DE69433563T2

DE69433563T2 - Gegen das ca55.1 antigen gerichtete bindende strukturen

Info

Publication number: DE69433563T2
Application number: DE69433563T
Authority: DE
Inventors: Michael Samuel Macclesfield ROSE; Christopher Macclesfield BOOT; Clive Graham Macclesfield COPLEY; Douglas Stephen Macclesfield PATERSON; Susan Margaret Macclesfield HALL; Andrew Firmin Macclesfield WRIGHT; David Charles Macclesfield BLAKEY
Original assignee: AstraZeneca AB
Current assignee: AstraZeneca AB
Priority date: 1993-12-03
Filing date: 1994-11-29
Publication date: 2004-12-23
Anticipated expiration: 2014-11-30
Also published as: ES2214494T3; DK0731838T3; US5665357A; AU1113095A; JPH09506507A; EP0731838A1; CA2174972A1; WO1995015382A1; ATE259877T1; DE69433563D1; JP3962087B2; EP0731838B1; PT731838E; AU684863B2; NZ276745A; GB9424108D0; IL111748A0

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues, für die Diagnose und Therapie von Krebs geeignetes tumorassoziiertes Antigen (CA55.1).
Es ist bekannt, daß die Transformation von normalen Gewebezellen zu Tumorzellen mit einer Veränderung der Kohlenhydratstruktur auf der Zelloberfläche einhergeht. Viele dieser Zelloberflächen-Kohlenhydratstrukturen dienen als Antigene, und die durch den Tumor modifizierten Strukturen stellen eine Art eines sogenannten tumorassoziierten Antigens (siehe Altered Glycosylation in Tumour Cells, Hrsg. Reading, Hakamori und Marcus 1988 Arthur R. Liss Verlag) dar. Solche Antigene lassen sich beispielsweise zur Herstellung von monospezifischen Antikörpern mittels Hybridomtechnologie verwenden. Die Anwendung der Hybridomtechnologie zur Isolierung und Produktion von monoklonalen Antikörpern ist mittlerweile gut bekannt und wurde zuerst von Kohler und Milstein (Nature, 256, 495–497, 1975) beschrieben.
Tumorassoziierte Antigene wurden in Zusammenhang mit humanen Tumorerkrankungen beschrieben, so wurden beispielsweise CEA (carcinoma embryonic antigen, Gold und Freedman, J Exp Med, 121, 439, 1965), GICA (gastrointestinal cancer antigen), das das CA19.9-Epitop enthält, und das C242.2-Epitop auf CA50 (Larson et al., Int J Cancer, 42, 877–882, 1988) nachgewiesen, insbesondere in gastrointestinalen Karzinomen. Alle diese Anitgene liegen auf der Tumorzellenoberfläche vor und lassen sich auch im Blutserum nachweisen.
Das Konzept der Verwendung solcher Antikörper zum Targeting von tumorassoziierten Antigenen bei der Behandlung von Krebs gibt es schon seit über 10 Jahren (Herlyn et. al. (1980) Cancer Research 40, 717). Antikörper lassen sich zum zielgerichteten Transport verschiedener chemischer und biologischer Mittel zum Tumor verwenden, und solche Konjugate sind mit besonders gutem Erfolg als Grundlage für viele Verfahren von sowohl der in-vitro- als auch der in-vivo-Diagnose eingesetzt worden. Die Verwendung von Immunokonjugaten in der Krebstherapie ist ebenfalls vielversprechend (Lord et al. (1985) Trends in Biotechnology 3, 175; Vitetta et al (1987) Science 238, 1098). Dieser Ansatz ist technisch anspruchsvoller als diagnostische Anwendungen und hat als Voraussetzung, daß die tumorassoziierten Antigene, auf die diese immunotherapeutischen Ansätze abzielen, überaus tumorspezifisch sind und in vitalen humanen Geweben nicht in nennenswertem Ausmaße exprimiert werden. Neben der Eigenschaft einer spezifisch tumorassoziierten Gewebeverteilung ist auch das metabolische Schicksal des Antigens in der Tumorzelle selbst eine wichtige Eigenschaft. Es wurde gefunden, daß die Wirksamkeit verschiedener Konjugate von monoklonalen Antikörpern und ihren Derivaten von der Internalisierungsrate des tumorassoziierten Antigens von der Membranoberfläche der Zelle abhängt. Insbesondere bei bestimmten Konjugaten, nämlich bei Immunotoxinen, ist es für die pharmazeutische Wirksamkeit erforderlich, daß das Antigenmolekül schnell und kontinuierlich von der Oberfläche der Tumorzelle internalisiert wird. Bei Anwendungen im Zusammenhang mit Immunotoxin- oder Arzneimittelkonjugaten ist ein hohes Ausmaß an Internalisierung bzw. Endozytose wünschenswert, bei anderen Anwendungen wie einer antikörpergerichteten Enzym-Prodrug-Therapie oder Strahlentherapie ist dies jedoch keine wesentliche Eigenschaft.
Man geht davon aus, daß, damit sich ein tumorspezifisches Antigen für die Behandlung von Krebs eignet, es im allgemeinen die folgenden Bedingungen erfüllen muß: 1) es muß in beträchtlichem Ausmaß auf der Oberfläche der meisten Tumorzellen exprimiert werden (im allgemeinen > 10 000 Moleküle pro Zelle) und; 2) es darf in vitalen normalen Geweben nur in geringen Konzentrationen exprimiert werden bzw. nicht nachweisbar sein.
Es besteht ein Bedarf an weiteren und verbesserten, für die Krebsdiagnose und -therapie geeigneten tumorspezifischen Antigenen.
Die vorliegende Erfindung beruht auf der Entdeckung des als CA55.1 bezeichneten tumorassoziierten Antigens (wie hier definiert). Das Antigen weist mehrere Eigenschaften auf, aufgrund deren es ein bekannten tumorspezifischen Antigenen überlegenes Target für die Immunotherapie oder Diagnose bestimmter Krebsarten ist. Es wird von den meisten kolorektalen Tumoren exprimiert und in normalem Kolongewebe, wenn überhaupt, nur in geringem Ausmaß exprimiert. Weiterhin wird der nach der Bindung des Antikörpers an das zellgebundene CA55.1 gebildete Komplex mit großer Geschwindigkeit in die Tumorzellen internalisiert bzw. von den Tumorzellen durch Endozytose aufgenommen.
Gemäß einem Aspekt der vorliegenden Erfindung wird eine Antigenbindungsstruktur mit „complementary determining regions" (CDRs), die das Antigen CA55.1 erkennen, bereitgestellt, wobei das Antigen folgendes aufweist:

a) drei dominante Spezies mit Molekulargewichten nach SDS-PAGE in Bereichen von etwa 48 bis 52 kD, etwa 58 kD bis 72 kD und etwa 88 kD bis 92 kD;
b) eine subzelluläre Stelle in der Membranfraktion von COLO-205-Tumorzellen (ATCC Nr. CCL 22) und
c) eine komplexe, N-gebundene Kohlenhydratstruktur; und wobei die Antigenbindungsstruktur wenigstens eine der folgenden Eigenschaften aufweist:
i) die Antigenbindungsstruktur inhibiert kompetitiv die Bindung des monoklonalen Antikörpers 55.1 (ECACC Nr. 93081901) an das CA55.1-Antigen oder
ii) das Peptid ACEHRGSGWC (SEQ ID NR: 26), wie es auf der Oberfläche des Bakteriophagen NCIMB Nr. 40638 vorkommt, bindet sich beim Inkubieren mit festphasengekoppelter Antigenbindungsstruktur mit einer effektiven Bindung von 10 pM oder weniger an die Antigenbindungsstruktur oder
iii) das Peptid ACEHRGSGWC (SEQ ID NR: 26), wie es auf der Oberfläche des Bakteriophagen NCIMB Nr. 40638 vorkommt, inhibiert beim Präinkubieren mit der Antigenbindungsstruktur die Bindung der Antigenbindungsstruktur an festphasengekoppelte Colo 205-Zellen (ATCC Nr. CCL 222) kompetitiv bei einer effektiven Konzentration von 200 nM oder weniger.

Lektinbindungsuntersuchungen am aufgereinigten CA55.1-Antigen zeigen, daß es sich bei dem CA55.1-Kohlenhydrat um ein über Stickstoff gebundenes komplexes Oligosaccharid ohne α(2–6) oder α(2–3) an Galactose gebundenene Sialylsäurereste handelt. Ein Test zur Erkennung von CA55.1 (durch kompetitive Hemmung der Bindung des Antikörpers 55.1) ist unten in Beispiel 7 ausgeführt. Tests zur Messung der Bindung in Gegenwart des ACEHRGSGWC-Phagen (SEQ ID NR 26) sind in Beispiel 14 ausgeführt. Ein subzelluläres Vorhandensein in der Membranfraktion bedeutet, daß das Antigen in einer aus ganzen Zellen durch ein Verfahren wie dem in Beispiel 7.1a beschriebenen produzierten Membranfraktion vorhanden ist.
Bei der Suche nach neuen Antagonisten der Bindung von MAK (monoklonaler Antikörper) 55.1 an sein Antigen wurden Bibliotheken des Bakteriophagen M13 mit statistischen Peptidsequenzen am N-Terminus des Minor Coat Protein pIII des Phagen erzeugt und gegen an Polystyrol immobilisierten MAK 55.1 gescreent. Als Ergebnis eines solchen Screenings wurde ein am N-Terminus von pIII die Sequenz ACEHRGSGWC (Ein-Buchstaben-Aminosäurekode; (SEQ ID NR 26)) aufweisender Phage gefunden, der die Bindung von MAK 55.1 an sein Antigen auf Colo-205-Zellen hemmt.
In der Literatur gibt es bereits Beispiele für aus Bibliotheken von von Phagen hergestellten Peptiden ausgewählten Peptidmimetika, die gegen kohlenhydratbindende Proteine gescreent wurden, einschließlich Peptidliganden für das mannosebindende Protein Concanavalin A (Con A) (Scott et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Band 89, S. 5398–5402, 1992; auch Oldenburg et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Band 89, S. 5393–5397, 1992), und einem Antikohlenhydrat-MAK (Hoess et al., Gene, Band 128, S. 43–49, 1993). Die unabhängigen Resultate der beiden Gruppen, die Con A untersucht haben, zeigen bei den ausgewählten Peptidsequenzen einschließlich des wiederkehrenden Motivs YPY eine große Übereinstimmung; Screening gegen den MAK führte zu einer Selektion des wiederkehrenden Motivs PWLY. Es wurde darüber spekuliert, ob die von beiden kohlenhydratbindenden Proteinen ausgewählten aromatischen Seitenketten sich in ähnlicher stereochemischer Konfiguration wie Zuckerringe aneinanderlagern. Im Gegensatz dazu fehlen der vom MAK 55.1 ausgewählten Struktur die hydrophoben und konformationellen Eigenschaften der oben beschriebenen Liganden, die Struktur wurde aus einer Bibliothek von nominell cyclischen Peptiden ausgewählt, und bei einem Screening von MAK 55.1 gegen beim Anmelder erstellte Bibliotheken geradkettiger Peptide wurde keine Selektion beobachtet (die anderen Gruppen hatten bindende Substanzen aus Bibliotheken geradkettiger Peptide ausgewählt). Eine Suche nach der Sequenz ACEHRGSGWC in Datein von Proteinsequenzen zeigte keine Homologie mit irgendwelchen bekannten Peptiden, die Sequenz, an die sich MAK 55.1 bindet, ist also neu.
Bei einer antigenbindenden Struktur handelt es sich im allgemeinen um einen Antikörper (oder ein Fragment davon oder ein modifiziertes Antikörperkonstrukt wie scFv), und diese Struktur ist als eine Proteinsequenz definiert, die das CA55.1-Antigen erkennt und sich daran bindet. Die Bindungsaffinität für das CA55.1-Antigen beträgt vorzugsweise wenigstens 10^–5 M, noch bevorzugter beträgt die Bindungsaffinität für das CA55.1-Antigen wenigstens 10^–6 M, noch bevorzugter beträgt die Bindungsaffinität für das CA55.1-Antigen wenigstens 10^–7 M, noch bevorzugter beträgt die Bindungsaffinität für das CA55.1-Antigen wenigstens 10^–8 M, noch bevorzugter beträgt die Bindungsaffinität für das CA55.1-Antigen wenigstens 10^–9 M, noch bevorzugter beträgt die Bindungsaffinität für das CA55.1-Antigen wenigstens 10^–10 M und insbesondere beträgt die Bindungsaffinität für das CA55.1-Antigen wenigstens 10^–11 M. Die Proteinsequenz der antigenbindenden Struktur leitet sich normalerweise von einem Immunoglobulin oder einer Immunoglobulindomäne der Immunoglobulin-Superfamilie ab, wobei es sich dabei entweder um das vollständige natürliche Molekül, ein Fragment davon oder eine Spezies, die so entwickelt wurde, daß nur die Strukturmerkmale der Immunoglobulinfalten, die eine produktive Bindung an das Antigen ermöglichen, konserviert wurden, handeln kann. Vorzugsweise liegen der antigenbindenden Struktur die CDRs von Antikörper 55.1 zugrunde. Bei den CDRs bzw. Complementarity Determining Regions handelt es sich um die Sequenzen innerhalb der hypervariablen Schleifen der variablen Antikörperdomänen, von denen man annimmt, daß sie entscheidend bei der Bestimmung der Spezifität der Antigen-Antikörper-Wechselwirkung sind (Kabat et al (1987) in Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Depy Health und Human Services, Washington D. C.); CDRs sind hier jedoch so definiert, daß sie Rahmenreste mit einschließen, wenn diese zur Bindung beitragen. Beim Antikörper 55.1 wurden die CDRs durch Homologie mit den hypervariablen Sequenzen anderer muriner Antikörper bestimmt.
Bei den CDRs der schweren Ketten handelt es sich um:

1 Pos 31–35 inkl. = G Y W I H (SEQ ID NR: 27)
2 Pos 50–66 inkl. = E V N P S T G R S D Y N E K F K N (SEQ ID NR: 28)
3 Pos 99–110 inkl. = E R A Y G Y D D A M D Y (SEQ ID NR: 29)

Bei den CDRs der leichten Ketten handelt es sich um:

1 Pos 24–40 inkl. = K S S Q S L L N S R T R K N Y L A (SEQ ID NR: 30)
2 Pos 56–62 inkl. = W A S T R T S (SEQ ID NR: 31)
3 Pos 95–102 inkl. = K Q S Y T L R T (SEQ ID NR: 32)

Gemäß einem Aspekt der vorliegenden Erfindung wird eine antigenbindende Struktur mit Complementary Determining Regions (CDRs), die das Antigen CA55.1 erkennen, wobei die CDRs die folgenden Sequenzen haben:

a) schwere Kette CDR1 G Y W I H (SEQ ID NR: 27) CDR2 E V N P S T G R S D Y N E K F K N (SEQ ID NR: 28) CDR3 E R A Y G Y D D A M D Y (SEQ ID NR: 29);
b) leichte Kette CDR1 K S S Q S L L N S R T R K N Y L A (SEQ ID NR: 30) CDR2 W A S T R T S (SEQ ID NR: 31) CDR3 K Q S Y T L R T (SEQ ID NR: 32); oder ein konservatives Analogon davon, bereitgestellt.

Gemäß einem Aspekt der vorliegenden Erfindung wird eine antigenbindende Struktur mit der folgenden, gegebenenfalls humanisierten, Struktur:
einer Schwere-Kette-Sequenz (SEQ ID NR: 33)
und
einer Leichte-Kette-Sequenz (SEQ ID NR: 34):
oder eines der folgenden Konstrukte davon:
F(ab')2; F(ab'), Fab, Fv, Einzelkette Fv & V-min oder ein konservatives Analogon davon, bereitgestellt.
Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird eine für die variable Region der leichten Kette oder der schweren Kette eines Antikörpers kodierende Polynukleotidsequenz bereitgestellt, die unter strikten Bedingungen mit einer für CDR3 der schweren oder leichten Kette des Antikörpers 55.1 (ECACC-Deposit-Nr. 93081901) kodierenden Polynukleotidsequenz hybridisiert.
Vorzugsweise kodiert das Polynukleotid für zwei (insbesondere drei) CDRs der schweren oder leichten Kette von Antikörper 55.1. Ein Hybridisierungstest ist unten in Beispiel 10 beschrieben.
Gemäß einem Aspekt der vorliegenden Erfindung wird eine Polynukleotidsequenz bereitgestellt, die für wenigstens die variable Region der schweren Kette oder einer leichten Kette einer wie oben definierten antigenbindenden Struktur kodiert.
Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird eine antigenbindende Struktur mit einer durch eine wie oben definierten Polynukleotidsequenz kodierten Sequenz bereitgestellt.
Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird eine antigenbindende Struktur mit wenigstens einer CDR3 von Antikörper 55.1 (ECACC-Deposit-Nr. 93081901) oder einem konservativen Analogon davon bereitgestellt. Vorzugsweise hat die antigenbindende Struktur wenigstens 3 CDRs (noch bevorzugter 4 CDRs, noch bevorzugter 5 CDRs und insbesondere 6 CDRs) von Antikörper 55.1 oder einem konservativen Analogon davon.
Bei einem konservativen Analogon handelt es sich um eine Proteinsequenz, bei der die Bindungseigenschaften der antigenbindenden Struktur unverändert sind, die sich jedoch in ihrer Sequenz durch eine oder mehrere konservative Aminosäuresubstitutionen unterscheidet. Für die Zwecke dieses Dokuments ist eine konservative Aminosäuresubstitution eine Substitution, bei der die Wahrscheinlichkeit, daß sie in der Natur vorkommt, mehr als zehnmal größer ist als die Wahrscheinlichkeit, daß die Substitution zufällig auftritt (wie durch die von Dayhoff et al., Atlas of Protein Sequence and Structure, 1971, Seite 95–96 und 9–10, beschriebenen Berechnungsverfahren definiert).
Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Antikörper mit einer wie oben beschriebenen antigenbindenden Struktur bereitgestellt.
Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein wie oben beschriebener Antikörper bzw. ein wie oben beschriebenes Antikörperfragment bereitgestellt, der/das dadurch gekennzeichnet ist, daß er/es humanisiert ist.
Bei einem humanisierten Antikörper, einem humanisierten verwandten Fragment bzw. einer humanisierten antikörperbindenden Struktur handelt es sich um ein Polypeptid, das größtenteils aus einem Strukturgerüst von vom Menschen stammenden Immunoglobulinsequenzen besteht, die in und um die antigenbindende Stelle (Complementarity Determining Regions bzw. CDRs) nicht vom Menschen stammende Aminosäuresequenzen aufweisen. Die entsprechenden Techniken sind beispielsweise in WO 91/09967, EP 0328404 und Queen et al. Proc Natl Acad Sci 86,10029, Mountain und Adair (1989) Biotechnology and Genetic Engineering Reviews 10, 1 (1992) ausführlich beschrieben, wenngleich auch alternative Humanisierungsmethoden in Betracht gezogen werden, wie z. B das „Antikörperfurnieren" („antibody veneering") von an der Oberfläche befindlichen Resten ( EP 519596 , Merck/NIH, Padlan et al). Die Herstellung von chimären humanisierten Antikörperfragmenten von Antikörper 55.1 ist hier in Beispiel 3 beschrieben.
Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird eine Wirtszelle, transformiert mit einer Polynukleotidsequenz, oder ein aus der Wirtszelle entwickeltes transgenes, nichthumanes Tier oder eine aus der Wirtszelle entwickelte transgene Pflanze bereitgestellt, wobei die Polynukleotidsequenz für wenigstens die variable Region der schweren Kette oder der leichten Kette einer wie oben definierten antigenbindenden Struktur kodiert.
Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird Hybridom 55.1, hinterlegt als ECACC-Deposit Nr. 93081901, bereitgestellt.
Hybridom 55.1 wurde gemäß dem Budapester Vertrag am 19. August 1993 bei der European Collection of Animal Cell Cultures (ECACC), PHLS Centre for Applied Microbiology & Research, Porton Down, Salisbury, Wiltshire SP4 0JG, Großbritannien, unter der Deposit-Referenznr. 93081901 hinterlegt.
Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung werden der unter der NCIMB-Nr. 40638 hinterlegte ACEHRGSGWC-Phage bereitgestellt.
Der ACEHRGSGWC-Phage wurde gemäß dem Budapester Vertrag am 10. Mai 1994 bei The National Collections of Industrial and Marine Bacteria, 23 St Machar Drive, Aberdeen AB2 1RY, Schottland, Großbritannien, unter der Deposit-Referenznummer NCIMB 40638 hinterlegt.
Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung wenigstens einer variablen Region einer schweren oder leichten Kette einer wie oben definierten Antigenbindungsstruktur bereitgestellt, bei dem man:

a) eine Wirtszelle mit einer Polynukleotidsequenz, die für wenigstens die variable Region der schweren oder leichten Kette der Antigenbindungsstruktur kodiert, transformiert, und gegebenenfalls die transformierte Wirtszelle zu einer transgenen Pflanze entwickelt;
b) die Wirtszelle bzw. die transgene Pflanze Bedingungen aussetzt, bei denen die Expression und gegebenenfalls Sezernierung wenigstens der variablen Region gefördert wird, und gegebenenfalls
c) die variable Region wenigstens teilweise reinigt.

Vorzugsweise werden sowohl die variablen Regionen der schweren und der leichten Kette in der selben Zelle exprimiert und dadurch unter Bildung einer antigenbindenden Struktur zusammengefügt.
Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung des monoklonalen Antikörpers 55.1 bereitgestellt, bei dem man:

a) das als ECACC-Deposit Nr. 93081901 hinterlegte Hybridom 55.1 in einem Medium unter Bedingungen kultiviert, bei denen die Expression des Antikörpers daraus gefördert wird, und
b) den Antikörper 55.1 aus dem Kulturmedium gewinnt und gegebenenfalls
c) ein F(ab')2-Fragment des Antikörpers 55.1 durch enzymatische Verdauung herstellt.

Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Konjugat bereitgestellt, das eine Effektoreinheit (vorzugsweise ein Toxin, jedoch auch ein Enzym oder einen radioaktiven Liganden) und eine wie oben beschriebene antigenbindende Struktur bzw. einen wie oben beschriebenen Antikörper enthält.
Es versteht sich, daß das Konjugat der vorliegenden Erfindung nicht zwingenderweise aus einem Effektormolekül und einem Antikörpermolekül besteht. So kann das Konjugat beispielsweise mehr als ein Effektormolekül pro Antikörpermolekül enthalten.
Handelt es sich bei dem Effektormolekül um ein Toxin, so umfaßt diese Toxineinheit im allgemeinen eine Komponente, die zytotoxische Eigenschaften aufweist und daher dazu in der Lage ist, Zellen nach der Internalisierung zu töten.
Toxineinheit und antigenbindende Struktur können direkt aneinander gekuppelt sein oder indirekt gekuppelt sein. Toxineinheit und antigenbindende Struktur sind im allgemeinen so gekuppelt, daß die Geometrie des Konjugats es der antigenbindenden Struktur erlaubt, sich an ihre Zielzelle zu binden. Toxineinheit und antigenbindende Struktur sind vorzugsweise so gekuppelt, daß das Konjugat außerhalb der Zelle stabil und innerhalb der Zelle unstabil ist, so daß Toxineinheit und antigenbindende Struktur außerhalb der Zielzelle aneinander gekuppelt bleiben, jedoch nach der Internalisierung die Toxineinheit freigesetzt wird. Das Konjugat weist somit vorzugsweise eine intrazellulär spaltbare/extrazellulär stabile Stelle auf.
Zu den Konjugaten, in denen die Toxineinheit direkt an die sich an die Zielzelle bindende Einheit gekuppelt ist, zählen beispielsweise die, in denen die Toxineinheit und die antigenbindende Struktur über eine zwischen einer Thiolgruppe an der Toxineinheit und einer Thiolgruppe an der antigenbindenden Struktur gebildete Disulfidbrücke gekuppelt sind. Ausführliche Angaben zur Herstellung und den Eigenschaften von Immunotoxinen und anderen Konjugaten finden sich in der europäischen Patentanmeldung EP 528 527 (Publikationsnr.), die hiermit durch Verweis Bestandteil der vorliegenden Anmeldung wird.
Gemäß einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung wird eine ein wie oben beschriebenes Immunotoxin enthaltende pharmazeutische Zusammensetzung bereitgestellt.
Es versteht sich, daß Dosis und Dosierungsprotokoll von der jeweiligen verwendeten Toxineinheit, der Zielzellenpopulation und der Anamnese des Patienten abhängen. Die Dosis an verabreichtem Konjugat liegt typischerweise im Bereich von 0,1 bis 1 mg/kg Gewicht des Patienten.
Die Konjugate der vorliegenden Erfindung werden normalerweise in Form einer pharmazeutischen Zusammensetzung verabreicht. Gemäß der vorliegenden Erfindung wird somit auch eine pharmazeutische Zusammensetzung bereitgestellt, die ein (wie hier definiertes) Konjugat zusammen mit einem pharmazeutisch unbedenklichen Verdünnungsmittel bzw. Träger enthält. Ein Beispiel einer solchen Formulierung ist hier in Beispiel 9 angeführt.
Pharmazeutische Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können als verschiedene Dosierungsformen formuliert werden. Im allgemeinen werden die Konjugate der vorliegenden Erfindung parenteral, vorzugsweise intravenös, verabreicht. Eine besondere pharmazeutische Zusammensetzung ist die, die als eine für eine Verabreichung durch Injektion geeignete Einheitsdosisform formuliert ist. Besonders geeignete Zusammensetzungen umfassen somit eine Lösung, Emulsion oder Suspension des Immunotoxins zusammen mit einem pharmazeutisch unbedenklichen, parenteralen Träger bzw. Verdünnungsmittel. Als Träger bzw. Verdünnungsmittel eignen sich beispielsweise wäßrige Vehikel, zum Beispiel Wasser und Kochsalzlösung, und nicht-wäßrige Vehikel, zum Beispiel fette Öle oder Liposomen. Die Zusammensetzungen können Mittel enthalten, die die Stabilität des Konjugats in der Zusammensetzung verbessern. Die Zusammensetzung kann beispielsweise einen Puffer, zum Beispiel Tween, enthalten. Die Konzentration des Konjugats wird schwanken; im allgemeinen wird das Konjugat jedoch in Konzentrationen von etwa 1 bis 10 mg/Dosis formuliert.
Antikörper 55.1 ist selektiv für Pankreastumorzellen und kolorektale Tumorzellen, und es wurde gefunden, daß es sich bei Konjugaten, die diesen Antikörper enthalten, um wirksame, für kolorektale Tumorzellen selektive Immunotoxine handelt.
Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Expressionsvektor bereitgestellt, der für eine wie hier definierte antigenbindende Struktur kodiert.
Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Expressionsvektor bereitgestellt, der für wenigstens die variable Region der schweren oder leichten Kette einer wie oben definierten antigenbindenden Struktur kodiert.
Als Wirte für die Koexpression von cDNA der H-(schweren) und L-(leichten) Ketten des Antikörpers und Fragmenten davon wurden Säugetierzellen (CHO, COS, Myeloma) verwendet, wodurch man Protein mit der angegebenen Bindungsaktivität erhielt (Bebbington, C., 1991, Methods, Band 2, S. 136–145, und Adair, J., 1992, Immunological Reviews, Band 130). Die cDNAs können in Plasmide eingeschleust werden und sich dort in die chromosomale DNA integrieren. Die Plasmide benötigen einen selektierbaren Marker für die Erhaltung in transfizierten Wirten, einen effizienten eukaryontischen Promotor, der einen hohen Transkriptionsgrad aus den cDNA sicherstellt, zweckmäßige Restriktionsstellen für das Klonieren und die Polyadenylierung und Signale, die anzeigen, daß die Transkription beendet ist, damit die Nachricht nicht verfälscht wird. In der Literatur sind mehrere solcher Vektoren beschrieben (Bebbington, C. et al., 1992, Bio/Technology, Band 10, S. 169–175, und Wright, A., 1991, Methods, Band 2, S. 125–135), und es gibt im Handel erhältliche Vektoren wie pRc/CMV (Invitrogen Corp., siehe 8), die die erforderlichen Kriterien erfüllen.
Die Expression einer Reihe von Antikörperfragmenten in E. coli ist gut dokumentiert (Übersichtsartikel von Pluckthun, A., Immunological Reviews, 1992, Band 130, S. 151–188 und Skerra, A., Current Opinion in Immunology, 1993, Band 5, S. 256–262). Die intrazelluläre Expression von Fd- und L-Ketten wurde beschrieben (Cabilly, S., 1989, Gene, Band 85, p553–557), hierzu könnte jedoch eine in-vitro-Umfaltung und Neuanordnung der Ketten erforderlich sein (Buchner, J und Rudolph, R., 1991, Bio/Technology, Band 9, S. 157–162), damit Bindungsaffinität entsteht. Eine effizientere Route zum Erhalt von aktiven Antikörperfragmenten ist über periplasmische Sekretion (Better, M. et al., 1988, Science, Band 240, S. 1041–1043). Die H- und L-Ketten-Komponenten der Antikörperfragmente werden zusammen von einem einzelnen Plasmid exprimiert. Jede Antikörperkette ist mit einem bakteriellen Leader-Peptid versehen, das es zum E.-coli-Periplasma leitet, wo der Leader abgespalten wird und sich die freien Ketten zu löslichen und aktiven Antikörperfragmenten zusammenlagern. Man nimmt an, daß dieser Prozeß dem natürlichen Prozeß in eukaryontischen Zellen ähnelt, bei dem die exprimierten Antikörperketten vor der Assoziation zu ganzen Antikörpern in das Lumen des ER wandern. Dieser Prozeß führt häufig dazu, daß im Kulturüberstand Bindungsaktivität vorhanden ist.
Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird eine Wirtszelle bereitgestellt, die mit einem wie oben beschriebenen Vektor, der mit der Expression in der Wirtszelle kompatibel ist, transformiert ist.
Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird eine Wirtszelle bereitgestellt, die mit einer wie oben definierten Polynukleotidsequenz transformiert ist.
Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung wenigstens einer variablen Region einer schweren oder leichten Kette einer wie oben definierten Antigenbindungsstruktur bereitgestellt, bei dem man:

a) eine Wirtszelle mit einer Polynukleotidsequenz, die für wenigstens die variable Region kodiert, transformiert;
b) die Wirtszelle Bedingungen aussetzt, bei denen die Expression und gegebenenfalls Sezernierung wenigstens der variablen Region gefördert wird, und gegebenenfalls
c) die variable Region wenigstens teilweise reinigt.

Vorzugsweise werden die variablen Regionen sowohl der schweren als auch der leichten Ketten in der gleichen Wirtszelle exprimiert und dabei unter Bildung einer antigenbindenden Struktur zusammengebaut.
Bei einigen Expressionssystemen bedient man sich einer Wirtszelle mit einem Vektor; solche Systeme sind gut bekannt, beispielsweise in E.-coli-, Hefe- und Säugetierwirten (siehe Methods in Enzymology 185, Academic Press 1990). Auch andere Expressionssysteme werden in Betracht gezogen, beispielsweise transgene Tiere mit Ausnahme des Menschen, bei denen das Gen, um das es sich handelt, vorzugsweise aus einem Vektor ausgeschnitten und vorzugsweise zusammen mit einem Milchdrüsen-Promotor für die direkte Exprimierung des Proteins in die Milch des Tieres, in den Pronukleus einer Säugetierzygote eingeschleust wird (gewöhnlich durch Mikroinjektion in einen der beiden Kerne (gewöhnlich den männlichen Kern) des Pronukleus) und anschließend einer Ziehmutter eingepflanzt wird. Ein Teil der von der Ziehmutter gezeugten Tiere wird das eingeschleuste Gen, das sich in ein Chromosom integriert hat, tragen und exprimieren. Gewöhnlich wird das integrierte Gen durch herkömmliche Züchtung an die Nachkommen weitergegeben, was eine einfache Bestandsvergrößerung ermöglicht. Vorzugsweise wird das Protein, um das es sich handelt, einfach aus der Milch der weiblichen transgenen Tiere gewonnen. Der Leser sei auf die folgenden Veröffentlichungen verwiesen: Simons et al. (1988), Bio/Technology 6: 179–183; Wright et al. (1991) Bio/Technology 9: 830–834; US-Patentschrift Nr. 4,873,191 und US-Patentschrift Nr. 5,322,775. Die Manipulation von Mäuseembryos ist in Hogan et al., "Manipulating the Mouse Embryo; A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory 1986, beschrieben.
Weiterhin werden Verfahren mit transgenen Pflanzen in Betracht gezogen, wie beispielsweise in den folgenden Veröffentlichungen beschrieben: Swain W. F. (1991) TIBTECH 9: 107–109; Ma J. K. C. et al. (1994) Eur. J. Immunology 24: 131–138; Hiatt A. et al. (1992) FEBS Letters 307: 71–75; Hein M. B. et al. (1991) Biotechnology Progress 7: 455–461; Duering K. (1990) Plant Molecular Biology 15: 281–294.
Falls gewünscht können Wirtsgene durch Standardvorschriften inaktiviert oder modifiziert werden, wie unten kurz umrissen und beispielsweise in "Gene Targeting; A Practical Approach", IRL Press 1993, beschrieben. Vorzugsweise kloniert man das Targetgen oder einen Teil davon in einen Vektor mit einem Selektionsmarker (wie Neo), der in das Gen insertiert wird, um seine Funktion zu unterbinden. Der Vektor wird linearisiert und dann (gewöhnlich durch Elektroporation) in embryonische Stammzellen (ES-Zellen) (beispielsweise aus einem 129/01a-Mäusestamm gewonnen) transformiert, wobei es anschließend in einem Teil der Stammzellen zu homologen Rekombinationen kommt. Die das gestörte Gen enthaltenden Stammzellen werden expandiert und in eine Blastozyte (wie beispielsweise aus einer C57BL/6J-Maus) injiziert und zur Entwicklung einer Ziehmutter eingepflanzt. Chimäre Nachkommen lassen sich durch Hüllfarbmarker identifizieren. Man züchtet Chimären, um sicherzustellen, daß die ES-Zellen durch Paarung mit Mäusen mit genetischen Markern zur Keimbahn beitragen, wodurch es möglich ist, zwischen von den ES stammenden und den von den Blastozyten des Wirtes stammenden Gameten zu unterscheiden. Die Hälfte der von den ES-Zellen stammenden Gameten wird die Genmodifikation tragen. Die Nachkommen werden (z. B. durch Southern-Blotting) zur Identifikation der Nachkommen mit einem gestörten Gen (etwa 50% der Nachkommenschaft) untersucht. Diese ausgewählten Nachkommen sind heterozygot und können daher mit anderen heterozygoten Nachkommen gepaart werden, worauf die homozygoten Nachkommen ausgewählt werden (etwa 25% der Nachkommenschaft). Transgene Tiere mit einem Knockout-Gen können mit durch bekannte Verfahren wie Mikroinjektion von DNA in Pronuklei, Spheroblastenfusion (Jakobovits et al. (1993) Nature 362: 255–258) oder lipidvermittelte Transfektion (Lamb et al. (1993) Nature Genetics 5 22–29) von ES-Zellen erzeugten transgenen Tieren gekreuzt werden, wodurch man transgene Tiere mit endogenem Knockout-Gen und fremden Gensubstitutionen erhält.
ES-Zellen mit zielgerichteter Genstörung lassen sich weiter modifizieren, indem man sie mit einer eine spezifische Veränderung enthaltenden Targetgensequenz, die vorzugsweise in einen Vektor kloniert ist und vor der Transformation linearisiert wird, transformiert. Nach der homologen Rekombination wird das veränderte Gen in das Genom eingeschleust. Diese embryonischen Stammzellen können anschließend wie oben beschrieben zur Erzeugung von transgenen Tieren verwendet werden.
Unter den Ausdruck „Wirtszelle" fallen alle prokaryontischen oder eukaryontischen Zellen, die sich für Expressionsverfahren eignen, wie beispielsweise Bakterien, Hefen, Pflanzenzellen und nicht-humane Säugetierzygoten, -oozyten, -blastozyten, embryonische Stammzellen und andere für transgene Techniken geeignete Zellen. Wenn es der Kontext zuläßt, so schließt der Ausdruck „Wirtszelle" auch eine aus transformierten nicht-humanen Säugetierzygoten, -oozyten, -blastozyten, embryonischen Stammzellen, Pflanzenzellen und anderen für transgene Techniken geeigneten Zellen entwickelte Pflanze oder ein solches nicht-humanes Säugetier ein.
Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung des monoklonalen Antikörpers 55.1 bereitgestellt, bei dem man:

a) das als ECACC-Deposit Nr. 93081901 hinterlegte Hybridom 55.1 kultiviert, und
b) den Antikörper 55.1 aus dem Kulturmedium gewinnt und gegebenenfalls
c) ein F(ab')2-Fragment des Antikörpers 55.1 durch enzymatische Verdauung herstellt.

Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird eine antigenbindende Struktur bereitgestellt, bei der es sich um das als ECACC-Deposit Nr. 93081901 hinterlegte Hybridom 55.1 handelt.
Mit der vorliegenden Erfindung ist es möglich, ein Toxin zu Zellen, die das Antigen CA55.1 aufweisen, zu lenken, indem man für die Zielsuche ein Immunotoxinkonjugat verwendet, das ein Toxin und eine wie oben definierte antigenbindende Struktur enthält.
Wie erwähnt ist das Konjugat fähig dazu, gastrointestinale Tumorzellen abzutöten. Das Konjugat (bzw. "Immunotoxin") ist somit dazu in der Lage, die Toxineinheit zur Tumorzelle zu transportieren, so daß die Toxineinheit ihre zytotoxischen Eigenschaften zur Anwendung bringen kann. Das Konjugat wird daher im allgemeinen dazu in der Lage sein, sich an Tumorzellen zu binden (über die Bindung der targetzellenbindenden Einheit an die Tumorzellen) und es der Toxineinheit zu ermöglichen, in die Zelle zu gelangen, das heißt, es der Toxineinheit zu ermöglichen, internalisiert zu werden. Besonders wirksame Konjugate weisen im allgemeinen die folgenden Eigenschaften auf:

1. Die antigenbindende Struktur sollte dazu fähig sein, sich an ein Tumorzellenoberflächenantigen zu binden.
2. Das Zelloberflächenantigen sollte auf Tumorzellen in einer großen Anzahl von Kopien vorhanden sein, beispielsweise wenigstens zehntausend pro Zelle.
3. Das Antigen sollte auf normalen Zellen nicht in einer großen Anzahl von Kopien exprimiert sein.
4. Der Antikörper:Antigen-Komplex sollte effizient internalisiert werden, so daß die Toxineinheit ihre Zytotoxizität intrazellulär ausüben kann.
5. Das Konjugat sollte vorzugsweise so konstruiert sein, daß es ausreichend stabil ist, um im Blut so lange unversehrt zu bleiben, bis die Toxineinheit bei den Tumorzellen angelangt ist, sowie so leicht spaltbar, daß eine Freisetzung der Toxineinheit erfolgen kann, wenn die Toxineinheit einmal im Inneren der Zelle ist.

