核苷酸序列编码人源CH2氨基酸序列，所述氨基酸序列包含在位置252和257的氨基酸残基之间的至少一个修饰，其中所述修饰在酸性环境中(例如在内涵体中，其pH范围约5.5至约6.0)增加所述人源CH2氨基酸序列对FcRn的亲和性。
在一个实施方式中，所述重链恒定区核苷酸序列编码人源CH2氨基酸序列，所述氨基酸序列包含在位置307和311的氨基酸残基之间的至少一个修饰，其中所述修饰在酸性环境中(例如在内涵体中，其pH范围约5.5至约6.0)增加所述人源CH2氨基酸序列对FcRn的亲和性。
在一个实施方式中，所述重链恒定区核苷酸序列编码人源CH3氨基酸序列，所述CH3氨基酸序列包含在位置433和436的氨基酸残基之间的至少一个修饰，其中所述修饰在酸性环境中(例如在内涵体中，其pH范围约5.5至约6.0)增加所述CH3氨基酸序列对FcRn的亲和性。
在一个实施方式中，由如本申请所述的重链恒定区核苷酸序列编码的所述人源重链恒定区氨基酸序列包含选自下组的突变：M428L、N434S及其组合。在一个实施方式中，所述人源恒定区氨基酸序列包含选自下组的突变：M428L、V259I、V308F及其组合。在一个实施方式中，所述人源恒定区氨基酸序列包含N434A突变。在一个实施方式中，所述人源恒定区氨基酸序列包含选自下组的突变：M252Y、S254T、T256E及其组合。在一个实施方式中，所述人源恒定区氨基酸序列包含选自下组的突变：T250Q、M248L或这两者。在一个实施方式中，所述人源恒定区氨基酸序列包含选自下组的突变：H433K、N434Y或这两者。
在一个实施方式中，所述重链恒定区氨基酸序列是非人源恒定区氨基酸序列，并且所述重链恒定区氨基酸序列包含上文所述的任意类型修饰的一种或多种。
在一个实施方式中，所述重链恒定区核苷酸序列是人源重链恒定区氨基酸序列，并且所述人源重链恒定区氨基酸序列包含上文所述的任意类型修饰的一种或多种。
在免疫球蛋白轻链基因中经工程改造的组氨酸残基
在各种实施方式中，本申请提供了基因修饰的非人动物(例如哺乳动物，例如小鼠、大鼠、家兔等)，所述非人动物在其基因组例如在其种系中包含编码显示出pH依赖性抗原结合的人源抗体分子的核苷酸序列，例如包含重排的人源免疫球蛋白轻链可变区序列的免疫球蛋白轻链的核苷酸序列，所述核苷酸序列编码显示出pH依赖性抗原结合的抗体；包含其的胚胎、细胞和组织；制备其的方法；以及使用其的方法。
发明人发现能够通过在轻链序列的一个或多个位置修饰免疫球蛋白轻链可变区制备非人动物，所述非人动物表达能够以pH依赖的方式与抗原结合的抗体。本申请描述了在非人动物的种系中进行修饰以使得所述动物在抗体的CDR中表达组氨酸的方法。特别地，本申请描述了在小鼠种系中的免疫球蛋白轻链可变序列中进行修饰的方法。例如轻链的可变区序列通常在可变区序列显示出体细胞高突变，并且在一些情况下，这种突变能够导致组氨酸残基的取代(参见例如图15)。这种突变甚至能够发生在互补性决定区(CDR)，该区域是负责抗原结合的可变结构域的区域。在一些情况下，这种突变能够导致抗体显示出pH依赖性抗原结合，例如与在中性pH下的抗原结合相比在酸性pH下抗原结合降低。这种pH依赖性抗原结合是理想的，因为其能够使抗体在细胞外与抗原结合，并且当内化进入内涵体时，释放抗原并循环回表面与其他抗原结合，以避免靶点介导的清除。通过使用随机his扫描诱变以实现这种作用引入组氨酸残基的方法在抗-IL-6R抗体中工程化改造生成pH依赖的结合性质已被报道(US 2011/0111406 A1)。然而，抗体残基的随机诱变可能导致抗体与抗原亲和性的降低。对非人动物基因修饰以便在抗体序列中表达组氨酸取代能够生成对目的抗原生成应答的高亲和性抗体，因为组氨酸修饰也将显示出pH依赖性的抗原结合。
因此，在各种实施方式中，本申请提供了一种基因修饰的非人动物(例如啮齿动物，例如小鼠或大鼠)，所述非人动物在其基因组例如在其种系中包含含有修饰的人源免疫球蛋白轻链可变区序列，以使得在动物表达的抗体中能够以pH依赖的方式与抗原结合。在一个实施方式中，所述非人动物包含在人源免疫球蛋白轻链可变区序列(例如VL和/或JL区段序列)中的修饰，所述修饰包含在至少一个非组氨酸密码子被组氨酸密码子的取代(在一些情况下，也可以称为“组氨酸取代”，“组氨酸密码子取代”等)。在一个实施方式中，所述动物包含在人源免疫球蛋白轻链互补性决定区(CDR；例如CDR1、CDR2和/或CDR3)的核苷酸序列中至少一个非组氨酸密码子被组氨酸密码子的取代。在一个实施方式中，所述取代在CDR3密码子中。在一个实施方式中，所述轻链是κ轻链。在一个实施方式中，所述动物表达免疫球蛋白轻链，例如轻链CDR，例如轻链CDR3，其包含至少一个氨基酸被组氨酸的取代。在另一个实施方式中，所述轻链是λ轻链。在有一个实施方式中，所述小鼠在κ和λ轻链中包含至少一个非组氨酸密码子被组氨酸密码子的取代。
组氨酸残基由两种不同的密码子CAT和CAC编码(脱氧核糖核酸残基)。因此，非组氨酸密码子可以被CAT或CAC取代。所述取代是在其种系配置(即非体细胞突变的状态)中的密码子中进行工程改造，所述密码子不编码组氨酸残基。
在一个实施方式中，轻链是通用轻链(也称为共有轻链)。如在美国专利申请号13/022,759、13/093,156、13/412,936和13/488,628(美国专利申请公开号2011/0195454、2012/0021409、2012/0192300和2013/0045492)中所述，选择针对多种重链的共有轻链的非人动物(例如小鼠)具有实用价值。在各种实施方式中，在非人动物中表达的仅含有共有轻链的抗体将具有能够与相同或基本相同的轻链结合和表达的重链。这在制备双特异性抗体中特别有用。例如，可以使用第一免疫原对这种动物进行免疫以生成表达特异性与第一表位结合的抗体的B细胞。可以使用第二免疫原对所述动物(或基因相同的动物)进行免疫以生成表达特异性与第二表位结合的抗体的B细胞。可以由所述B细胞克隆可变重链区并且在细胞中与相同的重链恒定区和相同的轻链(例如共有轻链)表达以制备双特异性抗体，其中所述双特异性抗体的重链组分已由动物选择以便与相同的轻链组分结合和表达。在所述的各种实施方式中，基因工程改造小鼠的可变区是人源可变区。
因此，经过工程改造的小鼠能够生成将适于与相当多样的重链家族配对的免疫球蛋白轻链，包括其人源可变区分离自种系序列的重链，例如亲和性成熟或体细胞突变的可变区。在各种实施方式中，所述小鼠被设计为使人源轻链可变结构域与包含体细胞突变的人源重链可变结构域配对，从而使获得适用于人用疗法的高亲和性结合蛋白的途径成为可能。
基因工程小鼠，通过在生物体内的长期和复杂的抗体选择过程，在人源重链可变结构域与有限数量的人源轻链选择的配对多样性收集方面做出了生物学适宜的选择。为了达到这个目的，将小鼠进行工程改造以使其存在有限数量的人源轻链可变结构域选择与广泛多样的人源重链可变结构域选择的结合。当使用免疫原刺激时，所述小鼠将其库中解决方案的数量最大化以发展针对免疫原的抗体，其主要或单独受限于其库中的数量或轻链的选择。在各种实施方式中，这包括使小鼠获得适宜的和相容的轻链可变结构域的体细胞突变，尽管如此其将与相对种类较多的人源重链可变结构域具有相容性，包括特别是体细胞突变的人源重链可变结构域。
在美国专利公开号2011/0195454、2012/0021409、2012/0192300和2013/0045492中描述了工程改造的共有轻链小鼠，所述小鼠包含编码有限的轻链选择库的核酸序列，例如共有或通用轻链“ULC”，其包含不超过两个VL区段或单一重排的人源免疫球蛋白轻链可变区序列。为获得这种有限的库，对小鼠进行工程改造以使其不具有或基本上不具有制备或重排天然的小鼠轻链可变结构域的能力。在一个方面，这通过例如缺失小鼠的轻链可变区基因区段实现。如此前所描述的，然后通过选择外源性适宜的人源轻链可变区基因区段，将其与所述内源性小鼠轻链恒定结构域可操作地连接可以对所述内源性小鼠基因座进行修饰，所述连接以一种方式以使得所述外源性人源可变区基因区段能够与所述内源性小鼠轻链恒定区基因组合并且形成重排的反向嵌合的轻链基因(人源可变区，小鼠恒定区)进行。在各种实施方式中，所述轻链可变区是能够体细胞突变的。在各种实施方式中，为使所述轻链可变区获得体细胞突变的能量最大化，在小鼠中保留适宜的增强子。在一个方面，在修饰小鼠κ轻链基因座以使用人源κ轻链基因区段取代内源性小鼠κ轻链基因区段中，所述小鼠的κ内含子增强子和小鼠κ3’增强子被具有功能的保持或不被破坏。
因此，本申请提供了一种基因工程小鼠，所述小鼠表达有限的反向嵌合(人源可变区，小鼠恒定区)轻链库与多样的反向嵌合(人源可变区，小鼠恒定区)重链结合。在各种实施方式中，所述内源性小鼠κ轻链基因区段缺失并且使用单一(或两个)重排的人源轻链区取代，其与内源性小鼠Cκ基因可操作地连接。在最大化所述重排的人源轻链区的体细胞高突变的实施方式中，所述小鼠的κ内含子增强子和所述小鼠的κ3’增强子被保留。在各种实施方式中，所述小鼠还包含不具有功能的λ轻链基因座或将其缺失，或包含使所述基因座不能生成λ轻链的缺失。
通用轻链小鼠针对各种抗原生成的抗体能够利用多样的重链可变区序列库，所述重链可变区序列库含有多样的VH、DH和JH区段库。在这种基因工程ULC小鼠中生成的抗体在设计双特异性治疗性抗体中是有用的；然而，与任何其他抗体一样，各个双特异性抗体在其在血浆中的生命周期中仅可能与一个靶点结合；所述抗体内化进入内涵体并且靶向至溶酶体中降解。研究显示MHC-I类样Fcγ受体FcRn能够通过分选内涵体将其循环回细胞表面进而从溶酶体降解中挽救免疫球蛋白。Simister和Mostov(1989)An Fc receptorstructurally related to MHC class I antigens(在结构上与MHC I类抗原相关的Fc受体).Nature 337:184-87。如上文所解释的，为提高抗体循环的效率，对抗体序列进行进一步的修饰，例如使得在酸性pH下(例如内涵体的pH)的抗原结合降低，而在中性pH下(例如体液如血液的pH)保持抗体-抗原的亲和性和特异性的修饰是有益的。本申请所述的非人动物，其中在通用轻链序列中的组氨酸残基取代非组氨酸残基是有益的，因为其基于通用轻链形式能够生成的高亲和性抗体还显示出pH依赖性结合，例如在酸性pH下与在中性pH下相比显示出与抗原的结合降低。
因此，在一个实施方式中，本申请提供了一种非人动物(例如啮齿动物，例如小鼠或大鼠)，所述非人动物在其基因组例如在其种系中包含来自有限的人源轻链可变基因区段的有限的人源轻链可变区库或单一人源轻链可变区，其中所述人源轻链可变区包含至少一个非组氨酸密码子被组氨酸密码子的取代。在一些实施方式中，本申请提供了基因工程的非人动物，所述非人动物包含单一未经重排的人源轻链可变区基因区段(或两个人源轻链可变区基因区段)，所述基因区段重排以形成重排的人源轻链可变区基因(或两个重排的轻链可变区基因)，所述基因表达单一的轻链(或其表达一条或全部两条轻链)，其中所述轻链可变区基因包含至少一个非组氨酸密码子被组氨酸密码子的取代。由这些组氨酸取代的轻链可变区基因编码的重排的人源轻链可变结构域能够与由动物选择的多条亲和性突变的人源重链配对，其中所述重链可变区特异性地与不同表位结合。在各种实施方式中，所述至少一个非组氨酸残基被组氨酸残基的取代结果生成重排的人源轻链，当其与同源重链表达时，以pH依赖的方式与其抗原结合。
本申请提供了基因工程动物，所述动物由有限的人源轻链可变区基因序列库表达有限的人源轻链可变结构域库或单一的人源轻链可变结构域，其中所述可变区基因序列包含至少一个非组氨酸密码子被组氨酸密码子的取代。在一些实施方式中，本申请提供了基因工程动物，所述动物包含单一V/J人源轻链序列(或两个V/J序列)，所述序列包含至少一个非组氨酸密码子被组氨酸密码子的取代并表达单一轻链的可变区(或表达一个或全部两个可变区)。在一个方面，包含可变序列的轻链能够与由动物克隆选择的多个亲和性成熟的人源重链配对，其中所述重链可变区特异性地与不同表位结合。在一个实施方式中，所述抗体与其抗原以pH依赖性的方式结合。在一个实施方式中，所述单一V/J人源轻链序列选自Vκ1-39Jκ5和Vκ3-20Jκ1。在一个实施方式中，所述两个V/J序列是Vκ1-39Jκ5和Vκ3-20Jκ1。在一个实施方式中，所述Vκ1-39Jκ5和Vκ3-20Jκ1序列是重排的V/J序列。
在一个方面，本申请提供了基因修饰的非人动物，所述动物包含单一的人源免疫球蛋白轻链VL基因区段，所述基因区段能够与人源JL基因区段(选自一个或多个JL区段)重排并编码免疫球蛋白轻链的人源可变结构域，其中所述单一的人源免疫球蛋白轻链VL基因区段和/或人源JL基因区段包含至少一个非组氨酸密码子被组氨酸密码子的取代。在另一个方面，本申请提供了一种基因修饰的小鼠，所述小鼠包含不超过两个人源VL基因区段，其均能够与人源JL基因区段(选自一个或多个JL区段)重排并且编码免疫球蛋白轻链的人源可变结构域，其中不超过两个VL基因区段和/或JL基因区段均包含至少一个非组氨酸残基被组氨酸残基的取代。
本申请还提供了一种基因修饰的非人动物，所述非人动物在其基因组例如在其种系中包含单一重排的人源免疫球蛋白轻链可变区序列，所述序列包含人源VL和JL序列，其中所述单一重排的人源免疫球蛋白轻链可变区包含至少一个非组氨酸密码子被组氨酸密码子的取代。在一个方面，所述单一重排的人源免疫球蛋白轻链可变区序列来源于人源种系VL和JL基因序列，但是具有组氨酸取代。在一个实施方式中，所述人源免疫球蛋白轻链是人源免疫球蛋白κ链。因此，在一个实施方式中，所述人源VL基因序列选自Vκ1-39和Vκ3-20。在一个实施方式中，所述单一重排的人源免疫球蛋白轻链可变区序列包含重排的Vκ1-39/J或Vκ3-20/J序列。在一个实施方式中，所述人源JL基因序列选自Jκ1、Jκ2、Jκ3、Jκ4和Jκ5。在一个实施方式中，所述人源JL序列选自Jκ1和Jκ5。在一个实施方式中，所述单一重排的人源免疫球蛋白轻链可变区序列选自Vκ1-39Jκ5和Vκ3-20Jκ1(例如，但是具有组氨酸取代)。在一个替代实施方式中，所述人源免疫球蛋白轻链是人源λ链。
在一个实施方式中，所述至少一个非组氨酸密码子被组氨酸密码子的取代在编码轻链可变结构域的互补性决定区(CDR)的核苷酸序列中。在一个实施方式中，所述至少一个非组氨酸密码子被组氨酸密码子的取代在编码轻链可变结构域的CDR1、CDR2或CDR3的核苷酸序列中。在一个特定的实施方式中，所述取代在编码CDR3的核苷酸序列中。
在一个方面，所述取代是在人源轻链可变区基因序列的CDR3密码子中至少一个非组氨酸密码子被组氨酸密码子的取代。在一个实施方式中，所述取代是一个、两个、三个、四个或更多个CDR3密码子。在所述实施方式中，其中所述单一重排的人源免疫球蛋白轻链可变区是Vκ1-39Jκ5可变区，至少一个非组氨酸密码子被组氨酸密码子的取代包含在编码CDR3的免疫球蛋白轻链基因序列中的位置的取代，其被设计为在选自105、106、108、111及其组合的位置表达组氨酸。在一个实施方式中，所述取代被设计为在位置105和106表达组氨酸。在一个实施方式中，所述取代被设计为在位置105和111表达组氨酸。在一个实施方式中，所述取代被设计为在位置105和108表达组氨酸。在一个实施方式中，所述取代被设计为在位置105、108和111表达组氨酸。在一个实施方式中，所述取代被设计为在位置105、106和108表达组氨酸。在一个实施方式中，所述取代被设计为在位置106和108表达组氨酸。在一个实施方式中，所述取代被设计为在位置106和111表达组氨酸。在一个实施方式中，所述取代被设计为在位置108和111表达组氨酸。在一个实施方式中，所述取代被设计为在位置106、108和111表达组氨酸。在又一个实施方式中，所述取代被设计为在位置106、108和111表达组氨酸。在一个实施方式中，所述取代被设计为在位置105、106和111表达组氨酸。在一个实施方式中，所述取代被设计为在位置105、106、108和111表达组氨酸。组氨酸取代区的核酸和氨基酸序列在图16的序列比对中进行了描述并且如SEQ ID NO:327-357所示。
在所述实施方式中，其中所述单一重排的人源免疫球蛋白轻链可变区是Vκ3-20Jκ1可变区，至少一个非组氨酸密码子被组氨酸密码子的取代包含在编码CDR3的免疫球蛋白轻链基因序列中的位置的取代，其被设计为在选自105、106、107、109及其组合的位置表达组氨酸。在一个实施方式中，所述取代被设计为在位置105和106表达组氨酸。在一个实施方式中，所述取代被设计为在位置105和107表达组氨酸。在一个实施方式中，所述取代被设计为在位置105和109表达组氨酸。在一个实施方式中，所述取代被设计为在位置106和107表达组氨酸。在一个实施方式中，所述取代被设计为在位置106和109表达组氨酸。在一个实施方式中，所述取代被设计为在位置107和109表达组氨酸。在一个实施方式中，所述取代被设计为在位置105、106和107表达组氨酸。在一个实施方式中，所述取代被设计为在位置105、107和109表达组氨酸。在一个实施方式中，所述取代被设计为在位置106、108和111表达组氨酸。在一个实施方式中，所述取代被设计为在位置105、106和109表达组氨酸。在另一个实施方式中，所述取代被设计为在位置105、106、107和109表达组氨酸。示例性的组氨酸取代区的核酸和氨基酸序列在图27的序列比对中进行了描述并且如SEQ ID NO:398-403所示。
氨基酸位置(105、106等)基于Lefranc等，(2003)Dev.Comp.Immunol.27:55-77中描述的独特的编号，并且其也可见于www.imgt.org。
在一个实施方式中，所述人源VL基因区段与人源或非人源前导序列可操作地连接。在一个实施方式中，所述前导序列是非人源前导序列。在一个特定的实施方式中，所述非人源前导序列是小鼠Vκ3-7前导序列。在一个特定的实施方式中，所述前导序列与未经重排的人源VL基因区段可操作地连接。在一个特定的实施方式中，所述前导序列与重排的人源VL/JL序列可操作地连接。因此，在一个特定的实施方式中，包含至少一个组氨酸取代的单一重排的Vκ1-39/Jκ5或Vκ3-20/Jκ1可变区基因序列与小鼠Vκ3-7前导序列可操作地连接。
在一个实施方式中，所述VL基因区段与免疫球蛋白启动子序列可操作地连接。在一个实施方式中，所述启动子序列是人源启动子序列。在一个特定的实施方式中，所述人源免疫球蛋白启动子是人源Vκ3-15启动子。在一个特定的实施方式中，所述启动子与未经重排的人源VL基因区段可操作地连接。在一个特定的实施方式中，所述启动子与重排的人源VL/JL序列可操作地连接。因此，在一个特定的实施方式中，包含至少一个组氨酸取代的单一重排的Vκ1-39/Jκ5或Vκ3-20/Jκ1可变区基因序列与人源Vκ3-15启动子可操作地连接。
在一个实施方式中，所述轻链基因座包含5’翼侧(相对于VL基因区段的转录方向)为人源免疫球蛋白启动子和3’翼侧为人源VL基因区段的前导序列，所述人源VL基因区段使用人源JL区段重排并且编码反向嵌合轻链的可变结构域，所述反向嵌合轻链包含内源性非人源轻链恒定区(CL)。在一个特定的实施方式中，所述VL和JL基因区段在非人源Vκ基因座，并且所述非人源CL是非人源Cκ(例如小鼠Cκ)。在一个特定的实施方式中，所述可变区序列与非人源恒定区序列例如非人源Cκ基因序列可操作地连接。
在一个实施方式中，所述轻链基因座包含5’翼侧(相对于VL基因区段的转录方法)为人源免疫球蛋白启动子和3’翼侧为重排的人源可变区序列(VL/JL序列)的前导序列并且所述重排的人源可变区序列编码反向嵌合轻链的可变结构域，所述反向嵌合的轻链包含内源性非人源轻链恒定区(CL)。在一个特定的实施方式中，所述重排的人源VL/JL序列在非人源κ基因座，并且所述非人源CL是非人源Cκ。在一个特定的实施方式中，所述重排的人源可变区序列与所述非人源免疫球蛋白轻链恒定区序列例如非人源Cκ基因序列可操作地连接。在一个实施方式中，所述非人源免疫球蛋白轻链恒定区序列是内源性非人源序列。在一个实施方式中，所述非人动物是小鼠并且所述Cκ基因序列是小鼠Cκ基因序列。在一个实施方式中，所述重排的人源免疫球蛋白轻链可变区序列包含在内源性非人源(例如小鼠)免疫球蛋白轻链基因座(κ基因座)的至少一个非组氨酸密码子被组氨酸密码子的取代。所述基因座的示例性实施方式见图23C、23E、29C和29D。
在一个实施方式中，所述基因修饰的非人动物是小鼠，并且所述小鼠的可变区基因座是κ轻链基因座，并且所述κ轻链基因座包含小鼠内含子增强子、小鼠κ3’增强子或者内含子增强子和κ3’增强子两者。
