KR20020087431A - 리간드-면역원 접합체를 사용한 치료 방법 - Google Patents

리간드-면역원 접합체를 사용한 치료 방법 Download PDF

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Abstract

숙주 동물에서, 특정 리간드에 대한 결합 부위를 우선적으로 발현하거나, 유일하게 발현하거나 또는 과다발현하는 병원성 세포로서 이 병원성 세포 집단의 내인성 면역 반응-매개 제거를 증진시키기 위한 방법 및 제약학적 조성물이 제공된다. 본 발명은 면역원에 접합된 리간드를 병원성 세포 집단을 함유한 숙주 동물에 투여하는 것을 포함한다. 면역원에 대항하여 작용하는, 기존의 항체 또는 수동 면역을 이루기 위해 숙주 동물에 투여된 항체가 리간드-면역원 접합체에 결합하고, 그 결과 숙주의 면역 반응에 의해 병원성 세포가 제거된다. 세포 사멸제, 종양 침투 증진제, 화학요법제, 항균제, 세포독성 면역 세포, 및 내인성 면역 반응을 자극할 수 있고 리간드-면역원 접합체에 결합하지 않는 화합물로 구성된 군에서 선택되는, 적어도 하나의 추가의 치료 인자를 투여한다.

Description

리간드-면역원 접합체를 사용한 치료 방법{METHOD OF TREATMENT USING LIGAND-IMMUNOGEN CONJUGATES}
본 발명은 병원성 세포 집단의 존재를 특징으로 하는 질병 상태를 치료하는데 사용하기 위한 방법 및 제약학적 조성물에 관한 것이다. 더욱 특별하게는, 병원성 세포에 대한 숙주 면역 반응을 증진시키고/시키거나 재명령하기 위하여, 세포를 표적으로 하는 리간드-면역원 복합체를 바람직하게는 면역 체계 자극제 또는 기타 치료 인자와 함께 질병에 걸린 숙주에 투여한다.
배경기술 및 발명의 요약
포유류 면역 체계는 종양 세포, 기타 병원성 세포 및 침입 외래 병원체의 인식 및 제거를 위한 수단을 제공한다. 면역 체계는 통상 강력한 방어선을 제공하지만, 암세포, 기타 병원성 세포 또는 감염성 인자가 숙주 면역 반응을 피하고, 공존하는 숙주 병원성과 함께 증식하거나 지속되는 경우가 여전히 많이 존재한다. 복제 신생물을 없애기 위해 화학요법제 및 방사선 요법이 개발되어 왔다. 그러나, 모두 그런 것은 아니지만, 통상적으로 입수가능한 화학요법제 및 방사선요법 섭생의 대부분은, 암 세포를 파괴하는 작용을 할 뿐만 아니라 조혈 체계의 세포와 같은 정상 숙주 세포에 영향을 미치기 때문에 불리한 부작용을 갖는다. 또한, 숙주 약물 내성이 발현되는 경우에는 화학요법제가 제한된 효능을 갖는다.
컴피턴트 면역 반응을 피함으로써, 또는 약물 요법이나 기타 건강상의 문제로 인해 숙주 면역 체계가 손상을 받은 경우에, 외래 병원체가 숙주에서 증식할 수 있다. 다수의 치료 화합물이 개발되어 왔지만, 많은 병원체들은 이러한 치료법에 대해 내성이거나 내성이 되었다. 암세포 및 감염성 유기체가 치료제에 대한 내성을 발현하는 능력과, 통상적으로 입수가능한 항암제의 부작용으로 인해, 낮은 숙주 독성과 함께 병원성 세포 집단에 대해 특이적인 새로운 치료법의 개발이 강력히 요구되고 있다.
연구자들은, 세포독성 화합물을 암세포에 대해 특이적으로 표적화함으로써 암세포를 파괴하기 위한 치료 프로토콜을 개발하였다. 이러한 프로토콜은, 정상 세포로의 독소 전달을 최소화하기 위한 시도에서, 암세포에 대해 특유하거나 암세포에 의해 과다발현된 수용체에 결합하는 리간드에 접합된 독소를 이용한다. 이러한 접근법을 사용하여, 병원성 세포 위의 특정한 수용체에 작용하는 항체로 구성된 면역 독소가 개발되었으며, 상기 항체는 리신, 슈도모나스 외독소, 디프테리아 독소 및 종양 괴사 인자와 같은 독소에 연결된다. 이러한 면역독소는 항체에 의해 인식되는 특정한 수용체를 함유한 종양 세포를 표적으로 한다 [Olsnes, S., Immunol. Today, 10, pp.291-295, 1989; Melby,E.L., Cancer Res., 53(8), pp.1755-1760, 1993; Better, M.D., PCT 공개 번호 WO91/07418호, 1991년 5월 30일].
숙주내에서 암세포 또는 외래 병원체 집단을 선택적으로 표적화하기 위한 다른 접근법은 병원성 세포에 대항한 숙주 면역 반응을 증진시키는 것이고, 이에 의해 독립적인 숙주 독성을 나타낼 수도 있는 화합물의 투여 필요성을 없앨 수 있다. 면역요법을 위해 보고된 하나의 방법은, 항체, 예를들어 유전자 조작된 다중체 항체를 종양 세포 표면에 결합시켜 세포 표면 위에 항체의 항상부를 나타내고 이에 의해 다양한 면역 체계 매개 과정에 의해 종양 세포 사멸을 유도하는 것이다. [De Vita, V.T., Biologic Therapy of Cancer, 제2판, 림핀코트 필라델피아, 1995; Soulillou, J.P., 미국 특허 5,672,486]. 그러나, 이러한 접근법은 종양-특이적 항원을 한정함에 있어서의 어려움으로 인해 복잡해졌다. 숙주 면역 적격성에 의존하는 다른 접근법은, 면역 세포가 종양에 직접 결합하는 것을 촉진하기 위해, 항-T 세포 수용체 항체 또는 항-Fc 수용체 항체를 종양 세포 표면에 표적화하는 것이다 [Kranz, D.M. 미국 특허 5,547,668호]. 사이토카인에 융합되는 항원을 포함한 백신에 의존하는, 백신-기초 접근법이 또한 기재되어 있으며, 상기 사이토카인은 백신 항원의 면역원성을 변성시키고 따라서 병원성 인자에 대한 면역 반응을 자극한다 [Phillai,S., PCT 공개 번호 WO91/11146호, 1991년 2월 7일 공개]. 이 방법은 보고된 면역 반응의 간접적인 변조를 근거로 한다. 원하지 않는 세포 집단을 사멸시키기 위한 다른 접근법은, 항원에 연결된 항-흉선세포 글로블린의 IL-2 또는 Fab 단편을 이용하여 원하지 않는 T 세포를 제거하는 것이다; 그러나, 보고된 실험 데이타를 기초로 할때, 이 방법은 표적화 세포 집단의 단지 50% 만을 제거하는 것으로 보이고, 생체내에서 비특이적 세포 사멸을 일으킨다 (다시말해서, T세포가 아닌 말초혈액 림프구의 50%가 또한 사멸된다 [Pouletty,P., PCT 공개 번호 WO97/37690호, 1997년 10월 16일 공개]). 따라서, 감염된 숙주에서 병원성 세포 집단의 존재를 특징으로 하는 질병 상태를 치료하는데 작용하는 치료법이 여전히 요구되고 있다.
본 발명은, 병원성 세포 집단의 숙주 면역 체계 인식 및 이러한 세포 집단에 대한 반응을 증가시킴으로써, 숙주내에서 병원성 세포 집단을 제거하는 방법에 관한 것이다. 효과적으로, 내인성 면역 반응에 의해 매개된 병원성 세포 집단의 제거를 향상시키기 위해 세포 병원체의 항원성을 증가시킨다. 이 방법은 세포독성 또는 항균 치료제의 사용을 피하거나 최소화한다. 이 방법은 리간드-면역원 접합체의 투여를 포함하며, 여기에서 리간드는 생체내에서 리간드 결합 잔기를 유일하게 발현하거나, 우선적으로 발현하거나 또는 과다발현하는 병원성 세포 집단에 특이적으로 결합할 수 있고, 리간드 접합된 면역원은 항체 생성을 유도할 수 있거나 더욱 바람직하게는 숙주 동물내에서 내인성 또는 공동-투여된 외인성 항체에 의해 인식될 수 있다. 면역 체계에 의해 매개되는 병원성 세포의 제거는, 병원성 세포에 의해 유일하게 발현되거나, 과다발현되거나 또는 우선적으로 발현되는 수용체, 운반체 또는 기타 표면에 존재하는 단백질에 면역원-접합 리간드를 결합시킴으로써 이루어진다. 병원성 세포에 의해 유일하게 발현되거나, 과다발현되거나 또는 우선적으로 발현되는 표면-존재 단백질은, 비-병원성 세포 위에는 존재하지 않거나 소량 존재하는 수용체이며, 병원성 세포의 선택적 제거 수단을 제공한다. 치료 효능을 향상시키기 위하여, 적어도 하나의 추가의 치료 인자, 예를들어 면역 체계 자극제, 세포 사멸제, 종양 침투 증진제, 화학요법제, 세포독성 면역 세포 또는 항균제를 숙주 동물에 공동-투여할 수도 있다.
하나의 실시양태에서, 본 발명의 방법은, 표적화된 병원체 세포 집단 위에서 유일하게 발현되거나, 우선적으로 발현되거나 또는 과다발현된 세포 표면 단백질에 생체내에서 고 친화력 특이적 결합할 수 있는 리간드로서, 숙주 동물에서 이에 대항한 선천성 또는 후천성 면역이 이미 존재하거나 또는 유도될 수 있는 면역원에 접합되는 리간드를 투여하고, 임의로 내인성 면역 반응 활성화제 또는 세포독성 화합물인 적어도 하나의 치료 인자를 공동-투여하는 단계를 포함한다. 하나의 바람직한 실시양태에서, 방법은 리간드-면역원 접합체 조성물을 숙주 동물에 투여하는 것을 포함하고, 이때 리간드는 엽산 또는 다른 엽산염 수용체 결합 리간드이다. 리간드는, 예를들어 공유 결합에 의해, 숙주 세포에서 항체 반응을 유도할 수 있는 면역원, 또는 더욱 바람직하게는 숙주 동물에서 기존의 내인성 항체 (선천성 또는 후천성 면역의 결과) 또는 공동-투여된 항체 (다시말해서, 수동 면역화를 통해)에 결합할 수 있는 면역원에 접합된다. 리간드-면역원 복합체에 특이적 결합할 수 없지만 내인성 면역 반응을 자극 또는 증진시킬 수 있는 적어도 하나의 추가의 치료 인자, 세포 사멸제, 종양 침투 증진제, 예컨대 염증성 또는 전염증성 약제, 화학요법제, 세포독성 면역 세포, 또는 항균제를, 리간드-면역원 접합체의 투여와 함께 숙주 동물에 투여할 수 있다.
