DE69838454T2

DE69838454T2 - Natürlicher menschlicher antikörper

Info

Publication number: DE69838454T2
Application number: DE69838454T
Authority: DE
Inventors: Masayuki Gotenba-shi TSUCHIYA
Original assignee: Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1997-10-03
Filing date: 1998-10-02
Publication date: 2008-02-07
Anticipated expiration: 2018-10-03
Also published as: BR9812846A; RU2221809C2; US7052873B2; NO20001671L; IL135221A0; WO1999018212A1; NO20001671D0; JP3992298B2; CN1277632A; EP1020522B1; AU750453B2; NZ503489A; KR100473836B1; US20030103970A1; KR20010030918A; AU9283098A; US20060008456A1; ATE373712T1; ES2293691T3; DE69838454D1

Description

Technisches Gebiet
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung natürlicher humanisierter Antikörper und den natürlichen humanisierten Antikörper, erhalten durch das Verfahren zur Herstellung. Die vorliegende Erfindung betrifft auch DNA, die den natürlichen humanisierten Antikörper codiert, einen Expressionsvektor, umfassend die DNA, einen Wirt, umfassend die DNA und ein Herstellungsverfahren für einen natürlichen humanisierten Antikörper aus Zellen, in die die DNA eingeführt wurde.
Stand der Technik
Monoklonale Maus-Antikörper können relativ einfach durch die weit verbreitet verwendete Hybridomtechnik (Köhler, G. und Milstein, C. Nature (1975) 256, 495-497) isoliert werden. Andererseits muß ein ähnliches Verfahren für menschliche Hybridome noch eine breite Verbreitung finden, obwohl erwartet wird, daß dies eintreffen wird. Weiterhin besteht ein Bedarf an Antikörpern gegen menschliche Antigene in klinischen Anwendungen und daher ist eine Erzeugung von monoklonalen Maus-Antikörpern für die Entwicklung von Antikörperpharmazeutika unersetzlich.
Tatsächlich wurde eine Zahl monoklonaler Antikörper gegen Tumorzellen und Viren isoliert und diese wurden in klinischen Anwendungen untersucht. Es hat sich ergeben, daß jedoch Maus-Antikörper, die für Menschen Fremdsubstanzen sind, HAMA (menschliche Anti-Maus-Antikörper) induzieren, und zwar aufgrund der starken Antigenizität und dies ist natürlich für klinische Anwendungen extrem ungeeignet, da Probleme wie eine schwache Aktivität und Induktion von ADCC auftreten (Schroff, R.W., Cancer Res. (1985) 45, 879-885; Shawler, D.L. et al., J. Immunol. (1985) 135, 1530-1535).
Um dieses Problem zu lösen wurde ein chimärer Antikörper erzeugt (Neuberger, S.M. et al., Nature (1984) 312, 604-608;, Boulianne, G.L. et al., Nature (1984) 312, 643-646). Chimäre Antikörper werden hergestellt indem eine variable Region eines Maus-Antikörpers mit einer konstanten Region eines menschlichen Antikörpers verbunden werden, d.h. in einem chimären Antikörper wurde die konstante Region des Maus-Antikörpers, die für eine besonders starke Antigenizität verantwortlich ist, durch das menschliche Gegenstück ersetzt. Dies sollte eine physiologische Bindung an einen menschlichen Fc-Rezeptor und eine Induktion von Fc-vermittelten Funktionen ermöglichen. Tatsächlich wurde über deutliche Verminderungen der Antigenizität in einer klinischen Studie unter Verwendung chimärer Antikörper berichtet (LoBuglio, A.F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1989) 86, 4220-4224). Es wurde jedoch auch von Fällen berichtet, bei denen sich HAMA gegen Mausvariable Regionen entwickelten (LoBuglio, A.F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1989) 86, 4220-4224).
Dementsprechend wurden Verfahren entwickelt um einen humanisierten Antikörper herzustellen, der einem menschlichen Antikörper näher steht, jedoch sind diese komplizierter. Hierbei handelt es sich um ein Verfahren zur Rekonstruktion der Antigen-Bindungsstelle eines Maus-Antikörpers auf einen menschlichen Antikörper (Zones P.T. et al., Nature (1986) 321, 5225-525; Verhoeyen, M. et al., Science (1988) 239, 1534-1536; Riechmann, L. et al., Nature (1988) 332, 323-327)). So umfaßt eine variable Region eines Antikörpers für sowohl die H- als auch die L-Kette, vier Framework-Regionen (FRs) und drei die Komplementarität bestimmende Regionen (CDRs), die dazwischen in Sandwichform gelagert sind.
Es ist bekannt, daß die CDR im wesentlichen für die Bildung von Antigen-Bindungsstellen verantwortlich sind und einige Aminosäurereste aus der FR sind daran entweder direkt oder indirekt beteiligt. Da die Grundstrukturen von Antikörpern untereinander ähnlich sind, wurde es als möglich erachtet eine Antigenbindungsstelle eines Antikörpers auf einen anderen Antikörper zu pfropfen. Die von G. Winter geführte Forschergruppe hat tatsächlich erfolgreich CDRs eines Maus-anti-Rhizobium-Antikörpers auf einen menschlichen Antikörper gepfropft (CDR-Grafting) und dadurch einen humanisierten Antikörper mit einer Rhizobium-Bindungsaktivität erhalten (Jones, P.T. et al., Nature (1986) 321, 522-525).
Die Humanisierung durch CDR-Grafting allein stellte jedoch in einigen Fällen keinen humanisierten Antikörper bereit, der eine ähnliche Antigen-Bindungsaktivität wie der ursprüngliche Maus-Antikörper aufweist. Dementsprechend wurden wie oben beschrieben Versuche unternommen, um einige FR-Aminosäurereste zu ersetzen. FR-Aminosäurereste, die ersetzt werden sollten, sind an dem Erhalt der Struktur der Aminosäurereste beteiligt, die die grundlegende Struktur eines Antikörpermoleküls (kanonische Struktur; Chothia, C. et al, Nature (1989) 342, 877-883; Chothia, C. und Lesk, A.M.J. Molec. Biol. (1987) 196, 901-917) oder CDRs bilden oder die direkt mit Antigenmolekülen in Wechselwirkung treten (siehe internationale Patentveröffentlichungen WO 91/09967 und WO 90/07861 ).
Tatsächlich wurden Aminosäuresubstitutionen an der FR für die meisten humanisierten Antikörper durchgeführt, wobei künstliche FR-Sequenzen, die nicht natürlicherweise auftreten, gebildet werden. Manchmal wurden zu viele Aminosäuresubstitutionen durchgeführt, was die ursprüngliche Bedeutung eines CDR-Graftings zum Minimieren der Antigenizität eines Maus-Antikörpers zweifelhaft erscheinen läßt (Queen, C. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1989) 86, 10029-10033; Co, M.S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1991) 88, 2869-2873).
Eine Lösung für dieses Problem ist die Entwicklung von Verfahren zur Selektion menschlicher FRs. So hängt die Zahl von FR-Aminosäureresten, die ersetzt werden sollten, von der Homologie zwischen den FRs des für das CDR-Grafting gewählten menschlichen Antikörpers und den FRs des ursprünglichen Maus-Antikörpers ab. Dementsprechend werden in der Regel menschliche FRs mit hoher Homologie zu Maus-FRs gewählt um den Grad der Substitution zu minimieren (Sato, K. et al., Mol. Immunol. (1994), 31 (5), 371-381; Ohtomo, T. et al., Mol. Immunol. (1995), 32 (6), 407-416). In vielen Fällen haben jedoch sogar die FRs des so erhaltenen humanisierten Antikörpers Aminosäuresequenzen, die natürlicherweise nicht auftreten, was zu einem Antigenizitätsproblem führen kann. Daher besteht ein Bedarf an einer Technologie zur Konstruktion eines humanisierten Antikörpers, der die obigen Probleme lösen kann, eine niedrigere Wahrscheinlichkeit zur Induktion einer Antigenizität aufweist sowie eine höhere Sicherheit.
Offenbarung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung ist eine Verbesserung des konventionellen Verfahrens zur Konstruktion eines humanisierten Antikörpers und stellt ein Verfahren zur Konstruktion eines humanisierten Antikörpers bereit, der sich die Antigen-Bindungsaktivität des ursprünglichen Maus-Antikörpers vollständig beibehält und der natürlich auftretende menschliche FRs umfaßt, anders gesagt ein Verfahren zur Konstruktion eines humanisierten Antikörpers, der keine Aminosäuresubstitution auf der FR involviert.
So stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines natürlichen humanisierten Antikörpers bereit, das die Durchführung einer Homologiesuche für die FR eines primären Design-Antikörpers und die Selektion einer natürlichen menschlichen FR, die sich die künstlichen Aminosäurereste erhält, enthalten in der FR des primären Design-Antikörpers und eine Homologie dazu aufweist, umfaßt. Wie hier verwendet ist der primäre Design-Antikörper ein humanisierter Antikörper (der auch als umgeformter menschlicher Antikörper bezeichnet wird), der durch konventionelles CDR-Grafting hergestellt wurde.
Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Herstellung eines natürlichen humanisierten Antikörpers bereit, das die Durchführung einer Homologiesuche für die FR eines primären Design-Antikörpers, die Selektion eines natürlichen menschlichen FR, die sich die künstlichen Aminosäurereste erhält, die in der FR des primären Design-Antikörpers enthalten sind und eine Homologie dazu aufweist und den Austausch von ein oder einer Vielzahl von unterschiedlichen Aminosäureresten zwischen der FR des primären Design-Antikörpers und des gewählten natürlichen menschlichen FR umfaßt.
Vorzugsweise umfaßt der primäre Design-Antikörper in dem obigen Herstellungsverfahren CDRs, die von einer ersten Tierart abstammen und FRs, die von einer zweiten Tierart abstammen. Noch bevorzugter ist die erste Tierart in dem ersten primären Design-Antikörper ein nicht-menschlicher Säuger und die zweite Tierart ist menschlich. Beispiele für die erste Tierart, d.h. einen Säuger, beinhalten Maus, Ratte, Hamster, Kaninchen und Affe.
Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Herstellung eines natürlichen humanisierten Antikörpers bereit, das die Durchführung einer Homologiesuche für die FR eines primären Design-Antikörpers, die Auswahl einer natürlichen menschlichen FR, die sich die künstlichen Aminosäurereste erhält, abstammend von der FR des nicht-menschlichen Antikörpers, enthalten in der FR des primären Design-Antikörpers und mit einer hohen Homologie dazu und den Austausch von ein oder einer Vielzahl von unterschiedlichen Aminosäurereste zwischen der FR des primären Design-Antikörper und der gewählten natürlichen menschlichen FR umfaßt.
Die vorliegende Erfindung stellt auch einen natürlichen humanisierten Antikörper bereit, der durch das obige Herstellungsverfahren erhalten wurde.
Die vorliegende Erfindung stellt auch einen natürlichen humanisierten Antikörper bereit, enthaltend die CDRs, die von einer ersten Tierart abstammen und die FRs, die von einer zweiten Tierart abstammen, dadurch gekennzeichnet, daß die FRs eine Aminosäuresequenz umfassen, die sich von den FRs unterscheidet, die für das CDR-Grafting verwendet wurden, und zwar in einer oder einer Vielzahl von Aminosäureresten und wird ersetzt durch die FR, abstammend von der zweiten Tierart mit denselben Aminosäureresten wie die unterschiedlichen Aminosäurereste an denselben Positionen. Vorzugsweise ist die erste Tierart ein nicht-menschlicher Säuger und die zweite Tierart ist menschlich. Beispiele für die erste Tierart, d.h. einen Säuger, beinhalten Maus, Ratte, Hamster, Kaninchen und Affe.
Die vorliegende Erfindung stellt auch eine DNA bereit, codierend den obigen natürlichen humanisierten Antikörper.
Die vorliegende Erfindung stellt auch einen Expressionsvektor bereit, umfassend die obige DNA.
Die vorliegende Erfindung stellt auch einen nicht-menschlichen Wirt bereit, umfassend die obige DNA.
Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Herstellung eines natürlichen humanisierten Antikörpers bereit, das das Kultivieren von Zellen umfaßt, in die ein Expressionsvektor, umfassend die obige DNA, eingeführt wurde und das Sammeln des gewünschten natürlichen humanisierten Antikörpers aus der Kultur der Zellen.
Die vorliegende Erfindung stellt auch eine pharmazeutische Zusammensetzung bereit, umfassend einen natürlichen humanisierten Antikörper.
Kurze Erklärung der Zeichnungen
1 ist eine Graphik, die zeigt, daß die Fluoreszenzintensität eines chimären anti-HM1.24-Antikörpers ähnlich zu der eines Maus-anti-HM1.24-Antikörpers im Vergleich zu einem Kontroll-Antikörper in der FCM-Analyse unter Verwendung einer humanen Myelom-Zelllinie KPMM2 verlagert ist.
2 ist eine Graphik, die zeigt, daß der chimäre anti-HM1.24-Antikörper die Bindung eines biotinylierten Maus-anti-HM1.24-Antikörpers an die WISH-Zellen in einer dosisabhängigen Weise, ähnlich wie der Maus-anti-HM1.24-Antikörper inhibiert.
3 ist eine Graphik, die zeigt, daß der chimäre anti-HM1.24-Antikörper eine erhöhte cytotoxische Aktivität gegenüber den RPMI 8226-Zellen mit ansteigenden E/T-Verhältnissen aufweist, während das Kontroll-IgG1- oder Maus-anti-HM1.24-Antikörper keine cytotoxische Aktivität gegen die RPMI 8226-Zellen aufweisen.
4 ist ein Diagramm, das ein Verfahren zur Konstruktion der L-Kette eines umgeformten menschlichen anti-HM1.24-Antikörpers durch CDR-Grafting unter Verwendung des PCR-Verfahrens darstellt.
5 ist ein Diagramm, das ein Verfahren zur Konstruktion der H-Kette des umgeformten menschlichen anti-HM1.24-Antikörpers darstellt, worin die Oligonukleotide RVH1, RVH2, RVH3 und RVH4 durch das PCR-Verfahren zusammengeführt werden.
6 ist ein Diagramm, das ein Verfahren zur Konstruktion der H-Ketten-V-Region eines Mensch-Maus-Hybrid-anti-HM1.24-Antikörpers darstellt.
7 ist ein Diagramm, das ein Verfahren zur Konstruktion der H-Ketten-V-Region des Maus-menschlichen Hybrid-anti-HM1.24-Antikörpers darstellt.
8 ist eine Graphik, die zeigt, daß die L-Kettenversion a eines umgeformten menschlichen anti-HM1.24-Antikörpers einer Antigen-Bindungsaktivität von ähnlichem Grad wie derjenigen eines chimären anti-HM1.24-Antikörpers aufweist. In der Figur repräsentieren -1 und -2 unterschiedliche Chargen.
9 ist eine Graphik, die die Antigen-Bindungsaktivität eines umgeformten menschlichen anti-HM1.24-Antikörpers, hergestellt aus einer Kombination der L-Kettenversion a und der H-Kettenversion a, b, f oder h darstellt und des chimären anti-HM1.24-Antikörpers.
10 ist eine Graphik, die die Antigen-Bindungsaktivität eines umgeformten menschlichen anti-HM1.24-Antikörpers, hergestellt aus einer Kombination der L-Kettenversion b und der H-Kettenversion a, b, f oder h darstellt und des chimären anti-HM1.24-Antikörpers.
11 ist eine Graphik, die die Bindungsinhibitionsaktivität eines umgeformten menschlichen anti-HM1.24-Antikörpers, hergestellt aus einer Kombination der L-Kettenversion a und der H-Kettenversion a, b, f oder h darstellt und des chimären anti-HM1.24-Antikörpers.
12 ist eine Graphik, die die Bindungsinhibitionsaktivität eine umgeformten menschlichen anti-HM1.24-Antikörpers, hergestellt aus einer Kombination der L-Kettenversion b und der H-Kettenversion a, b, f oder h darstellt und des chimären anti-HM1.24-Antikörpers.
13 ist eine Graphik, die die Antigen-Bindungsaktivität der H-Kettenversionen a, b, c und d des umgeformten menschlichen anti-HM1.24-Antikörpers und des chimären anti-HM1.24-Antikörpers darstellt.
14 ist eine Graphik, die die Antigen-Bindungsaktivität der H-Kettenversionen a und e des umgeformten menschlichen anti-HM1.24-Antikörpers und des chimären anti-HM1.24-Antikörpers darstellt. In der Figur repräsentieren -1 und -2 unterschiedliche Chargen.
15 ist eine Graphik, die die Bindungsinhibitionsaktivität der H-Kettenversionen a, c, p und r des umgeformten menschlichen anti-HM1.24-Antikörpers und des chimären anti-HM1.24-Antikörpers darstellt.
16 ist eine Graphik, die die Antigen-Bindungsaktivität eines menschlichen-Maus-Hybrid-anti-HM1.24-Antikörpers, eines Maus-Mensch-Hybrid-anti-HM1.24-Antikörpers und eines chimären anti-HM1.24-Antikörpers darstellt.
17 ist eine Graphik, die die Antigen-Bindungsaktivität der H-Kettenversion a, b, c und f eines umgeformten menschlichen anti-HM1.24-Antikörpers und eines chimären anti-HM1.24-Antikörpers darstellt.
18 ist eine Graphik, die die Antigen-Bindungsaktivität der H-Kettenversion a und g eines umgeformten menschlichen anti-HM1.24-Antikörpers und eines chimären anti-HM1.24-Antikörpers darstellt.
19 ist eine Graphik, die die Bindungsinhibitionsaktivität der H-Kettenversion a und g eines umgeformten menschlichen anti-HM1.24-Antikörpers und eines chimären anti-HM1.24-Antikörpers darstellt.
20 ist eine Graphik, die die Antigen-Bindungsaktivität der H-Kettenversion h und i eines umgeformten menschlichen anti-HM1.24-Antikörpers und eines chimären anti-HM1.24-Antikörpers darstellt.
21 ist eine Graphik, die die Antigen-Bindungsaktivität der H-Kettenversion f, h und j eines umgeformten menschlichen anti-HM1.24-Antikörpers und eines chimären anti-HM1.24-Antikörpers darstellt.
22 ist eine Graphik, die die Bindungsinhibitionsaktivität der H-Kettenversion h und i eines umgeformten menschlichen anti-HM1.24-Antikörpers und eines chimären anti-HM1.24-Antikörpers darstellt.
23 ist eine Graphik, die die Bindungsinhibitionsaktivität der H-Kettenversion f, h und j eines umgeformten menschlichen anti-HM1.24-Antikörpers und eines chimären anti-HM1.24-Antikörpers darstellt.
24 ist eine Graphik, die die Antigen-Bindungsaktivität der H-Kettenversion h, k, l, m, n und o eines umgeformten menschlichen anti-HM1.24-Antikörpers und eines chimären anti-HM1.24-Antikörpers darstellt.
25 ist eine Graphik, die die Antigen-Bindungsaktivität der H-Kettenversionen a, h, p und q eines umgeformten menschlichen anti-HM1.24-Antikörpers und eines chimären anti-HM1.24-Antikörpers darstellt.
26 ist eine Graphik, die die Bindungsinhibitionsaktivität der H-Kettenversion h, k, 1, m, n und 0 eines umgeformten menschlichen anti-HM1.24-Antikörpers und eines chimären anti-HM1.24-Antikörpers an WISH-Zellen darstellt.
27 ist eine Graphik, die die Bindungsinhibitionsaktivität der H-Kettenversion a, h, p und q eines umgeformten menschlichen anti-HM1.24-Antikörpers und eines chimären anti-HM1.24-Antikörpers darstellt.
28 ist eine Graphik, die die Antigen-Bindungsaktivität der H-Kettenversion a, c, p und r eines umgeformten menschlichen anti-HM1.24-Antikörpers und eines chimären anti-HM1.24-Antikörpers darstellt.
29 ist eine Graphik, die darstellt, daß der natürliche humanisierte anti-HM1.24-Antikörper (der sekundäre Design-Antikörper) eine Antigen-Bindungsaktivität eines ähnlichen Grads wie der umgeformte menschliche anti-HM1.24-Antikörper (der primäre Design-Antikörper) aufweist.
30 ist eine Graphik, die darstellt, daß der natürliche humanisierte anti-HM1.24-Antikörper (der sekundäre Design-Antikörper) eine Bindungsinhibitionsaktivität eines ähnlichen Grads wie der umgeformte menschliche anti-HM1.24-Antikörper (der primäre Design-Antikörper) aufweist.
31 ist eine Graphik, die zeigt, daß der gereinigte umgeformte menschliche anti-HM1.24-Antikörper eine Antigen-Bindungsaktivität von ähnlichem Grad wie diejenige des chimären menschlichen anti-HM1.24-Antikörpers aufweist.
32 ist eine Graphik, die zeigt, daß der gereinigte umgeformte menschliche anti-HM1.24-Antikörper eine Bindungsinhibitionsaktivität von ähnlichem Grad wie diejenige des chimären menschlichen anti-HM1.24-Antikörpers aufweist.
33 ist eine Graphik, die zeigt, daß der natürliche humanisierte anti-HM1.24-Antikörper (der sekundäre Design-Antikörper) eine erhöhte cytotoxische Aktivität gegen die KPMM2-Zellen mit ansteigenden E/T-Verhältnissen aufweist.
Ausführungsform zur Durchführung der Erfindung
1. Natürliche FR-Sequenz
