JPH08228777A - 混成タンパク質生産用融合遺伝子 - Google Patents
混成タンパク質生産用融合遺伝子Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 標的細胞に対して毒素を選択的に結合せしめ
る混成タンパク質を生産させるための融合遺伝子を提供
する。 【解決手段】 混成タンパク質を予定された類の細胞に
選択的に結合させるのに有効な細胞結合配位子の結合ド
メインの少なくとも一部分をコードする第１の断片と、
当該部分に結合したジフテリア毒素の断片Ａの如きもの
を細胞膜の中へまたはこれを通って転移させることが出
来るジフテリア毒素の転移ドメインの少なくとも一部を
コードする第２の断片を含む、融合遺伝子を作成する。
る混成タンパク質を生産させるための融合遺伝子を提供
する。 【解決手段】 混成タンパク質を予定された類の細胞に
選択的に結合させるのに有効な細胞結合配位子の結合ド
メインの少なくとも一部分をコードする第１の断片と、
当該部分に結合したジフテリア毒素の断片Ａの如きもの
を細胞膜の中へまたはこれを通って転移させることが出
来るジフテリア毒素の転移ドメインの少なくとも一部を
コードする第２の断片を含む、融合遺伝子を作成する。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、ＤＮＡ組換え技術
の使用による混成タンパク質(hybrid protein)分子の
製造及び当該分子の医療疾患治療への適用に関するもの
である。
の使用による混成タンパク質(hybrid protein)分子の
製造及び当該分子の医療疾患治療への適用に関するもの
である。
【０００２】
【従来の技術および発明が解決しようとする課題】これ
まで、混成タンパク質をコードする融合遺伝子(fused
gene)の多くの例が文献に報告されている。例えば、ビ
ラーコマロフ(Ｖilla−Ｋomaroff)等：Ｐroc．Ｎat．Ａ
cad．Ｓci．Ｕ.Ｓ.Ａ.，７５巻３７２７−３７３１頁
(１９７８年)は、非細胞質性細菌遺伝子に融合した真核
性構造遺伝子で構成する融合遺伝子について記載してお
り、この融合遺伝子は細胞質外に運ばれる混成タンパク
質をコードしている。混成タンパク質は、また、２種の
異るタンパク質分子のカップリングによる方法でも製造
されるが、この方法はＤＮＡ組換技術を含まない。例え
ば、選ばれた細胞に特異的に結合することが出来る配位
子(ligand)に結合した毒素から成る治療用混成タンパク
質を、カップリングによって形成することが提案されて
いる。このような混成タンパク質を製造する１つの試み
として、チャン（Ｃhang）等：Ｊ．Ｂiol．Ｃhem.，２
５２巻１５１５−１５２２頁(１９７７年)の報告によれ
ば、ジスルフィド結合で橋かけ(crosslinking)すること
により、ヒト胎盤性乳腺刺激ホルモン(human placenta
l lactogen hormone)に結合したジフテリア毒素Ａ鎖
から成る混成物（hybrid)が形成されている。この混成
タンパク質は、ラクトジェン(lactogen）受容体を含有
する細胞に結合しているが、それらの細胞におけるタン
パク質合成を阻止しなかった。
まで、混成タンパク質をコードする融合遺伝子(fused
gene)の多くの例が文献に報告されている。例えば、ビ
ラーコマロフ(Ｖilla−Ｋomaroff)等：Ｐroc．Ｎat．Ａ
cad．Ｓci．Ｕ.Ｓ.Ａ.，７５巻３７２７−３７３１頁
(１９７８年)は、非細胞質性細菌遺伝子に融合した真核
性構造遺伝子で構成する融合遺伝子について記載してお
り、この融合遺伝子は細胞質外に運ばれる混成タンパク
質をコードしている。混成タンパク質は、また、２種の
異るタンパク質分子のカップリングによる方法でも製造
されるが、この方法はＤＮＡ組換技術を含まない。例え
ば、選ばれた細胞に特異的に結合することが出来る配位
子(ligand)に結合した毒素から成る治療用混成タンパク
質を、カップリングによって形成することが提案されて
いる。このような混成タンパク質を製造する１つの試み
として、チャン（Ｃhang）等：Ｊ．Ｂiol．Ｃhem.，２
５２巻１５１５−１５２２頁(１９７７年)の報告によれ
ば、ジスルフィド結合で橋かけ(crosslinking)すること
により、ヒト胎盤性乳腺刺激ホルモン(human placenta
l lactogen hormone)に結合したジフテリア毒素Ａ鎖
から成る混成物（hybrid)が形成されている。この混成
タンパク質は、ラクトジェン(lactogen）受容体を含有
する細胞に結合しているが、それらの細胞におけるタン
パク質合成を阻止しなかった。
【０００３】また、同様にジスルフィド結合で橋かけす
ることにより、ヒト妊娠尿性腺刺激ホルモン（human c
horionic gonadotropin hormone）に結合したリシン
Ａ毒素から成る混成タンパク質も報告されており、特異
性を有すると記載されているが、その結合能力は報告さ
れておらず、更に、ラットライディヒ腫瘍細胞における
タンパク質合成を顕著に阻止するには、極めて高い濃度
を必要としており、そのため、エンドシト−シスによっ
て“非特異的に”取り込まれるのか、混成物の毒素部分
が標的細胞の細胞膜を横切る輸送によって“特異的に”
取り込まれるのかを区別するのは困難である（オエルト
マン(Ｏeltman)等：Ｊ.Ｂiol．Ｃhem.，２５４巻１０２
８−１０３２頁(１９７９年)）。同様の欠点が、シスタ
ミンを橋かけ剤として用いてインシュリンに結合したジ
フテリアＡから成る混成物に見出された（ミスキミンズ
（Ｍiskimins）等：Ｂiochem．Ｂiophys．Ｒes．Ｃommu
n.，９１巻１４５−１５１頁(１９７９年)）。また、異
種二官能橋かけ剤（heterobifunctional crosslinke
r）によって表皮成長因子(ＥＧＦ)に結合したリシンＡ
から成る混成物も製造されたが、ＥＧＦによって付与し
た結合特性は特定の細胞に限定されず、広範囲の細胞種
に及ぶ（コーリー(Ｃawley)等：Ｃell，２２巻５６３−
５７０頁(１９８０年)）。
ることにより、ヒト妊娠尿性腺刺激ホルモン（human c
horionic gonadotropin hormone）に結合したリシン
Ａ毒素から成る混成タンパク質も報告されており、特異
性を有すると記載されているが、その結合能力は報告さ
れておらず、更に、ラットライディヒ腫瘍細胞における
タンパク質合成を顕著に阻止するには、極めて高い濃度
を必要としており、そのため、エンドシト−シスによっ
て“非特異的に”取り込まれるのか、混成物の毒素部分
が標的細胞の細胞膜を横切る輸送によって“特異的に”
取り込まれるのかを区別するのは困難である（オエルト
マン(Ｏeltman)等：Ｊ.Ｂiol．Ｃhem.，２５４巻１０２
８−１０３２頁(１９７９年)）。同様の欠点が、シスタ
ミンを橋かけ剤として用いてインシュリンに結合したジ
フテリアＡから成る混成物に見出された（ミスキミンズ
（Ｍiskimins）等：Ｂiochem．Ｂiophys．Ｒes．Ｃommu
n.，９１巻１４５−１５１頁(１９７９年)）。また、異
種二官能橋かけ剤（heterobifunctional crosslinke
r）によって表皮成長因子(ＥＧＦ)に結合したリシンＡ
から成る混成物も製造されたが、ＥＧＦによって付与し
た結合特性は特定の細胞に限定されず、広範囲の細胞種
に及ぶ（コーリー(Ｃawley)等：Ｃell，２２巻５６３−
５７０頁(１９８０年)）。
【０００４】
【課題を解決するための手段】今回、タンパク質を単一
単位として合成する、即ち、断片を橋かけでなくペプチ
ド結合によって互いに結合させた、優れたジフテリア毒
素／ホルモン混成タンパク質を製造し得ることを見出し
た。本発明は図面を参照することによって最も良く理解
されよう。図面において、第１図は、ジフテリア毒素分
子の図式的説明であり；第２図は、本発明の混成タンパ
ク質分子の図式的説明であり；第３図は、コリネファー
ジ(corynephage)βトックスの３.９kb ＢamＨ−Ｉ制限
断片上のジフテリアトックス(tox)オペロンの位置及び
