JP2017031157A - １７ｎａｖ１．３およびｎａｖ１．７の強力かつ選択的阻害剤 - Google Patents

１７ｎａｖ１．３およびｎａｖ１．７の強力かつ選択的阻害剤 Download PDF

Info

Publication number
JP2017031157A
JP2017031157A JP2016161682A JP2016161682A JP2017031157A JP 2017031157 A JP2017031157 A JP 2017031157A JP 2016161682 A JP2016161682 A JP 2016161682A JP 2016161682 A JP2016161682 A JP 2016161682A JP 2017031157 A JP2017031157 A JP 2017031157A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
methyl
composition
amino acid
arginine
residues
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP2016161682A
Other languages
English (en)
Inventor
ジヤステイン・ケイ・マレー
K Murray Justin
レスリー・ピー・ミランダ
Leslie P Miranda
ステフアン・アイ・マツクドノー
I Mcdonough Stefan
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Amgen Inc
Original Assignee
Amgen Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Amgen Inc filed Critical Amgen Inc
Publication of JP2017031157A publication Critical patent/JP2017031157A/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/43504—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates
    • C07K14/43513—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates from arachnidae
    • C07K14/43518—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates from arachnidae from spiders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/6811—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin
    • A61K47/6817—Toxins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/04—Centrally acting analgesics, e.g. opioids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A61P29/02—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID] without antiinflammatory effect
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/44—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material not provided for elsewhere, e.g. haptens, metals, DNA, RNA, amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/35—Valency
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Insects & Arthropods (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

【課題】急性、持続性、もしくは慢性疼痛を治療、又は予防する有効な方法の提供。
【解決手段】末梢に限定される電位依存性ナトリウムチャンネル、ＮａＶ１．７及びＮａＶ１．３の二重阻害剤であるタランチュラ（Grammostola porteri）の毒から単離したＧｐＴｘ−１と呼ぶペプチド（アミノ酸配列DCLGFMRKCIPDNDKCCRPNLVCSRTHKWCKYVF-NH2）及びＧｐＴｘ−１のペプチドアナログの提供。
【選択図】図１０

Description

本出願全体を通して、様々な刊行物を丸括弧または角括弧内で引用する。これらの刊行物の開示は、本発明が関連する最新技術をより完全に記載するために本出願で参照することによって本明細書中に組み込まれる。
発明の分野
本発明は、生化学技術、特に治療用ペプチドおよび複合体に関する。
関連技術の考察
電位依存性ナトリウムチャンネル（ＶＧＳＣ）は、中枢および末梢ニューロン、心筋細胞および骨格筋細胞、ならびに神経内分泌細胞などの興奮細胞における活動電位の開始および伝播に関与する糖タンパク質複合体である。ほ乳類のナトリウムチャンネルは、中心、孔形成アルファ（α）サブユニットおよび補助ベータ（β）サブユニットから構成されるヘテロ三量体である。アルファサブユニット遺伝子における突然変異は、ヒトにおけるてんかん、ＱＴ延長症候群、および高カリウム血性周期性四肢まひなどの発作性疾患、ならびにマウスにおける運動終板疾患および小脳性運動失調症と関連づけられている。（Isom, Sodium channel beta subunits: anything but auxiliary, Neuroscientist 7(1):42-54 (2001)）。β−サブユニットは、ＶＧＳＣにおけるα−サブユニットの限局化、発現および機能的特性を調節する。
電位依存性ナトリウムチャンネルは、９つの異なるサブタイプからなるファミリーを含む（ＮａＶ１．１〜ＮａＶ１．９）。表１で示されるように、これらのサブタイプは、組織特異的限局化および機能差を示す（Goldin, A. L., Resurgence of sodium channel research, Annu Rev Physiol 63: 871-94 (2001); Wilson et al., Compositions useful as inhibitors of voltage-gated ion channels、米国特許第２００５／０１８７２１７Ａ１号を参照のこと）。この遺伝子ファミリーの３つのメンバー（ＮａＶ１．８、１．９、１．５）は、周知のナトリウムチャンネルブロッカーであるテトロドトキシン（ＴＴＸ）によるブロックに対して耐性であり、この遺伝子ファミリー内でサブタイプ特異性を示す。突然変異分析は、ＴＴＸ結合の重要な残基としてのグルタメート３８７を特定している（Noda, M., H. Suzuki, et al., A single point mutation confers tetrodotoxin and saxitoxin insensitivity on the sodium channel II” FEBS Lett 259(1): 213-6 (1989)を参照のこと）。
ＶＧＳＣファミリーとラットＴＴＸ ＩＣ５０値。略語：ＣＮＳ＝中枢神経系、ＰＮＳ＝末梢神経系、ＤＲＧ＝後根神経節、ＴＧ＝三叉神経節。（Wilson et al., Compositions useful as inhibitors of Voltage-gated ion channels、米国特許第２００５／０１８７２１７Ａ１号；Goldin, Resurgence of Sodium Channel Research, Annu Rev Physiol 63:871-94 (2001)を参照のこと）。
Figure 2017031157
一般的に、電位依存性ナトリウムチャンネル（ＮａＶ）は、神経系中の興奮性組織における活動電位の迅速な立ち上がりを開始することに関与し、通常および異常な痛覚を構成およびコード化する電気シグナルを伝達する。ＮａＶチャンネルのアンタゴニストは、これらの疼痛シグナルを減弱することができ、限定されないが、急性、慢性、炎症性、および神経因性疼痛をはじめとする様々な疼痛状態を治療するために有用である。公知のＮａＶアンタゴニスト、例えばＴＴＸ、リドカイン、ブピバカイン、フェニトイン、ラモトリジン、およびカルパマゼピンは、ヒトおよび動物モデルにおいて疼痛を軽減するために有用であることが示されている。（Mao, J. and L. L. Chen, Systemic lidocaine for neuropathic pain relief, Pain 87(1): 7-17 (2000); Jensen, T. S., Anticonvulsants in neuropathic pain: rationale and clinical evidence, Eur J Pain 6 (Suppl A): 61-68 (2002); Rozen, T. D., Antiepileptic drugs in the management of cluster headache and trigeminal neuralgia, Headache 41 Suppl 1: S25-32 (2001); Backonja, M. M., Use of anticonvulsants for treatment of neuropathic pain, Neurology 59(5 Suppl 2): S14-7 (2002)を参照のこと）。
ＴＴＸ感受性電位依存性ＮａＶ１．７チャンネルのα−サブユニットは、ＳＣＮ９Ａ遺伝子によってコード化される。ＮａＶ１．７チャンネルは、後根神経節の末梢感覚ニューロンで優先的に発現され、そのいくつかは疼痛の知覚に関与する。ヒトでは、ＳＣＮ９Ａ遺伝子における突然変異は、疼痛経路におけるこの遺伝子の重要な役割を示している。例えば、疼痛知覚におけるＮａＶ１．７チャンネルの役割は、原発性肢端紅痛症（ＰＥ）、遺伝性肢端紅痛症（ＩＥＭ）、および発作性激痛障害（ＰＥＰＤ）などの遺伝性疼痛症候群の病因学的基礎としてＳＣＮ９Ａ遺伝子における機能獲得型突然変異を明らかにした最近の臨床遺伝子連鎖解析によって立証された。（例えば、Yang et al., Mutations in SCN9A, encoding a sodium channel alpha subunit, in patients with primary erythermalgia, J. Med. Genet. 41:171-174 (2004); Harty et al., NaV1.7 mutant A863P in erythromelalgia: effects of altered activation and steady-state inactivation on excitability of nociceptive dorsal root ganglion neurons, J. Neurosci. 26(48):12566-75 (2006); Estacion et al., NaV1.7 gain-of-function mutations as a continuum: A1632E displays physiological changes associated with erythromelalgia and paroxysmal extreme pain disorder mutations and produces symptoms of both disorders, J. Neurosci. 28(43):11079-88 (2008)を参照のこと）。加えて、ＮａＶ１．７の過剰発現が強力に転移性の前立腺ガン細胞系で検出されている。（Diss et al., A potential novel marker for human prostate cancer: voltage-gated sodium channel expression in vivo, Prostate Cancer and Prostatic Diseases 8:266-73 (2005); Uysal-Onganer et al., Epidermal growth factor potentiates in vitro metastatic behavior human prostate cancer PC-3M cells: involvement of voltage-gated sodium channel, Molec. Cancer 6:76 (2007)）。
ＳＣＮ９Ａ遺伝子の機能喪失型突然変異の結果、それ以外では健常な個体がどのような形態の疼痛も全く知覚できなくなる。（例えば、Ahmad et al., A stop codon mutation in SCN9A causes lack of pain sensation, Hum. Mol. Genet. 16(17):2114-21 (2007)）。
条件付きノックアウトマウスにおけるＳＣＮ９Ａ遺伝子の細胞特異的欠失は、機械的痛み、熱痛または炎症性痛覚を感知するそれらの能力を減弱する。（Nassar et al., Nociceptor-specific gene deletion reveals a major role for NaV1.7 (PN1) in acute and inflammatory pain, Proc. Natl. Acad. Sci, U S A. 101(34): 12706-12711 (2004)）。
そのような証拠に基づいて、後根神経節（ＤＲＧ）の末梢感覚ニューロンにおけるＮａＶ１．７チャンネル活性または発現レベルを減少させることが、例えば慢性疼痛、神経因性疼痛、および神経痛のための有効な疼痛治療として提案されている。（例えば、Thakker et al., Suppression of SCN9A gene expression and/or function for the treatment of pain、国際公開第２００９／０３３０２７Ａ２号；Yeomans et al., Decrease in inflammatory hyperalgesia by herpes vector-mediated knockdown of NaV1.7 sodium channels in primary afferents, Hum. Gene Ther. 16(2):271-7 (2005); Fraser et al., Potent and selective NaV1.7 sodium channel blockers、国際公開第２００７／１０９３２４Ａ２号；Hoyt et al., Discovery of a novel class of benzazepinone Na(v)1.7 blockers: potential treatments for neuropathic pain, Bioorg. Med. Chem. Lett. 17(16):4630-34 (2007); Hoyt et al., Benzazepinone NaV1.7 blockers: Potential treatments for neuropathic pain, Bioorg. Med. Chem. Lett. 17(22):6172-77 (2007)）。
ＴＴＸ感受性電位依存性ＮａＶ１．３チャンネルのα−サブユニットは、ＳＣＮ３Ａ遺伝子によってコード化される。ヒトＮａｖ１．３の４つのスプライスバリアントが異なる生物物理学的特性を有することが報告された（Thimmapaya et al., Distribution and functional characterization of human NaV1.3 splice variants, Eur. J. Neurosci. 22:1-9 (2005)）。ＮａＶ１．３の発現は、神経損傷後のＤＲＧニューロン内および脊髄損傷後の視床ニューロンで上方調節されることが示されている。（Hains et al., Changes in electrophysiological properties and sodium channel NaV1.3 expression in thalamic neurons after spinal cord injury, Brain 128:2359-71 (2005)）。Ｎａｖ１．３（Ｋ３５４Ｑ）における機能獲得型突然変異は、てんかんと関連があるとされた。（Estacion et al., A sodium channel mutation linked to epilepsy increases ramp and persistent current of NaV1.3 and induces hyperexcitability in hippocampal neurons, Experimental Neurology 224(2):362-368 (2010)）。
様々な生物によって産生される毒素ペプチドは、イオンチャネルを標的とするように進化してきた。ヘビ、サソリ、クモ、ハチ、巻貝およびイソギンチャクは、イオンチャネルおよび受容体を強力かつ選択的に標的とする小型生物活性毒素ペプチドすなわち「毒素」の豊富な供給源としての役割を果たす可能性がある毒を産生する生物の数例である。ほとんどの場合、これらの毒素ペプチドは、チャンネル孔に結合し、イオン伝導路を物理的にブロックすることによって、イオンチャネルの強力なアンタゴニストすなわち阻害剤として進化してきた。他のいくつかの場合、いくつかのタランチュラ毒素ペプチドのように、ペプチドは、孔の外側の領域（例えば、電位センサードメイン）に結合することによって、チャンネル機能を拮抗することが判明している。
天然の毒素ペプチドは通常、約２０〜約８０アミノ酸の長さであり、２〜５のジスルフィド結合を含み、非常にコンパクトな構造を形成する。（例えば、サソリ、イソギンチャクおよびイモガイの毒由来の）毒素ペプチドが単離され、イオンチャネルに対するそれらの影響について特徴づけられている。そのようなペプチドは、有効性、安定性、および選択性の重大な問題に対処するために特によくあう比較的少数の構造フレームワークから進化したようである。（例えば、Dauplais et al., On the convergent evolution of animal toxins: conservation of a diad of functional residues in potassium channel-blocking toxins with unrelated structures, J. Biol. Chem. 272(7):4302-09 (1997); Alessandri-Haber et al., Mapping the functional anatomy of BgK on Kv1.1, Kv1.2, and Kv1.3, J. Biol. Chem. 274(50):35653-61 (1999)を参照のこと）。サソリおよびイモガイ（Conus）毒素ペプチドの大部分は、例えば、１０〜４０のアミノ酸および最高５のジスルフィド結合を含み、多くの場合タンパク質分解に対して耐性である非常にコンパクトかつ拘束された構造（マイクロプロテイン）を形成する。コノトキシンおよびサソリ毒素ペプチドは、それらのジスルフィド結合およびペプチド折りたたみに基づいて多くのスーパーファミリーに分けることができる。これらのうちの多くの溶液構造は、それらのコンパクトな構造を示し、それらのファミリーフォールディングパターンの保存を実証する核磁気共鳴（ＮＭＲ）分光法によって決定されている。（例えば、Tudor et al., Ionisation behaviour and solution properties of the potassium-channel blocker ShK toxin, Eur. J. Biochem. 251(1-2):133-41(1998); Pennington et al., Role of disulfide bonds in the structure and potassium channel blocking activity of ShK toxin, Biochem. 38(44): 14549-58 (1999); Jaravine et al., Three-dimensional structure of toxin OSK1 from Orthochirus scrobiculosus scorpion venom, Biochem. 36(6):1223-32 (1997); del Rio-Portillo et al.; NMR solution structure of Cn12, a novel peptide from the Mexican scorpion Centruroides noxius with a typical beta-toxin sequence but with alpha-like physiological activity, Eur. J. Biochem. 271(12): 2504-16 (2004); Prochnicka-Chalufour et al., Solution structure of discrepin, a new K+-channel blocking peptide from the alpha-KTx15 subfamily, Biochem. 45(6):1795-1804 (2006)）。保存されたジスルフィド構造はさらに、毒素ファミリーの個々の薬理活性を反映する可能性がある。（Nicke et al. (2004), Eur. J. Biochem. 271: 2305-19, Table 1; Adams (1999), Drug Develop. Res.46: 219-34）。例えば、α−コノトキシンは、明確に定義された４つのシステイン／２つのジスルフィドループ構造を有し（Loughnan, 2004）、ニコチン性アセチルコリン受容体を阻害する。対照的に、ω−コノトキシンは６つのシステイン／３つのジスルフィドループのコンセンサス構造を有し（Nielsen, 2000）、カルシウムチャンネルをブロックする。毒素の構造サブセットは電位依存性またはカルシウム活性化カリウムチャンネルのいずれかを阻害するように進化してきた。
クモ毒は、Ｋｖ、Ｃａｖ、およびＮａｖチャンネルをはじめとする電位依存性イオンチャネルを標的とする多くのペプチド毒素を含有する。多くのこれらのペプチドは、阻害性シスチンノット（ＩＣＫ）構造モチーフに適合するゲート修飾物質である（Norton et al., The cystine knot structure of ion channel toxins and related polypeptides, Toxicon 36(11):1573-1583 (1998); Pallaghy et al., A common structural motif incorporating a cystine knot and a triple-stranded β-sheet in toxic and inhibitory polypeptides, Prot. Sci. 3(10):1833-6, (1994)を参照のこと）。いくつかのサソリおよびイソギンチャク毒と対照的に、多くのクモ毒は失活速度に影響を及ぼさないが、電位センサーの開口チャンネル立体構造中への移動を制限することによってチャンネル活性を阻害し、それらの活性化の電位依存性をより正電位にシフトさせる。これらのクモ毒の多くは、電位依存性イオンチャネルファミリー内および全体にわたって無差別である。
ＶＧＳＣを標的とする様々な毒素ペプチドが特に報告されている（Billen et al., Animal peptides targeting voltage-activated sodium channels, Cur. Pharm. Des. 14:2492-2502, (2008)を参照のこと）。３つのクラスのペプチド毒素が記載されている：１）サイト１毒素であるμ−コノトキシンは、チャンネルの孔に結合し、伝導路を物理的に塞ぐ；２）α−サソリ毒素、いくつかのイソギンチャク毒およびδ−コノトキシンを含むサイト３毒素は、ドメインＩＶのＳ３−Ｓ４リンカーに結合し、チャンネル失活を減速する；そして３）β−サソリ毒素を含むサイト４毒素は、ドメインＩＩ中のＳ３−Ｓ４リンカーに結合し、チャンネル活性化を促進する。ペプチドのサイト３およびサイト４ファミリーはどちらもＮａｖチャンネルの開口確率を変更し、ゲート遷移に影響を及ぼし、したがって「ゲート修飾物質」と呼ばれる。
最初にConus kinoshitaiから単離されたサイト１毒素であるμ−コノトキシンＫＩＩＩＡ（配列番号５３０）、は、３つの分子内ジスルフィド結合に関与する６つのシステイン残基を含む１６アミノ酸の長さの、Ｃ末端がアミド化されたペプチドである。これは最初に両生類後根神経節（ＤＲＧ）ニューロンにおいてテトロドトキシン（ＴＴＸ）耐性ナトリウムチャンネルの阻害剤として特徴付けられた（Bulaj et al., Novel conotoxins from Conus striatus and Conus kinoshitai selectively block TTX-resistant sodium channels, Biochem. 44(19):7259-7265, (2005)を参照のこと）。後に、これは、マウスＤＲＧニューロンにおいてＴＴＸ耐性ナトリウム電流よりもＴＴＸ感受性ナトリウム電流をより有効に阻害することが判明した（Zhang et al., Structure/function characterization of μ-conotoxin KIIIA , an analgesic, nearly irreversible blocker of mammalian neuronal sodium channels, J. Biol. Chem. 282(42):30699-30706, (2007)を参照のこと）。ＫＩＩＩＡは、以下の有効性の順位でアフリカツメガエル（Xenopus laevis）卵母細胞中で発現されたクローンほ乳類の（齧歯類）チャンネルをブロックすることが判明した：ＮａＶ１．２＞ＮａＶ１．４＞ＮａＶ１．６＞ＮａＶ１．７＞ＮａＶ１．３＞ＮａＶ１．５。ＫＩＩＩＡの腹腔内注射は、マウスにおいてホルマリンで誘発される疼痛アッセイで鎮痛作用を示し、１．６ナノモル／マウス（０．１ｍｇ／ｋｇ）のＥＤ５０で、運動障害が観察されなかった；さらに高い用量（１０ナノモル）で、麻痺acitityではないが多少の運動障害が観察された。（Zhang et al., 2007を参照のこと）。アラニンのＬｙｓ７およびＡｒｇ１０での置換は、最大ブロックを修飾し、一方、Ｈｉｓ１２およびＡｒｇ１４の置換はＮａｖイソ型特異性を変更した。（McArthur et al., Interactions of key charged residues contributing to selective block of neuronal sodium channels by μ-conotoxin KIIIA, Mol. Pharm. 80(4): 573-584, (2011)を参照のこと）。ＫＩＩＩＡの「アラニンスキャン」アナログは、Ｌｙｓ７、Ｔｒｐ８、Ａｒｇ１０、Ａｓｐ１１、Ｈｉｓ１２、およびＡｒｇ１４がｒＮａＶ１．４に対する活性について重要であると確認した。（Zhang et al., 2007）。ＫＩＩＩＡのＮＭＲ溶液構造は、これらの残基を分子のＣ末端付近のα−ヘリックス内または隣接して認識する。（Khoo et al., Structure of the analgesic μ-conotoxin KIIIA and effects on the structure and function of disulfide deletion, Biochem. 48(6):1210-1219, (2009)を参照のこと）。Ｃｙｓ１とＣｙｓ９との間のジスルフィド結合は、アラニン（ＫＩＩＩＡ［Ｃ１Ａ，Ｃ９Ａ］）の置換によって、化合物の活性を大幅に減少させることなく除去することができる。（Khoo et al., 2009; Han et al., Structurally minimized μ-conotoxin analogs as sodium channel blockers: implications for designing conopeptide-based therapeutics, ChemMedChem 4(3):406-414, (2009)を参照のこと）。Ｃｙｓ２とＣｙｓ１６との間の第２のジスルフィド結合を、セレノシステイン残基間のジセレニド結合と置換すると、ＫＩＩＩＡのジスルフィド除去セレノコノペプチドアナログが生じた。これらの化合物はＫＩＩＩＡの活性を保持するが、合成的により利用しやすい。（Han et al., Disulfide-depleted selenoconopeptides: simplified oxidative folding of cysteine-rich peptides, ACS Med. Chem. Lett.1(4):140-144, (2010)を参照のこと）。天然の構造は、Ｎａｖ阻害活性を有するラクタム安定化らせん形ペプチドスカフォールドにさらに最小化されている。（Khoo et al., Lactam-stabilized helical analogues of the analgesic μ-conotoxin KIIIA, J. Med. Chem. 54:7558-7566 (2011)を参照のこと）。ＫＩＩＩＡは、ＶＧＳＣの伝導孔の前腔中の神経毒受容体部位１に結合し、悉無律的にチャンネルをブロックする。最近の研究は、ＫＩＩＩＡのいくつかのアナログは、ナトリウム電流を部分的にだけ阻害し、ＴＴＸおよびサキシトキシン（ＳＴＸ）と同時に結合することができる可能性があることを証明した。（Zhang et al., Cooccupancy of the outer vestibule of voltage-gated sodium channels by μ-conotoxin KIIIA and saxitoxin or tetrodotoxin, J. Neurophys. 104(1):88-97, (2010); French et al., The tetrodotoxin receptor of voltage-gated sodium channels - perspectives from interactions with μ-conotoxins, Marine Drugs 8:2153-2161, (2010); Zhang et al., μ-Conotoxin KIIIA derivatives with divergent affinities versus efficacies in blocking voltage-gated sodium channels. Biochem. 49(23):4804-4812, (2010); Zhang et al., Synergistic and antagonistic interactions between tetrodotoxin and μ-conotoxin in blocking voltage-gated sodium channels, Channels 3(1):32-38, (2009)を参照のこと）。
ＯＤ１（配列番号５８９）は、イランキイロサソリ（Iranian yellow scorpion）Odonthobuthus doriaeの毒から単離されたα様毒素である。（Jalali et al., OD1, the first toxin isolated from the venom of the scorpion Odonthobuthus doriae active on voltage-gated Na+ channels, FEBS Lett. 579(19):4181-4186, (2005)を参照のこと）。このペプチドは６５アミノ酸の長さであり、３つのジスルフィド結合を形成する６つのシステイン残基を含むアミド化されたＣ末端を有する。ＯＤ１は、急速な失活を阻害し（ＥＣ５０＝４．５ｎＭ）、あらゆる電圧でのピーク電流を増加させ、永久電流を誘導し、ＮａＶ１．８およびＮａＶ１．３に対する選択性を有するＮａＶ１．７モジュレータとして特徴付けられている。（Maertens et al., Potent modulation of the voltage-gated sodium channel Nav1.7 by OD1, a toxin from the scorpion Odonthobuthus doriae, Mol. Pharm. 70(1):405-414, (2006)を参照のこと）。
Ｈｕｗｅｎ毒素−ＩＶ（ＨＷＴＸ−ＩＶ；配列番号５２８）は、中国トリトリクモ（Chinese bird spider）Selenocosmia huwenaの毒から単離された６つのシステイン残基間に３つのジスルフィドブリッジを有する３５残基Ｃ末端ペプチドアミドである（Peng et al., Function and solution structure of huwentoxin - IV , a potent neuronal tetrodotoxin (TTX)-sensitive sodium channel antagonist from chinese bird spider Selenocosmia huwena, J. Biol. Chem. 277(49):47564-47571, (2002)を参照のこと）。ジスルフィド結合パターン（Ｃ１−Ｃ４、Ｃ２−Ｃ５、Ｃ３−Ｃ６）およびＮＭＲ溶液構造の故に、ＨＷＴＸ−ＩＶはＩＣＫ構造ファミリーに分類される。なぜなら、Ｃ３−Ｃ６ジスルフィド結合は、他の２つのジスルフィドブリッジ（Ｃ１−Ｃ４およびＣ２−Ｃ５）によって形成される1６残基環を通り抜けるからである。ＨＷＴＸ−ＩＶは、３０ｎＭのＩＣ５０値で成体ラットＤＲＧニューロンにおいてＴＴＸ感受性ナトリウム電流を阻害するが、１００ｎＭまでの濃度でＴＴＸ耐性ＶＧＳＣに対して影響を及ぼさない。（Peng et al., 2002を参照のこと）。ＨＷＴＸ−ＩＶはさらに、ラット海馬ニューロンにおいて中枢ニューロンナトリウムチャンネルに対して１２倍効力が低く、このことは、それがＮａＶ１．７に対して選択的である可能性があることを示唆する。（Xiao et al., Synthesis and characterization of huwentoxin-IV, a neurotoxin inhibiting central neuronal sodium channels, Toxicon 51(2):230-239, (2008)を参照のこと）。ＶＧＳＣサブタイプに対してＨＷＴＸ−ＩＶを試験することによって、相対感度がｈＮａｖ１．７（ＩＣ５０＝２６ｎＭ）＞ｒＮａｖ１．２＞＞ｒＮａｖ１．３＞ｒＮａｖ１．４≧ｈＮａｖ１．５であることが見出された（Xiao et al., Tarantula huwentoxin-IV inhibits neuronal sodium channels by binding to receptor site 4 and trapping the domain II voltage sensor in the closed configuration, J. Biol. Chem. 283(40):27300-27313, (2008)を参照のこと）。部位特異的タンパク質突然変異誘発により、ＨＷＴＸ−ＩＶの結合が神経毒部位４（ドメインＩＩ間の細胞外Ｓ３−Ｓ４リンカー）にマッピングされ、電圧およびチャンネル活性化における変化に反応したその挙動はＮａｖ１．７の電圧センサーへの結合および静止立体配置（resting configuration）中へのその捕捉と一致する。（Xiao et al., 2008を参照のこと）。関連するファミリーメンバーであるＨｕｗｅｎ毒素−Ｉ（ＨＷＴＸ−Ｉ；配列番号５２９）、はＶＧＳＣに対して効力がより低いが、Ｎ型ＣａＶチャンネルに対して活性である。（Wang et al., The cross channel activities of spider neurotoxin huwentoxin I on rat dorsal root ganglion neurons, Biochem. Biophys. Res. Comm. 357(3):579-583, (2007); Chen et al., Antinociceptive effects of intrathecally administered huwentoxin-I, a selective N-type calcium channel blocker, in the formalin test in conscious rats, Toxicon 45(1):15-20, (2005); Liang et al., Properties and amino acid sequence of huwentoxin-I, a neurotoxin purified from the venom of the Chinese bird spider Selenocosmia huwena, Toxicon 31(8):969-78, (1993)を参照のこと）。
タランチュラThixopelma pruriensの毒から単離されたＰｒｏＴｘ−ＩＩ（配列番号５３１）は、Ｃ末端遊離酸、および３つのジスルフィド結合を形成する６つのシステイン残基を有する３０アミノ酸ポリペプチドである。それはＩＣＫファミリーの他のメンバーとは異なる。なぜなら、通常の４〜１１のかわりに第５システイン残基と第６システイン残基との間に３つの残基のみを含むからである。ＰｒｏＴｘ−ＩＩは、ＮａＶ１．２、ＮａＶ１．７（ＩＣ５０＜１ｎＭ）、ＮａＶ１．５、およびＮａＶ１．８を含むいくつかのＮａＶチャンネルサブタイプ、ならびにＣａｖ３．１チャンネルの強力な阻害剤であるが、ＫＶチャンネルの阻害剤ではない。（Middleton et al., Two tarantula peptides inhibit activation of multiple sodium channels, Biochem. 41(50):14734-14747, (2002); Priest et al., ProTx-I and ProTx-II: gating modifiers of voltage-gated sodium channels, Toxicon 49(2):194-201, (2007); Edgerton et al., Inhibition of the activation pathway of the T-type calcium channel CaV3.1 by ProTxII, Toxicon 56(4):624-636, (2010)を参照のこと）。ＰｒｏＴｘ−ＩＩの「アラニンスキャン」アナログがＮａｖ１．５に対して試験され、Ｍｅｔ６、Ｔｒｐ７、Ａｒｇ１３、Ｍｅｔ１９、Ｖａｌ２０、Ａｒｇ２２、Ｌｅｕ２３、Ｔｒｐ２４、Ｌｙｓ２７、Ｌｅｕ２９、およびＴｒｐ３０が活性について重要であると特定された。（Smith et al., Molecular interactions of the gating modifier toxin ProTx-II with Nav1.5: implied existence of a novel toxin binding site coupled to activation, J. Biol. Chem. 282(17):12687-12697, (2007)を参照のこと）。生物物理学的な特徴づけにより、ＰｒｏＴｘ−ＩＩがＨｗＴｘ−ＩＶとは脂質膜と相互作用するその能力で異なることが示された。（Smith et al., Differential phospholipid binding by site 3 and site 4 toxins: implications for structural variability between voltage-sensitive sodium channel comains, J. Biol. Chem. 280(12):11127-11133, (2005)を参照のこと。０．０１および０．１ｍｇ／ｋｇでの静脈注射の用量のＰｒｏＴｘ−ＩＩは十分に許容されたが、１ｍｇ／ｋｇ用量は致死的であった。ＰｒｏＴｘ−ＩＩは機械的痛覚過敏研究では効力はなかった。（Schmalhofer et al., ProTx-II, a selective inhibitor of NaV1.7 sodium channels, blocks action potential propagation in nociceptors, Mol. Pharm. 74(5):1476-1484, (2008)を参照のこと）。くも膜下腔内投与は０．１ｍｇ／ｋｇで致死的であり、さらに低い用量での痛覚過敏研究では有効ではなかった。脱鞘皮膚神経へのＰｒｏＴｘ−ＩＩ適用は、Ｃ繊維複合活動電位（C-fiber compound action potential)を完全にブロックしたが、損傷されていない神経の活動電位伝播に対してはほとんど影響を及ぼさなかった。（Schmalhofer et al., 2008を参照のこと）。ＰｒｏＴｘ−ＩＩは、ＮａＶ１．７のドメインＩＩのＳ３−Ｓ４リンカーに結合して、チャンネル活性化を阻害すると考えられるが、メインＩＶ電位センサーと相互作用し、さらに高い濃度においてナトリウムチャンネル活性化に影響を及ぼす可能性がある。（Xiao et al., The tarantula toxins ProTx-II and huwentoxin-IV differentially interact with human Nav1.7 voltage sensors to inhibit channel activation and inactivation, Mol. Pharm. 78(6):1124-1134, (2010); Sokolov et al., Inhibition of sodium channel gating by trapping the domain II voltage sensor with protoxin II, Mol. Pharm. 73(3):1020-1028, (2008); Edgerton et al., Evidence for multiple effects of ProTxII on activation gating in NaV1.5, Toxicon 52(3):489-500, (2008)を参照のこと）。
毒素ペプチドの産生は、有毒生物において複雑なプロセスであり、合成的にはなお一層複雑なプロセスである。それらの保存されたジスルフィド構造および効率的な酸化的リフォールディングの必要性のために、毒素ペプチドは合成に課題を提示する。（Steiner and Bulaj, Optimization of oxidative folding methods for cysteine-rich peptides: a study of conotoxins containing three disulfide bridges, J. Pept. Sci. 17(1): 1-7, (2011); Gongora-Benitez et al., Optimized Fmoc solid-phase synthesis of the cysteine-rich peptide Linaclotide, Biopolymers Pept. Sci. 96(1):69-80, (2011)を参照のこと）。毒素ペプチドはイオンチャネルの非常に選択的な薬理学的阻害剤として長年にわたり使用されているが、毒素ペプチドの合成およびリフォールディングの高いコストならびにそれらのインビボでの短い半減期は、これらのペプチドの治療法としての探求を妨げている。小分子阻害剤をイオンチャネルの治療用アンタゴニストとして特定するために、毒素ペプチド自体に対してよりもはるかに多大な努力が費やされてきた。１つの例外は、ニューロン特異的Ｎ型電位感受性カルシウムチャンネルの阻害剤である小型ω−コノトキシンＭＶＩＩＡペプチド（Prialt（登録商標）、ジコノチド）の難治性疼痛の治療のための認可である。しかしながら、ジコノチドの合成およびリフォールディング製造プロセスは費用がかかり、インビボでの半減期が非常に短い（約４時間）小ペプチドしか得られない。
ヒトにおける小規模臨床試験は、非ペプチドテトロドトキシンの局所的非全身性注射が、ガンおよび／または化学療法に起因する疼痛に苦しんでいる患者で痛みの軽減をもたらすことを示した（Hagen et al., J Pain Symp Manag 34:171-182 (2007)）。テトロドトキシンは、ＮａＶ１．３およびＮａＶ１．７を含むナトリウムチャンネルの非ＣＮＳ−浸透阻害剤である；ナトリウムチャンネルサブタイプ間で選択性がないために全身的に使用することはできないが、その有効性は、末梢ニューロンにおいてＮａＶ１．７および／またはＮａＶ１．３の阻害剤で慢性疼痛症候群を治療するためのさらなる確証を与える。
ポリペプチドは、典型的には、小分子に特徴的であるよりも大きな標的選択性の利点を示す。Ｎａｖ１．７および／またはＮａｖ１．３について選択的な非ＣＮＳ浸透毒素ペプチドおよびペプチドアナログが望ましく、それらが本発明によって提供される。
米国特許出願公開第２００５／０１８７２１７号明細書 国際公開第２００９／０３３０２７号 国際公開第２００７／１０９３２４号
Isom, Sodium channel beta subunits: anything but auxiliary, Neuroscientist 7(1):42-54 (2001) Goldin, A. L., Resurgence of sodium channel research, Annu Rev Physiol 63: 871-94 (2001) Wilson et al., Compositions useful as inhibitors of voltage-gated ion channels Noda, M., H. Suzuki, et al., A single point mutation confers tetrodotoxin and saxitoxin insensitivity on the sodium channel II" FEBS Lett 259(1): 213-6 (1989) Mao, J. and L. L. Chen, Systemic lidocaine for neuropathic pain relief, Pain 87(1): 7-17 (2000) Jensen, T. S., Anticonvulsants in neuropathic pain: rationale and clinical evidence, Eur J Pain 6 (Suppl A): 61-68 (2002) Rozen, T. D., Antiepileptic drugs in the management of cluster headache and trigeminal neuralgia, Headache 41 Suppl 1: S25-32 (2001) Backonja, M. M., Use of anticonvulsants for treatment of neuropathic pain, Neurology 59(5 Suppl 2): S14-7 (2002) Yang et al., Mutations in SCN9A, encoding a sodium channel alpha subunit, in patients with primary erythermalgia, J. Med. Genet. 41:171-174 (2004) Harty et al., NaV1.7 mutant A863P in erythromelalgia: effects of altered activation and steady-state inactivation on excitability of nociceptive dorsal root ganglion neurons, J. Neurosci. 26(48):12566-75 (2006) Estacion et al., NaV1.7 gain-of-function mutations as a continuum: A1632E displays physiological changes associated with erythromelalgia and paroxysmal extreme pain disorder mutations and produces symptoms of both disorders, J. Neurosci. 28(43):11079-88 (2008) Diss et al., A potential novel marker for human prostate cancer: voltage-gated sodium channel expression in vivo, Prostate Cancer and Prostatic Diseases 8:266-73 (2005) Uysal-Onganer et al., Epidermal growth factor potentiates in vitro metastatic behavior human prostate cancer PC-3M cells: involvement of voltage-gated sodium channel, Molec. Cancer 6:76 (2007) Ahmad et al., A stop codon mutation in SCN9A causes lack of pain sensation, Hum. Mol. Genet. 16(17):2114-21 (2007) Nassar et al., Nociceptor-specific gene deletion reveals a major role for NaV1.7 (PN1) in acute and inflammatory pain, Proc. Natl. Acad. Sci, U S A. 101(34): 12706-12711 (2004) Thakker et al., Suppression of SCN9A gene expression and/or function for the treatment of pain Yeomans et al., Decrease in inflammatory hyperalgesia by herpes vector-mediated knockdown of NaV1.7 sodium channels in primary afferents, Hum. Gene Ther. 16(2):271-7 (2005) Fraser et al., Potent and selective NaV1.7 sodium channel blockers Hoyt et al., Discovery of a novel class of benzazepinone Na(v)1.7 blockers: potential treatments for neuropathic pain, Bioorg. Med. Chem. Lett. 17(16):4630-34 (2007) Hoyt et al., Benzazepinone NaV1.7 blockers: Potential treatments for neuropathic pain, Bioorg. Med. Chem. Lett. 17(22):6172-77 (2007) Thimmapaya et al., Distribution and functional characterization of human NaV1.3 splice variants, Eur. J. Neurosci. 22:1-9 (2005) Hains et al., Changes in electrophysiological properties and sodium channel NaV1.3 expression in thalamic neurons after spinal cord injury, Brain 128:2359-71 (2005) Estacion et al., A sodium channel mutation linked to epilepsy increases ramp and persistent current of NaV1.3 and induces hyperexcitability in hippocampal neurons, Experimental Neurology 224(2):362-368 (2010) Dauplais et al., On the convergent evolution of animal toxins: conservation of a diad of functional residues in potassium channel-blocking toxins with unrelated structures, J. Biol. Chem. 272(7):4302-09 (1997) Alessandri-Haber et al., Mapping the functional anatomy of BgK on Kv1.1, Kv1.2, and Kv1.3, J. Biol. Chem. 274(50):35653-61 (1999) Tudor et al., Ionisation behaviour and solution properties of the potassium-channel blocker ShK toxin, Eur. J. Biochem. 251(1-2):133-41(1998) Pennington et al., Role of disulfide bonds in the structure and potassium channel blocking activity of ShK toxin, Biochem. 38(44): 14549-58 (1999) Jaravine et al., Three-dimensional structure of toxin OSK1 from Orthochirus scrobiculosus scorpion venom, Biochem. 36(6):1223-32 (1997) del Rio-Portillo et al.; NMR solution structure of Cn12, a novel peptide from the Mexican scorpion Centruroides noxius with a typical beta-toxin sequence but with alpha-like physiological activity, Eur. J. Biochem. 271(12): 2504-16 (2004) Prochnicka-Chalufour et al., Solution structure of discrepin, a new K+-channel blocking peptide from the alpha-KTx15 subfamily, Biochem. 45(6):1795-1804 (2006) Nicke et al. (2004), Eur. J. Biochem. 271: 2305-19, Table 1; Adams (1999), Drug Develop. Res.46: 219-34 Norton et al., The cystine knot structure of ion channel toxins and related polypeptides, Toxicon 36(11):1573-1583 (1998) Pallaghy et al., A common structural motif incorporating a cystine knot and a triple-stranded β-sheet in toxic and inhibitory polypeptides, Prot. Sci. 3(10):1833-6, (1994) Billen et al., Animal peptides targeting voltage-activated sodium channels, Cur. Pharm. Des. 14:2492-2502, (2008) Bulaj et al., Novel conotoxins from Conus striatus and Conus kinoshitai selectively block TTX-resistant sodium channels, Biochem. 