JP2005514919A - 骨抗吸収化合物 - Google Patents

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Abstract

本発明は、ＲＡＮＫに結合し、ＲＡＮＫＬ外部表面ループのアミノ酸配列を含むポリペプチドに関する。本発明はまた、このようなポリペプチドのフラグメント、アナログ、および誘導体に関する。本発明はさらに、本明細書に記載されるポリペプチドを含む組成物に関する。破骨細胞分化を阻害する方法、骨吸収を阻害する方法、およびＲＡＮＫＬ活性を競合的に阻害する方法もまた、包含される。本発明はまた、骨塊の損失によって少なくとも部分的に特徴付けられる疾患または状態を処置するための方法を提供する。

Description

本願は、以下の米国出願に関連し、かつこれらの利益を主張する。これらの米国出願は、本明細書中で参考として援用される：２００１年３月２２日出願の第６０／２７７，８５５号；２００２年３月２２日出願の第１０／１０５，０５７号；２００１年８月９日出願の第６０／３１１，１６３号；２００２年８月９日出願の第１０／２１５，４４６号；２００１年１０月３１日出願の第６０／３２９，２３１号；２００１年１０月１５日出願の第６０／３２９，３９３号；２００１年１０月１５日出願の第６０／３２９，３６０号；２００１年１０月２１日出願の第６０／３２８，８７６号；２００２年１０月１５日出願の米国出願、Ｌａｍらの表題「ＲＡＮＫＬ Ｍｉｍｉｃｓ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｔｈｅｒｅｏｆ」；２００２年１０月１５日出願の米国出願、Ｌａｍらの表題「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ Ｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ」。
本発明は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ Ｇｒａｎｔｓ ＡＲ３２７８８、ＡＲ４６１２３およびＤＥ０５４１３のもとで、一部、米国政府の助成を受けてなされた。米国政府は、本発明において特定の権利を有する。
（発明の分野）
本発明は、ＲＡＮＫに結合し、そしてそのアミノ酸配列が、ＲＡＮＫＬの１つ以上の外部表面ループＡＡ”、ＣＤ、ＥＦおよびＤＥを含む、ポリペプチドに関する。このポリペプチドのフラグメント、アナログ、および誘導体がさらに提供される。
本発明はまた、本明細書中に提供されるポリペプチド、ならびに／またはそのフラグメント、アナログ、および誘導体を含む薬学的組成物に関する。本発明はさらに、破骨細胞の分化を阻害するための方法およびＲＡＮＫＬを競合的に阻害するための方法を提供し、この方法は、有効量の上記の組成物を投与する工程を包含する。骨吸収を阻害するための方法および骨質量の喪失により少なくとも部分的に特徴付けられる疾患または状態を処置するための方法もまた提供される。
（背景）
骨の喪失または細くなること（ｔｈｉｎｎｉｎｇ）において顕在する種々の状態および疾患は、重要かつますます増加する健康懸念である。３千万人のアメリカ人および世界中で１億人もの人々が、骨粗鬆症単独についての危険性があると推定されている。Ｍｕｎｄｙら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８６：１９４６−１９４９（１９９９）。骨喪失を含むことが公知の他の状態としては、以下が挙げられる：若年性骨粗鬆症、骨形成不全症、高カルシウム血症、上皮小体機能亢進症、骨軟化症、骨石灰脱失症、骨溶解性骨疾患、骨壊死、骨のパジェット病、慢性関節リウマチに起因する骨喪失、炎症性関節炎、骨髄炎、コルチコステロイド処置、代謝性骨疾患、歯周骨喪失、癌に起因する骨喪失、骨質量の加齢関連の喪失、および骨減少症の他の形態。さらに、新規骨形成は、多くの状況（例えば、骨修復、または骨折、骨欠損、形成外科、歯科および他の移植物のための置換を促進するため）ならびに他のこのような状況において必要とされる。
骨は、結合組織の高密度の特殊化した形態である。骨基質は、既存の骨基質の表面またはその近くに位置する骨芽細胞によって形成される。骨は、破骨細胞（マクロファージの一種）として公知の別の細胞型によって吸収（侵食）される。これらの細胞は、骨の無機質を溶解する酸および骨の有機成分を消化するヒドロラーゼを分泌する。従って、骨の形成および再構築は、骨芽細胞の生成活性と破骨細胞の侵食活性との間の進行中の相互作用を含む動的なプロセスである。Ａｌｂｅｒｔｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｅｌｌ，Ｇａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｎ．Ｙ．（第３版、１９９４），ｐｐ．１１８２−１１８６。
骨喪失の臨床的に認められた治療の現在の形態は、主に、これらが、骨吸収プロセスを阻害するという点で、抗吸収である。骨粗鬆症の処置のために使用されているかまたは示唆されている薬剤には、骨吸収を阻害するその主張された能力に起因して、エストロゲン、選択的エストロゲンレセプターモジュレーター（ＳＥＲＭ）、カルシウム、カルシトリオール、カルシトニン（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｐ．ら、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２８：１７４７−１７５３）、アレンドロネート（ａｌｅｎｄｒｏｎａｔｅ）（Ｓａａｇ，Ｋ．ら、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３３９：２９２−２９９）および他のビスホスホネートがある。Ｌｕｃｋｍａｎら、Ｊ．Ｂｏｎｅ Ｍｉｎ．Ｒｅｓ．１３，５８１（１９９８）。しかし、現在利用可能な抗吸収剤は、骨吸収／再構築の阻害に対するその影響に関連する所望されない影響または他の望まれない副作用を有し得る。
結果として、骨喪失の疾患の処置のための他の化合物を得ることが、非常に所望される。骨細胞生物学の分野における重要な発展は、ＲＡＮＫリガンド（オステオプロテゲリンリガンド（ＯＰＧＬ）、ＴＮＦ関連活性化誘導性サイトカイン（ＴＲＡＮＣＥ）または破骨細胞分化因子（ＯＤＦ）とも呼ばれる）（これは、間質細胞、骨芽細胞、活性化Ｔリンパ球および乳腺上皮上で発現される）が、マクロファージの破骨細胞への分化に重要な独自の分子であるという、最近の発見である。Ｌａｃｅｙら、Ｃｅｌｌ ９３：１６５−１７６（１９９８）（Ｏｓｔｅｏｐｒｏｔｅｇｅｒｉｎ Ｌｉｇａｎｄ Ｉｓ ａ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｔｈａｔ Ｒｅｇｕｌａｔｅｓ Ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ａｎｄ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ．）。（ＲＡＮＫＬについての細胞表面レセプターがＲＡＮＫ（壊死因子（ＮＦ）−κＢのレセプターアクチベータ）である。ＲＡＮＫＬは、約５０アミノ酸未満の細胞内ドメイン、約２１アミノ酸の膜貫通ドメイン、および約２４０〜２５０アミノ酸の細胞外ドメインを有する、２型膜貫通タンパク質である。ＲＡＮＫＬは、膜貫通形態および可溶性形態で天然に存在する。少なくとも、マウス、ラットおよびヒト形態のＲＡＮＫＬについての推定アミノ酸配列ならびにそれらの改変体が公知である。例えば、Ａｎｄｅｒｓｏｎら、米国特許第６，０１７，７２９号、Ｂｏｙｌｅ、米国特許第５，８４３，６７８号およびＸｕ Ｊ．ら、Ｊ．Ｂｏｎｅ Ｍｉｎ．Ｒｅｓ．（２０００／１５：２１７８）（これらは、参考として本明細書中で援用される）を参照のこと。さらに、本発明者らは、２００１年８月９日出願の米国出願番号第６０／３１１，１６３号および２００２年８月９日出願の米国出願番号１０／２１５，４４６号に開示されたように、ＲＡＮＫＬの細胞外ドメインの結晶構造を解明した。