配向を示す制限地図(restriction map)(以下に一層詳
細に説明するように、野生型トックス対立遺伝子に見ら
れず、突然変異体トックス228対立遺伝子のみに見られ
るＮＲＵＩサイトを含む)であり；第４図は、本発明の
混成タンパク質をコードする本発明の融合遺伝子の図式
的説明である(コード化されたタンパク質断片を参照に
して、遺伝子断片に標識を付ける)。
単位として合成する、即ち、断片を橋かけでなくペプチ
ド結合によって互いに結合させた、優れたジフテリア毒
素／ホルモン混成タンパク質を製造し得ることを見出し
た。本発明は図面を参照することによって最も良く理解
されよう。図面において、第１図は、ジフテリア毒素分
子の図式的説明であり；第２図は、本発明の混成タンパ
ク質分子の図式的説明であり；第３図は、コリネファー
ジ(corynephage)βトックスの３.９kb ＢamＨ−Ｉ制限
断片上のジフテリアトックス(tox)オペロンの位置及び
配向を示す制限地図(restriction map)(以下に一層詳
細に説明するように、野生型トックス対立遺伝子に見ら
れず、突然変異体トックス228対立遺伝子のみに見られ
るＮＲＵＩサイトを含む)であり；第４図は、本発明の
混成タンパク質をコードする本発明の融合遺伝子の図式
的説明である(コード化されたタンパク質断片を参照に
して、遺伝子断片に標識を付ける)。
【０００５】第１図を参照すると、ジフテリア毒素分子
は、数種の機能“ドメイン（domains)”から成り、分子
のアミノ末端に始まり、疎水性リーダーシグナル配列
ｓ、酵素的活性フラグメントＡ、開裂ドメインを含有す
る１４個のアミノ酸のプロテアーゼ感受性ジスルフィド
ループ(ＤＳＬ)ｌ1、更に、疎水性ドメインｈ、ＤＳＬ
ｌ2およびａで示したカルボキシ末端を含む、断片Ｂを
持つことを特徴とする。
は、数種の機能“ドメイン（domains)”から成り、分子
のアミノ末端に始まり、疎水性リーダーシグナル配列
ｓ、酵素的活性フラグメントＡ、開裂ドメインを含有す
る１４個のアミノ酸のプロテアーゼ感受性ジスルフィド
ループ(ＤＳＬ)ｌ1、更に、疎水性ドメインｈ、ＤＳＬ
ｌ2およびａで示したカルボキシ末端を含む、断片Ｂを
持つことを特徴とする。
【０００６】ジフテリア毒素が感受性真核細胞を中毒さ
せる方法は、少くとも次の工程を含む：(i)ジフテリア
毒素が、感受性細胞の表面で特定のレセプターに結合
し；(ii)毒素分子は、そのレセプターに結合しながら、
エンドシト−シス小胞(endocytic vesicle)内に内在化
され（internalized）；(iii)内在化（internalizatio
n）される前か、またはエンドシト−シス小胞内のどち
らかで、毒素分子がＮ−末端から４７,０００ダルトン
の領域内のサイトで開裂(又は処理)され；(iv)エンドシ
ト−シス小胞のpＨが６以下に低下するにつれて、毒素
の構造中間体型は、そのレセプターに依然結合したまま
膜の中に挿入され；(v)膜の中に一旦埋め込まれると、
疎水性ドメインｈが細孔を形成し；(vi)フラグメントＡ
とＢの間のｌ1においてタンパク質分解開裂が起こり；
(vii)その後、フラグメントＡ、又はフラグメントＡを
含有するポリペプチドが細胞質ゾル(cytosol)の中に放
出され；(viii)フラグメントＡの触媒活性、即ち、延長
因子２のニコチンアミドアデニンジヌクレオチド−アデ
ノシンジホスフェートリボシル化が、中毒細胞の死を引
き起こす。細胞質ゾルに導入したフラグメントＡの単一
分子が、細胞を殺すのに十分であることは明らかであ
る。
せる方法は、少くとも次の工程を含む：(i)ジフテリア
毒素が、感受性細胞の表面で特定のレセプターに結合
し；(ii)毒素分子は、そのレセプターに結合しながら、
エンドシト−シス小胞(endocytic vesicle)内に内在化
され（internalized）；(iii)内在化（internalizatio
n）される前か、またはエンドシト−シス小胞内のどち
らかで、毒素分子がＮ−末端から４７,０００ダルトン
の領域内のサイトで開裂(又は処理)され；(iv)エンドシ
ト−シス小胞のpＨが６以下に低下するにつれて、毒素
の構造中間体型は、そのレセプターに依然結合したまま
膜の中に挿入され；(v)膜の中に一旦埋め込まれると、
疎水性ドメインｈが細孔を形成し；(vi)フラグメントＡ
とＢの間のｌ1においてタンパク質分解開裂が起こり；
(vii)その後、フラグメントＡ、又はフラグメントＡを
含有するポリペプチドが細胞質ゾル(cytosol)の中に放
出され；(viii)フラグメントＡの触媒活性、即ち、延長
因子２のニコチンアミドアデニンジヌクレオチド−アデ
ノシンジホスフェートリボシル化が、中毒細胞の死を引
き起こす。細胞質ゾルに導入したフラグメントＡの単一
分子が、細胞を殺すのに十分であることは明らかであ
る。
【０００７】本発明の混成タンパク質は、混成タンパク
質のアミノ末端に始まり、順番にペプチド結合によって
互いに結合した次のペプチド断片を含む: a) ジフテリア毒素の酵素的活性フラグメントＡ(タン
パク質を分泌する間に切り取られるリーダーフラグメン
トsを持たない)、 b) ジフテリア毒素の前記フラグメントＡに隣接した開
裂ドメインｌ1を含む断片、 c) 少なくとも、ｌ1とトックス228対立遺伝子のＮＲＵ
Ｉサイトのトックスオペロン上の位置から約９０塩基対
上流の位置との間にある、トックスオペロンのフラグメ
ントＢをコードする遺伝子断片の部分によってコードさ
れた、ジフテリア毒素のフラグメントＢの部分を含む断
片と、 d) 細胞特異性ポリペプチド配位子の一部分を含む断片
で、該部分はポリペプチド配位子の結合ドメインの少く
とも一部分を含み、結合ドメインの該部分は混成タンパ
ク質をジフテリア毒素の酵素活性フラグメントＡによっ
て攻撃される予定された細胞に選択的に結合させるのに
有効である。
質のアミノ末端に始まり、順番にペプチド結合によって
互いに結合した次のペプチド断片を含む: a) ジフテリア毒素の酵素的活性フラグメントＡ(タン
パク質を分泌する間に切り取られるリーダーフラグメン
トsを持たない)、 b) ジフテリア毒素の前記フラグメントＡに隣接した開
裂ドメインｌ1を含む断片、 c) 少なくとも、ｌ1とトックス228対立遺伝子のＮＲＵ
Ｉサイトのトックスオペロン上の位置から約９０塩基対
上流の位置との間にある、トックスオペロンのフラグメ
ントＢをコードする遺伝子断片の部分によってコードさ
れた、ジフテリア毒素のフラグメントＢの部分を含む断
片と、 d) 細胞特異性ポリペプチド配位子の一部分を含む断片
で、該部分はポリペプチド配位子の結合ドメインの少く
とも一部分を含み、結合ドメインの該部分は混成タンパ
ク質をジフテリア毒素の酵素活性フラグメントＡによっ
て攻撃される予定された細胞に選択的に結合させるのに
有効である。
【０００８】含有される毒素分子の必要な部分は、第１
図の線yとxとの間の分子の部分として表わされる。混成
タンパク質は、好ましくは、毒素分子のプロテアーゼ感
受性ＤＳＬ ｌ2、即ち線xとzとの間の分子の部分も含
む。線zは、好ましくは、Ｂのカルボキシ末端から４７
アミノ酸の点、即ち、l2の端よりも遠くで、フラグメン
トＢの普遍的真核性結合部位が確実に除かれる部位にあ
り、それゆえ、細胞との結合は、細胞特異性ポリペプチ
ド配位子の結合ドメインによって制御されるであろう。
有効な毒素として作用するためには、フラグメントＢの
１／２よりやや多くを該分子に付与しなければならない
ことが証明されている。
図の線yとxとの間の分子の部分として表わされる。混成
タンパク質は、好ましくは、毒素分子のプロテアーゼ感
受性ＤＳＬ ｌ2、即ち線xとzとの間の分子の部分も含
む。線zは、好ましくは、Ｂのカルボキシ末端から４７
アミノ酸の点、即ち、l2の端よりも遠くで、フラグメン
トＢの普遍的真核性結合部位が確実に除かれる部位にあ
り、それゆえ、細胞との結合は、細胞特異性ポリペプチ
ド配位子の結合ドメインによって制御されるであろう。
有効な毒素として作用するためには、フラグメントＢの
１／２よりやや多くを該分子に付与しなければならない
ことが証明されている。
