KR20220071261A - 활성 폴리펩타이드 화합물 - Google Patents

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Abstract

본원 개시내용은 약물 기술 분야, 구체적으로 활성 폴리펩타이드 화합물에 관한 것이고, 이는 Y-ID-X 또는 X-ID-Y이고; 여기서, Y는 PTH/PTHrP 수용체 효능제 또는 파골세포 억제제이고; ID는 상기 분자 내 펩타이드 결합 또는 링커이고, 이는 X를 Y에 연결하고; X는 골형성 성장 펩타이드 수용체 효능제, 골수 중간엽 줄기 세포 자극제 또는 조혈 줄기 세포 자극제이다. 또한 본원 개시내용은 상기 화합물을 포함하는 약제학적 조성물, 및 골형성 결함 또는 골 미네랄 밀도 감소와 관련된 질환 또는 장애를 예방하거나, 치료하거나 완화시키기 위한 약물의 제조에서 상기 화합물 및 약제학적 조성물의 용도에 관한 것이다.

Description

활성 폴리펩타이드 화합물
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2019년 10월 10일자로 출원된 중국 특허 출원 제 201910958680.0호의 우선권 및 2019년 12월 26일자로 출원된 미국 특허 출원 제16/727,078호의 우선권을 주장하고 이들의 개시내용은 본원에 참조로 포함된다.
본원의 개시내용은 약물 기술 분야, 구체적으로 골화를 효과적으로 촉진시킬 수 있는 화합물, 및 상기 화합물을 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다. 특히, 본원 개시내용에 따른 화합물은 이특이적 융합 폴리펩타이드 화합물이다.
골다공증은 골질량이 감소하고 골조직의 미세구조가 파괴되어 골의 통증이 증가하고 골이 약해지며 골절이 일어나기 쉬운 것을 특징으로 하는 대사성 골 질환이다. 현재에, 전세계적으로 골다공증 환자는 10억 2000만명이 넘고 상기 숫자는 2030년까지 13억 6천만명으로 증가할 것으로 예상된다. 골다공증에 의해 유발된 골절을 갖는 환자의 수는 또한 289,000명에 도달하고 이에 의해 유발된 경제적 부담은 매년 수십억에 도달할 것이다. 중국에서 상기 상황은 또한 낙관적이지 않다. 진단 표준으로서 2.0 SD를 사용한 2016년 연구는 전국가적으로 40세 이상의 골다공증 집단이 약 1억4천만명이고 총 인구의 24.62%를 차지하는 것으로 밝혀졌다.
골다공증에 대한 이해가 깊어짐에 따라 골다공증은 다양한 원인에 의해 유발되는 것으로 사료되고 있으며 일반적으로 세 가지 유형이 있다: 첫 번째는 나이가 들면서 발생하는 생리학적 퇴행성 질환인 1차 골다공증이고; 두 번째는 다른 질환이나 약물 또는 기타 인자에 의해 유도되는 2차 골다공증이고; 세 번째는 특발성 골다공증으로 8~14세 청소년에게 흔히 발생하며 이의 대부분은 유전학적 가족력을 갖고 여성은 남성보다 많다. 1차 골다공증은 2개 유형으로 나눌 수 있다. I형은 폐경기후 골다공증이고 이는 전환율이 높은 유형의 골다공증이다. II형은 저전환형인 노인성 골다공증으로 65세 이상의 노년층에서 주로 발생한다. 폐경기 후 골다공증의 발병기전은 비교적 단순하고, 주로 에스트로겐 결핍으로 인한 파골세포 기능의 증가와 골흡수 촉진으로 인해 유발된 골소실 가속화와 관련이 있고, 또한 나이가 들어감에 따라 골 손실이 증가하고 골 질량은 감소하며 골 밀도는 피크보다 훨씬 낮으며 장기간 침대에 누워 있으면 골 손실이 가속화된다. 골다공증의 주요 임상적 증상은 다음과 같다: ① 요통이나 몸 주위의 골격성 통증으로 나타나며, 하중이 증가하면 통증이 악화되며, 통증이 심할 경우 뒤집기, 일어서기, 걷기가 힘든 통증; ② 척추 기형: 높이 또는 혹의 단축, 척추 기형 또는 신장 제한. ③ 골절.
인간의 수명 연장 및 사회의 고령화와 함께, 골다공증은 인간의 중요한 건강 문제가 되었다. 현재 중국은 60세 이상 인구가 약 1억 7,300만 명으로 세계에서 절대 노인인구가 가장 많은 나라이다. 2003년부터 2006년까지 실시한 대규모 국가역학조사는 척추 및 대퇴골 및 목뼈의 골밀도 값을 기준으로 50세 이상의 골다공증 유병률이 여성이 20.7%, 남성이 14.4%임을 보여주었다. 골다공증의 유병률은 60세 이상의 인간들, 특히 여성에서 상당히 증가한다. 조사에 따르면 2006년에 약 6,944만 명의 50세 이상 인구가 골다공증을 앓고 있으며 약 2억 1,000만 명이 낮은 골질량을 가지고 있는 것으로 평가된다. 중국인의 고관절 골절율은 향후 수십 년 동안 크게 증가할 것으로 추정된다. 여성의 일생에서 골다공증 골절의 위험(40%)은 유방암, 자궁내막암, 난소암을 합친 것보다 높았다.
골다공증은 한 가지 인자에 의해 유발되지 않는다. 발병기전에 관여한 인자들은 다음을 포함한다: ① 유전학적 인자; ② 칼슘과 비타민 D의 결핍; ③ 널리 알려져 있는 에스트로겐 부족으로 인한 골다공증과 에스트로겐 대체 효과; ④ 남성 골다공증에 또한 관여하는 안드로겐 결핍 및 ⑤ 노년의 퇴행성 기전.
골다공증은 가능한한 조기에 치료되어야 한다. 완전하게 및 부분적으로 소실된 골 유닛 (주상골 유닛 및 직경 0.2 mm의 피질골의 섬유주)는 재생이 불가능하지만 얇아진 골 유닛은 치료 후 원래의 상태로 회복될 수 있다. 따라서 소실된 골 단위 (골다공증 형성)를 역전시키는 것은 불가능하지만 조기 중재로 대부분의 인간들의 골다공증을 예방할 수 있다. 폐경기 여성 (45세)은 치료를 개시해야 하며 남성은 10년 후에 개시할 수 있다.
골다공증의 치료 및 이의 발병 예방에 사용되는 약물은 세 가지 범주로 나눈다. 첫 번째 범주는 칼시토닌, 이인산, 에스트로겐, 이소플라본과 같은 골흡수를 억제하는 약물이다. 두 번째 범주는 불소, 합성 스테로이드, 부갑상선 호르몬 및 이소플라본을 포함하는 골화를 촉진하는 약물이다. 세번째 범주는 칼슘 제제, 비타민 D 및 활성 비타민 D를 포함하는 골 미네랄화를 촉진시키는 약물이다. 그 중, 항골다공증 치료 약물은 주로 칼시토닌, 골 칼슘 조절제, 선택적 에스트로겐 수용체 조절제 (SERMS) 및 부갑상선 호르몬 (PTH)이다. 에스트로겐은 유방암과 자궁내막암의 위험을 유발할 수 있으며, 칼시토닌은 쉽게 부갑상선기능항진증을 유발하고 항체를 생성한다. 랄록시펜과 같은 선택적 에스트로겐 수용체 조절제 (SERM)는 새로운 척추 골절의 발병률을 줄일 수 있지만(척추 골절에서 30-50% 감소), 고관절 및 기타 비척추 골절에 미치는 영향은 불분명하다. 비스포스포네이트 약물은 생체이용률이 불량하여 공복에 물과 함께 복용해야 하며, 눕지 않은 자세와 음식 없이 최소 30분 이상 유지해야 하기 때문에 환자들에게 많은 불편을 야기한다. 부갑상선 호르몬 (PTH)은 또한 골 미네랄 밀도, 골 마커를 증가시키고 골절 위험을 줄이기 위해 고위험 골절이 있는 폐경기 후 골다공증의 치료에서 골화 촉진제로도 사용된다. 부갑상선 호르몬은 고위험 골절이 있는 남성의 원발성 또는 성선기능저하 골다공증에도 승인된다. 연구에 따르면 부갑상선 호르몬이 새로운 척추 사례를 65%-69%까지 줄일 수 있음이 확인되었다. 부갑상선 호르몬 유사체인 테리파라타이드 (teriparatide)는 현재 시판되고 있는 이러한 유형의 약물로서 골화 및 골 흡수를 자극하여 폐경기 후 여성의 골절 발생률을 감소시킬 수 있다. 투여 방식에 의존하여, 이것은 또한 골 미네랄 밀도를 증가시키거나 감소시킬 수 있다. 테리파라타이드의 일반적인 부작용은 메스꺼움, 사지 통증, 현기증 및 심한 현기증 (swirl)이다. 그러나, 골육종의 위험이 증가하는 경우 부갑상선 호르몬이 사용되지 말아야 하는 것은 당연하다. 아동, 비폐쇄형 골간단이 있는 환자, 종양 골 전이 또는 골 악성 종양이 있는 환자, 골다공증 이외의 대사성 골 질환이 있는 환자, 기존 고칼슘혈증 환자, 이전에 골방사선 요법을 받은 환자에게는 부갑상선 호르몬을 사용해서는 안 된다.
RANKL 억제제 약물, 예를 들어 데노수맙은 인간 유래된 IgG2 모노클로날 항체로서 RANKL과 특이적으로 결합하여 파골세포의 형성, 활성화 및 생존을 억제하여 골절의 발생률을 감소시킬 수 있다. 특정 RANKL 억제제로서 데노수맙은 골흡수 방지를 위한 새로운 기전을 개방한다. 베아우도인 (Beaudoin) 등은 12~24개월 치료 후 골절 위험 감소에 있어 데노수맙과 비스포스포네이트 간에 유의적인 차이가 없음을 발견하였다. 그러나, OPG/RANK/RANKL 신호전달 경로도 인간의 면역반응에 관여하기 때문에 이 경로의 억제제로서 면역질환을 유발할 위험성이 있을 수 있고 장기 적용에 대한 안전성에 대한 추가 연구가 필요하다.
또한, 부갑상선 호르몬 유사 호르몬 (PTHLH)이라고도 하는 부갑상선 호르몬 관련 단백질 (PTHrP)은 공통된 PTH/PTHrP 수용체에 대한 결합을 포함하여 PTH와 많은 생물학적 효과를 공유한다. 현재, 부갑상선 호르몬 관련 단백질 유사체 약물은 점차 골다공증 약물에 대한 새로운 연구 방향 중 하나가 되었다.
현재의 상황에 비추어 볼 때 골다공증의 치료는 큰 진전을 이루었지만 여전히 골 미네랄 밀도의 저하와 골다공증을 완전하고 지속적으로 보정하는 것은 불가능하다. 대부분의 골다공증 환자의 상태는 시기적절하고 효과적인 방법으로 조절되지 않고 있으며, 골다공증의 치료는 이상적인 목표에 도달하지 못하여 더 많은 연구가 필요하다. 현재, 골다공증의 치료와 골다공증성 골절의 치료 및 예방에 있어서, 더 나은 효능과 더 적은 부작용으로 골형성을 촉진하는 펩타이드 화합물의 지속적인 개발은 매우 의의가 있다.
발명의 개요
하나의 양상에서, 본 발명의 하나의 목적은 활성 폴리펩타이드 화합물을 제공하는 것이며, 본원 개시내용이 제공하는 활성 폴리펩타이드 화합물은 다중 표적 활성을 가지며, 동시에 다중 양상에서 조절 또는 치료의 역할을 할 수 있다.
본원 개시내용의 상기 목적을 실현하기 위해, 본원의 개시내용은 하기의 기술적 해결책을 채택한다.
본원의 개시내용은 첫번째로 활성화 폴리펩타이드 화합물을 제공하고, 상기 화합물은 하기의 화학식 Ia 또는 화학식 Ib로 나타낸 구조를 갖거나 이의 약제학적으로 허용되는 염이다:
[화학식 Ia ]
Y-ID-X
[화학식 Ib]
X-ID-Y
상기 식에서,
Y는 PTH/PTHrP 수용체 효능제 또는 파골세포 억제제이고;
ID는 분자 내 펩타이드 결합, 또는 X를 Y에 연결하는 링커이고;
X는 골형성 성장 펩타이드 수용체 효능제, 골수 중간엽 줄기 세포 자극제 또는 조혈 줄기 세포 자극제이다.
본원의 개시내용에서 활성 폴리펩타이드 화합물 Y-ID-X (Ia) 또는 X-ID-Y (Ib)에 대해, 한편으로는 일부 화합물이 상이한 활성 영역에서 상이한 생리학적 효과를 발휘함에 의해 전반적으로 이중-작용 활성을 발휘할 수 있고; 또 다른 한편으로는 일부 화합물의 분자 내 ID 구조는 체내에서 분해된다. ID가 펩타이드 결합인 경우, 이는 가수분해를 통해 절단되어 폴리펩타이드 Y (PTH/PTHrP 수용체 효능제 또는 파골세포 억제제로서) 및 폴리펩타이드 X (골형성 성장 펩타이드 수용체 효능제, 골수 중간엽 줄기 세포 자극제 또는 조혈 줄기 세포 자극제로서)를 형성하고, 이들은 각각 기능한다. 대안적으로, ID가 링커인 경우, ID는 또한 가수분해 또는 효소용해를 통해 활성 펩타이드 X 및 활성 펩타이드 Y를 방출할 수 있다. 본원의 개시내용에서, 활성 폴리펩타이드 화합물은 PTH/PTHrP 수용체와 결합하여 PTH/PTHrP 수용체를 자극하거나 파골세포를 억제하여 골화를 촉진시키고 골 미네랄 밀도를 증가시킬 수 있을 뿐만 아니라 골형성 성장 펩타이드 수용체를 자극하고 조혈 줄기 세포를 자극함에 의해 말초 혈액에서 유핵세포 수준 (예를 들어, 단핵 세포, 림프구 및 백혈구 세포)를 유지하는 역할을 수행할 수 있다.
일부 구현예에서, 본원의 개시내용의 활성 폴리펩타이드 화합물에서 Y는 M-CSF (콜로니-자극 인자-1로서도 공지된 대식세포 콜로니-자극 인자) 길항제, RANKL (핵 인자 κ B 리간드의 수용체 활성화인자) 억제제, RANKL 항체, MMP (매트릭스 메탈로프로테이나제) 억제제, 칼시토닌, 부갑상선 호르몬 또는 부갑상선 호르몬 관련 단백질이다.
일부 구현예에서, 본원 개시내용의 활성 폴리펩타이드 화합물 내 Y는 화학식 II에 나타낸 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 쇄:
[화학식 II]
A1-Val-Ser-Glu-His-Gln-Leu-A8-His-Asp-Lys-Gly-Lys-Ser-Ile-Gln-A17-Leu-Arg-Arg-Arg-A22-A23-Leu-A25-A26-Leu-A28-A29-A30-A31-His-Thr-Ala
상기 식에서,
A1은 Ala, Val, Leu 또는 Ile이고;
A8은 Leu 또는 Ile이고;
A17은 Asp 또는 Glu이고;
A22은 Glu, Asp 또는 Phe이고;
A23은 Leu, Ile 또는 Phe이고;
A25는 Glu, Asp 또는 His이고;
A26은 Lys, His 또는 Arg이고;
A28은 Leu, Ile 또는 Val이고;
A29는 Ala, (N-Me)Ala 또는 Aib이고;
A30은 Lys 또는 Glu이고;
A31은 Leu 또는 Ile이고;
펩타이드 쇄 Y의 아미노 말단은 유리되어 있거나 화학적으로 변형되고, 펩타이드 쇄 Y의 카복실 말단은 유리되어 있거나 화학적으로 변형되어 있다.
본원 개시내용의 특정 구현예에서, 본원 개시내용의 활성 폴리펩타이드 화합물에서, 펩타이드 쇄 Y 내 아미노산은 모두 L형 아미노산이다.
본원 개시내용의 일부 특정 구현예에서, 본원 개시내용의 활성 폴리펩타이드 화합물에서, Y는 하기의 서열번호 16-서열번호 22에 나타낸 바와 같은 구조를 갖는 폴리펩타이드 중 하나이다:
Figure pct00001
Figure pct00002
Figure pct00003
Figure pct00004
Figure pct00005
Figure pct00006
Figure pct00007
.
일부 구현예에서, 본원 개시내용의 활성 폴리펩타이드 화합물 내 X는 조혈 줄기 세포 자극제이고, 즉, X는 조혈 성장 인자, 혈소판 콜로니-자극 인자, 과립구 콜로니 자극 인자, 에리트로포이에틴, 인터류킨 3 (IL3) 또는 재조합 인간 인터류킨 11이다.
일부 구현예에서, 본원 개시내용의 활성 폴리펩타이드 화합물 내 X는 화학식 IIIa 또는 화학식 IIIb에 나타낸 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 쇄이다:
[화학식 IIIa]
Tyr-(Arg)m-(Gly)n-Phe-Gly-Gly
[화학식 IIIb]
Gly-Gly-Phe-(Gly)n-(Arg)m-Tyr
상기 식에서,
m 및 n은 독립적으로 0, 1 또는 2이고;
펩타이드 쇄 X의 아미노 말단은 유리되어 있거나 화학적으로 변형되고, 펩타이드 쇄 X의 카복실 말단은 유리되어 있거나 화학적으로 변형되어 있다.
일부 구현예에서, 본원 개시내용의 활성 폴리펩타이드 화합물 내 X는 5-6개 아미노산으로 이루어진 펩타이드 쇄이고, 이는 하기 서열번호 1-서열번호 8에 나타낸 바와 같은 아미노산 서열을 갖는다:
Figure pct00008
.
일부 구현예에서, 본원 개시내용의 활성 폴리펩타이드 화합물 내 ID는 X와 Y 사이의 링커이고; 상기 링커는 아미노-치환된 C1-8 알킬산, 폴리에틸렌 글리콜 중합체 쇄 또는 1-10개의 아미노산으로 이루어진 펩타이드 분절이고, 상기 펩타이드 분절 내 아미노산은 프롤린, 아르기닌, 알라닌, 트레오닌, 글루탐산, 아스파르트산, 라이신, 글루타민, 아스파라긴 또는 글라이신으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
본원 개시내용의 일부 특정 구현예에서, 링커는 하기의 링커 중 하나이다:
(1) (Gly-Ser)p, 여기서, p는 1, 2, 3, 4 또는 5이고;
(2) (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)t, 여기서, t는 1, 2 또는 3이고;
(3) Ala-Glu-Ala-Ala-Ala-Lys-Ala;
(4) 4-아미노부티르산 또는 6-아미노카프로산이고;
(5) (PEG)q, 여기서, q는 1, 2, 3, 4 또는 5이다.
일부 구현예에서, 본원의 개시내용에 따른 활성 폴리펩타이드 화합물은 화학식 IV에 나타낸 구조를 갖거나, 화학식 IV에 나타낸 화합물의 약제학적으로 허용되는 염이다:
[화학식 IV]
A1-Val-Ser-Glu-His-Gln-Leu-A8-His-Asp-Lys-Gly-Lys-Ser-Ile-Gln-A17-Leu-Arg-Arg-Arg-A22-A23-Leu-A25-A26-Leu-A28-A29-A30-A31-His-Thr-Ala-A35
상기 식에서,
A1은 Ala, Val, Leu 또는 Ile이고;
A8은 Leu 또는 Ile이고;
A17은 Asp 또는 Glu이고;
A22은 Glu, Asp 또는 Phe이고;
A23은 Leu, Ile 또는 Phe이고;
A25는 Glu, Asp 또는 His이고;
A26은 Lys, His 또는 Arg이고;
A28은 Leu, Ile 또는 Val이고;
A29는 Ala, (N-Me)Ala 또는 Aib이고;
A30은 Lys 또는 Glu이고;
A31은 Leu 또는 Ile이고;
A35는 화학식 IIIa 또는 IIIb에 나타낸 아미노산 서열의 펩타이드 쇄를 갖는다:
[화학식 IIIa]
Tyr-(Arg)m-(Gly)n-Phe-Gly-Gly
[화학식 IIIb]
Gly-Gly-Phe-(Gly)n-(Arg)m-Tyr
상기 식에서, m 및 n은 독립적으로 0, 1 또는 2이고;
A1로 나타낸 아미노산의 아미노 말단은 유리되어 있거나 화학적으로 변형되고, 펩타이드 쇄 A35의 카복실 말단은 유리되어 있거나 화학적으로 변형되어 있다.