在一个实施方式中，所述非人动物(例如啮齿动物，例如大鼠或小鼠)包含不具有功能的免疫球蛋白λ轻链基因座。在一个特定的实施方式中，所述λ轻链基因座包含所述基因座的一个或多个序列的缺失，其中所述一个或多个缺失使得所述λ轻链基因座不能重排以形成轻链基因。在另一个实施方式中，所述λ轻链的全部或基本上全部的VL基因区段缺失。在一个实施方式中，所述非人动物(例如啮齿动物，例如小鼠或大鼠)包含重排的人源免疫球蛋白轻链可变区序列，所述轻链可变区系列包含至少一个非组氨酸密码子被组氨酸密码子的取代，并且缺乏具有功能的未经重排的免疫球蛋白轻链可变区，例如内源性未经重排的轻链可变区。在一个实施方式中，所述重排的、组氨酸取代的人源免疫球蛋白轻链可变区基因序列取代内源性未经重排的免疫球蛋白轻链可变区基因序列。
在一个实施方式中，所述动物生成包含来源于人源可变区序列的体细胞突变的可变结构域的轻链，所述人源可变区序列包含至少一个非组氨酸密码子被组氨酸密码子的取代。在一个实施方式中，所述轻链包含来源于人源可变区序列的体细胞突变的可变结构域和非人源Cκ区，所述人源可变区序列包含至少一个非组氨酸密码子被组氨酸密码子的取代。在一个实施方式中，所述非人动物不表达λ轻链。
本领域技术人源将理解尽管将至少一个非组氨酸残基被组氨酸残基的取代基因工程改造进入人源免疫球蛋白轻链可变区，但是由于体细胞高突变，并不是在基因修饰的非人动物中生成的所有抗体均在工程改造的位置携带该组氨酸残基。然而，在非人动物中生成的广泛的抗体库将能够选择体内生成的对目的抗原具有高亲和性同时保留引入种系的组氨酸修饰的抗原特异性抗体，并且因此显示出pH依赖性抗原结合。
因此，在一个实施方式中，所述动物保留至少一个使用组氨酸取代非组氨酸。在一个实施方式中，所述动物在其引入其可变区基因的体细胞突变的轻链可变结构域中保留全部或基本上全部的组氨酸取代。
在一个实施方式中，本申请所述的基因修饰的非人动物在其基因组例如在其种系中还包含未经重排的免疫球蛋白重链可变区，所述未经重排的免疫球蛋白重链可变区包含VH、DH和JH基因区段序列。在一个实施方式中，所述VH、DH和JH基因区段是人源VH、DH和JH基因区段序列，并且所述未经重排的免疫球蛋白重链可变区是人源重链可变区。在一个实施方式中，所述人源VH、DH和JH基因区段序列与非人源重链恒定区序列可操作地连接。在一个实施方式中，所述非人源重链恒定区序列是内源性非人源重链恒定区序列。在一个实施方式中，所述人源重链基因区段序列在内源性非人源免疫球蛋白重链基因座。在一个实施方式中，在非人动物中包含的所述人源免疫球蛋白重链可变区序列还包含至少一个非组氨酸密码子被组氨酸密码子的取代。
在一个实施方式中，本申请所述的非人动物表达免疫球蛋白轻链，所述免疫球蛋白轻链包含非人源轻链恒定区序列。在一个实施方式中，所述非人动物表达免疫球蛋白轻链，所述免疫球蛋白轻链包含人源轻链恒定区序列。
在一个实施方式中，本申请所述的非人动物表达免疫球蛋白重链，所述免疫球蛋白重链包含选自下述的非人源序列：CH1序列、铰链序列、CH2序列、CH3序列及其组合。
在一个实施方式中，所述非人动物表达免疫球蛋白重链，所述免疫球蛋白重链包含选自下述的人源序列：CH1序列、铰链序列、CH2序列、CH3序列及其组合。
在所述实施方式中，所述动物包含单一重排的免疫球蛋白轻链可变区，所述免疫球蛋白轻链可变区包含至少一个非组氨酸密码子被组氨酸密码子取代，在所述动物种系中的重排的免疫球蛋白轻链序列在内源性非人源免疫球蛋白轻链基因座。在一个特定的实施方式中，在所述动物种系中包含至少一个非组氨酸密码子被组氨酸密码子取代的所述重排的免疫球蛋白轻链序列取代了在内源性非人源免疫球蛋白轻链基因座的全部或基本上全部的内源性非人源轻链V和J区段序列。
在一个实施方式中，所述非人动物包含内源性VH基因区段被一个活多个人源VH基因区段取代，其中所述人源VH基因区段与非人源CH区基因可操作地连接，以使得所述非人源动物重排所述人源VH基因区段并且表达包含人源VH结构域和非人源CH的反向嵌合免疫球蛋白重链。在一个实施方式中，90-100％的未经重排的非人源VH基因区段被至少一个未经重排的人源VH基因区段取代。在一个特定的实施方式中，全部或基本上全部(例如90-100％)的内源性非人源VH基因区段被至少一个未经重排的人源VH基因区段取代。在一个实施方式中，所述取代使用至少19个、至少39个或至少80或81个未经重排的人源VH基因区段。在一个实施方式中，所述取代使用至少12个具有功能的未经重排的人源VH基因区段、至少25个具有功能的未经重排的人源VH基因区段或至少43个具有功能的未经重排的人源VH基因区段。在一个实施方式中，所述非人动物包含全部非人源DH和JH区段被至少一个未经重排的人源DH区段和至少一个未经重排的人源JH区段取代。在一个实施方式中，所述非人动物包含全部非人源DH和JH区段被全部未经重排的人源DH区段和全部未经重排的人源JH区段取代。
一种非人动物例如小鼠，所述非人动物在其基因组中例如在其种系中包含有限的人源免疫球蛋白轻链可变区库，例如单一重排的人源免疫球蛋白轻链可变区(例如Vκ1-39/Jκ5或Vκ3-20/Jκ1)，其具有至少一个非组氨酸密码子被组氨酸密码子取代和多样性的未经重排的人源VH、DH和JH区段库，所述非人动物能够生成由来源于未经重排的人源VH、DH和JH区段的各种置换的重链可变区序列编码的抗原结合蛋白，其中所述VH、DH和JH区段存在于来源于所述动物的基因组中存在的全部或基本上全部具有功能的人源VH、DH和JH区段的重链可变序列中。本申请所述的基因修饰动物的细胞例如B细胞中表达的重链可变结构域序列的各种可用的可能性(即来源于各种具有功能的人源V、D和J区段的组合)如，美国专利申请公开号2011/0195454、2012/0021409、2012/0192300和2013/0045492中所述。在各种实施方式中，在所述非人动物的种系中包含重排的人源免疫球蛋白轻链可变区序列和未经重排的人源免疫球蛋白重链可变区序列，所述重排的人源免疫球蛋白轻链可变区序列包含至少一个非组氨酸密码子被组氨酸密码子取代。
在一个实施方式中，所述非人动物包含一个拷贝的一个或全部两个重排的人源免疫球蛋白轻链可变区序列和未经重排的人源免疫球蛋白重链可变区序列，所述重排的人源免疫球蛋白轻链可变区序列包含至少一个非组氨酸密码子被组氨酸密码子取代。在另一个实施方式中，所述非人动物包含两个拷贝的一个或全部两个重排的人源免疫球蛋白轻链可变区序列和未经重排的人源免疫球蛋白重链可变区序列，所述重排的人源免疫球蛋白轻链可变区序列包含至少一个非组氨酸密码子被组氨酸密码子取代。因此，所述非人动物针对一个或全部两个重排的人源免疫球蛋白轻链可变区序列和未经重排的人源免疫球蛋白重链可变区序列是纯合子或杂合子，所述重排的人源免疫球蛋白轻链可变区序列包含至少一个非组氨酸密码子被组氨酸密码子取代。
除了在其基因组中包含免疫球蛋白轻链可变区序列(例如单一重排的免疫球蛋白轻链可变区基因序列)的基因修饰的非人动物以外，所述免疫球蛋白轻链可变区基因序列包含至少一个非组氨酸密码子被组氨酸密码子取代(例如在轻链的CDR3中)，本申请还提供了一种基因修饰的非人动物，所述非人动物包含具有一个或多个组氨酸密码子添加的免疫球蛋白轻链可变区基因序列，以使得所表达的可变结构域包含附加的氨基酸，所述氨基酸如果没有经过体细胞高突变，为组氨酸。
包含如本申请所述的具有至少一个非组氨酸密码子被组氨酸密码子取代的人源免疫球蛋白轻链可变区基因序列的基因修饰的非人动物可以选自下组：小鼠、大鼠、家兔、猪、牛(例如奶牛、公牛、水牛)、鹿、绵羊、山羊、鸡、猫、犬、雪貂、灵长类(例如狨猴、恒河猴)。对于适于基因修饰的ES细胞不易获得的非人动物而言，使用如本申请所描述的那些独特的方法制备包含基因修饰的非人动物。这种方法包括例如修饰非ES细胞基因组(例如成纤维细胞或诱导性多能干细胞)和使用核转移将所述修饰的基因组转移至适宜的细胞例如卵母细胞，并且在适宜条件下在非人动物中妊娠所述修饰的细胞(例如修饰的卵细胞)以形成胚胎。
在一个方面，所述非人动物是哺乳动物。在一个方面，所述非人动物是小型哺乳动物，例如跳鼠科(Dipodoidea)总科或鼠科(Muroidea)总科的。在一个实施方式中，所述基因修饰的动物是啮齿动物。在一个实施方式中，所述啮齿动物选自小鼠、大鼠和仓鼠。在一个实施方式中，所述啮齿动物选自鼠科总科。在一个实施方式中，所述基因修饰的动物来自选自下述的科：丽仓鼠科(Calomyscidae)(例如小鼠样仓鼠)、仓鼠科(Cricetidae)(例如仓鼠、新世界大鼠和小鼠、田鼠)、鼠科(Muridae)(真小鼠和大鼠、沙鼠、多刺鼠、黄冠鼠)、马岛鼠科(Nesomyidae)(攀鼠、岩鼠、白尾大鼠、马达加斯加大鼠和小鼠)、刺山鼠科(Platacanthomyidae)(例如多刺睡鼠)和鼹形鼠科(Spalacidae)(例如鼹鼠、竹鼠和鼢鼠)。在一个特定的实施方式中，所述基因修饰的啮齿动物选自真小鼠或大鼠(鼠科)、沙鼠、多刺小鼠和黄冠鼠。在一个实施方式中，所述基因修饰的小鼠来自鼠科成员。在一个实施方式中，所述动物是啮齿动物。在一个特定的实施方式中，所述啮齿动物选自小鼠和大鼠。在一个实施方式中，所述非人动物是小鼠。
在一个特定的实施方式中，所述非人动物是啮齿动物，其是C57BL品系的小鼠，选自C57BL/A、C57BL/An、C57BL/GrFa、C57BL/KaLwN、C57BL/6、C57BL/6J、C57BL/6ByJ、C57BL/6NJ、C57BL/10、C57BL/10ScSn、C57BL/10Cr和C57BL/Ola。在另一个实施方式中，所述小鼠是选自下组的129品系：129P1、129P2、129P3、129X1、129S1(例如129S1/SV、129S1/SvIm)、129S2、129S4、129S5、129S9/SvEvH、129S6(129/SvEvTac)、129S7、129S8、129T1、129T2(参见例如Festing等，(1999)Revised nomenclature for strain 129mice(129小鼠品系经修订的命名法),Mammalian Genome 10:836，亦参见Auerbach等(2000)Establishment andChimera Analysis of 129/SvEv-and C57BL/6-Derived Mouse Embryonic Stem CellLines(129/SvEv-和C57BL/6-来源的小鼠胚胎干细胞系的建立和嵌合体分析))。在一个特定实施方式中，所述基因修饰的小鼠是前述129品系和前述C57BL/6品系的混合物。在另一个特定实施方式中，所述小鼠是前述129品系的混合物或前述BL/6品系的混合物。在一个特定实施方式中，所述混合的129品系是129S6(129/SvEvTac)品系。在另一个实施方式中，所述小鼠是BALB品系，例如BALB/c品系。在又一个实施方式中，所述小鼠是BALB品系和另一个前述品系的混合物。
在一个实施方式中，所述非人动物是大鼠。在一个实施方式中，所述大鼠选自Wistar大鼠、LEA品系、Sprague Dawley品系、Fischer品系、F344、F6和Dark Agouti。在一个实施方式中，所述大鼠品系是两种或多种选自下组的品系的混合物：Wistar、LEA、SpragueDawley、Fischer、F344、F6和Dark Agouti。
因此，在一个实施方式中，所述基因修饰的非人动物是啮齿动物。在一个实施方式中，所述基因修饰的非人动物是大鼠或小鼠。在一个实施方式中，所述动物是小鼠。因此，在一个实施方式中，本申请提供了一种基因修饰的小鼠，所述小鼠在其基因组中例如在其种系中包含单一重排的人源免疫球蛋白轻链可变区，所述人源免疫球蛋白轻链可变区包含人源VL和JL基因区段，其中所述单一未经重排的人源免疫球蛋白轻链可变区包含至少一个非组氨酸密码子被组氨酸密码子取代。在一个实施方式中，所述小鼠缺乏具有功能的未经重排的免疫球蛋白轻链可变区(例如缺乏具有功能的未经重排的V和J基因区段序列)。在一个实施方式中，具有组氨酸密码子取代的所述未经重排的人源免疫球蛋白轻链可变区是Vκ1-39/Jκ或Vκ3-20/Jκ可变区。在一个实施方式中，所述J区段序列选自Jκ1、Jκ2、Jκ3、Jκ4和Jκ5。在一个实施方式中，所述J区段是Jκ1或Jκ5。在一个实施方式中，至少一个非组氨酸密码子被组氨酸密码子的取代发生在编码CDR3区的核苷酸序列中。在一个实施方式中，其中所述重排的可变区序列是Vκ1-39/Jκ5序列，所述组氨酸取代被设计为在选自105、106、108、111及其组合的位置表达。在另一个实施方式中，其中所述重排的可变区序列是Vκ3-20/Jκ1序列，所述组氨酸取代被设计为在选自105、106、107、109及其组合的位置表达。在一个实施方式中，具有取代的组氨酸密码子的所述重排的免疫球蛋白轻链可变区与内源性小鼠免疫球蛋白恒定区基因序列(例如Cκ基因序列)可操作地连接。在一个实施方式中，所述小鼠在其基因组中例如在其种系中还包含未经重排的免疫球蛋白重链可变区，所述未经重排的免疫球蛋白重链可变区包含人源VH、DH和JH区段。在一个实施方式中，所述人源VH、DH和JH区段与内源性小鼠免疫球蛋白重链恒定区基因序列可操作地连接。在各种实施方式中，在所述小鼠的种系中包含重排的人源免疫球蛋白轻链可变区序列和未经重排的人源免疫球蛋白重链可变区序列，所述重排的人源免疫球蛋白轻链可变区序列包含至少一个非组氨酸密码子被组氨酸密码子的取代。
本申请提供了一种用于生成本申请所述的基因修饰的非人动物例如小鼠的靶向载体。在一个方面，本申请提供了一种靶向载体，所述靶向载体相对于所述载体5’和3’小鼠同源臂的序列的转录方向从5’至3’包含：5’小鼠同源臂、人源或小鼠免疫球蛋白启动子、人源或小鼠前导序列、人源可变区，所述人源可变区选自重排的人源Vκ1-39Jκ5或重排的人源Vκ3-20Jκ1并且包含至少一个非组氨酸密码子被组氨酸密码子的取代、和3’小鼠同源臂。在一个实施方式中，5’和3’同源臂将所述载体靶向至相对于增强子序列的5’端，所述序列的5’端在所述小鼠Cκ基因的5’端和近端。在另一个实施方式中，所述靶向载体包含5’小鼠同源臂、后接在重组位点翼侧的选择性表达盒、人源或小鼠免疫球蛋白启动子、人源或小鼠前导序列、人源可变区，所述人源可变区选自重排的人源Vκ1-39Jκ5或重排的人源Vκ3-20Jκ1并且包含至少一个非组氨酸密码子被组氨酸密码子的取代、后接3’小鼠同源臂，所述同源臂包含小鼠增强子和恒定区(Cκ序列)。
选择性表达盒是插入靶向构建体的核苷酸序列，以便于选择具有整合了目的构建体的细胞(例如ES细胞)。多种适宜的选择性表达盒是本领域公知的。通常，在存在特定抗生素(例如Neo、Hyg、Pur、CM、Spec等)的条件下选择性表达盒能够得到阳性选择。此外，选择性表达盒的翼侧可以是重组位点，这使得在使用重组酶处理后可以将选择性表达盒去除。常用的重组位点是loxP和Frt，其分别由Cre和Flp酶识别，但其他的也是本领域公知的。
在一个实施方式中，所述启动子是人源免疫球蛋白可变区基因区段启动子。在一个特定的实施方式中，所述启动子是人源Vκ3-15启动子。在一个实施方式中，所述前导序列是小鼠前导序列。在一个特定的实施方式中，所述小鼠前导序列是小鼠Vκ3-7前导序列。所述靶向载体的示例性实施方式见于图23B和29B。
在一个方面，本申请提供了如上文所述的靶向载体，但是在5’小鼠同源臂的位置，人源或小鼠启动子的5’翼侧是位点特异性重组酶识别位点(SRRS)，并且在3’小鼠同源臂的位置，人源VL区的3’翼侧是SRRS。
本申请还提供了一种制备如本申请所述的基因修饰的非人动物(例如啮齿动物，例如小鼠或大鼠)的方法。在一个方面，如实施例中所述，用于制备如本申请所述的基因修饰的非人动物的方法利用靶向载体，使用技术制备，将所述构建体引入ES细胞，并且使用技术将靶向ES细胞克隆引入小鼠胚胎。可以使用多种分子生物学技术例如位点定向突变或从头DNA合成将组氨酸修饰引入所述靶向载体。在基因靶向完成后，筛选基因修饰的非人动物的ES细胞以确证成功引入了外源性目的核苷酸序列或表达外源性多肽。多种技术是本领域技术人员所公知的，包括(但不限于)Southern印迹、长PCR、定量PCT(例如使用的实时PCR)、荧光原位杂交、Northern印迹、流式细胞术、Western分析、免疫细胞化学、免疫组织化学等。在一个例子中，可以通过使用Valenzuela等，(2003)High-throughput engineering of the mouse genome coupledwith high-resolution expression analysis(与高分辨表达分析偶联的小鼠基因组的高通量工程改造),Nature Biotech.21(6):652-659中所述的改进的等位基因实验筛选小鼠等位基因的缺失和/或人源等位基因的获得来鉴定携带目的基因修饰的非人动物(例如小鼠)。在基因修饰的动物中鉴定特异性核苷酸或氨基酸序列的其他实验是本领域技术人员公知的。
因此，在一个实施方式中，生成基因修饰的非人动物的方法包括使用人源免疫球蛋白轻链可变区基因序列(包含人源VL和JL基因区段)取代在所述动物中的免疫球蛋白轻链可变区基因序列，其中所述人源免疫球蛋白可变区基因序列包含至少一个非组氨酸密码子被组氨酸密码子的取代。在一个实施方式中，所述至少一个非组氨酸密码子被组氨酸密码子的取代发生在编码CDR区例如CDR3区的核苷酸序列中。
在一个实施方式中，生成如本申请所述的经基因修饰的非人动物的方法包括使用单一重排的人源免疫球蛋白轻链可变区基因序列取代在所述动物中的免疫球蛋白轻链可变区基因序列，所述单一重排的人源免疫球蛋白轻链可变区基因序列包含人源VL和JL基因区段序列，其中所述单一重排的人源免疫球蛋白可变区基因序列包含至少一个非组氨酸密码子被组氨酸密码子的取代。在一个实施方式中，所述取代在CDR密码子中。在一个实施方式中，所述取代是1、2、3、4或更多个CDR3密码子的取代。在一个实施方式中，所述单一重排的人源免疫球蛋白轻链可变区基因序列是基于选自Vκ1-39Jκ5和Vκ3-20Jκ1的人源种系重排的轻链可变区序列。因此，在一个实施方式中，所述单一重排的人源免疫球蛋白轻链可变区基因序列来源于Vκ1-39Jκ5，至少一个非组氨酸密码子被组氨酸密码子取代被设计为在选自105、106、108、111及其组合的位置表达组氨酸。在一个实施方式中，所述单一重排的人源免疫球蛋白轻链可变区基因序列来源于Vκ3-20κ1，至少一个非组氨酸密码子被组氨酸密码子取代被设计为在选自105、106、107、109及其组合的位置表达组氨酸。
在另一个实施方式中，生成本申请所述的非人动物(即包含本申请所述的经基因修饰的免疫球蛋白轻链基因座)的方法包括修饰非人动物的基因组以便在免疫球蛋白轻链基因座中缺失或使内源性免疫球蛋白轻链V和J区段不具有功能，并且将单一重排的人源轻链可变区基因序列至于基因组中，所述单一重排的人源轻链可变区基因序列包含至少一个非组氨酸密码子被组氨酸密码子的取代。在一个实施方式中，所述方法生成经基因修饰的非人动物，所述非人动物包含富含显示出pH依赖地与目的抗原结合的抗体的B细胞群。
在一些实施方式中，生成本申请所述的基因修饰的非人动物的方法包括在所述动物中使用人源序列取代免疫球蛋白轻链可变区基因序列，所述动物还包括使用人源免疫球蛋白重链可变区基因序列取代内源性非人源免疫球蛋白重链可变区基因序列，所述人源免疫球蛋白重链可变区基因序列包含如上文所述的各个或人源VH、DH和JH序列库中的至少一个。在一个实施方式中，为了生成包含内源性免疫球蛋白轻链可变区基因序列被包含至少一个非组氨酸密码子被组氨酸密码子取代的人源轻链可变区基因序列取代和内源性非人源免疫球蛋白重链可变区基因序列被人源免疫球蛋白重链可变区基因序列取代的非人动物，将具有轻链可变区基因序列取代的动物与具有重链可变区基因序列取代的动物交配繁殖。
发明人目前提供了基因工程非人动物(例如啮齿动物，例如大鼠或小鼠)，所述非人动物表达抗原结合蛋白例如抗体，所述抗原结合蛋白包含通用轻链例如人源通用轻链(例如来源于单一重排的人源免疫球蛋白轻链可变区的轻链)，所述通用轻链包含一个或多个组氨酸修饰，其中所述抗原结合蛋白显示出与靶抗原的pH依赖性地抗原结合。所述动物被基因工程改造以包含含有一个或多个组氨酸修饰的轻链CDR3。在各种实施方式中，所述轻链CDR3包含在一簇中的两个、三个或四个或者更多个组氨酸残基。
