NO332160B1 - Sammensetning omfattende ligand-immunogene konjungater. - Google Patents

Abstract

En fremgangsmåte og farmasøytisk sammensetning er tilveiebrakt for å forsterke den endogene immunresponsformidlede elimineringen av en populasjon av patogene celler i et vertsdyr hvor de patogene cellene fortrinnsvis uttrykker, unikt uttrykker eller overuttrykker et bindingssete for en bestemt ligand. Oppfinnelsen omfatter å administrere liganden konjungert til et immunogen til et vertsdyr rommende populasjonen av patogene celler. Antistoffer, pre- eksisterende eller administrert til vertsdyret for å etablere en passiv immunitet, rettet mot immunogenet binder til ligandimmunogenkonjungatet resulterende i eliminering av den patogene cellen ved vertens immunrespons. Minst en ytterligere terapeutisk faktor er administrert valgt fra gruppen bestående av et celledrapsmiddel, en tumorpenetreringsforsterker, et kjemoterapeutisk middel, antimikrobielt middel, en cytotoksisk immuncelle og en forbindelse i stand til å stimulere en endogen immunrespons hvor forbindelsen ikke binder til ligandimmunogenkonjungatet.

Description

Fagfeltet for oppfinnelsen

Denne oppfinnelsen er relatert til en farmasøytisk sammensetning som kan anvendes i behandling av sykdomstilstanderkarakterisert vedeksistensen av patogene

cellepopulasjoner. Nærmere bestemt kan cellemålrettede ligand-immunogenkomplekser administreres til en syk vert, fortrinnsvis i kombinasjon med en immunsystemstimulans eller annen terapeutisk faktor for å forsterke og/eller omdirigere vert immunresponser til de patogene cellene.

Bakgrunn og sammendrag av oppfinnelsen

Det mammalske immunsystemet tilveiebringer et hjelpemiddel for gjenkjenning og eliminering av tumorceller, andre patogene celler og invaderende fremmede patogener. Mens immunsystemet normalt tilveiebringer et sterkt forsvar, er det fortsatt mange eksempler hvor cancerceller, andre patogene celler eller infiserende midler unnviker en vert immunrespons og prolifererer eller fortsetter med medvirkende vertspatogenitet. Kjemoterapeutiske midler og strålingsterapier har blitt utviklet for å eliminere replikerende neoplasma. Imidlertid, de fleste, om ikke alle, av de nåværende tilgjengelige kjemoterapeutiske midlene og stråleterapikurer har uheldige bivirkninger på grunn av at de virker ødeleggende ikke bare på cancerceller, men de har også innvirkning på normale vertceller, slik som celler i det hematopoetiske systemet. Videre, kjemoterapeutiske midler har begrenset effektivitet i eksempler hvor vertsresistens mot legemidler er utviklet.

Fremmede patogener kan også proliferere i en vert ved å unnvike en kompetent immunrespons eller hvor vertens immunsystem har blitt kompromittert ved legemiddelterapier eller ved andre helseproblemer. Selv om mange terapeutiske forbindelser har blitt utviklet, er eller har mange patogener blitt resistente mot slike terapeutika. Kapasiteten for cancerceller og infeksiøse organismer til å utvikle resistens mot terapeutiske midler og de uheldige bivirkningene til de nåværende tilgjengelige anti-cancer legemidlene, belyser behovet for utviklingen av nye terapier spesifikke for patogene cellepopulasjoner med redusert vertstoksisitet.

Forskere har utviklet terapeutiske protokoller for å ødelegge cancerceller ved å målrette cytotoksiske forbindelser spesielt til slike celler. Disse protokollene benytter toksiner konjugert til ligander som binder til reseptorer unike for, eller overuttrykket av cancerceller, i et forsøk på å minimalisere levering av toksinet til normale celler. Ved å benytte denne metoden har enkelte immunotoksiner blitt utviklet bestående av antistoffer rettet mot spesifikke reseptorer på patogene celler, antistoffene har blitt bundet til toksiner slik som ricin, pseudomonas eksotoksin, difteria toksin og tumornekrosefaktor. Disse immunotoksinene målrettes til tumorceller bærende de spesifikke reseptorene gjenkjent av antistoffet (Olsnes, S., Immunol. Today, 10, s. 291-295, 1989; Melby, ELLER LIGNENDE, Cancer Res., 53(8), s. 1755-1760, 1993; Better, M.D., PCT Publication Number WO 91/07418, utgitt 30. mai 1991).

En annen tilnærming for og selektivt målrette populasjoner av cancerceller eller fremmede patogener i en vert, er å forsterke vertens immunrespons mot de patogene cellene, derved unngå behovet for å administrere forbindelser som også kan vise uavhengig vertstoksisitet. En rapportert strategi for immunoterapi er å binde antistoffer, for eksempel genetisk fremstilte multimere antistoffer til tumorcelleoverflaten for å fremvise den konstante regionen til antistoffene på celleoverflaten og derved indusere tumorcelledrap ved ulike immunsystemformidlede prosesser. (De Vita, V.T., Biologic Therapy of Cancer, 2. utg. Philadelphia, Lipincott, 1995; Soulillou, J.P., US patent 5,672,486). Imidlertid, denne metoden har blitt komplisert ved vanskelighetene i å definere tumorspesifikke antigener. En annen metode for å stole på vertens immunkompetanse er målrettingen av et anti-T-cellereseptorantistoff eller anti-Fc-reseptorantistoff til tumorcelleoverflater for å fremme direkte binding av immunceller til tumorer (Kranz, D.M., US patent 5,547,668). En vaksinebasert metode har også blitt beskrevet som er basert på en vaksine omfattende antigener fusert til cytokiner der cytokinet modifiserer immunogeniteten til vaksineantigenet og, på denne måten, stimulere immunresponsen til det patogene middelet (Pillai, S., PCT-publikasjon nr. WO 91/11146, utgitt 7. februar 1991). Den metoden er basert på indirekte modulering av immunresponsen rapportert. En annen tilnærming for å drepe uønskede cellepopulasjoner benytter IL-2 eller Fab-fragmenter til anti-tymocyttglobulin bundet til antigener for å eliminere uønskede T-celler; imidlertid, basert på rapporterte eksperimentelle data, viser denne fremgangsmåten at den eliminere bare 50% av den målrettede cellepopulasjonen og resulterer i ikke-spesifikk celledrap in vivo (dvs. 50% av perifere blodlymfocytter som ikke er T-celler blir også drept (Pouletty, P., PCT publikasjon nr. WO 97/37690, utgitt 16. oktober 1997)). Derfor, er det et signifikant behov for terapier rettet mot behandling av sykdomstilstanderkarakterisert vedeksistensen av patogene cellepopulasjoner i en angrepet vert.

Reddy J.A and Low P.S., Critical Review in Therapeutic Drug Carrier Systems, vol. 15, 1998, s. 587-627 omhandler en anvendelse av et ligand-immunogen konjugat bestående av folinsyre kovalent bundet til bispesifikke antistoffer eller enkeltkjedede antistoffer i stand til å eliminere en populasjon av patogene celler i en vert.

WO 9636367 beskriver en metode for å øke transporten av eksogent molekyl gjennom en cellemembran med biotin eller folatreseptorer som initierer transmembran transport av reseptorbundne forbindelser. Dette innebærer dannelse av et kompleks mellom en ligand; folinsyre og et eksogent molekyl.

Foreliggende oppfinnelse omfatter sammensetning, kjennetegnet ved at den omfatter fluoresceinisotiocyanat (FITC) konjugert til folsyre via en y-karboksylbundet etylendiaminbro og en farmasøytisk akseptabel væskebærer.

En fremgangsmåte for å eliminere patogene cellepopulasjoner i en vert ved å øke vertens immunsystemgjenkjenning av og respons til slike cellepopulasjoner er mulig å gjennomføre. Antigenisiteten til de cellulære patogenene økes for å forsterke den endogene immunresponsformidlede elimineringen av populasjonen av patogene celler. Fremgangsmåten unngår eller minimaliserer anvendelsen av cytotoksiske eller antimikrobielle terapeutiske midler. Fremgangsmåten omfatter å administrere et ligandimmunogenkonjugat hvor liganden er i stand til og spesifikt binde til en populasjon av patogene celler in vivo som unikt uttrykker, fortrinnsvis uttrykker, eller overuttrykker en ligandbindingshalvdel, og det ligandkonjugerte immunogenet er i stand til å bringe frem antistoffproduksjon eller mer foretrukket, i stand til å bli gjenkjent av endogene eller koadministrerte eksogene antistoffer i vertsdyret. Den immunsystemformidlede elimineringen av patogene celler er styrt ved bindingen av det immunogenkonjugerte ligandet til en reseptor, en transporter eller annet overflatepresentert protein unikt uttrykt, overuttrykt eller fortrinnsvis uttrykt av den patogene cellen. Et overflatepresentert protein unikt uttrykt, overuttrykt eller fortrinnsvis uttrykt av den patogene cellen, er en reseptor ikke tilstede eller tilstede i mindre mengder på ikke-patogene celler som tilveiebringer et middel for selektiv eliminering av de patogene cellene. Minst en ytterligere terapeutisk faktor, for eksempel en immunsystemstimulant, et celledrepende middel, en tumorpenetreringsforsterker, et kjemoterapeutisk middel, en cytotoksisk immuncelle eller et antimikrobielt middel kan koadministreres til vertsdyret for å forsterke terapeutisk effektivitet.