Im allgemeinen wird der Dosisbereich für ein solches Konjugat als Fraktion einer etablierten toxischen Dosis (z. B. der maximal verträglichen Dosis) festgelegt. Gewöhnlich wendet man diesen Ansatz auch beim Menschen an. Typischerweise würde der Dosisbereich 50–5000 μg/kg betragen.
Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird die Verwendung eines wie oben beschriebenen Antikörpers in einem diagnostischen Verfahren bereitgestellt.
Ein diagnostisches Verfahren ist der Immunoassay. Ein auf den neuen erfindungsgemäßen Antikörpern basierender Immunoassay für in-vitro-Tests läßt sich nach herkömmlichen, im Stand der Technik bekannten immunologischen Verfahren unter Anwendung des erfindungsgemäßen Antikörpers in markierter oder nicht markierter Form und der Bestimmung der Komplexbildung des Antikörpers mit spezifischen antigenen Spezies in der zu testenden Probe entwickeln. In einem Fall kann der Antikörper mit einem nachweisbaren Marker wie z. B. einem radioaktiven Marker, einem Chemilumineszenzmarker, einem Fluoreszenzmarker oder einem Enzymmarker markiert sein. Alternativ dazu wird der Antikörper über den mit einer markierten Substanz gebildeten Komplex oder durch Verfahren ohne Anwendung markierter Verbindungen wie Biosensorverfahren, die beispielsweise auf der Oberflächen-Plasmonresonanz beruhen, nachgewiesen. Die Probe kann beispielsweise in Form einer Körperflüssigkeit, wie als Serum, oder einer Gewebezubereitung (histochemischer Assay) vorliegen.
Für Zwecke der in-vivo-Diagnose von Krebs kann man die antigenbindende Struktur entweder mit Enzymen wie Meerrettichperoxidase und bakterieller Luciferase, die ein meßbares Signal produzieren, oder mit Fluoreszenzmarkern oder Radioisotopen, die nachgewiesen und direkt quantifiziert werden können, konjugieren. In einem Standardimmunoassaysystem bieten solche Konjugate ein Mittel, das Vorhandensein bzw. die Abwesenheit von CA55.1 in Körpergeweben zu messen, was als Folge einen schnellen und einfachen Test für die Diagnose von Tumorerkrankungen ermöglicht. Siehe die allgemeinen Beschreibungen der betreffenden Techniken in Enzyme Immunoassay, E. T. Ilaggio, CRC Press und US-Patentschrift Nr. 3,690,8334, US-Patentschrift Nr. 3,791,932, US-Patentschrift Nr. 3,817,837, US-Patentschrift Nr. 3,850,578, US-Patentschrift Nr. 3,853,987, US-Patentschrift Nr. 3,867,517, US-Patentschrift Nr. 3,901,654, US-Patentschrift Nr. 3,935,074, US-Patentschrift Nr. 3,984,533, US-Patentschrift Nr. 3,996,345 und US-Patentschrift Nr. 4,098,876.
Bei der Krebstherapie beinhalten, wenngleich man die antigenbindende Struktur ohne weitere Modifikation anwenden könnte, die bevorzugten Ausführungsformen eine antigenbindende Struktur, die mit toxischen Mitteln konjugiert werden kann, die die Krebszellen oder die Zellen in der unmittelbaren Nähe dieser Krebszellen, die das CA55.1-Antigen tragen, abtöten können. Bei der bevorzugten Ausführungsform ist die antigenbindende Struktur mit einem Proteintoxin wie Ricin, Diptherietoxin, dem Enterotoxin von Staphylococcus, dem Exotoxin von Pseudomonas, Abrin oder einem anderen ribosomalen inaktivierenden Protein konjugiert. Diese Proteine können entweder chemisch mit einem chemischen Quervernetzungsmittel oder genetisch durch die Konstruktion eines Fusionsproteins, das eine einzelne lineare Aminosäuresequenz der gesamten antigenbindenden Struktur oder eines Teils davon und des gesamten Proteintoxins oder eines Teils davon enthält, an die antigenbindende Struktur gebunden sein. Da CA55.1 schnell internalisiert wird, tritt das Proteintoxin selektiv in die Tumorzellen ein und führt zu ihrem Tod.
Eine selektive Abtötung der Tumorzellen läßt sich auch erreichen, indem man die antigenbindende Struktur entweder direkt oder durch chemische Derivatisierung mit makrocyclischen Chelatbildnern konjugiert, die energiereiche Radioisotopen wie 90Y, 131I und 111In enthalten. Die antigenbindende Struktur dient zur zielgerichteten Anreicherung des Isotopen am Tumor, und die vom Isotopen abgegebene Strahlung zerstört die DNA der umgebenden Zellen und tötet den Tumor.
Eine selektive Abtötung der Tumorzellen läßt sich auch erreichen, indem man die antigenbindende Struktur mit zytotoxischen und zytostatischen Arzneimitteln wie Methotrexat, Chlorambucil, Adriamycin, Daunorubicin und Vincristin konjugiert. Diese Arzneimittel werden seit vielen Jahren in der Klinik eingesetzt, wobei ihr therapeutischer Nutzen häufig durch nicht-spezifische Toxizität eingeschränkt ist. Durch eine Konjugation dieser Arzneimittel mit der an das CA55.1-Antigen bindenden Struktur können diese Arzneimittel an der Tumorstelle angereichert werden, wodurch die an den Tumor verabreichte Dosis des Arzneimittels erhöht wird, ohne daß es aufgrund der Wirkung dieser Arzneimittel auf andere Gewebe wie Knochenmark oder das Nervensystem zu unerwünschten Nebenwirkungen kommt.
Eine selektive Abtötung der Tumorzellen läßt sich auch erreichen, indem man die antigenbindende Struktur mit einem Enzym konjugiert, das dazu in der Lage ist, die Umwandlung einer nicht-toxischen Dosis einer Prodrug in eine wirksame toxische Arzneimittelverbindung zu katalysieren. Die Verabreichung des Konjugats führt zu einer Anreicherung der Enzymaktivität an der Tumorstelle. Eine anschließende Verabreichung der Prodrug hat eine örtlich begrenzte Produktion des toxischen Arzneimittels und eine selektive Abtötung an der Tumorstelle zur Folge. Dieser Ansatz ist in WO 88/07378, US-Patentschrift Nr. 4,975,278 und WO89/10140 beschrieben.
Eine weitere Anwendung ist die Verwendung von CA55.1 zur Isolierung von antigenbindenden Strukturen, die sich zur Isolierung weiterer Antikörper, idiotypisch mit CA55.1-spezifischen Antikörpern, einsetzen lassen. Diese Antikörper können dann als Tumorimpfstoffe zur Induktion oder zum Auffrischen einer natürlichen Immunreaktion auf CA55.1-tragende Tumore verwendet werden. Ein Beispiel für diesen Ansatz wird in Nepom et. al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S. (1984) 81, 2864, angeführt.
Das Verfahren zur Herstellung von an das CA55.1-Antigen bindenden Strukturen ist in BEISPIEL 1 und BEISPIEL 2 beschrieben und erfordert zunächst die Produktion vieler tausender monoklonaler Antikörper gegen eine das Antigen CA55.1 tragende Tumorzelle und dann ein Screening auf die bestimmten Antikörper, die spezifisch mit CA55.1 reagieren (BEISPIEL 6). Diese Technologie wird allgemein angewendet, indem man Milzzellen aus Nagern, die entweder mit dem CA55.1-Antigen oder mit Zellen oder Membranzubereitungen von Zellen, die das CA55.1-Antigen exprimieren, wie COLO 205 (ATCC CCL 222, Can. Res. [1978] 38, 13455), immunisiert worden sind, und eine Nagetier-Myelomzellinie wie Sp/2 (ECACC Kat.-Nr. 85110503, Methods in Enzymol [1981] 73B, 3), fusioniert. Das Produkt dieser Fusion ist eine Nagetier-Hybridomzellinie, die einen monoklonalen Nagetierantikörper wie den Maus-IgG1-55.1-Antikörper exprimiert. Bei den oben beschriebenen Anwendungen handelt es sich bei der für eine bestimmte Anwendung vorteilhaftesten antigenbindenden Struktur nicht immer um den durch die Hybridomfusionstechnologie erzeugten intakten monoklonalen Nagetier-Antikörper, und am besten modifiziert man das Molekül unter Erhalt der ursprünglichen Bindungsspezifität für CA55.1 weiter.
Insbesondere bei einer wiederholten in-vivo-Verabreichung des Nagetier-Antikörpers an Menschen, entweder als antigenbindende Struktur allein oder als Konjugat, kommt es im Empfänger zu einer Immunreaktion gegen den Nagetier-Antikörper; die HAMA-Reaktion. Ist eine wiederholte Verabreichung erforderlich, so beeinträchtigt die HAMA-Reaktion die Wirksamkeit der pharmazeutischen Zusammensetzung. Die Immunogenität der antigenbindenden Struktur läßt sich durch chemische Modifikation der antikörperbindenden Struktur mit einem hydrophilen Polymer wie Polyethylenglycol oder durch Anwendung von gentechnischen Verfahren, mit denen man die antikörperbindende Struktur humaner macht, herabsetzen. So kann man beispielsweise die Gensequenzen der variablen Domänen des Nagetier-Antikörpers, die an CA55.1 binden, durch die variablen Domänen von humanem Myelomprotein ersetzen, wodurch man rekombinate chimäre Antikörper erhält. Diese Vorschriften sind in EP 194276 , EP 0120694 , EP 0125023 , EP 0171496 , EP 0173494 und WO 86/01533 ausführlich beschrieben. Alternativ dazu kann man die Gensequenzen der Complementarity Determining Regions bzw. CDRs der CA55.1-bindenden Nagetier-Antikörper isolieren oder synthetisieren und gegen die entsprechenden Sequenzregionen eines homologen humanen Antikörpergens austauschen, wodurch man einen humanen Antikörper mit der Spezifität des ursprünglichen Nagetier-Antikörpers erhält. Diese Vorschriften sind in EP 023940 , WO 90/07861 und WO91/09967 beschrieben. Alternativ dazu kann man einen Großteil der Oberflächenreste der variablen Domäne des Nagetier-Antikörpers in die Reste umwandeln, die man normalerweise auf einem homologen humanen Antikörper findet, wodurch ein Nagetier-Antikörper produziert wird, der ein Oberflächen „furnier" von Resten aufweist und daher vom Körper des Menschen als Selbst angesehen wird. Dieser Ansatz wurde von Padlan et al. (1991) Mol. Immunol. 28, 489, realisiert.
Bei vielen Anwendungen wird die Wirksamkeit der antikörperbindenden Struktur durch eine Verringerung der Größe der antikörperbindenden Struktur und eine einhergehende Verbesserung der Gewebepenetration und anderer pharmakodynamischer Eigenschaften der pharmazeutischen Zusammensetzung verbessert. Dies läßt sich erzielen, indem man die Fc-Region des Antikörpermoleküls entweder enzymatisch (BEISPIEL 4) oder durch gentechnische Verfahren unter Herstellung eines rekombinanten Fab'- oder F(ab)2-Fragments (Beispiel 3.3) entfernt.
Gentechnische Verfahren lassen sich auch zur weiteren Verringerung der Größe der antigenbindenden Struktur einsetzen. Die Fv, die die CDRs enthalten, können erzeugt und in Isolation exprimiert und beispielsweise unter Anwendung von Disulfidbrücken chemisch quervernetzt werden. Alternativ dazu können die Domänen sowohl der leichten als auch der schweren Ketten, die die Fv-Struktur ausmachen, als Einzelpolypeptidkette (single polypeptide chain (SCFv)) hergestellt werden, indem man die Fv-Domänen mit einer Linkerpeptidsequenz aus dem natürlichen C-Terminus einer Domäne mit dem N-Terminus der anderen Domäne kondensiert (siehe BEISPIEL 3.3 und PCT/US/87/02208 und US-Patentschrift Nr. 4,704,692). Alternativ dazu kann man eine einzelne Fv-Domaine unter Bildung eines Einzeldomän-Antikörpers bzw. dAb in Isolation exprimieren, wie von Ward et al. Nature (1989) 341, 544, beschrieben. Ein anderer Typ von antigenbindender Struktur ist ein wie in der internationalen Patentanmeldung WO 94/12625 (Erfinder Slater & Timms) offenbartes V-min-Konstrukt.
Die Erfindung wird durch die folgenden nichteinschränkenden Beispiele erläutert, wobei:
1 zeigt Zelldichte und IgG-Konzentration einer Kultur des 55.1-Hybridoms in serumhaltigem Medium;
2 zeigt Zelldichte und IgG-Konzentration einer Kultur des 55.1-Hybridoms in proteinfreiem Medium;
3 zeigt eine Plasmidkarte von pICI1646;
4 zeigt die Endozytose von CA55.1;
5 zeigt die in-vivo-Antitumorwirkung eines 55.1-Antikörper-Ricin-Konjugats;
6 zeigt die Wiedergabe eines Western-Blots von mit PNGase behandelten Colo-205-Zellen;
7A & 7B zeigen Wiedergaben von Western-Blots mit den Lektinen DSA und GNA;
8 zeigt eine Karte von Plasmid pRc/CMV;
9 zeigt einen Western-Blot, aus dem die Expression von Fab' und F(ab')2 ersichtlich ist;
10 zeigt ELISA-Daten zur Fab'- und F(ab')₂-Bindung;
11 zeigt einen Western-Blot, aus dem die scFv-Expression ersichtlich ist;
12 zeigt ELISA-Daten zur scFv-Bindung;
13 zeigt die Spezifität der direkten Bindung des ACEHRGSGWC-Phagen an 55.1-Antikörper
14 zeigt die Spezifität der Bindung des ACEHRGSGWC-Phagen in einem Verdrängungsassay
15 & 16 zeigen die cDNA-Sequenzen der schweren und der leichten Kette von Antikörper 55.1. Man beachte das Vorhandensein von sekretorischen Leaderpeptid-Sequenzen, die in den reifen Antikörperketten vorkommen. Die Leadersequenzen sind im 3-Buchstaben-Aminosäurekode und die reifen Sequenzen im Ein-Buchstaben-Kode gezeigt.
17 zeigt ein Flußdiagramm für die Bildung von Antikörpern gegen das 55.1-Antigen.
18 zeigt die doppelsträngige DNA-Sequenz des für den Nachweis des Antikörpers verwendeten c-myc-Tag.
Tabelle 1 zeigt die Zelldichte und IgG-Konzentration in serumhaltigem Medium bei der Kultivierung von 55.1-Hybridom;
Tabelle 2 zeigt die Zelldichte und IgG-Konzentration in proteinfreiem Medium bei der Kultivierung von 55.1-Hybridom;
Tabelle 3 zeigt die Reaktivität von 55.1-Antikörper mit kolorektalen Tumoren und
Tabelle 4 zeigt mit 55.1-Antikörper angefärbte Proben normalen Gewebes.
Abkürzungen
SDS-PAGE steht für Natriumdodecylsulfat-(sodium dodecyl sulphate, SDS) Polyacrylamidgelelektrophorese (PAGE)
TABELLE 1: WACHSTUM UND IgG-PRODUKTION VON 55.1 IN 5% FBS IN EINER ROLLKULTUR
TABELLE 2: WACHSTUM UND IgG-PRODUKTION VON 55.1 IN PROTEINFREIEM MEDIUM IN EINER ROLLKULTUR
TABELLE 3 55.1 Reaktivität mit kolorektalen Tumoren in Menschen
TABELLE 4 Anteil des mit 55.1 angefärbten normalen Gewebes
BEISPIEL 1 – Herstellung von 55.1-Antikörper und von Antikörpern, die kreuzreaktiv mit CA55.1 sind
Seit seinen Anfängen im Jahre 1976 wird die Bildung von monoklonalen Antikörpern auf die Suche nach für Krebszellen selektive Antigene angewendet. Im Gegensatz zur Bildung von Antikörpern gegen ein vollständig aufgereinigtes Antigen werden bei diesem Verfahren Mäuse mit einer weniger reinen Zubereitung immunisiert und dann eine Auswahlkaskade angewendet, wodurch Antikörper der erforderlichen Spezifität identifiziert werden. Auf diese Weise identifizierte Antikörper lassen sich dann unter Anwendung von dem Fachmann gut bekannten Vorschriften zur Identifikation des krebsselektiven Antigens einsetzen.
Nach der Identifikation des Antigens, lassen sich weitere Antikörper mit einer ähnlichen Spezifität herstellen, indem man Tiere mit einer angereicherten Zubereitung des Antigens (wie der nach dem in Beispiel 11 beschriebenen Verfahren hergestellten Zubereitung) immunisiert, die Milzzellen dieser Tiere wie unten beschrieben mit einer geeigneten Myelomzellinie fusioniert und die so erhaltenen Hybridome unter Anwendung des in BEISPIELEN 6 UND 7 beschriebenen Verfahrens auf die Produktion von monoklonalen Antikörpern screent, die kreuzreaktiv mit dem monoklonalen Antikörper 55.1 sind.
1.1 Erstellen der Hybridomazellinie und Produktion von 120/466.034.017.023.023.003; Herstellung etablierter Milzzellen
Eine im Handel von der American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, Md., USA, unter der Zugangsnr. CCL 222 erhältliche humane Kolorektalkarzinom-Zellinie, COLO 205, wurde routinemäßig in serumfreiem Medium kultiviert. Die Zellen wurden geerntet, wenn sie eine ungefähre Dichte von 7 × 10⁵ erreicht hatten und dann 3mal mit Iscoves-Basalmedium (proteinfrei) für die Immunisierung gewaschen.
8- bis 10-Wochen-alte BALB/c-Mäuse wurden intraperitoneal mit einer „Priming Dose" von 100 μg von aus in 0,1 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung und 0,1 ml komplettem Freund-Adjuvans suspendierten COLO-205-Zellen gewonnenen Membranen immunisiert. Nach zwei Wochen und abermals nach 4 Wochen wurden den Tieren Auffrischungsimpfungen von weiteren 100-μg-Dosen von in phosphatgepufferter Kochsalzlösung und inkomplettem Freund-Adjuvans suspendierten COLO-205-Membranen verabreicht. Sechs Wochen nach der zweiten Auffrischungsimpfung erhielten die Mäuse eine abschließende intraperitoneale Immunisierung von 100 μg lediglich in phosphatgepufferter Kochsalzlösung suspendierten Colo205-Membranen, die Tiere wurden vier Tage später getötet und die Milzen wurden entnommen. Die Milzen wurden dann durch Injektion von Dulbecco's Modified Eagle's Medium in den Milzsack in eine Einzelzellsuspension dissoziiert.
1.2 Herstellung von Hybridomen
1,95 × 10⁸ Milzzellen aus der oben beschriebenen Zellsuspension wurden mit 2,136 × 10⁷ Myelomzellen aus der Maus-Myelomzellinie NS0 (erhältlich von der European Collection of Animal Cell Cultures unter der Zugangsnr. 85110503) gemischt. Das Röhrchen wurde zentrifugiert, und alle Flüssigkeit wurde dekantiert. Das Röhrchen wurde dann bei 37°C langsam (im Verlauf von 1 min unter ständigem Rühren) mit 1 ml PEG-Lösung (Boehringer PEG1500) versetzt und dann eine weitere Minute lang gerührt. Die Fusion wurde durch Zugabe von Dulbecco's Modified Eagle's Medium nach dem folgenden Protokoll unterbrochen: 2 ml während der ersten 2 Minuten, 8 ml während der nächsten 4 Minuten und weitere 10 ml im Verlauf von 2 Minuten. Das Röhrchen wurde dann zentrifugiert und in 30 ml DMEM mit 10% fetalem Kälberserum resuspendiert. Aliquots von 50 μl wurden auf die Vertiefungen von 6 Gewebekulturschalen mit jeweils 96 Vertiefungen verteilt. Nach 24 Stunden wurden pro Vertiefung 50 μl DMEM mit 10% fetalem Kälberserum und doppelstarker Hypoxanthin/Aminopterin/Thymidin-(HAT-)Zusatz zugegeben. 7 Tage später wurden in jede Vertiefung 200 μl DMEM mit 10% fetalem Kälberserum und einfachstarke Hypoxanthin/Aminopterin/Thymidin-(HAT-)Zusätze gegeben.
1.3 Screening von Antikörperhybridomen
Das verbrauchte Medium von Tag 13 oben wurde auf COLO-205-positive/Normalkolon-negative Antikörper getestet. Kurz gesagt wurden die Vertiefungen von zwei Sätzen Nunc-Immunoplates Maxisorp entweder mit 105 Zellen/Vertiefung COLO-205-Zellen; Beschichtungsvolumen 100 μl, oder mit von normalem Kolon stammenden Membranen (10 μg/ml, 100 μl pro Vertiefung) beschichtet. Die Platten wurden zentrifugiert, 100 μl 0,2% Glutaraldehyd in PBS wurden zugegeben und es wurde 20' bei Raumtemperatur inkubiert. Die Platten wurden dann mit FES-Tween gewaschen und mit 0,10%iger Schweinegelatine in PBS, 200 μl pro Vertiefung, blockiert. In die beschichteten Vertiefungen der beiden Sätze von Platten wurde dann das obenerwähnte verbrauchte Kulturmedium von Tag 13 gegeben, 50 μl/Vertiefung. Nach 2stündiger Inkubation bei Raumtemperatur wurden in jede Vertiefung 100 μl peroxidasekonjugiertes Anti-Maus-IgG (Sigma, Ziege-anti-Maus-IgG, ganzes Molekül, absorbiert an Rattenserumprotein, A8924)), verdünnt (1/2000) mit 0,1% Tween 20-PBS, gegeben, und es wurde 2 Stunden lang bei Raumtemperatur inkubiert. Dann wurden in jede Vertiefung 100 μl Substrat in Form von 90 μg OPD, gelöst in 100 ml Citrat-Phosphat-Puffer, pH 4,5, plus 15 μl 30% Wasserstoffperoxid, gegeben, und es wurde 15 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert. Die Reaktion wurde dann durch Zugabe von 50 μl Citronensäure (0,5 M) gestoppt, und es wurde die Extinktion bei 450 nm gemessen.
Bei Screening der Produkte von Hybridomen darauf, ob sie in der Lage sind, sich an spezifische Targets zu binden, ist es vorteilhaft, einen zweiten markierten Antispezies-Antikörper zu verwenden, der erstens die von einem Hybridomprodukt gewünschten Eigenschaften wiederspiegelt und zweitens keine Hybridomprodukte ausschließt (das heißt, nicht damit reagiert), die diese Eigenschaften aufweisen können. Speziell wurde bei der Entdeckung von 55.1 darauf geachtet, monoklonale IgM-Antikörper von der weiteren Untersuchung auszuschließen, da diese Moleküle Teil der frühen humoralen Reaktion sind und im allgemeinen eine geringe Affinität und eine schlechte Spezifität aufweisen. Um dies zu erreichen wurden eine Reihe von im Handel erhältlichen Anti-Maus-IgG-Peroxidase-Konjugaten darauf gescreent, ob sie mit Maus-IgM reagieren, und dann wurden alle Zubereitungen verworfen, die diese Eigenschaft aufwiesen. Es sollten jedoch keine monoklonalen Antikörper der Unterklasse IgG ausgeschlossen werden. Der nächste Schritt war daher, zu bestimmen, ob die verbliebenen im Handel erhältlichen Konjugate mit Maus-IgG1, -IgG2a, -IgG2b und -IgG3 reagieren. Es wurde keine im Handel erhältliche Zubereitung gefunden, die sowohl nicht mit Maus-IgM reagiert als auch mit allen Unterklassen von Maus-IgG gleich gut reagiert. Dies wurde gelöst, indem das beste Anti-Maus-IgG-Reagens durch Zugabe von spezifischem/n Anti-Unterklasse-Konjugat(en) verbessert wurde. Die letzte Zubereitung erkannte die vier anerkannten Unterklassen von Maus-IgG gleich gut.
