JPH09503003A

JPH09503003A - クラスｉｉのアルファ鎖断片による免疫調節

Info

Publication number: JPH09503003A
Application number: JP8502506A
Authority: JP
Inventors: クレイバーガー、キャロル; クレンスキー、アラン、エム．
Original assignee: ザボードオブトラスティーズオブザレランドスタンフォードジュニアユニバーシティ
Priority date: 1994-06-16
Filing date: 1995-06-16
Publication date: 1997-03-25
Also published as: EP0723458A4; WO1995034321A1; EP0723458A1; AU2705795A; CA2169762A1

Abstract

(57)【要約】クラスIIＭＨＣ抗原のαサブユニットのペプチドは、Ｔ細胞の活性の調節に用いられる。前記ペプチドは、それ自身のみ又は他の薬剤と併用することによって、治療、特に移植に関連した治療に使用することができる。

Description

【発明の詳細な説明】［発明の名称］クラスＩＩのアルファ鎖断片による免疫調節［発明の属する技術分野］本発明は免疫調節療法に関する。［発明の背景］免疫抑制療法の進歩にも拘らず、移植（transplant engraftment）を成功させるための主題の障害は移植拒絶または移植片対宿主の病気（host disease）となる同種異系間の免疫応答である。現在利用できる非特異的な免疫抑制療法は腎臓毒（nephrotoxicity）、高血圧症、高脂血症及び骨病（bone disease）を含む感染と種々の有害な副作用の危険性が増大している。現在の免疫抑制剤のすべてをもってしても、激しい移植拒絶と長期間の移植による生存の失敗が続いている。体液の及び細胞のリンパ応答はゆっくりと明瞭になりつつある。しかしながら達成されてきた実質的な進歩にも拘らず、説明のつかない免疫応答についての多くの面がなお存在する。移植を成功させるために実質的に重要である１つの面は寛容（tolerization）であり、これは細胞の消耗、抑制、アネルギー（anergy）を伴うかもしれない。移植体の他にＴ細胞の増殖及び／または活性化の抑制が重要であるという他の指摘もある。これらは自己免疫、ガン、Ｔ細胞が媒介する細胞毒性等を含む。したがって同種異系間の移植を受け入れるための寛容を伴う自然に起こるプロセスを集めることができることは実質的な価値があるだろう。［参考文献］ Sayeth et al.，Induction of Immunity and Oral Tolerance with Polymorph ic Class II Major Histocompatibility Complex Allopeptides in the Rat，Pr oc．Natl．Acad Sci．USA，89：7762-7766(1992)。Sayegh et al.，Thymic Reco gnition of Class II Major Histocompatibility Complex Allopeptides Induce s Donor Specific Unresponsiveness to Renal Allografts，Transplantation 5 6:461(1993)。Sayegh et al.，Induction of Immunity and Oral Tolerance to Alloantigen by Polymorphic Class II Major Histocompatibility Complex All opeptides in the Rat，Transplantation Proc．25:357(1993)。Beuichon et al .，Donor MHC Peptides Are Presented by Recepient MHC Molecules during Gr aft Rejection，J．Exp．Med．175:305(1992)。Wachtsinger et al．Mechanisms of Allo-Recognition，Transplantation 57:572-576(1994)．