FI79120C - Fusionerad gen och foerfarande foer framstaellning av ett terapeutiskt anvaendbart hybridprotein. - Google Patents
Fusionerad gen och foerfarande foer framstaellning av ett terapeutiskt anvaendbart hybridprotein. Download PDFInfo
- Publication number
- FI79120C FI79120C FI840090A FI840090A FI79120C FI 79120 C FI79120 C FI 79120C FI 840090 A FI840090 A FI 840090A FI 840090 A FI840090 A FI 840090A FI 79120 C FI79120 C FI 79120C
- Authority
- FI
- Finland
- Prior art keywords
- fragment
- hybrid protein
- gene
- encoding
- region
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/34—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Corynebacterium (G)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/665—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans derived from pro-opiomelanocortin, pro-enkephalin or pro-dynorphin
- C07K14/68—Melanocyte-stimulating hormone [MSH]
- C07K14/685—Alpha-melanotropin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/665—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans derived from pro-opiomelanocortin, pro-enkephalin or pro-dynorphin
- C07K14/68—Melanocyte-stimulating hormone [MSH]
- C07K14/69—Beta-melanotropin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/55—Fusion polypeptide containing a fusion with a toxin, e.g. diphteria toxin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
- C07K2319/74—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor
- C07K2319/75—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor containing a fusion for activation of a cell surface receptor, e.g. thrombopoeitin, NPY and other peptide hormones
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S930/00—Peptide or protein sequence
- Y10S930/01—Peptide or protein sequence
- Y10S930/31—Linker sequence
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Amplifiers (AREA)
- Secondary Cells (AREA)
- Adhesives Or Adhesive Processes (AREA)
Description
79120
Fuusioitu geeni ja menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisen hybridiproteiinin valmistamiseksi
Keksinnön kohteena on yhdistelmä-DNA-tekniikan 5 käyttö hybridiproteiinimolekyylien valmistamiseksi. Tällaisia molekyylejä voidaan käyttää sairaustilojen hoitoon.
Kirjallisuus sisältää monia esimerkkejä fuusioituneista geeneistä, jotka koodaava hybridiproteiineja. Esimerkiksi Villa-Komaroff et ai., (1978) P N A S USA 75, 10 ss. 3727 - 3731 kuvaa fuusioitunutta geeniä, joka on valmistettu eukaryoottisesta rakennegeenistä, joka on yhdistetty solulimattomaan bekteerigeeniin. Tämä fuusioitunut geeni koodaa hybridiproteiinia, joka siirtyy ulos soluli-masta.
15 Hybridiproteiineja on tehty myös menetelmillä, esim.
kahden erilaisen proteiinimolekyylin kytkeminen, joihin ei sisälly yhdistelmä-DNA-tekniikkaa. On esimerkiksi ehdotettu muodostettaviksi kytkemällä terapeuttisia hybridi-proteiineja, jotka koostuvat toksiinista, joka on kytketty 20 ligandiin, joka pystyy spesifisesti sitoutumaan valittuun luokkaan soluja. Eräästä yrityksestä tällaisen hybridiproteiinin valmistamiseksi, jonka ovat esittäneet Chang et ai. (1977), J. Biol. Chem. 252, ss. 1515 - 1522, oli tuloksena hybridi, joka koostui difteriatoksiini-A-ketjusta 25 kytkettynä ihmisen istukka-laktogeenihormoniin disulfidi-sidoksen välityksellä. Vaikka hybridiproteiini sitoutui laktogeenireseptoreita sisältäviin soluihin, se ei estänyt proteiinisynteesiä näissä soluissa.
On esitetty myös hybridiproteiini, joka koostuu 30 risiini-A-toksiinista kytkettynä ihmisen koriongonadotro-piinihormonin β-ketjuun samanlaisen disulfidisidoksen välityksellä; vaikka sillä sanotaan olevan spesifisyyttä, sen sitomiskykyä ei ole esitetty, ja tarvittiin äärimmäisen suuria pitoisuuksia proteiinisynteesin merkitseväksi estä-35 miseksi rotan Leydig-kasvainsoluissa, mikä tekee vaikeaksi 2 79120 erottaa "ei-spesifisen" sisääntulon, jonka aiheuttaa en-dosytoosi, ja "spesifisen" sisääntulon välillä, jonka aiheuttaa hybridin myrkyllisen osan siirtyminen kohdesolu-jen solulimamembraanin poikki [Oeltman et ai. (1979), J.
5 Biol. Chem. 254, ss. 1028 - 1032]. Sama puute havaittiin hybridissä, joka koostui difteria-A:sta, joka oli kytketty insuliiniin käyttäen kystamiinia silloitusaineena [Mis-kimins et ai. (1979) Biochem. Biophys. Res. Commun. 91, ss. 143 - 151]. On myös valmistettu hybridi, joka koostuu 10 risiini-A:sta, joka on kytketty orvaskesikasvutekijään (EGF) heterofunktionaalisen silloitusaineen avulla, mutta EFG:n antamat sitoutumisominaisuudet eivät rajoitu spesifisiin soluihin, vaan käsittävät laajan valikoiman solu-tyyppejä [Cawley et ai (1980) Cell, 22, ss. 563 - 570].
15 Nyt on keksitty, että voidaan valmistaa parempi difteriatoksiini/hormoni-hybridiproteiini, jossa proteiini syntetisoidaan yksinkertaiseksi yksiköksi; ts. osasia ei liitetä yhteen silloittamalla vaan peptidisidoksilla. Keksintö tulee parhaiten ymmärretyksi viittaamalla piir-20 roksiin, joista kuva 1 on kaavamainen esitys difteriatoksiinimole-kyylistä; kuva 2 on kaavamainen esitys keksinnön mukaisesti valmistetusta hybridiproteiinimolekyylistä; 25 kuva 3 on pilkontakartta, joka osoittaa difteria- tox-operonin sijainnin ja suuntauksen korynefaagin pto* 3,9 kb:n BamH-I-pilkontafragmentilla (mukaanlukien paikka, NRU I, jota ei löytynyt villintyyppisellä tox-alleelillä, vaan ainoastaan mutantti-tox228-alleenilla, kuten seuraa-30 vassa yksityiskohtaisemmin selostetaan); ja kuva 4 on kaavamainen esitys keksinnön mukaisesta fuusioidusta geenistä, joka koodaa hybridiproteiinia (gee-nifragmentit on merkitty koodatun proteiinin fragmentteja vastaavasti).
3 79120
Keksinnön kohteena on fuusioitu geeni, jolle on tunnusomaista, että se sisältää difteriatoksiinia koodaavan geenifragmentin yhdistettynä geenifragmenttiin, joka koodaa soluspesifistä polypeptidiligandia, jolloin tämä fuusioitu 5 geeni koodaa hybridiproteiinia ja jolloin difteriatoksii-nigeenifragmentti sisältää alueen, joka koodaa difteria-toksiinin hydrofobista johtofragmenttia, alueen, joka koodaa difteriatoksiinin entsymaattisesti aktiivista fragmenttia A, alueen, joka koodaa proteaasiherkkää silmukkaa 10 1χ difteriatoksiinin fragmentin A vieressä, ja ainakin osan fragmentin B hydrofobista aluetta koodaavasta alueesta, kuitenkin ilman aluetta, joka koodaa fragmentin B yleistä eukaryoottista sitoutumiskohtaa, jolloin mainittu polypeptidiligandia koodaava geenifragmentti koodaa maini-15 tun ligandin osaa, joka aikaansaa mainitun hybridiproteii-nin sitoutumisen selektiivisesti solujen ennalta määrättyyn luokkaan.
Keksinnön kohteena on edelleen menetelmä hybridipro-teiinin valmistamiseksi siten, että edellä määritelty 20 fuusioitu geeni liitetään kloonausvektoriin, jolla transformoidaan isäntäsolu ja isäntäsolua viljellään hybridi-proteiinin tuottamiseksi.
Kuvaan 1 viitaten koostuu difteriatoksiinimolekyyli useista funktionaalisista "alueista", jotka voidaan karak-25 terisoida molekyylin aminopäätteisestä päästä lähtien hydrofobiseksi johtosignaalisekvenssiksiksi s, entsymaattisesti aktiiviseksi fragmentiksi A, 14 aminohapon avoimeksi proteaasiherkäksi disulfidisilmukaksi (DSL) 1: , joka sisältää pilkonta-alueen, ja fragmentiksi B, joka sisältää 30 hydrofobisen alueen h. DSLrksi 12 ja karboksipäätteiseksi pääksi, täydennykseksi a.
