SK288201B6 - Farmaceutický prostriedok - Google Patents

Abstract

Je opísaný farmaceutický prostriedok, ktorý obsahuje fluoresceínizotiokyanát (FITC), konjugovaný na kyselinu listovú prostredníctvom ?-karboxylovej skupiny pripojenej etyléndiamínovým mostíkom, a jeho farmaceuticky prijateľný nosič.

Description

Oblasť techniky

Tento vynález sa týka farmaceutického prostriedku, ktorý obsahuje fluoresceínizotiokyanát (FITC), konjugovaný na kyselinu listovú prostredníctvom γ-karboxylovej skupiny pripojenej etyléndiamínovým mostíkom a jeho farmaceutický prijateľný nosič.

Doterajší stav techniky

Cicavčí imunitný systém predstavuje prostriedky na rozpoznanie a elimináciu nádorových buniek, iných patogénnych buniek a invazívnych cudzích patogénov. Zatiaľ čo normálne imunitný systém poskytuje silnú obrannú líniu, existuje veľa prípadov, pri ktorých nádorové bunky, iné patogénne bunky alebo infekčné agensy obídu imunitnú odpoveď a proliferujú či pretrvávajú za súčasného patogénneho pôsobenia na hostiteľa. Existujú chemoterapeutické prostriedky a spôsoby radiačnej terapie na elimináciu replikácie novotvarov. Avšak väčšina, ak nie všetky, zo súčasne dostupných chemoterapeutických prostriedkov a spôsobov radiačnej terapie vykazuje nepriaznivé vedľajšie účinky, lebo nielen ničia rakovinové bunky, ale tiež ovplyvňujú normálne bunky pacienta, ako sú bunky krvotvomého systému. Navyše majú chemoterapeutické prostriedky obmedzenú účinnosť v prípadoch, v ktorých sa u pacienta vyvinie rezistencia na lieky.

Cudzie patogény môžu u pacienta rovnako proliferovať tým, že sa vyhnú kompetentnej imunitnej odpovedi alebo v prípadoch, kedy bol imunitný systém pacienta ohrozený liekovou terapiou alebo inými zdravotnými problémami. I keď existuje rad terapeutických zlúčenín, mnohé patogény sú rezistentné alebo sa stávajú rezistentnými na tieto terapeutické prostriedky. Schopnosť rakovinových buniek a infekčných organizmov vyvinúť rezistenciu na terapeutické prostriedky a nepriaznivé vedľajšie účinky súčasne dostupných protinádorových liekov zdôrazňuje potrebu vývoja nových terapeutických spôsobov špecifických pre populácie patogénnych buniek so zníženou toxicitou pre príjemcu.

Výskumní pracovnici vyvíjajú terapeutické spôsoby na ničenie nádorových buniek na základe cielenia cytotoxických zlúčenín špecificky na tieto bunky. Tieto spôsoby používajú toxíny konjugované s ligandmi, ktoré sa viažu na receptory jedinečné pre nádorové bunky alebo nadmerne exprimované nádorovými bunkami v snahe minimalizovať dodávku toxínu k normálnym bunkám. S použitím tohto prístupu sa vyvinuli niektoré imunotoxíny zahrňujúce protilátky smerované na špecifické receptory patogénnych buniek a tieto protilátky sú pripojené na toxíny, ako je ricín, exotoxín Pseudomonas, toxín Diptheria a faktor nekrózy tumoru. Tieto imunotoxíny sa zameriavajú na nádorové bunky nesúce špecifické receptory rozpoznávané protilátkou (S. Olsnes, Immunol. Today, 10, 291 - 295, 1989; E. L. Melby, Cancer Res., 53, 8, 1755 - 1760, 1993; M. D. Better, publikácia PCT WO 91/07418, 30. mája 1991).

Ďalším prístupom k selektívnemu cieleniu na populácie nádorových buniek alebo cudzích patogénov u pacienta je zvýšenie jeho imunitnej odpovede na patogénne bunky, čím sa predchádza potrebe podávania zlúčenín, ktoré môžu tiež vykazovať toxicitu pre príjemcu. Jedna z opisovaných stratégií imunoterapie je viazať protilátky, napríklad multimérne protilátky vyvinuté genetickým inžinierstvom, na povrch nádorovej bunky kvôli vytvoreniu konštantnej oblasti protilátok na bunkovom povrchu, a tým kvôli indukcii usmrcovania buniek rôznymi spôsobmi sprostredkovanými imunitným systémom (V. T. De Vitá, Biológie Therapy of Cancer, 2. vyd., Philadelphia, Lippincott, 1995, J. P. Soulillou, US patent č. 5 672 486). Tento prístup sa však komplikuje ťažkosťami pri definícii antigénov špecifických pre tumor. Ďalší prístup spoliehania sa na imunokompetenciu pacienta je cielenie protilátky proti T-bunkovým receptorom alebo protilátky proti Fc-receptorom na povrchy buniek tumorov kvôli podpore priamej väzby imunitných buniek k tumorom (D. M. Kranz, US patent č. 5 547 668). Opisuje sa tiež prístup založený na očkovacej látke, ktorý spočíva na očkovacej látke obsahujúcej antigény pripojené k cytokínom, s cytokínom modifikujúcim imunogenitu antigénu očkovacej látky, a tým stimulujúcim imunitnú odpoveď na patogénne agensy (S. Pillai, publikácia PCT WO 91/11146, 7. februára 1991). Tento spôsob spočíva na nepriamom pozmenení opisovanej imunitnej odpovede. Ďalší prístup k usmrteniu nežiaducich populácií buniek používa fragmenty IL-2 alebo Fab antitymocytového globulínu pripojené na antigény kvôli eliminácii nežiaducich T-buniek, ale na základe opisovaných experimentálnych údajov sa zisťuje, že tento spôsob eliminuje len 50 % cieľovej bunkovej populácie a vedie k nešpecifickému usmrcovaniu buniek in vivo (t. j. usmrcuje sa tiež 50 % lymfocytov periférnej krvi, ktoré nie sú T-bunkami (P. Pouletty, publikácia PCT WO 97/37690, 16. októbra 1997)). Preto zostáva značná potreba spôsobov liečenia zameraných na liečenie chorobných stavov charakterizovaných prítomnosťou populácií patogénnych buniek u postihnutého pacienta.

Podstata vynálezu

Predmetom tohto vynálezu je farmaceutický prostriedok, ktorého podstata spočíva v tom, že obsahuje fluoresceínizotiokyanát (FITC), konjugovaný na kyselinu listovú prostredníctvom γ-karboxylovej skupiny pripojenej etyléndiamínovým mostíkom a jeho farmaceutický prijateľný nosič.

Ďalej sa uvádzajú podrobnejšie údaje súvisiace s predmetným vynálezom rovnako ako údaje, ktoré majú objasniť vynález v celej jeho šírke.

Zo všeobecného hľadiska môže farmaceutický prostriedok nachádzať použitie pri liečení chorobných stavov charakterizovaných prítomnosťou populácií patogénnych buniek. Konkrétnejšie sa chorému príjemcovi podávajú komplexy ligand-imunogén cielené na bunky, prednostne v kombinácii so stimulátorom alebo iným terapeutickým faktorom na zvýšenie alebo opätovné nasmerovanie imunitných odpovedí príjemcu na patogénne bunky.

Spôsob eliminácie populácie patogénnych buniek pacienta sa zameriava na zvyšovanie rozpoznávania imunitného systému a odpovede na tieto bunkové populácie. Antigénne pôsobenie bunkových patogénov sa účinne zvyšuje kvôli posilneniu endogénnej eliminácie populácie patogénnych buniek sprostredkovanej imunitnou odpoveďou. Tento spôsob sa vyhýba použitiu alebo minimalizuje použitie cytotoxických alebo antimikrobiálnych terapeutických prostriedkov. Tento spôsob zahrňuje podávanie konjugátu ligand-imunogén, pri ktorom je tento ligand schopný špecifickej väzby s populáciou patogénnych buniek in vivo, ktorá jedinečne exprimuje, preferenčne exprimuje alebo nadmerne exprimuje väzbový zvyšok ligandu, a imunogén konjugovaný s ligandom je schopný rozpoznať tvorbu protilátky alebo je prednostne schopný rozpoznania endogénnymi, či súčasne podávanými exogénnymi protilátkami u hostiteľského živočícha. Eliminácia patogénnych buniek sprostredkovaná imunitným systémom sa zameriava väzbou ligandu konjugovaného s imunogénom k receptoru, transportéru alebo inému jedinečne exprimovanému proteínu prezentovanému na povrchu, nadmerne exprimovanému alebo preferenčne exprimovanému patogénnou bunkou. Proteín na povrchu, ktorý je jedinečne exprimovaný, nadmerne exprimovaný alebo preferenčne exprimovaný patogénnou bunkou, je receptor prítomný alebo neprítomný pri nižších množstvách nepatogénnych buniek s poskytnutím prostriedku na selektívnu elimináciu patogénnych buniek. Hostiteľskému živočíchovi možno kvôli zvýšeniu terapeutickej účinnosti podávať aspoň jeden ďalší terapeutický faktor, napríklad stimulátor imunitného systému, prostriedok usmrcujúci bunky, prostriedok zvyšujúci prenikanie do tumoru, chemoterapeutický prostriedok, cytotoxické imunitné bunky alebo antimikrobiálny prostriedok.