［発明の概要］クラスＩＩ主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）抗原のアルファ鎖のα₁ヘリックスの少なくとも一部分に対応するペプチドは免疫調節のために用いられる。そのペプチド、それから誘導される変異体、及び擬ペプチド剤が免疫応答が調節される宿主に対して与えられる。［具体的な態様の説明］本発明に従って、成分、特にオリゴペプチドが提供される、これはクラスＩＩＭＨＣ抗原のアルファ鎖のα₁ヘリックスの中に入る少なくとも８つのアミノ酸について同じ配列をもち、または配列と競合できるものである、さらに特には人間のリンパ球抗原（ＨＬＡ）を提供する。人間のＭＨＣ抗原または他の種において同等のものと関連のあるクラスＩＩのＨＬＡはＤＰ、ＤＱ、及びＤＲを含む。特に重要なのはおよそアミノ酸５０からアミノ酸８５までのアミノ酸、より一般にはおよそアミノ酸５３からアミノ酸８０までのアミノ酸、特にはおよそアミノ酸７１からアミノ酸８０までの範囲のアミノ酸を含むアルファ鎖の領域である。実質的にはより長いアミノ酸配列が用いられうる、これらの付加的なフランキング（flanking）アミノ酸群は免疫調節活性を提供するよりもむしろ特異的な目的に使われるであろう。多くの場合、特異的なアミノ酸は重要ではない、したがって置換することができる、特に保存的な置換については可能である。さらに、完全なα₁ヘリックスは結合にとって必須でないと思われる、このためオリゴペプチド間で保存された領域のみが望ましい効果のために要求される。保存された領域においてさえ、種々の置換がなされうる、そこでは極性と大きさの変動が結合パートナーによって占められうる。便利なことに、置換はアラニンとバリン、またはそのいずれかのアミノ酸、または酸性、塩基性のアミノ酸すなわちＮ及びＱ間でなされる。大部分は、本発明のペプチド成分はつぎの配列を含む少なくともおよそ８つのアミノ酸のオリゴペプチドを含む。式１：ａａ⁵³aａ⁵⁴ａａ⁵⁵ａａ⁵⁶Ｆａａ⁵⁸ａａ⁵⁹Ｑａａ⁶¹ａａ⁶²Ｌａａ⁶⁴ＮＩＡａａ⁶⁸ ａａ⁶⁹ａａ⁷⁰ａａ⁷¹ＮＬａａ⁷⁴ａａ⁷⁵ａａ⁷⁶ａａ⁷⁷ａａ⁷⁸Ｒａａ⁸⁰ａａ⁸¹ ａａ⁸²ａａ⁸³ ここでａａ５３、ａａ５４及びａａ５５はプロリン、脂肪族及び芳香族の両方の酸性アミノ酸または塩基性アミノ酸、さらに特にＶ、Ｉ、Ｌ、Ｄ、Ｅ、Ｋ、ＲまたはＦ以外の中性アミノ酸を含むアミノ酸である。ａａ⁵⁶はＫ，Ｒ，Ｓ又はＴ、特にＲ又はＳ；ａａ⁵⁸はＤ又はＥ；ａａ⁵⁹はＧ，Ａ又はＰ、特にＡ又はＰ；ａａ⁶¹はＡ，Ｇ又はＦ、特にＧ又はＦ；ａａ⁶²はＡ又はＧ；ａａ⁶⁴Ｇ，Ａ，Ｓ又はＴ、特にＡ又はＴ；ａａ⁶⁸はＩ，Ｌ又はＶ、特にＩ又はＶ；ａａ⁶⁹はＤ，Ｅ，Ｉ，Ｌ又はＶ、特にＤ又はＬ；ａａ⁷⁰はＫ，Ｎ，Ｑ又はＲ、特にＫ又はＮ；ａａ⁷¹はＨ，Ｎ，Ｑ，Ｓ又はＴ、特にＨ，Ｎ又はＳ；ａａ⁷⁴はＤ，Ｅ，Ｎ又はＱ、特にＥ又はＮ；ａａ⁷⁵はＩ，Ｌ，Ｓ，Ｔ又はＶ、特にＩ又はＴ；ａａ⁷⁶はＩ，Ｌ，Ｎ又はＶ、特にＬ，Ｍ又はＶ：ａａ⁷⁷はＩ，Ｌ，Ｓ，Ｔ又はＶ、特にＩ又はＴ；ａａ⁷⁸はＫ，Ｎ，Ｑ又はＲ、特にＫ又はＱ；ａａ⁸⁰はＳ，Ｔ又はＹ、特にＳ又はＹ；ａａ⁸¹はＮ，Ｑ，Ｖ，Ａ又はＹ；ａａ⁸²はＳ，Ｔ又はＣ；及びａａ⁸³Ｓ，Ｔ，Ｋ又はＲ。特に重要なのは配列７１〜７９のなかにある少なくとも８つのアミノ酸をもつ配列である、この領域においてさえ、ある置換は全体の活性の損失なしに許容されるにも拘らず、そこではこれらのアミノ酸は置換による活性の減退に対するさらなる実体（subject）であろう。一般には２０％未満、より一般的には１０％未満のアミノ酸が置換されまたは消滅するであろう、置換される数は一般には３未満、より一般的には２未満である。大部分は、これらの置換は保存的な置換であろう、そこでは次表は同列上のアミノ酸は互いに置換されうることを示している。ここでＰはＧ又はＡの置換には用いられないであろう。一方Ｉ，Ｌ，Ｍ，Ｎ，Ｑ及びＶは互いに置換されうる。ＨＬＡからの特に重要な配列は以下の通りである：主題のペプチドは広い種々の方法で修正されうる。すでに示したように主題のペプチドは天然のまたは非天然のアミノ酸、特にＤ−ステレオイソマーにより変異原化するかもしれない。置換と消滅に関しては、予め示された制限が適用されるであろう、そこでは置換は異なるステレオイソマーを含む、一方アミノ酸のすべては非天然のステレオイソマーで置換されうる。