44(19):7259-7265, (2005) Zhang et al., Structure/function characterization of μ-conotoxin KIIIA , an analgesic, nearly irreversible blocker of mammalian neuronal sodium channels, J. Biol. Chem. 282(42):30699-30706, (2007) McArthur et al., Interactions of key charged residues contributing to selective block of neuronal sodium channels by μ-conotoxin KIIIA, Mol. Pharm. 80(4): 573-584, (2011) Khoo et al., Structure of the analgesic μ-conotoxin KIIIA and effects on the structure and function of disulfide deletion, Biochem. 48(6):1210-1219, (2009) Han et al., Structurally minimized μ-conotoxin analogs as sodium channel blockers: implications for designing conopeptide-based therapeutics, ChemMedChem 4(3):406-414, (2009) Han et al., Disulfide-depleted selenoconopeptides: simplified oxidative folding of cysteine-rich peptides, ACS Med. Chem. Lett.1(4):140-144, (2010) Khoo et al., Lactam-stabilized helical analogues of the analgesic μ-conotoxin KIIIA, J. Med. Chem. 54:7558-7566 (2011) Zhang et al., Cooccupancy of the outer vestibule of voltage-gated sodium channels by μ-conotoxin KIIIA and saxitoxin or tetrodotoxin, J. Neurophys. 104(1):88-97, (2010) French et al., The tetrodotoxin receptor of voltage-gated sodium channels - perspectives from interactions with μ-conotoxins, Marine Drugs 8:2153-2161, (2010) Zhang et al., μ-Conotoxin KIIIA derivatives with divergent affinities versus efficacies in blocking voltage-gated sodium channels. Biochem. 49(23):4804-4812, (2010) Zhang et al., Synergistic and antagonistic interactions between tetrodotoxin and μ-conotoxin in blocking voltage-gated sodium channels, Channels 3(1):32-38, (2009) Jalali et al., OD1, the first toxin isolated from the venom of the scorpion Odonthobuthus doriae active on voltage-gated Na+ channels, FEBS Lett. 579(19):4181-4186, (2005) Maertens et al., Potent modulation of the voltage-gated sodium channel Nav1.7 by OD1, a toxin from the scorpion Odonthobuthus doriae, Mol. Pharm. 70(1):405-414, (2006) Peng et al., Function and solution structure of huwentoxin - IV , a potent neuronal tetrodotoxin (TTX)-sensitive sodium channel antagonist from chinese bird spider Selenocosmia huwena, J. Biol. Chem. 277(49):47564-47571, (2002) Xiao et al., Synthesis and characterization of huwentoxin-IV, a neurotoxin inhibiting central neuronal sodium channels, Toxicon 51(2):230-239, (2008) Xiao et al., Tarantula huwentoxin-IV inhibits neuronal sodium channels by binding to receptor site 4 and trapping the domain II voltage sensor in the closed configuration, J. Biol. Chem. 283(40):27300-27313, (2008) Wang et al., The cross channel activities of spider neurotoxin huwentoxin I on rat dorsal root ganglion neurons, Biochem. Biophys. Res. Comm. 357(3):579-583, (2007) Chen et al., Antinociceptive effects of intrathecally administered huwentoxin-I, a selective N-type calcium channel blocker, in the formalin test in conscious rats, Toxicon 45(1):15-20, (2005) Liang et al., Properties and amino acid sequence of huwentoxin-I, a neurotoxin purified from the venom of the Chinese bird spider Selenocosmia huwena, Toxicon 31(8):969-78, (1993) Middleton et al., Two tarantula peptides inhibit activation of multiple sodium channels, Biochem. 41(50):14734-14747, (2002) Priest et al., ProTx-I and ProTx-II: gating modifiers of voltage-gated sodium channels, Toxicon 49(2):194-201, (2007) Edgerton et al., Inhibition of the activation pathway of the T-type calcium channel CaV3.1 by ProTxII, Toxicon 56(4):624-636, (2010) Smith et al., Molecular interactions of the gating modifier toxin ProTx-II with Nav1.5: implied existence of a novel toxin binding site coupled to activation, J. Biol. Chem. 282(17):12687-12697, (2007) Smith et al., Differential phospholipid binding by site 3 and site 4 toxins: implications for structural variability between voltage-sensitive sodium channel comains, J. Biol. Chem. 280(12):11127-11133, (2005) Schmalhofer et al., ProTx-II, a selective inhibitor of NaV1.7 sodium channels, blocks action potential propagation in nociceptors, Mol. Pharm. 74(5):1476-1484, (2008) Xiao et al., The tarantula toxins ProTx-II and huwentoxin-IV differentially interact with human Nav1.7 voltage sensors to inhibit channel activation and inactivation, Mol. Pharm. 78(6):1124-1134, (2010) Sokolov et al., Inhibition of sodium channel gating by trapping the domain II voltage sensor with protoxin II, Mol. Pharm. 73(3):1020-1028, (2008) Edgerton et al., Evidence for multiple effects of ProTxII on activation gating in NaV1.5, Toxicon 52(3):489-500, (2008) Steiner and Bulaj, Optimization of oxidative folding methods for cysteine-rich peptides: a study of conotoxins containing three disulfide bridges, J. Pept. Sci. 17(1): 1-7, (2011) Gongora-Benitez et al., Optimized Fmoc solid-phase synthesis of the cysteine-rich peptide Linaclotide, Biopolymers Pept. Sci. 96(1):69-80, (2011) Hagen et al., J Pain Symp Manag 34:171-182 (2007)
本発明は、末梢に限定される（peripherally-restricted）ＮａＶ１．７阻害剤である、単離されたポリペプチドを含む組成物に関する。１つの実施形態において、単離されたポリペプチドは、本明細書中に記載するように、本発明者等が「ＧｐＴｘ−１」と呼ぶペプチドであり、タランチュラGrammostola porteriの毒から単離した、アミノ酸配列DCLGFMRKCIPDNDKCCRPNLVCSRTHKWCKYVF-NH2（配列番号１）を有するＮａＶ１．７およびＮａＶ１．３の二重阻害剤である。本発明の他の実施形態は、ＧｐＴｘ−１のペプチドアナログを含む。他の実施形態において、本発明は、式：
Xaa 1Xaa 2 Xaa 3Xaa 4Xaa 5Xaa 6Xaa 7Xaa 8Xaa 9Xaa 10Xaa 11Xaa 12Xaa 13Xaa 14Asp15 Xaa 16 Xaa 17 Xaa 18Xaa 19 Xaa 20 Xaa 21Xaa 22Xaa 23 Xaa 24Xaa 25 Xaa 26Xaa 27Xaa 28Xaa 29 Xaa 30 Xaa 31Lys32Xaa 33Xaa 34Xaa 35 Xaa 36Xaa 37Xaa 38／／配列番号４７５
のアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドまたはその薬剤的に許容される塩を含む組成物に関し、
式中：
Ｘａａ １Ｘａａ ２は存在しない；またはＸａａ １は任意のアミノ酸残基であり、Ｘａａ ２は任意のアミノ酸残基である；またはＸａａ １は存在せず、Ｘａａ ２は任意のアミノ酸残基である；
Ｘａａ １８がＣｙｓである場合、Ｘａａ ３はＣｙｓである；またはＸａａ １８がＳｅＣｙｓである場合、Ｘａａ ３はＳｅＣｙｓである；またはＸａａ １８がアルキルアミノ酸残基である場合、Ｘａａ ３はアルキルアミノ酸残基である；
Ｘａａ ４は、酸性、疎水性、塩基性、または中性親水性アミノ酸残基である；
Ｘａａ ５は、Ｇｌｙ、Ａｌａ、疎水性、または塩基性アミノ酸残基である；
Ｘａａ ６は、Ｇｌｙ、Ａｌａ、２−Ａｂｕ、Ｎｌｅ、Ｎｖａ、または疎水性アミノ酸残基である；
Ｘａａ ７は、Ｇｌｙ、Ａｌａ、芳香族、または疎水性アミノ酸残基である；
Ｘａａ ８は、塩基性、酸性、もしくは中性親水性アミノ酸残基、またはＡｌａ残基である；
Ｘａａ ９は、塩基性または中性親水性アミノ酸残基である；
Ｘａａ ２４がＣｙｓである場合、Ｘａａ １０はＣｙｓである；またはＸａａ ２４がＳｅＣｙｓである場合、Ｘａａ １０はＳｅＣｙｓである；
Ｘａａ １１は任意のアミノ酸残基である；
Ｘａａ １２は、Ｐｒｏ、酸性、中性、または疎水性アミノ酸残基である；
Ｘａａ １３は任意のアミノ酸残基である；
Ｘａａ １４は任意のアミノ酸残基である；
Ｘａａ １６は、塩基性、中性親水性、もしくは酸性アミノ酸残基、またはＡｌａ残基である；
Ｘａａ ３１がＣｙｓである場合、Ｘａａ １７はＣｙｓである；またはＸａａ ３１がＳｅＣｙｓである場合、Ｘａａ １７はＳｅＣｙｓである；
Ｘａａ １８は、Ｃｙｓ、ＳｅＣｙｓ、またはアルキルアミノ酸残基である；
Ｘａａ １９は任意のアミノ酸残基である；
Ｘａａ ２０は、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、塩基性、または中性親水性残基である；
Ｘａａ ２１は、塩基性、疎水性、または中性親水性アミノ酸残基である；
Ｘａａ ２２は、疎水性または塩基性アミノ酸残基である；
Ｘａａ ２３は、疎水性、塩基性、または中性親水性アミノ酸残基である；
Ｘａａ ２４は、ＣｙｓまたはＳｅＣｙｓ残基である；
Ｘａａ ２５は、Ｓｅｒ、Ａｌａ、または中性親水性アミノ酸残基である；
Ｘａａ ２６は、Ａｌａ、酸性、塩基性、または中性親水性アミノ酸残基である；
Ｘａａ ２７は、酸性、塩基性、中性親水性または疎水性残基である；
Ｘａａ ２８は、芳香族または塩基性アミノ酸残基である；
Ｘａａ ２９は、酸性、塩基性、または中性親水性アミノ酸残基である；
Ｘａａ ３０は、Ｔｒｐ、５−ブロモＴｒｐ、６−ブロモＴｒｐ、５−クロロＴｒｐ、６−クロロＴｒｐ、１−Ｎａｌ、２−Ｎａｌ、またはチオＴｒｐ残基である；
Ｘａａ ３１は、ＣｙｓまたはＳｅＣｙｓである；
Ｘａａ ３３は、疎水性または芳香族アミノ酸残基である；
Ｘａａ ３４は任意のアミノ酸残基である；
Ｘａａ ３５は疎水性アミノ酸残基である；
Ｘａａ ３６、Ｘａａ ３７、およびＸａａ ３８のそれぞれは独立して存在しないか、または独立して中性、塩基性、もしくは疎水性アミノ酸残基である；
ここで：
Ｘａａ ３およびＸａａ １８がどちらもＣｙｓ残基である場合、残基Ｘａａ ３と残基Ｘａａ １８との間にはジスルフィド結合がある；またはＸａａ ３およびＸａａ １８がどちらもＳｅＣｙｓ残基である場合、残基Ｘａａ ３と残基Ｘａａ １８との間にはジセレニド結合がある；
Ｘａａ １０およびＸａａ ２４がどちらもＣｙｓ残基である場合、残基Ｘａａ １０と残基Ｘａａ ２４との間にはジスルフィド結合がある；またはＸａａ １０およびＸａａ ２４がどちらもＳｅＣｙｓ残基である場合、残基Ｘａａ １０と残基Ｘａａ ２４との間にはジセレニド結合がある；
Ｘａａ １７およびＸａａ ３１がどちらもＣｙｓ残基である場合、残基Ｘａａ １７と残基Ｘａａ ３１との間にはジスルフィド結合がある；またはＸａａ １７およびＸａａ ３１がどちらもＳｅＣｙｓ残基である場合、残基Ｘａａ １７と残基Ｘａａ ３１との間にはジセレニド結合がある；
アミノ末端残基は、場合によって、アセチル化、ビオチニル化、４−ペンチノイル化、またはＰＥＧ化されている；そして
カルボキシ末端残基は場合によってアミノ化されている。
特定の実施形態において、組成物は、配列番号３〜３０、３２〜７２、７４〜１３４、１３６〜１７８、１８０〜２１１、２１８〜２３９、２４１〜３０５、３０７〜３６３、３６６〜３８６、３８８〜４３２、４３４〜４７４、５１５〜５２７、５３２〜５８８、５９０、５９１、５９３〜７７５、７７７、７７８、７８０〜７８８、７９０〜１０４９、および１０６２〜３０８６から選択されるアミノ酸配列を含む。
本発明は、配列番号３〜１３４、１３６〜３０５、３０７〜３８６、３８８〜４７４、５１５〜５２７、５３２〜５８８、５９０、５９１、５９３〜１０４９、および１０６２〜３０８６から選択されるアミノ酸配列を含む組成物を含む。
本発明はさらに、非カノニカルアミノ酸を含まない、配列番号３〜１３４、１３６〜３０５、３０７〜３８６、３８８〜４７４、５１５〜５２７、５３２〜５８８、５９０、５９１、５９３〜１０４９、および１０６２〜３０８６のいずれかをコード化する核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）；当該核酸を含む発現ベクター；および当該発現ベクターを含む組換え宿主細胞を含む。本発明の組成物は、疼痛、たとえば急性、持続性、もしくは慢性疼痛を治療、または予防する有効な方法を提供する。例えば、Ｎａｖ１．７およびＮａｖ１．３の二重阻害剤は、慢性疼痛のいくつかの形態で、特にＮａｖ１．７阻害単独では不十分である場合に、有効である可能性がある。的はずれのナトリウムチャンネル、特に心臓の興奮性（Ｎａｖ１．５）および骨格筋興奮性（ＮａＶ１．４）に影響を及ぼすものに対する選択性は、任意の全身送達された治療薬について重要である。この選択性は二重阻害剤にとって特に高いハードルである。本発明の組成物はＮａｖ１．５およびＮａｖ１．４に対するそのような選択性を提供する。例えば、ＧｐＴｘ−１ペプチド（配列番号１）はＮａｖ１．４の弱い阻害剤である。さらに、ＧｐＴｘ−１はＮａｖ１．４の生理的非失活状態に対してほとんど影響を及ぼさないように、Ｎａｖ１．４の阻害は強力に状態依存性である。（これはＧｐＴｘ−１とテトロドトキシンとの間の重要な差異であり、Ｎａｖ１．４に対してほとんど選択性を有さず、Ｎａｖ１．４の失活状態および非失活状態を等しく阻害する）。
その結果として、本発明はさらに、本発明の組成物および薬剤的に許容される担体を含有する医薬組成物または薬剤に関する。
ＧｐＴｘ−１およびＧｐＴｘ−１ペプチドアナログは研究手段としても有用である。これまで、Ｎａｖ１．７またはＮａｖ１．３の利用可能な特異的生化学プローブはなく、特に生細胞の細胞膜中の正しく折り畳まれた機能的Ｎａｖ１．７に関するプローブはなかった。ＧｐＴｘ−１およびその同族体はＮａｖ１．７／Ｎａｖ１．３を阻害するので、それらは明らかにチャンネル分子に強力かつ選択的に結合する。ＮＭＲおよび残基置換によって規定されるＧｐＴｘ−１の非活性部位での蛍光または他のトレーサー基での標識は、限定されないが、ナトリウムチャンネルの局在化、ナトリウムチャンネルを発現する細胞の分類、およびＮａｖ１．７またはＮａｖ１．３に結合するペプチドについてのスクリーニングまたはパニングに好適な研究手段を提供することができる。
上のパネルは、Grammostola porteriから抽出された粗毒の逆相（ＲＰ）ＨＰＬＣ分離を示す。ｘ軸に沿った目盛りは、分別のタイムスライスを表す。下のパネルは、ＮａＶ１．７ ＩｏｎＷｏｒｋｓ（登録商標）Ｑｕａｔｒｒｏ（ＩＷＱ）アッセイにおける単離された毒画分（制御率、ＰＯＣ）の活性を示す。画分３１（長方形で示す）はＲＰ−ＨＰＬＣクロマトグラムで主要ピークを含み、イオンチャネルアッセイで＞８０％阻害を示し、そして後に解析して、ＧｐＴｘ−１（配列番号１）を得た。 挿入画は、Grammostola porteri毒の初期分離からの表示された画分（３１）の高分解能エレクトロスプレーイオン化質量分析（ＥＳＩ−ＭＳ）分析を示す。矢印は、最終的にＧｐＴｘ−１と同定された、４０７１Ｄａの分子量を有するペプチドの異なるイオン化状態について観察された（ｍ／ｚ）比を示す。質量スペクトルにおけるさらなるピークは、毒画分が少なくとも４つの異なるペプチドの混合物であることを示す。 Grammostola porteri毒の分離からの画分３１のマトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ）分析を示す。挿入画は、低および中質量範囲を示す。４０７４．９のｍ／ｚ比を有するピークは、最終的にＧｐＴｘ−１と同定されたが、この画分は４つの異なるペプチドの混合物である。 上のパネルは、Grammostola porteri毒の初期分離からの画分３１中の物質のＲＰ−ＨＰＬＣ分離（細分画）を示す。Ｘ軸に沿った目盛りは細分画のタイムスライスを表す。下のパネルは、ＮａＶ１．７ＩｏｎＷｏｒｋｓ（登録商標）Ｑｕａｔｒｒｏ（ＩＷＱ）アッセイにおいて単離された副画分（ＰＯＣ）の活性を示す。ＲＰ−ＨＰＬＣクロマトグラムにおける主要ピークはＮａＶ１．７アッセイで最も活性であり、解析してＧｐＴｘ−１を同定した。 合成ＧｐＴｘ−１のＬＣ−ＭＳ分析を示す。上のパネルは２１４ｎｍでのＵＶ吸光度のＲＰ−ＨＰＬＣクロマトグラムを示す。下のパネルは、ＥＳＩ−ＭＳ検出器の合計イオン計数（ＴＩＣ）を示す。 図５中の６．７５分を有する保持時間（ｒｔ）のピークのＥＳＩ−ＭＳ分析を示す。１３５８．８および１０１９．４のｍ／ｚ比を有するピークは、それぞれ、ＧｐＴｘ−１の［Ｍ＋３Ｈ］３＋および［Ｍ＋３Ｈ］４＋荷電状態を表し、これは４０７１．９Ｄａのモノアイソトロピック分子量を有する。 ＮＭＲ分光法によるＧｐＴｘ−１の構造決定から得られる２０の最低エネルギー立体構造（ＲＭＳＤ＝０．１±０．０５Å）のペプチド骨格のオーバーレイを示す。 ＮＭＲ分光法によるＧｐＴｘ−１の構造決定から得られる２０の最低エネルギー立体構造（ＲＭＳＤ＝０．７４±０．１２Å）についてのペプチド重原子のオーバーレイを示す。 ＮＭＲ分光法によるＧｐＴｘ−１の構造決定から得られるペプチド骨格およびジスルフィド結合（システイン残基に対応する数を有する）のリボン表示を示す。 Ｃ末端β鎖ならびに残基Ｐｈｅ５およびＭｅｔ６によって形成される疎水性および推定結合面が読者の方に向いた位置のＧｐＴｘ−１を示し、右側は、重要な残基の側鎖が表されたペプチド骨格のリボン表示であり、そして左は、分子の部分的に透明な表面レンダリングを示す。 左は、不透明表面を有するＧｐＴｘ−１の疎水性および推定結合面を示す。右は、分子を時計回りに９０°回転させて、ペプチドのフラットな疎水性面と親水性（溶媒にさらされた）面との間の位相的対比を示す。 Ａ〜Ｎは、例えば限定されないが、本明細書中に記載されるＬ５またはＬ１０などの任意のペプチジルリンカー部分によって、免疫グロブリンの１以上のドメインと融合したＧｐＴｘ−１、または毒素（例えば、ＧｐＴｘ−１）ペプチドアナログ（短い不規則な曲線）などの薬理活性毒素の１以上の単位を含む、本発明の組成物のいくつかの実施形態の概略的構造を示す。これらの概略図は更に典型的なＩｇＧ１を示すが、これらは、ヒンジで４つのジスルフィド結合を有し、重鎖および軽鎖を連結するジスルフィド結合の異なる配置を有するＩｇＧ２、ならびにＩｇＧ３およびＩｇＧ４にも同様に適用されることが意図される。図１２Ａは、免疫グロブリンＦｃ領域モノマーの一方のＣ末端と融合または複合体化した毒素ペプチドアナログとの一価ヘテロ二量体Ｆｃ−毒素ペプチドアナログ融合体または複合体を表す。 Ａ〜Ｎは、例えば限定されないが、本明細書中に記載されるＬ５またはＬ１０などの任意のペプチジルリンカー部分によって、免疫グロブリンの１以上のドメインと融合したＧｐＴｘ−１、または毒素（例えば、ＧｐＴｘ−１）ペプチドアナログ（短い不規則な曲線）などの薬理活性毒素の１以上の単位を含む、本発明の組成物のいくつかの実施形態の概略的構造を示す。これらの概略図は更に典型的なＩｇＧ１を示すが、これらは、ヒンジで４つのジスルフィド結合を有し、重鎖および軽鎖を連結するジスルフィド結合の異なる配置を有するＩｇＧ２、ならびにＩｇＧ３およびＩｇＧ４にも同様に適用されることが意図される。図１２Ｂは、免疫グロブリンＦｃ領域モノマーの両方のＣ末端と融合した毒素ペプチドアナログを有する、二価ホモ二量体型Ｆｃ−毒素ペプチドアナログ融合体または複合体を表す。 Ａ〜Ｎは、例えば限定されないが、本明細書中に記載されるＬ５またはＬ１０などの任意のペプチジルリンカー部分によって、免疫グロブリンの１以上のドメインと融合したＧｐＴｘ−１、または毒素（例えば、ＧｐＴｘ−１）ペプチドアナログ（短い不規則な曲線）などの薬理活性毒素の１以上の単位を含む、本発明の組成物のいくつかの実施形態の概略的構造を示す。これらの概略図は更に典型的なＩｇＧ１を示すが、これらは、ヒンジで４つのジスルフィド結合を有し、重鎖および軽鎖を連結するジスルフィド結合の異なる配置を有するＩｇＧ２、ならびにＩｇＧ３およびＩｇＧ４にも同様に適用されることが意図される。図１２Ｃは、免疫グロブリンＦｃ領域モノマーの一方のＮ末端と融合または化学的に複合体化した毒素ペプチドアナログを有する、一価ヘテロ二量体の毒素ペプチドアナログ−Ｆｃ融合体または複合体を表す。 Ａ〜Ｎは、例えば限定されないが、本明細書中に記載されるＬ５またはＬ１０などの任意のペプチジルリンカー部分によって、免疫グロブリンの１以上のドメインと融合したＧｐＴｘ−１、または毒素（例えば、ＧｐＴｘ−１）ペプチドアナログ（短い不規則な曲線）などの薬理活性毒素の１以上の単位を含む、本発明の組成物のいくつかの実施形態の概略的構造を示す。これらの概略図は更に典型的なＩｇＧ１を示すが、これらは、ヒンジで４つのジスルフィド結合を有し、重鎖および軽鎖を連結するジスルフィド結合の異なる配置を有するＩｇＧ２、ならびにＩｇＧ３およびＩｇＧ４にも同様に適用されることが意図される。図１２Ｄは、免疫グロブリンＦｃ領域モノマーの両方のＮ末端と融合した毒素ペプチドアナログを有する、二価ホモ二量体型毒素ペプチドアナログ−Ｆｃ融合体または複合体を表す。 Ａ〜Ｎは、例えば限定されないが、本明細書中に記載されるＬ５またはＬ１０などの任意のペプチジルリンカー部分によって、免疫グロブリンの１以上のドメインと融合したＧｐＴｘ−１、または毒素（例えば、ＧｐＴｘ−１）ペプチドアナログ（短い不規則な曲線）などの薬理活性毒素の１以上の単位を含む、本発明の組成物のいくつかの実施形態の概略的構造を示す。これらの概略図は更に典型的なＩｇＧ１を示すが、これらは、ヒンジで４つのジスルフィド結合を有し、重鎖および軽鎖を連結するジスルフィド結合の異なる配置を有するＩｇＧ２、ならびにＩｇＧ３およびＩｇＧ４にも同様に適用されることが意図される。図１２Ｅは、そのＣ末端に融合した毒素ペプチドアナログを有する、免疫グロブリン重鎖（ＨＣ）＋免疫グロブリン軽鎖（ＬＣ）＋免疫グロブリンＦｃモノマーを含む一価ヘテロ三量体Ｆｃ−毒素ペプチドアナログ／Ａｂを表す。 Ａ〜Ｎは、例えば限定されないが、本明細書中に記載されるＬ５またはＬ１０などの任意のペプチジルリンカー部分によって、免疫グロブリンの１以上のドメインと融合したＧｐＴｘ−１、または毒素（例えば、ＧｐＴｘ−１）ペプチドアナログ（短い不規則な曲線）などの薬理活性毒素の１以上の単位を含む、本発明の組成物のいくつかの実施形態の概略的構造を示す。これらの概略図は更に典型的なＩｇＧ１を示すが、これらは、ヒンジで４つのジスルフィド結合を有し、重鎖および軽鎖を連結するジスルフィド結合の異なる配置を有するＩｇＧ２、ならびにＩｇＧ３およびＩｇＧ４にも同様に適用されることが意図される。図１２Ｆは、ＨＣモノマーの一方のＣ末端に融合した毒素ペプチドアナログを有する、一価ヘテロ四量体（ＨＴ）抗体ＨＣ−毒素ペプチドアナログ融合体または複合体を表す。 Ａ〜Ｎは、例えば限定されないが、本明細書中に記載されるＬ５またはＬ１０などの任意のペプチジルリンカー部分によって、免疫グロブリンの１以上のドメインと融合したＧｐＴｘ−１、または毒素（例えば、ＧｐＴｘ−１）ペプチドアナログ（短い不規則な曲線）などの薬理活性毒素の１以上の単位を含む、本発明の組成物のいくつかの実施形態の概略的構造を示す。これらの概略図は更に典型的なＩｇＧ１を示すが、これらは、ヒンジで４つのジスルフィド結合を有し、重鎖および軽鎖を連結するジスルフィド結合の異なる配置を有するＩｇＧ２、ならびにＩｇＧ３およびＩｇＧ４にも同様に適用されることが意図される。図１２Ｇは、両方のＨＣモノマーのＣ末端上に毒素ペプチドアナログを有する二価ＨＴ抗体Ａｂ ＨＣ−毒素ペプチドアナログ融合体または複合体を表す。 Ａ〜Ｎは、例えば限定されないが、本明細書中に記載されるＬ５またはＬ１０などの任意のペプチジルリンカー部分によって、免疫グロブリンの１以上のドメインと融合したＧｐＴｘ−１、または毒素（例えば、ＧｐＴｘ−１）ペプチドアナログ（短い不規則な曲線）などの薬理活性毒素の１以上の単位を含む、本発明の組成物のいくつかの実施形態の概略的構造を示す。これらの概略図は更に典型的なＩｇＧ１を示すが、これらは、ヒンジで４つのジスルフィド結合を有し、重鎖および軽鎖を連結するジスルフィド結合の異なる配置を有するＩｇＧ２、ならびにＩｇＧ３およびＩｇＧ４にも同様に適用されることが意図される。図１２Ｈは、ＬＣモノマーの１つのＮ末端に融合した毒素ペプチドアナログを有する一価ＨＴ毒素ペプチドアナログ−ＬＣ Ａｂを表す。 Ａ〜Ｎは、例えば限定されないが、本明細書中に記載されるＬ５またはＬ１０などの任意のペプチジルリンカー部分によって、免疫グロブリンの１以上のドメインと融合したＧｐＴｘ−１、または毒素（例えば、ＧｐＴｘ−１）ペプチドアナログ（短い不規則な曲線）などの薬理活性毒素の１以上の単位を含む、本発明の組成物のいくつかの実施形態の概略的構造を示す。これらの概略図は更に典型的なＩｇＧ１を示すが、これらは、ヒンジで４つのジスルフィド結合を有し、重鎖および軽鎖を連結するジスルフィド結合の異なる配置を有するＩｇＧ２、ならびにＩｇＧ３およびＩｇＧ４にも同様に適用されることが意図される。図１２Ｉは、ＨＣモノマーの１つのＮ末端に融合した毒素ペプチドアナログを有する一価ＨＴ毒素ペプチドアナログ−ＨＣ Ａｂを表す。 Ａ〜Ｎは、例えば限定されないが、本明細書中に記載されるＬ５またはＬ１０などの任意のペプチジルリンカー部分によって、免疫グロブリンの１以上のドメインと融合したＧｐＴｘ−１、または毒素（例えば、ＧｐＴｘ−１）ペプチドアナログ（短い不規則な曲線）などの薬理活性毒素の１以上の単位を含む、本発明の組成物のいくつかの実施形態の概略的構造を示す。これらの概略図は更に典型的なＩｇＧ１を示すが、これらは、ヒンジで４つのジスルフィド結合を有し、重鎖および軽鎖を連結するジスルフィド結合の異なる配置を有するＩｇＧ２、ならびにＩｇＧ３およびＩｇＧ４にも同様に適用されることが意図される。図１２Ｊは、ＬＣモノマーの一方のＣ末端と融合した毒素ペプチドアナログを有する、一価ＨＴ Ａｂ ＬＣ−毒素ペプチドアナログ融合体または複合体（すなわち、ＬＣ−毒素ペプチドアナログ融合体または複合体＋ＬＣ＋２（ＨＣ））を表す。 Ａ〜Ｎは、例えば限定されないが、本明細書中に記載されるＬ５またはＬ１０などの任意のペプチジルリンカー部分によって、免疫グロブリンの１以上のドメインと融合したＧｐＴｘ−１、または毒素（例えば、ＧｐＴｘ−１）ペプチドアナログ（短い不規則な曲線）などの薬理活性毒素の１以上の単位を含む、本発明の組成物のいくつかの実施形態の概略的構造を示す。これらの概略図は更に典型的なＩｇＧ１を示すが、これらは、ヒンジで４つのジスルフィド結合を有し、重鎖および軽鎖を連結するジスルフィド結合の異なる配置を有するＩｇＧ２、ならびにＩｇＧ３およびＩｇＧ４にも同様に適用されることが意図される。図１２Ｋは、ＬＣモノマーの両方のＣ末端と融合した毒素ペプチドアナログを有する、二価ＨＴ Ａｂ ＬＣ−毒素ペプチドアナログ融合体または複合体（すなわち、２（ＬＣ−毒素ペプチドアナログ融合体または複合体）＋２（ＨＣ））を表す。 Ａ〜Ｎは、例えば限定されないが、本明細書中に記載されるＬ５またはＬ１０などの任意のペプチジルリンカー部分によって、免疫グロブリンの１以上のドメインと融合したＧｐＴｘ−１、または毒素（例えば、ＧｐＴｘ−１）ペプチドアナログ（短い不規則な曲線）などの薬理活性毒素の１以上の単位を含む、本発明の組成物のいくつかの実施形態の概略的構造を示す。これらの概略図は更に典型的なＩｇＧ１を示すが、これらは、ヒンジで４つのジスルフィド結合を有し、重鎖および軽鎖を連結するジスルフィド結合の異なる配置を有するＩｇＧ２、ならびにＩｇＧ３およびＩｇＧ４にも同様に適用されることが意図される。図１２Ｌは、ＬＣモノマーの両方およびＨＣモノマーの一方のＣ末端と融合した毒素ペプチドアナログを有する、三価ＨＴ Ａｂ ＬＣ−毒素ペプチドアナログ／ＨＣ−毒素ペプチドアナログ（すなわち、２（ＬＣ−毒素ペプチドアナログ融合体または複合体）＋ＨＣ−毒素ペプチドアナログ融合体または複合体＋ＨＣを表す。 Ａ〜Ｎは、例えば限定されないが、本明細書中に記載されるＬ５またはＬ１０などの任意のペプチジルリンカー部分によって、免疫グロブリンの１以上のドメインと融合したＧｐＴｘ−１、または毒素（例えば、ＧｐＴｘ−１）ペプチドアナログ（短い不規則な曲線）などの薬理活性毒素の１以上の単位を含む、本発明の組成物のいくつかの実施形態の概略的構造を示す。これらの概略図は更に典型的なＩｇＧ１を示すが、これらは、ヒンジで４つのジスルフィド結合を有し、重鎖および軽鎖を連結するジスルフィド結合の異なる配置を有するＩｇＧ２、ならびにＩｇＧ３およびＩｇＧ４にも同様に適用されることが意図される。図１２Ｍは、各ＨＣモノマーの免疫グロブリンＦｃ領域の内部ループに挿入された毒素ペプチドアナログ部分を有する二価抗体を表す。 Ａ〜Ｎは、例えば限定されないが、本明細書中に記載されるＬ５またはＬ１０などの任意のペプチジルリンカー部分によって、免疫グロブリンの１以上のドメインと融合したＧｐＴｘ−１、または毒素（例えば、ＧｐＴｘ−１）ペプチドアナログ（短い不規則な曲線）などの薬理活性毒素の１以上の単位を含む、本発明の組成物のいくつかの実施形態の概略的構造を示す。これらの概略図は更に典型的なＩｇＧ１を示すが、これらは、ヒンジで４つのジスルフィド結合を有し、重鎖および軽鎖を連結するジスルフィド結合の異なる配置を有するＩｇＧ２、ならびにＩｇＧ３およびＩｇＧ４にも同様に適用されることが意図される。図１２Ｎは、ＨＣモノマーの１つの免疫グロブリンＦｃ領域の内部ループ中に挿入された毒素ペプチドアナログ部分を有する一価抗体を表す。二量体、または三量体は、単鎖をコード化するデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）構築物の発現により、ある宿主細胞では自発的に形成される。他の宿主細胞では、細胞を二量体／三量体の形成に好都合な条件に置くことができるか、または二量体／三量体をインビトロで形成することができる。２以上のＨＣモノマー、ＬＣモノマー、または免疫グロブリンＦｃ領域モノマーが１つの実施形態の一部である場合、各モノマーは、必要に応じて、同一である可能性があるか、または互いに異なっている可能性がある。 Ａ〜Ｆは、ヒト三叉神経節（図１３Ａ〜Ｂ）およびヒト後根神経節（図１３Ｃ〜Ｆ）におけるＮａＶ１．７伝令ＲＮＡの発現を検出するインサイツハイブリダイゼーション研究を表す。図１３Ａ、図１３Ｃ、図１３Ｅは、ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色された細胞を示し、図１３Ｂ、図１３Ｄ、および図１３Ｆは、３３Ｐ標識されたアンチセンスプローブのハイブリダイゼーションによるＮａｖ１．７の発現を青色のドットとして示す。ＮａＶ１．７特異的染色は胃および小腸の筋層間神経叢でも検出された。ＮａＶ１．７特異的染色は、ヒト小脳、大脳皮質、副腎髄質、または下垂体では検出されず、淡い染色だけが視床下部核で検出された。脊髄からの染色は、前面運動野の淡い染色および脊髄上衣（中心管の内側を覆う上皮細胞）に限定された。全ての染色は、ホルマリン固定パラフィン包埋組織上、ＲＮＡｓｅのない条件下で実施した。クローンヒトＮａＶ１．７を発現するＨＥＫ−２９３Ｔ細胞系上の正のシグナル、ならびに以下のナトリウムチャンネル：ｈＮａＶ１．１（ＨＥＫ−２９３Ｔ）、ｈＮａＶ１．２（ＣＨＯ）、ｈＮａＶ１．３（ＣＨＯ）、ｈＮａＶ１．４（ＨＥＫ−２９３Ｔ）、ｈＮａＶ１．５（ＨＥＫ−２９３Ｔ）、ｈＮａＶ１．６（ＨＥＫ−２９３Ｔ）、ｒＮａＶ１．３（ＨＥＫ−２９３Ｔ）のいずれかを発現する細胞系、および親２９３Ｔ細胞系上でシグナルがないことを実証することによって、プローブをＮａＶ１．７に対する特異性について検証した。 Ａ〜Ｆは、ヒト三叉神経節（図１３Ａ〜Ｂ）およびヒト後根神経節（図１３Ｃ〜Ｆ）におけるＮａＶ１．７伝令ＲＮＡの発現を検出するインサイツハイブリダイゼーション研究を表す。図１３Ａ、図１３Ｃ、図１３Ｅは、ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色された細胞を示し、図１３Ｂ、図１３Ｄ、および図１３Ｆは、３３Ｐ標識されたアンチセンスプローブのハイブリダイゼーションによるＮａｖ１．７の発現を青色のドットとして示す。ＮａＶ１．７特異的染色は胃および小腸の筋層間神経叢でも検出された。ＮａＶ１．７特異的染色は、ヒト小脳、大脳皮質、副腎髄質、または下垂体では検出されず、淡い染色だけが視床下部核で検出された。脊髄からの染色は、前面運動野の淡い染色および脊髄上衣（中心管の内側を覆う上皮細胞）に限定された。全ての染色は、ホルマリン固定パラフィン包埋組織上、ＲＮＡｓｅのない条件下で実施した。クローンヒトＮａＶ１．７を発現するＨＥＫ−２９３Ｔ細胞系上の正のシグナル、ならびに以下のナトリウムチャンネル：ｈＮａＶ１．１（ＨＥＫ−２９３Ｔ）、ｈＮａＶ１．２（ＣＨＯ）、ｈＮａＶ１．３（ＣＨＯ）、ｈＮａＶ１．４（ＨＥＫ−２９３Ｔ）、ｈＮａＶ１．５（ＨＥＫ−２９３Ｔ）、ｈＮａＶ１．６（ＨＥＫ−２９３Ｔ）、ｒＮａＶ１．３（ＨＥＫ−２９３Ｔ）のいずれかを発現する細胞系、および親２９３Ｔ細胞系上でシグナルがないことを実証することによって、プローブをＮａＶ１．７に対する特異性について検証した。 Ａ〜Ｆは、ヒト三叉神経節（図１３Ａ〜Ｂ）およびヒト後根神経節（図１３Ｃ〜Ｆ）におけるＮａＶ１．７伝令ＲＮＡの発現を検出するインサイツハイブリダイゼーション研究を表す。図１３Ａ、図１３Ｃ、図１３Ｅは、ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色された細胞を示し、図１３Ｂ、図１３Ｄ、および図１３Ｆは、３３Ｐ標識されたアンチセンスプローブのハイブリダイゼーションによるＮａｖ１．７の発現を青色のドットとして示す。ＮａＶ１．７特異的染色は胃および小腸の筋層間神経叢でも検出された。ＮａＶ１．７特異的染色は、ヒト小脳、大脳皮質、副腎髄質、または下垂体では検出されず、淡い染色だけが視床下部核で検出された。脊髄からの染色は、前面運動野の淡い染色および脊髄上衣（中心管の内側を覆う上皮細胞）に限定された。全ての染色は、ホルマリン固定パラフィン包埋組織上、ＲＮＡｓｅのない条件下で実施した。クローンヒトＮａＶ１．７を発現するＨＥＫ−２９３Ｔ細胞系上の正のシグナル、ならびに以下のナトリウムチャンネル：ｈＮａＶ１．１（ＨＥＫ−２９３Ｔ）、ｈＮａＶ１．２（ＣＨＯ）、ｈＮａＶ１．３（ＣＨＯ）、ｈＮａＶ１．４（ＨＥＫ−２９３Ｔ）、ｈＮａＶ１．５（ＨＥＫ−２９３Ｔ）、ｈＮａＶ１．６（ＨＥＫ−２９３Ｔ）、ｒＮａＶ１．３（ＨＥＫ−２９３Ｔ）のいずれかを発現する細胞系、および親２９３Ｔ細胞系上でシグナルがないことを実証することによって、プローブをＮａＶ１．７に対する特異性について検証した。 Ａ〜Ｆは、ヒト三叉神経節（図１３Ａ〜Ｂ）およびヒト後根神経節（図１３Ｃ〜Ｆ）におけるＮａＶ１．７伝令ＲＮＡの発現を検出するインサイツハイブリダイゼーション研究を表す。図１３Ａ、図１３Ｃ、図１３Ｅは、ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色された細胞を示し、図１３Ｂ、図１３Ｄ、および図１３Ｆは、３３Ｐ標識されたアンチセンスプローブのハイブリダイゼーションによるＮａｖ１．７の発現を青色のドットとして示す。ＮａＶ１．７特異的染色は胃および小腸の筋層間神経叢でも検出された。ＮａＶ１．７特異的染色は、ヒト小脳、大脳皮質、副腎髄質、または下垂体では検出されず、淡い染色だけが視床下部核で検出された。脊髄からの染色は、前面運動野の淡い染色および脊髄上衣（中心管の内側を覆う上皮細胞）に限定された。全ての染色は、ホルマリン固定パラフィン包埋組織上、ＲＮＡｓｅのない条件下で実施した。クローンヒトＮａＶ１．７を発現するＨＥＫ−２９３Ｔ細胞系上の正のシグナル、ならびに以下のナトリウムチャンネル：ｈＮａＶ１．１（ＨＥＫ−２９３Ｔ）、ｈＮａＶ１．２（ＣＨＯ）、ｈＮａＶ１．３（ＣＨＯ）、ｈＮａＶ１．４（ＨＥＫ−２９３Ｔ）、ｈＮａＶ１．５（ＨＥＫ−２９３Ｔ）、ｈＮａＶ１．６（ＨＥＫ−２９３Ｔ）、ｒＮａＶ１．３（ＨＥＫ−２９３Ｔ）のいずれかを発現する細胞系、および親２９３Ｔ細胞系上でシグナルがないことを実証することによって、プローブをＮａＶ１．７に対する特異性について検証した。 Ａ〜Ｆは、ヒト三叉神経節（図１３Ａ〜Ｂ）およびヒト後根神経節（図１３Ｃ〜Ｆ）におけるＮａＶ１．７伝令ＲＮＡの発現を検出するインサイツハイブリダイゼーション研究を表す。図１３Ａ、図１３Ｃ、図１３Ｅは、ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色された細胞を示し、図１３Ｂ、図１３Ｄ、および図１３Ｆは、３３Ｐ標識されたアンチセンスプローブのハイブリダイゼーションによるＮａｖ１．７の発現を青色のドットとして示す。ＮａＶ１．７特異的染色は胃および小腸の筋層間神経叢でも検出された。ＮａＶ１．７特異的染色は、ヒト小脳、大脳皮質、副腎髄質、または下垂体では検出されず、淡い染色だけが視床下部核で検出された。脊髄からの染色は、前面運動野の淡い染色および脊髄上衣（中心管の内側を覆う上皮細胞）に限定された。全ての染色は、ホルマリン固定パラフィン包埋組織上、ＲＮＡｓｅのない条件下で実施した。クローンヒトＮａＶ１．７を発現するＨＥＫ−２９３Ｔ細胞系上の正のシグナル、ならびに以下のナトリウムチャンネル：ｈＮａＶ１．１（ＨＥＫ−２９３Ｔ）、ｈＮａＶ１．２（ＣＨＯ）、ｈＮａＶ１．３（ＣＨＯ）、ｈＮａＶ１．４（ＨＥＫ−２９３Ｔ）、ｈＮａＶ１．５（ＨＥＫ−２９３Ｔ）、ｈＮａＶ１．６（ＨＥＫ−２９３Ｔ）、ｒＮａＶ１．３（ＨＥＫ−２９３Ｔ）のいずれかを発現する細胞系、および親２９３Ｔ細胞系上でシグナルがないことを実証することによって、プローブをＮａＶ１．７に対する特異性について検証した。 Ａ〜Ｆは、ヒト三叉神経節（図１３Ａ〜Ｂ）およびヒト後根神経節（図１３Ｃ〜Ｆ）におけるＮａＶ１．７伝令ＲＮＡの発現を検出するインサイツハイブリダイゼーション研究を表す。図１３Ａ、図１３Ｃ、図１３Ｅは、ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色された細胞を示し、図１３Ｂ、図１３Ｄ、および図１３Ｆは、３３Ｐ標識されたアンチセンスプローブのハイブリダイゼーションによるＮａｖ１．７の発現を青色のドットとして示す。ＮａＶ１．７特異的染色は胃および小腸の筋層間神経叢でも検出された。ＮａＶ１．７特異的染色は、ヒト小脳、大脳皮質、副腎髄質、または下垂体では検出されず、淡い染色だけが視床下部核で検出された。脊髄からの染色は、前面運動野の淡い染色および脊髄上衣（中心管の内側を覆う上皮細胞）に限定された。全ての染色は、ホルマリン固定パラフィン包埋組織上、ＲＮＡｓｅのない条件下で実施した。クローンヒトＮａＶ１．７を発現するＨＥＫ−２９３Ｔ細胞系上の正のシグナル、ならびに以下のナトリウムチャンネル：ｈＮａＶ１．１（ＨＥＫ−２９３Ｔ）、ｈＮａＶ１．２（ＣＨＯ）、ｈＮａＶ１．３（ＣＨＯ）、ｈＮａＶ１．４（ＨＥＫ−２９３Ｔ）、ｈＮａＶ１．５（ＨＥＫ−２９３Ｔ）、ｈＮａＶ１．６（ＨＥＫ−２９３Ｔ）、ｒＮａＶ１．３（ＨＥＫ−２９３Ｔ）のいずれかを発現する細胞系、および親２９３Ｔ細胞系上でシグナルがないことを実証することによって、プローブをＮａＶ１．７に対する特異性について検証した。 １４Ａ〜Ｅは、ラット知覚神経節から急に単離された個々のニューロンがナトリウム電流の異種集団を発現することを示す。個々のニューロンは、高速テトロドトキシン−感受性ナトリウム電流（ＮａＶ１．７およびＮａＶ１．３の可能性が高い）、低速テトロドトキシン耐性ナトリウム電流（ＮａＶ１．８の可能性が高い）、または混合集団（どの電流型も全ナトリウム電流の９０％超をコード化しない）のいずれかを発現した。図１４Ａ〜Ｃは、高速ＴＴＸ−Ｓ（図１４Ａ）、混合（図１４Ｂ）、または低速ＴＴＸ−Ｒ（図１４Ｃ）ナトリウム電流を発現するニューロンの例を示す。 １４Ａ〜Ｅは、ラット知覚神経節から急に単離された個々のニューロンがナトリウム電流の異種集団を発現することを示す。個々のニューロンは、高速テトロドトキシン−感受性ナトリウム電流（ＮａＶ１．７およびＮａＶ１．３の可能性が高い）、低速テトロドトキシン耐性ナトリウム電流（ＮａＶ１．８の可能性が高い）、または混合集団（どの電流型も全ナトリウム電流の９０％超をコード化しない）のいずれかを発現した。図１４Ａ〜Ｃは、高速ＴＴＸ−Ｓ（図１４Ａ）、混合（図１４Ｂ）、または低速ＴＴＸ−Ｒ（図１４Ｃ）ナトリウム電流を発現するニューロンの例を示す。 １４Ａ〜Ｅは、ラット知覚神経節から急に単離された個々のニューロンがナトリウム電流の異種集団を発現することを示す。個々のニューロンは、高速テトロドトキシン−感受性ナトリウム電流（ＮａＶ１．７およびＮａＶ１．３の可能性が高い）、低速テトロドトキシン耐性ナトリウム電流（ＮａＶ１．８の可能性が高い）、または混合集団（どの電流型も全ナトリウム電流の９０％超をコード化しない）のいずれかを発現した。図１４Ａ〜Ｃは、高速ＴＴＸ−Ｓ（図１４Ａ）、混合（図１４Ｂ）、または低速ＴＴＸ−Ｒ（図１４Ｃ）ナトリウム電流を発現するニューロンの例を示す。 １４Ａ〜Ｅは、ラット知覚神経節から急に単離された個々のニューロンがナトリウム電流の異種集団を発現することを示す。個々のニューロンは、高速テトロドトキシン−感受性ナトリウム電流（ＮａＶ１．７およびＮａＶ１．３の可能性が高い）、低速テトロドトキシン耐性ナトリウム電流（ＮａＶ１．８の可能性が高い）、または混合集団（どの電流型も全ナトリウム電流の９０％超をコード化しない）のいずれかを発現した。図１４Ｄ〜Ｅは、脊髄神経結紮（「ＳＮＬ」）外科手術を受けたラットの知覚神経節から単離されたニューロン（図１４Ｅ）は、対照ラット（図１４Ｄ）よりもはるかに大きな割合の高速ＴＴＸ−Ｓ電流を発現することを示す。 １４Ａ〜Ｅは、ラット知覚神経節から急に単離された個々のニューロンがナトリウム電流の異種集団を発現することを示す。個々のニューロンは、高速テトロドトキシン−感受性ナトリウム電流（ＮａＶ１．７およびＮａＶ１．３の可能性が高い）、低速テトロドトキシン耐性ナトリウム電流（ＮａＶ１．８の可能性が高い）、または混合集団（どの電流型も全ナトリウム電流の９０％超をコード化しない）のいずれかを発現した。図１４Ｄ〜Ｅは、脊髄神経結紮（「ＳＮＬ」）外科手術を受けたラットの知覚神経節から単離されたニューロン（図１４Ｅ）は、対照ラット（図１４Ｄ）よりもはるかに大きな割合の高速ＴＴＸ−Ｓ電流を発現することを示す。 Ａ〜Ｂは、ＫＩＩＩＡ（配列番号５３０）、ＧｐＴｘ−１（１−３４）（配列番号１）、Ｈｕｗｅｎ毒素−ＩＶ（配列番号５２８）、Ｈｕｗｅｎ毒素−Ｉ（配列番号５２９）、およびＰｒｏＴｘ ＩＩ（配列番号５３１）の配列アラインメントを示す。 Ａ〜Ｂは、ＫＩＩＩＡ（配列番号５３０）、ＧｐＴｘ−１（１−３４）（配列番号１）、Ｈｕｗｅｎ毒素−ＩＶ（配列番号５２８）、Ｈｕｗｅｎ毒素−Ｉ（配列番号５２９）、およびＰｒｏＴｘ ＩＩ（配列番号５３１）の配列アラインメントを示す。 １ｍｇ／皮下（「ｓ．ｃ．」）投与後のマウス血漿中のＧｐＴｘ−１の濃度−時間プロファイルを示す。ＧｐＴｘ−１濃度は、３匹の動物のうち２匹で定量下限より低く、プロファイルを得ることはできなかった。 １ｍｇ／ｋｇ静脈内（「ｉ．ｖ．」）投与後の２匹のマウスからの血漿中の［Ａｌａ５］ＧｐＴｘ−１（配列番号２２）の濃度−時間プロファイルを示す（第３のマウスからの暴露は定量下限より低く、プロファイルを得ることはできなかった。） ５ｍｇ／ｋｇのｓ．ｃ．用量（ｎ＝３）、１ｍｇ／ｋｇのｓ．ｃ．用量（ｎ＝２）、および１ｍｇ／ｋｇ静脈内（ｉ．ｖ．）用量（ｎ＝２）後のマウスからの血漿中の［Ａｌａ５］ＧｐＴｘ−１（配列番号２２）の平均血漿濃度−時間プロファイルを示す。５ｍｇ／ｋｇ用量について、血漿中のペプチド濃度は、約０．６μＭで維持され、３時間で、ＰａｔｃｈＸｐｒｅｓｓ（登録商標）（ＰＸ）によるインビトロＮａｖ１．７noＩＣ５０の約４０倍であった。 ｈＥＲＧに対して試験したＧｐＴｘ−１（配列番号１；ｎ＝７）、［Ａｌａ５］ＧｐＴｘ−１（配列番号２２；ｎ＝８）、およびＢＳＡ対照についての用量応答関係を示す。両化合物についてのＩＣ５０値は１０μＭ超であった。 ｈＮａｖ１．５に対して試験したＧｐＴｘ−１（配列番号１；ｎ＝７）の用量応答関係を示す。ＧｐＴｘ−１のＩＣ５０値は９．８μＭであった。 ｈＮａｖ１．５に対して試験した［Ａｌａ５］ＧｐＴｘ−１（配列番号２２、ｎ＝９）の用量応答関係を示す。［Ａｌａ５］ＧｐＴｘ−１のＩＣ５０値は３０μＭ超であった。 ｈＮａｖ１．７チャンネルに対するＧｐＴｘ−１（配列番号１）の影響を示す。セルを−１４０ｍＶで保持し、ピーク内向きｈＮａｖ１．７電流を−１０ｍＶで測定した。「ベースライン」曲線はＧｐＴｘ−１前のｈＮａｖ１．７電流を示し、「１００ｎＭ ＧｐＴｘ−１」曲線はＧｐＴｘ−１添加後のｈＮａｖ１．７電流を示す。 ｈＮａｖ１．７チャンネルに対するＧｐＴｘ−１（配列番号１）の用量−応答曲線を示す。ピーク内向きｈＮａｖ１．７電流を増大する濃度のＧｐＴｘ−１の濃度の存在下、−１０ｍＶで測定し、細胞を−１４０ｍＶで保持した。電流を正規化し、１００はペプチドを添加しないＮａｖ１．７電流を表し、０は完全ブロック後のＮａｖ１．７電流を表した。ｈＮａｖ１．７チャンネルに対するＧｐＴｘ−１のＩＣ５０は７．４０ｎＭであった。 ｈＮａｖ１．７チャンネルに対して増加する濃度のＧｐＴｘ−１（配列番号１）の時間経過を示す。ピーク内向きｈＮａｖ１．７電流を増加する濃度のＧｐＴｘ−１の存在下で１０秒ごとに−１０ｍＶで測定し、細胞を−１４０ｍＶで保持した。「ベースライン」はＧｐＴｘ−１の非存在下でのｈＮａｖ１．７電流を示し、「ウォッシュ」はＧｐＴｘ−１の除去後のｈＮａｖ１．７電流を示す。 ｈＮａｖ１．３チャンネルに対するＧｐＴｘ−１（配列番号１）の効果を示す。細胞を−１４０ｍＶで保持し、ピーク内向きｈＮａｖ１．３電流を−１０ｍＶで測定した。「ベースライン」曲線はＧｐＴｘ−１前のｈＮａｖ１．３電流を示し、「３００ｎＭ ＧｐＴｘ−１」曲線はＧｐＴｘ−１添加後のｈＮａｖ１．３電流を示す。 ｈＮａｖ１．３チャンネルに対するＧｐＴｘ−１（配列番号１）の用量−応答曲線を示す。ピーク内向きｈＮａｖ１．３電流を増加する濃度のＧｐＴｘ−１の存在下で−１０ｍＶにて測定し、細胞を−１４０ｍＶで保持した。電流を正規化し、１００はペプチド添加なしのＮａｖ１．３電流を表し、０は完全ブロック後のＮａｖ１．３電流を表した。ｈＮａｖ１．３チャンネルに対するＧｐＴｘ−１のＩＣ５０は１６．８ｎＭであった。 ｈＮａｖ１．３チャンネルに対する増加する濃度のＧｐＴｘ−１（配列番号１）の時間経過を示す。ピーク内向きｈＮａｖ１．３電流を、増加する濃度のＧｐＴｘ−１の存在下で１０秒ごとに−１０ｍＶにて測定し、細胞を−１４０ｍＶで保持した。「ベースライン」は、ＧｐＴｘ−１の非存在下でのｈＮａｖ１．３電流を示し、「ウォッシュ」はＧｐＴｘ−１の除去後のｈＮａｖ１．３電流を示す。 ＧｐＴｘ−１（配列番号１）のｈＮａｖ１．４チャンネルに対する効果を示す。細胞を−１４０ｍＢに保持し、ピーク内向きｈＮａｖ１．４電流を−１０ｍＶで測定した。「ベースライン」曲線はＧｐＴｘ−１前のｈＮａｖ１．４電流を示し、「３μＭＧｐＴｘ−１」曲線はＧｐＴｘ−１添加後のｈＮａｖ１．４電流を示す。 ｈＮａｖ１．４チャンネルに対するＧｐＴｘ−１（配列番号１）の用量−応答曲線を示す。ピーク内向きｈＮａｖ１．４電流を増加する濃度のＧｐＴｘ−１の存在下で−１０ｍＶにて測定し、細胞を−１４０ｍＶで保持した。電流を正規化し、１００はペプチド添加のないＮａｖ１．４電流を表し、０は完全ブロック後のＮａｖ１．４電流を表した。ｈＮａｖ１．４チャンネルに対するＧｐＴｘ−１のＩＣ５０は２．９μＭであった。 ｈＮａｖ１．４チャンネルに対するＧｐＴｘ−１（配列番号１）の用量−応答曲線を示す。ピーク内向きｈＮａｖ１．４電流を増加する濃度のＧｐＴｘ−１の存在下で−１０ｍＶにて測定し、細胞を、約２０％の失活をもたらす電位で保持した。ＧｐＴｘ−１は、チャンネルが部分的に失活する場合、ｈＮａｖ１．４に対してより強力であることに留意されたい。電流を正規化し、１００はペプチド添加のないＮａｖ１．４電流を表し、０は完全ブロック後のＮａｖ１．４電流を表した。部分的に失活したｈＮａｖ１．４チャンネルに対するＧｐＴｘ−１のＩＣ５０は０．２６μＭであった。 ｈＮａｖ１．４チャンネルに対する増加する濃度のＧｐＴｘ−１（配列番号１）の時間経過を示す。ピーク内向きｈＮａｖ１．４電流を、増加する濃度のＧｐＴｘ−１の存在下で１０秒ごとに−１０ｍＶにて測定し、細胞を−１４０ｍＶで保持した。「ベースライン」は、ＧｐＴｘ−１の非存在下でのｈＮａｖ１．４電流を示し、「ウォッシュ」は、ＧｐＴｘ−１の除去後のｈＮａｖ１．４電流を示す。 ｈＮａｖ１．４チャンネルに対する増加する濃度のＧｐＴｘ−１（配列番号１）の時間経過を示す。ピーク内向きｈＮａｖ１．４電流を、増加する濃度のＧｐＴｘ−１の存在下で１０秒ごとに−１０ｍＶにて測定し、細胞を−１４０ｍＶ（四角）または約２０％失活をもたらす電位（丸）で保持した。「ベースライン」は、ＧｐＴｘ−１の非存在下でのｈＮａｖ１．４電流を示し、「ウォッシュ」は、ＧｐＴｘ−１の除去後のｈＮａｖ１．４電流を示す。ＧｐＴｘ−１は、チャンネルが部分的に失活する場合、ｈＮａｖ１．４に対してより強力であることに留意されたい。 図３１は、ｈＮａｖ１．５チャンネルに対するＧｐＴｘ−１（配列番号１）の効果を示す。細胞を−１４０ｍＢに保持し、ピーク内向きｈＮａｖ１．５電流を−１０ｍＶで測定した。「ベースライン」曲線は、ＧｐＴｘ−１前のｈＮａｖ１．５電流を示し、「３μＭＧｐＴｘ−１」曲線はＧｐＴｘ−１添加後のｈＮａｖ１．５電流を示す。 ｈＮａｖ１．５チャンネルに対するＧｐＴｘ−１（配列番号１）の用量−応答曲線を示す。ピーク内向きｈＮａｖ１．５電流を増加する濃度のＧｐＴｘ−１の存在下で−１０ｍＶにて測定し、細胞を−１４０ｍＶで保持した。電流を正規化し、１００はペプチド添加のないＮａｖ１．５電流を表し、０は完全ブロック後のＮａｖ１．５電流を表した。ｈＮａｖ１．５チャンネルに対するＧｐＴｘ−１のＩＣ５０は８．９μＭであった。 ｈＮａｖ１．５チャンネルに対する増加する濃度のＧｐＴｘ−１（配列番号１）の時間経過を示す。ピーク内向きｈＮａｖ１．５電流を、増加する濃度のＧｐＴｘ−１の存在下で１０秒ごとに−１０ｍＶにて測定し、細胞を−１４０ｍＶで保持した。「ベースライン」は、ＧｐＴｘ−１の非存在下でのｈＮａｖ１．５電流を示し、「ウォッシュ」はＧｐＴｘ−１の除去後のｈＮａｖ１．５電流を示す。 ｈＮａｖ１．７チャンネルに対する［Ａｌａ５］ＧｐＴｘ−１（配列番号２２）の効果を示す。細胞を−１４０ｍＢに保持し、ピーク内向きｈＮａｖ１．７電流を−１０ｍＶで測定した。「ベースライン」曲線は［Ａｌａ５］ＧｐＴｘ−１添加前のｈＮａｖ１．７電流を示し、「３００ｎＭ［Ａｌａ５］ＧｐＴｘ−１」曲線は［Ａｌａ５］ＧｐＴｘ−１添加後のｈＮａｖ１．７電流を示す。細胞を、約２０％の失活をもたらす電位で保持した。 ｈＮａｖ１．７チャンネルに対する［Ａｌａ５］ＧｐＴｘ−１（配列番号２２）の用量−応答曲線を示す。ピーク内向きｈＮａｖ１．７電流を、増加する濃度の［Ａｌａ５］ＧｐＴｘ−１の存在下、−１０ｍＶで測定し、細胞を、約２０％の失活をもたらす電位で保持した。電流を正規化し、１００はペプチド添加のないＮａｖ１．７電流を表し、０は完全ブロック後のＮａｖ１．７電流を表した。部分的に失活したｈＮａｖ１．７チャンネルに対する［Ａｌａ５］ＧｐＴｘ−１のＩＣ５０は１３．２ｎＭであった。 ｈＮａｖ１．７チャンネルに対する増加する濃度の［Ａｌａ５］ＧｐＴｘ−１（配列番号２２）の時間経過を示す。ピーク内向きｈＮａｖ１．７電流を、増加する濃度の［Ａｌａ５］ＧｐＴｘ−１の存在下で１０秒ごとに−１０ｍＶにて測定し、細胞を、−１４０ｍＶ（四角）または約２０％失活をもたらす電位（丸）で保持した。「ベースライン」は、［Ａｌａ５］ＧｐＴｘ−１の非存在下でのｈＮａｖ１．７電流を示し、「ウォッシュ」は［Ａｌａ５］ＧｐＴｘ−１の除去後のｈＮａｖ１．７電流を示す。 マウス後根神経節（ＤＲＧ）ニューロンにおいてＴＴＸ感受性Ｎａｖチャンネルに対して増大する濃度のＧｐＴｘ−１（配列番号１）の時間経過を示す。ピーク内向きＮａｖ電流を、増加する濃度のＧｐＴｘ−１の存在下で１０秒ごとに−１０ｍＶにて測定し、細胞を−１４０ｍＶで保持した。