V jednom svojom uskutočnení zahrňuje tento spôsob kroky podávania ligandov schopných vysokoafinitnej špecifickej väzby in vivo s proteínmi bunkového povrchu jedinečne exprimovanými, preferenčne exprimovanými alebo nadmerne exprimovanými na populáciu cieľových patogénnych buniek, kde sa tieto ligandy konjugujú s imunogénmi, proti ktorým už existuje vrodená či získaná imunita alebo ktoré možno u hostiteľského živočícha rozpoznať, a prípadné súčasné podávanie aspoň jedného terapeutického faktora, ktorý je endogénnym aktivátorom imunitnej odpovede alebo cytotoxickou zlúčeninou. V jednom výhodnom uskutočnení tento spôsob zahrňuje podávanie prostriedku konjugátu ligand-imunogén hostiteľskému živočíchovi, kde je týmto ligandom kyselina listová alebo iný väzbový ligand foliátového receptora. Tento ligand je konjugovaný, napríklad kovalentnou väzbou, s imunogénom schopným zachytiť odpoveď protilátky u hostiteľského živočícha alebo výhodnejšie s imunogénom schopným väzby s vopred existujúcimi endogénnymi protilátkami (následkom vrodenej či získanej imunity) alebo so súčasne podávanými protilátkami (t. j. pasívnou imunizáciou) hostiteľskému živočíchovi. Hostiteľskému živočíchovi možno v spojení s podávaním konjugátov ligand-imunogén podávať aspoň jeden ďalší terapeutický faktor, ktorý nie je schopný Špecifickej väzby na komplex ligand-imunogén, ale je schopný stimulovať alebo zvyšovať endogénnu imunitnú odpoveď, prostriedok usmrcujúci bunky, prostriedok na zvýšenie prieniku do tumoru, ako je zápalový či prozápalový prostriedok, chemoterapeutický prostriedok, cytotoxické imunitné bunky alebo antimikrobiálny prostriedok.

V súlade s ďalším uskutočnením tohto vynálezu sa poskytuje spôsob zvyšovania endogénnej špecifickej eliminácie populácie patogénnych buniek sprostredkovanej imunitnou odpoveďou u hostiteľského živočícha s touto populáciou, kde členovia tejto bunkovej populácie majú prístupné väzbové miesto pre ligand. Tento spôsob zahrňuje krok podávania tomuto hostiteľskému živočíchovi prípravku konjugátu ligand-imunogén zahrňujúceho komplex ligandu a imunogénu, kde je známe, že sa tento imunogén rozpoznáva endogénnou či exogénnou protilátkou u hostiteľa alebo sa rozpoznáva priamo imunitnou bunkou hostiteľa, a aspoň jedného ďalšieho prípravku zahrňujúceho terapeutický faktor, ktorý sa volí z prípadov prostriedku usmrcujúceho bunky, prostriedku zvyšujúceho prenikanie do tumoru, chemoterapeutického prostriedku, antimikrobiálneho prostriedku, cytotoxickej imunitnej bunky a zlúčeniny schopnej stimulácie endogénnej imunitnej odpovede, pri ktorej sa táto zlúčenina neviaže s konjugátom ligand-imunogén.

Podľa alternatívneho uskutočnenia tohto vynálezu sa poskytuje spôsob zvyšovania endogénnej špecifickej eliminácie populácie patogénnych buniek u hostiteľského živočícha sprostredkovanej imunitnou odpoveďou, pri ktorej táto populácia exprimuje väzbové miesto pre ligand. Tento spôsob zahrňuje kroky podávania hostiteľskému živočíchovi prípravku obsahujúceho komplex tohto ligandu a imunogénu, podávanie protilátok cielených proti imunogénu a podávanie aspoň jedného ďalšieho terapeutického faktora, ktorý sa volí z prípadov prostriedku usmrcujúceho bunky, prostriedku zvyšujúceho prienik do tumoru, chemoterapeutického prostriedku, antimikrobiálneho prostriedku, cytotoxickej imunitnej bunky a stimulátora endogénnej imunitnej odpovede, ktorý sa neviaže na komplex ligand-imunogén.

V jednom výhodnom uskutočnení tohto vynálezu sa poskytuje spôsob zvyšovania endogénnej eliminácie populácie patogénnych buniek u hostiteľa sprostredkovanej imunitnou odpoveďou, pri ktorom táto populácia preferenčne exprimuje, jedinečne exprimuje alebo nadmerne exprimuje receptor kyseliny listovej. Tento spôsob zahrňuje krok podávania tomuto hostiteľovi prípravku obsahujúceho kovalentne viazaný konjugát imunogénu, o ktorom je známe, že sa tento imunogén rozpoznáva endogénnou či exogénnou protilátkou hostiteľa alebo sa rozpoznáva priamo imunitnou bunkou hostiteľa, a Ugandu zahrňujúceho kyselinu listovú alebo analóg kyseliny listovej majúci glutamylovú skupinu, v ktorom sa uskutočňuje kovalentná väzba na imunogén len prostredníctvom γ-karboxylovej skupiny glutamylovej skupiny. V ďalšom uskutočnení sa podáva hostiteľovi aspoň jeden ďalší prípravok zahrňujúci terapeutický faktor, ktorý sa volí z prípadov prostriedku usmrcujúceho bunky, prostriedku zvyšujúceho prienik do nádoru, chemoterapeutického prostriedku, antimikrobiálneho prostriedku, cytotoxickej imunitnej bunky a zlúčeniny schopnej stimulácie endogénnej imunitnej odpovede a táto zlúčenina sa neviaže na konjugát ligand-imunogén.

V ďalšom uskutočnení tohto vynálezu sa poskytuje spôsob zvyšovania endogénnej špecifickej eliminácie populácie patogénnych buniek hostiteľa sprostredkovanej imunitnou odpoveďou, pri ktorom táto populácia preferenčne exprimuje, jedinečne exprimuje alebo nadmerne exprimuje receptor kyseliny listovej. Tento spôsob zahrňuje krok podávania tomuto hostiteľovi prípravku obsahujúceho kovalentne viazaný konjugát imunogénu, ktorý sa rozpoznáva endogénnou či exogénnou protilátkou hostiteľa alebo sa rozpoznáva priamo imunitnou bunkou hostiteľa, a Ugandu obsahujúceho kyselinu listovú alebo analóg kyseliny listovej majúci glutamylovú skupinu, kde kovalentná väzba na imunogén je sprostredkovaná len α-karboxylovou skupinou glutamylovej skupiny. V ďalšom uskutočnení sa podáva hostiteľovi aspoň jeden ďalší prípravok zahrňujúci terapeutický faktor, ktorý sa volí z prípadov prostriedku usmrcujúceho bunky, prostriedku zvyšujúceho prienik do tumoru, chemoterapeutického prostriedku, antimikrobiálneho prostriedku, cytotoxickej imunitnej bunky a zlúčeniny schopnej stimulácie endogénnej imunitnej odpovede, kde sa táto zlúčenina neviaže na konjugát ligand-imunogén.

V ďalšom uskutočnení tohto vynálezu je cieľovou populáciou patogénnych buniek populácia rakovinových buniek. V ďalšom uskutočnení predstavuje cieľová populácia buniek populáciu endogénnych buniek infikovaných vírusom. V ďalšom uskutočnení je cieľová populácia buniek populáciou exogénnych organizmov, ako sú baktérie, mykoplazmy, kvasinky alebo plesne. Konjugát ligand-imunogén sa viaže na povrch buniek tumoru alebo patogénnych organizmov a „označuje“ bunky cieľovej populácie imunogénom, čím spúšťa imunitné sprostredkovanú odpoveď zameranú na populáciu označených buniek. Protilátky podávané hostiteľovi pri pasívnej imunizácii alebo protilátky prítomné v systéme hostiteľa na základe vopred existujúcej vrodenej či získanej imunity sa viažu na imunogén a spúšťajú endogénne imunitné odpovede. Väzba protilátok na konjugát ligand-imunogén naviazaný na bunky vedie k cytotoxicite sprostredkovanej komplementom, cytotoxicite sprostredkovanej bunkami dependentnými od protilátky, opsonizácii protilátky a fagocytóze, zhlukovaniu receptorov indukovaných protilátkou, signalizácii zániku buniek alebo pokojného stavu alebo akejkoľvek humorálnej či bunkovej imunitnej odpovedi stimulovanej protilátkou, ktorá sa viaže na konjugáty ligand-imunogén naviazané na bunku. V prípadoch, v ktorých možno antigén priamo rozpoznať imunitnými bunkami bez predchádzajúcej opsonizácie protilátky, môže dôjsť k priamemu usmrcovaniu patogénnych buniek.

Eliminácia cudzích patogénov alebo infikovaných, či neoplastických endogénnych buniek sa môže ďalej zvyšovať podávaním terapeutického faktora schopného stimulácie a endogénnej imunitnej odpovede, prostriedku usmrcujúceho bunky, prostriedku zvyšujúceho priestupnosť tumoru, chemoterapeutického prostriedku, cytotoxickej imunitnej bunky alebo antimikrobiálneho prostriedku. V jednom uskutočnení sú cytotoxické imunitné bunky populáciou cytotoxických imunitných buniek, ktorá sa izoluje, expanduje ex vivo, a potom sa podáva hostiteľovi. V ďalšom uskutočnení tohto vynálezu sa používa imunostimulačný prostriedok, a týmto imunostimulačným prostriedkom môže byť interleukín, ako je IL-2, IL-12 alebo IL-15, alebo IFN, ako je IFN-a, IFN-β alebo IFN-γ, alebo GM-CSF. V ďalšom uskutočnení môže byť imunostimulačným prostriedkom cytokínový prostriedok obsahujúci kombináciu cytokínov, ako je IL-2, IL-12 alebo IL-15 spolu s IFN-a, IFN-β alebo IFN-γ, alebo GM-CSF, alebo akákoľvek účinná kombinácia týchto látok, alebo akákoľvek ďalšia efektívna kombinácia cytokínov.

Zo širšieho hľadiska tohto vynálezu sa poskytuje farmaceutický prostriedok obsahujúci terapeuticky účinné množstvo konjugátu ligand-imunogén schopného špecifickej väzby na populáciu patogénnych buniek hostiteľa kvôli podpore špecifickej eliminácie týchto buniek získanou či vrodenou imunitnou odpoveďou, súčasným podávaním protilátok alebo priamo imunitnou bunkou hostiteľa, terapeutický faktor zvolený z prípadov prostriedku usmrcujúceho bunky, prostriedku zvyšujúceho prienik do tumoru, chemoterapeutického prostriedku, antimikrobiálneho prostriedku, cytotoxickej imunitnej bunky a zlúčeniny schopnej stimulovať endogénnu imunitnú odpoveď, pri ktorej sa táto zlúčenina neviaže na konjugát ligand-imunogén, a farmaceutický prijateľný nosič týchto prostriedkov. V jednom uskutočnení je farmaceutickým prostriedkom parenterálna dávková forma s predĺženým uvoľňovaním. V ďalšom uskutočnení je terapeutickým faktorom imunos4 timulačný prostriedok obsahujúci zlúčeninu zvolenú zo skupiny interleukínov, ako je IL-2, IL-12, 1L-15 a IFN, ako je IFN-a, IFN-β, IFN-γ a GM-CSF alebo ich kombinácie.