在一个实施方式中，本申请提供了一种基因工程非人动物，所述非人动物包含抗原特异性抗体群，作为在轻链可变区基因序列中密码子修饰的结果所述抗原特异性抗体群表达组氨酸残基，并且显示出pH依赖性靶抗原结合。在一个实施方式中，这些动物包含B细胞群，与在本申请所述的免疫球蛋白轻链可变区中不包含至少一个非组氨酸密码子被组氨酸密码子取代的动物中生成的抗原特异性抗体群相比，所述B细胞群富含显示出pH依赖性结合性质(例如在酸性pH与在中性pH相比，解离半衰期(t1/2)降低)的抗体例如抗原特异性抗体。在一个实施方式中，在本申请所述的基因工程动物中生成的显示出pH依赖性抗原结合性质的抗原特异性抗体的富集程度与在轻链可变区中包含组氨酸取代的相似动物相比高约2倍，例如高约5倍，例如高约10倍。因此，本发明的基因修饰的动物富含具有改善的抗体循环性质的抗体，这是为了减少靶点介导的清除以及降低基于这种在体内生成的抗体形式开发的治疗性抗原结合蛋白的剂量和/或给药频率所需要的。
因此，本申请提供了一种抗原结合蛋白，所述抗原结合蛋白在本申请所述的基因修饰的非人动物中生成，其中所述抗原结合蛋白显示出pH依赖性抗原结合。在一个实施方式中，所述抗原结合蛋白是抗体，例如抗原特异性抗体。在一个实施方式中，所述抗体包含轻链，所述轻链包含来源于重排的人源免疫球蛋白轻链可变基因区段的人源轻链可变结构域，在所述重排的人源免疫球蛋白轻链可变基因区段的种系基因序列中至少一个非组氨酸密码子被组氨酸密码子取代，并且其中所述抗体在其表达的人源轻链可变结构域中保留了至少一个组氨酸取代。在一个实施方式中，所述抗体包含轻链，所述轻链包含来源于单一重排的人源轻链可变区基因序列的人源轻链可变结构域，其中所述单一重排的轻链可变区基因序列包含至少一个非组氨酸密码子被组氨酸密码子的取代，并且其中所述抗体在其表达的轻链可变结构域中保留了至少一个组氨酸取代。在一个实施方式中，所述抗体包含来源于人源Vκ1-39Jκ5或Vκ3-20Jκ1重排的轻链，其中所述人源Vκ1-39Jκ5或Vκ3-20Jκ1基因序列包含至少一个非组氨酸密码子被组氨酸密码子的取代，并且其中所述抗体在其表达的轻链可变结构域中保留了至少一个组氨酸取代。在一些实施方式中，所述抗体在其表达的轻链可变结构域中保留了全部或基本上全部的组氨酸取代。在一个实施方式中，所述取代是在编码轻链可变区基因序列的CDR3的核苷酸序列中三个非组氨酸密码子被三个组氨酸密码子取代，并且所述抗体在其表达的轻链可变结构域中保留了全部三个组氨酸取代。在一个实施方式中，所述取代是在编码轻链可变区基因序列的CDR3的核苷酸序列中四个非组氨酸密码子被四个组氨酸密码子取代，并且所述抗体在其表达的轻链可变结构域中保留了三个或四个组氨酸取代。
在一个实施方式中，所述抗体的轻链还包含非人源轻链恒定区氨基酸序列，例如内源性轻链恒定区氨基酸序列。此外，在本申请所述的基因修饰的非人动物中生成的所述抗体例如抗原特异性抗体还包含重链，所述重链包含来源于重排的人源重链V、D和J区段的人源重链可变结构域。人源重链V、D和J区段可以选自在内源性非人源重链基因座存在的人源重链区段库，例如在至少一个具有功能的V、在至少一个具有功能的D和在至少一个具有功能的J区段，例如直到完整的具有功能的人源V、D和J区段库。示例性的人源重链可变区段的可能性的重排可以收集自IMGT数据库中的具有功能的人源V、D和J区段列表，以及来自美国申请公开号2011/0195454、2012/0021409、2012/0192309和2013/0045492。而且，在一个实施方式中，所述抗体的重链包含非人源重链恒定区氨基酸序列，例如内源性非人源重链恒定区氨基酸序列。在一个实施方式中，所述非人源重链恒定区包含CH1、铰链、CH2和CH3结构域。在一个实施方式中，所述抗体是IgG、IgE、IgD、IgM或IgA同种型。
因此，在一个实施方式中，本申请提供了在本申请所述的基因修饰的非人动物中生成的结合蛋白，其中所述结合蛋白包含反向嵌合轻链，所述反向嵌合轻链包含(a)来源于人源Vκ1-39Jκ5重排的轻链可变结构域，所述人源Vκ1-39Jκ5重排包含至少一个非组氨酸密码子被组氨酸密码子的取代，其中所述轻链在其表达的轻链可变结构域中保留了至少一个组氨酸取代和(b)非人源例如小鼠的轻链恒定区氨基酸序列，其中所述轻链与反向嵌合重链结合，所述反向嵌合重链包含(a)来源于人源V、D和J区段重排的重链可变结构域，其中所述V、D和J区段选自在所述动物中存在的人源V、D和J区段库，和(b)非人动物例如小鼠的重链恒定区氨基酸序列。在一个实施方式中，所述人源V、D和J区段库包含至少一个具有功能的V、至少一个具有功能的D和至少一个具有功能的J区段，例如直到完整的具有功能的人源V、D和J区段库。在一个实施方式中，所述重链和轻链恒定结构域是内源性重链和轻链恒定区。在一个实施方式中，所述重链和轻链可变结构域是体细胞突变的结构域。在一个实施方式中，所述体细胞突变的轻链结构域保留了至少一个引入种系序列的组氨酸取代。在一些实施方式中，所述体细胞突变的轻链结构域保留了全部或基本上全部的引入种系序列的组氨酸取代。在一个实施方式中，所述抗原结合蛋白显示出pH依赖性的抗原结合性质。
在另一个实施方式中，本申请提供的是在本申请所述的基因修饰的非人动物中生成的结合蛋白，其中所述结合蛋白包含反向嵌合轻链，所述反向嵌合轻链包含(a)来源于人源Vκ3-20Jκ1重排的轻链可变结构域，所述人源Vκ3-20Jκ1重排包含至少一个非组氨酸密码子被组氨酸密码子的取代，其中所述轻链在其表达的轻链可变结构域中保留了至少一个组氨酸取代和(b)非人源例如小鼠的轻链恒定区氨基酸序列，其中所述轻链与反向嵌合重链结合，所述反向嵌合重链包含(a)来源于人源V、D和J区段重排的重链可变结构域，其中所述V、D和J区段选自在所述动物中存在的人源V、D和J区段库，和(b)非人动物例如小鼠的重链恒定区氨基酸序列。在一个实施方式中，所述人源V、D和J区段库包含至少一个具有功能的V、至少一个具有功能的D和至少一个具有功能的J区段，例如直到完整的具有功能的人源V、D和J区段库。在一个实施方式中，所述重链和轻链恒定区是内源性重链和轻链恒定区。在一个实施方式中，所述重链和轻链可变结构域是体细胞突变的结构域。在一个实施方式中，所述体细胞突变的轻链结构域保留了至少一个引入种系序列的组氨酸取代。在一些实施方式中，所述体细胞突变的轻链结构域保留了全部或基本上全部的引入种系序列的组氨酸取代。在一个实施方式中，所述抗原结合蛋白显示出pH依赖性的抗原结合性质。
在一个实施方式中，本申请还提供的是本申请所述的基因修饰的动物的B细胞，在所述基因修饰的动物的种系中包含本申请所述的组氨酸修饰的人源轻链可变区序列，例如组氨酸修饰的单一重排的人源轻链可变区序列并表达本申请所述的抗原结合蛋白。在一个实施方式中，在B细胞中表达的所述抗原结合蛋白例如抗体保留了至少一个引入种系中的组氨酸残基，并且显示出pH依赖性的抗原结合性质。在一些实施方式中，在B细胞中表达的所述抗原结合蛋白例如抗体保留了全部或基本上全部引入种系中的组氨酸残基，并且显示出pH依赖性的抗原结合性质。
在各种实施方式中，本申请所述的基因修饰的非人动物包含人源轻链可变区基因序列例如单一重排的人源轻链可变区基因序列(例如Vκ1-39Jκ5或Vκ3-20Jκ1序列)，所述人源轻链可变区基因序列包含至少一个非组氨酸密码子被组氨酸密码子的取代(或者引入种系序列中的附加组氨酸密码子)。这些插入或取代使得在非人动物中包含的B细胞群富含针对其抗原具有pH依赖性结合性质的抗原结合蛋白。在一个实施方式中，在本申请所述的非人动物中生成的抗原结合蛋白例如抗体针对抗原刺激显示出pH依赖性的抗原结合同时在中性pH下针对抗原显示出高亲和性，例如约7.0和约8.0之间的pH，例如约7.0和约7.4的pH，例如约7.2和约7.4之间的pH，例如体液如血液的pH。在一个实施方式中，在中性pH下所述抗原结合蛋白对其抗原的亲和性以解离常数(KD)计低于10-6M、例如低于10-8M、例如低于10- 9M、例如低于10-10M、例如低于10-11M、例如低于10-12M。
在一个实施方式中，在本申请所述的基因修饰的非人动物中生成的抗原结合蛋白例如抗体与中性pH相比显示出在酸性pH下(例如pH 6.0或更低、例如pH在约5.0和约6.0之间、pH约5.75和约6.0之间，例如内涵体或溶酶体隔室的pH)与其抗原降低的结合。在一个实施方式中，在本申请所述的基因修饰的非人动物中生成的抗原结合蛋白例如抗体在酸性pH显示出与抗原无结合，而在中性pH保持与抗原的结合。在一个实施方式中，在本申请所述的基因修饰的非人动物中生成的抗原结合蛋白与在中性pH下抗原结合蛋白的解离半衰期(t1/2)相比在酸性pH下的解离半衰期(t1/2)降低至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约10倍、至少约15倍、至少约20倍、至少约25倍或至少约30倍。在一个实施方式中，本申请所述的基因修饰的非人动物表达的抗原结合蛋白抗体在酸性pH和37℃下具有的t1/2为约2min或更短。在一个实施方式中，本申请所述的基因修饰的非人动物表达的抗原结合蛋白抗体在酸性pH和37℃下具有的t1/2为约1min或更短。在一个实施方式中，本申请所述的基因修饰的非人动物表达的抗原结合蛋白抗体在酸性pH和25℃下具有的t1/2为约2min或更短。在一个实施方式中，本申请所述的经基因修饰的非人动物表达的抗原结合蛋白抗体在酸性pH和25℃下具有的t1/2为约1min或更短。
动力学参数如平衡解离常数(KD)和解离半衰期(t1/2)可以由动力学速率常数计算：KD(M)＝kd/ka；和t1/2(min)＝ln2/(60*kd)。
在一个实施方式中，在本申请所述的基因修饰的非人动物中生成的抗原结合蛋白例如抗体显示出与FcRn分子增加的结合。如上文所述，FcRn是在内涵体隔室中存在的受体，其能够在酸性pH下结合免疫球蛋白并且将其循环回表面。筛选在本申请所述的基因修饰的非人动物中的抗体分子为选择具有三个有益的参数的抗体：对抗原具有高亲和性、pH依赖性抗原结合(在酸性pH下具有较弱的抗原结合)和与FcRn增加的结合提供了独特的机会。
在一个实施方式中，本申请所述的基因修饰的非人动物包含对抗原生成应答的B细胞群并且所述B细胞群富含抗原结合蛋白例如抗体，当将其重新制成治疗剂时，与在其人源轻链可变区基因序列中不包含组氨酸修饰的非人动物中针对相同抗原生成的等价B细胞群相比，将治疗剂量向受试者施用时其显示出增加的血清半衰期。因此，在一个实施方式中，在本申请所述的基因修饰的非人动物中针对目的抗原生成的抗原结合蛋白例如抗体，当将其重新制成治疗剂时，与在其人源轻链可变区基因序列中不包含组氨酸修饰的非人动物中针对相同抗原生成的抗原结合蛋白(当将其重新制成治疗剂并且以相同的治疗剂量施用时)的血清半衰期相比，将治疗剂量向受试者施用时其显示出增加的血清半衰期。在一些实施方式中，血清半衰期的增加是约2倍，例如约5倍、例如约10倍、例如约15倍、例如约20倍或更高。
在一个方面，本申请提供了来源于如本申请所述的非人动物的多能干细胞、诱导型多能干细胞或全能干细胞。在一个特定的实施方式中，所述细胞是胚胎干(ES)细胞。
在一个方面，本申请提供了来源于如本申请所述的非人动物的组织。在一个实施方式中，所述组织来源于如本申请所述的非人动物的脾脏、淋巴结或骨髓。
在一个方面，本申请提供了来源于如申请所述的非人动物的细胞核。在一个实施方式中，所述细胞核来自不是B细胞的二倍体细胞。
在一个方面，本申请所提供的非人细胞分离自如本申请所述的非人动物(例如啮齿动物，例如小鼠或大鼠)。在一个实施方式中，所述细胞是ES细胞。在一个实施方式中，所述细胞是淋巴细胞。在一个实施方式中，所述淋巴细胞是B细胞。在一个实施方式中，所述B细胞表达嵌合重链，所述嵌合重链包含来源于人源基因区段的可变结构域；和轻链，所述轻链来源于具有至少一个非组氨酸密码子被组氨酸密码子取代的重排的人源Vκ1-39/J序列，具有至少一个非组氨酸密码子被组氨酸密码子取代的重排的人源Vκ3-20/J序列或其组合并且还包含在种系中编码的至少一个氨基酸被组氨酸取代；其中所述重链可变结构域与非人源恒定区融合并且所述轻链可变结构域与非人源或人源恒定区融合。
在一个方面，本申请提供了杂交瘤，其中所述杂交瘤由如本申请所述的非人动物的B细胞制备。在一个特定的实施方式中，所述B细胞来自如本申请所述的小鼠，所述小鼠已使用包含目的抗原的免疫原免疫，并且所述B细胞表达与目的表位结合的结合蛋白，所述结合蛋白具有体细胞突变的人源可变重链结构域和小鼠CH，并且具有来源于具有至少一个非组氨酸密码子被组氨酸密码子取代的重排的人源Vκ1-39Jκ5或具有至少一个非组氨酸密码子被组氨酸密码子取代的重排的人源Vκ3-20Jκ1的人源可变轻链结构域和小鼠CL，其中所述人源轻链结构域包含至少一个在种系中编码的氨基酸被组氨酸的取代。
本申请还提供了一种细胞，所述细胞表达在本申请所述的非人动物中生成的抗原结合蛋白。在一个实施方式中，所述细胞选自CHO、COS、293、HeLa和表达病毒核酸序列的视网膜细胞(例如PERC.6TM细胞)。
在一个方面，本申请提供了一种非人胚胎，其中所述胚胎包含来源于如本申请所述的非人动物的供体ES细胞。
本申请所述的非人动物对生成表达在CDR3中具有组氨酸的抗体的B细胞是有用的。在CDR3中安置组氨酸的动物在通常情况下对制备抗体是有用的，并且对于开发在中性pH或大约中性pH以足够的亲和性结合靶点，但是在酸性pH下不结合或较弱地结合相同靶点的抗体是特别有用的。
所述非人动物对生成能够用于制备例如通过在CDR3中包含组氨酸的人源免疫球蛋白可变结构域结合其靶点的人用治疗性结合蛋白的抗体的可变区是有用的。在较低pH下改变的结合将在一些情况下提供更快的周转，因为治疗剂将在细胞表面上结合靶点，在内涵体中被内化，并且在内涵体中更容易或更迅速地从靶点上解离，这样所述治疗剂能够再循环与靶点上的其他分子结合(例如另一个细胞或同一细胞上的)。在一些情况下，这将导致能够以更低的剂量使用治疗剂，或以更低的频率使用治疗剂。这对于出于安全性或毒性原因不希望频繁地给药或以超过一定剂量给药是特别有用的。其结果是，当向受试者施用时所述抗体治疗剂的血清半衰期将增加。
所述非人动物例如啮齿动物例如小鼠或大鼠在用于在动物中增加B细胞数量的方法中是有用的，所述动物显示出具有在其中含有一个或多个组氨酸的CDR3的抗体可变区。所述非人动物对于生成将显示出pH依赖性抗原结合的抗体序列是有用的。所述非人动物对于针对单一免疫生成更大数量的抗体序列是有用的，其中所述抗体将显示出pH依赖性抗原结合。
抗原结合蛋白和生成抗原结合蛋白的方法
在一个方面，本申请还提供了一种由本申请所述的基因修饰的非人动物使用本领域中使用的标准方法生成人源抗原结合蛋白例如抗体的方法，所述人源抗原结合蛋白显示出pH依赖性的抗原结合。
多种用于生产抗体的技术已有描述。例如，在各种实施方式中，在如本申请所述的小鼠中生产嵌合抗体。能够直接从免疫小鼠的B细胞中分离抗体(参见例如U.S.2007/0280945A1)和/或免疫小鼠的B细胞能够用于制备杂交瘤(Kohler and Milstein,1975,Nature 256:495-497)。编码来自如本申请所述的非人动物的抗体(人源重链和/或轻链)的DNA使用常规技术易于分离和测序。来源于如本申请所述的非人动物的杂交瘤和/或B细胞是这种DNA的优选来源。一旦分离，可以将所述DNA放入表达载体中，然后将其转染进入不另外生成免疫球蛋白的宿主细胞中，以获得在重组的宿主细胞中单克隆抗体的合成。所述DNA还可以被修饰，例如通过使用人源重链和轻链恒定结构域的编码序列取代非人源序列。因此，一旦具有所需特性例如亲和性、表位、pH依赖性抗原结合等的抗体的核酸序列被确定，则使用所需的人源恒定区序列取代非人源恒定区基因序列以生成含有非IgM同种型例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的全人源抗体。
因此，在一个实施方式中，本申请提供的是一种生成显示出pH依赖性抗原结合性质的抗体的方法，所述方法包括生成如本申请所述的非人动物(例如小鼠)，使用目的抗原免疫小鼠，使非人动物针对所述抗原激发免疫应答，并且在所述非人动物中选择显示出pH依赖性抗原结合性质的抗原特异性抗体，例如与在中性pH相比在酸性pH下显示出与所述抗原更弱的结合。
本申请还提供了制备多特异性抗原结合蛋白例如双特异性抗原结合蛋白的方法。这些是能够以高亲和性与一个以上的表位结合的分子。本发明的优点包括能够选择适宜的高结合(例如亲和性成熟的)重链免疫球蛋白链，所述重链免疫球蛋白链将均与单一轻链结合。此外，本发明的优点包括能够生成显示出pH依赖性抗原结合的多特异性例如双特异性抗原结合蛋白。
由于双特异性抗体的双重性质(即，可以对一个多肽的不同表位具有特异性或可以含有针对一个以上的靶多肽具有特异性的抗原结合结构域，参见例如Tutt等，1991,J.Immunol.147:60-69；Kufer等，2004,Trends Biotechnol.22:238-244)，使其提供了多种针对治疗性应用的有用的优点。例如，所述双特异性抗体能够作为疫苗佐剂用于重新定向细胞毒性(例如杀死肿瘤细胞)，用于向凝块递送血栓溶解剂，作为在靶向位点(例如肿瘤)的转化酶活化的前药，用于治疗感染性疾病，将免疫复合物靶向至细胞表面受体或者用于向肿瘤细胞递送免疫毒素。
本申请所述的双特异性抗体还能够用于多种治疗性和非治疗性和/或诊断测定方法，如酶免疫测定、双位点免疫测定、各种疾病(例如癌症)的体外或体内免疫诊断、竞争性结合测定、直接和间接三明治测定和免疫沉淀测定。所述双特异性抗体的其他用途对本领域技术人员而言将是显而易见的。
用于从重组细胞培养物制备双特异性抗体片段的一些技术已有报道。然而，双特异性结合蛋白的合成和表达还存在问题，部分是由于与鉴定能够与两种不同的重链结合和表达的适宜的轻链相关的问题，部分是由于分离的问题。在各种实施方式中，本申请所述的组合物和方法提供了全长双特异性抗体的优点，其不需要通过增加组分的稳定性/相互作用以维持常规免疫球蛋白结构的特定修饰。在各种实施方式中，这种修饰已证实是繁琐的并且是发展双特异性抗体技术及其在治疗人类疾病中的潜在用途中的障碍。因此，在各种实施方式中，通过提供具有附加的多特异性性质的天然的免疫球蛋白结构(即全长)，全长双特异性抗体维持了此前的双特异性片段缺乏的关键的效应器功能，并且还提供了治疗性，其显示出具有更长半衰期的重要的药代动力学参数。
本申请所述的方法和组合物允许针对基因修饰的小鼠通过其他天然的过程选择能够与一个以上的重链结合和表达的适宜的轻链，所述重链包含体细胞突变的(例如亲和性成熟的)重链，其中所述轻链还赋予了所述抗原结合蛋白pH依赖性的抗原结合性质。来自如本申请所述的经免疫小鼠适宜B细胞的人源重链和轻链可变区序列能够被鉴定并且与适宜的人源恒定区基因序列(例如人源IgG1)在表达载体的框架中克隆，所述经免疫的小鼠表达具有反向嵌合重链(即人源可变区和小鼠恒定区)的亲和性成熟的抗体。可以制备两个这种构建体，其中各构建体均编码与不同表位结合的人源重链可变结构域。一个所述人源轻链可变区(例如人源Vκ1-39Jκ5或人源Vκ3-20Jκ1)，所述人源轻链可变区含有至少一个非组氨酸密码子被组氨酸密码子取代，能够在框架与适宜的人源轻链恒定区基因(例如人源κ恒定基因)融合。这三个全长的人源重链和轻链构建体能够置于用于表达的适宜细胞中。所述细胞将表达两种主要物质：具有相同轻链的同源二聚的重链和具有相同轻链的异源二聚的重链。为了使得这些主要物质易于分离，对一条所述重链进行修饰以缺失蛋白A结合决定簇，以使得同源二聚的结合蛋白与异源二聚的结合蛋白具有不同的亲和性。解决这个问题的组合物和方法在2010年6月25日提交的名称为“Readily Isolated BispecificAntibodies with Native Immunoglobulin Format(具有天然免疫球蛋白形式的易于分离的双特异性抗体)”的USSN 12/832,838中进行了描述，其公开号为US 2010/0331527A1。一旦包含具有相同的轻链的异源二聚的重链的物质被选择，则可以筛选这种双特异性抗原结合蛋白以确认其pH依赖性抗原结合性质的保留情况。
在一个方面，本申请提供了如本申请所述的表位结合蛋白，其中人源轻链和重链可变区序列来源于已被包含目标表位的抗原免疫的本申请所述的动物。
在一个实施方式中，本申请提供了表位结合蛋白，所述表位结合蛋白包含第一和第二多肽，所述第一多肽从N-末端到C-末端包含选择性与第一表位结合的第一表位结合区，后接恒定区，所述恒定区包含选自IgG1、IgG2、IgG4及其组合的人源IgG的第一CH3区；和从N-末端到C-末端第二多肽包含选择性与第二表位结合的第二表位结合区，后接恒定区，所述恒定区包含选自IgG1、IgG2、IgG4及其组合的人源IgG的第二CH3区，其中所述第二CH3区包含降低或消除所述第二CH3结构域与蛋白A结合的修饰。在例如美国专利申请号2010/0331527和2011/0195454中对各种这种修饰进行了描述。