【０００９】本発明の混成タンパク質分子の図式的説明
である第２図を参照すれば、ジフテリア毒素のy−z部分
は、ペプチド結合によって、細胞特異性ポリペプチド配
位子、即ち、ジフテリア毒素分子の酵素活性フラグメン
トＡによって攻撃されるべき予定された細胞に選択的に
結合するポリペプチドのフラグメントｒに結合してい
る。フラグメントrは、配位子全体、または配位子の結
合ドメインの全体または結合ドメインの有効な部分を含
む配位子の一部から成ることができる。
である第２図を参照すれば、ジフテリア毒素のy−z部分
は、ペプチド結合によって、細胞特異性ポリペプチド配
位子、即ち、ジフテリア毒素分子の酵素活性フラグメン
トＡによって攻撃されるべき予定された細胞に選択的に
結合するポリペプチドのフラグメントｒに結合してい
る。フラグメントrは、配位子全体、または配位子の結
合ドメインの全体または結合ドメインの有効な部分を含
む配位子の一部から成ることができる。
【００１０】用いる配位子が大きい場合、分子の結合ド
メインをフラグメントＢの疎水性ドメインｈの近くに位
置させるために、配位子の非結合部分はできるだけ少な
くすることが望ましい。また、配位子分子の結合ドメイ
ンの全部、またはほとんどを含むのが望ましい。アミノ
酸１３の小さいペプチドであるαメラニン細胞刺激ホル
モン(ＭＳＨ)又はアミノ酸１７を含有するβＭＳＨの場
合、分子のカルボキシ末端で９個のアミノ酸から成る分
子の部分、または分子全体を用いることができる。
メインをフラグメントＢの疎水性ドメインｈの近くに位
置させるために、配位子の非結合部分はできるだけ少な
くすることが望ましい。また、配位子分子の結合ドメイ
ンの全部、またはほとんどを含むのが望ましい。アミノ
酸１３の小さいペプチドであるαメラニン細胞刺激ホル
モン(ＭＳＨ)又はアミノ酸１７を含有するβＭＳＨの場
合、分子のカルボキシ末端で９個のアミノ酸から成る分
子の部分、または分子全体を用いることができる。
【００１１】細胞特異性配位子内の結合ドメインが位置
する領域は、現在、多数の配位子について知られてい
る。更に、固体相ポリペプチド合成における最近の進歩
は、当業者が配位子の種々の断片を合成し、更に、それ
らが、攻撃される細胞に結合する能力を試験することに
よって、実質的に、幾つかの該配位子の結合ドメインを
決定することを可能にする。
する領域は、現在、多数の配位子について知られてい
る。更に、固体相ポリペプチド合成における最近の進歩
は、当業者が配位子の種々の断片を合成し、更に、それ
らが、攻撃される細胞に結合する能力を試験することに
よって、実質的に、幾つかの該配位子の結合ドメインを
決定することを可能にする。
【００１２】本発明の混成タンパク質分子は、その配位
子結合ドメインに結合する特定種類の細胞を除いて、全
ての哺乳類細胞に対し実質的に非毒性である。このよう
に、本発明の混成タンパク質は、他の多数の治療剤、例
えば、一般の細胞毒素（cytotoxic）抗癌剤よりもずっ
と特異的である。
子結合ドメインに結合する特定種類の細胞を除いて、全
ての哺乳類細胞に対し実質的に非毒性である。このよう
に、本発明の混成タンパク質は、他の多数の治療剤、例
えば、一般の細胞毒素（cytotoxic）抗癌剤よりもずっ
と特異的である。
【００１３】断片がペプチド結合を介して結合している
本発明の混成タンパク質は、また、橋かけした混成物よ
りも優れている。何故なら、本発明のタンパク質は、全
ての同一分子が特定の細胞にとって有効かつ選択的であ
る、均質試料として提供出来るからである。
本発明の混成タンパク質は、また、橋かけした混成物よ
りも優れている。何故なら、本発明のタンパク質は、全
ての同一分子が特定の細胞にとって有効かつ選択的であ
る、均質試料として提供出来るからである。
【００１４】本発明の混成タンパク質が結合し、かつ攻
撃する特定の細胞は、混成分子の結合ドメインを与える
特定のポリペプチド配位子によって決定される。攻撃さ
れるべき特定の細胞に対して特異的な結合ドメインを有
する任意の細胞特異性ポリペプチド配位子を用いること
が出来る。ポリペプチドホルモンは、当該配位子として
有用である。例えば、α又はβＭＳＨの結合領域の一部
を用いて作った混成物は、選択的にメラニン細胞（mela
nocyte）に結合して混成物を黒色腫の治療に有用なもの
にする。その他の配位子は、様々な特異性を与え、例え
ば、サブスタンスＰの結合ドメインは、痛みの伝達に含
まれるニューロンの表面に受容体を認識するので、サブ
スタンスＰを用いて作った混成物は、該ニューロンを破
壊して慢性痛を和らげるのに用いることができる。ま
た、これらの混成物は、サブスタンスＰレセプターを含
有する神経系領域をマップするのにも用いることができ
る。その他の使用可能な特異性−結合配位子はソマトス
タチン(somatostatin)、インターロイキン(interleuki
n)Ｉ、インターロイキンII、インターロイキンIIIを含
む。インターロイキンIIは、活性化Ｔ細胞を含むアレル
ギー反応および狼瘡等の自己免疫性疾患におけるその役
割の故に特に重要である。加えて、インターロイキンの
全てがＴ細胞に対して特異的であるから、インターロイ
キンを用いて作った混成物は、免疫系統を含む癌の処
置、および移植器官の拒絶反応の阻止に使用され得る。
その他の細胞特異性結合ドメインを有する有用なポリペ
プチド配位子の例は、濾胞刺激ホルモン(卵巣細胞に対
して特異的)、黄体形成ホルモン(卵巣細胞に対して特異
的)、甲状腺刺激ホルモン(甲状腺細胞に対して特異
的)、パソプレシン（子宮細胞、並びに膀胱及び腸細胞
に対して特異的)、プロラクチン(乳房細胞に対して特異
的)、及び成長ホルモン（所定の骨細胞に対して特異
的）等である。
撃する特定の細胞は、混成分子の結合ドメインを与える
特定のポリペプチド配位子によって決定される。攻撃さ
れるべき特定の細胞に対して特異的な結合ドメインを有
する任意の細胞特異性ポリペプチド配位子を用いること
が出来る。ポリペプチドホルモンは、当該配位子として
有用である。例えば、α又はβＭＳＨの結合領域の一部
を用いて作った混成物は、選択的にメラニン細胞（mela
nocyte）に結合して混成物を黒色腫の治療に有用なもの
にする。その他の配位子は、様々な特異性を与え、例え
ば、サブスタンスＰの結合ドメインは、痛みの伝達に含
まれるニューロンの表面に受容体を認識するので、サブ
スタンスＰを用いて作った混成物は、該ニューロンを破
壊して慢性痛を和らげるのに用いることができる。ま
た、これらの混成物は、サブスタンスＰレセプターを含
有する神経系領域をマップするのにも用いることができ
る。その他の使用可能な特異性−結合配位子はソマトス
タチン(somatostatin)、インターロイキン(interleuki
n)Ｉ、インターロイキンII、インターロイキンIIIを含
む。インターロイキンIIは、活性化Ｔ細胞を含むアレル
ギー反応および狼瘡等の自己免疫性疾患におけるその役
割の故に特に重要である。加えて、インターロイキンの
全てがＴ細胞に対して特異的であるから、インターロイ
キンを用いて作った混成物は、免疫系統を含む癌の処
置、および移植器官の拒絶反応の阻止に使用され得る。
その他の細胞特異性結合ドメインを有する有用なポリペ
プチド配位子の例は、濾胞刺激ホルモン(卵巣細胞に対
して特異的)、黄体形成ホルモン(卵巣細胞に対して特異
的)、甲状腺刺激ホルモン(甲状腺細胞に対して特異
的)、パソプレシン（子宮細胞、並びに膀胱及び腸細胞
に対して特異的)、プロラクチン(乳房細胞に対して特異
的)、及び成長ホルモン（所定の骨細胞に対して特異
的）等である。
【００１５】本発明の混成タンパク質は、好ましくは、
混成タンパク質をコードする所望の融合遺伝子を形成
し、次に、常套の方法を用いて融合遺伝子を発現させる
ことを含むＤＮＡ組換技術を用いて調製される。第３図
を参照すると、コリネファージβトックス＋の３.９kb
Ｂam Ｈ−Ｉ制限断片上のジフテリアトックスオペロン
の位置及び配向は、トックスオペロンを所望の位置で切
断し、かつオペロンの所望の部分を、選択したポリペプ
チド配位子に対応する遺伝子の所望の部分に融合させ
る。トックスオペロンについての一層詳細な説明及びフ