일부 구현예에서, 본원 개시내용의 활성 폴리펩타이드 화합물에서, 펩타이드는 N-말단 (아미노 말단), C-말단 (카복실 말단) 또는 양 말단 상에서 변형될 수 있다. 아미노 말단의 화학적 변형은 아실화, 설포닐화, 알킬화 및 PEG 변형을 포함하고; 카복실 말단의 화학적 변형은 아미드화, 설포닐화 및 PEG 변형을 포함한다.
추가로, 아미노 말단의 화학적 변형은 아미노의 아세틸화, 벤조일화 또는 설포닐화이고; 아미노 말단의 알킬화는 C1-6 알킬화 또는 방향족 알킬화이고; 카복실 말단의 화학적 변형은 상기 카복실 내 OH가 NH2 또는 설파미드에 의해 치환되거나, 카복실 내 OH가 기능성화된 PEG 분자에 연결되어 있다는 것이다.
본원 개시내용의 일부 특이적 구현예에서, 화학식 Ia 또는 화학식 Ib에 나타낸 바와 같은 화합물은 하기의 서열번호 9-서열번호 15 중 하나의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염이다:
Figure pct00009
Figure pct00010
추가로, 본원 개시내용의 활성 폴리펩타이드 화합물은 추가로 폴리펩타이드 화합물의 아미노산의 측쇄 그룹을 화학적으로 변형시킴에 의해 수득된 화합물; 또는
배위 화합물, 폴리펩타이드 화합물 및 금속 이온에 의해 형성된 복합체 또는 킬레이트; 또는
상기 폴리펩타이드 화합물에 의해 형성된 수화물 또는 용매화물을 포함한다.
일부 구현예에서, 폴리펩타이드 화합물의 아미노산의 측쇄 그룹을 화학적으로 변형시킴에 의해 수득된 화합물은 상기 폴리펩타이드 화합물 또는 시스테인 또는 시스테인을 포함하는 펩타이드로부터 형성된 디설파이드 결합을 갖는 화합물 내 시스테인에서 설프하이드릴로부터 형성된 티오에테르 또는 티오글리코시드; 또는
상기 폴리펩타이드 화합물 내 티로신의 페놀 하이드록실 그룹으로부터 형성된 에스테르, 에테르 및 글리코시드; 또는
상기 폴리펩타이드 화합물 내 티로신 또는 페닐알라닌의 벤젠 환을 치환함에 의해 제조된 화합물이다.
본원 개시내용에 개시된 폴리펩타이드 화합물의 다른 변이체도 본원 개시내용의 범위에 포함된다는 점에서 유의해야 하며, 특히 단순히 보존된 아미노산을 대체함으로써 수득된 임의의 변이체를 포함한다.
본원 개시내용에 의해 제공된 활성 폴리펩타이드 화합물은 유리된 폴리펩타이드 또는 염의 형태로 존재할 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 염은 약제학적으로 허용되는 염이다.
용어 "약제학적으로 허용되는"은 물질 또는 조성물이 제제 중에 함유된 다른 성분 및/또는 치료받는 포유류와 화학적으로 및/또는 독성학적으로 상용성이어야만 함을 의미한다.
본원 개시내용에서, "약제학적으로 허용되는 염"은 통상의 화학적 방법에 의해 모계 화합물 및 알칼린 또는 산 부분에 의해 제조될 수 있다. 일반적으로 말해서, 상기 염은 상기 화합물의 유리된 산 형태를 화학양론적 양의 적합한 염기 (예를 들어, Na, Ca, Mg 또는 K의 수산화물, 탄산염, 중탄산염 등)와 반응시킴에 의해, 또는 상기 화합물의 유리된 염 형태를 화학양론적 양의 적합한 산, 이들 염과 반응시킴에 의해 제조될 수 있다. 상기 종류의 반응은 일반적으로 물, 유기 용매 또는 이의 혼합물에서 수행한다. 일반적으로, 적합한 조건하에서, 비-수성 매질, 예를 들어, 에틸 에테르, 에틸 아세테이트, 에탄올, 이소프로판올 또는 아세토니트릴이 사용될 필요가 있다. 염의 예는 유기산 (예를 들어, 아세트산, 트리플루오로아세트산, 락트산, 말레산, 시트르산, 말산, 아스코르브산, 숙신산, 벤조산, 메탄술폰산, 톨루엔술폰산 또는 파모산), 무기산 (예를 들어, 염산, 황산 또는 인산) 및 중합체산 (예를 들어, 탄닌산, 카르복시메틸 셀룰로스, 폴리락트산, 폴리글리콜산 또는 폴리락트산-글리콜산 공중합체)을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, 문헌 ("Remington's Pharmaceutical Sciences", the 20 th Edition, Mack Publishing Company, Easton, Pa., (1985); 및 (Handbook of Pharmaceutical Salts: Properties, Selection, and Use)" ,Stahl and Wermuth (Wiley-VCH, Weinheim, Germany, 2002)에서, 다른 적합한 염의 목록이 발견될 수 있다.
본원 개시내용에 의해 제공된 활성 폴리펩타이드 화합물은 구조물을 연결함에 의해 작제되고, 다중-표적 효과를 갖는 활성 폴리펩타이드에 속하고, 이들은 PTH/PTHrP 수용체를 자극하거나 파골세포를 억제할 수 있을 뿐만 아니라, 골형성 성장 펩타이드 수용체를 자극하거나, 골수 중간엽 줄기 세포를 자극하거나 조혈 줄기 세포를 자극할 수 있다. 본원 개시내용에 의해 제공된 활성 폴리펩타이드 화합물은 PTH/PTHrP 수용체를 자극한다. 한편, 활성 폴리펩타이드 화합물은 다중 세포주(예를 들어, 파골세포, 골 라이닝 세포, 골 세포 등)에 영향을 줌에 의해 AC-Camp-PKA 경로를 자극하고, 파골세포 활성을 증가시키고, 골 질량을 증가시키고, 골 미네랄 밀도를 증가시키고 골 강도등을 개선시키는 것과 같은 골화 (골 및 연골)를 촉진시키는 역할을 수행하고; 다른 한편으로, 본원 개시내용에 의해 제공된 폴리펩타이드 화합물은 골수 중간엽 줄기 세포에 대해 효과를 갖고, 파골세포로의 이의 분화를 촉진시키고, ALP의 활성을 증가시키고, I형 콜라겐, 오스테오칼신 및 Cbfα1 mRNA의 전사를 상향조절하고, 칼슘 염 침적 및 매트릭스 미네랄화를 촉진시키고, 골화를 촉진시키고, 골절 치유를 가속화하고, 골 미네랄 밀도 등을 증가시킴을 포함한다. 이것은 골수 조혈 줄기 세포에 작용하고, 파골세포 및 다른 골수 세포주를 상향조절함에 의해 골수의 조혈 미세환경을 개선시켜 조혈 자극 인자를 생성한다.
본원 개시내용의 약력학 활성 실험은 본원 개시내용에 의해 제공된 폴리펩타이드 화합물이 난소 제거된 골다공증 모델 래트의 요추 및 대퇴골의 골 미네랄 밀도를 유의적으로 증가시킬 수 있음을 입증한다. 본원 개시내용에서 활성 폴리펩타이드 화합물의 투여 그룹의 요추의 골 미네랄 밀도 및 대퇴골의 골 미네랄 밀도의 증가된 퍼센트는 양성 대조군 아발롭타이드 (abaloptide) 그룹의 것과 비교하였다. 아발롭타이드 투여 기간 동안, 단핵 세포, 림프구, 및 백혈구 세포와 같은 말초 유핵세포에 대한 유의적 억제효과가 있었으나, 본원 개시내용의 활성 폴리펩타이드 화합물은 말초 혈핵 유핵세포에 대한 부작용이 없어 본원 개시내용의 활성 폴리펩타이드 화합물이 투여 기간 동안 면역에 대한 영향을 피하면서, 아발롭타이드의 부작용을 극복함을 보여준다.
본원 개시내용의 약력학 활성 실험은 추가로 본원 개시내용의 활성 폴리펩타이드 화합물이 레티노산-유도된 골다공증 래트의 대퇴골의 최대 부하량을 증가시키고, 골의 미세구조를 개선시킬 수 있고, 구체적으로 골 표면적/골 용적 비율, 섬유주 수 (TbN) 및 섬유주 간격을 개선시킴을 포함하고, 상기 효과는 시판되는 약물 아발롭타이드보다 우수하고; 본원 개시내용의 활성 폴리펩타이드 화합물은 아발롭타이드에 의해 유발된 골수 억제의 부작용을 피할 수 있다.
이를 기반으로 하여, 본원의 개시내용은 추가로 본원 개시내용의 활성 폴리펩타이드 화합물을 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 임의로, 약제학적 조성물은 추가로 약제학적으로 허용되는 보조제, 부형제, 담체 및 이의 용매 중 적어도 하나를 포함한다.
일부 구현예에서, 본원 개시내용의 약제학적 조성물은 추가로 다른 치료학적 제제를 포함한다. 다른 치료학적 제제는 골 흡수를 억제하는 약물, 골화를 촉진시키는 약물, 골 미네랄화 또는 부갑상선 호르몬 관련 단백질을 촉진시키는 약물로부터 선택된다.
여기서, 골 흡수를 억제하는 약물은 칼시토닌, 디포스포네이트, 오에스트로겐, 선택적 오에스트로겐 수용체 조절제 및 이소플라본을 포함하고; 골화를 촉진시키는 약물은 플루오라이드, 합성된 스테로이드, 부갑상선 호르몬 및 부갑상선 호르몬 관련 단백질을 포함하고; 골 미네랄화를 촉진시키는 약물은 칼슘 제제, 비타민 D 및 활성 비타민 D를 포함하고; 부갑상선 호르몬 관련 단백질은 테리파라타이드 또는 아발롭타이드이다.
본원 개시내용에서, "약제학적으로 허용되는 보조제"는 투여 형태 또는 약제학적 조성물의 일관성과 관련된 약제학적으로 허용되는 물질, 혼합물 또는 용매를 의미한다. 각각의 보조제는 혼합될 때 약제학적 조성물의 다른 성분과 상용성이 있어야 본원에 개시된 활성 폴리펩타이드 화합물의 효능을 크게 감소시키는 상호작용 및 환자에게 투여될 때 약제학적으로 허용되지 않는 약제학적 조성물을 초래하는 상호작용을 피할 수 있다. 또한, 각 보조제는 예를 들어 충분히 높은 순도로 약제학적으로 허용 가능해야만 한다. 적합한 약제학적으로 허용되는 보조제는 선택된 특정 투여 형태에 따라 다양하다. 또한, 약제학적으로 허용되는 보조제는 조성물에서 이들의 특정 기능에 기초하여 선택될 수 있다. 예를 들어, 균일한 투여 형태의 생성을 용이하게 하는 일부 약제학적으로 허용되는 액세서리가 선택될 수 있다. 안정한 투여 형태의 생성을 용이하게 하는 특정 약제학적으로 허용되는 보조제가 선택될 수 있다. 신체의 하나의 기관 또는 신체 일부로부터 본원에 개시된 활성 폴리펩타이드 화합물을 환자에게 투여될때 신체의 또 다른 기관 또는 일부로 옮기거나 전달함을 용이하게 하는 특정 약제학적으로 허용되는 보조제가 선택될 수 있다. 환자 순응도를 증진시키는 특정 약제학적으로 허용되는 보조제가 선택될 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 보조제는 하기의 유형의 보조제를 포함한다: 희석제, 충전제, 결합제, 붕해제, 윤활제, 활택제, 과립화제, 코팅제, 습윤제, 용매, 공용매, 현탁제, 유화제, 감미료, 향미제, 맛 차폐제, 착색제, 고결 방지제, 습윤제, 킬레이트제, 가소제, 점착부여제, 산화방지제, 방부제, 안정화제, 계면활성제 및 완충제. 당업자는 특정 약제학적으로 허용되는 보조제가 제형에 얼마나 많은 보조제가 존재하는지 및 어떤 다른 보조제가 제형에 존재하는지에 따라 하나 초과의 기능을 제공하고 대안적인 기능을 제공할 수 있음을 인지할 것이다.
또 다른 양상에서, 본원의 개시내용은 추가로 골형성 결함 및 골 미네랄 밀도 감소와 관련된 질환 또는 장애를 예방하거나, 치료하거나 완화시키기 위한 약물의 제조에서 본원 개시내용의 활성 폴리펩타이드 화합물의 용도 및 약제학적 조성물의 용도를 제공하고, 상기 질환은 골다공증을 포함한다.
또 다른 양상에서, 본원 개시내용은 추가로 PTH/PTHrP 수용체 자극, 파골세포 억제, 골형성 성장 펩타이드 수용체 자극, 골수 중간엽 줄기 세포 또는 조혈 줄기 세포 자극에 사용되는 의약의 제조에서 본원 개시내용의 활성 폴리펩티드 화합물 및 약제학적 조성물의 용도를 추가로 제공한다.
본원 개시내용은 유효량의 본원 개시내용의 활성 폴리펩타이드 화합물 또는 약제학적 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 골형성 결함 또는 골 미네랄 밀도 감소와 관련된 질환 또는 장애를 예방하거나, 치료하거나 완화시키는 방법을 추가로 제공한다.
본원 개시내용의 약제학적 조성물은 대상체의 골화를 자극하기 위해 사용될 수 있다. 따라서 골다공증과 같은 골형성 결함과 관련된 질환 또는 장애를 치료하는 데 사용할 수 있다.
일부 구현예에서, 본원 개시내용은 대상체의 골다공증을 치료하는 방법에 관한 것이고, 상기 방법은 유효량의 본원 개시내용의 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
달리 명시되지 않는 한, 여기에서 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본원 개시가 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해된다. 본원 개시내용과 관련된 모든 특허 및 공보는 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.
본원의 개시내용에서 "아미노산"은 천연 및 인공 아미노산을 나타낸다. 20개의 천연 아미노산 (L-이성질체)은 3문자 코드 또는 대문자 하나의 문자 코드로 나타낸다. 특히 기재되지 않은 경우, 3문자 코드로 나타낸 아미노산은 비-키랄 글라이신을 제외한 L-이성체이다: 알라닌 ("Ala" 또는 "A"), 아르기닌 ("Arg" 또는 "R"), 아스파라긴("Asn" 또는 "N "), 아스파르트산 ("Asp" 또는 "D"), 시스테인 ("Cys" 또는 "C"), 글루타민 ("Gln" 또는 "Q"), 글루탐산 ("Glu" 또는 "E"), 글리신 ("Gly" 또는 "G"), 히스티딘("His" 또는 "H"), 이소류신 ("Ile" 또는 "I"), 류신 ("Leu" 또는 "L"), 라이신 ("Lys" 또는 " K"), 메티오닌 ("Met" 또는 "M"), 페닐알라닌 ("Phe" 또는 "F"), 프롤린 ("Pro" 또는 "P"), 세린 ("Ser" 또는 "S"), 트레오닌 ("Thr" 또는 "T"), 트립토판 ("Trp" 또는 "W"), 티로신 ("Tyr" 또는 "Y") 및 발린 ("Val" 또는 "V"). L-노르류신 및 L-노르발린은 각각 (NLeu) 및 (NVal)로 나타낼 수 있다.
19개의 천연 키랄 아미노산은 상응하는 D-이성체를 갖고, 본원 개시내용에서 접두사 "D-" 또는 소문자 1문자 코드를 갖는 3문자 코드로 나타낸다: D-알라닌 ("D-Ala" 또는 "a"), D-아르기닌 ("D-Arg" 또는 "r"), D-아스파라긴("D-Asn" 또는 "a"), D-아스파르트산 ("D-Asp" 또는 "d"), D-시스테인 ("D-Cys" 또는 "c"), D형 글루타민 ("D-Gln" 또는 "q"), D-글루탐산 ("D- Glu" 또는 "e"), D-히스티딘("D-His" 또는 "h"), D-이소류신 ("D-Ile" 또는 "i"), D-류신 ("D-Leu" 또는 "l "), D-라이신 ("D-Lys" 또는 "k"), D-메티오닌 ("D-Met" 또는 "m"), D-페닐알라닌 ("D-Phe" 또는 "f"), D- 프롤린 ("D-Pro" 또는 "p"), D-세린 ("D-Ser" 또는 "s"), D-트레오닌 ("D-Thr" 또는 "t"), D-트립토판 ("D- Trp" 또는 "w"), D-티로신 ("D-Tyr" 또는 "y") 및 D-발린 ("D-Val" 또는 "v").
"아미노산 잔기"는 일반적으로 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질 단량체 서브유닛을 나타내는 데 사용되고 "아미노산"은 일반적으로 유리된 분자를 나타내는 데 사용되지만 용어 "아미노산" 및 "아미노산 잔기"는 본원의 개시내용에서 상호교환적으로 사용된다.
2개의 아미노산은 모두 서로 연결되어 펩타이드 결합을 형성하고, 여러 아미노산은 서로 연결되어 다중 펩타이드 결합을 형성한다. 다중 아미노산이 상호 연결되어 형성된 다중 펩타이드 결합을 포함하는 쇄 구조는 "펩타이드 쇄" 또는 "펩타이드 분절"로 불리운다.
본원에 사용된 바와 같은 "펩타이드" 및 "폴리펩타이드"는 이들의 분자 크기와는 상관 없이 펩타이드 결합에 의해 연결된 아미노산 잔기 쇄로 구성된 중합체를 언급한다. 용어 "펩타이드" 및 "폴리펩타이드"는 본원 개시내용에서 상호교환적으로 사용된다.
달리 명시되지 않는 경우, 펩타이드 서열은 아미노 말단(N-말단)에서 카복실-말단(C-말단)의 순서로 주어진다.
PTH/PTHrP 수용체 효능제의 파골세포(또는 기질 세포 전구체)에 위치한 PTH/PTHrP 수용체는 내인성 천연 리간드 PTH 및 PTHrP(1-36)에 의해 활성화될 수 있는 G 단백질 커플링된 수용체 슈퍼패밀리의 구성원이다. 리간드는 PTH/PTHrP 수용체에 결합하고 세포에서 2개 신호 전달 경로를 활성화시킬 수 있다. 하나는 아데닐레이트 사이클라제/cAMP/Gs 관련 단백질 키나제 A이다. 다른 하나는 이노시톨 트리포스페이트/세포내 칼슘/Gq 관련 단백질 키나제 C 경로이다. PTH/PTHrP 수용체 효능제는 PTH/PTHrP 수용체에 결합할 수 있고 세포내 신호전달 경로를 활성화시킬 수 있는 물질을 언급하고, 예를 들어, 이에 제한되지 않지만 본원의 개시내용에 따른 펩타이드 쇄 Y, PTHrP(1-36), PTH(1-34), 테리파라티드 등이다.
파골세포 억제제: 파골세포(OC)는 골 흡수의 주요 기능 세포로 미네랄과 유기 골 기질의 용해에 관여한다. 파골세포 억제제는 파골세포의 형성 또는 활성을 억제하여 골 흡수를 차단할 수 있다. 파골세포 억제제는 파골세포 활성을 억제하고 아폽토시스를 가속화하는 비스포스포네이트 (BP) (예를 들어, 알렌드로네이트, 조메타, 피로포스페이트 유사체), M-CSF 길항제 (예를 들어, M-CSF 항체), RANKL 억제제 (예를 들어, RANKL 항체), 오스테오프로테게린 (OPG), 혈소판 유래 성장 인자 (PDGF) 및 기질 메탈로프로테이나제 (MMP) 억제제를 포함한다.
