CN102448482A - 甲状旁腺素肽和甲状旁腺素相关蛋白肽及使用方法 - Google Patents

Abstract

本文提供甲状旁腺素(PTH)肽和甲状旁腺素相关蛋白(PTHrP)肽(例如PTH类似物、PTHrP类似物)及相关变体、化学衍生物、融合多肽、多聚体多肽和肽模拟物、拟肽等。本文还提供它们在细胞(例如成骨细胞)中激活PTH受体的方法、治疗患有骨损失的受治疗者的方法(例如通过给予PTH肽或PTHrP肽(例如PTH类似物或PTHrP类似物))、改善受治疗者的骨质疏松症相关症状的方法、延缓受治疗者的骨质疏松症的进展的方法和使受治疗者的骨再生的方法中的用途。

Description

甲状旁腺素肽和甲状旁腺素相关蛋白肽及使用方法

相关申请的交叉引用

本申请要求2009年3月27日申请的美国临时申请号61/164,284的优先权，所述申请的内容通过引用全部结合到本文中。

通过引用电子提交材料结合

通过引用全部结合的是与本文同时提交的计算机可读序列表，其识别如下：2010年3月26日创建的一份44.9 KB ASCII(文本)文件，名为“VAN067FP409WOSequenceListing.txt”。

发明领域

本发明属于生物化学和医学领域，并涉及激活甲状旁腺素受体的肽或多肽以及使用这些肽或多肽以提高骨生长(例如治疗骨质疏松症)或治疗癌症的方法。

发明背景

甲状旁腺素受体(PTH1R)是B类G蛋白偶联受体(GPCR)，其转导来自在骨生物学中具有不同功能的以下两个相关的信号转导分子的信号：甲状旁腺素(PTH)和甲状旁腺素相关蛋白(PTHrP)[(1)；综述参见(2，3)]。PTH是84个氨基酸的多肽内分泌激素，它由甲状旁腺产生，并在响应低钙水平时被分泌到循环中[综述参见(4-6)]。PTH的典型作用受在骨和肾组织中表达的PTH1R介导，包括刺激破骨细胞骨吸收以维持钙稳态和刺激钙重吸收、合成1，25-二羟基维生素D3以及肾中的磷酸盐排泄。自相矛盾的是，PTH对导致骨形成的成骨细胞也有刺激作用[综述参见(7)]，为PTH作为骨质疏松症的合成代谢疗法的临床应用提供了分子基础(8)。合成代谢PTH疗法需要间歇性给予以避免随着循环中PTH的持续升高而占优势的骨吸收作用。

PTHrP为141个氨基酸的多肽，最初作为造成恶性体液性高钙血症的因子分离出来(9-12)，随后表明是调节软骨内骨形成的决定性的发育因子[(13，14)；综述参见(15)]。PTHrP局部产生，并以旁分泌/自分泌方式起作用激活软骨细胞上表达的PTH1R以调节其增殖和分化。PTHrP当给予骨质疏松症患者时还具有合成代谢作用(16)，但是比起通过将骨吸收与骨形成解偶联而产生的PTH，似乎更纯粹是合成代谢的(17)。

PTH和PTHrP可通过PTH1R激活若干下游信号转导途径以介导其作用，但是通过Gα_s偶联的cAMP/PKA途径的活化占优势，并负责骨合成代谢作用(18)。PTH和PTHrP N端34个残基的肽片段足以结合并激活PTH1R至与天然分子相同的程度，而且PTH-(1-34)和PTHrP-(1-34)对于激活cAMP信号转导同样有效(1)。其与受体的相互作用遵循“二结构域”模型。残基1-14与嵌入膜中的7-跨膜(7-TM)螺旋结构域相互作用，而残基15-34与受体的N端胞外结构域(ECD)相互作用(19，20)。PTH和PTHrP的1-14片段有8个氨基酸的序列同一性，反映了这个片段在激活受体方面所起的决定性作用(20)。15-34片段赋予与受体结合的高亲和力，但是PTH和PTHrP的这个部分不太保守，仅有3个氨基酸的同一性。PTH和PTHrP在溶液中形成类似的α-螺旋结构(21，22)。

虽然PTH和PTHrP具有共有的二结构域受体结合机制、共同的二级结构和信号转导的均等激活，但是它们与两种药理上截然不同的PTH1R构象结合的能力不同，所述构象通过G蛋白偶联存在与否来区分。各个肽以类似的高亲和力与G蛋白偶联受体(RG构象状态)结合，但是不存在G蛋白偶联(R0构象状态)时，PTHrP结合显著减弱，而PTH结合仅稍有降低(23-25)。因此，与PTH相比，PTHrP对RG的选择性更大。PTH和PTHrP的不同R0/RG选择性特征与对cAMP信号转导的不同时间效应有关。在配体洗出后，PTH比PTHrP诱导较长久的cAMP信号(23)。趋异残基5(PTH中的Ile，PTHrP中的His)是肽的R0/RG选择性差异的关键性决定因素(23，25)，但是PTH的15-34片段有助于其强R0结合(23，26)，这就表明与ECD的相互作用有助于cAMP信号转导的持续。重要的是，cAMP信号转导的时间差异在体内可能具有重大作用。在接受每日注射的小鼠中，与野生型PTH相比，表现出R0结合提高的PTH类似物在细胞中诱导持续的cAMP反应，并导致骨小梁体积增加和骨皮质吸收增加(26)。这些研究表明PTH和PTHrP的R0/RG选择性特征有助于肽的不同生理和治疗作用，并强调了详细理解PTH和PTHrP与受体结合如何不同的结构基础的重要性。

本发明人之前开发了使他们能够测定与PTH[PTH(15-34)NH2]的C端酰胺化15-34片段复合的PTH1R ECD的高分辨率晶体结构的方法(27)。ECD在大肠杆菌(E.coli)中表达为与细菌麦芽糖结合蛋白(MBP)的C端连接的融合蛋白。在为适当形成3个二硫键所需的体外二硫键改组反应期间，MBP使ECD增溶，并有利于融合蛋白结晶。PTH1R ECD形成在B类GPCR ECD中保守的折叠(28-30)，并且由N端α-螺旋接着2个反向平行的β-折叠和1个短的C端α-螺旋组成，通过3个二硫键全部保持在一起。PTH(15-34)NH2形成与二级结构元件的界面处的疏水沟结合的两亲性α-螺旋。

发明简述

本发明人开发出与PTH1R的胞外结构域(ECD)结合的PTHrP的高分辨率晶体结构，并将其与PTH-PTH1R ECD复合物进行了比较。类似于PTH，PTHrP形成与ECD中的疏水沟结合的两亲性α-螺旋，然而PTH形成连续的直的螺旋，而PTHrP螺旋在C端轻微弯曲并“展开”，在肽的C端和ECD之间引起显著不同的接触。受体通过改变肽结合部位的2个残基的构象而适应不同的结合模式。受此结构引导，本发明人设计了杂合肽，该肽在决定不同结合模式的位置上含有PTH和PTHrP残基交换；表现出ECD-结合减弱的杂合肽对细胞膜中PTH1R的G蛋白解偶联构象(R0)的亲和力也降低，但是保持与G蛋白偶联构象(RG)的正常结合。RG选择性肽有效地刺激细胞中cAMP的积累，但在配体洗出后产生较短期的反应，这就表明它们可能通过在受体上提供有效但脉动的作用而具有治疗价值。

本发明人已证实PTH和PTHrP以类似亲和力与ECD结合，并且提出与MBP-PTH1R ECD融合蛋白复合的PTHrP[PTHrP(12-34)NH2]C端酰胺化12-34片段的高分辨率晶体结构。PTH结合结构和PTHrP结合结构的比较揭示肽的ECD结合模式的显著差异(主要在肽的C端)。

本发明人采用PTH结合结构和PTHrP结合结构作为指导设计PTH和PTHrP肽类似物，其中一些是在决定不同ECD结合模式的位置上含有残基交换的杂合PTH/PTHrP肽，使他们能够获得以时间上较短的反应有效刺激cAMP信号转导的RG选择性肽。这些类似物可作为缺乏高血钙副作用的更纯粹的合成代谢PTH类似物，通过在受体上提供有效但脉动的作用而具有治疗潜力。

根据前文，本发明提供PTH肽，其包含在肽C端部分(例如SEQID NO：9的氨基酸15-34)内的位置上具有氨基酸取代的野生型PTH(SEQ ID NO：9)的氨基酸序列。正如本文首次表明的一样，与野生型PTH相比，本公开内容的PTH肽表现改变的生物学性质(例如与野生型PTH对PTH1R的R0构象的亲和力相比，对PTH1R的G蛋白解偶联构象(R0)的亲和力降低，同时PTH肽保持与PTH1R的G蛋白偶联构象(RG)结合，并且能够刺激细胞中cAMP的积累；与PTH1R的ECD的结合减弱)。据相信这种改变的生物学性质提高这些PTH肽的治疗潜力。

在一些方面，PTH肽包含在氨基酸位置12、14、16、17和27的一个或多个上具有氨基酸取代的野生型PTH(SEQ ID NO：9)的氨基酸序列或其包含二硫键的类似物。

在一些方面，PTH肽包含在SEQ ID NO：9的23、27、28和31位的一个或多个上具有氨基酸取代的野生型PTH的C端部分(SEQ IDNO：9的氨基酸15-34)。在一些实施方案中，与野生型PTH(SEQ ID NO：9)对PTH1R的R0构象的亲和力相比，PTH肽表现出对甲状旁腺素受体(PTH1R)的G蛋白解偶联构象(R0)的亲和力降低，但仍保持与PTH1R的G蛋白偶联构象(RG)结合，并刺激细胞中cAMP的积累。

在其它方面，PTH肽包含SEQ ID NO：9的氨基酸15-34，其中在20、21、23、24、27、28和34位的一个或多个上具有氨基酸取代。在具体的实施方案中，与野生型PTH与PTH1R的ECD结合相比，PTH肽表现出与PTH1R的胞外结构域(ECD)的结合减弱。

本文还提供PTHrP肽，所述PTHrP肽包含在肽C端部分(例如SEQ ID NO：79的氨基酸12-34)内的位置上具有氨基酸取代的野生型PTHrP(SEQ ID NO：79)的氨基酸序列。正如本文首次表明的一样，与野生型PTHrP相比，本公开内容的PTHrP肽表现出改变的生物学性质(例如与野生型PTHrP对PTH1R的R0构象的亲和力相比，对PTH1R的G蛋白解偶联构象(R0)的亲和力降低，同时PTHrP肽保持与PTH1R的G蛋白偶联构象(RG)结合，并且能够刺激细胞中cAMP的积累；与PTH1R的ECD的结合减弱)。据相信这种改变的生物学性质提高这些PTHrP肽的治疗潜力。

在一些方面，PTHrP肽包含在SEQ ID NO：79的23、27、28和31位的一个或多个上具有氨基酸取代的野生型PTHrP的C端部分(SEQ ID NO：79的氨基酸12-34)。在具体方面，与野生型PTHrP(SEQID NO：79)对PTH1R的R0构象的亲和力相比，PTHrP肽表现出对PTH1R的G蛋白解偶联构象(R0)的亲和力降低，但仍保持与PTH1R的G蛋白偶联构象(RG)结合，并刺激细胞中cAMP的积累。

在某些方面，PTHrP肽包含SEQ ID NO：79的氨基酸12-34，其中在20、21、23、24、27、28、32和33位的一个或多个上具有氨基酸取代。在具体方面，与野生型PTHrP与ECD或PTH1R的结合相比，PTHrP肽表现出与PTH1R的ECD的结合减弱。

在具体的实施方案中，本文所述PTH肽和PTHrP肽(或多肽类似物)包含SEQ ID NO：1-101中任一个的氨基酸序列。本文还提供其变体、融合蛋白、多聚体肽、肽模拟物(peptidomimetic)、拟肽和化学衍生物。这类PTH或PTHrP肽或多肽融合蛋白可包括PTH或PTHrP肽或多肽类似物之一、任选接头区和与PTH或PTHrP肽或多肽类似物连接或者与接头区连接的第二多肽，所述第二多肽不与PTH或PTHrP肽或多肽类似物天然连接。同样，PTH或PTHrP肽或多肽类似物可与促进进入细胞的其它肽连接。

在示例性的实施方案中，PTH肽(或多肽类似物)包含SEQ ID NO：1-78中任一个的氨基酸序列及其变体、融合蛋白、多聚体肽、肽模拟物、拟肽和化学衍生物。在具体的实施方案中，PTH肽包含SEQ ID NO：55的氨基酸序列。

在其它示例性的实施方案中，PTHrP肽(或多肽类似物)包含SEQID NO：79-101中任一个的氨基酸序列及其变体、融合蛋白、多聚体肽、肽模拟物、拟肽和化学衍生物。在具体的实施方案中，PTH肽包含SEQID NO：81的氨基酸序列。

本发明还提供用于治疗骨质疏松症的药盒。在一些方面，药盒含有选自本文所述的PTH肽或类似物和本文所述的PTHrP肽的肽，以及将所述肽给予患有骨质疏松症的受治疗者的说明书。

本文所述的PTH肽、PTHrP肽和类似物、化学衍生物、融合多肽、多聚体肽可用于制备用于治疗骨质疏松症的药物。因此，本发明还提供包含本文所述的PTH或PTHrP肽(或多肽类似物、类似物、化学衍生物、融合多肽、多聚体肽等)和药学上可接受的载体或赋形剂的组合物，例如药物组合物。

还包括本发明用于在细胞中激活PTH受体的方法，所述方法包括将上述PTH或PTHrP肽或多肽类似物导入细胞，使得肽或多肽引起所述PTH受体激活。这种方法可在活的动物中进行，所述细胞可以是成骨细胞，所述导入可以通过口服递送或注射。

此外，本发明包括用于治疗患有非所需骨损失相关疾病或病症的哺乳动物受治疗者的方法，所述方法包括将有效量的上述药物组合物给予患有非所需骨损失的受治疗者，从而治疗所述受治疗者。对于该方法，所述受治疗者可以是人，所述疾病可以是骨质疏松症。

本发明此外还提供改善受治疗者的骨质疏松症相关症状的方法、延缓受治疗者的骨质疏松症的进展的方法和使受治疗者的骨再生的方法，所述方法各包括以有效改善受治疗者的骨质疏松症相关症状、延缓受治疗者的骨质疏松症的进展或使受治疗者的骨再生的量，将本文所述药物组合物给予受治疗者。

下面更详细地描述本发明的其它方面和实施方案。

附图说明

结合附图阅读时，可更好地理解前面的概述以及下面的发明详述。为了说明本发明的目的，用图表、本发明优选的某些实施方案来说明。然而，应当理解的是，本发明不限于所显示的精确排列和手段。

图1A-1D表示与PTH1R ECD结合的PTH和PTHrP。图1A和图1B显示用AlphaScreen发光邻近测定(luminescent proximity assay)评价所示的PTH(图1A)或PTHrP(图1B)肽与N端生物素化PTH(7-34)NH2(23nM)和MBP-PTH1R ECD融合蛋白(23nM)的缔合竞争的能力。数据表示一式两份样品的平均值。图1C和图1D显示用Octet Red系统获得的实时结合数据的稳态分析。将生物素化PTH1R ECD固定在链霉抗生物素传感器触头(tip)上，并对PTH(1-34)NH2(图1C)和PTHrP(1-34)NH2(图1D)结合进行了评价。组图图1C和图1D中的曲线显示反应对从原始结合数据(图6)得到的肽浓度曲线。PTH和PTHrP的Kd值分别为2.8μM和0.99μM。

图2A-2I显示与PTHrP(12-34)复合的PTH1R ECD的结构和PTH结合的PTH1R ECD的比较。图2A显示PTHrP-ECD复合物的全貌图，其中ECD为石板蓝色，PTHrP为品红色。在电子密度图中未观察到残基57-101。为了清楚，未显示MBP。图2B显示ECD的分子表面，显示了由PTHrP的F23′、L24′、L27′和I28′接触的疏水沟。表面按原子类型着色：碳为灰色，氮为蓝色，氧为红色。图2C是PTHrP的省略电子密度图。F_o-F_c省略图用等值线为3σ的绿色网格线表示，2F_o-F_c省略图用等值线为1σ的蓝色网格线表示。图2D显示PTHrP-ECD界面的细节图。PTHrP用品红色线圈表示，选定的侧链用小棒表示。红色短划线表示氢键，红色球体是水分子。图2E是包括PTHrP的残基32-34的氢键网的近视图。图2F显示PTHrP-ECD复合物和PTH-ECD复合物的结构比对(PDB码3C4M)。PTHrP-ECD复合物的着色如上，PTH为黄色，PTH结合的ECD为绿色。选定的侧链用小棒表示。PTHrP-ECD复合物的氢键用红色破折号表示，PTH-ECD复合物的用绿色破折号表示。图2G是人PTH和PTHrP残基1-34的氨基酸序列比对，其中α-螺旋长度标于序列上方和下方。图2H显示AlphaScreen单点竞争测定(single point competition assay)的结果，该测定评价PTH(15-34)NH2丙氨酸扫描肽(alanine-scan peptide)(20μM)与生物素-PTH(23nM)和MBP-PTH1R-ECD(23nM)的相互作用竞争的能力。结果是一式两份样品的平均值。图21显示除PTHrP(12-34)NH2丙氨酸扫描肽外与组图图2H相同的AlphaScreen测定的结果。

图3A-3D表示杂合PTH/PTHrP肽与MBP-PTH1R ECD蛋白的结合。图3A显示AlphaScreen单点竞争测定的结果，该测定评价PTH(15-34)NH2支架(20μM)中的杂合肽与生物素-PTH(23nM)和MBP-PTH1R-ECD(23nM)的相互作用竞争的能力。结果是一式两份样品的平均值。图3B显示除PTHrP(12-34)NH2支架中的杂合肽外与组图图3A相同的AlphaScreen测定的结果。图3C是由PTH-ECD结构中的W23′和K27′形成的范德瓦尔斯接触的近视图。图3D是由PTHrP-ECD结构中的F23’和L27’形成的范德瓦尔斯接触的近视图。

图4A和图4B表示杂合PTH/PTHrP(1-34)NH2肽与细胞膜中PTH1R的R0和RG状态的结合。图4A显示PTH(1-34)NH2支架中的所示杂合肽与R0和RG受体状态的结合。图4B显示PTHrP(1-34)NH2支架中的所示杂合肽与R0和RG受体状态的结合。

图5A和图5B显示RG选择性的杂合PTH/PTHrP(1-34)NH2肽的信号转导性质。图5A显示cAMP积累的剂量反应测定的结果。将瞬时表达PTH1R的COS细胞用所示肽于37℃刺激30分钟，之后将细胞裂解，并评价cAMP含量。数据是一式两份样品的平均值，并标准化至在野生型PTH(1-34)NH2存在下观察到的最高cAMP水平。基础cAMP为0.24pmol/孔，PTH诱导的最大cAMP为6.1pmol/孔。PTH、PTH(W23′F/V31′I)、PTHrP和PTHrP(L27K)的EC50值分别为71.6pM、41.5pM、67.7pM和44.4pM。图5B显示配体洗出测定的结果。将细胞用所示肽于室温刺激10分钟，洗出配体，并在洗出后的所示时间评价cAMP积累。结果是一式两份样品的平均值，并标准化至最初刺激期间诱导的cAMP水平。基础cAMP为约0.24pmol/孔，而最初刺激诱导的最大cAMP为约2.9pmol/孔。

图6A和图6B显示PTH和PTHrP与PTH1R ECD结合的Octet Red实时分析。图6A显示将生物素化PTH1R ECD固定在链霉抗生物素传感器触头上，并在下列浓度评价PTH(1-34)NH₂的结合：156.25nM、312.5nM、625nM、1.25μM、2.5μM、5μM、10μM。图6B表示除评价PTHrP(1-34)NH₂的结合以外与图6A相同的组图。

图7A和图7B表示PTH类似物的萤光素酶测定的结果。各PTH类似物都有以##-##-##-##-SBSL形式给出的标识符。图7A和图7B(0.1nM和0.03nM)中，各PTH类似物用##-##-SBSL标示(例如“07-12-18-40-SBSL”表示为“18-40”)。

发明详述

总则

应当理解的是，本发明不限于下述本发明的具体实施方案，因为可对具体实施方案进行变动并仍落入随附权利要求书的范围内。还应当理解的是，所采用的术语用于描述具体实施方案的目的，并无意进行限制。相反，本发明的范围应由随附权利要求书来确定。

除非另有说明，否则本文使用的所有科技术语都具有本发明所属领域普通技术人员通常理解的含义。一般来讲，本文使用的命名法和下文描述的细胞培养、分子遗传学、有机化学和核酸化学的实验室规程是众所周知和本领域通常使用的。虽然类似或等同于本文所述方法、装置和材料的任何方法、装置和材料都可用于实施或检验本发明，但是下面描述优选的方法、装置和材料。

在本说明书和随附权利要求书中，单数形式包括相关的复数，除非文中清楚地另外说明。

除非文中明确地另外规定，否则应当理解的是当提供数值范围时，在该范围的上限和下限之间的至下限单位的十分之一程度的每个中间值和任何其它规定值或在该规定范围的中间值都包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立包括在更小的范围内，并且也包括在本发明内，受该规定范围中任何具体排除在外的界限的约束。如果该规定范围包括一个或两个界限，则不包括这些所包括的界限中任一个或两个的范围也包括在本发明中。

本申请中提及的所有参考文献、专利、专利出版物、论文和数据库都通过引用全部结合到本文中，如同各自具体和单独地通过引用结合到本文中一样。结合这类专利、专利出版物、论文和数据库用于描述和公开在这些专利、专利出版物、论文和数据库中描述过的本发明的主题组成部分的目的，所述组成部分可与现描述的发明相关联地使用。并非承认本文提供的信息是本发明的现有技术，而只是提供来帮助读者理解。

在附图和下面的描述中给出了本发明的一个或多个实施方案的详情。从说明书和附图、实施例、序列表和权利要求书来看，本发明的其它特征、实施方案和优势将是显而易见的。通过参照下文所包括的具体实施方案、实施例和序列表的下列详细描述，可更容易地理解本发明的优选实施方案。

