NO176575B - Sammensmeltet gen, kloningsvektor, samt anvendelse av kloningsvektoren - Google Patents

Sammensmeltet gen, kloningsvektor, samt anvendelse av kloningsvektoren Download PDF

Info

Publication number
NO176575B
NO176575B NO840089A NO840089A NO176575B NO 176575 B NO176575 B NO 176575B NO 840089 A NO840089 A NO 840089A NO 840089 A NO840089 A NO 840089A NO 176575 B NO176575 B NO 176575B
Authority
NO
Norway
Prior art keywords
fragment
gene
fused
ligand
diphtheria toxin
Prior art date
Application number
NO840089A
Other languages
English (en)
Other versions
NO176575C (no
NO840089L (no
Inventor
John R Murphy
Original Assignee
Harvard College
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Harvard College filed Critical Harvard College
Publication of NO840089L publication Critical patent/NO840089L/no
Publication of NO176575B publication Critical patent/NO176575B/no
Publication of NO176575C publication Critical patent/NO176575C/no

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/34—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Corynebacterium (G)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/665—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans derived from pro-opiomelanocortin, pro-enkephalin or pro-dynorphin
    • C07K14/68—Melanocyte-stimulating hormone [MSH]
    • C07K14/685—Alpha-melanotropin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/665—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans derived from pro-opiomelanocortin, pro-enkephalin or pro-dynorphin
    • C07K14/68—Melanocyte-stimulating hormone [MSH]
    • C07K14/69—Beta-melanotropin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/55—Fusion polypeptide containing a fusion with a toxin, e.g. diphteria toxin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
    • C07K2319/74—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor
    • C07K2319/75—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor containing a fusion for activation of a cell surface receptor, e.g. thrombopoeitin, NPY and other peptide hormones
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S930/00—Peptide or protein sequence
    • Y10S930/01—Peptide or protein sequence
    • Y10S930/31—Linker sequence