골형성 성장 펩타이드 수용체 효능제 (골형성 성장 펩타이드 수용체 활성화 인자)는 골형성 성장 펩타이드 수용체 신호전달 경로를 활성화시키고, 파골세포의 증식 및 분화를 촉진시키고, 골수 조혈 줄기 세포 및 골수 중간엽 줄기세포의 증식을 자극할 수 있는 물질을 언급하고, 조혈 줄기 세포의 자가-회복 능력을 유지하고 거핵구의 성장을 억제할 수 있다. 골형성 성장 펩타이드 수용체 효능제는 소분자 화합물 또는 폴리펩타이드 분자일 수 있다. 골형성 성장 펩타이드 수용체는 파골세포 상에 위치한 G 단백질 커플링된 수용체이다. 미토겐 활성화된 단백질 키나제 (MAPK), Src 및 RhoA 경로는 골형성 성장 펩타이드 수용체 효능제가 골형성 성장 펩타이드 수용체에 결합한 후에 활성화될 수 있다. MAP 경로의 활성화는 유사분열을 증가시키고 파골세포, 골수 조혈 줄기 세포 및 골수 중간엽 줄기 세포에 대한 유사분열 증식 효과를 갖고; Src 및 RhoA 경로의 활성화는 파골세포의 내인성 골형성 성장 펩타이드의 자가분비 발현을 조절하고 알칼린 포스파타제 분비를 촉진하고 I형 콜라겐, 오스테오칼신 및 Cbfα1 mRNA의 전사를 상향 조절하고, 칼슘 염 침적 및 기질 미네랄화를 촉진시킬 수 있고; 골형성을 촉진시키고, 골절 치유를 가속화하고, 골미네랄 밀도를 증가시킬 수 있다. 골형성 성장 펩타이드 수용체 효능제는 면역반응성 OGP, 구체적으로 유리된 OGP, OGP(10-14), 재조합 OGP 및 OCP-골형성 성장 펩타이드 결합 단백질 (OGPBP) 및 본원 개시내용의 화합물에서 펩타이드 쇄 X와 같은 유사한 활성을 갖는 천연 또는 인공 폴리펩타이드 화합물을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
골수 중간엽 줄기 세포 자극제: 골수 중간엽 줄기 세포는 또한 골수 기질 세포로도 공지되어 있다. 골수 중간엽 줄기 세포는 골수에서 조혈 줄기 세포(HSC)에 대한 기계적 지지를 갖고, 조혈을 지원하기 위해 조혈을 조절하는 다양한 세포 인자 (예를 들어, IL-6, IL-11, LIF, M-CSF 및 SCF 등)를 분비할 수 있다. 이들은 또한 분화 잠재력을 갖고, 파골세포, 섬유아세포, 망상적혈구, 지방세포 및 내피 세포로 분화할 수 있다. 골수 중간엽 줄기 세포 자극제는 골수 중간엽 줄기 세포를 자극하여 조혈 세포 인자를 분비하고 조절함으로써 조혈 기능을 촉진시키고/시키거나 골수 중간엽 줄기 세포를 유도하여 증식 및 분화를 유도할 수 있는 물질을 언급한다. 골수 중간엽 성장 줄기 세포 자극제는 면역반응성 OGP, 구체적으로 유리된 OGP, OGP(10-14), 재조합 OGP 및 OCP-골형성 성장 펩타이드 결합 단백질 (OGPBP) 및 본원 개시내용의 화합물에서 펩타이드 쇄 X와 같은 유사한 활성을 갖는 천연 또는 인공 폴리펩타이드 화합물을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
조혈 줄기 세포 자극제: 조혈 줄기 세포(HSC)는 자가 재생 능력을 갖고 모든 혈액 세포 또는 면역 세포로 분화할 수 있는 세포 그룹이다. 조혈 줄기 세포는 골수, 말초혈액 및 제대혈에서 얻을 수 있다. 조혈 줄기 세포를 자극하여 조혈을 촉진할 수 있는 활성 물질은 조혈 줄기 세포 자극제로 불리운다. 본원 개시내용의 조혈 줄기 세포 자극제는 조혈 성장 인자 (HGF), 혈소판 콜로니 자극 인자, 과립구 콜로니 자극 인자 (G-CSF), 에리트로포이에틴 (EPO), 인터류킨 3 (IL3), 재조합 인간 인터류킨 11 (IL11), TAT-H0XB4H 재조합 단백질, 및 본원 개시내용의 화합물에서의 펩타이드 쇄 X를 포함한다. 조혈 줄기 세포 자극제는 조혈 줄기 세포의 증식을 촉진하고 백혈구, 적혈구, 혈소판 등과 같은 혈액 세포의 감소를 보완한다.
본원에 사용되는 용어 "링커"는 이것이 펩타이드 쇄 X와 펩타이드 쇄 Y의 생리학적 활성에 영향을 미치지 않는 한, 폴리펩타이드 단편 X와 폴리펩타이드 단편 Y를 연결하기 위한 연결 단편이다. 이의 길이와 구조에는 어떠한 제한이 없다. 링커는 2개의 펩타이드 분절을 위한 특정 공간을 제공할 수 있어 펩타이드 분절이 서로 간섭하지 않고 올바르게 폴딩되도록 하는 경향이 있다. 링커는 또한 두 펩타이드 분절 간의 상호작용을 위한 더 많은 가능성을 제공하고 이들 간에 상승작용을 촉진한다. 링커는 소수성 링커, 가요성 친수성 링커, 및 펩타이드 단편 링커를 포함한다. 본원 개시내용에서 소수성 링커는 주로 아미노-치환된 C1-8 알킬산, 예를 들어, 4-아미노부티르산 또는 6-아미노헥산산이고; 친수성 링커는 일반적으로 (PEG)q와 같은 PEG 중합체 쇄이고, 여기서 q는 1, 2, 3, 4 또는 5이고; 펩타이드 단편 링커는 1 내지 10개의 아미노산으로 구성된 펩타이드 단편이다. 제조 용이성의 관점에서, 링커는 1 내지 10개의 아미노산 길이를 포함하는 폴리펩타이드 단편으로 효소 분해 부위를 포함한다. 일부 구현예에서, 링커는 2-8개 아미노산 길이의 단편이고; 일부 다른 구현예에서, 링커는 2-7개 아미노산 길이의 단편이다. 본원 개시내용의 구현에서, 상기 링커를 구성하는 아미노산은 프롤린, 아르기닌, 페닐알라닌, 트레오닌, 글루탐산, 아스파라긴, 라이신, 글루타민, 아스파라긴 및 글라이신으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 본원 개시내용의 실제 예에서, 링커 m은 (1) (Gly-Ser)p (여기서, p는 1, 2, 3, 4 또는 5이다); (2) (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)t (여기서, t는 1, 2 또는 3이다); 또는 (3) Ala-Glu-Ala-Ala-Ala-Lys-Ala이다. 보다 구체적으로, 링커는 Gly-L-Ser-Gly, (Gly-L-Ser)2, (Gly-L-Ser)3, 또는 L-Ser-Gly-Gly-L-Ser-Gly-Gly-L-Ser이다. 링커는 펩타이드 쇄의 2개 부분을 분리하여 서로 간의 입체 장애 효과를 감소시키며, 링커는 생체 내에서 가수분해될 수 있어 펩타이드 분절의 각각의 활성 효과에 이롭다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "화학적 변형" 또는 "캡핑"은 상호교환적으로 사용되며, 공유 변형을 통해 화합물의 한쪽 또는 양쪽 말단에 보호 그룹을 도입하는 것을 나타낸다. 적합한 보호 그룹은 펩타이드의 생물학적 활성을 감소시키지 않으면서 펩타이드 말단을 캡핑하는 작용을 한다. 화학적 변형은 화합물의 아미노 또는 카복시 말단 또는 티올 함유 아미노산을 포함하는 둘 다의 임의의 잔기에 있을 수 있다.
펩타이드 치료학적 제제는 펩티다제에 의한 공격에 민감할 수 있다. 엑소펩티다제는 일반적으로 펩타이드 또는 단백질의 아미노 또는 카복시 말단으로부터 아미노산 잔기를 절단하는 비특이적 효소이다. 아미노산 서열 내에서 절단하는 엔도펩티다제는 또한 비특이적일 수 있으나; 엔도펩티다아제는 일반적으로 특정 아미노산 서열(인지 부위)을 인지하고 그 부위 또는 그 근처에서 펩타이드를 절단한다. 따라서 화합물에 대한 변형은 상기 화합물을 단백질용해 분해로부터 보호하기 위해 고려된다. 단백질용해 분해로부터 펩타이드를 보호하는 한 가지 방법은 펩타이드의 아미노 및/또는 카복실 말단의 화학적 변형 또는 "캡핑"을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 펩타이드의 N-말단 및 C-말단은 유리된 것일 수 있다. C-말단이 유리된 경우, 어떠한 치환체도 첨가되지 않거나 "-OH"로 나타낸다. C-말단이 유리된 경우, 어떠한 치환체도 첨가되지 않거나 "H"로 나타낸다. 다른 구현예에서, 본원 개시내용의 펩티드 분절은 화학적으로 변형될 수 있다.
일부 보다 구체적인 구현예에서, N-아세틸 펩타이드 (본원 개시내용의 구조 또는 화학식에서 "Ac-"로 표현됨)는 화합물의 아미노 말단의 화학적 변형의 아세틸화에 의해 생성된다. 다른 구현예에서, 1차 카복스아미드 (본원 개시내용의 펩타이드 서열, 구조 또는 화학식에서 "-NH2"로 나타냄)는 펩타이드의 카복실 말단을 아미드화에 적용함에 의해 C-말단에서 생성될 수 있다. 일부 구현예에서, 아미노- 및 카복시-말단은 각각 아세틸화 및 아미드화에 의해 화학적으로 변형된다. 그러나, 다른 캡핑 그룹이 가능하다. 예를 들어, 아미노 말단은 아세틸, 벤조일 등과 같은 그룹으로 아실화에 의해 캡핑되거나 아세틸로 캡핑된 β-알라닌과 같은 천연 또는 비천연 아미노산을 사용하여 캡핑되거나 벤질 또는 부틸과 같은 그룹으로 알킬화함에 의해 캡핑되거나 설포닐화에 의해 캡핑되어 설폰아미드를 형성할 수 있다. 유사하게, 카복시 말단은 에스테르화되거나 2차 아미드 및 아실설폰아미드 등으로 전환될 수 있다. 일부 구현예에서, 아미노- 또는 카복시-말단은 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 모이어티를 연결하기 위한 부위를 포함할 수 있고, 즉 아미노 또는 카복시-말단은 적합한 기능성화된 PEG와의 반응에 의해 화학적으로 변형될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 "치료"는 예방학적 및 치료학적 치료를 포함할 수 있다. 예를 들어, 치료학적 치료는 골다공증의 발병을 지연, 억제 또는 예방하고, 골다공증과 연관된 증상을 감소 또는 제거하는 것을 포함할 수 있다. 예방적 치료는 골다공증의 발생을 예방, 억제 또는 지연시키는 것을 포함할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 "치료학적 유효량"은 목적하는 반응을 유발하기에 충분한 용량을 언급한다. 본원 개시내용에서, 예상되는 생물학적 반응은 상기 대상체에서 골 손실률의 감소 및/또는 골량 및 골 미네랄 밀도의 증가이다.
본원 개시내용에 따른 골다공증은 다중 원인에 의해 유발되는 골질환의 그룹이다. 골 조직의 정상적인 석회화, 칼슘염과 기질의 정상적인 비율을 갖고, 단위 용적당 골 조직 용적이 감소하는 것을 특징으로 하는 대사성 골 질환이다. 골다공증은 원인에 따라 특발성(1차) 골다공증과 2차 골다공증으로 분류될 수 있다. 여기서, 1차 골다공증은 청소년 성인 골다공증, 폐경기 골다공증 및 노인성 골다공증을 포함한다. 2차 골다공증의 원인은 다음을 포함한다: ① 내분비 코르티솔 증가, 갑상선기능항진증, 1차 부갑상샘기능항진증, 말단비대증, 성선기능저하증, 당뇨병 등; ② 임신, 모유 수유; ③ 영양 단백질 결핍, 비타민 C 및 D 결핍, 저칼슘 식이, 알코올 중독 등; ④ 유전된 골형성 불완전 염색체 이상; ⑤ 간 질환; ⑥ 신장질환, 만성신염, 혈액투석; ⑦ 약물 코르티코스테로이드, 항간질 약물, 항종양 약물(예를 들어, 메토트렉세이트), 헤파린 등; ⑧ 장기간의 침상안정, 하반신마비, 우주비행 등 후 대상체에서 흔히 발견되며 골절, 수덱(Sudeck) 위축증, 손상 후 골 위축 등 후 국부적으로 발견되는 퇴행성 전신성 골다공증; ⑨ 위장관 흡수장애 위절제술; ⑩ 류마티스 관절염.
상기 언급된 질환 또는 장애를 치료하기 위한 본원 개시내용에서 활성 폴리펩타이드 화합물의 용량은 투여 방식, 대상체의 연령 및 체중, 및 치료될 대상체의 건강 상태에 따라 상이하고, 궁극적으로 의사 또는 수의사가 결정한다. 골다공증과 같은 골 성장 결함 등과 관련된 질환 또는 장애의 치료를 위해 상기 일반식으로 포함되는 펩타이드를 사용하는 것 또한 본원 개시내용의 범위 내에 있는 것으로 간주된다.
본원에 개시된 활성 폴리펩타이드 화합물은 일반적으로 목적하는 경로로 환자에게 투여하기에 적합한 투여 형태로 제형화된다. 치료학적 유효량의 본원 개시내용의 펩타이드 및 약제학적으로 허용되는 담체(예를 들어, 탄산마그네슘, 락토스, 또는 치료학적 화합물이 콜로이드성 분자를 형성하게 하는 인지질)는 조합되어 대상체에게 투여될 (경구, 정맥내, 경피, 폐내, 질내, 피하, 비강내, 이온삼투법 또는 경기관에 의해) 치료학적 조성물(예를 들어, 환제, 정제 , 캡슐 또는 액체)을 형성한다. 경구 투여용 환제, 정제 또는 캡슐은 활성 조성물이 분해되는 것을 방지하고 소장으로 진입하기에 충분한 기간 동안 위에서 위산 또는 장내 효소로부터 활성 조성물을 보호하는 보호 물질로 코팅될 수 있다. 치료학적 조성물은 또한 피하 또는 근육내 투여를 위한 생분해성 또는 비-생분해성 지속 방출 제제의 형태로 있을 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 제3,773,919호, 미국 특허 제4,767,628호 및 PCT 출원 WO 94/15587을 참조한다. 연속 투여는 또한 이식가능하거나 외부 펌프 (예를 들어, INFUSADOTM 펌프)로 달성될 수 있다. 투여는 1일 1회와 같이 주기적으로, 또는 지속 방출 제형과 같이 낮은 투여량으로 연속적으로 수행될 수 있다. 본원 개시내용에 따른 약제학적 조성물의 투여 경로는 다음을 포함하지만 이에 제한되지 않는다: 피하 주사, 피하 지속성 제제, 정맥내 주사, 정맥내 또는 피하 주입, 안내 주사, 피내 주사, 근육내 주사, 복강내 주사, 기관내 투여, 지질내 투여, 동맥내 투여, 척추강내 투여, 경막외 투여, 흡입, 비강내 투여, 설하 투여, 협측 투여, 직장 투여, 질 투여, 두개내 및 국소 투여, 경피 투여 또는 국소 전달(예를 들어, 카테터 또는 스텐트). 신체로의 약물의 경피 전달은 생물학적 활성 물질을 대상체에게 전신 전달하기 위한 바람직하고 간편한 방법이며, 특히 경구 생체이용률이 불량한 물질 (예를 들어, 단백질 및 펩타이드)을 전달하기 위한 방법이다. 화합물은 경피 전달 경로를 통해 피부의 외부 각질층에 침투할 수 있으며, 이는 물질이 신체에 진입하는 효과적인 장벽으로서 작용한다. 각질층 아래에는 혈관을 포함하지 않지만 약간의 신경을 갖는 생기 있는 표피가 있다. 보다 더 깊은 곳에 진피는 혈관, 림프계 및 신경을 포함한다. 각질층 장벽을 가로지르는 약물은 일반적으로 흡수 및 전신 분포를 위해 진피의 모세관으로 확산될 수 있다.
용어 "피내"는 본원에 기재된 치료 방법에서 활성 폴리펩타이드 화합물의 치료학적 유효량이 피부에 적용되어 화합물을 각질층 아래의 피부층에 전달함으로써 목적하는 치료학적 효과를 달성함을 의미한다. 용어 "피하"는 본원에 기재된 치료 방법에서 활성 폴리펩타이드 화합물의 치료학적 유효량이 피부에 적용되어 화합물을 각질층 아래의 피하 조직에 전달함으로써 목적하는 치료학적 효과를 달성함을 의미한다.
본원에 기재된 활성 폴리펩타이드 화합물은 별개의 활성제로서 투여될 수 있거나, 동일하거나 유사한 치료학적 활성을 갖고 이러한 조합 투여에 대해 안전하고 효과적인 것으로 결정된 다른 화합물을 비롯한 다른 치료학적 제제와 조합하여 투여될 수 있다. 하나의 양상에서, 본원 개시내용은 본원에 개시된 활성 폴리펩타이드 화합물 및 하나 이상의 치료학적 활성제를 포함하는 안전하고 유효량의 조합 약물을 투여하는 것을 포함하는, 질환 또는 장애를 치료, 예방 또는 개선하는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 조합 약물은 1종 또는 2종의 다른 치료학적 제제를 포함한다. 다른 치료학적 제제는 골 흡수를 억제하는 약물, 골화를 촉진시키는 약물, 골 미네랄화 또는 부갑상선 호르몬 관련 단백질을 촉진시키는 약물로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
조합 용법에서 사용되는 치료요법(치료 또는 절차)의 특정 조합은 목적하는 치료 및/또는 절차의 상용성과 성취하기 위한 목적하는 치료학적 효과를 고려해야 한다. 본원에 정의된 바와 같은 조합 치료요법은 치료요법의 개별 성분들을 동시에, 순차적으로 또는 별도로 투여함에 의해 성취될 수 있다.
본원의 개시내용의 각각의 펩타이드는 대상체 (다른 말로 환자와 같은 포유류)에서 골 성장을 자극할 수 있다. 따라서 단독으로 투여하거나 골흡수를 억제하는 약물, 골형성을 촉진시키는 약물, 골 미네랄화를 촉진시키는 약물 또는 부갑상선 호르몬 관련 단백질과 조합 투여하는 경우, 펩타이드는 골다공증 및 골절을 치료하는데 효과적이다. 본원의 개시내용에 따른 활성 폴리펩타이드 화합물이 유사한 효과를 갖는 이들 치료학적 제제와 함께 사용되는 경우, 순차적으로 적용하는 것이 골 미네랄 밀도를 개선시키기 위해 보다 유리하다.
이하, 본원 개시내용의 구현예 또는 당업계에 있어서의 기술적 해결방안을 보다 명확하게 설명하기 위하여 실시예의 기재 또는 당업계에 사용된 도면을 간략히 소개한다.
도 1은 대조군 그룹, 모델 그룹, 아발롭타이드 그룹(Aba 그룹), 실시예 1의 20 μg/kg 용량 그룹, 실시예 2의 20 μg/kg 용량 그룹 및 실시예 5의 20μg/kg 용량 그룹에서 대퇴골의 활차의 마이크론 X선 3D 이미지화 시스템에 의해 스캔된 도면을 나타낸다.
이하, 본원의 개시내용은 구체적인 실시예를 참조로 더욱 상세하게 기재될 것이지만, 본원 개시내용의 구현예는 이에 제한되지 않는다. 본원의 개시내용의 구현예는 단지 본원의 개시내용을 설명하기 위한 것으로, 본원의 개시내용을 제한하는 것이 아니다. 따라서, 본원의 개시내용 방법의 전제하에 본원 개시내용에 대한 어떠한 개선도 본원 개시내용의 보호 범위에 속한다. 일반적으로, 본원 개시내용의 화합물은 본원 개시내용에 기재된 방법에 의해 제조될 수 있다. 당업자는 또한 널리 공지된 방법을 사용하여 본원 개시내용에 기재된 구조를 갖는 폴리펩타이드 화합물을 생성하기 위해 순차적 또는 상이한 합성 단계를 선택할 수 있다. 하기 반응식 및 실시예는 본원 개시내용의 내용을 추가로 예시하기 위해 제공된다.