Fremgangsmåten kan bestå av trinnene å administrere ligander i stand til spesifikt å binde med høy affinitet in vivo til celleoverflateproteiner unikt uttrykt, fortrinnsvis uttrykt eller overuttrykt på den målrettede patogene cellepopulasjonen, nevnte ligander er konjugert til immunogener mot hvilken en iboende eller en tilegnet immunitet allerede eksisterer eller kan fremkalles i vertsdyret og eventuelt koadministrering av minst en terapeutisk faktor som er en endogen immunresponsaktivator eller en cytotoksisk forbindelse. Fremgangsmåten kan videre bestå av å administrere et ligand-immunogen konjugat sammensetning til vertsdyret hvor liganden er folsyre eller en annen folatreseptor bindingsligand. Liganden er konjugert, for eksempel ved en kovalent binding til et immunogen i stand til å fremkalle en antistoffrespons i vertsdyret eller et immunogen i stand til å binde til tre eksisterende endogene antistoffer (som følger av en iboende eller tilegnet immunitet) eller koadministrerte antistoffer (dvs. via passiv immunisering) i vertsdyret. Minst én ytterligere terapeutisk faktor, som ikke i stand til å spesifikt binde til ligand-immunogenkomplekset, men er i stand til å stimulere eller forsterke en endogen immunrespons, et celledrapsmiddel, en tumorpenetreringsforsterker slik som et inflammatorisk eller pro-inflammatorisk middel, et kjemoterapeutisk middel, en cytotoksisk immuncelle eller et anti-mikrobielt middel kan administreres til vertsdyret i forbindelse med administrasjon av ligand-immuogenkonjugatene.

Det er også mulig å tilveiebringe en fremgangsmåte for å forsterke en endogen immunresponsformidlet spesifikk eliminering av en populasjon av patogene celler i et vertsdyr omfattende nevnte populasjon hvor medlemmene av nevnte cellepopulasjon har et tilgjengelig bindingssete for en ligand. Fremgangsmåten omfatter trinnet å administrere til nevnte vert en ligand-immuonogen konjungatsammensetning omfattende et kompleks av liganden og et immunogen hvor nevnte immunogen er kjent for å bli gjenkjent av en endogent eller et eksogent antistoff i verten eller er kjent for å bli gjenkjent direkte av en immuncelle i verten, og minst en ytterligere sammensetning omfattende en terapeutisk faktor, nevnte faktor kan velges fra gruppen bestående av et celledrapsmiddel, en tumorpenetreringsforsterker, et kjemoterapeutisk middel, et antimikrobielt middel, en cytotoksisk immuncelle og en forbindelse i stand til å stimulere en endogen immunrespons hvor forbindelsen ikke binder til ligand-immunogenkonjugatet.

Videre er det mulig å fremsette en fremgangsmåte for å forsterke en endogen immunresponsformidlet spesifikk eliminering av en populasjon av patogene celler i et vertsdyr, omfattende nevnte populasjon hvor nevnte populasjon uttrykker et bindingssetet for en ligand. Fremgangsmåten omfatter trinnene av å administrere til verten en sammensetning omfattende et kompleks av nevnte ligand og et immunogen, å administrere til verten antistoffer rettet mot immunogener og å administrere til nevnte vert minst en ytterligere terapeutisk faktor, nevnte faktor kan velges fra gruppen bestående av et celledrapsmiddel, en tumorpenetreringsforsterker, et kjemoterapeutisk middel, et antimikrobielt middel, en cytotoksisk immuncelle og en stimulant av en endogen immunrespons som ikke binder til ligand-immunogenkomplekset.

En mulig fremgangsmåte for å forsterke en endogen immunresponsformidler er å spesifikk eliminere en populasjon av patogene celler i et vertsdyr omfattende nevnte populasjon hvor nevnte populasjon fortrinnsvis uttrykker, unikt uttrykker eller overuttrykker en folsyrereseptor, fremgangsmåten omfatter trinnet av å administrere til nevnte vert en sammensetning omfattende et kovalent bundet konjugat av et immunogen hvor immunogenet er kjent for å bli gjenkjent av et endogent eller eksogent antistoff i verten, eller er kjent for å bli gjenkjent direkte ved en immuncelle i verten, og en ligand omfattende folsyre eller folsyreanaloger som har en glutamylgruppe hvor den kovalente bindingen til immunogenet er bare gjennom y-karboksygruppen til glutamylgruppen. En ytterligere sammensetning kan også administreres til verten, sammensetningen omfatter en terapeutisk faktor, nevnte faktor kan velges fra gruppen bestående av et celledrapsmiddel, en tumorpenetreringsforsterker, et kjemoterapeutisk middel, et antimikrobielt middel, en cytotoksisk immuncelle og en forbindelse i stand til å stimulere en endogen immunrespons hvor forbindelsen ikke binder til ligand-immunogenkonjungatet.

Fremgangsmåte for å forsterke en endogen immunresponsformidlet spesifikk eliminering av en populasjon av patogene celler i et vertsdyr omfattende nevnte populasjon, hvor nevnte populasjon fortrinnsvis uttrykker, unikt uttrykker eller overuttrykker en folsyrereseptor kan også være et alternativ. Fremgangsmåten omfatter trinnene av å administrere til nevnte vert en sammensetning omfattende et kovalent bundet konjugat av et immunogen hvor immunogenet er kjent for å bli gjenkjent av et endogent eller eksogent antistoff i verten eller er kjent for å bli gjenkjent direkte av en immuncelle i verten og en ligand omfattende folsyre eller folsyreanaloger som har en glutamylgruppe hvor den kovalente bindingen til immunogenet bare er gjennom a-karboksygruppen til glutamylgruppen. Minst en ytterligere sammensetning administrert til verten omfattende en terapeutisk faktor kan anvendes, nevnte faktor værende valgt fra gruppen bestående av et celledrapsmiddel, en tumorpenetreringsforsterker, et kjemoterapeutisk middel, et antimikrobielt middel, en cytotoksisk immuncelle, og en forbindelse i stand til å stimulere en endogen immunrespons hvor forbindelsen ikke binder til ligand-immunogenkonjungatet.

I en videre utførelsesform av denne oppfinnelsen er den målrettede patogene cellepopulasjonen en cancercellepopulasjon. I en ytterligere utførelsesform er den målrettede cellepopulasjonen virusinfiserte endogene celler. I en ytterligere utførelsesform er den målrettede cellepopulasjonen eksogene organismer slik som bakterier, mykoplasma, gjær eller sopp. Ligand-immunogenkonjungatet binder til overflaten av tumorcellene eller patogene organismer og "merker" cellemedlemmene av den målrettede cellepopulasjonen med immunogener, derved utløses en immunformidlet respons rettet mot den merkede cellepopulasjonen. Antistoffer administrert til verten i en passiv immunisering eller antistoffer eksisterende i vertssystemet fra en preeksisterende iboende eller tilegnet immunitet, binder til immunogenet og utløser endogene immunresponser. Antistoffbinding til det cellebundne ligand-immunogenkonjungatet resulterer i en komplementformidlet cytotoksisitet, antistoffavhengig celleformidlet cytotoksisitet, antistoff oppsonisering og fagocytose, antistoffindusert reseptorsammenknytting, signaliserende celledød eller hvile eller enhver annen humoral eller cellulær immunrespons stimulert ved antistoffbinding til cellebundne ligand-immunogenkonjungater. I tilfeller hvor et antistoff kan bli direkte gjenkjent av immunceller uten foregående antistoffoppsonisering, direkte drap av patogene celler kan forekomme.

Eliminering av de fremmede patogener eller infiserte eller neoplastiske endogene celler kan bli ytterligere forsterket ved administrering av en terapeutisk faktor i stand til å stimulere en endogen immunrespons, et celledrapsmiddel, en tumorpenetreringsforsterker, et kjemoterapeutisk middel, en cytotoksisk immuncelle eller et antimikrobielt middel. Den cytotoksiske immuncellen kan være en cytotoksisk immuncelle populasjon som er isolert, ekspandert ex vivo og deretter injisert i et vertsdyr. Det kan også benyttes immunstimulant, der immunstimulaten kan være et interleukin slik som IL-2, IL-12 eller IL-15 eller et IFN slik som IFN-a, IFN-p eller IFN-y, eller GM-CSF. En annen mulighet er at immunstimulanten kan være en cytokinsammensetning omfattende kombinasjoner av cytokiner slik som IL-2, IL-12 eller IL-15 i kombinasjon med IFN-a, IFN-P eller IFN-y eller GM-CSF eller enhver effektiv kombinasjon derav, eller enhver annen effektiv kombinasjon av cytokiner.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer en farmasøytisk sammensetning omfattende terapeutisk effektive mengder av et ligand-immunogenkonjungat i stand til å spesifikt binde til en populasjon av patogene celler i et vertsdyr for å fremme spesifikk eliminering av nevnte celler, ved en tilegnet eller iboende immunrespons, koadministrerte antistoffer eller direkte ved en immuncelle i verten, en terapeutisk faktor valgt fra gruppen bestående av et celledrapsmiddel, en tumorpenetreringsforsterker, et kjemoterapeutisk middel, et antimikrobielt middel, en cytotoksisk immuncelle og en forbindelse i stand til å stimulere en endogen immunrespons, hvor forbindelsen ikke binder til ligand-immunogenkonjungatet og en farmasøytisk akseptabel bærer derav. I en utførelsesform er den farmasøytiske sammensetningen i en parenteral forlenget frigjøringsdoseringsform. Den terapeutiske faktoren kan være en immunstimulant omfattende en forbindelse valgt fra gruppen bestående av interleukiner slik som IL-2, IL-12, IL-15, IFNer slik som IFN-a, INF-J3 eller INF-y og GM-CSF eller kombinasjoner derav.

Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen

Oppfinnelsen relaterer seg til farmasøytisk sammensetning til anvendelse i behandling av sykdomstilstanderkarakterisert vedeksistensen av patogene cellepopulasjoner. Nærmere bestemt kan cellemålrettede ligand-immunogenkomplekser administreres til en syk vert, fortrinnsvis i kombinasjon med en immunsystemstimulans eller annen terapeutisk faktor for å forsterke og/eller omdirigere vert immunresponser til de patogene cellene.

Sammensetningen i følge oppfinnelsen kan benyttes i fremgangsmåter for terapeutiske behandlingen av en vert med cancer eller en vert infisert med patogene organismer. Fremgangsmåtene resulterer i forsterkning av den immunresponsformidlede elimineringen av patogene cellepopulasjoner ved gjengivelse/merking av de patogene cellene antigene resulterende i deres gjenkjenning og eliminering ved vertens immunsystem. Fremgangsmåten benytter et ligand-immunogenkonjungat i stand til å binde med høy affinitet til cancerceller eller andre patogene midler. Høyaffinitetsbindingen kan være iboende til liganden og den kan bli modifisert (forsterket) ved anvendelsen av en kjemisk modifisert ligand eller fra den bestemte kjemiske bindingen mellom liganden og immunogenet som er tilstede i konjugatet. Fremgangsmåten kan også benytte kombinasjonsterapi ved å benytte ligand-immunogenkonjungatet og en ytterligere terapeutisk faktor i stand til å stimulere en endogen immunrespons, et celledrapsmiddel, et kjemoterapeutisk middel, en tumorpenetreringsforsterker, en cytotoksisk immuncelle eller et antimikrobielt middel for å forsterke immunresponsformidlet eliminering av de patogene cellepopulasjonene.

Fremgangsmåten kan anvendes for å forsterke en endogen immunresponsformidlet eliminering av en populasjon av patogene celler i et vertsdyr omfattende populasjonen av patogene celler. Fremgangsmåten er anvendelig for populasjoner av patogene celler som forårsaker et utvalg av sykdommer slik som cancer og infeksiøse sykdommer. Derfor, kan populasjonen av patogene celler være en cancercellepopulasjon som er tumorgen, inkluderende godartede tumorer og ondartede tumorer, eller den kan være ikke-tumorgen. Cancercellepopulasjonen kan oppstå spontant eller ved slike prosesser som mutasjoner tilstede i kimcellene til vertsdyret eller somatiske mutasjoner, eller den kan være kjemisk-, viralt- eller strålingsindusert. Oppfinnelsen kan anvendes for å behandle cancere som carcinomer, sarkomer, lymfomer, Hodgekins sykdom, melanomer, mesoteliomer, Burkitts lymfom, nasoparyngiale carcinomer, leukemier og myelomer. Cancercellepopulasjonen kan inkludere, men er ikke begrenset til oral, tyroid, endokrin, hud, gastrisk, esofagial, laryngial, pankreas, tarm, blære, bein, ovarisk, livmorhals, livmor, bryst, testis, prostata, rektal, nyre, lever og lunge cancere.

Populasjonen av patogene celler kan også være et eksogent patogen eller en cellepopulasjon omfattende et eksogent patogen, for eksempel et virus. Den foreliggende oppfinnelsen kan anvendes mot slike eksogene patogener som bakterier, sopp, virus, mykoplasma og parasitter. Infeksiøse midler som kan behandles er enhver infeksiøs organisme kjent innen fagfeltet som forårsaker patogenese i et dyr, inkluderende slike organismer som bakterier som er gram-negative eller gram-positive, kokker eller basiller, DNA og RNA-virus inkluderende, men ikke begrenset til DNA-virus slik som papillomavirus, parvovirus, adenovirus, herpesvirus og vaksinavirus, og RNA-virus slik som arenavirus, koronavirus, rinovirus, respiratoriske synsytialvirus, influensavirus, pikornavirus, paramyksovirus, reovirus, retrovirus og rabdovirus. Av spesiell interesse er bakterier som er resistente for antibiotika slik som antibiotika-resistente Streptococcus arter og Staphlococcus arter eller bakterier som er følsomme for antibiotika, men forårsaker tilbakevendende infeksjoner når behandlet med antibiotika, slik at resistente organismer eventuelt utvikles. Slike organismer kan bli behandlet med ligand-immunogenkonjungatene i følge foreliggende oppfinnelsen i kombinasjon med lavere doser av antibiotika enn det som normalt ville bli administrert til en pasient for å unngå utviklingen av disse antibiotikarsistente bakteriestammene. Den foreliggende oppfinnelsen kan også anvendes mot enhver sopp, mykoplasma arter, parasitter eller andre infeksiøse organismer som forårsaker sykdom i dyr. Eksempler på sopp som kan bli behandlet med tidligere nevnte fremgangsmåte inkluderer sopp som kan gro som mugg eller er gjærlignende, inkluderende for eksempel sopp som forårsaker sykdommer slik som ringorm, histoplasmose, blastomykose, aspergillose, krytokokkose, sporotrikose, kokkidioidomykose, parakokkidio-idomykose og kandidia. Parasittinfeksjoner som inkluderende, for eksempel, infeksjoner forårsaket ved somatisk bendelorm, blodigler, vevsrundormer, amøber og Plasmodium, Trypanosoma, Leishmania og Toxoplasma arter er også mulig å behandle. Parasitter av spesiell interesse er de som uttrykker folatreseptorer og binder folat; litteraturen er imidlertid full av referanser til ligander som viser høy affinitet for infeksiøse organismer, for eksempel penicilliner og cefalosporiner kjent for deres antibiotiske aktivitet og spesifikk binding til bakteriecelleveggforløpere, kan på lignende måte bli benyttet som ligander for å fremstille ligand-immunogenkonjungater for anvendelse.

Ligand-immunogenkonjungatene i følge oppfinnelsen kan også bli rettet mot en cellepopulasjon omfattende endogene patogener, hvor patogen spesifikke antigener fortrinnsvis uttrykkes på overflaten av celler omfattende patogenene, og virker som reseptorer for liganden med den ligandspesifikke bindingen til antigenet.

Nevnte fremgangsmåte kan også benyttes i både human klinisk medisin og veterinære anvendelser. Derfor kan vertsdyrene omfattende populasjoner av patogene organismer og behandlet med ligand-immunogenkonjungater være mennsker eller, i tilfellet av veterinæranvendelser, være et laboratoriedyr, landbruksdyr, husdyr eller ville dyr. Den foreliggende oppfinnelsen kan anvendes på vertsdyr inkluderende, men ikke begrenset til mennesker, laboratoriedyr slik som gnagere (for eksempel mus, rotter, hamstere osv)., kaniner, aper, sjimpanser, husdyr slik som hunder, katter og kaniner, dyr i landbruket slik som kuer, hester, griser, sauer, geiter og ville dyr i fangenskap slik som bjørner, pandaer, løver, tigere, leoparder, elefanter, sebraer, sjiraffer, gorillaer, delfiner og hvaler.

Ligand-immunogenkonjungatet administreres fortrinnsvis parenteralt til vertsdyret, for eksempel intradermalt, subkutant, intramuskulært, intraperitonealt eller intravenøst. Alternativt, kan konjugatet administreres til vertsdyret ved andre medisinske nyttige prosesser og enhver effektiv dose og egnede terapeutiske doseringsformer inkluderende forlenget frigjøringsdoseringsformer kan bli benyttet. Nevnte fremgangsmåte kan benyttes i kombinasjon med kirurgisk fjerning av en tumor, strålingsterapi, kjemoterapi eller biologiske terapier, slike som andre immunoterapier, som for eksempel monoklonal antistoffterapi, behandling med immunomodulatoriske midler, adoptiv overføring av immuneffektorceller, behandling med hematopoetiske vekstfaktorer, cytokiner og vaksinasjon.