Prosessi, jolla difteriatoksiini myrkyttää herkkiä eukaryoottisia soluja, käsittää ainakin seuraavat vaiheet: (i) difteriatoksiini sitoutuu spesifisiin reseptoreihin 35 herkän solun pinnalla; 4 79120 (ii) kun toksiinimolekyyli on sitoutuneena reseptoriinsa, se siirtyy endosyyttisen rakkulan sisään; (iii) joko ennen endosyyttiseen rakkulaan siirtymistä tai sen sisällä toksiinimolekyyli katkeaa (tai prosessoi- 5 tuu) kohdassa, joka on 47 000 daltonin alueella N-päättei-sestä päästä; (iv) kun endosyyttisen rakkulan pH laskee arvoon alle 6, toksiinin rakennevälimuoto, sen vielä ollessa sitoutunut reseptoriinsa, liittyy membraaniin; 10 (v) membraaniin upotettuna hydrofobinen alue h muodostaa huokosen; (vi) tapahtuu proteolyyttinen pilkonta l1:ssä, fragmentin A ja B välissä; (vii) sen jälkeen fragmentti A tai polypeptidi, joka 15 sisältää fragmentin A, vapautuu soludispersioon: (viii) fragmentin A katalyttinen aktiivisuus, ts. piden-nystekijän 2 nikotiiniamidi-adeniini-dinukleotidi - adeno-siini-difosfaatti-ribosylaatio, aiheuttaa myrkytetyn solun kuoleman. On ilmeistä, että fragmentin A yhden ainoan mole- 20 kyylin tuominen soludispersioon on riittävä tappamaan solun.
Keksinnön mukaisesti valmistetut hybridiproteiinit sisältävät peräkkäisessä järjestyksessä alkaen hybridipro-teiinin aminopäätteisestä päästä, seuraavat peptidifrag-25 mentit, jotka ovat liittyneet yhteen peptidisidoksin: a) difteriatoksiinin entsymaattisesti aktiivisen fragmentin A (ilman johtofragmenttia s, joka leikkautuu proteiinin erittymisen aikana), b) fragmentin, joka sisältää pilkonta-alueen lx difteria-30 toksiinin fragmentin A vieressä, c) fragmentin, joka sisältää difteriatoksiinin fragmentista B ainakin sen osan, joka koodaa tox-operonin fragmenttia B koodaavan geenifragmentin osaa, joka on 12 :n ja aseman välissä, joka sijaitsee noin 90 emäsparia ylävirtaan 35 tox2 2 8 -alleelin NRU I-kohdan asemasta tox-operonilla, ja 5 79120 d) fragmentin, joka käsittää soluspesifisen polypeptidi-ligandin osan, joka osa sisältää ainakin osan polypeptidi-ligandin sitornisalueesta, jolloin sitomisalueen osa pystyy aikaansaamaan hybridiproteiinin sitoutumisen selektiivi-5 sesti ennalta määrättyyn soluluokkaan, johon difteriatoksiinin entsymaattisesti aktiivinen fragmentti A hyökkää. Hybridiproteiiniin sisällytetty tarpeellinen toksiinimole-kyylin osa on kuvattu molekyylien osana viivojen y ja x välissä kuviossa 1. Edullisesti hybridiproteiini sisältää 10 myös toksiinimolekyylin proteaasiherkän DSL:n 12 , ts. siihen on sisällytetty myös molekyylin osa viivojen x ja z välissä. Viiva z on edullisesti kohdassa, joka on 47 aminohapon päässä B' :n karboksipäätteisestä päästä, ts. 12:n päässä, ei lähempänä, sen takaamiseksi, että fragmen-15 tin B yleinen eukaryoottinen sitomiskohta sulkeutuu pois, niin että sitoutumista säätelee soluspesifisen ligandin sitomisalue. On esitetty, että vähän enemmän kuin puolet osasesta B täytyy olla mukana, jotta molekyyli toimisi tehokkaana toksiinina.
20 Viitaten kuvaan 2, keksinnön mukaisesti valmistetun hybridiproteiinimolekyylin kaavamaiseen esitykseen, on difteriatoksiinimolekyylin y - z-osa liittynyt peptidisi-doksella soluspesifisen polypeptidiligandin fragmenttiin r, ts. polypeptidiin, joka selektiivisesti sitoutuu ennalta 25 määrättyyn solujen luokkaan, joihin difteriatoksiinimolekyylin entsymaattisesti aktiivisen fragmentin A on määrä hyökätä. Fragmentti r voi käsittää koko ligandin tai ligandin osan, joka sisältää ligandin koko sitomisalueen tai sitomisalueen tehokkaan osan.
30 Kun käytetty ligandi on suuri, on toivottavaa, että ligandista sisällytetään hybridiproteiiniin niin vähän sitomattomasta osasta kuin mahdollista, niin että molekyylin sitova alue sijaitsee lähellä fragmentin B hydrofobista aluetta h. On myös toivottavaa sisällyttää hybridimolekyy-35 liin kaikki tai suurin osa ligandimolekyylin sitovasta 6 79120 alueesta. Kun kysymyksessä on α-melanosyyttiä stimuloiva hormoni (MSH), joka on pieni 13 aminohappoa käsittävä peptidi, tai β MSH, joka sisältää 17 aminohappoa, voidaan käyttää molekyylien osaa, joka sisältää 9 aminohappoa 5 molekyylin karboksipäätteisessä päässä, tai koko molekyyliä.
Alueet soluspesifisten ligandien sisällä, joilla alueilla sitova alue sijaitsee, ovat tunnettuja joukolle tällaisia ligandeja. Lisäksi viimeaikaiset edistysaskeleet 10 kiintofaasi-polypeptidisynteeseissä voivat tehdä tähän teknologiaan perehtyneille mahdolliseksi määrittää käytännöllisesti katsoen minkä tahansa tällaisen ligandin sitova alue syntetisoimalla ligandin eri fragmentteja ja testaamalla niitä kyvyn suhteen sitoutua hyökkäyksen kohteeksi 15 joutuvien solujen luokkaan.
Keksinnön mukaisesti valmistetut hybridiproteiini-molekyylit ovat itse asiassa myrkyttömiä kaikille nisäkäs-soluille lukuunottamatta erikoisluokan soluja, joihin ligandin sitova alue sitoutuu. Siten nämä hybridiproteiinit 20 ovat paljon spesifisempiä kuin monet muut terapeuttisesti aineet, esim. yleiset solymyrkylliset syövän vastaiset lääkeaineet.
Keksinnön mukaisesti valmistetut hybridiproteiinit, joiden osat ovat liittyneet toisiinsa peptidisidoksilla, 25 ovat myös parempia kuin silloitetut hybridit, koska keksinnön mukaisesti valmistettuja proteiineja voidaan aikaansaada homogeenisenä näytteenä, jossa kaikki identtiset molekyylit ovat tehokkaita ja selektiivisiä solujen tietylle luokalle.
30 Solujen, joihin keksinnön mukaisesti valmistetut hybridiproteiinit sitoutuvat ja hyökkäävät, erikoisluokan määrää spesifinen polypeptidiligandi, jolla on hybridimo-lekyylin sitova alue. Voidaan käyttää mitä tahansa solu-spesifistä polypeptidiligandia, jolla on sitova alue, joka 35 on spesifinen hyökkäyksen alaiseksi joutuvien solujen 7 79120 erikoisluokalle. Polypeptidihormonit ovat käyttökelpoisia tällaisia ligandeja. Esimerkiksi hybridit, jotka on tehty käyttäen a- tai β-MSHtn sitovan alueen osaa, sitoutuvat selektiivisesti melanosyytteihin tehden hybridit käyttö-5 kelpoisiksi melanooman hoidossa. Muut ligandit antavat erilaisia spesifisyyksiä; esimerkiksi aineen P sitova alue tunnistaa reseptoreita kivun esiintymiseen osallistuvien neuronien pinnoilla, niin että hybridejä, jotka on tehty käyttäen ainetta P, voidaan käyttää tällaisten neuronien 10 hävittämiseen kroonisen kivun helpottamiseksi. Näitä hybridejä voidaan käyttää myös hermojärjestelmän alueiden kartoittamiseen, jotka alueet sisältävät aineen P reseptoreita. Muita käyttökelpoisia spesifisesti sitovia ligandeja ovat semotostatiini, interleukiini I, interleukiini 15 II ja interleukiini III. Interleukiini II on erityisen tärkeä, mikä johtuu sen osasta allergisissa reaktioissa ja autoimmuunisairauksissa, kuten lupuksessa, johon liittyy aktivoituja T-soluja. Koska kaikki interleukiinit ovat spesifisiä T-soluille, niitä käyttäen tehtyjä hybridejä 20 voitaisiin lisäksi käyttää immuunisysteemiin liittyvien syöpien hoitoon ja estämään siirrettyjen elinten hylkimistä. Muita käyttökelpoisia polypeptidiligandeja, joilla on soluspesifisiä sitovia alueita, ovat stimuloiva rakkula-hormooni (spesifinen munasarjasoluille); lutenisoiva hor-25 moni (spesifinen munasarjasoluille); stimuloiva tyroidi-hormoni (spesifinen tyroidisoluille); vasopressiini (spesifinen kohtusoluille, sekä myös rakko- ja suolisoluille); prolaktiini (spesifinen rintasoluille); ja kasvuhormoni (spesifinen tietyille luusoluille).