Ďalej sa uvádzajú ešte ďalšie podrobné informácie súvisiace s predloženým vynálezom.

Predložený vynález umožňuje dosiahnuť spôsob terapeutického liečenia hostiteľa s nádorom alebo hostiteľa infikovaného patogénnymi organizmami. Tento spôsob vedie k zvýšeniu eliminácie populácií patogénnych buniek sprostredkovanej imunitnou odpoveďou tým, že sa patogénne bunky stanú antigénnymi, že sa označia, čo spôsobí ich rozpoznanie a elimináciu imunitným systémom hostiteľa. Tento model používa konjugát ligand-imunogén schopný vysokoafinitnej väzby s nádorovými bunkami alebo inými patogénnymi elementmi. Vysokoafinitná väzba môže byť vlastná ligandu a môže byť modifikovaná (posilnená) použitím chemicky modifikovaného ligandu alebo konkrétnou chemickou väzbou medzi ligandom a imunogénom, ktorá sa vyskytuje v konjugáte. Tento spôsob môže tiež použiť kombinovanú terapiu použitím konjugátu ligand-imunogén a prídavného terapeutického faktora schopného stimulovať endogénnu imunitnú odpoveď, prostriedku usmrcujúceho bunky, chemoterapeutického prostriedku, prostriedku zvyšujúceho prienik do nádoru, cytotoxickej imunitnej bunky alebo antimikrobiálneho prostriedku kvôli zvýšeniu eliminácie patogénnych buniek sprostredkovanej imunitnou odpoveďou.

Spôsob sa používa na zvýšenie endogénnej eliminácie populácie patogénnych buniek imunitnou odpoveďou u hostiteľa tejto populácie patogénnych buniek. Vynález možno aplikovať na populácie patogénnych buniek, ktoré spôsobujú rad patologických stavov, ako je rakovina a infekčné choroby. Preto populáciou patogénnych buniek môže byť populácia rakovinových buniek, ktorá je tumorogénna, vrátane benígnych tumorov a malígnych tumorov, alebo môže byť netumorogénna. Populácia rakovinových buniek môže vznikať spontánne alebo takými procesmi, ako sú mutácie prítomné v zárodkovej línii hostiteľského živočícha alebo somatickými mutáciami, alebo môže byť indukovaná chemicky, vírusmi alebo žiarením. Tento vynález možno použiť na liečenie typov rakoviny, ako sú karcinómy, sarkómy, lymfómy, Hodgkinova choroba, melanómy, mezoteliómy, Burkittov lymfóm, nazofaryngeálne karcinómy, leukémia a myelómy. Populácia rakovinových buniek môže zahrňovať, ale bez obmedzenia, ústne, tyroidálne, endokrinné, kožné, žalúdkové, pažerákové, hltanové, pankreatické, črevné, žlčové, kostné, vaječníkové, cervikálne, maternicové, prsníkové, testikuláme, prostatické, rektálne, obličkové, pečeňové a pľúcne nádory.

Populácia patogénnych buniek môže byť tiež exogénnym patogénom alebo bunkovou populáciou s exogénnym patogénom, napríklad vírusom. Predmetný vynález sa tiež môže použiť pre také exogénne patogény, ako sú baktérie, plesne, vírusy, mykoplazmy a parazity. Infekčné agensy, ktorých pôsobenie možno liečiť na základe tohto vynálezu, sú akékoľvek infekčné organizmy známe v odbore, ktoré spôsobujú patogenetické zmeny u zvieraťa vrátane takých organizmov, ako sú baktérie, ktoré sú gramnegatívne alebo grampozitívne, koky či bacily, vírusy DNA a RNA vrátane, ale bez obmedzenia, DNA vírusov, ako sú papilomavírusy, parvovírusy, adenovírusy, herpesvírusy a vakciniavírusy, a RNA vírusov, ako sú arenavírusy, koronavírusy, rhinovírusy, respiračné syncytiálne vírusy, vírusy chrípky, pikomavírusy, paramyxovírusy, reovírusy, retrovírusy a rhabdovírusy. Predmetom zvláštneho záujmu sú baktérie, ktoré sú rezistentné na antibiotiká, ako sú druhy streptokokov a druhy stafýlokokov, ktoré sú rezistentné na antibiotiká alebo baktérie, ktoré sú citlivé na antibiotiká, ale spôsobujú rekurentné infekcie liečené antibiotikami, takže sa prípadne vyvíjajú rezistentné organizmy. Pôsobenie týchto organizmov možno liečiť konjugátmi ligand-imunogén podľa tohto vynálezu v kombinácii s nižšími dávkami antibiotík, ktoré by sa normálne podávali pacientovi, aby sa predišlo rozvoju týchto bakteriálnych kmeňov rezistentných na antibiotiká. Tento vynález možno tiež použiť v prípade akýchkoľvek plesní, druhov mykoplazmy, parazitov a ďalších infekčných organizmov, ktoré spôsobujú ochorenie u zvierat. Príklady plesní, ktoré možno liečiť spôsobom podľa tohto vynálezu, zahrňujú plesne, ktoré rastú ako typické plesne, alebo sú typu kvasiniek vrátane napríklad plesní spôsobujúcich choroby, ako je dermatofytóza, blastomykóza, aspergilóza, streptokokóza, sporotrichóza, kokcidioidomykóza, parakokcidioidomykóza a kandidáza. Tento vynález možno tiež využiť na liečenie parazitámych infekcií vrátane, ale bez obmedzenia, infekcií spôsobených somatickými pásomnicami, krvnými motolicami, tkanivovými hlísticami, amébou a druhmi Plasmodium, Trypanosoma, Leishmania a Toxoplasma. Obzvlášť dôležité parazity sú tie, ktoré exprimujú foliátové receptory a viažu foliát, ale v literatúre je rad odkazov na ligandy vykazujúce vysokú afinitu k infekčným organizmom. Napríklad penicilíny a cefalosporíny známe kvôli svojej vysokej antibiotickej aktivite a špecifickej väzbe na prekurzory steny bakteriálnej bunky možno podobne použiť ako ligandy na prípravu konjugátov ligand-imunogén na použitie podľa tohto vynálezu. Konjugáty ligand-imunogén podľa tohto vynálezu sa môžu tiež zameriavať na populáciu buniek s endogénnymi patogénmi, kde sa na povrchu buniek s patogénmi preferenčne exprimujú patogén-špecifické antigény a pôsobia ako receptory pre ligand so špecifickou väzbou ligandu s antigénom.

Spôsob možno použiť v humánnej klinickej medicíne i vo veterinárnych aplikáciách. Preto hostiteľský živočích nesúci populáciu patogénnych organizmov a liečený konjugátmi ligand-imunogén môže byť človek alebo v prípade veterinárnych aplikácií to môže byť laboratórne, hospodárske, domáce, či divoké zviera. Spôsob možno aplikovať na hostiteľské živočíchy vrátane, ale bez obmedzenia, ľudí, laboratórnych zvierat, ako sú hlodavce (napríklad myši, krysy, škrečky, atď.), králiky, opice, šimpanzy, domáce zvieratá, ako sú psi, mačky a králiky, hospodárske zvieratá, ako sú kravy, kone, prasce, ovce, kozy a divoké zvieratá v zajatí, ako sú medvede, pandy, levy, tigre, leopardy, slony, zebry, žirafy, gorily, delfíny a veľryby.

Konjugát ligand-imunogén sa prednostne podáva hostiteľskému zvieraťu parenterálne, t. j. intradermálne, subkutánne, intramuskulárne, intraperitoneálne alebo intravenózne. Alternatívne možno konjugát podávať hostiteľskému živočíchovi iným medicínsky použiteľným spôsobom a možno použiť akúkoľvek účinnú dávku a vhodnú terapeutickú dávkovú formu vrátane dávkových foriem s predĺženým spôsobom uvoľňovania. Spôsob možno použiť v kombinácii s chirurgickým odstránením tumoru, radiačnou terapiou, chemoterapiou alebo biologickými terapiami, ako sú ostatné imunoterapie vrátane, ale bez obmedzenia, terapie monoklonálnymi protilátkami, liečenie imunomodulačnými prostriedkami, adoptívny transfer imunitných efektorových buniek, liečenie krvotvomými rastovými faktormi, cytokínmi a očkovanie.

Konjugát ligand-imunogén možno zvoliť zo širokého rozmedzia ligandov a imunogénov. Tieto ligandy musia byť schopné špecifickej eliminácie populácie patogénnych buniek z organizmu hostiteľského zvieraťa vďaka preferenčnej expresii receptora pre ligand prístupného pre väzbu ligandu na patogénnych bunkách. Prijateľné ligandy zahrňujú kyselinu listovú, analógy kyseliny listovej a ďalšie foliátové molekuly, ktoré viažu receptory, ďalšie vitamíny, peptidové ligandy identifikované skríningom, tumor-špecifické peptidy, tumor-špecifické aptaméry, tumor-špecifické glycidy, tumor-špecifické monoklonálne alebo polyklonálne protilátky, Fab alebo scFv (t. j. premenná oblasť jednotlivého reťazca) fragmenty protilátok, ako je napríklad fragment Fab protilátky zameranej na EphA2 alebo ďalšie proteíny špecificky exprimované alebo jedinečne prístupné na metastatických nádorových bunkách, malé organické molekuly odvodené od kombinačných knižníc, rastové faktory, ako sú EGF, FGF, inzulín a rastové faktory typu inzulínu a homológne polypeptidy, somatostatín a jeho analógy, transferín, komplexy lipoproteínu, žlčové soli, selektíny, steroidné hormóny, peptidy obsahujúce Arg-Gly-Asp, retinoidy, rôzne Galektíny, delta-opioidové receptorové ligandy, cholecystokinínové A-receptorové ligandy, ligandy špecifické pre ATI alebo AT2 receptory angiotenzínu, peroxizómové proliferačne aktivované receptorové γ-ligandy, β-laktámové protilátky, malé organické molekuly vrátane antimikrobiálnych liekov a ďalšie molekuly, ktoré sa špecificky viažu na receptor preferenčne exprimovaný na povrchu tumorových buniek alebo infekčných organizmov, alebo fragmenty ktorejkoľvek z týchto molekúl. Predmetom záujmu v oblasti ligandov, ktoré sa viažu na infekčné organizmy, sú ktorékoľvek molekuly, ako sú antibiotiká alebo iné lieky, o ktorých je v odbore známe, že sa viažu na mikroorganizmy. Navrhnuté riešenie sa tiež týka ligandov, ktoré sú molekulami, ako sú antimikrobiálne lieky navrhnuté tak, aby sa prispôsobovali väzbovému vrecku daného receptora na základe kryštálovej štruktúry tohto receptora alebo inému proteínu bunkového povrchu a tieto receptory sa preferenčne exprimujú na povrchu tumorov, baktérií, vírusov, mykoplaziem, plesní, parazitov či ďalších patogénov. Vo výhodnom uskutočnení tohto vynálezu sa tiež uvažuje, že sa ligandy, ktoré sa viažu na ktorékoľvek tumorové antigény či ďalšie molekuly, preferenčne exprimujú na povrchu tumorových buniek.