I overensstemmelse med den foreliggende oppfinnelsen, kan ligand-immunogenkonjungatet velges fra et stort utvalg av ligander og immunogener. Ligandene må være i stand til og spesifikt eliminere en populasjon av patogene celler i et vertsdyr på grunn av fortrinnsberettiget ekspresjon av en reseptor til liganden, tilgjengelig for ligandbinding på de patogene cellene. Akseptable ligander inkluderer folsyre, analoger av folsyre og andre folatreseptorbindingsmolekyler, andre vitaminer, peptidligander identifisert fra bibliotekscreening, tumorspesifikke peptider, tumorspesifikke aptamerer, tumorspesifikke karbohydrater, tumorspesifikke monoklonale eller polyklonale antistoffer, Fab eller scFv (dvs. en enkeltkjede variabel region)-fragmenter av antistoffer slik som for eksempel et Fab-fragment til et antistoff rettet mot EphA2 eller andre proteiner spesifikt uttrykket eller unikt tilgjengelige på metastatiske cancerceller, små organiske molekyler derivert fra kombinasjonsbiblioteker, vekstfaktorer slik som EGF, FGF, insulin og insulinlignende vekstfaktorer og homologe polypeptider, somatostatin og dets analoger, transferrin, lipoproteinkomplekser, gallesalter, selektiner, steroid hormoner, Arg-Gly-Asp-inneholdende peptider, retinoider, ulike galectiner, 5-opiod reseptorligander, kolecystokinin A-reseptorligander, ligander spesifikke for angiotensin ATI eller AT2-reseptorer, peroksisom proliferatoraktivert reseptor y-ligander, P-laktam antibiotika, små organiske molekyler inkluderende antimikrobielle legemidler og andre molekyler som binder spesifikt til en reseptor fortrinnsvis uttrykt på overflaten til tumorceller eller på en infeksiøs organisme, eller fragmenter av ethvert av disse molekylene. Av interesse i tilfellet av ligander som binder til infeksiøse organismer er ethvert molekyl, slik som antibiotika eller andre legemidler som er kjent innen fagfeltet for å fortrinnsvis binde til mikroorganisme. Oppfinnelsen henvender seg også til ligander som er molekyler slik som antimikrobielle legemidler, fremstilt for å passe inn i bindingslommen til en bestemt reseptor, basert på krystallstrukturen til reseptoren eller andre celleoverflateproteiner, og hvor slike reseptorer er fortrinnsvis uttrykt på overflaten av tumorer, bakterier, virus, mykoplasmaer, sopp, parasitter eller andre patogener. Det er også betraktet, i en foretrukket utførelsesform av oppfinnelsen, at ligander binder til ethvert tumorantigen eller andre molekyler fortrinnsvis uttrykt på overflaten til tumorceller kan bli benyttet.

Bindingssetet for liganden kan inkludere reseptorer for ethvert molekyl i stand til og spesifikt binde til en reseptor hvor reseptoren eller andre proteiner er fortrinnsvis uttrykt på populasjonen av patogene celler inkluderende for eksempel reseptorer for vekstfaktorer, vitaminer, peptider, inkluderende opioidpeptider, hormoner, antistoffer, karbohydrater og små organiske molekyler. Bindingssetet kan også være et bindingssete for ethvert molekyl, slik som et antibiotikum eller annet legemiddel hvor setet er kjent innen fagfeltet til å fortrinnsvis eksistere på mikroorganismer. For eksempel subjektbindingsseter kan være bindingseter i bakteriecelleveggen for et p-laktam antibiotikum slik som penicillin eller bindingsseter for et antiviralt middel unikt presentert på overflaten av et virus. Oppfinnelsen henvender seg også til bindingsseter for ligander, slik som antimikrobielle legemidler fremstilt for å passe inn i bindingssetet i reseptoren basert på en krystallstruktur av reseptoren, og hvor reseptoren er fortrinnsvis uttrykt på overflaten til de patogene cellene eller organismene. Det er også betraktet at tumorspesifikke antigener kan fungere som bindingsseter for ligander i nevnte fremgangsmåte. Et eksempel på et tumorspesifikt antigen som vil kunne fungere som et bindingssete for ligand-immunogenkonjungater er en ekstracellulær epitop av et medlem av efrin-familien av proteiner, slik som EphA2. EphA2-ekspresjon er begrenset til celle-celleforbindelser i normale celler, men EphA2 er distribuert over hele celleoverflaten i metastatiske tumorceller. Derfor vil EphA2 på metastatiske celler være tilgjengelig for binding til for eksempel et Fab-fragment av et antistoff konjugert til et immunogen, mens proteinet vil ikke være tilgjengelig for binding til Fab-fragmentet på normale celler, resulterende i et ligand-immunogenkonjungat spesifikt for metastatiske cancerceller. Oppfinnelsen betrakter videre anvendelsen av kombinasjoner av ligand-immunogenkonjungater for å maksimalisere målretting av de patogene cellene for eliminering ved en tilegnet eller iboende immunrespons eller ved koadministrerte antistoffer.

Akseptable immunogener for anvendelse er i stand til å fremkalle antistoffproduksjon i et vertsdyr resulterende i en pre-eksisterende immunitet eller som utgjør del av det iboende immunsystemet. Alternativt kan antistoffer rettet mot immunogenet bli administrert til vertsdyret for å etablere en passiv immunitet. Egnede immunogener kan inkludere antigener eller antigene peptider mot hvilke en pre-eksisterende immunitet har utviklet seg via normale planmessige vaksinasjoner eller fra tidligere naturlig eksponering for slike midler som poliovirus, stivkrampe, tyfus, røde hunder, meslinger, kusma, kikhoste, tuberkulose og influensa antigener, og a-galaktosylgrupper. I slike tilfeller vil ligand-immunogenkonjungatene bli benyttet for å omdirigere en tidligere tilegnet humoral eller cellulær immunitet til en populasjon av patogene celler i vertsdyret for eliminering av de fremmede cellene eller patogene organsimer. Andre egnede immunogener inkluderer antigener eller antigene peptider som vertsdyret har utviklet en ny immunitet til gjennom immunisering mot et unaturlig antigen eller hapten (for eksempel fluorescein-isotiocyanat eller dinitrofenyl) og antigener mot hvilke en iboende immunitet eksisterer (for eksempel superantigener og muramyl dipeptid).

Ligandene og immunogenene kan konjungeres ved å benytte enhver fremgangsmåte for å danne et kompleks kjent innen fagfeltet. Dette kan inkludere kovalent, ionisk eller hydrogenbinding av liganden til immunogenet, enten direkte eller indirekte via en bindingsgruppe slik som en divalent linker. Konjugatet er vanligvis dannet ved kovalent binding av liganden til immunogenet gjennom dannelsen av amid, ester eller iminobindinger mellom syre, aldehyd, hydroksy, amino eller hydrazogrupper på den respektive komponenten av komplekset. I en foretrukket utførelsesform av oppfinnelsen er liganden folsyre, en analog av folsyre eller ethvert annet folatreseptorbindende molekyl kan også anvendes, folatliganden er konjugert til immunogenet ved en prosedyre som benytter trifluoreddiksyreanhydrid for å lage y-estere av folsyre via et pteroylazid intermediat. Denne foretrakkede prosedyren resulterer i syntesen av en folatligand, konjugert til immunogenet bare gjennom y-karboksygruppen av glutaminsyregrappene hos folat hvor y-konjugatet binder til folatreseptoren med høy affinitet, unngående dannelsen av blandinger av et a-konjugat og y-konjugatet. Alternativt, rene a-konjugater kan bli preparert fra intermediater hvor y-karboksygruppen er selektivt blokkert, a-konjugatet er dannet og y-karboksygrappen er deretter deblokkert ved å benytte organiske synteseprotokoller og prosedyrer kjent innen fagfeltet. Særlig kan andre vitaminer bli benyttet som ligander for å preparere konjugatene i overensstemmelse med denne oppfinnelsen. For eksempel, ligandimmunogenkonjugater kan dannes ved biotin og riboflavin så vel som folat. (Se US patent nr.: 5,108,921, 5,416,016 og 5,635,382).

Ligand-immunogenkonjungatene i følge oppfinnelsen forsterker en endogen immunrespons formidlet eliminering av en populasjon av patogene celler. Den endogene immunresponsen kan inkludere en humoral respons, en celleformidlet immunrespons og enhver annen immunrespons endogent for vertsdyret inklusiv komplementformidlet cellelysering, antistoffavhengig celleformidlet cytotoksisitet (ADCC), antistoff oppsonisering medførende til fagocytose, sammenknytting av reseptorer ved antistoffbinding resulterende i signalisering av apoptose, antiproliferering eller differensiering og direkte immuncellegjenkjenning av det leverte antigenet/haptenet. Det er også overveiet at den endogene immunresponsen vil anvende sekresjonen av cytokiner som regulerer slike prosesser som multiplikasjonen og migreringen av immunceller. Den endogene immunresponsen kan inkludere deltagelsen av slike immuncelletyper som B-celler, T-celler, inkluderende hjelper og cytotoksiske T-celler, makrofager, naturlige drapsceller, neutrofiler, LAK-celler og lignende.

Den humorale responsen kan være en respons indusert ved slike prosesser som normalt planlagt vaksinasjon eller aktiv immunisering med et naturlig antigen eller et unaturlig antigen eller hapten (f.eks. fluoresceinisotiocyanat), med det unaturlige antigenet induserende en ny immunitet. Aktiv immunisering involverer multiple injeksjoner av det unaturlige antigenet eller haptenet planlagt utenfor en normal vaksinasjonsregime for å indusere den nye immuniteten. Den humorale responsen kan også resultere i fra en iboende immunitet hvor vertsdyret har en naturlig pre-eksisterende immunitet, slik som en immunitet for a-galaktosylgrupper. Alternativt kan en passiv immunitet etableres ved å administrere antistoffer til vertsdyret slik som naturlige antistoffer samlet fra serum eller monoklonale antistoffer som kan eller ikke kan være genetiske konstruerte antistoffer, inkluderende humaniserte antistoffer. Benyttelsen av en bestemt mengde av et antistoffreagens for å utvikle en passiv immunitet og anvendelsen av et ligand-immunogenkonjugat hvor de passivt administrerte antistoffene er rettet til immunogenet, vil tilveiebringe fordelen av et standard sett av reagenser til anvendelse i tilfeller hvor en pasients pre-eksisterende antistofftiter til andre potensielle antigener ikke er terapeutisk anvendelig. De passivt administrerte antistoffene kan bli "koadministrert" med ligand-immunogenkonjugatet og koadministreringen er definert som administrering av antistoffer ved et tidspunkt før, ved det samme tidspunktet som før, eller ved et tidspunkt etterfølgende administrasjon av ligand-immunogenkonjungatet.