ラグメントＡのクローニングについての説明は、レオン
グ（Ｌeong）等：Ｓcience，２２０巻５１５頁(１９８
３年)に記載されており、参照文献としてここに引用す
る。プラスミドpＤＴ２０１を作るために、そこに記載
されたようにクローン化されたフラグメントＡは、１９
８３年５月１１日、メリーランド、ロックビル在、アメ
リカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａmerica
n Ｔype Ｃulture Ｃollection）にＡＴＣＣ寄託番
号第３９３５９号として寄託されている。
混成タンパク質をコードする所望の融合遺伝子を形成
し、次に、常套の方法を用いて融合遺伝子を発現させる
ことを含むＤＮＡ組換技術を用いて調製される。第３図
を参照すると、コリネファージβトックス＋の３.９kb
Ｂam Ｈ−Ｉ制限断片上のジフテリアトックスオペロン
の位置及び配向は、トックスオペロンを所望の位置で切
断し、かつオペロンの所望の部分を、選択したポリペプ
チド配位子に対応する遺伝子の所望の部分に融合させ
る。トックスオペロンについての一層詳細な説明及びフ
ラグメントＡのクローニングについての説明は、レオン
グ（Ｌeong）等：Ｓcience，２２０巻５１５頁(１９８
３年)に記載されており、参照文献としてここに引用す
る。プラスミドpＤＴ２０１を作るために、そこに記載
されたようにクローン化されたフラグメントＡは、１９
８３年５月１１日、メリーランド、ロックビル在、アメ
リカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａmerica
n Ｔype Ｃulture Ｃollection）にＡＴＣＣ寄託番
号第３９３５９号として寄託されている。
【００１６】第３図及び４図を参照すると、本発明の混
成タンパク質をコードする融合遺伝子(第４図)を製造す
るのに用いられるジフテリアトックスオペロン(第３図)
の部分は、好ましくは、点線によって示すフラグメント
Ｄの部分、即ち、初めのＳau３ＡＩサイトからＳＰＨＩ
サイトまでのトックス遺伝子の部分である。このよう
に、フラグメントＤは、フラグメントＡをコードする８
３１塩基対(bp)遺伝子断片(プロモーターを含む構造遺
伝子の前方にある１７７bp配列及び第１図のシグナル配
列ｓをコードする部分を含む)；フラグメントＢの疎水
性ドメインをコードする遺伝子断片の部分；及びＤＳＬ
ｌ2をコードする遺伝子断片を含む。
成タンパク質をコードする融合遺伝子(第４図)を製造す
るのに用いられるジフテリアトックスオペロン(第３図)
の部分は、好ましくは、点線によって示すフラグメント
Ｄの部分、即ち、初めのＳau３ＡＩサイトからＳＰＨＩ
サイトまでのトックス遺伝子の部分である。このよう
に、フラグメントＤは、フラグメントＡをコードする８
３１塩基対(bp)遺伝子断片(プロモーターを含む構造遺
伝子の前方にある１７７bp配列及び第１図のシグナル配
列ｓをコードする部分を含む)；フラグメントＢの疎水
性ドメインをコードする遺伝子断片の部分；及びＤＳＬ
ｌ2をコードする遺伝子断片を含む。
【００１７】第３図に示すように、フラグメントＡをコ
ードする遺伝子断片の初めの１７７bpは、トックスプロ
モーターの前方にあり、トックスオペロンの一部ではな
いＤＮＡを含む。このＤＮＡは無関係であり、転写され
ない。それは、単に、フラグメントＡをコードする遺伝
子断片の初めの部分にあるＳau ３ＡＩサイトがトック
スプロモーター(Ｈind IIIの直ぐ左側の線として表わさ
れる)に近い最も便利な制限サイトであるが故に含まれ
ているに過ぎない。
ードする遺伝子断片の初めの１７７bpは、トックスプロ
モーターの前方にあり、トックスオペロンの一部ではな
いＤＮＡを含む。このＤＮＡは無関係であり、転写され
ない。それは、単に、フラグメントＡをコードする遺伝
子断片の初めの部分にあるＳau ３ＡＩサイトがトック
スプロモーター(Ｈind IIIの直ぐ左側の線として表わさ
れる)に近い最も便利な制限サイトであるが故に含まれ
ているに過ぎない。
【００１８】フラグメントＤは、それを単に、トックス
オペロンからＳau ３ＡＩ及びＳＰＨＩ部位での切断を
経て切り取ることにより得ることができるはずである。
その代りの方法として、遺伝子断片を以下のように、互
いに融合することもできる。まず、フラグメントＡをコ
ードする遺伝子断片を得、次にフラグメントＢのほとん
どをコードする遺伝子断片、Ｓau ３ＡＩからＳau ３Ａ
Ｉまで(第３図のＢ')を得る。フラグメントＢ'をコード
する遺伝子断片をプラスミドpＵＣ８中でクローン化し
てプラスミドpＤＴ３０１を作る。これは、１９８３年
５月１１日、前記アメリカン・タイプ・カルチャー・コ
レクションにＡＴＣＣ寄託番号第３９３６０号として寄
託されている。フラグメントＢ'を酵素Ｂal３１を用い
て、トックス228上のＮＲＵＩサイト（野生型トックス
対立遺伝子はＮＲＵＩサイトを持たない)の位置まで約
２００bpカットバックして、Ｂ”(第３図)を得る。フラ
グメントＡ及びＢ”を融合し、ｌ2をコードする断片を
Ｂ”に融合し、ポリペプチド配位子の所望の部分をコー
ドする断片をｌ2に融合する。
オペロンからＳau ３ＡＩ及びＳＰＨＩ部位での切断を
経て切り取ることにより得ることができるはずである。
その代りの方法として、遺伝子断片を以下のように、互
いに融合することもできる。まず、フラグメントＡをコ
ードする遺伝子断片を得、次にフラグメントＢのほとん
どをコードする遺伝子断片、Ｓau ３ＡＩからＳau ３Ａ
Ｉまで(第３図のＢ')を得る。フラグメントＢ'をコード
する遺伝子断片をプラスミドpＵＣ８中でクローン化し
てプラスミドpＤＴ３０１を作る。これは、１９８３年
５月１１日、前記アメリカン・タイプ・カルチャー・コ
レクションにＡＴＣＣ寄託番号第３９３６０号として寄
託されている。フラグメントＢ'を酵素Ｂal３１を用い
て、トックス228上のＮＲＵＩサイト（野生型トックス
対立遺伝子はＮＲＵＩサイトを持たない)の位置まで約
２００bpカットバックして、Ｂ”(第３図)を得る。フラ
グメントＡ及びＢ”を融合し、ｌ2をコードする断片を
Ｂ”に融合し、ポリペプチド配位子の所望の部分をコー
ドする断片をｌ2に融合する。
【００１９】上記のスキームでは、フラグメントＢ'を
コード化する遺伝子断片は、ＮＲＵＩの正確な位置まで
カットバックするのが好ましいが、ＮＲＵＩより９０bp
先の位置とｌ2コード化領域の端との間(即ち、ＮＲＵＩ
の９０bp先の位置とｌ2コード化領域の始まりとの間の
２０８bp領域内)の任意の位置までカットバックするこ
ともできる。又はＢ'コード化断片をｌ2コード化領域の
カルボキシ末端(ＮＲＵＩから１２９bp下流)までカット
バックすることもでき、この場合、合成ｌ2コード化領
域の融合は不必要である。(Ｂ'コード化領域をカットバ
ックして、それに合成ｌ2コード化断片を融合する場
合、一般にＮＲＵＩとＳＰＨＩとの間に、普通多少の塩
基対が認められるが、それらは融合遺伝子中には存在し
ないから、厳密に言えば、第３図のＤの全て、又は第１
及び第２図のy−zの全てが必ずしも含まれるのではない
ことは、明らかである。）
コード化する遺伝子断片は、ＮＲＵＩの正確な位置まで
カットバックするのが好ましいが、ＮＲＵＩより９０bp
先の位置とｌ2コード化領域の端との間(即ち、ＮＲＵＩ
の９０bp先の位置とｌ2コード化領域の始まりとの間の
２０８bp領域内)の任意の位置までカットバックするこ
ともできる。又はＢ'コード化断片をｌ2コード化領域の
カルボキシ末端(ＮＲＵＩから１２９bp下流)までカット
バックすることもでき、この場合、合成ｌ2コード化領
域の融合は不必要である。(Ｂ'コード化領域をカットバ
ックして、それに合成ｌ2コード化断片を融合する場
合、一般にＮＲＵＩとＳＰＨＩとの間に、普通多少の塩
基対が認められるが、それらは融合遺伝子中には存在し
ないから、厳密に言えば、第３図のＤの全て、又は第１
及び第２図のy−zの全てが必ずしも含まれるのではない
ことは、明らかである。）
【００２０】代りの方法としては、上記のスキーム程に