Ungefähr 600 Hybridomklone wurden getestet. Zunächst reagierten 165 dieser Klone mit COLO-250-Zellen. Es konnte gezeigt werden, daß 43 von diesen auch mit normaler humaner Kolonmembran reagieren, und diese wurden verworfen. Ein aus den verbliebenen Hybridomen gewonnener, als 120/466 bezeichneter Klon wurde als isotypisch mit der IgG1-Klasse identifiziert. Das 120/466-Hybridom wurde dann einer Reihe von Subklonierungsschritten unterzogen, wodurch man schließlich einen letzten stabilen monoklonalen Antikörper erhielt, der einen als 120/466.034.017.023.023.003 bezeichneten Klon produzierte, der als 55.1 bekannt wurde.
Das 120/466-Hybridom wurde somit zuerst kloniert, was einen als 120/466.034 bezeichneten Klon lieferte. Dieser Klon wurde wiederum unter Bildung von Klon 120/466.034.017 kloniert; dieser Klon wurde wiederum unter Bildung von Klon 120/466.034.017.023 kloniert; dieser Klon wurde wiederum unter Bildung von Klon 120/466.034.017.023.023 kloniert; dieser Klon wurde wiederum unter Bildung von Klon 120/466.034.017.023.023.003 kloniert. Bei all diesen Klonierungen wurde die Hybridomsuspension mit durch Hypoxanthin/Thymidin (HT) ergänztem Kulturmedium an eine Dichte von 2,5 Zellen/ml verdünnt. In jede Vertiefung einer Kulturschale mit 96 Vertiefungen wurden 200 μl (1 Zelle) gegeben. Nach 5–7 Tagen wurden durch optische Überprüfung mit einem Mikroskop Einzellenklone entdeckt. An Tag 17 wurde das Medium gewechselt, und Aliquots der verbauchten Medien wurden auf die Menge an Antikörper, der gemäß wie oben beschrieben durchgeführtem ELISA an COLO-205-Zellen, jedoch nicht an normale Membranen, bindet, analysiert. Die hinsichtlich einer positiven Reaktion im COLO-205-ELISA besten Klone, die im ELISA mit normalen Zellen immer noch negativ reagierten, wurden ausgewählt und für die weitere Entwicklung in Vials in flüssigem Stickstoff eingefroren.
Eine Überprüfung der Klonierung von 120/466.034.017 ergab, daß 66% der Zellen Antikörper produzierten, die mit Colo-205-Zellen reagierten. Eine Überprüfung der Klonierung von 120/466.034.017.023 ergab, daß 100% der Zellen Antikörper produzierten, die mit Colo-205-Zellen reagierten. Eine Überprüfung der Klonierung von 120/466.034.017.023.023 ergab, daß 100 der Zellen Antikörper produzierten, die mit Colo-205-Zellen reagierten. Nach dem Klonieren wurden die Hybridome, die mit COLO-205-Zellen reagierten und nicht mit normaler humaner Kolonmembran reagierten, dann zur Identifizierung von 55.1 wie folgt getestet.
Die von den Hybridomen sezernierten Antikörper (verbrauchte Medien von 10⁷ Zellen, die ungefähr 7 Tage lang in 75-cm²-Kolben kultiviert worden waren) wurden (wie in Beispiel 6 beschrieben) immunohistologisch auf Gewebeschnitten von 4 von 4 verschiedenen Patienten mit primärem Kolorektalkrebs erhaltenen Kolontumoren getestet. Antikörper, die eine starke Bindung (++ siehe Beispiel 6) an wenigstens 2 dieser Tumore zeigten, wurden in einem größeren Satz von Kolorektaltumorschnitten von 10 verschiedenen Patienten immunohistologisch auf Reaktivität untersucht. Antikörper, die eine starke Bindung (++) an wenigstens 5 dieser Tumore zeigten, wurden weiter untersucht.
Auf dieser Stufe wurden die Hybridomüberstände gegen den Satz von 10 Kolorektaltumoren titriert, um die höchste Verdünnung des Überstands zu bestimmen, bei der es zu einer starken Reaktion (++) mit wenigstens 50% der Tumore kam. Diese Konzentration wurde als „Arbeitskonzentration" bezeichnet und zum Screening einer Reihe von Sätzen normaler Gewebe verwendet. Zur Minimierung des Screenings normalen Gewebes wurde eine vierstufige Screening-Kaskade für normales Gewebe entwickelt, bei der kritischere Gewebe zuerst gescreent wurden. Die Hybridome wurden verworfen, wenn der Antikörper, den sie sezernierten, nicht die Reaktivitätskriterien jedes Schrittes der Kaskade erfüllte. Bei den Kaskadenschritten, den Geweben und den Auswahlkriterien handelte es sich um folgende:
Diese Screening-Kaskade führte zur Identifikation von Antikörper 55.1
BEISPIEL 2 – Gewinnung von 55.1-Antikörper aus der hinterlegten Zellinie ECACC Nr. 93081901
2.1 Gewinnung aus serumhaltigem Medium
Eine durch Einfrieren konservierte 1-ml-Ampulle wurde aus dem flüssigen Stickstoff genommen und in einem 37°C-Wasserbad schnell aufgetaut. Der Inhalt wurde aseptisch in ein steriles 15-ml-Zentrifugenröhrchen überführt. Die Zellen wurden durch tropfenweise Zugabe von 10 ml Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) mit 10 Vol.-% fetalem Kälberserum (FKS) und einhergehendes vorsichtiges Mischen resuspendiert. Die Suspension wurde 10 min bei 50 × g zentrifugiert, der Überstand wurde aseptisch abgenommen und das Pellet wurde in 10 ml DMEM und 10% FKS in einem mit 95% Luft/5% Kohlendioxid vorbegasten 25-ml-Gewebekulturkolben resuspendiert. Der Kolben wurde bei 37°C im Dunkeln inkubiert.
Nach 3 Tagen wurde der Kolben subkultiviert, indem man den Inhalt des gesamten Kolben in einen größeren 75-ml- Kolben gab und mit DMEM + 10% FKS (letzliche lebensfähige Dichte = 2,5 × 10⁵ Zellen/ml) verdünnte. Eine weitere Expansion auf 162-ml-Kolben wurde auf ähnliche Weise durchgeführt, wobei allerding die FKS-Konzentration auf 5% reduziert wurde.
Kulturüberstände für die Aufreinigung wurden in 250-ml- und 500-ml-Rollkulturen in 490-ml- bzw. 850-ml-Rollkulturflaschen zubereitet. Die Kulturen wurden mit 2,6 × 10⁵ lebensfähigen Zellen/ml in vorbegasten Rollflaschen, die bei 3 U/min gerollt und bei 37°C inkubiert wurden, beimpft. Die Kulturen wurden bis zur Reife kultiviert und 309 Stunden nach der Inokulation, als die Lebensfähigkeit der Zellen 0% betrug und die IgG-Konzentration ein Maximum erreicht hatte (Tabelle 1 und 1), geerntet.
2.2 Gewinnung aus proteinfreiem Medium
Rollkulturen in 5% FBS wurden durch Reihenpassagieren in mit FBS ergänztem Gibco Protein Free Hybridoma Medium II (PFHMII, Katalognummer 074-03600P) auf proteinfreies Wachstum und Produktivität angepaßt. Nachdem sich nach den jeweils aufeinanderfolgenden Reduktionen wieder ein gesundes Wachstum eingestellt hatte, wurde die FBS-Konzentration in 50%-Schritten herabgesenkt. Die Kulturen wurden mit 3 × 10⁵ lebensfähigen Zellen/ml beimpft und während des Anpassungsprozesses zu nicht mehr als 1 × 10⁶ lebensfähige Zellen/ml heranwachsen gelassen. Nachdem die Anpassung an das proteinfreie Wachstum erfolgt war, wurden wie oben zur Aufreinigung Kulturüberstände in 250-ml- und 500-ml-Rollkulturen zubereitet. Die Kulturen wurden mit 2,0 × 10⁵ lebensfähigen Zellen/ml in vorbegasten Rollkulturflaschen, die bei 3 U/min gerollt und bei 37°C inkubiert wurden, beimpft. Die Kulturen wurden bis zur Reife kultiviert und 236 Stunden nach der Inokulation, als die Lebensfähigkeit der Zellen 0% betrug und Immunoglobulin-G-(IgG-)Konzentration ein Maximum erreicht hatte (siehe Tabelle 2 und 2), geerntet.
2.3 Behandlung der geernteten Kulturen
Nach dem Ernten wurden die Rollkulturüberstande durch 30minütige Zentrifugation bei 60 g geklärt. Die geklärten Überstände wurden bis zur Aufreinigung steril bei 4°C im Dunkeln gelagert.
2.4 Aufreinigung von 55.1
55.1-Antikörper wurde durch Adsorption an und Elution von Protein A aus Zellkulturüberständen isoliert.
5 Liter 55.1-Antikörperzellkulturüberstand, herangezogen in einem serumfreien Nährstoffmedium, mit ungefähr 80 mg AK/Liter, wurden durch Zugabe unter Rühren von 562,5 g Glycin + 876,6 g Natriumchlorid auf 1,5 M Glycin/3 M Natriumchlorid eingestellt. Der pH-Wert der Lösung wurde mit 5 M Natriumhydroxid auf 8,9 eingestellt. Die so erhaltene Lösung wurde durch Pumpen durch einen Vorfilter (Millipore 'Polygard'-Kartuschenfilter) und dann einen 0,45-μ-Filter (Millipore Millidisk PVDF-Kartuschenfilter) filtriert.
Eine Nygene-Protein-A-Kartusche mit 500 mg nominaler IgG-Kapazität und einem Bettvolumen von 500 ml wurde mit 4 Bettvolumina von 0,45μ-vorfiltriertem 1,5 M Glycin/3 M Natriumchlorid-Puffer, pH 8,9, bei einer Fließgeschwindigkeit von 500 ml/Minute unter Anwendung einer peristaltischen Pumpe gewaschen.
Alle anschließend mit der Nygene-Kartusche verwendeten Puffer wurden durch einen 0,45-μ-Filter vorfiltriert.
Der filtrierte 55.1-Kulturüberstand wurde bei einem pH-Wert von 8,9 ebenfalls bei 500 ml/min durch die Kartusche gepumpt, und die Säule wurde mit den 5 Bettvolumina des Glycin-Salz-Puffers gewaschen, bis jeglicher Methylrotindikator von der Kartusche entfernt war. Die Kartusche wurde dann bei der gleichen Fließgeschwindigkeit mit 1 Bettvolumen PBS gewaschen, und anschließend wurde der 55.1-Antikörper bei einer Fließgeschwindigkeit von 250 ml/min mit 3 Bettvolumina 100 mM Natriumcitrat, pH 2,8, eluiert, wobei 50-ml-Fraktionen abgenommen wurden und das Vorliegen des AK durch W A280 nm verfolgt wurde. Alle antikörperhaltigen Fraktionen wurden vereinigt und mit 1M Natriumhydroxid neutralisiert.
Die Glycin/Salz-Säulenabläufe und Waschlösungen wurden nochmals über die Protein-A-Kartusche gegeben, wodurch man weitere etwa 15% Antikörper mit der anschließenden Citratwäsche erhielt.
Der Puffer der vereinigten Antikörper wurde gegen PBS-Puffer (PBS = phosphate-buffered saline, phosphatgepufferte Kochsalzlösung) ausgetauscht. SDS-PAGE der vereinigten Antikörper zeigte eine Reinheit von > 90% bei einer Antikörperausbeute von 360 mg.
BEISPIEL 3 – Gewinnung von antikörperbindenden Strukturen unter Anwendung rekombinanter DNA-Technologie
3.1 Bestimmung der cDNA-Sequenzen der schweren und leichten Kette von 55.1
Im folgenden Beispiel wird die Konstruktion einer cDNA-Bibliothek aus dem 55.1-Hybridom, die Isolierung von spezifischen, für die Proteine der schweren und leichten Kette kodierenden cDNA-Klonen und die Bestimmung der vollständigen DNA-Sequenz dieser Klone beschrieben.
3.1 (a) Gewinnung von mRNA aus Hybridomzellen
Für die Isolierung von polyA+ mRNA aus eukaryontischen Zellen gibt es mehrere Vorschriften (Sambrook J., Fritsch E. F., Maniatis T., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2. Auflage, 1989, Kapitel 8, S. 3, im folgenden als Maniatis bezeichnet). Ein solches Verfahren steht in Form eines Kits von Pharmacia zur Verfügung; dieses Verfahren beruht auf der Lyse einer relativ kleinen Zahl an Zellen (10⁷ oder weniger) und anschließende Bindung von polyA+ mRNA an eine Oligo-dT-Säule. Nicht gewünschte Zellkomponenten werden durch Waschen mit einer niedrigen Salzkonzentration entfernt, bevor bei erhöhter Temperatur die mRNA mit einer salzreichen Lösung eluiert wird.
mRNA wurde aus 10⁷ 55.1-Hybridomzellen unter Anwendung des Quickprep-mRNA-Kits (Pharmacia Biotechnology Ltd.) gewonnen. Die Konzentration der mRNA wurde durch Scannen einer Probe bei 300–220 nm in einem Uvikon-930-Spektrophotometer (Kontron Instruments) unter Annahme einer Extinktionskoeffizienten von 40 μg/ml bei 260 nm abgeschätzt. Die mRNA wurde als 2,5-μg-Aliquots, ausgefällt in Ethanol, aufbewahrt.
3.1 (b) cDNA-Synthese und Klonen
Das für die cDNA-Synthese angewandte Verfahren basierte auf dem von Gubler und Hofman, das auf der reversen Transkription von geprimter mRNA und anschließender RNAse-H-Behandlung zum Primen und zur Synthese des zweiten Strangs durch DNA-Polymerase I beruht. Einen Überblick über andere Methoden zur Synthese von cDNA gibt Maniatis (Kapitel 8).
Eine 5-μg-Probe von mRNA wurde in einer mit RNAsefreiem Wasser zubereiteten 10-μl-Lösung mit 2,5 u Placenta-RNAse-Inhibitor (Life Technologies Ltd.) durch Inkubieren bei 70°C mit Oligo-dT (12–18mer Mischung, Pharmacia Biotechnology Ltd., 0,5 μg) geprimt und dann mit Eis gekühlt. Anschließend wurde der erste cDNA-Strang synthetisiert, indem man 4 μl 5 × H-RT-Puffer (250 mM Tris, pH 8,3, 200 mM KCl, 30 mM MgCl₂ und 0,5 mg/ml BSA), 2 μl 0,1 M DTT (Dithiothreit), 1 μl dNTP-Mix (dATP, dCTP, dGTP und dTTP zu 20 mM), 4 μl Superscript Reverse Transcriptase (Life Technologies Ltd.) zugab und 1 Stunde lang bei 42°C inkubierte. Zur Bildung des zweiten Strangs wurden 1,5 μl dNTP-Mix (wie oben), 92,5 μl RNAse-freies Wasser, 30 μl 5 × Reaktionspuffer (125 mM Tris, pH 7,5, 500 mM KCl, 25 mM MgCl2, 50 mM (NH₄)₂SO₄ und 0,5 mg/ml β-NAD), 1 μl T4-DNA-Ligase (10 u, Life Technologies Ltd.), 4 μl DNA-Polymerase I (40 u, Life Technologies Ltd.) und 1 μl RNAse H (2,7 u, Life Technologies Ltd.) zugegeben und weitere 2 Stunden lang bei 16°C inkubiert. Um sicherzustellen, daß man eine cDNA mit stumpfem Ende erhielt, wurde nach Zugabe von 2 μl T4-DNA-Polymerase (10 u, Life Technologies Ltd.) abschließend 5 Minuten lang bei 16°C inkubiert. Die Enzymaktivität wurde dann durch 10minütiges Inkubieren bei 70°C gestoppt.
Zu Vorbereitung der cDNA für das Klonen wurde die obige Lösung mit dem gleichen Volumen an Phenol extrahiert und die so erhaltene wäßrige Phase wurde mit dem gleichen Volumen an Phenol : Chloroform (50 : 50 v : v) extrahiert, um Proteine zu entfernen, bevor durch Zentrifugiersäulenchromatographie mit Sepharose C4-LB in einer von Pharmacia Bioctechnology Ltd. erworbenen Säule, angewendet gemäß den Angaben des Herstellers, aufgereinigt wurde. Die aufgereinigte cDNA wurde dann mit 5 μl EcoRI/NotI-Adaptoren (Pharmacia Biotechnology Ltd.), 1 μl ATP-Lösung (5 mM) und 3 μl T4-DNA-Ligase (10 u, Pharmacia Biotechnology Limited) gemischt und über Nacht bei 12°C inkubiert. Die cDNA plus Adaptoren wurde dann durch Zugabe von 10 μl ATP-Lösung (5 mM) und 1 μl T4-Polynukleotidkinase (10 u, Pharmacia Biotechnology Limited) und 30minütiges Inkubieren bei 37°C phosphoryliert. Die Lösung wurde abermals mit gleichen Volumina Phenol und Phenol : Chloroform extrahiert und zum Entfernen überschüssiger Adaptoren durch Zentrifugiersäulenchromatographie aufgereinigt. Die cDNA auf dieser Stufe ist fertig für das Klonieren in ein geeignetes Plasmid oder einen geeigneten Phagenvektor.
Zum Erstellen einer cDNA-Bibliothek wurde pBluescript (Stratagene Cloning Systems) verwendet. Dieser Phagemidvektor verfügt über eine einzelne EcoRI-Klonierungsstelle, ein Ampicillinresistenzgen und sowohl ColEI- als auch fI-Replikationsursprünge für die Isolierung von entweder doppelsträngiger oder einzelsträngiger DNA. 5 μg pBluescript KS-DNA wurde mit 30 u EcoRI (Promega Corporation) in einer 90 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM MgCl2 und 50 mM NaCl enthaltenden Lösung bei 37°C 45 Minuten lang vollständig verdaut. Zum Abspalten der 5'-Phosphatgruppen wurden dann 2 μl alkalische Phosphatase aus Kälberdarm (2 u, Boehringer Mannheim) zugesetzt und weitere 30 Minuten lang bei 37°C inkubiert. Die Phosphataseaktivität wurde durch 10minütige Inkubation bei 70°C zerstört.
5 μl der cDNA plus Adaptoren wurde mit 25 ng EcoRI/CIP-behandeltem pBluescript in einer Lösung mit 30 mM Tris-HCl, pH 7,8, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, 1 mM ATP und 1,5 u T4 DNA-Ligase (Promega Corporation) bei 16°C 2,5 Stunden lang ligiert. 5-μl- und 2,5-μl-Aliquots dieses Ansatzes wurden für die Transformation von 100 μl bzw. 50 μl kompetenten DH5α-Zellen von E. coli (Life Technologies Ltd.) unter Anwendung des mit den Zellen gelieferten Protokolls verwendet. Transformierte Zellen wurden auf L-Agar plus 100 μg/ml Ampicillin, 1 mM IPTG und 0,2% X-Gal plattiert und über Nacht bei 37°C inkubiert. Klone mit cDNA-Insertionen wurden danach ausgewählt, daß sie auf dem obigen Medium weiße Kolonien bildeten, im Gegensatz zu der von den ausgangsplasmidhaltigen Zellen gebildeten blauen Farbe. Zweihundert weiße Kolonien wurden in 50er Chargen jeweils zweimal auf Nitrocellulosescheiben (Schleicher und Schull) übertragen, die auf Platten mit L-Agar plus Ampicillin gelegt wurden. Ein dritter Satz Platten ohne Filter wurde ausgestrichen, wodurch ein Masterstock der ausgewählten Kolonien gebildet wurde. Nachdem über Nacht bei 37°C inkubiert worden war, wurden die Nitrocellulosefilter abgenommen und nach dem Verfahren von Grunstein und Hogness (Maniatis, Kapitel 1, S. 102) aufgearbeitet, wodurch die Bakterienzellen in situ lysiert wurden. Die Filter wurden auf 3 MM-Papier (Whatman) gelegt, das in verschiedenen Reagentien eingeweicht worden war – 10% SDS (2 Minuten), 3 M NaOH, 1 M NaCl (5 Minuten) und 1 M Tris, pH 6,8 (2 × 2 Minuten). Die die lysierten Zellen enthaltenden Filter wurden auf 3 MM-Papier übertragen, das mit 20 × SSC (3 M NaCl, 0,3 M Natriumcitrat) angefeuchtet worden war, und die DNA wurde mit den Filtern quervernetzt, indem man sie in einem auf Auto-Crosslink (120.000 μJoule) eingestellten Stratalinker 2400 (Stratagene Ltd.) UV-Licht aussetzte. Die Filter wurden vor der Verwendung zum Testen (siehe unten) an der Luft getrocknet. Die Masterstock-Platten wurden bis zur Verwendung bei 4°C aufbewahrt.
3.1 (c) Screening der cDNA-Bibliothek
Zur Gewinnung effektiver Sonden für das Screening der cDNA-Bibliothek wurden die DNAs der variablen Regionen der schweren und leichten Ketten von 55.1 durch Polymerasekettenreaktion (PCR, Saiki, R. et al., 1985, Science, Band 230 S. 1350–1354) isoliert. Dies war möglich, da die Daten der N-terminalen Proteinsequenz für beide Ketten zur Verfügung stehen (siehe oben). Mit diesen Daten wurden 5'-PCR-Primer entwickelt (SEQ ID NR: 1–4). Für jede Sequenz wurden zwei Primer synthetisiert, von denen einer auf den am häufigsten vorkommenden, aus veröffentlichten Sequenzen (Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4. Auflage, 1987, Kabat, E. A., Wu, T. T., Reid-Miller, M., Perry, H. M. und Gottesman, K. S., veröffentlicht vom U.S. Department of Health and Human Services, im folgenden als Kabat bezeichnet) bestimmten Codons für Maus-V-Regionen basierte (SEQ ID NR: 1 und 3) und der andere in einigen Basenpositionen degeneriert war, um mehrere Codonoptionen abzudecken (SEQ ID NR: 2 und 4). Die PCR-Primer für das 3'-Ende (SEQ ID NR: 5 und 6) waren zu den in Kabat für die 5'-Regionen von CH1 von IgG1 bzw. den 3'-Terminus von Cκ veröffentlichten Sequenzen komplementär. Der Schwere-Ketten-Isotyp wurde durch einen Assay (siehe oben) bestimmt, und die N-terminale VL-Proteinsequenz deutete darauf hin, daß es sich bei der leichten Kette um den kappa-Isotyp handelte. Diese Primer für das 3'-Ende der konstanten Region konnten auch selbst als Screeningsonden verwendet werden.
3.1 (d) Oligo-Synthese
Alle verwendeten Oligonukleotidsequenzen wurden nach den von Applied Biosystems Inc. zur Verfügung gestellten Protokollen im 0,2-μmol-Maßstab auf Applied Biosystems 380B- oder 394-DNA-Synthesizern aus 5'-Dimethoxytrityl-basengeschützten Nukleosid-2-cyanoethyl-N,N-di-isopropyl-phosphoramiditen und geschützten Nukleosiden, die an Glas mit definierter Porengröße gebunden waren, synthetisiert.
Alternativ dazu können die Oligonukleotide manuell durch von Atkinson und Smith in "Oligonucleotide Synthesis, a manual approach" (M. T. Gait, Herausgeber, IRL Press, Oxford, Washington D. C., Seiten 35–81) beschriebene Verfahren hergestellt werden.
Die synthetisierten Oligonukleotide wurden jeweils, nachdem sie von der Festphase abgespalten worden waren und alle Schutzgruppen entfernt worden waren, in doppelt destilliertem Wasser (1 ml) gelöst.
3.1 (e) Herstellung der Sonde
DNA-Fragmente der variablen Region wurden mittels PCR aus cDNA hergestellt. 1 μl cDNA wurde zu 100 μl einer Reaktionsmischung gegeben, die 10 mM Tris-HCl, pH 8,3, 50 mM KCl, 0,1% Gelatine, 1,5 mM MgCl2, jeweils 1,25 mM dATP, dCTP, dGTP und dTTP, jeweils 1 μM eines geeigneten Oligopaars und 2,5 u Taq-DNA-Polymerase (Amplitaq, Perkin-Elmer Cetus) enthielt. Die Ansätze wurden jeweils mit 100 μl Mineralöl überschichtet und 1,5 Minuten lang bei 94°C, 1 Minute bei 50°C und 2,0 Minuten bei 72°C über 25 Zyklen plus 10 Minuten bei 72°C inkubiert. Außerdem wurden Kontrollreaktionen ohne DNA durchgeführt.
Die PCR-Reaktionen wurden analysiert, indem man jeweils eine 5-μl-Probe auf 0,8%igem Agarosegel (Pharmacia Biotechnology) laufen ließ, das anschließend mit einer 1-μg/ml-Ethidiumbromidlösung (Sigma Chemical Company Ltd.) angefärbt wurde, wobei die DNA auf einem UV-Transilluminator sichtbar gemacht wurde. Bei allen PCRs mit 55.1-cDNA war das Vorhandensein einer Bande von ungefähr 400 bp zu erkennen, was eine erfolgreiche Amplifikation der variablen Regionen anzeigt. Das Fehlen einer DNA-Bande bei den Kontrollreaktionen zeigte, daß die verwendeten Reagentien keine kontaminierende DNA enthielten.