당업자는 본원 개시내용에 기재된 폴리펩타이드 화합물이 고체상 합성(SPPS), 액체상 합성 및 효소적 합성에 의해 제조될 수 있음을 인지할 것이다. 상이한 제조 방법에 의해 제조된 본원 개시내용의 폴리펩타이드 화합물은 모두 본원 개시내용의 범위에 속한다. 예를 들어, 펩타이드 화합물은 일반적으로 고체상 합성에 의해 제조된다. 고체상 합성은 예를 들어, 통상적인 폴리스티렌- 디비닐벤젠 가교결합된 수지, 폴리아크릴아미드, 폴리에틸렌-글리콜 수지 등으로부터 선택될 수 있다: 왕(Wang) 수지, Fmoc-Pro-CTC, 링크 아미드 링커 MBHA 수지 등. 상이한 연결 서열에 따라, 적당한 수지가 선택된다. 예를 들어, 카복실-말단 아미노산의 카복실 그룹은 먼저 중합체 고체상 담체에 공유 결합될 수 있다. Α-아미노 그룹의 보호 그룹은 또한 Fmoc, Boc 또는 Z일 수 있다. C-말단에서 N-말단까지 아미노산은 특정 서열에 따라 탈보호, 축합, 재-탈보호 및 축합의 반복적인 과정에 적용되어 보호 그룹을 갖는 펩타이드 쇄 수지를 제공하고, 이는 수지 제거 및 탈보호 단계에 적용하여 요구되는 펩타이드 쇄를 수득한다. 아미노-말단 상의 아미노산의 아미노는 또한 중합체 고체상 담체에 공유 결합될 수 있다. 역 합성에 의해, N-말단에서 C-말단까지 아미노산은 특정 서열에 따라 탈보호, 축합, 재-탈보호 및 축합의 반복적인 과정에 적용되어 보호 그룹을 갖는 펩타이드 쇄 수지를 제공하고, 이는 수지 제거 및 탈보호 단계에 적용하여 요구되는 펩타이드 쇄를 수득한다. 상이한 종류의 수지를 사용함에 의해 수득된 펩타이드 쇄의 말단은 상이할 수 있다. 예를 들어, 왕 수지에 의해 제조된 펩타이드 분절은 유리된 카복실 말단을 갖는다. 유사하게, 링크-AM 아미노 수지가 고체상으로 사용되는 경우, NH2 변형된 카복실 말단을 갖는 펩타이드 분절이 수득된다.
펩타이드 화합물 합성을 위해 요구되는 아미노산 원료 물질은 제조원 (GL Biochemical (Shanghai) Co., Ltd.)으로부터 구입하고; 고체상 합성 수지는 제조원 (Xi' an Sunresin Technology New Material Co., Ltd.)으로부터 구입하고; 사용되는 아미노산 축합 촉매 TBTU 및 DIEA는 제조원 (Suzhou Highfine Biotechnology Co., Ltd.)으로부터 구입하였다. HPLC의 제조에 사용되는 용출물은 크로마토그래피 등급이다. 시약은 제조원 (Aldrich Chemical Company, Arco Chemical Company 및 Alfa Chemical Company)과 같은 상업적 공급업체에서 구입했으며 달리 명시되지 않는 한 추가 정제 없이 사용하였다. 사용되는 분석 및 검출 장비는 상기 분야에서 통상적인 기구 및 장비이다. 아래 기재된 실시예에서 달리 명시되지 않는 한 모든 온도는 섭씨로 설정되고 주어진 온도는 ±5℃의 변동 범위를 가질 수 있다.
펩타이드 화합물의 구조를 동정하는 경우, QE 동정, 단백질의 N-말단 분석 (질량 분광측정에 의한) 및 폴리펩타이드 단백질의 N-말단 서열 분석을 이용하여 1차 구조를 확인하였고, 원형 이색성 스캐닝 분석을 이용하여 2차 구조를 확인하였다.
본원 개시내용의 실시예에서, 폴리펩타이드 화합물의 환형 이색성 스캐닝 분석을 Chirascan Plus V100 환형 이색성 분광측정기 (British Applied Optics)로 수행하여 원자외선 (190-260 nm) 및 근자외선 (250-340 nm) 영역에서 단백질 시험 생성물의 환형 이색성 (CD) 흡수 스펙트럼을 수거하고 소프트웨어로 2차 구조를 분석한다. 구체적 측정에서 기본 시험 (background test)과 블랭크 완충액 시험을 위해 180~340 nm의 스캐닝 파장을 설정하고 이어서, 180~340 nm의 범위에서 1mg/mL CSA 표준용액의 환형 이색성 원근 자외선 흡광도를 수집하였다. 스캔된 모든 스펙트럼은 소프트웨어 프로-데이터 뷰어 (Pro-Data Viewer)로 기준선 및 평활화 처리를 공제하기 위해 적용하였다. 표준 샘플의 피크와 밸리 (valley) CD 값의 비율을 계산하였고, 유효 비율 범위는 2.08±0.06이다. CDNN 소프트웨어를 사용하여 시험 샘플의 2차 구조에 피팅하고 Milli-Degress 모드에서 상이한 파장 간격에서 나선, 역평행+평행, 베타 회전 및 랜덤 코일의 비율을 계산하였다.
본원 개시내용의 실시예에서 폴리펩타이드 화합물의 QE 동정에서는 단백질 폴리펩타이드를 엔도뉴클레아제 (일반적으로 트립신)를 사용한 효소용해에 적용하고 이어서, LC/MS/MS (nanoLC-QE)를 이용하여 효소용해 후 샘플을 분석하였다. 마지막으로 MASCOT와 같은 질량 분광측정 소프트웨어를 사용하여 LC/MS/MS 데이터를 분석하여 표적 단백질 및 펩타이드 분자의 정성적 동정 정보를 수득하였다. 특이적 측정에서, 시험 생성물이 감소되고 알킬화된 후, 트립신 (1:50의 질량비로)을 첨가하고 효소용해는 20시간 동안 37℃에서 수행하였다. 효소용해 생성물은 탈염시키고, 동결건조시키고, 0.1% FA 용액에 재용해시켜 사용할 때까지 -20℃에서 저장하였다. Q Exactive (Thermo Fisher)와 Easy-nLC 1000(Thermo Fisher)을 사용하였다. 폴리펩타이드 및 폴리펩타이드 단편의 질량 대 전하 비율은 다음과 같이 수집되었다: 20개의 단편 스펙트럼 (MS2 스캔)은 각 전체 스캔 후에 수집되었다. 질량 분광측정 시험의 미가공 파일을 사용하여 Mascot2.2 소프트웨어로 상응하는 데이터베이스를 검색하여 최종적으로 동정된 단백질 결과를 수득하였다.
본원 개시내용의 실시예에서, 폴리펩타이드 화합물의 단백질 N-말단 서열 분석 (질량 분광측정에 의한)의 실험 방법은: 단백질을 트립신, 키모트립신 및 Glu-C 효소로 각각 효소용해에 적용시키고 이어서, LC-MS/MS (Xevo G2-XS QTof，Waters)을 사용하여 효소용해 후 펩타이드 분절 샘플을 분석함에 의해 수행하였다. 효소용해 방법: 시험 생성물 50 μg을 적당량의 구아니딘 염산염에 용해시켜 변성시키고 이어서, DTT와 IAM 반응 후 디설파이드 결합을 환원시켜 알킬화 변형에 의해 보호하고 트립신 1 μg, 키모트립신 1 μg, Glu-C 효소 1 μg을 희석 후 첨가하고, 37℃에서 20시간 동안 반응시켰다. 마지막으로 UNIFI 소프트웨어를 사용하여 LC-MS/MS 데이터를 분석하였고, 알고리즘 결과를 기준으로 시험 생성물의 N-말단 아미노산 서열이 이론적인 서열과 일치하는지의 여부를 결정하였다. 특정 측정을 위해 기구는 (1) 고분해능 질량 분광측정기: XevoG2-XS QTof (Waters) 및 (2) 초고성능 액체 크로마토그래피: UPLC (Acquity UPLC I-Class)(Waters)였다.
본원 개시내용의 실시예에서 폴리펩타이드 화합물의 폴리펩타이드 단백질의 N-말단 서열 분석은 시험 생성물의 N-말단 서열을 전자동 단백질 펩타이드 서열분석기에 의해 분석하여 수행하였다. 본원 개시내용의 실시예에서는 PPSQ 전자동 단백질 펩타이드 서열분석기 (SHIMADZU)를 사용하였다. 샘플 이름, 샘플 번호, 시험 주기 수 및 방법 파일 선택은 소프트웨어 PPSQ 분석으로 설정되었으며 설정이 완료된 후 시험을 개시하였다. 데이터 및 아틀라스 처리: PPSQ에 의해 생성된 미가공 데이터 및 스펙트럼이 동정되었고 PPSQ 데이터 처리 소프트웨어로 피크가 표시되고 해당 스펙트럼이 유래되었다.
본원 개시내용의 실시예에서, 폴리펩타이드 화합물의 예비 구조는 질량 분광측정에 의해 결정되었다. ABSciex 5800 MALDI-TOF/TOF를 이용하여 고분해능 질량 분광측정기를 수행하여 단백질의 상대적 분자량을 시험하고, 폴리펩타이드의 정확하고 신뢰할만한 상대적 분자량 정보를 수득하였다.
하기의 약어는 본원 개시내용 전반에 걸쳐 사용한다:
Boc: 3급-부톡시카보닐
DIEA: 디이소프로필에틸아민
DCM: 디클로로메탄
CH3CN: 아세토니트릴
DCM: 디클로로메탄
DMF: N,N-디메틸포름아미드
DEPBT: 3-(디에톡시 오르토아실록시) -1,2,3-벤조트리아진-4-온
DIEA: 디이소프로필에틸아민
Et2O: 에틸 에테르
EDT: 에틸렌 디티올
Fmoc: 9H-플루오렌-9-일메톡시카보닐
H2O: 물
HBTU: 2-(1H-벤조트리아졸-1-일-)-1,1,3,3-테트라메틸우레아 헥사플루오로포스페이트
NMP: 1-메틸-피롤리딘-2-온
Ot-Bu: 3급-부톡시
PyBOP: 1H-벤조트리아졸-1-일옥시트리피롤리디닐 헥사플루오로포스페이트
Pbf: 2,2,4,6,7-펜타메틸벤조디하이드로푸란-5-설포닐
t-Bu: 3급-부틸
Trt: 트리틸
TIS: 트리이소프로필 실란
T3P: 1-프로필 포스포릭 무수물
TFA: 트리플루오로아세트산
Trt: 트리틸
r.t: 실온
TA: 티오아니솔
제조예
하기 특정 실시예에서, 본원 개시내용의 펩타이드는 표준 고체상 합성 방법에 의해 제조될 수 있다. 상기 제조 과정은 이하에서 상세히 설명한다. 본원 개시내용의 다른 펩타이드는 당업자에 의해 유사한 방법에 의해 제조될 수 있다.
실시예 1: Ala-Val-Ser-Glu-His-Gln-Leu-Leu-His-Asp-Lys-Gly-Lys-Ser-Ile-Gln-Asp-Leu-Arg-Arg-Arg-Glu-Leu-Leu-Glu-Lys-Leu-Leu-(N-Me)Ala-Lys-Leu-His-Thr-Ala-Tyr-Gly-Phe-Gly-Gly (서열번호 9로서 나타낸 폴리펩타이드 서열)의 제조
상기 예는 C 말단에서 N 말단으로 합성하였다.
(1-1) 수지의 전처리: 30 g 2-CTA 수지 (치환 정도 0.93 mmol/g, 27 mmol)는 칭량하고 250 mL의 시험 튜브에 위치시켰다. 수지는 30분 동안 180 mL의 DCM으로 팽윤시켰다. 용매를 진공 펌핑 제거하였다. 이어서, DCM (100 mL)은 상기에 첨가하고, 질소를 도입하고 온도가 25℃에 도달할때까지 가열하였다. SOCl2 (10 mL, 5.0 당량)는 적가하고, 온도는 30-35℃에서 유지시키고, 2시간 동안 반응시켰다. 반응을 완결한 후, 질소를 가압하여 도입하고 용매를 진공 펌핑 제거하였다. DCM (100 mL×3)은 수지를 세척하기 위해 첨가하였고, 용매는 세척 후 매번 펌핑 제거하였다.
(1-2) S1 아미노산 연결: Fmoc-Gly-OH (32.5 g, 108 mmol)를 칭량하고 100 mL DCM에 용해시켰다. 완전히 용해시킨 후, DIEA (23 mL, 135 mmol)를 첨가하였다. 수득된 혼합물을 시험 튜브에 넣고, 질소를 도입하고 혼합물을 교반하고 2시간 동안 20℃-30℃에서 반응시켰다. 메탄올 및 DIEA의 혼합 용매 (메탄올: DIEA = 9:1) 12 mL를 적가하여 10분 동안 반응되지 않은 부위를 밀봉시켰다.용매를 펌핑 제거하였다. 수지는 DCM (150 mL×2)으로 세척하였다. 세척 후, 용매는 펌핑 제거하였다. 이어서, DMF (150 mL×2)를 사용하여 수지를 세척하고, 용매는 세척 후 펌핑 제거하였다. 이어서, 수지는 30분 동안 120 mL의 DMF로 팽윤시켰다. 용매는 펌핑 제거하고 탈보호는 2회 동안 20%의 용적 비를 갖는 피페리딘/DMF 용액 (120 mL)으로 수행하였다. 시간은 각각 10분 및 15분이다. 반응 온도는 20℃-30℃에서 제어하였다. 탈보호 후, 용매는 펌핑 제거하고 수지는 DMF (120 mL×6)로 세척하였다. 세척 후, 용매는 펌핑 제거하고 수지는 시험 튜브에 방치하였다. 닌하이드린을 사용하여 수지 색상을 시험하였고 수지는 보라-검정색이었다. 다음 단계를 수행하였다. 흡광도는 분광측정 방법에 의해 검출하였고, 수지의 치환 정도는 0.8641 mmol/g인 것으로 계산되었다.
(1-3) S2 아미노산 연결:
Fmoc-Gly-OH (19.0 g, 63.9 mmol, 3.0 당량) 및 PyBOP (33.25 g, 63.9 mmol, 3.0 당량)을 칭량하고 50 mL DMF로 용해시켰다. 완전히 용해 시킨 후, DIEA (10.5 mL, 63.9 mmol)를 첨가하였다. 수득된 혼합물을 시험 튜브에 넣고, 질소를 도입하고 혼합물을 교반하고 2시간 동안 20℃-30℃에서 반응시켰다. 닌하이드린을 사용하여 수지의 색상을 시험하였고, 수지는 투명 황색이었다. 반응 후, 용매는 펌핑 제거하고 수지는 DMF (120 mL×3)로 세척하였다. 세척 후, 용매는 펌핑 제거하고 탈보호는 2회 동안 20%의 용적 비를 갖는 피페리딘/DMF 용액 (120 mL)으로 수행하였다. 시간은 각각 10분 및 15분이다. 반응 온도는 20℃-30℃에서 제어하였다. 탈보호 후, 용매는 펌핑 제거하고 수지는 DMF (120 mL×6)로 세척하였다. 세척 후, 용매는 펌핑 제거하고 수지는 시험 튜브에 방치하였다. 닌하이드린을 사용하여 수지 색상을 시험하였고 수지는 보라-검정색이었다. 다음 단계를 수행하였다.
(1-4) S3 아미노산 연결:
Fmoc-Phe-OH (24.75 g, 63.9 mmol, 3.0 당량) 및 PyBOP (33.25 g, 63.9 mmol, 3.0 당량)를 칭량하고 50 mL DMF에 용해시켰다. 완전히 용해 시킨 후, DIEA (10.5 mL, 63.9 mmol)를 첨가하였다. 수득된 혼합물을 시험 튜브에 넣고, 질소를 도입하고 혼합물을 교반하고 온도를 20℃-30℃에서 조절하고 2시간 동안 반응시켰다. 닌하이드린을 사용하여 수지의 색상을 시험하였고, 수지는 투명 황색이었다. 반응 후, 용매는 펌핑 제거하고 수지는 DMF (120 mL×3)로 세척하였다. 세척 후, 용매는 펌핑 제거하고 탈보호는 2회 동안 20%의 용적 비를 갖는 피페리딘/DMF 용액 (120 mL)으로 수행하였다. 시간은 각각 10분 및 15분이고, 반응 온도는 20℃-30℃에서 조절하였다. 탈보호 후, 용매는 펌핑 제거하고 수지는 DMF (120 mL×6)로 세척하였다. 세척 후, 용매는 펌핑 제거하고 수지는 시험 튜브에 방치하였다. 닌하이드린을 사용하여 수지 색상을 시험하고 수지는 보라-검정색이었다. 다음 단계를 수행하였다.
(1-5) 단계 (1-4)를 반복하였다. S4 아미노산 Fmoc-Gly-OH, S5 아미노산 Fmoc-Tyr(t-Bu)-OH, S6 아미노산 Fmoc-Ala-OH, S7 아미노산 Fmoc-Thr(t-Bu)-OH, S8 아미노산 Fmoc-His(trt)-OH, S9 아미노산 Fmoc-Leu-OH, S10 아미노산 Fmoc-Lys(Boc)-OH, S11 아미노산 Fmoc-(N-Me)Ala-OH, S12 아미노산 Fmoc-Leu-OH, S13 아미노산 Fmoc-Leu-OH, S14 아미노산 Fmoc-Lys(Boc)-OH, S15 아미노산 Fmoc-Glu(Ot-Bu)-OH, S16 아미노산 Fmoc-Leu-OH, S17 아미노산 Fmoc-Leu-OH, S18 아미노산 Fmoc-Glu(Ot-Bu)-OH, S19 아미노산 Fmoc-Arg(pbf)-OH, S20 아미노산 Fmoc-Arg(pbf)-OH, S21 아미노산 Fmoc-Arg(pbf)-OH, S22 아미노산 Fmoc-Leu-OH, S23 아미노산 Fmoc-Asp(OtBu)-OH, S24 아미노산 Fmoc-Gln(trt)-OH, S25 아미노산 Fmoc-Ile-OH, S26 아미노산 Fmoc-Ser(tBu)-OH, S27 아미노산 Fmoc-Lys(Boc)-OH, S28 아미노산 Fmoc-Gly-OH, S29 아미노산 Fmoc- Lys(Boc)-OH, S30 아미노산 Fmoc-Asp(Ot-Bu)-OH, S31 아미노산 Fmoc-His(trt)-OH, S32 아미노산 Fmoc-Leu-OH, S33 아미노산 Fmoc-Leu-OH, S34 아미노산 Fmoc-Gln(trt)-OH, S35 아미노산 Fmoc-His(trt)-OH, S36 아미노산 Fmoc-Glu(Ot-Bu)-OH, S37 아미노산 Fmoc-Ser(t-Bu)-OH, S38 아미노산 Fmoc-Val-OH 및 S39 아미노산 Fmoc-Ala-OH은 연속으로 연결되었고 펩타이드 수지는 다음 작업을 수행하기 위해 수득하였다.
(1-6) 수지 수축: 메탄올 (80 mL)을 먼저 시험 튜브에 첨가하고 수지를 5분 동안 수축시키고 용매는 펌핑 제거하였다. 수축은 10분에 1회 3회 반복하였다. 수축 후 매번, 용매는 다음 수축 전 완전히 펌핑 제거하였다. 이어서, 수축된 수지는 진공 건조 오븐에 위치시키고, 35℃에서 건조시키고, 18.82 g 펩타이드 수지를 수득하였다.
(1-7) 펩타이드 분절 크랙킹: 155 mL TFA, 8mL TIS, 4.12 mL EDT, 2 mL TA, 4.12 mL 물 및 2 mL 아니졸은 균등하게 혼합하여 용해물을 제조하였다. 단계 (1-6)에서 제조된 18.82 g의 펩타이드 수지를 칭량하고 펩타이드 수지를 혼합하고 밀봉하고 광으로부터 보호하였다. 혼합물을 교반하고 반응시키고, 온도는 25℃-35℃에서 유지시키고, 2시간 동안 반응시켰다. 반응 후, 샌드 코어 깔때기를 사용하여 수지를 제거하였다. 진공하에 용매를 제거한 후, 메틸 3급 부틸 에테르 (450 mL)를 나머지 액체에 첨가하고 2시간 동안 0℃-10℃에서 결정화하였다. 상기 혼합물은 원심분리하여 결정화 용액을 제거하고, 침전물은 3회 동안 메틸 3급 부틸 에테르로 세척하였다. 침전물을 수거하고 35℃에서 진공 건조시켜 폴리펩타이드 (서열번호 9) Ala-Val-Ser-Glu-His-Gln-Leu-Leu-His-Asp-Lys-Gly-Lys-Ser-Ile-Gln-Asp-Leu-Arg-Arg-Arg-Glu-Leu-Leu-Glu-Lys-Leu-Leu-(N-Me)Ala-Lys-Leu-His-Thr-Ala-Tyr-Gly-Phe-Gly-Gly를 수득하였다.
(1-8) 정제: 단계 (1-7)에서 수득된 펩타이드 조 용액을 0.45 μm 필터 막으로 여과시킨 후, 용액은 10 μm C-18 실리카 겔로 채워진 20 mm×150 mm 컬럼에서 정제용 HPLC 정제에 적용하였다. 검출 파장은 220 nm였다. 이동상 A는 0.1% TFA였고, 이동상 B는 아세토니트릴이었다. 농도구배 용출은 하기의 표 A에 따라 수행하였다.