は好適ではないが、配位子コード化遺伝子断片を、ｌ２
コード化断片を用いないで、直接Ｂ”に融合することで
ある。l2コード化断片を含むか、または省略するか、い
ずれにせよ融合遺伝子は、野生型対立遺伝子よりもむし
ろ突然変異体トックス228対立遺伝子由来のＢ"暗号化遺
伝子断片を用いて作ることができる。ＮＲＵＩサイトを
含むトックス228対立遺伝子を処理して、容易にＢ”暗
号化断片が得られる。トックス228対立遺伝子はウチダ
（Ｕchida）等：Ｊ.Ｂiol．Ｃhem.，２４８巻３８３８
頁（１９７３年）に記載されており、参照文献としてこ
こに引用する。
は好適ではないが、配位子コード化遺伝子断片を、ｌ２
コード化断片を用いないで、直接Ｂ”に融合することで
ある。l2コード化断片を含むか、または省略するか、い
ずれにせよ融合遺伝子は、野生型対立遺伝子よりもむし
ろ突然変異体トックス228対立遺伝子由来のＢ"暗号化遺
伝子断片を用いて作ることができる。ＮＲＵＩサイトを
含むトックス228対立遺伝子を処理して、容易にＢ”暗
号化断片が得られる。トックス228対立遺伝子はウチダ
（Ｕchida）等：Ｊ.Ｂiol．Ｃhem.，２４８巻３８３８
頁（１９７３年）に記載されており、参照文献としてこ
こに引用する。
【００２１】より詳細には、本発明の混成タンパク質を
コードする融合遺伝子は、次のようにして作ることがで
きる。ベクター 好適なベクターはプラスミドpＵＣ７、pＵＣ８、pＵＣ
９、およびpＢＲ３２２である。ビエラ（Ｖiera）等：
Ｇene，１９巻２５９頁(１９８２年)（参照文献として
ここに引用する）に記載されているpＵＣプラスミド
は、特に融合遺伝子の明瞭な作成法である二重消化クロ
ーニング（double digest cloning）に適している。
コードする融合遺伝子は、次のようにして作ることがで
きる。ベクター 好適なベクターはプラスミドpＵＣ７、pＵＣ８、pＵＣ
９、およびpＢＲ３２２である。ビエラ（Ｖiera）等：
Ｇene，１９巻２５９頁(１９８２年)（参照文献として
ここに引用する）に記載されているpＵＣプラスミド
は、特に融合遺伝子の明瞭な作成法である二重消化クロ
ーニング（double digest cloning）に適している。
【００２２】プラスミドｐＤＴ２０１およびｐＤＴ３０
１の製造 コリネバクテリオファージβトックス＋をマーフィー
（Ｍurphy）等：Ｐroc．Ｎat．Ａcad．Ｓci．ＵＳＡ，
７１巻１１−１５頁(１９７４年)の記載に従って調製
し、制限エンドヌクレアーゼＢamＨ−１で消化した。
３.９kb断片をコスタ（Ｃosta）等：Ｊ.Ｂacteriol.，
１４８巻１２４−１３０頁(１９８１年)の記載に従っ
て、アガロースゲル電気泳動により単離した。次に、精
製した断片を制限エンドヌクレアーゼＳau ３Ａ１で消
化し、３.９kb断片を２種の主な切片、９７７塩基対(b
p)切片および８３１bp切片に切断した。
１の製造 コリネバクテリオファージβトックス＋をマーフィー
（Ｍurphy）等：Ｐroc．Ｎat．Ａcad．Ｓci．ＵＳＡ，
７１巻１１−１５頁(１９７４年)の記載に従って調製
し、制限エンドヌクレアーゼＢamＨ−１で消化した。
３.９kb断片をコスタ（Ｃosta）等：Ｊ.Ｂacteriol.，
１４８巻１２４−１３０頁(１９８１年)の記載に従っ
て、アガロースゲル電気泳動により単離した。次に、精
製した断片を制限エンドヌクレアーゼＳau ３Ａ１で消
化し、３.９kb断片を２種の主な切片、９７７塩基対(b
p)切片および８３１bp切片に切断した。
【００２３】次に、Ｓau ３Ａ１消化ＤＮＡをアガロー
スゲルで電気泳動にかけ、９７７bpおよび８３１bp断片
をゲルから摘出し、抽出した。８３１bp断片は、ジフテ
リアトックスプロモーター／オペレーター領域、ＧＴＧ
トックス翻訳開始シグナル、２４アミノ酸トックスリー
ダー配列（アミノ酸−２４から−１）、およびジフテリ
アトキシンのフラグメントＡ（アミノ酸−２４から１９
３）全体をコードする。９７７bp断片は、ジフテリアト
キシンのフラグメントＢ（アミノ酸１９４から５１８）
をコードする。
スゲルで電気泳動にかけ、９７７bpおよび８３１bp断片
をゲルから摘出し、抽出した。８３１bp断片は、ジフテ
リアトックスプロモーター／オペレーター領域、ＧＴＧ
トックス翻訳開始シグナル、２４アミノ酸トックスリー
ダー配列（アミノ酸−２４から−１）、およびジフテリ
アトキシンのフラグメントＡ（アミノ酸−２４から１９
３）全体をコードする。９７７bp断片は、ジフテリアト
キシンのフラグメントＢ（アミノ酸１９４から５１８）
をコードする。
【００２４】ｐＤＴ２０１の製造 ビエラ（Ｖiera）等：Ｇene，１９巻２５９頁(１９８２
年)に記載されており、またマサチューセッツ、ビバリ
ー在、ニュー・イングランド・バイオラブス（Ｎew Ｅn
gland Ｂiolabs）から販売されているプラスミドｐＵＣ
８を制限エンドヌクレアーゼＢamＨ−１で消化し、次に
アルカリホスファターゼで処理した。次に、３.９kb Ｂ
amＨ−１断片の８３１bpＳau３Ａ１セグメントをＴ4Ｄ
ＮＡリガーゼ（ニュー・イングランド・バイオラブス）
でアルカリホスファターゼ処理済みｐＵＣ８のＢamＨ−
１部位に連結し、標準的な手法に従いプラスミドｐＤＴ
２０１を製造した。
年)に記載されており、またマサチューセッツ、ビバリ
ー在、ニュー・イングランド・バイオラブス（Ｎew Ｅn
gland Ｂiolabs）から販売されているプラスミドｐＵＣ
８を制限エンドヌクレアーゼＢamＨ−１で消化し、次に
アルカリホスファターゼで処理した。次に、３.９kb Ｂ
amＨ−１断片の８３１bpＳau３Ａ１セグメントをＴ4Ｄ
ＮＡリガーゼ（ニュー・イングランド・バイオラブス）
でアルカリホスファターゼ処理済みｐＵＣ８のＢamＨ−
１部位に連結し、標準的な手法に従いプラスミドｐＤＴ
２０１を製造した。
【００２５】ｐＤＴ３０１の製造 ３.９kbＢamＨ−１断片の９７７bpＳau３Ａ１セグメン
トをＴ4ＤＮＡリガーゼでアルカリホスファターゼ処理
済みｐＵＣ８のＢamＨ−１部位に連結し、標準的な手法
に従いプラスミドｐＤＴ３０１を製造した。
トをＴ4ＤＮＡリガーゼでアルカリホスファターゼ処理
済みｐＵＣ８のＢamＨ−１部位に連結し、標準的な手法
に従いプラスミドｐＤＴ３０１を製造した。
【００２６】融合遺伝子 以下は、トックス配列と配位子（この場合、ＭＳＨ）配
列との間にプロテアーゼ感受性ループｌ2を含有するジ
フテリア毒素−ＭＳＨ融合遺伝子を組み立てるフローチ
ャートである。
列との間にプロテアーゼ感受性ループｌ2を含有するジ
フテリア毒素−ＭＳＨ融合遺伝子を組み立てるフローチ
ャートである。
【００２７】
【化１】
【００２８】上記のフローチャートを参照すると、工程
(i)では、初めにフラグメントＡコード化遺伝子断片を
前記Ｓcience誌（２２０巻，５１５頁）に記載されてい
るような方法で得て、精製する。なお、Ｓau ３Ａ１は
当該技術分野でよく知られた制限部位であり、Ｓau ３
Ａ１-２とは２個所のＳau ３Ａ１部位で切断された断
片を示す。工程(ii)では、酵素Ｂal３１を用いて一層大
きなフラグメントＢ'コード化領域をカットバックする
ことによってフラグメントＢ"コード化断片を得る。
(i)では、初めにフラグメントＡコード化遺伝子断片を
前記Ｓcience誌（２２０巻，５１５頁）に記載されてい
るような方法で得て、精製する。なお、Ｓau ３Ａ１は
当該技術分野でよく知られた制限部位であり、Ｓau ３
Ａ１-２とは２個所のＳau ３Ａ１部位で切断された断
片を示す。工程(ii)では、酵素Ｂal３１を用いて一層大
きなフラグメントＢ'コード化領域をカットバックする
ことによってフラグメントＢ"コード化断片を得る。
【００２９】第３図に示すように、フラグメントＢ'を
コードする遺伝子断片は２個所のＳau ３Ａ１サイトの
間の１,０２３bp領域であって、１番目のＳau ３Ａ１サ
イトはｌ1内の第３アルギニンをコードするＤＮＡ配列
にあり、２番目のＳau ３Ａ１サイトはトックス構造遺
伝子の端より４９bp前方である。前記したようにＢ'を
コードする遺伝子断片をpＵＣ８中でクローン化した。