본 발명의 다른 실시양태에 따르면, 병원성 세포 집단의 구성원들이 리간드를 위해 적절한 결합 부위를 갖는 병원성 세포 집단을 함유한 숙주 동물에서, 병원성 세포 집단의 내인성 면역 반응-매개 특이적 제거를 증진시키는 방법이 제공된다. 이 방법은, 리간드와 면역원의 복합체를 포함하고 상기 면역원이 숙주에서 내인성 또는 외인성 항체에 의해 인식되는 것으로 알려지거나 또는 숙주에서 면역 세포에 의해 직접적으로 인식되는 것으로 알려져 있는 리간드-면역원 접합체 조성물과, 세포 사멸제, 종양 침투 증진제, 화학요법제, 항균제, 세포독성 면역 세포 및 내인성 면역 반응을 자극할 수 있고 리간드-면역원 접합체에 결합하지 않는 화합물로 구성된 군에서 선택되는 치료 인자를 포함한 적어도 하나의 추가의 조성물을 숙주에 투여하는 단계를 포함한다.
본 발명의 대안적인 실시양태에 따르면, 리간드를 위한 결합 부위를 발현하는 병원성 세포 집단을 함유한 숙주 동물에서, 병원성 세포 집단의 내인성 면역 반응-매개 특이적 제거를 증진시키는 방법이 제공된다. 이 방법은, 상기 리간드와 면역원의 복합체를 포함한 조성물을 숙주에 투여하고, 면역원에 대항하여 작용하는 항체를 숙주에 투여하고, 세포 사멸제, 종양 침투 증진제, 화학요법제, 항균제, 세포독성 면역 세포, 및 리간드-면역원 복합체에 결합하지 않는 내인성 면역 반응의 자극제로 구성된 군에서 선택되는 적어도 하나의 추가의 치료 인자를 숙주에 투여하는 단계들을 포함한다.
본 발명의 하나의 바람직한 실시양태에서, 엽산 수용체를 우선적으로 발현하거나 유일하게 발현하거나 또는 과다발현하는 병원성 세포 집단을 함유한 숙주 동물에서, 병원성 세포 집단의 내인성 면역 반응-매개 특이적 제거를 증진시키는 방법이 제공된다. 이 방법은, 숙주에서 내인성 또는 외인성 항체에 의해 인식되는 것으로 알려지거나 또는 숙주에서 면역 세포에 의해 직접 인식되는 것으로 알려진면역원과, 면역원에 대한 공유 결합이 글루타밀기의 γ-카르복시기 만을 통해 이루어지는 글루타밀 기를 가진 엽산 또는 엽산 유사체를 포함한 리간드와의 공유 결합 접합체를 포함하는 조성물을 숙주에 투여하는 단계를 포함한다. 다른 실시양태에서, 치료 인자를 포함한 적어도 하나의 추가 조성물을 숙주에 투여하고, 이때 상기 인자는 세포 사멸제, 종양 침투 증진제, 화학요법제, 항균제, 세포독성 면역 세포 및 리간드-면역원 접합체에 결합하지 않고 내인성 면역 반응을 자극할 수 있는 화합물로 구성된 군에서 선택된다.
본 발명의 또 다른 실시양태에서, 엽산 수용체를 우선적으로 발현하거나, 유일하게 발현하거나 또는 과다발현하는 병원성 세포 집단을 함유한 숙주 동물에서, 병원성 세포 집단의 내인성 면역 반응-매개 특이적 제거를 증진시키는 방법이 제공된다. 이 방법은 숙주에서 내인성 또는 외인성 항체에 의해 인식되는 것으로 알려지거나 또는 숙주에서 면역 세포에 의해 직접 인식되는 것으로 알려진 면역원과, 면역원에 대한 공유 결합이 글루타밀기의 γ-카르복시기 만을 통해 이루어지는 글루타밀 기를 가진 엽산 또는 엽산 유사체를 포함한 리간드와의 공유 결합 접합체를 포함하는 조성물을 숙주에 투여하는 단계를 포함한다. 다른 실시양태에서, 치료 인자를 포함한 적어도 하나의 추가 조성물을 숙주에 투여하고, 이때 상기 인자는 세포 사멸제, 종양 침투 증진제, 화학요법제, 항균제, 세포독성 면역 세포 및 리간드-면역원 접합체에 결합하지 않고 내인성 면역 반응을 자극할 수 있는 화합물로 구성된 군에서 선택된다.
본 발명의 다른 실시양태에서, 표적화된 병원성 세포 집단은 암 세포 집단이다. 또 다른 실시양태에서, 표적화된 세포 집단은 바이러스-감염된 내인성 세포이다. 다른 실시양태에서, 표적화된 세포 집단은 세균, 마이코플라즈마 효모 또는 진균과 같은 외인성 유기체 집단이다. 리간드-면역원 접합체는 종양 세포 또는 병원성 유기체의 표면에 결합하고, 면역원을 가진 표적화 세포 집단의 세포 구성원을 "표지화"하며, 이에 의해 표지화된 세포 집단에서 작용하는 면역 매개 반응을 유발한다. 수동 면역화에서 숙주에 투여된 항체 또는 기존의 선천성 또는 후천성 면역으로부터 숙주 체계에 존재하는 항체가 면역원에 결합하고 내인성 면역 반응을 유발한다. 세포-결합된 리간드-면역원 접합체에 결합하는 항체는, 보체-매개 세포독성, 항체-의존성 세포-매개 세포독성, 항체 옵소닌작용 및 식작용, 세포 사멸 또는 정지를 신호화하는 항체-유도된 수용체 집락, 또는 세포-결합된 리간드-면역원 접합체에 결합하는 항체에 의해 자극을 받는 기타 체액 또는 세포 면역 반응을 일으킨다. 이전의 항체 옵소닌작용없이 항원이 면역 세포에 의해 직접 인식될 수 있는 경우에는, 병원성 세포의 직접적인 사멸이 일어날 수 있다.
내인성 면역 반응을 자극할 수 있는 치료 인자, 세포 사멸제, 종양 침투 증진제, 화학요법제, 세포독성 면역 세포 또는 항균제를 투여함으로써, 외래 병원체 또는 감염되거나 신생 내인성 세포의 제거를 더욱 촉진할 수 있다. 하나의 실시양태에서, 세포독성 면역 세포는 단리되고 생체외 팽창된 다음 숙주 동물에 주입되는 세포독성 면역 세포 집단이다. 본 발명의 다른 실시양태에서, 면역자극제가 사용되고 면역자극제는 IL-2, IL-12 또는 IL-15와 같은 인터루킨 또는 IFN-α, IFN-β 또는 IFN-γ와 같은 IFN 또는 GM-CSF일 수 있다. 다른 실시양태에서, 면역자극제는 IFN-α, IFN-β 또는 IFN-γ 또는 GM-CSF와 조합된 IL-2, IL-12 또는 IL-15와 같은 사이토카인의 조합, 또는 이들의 효과적인 임의의 조합 또는 사이토카인의 다른 효과적인 임의의 조합을 포함하는 사이토카인 조성물일 수도 있다.
본 발명의 또 다른 실시양태에서, 후천성 또는 선천성 면역 반응, 공동-투여된 항체, 또는 직접적으로 숙주내의 면역 세포에 의해 병원성 세포의 특이적 제거를 촉진하기 위하여 숙주 동물에서 병원성 세포 집단에 특이적으로 결합할 수 있는 리간드-면역원 접합체의 치료적 유효량, 세포 사멸제, 종양 침투 증진제, 화학요법제, 항균제, 세포독성 면역 세포, 및 리간드-면역원 접합체에 결합하지 않고 내인성 면역 반응을 자극할 수 있는 화합물로 구성된 군에서 선택되는 치료 인자, 및 제약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 제약학적 조성물이 제공된다. 하나의 실시양태에서, 제약학적 조성물은 비경구적 지속 방출 투여 형태이다. 다른 실시양태에서, 치료 인자는 IL-2, IL-12, IL-15와 같은 인터루킨, IFN-α, IFN-β 또는 IFN-γ와 같은 IFN 및 GM-CSF, 또는 이들의 조합으로 구성된 군에서 선택되는 화합물을 포함한 면역 자극제이다.
암에 걸린 숙주 또는 병원성 유기체로 감염된 숙주의 치료를 위한 방법이 제공된다. 이러한 방법에 의하여, 병원성 세포를 숙주 면역 체계에 의해 인식 및 제거되도록 항원성으로 공급/표지화함으로써, 병원성 세포 집단의 면역 반응-매개 제거가 증진된다. 이 방법은 암 세포 또는 기타 병원성 인자에 고 친화력 결합할 수 있는 리간드-면역원 접합체를 사용한다. 고 친화력 결합은 리간드 고유의 성질일수 있고, 화학적으로 변형된 리간드를 사용함으로써 또는 접합체에 존재하는 리간드와 면역원 사이의 특정한 화학 결합으로부터 변성(증진)될 수도 있다. 이 방법은 또한, 병원성 세포 집단의 면역 반응-매개 제거를 증진하기 위하여, 리간드-면역원 접합체 및 세포 사멸제, 화학요법제, 종양 침투 증진제, 세포독성 면역 세포 또는 항균제와 같이 내인성 면역 반응을 자극할 수 있는 추가의 치료 인자를 사용함으로써 조합 치료를 이용할 수도 있다.
본 발명의 방법은, 병원성 세포 집단을 함유하는 숙주 동물에서, 병원성 세포 집단의 내인성 면역 반응-매개 제거를 증진하기 위해 사용된다. 본 발명은, 암 및 감염성 질병과 같은 다양한 병변을 일으키는 병원성 세포 집단에 적용될 수 있다. 즉, 병원성 세포 집단은 양성 종양 및 악성 종양을 포함한 종양 형성성의 암세포 집단일 수도 있거나, 또는 비-종양 형성성일 수 있다. 암 세포 집단은 자발적으로 또는 숙주 동물의 발아체에 존재하는 돌연변이 또는 체세포 돌연변이와 같은 과정에 의해 생겨날 수 있거나, 또는 화학적으로, 바이러스에 의해 또는 방사선에 의해 유도될 수도 있다. 본 발명은 암종, 육종, 림프종, 호지킨병, 흑색종, 중피종, 버키트(Burkitt) 림프종, 비인두암종, 백혈병 및 골수종과 같은 암을 치료하기 위해 사용될 수 있다. 암 세포 집단은 경구, 갑상선, 내분비, 피부, 위, 식도, 후두, 췌장, 결장, 방광, 골, 난소, 경추, 자궁, 유방, 고환, 전립선, 직장, 신장, 간 및 폐의 암을 포함할 수 있지만 이에 한정되지 않는다.