30 Näitä hybridiproteiineja valmistetaan käyttäen yhdistelmä-DNA-tekniikkaa, joka käsittää halutun fuusioidun geenin muodostamisen, joka koodaa hybridiproteiinia, ja tämän fuusioidun geenin ekspressoinnin tavanomaisia menettelytapoja käyttäen. Viitaten kuvaan 3 sallii difteria-35 tox-operonin sijainti ja suuntaus korynefagin β* °x+ 3,9 8 79120 kb:n BamHI-pilkontafragmentilla tox-operonin pilkonnan halutussa kohdassa ja operonin halutun osasen yhdistämisen geenin halutun osan kanssa valikoitua polypeptidiligandia varten. Yksityiskohtaisemman kuvauksen tox-operonista ja 5 selostuksen fragmentin A kloonaamiseksta on esittänyt Leong et ai. (1983) Science 220, s. 515. Fragmentti A, joka oli kloonattu kuten siinä selostettiin plasmidin pDT201 valmistamiseksi, talletettiin kokoelmaan American Type Culture Collection, Rockville, MD, toukokuussa 1983, ja sille on 10 annettu ATCC-talletusnumero 39 359.
Viitaten kuviin 3 ja 4, on difteria tox-operonin (kuva 3) osa, jota käytetään fuusioidun geenin (kuva 4) valmistamiseen, joka koodaa keksinnön mukaisesti valmistettavia hybridiproteiineja, edullisesti osa, joka on 15 esitetty katkoviivoin, jotka rajaavat fragmentin D; ts. tox-geenin osa ensimmäisestä Sau 3AI-kohdasta SPH I-koh-taan. Fragmentti D sisältää siten 831 emäsparin (bp) gee-nifragmentin, joka koodaa fragmenttia A (sisältäen raken-negeeniä edeltävän 177 bp:n sekvenssin, joka sisältää 20 promoottorin ja osan, joka koodaa signaalisekvenssiä S kuvassa 1); geenifragmentin osan, joka koodaa fragmentin B hydrofobista aluetta; ja geenifragmentin, joka koodaa DSL:n 12 .
Kuten kuvassa 3 on esitetty, fragmenttia A koodaavan 25 geeni fragmentin ensimmäiset 177 emäsparia tox-promoottorin edessä sisältävät jonkin verran DNA:ta, joka ei ole tox-operonin osa. Tämä DNA on asiaankuulumaton ja ei trans-kriboidu; se otetaan mukaan ainoastaan koska fragmenttia A koodaavan geenifragmentin alussa oleva Sau 3AI-kohta on 30 sopivin pilkontakohta lähellä tox-promoottoria (joka on kuvattu viivana heti vasemmalle Hind III:sta).
Tulisi olla mahdollista saada fragmentti D leikkaamalla se yksinkertaisesti tox-operonista pilkkomalla kohdissa Sau 3AI ja SPH I. Vaihtoehtoisesti geenifragmentit 35 voidaan liittää yhteen seuraavasti. Ensin valmistetaan 9 79120 geenifragmentti, joka koodaa fragmenttia A. Seuraavaksi valmistetaan geenifragmentti, joka koodaa suurimman osan fragmentista B, kohdasta Sau 2AI kohtaan Sau 3AI (B' kuvassa 3). Geenifragmentti, joka koodaa fragmenttia B’, on 5 kloonattu plasmidissa pUC8 plasmidin pDT301 valmistamiseksi ja se talletettiin kokoelmaan American Type Culture Collection, Rockville, MD, toukokuussa 1983 ja sille annettiin ATCC-talletusnumero 39 360. Fragmentista B' lohkaistaan entsyymillä Ball31 noin 200 emäsparia, NRU I-kohdan asemaan 10 tox2 2 8 : 11a (villintyyppisellä tox-alleelilla ei ole NRU-kohtaa), niin että saadaan B" (kuva 3). Fragmentit A ja B" yhdistetään, fragmentti, joka koodaa 12:ta yhdistetään fragmenttiin B" ja fragmentti, joka koodaa polypeptidili-gandin haluttua osaa, yhdistetään 12:een.
15 Edellä esitetyssä kaaviossa fragmenttia B' koodaava geenifragmentti katkaistaan edullisesti tarkasti NRU I-kohdasta, mutta se voidaan myös katkaista mistä tahansa kohdasta 90 bp NRU I:n edessä olevan kohdan ja 12:ta koo-daavan alueen pään välillä (ts. 208 bp:n alueella 90 bp:n 20 NRU I:n edessä olevan kohdan ja 12 :ta koodaavan alueen alun välissä). Vaihtoehtoisesti B':tä koodaava fragmentti voitaisiin katkaista l2:ta koodaavan alueen (129 bp ala-virtaan NRU I:stä) karboksipäätteisestä päästä, jossa tapauksessa synteettisen l2:ta koodaavan alueen yhdistä-25 minen on tarpeeton. On ilmeistä, että kun B':tä koodaava aluen katkaistaan ja siihen yhdistetään synteettinen 12:ta koodaava fragmentti, niin yleensä NRU I:n ja SPH I:n välissä on pieni määrä emäspareja, joita ei ole läsnä fuusioidussa geenissä, niin että täsmällisesti sanoen kaikkea 30 kuvan 3 D:stä tai kaikkea kuvien 1 ja 2 y - z:stä ei välttämättä sisällytetä.
Eräs vaihtoehtoinen menettelytapa, joka on vähemmän edullinen kuin edellä esitetty kaavio, on yhdistää ligandia koodaava geenifragmentti suoraan B":hen käyttämättä l2:ta 35 koodaavaa fragmenttia.
79120 ίο
Fuusioitu geeni, joko sisällyttäen tai jättäen pois 12:ta koodaava fragmentti, voidaan vaihtoehtoisesti tehdä käyttäen B":tä koodaavaa geenifragmenttia mutantti tox2 2 8 -alleelista mieluummin kuin villintyyppistä alleelia.
5 tox2 2 8 -alleelia, joka sisältää NRU I-kohdan, on helppo käsitellä niin, että saadaan B":tä koodaava fragmentti. tox2 2 a-alleelia ovat selostaneet Uchida et ai., Jour. Biol. Chem. 248 (1973), s. 3838.
Yksityiskohtaisemmin voidaan keksinnön mukaisia 10 hybridiproteiineja koodaavia geenejä valmistaa seuraavasti.
Vektorit
Edullisia vektoreita ovat plasmidit pUC7, pUC8, pUC9 ja pBR322. pUC-plasmidit, joita ovat kuvanneet Viera et ai., Gene 19 (1982), s. 259, ovat erityisen sopivia 15 kaksoisdigestointikloonausta varten, joka menetelmä mahdollistaa fuusioitujen geenien tekemisen yksiselitteisesti.
Fuusioitu geeni
Seuraavassa on kulkukaavio difteriatoksiini-MSH-fuusioitujen geenien rakentamiseksi, jotka sisältävät 20 proteaasiherkän silmukan 12 tox-sekvenssien ja ligandi (tässä tapauksessa MSH-) sekvenssien välissä.