配向（転写方向）がlac Ｚ遺伝子のそれと同じであるこ
の断片を持っているプラスミドをpＤＴ３０１とした(la
c Ｚ及びＢ'遺伝子はpＤＴ３０１上のフレーム外であ
る)。
コードする遺伝子断片は２個所のＳau ３Ａ１サイトの
間の１,０２３bp領域であって、１番目のＳau ３Ａ１サ
イトはｌ1内の第３アルギニンをコードするＤＮＡ配列
にあり、２番目のＳau ３Ａ１サイトはトックス構造遺
伝子の端より４９bp前方である。前記したようにＢ'を
コードする遺伝子断片をpＵＣ８中でクローン化した。
配向（転写方向）がlac Ｚ遺伝子のそれと同じであるこ
の断片を持っているプラスミドをpＤＴ３０１とした(la
c Ｚ及びＢ'遺伝子はpＤＴ３０１上のフレーム外であ
る)。
【００３０】再度、上記フローチャートを参照すると、
pＤＴ３０１をＨind III消化を経て開き、次に、Ｂ'コ
ード化断片をエキソヌクレアーゼＢal ３ １で種々の時
間処理することによってカットバックする。次に、得ら
れた縮小遺伝子断片（種々の長さ）の端をＥco Ｒ１及
びＰst １リンカーとの平滑末端連結に付し、次いでこ
の断片をＳau ３Ａ１で消化する。これはＢ'の部分を
コードする遺伝子断片の不均一（大きさに関し）集団を
与える。
pＤＴ３０１をＨind III消化を経て開き、次に、Ｂ'コ
ード化断片をエキソヌクレアーゼＢal ３ １で種々の時
間処理することによってカットバックする。次に、得ら
れた縮小遺伝子断片（種々の長さ）の端をＥco Ｒ１及
びＰst １リンカーとの平滑末端連結に付し、次いでこ
の断片をＳau ３Ａ１で消化する。これはＢ'の部分を
コードする遺伝子断片の不均一（大きさに関し）集団を
与える。
【００３１】次に、これらの断片をpＵＣ８のＢamＨ１
−Ｐst１部位又はＢamＨ１−ＥcoＲ１部位のどちらかで
再びクローン化する。これらの部位におけるクローニン
グは、単に、一端にＢamＨ１(Ｓan ３Ａ１)切断部位を
有し、他端にＰst１又ＥcoＲ１切断部位を有するクロー
ンの選択を許すにすぎない。また、二重消化されたpＵ
Ｃ８におけるクローニングは、ただ１種の断片配向のみ
を許し、Ｘ−Ｇプレート上の青色コロニー(lac Ｚを発
現するもの)の選択は、短縮したＢ'コード化領域とlac
Ｚの間のインフレーム結合を証明する。好適なクローン
は、Ｂ'コード化領域の長さが８３０bpであるもの、即
ち、遺伝子がトックス228上のＮＲＵＩの位置にまで２
００bpカットバックされたものである。
−Ｐst１部位又はＢamＨ１−ＥcoＲ１部位のどちらかで
再びクローン化する。これらの部位におけるクローニン
グは、単に、一端にＢamＨ１(Ｓan ３Ａ１)切断部位を
有し、他端にＰst１又ＥcoＲ１切断部位を有するクロー
ンの選択を許すにすぎない。また、二重消化されたpＵ
Ｃ８におけるクローニングは、ただ１種の断片配向のみ
を許し、Ｘ−Ｇプレート上の青色コロニー(lac Ｚを発
現するもの)の選択は、短縮したＢ'コード化領域とlac
Ｚの間のインフレーム結合を証明する。好適なクローン
は、Ｂ'コード化領域の長さが８３０bpであるもの、即
ち、遺伝子がトックス228上のＮＲＵＩの位置にまで２
００bpカットバックされたものである。
【００３２】次の工程(iii)はプロテアーゼ感受性ルー
プl2をコードする遺伝子断片のイン・ビトロ合成であ
る。これは、常套の固相オリゴヌクレオチド合成によっ
て行う。合成した後に付着させるＰst１及びＥcoＲ１リ
ンカーを含有するこの断片の配列を下に示す：
プl2をコードする遺伝子断片のイン・ビトロ合成であ
る。これは、常套の固相オリゴヌクレオチド合成によっ
て行う。合成した後に付着させるＰst１及びＥcoＲ１リ
ンカーを含有するこの断片の配列を下に示す：
【化２】
【００３３】次の工程(iv)は、工程(ii)由来のＢ”コー
ド化断片と工程(iii)由来のｌ2コード化断片とをpＵＣ
８上のＢamＨ１−ＥcoＲ１サイトでクローニングするも
のである。
ド化断片と工程(iii)由来のｌ2コード化断片とをpＵＣ
８上のＢamＨ１−ＥcoＲ１サイトでクローニングするも
のである。
【００３４】次に天然源か、或はオリゴヌクレオチド合
成によって、細胞特異性配位子の一部をコードする所望
の断片を得る。例えば、α及びβＭＳＨの特定の結合部
分をコードする遺伝子断片は常套の固相オリゴヌクレオ
チド合成を経て合成することができる。それらの遺伝子
断片のＤＮＡ配列を適当なリンカーと共に以下に示す：
成によって、細胞特異性配位子の一部をコードする所望
の断片を得る。例えば、α及びβＭＳＨの特定の結合部
分をコードする遺伝子断片は常套の固相オリゴヌクレオ
チド合成を経て合成することができる。それらの遺伝子
断片のＤＮＡ配列を適当なリンカーと共に以下に示す：
【化３】
【００３５】なお、上記したＰst１リンカー、ＥcoＲ１
リンカー及びＢamＨ１リンカーは、それぞれ制限酵素Ｐ
st１、ＥcoＲ１及びＢamＨ１で認識される部位を持った
ＤＮＡの短鎖を指称し、ニュー・イングランド・バイオ
ラブス（Ｎew Ｅngland Ｂiolabs.)から入手可能であ
る。pＵＣ８の独特のＰst１及びＥcoＲ１サイトは、ｌ2
コード化断片より下流にある上記合成ＭＳＨ配列のどち
らかの二次クローニングを可能にする。
リンカー及びＢamＨ１リンカーは、それぞれ制限酵素Ｐ
st１、ＥcoＲ１及びＢamＨ１で認識される部位を持った
ＤＮＡの短鎖を指称し、ニュー・イングランド・バイオ
ラブス（Ｎew Ｅngland Ｂiolabs.)から入手可能であ
る。pＵＣ８の独特のＰst１及びＥcoＲ１サイトは、ｌ2
コード化断片より下流にある上記合成ＭＳＨ配列のどち
らかの二次クローニングを可能にする。
【００３６】最終的に（工程vi）、フラグメントＡコー
ド化遺伝子断片をβ”−ｌ2−ＭＳＨをコードする遺伝
子断片に融合して、第４図（コード化したタンパク質断
片を参照して標識をつける）に示すように遺伝子融合を
完了し、選択した細胞（この場合、メラニン細胞）に選
択的に結合して攻撃する、混成タンパク質をコード化す
る。別の適当なポリペプチド配位子の例は、サブスタン
スＰであり、それの利用については先に説明している。
基本的には、α又はβＭＳＨ遺伝子よりもむしろサブス
タンスＰ遺伝子を含有する融合遺伝子を、上記したよう
に作成する。サブスタンスＰ遺伝子は、常套の固相オリ
ゴヌクレオチド合成を用いて合成する。サブスタンスＰ
遺伝子配列は、
ド化遺伝子断片をβ”−ｌ2−ＭＳＨをコードする遺伝
子断片に融合して、第４図（コード化したタンパク質断
片を参照して標識をつける）に示すように遺伝子融合を
完了し、選択した細胞（この場合、メラニン細胞）に選
択的に結合して攻撃する、混成タンパク質をコード化す
る。別の適当なポリペプチド配位子の例は、サブスタン
スＰであり、それの利用については先に説明している。
基本的には、α又はβＭＳＨ遺伝子よりもむしろサブス
タンスＰ遺伝子を含有する融合遺伝子を、上記したよう
に作成する。サブスタンスＰ遺伝子は、常套の固相オリ
ゴヌクレオチド合成を用いて合成する。サブスタンスＰ
遺伝子配列は、
【化４】 である。
【００３７】上記から明らかなように、ポリペプチド配
位子に対する遺伝子配列の部分は、対応するアミノ酸配
列が、混成タンパク質を予定の細胞に結合させ得るに十
分なものでなければならない。好ましくは、ポリペプチ
ドホルモンの遺伝子は配位子の結合ドメインの遺伝子配
列の全て、又はほとんどを含むであろう。
位子に対する遺伝子配列の部分は、対応するアミノ酸配
列が、混成タンパク質を予定の細胞に結合させ得るに十
分なものでなければならない。好ましくは、ポリペプチ
ドホルモンの遺伝子は配位子の結合ドメインの遺伝子配
列の全て、又はほとんどを含むであろう。
【００３８】一般には、上記実施例のように、クローニ
ングベクター、例えばファージ又はプラスミドを用いて
巧妙な操作が行われる。ポリペプチド配位子の結合ドメ
インをコードする遺伝的材料は、クローン化ＤＮＡ、或
は合成オリゴヌクレオチド配列のどちらかであり得、ど
ちらも、用いられる特別の配位子遺伝子に対して、より
好適である。融合遺伝子は、通常、クローニングベクタ