用于制备与一个以上表位结合并且显示出pH依赖性表位结合性质的表位结合蛋白的一种方法是使用包含第一目标表位的抗原免疫根据本发明的第一小鼠，其中所述小鼠包含(1)内源性免疫球蛋白轻链可变区基因座，所述基因座不含有内源性小鼠轻链可变区基因序列，所述基因座能够重排并且形成轻链，其中在所述内源性小鼠免疫球蛋白轻链可变区基因座的是与所述小鼠内源性轻链恒定区基因可操作地连接的单一重排的人源轻链可变区，并且所述重排的人源轻链可变区选自含有至少一个非组氨酸密码子被组氨酸密码子取代的人源Vκ1-39Jκ5和Vκ3-20Jκ1，以及(2)已全部或部分被人源VH基因区段取代的内源性小鼠VH基因区段，以使得由所述小鼠制备的免疫球蛋白重链全部的或基本上全部是包含人源可变结构域和小鼠恒定结构域的重链。当免疫时，这种小鼠将制备反向嵌合抗体，所述抗体仅含有两种人源轻链可变结构域(例如人源Vκ1-39Jκ5或人源Vκ3-20Jκ1中的一种，例如含有至少一个氨基酸被组氨酸的取代)中的一种。通常地，在所述反向嵌合抗体中将保留引入种系序列中的至少一些取代的组氨酸残基。一旦编码与目的表位结合并表达显示出pH依赖性抗原结合性质的抗体的重链可变结构域的B细胞被鉴定，则能够获取(例如通过PCR)所述重链可变区(以及任选地轻链可变区)的核苷酸序列并且将其克隆进表达构建体中以使其与适宜的人源免疫球蛋白重链恒定区序列同在框架中。可以重复该过程以鉴定与第二表位结合的第二重链可变结构域，并且可以获取第二重链可变区基因序列，将其克隆进表达载体中以使其与第二适宜的人源免疫球蛋白重链恒定区序列同在框架中。由恒定区基因序列编码的所述第一和第二免疫球蛋白恒定结构域可以是相同的或不同的同种型，并且可以根据本申请或在US 2010/0331527A1中所描述的对一个所述免疫球蛋白恒定结构域(而不是另一个)进行修饰，并且可以在适宜的细胞中表达表位结合蛋白并基于其与同源二聚的表位结合蛋白针对蛋白A不同的亲和性将其分离，例如如US 2010/0331527A1中所描述的。
因此，在各种实施方式中，在将DNA分离并且对编码具有所需的特异性/亲和性的所述第一和第二人源重链可变结构域的所述第一和第二核酸序列，以及编码人源轻链结构域(分离自如本申请所述的非人动物的种系重排的序列或轻链序列)并包含至少一个非组氨酸密码子被组氨酸密码子取代的第三核酸序列进行选择后，使用在本领域中广泛使用的重组技术表达编码所述分子的所述三个核酸序列以形成所述双特异性抗体。通常，可供选择的表达系统将涉及哺乳动物细胞表达载体和宿主，以使得所述双特异性抗体适宜的糖基化(例如在双特异性抗体的情况下其包含糖基化的抗体结构域)。然而，还能够在原核表达系统中生产所述分子。在通常情况下，使用在单一载体或独立的多个载体上的编码所述第一人源重链可变结构域和所述第二人源重链可变结构域两者、所述人源轻链结构域的DNA转化所述宿主细胞。然而，也可以在独立的表达系统中表达所述第一人源重链可变结构域、第二人源重链可变结构域和人源轻链结构域(所述双特异性抗体的成分)并且在体外偶联所表达的多肽。在各种实施方式中，所述人源轻链结构域来源于具有至少一个非组氨酸密码子被组氨酸密码子取代(例如在CDR密码子中)的种系序列，。在各种实施方式中，所述人源轻链结构域在所述轻链结构域的轻链可变序列中包含不超过1个、不超过2个、不超过3个、不超过4个或不超过5个体细胞高突变。在一些实施方式中，所述体细胞高突变不改变引入所述轻链可变区种系序列中的至少一个组氨酸残基的存在。
在各种实施方式中，编码两条重链和具有至少一个非组氨酸被组氨酸取代的单一人源轻链的所述核酸(例如cDNA或基因组DNA)被插入用于进一步克隆(DNA的扩增)和/或表达的可复制载体中。多种载体是可利用的并且通常包括但不限于下述中的一种或多种：单一序列、复制原点、一种或多种标记基因、增强子元件、启动子和转录终止序列。可以单独地或基于宿主细胞的选择或实验确定的其他标准挑选各种成分。各种成分的若干例子是本领域公知的。
表达和克隆载体通常含有被宿主生物体识别并且与编码所述双特异性抗体的各个或全部成分的核酸序列可操作地连接的启动子。被多种潜在宿主细胞识别的大量启动子是众所周知的。通过限制性内切酶消化从来源DNA除去启动子并将分离的启动子序列插入载体，将这些启动子与双特异性抗体编码DNA可操作地连接。
在原核宿主细胞(酵母、真菌、昆虫、植物、动物、人或来自其他多细胞生物体的有核细胞)中使用的表达载体还可以含有终止转录和稳定mRNA所必需的序列。这种序列通常从原核或病毒DNA或cDNA的非翻译区的5'端和偶尔3'端获得。这些区域含有被转录为在编码双特异性抗体成分mRNA非翻译部分中的多聚腺苷酸片段的核苷酸区段。针对各种实施方式的适宜的表达载体包括在编码所述双特异性抗体DNA的哺乳动物细胞中提供瞬时表达的那些。在通常情况下，瞬时表达涉及使用能够在宿主细胞中有效地复制的表达载体，以使得所述宿主细胞累积所述表达载体的多个拷贝并且转而合成高水平的由所述表达载体编码的所需的多肽。包含适宜的表达载体和宿主细胞的瞬时表达系统能够方便地对由克隆的DNA编码的多肽进行阳性鉴定，以及能够迅速筛选与具有所述第一或第二人源重链可变结构域的同源二聚体的母体抗体相比具有所需的结合特异性/亲和性或所需的凝胶迁移特性的双特异性抗体。
在各种实施方式中，一旦编码所述双特异性抗体成分的DNA被组装进入如本申请所述的所需的载体，则其被引入用于表达和回收的适宜的宿主细胞。可以使用适于所选择的宿主细胞的本领域公知的标准技术实现转染宿主细胞(例如电穿孔、核显微注射、与完整细胞的细菌原生质体融合或多聚阳离子例如聚凝胺、聚鸟氨酸等)。
在各种实施方式中，选择最适于含有所述成分的表达载体并且能够最高效和最有利地生产双特异性抗体种类的宿主细胞。用于表达的示例性宿主细胞包括那些原核生物和真核生物(单细胞或多细胞)、细菌细胞(例如大肠杆菌(E.coli)、芽孢杆菌属(Bacillus)、链霉菌属(Streptomyces)等的菌株)、分枝杆菌细胞、真菌细胞、酵母细胞(例如酿酒酵母(S.cerevisiae)、粟酒裂殖酵母(S.pombe)、巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)、甲醇毕赤酵母(P.methanolica)等)、植物细胞、昆虫细胞(例如SF-9、SF-21、杆状病毒感染的昆虫细胞、粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)等)、非人动物细胞、人细胞或细胞融合例如杂交瘤或四价体杂交瘤。在各种实施方式中，所述细胞是人、猴、猿、仓鼠、大鼠或小鼠细胞。在各种实施方式中，所述细胞是真核细胞并且选自下述细胞：CHO(例如CHO K1、DXB-11CHO、Veggie-CHO)、COS(例如COS-7)、视网膜细胞、Vero、CV1、肾(例如HEK293、293EBNA、MSR 293、MDCK、HaK、BHK)、HeLa、HepG2、WI38、MRC 5、Colo205、HB 8065、HL-60、(例如BHK21)、Jurkat、Daudi、A431(表皮)、CV-1、U937、3T3、L细胞、C127细胞、SP2/0、NS-0、MMT 060562、Sertoli细胞、BRL3A细胞、HT1080细胞、骨髓瘤细胞、肿瘤细胞和来源于前述细胞的细胞系。在各种实施方式中，所述细胞包括一种或多种病毒基因，例如表达病毒基因的视网膜细胞(例如PER.C6TM细胞)。
可以在多种培养基中培养用于生产所述双特异性抗体的哺乳动物宿主细胞。市售的培养基如Ham F10(西格玛)、基本必须培养基((MEM)，西格玛)、RPMI-1640(西格玛)和达尔贝科改良的伊格尔培养基((DMEM)，西格玛)适于培养所述宿主细胞。培养基可以根据需要补充激素和/或其他生长因子(如胰岛素、转铁蛋白或表皮生长因子)、盐类(如氯化钠、钙盐、镁盐和磷酸盐)、缓冲剂(如HEPES)、核苷(如腺苷和胸苷)、抗生素(如GENTAMYCINTM)、微量元素(定义为通常在终浓度中以微摩范围存在的无机化合物)和葡萄糖或等效的能量源。还可以以本领域技术人员公知的适宜浓度包含任意其他的添加剂。在各种实施方式中，培养条件如温度、pH等是所选择的用于表达的宿主细胞此前使用的那些并且对本领域技术人员而言将是显而易见的。
所述双特异性抗体可以作为分泌多肽从培养基中回收，但当直接生产而无分泌信号时其也可以从宿主细胞的裂解物中回收。如果所述双特异性抗体是膜结合的，则可以使用适宜的去垢剂(例如Triton-X 100)使其从膜上释放。
分离后，通过与一个、优选地全部两个抗原的pH依赖性结合的能力筛选双特异性抗体，所述双特异性抗体包含两个人源重链和单一人源轻链，所述人源轻链来源于包含至少一个非组氨酸密码子被组氨酸密码子取代的选自Vκ1-39Jκ5和Vκ3-20Jκ1序列的重排的人源轻链可变区基因序列。能够通过多种本领域可用和下述实施方式中描述的技术例如BIACORETM测定确定在中性和酸性pH下双特异性抗体与其抗原结合能力的不同(例如其显示出在酸性pH下与中性pH下相比t1/2降低的能力)。
生成具有pH依赖性抗原结合的抗原结合蛋白的其他方法
本申请提供了在本申请所述的经基因修饰的非人动物中生成具有pH依赖性抗原结合性质的抗原结合蛋白的各种方法。本申请还提供了在体外生成具有pH依赖性抗原结合性质的抗原结合蛋白的方法。这种方法可以涉及在经基因修饰的非人动物的体内生成各种抗原结合蛋白的成分，然后将其在生物体外修饰和组装，作为蛋白复合物在哺乳动物细胞培养中表达。
在一个实施方式中，生成具有pH依赖性抗原结合性质的抗原结合蛋白的所述方法利用了抗原结合蛋白序列，例如抗体序列，所述抗原结合蛋白序列在含有有限的轻链可变区V和J区段(例如人源轻链可变区V和J区段)的库的小鼠中生成，例如“通用轻链”或“共有轻链”小鼠(“ULC”小鼠)，如在美国专利申请公开号2011/0195454、2012/0021409、2012/0192300和2013/0045492中描述的小鼠。在一个实施方式中，生成具有pH依赖性抗原结合性质的抗原结合蛋白的所述方法利用了抗原结合蛋白序列，所述抗原结合蛋白序列在含有单一重排的人源轻链可变区基因序列的小鼠中生成。在一个实施方式中，所述方法利用了在小鼠中生成的抗原结合蛋白，所述小鼠含有选自人源Vκ1-39Jκ5和人源Vκ3-20Jκ1的单一重排的人源轻链可变区基因序列。
在一个实施方式中，用于生成具有pH依赖性抗原结合性质的抗原结合蛋白例如抗体的所述方法包含选择与目的抗原结合的第一抗体(例如以所需的亲和性与目的抗原结合)，修饰所述第一抗体的免疫球蛋白轻链核苷酸序列以包含至少一个非组氨酸密码子被组氨酸密码子的取代，在细胞中表达所述第一抗体的免疫球蛋白重链和经修饰的免疫球蛋白轻链，并且选择在所述细胞中表达的第二抗体，所述第二抗体在中性pH下与目的抗原结合(例如保持针对目的抗原的所需的亲和性)并且在酸性pH下显示出与目的抗原降低的结合。
在一个实施方式中，用于生成具有pH依赖性抗原结合性质的抗原结合蛋白例如抗体的所述方法包含选择来自抗体(例如从非人动物(例如小鼠，例如ULC小鼠)获得)的免疫球蛋白重链，所述抗体包含具有单一重排的人源免疫球蛋白轻链可变区序列的免疫球蛋白轻链，其中所述抗体与目的抗原结合(例如以所需的亲和性与目的抗原结合)；修饰所述免疫球蛋白轻链的核酸序列以使得所述单一重排的人源免疫球蛋白轻链可变区序列包含至少一个非组氨酸密码子被组氨酸密码子的取代；在其可变结构域中表达所选择的免疫球蛋白重链和含有至少一个氨基酸被组氨酸取代的免疫球蛋白轻链；并且选择在中性pH下保持与目的抗原的结合(例如保持针对目的抗原的所需的亲和性)而在酸性pH下显示出与目的抗原降低的结合的抗体。在各种实施方式中，所述免疫球蛋白重链来源于重排的人源重链可变基因区段(人源V、D和J区段)。
在一个实施方式中，用于生成具有pH依赖性抗原结合性质的抗原结合蛋白例如抗体的所述方法包含(1)使用目的抗原免疫非人动物例如小鼠，所述非人动物包含单一重排的人源轻链可变区基因序列和未经重排的人源重链可变基因区段(V、D和J区段)库并且使得小鼠生成针对所述抗原的免疫应答，(2)在所述非人动物中例如在所述小鼠中选择以所需的亲和性与目的抗原结合的抗体，(3)从所述非人动物例如从所述小鼠中分离以所需的亲和性与目的抗原结合的所述抗体的免疫球蛋白重链的核苷酸序列，(4)确定所述重链的核苷酸序列，(5)修饰含有所述单一重排的人源免疫球蛋白轻链可变区的免疫球蛋白轻链的核苷酸序列以包含至少一个非组氨酸密码子被组氨酸密码子的取代，(6)在细胞中表达以所需亲和性与目的抗原结合的所述抗体的免疫球蛋白重链和含有所述组氨酸取代的免疫球蛋白轻链，和(7)确定在细胞中表达的所述抗体是否在中性pH下保持与抗原结合而在酸性pH下显示出降低的结合。在一个实施方式中，在细胞中表达的所述抗体在中性pH下显示出与所述抗原所需的亲和性。在各种实施方式中，所述免疫球蛋白重链来源于人源重链可变基因区段(人源V、D和J区段)的重排。
在一个实施方式中，含有单一重排的人源轻链可变区基因序列的所述小鼠是在例如美国专利申请公开号2011/0195454、2012/0021409、2012/0192300和2013/0045492中描述的通用轻链或共有轻链“ULC”小鼠。在一个实施方式中，所述单一重排的人源轻链可变区基因序列选自人源Vκ1-39Jκ5和人源Vκ3-20Jκ1序列。
在一个实施方式中，所述目的抗原选自可溶性抗原、细胞表面抗原(例如肿瘤抗原)和细胞表面受体。在特定的实施方式中，所述细胞表面受体是免疫球蛋白受体。在特定的实施方式中，所述免疫球蛋白受体是Fc受体。
在一个实施方式中，以解离常数(KD)表示的抗体针对抗原所需的亲和性在中性pH下低于10-6M，例如低于10-8M，例如低于10-9M，例如低于10-10M，例如低于10-11M，例如低于10-12M。
如上文所解释的，所述ULC小鼠，在一个实施方式中，包含单一重排的人源免疫球蛋白轻链可变基因序列，并且表达针对所述抗原生成应答的抗体，其中抗体针对所述抗原的亲和性主要由抗体的重链所介导。这些小鼠包含人源重链可变(V、D和J)区段库，其重排以编码抗体的人源重链可变结构域，所述抗体还包含来源于单一重排的人源轻链可变序列的轻链。在一个实施方式中，在与抗原接触后，这些小鼠利用多样性的人源重链可变(V、D和J)区段库以生成对所述抗原具有亲和性和特异性的抗体。因此，在与所述抗原接触后，可以将在所述ULC小鼠中生成的所述抗体的免疫球蛋白重链的核苷酸序列分离并利用其生成所需的还含有来源于单一重排的人源免疫球蛋白轻链可变区序列的免疫球蛋白轻链(例如具有至少一个非组氨酸密码子被组氨酸密码子取代的单一重排的人源免疫球蛋白轻链可变区序列)的结合蛋白。
在所述ULC小鼠的一个实施方式中，90-100％的未经重排的非人源VH基因区段被至少一个未经重排的人源VH基因区段取代。在特定的实施方式中，全部或基本上全部(例如90-100％)的内源性非人源VH基因区段被至少一个未经重排的人源VH基因区段取代。在一个实施方式中，所述取代具有至少19个、至少39个或者至少80或81个未经重排的人源VH基因区段。在一个实施方式中，所述取代具有至少12个具有功能的未经重排的人源VH基因区段、至少25个具有功能的未经重排的人源VH基因区段或者至少43个具有功能的未经重排的人源VH基因区段。在一个实施方式中，所述非人源动物包含全部非人源DH和JH区段被至少一个未经重排的人源DH区段和至少一个未经重排的人源JH区段取代。在一个实施方式中，所述非人动物包含全部非人源DH和JH区段被全部未经重排的人源DH区段和全部未经重排的人源JH区段取代。因此，所述ULC小鼠利用多样性的人源可变区基因区段(V、D和J区段)库生成对目的抗原生成应答的抗体。
一旦与目的抗原结合并具有所需亲和性的抗体的重链被确定，分离所述重链的核苷酸序列并对其进行测序。将所述序列克隆至适宜的宿主细胞例如真核细胞例如CHO细胞表达的载体中。在一个实施方式中，所述人源重链恒定区的序列被克隆至从小鼠中(例如从ULC小鼠中)分离的人源重链可变区序列的下游。
在一个实施方式中，生成具有pH依赖性抗原结合性质的抗原结合蛋白包括修饰所述免疫球蛋白轻链的核苷酸序列，特别是所述单一重排的人源免疫球蛋白轻链可变区的序列，以使其包含至少一个非组氨酸密码子被组氨酸密码子取代。用于修饰核苷酸序列的各种技术是本领域公知的，例如定点诱变。此外，可以从头合成含有所需组氨酸突变的核苷酸序列。
在一个实施方式中，所述至少一个非组氨酸密码子被组氨酸密码子的取代包含导致一个、两个、三个、四个或更多个组氨酸残基的表达的取代。在一个实施方式中，所述取代导致三个或四个组氨酸残基的表达。在一个实施方式中，所述取代在免疫球蛋白轻链可变区中。在一个实施方式中，所述取代在CDR密码子(例如CDR1、CDR3和/或CDR3)。在一个实施方式中，所述取代在CDR3密码子中。
在一个实施方式中，其中所述免疫球蛋白轻链核酸序列包含Vκ1-39Jκ5基因序列，并且所述取代在CDR3密码子中，所述取代使得在选自105、106、108、111及其组合的位置表达组氨酸。在一个实施方式中，所述取代使得在位置105、106、108和111表达组氨酸。在一个实施方式中，所述取代使得在位置105和106表达组氨酸。在一个实施方式中，所述取代使得在位置105和108表达组氨酸。在一个实施方式中，所述取代使得在位置105和111表达组氨酸。在一个实施方式中，所述取代使得在位置106和108表达组氨酸。在一个实施方式中，所述取代使得在位置106和111表达组氨酸。在一个实施方式中，所述取代使得在位置108和111表达组氨酸。在一个实施方式中，所述取代使得在位置105、106和108表达组氨酸。在一个实施方式中，所述取代使得在位置105、106和111表达组氨酸。在一个实施方式中，所述取代使得在位置105、108和111表达组氨酸。在一个实施方式中，所述取代使得在位置106、108和111表达组氨酸。包含多个组氨酸取代的Vκ1-39Jκ5CDR3区的氨基酸和核酸序列如图16所示并包括在序列表中。
在一个实施方式中，其中所述免疫球蛋白轻链核酸序列包含Vκ3-20Jκ1基因序列，并且所述取代在CDR3密码子中，所述取代使得在选自105、106、107、109及其组合的位置表达组氨酸。在一个实施方式中，所述取代使得在位置105、106、107和109表达组氨酸。在一个实施方式中，所述取代使得在位置105和106表达组氨酸。在一个实施方式中，所述取代使得在位置105和107表达组氨酸。在一个实施方式中，所述取代使得在位置105和109表达组氨酸。在一个实施方式中，所述取代使得在位置106和107表达组氨酸。在一个实施方式中，所述取代使得在位置106和109表达组氨酸。在一个实施方式中，所述取代使得在位置107和109表达组氨酸。在一个实施方式中，所述取代使得在位置105、106和107表达组氨酸。在一个实施方式中，所述取代使得在位置105、106和109表达组氨酸。在一个实施方式中，所述取代使得在位置105、107和109表达组氨酸。在一个实施方式中，所述取代使得在位置106、107和109表达组氨酸。包含多个组氨酸取代的Vκ3-20Jκ1CDR3区的所选择的氨基酸和核酸序列如图27所示并包括在序列表中。
一旦所述免疫球蛋白轻链的序列例如人源免疫球蛋白轻链可变结构域被修饰以使得在所需位置包含组氨酸残基，则所述轻链的核苷酸序列被克隆至适宜在宿主细胞例如真核细胞例如CHO细胞中表达的载体中。在一个实施方式中，所述人源轻链恒定区的序列被克隆至所述经修饰的人源可变区核苷酸序列的下游。
在一个实施方式中，在适宜的宿主细胞例如真核宿主细胞例如CHO细胞中共表达含有编码经修饰的人源免疫球蛋白轻链和所选择的人源免疫球蛋白重链的核苷酸序列的载体以生成抗原结合蛋白。多种能够用于表达的宿主细胞是本领域所公知的并且在整个本说明书中被提及。
在所述宿主细胞中生成的抗原结合蛋白例如抗体可以分泌进入细胞上清液，针对正确的表达和在中性pH下对原始抗原的亲和性对其进行筛选。还可以从细胞裂解物中，或者如果是膜结合的，则使用去垢剂(例如Triton-X)使其从膜上释放，回收所述抗原结合蛋白。可以对具有所需特性的所述抗原结合蛋白进行纯化。
在一个实施方式中，含有组氨酸修饰的所述抗原结合蛋白保持了对所述抗原的亲和性，所述亲和性与不包含组氨酸取代的相同(原始)抗原结合蛋白对所述抗原的亲和性相当。在一个实施方式中，以解离常数(KD)表示的所述组氨酸修饰的抗原结合蛋白对所述目的抗原的亲和性在中性pH下低于10-6M，例如低于10-8M，例如低于10-9M，例如低于10-10M，例如低于10-11M，例如低于10-12M。