병원성 세포 집단은 또한 외인성 병원체 또는 외인성 병원체를 함유한 세포 집단, 예를들어 바이러스일 수도 있다. 본 발명은 세균, 진균, 바이러스, 마이코플라즈마 및 기생충과 같은 외인성 병원체에 적용될 수 있다. 본 발명으로 처리될 수 있는 감염 인자는, 동물에서의 병인론을 유발하는 당 기술분야에 인식된 감염성 유기체이며, 그람-음성 또는 그람-양성 구균 또는 간균인 세균, 유두종바이러스, 파르보바이러스, 아데노바이러스, 헤르페스바이러스, 및 종두증 바이러스와 같은 DNA 바이러스 및 아레나바이러스, 코로나바이러스, 라이노바이러스, 호흡기 합포체 바이러스, 인플루엔자 바이러스, 피코르나바이러스, 파라믹소바이러스, 레오바이러스, 레트로바이러스 및 랍도바이러스와 같은 RNA 바이러스를 포함하지만 이에 한정되지 않는 DNA 및 RNA 바이러스와 같은 유기체를 포함한다. 특히 중요한 것은, 항생물질 내성 스트렙토코쿠스(Streptococcus)종 및 스타플로코쿠스(Staphlococcus) 종과 같은 항생물질에 대해 내성인 세균, 또는 항생물질에 대해 감수성이지만 항생물질로 처리된 재발성 감염을 일으켜서 결국 내성 유기체로 발전되는 세균이다. 이러한 항생물질-내성 세균 균주의 발생을 피하기 위해 환자에게 통상 투여되는 것보다 더 적은 양의 항생물질과 함께 본 발명의 리간드-면역원 접합체로 유기체를 치료할 수 있다. 본 발명은 또한 동물에서 질병을 일으키는 진균, 마이코플라즈마종, 기생충 또는 기타 감염성 유기체에 적용될 수 있다. 본 발명의 방법으로 치료될 수 있는 진균의 예는, 백선, 히스토플라스마병, 분아균증, 국균증, 효모균증, 스포로트리쿰증, 콕시디오이테스진균증, 파라콕시디오-이도미코시스증 및 칸디다감염증과 같은 질병을 일으키는 진균을 포함하여, 곰팡이처럼 성장하거나 효모와 같은 진균을 포함한다. 본 발명은, 이에 한정되는 것은 아니지만 체세포 촌충, 혈액 흡충, 조직 회충, 아메바, 플라스모디움(Plasmodium), 트리파노소마(Trypanosoma),레이시마니아(Leishmania) 및 톡소플라스마(Toxoplasma)종에 의해 유발된 감염을 포함한 기생충 감염을 치료하기 위해 사용될 수도 있다. 특히 중요한 기생충은 엽산염 수용체를 발현하고 엽산염을 결합하는 기생충이다; 그러나, 문헌에는 감염성 유기체에 대해 고 친화력을 나타내는 리간드에 관한 언급이 많이 존재한다. 예를들어, 항생물질 활성과 세균 세포벽 전구체에 대한 특이적 결합이 공지된 페니실린 및 세파로스포린이 본 발명에 따라 사용되는 리간드-면역원 접합체를 제조하기 위한 리간드로서 유사하게 사용될 수 있다. 본 발명의 리간드-면역원 접합체는 내인성 병원체를 함유한 세포 집단에 작용할 수 있으며, 여기에서 병원체-특이적 항원은 병원체를 함유한 세포의 표면 위에서 우선적으로 발현되며, 항원에 특이적으로 결합하는 리간드와 함께 리간드에 대한 수용체로서 작용한다.
본 발명의 방법은 인간 임상 의학 및 수의학 용도를 위해 사용될 수 있다. 즉, 병원성 유기체 집단을 포함하고 리간드-면역원 집합체로 치료되는 숙주 동물이 인간일 수도 있거나, 또는 수의학 용도의 경우에는 실험용, 농업용, 애완 또는 야생 동물일 수도 있다. 본 발명은 인간, 설치류(예, 생쥐, 쥐, 햄스터 등), 토끼, 원숭이, 침팬치와 같은 실험용 동물, 개, 고양이 및 토끼와 같은 애완 동물, 소, 말, 돼지, 양, 염소와 같은 농업용 동물, 및 곰, 사자, 호랑이, 표범, 코끼리, 얼룩말, 기린, 고릴라, 돌고래 및 고래와 같은 감금된 야생 동물을 포함하지만 이에 한정되지 않는 숙주 동물에 적용될 수도 있다.
리간드-면역원 접합체를 숙주 동물에 비경구적으로, 예를들어 피내, 피하, 근육내, 복강내 또는 정맥내 투여하는 것이 바람직하다. 대안적으로, 접합체를 다른 의학적으로 유용한 방법에 의해 숙주 동물에 투여할 수도 있으며, 지속 방출 투여 형태를 포함한 적절한 치료적 투여 형태와 효과적인 투여량이 사용될 수 있다. 본 발명의 방법은 종양의 수술 제거, 방사선요법, 화학요법 또는 생물학적 요법, 예컨대 단클론성 항체 요법, 면역조절제로의 치료, 면역 효과기 세포의 선택적 전달, 조혈 성장 인자로의 치료, 사이토카인 및 예방접종에 한정되지 않지만 이들을 포함하는 기타 면역요법과 함께 사용될 수 있다.
본 발명에 따르면, 다양한 종류의 리간드 및 면역원으로부터 리간드-면역원 접합체가 선택될 수 있다. 리간드는, 병원성 세포 위에서 리간드 결합을 위해 이용될 수 있는 리간드에 대한 수용체의 우선적 발현으로 인하여, 숙주 동물에서 병원성 세포 집단을 특이적으로 제거할 수 있어야 한다. 허용가능한 리간드는, 엽산, 엽산의 유사체 및 기타 엽산염 수용체-결합 분자, 기타 비타민, 라이브러리 선별로부터 동정된 펩티드 리간드, 종양-특이성 펩티드, 종양-특이성 아프타머, 종양-특이성 탄수화물, 종양-특이성 단클론성 또는 다클론성 항체, 항체의 Fab 또는 scFv (즉, 단쇄 가변 영역)단편, 예를들어 EphA2에 작용하는 항체의 Fab 단편 또는 전이 암 세포 위에서 특이적으로 발현되거나 유일하게 접근가능한 기타 단백질, 조합 라이브러리로부터 유래된 작은 유기 분자, 성장 인자, 예컨대 EGF, FGF, 인슐린 및 인슐린-유사 성장 인자, 및 상동성 폴리펩티드, 소마토스타틴 및 그의 유사체, 트랜스페린, 지방단백질 복합체, 담즙염, 셀렉틴, 스테로이드 호르몬, Arg-Gly-Asp 함유 펩티드, 레티노이드, 각종 갈렉틴, δ-아편양제제 수용체 리간드, 콜레시스토키닌 A 수용체 리간드, 안기오텐신 AT1 또는 AT2 수용체에 대해 특이적인 리간드, 페록시좀 증식인자-활성화 수용체 γ리간드, β-락탐 항생물질, 항균 약물을 포함한 작은 유기 분자, 및 종양 세포의 표면 또는 감염성 유기체 상에서 우선적으로 발현되는 수용체에 특이적으로 결합하는 기타 분자, 또는 이러한 분자들의 단편을 포함한다. 감염성 유기체에 결합하는 리간드의 경우에 중요한 것은, 미생물에 우선적으로 결합하는 것으로 당 기술분야에 알려진 분자, 예컨대 항생물질 또는 기타 약물이다. 본 발명은 수용체의 결정 구조를 기초로 하여 특정한 수용체의 결합 포켓내에 일치하는 구조를 가진 분자, 예컨대 항균 약물 또는 기타 세포 표면 단백질인 리간드에 적용되며, 여기에서 이러한 수용체는 종양, 세균, 바이러스, 마이코플라즈마, 진균, 기생충 또는 기타 병원체의 표면 위에서 우선적으로 발현된다. 또한, 본 발명의 바람직한 실시양태에서, 종양 세포의 표면 위에서 우선적으로 발현되는 종양 항원 또는 기타 분자에 결합하는 리간드가 이용될 수도 있는 것으로 이해된다.
리간드에 대한 결합 부위는 수용체에 특이적으로 결합할 수 있는 임의의 분자에 대한 수용체를 포함할 수도 있으며, 여기에서 수용체 또는 기타 단백질은 예를들어 성장 인자, 비타민, 펩티드 (아편양제제 펩티드 포함), 호르몬, 항체, 탄수화물 및 작은 유기분자에 대한 수용체를 포함한 병원성 세포 집단에서 우선적으로 발현된다. 결합 부위는 항생물질 또는 기타 약물과 같은 분자에 대한 결합 부위일 수도 있으며, 이때 부위는 미생물 위에 우선적으로 존재하는 것으로 당 기술분야에 공지되어 있다. 예를들어, 주제의 결합 부위는 페니실린과 같은 β-락탐 항생물질에 대해 세균 세포벽에 있는 결합 부위일 수도 있거나, 또는 바이러스 표면에 유일하게 존재하는 항균제에 대한 결합 부위일 수도 있다. 본 발명은 또한 수용체의 결정 구조를 기초로 하여 수용체의 결합 부위에 일치하도록 고안된 리간드, 예컨대 항균 약물에 대한 결합 부위에 적용되며, 여기에서 수용체는 병원성 세포 또는 유기체의 표면 위에서 우선적으로 발현된다. 본 발명의 방법에서 종양-특이적 항원은 리간드를 위한 결합 부위로서 작용할 수 있는 것으로 이해된다. 리간드-면역원 접합체에 대한 결합 부위로서 작용할 수 있는 종양-특이적 항원의 예는 단백질의 에프린계의 구성원, 예컨대 EphA2의 세포외 에피토프이다. EphA2 발현은 정상 세포에서 세포-세포 접합으로 제한되지만, 전이 종양 세포에서는 전체 세포 표면에 걸쳐 EphA2가 분포된다. 따라서, 전이 세포 위의 EphA2는 면역원에 접합된 항체의 Fab 단편에 결합하기 위해 이용될 수 있는 반면, 단백질은 정상 세포 위의 Fab 단편에 결합하기 위해 이용될 수 없으며, 그 결과 전이 암세포에 특이적인 리간드-면역원 접합체가 얻어진다. 본 발명은 또한, 후천성 또는 선천성 면역 반응에 의해 또는 공동-투여된 항체에 의해 제거하기 위한 병원성 세포의 표적화를 최대화하기 위하여, 리간드-면역원 접합체의 사용을 의도하고 있다.
본 발명에서 사용하기 위해 허용가능한 면역원은, 숙주 동물에서 항체 생성을 유도할 수 있거나 또는 기존의 면역이 얻어지도록 숙주 동물에서 미리 유도된 항체 생성을 갖거나 또는 선천성 면역 체계의 일부를 구성하는 면역원이다. 대안적으로, 면역원에 대항하여 작용하는 항체를 숙주 동물에 투여하여 수동 면역을 이룰 수도 있다. 본 발명에서 사용하기에 적절한 면역원은, 정상적으로 예정된 예방접종을 통해 또는 폴리오바이러스, 파상풍, 발진티푸스, 풍진, 홍역, 볼거리, 백일해, 결핵 및 인플루엔자 항원 및 α-갈락토실기와 같은 인자에 먼저 자연적으로 노출되는 것을 통해, 그에 대항한 기존의 면역이 발현되어지는 항원 또는 항원성 펩티드를 포함한다. 이러한 경우에, 외래 세포 또는 병원성 유기체의 제거를 위해, 미리 획득된 체액성 또는 세포성 면역을 숙주 동물내의 병원성 세포 집단에 재작용시키기 위해 리간드-면역원 접합체가 사용된다. 다른 적절한 면역원은, 숙주 동물이 비천연 항원 또는 합텐 (예, 플루오레신 이소티오시아네이트 또는 디니트로페닐)에 대항한 면역화를 통해 새로운 면역을 발현하는 항원 또는 항원성 펩티드 및 선천성 면역이 존재하는 항원 (예, 슈퍼항원 및 뮤라밀 디펩티드)을 포함한다.