ー、例えばプラスミド又はファージの上に存在し、培養
微生物を形質転換するのに用いられる。次に、従来技術
を用いて混成タンパク質を細胞の培養基から採取する。
ングベクター、例えばファージ又はプラスミドを用いて
巧妙な操作が行われる。ポリペプチド配位子の結合ドメ
インをコードする遺伝的材料は、クローン化ＤＮＡ、或
は合成オリゴヌクレオチド配列のどちらかであり得、ど
ちらも、用いられる特別の配位子遺伝子に対して、より
好適である。融合遺伝子は、通常、クローニングベクタ
ー、例えばプラスミド又はファージの上に存在し、培養
微生物を形質転換するのに用いられる。次に、従来技術
を用いて混成タンパク質を細胞の培養基から採取する。
【００３９】本発明の混成タンパク質を、ポリペプチド
配位子が選択的に結合することができる、望まれない細
胞が存在することを特徴とする医療疾患、例えば癌にか
かっている哺乳動物、例えばヒトに投与する。タンパク
質の投与量は、病気の種類、病気の範囲、病気にかかっ
ている哺乳動物の大きさ及び種に応じて変わる。量は、
通常、癌の治療に用いられるその他の細胞毒性剤の量的
範囲にあるが、時には混成タンパク質の特異性のゆえ
に、より少い量でもよい場合がある。
配位子が選択的に結合することができる、望まれない細
胞が存在することを特徴とする医療疾患、例えば癌にか
かっている哺乳動物、例えばヒトに投与する。タンパク
質の投与量は、病気の種類、病気の範囲、病気にかかっ
ている哺乳動物の大きさ及び種に応じて変わる。量は、
通常、癌の治療に用いられるその他の細胞毒性剤の量的
範囲にあるが、時には混成タンパク質の特異性のゆえ
に、より少い量でもよい場合がある。
【００４０】混成タンパク質は、任意の従来方法、例え
ば、注射あるいは時限放出インプラント（timed−rele
ａse implant）による方法を用いて投与することができ
る。ＭＳＨ混成物の場合、局所用クリームを用いて初期
癌細胞を殺すことができ、さらに注射又はインプラント
を用いて転移細胞を殺すことができる。該混成タンパク
質は、毒性の無い、医薬上許容し得る任意の担体物質と
組み合わせることもできる。
ば、注射あるいは時限放出インプラント（timed−rele
ａse implant）による方法を用いて投与することができ
る。ＭＳＨ混成物の場合、局所用クリームを用いて初期
癌細胞を殺すことができ、さらに注射又はインプラント
を用いて転移細胞を殺すことができる。該混成タンパク
質は、毒性の無い、医薬上許容し得る任意の担体物質と
組み合わせることもできる。
【図１】 第１図は、ジフテリア毒素分子の図式的説明
であり；
であり；
【図２】 第２図は、本発明の混成タンパク質分子の図
式的説明であり；
式的説明であり；
【図３】 第３図は、コリネファージ(corynephage)β
トックスの３.９kb ＢamＨ−Ｉ制限断片上のジフテリア
トックス(tox)オペロンの位置及び配向を示す制限地図
であり；
トックスの３.９kb ＢamＨ−Ｉ制限断片上のジフテリア
トックス(tox)オペロンの位置及び配向を示す制限地図
であり；
【図４】 第４図は、本発明の混成タンパク質をコード
する本発明の融合遺伝子の図式的説明である。
する本発明の融合遺伝子の図式的説明である。
Claims (15)
- 【請求項１】 混成タンパク質を予定された類の細胞に
選択的に結合させるのに有効な細胞結合配位子の結合ド
メインの少なくとも一部分をコードする第１の断片と、
当該部分に結合したジフテリア毒素の断片Ａの如きもの
を細胞膜の中へまたはこれを通って転移させることが出
来るジフテリア毒素の転移ドメインの少なくとも一部を
コードする第２の断片を含む、融合遺伝子。 - 【請求項２】 上記第２断片が、開裂ドメインｌ1の３'
末端とトックス228対立遺伝子のＮＲＵＩサイトからｌ2
コード領域の末端に向かって約９０塩基対上流の位置の
間のジフテリアトックスオペロンの断片をコードする、
請求項１記載の融合遺伝子。 - 【請求項３】 上記第２断片が、開裂ドメインｌ1の３'
末端からトックス228対立遺伝子のＮＲＵＩサイトまで
のジフテリア毒素の断片Ｂの部分をコードする、請求項
１記載の融合遺伝子。 - 【請求項４】 上記第２断片が、更にジフテリア毒素の
プロテアーゼ感受性ループｌ2をコードする、請求項１
記載の融合遺伝子。 - 【請求項５】 上記第２断片が、第１Ｓau ３ＡＩサイ
トからＳＰＨＩサイトまでのジフテリアトックスオペロ
ンの部分をコードする、請求項１記載の融合遺伝子。 - 【請求項６】 上記ポリペプチド配位子が、ホルモンで
ある、請求項１記載の融合遺伝子。 - 【請求項７】 上記ホルモンが、上記混成タンパク質を
悪性メラニン細胞に結合させるのに有効なα−メラノサ
イト刺激ホルモン（ＭＳＨ）である、請求項６記載の融
合遺伝子。 - 【請求項８】 上記ホルモンが、上記混成タンパク質を
悪性メラニン細胞に結合させるのに有効なβ−メラノサ
イト刺激ホルモン（ＭＳＨ）である、請求項６記載の融
合遺伝子。 - 【請求項９】 上記ホルモンが、上記混成タンパク質を
生長ホルモンに対する受容体を持った骨細胞に結合させ
るのに有効な生長ホルモンである、請求項６記載の融合
遺伝子。 - 【請求項１０】 上記配位子が、インターロイキンであ
る、請求項１記載の融合遺伝子。 - 【請求項１１】 上記インターロイキンが、上記混成タ
ンパク質をインターロイキン−１に対する受容体を持っ
た細胞へ結合させるのに有効なインターロイキン−１で
ある、請求項１０記載の融合遺伝子。 - 【請求項１２】 上記インターロイキンが、上記混成タ
ンパク質をインターロイキン−２に対する受容体を持っ
た細胞へ結合させるのに有効なインターロイキン−２で
ある、請求項１０記載の融合遺伝子。 - 【請求項１３】 上記インターロイキンが、上記混成タ
ンパク質をインターロイキン−３に対する受容体を持っ
た細胞へ結合させるのに有効なインターロイキン−３で
ある、請求項１０記載の融合遺伝子。 - 【請求項１４】 上記第１断片が、上記配位子の全結合
ドメインをコードする、請求項１記載の融合遺伝子。 - 【請求項１５】 上記第１断片が、上記配位子の全体を
コードする、請求項１記載の融合遺伝子。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US37738682A | 1982-05-12 | 1982-05-12 | |
| US377386 | 1982-05-12 |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP58502198A Division JP2534222B2 (ja) | 1982-05-12 | 1983-05-12 | 混成タンパク質生産用融合遺伝子 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH08228777A true JPH08228777A (ja) | 1996-09-10 |
Family
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Family Applications (3)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP58502198A Expired - Lifetime JP2534222B2 (ja) | 1982-05-12 | 1983-05-12 | 混成タンパク質生産用融合遺伝子 |
| JP5150349A Pending JPH06239896A (ja) | 1982-05-12 | 1993-06-22 | 混成タンパク質 |
| JP8022430A Pending JPH08228777A (ja) | 1982-05-12 | 1996-02-08 | 混成タンパク質生産用融合遺伝子 |
Family Applications Before (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP58502198A Expired - Lifetime JP2534222B2 (ja) | 1982-05-12 | 1983-05-12 | 混成タンパク質生産用融合遺伝子 |