Um Antikörper gegen eine Vielzahl von Antigenen zu erzeugen, von den Genen, umfassend begrenzte Antikörper-variable Regionen, haben Organismen einen Mechanismus zur Einführung statistischer Gen-Mutationen (sogenannte somatische Mutationen) in die variablen Antikörperregionen. In der Theorie sollte dies extrem unterschiedliche FR-Aminosäuresequenzen bilden, in der Praxis neigen die Positionen der Aminosäurerest jedoch eher zu einer Einführung von Mutationen und die Arten von Aminosäureresten scheinen auf einen bestimmten Grad begrenzt zu sein, wie bestimmt durch Strukturanalyse vieler menschlicher Antikörper FRs, für die die tatsächlichen Strukturen aufgeklärt wurden.
Wie hier verwendet, bezieht sich die Bezeichnung FR auf die FR, die in Kabat, E.A. et al., Sequence of Proteins of Immunological Interest (1991) definiert wurde. So sind in der H-Kette FR1 die Aminosäuren Nr. 1 bis 30, FR2 die Aminosäuren Nr. 36 bis 49, FR3 die Aminosäuren Nr. 66 bis 94 und FR4, die Aminosäuren Nr. 103 bis 113. Andererseits liegt in der L-Kette die FR1 bei den Aminosäuren 1 bis 23, die FR2 bei den Aminosäuren Nr. 35 bis 49, die FR3 bei den Aminosäuren Nr. 57 bis 88, und die FR4 bei den Aminosäuren Nr. 98 bis 107.
2. Von menschlichen FR zu natürlichen menschlichen FR
In vielen Fällen haben humanisierte Antikörper (auch umgeformte menschliche Antikörper genannt), erzeugt durch das konventionelle CDR-Grafting-Verfahren FR-Aminosäuresequenzen, die in der Natur nicht angetroffen werden können. Da jedoch eine Vielfalt von FR-Aminosäuresequenzen bereits durch eine somatische Mutation wie oben beschrieben gefunden wurde, ist es möglich, daß FRs mit künstlichen Aminosäureresten, erzeugt durch Humanisierung, in menschliche FRs umgewandelt werden könnten, die in der Natur auftreten.
Die vorliegende Erfindung soll einen humanisierten Antikörper erzeugen, umfassend natürlich auftretende menschliche FRs anstelle von künstlichen FRs durch weitere Verarbeitung eines humanisierten Antikörpers, der durch eine konventionelle Humanisierungstechnologie konstruiert wurde. Wenn ein humanisierter Antikörper, der eine Aminosäuresubstitution durchlaufen hat, einer Homologiesuche unter Verwendung von menschlichen Antikörper-FRs und bekannten Datenbanken wie Swiss Prot (Proteinsequenz-Datenbank), GenBank (Nukleinsäuresequenz-Datenbank), PRF (Proteinsequenz-Datenbank), PIR (Proteinsequenz-Datenbank) und GenPept (translatierte Proteinsequenz von GenBank) unterworden wurde, können menschliche FRs mit vollständig gepaarten Aminosäuresequenzen oder menschliche FRs mit einer Homologie gefunden werden.
Im ersteren Fall wurde die FR-Substitution durchgeführt wenn von der menschlichen FR gesehen wurde, die als Akzeptor für das CDR-Grafting verwendet wurde, worin eine gebildete FR, von der angenommen wurde, daß sie künstlich ist, in der natürlichen FR vorliegt, die als Akzeptor betrachtet werden kann und daher kann eine FR, die keine FR-Substitution durchlaufen hat, erhalten werden. Im letzteren Fall ist es durch Fokussieren auf die Aminosäuresequenz der menschlichen FR mit hoher Homologie zu einer künstlichen FR möglich, eine Aminosäuresubstitution in der künstlichen FR zu bewirken, die dazu führt, daß man zu einem geeigneten natürlichen menschlichen Antikörper zurückkehrt, wodurch eine vollständige Paarung zu der natürlichen menschlichen FR ausgelöst wird. Dieses Verfahren repräsentiert eine Humanisierung an CDR-gepfropften Antikörpern.
Da die Homologiesuche von Aminosäuresequenzen zwischen menschlichen Antikörpern in diesem Fall durchgeführt wird, ist es möglich, eine menschliche FR zu finden, die zu derselben Subgruppe wie die menschliche FR gehört, die bei dem CDR-Grafting verwendet wird und eine Aminosäuresequenz mit extrem hoher Homologie zu finden. So erfüllt eine natürliche menschliche FR, erhalten für jede FR mehr als nötig die Konsensussequenz der Subgruppe, obwohl sie von unterschiedlichen Antikörpern abstammt.
3. Humanisierte Antikörper mit natürlicher Sequenz
Der in der vorliegenden Erfindung erhaltene natürliche humanisierte Antikörper umfaßt menschliche Antikörper-FRs, von denen erkannt wurde, daß sie in der Natur auftreten. Obwohl die FR1 bis FR4 manchmal von unterschiedlichen Antikörpern abstammen, ermöglicht es die Homologiesuche zwischen menschlichen Antikörpern eine Selektion von Antikörpern durchzuführen, die nur zu derselben Subgruppe gehören, wie oben beschrieben. Die FR-Struktur von jedem Antikörper in derselben Subgruppe hat eine sehr ähnliche Struktur zueinander und tatsächlich wurden humanisierte Antikörper, basierend auf Konsensussequenzen in der Subgruppe erzeugt (Kettleborough, C.A. et al., Protein Engng. (1991), 4, 773-783; Satoh, K. et al., Molec. Immun. (1994) 31, 371-381).
Es wird angenommen, daß bei Antikörpern wie oben beschrieben extrem unterschiedliche Aminosäuresequenzen natürlich durch somatische Mutation auftreten. Nur einige der Strukturen wurden gegenwärtig charakterisiert. Wenn die FR-Sequenz des erhaltenen Antikörpers in der Natur nicht gefunden werden kann ist nicht klar, ob die FR in der Natur vorliegt oder nicht. Wenn Antikörper als Pharmazeutika betrachtet werden, stellt die Konstruktion von CDR-Grafting-Antikörpern, umfassend natürlich auftretende menschliche FRs einen Antikörper bereit, der gegenüber konventionellen humanisierten Antikörpern im Hinblick auf das Ziel der vorliegenden Erfindung zur Reduktion der Antigenizität überlegene Eigenschaften aufweist.
4. Verfahren zur Konstruktion eines neuen humanisierten Antikörpers
Die vorliegende Erfindung löst mit einem humanisierten Antikörper assoziierte Problem, der durch die konventionelle Technik der Humanisierung konstruiert wurde, d.h. sie eliminiert die Antigenizität, die sich aus künstlichen FRs ergibt, die in der Natur nicht angetroffen werden. Ansonsten handelt es sich um eine Technologie um einen humanisierten Antikörper durch CDR-Grafting zu konstruieren, bestehend aus menschlichen FRs, die tatsächlich in der Natur angetroffen werden. Die Aminosäuresequenzen künstlicher FRs beziehen sich auf die Aminosäuresequenzen der FRs, die als ganzes nicht in der Natur angetroffen werden können. Die künstlichen Aminosäuresequenzen, enthalten in den FRs, beziehen sich auf diejenigen Aminosäuresequenzen, die in der Natur in FRs nicht angetroffen werden können.
Als Aminosäuresequenzen von FRs, die in der Natur nicht angetroffen werden, können FRs mit einer Aminosäuresequenz erwähnt werden, worin menschliche Aminosäurerest in einer FR zu Aminosäureresten zurückgekehrt sind, die in der FR eines Antikörpers angetroffen werden, der von einem nicht-menschlichen Säuger abstammt und der die Matrize für die Humanisierung in einem humanisierten Antikörper, konstruiert durch die konventionelle Antikörper-Humanisierungstechnik abstammt. Alternativ können in einem humanisierten Antikörper, konstruiert durch die konventionelle Antikörper-Humanisierungstechnik FRs erwähnt werden, die eine Aminosäuresequenz aufweisen, die nicht in Antikörpern gefunden wird, die von Menschen und nicht-menschlichen Säugern abstammt.
Das Verfahren zur Erzeugung des natürlichen humanisierten Antikörpers der vorliegenden Erfindung wird unten beschrieben.
Zunächst wird eine FR des menschlichen Antikörpers zur Verwendung beim CDR-Grafting durch ein konventionelles Verfahren gewählt. Die FR wird einer Aminosäuresubstitution unterworfen, um einen humanisierten Antikörper mit einer biologischen Aktivität entsprechend derjenigen eines Maus-Antikörpers oder höher zu konstruieren. Dies wird als Endprodukt des humanisierten Antikörpers im konventionellen Verfahren angesehen, jedoch ist dies in der vorliegenden Erfindung nur ein Intermediat zur Konstruktion eines natürlichen humanisierten Antikörpers mit einer natürlichen Sequenz. In der vorliegenden Erfindung wird dieser als primärer Design-Antikörper bezeichnet.
Darauffolgend wird eine Homologiesuche an jeder der FRs des primären Design-Antikörpers durchgeführt. FRs mit einer vollständigen Paarung bedeuten, daß die FRs bereits die natürlichen FRs umfaßt haben. Andererseits wird eine Reihe von natürlichen menschlichen FRs aufgeführt, die zu derselben Subgruppe wie der primäre Design-Antikörper gehören, und die eine Homologie, jedoch nicht eine vollständige Paarung zu dem primären Design-Antikörper aufweisen. Aus der Liste können die besonders geeigneten natürlichen menschlichen FRs gewählt werden, die sich den Aminosäurerest der FR erhalten, abstammend von einem nicht-menschlichen Säuger, wie zum Beispiel einer Maus, der für die Konstruktion des primären Design-Antikörpers wichtig war und eine Homologie mit dem primären Design-Antikörper aufweist.
Die Homologiesuche nach FRs kann unter Verwendung bekannter Datenbanken durchgeführt werden. Beispiele für solche Datenbanken beinhalten Swiss Prot, GenBank, PRF, PIR und GenPept. Die Homologiesuche wird unter Verwendung dieser Datenbanken durchgeführt, worin "die FR mit einer Homologie zu der FR des primären Design-Antikörpers", aufgeführt durch die Homologiesuche, sich auf die FR bezieht, die eine Homologie in der Aminosäuresequenz von mindestens 80 %, vorzugsweise mindestens 90 %, noch bevorzugter mindestens 91 %, besonders bevorzugt mindestens 92 %, besonders bevorzugt mindestens 93 %, besonders bevorzugt mindestens 94 %, besonders bevorzugt mindestens 95 %, besonders bevorzugt mindestens 96 % oder mehr, besonders bevorzugt 97 % oder mehr, besonders bevorzugt 98 % oder mehr und besonders bevorzugt 99 % oder mehr aufweist. Die Homologie des Proteins kann durch den Algorithmus bestimmt werden, der von Wilbur, W.J. und Lipman, D.J., Proc. Natl. Acad. Sci USA (1983) 80, 726-730 beschrieben wurde.
Aminosäurereste eines nicht-menschlichen Säugers, die für die Konstruktion des primären Design-Antikörpers wichtig waren beziehen sich auf Aminosäurereste, die von einer nicht-menschlichen FR abstammen, enthalten in einer künstlichen FR. Viele solcher Aminosäurereste werden in den Aminosäureresten angetroffen (kanonische Struktur), die für die zugrundeliegende Struktur des Antikörpermoleküls verantwortlich sind, bei den Aminosäureresten, die an dem Erhalt der Struktur der CDRs beteiligt sind oder den Aminosäureresten, die direkt mit einem Antigenmolekül in Wechselwirkung treten und beinhalten beispielsweise eine Aminosäure an Position 71 der H-Kette, eine Aminosäure an Position 94 der H-Kette und ähnliche, obwohl diese abhängig von dem Antikörper variieren können.
Wenn einer oder eine Vielzahl der Aminosäurereste, die sich zwischen der FR des primären Design-Antikörper und der natürlichen FR unterscheiden ersetzt werden, wie oben erwähnt, um einen humanisierten Antikörper zu erzeugen, der die Aminosäurerest der natürlichen menschlichen FR aufweist, umfaßt der humanisierte Antikörper (natürlicher humanisierter Antikörper; bezeichnet als sekundärer Design-Antikörper), der so erhalten wird, alle natürlichen FRs. In diesem Fall sind alle menschlichen FRs vorzugsweise menschliche FRs, die zur selben Subgruppe gehören und noch bevorzugter stammen sie von demselben Antikörper ab. Weiterhin müssen nicht alle menschlichen FRs zu derselben Subgruppe gehören solange sie in einen Antikörper umgeformt werden und bestimmte Antigen-Bindungsaktivitäten bereitstellen und sie sind dadurch nicht auf die menschlichen FRs begrenzt, die zur selben Subgruppe gehören. Gemäß der vorliegenden Erfindung bedeutet eine Vielzahl von Aminosäureresten 2 oder mehr Aminosäurerest, vorzugsweise 2 oder mehr und 10 und weniger Aminosäurereste, noch bevorzugter 2 oder mehr und 5 oder weniger Aminosäurereste, noch bevorzugt 2 oder mehr und 4 oder weniger Aminosäurereste und noch bevorzugter 2 oder mehr und 3 oder weniger Aminosäurereste in der Aminosäuresequenz.
Eine Homologie zwischen einer künstlichen FR und einer natürlichen menschlichen FR beträgt mindestens 80 %, vorzugsweise mindestens 90 %, vorzugsweise mindestens 91 %, vorzugsweise mindestens 92 %, vorzugsweise mindestens 93 %, vorzugsweise mindestens 94 %, vorzugsweise mindestens 95 %, vorzugsweise mindestens 96 % oder mehr, vorzugsweise mindestens 97 % oder mehr, vorzugsweise mindestens 98 % oder mehr, vorzugsweise mindestens 99 % oder mehr.
Dann wird es dem sekundären Design-Antikörper ermöglicht in einem geeigneten Expressionssystem exprimiert zu werden, beispielsweise in einer tierischen Zelle um die Antigen-Bindungsaktivität und ähnliches zu bewerten.
Weiterhin kann das Herstellungsverfahren der vorliegenden Erfindung selbst ohne die tatsächliche Konstruktion des primären Design-Antikörpers bewirkt werden. So wird der primäre Design-Antikörper auf konventionelle Weise entworfen und ohne Bewertung davon kann der sekundäre Design-Antikörper entworfen werden, der direkt bewertet werden kann. Tatsächlich involviert jedoch die Identifizierung wichtiger FR-Reste manchmal Experimente und der sekundäre Design-Antikörper wird vorzugsweise konstruiert, nachdem der konventionelle primäre Design-Antikörper experimentell konstruiert wurde.
Spezifisch wurde der natürliche humanisierte Antikörper der vorliegenden Erfindung gemäß einem Aspekt der vorliegenden Erfindung mit dem Maus-anti-HM1.24-Antikörper (Goto, T. et al., Blood (1994) 84, 1922-1930) als Matrize erzeugt.
Für natürliche humanisierte Antikörper, die wie oben erwähnt entworfen wurden, kann das Gen, das es codiert, durch ein bekanntes Verfahren erhalten werden. Beispielsweise werden etliche Oligonukleotide synthetisiert, die überlappende Enden aufweisen, korrespondierend zu der DNA, die die Aminosäuresequenz des entworfenen natürlichen humanisierten Antikörpers codiert. Ein PCR-Verfahren wird unter Verwendung dieser Oligonukleotide als Primer durchgeführt. Dann wird ein PCR-Verfahren unter Verwendung von Primern durchgeführt, die die beiden Enden der DNA definieren, die die Aminosäuresequenz des entworfenen natürlich humanisierten Antikörpers codieren um das Gen zu erhalten, das den gewünschten natürlichen humanisierten Antikörper codiert.
Gene, die einen natürlichen humanisierten Antikörper codieren, der wie oben beschrieben konstruiert wurde, können durch ein bekanntes Verfahren exprimiert werden um den natürlichen humanisierten Antikörper zu erhalten. Im Fall von Säugerzellen kann eine Expression unter Verwendung eines üblicherweise verwendeten nützlichen Promotors/Enhancers, des zu exprimierenden Antikörpergens und von DNA bewirkt werden, worin das Poly-A-Signal operabel an eine 3' stromabwärts gelegene Seite davon gebunden wurde oder unter Verwendung eines Vektors, der diese enthält. Beispiele für den Promotor/Enhancer beinhalten den menschlichen Cytomegalievirus immediate early Promotor/Enhancer.
Zusätzlich können als Promotor/Enhancer, die für die Expression eines Antikörpers zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, virale Promotoren/Enhancer verwendet werden, wie beispielsweise Retrovirus, Polyomavirus, Adenovirus und Simianvirus 40 (SV40) und Promotoren/Enhancer, die von Säugerzellen abstammen, wie beispielsweise der menschliche Elongationsfaktor 1α (HEF1α).
Beispielsweise kann die Expression auf einfache Weise durch das Verfahren von Mulligan et al. (Nature (1979) ,77, 108) bewirkt werden, wenn der SV40-Promotor/Enhancer verwendet wird oder durch das Verfahren von Mizushima et al. (Nucleic Acids Res. (1990) 18, 5322), wenn der HEF1α-Promotor/Enhancer verwendet wird.
Im Fall von Escherichia coli (E. coli) kann die Expression durch einen operables Anbinden eines üblicherweise verwendeten nützlichen Promotors, einer Signalsequenz für die Antikörpersekretion und das Antikörpergen, das exprimiert werden soll, bewirkt werden, gefolgt von seiner Expression. Als Promotor kann beispielsweise der lacZ-Promotor und der araB-Promotor erwähnt werden. Das Verfahren von Ward et al. (Nature (1998) 341, 544-546; FASER J. (1992) 6, 2422-2427) kann verwendet werden, wenn der lacZ-Promotor verwendet wird und das Verfahren von Retter et al. (Science (1988) 240, 1041-1043) kann verwendet werden, wenn der araB-Promotor verwendet wird.
Als Signalsequenz für die Antikörpersekretion kann die pelB-Signalsequenz (Lei, S.P. et al., J. Bacteriol. (1987) 169, 4379) verwendet werden, wenn im Periplasma von E. coli produziert wird. Nach Abtrennung des im Periplasma erzeugten Antikörpers wird die Struktur des Antikörpers auf geeignete Weise vor der Verwendung neuerlich gefaltet (siehe beispielsweise die internationale Patentveröffentlichung WO 96/30394 und die japanische geprüfte Patentveröffentlichung (Kokoku) Nr. 7(1995)-93879).
Als Replikationsursprung können diejenigen verwendet werden, die von SV40, Polyomavirus, Adenovirus, Rinder-Papillomavirus (BPV) und ähnlichen abstammen. Weiterhin können zur Amplifikation der Gen-Kopiezahl in dem Wirtszellsystem Expressionsvektoren als selektierbare Marker das Aminoglycosidtransferase-(APH)-Gen, das Thymidinkinase-(TK)-Gen, das E. coli-Xanthinguaninphosphoribosyltransferase-(Ecogpt)-Gen, das Dihydrofolatreduktase-(dhfr)-Gen und ähnliche beinhalten.
Für die Produktion des Antikörpers zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung kann jedes Produktionssystem verwendet werden. Das Produktionssystem der Antikörperpräparation umfaßt die in-vitro- oder in-vivo-Produktionssysteme. Als in-vitro-Produktionssystem kann ein Produktionssystem erwähnt werden, das eukaryontische Zellen verwendet und ein Produktionssystem, das prokaryotische Zellen verwendet.
Wenn die eukaryontischen Zellen verwendet werden, gibt es Produktionssysteme, die tierische Zellen, Pflanzenzellen und Pilzzellen verwenden. Bekannte tierische Zellen beinhalten (i) Säugerzellen wie zum Beispiel CHO-Zellen (J. Exp. Med. (1995) 108, 945), COS-Zellen, Myelomzellen, Babyhamsternieren-(BHK)-Zellen, HeLa-Zellen und Verozellen, (2) Amphibienzellen wie zum Beispiel Xenopus-Oocyten (Valle et al., Nature (1981) 291, 358-340) oder (3) Insektenzellen, wie beispielsweise sf9, sf21 und Tn5. Als CHO-Zellen werden vorzugsweise dhfr-CHO (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1980) 77, 4216-4220) verwendet, denen das DHFR-Gen fehlt und CHO K-1 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1968) 60, 1275).
Bekannte Pflanzenzellen beinhalten beispielsweise diejenigen, die von Nicotiana tabacum abstammen, das einer Calluskultur unterworfen wird. Bekannte Pilzzellen beinhalten Hefen wie zum Beispiel die Gattung Saccheromyces, beispielsweise Saccharomyces cerevisiae oder filamentöse Pilze wie zum Beispiel von der Gattung Aspergillus, beispielsweise Aspergillus niger.
Wenn prokaryontische Zellen verwendet werden gibt es Produktionssysteme, die bakterielle Zellen verwenden. Bekannte bakterielle Zellen beinhalten Escherichia coli (E. coli) und Bacillus subtilis.
Durch Transformation dieser Zellen mit dem Gen, das den natürlichen humanisierten Antikörper der vorliegenden Erfindung codiert und Kultivierung der transformierten Zellen in vitro, können natürliche humanisierte Antikörper erhalten werden. Die Kultivierung wird in einem bekannten Verfahren durchgeführt. Als Kulturflüssigkeit können beispielsweise DMEM, MEM, RPMI1640 und IMDM verwendet werden und Serumzusatzstoffe wie fötales Kälberserum (FCS) kann in Kombination verwendet werden oder es kann ein serumfreies Kulturmedium verwendet werden. Zusätzlich können Antikörper in vivo erzeugt werden indem Zellen implantiert werden, in die das Antikörpergen eingeführt wurde, und zwar in die Abdominalhöhle eines Tieres oder ähnliches.