Väzbové miesto pre ligand môže zahrňovať receptory ktorejkoľvek molekuly schopnej špecifickej väzby s receptorom, kde sa tento receptor či iný proteín preferenčne exprimuje na populáciu patogénnych buniek vrátane napríklad receptorov pre rastové faktory, vitamíny, peptidy vrátane opioidových peptidov, hormóny, protilátky, glycidy a malé organické molekuly. Toto väzbové miesto môže tiež byť väzbovým miestom pre ktorúkoľvek molekulu, ako je antibiotický či iný liek, kde je známe v odbore, že toto miesto preferenčne existuje na mikroorganizmoch. Napríklad sa môže uvažovať o väzbovom mieste na stene bakteriálnej bunky pre β-laktámové antibiotiká, ako je penicilín, alebo väzbovom mieste pre antivírusový prostriedok jedinečne prítomný na povrchu vírusu. Väzbové miesta pre ligandy, ako sú antimikrobiálne lieky sú navrhnuté tak, aby sa prispôsobili väzbovému miestu receptora na základe kryštalickej štruktúry receptora, a pre prípady, kedy sa receptor preferenčne exprimuje na povrchu patogénnych buniek či organizmov. Tiež sa uvažuje, že tumoršpecifické antigény môžu pôsobiť ako väzbové miesta pre ligandy v spôsobe podľa tohto vynálezu. Príkladom tumor-Špecifického antigénu, ktorý môže pôsobiť ako väzbové miesto pre konjugáty ligand-imunogén, je extracelulámy epitop člena Ephrínovej skupiny proteínov, ako je EphA2. Expresia EphA2 sa obmedzuje na spojenie medzi bunkami pri normálnych bunkách, ale EphA2 sa vyskytuje v rámci celého bunkového povrchu v metastatických tumorových bunkách. Preto by bol EphA2 na metastatických bunkách prístupný pre väzbu napríklad fragmentu Fab protilátky konjugovanej s imunogénom, zatiaľ čo by tento proteín nebol prístupný pre väzbu s fragmentom Fab na normálnych bunkách, čo by mohlo spôsobovať tvorbu konjugátu ligand-imunogén špecifického pre metastatické nádorové bunky. Tento vynález ďalej uvažuje o použití kombinácie konjugátu ligand-imunogén kvôli dosiahnutiu maximálneho cielenia na patogénne bunky kvôli ich eliminácii na základe získanej či vrodenej imunitnej odpovede alebo s použitím súčasne podávaných protilátok.

Prijateľnými imunogénmi sú tie imunogény, ktoré sú schopné rozpoznať tvorbu protilátky u hostiteľského živočícha alebo ktoré prv rozpoznali tvorbu protilátky u hostiteľského živočícha s výsledkom vopred existujúcej imunity, alebo ktoré tvoria časť vrodeného imunitného systému. Alternatívne možno protilátky zamerané proti imunogénu podávať hostiteľskému živočíchovi kvôli vytvoreniu pasívnej imunity. Vhodné imunogény zahrňujú antigény či antigénne peptidy, proti ktorým sa vyvinula vopred existujúca imunita prostredníc6 tvom normálneho očkovania podľa rozpisu alebo predchádzajúcou prirodzenou expozíciou týmto agensom, ako sú antigény poliovírusu, mikroorganizmy tetanu, týfusu, rubeoly, osýpok, príušníc, čierneho kašľa, tuberkulózy a chrípky a α-galaktozylovej skupiny. V týchto prípadoch sa použijú konjugáty ligand-imunogén na opätovné zameranie skôr získanej humorálnej či bunkovej imunity populácií patogénnych buniek u hostiteľského živočícha kvôli eliminácii cudzích buniek alebo patogénnych organizmov. Ďalšie vhodné imunogény zahrňujú antigény alebo antigénne peptidy, pre ktoré hostiteľský živočích vyvinul novú imunitu imunizáciou proti neprirodzenému antigénu či hapténu (napríklad fluoresceínizotiokyanátu alebo dinitrofenylu), a antigény, proti ktorým existuje vrodená imunita (napríklad superantigény a muramyldipeptid).

Ligandy a imunogény možno konjugovať s použitím akéhokoľvek spôsobu tvorby komplexu uznávaného v odbore. Ten môže zahrňovať kovalentnú, iónovú či vodíkovú väzbu ligandu na imunogén, buď priamo, či nepriamo prostredníctvom spojovacej skupiny, ako je bivalentný spojovací element. Tento konjugát sa zvyčajne tvorí kovalentnú väzbu ligandu s imunogénom tvorbou amidu, amidovej, esterovej alebo imínovej väzby medzi skupinami kyseliny, aldehydu, hydroxylovými skupinami, aminoskupinami alebo hydrazoskupinami na príslušných zložkách komplexu. Vo výhodnom uskutočnení tohto vynálezu je ligandom kyselina listová, analóg kyseliny listovej alebo iná molekula, ktorá viaže foliátový receptor, a foliátový ligand sa konjuguje s imunogénom spôsobom, ktorý využíva anhydrid kyseliny trifluóroctovej na prípravu γ-esterov kyseliny listovej prostredníctvom pteroylazidového medziproduktu. Tento výhodný spôsob vedie k syntéze foliátového ligandu konjugovaného imunogénom len prostredníctvom γ-karboxylovej skupiny skupín kyseliny glutámovej foliátu, kde sa γ-konjugát viaže na foliátový receptor s vysokou afinitou a predchádza sa tvorbe zmesí α-konjugátu a γ-konjugátu. Alternatívne možno pripraviť z medziproduktov α-konjugáty, keď sa γ-karboxylová skupina selektívne blokuje, a potom sa následne deblokuje s použitím spôsobov uznávaných v odbore organickej syntézy. Stojí za zmienku, že možno použiť ďalšie vitamíny ako ligandy na prípravu konjugátov podľa tohto vynálezu. Napríklad konjugáty ligand-imunogén sa môžu tvoriť s biotínom a riboflavínom rovnako ako s foliátom (pozri US patenty č. 5 108 921, 5 416 016 a 5 635 382, ktoré sú tu zahrnuté formou odkazu).

Konjugáty ligand-imunogén zvyšujú elimináciu populácie patogénnych buniek zvyšovanou endogénnou imunitnou odpoveďou. Táto endogénna imunitná odpoveď môže zahrňovať humorálnu odpoveď, imunitnú odpoveď sprostredkovanú bunkami a akúkoľvek inú imunitnú odpoveď endogénnu pre hostiteľského živočícha vrátane cytolýzy sprostredkovanej komplementom, protilátkovo dependentnej cytotoxicity sprostredkovanej komponentom (ADCC), opsonizácie protilátky vedúcej k fagocytóze, zhlukovania receptorov pri väzbe protilátky vedúcej k signalizácii apoptózy, antiproliferácie alebo diferenciácie a priameho rozpoznania dodaného antigénu/hapténu imunitnej bunky. Tiež sa uvažuje, že endogénna imunitná odpoveď používa sekréciu cytokínov, ktoré regulujú tieto procesy, ako je multiplikácia a migrácia imunitných buniek. Endogénna imunitná odpoveď môže zahrňovať účasť takých bunkových typov, ako sú B-bunky, T-bunky vrátane helperových a cytotoxických T-buniek, makrofágov, buniek prirodzených zabijakov, neutrofilov, buniek LAK a podobne.

Humorálna odpoveď môže byť odpoveďou indukovanou takými procesmi, ako je normálne očkovanie podľa rozpisu alebo aktívnou imunizáciou prirodzeným antigénom alebo neprirodzeným antigénom či hapténom (napríklad fluoresceínizotiokyanátom) a neprirodzeným antigénom indukujúcim novú imunitu. Aktívna imunizácia zahrňuje niekoľkonásobné injekcie neprirodzeného antigénu či hapténu podávaného mimo normálneho očkovacieho režimu kvôli vyvolaniu novej imunity. Humorálna odpoveď môže tiež vyplývať z vrodenej imunity, kde má hostiteľský živočích prirodzenú vopred existujúcu imunitu, ako je imunita proti a-galaktozylovým skupinám. Alternatívne sa môže vytvoriť pasívna imunita podaním protilátok proti hostiteľskému živočíchovi, ako sú prirodzené protilátky získané zo séra alebo monoklonálne protilátky, ktoré môžu a nemusia byť protilátkami vyvinutými spôsobmi genetického inžinierstva, vrátane humanizovaných protilátok. Použitie konkrétneho množstva protilátkového prostriedku na rozvoj pasívnej imunity a použitie konjugátu ligand-imunogén, pri ktorom sa pasívne podávané protilátky zameriavajú na imunogén, by poskytlo výhodu štandardného súboru prostriedkov použitých v prípadoch, kedy vopred existujúci titer pacientových protilátok proti potenciálnym ďalším antigénom nie je terapeuticky použiteľný. Pasívne podávané protilátky sa môžu podávať súčasne s konjugátom ligand-imunogén a súčasné podávanie sa definuje ako podávanie protilátok v čase pred podaním, v čase podania a v čase po podaní konjugátu ligand-imunogén.