Det er overveiet at de pre-eksisterende antistoffer, induserte antistoffer eller passivt administrerte antistoffer vil bli redirigert til turmorcellene eller infeksiøse organismer ved fortrinnsberettiget binding av ligand-immunogenkonjungatene til disse invaderende cellene eller organismene, og at de patogene cellene vil bli drept ved komplementformidlet lysering, ADCC, antistoffavhengig fagocytose eller antistoff sammenknytting av reseptorer. Den cytotoksiske prosessen kan også involvere andre typer av immunresponser slik som celleformidlet immunitet, så vel som sekundære responser som oppstår når de tiltrakkede antigen presenterende cellene fagocyterer de uønskede cellene og presenterer naturlige tumorantigener eller antigener for fremmede patogener for immunsystemet for eliminering av cellene eller organismene bærende antigenene.

Minst en ytterligere sammensetning omfattende en terapeutisk faktor kan administreres til verten i kombinasjon eller som et hjelpemiddel til den ovenfor detaljerte metodologien for å forsterke den endogene immunresponsformidlede elimineringen av populasjonen av patogene celler, eller mer enn en ytterligere terapeutisk faktor kan bli administrert. Den terapeutiske faktoren kan velges fra en forbindelse i stand til å stimulere en endogen immunrespons, et kjemoterapeutisk middel, et antimikrobielt middel eller andre terapeutiske faktorer i stand til å komplementere effektiviteten til det administrerte ligand-immunogenkomplekset. Nevnte fremgangsmåte kan utføres ved å administrere til verten, i tillegg til de ovenfor beskrevne konjugatene, forbindelser eller sammensetninger i stand til å stimulere en endogen immunrespons, som for eksempel immuncellevekstfaktorer slik som interleukiner 1-18, stamcellefaktor, basal FGF, EGF, G-CSF, GM-CSF, FLK-2 ligand, HILDA, MIP-la, TFG a, TGF p, M-CSF, IFN a, IFN p, IFN y, løselig CD23, LIF og kombinasjoner derav.

Terapeutiske effektive kombinasjoner av disse cytokinene kan også bli benyttet. I en foretrukket utførelsesform, for eksempel terapeutiske effektive mengder av IL-2, for eksempel i mengder varierende fra omkring 5000 IU/dose/dag til omkring 500.000 IU/dose/dag i en daglig multipell dose regime og IFN-a, for eksempel i mengder varierende omkring 7500 IU/dose/dag til omkring 150.000 IU/dose/dag i en multipell daglig dose regime er benyttet sammen med folatbundet fluoresceinisotiocyanat for å eliminere patogene celler i et vertsdyr omfattende en slik populasjon av celler. IL-12 og IFN-a er mulig å benytte i terapeutisk effektive mengder, også IL-15 og IFN-a er mulig å benytte i terapeutisk effektive mengder. Videre kan IL-2, IFN-a eller IFN-y og GM-CSF benyttet i kombinasjon. Fortrinnsvis kan terapeutiske faktorer(er) benyttes, slike som IL-2, IL-12, IL-15, IFN-a, IFN-y og GM-CSF, inkluderende kombinasjoner derav, aktiv(e) naturlige drapsceller og/eller T-celler. Alternativt kan den terapeutiske faktoren eller kombinasjoner derav inkluderende et interleukin i kombinasjon med interferon og GM-CSF aktivere andre immuneffektorceller slik som makrofager, B-celler, neutrofiler, LAK-celler eller lignende. Enhver annen effektiv kombinasjon av cytokiner inkluderende kombinasjoner av andre interleukiner og interferoner og kolonistimulerende faktorer er også overveiet.

Kjemoterapeutiske midler som er cytotoksiske i seg selv og som kan virke for å forsterke tumorpermeabilitet, er egnet for anvendelse i tidligere nevnte fremgangsmåte, og inkluderer adrenokortikoider, alkylerende midler, antiandrogener, antiøstrogener, androgener, østrogener, antimetabolitter slik som cytosin arabinosid, purinanaloger, pyrimidinanaloger og metotraksat, busulfan, karboplatin, klorambucilin, cisplatin og andre platinaforbindelser, tamoksifen, taksol, cyklofosfamin, plantealkaloider, prednison, hydroksyurea, teniposid, antibiotika slik som mitomycin C og bleomycin, nitrogensenneper, nitrosureaer, vinkristin, vinblastin, inflammatoriske og proinflammatoriske midler og ethvert annet kjemoterapeutisk middel kjent innen fagfeltet. Andre terapeutiske midler som kan administreres sammen med administrasjonen av de foreliggende konjungatene inkluderer penicilliner, sefalosporiner, vankomycin, erytromycin, klindamycin, rifampin, kloramfenikol, aminoglykosider, gentamicin, amfotericin B, acyklovir, trifluridin, ganciklovir, zidovudin, amantadin, ribavirin og enhver annen antimikrobiell forbindelse kjent innen fagfeltet.

Elimineringen av populasjonen av patogene celler vil omfatte en reduksjon eller eliminering av tumormasse eller av patogene organismer resulterende i en terapeutisk respons. I tilfellet av en tumor kan elimineringen være en eliminering av celler hos primærtumoren eller av celler som har metastasert eller i prosessen av å dissosiere fra primærtumoren en profylaktisk behandling for å hindre tilbakekomst av en tumor etter dens fjerning ved enhver terapeutisk metode inkludert kirurgisk fjerning av tumoren, strålingsterapi, kjemoterapi eller biologisk terapi er også betraktet i overensstemmelse med denne oppfinnelsen. Den profylaktiske behandlingen kan være en initial behandling med ligand-immunogenkonjungatet slik som behandling i en daglig multipell dose regime og/eller kan være en tilleggsbehandling av serier av behandlinger etter et intervall av dager eller måneder etterfølgende initial behandling(er).

Det er også mulig å fremstille farmasøytiske sammensetninger omfattende en mengde av et ligand-immunogenkonjugat effektiv for å "merke" en populasjon av patogene celler i et vertsdyr for spesifikk eliminering ved en endogen immunrespons eller koadministrerte antistoffer. Sammensetningen omfatter videre en mengde av en ytterligere faktor effektiv til å forsterke elimineringen av de patogene cellene valgt fra gruppen bestående av et celledrapsmiddel, en tumorpenetreringsforsterker, et kjemoterapeutisk middel, et antimikrobielt middel, en cytotoksisk immuncelle og en forbindelse i stand til å stimulere en endogen immunrespons hvor forbindelsen ikke binder seg til ligand-immunogenkonjungatet. Den farmasøytiske sammensetningen inneholder terapeutiske effektive mengder av ligand-immunogenkonjugatet og den terapeutiske faktoren, faktoren kan omfatte et cytokin slik som IL-2, IL-12 eller IL-15 eller kombinasjoner av cytokiner inkluderende IL-2, IL-12 eller IL-15 og interferoner slik som IFN-a eller IFN-y og kombinasjoner av interferoner, interleukiner og kolonistimulerende faktorer slik som GM-CSF.

Den daglige enhetsdoseringen av ligand-immunogenkonjugatet kan variere signifikant avhengig av vertens tilstand, sykdomstilstanden som skal behandles, den molekylære vekten av konjugatet, dets administreringsmåte og vevsdistribusjon og muligheten av samtidig bruk av andre terapeutiske behandlinger, slik som strålingsterapi. Den effektive mengden som skal administreres til en pasient er basert på kroppsoverflatearealet, pasientvekt, og legens fastsettelse av pasientens tilstand. En effektiv dose kan variere fra omkring 1 ng/kg til omkring 1 mg/kg, eller fra omkring 1 ug/kg til omkring 500 ug/kg, eller fra omkring 1 ug/kg til omkring 100 ug/kg.

Ethvert effektivt regime for å administrere ligand-immunogenkonjugatet og den terapeutiske faktoren for å omdirigere pre-eksisterende antistoffer til tumorcellene eller infeksiøse organismer eller for å indusere en humoral respons til immunogenet, kan benyttes. For eksempel kan ligand-immunogenkonjungatet og terapeutisk faktor administreres som enkle doser, eller de kan deles opp og administrert som en daglig multipell dose regime. Videre kan et vekslende regime, som for eksempel en til tre dager per uke, benyttes som et alternativ til daglig behandling, slik avbrutt eller vekslende daglig regime er betraktet å være ekvivalent til daglig behandling. Det er mulig å behandle en vert med multiple injeksjoner av ligand-immunogenkonjungatet og den terapeutiske faktoren for å eliminere populasjonen av patogene celler. Verten injiseres mange ganger (fortrinnsvis omkring 2 til omkring 50 ganger) med ligand-immunogenkonjungatet, for eksempel ved 12-72 timers intervaller eller ved 48-72 timers intervaller. Ytterligere injeksjoner av liganden-immunogenkonjungatet kan administreres til pasienten ved et intervall på dager eller måneder etter den initiale injeksjonen(e) og tilleggsinjeksjonene hindrer tilbakefall av sykdom. Alternativt kan den initiale injeksjonen(e) av ligand-immunogenkonjungatet hindre tilbakefall av sykdom.