본 발명의 리간드 및 면역원은 당 기술분야에 인식된 복합체를 형성하는 임의의 방법을 사용함으로써 접합될 수 있다. 이것은 리간드를 면역원에 직접적으로 또는 2가 링커와 같은 연결기를 통해 간접적으로 공유, 이온 또는 수소 결합시키는 것을 포함할 수 있다. 접합체는 전형적으로 복합체의 각각의 성분 위에서 산, 알데히드, 히드록시, 아미노 또는 히드라조기 간의 아미드, 에스테르 또는 이미노 결합 형성을 통해 리간드를 면역원에 공유 결합시킴으로써 형성된다. 본 발명의 바람직한 실시양태에서, 리간드는 엽산, 엽산의 유사체, 또는 임의의 기타 엽산염-수용체 결합 분자이고, 프테로일 아지드 중간체를 통해 엽산의 γ-에스테르를 제조하기 위하여 트리플루오로아세트 안히드라이드를 사용하는 절차에 의해 엽산염 리간드가 면역원에 접합된다. 이러한 바람직한 절차에 의해, 단지 엽산염의 글루탐산기의 γ-카르복시기를 통해서만 면역원에 접합되어진 엽산염 리간드가 합성되며, 여기에서 γ-접합체는 높은 친화력으로 엽산염 수용체에 결합하고, α-접합체와γ-접합체의 혼합물 형성을 피한다. 대안적으로, 중간체로부터 순수한 α-접합체가 제조될 수 있으며, 이때 γ-카르복시기가 선택적으로 차단되고, α-접합체가 형성되며, 이어서 당 기술분야에 인식된 유기 합성 프로토콜 및 절차를 사용하여 γ-카르복시기가 해제된다. 특히, 본 발명에 따른 접합체를 제조하기 위하여 기타 비타민이 리간드로서 사용될 수도 있다. 예를들어, 엽산염 뿐만 아니라 비오틴 및 리보플라빈을 사용하여 리간드-면역원 접합체가 형성될 수 있다 (여기에서 참고문헌으로 인용된 미국 특허 5,108,921호, 5,416,016호 및 5,635,382호 참조).
본 발명의 리간드-면역원 접합체는 병원성 세포 집단의 내인성 면역 반응-매개 제거를 증진시킨다. 내인성 면역 반응은 체액성 반응, 세포-매개 면역 반응, 및 보체-매개 세포 융해, 항체-의존성 세포-매개 세포 독성(ADCC), 식작용을 유도하는 항체 옵소닌작용, 세포고사를 신호화하는 항체 결합시의 수용체 집락형성, 증식 억제, 또는 분화, 및 전달된 항원/합텐의 직접적인 면역 세포 인식을 포함하여, 숙주 동물에 내인성인 임의의 기타 면역 반응을 포함할 수도 있다. 또한, 내인성 면역 반응은 면역 세포의 다중화 및 이동과 같은 과정을 조절하는 사이토카인의 분비를 사용하는 것으로 이해된다. 내인성 면역 반응은 B 세포, 헬퍼 및 세포독성 T 세포를 포함한 T 세포, 대식세포, 천연 킬러 세포, 호중구, LAK 세포 등과 같은 면역 세포 유형의 참여를 포함할 수도 있다.
체액성 반응은 정상적으로 예정된 예방접종, 또는 천연 항원 또는 비천연 항원 또는 합텐 (예, 플루오레신 이소티오시아네이트), 새로운 면역을 유도하는 비천연 항원을 사용한 능동 면역화와 같은 과정에 의해 유도되는 반응일 수도 있다.능동 면역화는 새로운 면역을 유도하기 위하여 정상 예방접종 이외의 예정된 비천연 항원 또는 합텐을 여러번 주입하는 것을 포함한다. 체액성 반응은, 숙주 동물이 α-갈락토실기에 대한 면역과 같은 기존의 천연 면역을 갖는 경우에, 선천성 면역으로부터 생길 수도 있다. 대안적으로, 수동 면역은, 혈청으로부터 수집되는 천연 항체 또는 인간화 항체를 포함하여 유전자 조작 항체일 수도 있거나 아닐 수도 있는 단클론성 항체와 같은 항체를 숙주 동물에 투여함으로써 이루어질 수 있다. 수동 면역을 발생시키기 위해 특정량의 항체 시약을 이용하는 것과, 수동적으로 투여된 항체가 면역원에 작용하는 리간드-면역원 접합체를 사용하는 것은, 다른 잠재적인 항원에 대해 환자가 가진 기존의 항체 역가가 치료적으로 유용하지 않은 경우에 사용되어지는 표준 시약 세트의 장점을 제공한다. 수동적으로 투여된 항체를 리간드-면역원 접합체와 함께 "공동-투여"할 수도 있고, 공동-투여란 리간드-면역원 접합체의 투여 전, 투여와 동시 또는 투여 후에 항체의 투여로서 정의된다.
기존의 항체, 유도된 항체 또는 수동적으로 투여된 항체는 침입 세포 또는 유기체에 리간드-면역원 접합체를 우선적으로 결합시킴으로써 종양 세포 또는 감염 유기체에 재작용하고, 병원성 세포는 보체-매개 용균, ADCC, 항체-의존성 식작용 또는 수용체의 항체 집락형성에 의해 사멸되는 것으로 이해된다. 세포독성 과정은 다른 유형의 면역 반응, 예컨대 세포-매개 면역 뿐만 아니라, 유인된 항원-제시 세포가 원하지 않는 세포를 식작용분해하고, 항원을 포함한 세포 또는 유기체의 제거를 위해 면역 체계에 천연 종양 항원 또는 외래 병원체의 항원을 제시할 때 일어나는 2차 반응을 포함할 수도 있다.
병원성 세포 집단의 내인성 면역 반응-매개 제거를 증진시키기 위하여, 치료 인자를 포함한 적어도 하나의 추가의 조성물을 상기 기재된 방법과 병용하여 또는 보조제로서 숙주에 투여할 수도 있거나, 또는 하나 이상의 추가의 치료 인자를 투여할 수도 있다. 치료 인자는 내인성 면역 반응을 자극할 수 있는 화합물, 화학요법제, 항균제, 또는 투여된 리간드-면역원 착물의 효능을 보충할 수 있는 기타 치료 인자로부터 선택될 수도 있다. 본 발명의 방법은 상기 기재된 접합체 이외에도 추가로 내인성 면역 반응을 자극할 수 있는 화합물 또는 조성물, 예컨대 이에 한정되지는 않지만 사이토카인 또는 인터루킨 1-18과 같은 면역 세포 성장 인자, 간세포 인자, 기본 FGF, EGF, G-CSF, GM-CSF, FLK-2 리간드, HILDA, MIP-1α, TGFα, TGFβ, M-CSF, IFNα, IFNβ, IFNγ, 가용성 CD23, LIF 및 이들의 조합을 포함한 화합물 또는 조성물을 숙주에 투여함으로써 실행될 수 있다.
이러한 사이토카인의 치료적으로 효과적인 조합이 사용될 수도 있다. 바람직한 실시양태에서, 병원성 세포 집단을 함유한 숙주 동물에서 병원성 세포를 제거하기 위하여, 치료적 유효량의 IL-2, 예를들어 다회 복용 매일 섭생법에서 약 5000IU/복용/일 내지 약 500,000IU/복용/일 범위의 IL-2 및 예를들어 다회 복용 매일 섭생법에서 약 7500 IU/복용/일 내지 약 150,000 IU/복용/일 범위의 IFN-α를 엽산염-결합 플루오레신 이소티오시아네이트와 함께 사용한다. 다른 바람직한 실시양태에서, IL-12 및 IFN-α가 치료적 유효량으로 사용되고 또 다른 바람직한 실시양태에서 IL-15 및 IFN-α가 치료적 유효량으로 사용된다. 대안적인 바람직한 실시양태에서, IL-2, IFN-α 또는 IFN-γ 및 GM-CSF가 조합되어 사용된다. 바람직하게는, IL-2, IL-12, IL-15, IFN-α, IFN-γ 및 GM-CSF 및 이들의 조합과 같은 사용되는 치료 인자(들)이 천연 킬러 세포 및/또는 T 세포를 활성화한다. 대안적으로, 인터페론 및 GM-CSF와 조합된 인터루킨을 포함한 치료 인자 또는 이들의 조합이 대식세포, B-세포, 호중구, LAK 세포 등과 같은 다른 면역 효과기 세포를 활성화시킬 수도 있다. 본 발명은 또한 다른 인터루킨 및 인터페론과 콜로니 자극 인자의 조합을 포함한 사이토카인의 다른 효과적인 조합의 사용을 의도한다.
본 발명의 방법에서 사용하기에 적절한, 세포독성 자체이고 종양 침투성을 증진시키는 작용을 할 수 있는 화학요법제는, 아드레노코르티코이드, 알킬화제, 항안드로겐, 항에스트로겐, 안드로겐, 에스트로겐, 항대사물질, 예컨대 시토신 아라비노시드, 퓨린 유사체, 피리미딘 유사체, 및 메토트렉세이트, 부살판, 카르보플라틴, 클로람부실, 시스플라틴 및 기타 백금 화합물, 타목시펜, 탁솔, 시클로포스파미드, 식물 알카로이드, 프레드니존, 히드록시우레아, 테니포시드, 항생물질, 예컨대 미토마이신C 및 블레오마이신, 니트로겐 머스타드, 니트로스우레아, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 염증성 및 전염증성 약제, 및 기타 당 기술분야에 인식된 화학요법제를 포함한다. 본 발명의 접합체의 투여에 보조제로서 투여될 수 있는 기타 치료제는 페니실린, 세파로스포린, 반코마이신, 에리트로마이신, 클린다마이신, 리팜핀, 클로람페니콜, 아미노글리코시드, 겐타마이신, 암포테리신B, 아시클로비르, 트리플루리딘, 간시클로비르, 지도부딘, 아만타딘, 리바비린, 및 기타 당 기술분야에 인식된 임의의 항균 화합물을 포함한다.