[표 A] 농도구배 용출 프로그램
Figure pct00011
표적 폴리펩타이드 생성물을 함유하는 분획물을 수거하고 순도는 95.8%였다. 수거된 분획을 조합하고, 용매는 진공 제거하고 폴리펩타이드 화합물은 동결건조시켰다. 수득된 최종 생성물은 분석 RP-HPLC (체류 시간), LC-MS 및 MALDI/TOF-MS에 의해 동정하였다.
MALDI/TOF-MS(ESI): 4441.2236 [M+H] +.
QE 동정 및 분석에 따라, 수득된 폴리펩타이드 화합물의 서열은 서열번호 9에 나타낸 바와 같다.
검정: 수분 함량은 차이니즈 파마코포에이아(Chinese Pharmacopoeia)에서 수분 결정 방법에 의해 수분 적정기로 측정하였고 TFA 함량은 차이니즈 파마코포에이아에서 아세트산 함량 검출 방법에 의해 측정하였고, 폴리펩타이드의 함량은 83.7%였다.
실시예 2: Ala-Val-Ser-Glu-His-Gln-Leu-Leu-His-Asp-Lys-Gly-Lys-Ser-Ile-Gln-Asp-Leu-Arg-Arg-Arg-Glu-Leu-Leu-Glu-Lys-Leu-Leu-Aib-Lys-Leu-His-Thr-Ala-Tyr-Gly-Phe-Gly-Gly (서열번호 10으로서 나타낸 폴리펩타이드 서열)의 제조
화합물은 C 말단에서 N 말단으로 합성하였다:
(2-1) 수지의 전처리: 30 g의 2-CTA 수지 (치환 정도 0.93 mmol/g, 27 mmol)를 칭량하고 250 mL의 시험 튜브에 배치하고 30분 동안 DCM (200 mL)에서 팽윤시켰다. 용매를 진공 펌핑 제거하였다. 이어서, DCM (100 mL)을 첨가하고, 질소를 도입하고 온도가 25℃에 도달할때까지 가열하였다. SOCl2 (10 mL, 5.0 당량)는 적가하고, 온도는 30-35℃에서 유지시키고, 반응은 24시간 동안 수행하였다.반응을 완결한 후, 질소를 도입하고 용매를 펌핑 제거하였다. DCM (100 mL×3)은 수지를 세척하기 위해 첨가하였고, 용매는 세척 후 매번 펌핑 제거하였다.
(2-2) S1 아미노산 연결: Fmoc-Gly-OH (32.5 g, 108 mmol)를 칭량하고 100 mL DCM에 용해시켰다. 완전히 용해 시킨 후, DIEA (23 mL, 135 mmol)를 첨가하였다. 수득된 혼합물을 시험 튜브에 첨가하고, 질소를 도입하고 교반하고 2시간 동안 20℃-30℃에서 반응시켰다. 메탄올 및 DIEA의 혼합 용매 (메탄올: DIEA = 9:1) 12 mL를 첨가하여 10분 동안 반응되지 않은 부위를 밀봉시켰다. 용매를 펌핑 제거하였다. 수지는 DCM (150 mL×2)으로 세척하였다. 세척 후, 용매는 펌핑 제거하였다. 이어서, DMF (150 mL×2)를 사용하여 수지를 세척하고, 용매는 세척 후 펌핑 제거하였다. 이어서, 수지는 30분 동안 120 mL의 DMF로 팽윤시켰다. 용매는 펌핑 제거하고 탈보호는 2회 동안 20%의 용적 비를 갖는 피페리딘/DMF 용액 (120 mL)으로 수행하였다. 시간은 각각 10분 및 15분이고, 반응 온도는 20℃-30℃에서 조절하였다. 탈보호 후, 용매는 펌핑 제거하고 수지는 DMF (120 mL×6)로 세척하였다. 세척 후, 용매는 펌핑 제거하고 수지는 시험 튜브에 방치하였다. 닌하이드린을 사용하여 수지 색상을 시험하였고 수지는 보라-검정색이었다. 다음 단계를 수행하였다. 흡광도는 분광측정 방법에 의해 검출하였고, 수지의 치환 정도는 0.8641 mmol/g인 것으로 계산되었다.
(2-3) S2 아미노산 연결:
Fmoc-Gly-OH (19.0 g, 63.9 mmol, 3.0 당량) 및 DEPBT (19.17g, 63.9 mmol, 3.0 당량)를 칭량하고 50 mL DMF에 용해시켰다. 완전히 용해 시킨 후, DIEA (10.5 mL, 63.9 mmol)를 첨가하였다. 수득된 혼합물을 시험 튜브에 첨가하고, 질소를 도입하고 교반하고 2시간 동안 20℃-30℃에서 반응시켰다. 닌하이드린을 사용하여 수지의 색상을 시험하였고, 수지는 투명 황색이었다. 반응을 완결시킨 후, 용매는 펌핑 제거하고 수지는 DMF (120 mL×3)로 세척하였다. 용매는 세척 후 펌핑 제거하고 탈보호는 2회 동안 20%의 용적 비를 갖는 피페리딘/DMF 용액 (120 mL)으로 수행하였다. 시간은 각각 10분 및 15분이고, 반응 온도는 20℃-30℃에서 조절하였다. 탈보호 후, 용매는 펌핑 제거하고 수지는 DMF (120 mL×6)로 세척하였다. 세척 후, 용매는 펌핑 제거하고 수지는 시험 튜브에 방치하였다. 닌하이드린을 사용하여 수지 색상을 시험하였고 수지는 보라-검정색이었다. 다음 단계를 수행하였다.
(2-4) S3 아미노산 연결:
Fmoc-Phe-OH (24.75 g, 63.9 mmol, 3.0 당량) 및 DEPBT (19.17g, 63.9 mmol, 3.0 당량)를 칭량하고 50 mL DMF에 용해시켰다. 완전히 용해 시킨 후, DIEA (10.5 mL, 63.9 mmol)를 첨가하였다. 수득된 혼합물을 시험 튜브에 첨가하고, 질소를 도입하고 교반하고 2시간 동안 20℃-30℃에서 반응시켰다. 닌하이드린을 사용하여 수지의 색상을 시험하였고, 수지는 투명 황색이었다. 반응 후 용매를 펌핑 제거하고, 수지는 DMF (120 mL x 3)로 세척하고, 용매는 펌핑 제거하고 탈보호는 2회 동안 20%의 용적 비를 갖는 피페리딘/DMF 용액 (120 mL)으로 수행하였다. 시간은 각각 10분 및 15분이고, 반응 온도는 20℃-30℃에서 조절하였다. 탈보호 후, 용매는 펌핑 제거하고 수지는 DMF (120 mL×6)로 세척하였다. 세척 후, 용매는 펌핑 제거하고 수지는 시험 튜브에 방치하였다. 닌하이드린을 사용하여 수지 색상을 시험하였고 수지는 보라-검정색이었다. 다음 단계를 수행하였다.
(2-5) 단계 (2-4)를 반복하였다. S4 아미노산 Fmoc-Gly-OH, S5 아미노산 Fmoc-Tyr(t-Bu)-OH, S6 아미노산 Fmoc-Ala-OH, S7 아미노산 Fmoc-Thr(t-Bu)-OH, S8 아미노산 Fmoc-His(trt)-OH, S9 아미노산 Fmoc-Leu-OH, S10 아미노산 Fmoc-Lys(Boc)-OH, S11 아미노산 Fmoc-Aib-OH, S12 아미노산 Fmoc-Leu-OH, S13 아미노산 Fmoc-Leu-OH, S14 아미노산 Fmoc-Lys(Boc)-OH, S15 아미노산 Fmoc-Glu(Ot-Bu)-OH, S16 아미노산 Fmoc-Leu-OH, S17 아미노산 Fmoc-Leu-OH, S18 아미노산 Fmoc-Glu(Ot-Bu)-OH, S19 아미노산 Fmoc-Arg(pbf)-OH, S20 아미노산 Fmoc-Arg(pbf)-OH, S21 아미노산 Fmoc-Arg(pbf)-OH, S22 아미노산 Fmoc-Leu-OH, S23 아미노산 Fmoc-Asp(Ot-Bu)-OH, S24 아미노산 Fmoc-Gln(trt)-OH, S25 아미노산 Fmoc-Ile-OH, S26 아미노산 Fmoc-Ser(t-Bu)-OH, S27 아미노산 Fmoc-Lys(Boc)-OH, S28 아미노산 Fmoc-Gly-OH, S29 아미노산 Fmoc- Lys(Boc)-OH, S30 아미노산 Fmoc-Asp(Ot-Bu)-OH, S31 아미노산 Fmoc-His(trt)-OH, S32 아미노산 Fmoc-Leu-OH, S33 아미노산 Fmoc-Leu-OH, S34 아미노산 Fmoc-Gln(trt)-OH, S35 아미노산 Fmoc-His(trt)-OH, S36 아미노산 Fmoc-Glu(Ot-Bu)-OH, S37 아미노산 Fmoc-Ser(t-Bu)-OH, S38 아미노산 Fmoc-Val-OH and S39 아미노산 Fmoc-Ala-OH는 연속으로 연결시키고 펩타이드 수지는 다음 작업을 수행하기 위해 수득하였다.
(2-6) 수지 수축: 메탄올 (80 mL)을 먼저 시험 튜브에 첨가하고 수지를 5분 동안 수축시키고 용매는 펌핑 제거하였다. 수축은 10분에 1회 3회 반복하였다. 수축 후 매번, 용매는 다음 수축 전 완전히 펌핑 제거하였다. 이어서, 수축된 수지는 진공 건조 오븐에 위치시키고, 35℃에서 건조시키고, 18.82 g 펩타이드 수지를 수득하였다.
(2-7) 펩타이드 분절 크랙킹: 155 mL TFA, 8mL TIS, 4.12 mL EDT, 2 mL TA, 4.12 mL 물 및 2 mL 아니졸은 균등하게 혼합하여 용해물을 제조하였다. 단계 (2-6)에서 제조된 18.82 g의 펩타이드 수지를 칭량하고 용해물과 펩타이드 수지를 혼합하고 밀봉하고 광으로부터 보호하였다. 혼합물을 교반하고 반응시키고, 온도는 25℃-35℃에서 유지시키고, 2시간 동안 반응시켰다. 반응 후, 샌드 코어 깔때기를 사용하여 수지를 제거하였다. 진공하에 용매를 제거한 후, 메틸 3급 부틸 에테르 (450 mL)를 나머지 액체에 첨가하고 결정화는 2시간 동안 저온 (0℃-10℃)에서 수행하였다. 상기 수득한 혼합물은 원심분리하여 결정화 용액을 제거하고, 침전물은 3회 동안 메틸 3급 부틸 에테르로 세척하였다. 침전물을 수거하고 35℃에서 진공 건조시키고, 폴리펩타이드 (서열번호 10) Ala-Val-Ser-Glu-His-Gln-Leu-Leu-His-Asp-Lys-Gly-Lys-Ser-Ile-Gln-Asp-Leu-Arg-Arg-Arg-Glu-Leu-Leu-Glu-Lys-Leu-Leu-Aib-Lys-Leu-His-Thr-Ala-Tyr-Gly-Phe-Gly-Gly를 수득하였다.
(2-8) 정제: 단계 (2-7)에서 수득된 펩타이드 조 용액을 0.45 μm 필터 막으로 여과시킨 후, 용액은 10 μm C-18 실리카 겔로 채워진 20 mm×150 mm 컬럼에서 정제용 HPLC 정제에 적용하였다. 검출 파장은 220 nm였다. 이동상 A는 0.1% TFA였고, 이동상 B는 아세토니트릴이었다. 농도구배 용출은 하기의 표 A에 따라 수행하였다.
[표 A] 농도구배 용출 프로그램
Figure pct00012
표적 폴리펩타이드 생성물을 함유하는 분취물을 수거하고 순도는 95.8%였다. 수거된 분획을 조합하고, 용매는 진공 제거하고 폴리펩타이드 화합물은 동결건조시켰다. 수득된 최종 생성물은 분석 RP-HPLC (체류 시간), LC-MS 및 MALDI/TOF-MS에 의해 동정하였다.
LC-MS(ESI): m/z 1112.2 [M/4+H]+.
MALDI/TOF-MS(ESI): m/z 4441.4175 [M+H]+.
QE 동정 및 분석에 따라, 수득된 폴리펩타이드 화합물의 서열은 서열번호 10에 나타낸 바와 같다.
검정: 수분 함량은 차이니즈 파마코포에이아 (Chinese Pharmacopoeia)에서 수분 결정 방법에 의해 수분 적정기로 측정하였고 TFA 함량은 차이니즈 파마코포에이아에서 아세트산 함량 검출 방법에 의해 측정하였고, 폴리펩타이드의 함량은 85.9%였다.
실시예 3: Ala-Val-Ser-Glu-His-Gln-Leu-Leu-His-Asp-Lys-Gly-Lys-Ser-Ile-Gln-Asp-Leu-Arg-Arg-Arg-Glu-Leu-Leu-Glu-Lys-Leu-Leu-Ala-Lys-Leu-His-Thr-Ala-Tyr-Arg-Gly-Phe-Gly-Gly (서열번호 11로서 나타낸 폴리펩타이드 서열）의 제조
화합물은 C 말단에서 N 말단으로 합성하였다：
(3-1) 수지의 전처리: 30 g의 2-CTA 수지 (치환 정도 0.93 mmol/g, 27 mmol)를 칭량하고 250 mL의 시험 튜브에 놓고 30분 동안 DCM (200 mL)에서 팽윤시켰다. 용매를 진공 펌핑 제거하였다. 이어서, DCM (100 mL)을 첨가하고, 질소를 도입하고 온도가 25℃에 도달할때까지 가열하였다. SOCl2 (10 mL, 5.0eq)는 적가하고, 온도는 30-35℃에서 유지시키고, 2시간 동안 반응시켰다. 반응을 완결한 후, 질소를 도입하고 용매를 펌핑 제거하였다. DCM (100 mL×3)은 수지를 세척하기 위해 첨가하였고, 용매는 세척 후 매번 펌핑 제거하였다.
(3-2) S1 아미노산 연결: Fmoc-Gly-OH (32.5 g, 108 mmol)를 칭량하고 100 mL DCM에 용해시켰다. 완전히 용해 시킨 후, DIEA (23 mL, 135 mmol)를 첨가하였다. 수득된 혼합물을 시험 튜브에 첨가하고, 질소를 도입하고 교반하고 2시간 동안 20℃-30℃에서 반응시켰다. 메탄올 및 DIEA의 혼합 용매 (메탄올: DIEA = 9:1) 12 mL를 첨가하고 10분 동안 반응되지 않은 부위를 밀봉시켰다. 용매를 펌핑 제거하였다. 수지는 DCM (150 mL×2)으로 세척하였다. 세척 후, 용매는 펌핑 제거하였다. 이어서, DMF (150 mL×2)를 사용하여 수지를 세척하고, 용매는 세척 후 펌핑 제거하였다. 이어서, 수지는 30분 동안 120 mL의 DMF로 팽윤시켰다. 용매는 펌핑 제거하고 탈보호는 2회 동안 20%의 용적 비를 갖는 피페리딘/DMF 용액 (120 mL)으로 수행하였다. 시간은 각각 10분 및 15분이고, 반응 온도는 20℃-30℃에서 조절하였다. 탈보호 후, 용매는 펌핑 제거하고 수지는 DMF (120 mL×6)로 세척하였다. 세척 후, 용매는 펌핑 제거하고 수지는 시험 튜브에 방치하였다. 닌하이드린을 사용하여 수지 색상을 시험하였고 수지는 보라-검정색이었다. 다음 단계를 수행하였다. 흡광도는 분광측정 방법에 의해 검출하였고, 수지의 치환 정도는 0.8641 mmol/g인 것으로 계산되었다.
(3-3) S2 아미노산 연결:
Fmoc-Gly-OH (19.0 g, 63.9 mmol, 3.0 당량) 및 T3P (20.33g, 63.9 mmol, 3.0 당량)를 칭량하고 50 mL DMF에 용해시켰다. 완전히 용해 시킨 후, DIEA (10.5 mL, 63.9 mmol)를 첨가하였다. 수득된 혼합물을 시험 튜브에 첨가하고, 질소를 도입하고 교반하고 2시간 동안 20℃-30℃에서 반응시켰다. 닌하이드린을 사용하여 수지의 색상을 시험하였고, 수지는 투명 황색이었다. 반응을 완결시킨 후, 용매는 펌핑 제거하고 수지는 DMF (120 mL×3)로 매번 3분 세척하였다. 용매는 세척 후 펌핑 제거하고 탈보호는 2회 동안 23%의 용적 비를 갖는 피페리딘/DMF 용액 (120 mL)으로 수행하였다. 시간은 각각 10분 및 15분이고, 반응 온도는 20℃-30℃에서 조절하였다. 탈보호 후, 용매는 펌핑 제거하고 수지는 DMF (120 mL×6)로 세척하였다. 세척 후, 용매는 펌핑 제거하고 수지는 시험 튜브에 방치하였다. 닌하이드린을 사용하여 수지 색상을 시험하였고 수지는 보라-검정색이었다. 다음 단계를 수행하였다.
(3-4) S3 아미노산 연결
Fmoc-Phe-OH (24.75 g, 63.9 mmol, 3.0 당량) 및 T3P（19.17g, 63.9 mmol, 3.0 당량)를 칭량하고 50 mL의 DMF에 용해시켰다. 완전히 용해 시킨 후, DIEA (10.5 mL, 63.9 mmol)를 첨가하였다. 수득된 혼합물을 시험 튜브에 첨가하고, 질소를 도입하고 교반하고 2시간 동안 20℃-30℃에서 반응시켰다. 닌하이드린을 사용하여 수지의 색상을 시험하였고, 수지는 투명 황색이었다. 반응을 완결한 후 용매를 펌핑 제거하고, 수지는 DMF (120 mL x 3)로 세척하고, 용매는 세척 후 펌핑 제거하고 이어서, 탈보호는 2회 동안 20%의 용적 비를 갖는 피페리딘/DMF 용액 (120 mL)으로 수행하였다. 시간은 각각 10분 및 15분이고, 반응 온도는 20℃-30℃에서 조절하였다. 탈보호 후, 용매는 펌핑 제거하고 수지는 DMF (120 mL×6)로 세척하였다. 세척 후, 용매는 펌핑 제거하고 수지는 시험 튜브에 방치하였다. 닌하이드린을 사용하여 수지 색상을 시험하였고 수지는 보라-검정색이었다. 다음 단계를 수행하였다.
(3-5) 단계 (3-4)를 반복하였다. S4 아미노산 Fmoc-Gly-OH, S5 아미노산 Fmoc-Arg(pbf)-OH, S6 아미노산 Fmoc-Tyr(t-Bu)-OH, S7 아미노산 Fmoc-Ala-OH, S8 아미노산 Fmoc-Thr(t-Bu)-OH, S9 아미노산 Fmoc-His(trt)-OH, S10 아미노산 Fmoc-Leu-OH, S11 아미노산 Fmoc-Lys(Boc)-OH, S12 아미노산 Fmoc-Ala-OH, S13 아미노산 Fmoc-Leu-OH, S14 아미노산 Fmoc-Leu-OH, S15 아미노산 Fmoc-Lys(Boc)-OH, S16 아미노산 Fmoc-Glu(Ot-Bu)-OH, S17 아미노산 Fmoc-Leu-OH, S18 아미노산 Fmoc-Leu-OH, S19 아미노산 Fmoc-Glu(Ot-Bu)-OH, S20 아미노산 Fmoc-Arg(pbf)-OH, S21 아미노산 Fmoc-Arg(pbf)-OH, S22 아미노산 Fmoc-Arg(pbf)-OH, S23 아미노산 Fmoc-Leu-OH, S24 아미노산 Fmoc-Asp(Ot-Bu)-OH, S25 아미노산 Fmoc-Gln(trt)-OH, S26 아미노산 Fmoc-Ile-OH, S27 아미노산 Fmoc-Ser(t-Bu)-OH, S28 아미노산 Fmoc-Lys(Boc)-OH, S29 아미노산 Fmoc-Gly-OH, S30 아미노산 Fmoc-Lys(Boc)-OH, S31 아미노산 Fmoc-Asp(Ot-Bu)-OH, S32 아미노산 Fmoc-His(trt)-OH, S33 아미노산 Fmoc-Leu-OH, S34 아미노산 Fmoc-Leu-OH, S35 아미노산 Fmoc-Gln(trt)-OH, S36 아미노산 Fmoc-His(trt)-OH, S37 아미노산 Fmoc-Glu(Ot-Bu)-OH, S38 아미노산 Fmoc-Ser(t-Bu)-OH, S39 아미노산 Fmoc-Val-OH and S40 아미노산 Fmoc-Ala-OH를 연속으로 연결하고 펩타이드 수지는 다음 작업을 수행하기 위해 수득하였다.