部位７４及び７７は活性の保持のための修正を許容する。例えば、ほぼ同じ鎖長（およそ５から８の領域において、ヘテロ原子を含む）、例えばＴ、をもつ中性のアミノ酸によるＩの置換は部分的に活性の損失を招く。一方位置７４の中性のＮの置換は活性について実質的な効果をもたない。そこでは酸性アミノ酸、Ｄ、が置換のために用いられる。対照的にＤによるＮの置換は活性を消滅させる。その活性はＴ細胞増殖を誘発するコンコナバリン（Conconavalin）Ａのペプチドによる阻害である。ある特定の部位が示されたペプチドにおいて置換にしたがうかどうかを決定するために、組み合わせの手法を用いてペプチドが合成によって製造されうる。そこでは示されたアッセイにおいてその活性のためにスクリーンされうる。アッセイは簡単でペプチドは活性のためにスクリーンされうる、そこでは保存的または非保存的置換がある特定部位のアミノ酸が必須であるかどうかを決定するために用いられうる。通常置換の数は３以下、より通常は２以下、一般的には１以下であろう。ある特別な部位が必須でないと決定されると、その部位は置換されてもよい。一方１つの必須でない部位を含む２つの置換の効果を決定するために他の部位の置換をしてもよい。主題のペプチドはあらゆる哺乳類から得られる：家畜、実験動物のような；例えばマウス、子牛、イヌ科の動物、ネコ科の動物、ウマ科の動物、うさぎ、霊鳥類；そして特に人間。主題の配列は異なるＭＨＣ抗原の対立遺伝子の広い範囲にわたって活性を有するので、同種異系間のまたは異種間の配列を用いてもよい。さらにペプチドは異なる目的のために種々の他の成分に対してペプチドにそったあらゆる近接した部位、特に末端部に、共有結合等によって結合してもよい、そこではＮ末端群が置換され及び／またはＣ末端群が置換される。ペプチドは以下のものに結合できる：ａ）抗体の生産のための免疫化のための宿主への投与のための免疫原；ｂ）合成遺伝子等の合成、発現手段による特別なＭＨＣ抗原についての近接していないＭＨＣ配列；ｃ）脂質またはポリアルキレンオキシ（polyalkyleneoxy）群；ｄ）糖；またはｅ）核酸。特に重要なのは合成遺伝子の合成または発現により他のペプチドに主題のペプチドを結合することである、そこではその他のペプチドは宿主に投与されたときに主題のペプチドの安定性を高めるために提供される。免疫グロブリンの定常領域ＩｇＧＦｃのような種々のペプチドを用いることができる。ペプチドは標的分子に対するペプチドの結合の検索のために、直接的かまたは間接的に種々の標識にリンクしてもよい。標識は酵素、蛍光、化学的発光（chemiluminescers）、ラジオアイソトープ等を含む。さらに主題のペプチドは、主題の分子に対して特異的な親和性を有する分子を含む細胞または細胞断片のアフィニティーセパレーション（affinity separ ation）に供するために、粒子、容器壁等の固体基質に結合してもよい。主題のペプチドはＴ細胞の活性とアネルギーに関連したメカニズムの調査と解明に拡張して用いることができる。主題のペプチドは特別な刺激、例えばコンカナバリンＡに対するＴ細胞の活性を保護するために用いてもよい、そこでは経路のブロックが調査されうる。主題のペプチドと関連して細胞内または細胞外のいずれかの異なる試薬を用いることにより、主題のペプチドの存在により影響されるＴ細胞の活性に関連した経路を分離することができる。主題のペプチドは、主題のペプチドの効果を増加させるため、またはいずれかの経路にＴ細胞を導くため主題のペプチドの効果を支配する能力に関する成分をスクリーニングするのに用いられうる。Ｔ細胞の部分的な集合は他の表現型特性と同様に主題のペプチドに対する結合親和性によって分類することができる。例えば、腫瘍浸潤（infiltrating）リンパ球、ナチュラルキラー細胞、滑液に向かう細胞、粘膜組織、皮下組織、リンパ組織等は、主題のペプチドに対する結合に関して分類することができる。この方法で、主題のペプチドは特異な指示関連した特異な応用のために用いることができる。主題のペプチドはシングルポリペプチドを供給するために共に結合することができる。そこではポリペプチドはシングルペプチドの重合体または異なる主題のペプチドの組み合わせである。