在一个实施方式中，含有本申请所述的组氨酸修饰的所述抗原结合蛋白例如抗体显示出pH依赖性的抗原结合性质。在一个实施方式中，含有组氨酸修饰的所述抗原结合蛋白与无所述组氨酸修饰的等价抗原结合蛋白(除组氨酸修饰外氨基酸序列相同的抗原结合蛋白)相比具有增加的pH依赖性性质。在一个实施方式中，本申请所述的抗原结合蛋白在中性pH下保持与所述抗原的结合(例如在中性pH下保持针对所述抗原的所需的亲和性)，但在酸性pH下显示出降低的结合。在一个实施方式中，本申请所述的抗原结合蛋白例如抗体在酸性pH下显示出不与所述抗原结合，但在中性pH下保持与所述抗原的结合。在一个实施方式中，本申请所述的抗原结合蛋白在酸性pH下具有的解离半衰期(t1/2)与在中性pH下相比降低至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约10倍、至少约15倍、至少约20倍、至少约25倍或至少约30倍。在一个实施方式中，本申请所述的抗原结合蛋白在酸性pH和37℃下具有的t1/2为约2min或更短。在一个实施方式中，本申请所述的抗原结合蛋白在酸性pH和37℃下具有的t1/2为约1min或更短。在一个实施方式中，本申请所述的抗原结合蛋白在酸性pH和25℃下具有的t1/2为约2min或更短。在一个实施方式中，本申请所述的抗原结合蛋白在酸性pH和25℃下具有的t1/2为约1min或更短。
在一个实施方式中，将含有本申请所述的组氨酸修饰的抗原结合蛋白例如抗体以治疗剂量施用给受试者后表现出与将不含组氨酸修饰的抗原结合蛋白(例如不含组氨酸修饰的原始抗原结合蛋白)以等价的治疗剂量施用后的相比增加的血清半衰期。在一些实施方式中，在施用一个剂量的含有本申请所述的组氨酸修饰的抗原结合蛋白后的血清半衰期与施用相同剂量的不含组氨酸修饰的抗原结合蛋白后的血清半衰期相比增加约2倍，例如约5倍、例如约10倍、例如约15倍、例如约20倍或更高。在一个实施方式中，血清半衰期是至少约1天，例如至少约2天、例如至少约7天、例如至少约14天、例如至少约30天、例如至少约60天。
除了用于生成上文所述的具有pH依赖性的抗原结合性质的抗原结合蛋白的体外方法以外，本申请还提供了通过所述方法生成的抗原结合蛋白例如抗体。此外，可以利用所述方法生成多特异性例如双特异性抗原结合蛋白，通过选择与小鼠中的共有(通用)轻链结合的两种不同的人源免疫球蛋白重链，确定所述重链的核苷酸序列，修饰通用轻链以包含如上文所述的组氨酸取代，并且在宿主细胞中共表达两条人源重链和单一的组氨酸修饰的通用轻链。用于生成上文所述的抗原结合蛋白的各个步骤均可以用于生成双特异性抗原结合蛋白的方法。经确证针对所述抗原具有所需的亲和性和pH依赖性抗原结合性质的双特异性抗原结合蛋白可以被纯化。因此，本申请提供了双特异性抗体，所述双特异性抗体包含两条人源重链和单一的人源轻链，所述人源轻链包含由人源可变区基因例如Vκ1-39Jκ5或Vκ3-20Jκ1可变区基因编码的人源轻链可变结构域序列，所述人源可变区基因包含至少一个非组氨酸密码子被组氨酸密码子的取代。
本申请还提供了用于制备抗原结合蛋白的构建体，所述抗原结合蛋白包含人源免疫球蛋白重链和含有组氨酸取代的人源免疫球蛋白轻链。本申请还提供了表达本申请所述的抗原结合蛋白例如抗体的宿主细胞。
实施例
本发明提供下述实施例以便向本领域的普通技术人员提供如何制备和使用本发明的完整公开和描述，而不是旨在限定发明人所认为的发明的范围。做出努力以确保所使用的数量(例如量、温度等)的准确度，但是应考虑一些实验误差和偏差。除非另有明示，份数以重量份计、分子量以平均分子量表示、温度以摄氏度表示，并且压力为处于或接近大气压。
实施例1：包含组氨酸取代的D基因区段的人源化免疫球蛋白重链基因座的构建
通过使用细菌人工染色体(BAC)DNA在细菌细胞(BHR)中进行一系列同源重组反应实施含有组氨酸取代的人源D基因区段的免疫球蛋白重链基因座的构建。使用基因工程技术生成用于产生基因工程小鼠的若干靶向构建体，所述基因工程小鼠表达含有一个或多个组氨酸残基的重链可变结构域(参见例如美国专利号和Valenzuela,D.M.et al.(2003),High-throughput engineering of the mouse genomecoupled with high-resolution expression analysis(与高分辨表达分析偶联的小鼠基因组的高通量工程改造),Nature Biotechnology 21(6):652-659)。
首先，通过计算模拟以四个片段(4个重复)的形式合成人源D基因区段，其中在亲水性框架中编码酪氨酸(Y)、天冬酰胺(N)、丝氨酸(S)、甘氨酸(G)和天冬氨酸(D)的密码子被组氨酸密码子取代(在下文中“组氨酸取代的人源D基因区段”，即HD 1.1-6.6(9586bp；SEQ ID NO:1)、HD 1.7-6.13(9268bp；SEQ ID NO:2)、HD 1.14-6.19(9441bp；SEQ ID NO:3)和HD 1.20-6.25,1.26(11592bp；SEQ ID NO:4)(图3)。所述四个重复还在末端含有用于将其重新连接在一起的独特的限制性内切酶位点。在各人源D基因区段中的组氨酸取代的特定位置(以粗体标记)如图1A和1B中标记为“亲水性”的一栏所示。如图1所示，所述修饰在亲水性阅读框架中引入组氨酸密码子的同时，还将“终止”阅读框架中的一些终止密码子变为丝氨酸密码子。然而，所述修饰几乎没有改变“疏水性”阅读框架。连接四个合成的D区段重复的详细程序如图3中所示(顺序连接)。所得到的克隆从5’至3’含有小鼠同源臂、翼侧为loxP位点的新霉素表达盒、含有组氨酸取代的人源D基因区段(即HD 1.1-6.6(9586bp；SEQID NO:1)、HD 1.7-6.13(9268bp；SEQ ID NO:2)、HD 1.14-6.19(9441bp；SEQ ID NO:3)和HD1.20-6.25,1.26(11592bp；SEQ ID NO:4))、氯霉素选择性表达和3’同源臂。
进行下述六个基因修饰以便使用上文所述的组氨酸取代的人源D基因区段在人源化小鼠中取代内源性人源D基因区段。
首先，将含有大观霉素选择性表达盒和AsiSI限制性位点的pLMa0174靶向至MAID1116克隆的5’末端(步骤1BHR(Spec)；图2)。在步骤1中，氯霉素选择性表达盒、新霉素选择性表达盒、loxP位点、两个VH基因区段(hVH1-3和hVH1-2)和人源Adam6p基因，其均位于hVH6-1的5’上游，将其均从MAID 1116克隆中缺失并使用大观霉素表达盒取代以产生VI433克隆。
其次，在步骤2中(BHR(Hyg+Spec)；图2)，将含有翼侧为FRT位点的潮霉素表达盒的pNTu0002靶向至含有人源免疫球蛋白DH基因区段的区域。在步骤2中，将全部的人源重链D基因区段从VI433中缺失并使用潮霉素表达盒取代以产生MAID6011VI 434(克隆1)。所述修饰还在潮霉素表达盒的5’和3’末端引入PI-SceI和I-CeuI限制性内切酶位点。
再次，通过限制性消化和连接将含有组氨酸取代的人源D基因区段(HD 1.1-6.6(9586bp；SEQ ID NO:1)、HD 1.7-6.13(9268bp；SEQ ID NO:2)、HD 1.14-6.19(9441bp；SEQID NO:3)和HD 1.20-6.25,1.26(11592bp；SEQ ID NO:4))的基因组区域引入在MAID6011VI434的PI-SceI和I-CeuI位点之间的区域(PI-SceI/I-CeuI连接修饰的1116(Kan+Spec)；图4)。其所产生的MAID6012VI469从5’至3’含有大观霉素表达盒、含有VH6-1的约50kb的基因组区域、翼侧为loxP位点的新霉素表达盒、约40kb的组氨酸取代的人源D基因区段(HD 1.1-6.6(9586bp；SEQ ID NO:1)、HD 1.7-6.13(9268bp；SEQ ID NO:2)、HD 1.14-6.19(9441bp；SEQ ID NO:3)和HD 1.20-6.25,1.26(11592bp；SEQ ID NO:4))和含有人源JH基因区段的约25kb的基因组区域，后接小鼠Ei(mIgH内含子增强子；SEQ ID NO:5)、小鼠转换区(SEQ ID NO:6)和小鼠IgM恒定区核苷酸序列(mIgM外显子1；SEQ ID NO:7)。基于卡那霉素和大观霉素选择选择含有所述修饰的细菌细胞。
第四，如图5中所示，通过电穿孔将MAID 6011VI434靶向至MAID 1460杂合子小鼠ES细胞以便从MAID 1460克隆中除去全部内源性人源D基因区段。其所产生的MAID 6011杂合子小鼠ES细胞在其免疫球蛋白重链基因座中(在129品系来源的染色体上)从5’至3’含有FRT位点、人源VH基因区段、包含adam6a/b基因的小鼠基因组区域、翼侧为FRT位点的潮霉素表达盒和人源JH区段，后接小鼠Ei序列和IgM恒定区核苷酸序列。通过使用如图6所示的探针和引物确证了MAID 6011的基因修饰(等位基因丧失、等位基因获得和存在母本等位基因)。
第五，使用电穿孔将MAID 6012VI469引入MAID 6011杂合子小鼠ES细胞以便将组氨酸取代的人源D基因区段(即HD 1.1-6.6(9586bp；SEQ ID NO:1)、HD 1.7-6.13(9268bp；SEQ ID NO:2)、HD 1.14-6.19(9441bp；SEQ ID NO:3)和HD 1.20-6.25,1.26(11592bp；SEQID NO:4))引入MAID 6011。所述靶向步骤从MAID 6011中除去翼侧为loxP位点的潮霉素选择性表达盒并且使用组氨酸取代的人源D基因区段取代所述序列。这使得MAID 6012杂合子ES细胞含有野生型C57BL/6品系来源的染色体和基因修饰的129品系来源的染色体，所述染色体含有人源野生型VH和JH基因区段和本申请所述的组氨酸取代的人源D基因区段。此外，含有小鼠基因组区域的ES细胞在VH和D区段之间含有adam6a/b基因和翼侧为loxP位点的新霉素表达盒(图7)。通过使用如图8所示的探针和引物确证了MAID 6012的基因修饰(等位基因丧失、等位基因获得和存在母本等位基因)。
最后，使用电穿孔将表达Cre重组酶的质粒引入MAID 6012ES细胞以便从MAID6012ES细胞中除去新霉素选择性表达盒，结果得到MAID 6013杂合子ES细胞(图9)。最终的MAID 6013杂合子(“MAID 6013het”)ES细胞含有野生型C57BL/6品系来源的染色体和基因修饰的129品系来源的染色体，所述129品系来源的染色体在其免疫球蛋白重链基因座中从5’至3’含有如图9所示的：(1)FRT位点；(2)人源VH基因区段；(3)包含adam6a/b基因的小鼠基因组区域；(4)翼侧为FRT位点的新霉素选择性表达盒；(5)组氨酸取代的人源D基因区段(HD 1.1-6.6(9586bp；SEQ ID NO:1)、HD 1.7-6.13(9268bp；SEQ ID NO:2)、HD 1.14-6.19(9441bp；SEQ ID NO:3)和HD 1.20-6.25,1.26(11592bp；SEQ ID NO:4))；(6)人源JH基因区段；后接(7)小鼠Ei序列(mIgH内含子增强子；SEQ ID NO:5)，(8)转换区(SEQ ID NO:6)；和(9)小鼠IgM恒定区核苷酸序列(mIgM外显子1；SEQ ID NO:7)。
使用上文所述的靶向的ES细胞(MAID 6013)作为供体ES细胞并且通过法将其引入8细胞阶段的小鼠胚胎(参见例如US 7,576,259、US 7,659,442、US 7,294,754、US 2008-0078000A1)。通过使用图8中所示引物和探针的基因分型对携带含有本申请所述的组氨酸修饰的人源重链D基因区段的基因修饰的免疫球蛋白重链基因座的小鼠进行鉴定。将所得到的基因修饰的F0小鼠与野生型小鼠交配以获得F1后代。对F1幼仔进行基因分型，并且选择针对含有组氨酸取代的人源重链D基因区段的基因修饰的免疫球蛋白基因座是杂合子的F1幼仔进行进一步表征。
实施例2：重排的重链可变区核苷酸序列的分析
接下来，检查是否所述基因修饰的小鼠含有本申请所述的组氨酸取代的人源D基因区段，例如6013F0杂合子小鼠，所述小鼠在其种系中含有129品系来源的染色体，所述染色体含有人源VH、JH基因区段和组氨酸取代的人源D基因区段(HD 1.1-6.6(9586bp；SEQ IDNO:1)、HD 1.7-6.13(9268bp；SEQ ID NO:2)、HD 1.14-6.19(9441bp；SEQ ID NO:3)和HD1.20-6.25,1.26(11592bp；SEQ ID NO:4))，所述小鼠能够表达重排的重链V(D)J序列，所述序列含有来源于基因修饰的免疫球蛋白重链基因座的一个或多个组氨酸密码子。
最后，通过逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)针对来源于组氨酸取代的人源D基因区段的IgM CDR3序列的存在情况分析从6013F0杂合子小鼠的脾脏B细胞中分离的mRNA序列。
简言之，收集脾脏并使用玻片在1xPBS(Gibco)中匀浆。在离心机中将细胞离心沉淀(500xg，5分钟)，并且在ACK裂解缓冲液(Gibco)中裂解红细胞3分钟。使用1xPBS洗涤细胞并使用0.7μm的细胞滤网过滤。使用针对CD19的MACS磁性阳性选择从脾细胞中分离B-细胞(德国美天旎生物公司(Miltenyi Biotec))。使用RNeasy Plus试剂盒(凯杰公司(Qiagen)从离心沉淀的B细胞中分离总RNA)。使用Direct mRNA微量试剂盒(凯杰公司(Qiagen))从总RNA中分离PolyA+mRNA。
使用SMARTerTM Pico cDNA合成试剂盒(美国克隆达公司(Clontech))通过5’RACE从脾脏B细胞中制备双链cDNA。使用英骏公司(Invitrogen)的Superscript II和dNTP代替克隆达公司的逆转录酶和dNTP。使用IgM恒定区特异性引物和SMARTerTM 5’RACE引物(表1)由cDNA扩增重链可变区(VH)抗体库。使用PCR纯化试剂盒(凯杰公司(Qiagen))纯化PCR产物。使用相同的5’RACE引物和嵌套的对IgM恒定区具有特异性的3’引物进行第二轮PCR(表2)。使用SizeSelectTM 系统(英骏公司(Invitrogen))纯化第二轮的PCR产物。使用加入454个适体和条形码的引物进行第三轮PCR。使用XP小珠纯化第三轮PCR产物。使用KAPA实验室定量试剂盒(KAPA生物系统公司(KAPA Biosystems))通过对纯化的PCR产物进行定量。使用454GS小型钛系列Lib-A emPCR试剂盒(罗氏诊断公司(Roche Diagnostics))对混合文库进行乳液PCR(emPCR)并且根据生产厂商的方案使用Roche 454GS小型仪器进行双向测序。
表1
表2
生物信息分析
根据样品条码的极佳匹配和对质量的整理对454条序列进行分类。使用在本地安装的igblast(NCBI,v2.2.25+)将重排的Ig序列与人源种系V、D和J区段数据库进行比对，根据比对结果对序列进行注释。当检测到具有相同评分的多个最佳命中时，将序列标记为不明确并从分析中除去。开发一组perl脚本以对结果进行分析并且在mysql数据库中存储数据。针对轻链CDR3区被定义为保守的C密码子和FGXG基序之间(SEQ ID NO:320)和针对重链CDR3区被定义为保守的C密码子和WGXG基序之间(SEQ ID NO:321)。仅使用生产的抗体确定CDR3的长度。
如图11-13所示，6013F0杂合子小鼠表达编码CDR3中的一个或多个组氨酸密码子的多样性的重排重链可变区mRNA序列(重排的V-D-J序列)的库。测序数据表明出现在CDR3中的组氨酸密码子来源于在本申请所述的6013小鼠的基因修饰的免疫球蛋白重链基因座中存在的多种组氨酸取代的人源D基因区段。
实施例3：在抗原特异性人源轻链中的组氨酸使用情况
对来自抗原特异性人源抗体的所选定的轻链的氨基酸序列进行比对。针对选定数量的抗原特异性人源抗体的人源Vκ1-39-来源的轻链CDR中的组氨酸突变进行鉴定(图15)。从经免疫的经工程改造以含有单一重排的人源Vκ1-39轻链并且携带在所述小鼠的抗体库中产生的体细胞高突变的小鼠(参见US 2011/0195454A1)中分离人源Vκ1-39-来源的轻链。
使用本领域公知的分子诱变技术将组氨酸残基工程改造进入重排的人源Vκ1-39轻链。经工程改造的残基的位置见图16。
构建含有工程改造的组氨酸残基的人源Vκ1-39-来源的轻链可变区并且在特异性针对人源细胞表面受体的抗体形式中将其与各种人源重链可变区配对以便在CHO细胞中对其表达情况进行分析。
将具有特定重链和具有所示组氨酸修饰(例如105、106、108、111)的轻链的CHO细胞接种于48孔板的孔中。次日，将与重链和轻链对应的等量(400ng)的DNA与转染试剂(Lipofectin 2000)混合，通过孵育使其形成复合物，并将该复合物加入至已铺板的细胞中。四天后，收集培养基。该培养基中含有所表达的抗体。
具有与在CDR3中含有一个或多个组氨酸取代的轻链配对的不同重链的CHO细胞表达得很好。对在CHO细胞上清液中抗体表达的水平(以ng/mL计)进行确定，所述CHO细胞被在轻链CDR3中的选定位点具有组氨酸残基工程改造的抗体基因转染。
通过蛋白印迹测定的CHO细胞上清液中使用选定重链的抗原特异性重链与经组氨酸工程改造的轻链配对的表达情况如图18所示。ULC指重排的人源Vκ1-39-来源的轻链。
在BIACORETM仪器上使用针对所述抗体的靶抗原(细胞表面受体序列)对培养基的分装物进行分析。在芯片上捕获抗体。抗体捕获水平如图19A-19J所示，以RU计。在BIACORETM芯片上捕获的抗体与含有靶抗原序列的流体接触。测定靶抗原的抗体捕获情况，以及结合速率和其他参数，如图所示。停止抗原流并且根据抗原从结合抗体上的分离情况确定解离速率。
使用BIACORETM T100仪器(GE医疗集团(GE Healthcare))通过SPR(表面等离子体共振)确定所选定抗体上清液的平衡解离常数(KD)(表观)。在pH 7.4和pH 5.75测定动力学。结果如图19A-19J所示。
如图19A-19J所示，抗体与细胞表面受体结合的数据显示所述组氨酸修饰直接影响了抗原(例如细胞表面受体)的结合，其在pH 7.4和pH 5.75下具有不同的亲和性，所述抗体的轻链被修饰以编码在CDR中特定位置的组氨酸残基且Vκ1-30/Jκ5轻链与所示的重链配对。需要的组氨酸修饰是在pH 7.4下保持结合但在pH 5.75下显示出较低的结合或检测不到结合。
实施例4：在抗原特异性人源轻链中的组氨酸残基的鉴定
在美国专利申请号13/022,759、13/093,156和13/412,936(公开号分别为2011/0195454、2012/0021409和2012/0192300)中描述了共有轻链小鼠(例如Vκ1-39or Vκ3-20共有轻链小鼠)的生成和在这些小鼠中抗原特异性抗体的生成。简言之，使用技术(参见例如美国专利号6,586,251和Valenzuela等，(2003)High-throughputengineering of the mouse genome coupled with high-resolution expressionanalysis(与高分辨表达分析偶联的小鼠基因组的高通量工程改造),Nature Biotech.21(6):652-659)制备重排的人源种系轻链靶向载体以修饰小鼠基因组细菌人工染色体(BAC)克隆，并且对基因组构建体进行工程改造以使其含有单一重排的人源种系轻链区并将其插入内源性κ轻链基因座，所述基因座此前已被修饰以缺失内源性κ可变和连接基因区段。然后使用靶向的BAC DNA电转染小鼠ES细胞以形成用于生成嵌合小鼠的经修饰的ES细胞，所述嵌合小鼠表达重排的人源种系Vκ1-39Jκ5或Vκ3-20Jκ1区。使用经靶向的ES细胞作为供体ES细胞并且通过法(参见例如美国专利号7,294,754和Poueymirou等，(2007)F0generation mice that are essentially fully derived from the donorgene-targeted ES cells allowing immediate phenotypic analyses(基本上完全来源于供体基因靶向的ES细胞并且能够进行直接的表型分析的F0代小鼠)Nature Biotech.25(1):91-99)将其引入8-细胞阶段的小鼠胚胎中。通过使用改良的等位基因测定(Valenzuela等，如上文所述)进行基因型分析鉴定独立地携带经工程改造的人源种系Vκ1-39Jκ5或Vκ3-20Jκ1轻链区的所述测定检测独特的重排的人源种系轻链区的存在情况。