为了公开内容清楚起见，而非意在限制，将本发明的详细说明分成以下小节。

PTH肽和PTHrP肽

PTH和PTHrP通过激活其共同的受体PTH1R来诱导截然不同的生物效应。理解肽如何与受体结合的高分辨结构对阐明负责通过PTH调节无机离子稳态和骨重建以及通过PTHrP调节骨发育的生化机制是重要的，并且还实际应用于辅助合理设计用于治疗目的的肽类似物。本发明人对与PTH1R ECD复合的PTHrP的结构进行了解析。结合PTH-PTH1R ECD复合物的现有结构(27)，本发明人掌握了PTH1RECD所采用的识别PTH和PTHrP的结构机制的全貌。所述肽作为接触ECD中的疏水沟的两亲性α-螺旋与ECD结合。在15-34片段上的3个不变残基中的2个即R20′和L24′锚定相互作用。在残基L24′后，所述肽趋异(diverge)使得其C端与ECD有显著不同的接触(图2F)，这是通过我们的ECD结合数据预测的结果，该数据表明PTH而非PTHrP的C端酰胺基的对ECD结合重要(图1)。15-34片段的第3个不变残基H32′在PTHrP结合结构中为受体提供决定性的氢键，但是在PTH结合结构中暴露于溶剂。令人感兴趣的是，R20′和L24′在TIP39(一种激活PTH 2型受体的肽)中是保守的(36)，但H32′却不是，这与本发明人的观察结果一致，即15-34片段的N端部分提供肽-ECD相互作用的锚定点，而C端部分在其与受体的相互作用中变化。

受体以相对较小的改变(包括Ile115在响应PTHrP弯曲时的移动和L41旋转异构体拨动开关机制(toggle switch mechanism))适应稍有不同的结合模式，以保持与配体的范德瓦尔斯接触，而不管配体在23位不同的侧链体积(图3C和图3D)。

至于ECD结合，PTHrP一般比PTH更耐受变动。PTHrP的4个单交换突变体有3个保持与ECD正常结合，但是PTH单交换突变体中只有一个保持与ECD正常结合。PTH相互作用可能对保守取代更敏感，因为其与ECD较高的表面互补性和较大的埋入表面区域，这在响应突变时为界面调节留下较小的空间。这就表明，PTHrP可提供更好的支架，以在其中引入用于治疗性类似物开发的改变。

本发明人最初怀疑PTH和PTHrP的不同ECD结合模式可能有助于其不同的R0/RG选择性特征。虽然这似乎不是实情，但高分辨结构的可获得性的确引导他们合理设计了最终使他们获得对G蛋白偶联受体有高选择性的肽的交换改变。意料不到的是，RG选择性由于减弱ECD结合的交换突变而提高。然而，与只是ECD亲和力相比，R0/RG选择性更复杂。与PTH(1-34)相比，显示ECD结合降低的PTH(1-28)的RG选择性更大，而与PTH(1-34)相比，RG亲和力却同样降低(26)。显然，残基29-34必定有助于RG选择性杂合PTH/PTHrP(1-34)肽保持正常RG结合的能力。因此，有至少两种不同的改变给定PTH或PTHrP肽的R0/RG选择性特征的方法。RG选择性可通过5位上的His(据推测经由与受体的7-TM结构域的相互作用)而提高，且也通过由肽的C端部分引起的ECD结合减弱而提高，但是残基29-34对保持正常RG结合是重要的。

RG选择性肽有效地刺激cAMP积累，但具有较短的信号转导寿命(图5)，这就表明这些肽对受体提供脉动作用。虽然造成较短信号转导持续时间的基础生化机制尚不明了，但是这些肽在药理上可用作“有偏”药剂，其可诱导对骨的合成代谢作用，同时限制由受体的持续刺激而产生的骨吸收作用。实际上，比起PTH，PTHrP似乎是更纯粹的合成代谢剂(anabolic agent)，缺乏有害的高血钙副作用(17)。如果PTHrP的R0亲和力降低有助于这种作用，那么本文提供的RG选择性肽，特别是PTHrP(1-34)[L27K]，可具有作为用于治疗骨质疏松症的更纯粹的合成代谢类似物的治疗潜力。

根据前文，本发明提供PTH肽，其包含在肽C端部分(例如SEQID NO：9的氨基酸15-34)内的位置上具有氨基酸取代的野生型PTH(SEQ ID NO：9)的氨基酸序列。正如本文首次表明的一样，与野生型PTH相比，本公开内容的PTH肽表现出改变的生物学性质(例如与野生型PTH对PTH1R的R0构象的亲和力相比，对PTH1R的G蛋白解偶联构象(R0)的亲和力降低，同时PTH肽保持与PTH1R的G蛋白偶联构象(RG)结合，并且能够刺激细胞中cAMP的积累；与PTH1R的ECD的结合减弱)。据相信这种改变的生物学性质提高这些PTH肽的治疗潜力。

在一些方面，本文提供的PTH肽包含在SEQ ID NO：9的氨基酸位置12、14、16、17和27的一个或多个上具有氨基酸取代的野生型PTH(SEQ ID NO：9)的氨基酸序列或其包含二硫键的类似物。

在一些实施方案中，SEQ ID NO：9特定位置的一个或多个上的氨基酸取代是对SEQ ID NO：9而言是天然的氨基酸的保守氨基酸取代。在具体的实施方案中，保守氨基酸取代是符合本文所述教导的保守氨基酸取代。参见“变体肽”。在示例性的实施方案中，保守氨基酸取代是下列组别之一中的一个氨基酸被另一个氨基酸替换：

I.小的脂肪族非极性或略有极性的残基：

Ala、Ser、Thr、Pro、Gly；

II.极性的带负电荷的残基及其酰胺和酯：

Asp、Asn、Glu、Gln、半胱磺酸和高半胱磺酸；

III.极性带正电荷的残基：

His、Arg、Lys；鸟氨酸(Orn)；

IV.大的脂肪族非极性残基：

Met、Leu、Ile、Val、Cys、正亮氨酸(Nle)、高半胱氨酸；

V.大的芳族残基：

Phe、Tyr、Trp、乙酰基苯丙氨酸。

在其它实施方案中，氨基酸取代不是保守氨基酸取代，例如是非保守氨基酸取代。

因此，在具体的实施方案中，本公开内容的PTH肽包含SEQ IDNO：53的序列，其中12位上的氨基酸为Gly、Val、Ala或其保守取代，其中14位上的氨基酸为His、Phe、Leu或其保守取代，其中16位上的氨基酸为Asn、Thr或其保守取代，其中17位上的氨基酸为Ser、Asp、Asn或其保守取代，其中27位上的氨基酸为Lys、Leu或其保守取代。在更具体的实施方案中，本公开内容的PTH肽包含SEQ IDNO：1-10和13-20中任一个的氨基酸序列.

在一些方面，本公开内容的PTH肽包含在SEQ ID NO：9的23、27、28和31位的一个或多个上具有氨基酸取代的野生型PTH的C端部分(SEQ ID NO：9的氨基酸15-34)。在一些实施方案中，与野生型PTH(SEQ ID NO：9)对PTH1R的R0构象的亲和力相比，PTH肽表现出对甲状旁腺素受体(PTH1R)的G蛋白解偶联构象(R0)的亲和力降低，但仍保持与PTH1R的G蛋白偶联构象(RG)结合，并刺激细胞中cAMP的积累。在一些实施方案中，与野生型PTH与PTH1R的ECD的结合相比，PTH肽表现出与PTH1R的胞外结构域(ECD)的结合也减弱。

在具体的实施方案中，SEQ ID NO：9的23、27、28和31位的一个或多个上的氨基酸被SEQ ID NO：79相应位置上的氨基酸置换。例如，SEQ ID NO：9的23位的氨基酸被SEQ ID NO：79相应位置上的氨基酸置换是Trp被SEQ ID NO：79的23位上的氨基酸(Phe)置换。同样，例如，SEQ ID NO：9的19位上的氨基酸被SEQ ID NO：79相应位置上的氨基酸置换是Glu被SEQ ID NO：79的19位上的氨基酸(Arg)置换。

在一些实施方案中，PTH肽包含在SEQ ID NO：9的23、27、28和31位的一个或多个上具有氨基酸取代的SEQ ID NO：9的氨基酸15-34，并且在PTH肽的N端还包含SEQ ID NO：9的氨基酸1-14。在这类实施方案中，PTH肽包含在SEQ ID NO：9的23、27、28和31位的一个或多个上具有氨基酸取代的SEQ ID NO：9的氨基酸1-34。因此，在一些实施方案中，PTH肽包含SEQ ID NO：57-66中任一个的氨基酸序列。

在一些方面，PTH肽包含在20、21、23、24、27、28和34位的一个或多个上具有氨基酸取代的SEQ ID NO：9的氨基酸15-34。在具体的实施方案中，与野生型PTH与PTH1R的ECD的结合相比，PTH肽表现出与PTH1R的胞外结构域(ECD)的结合减弱。在一些实施方案中，与野生型PTH(SEQ ID NO：9)对PTH1R的R0构象的亲和力相比，PTH肽表现出对PTH1R的G蛋白解偶联构象(R0)的亲和力降低，其中PTH肽保持与PTH1R的G蛋白偶联构象(RG)的结合，且其中PTH肽刺激细胞中cAMP的积累。在一些实施方案中，PTH肽包含在23或28位或者在23和28位两者上的氨基酸取代。在一些实施方案中，PTH肽另包含在21、27和34位的一个或多个上的氨基酸取代。

在一些实施方案中，PTH肽包含SEQ ID NO：9的氨基酸15-34，其中在SEQ ID NO：9的20、21、23、24、27、28和34位的一个或多个上具有氨基酸取代，并且在PTH肽的N端还包含SEQ ID NO：9的氨基酸1-14。在这类实施方案中，PTH肽包含SEQ ID NO：9的氨基酸1-34，其中在20、21、23、24、27、28和34位的一个或多个上具有氨基酸取代。

在规定位置上的氨基酸取代可以是本文描述的保守氨基酸取代或非保守氨基酸取代。在具体的实施方案中，氨基酸取代是规定位置上的天然氨基酸的氨基酸被Ala置换。因此，在具体的实施方案中，PTH肽在20、21、23、24、27、28和34位的一个或多个上包含Ala。因此，在一些实施方案中，PTH肽包含SEQ ID NO：68-71、73、74和78中任一个的氨基酸序列。

除本文描述的PTH肽以外，本发明还提供PTHrP肽，其包含在肽C端部分(例如SEQ ID NO：79的氨基酸12-34)内的位置上具有氨基酸取代的野生型PTHrP(SEQ ID NO：79)的氨基酸序列。正如本文首次表明的一样，与野生型PTHrP相比，本公开内容的PTHrP肽表现出改变的生物学性质(例如与野生型PTHrP对PTH1R的R0构象的亲和力相比，对PTH1R的G蛋白解偶联构象(R0)的亲和力降低，同时PTHrP肽保持与PTH1R的G蛋白偶联构象(RG)的结合，并且能够刺激细胞中cAMP的积累；与PTH1R的ECD的结合减弱)。据相信这种改变的生物学性质提高这些PTHrP肽的治疗潜力。

在一些方面，PTHrP肽包含在SEQ ID NO：79的23、27、28和31位的一个或多个上具有氨基酸取代的野生型PTHrP的C端部分(SEQ ID NO：79的氨基酸12-34)。在具体方面，与野生型PTHrP(SEQID NO：79)对PTH1R的R0构象的亲和力相比，PTHrP肽表现出对PTH1R的G蛋白解偶联构象(R0)的亲和力降低，但仍保持与PTH1R的G蛋白偶联构象(RG)结合，并刺激细胞中cAMP的积累。在一些实施方案中，与野生型PTHrP与ECD或PTH1R的结合相比，PTHrP肽表现出与PTH1R的ECD的结合也减弱。

在具体的实施方案中，在SEQ ID NO：79的23、27、28和31位的一个或多个上的氨基酸被SEQ ID NO：9相应位置上的氨基酸取代。例如，SEQ ID NO：79的23位上的氨基酸被SEQ ID NO：9相应位置上的氨基酸置换是Phe被SEQ ID NO：9的23位的氨基酸(Trp)置换。同样，例如，SEQ ID NO：79的5位上的氨基酸被SEQ ID NO：9相应位置上的氨基酸置换是His被SEQ ID NO：9的5位上的氨基酸(He)置换。

在一些实施方案中，PTHrP肽包含在SEQ ID NO：79的23、27、28和31位的一个或多个上具有氨基酸取代的SEQ ID NO：79的氨基酸12-34，并且在PTHrP肽的N端还包含SEQ ID NO：79的氨基酸1-11。在这类实施方案中，PTHrP肽包含在SEQ ID NO：79的23、27、28和31位的一个或多个上具有氨基酸取代的SEQ ID NO：79的氨基酸1-34。因此，在一些实施方案中，PTHrP肽包含SEQ ID NO：80-90中任一个的氨基酸序列。

在一些方面，PTHrP肽包含SEQ ID NO：79的氨基酸12-34，其中在20、21、23、24、27、28、32和33位的一个或多个上具有氨基酸取代。在具体方面，与野生型PTHrP与ECD或PTH1R的结合相比，PTHrP肽表现出与PTH1R的ECD的结合减弱。在一些实施方案中，与野生型PTHrP(SEQ ID NO：79)对PTH1R的R0构象的亲和力相比，PTH肽表现出对PTH1R的G蛋白解偶联构象(R0)的亲和力降低，其中PTHrP肽保持与PTH1R的G蛋白偶联构象(RG)的结合，且其中PTHrP肽刺激细胞中cAMP的积累。在一些实施方案中，PTHrP肽包含在22或27位或者在22和27位两者上的氨基酸取代。

在一些实施方案中，PTHrP肽包含SEQ ID NO：79的氨基酸12-34，其中在20、21、23、24、27、28、32和33位的一个或多个上具有氨基酸取代，并且在PTHrP肽的N端还包含SEQ ID NO：79的氨基酸1-11。在这类实施方案中，PTHrP肽包含在SEQ ID NO：79的20、21、23、24、27、28、32和33位的一个或多个上具有氨基酸取代的SEQ ID NO：79的氨基酸1-34。

在规定位置上的氨基酸取代可以是本文描述的保守氨基酸取代或非保守氨基酸取代。在具体的实施方案中，氨基酸取代是规定位置上的天然氨基酸的氨基酸被Ala置换。因此，在具体的实施方案中，PTHrP肽在20、21、23、24、27、28、32和33位的一个或多个上包含Ala。因此，在一些实施方案中，PTHrP肽包含SEQ ID NO：93-98、100和101中任一个的氨基酸序列。

PTH肽和PTHrP肽的活性

在本公开内容的一些方面，PTH肽、其类似物和PTHrP肽是PTH1R的有效激动剂。在示例性的实施方案中，PTH肽、其类似物和PTHrP肽表现出对PTH1R的EC50与野生型PTH或PTHrP对PTH1R受体的EC50至少相同或者大致相同。在一些实施方案中，本公开内容的PTH肽或PTHrP肽的功效(通过以本公开内容PTH肽或PTHrP肽的EC50除野生型PTH或PTHrP对PTH1R的EC50，然后将这个数值乘以100％来计算)，为至少或约10％、至少或约15％、至少或约20％、至少或约25％、至少或约30％、至少或约35％、至少或约40％、至少或约45％、至少或约50％、至少或约55％、至少或约60％、至少或约65％、至少或约70％、至少或约75％、至少或约80％、至少或约85％、至少或约90％、至少或约95％、至少或约100％、至少或约200％、至少或约500％、至少或约1000％。

如本文所述，PTH1R被PTH和PTHrP激活导致细胞(例如成骨细胞)中cAMP的积累。在本公开内容的一些方面，PTH肽、其类似物和PTHrP肽是PTH1R的有效激动剂，并导致细胞中显著量cAMP的积累。在具体的实施方案中，与野生型PTH(SEQ ID NO：9)或野生型PTHrP(SEQ ID NO：79)的cAMP反应相比，由PTH肽和PTHrP肽或其类似物刺激的对PTH1R的反应是较短期的cAMP反应。在一些具体的实施方案中，PTH肽包含SEQ ID NO：64。在一些具体的实施方案中，PTHrP肽包含SEQ ID NO：81。

PTH肽和PTHrP肽的类似物

本文还提供本文所述的PTH肽的类似物(例如包含在氨基酸位置12、14、16、17和27的一个或多个上具有氨基酸取代的野型PTH(SEQID NO：9)的氨基酸序列的PTH肽)，所述类似物包含连接两个非连续氨基酸的分子内桥。在具体的实施方案中，分子内桥为二硫键。在类似物包含二硫键的一些实施方案中，PTH肽还包含其中对SEQ ID NO：9而言是天然的氨基酸被含硫氨基酸(例如Cys(例如L-Cys、D-Cys)、半胱磺酸、高半胱磺酸等)取代的氨基酸取代。

因此，在一些实施方案中，类似物包含SEQ ID NO：54-56中任一个的氨基酸序列，其中19、22和25位上的氨基酸中两个由二硫键连接。在具体的实施方案中，二硫键连接19位的氨基酸与22位的氨基酸。在其它更具体的实施方案中，19位的氨基酸为D-Cys，22位的氨基酸为Cys。在其它具体的实施方案中，类似物的二硫键连接22位的氨基酸与25位的氨基酸，而在更具体的实施方案中，22和25位上的氨基酸各为Cys。如上所述，在某些实施方案中，类似物包含SEQ IDNO：11、12和21-52中任一个的氨基酸序列。

本文还提供本文所述的PTHrP肽的类似物(例如PTHrP肽，其包含在PTHrP肽的C端部分(SEQ ID NO：79的氨基酸12-34)内的一个或多个氨基酸上有氨基酸取代的野生型PTHrP(SEQ ID NO：79)的氨基酸序列，所述类似物包含连接两个非连续氨基酸的分子内桥。在具体的实施方案中，分子内桥为二硫键。在类似物包含二硫键的一些实施方案中，PTHrP肽还包含其中对SEQ ID NO：79而言是天然的氨基酸被含硫氨基酸(例如Cys(例如L-Cys、D-Cys)、半胱磺酸、高半胱磺酸等)取代的氨基酸取代。在一些实施方案中，类似物在19和22位上或在22和25位上包含二硫键。

变体肽

PTH或PTHrP肽或多肽类似物的“变体”是指与所述肽或多肽类似物基本上相同的分子，其中一个或多个氨基酸残基已被取代(取代变体)，或者缺失(缺失变体)或添加(添加变体)一个或多个残基。优选这类取代、添加或缺失导致生物活性得到改进或临床性质得到改进而又不显著降低所需要的生物效应或生化作用。评价所给出的一个或多个残基的取代、添加或缺失是否会对肽产生所需影响尽在本领域技术人员的掌握之中。有关蛋白质化学和结构的详细描述，参见Schulz，G.E.等，Principles of Protein Structure，Springer-Verlag，New York，1979以及Creighton，T.E.，Proteins：Structure and Molecular Principles，W.H.Freeman & Co.，San Francisco，1984，所述文献通过引用结合到本文中。可在本发明的肽分子中进行的取代类型是保守取代，本文定义为下列组别之一内的交换：1.小的脂肪族非极性或略有极性的残基：例如Ala、Ser、Thr、Gly；2.极性带负电荷的残基及其酰胺：例如Asp、Asn、Glu、Gln；3.极性带正电荷的残基：例如His、Arg、Lys；Pro，由于其不寻常的几何结构，而紧紧地约束链。通过选择较不保守的取代，例如在上述各组(或上文未显示的两个其它氨基酸组别)之间而非组内，对功能性质进行相当的改变，这将引起对维持以下方面的作用的更显著的不同：(a)取代区域中肽主链的结构，(b)靶部位上分子的电荷或疏水性，或(c)侧链的体积。本发明的大多数取代是在肽分子的特征方面不产生根本改变的取代。即使难以在这样做之前预测取代的确切作用，本领域的技术人员也应理解可通过常规筛选测定，优选本文所述的生物学测定和生化测定，来评价这种作用。通过本领域普通技术人员熟知的方法测定肽性质的改进，包括氧化还原或热稳定性、疏水性、对蛋白酶降解的易感性或与载体聚集或聚集成多聚体的趋势。

变体与本发明PTH或PTHrP肽或多肽类似物之一可有50％序列同一性，或者与PTH或PTHrP肽或多肽类似物有60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性。

PTH肽或PTHrP肽的其它修饰

本发明还包括其中一个或多个L-氨基酸被一个或多个D-氨基酸取代的肽和多肽。另外，还可提供修饰氨基酸或氨基酸的化学衍生物，使得所述肽含有通常不是天然蛋白质部分的其它化学部分或修饰氨基酸。这类衍生化部分可改进溶解度、吸收、生物半衰期等。能够介导这些作用的部分公开于例如Remington′s Pharmaceutical Sciences，第16版，Mack Publishing Co.，Easton，Pa.(1980)。本文进一步描述了化学衍生物。参见“化学衍生物”。

可使本文所描述的肽糖基化、酰胺化、羧化、磷酸化、酯化、N-酰化、环化(通过例如二硫桥)或转化成酸加成盐和/或任选二聚体化或多聚体化或缀合化。

C端酰胺化

如本文进一步的论述一样，在一些实施方案中，本公开内容的PTH肽、PTHrP肽或其类似物包含替换C端羧酸的C端酰胺基。在这种情况下，C端残基的骨架包含N-C_α-CONH₂。

盐

在一些实施方案中，PTH肽或PTHrP肽(包括其类似物或变体)为盐的形式，例如药学上可接受的盐。本文使用的术语“药学上可接受的盐”是指保持母体化合物的生物活性的化合物的盐，所述盐不是生物学或其它方面不合乎需要的。这类盐可在类似物的最后分离和纯化期间原位制备，或者通过使游离碱官能团与合适的酸反应来单独制备。本文公开的许多化合物能够借助氨基和/或羧基或其类似基团的存在来形成酸式盐和/或碱式盐。

药学上可接受的酸加成盐可由无机酸和有机酸制备。代表性的酸加成盐包括但不限于乙酸盐、己二酸盐、藻酸盐、柠檬酸盐、天冬氨酸盐、苯甲酸盐、苯磺酸盐、硫酸氢盐、丁酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、二葡糖酸盐、甘油磷酸盐、半硫酸盐、庚酸盐、己酸盐、富马酸盐、盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、2-羟乙磺酸盐(异硫代硫酸盐)、乳酸盐、马来酸盐、甲磺酸盐、烟酸盐、2-萘磺酸盐、草酸盐、棕榈酸盐(palmitoate)、果胶酸盐、过硫酸盐、3-苯基丙酸盐、苦味酸盐、新戊酸盐、丙酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、硫氰酸盐、磷酸盐、谷氨酸盐、碳酸氢盐、对甲苯磺酸盐和十一烷酸盐。由包括以下无机酸得到的盐：盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等。由包括以下有机酸得到的盐：乙酸、丙酸、乙醇酸、丙酮酸、草酸、苹果酸、丙二酸、琥珀酸、马来酸、富马酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、肉桂酸、扁桃酸、甲磺酸、乙磺酸、对甲苯磺酸、水杨酸等。可用来形成药学上可接受的酸加成盐的酸的实例包括例如盐酸、氢溴酸、硫酸和磷酸等无机酸，和草酸、马来酸、琥珀酸和柠檬酸等有机酸。