「対照」は、ＧｐＴｘ−１の非存在下でのＮａｖ電流を示し、「ＴＴＸ」は、３００ｎＭのＴＴＸ存在下でのＮａｖ電流を示し、「ウォッシュ」は、ＧｐＴｘ−１およびＴＴＸの除去後のＮａｖ電流を示す。ＧｐＴｘ−１はほぼ全てのＴＴＸ感受性Ｎａｖ電流を遮断したことに留意されたい。この研究で測定された電流はほぼ全てのＴＴＸ感受性電流であり、失活の高速動力学に基づいた記録の開始時で同定された。 マウスＤＲＧニューロンにおけるＴＴＸ感受性Ｎａｖチャンネルに対するＧｐＴｘ−１（配列番号１）の代表的な用量−応答曲線を示す。ピーク内向きＮａｖ電流を増加する濃度のＧｐＴｘ−１の存在下で−１０ｍＶにて測定し、細胞を−１４０ｍＶで保持した。ｍＤＲＧニューロンにおけるＴＴＸ感受性ナトリウムチャンネルに対するＧｐＴｘ−１のＩＣ５０値は７．１ｎＭであると測定された。電流を正規化し、１００はペプチドを添加しにＴＴＸ感受性電流であり、０は完全ブロック後のＴＴＸ感受性電流であった。 マウスＤＲＧニューロンにおけるＴＴＸ感受性Ｎａｖチャンネルに対する単一濃度のＧｐＴｘ−１（配列番号１）の効果を示す。細胞を−１４０ｍＶに保持し、ピーク内向きＮａｖ電流を−１０ｍＶで測定した。「ベースライン」曲線はＧｐＴｘ−１添加前のＮａｖ電流を示し、「２００ｎＭ ＧｐＴｘ−１」曲線はＧｐＴｘ−１添加後のＮａｖ電流を示す。対照電流の失活は、数ミリ秒で完了し、これによりＴＴＸ感受性電流がＴＴＸ抵抗電流から区別されることに留意されたい。 図４０は、マウスＤＲＧニューロンにおけるＴＴＸ感受性Ｎａｖチャンネルに対する増加する濃度のＧｐＴｘ−１（配列番号１）の時間経過を示す。ピーク内向きＮａｖ電流を、増加する濃度のＧｐＴｘ−１の存在下で１０秒ごとに−１０ｍＶにて測定し、細胞を、約２０％の失活をもたらす電位で保持した。「対照」は、ＧｐＴｘ−１の非存在下でのＮａｖ電流を示し、「ＴＴＸ」は３００ｎＭのＴＴＸ存在下でのＮａｖ電流を示し、「ウォッシュ」はＧｐＴｘ−１およびＴＴＸの除去後のＮａｖ電流を示す。３００ｎＭのＴＴＸはさらなる電流遮断をもたらさなかったので、ＧｐＴｘ−１は全てのＴＴＸ感受性Ｎａｖ電流を遮断したことに留意されたい。 高速失活動力学によって定義される、マウスＤＲＧニューロンにおけるＴＴＸ感受性Ｎａｖチャンネルに対するＧｐＴｘ−１（配列番号１）の代表的な用量−応答曲線を示す。ピーク内向きＮａｖ電流を増加する濃度のＧｐＴｘ−１の存在下で−１０ｍＶにて測定し、細胞を、約２０％の失活をもたらす電位で保持した。ｍＤＲＧニューロンにおけるＴＴＸ感受性ナトリウムチャンネルに対するＩＣ５０値は４．７ｎＭと測定された。電流を正規化し、１００はペプチド添加のないＴＴＸ感受性電流を表し、０は完全ブロック後のＴＴＸ感受性電流を表した。 図４２は、マウスＤＲＧニューロンにおけるＴＴＸ感受性Ｎａｖチャンネルに対するＧｐＴｘ−１（配列番号１）の効果を示す。細胞を、約２０％失活をもたらす電位で保持し、ピーク内向きＮａｖ電流を−１０ｍＶで測定した。「ベースライン」曲線はＧｐＴｘ−１添加前のＮａｖ電流を示し、「２００ｎＭのＧｐＴｘ−１」曲線はＧｐＴｘ−１添加後のＮａｖ電流を示す。 マウスＤＲＧニューロンにおけるＴＴＸ感受性Ｎａｖチャンネルに対する増加する濃度の［Ａｌａ５］ＧｐＴｘ−１（１−３４）（配列番号２２）の時間経過を示す。ピーク内向きＮａｖ電流を増加する濃度の［Ａｌａ５］ＧｐＴｘ−１（１−３４）（配列番号２２）の存在下で１０秒ごとに−１０ｍＶで測定し、細胞を−１４０ｍＶで保持した。「対照」は、［Ａｌａ５］ＧｐＴｘ−１（１−３４）（配列番号２２）の非存在下でのＮａｖ電流を示し、「ＴＴＸ」は３００ｎＭのＴＴＸの存在下でのＮａｖ電流を示し、「ウォッシュ」は、［Ａｌａ５］ＧｐＴｘ−１（１−３４）（配列番号２２）およびＴＴＸの除去後のＮａｖ電流を示す。［Ａｌａ５］ＧｐＴｘ−１（１−３４）（配列番号２２）はほぼ全てのＴＴＸ感受性Ｎａｖ電流をブロックしたことに留意されたい。 マウスＤＲＧニューロンにおけるＴＴＸ感受性Ｎａｖチャンネルに対する［Ａｌａ５］ＧｐＴｘ−１（１−３４）（配列番号２２）の代表的な用量−応答曲線を示す。ピーク内向きＮａｖ電流を、増加する濃度の［Ａｌａ５］ＧｐＴｘ−１（１−３４）の存在下で−１０ｍＶにて測定し、細胞を−１４０ｍＶで保持した。ｍＤＲＧニューロンにおけるＴＴＸ感受性ナトリウムチャンネルに対する［Ａｌａ５］ＧｐＴｘ−１（１−３４）のＩＣ５０値は１７．０ｎＭと測定された。電流を正規化し、１００はペプチド添加のないＴＴＸ感受性電流を表し、０は完全ブロック後のＴＴＸ感受性電流を表した。 マウスＤＲＧニューロンにおけるＴＴＸ感受性Ｎａｖチャンネルに対する［Ａｌａ５］ＧｐＴｘ−１（１−３４）（配列番号２２）の効果を示す。細胞を−１４０ｍＢに保持し、ピーク内向きＮａｖ電流を−１０ｍＶで測定した。「ベースライン」曲線は、［Ａｌａ５］ＧｐＴｘ−１（１−３４）（配列番号２２）の添加前のＮａｖ電流を示し、「３００ｎＭの配列番号２２」曲線は、配列番号２２添加後のＮａｖ電流を示し、そして「３００ｎＭの配列番号２２＋３００ｎＭのＴＴＸ」曲線は配列番号２２およびＴＴＸ添加後のＮａｖ電流を示す。［Ａｌａ５］ＧｐＴｘ−１（１−３４）はＴＴＸ感受性Ｎａｖ電流を選択的にブロックしたが、ＴＴＸ−耐性Ｎａｖ電流はブロックしなかったことに留意されたい。 ｈＮａｖ１．７チャンネルに対するペプチドモノマー［Ｐｈｅ６，Ａｔｚ１３］ＧｐＴｘ−１（１−３４）（配列番号５９１）のホモ二量体型複合体（ホモ二量体型複合体１）の増加する濃度の時間経過を示す。ピーク内向きｈＮａｖ１．７電流を、増加する濃度のホモ二量体型複合体１の存在下で１０秒ごとに−１０ｍＶで測定し；細胞を−１４０ｍＶで保持した。「対照」は、ホモ二量体型複合体１の非存在下でのヒトＮａｖ１．７（ｈＮａｖ１．７）電流を示し、「ウォッシュ」はホモ二量体型複合体１の除去後のｈＮａｖ１．７電流を示す。 ヒトＮａｖ１．７チャンネルに対するホモ二量体型複合体１の代表的な用量−応答曲線を示す。ピーク内向きｈＮａｖ１．７電流を増加する濃度のホモ二量体型複合体１の存在下で−１０ｍＶにて測定し、細胞を−１４０ｍＶで保持した。ｈＮａｖ１．７ナトリウムチャンネルに対するホモ二量体型複合体１のＩＣ５０値は１．２ｎＭと測定された。電流を正規化し、１００はペプチド添加のないＮａｖ１．７電流を表し、０は完全ブロック後のＮａｖ１．７電流を表した。 ホモ二量体型複合体１のウォッシュアウト後のｈＮａｖ１．７電流の回復を示す。ピーク内向きｈＮａｖ１．７電流を３ｎＭまたは３００ｎＭのホモ二量体型複合体１の存在下で１０秒ごとに−１０ｍＶにて測定し、細胞を−１４０ｍＶで保持した。「対照」は、ホモ二量体型複合体１の存在下でのｈＮａｖ１．７電流を示し、「ウォッシュ」は、ホモ二量体型複合体１の除去後のｈＮａｖ１．７電流を示す。ｈＮａｖ１．７電流は３ｎＭのホモ二量体型複合体１のウォッシュアウト後に部分的に回復したが、３００ｎＭのホモ二量体型複合体１のウォッシュアウト後には回復しなかったことに留意されたい。 ｈＮａｖ１．７チャンネルに対するホモ二量体型複合体１の効果を示す。細胞を−１４０ｍＢに保持し、ピーク内向きｈＮａｖ１．７電流を−１０ｍＶで測定した。「ベースライン」曲線は、ホモ二量体型複合体１添加前のｈＮａｖ１．７電流を示し、「１０ｎＭホモ二量体型複合体１」曲線はホモ二量体型複合体１添加後のｈＮａｖ１．７電流を示す。 ｈＮａｖ１．７チャンネルに対する増加する濃度のホモ二量体型複合体１の時間経過を示す。ピーク内向きｈＮａｖ１．７電流を増加する濃度のホモ二量体型複合体１の存在下で１０秒ごとに−１０ｍＶにて測定し、細胞を、約２０％の失活をもたらす電位で保持した。「対照」は、ホモ二量体型複合体１の非存在下でのｈＮａｖ１．７電流を示し、「ウォッシュ」はホモ二量体型複合体１の除去後のｈＮａｖ１．７電流を示す。 図５１は、ｈＮａｖ１．７チャンネルに対するホモ二量体型複合体１の代表的な用量−応答曲線を示す。ピーク内向きｈＮａｖ１．７電流を増加する濃度のホモ二量体型複合体１の存在下で−１０ｍＶにて測定し、細胞を、約２０％の失活をもたらす電位で保持した。ｍＤＲＧニューロンにおけるＴＴＸ感受性ナトリウムチャンネルに対するホモ二量体型複合体１のＩＣ５０値は０．６６ｎＭと測定された。電流を正規化し、１００はペプチド添加のないＮａｖ１．７電流を表し、０は完全ブロック後のＮａｖ１．７電流を表した。 ｈＮａｖ１．７チャンネルに対するホモ二量体型複合体１の効果を示す。細胞を、約２０％失活をもたらす電位で保持し、ピーク内向きｈＮａｖ１．７電流を−１０ｍＶで測定した。「ベースライン」曲線は、ホモ二量体型複合体１添加前のｈＮａｖ１．７電流を示し、「３ｎＭホモ二量体型複合体１」曲線はホモ二量体型複合体１添加後のｈＮａｖ１．７電流を示す。 ｈＮａｖ１．５チャンネルに対する増加する濃度のホモ二量体型複合体１の時間経過を示す。ピーク内向きｈＮａｖ１．５電流を増加する濃度のホモ二量体型複合体１の存在下で１０秒ごとに−１０ｍＶにて測定し、細胞を−１４０ｍＶで保持した。「対照」はホモ二量体型複合体１の非存在下でのｈＮａｖ１．５電流を示し、「ウォッシュ」はホモ二量体型複合体１の除去後のｈＮａｖ１．５電流を示す。ｈＮａｖ１．５電流はホモ二量体型複合体１のウォッシュアウト後に部分的に回復することに留意されたい。 ｈＮａｖ１．５チャンネルに対するホモ二量体型複合体１の代表的な用量−応答曲線を示す。ピーク内向きｈＮａｖ１．５電流を増加する濃度のホモ二量体型複合体１の存在下で−１０ｍＶにて測定し、細胞を−１４０ｍＶで保持した。ｈＮａｖ１．５ナトリウムチャンネルに対するホモ二量体型複合体１のＩＣ５０値は７５．５ｎＭと測定された。電流を正規化し、１００はペプチド添加のないＮａｖ１．５電流を表し、０は完全ブロック後のＮａｖ１．５電流を表した。 ｈＮａｖ１．５チャンネルに対するホモ二量体型複合体１の効果を示す。細胞を−１４０ｍＶに保持し、ピーク内向きｈＮａｖ１．５電流を−１０ｍＶで測定した。「ベースライン」曲線はホモ二量体型複合体１添加前のｈＮａｖ１．５電流を示し、「２μＭホモ二量体型複合体１」曲線はホモ二量体型複合体１添加後のｈＮａｖ１．５電流を示す。 ｈＮａｖ１．５チャンネルに対する増加する濃度のホモ二量体型複合体１の時間経過を示す。ピーク内向きｈＮａｖ１．５電流を増加する濃度のホモ二量体型複合体１の存在下で１０秒ごとに−１０ｍＶにて測定し、細胞を、約２０％の失活をもたらす電位で保持した。「対照」はホモ二量体型複合体１の非存在下でのｈＮａｖ１．５電流を示し、「ウォッシュ」はホモ二量体型複合体１の除去後のｈＮａｖ１．５電流を示す。 ｈＮａｖ１．５チャンネルに対するホモ二量体型複合体１の代表的な用量−応答曲線を示す。ピーク内向きｈＮａｖ１．５電流を増加する濃度のホモ二量体型複合体１の存在下で−１０ｍＶにて測定し、細胞を、約２０％の失活をもたらす電位で保持した。ｈＮａｖ１．５ナトリウムチャンネルに対するホモ二量体型複合体１のＩＣ５０値は５７ｎＭと測定された。電流を正規化し、１００はペプチド添加のないＮａｖ１．５電流を表し、０は完全ブロック後のＮａｖ１．５電流を表した。 ｈＮａｖ１．５チャンネルに対するホモ二量体型複合体１の効果を示す。細胞を、約２０％失活をもたらす電位で保持し、ピーク内向きｈＮａｖ１．５電流を−１０ｍＶで測定した。「ベースライン」曲線はホモ二量体型複合体１添加前のｈＮａｖ１．５電流を示し、「２ｕＭホモ二量体型複合体１」曲線はホモ二量体型複合体１添加後のｈＮａｖ１．５電流を示す。 ５ｍｇ／ｋｇのｓ．ｃ．の１時間前処置用量を施したオスＣＤ−１マウスにおけるホルマリン疼痛モデルでの［Ａｌａ５］ＧｐＴｘ−１（１−３４）（配列番号２２）の効果の時間経過を示す。ペプチドは最初または急性相（ホルマリン注射後０〜５分）で効果がなかった。ペプチドは、ビヒクル（ＰＢＳ）と比較して、第２段階（ホルマリン注射後５〜４０分、脊髄感作と関連）中に病期に冒された前肢のリフティングおよび／またはリッキングに費やされる時間を有意に減少させた。この実験では、陽性対照として使用した１ｍｇ／ｋｇのｓ．ｃ．用量のモルヒネは、動物において疼痛応答を有意に減少させるには不十分であり、後の実験では３ｍｇ／ｋｇまで増加させた。ペプチドについての最終血漿暴露（ホルマリン注射後４５分でのペプチド血漿濃度）は０．８０±０．２１μＭであった。 第１段階（ホルマリン注射後０〜５分）中、５ｍｇ／ｋｇのｓ．ｃ．の１時間前処置用量を施したオスＣＤ−１マウスにおけるホルマリン疼痛モデルでの［Ａｌａ５］ＧｐＴｘ−１（１−３４）（配列番号２２）の効果を示す。ペプチドもモルヒネ陽性対照もどちらも第１段階中で病気に冒された前足のリフティングおよび／またはリッキングに費やされる時間を有意に減少させなかった。この第１段階中のフリッキングの薬理学的減弱は、一般的に、実際の疼痛の減弱よりもむしろ、動物の動作、意識、または健康に対する非特異的効果を反映する。 第２段階（ホルマリン注射後５〜４０分）中、５ｍｇ／ｋｇのｓ．ｃ．の１時間前処置用量を施したオスＣＤ−１マウスにおけるホルマリン疼痛モデルでの［Ａｌａ５］ＧｐＴｘ−１（１−３４）（配列番号２２）の効果を示す。ペプチドは、第２段階中で病気に冒された前足のリフティングおよび／またはリッキングに費やされる時間を有意に減少させたが、モルヒネ対照は減少させなかった。ここでも、モルヒネ陽性対照の効果が無いことは、アッセイに「不合格」であることを反映するのではなく、モルヒネの濃度に応答するマウスの変動を反映する。以降の実験のモルヒネは３ｍｇ／ｋｇまで増加させた。 ５ｍｇ／ｋｇのｓ．ｃ．の１時間前処置用量を施したオスＣＤ−１マウスにおけるホルマリン疼痛モデルで足浮腫に対する［Ａｌａ５］ＧｐＴｘ−１（１−３４）（配列番号２２）の効果を示す。ペプチドもモルヒネ陽性対照も、ビヒクル（ＰＢＳ）と比較してホルマリン注射に起因する足浮腫を有意に減少しなかった。 ５、１．６７、および０．５ｍｇ／ｋｇのｓ．ｃ．の１時間前処置用量を施したオスＣＤ−１マウスにおけるホルマリン疼痛モデルの繰り返しでの［Ａｌａ５］ＧｐＴｘ−１（１−３４）（配列番号２２）の効果の時間経過を示す。ペプチドは、第１段階（ホルマリン注射後０〜５分）においてどの用量でも効果が無かった。陽性対照（３ｍｇ／ｋｇのｓ．ｃ．用量のモルヒネ）は、第１段階で病気に冒された前足のリフティング／リッキングに費やされる時間を有意に減少させた。５ｍｇ／ｋｇのｓ．ｃ．用量の［Ａｌａ５］ＧｐＴｘ−１（１−３４）（配列番号２２）は、モルヒネ陽性対照と同様に、研究の第２段階でリフティング／リッキングに費やされる時間の有意な減少を示した。さらに低いペプチド用量（１．６７および０．５ｍｇ／ｋｇのｓ．ｃ．）は第２段階でビヒクルと比べて効果はなかった。最終暴露（ホルマリン注射後４５分でのペプチド血漿濃度）は、５．０、１．６７、および０．５ｍｇ／ｋｇ用量についてそれぞれ、０．５８±０．２６μＭ、０．１５±０．０５μＭ、および０．０４±０．２μＭであった。 ５、１．６７、および０．５ｍｇ／ｋｇのｓ．ｃ．の１時間前処置用量を施したオスＣＤ−１マウスにおけるホルマリン疼痛モデルの第１段階での［Ａｌａ５］ＧｐＴｘ−１（１−３４）（配列番号２２）の効果を示す。ペプチドは、ビヒクルと比較して第１段階（ホルマリン注射後０〜５分）でどの用量でも効果はなかったが、陽性対照（３ｍｇ／ｋｇのｓ．ｃ．用量のモルヒネ）は、第１段階で病気に冒された前足のリフティング／リッキングに費やされる時間を有意に減少させた。 ５、１．６７、および０．５ｍｇ／ｋｇのｓ．ｃ．の１時間前処置用量を施したオスＣＤ−１マウスにおけるホルマリン疼痛モデルの第２段階での［Ａｌａ５］ＧｐＴｘ−１（１−３４）（配列番号２２）の効果を示す。５ｍｇ／ｋｇのｓ．ｃ．用量のペプチドは、モルヒネ陽性対照と同様に、研究の第２段階でリフティング／リッキングに費やされる時間の有意な減少を示した。更に低いペプチド用量（１．６７および０．５ｍｇ／ｋｇのｓ．ｃ．）は第２段階でビヒクルと比較して効果は無かった。 ５、１．６７、および０．５ｍｇ／ｋｇのｓ．ｃ．の１時間前処置用量を施したオスＣＤ−１マウスにおけるホルマリン疼痛モデルでの足浮腫に対する［Ａｌａ５］ＧｐＴｘ−１（１−３４）（配列番号２２）の効果を示す。ペプチドもモルヒネ対照もどちらもビヒクル（ＰＢＳ）と比較してホルマリン注射に起因する足浮腫を有意に減少させなかった。 ５、３、および１ｍｇ／ｋｇのｓ．ｃ．の１時間前処置用量を施したオスＣＤ−１マウスにおけるホルマリン疼痛モデルの３回目の繰り返しでの［Ａｌａ５］ＧｐＴｘ−１（１−３４）（配列番号２２）の効果の時間経過を示す。５ｍｇ／ｋｇペプチド用量および３ｍｇ／ｋｇのｓ．ｃ．用量のモルヒネ（３０分前処置）は第１段階（ホルマリン注射後０〜５分）で効果がなかった。しかしながら、さらに低いペプチド用量（１および３ｍｇ／ｋｇのｓ．ｃ．）は、ビヒクル対照と比較してリフティング／リッキングに費やされる時間を増加させるようであった。５ｍｇ／ｋｇのｓ．ｃ．用量の［Ａｌａ５］ＧｐＴｘ−１（１−３４）（配列番号２２）は、モルヒネ対照と同様に、研究の第２段階でリフティング／リッキングに費やされる時間の有意な減少を示した。しかしながら、さらに低いペプチド用量は、第２段階でビヒクル対照と比較してリフティング／リッキング行動の減少を示さなかった。１ｍｇ／ｋｇのｓ．ｃ．群はビヒクル対照と有意に異ならなかったが、一方、３ｍｇ／ｋｇのｓ．ｃ．群は第２段階でリフティング／リッキングに費やされる時間を有意に増加させるようであった。最終暴露（ホルマリン注射後４５分でのペプチド血漿濃度）は５．０、３、および１ｍｇ／ｋｇ用量についてそれぞれ１．８４±０．１８μＭ、０．５３±０．２３μＭ、および０．２０±０．０５μＭであった。 ５、３、および１ｍｇ／ｋｇのｓ．ｃ．の１時間前処置用量を施したオスＣＤ−１マウスにおけるホルマリン疼痛モデルの第１段階での［Ａｌａ５］ＧｐＴｘ−１（１−３４）（配列番号２２）の効果を示す。５ｍｇ／ｋｇペプチド用量および３ｍｇ／ｋｇのｓ．ｃ．用量のモルヒネは第１段階（ホルマリン注射後０〜５分）で効果がなかった。しかしながら、さらに低いペプチド用量（１および３ｍｇ／ｋｇのｓ．ｃ．）は、対照と比較してリフティング／リッキングに費やされる時間を増加させるようであった。 ５、３、および１ｍｇ／ｋｇのｓ．ｃ．の１時間前処置用量を施したオスＣＤ−１マウスにおいてホルマリン疼痛モデルの第２段階での［Ａｌａ５］ＧｐＴｘ−１（１−３４）（配列番号２２）の効果を示す。５ｍｇ／ｋｇのｓ．ｃ．用量のペプチドは、モルヒネ陽性対照と同様に、研究の第２段階でリフティング／リッキングに費やされる時間の有意な減を示した。しかしながら、更に低いペプチド用量は、第２段階においてビヒクル対照と比較してリフティング／リッキング行動の減少を示さなかった。１ｍｇ／ｋｇのｓ．ｃ．群はビヒクル対照と有意に異ならなかったが、一方、３ｍｇ／ｋｇのｓ．ｃ．群第２段階でリフティング／リッキングに費やされる時間を有意に増加させるようであった。 ５、３、および１ｍｇ／ｋｇのｓ．ｃ．の１時間前処置用量を施したオスＣＤ−１マウスにおけるホルマリン疼痛モデルでの足浮腫に対する［Ａｌａ５］ＧｐＴｘ−１（１−３４）（配列番号２２）の効果を示す。ペプチドもモルヒネ対照もどちらも、ビヒクル（ＰＢＳ）と比較してホルマリン注射に起因する足浮腫を有意に減少させなかった。 オスＣＤ−１マウスにおいて３および５ｍｇ／ｋｇのｓ．ｃ．用量と１時間の前処置時間での［Ａｌａ５］ＧｐＴｘ−１（１−３４）（配列番号２２）の自発運動の全基本的運動要素に対する効果を示す。どの用量のペプチドもビヒクル対照と比較して探索行動を有意に減少させなかった。最終暴露（ペプチド注射２持間後のペプチド血漿濃度）は５および３ｍｇ／ｋｇのｓ．ｃ．用量についてそれぞれ１．７９±０．３８および０．８９±０．３３μＭであった。 オスＣＤ−１マウスにおいて自発運動の微細運動要素に対する５ｍｇ／ｋｇのｓ．ｃ．と１時間の前処置時間での［Ａｌａ５］ＧｐＴｘ−１（１−３４）（配列番号２２）の効果を示す。３ｍｇ／ｋｇ用量で、微細運動は有意に影響を受けなかった。５ｍｇ／ｋｇ用量で、ペプチドはビヒクルと比較して全微細運動を有意に減少させた。 オスＣＤ−１マウスにおける自発運動の合計立ち上がり要素に対する３および５ｍｇ／ｋｇのｓ．ｃ．用量と１時間の前処置時間での［Ａｌａ５］ＧｐＴｘ−１（１−３４）（配列番号２２）の効果を示す。ペプチドのどの用量もビヒクル対照と比較して探索行動を有意に減少させなかった。 オスＣＤ−１マウスにおける自発運動の合計立ち上がり時間要素に対する３および５ｍｇ／ｋｇのｓ．ｃ．用量と１時間の前処置時間での［Ａｌａ５］ＧｐＴｘ−１（１−３４）（配列番号２２）の効果を示す。３ｍｇ／ｋｇ用量で、合計立ち上がり時間は有意に影響を受けなかった。５ｍｇ／ｋｇ用量で、ペプチドはビヒクルと比較して合計立ち上がり時間を有意に減少させなかった。 ５ｍｇ／ｋｇのｓ．ｃ．用量と１時間の前処置時間での［Ａｌａ５］ＧｐＴｘ−１（１−３４）（配列番号２２）ならびに３０ｍｇ／ｋｇ腹腔内（「ｉ．ｐ．」）用量と３０分前処置時間でのメキシレチンの、ベラトリジン注射後２０分間測定されたオスＣＤ−１マウスにおけるベラトリジンで誘発された（後足に１μｇ注射）自発的侵害受容挙動に対する効果を示す。全体として、ビヒクル群から良好な足リフティング応答があり、これはメキシレチンで有意に逆転された。５ｍｇ／ｋｇで、［Ａｌａ５］ＧｐＴｘ−１（１−３４）（配列番号２２）はリフティング挙動を有意に減少させなかった。全群にわたって足浮腫の減少はない。 ５ｍｇ／ｋｇのｓ．ｃ．用量と１時間の前処置時間での［Ａｌａ５］ＧｐＴｘ−１（１−３４）（配列番号２２）および３０ｍｇ／ｋｇのｉ．ｐ．用量と３０分の前処置時間でのメキシレチンの、オスＣＤ−１マウスにおけるベラトリジンで誘発された（後足で１μｇ注射）足浮腫に対する効果を示す。全ての群にわたって足浮腫の減少はない。 ５ｍｇ／ｋｇのｓ．ｃ．用量と１時間の前処置時間での［Ａｌａ５］ＧｐＴｘ−１（１−３４）（配列番号２２）および３０ｍｇ／ｋｇのｉ．ｐ．用量と３０分の前処置時間でのメキシレチンの、オスＣＤ−１マウスにおけるベラトリジンで誘発された（後足に１μｇ注射）自発的侵害受容挙動に対する効果の時間経過を示す。全体的に実験の全期間にわたってビヒクル群からの良好な前足リフティング応答があり、これはメキシレチンで有意に逆転された。５ｍｇ／ｋｇで、［Ａｌａ５］ＧｐＴｘ−１（１−３４）（配列番号２２）は全実験の経過中にリフティング挙動を有意に減少させることができなかったが、１０〜１５および１５〜２０分の時間瓶中に足リフティングおよびリッキングの減少の傾向があった。最終暴露（ペプチド注射後１．５時間でのペプチド血漿濃度）は５ｍｇ／ｋｇ用量について０．７０±０．１０μＭであった。 １および５ｍｇ／ｋｇのｓ．ｃ．用量と１時間の前処置時間（ｎ＝９〜１０）での［Ａｌａ５］ＧｐＴｘ−１（１−３４）（配列番号２２）および３０ｍｇ／ｋｇのｉ．ｐ．用量と３０分の前処置時間（ｎ＝１０）でのメキシレチンの、オスＣＤ−１マウスにおけるベラトリジンで誘発された（後足に１μｇ注射）自発的侵害受容挙動に対する繰り返し試験を示す。全体的にビヒクル群からの良好な足リフティング応答があり、これはメキシレチンで有意に逆転された。１および５ｍｇ／ｋｇで、［Ａｌａ５］ＧｐＴｘ−１（１−３４）（配列番号２２）はリフティング挙動を有意に減少させなかった。 １および５ｍｇ／ｋｇのｓ．ｃ．用量と１時間の前処置時間での［Ａｌａ５］ＧｐＴｘ−１（１−３４）（配列番号２２）および３０ｍｇ／ｋｇのｉ．ｐ．用量と３０分の前処置時間でのメキシレチンの、オスＣＤ−１マウスにおけるベラトリジンで誘発された（後足に１μｇ注射）足浮腫に対する効果を示す。どの群においても足浮腫の減少はなかった。 図８０は、１および５ｍｇ／ｋｇのｓ．ｃ．用量と１時間の前処置時間での［Ａｌａ５］ＧｐＴｘ−１（１−３４）（配列番号２２）ならびに３０ｍｇ／ｋｇのｉ．ｐ．用量と３０分の前処置時間でのメキシレチンの、オスＣＤ−１マウスにおいてベラトリジンで誘発された（後足に１μｇ注射）自発的侵害受容挙動に対する効果の時間経過を示す。全体として実験の全期間にわたってビヒクル群からの良好な足リフティング応答があり、これはメキシレチンで有意に逆転された。１および５ｍｇ／ｋｇで、［Ａｌａ５］ＧｐＴｘ−１（１−３４）（配列番号２２）は実験の過程中のどの時点でもリフティング挙動を有意に減少させなかった。最終暴露（ペプチド注射後１．５時間でのペプチド血漿濃度）は、５および１ｍｇ／ｋｇ用量についてそれぞれ０．７２±０．１３および０．０９±０．０５μＭであった。 アルキン含有ペプチド［Ｐｈｅ６；Ｐｒａ１３］ＧｐＴｘ−１（１−３４）（配列番号１０４９）と２ｋＤａのＰＥＧビス−アジドとを銅触媒１，３−双極性環付加反応によって反応させて、配列中のプロパルギルグリシンすなわちＰｒａ残基を３−（１，２，３−トリアゾール−４−イル）アラニンすなわちＡｔｚ残基に変換することによって２つのトリアゾール結合を有する部位特異的ホモ二量体型ペプチドを得ることを示す。 ２ステップシーケンスを示し、まず、アルキン含有ペプチド［Ａｌａ５、Ｐｈｅ６、Ｐｒａ１３、Ｌｅｕ２６、Ａｒｇ２８］ＧｐＴｘ−１（１−３４）（配列番号６４０）とアジド−ＰＥＧ１１−ブロモアセトアミドリンカーとを銅触媒１，３−双極性環付加反応によって反応させて、ペプチド配列中のプロパルギルグリシンすなわちＰｒａ残基を３−（１，２，３−トリアゾール−４−イル）アラニンすなわちＡｔｚ残基に変換することによって、トリアゾール結合を有する部位特異的にＰＥＧ化されたペプチド−リンカー構築物（配列番号１０６２）を得る。第２に、抗ＤＮＰ ｍＡｂ（Ｅ２７３Ｃ）ｈＩｇＧ１（免疫グロブリンモノマー配列番号３０８７；配列番号３０８８；配列番号３０８７；配列番号３０８８を含む）中の改変された遊離システインはペプチド−リンカー中のブロモアセトアミド官能基と反応して、安定なチオアセトアミド結合を有する部位特異的免疫グロブリンペプチド複合体（免疫グロブリンペプチド複合体１）を形成する。１つのシステインが反応する場合、示されるような一価免疫グロブリンペプチド複合体が得られるが、両システインが反応する場合、二価免疫グロブリンペプチド複合体が得られる。 ＳＰ−カラム上での精製前のペプチド−リンカー構築物（配列番号１０６２）と抗ＤＮＰ ｍＡｂ（Ｅ２７３Ｃ）ｈＩｇＧ１（免疫グロブリンモノマー配列番号３０８７；配列番号３０８８；配列番号３０８７；配列番号３０８８を含む）との部位特異的複合体化反応混合物の還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。約７５％のｍＡｂ重鎖（ＨＣ）は５−ｋＤシフトを示し、このことは、単一のＧｐＴＸ−１ペプチドアナログの複合体化を意味する。分子量バンドが高いほど、過還元によるさらに高次の複合体を意味する。 ペプチド−リンカー構築物（配列番号１０６２）と抗ＤＮＰ ｍＡｂ（Ｅ２７３Ｃ）ｈＩｇＧ１（免疫グロブリンモノマー配列番号３０８７；配列番号３０８８；配列番号３０８７；配列番号３０８８を含む）との部位特異的複合体化反応混合物の精製からの結果を示す。左のパネルは、５ｍＬのＨｉＴｒａｐ ＳＰ−ＨＰカラムを使用した複合体化反応の２８０ｎｍでのＵＶ吸光度のカチオン交換クロマトグラムを示す。右のパネルは、抗体−ペプチド複合体の内部ジスルフィド結合がインタクトであることを示すカチオン交換クロマトグラムからのピークの非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（左）、およびカチオン交換クロマトグラムからの還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（右）を示す。ピーク１は非反応抗体の重鎖（ＨＣ）を示す。ピーク２はＨＣの約５０％がシフトしたことを示し、一価抗体−ＧｐＴｘ−１ペプチドアナログ複合体を意味する。ピーク３はほぼ１００％のＨＣがシフトしたことを示し、二価抗体−ＧｐＴｘ−１ペプチドアナログ複合体を意味する。 ペプチド−リンカー構築物（配列番号１０６２）と抗ＤＮＰ ｍＡｂ（Ｅ２７３Ｃ）ｈＩｇＧ１ Ｆｃ領域（配列番号３０８９のホモ二量体）との部位特異的複合体化反応混合物の精製からの結果を示す。左のパネルは、５ｍＬ ＨｉＴｒａｐ ＳＰ−ＨＰカラムを用いた複合体化反応の２８０ｎｍでのＵＶ吸光度のカチオン交換クロマトグラムを示す。右のパネルは、抗体−ペプチド複合体の内部ジスルフィド結合がインタクトであることを示すカチオン交換クロマトグラムからのピークの非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（左）およびカチオン交換クロマトグラムからのピークの還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（右）を示す。ピーク１はＨＣの約５０％がシフトしたことを示し、一価抗体−ペプチド複合体を意味する。ピーク２はほぼ１００％のＨＣがシフトしたことを示し、二価抗体−ペプチド複合体を意味する。 図８５は、（上のパネル）未修飾抗ＤＮＰ ｍＡｂ（Ｅ２７３Ｃ）ｈＩｇＧ１（配列番号３０８７；配列番号３０８８；配列番号３０８７；配列番号３０８８を含む）および（下のパネル）二価抗体−ＧｐＴｘ−１ペプチドアナログ複合体（免疫グロブリンペプチド複合体２）についての、Ｔｏｓｏｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｓｕｐｅｒ ＳＷ３０００、４μＭ、２５０Ａ、４．６ｍｍ×３０ｃｍカラムで、１００ｍＭリン酸ナトリウム、２５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６．８中、０．３５ｍＬ／ｍｉｎの定組成溶離で２０分間実施した、２８０ｎｍでのＵＶ吸光度の分析的サイズ排除クロマトグラムを示す。クロマトグラムはペプチド複合体試料中の凝集を示さない。 抗ＤＮＰ ｍＡｂ（Ｅ２７３Ｃ）ｈＩｇＧ１（免疫グロブリンモノマー配列番号３０８７；配列番号３０８８；配列番号３０８７；配列番号３０８８を含む）とのペプチド−リンカー構築物の二価ペプチド複合体（配列番号１０６２）の解析されたＬＣ−ＭＳ ＴＯＦから得られた結果を示し、これは免疫グロブリンペプチド複合体２である。複数のピークの存在は、異なるグリコシル化イソ型を意味する。 抗ＤＮＰ ｍＡｂ（Ｅ５２Ｃ）ｈＩｇＧ１ Ｆｃ領域（配列番号３０８９のホモ二量体）とペプチド−リンカー構築物との二価ペプチド複合体（配列番号１０６２）の解析されたＬＣ−ＭＳ ＴＯＦからの結果を示し、これはＦｃ−ペプチド複合体２である。複数のピークの存在は、異なるグリコシル化イソ型を意味する。 例示説明の目的のためのみに、Ｆｃ−ペプチド複合体１の略図を示す。免疫グロブリン抗ＤＮＰ ｍＡｂ（Ｅ５２Ｃ）ｈＩｇＧ１ Ｆｃ領域（配列番号３０８９のホモ二量体）のホモロジーモデルを免疫グロブリン結晶構造（１ＨＺＨ．ｐｄｂ）から構築し、一様に塗りつぶされたリボンとして表す。配列番号３０８９のＣｙｓ５２（共役部位）をＣＰＫ形式で表す。ＰＥＧ１１リンカーを、この実施形態における任意の構造で、免疫グロブリンＦｃ領域中のＣ５２残基をペプチド中のＡｔｚ１３残基と接続する一様に塗りつぶされた管として表示する。ペプチド（配列番号１０４６）のホモロジーモデルをＧｐＴｘ−１のＮＭＲ構造から構築し、一様に塗りつぶされたリボンとして表示し、この実施形態では免疫グロブリンＦｃ領域に対して任意の相対配向で示す。 例示説明の目的のためのみにＦｃ−ペプチド複合体２の略図を示す。抗ＤＮＰ ｍＡｂ（Ｅ５２Ｃ）ｈＩｇＧ１Ｆｃ領域（配列番号３０８９のホモ二量体）のホモロジーモデルを免疫グロブリン結晶構造（１ＨＺＨ．ｐｄｂ）から構築し、一様に塗りつぶされたリボンとして表す。両Ｆｃ領域モノマー（配列番号３０８９）のＣｙｓ５２残基は共役部位であり、ＣＰＫ形式で表す。免疫グロブリンＦｃ領域中のＣ５２残基をペプチド中のＡｔｚ１３残基と接続する任意構造におけるこの実施形態では、ＰＥＧ１１リンカーは一様に塗りつぶされたチューブとして示される。ペプチド（配列番号１０４６）のホモロジーモデルをＧｐＴｘ−１のＮＭＲ構造から構築し、一様に塗りつぶされたリボンとして表示し、免疫グロブリンＦｃ領域に対して任意の相対配向で示す。Ｆｃ−ペプチド複合体２の二価特質を反映する２つのペプチドが示される。 例示説明の目的のためのみに免疫グロブリンペプチド複合体１の略図を示す。抗ＤＮＰ ｍＡｂ（Ｅ２７３Ｃ）ｈＩｇＧ１（免疫グロブリンモノマーである配列番号３０８７；配列番号３０８８；配列番号３０８７；配列番号３０８８を含む）のホモロジーモデルを免疫グロブリン結晶構造（１ＨＺＨ．ｐｄｂ）から構築し、一様に塗りつぶされたリボンとして表す。共役部位であるＣｙｓ２７３をＣＰＫ形式で表す。この実施形態において、ＰＥＧ１１リンカーは、免疫グロブリン中のＣ２７３残基をペプチド中のＡｔｚ１３残基に接続する任意クモ毒において一様に塗りつぶされたチューブとして表される。ペプチド（配列番号１０４６）のホモロジーモデルをＧｐＴｘ−１のＮＭＲ構造から構築し、一様に塗りつぶされたリボンとして表示し、この実施形態では免疫グロブリンに対する任意の相対配向で示される。 例示説明の目的のためのみに免疫グロブリンペプチド複合体２の略図を示す。抗ＤＮＰ ｍＡｂ（Ｅ２７３Ｃ）ｈＩｇＧ１（免疫グロブリンモノマー配列番号３０８７；配列番号３０８８；配列番号３０８７；配列番号３０８８を含む）のホモロジーモデルを免疫グロブリン結晶構造（１ＨＺＨ．ｐｄｂ）から構築し、一様に塗りつぶされたリボンとして表す。両Ｃｙｓ２７３残基、すなわち共役部位は、ＣＰＫ形式で表される。この実施形態において、ＰＥＧ１１リンカーは免疫グロブリン中のＣ２７３残基をペプチド中のＡｔｚ１３残基に接続する任意クモ毒中の一様に塗りつぶされたチューブとして表される。ペプチド（配列番号１０４６）のホモロジーモデルをＧｐＴｘ−１のＮＭＲ構造から構築し、一様に塗りつぶされたリボンとして表示し、この実施形態における免疫グロブリンに対して任意の相対配向で示す。免疫グロブリンペプチド複合体２の二価特質を反映するように２つのペプチドを示す。 １および１０ｍｇ／ｋｇのｓ．ｃ．用量をマウス（ｎ＝３）に投与した後のＧｐＴｘ−１ペプチドアナログ−Ｆｃ複合体（Ｆｃ−ペプチド複合体２）および対照Ｆｃ（配列番号３０８９のホモ二量体）の平均血漿濃度−時間プロファイルを示す。 マウス（ｎ＝３）に１ｍｇ／ｋｇのｓ．ｃ．および１０ｍｇ／ｋｇのｓ．ｃ．を投与した後のペプチド−ＩｇＧ複合体（免疫グロブリンペプチド複合体２）および対照ＩｇＧ（配列番号３０８７；配列番号３０８８；配列番号３０８７；配列番号３０８８を含むｈＩｇＧ１ ｍＡｂ）の平均血漿濃度−時間プロファイルを示す。 高速ナトリウム電流および電位依存性カリウム電流に対する５００ｎＭでのペプチド［Ａｌａ５］ＧｐＴｘ−１（配列番号２２）の効果を示す。曲線は、ラット後根神経節から酵素によって単離されたニューロンからの電圧−クランプ記録である。組み合わされた内向きナトリウムおよび外向きカリウム電流が−９０ｍＶの保持電圧から０ｍＶまで２０ｍｓ刻みで同時に惹起された。右の曲線は、５００ｎＭのペプチド添加後約１６０秒かかった。５００ｎＭでの［Ａｌａ５］ＧｐＴｘ−１（配列番号２２）は高速ナトリウム電流をブロックしたが、電位依存性カリウム電流はブロックしなかった。 ５ｍｇ／ｋｇのｓ．ｃ．の１時間前処置用量を施したオスＣＤ−１マウスにおけるホルマリン疼痛モデルでの［Ｇｌｕ２９］ＧｐＴｘ−１（１−３４）（配列番号３０）の効果の時間経過を示す。５ｍｇ／ｋｇペプチド用量および３ｍｇ／ｋｇのｓ．ｃ．用量の陽性対照モルヒネ（３０分の前処置）は第１段階（ホルマリン注射後０〜５分）で有意な効果が無かった。５ｍｇ／ｋｇのｓ．ｃ．用量の［Ｇｌｕ２９］ＧｐＴｘ−１（１−３４）（配列番号３０）は、研究の第２段階（ホルマリン注射後５〜４０分）でリフティング／リッキングに費やされる時間の有意な減少を示さなかったが、モルヒネ陽性対照は第２段階でリフティング／リッキングに費やされる時間を有意に減少させた。最終暴露（ホルマリン注射後４５分でのペプチド血漿濃度）は５ｍｇ／ｋｇペプチド用量について０．５０２±０．２７１μＭであった。 ５ｍｇ／ｋｇのｓ．ｃ．の１時間前処置用量を施したオスＣＤ−１マウスにおけるホルマリン疼痛モデルの第１段階で［Ｇｌｕ２９］ＧｐＴｘ−１（１−３４）（配列番号３０）の効果を示す。５ｍｇ／ｋｇペプチド用量および３ｍｇ／ｋｇのｓ．ｃ．用量のモルヒネは第１段階（ホルマリン注射後０〜５分）で効果がなかった。 ５ｍｇ／ｋｇのｓ．ｃ．の１時間前処置用量を施したオスＣＤ−１マウスにおいてホルマリン疼痛モデル（ホルマリン注射後５〜４０分）の第２段階における［Ｇｌｕ２９］ＧｐＴｘ−１（１−３４）（配列番号３０）の効果を示す。５ｍｇ／ｋｇのｓ．ｃ．用量のペプチドは、ビヒクル対照に対する研究の第２段階においてリフティング／リッキングに費やされる時間の有意な減少を示さなかった。モルヒネ陽性対照は第２段階においてリフティング／リッキングに費やされる時間の有意に減少させた。 １時間前処置用量５ｍｇ／ｋｇのｓ．ｃ．を施したオスＣＤ−１マウスのホルマリン疼痛モデルにおける足浮腫に対する［Ｇｌｕ２９］ＧｐＴｘ−１（１−３４）（配列番号３０）の効果を示す。ペプチドもモルヒネ対照も、ビヒクル（ＰＢＳ）に対してホルマリン注射によって引き起こされる足浮腫を有意に軽減しなかった。 オスＣＤ−１マウスにおいて、５ｍｇ／ｋｇのｓ．ｃ．用量と１時間の前処置時間での［Ａｌａ５］ＧｐＴｘ−１（１−３４）（配列番号２２）の自発運動の全基本的運動要素に対する効果の繰り返しを示す。全基本的運動は、５ｍｇ／ｋｇペプチド用量によって有意に減少した。最終暴露（ペプチド注射後２時間のペプチド血漿濃度）は２．１±０．４７μＭであった。 オスＣＤ−１マウスにおいて、［Ａｌａ５］ＧｐＴｘ−１（１−３４）（配列番号２２）の５ｍｇ／ｋｇのｓ．ｃ．用量と１時間の前処置時間での、自発運動の微細運動要素に対する影響を示す。５ｍｇ／ｋｇ用量で、ペプチドはビヒクルと比較して全微細運動を有意に減少させた。 オスＣＤ−１マウスにおける、［Ａｌａ５］ＧｐＴｘ−１（１−３４）（配列番号２２）の５ｍｇ／ｋｇのｓ．ｃ．用量と１時間の前処置時間での自発運動の合計立上り要素に対する影響を示す。５ｍｇ／ｋｇ用量で、ペプチドはビヒクル対照と比較して合計立ち上がりを有意に減少させた。 オスＣＤ−１マウスにおける、［Ａｌａ５］ＧｐＴｘ−１（１−３４）（配列番号２２）の５ｍｇ／ｋｇのｓ．ｃ．用量と１時間の前処置時間での自発運動の合計立ち上がり時間要素に対する影響を示す。５ｍｇ／ｋｇ用量で、ペプチドは、ビヒクル対照と比べて合計立ち上がり時間を有意に減少させた。 オスＣＤ−１マウスにおける、［Ｇｌｕ２９］ＧｐＴｘ−１（１−３４）（配列番号３０）の５ｍｇ／ｋｇのｓ．ｃ．用量と１時間の前処置時間での自発運動の全基本的運動要素に対する影響を示す。ペプチド用量は、ビヒクル対照と比較して探索行動または全基本的運動を有意に減少させなかった。最終暴露（ペプチド注射後２時間でのペプチド血漿濃度）は５ｍｇ／ｋｇのｓ．ｃ．ペプチド用量について０．７７１±０．２７２μＭであった。 オスＣＤ−１マウスにおける、［Ｇｌｕ２９］ＧｐＴｘ−１（１−３４）（配列番号３０）の５ｍｇ／ｋｇのｓ．ｃ．用量と１時間の前処置時間での自発運動の微細運動要素に対する影響を示す。５ｍｇ／ｋｇ用量で、微細運動は、ビヒクル対照と比較して有意に影響を受けなかった。 オスＣＤ−１マウスにおける、［Ｇｌｕ２９］ＧｐＴｘ−１（１−３４）（配列番号３０）の５ｍｇ／ｋｇのｓ．ｃ．用量と１時間の前処置時間での自発運動の合計立上り要素に対する影響を示す。ペプチド用量は、ビヒクル対照と比較して、探索行動または合計立ち上がりを有意に減少させなかった。 オスＣＤ−１マウスにおける、［Ｇｌｕ２９］ＧｐＴｘ−１（１−３４）（配列番号３０）の５ｍｇ／ｋｇのｓ．ｃ．用量と１時間の前処置時間での自発運動の合計立ち上がり時間要素に対する影響を示す。５ｍｇ／ｋｇ用量で、合計立ち上がり時間は、ビヒクル対照と比較して有意に影響を受けなかった。 オスＣＤ−１マウスにおける、５ｍｇ／ｋｇのｓ．ｃ．用量と１時間の前処置時間での［Ｇｌｕ２８］ＧｐＴｘ−１（１−３４）（配列番号１５３）の自発運動の全基本的運動要素に対する影響を示す。全基本的運動は、５ｍｇ／ｋｇペプチド用量により有意に減少した。最終暴露（ペプチド注射後２時間でのペプチド血漿濃度）は１．２８±０．４０３μＭであった。 オスＣＤ−１マウスにおける、５ｍｇ／ｋｇのｓ．ｃ．用量と１時間の前処置時間での［Ｇｌｕ２８］ＧｐＴｘ−１（１−３４）（配列番号１５３）の、自発運動の微細運動要素に対する効果を示す。５ｍｇ／ｋｇ用量で、ペプチドはビヒクルと比較して全微細運動を有意に減少させた。 オスＣＤ−１マウスにおける、５ｍｇ／ｋｇのｓ．ｃ．用量と１時間の前処置時間での［Ｇｌｕ２８］ＧｐＴｘ−１（１−３４）（配列番号１５３）の、自発運動の合計立上り要素に対する影響を示す。５ｍｇ／ｋｇ用量で、ペプチドはビヒクル対照と比較して合計立ち上がりを有意に減少させた。 オスＣＤ−１マウスにおける、５ｍｇ／ｋｇのｓ．ｃ．用量と１時間の前処置時間での［Ｇｌｕ２８］ＧｐＴｘ−１（１−３４）（配列番号１５３）の、自発運動の合計立ち上がり時間要素に対する影響を示す。５ｍｇ／ｋｇ用量で、ペプチドはビヒクル対照と比較して合計立ち上がり時間を有意に減少させた。 オスＣＤ−１マウスにおける、１０ｍｇ／ｋｇのｓ．ｃ．用量と１時間の前処置時間でのＦｃ−ペプチド複合体２および免疫グロブリンペプチド複合体２の、自発運動の全基本的運動要素に対する影響を示す。ペプチド複合体用量は、ビヒクル対照に比べて探索行動または全基本的運動を有意に減少させなかった。最終暴露（ペプチド複合体注射後２４．５時間でのペプチド複合体血漿濃度）は、１０ｍｇ／ｋｇのｓ．ｃ．用量のＦｃ−ペプチド複合体２および免疫グロブリンペプチド複合体２についてそれぞれ０．０３４±０．００９μＭおよび０．０５１±０．００７μＭであった。 オスＣＤ−１マウスにおける自発運動の微細運動要素に対する、１０ｍｇ／ｋｇのｓ．ｃ．用量のＦｃ−ペプチド複合体２および免疫グロブリンペプチド複合体２と１時間前処置での影響を示す。１０ｍｇ／ｋｇ用量で、微細運動は、ビヒクル対照と比べていずれのペプチド複合体にも有意な影響を受けなかった。 １０ｍｇ／ｋｇのｓ．ｃ．用量のＦｃ−ペプチド複合体２および免疫グロブリンペプチド複合体２と１時間の前処置時間での、オスＣＤ−１マウスにおける自発運動の合計立上り要素に対する影響を示す。ペプチド複合体用量は、ビヒクル対照に関して探索行動または合計立ち上がりを有意に減少させなかった。 １時間の前処置時間での１０ｍｇ／ｋｇのｓ．ｃ．用量のＦｃ−ペプチド複合体２および免疫グロブリンペプチド複合体２の、オスＣＤ−１マウスにおける自発運動の合計立ち上がり時間要素に対する影響を示す。１０ｍｇ／ｋｇ用量で、合計立ち上がり時間は、ビヒクル対照と比較していずれのペプチド複合体によっても有意な影響を受けなかった。 １０ｍｇ／ｋｇのｓ．ｃ．の１時間の前処置用量を施したオスＣＤ−１マウスにおけるホルマリン疼痛モデルでのＦｃ−ペプチド複合体２および免疫グロブリンペプチド複合体２の効果の時間経過を示す。１０ｍｇ／ｋｇペプチド用量および３ｍｇ／ｋｇのｓ．ｃ．用量の陽性対照モルヒネ（３０分前処置）は第１段階（ホルマリン注射後０〜５分）で有意な効果はなかった。１０ｍｇ／ｋｇのｓ．ｃ．用量のＦｃ−ペプチド複合体２および免疫グロブリンペプチド複合体２は、研究の第２段階（ホルマリン注射後５〜４０分）でリフティング／リッキングに費やされる時間の有意な減少は示さなかったが、モルヒネ陽性対照は第２段階でリフティング／リッキングに費やされる時間を有意に減少させた。最終暴露（ホルマリン注射後４５分でのペプチド複合体血漿濃度）は、１０ｍｇ／ｋｇ用量のＦｃ−ペプチド複合体２および免疫グロブリンペプチド複合体２についてそれぞれ０．０３５±０．０１１μＭおよび０．０４０±０．０１１μＭであった。 １０ｍｇ／ｋｇのｓ．ｃ．の１時間の前処置用量を施したオスＣＤ−１マウスにおけるホルマリン疼痛モデルの第１段階におけるＦｃ−ペプチド複合体２および免疫グロブリンペプチド複合体２の効果を示す。１０ｍｇ／ｋｇのｓ．ｃ．用量のＦｃ−ペプチド複合体２および免疫グロブリンペプチド複合体２ならびに３ｍｇ／ｋｇのｓ．ｃ．用量のモルヒネは第１段階で効果がなかった（ホルマリン注射の０〜５分後）。 １０ｍｇ／ｋｇのｓ．ｃ．の１時間の前処置用量を施したオスＣＤ−１マウスにおけるホルマリン疼痛モデル（ホルマリン注射後５〜４０分）でのＦｃ−ペプチド複合体２および免疫グロブリンペプチド複合体２の効果を示す。１０ｍｇ／ｋｇのｓ．ｃ．用量のＦｃ−ペプチド複合体２および免疫グロブリンペプチド複合体２は、ビヒクル対照と比較した研究の第２段階においてリフティング／リッキングに費やされる時間の有意な減少は示さなかった。モルヒネ陽性対照は、第２段階でリフティング／リッキングに費やされる時間を有意に減少させた。
本明細書で使用されるセクションの見出しは、単に構成を目的としたものであり、記載される主題を限定するものと解釈されるべきではない。
定義
本明細書において特に定義されない限り、本出願との関連において使用される科学的および技術的用語は、当業者により一般に理解される意味を有するものとする。さらに、文脈により特に要求されない限り、単数の用語は複数形を含み、複数の用語は単数形を含むものとする。従って、本明細書および添付される特許請求の範囲において使用される、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」には、文脈が明確に指示しない限り、複数の指示物も含まれる。例えば、「タンパク質（a protein）」との言及は、複数のタンパク質を含み；「細胞（a cell）」との言及は、複数の細胞の集団を含む。
「ポリペプチド」および「タンパク質」は、本明細書において互換可能に使用され、ペプチド結合を介して共有結合した２つ以上のアミノ酸の分子鎖を含む。この用語は、生成物の特定の長さを指さない。従って、「ペプチド」および「オリゴペプチド」は、ポリペプチドの定義内に含まれる。該用語には、ポリペプチドの翻訳後修飾、例えば、グリコシル化、アセチル化、ビオチン化、４−ペンチノイル化（4-pentynoylation）、ＰＥＧ化、リン酸化等が含まれる。さらに、タンパク質断片、アナログ、突然変異タンパク質または変異体タンパク質、融合タンパク質等が、ポリペプチドの意味の中に含まれる。公知のタンパク質工学技術を使用して組換えにより発現し得る、１つもしくは複数のアミノ酸アナログまたは非標準もしくは非天然アミノ酸が含まれる分子も、この用語に含まれる。さらに、融合タンパク質を、本明細書に記載されるとおり、公知の有機化学技術により、誘導体化することができる。
本発明の別のペプチドもしくはポリペプチドまたは半減期延長部分に、リンカー部分を介して直接的または間接的のどちらかで共有結合的に連結、付着、または結合した、本発明のペプチドまたはポリペプチドを含む本発明の組成物は、化学的手段（例えば、翻訳後または合成後に）よって、または組換え融合によって複合体化されているかのいずれにせよ、「複合体」または「複合体化した」分子である。
「ビオチン」は水溶性のビタミンＢ群、すなわち、テトラヒドロチオフェン環と縮合したウレイド（テトラヒドロイミジザロン）環（式Ｉを参照のこと）から成る、ビタミンＢ７である。
Figure 2017031157
吉草酸置換基が、テトラヒドロチオフェン環の炭素原子のうちの１つに付着している。自然では、ビオチンは脂肪酸およびロイシンの代謝における補酵素であり、ｉｎ ｖｉｖｏでの糖新生において役割を果たす。ビオチンは、四量体タンパク質のアビジン（例えば、ニワトリアビジン、細菌性ストレプトアビジン、およびニュートラアビジン）に、約１０−１４Ｍ〜１０−１６Ｍの平衡解離定数ＫＤで、非常に強力に結合し、これは強度においては共有結合に近い、最も強力な既知のタンパク質−リガンド相互作用のうちの１つである。（Laitinen et al.. Genetically engineered avidins and streptavidins, Cell Mol Life Sci. 63 (24): 2992-30177 (2006)）。ビオチン−アビジンの非共有結合性相互作用は、異なる生物工学的な用途において、多く使用される。（Laitinen et al., Genetically engineered avidins and streptavidins, Cell Mol Life Sci. 63 (24): 2992-30177 (2006)を参照のこと。）
「ビオチン化された」とは、物質が１つまたは複数のビオチン部分に、共有結合的に複合体化していることを意味する。本発明を実施する上で有用なビオチン化されたペプチドは、市販品を購入することができ（例えば、ミッドウェスト・バイオテック社（Midwest Bio-Tech Inc.））、または容易に合成およびビオチン化することができる。ペプチドなどの化合物のビオチン化は、いかなる公知の化学技術によっても行うことができる。これらには、１級アミンビオチン化、スルフヒドリルビオチン化、およびカルボキシルビオチン化が含まれる。例えば、リジン側鎖のイプシロン−アミンおよびＮ末端α−アミンとして存在する、ペプチド上のアミン基は、１級アミンビオチン化の一般的な標的である。アミン反応性ビオチン化試薬は、水溶性に基づいて２つの群に分けることができる。
１）ビオチンのＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）−エステルは、水溶液中で不良な溶解度を有する。水溶液中の反応においては、それらをまず有機溶媒に溶解し、次いで水性の反応混合物中に希釈しなければならない。この目的のために最も一般に使用される有機溶媒は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）およびジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）であり、これらは低濃度において、ほとんどのタンパク質と適合性である。
２）ビオチンのスルホ−ＮＨＳ−エステルは、水中でより溶け易く、容易に加水分解するため、使用の直前に水に溶解する。スルホ−ＮＨＳ−エステルの水溶性は、それらのＮ−ヒドロキシスクシンイミド環上のスルホネート基から生じ、有機溶媒中に試薬を溶解する必要を排除する。
ＮＨＳ−およびスルホ−ＮＨＳ−エステルの化学反応は、本質的に同じである。すなわちアミド結合が形成され、ＮＨＳまたはスルホ−ＮＨＳが脱離基となる。エステルの標的が脱プロトン化された１級アミンであるため、反応はｐＨ７以上で広く行われる。ＮＨＳ−エステルの加水分解は、主要な競合反応であり、加水分解の速度は、ｐＨの増加とともに増加する。ＮＨＳ−およびスルホ−ＮＨＳ−エステルは、ｐＨ７で数時間の半減期を有するが、ｐＨ９ではわずか数分間である。ＮＨＳ−エステルをペプチドの１級アミンに複合体化するための条件には、４〜３７℃の範囲のインキュベーション温度、７〜９の範囲の反応ｐＨ値、および数分間から約１２時間までのインキュベーション時間が含まれる。アミン類（例えばトリスまたはグリシン）を含む緩衝剤は、反応と競合するため、避けなければならない。ＨＡＢＡ染色（２−（４−ヒドロキシアゾベンゼン）安息香酸）法を使用して、ビオチン化の程度を判定することができる。簡単に説明すると、ＨＡＢＡ染料はアビジンと結合し、特徴的な吸光度をもたらす。ビオチンが、ビオチン化されたタンパク質または他の分子の形態で導入される場合、それが染料に置き換わり、５００ｎｍでの吸光度の変化をもたらす。吸光度の変化は、試料中のビオチンのレベルに正比例する。
アミノ酸残基の「４−ペンチノイル化（pentynoylation）」とは、一般に、Ｎ末端を介したまたは側鎖での、標準的なアミド結合反応により、４−ペンタン酸をカップリングすることによる。付加的なＰＥＧ化のために適切な場合は、４−ペンチノイル化（pentynoylation）は、銅を触媒とする１，３−双極子環化付加反応（いわゆる「クリック」反応）において、アルキンを代替として使用することにより、アジド−ＰＥＧ分子中のアジドと反応させ、ペプチドとＰＥＧとをトリアゾールを介して連結することができる。
「単離されたポリペプチド」は、ポリペプチドの天然源において通常付随する、少なくとも１つの混入ポリペプチド分子から精製または分離されたポリペプチド分子である。単離されたポリペプチド分子は、天然の形態以外であるかまたは環境以外にある。
「毒素ペプチド」には、毒素から単離することが出来る、天然の薬理学的に活性なペプチドまたはポリペプチドと同一のアミノ酸配列を有するペプチドおよびポリペプチドが含まれ、そのような天然分子の、修飾されたペプチドアナログも含まれる（例えば、そのすべてが、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる、Kalman et al., ShK-Dap22, a potent Kv1.3-specific immunosuppressive polypeptide, J. Biol. Chem. 273(49):32697-707 (1998); Kem et al., 米国特許第６，０７７，６８０号; Mouhat et al., OsK1 derivatives,国際公開第２００６／００２８５０Ａ２号; Chandy et al., Analogs of SHK toxin and their uses in selective inhibition of Kv1.3 potassium channels, 国際公開第２００６／０４２１５１号; Sullivan et al., Toxin peptide therapeutic agents, 国際公開第２００６／１１６１５６Ａ２号を参照のこと）。ヘビ、サソリ、クモ、ミツバチ、巻貝（snail）およびイソギンチャクは、強力かつ選択的にイオンチャネルおよび受容体を標的とする、小分子の生理活性毒素ペプチドまたは「毒素類」の豊富な供給源として役立ち得る毒素を生成する生物の、いくつかの例である。ＧｐＴｘ−１（配列番号１）；ＧｐＴｘ−２（配列番号４６７）；ＧｐＴｘ−３（配列番号４６８）；ＧｐＴｘ−４（配列番号４６９）；ＧｐＴｘ−５（配列番号４７０）；ＧｐＴｘ−６（１−３５）（配列番号４７１）；およびＧｐＴｘ−７（１−３５）（配列番号４７３）は、毒素ペプチドの例である。電位依存性ナトリウムチャネルを阻害する毒素のいくつかの他の例としては、タランチュラ、Ｏｒｎｉｔｈｏｃｔｏｎｕｓ ｈｕｗｅｎａの毒から単離された、Ｈｕｗｅｎｔｏｘｉｎ−ＩＶ（ＥＣＬＥＩ ＦＫＡＣＮ ＰＳＮＤＱ ＣＣＫＳＳ ＫＬＶＣＳ ＲＫＴＲＷ ＣＫＹＱＩ−ＮＨ２／／配列番号５２８）およびＨｕｗｅｎｔｏｘｉｎ−Ｉ（ＡＣＫＧＶ ＦＤＡＣＴ ＰＧＫＮＥ ＣＣＰＮＲ ＶＣＳＤＫ ＨＫＷＣＫ ＷＫＬ／／配列番号５２９）；海洋性イモガイ（marine cone snail）、Ｃｏｎｕｓ ｋｉｎｏｓｈｉｔａｉの毒から単離されたＫＩＩＩＡ（ＣＣＮＣＳ ＳＫＷＣＲ ＤＨＳＲＣ Ｃ−ＮＨ２／／配列番号５３０）；およびタランチュラ、Ｔｈｒｉｘｏｐｅｌｍａ ｐｒｕｒｉｅｎｓの毒から単離されたＰｒｏＴｘＩＩ（ＹＣＱＫＷ ＭＷＴＣＤ ＳＥＲＫＣ ＣＥＧＭＶ ＣＲＬＷＣ ＫＫＫＬＷ／／配列番号５３１）が挙げられる。別の例は、サソリ、Ｏｄｏｎｔｈｏｂｕｔｈｕｓ ｄｏｒｉａｅの毒から単離された毒素である、アルファ毒素ＯＤ１（ＧＶＲＤＡＹＩＡＤＤ ＫＮＣＶＹＴＣＡＳＮ ＧＹＣＮＴＥＣＴＫＮ ＧＡＥＳＧＹＣＱＷＩ ＧＲＹＧＮＡＣＷＣＩ ＫＬＰＤＥＶＰＩＲＩＰＧＫＣＲ−ＮＨ２／／配列番号５８９）である。毒素ペプチドの別の例は、サソリ、Ｏｒｔｈｏｃｈｉｒｕｓ ｓｃｒｏｂｉｃｕｌｏｓｕｓの毒から単離された毒素ペプチドである、ＯＳＫ１（ＯｓＫ１としても知られる）である。（例えば、Mouhat et al., K+ channel types targeted by synthetic OSK1, a toxin from Orthochirus scrobiculosus scorpion venom, Biochem. J. 385:95-104 (2005); Mouhat et al., Pharmacological profiling of Orthochirus scrobiculosus toxin 1 analogs with a trimmed N-terminal domain domain, Molec. Pharmacol. 69:354- 62 (2006); Mouhat et al., OsK1 derivatives, 国際公開第２００６／００２８５０Ａ２号）。別の例は、イソギンチャク、Ｓｔｉｃｈｏｄａｃｔｙｌａ ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓの毒から単離されたＳｈＫ、およびそのペプチドアナログである。（例えば、Tudor et al., Ionisation behaviour and solution properties of the potassium-channel blocker ShK toxin, Eur. J. Biochem. 251(1-2):133-41(1998); Pennington et al., Role of disulfide bonds in the structure and potassium channel blocking activity of ShK toxin, Biochem. 38(44): 14549-58 (1999); Kem et al., ShK toxin compositions and methods of use, 米国特許第６，０７７，６８０号；Lebrun et al., Neuropeptides originating in scorpion, 米国特許第６，６８９，７４９号; beeton et al., Targeting effector memory T cells with a selective peptide inhibitor of Kv1.3 channnels for therapy of autoimmune diseases, Molec. Pharmacol. 67(4):1369-81 (2005); and Sullivan et al., Selective and potent peptide inhibitors of KV1.3, 国際公開第２０１０／１０８１５４Ａ２号）。