Description

Oppfinnelsen vedrører anvendelse av rekombinant-DNA-teknikker for å lage hybrid-proteinmolekyler. Slike molekyler kan anvendes ved behandling av medisinske forstyrrelser.
Mer bestemt vedrører oppfinnelsen et sammensmeltet gen som omfatter et fragment av det gen som koder for difteri-toksin sammensmeltet til et fragment av et gen som koder for en cellespesifikk polypeptidligand. Den henvises forøvrig til krav 1.
Oppfinnelsen vedrører videre en kloningsvektor, som beskrevet i krav 6, samt anvendelse av kloningsvektoren, som beskrevet i krav 7.
Litteraturen inneholder mange eksempler på sammensmeltede gener som koder for hybridproteiner. Eksempelvis beskriver Villa-Komaroff et al. (1978) P.N.A.S. U.S.A. 75, 3727-3731 et sammensmeltet gen bygd opp av et eukaryotisk strukturelt gen sammensmeltet til et ikke-cytoplasmisk bakterielt gen. Det sammensmeltede gen koder for et hybridprotein som transporteres ut av cytoplasmaet.
Hybridproteiner er også laget ved metoder som f.eks. anvender kobling av to forskjellige proteinmolekyler, som ikke innebærer rekombinant-DNA-teknikker. Eksempelvis er det foreslått å danne, ved kobling, terapeutiske hybridproteiner som består av et toksin koblet til en ligand med evne til å binde seg spesifikt til en utvalgt klasse av celler. Ett forsøk på å lage et slikt hybridprotein, rapportert av Chang et al. (1977) J. Biol. Chem. 252, 1515-1522, resulterte i et hybrid som besto av difteri-toksin A-kjede koblet til human-placentalt laktogen-hormon ved tverrbinding via en disulfidbinding. Hybridproteinet inhiberte ikke proteinsyntesen i disse celler, selv om det bandt seg til celler som inneholder laktogen-reseptorer.
Et hybridprotein bestående av ricin A-toksin koblet til jø-kjeden i human-chorionisk gonadotropin-hormon ved likeledes å tverrbinde via en disulfidbinding er også rapportert. Selv om den sies å ha spesifisitet, er dens bindingsevne ikke rapportert, og ekstremt høye konsentrasjoner var nødvendige for signifikant å inhibere proteinsyntese i Leydig-tumorceller hos rotte, hvilket gjør det vanskelig å skjelne mellom "ikke-spesifikk" adgang forårsaket av endocytose, og "spesifikk" adgang forårsaket av transport av den toksiske del av hybridet over den cytoplasmiske membran i målcellene, se Oeltman et al. (1979) J. Biol. Chem., 254. 1028-1032. Den samme mangel ble funnet hos et hybrid om besto av difteri A koblet til insulin under anvendelse av cystamin som tverrbindingsmiddel, se Miskimins et al. (1979) Biochem. Biophys. Res. Commun., 91, 143-151. Et hybrid som besto av ricin A koblet til epidermal vekstfaktor (EGF) ved hjelp av en heterobi-funksjonell tverrbinding er også laget, men bindekarakteristikkene tilveiebragt av EGF er ikke begrenset til spesifikke celler, men omfatter et stort utvalg av celletyper, se Cawley et al., (1980) Cell, 22, 563-570.
Det sammensmeltede gen i henhold til oppfinnelsen kan anvendes til å lage et overlegent difteri-toksin/hormon-hybridprotein hvor proteinet er syntetisert som en enkelt enhet, dvs.
at fragmenter knyttes sammen, ikke ved tverrbinding, men ved peptidbindinger.
Oppfinnelsen vil bli best forstått ved betraktning av tegningene, hvor: Fig. 1 er en skjematisk presentasjon av det nevnte difteri- toksinmolekyl; Fig. 2 er en skjematisk presentasjon av et hybridprotein molekyl; Fig. 3 er et restriksjonskart som viser lokaliseringen og orienteringen av difteri- tox-operonet på 3,9 kb BamH-I-restriksjonsfragmentet til corynefag /?<tox> (inklusive et punkt, NRU I, som ikke er funnet på tox-allel av villtype, men bare på mutant-tox<228->allelen, hvilket vil bli forklart mer detaljert nedenunder), og Fig. 4 er en skjematisk presentasjon av et sammensmeltet gen i henhold til oppfinnelsen, som koder for et hybridprotein (genfragmentene er merket på grunnlag av de utkodede proteinfragmenter).
Under henvisning til fig. 1 består difteri-toksinmolekylet av flere funksjonelle "domener" som kan karakteriseres, idet man starter ved aminoterminalenden til molekylet, som hydrofob leder-signalsekvens s, enzymatisk aktivt fragment A, den fjorten amino-syre-eksponerte proteasesensitive disulfid-loop (DSL) £lf som inneholder et spaltningsdomene, og fragment B, som inkluderer hydrofob-domene h, DSL £2'°9 karboksyterminalende a "make-up" a.
Den prosess ved hvilken difteri-toksin intoksikerer sensitive eukaryotiske celler innebærer minst følgende trinn: (i) difteri-toksin binder seg til spesifikke reseptorer på overflaten av en sensitiv celle: (ii) mens det er bundet til sin reseptor, internaliseres toksinmolekylet i en endocytisk vesikkel; (iii) enten før internalisering, eller i den endocytiske vesikkel, spaltes toksinmolekylet (eller det forarbeides) ved et punkt i området på 47 000 dalton fra den N-terminale ende; (iv) etter hvert som pH-verdien til den endocytiske vesikkel avtar til under 6, innsettes den strukturelle inter-mediære form av toksin, mens den fremdeles er bundet til sin reseptor, i membranen; (v) så snart den er innleiret i membranen, danner det hydrofobe domene h en pore; (vi) en proteolytisk spaltning i mellom fragmentene A og B inntreffer; (vii) deretter frigis fragment A, eller et polypeptid som inneholder fragment A, inn i cytosolen; (viii) den katalytiske aktivitet hos fragment A, dvs. niktoin-amid-adenin-dinukleotid - adenosin-difosfat-ribosylering av forlengelsesfaktor 2, forårsaker død hos den intoksi-kerte celle. Det er innlysende at et enkelt molekyl i fragment A som er innført i cytosolen, er tilstrekkelig til å drepe cellen.
Hybridproteinene inkluderer, i sekvensiell orden, idet man begynner ved amino-terminalenden til hybridproteinet, følgende peptidfragmenter, knyttet sammen ved peptidbindinger: a) det enzymatiske aktive fragment A hos difteri-toksin (uten lederen fragment s, som er kuttet under sekresjon av
proteinet),
b) et fragment inklusive spaltningsdomenet som er nærstående nevnte fragment A i difteri-toksin, c) et fragment som omfatter minst den del av fragment B i difteri-toksin som kodes av den del av fragment B som koder genfragment til tox-operonet mellom t-^ og posisjonen ca. 90 basepar oppstrøms for posisjonen på tox-operonet til NRU I-punktet til tox<228->alleien, og d) et fragment som omfatter en del av en cellespesifikk polypeptidligand, idet delen inkluderer minst en del av bindingsdomenet til polypeptidliganden, idet den del av bindingsdomenet er effektiv med hensyn til å få hybridproteinet til å binde seg selektivt til en forutbestemt klasse av celler som skal angripes av enzymatisk aktivt fragment A fra difeteri-toksin. Den nødvendige del av toksinmolekylet som er inkludert, er avtegnet som delen av molekylet mellom linjene y og x i fig. 1.
Fortrinnsvis inkluderer også hybridproteinet protease-sensitivt DSL £2 fra toksinmolekylet, dvs. at delen av molekylet mellom linjene x og z også er inkludert. Linje z er fortrinnsvis ved punktet 47 aminosyrer fra karboksylterminalnden til B<1>, dvs. ved enden av £2, ikke nærmere, for å sikre at det generaliserte eukaryotiske bindingspunkt i fragment B er utelukket, slik at avbindingen vil bli styrt av avbindingsdomenet til den celle-spesifikke ligand. Det er vist at litt mer enn halvparten av fragment B må være tilveiebragt for molekylet slik at det kan virke som et effektivt toksin.
Under henvisning til fig. 2 så viser denne en skjematisk presentasjon av et hybridproteinmolekyl som her beskrevet, hvor y-z-delen av difteri-toksinmolekylet via en peptidbinding er tilknyttet fragment r i en cellespesifikk polypeptidligand; dvs. et polypeptid som selektivt binder seg til en forutbestemt klasse av celler som skal angripes av enzymatisk aktivt fragment A i difteri-toksinmolekylet. Fragment r kan bestå av hele liganden, eller en del av liganden som inkluderer hele avbindingsdomenet i liganden, eller en effektiv del av avbindingsdomenet.