Uvažuje sa, že vopred prítomné protilátky, indukované protilátky alebo pasívne podávané protilátky budú opäť zamerané na tumorové bunky či infekčné organizmy preferenčnou väzbou konjugátov ligand-imunogén k týmto invazívnym bunkám či organizmom a že tieto patogénne bunky budú usmrcované cytolýzou sprostredkovanou komplementom, ADCC, protilátkovo dependentnou fagocytózou alebo protilátkovým zhlukovaním receptorov. Cytotoxický proces môže tiež zahrňovať ďalšie typy imunitných odpovedí, ako je imunita sprostredkovaná bunkami, rovnako ako sekundárnych odpovedí, ktoré vznikajú, ak priťahované bunky prezentujúce antigény fagocytujú nežiaduce bunky a prítomné prirodzené tumorové antigény či antigény cudzích patogénov pre imunitný systém kvôli eliminácii buniek alebo organizmov nesúcich antigény.

Aspoň jeden ďalší prípravok zahrňujúci jeden terapeutický faktor možno podávať hostiteľovi v kombiná7 cii s opísaným spôsobom alebo ako adjuvantný prostriedok kvôli zvýšeniu eliminácie populácie patogénnych buniek sprostredkovanej imunitnou odpoveďou alebo možno podávať viac ako jeden ďalší faktor. Tento terapeutický faktor možno zvoliť zo zlúčenín schopných stimulácie endogénnej imunitnej odpovede, chemoterapeutických prostriedkov, antimikrobiálnych prostriedkov alebo ďalších terapeutických faktorov schopných dopĺňať účinnosť podávaného komplexu ligand-imunogén. Spôsob sa môže vykonávať podávaním hostiteľovi navyše k opísaným konjugátom zlúčenín či prípravkov schopných stimulácie endogénnej imunitnej odpovede vrátane, ale bez obmedzenia, cytokínov alebo imunitných bunkových rastových faktorov, ako sú interleukíny 1 až 18, faktor kmeňových buniek, základný FGF, EGF, G-CSF, GM-CSF, FLK-2 ligand, HILDA, ΜΙΡ-Ια, TGF-a, TGF-β, M-CSF, IFN-a, IFN-β, IFN-γ, rozpustný CD23, LIF a ich kombinácie.

Možno tiež použiť terapeuticky účinné kombinácie týchto cytokínov. V jednom výhodnom uskutočnení sa napríklad používajú terapeuticky účinné množstvá IL-2, napríklad v rozmedzí 5 000 medzinárodných jednotiek/dávka/deň až zhruba 500 000 medzinárodných jednotiek/dávka/deň vo viacpočetnom dávkovom dennom režime a IFN-α, napríklad v množstve v rozmedzí od zhruba 7 500 medzinárodných jednotiek/dávka/deň do zhruba 150 000 medzinárodných jednotiek/dávka/deň vo viacpočetnom dávkovom režime spolu s fluoresceínizotiokyanátom viazaným na foliát kvôli eliminácii patogénnych buniek z organizmu živočícha s týmito patogénnymi bunkami. V ďalšom výhodnom uskutočnení sa používajú IL-12 a IFN-α v terapeuticky účinných množstvách a v ďalšom výhodnom uskutočnení sa používajú IL-15 a IFN-α v terapeuticky účinných množstvách. V alternatívnom výhodnom uskutočnení sa používajú v kombinácii IL-2, IFN-α alebo IFN-γ a GM-CSF. Prednostne sa používajú terapeutické faktory, ako sú IL-2, IL-12, IL-15, IFN-a, IFN-γ a GM-CSF vrátane ich kombinácií, ktoré aktivujú bunky prirodzených zabijakov a/alebo T-bunky. Alternatívne môže terapeutický faktor alebo kombinácie týchto faktorov vrátane interleukínu v kombinácii s interferónom a GM-CSF aktivovať ďalšie imunitné efektorové bunky, ako sú makrofágy, B-bunky, neutrofily, bunky LAK alebo podobne. Tento vynález tiež uvažuje o použití akejkoľvek inej efektívnej kombinácie cytokínov vrátane kombinácií s ostatnými interleukínmi a interferónmi a faktormi stimulujúcimi tvorbu kolónií.

Chemoterapeutické prostriedky, ktoré samotné sú cytotoxické a môžu zvyšovať permeabilitu tumoru, vhodné na použitie v opísanom spôsobe zahrňujú adrenokortikoidy, alkylačné prostriedky, antiandrogény, antiestrogény, androgény, estrogény, antimetabolity, ako je cytozínarabinozid, purínové analógy, pyrimidínové analógy a metotrexát, busulfán, karboplatín, chlorambucil, cisplatín a ďalšie platinové zlúčeniny, tamoxifén, taxol, cyklofosfamid, rastlinné alkaloidy, prednizón, hydroxymočovinu, tenipozid, antibiotiká, ako je mitomycín C a bleomycin, yperity, nitrózmočoviny, vinkristin, vinblastin, protizápalové a prozápalové prostriedky a akékoľvek ďalšie prostriedky na chemoterapiu uznávané v odbore. Ďalšie terapeutické prostriedky možno podávať ako adjuvantné prostriedky pri podávaní konjugátov podľa tohto vynálezu, vrátane penicilínu, cefalosporínov, vankomycínu, erytromycínu, klindamycínu, rifampínu, chloramfenikolu, aminoglykozidov, gentamicínu, amfotericínu B, acyklovírusu, trifluridínu, ganciklovírusu, zidovudínu, amantadínu, rebavirínu a akýchkoľvek antimikrobiálnych zlúčenín uznávaných v odbore.

Eliminácia populácie patogénnych buniek bude zahrňovať redukciu či elimináciu masy tumoru alebo patogénnych organizmov následkom terapeutickej odpovede. V prípade tumoru môže eliminácia byť elimináciou buniek primárneho tumoru alebo elimináciou buniek, ktoré metastázovali alebo sú v procese disociácie z primárneho tumoru. Rovnako sa uvažuje o profylaktickej liečbe kvôli prevencii návratu tumoru po jeho odstránení akoukoľvek terapeutickou cestou vrátane chirurgického odstránenia tumoru, radiačnej terapie, chemoterapie alebo biologickej terapie. Profylaktické liečenie môže byť počiatočné liečenie s konjugátom ligand-imunogén, ako je liečenie vo viacdávkovom dennom režime a/alebo ďalšie liečenie či liečebné rady po intervaloch dní či mesiacov po počiatočnom liečení.

Farmaceutické prípravky môžu zahrňovať množstvo konjugátu ligand-imunogén efektívny na „označenie“ populácie patogénnych buniek u hostiteľského živočícha kvôli špecifickej eliminácii prostredníctvom endogénnej imunitnej odpovede alebo súčasne podávaných protilátok. Tento prípravok ďalej obsahuje množstvo prídavného faktora účinné na zvýšenie eliminácie patogénnych buniek zvoleného zo skupiny prostriedkov usmrcujúcich bunky, prostriedkov zvyšujúcich prienik do tumoru, chemoterapeutických prostriedkov, antimikrobiálnych prostriedkov, cytotoxických imunitných buniek a zlúčenín schopných stimulácie endogénnej imunitnej odpovede, pri ktorej sa zlúčenina neviaže na konjugát ligand-imunogén. Farmaceutický prostriedok obsahuje terapeuticky účinné množstvo konjugátu ligand-imunogén a terapeutického faktora a tento faktor môže zahrňovať cytokíny, ako je IL-2, IL-12 alebo IL-15 alebo kombinácie cytokínov vrátane IL-2, IL-12 alebo IL-15 a interferóny, ako je IFN-α alebo IFN-γ a kombinácie interferónov, interleukínov a faktorov stimulujúcich tvorbu kolónií, ako je GM-CSF.

Jednotková denná dávka konjugátu ligand-imunogén sa môže značne meniť v závislosti od stavu hostiteľa, liečenej choroby, od molekulárnej hmotnosti konjugátu, spôsobu podania a tkanivovej distribúcie a od možnosti súčasného použitia ďalších terapeutických spôsobov liečby, ako je radiačná terapia. Účinné množstvo na podanie pacientovi závisí od povrchu tela, hmotnosti pacienta a fyzikálneho posúdenia pacientovho stavu. Účinná dávka môže byť v rozmedzí od zhruba 1 ng/kg do zhruba 1 mg/kg, prednostnejšie od zhruba 1 pg/kg do zhruba 500 pg/kg a najlepšie od zhruba 1 pg/kg do zhruba 100 pg/kg.

Akýkoľvek účinný režim na podávanie konjugátu ligand-imunogén a terapeutického faktora na presmerovanie vopred existujúcich protilátok na tumorové bunky či infekčné organizmy alebo na vyvolanie humorálnej odpovede na imunogén. Napríklad možno podávať konjugát ligand-imunogén a terapeutický faktor v jednotlivej dávke alebo ju možno rozdeliť a podávať v režime niekoľkých denných dávok. Ďalej možno používať striedavý režim, napríklad jeden až tri dni v týždni ako alternatívu k dennému podávaniu a na účely definície tohto vynálezu možno považovať taký prerušovaný či striedavý denný režim ako ekvivalentný s každodenným podávaním. Vo výhodnom uskutočnení sa hostiteľ lieči viacerými injekciami konjugátu ligandimunogén a terapeutického faktora kvôli eliminácii populácie patogénnych buniek. V jednom uskutočnení sa hostiteľovi podáva injekčné niekoľkokrát (prednostne zhruba 2 x až zhruba 50 x) konjugát ligand-imunogén, napríklad v intervaloch 12 až 72 hod alebo 48 až 72 hod. Ďalšie injekcie konjugátu ligand-imunogén možno podávať pacientovi v intervale dní či mesiacov po počiatočných injekciách a ďalšie injekcie bránia novému výskytu choroby. Alternatívne môžu brániť novému výskytu choroby počiatočné injekcie konjugátu ligandimunogén.