ＲＡＮＫＬ（ＯＰＧＬ）は、骨吸収の強力な誘導因子および破骨細胞発達の正の調節因子として、同定されている（Ｌａｃｅｙら、前出）。破骨細胞の分化および活性化における因子としてのその役割に加えて、ＲＡＮＫＬは、ヒト樹状細胞（ＤＣ）クラスター形成を誘導することが報告されている。Ａｎｄｅｒｓｏｎら（前出）、および乳腺上皮発生（Ｊ．Ｆａｔａら、「Ｔｈｅ ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ｏｓｔｅｏｐｒｏｔｅｇｅｒｉｎ ｌｉｇａｎｄ ｉｓ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｆｏｒ ｍａｍｍａｒｙ ｇｌａｎｄ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ」、Ｃｅｌｌ，１０３：４１−５０（２０００））。最近、本発明者らは、２００１年３月２２日出願の米国出願番号第６０／２７７，８５５号および２００２年３月２２日出願の出願番号第１０，１０５，０５７号において開示されたように、ＲＡＮＫＬが、同化骨形成プロセスにおいて役割を果たし、そして骨芽細胞増殖または骨結節鉱化作用の刺激のための方法において利用され得ることを決定した。本発明者らはまた、最近、２００１年８月９日出願の米国出願番号第６０／３１１，１６３号および２００２年８月９日出願の米国出願番号１０／２１５，４４６号に開示されたように、ＲＡＮＫＬの細胞外ドメイン（ｅｃｔｏｄｏｍａｉｎ）の正確な３次元構造を決定し、そしてＲＡＮＫと相互作用するＲＡＮＫＬの独特の外部表面ループのアミノ酸配列を位置決定した。
従って、現在の医療での骨喪失障害の処置における限られた成功に起因して、このような状態の処置のための新規な治療を開発する必要性が存在する。
（発明の要旨）
従って、本発明の目的には、ＲＡＮＫＬの外部表面ループＡＡ”、ＣＤ、ＤＥ、またはＥＦの１つ以上を含み、ＲＡＮＫに結合する能力を有するポリペプチドを提供することがある。これらのＲＡＮＫＬループは、以下に記載されるＲＡＮＫＬ分子の部分（配列番号６）に対応する：
ＡＡ”は、アミノ酸残基１７０〜１９３（配列番号２）を含み、
ＣＤは、アミノ酸残基２２４〜２３３（配列番号３）を含み、
ＤＥは、アミノ酸残基２４５〜２５１（配列番号４）を含み、そして
ＥＦは、アミノ酸残基２６１〜２６９（配列番号５）を含む。
ＡＡ”ループ配列の一部を含むポリペプチドもまた、本発明に含まれ、そしてこれは、アミノ酸残基１７５から１８５（配列番号１）を含む。配列番号７および配列番号１１のポリペプチドは、ヒトＲＡＮＫＬのＡＡ”ループの天然に存在する改変体である。両方とも、ヒトＲＡＮＫＬの天然の改変体である。配列番号８、配列番号９および配列番号１０は、それぞれ、ヒトＲＡＮＫＬループＣＤ、ＤＥおよびＥＦの表面ループポリペプチド配列である。
別の局面において、本発明は、ＲＡＮＫに結合し、かつ配列番号１〜配列番号５および配列番号７〜配列番号１１からなる群から選択される配列からなるポリペプチドを含む。
ＲＡＮＫＬの外部表面ループを含み、かつＲＡＮＫＬを競合的に阻害する能力を有するポリペプチドを提供することは、本発明の別の目的である。
このようなポリペプチドのフラグメント、アナログ、および誘導体を提供することは、本発明のさらなる目的である。このようなフラグメント、アナログおよび誘導体を得るための方法は、本明細書中に記載される。
別の局面において、本発明は、このポリペプチドを含む薬学的組成物を提供する。この組成物はさらに、薬学的に受容可能なキャリア、アジュバント、可溶化剤、安定剤、および／または抗酸化剤を含み得る。
本発明はまた、破骨細胞の分化を阻害するための方法、ＲＡＮＫＬを競合的に阻害する方法、および骨吸収を阻害するための方法を包含する。このような方法は、本発明の組成物の投与を包含する。骨質量の喪失により少なくとも部分的に特徴づけられる疾患および状態を処置するための方法が、さらに提供される。好ましい実施形態において、このような方法は、骨粗しょう症、骨溶解性骨疾患、慢性関節リウマチ、および骨格転移を処置するために使用される。
他の目的および特徴は、一部は明らかであり、そして一部は本明細書中以下に指摘される。
（略語および定義）
本発明の理解を容易にするために、多数の用語が、以下に定義される：
２０の遺伝コードされるＬ−アミノ酸についての本明細書中で使用されるアミノ酸命名法は、慣用のものであり、そして以下のとおりに略される：
Figure 2005514919
Figure 2005514919
 本明細書中で使用される場合、別に具体的に記載されなければ、３文字略号及び一文字略号は、Ｄ配置またはＬ配置のいずれかのアミノ酸を示す。例えば、Ａｒｇは、Ｄ−アルギニンおよびＬ−アルギニンを示し、そしてＲは、Ｄ−アルギニンおよびＬ−アルギニンを示す。
別段規定されない限り、ポリペプチド配列が、連続した一文字略語および／または三文字略語として示される場合、その配列は、一般的な慣例に従って、Ｎ→Ｃ方向に示される。本明細書中で使用される場合、「Ｃ」とは、アミノ酸残基のα炭素をいう。本明細書中で記載される種々のポリペプチドにおける保存的アミノ酸置換を決定し、そして種々のペプチドおよびペプチドアナログを記載する目的で、アミノ酸は、アミノ酸側鎖の物理的−化学的特徴に主に依存して、便宜的に２つの主要な分類（親水性および疎水性）に分類され得る。これら２つの主な分類は、アミノ酸側鎖の特徴をより厳密に規定する下位分類にさらに分類され得る。例えば、親水性アミノ酸のクラスは、酸性アミノ酸、塩基性アミノ酸および極性アミノ酸にさらに下位分類され得る。アミノ酸の種々の分類の規定は、以下の通りである：
「親水性アミノ酸」とは、Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇら，１９８４，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１７９：１２５−１４２の正規化したコンセンサス疎水性スケールに従って、ゼロ未満の疎水性を示すアミノ酸をいう。遺伝的にコードされる親水性アミノ酸は、Ｔｈｒ（Ｔ）、Ｓｅｒ（Ｓ）、Ｈｉｓ（Ｈ）、Ｇｌｕ（Ｅ）、Ａｓｎ（Ｎ）、Ｇｌｎ（Ｑ）、Ａｓｐ（Ｄ）、Ｌｙｓ（Ｋ）、およびＡｒｇ（Ｒ）を含む。
「酸性アミノ酸」とは、７未満の側鎖ｐＫ値を有する親水性アミノ酸をいう。酸性アミノ酸は、代表的には、水素イオンの喪失に起因して、生理学的ｐＨで負に荷電した側鎖を有する。遺伝的にコードされた酸性アミノ酸は、Ｇｌｕ（Ｅ）およびＡｓｐ（Ｄ）を含む。
「塩基性アミノ酸」とは、７より大きな側鎖ｐＫ値を有する親水性アミノ酸をいう。塩基性アミノ酸は、代表的には、ヒドロニウムイオンとの関連に起因して、生理学的ｐＨにて正に荷電した側鎖を有する。遺伝的にコードされたアミノ酸は、Ｈｉｓ（Ｈ）および、Ａｒｇ（Ｒ）およびＬｙｓ（Ｋ）を含む。
「極性アミノ酸」とは、生理学的ｐＨで荷電していない側鎖を有するが、２つの原子に共通して共有される電子対が、その原子のうちの１つによりより密接して保持される親水性アミノ酸をいう。遺伝的にコードされた極性アミノ酸は、Ａｓｎ（Ｎ）、Ｇｌｎ（Ｑ）、Ｓｅｒ（Ｓ）およびＴｈｒ（Ｔ）をいう。
「疎水性」アミノ酸とは、Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ，１９８４，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１７９：１２５−１４２の正規化したコンセンサス疎水性スケールに従って、ゼロより大きな疎水性を示すアミノ酸をいう。遺伝的にコードされたアミノ酸は、Ｐｒｏ（Ｐ）、Ｉｌｅ（Ｉ）、Ｐｈｅ（Ｆ）、Ｖａｌ（Ｖ）Ｌｅｕ（Ｌ）、Ｔｒｐ（Ｗ）、Ｍｅｔ（Ｍ）、Ａｌａ（Ａ）、Ｇｌｙ（Ｇ）およびＴｙｒ（Ｙ）を含む。
「芳香族アミノ酸」とは、少なくとも１つの芳香族環またはヘテロ芳香族環を有する側鎖を有する疎水性アミノ酸をいう。芳香族環またはヘテロ芳香族環は、１つ以上の置換基（例えば、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＣＮ、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−Ｉ、−ＮＯ２、−ＮＯ、−ＮＨ２、−ＮＨＲ、−ＮＲＲ、−Ｃ（Ｏ）Ｒ、−Ｃ（Ｏ）ＯＨ、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、−Ｃ（Ｏ）ＮＨＲ、−Ｃ（Ｏ）ＮＲＲなど）を含み得、ここでＲは、独立して、（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル、置換（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル、（Ｃ２〜Ｃ６）アルケニル、置換（Ｃ２〜Ｃ６）アルケニル、（Ｃ２〜Ｃ６）アルキニル、置換（Ｃ２〜Ｃ６）アルキニル、（Ｃ５〜Ｃ２０）アリール、置換（Ｃ５〜Ｃ２０）アリール、（Ｃ６〜Ｃ２６）アリールアルキル、置換（Ｃ６〜Ｃ２６）アリールアルキル、５〜２０員のヘテロアリール、置換された５〜２０員のヘテロアリール、６〜２６員のヘテロアリールアルキル、または置換された６〜２６員のヘテロアリールアルキルである。遺伝的にコードされた芳香族アミノ酸は、Ｈｉｓ（Ｈ）、Ｐｈｅ（Ｆ）、Ｔｙｒ（Ｙ）およびＴｒｐ（Ｗ）を含む。