(3-6) 수지 수축: 메탄올 (80 mL)을 먼저 시험 튜브에 첨가하고 수지를 5분 동안 수축시키고 용매는 펌핑 제거하였다. 수축은 10분에 1회 3회 반복하였다. 수축 후 매번, 용매는 다음 수축 전 완전히 펌핑 제거하였다. 이어서, 수축된 수지는 진공 건조 오븐에 위치시키고, 35℃에서 건조시키고, 19.56g 펩타이드 수지를 수득하였다.
(3-7) 펩타이드 분절 크랙킹: 155 mL TFA, 8mL TIS, 4.12 mL EDT, 2 mL TA, 4.12 mL 물 및 2 mL 아니졸은 균등하게 혼합하여 용해물을 제조하였다. 단계 (3-6)에서 제조된 18.82 g의 펩타이드 수지를 칭량하고 용해물과 펩타이드 수지를 혼합하고 밀봉하고 광으로부터 보호하였다. 혼합물을 교반하고 반응시키고, 온도는 25℃-35℃에서 유지시키고, 2시간 동안 반응시켰다. 반응을 완결한 후, 샌드 코어 깔때기를 사용하여 수지를 제거하였다. 진공하에 용매를 제거한 후, 메틸 3급 부틸 에테르 (450 mL)를 나머지 액체에 첨가하고 결정화는 2시간 동안 저온(0℃-10℃)에서 수행하였다. 상기 혼합물은 원심분리하여 결정화 용액을 제거하고, 수득된 침전물은 3회 동안 메틸 3급 부틸 에테르로 세척하였다. 침전물을 수거하고 35℃에서 진공 건조시켜 폴리펩타이드 (서열번호 11) Ala-Val-Ser-Glu-His-Gln-Leu-Leu-His-Asp-Lys-Gly-Lys-Ser-Ile-Gln-Asp-Leu-Arg-Arg-Arg-Glu-Leu-Leu-Glu-Lys-Leu-Leu-Ala-Lys-Leu-His-Thr-Ala-Tyr-Arg-Gly-Phe-Gly-Gly를 수득하였다.
(3-8) 정제: 단계 (3-7)에서 수득된 펩타이드 조 용액을 0.45 μm 필터 막으로 여과시킨 후, 혼합물은 10 μm C-18 실리카 겔로 채워진 20 mm×150 mm 컬럼에서 정제용 HPLC 정제에 적용하였다. 검출 파장은 220 nm였다. 이동상 A는 0.1% TFA였고, 이동상 B는 아세토니트릴이었다. 농도구배 용출은 하기의 표 A에 따라 수행하였다.
[표 A] 농도구배 용출 프로그램
Figure pct00013
표적 폴리펩타이드 생성물을 함유하는 분취물을 수거하고 순도는 96.1%였다. 수거된 분획물을 조합하고, 용매는 진공 제거하고 폴리펩타이드 화합물은 동결건조시켰다. 수득된 최종 생성물은 분석 RP-HPLC (체류 시간) 및 MALDI/TOF-MS에 의해 동정하였다.
MALDI/TOF-MS(ESI): m/z 4585.2 [M+H]+.
QE 동정 및 분석에 따라, 수득된 폴리펩타이드 화합물의 서열은 서열번호 11에 나타낸 바와 같다.
검정: 수분 함량은 차이니즈 파마코포에이아 (Chinese Pharmacopoeia)에서 수분 결정 방법에 의해 수분 적정기로 측정하였고 TFA 함량은 차이니즈 파마코포에이아에서 아세트산 함량 검출 방법에 의해 측정하였고, 폴리펩타이드의 함량은 81.97%였다.
실시예 4: Ala-Val-Ser-Glu-His-Gln-Leu-Leu-His-Asp-Lys-Gly-Lys-Ser-Ile-Gln-Asp-Leu-Arg-Arg-Arg-Phe-Phe-Leu-His-His-Leu-Ile-Ala-Glu-Ile-His-Thr-Ala-Tyr-Gly-Phe-Gly-Gly (서열번호 12에 나타낸 폴리펩타이드 서열)의 제조
실시예 2에 나타낸 바와 같은 공정을 채택하였다. 0.93 mmol/g의 치환 정도를 갖는 2-CTA 수지를 사용하였다. 수지는 먼저 팽윤시켜 2-CTA 수지를 CTC 수지로 제조하였다. 이어서, 측쇄 보호된 아미노산 Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Tyr(t-Bu)-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Thr(t-Bu)-OH, Fmoc-His(trt)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Glu(Ot-Bu)-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-His(trt)-OH, Fmoc-His(trt)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Arg(pbf)-OH, Fmoc-Arg(pbf)-OH, Fmoc-Arg(pbf)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Asp(Ot-Bu)-OH, Fmoc-Gln(trt)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Ser(t-Bu)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Asp(Ot-Bu)-OH, Fmoc-His(trt)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Gln(trt)-OH, Fmoc-His(trt)-OH, Fmoc-Glu(Ot-Bu)-OH, Fmoc-Ser(t-Bu)-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Ala-OH를 연속으로 연결하여 펩타이드 수지를 수득하였다. 최종적으로, TFA, TIS, EDT, TA, 물 및 아니졸을 균등하게 혼합함에 의해 제조된 용해물을 사용하여 펩타이드 수지를 처리하였다. 측쇄 보호 그룹을 제거하고 수지를 동시에 크랙킹하여 조 펩타이드 생성물(서열번호 12): Ala-Val-Ser-Glu-His-Gln-Leu-Leu-His-Asp-Lys-Gly-Lys-Ser-Ile-Gln-Asp-Leu-Arg-Arg-Arg-Phe-Phe-Leu-His-His-Leu-Ile-Ala-Glu-Ile-His-Thr-Ala-Tyr-Gly-Phe-Gly-Gly를 수득하였다.
폴리펩타이드 조 생성물은 역상 정제용 고압 액체상 크로마토그래피 (HPLC)에 의해 정제하였고, 검출 파장은 220 nm였고, 이동상 A는 0.1% TFA였고, 이동상 B는 아세토니트릴이었다. 순수 생성물을 함유하는 분획물을 조합하여 동결건조시켜 폴리펩타이드 생성물을 수득하였다. HPLC에 의해 검출된 순도는 94.8%였다. 수득된 최종 생성물은 MALDI/TOF-MS에 의해 동정하였다.
MALDI/TOF-MS(ESI) (ESI): m/z 4450.12 [M+H]+.
QE 동정 및 분석에 따라, 수득된 폴리펩타이드 화합물의 서열은 서열번호 12에 나타낸 바와 같다.
실시예 5: Ala-Val-Ser-Glu-His-Gln-Leu-Leu-His-Asp-Lys-Gly-Lys-Ser-Ile-Gln-Asp-Leu-Arg-Arg-Arg-Phe-Phe-Leu-His-His-Leu-Ile-Aib-Glu-Ile-His-Thr-Ala-Tyr-Arg-Phe-Gly-Gly (서열번호 13으로서 나타낸 폴리펩타이드 서열)의 제조
실시예 2에 나타낸 바와 같은 공정을 채택하였다. 0.93 mmol/g의 치환 정도를 갖는 2-CTA 수지를 사용하였다. 수지는 먼저 팽윤시켜 2-CTA 수지를 CTC 수지로 제조하였다. 이어서, 측쇄-보호된 아미노산 Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Arg(pbf)-OH, Fmoc-Tyr(t-Bu)-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Thr(t-Bu)-OH, Fmoc-His(trt)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Glu(Ot-Bu)-OH, Fmoc-Aib-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-His(trt)-OH, Fmoc-His(trt)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Arg(pbf)-OH, Fmoc-Arg(pbf)-OH, Fmoc-Arg(pbf)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Asp(Ot-Bu)-OH, Fmoc-Gln(trt)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Ser(t-Bu)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Asp(Ot-Bu)-OH, Fmoc-His(trt)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Gln(trt)-OH, Fmoc-His(trt)-OH, Fmoc-Glu(Ot-Bu)-OH, Fmoc-Ser(t-Bu)-OH, Fmoc-Val-OH 및 Fmoc-Ala-OH는 연속으로 연결하여 펩타이드 수지를 수득하였다. 최종적으로, TFA, TIS, EDT, TA, 물 및 아니졸을 균등하게 혼합함에 의해 제조된 용해물을 사용하여 펩타이드 수지를 처리하였다. 측쇄 보호 그룹을 제거하고, 수지를 동시에 크랙킹하여 조 펩타이드 생성물 (서열번호 13): Ala-Val-Ser-Glu-His-Gln-Leu-Leu-His-Asp-Lys-Gly-Lys-Ser-Ile-Gln-Asp-Leu-Arg-Arg-Arg-Phe-Phe-Leu-His-His-Leu-Ile-Aib-Glu-Ile-His-Thr-Ala-Tyr-Arg-Phe-Gly-Gly를 수득하였다.
폴리펩타이드 조 생성물은 역상 정제용 고압 액체상 크로마토그래피 (HPLC)에 의해 정제하였고, 검출 파장은 220 nm였고, 이동상 A는 0.1% TFA였고, 이동상 B는 아세토니트릴이었다. 순수 생성물을 함유하는 분획물을 조합하여 동결건조시켜 폴리펩타이드 생성물을 수득하였다. HPLC에 의해 검출된 순도는 94.8%였다. 수득된 최종 생성물은 MALDI/TOF-MS에 의해 동정하였다.
MALDI/TOF-MS(ESI): m/z 4599.253 [M+H]+.
QE 동정 및 분석에 따라, 수득된 폴리펩타이드 화합물의 서열은 서열번호 13에 나타낸 바와 같다.
실시예 6: Ala-Val-Ser-Glu-His-Gln-Leu-Ile-His-Asp-Lys-Gly-Lys-Ser-Ile-Gln-Glu-Leu-Arg-Arg-Arg-Phe-Phe-Leu-His-His-Leu-Ile-Aib-Glu-Ile-His-Thr-Ala-Tyr-Gly-Phe-Gly-Gly (서열번호 14로서 나타낸 폴리펩타이드 서열)의 제조
실시예 2에 나타낸 바와 같은 공정을 채택하였다. 0.93 mmol/g의 치환 정도를 갖는 2-CTA 수지를 사용하였다. 수지는 먼저 팽윤시켜 2-CTA 수지를 CTC 수지로 제조하였다. 이어서, 측쇄 보호된 아미노산 Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Tyr(t-Bu)-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Thr(t-Bu)-OH, Fmoc-His(trt)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Glu(Ot-Bu)-OH, Fmoc-Aib-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-His(trt)-OH, Fmoc-His(trt)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Arg(pbf)-OH, Fmoc-Arg(pbf)-OH, Fmoc-Arg(pbf)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Glu(Ot-Bu)-OH, Fmoc-Gln(trt)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Ser(t-Bu)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Asp(Ot-Bu)-OH, Fmoc-His(trt)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Gln(trt)-OH, Fmoc-His(trt)-OH, Fmoc-Glu(Ot-Bu)-OH, Fmoc-Ser(t-Bu)-OH, Fmoc-Val-OH 및 Fmoc-Ala-OH는 연속으로 연결하여 펩타이드 수지를 수득하였다. 최종적으로, TFA, TIS, EDT, TA, 물 및 아니졸을 균등하게 혼합함에 의해 제조된 용해물을 사용하여 펩타이드 수지를 처리하였다. 측쇄 보호 그룹을 제거하고 수지는 동시에 크랙킹하여 조 펩타이드 생성물(서열번호 14): Ala-Val-Ser-Glu-His-Gln-Leu-Ile-His-Asp-Lys-Gly-Lys-Ser-Ile-Gln-Glu-Leu-Arg-Arg-Arg-Phe-Phe-Leu-His-His-Leu-Ile-Aib-Glu-Ile-His-Thr-Ala-Tyr-Gly-Phe-Gly-Gly를 수득하였다.
폴리펩타이드 조 생성물은 역상 정제용 고압 액체상 크로마토그래피 (HPLC)에 의해 정제하였고, 검출 파장은 220 nm였고, 이동상 A는 0.1% TFA였고, 이동상 B는 아세토니트릴이었다. 순수 생성물을 함유하는 분획물을 조합하여 동결건조시켜 폴리펩타이드 생성물을 수득하였다. HPLC에 의해 검출된 순도는 94.8%였다. 수득된 최종 생성물은 MALDI/TOF-MS에 의해 동정하였다.
MALDI/TOF-MS(ESI): m/z 4514.15 [M+H]+.
QE 동정 및 분석에 따라, 수득된 폴리펩타이드 화합물의 서열은 서열번호 14에 나타낸 바와 같다.
실시예 7: Ala-Val-Ser-Glu-His-Gln-Leu-Ile-His-Asp-Lys-Gly-Lys-Ser-Ile-Gln-Glu-Leu-Arg-Arg-Arg-Phe-Phe-Leu-His-His-Leu-Leu-Ala-Glu-Ile-His-Thr-Ala-Tyr-Gly-Phe-Gly-Gly (서열번호 15로서 나타낸 폴리펩타이드 서열)의 제조
실시예 2에 나타낸 바와 같은 공정을 채택하였다. 0.93 mmol/g의 치환 정도를 갖는 2-CTA 수지를 사용하였다. 수지는 먼저 팽윤시켜 2-CTA 수지를 CTC 수지로 제조하였다. 이어서, 측쇄 보호된 아미노산 Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Tyr(t-Bu)-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Thr(t-Bu)-OH, Fmoc-His(trt)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Glu(Ot-Bu)-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-His(trt)-OH, Fmoc-His(trt)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Arg(pbf)-OH, Fmoc-Arg(pbf)-OH, Fmoc-Arg(pbf)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Glu(Ot-Bu)-OH, Fmoc-Gln(trt)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Ser(t-Bu)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Asp(Ot-Bu)-OH, Fmoc-His(trt)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Gln(trt)-OH, Fmoc-His(trt)-OH, Fmoc-Glu(Ot-Bu)-OH, Fmoc-Ser(t-Bu)-OH, Fmoc-Val-OH 및 Fmoc-Ala-OH는 연속으로 연결하여 펩타이드 수지를 수득하였다. 최종적으로, TFA, TIS, EDT, TA, 물 및 아니졸을 균등하게 혼합함에 의해 제조된 용해물을 사용하여 펩타이드 수지를 처리하였다. 측쇄 보호 그룹을 제거하고, 수지는 동시에 크랙킹하여 조 펩타이드 생성물(서열번호 15): Ala-Val-Ser-Glu-His-Gln-Leu-Ile-His-Asp-Lys-Gly-Lys-Ser-Ile-Gln-Glu-Leu-Arg-Arg-Arg-Phe-Phe-Leu-His-His-Leu-Leu-Ala-Glu-Ile-His-Thr-Ala-Tyr-Gly-Phe-Gly-Gly을 수득하였다.
폴리펩타이드 조 생성물은 역상 정제용 고압 액체상 크로마토그래피 (HPLC)에 의해 정제하였고, 검출 파장은 220 nm였고, 이동상 A는 0.1% TFA였고, 이동상 B는 아세토니트릴이었다. 순수 생성물을 함유하는 분획물을 조합하여 동결건조시켜 폴리펩타이드 생성물을 수득하였다. HPLC에 의해 검출된 순도는 94.8%였다. 수득된 최종 생성물은 MALDI/TOF-MS에 의해 동정하였다.
MALDI/TOF-MS(ESI): m/z 4514.15 [M+H]+.
QE 동정 및 분석에 따라, 수득된 폴리펩타이드 화합물의 서열은 서열번호 15에 나타낸 바와 같다.
효과 예
(I) 난소 제거된 SD 래트에 대한 본원 개시내용에서 화합물의 골다공증 치료학적 효과에 대한 연구
실험 방법: 약 22주령의 암컷 SD 래트를 실험에 사용하였다. 영양공급 조건: 동물 방의 온도는 21±5℃이고 상대 습도는 35±10%이고; 동물 방은 매일 12시간 동안 빛에 노출시키고 12시간 동안 암실에 노출시켰다. 동물에는 물에 자유롭게 접근하게 하였다. SD 래트는 난소절제술(OVX)에 적용하고 이어서, 골다공증 모델을 유도하기 위해 3개월 추가로 영양공급하였다. 래트는 대퇴골의 골 미네랄 밀도에 따라 분류되었다: ① 샴 (sham) 그룹: 동일한 용적의 생리식염수를 피하 투여하였고; ② OVX 그룹 (모델 그룹): 동일한 용적의 생리식염수를 피하 투여하였고; ③ 양성 약물 아발롭타이드 (Aba-5)의 5 μg 투여 그룹: 5 μg/kg 아발롭타이드 (Aba)는 피하 투여하였다. 3개 용량의 투여 그룹은 각각의 시험 화합물에 대해 설정하였다. 시험 화합물의 2.5 μg/kg 투여 그룹: 2.5 μg/kg 시험 화합물은 피하 투여하였다. 시험 화합물의 5 μg/kg 투여 그룹: 5 μg/kg 시험 화합물은 피하 투여하였다. 시험 화합물의 10 μg/kg 투여 그룹: 10 μg/kg 시험 화합물은 피하 투여하였다. 투여는 주 5회 수행하였고, 연속적으로 25주 동안 지속하였다. 시험 화합물은 실시예 1 내지 5에서의 폴리펩타이드 화합물 (서열번호 9 내지 서열번호 13에 나타낸 바와 같이)이다. 아발롭타이드는 시판중에 있는 폐경기 후 골다공증을 치료하기 위한 약물이다.
검출 방법: 검출 지표의 시간 및 내용은 이후에 나타낸다.
1) 골 미네랄 밀도 (BMD)는 모델 확립 전 (-13w), 투여 전 (0w), 투여 6w, 12w, 25w, 37w, 49w 후 이중 에너지 X선 골밀도 측정법(DXA)으로 검출하였다.
2) 혈액은 투여 전 (0w) 및 투여 후 25w에서 안와에서 수거하고, 전혈로 혈액 정기검사를 수행하였다.
3) 투여 후 25w에서, 혈청을 유지하고 골 턴오버 마커 (CTx (β-CTX, 혈청), OC (혈청) 및 혈청 프로콜라겐 1형 N-말단 프로펩타이드 (PINP))를 검출하였고, 칼슘, 인 및 알칼린 포스파타제 (ALP)를 검출하였다.
4) 투여 후, 래트의 양측부의 대퇴골과 요추를 수거하여 MicroCT, 조직형태 검출 및 생체역학 검출에 적용하였다.
데이터의 통계학적 분석: 데이터는 SPSS 20 소프트웨어로 처리하였다. 정규성 시험에 따른 데이터는 일원 분산 분석 (one-way analysis of vairance)에 적용하고; 정규성 시험과 일치하지 않는 데이터는 순위합 시험에 적용하였다. 데이터는 평균 값 ± 표준 오차로 나타낸다.
실험 결과
(1) 대퇴골과 요추의 골 미네랄 밀도를 측정하고, 각 검출 시점에서 대퇴골과 요추의 밀도 변화 퍼센트를 계산하여 표 1에 나타낸다.
골 미네랄 밀도 변화의 퍼센트 = (검출 시점에 골 미네랄 밀도 - 투여 전 골 밀도)/ 투여 전 골 밀도 *100%
[표 1] 각각의 그룹에서 래트의 골 미네랄 밀도 및 변화 퍼센트
Figure pct00014
참고: 샴 그룹과 비교하여 *는 P<0.05를 나타내고, **는 P<0.01를 나타내고, ***는 P<0.001를 나타내고; OVX 그룹과 비교하여 #는 P<0.05를 나타내고, ##는 P<0.01를 나타내고, ###은 P<0.001를 나타내고; Aba-5μ/kg 그룹과 비교하여 &는 P<0.05를 나타내고, &&는 P<0.01을 나타내고, &&&는 P<0.001를 나타낸다.