Terapeutický faktor možno podávať hostiteľskému živočíchovi pred podaním, v dobe podania alebo po podaní konjugátu ligand-imunogén a terapeutický faktor možno podávať ako časť toho istého prípravku obsahujúceho konjugát alebo ako časť iného prípravku, ako je konjugát ligand-imunogén. Možno použiť akýkoľvek takýto terapeutický prípravok obsahujúci terapeutický faktor v terapeuticky účinnej dávke. Navyše možno použiť viac ako jeden typ konjugátu ligand-imunogén. Napríklad možno hostiteľského živočícha vopred imunizovať fluoresceínizotiokyanátom a dinitrofenylom a následne liečiť fluoresceínizotiokyanátom a dinitrofenylom v súvislosti s rovnakými alebo inými ligandmi v protokole súčasného podávania. V prípade chemoterapeutických a antimikrobiálnych prostriedkov možno podávať terapeutický faktor v suboptimálnej dávke spolu s konjugátom ligand-imunogén pri kombinovanej terapii, aby sa predišlo vývoju rezistencie na chemoterapeutický či antimikrobiálny prostriedok u hostiteľského živočícha.

Konjugát ligand-imunogén a terapeutický faktor sa prednostne injikujú parenterálne a tieto injekcie môžu byť intraperitoneálne, subkutánne, intramuskuláme, intravenózne alebo intratekálne. Konjugát ligand-imunogén a terapeutický faktor sa môže tiež dodávať s použitím malého čerpadla. Príklady parenterálnych dávkových foriem zahrňujú vodné roztoky aktívneho prostriedku v izotonickom roztoku chloridu sodného, 5 % glukózy alebo iných dobre známych farmaceutický prijateľných kvapalných nosičoch, ako sú kvapalné alkoholy, glykoly, estery a amidy. Parenterálna dávková forma môže byť vo forme rekonštituovateľného lyofilizátu obsahujúceho dávku konjugátu ligand-imunogén a terapeutického faktora. V jednom výhodnom aspekte tohto uskutočnenia možno podávať akýkoľvek počet dávkových foriem s predĺženým uvoľňovaním známych v odbore, ako sú napríklad biodegradovateľné glycidové matrice opisované v US patentoch č. 4 713 249, 5 266 333 a 5 417 982, ktorých opisy sa tu zahrňujú formou odkazu.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad 1

Účinok konjugátov foliát-fluoresceínizotiokyanát na prežívanie myší s implantovaným tumorom pľúc

Myšie samice Balb/c staré 6 až 8 týždňov (zhruba 20 až 22 g) sa súčasne imunizujú na rôznych miestach bovínnym sérumalbumínom (BSA) značeným fluoresceínizotiokyanátom (FITC) s pomocou komerčného adjuvantného prostriedku (napríklad Freundov adjuvans alebo Titer Max™-Gold). Po overení, že titre proti protilátke FITC sú vysoké u všetkých myší (ako ukazujú výsledky esejí ELISA vzoriek séra myší), každému zvieraťu sa podá intraperitoneálne 5 x 10⁵ buniek M109 bunkovej línie syngénneho pľúcneho karcinómu, ktoré exprimujú vysoké hladiny foliátového receptoru. Miesta nádorov sa nechajú pripojiť a rásť. Po dobu 4 a 7 dní po implantácii nádorových buniek sa všetkým zvieratám podáva intraperitoneálne buď fyziologický roztok pufrovaný fosfátom, alebo špecifické množstvo FITC konjugovaného na kyselinu listovú prostredníctvom γ-karboxylovej skupiny pripojenej etyléndiamínovým mostíkom. Podané koncentrácie foliát-FITC sú 0 (kontrola PBS), 4,5, 45, 450 a 4 500 mmol/kg a 8 myší dostáva každú z týchto koncentrácií foliát-FITC s celkovým množstvom aplikovaných zvierat 40. Rad 5-denných injekcií (dni 8 až 12) 5 000 medzinárodných jednotiek rekombinantného ľudského IL-2 sa potom podáva všetkým myšiam kvôli stimulácii imunitného systému. Účinnosť tejto imunoterapie sa hodnotí monitorovaním prežívania ako funkcie času myši liečenej konjugátom foliát-FITC v porovnaní s kontrolami. Ako ukazuje obrázok 1, medián prežívania myši liečenej konjugátom foliát-FITC závisí od dávky, kontrolné myši vykazujú medián prežívania 23 dní po implantácii tumoru a myši skupiny foliát-FITC prežívajú po narastajúcej dobe pri zvyšovaní dávky konjugátu. Už 45 nmol/kg foliátu-FITC podporilo dlhodobé prežívanie myší a vyššie dávky boli úmerne účinnejšie. I keď sa foliát-FITC koncentruje v tumoroch, určité množstvo foliátu-FITC je prítomné v tkanive obličiek (ale nie v porovnateľných hladinách v ostatných normálnych tkanivách). Pri pitve autorizovaným veterinárnym patológom sa nezistili žiadne známky toxicity v obličke ani iných orgánoch.

Príklad 2

Zobrazenie normálneho tkaniva oproti tumorovému tkanivu foliátom konjugovaným s fluoresceínizotiokyanátom

Tento spôsob je podobný spôsobu opísanému v príklade 1 s tým rozdielom, že zvieratá dostávajú tumorové bunky 24JK-FBP a myši sa utratia skoro po injekcii konjugátu foliát-FITC a tkanivo sa rozdelí na tenké rezy a vyšetrujú sa imunofluorescenciou FITC s použitím konfokálneho fluorescenčného mikroskopu kvôli lokalizácii konjugátu foliát-FITC v jednotlivých tkanivách vrátane tumoru, obličky, pečene a svalu. Obrázok 2 ukazuje fázovo kontrastné mikrofotografíe rôznych tkanivových rezov ako kontrolu spolu s fluorescenčnými mikrofotografiami. Zisťuje sa, že sa konjugát foliát-FITC lokalizuje špecificky v tkanive tumoru a v bunkách proximálnych tubulov obličiek, kde sa jedinečne vyskytujú receptory kyseliny listovej.

Príklad 3

Zobrazenie tkaniva tumoru foliátom konjugovaným na fluoresceínizotiokyanát alebo kozím protimyším imunoglobulínom značeným fýkoerytrínom

Postupy sú podobné spôsobom opísaným v príklade 2 s tým rozdielom, že sa používajú bunky M109 a tkanivá sa vyšetrujú fluorescenciou FITC (zelené zobrazenie) a fluorescenciou fykoerytrínu (PE) (červené zobrazenie). Pri fluorescencii PE sa fluorescenčná značka pripája na kozí protimyší imunoglobulín ako protilátku na použitie pri detekcii väzby endogénnych myších protilátok proti FITC ku konjugátu foliát-FITC, ktorý sa akumuluje na bunkách tumoru. Tumorové tkanivá spracované a nespracované konjugátom foliátFITC sa porovnávajú a oba typy vzoriek sa tiež vyšetrujú fázovo kontrastnou mikroskopiou, ako sa opisuje v príklade 2. Fluorescencia FITC ukazuje lokalizáciu konjugátu foliát-FITC v tumorových tkanivách (obr. 3). Fluorescencia PE preukazuje, že sa endogénne myšie protilátky proti FITC viazané na konjugát foliát-FITC lokalizujú v tumorových bunkách. Ďalšie štúdie (neuvádzajú sa výsledky) preukazujú nedostatok takejto väzby imunoglobulínu normálneho tkaniva vrátane obličiek. Neprítomnosť väzby protilátky na konjugát foliát-FITC lokalizovaný v obličkových tkanivách vyplýva zo skutočnosti, že pokiaľ je foliátový receptor na apikálnej membráne buniek proximálnych tubulov obličiek, nemajú protilátky prístup k tejto oblasti obličiek. Fázovo kontrastné zobrazenie (prenesené obrazy) ukazujú morfológiu ošetrených a neošetrených tumorových tkanív s preukázaním zániku buniek v ošetrených vzorkách.

Príklad 4

Účinok konjugátov foliát-fluoresceínizotiokyanát na rast solídnych tumorov

Tieto spôsoby sú podobné spôsobu opísanému v príklade 1 s tou výnimkou, že každé zviera dostáva spontánne do oblasti ramena 1 x 10⁶ buniek M109 (deň 0) po predchádzajúcej imunizácii FITC. Imunizácia konjugátom foliát-FITC po implantácii tumorových buniek predstavuje 1 500 nmol/kg konjugátu foliát-FITC podávaných v 6 intraperitoneálnych dávkach v intervaloch 48 hodín (dni 7, 9, 11, 13, 15 a 17). Výsledné solídne tumory ramena sa merajú a stanoví sa percentuálny nárast veľkosti tumoru. Krivky rastu tumoru znázornené na obr. 4 ukazujú, že sa rast tumoru významne inhibuje u zvierat liečených konjugátom foliát-FITC v kombinácii s interleukínom IL-2.

Príklad 5

Účinok liečby kombináciami cytokínov

Tieto spôsoby sú podobné spôsobom opísaným v príklade 1 s tým rozdielom, že sa zvieratá ošetrujú 5 dní injekciami (dni 8 až 12) 5 000 medzinárodných jednotiek rekombinantného ľudského interleukínu IL-2 spolu s IFN-a (5 denných injekcií 2,5 x 10⁴ jednotiek/deň), IL-12 (5 denných injekcií 0,5 pg/deň) alebo TNF-a (3 injekcie v dňoch 8, 10 a 12, 2 pg/deň) po injekcii 2 dávok 1 500 nmol/kg konjugátu foliát-FITC alebo aminofluoresceínu v dňoch 4 a 7 alebo implantácii tumorových buniek. Ďalej, v snahe skrátiť čas požadovaný na získanie dát o dlhodobom prežívaní, sa tumory implantujú intraperitoneálne blízko k jadru. Tým sa prežívanie myší s tumorom všeobecne skráti v porovnaní s prežívaním na obr. 1. Výsledky ukázané na obr. 5 ukazujú, že IL-2 samotný bol účinnejší pri podpore prežívania zvierat ako kombinovaná liečba s IL-2 a IL-12 alebo s IL-2 a TNF-α. Oproti tomu bola kombinovaná liečba IL-2 a IFN-α účinnejšia pri podpore dlhodobého prežívania ako IL-2 samotný. Aminofluoresceín sa podáva injekčné spolu s rôznymi kombináciami cytokínov ako kontrola, lebo táto látka nie je pripojená na foliát a nebude znova cieliť antifluoresceínové protilátky k tumorovým bunkám.