「無極性アミノ酸」とは、側鎖を有する疎水性アミノ酸であって、その側鎖が、生理的ｐＨにて荷電しておらず、かつ２つの原子により一般的に共有される電子対がその２つの原子の各々により概して等しく保持されている結合を有する（すなわち、その側鎖が極性ではない）、疎水性アミノ酸を指す。遺伝的にコードされる無極性アミノ酸としては、Ｌｅｕ（Ｌ）、Ｖａｌ（Ｖ）、Ｉｌｅ（Ｉ）、Ｍｅｔ（Ｍ）、Ｇｌｙ（Ｇ）およびＡｌａ（Ａ）が挙げられる。
「脂肪族アミノ酸」とは、脂肪族炭化水素側鎖を有する疎水性アミノ酸を指す。遺伝的にコードされる脂肪側アミノ酸としては、Ａｌａ（Ａ）、Ｖａｌ（Ｖ）、Ｌｅｕ（Ｌ）およびＩｌｅ（Ｉ）が挙げられる。
「ヒドロキシ置換脂肪族アミノ酸」とは、ヒドロキシ置換側鎖を有する親水性極性アミノ酸を指す。遺伝的にコードされるヒドロキシ置換脂肪族アミノ酸としては、Ｓｅｒ（Ｓ）およびＴｈｒ（Ｙ）が挙げられる。
アミノ酸残基Ｃｙｓ（Ｃ）は、他のＣｙｓ（Ｃ）残基または他のスルファニル含有アミノ酸とともにジスルフィド架橋を形成し得る点で、普通ではない。Ｃｙｓ（Ｃ）残基（および−ＳＨ含有側鎖を有する他のアミノ酸）が、還元自由−ＳＨ形態または酸化ジスルフィド架橋形態のいずれかの状態でペプチド中に存在する能力は、Ｃｙｓ（Ｃ）残基がペプチドに正味の疎水性特徴または親水性特徴を付与するか否かに影響する。Ｃｙｓ（Ｃ）は、Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇの標準化コンセンサススケール（Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ，１９８４，上記）に従って疎水性０．２９を示すが、本発明の目的のためには、Ｃｙｓ（Ｃ）は、上記に規定される一般的分類に関わらず、極性疎水性アミノ酸として分類されることが、理解されるべきである。
当業者によって理解されるように、上記に規定される分類は、相互に網羅的ではない。従って、２つ以上の物理的−化学的特性を示す側鎖を有するアミノ酸は、複数のカテゴリーに含まれ得る。例えば、極性置換基でさらに置換され得る芳香族部分を有するアミノ酸側鎖（例えば、Ｔｙｒ（Ｔ））は、芳香族疎水性特性と、極性特性または親水性特性との両方を示し得、従って、芳香族カテゴリーおよび極性カテゴリーの両方に含まれ得る。別の例として、Ｈｉｓ（Ｈ）は、芳香族カテゴリーおよび塩基性カテゴリーに入る側鎖を有する。任意のアミノ酸の適切な分類は、特に本明細書中に提供される詳細な開示を考慮すると、当業者にとって明らかである。
上記に規定されるカテゴリーは、遺伝的にコードされるアミノ酸に関して例示されているが、アミノ酸置換は、遺伝的にコードされるアミノ酸に限定される必要はなく、特定の実施形態においては、好ましくは、遺伝的にコードされるアミノ酸に限定はされない。実際、本明細書中に記載される化合物のうちの多くは合成により生成され得るので、それらは、１つ以上の遺伝的にコードされないアミノ酸を含み得る。従って、天然に存在する遺伝的にコードされるアミノ酸に加えて、構造（１）のコアペプチド中のアミノ酸残基が、天然に存在する非コードアミノ酸および合成アミノ酸により置換され得る。
本発明の構成要素が構成され得る、一般的に遭遇する特定のアミノ酸としては、β−アラニン（β−Ａｌａ）および他のω−アミノ酸（例えば、３−アミノプロミオン酸、２，３−ジアミノプロピオン酸（Ｄｐｒ）、４−アミノ酪酸など）；α−アミノイソ酪酸（Ａｉｂ）；ε−アミノヘキサン酸（Ａｈａ）、δ−アミノ吉草酸、（Ａｖａ）、Ｎ−メチルグリシンまたはサルコシン（ＭｅＧｌｙ）；オルニチン（Ｏｒｎ）；シトルリン（Ｃｉｔ）；ｔ−ブチルアラニン（ｔ−ＢｕＡ）；ｔ−ブチルグリシン（ｔ−ＢｕＧ）；Ｎ−メチルイソロイシン（ＭｅＩｌｅ）；フェニルグリシン（Ｐｈｇ）；シクロヘキシルアラニン（Ｃｈａ）；ノルロイシン（Ｎｌｅ）；ナフチルアラニン（Ｎａｌ）；４−クロロフェニルアラニン（Ｐｈｅ（４−Ｃｌ））；２−フルオロフェニルアラニン（Ｐｈｅ（２−Ｆ））；３−フルオロフェニルアラニン（Ｐｈｅ（３−Ｆ））；４−フルオロフェニルアラニン（Ｐｈｅ（４−Ｆ））；ペニシルアミン（Ｐｅｎ）；１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−３−カルボン酸（Ｔｉｃ）；β−２−チエニルアラニン（Ｔｈｉ）；メチオニンスルホキシド（ＭＳＯ）；ホモアルギニン（ｈＡｒｇ）；Ｎ−アセチルリジン（ＡｃＬｙｓ）；２，４−ジアミノ酪酸（Ｄｂｕ）；２，３−ジアミノ酪酸（Ｄａｂ）；ｐ−アミノフェニルアラニン（Ｐｈｅ（ｐＮＨ２））；Ｎ−メチルバリン（ＭｅＶａｌ）；ホモシステイン（ｈＣｙｓ）、ホモフェニルアラニン（ｈＰｈｅ）およびホモセリン（ｈＳｅｒ）；ヒドロキシプロリン（Ｈｙｐ）、ホモプロリン（ｈＰｒｏ）、Ｎ−メチル化アミノ酸およびペプトイド（Ｎ−置換グリシン）が挙げられるが、これらに限定されない。
上で規定されたカテゴリーに従って、遺伝的にコードされるアミノ酸およびコードされないアミノ酸の分類は、以下の表３に要約される。表３は、例示の目的のためのみであり、本発明において使用され得るアミノ酸残基の排他的な列挙であるということを支持しないことが理解される。追加のアミノ酸は、Ｆａｓｍａｎ、１９８９、Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，ｐｐ３−７０およびそこに引用される参考文献中に見出され得る。
本明細書中で使用される場合、「組換え核酸」は、その生成の方法またはその構造のいずれかにより定義される。その生成の方法に対する参考文献において、例えば、産物は、組換え核酸技術を使用するプロセスにより生成された。その技術は、例えば、ヌクレオチド配列中のヒト介入、代表的に選択または生成を含む。あるいは、組換え核酸は、互いに天然に隣接しない２つのフラグメントの融合を含む配列の生成により作製された核酸であり得るが、天然の産物（例えば、天然に存在する変異体）を排除すると意味される。従って、例えば、任意の合成オリゴヌクレオチドプロセスを使用して得られた配列を含む核酸のように、天然に存在しない任意のベクターで細胞を形質転換することにより作製された産物は、含まれる。配列認識部位を代表的に導入するまたは取り除く一方、同じまたは保存的アミノ酸をコードする冗長性コドンでコドンを置換することが、しばしばなされる。あるいは、一般的に入手可能な天然の形態において見出されない機能の所望の組み合わせを含む単一の遺伝的実体を生成する所望の機能の核酸セグメントと一緒に結合するように実施される。制限酵素認識部位は、しばしばそのような人為的操作の標的であるが、他の部位特異的標的（例えば、プロモーター、ＤＮＡ複製部位、調節配列、制御配列または他の有用な特徴）は、設計により組み込まれ得る。
本明細書中で使用される場合、「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」は、交換可能に使用され、ホスホジエステル結合により一緒に結合される少なくとも２ヌクレオチドのポリマーを意味し、リボヌクレオチドまたはデオキシヌクレオチドのいずれかからなり得る。
本明細書中で使用される場合、「配列」とは、モノマーがポリマー中で症実線形順序（例えば、ポリペプチド中のアミノ酸の順序またはポリヌクレオチド中のヌクレオチドの順序）を意味する。
本明細書中で使用される場合、「ペプチド」、「ポリペプチド」および「タンパク質」は、交換可能に使用され、ペプチド結合により連結される２つ以上のアミノ酸からなる構成要素を意味する。
本明細書中で使用される場合、「組換えタンパク質」とは、ネイティブなアミノ酸配列であろうと変異体の主なアミノ酸配列であろうと、遺伝子および／またはタンパク質が天然に見出される細胞以外の細胞において組換えＤＮＡ分子により運ばれた遺伝子の発現により得られるタンパク質を意味する。言い換えれば、その遺伝子は、発現された宿主に対して異質である。その遺伝子に対して親和性生成一部をコードするポリヌクレオチドの付加を含む遺伝子の任意の改変が、この定義の目的でその遺伝子を非天然にすることに留意されるべきである。従って、この遺伝子は、任意の細胞において「天然に」見出されない。
本明細書中において使用される場合、「ムテイン」とは、ポリペプチドのフラグメント、誘導体、およびアナログを含む。
本明細書中において使用される場合、「ＲＡＮＫ」とは、ＲＡＮＫタンパク質、組換えＲＡＮＫタンパク質、ＲＡＮＫ融合タンパク質、これらのアナログ、誘導体および模倣物をいう。
本明細書中において使用される場合、用語「動物」は、ヒトを含む。
語句「予防または阻害（を行う）」とは、観察される特性が、処置が使用されない場合より測定可能に低いような程度まで、阻害されるか、別の様式で発現されるか、または低下されるかのいずれかによって影響を受けることである。阻害の程度の測定は、当業者において公知である方法によって、インビトロで決定され得る。