결과 및 논의: 표 1에 기초하여, OVX 모델 그룹과 비교하여, 실시예 1-5의 시험 화합물 그룹은 2.5 μg/kg, 5 μg/kg 및 10 μg/kg의 용량으로 25주간 투여하고, 대퇴골과 요추의 골 미네랄 밀도는 OVX 유도 래트 골다공증 모델에서 유의적으로 증가하였다. 추가로, 실시예 1 내지 5에서 시험 화합물 간의 용량-반응 관계 및 골다공증 래트의 골 미네랄 밀도의 증가가 있다.
샴 그룹과 비교하여, 실시예 1-5의 시험 화합물 그룹에는 2.5 μg/kg, 5 μg/kg 및 10 μg/kg의 용량을 25주 동안 투여하였고, 골다공증 래트의 대퇴골 및 요추의 골 미네랄 밀도가 증가하였고, 최종적으로 샴 그룹의 골 미네랄 밀도와 비교하여 골 미네랄 밀도와는 유의적인 차이가 없었다. 일부 투여 그룹에서, 래트의 골 미네랄 밀도는 샴 그룹의 것 보다 훨씬 높고 이는 투여 25주 후 대퇴골과 요추의 골 미네랄 밀도가 이미 정상 수준에 근접했음을 지적한다. 이는 본원 개시내용에서 폴리펩타이드 화합물이 골화를 촉진하고 골 미네랄 밀도를 증가시킬 수 있음을 입증하였다.
시판된 약물 아발롭타이드를 5 μg/kg의 용량으로 25주간 투여한 후, 골다공증 래트의 대퇴골 골 미네랄 밀도가 30.28±2% 증가하였다. 시험 화합물 1-5이 5 μg/kg의 용량으로 투여되는 경우, 골다공증 래트의 대퇴골의 골 미네랄 밀도는 각각 37.67±2.70%, 29.17±1.86%, 27.19±1.33%, 31.61±1.54% 및 46.29 ±2.42%로 증가하였다. 시판되는 약물 아발롭타이드를 5 μg/kg의 용량으로 25주간 투여 후, 골다공증 래트의 요추의 골 미네랄 밀도는 21.66±2.12%로 증가하였다. 시험 화합물 1-5이 5 μg/kg의 용량으로 투여되는 경우, 골다공증 래트의 요추의 골 미네랄 밀도는 각각 24.82±4.93%, 29.61±2.26%, 20.41±2.56%, 25.79± 2.06% 및 34.29 ± 7.15%로 증가하였다.
(2) 각 그룹에서 동물의 혈액의 일상적인 검사 결과를 표 2에 나타낸다.
[표 2] 각각의 그룹에서 래트의 말초 혈액의 면역 관련 지표
Figure pct00015
참고: WBC: 백혈구 세포, 림프: 림프구, Gran: 호중구 과립구; 샴 그룹과 비교하여 *는 P<0.05를 나타내고, **는 P<0.01를 나타내고, ***는 P<0.001를 나타내고; OVX 그룹과 비교하여 #는 P<0.05를 나타내고, ##는 P<0.01를 나타내고, ###은 P<0.001를 나타내고; Aba-5μ/kg 그룹과 비교하여 &는 P<0.05를 나타내고, &&는 P<0.01을 나타내고, &&&는 P<0.001를 나타낸다.
결과 및 고찰: 표 2에 기반하여 샴 그룹과 비교해서 OVX 그룹에서 골다공증 래트의 백혈구 세포, 림프구 및 호중구 과립구의 수는 유의적으로 변화하지 않았고, 이는 골다공증 래트의 말초 혈액에서 핵형 수준이 정상을 유지하였다는 결론을 내릴 수 있었다.
아발롭타이드 대조군에서 25주간 투여 후 백혈구 세포수는 OVX 골다공증 모델 대조군 그룹 및 샴 대조군 그룹에 비해 유의적으로 감소하였고 림프구 수는 샴 대조군 그룹에 비해 유의적으로 감소하였으며 호중구 과립구 수는 OVX 그룹에 비해 유의적으로 감소하였다.
OVX 모델 그룹 및 샴 대조군 그룹과 비교하여, 실시예 1-5의 시험 화합물을 2.5 μg/kg, 5 μg/kg 및 10 μg/kg의 용량으로 25주 동안 투여한 후, 백혈구 세포, 림프구 및 호중구 과립구의 수는 정상을 유지하고, 이는 본원 개시내용의 화합물이 골다공증 래트의 골화를 촉진하고 골 미네랄 밀도를 개선시키면서 말초혈액 내 핵세포 수를 안정화시킴을 지적한다.
5 μg/kg의 아발롭타이드 투여 그룹과 비교하여, 실시예 1-5에서 시험 화합물을 2.5 μg/kg, 5 μg/kg 및 10 μg/kg의 용량으로 25주 동안 투여한 후, 백혈구 세포, 림프구 및 호중구 과립구의 수는 아발롭타이드 그룹의 것 보다 유의적으로 높았다. 아발롭타이드의 투여 기간 동안 말초혈액 내 단핵구 세포, 림프구 및 백혈구 세포가 유의적으로 감소한 반면, 본원 개시내용의 화합물은 말초혈액 세포의 핵세포 수준을 유의적으로 안정화시키고 아발롭타이드의 부작용을 극복하였다.
(II) 본원 개시내용에서 화합물의 레티노산 유도성 골다공증 치료 효과에 관한 연구
실험 방법: SD 래트에 위관 영양법에 의해 투여하여 래트 골다공증 모델을 유도하였다. 모델 확립 후, 래트는 대퇴골의 골 미네랄 밀도에 따라 무작위로 분류하였다: ① 비히클 그룹 (대조군 그룹): 생리식염수는 시험 화합물과 동일한 용적으로 피하 주사하였고, 대두유는 레티노산과 동일한 용적으로 위관영양법에 의해 투여하였고; ② 모델 그룹: 동일한 용적의 생리식염수를 피하투여 하였고; 골다공증 상태를 유지하기 위해 격일로 위관영양법에 의해 레티노산 (RA)을 투여하고; ③ 양성 약물 아발롭타이드 (Aba-20) 20 μg 용량 그룹: 10 μg/kg의 아발롭타이드는 피하 투여하였고, 레티노산은 격일로 위관영양법에 의해 투여하였다. 3개 용량의 투여 그룹은 각각의 시험 화합물에 대해 설정하였다. - 시험 화합물의 10 μg/kg 용량 그룹: 10 μg/kg 시험 화합물은 피하 투여하였고, 레티노산은 격일로 위관영양법에 의해 투여하였다. - 시험 화합물의 20 μg/kg 용량 그룹: 20 μg/kg 시험 화합물은 피하 투여하였고, 레티노산은 격일로 위관영양법에 의해 투여하였다. - 시험 화합물의 40 μg/kg 용량 그룹: 40 μg/kg 시험 화합물은 피하 투여하였고, 레티노산은 격일로 위관영양법에 의해 투여하였다. 투여는 시험 약물의 희석제로 생리식염수를 사용하여 주 5회 수행하였고, 투여는 12주간 연속적으로 지속하였다. 레티노산의 유도 용량은 약 80 mg/kg이었고, 모델 확립 후 유지용량은 약 30 mg/Kg이었고, 유도제의 용매는 대두유였다.
검출 지표의 시간 및 내용은 이후에 나타낸다.
1) 투여 전 (0w), 및 투여 후 12w에서 이중 에너지 X선 골밀도측정법(DXA)으로 골 미네랄 밀도 (BMD)를 검출하였다.
2) 투여 전 (0w) 및 투여 후 12w에서 안와로부터 혈액을 채혈하고 혈청을 제거하여 칼슘, 인 및 알칼린 포스파타제 (ALP)의 검출을 수행하였고; 전혈의 다른 부분은 혈액 정기 검사에 적용하였다.
3) 투여 12w 후, 안와에서 채혈한 혈액의 혈청을 골 턴오버 마커 (CTx(β-CTX, 혈청), OC (혈청) 및 혈청 프로콜라겐 1형 N-말단 프로펩티드 (PINP))를 검출에 적용하였다.
투여가 완료된 후 좌측 경골을 이용하여 골수 도말을 제조하였다.좌측 대퇴골은 3점 굽힘 시험에 적용하였고, 우측 대퇴골은 CT 스캔에 적용하고 이를 사용하여 병리학적 절편을 제조하였다.
데이터의 통계학적 분석: 데이터는 SPSS 20 소프트웨어로 처리하였다. 정규성 시험에 따른 데이터는 일원 분산 분석에 적용하고; 정규성 시험과 일치하지 않는 데이터는 순위합 시험에 적용하였다. 데이터는 평균 값 ± 표준 오차로 나타낸다.
실험 결과:
(1) 레티노산 유도 골다공증 래트의 골수 핵세포에 대한 화합물의 영향
레티노산 유도 골다공증 래트의 골수강 내 핵세포의 수를 계수하여 표 3에 나타내었다.
[표 3] 투여 12주 후에 골수 핵세포의 수
Figure pct00016
참고: Aba: 양성 약물 아발롭타이드; RA: 레티노산; 대조군 그룹과 비교하여, *** 는 p<0.001를 나타내고; RA 그룹과 비교하여 #는 p<0.05를 나타내고; Aba-20 μg/kg 그룹과 비교하여, &&는 p<0.01를 나타내고; Aba-20 μg/kg 그룹과 비교하여 &는 p<0.05를 나타낸다.
결과 및 고찰: 12w 동안 투여 후 대조군과 비교하여, 골수강 내 핵세포 수가 20 μg/kg의 아발롭타이드 그룹에서 유의하게 감소하였고 (P<0.001); 모델 그룹과 비교하여 골수강 내 핵세포의 수는 20 μg/kg의 아발롭타이드 그룹에서 유의적으로 감소하였다 (P<0.05). 레티노산으로 유도된 골다공증 래트는 골수 억제가 없었고, 아발롭타이드는 정상 래트와 골다공증 래트의 골수에 대한 명백한 억제 효과를 가졌다.
20 μg/kg 용량의 아발롭타이드 그룹과 비교하여, 시험 화합물 1-5의 10 및 20 μg/kg 용량 그룹에서 핵세포의 수가 유의적으로 증가하였다 (P<0.05). 시험 화합물 1-5의 투여 그룹에서 골수 핵세포의 수는 또한 정상 수준에 근접하였다 (대조군 그룹과 비교하여 어떠한 유의적인 차이가 없었다). 본원 개시내용의 화합물은 골수 핵세포의 수를 안정화시켰다.
(2) 레티노산 유도 골다공증 래트의 골 미세구조에 대한 화합물의 영향
실험 종료 후 래트의 우측 대퇴골을 수거하여 CT 검출에 적용하고, 골표면적/골용적 비(BV/TV), 섬유주 수(TbN), 섬유주 간격 (TbSp)을 계산하고 그 결과를 표 4에 나타내었다. 대조군 그룹, 모델 그룹, 아발롭타이드 그룹, 실시예 1의 20 μg/kg 용량 그룹, 실시예 2의 20 μg/kg 용량 그룹 및 실시예 5의 20 μg/kg 용량 그룹 각각으로부터 하나의 예를 선택하고, 이들의 대퇴골의 활차의 마이크론 X선 3D 이미지화 시스템에 의한 스캔한 도면은 도 1에 나타냈다.
[표 4] 레티노산 유도 골다공증을 갖는 래트의 골 미세구조에 대한 화합물의 효과
Figure pct00017
참고: 대조군 그룹과 비교하여 *는 P<0.05를 나타내고, **는 P<0.01를 나타내고, ***는 P<0.001를 나타내고; RA 그룹과 비교하여 #는 P<0.05를 나타내고, ##는 P<0.01를 나타내고, ###는 P<0.001를 나타내고; Aba-20 μg/kg 그룹과 비교하여 &는 P<0.05를 나타내고; n=6-8이다.
결과 및 고찰: 표 4로부터 12w 동안 투여 후 대조군과 비교하여 RA 그룹의 골 용적/총 용적 BV/TV(P<0.01) 및 섬유주 수 TbN(P<0.001)는 유의적으로 감소하였고, 섬유주 간격 TbSp(P<0.001)는 유의적으로 증가하여 Model(RA) 그룹에서 래트의 골조직 미세구조가 심하게 손상되었음을 지적한다.
모델 그룹/RA와 비교하여, 시험 화합물 1-5의 각 용량 그룹의 골 용적/총 용적 BV/TV 및 섬유주 수 TbN은 유의적으로 증가하였고, 섬유주 간격 TbSp (P<0.001)는 유의적으로 감소하여, 이는 본원 개시내용의 시험 화합물을 투여한 후 래트의 대퇴골의 골량이 증가하고 골 조직의 미세구조 손상이 복구되었음을 지적한다.
동일한 용량(20 μg/kg)하에 시험 화합물 1-5는 골 표면적/총 부피 비율 (BV/TV), 섬유주 수 (TbN) 및 섬유주 간격 (TbSp) 개선 양상에서 아발롭타이드보다 명백히 우수하였고, 이는 본원 개시내용의 화합물이 높은 턴오버 골다공증을 치료하는데 있어서 아발롭타이드보다 우수함을 보여준다.
(3) 레티노산 유도 골다공증 래트의 생체역학에 대한 화합물의 영향
실험 후, 래트의 좌측 상에 대퇴골을 수거하였고, 3점 역학 시험에 적용하고, 실험 결과는 표 5에 나타냈다.
[표 5] 골다공증 래트의 3점 역학 시험에 대한 화합물의 영향
Figure pct00018
참고: Aba: 양성 약물 아발롭타이드; RA: 유도제 레티노산; 대조군 그룹과 비교하여, **는 p<0.01을 나타내고, ***는 p<0.001을 나타내고; RA 그룹과 비교하여, #는 p<0.05를 나타내고, ##는 p<0.01을 나타내고; n=5-14이다.
결과 및 고찰: 12w 동안 투여 후 대퇴골 3점 역학 시험을 수행하였다. 대조군과 비교하여, 모델 그룹의 피크 부하는 유의적으로 감소(P<0.001)하였고, 이는 레티노산 유도 골다공증 래트의 대퇴골의 피크 부하가 유의하게 감소하였음을 지적한다.
모델 그룹과 비교하여, 시험 화합물의 20 μg/kg, 40 μg/kg 용량 그룹에서 래트의 대퇴골의 피크 부하가 유의적으로 증가하였다 (P<0.05). 아발롭타이드의 20 μg/kg 용량 그룹의 피크부하는 모델 그룹에 비해 유의적으로 증가하지 않았다. 골다공증의대퇴골의 피크 부하를 개선시키는 양상에서, 본원 개시내용의 화합물은 아발롭타이드 보다 우수하였다.
요약하면, 아발롭타이드와 비교하여, 본원 개시내용에서 화합물은 골수 및 말초 혈액 둘다에서 핵세포 수준을 유의적으로 안정화시킬 수 있다. 본원 개시내용에서 화합물은 레티노산 유도 골다공증 래트의 피크 부하를 증가시킬 수 있고, 상기 효과는 아발롭타이드의 것 보다 우수하다. 본원 개시내용의 화합물은 또한 구체적으로 골표면적/총 용적 비율 (BV/TV), 섬유주 수(TbN) 및 섬유주 간격을 개선시킴을 포함하는, 골의 미세구조를 개선할 수 있고, 그 효과는 시판되는 약물 아발롭타이드보다 우수하다.
본원의 개시내용은 또한 하기의 구현예에 관한 것이다:
1. 하기 화학식 Ia 또는 화학식 Ib로 나타낸 구조를 갖거나 이의 약제학적으로 허용되는 염인 활성 폴리펩타이드 화합물.
[화학식 Ia]
Y-ID-X
[화학식 Ib]
X-ID-Y
상기 식에서,
Y는 PTH/PTHrP 수용체 효능제 또는 파골세포 억제제이고;
ID는 분자 내 펩타이드 결합, 또는 X를 Y에 연결하는 링커이고;
X는 골형성 성장 펩타이드 수용체 효능제, 골수 중간엽 줄기 세포 자극제 또는 조혈 줄기 세포 자극제이다.
2. 구현예 1에 있어서, Y가 M-CSF 길항제, RANKL 억제제, RANKL 항체, MMP 억제제, 칼시토닌, 부갑상선 호르몬 또는 부갑상선 호르몬 관련 단백질인, 활성 폴리펩타이드 화합물.
3. 구현예 1 또는 2에 있어서, Y가 화학식 II로 나타낸 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 쇄인, 활성 폴리펩타이드 화합물:
[화학식 II]
A1-Val-Ser-Glu-His-Gln-Leu-A8-His-Asp-Lys-Gly-Lys-Ser-Ile-Gln-A17-Leu-Arg-Arg-Arg-A22-A23-Leu-A25-A26-Leu-A28-A29-A30-A31-His-Thr-Ala
상기 식에서,
A1은 Ala, Val, Leu 또는 Ile이고;
A8은 Leu 또는 Ile이고;
A17은 Asp 또는 Glu이고;
A22은 Glu, Asp 또는 Phe이고;
A23은 Leu, Ile 또는 Phe이고;
A25는 Glu, Asp 또는 His이고;
A26은 Lys, His 또는 Arg이고;
A28은 Leu, Ile 또는 Val이고;
A29는 Ala, (N-Me)Ala 또는 Aib이고;
A30은 Lys 또는 Glu이고;
A31은 Leu 또는 Ile이고;
상기 펩타이드 쇄 Y의 아미노 말단은 유리되어 있거나 화학적으로 변형되고, 펩타이드 쇄 Y의 카복실 말단은 유리되어 있거나 화학적으로 변형되어 있다.
4. 구현예 1 내지 3 중 어느 하나에 있어서, X가 조혈 줄기 세포 자극제, 조혈 성장 인자, 혈소판 콜로니-자극 인자, 과립구 콜로니 자극 인자, 에리트로포이에틴, 인터류킨 3 또는 재조합 인간 인터류킨 11인, 활성 폴리펩타이드 화합물.
5. 구현예 1 내지 4 중 어느 하나에 있어서, X가 화학식 IIIa 또는 IIIb로 나타낸 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 쇄인, 활성 폴리펩타이드 화합물:
[화학식 IIIa]
Tyr-(Arg)m-(Gly)n-Phe-Gly-Gly
[화학식 IIIb]
Gly-Gly-Phe-(Gly)n-(Arg)m-Tyr
상기 식에서,
m 및 n은 독립적으로 0, 1 또는 2이고;
상기 펩타이드 쇄 X의 아미노 말단은 유리되어 있거나 화학적으로 변형되고, 펩타이드 쇄 X의 카복실 말단은 유리되어 있거나 화학적으로 변형되어 있다.
6. 구현예 5에 있어서, X가 하기 서열번호 1 내지 서열번호 8 중 하나에 나타낸 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 5 내지 6개 아미노산으로 이루어진 펩타이드 쇄인, 활성 폴리펩타이드 화합물:
Figure pct00019
7. 구현예 1 내지 6 중 어느 하나에 있어서, ID가 X와 Y 사이의 링커이고; 상기 링커가 아미노-치환된 C1-8 알킬 카복실산, 폴리에틸렌 글리콜 중합체 쇄 또는 1 내지 10개의 아미노산으로 이루어진 펩타이드 분절이고, 상기 펩타이드 분절 내 아미노산이 프롤린, 아르기닌, 알라닌, 트레오닌, 글루탐산, 아스파르트산, 라이신, 글루타민, 아스파라긴 또는 글라이신으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 활성 폴리펩타이드 화합물.
8. 구현예 7에 있어서, 상기 링커가 하기의 링커 중 하나인, 활성 폴리펩타이드 화합물:
(1) (Gly-Ser)p, 여기서, p는 1, 2, 3, 4 또는 5이고;
(2) (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)t, 여기서, t는 1, 2 또는 3이고;
(3) Ala-Glu-Ala-Ala-Ala-Lys-Ala;
(4) 4-아미노부티르산 또는 6-아미노카프로산이고;
(5) (PEG)q, 여기서, q는 1, 2, 3, 4 또는 5이다.