Als in-vivo-Produktionssystem können diejenigen erwähnt werden, die Tiere verwenden und diejenigen die Pflanzen verwenden. Das Gen des Antikörpers wird in ein Tier oder eine Pflanze eingeführt und der Antikörper wird in einem solchen Tier oder einer solchen Pflanze erzeugt und dann gesammelt.
Wenn Tiere verwendet werden, gibt es Produktionssysteme, die Säuger und Insekten verwenden.
Als Säuger können Ziegen, Schweine, Schafe, Mäuse und Rinder verwendet werden (Vicki Glaser, SPECTRUM Biotechnology Applications, 1993). Wenn Säuger verwendet werden, können auch transgene Tiere verwendet werden.
Beispielsweise wird ein Antikörpergen in ein Gen inseriert, codierend ein Protein, das inhärent in Milch erzeugt wird, wie zum Beispiel Ziegen-β-Casein, um Fusionsgene herzustellen. DNA-Fragmente, enthaltend das Fusionsgen, in die das Antikörpergen inseriert wurde, werden in einen Ziegenembryo injiziert und der Embryo wird in eine weibliche Ziege eingeführt. Der gewünschte Antikörper wird aus der Milch erhalten, erzeugt von der trangenen Ziege, die der Ziege geboren wurde, die den Embryo erhielt oder Nachkommen davon. Um die Menge an Milch zu erhöhen, die den gewünschten Antikörper enthält, erzeugt von der transgenen Ziege, können der transgenen Ziege Hormone je nach Bedarf verabreicht werden (Ebert, K.M. et al., Bio/Technology (1994) 12, 699-702).
Wenn Insekten verwendet werden, können Seidenwürmer verwendet werden. Wenn Seidenwürmer verwendet werden, wird der Seidenwurm mit einem Baculovirus infiziert, in den das gewünschte Antikörpergen inseriert wurde und der gewünschte Antikörper kann aus der Körperflüssigkeit des Seidenwurms erhalten werden (Susumu, M. et al., Nature (1985) 315, 592-594).
Wenn Pflanzen verwendet werden, kann beispielsweise Tabak verwendet werden. Wenn weiterhin Tabak verwendet wird, wird das gewünschte Antikörpergen in einen Expressionsvektor für Pflanzen inseriert, beispielsweise pMON 530, und dann wird der Vektor in ein Bakterium wie Agrobacterium tumefaciens eingeführt. Das Bakterium wird dann in Tabak infiziert, wie zum Beispiel Nicotiana tabacum, um den gewünschten Antikörper aus den Blättern des Tabaks zu erhalten (Julian, C.-C. Ma et al., Eur. J. Immunol. (1994) 24, 131-138).
Wie oben beschrieben, umfaßt "Wirt" wie hier verwendet Tiere und Pflanzen, die den gewünschten natürlichen humanisierten Antikörper erzeugen. Wenn der Antikörper in in-vitro- oder in-Vivo-Antikörpersystemen erzeugt wird, wie oben beschrieben, kann eine DNA, codierend eine H-Kette oder eine L-Kette eines Antikörpers getrennt in einen Expressionsvektor integriert und ein Wirt simultan transformiert werden, oder DNA, codierend eine H-Kette oder DNA, codierend eine L-Kette können in einen einzelnen Expressionsvektor integriert werden und der Wirt wird damit transformiert (siehe internationale Patentveröffentlichung WO 94-11523 ).
Als Verfahren zur Einführung eines Expressionsvektors in einen Wirt kann ein bekanntes Verfahren, wie zum Beispiel das Calciumphosphat-Verfahren (Virology (1973) 52, 456-467) und das Elektroporationsverfahren (EMBO J. (982) 1, 841-845) und ähnliches verwendet werden.
Ein natürlicher humanisierter Antikörper, der wie oben beschrieben erzeugt und exprimiert wird, kann aus dem Inneren oder vom Äußeren einer Zelle oder von dem Wirt getrennt und dann zur Homogenität gereinigt werden. Die Trennung und Reinigung des natürlichen humanisierten Antikörpers zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung kann durch konventionelle Verfahren der Trennung und Reinigung bewirkt werden, die für Proteine verwendet werden, ohne daß diesen irgendeine Begrenzung auferlegt ist. Die Trennung und Reinigung kann durch Kombination von Chromatographie wie Affinitätschromatographie, Filtration, Ultrafiltration, Aussalzen, Dialyse und ähnlichem auf geeignete Weise bewirkt werden (Antibodies: A Laboratory Manual, Hrsg. Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988).
Als für eine solche Affinitätschromatographie verwendete Säule kann eine Protein A-Säule und eine Protein G-Säule erwähnt werden. Als Träger zur Verwendung in der Protein A-Säule können Hyper D, POROS, Sepharose F.F. (Pharmacia) und ähnliche erwähnt werden.
Andere Chromatographieverfahren als eine Affinitätschromatographie beinhalten beispielsweise eine Ionenaustauschchromatographie, eine hydrophobe Chromatographie, eine Gelfiltration, eine Umkehrphasenchromatographie, eine Adsorptionschromatographie und ähnliche (Strategies for Protein Purification and Characerization: A Laboratory Course Manual. Hrsg. Daniel R. Marshak et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1996).
Diese Chromatographien können unter Verwendung einer Flüssigchromatographie wie beispielsweise HPLC, FPLC und ähnliche durchgeführt werden.
Die Konzentration des natürlichen humanisierten Antikörpers der vorliegenden Erfindung kann durch Messen der Absorption oder durch einen Enzym-gebundenen Immunosorbent-Assay (ELISA) und ähnliches bestimmt werden. Wenn so eine Absorptionsmessung verwendet wird, wird der erhaltene natürliche humanisierte Antikörper auf geeignete Weise mit PBS verdünnt und dann wird die Absorption bei 280 nm gemessen, gefolgt von einer Kalkulation unter Verwendung des Absorptionskoeffizienten von 1,35 OD bei 1 mg/ml.
Wenn das ELISA-Verfahren verwendet wird, wird die Messung wie folgt durchgeführt. Sc werden 100 μl von Ziegen-anti-menschlichem IgG (hergestellt von BIO SOURCE), verdünnt auf 1 mg/ml in 0,1 M Bicarbonatpuffer, pH 9,6 zu einer Platte mit 96 Vertiefungen (hergestellt von Nunc) zugefügt und über Nacht bei 4°C inkubiert, um den Antikörper zu immobilisieren. Nach dem Blockieren werden 100 μl von jeweils geeignet verdünnten natürlichem humanisierten Antikörper der vorliegenden Erfindung oder einer Probe, enthaltend den Antikörper oder menschlichem IgG (hergestellt von CAPPEL) einer bekannten Konzentration als Standard zugefügt und bei Raumtemperatur 1 Stunde inkubiert.
Nach dem Waschen werden 100 μl von 5000-fach verdünntem alkalische Phosphatase-markierten anti-menschlichen IgG-Antikörper (hergestellt von BIO SOURCE) zugefügt und 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Nach dem Waschen wird die Substratlösung zugefügt und inkubiert, gefolgt von einer Messung der Absorption bei 405 nm unter Verwendung des MICROPLATE READER Model 3550 (hergestellt von Bio-Rad) um die Konzentration des gewünschten Antikörpers zu berechnen. BIAcore (hergestellt von Pharmacia) kann für die Messung der Antikörperkonzentration verwendet werden.
Die Antigen-Bindungsaffinität, die Bindungsinhibitionsaktivität und die neutralisierende Aktivität des natürlichen humanisierten Antikörpers der vorliegenden Erfindung können durch bekannte Verfahren bewertet werden. Beispielsweise können als Verfahren zur Bestimmung der Aktivität des natürlichen humanisierten Antikörpers der vorliegenden Erfindung ein ELISA, ein EIA (Enzymimmunoassay), ein RIA (Radioimmunoassay) oder das fluoreszente Antikörperverfahren erwähnt werden. Für die Bewertung des obigen Antikörpers BIAcore (hergestellt von Pharmacia) verwendet werden.
Der natürliche humanisierte Antikörper der vorliegenden Erfindung kann ein Antikörperfragment oder modifizierte Versionen davon sein. Beispielsweise können als Antikörperfragmente Fab, F(ab')₂, Fv oder einzelkettiges Fv (scFv) erwähnt werden. scFv hat eine Struktur, worin die Fvs der H-Kette und der L-Kette über einen geeigneten Linker ligiert sind.
Um diese Antikörper zu erzeugen, werden die Antikörper mit einem Enzym wie Papain oder Pepsin behandelt oder Gene, die diese Antikörperfragmente codieren, werden konstruiert und in einen Expressionsvektor eingeführt, der in einer geeigneten Wirtszelle exprimiert wird, um sie zu exprimieren (siehe beispielsweise Co, M.S. et al., J. Immunol. (1994) 152, 2968-2976; Retter, M. und Horwitz, A.H., Methods in Enzymology (1989) 178, 476-496, Academic Press Inc.; Plucktrun, A. und Skerra, A., Methods in Enzymol. (1989) 178, 476-496, Academic Press Inc.; Lamoyi, E., Methods in Enzymol. (1986) 121, 652-663; Rousseaux, J. et al., Methods in Enzymol. (1986) 121, 663-669; Bird, R.E. und Walker, B.W., TIBTECH (1991) 9, 132-137).
scFv kann durch Ligation der V-Region der H-Kette und der V-Region der L-Kette eines Antikörpers erhalten werden (siehe Internationale Patent Veröffentlichung WO 88-09344 ). Bei scFv sind die V-Region der H-Kette und die V-Region der L-Kette vorzugsweise über einen Linker ligiert, vorzugsweise ein Peptidlinker (Hutson, J.S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1988) 85, 5879-5883). Die V-Region der H-Kette und die V-Region der L-Kette in dem scFv können von jedem der oben erwähnten Antikörper abstammen. Als Peptidlinker für die Ligation der V-Regionen kann jedes einzelkettige Peptid, umfassend beispielsweise eins, das 12 bis 19 Aminosäurereste umfaßt, verwendet werden (siehe US-Patent US 5525491 ).
DNA, die scFv codiert, kann unter Verwendung von DNA erhalten werden, die die H-Kette oder die H-Ketten-V-Region des oben erwähnten Antikörpers codiert und DNA, codierend die L-Kette oder die L-Ketten-V-Region des obigen Antikörpers als Matrize, durch Amplifikation des Teils der DNA, codierend die gewünschte Aminosäuresequenz unter den obigen Sequenzen durch das PCR-Verfahren mit dem Primerpaar, das die beiden Enden spezifiziert und durch weitere Amplifikation der Kombination von DNA, codierend den Peptidlinkerbereich und des Primerpaars, das die beiden Enden der DNA definiert, zur Ligation an die H-Kette bzw. die L-Kette.
Sobald DNAs, die scFv codieren konstruiert sind, kann ein Expressionsvektor, der sie enthält, und ein Wirt, der mit dem Expressionsvektor transformiert wurde, erhalten werden und zwar durch konventionelle Verfahren und scFv kann unter Verwendung des resultierenden Wirts durch konventionelle Verfahren erhalten werden.
Diese Antikörperfragmente können erzeugt werden, indem das Gen davon auf ähnliche Weise wie oben erwähnt erhalten wird und indem man dies in einem Wirt exprimiert. "Antikörper" wie im Anspruch der vorliegenden Anmeldung umfaßt diese Antikörperfragmente.
Als modifizierte Antikörper können Antikörper, die mit verschiedenen Molekülen wie Polyethylenglykol (PEG) assoziiert sind, verwendet werden. "Antikörper" wie im Anspruch der vorliegenden Anmeldung verwendet umfaßt diese modifizierten Antikörper. Diese modifizierten Antikörper können durch chemische Modifikation der so erhaltenen Antikörper erhalten werden. Diese Verfahren wurden bereits auf dem Gebiet etabliert.
Der natürliche humanisierte Antikörper der vorliegenden Erfindung kann oral oder parenteral, entweder systemisch oder topisch verabreicht werden. Der parenterale Weg kann aus einer intravenösen Injektion wie zum Beispiel einer Tropfinfusion, einer intramuskulären, einer intraperitonealen Injektion und einer subkutanen Injektion gewählt werden und das Verabreichungsverfahren kann je nach Bedarf abhängig vom Alter und Zustand des Patienten gewählt werden.
Der natürliche humanisiert Antikörper der vorliegenden Erfindung kann in einer Dosierung verabreicht werden, die genügt um die pathologische Bedingung zumindest teilweise zu blockieren oder zu behandeln. Beispielsweise wird die effektive Dosis aus einem Bereich von 0,01 mg bis 100 mg pro kg Körpergewicht pro Verabreichung gewählt. Alternativ kann eine Dosierung in einem Bereich von 1 bis 1000 mg, vorzugsweise 5 bis 50 mg pro Patient gewählt werden. Der natürliche humanisierte Antikörper der vorliegenden Erfindung ist jedoch nicht auf diesen Dosen begrenzt.
Der erfindungsgemäße natürliche humanisierte Antikörper kann pharmazeutisch annehmbare Träger oder Additive enthalten, je nach Verabreichungsweg. Beispiele für solche Träger oder Additive beinhalten Wasser, ein pharmazeutisch annehmbares organisches Lösungsmittel, Collagen, Polyvinylalkohol, Polyvinylpyrrolidon, ein Carboxyvinylpolymer, Carboxymethylcellulosenatrium, Polyacrylnatrium, Natriumalginat, wasserlösliches Dextran, Carboxymethylstärkenatrium, Pectin, Methylcellulose, Ethylcellulose, Xanthan-Gummi, Gummi arabicum, Casein, Gelatine, Agar, Diglycerin, Propylenglykol, Polyethylenglykol, Vaseline, Paraffin, Stearylalkohol, Stearinsäure, menschliches Serumalbumin (HSA), Mannit, Sorbit, Lactose, ein pharmazeutisch annehmbares Tensid und ähnliche. Die verwendeten Additive werden aus dem obigen gewählt oder aus Kombinationen daraus, abhängig von der Dosierungsform, sind jedoch nicht darauf begrenzt.
Referenzbeispiele
Bevor die vorliegende Erfindung unter Bezugnahme auf die Arbeitsbeispiele erklärt wird, werden Referenzbeispiele als Einführung beschrieben.
Referenzbeispiel 1: Klonierung von cDNA, codierend die variable Region eines Maus-anti-HM1.24-Antikörpers
1. Isolation von Messenger-RNA (mRNA)
Unter Verwendung des Fast-Track-mRNA-Isolations-Kits, Version 3.2 (hergestellt von Invitrogen) und zwar gemäß den beigefügten Anweisungen wurde mRNA aus 2 × 10⁸ Hybridomzellen (FERN BP-5233) isoliert, die einen Maus-anti-HM1.24-Antikörper erzeugen.
2. Amplifikation des Gens, das die variable Region des Antikörpers codiert, durch das PCR-Verfahren
Eine PCR wurde unter Verwendung des Amplifikations-Thermal-Cyclers (hergestellt von Perkin Elmer Cetus) durchgeführt.
2-1. Amplifikation und Fragmentierung des Gens, das die V-Region einer Maus-L-Kette codiert.
Aus der so isolierten mRNA wurde einzelsträngige cDNA unter Verwendung des AMV Reverse Transcriptase First-strand-cDNA-Synthesis-Kit (hergestellt von Life Science) synthetisiert und für die PCR verwendet. Als für die PCR verwendete Primer wurden MKV (Maus-kappa-variable) Primer (Jones, S.T. et al., Bio/Technology, 9, 99-89 (1991)) wie dargestellt in SEQ ID NO: 29 bis 39 verwendet, die an die Leadersequenz einer Maus-kappa-Typ-L-Kette hybridisieren.
100 μl der PCR-Lösung, enthaltend 10 mM Tris-HCl (ph 8,3), 50 mM KCl, 0,1 mM dNTPs (dATP, dGTP, dCTP, dTTP), 1,5 mM MgCl₂, 5 Einheiten DNA-Polymerase Ampli Taq (hergestellt durch Perkin Elmer Cetus), 0,25 mM der MKV-Primer, wie dargestellt in SEQ ID NO: 29 bis 39, 3 mM der MKC-Primer, dargestellt in SEQ ID NO: 40 und 100 ng einzelsträngige cDNA wurde mit 50 μl mineralischen Öl bedeckt und dann bei einer anfänglichen Temperatur von 94°C 3 Minuten, dann bei 94°C für 1 Minute, bei 55°C für 1 Minute und bei 72°C für 1 Minute in dieser Reihenfolge erwärmt. Nach 30-facher Wiederholung dieses Zyklus wurde die Reaktionsmischung 10 Minuten bei 72°C inkubiert. Das amplifizierte DNA-Fragment wurde durch niedrigschmelzende Agarose (hergestellt von Sigma) gereinigt und mit XmaI (hergestellt von New England Biolabs) uns SalI (hergestellt von Takara Shuzo) bei 37°C verdaut.
2-2. Amplifikation und Fragmentierung von cDNA, codierend die V-Region einer Maus-H-Kette
Das Gen, das die V-Region von einer Maus-H-Kette codiert wurde durch das 5'-RACE-Verfahren (Rapid Amplification of cDNA ends; Frohman, M.A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 8998-9002 (1988), Edwards, J.B.D.M., et al., Nucleic Acids Res., 19, 5227-5232 (1991)) amplifiziert. Nachdem eine cDNA unter Verwendung des Primers P1 (SEQ ID NO: 63), der spezifisch mit der konstanten Region von Maus-IgG2a hybridisiert, synthetisiert wurde, wurde eine cDNA, codierend die V-Region einer Maus-H-Kette durch den 5'-AmpliFINDER RACE KIT (hergestellt von CLONTECH) unter Verwendung des Primers MHC 2a (SEQ ID NO: 64) amplifiziert, der spezifisch an die konstante Region von Maus-IgG2a hybridisiert und dem Anchor-Primer (SEQ ID NO: 101), der dem Kit beigefügt war. Das amplifizierte DNA-Fragment wurde mit niedrigschmelzender Agarose (hergestellt von Sigma) gereinigt und mit EcoRI (hergestellt von Takara) und XmaI (hergestellt von New England Biolabs) bei 37°C verdaut.
3. Linking und Transformation
Das DNA-Fragment, umfassend das Gen, das die V-Region der Maus-kappa-Typ-L-Kette codiert, hergestellt wie oben, wurde mit dem pUC19-Vektor ligiert, hergestellt durch Verdau mit SalI und XmaI, und zwar durch Reaktion in einer Reaktionsmischung, enthaltend 50 mM Tris-HCl (pH 7,6), 10 mM MgCl₂, 10 mM Dithiothreitol, 1 mM ATP, 50 mg/ml Polyethylenglykol (8000) und einer Einheit T4-DNA-Ligase (hergestellt von GIBCO-BRL) für 2,5 Stunden bei 16°C. Auf ähnliche Weise wurde das Gen, das die V-Region der Maus-H-Kette codierte umgesetzt und mit den pUC19-Vektor ligiert, hergestellt durch Verdau für 3 Stunden bei 16°C mit EcoRI und XmaI.
Dann wurden 10 μl der obigen Ligationsmischung zu 50 μl der kompetenten Zellen von Escherichia coli DH5 zugefügt, was man 30 Minuten auf Eis stehen ließ, 1 Minute bei 42°C und wiederum 1 Minute auf Eis. Darauffolgend wurden 400 μl 2xYT-Medium (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)) hinzugefügt, es wurde 1 Stunde bei 37°C inkubiert und dann wurden die E. coli auf dem 2xYT-Agar-Medium ausplattiert (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)), enthaltend 50 μg/ml Ampicillin und dann über Nacht bei 37°C inkubiert, um die E. coli-Transformante zu erhalten.
Die Transformante wurde über Nach bei 37°C in 10 ml 2xYT-Medium kultiviert, enthaltend 50 μg/ml Ampicillin und dann wurde aus dieser Kultur Plasmid-DNA unter Verwendung des Alkaliverfahrens (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)) hergestellt.
Das so erhaltene Plasmid, enthaltend das Gen, codierend die V-Region der Maus-kappa-Typ-L-Kette, abstammend von dem Hybridom, das den anti-HM1.24-Antikörper erzeugt, wurde pUCHMVL9 genannt. Das durch das oben erwähnte Verfahren erhaltene Plasmid, enthaltend das Gen, das die V-Region der Maus-H-Kette codiert, abstammend von dem Hybridom, das den anti-HM1.24-Antikörper erzeugt, wurde pUCHMVHR16 genannt.
Referenzbeispiel 2: Bestimmung der Nukleotidsequenz der DNA
Die Nukleotidsequenz der cDNA, codierend die Region des oben erwähnten Plasmids wurde unter Verwendung des automatischen DNA-Sequencers (hergestellt von Applied Biosystem Inc.) und des Taq Dye Deoxy Terminator Cycle Sequencing Kit (hergestellt von Applied Biosystem Inc.) gemäß dem Protokoll, das von dem Hersteller angegeben wird, bestimmt.
Die Nukleotidsequenz des Gens, das die V-Region der L-Kette des Maus-anti-HM1.24-Antikörpers codiert, enthalten in dem Plasmid pUCHMVL9 wird in SEQ ID NO: 1 dargestellt. Die Nukleotidsequenz des Gens, das die V-Region der H-Kette des Maus-anti-HM1.24-Antikörpers codiert, enthalten in dem Plasmid pUCHMVHR16 wird in SEQ ID NO: 3 dargestellt.
Referenzbeispiel 3: Bestimmung der CDR
Die Gesamtstrukturen der V-Regionen einer L-Kette und einer H-Kette haben eine Ähnlichkeit zueinander, worin vier Framework-Teile durch drei hypervariable Regionen verbunden sind, d.h. komplementaritätsbestimmende Regionen (CDR). Die Aminosäuresequenz des Frameworks ist relativ gut konserviert, jedoch ist die Variation in der Aminosäuresequenz extrem hoch (Kabat, E.A. et al., "Sequences of Proteins of Immunological Interest", US Dept. Health and Human Services, 1983).
Basierend auf diesen Tatsachen wurde die Aminosäuresequenz der variablen Region des anti-HM1.24-Antikörpers an die Datenbank der Aminosäuresequenz von Antikörpern angepaßt, um die Homologie zu untersuchen und die CDR-Region wurde wie in Tabelle 1 dargestellt, bestimmt. Tabelle 1