毒素ペプチドは一般に、約２０〜約８０アミノ酸長であり、２〜５つのジスルフィド結合を含み、非常にコンパクトな構造を形成する。毒素ペプチド（例えば、サソリ、イソギンチャクおよびイモガイの毒由来の）は、単離され、およびそれらのイオンチャネルにおける影響に関して特徴付けされている。このようなペプチドは、効力および安定性という重大な問題に対処するために特に好適な、比較的少数の構造的フレームワークから進化したと思われる。サソリおよびイモガイ属（Conus）の毒素ペプチドの多くは、例えば、１０〜４０個のアミノ酸および最大５つのジスルフィド結合を含み、タンパク分解に抵抗性であることが多い、極めてコンパクトかつ圧縮された（constrained）構造（マイクロタンパク質）を形成する。コノトキシンおよびサソリ毒素ペプチドは、それらのジスルフィド結合およびペプチドの折り畳みに基づいて、いくつかのスーパーファミリーに分類することができる。多くの毒素ペプチドの溶液構造がＮＭＲ分光法により決定され、それらのコンパクトな構造を実証し、ファミリーの折り畳みパターンの保存を立証している。（例えば、Tudor et al., Ionisation behaviour and solution properties of the potassium-channel blocker ShK toxin, Eur. J. Biochem. 251(1-2):133-41(1998); Pennington et al., Role of disulfide bonds in the structure and potassium channel blocking activity of ShK toxin, Biochem. 38(44): 14549-58 (1999); Jaravine et al., Three-dimensional structure of toxin OSK1 from Orthochirus scrobiculosus scorpion venom, Biochem. 36(6):1223-32 (1997); del Rio-Portillo et al.; NMR solution structure of Cn12, a novel peptide from the Mexican scorpion Centruroides noxius with a typical beta-toxin sequence but with alpha-like physiological activity, Eur. J. Biochem. 271(12): 2504-16 (2004); Prochnicka-Chalufour et al., Solution structure of discrepin, a new K+-channel blocking peptide from the alpha-KTx15 subfamily, Biochem. 45(6):1795-1804 (2006)）。他の例は、当技術分野で公知であるか、または、それぞれ参照によりその全体が組み込まれる、Sullivan et al., Toxin peptide Therapeutic agents, 国際公開第０６１１６１５６Ａ２号または米国特許第７，８３３，９７９号；Sullivan et al., Selective and potent peptide inhibitors of KV1.3, 国際公開第２０１０／１０８１５４Ａ２号； Mouhat et al., OsK1 derivatives, 国際公開第２００６／００２８５０Ａ２号； Sullivan et al., 米国特許出願第１１／９７８，０７６号（２００７年、１０月２５日に出願された、 というタイトルの）、Lebrun et al., 米国特許第６，６８９，７４９号に見出すことができる。
「ペプチドアナログ」という用語は、天然のペプチド配列と、少なくとも１つのアミノ酸残基の置換、内部付加、もしくは少なくとも１つのアミノ酸の内部欠失、および／またはアミノ末端もしくはカルボキシ末端のトランケーションもしくは付加、および／またはカルボキシ末端のアミド化により異なる配列を有するペプチドを指す。「内部欠失」とは、天然の配列のＮ末端またはＣ末端以外の位置からのアミノ酸の欠如を指す。同様に、「内部付加」とは、天然の配列のＮ末端またはＣ末端以外の位置における、アミノ酸の存在を指す。
本発明の組成物の実施形態は、毒素ペプチドアナログ、またはその薬剤的に許容される塩を含む。「毒素ペプチドアナログ」は、目的の天然毒素ペプチド配列、例えばＧｐＴｘ−１（ＤＣＬＧＦＭＲＫＣＩＰＤＮＤＫＣＣＲＰＮＬＶＣＳＲＴＨＫＷＣＫＹＶＦ−ＮＨ２／／配列番号１）と比較して、目的の天然毒素ペプチド配列の修飾を含む（例えば、上述のアミノ酸残基の置換、内部付加または挿入、内部欠失、および／またはアミノ末端もしくはカルボキシ末端のトランケーション、もしくは付加）。本発明の毒素ペプチドアナログは、２０〜約８０アミノ酸残基長であり、および配列番号１に関して、Ｃ１−Ｃ４、Ｃ２−Ｃ５およびＣ３−Ｃ６ジスルフィド（またはジセレニド）結合を有し、ここで、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５およびＣ６は、慣習的にペプチドのＮ末端を左側に示した、毒素ペプチドの一次配列に出現するシステイン（またはセレノシステイン）残基の順番を表し、アミノ酸配列中の１番目および６番目のシステイン（またはセレノシステイン）はジスルフィド結合（またはＳｅＣｙｓの場合はジセレニド結合）を形成し、２番目および４番目のシステイン（またはセレノシステイン）はジスルフィド結合（または、ＳｅＣｙｓの場合はジセレニド結合）を形成し、および３番目および５番目のシステイン（またはセレノシステイン）はジスルフィド結合（ＳｅＣｙｓの場合はまたはジセレニド結合）を形成する。本明細書に記載される通り、本発明の毒素ペプチドアナログはまた、配列番号１に関して、Ｎ末端および／またはＣ末端に付加的なアミノ酸残基を有し得る。
組成物の「生理的に許容される塩」、例えば、毒素ペプチドアナログの塩とは、薬剤的に許容されることが知られるかまたは後にそうであると発見された、いかなる塩をも意味する。薬剤的に許容される塩のいくつかの非限定的な例としては：酢酸塩；トリフルオロ酢酸塩；ハロゲン化水素酸塩、例えば塩酸塩および臭化水素酸塩；硫酸塩；クエン酸塩；マレイン酸塩；酒石酸塩；グリコール酸塩；グルコン酸塩；コハク酸塩；メシル酸塩；ベシル酸；没食子酸エステルの塩（没食子酸は、３，４、５トリヒドロキシ安息香酸としても知られる）例えば、ペンタガロイルグルコース（ＰＧＧ）および没食子酸エピガロカテキン（ＥＧＣＧ）、硫酸コレステリルの塩、パモ酸塩、タンニン酸塩およびシュウ酸塩が挙げられる。
「融合タンパク質」という用語は、タンパク質が、２つ以上の親タンパク質またはポリペプチドに由来するポリペプチド成分を含むことを示す。一般に融合タンパク質は、１つのタンパク質由来のポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列に、異なるタンパク質由来のポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列がインフレームで付加され、所望によりリンカーにより分離されている融合遺伝子から発現する。次いで、組換え宿主細胞により、単一のタンパク質として、融合遺伝子を発現させることができる。
本明細書で使用される「−模倣ペプチド」、「ペプチド模倣体」および「−アゴニストペプチド」という用語は、目的の天然タンパク質と同等の生物活性を有するペプチドまたはタンパク質、例えば、限定されないが、毒素ペプチド分子を指す。これらの用語は、例えば、天然分子の作用を増強することにより、天然ペプチド分子の活性を間接的に模倣するペプチドを、さらに含む。
「−アンタゴニストペプチド」、「ペプチドアンタゴニスト」および「阻害剤ペプチド」という用語は、目的の受容体の生物活性を遮断もしくは何らかの方法で妨害するか、または目的の受容体の公知のアンタゴニストもしくは阻害剤、例えば、限定されないが、イオンチャネル（例えば、Ｋｖ１．３）もしくはＧタンパク質結合受容体（ＧＰＣＲ）と同等の生物活性を有する、ペプチドを指す。
タンパク質の「ドメイン」とは、タンパク質全体の任意の部分であり、最大、完全タンパク質までを含むが、一般に完全タンパク質よりも少ない部分を含む。ドメインは、タンパク質鎖の残りとは独立して、折りたたむことができるが、折りたたむ必要はなく、および／または特定の生物学的、生化学的、もしくは構造的機能もしくは位置（例えば、リガンド結合ドメイン、または細胞質、膜貫通もしくは細胞外ドメイン）と相関し得る。
宿主細胞中で組換えＤＮＡ技術により作製されたタンパク質に関して、本明細書で使用される「可溶性」とは、水溶液中に存在するタンパク質であり；タンパク質がツインアルギニンシグナルアミノ酸配列を含む場合には、可溶性タンパク質は、グラム陰性菌宿主中で細胞膜周辺腔へ排出されるか、または分泌可能な真核生物宿主細胞により、もしくは適切な遺伝子（例えば、ｋｉｌ遺伝子）を有する細菌宿主により、培地中に分泌される。従って可溶性のタンパク質とは、宿主細胞内部の封入体中には存在しないタンパク質である。あるいは、文脈に応じて、可溶性タンパク質は、細胞膜中に組み込まれた状態では存在しないタンパク質である。これに対して、不溶性タンパク質は、宿主細胞中の細胞質顆粒（封入体と呼ばれる）内部に、変性した形態で存在するタンパク質である。または同じく文脈に応じて、不溶性タンパク質は、限定されないが、細胞質膜、ミトコンドリア膜、葉緑体膜、小胞体膜等を含む細胞膜中に存在するタンパク質である。
著しい量のイオン性界面活性剤（例えば、ＳＤＳ）または変性剤（例えば，尿素、塩酸グアニジン）を含まない水溶液中で「可溶性」である（すなわち、溶解した、または溶解され得る）タンパク質と、溶液内に分散された不溶性タンパク質分子の懸濁液として存在するタンパク質もまた、区別される。「可溶性」タンパク質は、液体媒体中に存在する細胞を除去するために十分な条件を使用した遠心分離（例えば、５，０００×ｇで４〜５分間の遠心分離）により、タンパク質を含む溶液から、除去されない。本発明の組成物のいくつかの実施形態においては、宿主細胞により毒素ペプチドアナログが合成され、細胞の封入体内部で不溶性形態で隔離され、これは次いで、細胞抽出物中の他の細胞成分から、比較的容易に精製することができ、続いて毒素ペプチドアナログを可溶化し、再度折りたたみ、および／またはさらに精製することができる。
「可溶性」タンパク質（すなわち、宿主細胞中で発現される際、可溶性形態で産生されるタンパク質）と、「可溶化された」タンパク質は、区別される。封入体の内部に存在するかまたは細胞膜中に組み込まれた状態で存在する不溶性組換え型タンパク質は、精製された封入体または細胞膜を、塩酸グアニジン、尿素またはドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）等の変性剤で処理することにより、可溶化（すなわち、可溶性の形態にされる）することができる。次いで、回収されたタンパク質の再生（再折り畳み）を可能にするために、これらの変性剤を、可溶化されたタンパク質製剤から、除去しなくてはならない。本発明の組成物は、活性形態に再度折り畳まれ得るが、すべてのタンパク質が、変性剤中での可溶化および変性剤の除去後に、活性構造に再折り畳みするとは限らない。多くのタンパク質が、変性剤の除去時に沈殿する。ＳＤＳは、封入体および細胞膜を可溶化するために使用することができ、溶液中に低濃度でタンパク質を維持する。しかしながら、透析はＳＤＳのすべてを除去するとは限らない（ＳＤＳは透析では除去されないミセルを形成し得る）；従って、ＳＤＳによって可溶化された封入体タンパク質およびＳＤＳによって可溶化された細胞膜タンパク質は、可溶性であるが、再折り畳みしない。
「分泌された」タンパク質とは、分泌シグナルペプチド配列の結果として、小胞体、分泌小胞、または細胞外空間へ誘導され得るタンパク質、および必ずしもシグナル配列を含まずに細胞外空間へ放出されるタンパク質を指す。分泌タンパク質が細胞外空間へ放出された場合、分泌タンパク質は、細胞外プロセシングを経て、「成熟」タンパク質を産生し得る。細胞外空間への放出は、エキソサイトーシスおよびタンパク質切断を含む、多くの機序により発生し得る。本発明の組成物のいくつかの他の実施形態においては、毒素ペプチドアナログを、宿主細胞により、分泌タンパク質として合成することができ、次いでそれを細胞外空間および／または培地から、さらに精製することができる。
「組換え」という用語は、材料（例えば、核酸またはポリペプチド）がヒトの介入により、人工的にまたは合成的に（すなわち、非天然的に）改変されていることを表す。改変は、その天然の環境または状態にある、または天然の環境または状態から取り除かれた材料において、実施することができる。例えば、「組換え核酸」とは、例えば、クローニング、ＤＮＡシャフリング、もしくは、他の公知の分子生物学的操作の間、核酸を組み替えることにより作製されるものである。そのような分子生物学的操作の例は、Maniatis et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. (1982)において見出される。「組換えＤＮＡ分子」とは、そのような分子生物学的技術を用いて連結されたＤＮＡのセグメントから成る。本明細書で使用される「組換えタンパク質」または「組換えポリペプチド」という用語は、組換えＤＮＡ分子を使用して発現されたタンパク質分子を指す。「組換え宿主細胞」とは、組換え核酸を含むおよび／または発現する細胞である。
「ポリヌクレオチド」または「核酸」という用語には、２つ以上のヌクレオチド残基を含む、一本鎖および二本鎖のヌクレオチドポリマーの両方が含まれる。ポリヌクレオチドを含むヌクレオチド残基は、リボヌクレオチドもしくはデオキシリボヌクレオチド、またはどちらかの種類のヌクレオチドの修飾形態であり得る。前記修飾には、塩基修飾、例えばブロモウリジンおよびイノシン誘導体、リボース修飾、例えば２’，３’−ジデオキシリボース、およびヌクレオチド間結合の修飾、例えばホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレノエート、ホスホロジセレノエート、ホスホロアニロチオエート、ホスホラニラデートおよびホスホロアミデートが含まれる。
「オリゴヌクレオチド」という用語は、２００以下のヌクレオチド残基を含むポリヌクレオチドを意味する。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、１０〜６０塩基長である。他の実施形態において、オリゴヌクレオチドは１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０〜４０ヌクレオチド長である。オリゴヌクレオチドは、例えば、変異体遺伝子の構築における使用のための、一本鎖または二本鎖であり得る。オリゴヌクレオチドは、センスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドであり得る。オリゴヌクレオチドは、定量化または検出を容易にするための同位体標識（例えば、１２５Ｉ、１４Ｃ、１３Ｃ、３５Ｓ、３Ｈ、２Ｈ、１３Ｎ、１５Ｎ、１８Ｏ、１７Ｏ等）、検出アッセイのための蛍光標識、ハプテンまたは抗原性標識を含む、標識を含み得る。オリゴヌクレオチドを、例えば、ＰＣＲプライマー、クローニングプライマーまたはハイブリダイゼーションプローブとして、使用することもできる。
本明細書において互換可能に使用される「ポリヌクレオチド配列」または「ヌクレオチド配列」または「核酸配列」とは、文脈に応じて、オリゴヌクレオチド、ＤＮＡおよびＲＮＡ、核酸のものを含むポリヌクレオチド中のヌクレオチド残基の一次配列、またはヌクレオチド残基の一次配列を表す文字列である。いかなる指定されたポリヌクレオチド配列からも、所与の核酸または相補的なポリヌクレオチド配列のいずれかを決定することができる。ゲノムまたは合成起源のＤＮＡまたはＲＮＡが含まれ、これらは一本鎖また二本鎖であり得、センスまたはアンチセンス鎖でもあり得る。特に指定されない限り、本明細書に記載されるあらゆる一本鎖ポリヌクレオチド配列の左端は５’末端であり；二本鎖のポリヌクレオチド配列の左側方向は５’方向と呼ばれる。新生ＲＮＡ転写産物の５’〜３’付加の方向は転写方向と呼ばれ；ＲＮＡ転写物の５’末端に対して５’側にある、ＲＮＡ転写物と同じ配列を有するＤＮＡ鎖上の配列領域は「上流配列」と呼ばれ；ＲＮＡ転写産物の３’末端に対して３’にある、ＲＮＡ転写物と同じ配列を有するＤＮＡ鎖上の配列領域は「下流配列」と呼ばれる。
本明細書において使用される場合、「単離された核酸分子」または「単離された核酸配列」とは、（１）核酸の天然源において通常付随する、少なくとも１つの混入核酸分子から識別されかつ分離された、または（２）目的の核酸の配列を決定できるように、クローン化され、増幅され、タグ付けされ、または別途、バックグラウンド核酸から区別された、のどちらかである、核酸分子である。単離された核酸分子は、天然の形態以外であるかまたは環境以外にある。しかしながら、単離された核酸分子は、通常ポリペプチド（例えば、オリゴペプチドまたは抗体）を発現する細胞中に含まれる核酸分子を含み、ここで、例えば、核酸分子は、天然細胞の染色体上の位置とは異なる、染色体上の位置にある。
本明細書において使用される場合、「をコードする核酸分子」、「をコードするＤＮＡ配列」および「をコードするＤＮＡ」という用語は、デオキシリボ核酸鎖に沿った、デオキシリボヌクレオチドの順序または配列を指す。これらのデオキシリボヌクレオチドの順序は、ｍＲＮＡ鎖に沿ったリボヌクレオチドの順序を決定し、ポリペプチド（タンパク質）鎖に沿ったアミノ酸の順序をも決定する。ＤＮＡ配列はこのようにして、ＲＮＡ配列およびアミノ酸配列をコードする。
「遺伝子」という用語は、生物学的機能に関連するあらゆる核酸を指すために、広義に使用される。遺伝子は一般に、コード配列および／またはそのようなコード配列の発現に必要とされる制御配列を含む。「遺伝子」という用語は、特定のゲノム配列または組換え配列、およびその配列にコードされるｃＤＮＡまたはｍＲＮＡにも適用される。「融合遺伝子」は、天然では一緒に存在しない、またはコードされた融合タンパク質（すなわち、キメラタンパク質）中に存在する同一の配列中に天然では一緒に存在しない、異なるタンパク質由来の部分を含むポリペプチドをコードする、コード領域を含む。遺伝子はまた、例えば、他のタンパク質の認識配列を形成する、非発現性核酸セグメントをも含む。転写因子などの制御タンパク質が結合する、転写制御要素を含む非発現性制御配列は、隣接したまたは近くの配列の転写をもたらす。
「遺伝子の発現」または「核酸の発現」とは、文脈に応じて、ＤＮＡのＲＮＡへの転写（所望により、例えば、スプライシングなどのＲＮＡの修飾を含む）、ＲＮＡのポリペプチドへの翻訳（その後のポリペプチドの翻訳後修飾を含み得る）、または転写および翻訳の両方を意味する。
本明細書で使用される「コード領域」または「コード配列」という用語は、構造遺伝子に関して使用される場合、新生ポリペプチド中に、ｍＲＮＡ分子の翻訳の結果として存在するアミノ酸をコードするヌクレオチド配列を指す。コード領域は、真核生物においては、５’側では、開始メチオニンをコードするヌクレオチド３連子「ＡＴＧ」と隣接し、３’側では、停止コドン（すなわち、ＴＡＡ、ＴＡＧ、ＴＧＡ）を特定する３つの３連子のうちの１つと隣接する。
「制御配列」または「制御シグナル」という用語は、特定の宿主細胞において、それが結合しているコード配列の発現およびプロセシングに影響を与え得るポリヌクレオチド配列を指す。そのような制御配列の性質は、宿主生物に依存し得る。特定の実施形態において、原核生物の制御配列は、プロモーター、リボソーム結合部位、および転写終結配列を含み得る。真核生物の制御配列は、転写因子、転写エンハンサー配列または要素、ポリアデニル化部位、および転写終結配列に対する１つまたは複数の認識部位を含む、プロモーターを含み得る。制御配列は、リーダー配列および／または融合パートナー配列を含み得る。プロモーターおよびエンハンサーは、転写に関わる細胞タンパク質と特異的に相互作用するＤＮＡの短いアレイから成る（Maniatis, et al., Science 236:1237 (1987)）。プロモーターおよびエンハンサー要素は、酵母菌、昆虫および哺乳類の細胞ならびにウイルス（類似する制御要素、すなわち、プロモーターは、原核生物にも存在する）中の遺伝子を含む、種々の真核生物源から単離されている。特定のプロモーターおよびエンハンサーの選択は、目的のタンパク質を発現させるために、どの細胞型が使用されるかに依存する。いくつかの真核性のプロモーターおよびエンハンサーは、広範な宿主を有するが、一方他のものは、限定された細胞型のサブセットにおいて機能する（概要については、Voss, et al., Trends Biochem. Sci., 11:287 (1986) and Maniatis, et al., Science 236:1237 (1987)を参照のこと）。
「ベクター」という用語は、タンパク質コード情報を、宿主細胞中へ移送するために使用される、あらゆる分子または実体（例えば、核酸、プラスミド、バクテリオファージまたはウイルス）を意味する。
本明細書で使用される「発現ベクター」または「発現構築体」という用語は、所望のコード配列、および特定の宿主細胞において、機能的に連結されたコード配列の発現のために必要な適切な核酸制御配列を含む、組換えＤＮＡ分子を指す。発現ベクターは、限定されないが、転写、翻訳に影響を与えるかまたは制御する配列、および、イントロンが存在する場合は、そこに機能的に連結されたコード領域のＲＮＡスプライシングに影響を与える配列を含み得る。原核生物における発現に必要な核酸配列には、プロモーター、所望によりオペレーター配列、リボソーム結合部位、および場合によっては他の配列が含まれる。真核生物の細胞は、プロモーター、エンハンサー、ならびに終結およびポリアデニル化シグナルを利用することが知られている。所望の場合、目的のポリペプチドを細胞からより容易に単離するために、発現されるポリペプチドが組換え宿主細胞により分泌され得るように、分泌シグナルペプチド配列もまた、所望により、目的のコード配列に機能的に連結された発現ベクターによってコードされ得る。そのような技術は、当技術分野において公知である。（例えば、E.g., Goodey, Andrew R.; et al., Peptide and DNA sequences, 米国特許第５，３０２，６９７号；Weiner et al., Compositions and methods for protein secretion, 米国特許第６，０２２，９５２号および同第６，３３５，１７８号；Uemura et al., Protein expression vector and utilization thereof, 米国特許第７，０２９，９０９号；Ruben et al., 27 human secreted proteins, 米国特許出願公開第２００３／０１０４４００Ａ１号）。
本明細書で使用される「機能的な組み合わせで」、「機能的な順番で」および「機能的に連結された」という用語は、所与の遺伝子の転写および／または所望のタンパク質分子の合成を誘導することができる核酸分子が産生されるような方法における、核酸配列の結合を指す。該用語はまた、機能性タンパク質が産生される様態における、アミノ酸配列の結合をも指す。例えば、タンパク質コード配列に「機能的に連結された」ベクター中の制御配列は、タンパク質コード配列の発現が、制御配列の転写活性と適合する条件下で達成されるように、そこに結合している。
「宿主細胞」という用語は、核酸で形質転換されたか、または形質転換され得、それにより目的の遺伝子を発現する細胞を意味する。この用語は、子孫が、最初の親細胞と、形態または遺伝子構造において同一であるか否かに関わらず、目的の遺伝子が存在する限り、親細胞の子孫を含む。多数の入手可能なかつ公知の宿主細胞のうちのいずれをも、この発明の実施のために使用することができる。特定の宿主の選択は、当技術分野で認知されたいくつかの要因に依存する。これらには、例えば、選択された発現ベクターとの適合性、ＤＮＡ分子によりコードされたペプチドの毒性、形質転換の割合、ペプチドの回収容易性、発現特性、生体安全性および費用が含まれる。これらの要因のバランスは、すべての宿主が、特定のＤＮＡ配列の発現において、同等に有効ではないこともあるという理解を持って決定されなければならない。これらの一般的ガイドライン内での、培養における有用な微生物の宿主細胞には、細菌（例えば大腸菌（Escherichia coli）菌種）、酵母菌（例えばサッカロミセス属（Saccharomyces）菌種）および他の真菌細胞、昆虫細胞、植物細胞、哺乳類（ヒトを含む）細胞、例えば、ＣＨＯ細胞およびＨＥＫ−２９３細胞が含まれる。ＤＮＡレベルにおいても、同様に修飾することができる。ペプチドをコードするＤＮＡ配列を、選択された宿主細胞とより適合性のあるコドンへと変化させることができる。大腸菌（E. coli）に関しては、最適化されたコドンが、当技術分野において公知である。コドンを置換して、制限部位を除去するかまたはサイレントな制限部位を含有させることもでき、これは選択された宿主細胞におけるＤＮＡのプロセシングを補助し得る。次に、形質転換された宿主を培養し、精製する。所望の化合物が発現されるように、宿主細胞を従来の発酵条件下で培養することもできる。そのような発酵条件は、当技術分野において公知である。
「トランスフェクション」という用語は、細胞による、外来性または外因性ＤＮＡの取り込みを意味し、外来性ＤＮＡが細胞膜の内部に導入されている場合、細胞は「トランスフェクトされている」。多くのトランスフェクション技術が、当技術分野において公知であり、かつ本明細書に開示される。例えば、Graham et al., 1973, Virology 52:456; Sambrook et al., 2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, supra; Davis et al., 1986, Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier; Chu et al., 1981, Gene 13:197.を参照のこと。このような技術を使用して、１つまたは複数の外来性ＤＮＡ部分を、好適な宿主細胞中に導入することができる。
「形質転換」という用語は、細胞の遺伝的特性における変化を指し、新たなＤＮＡまたはＲＮＡを含むように修飾されている場合、細胞は形質転換されている。例えば、トランスフェクション、形質導入、またはたの技術により新たな遺伝子材料を導入することにより、細胞がその天然の状態から遺伝的に修飾されている場合、細胞は形質転換されている。トランスフェクションまたは形質導入の後、形質転換ＤＮＡは、細胞の染色体中に物理的に統合されることにより、その細胞のＤＮＡと組み変わることもあり、またはエピソーム要素として、複製されることなく一過性に維持されることもあり、またはプラスミドとして独立して複製することもある。細胞は、形質転換ＤＮＡが細胞の分裂とともに複製される場合、「安定に形質転換され」ているとみなされる。
「導入遺伝子」という用語は、哺乳動物または哺乳類の胚の１つまたは複数の細胞中に挿入し得る、宿主からの異なる種に由来する、単離されたヌクレオチド配列を指す。導入遺伝子は、所望により、導入遺伝子の転写および／または発現を、細胞機構とともに、直接的または間接的のどちらかで調節するために機能し得る、他の遺伝要素（例えばプロモーター、ポリＡ配列等）に、機能的に連結され得る。あるいは、またはさらに、導入遺伝子は、哺乳類の細胞または胚の核の染色体ＤＮＡ中への導入遺伝子の統合（例えば、相同組換えにおけるような）を補助するヌクレオチド配列に、結合し得る。導入遺伝子は、哺乳動物の内在性遺伝子材料中の特定のヌクレオチド配列に対して相同または異種のどちらかであるヌクレオチド配列から成り得、またはハイブリッド配列（すなわち、哺乳動物の遺伝子材料に対して、導入遺伝子の１つまたは複数の部分が相同であり、１つまたは複数の部分が異種である）である。導入遺伝子ヌクレオチド配列は、哺乳動物中に内在的に存在するポリペプチドまたはポリペプチドの変異体をコードすることもあり、哺乳動物中に天然には存在しないポリペプチド（すなわち、外来性のポリペプチド）をコードすることもあり、または内在性および外来性のポリペプチドのハイブリッドをコードすることもある。導入遺伝子がプロモーターに機能的に連結されている場合、プロモーターは、哺乳動物および／または導入遺伝子に対して、相同または異種であり得る。あるいは、プロモーターは、内在性および外来性のプロモーター要素のハイブリッドであり得る（エンハンサー、サイレンサー、サプレッサー等）。
ペプチド
組換えＤＮＡおよび／またはＲＮＡに媒介されるタンパク質発現およびタンパク質工学技術、またはペプチドを作製するあらゆる他の方法が、本発明のポリペプチド、例えば、毒素ペプチドアナログおよびその融合タンパク質複合体（例えば、毒素ペプチドアナログおよび免疫グロブリンＦｃ領域、トランスサイレチン、またはヒト血清アルブミンを含む融合タンパク質）の作製に適用可能である。例えば、形質転換された宿主細胞中に、ペプチドを作成することができる。簡単に説明すると、ペプチドをコードする組換えＤＮＡ分子、または構築物を作製する。そのようなＤＮＡ分子を作製する方法は、当技術分野において公知である。例えば、好適な制限酵素を使用して、ペプチドをコードする配列をＤＮＡから切除する。多数の入手可能なかつ公知の宿主細胞のうちのいずれをも、この発明の実施のために使用することができる。特定の宿主の選択は、当技術分野で認知された、いくつかの要因に依存する。これらには、例えば、選択された発現ベクターとの適合性、ＤＮＡ分子によりコードされたペプチドの毒性、形質転換の速度、ペプチド回収の容易性、発現特性、生体安全性および費用が含まれる。これらの要因のバランスは、すべての宿主が、特定のＤＮＡ配列の発現において、同等に有効ではないこともあるという理解を持って決定されなければならない。これらの一般的ガイドライン内での、培養における有用な微生物の宿主細胞には、細菌（例えば大腸菌（Escherichia coli）菌種）、酵母菌（例えばサッカロミセス属（Saccharomyces）菌種）および他の真菌細胞、昆虫細胞、植物細胞、哺乳類（ヒトを含む）細胞、例えば、ＣＨＯ細胞およびＨＥＫ−２９３細胞が含まれる。ＤＮＡレベルにおいても、同様に修飾することができる。ペプチドをコードするＤＮＡ配列を、選択された宿主細胞とより適合性のあるコドンへと変化させることができる。大腸菌（E. coli）に関しては、最適化されたコドンが、当技術分野において公知である。コドンを置換して、制限部位を除去するかまたはサイレントな制限部位を含有させることもでき、これは選択された宿主細胞におけるＤＮＡのプロセシングを補助し得る。次に、形質転換された宿主を培養し、精製する。所望の化合物が発現されるように、宿主細胞を従来の発酵条件下で培養することもできる。そのような発酵条件当技術分野において公知である。さらに、ＤＮＡは所望により、融合タンパク質のコード領域の５’側に、発現された毒素ペプチドアナログに機能的に連結されたシグナルペプチド配列（例えば、分泌シグナルペプチド）を、さらにコードする。薬理学的に活性な本発明の毒素ペプチドアナログに結合した、二量体のＦｃ融合タンパク質（「ペプチボディ」）またはキメラの免疫グロブリン（軽鎖＋重鎖）−Ｆｃヘテロ三量体（「ヘミボディ」）を含む、哺乳類の細胞による本発明の組成物の組換え発現に有用な、適切な組換え方法および例示的なＤＮＡ構築物のさらなる例については、例えば、ともに参照により本明細書にその全体が組み込まれる、Sullivan et al., Toxin peptide Therapeutic Agents, 米国特許出願公開第２００７／００７１７６４号、および国際公開第２００８／０８８４２２号として公開された、Sullivan et al., Toxin peptide Therapeutic Agents,国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０２２８３１号を参照のこと。
本発明のペプチド組成物は、合成方法によっても作製することができる。固相合成は、小分子ペプチドを作製する、最も費用対効果の高い方法であるため、個々のペプチドを作製する好ましい技術である。例えば、公知の固相合成技術には、保護基、リンカー、および固相支持体の使用、ならびに特定の保護および脱保護反応条件、リンカー切断条件、スカベンジャーの使用、および固相ペプチド合成の他の態様が含まれる。好適な技術は、当技術分野において公知である。（例えば、Merrifield (1973), Chem. Polypeptides, pp. 335-61 (Katsoyannis and Panayotis eds.); Merrifield (1963), J. Am. Chem. Soc. 85: 2149; Davis et al. (1985), Biochem. Intl. 10: 394-414; Stewart and Young (1969), Solid Phase Peptide Synthesis; 米国特許第３，９４１，７６３号；Finn et al. (1976), The Proteins (3rd ed.) 2: 105-253; and Erickson et al. (1976), The Proteins (3rd ed.) 2: 257-527; "Protecting Groups in Organic Synthesis," 3rd Edition, T. W. Greene and P. G. M. Wuts, Eds., John Wiley & Sons, Inc., 1999; NovaBiochem Catalog, 2000; "Synthetic Peptides, A User's Guide," G. A. Grant, Ed., W.H. Freeman & Company, New York, N.Y., 1992; "Advanced Chemtech Handbook of Combinatorial & Solid Phase Organic Chemistry," W. D. Bennet, J. W. Christensen, L. K. Hamaker, M. L. Peterson, M. R. Rhodes, and H. H. Saneii, Eds., Advanced Chemtech, 1998; "Principles of Peptide Synthesis, 2nd ed.," M. Bodanszky, Ed., Springer-Verlag, 1993; "The Practice of Peptide Synthesis, 2nd ed.," M. Bodanszky and A. Bodanszky, Eds., Springer-Verlag, 1994; "Protecting Groups," P. J. Kocienski, Ed., Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Germany, 1994; "Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis, A Practical Approach," W. C. Chan and P. D. White, Eds., Oxford Press, 2000, G. B. Fields et al., Synthetic Peptides: A User's Guide, 1990, 77-183）。本発明の組成物を作製するために適用可能な、当技術分野で公知の合成および精製方法のさらなる例については、例えば、ともに参照により本明細書にその全体が組み込まれる、Sullivan et al., Toxin peptide Therapeutic Agents, 米国特許出願公開第２００７／００７１７６４号、および国際公開第２００８／０８８４２２Ａ２号として公開された、Sullivan et al., Toxin peptide Therapeutic Agents,国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０２２８３１号を参照のこと。
本明細書において毒素ペプチドアナログをさらに説明する上で、天然ペプチドおよびタンパク質に一般的に組み込まれている、２０種の「標準」アミノ酸残基の識別を示すために、一文字の略語がしばしば適用される（表２）。そのような一文字の略語は、３文字の略語、または省略されていないアミノ酸の名称と、意味において完全に互換可能である。本明細書で使用される一文字の略語法においては、大文字はＬ−アミノ酸を示し、小文字はＤ−アミノ酸を示す。例えば、略語「Ｒ」はＬ−アルギニンを示し、略語「ｒ」はＤ−アルギニンを示す。
表２。標準アミノ酸の一文字略語。３文字略語はカッコ内に示す。
Figure 2017031157
Figure 2017031157
アミノ酸配列におけるアミノ酸置換は、本明細書において一般に、特定の位置のアミノ酸残基に対する一文字略語、その後、目的の天然配列と相対的な、数字で表したアミノ酸の位置、次いで、置換されたアミノ酸残基の一文字の記号により示される。例えば、「Ｔ３０Ｄ」は、目的の天然配列に対する、アミノ酸位置３０での、アスパラギン酸残基によるスレオニン残基の置換を表している。
組換えにより発現している細胞を使用するタンパク質工学の公知の技術を用いることにより、非標準アミノ酸残基を、本発明の範囲に含まれるペプチドに、組み込むことができる。（例えば、Link et al., Non-canonical アミノ acids in protein engineering, Current Opinion in Biotechnology, 14(6):603-609 (2003)を参照のこと）。「非標準アミノ酸残基」という用語は、天然タンパク質中に一般的に組み込まれている２０種の標準アミノ酸のうちではない、Ｄ型またはＬ型のアミノ酸残基、例えば、β−アミノ酸、ホモアミノ酸、環状アミノ酸および誘導体化した側鎖を有するアミノ酸を指す。例としては、（Ｌ型またはＤ型の）β−アラニン、β−アミノプロピオン酸、ピペリジン酸、アミノカプロン酸、アミノヘプタン酸、アミノピメリン酸、デスモシン、ジアミノピメリン酸、Ｎα−エチルグリシン、Ｎα−エチルアスパラギン、ヒドロキシリジン、ａｌｌｏ−ヒドロキシリジン、イソデスモシン、ａｌｌｏ−イソロイシン、ω−メチルアルギニン、Ｎα−メチルグリシン、Ｎα−メチルイソロイシン、Ｎα−メチルバリン、γ−カルボキシグルタメート、ε−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルリジン、ε−Ｎ−アセチルリジン、Ｏ−ホスホセリン、Ｎα−アセチルセリン、Ｎα−ホルミルメチオニン、３−メチルヒスチジン、５−ヒドロキシリジン、および他の類似のアミノ酸、および以下の表３に記載されるもの、ならびに本明細書に記載されるこれらのうちのいずれかの誘導体化形態が挙げられる。表３は、本発明において有用ないくつかの例示的な非標準アミノ酸残基、および本明細書において一般に使用される関連する略語を含むが、当業者は異なる略語および命名法が、同一の物質に適用可能であり、本明細書において互換可能に使用され得ることを理解するであろう。本明細書に記載されるいくつかのアミノ酸配列は、Ｎ末端のアミノ基を表す、「｛Ｈ｝−」をＮ末端に含み得、および／またはＣ末端のカルボキシ基を表す「−｛遊離酸｝」をＣ末端に含み得る。
表３。本発明における、ペプチド配列中へのアミノ酸の付加、挿入、または置換のための、有用な非標準アミノ酸。表３に記載される略語が、本明細書の別の場所で開示される同一の物質に対する別の略語と異なる場合には、両方の略語が適用可能であると理解される。表３に記載されるアミノ酸は、特に言及しない限り、Ｌ型またはＤ型であり得る。
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
生化学的命名法に関するＵＰＡＣ−ＩＵＢ合同委員会（UPAC-IUB Joint Commission on Bio化学的 Nomenclature）（ＪＣＢＮ）による、アミノ酸およびペプチドの命名法および記号体系（Nomenclature and Symbolism for アミノ Acids and Peptides）は、以下の文書において公開されている：Biochem. J., 1984, 219, 345-373; Eur. J. Biochem., 1984, 138, 9-37; 1985, 152, 1; 1993, 213, 2; Internat. J. Pept. Prot. Res., 1984, 24, following p 84; J. Biol. Chem., 1985, 260, 14-42; Pure Appl. Chem., 1984, 56, 595-624; アミノ Acids and Peptides, 1985, 16, 387-410; Biochemical Nomenclature and Related Documents, 2nd edition, Portland Press, 1992, pages 39-69。
本発明の組成物のペプチドドメインに対する１つまたは複数の有用な修飾には、公知の化学技術により達成される、アミノ酸付加または挿入、アミノ酸欠失、ペプチドトランケーション、アミノ酸置換、および／またはアミノ酸残基の化学的誘導体化が含まれ得る。例えば、このように修飾されたアミノ酸配列には、目的の天然配列のアミノ酸配列と比較して、そこに挿入されたかまたは置換された少なくとも１つのアミノ酸残基が含まれ、そこに挿入されたかまたは置換されたアミノ酸残基は、求核性または求電子性の反応性官能基を含む側鎖を有し、それによりペプチドは、リンカーおよび／または半減期延長部分に共有結合している。本発明において、そのような求核性または求電子性の反応性官能基の有用な例としては、限定されないが、チオール、１級アミン、セレノ、ヒドラジド、アルデヒド、カルボン酸、ケトン、アミノオキシ、マスクされた（保護された）アルデヒド、またはマスクされた（保護された）ケト官能基が挙げられる。求核性の反応性官能基を含む側鎖を有するアミノ酸残基の例としては、限定されないが、リジン残基、ホモリジン、α，β−ジアミノプロピオン酸残基、α，γ−ジアミノ酪酸残基、オルニチン残基、システイン、ホモシステイン、グルタミン酸残基、アスパラギン酸残基、またはセレノシステイン（「ＳｅＣｙｓ」）残基が挙げられる。
アミノ酸残基は、通常、異なる化学的および／または物理的特性に応じて、分類される。「酸性アミノ酸残基」という用語は、酸性基を含む側鎖を有する、Ｄ型またはＬ型のアミノ酸残基を指す。例示的な酸性残基としては、アスパラギン酸およびグルタミン酸残基が挙げられる。「アルキルアミノ酸残基」という用語は、線状、分岐、または環状（プロリン中のアミノ酸アミンに対してを含む）であり得る、Ｃ１−６アルキル側鎖を有するＤ型またはＬ型のアミノ酸残基を指し、ここでＣ１−６アルキルは、Ｃ１−４ハロアルキル、ハロ、シアノ、ニトロ、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒｂ、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲａ、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲａＲａ、−Ｃ（＝ＮＲａ）ＮＲａＲａ、−ＮＲａＣ（＝ＮＲａ）ＮＲａＲａ、−ＯＲａ、−ＯＣ（＝Ｏ）Ｒｂ、−ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲａＲａ、−ＯＣ２−６アルキルＮＲａＲａ、−ＯＣ２−６アルキルＯＲａ、−ＳＲａ、−Ｓ（＝Ｏ）Ｒｂ、−Ｓ（＝Ｏ）２Ｒｂ、−Ｓ（＝Ｏ）２ＮＲａＲａ、−ＮＲａＲａ、−Ｎ（Ｒａ）Ｃ（＝Ｏ）Ｒｂ、−Ｎ（Ｒａ）Ｃ（＝Ｏ）ＯＲｂ、−Ｎ（Ｒａ）Ｃ（＝Ｏ）ＮＲａＲａ、−Ｎ（Ｒａ）Ｃ（＝ＮＲａ）ＮＲａＲａ、−Ｎ（Ｒａ）Ｓ（＝Ｏ）２Ｒｂ、−Ｎ（Ｒａ）Ｓ（＝Ｏ）２ＮＲａＲａ、−ＮＲａＣ２−６アルキルＮＲａＲａおよび−ＮＲａＣ２−６アルキルＯＲａから選択される０、１、２または３個の置換基で置換され；ここでＲａは、それぞれの場合において、独立して、ＨまたはＲｂであり；およびＲｂは、それぞれの場合において、独立して、ハロ、Ｃ１−４ａｌｋ、Ｃ１−３ハロａｌｋ、−ＯＣ１−４ａｌｋ、−ＮＨ２、−ＮＨＣ１−４ａｌｋ、および−Ｎ（Ｃ１−４ａｌｋ）Ｃ１−４アルキルから選択される０、１、２または３個の置換基により置換されたＣ１−６アルキル；または、それらのいずれかのプロトン化型であり、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、セリン、スレオニン、リジン、アルギニン、ヒスチジン、アルパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン、システイン、メチオニン、ヒドロキシプロリン、シクロヘキシルアラニン、ノルロイシン、ノルバリン、２−アミノ酪酸を含むが、その残基がアリールまたは芳香族基を含まない。「芳香族アミノ酸残基」という用語は、芳香族基を含む側鎖を有する、Ｄ型またはＬ型のアミノ酸残基を指す。例示的な芳香族の残基としては、トリプトファン、チロシン、３−（１−ナフチル）アラニン、ヒスチジン、またはフェニルアラニン残基が挙げられる。「塩基性アミノ酸残基」という用語は、塩基性基を含む側鎖を有する、Ｄ型またはＬ型のアミノ酸残基を指す。例示的な塩基性アミノ酸残基としては、ヒスチジン、リジン、ホモリジン、オルニチン、アルギニン、Ｎ−メチル−アルギニン、ω−アミノアルギニン、ω−メチル−アルギニン、１−メチル−ヒスチジン、３−メチル−ヒスチジン、およびホモアルギニン（ｈＲ）残基が挙げられる。「親水性アミノ酸残基」という用語は、極性基を含む側鎖を有する、Ｄ型またはＬ型のアミノ酸残基を指す。例示的な親水性残基としては、システイン、セリン、スレオニン、ヒスチジン、リジン、アスパラギン、アルパラギン酸、グルタミン酸、グルタミン、およびシトルリン（Ｃｉｔ）残基が挙げられる。「親油性アミノ酸残基」という用語は、非荷電の、脂肪族または芳香族基を含む側鎖を有する、Ｄ型またはＬ型のアミノ酸残基を指す。例示的な親油性の側鎖としては、フェニルアラニン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、バリン、トリプトファン、およびチロシンが挙げられる。アラニン（Ａ）は両親媒性であり、親水性または親油性（すなわち、疎水性）残基として作用することができる。従ってアラニンは、「親油性」（すなわち、「疎水性」）残基および「親水性」残基の両方の定義内に含まれる。「非機能性」または「中性」アミノ酸残基という用語は、酸性基、塩基性基または芳香族基を欠く側鎖を有する、Ｄ型またはＬ型のアミノ酸残基を指す。例示的な中性アミノ酸残基としては、メチオニン、グリシン、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、およびノルロイシン（Ｎｌｅ）残基が挙げられる。
毒素ペプチドアナログのさらなる有用な実施形態は、本明細書に開示される毒素ポリペプチドのアミノ酸配列の保存的修飾に起因し得る。保存的修飾により、そのような修飾を行う結合（例えば、ＰＥＧ結合）ペプチドの機能的、物理的、および化学的特徴と類似する特徴を有する、半減期延長部分結合ペプチドが生成される。本明細書に開示される結合毒素ペプチドアナログの、そのような保存的に修飾された形態もまた、本発明の実施形態として意図される。
対照的に、ペプチドの機能的および／または化学的特徴の実質的な修飾は、（ａ）置換領域における分子骨格の構造、例えば、α−ヘリックス構造、（ｂ）標的部位における分子の電荷もしくは疎水性、または（ｃ）分子の大きさ、の維持における影響が有意に異なるアミノ酸配列中の、置換を選択することにより達成され得る。
例えば、「保存的アミノ酸置換」は、その位置のアミノ酸残基の極性または電荷にほとんどまたは全く影響がないように、天然アミノ酸残基を、非天然残基で置換することを含み得る。さらに、ポリペプチド中のいかなる天然残基もまた、「アラニンスキャニング変異誘発」に関して先に記載されている通り、アラニンで置換され得る（例えば、アラニンスキャニング変異誘発について論じている、MacLennan et al., Acta Physiol. Scand. Suppl., 643:55-67 (1998); Sasaki et al., 1998, Adv. Biophys. 35:1-24 (1998)を参照のこと）。
本発明の組成物のいくつかの有用な実施形態において、毒素ペプチドのアミノ酸配列は、目的の天然毒素ペプチド配列、例えば、限定されないが、天然ＧｐＴｘ−１配列（配列番号１）、ＧｐＴｘ−１のペプチドアナログ、または表５Ａ、表５Ｂ、および表３１、もしくは本明細書の他の場所に記載されるアミノ酸配列を有するいずれかの他の毒素ペプチドと比較して、１つまたは複数の方法で修飾されている。１つまたは複数の有用な修飾には、公知の化学技術により達成される、アミノ酸付加または挿入、アミノ酸欠失、ペプチドトランケーション、アミノ酸置換、および／または、アミノ酸残基の化学的誘導体化が含まれ得る。このような修飾は、例えば、強化された効力、選択性、および／またはタンパク分解安定性等の目的のためであり得る。当業者は、このような強化された特性を有するペプチドアナログを設計する技術、例えば、アラニンスキャニング、公知の毒素ペプチド配列を使用するアライメント媒介変異誘発（alignment mediated mutagenesis）に基づく合理的設計、および／または分子モデリングを認識している。
「プロテアーゼ」という用語は、「ペプチダーゼ」と同義である。プロテアーゼは、酵素の２つの群を含み、それらはそれぞれ、タンパク質内の諸ポイントでペプチド結合を切断するエンドペプチダーゼ、およびＮ末端またはＣ末端のどちらかから１つまたは複数のアミノ酸を除去するエキソペプチダーゼである。「プロテイナーゼ」という用語も、エンドペプチダーゼの同義語として使用される。プロテイナーゼの４つの機構的クラスは、セリンプロテイナーゼ、システインプロテイナーゼ、アスパラギン酸プロテイナーゼ、およびメタロプロテイナーゼである。これらの４つの機構的クラスに加えて、触媒機構が未知であるプロテアーゼに対して割り当てられる、酵素命名法のセクションがある。これは、触媒機構が特定されていないことを示す。
切断サブサイト命名法（Cleavage subsite nomenclature）は、ＳｃｈｅｃｈｔｅｒおよびＢｅｒｇｅｒにより作製されたスキームから、一般に採用される。（Schechter I. & Berger A., On the size of the active site in proteases. I. Papain, Biochemical and Biophysical Research Communication, 27:157 (1967); Schechter I. & Berger A., On the active site of proteases. 3. Mapping the active site of Papain; specific inhibitor peptides of papain, Bio化学的 and Biophysical Research Communication, 32:898 (1968)）。このモデルに従うと、切断を経る基質中のアミノ酸残基は、切断された結合からＮ末端方向に、Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３、Ｐ４等と示される。同様に、Ｃ末端方向の残基は、Ｐ１’、Ｐ２’、Ｐ３’、Ｐ４’等と示される。
当業者は、目的のプロテアーゼ結合またはプロテアーゼ切断部位を特定するための種々のツールを認識している。例えば、ＰｅｐｔｉｄｅＣｕｔｔｅｒソフトウェアツールは、スイスバイオインフォマティクス研究所（Swiss Institute of Bioinformatics）（ＳＩＢ；ｗｗｗ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｔｏｏｌｓ／ｐｅｐｔｉｄｅｃｕｔｔｅｒ）のＥｘＰＡＳｙ（Ｅｘｐｅｒｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ）のプロテオミクスサーバーを介して入手可能である。ＰｅｐｔｉｄｅＣｕｔｔｅｒは、ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴおよび／またはＴｒＥＭＢＬデータベースまたはユーザが入力したタンパク質配列から、プロテアーゼ切断部位のタンパク質配列を検索する。単一のプロテアーゼおよび化学品、プロテアーゼおよび化学品の精選物またはリスト全体を使用することができる。酵素名に従ってアルファベット順にグループ分けされるか、またはアミノ酸番号に従って順番にグループ分けされるかのどちらかの、切断部位の表という、異なる形態の結果の出力も利用可能である。出力の第三の選択肢は、切断部位のマップである。マッピングされた配列および切断部位は、ブロックにグループ分けされ、ブロックのサイズは、ユーザが選択することができる。プロテアーゼ切断部位を判定するための、他のツールも公知である。（例えば、Turk, B. et al., Determination of protease cleavage site motifs using mixture-based oriented peptide libraries, Nature Biotechnology, 19:661-667 (2001); Barrett A. et al., Handbook of proteolytic enzymes, Academic Press (1998)）。
セリンプロテイナーゼは、哺乳類のプロテアーゼ酵素、例えばキモトリプシン、トリプシンまたはエラスターゼまたはカリクレインを含む、キモトリプシンファミリーを含む。セリンプロテイナーゼは、基質残基と相互作用する種々の酵素サブサイトにおける、アミノ酸置換と関連した異なる基質特異性を示す。いくつかの酵素は、基質との広範な相互作用部位を有するが、他のものは、Ｐ１基質残基に制限された特異性を有する。
トリプシンは、位置Ｐ１のＲまたはＫで、優先的に切断する。Ｋｅｉｌ（１９９２）により実施された統計的研究は、トリプシン切断の間の、ＡｒｇおよびＬｙｓ結合（すなわち、それぞれ位置Ｐ２およびＰ１’）周囲の残基の負の影響を説明した（Keil, B., Specificity of proteolysis, Springer-Verlag Berlin-Heidelberg-NewYork, 335 (1992)）。位置Ｐ１’のプロリン残基は、通常、トリプシン切断に、強力な負の影響を与える。同様に、Ｐ１’にあるＲおよびＫ、ならびに、位置Ｐ２およびＰ１’にある負に荷電した残基は、阻害をもたらす。
キモトリプシンは、位置Ｐ１のＷ、ＹまたはＦで優先的に切断し（高特異性）、これより低い程度で、位置Ｐ１のＬ、ＭまたはＨ残基で切断する（Keil、1992）。これらの規則に対する例外は、以下のとおりである：Ｗが位置Ｐ１に存在する場合において、ＭまたはＰが同時に位置Ｐ１’に存在する場合、切断は遮断される。さらに、位置Ｐ１’のプロリン残基は、位置Ｐ１に存在するアミノ酸に関わらず、ほぼ完全に切断を遮断する。Ｍ残基が位置Ｐ１に存在する場合、切断は、位置Ｐ１’におけるＹ残基の存在により遮断される。最後に、Ｈが位置Ｐ１に位置する場合、Ｄ、ＭまたはＷ残基の存在もまた切断を遮断する。
膜メタロエンドペプチダーゼ（ＮＥＰ、中性エンドペプチダーゼ、腎臓刷子縁中性プロテイナーゼ、エンケファリナーゼ、ＥＣ３．４．２４．１１）は、疎水性アミノ酸残基のアミノ側で、ペプチドを切断する。（Connelly, JC et al., Neutral Endopeptidase 24.11 in Human Neutrophils: Cleavage of Chemotactic Peptide, PNAS, 82(24):8737-8741 (1985)）。
トロンビンは、位置Ｐ１のＲ残基を優先的に切断する（Keil、1992）。トロンビンの天然基質はフィブリノゲンである。最適な切断部位は、Ｒ残基が位置Ｐ１にあり、Ｇｌｙが位置Ｐ２および位置Ｐ１’にある場合である。同様に、疎水性アミノ酸残基が位置Ｐ４および位置Ｐ３に存在する場合、プロリン残基が位置Ｐ２に、Ｒ残基が位置Ｐ１に、ならびに非酸性アミノ酸残基が位置Ｐ１’および位置Ｐ２’に存在する場合である。その天然基質フィブリノゲンに非常に重要な残基は、Ｐ１０にあるＤ残基である。
カスパーゼは、保存されたアミノ酸配列を有する活性部位を有し、ペプチドをＤ残基後に特異的に切断する、システインプロテアーゼのファミリーである。（Earnshaw WC et al., Mammalian caspases: Structure, activation, substrates, and functions during apoptosis, Annual Review of Biochemistry, 68:383-424 (1999)）。