Príklad 6

Účinok niekoľkých injekcií konjugátov foliát-fluoresceínizotiokyanát

Tieto spôsoby sú podobné spôsobom opísaným v príklade 1 s tým rozdielom, že sa zvieratám podáva intraperitoneálne v intervaloch 48 hodín 6 denných injekcií (dni 7, 9, 11, 13, 15 a 17 po implantácii tumorových buniek) 1 500 nmol/kg konjugátu foliát-FITC. Výsledky ukazujú (obrázok 6), že niekoľko injekcií konjugátu foliát-FITC zlepšuje dlhodobé prežívanie zvierat liečených konjugátom foliát-FITC a IL-2 v porovnalo ní s 2 injekciami konjugátu foliát-FITC podávanými v dňoch 4 a 7 po implantácii tumorových buniek.

Príklad 7

Synergický účinok konjugátu foliát-fluoresceínizotiokyanát a IL-2

Tieto spôsoby sú podobné spôsobom opísaným v príklade 1 s tým rozdielom, že sa zvieratám podáva injekčné 1 500 nmol/kg konjugátu foliát-FITC a niektoré zvieratá sa ošetrujú buď konjugátom foliát-FITC, alebo samotným IL-2. Ďalej sa tumorové bunky implantujú intraperitoneálne, ako sa opisuje v príklade 5. Tento experiment (pozri obrázok 7) sa vykonáva kvôli stanoveniu toho, či prispieva konjugát foliát-FITC a IL-2 synergicky k podpore dlhodobého prežívania myší s nádorom. Mediány dôb prežívania pre kontrolnú skupinu (n = 8) a skupiny (n = 8) ošetrenej IL-2 konjugátom foliát-FITC alebo konjugátom foliát-FITC + IL2 sú 18, 19, 22, resp. 42 dní. Výsledky ukázané na obrázku 7 dokazujú, že schopnosť konjugátu foliát-FITC a IL-2 predĺžiť prežívanie myší s tumorom je silne synergická pri nízkej dávke, kde IL-2 má zanedbateľný účinok na dobu prežívania myší za neprítomnosti konjugátu foliát-FITC a foliát-FITC má len malý účinok.

Príklad 8

Účasť NK buniek pri synergickom účinku konjugátov foliát-fluoresceínizotiokyanát a IL-2

Tieto spôsoby sú podobné spôsobom opísaným v príklade 7 s tým rozdielom, že sa jedna skupina zvierat ošetruje polyklonálnou králičou protimyšou protilátkou NK buniek (anti-asialo GM1, Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Richmond Va) v kombinácii s konjugátom foliát-FITC a IL-2. Každá myš dostáva injekčné 0,2 ml zásobného roztoku protilátky v zriedení 1 : 10 v dňoch 1, 4, 9 a 14 po implantácii tumoru kvôli dosiahnutiu vyčerpania NK-buniek. Medián časov prežitia pre kontrolnú skupinu a skupiny liečené konjugátom foliát-FITC + IL-2 alebo foliát-FITC + IL-2 + α-NK Ab sú 18, 42, resp. 18,5 dní. Výsledky na obrázku 8 preukazujú, že NK-bunky sprostredkovávajú synergické zvýšenie dlhodobého prežitia myší s tumorom dosiahnuté kombinovanou liečbou konjugátom foliát-FITC a IL-2.

Príklad 9

Rozvoj bunkovej imunity proti tumorovým bunkám M109

Tieto spôsoby sú podobné spôsobom v príklade 1 s tým rozdielom, že sa tumorové bunky implantujú intraperitoneálne v polohe opísanej v príklade 5 a zvieratám sa podáva fyziologický roztok pufrovaný fosfátom (kontrola) alebo konjugát foliát-FITC (1 500 nmol/kg), IL-2 (250 000 medzinárodných jednotiek/dávka) a IFN-a (25 000 medzinárodných jednotiek/dávka) v dňoch 7, 8, 9, 11 a 14 po implantácii tumorových buniek. Navyše sa zvieratá vystavia injekcii 5 x 10⁵ buniek M109 v 62. deň po počiatočnej implantácii tumorových buniek, injekcii 1,5 x 10⁶ buniek M109 v 96. deň po počiatočnej implantácii tumorových buniek alebo injekcii 2,5 x 10⁵ buniek línie 1 (spontánny ľudský karcinóm a Balb/c) v 127. deň po počiatočnej implantácii tumorových buniek.

Ako ukazuje obrázok 9, medián času prežívania kontrolných myší injikovaných 5 x 10⁵ bunkami M109 je 18,5 dňa. Medián času prežívania kontrolných myší injikovaných 1,5 x 10⁶ buniek M109 je 18 dní. Medián času prežívania kontrolných myší injikovaných bunkami línie 1,2,5 x 10⁵, je 23,5 dňa. Medián času prežívania myší injikovaných 5 x 10⁵ bunkami M109 a liečených konjugátom foliát-FITC v kombinácii s IL-2 a IFN-α s ďalším podaním buniek v 62. deň, 5 x 10⁵ buniek M109, v 96. deň 1,5 x 10⁶ buniek M109 a v 127. deň 2,5 x 10⁵ buniek línie 1, je dlhší ako 192 dní.

Výsledky ukázané na obrázku 9 preukazujú rozvoj dlhodobej bunkovej imunity špecifickej pre typ buniek u zvierat liečených konjugátom foliát-FITC v kombinácii s IL-2 a IFN-α. Táto dlhodobá imunita bráni zvieratá implantované bunkami M109 a liečené imunoterapiou cielenou na foliát proti opätovnému výskytu choroby do ďalšej aplikácie buniek následnou injekciou buniek M109. Čas prežívania týchto zvierat po konečnej záťaži bunkami línie 1 môže byť následkom prítomnosti foliátových receptorov na bunkách línie 1 pri nižších hladinách ako na bunkách M109 a prítomnosti tumorových antigénov zdieľaných medzi bunkami M109 a bunkami línie 1 vedúcej k imunitnej odpovedi špecifickej pre bunky M109 schopné skríženej reakcie s bunkami línie 1.

Príklad 10

Účinok dávky IL-2 na prežívanie myší liečených konjugátmi foliát-fluoresceínizotiokyanát

Tieto spôsoby sú podobné spôsobom opísaným v príklade 1 s tým rozdielom, že sa tumorové bunky implantujú intraperitoneálne v polohe opísanej v príklade 5 a zvieratá sa liečia fyziologickým roztokom pufrovaným fosfátom (kontrola) a súčasne sa im aplikuje injekčné foliát-FITC (1 500 nmol/kg) a IL-2 v dávkach 5 x 10³ medzinárodných jednotiek (1 x), 0,5 x 10⁵ medzinárodných jednotiek (10 x), 2,5 x 10⁵ medzinárodných jednotiek (50 x) alebo 5 x 10⁵ medzinárodných jednotiek (100 x) v dňoch 7, 8, 9, 11 a 14 po implantácii tumorových buniek. Navyše sa zvieratá imunizujú prostriedkom keyhole limpit hemokyanín (KLH) značeným FITC namiesto bovínnym sérumalbumínom značeným FITC. Ako ukazuje obrázok 10, medián času prežívania myší s implantovanými bunkami M109 liečených konjugátom foliát-FITC rastie s rastúcou dávil kou IL-2 nad hodnotu dávok IL-2 5 x 10³ medzinárodných jednotiek. Oproti tomu sa nepozoruje žiaden podstatný rozdiel medzi mediánmi časov prežívania kontrolných myší (myši, ktoré dostali bunky M109 a liečené fyziologickým roztokom pufrovaným fosfátom) a myší liečených samotným IL-2.

Príklad 12

Zlepšenie prežívania myší liečených konjugátmi foliát-fluoresceínizotiokyanát a IL-2 prostredníctvom IFN-a Spôsoby sú podobné spôsobom opísaným v príklade 1 s tým rozdielom, že sa tumorové bunky implantujú intraperitoneálne v polohe opísanej v príklade 5 a zvieratá sa liečia fyziologickým roztokom pufrovaným fosfátom (kontrola) alebo sa súčasne podáva konjugát foliát-FITC (1 500 nmol/kg) a IL-2 (5 000 medzinárodných jednotiek/dávka) alebo foliát-FITC (1 500 nmol/kg), IL-2 (5 000 medzinárodných jednotiek/dávka) a

IFN-a (25 000 jednotiek/dávka) v dňoch 7, 8, 9, 11 a 14 po implantácii tumorových buniek. Ďalšia skupina myší dostáva injekčné foliát-FITC, IL-2 a IFN-α, zvieratá však nie sú vopred imunizované komplexom bovínny sérumalbumín-FITC. Obrázok 11 ukazuje, že medián času prežívania pre kontrolné myši liečené fyziologickým roztokom pufrovaným fosfátom je 18,5 dňa, medián času prežívania pre myši, ktoré súčasne dostávajú injekčné foliát FITC a IL-2 je 20,5 dní, medián času prežívania pre myši, ktoré dostávajú injekčné súčasne foliát FITC, IL-2 a IFN-α, je väčší ako 60 dní a medián času prežívania pre myši, ktoré súčasne dostávajú injekčné foliát FITC, IL-2 a IFN-α, ale nie sú vopred imunizované, je 24,3 dňa. Medián času prežívania pre myši, ktoré dostávajú injekčné foliát FITC a IL-2, sa podstatne neodlišuje od mediánu pre kontrolné myši, lebo tieto myši dostávali injekčné 5 000 medzinárodných jednotiek IL-2 a ako opisuje príklad 10, sú nutné dávky IL-2 nad 5 000 medzinárodných jednotiek kvôli zvýšeniu mediánu času prežívania myší liečených konjugátom foliát-FITC pri režime dní 7, 8, 9, 11 a 14. Výsledky ukázané na obrázku 11 preukazujú, že IFNα zvyšuje nárast mediánu času prežívania, ktorý nastáva ako výsledok liečby myší implantovanými tumorovými bunkami s konjugátom FITC a IL-2.