병원성 세포 집단의 제거는 종양 덩어리 또는 병원성 유기체의 감소 또는 제거를 포함하며 이에 의해 치료 반응이 얻어진다. 종양의 경우에, 제거는 1차 종양 세포의 제거 또는 1차 종양으로부터 전이되거나 해리 과정에 있는 세포의 제거일 수 있다. 본 발명에 따르면, 종양의 수술 제거, 방사선 요법, 화학요법 또는 생물학적 요법을 포함한 치료적 접근법에 의해 종양을 제거한 후 종양 재발을 방지하기 위한 예방적 치료도 또한 의도된다. 예방적 치료는 리간드-면역원 접합체에 의한 초기 치료, 예컨대 다회 복용 매일 섭생법으로의 치료일 수도 있고/있거나, 초기 치료후 수일 또는 수개월 간격 후에 추가의 치료 또는 연속 치료일 수도 있다.
또한 본 발명은, 내인성 면역 반응에 의해 또는 공동-투여된 항체에 의해 특이적으로 제거하기 위한 숙주 동물내의 병원성 세포 집단을 "표지화"하는데 효과적인 양의 리간드-면역원 접합체를 포함하는 제약학적 조성물에 관한 것이다. 조성물은 세포 사멸제, 종양 침투 증진제, 화학요법제, 항균제, 세포독성 면역세포, 및 리간드-면역원 접합체에 결합하지 않고 내인성 면역 반응을 자극할 수 있는 화합물로 구성된 군에서 선택되는 추가의 인자를, 병원성 세포의 제거를 증진시키는데 효과적인 양으로 더욱 포함한다, 제약학적 조성물은 치료적 유효량의 리간드-면역원 접합체 및 치료 인자를 함유하고, 인자는 IL-2, IL-12 또는 IL-15와 같은 사이토카인 또는 IL-2, IL-12 또는 IL-15를 포함한 사이토카인의 조합, IFN-α 또는 IFN-γ와 같은 인터페론 및 인터페론의 조합, 인터루킨 및 콜로니 자극 인자, 예컨대 GM-CSF를 포함할 수도 있다.
리간드-면역원 접합체의 단위 1일 투여량은 숙주 상태, 치료되는 질병 상태, 접합체의 분자량, 투여 경로 및 조직 분포, 및 방사선요법과 같은 다른 치료요법과의 공동 사용가능성에 의존하여 상당히 변할 수 있다. 환자에게 투여되는 유효량은 신체 표면적, 환자 체중 및 환자 상태의 의사 판단을 기초로 한다. 유효 투여량은 약 1 ng/kg 내지 약 1 mg/kg, 더욱 바람직하게는 약 1 ㎍/kg 내지 약 500 ㎍/kg, 가장 바람직하게는 약 1 ㎍/kg 내지 약 100 ㎍/kg의 범위일 수 있다.
종양 세포 또는 감염성 유기체에 기존의 항체를 재작용시키거나 면역원에 체액성 반응을 유도하기 위하여, 리간드-면역원 접합체 및 치료 인자를 투여하기 위해 효과적인 섭생법이 사용될 수 있다. 예를들어, 리간드-면역원 접합체 및 치료 인자를 1회 복용으로 투여할 수 있거나, 또는 다회 복용 매일 섭생법으로 나누어 투여할 수 있다. 또한, 1주일당 1일 내지 3일의 시차 섭생법이 매일 치료의 대안으로서 사용될 수 있고, 본 발명을 한정하기 위한 목적에서 이러한 간헐 또는 시차 일일 섭생법은 매일 치료와 균등하고 본 발명의 범위내에 있는 것으로 간주된다. 본 발명의 바람직한 실시양태에서, 병원성 세포 집단을 제거하기 위하여 리간드-면역원 접합체 및 치료 인자를 여러번 주사하여 숙주를 처리한다. 하나의 실시양태에서, 예를들어 12 내지 72 시간 간격으로 또는 48 내지 72시간 간격으로 리간드-면역원 접합체를 여러번 (바람직하게는 약 2 내지 약 50회 이하) 숙주에 주사한다. 초기 주사(들) 후에 수일 또는 수개월 간격으로 리간드-면역원 접합체의 추가 주사를 환자에게 투여할 수 있으며, 추가 주사는 질병의 재발을 막는다. 대안적으로, 리간드-면역원 접합체의 초기 주사(들)는 질병의 재발을 막을 수 있다.
치료 인자를 리간드-면역원 접합체의 전에, 후에 또는 그와 동시에 숙주 동물에 투여할 수도 있으며, 치료 인자를 접합체를 함유하는 동일 조성물의 일부로서또는 리간드-면역원 접합체와 상이한 조성물의 일부로서 투여할 수도 있다. 치료 인자를 함유한 이러한 치료 조성물은 치료적 유효량으로 본 발명에서 사용될 수 있다. 추가로, 하나 이상의 유형의 리간드-면역원 접합체가 사용될 수도 있다. 예를들어, 숙주 동물을 플루오레신 이소티오시아네이트 및 디니트로페닐 모두로 사전 면역화하고, 이어서 공동-투여 프로토콜에서 동일하거나 상이한 리간드에 연결된 플루오레신 이소티오시아네이트 및 디니트로페닐로 처리할 수도 있다. 화학요법제 및 항균제의 경우에, 숙주 동물에 의해 화학요법제 또는 항균제에 대한 내성이 발현되는 것을 피하기 위하여, 치료 인자를 조합 요법으로 리간드-면역원 접합체와 함께 적정이하 투여량으로 투여할 수도 있다.
리간드-면역원 접합체와 치료 인자를 바람직하게는 비경구적으로 주사하고, 이러한 주사는 복강내 주사, 피하 주사, 근육내 주사, 정맥 주사 또는 협막내 주사일 수도 있다. 또한, 저속 펌프를 사용하여 리간드-면역원 접합체 및 치료 인자를 전달할 수도 있다. 비경구적 투여 형태의 예는 등장 식염수, 5% 글루코스 또는 기타 공지된 제약학적으로 허용가능한 액체 담체, 예컨대 액체 알콜, 글리콜, 에스테르 및 아미드 중의 활성 약제의 수용액을 포함한다. 본 발명에 따른 비경구적 투여 형태는 리간드-면역원 접합체 및 치료 인자의 투여량을 포함한 재구성가능한 동결건조물 형태일 수 있다. 본 발명의 실시양태의 한가지 바람직한 측면에서, 당 기술분야에 공지된 다수의 지속 방출 투여 형태, 예를들어 미국 특허 4,713,249호, 5,266,333호 및 5,417,982호 (이들의 개시내용은 본 명세서에서 참고문헌으로 포함된다)에 기재된 생분해성 탄수화물 기질이 투여될 수 있다.
실시예 1
폐 종양 이식물을 가진 생쥐의 생존율에 미치는 엽산염-플루오레신 이소티오시아네이트 접합체의 효과
시판되는 아쥬반트 (예, 프로인드 아쥬반트 또는 티터 맥스TM-골드 (Titer MaxTM-Gold))를 사용하여, 6 내지 8주령 (∼20-22 그램) 암컷 Balb/c 생쥐를 플루오레신 이소티오시아네이트(FITC)-표지화 소혈청 알부민(BSA)으로 여러 부위에서 피하 면역시켰다. 모든 생쥐에서 항-FITC 항체 역가가 높다는 것을 확인한 후에 (생쥐의 혈청 샘플의 ELISA 분석 결과에 의해 입증됨), 다량의 엽산염 수용체를 발현하는 동유전자형 폐암 세포주인 5×105M109 세포를 각각의 동물에 복강내 주사하였다. 이어서, 암 좌위를 부착시키고 성장시켰다. 암세포 이식후 4일 및 7일에, 감마 카르복실-연결된 에틸렌 디아미드 가교를 통해 엽산에 접합된 특정량의 FITC 또는 인산염 완충 식염수(PBS)를 모든 동물에 복강내 주사하였다. 엽산염-FITC 주사 농도는 0 (PBS 대조), 4.5, 45, 450 및 4500 n몰/kg이었으며, 총 40 마리의 동물 중에서 각각의 엽산염-FITC 농도당 8마리의 생쥐를 주사하였다. 이어서, 면역 체계를 자극하기 위하여, 5000IU의 재조합 인간 IL-2의 연속 5일 주사(8일 내지 12일째)를 모든 생쥐에 투여하였다. 이어서, 대조 동물에 비해, 엽산염-FITC 처리된 생쥐의 시간의 함수로서의 생존율을 측정함으로써 이러한 면역요법의 효능을 평가하였다. 도 1에 나타낸 바와 같이, 엽산염-FITC로 처리된 생쥐의 중간 생존율은,종양 이식후 23일의 중간 생존율을 나타내는 대조 생쥐와 함께 투여량-의존성이었으며, 접합체의 투여량이 증가함에 따라 엽산염-FITC 생쥐가 점점 더 오래 생존한다. 45 n몰/kg 정도의 적은 양의 엽산염-FITC로도 생쥐의 장기간 생존율을 증가시킬 수 있으며, 투여량이 더 높아질수록 그에 비례하여 더 효과적이었다. 엽산염-FITC는 종양에 집중된 것으로 발견되었으나, 일부 엽산염-FITC는 신장 조직에 존재하였다 (그러나, 기타 정상 조직에서의 상응하는 수준은 아니다). 면허를 가진 수의병리학자에 의한 부검 시험에서 신장 또는 정상 기관 독성은 검출되지 않았다.
실시예 2
플루오레신 이소티오시아네이트에 접합된 엽산염을 이용한 정상조직 대 종양조직의 영상화
동물에 24JK-FBP 종양 세포를 주사하고, 엽산염-FITC로 주사한 직후 생쥐를 희생시키고, 조직을 얇게 절단하고, 동초점 형광 현미경을 사용하여 FITC 면역형광법에 의해 종양, 신장, 간 및 근육 조직을 포함한 특정 조직에의 엽산염-FITC의 편재를 시험하는 것 이외에는 실시예 1에 기재된 것과 유사한 절차를 수행하였다. 도 2는 형광 현미경사진과 함께 대조군으로서 각종 조직편의 상 대비 현미경사진을 나타낸다. 엽산염-FITC는, 종양 조직 및 엽산에 대한 수용체가 유일하게 풍부한 신장 근위 세관 세포에 특이적으로 편재하는 것으로 밝혀졌다.
실시예 3
플루오레신 이소티오시아네이트에 접합된 엽산염 또는 피코에리트린-표지화 염소 항-마우스 IgG를 사용한 종양 조직의 영상화
M109 세포를 사용하고, FITC 플루오레신(녹색 영상) 및 피코에리트린(PE) 형광 (적색 영상)에 의해 조직을 시험하는 것 이외에는 실시예 2에 기재된 바와 유사한 절차를 수행하였다. PE 형광을 위하여, 종양 세포 위에 축적된 엽산염-FITC 접합체에 내인성 생쥐 항-FITC 항체가 결합하는 것을 검출하는데 사용하기 위하여 염소 항-마우스 IgG 항체에 형광 표지를 연결하였다. 엽산염-FITC 처리 및 비처리 종양 조직을 비교하고, 실시예 2에 기재된 바와 같이 상 대비 현미경에 의해 양쪽 종류의 샘플을 시험하였다. FITC 형광은 종양 조직에서 엽산염-FITC의 편재를 증명한다 (도 3). PE 형광은, 엽산염-FITC 접합체에 결합된 내인성 생쥐 항-FITC 항체가 종양 세포에 편재됨을 증명한다. 다른 연구(도시되지 않음)는 신장을 포함한 정상 조직에 결합하는 IgG의 결여를 증명한다. 신장 조직에 위치한 엽산염-FITC에 결합한 항체가 부재하는 것은, 엽산염 수용체가 신장 근위 세관 세포의 위쪽 막에 존재한다면 항체가 신장의 그 영역에 접근할 수 없다는 사실에서 유래된다. 상 대비 영상 (투과된 영상)은 처리 및 비처리 종양 조직의 형태를 나타내고, 이는 처리된 샘플에서 세포가 사멸함을 밝히고 있다.