Ａｒｇ−Ｃプロテイナーゼは、位置Ｐ１のＲ残基で、優先的に切断する。切断の挙動は、位置Ｐ１’の残基によっては、中程度にしか影響されないようである。（Keil、 1992）。Ａｓｐ−Ｎエンドペプチダーゼは、位置Ｐ１’のＤ残基との結合を、特異的に切断する。（Keil、 1992）。
前述の記載は、単なる例示に過ぎず、当業者が本発明を実施する上で除外することに関心を持ち得る、プロテアーゼ結合および／または切断部位に関して、当業者に利用可能な知識を網羅的に羅列したものではない。
所望のアミノ酸置換（保存的または非保存的であるかに関わらず）は、そのような置換が望まれる時に、当業者により決定され得る。例えば、アミノ酸置換を使用して、ペプチド配列の重要な残基を特定するか、または本明細書に記載されるペプチドもしくはビヒクル結合ペプチド分子の親和性を増加もしくは減少させることができる。
天然残基は、共通する側鎖の特性に基づいて、以下のクラスに分類し得る：
１）疎水性：ノルロイシン（ＮｏｒまたはＮｌｅ）、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
２）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；
３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
５）鎖の配向に影響を与える残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；および
６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。
保存的アミノ酸置換は、これらのクラスのうちの１つのメンバーを、同じクラスの別のメンバーと交換することを含み得る。保存的アミノ酸置換は、一般に、生物系における合成ではなく、化学的ペプチド合成により組み込まれる、非天然アミノ酸残基を包含し得る。これらはペプチド模倣体および他の逆転型または反転型のアミノ酸部分を含む。
非保存的置換は、これらのクラスのうちの１つのメンバーを、別のクラスからのメンバーと交換することを含み得る。このような置換された残基を、毒素ペプチドアナログの領域に導入し得る。
ある実施形態に従って、このような変更を実施する上で、アミノ酸の疎水性親水性指標を考慮し得る。各アミノ酸には、その疎水性および電荷特性に基づいて、疎水性親水性指標が割り当てられている。それらは以下の通りである：イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン／シスチン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（−０．４）；スレオニン（−０．７）；セリン（−０．８）；トリプトファン（−０．９）；チロシン（−１．３）；プロリン（−１．６）；ヒスチジン（−３．２）；グルタミン酸（−３．５）；グルタミン（−３．５）；アスパラギン酸（−３．５）；アスパラギン（−３．５）；リジン（−３．９）；およびアルギニン（−４．５）。
相互作用的な生物学的機能をタンパク質に付与する上での、疎水性親水性アミノ酸指標の重要性は、当技術分野で理解されている（例えば、Kyte et al., 1982, J. Mol. Biol. 157:105-131を参照のこと）。あるアミノ酸を、類似する疎水性親水性指標またはスコアを有する他のアミノ酸と置換し、それでもなお類似する生物活性を保持し得ることが知られている。疎水性親水性指標に基づいて変更を行う際、ある実施形態においては、疎水性親水性指標が±２内であるアミノ酸の置換が含まれる。ある実施形態においては、±１内のものが含まれ、およびある実施形態においては、±０．５内のものが含まれる。
特に、それにより作製された生物学的に機能的なタンパク質またはペプチドが、本明細書に開示される免疫学的実施形態における使用のために意図されている場合、同様のアミノ酸の置換を、親水性に基づいて効果的に行うことができるということが、当技術分野において理解される。ある実施形態において、隣接するアミノ酸の親水性により左右される、タンパク質の最大局所平均親水性は、その免疫原性および抗原性、すなわちタンパク質の生物学的特性と相関する。
以下の親水性値が、これらのアミノ酸残基に割り当てられている：アルギニン（＋３．０）；リジン（＋３．０）；アスパラギン酸（＋３．０±１）；グルタミン酸（＋３．０±１）；セリン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）；グルタミン（＋０．２）；グリシン（０）；スレオニン（−０．４）；プロリン（−０．５±１）；アラニン（−０．５）；ヒスチジン（−０．５）；システイン（−１．０）；メチオニン（−１．３）；バリン（−１．５）；ロイシン（−１．８）；イソロイシン（−１．８）；チロシン（−２．３）；フェニルアラニン（−２．５）およびトリプトファン（−３．４）。同様の親水性値に基づいて変更を行う上で、ある実施形態においては、親水性値が±２内であるアミノ酸の置換が含まれ、ある実施形態においては、±１内のものが含まれ、およびある実施形態においては、±０．５内のものが含まれる。親水性に基づいて、一次アミノ酸配列から、エピトープを特定することもできる。これらの領域は、「エピトープコア領域」とも呼ばれる。
保存的置換の例としては、例えばイソロイシン、バリン、ロイシンノルロイシン、アラニン、もしくはメチオニンなどの、１つの非極性（疎水性）アミノ酸残基と別のものとの置換；例えばアルギニンとリジン間、グルタミンとアスパラギン間、グリシンとセリン間の、１つの極性（親水性）アミノ酸残基と別のものとの置換；例えばリジン、アルギニンもしくはヒスチジンなどの、１つの塩基性アミノ酸残基と別のものとの置換；または、例えばアスパラギン酸もしくはグルタミン酸などの、１つの酸性残基と別のものとの置換；が挙げられる。「保存的アミノ酸置換」という用語は、非誘導体化残基のかわりに、化学的に誘導体化された残基の使用も含むが、但し、そのようなポリペプチドが、必要な生理活性を示す場合に限る。本発明において有用であり得る、他の例示的なアミノ酸置換を、以下の表４に示す。
表４。いくつかの有用なアミノ酸置換。
Figure 2017031157
Figure 2017031157
例示として、以下の式：
Ｘａａ １Ｘａａ ２Ｘａａ ３Ｘａａ ４Ｘａａ ５Ｘａａ ６Ｘａａ ７Ｘａａ ８Ｘａａ ９Ｘａａ １０Ｘａａ １１Ｘａａ １２Ｘａａ １３Ｘａａ １４Ａｓｐ１５Ｘａａ １６Ｘａａ １７Ｘａａ １８Ｘａａ １９Ｘａａ ２０Ｘａａ ２１Ｘａａ ２２Ｘａａ ２３Ｘａａ ２４Ｘａａ ２５Ｘａａ ２６Ｘａａ ２７Ｘａａ ２８Ｘａａ ２９Ｘａａ ３０Ｘａａ ３１Ｌｙｓ３２Ｘａａ ３３Ｘａａ ３４Ｘａａ ３５Ｘａａ ３６Ｘａａ ３７Ｘａａ ３８／／配列番号４７５
で表されるアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドを含む組成物またはその薬剤的に許容される塩に関する、本発明の実施形態において、
式中：
Ｘａａ １Ｘａａ ２は存在しないか；またはＸａａ １はいずれかのアミノ酸残基であり、およびＸａａ ２はいずれかのアミノ酸残基であるか；またはＸａａ １は存在せず、およびＸａａ ２はいずれかのアミノ酸残基であり；
Ｘａａ １８ｘがＣｙｓである場合、Ｘａａ ３はＣｙｓであり；または、Ｘａａ １８がＳｅＣｙｓである場合、Ｘａａ ３はＳｅＣｙｓであり；またはＸａａ １８がアルキルアミノ酸残基である場合（例えば、Ｘａａ ３およびＸａａ １８は、独立して、Ａｌａまたは２−Ａｂｕ残基であり得る）、Ｘａａ ３はアルキルアミノ酸残基であり；
Ｘａａ ４は酸性、疎水性、塩基性、または中性親水性のアミノ酸残基であり（例えば、Ｘａａ ４は、Ａｌａ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、ホスホセリン、ホスホチロシン、ガンマ−カルボキシグルタミン酸、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｖａｌ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、ホモリジン、オルニチン、アルギニン、Ｎ−メチル−アルギニン、ω−アミノアルギニン、ω−メチル−アルギニン、１−メチル−ヒスチジン、３−メチル−ヒスチジン、ホモアルギニン、Ｎ−メチル−リジン、Ｎ−ε−メチルリジン、Ｄａｂ、シクロヘキシルグリシン（Ｃｈｇ）、シクロヘキシルアラニン（Ｃｈａ）、グリシン、ノルロイシン、ノルバリン、１−Ｎａｌ、２−Ｎａｌ、４−フェニル−フェニルアラニン（Ｂｉｐ）、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、およびＣｉｔ残基から選択され得る）；
Ｘａａ ５は、Ｇｌｙ、Ａｌａ、疎水性、または塩基性アミノ酸残基であり（例えば、Ｘａａ ５は、Ａｌａ、Ｐｈｅ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｖａｌ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、ホモリジン、オルニチン、アルギニン、Ｎ−メチル−アルギニン、ω−アミノアルギニン、ω−メチル−アルギニン、１−メチル−ヒスチジン、３−メチル−ヒスチジン、ホモアルギニン、Ｎ−メチル−リジン、Ｎ−ε−メチルリジン、Ｄａｂ、グリシン、ノルロイシン、ノルバリン、１−Ｎａｌ、２−Ｎａｌ、１’ＮＭｅ−Ｔｒｐ、シクロヘキシルグリシン（Ｃｈｇ）、シクロヘキシルアラニン（Ｃｈａ）、および４−フェニル−フェニルアラニン（Ｂｉｐ）残基から選択され得る）；
Ｘａａ ６は、Ｇｌｙ、Ａｌａ、２−Ａｂｕ、ノルロイシン（Ｎｌｅ）、ノルバリン（Ｎｖａ）、または疎水性アミノ酸残基であり（例えば、Ｘａａ ６は、Ａｌａ、Ｐｈｅ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｖａｌ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、プロリン、チアプロリン、メチオニン、グリシン、１−Ｎａｌ、２−Ｎａｌ、１’ＮＭｅ−Ｔｒｐ、シクロペンチルグリシン（Ｃｐｇ）、フェニルグリシン、Ｎ−メチルロイシン、Ｎ−メチルフェニルアラニン、Ｎ−メチルバリン、シクロヘキシルグリシン（Ｃｈｇ）、シクロヘキシルアラニン（Ｃｈａ）、２−クロロ−フェニルアラニン、４−クロロ−フェニルアラニン、３，４−ジクロロフェニルアラニン、４−トリフルオロメチル−フェニルアラニン、および４−フェニル−フェニルアラニン（Ｂｉｐ）残基から選択され得る）；
Ｘａａ ７はＧｌｙ、Ａｌａ、芳香族、または疎水性のアミノ酸残基であり（例えば、Ｘａａ ７は、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｐｈｅ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｖａｌ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｒｏ、２−ピリジニルアラニン、ノルロイシン、ノルバリン、１−Ｎａｌ、２−Ｎａｌ、１’ＮＭｅ−Ｔｒｐ、シクロヘキシルグリシン（Ｃｈｇ）、シクロヘキシルアラニン（Ｃｈａ）、２−クロロ−フェニルアラニン、４−クロロ−フェニルアラニン、３，４−ジクロロフェニルアラニン、４−トリフルオロメチル−フェニルアラニン、および４−フェニル−フェニルアラニン（Ｂｉｐ）残基から選択され得る）；
Ｘａａ ８は、塩基性、酸性、または中性親水性アミノ酸残基、またはＡｌａ残基であり（例えば、Ｘａａ ８は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、ホモリジン、オルニチン、アルギニン、Ｎ−メチル−アルギニン、ω−アミノアルギニン、ω−メチル−アルギニン、１−メチル−ヒスチジン、３−メチル−ヒスチジン、ホモアルギニン、Ｎ−メチル−リジン、Ｎ−ε−メチルリジン、Ｄａｂ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｃｉｔ、ホスホセリン、ホスホチロシン、ガンマ−カルボキシグルタミン酸、Ａｓｐ、およびＧｌｕ残基から選択され得る）；
Ｘａａ ９は、塩基性または中性親水性アミノ酸残基であり（例えば、Ｘａａ ９は、Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｍｅｔ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、ホモリジン、オルニチン、アルギニン、Ｎ−メチル−アルギニン、ω−アミノアルギニン、ω−メチル−アルギニン、１−メチル−ヒスチジン、３−メチル−ヒスチジン、ホモアルギニン、Ｎ−メチル−リジン、Ｎ−ε−メチルリジン、Ｄａｂ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、およびＣｉｔ残基から選択され得る）；
Ｘａａ ２４がＣｙｓである場合、Ｘａａ １０は、Ｃｙｓであり；またはＸａａ ２４がＳｅＣｙｓである場合、Ｘａａ １０はＳｅＣｙｓであり；
Ｘａａ １１は、いずれかのアミノ酸残基であり（例えば、Ｘａａ １１は、Ａｌａ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｐｈｅ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、Ｐｒｏ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｒａ、Ａｔｚ、ホモリジン、オルニチン、Ｎ−メチル−アルギニン、ω−アミノアルギニン、ω−メチル−アルギニン、１−メチル−ヒスチジン、３−メチル−ヒスチジン、ホモアルギニン、Ｎ−メチル−リジン、Ｎ−ε−メチルリジン、Ｄａｂ、ノルロイシン、ノルバリン、１−Ｎａｌ、２−Ｎａｌ、シクロヘキシルグリシン（Ｃｈｇ）、シクロヘキシルアラニン（Ｃｈａ）、および４−フェニル−フェニルアラニン（Ｂｉｐ）残基から選択され得る）；
Ｘａａ １２は、Ｐｒｏ、酸性、中性、または疎水性のアミノ酸残基であり（例えば、Ｘａａ １２は、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、セリン、スレオニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グリシン、ノルロイシン、ノルバリン、１−Ｎａｌ、２−Ｎａｌ、１’ＮＭｅ−Ｔｒｐ、Ｃｈａ、および４−フェニル−フェニルアラニン（Ｂｉｐ）、シクロヘキシルグリシン（Ｃｈｇ）、シクロヘキシルアラニン（Ｃｈａ）、アスパラギン、グルタミン、メチオニン、ヒドロキシプロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、およびチロシンから選択され得る）；
Ｘａａ １３は、いずれかのアミノ酸残基であり（例えば、Ｘａａ １３は、Ａｌａ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｐｈｅ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、Ｐｒｏ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｒａ、Ａｔｚ、ホモリジン、オルニチン、Ｎ−メチル−アルギニン、ω−アミノアルギニン、ω−メチル−アルギニン、１−メチル−ヒスチジン、３−メチル−ヒスチジン、ホモアルギニン、Ｎ−メチル−リジン、Ｎ−ε−メチルリジン、Ｄａｂ、ノルロイシン、ノルバリン、１−Ｎａｌ、２−Ｎａｌ、シクロヘキシルグリシン（Ｃｈｇ）、シクロヘキシルアラニン（Ｃｈａ）、および４−フェニル−フェニルアラニン（Ｂｉｐ）残基から選択され得る）；
Ｘａａ １４は、いずれかのアミノ酸残基であり（例えば、Ｘａａ １４は、Ａｌａ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｐｈｅ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、Ｐｒｏ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｒａ、Ａｔｚ、ホモリジン、オルニチン、Ｎ−メチル−アルギニン、ω−アミノアルギニン、ω−メチル−アルギニン、１−メチル−ヒスチジン、３−メチル−ヒスチジン、ホモアルギニン、Ｎ−メチル−リジン、Ｎ−ε−メチルリジン、Ｄａｂ、ノルロイシン、ノルバリン、１−Ｎａｌ、２−Ｎａｌ、シクロヘキシルグリシン（Ｃｈｇ）、シクロヘキシルアラニン（Ｃｈａ）、および４−フェニル−フェニルアラニン（Ｂｉｐ）残基から選択され得る）；
Ｘａａ １６は、塩基性、中性親水性、または酸性のアミノ酸残基、またはＡｌａ残基であり（例えば、Ｘａａ １６は、Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｍｅｔ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ｐｒａ、Ａｔｚ、ホモリジン、オルニチン、アルギニン、Ｎ−メチル−アルギニン、ω−アミノアルギニン、ω−メチル−アルギニン、１−メチル−ヒスチジン、３−メチル−ヒスチジン、ホモアルギニン、Ｎ−メチル−リジン、Ｎ−ε−メチルリジン、Ｄａｂ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｃｉｔ、ホスホセリン、ホスホチロシン、ガンマ−カルボキシグルタミン酸、Ａｓｐ、およびＧｌｕ残基から選択され得る）；
Ｘａａ ３１がＣｙｓである場合、Ｘａａ １７はＣｙｓであり；またはＸａａ ３１がＳｅＣｙｓである場合、Ｘａａ １７はＳｅＣｙｓであり；
Ｘａａ １８は、Ｃｙｓ、ＳｅＣｙｓ、またはアルキルアミノ酸残基であり；
Ｘａａ １９は、いずれかのアミノ酸残基であり（例えば、Ｘａａ １９は、Ａｌａ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｐｈｅ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、Ｐｒｏ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、ホモリジン、オルニチン、Ｎ−メチル−アルギニン、ω−アミノアルギニン、ω−メチル−アルギニン、１−メチル−ヒスチジン、３−メチル−ヒスチジン、ホモアルギニン、Ｎ−メチル−リジン、Ｎ−ε−メチルリジン、Ｄａｂ、ノルロイシン、ノルバリン、１−Ｎａｌ、２−Ｎａｌ、シクロヘキシルグリシン（Ｃｈｇ）、シクロヘキシルアラニン（Ｃｈａ）、および４−フェニル−フェニルアラニン（Ｂｉｐ）残基から選択され得る）；
Ｘａａ ２０は、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、塩基性、または中性親水性残基であり（例えば、Ｘａａ ２０は、Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｍｅｔ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、ホモリジン、オルニチン、アルギニン、Ｎ−メチル−アルギニン、ω−アミノアルギニン、ω−メチル−アルギニン、１−メチル−ヒスチジン、３−メチル−ヒスチジン、ホモアルギニン、Ｎ−メチル−リジン、Ｎ−ε−メチルリジン、Ｄａｂ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、およびＣｉｔ残基から選択され得る）；
Ｘａａ ２１は、塩基性、疎水性、または中性親水性アミノ酸残基であり（例えば、Ｘａａ ２１は、Ａｌａ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｖａｌ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、ホモリジン、オルニチン、アルギニン、Ｎ−メチル−アルギニン、ω−アミノアルギニン、ω−メチル−アルギニン、１−メチル−ヒスチジン、３−メチル−ヒスチジン、ホモアルギニン、Ｎ−メチル−リジン、Ｎ−ε−メチルリジン、Ｄａｂ、シクロヘキシルグリシン（Ｃｈｇ）、シクロヘキシルアラニン（Ｃｈａ）、グリシン、ノルロイシン、ノルバリン、１−Ｎａｌ、２−Ｎａｌ、４−フェニル−フェニルアラニン（Ｂｉｐ）、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、およびＣｉｔ残基から選択され得る）；
Ｘａａ ２２は、疎水性または塩基性アミノ酸残基であり（例えば、Ｘａａ ２２は、Ａｌａ、Ｐｈｅ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｖａｌ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、ホモリジン、オルニチン、アルギニン、Ｎ−メチル−アルギニン、ω−アミノアルギニン、ω−メチル−アルギニン、１−メチル−ヒスチジン、３−メチル−ヒスチジン、ホモアルギニン、Ｎ−メチル−リジン、Ｎ−ε−メチルリジン、Ｄａｂ、グリシン、ノルロイシン、ノルバリン、１−Ｎａｌ、２−Ｎａｌ、１’ＮＭｅ−Ｔｒｐ、シクロヘキシルグリシン（Ｃｈｇ）、シクロヘキシルアラニン（Ｃｈａ）、および４−フェニル−フェニルアラニン（Ｂｉｐ）残基から選択され得る）；
Ｘａａ ２３は、疎水性、塩基性、または中性親水性アミノ酸残基であり（例えば、Ｘａａ ２３は、Ａｌａ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｖａｌ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ｐｒａ、Ａｔｚ、ホモリジン、オルニチン、アルギニン、Ｎ−メチル−アルギニン、ω−アミノアルギニン、ω−メチル−アルギニン、１−メチル−ヒスチジン、３−メチル−ヒスチジン、ホモアルギニン、Ｎ−メチル−リジン、Ｎ−ε−メチルリジン、Ｄａｂ、シクロヘキシルグリシン（Ｃｈｇ）、シクロヘキシルアラニン（Ｃｈａ）、グリシン、ノルロイシン、ノルバリン、１−Ｎａｌ、２−Ｎａｌ、４−フェニル−フェニルアラニン（Ｂｉｐ）、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、およびＣｉｔ残基から選択され得る）；
Ｘａａ ２４は、ＣｙｓまたはＳｅＣｙｓ残基であり；
Ｘａａ ２５は、Ｓｅｒ、Ａｌａ、または中性親水性アミノ酸残基であり（例えば、Ｘａａ ２５は、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、Ｍｅｔ、グリシン、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、およびＣｉｔ残基から選択される）；
Ｘａａ ２６は、Ａｌａ、酸性、塩基性、または中性親水性アミノ酸残基であり（例えば、Ｘａａ ２６は、Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｍｅｔ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、ホモリジン、オルニチン、アルギニン、Ｎ−メチル−アルギニン、ω−アミノアルギニン、ω−メチル−アルギニン、１−メチル−ヒスチジン、３−メチル−ヒスチジン、ホモアルギニン、Ｎ−メチル−リジン、Ｎ−ε−メチルリジン、Ｄａｂ、グリシン、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、ホスホセリン、ホスホチロシン、ガンマ−カルボキシグルタミン酸、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、およびＣｉｔ残基から選択され得る）；
Ｘａａ ２７は、酸性、塩基性、中性親水性、または疎水性の残基であり（例えば、Ｘａａ ２７は、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｓｅｒ、Ｍｅｔ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、ホモリジン、オルニチン、アルギニン、Ｎ−メチル−アルギニン、ω−アミノアルギニン、ω−メチル−アルギニン、１−メチル−ヒスチジン、３−メチル−ヒスチジン、ホモアルギニン、Ｎ−メチル−リジン、Ｎ−ε−メチルリジン、Ｄａｂ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、ホスホセリン、ホスホチロシン、ガンマ−カルボキシグルタミン酸、シクロヘキシルグリシン（Ｃｈｇ）、シクロヘキシルアラニン（Ｃｈａ）、ノルロイシン、ノルバリン、１−Ｎａｌ、２−Ｎａｌ、４−フェニル−フェニルアラニン（Ｂｉｐ）、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、およびＧｌｙ残基から選択され得る）；
Ｘａａ ２８は、芳香族または塩基性アミノ酸残基であり（例えば、Ｘａａ ２８は、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、ホモリジン、オルニチン、アルギニン、Ｎ−メチル−アルギニン、ω−アミノアルギニン、ω−メチル−アルギニン、１−メチル−ヒスチジン、３−メチル−ヒスチジン、ホモアルギニン、Ｎ−メチル−リジン、Ｎ−ε−メチルリジン、Ｄａｂ、１−Ｎａｌ、２−Ｎａｌ、２−ピリジル−アラニン、３−ピリジル−アラニン、４−ピリジル−アラニン、４−ピペリジニル−アラニン、および４−フェニル−フェニルアラニン（Ｂｉｐ）残基から選択され得る）；
Ｘａａ ２９は、酸性、塩基性、または中性親水性アミノ酸残基である（例えば、Ｘａａ ２９は、Ａｌａ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、ホスホセリン、ホスホチロシン、ガンマ−カルボキシグルタミン酸、Ｐｈｅ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｓｎ、Ｐｒｏ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ、Ｐｒａ、Ａｔｚ、ホモリジン、オルニチン、Ｎ−メチル−アルギニン、ω−アミノアルギニン、ω−メチル−アルギニン、１−メチル−ヒスチジン、３−メチル−ヒスチジン、ホモアルギニン、Ｎ−メチル−リジン、Ｎ−ε−メチルリジン、およびＤａｂ残基から選択され得る）。
いくつかの有用な実施形態において、Ｘａａ ２９は、酸性または中性親水性残基であり（例えば、Ａｌａ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、ホスホセリン、ホスホチロシン、またはガンマ−カルボキシグルタミン酸残基［例えば、配列番号１０７１−２７９８］）；
Ｘａａ ３０は、Ｔｒｐ、５−ブロモＴｒｐ、６−ブロモＴｒｐ、５−クロロＴｒｐ、６−クロロＴｒｐ、１−Ｎａｌ、２−Ｎａｌ、またはチオＴｒｐ残基であり；
Ｘａａ ３１は、ＣｙｓまたはＳｅＣｙｓであり；
Ｘａａ ３３は、疎水性または芳香族のアミノ酸残基であり（例えば、Ｘａａ ３３は、Ｐｈｅ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｖａｌ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、ノルロイシン、ノルバリン、１−Ｎａｌ、２−Ｎａｌ、２−ピリジル−アラニン、３−ピリジル−アラニン、４−ピリジル−アラニン、４−ピペリジニル−アラニン、１’ＮＭｅ−Ｔｒｐ、シクロヘキシルグリシン（Ｃｈｇ）、シクロヘキシルアラニン（Ｃｈａ）、２−クロロ−フェニルアラニン、４−クロロ−フェニルアラニン、３，４−ジクロロフェニルアラニン、４−トリフルオロメチル−フェニルアラニン、および４−フェニル−フェニルアラニン（Ｂｉｐ）残基から選択され得る）；
Ｘａａ ３４は、いずれかのアミノ酸残基であり（例えば、Ｘａａ ３４は、Ａｌａ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｐｈｅ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、Ｐｒｏ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｒａ、Ａｔｚ、ホモリジン、オルニチン、Ｎ−メチル−アルギニン、ω−アミノアルギニン、ω−メチル−アルギニン、１−メチル−ヒスチジン、３−メチル−ヒスチジン、ホモアルギニン、Ｎ−メチル−リジン、Ｎ−ε−メチルリジン、Ｄａｂ、ノルロイシン、ノルバリン、１−Ｎａｌ、２−Ｎａｌ、１’ＮＭｅ−Ｔｒｐ、シクロヘキシルグリシン（Ｃｈｇ）、シクロヘキシルアラニン（Ｃｈａ）、２−クロロ−フェニルアラニン、４−クロロ−フェニルアラニン、３，４−ジクロロフェニルアラニン、４−トリフルオロメチル−フェニルアラニン、２−ピリジル−アラニン、３−ピリジル−アラニン、４−カルボキシ−フェニルアラニン、および４−フェニル−フェニルアラニン（Ｂｉｐ）残基から選択され得る）；
Ｘａａ ３５は、疎水性アミノ酸残基であり（例えば、Ｘａａ ３５は、Ｐｈｅ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｖａｌ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、ノルロイシン、ノルバリン、１−Ｎａｌ、２−Ｎａｌ、１’ＮＭｅ−Ｔｒｐ、シクロヘキシルグリシン（Ｃｈｇ）、シクロヘキシルアラニン（Ｃｈａ）、２−クロロ−フェニルアラニン、４−クロロ−フェニルアラニン、３，４−ジクロロフェニルアラニン、４−トリフルオロメチル−フェニルアラニン、および４−フェニル−フェニルアラニン（Ｂｉｐ）残基から選択され得る）；
各Ｘａａ ３６、Ｘａａ ３７、およびＸａａ ３８は、独立して存在しないか、または独立して中性、塩基性、または疎水性アミノ酸残基であり（例えば、各Ｘａａ ３６、Ｘａａ ３７、およびＸａａ ３８はｃ独立して不在であり得るか、または独立して、Ａｌａ、Ｐｈｅ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、Ｐｒｏ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、ホモリジン、オルニチン、Ｎ−メチル−アルギニン、ω−アミノアルギニン、ω−メチル−アルギニン、１−メチル−ヒスチジン、３−メチル−ヒスチジン、ホモアルギニン、Ｎ−メチル−リジン、Ｎ−ε−メチルリジン、Ｄａｂ、ノルロイシン、ノルバリン、１−Ｎａｌ、２−Ｎａｌ、シクロヘキシルグリシン（Ｃｈｇ）、シクロヘキシルアラニン（Ｃｈａ）、および４−フェニル−フェニルアラニン（Ｂｉｐ）残基から選択される）；
およびここで：
Ｘａａ ３およびＸａａ １８がともにＣｙｓ残基である場合、残基Ｘａａ ３および残基Ｘａａ １８間にはジスルフィド結合があり；またはＸａａ ３およびＸａａ １８がともにＳｅＣｙｓ残基の場合、残基Ｘａａ ３および残基Ｘａａ １８間にはジセレニド結合があり；
Ｘａａ １０およびＸａａ ２４がともにＣｙｓ残基である場合、残基Ｘａａ １０および残基Ｘａａ ２４間にはジスルフィド結合があり；またはＸａａ １０およびＸａａ ２４がともにＳｅＣｙｓ残基である場合、残基Ｘａａ １０および残基Ｘａａ ２４間にはジセレニド結合があり；
Ｘａａ １７およびＸａａ ３１がともにＣｙｓ残基である場合、残基Ｘａａ １７および残基Ｘａａ ３１間にはジスルフィド結合があり；またはＸａａ １７およびＸａａ ３１がともにＳｅＣｙｓ残基である場合、残基Ｘａａ １７および残基Ｘａａ ３１間にはジセレニド結合があり；
アミノ末端残基は、所望により、アセチル化、ビオチン化、４−ペンチノイル化、またはＰＥＧ化されており；ならびに
カルボキシ末端残基は、所望により、アミド化されている。そのようなＣ末端でアミド化されたものの、多くの特定の例を、表５Ａおよび表５Ｂに示す。
直上に記載した、本発明の組成物の別の例（配列番号４７５）は、単離されたポリペプチドが、以下の式：
Ｘａａ １Ｘａａ ２Ｃｙｓ３Ｘａａ ４Ｘａａ ５Ａｌａ６Ｘａａ ７Ｘａａ ８Ｘａａ ９Ｃｙｓ１０Ｘａａ １１Ｘａａ １２Ｘａａ １３Ｘａａ １４Ａｓｐ１５Ｘａａ １６Ｃｙｓ１７Ｃｙｓ１８Ｘａａ １９Ｘａａ ２０Ｘａａ ２１Ｘａａ ２２Ｘａａ ２３Ｃｙｓ２４Ｘａａ ２５Ｘａａ ２６Ｘａａ ２７Ｘａａ ２８Ｘａａ ２９Ｘａａ ３０Ｃｙｓ３１Ｌｙｓ３２Ｘａａ ３３Ｘａａ ３４Ｘａａ ３５Ｘａａ ３６Ｘａａ ３７Ｘａａ ３８／／配列番号４７６のアミノ酸配列を含む、組成物であり、および配列番号４７６の可変位置は、配列番号４７５の可変位置に関する直前の段落において、例証されている。特に有用な組成物の実施形態は、配列番号４７５の位置Ｘａａ ６に、Ａｌａ、Ｇｌｙ、２−Ａｂｕ、Ｎｌｅ、またはＮｖａ残基を含み、これらの実施形態のうちのいくつかは、配列番号４７５の位置Ｘａａ ２７にも、Ｇｌｕ残基を有し、例としては［Ａｌａ５、Ｇｌｕ２６］ＧｐＴｘ−１、［Ｇｌｙ５、Ｇｌｕ２６］ＧｐＴｘ−１、［２−Ａｂｕ５、Ｇｌｕ２６］ＧｐＴｘ−１、［Ｎｌｅ５、Ｇｌｕ２６］ＧｐＴｘ−１、または［Ｎｖａ５、Ｇｌｕ２６］ＧｐＴｘ−１ペプチドアナログが挙げられ、これらはまた、所望により、他のアミノ酸位置に追加の置換アミノ酸残基を有し得、ならびに／またはＮ末端および／もしくはＣ末端に追加の残基を有し得る。他の有用な例は、配列番号４７５の位置Ｘａａ ２９または配列番号４７６のＸａａ ２９に、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、またはＧｌｎ残基を含み、配列番号４７５の位置Ｘａａ ２７にはＧｌｕ残基を有するかまたは有さない、例えば、［Ａｌａ５、Ａｓｐ２８］ＧｐＴｘ−１、［Ａｌａ５、Ｇｌｕ２８］ＧｐＴｘ−１、［Ａｌａ５、Ｇｌｎ２８］ＧｐＴｘ−１、［Ａｌａ５、Ｇｌｕ２６、Ａｓｐ２８］ＧｐＴｘ−１、［Ａｌａ５、Ｇｌｕ２６、Ｇｌｕ２８］ＧｐＴｘ−１、［Ａｌａ５、Ｇｌｕ２６、Ｇｌｎ２８］ＧｐＴｘ−１、［Ｇｌｙ５、Ａｓｐ２８］ＧｐＴｘ−１、［Ｇｌｙ５、Ｇｌｕ２８］ＧｐＴｘ−１、［Ｇｌｙ５、Ｇｌｎ２８］ＧｐＴｘ−１、［Ｇｌｙ５、Ｇｌｕ２６、Ａｓｐ２８］ＧｐＴｘ−１、［Ｇｌｙ５、Ｇｌｕ２６、Ｇｌｕ２８］ＧｐＴｘ−１、［Ｇｌｙ５、Ｇｌｕ２６、Ｇｌｎ２８］ＧｐＴｘ−１、［２−Ａｂｕ５、Ａｓｐ２８］ＧｐＴｘ−１、［２−Ａｂｕ５、Ｇｌｕ２８］ＧｐＴｘ−１、［２−Ａｂｕ５、Ｇｌｎ２８］ＧｐＴｘ−１、［２−Ａｂｕ５、Ｇｌｕ２６、Ａｓｐ２８］ＧｐＴｘ−１、［２−Ａｂｕ５、Ｇｌｕ２６、Ｇｌｕ２８］ＧｐＴｘ−１、［２−Ａｂｕ５、Ｇｌｕ２６、Ｇｌｎ２８］ＧｐＴｘ−１、［Ｎｌｅ５、Ａｓｐ２８］ＧｐＴｘ−１、［Ｎｌｅ５、Ｇｌｕ２８］ＧｐＴｘ−１、［Ｎｌｅ５、Ｇｌｎ２８］ＧｐＴｘ−１、［Ｎｌｅ５、Ｇｌｕ２６、Ａｓｐ２８］ＧｐＴｘ−１、［Ｎｌｅ５、Ｇｌｕ２６、Ｇｌｕ２８］ＧｐＴｘ−１、および［Ｎｌｅ５、Ｇｌｕ２６、Ｇｌｎ２８］ＧｐＴｘ−１、［Ｎｖａ５、Ａｓｐ２８］ＧｐＴｘ−１、［Ｎｖａ５、Ｇｌｕ２８］ＧｐＴｘ−１、［Ｎｖａ５、Ｇｌｎ２８］ＧｐＴｘ−１、［Ｎｖａ５、Ｇｌｕ２６、Ａｓｐ２８］ＧｐＴｘ−１、［Ｎｖａ５、Ｇｌｕ２６、Ｇｌｕ２８］ＧｐＴｘ−１、および［Ｎｖａ５、Ｇｌｕ２６、Ｇｌｎ２８］ＧｐＴｘ−１を含む。
配列番号４７５の位置Ｘａａ ６にＡｌａ残基を含むアミノ酸配列を含む、組成物のいくつかの例としては：表５Ａおよび表５Ｂに記載される、配列番号２２、２５２−２６３、４１９−４３９、５１８−５２１、５２４、５２５、５６２−５８０、６０２、６９１、６９２、６９６−７０３、７１５、７２１−７３５、７３７−７４９、７５６、７５７、７６１、７６２、７６４−７７１、７８７−７９６、７９８、８００、８０２、８０３、８０９−８１２、１０２８、１０３０−１０４０、１０４３−１０４７、１０６２−１０６５、１０６８−１０７０、１０８２、１０９６、１１１０、１１２４、１１３５、１１４６、１１５７、１１６５、１１７３、１１８１、１１９２、１２０３、１２１４、１２２２、１２３０、１２３８、１２４９、１２６０、１２７１、１２７９、１２８７、１２９５、１３０６、１３１７、１３２８、１３３６、１３４４、１３５２、１３６０、１３６８、１３７６、１３８４、１３９２、１４００、１４０８、１４１６、１４２４、１４３２、１４４０、１４４８、１４５６、１４６４、１４７２、１４８０、１４８８、１４９６、１５０４、１５１２、１５２０、１５２８、１５３６、１５４４、１５５２、１５６０、１５６８、１５７６、１５８４、１５９２、１６００、１６０８、１６１６、１６２４、１６３２、１６４０、１６５８、１６７２、１６８６、１７００、１７１１、１７２２、１７３３、１７４１、１７４９、１７５７、１７６８、１７７９、１７９０、１７９８、１８０６、１８１４、１８２５、１８３６、１８４７、１８５５、１８６３、１８７１、１８８２、１８９３、１９０４、１９１２、１９２０、１９２８、１９３６、１９４４、１９５２、１９６０、１９６８、１９７６、１９８４、１９９２、２０００、２００８、２０１６、２０２４、２０３２、２０４０、２０４８、２０５６、２０６４、２０７２、２０８０、２０８８、２０９６、２１０４、２１１２、２１２０、２１２８、２１３６、２１４４、２１５２、２１６０、２１６８、２１７６、２１８４、２１９２、２２００、２２０８、２２１６、２２３４、２２４８、２２６２、２２７６、２２８７、２２９８、２３０９、２３１７、２３２５、２３３３、２３４４、２３５５、２３６６、２３７４、２３８２、２３９０、２４０１、２４１２、２４２３、２４３１、２４３９、２４４７、２４５８、２４６９、２４８０、２４８８、２４９６、２５０４、２５１２、２５２０、２５２８、２５３６、２５４４、２５５２、２５６０、２５６８、２５７６、２５８４、２５９２、２６００、２６０８、２６１６、２６２４、２６３２、２６４０、２６４８、２６５６、２６６４、２６７２、２６８０、２６８８、２６９６、２７０４、２７１２、２７２０、２７２８、２７３６、２７４４、２７５２、２７６０、２７６８、２７７６、２７８４、２７９２、２８０８、２８２２、２８３３、２８４４、２８５５、２８６３、２８７１、２８７９、２８９０、２９０１、２９１２、２９２０、２９２８、２９３６、２９４４、２９５２、２９６０、２９６８、２９７６、２９８４、２９９２、３０００、３００８、３０１６、３０２４、３０３２、３０４０、３０４８、３０５６、３０６４、３０７２、および３０８０が挙げられる。他の例は、表５Ａおよび表５Ｂに記載される、配列番号５９７−６０１および８１３−１０２７などの、前述のうちのいずれかのＣ末端に、遊離酸を含む（アミド化されたＣ末端残基ではなく）。
配列番号４７５の位置Ｘａａ ６にＧｌｙ残基を含むアミノ酸配列を含む、組成物のいくつかの例としては：表５Ａおよび表５Ｂに記載される、配列番号２６５、７５１、７５２、７５４、７５５、１０８１、１０９５、１１０９、１１２３、１１３４、１１４５、１１５６、１１６４、１１７２、１１８０、１１９１、１２０２、１２１３、１２２１、１２２９、１２３７、１２４８、１２５９、１２７０、１２７８、１２８６、１２９４、１３０５、１３１６、１３２７、１３３５、１３４３、１３５１、１３５９、１３６７、１３７５、１３８３、１３９１、１３９９、１４０７、１４１５、１４２３、１４３１、１４３９、１４４７、１４５５、１４６３、１４７１、１４７９、１４８７、１４９５、１５０３、１５１１、１５１９、１５２７、１５３５、１５４３、１５５１、１５５９、１５６７、１５７５、１５８３、１５９１、１５９９、１６０７、１６１５、１６２３、１６３１、１６３９、１６５７、１６７１、１６８５、１６９９、１７１０、１７２１、１７３２、１７４０、１７４８、１７５６、１７６７、１７７８、１７８９、１７９７、１８０５、１８１３、１８２４、１８３５、１８４６、１８５４、１８６２、１８７０、１８８１、１８９２、１９０３、１９１１、１９１９、１９２７、１９３５、１９４３、１９５１、１９５９、１９６７、１９７５、１９８３、１９９１、１９９９、２００７、２０１５、２０２３、２０３１、２０３９、２０４７、２０５５、２０６３、２０７１、２０７９、２０８７、２０９５、２１０３、２１１１、２１１９、２１２７、２１３５、２１４３、２１５１、２１５９、２１６７、２１７５、２１８３、２１９１、２１９９、２２０７、２２１５、２２３３、２２４７、２２６１、２２７５、２２８６、２２９７、２３０８、２３１６、２３２４、２３３２、２３４３、２３５４、２３６５、２３７３、２３８１、２３８９、２４００、２４１１、２４２２、２４３０、２４３８、２４４６、２４５７、２４６８、２４７９、２４８７、２４９５、２５０３、２５１１、２５１９、２５２７、２５３５、２５４３、２５５１、２５５９、２５６７、２５７５、２５８３、２５９１、２５９９、２６０７、２６１５、２６２３、２６３１、２６３９、２６４７、２６５５、２６６３、２６７１、２６７９、２６８７、２６９５、２７０３、２７１１、２７１９、２７２７、２７３５、２７４３、２７５１、２７５９、２７６７、２７７５、２７８３、２７９１、２８０７、２８２１、２８３２、２８４３、２８５４、２８６２、２８７０、２８７８、２８８９、２９００、２９１１、２９１９、２９２７、２９３５、２９４３、２９５１、２９５９、２９６７、２９７５、２９８３、２９９１、２９９９、３００７、３０１５、３０２３、３０３１、３０３９、３０４７、３０５５、３０６３、３０７１、および３０７９が挙げられる。
配列番号４７５の位置Ｘａａ ６に２−Ａｂｕ残基を含むアミノ酸配列を含む、組成物のいくつかの例としては：表５Ａおよび表５Ｂに記載される、配列番号６０５、６３６、６４９、７０６、７０７、７１８、７５３、７５８、７９７、７９９、８０１、８０４、８０７、８０８、１０２９、１０４１、１０４２、１０４８、１０６６、１０６７、１０８３、１０９７、１１１１、１１２５、１１３６、１１４７、１１５８、１１６６、１１７４、１１８２、１１９３、１２０４、１２１５、１２２３、１２３１、１２３９、１２５０、１２６１、１２７２、１２８０、１２８８、１２９６、１３０７、１３１８、１３２９、１３３７、１３４５、１３５３、１３６１、１３６９、１３７７、１３８５、１３９３、１４０１、１４０９、１４１７、１４２５、１４３３、１４４１、１４４９、１４５７、１４６５、１４７３、１４８１、１４８９、１４９７、１５０５、１５１３、１５２１、１５２９、１５３７、１５４５、１５５３、１５６１、１５６９、１５７７、１５８５、１５９３、１６０１、１６０９、１６１７、１６２５、１６３３、１６４１、１６５９、１６７３、１６８７、１７０１、１７１２、１７２３、１７３４、１７４２、１７５０、１７５８、１７６９、１７８０、１７９１、１７９９、１８０７、１８１５、１８２６、１８３７、１８４８、１８５６、１８６４、１８７２、１８８３、１８９４、１９０５、１９１３、１９２１、１９２９、１９３７、１９４５、１９５３、１９６１、１９６９、１９７７、１９８５、１９９３、２００１、２００９、２０１７、２０２５、２０３３、２０４１、２０４９、２０５７、２０６５、２０７３、２０８１、２０８９、２０９７、２１０５、２１１３、２１２１、２１２９、２１３７、２１４５、２１５３、２１６１、２１６９、２１７７、２１８５、２１９３、２２０１、２２０９、２２１７、２２３５、２２４９、２２６３、２２７７、２２８８、２２９９、２３１０、２３１８、２３２６、２３３４、２３４５、２３５６、２３６７、２３７５、２３８３、２３９１、２４０２、２４１３、２４２４、２４３２、２４４０、２４４８、２４５９、２４７０、２４８１、２４８９、２４９７、２５０５、２５１３、２５２１、２５２９、２５３７、２５４５、２５５３、２５６１、２５６９、２５７７、２５８５、２５９３、２６０１、２６０９、２６１７、２６２５、２６３３、２６４１、２６４９、２６５７、２６６５、２６７３、２６８１、２６８９、２６９７、２７０５、２７１３、２７２１、２７２９、２７３７、２７４５、２７５３、２７６１、２７６９、２７７７、２７８５、２７９３、２８０９、２８２３、２８３４、２８４５、２８５６、２８６４、２８７２、２８８０、２８９１、２９０２、２９１３、２９２１、２９２９、２９３７、２９４５、２９５３、２９６１、２９６９、２９７７、２９８５、２９９３、３００１、３００９、３０１７、３０２５、３０３３、３０４１、３０４９、３０５７、３０６５、３０７３、および３０８１が挙げられる。
配列番号４７５の位置Ｘａａ ６にＮｌｅ残基を含むアミノ酸配列を含む、組成物のいくつかの例としては：表５Ａおよび表５Ｂに記載される、配列番号６０７、６３８、６５１、１０８５、１０９９、１１１３、１１２７、１１３８、１１４９、１１６０、１１６８、１１７６、１１８４、１１９５、１２０６、１２１７、１２２５、１２３３、１２４１、１２５２、１２６３、１２７４、１２８２、１２９０、１２９８、１３０９、１３２０、１３３１、１３３９、１３４７、１３５５、１３６３、１３７１、１３７９、１３８７、１３９５、１４０３、１４１１、１４１９、１４２７、１４３５、１４４３、１４５１、１４５９、１４６７、１４７５、１４８３、１４９１、１４９９、１５０７、１５１５、１５２３、１５３１、１５３９、１５４７、１５５５、１５６３、１５７１、１５７９、１５８７、１５９５、１６０３、１６１１、１６１９、１６２７、１６３５、１６４３、１６６１、１６７５、１６８９、１７０３、１７１４、１７２５、１７３６、１７４４、１７５２、１７６０、１７７１、１７８２、１７９３、１８０１、１８０９、１８１７、１８２８、１８３９、１８５０、１８５８、１８６６、１８７４、１８８５、１８９６、１９０７、１９１５、１９２３、１９３１、１９３９、１９４７、１９５５、１９６３、１９７１、１９７９、１９８７、１９９５、２００３、２０１１、２０１９、２０２７、２０３５、２０４３、２０５１、２０５９、２０６７、２０７５、２０８３、２０９１、２０９９、２１０７、２１１５、２１２３、２１３１、２１３９、２１４７、２１５５、２１６３、２１７１、２１７９、２１８７、２１９５、２２０３、２２１１、２２１９、２２３７、２２５１、２２６５、２２７９、２２９０、２３０１、２３１２、２３２０、２３２８、２３３６、２３４７、２３５８、２３６９、２３７７、２３８５、２３９３、２４０４、２４１５、２４２６、２４３４、２４４２、２４５０、２４６１、２４７２、２４８３、２４９１、２４９９、２５０７、２５１５、２５２３、２５３１、２５３９、２５４７、２５５５、２５６３、２５７１、２５７９、２５８７、２５９５、２６０３、２６１１、２６１９、２６２７、２６３５、２６４３、２６５１、２６５９、２６６７、２６７５、２６８３、２６９１、２６９９、２７０７、２７１５、２７２３、２７３１、２７３９、２７４７、２７５５、２７６３、２７７１、２７７９、２７８７、２７９５、２８１１、２８２５、２８３６、２８４７、２８５８、２８６６、２８７４、２８８２、２８９３、２９０４、２９１５、２９２３、２９３１、２９３９、２９４７、２９５５、２９６３、２９７１、２９７９、２９８７、２９９５、３００３、３０１１、３０１９、３０２７、３０３５、３０４３、３０５１、３０５９、３０６７、３０７５、および３０８３が挙げられる。
配列番号４７５の位置Ｘａａ ６にＮｖａ残基を含むアミノ酸配列を含む、組成物のいくつかの例としては：表５Ａおよび表５Ｂに記載される、配列番号６０６、６３７、６５０、７０５、７０８、７１７、７５９、７６０、８０５、８０６、１０８４、１０９８、１１１２、１１２６、１１３７、１１４８、１１５９、１１６７、１１７５、１１８３、１１９４、１２０５、１２１６、１２２４、１２３２、１２４０、１２５１、１２６２、１２７３、１２８１、１２８９、１２９７、１３０８、１３１９、１３３０、１３３８、１３４６、１３５４、１３６２、１３７０、１３７８、１３８６、１３９４、１４０２、１４１０、１４１８、１４２６、１４３４、１４４２、１４５０、１４５８、１４６６、１４７４、１４８２、１４９０、１４９８、１５０６、１５１４、１５２２、１５３０、１５３８、１５４６、１５５４、１５６２、１５７０、１５７８、１５８６、１５９４、１６０２、１６１０、１６１８、１６２６、１６３４、１６４２、１６６０、１６７４、１６８８、１７０２、１７１３、１７２４、１７３５、１７４３、１７５１、１７５９、１７７０、１７８１、１７９２、１８００、１８０８、１８１６、１８２７、１８３８、１８４９、１８５７、１８６５、１８７３、１８８４、１８９５、１９０６、１９１４、１９２２、１９３０、１９３８、１９４６、１９５４、１９６２、１９７０、１９７８、１９８６、１９９４、２００２、２０１０、２０１８、２０２６、２０３４、２０４２、２０５０、２０５８、２０６６、２０７４、２０８２、２０９０、２０９８、２１０６、２１１４、２１２２、２１３０、２１３８、２１４６、２１５４、２１６２、２１７０、２１７８、２１８６、２１９４、２２０２、２２１０、２２１８、２２３６、２２５０、２２６４、２２７８、２２８９、２３００、２３１１、２３１９、２３２７、２３３５、２３４６、２３５７、２３６８、２３７６、２３８４、２３９２、２４０３、２４１４、２４２５、２４３３、２４４１、２４４９、２４６０、２４７１、２４８２、２４９０、２４９８、２５０６、２５１４、２５２２、２５３０、２５３８、２５４６、２５５４、２５６２、２５７０、２５７８、２５８６、２５９４、２６０２、２６１０、２６１８、２６２６、２６３４、２６４２、２６５０、２６５８、２６６６、２６７４、２６８２、２６９０、２６９８、２７０６、２７１４、２７２２、２７３０、２７３８、２７４６、２７５４、２７６２、２７７０、２７７８、２７８６、２７９４、２８１０、２８２４、２８３５、２８４６、２８５７、２８６５、２８７３、２８８１、２８９２、２９０３、２９１４、２９２２、２９３０、２９３８、２９４６、２９５４、２９６２、２９７０、２９７８、２９８６、２９９４、３００２、３０１０、３０１８、３０２６、３０３４、３０４２、３０５０、３０５８、３０６６、３０７４、および３０８２が挙げられる。
本発明の組成物の他の例となる実施形態は、表５Ａ、表５Ｂ、および表３１に記載されるアミノ酸配列のうちの１つを有する、ＧｐＴｘ−１の非結合および結合ペプチドアナログである。本発明の単離されたポリペプチドの特定の実施形態は、配列番号３〜１３４、１３６〜３０５、３０７〜３８６、３８８〜４７４、５１５〜５２７、５３２〜５８８、５９０、５９１、５９３〜１０４９、および１０６２〜３０８６以下から選択されるアミノ酸配列、より詳細には、配列番号３〜３０、３２〜７２、７４〜１３４、１３６〜１７８、１８０〜２１１、２１８〜２３９、２４１〜３０５、３０７〜３６３、３６６〜３８６、３８８〜４３２、４３４〜４７４、５１５〜５２７、５３２〜５８８、５９０、５９１、５９３〜７７５、７７７、７７８、７８０〜７８８、７９０〜１０４９、および１０６２〜３０８６から選択されるアミノ酸配列を有するものを含む。本明細書に記載される任意のリンカー部分および薬剤的に許容される、共有結合的に連結された半減期延長部分をさらに含むこれらのうちのいずれも、本発明の範囲に含まれる。これらのポリペプチドのうちのいずれかを含む医薬組成物（共有結合的に連結された半減期延長部分を含むかまたは含まない）、および薬剤的に許容される担体もまた、本発明の範囲に含まれる。
表５Ａ。ＧｐＴｘ−１およびＧｐＴｘ−１ペプチドアナログのアミノ酸配列。｛Ｈ｝−＝Ｎ末端アミノ基；−｛アミド｝＝アミド化されたＣ末端；Ａｃ−＝アセチル化されたＮ末端；−｛遊離酸｝＝カルボキシル化されたＣ末端；｛ビオチン｝−＝ビオチン化されたＮ末端；｛４−Ｐｅｎ｝−＝４−ペンチノイル化されたＮ末端；｛ブロモアセトアミド−ＰＥＧ１１−トリアゾール｝−＝Ｎ末端に共有結合した３−（１−（１−ブロモ−２−オキソ−６，９，１２，１５，１８，２１，２４，２７，３０，３３，３６−ウンデカオキサ−３−アザオクタトリアコンタン−３８−イル）−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４−イル）プロパノイル。
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
表５Ｂ。ＧｐＴｘ−１およびＧｐＴｘ−１ペプチドアナログのアミノ酸配列。−｛アミド｝＝アミド化されたＣ末端。
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
本明細書の上で述べた通り、本発明に従うと、公知の有機化学技術により、本発明の組成物のペプチド部分を、１つまたは複数のアミノ酸残基で、化学的に誘導体化することもできる。「化学的誘導体」または「化学的に誘導体化された」とは、機能性側鎖の反応により、化学的に誘導体化された１つまたは複数の残基を有する、対象のペプチドを指す。そのような誘導体化された分子としては、例えば、遊離アミノ基が誘導体化されて、アミン塩酸塩、ｐ−トルエンスルホニル基、カルボベンゾキシ基、ｔ−ブチルオキシカルボニル基、クロロアセチル基またはホルミル基を形成する分子が挙げられる。遊離カルボキシル基を誘導体化して、塩、メチルもしくはエチルエステル、または他の種類のエステル、またはヒドラジドを形成することもできる。遊離ヒドロキシル基を誘導体化して、Ｏ−アシルまたはＯ−アルキル誘導体を形成することもできる。ヒスチジンのイミダゾール窒素を誘導体化して、Ｎ−ｉｍ−ベンジルヒスチジンを形成することもできる。２０種の標準アミノ酸の、１つまたは複数の天然アミノ酸誘導体を含むペプチドもまた、Ｌ型またはＤ型のどちらであっても、化学的誘導体として含まれる。例えば、プロリンを４−ヒドロキシプロリンで置換することができ；リジンを５−ヒドロキシリジンで置換することができ；ヒスチジンを３−メチルヒスチジンで置換することができ；セリンをホモセリンで置換することができ；リジンをオルニチンですることができる。
いくつかの実施形態において、有用な誘導体化には、ビヒクルとの結合がＮ末端の遊離アミノ基で起こることを防止できるように、ペプチドのアミノ末端が化学的に遮断されているものが含まれる。このような修飾の他の有益な効果、例えば、毒素ペプチドアナログの酵素的タンパク分解に対する感受性の低減などもあり得る。Ｎ末端を、置換アミンにアシル化または修飾することもでき、または別の官能基、例えば芳香族部分（例えば、インドール酸、ベンジル（ＢｚｌまたはＢｎ）、ジベンジル（ＤｉＢｚｌまたはＢｎ２）、またはベンジルオキシカルボニル（ＣｂｚまたはＺ））、Ｎ，Ｎ−ジメチルグリシンまたはクレアチンで誘導体化することもできる。例えば、いくつかの実施形態において、アシル部分、例えば、限定されないが、ホルミル、アセチル（Ａｃ）、プロパノイル、ブタニル、ヘプタニル、ヘキサノイル、オクタノイル、またはノナノイルを、ペプチドのＮ末端に共有結合的に連結することができ、これは、ビヒクルのペプチドへの結合の間の望まれない副反応を予防することができる。他の例示的なＮ末端誘導体基としては、−ＮＲＲ１（−ＮＨ２以外の）、−ＮＲＣ（Ｏ）Ｒ１、−ＮＲＣ（Ｏ）ＯＲ１、−ＮＲＳ（Ｏ）２Ｒ１、−ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨＲ１、スクシンイミド、またはベンジルオキシカルボニル−ＮＨ−（Ｃｂｚ−ＮＨ−）が挙げられ、ここでＲおよびＲ１はそれぞれ独立して水素または低級アルキルであり、ここでフェニル環は、Ｃ１−Ｃ４アルキル、Ｃ１−Ｃ４アルコキシ、クロロ、およびブロモから選択される１〜３個の置換基で置換され得る。
いくつかの実施形態においては、アミノ酸残基間の１つまたは複数のペプチジル［−Ｃ（Ｏ）ＮＲ−］結合を、非ペプチジル結合で置換することができる。例示的な非ペプチジル結合は、−ＣＨ２−カルバメート［−ＣＨ２−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ−］、ホスホネート、−ＣＨ２−スルホンアミド［−ＣＨ２−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ−］、尿素［−ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨ−］、−ＣＨ２−２級アミン、およびアルキル化されたペプチド［−Ｃ（Ｏ）ＮＲ６−］であり、ここでＲ６は低級アルキルである。
いくつかの実施形態においては、１つまたは複数の個々のアミノ酸残基を、誘導体化することができる。以下に例として詳細に説明される通り、種々の誘導体化剤が、選択された側鎖または末端残基と、特異的に反応することが知られている。
リシニル残基およびアミノ末端残基を、リシニル残基の電荷を逆転させる、コハク酸または他のカルボン酸無水物と反応させてもよい。アルファ−アミノ含有残基を誘導体化するための他の好適な試薬としては、イミドエステル、例えばメチルピコリンイミデート；ピリドキサールホスフェート；ピリドキサール；クロロボロヒドリド；トリニトロベンゼンスルホン酸；Ｏ−メチルイソ尿素；２，４ペンタンジオン；およびグリオキシレートとの、トランスアミナーゼ触媒反応が挙げられる。
フェニルグリオキサール、２，３−ブタンジオン、１，２−シクロヘキサンジオン、およびニンヒドリンを含む、いくつかの通常の試薬のうちのいずれか１つまたは組み合わせとの反応により、アルギニル残基を修飾してもよい。アルギニル残基の誘導体化は、グアニジン官能基の高ｐＫａのために、アルカリ性条件において反応を行うことを必要とする。さらに、これらの試薬は、リジン基およびアルギニンイプシロン−アミノ基と、反応し得る。
チロシル残基の特異的修飾は、広く研究されており、特に、芳香族のジアゾニウム化合物またはテトラニトロメタンとの反応により、スペクトル標識をチロシル残基に導入することに関心が置かれている。最も一般的には、Ｎ−アセチルイミジゾールおよびテトラニトロメタンが、それぞれＯ−アセチルチロシル種および３−ニトロ誘導体を形成するために使用される。