Den terapeutiske faktoren kan bli administrert til vertsdyret før, etter eller på samme tidspunkt som ligand-immunogenkonjungatet og den terapeutiske faktoren kan administreres som en del av den samme sammensetningen inneholdende konjungatet eller som del av en annen sammensetning enn ligand-immunogenkonjungatet. Enhver slik terapeutisk sammensetning inneholdende den terapeutiske faktoren og en terapeutisk effektiv dose kan benyttes. I tillegg kan mer enn en type av ligand-immunogenkonjungat benyttes. For eksempel kan vertsdyret bli preimmunisert med både fluoresceininsotiocyanat og dinitrofenyl og deretter behandlet med fluoresceinisotiocyanat og dinitrofenyl bundet til det samme eller ulike ligander i en ko-doseringsprotokoll. I tilfellet av kjemoterapeutiske og antimikrobielle midler kan den terapeutiske faktoren bli administrert ved en suboptimal dose sammen med ligand-immunogenkonjungatet i en kombiansjonsterapi for å unngå utvikling av resistens for det kjemoterapeutiske eller antimikrobielle middelet hos vertsdyret.

Ligand-immunogenkonjungatet og den terapeutiske faktoren injiseres fortrinnsvis parenteralt, slike injeksjoner kan være intraperitonealinjeksjoner, subkutane injeksjoner, intramuskulære injeksjoner, intravenøse injeksjoner eller intratekalinjeksjoner. Ligand-immunogenkonjungatet og den terapeutiske faktoren kan også bli levert ved å benytte en sakte pumpe. Eksempler på parenterale doseringsformer i følge foreliggende oppfinnelse inkluderer vandige løsninger av det aktive middelet i en isoton saltoppløsning, 5% glukose eller andre vel kjente farmasøytiske akseptable væskebærere slik som alkoholløsninger, glykoler, estere og amider.

Parenteraldoseringsformen i overensstemmelse med denne oppfinnelsen kan være i formen av et rekondisjonerbart lyofilisat omfattende dosen av ligand-immunogenkonjungatet og terapeutisk faktor. IEnhver av et antall av forlengede frigjøringsdoseringsformer kjent innen fagfeltet kan administreres slik som, for eksempel biodegraderbare karbohydrat matrixene beskrevet i US patentnr.: 4,713,249, 5,266,333 og 5,417,982.

Under følger eksempler og referanseksempler

EKSEMPEL 1

Effekt av folat-fluoresceinisotiocyanatkonjungater på overlevelse av mus med lungetumorimplantater

6 til 8 uker gamle (~20-22 gram) Balb/c hunnmus ble immunisert subkutant multiple steder med fluoresceinisotiocyanat (FITC)-merket bovint serumalbumin (BSA) ved å benytte et kommersielt hjelpemiddel (f.eks. Freuds adjuvant eller Titer Max-Gold). Etter forsikring om at anti-FITC-antistofftiter var høy i alle mus (som bevist ved resultatene av ELISA-tester av serumprøver av musene), ble hvert dyr injisert intraperitonealt med 5 x IO<5>M109 celler, en syngen lungecancercellelinje som uttrykker høye nivåer av folatreseptoren. Cancerstedene ble så tillatt å feste seg og vokse. Ved 4 og 7 dager etter cancercelleimplantering, ble alle dyrene injisert intraperitonealt med enten fosfat bufret saltoppløsning (PBS) eller en spesifikk mengde av FITC-konjugert til folsyre via en y-karboksylbundet etylendiaminbro. Konsentrasjonene av folat-FITC injisert var 0 (PBS-kontroll), 4,5, 45, 450 og 4500 nmol/kg og 8 mus ble injisert for hver folat-FITC-konsentrasjon for en total av 40 dyr injisert. En serie av 5 daglige injeksjoner (dagene 8 tom 12) av 5000IU av rekombinant human IL-2 ble så administrert til alle musene for å stimulere immunsystemet. Effektiviteten av denne immunoterapien ble så evaluert ved å monitorere overlevelse som en funksjon av tid av folat-FITC-behandlede mus sammenlignet med kontrolldyr. Som vist i fig. 1 var median overlevelse av mus behandlet med folat-FITC doseavhengig med kontrollmus oppnående en medianoverlevelse på 23 dager etter tumorimplantering og folat-FITC mus overlevende tiltagende lenger ettersom dosen av konjungatet ble økt. Så lite som 45 nmol/kg av folat-FITC var i stand til å fremme langtidsoverlevelse av mus med høyere doser værende proporsjonalt mer effektive. Selv om folat-FITC ble funnet å konsentreres i tumorer, var noe folat-FITC tilstede i nyrevev (men ikke i sammenlignbare nivåer i andre normale vev). Ingen nyre eller normal organtoksisitet ble detektert i obduksjonsundersøkelser av en godkjent veterinærpatolog.

EKSEMPEL 2

Avbilding av normalt kontratumorvev med folat konjugert til fluoresceinisotiocyanat

Prosedyrene var lignende dem beskrevet i Eksempel 1 unntatt at dyrene ble injisert med 24 JK-FBP tumorceller, og mus ble avlivet kort tid etter injeksjon med folat-FITC, og vev ble snittet tynt og eksaminert ved FITC immunofluorescens ved å benytte konfokal fluorescens mikroskopi for lokalisering av folat-FITC i bestemte vev inkluderende tumor, nyre, lever og muskelvev. Fig. 2 viser fasekontrast mikrografer av de ulike vevsskivene som kontroller sammen med fluorescensmikrografene. Folat-FITC ble funnet å være lokalisert spesifikt i tumorvev og i nyreproksimal tubuliceller hvor reseptorer for folsyre er unikt i overflod.

EKSEMPEL 3

Avbilding av tumorvev med folatkonjugert til fluoresceinisotiocyanat eller med fykoerytrin-merket geit anti-mus IgG

Prosedyrene var lignende til dem beskrevet i Eksempel 2 med unntak av at M109-celler var benyttet, og vev ble eksaminert ved FITC-fiuorescens (grønne bilder) og fykoerytrin (PE) fluorescens (rød bilder). For PE-fluorescens var det fluorescerende merket bundet til geit anti-mus IgG-antistoffer for benyttelse i å detektere binding av endogene muse-anti-FITC-antistoffer til folat-FITC-konjungatet som akkumuleres på tumorcellene. Folat-FITC-behandlede og ubehandlede tumorvev ble sammenlignet, og begge typer av prøver ble også eksaminert ved fase-kontrast mikroskopi som beskrevet i Eksempel 2. FITC-fluorescensen demonstrerer lokalisering av folat-FITC til tumorvev (fig. 3). PE-fluorescensen demonstrerer at endogene muse-anti-FITC-antistoffer bundet til folat-FITC-konjungater er lokalisert til tumorceller. Andre studier (ikke vist) demonstrerte mangelen av slik IgG-binding til normale vev, inkluderende nyre. Fraværet av antistoffbinding til folat-FITC lokalisert i nyrevev oppstår fra det faktum at hvis folatreseptoren er på den appikale membranen til nyreproksimal tubulicellene får ikke antistoffene tilgang til den regionen av nyren. Fasekontrastbildene (transmitterte bilder) viser morfologien av behandlede og ubehandlede tumorvev, avslørende døden av celler i de behandlede prøvene.

EKSEMPEL 4

Effekt av folat fluoresceinisotiocyanatkonjungater på vekst av solide tumorer Prosedyrene var lignende til dem beskrevet i Eksempel 1 med unntak av at hvert dyr ble injisert subkutant i skulderen med 1 x IO<6>M109-celler (dag 0) etterfølgende tidligere immunisering med FITC. Immuniseringene med folat-FITC etter tumorcelleimplantering bestod av 1500 nmol/kg av folat-FITC gitt i 6 intraperitoneale doser ved 48 timers intervaller (dager 7, 9,11,13,15 og 17). De resulterende solide skuldertumorene ble målt og prosent økning i tumorstørrelse ble bestemt. Tumorvekstkurvene avbildet i fig. 4 viser at veksten av solide tumorer var signifikant inhibert når dyrene ble behandlet med folat-FITC i kombinasjon med IL-2.