通常配列の数は少なくとも２で２０以下、通常はおよそ１０以下の配列または繰り返しであろう。あるいは主題のペプチドはより広い活性スペクトルまたは相乗的な活性を提供するための混合物中で結合しているかもしれない。主題のペプチドは種々の方法で調製されうる。便利にもそれらはベックマン（ Beckman,Applied Biosystem Inc.）のような自動合成機または他の自動装置を用いて伝統的な技術によって合成することができる。あるいは特別なペプチドをコードするＤＮＡ配列が調製され望ましいペプチドを提供するためにクローンされ、発現されうる。この場合、メチオニンが第１のアミノ酸でありまたはシグナル配列が提供されうる。そこでは発現されたペプチドがシグナルペプチドのプロセッシングおよび除去のために分泌される。合成されたＤＮＡ配列を調製するための技術は文献で広範に記載されており議論する必要はない。Molecular Biology: A Lboratory Manual，eds．Sambrook et al.，Cold Spring Harbor Laboratorie s，Cold Spring Harbor，NY 1989を参照せよ。あるいは、ペプチドは天然のソース（sources）から単離できうる。また例えばイオン交換物質のクロマトグラフィ、大きさによる分離、イムノアフィニティクロマトグラフィおよび電気泳動を含む既知の技術によって精製できうる。ここで用いられているように、用語”実質的に純粋なペプチド成分の調製”とは通常およそ７０％より多いペプチドがポリペプチドが自然に会合する原料−これは天然のまたはペプチドの生産原である−を有さない、好ましくはおよそ８０％より多いペプチドがこれらの原料を有さない、さらに好ましくはおよそ９５％より多いペプチドがこれらの原料を有さないペプチドの調製を意味する。しかしながらこれらの原料はペプチドが薬剤成分の調製において混合される原料を排除する。配列は意図された目的に応じて修正されうる。固体基質または他の分子に対するペプチドのリンクを許容する異なるＮまたはＣ末端群が導入されうる。ペプチドを製造する合成過程においてあらゆる分子が内部の部位または末端に導入されうる、それはペプチドが調製される目的に依存して連続的反応を許容しうる。診断の目的のために広い種々の標識が末端にリンクされうる。それは直接的または間接的に検出シグナルを提供しうる。例えば蛍光体、酵素、粒子等のような標識に結合を提供する末端または他の分子に蛍光体が導入されうる。そこでは他の分子は特異的な結合をペアまたは受容体、例えば抗体のハプテニックな（hapt enic）または抗原的なメンバーである。例えば結合は末端または例えばビオチン（biotin）に導入されうる。それは酵素または蛍光体等接合するアビジン（avid in）と結合するであろう。あるいは種々の反応部位が粒子、固体基質、巨大分子などとリンクするため末端に導入されうる。例えば保護された中間の側鎖により固体基質と結合した伸張鎖の内部のアミノ基がメチルジチオベンゾイン酸（meth yldithiobenzoic acid）（ＭＤＴＢ）と接合するかもしれない。フリーのメルカプタン群（group）は活性化されたオレフィンとの接合のために用いられうる。こうして血清アルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン（keyhole limpet hemocyanin）、小牛βグロブリン等のようなタンパタ質はイムノアッセイに用いるため、アフィニティクロマトグラフィ等のためペプチドに対する抗体を生産するための免疫原を提供するためペプチドに接合しうる。あるいはペプチドはＤＮＡ配列を調製することにより他のポリペプチドを結合できる。そのＤＮＡ配列は重要な結合ペプチドを含む融合タンパク質を提供するようにタンパク質に対してＮ末端、Ｃ末端または内部でペプチドを有する。この方法で酵素的活性を有する融合タンパク質が生産されうる。その酵素的活性は重要なペプチドと結合する巨大分子、例えば抗体により調節されうる。こうして本発明のペプチドは種々の最終目的のために広い種々の方法で修飾されうるがなお生物学的活性を維持してきた。主題のペプチドに結合するＴ細胞に同定することにより、その活性は主題のペプチドにより調節され、移植の場合の拒絶を抑制することができるかどうかを決定しうる。