カルボキシル側鎖基（アスパルチルまたはグルタミル）は、カルボジイミド（Ｒ’−Ｎ＝Ｃ＝Ｎ−Ｒ’）、例えば１−シクロヘキシル−３−（２−モルホリニル−（４−エチル）カルボジイミドまたは１−エチル−３−（４−アゾニア−４，４−ジメチルペンチル）カルボジイミドとの反応により、選択的に修飾され得る。さらに、アスパルチルおよびグルタミル残基は、アンモニウムイオンとの反応により、アスパラギニルおよびグルタミニル残基に変換され得る。
グルタミニルおよびアスパラギニル残基を、対応するグルタミルおよびアスパルチル残基に、脱アミド化してもよい。あるいは、これらの残基を穏やかな酸性条件下で脱アミド化する。これらの残基のどちらの形態も、本発明の範囲に含まれる。
システイニル残基を、アミノ酸残基または他の部分により置換して、ジスルフィド結合を排除するか、または逆に、架橋結合を安定化させることができる（例えば、Bhatnagar et al., J. Med. Chem., 39:3814-3819 (1996)を参照のこと）。
二官能性物質による誘導体化は、ペプチドまたはそれらの機能的誘導体を、所望の場合、不水溶性の支持マトリックスに架橋結合させるため、または他の巨大分子ビヒクルに架橋結合させるために有用である。一般に使用される架橋剤としては、例えば、１，１−ビス（ジアゾアセチル）−２−フェニルエタン、グルタルアルデヒド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、例えば、４−アジドサリチル酸とのエステル、３，３’−ジチオビス（スクシンイミジルプロピオナート）などのジスクシンイミジルエステルを含むホモ二官能性のイミドエステル、および二官能性のマレイミド、例えばビス−Ｎ−マレイミド−１，８−オクタンが挙げられる。誘導体化物質、例えばメチル−３−［（ｐ−アジドフェニル）ジチオ］プロピオイミデートは、光の存在下で架橋を形成することができる、光活性化可能な中間体をもたらす。あるいは、反応性の不水溶性マトリックス、例えば臭化シアンで活性化された炭水化物および反応性基質（例えば、米国特許第３，９６９，２８７号；同第３，６９１，０１６号；同４，１９５，１２８号；同４，２４７，６４２号；同４，２２９，５３７号；および同４，３３０，４４０号に記載される）が、タンパク質固定化のために用いられる。
他の、可能性のある修飾としては、プロリンおよびリジンのヒドロキシル化、セリルまたはトレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、Ｃｙｓ中の硫黄原子の酸化、リジン、アルギニン、およびヒスチジン側鎖のアルファ−アミノ基のメチル化が挙げられる。Creighton, Proteins: Structure and Molecule Properties (W. H. Freeman & Co., San Francisco), 79-86 (1983)。
上述の誘導体化の例は、網羅的な羅列を意図したものではなく、単に例示を意図したものである。
組成物の作製は、適用可能な場合、好適なタンパク質精製技術も含み得る。本発明の組成物いくつかの実施形態において、定量化または検出をしやすくするため、好適な同位体標識（例えば、１２５Ｉ、１４Ｃ、１３Ｃ、３５Ｓ、３Ｈ、２Ｈ、１３Ｎ、１５Ｎ、１８Ｏ、１７Ｏ等）を含むように、分子を作製することができる。
半減期延長部分。所望により、治療的必要性に適合させるための、分子の薬物動態プロファイルの調節のため、本発明の組成物は、種々の質量および配置の１つまたは複数の半減期延長部分を含み得、その半減期延長部分または複数の部分は、毒素ペプチドアナログに、共有結合的に融合、付着、連結または結合し得る。「半減期延長部分」とは、タンパク質分解もしくは他の活性低減性の化学的修飾によりｉｎ ｖｉｖｏでの分解を防止もしくは緩和し、ｉｎ ｖｉｖｏでの半減期もしくは、例えば限定されないが、吸収速度の増加などの他の薬物動態学的特性を増加させ、毒性を減少させ、免疫原性を減少させ、溶解度を向上させ、目的の標的に関する毒素ペプチドアナログの生物活性および／もしくは標的選択性を増加させ、ならびに／または非結合型の毒素ペプチドアナログと比較して、製造可能性を増加させる、分子を指す。本発明において、半減期延長部分は、薬剤的に許容されるものである。
ｉｎ ｖｉｖｏでの腎臓の濾過によるクリアランスを防ぐために、本発明の組成物が十分な水力学的な大きさを達成するように、半減期延長部分を選択することができる。例えば、実質的に直鎖、分岐鎖（ｂｒ）、または樹枝状形態の重合体高分子である、半減期延長部分を選択することができる。あるいは、本発明の組成物が、ｉｎ ｖｉｖｏで、血清タンパクと結合して複合体を形成するように、およびそのように形成された複合体が実質的に腎臓のクリアランスを回避するように、半減期延長部分を選択することもできる。半減期延長部分は、例えば、脂質；コレステロール基（例えばステロイド）；炭水化物もしくはオリゴ糖；またはサルベージ受容体と結合する、いかなる天然もしくは合成のタンパク質、ポリペプチドもしくはペプチドでもあり得る。
本発明において、使用し得る例となる半減期延長部分としては、免疫グロブリンＦｃ領域、もしくはその部分、または生物学的に好適なポリマーもしくはコポリマー、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）もしくはポリプロピレングリコールなどのポリアルキレングリコール化合物が挙げられる。他の適切なポリアルキレングリコール化合物としては、限定されないが、以下の種類の荷電または中性ポリマーが挙げられる：デキストラン、ポリリジン、コロミン酸または他の炭水化物ベースのポリマー、アミノ酸のポリマー、およびビオチン誘導体。いくつかのモノマー融合タンパク質または結合タンパク質の実施形態においては、好ましくはヒト由来の免疫グロブリンであり、および免疫グロブリンのうちのいずれか、例えば、限定されないが、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４などを含む、免疫グロブリン（軽鎖および重鎖を含む）またはその部分を、半減期延長部分として使用することができる。
本発明において、半減期延長部分の他の例としては、エチレングリコールのコポリマー、プロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ポリ−１，３−ジオキソラン、ポリ−１，３，６−トリオキサン、エチレン無水マレイン酸コポリマー、ポリアミノ酸（例えば、ポリリジンまたはポリオルニチン）、デキストランｎ−ビニルピロリドン、ポリｎ−ビニルピロリドン、プロピレングリコールホモポリマー、プロピレンオキシドポリマー、エチレンオキシドポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール、ポリビニルアルコール、直鎖または分岐グリコシル化鎖、ポリアセタール、長鎖脂肪酸、長鎖疎水性脂肪族基、またはポリシアル酸が挙げられる。（例えば、参照により本明細書にその全体が組み込まれる、ＰｏｌｙＸｅｎ（商標）技術; Gregoriadis et al., Improving the therapeutic efficacy of peptides and proteins: a role for polysialic acids, Intl. J. Pharmaceutics, 300:125-30 (2005)）。
組成物の他の実施形態において、半減期延長部分は、毒素ペプチドアナログのＮ末端に共有結合した、陰イオンに荷電した化学物質であり、その陰イオンに荷電した化学物質としては、限定されないが、ホスホチロシン、ホスホセリン、ｐ−ホスホノ（ジフルオロ−メチル）−フェニルアラニン（Ｐｆｐ）、ｐ−ホスホノ−メチル−フェニルアラニン（Ｐｍｐ），ｐ−ホスファチジル−フェニルアラニン（Ｐｐａ）、またはｐ−ホスホノ−メチルケト−フェニルアラニン（Ｐｋｐ）が挙げられ、これらは毒素ペプチドアナログのＮ末端に、ＡＥＥＡリンカーまたは本明細書に記載の他のリンカーによって、所望より間接的に、共有結合することができる。（Chandy et al., Analogs of ShK toxin and their uses in selective inhibition of Kv1.3 potassium channels, WO 2006/042151 A2; Beeton et al., Targeting effector memory T cells with a selective peptide inhibitor of Kv1.3 channels for therapy of autoimmune diseases, Molec. Pharmacol. 67(4):1369-81 (2005); Pennington et al., Engineering a stable and selective peptide blocker of the Kv1.3 channel in T lymphocytes, Molecular Pharmacology Fast Forward, published January 2, 2009 as doi:10.1124/mol.108.052704 (2009)を参照のこと；これらの参考文献のすべては、参照により本明細書に組み込まれる）。ＡＥＥＡは、２−（２−（２−アミノエトキシ）エトキシ）酢酸（８−アミノ−３，６−ジオキサオクタン酸としても知られる）である。（例えば、Beeton et al., Targeting effector memory T cells with a selective peptide inhibitor of Kv1.3 channels for therapy of autoimmune diseases, Molec. Pharmacol. 67(4):1369-81 (2005)を参照のこと）。
本発明に従うと、半減期延長部分の他の実施形態は、生理学的な温度、ｐＨ、およびイオン強度条件下で、長半減期血清タンパク質に対して結合親和性を有する、ペプチドリガンドまたは小（有機）分子リガンドを含む。例としては、アルブミン結合ペプチドもしくは小分子リガンド、トランスサイレチン結合ペプチドもしくは小分子リガンド、チロキシン結合グロブリン結合ペプチドもしくは小分子リガンド、抗体結合ペプチドもしくは小分子リガンド、または長半減期血清タンパク質に対して親和性を有する別のペプチドもしくは小分子が挙げられる。（例えば、Blaney et al., Method and compositions for increasing the serum half-life of pharmacologically active agents by binding to transthyretin-selective ligands、米国特許第５，７１４，１４２号；Sato et al., Serum albumin binding moieties、米国特許出願公開第ＵＳ２００３／００６９３９５Ａ１号；Jones et al., Pharmaceutical active conjugates、米国特許第６，３４２，２２５号を参照のこと）。「長半減期血清タンパク質」は、いわゆる「担体タンパク質」（例えばアルブミン、トランスフェリンおよびハプトグロビン）、フィブリノゲンおよび他の血液凝固因子、補体成分、免疫グロブリン、酵素阻害剤、例えばアンジオテンシンおよびブラジキニン等の物質の前駆体、ならびに多くの他の種類のタンパク質を含む、哺乳類の血漿中に溶解した何百もの異なるタンパク質のうちの１つである。本発明は、薬剤的に許容される半減期延長部分、例えば、限定されないが、本明細書に記載されるものなどのいかなる単一の種の使用、または、２つ以上の異なる半減期延長部分、例えばＰＥＧおよび免疫グロブリンＦｃ領域もしくはその一部分（例えば、Feige et al., Modified peptides as therapeutic agents、米国特許第６，６６０，８４３号を参照のこと）、例えばＦｃのＣＨ２ドメイン、アルブミン（例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）；例えば、Rosen et al., Albumin fusion proteins、米国特許第６，９２６，８９８号および米国特許出願公開第２００５／００５４０５１号；Bridon et al., Protection of endogenous therapeutic peptides from peptidase activity through conjugation to blood components、米国特許第６，８８７，４７０号を参照のこと）、トランスサイレチン（ＴＴＲ；例えば、Walker et al., Use of transthyretin peptide/protein fusions to increase the serum half-life of pharmacologically active peptides/proteins、米国特許出願公開第２００３／０１９５１５４Ａ１号；同２００３／０１９１０５６Ａ１号を参照のこと）、もしくはチロキシン結合グロブリン（ＴＢＧ）、もしくは、例えば免疫グロブリン（軽鎖＋重鎖）およびＦｃ領域の組みあわせ（ヘテロ三量体の組み合わせ、いわゆる「ヘミボディ」）、例えば参照により本明細書にその全体が組み込まれる、Sullivan et al., Toxin peptide Therapeutic Agents、国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０２２８３１号（国際公開第２００８／０８８４２２号として公開）に記載されるものなど、の組み合わせの使用をも包含する。
毒素ペプチドアナログは、半減期延長部分または複数の部分に、毒素ペプチドのＮ末端および／またはＣ末端を介して複合体化することができ、または、Ｆ１が毒素ペプチドアナログのＮ末端のより近くに結合して、その一次アミノ酸配列に対して介在的に結合することもできる。
特に有用な半減期延長部分としては、免疫グロブリン（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４を含む、ヒト免疫グロブリン）が挙げられる。「免疫グロブリン」という用語は、それぞれが軽鎖（ＬＣ）に共有結合している２つの二量体化した重鎖（ＨＣ）；単一の二量体化していない免疫グロブリン重鎖および共有結合的で連結された軽鎖（ＨＣ＋ＬＣ）；またはキメラ免疫グロブリン（軽鎖＋重鎖）−Ｆｃヘテロ三量体（いわゆる「ヘミボディ」）を含む完全抗体を包含する。図１２Ａ〜Ｎおよび図８８〜９１は、そのような免疫グロブリン毒素ペプチド複合体の、いくつかの異なる実施形態を示す。
本発明のＧｐＴｘ−１ペプチドアナログと、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４アイソタイプのうちのいずれかの組換え免疫グロブリンとの、組換え融合または化学的結合は、薬物動態的半減期を延長するために有用であり得る（例えば、Doellgast et al.、国際公開第２０１０／１０８１５３Ａ２号を参照のこと）。Doellgast et al.,国際公開第２０１０／１０８１５３Ａ２号またはWalker et al.,国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０５２８４１号に開示される担体免疫グロブリンのうちのいずれも、または異なるアイソタイプ定常領域を含むそれらのうちのいずれかのアイソタイプ変換体、または当技術分野で公知の他の担体免疫グロブリンも、本発明の範囲に含まれる半減期延長部分として使用することができる。
ヒトＩｇＧ２重鎖（ＨＣ）定常領域の一例は、以下のアミノ酸配列を有する：
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＮＦＧＴＱＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＴＶＥＲＫＣＣＶＥＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＦＲＶＶＳＶＬＴＶＶＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＴＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＭＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ／／配列番号３０９０。
所望の場合、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４免疫グロブリンアイソタイプについての、他のＩｇＧアイソタイプの定常領域配列が、当技術分野において公知である。一般的に、ヒトＩｇＧ２は、エフェクター機能が望まれない標的に対して使用することができ、ヒトＩｇＧ１は、そのようなエフェクター機能（例えば、抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ））が望まれる状況において、使用することができる。ヒトＩｇＧ３は、比較的短い半減期を有し、ヒトＩｇＧ４は、抗体「半分子」を形成する。ヒトＩｇＧ１には４つの公知のアロタイプが存在する。好ましいアロタイプは、「ｈＩｇＧ１ｚ」と呼ばれ、「ＫＥＥＭ」アロタイプとしても知られる。ヒトＩｇＧ１アロタイプ「ｈＩｇＧ１ｚａ」（ＫＤＥＬ）、「ｈＩｇＧ１ｆ」（ＲＥＥＭ）、および「ｈＩｇＧ１ｆａ」もまた有用であり、すべてがＡＤＣＣエフェクター機能を有すると思われる。
ヒトｈＩｇＧ１ｚ重鎖（ＨＣ）定常領域は、以下のアミノ酸配列を有する：
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ／／配列番号３０９１。
ヒトｈＩｇＧ１ｚａ重鎖（ＨＣ）定常領域は、以下のアミノ酸配列を有する：
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ／／配列番号３０９２。
ヒトｈＩｇＧ１ｆ重鎖（ＨＣ）定常領域は、以下のアミノ酸配列を有する：
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ／／配列番号３０９３。
ヒトｈＩｇＧ１ｆａ重鎖（ＨＣ）定常領域は、以下のアミノ酸配列を有する：
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ／／配列番号３０９４。
ヒト免疫グロブリン軽鎖（ＬＣ）定常領域配列の一例は以下である（「ＣＬ−１」と命名する）：
ＧＱＰＫＡＮＰＴＶＴＬＦＰＰＳＳＥＥＬＱＡＮＫＡＴＬＶＣＬＩＳＤＦＹＰＧＡＶＴＶＡＷＫＡＤＧＳＰＶＫＡＧＶＥＴＴＫＰＳＫＱＳＮＮＫＹＡＡＳＳＹＬＳＬＴＰＥＱＷＫＳＨＲＳＹＳＣＱＶＴＨＥＧＳＴＶＥＫＴＶＡＰＴＥＣＳ／／配列番号３０９５。
ＣＬ−１は、抗体のｐＩを増加するために有用であり、便利である。「ＣＬ−２」、「ＣＬ−３」および「ＣＬ−７」と命名された、３つの他のヒト免疫グロブリン軽鎖定常領域があり、これらもまた、本発明の範囲内で使用することができる。ＣＬ−２およびＣＬ−３は、ヒト集団において、より一般的である。
ＣＬ−２ヒト軽鎖（ＬＣ）定常領域は、以下のアミノ酸配列を有する：
ＧＱＰＫＡＡＰＳＶＴＬＦＰＰＳＳＥＥＬＱＡＮＫＡＴＬＶＣＬＩＳＤＦＹＰＧＡＶＴＶＡＷＫＡＤＳＳＰＶＫＡＧＶＥＴＴＴＰＳＫＱＳＮＮＫＹＡＡＳＳＹＬＳＬＴＰＥＱＷＫＳＨＲＳＹＳＣＱＶＴＨＥＧＳＴＶＥＫＴＶＡＰＴＥＣＳ／／配列番号３０９６。
ＣＬ−３ヒトＬＣ定常領域は、以下のアミノ酸配列を有する：
ＧＱＰＫＡＡＰＳＶＴＬＦＰＰＳＳＥＥＬＱＡＮＫＡＴＬＶＣＬＩＳＤＦＹＰＧＡＶＴＶＡＷＫＡＤＳＳＰＶＫＡＧＶＥＴＴＴＰＳＫＱＳＮＮＫＹＡＡＳＳＹＬＳＬＴＰＥＱＷＫＳＨＫＳＹＳＣＱＶＴＨＥＧＳＴＶＥＫＴＶＡＰＴＥＣＳ／／配列番号３０９７。
ＣＬ−７ヒトＬＣ定常領域は、以下のアミノ酸配列を有する：
ＧＱＰＫＡＡＰＳＶＴＬＦＰＰＳＳＥＥＬＱＡＮＫＡＴＬＶＣＬＶＳＤＦＹＰＧＡＶＴＶＡＷＫＡＤＧＳＰＶＫＶＧＶＥＴＴＫＰＳＫＱＳＮＮＫＹＡＡＳＳＹＬＳＬＴＰＥＱＷＫＳＨＲＳＹＳＣＲＶＴＨＥＧＳＴＶＥＫＴＶＡＰＡＥＣＳ／／配列番号３０９８。
免疫グロブリン鎖の可変領域は、一般的に、同じ全体構造を示し、しばしば「相補性決定領域」またはＣＤＲと呼ばれる３つの超可変領域により連結された、比較的保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）を含む。上述の各重鎖／軽鎖対の２つの鎖由来のＣＤＲは、一般にフレームワーク領域によって整列され、存在する場合は、標的タンパク質上の特異的なエピトープまたはドメインと特異的に結合する構造を形成する。一般に、天然の軽鎖および重鎖可変領域はともに、Ｎ末端からＣ末端に向かって、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３およびＦＲ４、という要素の順番と一致する。これらのドメインのそれぞれにおいて位置を占めるアミノ酸に対して、番号を割り当てるための付番方式が考案されている。この付番方式はKabat Sequences of Proteins of Immunological Interest (1987 and 1991、NIH、Bethesda、MD)、またはChothia & Lesk, 1987, J. Mol. Biol. 196:901-917; Chothia et al., 1989, Nature 342:878-883において定義されている。
「抗体」、または互換的に「Ａｂ」は、四量体の糖タンパク質である。天然の抗体において、各四量体は、２つの同一のポリペプチド鎖対から成り、各対が、約２２０個のアミノ酸（約２５ｋＤａ）から成る１つの「軽」鎖および約４４０個のアミノ酸（約５０〜７０ｋＤａ）から成る１つの「重」鎖を有する。各鎖のアミノ末端部分は、主に抗原認識を担う、約１００〜１１０個以上のアミノ酸から成る「可変」（「Ｖ」）領域を含む。各鎖のカルボキシ末端部分は、主にエフェクター機能を担う定常領域を規定する。可変領域は、異なる抗体間で異なり、定常領域は、異なる抗体間で同一である。各重鎖または軽鎖の可変領域内には、抗原に対する抗体の特異性の決定を補助する、３つの超可変小領域が存在する。超可変領域間の可変領域残基はフレームワーク残基と呼ばれ、一般的に、異なる抗体間でも、いくらか相同である。免疫グロブリンは、それらの重鎖定常領域のアミノ酸配列に応じて、異なるクラスに分類し得る。ヒト軽鎖は、カッパ（κ）およびラムダ（λ）軽鎖に分類される。軽鎖および重鎖内で、可変および定常領域は、約１２個以上のアミノ酸から成る「Ｊ」領域により連結されており、重鎖は、約１０個以上のアミノ酸から成る「Ｄ」領域も含む。一般的に、Fundamental Immunology, Ch. 7 (Paul, W., ed., 2nd ed. Raven Press, N.Y. (1989)）を参照の事。本発明の範囲において、「抗体」は、組換えにより作成された抗体、およびグリコシル化を欠く抗体をも包含する。
「軽鎖」または「免疫グロブリン軽鎖」という用語には、完全長の軽鎖、および結合特異性を与えるのに十分な可変領域配列を有するその断片が含まれる。完全長の軽鎖には、可変領域ドメイン、ＶＬ、および定常領域ドメイン、ＣＬが含まれる。軽鎖の可変領域ドメインは、ポリペプチドのアミノ末端にある。軽鎖には、カッパ鎖およびラムダ鎖が含まれる。「重鎖」または「免疫グロブリン重鎖」という用語には、完全長の重鎖、および結合特異性を与えるのに十分な可変領域配列を有するその断片が含まれる。完全長の重鎖には、可変領域ドメイン、ＶＨ、ならびに３つの定常領域ドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３が含まれる。ＶＨドメインは、ポリペプチドのアミノ末端にあり、ＣＨドメインはカルボキシル末端にあり、ポリペプチドのカルボキシ末端に最も近いところにあるのはＣＨ３である。重鎖は、ミュー（μ）、デルタ（Δ）、ガンマ（γ）、アルファ（α）、およびイプシロン（ε）に分類され、抗体のアイソタイプを、それぞれＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、およびＩｇＥとして規定する。本発明の別個の実施形態において、重鎖はＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４サブタイプを含む）、ＩｇＡ（ＩｇＡ１およびＩｇＡ２サブタイプを含む）、ＩｇＭおよびＩｇＥを含む、いずれのアイソタイプのものであり得る。これらのうちのいくつかは、サブクラスまたはアイソタイプ、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２に、さらに分類され得る。各軽鎖／重鎖対の可変領域は、一般に抗体の抗原結合部位を形成するが、有用な担体抗体は、有用であるために、公知の抗原結合部位を有する必要はない（例えば、Doellgast et al.,国際公開第２０１０／１０８１５３Ａ２号；Walker et al. ,国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０５２８４１号を参照のこと）。異なるＩｇＧアイソタイプは、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）および補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）などの、異なるエフェクター機能（Ｆｃ領域をに媒介される）を有し得る。ＡＤＣＣにおいて、抗体のＦｃ領域は、免疫エフェクター細胞、例えばナチュラルキラー細胞およびマクロファージの表面のＦｃ受容体（ＦｃγＲ）に結合し、標的細胞の食作用または溶解をもたらす。ＣＤＣにおいては、細胞表面で補体カスケードを引き起こすことにより、抗体が標的細胞を死滅させる。
「Ｆｃ領域」、または本明細書において互換可能に使用される、「Ｆｃドメイン」または「免疫グロブリンＦｃ領域」は、完全抗体においては抗体のＣＨ１およびＣＨ２ドメインを含む、２つの重鎖断片を含む。２つの重鎖断片は、２つ以上のジスルフィド結合により、およびＣＨ３ドメインの疎水性の相互作用により、連結されている。
「サルベージ受容体結合エピトープ」という用語は、ＩｇＧ分子（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４）のｉｎ ｖｉｖｏでの血清半減期の増加を担う、ＩｇＧ分子のＦｃ領域のエピトープを指す。
「アロタイプ」とは、多くは定常領域における、抗体配列の変形であり、それはヒトにおいて免疫原性であり得、特異的対立遺伝子によりコードされる。アロタイプは、ヒトＩＧＨＣ遺伝子の５つ、ＩＧＨＧ１、ＩＧＨＧ２、ＩＧＨＧ３、ＩＧＨＡ２およびＩＧＨＥ遺伝子において特定されており、それぞれＧ１ｍ、Ｇ２ｍ、Ｇ３ｍ、Ａ２ｍ、およびＥｍアロタイプと命名されている。少なくとも１８個のＧｍアロタイプが知られている：ｎＧ１ｍ（１）、ｎＧ１ｍ（２）、Ｇ１ｍ（１、２、３、１７）またはＧ１ｍ（ａ、ｘ、ｆ、ｚ）、Ｇ２ｍ（２３）またはＧ２ｍ（ｎ）、Ｇ３ｍ（５、６、１０、１１、１３、１４、１５、１６、２１、２４、２６、２７、２８）またはＧ３ｍ（ｂ１、ｃ３、ｂ５、ｂ０、ｂ３、ｂ４、ｓ、ｔ、ｇ１、ｃ５、ｕ、ｖ、ｇ５）。２つのＡ２ｍアロタイプ、Ａ２ｍ（１）およびＡ２ｍ（２）が存在する。
抗体の構造および生成の詳細な説明に関しては、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Roth, D.B., and Craig, N.L., Cell, 94:411-414 (1998)を参照のこと。簡単に説明すると、重鎖および軽鎖免疫グロブリン配列をコードするＤＮＡを精製するプロセスは、発達中のＢ細胞において生じる。種々の免疫グロブリン遺伝子セグメントの再編成および連結の前、Ｖ、Ｄ、Ｊおよび定常（Ｃ）遺伝子セグメントは、一般的に、単一の染色体上に比較的近接して存在する。Ｂ細胞の分化の間、Ｖ、Ｄ、Ｊ（または、軽鎖遺伝子の場合はＶおよびＪのみ）遺伝子セグメントの適切なファミリーメンバーそれぞれのうちの１つが組み替えられて、重鎖および軽鎖免疫グロブリン遺伝子の、機能的に再編成された可変領域を形成する。この遺伝子セグメントの再編成プロセスは、順次的であると思われる。最初に、重鎖Ｄ−Ｊ結合が作成され、その後重鎖Ｖ−ＤＪ結合および軽鎖Ｖ−Ｊ結合が作成される。Ｖ、ＤおよびＪセグメントの再編成に加えて、軽鎖のＶおよびＪセグメントが連結されている場所、および重鎖のＤおよびＪセグメントが連結されている場所での可変的組み替えにより、免疫グロブリン重鎖および軽鎖の一次レパートリーに、さらなる多様性が生じる。軽鎖におけるこのような差異は、一般にＶ遺伝子セグメントの最終コドンおよびＪセグメントの第１コドン内で生じる。結合における同様の不正確さが、重鎖染色体上ではＤおよびＪＨセグメント間で生じ、１０ヌクレオチドほどに及ぶことがある。さらに、ゲノムＤＮＡによってコードされないいくつかのヌクレオチドが、ＤとＪＨおよびＶＨとＤ遺伝子セグメント間に挿入され得る。これらのヌクレオチドの付加は、Ｎ領域多様性として知られる。可変領域遺伝子セグメントにおけるこのような再編成およびこのような結合の間に生じ得る可変的組み替えの最終的な効果は、一次抗体レパートリーの産生である。
「超可変」領域という用語は、抗原結合を担う抗体のアミノ酸残基を指す。超可変領域は、相補性決定領域またはＣＤＲ由来のアミノ酸残基［すなわち、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)に記載される、軽鎖可変領域の残基２４〜３４（Ｌ１）、５０〜５６（Ｌ２）および８９〜９７（Ｌ３）ならびに重鎖可変領域の残基３１〜３５（Ｈ１）、５０〜６５（Ｈ２）および９５〜１０２（Ｈ３）］を含む。単一のＣＤＲでさえ、すべてのＣＤＲを含む完全な抗原結合部位よりもより低い親和性でではあるが、抗原を認識しかつ抗原と結合し得る。
超可変「ループ」由来の残基の代替の定義は、軽鎖可変領域中の残基２６〜３２（Ｌ１）、５０〜５２（Ｌ２）および９１〜９６（Ｌ３）ならびに重鎖可変領域中の残基２６〜３２（Ｈ１）、５３〜５５（Ｈ２）および９６〜１０１（Ｈ３）として、Chothia et al.、J. Mol.Biol. 196: 901-917 (1987)に、記載されている。
「フレームワーク」または「ＦＲ」残基とは、超可変領域残基以外の、可変領域残基である。
「抗体断片」は、インタクトな完全長の抗体の一部、好ましくはインタクトな抗体の抗原結合領域または可変領域を含む。抗体断片の例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖ断片；ダイアボディ；線状抗体（Zapata et al., Protein Eng.,8(10):1057-1062 (1995)）；単鎖抗体分子；および抗体断片から形成された多重特異性抗体が挙げられる。
抗体のパパイン消化は、それぞれが単一の抗原結合部位を有する、「Ｆａｂ」断片とよばれる２つの同一の抗原結合性断片と、定常領域を含む残りの「Ｆｃ」断片を産生する。Ｆａｂ断片は可変領域のすべて、ならびに軽鎖の定常領域および重鎖の第１定常領域（ＣＨ１）を含む。Ｆｃ断片は、炭水化物を提示し、かつ１つのクラスの抗体を別のクラスのものと識別する、多くの抗体エフェクター機能（補体および細胞受容体との結合など）を担う。
ペプシン処理は、抗体のＶＨおよびＶＬドメイン（これらのドメインは、単一のポリペプチド鎖中に存在する）を含む、２つの「単鎖Ｆｖ」または「ｓｃＦｖ」抗体断片を有する、Ｆ（ａｂ’）２断片をもたらす。Ｆａｂ断片は、抗体ヒンジ領域由来の１つまたは複数のシステインを含む重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端に、少数の付加的残基の含有することにより、Ｆａｂ’断片と異なる。Ｆｖポリペプチドは、Ｆｖが抗原結合のための所望の構造の形成することを可能にするポリペプチドリンカーを、ＶＨおよびＶＬドメイン間にさらに含むことが好ましい。ｓｃＦｖの概説については、Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. l 13, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)を参照のこと。
「Ｆａｂ断片」は、１つの軽鎖ならびに１つの重鎖のＣＨ１および可変領域から成る。Ｆａｂ分子の重鎖は、別の重鎖分子とジスルフィド結合を形成することができない。
「Ｆａｂ’断片」は、２つのＦａｂ’断片の２つの重鎖間に鎖間ジスルフィド結合が形成され、Ｆ（ａｂ’）２分子を形成し得るように、１つの軽鎖、ならびにＶＨドメインおよびＣＨ１ドメイン、さらにＣＨ１およびＣＨ２ドメイン間の領域をも含む１つの重鎖の一部を含む。
「Ｆ（ａｂ’）２断片」は、２つの重鎖間に鎖間ジスルフィド結合が形成されるように、２つの軽鎖、ならびにＣＨ１およびＣＨ２ドメイン間の定常領域の一部を含む２つの重鎖を含む。従ってＦ（ａｂ’）２断片は、２つの重鎖間のジスルフィド結合により連結されている、２つのＦａｂ’断片から成る。
「Ｆｖ」は、完全な抗原認識部位および結合部位を含む最小の抗体断片である。この領域は、密接に非共有結合した、１つの重鎖および１つの軽鎖の可変領域の二量体から成る。各可変領域の３つのＣＤＲが相互作用して、ＶＨ−ＶＬ二量体の表面上の抗原結合部位を規定するのは、この配置においてである。単一の可変領域（または抗原に対して特異的な３つのＣＤＲのみを含むＦｖの半分）は、完全な結合部位よりもより低い親和性においてではあるが、抗原を認識しかつ結合する能力を有する。
「単鎖抗体」は、重鎖および軽鎖可変領域が、可動性リンカーにより連結されて、単一のポリペプチド鎖を形成し、それが抗原結合性領域を形成する、Ｆｖ分子である。単鎖抗体は、その開示が参照によりその全体が組み込まれる、国際特許出願公開第ＷＯ８８／０１６４９号および米国特許第４，９４６，７７８号および同５，２６０，２０３号に、詳細に記載されている。
「単鎖Ｆｖ」または「ｓｃＦｖ」抗体断片は、抗体のＶＨおよびＶＬドメインを含み、ここでこれらのドメインは単一のポリペプチド鎖中に存在し、所望により、Ｆｖが抗原結合のための所望の構造を形成することを可能にするポリペプチドリンカーを、ＶＨおよびＶＬドメイン間に含む（Bird et al., Science 242:423-426, 1988, and Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883, 1988）。「Ｆｄ」断片は、ＶＨおよびＣＨ１ドメインから成る。
「ダイアボディ」という用語は、２つの抗原結合部位を有する小さな抗体断片を指し、その断片は、同一のポリペプチド鎖（ＶＨ ＶＬ）の軽鎖可変領域（ＶＬ）に連結された重鎖可変領域（ＶＨ）を含む。同一鎖上の２つのドメイン間の対形成を可能にするには短すぎるリンカーを使用することにより、ドメインは、もう１つの鎖の相補的ドメインと強制的に対になり、２つの抗原結合部位を形成する。ダイアボディは、例えば、欧州特許第４０４，０９７号；国際公開第９３／１１１６１号；および、Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)に、より詳細に記載されている。
「ドメイン抗体」とは、重鎖の可変領域または軽鎖の可変領域のみを含む、免疫学的に機能的な免疫グロブリン断片である。いくつかの場合においては、２つ以上のＶＨ領域が、ペプチドリンカーで共有結合的に連結されて、二価のドメイン抗体を形成する。二価のドメイン抗体の２つのＶＨ領域は、同一または異なる抗原を標的とし得る。
「エピトープ」という用語は、抗原結合タンパク質（例えば、抗体）が結合する、分子の部分のことである。この用語は、抗体またはＴ細胞受容体などの、抗原結合タンパク質に特異的に結合することができるいかなる決定因子をも含む。エピトープは隣接していてもいなくてもよい（例えば、単鎖ポリペプチドにおいて、ポリペプチド配列中で互いに隣接していないが、分子の構成においては抗原結合タンパク質が結合しているアミノ酸残基）。ある実施形態において、抗原結合タンパク質を生成するために使用されるエピトープと類似する３次元構造を含むが、抗原結合タンパク質を生成するために使用されるそのエピトープに存在するアミノ酸残基を全く含まないかまたは一部しか含まない、という点において、エピトープは模倣体であり得る。ほとんどの場合、エピトープはタンパク質上に存在するが、いくつかの例においては、例えば核酸などの他の種類の分子上に存在することもある。エピトープ決定因子は、アミノ酸、糖側鎖、ホスホリルまたはスルホニル基などの、化学的に活性な表面分子群を含んでもよく、特異的な３次元構造性、および／または特異的な電荷特性を有し得る。一般的に、特定の標的抗原に対して特異的な抗体は、タンパク質および／または高分子の複合混合物中の標的抗原上のエピトープを、優先的に認識する。
「同一性」という用語は、配列のアライメントおよび比較によって決定される、２つ以上のポリペプチド分子または２つ以上の核酸分子の配列間の関係を指す。「同一性パーセント」とは、比較される分子中のアミノ酸またはヌクレオチド間の同一の残基の割合（％）を意味し、比較される分子の最小のサイズに基づいて算出される。これらの計算においては、アライメント中のギャップ（存在する場合）を、特定の数理モデルまたはコンピュータプログラム（すなわち、「アルゴリズム」）によって扱わなければならない。整列された核酸またはポリペプチドの同一性を計算するために使用し得る方法としては、Computational Molecular Biology, (Lesk, A. M., ed.), (1988) New York: Oxford University Press; Biocomputing Informatics and Genome Projects, (Smith, D. W., ed.), 1993, New York: Academic Press; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, (Griffin, A. M., and Griffin, H. G., eds.), 1994, New Jersey: Humana Press; von Heinje, G., (1987) Sequence Analysis in Molecular Biology, New York: Academic Press; Sequence Analysis Primer, (Gribskov, M. and Devereux, J., eds.), 1991, New York: M. Stockton Press; and Carillo et al., (1988) SIAM J. Applied Math. 48:1073に記載されるものが挙げられる。例えば、配列同一性は、２つのポリペプチドのアミノ酸の位置における類似性を比較するために一般に使用される標準的方法により、判定することができる。ＢＬＡＳＴまたはＦＡＳＴＡなどのコンピュータプログラムを使用して、２つのポリペプチドまたは２つのポリヌクレオチド配列を、それらそれぞれの残基の最大の一致をもたらすように整列させる（１つもしくは両方の配列の完全長に沿って、または１つもしくは両方の配列の予め決定された部分に沿って、のどちらかで）。このプログラムはデフォルトオープニングペナルティ（default opening penalty）およびデフォルトギャップペナルティ（default gap penalty）を提供し、ＰＡＭ２５０［標準的スコアリングマトリックス；Dayhoff et al., in Atlas of Protein Sequence and Structure, vol. 5, supp. 3 (1978)を参照のこと］などのスコアリングマトリックスを、コンピュータプログラムと併せて使用することができる。次いで、例えば、同一性パーセントを、以下のように算出することができる：同一の一致の総数に１００を乗算し、次いで、一致したスパン内のより長い配列の長さと、２つの配列を整列させるためにより長い配列中に導入されたギャップの数の合計で除算する。同一性パーセントを算出する際は、配列間で最大の一致をもたらすように、比較される配列を整列させる。
ＧＣＧプログラムパッケージは、同一性パーセントを決定するために使用することができるコンピュータプログラムであり、該パッケージはＧＡＰを含む（Devereux et al., 1984, Nucl. Acid Res. 12:387; Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, WI）。コンピュータアルゴリズムであるＧＡＰを使用して、配列同一性パーセントを決定する、２つのポリペプチドまたは２つのポリヌクレオチドを整列させる。配列を、それらそれぞれのアミノ酸またはヌクレオチドの最大の一致をもたらすように、整列させる（アルゴリズムにより決定される「一致スパン」）。ギャップオープニングペナルティ（平均ダイアゴナルの３倍として計算され、「平均ダイアゴナル」は、使用される比較マトリックスのダイアゴナルの平均であり；「ダイアゴナル」は、特定の比較マトリックスによって、それぞれの完全なアミノ酸一致に割り当てられるスコアまたは数字である）およびギャップエクステンションペナルティ（通常、ギャップオープニングペナルティの１／１０倍である）、ならびにＰＡＭ２５０またはＢＬＯＳＵＭ６２などの比較マトリックスが、アルゴリズムとともに使用される。ある特定の実施形態において、標準の比較マトリックス（ＰＡＭ２５０比較マトリックスに関してはDayhoff et al., (1978) Atlas of Protein Sequence and Structure 5:345-352;ＢＬＯＳＵＭ６２比較マトリックスに関してはHenikoff et al.,(1992) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:10915-10919を参照のこと）は、アルゴリズムによっても使用される。
ＧＡＰプログラムを使用してポリペプチドまたはヌクレオチド配列の同一性パーセントを決定するための推奨パラメータは以下の通りである：
アルゴリズム：Ｎｅｅｄｌｅｍａｎら、１９７０年、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８巻：４４３〜４５３頁
比較マトリックス：上記のＨｅｎｉｋｏｆｆら、１９９２年からの、ＢＬＯＳＵＭ ６２；
ギャップペナルティ：１２（しかし末端ギャップについてはゼロペナルティ）
ギャップ長ペナルティ：４
類似性の閾値：０
２つのアミノ酸配列を整列させるためのあるアライメントスキームは、２つの配列の短い領域のみの一致をもたらすこともあり、この小さな整列した領域は、２つの完全長の配列間に有意な関連がなくても、非常に高い配列同一性を有し得る。従って、標的ポリペプチドの少なくとも５０個の隣接するアミノ酸にわたるアライメントをもたらすことが所望の場合、選択されたアライメントの方法（ＧＡＰプログラム）を調節することができる。
「修飾」という用語には、本発明の抗体および抗体断片を含む、免疫グロブリンとの関連において使用される場合、限定されないが、１つまたは複数のアミノ酸の改変（置換、挿入または欠失を含む）；化学的修飾；治療用または診断用薬剤との結合による共有結合的修飾；標識（例えば、放射性核種または種々の酵素による）；ポリマーの共有結合、例えばＰＥＧ化（ポリエチレングリコールによる誘導体化）および非天然アミノ酸の化学的合成による挿入または置換が含まれる。
「誘導体」という用語は、本発明の範囲に含まれる免疫グロブリン（抗体および抗体断片を含む）との関連において使用される場合、治療用または診断用薬剤との結合による共有結合的修飾、標識（例えば、放射性核種または種々の酵素による）、ポリマーの共有結合、例えばＰＥＧ化（ポリエチレングリコールによる誘導体化）および非天然アミノ酸の化学的合成による挿入または置換が行われた、免疫グロブリンタンパク質を指す。本発明の誘導体は、誘導体化されていない本発明の分子の結合特性を維持する。
本発明のいくつかの実施形態において、半減期延長部分は、免疫グロブリンＦｃ領域（例えば、アロタイプＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４のＦｃを含むヒト免疫グロブリンＦｃ領域）またはその一部分（例えば、Ｆｃ領域のＣＨ２ドメイン）、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、またはポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）、より詳細には、分子量約１０００Ｄａ〜約１０００００ＤａのＰＥＧである。
一価二量体のまたは二価二量体のＦｃ−毒素ペプチドアナログ融合体または複合体は、本発明の組成物の有用な実施形態である。「一価二量体の」Ｆｃ−毒素ペプチドアナログ融合体または複合体、または互換的に、「一価二量体」、または互換的に「一価ヘテロ二量体」は、二量体化したＦｃ領域のうちの１つだけと結合した毒素ペプチドアナログを含む、Ｆｃ−毒素ペプチドアナログ融合体または複合体である（例えば、ともに参照により本明細書にその全体が組み込まれる、Sullivan et al., Toxin Peptide Therapeutic Agents,米国特許出願公開第２００７／００７１７６４号、および国際公開第２００８／０８８４２２号として公開された、Sullivan et al., Toxin Peptide Therapeutic Agents,国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０２２８３１号の図２Ｂに模式的に示される）。「二価二量体の」Ｆｃ−毒素ペプチドアナログ融合体、または互換的に、「二価の二量体」または「二価のホモ二量体」は、それぞれが別個に毒素ペプチドアナログと複合体化した、二量体化したＦｃ領域の両方を有する、Ｆｃ−毒素ペプチドアナログ融合体または複合体である（例えば、ともに参照により本明細書にその全体が組み込まれる、Sullivan et al., Toxin peptide Therapeutic Agents,米国特許出願公開第２００７／００７１７６４号、および国際公開第２００８／０８８４２２号として公開された、Sullivan et al., Toxin peptide Therapeutic Agents,国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０２２８３１号の図２Ｃに模式的に示される）。
免疫グロブリンＦｃ領域には、本発明の範囲に含まれる好適な半減期延長部分である、Ｆｃ変異体が含まれる。サルベージ受容体への結合が維持される場合に限り、天然のＦｃを広範に修飾して、本発明のＦｃ変異体を形成することができる；例えば、国際公開第９７／３４６３１号、同第９６／３２４７８号、および同第０４／１１０４７２号を参照のこと。このようなＦｃ変異体において、本発明の融合体または複合体分子に必要とされていない構造的特徴または機能活性を提供する、天然のＦｃの１つまたは複数の部位を除去することができる。これらの部位は、例えば、残基を置換または除去する、該部位に残基を挿入する、または該部位を含有する部分をトランケーションすることにより、除去することができる。挿入または置換される残基はまた、改変されたアミノ酸、例えばペプチド模倣体またはＤ−アミノ酸でもあり得る。Ｆｃ変異体は、いくつかの理由において望ましくあり得、そのうちのいくつかを以下に記載する。例示的なＦｃ変異体としては、以下のような分子および配列が挙げられる：
ジスルフィド結合形成に関わる部位が除去される。このような除去により、本発明の分子を作製するために使用される宿主細胞中に存在する、他のシステイン含有タンパク質との反応を回避することができる。この目的のために、Ｎ末端のシステイン含有セグメントをトランケートするか、またはシステイン残基を除去するかもしくは他のアミノ酸（例えば、アラニル、セリル）で置換することができる。特に、配列番号４７８のＮ末端の２０のアミノ酸セグメント：
Met Glu Trp Ser Trp Val Phe Leu Phe Phe Leu Ser Val Thr Thr Gly
Val His Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu
Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
Ser Leu Ser Pro Gly Lys／／配列番号４７８
をトランケートするか、または配列番号４７８の位置７および１０で、システイン残基を除去もしくは置換することができる。システイン残基を除去した場合でも、単鎖Ｆｃ領域は、非共有結合で連結された二量体Ｆｃ領域を形成することができる。
２．選択された宿主細胞とより適合性にさせるために、天然のＦｃが修飾される。例えば、大腸菌（E.coli）中で、プロリンイミノペプチダーゼなどの消化酵素により認識され得る、一般的な天然ＦｃのＮ末端近くのＰＡジペプチド配列を除去することができる。特に、細菌細胞、例えば大腸菌（E.coli）中に、組み換えにより分子を発現させる場合、Ｎ末端メチオニン残基を付加することもできる。配列番号４７８のＦｃ領域は、１つのそのようなＦｃ変異体である。
３．選択された宿主細胞に発現される際のＮ末端の不均一性を防ぐために、天然のＦｃのＮ末端の一部が除去される。この目的のために、Ｎ末端の最初の２０のアミノ酸残基のうちのいずれか、特に位置１、２、３、４および５にあるものを、除去することができる。
４．１つまたは複数のグリコシル化部位が除去される。一般的にグリコシル化された残基（例えば、アスパラギン）は、細胞溶解応答をもたらし得る。このような残基を除去するか、またはグリコシル化されていない残基（例えば、アラニン）で置換することができる。
５．補体との相互作用に関わる部位、例えばＣ１ｑ結合部位が除去される。例えば、ヒトＩｇＧ１のＥＫＫトリペプチド配列を削除または置換することができる。補体の動員は、本発明の分子にとって有利でないことがあるため、このようなＦｃ変異体を用いて回避することができる。
５．サルベージ受容体以外のＦｃ受容体との結合に影響を与える部位が、除去される。天然のＦｃは、本発明の融合体または複合体分子に必要とされない、ある特定の白血球と相互作用する部位を有し得るため、それらを除去することができる。
７．ＡＤＣＣ部位が、ＡＤＣＣエフェクター機能を減少させるかもしくは排除するために除去されるか、または代替的に、非フコシル化もしくは脱フコシル化により、強化されたＡＤＣＣエフェクター機能のために修飾される。ＡＤＣＣ部位は、当技術分野において公知である；ＩｇＧ１中のＡＤＣＣ部位に関しては、例えば、Molec. Immunol. 29 (5): 633-9 (1992)を参照のこと。これらの部位も、同様に、本発明の融合体または複合体分子には必要でないため、所望により、除去するか、またはＡＤＣＣエフェクター機能を強化することができる。（Iida et al., Two mechanisms of the enhanced antibody-dependent cellular cytotoxicity (ADCC) efficacy of 非fucosylated therapeutic antibodies in human blood, BMC Cancer 9:58 doi:10.1186/1471-2407-9-58 (2009)を参照のこと）。
８．天然のＦｃが非ヒト抗体由来である場合に、天然のＦｃをヒト化することができる。一般に、天然のＦｃをヒト化するために、非ヒトの天然Ｆｃ中の選択された残基を、ヒトの天然Ｆｃ中に通常存在する残基で置換する。抗体のヒト化のための技術は、当技術分野において公知である。
９．米国特許第７，４４２，７７８号；同７，６４５，８６１号；同７，６５５，７６４号；同７，６５５，７６５号；同７，６６２，９３１号；同７，７５０，１２７号、および同７，７５０，１２８号に開示されるとおり、１つまたは複数の毒素ペプチドアナログ配列を、免疫グロブリンＦｃ領域のループ領域内の、内部結合部位または複数の部位に、挿入することができる。「ループ」領域または「Ｆｃループ」領域という用語は、ループ領域由来の一次構造のＮ末端およびＣ末端側で直接、αへリックスまたはβシートなどの二次構造を含む２つの領域を連結する、アミノ酸残基の一次配列を指す。例としては、限定されないが、ＣＨ２またはＣＨ３ループ領域が挙げられる。当業者は、ループ領域が、それ自体は二次構造を含まないが、二次またはより高次のタンパク質構造に影響を与えるかまたは寄与し得ることを理解する。「内部」複合体化部位という用語は、毒素ペプチドアナログ部分または複数の部分が、非終端である、すなわちＦｃ領域のα−アミノ部位またはα−カルボキシ部位を介していないことを意味するが、所望により、Ｆｃ領域のＮ末端および／またはＣ末端の終端で複合体化している付加的な部分も存在し得る。
１０．好適な長さおよび中性の電荷を有するリンカー、例えば「Ｌ２５」（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ；配列番号４９３）または「Ｌ２０」（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ；配列番号４７７）を、１つのＦｃ領域モノマーのＣ末端および第２のＦｃ領域モノマーのＮ末端間で共有結合的に融合させ、毒素ペプチドアナログを、第１のＦｃ領域モノマーのＮ末端もしくは第２のＦｃ領域モノマーのＣ末端、または第１および／もしくは第２のＦｃ領域モノマーのループ領域内に融合させることができる。このような分子を、細菌または哺乳類の細胞中で、組み換えにより発現させ、Ｆｃモノマー間に一般的なジスルフィド結合形成を有する、変異体「一価二量体」Ｆｃ−毒素ペプチドアナログ融合体または複合体を生成することができる（例えば、本明細書の実施例１３を参照のこと）。Ｆｃ変異体の他の例としては、以下が挙げられる：配列番号４７８において、位置１５のロイシンをグルタミン酸で；位置９９のグルタミン酸をアラニンで；ならびに位置１０１および１０３のリジンをアラニンで置換することができる。さらに、フェニルアラニン残基で、１つまたは複数のチロシン残基を置き換え得る。本発明の目的のために、変異体Ｆｃ領域はまた、モノマー免疫グロブリン重鎖、抗体、またはヘテロ三量体ヘミボディ（ＬＣ＋ＨＣ＋Ｆｃ）の部分でもあり得る。
代替の半減期延長部分は、サルベージ受容体に結合することができる、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、抗体、抗体断片、または小分子（例えば、ペプチド模倣体化合物）であろう。例えば、半減期延長部分として、１９９８年、４月１４日にPresta らに発行された米国特許第５，７３９，２７７号に記載される、ポリペプチドを使用することができる。ペプチドを、ＦｃＲｎサルベージ受容体との結合のために、ファージディスプレイにより選択することもできる。このようなサルベージ受容体結合化合物も、「半減期延長部分」の意味内に含まれ、かつ本発明の範囲に含まれる。増加した半減期（例えば、プロテアーゼに認識される配列を回避することにより）および、減少した免疫原性（例えば、抗体のヒト化において発見される、非免疫原性の配列を選ぶことにより）のために、このような半減期延長部分を選択するべきである。
上述の通り、ポリマー半減期延長部分を使用することもできる。半減期延長部分として有用な化学的部分を結合させるための種々の手段が、現在利用可能である；例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、“N-Terminally Chemically Modified Protein Compositions and Methods”と題された、特許協力条約（「ＰＣＴ」）国際公開第ＷＯ９６／１１９５３号を参照のこと。このＰＣＴ公開は、とりわけ、水溶性のポリマーの、タンパク質のＮ末端との選択的結合を開示している。
本発明の組成物のいくつかの実施形態において、ポリマー半減期延長部分は、毒素ペプチドアナログのＮ末端、Ｃ末端または１つもしくは複数の介在性側鎖に、共有結合で連結された、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。本発明の組成物のいくつかの実施形態は、非ＰＥＧ半減期延長部分または毒素ペプチドアナログ、またはこれらのうちのいずれかのいずれかの組み合わせに複合体化された、１つまたは複数のＰＥＧ部分をさらに含む。例えば、本発明の組成物中のＦｃ領域またはその部分を、還元的アルキル化プロセスにより、モノＰＥＧ化、ジＰＥＧ化、または多ＰＥＧ化することもできる。