11 79120 (i) pDT201 Sau3Al puhdistetaan Sau3Al-2 -^ digestointi (Fragmentti A) (ii) pDT301 Hind III ^ Bal31 Pst 1 ^ Sau3Al 5 diges- kat- linkke- digestointi tointi kaisu rit uudelleenkloonaus valikoidaan sini-Sau3Al-Pstl set pesäkkeet puhdistetaan 10 pUC8:ssa * X-G:llä oikea- ^ Sau3Al-Pstl ta lukusuun- (Fragmentti taa varten B") (iii) proteaasiherkän silmukan kloonaus Pstl-EcoRl- 15 12 (Pstl-silmukka-Eco-Rl)_^ kohtiin pUC9:llä ja in vitro-synteesi fragmentin puhdistus (iv) kloonataan (ii) Sau3Al-Pstl ja (iii) Pstl-Eco BamHl-EcoRl-kohtiin pUC8:lla (Sau 3Al-fragmentti 20 B"-silmukka-EcoR) (v) kloonataan (iv) Sau3Al-EcoRl ja MSH-sekvenssi BamHl-kohtaan pUC8:lla (Sau3Al-fragmentti B"-silmukka-MSH-BamHl) 25 (vi) kloonataan (i) Sau3Ai-fragmentti A-Sau3Al ja (v) Sau3Al-fragmentti B"-silmukka-MSH-BamHl-kohtaan pUC8:lla (Sau3Al-fragmentti A-fragmentti B"-sil-mukka-MSH-BamHl).
30
Viitaten edellä esitettyyn kulkukaavioon valmistetaan ja puhdistetaan ensin vaiheessa (i) fragmentin A koodaava geenifragmentti, kuten edellä mainitussa julkaisussa Science on selostettu. Vaiheessa (ii) saadaan frag- 12 79120 menttia B" koodaava fragmentti katkaisemalla suurempi fragmenttia B' koodaava alue käyttäen entsyymiä Bal31.
Kuten kuvassa 3 on esitetty, on fragmenttia B' koodaava geenifragmentti 1023 emäsparin alue kahden Sau2Al-5 kohdan välissä, joista ensimmäinen on DNA-sekvenssillä, joka koodaa kolmatta arginiiniä lx :ssä, ja joista toinen on 49 emäsparia ennen tox-rakennegeenin päätä. Geenifrag-mentti, joka koodaa B':tä, on kuten edellä mainittiin kloonattu pUC8:aan. Plasmidi, jolla on tämä fragmentti 10 samassa suuntauksessa kuin lac Z-geenissä, on nimetty pDT301:ksi (lac Z- ja B'-geenit ovat koodikaavan ulkopuolella pDT301:llä).
Viitaten jälleen edellä esitettyyn kulkukaavioon, pDT301 avataan HindiII-digestiolla ja sitten B':tä koodaava 15 fragmentti katkaistaan altistamalla se eksonukelaasille
Bal31 vaihteleviksi ajanjaksoiksi. Syntyneiden lyhennettyjen geenifragmenttien (jotka ovat eripituisia) päät liitetään sitten tylppäpäisesti EcoRl- ja Pstl-linkkereillä ja fragmenttia digestoidaan sitten SauRl:llä. Tästä on 20 tuloksena fragmenttia B' koodaavien geenifragmenttien heterogeeninen (koon suhteen) populaatio.
Nämä osaset kloonataan sitten uudelleen pUC8:n joko BamHl-Pstl- tai BamHl-EcoRl-kohtiin. Kloonaaminen näihin kohtiin tekee mahdolliseksi valikoida ainoastaan kloonit, 25 joissa on BamHl (Sau3Al) toisessa päässä ja Pstl tai EcoRl toisessa päässä. Myös kloonaus kaksoisdigestoidussa pUC8:ssa sallii ainoastaan yhden fragmentin suuntautumisen ja sinisten pesäkkeiden (niiden, jotka ekspressoivat lac Z:n) valikoiminen X-G-levyillä vahvistaa koodikanavan 30 sisäisen liitoksen lyhennetyn B':tä koodaavan alueen ja lac Z:n välissä. Edullisia klooneja ovat ne, joissa B':tä koodaava alue on 830 bp pitkä, ts. geeniä on lyhennetty 200 bp, asemaan NRU I tox2 2 8 : 11a.
13 791 20
Seuraava vaihe (III) on proteaasiherkkää silmukkaa 12 koodaavan geenifragmentin in vitro synteesi. Tämä suoritetaan tavanomaisen kiintofaasi-oligonukleotidisynteesin avulla. Tämän fragmentin sekvenssi mukaanluettuina Pstl-5 ja EcoRl-linkkerit, jotka liitetään synteesin jälkeen, on esitetty seuraavassa: _ Cys-Arg-Ala-Ile-Asp-Gly-Asp-Val-Thr-Phe-Cys- TGC-AGA-GCT-ATA-GAC-GGT-GAT-GTA-ACT-TTT-TGC 10 Pstl- EcoRl- linkkeri linkkeri
Seuraavana vaiheena (iv) on kloonata B":tä koodaa-va fragmentti vaiheesta (ii) ja l2:ta koodaava fragmentti 15 vaiheesta (iii) BamHl-EcoRl-kohtiin pUC8:lla.
Seuraavaksi aikaansaadaan haluttu fragmentti, joka koodaa osaa soluspesifisestä ligandista, joko luonnon lähteestä tai oligonukleotidisynteesillä. Esimerkiksi geeni-fragmentteja, jotka koodaavat a- ja β-MSHin spesifisiä 20 sitomisosia, voidaan syntetisoida tavanomaisen kiintofaasi -oiigonukleotidisynteesin kautta.
Näiden geeniosasten DNA-sekvenssit yhdessä sopivien linkkereiden kanssa on esitetty seuraavassa: 25 a-MSH:
Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val _AGC-TAT-AGC-TAG-GAA-CAT-TTT-AGA-TGC-GGX-AAA-CCX-GTX_
T C T G C C G
30 EcoRl- lopetuskodoni & linkkeri BamHl-linkkeri 14 79120 β-MSH:
Asp-Glu-Gly-Pro-Tyr-Met-Glu-His-Phe-
_GAT-GAA-GGT-CCA-TAT-ATG-GAG-CAC-TTT
5 CGXXC ATC
Arg-Trp-Gly-Ser-Pro-Pro-Lys-Asp AGA-TGG-GGT-TCT-CCG-CCG-AAA-GAT__
G X X X X TC C
10 EcoRl- lopetuskodoni & linkkeri BamHl-linkkeri pUC8:n ainoat Pstl- ja EcoRl-kohdat mahdollistavat 15 sen, että voidaan subkloonata edellä esitetyistä synteettisistä MSH-sekvensseistä alavirtaan 12:ta koodaavasta fragmentista.
Lopuksi (vaihe vi) fragmenttia A koodaava geeni-fragmentti yhdistetään geenifragmenttiin, joka koodaa B"-20 l2-MSH:ta, geenifuusion saattamiseksi täydelliseksi kuten kuvassa 4 on esitetty (merkitty koodattuina proteiinifragmentteina, jolloin saatu geeni koodaa hybridiproteiinia, joka selektiivisesti sitoutuu ja hyökkää solujen valittuun luokkaan (tässä tapauksessa melanosyytteihin).
25 Toinen esimerkki sopivasta polypeptidiligandista on aine P, jonka hyödyllisyys on selostettu edellä- Yhdistetty geeni, joka sisältää aineen P geenin eikä a- tai β-MSH-ggeniä, tehdään pääasiallisesti kuten edellä on hahmoteltu. Aineen P geeni syntetisoidaan käyttäen tavan-30 omaista kiintofaasi-oligonukleotidisynteesiä. Aineen P geenin sekvenssi on
CGTCCTAAACCTCAGCAGTTCTTCGGTCTGATG
15 791 20
Kuten edellä esitetystä on selvää, täytyy geneettisen sekvenssin osan polypeptidiligandia varten olla riittävä tekemään mahdolliseksi sen, että vastaava aminohapposekvenssi saa aikaan hybridiproteiinin sitoutumisen 5 solujen ennalta määrättyyn luokkaan. Edullisesti geeni polypeptidihormonia varten sisältää kaiken tai suurimman osan geneettisestä sekvenssistä ligandin sitovaa aluetta varten.
Yleensä, kuten edellä esitetyissä esimerkeissäkin, 10 käsittelyprosessit toteutetaan käyttäen kloonausvektorei-ta, esim. faageja tai plasmideja. Geneettinen aines, joka koodaa polypeptidiligandin sitovaa aluetta, voi olla joko kloonattu DNA tai synteettinen oligonukleotidisekvenssi, sen mukaan kumpi on sopivampi kulloinkin käytettyä ligan-15 digeeniä varten. Yleensä fuusioitu geeni sijaitsee kloo-nausvektorilla, esim. plasmidilla tai faagilla, jotka käytetään transformoimaan viljeltyjä mikro-organismeja. Hyb-ridiproteiini kootaan sitten talteen solujen kasvualustoista käyttäen tavanomaisia menetelmiä.