碱加成盐还可在水杨酸来源的最后的分离和纯化期间原位制备，或者通过使含羧酸部分与合适的碱(例如药学上可接受的金属阳离子的氢氧化物、碳酸盐或碳酸氢盐)或者与氨或有机伯胺、仲胺或叔胺反应制备。药学上可接受的盐尤其包括但不限于基于碱金属或碱土金属(例如锂、钠、钾、钙、镁)的阳离子和铝盐等和无毒季铵(quaternaryammonia)和胺阳离子，包括铵、四甲基铵、四乙基铵、甲基铵、二甲基铵、三甲基铵、三乙基铵、二乙基铵和乙基铵等。用于形成碱加成盐的其它代表性的有机胺包括例如乙二胺、乙醇胺、二乙醇胺、哌啶、哌嗪等。由有机碱得到的盐包括但不限于伯胺、叔胺和仲胺的盐。

此外，含碱性氮的基团可用本公开内容的PTH肽或PTHrP肽季铵化为低级烷基卤化物(例如甲基、乙基、丙基和丁基氯化物、溴化物和碘化物)；长链卤化物(例如癸基、月桂基、肉豆蔻基和硬脂基氯化物、溴化物和碘化物)；芳基烷基卤化物(如苄基和苯乙基溴化物等)。由此获得水溶性或油溶性产物或可分散产物。

化学衍生物

PTH或PTHrP肽或多肽类似物的“化学衍生物”是指含有通常不是PTH或PTHrP蛋白部分的其它化学部分的分子。蛋白质的共价修饰包括在本发明的范围内。可通过使靶向的氨基酸残基与能够与选定的侧链或末端残基反应的有机衍生剂反应，将这类修饰引入分子中。这类化学上的衍生化部分可改进蛋白质的溶解度、吸收、生物半衰期等。这些改变可在体内消除或减弱PTH或PTHrP肽或多肽类似物的不合乎需要的副作用。能够介导这些作用的部分公开于例如Remington′s Pharmaceutical Sciences，Mack Publishing Company，EastonPa.(Gennaro第18版，1990)。下述加帽肽是“天然”未加帽肽的优选的化学衍生物的实例。本发明的取代、添加或缺失变体的任何组合都可用任何本文公开的加帽基团加帽。

化学部分

作为化学衍生物一部分的化学部分可以是任何化学部分，包括天然存在的或非天然存在的生物分子、化合物，例如小分子量化合物，其在一些实施方案中对PTH肽或PTHrP肽是化学惰性的。一般来讲，化学部分是不会降低肽的活性的部分。备选地，化学部分是这样的化学部分：其改变(例如改进或提高)PTH肽或PTHrP肽的性质，例如提高稳定性、溶解度和/或肽的效能，缩短对PTH1R作用的持续时间，提高对RG的选择性，降低对R0的亲和力。在一个具体的实施方案中，化学部分为聚合物、碳水化合物、氨基酸、肽或脂质，例如脂肪酸或类固醇。

在一些实施方案中，化学部分是氨基酸。氨基酸可以是本领域已知的20种普通氨基酸中的任一种(Ala、Cys、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp、Tyr)或任何已知的非天然存在的氨基酸。用于本文目的的合适的合成氨基酸包括但不限于β-丙氨酸(β-Ala)、N-α-甲基-丙氨酸(Me-Ala)、氨基丁酸(Abu)、γ-氨基丁酸(γ-Abu)、氨基己酸(ε-Ahx)、氨基异丁酸(Aib)、氨基甲基吡咯甲酸、氨基哌啶甲酸、氨基丝氨酸(Ams)、氨基四氢吡喃-4-甲酸、精氨酸N-甲氧基-N-甲基酰胺、β-天冬氨酸(β-Asp)、氮杂环丁烷甲酸、3-(2-苯并噻唑基)丙氨酸、α-叔丁基甘氨酸、2-氨基-5-脲基-正戊酸(瓜氨酸、Cit)、β-环己基丙氨酸(Cha)、乙酰氨基甲基-半胱氨酸、二氨基丁酸(Dab)、二氨基丙酸(Dpr)、二羟基苯丙氨酸(DOPA)、二甲基噻唑烷(DMTA)、γ-谷氨酸(γ-Glu)、高丝氨酸(Hse)、羟脯氨酸(Hyp)、异亮氨酸N-甲氧基-N-甲基酰胺、甲基-异亮氨酸(MeIle)、六氢异烟酸(Isn)、甲基-亮氨酸(MeLeu)、甲基-赖氨酸、二甲基-赖氨酸、三甲基-赖氨酸、桥亚甲基脯氨酸(methanoproline)、甲硫氨酸-亚砜(Met(O))、甲硫氨酸-砜(Met(O₂))、正亮氨酸(Nle)、甲基-正亮氨酸(Me-Nle)、正缬氨酸(Nva)、鸟氨酸(Orn)、对氨基苯甲酸(PABA)、青霉胺(Pen)、甲基苯丙氨酸(MePhe)、4-氯苯丙氨酸(Phe(4-Cl))、4-氟苯丙氨酸(Phe(4-F))、4-硝基苯丙氨酸(Phe(4-NO₂))、4-氰基苯丙氨酸((Phe(4-CN))、苯基甘氨酸(Phg)、哌啶基丙氨酸、哌啶基甘氨酸、3，4-二氢脯氨酸、吡咯烷基丙氨酸、肌氨酸(Sar)、硒代半胱氨酸(Sec)、O-苄基-磷酸丝氨酸、4-氨基-3-羟基-6-甲基庚酸(Sta)、4-氨基-5-环己基-3-羟基戊酸(ACHPA)、4-氨基-3-羟基-5-苯基戊酸(AHPPA)、1，2，3，4-四氢-异喹啉-3-甲酸(Tic)、四氢吡喃甘氨酸、噻吩基丙氨酸(Thi)、O-苄基-磷酸酪氨酸、O-磷酸酪氨酸、甲氧基酪氨酸、乙氧基酪氨酸、O-(双-二甲基氨基-膦酰基)-酪氨酸、酪氨酸硫酸四丁胺(tyrosine sulfatetetrabutylamine)、甲基-缬氨酸(MeVal)和烷基化3-巯基丙酸。氨基酸可以是氨基酸的D-异构体或L-异构体。

在一些实施方案中，化学部分是肽，例如50个氨基酸以下的肽，例如二肽、三肽、4聚体、5聚体、6聚体、7聚体、8聚体、9聚体、10聚体、15聚体、20聚体、25聚体、30聚体、35聚体、40聚体、45聚体、50聚体。肽可包含本领域已知的任何氨基酸，例如本文所述的任何氨基酸。

聚合物可以是任何聚合物。聚合物可以是以下任一种的衍生化聚合物：聚酰胺；聚碳酸酯；聚亚烷基类及其衍生物，包括聚亚烷基二醇、聚环氧烷、聚对苯二甲酸亚烷基酯；丙烯酸酯和甲基丙烯酸酯的聚合物，包括聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(甲基丙烯酸乙酯)、聚(甲基丙烯酸丁酯)、聚(甲基丙烯酸异丁酯)、聚(甲基丙烯酸己酯)、聚(甲基丙烯酸异癸酯)、聚(甲基丙烯酸月桂酯)、聚(甲基丙烯酸苯酯)、聚(丙烯酸甲酯)、聚(丙烯酸异丙酯)、聚(丙烯酸异丁酯)和聚(丙烯酸十八酯)；聚乙烯聚合物，包括聚乙烯醇、聚乙烯醚、聚乙烯酯、聚乙烯卤化物、聚(乙酸乙烯酯)和聚乙烯吡咯烷酮；聚乙交酯；聚硅氧烷；聚氨酯及其共聚物；纤维素，包括烷基纤维素、羟基烷基纤维素、纤维素醚、纤维素酯、硝基纤维素、甲基纤维素、乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羟丁基甲基纤维素、乙酸纤维素、丙酸纤维素、乙酸丁酸纤维素、醋酸邻苯二甲酸纤维素、羧乙基纤维素、三乙酸纤维素和硫酸纤维素钠盐；聚丙烯；聚乙烯，包括聚(乙二醇)、聚(环氧乙烷)和聚(对苯二甲酸乙二酯)以及聚苯乙烯。

聚合物可以是生物可降解的聚合物，包括合成的生物可降解聚合物(例如乳酸和乙醇酸的聚合物、聚酐、聚(原酸)酯、聚氨酯、聚(丁酸(butic acid))、聚(戊酸)和聚(丙交酯-己内酯共聚物))以及天然的生物可降解聚合物(例如藻酸盐和其它多糖包括葡聚糖和纤维素、胶原、其化学衍生物(取代、添加化学基团(例如烷基、亚烷基)、羟基化、氧化和本领域技术人员常规进行的其它修饰)、白蛋白和其它亲水蛋白质(例如玉米醇溶蛋白和其它谷醇溶蛋白及疏水蛋白质)以及其任何共聚物或混合物。总体说来，这些材料通过体内酶促水解或暴露于水、通过表面或大块蚀解而降解。

聚合物可以是生物黏附的聚合物，例如H.S.Sawhney，C.P.Pathak和J.A.Hubbell披露于Macromolecules，1993，26，581-587(所述教导结合到本文中)的生物侵蚀的水凝胶；聚透明质酸、酪蛋白、明胶、明胶蛋白、聚酐、聚丙烯酸、藻酸盐、脱乙酰壳多糖、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(甲基丙烯酸乙酯)、聚(甲基丙烯酸丁酯)、聚(甲基丙烯酸异丁酯)、聚(甲基丙烯酸己酯)、聚(甲基丙烯酸异癸酯)、聚(甲基丙烯酸月桂酯)、聚(甲基丙烯酸苯酯)、聚(丙烯酸甲酯)、聚(丙烯酸异丙酯)、聚(丙烯酸异丁酯)和聚(丙烯酸十八酯)。

在一些实施方案中，聚合物是水溶性聚合物。合适的水溶性聚合物是本领域已知的，包括例如聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基纤维素(HPC；Klucel)、羟丙基甲基纤维素(HPMC；Methocel)、硝基纤维素、羟丙基乙基纤维素、羟丙基丁基纤维素、羟丙基戊基纤维素、甲基纤维素、乙基纤维素(Ethocel)、羟乙基纤维素、各种烷基纤维素和羟基烷基纤维素、各种纤维素醚、乙酸纤维素、羧甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、羧甲基纤维素钙、乙酸乙烯酯/巴豆酸共聚物、聚甲基丙烯酸羟基烷基酯、甲基丙烯酸羟基甲酯、甲基丙烯酸共聚物、聚甲基丙烯酸、聚甲基丙烯酸甲酯、马来酐/甲基乙烯基醚共聚物、聚乙烯醇、聚丙烯酸钠和聚丙烯酸钙、聚丙烯酸、酸式羧基聚合物、羧聚乙烯、羧基乙烯基聚合物、聚氧乙烯聚氧丙烯共聚物、聚甲基乙烯基醚-马来酐共聚物、羧基甲基酰胺、甲基丙烯酸钾二乙烯基苯共聚物、聚氧化亚乙基二醇、聚环氧乙烷及其衍生物、盐和组合。

碳水化合物可以是任何碳水化合物。碳水化合物可以是例如单糖(例如葡萄糖、半乳糖、果糖)、二糖(例如蔗糖、乳糖、麦芽糖)、寡糖(例如棉子糖、水苏糖)、多糖(淀粉、直链淀粉(amylase)、支链淀粉、纤维素、壳多糖、胼胝质、昆布多糖、木聚糖、甘露聚糖、墨角藻聚糖、半乳甘露聚糖。

脂质可以是任何脂质，例如脂肪酸(例如C4-C30脂肪酸、类二十烷酸、前列腺素、白三烯、血栓烷、N-酰基乙醇胺)、甘油脂(例如单、二、三取代甘油)、甘油磷酸脂(例如磷脂酰胆碱、磷脂酰肌醇、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸)、鞘脂(例如鞘氨醇、神经酰胺)、甾醇脂质(例如类固醇、胆固醇)、异戊烯醇脂(prenol lipid)、糖脂、聚酮化合物、油、蜡、胆固醇、甾醇、脂溶性维生素、单甘油酯、甘油二酯、甘油三酯、磷脂。

可通过使肽的靶向氨基酸残基与能够与选定的侧链或者这些靶向氨基酸的N端或C端残基反应的有机衍生剂反应，使肽与化学部分通过直接的共价键连接。肽或化学部分上的反应基团包括例如醛、氨基、酯、巯基、α-卤代乙酰基、马来酰亚胺基或肼基。衍生剂包括例如马来酰亚胺基苯甲酰基磺基琥珀酰亚胺酯(通过半胱氨酸残基缀合)、N-羟基琥珀酰亚胺(通过赖氨酸残基)、戊二醛、琥珀酐或其它本领域已知的衍生剂。

最通常使半胱氨酰残基与α-卤代乙酸(和相应的胺)(例如氯乙酸、氯乙酰胺)反应，得到羧基甲基衍生物或羧基酰氨基甲基衍生物。半胱氨酰残基还通过与以下化合物反应而衍生化：溴三氟丙酮、α-溴-β-(5-咪唑基(imidozoyl))丙酸、氯乙酰基磷酸酯、N-烷基马来酰亚胺、3-硝基-2-吡啶基二硫化物、甲基2-吡啶基二硫化物、对氯汞苯甲酸、2-氯汞基-4-硝基苯酚或氯-7-硝基苯并-2-氧杂-1，3-二唑。

组氨酰残基通过与焦碳酸二乙酯于pH 5.5-7.0下反应而衍生化，因为这种衍化剂对组氨酰侧链具有相对特异性。对溴苯酰甲基溴同样有用；该反应优选在0.1M卡可基酸钠中于pH 6.0下进行。

赖氨酰残基和氨基末端残基用琥珀酸酐或其它羧酸酐衍生化。用环状羧酸酐的衍生化具有逆转赖氨酰残基的电荷的作用。用于衍生化含quadrature氨基的残基的其它合适试剂包括亚氨酸酯例如甲基吡啶亚胺甲酯(methyl picolinimidate)、磷酸吡哆醛、吡哆醛、氯硼氢化物、三硝基苯磺酸、O-甲基异脲、2，4-戊二酮；以及转氨酶催化的与乙醛酸的反应。

精氨酰残基通过与一种或几种常规试剂反应来修饰，其中有苯基乙二醛、2，3-丁二酮、1，2-环己二酮和茚三酮。精氨酸残基的衍生化需要在碱性条件下进行反应，因为胍官能团的高的pKa。此外，这些试剂可与赖氨酸的基团以及精氨酸ε-氨基反应。

可通过与芳族重氮化合物或四硝基甲烷反应来进行酪氨酰残基的特定修饰，其中将光谱标记引入酪氨酰残基特别有益。最常见地，使用N-乙酰基咪唑和四硝基甲烷以分别形成O-乙酰基酪氨酰物类和3-硝基衍生物。

羧基侧基天冬氨酰或谷氨酰可通过与1-环己基-3-(2-吗啉基-(4-乙基)碳二亚胺或1-乙基-3-(4-氮鎓-4，4-二甲基戊基)碳二亚胺等碳二亚胺(R--N＝C＝N--R′)反应来进行选择性修饰。此外，可通过与氨反应将天冬氨酰和谷氨酰残基转化成天冬酰胺酰和谷氨酰胺酰残基。

其它修饰包括脯氨酸和赖氨酸的羟基化、丝氨酰或苏氨酰残基的羟基的磷酸化、赖氨酸的氨基的甲基化(Creighton，同上，第79-86页)、N端胺的乙酰化和C端羧基的酰胺化。

另一种共价修饰类型包括用化学方法或酶促方法使糖苷与肽偶联。糖可连接于：(a)精氨酸和组氨酸，(b)游离羧基，(c)游离巯基，例如半胱氨酸的游离巯基，(d)游离羟基，例如丝氨酸、苏氨酸或羟脯氨酸的游离羟基，(e)芳族残基，例如酪氨酸或色氨酸的芳族残基，或者(f)谷氨酰胺的酰胺基。这些方法可参见1987年9月11日公布的WO87/05330及Aplin和Wriston，CRC Crit.Rev.Biochem.，第259-306页(1981)。

化学部分可通过接头与肽间接连接。本文使用的“接头”为使两个单独的实体彼此连接的化学键、分子或分子的基团。接头可提供两个实体的最适间距，或者还可供给允许两个实体彼此分隔的不稳定键。不稳定键包括光可裂解基团、酸不稳定部分、碱不稳定部分和酶可切割基团。在一些实施方案中，接头是中间载体，例如多糖或多肽载体。多糖载体的实例包括氨基葡聚糖。合适多肽载体的实例包括聚赖氨酸、聚谷氨酸、聚天冬氨酸、其共聚物和这些氨基酸和其它氨基酸(例如为所得荷载载体提供所需要的溶解度性质的丝氨酸)的混合聚合物等。

融合蛋白

本发明包括“融合蛋白”，其包含与赋予融合蛋白有用性质的另一种肽或多肽融合的PTH或PTHrP肽或多肽类似物(变体或化学衍生物)。例如可将PTH或PTHrP肽或多肽类似物与促进PTH或PTHrP肽或多肽类似物被细胞摄取的多肽融合。

在一些实施方案中，PTH或PTHrP肽或多肽类似物(变体或化学衍生物)与其它肽或多肽直接融合。在具体的实施方案中，PTH或PTHrP肽或多肽类似物(变体或化学衍生物)位于其它肽或多肽的N端。在其它实施方案中，PTH或PTHrP肽或多肽类似物(变体或化学衍生物)位于其它肽或多肽的C端。

在一些实施方案中，PTH或PTHrP肽或多肽类似物(变体或化学衍生物)通过接头与其它肽或多肽融合。合适的接头是本领域已知的，包括但不限于氨基酸(例如本文所述的任何氨基酸)和肽(二肽、三肽、4聚体、5聚体、6聚体、7聚体、8聚体、9聚体、10聚体、15聚体、20聚体、25聚体、30聚体、35聚体、40聚体、45聚体、50聚体)。合适的氨基酸和肽包括本领域已知的氨基酸和肽(例如在本文“化学部分”中描述的任何氨基酸和肽)。

PTH肽或PTHrP(或其类似物或变体)与之融合的其它肽可以是血浆蛋白质、分泌信号、靶向部分、细胞因子、可溶性因子或者免疫球蛋白或其部分(例如可变区、CDR或Fc区)。已知的免疫球蛋白(Ig)类型包括IgG、IgA、IgE、IgD或IgM。Fc区是Ig重链的C端区，其负责与Fc受体结合，Fc受体完成例如再循环(这导致半衰期延长)、依赖抗体的细胞介导的细胞毒性(ADCC)和依赖补体的细胞毒性(CDC)等活性。

例如，按照某些定义，人IgG重链Fc区从重链的Cys226延伸到C端。“铰链区”一般由人IgG1的Glu216延伸到Pro230(可通过比对参与半胱氨酸键合的半胱氨酸，来将其它IgG同种型的铰链区与IgG1序列进行比对)。IgG的Fc区包括2个恒定结构域CH2和CH3。人IgGFc区的CH2结构域通常从氨基酸231延伸到氨基酸341。人IgG Fc区的CH3结构域常常从氨基酸342延伸到447。所提及的免疫球蛋白或者免疫球蛋白片段或区域的氨基酸编号全部基于Kabat等，1991，Sequences of Proteins of Immunological Interest，U.S.Department ofPublic Health，Bethesda，Md。在一个有关的实施方案中，Fc区可包含一个或多个天然或修饰的免疫球蛋白重链的恒定区(CH1除外)，例如IgG和IgA的CH2和CH3区或IgE的CH3和CH4区。

PTH肽或PTHrP肽与之融合的合适的其它肽包括免疫球蛋白序列的部分(其包含FcRn结合部位)。FcRn，一种补救受体，负责使免疫球蛋白再循环并使其返回血液中的循环。根据X射线晶体学，描述了与FcRn受体结合的IgG Fc部分的区域(Burmeister等1994，Nature372：379)。Fc与FcRn的主要接触区域接近CH2和CH3结构域的接点。Fc-FcRn接触全在单Ig重链内。主要的接触部位包括CH2结构域的氨基酸残基248、250-257、272、285、288、290-291、308-311和314以及CH3结构域的氨基酸残基385-387、428和433-436。

有的可包括或不包括FcγR结合部位。FcγR负责ADCC和CDC。与FcγR直接接触的Fc区内的位置的实例为氨基酸234-239(下铰链区)、氨基酸265-269(B/C环)、氨基酸297-299(C’/E环)和氨基酸327-332(F/G)环(Sondermann等，Nature 406：267-273，2000)。IgE的下铰链区也参与FcRI结合(Henry等，Biochemistry 36，15568-15578，1997)。参与IgA受体结合的残基参见Lewis等(J Immunol.175：6694-701，2005)。参与IgE受体结合的氨基酸残基参见Sayers等(J Biol Chem.279(34)：35320-5，2004)。

可对免疫球蛋白的Fc区进行氨基酸修饰。这类变体Fc区在Fc区的CH3结构域(残基342-447)中包含至少一个氨基酸修饰和/或在Fc区的CH2结构域(残基231-341)中包含至少一个氨基酸修饰。被认为赋予提高的对FcRn的亲和力的突变包括T256A、T307A、E380A和N434A(Shields等，2001，J.Biol.Chem.276：6591)。其它突变可降低Fc区与FcγRI、FcγRIIA、FcγRIIB和/或FcγRIIIA的结合而又不显著降低对FcRn的亲和力。例如，Fc区297位上的Asn被Ala或另一个氨基酸取代去除高度保守的N-糖基化位点，并可引起免疫原性降低伴随Fc区的半衰期延长，以及与FcγR的结合降低(Routledge等，1995，Transplantation 60：847；Friend等1999，Transplantation 68：1632；Shields等1995，J.Biol.Chem.276：6591)。还对IgG1的233-236位的氨基酸进行了修饰以降低与FcγR的结合(Ward和Ghetie 1995，TherapeuticImmunology 2：77，以及Armour等，1999，Eur.J.Immunol.29：2613)。一些示例性的氨基酸取代参见美国专利7,355,008和7,381,408，各通过引用全部结合到本文中。

多聚体

本发明还包括“多聚体肽”，即较长的肽或多肽，其中PTH或PTHrP肽或多肽类似物的基本肽序列重复约2-约100次，含有或不含间插间隔物或接头。在一个实施方案中，肽SEQ ID NO：10的多聚体(在本节中象征性地称为“JJJ”，其中J、J和J不代表单个氨基酸)由以下公式化实例表示：