Plasmid Sequenz Nr. CDR(1) CDR(2) CDR(3)

pUCHMVL9 5 bis 7 24-34 50-56 88-97

pUCHMvHR16 8 bis 10 31-35 50-66 99-109
Referenzbeispiel 4: Bestätigung der Expression der klonierten cDNA (Konstruktion des chimären anti-HM1.24-Antikörpers)
1. Konstruktion eines Expressionsvektors
Um einen Expressionsvektor zu konstruieren, der einen chimären anti-HM1.24-Antikörper exprimiert, wurden die cDNA-Klone pUCHMVL9 und pUCHMVHR16, codierend die V-Regionen der L-Kette bzw. der H-Kette des Maus-anti-HM1.24-Antikörpers durch das PCR-Verfahren modifiziert und dann in den HEF-Expressionsvektor (internationale Patentveröffentlichung WO 92/19759 ) eingeführt.
Der Rückwärtsprimer ONS-L722S (SEQ ID NO: 65) für die V-Region einer L-Kette und der Rückwärtsprimer VHR16S (SEQ ID NO: 66) für die V-Region einer H-Kette wurden so entworfen, daß sie an die DNA hybridisieren, die den Beginn der Leader-Sequenz der V-Region von jeder codiert und sie haben eine Kozak-Konsensus-Sequenz (Kozak, M. et al., J. Mol. Biol., 196, 947-950 (1987)) sowie die Erkennungsstelle für das HindIII-Restriktionsenzym. Der Vorwärtsprimer VL9A (SEQ ID NO: 67) für die V-Region der L-Kette und der Vorwärtsprimer VHR16A (SEQ ID NO: 68) für die V-Region einer H-Kette wurden so entworfen, daß sie an die DNA-Sequenz hybridisieren, die das Ende der J-Region codiert und sie haben eine Spleiß-Donorsequenz und die Erkennungsstelle für das BamHI-Restriktionsenzym.
100 μl der PCR-Reaktionsmischung, enthaltend 100 mM Tris-HCl (pH 8,3), 50 mM KCl, 0,1 mM dNTPs, 1,5 mM MgCl₂, 100 pmol von jeweils jedem Primer, 100 ng Matrizen-DNA (pUCHMVL9 oder pUCHMVHR16) und 5 Einheiten Ampli Taq-Enzym wurden mit 50 μl mineralischem Öl bedeckt und dann wurde nach einer anfänglichen Denaturierung bei 94°C für 1 Minute auf 94°C erwärmt, für 1 Minuten auf 55°C und für 1 Minute auf 72°C für 30 Zyklen und es wurde schließlich 10 Minuten bei 72°C inkubiert.
Das PCR-Produkt wurde durch niedrigschmelzendes Agarosegel gereinigt und mit HindIII und BamHI verdaut und dann an HEF-VL-gκ für die V-Region der L-Kette und HEF-VH-gγl für die V-Region der H-Kette kloniert. Nach Bestimmung der DNA-Sequenz wurden die Plasmide, die das DNA-Fragment enthielten, das die korrekte DNA-Sequenz enthält als HEF-1.24L-gκ bzw. HEF-1.24H-gγ1 bezeichnet.
Die Regionen, die die jeweiligen variablen Regionen der obigen Plasmide HEF-1.24L-gκ bzw. HEF-1.24H-gγ1 codieren wurden mit den Restriktionsenzymen HindIII und BamHI zum Erhalt von Restriktionsfragmenten verdaut, die in die HindIII- und BamHI-Stellen des Plasmidvektors pUC19 inseriert wurden und wurden als pUC19-1.24L-gκ bzw. pUC19-1.24H-gγ1 bezeichnet.
Escherichia coli, enthaltend die jeweiligen Plasmide pUC19-1.24L-gκ bzw. pUC19-1.24H-gγ1 wurden als Escherichia coli DH5 (pUC19-1.24L-gκ) bzw. Escherichia coli DH5 (pUC19-1.24H-gγ1) bezeichnet und wurden international am 29. August 1996 bei dem National Institute of Bioscience und Human-Techology, Agency of Industrial Science and Technology, MITI (Higashi 1-Chore 1-3, Tsukuba City, Ibaraki Prefecture, Japan) unter den Hinterlegungs-Nrn. FERN BP-5646 bzw. FERN BP-5644 gemäß den Vorschriften des Budapester Vertrags hinterlegt.
2. Transfektion in COS-7-Zellen
Um die transiente Expression des chimären anti-HN1.24-Antikörpers zu beobachten, wurden die obigen Expressionsvektoren in den COS-7-(ATCC CRL-1651)-Zellen getestet. HEF-1.24L-gκ bzw. HEF-1.24H-gγ1 wurden in COS-7-Zellen durch Elektroporation unter Verwendung des Gene Pulser-Instruments (hergestellt von BioRad) co-transformiert. Jede DNA (10 μg) wurde zu 0,8 ml Aliquots von 1 × 10⁷ Zellen/ml in PBS zugefügt und wurde Pulsen bei 1500 V und einer Kapazität von 25 μF unterworfen.
Nach einer Erholungsperiode von 10 Minuten bei Raumtemperatur wurden die elektroporierten Zellen zu 30 ml der DHEM-Kulturflüssigkeit (hergestellt von GIBCO) zugefügt, enthaltend 10 % γ-Globulin-freies fötales Rinderserum. Nach 72-stündiger Inkubation im CO₂-Inkubator BNA120D (hergestellt von TABAI) wurde der Kulturüberstand gesammelt, der Zellabfall durch Zentrifugation entfernt und der Überstand für das folgende Experiment verwendet.
3. FCM-Analyse
Die Antigen-Bindungsaktivität des chimären anti-HM1.24-Antikörpers wurde durch FCM (Flußcytometrie)-Analyse unter Verwendung von KPMM2-Zellen untersucht. Nachdem 4,7 × 10⁵ KPMM2-Zellen (japanische ungeprüfte Patentveröffentlichung (Kokai) Nr. 7(1995)-236475) mit PBS(–) gewaschen wurden, wurden 50 μl der Kultur von COS-7-Zellen, die den oben erwähnten chimären anti-HM1.24-Antikörper erzeugen und 50 μl FACS-Puffer (PBS(–), enthaltend 2 % fötales Rinderserum und 0,1 % Natriumazid) oder 5 μl 500 μg/ml gereinigter Maus-anti-HM1.24-Antikörper und 95 μl FACS-Puffer zugefügt und es wurde auf Eis für eine Stunde inkubiert.
Als Kontrolle wurden 50 μl eines 2 μg/ml Chimäre SK2 (internationale Patentveröffentlichung Nr. WO 94/28159 ) und 50 μl des FACS-Puffers oder 5 μl 500 μg/ml gereinigtes Maus-IgG2aκ (UPC10) (hergestellt von CAPPEL) anstelle des gereinigten Maus-anti-HM1.24-Antikörpers und 95 μl FACS-Puffer zugefügt und es wurde ähnlich inkubiert. Nach einem Waschen mit FACS-Puffer wurden 100 μl 25 μg/ml FITC-markierter Ziegen-anti-menschlicher-Antikörper (GAH) (hergestellt von CAPPEL) oder 10 μg/ml FITC markierter Ziegen-anti-Maus-Antikörper (GAM) (hergestellt von Becton Dickinson) zugefügt und es wurde 30 Minuten auf Eis inkubiert. Nach einem Waschen mit FACS-Puffer wurde in 1 ml FACS-Puffer suspendiert und die Fluoreszenzintensität in jeder Zelle wurde durch den FACScan (hergestellt von Becton Dickinson) gemessen.
Wie in 1 dargestellt ergab sich, daß der chimäre anti-HM1.24-Antikörper an die KPMM2-Zellen band, da der Peak der Fluoreszenzintensität sich bei den chimären anti-HM1.24-Antikörper versetzten Zellen im Vergleich zu der Kontrolle nach rechts verlagerte ähnlich, wie in dem Fall, in dem der Maus-anti-HM1.24-Antikörper zugefügt wurde. Dies bestätigte, daß die klonierte cDNA die variable Region des Maus-anti-HM1.24-Antikörpers codiert.
Referenzbeispiel 5: Etablierung der CHO-Zelllinie, die einen chimären anti-HM1.24-Antikörper stabil erzeugt
1. Konstruktion eines Expressionsvektors für die chimäre H-Kette
Durch Verdau des obigen Plasmids HEF-1.24H-gγ1 mit den Restriktionsenzymen PvuI und BamHI wurde ein ungefähr 2,8 kbp-Fragment, enthaltend den EF1-Promotor und die DNA, codierend die V-Region der H-Kette des Maus-anti-HM1.24-Antikörpers unter Verwendung eines 1,5%igen niedrigschmelzenden Agarosegels gereinigt. Dann wurde das obige DNA-Fragment in ein ungefähr 6 kbp-Fragment inseriert, hergestellt durch Verdau des Expressionsvektors, der für einen menschlichen H-Ketten-Expressionsvektor verwendet wurde, DHFR-ΔE-Rvh-PM1f (siehe internationale Patentveröffentlichung WO 92/19759 ), enthaltend das DHFR-Gen und das Gen, das die konstante Region einer menschlichen H-Kette codierte, mit PvuI und BamHI, um einen Expressionsvektor DHFR-ΔE-HEF-1.24-H-gγl für die H-Kette des chimären anti-HM1.24-Antikörpers zu erzeugen.
2. Geneinführung in die CHO-Zellen
Um ein stabiles Produktionssystem für den chimären anti-HM1.24-Antikörper zu etablieren, wurden die Gene für die oben erwähnten Expressionsvektoren HEF-1.24L-gκ bzw. DHFR-ΔE-HEF-1.24H-gγ1, die durch Verdau mit PvuI linearisiert worden waren, simultan in die CHO-Zelle DXBII (erhalten von dem Medical Research Council Collaboration Center) durch das Elektroporationsverfahren unter ähnlichen Bedingungen wie den oben erwähnten (die oben erwähnte Transfektion in COS-7-Zellen) simultan eingeführt.
3. Gen-Amplifikation durch MTX
Unter den mit dem Gen versehen CHO-Zellen können nur diejenigen CHO-Zellen, in die sowohl die L-Ketten- als auch die H-Kettenexpressionsvektoren eingeführt wurden, in der Nukleosid-freien α-MEM-Kulturflüssigkeit (hergestellt von GIBCO-BRL), wozu 500 μg/ml G418 (hergestellt von GIBCO-BRL) und 10 % fötales Rinderserum zugefügt worden waren, überleben, und so wurden sie selektiert. Darauffolgend wurden 10 nM MTX (hergestellt von Sigma) der obigen Kulturflüssigkeit zugefügt. Unter den so propagierten Klönen wurden diejenigen gewählt, die den chimären anti-HM1.24-Antikörper in großen Mengen erzeugen. Im Ergebnis wurden Klone #8 bis #13 erhalten, die eine Produktionseffizient von ungefähr 20 μg/ml des chimären Antikörpers zeigten und wurden als chimäre anti-HM1.24-Antikörper-erzeugende Zelllinien bezeichnet.
Referenzbeispiel 6: Konstruktion der chimären anti-HM1.24-Antikörper
Der chimäre anti-HM1.24-Antikörper wurde durch das folgende Verfahren konstruiert. Die obigen chimären anti-HM1.24-Antikörper-erzeugenden CHO-Zellen wurden einer kontinuierlichen Kultur für 30 Tage unter Verwendung des Medium Iscove's Modified Dulbecco's Medium (hergestellt von GIBCO-BRL), enthaltend 5 % γ-Globulin-freies Rinderserum von Neugeborenen (hergestellt von GIBCO-BRL) durch das hochdichte Zellkulturinstrument Verax-System 20 (hergestellt von CELLEX BIOSCIENCE Inc.) unterworfen.
An den Tagen 13, 20, 23, 26 und 30 nach Beginn der Kultivierung wurde die Kulturflüssigkeit unter Verwendung einer Druckfiltereinheit SARTOBRAN (hergestellt von Sartorius) gewonnen und dann wurde das chimäre anti-HM1.24-Antikörper unter Verwendung eines Großvolumen-Antikörpers-Sammelsystems Afi-Prep-System (hergestellt von Nippon Gaishi) unter einer Super Protein A-Säule (Bettvolumen: 100 ml, hergestellt von Nippon Gaishi) unter Verwendung von PBS als Absorptions/Wasch-Puffer und 0,1 M Natriumcitratpuffer (pH 3) als Elutionspuffer gemäß den beigefügten Instruktionen affinitätsgereinigt. Die eluierten Fraktionen wurden auf einen pH von ungefähr 7,4 durch sofortige Zugabe von 1M Tris-HCl (pH 8,0) eingestellt. Die Antikörperkonzentration wurde durch Absorption bei 280 nm gemessen und mit 1 μg/ml bei 1,35 OD berechnet.
Referenzbeispiel 7: Bestimmung der Aktivität des chimären anti-HM1.24-Antikörpers
Der chimäre anti-HM1.24-Antikörper wurde durch die folgende Bindungsinhibitionsaktivität bewertet:
1. Messung der Bindungsinhibitionsaktivität 1-1. Konstruktion eine biotinylierten anti-HM1.24-Antikörpers
Nachdem der Maus-anti-HM1.24-Antikörper mit 0,1 M Bicarbonatpuffer auf 4 mg/ml verdünnt wurde, wurden 4 μl 50 mg/ml Biotin-N-hydroxysuccinimid (hergestellt von EY LABS Inc.) hinzugefügt und dies ließ man bei Raumtemperatur 3 Stunden reagieren. Danach wurden 1,5 ml einer 0,2 M Glycin-Lösung hinzugefügt, es wurde 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert um die Reaktion zu beenden, und dann wurden die biotinylierten IgG-Fraktionen unter Verwendung der PD-10-Säule (hergestellt von Pharmacia Biotech) gesammelt.
1-2. Messung der Bindungsinhibitionsaktivität
Die Bindungsinhibitionsaktivität durch den Biotin-markierten Maus-anti-HM1.24-Antikörper wurde durch den Zell-ELISA unter Verwendung von menschlichen Nabelschnur-Membranzelllinien WISH-Zellen (ATCC CCL 25) gemessen. Die Zell-ELISA-Platten wurden wie folgt hergestellt. Zu einer Platte mit 96 Vertiefungen wurden 4 × 10⁵ Zellen/ml, hergestellt mit RPMI 1640 Medium, supplementiert mit 10%igem fötalem Rinderserum hinzugefügt, es wurde über Nacht inkubiert und nach zweimaligem Waschen mit PBS(–) wurden sie mit 0,1 % Glutaraldehyd (hergestellt von Nacalai Tesque Inc.) immobilisiert.
Nach dem Blockieren wurden 50 μl serieller Verdünnung des chimären anti-HM1.24-Antikörpers oder des Maus-anti-HM1.24-Antikörpers, erhalten durch Affinitätsreinigung jeder Vertiefung zugefügt und gleichzeitig wurden 50 μl 2 μg/ml Biotin-markierter Maus-anti-HM1.24-Antikörper zugefügt, es wurde 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert und dann wurde Peroxidase-markiertes Streptavidin (hergestellt von DAKO) hinzugefügt. Nach einstündiger Inkubation bei Raumtemperatur und einem Waschen wurde die Substratlösung zugefügt. Nach Beendigung der Reaktion durch Zugabe von 50 μl 6N Schwefelsäure wurde die Absorption bei 490 nm unter Verwendung des MICROPLATE READER Models 3550 (hergestellt von Bio-Rad) gemessen.
Das in 2 dargestellte Ergebnis zeigte, daß der chimäre anti-HM1.24-Antikörper eine ähnliche Bindungsinhibitionsaktivität an den Maus-anti-HM1.24-Antikörper wie der Biotin-markierte Maus-anti-HM1.24-Antikörper aufwies. Die zeigt an, daß der chimäre Antikörper dieselbe V-Region wie der Maus-anti-HM1.24-Antikörper aufwies.
Referenzbeispiel 8: Messung der ADCC-Aktivität des chimären anti-HM1.24-Antikörpers
Die ADCC (Antikörper-abhängige zelluläre Cytotoxizität)-Aktivität wurde gemäß dem Verfahren in Current Protocols in Immunology, Kapitel 7, Immunologic studies in humans, Herausgeber, Johan E. Coligan et al., John Wiley & Sons, Inc., 1993, gemessen.
1. Präparation von Effektorzellen
Monozyten wurden aus peripherem Blut oder Knochenmark gesunder Menschen abgetrennt und von Patienten mit multiplem Myelom, und zwar durch das Dichtezentrifugationsverfahren. So wurde eine gleiche Menge PBS(–) dem peripheren Blut und dem Knochenmark gesunder Menschen und von Patienten mit multiplem Myelom zugefügt, geschichtet auf Ficoll (hergestellt von Pharmacia)-Conrey (hergestellt von Daiichi Pharmaceutical Co. Ltd.) (relative Dichte 1,077) und es wurde 30 Minuten bei 400 g zentrifugiert. Die Monozytenschicht wurde gesammelt und es wurde zweimal mit RPMI 1640 (hergestellt von Sigma), supplementiert mit 10 % fötalem Rinderserum (hergestellt von Witaker) gewaschen und auf eine Zelldichte von 5 × 10⁶/ml mit derselben Kulturflüssigkeit hergestellt.
2. Herstellung von Zielzellen
Die menschliche Myelomzelllinie RPMI 8226 (ATCC CCL 155) wurde durch Inkubation in RPMI 1640 hergestellt (hergestellt von Sigma), supplementiert mit 10 % fötalem Rinderserum (hergestellt von Witaker) zusammen mit 0,1 mCi ⁵¹Cr-Natriumchromat bei 37°C für 60 Minuten radioaktiv markiert. Nach der radioaktiven Markierung wurden die Zellen dreimal mit Hanks balancierter Kochsalzlösung (HBSS) gewaschen und auf eine Konzentration von 2 × 10⁵/ml eingestellt.
3. ADCC-Assay
In eine Platte mit 96 Vertiefungen und U-Boden (hergestellt von Corning) wurden 50 μl 2 × 10⁵ Zielzellen/ml, 1 μg/ml affinitätsgereinigter chimärer anti-HM1.24-Antikörper und Maus-anti-HM1.24-Antikörper oder als Kontrolle menschliches IgG (hergestellt von Serotec) gegeben und die Platte wurde 15 Minuten bei 4°C gehalten.
Dann wurden 100 μl 5 × 10⁵ Effektorzellen/ml hinzugefügt und das Ergebnis wurde 4 Stunden in einem CO₂-Inkubator kultiviert, woraufhin das Verhältnis (E:T) der Effektorzellen (E) zu den Zielzellen (T) auf 0:1, 5:1, 20:1 oder 50:1 eingestellt wurde.
100 μl Überstand wurden entnommen und die in dem Kulturüberstand freigesetzte Radioaktivität wurde durch einen gamma-Zähler (ARC361, hergestellt von Aloka) gemessen. Zur Messung der maximalen Radioaktivität wurde 1 % NP-40 (hergestellt von BRL) verwendet. Die Cytotoxizität (%) wurde durch (A-C)/(B-C) × 100 berechnet, wobei A eine Radioaktivität (cpm) ist, freigesetzt in Gegenwart eines Antikörpers, B ist die Radioaktivität (cpm), freigesetzt durch NP-40 und C ist die Radioaktivität (cpm), freigesetzt durch die Kulturflüssigkeit allein ohne Antikörper.
Wie in 3 dargestellt, erhöhte sich die Cytotoxizität, wenn der chimäre anti-HM1.24-Antikörper zugefügt wurde im Vergleich zu dem Kontroll-IgG1, mit einem Anstieg im E:T-Verhältnis, was anzeigt, daß dieser chimäre anti-HM1.24-Antikörper eine ADCC-Aktivität aufwies. Da es keine Cytotoxizität zu beobachten gab, selbst wenn der Maus-anti-HM1.24-Antikörper zugefügt wurde, wurde weiterhin gezeigt, daß der Fc-Teil des menschlichen Antikörpers benötigt wird um eine ADCC-Aktivität zu erhalten, wenn die Effektorzelle eine vom Menschen abstammende Zelle ist.
Referenzbeispiel 9: Konstruktion des umgeformten menschlichen anti-HM1.24-Antikörpers
1. Entwurf der V-Region des umgeformten menschlichen anti-mM1.24-Antikörpers
Um den umgeformten menschlichen Antikörper zu konstruieren, worin die CDR des Maus-monoklonalen Antikörpers in einen menschlichen Antikörper transplantiert wurde, wird es bevorzugt, daß es eine hohe Homologie zwischen der FR des Maus-Antikörpers und der FR des menschlichen Antikörpers gibt. So wurden die V-Regionen der L-Kette und der H-Kette des Maus-anti-HM1.24-Antikörpers mit den V-Regionen aller bekannten Antikörper verglichen, deren Struktur unter Verwendung der Protein-Datenbank aufgeklärt wurde.
Die V-Region der L-Kette des Maus-anti-HM1.24-Antikörpers ist besonders ähnlich zu der Konsensussequenz der Subgruppe IV (HSGIV) der V-Region einer menschlichen L-Kette mit einer hohen Homologie von 66,4 %. Andererseits zeigt sie eine Homologie von 56,9 %, 55,8 % und 61,5 % zu HSGI, HSGII bzw. HSGIII.
Wenn die V-Region der L-Kette des Maus-anti-HM1.24-Antikörpers mit der V-Region der L-Kette bekannter menschlicher Antikörper verglichen wird, zeigt sie eine Homologie von 67,0 % zu der V-Region REI der menschlichen L-Kette, einer der Subgruppen I der V-Region einer menschlichen L-Kette. So wurde die FR von REI als Ausgangsmaterial zur Konstruktion der V-Region der L-Kette des umgeformten menschlichen anti-HM1.24-Antikörpers verwendet.
Eine Version a der L-Ketten-V-Region des umgeformten menschlichen anti-HM1.24-Antikörpers wurde entworfen. In dieser Version wurde die menschliche FR zu der auf REI- basierenden FR identisch gemacht, die in dem umgeformten menschlichen CAMPATH-1H-Antikörper vorliegt (siehe Riechmann, L. et al., Nature 322, 21-25 (1988)), die FR, enthalten in Version a der V-Region der L-Kette des umgeformten menschlichen anti-PM-2-Antikörpers wie beschrieben in der internationalen Patentveröffentlichung WO 92/19759 ) und die Maus-CDR wurde zu der CDR in der V-Region der L-Kette des Maus-anti-HM1.24-Antikörpers identisch gemacht.
Die H-Ketten-V-Region des Maus-anti-HM1.24-Antikörpers ist besonders ähnlich zu der Konsensussequenz von HSGI der V-Region einer menschlichen H-Kette mit einer Homologie von 54,7 %. Andererseits zeigt sie eine Homologie von 34,6 % und 48,1 % zu HSGII bzw. HSGIII. Wenn die V-Region der H-Kette des Maus-anti-HM1.24-Antikörpers mit der V-Region der H-Kette bekannter menschlicher Antikörper verglichen wird, waren FR1 bis FR3 besonders ähnlich zur V-Region der H-Kette des menschlichen Antikörpers HG3, einer der Subgruppe I der V-Region von einer menschlichen H-Kette (Rechavi, G. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80, 855-859) mit einer Homologie von 67,3 %.
Daher wurde die FR des menschlichen Antikörpers HG3 als Ausgangsmaterial zur Konstruktion der V-Region der H-Kette des umgeformten menschlichen anti-HM1.24-Antikörpers verwendet. Da jedoch die Aminosäuresequenz der FR4 von menschlichem HG3 nicht beschrieben wurde, wurde die Aminosäuresequenz der FR4 des menschlichen Antikörpers JH6 (Ravetech, J.V. et al., Cell, 27, 583-591), die die höchste Homologie zu der FR4 der H-Kette des Maus-anti-HM1.24-Antikörpers zeigt, verwendet. Die FR4 von JH6 hat dieselbe Aminosäuresequenz wie diejenige von FR4 der H-Kette des Maus-anti-HM1.24-Antikörpers mit Ausnahme einer Aminosäure.
In der ersten Version a der V-Region der H-Kette des umgeformten menschlichen anti-HM1.24-Antikörpers wurden die FR1 bis FR3 zu den FR1 bis FR3 von menschlichem HG3 identisch gemacht und die CDR wurde zu der CDR der V-Region der H-Kette des Maus-anti-HM1.24-Antikörpers identisch gemacht, außer, daß die Aminosäuren an Position 30 in der menschlichen FR1 und an Position 71 in der menschlichen FR3 zu den Aminosäuren in dem Maus-anti-HM1.24-Antikörper identisch gemacht wurden.
2. Konstruktion der V-Region der L-Kette des umgeformten menschlichen anti-HM1.24-Antikörpers
Die L-Kette des umgeformten menschlichen anti-HM1.24-Antikörpers wurde durch CDR-Grafting im PCR-Verfahren konstruiert. Das Verfahren ist in 4 dargestellt. 8 PCR-Primer wurden zur Konstruktion des umgeformten menschlichen anti-HM1.24-Antikörpers (Version a) mit der von dem menschlichen Antikörper REI abstammenden FR verwendet. Die externen Primer A (SEQ ID NO: 69) und H (SEQ ID NO: 70) wurden so entworfen daß sie mit der DNA-Sequenz des Expressionsvektors HEF-Vl-gκ hybridisieren.