将携带经工程改造的人源种系轻链基因座的小鼠(ULC小鼠)与含有内源性小鼠重链可变基因座被人源重链可变基因座取代的小鼠(参见US 6,596,541；小鼠，瑞恩泽制药公司(Regeneron Pharmaceuticals,Inc.))繁殖。
使用目的抗原攻击含有单一重排的人源种系轻链区的小鼠并且对含有通用轻链(例如Vκ1-39Jκ5)的抗体进行分离和测序。对所选定的来自在共有Vκ1-39Jκ5轻链小鼠中生产的抗原特异性人源抗体的轻链(A-K)的氨基酸序列进行比对。对所选定的若干抗原特异性人源抗体的人源Vκ1-39-来源的轻链CDR中的组氨酸突变进行了鉴定(图15)。种系Vκ1-39Jκ5可变结构域的部分氨基酸序列如上述比对和SEQ ID NO:325所示，完整可变结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO:404所示。
实施例5：组氨酸取代的人源通用轻链抗体的工程改造和表征
实施例5.1：组氨酸残基的工程改造以进入种系人源重排的轻链中
使用经特别设计以便在人源Vκ1-39Jκ5轻链的Q105、Q106、Y108和P111位置引入经工程改造的组氨酸残基的定点诱变引物将组氨酸残基工程改造进入重排的人源Vκ1-39Jκ5轻链。使用本领域公知的分子技术(例如QuikChange II XL定点诱变试剂盒，安捷伦科技(Agilent Technologies))进行定点诱变。在CDR3中经工程改造的残基的位置如图16所示，在图2中描述的组氨酸取代的CDR3的核酸序列如SEQ ID NO：328、330、332、334、336、338、340、342、344、346、348、350、352、354和356(对应于如SEQ ID NO：329、331、333、335、337、339、341、343、345、347、349、351、353、355和357所示的氨基酸序列)所示。种系重排的Vκ1-39Jκ5CDR3的核酸和氨基酸序列分别如SEQ ID NO：326和327所示。
实施例5.2：组氨酸工程改造的轻链的构建和表达
构建含有根据实施例2制备的种系工程改造的组氨酸残基的人源Vκ1-39-来源的轻链并将其与特异性针对人源细胞表面受体的多种人源重链(标记为1-5)配对以分析在CHO细胞中的表达。与组氨酸取代的Vκ1-39-来源的轻链配对的五条特异性针对人源细胞表面受体的人源重链来源于具有单一重排的人源轻链(人源Vκ1-39/Jκ5重排的轻链；参见US2011/0195454A1)的小鼠。
酶联免疫吸附试验(ELISA)：针对具有所示的组氨酸修饰的轻链和5条不同的重链，使用Fc ELISA对由CHO细胞分泌的抗体进行检测。所述轻链和重链序列(但针对所述修饰)在具有单一重排的人源轻链(例如人源Vκ1-39/Jκ5重排的轻链；参见US2011/0195454A1)的小鼠中生成。捕获抗体是山羊抗人IgG和检测抗体是山羊抗人(Fcγ特异性)-HRP。结果如图17所示。ULC+重链：特定的重链和未经修饰的人源Vκ1-39-来源的轻链。如图17所示，在所有的突变体中均检测到了表达。
蛋白免疫印迹。通过western印迹对CHO细胞上清液中表达的配对的抗原特异性重链和组氨酸工程改造的轻链对进行进一步分析。样品在4-12％的甘氨酸凝胶上进行电泳。使用选定重链(重链3)的结果如图18所示。ULC指重排的人源Vκ1-39-来源的轻链(如上文所述)。
实施例5.3：组氨酸工程改造的轻链的结合亲和性的测定
通过使用BIACORETM T200仪器(通用电气医疗集团(GE Healthcare))的SPR(表面等离子体共振)测定选定抗体上清液中的平衡解离常数(KD)、解离半衰期(t1/2)和其他动力学参数。在pH 7.4和pH 5.75下测定动力学。结果如图20A-20E所示。
使用实时表面等离子体共振生物传感器(Biacore T200)获得在中性pH(pH 7.4)和在酸性pH(pH 5.75)下抗体与免疫原结合的动力学结合性质(例如ka、kd、KD、t1/2等)的数值。使用小鼠抗-人Fc抗体将Biacore CM5传感器芯片衍生化以便从上清液中捕获抗体。然后将单一浓度(50nM)的免疫原以30μl/min的流速注射至捕获抗体的表面。监测2.5分钟抗体-抗原的结合，然后监测8分钟抗原从捕获抗体上的解离。使用Biacore T200评估软件1.0版通过物质转运模型将数据处理并拟合至1:1结合以确定动力学结合(ka)和解离(kd)速率常数。由动力学速率常数计算平衡解离常数(KD)和解离半衰期(t1/2)：KD(M)＝kd/ka；和t1/2(min)＝(ln2/(60*kd)。
如图20所示，在抗体与细胞表面受体的结合试验中，在5个抗体中具有组氨酸修饰的共有轻链(具有组氨酸修饰的CDR的Vκ1-39/Jκ5轻链)并且与抗原特异性人源重链配对的两个抗体显示出在pH 7.4和pH 5.75下以不同的亲和性与所述抗原(例如与细胞表面受体)结合。在pH 7.4下保持结合但在pH 5.75下显示出降低的结合或无可检测的结合的具有组氨酸修饰的抗体是所需要的。与在pH 7.4下相比，在pH 5.75下显示出降低的t1/2的具有组氨酸修饰的抗体是所需要的。
对含有组氨酸修饰的共有轻链和3种抗原特异性重链(标记为2、3和6)的三种抗体在不同pH下的抗原结合数据进一步汇总于图21。与在pH 7.4下相比，在pH 5.75下这些抗体显示出显著降低的抗原结合，其表现为例如在pH 5.75下t1/2降低或检测不到结合。
实施例6：包含组氨酸取代的Vκ1-39Jκ5通用轻链的基因修饰小鼠的工程改造和表征
实施例6.1：用于在重排的人源轻链可变区工程改造组氨酸残基的靶向载体的构建
由本领域公知的标准分子克隆技术并使用靶向载体制备的基因修饰的小鼠，所述小鼠含有具有组氨酸残基工程改造进入人源轻链的CDR区的重排的人源轻链基因。
简言之，使用技术(参见例如美国专利号6,586,251和Valenzuela等，(2003)High-throughput engineering of the mouse genome coupled with high-resolution expression analysis(与高分辨表达分析偶联的小鼠基因组的高通量工程改造),Nature Biotech.21(6):652-659)制备多种重排的人源种系轻链靶向载体以修饰小鼠基因组细菌人工染色体(BAC)DNA，以使其含有单一重排的人源种系轻链区并将其插入内源性κ轻链基因座，所述基因座此前以被修饰以缺失内源性κ可变和连接基因区段。所述重排的人源种系轻链区在轻链序列中的一个或多个核苷酸位置被修饰以编码在所述种系的相应位置正常不存在的组氨酸残基。将所述靶向载体电穿孔进入小鼠胚胎干(ES)细胞以创造并且使用定量PCR检测(例如TAQMANTM)确证。
特别地，构建这些靶向载体的策略如图23A-23F所示。使用如图22所示的位点定向诱变引物通过位点定向诱变(QuickChange II XL试剂盒)在CDR3区中使用组氨酸残基取代Q105、Q106、Y108和P111或者Q106、Y108和P111对生成用于共有(通用)轻链小鼠(在例如US2011/0195454A1中描述的“ULC小鼠”)的靶向载体使用的质粒进行修饰，所述质粒含有pBS+FRT-Ub-Hyg-FRT+小鼠Vκ3-7前导+人源Vκ1-39Jκ5(针对该工程改造步骤见图23A)。对所得到的载体(H105/106/108/111和H106/108/111)进行进一步修饰并且连接至含有小鼠Igκ恒定区、小鼠增强子、小鼠3’同源臂和SPEC表达盒的载体(图23B)。进一步的修饰包含连接至携带5’小鼠臂并含有Frt-Ub-NEO-Frt表达盒的载体中(图23B)。将所得到的靶向载体电穿孔进入含有小鼠Igκ可变基因座(含有κ可变和连接基因区段)缺失的ES细胞中(图23C-23F)。
通过使用对插入内源性κ轻链基因座的工程改造的Vκ1-39Jκ5轻链区具有特异性的探针的改良的等位基因测定(Valenzuela等)对阳性ES细胞克隆进行确证。在该检测中使用的引物和探针如下表3中和序列表中所示；所述探针的位置如图23C-23F所示。
表3：用于ES细胞筛选的引物和探针
通过用表达FLP的质粒转染ES细胞从而缺失由靶向构建体引入的NEO选择表达盒(图23C和23E)。任选地，可以通过与表达FLP重组酶的小鼠(例如US 6,774,279)繁殖除去新霉素表达盒。任选地，在小鼠中保留新霉素表达盒。
使用上文所述的经靶向的ES细胞作为供体ES细胞并且通过法(参见例如美国专利号7,294,754和Poueymirou等，(2007) F0 generation mice that areessentially fully derived from the donor gene-targeted ES cells allowingimmediate phenotypic analyses(基本上完全来源于供体基因靶向的ES细胞并且能够进行直接的表型分析的F0代小鼠)NatureBiotech. 25(1): 91-99)将其引入8-细胞阶段的小鼠胚胎。由如上文所述的经靶向的ES细胞制备的独立地携带经工程改造的人源轻链基因，所述经工程改造的人源轻链基因含有突变进入所述序列的一个或多个位置的组氨酸残基。
对胎仔进行基因分析并选择针对经工程改造的组氨酸修饰的人源轻链的胎仔杂合子表征所述轻链的表达和所表达的抗体的结合能力。用于特定含有具有三个(H106/108/111；“1930”)或四个(H105/105/108/111； “1927”)组氨酸修饰的通用轻链基因的小鼠进行基因分型的引物和探针列于下表4和如序列表中所示。在其通用轻链中含有组氨酸修饰的小鼠在本申请中称为“HULC”小鼠(组氨酸通用轻链小鼠)。
表4：基因分型使用的引物和探针
实施例6.2：在具有组氨酸取代的通用轻链的小鼠中对抗原免疫应答的分析
使用细胞表面受体(“抗原A”)作为免疫原免疫小鼠，所述小鼠针对利用在CDR3中具有4个组氨酸取代的Vk1-39和Jk5预先设定的人源к轻链的表达是杂合子(在下文中表示为“HULC 1927”)或针对利用在CDR3中具有3个组氨酸取代的Vk1-39和Jk5预先设定的人源к轻链的表达是杂合子(在下文中表示为“HULC 1930”)，或者是纯和的WT小鼠。在免疫接种开始前从小鼠中收集免疫前的血清。初始激发免疫时，通过足跖(f.p.)以25μl的体积施用混合了10μg CpG寡核苷酸作为佐剂(英骏公司(Invivogen))的2.35μg蛋白的免疫原。随后，通过相同的途径在第3、6、11、13、17、20天时共计6次对小鼠进行加强免疫，使用2.35μg抗原A以及10μg CpG和25μg Adju-Phos(德国邦泰(Brenntag))作为佐剂。分别在第15天和第22天在第4次和第6次加强免疫后对小鼠进行取血。对其抗血清进行检测以测定针对抗原A的抗体效价。
通过标准的ELISA测定针对抗原的抗体血清效价。为进行ELISA，使用含2μg/ml抗原A的磷酸盐缓冲液(PBS，欧文科学(Irvine Scientific))在4℃下将96孔微量滴定板(美国赛默飞公司(Thermo Scientific))包被过夜。次日，使用洗板机(分子装置(MolecularDevices))用含0.05％吐温20的磷酸盐缓冲液(PBS-T，西格玛奥德里奇(Sigma-Aldrich))洗板4次。然后使用250μl含0.5％牛血清白蛋白(BSA，西格玛奥德里奇(Sigma-Aldrich))的PBS封闭板并在室温下孵育1小时。然后使用PBS-T洗板4次。以初始1:300或1:1000的比例使用0.5％BSA-PBS三倍逐级稀释来自已免疫小鼠的血清和免疫前的血清，以双复孔加入已封闭的板中，然后在室温下孵育1小时。留出最后两孔空白作为二抗对照(本底对照)。在洗板机中再使用PBS-T洗板4次。然后以1:5000/1:10,000的稀释度将山羊抗小鼠IgG-Fc-辣根过氧化物酶(HRP)偶联的二抗(杰克逊免疫研究(Jackson Immunoresearch))加入板中并在室温下孵育1小时。然后使用PBS-T洗板8次并使用TMB/H2O2作为底物显色。将所述底物孵育20min并使用2N硫酸(H2SO4,VWR,cat#BDH3500-1)或1N磷酸(JT Baker,Cat#7664-38-2)终止反应。在450nm下在分光光度计(胜利者，铂金埃尔默(Victor,Perkin Elmer))上读板。使用图解PRISM软件计算抗体的效价。
通过注射免疫原在小鼠中诱导的免疫应答以抗体效价表示，将效价定义为在抗原结合吸光度比本底高两倍时最高血清稀释度的倒数。因此，该数值越高，针对所述免疫原产生的体液免疫应答越强。在两个品系的HULC小鼠和在WT小鼠中所述免疫原诱导的抗体效价均非常高，在这些品系之间未观察到显著差异(图24)。
实施例6.3：pH敏感性单克隆抗体的生成
当在这两个品系HULC小鼠和在WT小鼠中针对所述免疫原均达到所需的免疫应答时，从各小鼠品系中收集脾细胞并与小鼠骨髓瘤细胞融合以生成杂交瘤细胞，使其在96孔板中生长。在生长10天后，通过免疫原特异性ELISA对含有各杂交瘤细胞的孔的上清液进行筛选以鉴定阳性抗原结合样品。对于ELISA而言，使用1ug/mL抗-myc多克隆抗体(诺伟思生物制品(Novus Biologicals)，#NB600-34)在4℃下将96孔微量滴定板包被过夜以固定带有myc标签的抗原，随后使用含有0.5％(w/v)BSA的PBS溶液封闭。洗板，以1μg/mL的浓度将抗原溶液加入板中并使其在室温下与已包被的板结合1小时。随后，以1:50的稀释度将来自杂交瘤细胞的上清液加入所述孔中并使其在室温下结合1小时。使用与HRP(杰克逊免疫研究(Jackson Immunoresearch)，#115-035-164)偶联的抗小鼠IgG多克隆抗体检测与板结合的抗体。将TMB底物加入板(BD生物科学公司(BD Biosciences)，#51-2606KC/51-2607KC)中并根据生产厂商推荐的方案对色度信号进行显色。在Victor Wallac读板仪上在450nm记录吸光度。使用实时表面等离子体共振生物传感器(Biacore 4000)对定义为OD等于或大于0.5(具有OD为约0.1的基线)的抗原阳性样品进行亲和性筛选。
记录在中性pH(pH 7.4)和在酸性pH(pH 6.0)下抗体与所述免疫原结合的动力学结合参数(例如ka、kd、KD、t1/2等)。使用多克隆的山羊抗小鼠Fc抗体将Biacore CM4传感器芯片衍生化以便从上清液中捕获抗体。然后将单一浓度(100nM)的免疫原以30μl/min的流速注射至捕获抗体的表面。监测1.5分钟抗体-抗原的结合，然后监测2.5分钟抗原从捕获抗体上的解离。使用Biacore 4000评估软件1.0版通过物质转运模型将数据处理和拟合至1:1结合确定动力学结合(ka)和解离(kd)速率常数。由动力学速率常数计算平衡解离常数(KD)和解离半衰期(t1/2)：KD(M)＝kd/ka；和t1/2(min)＝(ln2/(60*kd)。选择一系列与在pH 7.4下相比在pH 6.0下显示出降低的结合的样品(pH敏感性)以及一系列在pH 7.4和pH 6.0之间显示出无显著的速率改变的对照样品(pH不敏感的对照)克隆生产。图25显示了对来自HULC和WT小鼠的抗原阳性总数和显示出pH敏感性抗原结合的抗原阳性数量的比较。
在抗原阳性中，从两个杂合子HULC1927小鼠和两个HULC1930中分别分离了18个和7个克隆，以及从WT小鼠的有1个克隆，这些克隆被制成单克隆。对单克隆杂交瘤的上清液进行中性和低pH下的抗原解离速率(解离速率)分析并使用细胞球团(pellets)进行轻链可变结构域DNA测序。
实施例6.4：在基于Vκ1-39Jκ5的组氨酸通用轻链小鼠的CDR3区中的测序和体细胞高突变
使用来自HULC和WT小鼠单克隆杂交瘤的细胞球团进行轻链可变结构域DNA测序。在被制成单克隆(参见上述的实施例3.3)并测序的26个克隆中，有15个已确证使用HULC或WT小鼠的轻链(MM和NN，见表4)。14个克隆来源于HULC杂合子小鼠(1927或1930小鼠)以及1个来源于WT小鼠。
在来源于HULC杂合子小鼠的14个抗原阳性样品中，12个单克隆抗体利用其相应的HULC轻链，而2个利用WT小鼠轻链。如表3中所示除了一个以外全部的利用HULC的抗体保留了全部所引入的组氨酸突变(以斜体表示的抗体)。对克隆AA的测序产生了2个不同的HULC序列，这在表5中以两个条目表示。
表5：在来自利用HULC轻链的克隆的轻链序列中保守的组氨酸插入和体细胞高突变的数量
实施例6.5：在基于Vκ1-39Jκ5的组氨酸通用轻链小鼠中产生的单克隆抗体的pH依赖性结合
为了进一步评估分离自HULC和WT小鼠的单克隆抗体的pH依赖性结合特性，进行结合实验，在实验中观察了在中性pH下抗体/抗原的结合相和在中性或酸性pH下观察了抗体/抗原的解离相。
使用多克隆的家兔抗小鼠Fc抗体将Biacore CM4传感器芯片衍生化。将单克隆抗体上清液捕获于抗小鼠Fc传感器的表面上。将两个浓度50nM(双复管)和16.7nM的免疫原以30μl/min的流速注射至捕获单克隆抗体的表面。在pH 7.4下监测4分钟抗体-抗原的结合，然后在pH 7.4或6.0下监测15分钟抗原从捕获单克隆抗体上的解离。使用Scrubber2.0版曲线拟合软件处理和拟合数据以确定解离(kd)速率常数并且如表6所示。由解离速率常数计算解离半衰期(t1/2)：t1/2(min)＝(ln2/kd)/60，并且如表6所示。显示表4中所列的若干抗体在各种pH条件下的结合/解离特性的传感图在图26中图解显示。在各图中的各条线表示在各抗体的不同浓度下的结合应答。所有实验均在25℃下进行。解离半衰期的值(t1/2)见上述的各传感图。应答以RU计。
表6：在中性和低pH下单克隆的HULC或WT抗体与其免疫原结合的解离(kd)速率常数和解离半衰期(t1/2)
*由于抗原结合信号较低不能确定kd和t1/2值
实施例7：含有组氨酸取代的Vκ3-20Jκ1通用轻链的基因修饰的小鼠的工程改造
如在例如美国专利申请号13/022,759、13/093,156、13/412,936和13/488,628(公开号分别为2011/0195454、2012/0021409、2012/0192300和2013/0045492)和在上述的实施例1中描述的生成含有共有Vκ3-20Jκ1轻链的小鼠。所述种系通用Vκ3-20Jκ1轻链可变结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO:383所示。
将组氨酸取代引入Vκ3-20Jκ1通用轻链靶向载体并且使用与在上述针对Vκ1-39Jκ5组氨酸修饰的通用轻链小鼠(HULC 1927和1930)的实施例3中所描述的类似策略由所述靶向载体生成小鼠。
简言之，用于生成组氨酸修饰的Vκ3-20Jκ1通用轻链靶向载体的策略总结于图29A-129D。使用如图28所示的定点诱变引物通过定点诱变(QuickChangelightning Kit)在CDR3区中使用组氨酸残基取代Q105、Q106、Y107和S109或者Q105、Q106和S109(见图27中的比对)对生成用于共有(通用)轻链小鼠(在例如US2011/0195454A1中描述的“ULC小鼠”)的靶向载体使用的质粒进行修饰，所述质粒含有pBS+FRT-Ub-Hyg-FRT+小鼠Vκ3-7前导+人源Vκ3-20Jκ1(针对该工程改造步骤见图29A)。对所得到的载体(H105/106/107/109和H105/106/109)进行进一步修饰并且连接至含有小鼠Igκ恒定区、小鼠增强子、小鼠3’同源臂和SPEC表达盒的载体(图29B)。进一步的修饰包含连接引入携带5’小鼠臂并含有Frt-UB-NEO-Frt表达盒的载体中(图29B)。将所得到的靶向载体电穿孔进入含有小鼠Igκ可变基因座(含有κ可变和连接基因区段)缺失的ES细胞中(图29C-29D)。
通过使用对插入内源性κ轻链基因座的工程改造的Vκ3-20κJ1轻链区具有特异性的探针的改良的等位基因测定(Valenzuela等)对阳性ES细胞克隆进行确证。在该检测中使用的引物和探针如下表7中和序列表中所示；所述探针的位置如图29C-29D所示。
表7：用于ES细胞筛选的引物和探针
通过使用表达FLP的质粒转染ES细胞缺失由靶向构建体引入的NEO选择表达盒(图29C和29D)。任选地，可以通过与表达FLP重组酶的小鼠(例如US 6,774,279)繁殖除去新霉素表达盒。任选地，在小鼠中保留新霉素表达盒。