20 Keksinnön mukaisesti valmistettuja hybridiproteii- neja annetaan nisäkkäälle, esim. ihmiselle, joka kärsii sairaustilasta, esim. syövästä, jolle on ominaista, että läsnä on ei-toivottuja soluja, joihin polypeptidiligandi voi selektiivisesti sitoutua. Annetun proteiinin määrä 25 vaihtelee sairauden lajin, sairauden laajuuden ja sairaudesta kärsivän nisäkkään koon ja lajin mukaan. Yleensä määrät ovat samalla alueella kuin annokset, joita käytetään muille solumyrkyille, joita käytetään syövän hoidossa, vaikkakin tietyissä tapauksissa tarvitaan pienempiä 30 määriä, mikä johtuu hybridiproteiinien spesifisyydestä.
16 791 20
Hybridiproteiineja voidaan antaa käyttäen mitä tahansa tavanomaista menetelmää; esim. ruiskeena tai ajoi-tetusti vapauttavan siirrännäisen kautta. MHS-hybridien tapauksessa voidaan käyttää paikallisia voiteita primää-5 risten syöpäsolujen tappamiseen, ja ruiskeita tai siirrännäisiä voidaan käyttää haarapesäkesolujen tappamiseksi. Hybridiproteiinit voidaan yhdistää minkä tahansa myrkyttömän, farmaseuttisesti hyväksyttävän kantajan kanssa.
Claims (14)
1. Fuusioitu geeni, tunnettu siitä, että se sisältää difteriatoksiinia koodaavan geenifragmentin 5 yhdistettynä geenifragmenttiin, joka koodaa soluspesifistä polypeptidiligandia, jolloin tämä fuusioitu geeni koodaa hybridiproteiinia ja jolloin difteriatoksiinigeenifrag-mentti sisältää alueen, joka koodaa difteriatoksiinin hydrofobista johtofragmenttia, alueen, joka koodaa difteria-10 toksiinin entsymaattisesti aktiivista fragmenttia A, alueen, joka koodaa proteaasiherkkää silmukkaa lx difteriatoksiinin fragmentin A vieressä, ja ainakin osan fragmentin B hydrofobista aluetta koodaavasta alueesta, kuitenkin ilman aluetta, joka koodaa fragmentin B yleistä eu-15 karyoottista sitoutumiskohtaa, jolloin mainittu polypeptidiligandia koodaava geenifragmentti koodaa mainitun li-gandin osaa, joka aikaansaa mainitun hybridiproteiinin sitoutumisen selektiivisesti solujen ennalta määrättyyn luokkaan.
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen fuusioitu geeni, tunnettu siitä, että fragmentin B hydrofobista aluetta koodaava alue käsittää 12-koodausalueen.
3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen fuusioitu geeni, tunnettu siitä, että polypeptidiligandi 25 on a- tai β-melanosyyttiä stimuloiva aine.
4. Kloonausvektori, tunnettu siitä, että se sisältää patenttivaatimuksen 1, 2 tai 3 mukaisen fuusioidun geenin.
5. Patenttivaatimuksen 4 mukaisen kloonausvektorin 30 käyttö aminohapposekvenssin ilmaisuun tavanomaisella menetelmällä . ie 79120
6. Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisen hybri-diproteiinin valmistamiseksi, joka proteiini käsittää pep-tidisidoksin yhteenliitettyjä proteiinifragmentteja, jolloin se käsittää, peräkkäisessä järjestyksessä alkaen hyb- 5 ridiproteiinin aminopäätteisestä päästä, a) difteriatoksiinin entsymaattisesti aktiivisen fragmentin A, b) fragmentin, joka sisältää pilkonta-alueen lx difteriatoksiinin fragmentin A vieressä, 10 c) fragmentin, joka sisältää ainakin osan difteria- toksiinin fragmentin B hydrofobisesta alueesta, eikä sisällä mainitun fragmentin B yleistä eukaryoottista sito-miskohtaa, ja d) framgentin, joka sisältää osan soluspesifisestä 15 polypeptidiligandista, jolloin tämä osa sisältää ainakin osan polypeptidiligandia sitovasta alueesta, jolloin tämän sitovan alueen osa pystyy aikaansaamaan hybridiprote-iinin sitoutumisen selektiivisesti ennalta määrättyyn solujen luokkaan, joihin vaikutetaan entsymaattisesti aktii-20 visella fragmentilla A, tunnettu siitä, että patenttivaatimuksen 1 mukainen a):ta, b):tä, c):tä ja d):tä koodaava fuusioitu geeni liitetään kloonausvektoriin, isäntäsolu transformoidaan tällä kloonausvektorilla ja isäntäsolua viljellään 25 hybridiproteiinin tuottamiseksi.
7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että fragmenttia c) koodaa fragmenttia B koodaavan geenifragmentin osa lx :n ja NRU I-kohdan aseman välissä.
8. Patenttivaatimuksen 6 tai 7 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että hybridiproteiini sisältää lisäksi fragmentin 12 fragmenttien c) ja d) välissä.
9. Patenttivaatimuksen 6 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että polypeptidiligandi on hor-35 moni. i9 791 20
10. Patenttivaatimuksen 9 mukainen menetelmä, tunnett u siitä, että polypeptidihormonin alue on a- tai β-melanosyyttiä stimuloivan hormonin alue, joka pystyy aikaansaamaan hybridiproteiinin sitoutumisen pahan- 5 laatuisiin melanosyyttisoluihin.
11. Patenttivaatimuksen 9 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että polypeptidihormonin osa on aineen P osa, joka pystyy aikaansaamaan hybridiproteiinin sitoutumisen kipureseptorineuroneihin.
12. Patenttivaatimuksen 9 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että polypeptidihormonin osa on interleukiini l:n osa, joka pystyy aikaansaamaan hybridi-proteiinin sitoutumisen T-soluihin.
13. Patenttivaatimuksen 9 mukainen menetelmä, 15 tunnettu siitä, että polypeptidihormonin osa on interleukiini II:n osa, joka pystyy aikaansaamaan hybridi-proteiinin sitoutumisen T-soluihin.