Når den ligand som anvendes er stor, er det ønskelig at så lite av den ikke-avbindende del som mulig av liganden blir inkludert, slik at bindingsdomenet til molekylet er beliggende nær det hydrofobe domene h i fragment B. Det er også ønskelig å inkludere alt eller det meste av avbindingsdomenet til ligandmolekylet. Når det gjelder a-melanocytt-stimulerende hormon (MSH), som er et lite peptid med 13 aminosyrer, eller /3MSH, som inneholder 17 aminosyrer, kan den del av molekylet som består av 9 aminosyrer ved karboksyterminalenden til molekylet, anvendes, eller hele molekylet kan anvendes.
De områder innen celle-spesifikke ligander hvor avbindingsdomenet er beliggende, er nå kjent for et antall slike ligander. Videre kan nylige fremskritt i fastfase-polypeptid-syntese gjøre det mulig for fagmannen på dette område å bestemme avbindingsdomenet til praktisk talt enhver slik ligand, ved å syntetisere forskjellige fragmenter i liganden og teste dem med hensyn på evne til å binde seg til klassen av celler som skal angripes.
Hybridproteinmolekylene som beskrives her, er praktisk talt ikke-toksiske for alle pattedyrceller med unntagelse av cellene fra den spesifikke klasse som de ligandbindende domene binder seg til. Således er hybridproteinene meget mer spesifikke enn mange andre terapeutiske midler, f.eks. generelle cytotoksiske anti-cancerdroger.
Hybridproteinene i hvilke fragmenter er knyttet via peptidbindinger, er også tverrbundne hybrider overlegne fordi de her beskrevne proteiner kan tilveiebringes i en homogen prøve, i hvilken alle de identiske molekyler er effektive og selektive for en spesiell klasse av celler.
Den spesifikke klasse av celler som bindes og angripes av disse hybridproteiner bestemmes av den spesifikke polypeptidligand som tilfører avbindingsdomenet til hybridmolekylet. Enhver cellespesifikk polypeptidligand kan anvendes som har et avbindings-domene som er spesifikt for en spesiell klasse av celler som skal angripes. Polypeptidhormoner er nyttige slike ligander. Hybrider laget under anvendelse av en del av avbindingsdomenet av a- eller Ø-MSH (MSH = melanocytt-stimulerende hormon), f.eks., binder seg selektivt til melanocytter, idet de gjør hybridene nyttige ved behandling av melanomer. Andre ligander tilveiebringer forskjellige spesifisiteter, f.eks. gjenkjenner avbindingsdomenet til substans P reseptorer på overflatene av neuroner som er involvert i transmisjon av smerte, slik at hybrider laget under anvendelse av substans P kan anvendes for å ødelegge slike neuroner for å mildne kronisk smerte. Disse hybrider kan også anvendes på kart-arealer i nervesystemet som inneholder substans P-reseptorer. Andre spesifikt-bindende ligander som kan anvendes inkluderer somotostatin, interleukin I, interleukin II og interleukin III. Interleukin II er av spesiell betydning på grunn av sin rolle i allergiske reaksjoner og autoimmune sykdommer, f.eks. lupus, som involverer aktiverte T-celler. I tillegg, siden alle inter-leukinene er spesifikke for T-celler, kunne hybrider som er laget med dem bli anvendt for å behandle cancer som involverer immun-systemet, og inhibere avstøtning av transplanterte organer.
Andre anvendelige polypeptidligander som har cellespesifikke avbindingsdomener er follikkelstimulerende hormon (spesifikt for ovarieceller); luteiniserende hormon (spesifikt for ovarieceller); thyroid-stimulerende hormon (spesifikt for thyroid-celler); vasopressin (spesifikt for uterus-celler så vel som blære- og innvoll-celler); prolaktin (spesifikt for brystceller); og veksthormon (spesifikt for visse benceller).
Hybridproteinene som her er beskrevet fremtilles fortrinnsvis under anvendelse av rekombinant-DNA-teknikker som involverer å danne det ønskede sammensmeltede gen som koder for hybridproteinet, og deretter utkoder det smeltede gen, under anvendelse av konvensjonelle prosesser. Under henvisning til fig. 3 tillater lokaliseringen og orienteringen av diferi- tox-operonet på 3.9 kb BamH-I restriksj onsfragmentet til corynefag /3<tox+> tox-operonet å bli splittet ved en ønsket lokalisering, og den ønskede del av det operon som skal sammensmeltes med den ønskede del av genet for en utvalgt polypeptidligand. En mer detaljert beskrivelse av tox-operonet, og en beskrivelse av kloning av fragment A, inneholdes i Leong et al. (1983) Science 220, 515, herved tatt med som referanse. Fragment A, klonet som beskrevet deri for å lage plasmid pDT201, ble deponert i American Type Culture Collection, Rockville, MD i mai, 1983, og har fått ATCC Accession nr. 39359.
Under henvisning til fig. 3 og 4 er den del av difteri- tox-operonet (fig. 3) som anvendes for å lage det sammensmeltede gen (fig. 4) som koder de nevnte hybridproteiner, fortrinnsvis den del som er antydet av de stiplede linjer som avgrenser fragment D; dvs. delen av tox-genet fra første Sau 3AI-punkt til SPH I-punktet. Fragment D inkluderer således det 831-basepar (bp) lange gen-fragment som koder fragment A (inklusive 177 bp-sekvensen foran det strukturelle gen som inkluderer promotoren og delen som koder signalfrekevensen, S i fig. 1); den del av genfragmentet som koder det hydrofobe domene i fragment B; og genfragmentet som koder DSL £2.
Som vist i fig. 3, inkluderer de første 177 bp til det gen-fragment som koder fragment A, foran tox-promotoren, noe DNA som ikke er del av tox-operonet. Denne DNA er irrelevant og er ikke transkribert; den er inkludert bare fordi Sau 3AI-punktet ved begynnelsen av fragment A som koder genfragment er det mest bekvemme restriksjonspunkt nær tox-promotoren (som er avsatt som linjen like til venstre for Hind III).
Det skulle være mulig å oppnå fragment D ved ganske enkelt å eksitere det fra tox-operonet via spaltning ved Sau 3AI og SPH I. Alternativt kan genfragmenter sammensmeltes som følger. Først oppnås det genfragment som koder fragment A. Deretter oppnås det genfragment som koder det meste av fragment B, fra Sau 3AI til Sau 3AI (B<1> i fig. 3). Det genfragment som koder fragment B' er blitt klonet i plasmid pUC8, til å lage plasmid pDT301, og ble deponert i American Type Culture Collection, Rockville, Md i mai 1983, og har fått ATCC Accession nr. 39360. Fragment B' kuttes ned, under anvendelse av enzym Bal31, ca. 2 00 bp, til posisjonen NRU I-punktet på tox<228> (villtypen tox-allel har ikke et NRU I-punkt), slik at man får B<11> (fig. 3). Fragmentene A og B" er sammensmeltet, et fragment som koder £2 er sammensmeltet til B<*1>, og et fragment som koder den ønskede del av polypeptidliganden er sammensmeltet til £2. ;I ovennevnte skjema kuttes fortrinnsvis det fragment B' som kutter genfragment ned til den presise lokalisering av NRU I, men kan også kuttes ned til enhver lokalisering mellom lokaliseringen 90 bp foran NRU I, og slutten av de £2-kodende område (dvs. i 208 bp-området mellom lokaliseringen 90 bp foran NRU I, og begynnelsen av det €2-kodende området). Eller det B<1->kodende fragment kunne kuttes ned til karboksyterminal-enden til det £2-kodende område (129 bp nedstrøms for NRU I), i hvilket tilfelle sammensmeltning av et syntetisk £2-kodende område er unødvendig. (Det skulle være innlysende at, når det B'-kodende område er kuttet ned og et syntetisk £2-kodende fragment er sammensmeltet med det, så vil det generelt være et lite antall basepar som normalt finnes mellom NRU I og SPH I som ikke vil være til stede i det sammensmeltede gen, slik at strengt tatt ikke alt av D i fig. 3, eller alt av y-z i fig. 1 og 2, nødvendigvis vil være inkludert). ;En alternativ metode, mindre foretrukket enn ovenstående skjema, er å sammensmelte det ligand-kodende genfragment direkte til B* 1 uten å anvende det £2-kodende fragment.