Die PCR-Produkte wurden jeweils mittels eines Centricon 100-Mikrokonzentrators (Amicon Ltd.) aufgereinigt. Die Ansätze wurden jeweils in einen Konzentrator gegeben, und das Volumen wurde durch Zugabe von doppelt destilliertem Wasser auf 2 ml erhöht. Die Einheit wurde dann 5 Minuten lang bei 2000 U/min zentrifugiert, und der Durchfluß wurde verworfen. Das zurückgehaltene Material wurde dann wieder auf 2 ml verdünnt, und die Einheit wurde nochmals zentrifugiert. Dieses Verfahren wurde ein drittes Mal wiederholt. Durch dieses Vorgehen werden überschüssige Oligos und Pufferkomponenten aus der amplifizierten DNA entfernt.
Mit den amplifizierten VH- und VL-Fragmenten wurden spezifische Hybridisierungssonden für cDNA-Klone der schweren und leichten Kette gewonnen. Radioaktiv markierte Sonden wurden mit einem T7 QuickPrime-Kit (Pharmacia Biotechnology Ltd.) wie folgt hergestellt 5 μl (~50 ng) des aufgereinigten PCR-Produktes wurden zu 32 μl doppelt destilliertem Wasser gegeben, und das Ganze wurde 2 Minuten lang bei 100°C inkubiert, wodurch die doppelsträngige DNA denaturiert wurde. Diese Probe wurde dann auf Eis gekühlt und anschließend mit 10 μl Reagensmix (eine gepufferte wäßrige Lösung mit dATP, dGTP, dTTP und statistischen Oligoprimern, vorwiegend 9meren), 2 μl α32P dCTP (20 μCi 3000 Ci/mmol, NEN), und 1 μl T7-Polymerase (4–8 u) versetzt. Der Ansatz wurde 20 Minuten lang bei 37°C inkubiert und dann mit 6 × SSC (1 M NaCl, 0,1 M Natriumcitrat), 0,1% SDS (sodium dodecyl sulphate, Natriumdodecylsulfat) und 0.25% Marvel^TM (fettreduziertes Trockenmilchpulver) auf 10 ml aufgefüllt, die dann als Sondenlösung verwendet wurden.
3.1 (f) Sondieren der Bibliothek
Die die ausgewählten Klone enthaltenden behandelten Filter (siehe oben) wurden in jeweils zwei Ansätzen in jeweils 90 ml 6 × SSC, 0,1% SDS, 0,25% Marvel^TM 3 Stunden lang bei 65°C in einem Techne HB-1-Hybridisationsofen unter Verwendung von rotierenden Glassröhrchen vorhybridisiert. Die Doppelansätze wurden dann jeweils im gleichen Apparat über Nacht bei 65°C mit 10 ml Sondenlösung (ein Ansatz mit der VH-Sonde und der andere mit VL) sondiert. Nach der Inkubation wurden die Filtersätze im gleichen Apparat jeweils 15 Minuten lang bei 65°C mit 100 ml 6 × SSC, 0,1% SDS, 30 Minuten lang bei 65°C mit 100 ml 3 × SSC, 0,1% SDS und 30 Minuten lang bei 65°C mit 100 ml 1 × SSC, 0,1% SDS gewaschen. Die gewaschenen Filter wurden an der Luft getrocknet und bei –70°C einer Autoradiografie mit Hyperfilm^TM MP (Amersham International) in Kombination mit einer schnellen Wolfram-Verstärkerfolie unterzogen.
Nach der Entwicklung des Films in einem automatischen Kodak-Filmentwicklungsgerät wurden 2 potentielle cDNA-Klone der schweren Kette und 1 potentieller cDNA-Klon der leichten Kette eindeutig durch Hybridisierung der entsprechenden Sonde identifiziert. Die Häufigkeit des Vorkommens der indentifizierten Antikörper-cDNA-Klone ist typisch für Hybridom-cDNA-Bibliotheken (Levy, S. et al., 1987, Gene, Band 54, S. 167–173).
3.1 (g) DNA-Sequenzanalyse von cDNA-Klonen
Die durch die Hybridisierung identifizierten potentiellen cDNA-Klone der schweren und leichten Kette wurden von der Masterplatte abgenommen und für die Plasmid-DNA-Herstellung im Großmaßstab verwendet. Mit den Klonen wurden jeweils 200 ml L-Brühe plus Ampicillin in einem 500-ml-Erlenmeyer-Kolben inokuliert. Die Kulturen wurden unter Schütteln über Nacht bei 37°C inkubiert. Nach der Kultivierung wurden die Zellen aus den Kulturen in einer Sorvall RC5C-Zentrifuge mit GS3-Rotor jeweils durch 10minütiges Zentrifugieren bei 5000 × g und bei 4°C pelletiert. Das Zellpellet der Kulturen wurde jeweils in 20 ml TE-Puffer resuspendiert und nochmals 10 Minuten lang bei 4°C in einer Sorvall RC5C-Zentrifuge mit SS-34-Rotor bei 2000 × g in einem Oak-Ridge-Röhrchen zentrifugiert. Die gewaschenen Zellpellets wurden jeweils in 3 ml eiskalter 25%iger Saccharoselösung, 50 mM Tris, pH 8,0, resuspendiert und auf Eis aufbewahrt. Frische Lysozymlösung (1,0 ml bei 10 mg/ml) wurde zugesetzt, der Inhalt wurde durch Rollen des Röhrchens durchmischt und es wurde noch weitere 5 Minuten lang inkubiert. Natriumethylendiamintetraessigsäurelösung (EDTA-Lösung) (1,0 ml einer 0,5 mM Lösung, pH 8,5) wurde zugegeben und der Inhalt wurde sachte durchmischt. Abschließend wurde mit 5,0 ml eiskalter Triton-X-Lösung (0,1% Triton X-100, 62,5 mM EDTA, 50 mM Tris, pH 8,0) versetzt, der Inhalt wurde sachte durchmischt und es wurde weitere 10 Minuten lang auf Eis inkubiert. Die Zelltrümmer wurden dann in einer Sorvall RCSC-Zentrifuge mit SS-34-Rotor durch 30minütiges Zentrifugieren bei 39.000 × g bei 4°C pelletiert. Der die Plasmid-DNA enthaltende Überstand wurde zu 16 g Caesiumchlorid und 150 μl Ethidiumbromidlösung (10 mg/ml) gegeben, und das Volumen wurde durch Zugabe von TE-Puffer auf 18,5 ml erhöht. Diese Lösung wurde in ein 18,5-ml-Polypropylen-Zentrifugenröhrchen mit Crimpdeckel (Sorvall Instruments) überführt. Das Röhrchen wurde verschlossen und in einer Sorvall OTD65B-Zentrifuge mit TV865B-Rotor (Titan, vertikal) 16 Stunden lang bei 180.000 × g und 18°C zentrifugiert.
Nach dem Zentrifugieren war die Plasmid-DNA als deutliche orangefarbene Bande im gebildeten CsCl/EtBR-Dichtegradienten sichtbar. Die Plasmid-DNA wurde unter Verwendung einer Injektionsspritze, mit der die Wand des Röhrchens durchstochen wurde, aus dem Gradienten abgezogen. Die aus dem Gradienten entnommene Probe wurde 3–4fach mit TE-Puffer verdünnt, und die DNA wurde durch Zugabe des gleichen Volumens an Isopropylalkohol ausgefällt und 10 Minuten lang auf Eis inkubiert. Die ausgefällte DNA wurde durch Zentrifugieren bei 17.000 × g in einer Sorvall RC5C-Zentrifuge mit SS-34-Rotor bei 4°C pelletiert, und der Überstand wurde verworfen. Das so erhaltene Pellet wurde mit 70%igem Ethanol (v/v) gewaschen und nochmals 5 Minuten lang zentrifugiert. Das Pellet wurde dann im Vakuum getrocknet, in 1,8 ml TE-Puffer und 200 μl 3 M Natriumacetatlösung resuspendiert und mit dem gleichen Volumen an Phenol extrahiert, wobei zur Phasentrennung 2 Minuten bei 17.000 × g zentrifugiert wurde. Die wäßrige Phase wurde nochmals mit dem gleichen Volumen an Chloroform extrahiert, bevor man die DNA durch Zugabe des gleichen Volumens an Ethanol bei –20°C ausfällte und 10 Minuten lang auf Eis inkubierte. Die aufgereinigte DNA wurde wie oben pelletiert und mit 70%igem Ethanol gewaschen, und das Pellet wurde im Vakuum getrocknet. Das getrocknete Pellet wurde in 500 μl doppelt destilliertem Wasser resuspendiert, und die DNA Konzentration wurde durch Scannen einer verdünnten Probe bei 300 bis 220 nm in einem UV-Spektrophotometer unter Anwendung eines Extinktionskoeffizienten von 50 μg/ml/OD 260 nm abgeschätzt.
Diese aufgereinigte Plasmid-DNA wurde für die DNA-Sequenzanalyse verwendet. Doppelsträngige DNA läßt sich unter Anwendung der Didesoxykettenterminierungsmethode von Sanger (Proc. Nat. Acad. Sci. USA 74, 1977, S. 5463) mit einem gemäß den beigefügten Protokollen angewendeten Marken-Sequenzierkit wie dem Sequenase-Kit von United States Biochemical Company zur DNA-Sequenzanalyse verwenden.
Für die DNA-Sequenzanalyse wurden Aliquots (2–4 μg) der Plasmid-DNA der cDNA-Klone der schweren und leichten Ketten verwendet. Die Aliquots wurden jeweils zunächst durch Inkubieren mit 0,2 M NaOH, 0,2 mM EDTA in einem Endvolumen von 100 μl 10 Minuten lang bei Raumtemperatur denaturiert. Die denaturierte DNA wurde dann durch Zusatz von 10 μl 3 M Natriumacetatlösung (pH 5,0) und 275 μl Ethanol ausgefällt und 10 Minuten lang auf Eis inkubiert. Die ausgefällte DNA wurde wie oben für die Plasmid-DNA beschrieben zurückgewonnen. Die denaturierte DNA wurde dann durch 2 Minuten Inkubieren mit jeweils 0,5 pmol eines geeigneten Primers in Gegenwart von Sequenase-Reaktionspuffer (40 mM Tris, pH 7,5, 25 mM MgCl2, 50 mM NaCl) und 10% Dimethylsulfoxid (DMSO) bei 65°C und anschließendes schrittweises Abkühlen auf 30°C für die Sequenzierung geprimt. Diese geprimten Matrizen wurden dann gemäß den beigefügten Protokollen für die Sequenzierungsreaktionen verwendet, wobei den Mischungen für Markierungen und Terminierungen 10% DMSO zugesetzt wurde.
Die Sequenzierungsreaktionen wurden nach hochauflösender Polyacrylamid-Gelelektrophorese durch Autoradiographie analysiert (Sanger und Coulson, 1978, FEBS Lett. 87, S. 107).
Die vollständigen Sequenzen der schweren und leichten Ketten der klonierten cDNAs sind unten angeführt (SEQ ID NR: 23 für die cDNA der H-Kette, SEQ ID NR: 36 für die Aminosäuresequenz, wobei die Korrelation zwischen beiden in 15 gezeigt ist; ebenso zeigt SEQ ID NR: 24 die cDNA der L-Kette, SEQ ID NR: 37 zeigt die Aminosäuresequenz und 16 zeigt die Korrelation zwischen beiden). Die Authentizität dieser Kodesequenzen wurde durch Vergleich mit einer aus aufgereinigtem Antikörperprotein gewonnenen N-terminalen Proteinsequenz bestätigt. Durch die DNA-Sequenz wird auch bestätigt, daß der Antikörper vom IgG1κ-Isotyp ist.
3.2 Expression des gesamten 55.1-Antikörpers in Myelomzellen
Im folgenden Beispiel wird die Expression des 55.1-Antikörpers in Myelomzellen unter Verwendung von in pRc/CMV klonierten Sequenzen (8) beschrieben.
pRc/CMV (8) verwendet die Enhancer/Promotor-Sequenzen aus dem unmittelbaren frühen Gen des humanen Cytomegalovirus (CMV) für hohe Transkriptionsniveaus, ein Neomycinresistenzgen für die Selektion von geneticinsulfatresistenten (G418-resistenten) stabilen Zellinien, jeweils nur einmal vorhandene Restriktionsenzymstellen (HindIII, BstXI, NotI, XbaI und ApaI) downstream von der Promotorsequenz und Polyadenylierungssignal/Transkriptionsterminierungs-Sequenzen aus Rinderwachstumshormon 3' von den Klonierungsstellen.
3.2 (a) Subklonieren in pRc/CMV
Die 55.1 cDNAs lassen sich intakt aus dem pBluescript-Vektor auf einem NotI-Fragment ausschneiden. Die Fragmente können anschließend jeweils unabhänig voneinander in die NotI-Stelle von pRc/CMV kloniert werden, um eine Expression vom CMV-Promotor zu ermöglichen.
Aliquots der verschiedenen DNAs, pRc/CMV (3 μg) p55.1H (5 μg) und p55.1L (10 μg) werden getrennt in einer Lösung verdaut, die NotI (5 u/μg), 10 mM Tris-acetat (pH 7,5), 10 mM Magnesiumacetat, 50 mM Kaliumacetat und 0,1% Triton X-100 enthält, wobei mindestens 1 Stunde lang bei 37°C inkubiert wird. Darüber hinaus wird das Produkt der Verdauung von pRc/CMV mit NotI anschließend in der gleichen Lösung 40 Minuten lang bei 37°C mit alkalischer Phosphatase aus Kälberdarm (2u, Pharmacia Biotechnology Ltd.) behandelt, und das Enzyms wird 15 Minuten bei 80°C inaktiviert. Hierdurch verhindert man einen erneuten Ringschluß des Vektors beim Ligieren. Die vollständige Verdauung wird durch Agarose-Gelelektrophorese analysiert, und die entsprechenden DNA-Fragmente (das pRc/CMV-Vektorband, 5,5 Kbp, und die 55.1-H- und -L-Insertionen, 1,5 Kbp bzw. 800 bp) werden aus dem Gel ausgeschnitten und wie oben aufgereinigt.
Die 55.1-cDNA-Fragmente werden jeweils wie oben beschrieben in getrennten Reaktionen mit dem pRc/CMV-Vektorfragment ligiert. Die ligierte DNA wird zur Transformation kompetenter DH5α-Zellen verwendet, und ampicillinresistente Klone werden für die Plasmid-DNA-Gewinnung und Restriktionsenzymanalyse mit NotI ausgewählt, wodurch die pRc/CMV-Klone mit den 55.1-H- und -L-Ketten-Insertionen identifiziert werden. Anschließend wendet man die PCR an, um die Klone mit der korrekten Orientierung der Insertion für die Expression aus denen mit der entsprechenden NotI-Insertion zu identifizieren. Aus jedem in Frage kommenden Klon wird eine Kolonie in 1 ml doppelt destilliertem Wasser resuspendiert. Die Zellen werden dann durch 1minütiges Zentrifugieren in einer Mikrozentrifuge bei 6000 U/min pelletiert, 800 μl des Überstands werden verworfen und das Zellpellet wird in den verbliebenen 200 μl resuspendiert. Die Zellen werden dann durch 1minütiges Inkubieren bei 100°C aufgebrochen, und das unlösliche Material wird 2 Minuten bei 12000 U/min in einer Mikrozentrifuge pelletiert. Ein μl des klaren Überstands wird dann in einem 20-μl-PCR-Ansatz mit einem T7-Promotor-Primer (SEQ ID NR: 7) und entweder – bei H-Ketten-Klonen – einem internen H-Ketten-Primer (SEQ ID NR: 8) oder – bei L-Ketten-Klonen – einem internen L-Ketten-Primer (SEQ ID NR: 6), 200 μM dNTPs, 10 mM Tris-HCl (pH 8,3), 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl2, 0,01% Gelatine und 0,5 u Taq-Polymerase (Amplitaq) eingesetzt und mit 20 μl leichtem Mineralöl (Sigma Chemical Company Ltd.) überschichtet. Kontrollreaktionen ohne DNA werden zum Nachweis von Verunreinigungen der Reagenzlösungen angesetzt. Alle Ansätze werden in einem programmierbaren Thermostaten (Techne PHC-1) 1,5 Minuten bei 94°C, 1,0 Minuten bei 50°C, 2 Minuten bei 72°C über 20 Zyklen plus 10 Minuten bei 72°C inkubiert. Die PCR-Produkte werden analysiert, indem man den gesamten Ansatz auf einem 0,8% Agarosegel laufen läßt. Klone mit der für die Expression korrekten Fragmentorientierung werden dadurch identifiziert, daß im Gegensatz zu den Kontrollreaktionen ein PCR-Produkt (~900 bp für die H-Kette und ~600 bp für die L-Kette) vorhanden ist. Klone mit der inkorrekten Fragmentorientierung produzieren kein PCR-Produkt, da beide Oligonukleotide den gleichen DNA-Strang primen. Ein H-Ketten-Klon mit der korrekten Orientierung wird als pRe/55.1H und ein korrekter L-Ketten-Klon als pRc/55.1L bezeichnet.
Mit diesen Klonen werden wie oben beschriebene Plasmidherstellungen im Großmaßstab durchgeführt, damit ausreichend DNA für die Transfektion von Myelomzellen zur Verfügung steht. Vor der Transfektion wird jeweils eine Probe (50 μg) der Plasmid-DNA (pRc55.1H, pRc55.1L und pRc/CMV) in einer Lösung mit 25 μ BglII, 6 mM Tris-HCl, pH 7,9, 6 mM MgCl2, 100 mM NaCl und 1 mM DTT bei 37°C mindestens 1 Stunde lang vollständig mit BglII verdaut. BglII linearisiert die Plasmid-DNA an einer Stelle außerhalb der Antikörpersequenzen und wichtiger Kontrollelemente und sollte die Integration der Expressionkassette in das Wirtsgenom erleichtern.
3.2 (b) Transfektion von Myelomzellen
Zum Einschleusen von DNA in eukaryontische Zellen gibt es verschiedene Verfahren (Bebbington, C., 1991, Methods, Band 2, S. 136–145). In der letzten Zeit verwendet man routinemäßig das Verfahren der Elektroporation, das die Calciumphosphat-DNA-Coausfällung ersetzt. Letztere Methode hat jedoch den Vorteil, daß es hierbei mit größerer Häufigkeit zur Integration der Plasmid-DNA in die chromosomale DNA kommt, und die Methode wird hier bevorzugt, da die gemeinsame Integration von 2 Plasmiden, die jeweils den gleichen Resistenzmarker tragen, erforderlich ist. Es ist zu erwarten, daß ein Teil der nach der Cotransfektion von H- und L-Ketten-tragenden Plasmiden erhaltenen G418-resistenten Kolonien funktionelle Antikörpermoleküle exprimieren. Für diese Arbeitsschritte eignen sich NSO-Myelomzellen (Methods in Enzymology, 1981, 73B, S. 3. ECACC Kat.-Nr. 85110503) als Wirtszellen, da bei ihnen kein endogen sezerniertes Antikörperprotein vorhanden ist.
Die angewandte Vorgehensweise beruht auf der von Gorman (1986, DNA Cloning, Band 2, S. 143, Academic Press, New York). Exponentiell wachsende NSO-Zellen in nicht-selektivem Medium (Dulbecco's Modified Eagle Medium; Life Technologies Ltd., plus 10% fetales Kälberserum aus einer anerkannten Quelle) werden in einer Dichte von 5 × 10⁵ pro Schale in 10 ml nicht-selektivem Wachstumsmedium in 9-cm-Petrischalen gesät und 24 Stunden lang bei 37°C inkubiert. Unmittelbar vor der Transfektion wird die Plasmid-DNA zusammen mit Calciumphosphat ausgefällt. Linearisierte Plasmid-DNA (pRc55.1H und pRc55.1L) wird in gleichen Teilen (jeweils 2,5, 5 oder 10 μg) in 0,5 ml einer wäßrigen, 62 mM CaCl2 enthaltenden Lösung gemischt. Die Mischungen werden dann jeweils zu 0,5 ml 2 × HBS-Lösung (280 mM NaCl, 2,8 mM Na2HPO4, 46 mM Hepes, pH 7,1) getropft, wobei die ganze Zeit gerührt wird. Dann leitet man Luft durch die Mischung, wodurch die Bildung des Calciumphosphat-DNA-Niederschlags unterstützt wird.
Das Wachstumsmedium wird von den NSO-Zellen abgenommen, und die Zellen werden dann mit 10 ml serumfreiem Medium gewaschen, das ebenfalls verworfen wird. Der Calciumphosphat-DNA-Niederschlag wird zusammen mit 1 ml serumfreiem Medium in eine Petrischale von Zellen gegeben. Man verwendet mehrere verschiedene Teile der beiden Expressionsplasmide und 2 verschiedene Mengen (5 und 10 μg) pRc/CMV als Kontrollen. Weiterhin wird eine Kontrolle ohne DNA angesetzt. Die Zellen werden 4 Stunden lang bei 37°C in Gegenwart des Niederschlags inkubiert, wobei gelegentlich geschaukelt wird, um zu verhindern, daß die Platte austrocknet. Der Niederschlag wird dann von den Zellen abgenommen und 1,5 Minuten lang durch 3 ml 15%iges Glycerin in 1 × HBS bei 37°C ersetzt, worauf mit 10 ml serumfreiem Medium gewaschen wird. Die Zellen werden dann 24 Stunden lang bei 37°C in 10 ml nicht-selektivem Medium inkubiert.
Nach 24 Stunden werden die transfizierten Zellen mit selektivem Medium (DMEM plus 10% FKS und 1,5 mg/ml G418-Geneticinsulfat, Life Technologies Ltd.) versetzt, und die Zellen werden dieser Selektion unterzogen, bis G418-resistente Kolonien in Erscheinung treten. Die Kolonien werden dann abgekratzt und unter G418-Selektion für die Analyse auf Antikörperexpression durch ELISA (siehe weiter unten) subkultiviert.
3.3 Expression von 55.1-Fragmenten in E. coli
In den folgenden Beispielen ist die Expression von chimären Fab'- und F(ab')2-Fragmenten (mit humanen konstanten Regionen) und einer Einzelketten-(singlechain) Fv (scFV) von 55.1 aus Plasmidvektoren in E. coli beschrieben.
3.3 (a) Vektorsysteme
Plasmidexpressionsvektoren, mit denen die Sezernierung von Antikörperfragmenten in das Periplasma von E. coli möglich ist, wurden von mehreren Gruppen beschrieben (Skerra, A. et al., 1991, Bio/Technology Band 9, S. 273–278. Carter, P. et al., 1992, Bio/Technology Band 10, S. 163–167. Better, M. et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. Band 90, S. 457–461). Diese bestehen im allgemeinen aus einem regulierbaren Promotor (lac, araB, lpp etc), der die Koexpression der Fd'- und L-Ketten-Fragmenten jeweils mit der eigenen Sekretions-Leadersequenz (pelB, ompA etc.) in einem Vektorhintergrund (pAT153, pUC19 etc), der die Selektion und Replikation innerhalb eines ausgewählten E. coli-Wirtes zuläßt, steuert. Ein solcher Vektor wurde konstruiert, indem man ein durch PCR aus Salmonella typhimurium gewonnenes araB/C-Promotor/Repressor-Element in einen auf pAT153 basierenden Vektor mit einem Tc-Resistenzgen, einer T4-Transkriptionsterminationssequenz und cer-Stabilitätsfunktion (ref) einschleuste. Zwei pelB-Leadersequenzen und humane CH1- und CK-Sequenzen wurden aus pSW1FabD1.3 (Skerra, A. et al., 1991, Anal. Biochem. Band 196, S. 151–155) gewonnen. Darüber hinaus wurden die pelB-Leadersequenzen zur Einführung spezifischer Restriktionsstellen durch stellengerichtete Mutagenese modifiziert. Die pelB-Sequenz upstream vom H-Ketten-Fragment wurde unter Einführung einer spezifischen NcoI-Stelle, d. h.
5' . . . TCGCTGCCCAACCAGCCATGGCC 3'
modifizert, wobei die unterstrichene Base eine G-zu-C-Substitution in der Originalsequenz darstellt, durch die die NcoI-Stelle (CCATGG) erhalten wurde.
Ein Vektor mit einer einzelnen pelB-Leadersequenz einschließlich der oben erwähnten NcoI-Stelle und den anderen Vektormerkmalen (pICI266) wurde gemäß Budapester Vertrag bei der National Collections of Industrial and Marine Bacteria Limited (NCIMB), 23 St. Machar Drive, Aberdeen, AB2 1RY, Schottland, Großbritannien, hinterlegt.
Auf ähnliche Weise wurde eine einzelne SfiI in die zweite pelB-Leadersequenz upstream von der L-Kette, d. h.
5' . . . TCGCGGCCCAACCGGCCCAGGCC 3'
eingefügt, wobei die unterstrichenen Basen für Basensubstitutionen stehen, durch die die SfiI-Stelle (GGCCCAACCGGCC) eingefügt und die Bildung einer zweiten NcoI-Stelle verhindert wird. Diese letzte Veränderung erfordert eine Aminosäuresubstitution (Met zu Gln), von der nicht anzunehmen ist, daß sie die Sezernierung beeinträchtigt, da der C-terminale Teil (Ala-Gln-Ala) jetzt mit dem des ompA-Leaders identisch ist.
Durch diese Modifikationen ist die Insertierung von Antikörper-V-Regionen upstream von und in-frame mit den entsprechenden C-Regionen auf einem NcoI-BstEII-Fragment bei VH und einem SfiI-XhoI-Fragment bei VL möglich. Dieses Plasmid hat im Vergleich zu früher beschriebenen Vektoren den Vorteil, daß sich die V-Regionen verschiedener Antikörper ohne N-terminale Aminosäuresubstitutionen insertieren lassen.