Die CDR-Grafting-Primer L1S (SEQ ID NO: 71), L2S (SEQ ID NO: 72) und L3S (SEQ ID NO: 73) haben die Sinn-DNA-Sequenz. Die CDR-Grafting-Primer L1A (SEQ ID NO: 74), L2A (SEQ ID NO: 75) und L3A (SEQ ID NO: 76) haben die Antisinn-DNA-Sequenz, und haben jeweils eine komplementäre DNA-Sequenz (20 bis 23 bp) zu der DNA-Sequenz am 5'-Ende der Primer L1S, L2S bzw. L3S.
In der ersten Stufe der PCR wurden die vier Reaktionen A-L1A, L1S-L2A, L2S-L3A und L3S-H zur Reinigung jedes PCR-Produkts durchgeführt. Die vier PCR-Produkte der ersten PCR ließ man sich miteinander durch ihre eigene Komplementarität anordnen (siehe internationale Patentveröffentlichung WO 92/19759 ). Dann wurden die externen Primer A und H zugefügt, um die Gesamtlängen-DNA, codierend die V-Region der L-Kette des umgeformten menschlichen anti-HM1.24-Antikörpers zu amplifizieren (zweite PCR). In der oben erwähnten PCR wurde das Plasmid HEF-RVL-M21a (siehe internationale Patentveröffentlichung WO 95/14041 ), codierend die Version a der V-Region der L-Kette des umgeformten menschlichen ONS-M21-Antikörpers, basierend auf der menschlichen Antikörper-REI-abstammenden FR als Matrize verwendet.
Auf der ersten Stufe der PCR wurde die PCR-Mischung, enthaltend 10 mM Tris-HCl (pH 8,3), 50 mM KCl, 0,1 mM dNTPs, 1,5 mM MgCl₂, 100 ng Matrizen-DNA, 100 mpol von jedem Primer und 5 U Ampli Tag verwendet. Jedes PCR-Röhrchen wurde mit 50 μl mineralischem Öl abgedeckt. Dann wurde nach zunächst einer Denaturierung durch Erwärmung auf 94°C ein Reaktionszyklus von 94°C für 1 Minute, 55°C für 1 Minute und 72°C für 1 Minute durchgeführt, woraufhin 10 Minuten bei 72°C inkubiert wurde.
Die PCR-Produkte A-L1A (215 bp), L1S-L2A (98 bp), L2S-L3A (140 bp) und L3S-H (151 bp) wurden unter Verwendung von 1,5 % niedrigschmelzendem Agarosegel gereinigt und in der zweiten PCR angeordnet. In der zweiten PCR wurden 98 μl der PCR-Mischung, enthaltend 1 μg von jeweils den PCR-Produkten der ersten Stufe und 5 U Ampli Tag für 2 Zyklen bei 94°C für 2 Minuten inkubiert, 55°C für 2 Minuten und 72°C für 2 Minuten und dann wurden 100 pmol von jeweils den externen Primern (A und H) zugefügt. Das PCR-Röhrchen wird mit 50 μl mineralischem Öl abgedeckt und 30 PCR-Zyklen wurden unter denselben Bedingungen wie oben durchgeführt.
Ein 516 bp DNA-Fragment, das sich aus der zweiten PCR ergab, wurde unter Verwendung eines 1,5 % niedrigschmelzenden Agarosegels gereinigt, mit BamHI und HindIII verdaut und die so erhaltenen DNA-Fragmente wurden in den HEF-Expressionsvektor HEF-VL-gκ kloniert. Nach Bestimmung der DNA-Sequenz wurde das DNA-Fragment mit der richtigen Aminosäuresequenz der V-Region der L-Kette des umgeformten menschlichen anti-HM1.24-Antikörpers als Plasmid HEF-RVLa-AHM-gκ bezeichnet. Die Aminosäuresequenz und die Nukleotidsequenz der V-Region der L-Kette, enthalten in diesem Plasmid HEF-RVLa-AHM-gκ sind in SEQ ID NO: 11 dargestellt.
Die Version b der V-Region der L-Kette des umgeformten menschlichen anti-HM1.24-Antikörpers wurde durch Mutagenese unter Verwendung von PCR konstruiert. Die mutagenen Primer FTY-1 (SEQ ID NO: 77) und FTY-2 (SEQ ID NO: 78) wurden so entworfen, daß sie Phenylalanin an Position 71 zu Tyrosin mutieren.
Nachdem die obigen Primer unter Verwendung des Plasmids HEF-RVLa-AHM-gκ als Matrize amplifiziert wurden, wurde das Endprodukt durch Verdau mit BamHI und HindIII gereinigt. Die erhaltenen DNA-Fragmente wurden in den HEF-Expressionsvektor HEF-VL-gκ kloniert, um das Plasmid HEF-RVLb-AHM-gκ zu erhalten. Die Aminosäuresequenz und die Rasensequenz der V-Region der L-Kette, enthalten in diesem Plasmid HEF-RVLb-AHM-gκ sind in SEQ ID NO: 13 dargestellt.
3. Konstruktion der H-Ketten-V-Region des umgeformten menschlichen anti-HM1.24-Antikörpers
3-1. Konstruktion von Versionen a bis e der H-Ketten-V-Region des umgeformten menschlichen anti-HM1.24-Antikörpers
DNA, codierend die V-Region der H-Kette des umgeformten menschlichen anti-HM1.24-Antikörpers wurde wie folgt entworfen. Durch Verbindung der DNA-Sequenz, die die FR1 bis 3 des menschlichen Antikörpers HG3 codierte und die FR4 des menschlichen Antikörpers JH6 mit der DNA-Sequenz, die die CDR der V-Region der H-Kette des Maus-anti-HM1.24-Antikörpers codierte, wurde eine Gesamtlängen-DNA, codierend die V-Region der H-Kette des umgeformten menschlichen anti-HM1.24-Antikörpers entworfen.
Dann wurden an das 5'-Ende und das 3'-Ende dieser DNA-Sequenz die HindIII-Erkennungsstelle/KOZAK-Konsensussequenz bzw. BamHI-Erkennungsstelle/Spleiß-Donorsequenz angehaftet, um die Insertion des HEF-Expressionsvektors zu ermöglichen.
Die so entworfene DNA-Sequenz wurde in vier Oligonukleotide getrennt. Darauffolgend wurden Oligonukleotide, die potentiell eine Anordnung dieser Oligonukleotide behindern könnten einer Computeranalyse im Hinblick auf ihre Sekundärstruktur unterworfen. Die Sequenzen der vier Oligonukleotide RVH1 bis RVH4 sind in den SEQ ID NO: 79 bis 82 dargestellt. Diese Oligonukleotide haben eine Länge von 119 bis 144 Basen und haben den 25 bis 26 bp überlappenden Bereich. Unter den Oligonukleotiden haben RVH2 (SEQ ID NO: 80) und RVH4 (SEQ ID NO: 82) die Sinn-DNA-Sequenz und RVH1 (SEQ ID NO: 79) und RVH3 (SEQ ID NO: 81) haben die Antisinn-DNA-Sequenz. Das Verfahren zur Anordnung dieser vier Oligonukleotide durch das PCR-Verfahren ist in der Figur (siehe 5) dargestellt.
Die PCR-Mischungen (98 μl), enthaltend 100 ng von jedem der vier Oligonukleotide und 5 U Ampli Tag wurden zunächst durch Erwärmung für 2 Minuten auf 94 °C denaturiert und wurden dann zwei Inkubationszyklen, umfassend 2 Minuten bei 94°C, und 2 Minuten bei 55°C sowie 2 Minuten bei 72°C unterworfen. Nachdem 100 pmol von jeweils RHP1 (SEQ ID NO: 83) und RHP2 (SEQ ID NO: 84) als externe Primer zugefügt worden waren, wurde das PCR Röhrchen mit 50 μl mineralischem Öl abgedeckt. Dann wurde zunächst durch Erwärmung für 1 Minute auf 94°C denaturiert und dieses wurde dann 38 Zyklen bei 94°C für 1 Minute, 55°C für 1 Minute und 72°C für 1 Minute unterworfen, woraufhin 10 Minuten bei 72°C inkubiert wurde.
Das 438 bp-DNA-Fragment wurde unter Verwendung von 1,5 % niedrigschmelzendem Agarosegel gereinigt, mit HindIII und BamHI verdaut und dann in den HEF-Expressionsvektor HEF-VH-gγl kloniert. Nach Bestimmung der Rasensequenz wurde das Plasmid, das das DNA-Fragment enthält, das die Aminosäuresequenz der korrekten V-Region der H-Kette codiert als HEF-RVHa-AHM-gγ1 bezeichnet. Die Aminosäuresequenz und die Rasensequenz der V-Region der H-Kette, enthalten in diesem Plasmid HEF-RVHa-AHM-gγ1 sind in SEQ ID NO: 11 dargestellt.
Jede der Versionen b, c, d und e der V-Region der H-Kette des umgeformten menschlichen anti-HM1.24-Antikörpers wurden wie folgt konstruiert.
Unter Verwendung des mutagenen Primers BS (SEQ ID NO: 85) und BA (SEQ ID NO: 86), die so entworfen waren um Arginin an Position 66 zu Lysin zu mutieren und des Plasmids HEF-RVHa-AHM-gγ1 als Matrizen-DNA wurde die Version b durch das PCR-Verfahren amplifiziert um das Plasmid HEF-RVHb-AHM-gγ1 zu erhalten. Die Aminosäuresequenz und die Rasensequenz der V-Region der H-Kette, enthalten in diesem Plasmid HEF-RVHb-AHM-gγ1 sind in SEQ ID NO: 17 dargestellt.
Unter Verwendung des mutagenen Primers CS (SEQ ID NO: 87) und CA (SEQ ID NO: 88), so entworfen, daß Threonin an Position 73 zu Lysin mutiert wird, und des Plasmids HEF-RVHa-AHN-gγ1 als Matrizen-DNA wurde die Version c durch das PCR-Verfahren amplifiziert um das Plasmid HEF-RVHc-AHM-gγ1 zu erhalten. Die Aminosäuresequenz und die Rasensequenz der V-Region der H-Kette, enthalten in diesem Plasmid HEF-RVHc-AHM-gγ1 sind in SEQ ID NO: 19 dargestellt.
Unter Verwendung des mutagenen Primers DS (SEQ ID NO: 89) und DA (SEQ ID NO: 90), so entworfen, daß Arginin an Position 66 zu Lysin und Threonin an Position 73 zu Lysin mutiert wird, und des Plasmids HEF-RVHa-AHM-gγ1 als Matrizen-DNA wurde die Version d durch das PCR-Verfahren amplifiziert um das Plasmid HEF-RVHd-AHM-gγ1 zu erhalten. Die Aminosäuresequenz und die Rasensequenz der V-Region der H-Kette, enthalten in diesem Plasmid HEF-RVHd-AHM-gγ1 sind in SEQ ID NO: 21 dargestellt.
Unter Verwendung des mutagenen Primers ES (SEQ ID NO: 91) und EA (SEQ ID NO: 92), so entworfen, daß Valin an Position 67 zu Alanin und Methionin an Position 69 zu Leucin mutiert wird, und des Plasmids HEF-RVHa-AHM-gγ1 als Matrizen-DNA wurde die Version e durch das PCR-Verfahren amplifiziert um das Plasmid HEF-RVHe-AHM-gγ1 zu erhalten. Die Äminosäuresequenz und die Rasensequenz der V-Region der H-Kette, enthalten in diesem Plasmid HEF-RVHe-AHM-gγ1 sind in SEQ ID NO: 23 dargestellt.
3-2. Konstruktion der H-Ketten-Hybrid-V-Region
Zwei H-Ketten-Hybrid-V-Regionen wurden konstruiert. Eine ist ein Maus-menschlicher Hybrid-anti-HM1.24-Antikörper, worin die Aminosäuresequenzen von FR1 und FR2 von dem Maus-anti-HM1.24-Antikörper abstammen und diejenigen von FR3 und FR4 von Version a der V-Region der H-Kette des umgeformten menschlichen anti-HM1.24-Antikörpers und der andere ist eine Mensch-Maus-Hybrid-anti-HM1.24-Antikörper, worin die Aminosäuresequenzen von FR1 und FR2 von Version a der V-Region der H-Kette des umgeformten menschlichen anti-HM1.24-Antikörpers abstammen und diejenigen von FR3 und FR4 von dem Maus-anti-HM1.24-Antikörper. Die Aminosäuresequenzen der CDR-Regionen stammen alle von dem Maus-anti-HM1.24-Antikörper.
Zwei H-Ketten-Hybrid-V-Regionen wurden durch das PCR-Verfahren konstruiert. Das Verfahren ist schematisch in den 6 und 7 dargestellt. Für die Konstruktion der zwei H-Ketten-Hybrid-V-Regionen wurden vier Primer verwendet. Die externen Primer a (SEQ ID NO: 93) und h (SEQ ID NO: 94) wurden so entworfen, daß sie mit der DNA-Sequenz des HEF- Expressionsvektors HEF-VH-gγ1 hybridisieren. Der H-Ketten-Hybrid-Konstruktionsprimer HYS (SEQ ID NO: 95) wurde so entworfen, daß er die Sinn-DNA-Sequenz enthielt und der H-Ketten-Hybridprimer HYA (SEQ ID NO: 96) so, daß er die Antisinn-DNA-Sequenz enthielt, so daß die DNA-Sequenzen zueinander komplementär waren.
Für die Konstruktion der H-Ketten-Hybrid-V-Region, worin die Aminosäuresequenzen von FR1 und FR2 von dem Maus-anti-HM1.24-Antikörper abstammen und diejenigen von FR3 und FR4 von Version a der V-Region der H-Kette des umgeformten menschlichen anti-HM1.24-Antikörpers, wurde eine PCR unter Verwendung des Plasmids HEF-1.24H-gγ1 als Matrize, des externen Primers a und des H-Ketten-Hybridprimers HYA und eine PCR unter Verwendung des Plasmids HEF-RVIa-AHM-gγ1 als Matrize, des H-Ketten-Hybridprimers HYS (SEQ ID NO: 95) und des externen Primers h (SEQ ID NO: 94), in der ersten Stufe der PCR durchgeführt, um jedes PCR-Produkt zu reinigen. Die beiden PCR-Produkte von der ersten PCR ließ man sich durch ihre eigene Komplementarität anordnen (siehe internationale Patentveröffentlichung WO 92/19759 ).
Dann wurde durch Zugabe der externen Primer a (SEQ ID NO: 93) und h (SEQ ID NO: 94) eine Gesamtlängen-DNA, codierend die H-Ketten-Hybrid-V-Region, worin die Aminosäuresequenzen von FR1 und FR2 von dem Maus-anti-HM1.24-Antikörper und diejenigen von FR3 und FR4 von Version a der V-Region der H-Kette des umgeformten menschlichen anti-HM1.24-Antikörpers abstammen in der zweiten PCR-Stufe amplifiziert.
Für die Konstruktion der H-Ketten-Hybrid-V-Region, worin die Aminosäuresequenzen von FR1 und FR2 von Version a der V-Region der H-Kette des umgeformten menschlichen anti-HM1.24-Antikörpers abstammen und diejenigen von FR3 und FR4 von dem Maus-anti-HM1.24-Antikörper, wurde eine PCR unter Verwendung des Plasmids HEF-RVHa-AHM-gγ1 als Matrize, des externen Primers a und des H-Ketten-Hybridprimers HYA und eine PCR unter Verwendung des Plasmids HEF-1.24-gγ1 als Matrize, des H-Ketten-Hybridprimers HYS und des externen Primers h in der ersten Stufe der PCR durchgeführt um jedes PCR-Produkt zu reinigen. Die beiden PCR-gereinigten Produkte aus der ersten PCR ließ man sich durch ihre eigene Komplementarität anordnen (siehe internationale Patentveröffentlichung WO 92/19759 ).
Dann wurde durch Zugabe der externen Primer a und h eine Gesamtlängen-DNA, codierend die H-Ketten-Hybrid-V-Region, worin die Aminosäuresequenzen von FR1 und FR2 von Version a der V-Region der H-Kette des umgeformten menschlichen anti-HM1.24-Antikörpers abstammten und diejenigen von FR3 und FR4 von dem Maus-anti-HM1.24-Antikörper in der zweiten PCR-Stufe amplifiziert.
Die Verfahren der ersten PCR, die Reinigung der PCR-Produkte, die Anordnung, die zweite PCR und das Klonieren in den HEF-Expressionsvektor HEF-VH-gγ1 wurden gemäß den Verfahren durchgeführt, die in "Beispiel 9. Konstruktion der V-Region der L-Kette des umgeformten menschlichen anti-HM1.24-Antikörpers" dargestellt sind.
Nach Sequenzieren der DNA-Sequenz wurde das Plasmid, das das DNA-Fragment enthielt, das die korrekte Aminosäuresequenz der H-Ketten-Hybrid-V-Region codierte, worin die Aminosäuresequenzen von FR1 und FR2 von dem Maus-anti-HM1.24-Antikörper und diejenigen von FR3 und FR4 von Version a der V-Region der H-Kette des umgeformten menschlichen anti-HM1.24-Antikörpers abstammten als HEF-MH-RVH-AHM-gγ1 bezeichnet. Die Aminosäure- und Rasensequenz der V-Region der H-Kette, enthalten in diesem Plasmid HEF-MH-RVH-AHM-gγ1 sind in SEQ ID NO: 97 dargestellt. Außerdem wurde das Plasmid, das das DNA-Fragment enthielt, codierend die korrekte Aminosäuresequenz der H-Ketten-Hybrid-V-Region, worin die Aminosäuresequenzen von FR1 und FR2 von Version a der V- Region der H-Kette des umgeformten menschlichen anti-HM1.24-Antikörpers und diejenigen von FR3 und FR4 von dem Maus-anti-HM1.24-Antikörper abstammten als HEF-HM-RVH-AHM-gγ1 bezeichnet. Die Aminosäure- und Rasensequenz der V-Region der H-Kette, enthalten in diesem Plasmid HEF-HM-RVH-AHM-gγ1 sind in SEQ ID NO: 99 dargestellt.
3-3. Konstruktion der Versionen f bis r der V-Region der H- Kette des umgeformten menschlichen anti-HM1.24-Antikörpers
Jede der Versionen f, g, h, i, j, k, l, m, n, o, p, q und r der V-Region der H-Kette des umgeformten menschlichen anti-HM1.24-Antikörpers wurde wie folgt konstruiert.
Unter Verwendung eines mutagenen Primers FS (SEQ ID NO: 102) und FA (SEQ ID NO: 103), so entworfen, daß Threonin an Position 75 zu Serin und Valin an Position 78 zu Alanin mutiert wird, und des Plasmids HEF-RVHe-AHM-gγ1 als Matrizen-DNA wurde Version f durch das PCR-Verfahren amplifiziert um das Plasmid HEF-RVHf-AHM-gγ1 zu erhalten. Die Aminosäure- und Rasensequenz der V-Region der H-Kette, enthalten in diesem Plasmid HEF-RVHf-AHM-gγ1 sind in SEQ ID NO: 25 dargestellt.
Unter Verwendung eines mutagenen Primers GS (SEQ ID NO: 104) und GA (SEQ ID NO: 105), so entworfen, daß Alanin an Position 40 zu Arginin mutiert wird, und des Plasmids HEF-RVHa-AHM-gγ1 als Matrizen-DNA wurde Version g durch das PCR-Verfahren amplifiziert um das Plasmid HEF-RVHg-AHM-gγ1 zu erhalten. Die Aminosäure- und Rasensequenz der V-Region der H-Kette, enthalten in diesem Plasmid HEF-RVHg-AHM-gγ1 sind in SEQ ID NO: 27 dargestellt.
Unter Verwendung eines mutagenen Primers FS (SEQ ID NO: 102) und FA (SEQ ID NO: 103) und des Plasmids HEF-RVHb-AHM-gγ1 als Matrizen-DNA wurde Version h durch das PCR-Verfahren amplifiziert um das Plasmid HEF-RVHh-AHM-gγ1 zu erhalten. Die Aminosäure- und Rasensequenz der V-Region der H-Kette, enthalten in diesem Plasmid HEF-RVHh-AHM-gγ1 sind in SEQ ID NO: 29 dargestellt.
Unter Verwendung eines mutagenen Primers IS (SEQ ID NO: 106) und IA (SEQ ID NO: 107), so entworfen, daß Arginin an Position 83 zu Alanin und Serin an Position 84 zu Phenylalanin mutiert wird, und des Plasmids HEF-RVHh-AHM-gγ1 als Matrizen-DNA wurde Version i durch das PCR-Verfahren amplifiziert um das Plasmid HEF-RVHi-AHM-gγ1 zu erhalten. Die Aminosäure- und Rasensequenz der V-Region der H-Kette, enthalten in diesem Plasmid HEF-RVHi-AHM-gγ1 sind in SEQ ID NO: 31 dargestellt.
Unter Verwendung eines mutagenen Primers JS (SEQ ID NO: 108) und JA (SEQ ID NO: 109), so entworfen, daß Arginin an Position 66 zu Lysin mutiert wird, und des Plasmids HEF-RVHf-AHM-gγ1 als Matrizen-DNA wurde Version j durch das PCR-Verfahren amplifiziert um das Plasmid HEF-RVHj-AHM-gγ1 zu erhalten. Die Aminosäure- und Rasensequenz der V-Region der H-Kette, enthalten in diesem Plasmid HEF-RVHj-AHM-gγ1 sind in SEQ ID NO: 33 dargestellt.
Unter Verwendung eines mutagenen Primers KS (SEQ ID NO: 110) und KA (SEQ ID NO: 111), so entworfen, daß Glutaminsäure an Position 81 zu Glutamin wird, und des Plasmids HEF-RVHh-AHM-gγ1 als Matrizen-DNA wurde Version k durch das PCR-Verfahren amplifiziert um das Plasmid HEF-RVHk-AHM-gγ1 zu erhalten. Die Aminosäure- und Rasensequenz der V-Region der H-Kette, enthalten in diesem Plasmid HEF-RVHk-AHM-gγ1 sind in SEQ ID NO: 35 dargestellt.
Unter Verwendung eines mutagenen Primers LS (SEQ ID NO: 112) und LA (SEQ ID NO: 113), so entworfen, daß Glutaminsäure an Position 81 zu Glutamin und Serin an Position 82B zu Isoleucin mutiert wird, und des Plasmids HEF-RVHh-AHM-gγ1 als Matrizen-DNA wurde Version 1 durch das PCR-Verfahren amplifiziert um das Plasmid HEF-RVHl-AHM-gγ1 zu erhalten. Die Aminosäure- und Basensequenz der V-Region der H-Kette, enthalten in diesem Plasmid HEF-RVHl-AHM-gγ1 sind in SEQ ID NO: 37 dargestellt.
Unter Verwendung eines mutagenen Primers MS (SEQ ID NO: 114) und MA (SEQ ID NO: 115), so entworfen, daß Glutaminsäure an Position 81 zu Glutamin, Serin an Position 82b zu Isoleucin und Threonin an Position 87 zu Serin mutiert wird, und des Plasmids HEF-RVHh-AHM-gγ1 als Matrizen-DNA wurde Version m durch das PCR-Verfahren amplifiziert um das Plasmid HEF-RVHm-AHM-gγ1 zu erhalten. Die Aminosäure- und Basensequenz der V-Region der H-Kette, enthalten in diesem Plasmid HEF-RVHm-AHM-gγ1 sind in SEQ ID NO: 39 dargestellt.
Unter Verwendung eines mutagenen Primers NS (SEQ ID NO: 116) und NA (SEQ ID NO: 117), so entworfen, daß Serin an Position 82B zu Isoleucin mutiert wird, und des Plasmids HEF-RVHh-AHM-gγ1 als Matrizen-DNA wurde Version n durch das PCR-Verfahren amplifiziert um das Plasmid HEF-RVHn-AHM-gγ1 zu erhalten. Die Aminosäure- und Basensequenz der V-Region der H-Kette, enthalten in diesem Plasmid HEF-RVHn-AHM-gγ1 sind in SEQ ID NO: 41 dargestellt.
Unter Verwendung eines mutagenen Primers OS (SEQ ID NO: 118) und OA (SEQ ID NO: 119), so entworfen, daß Threonin an Position 87 zu Serin mutiert wird, und des Plasmids HEF-RVHh-AHM-gγ1 als Matrizen-DNA wurde Version o durch das PCR-Verfahren amplifiziert um das Plasmid HEF-RVHn-AHM-gγ1 zu erhalten. Die Aminosäure- und Basensequenz der V-Region der H-Kette, enthalten in diesem Plasmid HEF-RVHn-AHM-gγ1 sind in SEQ ID NO: 43 dargestellt.
Unter Verwendung eines mutagenen Primers PS (SEQ ID NO: 120) und PA (SEQ ID NO: 121), so entworfen, daß Valin an Position 78 zu Alanin mutiert wird, und des Plasmids HEF-RVHq-AHM-gγ1 als Matrizen-DNA wurde Version p durch das PCR-Verfahren amplifiziert um das Plasmid HEF-RVHp-AHM-gγ1 zu erhalten. Die Aminosäure- und Rasensequenz der V-Region der H-Kette, enthalten in diesem Plasmid HEF-RVHp-AHM-gγ1 sind in SEQ ID NO: 45 dargestellt.
Unter Verwendung eines mutagenen Primers QS (SEQ ID NO: 122) und QA (SEQ ID NO: 123), so entworfen, daß Threonin an Position 75 zu Serin mutiert wird, und des Plasmids HEF-RVHa-AHM-gγ1 als Matrizen-DNA wurde Version q durch das PCR-Verfahren amplifiziert um das Plasmid HEF-RVHq-AHM-gγ1 zu erhalten. Die Aminosäure- und Rasensequenz der V-Region der H-Kette, enthalten in diesem Plasmid HEF-RVHq-AHM-gγ1 sind in SEQ ID NO: 47 dargestellt.