Det sammensmeltede gen, enten inklusive eller under ute-latelse av det £2-kodende fragment, kan alternativt lages ved anvendelse av det B<11->kodende genfragment fra den mutante tox<228->allel, snarere enn villtype-allelen. Den tox<228->allel, som inneholder NRU I-punktet, forarbeides lett slik at det gir det B<1>'-kodende fragment. Denne tox<228->allel er beskrevet i Uchida et al.
(1973) Jour. Biolog. Chem. 248, 3838, som herved tas med som referanse.
Mer detaljert kan sammensmeltede gener som koder hybridproteiner som her beskrives, lages på følgende måte.
Vektorer
De foretrukne vektorer er plasmidene pUC7, pUC8, pUC9 og pBR322. pUC-plasmidene, beskrevet av Viera et al. (1982) Gene 19, 259 (herved tatt med som referanse) er spesielt godt egnet for dobbelt-fordøyingskloning (fordøying med to forskjellige restrik-sjonsenzymer), en prosess som tillater de sammensmeltede gener å lages på utvetydig måte.
Sammensmeltet gen
Nedenunder er det vist et flytskjema for konstruksjon av difteri-toksin-MSH-sammensmeltede gener som inneholder den protease-sensitive loop £2 mellom tox-sekvensene og ligand-
(i dette tilfelle, MSH) sekvensene.
(iv) klon (ii) Sau3Al- Pstl og (iii) Pstl- Eco til BamHL- EcoRl-punktene på pUCB (Sau3Al-fragment B''-loop-EcoRl) (v) klon (iv) Sau3Al- EcoRl og MSH-sekvens til BamHl-punktet på pUCB (Sau3Al-fragment B''-loop-MSH- BamHl) (vi) klon (i) Sau3Al-fragment A- Sau3Al og (v) Sau3Al-fragment B<1>'-loop-MSH-BamHl til BamHl-punktet på pUCB
( Sau3Al-fragment A-fragment B''-loop-MSH- BamHl)
Under henvisning til ovenstående flytskjema, i trinn (i), oppnås først det fragment A-kodende genfragment og renses, som beskrevet i Science, JEd. I trinn (ii) oppnås det fragment B'<1->kodende fragment ved nedkutting av et større fragment B<1->kodende område under anvendelse av enzym Bal31.
Som vist i fig. 3, er det genfragment som koder fragment B' 1023 bp-området mellom to Sau3Al-punkter, det første av hvilke er den DNA-sekvens som koder det tredje arginin i Z^, og det annet av hvilke er 4 9 bp før enden av det strukturelle tox-gen. Det gen-fragment som koder B<1> er, som nevnt ovenfor, blitt klonet i pUC8. Det plasmid som bærer dette fragment i samme orientering som lac Z-genet er betegnet pDT3 01; ( lac Z- og B'-genene er utenfor rammen på pDT301).
Ved igjen å henvise til det ovenfor angitte flytskjema åpnes pDT3 01 via HindIII-fordøying, og deretter kuttes det B'-kodende fragment ned ved eksponering for exonukleasen Bal31 i varierende tidsrom. Endene av de resulterende avkortede genfragmenter (av varierende lengder) blir deretter butt-ende-ligert med EcoRl og Pstl bindeledd, og fragmentene fordøyes deretter med SauRl. Dette resulterer i en heterogen (hva størrelse angår) populasjon av genfragmenter som koder en del av B<1>.
Disse fragmenter reklones deretter i enten BamHl- Pstl- eller BamHl- EcoRl-punktene i pUC8. Kloning i disse punkter tillater utvelgelse bare av kloner som har BamHl (Sau3AL) på én ende og Pstl eller EcoRl på den annen.
Kloning i dobbelt-fordøyet pUC8 muliggjør også bare én fragment-orientering, og utvelgelse av blå kolonier (de som utkoder lac Z) på X-G-plater verifiserer en forbindelse innen rammen mellom det avkortede B'-kodende område og lac Z. De foretrukne kloner er de hvor det B'-kodende område er 830 bp langt; dvs. at genet er blitt kuttet ned 2 00 bp, til posisjonen til NRU I på tox<228>.
Det neste trinn (iii) er in vitro-syntesen av det genfragment som koder den protease-sensitive loop £2- Dette utføres ved hjelp av konvensjonell fastfase-oligonukleotid-syntese. Sekvensen til dette fragment, inklusive bindeleddene Pstl og EcoRl som er festet etter syntese, er vist nedenunder:
Neste trinn (iv) er å klone det B<1>'-kodende fragment fra trinn (ii) og det i2-kodende fragment fra trinn (iii) til BamHl-EcoRl-punkter på pUC8.
Deretter tilveiebringes det ønskede fragment som koder en del av den celle-spesifikke ligand, enten fra en naturlig kilde eller ved oligonukleotid-syntese. For eksempel kan genfragmenter som koder spesifikke avbindingsdeler av a- og /3-MSH syntetiseres via konvensjonell fastfase-oligonukleotid-syntese.
DNA-sekvensene til disse genfragmenter, sammen med de passende bindeledd, er vist nedenunder:
De unike Pstl- og EcoRl-punkter i pUC8 tillater subkloning av enhver av de ovennevnte syntetiske MSH-frekvenser, nedstrøms for det £2"kodende fragment.
Endelig (trinn vi) sammensmeltes det fragment A-kodende genfragment til det genfragment som koder B^-^-MSH, for å fullføre gensammensmeltningen som er illustrert i fig. 4 (merket på grunnlag av kodede proteinfragmenter), som koder for et hybridprotein som selektivt binder seg til og angriper en utvalgt klasse av celler (i dette tilfelle melanocytter).
Et annet eksempel på en egnet polypeptidligand er substans P, hvis nytte er beskrevet ovenfor. Et sammensmeltet gen som inneholder substans P-genet, snarere enn a- eller /3-MSH-genet, gjøres basisk, som beskrevet ovenfor. Substans P-genet syntetiseres ved anvendelse av konvensjonell fastfase-oligonukleotidsyntese. Substans P-gen-sekvens er:
Som det klart fremgår av ovenstående, må delen av den genetiske sekvens for polypeptidliganden være tilstrekkelig til å muliggjøre at den tilsvarende aminosyresekvens får hybridproteinet til å binde seg til den forutbestemte klasse av celler. Fortrinnsvis vil genet for polypeptidhormonet inkludere alt eller meste-parten av den genetiske sekvens for avbindingsdomenet av liganden.
Generelt, som i de ovenstående eksempler, utføres de mani-pulerende operasjoner ved anvendelse av kloningsvektorer; f.eks. fager eller plasmider. Det genetiske materiale som koder for avbindingsdomenet i polypeptidliganden kan enten være klonet DNA eller en syntetisk oligonukleotidsekvens, alt etter hva som måtte være mest passende for de spesielle ligand-gen som anvendes. Generelt vil det sammensmeltede gen sitte på en kloningsvektor, f.eks. et plasmid eller en fag, som anvendes for transformering av dyrkede mikroorganismer. Hybridproteinet innhøstes så fra dyrkningsmediene for cellene ved anvendelse av konvensjonelle teknikker.
Hybridproteinene som beskrives her administreres til et pattedyr, f.eks. et menneske, som lider av en medisinsk forstyr-relse, f.eks. cancer, karakterisert ved nærvær av en klasse av uønskede celler som en polypeptidligand selektivt kan binde seg til. Mengden av protein som administreres vil variere med typen sykdom, hvor langt sykdommen er kommet og størrelsen og hvilket pattedyr det er som lider av sykdommen. Generelt vil mengdene være i samme område som for andre cytotoksiske midler som anvendes ved behandling av cancer, selv om lavere mengder i visse tilfeller vil være nødvendig på grunn av hybridproteinenes spesifisitet.
Hybridproteinene kan administreres under anvendelse av hvilken som helst konvensjonell metode, f.eks. ved injeksjon, eller ved hjelp av et implantat som frigis med tiden. Når det gjelder MSH-hybrider, kan topiske kremer anvendes for å drepe primær-cancer-celler, og injeksjoner eller implantater kan anvendes for å drepe metastatiske celler. Hybridproteinene kan kombineres med hvilken som helst ikke-toksisk, famasøytisk akseptabel bærersubstans.

