JP2003509040A - 遺伝子導入により産生された融合タンパク質 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 トランスジェニック融合タンパク質を作製する方法。この方法は、融合タンパク質を発現するトランスジーンを含むトランスジェニック動物を提供し；該トランスジーンを発現させ；前記トランスジェニック動物の乳から前記融合タンパク質を回収する、各工程を含む。

Description

【発明の詳細な説明】 【０００１】 基金 ここに記載される作業は、契約番号NO1-CO-60000の下で、国立癌研究所、国立
衛生研究所からの連邦基金により一部資金供給されている。 【０００２】 関連出願 本出願は、ここに引用される1998年9月18日に先に出願された米国仮特許出願
第60/101,083号の恩恵を主張する。 【０００３】 発明の分野 本発明は、遺伝子導入により産生された融合タンパク質（例えば免疫グロブリ
ン−酵素融合タンパク質）、該融合タンパク質をコードする核酸、および該融合
タンパク質および核酸を作製および使用する方法に関する。 【０００４】 発明の背景 治療および診断の用途に開発される組換えタンパク質の数が増大している。し
かしながら、これらのタンパク質の多くは、従来の方法を使用して機能的形態お
よび／または必要な量で産生するのは困難であるまたは費用がかかる。従来の方
法には、特定のタンパク質の産生の原因である遺伝子を細菌、酵母、または哺乳
類細胞、例えばCOS細胞に挿入し、次に該細胞を培養培地で増殖する方法が含ま
れる。その後培養された細胞は所望のタンパク質を合成する。伝統的な細菌また
は酵母系では、機能的形態で多くの複合タンパク質を産生することができない。
哺乳類細胞は複合タンパク質を再生することができるのに対し、それらは通常、
増殖するのが困難であるまたは費用がかかり、しばしばわずかにmg/L量のタンパ
ク質しか産生しない。細菌、酵母または哺乳類系を使用することの制限は、適切
な翻訳後修飾および機能的形態への会合を必要とする、免疫グロブリン−酵素融
合タンパク質のような複合タンパク質に特にあてはまる。 【０００５】 発明の概要 概して、本発明は、遺伝子導入融合タンパク質、例えば免疫グロブリン−酵素
融合タンパク質を作製する方法を特徴とする。この方法には、融合タンパク質、
例えば免疫グロブリン−酵素融合タンパク質を発現するトランスジーンを含む、
遺伝子導入動物、例えばヤギまたはウシを提供し；該トランスジーンを発現させ
；および好ましくは、遺伝子導入動物の乳から融合タンパク質を回収する、各工
程を含む。（記載される実施の形態は、乳中での発現に関するが、他のプロモー
ター、例えば他の組織特異的プロモーター、例えば筋肉、毛、尿、血、または卵
特異的プロモーターを使用して他の組織または産物中で融合タンパク質を産生す
ることができる。） 詳細な説明 図面をまず説明する。 【０００６】 図１は、遺伝抗体および抗体アンジオジェニン(angiogenin)融合タンパク質の
略図である。 【０００７】 図２Aは、トランスフェリンレセプター抗体(E6)およびアンジオジェニン−酵
素融合(CH2Ang)についての遺伝子導入発現ベクターの構造の略図である。以下の
DNAを、マウスの乳腺での発現のために修飾されたヤギβ−カゼイン遺伝子のエ
キソン2と7との間で融合した(DiTullio et al., 1992)；抗ヒトトランスフェリ
ンレセプターモノクローナル抗体、E6の重鎖(I)；前述されるのと同じ、アンジ
オジェニン(Ang)をコードする遺伝子の5’端にCH2領域において融合される重鎖(
Rybak et al., 1992)(II)；E6抗体の軽鎖(III)。白いボックス、重鎖；斜交平行
線のボックス、軽鎖：斜線のボックス、Ang。 【０００８】 図２Bは、E6 IgG抗体またはCH2Ang融合タンパク質を産生する泌乳するメスか
ら収集された乳の還元条件下で抗−アンジオジェニンまたは抗−IgG抗体を使用
するウェスタン分析を示す。等量のPBSで希釈した15μlの乳をゲルに適用した。 【０００９】 図２Cは、還元または非還元条件下における精製されたE6抗体またはCH2Angの