用語「有効量」とは、統計学的に有意な効果を生じる、問題の物質の量を意味する。例えば、治療的使用についての「有効量」とは、骨折修復における治癒速度の臨床的に有意な増加；骨粗鬆症における骨の損失の逆転または阻害；骨粗鬆症の発祥の防止または遅延；歯科的な欠損の修復または予防；あるいは他の骨損失状態、疾患または欠損（本明細書中、上で議論されるものが挙げられるが、これらに限定されない）の処置または阻害を提供するために必要とされる、本明細書中の活性化合物を含有する組成物の量である。このような有効量は、慣用的な最適化技術を使用して決定され、そして処置される特定の状態、患者の状態、投与経路、処方、および開業医の判断ならびに当業者に明らかな他の要因に依存する。本発明の化合物に対して必要とされる投薬量（例えば、骨粗鬆症において）は、処置群とコントロール群との間の骨重量における統計的に有意な差異を誘導することが判然としている。骨重量におけるこの差異は、例えば、少なくとも１〜２％であり、または処置群に関する任意の臨床学的に有意な増大として見出され得る。治癒における臨床的に有意な増大の他の測定としては、例えば、破壊応力および応力、破壊応力およびねじれ、４点曲げについての試験、ならびに当業者にとって周知の他の生体力学試験が挙げられる。処置レジメンに対する一般的なガイドラインは、目的の疾患の動物モデルにおいて行われる実験から得られる。
本明細書中で使用される場合に、「処置」とは、予防法および治療法の両方を包含する。従って、被験体を処置するとき、本発明の化合物は、骨重量の喪失をすでに患っている被験体に投与され得るか、またはこのような状態の発生の予防または阻害を行うために投与され得る。
（発明の詳細な説明）
本発明に従って、ＲＡＮＫＬが破骨細胞前駆体の細胞分化を誘導することを防止することによって、ＲＡＮＫＬのＡＡ”ループのサブセットを表す配列のポリペプチドがＲＡＮＫＬの競合的アンタゴニストとして作用することを本出願人が発見した。さらに、破骨細胞分化の阻害の観測は、用量依存的であった。
米国特許出願第６０／３１１，１６３号および同第１０／２１５，４４６号（それぞれ、２００１年８月９日、および２００２年８月９日に出願された）は、ＲＡＮＫに対する結合を担うＲＡＮＫＬ表面の同一性を開示し、そして、これらは、外表面ループＡＡ”、ＣＤ、ＤＥ、およびＥＦを含む。ＲＡＮＫＬの外側（溶媒接触）表面ループは、ＴＮＦファミリーにおいて特有のものであり、多様な長さおよびコンフォメーションを明確に表示する：ＡＡ”ループ（ＲＡＮＫＬタンパク質の残基１７０〜１９３）は、ストランドＡとストランドＡ’に架橋しており、ＣＤループは（残基２２４〜２３３）は、ストランドＣとストランドＤを接続しており、ＥＦループ（残基２６１〜２６９）はストランドＥおよびストランドＦを連結しており、そして、ループＤＥ（残基２４５〜２５１）は、ストランドＤおよびストランドＥを接続する。ＲＡＮＫＬは、代表的なＴＮＦファミリーメンバーと比べて、より長いＡＡ”ループおよびより短いＥＦループを保持する。このＡＡ”ループは、ＣＤループの置換と一緒に、ＲＡＮＫＬ分子の上部３分の１に独特な表面を与え、他方、そのＤＥループの微妙なシフトが、ＲＡＮＫＬ分子の基部でレセプター結合溝をかたちづくる。ＲＡＮＫＬループおよびＲＡＮＫ／ＲＡＮＫＬ相互作用の結合特異性の詳細な説明として、米国特許出願第６０／３１１，１６３号および同第１０／２１５，４４６号（それぞれ、２００１年８月９日および２００２年８月９日の出願）を参照のこと。
従って、本出願人は、破骨細胞の分化のために阻害のためにＲＡＮＫＬ外表面ループ配列およびそのムテインを含むポリペプチドの使用を企図する。結果として、このようなポリペプチドは、骨重量の損失の少なくとも部分的に明らかなった疾患または状態を処置するために使用され得る。
従って、本発明は、ＲＡＮＫＬの外表面ループである、ＡＡ”、ＣＤ、ＤＥ、またはＥＦのうち１以上を含み、そしてＲＡＮＫに結合する能力を含むポリペプチドを提供する。このＲＡＮＫＬループは、以下のようにＲＡＮＫＬ分子の一部分（配列番号６）に対応する：
ＡＡ”は、アミノ酸残基１７０〜１９３（配列番号２）を含み、
ＣＤは、アミノ酸残基２２４〜２３３（配列番号３）を含み、
ＤＥは、アミノ酸残基２４５〜２５１（配列番号４）を含み、
そして、
ＥＦは、アミノ酸残基２６１〜２６９（配列番号５）を含む。
本発明は、アミノ酸残基１７５〜１８５を含むＡＡ”ループ配列（配列番号１）の部分を含むポリペプチドによって例証される。
１つの局面において、ＲＡＮＫＬループは、ＡＡ”ループの天然に存在する改変体である配列番号７および配列番号１１のポリペプチドを含むヒトＲＡＮＫＬの部分に対応する。両方とも、ヒトＲＡＮＫＬの天然の改変体である。配列番号８、配列番号９および配列番号１０は、それぞれ、ヒトＲＡＮＫＬループＣＤ、ＤＥ、およびＥＦの表面ループポリペプチド配列である。
別の局面において、本発明は、ＲＡＮＫに結合するポリペプチドを包含し、そして、配列番号１〜配列番号５および配列番号７〜配列番号１１からなる群より選択される配列からなる。別の局面において、本発明は、配列番号１〜配列番号５および配列番号７〜配列番号１１から選択される１以上のポリペプチドのコンカテマーを含む。別の局面において、本発明は、上記ポリペプチドの治療併用物を包含する。本発明はまた、ＲＡＮＫＬ外部表面ループを含みかつＲＡＮＫＬを競合的に阻害する能力を有するポリペプチドを提供する。
本発明の利点によって、上述のポリペプチドが、当業者によって通常使用される従来型の合成手順を使用して合成され得る。例えば、このポリペプチドは、Ｓｈｅｐｐａｒｄら（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ Ｐｅｒｋｉｎ Ｉ，ｐ．５３８）の方法に従って自動ペプチドプド合成機（例えば、Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＬＫＢ Ｂｉｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．，ＬＫＢ Ｂｉｏｌｙｎｋ ４１７０またはＭｉｌｌｉｇｅｎ，Ｍｏｄｅｌ ９０５０（Ｍｉｌｌｉｇｅｎ，Ｍｉｌｌｆｏｒｄ ＭＡ）によって製造された自動ペプチド合成機）によって化学的に合成され得る。この手順において、Ｎ，Ｎ’−ジクロロヘキシルカルボジイミドが、アミノ酸に添加され、そのアミン官能基が９−フルオロニルメトキシカルボニル（ｆｌｏｕｒｅｎｙｌ ｍｅｔｅｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ）（Ｆｍｏｃ）基によって保護されており、そして、所望のアミノ酸の無水物が保護されている。次いで、これらのＦｍｏｃ−アミノ酸無水物が、ペプチド合成のために使用され得る。Ｃ末端アミノ酸残基に対応するＦｍｏｃ−アミノ酸無水物は、触媒としてジメチルアミノピリジンを使用してカルボキシル基を介してＵｌｔｒｏｓｙｎ Ａ樹脂に固定される。次に、この樹脂は、ピペリジンを含むジメチルホルムアミドを使用して洗浄される。Ｃ末端アミノ酸のアミノ官能基の保護基は取り除かれる。所望のペプチドに対応する次のアミノ酸が、Ｃ末端アミノ酸に結合される。次いで、この脱保護プロセスは、反復される。次いで、連続的な所望のアミノ酸が、所望の配列のペプチドさが形成されるまで所望の配列のペプチド鎖が同じ様式で固定される。アセトアミドメチル以外の保護基が取り除かれ、そして、そのペプチドは溶媒中放出される。
あるいは、このペプチドは、本発明のポリペプチドを適切な発現ベクター中にコードする核酸分子を使用することによって合成され得、このベクターは、コードヌクレオチド配列を含む。このようなＤＮＡ分子は、自動ＤＮＡ配列決定機および遺伝コードにおける周知のコドン−アミノ酸関係を使用して調製され得る。このようなＤＮＡ分子はまた、オリゴヌクレオチドプローブおよび従来型のハイブリダイゼーション方法論を使用してゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡとして取得され得る。このようなＤＮＡ分子は、発現ベクターに組み込まれ得、このＤＮＡ分子は、そのＤＮＡの発現および適切な宿主（例えば、細菌（例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、酵母細胞、哺乳動物細胞、または昆虫細胞）におけるポリペプチドの産生に適合されたプラスミドを含む。哺乳動物発現系は、その化合物の薬学的および／または免疫学的な特性を改善し得るグリコシル化を容易にし得る。