Claims (7)

1. Sammensmeltet gen, karakterisert ved at det omfatter et fragment av det gen som koder for difteri-toksin sammensmeltet til et fragment av et gen som koder for en cellespesifikk polypeptidligand, idet nevnte sammensmeltede gen koder for et hybridprotein, idet nevnte fragment av nevnte difteri-toksin-gen inkluderer de deler som koder for (a) det enzymatisk aktive fragment A i difteri-toksin, (b) et fragment som inkluderer spaltningsdomenet £1 som er nærliggende nevnte fragment A i difteri-toksin, (c) et fragment som omfatter minst en del av det hydrofobe domene av fragment B i difteri-toksin og som ikke inkluderer det generaliserte eukaryotiske bindingspunkt i nevnte fragment B, og idet fragmentet av et gen som koder for nevnte polypeptidligand inkluderer minst en del av bindingsdomenet til nevnte polypeptidligand, idet nevnte del av bindingsdomenet er effektiv til å for-årsake at nevnte hybridprotein binder seg selektivt til en forutbestemt klasse av celler som skal angripes av nevnte enzymatisk aktive fragment A.
2. Sammensmeltet gen som angitt i krav 1, karakterisert ved at den del som koder for fragment c) er delen mellom og posisjonen på Nrul-punktet.
3. Sammensmeltet gen som angitt i krav 1 eller 2, karakterisert ved at nevnte fragment i difteri-toksin-genet inkluderer delen £2 mellom den del som koder for fragment c) og det genfragment som koder for liganden.
4. Sammensmeltet gen som angitt i hvilket som helst av kravene 1 til 3, karakterisert ved at nevnte ligand er et hormon.
5. Sammensmeltet gen som angitt i hvilket som helst av kravene 1 til 3, karakterisert ved at det genfragment som koder for nevnte ligand inkluderer en del som koder for en del av a- eller /3-melanocytt-stimulerende hormon som er effektivt til å binde seg til maligne melanocytt-celler.
6. Kloningsvektor, karakterisert ved at den inneholder det sammensmeltede gen som angitt i hvilket som helst av kravene 1 til 5, og kan uttrykke genet.
7. Anvendelse av kloningsvektor som angitt i krav 6, for ekspresjon av en aminosyresekvens ved anvendelse av konvensjonelle fremgangsmåter.
NO840089A 1982-05-12 1984-01-11 Sammensmeltet gen, kloningsvektor, samt anvendelse av kloningsvektoren NO176575C (no)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US37738682A 1982-05-12 1982-05-12
PCT/US1983/000723 WO1983003971A1 (en) 1982-05-12 1983-05-12 Hybrid proteins

Publications (3)

Publication Number Publication Date
NO840089L NO840089L (no) 1984-01-11
NO176575B true NO176575B (no) 1995-01-16
NO176575C NO176575C (no) 1995-04-26

Family

ID=23488913

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
NO840089A NO176575C (no) 1982-05-12 1984-01-11 Sammensmeltet gen, kloningsvektor, samt anvendelse av kloningsvektoren

Country Status (12)

Country Link
US (1) US4675382A (no)
EP (1) EP0108146B1 (no)
JP (3) JP2534222B2 (no)
AT (1) ATE25197T1 (no)
AU (1) AU573529B2 (no)
DE (1) DE3369466D1 (no)
ES (1) ES8407097A1 (no)
FI (1) FI79120C (no)
IT (1) IT1203672B (no)
NO (1) NO176575C (no)
NZ (1) NZ204229A (no)
WO (1) WO1983003971A1 (no)