Unter Verwendung eines mutagenen Primers CS (SEQ ID NO: 87) und CA (SEQ ID NO: 88), und des Plasmids HEF-RVHp-AHM-gγ1 als Matrizen-DNA wurde Version r durch das PCR-Verfahren amplifiziert um das Plasmid HEF-RVHr-AHM-gγ1 zu erhalten. Die Aminosäure- und Rasensequenz der V-Region der H-Kette, enthalten in diesem Plasmid HEF-RVHr-AHM-gγ1 sind in SEQ ID NO: 49 dargestellt.
Die Regionen, die die variable Region von jedem der oben erwähnten Plasmide HEF-RVLa-AHM-gκ und HEF-RVHr-AHM-gγ1 codierten wurden verdaut um Restriktionsfragmente zu erhalten, und zwar mit den Restriktionsenzymen HindIII und BamHI. Sie wurden in die HindIII- und BamHI-Stellen des Plasmidvektors pUC19 inseriert. Jedes Plasmid wurde als pUC19-RVLa-AHM-gκ und pUC19-RVHr-AHM-gγ1 bezeichnet.
Escherichia coli, das jedes der Plasmide pUC19-RVLa-AHM-gκ und pUC19-RVHr-AHM-gγ1 enthielt wurde als Escherichia coli DH5α (pUC19-RVLa-AHM-gκ) bzw. Escherichia coli DH5α (pUC19-RVHr-AHM-gγ1) bezeichnet und wurde am 29. August 1996 beim National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, MITI (Higashi 1-Chome 1-3, Tsukuba City, Ibaraki prefecture, Japan) unter den Hinterlegungsnummern FERM BP-5645 bzw. FERM BP-5643 gemäß den Vorschriften des Budapester Vertrags international hinterlegt.
4. Konstruktion des umgeformten menschlichen anti-HM1.24-Antikörpers, des chimären anti-HM1.24-Antikörpers und des H-Ketten-Hybrid-Antikörpers
Um jede Kette des umgeformten menschlichen anti-HM1.24-Antikörpers zu überprüfen, wurde der umgeformte menschliche anti-HM1.24-Antikörper und der chimäre anti-HM1.24-Antikörper als positiver Kontroll-Antikörper exprimiert. Bei der Konstruktion von jeweils der Version b und nach der V-Region der H-Kette des umgeformten menschlichen anti-HM1.24-Antikörpers ließ man den H-Ketten-Hybrid-Antikörper zur Untersuchung, welche Aminosäuresequenz in der FR substituiert werden sollte, exprimieren. Weiterhin wurde er in Kombination mit der chimären H-Kette exprimiert, um die Version a der L-Kette des umgeformten menschlichen anti-HM1.24-Antikörpers zu überprüfen.
4-1. Expression des umgeformten menschlichen anti-HM1.24-Antikörpers
Jeweils 10 μg des Expressionsvektors (HEF-RVHa-AHM-gγ1 bis HEF-RVHr-AHM-gγ1) für die H-Kette des umgeformten menschlichen anti-HM1.24-Antikörpers und des Expressionsvektors (HEF-RVLa-AHM-gκ oder HEF-RVLb-AHM-gκ) für die L-Kette des umgeformten menschlichen anti-HM1.24-Antikörpers wurden in COS-7-Zellen durch Elektroporation unter Verwendung des Gene Pulser-Instruments (hergestellt von BioRad) co-transformiert. Jede DNA (10 μg) wurde zu 0,8 ml Aliquots von 1 × 10⁷ Zellen/ml in PBS zugefügt und wurde Pulsen von 1500 V und einer Kapazität von 25 μF unterworfen.
Nach einer Erholungszeitspanne von 10 Minuten bei Raumtemperatur wurden die elektroporierten Zellen zu 30 ml DHEM-Kulturflüssigkeit (hergestellt von GIBCO), enthaltend 10 % γ-Globulin-freies fötales Rinderserum zugefügt. Nach 72-stündiger Inkubation im CO₂-Inkubator BNA120D (hergestellt von TABAI) unter Bedingungen von 37°C und 5 % CO₂ wurde der Kulturüberstand gesammelt, der Zellabfall durch Zentrifugation bei 1000 Upm für 5 Minuten in einer Zentrifuge 15PR-22 (hergestellt von HITACHI), ausgerüstet mit einem Zentrifugenrotor 03 (hergestellt von HITACHI) und einem Mikrokonzentrator (Centricon 100, hergestellt von Amicon) entfernt und es wurde unter Verwendung einer Zentrifuge J2-21 (hergestellt von BECKMAN), ausgerüstet mit einem Zentrifugenrotor JA-20.1 (hergestellt von BECKMAN) unter Bedingungen von 2000 Upm ultrafiltriert und für einen Zell-ELISA verwendet.
4-2. Expression des chimären anti-HM1.24-Antikörpers
Unter Verwendung von 10 μg von jeweils dem Expressionsvektor HEF-1.24H-gγ1 für die H-Kette des chimären menschlichen anti-HM1.24-Antikörpers und des Expressionsvektors HEF-1.24L-gκ für die L-Kette des chimären menschlichen anti-HM1.24-Antikörpers wurde der chimäre anti-HM1.24-Antikörper zur Verwendung für den Zell-ELISA gemäß dem oben erwähnten Verfahren zur Expression des umgeformten menschlichen anti-HM1.24-Antikörpers hergestellt.
4-3. Expression des anti-HM1.24-Antikörpers, umfassend
Version a der humanisierten L-Kette und die chimäre H-Kette Unter Verwendung von 10 μg von jeweils dem Expressionsvektor HEF-1.24H-gγ1 für die H-Kette des chimären menschlichen anti- HM1.24-Antikörpers und des Expressionsvektors HEF-RVLa-AHM-gκ für die Version a der L-Kette des umgeformten menschlichen anti-HM1.24-Antikörpers wurde der anti-HM1.24-Antikörper, umfassend Version a der humanisierten L-Kette und die chimäre H-Kette für die Verwendung für den Zell-ELISA gemäß dem oben erwähnten Verfahren zur Expression des umgeformten menschlichen anti-HM1.24-Antikörpers hergestellt.
4-4. Expression des H-Ketten-Hybrid-Antikörpers
Unter Verwendung von jeweils 10 μg des Expressionsvektors (HEF-MH-RVH-AHM-gγ1 oder HEF-HM-RVH-AHM-gγ1) für die V-Kette des H-Ketten-Hybrids und des Expressionsvektors HEF-RVLa-AHM-gκ für die L-Kette des umgeformten menschlichen anti-HM1.24-Antikörpers wurde der H-Ketten-Hybrid-Antikörper, der für den Zell-ELISA verwendet werden sollte gemäß dem oben erwähnten Verfahren zur Expression des umgeformten menschlichen anti-HM1.24-Antikörpers hergestellt.
4-5. Messung der Antikörperkonzentration
Die Konzentration des erhaltenen Antikörpers wurde durch ELISA gemessen. Jede Vertiefung einer ELISA-Platte mit 96 Vertiefungen (Maxisorp, hergestellt von NUNC) wurde durch Zugabe von 100 μl Ziegen-anti-menschlichen-IgG-Antikörper (hergestellt von BIO SOURCE), hergestellt auf eine Konzentration von 1 μg/ml mit dem Beschichtungspuffer (0,1 M NaHCO₃, 0,02 % NaN₃, pH 9,6) und Inkubationspuffer bei Raumtemperatur für 1 Stunden immobilisiert. Nach einem Blockieren mit 100 μl Verdünnungspuffer (50 mM Tris-HCl, 1 mM MgCl₂, 0,15 M NaCl, 0,05 % Tween 20, 0,02 % NaN₃, 1 % Rinderserumalbumin (BSA), pH 8,1) wurden 100 μl jeweils von seriellen Verdünnungen des umgeformten menschlichen anti-HM1.24-Antikörpers, des chimären anti-HM1.24-Antikörpers und des H-Ketten-Hybrid-Antikörpers, die durch Ultrafiltration konzentriert worden waren, jeder Vertiefung zugefügt und eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Dann wurden nach einem Waschen 100 μl alkalische Phosphatase-markierter Ziegen-anti-menschlicher-IgG-Antikörper (hergestellt von DAKO) zugefügt.
Nach einstündiger Inkubation bei Raumtemperatur und einem Waschen, wurden 100 μl 1 μg/ml Substratlösung (Sigma 104, p-Nitrophenylphosphat, hergestellt von SIGMA), gelöst in dem Substratpuffer (50 mM NaHCO₃, 10 mM MgCl₂, pH 9,8) zugefügt und dann wurde die Absorption bei 405 nm unter Verwendung des MICROPLATE READER MODEL 3550 (hergestellt von Bio Rad) gemessen. Als Standard für die Konzentrationsmessung wurde menschliches IgG1κ (hergestellt von The Einding Site) verwendet.
5. Etablieren der CHO-Zelllinie, die den menschlichen anti-HM1.24-Antikörper stabil erzeugt
5-1. Konstruktion des Expressionsvektors für die H-Kette des umgeformten menschlichen anti-HM1.24-Antikörpers
Durch Verdau des Plasmids HEF-RVHr-AHM-gγ1 mit dem Restriktionsenzymen PvuI und BamHI wurde ein ungefähr 2,8 kbp-Fragment, enthaltend die DNA, codierend den EF1-Promotor und die V-Region der H-Kette des umgeformten menschlichen anti-HM1.24-Antikörpers unter Verwendung eines 1,5%igen niedrigschmelzenden Agarosegels gereinigt. Dann wurde das obige DNA-Fragment in ein ungefähr 6 kbp-Fragment inseriert, das durch Verdau des Expressionsvektors mit PvuI und BamHI hergestellt wurde, der für einen menschlichen H-Ketten-Expressionsvektor verwendet wurde, DHFR-ΔE-RVh-PMlf (internationale Patentveröffentlichung WO 92/19759 ), enthaltend das DHFR-Gen und das Gen, codierend die konstante Region einer menschlichen H-Kette um einen Expressionsvektor DHFR-ΔE-HEF-RVHr-AHM-gγ1 für die H-Kette des umgeformten anti-HM1.24-Antikörpers zu konstruieren.
5-2. Gen-Einführung in CHO-Zellen
Um ein stabiles Produktionssystem des umgeformten anti-HM1.24-Antikörpers zu etablieren, wurden die Gene der oben erwähnten Expressionsvektoren DHFR-ΔE-RVHr-AHM-gγ1 und HEF-RVLa-AHM-gκ, die durch Verdau mit PvuI linearisiert worden waren simultan durch das Elektroporationsverfahren unter ähnlichen Bedingungen wie den oben erwähnten (Transfektion in die oben erwähnten COS-7-Zellen) in die CHO-Zelle DXB-11 eingeführt.
5-3. Gen-Amplifikation durch MTX
Unter den CHO-Zellen mit eingeführten Genen können nur diejenigen CHO-Zellen, in die sowohl die L- als auch die H-Kettenexpressionsvektoren eingeführt wurden, in einer Nukleosid-freien α-MEM-Kulturflüssigkeit (hergestellt von GIBCO-BRL), zu der 500 μg/ml G418 (hergestellt von GIBCO-BRL) und 10 % fötales Rinderserum zugefügt wurden, überleben und so wurden sie selektiert. Darauffolgend wurden 10 nM MTX (hergestellt von Sigma) der obigen Kulturflüssigkeit zugefügt. Unter den so propagierten Klonen wurden diejenigen, die den umgeformten anti-HM1.24-Antikörper in großen Mengen produzierten, selektiert. Im Ergebnis wurde ein Klon #1 erhalten, der eine Produktionseffizienz von ungefähr 3 μg/ml des umgeformten anti-HM1.24-Antikörpers zeigte und wurde als umgeformte anti-HM1.24-Antikörper-erzeugende Zellinie bezeichnet.
5-4. Konstruktion des umgeformten menschlichen anti-HM1.24-Antikörpers
Der umgeformte anti-HM1.24-Antikörper wurde durch das folgende Verfahren konstruiert. Die obigen CHO-Zellen, die den umgeformten anti-HM1.24-Antikörper produzieren, wurden 10 Tage unter Verwendung der Nukleosid-freien α-MEM- Kulturflüssigkeit (hergestellt von GIBCO-BRL), wozu 500 μg/ml G418 (hergestellt von GIBCO-BRL), enthaltend 10 % γ-Globulinfreies fötales Rinderserum (hergestellt von GIBCO-BRL) zugefügt worden waren unter Verwendung des CO₂-Inkubators BNAS120D (hergestellt von TABAI) unter Bedingungen von 37°C und 5 % CO₂ kultiviert. Am Tag 8 und 10 nach Beginn der Kultur wurde die Kulturflüssigkeit gewonnen, der Zellabfall wurde durch Zentrifugation für 10 Minuten bei 2000 Upm unter Verwendung der Zentrifuge RL-500SP (hergestellt von Tomy Seiko), ausgerüstet mit dem TS-9-Rotor entfernt und unter Verwendung eines Bottle-Top-Filters (hergestellt von FALCON) mit einer Membran mit Poren mit einem Durchmesser von 0,45 μm Filter-sterilisiert.
Nachdem eine gleiche Menge PBS(–) der Kulturflüssigkeit der CHO-Zellen, die den umgeformten menschlichen anti-HM1.24-Antikörper produzieren, zugefügt worden war, wurde der umgeformte anti-HM1.24-Antikörper unter Verwendung des Hochgeschwindigkeits-Antikörper-Reinigungssystems ConSep LC100 (hergestellt von MILLIPORE) und einer Hyper-D-Protein-A-Säule (hergestellt von Nippon Gaishi) unter Verwendung von PBS(–) als Absorptions/Waschpuffer und 0,1 M Natriumcitratpuffer (pH 3) als Elutionspuffer gemäß den beigefügten Instruktionen affinitätsgereinigt. Die eluierten Fraktionen wurden auf einen pH von ungefähr 7,4 durch direkte Zugabe von 1 M Tris-HCl (pH 8,0) eingestellt und dann wurde unter Verwendung des Zentrifugations-Ultrafiltrations-Konzentrators Centriprep 10 (hergestellt von MILLIPORE) eine Konzentration und Substitution zu PBS(–) durchgeführt und es wurde unter Verwendung eines Membranfilters MILLEX-GV (hergestellt von MILLIPORE) mit einer Porengröße von 0,22 μm filtersterilisiert, um den gereinigten umgeformten menschlichen anti-HM1.24-Antikörper zu erhalten. Die Antikörperkonzentration wurde durch eine Absorption bei 280 nm gemessen und mit 1 μg/ml als 1,35 OD berechnet.
Referenzbeispiel 11: Bestimmung der Aktivität des umgeformten anti-HM1.24-Antikörpers
Der umgeformte anti-HM1.24-Antikörper wurde auf die folgende Antigen-Bindungsaktivität und Bindungsinhibitionsaktivität hin bewertet.
1. Verfahren zur Messung der Antigen-Bindungsaktivität und Bindungsinhibitionsaktivität
1-1. Messung der Antigen-Bindungsaktivität
Die Antigen-Bindungsaktivität wurde durch einen Zell-ELISA unter Verwendung von WICH-Zellen gemessen. Zell-ELISA-Platten wurden wie im obigen Beispiel 7.1-2 beschrieben hergestellt.
Nach einem Blockieren wurden 100 μl serieller Verdünnungen des umgeformten menschlichen anti-HM1.24-Antikörpers, der aus dem Konzentrat des Kulturüberstandes von COS-7-Zellen erhalten wurde oder aus dem Kulturüberstand von CHO-Zellen gereinigt wurde, jeder Vertiefung zugefügt. Nach einer Inkubation für 2 Stunden bei Raumtemperatur und einem Waschen wurde ein Peroxidase-markierter Kaninchen-anti-menschlicher-IgG-Antikörper (hergestellt von DAKO) zugefügt. Nach 2-stündiger Inkubation bei Raumtemperatur und einem Waschen, wurde die Substratlösung zugefügt und es wurde inkubiert. Dann wurde die Reaktion durch Zugabe von 50 μl 6N Schwefelsäure beendet und die Absorption bei 490 nm wurde unter Verwendung des MICROPLATE READER Model 3550 (hergestellt von Bio-Rad) gemessen.
1-2. Messung der Bindungsinhibitionsaktivität
Die Bindungsinhibitionsaktivität durch den Biotin-markierten Maus-anti-HM1.24-Antikörper wurde durch den Zell-ELISA unter Verwendung von WISH-Zellen gemessen. Zell-ELISA-Platten wurden wie oben beschrieben hergestellt. Nach einem Blockieren wurden 50 μl serieller Verdünnungen des umgeformten menschlichen anti-HM1.24-Antikörpers, der aus dem Konzentrat des Kulturüberstands von COS-7-Zellen erhalten worden war oder aus dem Kulturüberstand von CHO-Zellen gereinigt wurde, jeder Vertiefung zugefügt und 50 μl 2 μg/ml Biotin-markierter Maus-anti-HM1.24-Antikörper wurde simultan zugefügt. Nach einer Inkubation bei Raumtemperatur für 2 Stunden und einem Waschen wurde Peroxidase-markiertes Streptavidin (hergestellt von DAKO) zugefügt. Nach einstündiger Inkubation bei Raumtemperatur und dann einem Waschen wurde die Substratlösung zugefügt und es wurde inkubiert. Dann wurde die Reaktion durch Zugabe von 50 μl 6N Schwefelsäure beendet und die Absorption bei 490 nm wurde unter Verwendung des MICROPLATE READER Model 3550 (hergestellt von Bio-Rad) gemessen.
2. Bewertung des umgeformten menschlichen anti-HM1.24-Antikörpers
2-1. L-Kette
Die Version a der L-Kette des umgeformten menschlichen anti-HM1.24-Antikörpers wurde wie oben erwähnt zur Messung der Antigen-Bindungsaktivität bewertet. Wie in 8 dargestellt, zeigt Version a der L-Kette, wenn sie in Kombination mit der chimären H-Kette exprimiert wird ein ähnliches Niveau einer Antigen-Bindungsaktivität. Unter Betrachtung eines weiteren Anstiegs der Aktivität und einer Kompatibilität mit der H-Kette wurde jedoch die Version b der L-Kette konstruiert. Die Versionen a und b der L-Kette wurden zusammen im Hinblick auf die Antigen-Bindungsaktivität und auf die Bindungsinhibitionsaktivität bewertet, wenn sie mit den Versionen a, b, f oder h der H-Kette kombiniert wurden. Wie in den 9, 10, 11 und 12 dargestellt, hatte Version a der L-Kette eine höhere Aktivität als Version b in beiden Aktivitäten in allen Versionen a, b, f und h der H-Kette. Daher wurde Version a der L-Kette des umgeformten menschlichen anti-HM1.24-Antikörpers für das folgende Experiment verwendet.
2-2. H-Kettenversionen a bis e
Die Versionen a bis e der H-Kette des umgeformten menschlichen anti-HM1.24-Antikörpers wurden in Kombination mit der Version a der L-Kette wie oben erwähnt zur Messung der Antigen-Bindungsaktivität und für die Bindungsinhibitionsaktivität bewertet. Das Ergebnis zeigte wie in 11, 13, 14 und 15 dargestellt an, daß alle Versionen schwächer in beiden Aktivitäten waren im Vergleich zu dem chimären anti-HM1.24-Antikörper, was nahe legte, daß eine weitere Aminosäuresubstitution nötig ist.
2-3. Der H-Ketten-Hybrid-Antikörper
Der H-Ketten-Hybrid-Antikörper wurde wie oben erwähnt zur Messung der Antigen-Bindungsaktivität bewertet. Das Ergebnis zeigte wie in 16 dargestellt, an, daß der Mensch-Maus-Hybrid-anti-HM1.24-Antikörper eine ähnliche Aktivität zu der des chimären anti-HM1.24-Antikörpers im Hinblick auf die Antigen-Bindungsaktivität zeigte, während der Maus-menschliche-Hybrid-anti-HM1.24-Antikörper eine schwächere Aktivität als der chimäre anti-HM1.24-Antikörper aufwies. Dies zeigte an, daß es zur Konstruktion des umgeformten menschlichen anti-HM1.24-Antikörpers mit einer ähnlichen Antigen-Bindungsaktivität wie der des chimären anti-HM1.24-Antikörpers notwendig ist Aminosäuren umzuwandeln, die in FR3 oder FR4 beinhaltet sind unter denjenigen, die in der V-Region der H-Kette enthalten sind.
2-4. Version f bis r der H-Kette
Die Version f der H-Kette des umgeformten menschlichen anti-HM1.24-Antikörpers wurde wie oben erwähnt zur Messung der Antigen-Bindungsaktivität bewertet. Das Ergebnis zeigte, wie in 17 dargestellt an, daß die Antigen-Bindungsaktivität im Vergleich zu dem chimären anti-HM1.24-Antikörper vermindert ist, jedoch im Vergleich zu den obigen Versionen a bis c erhöht ist, was nahe legt, daß irgendeine der vier Aminosäuren an den Positionen 67, 69, 75 und 78, die in dieser Version neu umgewandelt waren, für die Aktivität des umgeformten menschlichen Antikörpers verantwortlich ist.
Die Version g der H-Kette des umgeformten menschlichen anti-HM1.24-Antikörpers wurde wie oben erwähnt zur Messung der Antigen-Bindungsaktivität bewertet. Das Ergebnis zeigte, wie dargestellt in den 18 und 19 an, daß diese Version ein höchstens ähnliches Aktivitätsniveau zeigte, wie das der obigen Version a, was zeigte, daß, wie dargestellt für den obigen H-Ketten-Mensch-Maus-Hybrid-Antikörper die Aminosäure in Position 40, die in dieser Version umgewandelt war, für den Anstieg der Aktivität des umgeformten menschlichen Antikörpers nicht verantwortlich ist.
Die Versionen h bis j der H-Kette des umgeformten menschlichen anti-HM1.24-Antikörpers wurden wie oben erwähnt zur Messung der Antigen-Bindungsaktivität und der Bindungsinhibitionsaktivität bewertet. Die Ergebnisse zeigten, wie in den 20, 21, 22 und 23 dargestellt an, daß, alle Versionen im Hinblick auf beide Aktivitäten im Vergleich zu dem chimären anti-HM1.24-Antikörper schwächer waren und ähnlich waren wie die oben erwähnte Version f, was nahelegte, daß die Aminosäuren an den Positionen 67 und 69 unter den vier Aminosäuren, die in Version f neu umgewandelt waren, für den Anstieg der Aktivität des umgeformten menschlichen Antikörpers nicht verantwortlich waren.
Die Versionen k bis p der H-Kette des umgeformten menschlichen anti-HM1.24-Antikörpers wurden wie oben erwähnt zur Messung der Antigen-Bindungsaktivität und der Bindungsinhibitionsaktivität bewertet. Das Ergebnis zeigt, wie in den 24, 25, 26 und 27 dargestellt, daß alle Versionen im Hinblick auf beide Aktivitäten im Vergleich zum chimären anti-HM1.24-Antikörper schwächer waren und ähnlich wie die oben erwähnte Version h, was nahelegte, daß die Aminosäuren an Position 80 und danach, die in diesen 6 Versionen neu umgewandelt waren, für den Anstieg der Aktivität des umgeformten menschlichen Antikörpers nicht verantwortlich sind.
Version q der H-Kette des umgeformten menschlichen anti-HM1.24-Antikörpers wurde wie oben erwähnt zur Messung der Antigen-Bindungsaktivität und der Bindungsinhibitionsaktivität bewertet. Das Ergebnis zeigte, wie dargestellt in den 25 und 27 an, daß diese Version für beide Aktivitäten im Vergleich zu der obigen Version h oder p schwächer war und höchstens ähnlich zu der oben erwähnten a, was nahelegte, daß eine Substitution der Aminosäure an Position 78 für den Anstieg der Aktivität des umgeformten menschlichen Antikörpers essentiell ist.
Version r der H-Kette des umgeformten menschlichen anti-HM1.24-Antikörpers wurde durch das oben erwähnte Verfahren bewertet. Das in den 15 und 28 dargestellte Ergebnis zeigte an, daß Version r ein ähnliches Niveau einer Antigen-Bindungsaktivität und Bindungsinhibitionsaktivität wie diejenigen des chimären anti-HM1.24-Antikörpers aufwies.
Die obigen Ergebnisse zeigten an, daß die minimal nötige Umwandlung für den umgeformten menschlichen anti-HM1.24-Antikörper um ein ähnliches Niveau einer Antigen-Bindungsaktivät wie der Maus-anti-HM1.24-Antikörper oder chimäre anti-HM1.24-Antikörper aufzuweisen, an den Aminosäuren an Position 30, 71 und 78 und weiterhin 73 liegt.