タンパク質およびペプチドと、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）の共有結合は、治療用タンパク質のｉｎ ｖｉｖｏでの循環半減期を有意に延長するための手法として、広く知られている。ＰＥＧ部分は、かなりの水力学的半径をタンパク質に付加するため、ＰＥＧ化は、主に腎臓のクリアランスを遅らせることにより、この効果を達成する。（Zalipsky, S., et al., Use of functionalized poly(エチルene glycol)s for modification of polypeptides., in poly(エチルene glycol) chemistry: Biotechnical and biomedical applications., J.M. Harris, Ed., Plenum Press: New York., 347-370 (1992)）。タンパク質およびペプチドのＰＥＧ化によりしばしば付与される追加の利点には、増加した溶解度、タンパク質分解に対する抵抗性、ならびに減少した治療用ポリペプチドの免疫原性が含まれる。タンパク質ＰＥＧ化の利点は、ＰＥＧ−アデノシンデアミナーゼ（Ａｄａｇｅｎ（商標）／／エンゾン社（Enzon Corp.)）、ＰＥＧ−Ｌ−アスパラギナーゼ（Ｏｎｃａｓｐａｒ（商標）／エンゾン社（Enzon Corp.））、ＰＥＧ−インターフェロンα−２ｂ（ＰＥＧ−Ｉｎｔｒｏｎ（商標）／シェリング社（Schering）／エンゾン社（Enzon Corp.））、ＰＥＧ−インターフェロンα−２ａ（ＰＥＧＡＳＹＳ（商標）／ロシュ社（Roche））およびＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦ（Ｎｅｕｌａｓｔａ（商標）／アムジェン社（Amgen））ならびに臨床治験における多くの他のものを含む、いくつかのＰＥＧ化タンパク質の商品化により実証されている。
「ＰＥＧ化ペプチド」または「ＰＥＧ化タンパク質」とは、ペプチド自体のアミノ酸残基と、またはペプチドの残基に直接的にもしくは別のリンカー部分を介して間接的に共有結合したペプチジルもしくは非ペプチジルリンカーと、共有結合した、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分を有するペプチドを意味する。非限定的な例は、ペプチドと、３−（１−（１−ブロモ−２−オキソ−６，９，１２，１５，１８，２１，２４，２７，３０，３３，３６−ウンデカオキサ−３−アザオクタトリアコンタン−３８−イル）−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４−イル）プロパノイル（本明細書においては、略称「｛ブロモアセトアミド−ＰＥＧ１１−トリアゾール｝−」により示される）との、Ｎ末端結合である。
「ポリエチレングリコール」または「ＰＥＧ」とは、カップリング剤有りもしくは無しの、またはカップリングもしくは活性化部分（例えば、アルデヒド、ヒドロキシスクシンイミジル、ヒドラジド、チオール、トリフレート、トリシレート、アジルジン、オキシラン、オルトピリジルジスルフィド、ビニルスルホン、ヨードアセトアミドまたはマレイミド部分による）による誘導体化有りもしくは無しの、ポリアルキレングリコール化合物またはその誘導体を意味する。本発明によれば、有用なＰＥＧには、実質的に直線的な、直鎖ＰＥＧ、分岐ＰＥＧ（ｂｒＰＥＧ）、または樹枝状ＰＥＧが含まれる（例えば、Merrill, 米国特許第５，１７１，２６４号 ；Harris et al., Multiarmed, monofunctional, polymer for coupling to molecules and surfaces, 米国特許第５，９３２，４６２号；Shen, N-maleimidyl polymer derivatives, 米国特許第６，６０２，４９８号を参照のこと）。
簡単に説明すると、ＰＥＧ基は一般的に、ＰＥＧ部分上の反応性基（例えば、アルデヒド、アミノ、チオール、またはエステル基）から、本発明の化合物の反応性基（例えば、アルデヒド、アミノ、またはエステル基）に至る、アシル化または還元的アルキル化（または還元的アミノ化）により、本発明の組成物のペプチド部分に結合している。合成ペプチドのＰＥＧ化のための有用な戦略は、互いに対して相互反応性である特別な機能性をそれぞれが備えたペプチドおよびＰＥＧ部分を、溶液中で複合体結合（conjugate linkage）を形成することにより混合することから成る。ペプチドは、従来の固相合成法により、容易に作成することができる（例えば、本明細書の図５および６ならびに付随する文章を参照のこと）。ペプチドを、特定の部位で、適切な官能基により「予備活性化する」。前駆体を精製し、ＰＥＧ部分と反応させる前に、完全に特徴付けする。ＰＥＧによるペプチドのライゲーションは、通常水相において起こり、逆相分析ＨＰＬＣにより、容易にモニタすることができる。ＰＥＧ化ペプチドは、分取ＨＰＬＣにより容易に精製することができ、分析ＨＰＬＣ、アミノ酸解析およびレーザー脱離質量分析により特徴付けすることができる。
ＰＥＧは、市販されているか、または当技術分野で公知の方法に従ってエチレングリコールの開環重合により作製することができる、公知の水溶性ポリマーである（Sandler and Karo, Polymer Synthesis, Academic Press, New York, Vol. 3, pages 138-161）。本出願において、「ＰＥＧ」という用語は、大きさまたはＰＥＧの末端での修飾に関わらず、単官能性、二官能性、もしくは多官能性形態の、いかなるポリエチレングリコール分子をも包含するように広義に使用され、以下の式：
Ｘ−Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−１ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ， （Ｉ）
により表すことができ、式中ｎは２０〜２３００であり、ＸはＨまたは末端修飾、例えば、Ｃ１−４アルキルである。
いくつかの有用な実施形態において、本発明で使用されるＰＥＧは、一端が、ヒドロキシまたはメトキシで終わる；すなわちＸはＨまたはＣＨ３（「メトキシＰＥＧ」）である。式（Ｉ）に示される、ＯＨで終わるＰＥＧのもう一方の終端は、エーテル酸素結合、アミン結合、またはアミド結合を介して、活性化部分に共有結合するということが、留意される。化学構造において使用される場合、「ＰＥＧ」という用語は、示されるヒドロキシル基の水素が無く、酸素がリンカーの遊離炭素原子と反応してエーテル結合を形成するために利用可能な状態になっている、上述の式（Ｉ）を含む。より具体的には、ＰＥＧをペプチドと結合させるため、ペプチドを、「活性化」形態のＰＥＧと反応させなければならない。活性化されたＰＥＧは、以下の式：
（ＰＥＧ）−（Ａ） （ＩＩ）
により表すことができ、ここでＰＥＧ（上述で定義）は、活性化部分（Ａ）の炭素原子と共有結合して、エーテル結合、アミン結合、またはアミド結合を形成し、および（Ａ）は、ペプチドのアミノ酸残基上の、アミノ、アジド、アルキン、イミノ、マレイミド、Ｎ−スクシンイミジル、カルボキシル、アミノオキシ、セレノ、またはチオール基、または、毒素ペプチドアナログなどのペプチドに共有結合したリンカー部分と反応することができる、反応性基を含む。
活性化ＰＥＧの作製および生物学的に活性なペプチドとの結合のための技術は、当技術分野において公知である。（例えば、米国特許第５，６４３，５７５号、同５，９１９，４５５号、同５，９３２，４６２号、および同５，９９０，２３７号；Kinstler et al., N-terminally chemically modified protein compositions and methods, 米国特許第５，９８５，２６５号、および同５，８２４，７８４号；Thompson et al., PEGylation of polypeptides, 欧州特許第０５７５５４５Ｂ１号；Petit, Site specific protein modification, 米国特許第６，４５１，９８６号、および同６，５４８，６４４号；S. Herman et al., Poly(ethylene glycol) with reactive endgroups: I. Modification of proteins, J. Bioactive Compatible Polymers, 10:145-187 (1995); Y. Lu et al., PEGylated peptides III: Solid-phase synthesis with PEGylating reagents of varying molecular weight: synthesis of multiply PEGylated peptides, Reactive Polymers, 22:221-229 (1994); A.M. Felix et al., PEGylated Peptides IV: Enhanced biological activity of site-directed PEGylated GRF analogs, Int. J. Peptide Protein Res., 46:253-264 (1995); A.M. Felix, Site-specific poly(ethylene glycol)ylation of peptides, ACS Symposium Series 680(poly(ethylene glycol)): 218-238 (1997); Y. Ikeda et al., Polyethylene glycol derivatives, their modified peptides, methods for producing them and use of the modified peptides, 欧州特許第０４７３０８４Ｂ１号; G.E. Means et al., Selected techniques for the modification of protein side chains, in: Chemical modification of proteins, Holden Day, Inc., 219 (1971)を参照のこと）。
活性化ＰＥＧ、例えばＰＥＧ−アルデヒドまたはＰＥＧ−アルデヒド水和物は、公知の手段により化学的に合成するか、または商業的供給源、例えば、シアウォーターポリマー社（Shearwater Polymers）、（アラバマ州、ハンツビル）もしくはエンゾン社（Enzon, Inc.）（ニュージャージー州、ピスカタウェイ）から入手することができる。
本発明の目的に有用な活性化ＰＥＧの例は、ＰＥＧ−アルデヒド化合物（例えば、メトキシＰＥＧ−アルデヒド）、例えば、シアウォーターポリマー社（Shearwater Polymers）、（アラバマ州、ハンツビル）から市販されている、ＰＥＧ−プロピオンアルデヒドである。ＰＥＧ−プロピオンアルデヒドは、式：ＰＥＧ−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨＯにより表される。（例えば、米国特許第５，２５２，７１４号を参照のこと）。「ＰＥＧアルデヒド化合物」の意味には、ＰＥＧアルデヒド水和物、例えば、ＰＥＧアセトアルデヒドおよびＰＥＧビスアルデヒド水和物も含まれ、後者は、二官能性の活性化構造をもたらす。（例えば、Bentley et al., Poly(ethylene glycol) aldehyde hydrates and related polymers and applications in modifying amines, 米国特許第５，９９０，２３７号を参照のこと）。活性化多分岐ＰＥＧ−アルデヒド化合物を使用することができる（二価、三価、４価、八価の構築物をもたらす、複数のアームを含むＰＥＧ誘導体）。４アームのＰＥＧ誘導体を使用して、４つの毒素ペプチドアナログを各ＰＥＧ分子に結合させる。例えば、本発明に従うと、毒素ペプチドアナログを、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の１、２、３または４つのアミノ機能性部位で、ＰＥＧに結合させることができる。
本発明の方法に従って複合体化する際には、本明細書に記載のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を、還元的アミノ化により、毒素ペプチドアナログ自体のアミノ酸残基の、溶媒に暴露した少なくとも１つの遊離アミン部分に直接、共有結合させる。本発明の方法のいくつかの実施形態において、毒素ペプチドアナログは、毒素ペプチドアナログの１つまたは複数の１級または２級アミンにおいて１つのＰＥＧに結合するか、または毒素ペプチドアナログの単一の１級アミン部位において、２つのＰＥＧ基に結合する（例えば、これは還元的アミノ化反応が、過剰なＰＥＧ−アルデヒド化合物の存在を含む場合に起こり得る）。還元的アミノ化によるＰＥＧ化がペプチドの１級アミンにおいて生じる場合、分子あたり２つ以上のＰＥＧを有する反応生成物をいくらか（１〜１００％の範囲）を有することが珍しくないことが観察されており、所望のＰＥＧ化生成物が、分子あたり１つのみのＰＥＧを有するものである場合、この「過ＰＥＧ化」は、望ましくないこともある。ＰＥＧ化生成物分子あたり単一のＰＥＧを有するＰＥＧ化生成物が所望の場合、薬理学的に活性なペプチドの２級アミンを使用するＰＥＧ化を含む、本発明の方法の実施形態を使用することができるが、これは分子あたり１つのＰＥＧ基のみが、還元的アミノ化反応において転移されるからである。
１級アミン部分を提供することができるアミノ酸残基としては、リジン、ホモリジン、オルニチン、α、β−ジアミノプロピオン酸（Ｄａｐ）、α、β−ジアミノプロピオン酸（Ｄｐｒ）、およびα、γ−ジアミノ酪酸（Ｄａｂ）、アミノ酪酸（Ａｂｕ）、およびα−アミノ−イソ酪酸（Ａｉｂ）の残基が挙げられる。ポリペプチドＮ末端もまた、ＰＥＧ化のための有用なα−アミノ基を提供する。２級アミン部分を提供することができるアミノ酸残基としては、アルキルがＣ１〜Ｃ６である、ε−Ｎ−アルキルリジン、α−Ｎ−アルキルリジン、δ−Ｎ−アルキルオルニチン、α−Ｎ−アルキルオルニチン、またはＮ末端プロリンが挙げられる。
本発明のＰＥＧ化毒素ペプチドアナログを生成するための別の有用な活性化ＰＥＧは、ＰＥＧ−マレイミド化合物、例えば、限定されないが、マレイミドモノメトキシＰＥＧなどのメトキシＰＥＧ−マレイミドであり、これは本発明のＰＥＧ結合ペプチドを生成するために、特に有用である。（例えば、Shen, N-maleimidyl polymer derivatives, 米国特許第６，６０２，４９８号；C. Delgado et al., The uses and properties of PEG-linked proteins., Crit. Rev. Therap. Drug Carrier Systems, 9:249-304 (1992); S. Zalipsky et al., Use of functionalized poly(ethylene glycol)s for modification of polypeptides, in: Poly(ethylene glycol) chemistry: Biotechnical and biomedical applications (J.M. Harris, Editor, Plenum Press: New York, 347-370 (1992); S. Herman et al., Poly(ethylene glycol) with reactive endgroups: I. Modification of proteins, J. Bioactive Compatible Polymers, 10:145-187 (1995); P.J. Shadle et al., Conjugation of polymer to colony stimulating factor-1, 米国特許第４，８４７，３２５号；G. Shaw et al., Cysteine added variants IL-3 and chemical modifications thereof, 米国特許第５，１６６，３２２号および欧州特許第０４６９０７４Ｂ１号；G. Shaw et al., Cysteine added variants of EPO and chemical modifications thereof, 欧州特許第０６６８３５３Ａ１号；G. Shaw et al., Cysteine added variants G-CSF and chemical modifications thereof, 欧州特許第０６６８３５４Ａ１号；N.V. Katre et al., Interleukin-2 muteins and polymer conjugation thereof, 米国特許第５，２０６，３４４号；R.J. Goodson and N.V. Katre, Site-directed pegylation of recombinant interleukin-2 at its glycosylation site, Biotechnology, 8:343-346 (1990)）。
ポリ（エチレングリコール）ビニルスルホンは、チオール化されたアミノ酸残基、例えば、Ｃ残基での結合により、本発明のＰＥＧ結合毒素ペプチドアナログを生成するための、別の有用な活性化ＰＥＧである（例えば、M. Morpurgo et al., Preparation and characterization of poly(ethylene glycol) vinyl sulfone, Bioconj. Chem., 7:363-368 (1996);また、 Harris, Functionalization of polyethylene glycol for formation of active sulfone-terminated PEG derivatives for binding to proteins and biologically compatible materials, 米国特許第５，４４６，０９０号；同５，７３９，２０８号；同５，９００，４６１号；同６，６１０，２８１号および同６，８９４，０２５号；ならびに Harris, Water soluble active sulfones of poly(ethylene glycol)， 国際公開第９５／１３３１２Ａ１号も参照のこと）。本発明において有用な別の活性化型ＰＥＧは、ＰＥＧ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル化合物、例えば、メトキシＰＥＧ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル（ＮＨＳ）エステルである。
ＰＥＧのヘテロ二官能性活性化型もまた有用である。（例えば、Thompson et al., PEGylation reagents and biologically active compounds formed therewith, 米国特許第６，５５２，１７０号を参照のこと）。
組成物を作製する本発明の方法のさらなる他の実施形態においては、毒素ペプチドアナログを、公知の化学的技術により、活性化ＰＥＧ化合物、例えば限定されないが、チオール活性化ＰＥＧ化合物、ジオール活性化ＰＥＧ化合物、ＰＥＧ−ヒドラジド化合物、ＰＥＧ−オキシアミン化合物、またはＰＥＧ−ブロモアセチル化合物と反応させる。（例えば、S. Herman, Poly(ethylene glycol) with Reactive Endgroups: I. Modification of Proteins, J. Bioactive and Compatible Polymers, 10:145-187 (1995); S. Zalipsky, Chemistry of Polyethylene Glycol Conjugates with Biologically Active Molecules, Advanced Drug Delivery Reviews, 16:157-182 (1995); R. Greenwald et al., Poly(ethylene glycol) conjugated drugs and prodrugs: a comprehensive review, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 17:101-161 (2000)を参照のこと）。
本発明のＰＥＧ結合毒素ペプチドアナログを生成するための、さらにより好ましい活性化ＰＥＧは、２つ以上の活性化残基を有する多価のＰＥＧである。好ましい多価のＰＥＧ部分としては、限定されないが、以下に示すものが挙げられる：
Figure 2017031157
組成物作製のさらなる他の実施形態においては、本発明の毒素ペプチドアナログを、公知の化学的技術により、活性化多分岐ＰＥＧ化合物（二価、三価、四価、八価の構築物をもたらす、複数のアームを含むＰＥＧ誘導体）、例えば限定されないが、ペンタエリトリトールテトラ−ポリエチレングリコールエーテルと反応させる。機能化および活性化誘導体、例えば、限定されないが、Ｎ−スクシンイミジルオキシカルボニル）プロピル、ｐ−ニトロフェニルオキシカルボニル、（−ＣＯ２−ｐ−Ｃ６Ｈ４ＮＯ２）、３−（Ｎ−マレイミド）プロパンアミド、２−スルファニルエチル、および３−アミノプロピル。４アームのＰＥＧ誘導体を使用して、４つの毒素ペプチドアナログを、各ＰＥＧ分子に結合させる。例えば、本発明においては、毒素ペプチドアナログを：
（ａ）ＰＥＧの１、２、３または４つのアミノ機能性部位；
（ｂ）ＰＥＧの１、２、３または４つのチオール機能性部位；
（ｃ）ＰＥＧの１、２、３または４つのマレイミド機能性部位；
（ｄ）ＰＥＧの１、２、３または４つのＮ−スクシンイミジル機能性部位；
（ｅ）ＰＥＧの１、２、３または４つのカルボキシル機能性部位；または
（ｆ）ＰＥＧの１、２、３または４つのｐ−ニトロフェニルオキシカルボニル機能性部位；
において、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）と複合体化させることができる。
ＰＥＧの最小の実用的サイズは約５００ダルトン（Ｄａ）であり、それ未満ではＰＥＧは有毒となる。約５００Ｄａ超で、実際に所望される、ＰＥＧのいかなる分子量、例えば、約１，０００ダルトン（Ｄａ）〜１００，０００Ｄａ（ｎは２０〜２３００である）をも使用することができる。ＰＥＧモノマーの数（ｎ）は、各モノマーに対して、ＭＷ＝４４Ｄａを使用して、平均分子量から概算する。活性化リンカー上のＰＥＧの合計分子量は、医薬的使用に好適であることが望ましい。従って、ＰＥＧ分子の合計分子量は、約１００，０００Ｄａを超えるべきではない。いくつかの実施形態において、本発明のＰＥＧ結合毒素ペプチドアナログで使用されるＰＥＧの合計または総平均分子量は、約３，０００Ｄａ〜６０，０００Ｄａ（総ｎは７０〜１，４００）、より好ましくは約１０，０００Ｄａ〜４０，０００Ｄａ（総ｎは約２３０〜約９１０）である。最も好ましいＰＥＧの合計質量は、約２０，０００Ｄａ〜３０，０００Ｄａ（総ｎは約４５０〜約６８０）である。
毒素ペプチドアナログとの結合（介在するリンカー部分有りまたは無しの）に使用される半減期延長部分は、半減期延長部分が結合し得るアミノ酸残基の数に関して、多価（例えば、二価、三価、四価またはより高次の価数）であり得るため、組成物の「多量体」が作製され得るということが、理解されるであろう。いくつかの実施形態においては、本発明の組成物のペプチド部分は多価（例えば、二価、三価、四価またはより高次の価数）であり得、従って、本発明の組成物のいくつかの「多量体」は、２つ以上の半減期延長部分を有し得る。結果として、本発明の組成物の作製方法により、種々の、結合した半減期延長部分：ペプチド構造を生成することが可能である。例としては、一価の半減期延長部分および一価ペプチドは１：１複合体を生成し；二価のペプチドおよび一価の半減期延長部分は、２つの半減期延長部分を有するペプチド複合体を形成し得るが、二価の半減期延長部分および一価のペプチドは、２つのペプチド単位が単一の半減期延長部分に連結されている複合体を生成し得る；より高次の価の半減期延長部分の使用は、単一の半減期延長部分に結合した、ペプチド単位のクラスタの形成をもたらし得、より高次の価のペプチドは、複数の半減期延長部分で覆われ得る。さらなる例として、多価の半減期延長部分と毒素ペプチドアナログとの複合体化部位がシステインまたは他のアミノチオ−ルである場合は、Ｄ’Ａｍｉｃｏらにより開示される方法を使用し得る。（D’Amico et al., Method of conjugating aminothiol containing molecules to vehicles（（米国特許出願公開第２００６／０１９９８１２号として公開され、この出願は参照により本明細書にその全体が組み込まれる）。
ペプチド部分は、活性化された半減期延長部分と反応する２つ以上の反応性基を有し得、複合的な構造を形成する可能性を常に考慮しなければならず；単純な構造、例えば半減期延長部分およびペプチドの１：１付加物を形成すること、または二価の半減期延長部分を使用してペプチド：半減期延長部分：ペプチド付加物を形成することが所望の場合、ある割合の記載される生成物を生成するために、所定の比率の活性化された半減期延長部分およびペプチド材料、それらの所定の濃度を使用し、かつ反応を所定の条件下（例えば持続時間、温度、ｐＨ等）で行い、次いで記載される生成物を他の反応生成物から分離することが有益であろう。試薬の反応条件、割合および濃度は、必要に応じて適切にスケールアップしつつ、当業者の能力範囲内である比較的単純な試行錯誤実験により、得ることができる。生成物の精製および分離は、当業者に公知の従来の技術により、同様に達成される。
さらに、本発明の毒素ペプチドアナログに融合または結合した半減期延長部分の生理的に許容される塩もまた、本発明の組成物に包含される。
上述の半減期延長部分および本明細書に記載される他の半減期延長部分は、個々でも組み合わせでも有用であり、それは当技術分野、例えば、以下にさらに記載される通りである：ともに参照により本明細書にその全体が組み込まれる、Sullivan et al., Toxin peptide Therapeutic Agents, 米国特許出願公開第２００７／００７１７６４号、および国際公開第２００８／０８８４２２号として公開された、Sullivan et al., Toxin peptide Therapeutic Agents, 国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０２２８３１号。本発明は、限定されないが、本明細書に記載されるものなどの、薬剤的に許容される半減期延長部分のいかなる単一の種の、毒素ペプチドアナログとの複合体化における使用、または２つ以上の類似のまたは異なる半減期延長部分の組み合わせの使用も包含する。
リンカー
本明細書で使用される「リンカー部分」とは、本発明の組成物に含まれる毒素ペプチドアナログまたは他のポリペプチド鎖（例えば、免疫グロブリンＨＣもしくはＬＣまたは免疫グロブリンＦｃ領域）のアミノ酸残基に共有結合した、生物学的に許容されるペプチジルもしくは非ペプチジル有機基を指し、そのリンカー部分は、毒素ペプチドアナログもしくは他のポリペプチド鎖を、組成物中の別のペプチドもしくはポリペプチド鎖または半減期延長部分と、共有結合により連結もしくは複合体化する。組成物のいくつかの実施形態において、本明細書に記載される半減期延長部分は、毒素ペプチドアナログ自体のアミノ酸残基に直接的に、または所望により、毒素ペプチドアナログのアミノ酸残基に共有結合した、ペプチジルまたは非ペプチジルリンカー部分（限定されないが芳香族またはアリールリンカーを含む）に、結合、すなわち共有結合する。いかなるリンカー部分の存在も任意である。存在する場合、それは主に、１つの機能性部分を、本発明の組成物の分子の１つまたは複数の他の機能性部分との関連において、位置づけ、結合、連結するか、または提示もしくは位置を最適化するスペーサーとして機能するため、その化学構造は重要ではない。リンカー部分の存在は、本発明の組成物のいくつかの実施形態の薬理学的活性を最適化する上で、有用であり得る。リンカーは、ペプチド結合により連結されたアミノ酸から成ることが好ましい。リンカー部分は、存在する場合、独立して、本発明の組成物中に存在し得るいずれかの他のリンカーまたは複数のリンカーと同一であるかまたは異なり得る。上述の通り、リンカー部分は、存在する場合（毒素ペプチドアナログの一次アミノ酸配列内に、または毒素ペプチドアナログに半減期延長部分を結合するためのリンカーとして）、性質的には「ペプチジル」（すなわち、ペプチド結合により連結されたアミノ酸から成る）であり得、および、好ましくは、１〜最大約４０アミノ酸残基まで、より好ましくは、１〜最大約２０アミノ酸残基まで、および最も好ましくは１〜約１０アミノ酸残基の長さから成り得る。必ずしもではないが、好ましくは、リンカー中のアミノ酸残基は、２０種の標準アミノ酸由来であり、より好ましくは、システイン、グリシン、アラニン、プロリン、アスパラギン、グルタミン、および／またはセリンである。さらにより好ましくは、ペプチジルリンカーは、立体障害のない大多数のアミノ酸、例えば、ペプチド結合で連結された、グリシン、セリン、およびアラニンから成る。また、存在する場合、ｉｎ ｖｉｖｏでの循環において急速なタンパク質分解性の代謝回転を回避するようなペプチジルリンカーを選択することも望ましい。これらのアミノ酸のうちのいくつかは、当業者に公知の通り、グリコシル化され得る。例えば、シアリル化部位を構成する有用なリンカー配列は、Ｘ１Ｘ２ＮＸ４Ｘ５Ｇ（配列番号４７９）であり、ここでＸ１、Ｘ２，Ｘ４およびＸ５は、それぞれ独立していずれかのアミノ酸残基である。
他の実施形態において、ペプチジルリンカー部分の１〜４０のアミノ酸は、グリシン、アラニン、プロリン、アスパラギン、グルタミン、およびリジンから選択される。リンカーは、立体障害のない大多数のアミノ酸、例えばグリシンおよびアラニンから成ることが好ましい。従って、好ましいリンカーには、ポリグリシン、ポリセリン、およびポリアラニン、またはこれらのうちのいずれかの組み合わせが含まれる。いくつかの例示的なペプチジルリンカーは、ポリ（Ｇｌｙ）１−８、特に（Ｇｌｙ）３、（Ｇｌｙ）４（配列番号４８０）、（Ｇｌｙ）５（配列番号４８１）および（Ｇｌｙ）７（配列番号４８２）、ならびに、ＧｌｙＳｅｒおよびポリ（Ｇｌｙ）４Ｓｅｒ、例えば「Ｌ１５」（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ；配列番号４８３）、ポリ（Ｇｌｙ−Ａｌａ）２−４およびポリ（Ａｌａ）１−８である。ペプチジルリンカーの他の具体例としては、（Ｇｌｙ）５Ｌｙｓ（配列番号４８４）、および（Ｇｌｙ）５ＬｙｓＡｒｇ（配列番号４８５）が挙げられる。有用なペプチジルリンカーの他の例は：
（Ｇｌｙ）３Ｌｙｓ（Ｇｌｙ）４（配列番号４８６）；
（Ｇｌｙ）３ＡｓｎＧｌｙＳｅｒ（Ｇｌｙ）２（配列番号４８７）；
（Ｇｌｙ）３Ｃｙｓ（Ｇｌｙ）４（配列番号４８８）；および
ＧｌｙＰｒｏＡｓｎＧｌｙＧｌｙ（配列番号４８９）；
である。上述の命名法を説明すると、例えば、（Ｇｌｙ）３Ｌｙｓ（Ｇｌｙ）４は、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ（配列番号４９０）を意味する。ＧｌｙおよびＡｌａの他の組み合わせもまた有用である。
他の好ましいリンカーは、本明細書において、「Ｌ５」（ＧＧＧＧＳ；または「Ｇ４Ｓ」；配列番号４９１）、「Ｌ１０」（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ；配列番号４９２）；「Ｌ２０」（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ；配列番号４７７）；「Ｌ２５」（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ；配列番号４９３）として特定されるもの、および以下の実施例において使用される、いずれかのリンカーである。
ペプチドリンカー部分を含む、本発明の組成物のいくつかの実施形態において、酸性残基、例えば、グルタミン酸またはアスパラギン酸残基は、リンカー部分のアミノ酸配列中に配置される。例としては、以下のペプチドリンカー配列が挙げられる：
ＧＧＥＧＧＧ（配列番号４９４）；
ＧＧＥＥＥＧＧＧ（配列番号４９５）；
ＧＥＥＥＧ（配列番号４９６）；
ＧＥＥＥ（配列番号４９７）；
ＧＧＤＧＧＧ（配列番号４９８）；
ＧＧＤＤＤＧＧ（配列番号４９９）；
ＧＤＤＤＧ（配列番号５００）；
ＧＤＤＤ（配列番号５０１）；
ＧＧＧＧＳＤＤＳＤＥＧＳＤＧＥＤＧＧＧＧＳ（配列番号５０２）；
ＷＥＷＥＷ（配列番号５０３）；
ＦＥＦＥＦ（配列番号５０４）；
ＥＥＥＷＷＷ（配列番号５０５）；
ＥＥＥＦＦＦ（配列番号５０６）；
ＷＷＥＥＥＷＷ（配列番号５０７）；または
ＦＦＥＥＥＦＦ（配列番号５０８）。
他の実施形態において、リンカーは、リン酸化部位、例えば、Ｘ１Ｘ２ＹＸ４Ｘ５Ｇ（配列番号５０９）（ここでＸ１、Ｘ２、Ｘ４、およびＸ５はそれぞれ独立していずれかのアミノ酸残基である）；Ｘ１Ｘ２ＳＸ４Ｘ５Ｇ（配列番号５１０）（ここでＸ１、Ｘ２，Ｘ４およびＸ５はそれぞれ独立していずれかのアミノ酸残基である）；またはＸ１Ｘ２ＴＸ４Ｘ５Ｇ（配列番号５１１）（ここでＸ１、Ｘ２、Ｘ４およびＸ５はそれぞれ独立していずれかのアミノ酸残基である）を構成する。
ここで示されるリンカーは例示的なものであり、本発明の範囲に含まれるペプチジルリンカーは、さらにより長い場合もあり、かつ他の残基を含み得る。ペプチジルリンカーは、例えば、半減期延長部分との結合のためのシステイン、別のチオール、または求核試薬を含み得る。別の実施形態において、リンカーは、官能化半減期延長部分であるマレイミド、ヨードアセトアミドまたはチオエステルとの結合のための、システインもしくはホモシステイン残基、または他の２−アミノ−エタンチオ−ルもしくは３−アミノ−プロパンチオ−ル部分を含む。
別の有用なペプチジルリンカーは、ランダムなＧｌｙ／Ｓｅｒ／Ｔｈｒ配列、例えば：ＧＳＧＳＡＴＧＧＳＧＳＴＡＳＳＧＳＧＳＡＴＨ（配列番号５１２）またはＨＧＳＧＳＡＴＧＧＳＧＳＴＡＳＳＧＳＧＳＡＴ（配列番号５１３）を含む、大きな可動性リンカーであり、これは、おおよそ１ｋＤａのＰＥＧ分子の大きさであると推測される。あるいは、有用なペプチジルリンカーは、強固なへリックス構造を形成することが当技術分野で知られるアミノ酸配列から成る場合もある（例えば、強固なリンカー：−ＡＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＡＧＧ−／／配列番号５１４）。さらに、ペプチジルリンカーはまた、非ペプチジルセグメント、例えば、式−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−で表される、炭素数６の脂肪族分子をも含み得る。ペプチジルリンカーを、本明細書に記載の誘導体を形成するように、改変することもできる。
所望により、非ペプチジルリンカー部分はまた、半減期延長部分を半減期延長部分結合毒素ペプチドアナログのペプチド部分と結合させるためにも有用である。例えば、アルキルリンカー、例えば、−ＮＨ−（ＣＨ２）ｓ−Ｃ（Ｏ）−（ここでｓ＝２〜２０である）を使用することもできる。これらのアルキルリンカーは、いずれかの非立体障害基、例えば低級アルキル（例えば、Ｃ１−Ｃ６）、低級アシル、ハロゲン（例えば、Ｃｌ、Ｂｒ）、ＣＮ、ＮＨ２、フェニル等により、さらに置換され得る。例示的な非ペプチジルリンカーは、ＰＥＧリンカーである（例えば、以下に示すもの）：
（ＩＩＩ）
Figure 2017031157
 式中、ｎは、リンカーが約１００〜約５０００ダルトン（Ｄａ）、好ましくは約１００〜約５００Ｄａの分子量を有するようなものである。
一実施形態において、非ペプチジルリンカーは、アリールである。リンカーを、本明細書に記載されるものと同一の方法で改変して、誘導体を形成してもよい。さらに、ＰＥＧアルデヒドを使用する還元的アルキル化またはヒドロキシスクシンイミドもしくはＰＥＧのカルボネートエステルを使用するアシル化、またはチオール複合体化により、ＰＥＧ部分を、Ｎ末端アミンまたは選択された側鎖アミンと結合させてもよい。
「アリール」は、フェニルまたは飽和、部分飽和、もしくは不飽和の３−、４−、もしくは５員の炭素架橋と隣接して融合したフェニルであり、フェニルまたは架橋は、Ｃ１−８アルキル、Ｃ１−４ハロアルキルまたはハロから選択される０、１、２または３個の置換基により、置換される。「ヘテロアリール」は、不飽和の５、６もしくは７員の単環式、または部分飽和もしくは不飽和の６、７、８、９、１０もしくは１１員の二環式環であり、ここで少なくとも１つの環は不飽和であり、単環式および二環式環は、Ｎ、ＯおよびＳから選択される１、２、３もしくは４個の原子を含み、ここで環は、Ｃ１−８アルキル、Ｃ１−４ハロアルキルおよびハロから選択される、０、１、２もしくは３個の置換基により置換される。
本発明の組成物の非ペプチド部分、例えば非ペプチジルリンカーまたは非ペプチド半減期延長部分は、従来の有機化学反応により合成することができる。
上述は例証に過ぎず、本発明において所望により使用することができるリンカーの種類を網羅するものではない。
電位依存性ナトリウムチャネルＮａＶ１．３および／またはＮａＶ１．７の単離されたポリペプチドアンタゴニストを組み入れた本発明の組成物、特に、本発明の毒素ペプチドアナログ、ＧｐＴｘ−１およびＧｐＴｘ−１は、半減期延長部分に結合しているかいないかに関わらず、例えばヒトの、疼痛の治療における治療薬として有用である。いくつかのグループにより独立して反復して提供された、臨床的な遺伝情報は、Ｎａｖ１．７（ＳＣＮ９Ａ）遺伝子の生成物が、疼痛の認知のための主要な制御ポイントであることを明確に示す。ヒトにおいて、該遺伝子の機能喪失型の切断変異は、測定される全ての疼痛形態に対する完全な非感受性をもたらすが、一方ヒト慢性疼痛症候群である、原発性肢端紅痛症および発作性激痛障害は、Ｎａｖ１．７チャネルのより容易なまたはより長期化した開口をもたらす、ＮａＶ１．７における機能獲得型変異に起因する。注目すべきことに、ＮａＶ１．７における切断変異または機能獲得型変異のいずれかを有する患者に、他の主要な神経学的異常は存在しない（Goldberg et al., Clin Genet 71:311-319 (2007); Cox et al., Nature 444:894-898 (2006); Ahmad et al., Hum Mol Genet 16:2114-2121 (2007); Fertleman et al., Neurology 69:586-595 (2007)）。従って、ＮａＶ１．７を遮断する治療薬は、ヒトにおける疼痛治療のために、大いに有用であることが期待され得る。
具体的な臨床的慢性疼痛症候群としては、限定されないが、ガン、化学療法、変形性関節症、線維筋痛症、原発性肢端紅痛症、帯状疱疹後神経痛、有痛性糖尿病性神経障害、特発性有痛性神経障害、神経腫、発作性激痛障害、片頭痛、三叉神経痛、口顔の疼痛、群発性頭痛または他の頭痛、複合性局所疼痛症候群（ＣＲＰＳ）、腰椎術後疼痛症候群、坐骨神経痛（腰痛を含む）、間質性膀胱炎および骨盤痛、蜂巣炎およびリウマチ痛または関節痛を含む炎症誘発性の疼痛、に関連するかまたは起因する疼痛が挙げられる。ＮａＶ１．７阻害剤はまた、限定されないが、外傷、やけど、または手術後の疼痛を含む、急性または持続性疼痛の治療のためにも、多大な有用性を有し得る。特に、ＮａＶ１．７の阻害は、オピオイド薬剤の使用を制限する、認知および胃腸系への悪影響をもたらすことが予期されない。さらに、オピオイド類とは異なり、ＮａＶ１．７阻害剤は、呼吸抑制、患者の耐性、または習慣性を引き起こさないはずである。また、ヒトおよび非ヒト霊長類におけるＮａＶ１．７の発現は、圧倒的に末梢神経系において生じ、脳または脊髄におけるメッセージまたはタンパク質は極わずかであるかまたは全く無い（Ahmad et al.,Hum Mol 遺伝子16:2114-2121, 2007）。これらの研究と一致して、我々のデータは、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションで検査された死後のヒト由来のＣＮＳ領域内で、疼痛応答における既知の関与のない領域である、視床下部の核ならびに脊髄および脊髄上衣の腹側運動野において、ＮａＶ１．７の伝令ＲＮＡが、わずかな量のみ存在したことを示す。対照的に、大脳皮質、小脳、副腎髄質、下垂体、または腰髄の背側もしくは深部領域に、ＮａＶ１．７は存在しなかった。強力なＮａＶ１．７の発現が、後根神経節、三叉神経節、ならびに胃および腸の筋層間神経叢を含む末梢神経において、見いだされた（図１３Ａ−Ｅを参照のこと）。これは、ＮａＶ１．７の阻害剤が、ＣＮＳ浸透の必要なく、末梢神経系を介して、鎮痛有効性を発揮することを示唆する。ペプチドは一般的に血液脳関門を通過しないため、脳に媒介される一般的な非特異的副作用、例えば眩暈、錯乱、または鎮静をペプチドが起こさないという点において、ペプチド阻害剤は結果として、いくらかのＣＮＳ浸透性を有する小分子よりも優位性を有する。
ＮａＶ１．７の臨床的な遺伝子データは、ＮａＶ１．７が、神経系への損傷およびその後の神経系のリモデリングを有する患者において、疼痛認知におけるその主要な役割を維持するかどうかという問題には対処しない。このようなリモデリングは、多くの慢性疼痛症候群の特徴である可能性がある（Woolf and Ma, Neuron 55:353-364 (2007)）。このような場合において、ＮａＶ１．３ナトリウムチャネルの拮抗作用は、多大な治療的な利益を証明し得る。公開された結果は、ヒトにおける神経因性疼痛の標準的モデルである、脊髄神経結紮手術に付したラットの感覚神経における、ＮａＶ１．３をコードするｍＲＮＡの上方制御を示す（Hains et al., J Neurosci 24:4832-4839, 2004）。これは、一部の慢性疼痛症候群、特に神経因性疼痛において、ＮａＶ１．７に加えてＮａＶ１．３を阻害することが、最良の鎮痛有効性をもたらし得るということを意味する。ラット感覚神経の細胞体の電気生理学的研究は、脊髄神経の結紮が、ＳＣＮ９Ａ（ＮａＶ１．７）およびＳＣＮ３Ａ（ＮａＶ１．３）によりコードされる可能性が最も高い高速のテトロドトキシン感受性サブタイプへの、ナトリウムチャネル発現における劇的なシフトの原因となることを示す（図１４Ａ〜Ｅを参照のこと）。これもまた、いくつかの疼痛症候群において、Ｎａｖ１．７およびＮａｖ１．３の同時の二重阻害が、疼痛の最も効果的な抑制をもたらし得ることを意味する。
従って、本発明はまた、本明細書に記載される、疾患、障害、または他の医学的状態、例えば、限定されないが、本明細書に記載される、慢性疼痛、急性疼痛、もしくは持続性疼痛、または疼痛症候群のうちのいずれかの、治療または予防のための薬剤の製造における、本発明の組成物のうちの１つまたは複数の使用にも関する。
このような医薬組成物は、広範な送達経路、例えば、注射もしくは注入による血管内送達経路、皮下（「ｓ．ｃ．」）、静脈内（「ｉ．ｖ．」）、筋肉内、腹腔内（「ｉ．ｐ．」）、硬膜外、またはクモ膜下腔内送達経路、または経口、経腸、径肺（例えば、吸入剤）、鼻腔内、経粘膜（例えば、舌下投与）、経皮もしくは他の送達経路、および／または当技術分野で公知の投与形態により、患者に投与するために形成することができる。薬剤またはＧｐＴｘ−１もしくは他の本発明の組成物を含む医薬組成物の送達は、自己投与もしくは病院環境におけるもの、または、最も正確な投薬および最も安定した血漿暴露レベルを達成するための埋め込み型送達ポンプを介したものかどうかに関わらず、標準的な注射用の様式により実施し得る。本発明の医薬組成物を、液体形態に調製してもよく、または凍結乾燥形態などの乾燥粉末形態、または結晶形態に調製してもよい。経口または腸内の使用のために、医薬組成物を、例えば、錠剤、トローチ剤、ロゼンジ剤、水性または油性懸濁液、分散性の散剤または粒剤、乳剤、硬性または軟性カプセル剤、シロップ剤、エリキシル剤または腸内処方として形成することもできる。
医薬組成物
概論
本発明はまた、本発明の組成物および薬剤的に許容される担体を含む医薬組成物も提供する。このような医薬組成物は、広範な送達経路、例えば、注射または注入などによる血管内の送達経路、皮下、筋肉内、腹腔内、硬膜外もしくはクモ膜下腔内送達経路、または経口、経腸、径肺（例えば、吸入剤）、鼻腔内、経粘膜（例えば、舌下投与）、経皮もしくは他の送達経路、および／または当技術分野で公知の投与形態により患者に投与するために、形成することができる。本発明の医薬組成物を、液体形態に調製してもよく、または、乾燥粉末形態、例えば凍結乾燥された形態に調製してもよい。経口または腸内の使用のために、医薬組成物を、例えば、錠剤、トローチ剤、ロゼンジ剤、水性または油性懸濁液、分散性の散剤または粒剤、乳剤、硬性または軟性カプセル剤、シロップ剤、エリキシル剤または腸内処方として形成することもできる。
本発明の実施において、「薬剤的に許容される担体」とは、医薬組成物を製剤する上で有用な、当業者に公知のあらゆる生理的に許容される物質であり、これらには、単独または組み合わせで、あらゆる薬剤的に許容される希釈剤、賦形剤、分散剤、結合剤、充填剤、流動促進剤、減摩剤、圧縮補助剤、錠剤崩壊剤（崩壊剤）、懸濁化剤、滑沢剤、香味剤、付臭剤、甘味剤、浸透および透過促進剤、保存剤、界面活性剤、可溶化剤、乳化剤、増粘剤、補助剤、染料、コーティング剤、カプセル化材料、および／または他の添加物が含まれる。このような医薬組成物は、種々の緩衝剤内容（例えば、トリス−ＨＣｌ、アセテート、ホスフェート）、ｐＨ、およびイオン強度の希釈剤；界面活性剤および可溶化剤（例えばトゥイーン（登録商標）８０、ポリソルベート８０）、抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸、メタ重亜硫酸ナトリウム）、保存剤（例えば、Ｔｈｉｍｅｒｓｏｌ（登録商標）、ベンジルアルコール）および充填剤（例えば、ラクトース、マンニトール）等の添加物；ポリ乳酸、ポリグリコール酸等のポリマー化合物の微粒子製剤中への、またはリポソーム中への材料の組み入れ、を含み得る。ヒアルロン酸を使用することもでき、これは、循環中の持続期間の促進効果を有し得る。このような組成物は、物理的状態、安定性、ｉｎ ｖｉｖｏ放出速度、および本発明のタンパク質および誘導体のｉｎ ｖｉｖｏクリアランスの速度に影響を与える得る。例えば、その全体が参照により本明細書に組み入れられるRemington’s Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. (1990, Mack Publishing Co., Easton, PA 18042)、頁１４３５〜１７１２を参照のこと。組成物を、液体形態に調製することができ、または、乾燥粉末、例えば凍結乾燥形態に調製することもできる。埋め込み型徐放性製剤もまた、経皮または経粘膜製剤と同様に、有用である。さらに（または代替として）、本発明は、肺、鼻腔内、または皮下送達経路を介して投与することができる、当業者に公知の、種々の緩効性もしくは徐放性製剤または微小粒子製剤、例えば、徐放性微小粒子製剤などのうちのいずれかにおける使用のための組成物を提供する。（例えば、Murthy et al., Injectable compositions for the controlled delivery of pharmacologically active compound, 米国特許第６，８８７，４８７号；Manning et al., Solubilization of pharmaceutical substances in an organic solvent and preparation of pharmaceutical powders using the same, 米国特許第５，７７０，５５９号および同５，９８１，４７４号；Lieberman et al., Lipophilic complexes of pharmacologically active inorganic mineral acid esters of organic compounds, 米国特許第５，００２，９３６号；Gen, Formative agent of protein complex, 米国特許出願公開第２００２／０１１９９４６Ａ１号；Goldenberg et al., Sustained release formulations, 国際公開第２００５／１０５０５７Ａ１号を参照のこと）。
不活性な材料で、本発明の組成物を希釈するかまたは本発明の医薬組成物の体積を増加させることもできる。このような希釈剤には、炭水化物、特に、マンニトール、α−ラクトース、無水ラクトース、セルロース、ショ糖、修飾されたデキストランおよびデンプンが含まれ得る。三リン酸カルシウム、炭酸マグネシウムおよび塩化ナトリウムを含む、ある特定の無機塩も、充填剤として使用し得る。いくつかの市販の希釈剤は、Ｆａｓｔ−Ｆｌｏ、Ｅｍｄｅｘ、ＳＴＡ−Ｒｘ１５００、ＥｍｃｏｍｐｒｅｓｓおよびＡｖｉｃｅｌｌである。
種々の従来の増粘剤が、医薬組成物のクリーム、軟膏、座薬およびゲル形態、例えば限定されないが、アルギネート、キサンタンガム、またはワセリン等において有用であり、本発明の医薬組成物のそのような構成においても、使用され得る。浸透または透過促進剤、例えばポリエチレングリコールモノラウレート、ジメチルスルホキシド、Ｎ−ビニル−２−ピロリドン、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）−ピロリドン、または３−ヒドロキシ−Ｎ−メチル−２−ピロリドンもまた、使用することができる。ハイドロゲルマトリックスを作製するための有用な技術は、公知である。（例えば、Feijen, Biodegradable hydrogel matrices for the controlled release of pharmacologically active agents, 米国特許第４，９２５，６７７号；Shah et al., Biodegradable pH/thermosensitive hydrogels for sustained delivery of biologically active agents, 国際公開第００／３８６５１Ａ１号）。このような生分解性のゲルマトリックスは、例えば、タンパク性成分と多糖類またはムコ多糖類成分を架橋し、次いで送達される本発明の組成物とともに装填することにより、形成することができる。
無菌の溶液または懸濁液である、本発明の液体医薬組成物は、例えば、筋肉内、クモ膜下腔内、硬膜外、血管内（例えば、静脈内または動脈内）、腹腔内または皮下への注射により、患者に投与することが出来る。（例えば、Goldenberg et al., Suspensions for the sustained release of proteins, 米国特許第６，２４５，７４０号および国際公開第００／３８６５２Ａ１号を参照のこと）。無菌溶液を、静脈内注入により投与することもできる。本発明の組成物を、滅菌水、生理食塩水、緩衝生理食塩水または他の適切な無菌注射用媒体を使用して、患者に投与する前の都合の良い時間に溶解または懸濁することができる、凍結乾燥粉末などの無菌固体医薬組成物中に、含有させることができる。
埋め込み型の徐放性製剤もまた、本発明の医薬組成物の有用な実施形態である。例えば、ヒトまたは非ヒト脊椎動物の体内または皮下に埋め込まれた生分解性マトリックスである、薬剤的に許容される担体は、上述されるものと同様のハイドロゲルであり得る。あるいは、それを、ポリ−α−アミノ酸成分から形成してもよい。（Sidman, Biodegradable, implantable drug delivery device, and process for preparing and using same, 米国特許第４，３５１，３３７号）。薬剤送達のためのインプラントを作製するための他の技術もまた公知であり、本発明において有用である。
粉末形態において、薬剤的に許容される担体は、本発明の組成物を含む微細化された有効成分と混合される、微細化された固体である。例えば、いくつかの実施形態において、粉末形態は、医薬組成物を吸入剤として形成する際に有用である。（例えば、Zeng et al., Method of preparing dry powder inhalation compositions, 国際公開第２００４／０１７９１８号；Trunk et al., Salts of the CGRP antagonist BIBN4096 and inhalable powdered medicaments containing them, 米国特許第６，９００，３１７号を参照のこと）。
不活性な材料で、本発明の化合物を希釈するかまたはその体積を増加することができる。これらの希釈剤には、炭水化物、特にマンニトール、α−ラクトース、無水ラクトース、セルロース、ショ糖、修飾されたデキストランおよびデンプンが含まれ得る。三リン酸カルシウム、炭酸マグネシウムおよび塩化ナトリウムを含む、ある特定の無機塩もまた、充填剤として使用し得る。いくつかの市販の希釈剤は、Ｆａｓｔ−Ｆｌｏ（商標）、Ｅｍｄｅｘ（商標）、ＳＴＡ−Ｒｘ（商標）１５００、Ｅｍｃｏｍｐｒｅｓｓ（商標）およびＡｖｉｃｅｌｌ（商標）である。
医薬組成物の固体剤形への製剤には、崩壊剤が含まれ得る。崩壊剤として使用される材料としては、限定されないが、市販のデンプン系崩壊剤、Ｅｘｐｌｏｔａｂ（商標）を含む、デンプンが挙げられる。デンプングリコール酸ナトリウム、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ（商標）、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ウルトラミロペクチン、アルギン酸ナトリウム、ゼラチン、橙皮、酸カルボキシメチルセルロース、海綿およびベントナイトはすべて、使用可能である。不溶性陽イオン交換樹脂は、崩壊剤の別の形態である。粉末ガムを、崩壊剤および結合剤として使用することができ、これらには、寒天、カラヤまたはトラガントなどの粉末ガムが含まれ得る。アルギン酸およびそのナトリウム塩もまた、崩壊剤として有用である。
結合剤は、治療薬を結着させて硬質錠剤を形成するために使用することができ、例えばアカシア、トラガント、デンプンおよびゼラチンなどの天然物由来の材料を含み得る。他には、メチルセルロース（ＭＣ）、エチルセルロース（ＥＣ）およびカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）が挙げられる。ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）およびヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）の双方を、アルコール性溶液中で使用して、治療薬を顆粒化することができる。減摩剤を治療薬の製剤中に含有させて、製剤プロセスの間の固着を予防することができる。滑沢剤を、治療薬およびダイ壁間の層として使用することができ、これらには、限定されないが、ステアリン酸（そのマグネシウム塩およびカルシウム塩を含む）、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、流動パラフィン、植物油およびワックスが含まれ得る。可溶性の滑沢剤、例えばラウリル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸マグネシウム、種々の分子のポリエチレングリコール、Ｃａｒｂｏｗａｘ４０００および６０００もまた、使用することができる。
製剤の間の薬剤の流動性を改善し、圧縮の間の再配置を補助するための流動促進剤を、添加することもできる。流動促進剤には、デンプン、タルク、焼成シリカおよび水和ケイアルミン酸が含まれ得る。
本発明の化合物の水環境への溶解を補助するために、界面活性剤を湿潤剤として添加し得る。界面活性剤には、アニオン性界面活性剤、例えばラウリル硫酸ナトリウム、ジオクチルスルホコハク酸ナトリウムおよびジオクチルスルホン酸ナトリウムが含まれ得る。カチオン性界面活性剤を使用することもでき、これらには塩化ベンザルコニウムまたは塩化ベンゼトニウムが含まれ得る。界面活性剤として製剤に含まれ得る、可能性のある非イオン性界面活性剤のリストは、ラウロマクロゴール４００、ポリオキシ４０ステアレート、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油１０、５０および６０、モノステアリン酸グリセリン、ポリソルベート４０、６０、６５および８０、ショ糖脂肪酸エステル、メチルセルロースおよびカルボキシメチルセルロースである。これらの界面活性剤は、タンパク質または誘導体の製剤中に、単独でまたは異なる比率の混合物として存在し得る。
経口剤形
本発明の組成物の経口剤形もまた、有用である。必要な場合、経口送達が有効であるように、組成物を化学的に修飾することもできる。一般的に、意図される化学的修飾は、少なくとも１つの部分を分子自体に結合させることであり、ここで前記部分は、（ａ）タンパク分解の阻害；および（ｂ）胃または腸から血流への取り込みを可能にする。化合物の全体的な安定性の増加、および体内での循環時間の増加もまた、望まれる。本発明において、共有結合した半減期延長部分として有用な部分もまた、この目的に使用することができる。そのような部分の例としては、ＰＥＧ、エチレングリコールおよびプロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドンおよびポリプロリンが挙げられる。例えば、Abuchowski and Davis (1981), Soluble Polymer-Enzyme Adducts, Enzymes as Drugs (Hocenberg and Roberts, eds.), Wiley-Interscience, New York, NY, pp 367-83; Newmark, et al. (1982), J. Appl. Biochem. 4:185-9. を参照のこと。使用し得る他のポリマーは、ポリ−１，３−ジオキソランおよびポリ−１，３，６−チオキソカンである。上述の医薬品用途に好ましいものは、ＰＥＧ部分である。