Families Citing this family (115)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5080898A (en) * 1982-05-12 1992-01-14 The University Hospital Enzymatically active toxin coupled to a cell-specific ligand
FR2549855B1 (fr) * 1983-07-29 1987-03-27 Grp Genie Genetique Sequence nucleotidique codant pour le peptide signal de la toxine diphterique, vecteur contenant cette sequence nucleotidique, leur application a la transformation de micro-organismes et compositions peptidiques obtenues
DE3346953A1 (de) * 1983-12-24 1985-08-14 Organogen Medizinisch-Molekularbiologische Forschungsgesellschaft mbH, 6900 Heidelberg Cardiodilatin, ein neues peptidhormon und verfahren zu seiner herstellung
EP0335476A3 (en) * 1984-02-08 1989-12-13 Cetus Corporation Recombinant methods for the production of ricin a, ricin b, ricin or diphtheria toxin (dt)a or ab' fragment, suitable hosts and vectors therefor, and conjugates comprising ricin toxin a chain or diphtheria toxin
US5668255A (en) * 1984-06-07 1997-09-16 Seragen, Inc. Hybrid molecules having translocation region and cell-binding region
US6022950A (en) * 1984-06-07 2000-02-08 Seragen, Inc. Hybrid molecules having translocation region and cell-binding region
ES8708014A1 (es) * 1984-06-07 1987-09-01 Murphy John R Un procedimiento para preparar un gen fusionado que codifica una proteina hibrida susceptible de marcado y empleo en diagnosis.
US5807715A (en) * 1984-08-27 1998-09-15 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods and transformed mammalian lymphocyte cells for producing functional antigen-binding protein including chimeric immunoglobulin
GB8422238D0 (en) * 1984-09-03 1984-10-10 Neuberger M S Chimeric proteins
IL78775A (en) * 1985-05-15 1992-06-21 Biotech Australia Pty Ltd Oral vaccines
US6103243A (en) * 1985-05-15 2000-08-15 Biotechnology Australia Pty, Ltd Oral vaccines
US5169939A (en) * 1985-05-21 1992-12-08 Massachusetts Institute Of Technology & Pres. & Fellows Of Harvard College Chimeric antibodies
US5011684A (en) * 1985-09-05 1991-04-30 Beth Israel Hospital Association Lysing or blocking unwanted cells with IL-2 receptor-specific binding substance
US5336489A (en) * 1985-09-05 1994-08-09 The Beth Israel Hospital Association Treatment of allograft rejection with IL-2 receptor-specific cytotoxins
US5618920A (en) * 1985-11-01 1997-04-08 Xoma Corporation Modular assembly of antibody genes, antibodies prepared thereby and use
US5576195A (en) * 1985-11-01 1996-11-19 Xoma Corporation Vectors with pectate lyase signal sequence
AU6733287A (en) * 1985-11-13 1987-06-02 Murphy, J.R. Cys codon-modified dna
US4962188A (en) * 1985-12-06 1990-10-09 Cetus Corporation Recombinant ricin toxin A chain conjugates
US6051405A (en) * 1986-09-24 2000-04-18 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Constructs encoding recombinant antibody-toxin fusion proteins
US4892827A (en) * 1986-09-24 1990-01-09 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Recombinant pseudomonas exotoxins: construction of an active immunotoxin with low side effects
US5082927A (en) * 1986-09-24 1992-01-21 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Selectively cytotoxic IL-4-PE40 fusion protein
US6893625B1 (en) 1986-10-27 2005-05-17 Royalty Pharma Finance Trust Chimeric antibody with specificity to human B cell surface antigen
IL84285A (en) * 1986-10-27 1993-03-15 Int Genetic Engineering Chimeric antibody with specificity to human tumor antigen
IL85035A0 (en) * 1987-01-08 1988-06-30 Int Genetic Eng Polynucleotide molecule,a chimeric antibody with specificity for human b cell surface antigen,a process for the preparation and methods utilizing the same
US5149788A (en) * 1987-05-19 1992-09-22 Hoffmann-La Roche, Inc. Purification of chimeric proteins containing an IL-2 moiety by receptor-affinity chromatography
JP2868777B2 (ja) * 1987-08-20 1999-03-10 チルドレンズ・ホスピタル・コーポレイション ヒトマンノース結合タンパク質
US5270199A (en) * 1987-08-20 1993-12-14 The Children's Medical Center Corporation Human mannose-binding protein
US5792458A (en) * 1987-10-05 1998-08-11 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Mutant diphtheria toxin conjugates
AU2728588A (en) * 1987-10-23 1989-05-23 Genetics Institute Inc. Composition and method for treating cancers characterized by over-expression of the c-fms proto-oncogene
US5084556A (en) * 1987-10-23 1992-01-28 Genetics Institute, Inc. Composition of M-CSF conjugated to cytotoxic agents and a method for treating cancers characterized by over-expression of the c-fms proto-oncogene
US6004781A (en) * 1988-01-22 1999-12-21 The General Hospital Corporation Nucleic acid encoding Ig-CD4 fusion proteins
FI102355B1 (fi) * 1988-02-11 1998-11-30 Bristol Myers Squibb Co Menetelmä yhdistävän välikappaleen omaavien antrasykliini-immunokonjugaattien valmistamiseksi
US5827934A (en) * 1988-03-08 1998-10-27 The University Of Wyoming Cytotoxic diphtheria toxin fragments
US5582862A (en) 1988-04-04 1996-12-10 General Hospital Corporation Antibodies that bind to α2-antiplasmin crosslinked to fibrin which do not inhibit plasma α2-antiplasmin
US5372812A (en) * 1988-04-04 1994-12-13 The General Hospital Corporation Composition and method for acceleration of clot lysis
US5290914A (en) * 1988-04-28 1994-03-01 Mycogen Corporation Hybrid diphtheria-B.t. pesticidal toxins
DE68917138T2 (de) * 1988-05-19 1995-02-23 Beth Israel Hospital Toleranzinduktion gegenüber einem fremdantigen.
US5152980A (en) * 1988-05-19 1992-10-06 The Beth Israel Hospital Association Induction of tolerance to a foreign antigen IL-2 receptor-binding substances
US5260422A (en) * 1988-06-23 1993-11-09 Anergen, Inc. MHC conjugates useful in ameliorating autoimmunity
US6106840A (en) 1988-06-23 2000-08-22 Anergen, Inc. MHC conjugates useful in ameliorating autoimmunity
US5468481A (en) * 1988-06-23 1995-11-21 Amergen, Inc. MHC class II-peptide conjugates useful in ameliorating autoimmunity
US5194425A (en) * 1988-06-23 1993-03-16 Anergen, Inc. Mhc-mediated toxic conjugates useful in ameliorating autoimmunity
EP0378666A4 (en) * 1988-07-05 1992-01-22 Amgen Inc. Interleukin ii analogs
US5169933A (en) * 1988-08-15 1992-12-08 Neorx Corporation Covalently-linked complexes and methods for enhanced cytotoxicity and imaging
US5135736A (en) * 1988-08-15 1992-08-04 Neorx Corporation Covalently-linked complexes and methods for enhanced cytotoxicity and imaging
US5811265A (en) * 1988-08-19 1998-09-22 The General Hospital Corporation Hybrid immunoglobulin-thrombolytic enzyme molecules which specifically bind a thrombus, and methods of their production and use
US5609869A (en) * 1988-08-19 1997-03-11 The General Hospital Corporation Hybrid immunoglobulin-thrombolytic enzyme molecules which specifically bind a thrombus, and methods of their production and use
US5632991A (en) * 1988-11-14 1997-05-27 Brigham & Women's Hospital Antibodies specific for E-selectin and the uses thereof
JPH02169521A (ja) * 1988-12-22 1990-06-29 Ajinomoto Co Inc 自己免疫疾患治療剤
DE4004573A1 (de) * 1989-02-17 1990-08-23 Tanabe Seiyaku Co Neues versuchstier und seine herstellung
US5621078A (en) * 1989-03-22 1997-04-15 Merck & Co., Inc. Modified pseudomonas exotoxin PE40
AU5355790A (en) * 1989-04-19 1990-11-16 Cetus Corporation Multifunctional m-csf proteins and genes encoding therefor
CA2053911C (en) * 1989-04-21 1999-11-02 Ira H. Pastan Recombinant antibody-toxin fusion protein
IE901736L (en) * 1989-05-17 1990-11-17 Fuller H B Licensing Financ Polypeptide-antibody conjugate for inhibiting cell adhesion
EP0482068A1 (en) * 1989-07-14 1992-04-29 American Cyanamid Company Cytokine and hormone carriers for conjugate vaccines
US6207798B1 (en) 1989-08-03 2001-03-27 Merck & Co., Inc. Modified PE40 toxin fusion proteins
CA2065010A1 (en) * 1989-08-23 1991-02-24 Brian Seed Non-human primate cd4 polypeptides, fusions thereof, dna encoding, and uses thereof
CA2071969A1 (en) * 1989-12-22 1991-06-23 John R. Murphy Hybrid molecules having translocation region and cell-binding region
US5340935A (en) * 1990-01-05 1994-08-23 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. DNAS encoding proteins active in lymphocyte-medicated cytotoxicity
US5110912A (en) * 1990-03-02 1992-05-05 Seragen, Inc. Purification of il-2-containing hybrid compounds
WO1991013090A1 (en) * 1990-03-02 1991-09-05 Diane Williams Improved chimeric toxins
US5137877B1 (en) * 1990-05-14 1996-01-30 Bristol Myers Squibb Co Bifunctional linking compounds conjugates and methods for their production
EP0535088A4 (en) * 1990-06-13 1994-11-23 Univ Hospital Department Of Me Chimeric toxins with improved inter-domain geometry
IL98528A0 (en) * 1990-06-21 1992-07-15 Merck & Co Inc Pharmaceutical compositions containing hybrid for killing bladder cancer cells
NO175188C (no) * 1990-06-27 1994-09-14 Sjur Olsnes Fremgangsmåte for fremstilling av et peptidkonjugat med evne til å trenge inn i cellecytosol
US5594107A (en) * 1990-08-22 1997-01-14 University Of Saskatchewan Chimeric protein comprising an RTX-family cytotoxin and interferon-2 or interferon
US5238823A (en) * 1990-08-22 1993-08-24 Veterinary Infectious Disease Organization Interleukin-2-leukotoxin gene fusions and uses thereof
US5273889A (en) * 1990-08-22 1993-12-28 University Of Saskatchewan Gamma-iterferon-leukotoxin gene fusions and uses thereof
CA2089553C (en) * 1990-08-29 2000-06-27 Paul Schendel Multidomain hematopoiesis stimulators
WO1992006117A1 (en) * 1990-09-28 1992-04-16 Seragen, Inc. Inhibiting unwanted immune responses
EP0503050A4 (en) * 1990-09-28 1994-07-06 Ortho Pharma Corp Hybrid growth factors
US5328984A (en) * 1991-03-04 1994-07-12 The United States As Represented By The Department Of Health & Human Services Recombinant chimeric proteins deliverable across cellular membranes into cytosol of target cells
CA2108886A1 (en) * 1991-05-03 1992-11-04 Thasia G. Woodworth Interleukin receptor targeted molecules for treatment of inflammatory arthritis
EP0603194A4 (en) * 1991-07-05 1994-12-07 Seragen Inc TO THE RECEPTOR OF THE EPIDERMAL GROWTH FACTOR TARGETED MOLECULES FOR TREATING INFLAMMABLE ARTHRITIS.
US5621083A (en) * 1991-11-04 1997-04-15 Xoma Corporation Immunotoxins comprising ribosome-inactivating proteins
US6146850A (en) * 1991-11-04 2000-11-14 Xoma Corporation Proteins encoding gelonin sequences
US5837491A (en) * 1991-11-04 1998-11-17 Xoma Corporation Polynucleotides encoding gelonin sequences
US5571507A (en) * 1992-02-25 1996-11-05 Seragen, Inc. Methods of treating diabetes
GB9219562D0 (en) 1992-03-11 1992-10-28 Prendergast Kennet F Anti-viral peptides
DE69329643T2 (de) * 1992-04-13 2001-03-01 Dana Farber Cancer Inst Inc Gegen karzinom-assoziierte antigene gerichtete antikörper
DK96493D0 (da) * 1993-08-26 1993-08-26 Mouritsen Og Elsner Aps Fremgangsmaade til at inducere antistofresponser mod selvproteiner og autovaccine fremstillet ved fremgangsmaaden
US5804452A (en) * 1995-04-27 1998-09-08 Quidel Corporation One step urine creatinine assays
WO1997013410A1 (en) * 1995-10-13 1997-04-17 Boston Medical Center Corporation Hybrid molecules containing amidated polypeptide binding ligands
WO1997023243A1 (en) * 1995-12-22 1997-07-03 Bristol-Myers Squibb Company Branched hydrazone linkers
ATE255910T1 (de) * 1996-04-10 2003-12-15 Sangstat Medical Corp Zellmodulierende konjugate aus elementen aus spezifischen bindungspaaren
EP0941345A2 (en) * 1996-09-20 1999-09-15 The General Hospital Corporation Chimeric, humanized and single chain antibodies to alpha-2-antiplasmin
AU6587998A (en) * 1997-03-27 1998-10-20 Demeter Biotechnologies, Ltd. Ligand/lytic peptide compositions and methods of use
US6635740B1 (en) 1997-03-27 2003-10-21 Board Of Supervisors Of Louisiana State University And Agricultural And Mechanical College Ligand/lytic peptide compositions and methods of use
US7741435B2 (en) * 1997-07-09 2010-06-22 Advanced Targeting Systems, Inc. Substance P-saporin (SP-SAP) conjugates and methods of use thereof
US6251866B1 (en) 1997-08-05 2001-06-26 Watson Laboratories, Inc. Conjugates targeted to the interleukin-2 receptor
US6680058B1 (en) 1997-09-03 2004-01-20 Board Of Supervisors Of Louisiana State University And Agricultural And Mechanical College Compositions and methods for contraception in or sterilization of mammals
US6399575B1 (en) * 1998-11-10 2002-06-04 Auburn University Methods and compositions for targeting compounds to the central nervous system
WO2001037868A1 (en) * 1999-11-24 2001-05-31 Oklahoma Medical Research Foundation Assays and therapies for latent viral infection
BR0109704A (pt) * 2000-03-31 2003-04-29 Purdue Research Foundation Método de tratamento usando conjugados de imunógeno ligando
JP2004506417A (ja) * 2000-07-14 2004-03-04 ザイコス　インク． α−ＭＳＨ関連化合物および使用方法
WO2002022685A2 (en) * 2000-09-11 2002-03-21 Kufe Donald W Muc1 extracellular domain and cancer treatment compositions and methods derived therefrom
EP1958642A1 (en) * 2000-12-22 2008-08-20 Dana-Farber Cancer Institute Regulation of cell growth by MUC1
WO2002082081A2 (en) * 2001-04-06 2002-10-17 University Of Rochester Suppression of androgen receptor transactivation through new pathways to ar and ar coactivators and repressors
GB0112687D0 (en) * 2001-05-24 2001-07-18 Microbiological Res Authority Pharmaceutical use of secreted bacterial effector proteins
US20040002058A1 (en) * 2001-06-21 2004-01-01 Uab Research Foundation Chimeric capsid proteins and uses thereof
EP1409551A4 (en) * 2001-06-21 2004-10-13 Uab Research Foundation CHEMICAL CAPSIDE PROTEINS AND USES THEREOF
US20030124742A1 (en) * 2001-08-22 2003-07-03 Prakash Ramesh K. Conjugates targeted to target receptors
EP1434603B1 (en) * 2001-09-28 2009-12-16 Purdue Research Foundation Method of treatment using ligand-immunogen conjugates
US6846484B2 (en) * 2001-12-28 2005-01-25 Regents Of The University Of Minnesota DTAT fusion toxin
US20080090770A1 (en) * 2003-04-11 2008-04-17 Belmares Michael P Modulation of Muc1 Mediated Signal Transduction
US20060257428A1 (en) * 2003-08-22 2006-11-16 Harley John B Assays and therapies for latent viral infection
US8129506B2 (en) 2003-10-24 2012-03-06 Genzyme Corporation Modulation of the interaction of MUC1 with MUC1 ligands
US7585942B2 (en) * 2003-11-25 2009-09-08 Anjin Corporation Diphtheria toxin variant
CA2556729A1 (en) * 2004-02-23 2005-09-09 Genzyme Corporation Muc1 antagonist enhancement of death receptor ligand-induced apoptosis
EP1768662A2 (en) 2004-06-24 2007-04-04 Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. Small molecule immunopotentiators and assays for their detection
CA3153438C (en) 2006-09-07 2024-03-12 Scott & White Memorial Hospital Methods and compositions based on diphtheria toxin-interleukin-3 conjugates
US7972870B2 (en) 2007-02-02 2011-07-05 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Methods and compositions relating to the regulation of MUC1 by HSF1 and STAT3
US7871784B2 (en) * 2007-02-02 2011-01-18 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Methods and compositions relating to the regulation of apoptosis by MUC1 and BH3-containing proapoptotic proteins
EP2346904B1 (en) 2008-10-29 2017-04-12 China Synthetic Rubber Corporation Methods and agents for the diagnosis and treatment of hepatocellular carcinoma
WO2012068463A2 (en) 2010-11-18 2012-05-24 Beth Israel Deaconess Medicall Center, Inc. Methods of treating obesity by inhibiting nicotinamide n-methyl transferase (nnmt)