本発明の別の局面は、本発明のポリペプチドのフラグメント、アナログ、および誘導体を提供することである。用語「フラグメント」、「誘導体」および「アナログ」とは、本明細書中で使用される場合、ＲＡＮＫに結合する能力を保持する様式で改変された化合物を指す。従って、フラグメントは、ＲＡＮＫ結合機能がそのフラグメントにより保持される限り、本発明のペプチドの任意の適切な部分であり得る。改変は、ポリペプチドからそのフラグメント、アナログ、または誘導体への誘導体化のために当該分野で公知の技術のいずれかによって達成され得る。そのような用語、特に「アナログ」はまた、ＲＡＮＫＬに結合するＲＡＮＫＬ模倣物として機能するペプチド、非ペプチド、低分子、および他の化合物を特に包含する。
ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質のアミノ酸配列における改変が、元のアミノ酸配列と比較した場合に等価または優れた機能的特徴を提示する、等価またはおそらく改善された第２世代ペプチドなどを生じ得ることに、当業者は気付く。従って、本発明は、そのような改変アミノ酸配列を包含する。変化は、アミノ酸の挿入、欠失、置換、短縮、融合、環化、ジスルフィド架橋、サブユニット配列のシャッフリングなどを包含し得るが、これらに限定されず、但し、そのような改変により生じるペプチド配列は、ＲＡＮＫに結合する能力を保持する。そのような改変は、化合物の半減期、生物学的活性、吸収、分布、代謝、排泄、毒性などを改善するために行われ得る。そのような変化を作製する際に考慮され得る１つ要因は、アミノ酸の疎水性親水性指標である。タンパク質に対して相互作用性生物学的機能を付与する際の疎水性親水性アミノ酸指標の重要性は、ＫｙｔｅおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅにより考察された（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７：１０５〜１３２，１９８２）。アミノ酸の相対的疎水性親水性特徴は、生じるタンパク質の二次構造に寄与することが、受け入れられている。次いで、このことは、そのタンパク質と分子（例えば、酵素、基質、レセプター、ＤＮＡ、抗体、抗原など）との相互作用に影響する。
その疎水性および荷電特徴に基づいて、各アミノ酸に、以下のような疎水性親水性指標が割り当てられている：イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン／シスチン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（−０．４）；スレオニン（−０．７）；セリン（−０．８）；トリプトファン（−０．９）；チロシン（−１．３）；プロリン（−１．６）；ヒスチジン（−３．２）；グルタミン酸／グルタミン／アスパラギン酸／アスパラギン（−３．５）；リジン（−３．９）；およびアルギニン（−４．５）。
当該分野において知られているように、ペプチドまたはタンパク質中の特定のアミノ酸は、類似するヒドロパシー指数またはスコアを有する他のアミノ酸と置換され得、そして類似の生物学的活性を有する（すなわち、生物学的機能をなお維持する）結果的なペプチドまたはタンパク質を産生し得る。そのような変化をなす場合、±２以内のヒドロパシー指数を有するアミノ酸が互いに置換されることが好ましい。より好ましい置換は、アミノ酸が±１以内のヒドロパシー指数を有する置換である。最も好ましい置換は、アミノ酸が±０．５以内のヒドロパシー指数を有する置換である。
同様のアミノ酸がまた、親水性に基づき置換され得る。米国特許第４，５５４，１０１号は、隣接するアミノ酸の親水性により支配されるような、タンパク質の最も高い局所的平均親水性は、このタンパク質の生物学的特性と相関することを開示する。以下の親水性値が、アミノ酸に割り当てられている：アルギニン／リジン（＋３．０）；アルパラギン酸／グルタミン酸（＋３．０±１）；セリン（＋０．３）；アルパラギン／グルタミン（＋０．２）；グリシン（０）；スレオニン（−０．４）；プロリン（−０．５±１）；アラニン／ヒスチジン（−０．５）；システイン（−１．０）；メチオニン（−１．３）；バリン（−１．５）；ロイシン／イソロイシン（−１．８）；チロシン（−２．３）；フェニルアラニン（−２．５）；およびトリプトファン（−３．４）。従って、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質の中の１つのアミノ酸が、同様の親水性スコアを有する別のアミノ酸により置換され得、そして同様の生物学的活性を有する、すなわち、正確な生物学的機能をなお維持する結果的なタンパク質を提供し得る。そのような変化をなす場合において、好ましくは、±２以内のヒドロパシー指数を有するアミノ酸が互いに置換され、±１以内のヒドロパシー指数を有するアミノ酸がより好ましく、±０．５以内のヒドロパシー指数を有するアミノ酸が最も好ましい。
上で概説されるように、本発明のポリペプチドにおけるアミノ酸置換は、アミノ酸側鎖置換基の相対的な類似性（例えば、それらの疎水性、親水性、電荷、サイズなど）に基づき得る。本発明のポリペプチドなどの範囲内のサイレント（ｓｉｌｅｎｔ）な変化を生じる保存的アミノ酸変化を産生するように種々の前述の特性を考慮した例示的な置換が、天然に存在するアミノ酸が属するクラスの他のメンバーから選択され得る。アミノ酸が、以下の４つの群に分けられ得る：（１）酸性アミノ酸；（２）塩基性アミノ酸；（３）中性極性アミノ酸；および（４）中性非極性アミノ酸。これらの種々の群の範囲内の代表的アミノ酸としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：（１）酸性（負に荷電した）アミノ酸（例えば、アスパラギン酸およびグルタミン酸）；（２）塩基性（正に荷電した）アミノ酸（例えば、アルギニン、ヒスチジン、およびリジン）；（３）中性極性アミノ酸（例えば、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、シスチン、チロシン、アスパラギン、およびグルタミン）；および（４）中性非極性アミノ酸（例えば、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、およびメチオニン）。有利であると推定されない変化もまた、これらが機能的配列を生じる場合、有用であり得ることに注目すべきである。
従って、本発明のポリペプチドのフラグメント、誘導体またはアナログは、例えば、以下であり得るが、これらに限定されない：（ｉ）１つ以上のアミノ酸残基が、保存的または非保存的アミノ酸残基と置換され、そしてそのような置換されたアミノ酸残基は、遺伝的コードによりコードされていてもされていなくてもよいもの、（ｉｉ）１つ以上のアミノ酸残基が置換基を含むもの、（ｉｉｉ）成熟タンパク質が別の化合物（例えば、このタンパク質の半減期を増加させるような化合物）に融合されているもの、（ｉｖ）精製、もしくは検出および同定において補助するような追加のアミノ酸がこのタンパク質に融合されているもの、または（ｖ）特定の位置（例えば、細胞膜または細胞外コンパートメント）へのタンパク質の組織分配もしくは局在化の改変を補助するような追加のアミノ酸残基が、このタンパク質に融合されているもの；または（ｖｉ）別の分子（恐らく低分子の非ペプチド分子）がこのポリペプチドのＲＡＮＫ結合機能を模倣するもの。
ポリペプチドを改変してそれらの薬物としての能力を改善することは、当該分野における標準的な実施である。従って、改変が、ＲＡＮＫへのポリペプチドの結合および／またはそのポリペプチドが破骨細胞分化を阻害する能力に完全に影響することなくなされ得る。例えば、ＲＡＮＫＬのオリゴマー化が、このタンパク質の内在化を遅延させるための有用な技術であることが示されている。さらに、環化が、本発明のＲＡＮＫＬ模倣物を安定化させるために用いられ得る。同様に、ポリペプチドの安定性または他の有益な特性を増加させるための公知の処理（例えば、Ｌ−アミノ酸のＤ−アミノ酸での置換、またはＰＥＧ化（ＰＥＧ−ａｌａｔｉｏｎ））が用いられて、本発明のＲＡＮＫＬ模倣物に同様の影響を与え得る。
１つの局面において、このポリペプチド配列が、そのＮ末端および／またはＣ末端の両方のいずれかの残基に隣接し得る。含められる場合、そのような隣接する残基は、コア配列がＲＡＮＫに結合する能力およびＲＡＮＫ／ＲＡＮＫＬ相互作用を阻害する能力を有意に変化させるべきではない。隣接残基としては、ジスルフィド結合を容易にするシステインが挙げられ得る。従って、１つの実施形態において、本発明のポリペプチドは、各末端に隣接残基を含み得、この各末端は、各々、５残基未満であり得る。好ましい実施形態において、３残基未満の隣接する残基を各末端に含み、最も好ましくは、隣接する残基を含まない。