| JP5150349A Pending JPH06239896A (ja) | 1982-05-12 | 1993-06-22 | 混成タンパク質 |
Country Status (12)
| Country | Link |
|---|---|
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| EP (1) | EP0108146B1 (ja) |
| JP (3) | JP2534222B2 (ja) |
| AT (1) | ATE25197T1 (ja) |
| AU (1) | AU573529B2 (ja) |
| DE (1) | DE3369466D1 (ja) |
| ES (1) | ES522315A0 (ja) |
| FI (1) | FI79120C (ja) |
| IT (1) | IT1203672B (ja) |
| NO (1) | NO176575C (ja) |
| NZ (1) | NZ204229A (ja) |
| WO (1) | WO1983003971A1 (ja) |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5080898A (en) * | 1982-05-12 | 1992-01-14 | The University Hospital | Enzymatically active toxin coupled to a cell-specific ligand |
| FR2549855B1 (fr) * | 1983-07-29 | 1987-03-27 | Grp Genie Genetique | Sequence nucleotidique codant pour le peptide signal de la toxine diphterique, vecteur contenant cette sequence nucleotidique, leur application a la transformation de micro-organismes et compositions peptidiques obtenues |
| DE3346953A1 (de) * | 1983-12-24 | 1985-08-14 | Organogen Medizinisch-Molekularbiologische Forschungsgesellschaft mbH, 6900 Heidelberg | Cardiodilatin, ein neues peptidhormon und verfahren zu seiner herstellung |
| EP0170697B1 (en) * | 1984-02-08 | 1991-10-23 | Cetus Oncology Corporation | Toxin conjugates |
| US6022950A (en) * | 1984-06-07 | 2000-02-08 | Seragen, Inc. | Hybrid molecules having translocation region and cell-binding region |
| US5668255A (en) * | 1984-06-07 | 1997-09-16 | Seragen, Inc. | Hybrid molecules having translocation region and cell-binding region |
| ES8708014A1 (es) * | 1984-06-07 | 1987-09-01 | Murphy John R | Un procedimiento para preparar un gen fusionado que codifica una proteina hibrida susceptible de marcado y empleo en diagnosis. |
| US5807715A (en) * | 1984-08-27 | 1998-09-15 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Methods and transformed mammalian lymphocyte cells for producing functional antigen-binding protein including chimeric immunoglobulin |
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| IL78775A (en) * | 1985-05-15 | 1992-06-21 | Biotech Australia Pty Ltd | Oral vaccines |
| US6103243A (en) * | 1985-05-15 | 2000-08-15 | Biotechnology Australia Pty, Ltd | Oral vaccines |
| US5169939A (en) * | 1985-05-21 | 1992-12-08 | Massachusetts Institute Of Technology & Pres. & Fellows Of Harvard College | Chimeric antibodies |
| US5336489A (en) * | 1985-09-05 | 1994-08-09 | The Beth Israel Hospital Association | Treatment of allograft rejection with IL-2 receptor-specific cytotoxins |
| US5011684A (en) * | 1985-09-05 | 1991-04-30 | Beth Israel Hospital Association | Lysing or blocking unwanted cells with IL-2 receptor-specific binding substance |
| US5576195A (en) * | 1985-11-01 | 1996-11-19 | Xoma Corporation | Vectors with pectate lyase signal sequence |
| US5618920A (en) * | 1985-11-01 | 1997-04-08 | Xoma Corporation | Modular assembly of antibody genes, antibodies prepared thereby and use |
| ATE101162T1 (de) * | 1985-11-13 | 1994-02-15 | Hospital Univ | Durch cys-kodon modifizierte dns. |
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| US4892827A (en) * | 1986-09-24 | 1990-01-09 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Recombinant pseudomonas exotoxins: construction of an active immunotoxin with low side effects |
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| US6893625B1 (en) | 1986-10-27 | 2005-05-17 | Royalty Pharma Finance Trust | Chimeric antibody with specificity to human B cell surface antigen |
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