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4201770A (en) * 1973-05-07 1980-05-06 The Ohio State University Antigenic modification of polypeptides
US4302386A (en) * 1978-08-25 1981-11-24 The Ohio State University Antigenic modification of polypeptides
US4082613A (en) * 1976-04-23 1978-04-04 The Regents Of The University Of Minnesota Process for the production of insulin by genetically transformed fungal cells
IT1107772B (it) * 1977-08-22 1985-11-25 Cancer Res Inst Royal Procedimento per la produzione di complessi macromolecolari prodotto ottenuto e composizioni farmaceutiche che lo contengono come ingrediente attivo
US4336336A (en) * 1979-01-12 1982-06-22 President And Fellows Of Harvard College Fused gene and method of making and using same
JPS5616418A (en) * 1979-07-20 1981-02-17 Teijin Ltd Antitumor protein complex and its preparation
JPS5686121A (en) * 1979-12-14 1981-07-13 Teijin Ltd Antitumor proten complex and its preparation
FR2493846A1 (fr) * 1980-11-10 1982-05-14 Delbarre B Derives du 4h-benzo(4,5)cyclohepta(1,2-b)furanne, leur procede de preparation et leur application en tant que medicaments
US4394443A (en) * 1980-12-18 1983-07-19 Yale University Method for cloning genes
FR2504010B1 (fr) * 1981-04-15 1985-10-25 Sanofi Sa Medicaments anticancereux contenant la chaine a de la ricine associee a un anticorps antimelanome et procede pour leur preparation