(JJJ-X_m)_n-JJJ，其中m＝0或1，n＝1-100，X为间隔基，优选C₁-C₂₀烷基、C₁-C₂₀烯基、C₁-C₂₀炔基、含有高达9个氧原子的C₁-C₂₀聚醚或Glyz(z＝1-10)。

应当理解的是，这类多聚体可由本文所述的任何肽或多肽构建。此外，这类多聚体可包含肽单体及其已公开的变体的不同组合。这类寡聚体肽或多聚体肽可通过化学合成或通过本文所述的重组DNA技术制备。如以化学法产生，则寡聚体优选具有2-8个基本肽序列的重复。如以重组法产生，则多聚体可具有与表达系统允许的一样多的重复，例如2-约100个重复。

肽模拟物

用于这个方面的另一类化合物是低分子量“肽模拟化合物”(该术语也包括肽模拟物)。可通过结构研究鉴定这类肽模拟物，该结构研究对PTH或PTHrP肽或多肽类似物之一在候选肽模拟物存在或不存在时与PTH受体的共结晶进行比较。

PTH或PTHrP肽或多肽类似物的肽模拟物模拟PTH或PTHrP肽或多肽类似物之一的生物效应。肽模拟物可以是具有PTH或PTHrP肽或多肽类似物的立体化学性质的非天然肽或非肽物质，使得其具有肽的结合活性或生物活性。因此，本发明包括其中肽模拟化合物与其它肽偶联的化合物。

肽模拟物可以是再现PTH或PTHrP肽或多肽类似物的结合元件的立体空间性质的非天然肽或非肽物质，使得其具有PTH或PTHrP肽或多肽类似物的结合活性或生物活性。与相当于PTH或PTHrP肽或多肽类似物的线性肽类似，肽模拟物可具有结合面(其与PTH受体相互作用)和非结合面。此外，与PTH或PTHrP肽或多肽类似物的线性肽类似，肽模拟物的非结合面可含有可被各种治疗部分修饰但不修饰肽模拟物的结合面的官能团。模拟物的一个实施方案可在分子的非结合面含有苯胺。苯胺的NH2-基团的pKa为约4.5，因此可被任何NH2选择性试剂修饰却又不修饰肽模拟物结合面上的任何NH₂官能团。其它肽模拟物在其结合面上可能无任何NH₂官能团，因此，不考虑pK_a，任何NH₂都可出现在非结合面上作为缀合部位。此外，其它的可修饰官能团(例如--SH和--COOH)中可被掺入肽模拟物的非结合面中作为缀合部位。治疗部分还可在肽模拟物合成期间直接掺入，且优选出现在分子的非结合面上。

本发明还包括保持部分肽特征的化合物。例如，本发明肽内的任何蛋白水解不稳定的键都可被非肽元件例如电子等排物(N-甲基化；S1位点上的D-氨基酸)或者还原肽键选择性置换，同时分子的其余部分仍保持其肽性质。

已披露了许多生物活性肽的肽模拟化合物激动剂、底物或抑制剂，所述生物活性肽例如阿片肽、VIP、凝血酶、HIV蛋白酶等。用于设计和制备肽模拟化合物的方法是本领域已知的((Hruby，V.J.，Biopolymers 33：1073-1082(1993)；Wiley，R.A.等，Med.Res.Rev.13：327-384(1993)；Moore等，Adv.in Pharmacol 33：91-141(1995)；Giannis等，Adv.in Drug Res.29：1-78(1997)，所述参考文献通过引用全部予以结合)。这些方法用于制备具有至少环肽的结合能力和特异性并优选还具有生物活性的肽模拟物。考虑到本公开内容，本领域技术人员可获得的肽化学和普通有机化学的知识足以设计和合成这类化合物。例如，可通过检查本发明的肽(或游离或与PTH受体复合而结合)的获自晶体学的三维结构，来鉴定这类肽模拟物。备选地，可采用核磁共振波谱法获得与PTH受体结合的本发明肽的结构。更好地理解肽与其结合配偶体相互作用的立体化学可供合理设计这类肽模拟物。

拟肽

本发明还包括是N-取代甘氨酸的寡聚体的“拟肽”(Simon R J等，Proc Natl Acad Sci USA，1992 89：9367-9371)。设计非肽、小分子激动剂和拮抗剂的“拟肽”方法也可参见Horwell D C，Trends Biotechnol，1995，13：132-134。PTH或PTHrP肽或多肽类似物的拟肽包括一个或多个这类N-取代甘氨酸的取代或添加。取代基可以是4-氨基苯酚、异丁胺、丁二胺(NH₂(CH₂)₃NH₂)、环己烷甲胺、氨基甲基环丙烷、苄胺、甲胺、异丙胺、R(+)-(L-甲基苄胺)、5-(-1-α-甲基苄胺、N-3-胍基丙基等。Nguyen.J.T.等人(Science 1998，282：2088-2092)之前已证实，这类取代基导致SH3结合拟肽的生物活性提高。然而，取代基实际上可以是在甘氨酸的N位置取代的任何取代基，只要N-甘氨酸产物可在拟肽中进一步偶联。

本发明的PTH或PTHrP肽或多肽类似物(例如SEQ ID NO：10的肽)可在氨基端和羧基端分别用例如与氨基端N结合的乙酰基(“Ac”)和酰氨基(与C端羧基结合的--NH₂(“Am”))阻断或加帽。这种肽可在表示封闭基团为Ac基和Am基的单字母码中提及：Ac-SEQ ID NO：10的残基-Am。

N端加帽官能团优选与末端氨基官能团连接，并可选自：甲酰基；具有1-10个碳原子的烷酰基，例如乙酰基、丙酰基、丁酰基；具有1-10个碳原子的烯酰基，例如己-3-烯酰基；具有1-10个碳原子的炔酰基，例如己-5-炔酰基；芳酰基，例如苯甲酰基或1-萘甲酰基；杂芳酰基，例如3-吡咯甲酰基或4-喹啉酰基；烷基磺酰基，例如甲烷磺酰基；芳基磺酰基，例如苯磺酰基或磺胺酰基；杂芳基磺酰基，例如吡啶-4-磺酰基；具有1-10个碳原子的取代烷酰基，例如4-氨基丁酰基；具有1-10个碳原子的取代烯酰基，例如6-羟基-己-3-烯酰基；具有1-10个碳原子的取代炔酰基，例如3-羟基-己-5-炔酰基；取代芳酰基，例如4-氯苯甲酰基或8-羟基-萘-2-酰基；取代杂芳酰基，例如2，4-二氧代-1，2，3，4-四氢-3-甲基-喹唑啉-6-酰基；取代烷基磺酰基，例如2-氨基乙烷磺酰基；取代芳基磺酰基，例如5-二甲基氨基-1-萘磺酰基；取代杂芳基磺酰基，例如1-甲氧基-6-异喹啉磺酰基；氨基甲酰基或硫代氨甲酰基；取代氨基甲酰基(R′-NH-CO)或取代硫代氨甲酰基(R′-NH-CS)，其中R′为烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、取代烷基、取代烯基、取代炔基、取代芳基或取代杂芳基；取代氨基甲酰基(R′-NH-CO)或取代硫代氨甲酰基(R′-NH-CS)，其中R′是烷酰基、烯酰基、炔酰基、芳酰基、杂芳酰基、取代烷酰基、取代烯酰基、取代炔酰基、取代芳酰基或取代杂芳酰基，全部如上定义；C端加帽官能团可与末端羧基位于酰胺键中或与末端羧基位于酯键中。提供酰胺键的加帽官能团标为NR¹R²，其中R¹和R²可独立选自以下基团：氢；优选具有1-10个碳原子的烷基，例如甲基、乙基、异丙基；优选具有1-10个碳原子的烯基，例如丙-2-烯基；优选具有1-10个碳原子的炔基，例如丙-2-炔基；具有1-10个碳原子的取代烷基，例如羟基烷基、烷氧基烷基、巯基烷基、烷基硫代烷基、卤代烷基、氰基烷基、氨基烷基、烷基氨基烷基、二烷基氨基烷基、烷酰基烷基、羧基烷基、氨基甲酰基烷基；具有1-10个碳原子的取代烯基，例如羟基烯基、烷氧基烯基、巯基烯基、烷基硫代烯基、卤代烯基、氰基烯基、氨基烯基、烷基氨基烯基、二烷基氨基烯基、烷酰基烯基、羧基烯基、氨基甲酰基烯基；具有1-10个碳原子的取代炔基，例如羟基炔基、烷氧基炔基、巯基炔基、烷基硫代炔基、卤代炔基、氰基炔基、氨基炔基、烷基氨基炔基、二烷基氨基炔基、烷酰基炔基、羧基炔基、氨基甲酰基炔基；具有至多10个碳原子的芳酰基烷基，例如苯甲酰甲基或2-苯甲酰基乙基；芳基，例如苯基或1-萘基；杂芳基，例如4-喹啉基；具有1-10个碳原子的烷酰基，例如乙酰基或丁酰基；芳酰基，例如苯甲酰基；杂芳酰基，例如3-喹啉酰基；OR′或NR′R″，其中R′和R″独立地为氢、烷基、芳基、杂芳基、酰基、芳酰基、磺酰基、亚磺酰基；或SO2--R″′或SO--R″′，其中R″′是取代或未取代的烷基、芳基、杂芳基、烯基或炔基。

本文所述的PTH或PTHrP肽或多肽类似物的所有前述变体、融合蛋白、多聚体肽、肽模拟物、拟肽和化学衍生物，必须具有以下的PTH或PTHrP肽或多肽类似物的生物活性或生化活性：至少为下文实施例的测定中测定的PTH或PTHrP肽或多肽类似物的活性的约20％、30％、40％、50％、60、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％。备选地或此外，当在结合测定中用完整细胞、细胞流分、分离的含有PTH受体结合结构域的蛋白质或肽或者任何其它结合分子测试时，PTH或PTHrP肽或多肽类似物的前述变体、融合蛋白、多聚体肽、肽模拟物、拟肽和化学衍生物应与标记的PTH或PTHrP肽或多肽类似物竞争结合PTH受体。

逆反肽(retroinverso peptide)

对于本文公开的每个肽和多肽序列，本发明包括相应的逆-反序列，其中肽链的方向是倒转的，且其中所有的氨基酸属于D型。指定用于L型肽的N端加帽基团的整个范围和C端加帽基团的整个范围也旨在用于D型肽。

构建方法

本发明的肽和多肽可采用重组DNA技术制备。也可采用固相合成制备，例如由Merrifield(J.Amer.Chem.Soc，85：2149-54(1963))概述的固相合成，但是本领域已知的其它等同的化学合成也是有用的。可通过使受保护的α-氨基酸与合适的树脂偶联，从肽的C端开始固相肽合成。可通过将α-氨基受保护的氨基酸经由酯键与氯代甲基化树脂或与羟基甲基树脂连接，或者经由酰胺键与BHA树脂或MBHA树脂连接，来制备这类起始原料。

羟甲基树脂的制备参见Bodansky等，Chem.Ind.，38：1597-98(1966)。氯代甲基化树脂是市售的，可获自BioRad Laboratories，Richmond，Calif以及获自Lab.Systems，Inc。这类树脂的制备参见Stewart等，″Solid Phase Peptide Synthesis″(Freeman & Co.，SanFrancisco 1969)，第1章，1-6。BHA和MBHA树脂支持体是市售的，一般只有当待合成的所需多肽在C端具有未取代的酰胺时才使用。

可采用本领域众所周知的用于肽键形成的技术，使氨基酸与延伸的肽链偶联。例如，一种方法包括使氨基酸转化成可使氨基酸的羧基对与延伸肽链的游离N端氨基的反应更易感的衍生物。具体而言，可通过使C端与氯甲酸乙酯、氯甲酸苯酯、氯甲酸仲丁酯、氯甲酸异丁酯或新戊酰氯等酰基氯反应，将受保护的氨基酸的C端转化成混合酐。或者，可将氨基酸的C端转化成活性酯，例如2，4，5-三氯苯酯、五氯苯酯、五氟苯酯、对硝基苯酯、N-羟基琥珀酰亚胺酯或由1-羟基苯并三唑形成的酯。另一种偶联方法包括使用合适的偶联剂，例如N，N′-二环己基碳二亚胺或N，N′-二异丙基碳二亚胺。对本领域技术人员而言是显而易见的其它合适的偶联剂公开于Gross等，The Peptides：Analysis，Structure，Biology，第I卷，″Major Methods of Peptide BondFormation″(Academic Press 1979)。

在偶联反应期间必须保护用于肽合成的各个氨基酸的α-氨基以防止涉及其活性α-氨基官能团的副反应。某些氨基酸含有反应性侧链官能团(例如巯基、氨基、羧基和羟基)，这类官能团也必须用合适的保护基保护以防止在起始和后续偶联步骤两者期间发生在以下部位的化学反应：(1)α-氨基部位，或(2)反应性侧链部位。

在选择用于合成肽的具体保护基时，通常要遵循下列通则。具体而言，α-氨基保护基(1)在用于偶联反应的条件下应赋予α-氨基官能团惰性，(2)在不会脱去侧链保护基和不会改变肽片段的结构的条件下，在偶联反应后应容易脱去，和(3)在临偶联前，应充分降低激活时消旋的可能性。另一方面，侧链保护基(1)在用于偶联反应的条件下应赋予侧链官能团惰性，(2)在用于脱去α-氨基保护基的条件下应是稳定的，和(3)在不会改变肽链的结构的反应条件下，应容易地从所需完全装配的肽上脱去。

对本领域技术人员显而易见的是，已知用于肽合成的保护基随用于其脱去的试剂而在反应性方面不同。例如某些保护基，例如三苯基甲基和2-(对联苯基)异丙氧基羰基，是非常不稳定的，在温和酸条件下可被裂解。叔丁氧基羰基(BOC)、叔戊氧基羰基、金刚烷基氧基羰基和对甲氧基苄氧基羰基等其它保护基的不稳定性较低，其脱去需要中等强度的酸，例如三氟乙酸、盐酸或三氟化硼的乙酸溶液。苄氧基羰基(CBZ或Z)、卤代苄氧基羰基、对硝基苄氧基羰基、环烷基氧基羰基和异丙氧基羰基等其它保护基的不稳定性甚至更低，其脱去需要甚至更强的酸，例如氟化氢、溴化氢或三氟乙酸硼的三氟乙酸溶液。本领域已知的合适保护基参见Gross等，The Peptides：Analysis，Structure，Biology，第3卷：″Protection of Functional Groups in PeptideSynthesis″(Academic Press 1981)。

一些α-氨基保护基是BOC和FMOC。对于存在于Lys上的侧链氨基，可通过上文(1)中提及的任何基团予以保护，例如BOC、2-氯苄氧基羰基等。对于Arg的胍基，可通过硝基、甲苯磺酰基、CBZ、金刚烷基氧基羰基、2，2，5，7，8-五甲基苯并二氢吡喃-6-磺酰基、2，3，6-三甲基-4-甲氧基苯基磺酰基或BOC基团提供保护。对于Ser或Thr的羟基，可通过例如叔丁基；苄基(BZL)；或取代的BZL，例如对甲氧基苄基、对硝基苄基、对氯苄基、邻氯苄基和2，6-二氯苄基予以保护。对于Asp或Glu的羧基，可使用诸如BZL、叔丁基、环己基、环戊基等这类基团，通过例如酯化予以保护。对于His的咪唑氮，适宜用苄氧基甲基(BOM)或甲苯磺酰基(tosyi)部分作为保护基。对于Tyr的酚羟基，适宜采用例如四氢吡喃基、叔丁基、三苯甲基、BZL、氯苄基、4-溴苄基和2，6-二氯苄基等保护基。优选的保护基为溴苄氧基羰基。对于Asn或Gln的侧链氨基，优选使用呫吨基(Xan)。对于Met，优选氨基酸是未保护的。对于Cys的巯基，通常使用对甲氧基苄基。

其它标准的α-氨基脱保护试剂(例如HCl/二噁烷)和用于脱去特定α-氨基保护基的条件为本领域技术人员所掌握，例如Lubke等，Chemieund Biochemie der Aminosauren，Peptide und Proteine I，第II-1章，102-117(Georg Thieme Verlag Stuttgart 1975)中描述的那些。在脱去α-氨基保护基后，未保护的α-氨基，一般仍是侧链受保护的，可在预定序列中以逐步方式偶联。

逐步方法的备选方法是片段缩合方法，其中使预形成的长度短的肽(各代表所需序列的部分)与结合固相支持体的延伸氨基酸链偶联。对于这种逐步方法，特别合适的偶联试剂是N，N′-二环己基碳二亚胺或二异丙基碳二亚胺。同样，对于片段方法，选择偶联试剂以及选择为使所需性质和大小的片段偶联所需要的断裂方式对于成功是重要的，并且是本领域技术人员已知的。

通常将各个受保护的氨基酸或氨基酸序列以超过化学计算量的量导入固相反应器中，且偶联适宜在有机溶剂中进行，例如二甲基甲酰胺(DMF)、CH2Cl2或其混合物。如果发生不完全偶联，则通常在准备与下一个氨基酸偶联中脱去N-氨基保护基之前，重复偶联步骤。在脱去α-氨基保护基后，其余的α-氨基和侧链受保护的氨基酸可在预定序列中以逐步方式偶联。可以监测每个合成阶段中偶联反应的成功。监测合成的优选方法是通过茚三酮反应，参见Kaiser等，Anal.Biochem.，34：595(1970)。也可采用众所周知的市售方法和装置自动进行偶联反应，例如Beckman 990 Peptide Synthesizer。

在完成所需要的肽序列时，必须将受保护的肽从树脂支持体上切割下来，并且必须脱去所有的保护基。保护基的切割反应和脱去适宜与脱保护反应同时或相继完成。如果将肽锚定在树脂上的键是酯键，则可通过能够破坏酯键并能够渗入树脂基质的任何试剂切割。一种有用的方法是通过用液态无水氟化氢处理。这种试剂一般不仅仅将肽从树脂上切割下来，而且还将脱去所有的酸不稳定保护基，因此，将直接提供完全脱保护的肽。如果不是酸不稳定的其它保护基存在时，则必须进行其它脱保护步骤。可按照具体需要和情况，在上述氟化氢处理之前或之后进行这些步骤。

如果需要切割肽而不脱去保护基，则可对受保护的肽-树脂进行甲醇分解，因此产生受保护的肽，其中C端羧基是甲基化的。这种甲基酯随后可在温和的碱性条件下水解，得到游离C端羧基。然后可通过用强酸(例如液态氟化氢)处理脱去肽链上的保护基。甲醇分解的一种特别有用的技术是Moore等，Peptides，Proc.Fifth Amer.Pept.Symp.，518-521(Goodman等编辑，1977)中的技术，其中受保护的肽-树脂在冠醚存在下用甲醇和氰化钾处理。

如果采用氯代甲基化树脂，则用于将受保护的肽从树脂上切割下来的其它方法包括(1)氨解，和(2)肼解。如有需要，可将所得C端酰胺或酰肼水解成游离C端羧基部分，并按常规方法脱去保护基。可在将受保护的肽从支持体上切割下来之前或之后，脱去存在于N端α-氨基上的保护基。通常采用层析技术实现本发明肽的纯化，例如制备HPLC(包括反相HPLC)、凝胶渗透层析、离子交换层析、分配层析、亲和层析(包括单克隆抗体柱)等，或者其它常规技术，例如反流分布法等。

药物组合物、制剂、途径和剂量

本发明的药物组合物在本领域本身已知的制剂中包含PTH或PTHrP肽或多肽类似物(及其变体、融合蛋白、多聚体肽、肽模拟物、拟肽和化学衍生物)。本发明的药物制剂按已知方法制备，例如通过常规混合、制粒、溶解或冻干步骤。合适的赋形剂可包括填充剂、粘合剂、崩解剂、助剂和稳定剂，所有这些都是本领域已知的。用于胃肠外给药的合适制剂包括水溶性形式(例如水溶性盐)的蛋白质的水溶液剂。另外，可以给予活性化合物的混悬剂作为适当的油性注射混悬剂。合适的亲脂性溶剂或溶媒包括脂肪油(例如芝麻油)或合成脂肪酸酯，例如油酸乙酯或甘油三酯。水性注射混悬剂可含有可增加混悬剂的粘度的物质。绝对必要的是，溶媒、载体或赋形剂以及配制组合物的条件不得不利地影响PTH或PTHrP肽或多肽类似物的生物活性或药物活性。

组合物可呈冻干微粒材料、灭菌或无菌产生的溶液剂、片剂、安瓿剂等形式。可存在溶媒，例如水(优选缓冲至生理上可接受的pH，例如在磷酸缓冲盐溶液中)或其它惰性固体或液体材料，例如生理盐水或各种缓冲剂。具体的溶媒不是决定性的，本领域技术人员应了解哪种溶媒可用作本文所述的任何具体用途。

本发明的其它药学上可接受的载体为脂质体，活性蛋白包含在其中的药物组合物分散或不同地存在于小体中，小体由附在脂质层上的水性同心层组成。活性蛋白优选存在于内部或外部的水层和脂质层中，或者在任何情况下，都存在于一般称为脂质体混悬液的非均质系统中。

疏水层或脂质层一般但并非排它地包含磷脂(例如卵磷脂和鞘磷脂)、类固醇(例如胆固醇)、或多或少的离子型表面活性物质(例如磷酸联十六烷酯、硬脂胺或磷脂酸)和/或具有疏水性质的其它材料。

可配制本发明的全身给药的药物制剂用于肠内、胃肠外或局部给药，且可同时使用所有三种类型的制剂以实现活性成分的全身给药。

除药理活性肽或多肽类似物以外，在一些方面，药物组合物含有合适的药学上可接受的载体，所述载体包括赋形剂和助剂，其有利于将活性化合物加工成可在药学上使用的制剂，如本领域众所周知的。通过注射或口服给予的合适溶液剂可含有约0.01-99％活性化合物以及赋形剂。

表述“药学上可接受的”是指生理上容许的并且给予人时一般不会产生变态反应或类似不良反应(例如胃反应(gastric upset)、眩晕等)的分子实体和组合物。优选本文使用的术语“药学上可接受的”是指经过联邦政府或州政府管理机构批准或者登录于美国药典或其它普遍公认的药典，可用于动物、更特别用于人。可通过实现其预定目的的任何方法给予本发明的药物组合物。治疗任何具体疾病的临床领域的普通技术人员可容易地确定给药的量和方案。优选的量如下所述。