14. Patenttivaatimuksen 9 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että polypeptidihormonin osa on 20 interleukiini III:n osa, joka pystyy aikaansaamaan hybridiproteiinin sitoutumisen T-soluihin. 20 791 20
Applications Claiming Priority (4)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US37738682A | 1982-05-12 | 1982-05-12 | |
US37738682 | 1982-05-12 | ||
PCT/US1983/000723 WO1983003971A1 (en) | 1982-05-12 | 1983-05-12 | Hybrid proteins |
US8300723 | 1983-05-12 |
Publications (4)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
FI840090A0 FI840090A0 (fi) | 1984-01-11 |
FI840090A FI840090A (fi) | 1984-01-11 |
FI79120B FI79120B (fi) | 1989-07-31 |
FI79120C true FI79120C (fi) | 1989-11-10 |
Family
ID=23488913
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
FI840090A FI79120C (fi) | 1982-05-12 | 1984-01-11 | Fusionerad gen och foerfarande foer framstaellning av ett terapeutiskt anvaendbart hybridprotein. |
Country Status (12)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US4675382A (fi) |
EP (1) | EP0108146B1 (fi) |
JP (3) | JP2534222B2 (fi) |
AT (1) | ATE25197T1 (fi) |
AU (1) | AU573529B2 (fi) |
DE (1) | DE3369466D1 (fi) |
ES (1) | ES522315A0 (fi) |
FI (1) | FI79120C (fi) |
IT (1) | IT1203672B (fi) |
NO (1) | NO176575C (fi) |
NZ (1) | NZ204229A (fi) |
WO (1) | WO1983003971A1 (fi) |
Families Citing this family (115)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5080898A (en) * | 1982-05-12 | 1992-01-14 | The University Hospital | Enzymatically active toxin coupled to a cell-specific ligand |
FR2549855B1 (fr) * | 1983-07-29 | 1987-03-27 | Grp Genie Genetique | Sequence nucleotidique codant pour le peptide signal de la toxine diphterique, vecteur contenant cette sequence nucleotidique, leur application a la transformation de micro-organismes et compositions peptidiques obtenues |
DE3346953A1 (de) * | 1983-12-24 | 1985-08-14 | Organogen Medizinisch-Molekularbiologische Forschungsgesellschaft mbH, 6900 Heidelberg | Cardiodilatin, ein neues peptidhormon und verfahren zu seiner herstellung |
ATE68703T1 (de) * | 1984-02-08 | 1991-11-15 | Cetus Corp | Toxinkonjugate. |
US5668255A (en) * | 1984-06-07 | 1997-09-16 | Seragen, Inc. | Hybrid molecules having translocation region and cell-binding region |
US6022950A (en) * | 1984-06-07 | 2000-02-08 | Seragen, Inc. | Hybrid molecules having translocation region and cell-binding region |
NZ212312A (en) * | 1984-06-07 | 1988-09-29 | John Richard Murphy | Hybrid protein comprising fragments of diphtheria toxin and part of cell-specific ligand; and fused gene therefor |
US5807715A (en) * | 1984-08-27 | 1998-09-15 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Methods and transformed mammalian lymphocyte cells for producing functional antigen-binding protein including chimeric immunoglobulin |
GB8422238D0 (en) * | 1984-09-03 | 1984-10-10 | Neuberger M S | Chimeric proteins |
US6103243A (en) * | 1985-05-15 | 2000-08-15 | Biotechnology Australia Pty, Ltd | Oral vaccines |
IL78775A (en) * | 1985-05-15 | 1992-06-21 | Biotech Australia Pty Ltd | Oral vaccines |
US5169939A (en) * | 1985-05-21 | 1992-12-08 | Massachusetts Institute Of Technology & Pres. & Fellows Of Harvard College | Chimeric antibodies |
US5336489A (en) * | 1985-09-05 | 1994-08-09 | The Beth Israel Hospital Association | Treatment of allograft rejection with IL-2 receptor-specific cytotoxins |
US5011684A (en) * | 1985-09-05 | 1991-04-30 | Beth Israel Hospital Association | Lysing or blocking unwanted cells with IL-2 receptor-specific binding substance |
US5576195A (en) * | 1985-11-01 | 1996-11-19 | Xoma Corporation | Vectors with pectate lyase signal sequence |
US5618920A (en) * | 1985-11-01 | 1997-04-08 | Xoma Corporation | Modular assembly of antibody genes, antibodies prepared thereby and use |
AU6733287A (en) * | 1985-11-13 | 1987-06-02 | Murphy, J.R. | Cys codon-modified dna |
US4962188A (en) * | 1985-12-06 | 1990-10-09 | Cetus Corporation | Recombinant ricin toxin A chain conjugates |
US6051405A (en) * | 1986-09-24 | 2000-04-18 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services | Constructs encoding recombinant antibody-toxin fusion proteins |
US4892827A (en) * | 1986-09-24 | 1990-01-09 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Recombinant pseudomonas exotoxins: construction of an active immunotoxin with low side effects |
US5082927A (en) * | 1986-09-24 | 1992-01-21 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Selectively cytotoxic IL-4-PE40 fusion protein |
US6893625B1 (en) | 1986-10-27 | 2005-05-17 | Royalty Pharma Finance Trust | Chimeric antibody with specificity to human B cell surface antigen |
IL84285A (en) * | 1986-10-27 | 1993-03-15 | Int Genetic Engineering | Chimeric antibody with specificity to human tumor antigen |
IL85035A0 (en) * | 1987-01-08 | 1988-06-30 | Int Genetic Eng | Polynucleotide molecule,a chimeric antibody with specificity for human b cell surface antigen,a process for the preparation and methods utilizing the same |
US5149788A (en) * | 1987-05-19 | 1992-09-22 | Hoffmann-La Roche, Inc. | Purification of chimeric proteins containing an IL-2 moiety by receptor-affinity chromatography |
US5270199A (en) * | 1987-08-20 | 1993-12-14 | The Children's Medical Center Corporation | Human mannose-binding protein |
DE3856180T2 (de) * | 1987-08-20 | 1998-09-03 | Childrens Medical Center | Nukleinsaürefragmente, die mannose bindende fragmente vom menschlichen mannosebindenden protein kodieren |
US5792458A (en) * | 1987-10-05 | 1998-08-11 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Mutant diphtheria toxin conjugates |
WO1989003687A1 (en) * | 1987-10-23 | 1989-05-05 | Genetics Institute, Inc. | Composition and method for treating cancers characterized by over-expression of the c-fms proto-oncogene |
US5084556A (en) * | 1987-10-23 | 1992-01-28 | Genetics Institute, Inc. | Composition of M-CSF conjugated to cytotoxic agents and a method for treating cancers characterized by over-expression of the c-fms proto-oncogene |
US6004781A (en) * | 1988-01-22 | 1999-12-21 | The General Hospital Corporation | Nucleic acid encoding Ig-CD4 fusion proteins |
IL89220A (en) * | 1988-02-11 | 1994-02-27 | Bristol Myers Squibb Co | Immunoconjugates of anthracycline, their production and pharmaceutical preparations containing them |
US5827934A (en) * | 1988-03-08 | 1998-10-27 | The University Of Wyoming | Cytotoxic diphtheria toxin fragments |
US5582862A (en) | 1988-04-04 | 1996-12-10 | General Hospital Corporation | Antibodies that bind to α2-antiplasmin crosslinked to fibrin which do not inhibit plasma α2-antiplasmin |
US5372812A (en) * | 1988-04-04 | 1994-12-13 | The General Hospital Corporation | Composition and method for acceleration of clot lysis |
US5290914A (en) * | 1988-04-28 | 1994-03-01 | Mycogen Corporation | Hybrid diphtheria-B.t. pesticidal toxins |
EP0414816B1 (en) * | 1988-05-19 | 1994-07-27 | The Beth Israel Hospital Association | Induction of tolerance to a foreign antigen |
US5152980A (en) * | 1988-05-19 | 1992-10-06 | The Beth Israel Hospital Association | Induction of tolerance to a foreign antigen IL-2 receptor-binding substances |
US5468481A (en) * | 1988-06-23 | 1995-11-21 | Amergen, Inc. | MHC class II-peptide conjugates useful in ameliorating autoimmunity |
US5194425A (en) * | 1988-06-23 | 1993-03-16 | Anergen, Inc. | Mhc-mediated toxic conjugates useful in ameliorating autoimmunity |
US5260422A (en) * | 1988-06-23 | 1993-11-09 | Anergen, Inc. | MHC conjugates useful in ameliorating autoimmunity |
US6106840A (en) * | 1988-06-23 | 2000-08-22 | Anergen, Inc. | MHC conjugates useful in ameliorating autoimmunity |