EKSEMPEL 5

Effekt av behandling med kombinasjoner med cytokiner

Prosedyrene var lignende dem beskrevet i Eksempel 1 med unntak av at dyrene ble behandlet med 5 daglige injeksjoner (dagene 8 tom 12) av 5000IU av rekombinant human IL-2 sammen med enten IFN-a (5 daglige injeksjoner av 2,5 x IO<4>U/dag), IL-12 (5 daglige injeksjoner av 0,5 ug/dag), eller TNF-a (3 injeksjoner ved dag 8,10 og 12 på 2 ug/dag) følgende injeksjon med 2 doser av 1500 nmol/kg av folat-FITC eller aminofluoresein på dagene 4 og 7 etter tumorcelleimplantering. Videre, i et forsøk på å redusere tiden nødvendig for å oppnå langtids overlevelsesdata, ble tumorcellene implantert peritonealt nærme leveren. Derfor var levetiden for tumorbærende mus generelt forkortet sammenlignet til det vist i Eksempel 1. Resultatene vist i fig. 5 demonstrerer at IL-2 alene var mer effektiv i å fremme langtidsoverlevelse av dyr enn kombinasjonsbehandling med IL-2 og IL-12, eller med IL-2 og TNF-a. I kontrast var kombinasjonsbehandling med IL-2 og IFN-a mer effektiv i å fremme langtidsoverlevelse enn IL-2 alene. Aminofluorescein ble injisert sammen med de ulike cytokinkombinasjonene som en kontroll fordi denne forbindelsen er ikke bundet til folat og vil ikke remålsøke antifiuoreseinantistoffer til tumorceller.

EKSEMPEL 6

Effekt av multiple injeksjoner med folatfluoresceinisotiocyanatkonjungater Prosedyrene var lignende dem beskrevet i Eksempel 1 med unntak av at dyrene ble injisert intraperitonealt ved 48-timers intervaller med 6 daglige injeksjoner (dagene 7, 9, 11, 13, 15 og 17 etter tumorcelleimplantering) av 1500 nmol/kg av folat-FITC. Resultatene viser (fig.6) at multiple injeksjoner med folat-FITC forbedret langtidsoverlevelse av dyr behandlet med folat-FITC og IL-2 sammenlignet med to injeksjoner av folat-FITC gitt ved dagene 4 og 7 etter tumorcelleimplantering.

EKSEMPEL 7

Synergistisk effekt av folatfluoresceinisotiocyanatkonjungater og IL-2 Prosedyrene var lignende dem beskrevet i Eksempel 1 med unntak av at dyrene ble injisert med 1500 nmol/kg av folat-FITC og noen dyr ble behandlet med enten folat-FITC eller IL-2 alene. Videre ble tumorcellene implantert intraperitonealt som beskrevet i Eksempel 5. Dette eksperimentet (se fig. 7) ble utført for å bestemme hvorvidt folat-FITC og IL-2 virker synergistisk for å fremme langtidsoverlevelse av tumorbærende mus. Medianoverlevelsestider for kontrollgruppen (n = 8) og gruppene (n = 8) behandlet med IL-2, folat-FITC eller folat-FITC + IL-2 var henholdsvis 18, 19, 22 og 42 dager. Resultatene vist i fig. 7 viste at kapasiteten av folat-FITC og IL-2 for å fremme langtidsoverlevelse av tumorbærende mus er sterkt synergistisk med lav dose IL-2 alene som har en ubetydelig effekt på overlevelsen av musene i fraværet av folat-FITC og med folat-FITC som bare har en mindre effekt.

EKSEMPEL 8

NK-Celleinvolvering i den synergistiske effekten av

folatflouresceinisotiocyanatkonjungater og IL-2

Prosedyrene var lignende dem beskrevet i Eksempel 7 med unntak av at en gruppe av dyr ble behandlet med polyklonale kanin anti-mus NK-celle antistoffer (anti-asialo GM1; Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Richmond, Va) i kombinasjon med folat-FITC og IL-2. Hver mus ble injisert med 0,2 ml av en 1:10 fortynning av antistoff stamløsningen på dagene 1, 4, 9 og 14 etter tumorimplantering for å oppnå NK-celleutarming. Median overlevelsestider for kontrollgruppen og gruppene behandlet med folat-FITC + IL-2 eller folat-FITC + IL-2 + a-NK Ab var henholdsvis 18,42 og 18,5 dager. Resultatene vist i fig. 8 demonstrerer at NK-celler formidler den synergistiske forhøyelsen av langdtidsoverlevelse hos tumorbærende mus forårsaket ved kombinasjonsbehandling med folat-FITC og IL-2.

EKSEMPEL 9

Utvikling av cellulær immunitet mot M109 tumorceller

Prosedyrene var lignende dem beskrevet i Eksempel 1 med unntak av at tumorcellene ble implantert intraperitonealt i posisjonen beskrevet i Eksempel 5 og dyrene ble injisert med PBS (kontroll) eller ko-injisert med folat-FITC (1500 nmol/kg), IL-2 (250.000 IU/dose) og IFN-a (25000 U/dose) på dagene 7, 8, 9,11 og 14 etter tumorcelleimplantering. I tillegg ble dyrene utfordret ved injeksjon av 5 x 10<5>M109-celler på dag 62 etter initial tumorcelleimplantering, ved injeksjon av 1,5 x IO<6>M109- celler på dag 96 etter initial tumorcelleimplantering eller ved injeksjon av 2,5 x IO<5>Line 1 celler (en Balb/c spontan lungekarcinom) på dag 127 etter initial tumorcelleimplantering.

Som vist i fig. 9 var den mediane overlevelsestiden for kontrollmus injisert med 5 x IO<5>M109-celler 18,5 dager, den mediane overlevelsestiden for kontrollmus injisert med 1,5 x 10<6>M109-celler var 18 dager. Den mediane overlevelsestiden for kontrollmus injisert med 2,5 x IO<5>Line 1 celler var 23,5 dager. Den mediane overlevelsestiden for kontrollmus injisert med 5 x IO<5>M109-celler behandlet med folat-FITC i kombinasjon med IL-2 og IFN-a utfordret på dag 62 med 5 x IO<5>M109-celler, utfordret på dag 96 med 1,5 x IO<6>M109-celler og utfordret på dag 127 med 2,5 x IO<5>Line 1 celler var større enn 192 dager.

Resultatene vist i fig. 9 demonstrerte utviklingen av en langvarig celletypespesifikk cellulær immunitet i dyrene behandlet med folat-FITC i kombinasjon med IL-2 og IFN-a. Denne langvarige immuniteten beskyttet dyrene implantert med M109-celler og mottagende folatmålrettet immunoterpi fra gjentagelsen av sykdom ved utfordring ved en senere injeksjon med M109-celler. Overlevelsestiden i disse dyrene etter den endelige utfordringen med Line 1 celler kan være på grunn av tilstedeværelsen av folatreseptorer på Line 1 celler ved lavere nivåer enn på M109-celler og på grunn av tilstedeværelsen av tumorantigener delt mellom M109-celler og Line 1 celler resulterende i en M109-spesifik cellulær immunrespons i stand til å krysstale med Line 1 celler.

EKSEMPEL 10

Effekt av IL-2 dose på overlevelse hos mus behandlet med folat-fluoresceinisotiocyanatkonjungater

Prosedyrene var lignende dem beskrevet i Eksempel 1 med unntak av at tumorcellene ble implantert intraperitonealt i posisjonen beskrevet i Eksempel 5, og dyrene ble behandlet med PBS (kontroll) eller ble koinjisert med folat-FITC (1500 nmol/kg) og IL-2 ved doser av 5 x IO<3>IU (lx), 0,5 x 10<5>IU (10x), 2,5 x 10<5>IU (50x) eller 5 x 10<5>IU (lOOx) på dagene 7, 8, 9,11 og 14 etter tumorcelleimplantering. I tillegg ble dyrene immunisert med en FITC-merket "keyhole limpit hemocyanin" (KLH) fremfor FITC-merket BSA. Som vist i Fig. 10 økte den mediane overlevelsestiden hos mus implantert med M109-celler og behandlet med folat-FITC med økende IL-2 dose over en IL-2 dose på 5 x 10 IU. I kontrakt ble ingen vesentlig forskjell sett mellom de mediane overlevelsestidene hos kontrollmus (mus injisert med M109-celler og behandlet med PBS) og mus behandlet med IL-2 alene.

EKSEMPEL 11

IFN-a forhøyning av overlevelse hos mus behandlet med folat-fluoresceinisotiocyanatkonjungater og IL-2

Prosedyrene var lignende dem beskrevet i Eksempel 1 med unntak av at tumorcellene ble implantert intraperitonealt i posisjonen beskrevet i Eksempel 5 og dyrene ble behandlet med PBS (kontroll) eller ble koinjisert med folat-FITC (1500 nmol/kg) og IL-2 (5000 IU/dose) eller folat-FITC (1500 nmol/kg), IL-2 (5000 IU/dose) og IFN-a (25000 U/dose) ved dagene 7, 8, 9, 11 og 14 etter tumorcelle implantering. En ytterligere gruppe av mus ble koinjisert med folat-FITC, IL-2 og IFN-a, men dyrene var ikke preimmunisert med BSA-FITC. Fig. 11 viser at den mediane overlevelsestiden for kontrollmus behandlet med PBS var 18,5 dager, den mediane overlevelsestiden for mus koinjisert med folat-FITC og IL-2 var 20,5 dager, den mediane overlevelsestiden for mus koinjisert med folat-FITC, IL-2 og IFN-a var større enn 60 dager, og den mediane overlevelsestiden for mus koinjisert med et folat-FITC, IL-2 og IFN-a, men ikke preimmunisert var 24,3 dager. Den mediane overlevelsestiden for mus injisert med folat-FITC og IL-2 var ikke vesentlig forskjellig enn for kontrollmus fordi musene ble injisert med 5000 IU av IL-2 og som beskrevet i Eksempel 10, IL-2 doser på mer enn 5000 IU er nødvendig for å øke den mediane overlevelsestiden hos mus behandlet med folat-FITC ved å benytte kuren av dager 7, 8, 9,11 og 14. Resultatene vist i fig. 11 demonstrer at IFN-a ytterligere forsterker økningen i median overlevelsestid som foregår som et resultat av behandling av mus implantert med tumorceller med folat-FITC og IL-2.