本发明的方法包括通过胃肠外途径给药，胃肠外途径包括皮下(s.c.)、静脉内(i.v.)、肌内、腹膜内、鞘内、经皮、局部或吸入途径。优选的途径是通过注射。备选地或者同时地，可通过口服途径给予。所给予的剂量将取决于接受者的年龄、健康状况和体重、同时治疗的种类(如有的话)、治疗频率和所需效果的性质。

在本发明的方法中，组合物可给予一次，但也可给予6-12次(甚至更多次，正如本领域技术人员凭经验所掌握的一样)。治疗可每天进行，但也可每两天或每三天或者如一周一次不频繁地进行，这取决于在受治疗者中观察到的有益作用和任何毒性作用。

可将本文公开的药物制剂设计成下文所述的短效、速释、长效或缓释的。还可配制药物制剂用于即释、控释或慢释。本发明的组合物还可包括例如微团或脂质体或某些其它微囊形式，或者可以缓释形式给予以提供长期保存和/或递送效果。可按照任何方案，包括例如每日(每天1次、每天2次、每天3次、每天4次、每天5次、每天6次)、每两天、每三天、每四天、每五天、每六天、每周、每两周、每三周、每月或每两月一次地给予本公开内容的药物制剂。

按照一些实施方案，提供一种药物组合物，其包含本文所公开的优选无菌的且优选纯度水平为至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的任何PTH肽、PTHrP肽(或相关类似物或变体或化学衍生物、融合多肽、多聚体多肽、肽模拟物、拟肽、逆反肽)和药学上可接受的稀释剂、载体或赋形剂。这类组合物可含有浓度至少为A的PTH肽或PTHrP肽，其中A为0.001mg/ml、0.01mg/ml、0.1mg/ml、0.5mg/ml、1mg/ml、2mg/ml、3mg/ml、4mg/ml、5mg/ml、6mg/ml、7mg/ml、8mg/ml、9mg/ml、10mg/ml、11mg/ml、12mg/ml、13mg/ml、14mg/ml、15mg/ml、16mg/ml、17mg/ml、18mg/ml、19mg/ml、20mg/ml、21mg/ml、22mg/ml、23mg/ml、24mg/ml、25mg/ml或更高。在其它实施方案中，这类组合物可含有浓度至多为B的PTH肽或PTHrP肽，其中B为30mg/ml、25mg/ml、24mg/ml、23mg/ml、22mg/ml、21mg/ml、20mg/ml、19mg/ml、18mg/ml、17mg/ml、16mg/ml、15mg/ml、14mg/ml、13mg/ml、12mg/ml、11mg/ml、10mg/ml、9mg/ml、8mg/ml、7mg/ml、6mg/ml、5mg/ml、4mg/ml、3mg/ml、2mg/ml、1mg/ml或0.1mg/ml。在一些实施方案中，组合物可含有浓度范围为A-B mg/ml的PTH肽或PTHrP肽，例如0.001-30.0mg/ml。在一个实施方案中，药物组合物包含灭菌并任选保存在各种容器中的水溶液。本公开内容的PTH肽或PTHrP肽可用于一个实施方案以制备即用于注射的预配制溶液剂。在其它实施方案中，药物组合物包含冻干粉。可将药物组合物进一步包装作为本文另描述的药盒的一部分，药盒包括将组合物给予患者的一次性装置。容器或药盒可标明保存在环境室温下或保存在冷冻温度下。

药物组合物可包含任何药学上可接受的成分，包括例如酸化剂、添加剂、吸附剂、气雾剂抛射剂、排气剂、碱化剂、防结块剂、抗凝血剂、抗微生物防腐剂、抗氧化剂、抗菌剂、基质、粘合剂、缓冲剂、螯合剂、包衣剂、着色剂、干燥剂、洗涤剂、稀释剂、消毒剂、崩解剂、分散剂、促溶剂、染料、软化剂、乳化剂、乳液稳定剂、填充剂、成膜剂、增味剂、矫味剂、促流动剂、胶凝剂、成粒剂、湿润剂、润滑剂、粘膜粘着剂、软膏基质、软膏、油性溶媒、无机基质、软锭剂基质、色素、增塑剂、磨光剂、防腐剂、掩蔽剂、皮肤渗透剂、增溶剂、溶剂、稳定剂、栓剂基质、表面活性剂、表面活性物质、助悬剂、甜味剂、治疗剂、增稠剂、张度剂、毒性剂、增粘剂、吸水剂、水可混溶性共溶剂、水软化剂或润湿剂。

在一些实施方案中，药物组合物包含下列组分的任一种或组合：阿拉伯胶、乙酰舒泛钾、柠檬酸乙酰基三丁酯、柠檬酸乙酰基三乙酯、琼脂、白蛋白、醇、无水醇、变性醇、稀释酒精、油桐酸、海藻酸、脂肪族聚酯、氧化铝、氢氧化铝、硬脂酸铝、支链淀粉、α-直链淀粉、抗坏血酸、抗坏血酸棕榈酸酯、阿司帕坦、注射用抑菌水、皂土、皂土乳浆、苯扎氯铵、苄索氯铵、苯甲酸、苯甲醇、苯甲酸苄酯、溴硝丙二醇、丁羟茴醚、丁羟甲苯、羟苯丁酯、羟苯丁酯钠、藻酸钙、抗坏血酸钙、碳酸钙、环拉酸钙、无水磷酸氢钙、磷酸氢钙二水合物(dibasic dehydrate calcium phosphate)、磷酸三钙、丙酸钙、硅酸钙、山梨酸钙、硬脂酸钙、硫酸钙、硫酸钙半水合物、卡诺拉油(canola oil)、卡波姆、二氧化碳、羧甲基纤维素钙、羧甲基纤维素钠、β-胡萝卜素、角叉菜胶、蓖麻油、氢化蓖麻油、阳离子乳化蜡、乙酸纤维素、醋酞纤维素、乙基纤维素、微晶纤维素、粉状纤维素、硅化微晶纤维素、羧甲基纤维素钠、十六醇十八醇混合物、溴化十六烷基三甲铵、鲸蜡醇、氯己定、三氯叔丁醇、氯甲酚、胆固醇、醋酸氯己定、葡萄糖酸氯己定、盐酸氯己定、一氯二氟乙烷(HCFC)、一氯二氟甲烷、氯氟烃(CFC)、氯苯氧乙醇、氯二甲苯酚、玉米糖浆固体、无水柠檬酸、柠檬酸一水合物、可可脂、着色剂、玉米油、棉籽油、甲酚、间甲酚、邻甲酚、对甲酚、交联羧甲纤维素钠、交聚维酮、环拉酸、环糊精、葡萄糖结合剂、糊精、葡萄糖、无水葡萄糖、二唑烷基脲(diazolidinylurea)、邻苯二甲酸二丁酯、癸二酸二丁酯、二乙醇胺、邻苯二甲酸二乙酯、二氟乙烷(HFC)、二甲基-β-环糊精、环糊精型化合物(例如Captisol

)、二甲醚、邻苯二甲酸二甲酯、依地酸二钾(dipotassiumedentate)、依地酸二钠、磷酸氢二钠、多库酯钙、多库酯钾、多库酯钠、没食子酸十二醇酯、十二烷基三甲基溴铵、依地酸钙二钠、依地酸(edtic acid)、乙葡胺、乙醇、乙基纤维素、没食子酸乙酯、月桂酸乙酯、乙基麦芽酚、油酸乙酯、羟苯乙酯、羟苯乙酯钾、羟苯乙酯钠、乙香草醛、果糖、液状果糖、碾磨果糖、无热原果糖、粉状果糖、富马酸、明胶、葡萄糖、液状葡萄糖、饱和植物脂肪酸的甘油酯混合物、甘油、甘油二十二烷酸酯、甘油单油酸酯、甘油单硬脂酸酯、自乳化甘油单硬脂酸酯、柠檬酸硬脂酸甘油酯、甘氨酸、二醇类、glycofurol、瓜尔胶、五氟丙烷(HFC)、十六烷基三甲基溴化铵、高果糖浆、人血清白蛋白、烃(HC)、稀盐酸、II型氢化植物物、羟乙基纤维素、2-羟乙基-β-环糊精、羟丙基纤维素、低取代羟丙基纤维素、2-羟丙基-β-环糊精、羟丙基甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯、咪脲、靛胭脂、离子交换剂、氧化铁、异丙醇、肉豆蔻酸异丙酯、棕榈酸异丙酯、等渗盐水、高岭土、乳酸、拉克替醇、乳糖、羊毛脂、羊毛脂醇类、无水羊毛脂、卵磷脂、硅酸镁铝、碳酸镁、正常碳酸镁、无水碳酸镁、碱式碳酸镁、氢氧化镁、月桂基硫酸镁、氧化镁、硅酸镁、硬脂酸镁、三硅酸镁、无水三硅酸镁、苹果酸、麦芽、麦芽糖醇、麦芽糖醇溶液、麦芽糖糊精、麦芽酚、麦芽糖、甘露醇、中链甘油三酯、葡甲胺、薄荷脑、甲基纤维素、甲基丙烯酸甲酯、油酸甲酯、羟苯甲酯、羟苯甲酯钾、羟苯甲酯钠、微晶纤维素和羧甲基纤维素钠、矿物油、轻质矿物油、矿物油和羊毛脂醇、油、橄榄油、单乙醇胺、蒙脱石、没食子酸辛酯、油酸、棕榈酸、石蜡、花生油、凡士林、凡士林和羊毛脂醇、药用釉料、苯酚、液化苯酚、苯氧基乙醇、苯氧基丙醇、苯基乙醇、醋酸苯汞、硼酸苯汞、硝酸苯汞、聚克立林、聚克立林钾、泊洛沙姆、聚葡萄糖、聚乙二醇、聚环氧乙烷、聚丙烯酸脂、聚乙烯-聚氧丙烯-嵌段聚合物、聚甲基丙烯酸酯、聚氧乙烯烷基醚、聚氧乙烯蓖麻油衍生物、聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯、聚氧乙烯硬脂酸酯、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、藻酸钾、苯甲酸钾、碳酸氢钾、亚硫酸氢钾、氯化钾、柠檬酸钾、无水柠檬酸钾、磷酸氢钾、焦亚硫酸钾、磷酸二氢钾、丙酸钾、山梨酸钾、聚维酮、丙醇、丙酸、碳酸丙烯、丙二醇、丙二醇藻酸酯、没食子酸丙酯、羟苯丙酯、羟苯丙酯钾、羟苯丙酯钠、硫酸鱼精蛋白、油菜籽油、林格氏液、糖精、糖精铵、糖精钙、糖精钠、红花油、皂石、血清蛋白、芝麻油、胶态硅石、胶态二氧化硅、藻酸钠、抗坏血酸钠、苯甲酸钠、碳酸氢钠、亚硫酸氢钠、氯化钠、无水柠檬酸钠、柠檬酸钠二水合物(sodium citrate dehydrate)、氯化钠、环拉酸钠、依地酸钠、十二烷基硫酸钠、月桂基硫酸钠、焦亚硫酸钠、磷酸氢钠、磷酸二氢钠、磷酸三钠、无水丙酸钠、丙酸钠、山梨酸钠、羟基乙酸淀粉钠、硬脂酰醇富马酸钠、亚硫酸钠、山梨酸、山梨坦酯(脂肪酸山梨坦酯)、山梨糖醇、山梨糖醇溶液70％、大豆油、鲸蜡、淀粉、玉米淀粉、马铃薯淀粉、预糊化淀粉、可灭菌玉米淀粉、硬脂酸、纯化硬脂酸、硬脂醇、蔗糖、糖、可压糖、糖果剂的糖、糖球、转化糖、蔗糖-转化糖聚合物(Sugartab)、Sunset Yellow FCF、合成石蜡、滑石粉、酒石酸、酒石黄、四氟乙烷(HFC)、可可油、硫柳汞、二氧化钛、α生育酚、醋酸维生素E、α琥珀酸维生素E、β-生育酚、δ-生育酚、γ-生育酚、西黄蓍胶、三醋精、柠檬酸三丁酯、三乙醇胺、柠檬酸三乙酯、三甲基-β-环糊精、三甲基十四烷基溴化铵、三羟甲基氨基甲烷缓冲液、依地酸三钠、香草醛、I型氢化植物油、水、软水、硬水、无二氧化碳水、无热原水、注射用水、无菌吸入用水、注射用无菌水、冲洗用无菌水、蜡、阴离子乳化蜡、巴西棕榈蜡、阳离子乳化蜡、十六烷基酯蜡、微晶蜡、非离子乳化蜡、栓剂蜡、白蜡、黄蜡、白矿脂、羊毛脂、黄原胶、木糖醇、玉米醇溶蛋白、丙酸锌、锌盐、硬脂酸锌或通过引用全部予以结合的Handbook of PharmaceuticalExcipients，第3版，A.H.Kibbe(Pharmaceutical Press，London，UK，2000)中的任何赋形剂。Remington′s Pharmaceutical Sciences，第16版，E.W.Martin(Mack Publishing Co.，Easton，Pa.，1980)(其通过引用全部予以结合)公开了用于配制药学上可接受的组合物的各种组分和用于其制备的已知技术。除非任何常规物质与药物组合物不相容，否则包括其在药物组合物中的用途。还可将补充活性成分掺入组合物中。

在一些实施方案中，前述组分可以任何浓度存在于药物组合物中，例如至少A，其中A为0.0001％w/v、0.001％w/v、0.01％w/v、0.1％w/v、1％w/v、2％w/v、5％w/v、10％w/v、20％w/v、30％w/v、40％w/v、50％w/v、60％w/v、70％w/v、80％w/v或90％w/v。在一些实施方案中，前述组分可以任何浓度存在于药物组合物中，例如至多B，其中B为90％w/v、80％w/v、70％w/v、60％w/v、50％w/v、40％w/v、30％w/v、20％w/v、10％w/v、5％w/v、2％w/v、1％w/v、0.1％w/v、0.001％w/v或0.0001％。在其它实施方案中，前述组分可以任何浓度范围存在于药物组合物中，例如约A-约B。在一些实施方案中，A为0.0001％，B为90％。

可配制药物组合物以达到生理上相容的pH。在一些实施方案中，药物组合物的pH可为至少5、至少5.5、至少6、至少6.5、至少7、至少7.5、至少8、至少8.5、至少9、至少9.5、至少10或至少10.5直到并包括pH 11，这取决于制剂和给药途径。在某些实施方案中，药物组合物可包含缓冲剂以达到生理上相容的pH。缓冲剂可包括能够在所需要的pH下缓冲的任何化合物，例如磷酸缓冲剂(例如PBS)、三乙醇胺、Tris、N-二(羟乙基)甘氨酸、TAPS、曲辛、HEPES、TES、MOPS、PIPES、卡可基酸盐、MES等。在某些实施方案中，缓冲剂的强度为至少0.5mM、至少1mM、至少5mM、至少10mM、至少20mM、至少30mM、至少40mM、至少50mM、至少60mM、至少70mM、至少80mM、至少90mM、至少100mM、至少120mM、至少150mM或至少200mM。在一些实施方案中，缓冲剂的强度不超过300mM(例如至多200mM、至多100mM、至多90mM、至多80mM、至多70mM、至多60mM、至多50mM、至多40mM、至多30mM、至多20mM、至多10mM、至多5mM、至多1mM)。

给药途径

有关给药途径的下列论述仅提供用于举例说明示例性的实施方案，不应理解为以任何方式限制范围。

适于口服给予的制剂可包括：(a)液体溶液剂，例如溶于水、盐水或橙汁等稀释剂中的有效量的本公开内容的类似物；(b)各含有预定量的作为固体或颗粒的活性成分的胶囊剂、小药囊剂、片剂、糖锭剂和锭剂；(c)散剂；(d)合适液体中的混悬剂；和(e)合适的乳剂。液体制剂可包括稀释剂，例如水和醇，例如乙醇、苯甲醇和聚乙二醇，含或不含添加的药学上可接受的表面活性剂。胶囊剂形式可以是普遍的硬壳或软壳明胶类型，其含有例如表面活性剂、润滑剂和惰性填充剂，例如乳糖、蔗糖、磷酸钙和玉米淀粉。片剂形式可包含以下的一种或多种：乳糖、蔗糖、甘露醇、玉米淀粉、马铃薯淀粉、海藻酸、微晶纤维素、阿拉伯胶、明胶、瓜尔胶、胶态二氧化硅、交联羧甲纤维素钠、滑石粉、硬脂酸镁、硬脂酸钙、硬脂酸锌、硬脂酸和其它赋形剂、着色剂、稀释剂、缓冲剂、崩解剂、湿润剂、防腐剂、矫味剂和其它药理上相容的赋形剂。除含有本领域已知的这类赋形剂以外，糖锭剂形式可在调料中包含本公开内容的类似物，调料通常为蔗糖和阿拉伯胶或西黄蓍胶，以及软锭剂在惰性基质中包含本公开内容的类似物，惰性基质例如明胶和甘油，或者蔗糖和阿拉伯树胶、乳剂、凝胶等。

本公开内容的PTH肽、PTHrP肽(或相关类似物或变体或化学衍生物、融合多肽、多聚体多肽、肽模拟物、拟肽、逆反肽)，可单独或与其它合适的组分联合通过经肺给药递送，并且可制成气雾剂以通过吸入给予。可将这些气雾剂制剂装入加压的可接受的抛射剂中，例如二氯二氟甲烷、丙烷、氮等。它们也可配成用于非加压制剂(例如喷雾器或雾化器中)中的药物。这类喷雾剂制剂还可用来喷淋粘膜。在一些实施方案中，将PTH肽、PTHrP肽(或相关类似物或变体或化学衍生物、融合多肽、多聚体多肽、肽模拟物、拟肽、逆反肽)配成粉末混合物或配成微粒或纳米粒。合适的经肺制剂是本领域已知的。参见例如Qian等，Int J Pharm 366：218-220(2009)；Adjei和Garren，Pharmaceutical Research，7(6)：565-569(1990)；Kawashima等，JControlled Release 62(1-2)：279-287(1999)；Liu等，Pharm Res 10(2)：228-232(1993)；国际专利申请公开号WO 2007/133747和WO2007/141411。

适于胃肠外给药的制剂包括含水和无水的等渗无菌注射溶液剂，其可含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和使制剂与预期接受者血液等渗的溶质；以及含水和无水的无菌混悬剂，其可包括助悬剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂和防腐剂。术语“胃肠外”是指不通过消化道而通过某些其它途径，例如皮下、肌内、脊柱内或静脉内。本公开内容的PTH肽、PTHrP肽(或相关类似物或变体或化学衍生物、融合多肽、多聚体多肽、肽模拟物、拟肽、逆反肽)可与药用载体中的生理上可接受的稀释剂一起给予，药用载体例如无菌液体或液体混合物，包括水、盐水、葡萄糖水溶液和有关糖溶液、醇(例如乙醇或十六醇)、二醇(例如丙二醇或聚乙二醇)、二甲亚砜、甘油、缩酮(例如2，2-二甲基-153-二氧杂环戊烷-4-甲醇)、醚、聚(乙二醇)400、油、脂肪酸、脂肪酸酯或甘油酯、或含或不含添加的以下药学上可接受的表面活性剂的乙酰化脂肪酸甘油酯：例如皂或洗涤剂、助悬剂(例如果胶，卡波姆，甲基纤维素，羟丙基甲基纤维素或羧甲基纤维素)或乳化剂和其它药用辅料。

可用于胃肠外制剂的油包括石油、动物油、植物油或合成油。油的具体实例包括花生油、大豆油、芝麻油、棉籽油、玉米油、橄榄油、凡士林油和矿物油。用于胃肠外制剂的合适的脂肪酸包括油酸、硬脂酸和异硬脂酸。油酸乙酯和肉豆蔻酸异丙酯是合适的脂肪酸酯的实例。

用于胃肠外制剂的合适的皂包括脂肪碱金属盐、铵盐和三乙醇胺盐，和合适的洗涤剂包括(a)阳离子洗涤剂，例如二甲基二烷基卤化铵和烷基吡啶

卤化物，(b)阴离子洗涤剂，例如烷基磺酸盐、芳基磺酸盐和烯烃磺酸盐、烷基硫酸盐、烯烃硫酸盐、醚硫酸盐和甘油一硫酸酯盐以及磺基琥珀酸盐，(c)非离子洗涤剂，例如脂肪胺氧化物、脂肪酸烷醇酰胺和聚氧乙烯聚丙烯共聚物，(d)两性洗涤剂，例如烷基-β-氨基丙酸盐和2-烷基-咪唑啉季铵盐，和(e)其混合物。

胃肠外制剂通常在溶液中含有约0.5％-约25％重量的本公开内容的PTH肽、PTHrP肽(或相关类似物或变体或化学衍生物、融合多肽、多聚体多肽、肽模拟物、拟肽、逆反肽)。可以使用防腐剂和缓冲剂。为了最小化或消除对注射部位的刺激，这类组合物可含有一种或多种亲水-亲脂平衡(HLB)为约12-约17的非离子表面活性剂。这类制剂中表面活性剂的量通常为约5％-约15％重量。合适的表面活性剂包括聚乙二醇脱水山梨糖醇脂肪酸酯，例如脱水山梨糖醇单油酸酯和环氧乙烷与通过环氧丙烷与丙二醇缩合形成的疏水性基质的高分子量加合物。胃肠外制剂可以单位剂量或多剂量密封容器存在，例如安瓿和小瓶，并且可保存在冷冻干燥(冻干)条件下，临用前只需要加入注射用无菌液体赋形剂，例如水。临时注射溶液剂和混悬剂可由前述各种无菌散剂、颗粒剂和片剂制备。

注射制剂与本发明的一致。注射组合物的有效药用载体的要求为本领域普通技术人员所熟知(参见例如Pharmaceutics and PharmacyPractice，J.B.Lippincott Company，Philadelphia，PA，Banker和Chalmers编著，第238-250页(1982)；以及ASHP Handbook on InjectableDrugs，Toissel，第4版，第622-630页(1986))。

另外，可通过与各种基质(例如乳化基质或水溶性基质)混合将本公开内容的PTH肽、PTHrP肽(或相关类似物或变体或化学衍生物、融合多肽、多聚体多肽、肽模拟物、拟肽、逆反肽)制成用于直肠给药的栓剂。适于阴道给药的制剂可呈除活性成分以外含有本领域已知合适的载体的阴道栓剂、塞子、乳膏剂、凝胶、糊剂、泡沫剂或喷雾剂制剂。

本领域技术人员应理解的是，除上述药物组合物以外，可将本公开内容的PTH肽、PTHrP肽(或相关类似物或变体或化学衍生物、融合多肽、多聚体多肽、肽模拟物、拟肽、逆反肽)配制成包合络合物(例如环糊精包合络合物)或脂质体。