실시예 4
충실성 종양의 성장에 미치는 엽산염 플루오레신 이소티오시아네이트 접합체의 효과
FITC로 사전 면역화한 후에 각각의 동물에 1×106M109 세포를 어깨에서 피하 주사하는 것 (0일) 이외에는 실시예 1에 기재된 것과 유사한 절차를 수행하였다. 종양 세포 이식후에 엽산염-FITC로의 면역화는, 48시간 간격 (7일, 9일, 11일, 13일, 15일 및 17일)에서 6회 복강내 투여로 1500n몰/kg의 엽산염-FITC를 제공하는 것으로 구성되었다. 얻어지는 충실성 어깨 종양을 측정하고, 종양 크기에서의 % 증가를 결정하였다. 도 4에 나타낸 종양 성장 곡선은, 동물이 IL-2와 조합된 엽산염-FITC로 처리될 때 충실성 종양이 상당히 억제된다는 것을 나타낸다.
실시예 5
사이토카인의 조합에 의한 치료 효과
IFN-α (2.5×104U/일로 5회 매일 주사), IL-12 (0.5 ㎍/일로 5회 매일 주사) 또는 TNF-α (2 ㎍/일로 8일, 10일 및 12일에 3회 주사)과 함께 5000IU의 재조합 인간 IL-2를 5회 매일 주사 (8일 내지 12일)한 다음, 종양 세포 이식후 4일 및 7일째에 1500n몰/kg의 엽산염-FITC 또는 아미노플루오레신을 2회 투여량으로 주사하여 동물을 처리하는 것 이외에는 실시예 1에 기재된 것과 유사한 절차를 수행하였다. 또한, 장기간 생존율 데이타를 얻기 위해 필요한 시간을 줄이기 위한 노력에서, 간에 근접한 복강내에 종양 세포를 이식하였다. 따라서, 실시예 1에 나타낸 것에 비하여 종양-포함 생쥐의 수명이 일반적으로 단축되었다. 도 5에 나타낸 결과는, IL-2 단독이 IL-2 및 IL-12 또는 IL-2 및 TNF-α와의 조합 처리에 비하여 동물의 장기간 생존율을 증진시키는데 있어서 더욱 효과적임을 증명한다. 반대로, IL-2 및 IFN-α와의 조합 처리는 IL-2 단독에 비해 장기간 생존율을 증진시키는데 더욱 효과적이었다. 아미노플루오레신은 엽산염에 연결되지 않고 항-플루오레신항체를 종양 세포에 재표적화하지 않기 때문에, 이를 각종 사이토카인 조합과 함께 대조로서 주사하였다.
실시예 6
엽산염 플루오레신 이소티오시아네이트 접합체의 다수 주사 효과
48 시간 간격으로 1500n몰/kg의 엽산염-FITC의 6회 주사 (종양 세포 이식후 7일, 9일, 11일, 13일, 15일 및 17일)를 동물에 복강내 주사하는 것 이외에는 실시예 1에서와 유사한 절차를 수행하였다. 결과 (도 6)는, 종양 세포 이식후 4일 및 7일째에 엽산염-FITC를 2회 주사하는 것에 비하여, 엽산염-FITC로 여러번 주사하는 것이 엽산염-FITC 및 IL-2로 처리된 동물의 장기간 생존율을 개선시킴을 나타낸다.
실시예 7
엽산염 플루오레신 이소티오시아네이트 접합체 및 IL-2의 상승 효과
동물에 1500n몰/kg의 엽산염-FITC를 주사하고 일부 동물을 엽산염-FITC 또는 IL-2 단독으로 처리하는 것 이외에는 실시예 1에 기재된 것과 유사한 절차를 수행하였다. 또한, 실시예 5에 기재된 바와 같이, 종양 세포를 복강내 이식하였다. 엽산염-FITC 및 IL-2가 종양 함유 생쥐의 장기간 생존율을 증진시키는데 상승 작용을 하는지의 여부를 결정하기 위하여, 이 실험 (도 7 참조)이 수행되었다. 대조군 (n=8) 및 IL-2, 엽산염-FITC 또는 엽산염-FITC+IL-2로 처리된 군 (n=8)에 대한 중간 생존 기간은 각각 18, 19, 22 및 42일이었다. 도 7의 결과는, 종양-함유 생쥐의 장기간 생존율을 증진시키기 위한 엽산염-FITC 및 IL-2의 능력이, 엽산염-FITC의 부재시 및 단지 작은 효과만을 가진 엽산염-FITC를 사용할 때 생쥐의 생존에 대해 미미한 효과를 미치는 저-투여량 IL-2 단독으로도 강하게 상승된다는 것을 증명한다.
실시예 8
엽산염 플루오레신 이소티오시아네이트 접합체 및 IL-2의 상승 효과에서의 NK 세포 연관성
하나의 동물 군을, 엽산염-FITC 및 IL-2와 조합된 다클론성 토끼 항-마우스 NK 세포 항체 (항-아시알로 GM1; 미국 버지니아주 리치몬드의 와코 퓨어 케미칼 인더스트리즈 리미티드(Wako Pure Chemical Industries, Ltd.))로 처리하는 것 이외에는, 실시예 7에 기재된 것과 유사한 절차를 수행하였다. NK 세포 소실을 이루기 위해 종양 이식후 1일, 4일, 9일 및 14일째에 항체 원액의 1:10 희석액 0.2ml를 각각의 생쥐에 주사하였다. 대조군 및 엽산염-FITC + IL-2 또는 엽산염-FITC + IL-2 + α-NK Ab로 처리된 군에 대한 평균 생존 시간은 각각 18, 42 및 18.5일이었다. 도 8에 나타낸 결과는, NK 세포가 엽산염-FITC 및 IL-2와의 조합 처리에 의해 유발되는 종양-함유 생쥐의 장기간 생존율의 상승작용에 매개됨을 증명한다.
실시예 9
M109 종양 세포에 대항한 세포 면역의 발현
실시예 5에 기재된 위치에서 종양 세포를 복강내 이식하고, 종양 세포 이식후 7일, 8일, 9일, 11일 및 14일째에 동물에 PBS(대조)를 주사하거나 또는 엽산염-FITC (1500 n몰/kg), IL-2 (250,000 IU/투여) 및 IFN-α (25,000 U/투여)와 함께 공동-주사하는 것 이외에는 실시예 1에 기재된 것과 유사한 절차를 수행하였다.추가로, 처음 종양 세포 이식후 62일째에 5×105M109 세포의 주입에 의해, 처음 종양 세포 이식후 96일째에 1.5×106M109 세포의 주입에 의해, 또는 처음 종양 세포 이식후 127일째에 2.5×105라인 1 세포 (Balb/c 자발성 폐암종)의 주입에 의해 동물을 2차감염시켰다.
도 9에 나타낸 것과 같이, 5×105M109 세포를 주입한 대조 생쥐의 평균 생존 시간은 18.5일이었다. 1.5×106M109 세포를 주입한 대조 생쥐의 평균 생존 시간은 18일이었다. 2.5×105라인 1 세포를 주입한 대조 생쥐의 평균 생존 시간은 23.5일이었다. IL-2 및 IFN-α와 조합하여 엽산염-FITC로 처리된 5×105M109 세포를 주입하고, 62일째에 5×105M109 세포로 2차 감염시키고, 96일째에 1.5×106M109 세포로 2차 감염시키고, 127일째에 2.5×105라인 1 세포로 2차 감염된 생쥐의 평균 생존 시간은 192 일 이상이었다.
도 9에 나타낸 결과는, IL-2 및 IFN-α와 조합하여 엽산염-FITC로 처리된 동물에서의 장기간 지속성, 세포-유형 특이성 세포 면역의 발현을 증명한다. 이러한 장기간 지속성 면역은, M109 세포로 이식되고 엽산염-표적화 면역요법을 받은 동물을 이후의 M109 세포 주입에 의한 2차 감염시 질병이 재발하는 것으로부터 보호하였다. 라인 1 세포로 최종 2차감염 후 이러한 동물에서의 생존 시간은, M109 세포에서보다 라인 1 세포 위에서 엽산염 수용체가 더 낮은 수준으로 존재하고 M109 세포와 라인 1 세포간에 공유된 종양 항원이 존재하는 것에 기인할 수도 있으며, 그 결과 라인 1 세포와 혼선될 수 있는 M109-특이적 세포 면역 반응이 일어난다.
실시예 10
엽산염-플루오레신 이소티오시아네이트 접합체로 처리된 생쥐의 생존에 미치는 IL-2 투여 효과
실시예 5에 기재된 위치에서 종양 세포를 복강내 이식하고, 종양 세포 이식후 7일, 8일, 9일, 11일 및 14일째에 동물에 PBS(대조)를 주사하거나 또는 엽산염-FITC (1500 n몰/kg) 및 IL-2를 5×103IU(1X), 0.5×105IU(10X), 2.5×105IU(50X) 또는 5×105IU(100X)의 투여량으로 공동-주사하는 것 이외에는 실시예 1에 기재된 것과 유사한 절차를 수행하였다. 추가로, FITC-표지화 BSA가 아닌 FITC-표지화 키홀 림프트 헤모시아닌(KLH)으로 동물을 면역화하였다. 도 10에 나타낸 바와 같이, M109 세포로 이식되고 엽산염-FITC로 처리된 생쥐의 평균 생존 시간은 5×103IU의 IL-2 투여량 이상으로 IL-2 투여량이 증가함에 따라 증가되었다. 반대로, 대조 생쥐 (M109 세포로 주입되고 PBS로 처리된 생쥐)와 IL-2 단독으로 처리된 생쥐의 평균 생존 시간 사이의 실질적인 차이는 나타나지 않았다.