Die Antigen-Bindungsaktivität und die Bindungsinhibitionsaktivität für die H-Kettenversion a bis r des umgeformten menschlichen anti-HM1.24-Antikörpers sind in Tabelle 2 zusammengefaßt. Tabelle 2

H-Kettenversion	Antigen-Bindungsaktivität	Bindungsinhibitionsaktivität
a	+	+
b	+	+
c	+	+
d	+	nicht gemessen
e	+	nicht gemessen
f	++	++
g	+	+
h	++	++
i	++	++
j	++	++
k	++	++
l	++	++
m	++	++
n	++	++
o	++	++
p	++	++
q	+	+
r	+++	+++

Weiterhin sind die Aminosäuresequenzen des umgeformten menschlichen anti-HM1.24-Antikörpers und der Versionen a und b der L-Kette in Tabelle 3 dargestellt und diejenigen der Versionen a bis r der H-Kette des umgeformten menschlichen anti-HM1.24-Antikörpers sind in den Tabellen 4 bis 6 dargestellt.
Tabelle 3 Die Aminosäuresequenz der L-Ketten-V-Region
Tabelle 4 Die Aminosäuresequenz der H-Ketten-V-Region (1)
Tabelle 5 Die Aminosäuresequenz der H-Ketten-V-Region (2)
Tabelle 6 Die Aminosäuresequenz der H-Ketten-V-Region
3. Bewertung des gereinigten umgeformten menschlichen anti-RM1.24-Antikörpers
Der gereinigte umgeformte menschliche anti-HM1.24-Antikörper wurde im Hinblick auf die oben erwähnte Antigen-Bindungsaktivität und Bindungsinhibitionsaktivität bewertet. Das in den 31 und 32 dargestellte Ergebnis zeigte an, daß der umgeformte menschliche anti-HM1.24-Antikörper ein ähnliches Niveau einer Antigen-Bindungsaktivität und Bindungsinhibitionsaktivität wie der chimäre anti-HM1.24-Antikörper aufwies. Diese Tatsache zeigte an, daß der umgeformte menschliche anti-HM1.24-Antikörper dieselbe Antigen-Bindungsaktivität wie der Maus-anti-HM1.24-Antikörper aufwies.
Referenzbeispiel 12: Konstruktion des Hybridoms, das den Maus-anti-HM1.24-monoklonalen-Antikörper erzeugt
Das Hybridom, das den anti-HM1.24-monoklonalen-Antikörper erzeugt, wurde gemäß dem in Goto, T. et al., Blood (1994) 84, 1992-1930 beschriebenen Verfahren hergestellt.
Die Epstein-Barr-Virus nukleäre Antigen (EBNA)-negative Plasma-Zelllinie KPC-32 (1 × 10⁷ Zellen), die von Knochenmark von menschlichen Patienten mit multiplem Myelom abstammte (Goto, T. et al., Jpn. J. Clin. Hematol. (11991) 32, 1400) wurde intraperitoneal zweimal an BALB/c-Mäuse (hergestellt von Charles River) alle sechs Wochen verabreicht.
Um den Titer der Antikörperproduktion weiter anzuheben wurden 1,5 × 10⁶ KPC-32-Zellen in die Milz der Mäuse 3 Tage vor einer Opferung der Tiere injiziert (Goto, T. et al., Tokushima J. Exp. Med. (1990) 37, 89). Nach einem Opfern der Mäuse wurde die Milz entfernt und die Milzzellen gemäß dem Verfahren von Groth, de St. & Schreidegger (Cancer Research (1981) 41, 3465) entfernt und einer Zellfusion mit den Myelomzellen SP2/0 unterzogen.
Antikörper im Überstand der Hybridomkultur wurden durch ELISA (Posner, M.R. et al., J. Immunol. Methods (1982) 48, 23) unter Verwendung der KPC-32 Zell-beschichteten Platten einem Screening unterworfen. 5 × 10⁴ KPC-32 Zellen wurden in 50 ml PBS suspendiert und in Platten mit 96 Vertiefungen verteilt (U-Boden, Corning, hergestellt von Iwaki). Nach einem Blockieren mit PBS, enthaltend 1 % Rinderserumalbumin (BSA) wurde der Überstand des Hybridoms zugefügt und es wurde 2 Stunden bei 4°C inkubiert. Darauffolgend wurde Peroxidasemarkierter anti-Maus-IgG-Ziegen-Antikörper (hergestellt von Zymed) 1 Stunde bei 4°C umgesetzt, einmal gewaschen und mit der o-Phenylendiamin-Substratlösung (hergestellt von Sumitomo Bakelite) 30 Minuten bei Raumtemperatur umgesetzt.
Nach Beendigung der Reaktion mit 2N Schwefelsäure wurde die Absorption bei 492 nm unter Verwendung des ELISA-Readers (hergestellt von Bio-Rad) gemessen. Um das Hybridom zu entfernen, das den Antikörper gegen menschliches Immunglobulin erzeugt, war der positive Hybridom-Kulturüberstand vorher an menschliches Serum adsorbiert worden und die Reaktivität mit anderen subzellulären Komponenten wurde einem Screening unterworfen. Positive Hybridome wurden selektiert und ihre Reaktivität mit verschiedenen Zelllinien und menschlichen Proben wurde unter Verwendung einer Flußzytometrie untersucht. Die schließlich gewählten Hybridomklone wurden zweimal kloniert, in die Abdominalhöhle der Pristan-behandelten BALB/c-Mäuse injiziert und dann wurde daraus Ascites-Flüssigkeit erhalten.
Monoklonale Antikörper wurden aus dem Maus-Ascites durch Ammoniumsulfat-Präzipitation und Protein A-Affinitätschromatographie-Kits (Ampure PA, hergestellt von Amersham) gereinigt. Der gereinigte Antikörper wurde an Fluoresceinisocyanat (FITC) unter Verwendung des Quick-Tag-FITC-Konjugations-Kit (hergestellt von Boehringer Mannheim) konjugiert.
Im Ergebnis reagierte der von den 30 Hybridomklonen erzeugte monoklonale Antikörper mit KPC-32 und RPMI 8226-Zellen. Nach dem Klonieren wurde die Reaktivität des Überstands dieser Hybridome mit anderen Zellinien und peripheren Blutabstammenden Monozyten untersucht.
Von diesen waren drei Klone monoklonale Antikörper, die spezifisch mit Plasmazellen reagierten. Von diesen drei Klonen wurde der Hybridomklon, der den Klon aufwies, der für die Flußcytometrieanalyse besonders geeignet war und der eine Komplement-abhängige Cytotoxizität aufwies, gewählt und wurde als HM1.24 bezeichnet. Die Unterklasse der monoklonalen Antikörper, die von diesem Hybridom erzeugt wurden, wurde durch ELISA unter Verwendung eines Subklassen-spezifischen anti-Maus-Kaninchen-Antikörpers (hergestellt von Zymed) bestimmt. Der anti-HM1.24-Antikörper hatte die Subklasse IgG2a κ. Das Hybridom, das den anti-HM1.24-Antikörper erzeugt wurde international am 14. September 1995 bei dem National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, MITI (Higashi 1-Chome 1-3, Tsukuba City, Ibaraki prefecture, Japan) unter der Hinterlegungs-Nr. FERM BP-5233 gemäß den Vorschriften des Budapester Vertrags hinterlegt.
Referenzbeispiel 13: Klonierung von cDNA, codierend das HM1.24-Antigen-Polypeptid
1. Konstruktion einer cDNA-Bibliothek
1) Präparation von Gesamt-RNA
Die cDNA, die das HM1.24-Antigen codiert, das ein Antigen-Polypeptid ist, das von dem Maus-monoklonalen anti-HM1.24-Antikörper spezifisch erkannt wird, wurde wie folgt isoliert.
Aus der menschlichen multiplen Myelomzelllinie KPMM2 wurde Gesamt-RNA gemäß dem Verfahren von Chirgwin et al. (Biochemistry, 18, 5294 (1979)) hergestellt. So wurden 2,2 × 10⁸ KPMM2-Zellen vollständig in 20 ml 4M Guanidinisocyanat (hergestellt von Nacalai Tesque Inc.) homogenisiert.
Das Homogenat wurde auf die 5,3M Cäsiumchlorid-Schicht in dem Zentrifugenröhrchen geschichtet, das dann unter Verwendung eines Beckman SW40-Rotors bei 31 000 Upm bei 20°C 24 Stunden zentrifugiert wurde um RNA auszufällen. Das RNA-Präzipitat wurde mit 70 % Ethanol gewaschen und in 300 μl 10 mM Tris-HCl (pH 7,4), enthaltend 1 mM EDTA und 0,5 % SDS gewaschen. Nach Zugabe von Pronase (hergestellt von Boehringer) auf eine Konzentration von 0,5 mg/ml wurde 30 Minuten bei 37°C inkubiert. Die Mischung wurde mit Phenol und Chloroform extrahiert um RNA auszufällen. Dann wurde das RNA-Präzipitat in 200 μl 10 mM Tris-HCl (pH 7,4), enthaltend 1 mM EDTA gelöst.
2) Präparation von Poly(A)+RNA
Unter Verwendung von ungefähr 500 μg der wie oben hergestellten Gesamt-RNA als Rohmaterial wurde Poly(A)+RNA unter Verwendung des Fast Track 2.0m RNA-Isolations-Kit (hergestellt von Invitrogen) gemäß den dem Kit beigefügten Anweisungen gereinigt.
3) Konstruktion einer cDNA-Bibliothek
Unter Verwendung von 10 μg der obigen Poly(A)+RNA als Rohmaterial wurde eine doppelsträngige cDNA unter Verwendung von einem cDNA-synthetisierenden Kit TimeSaver-cDNA-Synthesis-Kit (hergestellt von Pharmacia) gemäß den dem Kit beigefügten Anweisungen synthetisiert und unter Verwendung der Directional Cloning Toolbox (hergestellt von Pharmacia) wurde ein EcoRI-Adapter gemäß den dem Kit beigefügten Anweisungen angebunden. Kinase und Restriktionsenzym NotI-Behandlung des EcoRI-Adapters wurde gemäß den dem Kit beigefügten Anweisungen durchgeführt. Weiterhin wurde eine Adapter-angebundene doppelsträngige cDNA mit einer Größe von ungefähr 500 bp oder mehr unter Verwendung eines 1,5%igen Agarose-Gels (hergestellt von SIGMA) zum Erhalt von ungefähr 40 μl Adapter-angebundener doppelsträngiger cDNA isoliert und gereinigt.
Die so hergestellte Adapter-angebundene doppelsträngige cDNA wurde unter Verwendung des pCOS1-Vektors (japanische ungeprüfte Patentveröffentlichung (Kokai) Nr. 8(1996)-255196) und T4 DNA-Ligase (hergestellt von GIBCO BRL), die vorher mit den Restriktionsenzymen EcoRI und NotI und alkalischer Phosphatase (hergestellt von Takara Shuzo) behandelt worden war, verbunden, um eine cDNA-Bibliothek zu konstruieren. Die konstruierte cDNA-Bibliothek wurde in den Escherichia coli-Stamm DH5 (hergestellt von GIBCO BRL) transduziert und die Gesamtgröße wurde als bei ungefähr 2,5 × 10⁶ unabhängigen Zellen liegend geschätzt.
2. Klonieren durch direkte Expression
1) Transfektion in COS-7-Zellen
Die cDNA wurde durch Kultivierung von ungefähr 5 × 10⁵ Klonen des oben transduzierten Escherichia coli in dem 2-YT-Medium (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)), enthaltend 50 μg/ml Ampicillin amplifiziert und Plasmid-DNA wurde aus Escherichia coli durch das Alkaliverfahren (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)) gewonnen. Die erhaltene Plasmid-DNA wurde in COS-7-Zellen durch Elektroporation unter Verwendung des Gene Pulser-Instrument (hergestellt von BioRad) transfiziert.
So wurden 10 μg der gereinigten Plasmid-DNA zu 0,8 ml COS-7-Zellen, die in PBS bei einer Konzentration von 1 × 10⁷ Zellen/ml suspendiert worden waren, zugefügt und wurden Pulsen bei 1500V und einer Kapazität von 25 μF unterzogen. Nach 10 Minuten Erholungsperiode bei Raumtemperatur wurden die elektroporierten Zellen in DMEM-Medium (hergestellt von GIBCO BRL), supplementiert mit 10 % fötalem Rinderserum unter Bedingungen von 37°C und 5 % CO₂ drei Tage kultiviert.
2) Präparation einer Panning-Schale
Eine Panning-Schale, beschichtet mit dem Maus-anti-HM1.24-Antikörper wurde durch das Verfahren von B. Seed et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 3365-3369 (1987)) hergestellt. So wurde der Maus-anti-HM1.24-Antikörper zu 50 mM Tris-HCl, pH 9,5 auf eine Konzentration von 10 μg/ml zugefügt. 3 ml der so hergestellten Antikörperlösung wurden einer Gewebekulturplatte mit einem Durchmesser von 60 mm zugefügt und bei Raumtemperatur 2 Stunden inkubiert. Nach 3-maligem Waschen mit PBS, enthaltend 0,15 M NaCl wurde 5 % fötales Rinderserum, 1 mM EDTA und 0,02 % NaN₃ zugefügt und nach einem Blockieren wurde dies für das folgende Klonieren verwendet.
3) Klonieren der cDNA-Bibliothek
Die wie oben beschrieben transfektierten COS-7-Zellen wurden durch PBS, enthaltend 5 mM EDTA abgelöst und dann einmal mit PBS, enthaltend 5 % fötales Rinderserum gewaschen. Dies wurde dann in PBS, enthaltend 5 % fötales Rinderserum und 0,02 % NaN₃ auf eine Konzentration von ungefähr 1 × 10⁶ Zellen/ml suspendiert, was zu der wie oben hergestellten Panning-Schale zugefügt und 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert wurde. Nach dreimaligem Waschen mit PBS, enthaltend 5 % fötales Rinderserum und 0,02 % NaN₃, wurde Plasmid-DNA von den Zellen, die an die Panning-Schale gebunden hatten, unter Verwendung einer Lösung, die 0,6 % SDS und 10 mM EDTA enthielt, gewonnen.
Die gewonnene Plasmid-DNA wurde wiederum in Escherichia coli DH5α trasduziert. Nach Amplifikation der obigen Plasmid-DNA wurde sie durch das Alkaliverfahren gewonnen. Die gewonnene Plasmid-DNA wurde durch das Elektroporationsverfahren in COS-7-Zellen transfiziert um Plasmid-DNA aus den gebundenen Zellen wie oben beschrieben zu gewinnen. Dasselbe Verfahren wurde noch einmal wiederholt und die gewonnene Plasmid-DNA wurde mit den Restriktionsenzymen EcoRI und NotI verdaut. Im Ergebnis wurde die Konzentration des Inserts mit einer Größe von ungefähr 0,9 kbp bestätigt. 50 μg Escherichia coli, transduziert mit einem Teil der gewonnenen Plasmid-DNA wurde auf die 2-YT-Agarplatte, enthaltend 50 μg/ml Ampicillin inokuliert. Nach einer Kultur über Nacht wurde Plasmid-DNA, enthaltend eine einzelne Kolonie gewonnen. Diese wurde mit den Restriktionsenzymen EcoRI und NotI verdaut und ein Klon p3.19 mit einem Insert von 0,9 kbp wurde erhalten.
Die Rasensequenz dieses Klons wurde durch Umsetzung unter Verwendung von PRISM, Terminator Cycle Sequencing Kit (hergestellt von Perkin Elmer) gemäß den dem Kit beigefügten Anweisungen bestimmt. Die Aminosäuresequenz und die Rasensequenz sind in SEQ ID NO: 128 dargestellt.
Die cDNA, die das Polypeptid mit der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 128 codiert, wurde in die XbaI-Spaltungsstelle des pUC19-Vektors inseriert und wurde als Plasmid pRS38-pUC19 hergestellt. Der Escherichia coli, der dieses Plasmid pRS38-pUC19 enthält, wurde international am 5. Oktober 1993 als Escherichia coli DH5α (pRS38-pUC19) beim National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, MITI (Higashi 1-Chome 1-3, Tsukuba City, Ibaraki Prefecture, Japan) unter der Hinterlegungs-Nr. FERM BP-4434 gemäß den Vorschriften des Budapester Vertrags hinterlegt (siehe japanische ungeprüfte Patentveröffentlichung (Kokai) Nr. 7(1995)-196694).
Beispiele
Als Beispiele natürlicher humanisierter Antikörper, bestehend aus den natürlichen FR-Sequenzen der vorliegenden Erfindung, wurde ein Präparationsbeispiel eines natürlichen humanisierten Antikörpers, basierend auf dem humanisierten anti-HM1.24-Antikörper beschrieben.
Beispiel 1
Der monoklonale Maus-anti-HM1.24-Antikörper wurde als umgeformter menschlicher anti-HM1.24-Antikörper durch CDR-Grafting wie in den Referenzbeispielen beschrieben humanisiert. Jede FR des menschlichen Antikörpers HG3 für FR1 bis FR3 und die FR4 des menschlichen Antikörpers JH6 für FR4 wurden für die Konstruktion der humanisierten H-Kette gewählt. Das Ergebnis der Untersuchung der FR-Aminosäurereste zeigte an, daß eine Aminosäuresubstitution an vier Stellen (FR1/30, FR3/71, 73, 78) (Tabellen 7 und 8) nötig war. Dieser humanisierte Antikörper hatte eine ähnliche Antigen-Bindungsaktivität wie der ursprüngliche Antikörper. Dieser humanisierte Antikörper (humanisierter Antikörper, umfassend RVLa/RVHr) wurde als primärer Design-Antikörper verwendet.
(1) Die Konstruktion der H-Kette
Für die FR des primären Design-Antikörpers wurde eine Homologiesuche an menschlichen FRs, die in der Natur angetroffen werden, unter Verwendung der Datenbanken Swiss Prot, GenBank, PRF, PIR und GenPept durchgeführt. Zunächst wurden 50 menschliche FRs angetroffen, die vollständig gepaarte Aminosäuresequenzen für FR1 aufweisen. So hatte die FR1 des primären Design-Antikörpers bereits eine natürliche Sequenz. Da keine Aminosäuresubstitutionen für FR2 und FR4 durchgeführt wurden, wurden 50 und 100 natürliche FRs einschließlich HG3 bzw. JH6 des natürlichen menschlichen Körpers gefunden.
Andererseits wurden keine vollständigen Paarungen für FR3 gefunden. Als FR3 mit der höchsten Homologie, wurden 546463 mit einer Homologie von 96,875 %, 1921296C, HUMIGHRF 1, U00583 1 und ähnliche gefunden (die Symbole sind alle Hinterlegungsnummern für die Datenbank).
So war in dem primären Design-Antikörper FR3 die FR, die künstliche Aminosäurereste enthielt, die in der Natur nicht angetroffen werden. Die Aminosäuresequenz wird mit der des menschlichen Antikörpers S46463 verglichen, die die höchste Homologie in Tabelle 9 aufwies.
Der Aminosäurerest an Position 70 war Methionin in der FR3 des primären Design-Antikörpers und Isoleucin in der FR3 des menschlichen Antikörpers S46463. Die anderen Aminosäuresequenzen hatten komplette Paarungen. So wurde der Aminosäurerest an Position 70 im primären Design-Antikörper durch Isoleucin ersetzt um sie in eine natürliche FR3 umzuwandeln. Dementsprechend ist der sekundäre Design-Antikörper, der erhalten wurde, ein CDR-Grafting-Antikörper, umfassend die natürliche menschliche FR des menschlichen Antikörpers S46463. Der so konstruierte sekundäre Design-Antikörper umfaßt FRs, die alle in der Natur angetroffen werden.
(2) Konstruktion der H-Ketten-V-Region des natürlichen humanisierten anti-HM1.24-Antikörpers
Die H-Ketten-V-Region des natürlichen humanisierten anti-HM1.24-Antikörpers wurde durch Mutagenese unter Verwendung von PCR konstruiert. Die mutagenen Primer SS (SEQ ID NO: 124) und SA (SEQ ID NO: 125) wurden so entworfen um Methionin an Position 69 zu Isoleucin zu mutieren.
Nachdem der obige Primer unter Verwendung des Plasmids HEF-RVHr-AHM-gγ1 als Matrize amplifiziert wurde, wurde das Endprodukt gereinigt, mit BamHI und HindIII verdaut und das erhaltene DNA-Fragment wurde in einen Expressionsvektor HEF-VH-gγ1 kloniert, um ein Plasmid HEF-RVHs-AHM-gγ1 zu erhalten. Die Aminosäure- und die Nukleotidsequenz der V-Region der H-Kette, die in diesem Plasmid enthalten ist, HEF-RVHs-AHN-gγ1 sind in SEQ ID NO: 126 dargestellt.
Die Region, die die variable Region des oben erwähnten Plasmids HEF-RVHs-AHM-gγ1 codierte, wurde mit den Restriktionsenzymen HindIII und BamHI verdaut, um ein Restriktionsfragment herzustellen. Dies wurde in die BamHI- und HindIII-Stellen des Plasmidvektors pUC19 inseriert. Das erhaltene Plasmid wurde als pUC19-RVHs-AHM-gγ1 bezeichnet.
Escherichia coli, der pUC19-RVHs-AHM-gγ1 enthielt, wurde als Escherichia coli DH5α (pUC19-RVHs-AHM-gγ1) bezeichnet und wurde international am 29. September 1997 bei dem National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, MITI (Higashi 1-Chome 1-3, Tsukuba City, Ibaraki Prefecture, Japan) unter der Hinterlegungs-Nr. FERN BP-6127 gemäß den Vorschriften des Budapester Vertrags hinterlegt.
2) Analyse der L-Kette
Obwohl Aminosäuren der FRs in der Konstruktion der L-Kette des primären Design-Antikörpers nicht substituiert waren, wurde auch für diese FRs eine Homologiesuche durchgeführt, da der menschliche Antikörper REI, der verwendet wurde, eine umgeformte FR aufwies (Riechmann, L. et al., Nature (1988) 332, 323-327), die bereits einer Aminosäuresubstitution unterzogen wurde. Das Ergebnis bestätigte die Gegenwart natürlicher Sequenzen, die zu den umgeformten FRs korrespondierten. So wurde demonstriert, daß keine Aminosäuresubstitution für die FRs der L-Kette benötigt wird.
Beispiel 2: Produktion eines natürlichen humanisierten anti-HM1.24-Antikörpers
(1) Expression des natürlichen humanisierten anti-RM1.24-Antikörpers
10 μg von jeweils dem Expressionsvektor (HEF-RVHS-AHM-gγ1) für die H-Kette des natürlichen humanisierten anti-HM1.24-Antikörpers und des Expressionsvektors (HEF-RVLa-AHM-gκ) für die L-Kette des umgeformten menschlichen anti-HM1.24-Antikörpers wurden in COS-Zellen durch Elektroporation unter Verwendung des Gene Pulser-Instruments (hergestellt von BioRad) co-transformiert. Jede DNA (10 μg) wurde zu 0,8 ml Aliquots von 1 × 10⁷ Zellen/ml in PBS zugefügt und wurde Pulsen bei 1500 V und einer Kapazität von 25 μF unterzogen.
Nach einer Erholungsperiode von 10 Minuten bei Raumtemperatur wurden die elektroporierten Zellen zu 30 ml DHEM Kulturflüssigkeit (hergestellt von GIBCO), enthaltend 10 % γ-Globulin-freies fötales Rinderserum zugefügt. Nach 72-stündiger Inkubation in einem CO₂-Inkubator BNA120D (hergestellt von TABAI) unter Bedingungen von 37°C und 5 % CO₂ wurde der Kulturüberstand gesammelt und der Zellabfall durch Zentrifugation bei 1000 Upm für 5 Minuten in einer Zentrifuge 505PR-22 (hergestellt von HITACHI), ausgerüstet mit einem Zentrifugenrotor 03 (hergestellt von HITACHI) entfernt. Dann wurde eine Ultrafiltration mit einem Mikrokonzentrator (Centricon 100, hergestellt von Amicon) unter Verwendung einer Zentrifuge J2-21 (hergestellt von BECKMAN), ausgerüstet mit einem Zentrifugenrotor JA-20.1 (hergestellt von BECKMAN) bei Bedingungen von 2000 Upm durchgeführt und eine Filtersterilisation wurde unter Verwendung eines Filters Milex GV13mm (hergestellt von Millipore) durchgeführt, um ein Produkt zu erhalten, das für den Zell-ELISA verwendet wurde.
(2) Messung der Antikörperkonzentration
Die Konzentration des erhaltenen Antikörpers wurde durch ELISA gemessen. Zu jeder Vertiefung einer ELISA-Platte mit 96 Vertiefungen (Maxisorp, hergestellt von NUNC) wurden 100 μl Ziegen-anti-menschlicher IgG-Antikörper (hergestellt von BIO SOURCE) hinzugefügt, hergestellt auf eine Konzentration von 1 μg/ml mit Beschichtungspuffer (0,1M NaHCO₃, 0,02 % NaN₃, pH 9,6) und die Platte wurde für eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Nach einem Blockieren mit 100 μl Verdünnungspuffer (50 mM Tris-HCl, 1 mM MgCl₂, 0,15 M NaCl, 0,05 % Tween 20, 0,02 % NaN₃, 1 % Rinderserumalbumin (ESA), pH 8,1) wurden 100 μl von jeweils seriellen Verdünnungen des natürlichen humanisierten anti-HM1.24-Antikörpers jeder Vertiefung zugefügt und die Platte wurde eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Dann wurden nach einem Waschen 100 μl alkalischer Phosphatase-markierter Ziegen-anti-menschlicher-IgG-Antikörper (hergestellt von DAKO) zugefügt.
Nach einstündiger Inkubation bei Raumtemperatur und einem Waschen wurden 100 μl einer 1 mg/ml Substratlösung (Sigma 104, p-Nitrophenylphosphat, hergestellt von SIGMA), gelöst in Substratpuffer (50 mM NaHCO₃, 10 mM MgCl₂, pH 9,8) zugefügt und dann wurde die Absorption bei 405 nm unter Verwendung des MICROPLATE READER Model 3550 (hergestellt von Bio Rad) gemessen. Als Standard für die Messung der Konzentration wurde menschliches IgG1κ (hergestellt von The Einding Site) verwendet.
(3) Etablieren der CHO-Zellinie, die stabil den natürlichen humanisierten anti-HM1.24-Antikörper erzeugt
Die CHO-Zellinie, die stabil den natürlichen humanisierten anti-HM1.24-Antikörper erzeugt, kann gemäß dem folgenden Verfahren etabliert werden.
(3)-1. Konstruktion eines Expressionsvektors für eine H-Kette eines natürlichen humanisierten anti-HM1.24-Antikörpers
Durch Verdau des Plasmids HEF-RVHs-AHM-gγ1 mit den Restriktionsenzymen PvuI und BamHI wurde ein ungefähr 2,8 kbp-Fragment, enthaltend DNA, die einen EF1-Promotor codierte und eine V-Region der H-Kette des natürlichen humanisierten anti-HM1.24-Antikörpers unter Verwendung eines 1,5%igen niedrigschmelzenden Agarosegels gereinigt. Dann wird das obige DNA-Fragment in ein ungefähr 6 kbp-Fragment inseriert, das durch Verdau mit PvuI und BamHI hergestellt wurde, dem Expressionsvektor, der für einen menschlichen H-Ketten-Expressionsvektor verwendet wird, DHFR-ΔE-RVh-PMlf (internationale Patentveröffentlichung WO 92/19759 ), enthaltend ein DHFR-Gen und ein Gen, codierend eine konstante Region einer menschlichen H-Kette, um einen Expressionsvektor DHFR-ΔE-HEF-RVHs-AHM-gγ1 für die H-Kette des natürlichen humanisierten anti-HM1.24-Antikörpers zu konstruieren.
(3)-2. Gen-Einführung in CHO-Zellen
Um ein stabiles Produktionssystem für den natürlichen humanisierten anti-HM1.24-Antikörper zu etablieren, wurden die Gene der oben erwähnten Expressionsvektoren DHFR-ΔE-RVHs-AHM-gγ1 und HEF-RVLa-AHM-gκ, die durch Verdau mit PvuI linearisiert worden waren, simultan in die CHO-Zelle DXB-11 durch das Elektroporationsverfahren unter ähnlichen Bedingungen wie den oben erwähnten (Transfektion in die oben erwähnten COS-7-Zellen eingeführt).
(3)-3. Gen-Amplifikation durch MTX
Von den CHO-Zellen, in die das Gen eingeführt wurde, können nur diejenigen CHO-Zellen, in die sowohl die L- als auch die H-Ketten-Expressionsvektoren eingeführt wurden, in einer Nukleosid-freien α-MEM-Kulturflüssigkeit (hergestellt von GIBCO-BRL), wozu 500 μg/ml G418 (hergestellt von GIBCO-BRL) und 10 % fötales Rinderserum zugefügt wurden, überleben und so wurden sie selektiert. Darauffolgend wurden 10 nM MTX (hergestellt von Sigma) der obigen Kultur zugefügt. Von den sich propagierenden Klonen wurden diejenigen, die einen natürlichen humanisierten anti-HM1.24-Antikörper in großer Menge erzeugten, selektiert.
(3)-4. Konstruktion des natürlichen humanisierten anti-HM1.24-Antikörpers
Der natürliche humanisierte anti-HM1.24-Antikörper wurde durch das folgende Verfahren konstruiert. Die obigen CHO-Zellen, die den natürlichen humanisierten anti-HM1.24-Antikörper produzieren, wurden 10 Tage unter Verwendung des Nukleosid-freien α-MEM-Kulturmediums (hergestellt von GIBCO-BRL), wozu 500 μg/ml G418 (hergestellt von GIBCO-BRL) enthaltend 10 % γ-Globulin-freies fötales Rinderserum (hergestellt von GIBCO-BRL) zugefügt worden waren unter Verwendung des CO₂-Inkubators BNAS120D (hergestellt von TABAI) unter Bedingungen von 37°C und 5 % CO₂ kultiviert. Am Tag 8 und 10 nach Beginn der Kultur wurde das Kulturmedium gewonnen, der Zellabfall wurde durch Zentrifugation für 10 Minuten bei 2000 Upm unter Verwendung der Zentrifuge RL-500SP (hergestellt von Tomy Seiko), ausgerüstet mit dem TS-9-Rotor entfernt und unter Verwendung eines Bottle-Top-Filters (hergestellt von FALCON), hergestellt mit einer Membran mit Poren mit einem Durchmesser von 0,45 μm, filtersterilisiert.
Nachdem eine gleiche Menge PBS(–) der Kulturflüssigkeit der CHO-Zellen, die den natürlichen humanisierten anti-HM1.24-Antikörper produzieren, zugefügt worden war, wurde der natürliche humanisierte anti-HM1.24-Antikörper unter Verwendung des Hochgeschwindigkeits-Antikörper-Reinigungssystems ConSep LC100 (hergestellt von MILLIPORE) und einer Hyper-D-Protein-A-Säule (hergestellt von Nippon Gaishi) unter Verwendung von PBS(–) als Absorptionspuffer und 0,1 M Natriumcitratpuffer (pH 3) als Elutionspuffer gemäß den beigefügten Instruktionen affinitätsgereinigt. Die eluierten Fraktionen wurden auf einen pH von ungefähr 7,4 durch direkte Zugabe von 1 M Tris-HCl (pH 8,0) eingestellt und dann wurde unter Verwendung des Zentrifugations-Ultrafiltrations-Konzentrators Centriprep 10 (hergestellt von MILLIPORE) eine Konzentration und Substitution zu PBS(–) durchgeführt und das Produkt wurde unter Verwendung eines Membranfilters MILLEX-GV (hergestellt von MILLIPORE) mit einer Porengröße von 0,22 μm filtersterilisiert, um den gereinigten natürlichen humanisierten anti-HM1.24-Antikörper zu erhalten. Die Antikörperkonzentration wurde durch eine Absorption bei 280 nm gemessen und mit 1 μg/ml pro 1,35 OD berechnet.
Beispiel 3. Bestimmung der Aktivität des natürlichen humanisierten anti-HM1.24-Antikörpers
Der natürliche humanisierte anti-HM1.24-Antikörper wurde auf die folgende Antigen-Bindungsaktivität, Bindungsinhibitionsaktivität und ADCC-Aktivität hin bewertet.
1. Verfahren zur Messung der Antigen-Bindungsaktivität und Bindungsinhibitionsaktivität
1-1. Messung der Antigen-Bindungsaktivität
Die Antigen-Bindungsaktivität wurde durch einen Zell-ELISA unter Verwendung von WICH-Zellen gemessen. Zell-ELISA-Platten wurden wie im obigen Beispiel 7.1-2 beschrieben hergestellt.
Nach einem Blockieren wurden 100 μl serieller Verdünnungen des natürlichen humanisierten anti-HM1.24-Antikörpers, der aus dem Konzentrat des Kulturüberstandes von COS-7-Zellen erhalten wurde, jeder Vertiefung zugefügt. Nach einer Inkubation für 2 Stunden bei Raumtemperatur und einem Waschen wurde ein Peroxidase-markierter Kaninchen-anti-menschlicher-IgG-Antikörper (hergestellt von DAKO) zugefügt. Nach 2-stündiger Inkubation bei Raumtemperatur und einem Waschen, wurde die Substratlösung zugefügt und es wurde inkubiert. Dann wurde die Reaktion durch Zugabe von 50 μl 6N Schwefelsäure beendet und die Absorption bei 490 nm wurde unter Verwendung des MICROPLATE READER Model 3550 (hergestellt von Bio-Rad) gemessen.
1-2. Messung der Bindungsinhibitionsaktivität
Die Bindungsinhibitionsaktivität durch den Biotin-markierten Maus-anti-HM1.24-Antikörper wurde durch den Zell-ELISA unter Verwendung von WISH-Zellen gemessen. Zell-ELISA-Platten wurden wie oben beschrieben hergestellt. Nach einem Blockieren wurden 50 μl serieller Verdünnungen des natürlichen humanisierten anti-HM1.24-Antikörpers, der aus dem Konzentrat des Kulturüberstands von COS-7-Zellen erhalten worden war, jeder Vertiefung zugefügt und 50 μl 2 μg/ml Biotin-markierter Maus-anti-HM1.24-Antikörper wurde simultan zugefügt. Nach einer Inkubation bei Raumtemperatur für 2 Stunden und einem Waschen wurde Peroxidase-markiertes Streptavidin (hergestellt von DAKO) zugefügt. Nach einstündiger Inkubation bei Raumtemperatur und dann einem Waschen, wurde die Reaktion durch Zugabe von 50 μl 6N Schwefelsäure beendet und die Absorption bei 490 nm wurde unter Verwendung des MICROPLATE READER Model 3550 (hergestellt von Bio-Rad) gemessen.
(2) Antigen-Bindungsaktivität und Bindungsinhibitionsaktivität
Die Bewertung der H-Kette des natürlichen humanisierten anti-HM1.24-Antikörpers wurde durch Messung der oben erwähnten Antigen-Bindungsaktivität und Bindungsinhibitionsaktivität in Kombination mit der L-Kettenversion a durchgeführt. Das in den 29 und 30 dargestellte Ergebnis zeigt an, daß der natürliche humanisierte anti-HM1.24-Antikörper (der sekundäre Design-Antikörper) eine Antigen-Bindungsaktivität und Bindungsinhibitionsaktivität eines ähnlichen Grades wie der primäre Design-Antikörper aufwies (umgeformter menschlicher anti-HM1.24-Antikörper: H-Kettenversion r).
(3) Messung der ADCC-Aktivität
Die ADCC-(Antikörper-abhängige celluläre Cytotoxizität)-Aktivität wurde gemäß den in Referenzbeispiel 8 beschriebenen Verfahren gemessen.
1. Präparation von Effektorzellen
Zu dem peripheren Blut eines gesunden menschlichen Subjekts wurde eine gleiche Menge PBS(–) zugefügt, worauf Ficoll-Paque (hergestellt von Pharmacia) beschichtet wurde und dies wurde bei 500 g 30 Minuten zentrifugiert. Die Monozytenschicht wurde entnommen und zweimal mit RPMI 1640 (hergestellt von GIBCO BRL), supplementiert mit 10 fötalem Rinderserum (hergestellt von GIBCO BRL) gewaschen und auf eine Zelldichte von 5 × 10⁶/ml mit derselben Kulturflüssigkeit eingestellt.
2. Präparation von Zielzellen
Die menschliche Myelomzelllinie KPMM2 (Hinterlegungs-Nr. P-14170, Patentanmeldung Nr. 6-58082) wurde durch Inkubation in RPMI 1640 (hergestellt von GIBCO BRL), supplementiert mit 10 % fötalem Rinderserum (hergestellt von GIBCO BRL) zusammen mit 0,1 mCi ⁵¹Cr-Natriumchromat bei 37°C für 60 Minuten radioaktiv markiert. Nach der radioaktiven Markierung wurden die Zellen dreimal mit demselben Puffer gewaschen und auf eine Konzentration von 2 × 10 ⁵/ml eingestellt.
3. Messung des ADCC-Assays
In eine Platte mit 96 Vertiefungen und einem U-Boden (hergestellt von Corning) wurden 50 μl 2 × 10⁵ Zielzellen/ml, 50 μl der vorher hergestellten Antikörperlösung, mit 4 μg/ml, 0,4 μg/ml, 0,04 μg/ml und 0,004 μg/ml hinzugegeben und dieses wurde 15 Minuten bei 4°C umgesetzt. Eine Lösung, die keinen natürlichen humanisierten anti-HM1.24-Antikörper (den sekundären Design-Antikörper) enthielt, wurde auf ähnliche Weise hergestellt und als Kontrolle verwendet.
Dann wurden 100 μl 5 × 10⁵ Effektorzellen/ml hinzugefügt und in einem CO₂-Inkubator für 4 Stunden kultiviert, wobei das Verhältnis (E:T) der Effektorzellen (E) zu den Zielzellen (T) auf 0:1, 20:1 und 50:1 eingestellt wurde. Da die Endkonzentration von jedem Antikörper 4-fach verdünnt war, gab es 1 μg/ml, 0,1 μg/ml, 0,01 μg/ml und 0,001 μg/ml wie auch keine Antikörperadditionskontrolle.
100 μl des Überstands wurden genommen und die in den Kulturüberstand freigesetzte Radioaktivität durch einen gamma-Counter (ARC361, hergestellt von Aloka) gemessen. Zur Messung der maximalen Radioaktivität wurde 1 % NP-40 (hergestellt von Nacalai Tesque Inc.) verwendet. Die Cytotoxizität (%) wurde durch (A-C)/(B-C) × 100 berechnet, wobei A die Radioaktivität (cpm) ist, die in Gegenwart des Antikörpers freigesetzt wird, B ist die Radioaktivität (cpm), die durch NP-40 freigesetzt wird und C ist die Radioaktivität (cpm) die durch das Kulturmedium allein ohne Antikörper freigesetzt wird.
4. Ergebnis
Wie in 33 dargestellt, erhöhte sich die spezifische Chromfreisetzungsrate, wenn der natürliche humanisierte anti-HM1.24-Antikörper (der sekundäre Design-Antikörper) zugefügt wurde mit einem Anstieg im E:T-Verhältnis abhängig von der Antikörperkonzentration im Vergleich zu der Kontrolle ohne zugefügten Antikörper. Dies zeigte daher an, daß dieser natürliche humanisierte anti-HM1.24-Antikörper (der sekundäre Design-Antikörper) eine ADCC-Aktivität hatte.
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines natürlichen humanisierten Antikörpers und den natürlichen humanisierten Antikörper, der durch das Herstellungsverfahren erhalten wird. Es handelt sich um eine ausgezeichnete Humanisierungstechnologie, die die mit dem CDR-Grafting assoziierten Probleme gelöst hat (Jones, P.T. et al., Nature (1986) 321, 522-525), erzeugt von G. Winter. Die Konstruktion des primären Design-Antikörpers kann als Zwischenstufe für die Konstruktion des humanisierten Antikörpers, umfassend natürliche menschliche FRs, betrachtet werden. Wenn ein Antikörper als pharmazeutisches Produkt entwickelt wird, umfassend ein rekombinantes Protein, ist der natürliche humanisierte Antikörper, der natürlich auftretende menschliche FRs umfaßt, im Hinblick auf Antigenizität und Sicherheit deutlich besser.
Wirkungen der Erfindung
Da der natürliche humanisierte Antikörper, der durch das Herstellungsverfahren der vorliegenden Erfindung erhalten wird, nicht die Aminosäurereste von nicht-natürlich auftretenden künstlichen FRs enthält, die in dem humanisierten Antikörper enthalten sind, der durch die konventionelle Humanisierungstechnologie erzeugt wird, wird es erwartet, daß er eine niedrige Antigenizität aufweist. Weiterhin wurde gezeigt, daß der durch das Herstellungsverfahren der vorliegenden Erfindung erhaltene natürliche humanisierte Antikörper eine ähnliche Aktivität aufweist wie der von einem nicht-menschlichen Säuger abstammende Antikörper, der als Matrize für die Humanisierung verwendet wurde. Daher ist der durch das Herstellungsverfahren der vorliegenden Erfindung erhaltene natürliche humanisierte Antikörper für die therapeutische Verabreichung an Menschen nützlich.
Referenz für die Mikroorganismen, hinterlegt gemäß dem Budapester Patentzusammenarbeitsvertrag, Regel 13-2 und Namen des Hinterlegungsinstituts.
Hinterlegungsinstitut