剂量

本发明范围内的药物组合物包括其中肽或多肽类似物的含有量足以达到预定目的的所有组合物。虽然个体的需要有变化，但是各组分的有效量的最佳范围的确定在本领域技术人员的掌握之中。通常剂量包括0.1-100mg/kg/体重。

对于本公开内容的目的，所给予的本公开内容的PTH肽、PTHrP肽(或相关类似物或变体或化学衍生物、融合多肽、多聚体多肽、肽模拟物、拟肽、逆反肽)的量或剂量在合理的时限内在受治疗者或动物中应足以实现例如治疗或预防反应。例如，本公开内容的PTH肽、PTHrP肽(或相关类似物或变体或化学衍生物、融合多肽、多聚体多肽、肽模拟物、拟肽、逆反肽)的剂量应在从给药时起约1-4分钟、1-4小时或1-4周或更长(例如5-20或更多周)的时间内，足以刺激本文所述cAMP的细胞分泌或在细胞中积累或者足以激活细胞中的PTH受体、治疗患有骨损失相关疾病或病症的受治疗者、改善骨质疏松症相关症状、延缓骨质疏松症的进展或者使骨再生。在某些实施方案中，时间可能甚至更久。可根据本公开内容的具体PTH肽、PTHrP肽(或相关类似物或变体或化学衍生物、融合多肽、多聚体多肽、肽模拟物、拟肽、逆反肽)的功效和待治疗的动物(例如人)的状况以及动物(例如人)的体重，来确定剂量。

用于确定所给予的剂量的许多测定是本领域已知的。对于本文的目的，可采用以下测定来确定要给予哺乳动物的起始剂量：包括在一组哺乳动物中比较当将规定剂量的本公开内容的PTH肽、PTHrP肽(或相关类似物或变体或化学衍生物、融合多肽、多聚体多肽、肽模拟物、拟肽、逆反肽)给予哺乳动物时由细胞刺激cAMP的程度，所述一组哺乳动物各给予不同剂量的PTH肽、PTHrP肽(或相关类似物或变体或化学衍生物、融合多肽、多聚体多肽、肽模拟物、拟肽、逆反肽)。测试刺激cAMP产生的程度的方法是本领域已知的，并包括本文实施例1中描述的方法。

还可通过给予本公开内容的具体类似物可能伴发的任何不良副作用的存在情况、性质和程度，来确定本公开内容的PTH肽、PTHrP肽(或相关类似物或变体或化学衍生物、融合多肽、多聚体多肽、肽模拟物、拟肽、逆反肽)的剂量。主治医师通常将考虑例如年龄、体重、一般健康状况、饮食、性别、待给予的本公开内容的PTH肽、PTHrP肽(或相关类似物或变体或化学衍生物、融合多肽、多聚体多肽、肽模拟物、拟肽、逆反肽)、给药途径和待治疗疾病的严重程度等各种因素，以确定用于治疗各个体患者的本公开内容的PTH肽、PTHrP肽(或相关类似物或变体或化学衍生物、融合多肽、多聚体多肽、肽模拟物、拟肽、逆反肽)的剂量。通过实例且不旨在限制本发明，本公开内容的PTH肽、PTHrP肽(或相关类似物或变体或化学衍生物、融合多肽、多聚体多肽、肽模拟物、拟肽、逆反肽)的剂量可为约0.0001-约1g/kg待治疗受治疗者体重/天、约0.0001-约0.001g/kg体重/天或约0.01mg-约1g/kg体重/天。

靶向形式

本领域普通技术人员容易理解的是，可用许多方式对本公开内容的PTH肽、PTHrP肽(或相关类似物或变体或化学衍生物、融合多肽、多聚体多肽、肽模拟物、拟肽、逆反肽)进行修饰，使得通过修饰提高本公开内容的PTH肽、PTHrP肽(或相关类似物或变体或化学衍生物、融合多肽、多聚体多肽、肽模拟物、拟肽、逆反肽)的治疗或预防功效。例如，本公开内容的PTH肽、PTHrP肽(或相关类似物或变体或化学衍生物、融合多肽、多聚体多肽、肽模拟物、拟肽、逆反肽)可与靶向部分直接缀合或通过接头间接缀合。将化合物，例如本文所述的PTH肽、PTHrP肽(或相关类似物或变体或化学衍生物、融合多肽、多聚体多肽、肽模拟物、拟肽、逆反肽)与靶向部分缀合的操作是本领域已知的。参见例如Wadhwa等，J Drug Targeting，3，111-127(1995)和美国专利号5,087,616。本文使用的术语“靶向部分”是指特异性识别和结合细胞表面受体，使得靶向部分引导本公开内容的PTH肽、PTHrP肽(或相关类似物或变体或化学衍生物、融合多肽、多聚体多肽、肽模拟物、拟肽、逆反肽)递送到表面受体在其上表达的细胞群中的任何分子或物质。靶向部分包括但不限于抗体或其片段、肽、激素、生长因子、细胞因子和与细胞表面受体结合的任何其它天然或非天然的配体(例如上皮生长因子受体(EGFR)、T细胞受体(TCR)、B细胞受体(BCR)、CD28、血小板衍生生长因子受体(PDGF)、烟碱乙酰胆碱受体(nAChR)等)。本文使用的“接头”为使两个分离的实体彼此结合的键、分子或分子基团。接头可提供两个实体的最适间距，或者还可提供允许两个实体彼此分开的不稳定键。不稳定键包括光可裂解基团、酸不稳定部分、碱不稳定部分和酶可切割基团。在一些实施方案中，术语“接头”是指使本公开内容的PTH肽、PTHrP肽(或相关类似物或变体或化学衍生物、融合多肽、多聚体多肽、肽模拟物、拟肽、逆反肽)与靶向部分桥接的任何物质或分子。本领域普通技术人员知道，本公开内容的PTH肽、PTHrP肽(或相关类似物或变体或化学衍生物、融合多肽、多聚体多肽、肽模拟物、拟肽、逆反肽)上对于本公开内容的类似物的功能不是必需的部位是用于与接头和/或靶向部分连接的理想部位，前提是，一旦与本公开内容的PTH肽、PTHrP肽(或相关类似物或变体或化学衍生物、融合多肽、多聚体多肽、肽模拟物、拟肽、逆反肽)连接，接头和/或靶向部分不会干扰本公开内容的PTH肽、PTHrP肽(或相关类似物或变体或化学衍生物、融合多肽、多聚体多肽、肽模拟物、拟肽、逆反肽)的功能，即刺激cAMP从细胞分泌、治疗骨质疏松症或癌症的能力。

控释制剂

备选地，可将本文所述PTH肽、PTHrP肽(或相关类似物或变体或化学衍生物、融合多肽、多聚体多肽、肽模拟物、拟肽、逆反肽)修饰成贮库制剂形式，使得相对于时间和机体内的位置控制将本公开内容的PTH肽、PTHrP肽(或相关类似物或变体或化学衍生物、融合多肽、多聚体多肽、肽模拟物、拟肽、逆反肽)释放到其被给予的机体内的方式(参见例如美国专利号4,450,150)。本公开内容的PTH肽、PTHrP肽(或相关类似物或变体或化学衍生物、融合多肽、多聚体多肽、肽模拟物、拟肽、逆反肽)的贮库制剂形式可为例如可植入组合物，所述可植入组合物包含本公开内容的PTH肽、PTHrP肽(或相关类似物或变体或化学衍生物、融合多肽、多聚体多肽、肽模拟物、拟肽、逆反肽)和多孔或非多孔材料(例如聚合物)，其中本公开内容的PTH肽、PTHrP肽(或相关类似物或变体或化学衍生物、融合多肽、多聚体多肽、肽模拟物、拟肽、逆反肽)被所述材料和/或降解的非多孔材料包封或扩散到整个材料和/或降解的非多孔材料中。然后将贮库制剂植入机体内的所需部位，本公开内容的PTH肽、PTHrP肽(或相关类似物或变体或化学衍生物、融合多肽、多聚体多肽、肽模拟物、拟肽、逆反肽)以预定速率从植入物中释放出来。

在某些方面，药物组合物经修饰以具有任何类型的体内释放特征。在一些方面，药物组合物为即释、控释、缓释、延释、迟释或两阶段释放制剂。配制用于控释的肽的方法是本领域已知的。参见例如Qian等，J Pharm 374：46-52(209)和国际专利申请公开号WO2008/130158、WO2004/033036、WO2000/032218和WO 1999/040942。

本发明的组合物还可包含例如微团或脂质体，或者某些其它的包封形式，或者可以缓释形式给予以提供长期保存和/或递送效果。本公开的药物制剂可按照任何方案给予，包括例如每日(每天1次、每天2次、每天3次、每天4次、每天5次、每天6次)、每两天、每三天、每四天、每五天、每六天、每周、每两周、每三周、每月或每两月一次。

组合

本公开内容的PTH肽、PTHrP肽(或相关类似物或变体或化学衍生物、融合多肽、多聚体多肽、肽模拟物、拟肽、逆反肽)可与另一种活性成分联合使用。例如本文公开的PTH肽、PTHrP肽(或相关类似物或变体或化学衍生物、融合多肽、多聚体多肽、肽模拟物、拟肽、逆反肽)可与另一种抗骨质疏松症药一起配制，所述另一种抗骨质疏松症药包括以下的任一种：二膦酸盐类，例如阿仑膦酸盐(Fosamax)、伊班膦酸盐(Boniva)、利塞膦酸盐(Actonel)和唑来膦酸(Reclast)，其减慢骨变薄速度并可导致骨密度提高；雷洛昔芬(Evista)，一种减慢骨变薄并引起骨厚度某种提高的选择性雌激素受体调节剂(SERM)；降钙素(Calcimar或Miacalcin)，一种有助于调节机体中钙水平并且是骨构建过程的部分的天然存在激素；甲状旁腺素(特立帕肽[Forteo])，通过注射给予；雌激素(例如含有或不含孕激素)；睾酮(注射剂、凝胶剂、贴剂)；

在一些实施方案中，本公开内容的PTH肽、PTHrP肽(或相关类似物或变体或化学衍生物、融合多肽、多聚体多肽、肽模拟物、拟肽、逆反肽)与抗癌药一起配制。合适的抗癌药是本领域已知的，包括任一种下列化疗药物：铂配位化合物、拓扑异构酶抑制剂、抗生素、抗有丝分裂生物碱和二氟核苷。

在一些实施方案中，铂配位化合物为顺-二氨二水合铂(II)-离子(diamminediaquoplatinum(II)-ion)；氯(二亚乙基三胺)-氯化铂(II)；二氯(乙二胺)-合铂(II)、二氨(1，1-环丁烷二羧根)合铂(II)(卡铂)；螺铂；异丙铂；二氨(2-乙基丙二酸根)-合铂(II)；乙二胺丙二酸根合铂(II)；水合(1，2-二氨基环己烷(dyclohexane))-硫酸根合铂(II)；(1，2-二氨基环己烷)丙二酸根铂(II)；(4-羧基邻苯二甲酸根)(1，2-二氨基环己烷)合铂(II)；(1，2-二氨基环己烷)-(异柠檬酸根)合铂(II)；(1，2-二氨基环己烷)顺(丙酮酸根)合铂(II)；(1，2-二氨基环己烷)草酸根合铂(II)；奥马铂和四铂。

在一些实施方案中，顺铂是用于本发明的组合物和方法的铂配位化合物。顺铂是在名PLATINOL^TM下由Bristol Myers-SquibbCorporation市售，可作为散剂获得，用于与水、无菌盐水或其它合适的溶媒一起配制。适用于本发明的其它铂配位化合物是已知的，并且是市售可获得的和/或可通过常规技术制备。顺铂或顺式-二氯二氨合铂II，在治疗各种人实体恶性肿瘤中已成功用作化疗药物多年。最近，在治疗各种人实体恶性肿瘤中，其它二氨基-铂络合物也具有作为化疗药物的功效。这类二氨基-铂络合物包括但不限于螺铂和卡铂。虽然顺铂和其它二氨基-铂络合物广泛用于人用化疗药物，但是不得不以可导致毒性问题(例如肾损害)的高剂量水平递送。

在一些实施方案中，化疗药物为拓扑异构酶抑制剂。拓扑异构酶是能够改变真核细胞中DNA拓扑结构的酶。它们对细胞功能和细胞增殖是决定性的。一般来讲，真核细胞中有两类拓扑异构酶，即I型和II型。拓扑异构酶I是分子量约为100,000的单体酶。该酶与DNA结合，引入暂时的单链缺口，解开双螺旋(或使其得以解开)，并随后在与DNA链解离前重新封闭缺口。最近的研究表明各种拓扑异构酶抑制剂在患有卵巢癌、食管癌或非小细胞肺癌的人的治疗中具有临床功效。

在一些方面，拓扑异构酶抑制剂为喜树碱或喜树碱类似物。喜树碱是由中国乡土树喜树(Camptotheca accuminata)和印度乡土树臭味假柴龙树(Nothapodytes foetida)产生的水不溶性细胞毒生物碱。喜树碱表现出针对多种肿瘤细胞的肿瘤细胞生长抑制活性。喜树碱类似物类的化合物通常是DNA拓扑异构酶I的特异性抑制剂。术语“拓扑异构酶的抑制剂”是指在结构上与喜树碱相关的任何肿瘤细胞生长抑制化合物。喜树碱类似物类的化合物包括但不限于托泊替康、伊立替康和9-氨基-喜树碱。

用途

虽然不受任何特定理论束缚，但是如本文首次描述一样，预期本文所述PTH肽和PTHrP肽表现出改变的性质，这种改变的性质赋予提高的治疗潜力。在这一方面，本发明提供治疗非所需骨损失相关疾病或病症的方法。所述方法包括以有效治疗受治疗者的量将本文所述药物组合物给予有需要的受治疗者。

本发明还提供治疗受治疗者的癌症的方法，所述方法包括以有效治疗受治疗者的量将本文所述药物组合物给予有需要的受治疗者。

术语“治疗”是指将包含PTH或PTHrP肽或多肽类似物(变体或化学衍生物)的药物组合物给予受治疗者。本文使用的术语“治疗”不一定意味着100％或完全治愈。更确切地说，存在本领域普通技术人员视之为具有潜在益处或治疗效果的不同的治疗程度。在这方面，本发明的方法可提供治疗哺乳动物的骨质疏松症或癌症的任何水平的任何量。此外，本发明方法所提供的治疗可包括治疗疾病或病症(例如待治疗的骨质疏松症或癌症)的一种或多种病况或症状，和/或可包括延缓疾病或病症的进展。例如治疗骨质疏松症，包括改善骨质疏松症相关症状、延缓骨质疏松症的进展和使骨再生。治疗包括将所述药物给予在出现临床疾病的迹象之前处于发生骨质疏松症或癌症风险的受治疗者，以及尚未进行治疗或已通过其它方法治疗的确诊有骨质疏松症或癌症的受治疗者。因此，本发明可用于预防或抑制骨质疏松症或癌症。

因此，本发明还提供改善骨质疏松症相关症状的方法。在一些实施方案中，骨质疏松症的症状是疼痛、背痛、脊柱、腕或髋骨折和身高损失。所述方法包括以有效改善受治疗者的骨质疏松症相关症状的量将本文所述药物组合物给予有需要的受治疗者。

本发明还提供延缓骨质疏松症的进展的方法。所述方法包括以有效延缓骨质疏松症的进展的量将本文所述药物组合物给予有需要的受治疗者。骨质疏松症的进展(或消退)可通过本领域已知方法监测，包括例如双X射线吸光光度法(dual X-ray absorptiometry，DXA或DEXA)、超声和定量计算体层摄影术(QCT)。

本发明还提供使骨再生的方法。所述方法包括以有效使骨再生的量将本文所述药物组合物给予有需要的受治疗者。可通过本文已知方法监测骨再生，包括例如测量受治疗者的骨矿物密度。

用于治疗骨损失(例如骨质疏松症或癌症)的PTH或PTHrP肽或多肽类似物的有效量或剂量的范围为约0.1-100mg/kg/体重。可优选通过体外注射细胞或体内注射活的动物来测定有效剂量，以便采用本文描述的各种方法确定最佳剂量范围。所给予的剂量将部分取决于接受者的健康状况和体重、其它并行治疗的存在(如有的话)、治疗频率和所需效果的性质。

本文使用的表述“有效量”或“对...有效的量”是指足以治疗或预防的量，且优选足以在血压升高、发热或白细胞计数等病理特征方面减少至少约25％、更优选至少50％、最优选至少90％，这是临床上显著的变化，正如可伴随其存在和活性的。在涉及本发明时，该术语还可指足以改善或逆转骨损失或癌症的量。

在一些实施方案中，非所需骨损失相关疾病或病症是骨质减少或骨质疏松症。

对于本文的目的，癌症可以是任何癌症。本文使用的术语“癌症”是指由异常和不受控制的细胞分裂引起的任何恶性生长或肿瘤，其可通过淋巴系统或血流扩散到机体的其它部分。癌症可以是任何癌症，包括以下的任一种：急性淋巴细胞癌、急性髓细胞白血病、小泡状横纹肌肉瘤、骨癌、脑癌、乳腺癌、肛门、肛管或直肠肛门的癌、眼癌、肝内胆管癌、关节癌、颈、胆囊或胸膜的癌、鼻、鼻腔或中耳的癌、口腔癌、外阴癌、慢性淋巴细胞白血病、慢性骨髓癌、结肠癌、食管癌、宫颈癌、胃肠类癌瘤、霍奇金淋巴瘤(Hodgkin lymphoma)、喉咽癌、肾癌、喉癌、肝癌、肺癌、恶性间皮瘤、黑色素瘤、多发性骨髓瘤、鼻咽癌、非霍奇金淋巴瘤、卵巢癌、胰腺癌、腹膜、网膜和肠系膜的癌、咽癌、前列腺癌、直肠癌、肾癌(例如肾细胞癌(RCC))、小肠癌、软组织癌、胃癌、睾丸癌、甲状腺癌、输尿管癌和膀胱癌。

受治疗者

本文使用的术语“受治疗者”是指任何多细胞的活的有机体。在一些实施方案中，受治疗者是哺乳动物。哺乳动物可以是任何哺乳动物，包括但不限于小鼠和仓鼠等啮齿目(Rodentia)哺乳动物以及兔等兔形目(Logomorpha)哺乳动物。在一些实施方案中，哺乳动物来源于食肉目(Carnivora)，包括猫科(Feline)(猫)和犬科(Canine)(狗)。在一些实施方案中，哺乳动物来源于偶蹄目(Artiodactyla)，包括牛科(Bovine)(牛)和猪科(Swine)(猪)或奇蹄目(Perssodactyla)，包括马科(Equine)(马)。在一些实施方案中，哺乳动物是灵长目(Primate)、Ceboid或Simoid(猴)或类人猿目(Anthropoid)(人和类人猿)的动物。本发明的优选动物受治疗者是哺乳动物。本发明特别用于治疗人受治疗者。

除上述治疗方法以外，可使用PTH肽和PTHrP肽(以及变体、类似物、化学衍生物、融合多肽或多聚体多肽、肽模拟物、拟肽、逆反肽)激活细胞中的PTH受体。所述方法包括将PTH肽或PTHrP肽(或其变体、类似物、化学衍生物、融合多肽或多聚体多肽、肽模拟物、拟肽、逆反肽)给予细胞使得激活PTH受体。

在一些实施方案中，这类方法在体外或离体进行。在这一方面，所述方法可用来监测受治疗者(例如人)的细胞或组织对PTH肽和PTHrP肽(以及变体、类似物、化学衍生物、融合多肽或多聚体多肽、肽模拟物、拟肽、逆反肽)的反应性。在一些实施方案中，进行所述方法用于基础研究目的或临床研究目的。

在一些实施方案中，这类方法在体内进行，使得细胞是活动物细胞，并且将PTH肽和PTHrP肽(以及变体、类似物、化学衍生物、融合多肽或多聚体多肽、肽模拟物、拟肽、逆反肽)给予活的动物，例如人。

在某些情况下，细胞是成骨细胞。当成骨细胞在活动物内时，所述方法可为治疗方法。在成骨细胞不是在活动物内的实施方案中，可进行所述方法用于基础研究或临床研究目的。

在一些实施方案中，细胞在活动物内，而且细胞是淋巴细胞或白细胞。可通过活动物以这种方式产生对PTH肽和PTHrP肽(以及变体、类似物、化学衍生物、融合多肽或多聚体多肽、肽模拟物、拟肽、逆反肽)有特异性的抗体。本文预期抗PTH肽和PTHrP肽(以及变体、类似物、化学衍生物、融合多肽或多聚体多肽、肽模拟物、拟肽、逆反肽)的抗体。

药盒

本发明还提供包括本文所述PTH肽、PTHrP肽、变体、类似物、化学衍生物、融合多肽或多聚体多肽的任一种和使用说明书的药盒。在一些实施方案中，药盒包括将PTH肽、PTHrP肽、变体、类似物、化学衍生物、融合多肽或多聚体多肽给予受治疗者(例如人)的说明书。在一些实施方案中，说明书包括给予患有骨质疏松症或癌症的受治疗者的说明。在一些实施方案中，药盒包括将PTH肽、PTHrP肽、变体、类似物、化学衍生物、融合多肽或多聚体多肽给予受治疗者的装置，例如注射器针头、笔(pen)装置、射流注射器或其它无针注射器。备选地或者此外，药盒可包括一个或多个容器，例如小瓶、管、瓶、单室或多室预灌装注射器、针筒、输注泵(外用或可植入)、射流注射器、预灌装笔装置等，任选预包装有冻干形式或水溶液剂的PTH肽、PTHrP肽、变体、类似物、化学衍生物、融合多肽、多聚体多肽。

现已对本发明进行了一般性描述，通过参照下列实施例可更容易地理解本发明，所述实施例通过举例说明而提供，并无意限制本发明，除非另有规定。

实施例

实施例1

实施例2-5的材料与方法

蛋白质纯化和肽合成。之前描述了含有与MBP的C端融合的PTH1R的残基29-187的MBP-PTH1R ECD-(His)6融合蛋白(27)。如补充方法所述，制备了无MBP且在N端生物素化标签的单个位点上经生物素化的分离的PTH1R ECD(残基23-191)。委托SynBioSci(Livermore，CA)合成了用于ECD结合研究和结晶的肽，并进行了HPLC纯化。由Massachusetts General Hospital Biopolymer Core机构合成了PTH/PTHrP(1-34)NH2杂合肽，并进行了HPLC纯化。所有肽都是C端酰胺化的，除非另有说明。