結合のための宿主のＴ細胞および主題のペプチドに対する応答をスクリーニングすることにより拒絶を防止するための治療の方向を決定することができる。脂質、特にリポソームまたは膜表面のペプチドまたはタンパタ質の存在を提供するためのリン脂質に対してペプチドまたはタンパク質を結合するために種々の技術が利用できる。ホスファチジルコリン（phosphatidyl choline）、ホスファチジルエタノールアミン（phosphatidyl ethanolamine）または他の脂質がＭＢＳＥ、グルタルアルデヒド（glutaraldehyde）、メチルジチオベンゾイン酸（me thyldithiobenzoic acid）等のような二重機能的リンク剤と共に用いうる。接合されたタンパク質を持ったリポソームの構造は文献で広く支持されている、US P atent 3,887,698;4,261,975および4,193,983を参照せよ。あるいはホスファチジルイノシトール、ファルネシル（farnesyl）、ジェラニルジェラニル（geranylgeran yl）、またはミリストイル（myristoyl）に対してペプチドを結合するコードする配列を提供しうる。修飾されたペプチドまたはタンパク質は水性媒質中で脂質と結合し望ましいリポソームを提供するために超音波処理される。それからリポソームは回収され指示された方法で用いられる。主題のペプチドはそれ自体でまたは他のペプチドまたはタンパク質との組み合わせにより、主題のペプチドまたは主題のペプチドと他のペプチドもしくはタンパク質の結合と結合するＣＴＬの存在を診断するために用いうる。主題のペプチドと他のペプチドまたはタンパク質との接合は前に記載したようにリンク剤を用いることにより調製できる、そこでは他のペプチドまたはタンパク質は結合しているＣＴＬの分離のための抗体と結合するための検出シグナル、抗原を提供するための酵素でありうる。あるいは主題のペプチドと他のペプチドは粒子、容器表面等のような固体表面と、共有結合的にまたは抗原抗体結合を通して、結合しうる。望むならば、主題のペプチドと抗原的なペプチドまたはタンパク質は蛍光的である粒子またはタンパク質と接合しうる。粒子またはタンパク質の結合は蛍光活性セルソーターにおいて選別し計数することを許容するであろう。主題のペプチドは哺乳類の宿主においてＣＴＬ活性を調節するために用いられうる。調節はＣＴＬ活性を阻害することによりまたは標的細胞を感作することにより行われる。これは生体外（ex vivo）でアフェレシス（apheresis）、を用いることにより達成できる、そこでは患者の血液は患者から取り出され、ペプチドが存在する装置を通して循環するが、主題のペプチドと活性のあるＣＴＬを除去するために表面に結合するかまたはＣＴＬに結合しその活性を阻害するために生理学適に受け入れられる媒質中でペプチドを添加することにより達成できる。あるいは、主題のペプチドは動脈または静脈のリンパ管内に、またはＣＴＬの阻害もしくは刺激を提供する移植部位において宿主に投与される。主題のペプチドは患者からとられた数の細胞と結合しうる、そこでは細胞は末梢における全細胞の一部にすぎないまたはその数は特別な細胞のタイプ、例えばＣＴＬ、クラスＩＴ細胞、クラスＩＩＴ細胞、ＮＫ細胞等を増加させる。その数が患者から除去されると細胞は調節されるべき細胞活性のために十分な時間培養されうる。それから細胞は洗浄されてペプチドを除去し宿主に対して再保存される。器官の移植の場合、前記主題のペプチドは、移植の前に投与され得り、一般的に、約２週間を超えず、繰り返しの処置が行われ得る。移植の時ないしその近くの時、前記主題の化合物は、その処置の間ないし直ちに投与され得る。前記主題のペプチドを含む媒質内に器官を浸すことにより、該主題のペプチドは前記器官を取り扱うのに用いられ得る。このように、器官とともに存在するＣＴＬは移植片対宿主の病気を防ぐために活性化される。前記ペプチドは１０^-3〜１０^-6の濃度で存在することができる。前記器官は貯蔵媒質なしに洗浄することができ、また、器官は、該器官の細胞に結合したペプチドとともに用いることができる。前記主題のペプチド、又は該主題のペプチドからなる化合物は、ＣＴＬ活性を阻害することができ、このことにより、標的細胞の溶解を阻害する。加えて、前記主題のペプチドは、不活性な前駆体の、活性状態の成熟したＣＴＬへの分化を減らすことによって、阻害を増大するのに用いられ得る。