9. 구현예 1 내지 8 중 어느 하나에 있어서, 화학식 IV에 나타낸 구조를 갖거나, 화학식 IV에 나타낸 화합물의 약제학적으로 허용되는 염인, 활성 폴리펩타이드 화합물:
[화학식 IV]
A1-Val-Ser-Glu-His-Gln-Leu-A8-His-Asp-Lys-Gly-Lys-Ser-Ile-Gln-A17-Leu-Arg-Arg-Arg-A22-A23-Leu-A25-A26-Leu-A28-A29-A30-A31-His-Thr-Ala-A35
상기 식에서,
A1은 Ala, Val, Leu 또는 Ile이고;
A8은 Leu 또는 Ile이고;
A17은 Asp 또는 Glu이고;
A22은 Glu, Asp 또는 Phe이고;
A23은 Leu, Ile 또는 Phe이고;
A25는 Glu, Asp 또는 His이고;
A26은 Lys, His 또는 Arg이고;
A28은 Leu, Ile 또는 Val이고;
A29는 Ala, (N-Me)Ala 또는 Aib이고;
A30은 Lys 또는 Glu이고;
A31은 Leu 또는 Ile이고;
A35는 화학식 IIIa 또는 IIIb에 나타낸 아미노산 서열의 펩타이드 쇄를 갖는다:
[화학식 IIIa]
Tyr-(Arg)m-(Gly)n-Phe-Gly-Gly
[화학식 IIIb]
Gly-Gly-Phe-(Gly)n-(Arg)m-Tyr
상기 식에서,
m 및 n은 독립적으로 0, 1 또는 2이고;
A1로 나타낸 아미노 말단은 유리되어 있거나 화학적으로 변형되고, 펩타이드 쇄 A35의 카복실 말단은 유리되어 있거나 화학적으로 변형되어 있다.
10. 구현예 9에 있어서, 상기 아미노 말단의 화학적 변형이 아실화, 설포닐화, 알킬화 및 PEG 변형을 포함하고; 상기 카복실 말단의 화학적 변형이 아미드화, 설포닐화 및 PEG 변형을 포함하는, 활성 폴리펩타이드 화합물.
11. 구현예 10에 있어서, 상기 아미노 말단의 화학적 변형이 아미노의 아세틸화, 벤조일화 또는 설포닐화이고; 상기 아미노 말단의 알킬화가 C1-6 알킬화 또는 방향족 알킬화이고; 상기 카복실 말단의 화학적 변형이 상기 카복실 내 OH가 NH2 또는 설파미드에 의해 치환되거나, 상기 카복실 내 OH가 기능성화된 PEG 분자에 연결되어 있는, 활성 폴리펩타이드 화합물.
12. 구현예 1 내지 11 중 어느 하나에 있어서, 하기의 서열번호 9 내지 서열번호 15 중 상기 화합물의 하나이거나, 이의 약제학적으로 허용되는 염인, 활성 폴리펩타이드 화합물:
Figure pct00020
Figure pct00021
13. 구현예 1에 있어서, 상기 폴리펩타이드 화합물의 아미노산의 측쇄 그룹을 화학적으로 변형시킴에 의해 수득된 화합물; 또는
배위 화합물, 폴리펩타이드 화합물 및 금속 이온에 의해 형성된 복합체 또는 킬레이트; 또는
상기 폴리펩타이드 화합물에 의해 형성된 수화물 또는 용매화물을 추가로 포함하는, 활성 폴리펩타이드 화합물.
14. 구현예 13에 있어서, 상기 폴리펩타이드 화합물의 아미노산의 측쇄 그룹을 화학적으로 변형시킴에 의해 수득된 화합물이 상기 폴리펩타이드 화합물 또는 시스테인 또는 시스테인을 포함하는 펩타이드로부터 형성된 디설파이드 결합을 갖는 화합물 내 시스테인에서 설프하이드릴로부터 형성된 티오에테르 또는 티오글리코시드; 또는
상기 폴리펩타이드 화합물 내 티로신의 페놀 하이드록실 그룹으로부터 형성된 에스테르, 에테르 및 글리코시드; 또는
상기 폴리펩타이드 화합물 내 티로신 또는 페닐알라닌의 벤젠 환을 치환함에 의해 제조된 화합물인, 활성 폴리펩타이드 화합물.
15. 구현예 1 내지 14 중 어느 하나에 따른 활성 폴리펩타이드 화합물 및 적어도 하나의 약제학적으로 허용되는 보조제, 부형제, 담체 및 이의 용매를 포함하는 약제학적 조성물.
16. 구현예 15에 있어서, 골 흡수를 억제하는 약물, 골화를 촉진시키는 약물, 골 미네랄화 또는 부갑상선 호르몬 관련 단백질을 촉진시키는 약물로부터 선택되는 다른 치료학적 제제를 포함하는, 약제학적 조성물.
17. 구현예 16에 있어서, 상기 골 흡수를 억제하는 약물이 칼시토닌, 디포스포네이트, 오에스트로겐, 선택적 오에스트로겐 수용체 조절제 및 이소플라본을 포함하고; 상기 골화를 촉진시키는 약물이 플루오라이드, 합성된 스테로이드, 부갑상선 호르몬 및 부갑상선 호르몬 관련 단백질을 포함하고; 상기 골 미네랄화를 촉진시키는 약물이 칼슘 제제, 비타민 D 및 활성 비타민 D를 포함하고; 상기 부갑상선 호르몬 관련 단백질이 테리파라타이드 또는 아발롭타이드인, 약제학적 조성물.
18. 골형성 결함 또는 골 미네랄 밀도 감소와 관련된 질환 또는 장애를 예방하거나, 치료하거나 완화시키기 위한 약물의 제조에서 구현예 1 내지 4 중 어느 하나에 따른 화합물 및 구현예 15 내지 18 중 어느 하나에 따른 약제학적 조성물의 용도로서, 상기 질환이 골다공증인, 용도.
위의 내용은 본 발명의 구체적인 바람직한 구현예와 결합된 본원 개시내용의 발명의 상세한 설명이지만, 본원 개시내용의 구체적인 실시 예가 이들 기재로 한정된 것으로 고려될 수 없다. 본원 개시내용이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본원 개시내용의 개념을 벗어나지 않고 몇 가지 간단한 추론 또는 대체가 이루어질 수 있으며, 이는 모두 본 발명의 보호 범위에 속하는 것으로 간주되어야 한다.
<110> SHAANXI MICOT TECHNOLOGY LIMITED COMPANY <120> ACTIVE POLYPEPTIDE COMPOUND <130> Unitalen 0725 <150> CN 201910958680.0 <151> 2019-10-10 <150> US 16/727,078 <151> 2019-12-26 <160> 22 <170> SIPOSequenceListing 1.0 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized polypeptide <400> 1 Tyr Gly Phe Gly Gly 1 5 <210> 2 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized polypeptide <400> 2 Tyr Arg Phe Gly Gly 1 5 <210> 3 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized polypeptide <400> 3 Tyr Arg Gly Phe Gly Gly 1 5 <210> 4 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized polypeptide <400> 4 Tyr Pro Phe Gly Gly 1 5 <210> 5 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized polypeptide <400> 5 Gly Gly Phe Gly Tyr 1 5 <210> 6 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized polypeptide <400> 6 Gly Gly Phe Arg Tyr 1 5 <210> 7 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized polypeptide <400> 7 Gly Gly Phe Gly Arg Tyr 1 5 <210> 8 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized polypeptide <400> 8 Gly Gly Phe Pro Tyr 1 5 <210> 9 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized polypeptide <220> <221> MOD_RES <222> (29)..(29) <223> Ala is Ala(N-Me) <400> 9 Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gln 1 5 10 15 Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Ala Lys Leu His 20 25 30 Thr Ala Tyr Gly Phe Gly Gly 35 <210> 10 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized polypeptide <220> <221> MOD_RES <222> (29) <223> Xaa is Aib <400> 10 Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gln 1 5 10 15 Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Xaa Lys Leu His 20 25 30 Thr Ala Tyr Gly Phe Gly Gly 35 <210> 11 <211> 40 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized polypeptide <400> 11 Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gln 1 5 10 15 Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Ala Lys Leu His 20 25 30 Thr Ala Tyr Arg Gly Phe Gly Gly 35 40 <210> 12 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized polypeptide <400> 12 Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gln 1 5 10 15 Asp Leu Arg Arg Arg Phe Phe Leu His His Leu Ile Ala Glu Ile His 20 25 30 Thr Ala Tyr Gly Phe Gly Gly 35 <210> 13 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized polypeptide <220> <221> Modification <222> (29) <223> Xaa is Aib <400> 13 Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gln 1 5 10 15 Asp Leu Arg Arg Arg Phe Phe Leu His His Leu Ile Xaa Glu Ile His 20 25 30 Thr Ala Tyr Arg Phe Gly Gly 35 <210> 14 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized polypeptide <220> <221> Modification <222> (29) <223> Xaa is Aib <400> 14 Ala Val Ser Glu His Gln Leu Ile His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gln 1 5 10 15 Glu Leu Arg Arg Arg Phe Phe Leu His His Leu Ile Xaa Glu Ile His 20 25 30 Thr Ala Tyr Gly Phe Gly Gly 35 <210> 15 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized polypeptide <400> 15 Ala Val Ser Glu His Gln Leu Ile His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gln 1 5 10 15 Glu Leu Arg Arg Arg Phe Phe Leu His His Leu Leu Ala Glu Ile His 20 25 30 Thr Ala Tyr Gly Phe Gly Gly 35 <210> 16 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized polypeptide <220> <221> MOD_RES <222> (29)..(29) <223> Ala is Ala(N-Me) <400> 16 Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gln 1 5 10 15 Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Ala Lys Leu His 20 25 30 Thr Ala <210> 17 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized polypeptide <220> <221> Modification <222> (29) <223> Xaa is Aib <400> 17 Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gln 1 5 10 15 Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Xaa Lys Leu His 20 25 30 Thr Ala <210> 18 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized polypeptide <400> 18 Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gln 1 5 10 15 Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Ala Lys Leu His 20 25 30 Thr Ala <210> 19 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized polypeptide <400> 19 Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gln 1 5 10 15 Asp Leu Arg Arg Arg Phe Phe Leu His His Leu Ile Ala Glu Ile His 20 25 30 Thr Ala <210> 20 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized polypeptide <220> <221> Modification <222> (29) <223> Xaa is Aib <400> 20 Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gln 1 5 10 15 Asp Leu Arg Arg Arg Phe Phe Leu His His Leu Ile Xaa Glu Ile His 20 25 30 Thr Ala <210> 21 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized polypeptide <220> <221> Modification <222> (29) <223> Xaa is Aib <400> 21 Ala Val Ser Glu His Gln Leu Ile His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gln 1 5 10 15 Glu Leu Arg Arg Arg Phe Phe Leu His His Leu Ile Xaa Glu Ile His 20 25 30 Thr Ala <210> 22 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized polypeptide <400> 22 Ala Val Ser Glu His Gln Leu Ile His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gln 1 5 10 15 Glu Leu Arg Arg Arg Phe Phe Leu His His Leu Leu Ala Glu Ile His 20 25 30 Thr Ala

Claims (19)

  1. 하기 화학식 Ia 또는 화학식 Ib로 표시되는 구조를 갖거나 이의 약제학적으로 허용되는 염인 활성 폴리펩타이드 화합물.
    [화학식 Ia]
    Y-ID-X
    [화학식 Ib]
    X-ID-Y
    상기 식에서,
    Y는 PTH/PTHrP 수용체 효능제 또는 파골세포 억제제이고;
    ID는 분자 내 펩타이드 결합, 또는 X를 Y에 연결하는 링커이고;
    X는 골형성 성장 펩타이드 수용체 효능제, 골수 중간엽 줄기 세포 자극제 또는 조혈 줄기 세포 자극제이다.
  2. 제1항에 있어서, Y가 M-CSF 길항제, RANKL 억제제, RANKL 항체, MMP 억제제, 칼시토닌, 부갑상선 호르몬 또는 부갑상선 호르몬 관련 단백질인, 활성 폴리펩타이드 화합물.
  3. 제1항에 있어서, Y가 화학식 II로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 쇄인, 활성 폴리펩타이드 화합물:
    [화학식 II]
    A1-Val-Ser-Glu-His-Gln-Leu-A8-His-Asp-Lys-Gly-Lys-Ser-Ile-Gln-A17-Leu-Arg-Arg-Arg-A22-A23-Leu-A25-A26-Leu-A28-A29-A30-A31-His-Thr-Ala
    상기 식에서,
    A1은 Ala, Val, Leu 또는 Ile이고;
    A8은 Leu 또는 Ile이고;
    A17은 Asp 또는 Glu이고;
    A22은 Glu, Asp 또는 Phe이고;
    A23은 Leu, Ile 또는 Phe이고;
    A25는 Glu, Asp 또는 His이고;
    A26은 Lys, His 또는 Arg이고;
    A28은 Leu, Ile 또는 Val이고;
    A29는 Ala, (N-Me)Ala 또는 Aib이고;
    A30은 Lys 또는 Glu이고;
    A31은 Leu 또는 Ile이고;
    상기 펩타이드 쇄 Y의 아미노 말단은 유리되어 있거나 화학적으로 변형되고, 펩타이드 쇄 Y의 카복실 말단은 유리되어 있거나 화학적으로 변형되어 있다.
  4. 제1항에 있어서, X가 조혈 줄기 세포 자극제, 조혈 성장 인자, 혈소판 콜로니-자극 인자, 과립구 콜로니 자극 인자, 에리트로포이에틴, 인터류킨 3 또는 재조합 인간 인터류킨 11인, 활성 폴리펩타이드 화합물.
  5. 제1항에 있어서, X가 화학식 IIIa 또는 화학식 IIIb로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 쇄인, 활성 폴리펩타이드 화합물:
    [화학식 IIIa]
    Tyr-(Arg)m-(Gly)n-Phe-Gly-Gly
    [화학식 IIIb]
    Gly-Gly-Phe-(Gly)n-(Arg)m-Tyr
    상기 식에서,
    m 및 n은 독립적으로 0, 1 또는 2이고;
    상기 펩타이드 쇄 X의 아미노 말단은 유리되어 있거나 화학적으로 변형되고, 펩타이드 쇄 X의 카복실 말단은 유리되어 있거나 화학적으로 변형되어 있다.
  6. 제5항에 있어서, X가 하기 서열번호 1 내지 서열번호 8 중 하나로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 5 내지 6개 아미노산으로 이루어진 펩타이드 쇄인, 활성 폴리펩타이드 화합물:
    Figure pct00022
  7. 제1항에 있어서, ID가 X와 Y 사이의 링커이고; 상기 링커가 아미노-치환된 C1-8 알킬 카복실산, 폴리에틸렌 글리콜 중합체 쇄 또는 1 내지 10개의 아미노산으로 이루어진 펩타이드 분절이고, 상기 펩타이드 분절 내 아미노산이 프롤린, 아르기닌, 알라닌, 트레오닌, 글루탐산, 아스파르트산, 라이신, 글루타민, 아스파라긴 및 글라이신으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 활성 폴리펩타이드 화합물.
  8. 제7항에 있어서, 상기 링커가 하기의 링커 중 하나인, 활성 폴리펩타이드 화합물:
    (1) (Gly-Ser)p, 여기서, p는 1, 2, 3, 4 또는 5이고;
    (2) (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)t, 여기서, t는 1, 2 또는 3이고;
    (3) Ala-Glu-Ala-Ala-Ala-Lys-Ala;
    (4) 4-아미노부티르산 또는 6-아미노카프로산이고;
    (5) (PEG)q, 여기서, q는 1, 2, 3, 4 또는 5이다.
  9. 제1항에 있어서, 화학식 IV로 표시되는 구조를 갖거나, 화학식 IV로 표시되는 화합물의 약제학적으로 허용되는 염인, 활성 폴리펩타이드 화합물:
    [화학식 IV]
    A1-Val-Ser-Glu-His-Gln-Leu-A8-His-Asp-Lys-Gly-Lys-Ser-Ile-Gln-A17-Leu-Arg-Arg-Arg-A22-A23-Leu-A25-A26-Leu-A28-A29-A30-A31-His-Thr-Ala-A35
    상기 식에서,
    A1은 Ala, Val, Leu 또는 Ile이고;
    A8은 Leu 또는 Ile이고;
    A17은 Asp 또는 Glu이고;
    A22은 Glu, Asp 또는 Phe이고;
    A23은 Leu, Ile 또는 Phe이고;
    A25는 Glu, Asp 또는 His이고;
    A26은 Lys, His 또는 Arg이고;
    A28은 Leu, Ile 또는 Val이고;
    A29는 Ala, (N-Me)Ala 또는 Aib이고;
    A30은 Lys 또는 Glu이고;
    A31은 Leu 또는 Ile이고;
    A35는 화학식 IIIa 또는 IIIb로 표시되는 아미노산 서열의 펩타이드 쇄를 갖는다:
    [화학식 IIIa]
    Tyr-(Arg)m-(Gly)n-Phe-Gly-Gly
    [화학식 IIIb]
    Gly-Gly-Phe-(Gly)n-(Arg)m-Tyr
    상기 식에서,
    m 및 n은 독립적으로 0, 1 또는 2이고;
    상기 A1로 표시되는 아미노산의 아미노 말단은 유리되어 있거나 화학적으로 변형되고, 펩타이드 쇄 A35의 카복실 말단은 유리되어 있거나 화학적으로 변형되어 있다.
  10. 제9항에 있어서, 상기 아미노 말단의 화학적 변형이 아실화, 설포닐화, 알킬화 및 PEG 변형을 포함하고; 상기 카복실 말단의 화학적 변형이 아미드화, 설포닐화 및 PEG 변형을 포함하는, 활성 폴리펩타이드 화합물.
  11. 제10항에 있어서, 상기 아미노 말단의 화학적 변형이 아미노의 아세틸화, 벤조일화 또는 설포닐화이고; 상기 아미노 말단의 알킬화가 C1-6 알킬화 또는 방향족 알킬화이고; 상기 카복실 말단의 화학적 변형이 상기 카복실 내 OH가 NH2 또는 설파미드에 의해 치환되거나, 상기 카복실 내 OH가 기능성화된 PEG 분자에 연결되어 있는, 활성 폴리펩타이드 화합물.
  12. 제1항에 있어서, 하기 서열번호 9 내지 서열번호 15 중 하나이거나, 이의 약제학적으로 허용되는 염인, 활성 폴리펩타이드 화합물:
    Figure pct00023

    Figure pct00024
  13. 제1항에 있어서, 상기 폴리펩타이드 화합물의 아미노산의 측쇄 그룹을 화학적으로 변형시킴에 의해 수득된 화합물; 또는
    배위 화합물, 폴리펩타이드 화합물 및 금속 이온에 의해 형성된 복합체 또는 킬레이트; 또는
    상기 폴리펩타이드 화합물에 의해 형성된 수화물 또는 용매화물을 추가로 포함하는, 활성 폴리펩타이드 화합물.
  14. 제13항에 있어서, 상기 폴리펩타이드 화합물의 아미노산의 측쇄 그룹을 화학적으로 변형시켜 수득된 화합물이 상기 폴리펩타이드 화합물, 또는 시스테인 또는 시스테인을 포함하는 펩타이드로부터 형성된 디설파이드 결합을 갖는 화합물 내 시스테인에서 설프하이드릴로부터 형성된 티오에테르 또는 티오글리코시드; 또는
    상기 폴리펩타이드 화합물 내 티로신의 페놀 하이드록실 그룹으로부터 형성된 에스테르, 에테르 및 글리코시드; 또는
    상기 폴리펩타이드 화합물 내 티로신 또는 페닐알라닌의 벤젠고리를 치환함에 의해 제조된 화합물인, 활성 폴리펩타이드 화합물.
  15. 제1항에 따른 활성 폴리펩타이드 화합물 및 적어도 하나의 약제학적으로 허용되는 보조제, 부형제, 담체 및 이의 용매를 포함하는 약제학적 조성물.
  16. 제15항에 있어서, 골 흡수를 억제하는 약물, 골화를 촉진시키는 약물, 골 미네랄화 또는 부갑상선 호르몬 관련 단백질을 촉진시키는 약물로부터 선택되는 다른 치료학적 제제를 포함하는, 약제학적 조성물.
  17. 제16항에 있어서, 상기 골 흡수를 억제하는 약물이 칼시토닌, 디포스포네이트, 오에스트로겐, 선택적 오에스트로겐 수용체 조절제 및 이소플라본을 포함하고; 상기 골화를 촉진시키는 약물이 플루오라이드, 합성된 스테로이드, 부갑상선 호르몬 및 부갑상선 호르몬 관련 단백질을 포함하고; 상기 골 미네랄화를 촉진시키는 약물이 칼슘 제제, 비타민 D 및 활성 비타민 D를 포함하고; 상기 부갑상선 호르몬 관련 단백질이 테리파라타이드 또는 아발롭타이드인, 약제학적 조성물.
  18. 제1항에 따른 화합물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 골형성 결함 또는 골 미네랄 밀도 감소와 관련된 질환 또는 장애를 예방하거나 치료하거나 완화시키는 방법.
  19. 제18항에 있어서, 상기 질환이 골다공증인, 방법.
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