Die CH1-Sequenz des pSW1Fab-Ausgangsvektors wurde ebenfalls durch Wiedereinschleusung des Cys-Restes für die Wechselwirkung mit der L-Kette, des kompletten Gelenks und einer Verlängerung an CH2 zur Unterstützung der Dimerisierung modifiziert. Dies wurde durch Insertion von synthetischen Oligonukleotidsequenzen zwischen SalI- und SphI-Stellen der ursprünglichen Sequenz (SEQ ID NR: 9 und 10) und anschließende Insertion weiterer synthetischer Oligonukleotidsequenzen (SEQ ID NR: 11 und 12) zwischen den PmlI- und HpaI-Stellen der ersten Insertion bewerkstelligt.
Der c-terminale Cys-Rest in CK wurde ebenfalls durch stellengerichtete Mutagenese wiederhergestellt, um eine kovalente Wechselwirkung zwischen den Fd- und L-Ketten zu ermöglichen.
Plasmid pICI1646 ist in 2 gezeigt.
3.3 (b) Gewinnung von 55.1-Fab'- und -F(ab')2-exprimierenden Klonen.
3.3 (b) i Isolation von Fragmenten der V-Region von 55.1
Zur Isolierung der 55.1-VH- und -VL-Regionen aus cDNA-Klonen mittels PCR wurden synthetische Oligonukleotide (SEQ ID NR: 13–16) entwickelt. Die Oligos wurden auch in die entsprechenden Klonierungsstellen (NcoI und BstEII für VH und SfiI und XhoI für VL) eingeschleust, um eine anschließende Klonierung in pICI1646 zu ermöglichen.
Es wurden PCRs angesetzt, die 15 ng Matrizen-DNA (cDNA-Klon der 55.1-H- oder -L-Kette in pBluescript), 100 pmol jedes Oligos (SEQ ID NR: 13 und 14 für VH und SEQ ID NR: 15 und 16 für VL) in einem 100-μl-Ansatz mit 200 μM dNTPs, 10 mM Tris-HCl (pH 8,3), 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl2, 0,01% Gelatine und 2,5 u Taq-Polymerase (Amplitaq) enthielten, und mit 100 μl leichtem Mineralöl überschichtet. Kontrollreaktionen ohne DNA wurden zum Nachweis von Verunreinigungen der Reagenzlösungen angesetzt. Alle Ansätze wurden in einem programmierbaren Thermostaten (rechne PHC-1) 1,5 Minuten bei 94°C, 1,0 Minuten bei 50°C, 2 Minuten bei 72°C über 20 Zyklen plus 10 Minuten bei 72°C inkubiert. Die PCRs wurden analysiert, indem man eine 5-μl-Probe auf einem 0,8% Agarosegel laufen ließ.
Die verbliebenen Fraktionen der PCR-Ansätze mit VH- und VL-Fragmenten wurden zum Entfernen von überschüssigen Oligos unter Anwendung von Centricon 100-Mikrokonzentratoren mit 3 jeweils 5minütigen Waschungen mit 2 ml doppelt destilliertem Wasser bei 1000 × g (wie oben beschrieben) aufgereinigt. Die die isolierten Fragmente der V-Region enthaltende Fraktion wurde zurückgehalten, und die DNA wurde innerhalb von 10 Minuten in 70%igem Ethanol und 0,3 M Natriumacetatlösung auf Eis ausgefällt. Die DNAs wurden dann jeweils durch 10minütiges Zentrifugieren in einer Mikrozentrifuge bei 13.000 U/min pelletiert, und die Pellets wurden mit 70%igem Ethanol gewaschen und im Vakuum getrocknet.
3.3 (b) ii Restriktionsverdauung des 55.1-VH-Fragments
Das durch PCR isolierte 55.1-VH-Produkt wurde dann durch Resuspendieren in einer 200-μl-Lösung mit 10 mM Tris-acetat, pH 7,5, 10 mM Magnesiumacetat, 50 mM Kaliumacetat und 25 u BstEII, die 1 Stunde lang bei 65°C inkubiert wurde, mit BstEII verdaut. Dieser Ansatz wurde auf Eis gekühlt und mit NcoI verdaut, indem man die Konzentrationen der Pufferkomponenten verdoppelte, 50 u NcoI zusetzte und 1 Stunde lang bei 37°C inkubierte. Die verdaute DNA wurde zum Entfernen von Proteinkontamination gemäß beigefügtem Protokoll mit Strataclean-Harz (Stratagene Ltd.) behandelt. Die DNA wurde mit Ethanol ausgefällt und dann in 20 μl sterilem, doppelt destilliertem Wasser resuspendiert.
Das verdaute Fragment wurde dann einer Elektrophorese auf einem 0,75%igem SeaPlaque GTG-Agarosegel (FMC Bioproducts) unterzogen, und die einzelnen Fragmente wurden nach dem beigefügten Protokoll durch Phenolextraktion aus dem Gel gereinigt. Die DNA wurde dann mit Ethanol ausgefällt und in 10 μl sterilem destilliertem Wasser resuspendiert. Zum Abschätzen der DNA-Konzentration wurde jeweils eine 1-μl-Probe des Fragments einer Elektrophorese auf einem 0,8% Agarosegel unterzogen.
3.3 (b) iii Klonieren des 55.1-VH-Fragments in pICI1646
Eine 5-μg-Probe von pICI1646 DNA wurde wie oben beim 55.1-VH-Fragment mit BstEII und NcoI verdaut. Wie oben wurde die verdaute DNA aufgereinigt und die DNA-Konzentration geschätzt.
Dann wurde ein 10-μl-Ligierungsansatz mit 100 ng des BstEII-NcoI-Vektorfragments, 50 ng des BstEII-NcoI 55.1-VH-Fragments und 2,5 u T4 DNA-Ligase in 30 mM Tris-HCl, pH 7,8, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT und 1 mM ATP angesetzt. Der Ligationsansatz wurde 2 Stunden lang bei 16°C inkubiert, und dann wurden mit einem 1-μl-Aliquot 20 μl kompetenter DH5α-Zellen von E. coli (Life Technologies Ltd.) gemäß den vom Lieferanten beigefügten Protokollen transformiert. Transformierte Zellen wurden auf einer L-Agarplatte mit 10 μg/ml Tetracyclin plattiert, die dann über Nacht bei 37°C inkubiert wurde.
Von der Agarplatte wurden sechs tetracyclinresistente Kolonien abgekratzt und jeweils in 10 ml L-Brühe plus 10 μg/ml Tetracyclin inokuliert. Diese Kulturen wurden unter Schütteln über Nacht bei 37°C inkubiert und dann zur Gewinnung von Plasmid-DNA nach dem Verfahren von Birnboim und Doly wie in Maniatis (Kapitel 1, S. 38) angegeben verwendet. Potentielle 55.1-VH-Klone wurden, verglichen mit dem Stammplasmid, auf Basis der Akquisition einer einzelnen DraIII-Restriktionsstelle ausgewählt. Aus 4 dieser Klone wurden Plasmidzubereitungen in größerem Maßstab unter Anwendung einer CsCl/EtBr-Dichtegradientenzentrifugation (siehe oben unter "DNA-Sequenzanalyse von cDNA-Klonen") angefertigt, und die Klone wurden durch DNA-Sequenzanalyse nach dem Verfahren von Sanger gemäß Sequenase-Kit (United States Biochemical Corp.) verifiziert. Ein Klon mit der korrekten Sequenz wurde als pICI1655 bezeichnet.
3.3 (b) iv Subklonierung des 55.1-VL-Fragments in pICI1655
Das isolierte 55.1-VL-Fragment und die pICI1655-Plasmid-DNA (jeweils ~5 μg) wurden mit 25 u SfiI in 200-μl-Ansätzen mit 10 mM Tris-HCl, pH 7,9, 10 mM MgCl2, 50 mM NaCl und 1 mM DTT verdaut und 1 Stunde lang bei 50°C inkubiert. Anschließend wurde jeder Verdauungsansatz mit 24 u XhoI versetzt und es wurde 1 weitere Stunde lang bei 37°C inkubiert. Die Verdauungsansätze wurden dann mit Strataclean-Harz behandelt, die DNA wurde mit Ethanol ausgefällt, in 20 μl sterilem, doppelt destilliertem Wasser resuspendiert und einer Elektrophorese auf einem 0,75% SeaPlaque GTG-Agarosegel unterzogen und die entsprechenden Vektor- und VL-Fragmente wurden wie oben angegeben isoliert. Die Konzentration der isolierten DNA-Fragmente wurde abgeschätzt, indem man 1-μl-Aliquots auf einem 0,8% Agarosegel laufen ließ.
Unter den oben für 55.1 VH angewendeten Bedingungen wurde mit 100 ng pICI1655-SfiI-XhoI-Fragment und 50 ng 55.1 VL-SfiI-XhoI-Fragment eine Ligierungsreaktion angesetzt. Der Ligierungsansatz wurde 3 Stunden lang bei 16°C inkubiert, und dann wurde 1 μl für die Transformierung kompetenter DH5α-Zellen in tetracyclinresistente Zellen verwendet. Für die Plasmid-DNA-Zubereitung in kleinem Maßstab wurden acht tetracyclinresistente Kolonien ausgewählt. Diese DNAs wurden darauf gescreent, ob im Vergleich zum Stammvektor eine spezielle SstI-Stelle verlorengegangen war. Für die Plasmid-DNA-Gewinnung in großem Maßstab wurden potentielle 55.1-F(ab')2-Klone ausgewählt, wobei die Bestätigung wie oben ausgeführt durch Datenanalyse der DNA-Sequenz erfolgte. Ein Klon mit den vorhergesagten DNA-Sequenzen der V-Region von 55.1 wurde als pICI1656 bezeichnet.
3.3 (b) v Expressionstudien
Zur Analyse der Antikörperfragmentexpression wurde pICI1656-DNA zum Transformieren der E. coli-Stämme MC1000 (ATCC Nr. 39531) und MC1061 (ATCC Nr. 53338) [Casadaban, M. J. und Cohen, S. N., 1980, J. Mol. Biol., Band 138, S. 179–207] verwendet. Hierbei handelt es sich um ara-Stämme, die nicht dazu in der Lage sind, die vom araB-Promotor zur Induktion der Expression verwendete Arabinose zu metabolisieren. Aus diesen beiden Stämmen wurden kompetente Zellen gewonnen und entsprechend den in Maniatis (Kapitel 1, S. 74–84) zitierten Methoden zu tetracyclinresistenten Zellen transformiert. Unter Verwendung von reinen Klonen aus den einzelnen Stämmen wurde dann die Expression durch Western-Blot und ELISA der Kulturüberstände analysiert.
3.3 (b) vi Gewinnung der Kulturüberstände
MC1000 (pICI1656) und MC1061 (pICI1656) wurden in 10 ml 2 × YT-Brühe plus 10 μg/ml Tetracyclin inokuliert und unter Schütteln über Nacht bei 37°C inkubiert. Die Übernachtkulturen wurden dann (1 zu 100) in 100 ml 2 × YT-Brühe plus Tetracyclin subkultiviert. Diese Kulturen wurden unter Schütteln 3 Stunden lang bei 37°C inkubiert. Im Anschluß daran wurde die Heizquelle des Inkubators abgeschaltet, worauf die Temperatur langsam (~1 Stunde) auf Raumtemperatur (25°C) fiel. Von den Kulturen wurden jeweils 10-ml-Proben genommen, deren OD₅₄₀ gemessen wurde (~0,7). Die Probe wurde zum Pelletieren der Zellen zentrifugiert (10 Minuten bei 2500 × g) und der Überstand wurde als Vorinduktionsprobe bei 4°C aufbewahrt.
Die Kulturen wurden jeweils bis zu einer Endkonzentration von 1% (v/v) mit Arabinoselösung (20% w/v) versetzt, und es wurde weitere 3 Stunden lang bei Raumtemperatur inkubiert. Im Anschluß daran wurde eine zweite 10 ml-Probe abgenommen, die OD₅₄₀ wurde gemessen (~0,85) und die Probe wurde zum Pelletieren der Zellen zentrifugiert. Der Überstand wurde bei 4°C aufbewahrt (Nachinduktionsprobe).
3.3 (b) vii Western-Blot-Analyse
Aliquots (15 μl) der einzelnen Überstandsproben wurden mit dem gleichen Volumen an Probenpuffer (62,5 mM Tris, pH 6,8, 1% SDS, 10% Saccharose und 0,05% Bromophenol-Blau) mit und ohne Reduktionsmittel (50 mM DTT) gemischt. Die Proben wurden 15 Minuten lang bei 100°C inkubiert und dann gemäß den Instruktionen des Herstellers einer Elektrophorese auf einem 8–18% Acrylamidgradientengel (Excel-Gelsystem von Pharmacia Biotechnology Products) in einem Multiphor-Apparat (LKB Produkter AB) unterzogen. Nach der Elektrophorese wurden die abgetrennten Proteine mit einem Novablot-Apparat (LKB Produkter AB) gemäß den Protokollen des Herstellers auf eine Hybond C-Super-Membran (Amersham International) überführt. Nach dem Blotten wurde die Membran an der Luft getrocknet.
Das Vorhandensein von Antikörperfragmenten wurde mit einem Anti-Mensch-Cκ-Antikörper-Peroxidase-Konjugat (Sigma Chemical Company, Produkt A7164) mit dem ECL-Detektionssystem (Amersham International) nachgewiesen.
Die Ergebnisse der Western-Blot-Analyse sind in 9 gezeigt. Die Expression von Antikörper fragmenten läßt sich eindeutig durch das Vorhandensein eines Signals in den Nachinduktionsproben, verglichen mit Leerwerten bei den Vorinduktionsproben, nachweisen. In Gegenwart von Reduktionsmittel findet man eine einzelne Bande von ~25 kD, was mit freien leichten Ketten vereinbar ist. In Abwesenheit von Reduktionsmittel sieht man zusätzliche Banden von ~50 kD und 100 kD, was mit der kovalenten Assoziation von Antikörperketten zu Fab'- und F(ab')2-Fragmenten vereinbar ist.
3.3 (b) viii ELISA-Analyse
Standardvorschriften für ELISA-Assays finden sich in "Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology" Hrsg. Burdon, R. H. und van Kippenberg, P. H., Band 15, "Practice and Theory of Enzyme Immunoassays", Tijssen, P., 1985, Elsevier Science Publishers B. V. Eine andere Informationsquelle ist "Antibodies – A Laboratory Manual" Harlow, E. und Lane, D. P. 1988, veröffentlicht von Cold Spring Harbor Laboratory.
Mit den Überstandsproben wurde in einem ELISA die Bindung an COLO205-Zellen (Semple, T. et al., 1978, Cancer Res., Band 38, S. 1345–1355, ATCC Nr. CCL 322) nachgewiesen. In serumfreiem Medium kultivierte COLO205-Zellen (Zeneca Pharmaceuticals ref. M1) wurden mit Glutaraldehyd (0,1%ige (v/v) Lösung in PBS) an Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen fixiert (10⁵ Zellen pro Vertiefung). Die Kulturüberstände wurden in die Vertiefungen gegeben und ~70 Stunden lang bei 4°C inkubiert, um eine Bindung der Antikörperfragmente zu ermöglichen. Nach Waschen mit PBS mit 15 (w/v) BSA und 0,5% (v/v) Tween 20, wurden mit dem Anti-Mensch-Cκ-Antikörper-Peroxidase-Konjugat (siehe oben) gebundene Antikörperfragmente mit o-Phenylendiamin (Sigma Chemical Company Ltd.) zur Farbentwicklung, die dann in einem ThermoMax-Plattenlesegerät (Molecular Devices) bei 490 nm gemessen wurde, nachgewiesen. Die Ergebnisse des ELISA sind in 10 gezeigt. Die spezifische Bindung der 55.1-Antikörperfragmente an COLO205 stellt man im Gegensatz zu nicht induzierten Proben und Kontrollen, die andere Antikörperfragmente mit anderen Spezifitäten als COLO205 exprimieren, bei induzierten MC1000- und MC1061-(pICI1654) Kulturüberständen fest.
3.3 (c) Gewinnung eines 55.1-scFV
Die schnelle Gewinnung von scFv-Fragmenten aus Antikörpern mittels PCR wurde beschrieben (Davis, G. T. et al., 1991, Bio/Technology, Band 9, S. 165–169). Die Konstruktion beruht auf der Verknüpfung der VH- und VL-Regionen der Antikörper durch einen flexiblen Peptid-Linker, der es den V-Regionen ermöglicht, sich in eine aktive Konformation zu falten. Separate VH- und VL-Regionen mit dem Linkerfragment werden durch PCR gewonnen, und die Komplementarität der Linkerregionen wird dann genutzt, um in einer anschließenden PCR ein Gen zu erzeugen, das für die scFv kodiert.
3.3 (c) i Konstruktion eines 55.1-scFv-exprimierenden Klons
Es wurden Oligonukleotide (SEQ ID NR: 13 und 16–20) entwickelt, die als PCR-Primer dienen. Oligo 20 kodiert für eine (Gly4Ser)3-Linkersequenz und ist darüber hinaus an seinem 3'-Ende komplementär zur 5'-Region der Antikörper-VL-Regionen. Oligo 21 ist komplementär zur Linkersequenz und weist Komplementarität zur 3'-Region von Antikörper-VH-Sequenzen auf. Es wurde ein weiterer Oligo (SEQ ID NR: 21) entwickelt, der komplementär zur 3'-Region von 55.1 VL ist, mit zusätzlichen in-frame Translationsterminierungskodons und einer EcoRI-Klonierungsstelle.
Die VH- und VL-Regionen von 55.1 wurden wie oben beschrieben bei der Konstruktion der 55.1-F(ab')2-exprimierenden Klone mit Oligos 13 und 17 für VH und 16 und 18 für VL durch PCR isoliert. Diese Fragmente (jeweils ~0,2 pmol) wurden mit Oligos 19 und 20 (jeweils 0,1 pmol) in einem 50-μl-PCR-Ansatz mit 200 μM dNTPs, 10 mM Tris-HCl (pH 8,3), 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl2, 0,01% Gelatine und 1,25 u Taq-Polymerase (Amplitaq) gemischt und mit 50 μl leichtem Mineralöl überschichtet. Eine Kontrollreaktion ohne die V-Regionen wurde ebenfalls angesetzt. Diese Ansätze wurden 1 Minute lang bei 94°C und 4 Minuten lang bei 63°C über 7 Zyklen inkubiert. Nach dieser Inkubation wurden weitere 50 μl einer Lösung mit 100 pmol an Oligos 13 und 21 und 200 μM dNTPs, 10 mM Tris-HCl (pH 8,3), 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl2, 0,01% Gelatine und 1,25 u Taq-Polymerase (Amplitaq) zugesetzt und weitere 1,5 Minuten lang bei 94°C, 1,0 Minuten lang bei 50°C und 2,5 Minuten lang bei 72°C über 25 Zyklen plus 10 Minuten bei 72°C inkubiert.
Die Analyse der PCR-Reaktionen durch Agarosegelelektrophorese bestätigte das Vorhandensein eines putativen scFv-Fragments (~750 bp) im Vergleich mit der PCR-Kontrollreaktion. Das Fragment wurde aufgereinigt, mit NcoI und EcoRI verdaut und nach die oben für die Konstruktion des F(ab')2-exprimierenden Klons beschriebenen Vorschriften in pICI1646 kloniert. Klone, die dazu in der Lage sind, die scFv zu exprimieren, wurden anschließend durch das Vorliegen eines 750 bp NcoI-EcoRI-Fragments identifiziert und durch DNA Sequenzanalyse bestätigt.
3.3 (c) ii Insertion einer Tag-Sequenz
Ein Nachweis des scFv-Fragments im Western-Blot und im ELISA ist mit herkömmlichen Reagentien nicht möglich. Durch Anfügen eines Tag-Peptids am c-Terminus würde man solche Analysen erleichtern. Für solche Zwecke läßt sich ein Decapeptid-c-myc-tag, das vom Antikörper aus Hybridom myc1-9E10 (der auch als 9E10 bezeichnet wird, Munro, S. und Pelham, H., 1986, Cell, Band 146, S. 291– 300. ECACC Nr. 85102202. ATCC Nr. CRL 1729) erkannt wird, verwenden. Dieses Tag ist auf einem XhoI-EcoRI-Fragment von Plasmid pSW1D1.3VH.VK.tag (Ward, E. S. et al., 1989, Nature, Band 341, S. 544–546) vorhanden oder läßt sich als Paar komplementärer Oligonukleotide synthetisieren (siehe 18 und SEQ ID NR: 25 & 35).
Ein XhoI-EcoRI-Fragment von pSW1D1.3VH.VK.tag wurde auf gereinigt und in den oben beschriebenen scFv-exprimierenden Klon, der mit XhoI und EcoRI unter Anwendung von Standardverfahren verdaut worden war, kloniert. Das Vorhandensein des Tag am c-Terminus von scFv wurde durch DNA-Sequenzanalyse bestätigt. Ein Klon mit der korrekten Konstruktion wurde als pICI1657 bezeichnet.
3.3 (c) iii Expressionsstudien
Nach der Transformation von MC1000- und MC1061-Stämmen mit DNA des pICI1657-Plasmids erfolgt eine Expressionsanalyse des Kulturüberstands durch Western-Blot (11) und ELISA-Assay (12) wie oben beschrieben, wobei allerdings der Nachweis durch Inkubation mit Antikörper 9E10 und eine anschließende zusätzliche 2stündige Inkubation mit einem Anti-Maus-Antikörper-Peroxidase-Konjugat (Sigma Chemical Company, Produkt A9044) vor der Zugabe des oxidierbaren Substrats erfolgte.
BEISPIEL 4 Darstellung von enzymatisch gewonnenen F(ab)2-Antigenbindungstrukturen
55.1-Antikörper wurde erfolgreich durch Proteolyse mit Papain gespalten, wodurch man wie unten ausgeführt das F(ab)2-Fragment erhielt.
15 mg 55.1-Antikörper mit einer Konzentration von 3 mg/ml wurde über Nacht bei 4°C gegen 3 mM EDTA/100 mM Natriumacetatpuffer, pH 5,5, dialysiert. 2 mg (= 200 μl) Papain [10 mg/ml Suspension von Boehringer Mannheim GmbH, Mannheim, Germany, Kat.-Nr. 108 014] wurde mit 200 μl 3 mM EDTA/100 mM Natriumacetat/100 mM Cystein, pH 5,5, verdünnt und 30 Minuten lang bei 37°C inkubiert. Das überschüssige Cystein wurde durch Chromatographie des Verdauungsprodukts bei 4°C auf einer 5-ml-Säule mit Sephadex G25 [Pharmacia, Uppsala, Schweden] in 3 mM EDTA/100 mM Natriumchlorid, pH-Wert des Puffers 5,5, vom reduzierten Papain abgetrennt. Es wurden Fraktionen gesammelt und zur Lokalisierung des eluierten reduzierten Papains durch UV-Adsorption [A280 nm] geprüft. Die Konzentration an reduziertem Papain wurde mit einem Extinktionskoeffizienten von 2,5 berechnet.
Ein Aliquot von 500 μg reduziertem Papain wurde in einem Enzym-Antikörper-Verhältnis von 1 zu 30 zum vordialysierten 55.1-Antikörper gegeben. Der Behälter wurde dann mit Stickstoff gespült, und die Mischung wurde 20 h bei 37°C in einem Wasserbad inkubiert. Das Fortschreiten der Umsetzung wurde durch Zugabe von 0,5 ml 100 mM N-Ethylmaleimid gestoppt.
Das rohe Verdauungsprodukt wurde über Nacht durch Dialyse bei 4°C in 1,5 M Glycin/3 M Natriumchloridpuffer, pH 8,9 überführt und auf eine 5-ml-Säule von Protein A Fast Flow Sepharose [Pharmacia, Uppsala, Schweden], die zuvor mit dem gleichen Puffer äquilibriert worden war, aufgetragen. Die Säule wurde mit 3 Säulenvolumina Glycin/Salz-Puffer, 3 Säulenvolumina 100 mM Natriumphosphat, pH 6,0, und schließlich 3 Säulenvolumina 100 mM Natriumcitrat, pH 3,0, eluiert, wobei Fraktionen gesammelt und das Eluens durch die UV-Extinktion bei 280 nm geprüft wurde. F(ab)2 bindet nicht an Protein A und eluiert mit der Glycin/Salz-Waschlösung, die kleineren Fragmente eluieren mit der Phosphatwaschlösung und unverdauter Antikörper mit der Citratwaschlösung, wie durch SDS- PAGE bestimmt. Die F(ab)2-haltigen Fraktionen wurden vereinigt und zur Aufbewahrung in phosphatgepufferte Kochsalzlösung (Natriumphosphat/150 mM Natriumchlorid pH 7,2) mit 3 mM EDTA dialysiert.
BEISPIEL 5 Gewinnung von Immunkonjugaten
5.1 Immunkonjugate von Antikörper 55.1
Eine Lösung des monoklonalem Antikörper 55.1 (200 mg) in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (Natriumphosphat/150 mM Natriumchlorid pH 7,2) mit einer Konzentration von 4,4 mg/ml wurde durch Membranfiltration bei 4°C (Amicon YM10-Membran, Amicon Ltd., Stonehouse, Gloucs., Großbritannien) auf 12 mg/ml eingeengt. Das Konzentrat wurde mit 0,5 Volumina Boratpuffer (100 mM Natriumborat pH 9,1) verdünnt. Die Proteinkonzentration wurde durch Prüfen der Extinktion bei 280 nm bestimmt, und es wurde festgestellt, daß der pH-Wert der gemischten Lösung 8,8 ± 0,1 betrug.