Name: National Institute of Bioscience and Human Technology, Agency of Industrial Science and Technology
Adresse: 1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki, Japan

Organismus (1)

Angabe: Escherichia coli DH5α (pRS38-pUC19)
Hinterlegungsnummer: FERN BP-4434
Hinterlegungsdatum: 5. Oktober 1993

Organismus (2)

Angabe: Hybridom HM1.24
Hinterlegungsnummer: FERN BP-5233
Hinterlegungsdatum: 14. September 1995

Organismus (3)

Angabe: Escherichia coli DH5α (pUC19-RVHr-AHM-gγ1)
Hinterlegungsnummer: FERN BP-5643
Hinterlegungsdatum: 29. August 1996

Organismus (4)

Angabe: Escherichia coli DH5α (pUC19-1.24H-gγ1)
Hinterlegungsnummer: FERN BP-5644
Hinterlegungsdatum: 29. August 1996

Organismus (5)

Angabe: Escherichia coli DH5α (pUC19-RVLa-AHM-gκ)
Hinterlegungsnummer: FERN BP-5645
Hinterlegungsdatum: 29. August 1996

Organismus (6)

Angabe: Escherichia coli DH5α (pUC19-RVHs-AHN-gγ1)
Hinterlegungsnummer: FERN BP-6127
Hinterlegungsdatum: 29. September 1997

SEQUENZPROTOKOLL
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Verfahren zur Herstellung eines natürlichen humanisierten Antikörpers, wobei eine Frameworkregion (FR) in dem humanisierten Antikörper eine FR ist, die natürlich in menschlichen Antikörpern auftritt, umfassend die folgenden Schritte: (i) Erhalten eines primären Design-Antikörpers, der durch ein Pfropfen von komplementaritätsbestimmenden Regionen (CDR) humanisiert ist und der in ein oder mehr Aminosäureresten der FRs zur Bildung einer Aminosäuresequenz substituiert ist, die in der Natur nicht auftritt; (ii) Durchführen einer Homologiesuche unter Verwendung einer Datenbank von Aminosäuresequenzen von FRs, die natürlich in menschlichen Antikörpern (natürliche FRS) auftreten, im Vergleich mit einer FR-Sequenz des primären Design-Antikörpers; (iii) Herstellen einer Liste der Aminosäuresequenz der natürlichen FRs mit einer hohen Homologie mit der FR-Sequenz des primären Design-Antikörpers; (iv) Selektieren einer natürlichen FR aus der Liste von Schritt (iii), die eine Sequenz enthält, die den Aminosäuresequenzen entspricht, die in Schritt (i) substituiert werden, und eine Aminosäuresequenz umfaßt, die dieselbe ist wie die FR-Sequenz des primären Design-Antikörpers oder eine hohe Homologie dazu aufweist; (v) wenn die FR-Sequenz des primären Design-Antikörpers ein oder mehrere Aminosäuren aufweist, die sich von den Aminosäuren der in Schritt (iv) gewählten natürlichen FR unterscheiden, Ersetzen der unterschiedlichen Aminosäuren in der FR-Sequenz des primären Design-Antikörpers mit den korrespondierenden Aminosäuren in der natürlichen FR; (vi) Konstruktion eines Expressionsvektors, der eine Aminosäuresequenz des über die Schritte (i) bis (v) erhaltenen Antikörpers exprimiert; (vii) Kultivieren von Zellen, umfassend einen Expressionsvektor, konstruiert in Schritt (vi) und (viii) Gewinnen des humanisierten Antikörpers, umfassend die natürliche FR aus der Kultur.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei der primäre Design-Antikörper CDRs eines Antikörpers eines nicht-menschlichen Säugers umfaßt und FRs eines Antikörpers eines Menschen umfaßt und mit einer künstlichen Aminosäuresequenz, die in der Natur nicht auftritt.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die Aminosäurereste solche sind, die in den FRs von nicht-menschlichen Säuger-Antikörpern auftreten.
Natürlicher humanisierter Antikörper, wobei eine Frameworkregion (FR) in dem humanisierten Antikörper eine FR ist, die natürlicherweise in menschlichen Antikörpern auftritt, enthaltend CDRs, abstammend von einem nicht-menschlichen Säuger, und FRs, abstammend von einem Menschen, dadurch gekennzeichnet, daß die FR eine Aminosäuresequenz umfaßt, die (einen) Aminosäurerest(e) umfaßt, die sich von denjenigen der FR eines primären Design-Antikörpers durch eine oder eine Vielzahl von Aminosäureresten unterscheiden, und daß die FR des primären Design-Antikörpers durch eine FR ersetzt wurde, abstammend von einem Menschen und mit denselben Aminosäureresten wie die unterschiedlichen Aminosäurereste an denselben Positionen.
Natürlicher humanisierter Antikörper gemäß Anspruch 4, wobei der nicht-menschliche Säuger eine Maus ist.
DNA, codierend den natürlichen humanisierten Antikörper gemäß Anspruch 4 oder 5.
Expressionsvektor, umfassend die DNA gemäß Anspruch 6.
Nicht-menschliche Wirtszelle, umfassend die DNA gemäß Anspruch 7.
Verfahren zur Herstellung eines natürlichen humanisierten Antikörpers, das die Kultivierung der Zellen umfaßt, worin ein Expressionsvektor umfassend die DNA gemäß Anspruch 6 eingeführt wurde, und Gewinnen des gewünschten natürlichen humanisierten Antikörpers aus der Kultur der Zellen.
Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend einen natürlichen humanisierten Antikörper, wobei eine Frameworkregion (FR) in dem humanisierten Antikörper eine FR ist, die natürlich in menschlichen Antikörpern auftritt.