ウェスタン分析を示す。ブロットを、それぞれ示された抗体、0.3μ E6、レーン
1および2；4μ E6、レーン3；0.7および0.2μg CH2Ang、レーン4および5で分析
した。 【００１０】 図３は、mRNA翻訳におけるアンジオジェニンまたはアンジオジェニン−抗体融
合(CH2Ang)の効果を示すグラフである。アンジオジェニンまたは融合タンパク質
を、BMV mRNAおよび[³⁵S]メチオニンを含有する溶解産物混合液に加えた。タン
パク質合成を、Newton et al., 1996に記載されるように新しく合成されたタン
パク質への標識の組込みを測定することにより測定した。2−3回の実験からのデ
ータをプールし、±SEMプロットした。結果は、偽処理した対照反応のパーセン
テージで示す。IC₅₀は、タンパク質合成を50%抑制するのに必要なAngまたはAng
融合タンパク質の濃度であり、用量反応曲線から測定した。黒丸、Ang；白丸、C
H2 Ang。 【００１１】 図４は、培養細胞中のアンジオジェニン−抗体融合の細胞毒性効果を示す用量
反応曲線を示すグラフである。SF539およびMDA-MB-231]^mdr細胞に対するCH2Ang
のインビボにおける毒性をタンパク質合成の抑制により査定した。細胞毒性アッ
セイを、本発明の方法において記載されるように細胞タンパク質中への[¹⁴C]ロ
イシンの組込みを測定することにより行った。アッセイは、血清の存在下で行い
、[¹⁴C]ロイシンを適用する前にロイシンおよび血清を有しない培地に変えた。I
C₅₀は、3日後にタンパク質合成を50%抑制するのに必要なアンジオジェニン融合
タンパク質の濃度であり、用量反応曲線から直接測定した。印より大きい時にSE
Mを行った。黒い印、SF539ヒトグリオーマ細胞；白い印、MDA-MB-23]^mdr1、ヒト
乳癌細胞。 【００１２】 本発明は、少なくとも一部、遺伝子導入により産生された融合タンパク質を提
供する。一つの実施の形態において、融合タンパク質には、毒素（例えば酵素の
サブユニット）に融合された免疫グロブリンサブユニット（例えば免疫グロブリ
ン重鎖または軽鎖）が含まれる。ここに記載される免疫グロブリン−酵素融合タ
ンパク質は、所望でない細胞、例えば腫瘍細胞に細胞毒性作用物質（例えば酵素
）を方向付ける作用をする。例えば、以下の実施例に記載される融合タンパク質
、（すなわち、酵素、例えばRNアーゼA、またはカルボキシペプチダーゼに融合
された癌胎児性抗原(CEA)に対する抗体）を使用して、腫瘍細胞に標的付けるこ
とができる。免疫グロブリン−酵素融合が腫瘍部位に集まるのに十分な時間を与
えた後、無毒性のプロドラッグを投与してもよい。このプロドラッグは、腫瘍部
位に局在する標的の酵素の作用により強い細胞毒性の薬に変わり、患者に許容で
きない毒性を与えずに薬の治療レベルを達成できる。 【００１３】実施例１ ；抗体−カルボキシペプチダーゼB融合の産生および試験 F(ab’)2−酵素融合タンパク質を、ヤギベータ−カゼイン発現ベクターBC350
中にサブクローニングした。3つの構成体：213（MF21q3-13、Fd-酵素融合遺伝子
）、LC（LC3、軽鎖）、および141（MF141-4、C末端ロイシンを有するpro領域）
のそれぞれについて、発現カセットを細菌性プラスミド配列から分離した。次に
3つのトランスジーンをマウス接合体中で共−マイクロインジェクションした。F
(ab’)-酵素融合タンパク質抗体の3つのサブユニットすべてを供給する7つのト
ランスジェニックマウス系およびトランスジーンLCおよび213のみを供給する3つ
の系を分析した。乳のサンプルを創始者および第1世代のメスから集め、ELISAお
よび酵素活性アッセイを行った。3つのトランスジーンを供給する7つの系のうち
4つは、1mg/mlより高いレベルで（おそらく4−6mg/mlまで）F(ab’)2-酵素融合
タンパク質を発現するのに対し、LCおよび213トランスジーンのみを供給する3つ
の系はすべて、0.1mg/mlより低いレベルで発現する。 【図面の簡単な説明】 【図１】 遺伝抗体および抗体アンジオジェニン融合タンパク質の略図 【図２Ａ】 トランスフェリンレセプター抗体(E6)およびアンジオジェニン−酵素融合(CH2