N-Succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)butyrat (der "Linker") wurde zu einer Konzentration von 10 mg/ml in trockenem, redestilliertem Dimethylformamid oder Acetonitril gelöst. Ein Aliquot dieser Lösung (0,352 ml) mit 3,52 mg N-Succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)butyrat wurde sofort zur konzentrierten Antikörperlösung gegeben. Die so erhaltene Lösung wurde durchmischt und dann eine Stunde lang bei 15°C stehen gelassen. Die Lösung wurde dann durch Gelpermeationschromatographie an einer 2,6 × 58 cm-Säule mit G25 Sephadex (Pharmacia, Uppsala, Schweden) mit einer Fließgeschwindigkeit von 2 ml/min und mit 50 mM Natriumphosphat/150 mM Natriumchlorid/1 mM EDTA-Puffer, pH 8,0, zum Entfernen von überschüssigen Reagentien entsalzt, und der Puffer des derivatisierten Antikörpers wurde ausgetauscht. Alternativ dazu kann man die Reaktionsprodukte durch Kreuzstromfiltration entfernen. Der entsalzte derivatisierte Antikörper wurde gepoolt, und die Proteinkonzentration wurde durch Prüfen der UV-Extinktion bei 280 nm bestimmt. Der Grad der Derivatisierung mit dem Linker wurde durch Zugabe eines Überschusses an Dithiothreitol und Verfolgen der Freisetzung von freien Thiopyridylgruppen bei 343 nm bestimmt. Es wurde gefunden, daß der Derivatisierungsgrad 4 bis 6 Linkergruppen pro Mol Antikörper betrug.
Rekombinantes Ricin A wurde durch Behandeln einer Lösung von Ricin A in Phosphatpuffer bei pH 8 mit einem Überschuß an Dithiothreitol reduziert und durch Kreuzstromfiltration eingeengt. Überschüssige Reagentien wurden durch Gelpermeationschromatographie an einer 2,6 × 58 cm-Säule mit G25 Sephadex (Pharmacia, Uppsala, Schweden) mit einer Fließgeschwindigkeit von 2 ml/min und einem 50 mM Natriumphosphat/150 mM Natriumchlorid/1 mM EDTA-Puffer, pH 8,0 entfernt.
Rekombinantes Ricin A wurde durch Mischen von Lösungen des zubereiteten rekombinanten Ricin A (190 mg) und derivatisiertem Antikörper (190 mg) in einem Ricin A : derivatisierter Antikörper-Gewichtsverhältnis von 1 : 1 an den derivatisierten Antikörper konjugiert. Glycerin wurde bis zu einer Konzentration von 20 Vol.-% zugegeben, und das Gefäß wurde mit Argon gespült. Die so erhaltene Lösung wurde 40 bis 65 Stunden lang auf 15°C gehalten.
Cystein wurde dann bis zu einer Endkonzentration von 0,2 mM (und in wenigstens 10fachem molarem Überschuß über die Linkergruppen auf dem Antikörper) zugesetzt, um die überschüssigen Linkergruppen am Antikörper zu blockieren. Die Lösung wurde durchmischt und 2–3 Stunden lang bei 20°C gehalten. Nach dem Blockieren mit Cystein wurde eine Probe des so erhaltenen Immunotoxins durch Behandeln mit einem Überschuß an Dithiothreitol analysiert und bei 343 nm auf vollständige Umsetzung geprüft.
Die das Konjugat enthaltende Lösung wurde dann durch Membranfiltration (Amicon YM10-Membrane, Amicon Ltd., Stonehouse, Gloucs. U. K.) eingeengt und auf eine 2,6 × 50 cm-Gelpermeationschromatographiesäule (Pharmacia HR300 Sephacryl, Pharmacia, Uppsala, Schweden) mit einer Fließgeschwindigkeit von 3 ml/min in 50 mM Natriumphosphat/25 mM Natriumchlorid/1 mM EDTA-Puffer aufgetragen. Die Effizienz dieses Schritts, bei dem Immunotoxin und nicht-konjugierter Antikörper von nicht-konjugiertem Ricin A abgetrennt werden, wurde durch on-line-Messung der UV-Absorption des Säulenablaufs bei 280 nm geprüft. Der die Mischung aus Immunotoxin und Antikörper enthaltende Peak wurde gepoolt, und die Proteinkonzentration wurde durch Prüfen der Extinktion bei 280 nm bestimmt.
Die so erhaltene Lösung, die sowohl nicht-konjugierten Antikörper als auch Immunotoxin enthält, wurde durch Zugabe von 1 M HCl auf einen pH-Wert von 6,3 eingestellt und mit einer Fließgeschwindigkeit von 1,5 ml/min auf eine 8 × 26 cm-Mimetic A6XL-Säule mit Triazinfarbstoffmatrix, (ACL plc, Cambridge, Großbritannien) aufgetragen. Die Säule wurde mit 100 ml Ausgangspuffer gewaschen, wobei nicht-konjugierter Antikörper eluiert, und das Immunotoxin wurde mit 0,5 M Natriumchlorid enthaltendem Ausgangspuffer eluiert. Die Immunotoxinlösung wurde gegen phosphatgepufferte Kochsalzlösung dialysiert, durch einen 0,22-Mikron-Filter filtriert und bei 4°C aufbewahrt.
Die Reinheit des Immunotoxins wurde durch SDS-Polyacrylamid-Elektrophorese bestimmt, wobei gefunden wurde, daß das Produkt insgesamt 45 mg Immunotoxin mit der folgenden Zusammensetzung enthielt: 50 bis 60% Mono-Ricin-A-Derivat, 10 bis 30% Di-Ricin-A-Derivat, 5 bis 15% Tri-Ricin-A-Derivat und < 10% nicht derivatisierter Antikörper.
Alternativ dazu kann man die Reihenfolge von Gelfiltrationsschritt (Entfernen des restlichen r-Ricin A) und den Farbstoffaffinitätschromatographieschritt (Entfernen der restlichen 55.1-Antikörper) in der Aufreinigungssequenz umstellen. Bei dieser Variation des Verfahrens wird die Konjugationsmischung unmittelbar nach dem Blockieren der nicht umgesetzten Linkereinheiten mit Cystein (wie oben beschrieben) mit destilliertem Wasser auf eine Leitfähigkeit von unter 5 mS verdünnt. Der pH-Wert wird dann mit 1 M Essigsäure auf 6,0 eingestellt, und die Lösung wird durch Membranfiltration geklärt. Die Lösung wird dann auf die Farbstoffligandensäule aufgetragen (2,5 ml Gel/mg in der Konjugationsmischung verwendetem r-Ricin A). Die Säule wird dann mit 0,68 Natriumacetat, pH 6,0, gewaschen, bis der nicht-konjugierte 55.1-Antikörper durch die Säule gewaschen worden ist. Das Immunotoxin und restliches r-Ricin A können dann mit 20 mM Natriumphosphatpuffer bei pH 7,0, Natriumchloridkonzentration 0,5 M, von der Säule eluiert werden. Dieses Eluat wird dann durch Kreuzflußfiltration mit einem spiralförmigen Kartuschen-Ultrafiltrationssystem konzentriert und auf eine Sephacryl S300HR-Säule (2,5 ml Gel pro mg in der ursprünglichen Konjugationsreaktion verwendetem Antikörper, in einem Volumen von < 5% des Gesamtvolumens der Säule) aufgetragen. Die Säule kann mit einem Puffer einer beliebigen geeigneten Formulierung wie z. B. phosphatgepufferter Kochsalzlösung, pH 7,2, äquilibriert werden.
5.2 Antikörper-55.1-F(ab)2-Immunokonjugate
Das aufgereinigte F(ab)2-Fragment wurde zunächst mit 3-(2-Pyridyldithio)propionsäure-N-hydroxysuccinimidester (SPDP, Sigma Chemical Company, St. Louis, U.S.A. Kat.-Nr. P 3415) derivatisiert. Ein 8facher molarer Überschuß an SPDP in Acetonitril (10 mg/ml) wurde zu 90 mg F(ab)2-Protein in 50 mM Natriumborat, 300 mM Natriumchlorid, pH 8,9, in einer Konzentration von 4 mg/ml gegeben. Nachdem gut durchmischt worden war, wurde die Derivatisierung ohne weiteres Rühren 60 min bei 24°C fortschreiten gelassen. Es ließ sich ein Derivatisierungsgrad zwischen 3 und 4 mol Linker/mol Antikörperfragment erzielen.
Überschüssiger Linker wurde durch Gelpermeationschromatography unter Anwendung einer mit 50 mM Natriumphosphat, 150 mM Natriumchlorid, 1 mM Ethylendiamintetraessigsäure, pH 8,0, äquilibrierten 200-ml-Säule von Pharmacia Sephadex G-25 (Pharmacia, Uppsala, Schweden) entfernt.
Das derivatisierte F(ab)2-Fragment wurde in 50 mM Phosphatpuffer, 20 Vol.-% bezüglich Glycerin, mit 100 mg der reduktionsmittelfreien, auf gereinigten Ricin-A-Kette versetzt. Bevor gründlich durchmischt wurde, wurde der Behälter mit sauerstofffreiem Stickstoff gespült. Die Konjugatreaktion fand dann 48 h lang bei 24°C statt.
Verbliebene aktivierte Linkergruppen auf dem F(ab)2-Fragment wurden dann durch Behandeln der konjugierten Reaktionsmischung mit 0,2 mM Cystein bei einer Proteinkonzentration von 4 mg/ml blockiert.
Die nach der Konjugationsreaktion erhaltenen 25 mg an Konjugat wurden wie im vorherigen Beispiel beschrieben durch Gelchromatographie mit einer Säule von 150 ml mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung, pH 7,2, äquilibriertem Sephacryl S-300HR von verbliebenem r-Ricin und Cystein gereinigt. Verbliebenes F(ab)2 wurde durch Farbstoffaffinitätschromatographie (ACL Mimetic Blue) entfernt. Die 50-ml-Mimetic Blue-Säule wurde in 50 mM Natriumphosphatpuffer, pH 6,5, äquilibriert. Die rohe Konjugatmischung wurde auf die Säule aufgetragen, und das nicht-konjugierte F(ab)2 wurde mit dem 50 mM Phosphatpuffer durch die Säule gewaschen. Das Konjugat wurde mit 50 mM Natriumphosphatpuffer, pH 6,5 mit 500 mM Natriumchlorid, eluiert. Die Gesamtausbeute der Vorschrift betrug 20%.
BEISPIEL 6 Selektivität von Antikörper 55.1
Die Selektivität eines Immunotoxins ist von überragender Wichtigkeit; ohne eine Bindung an tumorassoziiertes Antigen würde die Wirksamkeit fehlen, und eine unerwünschte Anreicherung in normalem Gewebe könnte Gewebetoxizität zur Folge haben. Zur Abschätzung der Selektivität wurden viele humane Normal- und Tumorgewebe auf Reaktivität mit Antikörper 55.1 untersucht, wobei ein empfindliches 3stufiges indirektes immunohistologisches Verfahren mit acetonfixierten, gefrorenen Cryostatschnitten zur Anwendung kam.
Die immunohistologischen Untersuchungen wurden an Schnitten von humanem Gewebe durchgeführt, die entweder bei einer operativen Entfernung oder post mortem erhalten wurden. Zum Erhalten einer optimalen Morphologie und Antigenizität wurden die Gewebe so frisch wie möglich verwendet, in kleine Stücke (etwa 1 cm2) geschnitten und vor der Aufbewahrung bei –80°C in flüssigem Stickstoff schockgefroren. Auf einem Cryostat wurden 6-μM-Gewebeschnitte angefertigt, die dann auf Vector-bonded Objektträger (Vector Labs) gelegt und 2 Minuten in eiskaltem Aceton fixiert wurden, bevor sie in Folie eingeschlagen und bei –80°C gelagert wurden. Die Objektträger wurden bei Raumtemperatur aufgetaut und dann unmittelbar vor der Verwendung aus der Folie entnommen. Die Schnitte wurden jeweils mit einem PAP-Stift umranded, und zu jedem Schnitt wurden entweder 100 μl 55.1-Antikörper, verdünnt auf 5 μg/ml in Tris-gepufferter Kochsalzlösung (Tris-Buffered Saline, TBS), 100 μl MOPC-Isotypkontrolle (Sigma, Chemical Company, St. Louis, U.S.A., Kat.-Nr. M 9269) in einer Konzentration von 5 μg/ml in TBS, oder 100 μl einer entsprechenden Positivkontrolle wie LP34 (Dako) gegeben. Alle anschließenden Inkubationen erfolgten bei Raumtemperatur über 30 Minuten in einer Kammer mit angefeuchteter Luft: alle Waschschritte wurden mit TBS mit zweimaligem Wechsel durchgeführt. Nach der Inkubation wurden die Objektträger gewaschen und 100 μl des zweiten Antikörperreagens, das aus 1/50 Kaninchen-Anti-Maus-Immunoglobulinen, konjugiert an Meerrettichperoxidase (Dako Patts) bestand, zugesetzt, und zu jedem Schnitt wurde 1/5-normales Humanserum (Sigma) in TBS gegeben. Die Objektträger wurden abermals inkubiert und mit TBS gewaschen. Zu jedem Schnitt wurde ein letzter Nachweis-Antikörper, 100 μl Schwein-Anti-Kaninchen-Immunoglobulin konjugiert an Meerrettichperoxidase (1/50 Verdünnung mit 1/5-normalem Humanserum in TBS) gegeben, und es wurde inkubiert und gründlich gewaschen. Aus 1 DAB-Tablette (Sigma) wurde mit 17 μl Wasserstoffperoxid in 17 ml TBS DAB-Substrat hergestellt, das tropfenweise durch Whatman Nummer 4 Filterpapier gegeben wurde. Nach 3 Minuten Inkubation wurde das überschüssige DAB von den Objektträgern abgeklopft, und die Objektträger wurden mit TBS gewaschen. Nach Gegenfärben mit Mayers Haematoxylin wurden die Schnitte in Alkoholen und Xylol dehydratisiert und vor der Untersuchung unter einem Mikroskop in E-Z-Mount (Shandon) angebracht.
Die Regionen mit Antikörperbindung wurden durch Braunfärbung auf den Schnitten sichtbar gemacht. Zur Bewertung des Ausmaßes der Bindung von 55.1-Antikörper an Gewebe wurde ein Bewertungssystem verwendet,
Die Daten aus der Untersuchung einer Palette von 18 individuellen Kolorektaltumoren deutete darauf hin, daß der 55.1-Antikörper mit ungefähr 80% der Tumore eine starke Bindung eingeht (Tabelle 3).
Eine weitere Analyse der Anfärbungen ergab, daß sich bei ungefähr 50% der Tumore (denen mit Bewertungen von ++ und +++) mehr als 50% der Zellen positiv färbten und daß die Anfärbung auf den baso-lateralen und apicalen Zellmembranen in Erscheinung trat. Es sollte daher ein Großteil der Epithelzellen eines bestimmten Tumors dem Targeting zugänglich sein. Darüber hinaus sollte die baso-laterale Expression ein wirksames Targeting des Antigens vom Blut aus begünstigen.
Wie in Tabelle 4 gezeigt, wurde ein breites Spektrum normaler Humangewebe auf Reaktivität mit 55.1 untersucht. Solch selektive Antikörper sind selten; lediglich 10/65.000 der während der Entwicklung von 55.1 erzeugten bzw. untersuchten Antikörperüberstände zeigten eine solche minimale Reaktivität mit normalem Gewebe.
BEISPIEL 7 Assay auf kompetitive Bindung an CA55.1
7.1 (a) Herstellung von löslichen COLO 205-Membranzubereitungen
Alle verwendeten Materialien sollten von der besten verfügbaren Qualität sein. Ein Pellet von 10E9 COLO205-Zellen wurde in 7 ml eiskaltem Lysepuffer (2,5% Tween 40, 10 mM Tris, 0,14 M NaCl, 1 mM PMSF, 1 mM NEM, 100 μM Pepstatin, pH 7,4) suspendiert, so daß man auf ein Gesamtvolumen von 10 ml kam. Die so erhaltene Lösung wurde eine Stunde lang in einem Eisbad gerührt. Die Zellen wurden dann homogenisiert und 10 min bei 1500 g und 4°C zentrifugiert. Der Überstand wurde abgesaugt und 1 Stunde lang bei 100.000 g und 4°C zentrifugiert. Das Pellet wurde mit 5 ml Solubilisierungspuffer (10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 50 mM Octylglucosid, 10 mM NEM, 1 mM PMSF, 0,1 mM Leupeptin, pH 7,4) versetzt, und die so erhaltene Suspension wurde 30 Minuten lang bei 4°C vorsichtig gerührt. Die Lösung wurde dann 20 Minuten lang bei 30.000 g zentrifugiert. Der Überstand, die solubilisierte COLO 205-Membranzubereitung, wurde abgesaugt und bei 4°C aufbewahrt.
7.1 (b) Verdrängungs-ELISA
Alle verwendeten Materialien sollten von der besten verfügbaren Qualität sein. Solubilisierte COLO 205-Membranzubereitung 1 zu 100 mit Beschichtungspuffer (20 mM Tris, 150 mM Natriumchlorid, pH 7,4) verdünnen, was die Antigen-Stammlösung ergibt. 50 μl der Antigen-Stammlösung in sechs Vertiefungen pro MAK pro Messung auf einer Mikrotiterplatte pipettieren. Vorsichtig 2 Stunden lang bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4°C rühren. In jede Vertiefung 50 μl Fixierpuffer (0,5% Glutaldehyd in Beschichtungspuffer) geben, 3 Minuten reagieren lassen, die Platte mit TBS (50 mM Tris, 100 mM Natriumchlorid, pH 7,4) waschen. In jede Vertiefung 200 μl Blockierpuffer (3% BSA in Beschichtungspuffer) geben und vorsichtig 1 Stunde lang bei Raumtemperatur rühren. Stammlösungen von MAK 55.1, markiert mit Biotin (Charo et. al. 1991 J. Biol. Chem. 266, S 1415–1421), und die TEST MAK werden in Antikörperpuffer (1% BSA in Beschichtungspuffer) angesetzt. Diese Stammlösungen werden dann kombiniert, wodurch man sechs Antikörperlösungen erhält, die die beiden MAKs in den folgenden Verhältnissen enthalten;
Antikörperlösung 1. 2 mg/ml 55.1 und 200 mg/ml TEST-MAK.
Antikörperlösung 2. 2 mg/ml 55.1 und 20 mg/ml TEST-MAK.
Antikörperlösung 3. 2 mg/ml 55.1 und 2 mg/ml TEST-MAK.
Antikörperlösung 4. 2 mg/ml 55.1 und 0,2 mg/ml TEST-MAK.
Antikörperlösung 5. 2 mg/ml 55.1 und 0,02 mg/ml TEST-MAK.
Antikörperlösung 6. 2 mg/ml 55.1.
Am Ende des Blockierungsschritts wurde die Platte mit TBS gewaschen, und jeweils 100 μl der Antikörperlösungen wurden in eine einzelne Vertiefung in jeder Reihe gegeben. Die Platte wurde dann vorsichtig 2 Stunden lang bei Raumtemperatur bewegt. Die Platte wurde dann mit TBS gewaschen, und in jede Vertiefung wurden 100 μl der zweiten Antikörperlösung (1 mg/ml Anti-Biotin-Peroxidase-gebundener MAK in Antikörperpuffer) gegeben, und es wurde 1 Stunde lang vorsichtig bewegt. 99,5 ml Citrat-Phosphat-Puffer (0,5 g Citronensäure, 1,7 g Dinatriumhydrogenphosphatdodecahydrat in 100 ml Milli-Q-Wasser) mit 0,5 ml Wasserstoffperoxidlösung (1 g Harnstoff-Wasserstoffperoxid in 25 ml Citrat-Phosphat-Puffer) und 80 mg O-Phenylendiamindihydrochlorid versetzen, was die Substratlösung ergibt. Die Platte wurde dann mit TBS gewaschen, und in jede Vertiefung wurden 100 μl Substratlösung gegeben, und es wurde vorsichtig gerührt. Die sich entwickelnde Farbe wird bei 495 nm beobachtet. Ist eine maximale Extinktion von 0,7 AUFS erreicht, so werden in alle Vertiefungen 50 μl Stoplösung gegeben, die Platte wird 5 Minuten lang vorsichtig bewegt und die Endextinktion wird abgelesen. Eine Inhibierung der Bindung von 55.1 durch den TEST-MAK ist dadurch zu erkennen, daß es zu einer von der TEST-MAK Konzentration abhängigen Abnahme der Farbintensität kommt.
BEISPIEL 8 In-Vivo-Aktivität der Immunokonjugate gegen CA55.1
Damit ein Antikörper bei der Konjugation mit Ricin A ein wirksames Immunotoxin liefert, ist es entscheidend, daß er sich an eine Zellmembrandeterminante auf Tumorzellen bindet und den Transport des Ricin A durch die Zellmembran und zu den Ribosomen erleichtert, um die Proteinsynthese zu inhibieren und Cytotoxizität zu induzieren.
Es wurde unter Anwendung von Durchflußcytometrie gezeigt, daß das 55.1-Antigen in hohen Konzentrationen auf mehreren Kolorektaltumorzellinien einschließlich COLO205 vorhanden ist. COLO-205-Zellen wurden für Routineuntersuchungen zur Internalisierung und für Cytotoxizitätsstudien verwendet. Wurde Antikörper 55.1 mit rekombinantem Ricin A konjugiert, so erhielt man ein hochwirksames Immunotoxin mit einem IC50 von 1 × 10^–11 M gegen COLO-205-Zellen.
Endocytose der 55.1-Bindung an COLO 205 wurde wie folgt gezeigt. Eine Zellsuspension von COLO-205-Zellen wurde auf 20 Millionen Zellen pro ml in Kulturmedium eingeengt. Iodierter Antikörper wurde zu 1 μg/ml zugesetzt, und es wurde 1 Stunde lang bei 4°C inkubiert. Die Zellen wurden zweimal durch Zentrifugieren bei 4°C gewaschen und dann mit frischem Medium auf 1 Million Zellen pro ml verdünnt. 1,5 ml Zellsuspension wurden dann in Kulturplatten mit 24 Vertiefungen gegeben, worauf bei 37°C inkubiert wurde. Zur Bearbeitung wurden in Abständen 1-ml-Proben abgenommen. Zellen und Mediumüberstände wurden durch Zentrifugieren voneinander getrennt. Einige Zellpellets wurden zum Entfernen von oberflächengebundenem Antikörper mit angesäuertem Pepsin (10 mg/ml, pH 2,5, 1 ml/Pellet bei 37°C, 40 min lang) behandelt. Die Zellen wurden dann durch Zentrifugieren gewaschen. Die Mediumüberstände wurden zur Bestimmung der proteinassoziierten Radioaktivität mit TCA behandelt. Es wurden jeweils sowohl die Radioaktivität der Zellpellets, der pepsinbehandelten Zellpellets, der Medien und der TCA-Ausfällungen der Medien gemessen. Somit wurden Oberflächenantikörper, internalisierte Antikörper und verlorene Antikörper (einschließlich Abbauprodukten) quantifiziert.
Verglichen mit nicht-internalisierenden Kontrollantikörpern wird 55.1 effizient in COLO-205-Zellen internalisiert, wobei ungefähr 25% der zellgebundenen Antikörper im Verlauf einer 4stündigen in-vitro-Inkubation und 40% im Verlauf einer 20stündigen Inkubationsperiode die Zellmembran überwinden (4).
Die in-vivo-Wirksamkeit von 55.1:Ricin A wurde in Modellen humaner Tumore, die als subkutane Transplantate in athymischen Nacktmäusen herangezogen wurden, untersucht.
Der primäre Antitumortest erfolgte mit Gruppen von 10 Mäusen, denen subkutan an der linken Flanke 5 × 10⁶ COLO-205-Zellen eingepflanzt worden waren. Die Tumore wurden bis zu einem Durchmesser von 0,5–0,7 cm wachsen gelassen, gewöhnlich 5–7 Tage nach der Implantation. Dann wurde über drei Tage einmal täglich 1 mg/kg 55.1:Ricin-A-Immunotoxin intravenös verabreicht. Die Kontrollgruppen erhielten lediglich i. v.-Dosen an Kochsalzlösung.
Bei diesem Protokoll kam es zu einer ganz wesentlichen Antitumorreaktion mit klaren Belegen für Tumorregressionen und vollständige Heilungen bei einigen Mäusen. Bei einem solchen Experiment wurden 2/10 Mäuse von ihren Tumoren geheilt. Bei den restlichen Mäusen kam es bei 4/10 zu mäßigen Wachstumsverzögerungen (10 Tage), und bei 4 zu relativ langen Wachstumsverzögerungen von mehr als 30 Tagen (5).
55.1:Ricin A ist somit ein in vivo hochwirksames, selektives cytotoxisches Mittel, das wirkt, indem es sich zielgerichtet an COLO-205-Zellen in Transplantaten fester Tumore anlagert und von diesen Zellen internalisiert wird. 55.1:Ricin A ist in solchen Modellen wesentlich wirksamer als herkömmliche Antikrebsmittel wie 5-Fluoruracil.
BEISPIEL 9 Pharmazeutische Zusammensetzung
Im folgenden wird eine ein Immunotoxin der vorliegenden Erfindung enthaltende repräsentative pharmazeutische Dosierungsform erläutert, die sich für therapeutische Anwendungen beim Menschen eignet.
Injektionslösung
Eine sterile wäßrige Injektionslösung, enthaltend:

Ricin A/55.1-Antikörper-Immunotoxin 1,0 mg

Natriumacetat-trihydrat 6,8 mg

Natriumchlorid 7,2 mg

Tween 20 0,05 mg pro ml Lösung
BEISPIEL 10 Hybridisierung von DNA-Sequenzen, die mit der 55.1 CDR3 DNA-Sequenz verwandt sind
10.1 Hybridisierungstest
Ein Verfahren zum Nachweis von nukleinsäurehaltigen Sequenzen, die mit dem Gen für die schwere Kette des 55.1-Antikörpers verwandt sind. Diese Nukleinsäuren können in verschiedenen Formen vorliegen, beispielsweise als DNA aus Bakterienkolonien oder die DNA/RNA aus eukaryontischen Zellen, wie oben beim Screening der cDNA-Bibliothek beschrieben auf einer Membran fixiert oder als Fragmente aufgereinigter Nukleinsäure, getrennt durch Gelelektrophorese und dann auf eine geeignete Membran übertragen, wie bei den Verfahren der Northern-(Maniatis, Kapitel 7, S. 39) oder Southern-(Maniatis, Kapitel 9, S. 31) Hybridisierung.
10.2 Hybridisierungssonde
Hybridisierungssonden können aus einem beliebigen für die 55.1-H-Kette kodierenden DNA- oder RNA-Fragment, insbesondere aus der variablen Region, vor allem der für CDR3 kodierenden Region dieser Region, gewonnen werden. Als spezifische Sonde für die für CDR3 kodierende Region läßt sich ein synthetisches Oligonukleotid (SEQ ID NR: 22) oder die komplementäre Sequenz davon verwenden.
Eine Hybridisierungssonde läßt sich aus einem synthetischen Oligonukleotid durch Addition einer radioaktiven 5'-Phosphatgruppe aus 32P-ATP durch Einwirkung von T4-Polynukleotidkinase erstellen. 20 pmol des Oligonukleotids werden zu einem 20 μl Ansatz mit 100 mM Tris, pH 7,5, 10 mM MgCl2, 0,1 mM Spermidine, 20 mM DTT, 7,55 M ATP, 0,55 M g 32P-ATP und 2,5 u T4-Polynukleotidkinase (Pharmacia Biotechnology Ltd, Uppsala, Schweden) gegeben. Der Ansatz wird vor der Verwendung in der Hybridisierung 30 Minuten lang bei 37°C und dann 10 Minuten bei 70°C inkubiert. Verfahren zur Anfertigung von Hybridisierungssonden aus Oligonukleotiden (Kapitel 11) oder aus DNA- und RNA-Fragmenten (Kapitel 10) sind in Maniatis aufgeführt. Für diese Vorschriften gibt es auch eine Reihe von Markenkits.
10.3 Hybridisierungsbedingungen
Filter mit der Nukleinsäure werden in einem geeigneten geschlossenen Gefäß in 100 ml einer Lösung mit 6 × SSC, 0,1% SDS und 0,25% Marvel^TM mindestens 1 Stunde lang bei 65°C vorhybridisiert. Mit einem Marken-Hybridiserungsapparat wie dem Modell HB-1 (rechne Ltd) lassen sich reproduzierbare Bedingungen für das Experiment schaffen.
Die Vorhybridisierungslösung wird dann durch 10 ml einer Sondenlösung mit 6 × SSC, 0,1% SDS, 0,25% Marvel und der oben erstellten Oligonukleotidsonde ersetzt. Die Filter werden in dieser Lösung 5 Minuten lang bei 65°C inkubiert, bevor man die Temperatur schrittweise auf unter 30°C fallen läßt. Die Sondenlösung wird dann verworfen, und die Filter werden bei Raumtemperatur 5 Minuten lang in 100 ml 6 × SSC, 0,1% SDS gewaschen. Weitere Waschungen erfolgen dann mit frischen Chargen der gleichen Lösung bei 30°C und dann in 10°C-Schritten bis zu 60°C, mit jeweils 5 Minuten pro Waschung.
Nach dem Waschen werden die Filter getrocknet und zum Belichten eines Röntgenfilms wie Hyperfilm MP (Amersham International) bei –70°C in einer lichtundurchlässigen Filmkassette unter Einsatz einer schnellen Wolfram-Verstärkerfolie zur Verstärkung des photographischen Bilds verwendet. Der Film wird über einen geeigneten Zeitraum (normalerweise über Nacht) belichtet und dann entwickelt, so daß das photographische Bild der radioaktiven Regionen auf den Filtern sichtbar wird. Verwandte Nukleinsäuresequenzen werden dadurch identifiziert, daß sie im Gegensatz zu total unverwandten Sequenzen, die kein Bild liefern sollten, auf einem photographischen Bild vorhanden sind. Idealerweise geben verwandte Sequenzen bei der höchsten Waschtemperatur (60°C) eine positive Reaktion. Es kann jedoch auch sein, daß verwandte Sequenzen nur bei den niedrigeren Waschtemperaturen (50, 40 oder 30°C) eine positive Reaktion geben.
Diese Ergebnisse hängen auch von der Beschaffenheit der verwendeten Sonde ab. Sonden mit längeren Nukleinsäurefragmenten müssen bei hoher Temperatur über längere Zeiträume hybridisiert werden, bleiben jedoch bei höheren Waschtemperaturen und/oder bei niedrigeren Salzkonzentrationen an verwandte Sequenzen gebunden. Bei kürzeren, gemischten oder entarteten Oligonukleotidsonden können weniger strikte Waschbedingungen wie niedrigere Temperaturen und/oder höhere Na+-Konzentrationen ausreichen. Eine Diskussion der Erwägungen bei Hybridisierungsprotokollen findet sich in Maniatis (Kapitel 11).
BEISPIEL 11 Analyse des tumorassoziierten CA55.1-Antigens
11.1 Solubilisierung von CA55.1 aus COLO-205-Zellen
Alle verwendeten Materialien sollten von der besten verfügbaren Qualität sein. Ein Pellet von 10E9 COLO205-Zellen wurde in 7 ml eiskaltem Lysepuffer (2,5% Tween 40, 10 mM Tris, 0,14 M NaCl, 1 mM PMSF, 1 mM NEM, 100 μM Pepstatin, pH 7,4) suspendiert, so daß man ein Gesamtvolumen von 10 ml erhielt. Die so erhaltene Lösung wurde eine Stunde lang in einem Eisbad gerührt. Die Zellen wurden dann homogenisiert und 10 min bei 1500 g und 4°C zentrifugiert. Der Überstand wurde abgesaugt und 1 Stunde lang bei 100.000 g und 4°C zentrifugiert. Das Pellet wurde mit 5 ml Solubilisierungspuffer (10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 50 mM Octylglucosid, 10 mM NEM, 1 mM PMSF, 0,1 mM Leupeptin, pH 7,4) versetzt, und die so erhaltene Suspension wurde 30 Minuten lang vorsichtig bei 4°C gerührt. Die Lösung wurde dann 20 Minuten lang bei 30.000 g zentrifugiert. Der Überstand, die solubilisierte COLO-205-Membranzubereitung, wurde abgesaugt und bei 4°C aufbewahrt.
11.2 Affinitätsaufreinigung von CA55.1
MAK 55.1 wurde unter Anwendung von Pharmacias Standardprotokoll (Beilage zu Pharmacia CNBr Activated Sepharose, Kat. Log. Nr. 17-0430-01, Pharmacia AB, Uppsala, Schweden) an CNBr-aktivierte Sepharose 4B gekuppelt. Die Matrix wurde dann mit Bindungspuffer (25 mM Tris, 150 mM NaCl, 50 mM Octylglucosid, pH 7,0.) äquilibriert. Das das 55.1-Antigen enthaltende Zelllysat wurde dann zur Matrix gegeben und über Nacht bei 4°C gut durchmischt. Die Matrix wurde dann mit 6 Säulenvolumina Waschpuffer (25 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 7,0) gewaschen. Die 55.1-Antigene wurden dann durch Waschen der Matrix mit 3 Säulenvolumina Elutionspuffer (25 mM Tris, 150 mM NaCl, 5M Natriumthiocyanat, pH 7,0.) eluiert. Die CA55.1 enthaltenden Fraktionen wurden durch Western Blotting mit 55.1-Antikörper wie unten beschrieben identifiziert.
11.3 SDS-PAGE und Western Blots von CA55.1
Die auf Reaktivität mit MAK 55.1 zu analysierenden Proben werden auf ein bereits gegossenes Pharmacia ExcelGel^TM (8-18%-Gradient Polyacrylamid) aufgetragen und nach dem von Pharmacia vorgeschlagenen Protokoll unter Anwendung der empfohlenen Bedingungen (600 Volt, 50 mA und 30 W über 90 Minuten, 15°C, siehe Beilage zum Pharmacia ExcelGel Pack, Kat. Nr. 80-1255-53, Pharmacia, Uppsala, Schweden) laufen gelassen. Das Gel wurde von der als Unterlage dienenden Plastikfolie abgezogen und mittels Elektroblott über 10–12 min bei 2,5 mA/cm2 auf eine PVDF-Membran übertagen. Nach dem Elektroblotten wurde die PVDF-Membran dann in Blockingpuffer, 3% BSA in TBS-Puffer (20 mM Tris, 500 mM NaCl, pH 7,4) gegeben und 1 Stunde lang vorsichtig bewegt. Die Membran wurde dann kurz mit Antikörperpuffer (1% BSA in TBS) abgespült und in Antikörperpuffer mit MAK 55.1 in einer Konzentration von 2 mg/l gegeben. Die PVDF-Membran wurde zwei Stunden lang vorsichtig bewegt.
Die Membran wurde dann kurz mit Milli-Q^TM-Wasser (entionisiertes Wasser bester Qualität) abgespült und 3 × 5 Minuten in Antikörperpuffer gewaschen. Die PVDF-Membran wurde dann in Antikörperpuffer gegeben, der MAK anti-Maus-gebunden an Meerrettichperoxidase in einer Konzentration von 1 mg/l enthielt. Die PVDF-Membran wurde dann 1 h vorsichtig bewegt. Die PVDF-Membran wurde dann kurz mit Milli-Q-Wasser abgespült und 3 × 5 Minuten mit Antikörperpuffer gewaschen, und abschließend 5 Minuten mit TBS gewaschen. Nachdem der letzte Waschschritt abgeschlossen war, wurden die HRP-Farbentwicklungslösung (60 mg 4-Chlor-1-napthol in 20 ml eiskaltem Methanol; innerhalb von 5 min vor der Verwendung zubereitet und im Dunkeln aufbewahrt) und die Peroxidlösung (60 μl eiskalter 30%iger H₂O₂-Lösung in 100 ml TBS. Unmittelbar vor der Verwendung hergestellt) zusammen zugegeben, und die Membran wurde sofort in die so erhaltene Lösung gegeben. Nachdem sich die Farbe entwickelt hatte, wurde die Reaktion durch Waschen der Membran mit 2 × 5-min-Waschungen in Milli-Q^TM-Wasser gestoppt. Die Membran wurde dann auf Fließpapier an der Luft getrocknet und aufbewahrt.
Die Ergebnisse dieses Experiments sind in 6 gezeigt. CA55.1 weist drei dominante Molekulargewichtsbanden in den Bereichen von etwa 48 bis 52 kD, etwa 58 kD bis 72 kD und etwa 88 kD bis 92 kd auf.
11.4 PNGase-F-Behandlung, Sialidase-Behandlung und Lektin-Blots
Daß das CA55.1-Epitop Kohlenhydrateigenschaften hat, wurde durch die Wirkungen der Enzyme PNGase F und Sialidase auf CA55.1 in Western Blots gezeigt. PNGase F spaltet ein N-gebundenes Oligosaccharid spezifisch zwischen dem Asparaginrest und dem benachbarten GlcNAc-Rest (X-GlcNAc-GlcNAc-Asn) von einem Glycoprotein, und es wird angenommen, daß das Enzym total spezifisch für diese Bindung ist. Sialidase spaltet nicht-reduzierende terminale Sialylsäuren und ist spezifisch für eine Reihe von alpha 2 → 3-, 6- oder 8-Bindungen.
11.4 (a) PNGase-Behandlung von CA55.1
Alle verwendeten Materialien sollten von der höchsten verfügbaren Reinheit sein. 40 μl COLO205-Membranzu bereitung wurde mit 40 μl Denaturierungspuffer (40 mM Natriumhydrogenphosphat, 0,5% SDS und 5% 2-Mercaptoethanol, pH 7,5) versetzt, und die so erhaltene Lösung wurde zwei Minuten lang gekocht. Nach dem Abkühlen wurden 2 μl Nonidet NP-40 (2,5 Vol.-%) zugegeben. Diese Lösung wurde mit 20 Einheiten PNGase F (N Glycosidase F, Ex. Boehringer Mannheim Kat. Nummer 913782) und dann mit 160 μl Verdauungspuffer (40 mM Natriumhydrogenphosphat, pH 7,5) und 160 μl Milli-Q-Wasser versetzt. Die so erhaltene Lösung wurde dann 18 h bei 37°C inkubiert.
11.4 (b) Sialidasebehandlung von CA55.1
Alle verwendeten Materialien sollten von der höchsten verfügbaren Reinheit sein. Sialidase (0,1 Einheiten, Oxford Glycosystems Kat. Nr. X-5011) wurde in 10 μl 500 mM Natriumacetatpuffer, pH 5, resuspendiert. Die so erhaltene Lösung wurde zu 40 μl COLO205-Membranzubereitung gegeben und 18 h bei 37°C inkubiert.
Die mit PNGase F und Sialidase behandelte COLO205-Membranzubereitung und eine Probe einer nicht behandelten Membranzubereitung wurden dann wie oben beschrieben einem Western-Blott unterzogen.
6 zeigt eine Darstellung der Ergebnisse des Western-Blots. Spalte 1 enthält die unbehandelte COLO205-Membranzubereitung, Spalte 2 die mit PNGase F behandelte Probe und Spalte 3 ist die mit Sialidase behandelte Probe. Spalte 1 zeigt die drei wichtigsten MAK 55.1-positiven Spezies mit einem Molekulargewicht von ungefähr 48–52 kD, 58–72 kD und 88–92 kD. Spalte 2 enthält keine nachweisbaren Spezies. Spalte 3 zeigt 55.1-positive Spezies mit Molekulargewichten von ungefähr 48–52 kD, 58–72 kD und 88–92 kD. In Spalte 3 waren die 55.1-positiven Spezies schwächer anfärbend als die Kontrollprobe in Spalte 1; es wird angenommen, daß diese Reduktion auf eine teilweise Proteinausfällung während der 18stündigen Inkubation bei 37°C zurückzuführen ist.
Diese Ergebnisse zeigen, daß durch die Behandlung einer COLO205-Membranzubereitung mit PNGase F die MAK-55.1-Reaktivität aufgehoben wird, daß jedoch eine Sialidasebehandlung die MAK-55.1-Reaktivität nicht vollständig abstellt. MAK 55.1 erkennt also ein N-gebundenes Oligosaccharid, und die terminalen Sialylsäurereste sind für eine Erkennung nicht notwendig.
11.4 (c) Lektin-Blotting von affinitätsgereinigten MAK-55.1-positiven Glycoproteinen
Eine partielle Struktur des Kohlenhydratteils des CA55.1-Antigens läßt sich mit Proteinen ableiten, die verschiedene Kohlenhydrat-Strukturmotive spezifisch erkennen. Diese Proteine bzw. Lektine lassen sich mit Enzymen markieren, durch die ihre Anordnung auf SDS-PAGE-Blots sichtbar gemacht werden kann.
Alle verwendeten Materialien sollten von der höchsten verfügbaren Reinheit sein. Eine lösliche COLO205-Membranzubereitung wurde durch Binden, Waschen und Eluieren von einer MAK-55.1-gekuppelten Affinitätssäule mit MAK-55.1-positiven Glycoproteinen angereichert. Diese angereicherte Fraktion wurde dann zusammen mit den empfohlenen Glycoproteinkontrollen einem Western Blott unterzogen und mit Boehringer Mannheim DIG-markierten Lektinen nach den Protokollen des Herstellers (DIG Glycan Differentiation Kit, Boehringer Mannheim Kat. Nummer 1210238) als Sonde geprüft.
7 zeigt eine Darstellung der Reaktivität von 4 Kontroll- und MAK-55.1-positiven Glycoproteinen mit Datura-stramonium-Agglutinin (DSA) und Galanthusnivalis-Agglutinin (GNA). 7A zeigt, daß DSA eine Kreuzreaktion mit den beiden hochmolekularen MAK-55.1-positiven Glycoproteinen, 58–72 kD und 88–92 kD, die in Spalten 6 & 7 aufgetragen wurden, eingeht. Bei dem MAK-55.1-positiven Glycoprotein mit dem niedrigsten Molekulargewicht (48–52 kD) wurde keine Kreuzreaktivität beobachtet; diese fehlende Kreuzreaktivität ist wahrscheinlich darauf zurückzuführen, daß nicht genügend Substanz aufgetragen wurde.
7B zeigt, daß es zwischen GNA und den in Spalten 6 und 7 aufgetragenen MAK-55.1-positiven Glycoproteinen keine erkennbare Kreuzreaktivität gibt. In beiden Fällen ist die Beladung in Spalte 7 5mal höher als die in Spalte 6, und bei den Glycoproteinkontrollen waren die korrekten Kreuzreaktivitäten zu sehen.
Das Lektin DSA zeigt eine Kreuzreaktion mit Galactose-beta(1-4)-N-acetylglucosamin; dieses Disaccharid kommt sowohl in komplexen als auch hybriden N-gebundenen Glycanen vor. DSA erkennt dieses Disaccharid auch in O-gebundenen Glycanen. Das Lektin GNA zeigt eine Kreuzreaktion mit terminal gebundenen Mannoseresten, die man in mannosereichen und hybriden N-gebundenen Glycanen findet. Dieses Lektin geht auch mit terminalen Mannoseresten an O-gebundenen Glycanen eine Kreuzreaktion ein. Da mit PNGase behandelte COLO205-Membranzubereitungen nicht MAK-55.1-positiv sind, erkennt MAK 55.1 ein N-gebundenes Glycan. Das positive Ergebnis mit DSA zeigt, daß dieses Glycan das Galactose-beta(1-4)-N-acetylglucosamin-Disaccharid enthält. Das negative Ergebnis mit GNA zeigt, daß das MAK-55.1-positive Glycan keine terminale Mannosegruppe enthält und daher nicht von mannosereichen oder hybriden Typen sein kann. Aus diesen Resultaten geht zusammengenommen hervor, daß MAK 55.1 ein komplexes N-gebundenes Glycan erkennt, das die Galactose-beta(1-4)-N-acetylglucosamin-Disaccharideinheit enthält.
BEISPIEL 12 Vermehrung, Titration und Aufbewahrung des die ACEHRGSGWC-Sequenz aufweisenden Phagen (ACEHRGSGWC-Phage)
ACEHRGSGWC-Phagen (NCIMB Nr. 40638; SEQ ID Nr 26) wurden in E. coli K12, Stamm TG1 (mit dem Phagen beim NCIMB hinterlegt) wie folgt vermehrt. Aus Einzelkolonien, die zur Aufrechterhaltung des F-Pilus auf Minimalmedium-Agarplatten (hergestellt wie unten beschrieben) kultiviert wurden, entnommene TG1-Zellen wurden in Flüssigkultur unter Schütteln bei 37°C in 2 × YT-(Yeast-Tryptone-, Hefe-Trypton-) Brühe (Difco) in stationärer Phase kultiviert. Aliquots der in der stationären Phase befindlichen Kultur (2 ml) wurden in frische Kolben mit 100 ml 2 × YTBrühe inokuliert und unter Schütteln bei 37°C bis zur Mitte der log-Phase kultiviert. Die Kulturen wurden mit ACEHRGSGWC-Phage (10¹¹ plaquebildende Einheiten) versetzt, und die Kolben wurden 10 min bei 37°C stehengelassen, um die Adsorption des Phagen an den F-Pili von E coli und die Insertion der viralen DNA zu ermöglichen. Die Kulturen wurden dann unter Schütteln 5 Stunden lang bei 37°C inkubiert, wodurch dem Phagen die Möglichkeit zur Replikation gegeben wurde.
Die Zellen wurden durch 10minütige Zentrifugation in einem Sorvall GSA oder einem ähnlichen Rotor bei 10.000 U/min und 4°C vom phagenhaltigen Überstand abgetrennt. Der Überstand wurde 15 min lang auf 65°C erhitzt, um gegebenenfalls noch verbliebene Zellen abzutöten, worauf 20 ml einer 20%igen (w/v) Lösung von Polyethylenglycol (PEG) in 2,5 M NaCl pro 100 ml Kulturüberstand zugesetzt wurden. Die Mischung wurde kräftig geschüttelt und zum Ausfällen der Phagenpartikel wenigstens 4 Stunden lang bei 4°C inkubiert. Der Phage wurde wie oben durch Zentrifugieren geerntet, der Überstand wurde verworfen und die Phagenpellets wurden in 50 mM Tris/HCl, 150 mM NaCl, pH 7,5 (TBS), 1 ml pro 100 ml des ursprünglichen Kulturüberstands, resuspendiert. Falls erforderlich wurden die Phagen wie oben mit PEG umgefällt, um besser aufgereinigte Zubereitungen zu erhalten. Die Phagen wurden in TBS aufbewahrt, entweder bei –20°C oder bei 4°C in Gegenwart von 0,02% w/v Natriumazid, ohne daß es bei der anschließenden Lebensfähigkeit nennenswerte Unterschiede gab.
Minimalmediumplatten wurden hergestellt, indem man 1,8% w/v Agar (Difco) in 400 ml Wasser autoklavierte. Nach dem Abkühlen auf etwa 50° wurden die folgenden Bestandteile zugesetzt: 5 × M9-Salze (100 ml); 1M Magnesiumsulfat (500 Mikroliter); 0,1 M Calciumchlorid (500 Mikroliter); 4 mg/ml Thiamin (500 Mikroliter); 20% w/v Glucose (5 ml).
BEISPIEL 13 Titration der Zahl an ACEHRGSGWC-Phagen
Die Anzahl lebensfähiger ACEHRGSGWC-Phagen (SEQ ID Nr 26) wurde von der Anzahl auf in fester Kultur kultivierten E. coli-Indikatorzellen vorhandenen plaquebildenden Einheiten abgeschätzt. Zellen vom E. coli-Stamm TG1 wurden wie oben beschrieben bis zur Mitte der log-Phase kultiviert, und 200-Mikroliter-Aliquots wurden mit 50-Mikroliter-Aliquots einer Reihenverdünnung des Phagen in TBS mit 1 mg/ml Rinderserumalbumin (bovine serum albumin) (TBS-BSA) infiziert. Die Zellen wurden für die Adsorption des Phagen und die Injektion der viralen DNA 10 min bei Raumtemperatur stehengelassen, mit 0,75% w/v Bacto-Agar (Difco) in 2 × YT-Brühe, die auf 48°C gehalten wurde, auf 4 ml verdünnt und dann sofort in Petrischalen mit einem Durchmesser von 90 mm, in die man zuvor 20 ml 1,5%iges Bacto-Agar in 2 × YT-Brühe gegeben hatte, gegossen. Die Platten wurden zum Entwickeln der Phagenplaques, die zum Abschätzen der Anzahl an lebensfähigen Phagen in den untersuchten Stammsuspensionen ausgezählt wurden, über Nacht bei 37°C inkubiert.
BEISPIEL 14 Bestimmung der Bindungsspezifität des ACEHRGSGWC-Phagen durch ELISA
14.1 Spezifität der direkten Bindung an MAK 55.1
Die Spezifität wurde bestimmt, indem man die direkte Bindung des Phagen in Suspension an polystyrolimmobilisiertem MAK 55.1 (ECACC Nr. 93081901), MAK 19.9 (Hybridom ATCC Nr. NS 1116 ND) und MAK C242 (Kabi-Pharmacia, Uppsala, Schweden) wie folgt bestimmte. Vertiefungen von Mikrotiterplatten aus Polystyrol (Nunc, Life Technologies Ltd, UK) wurden über Nacht bei 4°C mit 50-Mikroliter-Aliquots von MAK zu 0,1 mg/ml in 0,1 M Natriumhydrogencarbonatpuffer, 0,02% Natriumazid, pH 8,6 (Hydrogencarbonat-Azid) beschichtet. Die Platten wurden bei Raumtemperatur 2 Stunden lang mit 400-Mikroliter-Aliquots von 30 mg/ml BSA in Hydrogencarbonat-Azid, gefolgt von 3 × 400-Mikroliter-Waschungen mit TBS-BSA pro Vertiefung, wobei jede Waschung 5 min dauerte, blockiert.
Reihenverdünnungen des ACEHRGSGWC-Phagen wurden in 100-Mikroliter-Aliquots von TBS-BSA auf die antikörperbeschichteten Platten aufgetragen und über Nacht bei 4°C inkubiert, worauf die Platten mit 3 × 400-Mikroliter-Aliquots TBS-BSA mit 0,05% w/v Tween 20 (TBS-BSA-Tween) gewaschen wurden. In jede Vertiefung wurde Schaf-anti-M13-Meerrettichperoxidase-Konjugat (Pharmacia, Milton Keynes, Großbritannien) in einer 1 : 2500-Verdünnung in TBS-BSA in 100-Mikroliter-Aliquots gegeben, und es wurde 2 Stunden lang bei Raumtemperatur inkubiert. Die Platten wurden nochmals mit 3 × 400-Mikroliter-Aliquots TBS-BSA-Tween gewaschen und mit 200-Mikroliter-Aliquots OPD-Substrat (10 mg ortho-Phenylendiamin, 12,5 Mikroliter 30%ige Wasserstoffperoxidlösung pro 25 ml 0,1 M Citrat-Phosphat-Puffer, pH 5,0) entwickelt. Die Farbreaktionen wurden durch Zugabe von 50-Mikroliter-Aliquots von 0,5 M Citronensäure gestoppt, und die Extinktion wurde bei 450 nm abgelesen.
Die Ergebnisse (13) zeigten, daß die Bindung des ACEHRGSGWC-Phagen an MAK 55.1 spezifisch und absättigbar war. Zur Halbabsättigung der Bindung des ACEHRGSGWC-Phagen an MAK 55.1 kam es bei einem Phageninput von 2 × 10⁷ in einem Volume von 100 Mikroliter.
Ein Maß für die Bindungsaffinität wurde von der Avogadro-Zahl abgeleitet, wonach eine 1-molare Lösung 6 × 10²³ Moleküle Gelöstes pro Liter bzw. 6 × 10¹⁹ Moleküle pro 100 Mikroliter enthält. Ausgehend von dieser Zahl entsprechen 2 × 10⁷ Phagen pro 100 Mikroliter einer Konzentration von 0,3 pM ganzen Phagenpartikeln bzw. 1,5 pM vom Phagen präsentiertes Peptid (auf jedem M13-Phagenpartikel sind etwa 5 pIII-Moleküle vorhanden). Hieraus läßt sich schließen, daß die EC50, d. h. die für die 50%ige Absättigung von MAK 55.1 erforderliche Konzentration an Peptid-Phage, im Bereich von 1 pM liegt.
14.2 Spezifität der Bindung an MAK 55.1 im Colo-205-Verdrängungsassay
Die Spezifität wurde durch einen Assay bestimmt, in dem der ACEHRGSGWC-Phage mit MAK 55.1 in Lösung um das Epitop des an Polystyrol immobilisierten MAK konkurriert. Vertiefungen von Mikrotiterplatten wurden 30 min mit 100-Mikroliter-Aliquots von 10⁵ Colo-205-Zellen (ATCC Nr CCL 222) in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (50 mM Natriumphosphat, 150 mM Natriumchlorid, pH 7,4) (PBS), die durch 15minütige Zugabe eines gleichen Volumens an 1 Vol.-% Glutaraldehyd in PBS fixiert und 2 Stunden lang mit 10% w/v BSA in PBS (PBS-BSA) blockiert wurden, beschichtet, wobei alle Arbeitsschritte bei Raumtemperatur durchgeführt wurden. Die Platten wurden 3 × 5 min mit 400-Mikroliter-Aliquots PBS pro Vertiefung gewaschen und bis zur Verwendung bei 4°C in einer feuchten Schachtel aufbewahrt (bis zu 1 Monat nach dem Beschichten).
Reihenverdünnungen des ACEHRGSGWC-Phagen wurden über Nacht bei 4°C mit MAKs 55.1, 19.9 und C242, jeweils 20 Mikrogramm/ml in 250 Mikroliter PBS mit 10% w/v BSA und 0,005% w/v Tween 20 (Phagenverdünnungspuffer), inkubiert, worauf zweite 100-Mikroliter-Aliquots in die Vertiefungen von vorbereiteten Colo-205-Platten pipettiert und 3 Stunden lang bei Raumtemperatur inkubiert wurden, um eine Wechselwirkung zwischen den Reaktionspartnern zu ermöglichen. Die Platten wurden 3 × 5 min mit PBS mit 0,05% w/v Tween 20 (PBS-Tween-Puffer) gewaschen und mit 100-Mikroliter-Aliquots von Kaninchen-anti-Maus-IgG-Meerrettichperoxidase-Konjugat (Sigma, Poole, Großbritannien) in einer 1 : 1000-Verdünnung in Phagenverdünnungspuffer pro Vertiefung versetzt. Die Platten wurden 2 Stunden lang bei Raumtemperatur inkubiert und 3 × 5 min mit PBS-Tween-Puffer gewaschen, und die Farbe wurde mit OPD-Substrat entwickelt.
Die Ergebnisse (14) zeigen, daß die Bindungen von MAK 55.1 an Colo-205-Zellen, jedoch nicht die von MAKs 19.9 und C242, durch den ACEHRGSGW-Phagen inhibiert werden konnte, mit einem IC50 von 1012 Phageninput in einem Volumen von 100 Mikrolitern.
Ein Maß für die Bindungsaffinität wurde wie oben von der Avogadro-Zahl abgeleitet. Entsprechen 6 × 10¹⁹ Moleküle von Gelöstem pro 100 Mikroliter einer 1-molaren Lösung, so entsprechen 10¹² Phagenpartikel in 100 Mikrolitern einer 16,7 nM Konzentration an ganzen Partikeln bzw. einer 80 nM Konzentration an vom Phagen präsentiertem Peptid. Daraus läßt sich also schließen, daß der IC50, d. h. die zum Erzielen einer 50%igen Inhibierung der Bindung von MAK 55.1 an sein Antigen auf Colo-205-Zellen erforderliche Phagenkonzentration, in der Größenordnung von 20–100 nM liegt.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Antigenbindungsstruktur mit „complementary determining regions" (CDRs), die das Antigen CA55.1 erkennen, wobei das Antigen folgendes aufweist: a) drei dominante Spezies mit Molekulargewichten nach SDS-PAGE in Bereichen von etwa 48 bis 52 kD, etwa 58 kD bis 72 kD und etwa 88 kD bis 92 kD; b) eine subzelluläre Stelle in der Membranfraktion von COLO-205-Tumorzellen (ATCC Nr. CCL 22) und c) eine komplexe, N-gebundene Kohlenhydratstrukur; und wobei die Antigenbindungsstruktur wenigstens eine der folgenden Eigenschaften aufweist: i) die Antigenbindungsstruktur inhibiert die Bindung des monoklonalen Antikörpers 55.1 (ECACC Nr. 93081901) an das CA55.1-Antigen oder ii) das Peptid ACEHRGSGWC (SEQ ID NR: 26), wie es auf der Oberfläche des Bakteriophagen NCIMB Nr. 40638 vorkommt, bindet sich beim Inkubieren mit festphasengekoppelter Antigenbindungsstruktur mit einer effektiven Bindung von 10 pM oder weniger an die Antigenbindungsstruktur oder iii) das Peptid ACEHRGSGWC (SEQ ID NR: 26), wie es auf der Oberfläche des Bakteriophagen NCIMB Nr. 40638 vorkommt, inhibiert beim Präinkubieren mit der Antigenbindungsstruktur die Bindung der Antigenbindungsstruktur an festphasengekoppelte Colo 205-Zellen (ATCC Nr. CCL 222) kompetitiv bei einer effektiven Konzentration von 200 nM oder weniger.
Antigenbindungsstruktur nach Anspruch 1 mit „complementary determining regions" (CDRs), die das Antigen CA55.1 erkennen, wobei die CDRs die folgenden Sequenzen haben: a) schwere Kette CDR1 G Y W I H (SEQ ID NR: 27) CDR2 E V N P S T G R S D Y N E K F K N (SEQ ID NR: 28) CDR3 E R A Y G Y D D A M D Y (SEQ ID NR: 29); b) leichte Kette CDR1 K S S Q S L L N S R T R K N Y L A (SEQ ID NR: 30) CDR2 W A S T R T S (SEQ ID NR: 31) CDR3 K Q S Y T L R T (SEQ ID NR: 32); oder ein konservatives Analogon davon.
Antigenbindungsstruktur nach Anspruch 1 mit der folgenden, gegebenenfalls humanisierten, Struktur: einer Schwere-Kette-Sequenz (SEQ ID NR: 33)
und einer Leichte-Kette-Sequenz (SEQ ID NR: 34):
oder eines der folgenden Konstrukte davon: F(ab')2; F(ab'), Fab, Fv, Einzelkette Fv & V-min oder ein konservatives Analogon davon.
Polynukleotidsequenz, die für wenigstens die variable Region der schweren Kette oder der leichten Kette einer wie in einem der Ansprüche 1–3 definierten Antigenbindungsstruktur kodiert.
Expressionsvektor, der für wenigstens die variable Region der schweren oder leichten Kette einer wie in einem der Ansprüche 1–3 definierten Antigenbindungsstruktur kodiert.
Wirtszelle, transformiert mit einer Polynukleotidsequenz, oder ein aus der Wirtszelle entwickeltes transgenes, nichthumanes Tier oder eine aus der Wirtszelle entwickelte transgene Pflanze, wobei die Polynukleotidsequenz für wenigstens die variable Region der schweren Kette oder der leichten Kette einer wie in einem der Ansprüche 1–3 definierten Antigenbindungsstruktur kodiert.
Hybridom 55.1, hinterlegt als ECACC-Deposit Nr. 93081901.
ACEHRGSGWC-Phage, hinterlegt als NCIMB Nr. 40638.
Verfahren zur Herstellung wenigstens einer variablen Region einer schweren oder leichten Kette einer wie in einem der Ansprüche 1–3 definierten Antigenbindungsstruktur, bei dem man: a) eine Wirtszelle mit einer Polynukleotidsequenz, die für wenigstens die variable Region der schweren oder leichten Kette der Antigenbindungsstruktur kodiert, transformiert, und gegebenenfalls die transformierte Wirtszelle zu einer transgenen Pflanze entwickelt; b) die Wirtszelle bzw. die transgene Pflanze Bedingungen aussetzt, bei denen die Expression und gegebenenfalls Sezernierung wenigstens der variablen Region gefördert wird, und gegebenenfalls c) die variable Region wenigstens teilweise reinigt.
Verfahren nach Anspruch 9, bei dem sowohl die variablen Regionen der schweren und der leichten Kette in der selben Zelle exprimiert und dadurch unter Bildung einer antigenbindenden Struktur zusammengefügt werden.
Verfahren zur Herstellung des monoklonalen Antikörpers 55.1, bei dem man: a) das als ECACC-Deposit Nr. 93081901 hinterlegte Hybridom 55.1 in einem Medium unter Bedingungen kultiviert, bei denen die Expression des Antikörpers daraus gefördert wird, und b) den Antikörper 55.1 aus dem Kulturmedium gewinnt und gegebenenfalls c) ein F(ab')2-Fragment des Antikörpers 55.1 durch enzymatische Verdauung herstellt.
Immunotoxinkonjugat, umfassend ein Toxin und eine wie in einem der Ansprüche 1–3 definierte Antigenbindungsstruktur.
Pharmazeutische Zusammensetzung, enthaltend ein Immunotoxinkonjugat, das ein Toxin und eine wie in einem der Ansprüche 1–3 definierte Antigenbindungsstruktur umfaßt.
Antigenbindungsstruktur nach Anspruch 1, bei dem es sich um den durch Hybridom 55.1, hinterlegt als ECACC-Deposit Nr. 93081901, produzierten Antikörper handelt.
Verwendung einer wie in einem der Ansprüche 1–3 definierten Antigenbindungsstruktur in einem diagnostischen in-vitro-Verfahren.