실시예 11
엽산염-플루오레신 이소티오시아네이트 접합체 및 IL-2로 처리된 생쥐의 IFN-α생존율 향상
실시예 5에 기재된 위치에서 종양 세포를 복강내 이식하고, 종양 세포 이식후 7일, 8일, 9일, 11일 및 14일째에 동물에 PBS(대조)를 주사하거나 또는 엽산염-FITC (1500 n몰/kg) 및 IL-2 (5000 IU/투여) 또는 엽산염-FITC (1500 n몰/kg), IL-2 (5000 IU/투여) 및 IFN-α (25,000 U/투여)를 공동 주사하는 것 이외에는 실시예 1에 기재된 바와 유사한 절차를 수행하였다. 추가의 생쥐 군을 엽산염-FITC, IL-2 및 IFN-α로 공동 주사하였으나, 동물을 BSA-FITC로 사전 면역시키지 않았다. 도 11은, PBS로 처리된 대조 생쥐에 대한 평균 생존 시간이 18.5일이고, 엽산염-FITC 및 IL-2를 공동 주사한 생쥐에 대한 평균 생존 시간이 20.5일이고, 엽산염-FITC, IL-2 및 IFN-α를 공동-주사한 생쥐에 대한 평균 생존 시간이 60일 이상이고, 사전 면역되지 않았으나 엽산염-FITC, IL-2 및 IFN-α를 공동-주사한 생쥐에 대한 평균 생존 시간이 24.3일임을 나타낸다. 생쥐를 5,000 IU의 IL-2로 주사하였기 때문에, 엽산염-FITC 및 IL-2를 주사한 생쥐에 대한 평균 생존 시간은 대조 생쥐에 대한 시간과 실질적으로 상이하지 않았으며, 실시예 10에 기재된 바와 같이 5000IU 이상의 IL-2 투여량은 7일, 8일, 9일, 11일 및 14일의 섭생법을 사용하여 엽산염-FITC로 처리된 생쥐의 평균 생존 시간을 증가시키기 위해 필요하다. 도 11에 나타낸 결과는, 종양 세포로 이식된 생쥐를 엽산염-FITC 및 IL-2로 처리한 결과 발생하는 평균 생존 시간의 증가가 IFN-α에 의해 더욱 향상된다는 것을 증명한다.
실시예 12
엽산염-표적화 면역요법에 미치는 CD8 + T 세포 결손의 효과
실시예 5에 기재된 위치에서 종양 세포를 복강내 이식하고, 종양 세포 이식후 7일, 8일, 9일, 11일 및 14일째에 동물에 PBS (대조)를 주사하거나 엽산염-FITC (1500 n몰/kg), IL-2 (5000IU/투여) 및 IFN-α (25000 U/투여)를 공동 주사하는 것 이외에는 실시예 1에 기재된 바와 유사한 절차를 수행하였다. 추가의 생쥐 군에 아미노플루오레신(1500n몰/kg), IL-2 및 IFN-α을, 또는 엽산염-FITC, IL-2, IFN- 및 항-CD8+T세포 항체를 공동-주사하였다 (복수의 형태로 2일, 3일, 7일, 11일 및 15일에 투여됨). 도 12에 나타낸 바와 같이, 항-CD8+T 세포 항체는 엽산염-FITC, IL-2 및 IFN-α로 처리된 생쥐에서 평균 생존 시간의 증가를 억제하며, 이는 CD8+T 세포가 엽산염-표적화 면역요법에 의한 세포 면역 반응의 활성화에서 역할을 한다는 것을 나타낸다. 아미노플루오레신은 엽산염에 결합되지 않고 항-플루오레신 항체를 종양 세포에 재표적화하지 않기 때문에, 이 화합물을 IL-2, IFN-α 사이토카인 조합과 함께 주사하였다. 도 12는, M109 세포로 이식된 생쥐의 평균 생존 시간을 증가시킴에 있어서, IL-12 및 IFN-α와 함께 아미노플루오레신이 엽산염-FITC, IL-2 및 IFN-α 보다 훨씬 덜 효과적임을 나타낸다.
실시예 13
IL-2 및 IFN-α에 의해 향상된 엽산염-표적화 면역요법에 미치는 GM-CSF의 증대 효과
실시예 5에 기재된 위치에서 종양 세포를 복강내 이식하는 것 이외에는 실시예 1에 기재된 것과 유사한 절차를 수행하였다. 추가로, 도 13에 나타낸 바와 같이, 동물에 IL-2 (5000 IU/투여), IFN-α (25000U/투여) 및 GM-CSF (3000 U/투여)를 포함한 다수 사이토카인을 주사하였다. M109 세포 이식후 8일 내지 12일에서 5일 연속 매일 주사한 다음, 4일 및 7일에 1500 n몰/kg의 엽산염-FITC의 2회 투여로 주사하여 사이토카인을 공동-주사하였다. 도 13에 나타낸 결과는, PBS로 처리된 생쥐에 대한 평균 생존 시간이 19일이고, 엽산염-FITC 없이 IL-2, IFN-α 및 GM-CSF를 주사한 생쥐에 대한 평균 생존 시간은 22일이고, 엽산염-FITC, IL-2 및 IFN-α를 주사한 생쥐에 대한 평균 생존 시간은 38일이고, 엽산염-FITC, IL-2, IFN-α 및 GM-CSF를 주사한 생쥐에 대한 평균 생존 시간은 57.5일 이상임을 나타낸다. 결과는, IL-2 및 IFN-α로 처리된 생쥐에서 GM-CSF가 엽산염-표적화 종양 세포 사멸을 더욱 증대시킨다는 것을 증명한다. PBS, IL-2, IFN-α 및 GM-CSF를 주사한 생쥐에 대한 평균 생존 시간은 대조 생쥐에 대한 것과 상당히 다르지 않았으며, 이는 엽산염-FITC를 사용함으로써 종양-특이적 면역화 반응을 표적화하는 것이 중요함을 나타낸다.
실시예 14
엽산염-플루오레신 이소티오시아네이트 접합체로 처리된 생쥐의 생존율에 미치는 IFN-α투여의 효과
실시예 5에 기재된 위치에서 종양 세포를 복강내 이식하고, 동물을 PBS(대조)로 처리하거나, 또는 엽산염-FITC (1500n몰/kg) 및 IFN-α로 1.5×105IU/투여 (6x), 7.5×104IU/투여 (3x), 2.5×104IU/투여 (1x) 및 7.5×103IU/투여 (0.3x)의투여량으로 공동 주사하는 것 이외에는 실시예 1에 기재된 것과 유사한 절차를 수행하였다. 추가로, 동물을 FITC-표지화 BSA가 아닌 FITC-표지화 키홀 림피트 헤모시아닌(KLH)으로 면역화하였으며, 종양 세포 이식후 7일, 8일, 9일, 11일 및 14일에 동물에 엽산염-FITC 및 IFN-α를 주사하였다. 도 14에 나타낸 바와 같이, M109 세포로 이식되고 엽산염-FITC로 처리된 생쥐의 평균 생존 시간은, IFN-α 투여량을 0.8×104IU/투여의 IFN-α 투여량 이상으로 증가시킴에 따라 증가되었다.
실시예 15
엽산염-표적화 면역요법에 미치는 면역원으로서의 디니트로페닐의 효과
실시예 5에 기재된 위치에서 종양 세포를 복강내 이식하고, 종양 세포 이식후 7일, 8일, 9일, 11일 및 14일에 동물을 PBS(대조)로 처리하거나 또는 디니트로페닐(DNP) (1500n몰/kg), IL-2 (5000IU/투여/일) 및 IFN-α (2.5×104단위/일)로 공동 주사하거나, 또는 엽산염-디니트로페닐(DNP) (1500n몰/kg), IL-2 (5000IU/투여/일) 및 IFN-α (2.5×104단위/일)로 공동 주사하는 것 이외에는 실시예 1에 기재된 것과 유사한 절차를 수행하였다. 추가로, 동물을 DNP-표지화 키홀 림피트 헤모시아닌(KLH)으로 면역화하였다. 도 15에 나타낸 바와 같이, 엽산염-DNP, IL-2 및 IFN-α로 처리된 생쥐의 평균 생존 시간은 대조 생쥐(PBS로 처리) 또는 DNP, IL-2 및 IFN-α로 처리된 생쥐에 비해 증가되었다. 즉, DNP는 엽산염-표적화 면역요법에서 사용하기 위해 효과적인 면역원이다.
실시예 16
엽산염 플루오레신 이소티오시아네이트 접합체 및 IFN-α의 상승 효과
실시예 5에 기재된 위치에서 종양 세포를 복강내 이식하고, 종양 세포 이식후 7일, 8일, 9일, 11일 및 14일에 동물을 PBS (대조), IFN-α 단독 (7.5×104단위/일), 엽산염-FITC 단독 (1500n몰/kg)으로 처리하거나 엽산염-FITC (1500 n몰/kg) 및 IFN-α (7.5×104단위/일)로 공동 주사하는 것 이외에는 실시예 1에 기재된 것과 유사한 절차를 수행하였다. 추가로, 동물 (1군당 5마리 생쥐)을 FITC-표지화 BSA가 아닌 FITC-표지화 키홀 림피트 헤모시아닌(KLH)로 면역화하였다. 도 16에 나타낸 바와 같이, PBS (대조), IFN-α, 엽산염-FITC 또는 엽산염-FITC + IFN-α 로 처리된 군에 대한 평균 생존 시간은 각각 17일, 17일, 23일 및 33일이었다. 이러한 결과는, IL-2와 같이 IFN-α가 종양-함유 생쥐의 장기간 생존율을 증가시키기 위하여 엽산염-FITC와 함께 상승적으로 작용함을 나타낸다.
실시예 17
생쥐의 장기간 생존율에 미치는 고 농도의 사이토카인 및 면역원으로서의 디니트로페닐의 효과
실시예 5에 기재된 위치에서 종양 세포를 복강내 이식하고, 종양 세포 이식후 7일, 8일, 9일, 11일 및 14일에 동물을 PBS(대조)로 처리하거나 PBS, IL-2 (2.5×105단위/일) 및 IFN-α (7.5×104단위/일)로 공동-주사하거나, 또는 엽산염-디니트로페닐(DNP) (1500n몰/kg), IL-2 (2.5×105단위/일) 및 IFN-α (7.5×104단위/일)로 공동-주사하는 것 이외에는 실시예 1에 기재된 것과 유사한 절차를 수행하였다. 추가로, 동물을 DNP-표지화 키홀 림피트 헤모시아닌(KLH)으로 면역화하였다. 도 17에 나타낸 바와 같이, 엽산염-DNP, IL-2 및 IFN-α로 처리된 생쥐의 평균 생존 시간이 대조 생쥐(PBS로 처리됨) 또는 PBS, IL-2 및 IFN-α로 처리된 생쥐에 비해 증가되었다. 엽산염-DNP, IL-2 및 IFN-α (IL-2 및 IFN-α는 각각 2.5×105단위/일 및 7.5×104단위/일의 농도이다)로 처리된 생쥐는 완전히 치료되었다.

Claims (45)

  1. 면역원이 숙주에서 내인성 또는 외인성 항체에 의해 인식되는 것으로 알려져 있거나 숙주에서 면역 세포에 의해 직접 인식되는 것으로 알려진, 상기 면역원과 리간드와의 복합체를 포함하는 리간드-면역원 접합체 조성물; 및
    세포 사멸제, 종양 침투 증진제, 화학요법제, 항균제, 세포독성 면역 세포, 및 내인성 면역 반응을 자극할 수 있고 리간드-면역원 접합체에 결합하지 않는 화합물로 구성된 군에서 선택되는 치료 인자를 포함하는 하나 이상의 추가의 조성물을 숙주에 투여하는 단계를 포함하는,
    세포 집단의 구성원이 리간드에 접근가능한 결합 부위를 가진 병원성 세포 집단을 함유하는 숙주 동물에서, 상기 병원성 세포 집단의 내인성 면역 반응-매개 특이적 제거를 증진시키는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 병원성 세포 집단이 암세포 집단인 방법.