Ang)についての遺伝子導入発現ベクターの構造の略図 【図２Ｂ】 E6 IgG抗体またはCH2Ang融合タンパク質を産生する泌乳するメスから収集され
た乳の還元条件下で抗−アンジオジェニンまたは抗−IgG抗体を使用するウェス
タン分析を示す図 【図２Ｃ】 還元または非還元条件下で生成されたE6抗体またはCH2Angのウェスタン分析を
示す図 【図３】 mRNA翻訳におけるアンジオジェニンまたはアンジオジェニン−抗体融合(CH2An
g)の融合効果を示すグラフ 【図４】 培養細胞中のアンジオジェニン−抗体融合の細胞毒性効果を示す用量反応曲線
を示すグラフ

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） // Ａ６１Ｋ 38/00 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ， ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ， ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，Ｃ Ａ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ， ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，Ｋ Ｅ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ， ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，Ｒ Ｕ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ， ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (71)出願人 ザ ガヴァメント オブ ザ ユナイテッ ド ステイツ オブ アメリカ、アズ レ プリゼンテッド バイ ザ セクレタリ ー、 デパートメント オブ ヘルス ア ンド ヒューマン サーヴィスィズ アメリカ合衆国 20852 メリーランド州 ロックビル エグゼキュティブ ブルバ ード 6011 スイート 325 オフィス オブ テクノロジー トランスファー ナ ショナル インスティテュート オブ ヘ ルス内 (72)発明者 エッジ，マイケル ディー イギリス国 エスケー10 ４ティージー チェシャー マックルズフィールド オー ルダリー パーク ミアサイド (72)発明者 ポロック，ダン アメリカ合衆国 マサチューセッツ州 02053 メッドウェイ レッドゲイト ド ライヴ ４ (72)発明者 エシェラード，ヤン アメリカ合衆国 マサチューセッツ州 02130−3007 ジャマイカ プレイン モ ス ヒル ロード 248 (72)発明者 ミード，ハリー エム アメリカ合衆国 マサチューセッツ州 02158 ニュートン グラスミア ストリ ート 62 (72)発明者 ライバック，スザンナ エム アメリカ合衆国 メリーランド州 21702 フレデリック ラウンド ヒル ロード 7411ビー Ｆターム(参考） 4B024 AA01 CA04 CA07 DA02 EA02 EA04 FA02 GA11 HA01 HA03 4C084 AA06 DA27 DA39 DC01 DC50 NA14 ZB022 ZB262 4H045 AA10 AA20 BA10 BA41 CA40 DA01 DA75 EA20 FA71 FA74

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 【請求項１】 トランスジェニック融合タンパク質を作製する方法であって
   、該融合タンパク質を発現するトランスジーンを含むトランスジェニック動物を
   提供し；該トランスジーンを発現させ；および、前記トランスジェニック動物の
   乳から前記融合タンパク質を回収する、各工程を含むことを特徴とする方法。