使用上文所述的经靶向的ES细胞作为供体ES细胞并且通过法(参见例如美国专利号7,294,754和Poueymirou等，(2007)F0generation mice that areessentially fully derived from the donor gene-targeted ES cells allowingimmediate phenotypic analyses(基本上完全来源于供体基因靶向的ES细胞并且能够进行直接的表型分析的F0代小鼠)Nature Biotech.25(1):91-99)将其引入8-细胞阶段的小鼠胚胎。由如上文所述的经靶向的ES细胞制备的独立地携带经工程改造的人源轻链基因，所述经工程改造的人源轻链基因含有突变进入所述序列的一个或多个位置的组氨酸残基。
对胎仔进行基因分析并选择针对经工程改造的组氨酸修饰的人源轻链的胎仔杂合子表征所述轻链的表达和所表达的抗体的结合能力。用于特定含有具有三个(H105/106/109；“6183”)或四个(H105/105/108/111；“6181”)组氨酸修饰的通用轻链基因的小鼠进行基因分型的引物和探针列于下表6和如序列表中所示。在其通用轻链中含有组氨酸修饰的小鼠在本申请中称为“HULC”小鼠(组氨酸通用轻链小鼠)。
表8：用于基因分型的引物和探针
使用目的抗原免疫小鼠并对其生成具有pH依赖性结合的抗体的能力进行检测。
实施例8：含有组氨酸取代的单一重排的人源通用轻链(HULC)的小鼠的繁殖
本实施例描述了能够与本申请所述的任意一种HULC小鼠繁殖以形成含有多个基因修饰的免疫球蛋白基因座的多重基因修饰的小鼠品系的若干其他基因修饰的小鼠品系。
内源性Igλ的敲除(KO)。为了优化经工程改造的轻链基因座的使用情况，可以将上文所述的任意一种HULC小鼠(例如含有Vκ1-39Jκ5或Vκ3-20Jκ1组氨酸取代的通用轻链)与在内源性λ轻链基因座中含有缺失的另一种小鼠繁殖。在这种方法中，作为其唯一的轻链，所获得的后代将表达如上述实施例3和4中所述的重排的组氨酸取代的人源种系轻链区。通过本领域公知的标准技术进行繁殖，或者委托商业繁殖机构(例如杰克逊实验室公司(TheJackson Laboratory))。针对存在独特轻链区和缺乏内源性小鼠λ轻链，筛选携带经工程改造的组氨酸取代的轻链基因座和内源性λ轻链基因座缺失的小鼠品系。
人源化内源性重链基因座。将携带经工程改造的人源种系轻链基因座的小鼠(HULC小鼠)与含有内源性小鼠重链可变基因座被人源重链可变基因座取代的小鼠(参见US6,596,541；小鼠，瑞恩泽制药公司(Regeneron Pharmaceuticals,Inc.))繁殖。小鼠包含含有与内源性小鼠恒定区基因座可操作地连接的人源重链可变区的基因组，以使得所述小鼠针对抗原刺激应答产生含有人源重链可变结构域和小鼠重链恒定区的抗体。
获得了携带内源性小鼠重链可变区基因座被人源重链可变区基因座取代并且在内源性λ轻链基因座具有组氨酸取代的单一重排的人源轻链可变区的小鼠。在使用目的抗原免疫接种后获得含有体细胞突变的重链(人源重链可变结构域和小鼠CH)和组氨酸取代的单一人源轻链(HULC，人源轻链可变结构域和小鼠CL)的反向嵌合抗体。使用本领域公知的或上文所述的抗体分离和筛选方法鉴定在这种小鼠中生产的pH依赖性人源抗体。鉴定了表达所述抗体例如pH敏感性抗体的B细胞的可变轻链和重链核苷酸序列并且通过在适宜的表达系统中将可变重链和轻链区核苷酸序列分别与人源CH和CL核苷酸序列融合制备全人源抗体。
实施例9：基因修饰的小鼠的后代
将携带经工程改造含有本申请所述的重排的人源轻链可变区序列或单一重排的人源轻链可变区序列的有限库的人源种系轻链基因座的小鼠(HULC小鼠)与含有本申请所述的组氨酸修饰的人源重链可变基因座的小鼠繁殖。获得小鼠并且通过基因分型确证含有组氨酸修饰的人源轻链可变区的轻链序列和含有组氨酸修饰的人源重链可变区的重链序列的存在情况。
通过使用目的抗原免疫获得反向嵌合抗体，所述抗体含有组氨酸修饰的重链(人源组氨酸修饰的重链可变结构域和小鼠CH)和组氨酸修饰的单一人源轻链(HULC，人源组氨酸修饰的轻链可变结构域和小鼠CL)。采用本领域公知的或上文所述的抗体分离和筛选方法鉴定在这种小鼠中生成的pH依赖性人源抗体。鉴定表达所述抗体的B细胞的可变轻链和重链区核苷酸序列，所述抗体如pH依赖性抗体，并且通过在适宜的表达系统中分别将所述可变重链和轻链区核苷酸序列与人源CH和CL核苷酸序列融合制备全人源抗体。
等价物
本领域技术人员使用不超过常规实验将识别或能够确定本申请所述的本发明特定实施方式的多种等价物。这些等价物旨在被包括在下述权利要求中。尽管已参照其特定的实施方式对本发明进行了描述，但是本领域技术人员应理解在不脱离本发明真实精神和范围的前提下可以对其进行各种改变和可以用等价物替代。此外，对所述发明客观的精神和范围，可以进行采用特定情况、材料、物质的组合物、工艺、工艺步骤或步骤进行多种修订。所有这些修订均旨在所附权利要求的范围内。

Claims (36)

1.一种制备基因修饰的非人动物的方法，所述方法包括修饰所述非人动物使其在其种系中包括第一免疫球蛋白可变基因座，所述第一免疫球蛋白可变基因座包括未经重排的免疫球蛋白重链可变区核酸序列，所述未经重排的免疫球蛋白重链可变区核酸序列包括插入至少一个组氨酸密码子或用组氨酸密码子取代至少一个非组氨酸密码子，其中所述插入或取代的组氨酸密码子不由相应的野生型种系的未经重排的免疫球蛋白可变区核酸序列编码。
2.根据权利要求1所述的方法，进一步包括修饰所述非人动物使其在其种系中包括第二免疫球蛋白可变基因座，所述第二免疫球蛋白可变基因座包括免疫球蛋白轻链可变区核酸序列，所述免疫球蛋白轻链可变区核酸序列包括插入至少一个组氨酸密码子或用组氨酸密码子取代至少一个非组氨酸密码子，其中所述插入或取代的组氨酸密码子不由相应的野生型种系的免疫球蛋白可变区核酸序列编码。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述第一免疫球蛋白可变基因座包括未经重排的重链可变区核酸序列的功能性部分，所述未经重排的重链可变区核酸序列的功能性部分包括未经重排的VH、DH和JH基因区段和所述插入或取代的组氨酸。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述未经重排的VH、DH和JH基因区段是未经重排的人源VH、未经重排的人源DH和未经重排的人源JH基因区段。
5.根据权利要求3所述的方法，其中所述未经重排的VH、DH和JH基因区段是至少一个未经重排的人源VH基因区段、包含接头的合成的D区段和人源JH基因区段。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述合成的D区段包括至少一个组氨酸密码子。
7.根据权利要求2所述的方法，其中所述第二免疫球蛋白可变基因座包括未经重排的轻链可变区核酸序列的功能性部分，所述未经重排的轻链可变区核酸序列的功能性部分包括未经重排的VL和未经重排的JL基因区段和所述插入或取代的组氨酸。
8.根据权利要求2所述的方法，其中所述第二免疫球蛋白可变基因座包括重排的免疫球蛋白轻链可变区核酸序列，所述重排的免疫球蛋白轻链可变区核酸序列包括与JL基因区段重排的VL基因区段和所述插入或取代的组氨酸。
9.根据权利要求1所述的方法，其中所述插入或取代的组氨酸密码子是在编码可变结构域的核酸序列中并且所述组氨酸密码子在选自下述的区域中：免疫球蛋白链的N-末端区、免疫球蛋白链的环4区、重链的CDR1、重链的CDR2、重链的CDR3、轻链的CDR1、轻链的CDR2、轻链的CDR3及以上区域的组合。
10.根据权利要求2所述的方法，其中所述第一免疫球蛋白可变基因座或第二免疫球蛋白可变基因座中的至少一个可操作地与在内源性非人源免疫球蛋白基因座的内源性非人源恒定区核酸序列连接。
11.根据权利要求4所述的方法，其中所述未经重排的人源VH、未经重排的人源DH和未经重排的人源JH基因区段可操作地与内源性非人源免疫球蛋白重链恒定区核酸序列连接。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述内源性非人源免疫球蛋白重链恒定区核酸序列在内源性非人源免疫球蛋白基因座中。
13.根据权利要求7所述的方法，其中所述未经重排的VL和未经重排的JL基因区段可操作地与内源性非人源免疫球蛋白轻链恒定区序列连接。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述内源性非人源免疫球蛋白轻链恒定区序列在内源性非人源免疫球蛋白基因座。
15.根据权利要求1所述的方法，其中所述可变区核酸序列包含2、3、4或5个组氨酸的簇，所述组氨酸的簇为组氨酸密码子对非组氨酸密码子的取代和/或组氨酸密码子的插入。
16.根据权利要求4所述的方法，其中所述未经重排的重链基因座包含与所述重链基因座的方向相反的D基因区段。
17.根据权利要求2所述的方法，其中所述第一免疫球蛋白可变基因座包括包含所述插入或取代的组氨酸密码子的未经重排的免疫球蛋白重链可变区核酸序列，其中所述组氨酸密码子不是由相应的野生型种系基因区段编码；以及，
其中所述第二免疫球蛋白可变基因座包括包含所述插入或取代的组氨酸密码子的未经重排的免疫球蛋白轻链可变区核酸序列，其中所述组氨酸密码子不是由相应的野生型种系基因区段编码。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述未经重排的免疫球蛋白重链可变区核酸序列包括至少一部分功能性未经重排的人源免疫球蛋白重链可变区核酸序列，所述至少一部分功能性未经重排的人源免疫球蛋白重链可变区核酸序列包括未经重排的人源VH、未经重排的人源DH和未经重排的人源JH基因区段和所述插入或取代的组氨酸密码子。
19.根据权利要求17所述的方法，其中所述未经重排的免疫球蛋白轻链可变区核酸序列包括至少一部分功能性未经重排的人源免疫球蛋白轻链可变区核酸序列，所述至少一部分功能性未经重排的人源免疫球蛋白轻链可变区核酸序列包括未经重排的人源VL和未经重排的人源JL基因区段和所述插入或取代的组氨酸密码子。
20.根据权利要求17所述的方法，其中所述非人动物是啮齿动物。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述啮齿动物选自小鼠、大鼠和仓鼠。
22.根据权利要求17所述的方法，其中所述未经重排的免疫球蛋白重链可变区核酸序列包括未经重排的人源免疫球蛋白重链可变区核酸序列的至少功能性部分，所述未经重排的人源免疫球蛋白重链可变区核酸序列的至少功能性部分包括未经重排的人源VH、未经重排的人源DH和未经重排的人源JH基因区段并可操作地与非人源重链恒定区基因序列连接，其中一个或多个所述未经重排的人源VH、DH和JH基因区段包含所述插入或取代的组氨酸密码子，其中所述组氨酸密码子不是由相应的人源种系基因区段编码；以及
其中所述未经重排的轻链可变区核酸序列包括未经重排的人源免疫球蛋白轻链可变区序列的至少功能性部分，所述未经重排的人源免疫球蛋白轻链可变区核酸序列的至少功能性部分包括未经重排的人源VL和未经重排的人源JL区段并可操作地与非人源轻链恒定区基因序列连接，其中一个或多个所述未经重排的人源VL和JL基因区段包含所述插入或取代的组氨酸密码子，其中所述组氨酸密码子不是由相应的人源种系基因区段编码；
其中所述非人动物表达包含来源于所述非人动物种系中的组氨酸取代或组氨酸插入的免疫球蛋白重链可变结构域和/或免疫球蛋白轻链可变结构域。
23.根据权利要求22所述的方法，其中所述非人动物是哺乳动物。
24.根据权利要求23所述的方法，其中所述哺乳动物是啮齿动物。
25.根据权利要求24所述的方法，其中所述啮齿动物选自下组：小鼠、大鼠和仓鼠。
26.根据权利要求22所述的方法，其中所述非人源重链恒定区基因序列在所述非人动物种系中的内源性非人源免疫球蛋白基因座中。
27.根据权利要求26所述的方法，其中所述非人源轻链恒定区基因序列是在所述非人动物种系中的内源性非人源免疫球蛋白基因座中的非人源恒定区基因序列。
28.根据权利要求2所述的方法，其中所述第一免疫球蛋白可变基因座包括包含所述插入或取代的组氨酸密码子的未经重排的免疫球蛋白重链可变区核酸序列，其中所述组氨酸密码子不是由相应的野生型种系基因区段编码；以及，
其中所述第二免疫球蛋白可变基因座包括包含所述插入或取代的组氨酸密码子的重排的免疫球蛋白轻链可变区核酸序列，其中所述组氨酸密码子不是由相应的野生型种系基因区段编码。
29.根据权利要求28所述的方法，其中所述非人动物是啮齿动物。
30.根据权利要求29所述的方法，其中所述啮齿动物选自小鼠、大鼠和仓鼠。
31.根据权利要求28所述的方法，其中所述未经重排的免疫球蛋白重链可变区核酸序列包括未经重排的人源免疫球蛋白重链可变区核酸序列的至少功能性部分，所述未经重排的人源免疫球蛋白重链可变区核酸序列的至少功能性部分包括未经重排的人源VH、未经重排的人源DH和未经重排的人源JH基因区段并可操作地与非人源重链恒定区基因序列连接，其中一个或多个所述未经重排的人源VH、DH和JH基因区段包含所述插入或取代的组氨酸密码子，其中所述组氨酸密码子不是由相应的人源种系基因区段编码；以及
其中所述重排的免疫器蛋白轻链可变区序列包括与人源JL基因区段重排的人源VL基因区段并可操作地与非人源轻链恒定区基因序列连接，且其中所述重排的人源VLJL序列包括所述插入或取代的组氨酸密码子，其中所述组氨酸密码子不是由相应的人源种系基因区段编码；
其中所述非人动物表达包含来源于所述非人动物种系中的组氨酸取代或组氨酸插入的免疫球蛋白重链可变结构域和/或免疫球蛋白轻链可变结构域。
32.根据权利要求31所述的方法，所述非人动物为哺乳动物。
33.根据权利要求32所述的方法，所述哺乳动物为啮齿动物。
34.根据权利要求33所述的方法，其中所述啮齿动物选自下组：小鼠、大鼠和仓鼠。
35.根据权利要求31所述的方法，其中所述非人源重链恒定区基因序列是在所述非人动物种系中的内源性非人源免疫球蛋白基因座中。
36.根据权利要求31所述的方法，其中所述非人源轻链恒定区基因序列是在所述非人动物种系中的内源性非人源免疫球蛋白基因座中。
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Families Citing this family (37)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP5624276B2 (ja) 2006-03-31 2014-11-12 中外製薬株式会社 抗体の血中動態を制御する方法
JP5334319B2 (ja) 2007-09-26 2013-11-06 中外製薬株式会社 Ｃｄｒのアミノ酸置換により抗体の等電点を改変する方法
KR20220162801A (ko) 2008-04-11 2022-12-08 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 복수 분자의 항원에 반복 결합하는 항원 결합 분자
EP2647706B1 (en) 2010-11-30 2023-05-17 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antigen-binding molecule capable of binding to plurality of antigen molecules repeatedly
EP2679681B2 (en) 2011-02-25 2023-11-15 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha FcgammaRIIB-specific FC antibody
WO2013047748A1 (ja) 2011-09-30 2013-04-04 中外製薬株式会社 複数の生理活性を有する抗原の消失を促進する抗原結合分子
WO2013081143A1 (ja) 2011-11-30 2013-06-06 中外製薬株式会社 免疫複合体を形成する細胞内への運搬体（キャリア）を含む医薬
US20140013456A1 (en) 2012-03-16 2014-01-09 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Histidine Engineered Light Chain Antibodies and Genetically Modified Non-Human Animals for Generating the Same
KR20140134672A (ko) * 2012-03-16 2014-11-24 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 pH-의존성 결합 특성을 나타내는 항원-결합 단백질을 생성하는 마우스
CN107361011B (zh) 2012-03-16 2021-08-27 瑞泽恩制药公司 制备表达ph敏感性免疫球蛋白序列的非人动物的方法
EP2883449B1 (en) 2012-03-16 2018-02-07 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Histidine engineered light chain antibodies and genetically modified rodents for generating the same
AU2013302925B2 (en) 2012-08-13 2018-07-05 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Anti-PCSK9 antibodies with pH-dependent binding characteristics
BR112015001955A2 (pt) 2012-08-24 2017-11-07 Chugai Pharmaceutical Co Ltd variante de região fc específica de fcgamariib
ES2876009T3 (es) 2012-12-27 2021-11-11 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Polipéptido heterodimerizado
PT2840892T (pt) * 2013-02-20 2018-07-20 Regeneron Pharma Animais não humanos com sequências da cadeia pesada da imunoglobulina modificada
WO2014163101A1 (ja) 2013-04-02 2014-10-09 中外製薬株式会社 Ｆｃ領域改変体
US9738702B2 (en) * 2014-03-14 2017-08-22 Janssen Biotech, Inc. Antibodies with improved half-life in ferrets
KR102515796B1 (ko) 2014-12-19 2023-03-30 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 항-c5 항체 및 그의 사용 방법
KR20180054923A (ko) 2014-12-19 2018-05-24 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 항-마이오스타틴 항체, 변이체 Fc 영역을 함유하는 폴리펩타이드, 및 사용 방법
CN107428823B (zh) * 2015-01-22 2021-10-26 中外制药株式会社 两种以上抗-c5抗体的组合与使用方法
MX2017008978A (es) 2015-02-05 2017-10-25 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Anticuerpos que comprenden un dominio de union al antigeno dependiente de la concentracion ionica, variantes de la region fc, antiocuerpor de union a interleucina 8 (il-8) y usos de los mismos.