ECD-肽结合测定。采用AlphaScreen测定(Perkin-Elmer)，对肽与MBP-PTH1R ECD-H6融合蛋白的结合进行了评价。将反应混合物在室温下温育，反应混合物含有各5μg/ml链霉抗生物素包被的供体珠和镍螯合物包被的接纳珠，以及各23nM在50mM MOPS(pH 7.4)、150mM NaCl和7mg/ml BSA缓冲液中的N端生物素化PTH(7-34)NH2和MBP-PTH1R ECD-H6。单独使生物素化PTH和MBP-PTH1R ECD-H6分别与链霉抗生物素珠和镍螯合物珠预偶联1小时。将预偶联反应物混合，按所示加入未标记的竞争剂肽，将反应物温育4-5小时以达到平衡。采用Envision 2104读板仪(Perkin-Elmer)，在384孔optiplate中记录光子计数。应用Prism 5.0软件(GraphPadSoftware，San Diego)将数据拟合到用于测定IC50值的固定斜率剂量反应抑制方程式中。如下所述，采用Octet Red系统(ForteBio)，对肽与分离的PTH1R ECD的结合进行了实时分析。

结晶、数据采集、结构解析和精修。将10mM Tris-HCl(pH 7.5)、50mM NaCl、1mM麦芽糖和1mM EDTA中的MBP-PTH1R ECD-H6与合成的PTHrP片段(残基12-34)按1∶1.1摩尔比率(蛋白质∶肽)混合，在冰上温育30分钟，离心浓缩至20mg/ml以结晶。在20℃下，用7.5％PEG 2000、13％PEG 400的贮存溶液，通过坐滴(sitting drop)蒸气扩散方法，使双锥体晶体生长。通过透析过夜，将晶体转移到10％PEG2000、22％PEG 400、50mM NaCl、1mM EDTA的冷冻保护剂溶液中，并插入液氮中速冻。在Advanced Photon Source(Argonne，IL)的LS-CAT beamline 21-ID-F处，以

的波长和100°K的温度，从单晶收集数据集。应用HKL2000软件包(37)处理数据，用CCP4套件(38)将Scalepack强度转化成结构因素振幅。采用来自PDB坐标文件3C4M(27)的MBP和PTH1R ECD各自的检索模型，用Phaser(39)，通过分子置换，对结构进行了解析。在不对称单元中有一个MBP-PTH1R ECD:PTHrP(12-34)复合物。在O(40)中重建的迭代循环和用Refmac5(41)的约束精修完成了结构。还包括使用相当于MBP-麦芽糖复合物和ECD-PTHrP复合物的两个TLS组的TLS精修(42)。Procheck(43)验证的结构表明，93.6％的残基在拉氏图的最有利区域中，无残基位于不允许的区域。数据采集和精修统计数据列于表S1中。在CCP4套件内，对溶剂可接近表面面积和形状互补性进行了分析。用PyMol(44)绘制了结构图。

受体结合测定。如前所述(26)，对肽与细胞膜中G蛋白解偶联受体(R0)和G蛋白偶联受体(RG)构象结合进行了评价。

cAMP测定。在37℃/5％CO2培养箱中，将自美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection，Manassas，VA)获得的COS-1细胞培养在补充了10％胎牛血清的Dulbecco改良Eagle培养基中。将500,000个细胞接种在10cm培养皿中，次日上午通过DEAE-葡聚糖方法，用3μg编码hPTHIR的pcDNA3.1载体转染。转染后24小时，将约40,000个转染细胞接种在96孔板的各孔中。转染后48小时，将细胞用PBS(pH 7.4)洗涤两次，并用肽刺激。对于剂量反应测定，在补充了0.2％BSA、0.01％大豆胰蛋白酶抑制剂、0.1％杆菌肽和2mM 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX)的Krebs-Ringers-Hepes(KRH)缓冲液(25mM Hepes(pH 7.4)、104mM NaCl、5mM KCl、2mM CaCl2、1mMKH2PO4、1.2mM MgSO4)中，用肽于37℃刺激细胞30分钟。用冷的6％高氯酸终止反应，细胞裂解物用KHCO3中和。按照生产商的说明书，用LANCE cAMP试剂盒(Perkin-Elmer)测定了cAMP。对于配体洗出测定，在如上补充、但缺乏IBMX的KRH缓冲液中，将细胞用肽(100nM)于室温刺激10分钟。将细胞用缺乏IBMX的缓冲液洗涤3次，并在配体洗出后的所示时间，将缓冲液替换为含有IBMX的缓冲液，5分钟后终止反应，并如上对cAMP含量进行了评价。利用剂量反应测定的固定斜率剂量反应刺激方程式和配体洗出测定的单相指数式衰减方程式，用Prism 5.0软件进行了曲线拟合。

表达质粒构建。由pcDNA3.1/PTH1R对编码具有C端6个组氨酸残基标签的PTH1R残基23-191的DNA片段进行PCR扩增。片段用BamHI和NotI限制性内切核酸酶消化，并连接到pETDuet1载体(Novagen)中，该载体编码麦芽糖结合蛋白(MBP)接着多克隆位点1中的凝血酶切割位点(Th)和生物素化标签序列(GGLNDIFEAQKIEWHEDT；生物素化位点为粗体)以及多克隆位点2中的BirA生物素连接酶。所得载体共表达MBP-Th-生物素标签-PTHIR ECD-H6融合蛋白和BirA。通过编码区的自动化DNA测序证实了该构建体。

MBP-Th-生物素标签-PTHIR ECD融合蛋白的表达和纯化。将大肠杆菌Origami B(DE3)细胞(Novagen)用表达质粒转化，并在12L LB培养基中于37℃培养至对数中期。降低温度至16℃，加入生物素至5μM终浓度，并用0.4mM IPTG诱导蛋白质表达，总诱导时间约为19小时。收获细胞，重新悬浮于50mM Tris-HCl(pH 7.5)、150mM NaCl、10％甘油和25mM咪唑中。通过在10,000psi下匀浆使细胞裂解，所得裂解物通过离心澄清。将上清液直接加到50ml Ni2+ChelatingSepharose柱(GE Healthcare)上。柱用600ml 50mM Tris-HCl(pH 7.5)、150mM NaCl、10％甘油和72.5mM咪唑洗涤，缓冲液中的融合蛋白用262.5mM咪唑洗脱出来。合并峰流分，加到50mM Tris-HCl(pH7.5)、150mM NaCl和5％甘油中平衡的50ml直链淀粉高流动性柱(New England Biolabs)上。蛋白质用0-10mM麦芽糖的线性梯度洗脱。合并峰流分，稀释至1mg/ml，样品用1mM还原谷胱甘肽、1mM氧化谷胱甘肽和1∶1摩尔比率的纯化DsbC∶MBP-Th-生物素标签-PTHIRECD-H6于20℃处理23小时，以使二硫键得以改组。DsbC按之前描述(45)纯化。使二硫键改组反应混合物在上述50ml Ni2+chelatingsepharose柱中运行以除去DsbC。将洗脱的融合蛋白浓缩，加到300mlSuperdex200柱(GE Healthcare)上，并收集与正确折叠的蛋白质对应的峰流分。纯化样品的天然凝胶电泳表明，蛋白质约有50％生物素化，由迁移率略不同的两个明显条带所证实(数据未显示)。通过Bradford方法(46)测定了蛋白质浓度。

肽与生物素化PTH1R ECD结合的Octet Red实时分析。利用OctetRed系统(ForteBio)，通过生物层干涉量度技术，对生物素化PTH1RECD与PTH(1-34)NH2和PTHrP(1-34)NH2之间的相互作用进行了分析。通过以蛋白酶∶融合蛋白1∶750的比率(重量/重量)用人α-凝血酶(Haematologic Technologies Inc.)在4℃下消化过夜，从MBP-Th-生物素标签-PTHIR ECD融合蛋白中除去MBP。通过SDS-PAGE证实了完全切割(数据未显示)。将高结合链霉抗生物素传感器与在补充了2mg/ml BSA的KRH缓冲液中稀释至2μg/ml蛋白质的消化反应物一起温育，接着10μg/ml生物胞素封闭，并在补充了2mg/ml BSA的KRH缓冲液中洗涤3次以洗去消化混合物的非生物素化组分，并建立基线。将肽在具有2mg/ml BSA的KRH缓冲液中稀释，并在25℃下监测各肽缔合和解离达20分钟。为了说明非特异性结合，将用肽和缺乏PTH1R ECD的传感器触头获得的迹线从用肽和固定化PTH1R ECD获得的迹线中减去。另外，使用来自具有固定化PTH1R ECD但没有肽的传感器触头的迹线减去基线漂移。应用Octet Red分析软件分析数据。

实施例2

PTH和PTHrP与PTH1R ECD结合

采用AlphaScreen发光邻近测定(Perkin-Elmer)，对PTH和PTHrP与MBP-PTH1R ECD-H6融合蛋白的体外结合进行了评价。在该测定中，N端生物素化PTH(7-34)NH2与链霉抗生物素包被的供体珠结合，融合蛋白通过(His)6标签与镍螯合物包被的接纳珠结合。生物素化PTH和融合蛋白的缔合使珠接近，产生发光信号。本发明人之前表明，PTH(15-34)NH2以与用等温滴定量热法测定的约1μM的Kd值类似的IC50值竞争相互作用(27)。PTH(1-34)NH2和PTH(12-34)NH2两者均以约为1μM的IC50值竞争AlphaScreen相互作用(图1A)，与本发明人之前的观察结果一致。然而，PTH(1-34)OH结合融合蛋白的亲和力相比C端酰胺化肽的低至约1/10(图1A)。该结果和与PTH(15-34)NH2复合的PTH1R ECD的晶体结构一致，其表明C端酰胺基与ECD形成两个氢键(27)。相比之下，PTHrP(12-34)NH2和PTHrP(12-34)OH竞以约为2μM的类似的IC50值争相互作用(图1B)，这就表明PTHrP的C端酰胺基对于ECD结合不重要。

本发明人还通过采用利用生物层干涉量度技术以实时监测结合事件的Octet Red系统(ForteBio)，研究了肽与分离的PTH1R ECD的相互作用。按照实施例1中所描述的方法，制备了不含MBP且在该蛋白质N端的生物素化标签序列的单个残基上经生物素化的分离的PTH1R ECD(残基23-191)。将生物素化ECD固定在链霉抗生物素传感器触头的表面，并评价了溶液中游离的PTH(1-34)NH2和PTHrP(1-34)NH2的结合。实时结合曲线(图S1)的稳态分析表明，PTH和PTHrP结合ECD的Kd值分别为2.8μM和0.99μM(图1C和图1D)。PTH的Kd值与由他人采用Biacore技术获得的类似(31)。汇总结合数据表明，PTH和PTHrP结合PTH1R ECD的亲和力相似，但却表明基础生化机制的差异，因为C端酰胺化影响PTH而非PTHrP结合ECD的能力。

实施例3

PTHrP与PTH1R ECD结合的结构基础

为了理解在PTH和PTHrP结合机制的差异下的结构基础，本发明人确定了与PTHrP(12-34)NH2复合的MBP-PTH1R ECD-H6融合蛋白的晶体结构。通过分子置换对结构进行了解析，并在

分辨率下，精修至R因子为19.3％(自由R因子23.3％)(表2)。

表2

观察到除29-30、57-101、176-187和C端(His)6标签(排除在最终模型之外)以外的所有PTH1R残基的电子密度。PTH1R ECD形成之前观察到的保守B类GPCR ECD折叠(27)，而PTHrP形成与位于N端α-螺旋、2个β-折叠和短的C端α-螺旋的界面上的ECD的疏水沟结合的两亲性α-螺旋(图2A和图2B)。观察到PTHrP残基13-34的清晰的电子密度(图2C)。相互作用由包括PTHrP残基F23′、L24′、L27′和I28′的疏水相互作用和广泛的氢键网所介导(图2B、图2D和图2E)。[肽残基用撇号表示，以将其与受体残基相区别]。R19′与E35形成分子间盐桥，但这可能由限制R19′迁移性的晶体堆积的相互作用(未显示)引起，因为在天然蛋白质中，R19′接触受体的7-TM结构域(32)。保守的R20′与D137形成分子间盐桥、与M32的骨架羰基形成分子间氢键并与D17′的侧链形成可能稳定肽的螺旋构象的分子内氢键(图2D)。在残基I31′允许形成若干个另外的分子间氢键后，PTHrP螺旋在C端“解开”，所述分子间氢键包括H32′的δ氮与Y167的骨架酰胺氮之间、T33′的侧链羟基与A165的骨架酰胺氮和T163的骨架羰基之间以及A165的骨架羰基与T33′和A34′的骨架酰胺氮之间的氢键(图2E)。与图1B中我们的结合数据一致，PTHrP的C端酰胺基不与ECD形成任何相互作用。

实施例4：

PTH和PTHrP表现出不同的ECD结合模式。

PTHrP-ECD复合物的结构比对和本发明人之前发表的PTH-ECD复合物突出显示了在两种肽的结合机制中的相似性和差异(图2F)。在两种情况下，两亲性肽的疏水面结合ECD中的疏水沟，并由不变残基R20′和L24′锚定相互作用(图2G)。在结合模式中最显著的差异发生在肽的C端。PTH形成自L15′到F34′的连续α-螺旋，其中C端酰胺基与ECD形成重要的氢键。相比之下，PTHrP螺旋自I15′延伸到I31′，其后“解开”，C端酰胺基不参与受体结合。PTHrP螺旋轻微弯曲，使得其螺旋轴在残基L24′后偏离的PTH的螺旋轴，显然是由肽的23′、27′、28′和31′位的残基差异所致(图2F和图2G)。与PTHrP-ECD复合物的相比，PTH-ECD复合物的界面埋入的溶剂可接近表面面积为与PTHrP-ECD复合物的(Sc＝0.726)相比，通过Sc值测量(33)的PTH-ECD复合物的肽与ECD间的表面互补性略高(Sc＝0.782)。因此，相比PTHrP，PTH肽埋入略微更多的表面区域，并以略微“更紧的”互补性适应ECD。然而，两种肽对ECD表现出类似的亲和力，可能是通过PTHrP的残基32-34所形成的另外的氢键的结果(图2E)。

受体适应以微妙但明显的变化适应两种肽的不同结合模式。两种复合物中的ECD结构非常相似，其C-α位置的RMSD为但两种结构中，残基L41和I115的侧链表现不同构象(图2F)。似乎分别在ECD的L41和I115之间及在肽的23′和27′位之间存在偶联。在PTHrP结合的结构中，L41采取有利的χ1＝非对称(+)旋转异构体，χ2＝反式旋转异构体(34)，使得L41的δ1甲基与F23′的苯基环之间有范德瓦尔斯接触。相比之下，在PTH结合的结构中，L41采取不太有利的χ1＝反式旋转异构体，χ2＝非对称(-)旋转异构体，使得受体能够适应较大的W23′侧链，同时保持L41的δ2甲基与W23′的吲哚环之间的范德瓦尔斯接触。最近在Donnelly及其同事的卓越研究中预测了这种L41旋转异构体拨动开关机制(35)。在PTH结合的结构和PTHrP结合的结构中，I115采取相同的旋转异构体，但是在PTHrP结合状态中侧链显著向内位移朝向ECD的核心，无疑这是由PTHrP螺旋的弯曲和残基27′位的位移所致。这种I115构象与PTH结合模式不相容，因为I115的δ碳与V31′的γ2碳在空间上冲突。因此，ECD的肽结合部位表现可塑性，通过改变残基L41和I115的构象来采取PTH和PTHrP的不同结合模式。

为了验证晶体结构中观察到的不同的结合模式，本发明人在AlphaScreen测定中，通过评价PTH(15-34)NH₂和PTHrP(12-34)NH₂的丙氨酸扫描突变体竞争生物素化PTH与MBP-PTH1R ECD的相互作用的能力，检查了特异性PTH和PTHrP残基对ECD结合的贡献。如前所述(27)，PTH残基R20′、W23′、L24′和L28′对ECD结合是最关键的，以及V21′、K27′和F34′提供的额外贡献(图2H)。PTHrP残基R20′、R21′、F23′、L24′、L27′、I28′、H32′和T33′对ECD结合均重要，其中R20′和L24′提供最关键的接触(图21)。显然，对于ECD结合，PTHrP的F23′和I28′不如PTH的W23′和L28′关键。相反，对于ECD结合，PTHrP的L27′和H32′比PTH的K27′和H32′重要。这些体外结合结果与在晶体结构中所观察到的结合模式完全一致。

实施例5

杂合PTH/PTHrP肽与PTH1R ECD的结合。

本发明人试图准确确定哪些残基负责PTH和PTHrP的不同的ECD结合模式。晶体结构表明，肽的23′、27′、28′和31′位上的残基很大程度上决定了其ECD结合模式。本发明人推测，将一种肽的这些位置上的残基改变成另一种肽中存在的相应残基可能允许在PTH结合模式和PTHrP结合模式间进行转换。在AlphaScreen测定中，通过对这4个位置上含有PTH/PTHrP残基交换的杂合肽与纯化MBP-PTH1R ECD融合蛋白的结合进行评价，检验了这种假说。在PTH(15-34)NH₂和PTHrP(12-34)NH₂支架中制备杂合肽，杂合肽包括在这4个位置之一上进行单交换、在这4个位置中的两个上进行双重交换或在所有4个位置的四重交换而发生改变的肽。理论上，四重突变体应采取另一种肽的结合构象，保持正常的ECD结合亲和力，并根据其结合模式表现出对C端酰胺化敏感或不敏感。

PTH(15-34)NH₂肽在23′、31′位上较不容许相应的PTHrP残基，而28′的程度较低，正如W23′F、L28′I和V31′I单突变肽的ECD结合减弱所示(图3A)。相比之下，K27′L突变体保持正常结合，而且这种改变能够挽救W23′F/K27′L、K27′L/L28′I和K27′L/V31′I双重突变肽中W23′F、L28′I和VV31′I突变的缺陷。在W23′F/K27′L/L28′I/V31′I肽中一起包含所有4个交换突变导致ECD-结合某种程度的减弱，这就表明，至少对于PTH，PTH结合模式和PTHrP结合模式中的差异不仅仅由这4个位置决定。PTH支架中所有4个位置上交换的组合作用可能推动PTH朝向PTHrP结合模式，但PTH的N33′和F34′可能与PTHrP结合模式不相容(图2E)。

当用23′、28′和31′位上相应的PTH残基改变时，PTHrP(12-34)NH₂表现正常的ECD结合，但用L27′K改变时结合减弱(图3B)。在F23′W/L27′K、L27′K/I28′L和L27′K/I31′V双重突变肽中，L27′K改变的缺陷被F23′W改变完全挽救、被I28′L或I31′V改变部分挽救。四重突变PTHrP肽表现与ECD的正常结合，这与该肽采取PTH结合模式的可能性一致。

图3A和图3B中，数据的最显著特征是对于两种肽都是明显的23′和27′位的偶联。在任一支架中，在23位′上的Phe和27′位上的Lys的组合(F23′/K27′)导致ECD结合严重减弱，而W23′/K27′、W23′/L27′和F23′/L27′组合没有损害。最简单的解释是，F23′/K27′组合埋入的疏水表面区域不如其它组合多(图3C和图3D)。PTH中的W23′F改变因为Phe侧链较小而导致与受体不太疏水的接触，而且这可通过可从27′位上的Leu获得的额外范德瓦尔斯接触来补偿(图3C)，这就解释了K27′L改变对W23′F缺陷的挽救。同样，PTHrP中的L27′K改变导致与受体不太疏水的接触，因为与Leu不同，Lys在γ碳上无分支(图3D)。L27′K缺陷可通过可从23′位Trp获得的额外疏水接触补偿。

实施例6

杂合PTH/PTHrP肽对G蛋白偶联受体有选择性。

之前的研究表明，PTH的ECD结合部分有助于其与G蛋白解偶联受体(R0)的强的结合(23，26)。由于PTH和PTHrP对ECD表现相似的亲和力(图1)，因此本发明人想要知道不同的ECD结合模式是否有助于其R0/RG选择性差异。为了解决这个问题，本发明人将交换突变掺入PTH(1-34)NH2和PTHrP(1-34)NH2支架中，以利于分析肽与细胞膜中PTH1R的R0和RG构象的结合。在实验上，通过在受体和G蛋白的解偶联反应中包括GTPγS来研究R0构象，而通过共表达受体与显性阴性形式的Gαs来研究RG构象(23、25)。如果不同的ECD结合模式有助于R0/RG选择性，则与野生型PTHrP(1-34)相比，PTHrP(1-34)NH2[F23′W/L27′K/I28′L/I31′V]肽表现降低的RG选择性(较高的R0亲和力)，因为我们的ECD结合数据与该杂合肽采取PTHECD结合模式的想法一致。

与之前的研究一致，野生型PTH和PTHrP肽以类似的高亲和力(PTH的IC50约0.3nM，PTHrP的IC50约0.1nM)结合RG，PTHrP对RG更具选择性，对于R0表现低至1/245的亲和力(IC50约27nM)，而PTH对R0仅表现低至约1/14的亲和力(IC50约4nM)[图4A、图4B和表3]。

表3

与野生型PTHrP相比，PTHrP(1-34)NH2[F23′W/L27′K/I28′L/I31′V]肽(可能采取PTH ECD结合模式)表现略提高的R0亲和力(较高的RG选择性)，这就表明不同的ECD结合模式未有助于R0/RG选择性。实际上，导致ECD结合减弱的所有的交换突变也导致R0结合减弱，但是对RG结合几乎没有影响或无影响，R0亲和力降低的程度与ECD结合能力有关(图3和图4及表3)。PTH(1-34)NH₂[W23′F/V31′I]和PTHrP(1-34)NH₂[L27′K]最显著；两种肽均表现差的ECD结合和显著降低的R0亲和力，但是保持正常的RG亲和力。PTHrP(1-34)NH₂[L27′K]特别具有RG选择性，与RG(IC50约0.16nM)相比，对R0的亲和力降低1/7588(IC50约1.2μM)。由降低ECD结合的交换改变引起的R0结合减弱被恢复ECD结合的其它交换改变挽救(图3和图4)。这些结果表明，ECD亲和力而不是ECD结合模式，是PTH和PTHrP的R0/RG选择性特征的关键决定因素，并且可通过降低ECD亲和力来提高RG选择性。与野生型PTH相比，野生型PTHrP提高的RG选择性可能主要由趋异残基5决定(23、25)，因为所述肽对ECD具有类似的亲和力。