JPH03500415A (ja) * | 1988-07-05 | 1991-01-31 | アムジエン・インコーポレーテツド | インターロイキン2類似体 |
US5135736A (en) * | 1988-08-15 | 1992-08-04 | Neorx Corporation | Covalently-linked complexes and methods for enhanced cytotoxicity and imaging |
US5169933A (en) * | 1988-08-15 | 1992-12-08 | Neorx Corporation | Covalently-linked complexes and methods for enhanced cytotoxicity and imaging |
US5609869A (en) * | 1988-08-19 | 1997-03-11 | The General Hospital Corporation | Hybrid immunoglobulin-thrombolytic enzyme molecules which specifically bind a thrombus, and methods of their production and use |
US5811265A (en) * | 1988-08-19 | 1998-09-22 | The General Hospital Corporation | Hybrid immunoglobulin-thrombolytic enzyme molecules which specifically bind a thrombus, and methods of their production and use |
US5632991A (en) * | 1988-11-14 | 1997-05-27 | Brigham & Women's Hospital | Antibodies specific for E-selectin and the uses thereof |
JPH02169521A (ja) * | 1988-12-22 | 1990-06-29 | Ajinomoto Co Inc | 自己免疫疾患治療剤 |
DE4004573A1 (de) * | 1989-02-17 | 1990-08-23 | Tanabe Seiyaku Co | Neues versuchstier und seine herstellung |
US5621078A (en) * | 1989-03-22 | 1997-04-15 | Merck & Co., Inc. | Modified pseudomonas exotoxin PE40 |
AU5355790A (en) * | 1989-04-19 | 1990-11-16 | Cetus Corporation | Multifunctional m-csf proteins and genes encoding therefor |
DE69027210T2 (de) * | 1989-04-21 | 1997-01-23 | Protein Design Labs, Inc., Palo Alto, Calif. | Rekombinantes antikörper-toxin-fusion-protein |
IE901736L (en) * | 1989-05-17 | 1990-11-17 | Fuller H B Licensing Financ | Polypeptide-antibody conjugate for inhibiting cell adhesion |
WO1991001146A1 (en) * | 1989-07-14 | 1991-02-07 | Praxis Biologics, Inc. | Cytokine and hormone carriers for conjugate vaccines |
US6207798B1 (en) | 1989-08-03 | 2001-03-27 | Merck & Co., Inc. | Modified PE40 toxin fusion proteins |
AU648041B2 (en) * | 1989-08-23 | 1994-04-14 | General Hospital Corporation, The | Non-human primate CD4 polypeptides, fusions thereof, DNA encoding, and uses thereof |
JPH05502880A (ja) * | 1989-12-22 | 1993-05-20 | セラジェン・インコーポレーテッド | トランスロケーション領域および細胞結合領域を有するハイブリッド分子 |
US5340935A (en) * | 1990-01-05 | 1994-08-23 | Dana-Farber Cancer Institute, Inc. | DNAS encoding proteins active in lymphocyte-medicated cytotoxicity |
WO1991013090A1 (en) * | 1990-03-02 | 1991-09-05 | Diane Williams | Improved chimeric toxins |
US5110912A (en) * | 1990-03-02 | 1992-05-05 | Seragen, Inc. | Purification of il-2-containing hybrid compounds |
US5137877B1 (en) * | 1990-05-14 | 1996-01-30 | Bristol Myers Squibb Co | Bifunctional linking compounds conjugates and methods for their production |
CA2083487A1 (en) * | 1990-06-13 | 1991-12-14 | John R. Murphy | Chimeric toxins with improved inter-domain geometry |
IL98528A0 (en) * | 1990-06-21 | 1992-07-15 | Merck & Co Inc | Pharmaceutical compositions containing hybrid for killing bladder cancer cells |
NO175188C (no) * | 1990-06-27 | 1994-09-14 | Sjur Olsnes | Fremgangsmåte for fremstilling av et peptidkonjugat med evne til å trenge inn i cellecytosol |
US5273889A (en) * | 1990-08-22 | 1993-12-28 | University Of Saskatchewan | Gamma-iterferon-leukotoxin gene fusions and uses thereof |
US5594107A (en) * | 1990-08-22 | 1997-01-14 | University Of Saskatchewan | Chimeric protein comprising an RTX-family cytotoxin and interferon-2 or interferon |
US5238823A (en) * | 1990-08-22 | 1993-08-24 | Veterinary Infectious Disease Organization | Interleukin-2-leukotoxin gene fusions and uses thereof |
JP3149182B2 (ja) * | 1990-08-29 | 2001-03-26 | ジェネティックス・インスティテュート・インコーポレイテッド | 多領域造血刺激因子類 |
WO1992006117A1 (en) * | 1990-09-28 | 1992-04-16 | Seragen, Inc. | Inhibiting unwanted immune responses |
WO1992006116A1 (en) * | 1990-09-28 | 1992-04-16 | Ortho Pharmaceutical Corporation | Hybrid growth factors |
US5328984A (en) * | 1991-03-04 | 1994-07-12 | The United States As Represented By The Department Of Health & Human Services | Recombinant chimeric proteins deliverable across cellular membranes into cytosol of target cells |
CA2108886A1 (en) * | 1991-05-03 | 1992-11-04 | Thasia G. Woodworth | Interleukin receptor targeted molecules for treatment of inflammatory arthritis |
AU665360B2 (en) * | 1991-07-05 | 1996-01-04 | Seragen, Inc. | Epidermal growth factor receptor targeted molecules for treatment of inflammatory arthritis |
US5837491A (en) * | 1991-11-04 | 1998-11-17 | Xoma Corporation | Polynucleotides encoding gelonin sequences |
US6146850A (en) | 1991-11-04 | 2000-11-14 | Xoma Corporation | Proteins encoding gelonin sequences |
US5621083A (en) * | 1991-11-04 | 1997-04-15 | Xoma Corporation | Immunotoxins comprising ribosome-inactivating proteins |
US5571507A (en) * | 1992-02-25 | 1996-11-05 | Seragen, Inc. | Methods of treating diabetes |
GB9219562D0 (en) | 1992-03-11 | 1992-10-28 | Prendergast Kennet F | Anti-viral peptides |
EP0636029B1 (en) * | 1992-04-13 | 2000-11-08 | Dana-Farber Cancer Institute, Inc. | Antibodies specific for carcinoma-associated antigens |
DK96493D0 (da) * | 1993-08-26 | 1993-08-26 | Mouritsen Og Elsner Aps | Fremgangsmaade til at inducere antistofresponser mod selvproteiner og autovaccine fremstillet ved fremgangsmaaden |
US5804452A (en) * | 1995-04-27 | 1998-09-08 | Quidel Corporation | One step urine creatinine assays |
WO1997013410A1 (en) * | 1995-10-13 | 1997-04-17 | Boston Medical Center Corporation | Hybrid molecules containing amidated polypeptide binding ligands |
DK0871490T3 (da) * | 1995-12-22 | 2003-07-07 | Bristol Myers Squibb Co | Forgrenede hydrazonlinkere |
ES2210514T3 (es) * | 1996-04-10 | 2004-07-01 | Sangstat Medical Corporation | Conjugados citomoduladores de miembros de pares de union especificos. |
AU734997B2 (en) * | 1996-09-20 | 2001-06-28 | General Hospital Corporation, The | Composition and method for enhancing fibrinolysis using antibodies to alpha-2-antiplasmin |
US6635740B1 (en) | 1997-03-27 | 2003-10-21 | Board Of Supervisors Of Louisiana State University And Agricultural And Mechanical College | Ligand/lytic peptide compositions and methods of use |
AU6587998A (en) * | 1997-03-27 | 1998-10-20 | Demeter Biotechnologies, Ltd. | Ligand/lytic peptide compositions and methods of use |
US7741435B2 (en) * | 1997-07-09 | 2010-06-22 | Advanced Targeting Systems, Inc. | Substance P-saporin (SP-SAP) conjugates and methods of use thereof |
US6251866B1 (en) | 1997-08-05 | 2001-06-26 | Watson Laboratories, Inc. | Conjugates targeted to the interleukin-2 receptor |
US6680058B1 (en) | 1997-09-03 | 2004-01-20 | Board Of Supervisors Of Louisiana State University And Agricultural And Mechanical College | Compositions and methods for contraception in or sterilization of mammals |
US6399575B1 (en) * | 1998-11-10 | 2002-06-04 | Auburn University | Methods and compositions for targeting compounds to the central nervous system |
EP1233781A1 (en) * | 1999-11-24 | 2002-08-28 | Oklahoma Medical Research Foundation | Assays and therapies for latent viral infection |
SK288201B6 (sk) * | 2000-03-31 | 2014-06-03 | Purdue Research Foundation | Farmaceutický prostriedok |
CA2415938A1 (en) * | 2000-07-14 | 2002-01-24 | Zycos Inc. | Alpha-msh related compounds and methods of use |
US20050053606A1 (en) * | 2000-09-11 | 2005-03-10 | KUFE Donald W. | MUC1 extracellular domain and cancer treatment compositions and methods derived therefrom |
AU2002246791C1 (en) * | 2000-12-22 | 2008-04-03 | Dana-Farber Cancer Institute, Inc. | Regulation of cell growth by MUC1 |
AU2002303282A1 (en) * | 2001-04-06 | 2002-10-21 | University Of Rochester | Suppression of androgen receptor transactivation through new pathways to AR and AR coactivators and repressors |