Also Published As

Publication number Publication date
JPH08228777A (ja) 1996-09-10
ES522315A0 (es) 1984-08-16
ES8407097A1 (es) 1984-08-16
ATE25197T1 (de) 1987-02-15
US4675382A (en) 1987-06-23
FI840090A0 (fi) 1984-01-11
IT1203672B (it) 1989-02-15
EP0108146A1 (en) 1984-05-16
EP0108146B1 (en) 1987-01-28
FI840090A (fi) 1984-01-11
JPS59500814A (ja) 1984-05-10
FI79120C (fi) 1989-11-10
DE3369466D1 (en) 1987-03-05
JP2534222B2 (ja) 1996-09-11
AU573529B2 (en) 1988-06-16
NO176575C (no) 1995-04-26
NZ204229A (en) 1986-01-24
FI79120B (fi) 1989-07-31
IT8367525A0 (it) 1983-05-12
JPH06239896A (ja) 1994-08-30
NO840089L (no) 1984-01-11
AU1706283A (en) 1983-12-02
WO1983003971A1 (en) 1983-11-24
EP0108146A4 (en) 1984-05-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
NO176575B (no) Sammensmeltet gen, kloningsvektor, samt anvendelse av kloningsvektoren
US5080898A (en) Enzymatically active toxin coupled to a cell-specific ligand
EP0246307B1 (en) Cys codon-modified dna
JPH02501112A (ja) 免疫親和性による精製方法
EP0185076B1 (en) Hybrid protein
RU2142015C1 (ru) Фрагмент днк, кодирующий белок гелонина, и способ его получения, вектор, обеспечивающий экспрессию белка гелонина, рекомбинантный штамм e.coli - продуцент белка гелонина
WO1985002198A1 (en) Microbial expression of type i transforming growth factor, polypeptide analogs thereof and hybrid egf/tgf polypeptides
NO303579B1 (no) FremgangsmÕte for fremstilling av et TGF-&lt;alfa&gt;-PE40-hybridprotein
JP2771220B2 (ja) 植物性リボソーム不活化タンパク質をコードするヌクレオチド配列
EP0510018A1 (en) Lipoprotein signal peptide fused to antigenic polypeptides
WO2021147869A1 (zh) 利拉鲁肽衍生物及其制备方法
Choe et al. B3 (Fab)-PE38M: a recombinant immunotoxin in which a mutant form of Pseudomonas exotoxin is fused to the Fab fragment of monoclonal antibody B3
Parente et al. Clavin, a Type‐1 Ribosome‐Inactivating Protein from Aspergillus clavatus IF0 8605: cDNA Isolation, Heterologous Expression, Biochemical and Biological Characterization of the Recombinant Protein
WO1989002465A2 (en) Polypeptide production
US20040110671A1 (en) N-terminal modified recombinant human endostatin and its production
Tanaka et al. The epitope for anti‐type VII collagen monoclonal antibody (LH7: 2) locates at the central region of the N‐terminal non‐collagenous domain of type VII collagen
CA1217156A (en) Hybrid proteins
US5529932A (en) Isolated DNA encoding a plant ribosome inactivating protein from the leaves of saponaria officinalis
Geli et al. Synthesis and sequence-specific proteolysis of a hybrid protein (colicin A:: growth hormone releasing factor) produced in Escherichia coli
JP2021506330A (ja) 低ｐＨ挿入ペプチド及びその組成物
JP2829397B2 (ja) フィブリン結合活性ポリペプチド
CN114931651A (zh) 一种基于抗体IgG1-Fc结构域的靶向-药物及其制备方法与应用
Rasmussen Investigation of receptor binding sites in human transforming growth factor alpha
COLNAGHI et al. from zyxwvutsrqponmlkjih
Lazdunski Synthesis and sequence-specific proteolysis of a hybrid protein (colicin A:: growth hormone releasing factor) produced in zyxwvutsrqponmlkjihgfedcbaZYXWVUTSRQPONMLKJIHGFEDCBA Escherichia coli