また、前記主題のペプチドは、分裂促進因子や、例えばコンカナバリンＡやアンチＣＤ３抗体のような他の活性化合物の分裂促進的な応答を減少させるのに用いられ得る。前記主題のペプチドは、該ペプチドが誘導される特定のＨＬＡ抗原への特異性によるよりも、広範な種類のＭＨＣ抗原を有するＣＴＬで活性状態となることが見いだされた。前記主題のペプチドは、宿主を支配するための様々の手段において投薬され得る。主題のペプチドは、それ自身のみに用いてもよいし、サイクロスポリンＡ、ＦＫ５０６、イミュノトキシン、アンチＯＫＴ３、又はその類似体のような他の免疫抑制剤と組み合わせに用いてもよい。公知の免疫抑制剤と組み合わせて主題のペプチドを用いることにより、該免疫抑制剤の実質的に減らされた濃度を薬剤として用いることができ、一般的に約６０％未満、更に一般的には約４０％未満の通常の投薬が特定の状況下で用いられ、ＣＴＬ活性の十分な阻害を提供する。このように、免疫抑制剤組成の実質的側面の効果は、そのより低い濃度という利点により改善され得る。前記主題の薬剤は、クラスＩＭＨＣ抗原のα鎖のα−ヘリックスから得られるペプチドとともに用いることができる。特に、ＰＣＴ／ＵＳ９３／０１７５８及び本書面内に言及されている引例を参照。特別に重要なのはペプチドＢ２７０２，７５−８４であり、それは、特に、例えば８４−７５／７５−８４のように反転の繰り返しである、１又はそれ以上の複製で存在し得る。種々の生理学的な受容伝達物を、ペプチド自身のみ、又は脱イオン水、塩類、燐酸緩衝液に添加された塩類、水溶したエタノール等の他の薬と組み合わせて、前記主題のペプチドからなる薬剤において用いることができる。大抵の場合において、前記ペプチドは前記伝達物に高い溶解性を持っていると予想されるので、前記ペプチドの濃度は非常に広範な範囲にすることができる。通常、前記ペプチドは、約７５重量％、更に一般的には約５０重量％以下と予想され、また通常は１重量％以上である。投薬は、投与、投与の周期数、前記ペプチドの効能、及びそれに似たものの目的に非常に依存する。一般的に投薬は、活性配列を基準として、宿主に対して約０．０１〜１０ｍｇ／ｋｇの範囲である。主題のペプチドの半減期を促進するために、前記ペプチドはカプセル化されるか、リポソームのルーメン内に導入されるか、コロイドとして調製されるか、又は該ペプチドの寿命をのばす他の技術を用いることができる。前記主題のペプチドの活性に類似している薬剤の活性を評価する定量において、該ペプチドを用いることができる。一つは、結合条件下で、ＣＴＬ、ミクロソーム、ペプチドに結合した抗体、及びその類似物とともに、結合定量における薬剤と組み合わせた、標識されたペプチドを用いることである。このように、主題のペプチドと比較して、化合物はその効果性をスクリーニングされ得り、該主題のペプチドにより提供された作用の方式に関係づけられる。前記主題のペプチドは、薬剤をスクリーニングするのに用いられるための同定プロトコルを標準化するのに用いられ得る。前記主題のペプチドに結合する相補的な化合物を検出するために、該ペプチドを用いることができる。このように、前記主題のペプチドに結合する蛋白質を単離して、精製、例えば、アフィニティークロマトグラフィーをすることができる。次の実施例は、実例のために提供され、限定するために提供されない。実施例実施例１：クラスIIα鎖由来ペプチドの調製４つのペプチドを標準的な固相技術を用いた従来の合成法により調製した。参照により本書面内に組み込まれているエリクソンとメリフィールド（The Protei ns,Vol.2,3rd ed.,eds Neurath,H.and Hill,R.L.,p.255-527,Academic Press,N. Y.(1970)）を参照。前記ペプチドの３つは、アミノ酸５３〜７７の前記α₁ドメイン由来のアミノ酸であり、一つは前記α₁ドメインのアミノ酸５６〜８０であり、一つは前記α₁ドメインのアミノ酸６８〜７７であった。前記４つのペプチドは次の構造及び配列であった。：実施例２：クラスIIＨＬＡのα鎖の残基５０〜８０に相当するペプチドは、細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）前駆体がエフェクターＣＴＬに分化するのを阻害する。