Príklad 12

Účinok vyčerpania CD8⁺ T-buniek na imunoterapiu cielenú na foliát

Tieto spôsoby sú podobné spôsobom opísaným v príklade 1 s tým rozdielom, že sa tumorové bunky implantujú intraperitoneálne v polohe opísanej v príklade 5 a zvieratám sa podáva injekčné fyziologický roztok pufrovaný fosfátom (kontrola) alebo sa im súčasne podáva konjugát foliát-FITC (1 500 nmol/kg), IL-2 (5 000 medzinárodných jednotiek/dávka) a IFN-a (25 000 jednotiek/dávka) v dňoch 7, 8, 9, 11 a 14 po implantácii tumorových buniek. Ďalším skupinám myší sa súčasne podáva aminofluoresceín (1 500 nmol/kg), IL-2 a IFN-α alebo foliát-FITC, IL-2, IFN-α a protilátka proti bunkám CD8⁺T (vo forme ascitov a tieto myši sa aplikujú v dňoch 2, 3, 7, 11 a 15). Ako ukazuje obrázok 12, protilátka proti CD8⁺ T-bunkám inhibuje nárast strednej doby prežitia u myší liečených konjugátom foliát-FITC, IL-2 a IFN-α, čo ukazuje, že CD8⁺ T-bunky majú úlohu pri aktivácii bunkovej imunitnej odpovede imunoterapiou cielenou na foliát. Aminofluoresceín sa podáva injekčné spolu s kombináciou IL-2, IFN-α cytokín ako kontrola, lebo táto zlúčenina nie je pripojená na foliát a nebude znova cieliť protifluoresceínové protilátky na tumorové bunky. Obrázok 12 ukazuje, že aminofluoresceín spolu s IL-2 a IFN-α je oveľa menej efektívny ako foliát FITC, IL-2 a IFN-α pri zvyšovaní mediánu prežitia myší implantovaných bunkami M109.

Príklad 13

Zosilňovací účinok GM-CSF na foliátovú cielenú imunoterapiu s účinkom zvýšeným pomocou IL-2 a IFN-a Tieto spôsoby sú podobné spôsobom opísaným v príklade 1 s tým rozdielom, že sa tumorové bunky implantujú intraperitoneálne v polohe opísanej v príklade 5. Navyše, ako ukazuje obrázok 13, sa zvieratám podáva injekčné viacero cytokínov vrátane IL-2 (5 000 medzinárodných jednotiek/dávka), IFN-a (25 000 jednotiek/ dávka) a GM CSF (3 000 jednotiek/dávka). Cytokíny sa súčasne podávajú injekčné v sériách 5 denných injekcií v dňoch 8 až 12 po implantácii buniek M109, ktorá nasleduje po injekcii dvoch dávok 1 500 nmol/kg konjugátu foliát-FITC v dňoch 4 a 7. Výsledky zobrazené na obrázku 13 ukazujú, že medián času prežitia pre myši liečené fyziologickým roztokom pufrovaným fosfátom je 19 dní, medián času prežitia pre myši, ktorým sa injekčné podáva IL-2, IFN-α a GM-CSF bez foliátu-FITC, je 22 dní, medián času prežívania pre myši, ktorým sa injekčné podáva foliát-FITC, IL-2 a IFN-α, je 38 dní a medián času prežívania pre myši, ktorým sa injekčné podáva foliát-FITC, IL-2 a IFN-α a GM-CSF, je väčší ako 57,5 dní. Tieto výsledky ukazujú, že GM-CSF ďalej zosilňuje usmrcovanie tumorových buniek s cielením na foliát u myší, ktoré sa tiež liečia IL-2 a IFN-α. Medián doby prežívania pre myši, ktorým sa injekčné podáva PBS, IL-2, IFN-α a GM-CSF, nie je významne rozdielny proti kontrolným myšiam, čo ukazuje na dôležitosť cielenia nádorovo špecifickej imunitnej odpovede pri použití konjugátu foliát-FITC.

Príklad 14

Účinok dávky IFN-α na prežívanie myší liečených konjugátmi foliát-fluoresceínizotiokyanát

Tieto spôsoby sú podobné spôsobom opísaným v príklade 1 s tým rozdielom, že sa tumorové bunky im12 plantujú intraperitoneálne v polohe opísanej v príklade 5 a zvieratá sa liečia fyziologickým roztokom pufrovaným fosfátom (kontrola) alebo sa im súčasne podáva injekčné foliát-FITC (1 500 nmol/kg) a IFN-α v dávkach 1,5 x 10⁵ medzinárodných jednotiek/dávka (6x), 7,5 x 10⁴ medzinárodných jednotiek (3x), 2,5 x 10⁴ medzinárodných jednotiek/dávka (lx) a 7,5 x 10³ medzinárodných jednotiek/dávka (0,3x). Navyše sa zvieratá imunizujú keyhole limpit hemokyanínom (KLH) značeným FITC namiesto bovínneho sérumalbumínu značeného FITC a zvieratám sa podáva injekčné foliát-FITC a IFN-α v dňoch 7, 8, 9, 11 a 14 po implantácii tumorových buniek. Ako ukazuje obrázok 14, medián doby prežívania myší implantovaných bunkami M109 a liečených konjugátom foliát-FITC rastie s rastúcou dávkou IFN-α nad hodnotu dávky IFN-a 8 x 10⁴ medzinárodných jednotiek/dávka.

Príklad 13

Účinok dinitrofenylu ako imunogénu na foliátovú cielenú imunoterapiu

Tieto spôsoby sú podobné spôsobom opísaným v príklade 1 s tým rozdielom, že sa tumorové bunky implantujú intraperitoneálne v polohe opísanej v príklade 5 a zvieratá sa ošetrujú fyziologickým roztokom pufrovaným fosfátom (kontrola) alebo sa im súčasne podáva dinitrofenyl (DNP) (1 500 nmol/kg), IL-2 (5 000 medzinárodných jednotiek/dávka/deň) a IFN-a (2,5 x 10⁴ jednotiek/deň) alebo konjugát foliát-dinitrofenyl (DNP) (1 500 nmol/kg), IL-2 (5 000 medzinárodných jednotiek/dávka/deň) a IFN-a (2,5 x 10⁴ jednotiek/deň) v dňoch 7, 8, 9, 11 a 14 po implantácii tumorových buniek. Navyše sa zvieratá imunizujú keyhole limpit hemokyanínom (KLH) značeným DNP. Ako ukazuje obrázok 15, medián doby prežívania myší liečených konjugátom foliát-DNP, IL-2 a IFN-α narastá oproti kontrolným myšiam (liečeným fyziologickým roztokom pufrovaným fosfátom) alebo myšiam liečeným DNP, IL-2 a IFN-α. DNP je preto tiež účinným imunogénom na použitie pri foliátovo cielenej imunoterapii.

Príklad 16

Synergický účinok konjugátu foliát-fluoresceínizotiokyanát a IFN-a

Tieto spôsoby sú podobné spôsobom opísaným v príklade 1 s tým rozdielom, že sa tumorové bunky implantujú intraperitoneálne v polohe opísanej v príklade 5 a zvieratá sa liečia fyziologickým roztokom pufrovaným fosfátom (kontrola), samotným IFN-a (7,5 x 10⁴ jednotiek/deň), samotným konjugátom foliát-FITC (1 500 nmol/kg) alebo sa im súčasne podáva konjugát foliát-FITC (1 500 nmol/kg) a IFN-a (7,5 x 10⁴ jednotiek/deň) v dňoch 7, 8, 9, 11 a 14 po implantácii tumorových buniek. Navyše sa zvieratá (5 myší v každej skupine) imunizujú keyhole limpit hemokyanínom (KLH) značeným FITC namiesto bovínnym sérumalbumínom značeným FITC. Ako ukazuje obrázok 16, sú mediány času prežitia pre skupiny liečené fyziologickým roztokom pufrovaným fosfátom (kontrola), IFN-α, konjugátom foliát-FITC alebo konjugátom foliátFITC + IFN-a 17, 17, 23, resp. 33 dní. Tieto výsledky ukazujú, že IFN-α a IL-2 pôsobia synergicky s konjugátom foliát-FITC pri podpore dlhodobého prežívania myší s nádorom.

Príklad 17

Účinok dinitrofenylu ako imunogénu a cytokínov pri vysokých koncentráciách na dlhodobé prežívanie myší Tieto spôsoby sú podobné spôsobom opísaným v príklade 1 s tým rozdielom, že sa tumorové bunky implantujú intraperitoneálne v polohe opísanej v príklade 5 a zvieratá sa liečia fyziologickým roztokom pufrovaným fosfátom (kontrola) alebo sa súčasne podáva fyziologický roztok pufrovaný fosfátom, IL-2 (2,5 x 10⁵ jednotiek/ deň) a IFN-a (7,5 x 10⁴ jednotiek/deň) alebo foliát-dinitrofenyl (DNP) (1 500 nmol/kg), IL-2 (2,5 x 10⁵ jednotiek/deň) a IFN-a (7,5 x 10⁴ jednotiek/deň) v dňoch 7, 8, 9, 11 a 14 po implantácii tumorových buniek. Navyše sa zvieratá imunizujú keyhole limpit hemokyanínom (KLH) značeným DNP. Ako ukazuje obrázok 17, medián času prežívania myší liečených konjugátom foliát-DNP, IL-2 a IFN-α sa zvyšuje proti kontrolným myšiam (liečeným fyziologickým roztokom pufrovaným fosfátom) alebo myšiam liečeným fyziologickým roztokom pufrovaným fosfátom, IL-2 a IFN-α. Myši liečené konjugátom foliát-DNP, IL-2 a IFN-α (s IL-2 a IFN-α s koncentráciami 2,5 x 10⁵ jednotiek/deň a 7,5 x 10⁴ jednotiek/deň) sa celkom vylieči-

Claims (1)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Farmaceutický prostriedok, vyznačujúci sa tým, že obsahuje fluoresceínizotiokyanát (FITC), konjugovaný na kyselinu listovú prostredníctvom γ-karboxylovej skupiny pripojenej etyléndiamínovým mostíkom a jeho farmaceutický prijateľný nosič.

   Koniec dokumentu