EKSEMPEL 12

Effekt av utarming av CD8<+>T-celler på folat-målrettet immunoterapi Prosedyrene var lignende dem beskrevet i Eksempel 1 med unntak av at tumorcellene ble implantert intraperitonealt i posisjonen beskrevet i Eksempel 5, og dyrene ble injisert med PBS (kontroll) eller koinjisert med folat-FITC (1500 nmol/kg), IL-2 (5000 IU/dose) og IFN-a (25000 U/dose) på dagene 7, 8, 9,11 og 14 etter tumorcelleimplantering. Tilleggsgrupper av mus ble koinjisert med aminofluorescein (1500 nmol/kg), IL-2, og IFN-a eller med folat-FITC, IL-2, INF-a og anti-CD8<+>T-celle antistoff (i formen av acites og administrert på dagene 2, 3, 7, 11 og 15). Som vist i fig. 12 inhiberer anti-CD8<+>T-celle antistoffet økningen i gjennomsnitts overlevelsestid hos mus behandlet med folat-FITC, IL-2 og IFN-a indikerende at CD8<+>T-celler spiller en rolle i aktiveringen av den cellulære immunresponsen ved folatmålrettet immunoterapi. Aminofluorescein ble injisert sammen med IL-2, IFN-a cytokinkombinasjonen som en kontroll fordi denne forbindelsen er ikke bundet til folat og vil ikke remålrette anti-fluorescein antistoffer til tumorceller. Fig. 12 viser at aminofluorescein sammen med IL-2 og IFN-a er mye mindre effektiv enn folat FITC, IL-2 og IFN-a i å øke den mediane overlevelsestiden hos mus implantert med Ml 09-celler.

EKSEMPEL 13

Forsterkende effekt av GM-CSF på folatmålrettet immunoterapi forsterket ved IL-2 og IFN-a

Prosedyrene var lignende dem beskrevet i Eksempel 1 med unntak av at tumorcellene ble implantert intraperitonealt i posisjonen beskrevet i Eksempel 5.1 tillegg, som indikert i fig. 13, ble dyrene injisert med multiple cytokiner inkluderende IL-2 (5000 IU/dose), IFN-a (25000 U/dose) og GM-CSF (3000 U/dose). Cytokinene ble koinjisert i en serie av 5 daglige injeksjoner på dagene 8 til 12 etter M109 celleimplantering som var etterfølgende injeksjon med 2 doser av 1500 nmol/kg av folat-FITC på dagene 4 og 7. Resultatene avbildet i fig. 13 viser at den mediane overlevelsestiden for mus behandlet med PBS var 19 dager, den mediane overlevelsestiden for mus injisert med IL-2, IFN-a og GM-CSF uten folat-FITC var 22 dager, den mediane overlevelsestiden for mus injisert med et folat-FITC, IL-2 og IFN-a var 38 dager, og den mediane overlevelsestiden for mus injisert med folat-FITC, IL-2, IFN-a og GM-CSF var større enn 57,5 dager. Disse resultatene demonstrer at GM-CSF ytterligere forsterker folatmålrettet tumorcelledrap hos mus også behandlet med IL-2 og IFN-a. Den mediane overlevelsestiden for mus injisert med PBS, IL-2, IFN-a og GM-CSF var ikke signifikant forskjellig fra kontrollmus indikerende viktigheten av å målrette en tumorspesifikk immunrespons ved å benytte folat-FITC.

EKSEMPEL 14

Effekt av IFN-a dose på overlevelse av mus behandlet med folat-fluoresceinisotiocyanatkonjungater

Prosedyrene var lignende dem beskrevet i Eksempel 1 med unntak av at tumorcellene ble implantert intraperitonealt i posisjonen beskrevet i Eksempel 5, og dyrene ble behandlet med PBS (kontroll) eller ble koinjisert med folat-FITC (1500 nmol/kg) og IFN-a ved doser på 1,5 x 10<5>IU/dose (6x), 7,5 x 10<4>IU/dose (3x), 2,5 x IO4 IU/dose (lx) og 7,5 x IO3 IU/dose (0,3x). I tillegg ble dyrene immunisert med FITC-merket "keyhole limpit hemocyanin" (KLH) fremfor FITC-merket BSA, og dyrene ble injisert med folat-FITC og IFN-a på dagene 7, 8, 9,11 og 14 etter tumorcelleimplantering. Som vist i fig. 14 økte den mediane overlevelsestiden for mus implantert med M109-celler og behandlet med folat-FITC med økende IFN-a-dose over en IFN-a-dose på 0,8 x 10<4>IU/dose.

EKSEMPEL 15

Effekt av dinitrofenyl som immunogenet på folatmålrettet immunoterapi Prosedyrene var lignende dem beskrevet i Eksempel 1 med unntak av at tumorcellene ble implantert intraperitonealt i posisjonen beskrevet i Eksempel 5, og dyrene ble behandlet med PBS (kontroll) eller ble koinjisert med dinitrofenyl (DNP) (1500 nmol/kg), IL-2 (5000 IU/dose/dag) og IFN-a (2,5 x IO<4>enheter/dag) eller med folat-dinitrofenyl (DNP) (1500 nmol/kg), IL-2 (5000 IU/dose/dag) og IFN-a (2,5 x IO<4>enheter/dag) ved dagene 7, 8,9, 11 og 14 etter tumorcelleimplantering. I tillegg ble dyrene immunisert med DMP-merket "keyhole limpit hemocyanin" (KLH). Som vist i fig. 15 var den mediane overlevelsestiden hos mus behandlet med folat-DNP, IL-2 og IFN-a økt relativ til kontrollmus (behandlet med PBS) eller mus behandlet med DNP, IL-2 og IFN-a. Derfor er DNP også et effektivt immunogen for anvendelse i folat-målrettet immunoterapi.

EKSEMPEL 16

Synergistisk effekt av folat-flouresceinisotiocyanatkonjungater og IFN-a Prosedyrene var lignende dem beskrevet i Eksempel 1 med unntak av at tumorcellene ble implatert intraperitonealt i posisjonen beskrevet i Eksempel 5, og dyrene ble behandlet med PBS (kontroll), IFN-a alene (7,5 x IO4 enheter/dag), folat-FITC alene (1500 nmol/kg) eller ble koinjisert med folat-FITC (1500 nmol/kg) og IFN-a (7,5 x IO<4>enheter/dag) ved dagene 7, 8, 9,11 og 14 etter tumorcelleimplantering. I tillegg ble dyrene (5 mus per gruppe) immunisert med en FITC-merket "keyhole limpit hemocyanin" (KLH) fremfor FITC-merket BSA. Som vist i fig. 16 var de mediane overlevelsestidene for gruppene behandlet med PBS (kontroll), IFN-a, folat-FITC eller folat-FITC + IFN-a henholdsvis 17, 17,23 og 33 dager. Disse resultatene viser at IFN-a, som IL-2 virker synergistisk med folat-FITC for å fremme langtidsoverlevelse hos tumorbærende mus.

EKSEMPEL 17

Effekt av dinitrofenyl som immunogenet og cytokiner ved høye konsentrasjoner på langtidsoverlevelse hos mus

Prosedyrene var lignende dem som beskrevet i Eksempel 1 med unntak av at tumorcellene ble implantert intraperitonealt i posisjonen beskrevet i Eksempel 5 og musene ble behandlet med PBS (kontroll) eller ble koinjisert med PBS, IL-2 (2,5 x IO<5>enheter/dag) og IFN-a (7,5 x IO<4>enheter/dag) eller med folat-dinitrofenyl (DNP)

(1500 nmol/kg), IL-2 (2,5 x 10<5>enheter/dag) og IFN-a (7,5 x IO<4>enheter/dag) ved dagene 7, 8, 9, 11 og 14 etter tumorcelleimplantering. I tillegg ble dyrene immunisert med DNP-merket "keyhole limpit hemocyanin" (KLH). Som vist i fig. 17 var den mediane overlevelsestiden hos mus behandlet med folat-DNP, IL-2 og IFN-a økt relativt til kontrollmus (behandlet med PBS) eller mus behandlet med PBS, IL-2 og IFN-a. Musene behandlet med folat-DNP, IL-2 og IFN-a (med IL-2 og IFN-a ved konsentrasjoner på henholdsvis 2,5 x 10<5>enheter/dag og 7,5 x IO<4>enheter/dag) ble totalt kurert.

Claims (3)

1. Sammensetning,karakterisert vedat den omfatter fluoresceinisotiocyanat (FITC) konjugert til folsyre via en y-karboksylbundet etylendiaminbro og en farmasøytisk akseptabel væskebærer.

2. Sammensetning ifølge krav 1,karakterisert vedat nevnte sammensetning er i en parenteral doseringsform.

3. Sammensetning ifølge krav 1 eller krav 2,karakterisertv e d at nevnte farmasøytisk akseptable væskebærer er valgt fra isoton saltløsning, 5 % glukose, væske alkoholer, væske glykoler, væske estere og væske amider.