そのような分子は、当業者に公知の多数の改変を含み得る。例えば、置換アミド結合としては、一般的に、以下が挙げられ得るが、これらに限定されない：式−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）−の基であって、ここで、Ｒが、（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、置換（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ２−Ｃ６）アルケニル、置換（Ｃ２−Ｃ６）アルケニル、（Ｃ２−Ｃ６）アルキニル、置換（Ｃ２−Ｃ６）アルキニル、（Ｃ５−Ｃ２０）アリール、置換（Ｃ５−Ｃ２０）アリール、（Ｃ６−Ｃ２６）アリールアルキル、置換（Ｃ６−Ｃ２６）アリールアルキル、５〜２０員環のヘテロアリール、５〜２０員環の置換ヘテロアリール、６〜２６員環のヘテロアリールアルキル、および６〜２６員環の置換ヘテロアリールアルキルである、基。
アミド結合の等配電子体としては、一般的に、以下が挙げられ得るが、これらに限定されない：−ＣＨ２ＮＨ−、−ＣＨ２Ｓ−、−ＣＨ２ＣＨ２−、−ＣＨ＝ＣＨ−（シスおよびトランス）、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２−、−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２−および−ＣＨ２ＳＯ−。そのような非アミド結合を有する化合物およびそのような化合物を調製するための方法は、当該分野において周知である（例えば、Ｓｐａｔｏｌａ、１９８３年３月、Ｖｅｇａ Ｄａｔａ Ｖｏｌ．１、Ｉｓｓｕｅ ３；Ｓｐａｔｏｌａ、１９８３、「Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｂａｃｋｂｏｎｅ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ」： Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ編、Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ｐ．２６７（総説）；Ｍｏｒｌｅｙ、１９８０、Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．１：４６３−４６８；Ｈｕｄｓｏｎら、１９７９、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｒｏｔ．Ｒｅｓ．１４：１７７−１８５（−ＣＨ２ＮＨ−，−ＣＨ２ＣＨ２−）；Ｓｐａｔｏｌａら、１９８６、Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．３８：１２４３−１２４９（−ＣＨ２−Ｓ）；Ｈａｎｎ、１９８２、Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｐｅｒｋｉｎ Ｔｒａｎｓ．Ｉ．１：３０７−３１４（−ＣＨ＝ＣＨ−、シスおよびトランス）；Ａｌｍｑｕｉｓｔら、１９８０、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２３：１３９２−１３９８（−ＣＯＣＨ２−）；Ｊｅｎｎｉｎｇｓ−Ｗｈｉｔｅら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ．Ｌｅｔｔ．２３：２５３３（−ＣＯＣＨ２−）；欧州特許出願番号ＥＰ ４５６６５（１９８２）ＣＡ ９７：３９４０５（−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２−）；Ｈｏｌｌａｄａｙら、１９８３、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．２４：４４０１−４４０４（−Ｃ（ＯＨ）ＣＨ２−）；およびＨｒｕｂｙ、１９８２、Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．３１：１８９−１９９（−ＣＨ２−Ｓ−）を参照のこと）。
さらに、１つ以上のアミド結合が、ペプチドの構造にも活性にも実質的に干渉しないプチド模倣物またはアミド模倣物部分で置換され得る。あるいは、アミド結合の全てが、ペプチド模倣物部分で置換され得る。適切なアミド模倣物部分は、例えば、Ｏｌｓｏｎら、１９９３、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３６：３０３９〜３０４９に記載されている。
ペプチドおよびペプチドアナログは、必要に応じて、端のいずれかまたはその両方に必要に応じてペプチドまたはペプチドアナログを含み得、これらの末端は、１〜５残基またはそれより長い長さであり得る。ペプチドアナログは、代表的に、上記のような、少なくとも１つの改変された内部結合基（例えば、置換アミドまたはアミドの等配電子体）を含む。そのような追加のペプチドまたはペプチドアナログは、ＲＡＮＫＬアミノ酸配列の別の部分由来のアミノ酸配列を含み得るか、あるいは、これらの配列は、完全にランダムであり得る。そのようなランダム配列を含むペプチドが、生物学的活性（すなわち、ＲＡＮＫに結合する能力）について試験され得る。
ＲＡＮＫに結合する化合物を試験する１つの方法は、アッセイ（例えば、所望の化合物とＲＡＮＫとの間の結合アッセイ）を実施することにより決定される。１つの局面において、これは、ＲＡＮＫにこの化合物を接触させ、そしてその解離速度を決定することにより実施される。結合アッセイを実施するための多数の可能性が、当該分野において周知である。ＲＡＮＫに結合する化合物の能力の指標は、例えば、解離速度により決定され、そして結合活性と解離速度との対応は、当該分野において十分に確立されている。
例えば、このアッセイは、参照化合物、ペプチド、またはタンパク質（例えば、ＲＡＮＫＬ）またはこれらから単離した外部表面ループを、例えば、１２５Ｉを用いて放射標識し、そしてそれを１．５ｍｌのチューブの中でＲＡＮＫとともにインキュベートすることにより実施され得る。次いで、これらの反応物に、漸増濃度で試験化合物を添加する。至適インキュベーションの後、ＲＡＮＫ／化合物複合体を、例えば、クラマトグラフィーカラムを用いて分離し、そしてγカウンターを用いて、結合した１２５Ｉ標識したペプチドについて評価する。参照ペプチドの結合の５０％を阻害するのに必要な試験化合物の量を決定する。次いで、これらの値を、標識していない参照ペプチドの結合の濃度に対して正規化する（相対阻害濃度（ＲＩＣ）−１＝濃度試験／濃度参照）。小さいＲＩＣ−１の値は、強力な相対的結合を示し、一方で、大きいＲＩＣ−１の値は、弱い相対的結合を示す。例えば、Ｌａｔｅｋら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、Ｖｏｌ．９７、Ｎｏ．２１、ｐｐ．１１４６０〜１１４６５、２０００を参照のこと。当然、高スループットの結合アッセイ（例えば、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、Ａｃｔｅｌｉｏｎなどから市販されている結合アッセイ）はまた、化合物の結合を試験するのに適する。
「ブロック」形態のペプチドおよびペプチドアナログもまた、本発明の範囲内に含まれ、これらの形態において、Ｎ末端および／またはＣ末端が、Ｎ末端−ＮＨ２またはＣ末端−Ｃ（Ｏ）ＯＨと反応し得る部分でブロックされている。そのようなブロック化合物は、代表的には、Ｎ末端アシル化および／またはＣ末端アミド化もしくはエステル化されている。代表的なＮ末端ブロッキング基としては、Ｒ１Ｃ（Ｏ）−が挙げられ、ここで、Ｒ１は、水素、（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ２−Ｃ６）アルケニル、（Ｃ２−Ｃ６）アルキニル、（Ｃ５−Ｃ２０）アリール、（Ｃ６−Ｃ２６）アリールアルキル、５〜２０員環のヘテロアリール、または６〜２６員環のヘテロアリールアルキルである。好ましいＮ末端ブロッキング基としては、アセチル、ホルミル、およびダンシルが挙げられる。代表的なＣ末端ブロッキング基としては、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ１Ｒ１および−Ｃ（Ｏ）ＯＲ１が挙げられ、ここで各々のＲ１は、独立して、上で規定された通りである。好ましいＣ末端ブロッキング基としては、各々のＲ１が独立して（Ｃ１−Ｃ６）アルキルであり、好ましくはメチル、エチル、プロピル、またはイソプロピルであるＣ末端ブロッキング基が挙げられる。