GB0112687D0 (en) * | 2001-05-24 | 2001-07-18 | Microbiological Res Authority | Pharmaceutical use of secreted bacterial effector proteins |
WO2003000855A2 (en) * | 2001-06-21 | 2003-01-03 | Uab Research Foundation | Chimeric capsid proteins and uses thereof |
US20040002058A1 (en) * | 2001-06-21 | 2004-01-01 | Uab Research Foundation | Chimeric capsid proteins and uses thereof |
WO2003017938A2 (en) * | 2001-08-22 | 2003-03-06 | Watson Pharmaceuticals, Inc. | Conjugates targeted to target receptors |
DE60234782D1 (de) * | 2001-09-28 | 2010-01-28 | Purdue Research Foundation | Behandlungsverfahren mit liganden-immunogenkonjugaten |
US6846484B2 (en) | 2001-12-28 | 2005-01-25 | Regents Of The University Of Minnesota | DTAT fusion toxin |
WO2004092339A2 (en) * | 2003-04-11 | 2004-10-28 | Ilex Products, Inc. | Modulation of muc1 mediated signal transduction |
US20060257428A1 (en) * | 2003-08-22 | 2006-11-16 | Harley John B | Assays and therapies for latent viral infection |
WO2005042573A1 (en) | 2003-10-24 | 2005-05-12 | Dana-Farber Cancer Institute, Inc. | Modulation of the interaction of muc1 with muc1 ligands |
US7585942B2 (en) | 2003-11-25 | 2009-09-08 | Anjin Corporation | Diphtheria toxin variant |
WO2005082458A1 (en) * | 2004-02-23 | 2005-09-09 | Genzyme Corporation | Muc1 antagonist enhancement of death receptor ligand-induced apoptosis |
US20110104186A1 (en) | 2004-06-24 | 2011-05-05 | Nicholas Valiante | Small molecule immunopotentiators and assays for their detection |
PL3207941T6 (pl) | 2006-09-07 | 2020-11-16 | Scott & White Memorial Hospital | Sposoby i kompozycje oparte na koniugacie ludzkiej interleukiny (IL)-3 z toksyną błoniczą |
US7871784B2 (en) * | 2007-02-02 | 2011-01-18 | Dana-Farber Cancer Institute, Inc. | Methods and compositions relating to the regulation of apoptosis by MUC1 and BH3-containing proapoptotic proteins |
US7972870B2 (en) | 2007-02-02 | 2011-07-05 | Dana-Farber Cancer Institute, Inc. | Methods and compositions relating to the regulation of MUC1 by HSF1 and STAT3 |
US8821880B2 (en) | 2008-10-29 | 2014-09-02 | China Synthetic Rubber Corporation | Methods and agents for the diagnosis and treatment of hepatocellular carcinoma |
WO2012068463A2 (en) | 2010-11-18 | 2012-05-24 | Beth Israel Deaconess Medicall Center, Inc. | Methods of treating obesity by inhibiting nicotinamide n-methyl transferase (nnmt) |
Family Cites Families (10)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4201770A (en) * | 1973-05-07 | 1980-05-06 | The Ohio State University | Antigenic modification of polypeptides |
US4302386A (en) * | 1978-08-25 | 1981-11-24 | The Ohio State University | Antigenic modification of polypeptides |
US4082613A (en) * | 1976-04-23 | 1978-04-04 | The Regents Of The University Of Minnesota | Process for the production of insulin by genetically transformed fungal cells |
JPS5470384A (en) * | 1977-08-22 | 1979-06-06 | Inst Obu Kiyansaa Risaachi Roi | High molecular complex |
US4336336A (en) * | 1979-01-12 | 1982-06-22 | President And Fellows Of Harvard College | Fused gene and method of making and using same |
JPS5616418A (en) * | 1979-07-20 | 1981-02-17 | Teijin Ltd | Antitumor protein complex and its preparation |
JPS5686121A (en) * | 1979-12-14 | 1981-07-13 | Teijin Ltd | Antitumor proten complex and its preparation |
FR2493846A1 (fr) * | 1980-11-10 | 1982-05-14 | Delbarre B | Derives du 4h-benzo(4,5)cyclohepta(1,2-b)furanne, leur procede de preparation et leur application en tant que medicaments |
US4394443A (en) * | 1980-12-18 | 1983-07-19 | Yale University | Method for cloning genes |
FR2504010B1 (fr) * | 1981-04-15 | 1985-10-25 | Sanofi Sa | Medicaments anticancereux contenant la chaine a de la ricine associee a un anticorps antimelanome et procede pour leur preparation |
-
1983
- 1983-05-12 AU AU17062/83A patent/AU573529B2/en not_active Expired
- 1983-05-12 ES ES522315A patent/ES522315A0/es active Granted
- 1983-05-12 IT IT67525/83A patent/IT1203672B/it active
- 1983-05-12 JP JP58502198A patent/JP2534222B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1983-05-12 WO PCT/US1983/000723 patent/WO1983003971A1/en active IP Right Grant
- 1983-05-12 AT AT83902148T patent/ATE25197T1/de not_active IP Right Cessation
- 1983-05-12 EP EP83902148A patent/EP0108146B1/en not_active Expired
- 1983-05-12 DE DE8383902148T patent/DE3369466D1/de not_active Expired
- 1983-05-13 NZ NZ204229A patent/NZ204229A/en unknown
-
1984
- 1984-01-11 FI FI840090A patent/FI79120C/fi not_active IP Right Cessation
- 1984-01-11 NO NO840089A patent/NO176575C/no unknown
-
1985
- 1985-11-06 US US06/795,940 patent/US4675382A/en not_active Expired - Lifetime
-
1993
- 1993-06-22 JP JP5150349A patent/JPH06239896A/ja active Pending
-
1996
- 1996-02-08 JP JP8022430A patent/JPH08228777A/ja active Pending
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
FI840090A0 (fi) | 1984-01-11 |
AU573529B2 (en) | 1988-06-16 |
IT8367525A0 (it) | 1983-05-12 |
FI840090A (fi) | 1984-01-11 |
NO176575B (no) | 1995-01-16 |
EP0108146A1 (en) | 1984-05-16 |
ES8407097A1 (es) | 1984-08-16 |
EP0108146A4 (en) | 1984-05-03 |
EP0108146B1 (en) | 1987-01-28 |
NO840089L (no) | 1984-01-11 |
NZ204229A (en) | 1986-01-24 |
JP2534222B2 (ja) | 1996-09-11 |
JPS59500814A (ja) | 1984-05-10 |
ATE25197T1 (de) | 1987-02-15 |
US4675382A (en) | 1987-06-23 |
FI79120B (fi) | 1989-07-31 |
JPH08228777A (ja) | 1996-09-10 |
ES522315A0 (es) | 1984-08-16 |
JPH06239896A (ja) | 1994-08-30 |
IT1203672B (it) | 1989-02-15 |
AU1706283A (en) | 1983-12-02 |
DE3369466D1 (en) | 1987-03-05 |
NO176575C (no) | 1995-04-26 |
WO1983003971A1 (en) | 1983-11-24 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
FI79120C (fi) | Fusionerad gen och foerfarande foer framstaellning av ett terapeutiskt anvaendbart hybridprotein. | |
US5080898A (en) | Enzymatically active toxin coupled to a cell-specific ligand | |
US6022950A (en) | Hybrid molecules having translocation region and cell-binding region | |
US5965406A (en) | Recombinant DNAS encoding three-part hybrid proteins | |
Löwenadler et al. | A gene fusion system for generating antibodies against short peptides | |
FI100253B (fi) | Hybridiproteiini ja menetelmä sen valmistamiseksi ja käyttämiseksi | |
US5624827A (en) | DNA sequences encoding the plant toxin gelonin | |
EP0246307B1 (en) | Cys codon-modified dna | |
WO1989009825A1 (en) | Method for producing recombinant dna proteins | |
JPH02501112A (ja) | 免疫親和性による精製方法 | |
JPS61219395A (ja) | TGF‐βをコードしている核酸およびその用途 | |
JPH05500310A (ja) | 融合蛋白質の製造方法 | |
WO1985002198A1 (en) | Microbial expression of type i transforming growth factor, polypeptide analogs thereof and hybrid egf/tgf polypeptides | |
US5965405A (en) | Method for producing Fv fragments in eukaryotic cells | |
EP0510018A1 (en) | Lipoprotein signal peptide fused to antigenic polypeptides | |
US5047333A (en) | Method for the preparation of natural human growth hormone in pure form | |
US5411732A (en) | Preparation of fused proteins, antibodies and processes therefore | |
CN112251444B (zh) | 一种改造的amh基因序列及利用其制备amh的方法 | |
Tanaka et al. | The epitope for anti‐type VII collagen monoclonal antibody (LH7: 2) locates at the central region of the N‐terminal non‐collagenous domain of type VII collagen | |
CA1217156A (en) | Hybrid proteins | |
US5166316A (en) | Physiologically active peptides and a method of producing peptides | |
CA2083487A1 (en) | Chimeric toxins with improved inter-domain geometry | |
NZ227372A (en) | Murine monoclonal antibodies to human ifnalpha | |
JPS62228283A (ja) | Dna遺伝子、およびこれを含むプラスミドならびにこのプラスミドを用いる蛋白質の菌体外分泌法 | |
JPS61501168A (ja) | 生長因子における改良 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MA | Patent expired |
Owner name: PRESIDENT AND FELLOWS OF HARVARD COLLEGE |