通常のドナー由来のＰＢＬを、フィコール（Ficoll；ファルマシア社）を用いて単離し、１０％の胎児の子牛の血清及びＬ−グルタミンで補われたＲＰＭＩ１６４０でマイクロチターウエル（microtiter well）で示された数で２４の複製に培養した。前記ＥＢＶ形質転換された細胞系ＪＹを、同種異系刺激細胞として用いた。前記ＪＹ細胞の細胞分裂を防ぐため、それらを培養前に10,000radで照射した。ペプチドを、ＤＭＳＯに５０ｍｇ／ｍｌで溶解し、最終濃度１００μｇ／ｍｌを示すように添加した。６日後、培養を、⁵¹Ｃｒで標識されたＨＬＡ−Ａ２が移入されたＣ１Ｒ細胞の溶解を用いて、試験した。溶解が自発的な解放を超える１０％より多いのでウエルは陽性であると考えられた。実施例３：分裂促進因子コンカナバリンＡ（Con A）に対するヒトＰＢＬの増殖に対するペプチドの効果。通常のドナー由来の４×１０⁵ＰＢＬを、マイクロチターウエルで１μｇ／ｍｌと示されたペプチド量に培養した。２４時間後、ウエルは³Ｈ−チミジンで１ μＣｉのパルスを発し、付加的な２４時間の培養後、それを収集した。ＤＱ．５６−８０及びＤＲ５３−７７ペプチドが、ＣｏｎＡに対するＰＢＬの増殖を強く阻害することがわかった。前記ＤＱ．７１−８０及び前記ＤＰ．５３-７７はそれほど増殖を阻害しなかった。阻害は対立遺伝子に特異的でなかった。実施例３：ＨＬＡ−Ａ２特異的ＣＤ８＋ＣＴＬ、ＡＪＹの溶解に対するペプチドの効果実施例１で調製されたペプチドを、エフェクターで⁵¹ Ｃｒ標識されたＡ２＋標的絹胞の１０³ｃｐｍの付加前にＣＴＬとともに３０分間、プレインキュベートした：標的比率１：１，２．５：１，５：１，及び１０：１。細胞毒性の同定は、クレイバーガーら（Clayberger et al.,J.Exp.Med. (1984)162：1709-1714）、ライスら（Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1980)77:5432-54 36）の論文に記載された通り行った。ペプチドを、１００μｇ／ｍｌ添加し、プレートを４時間後に収集した。溶解はＤＱ．５６-８０ペプチドによって阻害されたが、ペプチドＤＱ．６８−７７、ＤＲ．５３−７７、及びＤＰ５３−７７では阻害されなかった。実施例４ＣＤ８＋ＣＴＬにより溶解を阻害するためのＤＱ．５６−８０における重要な残基の決定。一連の重複する１５アミノ酸ペプチドを調製し、上述のように溶解に対する効果を試験した。ペプチドは、ＤＱ．５３−６７、５６−８０、６５−７９、及び７１−８５を用いた。前記ＤＱ．６５−７９及び７１−８５は、溶解を阻害するのに最も有効であった。他の対立遺伝子に特異的なＣＴＬにおいて、似たような結果が得られた。前記ＤＱ．７１−８５は合成が難しいので、更なる試験で６５ −７９を選択した。実施例５：ＤＱ．６５−７９ペプチドの阻害効果における単一アミノ酸の変異の効果単一アミノ酸置換を、ＤＱ．６５−７９ペプチドに導入した。ＰＢＬを、上述のようなＣｏｎＡの増殖のために試験した。残基７２におけるＮからＤへの置換は、ＰＢＬのＣｏｎＡに対する増殖に対する阻害効果を阻害する。７６におけるＶからＴへの置換は、活性の部分的な損失を導く。残基７４におけるＮからＤへの置換は、阻害の効果がなくなった。クラスＩＢ２７０２．８４−７５／７５−８４ペプチドと、クラスIIペプチドＤＱ．６５−７９と、の活性の間に観測された類似性及び相違性の比較を行った。主題のペプチドは、ＣＴＬの攻撃を阻害する治療、特に同種異系細胞や組織、特に固相組織の移植の治療機会を提供することが、上述の結果から明らかになった。前記ペプチドは細胞を殺さないので、いったん該ペプチドの投薬が終われば、免疫応答は直ちに回復する。加えて、主題のペプチドを他の免疫抑制剤と組み合わせて用いてもよい。該薬剤は、望まざる有害な効果があるので、より低濃度の前記薬剤が望まざる側の効果を減らすために用いられる。本明細書内で言及された全ての出版物及び特許出願は、あたかも各々の独立した出版物又は特許出願が参照により組み込まれるよう特別に及び独立して示されているように、参照により本書面内に組み込まれている。前述の発明は、理解の明快さの目的のために、例解及び実施例によりいくらか詳しく記載されているが、付随する請求項の範囲から離れないところで特定の変異及び修飾がなされることは、本発明の技術において当業者にとって自明であろう。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＡ６１Ｋ 39/395 9454−4ＣＡ６１Ｋ 49/00 Ｚ 49/00 8415−4Ｃ 43/00