CN107438622A (zh) * 2015-03-19 2017-12-05 瑞泽恩制药公司 选择结合抗原的轻链可变区的非人动物
KR20180002782A (ko) 2015-05-06 2018-01-08 얀센 바이오테크 인코포레이티드 전립선 특이적 막 항원(psma) 이중특이성 결합제 및 그의 용도
US11359009B2 (en) 2015-12-25 2022-06-14 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Anti-myostatin antibodies and methods of use
KR102482103B1 (ko) * 2016-01-13 2022-12-28 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 조작된 중쇄 다양성 영역을 갖는 설치류
WO2017201476A1 (en) 2016-05-20 2017-11-23 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods for breaking immunological tolerance using multiple guide rnas
CN116458475A (zh) 2016-06-03 2023-07-21 瑞泽恩制药公司 表达外源末端脱氧核苷酸转移酶的非人动物
US11053308B2 (en) 2016-08-05 2021-07-06 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Method for treating IL-8-related diseases
WO2019190922A1 (en) 2018-03-24 2019-10-03 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Genetically modified non-human animals for generating therapeutic antibodies against peptide-mhc complexes, methods of making and uses thereof
AU2019241978A1 (en) * 2018-03-26 2020-11-05 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Anti-PfRH5 antibodies and antigen-binding fragments thereof
KR20210004994A (ko) 2018-03-26 2021-01-13 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 치료제를 시험하기 위한 인간화된 설치류
CN108486126A (zh) * 2018-03-27 2018-09-04 重庆金迈博生物科技有限公司 一种核酸分子及其在人源化抗体中的应用
KR102617284B1 (ko) 2018-06-14 2023-12-27 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 면역글로불린 중쇄 암호화 서열에서 dh-dh 재배열 가능한 비인간 동물
CA3187680A1 (en) 2020-09-11 2022-03-17 Yashu Liu Identification and production of antigen-specific antibodies
KR20230147048A (ko) 2020-12-16 2023-10-20 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 인간화 Fc 알파 수용체를 발현하는 마우스
US20220195014A1 (en) 2020-12-23 2022-06-23 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Nucleic acids encoding anchor modified antibodies and uses thereof
WO2024056044A1 (en) * 2022-09-16 2024-03-21 Biocytogen Pharmaceuticals (Beijing) Co., Ltd. Genetically modified non-human animals and methods for producing heavy-chain antibodies

Family Cites Families (96)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB8823869D0 (en) 1988-10-12 1988-11-16 Medical Res Council Production of antibodies
US6673986B1 (en) 1990-01-12 2004-01-06 Abgenix, Inc. Generation of xenogeneic antibodies
EP0515571B1 (en) 1990-02-16 1998-12-02 Boston Biomedical Research Institute Hybrid reagents capable of selectively releasing molecules into cells
US7041871B1 (en) 1995-10-10 2006-05-09 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US6255458B1 (en) * 1990-08-29 2001-07-03 Genpharm International High affinity human antibodies and human antibodies against digoxin
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
EP0546073B1 (en) 1990-08-29 1997-09-10 GenPharm International, Inc. production and use of transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5667988A (en) 1992-01-27 1997-09-16 The Scripps Research Institute Methods for producing antibody libraries using universal or randomized immunoglobulin light chains
US7067284B1 (en) 1992-01-27 2006-06-27 The Scripps Research Institute Methods for producing antibody libraries using universal or randomized immunoglobulin light chains
AU675661B2 (en) 1992-07-24 1997-02-13 Abgenix, Inc. Generation of xenogeneic antibodies
US5999908A (en) 1992-08-06 1999-12-07 Abelow; Daniel H. Customer-based product design module
CA2219486A1 (en) * 1995-04-28 1996-10-31 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
KR100308764B1 (ko) 1995-08-29 2001-12-17 마나배게이사꾸 키메라동물및그의제작법
JP2007312792A (ja) * 1995-08-29 2007-12-06 Kirin Pharma Co Ltd キメラ動物およびその作製法
RU2224766C2 (ru) 1997-04-14 2004-02-27 Микромет Аг Способ получения рецепторов для человеческих антигенов и их применение
IL132560A0 (en) 1997-05-02 2001-03-19 Genentech Inc A method for making multispecific antibodies having heteromultimeric and common components
US20020062010A1 (en) 1997-05-02 2002-05-23 Genentech, Inc. Method for making multispecific antibodies having heteromultimeric and common components
US6774279B2 (en) 1997-05-30 2004-08-10 Carnegie Institution Of Washington Use of FLP recombinase in mice
DE69838454T2 (de) 1997-10-03 2008-02-07 Chugai Seiyaku K.K. Natürlicher menschlicher antikörper
GB9823930D0 (en) 1998-11-03 1998-12-30 Babraham Inst Murine expression of human ig\ locus
JP2004524005A (ja) 2000-09-08 2004-08-12 マサチューセッツ　インスティテュート　オブ　テクノロジー Ｇ−ｃｓｆアナログ組成物および方法
US6586251B2 (en) 2000-10-31 2003-07-01 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of modifying eukaryotic cells
US6596541B2 (en) 2000-10-31 2003-07-22 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of modifying eukaryotic cells
US7105348B2 (en) 2000-10-31 2006-09-12 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of modifying eukaryotic cells
US20060199204A1 (en) 2001-10-05 2006-09-07 U.S. Epa Genetic testing for male factor infertility
US20030108925A1 (en) 2001-10-05 2003-06-12 U.S. Epa Genetic testing for male factor infertility
WO2003047336A2 (en) 2001-11-30 2003-06-12 Abgenix, Inc. TRANSGENIC ANIMALS BEARING HUMAN Igμ LIGHT CHAIN GENES
EP1512015B1 (en) 2002-06-12 2009-03-25 Genencor International, Inc. Methods for improving a binding characteristic of a molecule
WO2003105757A2 (en) 2002-06-12 2003-12-24 Genencor International, Inc. Methods and compositions for milieu-dependent binding of a targeted agent to a target
JP4836451B2 (ja) 2002-07-18 2011-12-14 メルス ベー ヴェー 抗体混合物の組換え生産
EP1439234A1 (en) 2003-01-08 2004-07-21 ARTEMIS Pharmaceuticals GmbH Targeted transgenesis using the rosa26 locus
EP1605058B1 (en) 2003-01-21 2009-05-13 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Method of screening light chain of antibody light chains
WO2004106375A1 (en) 2003-05-30 2004-12-09 Merus Biopharmaceuticals B.V. I.O. Fab library for the preparation of anti vegf and anti rabies virus fabs
US20100069614A1 (en) 2008-06-27 2010-03-18 Merus B.V. Antibody producing non-human mammals
CN1852925A (zh) 2003-07-15 2006-10-25 人类多克隆治疗公司 人源化免疫球蛋白基因座
CN1560081A (zh) 2004-02-17 2005-01-05 大连帝恩生物工程有限公司 用能产生人IgGl重链－κ轻链小鼠作为制备人源化单克隆抗体和应用
WO2005092925A2 (en) 2004-03-24 2005-10-06 Xencor, Inc. Immunoglobulin variants outside the fc region
US20050260711A1 (en) 2004-03-30 2005-11-24 Deepshikha Datta Modulating pH-sensitive binding using non-natural amino acids
CN101724071A (zh) * 2004-10-08 2010-06-09 杜门蒂斯有限公司 抗肿瘤坏死因子受体1的单域抗体及其使用方法
PT1802193E (pt) 2004-10-19 2014-06-23 Regeneron Pharma Método para gerar um murganho homozigótico para uma modificação genética
CA2585043A1 (en) 2004-10-22 2007-01-04 Medimmune, Inc. High affinity antibodies against hmgb1 and methods of use thereof
RU2290442C2 (ru) * 2005-03-21 2006-12-27 Всероссийский государственный научно-исследовательский институт животноводства (ВИЖ) Способ трансформации стволовых клеток семенников животных in vivo
LT2586459T (lt) * 2005-03-25 2017-09-25 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Vegf antagonisto kompozicijos
CA2604440A1 (en) 2005-04-29 2006-11-09 Inserm (Institut De La Sante Et De La Recherche Medicale) Transgenic animals and methods of making recombinant antibodies
AU2006322445B2 (en) 2005-12-05 2011-05-12 Symphogen A/S Anti-orthopoxvirus recombinant polyclonal antibody
US7910798B2 (en) 2006-03-31 2011-03-22 Medarex, Inc. Transgenic animals expressing chimeric antibodies for use in preparing human antibodies
ES2398076T3 (es) 2006-06-02 2013-03-13 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Anticuerpos de alta afinidad contra el receptor de IL-6 humano
US7608693B2 (en) 2006-10-02 2009-10-27 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. High affinity human antibodies to human IL-4 receptor
ES2859825T3 (es) 2006-10-02 2021-10-04 Regeneron Pharma Anticuerpos humanos con alta afinidad para el receptor IL-4 humano
CN101528767A (zh) * 2006-10-11 2009-09-09 埃博灵克斯股份有限公司 以基本不依赖pH的方式结合血清蛋白的氨基酸序列、包括其的化合物、及其用途
US20100034194A1 (en) 2006-10-11 2010-02-11 Siemens Communications Inc. Eliminating unreachable subscribers in voice-over-ip networks
NO347649B1 (no) 2006-12-14 2024-02-12 Regeneron Pharma Humant antistoff eller antistoff fragment som spesifikt binder human deltaliknende ligand 4 (hDII4), nukleinsyremolekyl som koder for slike og vektor og vert-vektorsystemer, samt fremgangsmåte for fremstilling, sammensetning og anvendelse.
EP2583550A1 (en) 2007-03-13 2013-04-24 National Jewish Health Methods for generation of antibodies
ITMI20071522A1 (it) 2007-07-27 2009-01-28 Areta Internat S R L Vaccino idiotipico
CA3187687A1 (en) 2007-09-14 2009-03-19 Adimab, Llc Rationally designed, synthetic antibody libraries and uses therefor
JP5334319B2 (ja) 2007-09-26 2013-11-06 中外製薬株式会社 Ｃｄｒのアミノ酸置換により抗体の等電点を改変する方法
BRPI0818865A2 (pt) * 2007-10-26 2015-05-05 Oklahoma Med Res Found Anticorpos monoclonais contra proteína c ativada.
CN101945893B (zh) 2007-12-14 2015-02-25 诺沃-诺迪斯克有限公司 抗人nkg2d抗体及其用途
CA2718495C (en) * 2008-03-14 2022-06-14 Humanzyme Limited Recombinant production of authentic human proteins using human cell expression systems
KR20220162801A (ko) 2008-04-11 2022-12-08 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 복수 분자의 항원에 반복 결합하는 항원 결합 분자
EP3456190B1 (en) 2008-06-27 2021-11-24 Merus N.V. Antibody producing transgenic murine animal
TWI516501B (zh) 2008-09-12 2016-01-11 禮納特神經系統科學公司 Ｐｃｓｋ９拮抗劑類
TWI440469B (zh) 2008-09-26 2014-06-11 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Improved antibody molecules
DK2346994T3 (da) 2008-09-30 2022-02-28 Ablexis Llc Knock-in-mus til fremstilling af kimære antistoffer
EP2196476A1 (en) * 2008-12-10 2010-06-16 Novartis Ag Antibody formulation
JO3672B1 (ar) 2008-12-15 2020-08-27 Regeneron Pharma أجسام مضادة بشرية عالية التفاعل الكيماوي بالنسبة لإنزيم سبتيليسين كنفرتيز بروبروتين / كيكسين نوع 9 (pcsk9).
CN112680475A (zh) 2008-12-18 2021-04-20 伊拉兹马斯大学鹿特丹医学中心 表达人源化抗体的非人转基因动物及其用途
KR20140056401A (ko) 2009-05-07 2014-05-12 볼보 컨스트럭션 이큅먼트 에이비 작업 기계 및 작업 기계를 작동하기 위한 방법
CN102449149B (zh) 2009-05-29 2014-04-23 莫佛塞斯公司 集合及其使用方法
MX2011014008A (es) 2009-06-26 2012-06-01 Regeneron Pharma Anticuerpos biespecificos facilmente aislados con formato de inmunoglobulina original.
DK3241435T3 (da) 2009-07-08 2021-08-23 Kymab Ltd Dyremodeller og terapeutiske molekyler
US20120204278A1 (en) 2009-07-08 2012-08-09 Kymab Limited Animal models and therapeutic molecules
DE112010002931T5 (de) 2009-07-16 2012-08-30 Wageningen Universiteit Regulierung von Zinkmangel und Zinktoleranz bei Pflanzen
GB2472108B (en) 2009-08-27 2011-07-13 Budha Singh Dhinjan Wall bead
SI2509409T1 (sl) 2009-12-10 2016-12-30 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Miši, ki tvorijo protitelesa težke verige
ES2547142T5 (es) 2010-02-08 2021-12-09 Regeneron Pharma Cadena ligera común de ratón
US20120021409A1 (en) 2010-02-08 2012-01-26 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Common Light Chain Mouse
US9796788B2 (en) 2010-02-08 2017-10-24 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Mice expressing a limited immunoglobulin light chain repertoire
US20130185821A1 (en) 2010-02-08 2013-07-18 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Common Light Chain Mouse
US20130045492A1 (en) 2010-02-08 2013-02-21 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods For Making Fully Human Bispecific Antibodies Using A Common Light Chain
MX2012010481A (es) * 2010-03-11 2012-10-09 Rinat Neuroscience Corp Anticuerpos con union de antigenos dependiente del ph.
TWI667257B (zh) 2010-03-30 2019-08-01 中外製藥股份有限公司 促進抗原消失之具有經修飾的ＦｃＲｎ親和力之抗體
NZ605966A (en) 2010-06-17 2015-04-24 Kymab Ltd Animal models and therapeutic molecules
PT3034608T (pt) 2010-06-22 2019-05-28 Regeneron Pharma Ratinhos expressando uma cadeia leve híbrida de imunoglobulina com uma região variável humana
KR101387377B1 (ko) 2011-02-25 2014-04-21 리제너론 파아마슈티컬스, 인크. Ａｄａｍ６ 마우스
PL3572517T3 (pl) 2011-08-05 2021-10-04 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Myszy z humanizowanym uniwersalnym łańcuchem lekkim
RU2732151C2 (ru) 2011-09-30 2020-09-11 Чугаи Сейяку Кабусики Кайся Библиотека зависимых от концентрации ионов связывающих молекул
GB201122047D0 (en) 2011-12-21 2012-02-01 Kymab Ltd Transgenic animals
JP2015509380A (ja) 2012-03-06 2015-03-30 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッドＲｅｇｅｎｅｒｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ． 共通の軽鎖のマウス
US20140013456A1 (en) 2012-03-16 2014-01-09 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Histidine Engineered Light Chain Antibodies and Genetically Modified Non-Human Animals for Generating the Same
CN107361011B (zh) 2012-03-16 2021-08-27 瑞泽恩制药公司 制备表达ph敏感性免疫球蛋白序列的非人动物的方法
EP2883449B1 (en) 2012-03-16 2018-02-07 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Histidine engineered light chain antibodies and genetically modified rodents for generating the same
KR20140134672A (ko) 2012-03-16 2014-11-24 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 pH-의존성 결합 특성을 나타내는 항원-결합 단백질을 생성하는 마우스
CN104582476B (zh) 2012-06-05 2017-03-08 瑞泽恩制药公司 使用共同轻链制备完全人双特异性抗体的方法
CN104903494B (zh) 2012-09-21 2017-11-03 瑞奥可塞恩探索集团有限公司 用于电解液体的电池
PT2840892T (pt) 2013-02-20 2018-07-20 Regeneron Pharma Animais não humanos com sequências da cadeia pesada da imunoglobulina modificada

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