本発明の好ましい実施形態において、骨の損失を予防または阻害する方法、破骨細胞分化を阻害する方法、およびＲＡＮＫＬ活性を競合阻害する方法が、本明細書中に記載されるスクリーニング方法により同定される化合物を含む組成物を投与することにより提供される。本発明の骨形成組成物が、その必要のある被験体に有効量のそのような組成物を提供することにより用いられ得る。これらの方法および組成物が、骨の損失または希薄化（ｔｈｉｎｎｉｎｇ）により特徴付けられる多くの疾患または状態を処置するために用いられ得る。そのような疾患および状態としては、以下が挙げられる：骨粗しょう症、若年性骨粗しょう症、骨形成不全症、高カルシウム血症、上皮小体機能亢進症、骨軟化症、骨石灰脱失症、骨溶解性骨疾患、骨壊死、骨のパジェット病、慢性関節リウマチに起因する骨損失、炎症性関節炎、骨髄炎、コルチコステロイド処置、転移性骨疾患、歯周骨損失、癌に起因する骨の損失、加齢性の骨の質量の損失、および他の形態の骨減少。好ましい実施形態において、本発明の方法および組成物は、骨粗しょう症、骨溶解性骨損失、慢性関節リウマチに起因する骨の損失、および骨転移を処置するために用いられる。
動物被験体を処置するのに使用するために、本発明の組成物が、薬学的組成物または獣医学的組成物として処方され得る。処置される被験体、投与の様式、および所望される処置の型（例えば、予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）、予防（ｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）、治療）に依存して、これらの組成物は、これらのパラメーターにふさわしい様式で処方される。そのような技術の概説は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、最新版、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡに見出される。
本発明の組成物の投与は、投与の種々のパラメーター（頻度、投与量、持続様式、および投与経路が挙げられる）を較正することによって、薬物速度論的および薬力学的に制御され得る。投与量、持続時間、および投与様式のバリエーションもまた、必要とされる活性を生み出すように操作され得る。
動物被験体またはヒト被験体への投与のために、本発明の化合物の投与量は、代表的には、０．０１〜１００ｍｇ／ｋｇである。しかし、投与レベルは、疾患または状況の性質、患者の状態、医師の判断、ならびに投与の頻度および様式に高度に依存する。経口経路が用いられる場合、この物質の吸収は、バイオアベイラビリティーに影響する因子である。低い吸収は、胃腸管においてより高い濃度で効果を有し、従って、より高い投与量が必要とされる。
この物質の適切な投与量が、動物モデル試験（ここで、有効用量レベル（例えば、ＥＤ５０）および毒性用量レベル（例えば、ＴＤ５０）ならびに致死用量レベル（例えば、ＬＤ５０またはＬＤ１０）が適切かつ受容可能な動物モデルにおいて確立される）を実施することによって適切に評価されるべきであることが理解される。さらに、物質が、そのような動物試験において効率的であることが証明された場合に、制御された臨床試験が実施されるべきである。
一般的に、処置において使用するために、本発明の化合物が、単独でかまたは骨の損失の処置のための他の組成物と組み合わせて用いられ得る。そのような組成物としては、以下が挙げられる：抗再吸収剤（例えば、ビスホスホネート、カルシトニン、カルシトリオール、エストロゲン、ＳＥＲＭおよびカルシウム供給源）、または骨形成補助剤（ｓｕｐｌｅｍｅｎｔａｌ ｂｏｎｅ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ａｇｅｎｔ）（例えば、パラチロイドホルモンもしくはその誘導体、骨形態発生タンパク質、オステオゲニン、ＮａＦ、またはスタチン）。本明細書中に参考として援用される米国特許第６，０８０，７７９号を参照のこと。投与の様式に依存して、これらの化合物は、適切な組成物へと処方される。
処方物が、全身性投与または局所的（ｔｏｐｉｃａｌ）投与もしくは局所（ｌｏｃａｌ）投与に適する様式で調製され得る。全身性処方物としては、注射（例えば、筋内注射、静脈内注射、または皮下注射）のために設計された処方物が挙げられるか（これらに限定されない）、または経皮投与、経粘膜投与、経鼻投与もしくは経口投与のために調製され得る。この処方物は、一般的に、希釈剤、およびいくつかの場合においてアジュバント、緩衝剤、保存料などを含む。
経口投与のために、これらの組成物はまた、リポソーム組成物中でかまたはマイクロエマルジョンとして投与され得る。適切な形態としては、当該分野において理解されるような、シロップ剤、カプセル剤、錠剤が挙げられる。注射のために、処方物は、液体溶液もしくは懸濁液としてかまたは注射前の液体中の溶解もしくは懸濁に適する固体形態としてか、または乳濁液として、従来の形態で調製され得る。適切な賦形剤としては、例えば、水、生理食塩水、デキストロース、グリセロールなどが挙げられる。そのような組成物はまた、一定量の非毒性補助物質（例えば、湿潤剤、または乳化剤、ｐＨ緩衝剤など（例えば、酢酸ナトリウム、ソルビタンモノラウレートなど））を含み得る。
本発明の組成物はまた、当業者に公知の種々の技術を用いて、患者（ヒトおよび他の脊椎動物（例えば、家畜動物（ｄｏｍｅｓｔｉｃ ａｎｉｍａｌ）、げっ歯類、および家畜（ｌｉｖｅｓｔｏｃｋ））の両方）における、骨の損失の減少および／または骨の質量の増加が所望される部位に局所的に投与され得る。例えば、これらの組成物としては、以下が挙げられ得る：スプレー剤、ローション、ゲルまたは他のビヒクル（例えば、アルコール、ポリグリコール、エステル、オイルおよびシリコーン）。そのような局所投与としては、例えば、損傷した骨を修復または置換するための骨折部位または骨の損失部位を含む。さらに、抗再吸収剤が、例えば、適切なキャリア中で、自己移植片、同種移植片または補綴物とネイティブの骨との接合部で、ネイティブの骨への移植片または補綴物の結合を支持するために投与され得る。
本発明の別の実施形態は、ＲＡＮＫＬのインヒビターについてスクリーニングするための競合結合アッセイにおけるＲＡＮＫＬループの使用を含む。ＲＡＮＫへの結合は、所望の化合物とＲＡＮＫとの間の結合アッセイとして上記のようなアッセイを実施することによって決定される。１つの局面において、これは、試験化合物をＲＡＮＫに接触させることおよびその解離速度を決定することによってなされる。結合アッセイを実施するための多くの可能性が、当該分野において周知である。化合物の、ＲＡＮＫに結合する能力の指標は、例えば、解離速度により決定され、そして結合活性と解離速度との相関は、当該分野において十分に確立されている。例えば、このアッセイは、参照化合物（例えば、１２５Ｉを有する配列番号１のＡＡ’’ループ配列の一部を含むポリペプチド）を放射標識すること、および１．５ｍｌのチューブ中でそれをＲＡＮＫと共にインキュベートすることによって実施され得る。次いで、試験化合物は、漸増濃度で、これらの反応物に添加される。最適なインキュベーションの後、ＲＡＮＫ／化合物複合体が、例えば、クロマトグラフィーカラムを用いて分離され、そしてγカウンターを用いて、結合された１２５Ｉ標識ペプチドについて評価される。参照化合物の結合の５０％を阻害するのに必要な試験化合物の量が決定される。次いで、これらの値は、標識されていない参照化合物の結合の濃度について正規化される（相対的阻害濃度（ＲＩＣ）−１＝濃度試験／濃度参照）。小さいＲＩＣ−１値は、強力な相対的結合を示し、一方で、大きいＲＩＣ−１値は、弱い相対的結合を示す。例えば、Ｌａｔｅｋら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、Ｖｏｌ．９７、Ｎｏ．２１、ｐｐ．１１４６０−１１４６５、２０００を参照のこと。配列番号２〜５において同定されるＲＡＮＫＬループおよびそのフラグメントもまた、そのようなアッセイにおいて参照化合物として、個々にかまたは組み合わせでの使用に適する。さらに、高スループットのアッセイもまた、１つ以上のＲＡＮＫＬループを含む結合アッセイを実施するために適切である。
本発明の他の特徴、目的、および利点は、当業者に明らかである。本明細書中に提示される説明および例示は、本発明、その原理およびその実際の適用を当業者に知らせることが意図される。当業者は、本発明をその多数の形態に、特定の使用の要件に最も適し得るように適合および適用し得る。従って、前述の本発明の特定の実施形態は、本発明を網羅することも限定することも意図しない。
本明細書中に引用される全ての刊行物および特許出願は、個々の刊行物または特許出願の各々が詳細かつ個別に参考として援用されると示されているかのように、本明細書中に参考として援用される。