Claims

【特許請求の範囲】１．ＣＴＬ活性を調節するための方法であって、完全なクラスIIＭＨＣ抗原とは別のポリペプチドであり、α₁ドメイン、該ドメインのＤ−立体異性体（stereoisomer）類似体、又は３未満の置換若しくは欠失を有する該ドメインの変異誘導体、の少なくとも８つのアミノ酸を含む、同種異系細胞に対して前記ＣＴＬ活性を調節するのに十分な量存在する、ポリペプチドと、宿主由来のＣＴＬを含む細胞集団と、を細胞接触させ、それにより前記ＣＴＬ活性が調節されることを特徴とする方法。２．前記細胞集団が血中に存在することを特徴とする請求項１に記載の方法。３．前記細胞集団が固相器官と関連していることを特徴とする請求項１に記載の方法。４．前記細胞接触が生体外で行われることを特徴とする請求項１に記載の方法。５．ＣＴＬ活性を調節するための方法であって、完全なクラスIIＭＨＣ抗原とは別のポリペプチドであり、α₁ドメイン、該ドメインのＤ−立体異性体（stereoisomer）類似体、又は３未満の置換がある該ドメインの変異誘導体、のアミノ酸７１〜８０の少なくとも８つのアミノ酸を含む、同種異系細胞に対して前記ＣＴＬ活性を調節するのに十分な量存在する、ポリペプチドと、宿主由来のＣＴＬを含む細胞集団と、を細胞接触させることを特徴とする方法。６．前記クラスIIＭＨＣ抗原がＨＬＡＤＰ０１０１、ＤＱ０３０１１、又はＤＲ０１０１であることを特徴とする請求項５に記載の方法。７．前記細胞集団が血中に存在することを特徴とする請求項５に記載の方法。８．前記細胞集団が固相器官と関連していることを特徴とする請求項５に記載の方法。９．前記細胞接触が生体外で行われることを特徴とする請求項５に記載の方法。１０．前記細胞接触が免疫抑制剤と組合わせて行われることを特徴とする請求項５に記載の方法。１１．前記免疫抑制剤が、クラスＩＭＨＣ抗原のα₁ヘリックス由来の配列を有するペプチドであることを特徴とする請求項１０に記載の方法。１２．前記免疫抑制剤が、Ｂ２７０２，７５−８４ペプチドの少なくとも一つの複製を含むことを特徴とする請求項１１に記載の方法。１３．ＣＴＬの活性を調節することが可能なポリペプチドであって、前記ポリペプチドは完全なクラスIIＭＨＣ抗原とは別のポリペプチドであり、 α₁ドメイン、該ドメインのＤ−立体異性体（stereoisomer）類似体、又は３未満の保存性のある置換若しくは欠失がある該ドメインの変異誘導体、のアミノ酸７１〜８０の少なくとも８つのアミノ酸からなることを特徴とするポリペプチド。１４．免疫源に結合されたことを特徴とする請求項１３に記載のポリペプチド。１５．検出可能な信号を提供することが可能な標識に結合されたことを特徴とする請求項１３に記載のポリペプチド。１６．前記標識が、酵素、蛍光体、ラジオアイソトープ、化学発光体、特異的な結合対を形成するハプテン類、特異的な結合対を形成する抗原類、レセプター、又は固体支持体であることを特徴とする請求項１５に記載のポリペプチド。１７．請求項１３に記載のポリペプチドに応答するように調製され、前記少なくとも８つのアミノ酸に特異的に結合する抗体。１８．前記抗体がモノクローナル抗体であることを特徴とする請求項１７に記載の抗体。１９．ＣＴＬの免疫調節における、薬剤活性を評価する方法であって、結合条件下において、前記薬剤と、請求項１５に記載のポリペプチドと、ＣＴＬ相補性結合物若しくは前記ポリペプチド用モノクローナル抗体と、を組合せて、前記薬剤の存在しない同一条件下における前記ポリペプチドの結合と比較して、前記ＣＴＬ相補性結合物若しくは抗ポリペプチドモノクローナル抗体に対する、前記ポリペプチドの結合量を評価することを特徴とする方法。２０．ＣＴＬによる標的細胞の分解の阻害剤が存在しない条件で、前記標的細胞と前記ＣＴＬ細胞とを含む細胞混合物における、ＣＴＬによる標的細胞の溶解を阻害する方法であって、クラスIIＭＨＣ抗原ＨＬＡＤＰ０１０１、ＤＱ０３０１１、ＤＲ０１０１のアミノ酸７１〜８０の少なくとも８つのアミノ酸からなるポリペプチドを溶菌を阻害する量、前記混合物に添加することを特徴とする方法。