在瞬时表达PTH1R的COS细胞中，评价了最具RG选择性的PTH和PTHrP杂合肽刺激cAMP积累的能力。PTH(1-34)NH2[W23′F/V31′I]和PTHrP(1-34)NH2[L27′K]诱导cAMP反应的效能与野生型肽的基本上相同，但是约为用野生型肽获得的最大cAMP水平的80％(图5A)。在这些实验条件下，最大反应的降低可反映亚化学计量的G蛋白水平，使得一部分受体总以解偶联状态存在，且不被RG选择性肽激活。为了分析cAMP信号转导的持续时间，我们采用了配体洗出方案(26)。用肽(100nM)对细胞进行10分钟刺激，并在配体洗出后的不同时间，评价了cAMP信号转导能力。RG选择性PTH和PTHrP杂合肽表现比野生型肽短期的反应(图5B)，这就表明，杂合肽对受体的作用更具脉动性。

实施例7

PTH类似物和萤光素酶测定。

本发明人设计了一系列具有更好效能和选择性的PTH类似物(图7A和图7B)。各个PTH类似物具有如下给出的标识符：##-##-##-##-SBSL。这类PTH肽或多肽由PTH肽(1-34)组成，其中氨基酸位置12、14、16、17和27的一个或多个上具有氨基酸取代；一些类似物包括19位的D-半胱氨酸取代和22位的半胱氨酸取代的二硫键，或22和25位的半胱氨酸取代的二硫键(参见SEQ ID No.1-52)，如下：

表4

用于PTH类似物萤光素酶测定的细胞培养物：

在5％CO2和95％湿度下，将AD-293细胞(Stratagene)在补充了10％FBS的α-MEM中于37℃维持。

PTH类似物萤光素酶测定：

将AD293细胞(Stratagene)接种在24孔培养皿中24小时，然后按照生产商的方案，使用Lipofectamine2000(Invitrogen)，用CRE-萤光素酶(pGL4.29/CRE-luc2p，promega，200ng/孔)、pcDNA-PTH1R(10ng/孔)和pHRLTK(Renilla萤光素酶，5ng/孔)共转染。在转染期间，将细胞培养物中的培养基更换为无FBS的OPTI-MEM。然后在转染后24小时，将不同浓度的PTH类似物(0.1nM或0.03nM)加入培养基中，并在4小时内，用双重萤光素酶测定试剂盒(Dual-luciferase assaykit，promega)测定转染细胞中的萤光素酶活性。参见图7A和图7B。

虽然根据某些优选的实施方案描述了前面的说明书，且许多详情为说明目的而列出，但是对本领域技术人员而言显而易见的是，可对本发明作出各种修饰和其它实施方案，在不偏离本发明的精神和范围的情况下，本文所述的某些详情可相当大地变化。

参考文献

在整个本公开内容中按照下面列出的所示编号引用下列参考文献。

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权利要求书(按照条约第19条的修改)

1.一种甲状旁腺素(PTH)肽或其包含二硫键的类似物，所述甲状旁腺素肽包含在氨基酸位置12、14、16、17和27的一个或多个上具有氨基酸取代的SEQ ID NO：9的氨基酸序列。

2.权利要求1的PTH肽或类似物，其包含SEQ ID NO：53的序列，其中12位氨基酸为Gly、Val、Ala或其保守取代，14位氨基酸为His、Phe、Leu或其保守取代，16位氨基酸为Asn、Thr或其保守取代，17位氨基酸为Ser、Asp、Asn或其保守取代，且27位氨基酸为Lys、Leu或其保守取代。

3.权利要求1或2的PTH肽或类似物，其中所述PTH肽包含SEQ ID NO：1-10和13-20中任一个的氨基酸序列。

4.权利要求1的PTH肽或类似物，其中所述类似物包含SEQ IDNO：54-56中任一个的氨基酸序列，其中在19、22和25位上的氨基酸中的两个由二硫键连接。

5.权利要求4的PTH肽或类似物，其中所述二硫键将19位氨基酸与22位氨基酸连接。

6.权利要求5的PTH肽或类似物，其中19位氨基酸是D-Cys，且22位氨基酸是Cys。

7.权利要求4的PTH肽或类似物，其中所述二硫键将22位氨基酸与25位氨基酸连接。

8.权利要求7的PTH肽或类似物，其中在22和25位上的氨基酸各自为Cys。

9.权利要求4的PTH肽或类似物，其中所述类似物包含SEQ IDNO：11、12和21-52中任一个的氨基酸序列。

10.前述权利要求中任一项的PTH肽或类似物，其中所述PTH肽或其类似物包含替换C端羧酸的C端酰胺基。

11.一种PTH肽，其包含在SEQ ID NO：9的23、27、28和31位的一个或多个上具有氨基酸取代的SEQ ID NO：9的氨基酸15-34。

12.权利要求11的PTH肽，其中与野生型PTH(SEQ ID NO：9)对PTH1R的R0构象的亲和力相比，所述PTH肽表现出对甲状旁腺素受体(PTH1R)的G蛋白解偶联构象(R0)的亲和力降低，其中所述PTH肽保持与PTH1R的G蛋白偶联构象(RG)结合，且其中所述PTH肽刺激细胞中cAMP的积累。

13.权利要求11的PTH肽，其中在SEQ ID NO：9的23、27、28和31位的一个或多个上的氨基酸被SEQ ID NO：79相应位置上的氨基酸取代。

14.权利要求11-13的PTH肽，其包含在SEQ ID NO：9的23、27、28和31位的一个或多个上具有氨基酸取代的SEQ ID NO：9的氨基酸1-34。

15.权利要求14的PTH肽，其包含SEQ ID NO：57-66中任一个的氨基酸序列。

16.权利要求11-15中任一项的PTH肽，其中与野生型PTH(SEQ ID NO：9)的cAMP反应相比，所述PTH肽表现较短期的cAMP反应。

17.权利要求16的PTH肽，其中所述PTH肽包含SEQ ID NO：64。

18.一种PTH肽，其包含在20、21、23、24、27、28和34位的一个或多个上具有氨基酸取代的SEQ ID NO：9的氨基酸15-34。

19.权利要求18的PTH肽，其中与野生型PTH与PTH1R的ECD的结合相比，所述PTH肽表现出与PTH1R的胞外结构域(ECD)的结合减弱。

20.权利要求18的PTH肽，其中与野生型PTH(SEQ ID NO：9)对PTH1R的R0构象的亲和力相比，所述PTH肽表现出对PTH1R的G蛋白解偶联构象(R0)的亲和力降低，其中所述PTH肽保持与PTH1R的G蛋白偶联构象(RG)结合，且其中所述PTH肽刺激细胞中cAMP的积累。

21.权利要求18-20的PTH肽，其中所述PTH肽在23或28位上或者在两个位置上包含氨基酸取代。

22.权利要求21的PTH肽，其中所述PTH肽在21、27和34位的一个或多个上包含氨基酸取代。

23.权利要求18-22中任一项的PTH肽，其包含SEQ ID NO：9的氨基酸1-34，其中在20、21、23、24、27、28和34位的一个或多个上具有氨基酸取代。

24.权利要求18的PTH肽，其在20、21、23、24、27、28和34位的一个或多个上包含Ala。

25.权利要求24的PTH肽，其包含SEQ ID NO：68-71、73、74和78中任一个的氨基酸序列。

26.一种PTHrP肽，其包含在SEQ ID NO：79的23、27、28和31位的一个或多个上具有氨基酸取代的SEQ ID NO：79的氨基酸12-34。

27.权利要求26的PTHrP肽，其中与野生型PTHrP(SEQ ID NO：79)对PTH1R的R0构象的亲和力相比，所述PTHrP肽表现出对PTH1R的G蛋白解偶联构象(R0)的亲和力降低，其中所述PTHrP肽保持与PTH1R的G蛋白偶联构象(RG)结合，且其中所述PTHrP肽刺激细胞中cAMP的积累。

28.权利要求27的PTHrP肽，其中在SEQ ID NO：79的23、27、28和31位的一个或多个上的氨基酸被SEQ ID NO：9相应位置上的氨基酸取代。

29.权利要求26-28的PTHrP肽，其包含在SEQ ID NO：79的23、27、28和31位的一个或多个上具有氨基酸取代的SEQ ID NO：79的氨基酸1-34。

30.权利要求29的PTHrP肽，其包含SEQ ID NO：80-90中任一个的氨基酸序列。

31.权利要求26-30中任一项的PTHrP肽，其中与野生型PTHrP(SEQ ID NO：79)的cAMP反应相比，所述PTHrP肽表现出较短期的cAMP反应。

32.权利要求31的PTHrP肽，其中所述PTHrP肽包含SEQ IDNO：81。

33.一种PTHrP肽，其包含在20、21、23、24、27、28、32和33位的一个或多个上具有氨基酸取代的SEQ ID NO：79的氨基酸12-34。

34.权利要求33的PTHrP肽，其中与野生型PTHrP与ECD或PTH1R的结合相比，所述PTHrP肽表现出与PTH1R的ECD的结合减弱。

35.权利要求33的PTHrP肽，其中与野生型PTHrP(SEQ ID NO：79)对PTH1R的R0构象的亲和力相比，所述PTH肽表现出对PTH1R的G蛋白解偶联构象(R0)的亲和力降低，其中所述PTHrP肽保持与PTH1R的G蛋白偶联构象(RG)结合，且其中所述PTHrP肽刺激细胞中cAMP的积累。

36.权利要求33-35的PTHrP肽，其中所述PTHrP肽在22或27位上或者在两个位置上包含氨基酸取代。

37.权利要求33-36中任一项的PTHrP肽，其包含SEQ ID NO：79的氨基酸1-34，其中在20、21、23、24、27、28、32和33位的一个或多个上具有氨基酸取代。

38.权利要求37的PTHrP肽，其在20、21、23、24、27、28、32和33位的一个或多个上包含Ala。

39.权利要求38的PTHrP肽，其包含SEQ ID NO：93-98、100和101中任一个的氨基酸序列。

40.一种化学衍生物，其包含前述权利要求中任一项的PTH肽或类似物或者PTHrP肽以及不是野生型PTH(SEQ ID NO：9)或野生型PTHrP(SEQ ID NO：79)的部分的化学部分。

41.一种融合多肽，其包含(a)前述权利要求中任一项的PTH肽或类似物或PTHrP肽，(b)任选接头区，和(c)与PTH肽或类似物或PTHrP肽连接，或者与所述接头区连接的第二多肽，其中所述第二多肽不与PTH肽或类似物或PTHrP肽天然连接。

42.一种多聚体肽，其包含重复约2-约100次的基础肽序列和任选包含间隔物，其中所述基础肽序列是前述权利要求中任一项的PTH肽或类似物或PTHrP肽的氨基酸序列。

43.一种药物组合物，其包含前述权利要求中任一项的PTH肽或类似物或PTHrP肽、权利要求40的化学衍生物、权利要求41的融合多肽或权利要求42的多聚体肽，和药学上可接受的载体或赋形剂。

44.一种用于治疗骨质疏松症的药盒，其包括选自权利要求1-25中任一项的PTH肽或类似物和权利要求26-39中任一项的PTHrP肽的肽，以及将所述肽给予患有骨质疏松症的受治疗者的说明书。

45.一种选自权利要求1-25中任一项的PTH肽或类似物和权利要求26-39中任一项的PTHrP肽的肽在制备用于治疗骨质疏松症的药物中的用途。

46.一种用于激活细胞中的PTH受体的方法，所述方法包括将前述权利要求中任一项的PTH肽或类似物或PTHrP肽给予细胞，使得所述PTH肽或类似物或PTHrP肽引起PTH受体被激活。

47.权利要求46的方法，其中所述细胞是成骨细胞。

48.权利要求46或47的方法，其中所述细胞处于活动物内，并且将所述PTH肽或类似物或PTHrP肽给予活动物。

49.权利要求48的方法，其中所述活动物是人。

50.权利要求48或49的方法，其中所述PTH肽或类似物或PTHrP肽通过口服递送或注射给予。

51.一种治疗患有非所需骨损失相关疾病或病症的受治疗者的方法，所述方法包括以有效治疗受治疗者的量将权利要求43的药物组合物给予受治疗者。

52.权利要求51的方法，其中所述受治疗者是人。

53.权利要求51或52的方法，其中所述疾病或病症是骨质疏松症。

54.一种改善受治疗者的骨质疏松症相关症状的方法，所述方法包括以有效改善受治疗者的骨质疏松症相关症状的量将权利要求43的药物组合物给予受治疗者。

55.一种延缓受治疗者的骨质疏松症的进展的方法，所述方法包括以有效延缓受治疗者的骨质疏松症的进展的量将权利要求43的药物组合物给予受治疗者。

56.一种使受治疗者的骨再生的方法，所述方法包括以有效使受治疗者的骨再生的量将权利要求43的药物组合物给予受治疗者。

Claims (56)

1. 一种甲状旁腺素(PTH)肽或其包含二硫键的类似物，所述甲状旁腺素肽包含在氨基酸位置12、14、16、17和27的一个或多个上具有氨基酸取代的SEQ ID NO：9的氨基酸序列。
2. 权利要求1的PTH肽或类似物，其包含SEQ ID NO：53的序列，其中12位氨基酸为Gly、Val、Ala或其保守取代，14位氨基酸为His、Phe、Leu或其保守取代，16位氨基酸为Asn、Thr或其保守取代，17位氨基酸为Ser、Asp、Asn或其保守取代，且27位氨基酸为Lys、Leu或其保守取代。
3. 权利要求1或2的PTH肽或类似物，其中所述PTH肽包含SEQ ID NO：1-10和13-20中任一个的氨基酸序列。
4. 权利要求1的PTH肽或类似物，其中所述类似物包含SEQ IDNO：54-56中任一个的氨基酸序列，其中在19、22和25位上的氨基酸中的两个由二硫键连接。
5. 权利要求4的PTH肽或类似物，其中所述二硫键将19位氨基酸与22位氨基酸连接。
6. 权利要求5的PTH肽或类似物，其中19位氨基酸是D-Cys，且22位氨基酸是Cys。
7. 权利要求4的PTH肽或类似物，其中所述二硫键将22位氨基酸与25位氨基酸连接。
8. 权利要求7的PTH肽或类似物，其中在22和25位上的氨基酸各自为Cys。
9. 权利要求4的PTH肽或类似物，其中所述类似物包含SEQ IDNO：11、12和21-52中任一个的氨基酸序列。
10. 前述权利要求中任一项的PTH肽或类似物，其中所述PTH肽或其类似物包含替换C端羧酸的C端酰胺基。
11. 一种PTH肽，其包含在SEQ ID NO：9的23、27、28和31位的一个或多个上具有氨基酸取代的SEQ ID NO：9的氨基酸15-34。
12. 权利要求11的PTH肽，其中与野生型PTH(SEQ ID NO：9)对PTH1R的R0构象的亲和力相比，所述PTH肽表现出对甲状旁腺素受体(PTH1R)的G蛋白解偶联构象(R0)的亲和力降低，其中所述PTH肽保持与PTH1R的G蛋白偶联构象(RG)结合，且其中所述PTH肽刺激细胞中cAMP的积累。
13. 权利要求11的PTH肽，其中在SEQ ID NO：9的23、27、28和31位的一个或多个上的氨基酸被SEQ ID NO：79相应位置上的氨基酸取代。
14. 权利要求11-13的PTH肽，其包含在SEQ ID NO：9的23、27、28和31位的一个或多个上具有氨基酸取代的SEQ ID NO：9的氨基酸1-34。
15. 权利要求14的PTH肽，其包含SEQ ID NO：57-66中任一个的氨基酸序列。
16. 权利要求11-15中任一项的PTH肽，其中与野生型PTH(SEQ ID NO：9)的cAMP反应相比，所述PTH肽表现较短期的cAMP反应。
17. 权利要求16的PTH肽，其中所述PTH肽包含SEQ ID NO：64。
18. 一种PTH肽，其包含在20、21、23、24、27、28和34位的一个或多个上具有氨基酸取代的SEQ ID NO：9的氨基酸15-34。
19. 权利要求18的PTH肽，其中与野生型PTH与PTH1R的ECD的结合相比，所述PTH肽表现出与PTH1R的胞外结构域(ECD)的结合减弱。
20. 权利要求18的PTH肽，其中与野生型PTH(SEQ ID NO：9)对PTH1R的R0构象的亲和力相比，所述PTH肽表现出对PTH1R的G蛋白解偶联构象(R0)的亲和力降低，其中所述PTH肽保持与PTH1R的G蛋白偶联构象(RG)结合，且其中所述PTH肽刺激细胞中cAMP的积累。
21. 权利要求18-20的PTH肽，其中所述PTH肽在23或28位上或者在两个位置上包含氨基酸取代。
22. 权利要求21的PTH肽，其中所述PTH肽在21、27和34位的一个或多个上包含氨基酸取代。
23. 权利要求18-22中任一项的PTH肽，其包含SEQ ID NO：9的氨基酸1-34，其中在20、21、23、24、27、28和34位的一个或多个上具有氨基酸取代。
24. 权利要求18的PTH肽，其在20、21、23、24、27、28和34位的一个或多个上包含Ala。
25. 权利要求24的PTH肽，其包含SEQ ID NO：68-71、73、74和78中任一个的氨基酸序列。
26. 一种PTHrP肽，其包含在SEQ ID NO：79的23、27、28和31位的一个或多个上具有氨基酸取代的SEQ ID NO：79的氨基酸12-34。
27. 权利要求26的PTHrP肽，其中与野生型PTHrP(SEQ ID NO：79)对PTH1R的R0构象的亲和力相比，所述PTHrP肽表现出对PTH1R的G蛋白解偶联构象(R0)的亲和力降低，其中所述PTHrP肽保持与PTH1R的G蛋白偶联构象(RG)结合，且其中所述PTHrP肽刺激细胞中cAMP的积累。
28. 权利要求27的PTHrP肽，其中在SEQ ID NO：79的23、27、28和31位的一个或多个上的氨基酸被SEQ ID NO：9相应位置上的氨基酸取代。
29. 权利要求26-28的PTHrP肽，其包含在SEQ ID NO：79的23、27、28和31位的一个或多个上具有氨基酸取代的SEQ ID NO：79的氨基酸1-34。
30. 权利要求29的PTHrP肽，其包含SEQ ID NO：80-90中任一个的氨基酸序列。
31. 权利要求26-30中任一项的PTHrP肽，其中与野生型PTHrP(SEQ ID NO：79)的cAMP反应相比，所述PTHrP肽表现出较短期的cAMP反应。
32. 权利要求31的PTHrP肽，其中所述PTHrP肽包含SEQ IDNO：81。
33. 一种PTHrP肽，其包含在20、21、23、24、27、28、32和33位的一个或多个上具有氨基酸取代的SEQ ID NO：79的氨基酸12-34。
34. 权利要求33的PTHrP肽，其中与野生型PTHrP与ECD或PTH1R的结合相比，所述PTHrP肽表现出与PTH1R的ECD的结合减弱。
35. 权利要求33的PTHrP肽，其中与野生型PTHrP(SEQ ID NO：79)对PTH1R的R0构象的亲和力相比，所述PTH肽表现出对PTH1R的G蛋白解偶联构象(R0)的亲和力降低，其中所述PTHrP肽保持与PTH1R的G蛋白偶联构象(RG)结合，且其中所述PTHrP肽刺激细胞中cAMP的积累。
36. 权利要求33-35的PTHrP肽，其中所述PTHrP肽在22或27位上或者在两个位置上包含氨基酸取代。
37. 权利要求33-36中任一项的PTHrP肽，其包含SEQ ID NO：79的氨基酸1-34，其中在20、21、23、24、27、28、32和33位的一个或多个上具有氨基酸取代。
38. 权利要求37的PTHrP肽，其在20、21、23、24、27、28、32和33位的一个或多个上包含Ala。
39. 权利要求38的PTHrP肽，其包含SEQ ID NO：93-98、100和101中任一个的氨基酸序列。
40. 一种化学衍生物，其包含前述权利要求中任一项的PTH肽或类似物或者PTHrP肽以及不是野生型PTH(SEQ ID NO：9)或野生型PTHrP(SEQ ID NO：79)的部分的化学部分。
41. 一种融合多肽，其包含(a)前述权利要求中任一项的PTH肽或类似物或PTHrP肽，(b)任选接头区，和(c)与PTH肽或类似物或PTHrP肽连接，或者与所述接头区连接的第二多肽，其中所述第二多肽不与PTH肽或类似物或PTHrP肽天然连接。
42. 一种多聚体肽，其包含重复约2-约100次的基础肽序列和任选包含间隔物，其中所述基础肽序列是前述权利要求中任一项的PTH肽或类似物或PTHrP肽的氨基酸序列。
43. 一种药物组合物，其包含前述权利要求中任一项的PTH肽或类似物或PTHrP肽、权利要求40的化学衍生物、权利要求41的融合多肽或权利要求42的多聚体肽，和药学上可接受的载体或赋形剂。
44. 一种用于治疗骨质疏松症的药盒，其包括选自权利要求1-25中任一项的PTH肽或类似物和权利要求26-39中任一项的PTHrP肽的肽，以及将所述肽给予患有骨质疏松症的受治疗者的说明书。
45. 一种选自权利要求1-25中任一项的PTH肽或类似物和权利要求26-39中任一项的PTHrP肽的肽在制备用于治疗骨质疏松症的药物中的用途。
46. 一种用于激活细胞中的PTH受体的方法，所述方法包括将前述权利要求中任一项的PTH肽或类似物或PTHrP肽给予细胞，使得所述PTH肽或类似物或PTHrP肽引起PTH受体被激活。
47. 权利要求46的方法，其中所述细胞是成骨细胞。
48. 权利要求46或47的方法，其中所述细胞处于活动物内，并且将所述PTH肽或类似物或PTHrP肽给予活动物。
49. 权利要求48的方法，其中所述活动物是人。
50. 权利要求48或49的方法，其中所述PTH肽或类似物或PTHrP肽通过口服递送或注射给予。
51. 一种治疗患有非所需骨损失相关疾病或病症的受治疗者的方法，所述方法包括以有效治疗受治疗者的量将权利要求43的药物组合物给予受治疗者。
52. 权利要求51的方法，其中所述受治疗者是人。
53. 权利要求51或52的方法，其中所述疾病或病症是骨质疏松症。
54. 一种改善受治疗者的骨质疏松症相关症状的方法，所述方法包括以有效改善受治疗者的骨质疏松症相关症状的量将权利要求43的药物组合物给予受治疗者。
55. 一种延缓受治疗者的骨质疏松症的进展的方法，所述方法包括以有效延缓受治疗者的骨质疏松症的进展的量将权利要求43的药物组合物给予受治疗者。
56. 一种使受治疗者的骨再生的方法，所述方法包括以有效使受治疗者的骨再生的量将权利要求43的药物组合物给予受治疗者。

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