以下の実施例は、本発明を例示するが、そのように例示された本発明の種々の局面を限定すると解釈されない。
（実施例１）
ＴＲＡＰ活性に対するＲＡＮＫＬの部分的ＡＡ’’ループポリペプチドの効果。野生型Ｃ３Ｈ／ＨＥＮＪマウスを、Ｈａｒｌａｎ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）から購入した。破骨細胞前駆体の細胞培養を確立するために、骨髄マクロファージ（ＢＭＭ）を４〜６週齢のマウスの全骨髄から単離し、そして組織培養ディッシュ中、５％ＣＯ２中で、３７℃にてインキュベートした。培養２４時間後、非付着細胞を回収し、そしてＦｉｃｏｌｌ Ｈｙｐａｑｕｅ勾配上で重ね、そして勾配界面の細胞を回収した。細胞を、組換えマウスＭ−ＣＳＦ（１０ｎｇ．ｍｌ）の存在下、５％のＣＯ２中、３７℃で、１０％の熱不活化胎児ウシ血清を添加したα−最小必須培地（α−ｍｉｎｉｍａｌ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｍｅｄｉｕｍ）中に６５，０００／ｃｍ２で再プレートした。次いで、これらの細胞培養物を、漸増濃度の配列番号１（ＡＡ’’ループのサブセット）のポリペプチドまたは試験化合物と同じ分子量を有するネガティブコントロールスクランブルペプチドのいずれかを用いて処理した。
この実験の結果を、図１に示す。図１から見出され得るように、酒石酸特異的酸ホスファターゼ（ＴＲＡＰ）によりモニタリングされるように、破骨細胞前駆体の細胞培養物への試験化合物の添加は、ＲＡＮＫＬが破骨細胞分化を誘導する能力を競合阻害する。このホスファターゼは、破骨細胞特異的酵素であり、そしてその能力は、破骨細胞分化に対応する。ＴＲＡＰ活性は、それが基質を切断する能力を呈色（ｃｏｌｏｒ−ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ）反応において計ることにより測定される。
図１から見出され得るように、破骨細胞分化阻害は、用量依存性である（すなわち、培養物中の試験化合物の濃度を増加させることは、ＴＲＡＰ活性を減少させ、一方で、ネガティブコントロールペプチドは、ＴＲＡＰ活性に対する影響を有さない）。
図１は、ＴＲＡＰ活性により測定された場合の破骨細胞生成に対する、漸増濃度のＰＳＧＳＨＫＶＴＬＳＳペプチド（配列番号１）の効果を示すグラフである。
【配列表】
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Claims (25)

  1. 配列番号１〜配列番号５および配列番号７〜配列番号１１から選択される１つ以上のアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドであって、該ポリペプチドは、ＲＡＮＫに結合する能力を有する、ポリペプチド。
  2. 保存的または非保存的改変を有し、かつ、ＲＡＮＫに結合する能力をなお有する、請求項１に記載のポリペプチド。
  3. ＲＡＮＫへの結合に関与するＲＡＮＫＬ配列を含むポリペプチドであって、該配列は、実質的に、配列番号１〜配列番号５および配列番号７〜配列番号１１から選択される１つ以上のアミノ酸配列からなり、そして該ポリペプチドは、ＲＡＮＫに結合する能力を有する、ポリペプチド。
  4. 保存的または非保存的改変を有し、かつ、ＲＡＮＫを結合するＲＡＮＫＬを阻害する能力を有する、請求項３に記載のポリペプチド。
  5. １つ以上のＲＡＮＫＬの外部表面ループを含む、ＲＡＮＫＬ以外のポリペプチドであって、該ポリペプチドは、ＲＡＮＫに結合する能力を有する、ポリペプチド。
  6. １つ以上のＲＡＮＫＬの外部表面ループを含むポリペプチドであって、該ポリペプチドは、ＲＡＮＫを結合するＲＡＮＫＬを競合的に阻害する能力を有する、ポリペプチド。
  7. 実質的に、配列番号１〜配列番号５および配列番号７〜配列番号１１から選択されるアミノ酸配列からなる、請求項１に記載のポリペプチド。
  8. 請求項１、２、３、４、５、６、または７に記載のポリペプチドのフラグメント、アナログ、模倣物または誘導体を含む化合物であって、該化合物は、ＲＡＮＫに結合する能力を有する、化合物。
  9. 薬学的組成物であって、薬学的に受容可能なキャリア、アジュバント、可溶化剤、安定剤、および／または抗酸化剤中に、有効量の請求項１、２、３、４、５、６、７に記載のポリペプチドを含む、薬学的組成物。
  10. 薬学的組成物であって、薬学的に受容可能なキャリア、アジュバント、可溶化剤、安定剤、および／または抗酸化剤中に、有効量の請求項８に記載のポリペプチドを含む、薬学的組成物。
  11. 破骨細胞分化を阻害する方法であって、有効量の請求項９に記載の薬学的組成物を投与する工程を包含する、方法。
  12. 骨吸収を阻害する方法であって、有効量の請求項９に記載の薬学的組成物を投与する工程を包含する、方法。
  13. ＲＡＮＫＬを競合的に阻害する方法であって、該方法は、有効量の請求項１〜８に記載の化合物を投与する工程を包含する、方法。
  14. ＲＡＮＫＬを競合的に阻害する方法であって、該方法は、有効量の請求項９に記載の化合物を投与する工程を包含する、方法。
  15. 疾患または状態を処置する方法であって、該疾患または状態は、骨粗しょう症、若年性骨粗しょう症、骨形成不全、高カルシウム血症、上皮小体機能亢進症、骨軟化症、骨石灰脱失症、骨溶解性骨疾患、骨壊死、パジェット骨疾患、慢性関節リウマチに起因する骨損失、炎症性関節炎、骨髄炎、コルチコステロイド処置、転移性骨疾患、歯周骨損失、癌に起因する骨損失、骨塊の年齢関連損失、およびオステオペニアの他の形態からなる群より選択され、ここで、該方法は、有効量の請求項９に記載の化合物を投与する工程を包含する、方法。
  16. 前記疾患または状態が、骨粗しょう症、骨溶解性骨疾患、慢性関節リウマチ、および骨格転移を含む、請求項１５に記載の方法。
  17. ポリペプチドであって、以下：
    （ａ）ＲＡＮＫへの結合に関与するＲＡＮＫＬ配列であって、該配列が、実質的に、配列番号１〜配列番号５および配列番号７〜配列番号１１から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列からなり、そして該ポリペプチドがＲＡＮＫに結合する能力を有する、ＲＡＮＫＬ配列；および
    （ｂ）さらなるアミノ酸残基であって、配列のＲＡＮＫに結合する能力を排除しない該配列と並列する、アミノ酸残基、
    を含む、ポリペプチド。
  18. 請求項１に記載のポリペプチドであって、以下の改変：
    （ｉ）該ポリペプチドの１つ以上のアミノ酸残基が、保存的または非保存的アミノ酸残基で置換され、このような残基が、遺伝子コードによってコードされる改変であっても、改変でなくてもよい、改変；
    （ｉｉ）１つ以上のアミノ酸残基が、置換基を含む、改変；
    （ｉｉｉ）該ポリペプチドが、該タンパク質の半減期を増加させるための化合物のような別の化合物に融合される、改変；
    （ｉｖ）さらなるアミノ酸が、該ポリペプチドに融合され、精製または検出および同定を補助する、改変；または
    （ｖ）さらなるアミノ酸残基が、該ポリペプチドに融合され、例えば、細胞膜または細胞外コンパートメントのような特定の位置への該タンパク質の組織分布または局在化の改変を補助する、改変、
    の１つ以上を有する、ポリペプチド。
  19. ＲＡＮＫＬ結合化合物をスクリーニングする方法であって、該方法は、試験化合物、参照化合物とＲＡＮＫとの間の結合アッセイを実施する工程を包含し、該参照化合物は、実質的に、配列番号１〜配列番号５および配列番号７〜配列番号１１から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列からなる、方法。
  20. 請求項１に記載のポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド。
  21. 遺伝子コードの変質に従って調節変質を呈する、請求項２０に記載のポリヌクレオチド。
  22. 請求項１に記載のポリペプチドに対して保存的置換を呈するポリペプチドをコードする、請求項２０に記載のポリヌクレオチド。
  23. 請求項２０、２１、または２２に記載のポリヌクレオチドを含む、発現ベクター。
  24. 請求項２３の発現ベクターを含む、宿主細胞。
  25. 請求項１５に記載の疾患を処置する方法であって、骨増殖を増強するために、必要のある被験体に有効量の１つ以上の薬学的組成物を投与する工程をさらに包含する、方法。
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