  3. 제2항에 있어서, 암세포 집단이 종양형성성인 방법.
  4. 제1항에 있어서, 병원성 세포 집단이 외인성 병원체이거나 또는 외인성 병원체를 함유한 내인성 세포 집단인 방법.
  5. 제4항에 있어서, 외인성 병원체가 세균, 진균, 바이러스, 마이코플라즈마 및 기생충으로 구성된 군에서 선택되는 방법.
  6. 제1항에 있어서, 리간드가 세포막 수용체에 특이적으로 결합가능한 비타민인 방법.
  7. 제6항에 있어서, 리간드가 엽산 및 기타 엽산염 수용체-결합 리간드로 구성된 군에서 선택되는 방법.
  8. 제1항에 있어서, 리간드가 공유, 이온 또는 수소 결합을 포함한 결합을 통해 면역원에 화학적으로 복합체형성되는 방법.
  9. 제8항에 있어서, 리간드가 리간드의 글루타밀 γ-카르복시 잔기를 통해서만 면역원에 공유 결합되는 글루타밀 잔기를 가진 엽산 유사체인 방법.
  10. 제8항에 있어서, 리간드가 리간드의 글루타밀 α-카르복시 잔기를 통해서만 면역원에 공유 결합되는 글루타밀 잔기를 가진 엽산 유사체인 방법.
  11. 제9항 또는 제10항에 있어서, 면역원과 리간드 간의 공유 결합이 면역원으로의 직접적인 공유 결합에 의해 또는 2가 링커를 통한 공유 결합에 의해 이루어지는방법.
  12. 제1항에 있어서, 리간드가 수용체에 결합가능한 작은 유기 분자이고, 상기 수용체가 상기 병원체 세포 집단의 표면 위에서 우선적으로 발현되거나, 유일하게 발현되거나 또는 과다발현되는 방법.
  13. 제12항에 있어서, 작은 유기 분자가 항균 약물인 방법.
  14. 제1항에 있어서, 리간드가 β-락탐 항생물질인 방법.
  15. 제1항에 있어서, 리간드 결합 부위가 전이 암세포 위에서 우선적으로 발현되거나, 유일하게 발현되거나 또는 과다발현된 항원인 방법.
  16. 제15항에 있어서, 리간드 결합 부위가 EphA2인 방법.
  17. 제1항에 있어서, 면역원이 20,000 달톤 미만의 분자량을 가진 유기 분자인 방법.
  18. 제17항에 있어서, 유기 분자가 플루오레신 또는 디니트로페닐인 방법.
  19. 제1항에 있어서, 면역원이 α-갈락토실기인 방법.
  20. 제1항에 있어서, 항체가 상기 숙주에 대해 외인성이고, 상기 접합체 조성물과 공동-투여되는 방법.
  21. 제1항에 있어서, 치료 인자가 사이토카인을 포함하는 방법.
  22. 제21항에 있어서, 치료 인자가 IL-2, IL-12, IL-15 또는 이들의 조합을 포함하는 방법.
  23. 제21항에 있어서, 치료 인자가 IFN-α 또는 IFN-γ와 조합된 IL-2, IL-12, IL-15 또는 그들의 조합을 포함하는 방법.
  24. 제21항에 있어서, 치료 인자가 IFN-α 또는 IFN-γ또는 이들의 조합 및 GM-CSF와 조합된 IL-2, IL-12, IL-15 또는 그들의 조합을 포함하는 방법.
  25. 제21항에 있어서, 치료 인자가 적어도 하나의 NK 세포 또는 T 세포 자극제를 포함하는 방법.
  26. 제1항에 있어서, 리간드-면역원 접합체 조성물이 다수 주사로 투여되는 방법.
  27. 제1항에 있어서, 숙주 동물이 미리 면역원에 자연적으로 노출되어, 숙주 동물이 면역원에 대한 내인성 항체의 존재에 의해 입증되는 상기 면역원에 대한 기존의 면역을 갖게 되는 방법.
  28. 제1항에 있어서, 숙주 동물이 비-자연적 과정에 의해 면역원에 미리 노출되어, 상기 면역원에 대한 숙주 동물의 면역 반응이 제공되는 방법.
  29. 제28항에 있어서, 동물의 면역 반응을 제공하는 비-자연적 과정이 예방접종인 방법.
  30. 제28항에 있어서, 면역 반응을 제공하는 비-자연적 과정이 능동 면역화인 방법.
  31. 제1항에 있어서, 내인성 면역 반응이 체액성 면역 반응을 포함하는 방법.
  32. 제31항에 있어서, 체액성 반응이 후천성 면역 반응인 방법.
  33. 제31항에 있어서, 체액성 반응이 선천성 면역 반응인 방법.
  34. 제32항에 있어서, 숙주 동물에 백신 조성물을 투여함으로써 후천성 반응이 유도되는 방법.
  35. 제1항에 있어서, 내인성 면역 반응이 세포-매개 면역 반응을 포함하는 방법.
  36. 제1항에 있어서, 내인성 면역 반응이 체액성 및 세포-매개 면역 반응을 포함하는 방법.
  37. 상기 리간드와 면역원의 복합체를 포함하는 조성물을 숙주에 투여하고;
    면역원에 대항하여 작용하는 항체를 숙주에 투여하고;
    세포 사멸제, 종양 침투 증진제, 화학요법제, 항균제, 세포독성 면역 세포, 및 리간드-면역원 복합체에 결합하지 않는 내인성 면역 반응의 자극제로 구성된 군에서 선택되는 적어도 하나의 추가의 치료 인자를 상기 숙주에 투여하는 단계
    를 포함하는, 리간드를 위한 결합 부위를 발현하는 병원성 세포 집단을 함유한 숙주 동물에서, 병원성 세포 집단의 내인성 면역 반응-매개 특이적 제거를 증진시키는 방법.
  38. 면역원이 숙주에서 내인성 또는 외인성 항체에 의해 인식되는 것으로 알려져 있거나 숙주에서 면역 세포에 의해 직접 인식되는 것으로 알려진, 상기 면역원의공유 결합된 접합체를 포함하는 조성물; 및
    글루타밀기의 γ-카르복시기를 통해서만 면역원에 대한 공유 결합이 이루어지는, 글루타밀기를 가진 엽산 또는 엽산 유사체를 포함하는 리간드를 숙주에 투여하는 단계를 포함하는,
    엽산 수용체를 우선적으로 발현하거나, 유일하게 발현하거나 또는 과다발현하는 병원성 세포 집단을 함유한 숙주 동물에서, 병원성 세포 집단의 내인성 면역 반응-매개 특이적 제거를 증진시키는 방법.
  39. 면역원이 숙주에서 내인성 또는 외인성 항체에 의해 인식되는 것으로 알려져 있거나 숙주에서 면역 세포에 의해 직접 인식되는 것으로 알려진, 상기 면역원의 공유 결합된 접합체를 포함하는 조성물; 및
    글루타밀기의 α-카르복시기를 통해서만 면역원에 대한 공유 결합이 이루어지는, 글루타밀기를 가진 엽산 또는 엽산 유사체를 포함하는 리간드를 숙주에 투여하는 단계를 포함하는,
    엽산 수용체에 대한 결합 부위를 우선적으로 발현하거나, 유일하게 발현하거나 또는 과다발현하는 병원성 세포 집단을 함유한 숙주 동물에서, 병원성 세포 집단의 내인성 면역 반응-매개 특이적 제거를 증진시키는 방법.
  40. 면역원이 숙주에서 내인성 또는 외인성 항체에 의해 인식되는 것으로 알려져 있거나 숙주에서 면역 세포에 의해 직접 인식되는 것으로 알려진, 상기 면역원의공유 결합된 접합체를 포함하는 조성물;
    글루타밀기의 γ-카르복시기를 통해서만 공유 결합이 이루어지는, 글루타밀기를 가진 엽산 또는 엽산 유사체를 포함하는 리간드; 및
    세포 사멸제, 종양 침투 증진제, 화학요법제, 항균제, 세포독성 면역 세포, 및 내인성 면역 반응을 자극할 수 있고 리간드-면역원 접합체에 결합하지 않는 화합물로 구성된 군에서 선택되는 치료 인자를 포함하는 하나 이상의 추가의 조성물을 숙주에 투여하는 단계를 포함하는,
    엽산 수용체에 대한 결합 부위를 우선적으로 발현하거나, 유일하게 발현하거나 또는 과다발현하는 병원성 세포 집단을 함유한 숙주 동물에서, 병원성 세포 집단의 내인성 면역 반응-매개 특이적 제거를 증진시키는 방법.
  41. 면역원이 숙주에서 내인성 또는 외인성 항체에 의해 인식되는 것으로 알려져 있거나 숙주에서 면역 세포에 의해 직접 인식되는 것으로 알려진, 상기 면역원의 공유 결합된 접합체를 포함하는 조성물;
    글루타밀기의 α-카르복시기를 통해서만 공유 결합이 이루어지는, 글루타밀기를 가진 엽산 또는 엽산 유사체를 포함하는 리간드; 및
    세포 사멸제, 종양 침투 증진제, 화학요법제, 항균제, 세포독성 면역 세포, 및 내인성 면역 반응을 자극할 수 있고 리간드-면역원 접합체에 결합하지 않는 화합물로 구성된 군에서 선택되는 치료 인자를 포함하는 하나 이상의 추가의 조성물을 숙주에 투여하는 단계를 포함하는,
    엽산 수용체를 우선적으로 발현하거나, 유일하게 발현하거나 또는 과다발현하는 병원성 세포 집단을 함유하는 숙주 동물에서, 병원성 세포 집단의 내인성 면역 반응-매개 특이적 제거를 증진시키는 방법.
  42. 숙주 동물내에서 후천성 또는 선천성 면역 반응, 공동-투여된 항체, 또는 직접적으로 면역 세포에 의하여 병원성 세포를 특이적으로 제거하기 위해, 숙주 동물에서 병원성 세포 집단에 특이적으로 결합가능한 리간드-면역원 접합체의 치료적 유효량; 세포 사멸제, 종양 침투 증진제, 화학요법제, 항균제, 및 내인성 면역 반응을 자극할 수 있고 리간드-면역원 접합체에 결합하지 않는 화합물로 구성된 군에서 선택되는 치료 인자; 및 제약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 제약학적 조성물.
  43. 제42항에 있어서, 비경구적 지속 방출 투여 형태의 제약학적 조성물.
  44. 제42항에 있어서, 치료 인자가 면역 자극제인 제약학적 조성물.
  45. 제44항에 있어서, 면역 자극제가 IL-2, IL-12, IL-15, IFN-α, IFN-γ 및 GM-CSF, 또는 이들의 조합으로 구성된 군에서 선택되는 화합물을 포함하는 제약학적 조성물.
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