経口送達剤形用に、ナトリウムＮ−（８−［２−ヒドロキシベンゾイル］アミノ）カプリレート（ＳＮＡＣ）などの、修飾された脂肪族アミノ酸の塩を担体として使用して、本発明の治療用化合物の吸収を促進することもまた可能である。ＳＮＡＣを使用するヘパリン製剤の臨床的な有効性は、エミスフィア・テクノロジー社（Emisphere Technologies）により実施された第ＩＩ相臨床試験において実証されている。米国特許第５，７９２，４５１号、“Oral drug delivery composition and methods.”を参照のこと。
一実施形態において、薬剤的に許容される担体は、液体であり得、医薬組成物は、溶剤、懸濁剤、乳濁剤、シロップ剤、エリキシル剤または加圧組成物の形態に調製される。有効成分（例えば、本発明の組成物）を、薬剤的に許容される液体担体、例えば水、有機溶媒、両方の混合物、または薬剤的に許容される油または脂肪中に溶解、希釈または懸濁することができる。液体担体には、他の好適な医薬品添加物、例えば界面活性剤および／または可溶化剤（例えば、トゥイーン８０、ポリソルベート８０）、乳化剤、適切なｐＨの緩衝剤（例えばトリス−ＨＣｌ、アセテート、ホスフェート）、補助剤、抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸、メタ重亜硫酸ナトリウム）、保存剤（例えば、Ｔｈｉｍｅｒｓｏｌ、ベンジルアルコール）、甘味剤、着香剤、懸濁化剤、増粘剤、充填剤（例えば、ラクトース、マンニトール）、着色剤、粘度制御剤、安定剤、電解質、オスモライトまたは浸透圧調節剤が含まれ得る。添加物を製剤中に含有させて、本発明の組成物の取り込みを促進することもできる。この特性を有する可能性のある添加物は、例えば、脂肪酸であるオレイン酸、リノール酸およびリノレン酸である。
経口固体剤形は有用であり、これらは、参照により本明細書にその全体が組み込まれる、Remington’s Pharmaceutical Sciences (1990)（上記）の第89章に全般的に記載されている。固体剤形としては、錠剤、カプセル剤、丸剤、トローチ剤またはロゼンジ剤、カシェ剤またはペレット剤が挙げられる。また、リポソームまたはプロテイノイドカプセル化を使用して、本発明の組成物を製剤することもできる（例えば、米国特許第４，９２５，６７３号において報告されるプロテイノイドマイクロスフェアなどのように）。リポソームカプセル化を使用し、リポソームを種々のポリマーで誘導体化することもできる（例えば、米国特許第５，０１３，５５６号）。治療薬のための、可能な固体剤形は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、K., Modern Pharmaceutics (1979), edited by G. S. Banker and C. T. Rhodesの第１０章に記載されている。一般に製剤は、本発明の化合物、ならびに胃環境に対する保護および生物学的に活性な材料の腸における放出を可能にする不活性成分を含む。
本発明の組成物を、約１ｍｍの粒径の粒剤またはペレット剤形態の微細な多粒子として、製剤中に含有させることもできる。カプセル投与のための材料の製剤は、粉末剤、軽く圧縮されたプラグまたは錠剤でもあり得る。治療薬を、圧縮により調製することもできる。
着色剤および着香剤は、全て含まれ得る。例えば、タンパク質（または誘導体）を製剤化し（例えば、リポソームまたはマイクロスフェアカプセル化により）、次いで、着色剤および着香剤を含む冷蔵保存飲料などの食用品中に、さらに含有させることができる。
錠剤形態においては、有効成分を、必要な圧縮特性を有する薬剤的に許容される担体と好適な割合で混合し、所望の形状およびサイズに圧縮する。
散剤および錠剤は、最大９９％までの有効成分を含有することが好ましい。好適な固体担体としては、例えば、リン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、タルク、糖類、ラクトース、デキストリン、デンプン、ゼラチン、セルロース、ポリビニルピロリジン、低融点ワックスおよびイオン交換樹脂が挙げられる。
徐放性製剤が望ましいものであり得る。拡散または浸出機構のどちらかによる放出を可能にする不活性マトリックス、例えば、ガムの中に、本発明の組成物を組み込むことができる。例えば、アルギネート、多糖類などの、徐々に分解するマトリックスを、製剤中に組み込むこともできる。本発明の組成物の別の徐放性形態は、Ｏｒｏｓ（商標）治療用システム（アルザ社（Alza Corp.）に基づく方法、すなわち、浸透作用に因り、単一の小さな開口部を介して水を侵入させて薬剤を押し出す半透膜に、薬剤を封入することによるものである。いくつかの腸溶コーティングもまた、遅延放出作用を有する。
他のコーティング剤を、製剤に使用することができる。これらには、コーティングパンに適用し得る種々の糖類が含まれる。治療薬を、フィルムコーティング錠剤で投与することもでき、この場合に使用される材料は、２つのグループに分類される。第１のグループは、非腸溶性材料であり、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、メチルヒドロキシ−エチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピル−メチルセルロース、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ポピドン（providone）およびポリエチレングリコールが含まれる。第２のグループは、通常はフタル酸のエステルである、腸溶性材料から成る。
材料の混合物を使用して、最適なフィルムコーティングを提供し得る。フィルムコーティングは、パンコーターもしくは流動床中で、または圧縮コーティングにより、実施し得る。
肺送達形態
本発明の組成物の肺送達もまた有用である。タンパク質（または誘導体）が、吸入の間に哺乳動物の肺に送達され、肺上皮層を横断して、血流に達する（これに関する他の報告としては、Adjei et al., Pharma. Res. (1990) 7: 565-9; Adjei et al. (1990), Internatl. J. Pharmaceutics 63: 135-44 (leuprolide acetate); Braquet et al. (1989), J. Cardiovasc. Pharmacol. 13 (suppl.5): s.143-146 (endothelin-1); Hubbard et al. (1989), Annals Int. Med. 3: 206-12 (α1-antitrypsin); Smith et al. (1989), J. Clin. Invest. 84: 1145-6 (α1-proteinase); Oswein et al. (March 1990), "Aerosolization of Proteins," Proc. Symp. Resp. Drug Delivery II, Keystone, Colorado (recombinant human growth hormone); Debs et al. (1988), J. Immunol. 140: 3482-8 (interferon-γand tumor necrosis factorα)および Platz et al.,米国特許第５，２８４，６５６号(granulocyte colony stimulating factor)が挙げられる。）
治療用製品の肺送達のために設計された広範な機械的デバイスが、本発明の実施において有用であり、限定されないが、噴霧器、定量吸入器、および粉末吸入器が挙げられ、これらのすべてが、当業者に公知である。本発明の実施のために好適な市販のデバイスのいくつかの具体例は、Ｕｌｔｒａｖｅｎｔ噴霧器、マリンクロット社（Mallinckrodt, Inc.）製、ミズーリ州、セントルイス；Ａｃｏｒｎ ＩＩ噴霧器、マークエスト・メディカルプロダクト社（Marquest Medical Products）製、コロラド州、エングルウッド；Ｖｅｎｔｏｌｉｎ定量吸入器、グラクソ社（Glaxo Inc.）製、ノースキャロライナ州、リサーチトライアングルパーク；およびＳｐｉｎｈａｌｅｒ粉末吸入器、ファイソンズ社（Fisons Corp．）製、マサチューセッツ、ベッドフォード;が含まれる。例えば、Helgesson et al., Inhalation device, 米国特許第６，８９２，７２８号； McDerment et al., Dry powder inhaler, 国際公開第０２／１１８０１Ａ１号；Ohki et al., Inhalant medicator, 米国特許第６，２７３，０８６号を参照のこと）。全てのこのようなデバイスは、本発明の化合物を投与するために好適な製剤を使用する必要がある。一般に、各製剤は、使用されるデバイスの種類に特異的であり、治療において有用な希釈剤、補助剤および／または担体に加え、適切な噴霧剤材料の使用を含み得る。
肺末梢部までの最も効果的な送達のために、本発明の化合物を、最も有利には、平均粒径が１０μｍ（またはミクロン）未満、最も好ましくは、０．５〜５μｍの微粒子形態に調製するべきである。
薬剤的に許容される賦形剤としては、炭水化物、例えばトレハロース、マンニトール、キシリトール、ショ糖、ラクトース、およびソルビトールが挙げられる。製剤における使用のための他の成分には、ＤＰＰＣ、ＤＯＰＥ、ＤＳＰＣおよびＤＯＰＣが含まれ得る。天然または合成の界面活性剤を使用することができる。ＰＥＧを使用することができる（タンパク質またはアナログの誘導体化における使用とは別であっても）。デキストラン、例えばシクロデキストランを使用することができる。胆汁酸塩および他の関連する促進剤を使用することができる。セルロースおよびセルロース誘導体を使用することができる。例えば、緩衝製剤における使用のように、アミノ酸を使用することができる。
リポソーム、マイクロカプセルもしくはマイクロスフェア、包接錯体、または他の種類の担体の使用もまた、意図される。
ジェット式または超音波式のどちらかの噴霧器での使用に好適な製剤は、一般に、溶液のｍＬあたり約０．１〜２５ｍｇの生物学的に活性なタンパク質の濃度で水に溶解した本発明の化合物を含む。製剤は、緩衝剤および単純な糖をも含み得る（例えば、タンパク質安定化および浸透圧の制御のため）。噴霧器用製剤はまた、エアロゾル形成の際の溶液の噴霧化により生じる、タンパク質の表面誘起凝集を減少させるかまたは防止するための界面活性剤をも含み得る。
定量吸入デバイスで使用するための製剤は、一般的に、界面活性剤の補助により噴霧剤中に懸濁された本発明の化合物を含有する、微細化された粉末を含む。噴霧剤は、この目的のために使用されるいかなる従来の材料、例えばクロロフルオロカーボン、ヒドロクロロフルオロカーボン、ヒドロフルオロカーボン、またはトリクロロフルオロメタン、ジクロロジフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタノール、および１，１，１，２−テトラフルオロエタンを含む炭化水素、またはそれらの組み合わせでもあり得る。好適な界面活性剤としては、ソルビタントリオレエートおよび大豆レシチンが挙げられる。オレイン酸もまた、界面活性剤として有用である。（例えば、Backstrom et al., Aerosol drug formulations containing hydrofluoroalkanes and alkyl saccharides, 米国特許第６，９３２，９６２号を参照のこと）。
粉末吸入デバイスから投与するための製剤は、本発明の化合物を含む微細化された乾燥粉末を含み、かつデバイスからの粉末散布を促進する量、例えば製剤の５０〜９０重量％の充填剤、例えばラクトース、ソルビトール、ショ糖、マンニトール、トレハロース、またはキシリトールをも含み得る。
経鼻送達形態
本発明において、本発明の組成物および／または医薬組成物の鼻腔内送達もまた有用であり、これにより、鼻内部への投与後、肺中に製品を沈着させる必要なく、組成物を血流まで直接通過させることができる。鼻腔内投与に好適な製剤としては、デキストランまたはシクロデキストランを含むものが挙げられ、および鼻腔内送達デバイスは公知である（例えば、Freezer, Inhaler, 米国特許第４，０８３，３６８号を参照のこと）。
経皮および経粘膜（例えば、頬側）送達形態
いくつかの実施形態においては、本発明の組成物を、薬剤的に許容される経皮または経粘膜パッチまたはトローチ剤の一部として形成する。経皮パッチ薬剤送達システム、例えば、マトリックス型の経皮パッチが公知であり、かつ本発明の医薬組成物のいくつかの実施形態を実施するために有用である。（例えば、Chien et al., Transdermal estrogen/progestin dosage unit, system and process, 米国特許第４，９０６，１６９号および同５，０２３，０８４号；Cleary et al., Diffusion matrix for transdermal drug administration and transdermal drug delivery devices including same, 米国特許第４，９１１，９１６号；Teillaud et al., EVA-based transdermal matrix system for the administration of an estrogen and/or a progestogen, 米国特許第５，６０５，７０２号；Venkateshwaran et al., Transdermal drug delivery matrix for coadministering estradiol and another steroid, 米国特許第５，７８３，２０８号；Ebert et al., Methods for providing testosterone and optionally estrogen replacement therapy to women, 米国特許第５，４６０，８２０号）。治療薬の経粘膜送達のための、種々の薬剤的に許容されるシステムもまた、当技術分野で公知であり、かつ本発明の実施と適合する。（例えば、Heiber et al., Transmucosal delivery of macromolecular drugs, 米国特許第５，３４６，７０１号および同５，５１６，５２３号；Longenecker et al., Transmembrane formulations for drug administration, 米国特許第４，９９４，４３９号）。
本発明の組成物の頬側送達もまた、有用である。頬側送達用製剤は、ペプチドとの使用が、当技術分野において公知である。例えば、口腔粘膜（例えば、舌下粘膜）を介した薬剤送達用に形成された、公知の錠剤またはパッチシステムには、薬剤、浸透促進剤、例えば胆汁酸塩またはフシジン酸、および親水性ポリマー、例えばヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、デキストラン、ペクチン、ポリビニルピロリドン、デンプン、ゼラチン、またはこの目的のために有用であることが公知のあらゆる他のポリマーを含有する内層を含む、いくつかの実施形態が含まれる。この内層は、口腔の湿潤粘膜組織に接触および接着するように適合させた一つの表面を有し得、かつ重なった非接着性の不活性層に接着する反対面を有し得る。所望により、そのような経粘膜送達システムは、内層が付加的な結合剤、着香剤、または充填剤をも含む、二層錠剤の形態であり得る。いくつかの有用なシステムは、浸透促進剤とともに、非イオン性界面活性剤を用いる。経粘膜送達デバイスは、クリーム剤、ゲル剤、もしくは軟膏剤などの遊離形態（free form）であってもよく、または錠剤、パッチ剤もしくはトローチ剤などの明確な形態（determinate form）を含んでもよい。本発明の組成物の送達は、例えば、接着層、裏打ち層、本発明の組成物を含む貯蔵部分を画定する透過性膜、膜の下にある剥離シールディスク（peel seal disc）、１つまたは複数のヒートシール、および取り外し可能な剥離ライナーなどの積層複合材を含む、経粘膜送達システムを介し得る。（例えば、Ebert et al., Transdermal delivery system with adhesive overlay and peel seal disc, 米国特許第５，６６２，９２5号；Chang et al., Device for administering an active agent to the skin or mucosa, 米国特許第４，８４９，２２４号および同４，９８３，３９５号）。これらの例は、利用可能な経粘膜薬剤送達技術の例示に過ぎず、本発明を限定するものではない。
投与量
上述の状態を治療するための方法に含まれる投与計画は、薬剤の作用を変化させる種々の因子、例えば患者の年齢、状態、体重、性別および食事、いずれかの感染の重症度、投与時間ならびに他の臨床的因子を考慮して、主治医により決定される。一般的に、一日の投与計画は、体重のキログラムあたり、本発明の化合物０．１〜１０００マイクログラムの範囲、好ましくはキログラム当たり０．１〜１５０マイクログラムの範囲にあるべきである。
さらなる説明のために、以下の番号を付与した実施形態が本発明に含まれる：
式：
Xaa 1Xaa 2 Xaa 3Xaa 4Xaa 5Xaa 6Xaa 7Xaa 8Xaa 9Xaa 10Xaa 11Xaa 12Xaa 13Xaa 14Asp15 Xaa 16 Xaa 17 Xaa 18Xaa 19 Xaa 20 Xaa 21Xaa 22Xaa 23 Xaa 24Xaa 25 Xaa 26Xaa 27Xaa 28Xaa 29Xaa 30Xaa 31Lys32Xaa 33Xaa 34Xaa 35 Xaa 36Xaa 37Xaa 38／／配列番号４７５
のアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドまたはその薬剤的に許容される塩を含む組成物であって、
式中：
Ｘａａ １Ｘａａ ２は存在しない；またはＸａａ １は任意のアミノ酸残基であり、Ｘａａ ２は任意のアミノ酸残基である；またはＸａａ １は存在せず、Ｘａａ ２は任意のアミノ酸残基であり；
Ｘａａ １８がＣｙｓである場合、Ｘａａ ３はＣｙｓである；またはＸａａ １８がＳｅＣｙｓである場合、Ｘａａ ３はＳｅＣｙｓである；またはＸａａ １８がアルキルアミノ酸残基である場合、Ｘａａ ３はアルキルアミノ酸残基であり；
Ｘａａ ４は、酸性、疎水性、塩基性、または中性親水性アミノ酸残基であり；
Ｘａａ ５は、Ｇｌｙ、Ａｌａ、疎水性、または塩基性アミノ酸残基であり；
Ｘａａ ６は、Ｇｌｙ、Ａｌａ、２−Ａｂｕ、Ｎｌｅ、Ｎｖａ、または疎水性アミノ酸残基であり；
Ｘａａ ７は、Ｇｌｙ、Ａｌａ、芳香族、または疎水性アミノ酸残基であり；
Ｘａａ ８は、塩基性、酸性、もしくは中性親水性アミノ酸残基、またはＡｌａ残基であり；
Ｘａａ ９は、塩基性または中性親水性アミノ酸残基であり；
Ｘａａ ２４がＣｙｓである場合、Ｘａａ １０はＣｙｓである；またはＸａａ ２４がＳｅＣｙｓである場合、Ｘａａ １０はＳｅＣｙｓであり；
Ｘａａ １１は任意のアミノ酸残基であり；
Ｘａａ １２は、Ｐｒｏ、酸性、中性、または疎水性アミノ酸残基である；
Ｘａａ １３は任意のアミノ酸残基であり；
Ｘａａ １４は任意のアミノ酸残基であり；
Ｘａａ １６は、塩基性、中性親水性、もしくは酸性アミノ酸残基、またはＡｌａ残基であり；
Ｘａａ ３１がＣｙｓである場合、Ｘａａ １７はＣｙｓであり；またはＸａａ ３１がＳｅＣｙｓである場合、Ｘａａ １７はＳｅＣｙｓであり；
Ｘａａ １８は、Ｃｙｓ、ＳｅＣｙｓ、またはアルキルアミノ酸残基であり；
Ｘａａ １９は任意のアミノ酸残基であり；
Ｘａａ ２０は、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、塩基性、または中性親水性残基であり；
Ｘａａ ２１は、塩基性、疎水性、または中性親水性アミノ酸残基であり；
Ｘａａ ２２は、疎水性または塩基性アミノ酸残基であり；
Ｘａａ ２３は、疎水性、塩基性、または中性親水性アミノ酸残基であり；
Ｘａａ ２４は、ＣｙｓまたはＳｅＣｙｓ残基であり；
Ｘａａ ２５は、Ｓｅｒ、Ａｌａ、または中性親水性アミノ酸残基であり；
Ｘａａ ２６は、Ａｌａ、酸性、塩基性、または中性親水性アミノ酸残基であり；
Ｘａａ ２７は、酸性、塩基性、中性親水性または疎水性残基であり；
Ｘａａ ２８は、芳香族または塩基性アミノ酸残基であり；
Ｘａａ ２９は、酸性、塩基性、または中性親水性アミノ酸残基であり；
Ｘａａ ３０は、Ｔｒｐ、５−ブロモＴｒｐ、６−ブロモＴｒｐ、５−クロロＴｒｐ、６−クロロＴｒｐ、１−Ｎａｌ、２−Ｎａｌ、またはチオＴｒｐ残基であり；
Ｘａａ ３１は、ＣｙｓまたはＳｅＣｙｓであり；
Ｘａａ ３３は、疎水性または芳香族アミノ酸残基であり；
Ｘａａ ３４は任意のアミノ酸残基であり；
Ｘａａ ３５は疎水性アミノ酸残基であり；
Ｘａａ ３６、Ｘａａ ３７、およびＸａａ ３８のそれぞれは独立して存在しないか、または独立して中性、塩基性、もしくは疎水性アミノ酸残基であり；
ここで：
Ｘａａ ３およびＸａａ １８がどちらもＣｙｓ残基である場合、残基Ｘａａ ３と残基Ｘａａ １８との間にはジスルフィド結合があり；またはＸａａ ３およびＸａａ １８がどちらもＳｅＣｙｓ残基である場合、残基Ｘａａ ３と残基Ｘａａ １８との間にはジセレニド結合があり；
Ｘａａ １０およびＸａａ ２４がどちらもＣｙｓ残基である場合、残基Ｘａａ １０と残基Ｘａａ ２４との間にはジスルフィド結合があり；またはＸａａ １０およびＸａａ ２４がどちらもＳｅＣｙｓ残基である場合、残基Ｘａａ １０と残基Ｘａａ ２４との間にはジセレニド結合があり；
Ｘａａ １７およびＸａａ ３１がどちらもＣｙｓ残基である場合、残基Ｘａａ １７と残基Ｘａａ ３１との間にはジスルフィド結合があり；またはＸａａ １７およびＸａａ ３１がどちらもＳｅＣｙｓ残基である場合、残基Ｘａａ １７と残基Ｘａａ ３１との間にはジセレニド結合があり；
アミノ−末端残基は、場合によってアセチル化、ビオチニル化、もしくは４−ペンチノイル化、またはＰＥＧ化されており；そして
カルボキシ末端残基は場合によってアミド化されている。
２．Ｘａａ ４が、Ａｌａ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｖａｌ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、ホモリジン、オルニチン、アルギニン、Ｎ−メチル−アルギニン、ω−アミノアルギニン、ω−メチル−アルギニン、１−メチル−ヒスチジン、３−メチル−ヒスチジン、ホモアルギニン、Ｎ−メチル−リジン、Ｎ−ε−メチルリジン、Ｄａｂ、シクロヘキシルグリシン（Ｃｈｇ）、シクロヘキシルアラニン（Ｃｈａ）、グリシン、ノルロイシン、ノルバリン、１−Ｎａｌ、２−Ｎａｌ、４−フェニル−フェニルアラニン（Ｂｉｐ）、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、ホスホセリン、ホスホチロシン、ガンマ−カルボキシグルタミン酸、およびＣｉｔ残基から選択される、実施形態１の組成物。
３．Ｘａａ ５が、Ａｌａ、Ｐｈｅ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｖａｌ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、ホモリジン、オルニチン、アルギニン、Ｎ−メチル−アルギニン、ω−アミノアルギニン、ω−メチル−アルギニン、１−メチル−ヒスチジン、３−メチル−ヒスチジン、ホモアルギニン、Ｎ−メチル−リジン、Ｎ−ε−メチルリジン、Ｄａｂ、グリシン、ノルロイシン、ノルバリン、１−Ｎａｌ、２−Ｎａｌ、１’ＮＭｅ−Ｔｒｐ、シクロヘキシルグリシン（Ｃｈｇ）、シクロヘキシルアラニン（Ｃｈａ）、および４−フェニル−フェニルアラニン（Ｂｉｐ）残基から選択される、実施形態１〜２の組成物。
４．Ｘａａ ６が、Ａｌａ、Ｇｌｙ、２−Ａｂｕ、Ｐｈｅ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｖａｌ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、プロリン、チアプロリン、メチオニン、グリシン、ノルロイシン、ノルバリン、１−Ｎａｌ、２−Ｎａｌ、１’ＮＭｅ−Ｔｒｐ、シクロペンチルグリシン（Ｃｐｇ）、フェニルグリシン、Ｎ−メチルロイシン、Ｎ−メチルフェニルアラニン、Ｎ−メチルバリン、シクロヘキシルグリシン（Ｃｈｇ）、シクロヘキシルアラニン（Ｃｈａ）、２−クロロ−フェニルアラニン、４−クロロ−フェニルアラニン、３，４−ジクロロフェニルアラニン、４−トリフルオロメチル−フェニルアラニン、および４−フェニル−フェニルアラニン（Ｂｉｐ）残基から選択される、実施形態１〜３の組成物。
５．Ｘａａ ７が、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｐｈｅ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｖａｌ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、ノルロイシン、ノルバリン、Ｐｒｏ、２−ピリジニルアラニン、１−Ｎａｌ、２−Ｎａｌ、１’ＮＭｅ−Ｔｒｐ、シクロヘキシルグリシン（Ｃｈｇ）、シクロヘキシルアラニン（Ｃｈａ）、２−クロロ−フェニルアラニン、４−クロロ−フェニルアラニン、３，４−ジクロロフェニルアラニン、４−トリフルオロメチル−フェニルアラニン、および４−フェニル−フェニルアラニン（Ｂｉｐ）残基から選択される、実施形態1〜４の組成物。
６．Ｘａａ ８が、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、ホモリジン、オルニチン、Ｎ−メチル−アルギニン、ω−アミノアルギニン、ω−メチル−アルギニン、１−メチル−ヒスチジン、３−メチル−ヒスチジン、ホモアルギニン、Ｎ−メチル−リジン、Ｎ−ε−メチルリジン、Ｄａｂ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｃｉｔ、Ａｓｐ、ホスホセリン、ホスホチロシン、ガンマ−カルボキシグルタミン酸、およびＧｌｕ残基から選択される、実施形態１〜５の組成物。
７．Ｘａａ ９が、Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｍｅｔ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、ホモリジン、オルニチン、アルギニン、Ｎ−メチル−アルギニン、ω−アミノアルギニン、ω−メチル−アルギニン、１−メチル−ヒスチジン、３−メチル−ヒスチジン、ホモアルギニン、Ｎ−メチル−リジン、Ｎ−ε−メチルリジン、Ｄａｂ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、およびＣｉｔ残基から選択される、実施形態１〜６の組成物。
８．Ｘａａ １１が、Ａｌａ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｐｈｅ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、Ｐｒｏ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｒａ、Ａｔｚ、ホモリジン、オルニチン、Ｎ−メチル−アルギニン、ω−アミノアルギニン、ω−メチル−アルギニン、１−メチル−ヒスチジン、３−メチル−ヒスチジン、ホモアルギニン、Ｎ−メチル−リジン、Ｎ−ε−メチルリジン、Ｄａｂ、ノルロイシン、ノルバリン、１−Ｎａｌ、２−Ｎａｌ、シクロヘキシルグリシン（Ｃｈｇ）、シクロヘキシルアラニン（Ｃｈａ）、および４−フェニル−フェニルアラニン（Ｂｉｐ）残基から選択される、実施形態１〜７の組成物。
９．Ｘａａ １２が、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、セリン、トレオニン、アスパラギン酸、グルタミン酸（glutamatic acid）、グリシン、ノルロイシン、ノルバリン、１−Ｎａｌ、２−Ｎａｌ、１’ＮＭｅ−Ｔｒｐ、Ｃｈａ、および４−フェニル−フェニルアラニン（Ｂｉｐ）、シクロヘキシルグリシン（Ｃｈｇ）、シクロヘキシルアラニン（Ｃｈａ）、アスパラギン、グルタミン、メチオニン、ヒドロキシプロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、およびチロシンから選択される、実施形態１〜８の組成物。
１０．Ｘａａ １３が、Ａｌａ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｐｈｅ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、Ｐｒｏ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｒａ、Ａｔｚ、ホモリジン、オルニチン、Ｎ−メチル−アルギニン、ω−アミノアルギニン、ω−メチル−アルギニン、１−メチル−ヒスチジン、３−メチル−ヒスチジン、ホモアルギニン、Ｎ−メチル−リジン、Ｎ−ε−メチルリジン、Ｄａｂ、ノルロイシン、ノルバリン、１−Ｎａｌ、２−Ｎａｌ、シクロヘキシルグリシン（Ｃｈｇ）、シクロヘキシルアラニン（Ｃｈａ）、および４−フェニル−フェニルアラニン（Ｂｉｐ）残基から選択される、実施形態１〜９の組成物。
１１．Ｘａａ １４が、Ａｌａ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｐｈｅ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、Ｐｒｏ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｒａ、Ａｔｚ、ホモリジン、オルニチン、Ｎ−メチル−アルギニン、ω−アミノアルギニン、ω−メチル−アルギニン、１−メチル−ヒスチジン、３−メチル−ヒスチジン、ホモアルギニン、Ｎ−メチル−リジン、Ｎ−ε−メチルリジン、Ｄａｂ、ノルロイシン、ノルバリン、１−Ｎａｌ、２−Ｎａｌ、シクロヘキシルグリシン（Ｃｈｇ）、シクロヘキシルアラニン（Ｃｈａ）、および４−フェニル−フェニルアラニン（Ｂｉｐ）残基から選択される、実施形態１〜１０の組成物。
１２．Ｘａａ １６が、Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｍｅｔ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ｐｒａ、Ａｔｚ、ホモリジン、オルニチン、アルギニン、Ｎ−メチル−アルギニン、ω−アミノアルギニン、ω−メチル−アルギニン、１−メチル−ヒスチジン、３−メチル−ヒスチジン、ホモアルギニン、Ｎ−メチル−リジン、Ｎ−ε−メチルリジン、Ｄａｂ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｃｉｔ、Ａｓｐ、ホスホセリン、ホスホチロシン、ガンマ−カルボキシグルタミン酸、およびＧｌｕ残基から選択される、実施形態１〜１１の組成物。
１３．Ｘａａ １９が、Ａｌａ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｐｈｅ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、Ｐｒｏ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、ホモリジン、オルニチン、Ｎ−メチル−アルギニン、ω−アミノアルギニン、ω−メチル−アルギニン、１−メチル−ヒスチジン、３−メチル−ヒスチジン、ホモアルギニン、Ｎ−メチル−リジン、Ｎ−ε−メチルリジン、Ｄａｂ、ノルロイシン、ノルバリン、１−Ｎａｌ、２−Ｎａｌ、シクロヘキシルグリシン（Ｃｈｇ）、シクロヘキシルアラニン（Ｃｈａ）、および４−フェニル−フェニルアラニン（Ｂｉｐ）残基から選択される、実施形態１〜１２の組成物。
１４．Ｘａａ ２０が、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、Ｍｅｔ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、ホモリジン、オルニチン、アルギニン、Ｎ−メチル−アルギニン、ω−アミノアルギニン、ω−メチル−アルギニン、１−メチル−ヒスチジン、３−メチル−ヒスチジン、ホモアルギニン、Ｎ−メチル−リジン、Ｎ−ε−メチルリジン、Ｄａｂ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、およびＣｉｔ残基から選択される、実施形態１〜１３の組成物。
１５．Ｘａａ ２１が、Ａｌａ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｖａｌ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、ホモリジン、オルニチン、アルギニン、Ｎ−メチル−アルギニン、ω−アミノアルギニン、ω−メチル−アルギニン、１−メチル−ヒスチジン、３−メチル−ヒスチジン、ホモアルギニン、Ｎ−メチル−リジン、Ｎ−ε−メチルリジン、Ｄａｂ、シクロヘキシルグリシン（Ｃｈｇ）、シクロヘキシルアラニン（Ｃｈａ）、グリシン、ノルロイシン、ノルバリン、１−Ｎａｌ、２−Ｎａｌ、４−フェニル−フェニルアラニン（Ｂｉｐ）、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、およびＣｉｔ残基から選択される、実施形態１〜１４の組成物。
１６．Ｘａａ ２２が、Ａｌａ、Ｐｈｅ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｖａｌ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、ホモリジン、オルニチン、Ｎ−メチル−アルギニン、ω−アミノアルギニン、ω−メチル−アルギニン、１−メチル−ヒスチジン、３−メチル−ヒスチジン、ホモアルギニン、Ｎ−メチル−リジン、Ｎ−ε−メチルリジン、Ｄａｂ、グリシン、ノルロイシン、ノルバリン、１−Ｎａｌ、２−Ｎａｌ、１’ＮＭｅ−Ｔｒｐ、シクロヘキシルグリシン（Ｃｈｇ）、シクロヘキシルアラニン（Ｃｈａ）、および４−フェニル−フェニルアラニン（Ｂｉｐ）残基から選択される、実施形態１〜１５の組成物。
１７．Ｘａａ ２３が、Ａｌａ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｖａｌ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ｐｒａ、Ａｔｚ、ホモリジン、オルニチン、Ｎ−メチル−アルギニン、ω−アミノアルギニン、ω−メチル−アルギニン、１−メチル−ヒスチジン、３−メチル−ヒスチジン、ホモアルギニン、Ｎ−メチル−リジン、Ｎ−ε−メチルリジン、Ｄａｂ、シクロヘキシルグリシン（Ｃｈｇ）、シクロヘキシルアラニン（Ｃｈａ）、グリシン、ノルロイシン、ノルバリン、１−Ｎａｌ、２−Ｎａｌ、４−フェニル−フェニルアラニン（Ｂｉｐ）、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、およびＣｉｔ残基から選択される、実施形態１〜１６の組成物。
１８．Ｘａａ ２５が、Ａｌａ、ＧｌｙＰｒｏ、Ｍｅｔ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、およびＣｉｔ残基から選択される、実施形態１〜１７の組成物。
１９．Ｘａａ ２６が、Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｍｅｔ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、ホモリジン、オルニチン、Ｎ−メチル−アルギニン、ω−アミノアルギニン、ω−メチル−アルギニン、１−メチル−ヒスチジン、３−メチル−ヒスチジン、ホモアルギニン、Ｎ−メチル−リジン、Ｎ−ε−メチルリジン、Ｄａｂ、グリシン、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、ホスホセリン、ホスホチロシン、ガンマ−カルボキシグルタミン酸、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、およびＣｉｔ残基から選択される、実施形態１〜１８の組成物。
２０．Ｘａａ ２７が、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｓｅｒ、Ｍｅｔ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、ノルロイシン、ノルバリン、１−Ｎａｌ、２−Ｎａｌ、シクロヘキシルグリシン（Ｃｈｇ）、シクロヘキシルアラニン（Ｃｈａ）、４−フェニル−フェニルアラニン（Ｂｉｐ）、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、ホモリジン、オルニチン、アルギニン、Ｎ−メチル−アルギニン、ω−アミノアルギニン、ω−メチル−アルギニン、１−メチル−ヒスチジン、３−メチル−ヒスチジン、ホモアルギニン、Ｎ−メチル−リジン、Ｎ−ε−メチルリジン、Ｄａｂ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、ホスホセリン、ホスホチロシン、ガンマ−カルボキシグルタミン酸、およびＧｌｙ残基から選択される、実施形態１〜１９の組成物。
２１．Ｘａａ ２８が、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、ホモリジン、オルニチン、Ｎ−メチル−アルギニン、ω−アミノアルギニン、ω−メチル−アルギニン、１−メチル−ヒスチジン、３−メチル−ヒスチジン、ホモアルギニン、Ｎ−メチル−リジン、Ｎ−ε−メチルリジン、Ｄａｂ、１−Ｎａｌ、２−Ｎａｌ、２−ピリジル−アラニン、３−ピリジル−アラニン、４−ピリジル−アラニン、４−ピペリジニル−アラニン、および４−フェニル−フェニルアラニン（Ｂｉｐ）残基から選択される、実施形態１〜２０の組成物。
２２．Ｘａａ ２９が、Ａｌａ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、ホスホセリン、ホスホチロシン、ガンマ−カルボキシグルタミン酸、Ｐｈｅ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｓｎ、Ｐｒｏ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ、Ｐｒａ、Ａｔｚ、ホモリジン、オルニチン、Ｎ−メチル−アルギニン、ω−アミノアルギニン、ω−メチル−アルギニン、１−メチル−ヒスチジン、３−メチル−ヒスチジン、ホモアルギニン、Ｎ−メチル−リジン、Ｎ−ε−メチルリジン、およびＤａｂ残基から選択される、実施形態１〜２１の組成物。
２３．Ｘａａ ３３が、Ｐｈｅ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｖａｌ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、ノルロイシン、ノルバリン、１−Ｎａｌ、２−Ｎａｌ、１’ＮＭｅ−Ｔｒｐ、シクロヘキシルグリシン（Ｃｈｇ）、シクロヘキシルアラニン（Ｃｈａ）、２−クロロ−フェニルアラニン、４−クロロ−フェニルアラニン、３，４−ジクロロフェニルアラニン、４−トリフルオロメチル−フェニルアラニン、２−ピリジル−アラニン、３−ピリジル−アラニン、４−ピリジル−アラニン、４−ピペリジニル−アラニン、および４−フェニル−フェニルアラニン（Ｂｉｐ）残基から選択される、実施形態１〜２２の組成物。
２４．Ｘａａ ３４が、Ａｌａ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｐｈｅ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、Ｐｒｏ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｒａ、Ａｔｚ、ホモリジン、オルニチン、Ｎ−メチル−アルギニン、ω−アミノアルギニン、ω−メチル−アルギニン、１−メチル−ヒスチジン、３−メチル−ヒスチジン、ホモアルギニン、Ｎ−メチル−リジン、Ｎ−ε−メチルリジン、Ｄａｂ、ノルロイシン、ノルバリン、１−Ｎａｌ、２−Ｎａｌ、１’ＮＭｅ−Ｔｒｐ、シクロヘキシルグリシン（Ｃｈｇ）、シクロヘキシルアラニン（Ｃｈａ）、２−クロロ−フェニルアラニン、４−クロロ−フェニルアラニン、３，４−ジクロロフェニルアラニン、４−トリフルオロメチル−フェニルアラニン、２−ピリジル−アラニン、３−ピリジル−アラニン、４−カルボキシ−フェニルアラニン、および４−フェニル−フェニルアラニン（Ｂｉｐ）残基から選択される、実施形態１〜２３の組成物。
２５．Ｘａａ ３５が、Ｐｈｅ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｖａｌ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、ノルロイシン、ノルバリン、１−Ｎａｌ、２−Ｎａｌ、１’ＮＭｅ−Ｔｒｐ、シクロヘキシルグリシン（Ｃｈｇ）、シクロヘキシルアラニン（Ｃｈａ）、２−クロロ−フェニルアラニン、４−クロロ−フェニルアラニン、３，４−ジクロロフェニルアラニン、４−トリフルオロメチル−フェニルアラニン、および４−フェニル−フェニルアラニン（Ｂｉｐ）残基から選択される、実施形態１〜２４の組成物。
２６．Ｘａａ ３６、Ｘａａ ３７、およびＸａａ ３８のそれぞれが独立して存在しないかまたは独立してＡｌａ、Ｐｈｅ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、Ｐｒｏ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、ホモリジン、オルニチン、Ｎ−メチル−アルギニン、ω−アミノアルギニン、ω−メチル−アルギニン、１−メチル−ヒスチジン、３−メチル−ヒスチジン、ホモアルギニン、Ｎ−メチル−リジン、Ｎ−ε−メチルリジン、Ｄａｂ、ノルロイシン、ノルバリン、１−Ｎａｌ、２−Ｎａｌ、シクロヘキシルグリシン（Ｃｈｇ）、シクロヘキシルアラニン（Ｃｈａ）、および４−フェニル−フェニルアラニン（Ｂｉｐ）残基から選択される、実施形態１〜２５の組成物。
２７．Ｘａａ ３およびＸａａ １８がアルキル残基である、実施形態１〜２６の組成物。
２８．Ｘａａ ３およびＸａａ １８が独立してＡｌａまたは２−Ａｂｕ残基である、実施形態２７の組成物。
２９．カルボキシ末端残基がアミド化されている、実施形態１〜２８の組成物。
３０．単離されたポリペプチドが、式：
Xaa 1Xaa 2 Cys3Xaa 4 Xaa 5Ala6 Xaa 7Xaa 8Xaa 9Cys10Xaa 11Xaa 12Xaa 13Xaa 14Asp15 Xaa 16 Cys17Cys18Xaa 19 Xaa 20 Xaa 21Xaa 22Xaa 23 Cys24Xaa 25 Xaa 26Xaa 27Xaa 28Xaa 29Xaa 30 Cys31Lys32Xaa 33Xaa 34Xaa 35 Xaa 36Xaa 37Xaa 38／／配列番号４７６のアミノ酸配列を含む、実施形態１〜２９の組成物。
３１．Ｘａａ ６がＡｌａである、実施形態１〜２９の組成物。
３２．Ｘａａ ２７がＧｌｕである、実施形態３１の組成物。
３３．Ｘａａ ２９がＡｓｐ、Ｇｌｕ、またはＧｌｎである、実施形態３１〜３２の組成物。
３４．配列番号２２、２５２〜２６３、４１９〜４３９、５１８〜５２１、５２４、５２５、５６２〜５８０、６０２、６９１、６９２、６９６〜７０３、７１５、７２１〜７３５、７３７〜７４９、７５６、７５７、７６１、７６２、７６４〜７７１、７８７〜７９６、７９８、８００、８０２、８０３、８０９〜８１２、１０２８、１０３０〜１０４０、１０４３〜１０４７、１０６２〜１０６５、および１０６８〜１０７０から選択されるアミノ酸配列を含む、実施形態３１の組成物。
３５．配列番号１０８２、１０９６、１１１０、１１２４、１１３５、１１４６、１１５７、１１６５、１１７３、１１８１、１１９２、１２０３、１２１４、１２２２、１２３０、１２３８、１２４９、１２６０、１２７１、１２７９、１２８７、１２９５、１３０６、１３１７、１３２８、１３３６、１３４４、１３５２、１３６０、１３６８、１３７６、１３８４、１３９２、１４００、１４０８、１４１６、１４２４、１４３２、１４４０、１４４８、１４５６、１４６４、１４７２、１４８０、１４８８、１４９６、１５０４、１５１２、１５２０、１５２８、１５３６、１５４４、１５５２、１５６０、１５６８、１５７６、１５８４、１５９２、１６００、１６０８、１６１６、１６２４、１６３２、１６４０、１６５８、１６７２、１６８６、１７００、１７１１、１７２２、１７３３、１７４１、１７４９、１７５７、１７６８、１７７９、１７９０、１７９８、１８０６、１８１４、１８２５、１８３６、１８４７、１８５５、１８６３、１８７１、１８８２、１８９３、１９０４、１９１２、１９２０、１９２８、１９３６、１９４４、１９５２、１９６０、１９６８、１９７６、１９８４、１９９２、２０００、２００８、２０１６、２０２４、２０３２、２０４０、２０４８、２０５６、２０６４、２０７２、２０８０、２０８８、２０９６、２１０４、２１１２、２１２０、２１２８、２１３６、２１４４、２１５２、２１６０、２１６８、２１７６、２１８４、２１９２、２２００、２２０８、２２１６、２２３４、２２４８、２２６２、２２７６、２２８７、２２９８、２３０９、２３１７、２３２５、２３３３、２３４４、２３５５、２３６６、２３７４、２３８２、２３９０、２４０１、２４１２、２４２３、２４３１、２４３９、２４４７、２４５８、２４６９、２４８０、２４８８、２４９６、２５０４、２５１２、２５２０、２５２８、２５３６、２５４４、２５５２、２５６０、２５６８、２５７６、２５８４、２５９２、２６００、２６０８、２６１６、２６２４、２６３２、２６４０、２６４８、２６５６、２６６４、２６７２、２６８０、２６８８、２６９６、２７０４、２７１２、２７２０、２７２８、２７３６、２７４４、２７５２、２７６０、２７６８、２７７６、２７８４、２７９２、２８０８、２８２２、２８３３、２８４４、２８５５、２８６３、２８７１、２８７９、２８９０、２９０１、２９１２、２９２０、２９２８、２９３６、２９４４、２９５２、２９６０、２９６８、２９７６、２９８４、２９９２、３０００、３００８、３０１６、３０２４、３０３２、３０４０、３０４８、３０５６、３０６４、３０７２、および３０８０から選択されるアミノ酸配列を含む、実施形態３１の組成物。
３６．配列番号５９７〜６０１および８１３〜１０２７から選択されるアミノ酸配列を含む、実施形態３１の組成物。
３７．Ｘａａ ６がＧｌｙである、実施形態１〜２９の組成物。
３８．Ｘａａ ２７がＧｌｕである、実施形態３７の組成物。
３９．Ｘａａ ２９がＡｓｐ、Ｇｌｕ、またはＧｌｎである、実施形態３７〜３８の組成物。
４０．配列番号２６５、７５１、７５２、７５４、７５５、１０８１、１０９５、１１０９、１１２３、１１３４、１１４５、１１５６、１１６４、１１７２、１１８０、１１９１、１２０２、１２１３、１２２１、１２２９、１２３７、１２４８、１２５９、１２７０、１２７８、１２８６、１２９４、１３０５、１３１６、１３２７、１３３５、１３４３、１３５１、１３５９、１３６７、１３７５、１３８３、１３９１、１３９９、１４０７、１４１５、１４２３、１４３１、１４３９、１４４７、１４５５、１４６３、１４７１、１４７９、１４８７、１４９５、１５０３、１５１１、１５１９、１５２７、１５３５、１５４３、１５５１、１５５９、１５６７、１５７５、１５８３、１５９１、１５９９、１６０７、１６１５、１６２３、１６３１、１６３９、１６５７、１６７１、１６８５、１６９９、１７１０、１７２１、１７３２、１７４０、１７４８、１７５６、１７６７、１７７８、１７８９、１７９７、１８０５、１８１３、１８２４、１８３５、１８４６、１８５４、１８６２、１８７０、１８８１、１８９２、１９０３、１９１１、１９１９、１９２７、１９３５、１９４３、１９５１、１９５９、１９６７、１９７５、１９８３、１９９１、１９９９、２００７、２０１５、２０２３、２０３１、２０３９、２０４７、２０５５、２０６３、２０７１、２０７９、２０８７、２０９５、２１０３、２１１１、２１１９、２１２７、２１３５、２１４３、２１５１、２１５９、２１６７、２１７５、２１８３、２１９１、２１９９、２２０７、２２１５、２２３３、２２４７、２２６１、２２７５、２２８６、２２９７、２３０８、２３１６、２３２４、２３３２、２３４３、２３５４、２３６５、２３７３、２３８１、２３８９、２４００、２４１１、２４２２、２４３０、２４３８、２４４６、２４５７、２４６８、２４７９、２４８７、２４９５、２５０３、２５１１、２５１９、２５２７、２５３５、２５４３、２５５１、２５５９、２５６７、２５７５、２５８３、２５９１、２５９９、２６０７、２６１５、２６２３、２６３１、２６３９、２６４７、２６５５、２６６３、２６７１、２６７９、２６８７、２６９５、２７０３、２７１１、２７１９、２７２７、２７３５、２７４３、２７５１、２７５９、２７６７、２７７５、２７８３、２７９１、２８０７、２８２１、２８３２、２８４３、２８５４、２８６２、２８７０、２８７８、２８８９、２９００、２９１１、２９１９、２９２７、２９３５、２９４３、２９５１、２９５９、２９６７、２９７５、２９８３、２９９１、２９９９、３００７、３０１５、３０２３、３０３１、３０３９、３０４７、３０５５、３０６３、３０７１、および３０７９から選択されるアミノ酸配列を含む、実施形態３７の組成物。
４１．Ｘａａ ６が２−Ａｂｕである、実施形態１〜２９の組成物。
４２．Ｘａａ ２７がＧｌｕである、実施形態４１の組成物。
４３．Ｘａａ ２９がＡｓｐ、Ｇｌｕ、またはＧｌｎである、実施形態４１〜４２の組成物。
４４．配列番号６０５、６３６、６４９、７０６、７０７、７１８、７５３、７５８、７９７、７９９、８０１、８０４、８０７、８０８、１０２９、１０４１、１０４２、１０４８、１０６６、１０６７、１０８３、１０９７、１１１１、１１２５、１１３６、１１４７、１１５８、１１６６、１１７４、１１８２、１１９３、１２０４、１２１５、１２２３、１２３１、１２３９、１２５０、１２６１、１２７２、１２８０、１２８８、１２９６、１３０７、１３１８、１３２９、１３３７、１３４５、１３５３、１３６１、１３６９、１３７７、１３８５、１３９３、１４０１、１４０９、１４１７、１４２５、１４３３、１４４１、１４４９、１４５７、１４６５、１４７３、１４８１、１４８９、１４９７、１５０５、１５１３、１５２１、１５２９、１５３７、１５４５、１５５３、１５６１、１５６９、１５７７、１５８５、１５９３、１６０１、１６０９、１６１７、１６２５、１６３３、１６４１、１６５９、１６７３、１６８７、１７０１、１７１２、１７２３、１７３４、１７４２、１７５０、１７５８、１７６９、１７８０、１７９１、１７９９、１８０７、１８１５、１８２６、１８３７、１８４８、１８５６、１８６４、１８７２、１８８３、１８９４、１９０５、１９１３、１９２１、１９２９、１９３７、１９４５、１９５３、１９６１、１９６９、１９７７、１９８５、１９９３、２００１、２００９、２０１７、２０２５、２０３３、２０４１、２０４９、２０５７、２０６５、２０７３、２０８１、２０８９、２０９７、２１０５、２１１３、２１２１、２１２９、２１３７、２１４５、２１５３、２１６１、２１６９、２１７７、２１８５、２１９３、２２０１、２２０９、２２１７、２２３５、２２４９、２２６３、２２７７、２２８８、２２９９、２３１０、２３１８、２３２６、２３３４、２３４５、２３５６、２３６７、２３７５、２３８３、２３９１、２４０２、２４１３、２４２４、２４３２、２４４０、２４４８、２４５９、２４７０、２４８１、２４８９、２４９７、２５０５、２５１３、２５２１、２５２９、２５３７、２５４５、２５５３、２５６１、２５６９、２５７７、２５８５、２５９３、２６０１、２６０９、２６１７、２６２５、２６３３、２６４１、２６４９、２６５７、２６６５、２６７３、２６８１、２６８９、２６９７、２７０５、２７１３、２７２１、２７２９、２７３７、２７４５、２７５３、２７６１、２７６９、２７７７、２７８５、２７９３、２８０９、２８２３、２８３４、２８４５、２８５６、２８６４、２８７２、２８８０、２８９１、２９０２、２９１３、２９２１、２９２９、２９３７、２９４５、２９５３、２９６１、２９６９、２９７７、２９８５、２９９３、３００１、３００９、３０１７、３０２５、３０３３、３０４１、３０４９、３０５７、３０６５、３０７３、および３０８１から選択されるアミノ酸配列を含む、実施形態４１の組成物。
４５．Ｘａａ ６がＮｌｅである、実施形態１〜２９の組成物。
４６．Ｘａａ ２７がＧｌｕである、実施形態４５の組成物。
４７．Ｘａａ ２９がＡｓｐ、Ｇｌｕ、またはＧｌｎである、実施形態４５〜４６の組成物。
４８．配列番号６０７、６３８、６５１、１０８５、１０９９、１１１３、１１２７、１１３８、１１４９、１１６０、１１６８、１１７６、１１８４、１１９５、１２０６、１２１７、１２２５、１２３３、１２４１、１２５２、１２６３、１２７４、１２８２、１２９０、１２９８、１３０９、１３２０、１３３１、１３３９、１３４７、１３５５、１３６３、１３７１、１３７９、１３８７、１３９５、１４０３、１４１１、１４１９、１４２７、１４３５、１４４３、１４５１、１４５９、１４６７、１４７５、１４８３、１４９１、１４９９、１５０７、１５１５、１５２３、１５３１、１５３９、１５４７、１５５５、１５６３、１５７１、１５７９、１５８７、１５９５、１６０３、１６１１、１６１９、１６２７、１６３５、１６４３、１６６１、１６７５、１６８９、１７０３、１７１４、１７２５、１７３６、１７４４、１７５２、１７６０、１７７１、１７８２、１７９３、１８０１、１８０９、１８１７、１８２８、１８３９、１８５０、１８５８、１８６６、１８７４、１８８５、１８９６、１９０７、１９１５、１９２３、１９３１、１９３９、１９４７、１９５５、１９６３、１９７１、１９７９、１９８７、１９９５、２００３、２０１１、２０１９、２０２７、２０３５、２０４３、２０５１、２０５９、２０６７、２０７５、２０８３、２０９１、２０９９、２１０７、２１１５、２１２３、２１３１、２１３９、２１４７、２１５５、２１６３、２１７１、２１７９、２１８７、２１９５、２２０３、２２１１、２２１９、２２３７、２２５１、２２６５、２２７９、２２９０、２３０１、２３１２、２３２０、２３２８、２３３６、２３４７、２３５８、２３６９、２３７７、２３８５、２３９３、２４０４、２４１５、２４２６、２４３４、２４４２、２４５０、２４６１、２４７２、２４８３、２４９１、２４９９、２５０７、２５１５、２５２３、２５３１、２５３９、２５４７、２５５５、２５６３、２５７１、２５７９、２５８７、２５９５、２６０３、２６１１、２６１９、２６２７、２６３５、２６４３、２６５１、２６５９、２６６７、２６７５、２６８３、２６９１、２６９９、２７０７、２７１５、２７２３、２７３１、２７３９、２７４７、２７５５、２７６３、２７７１、２７７９、２７８７、２７９５、２８１１、２８２５、２８３６、２８４７、２８５８、２８６６、２８７４、２８８２、２８９３、２９０４、２９１５、２９２３、２９３１、２９３９、２９４７、２９５５、２９６３、２９７１、２９７９、２９８７、２９９５、３００３、３０１１、３０１９、３０２７、３０３５、３０４３、３０５１、３０５９、３０６７、３０７５、および３０８３から選択されるアミノ酸配列を含む、実施形態４５の組成物。
４９．Ｘａａ ６がＮｖａである、実施形態１〜２９の組成物。
５０．Ｘａａ ２７がＧｌｕである、実施形態４９の組成物。
５１．Ｘａａ ２９がＡｓｐ、Ｇｌｕ、またはＧｌｎである、実施形態４９〜５０の組成物。
５２．配列番号６０６、６３７、６５０、７０５、７０８、７１７、７５９、７６０、８０５、８０６、１０８４、１０９８、１１１２、１１２６、１１３７、１１４８、１１５９、１１６７、１１７５、１１８３、１１９４、１２０５、１２１６、１２２４、１２３２、１２４０、１２５１、１２６２、１２７３、１２８１、１２８９、１２９７、１３０８、１３１９、１３３０、１３３８、１３４６、１３５４、１３６２、１３７０、１３７８、１３８６、１３９４、１４０２、１４１０、１４１８、１４２６、１４３４、１４４２、１４５０、１４５８、１４６６、１４７４、１４８２、１４９０、１４９８、１５０６、１５１４、１５２２、１５３０、１５３８、１５４６、１５５４、１５６２、１５７０、１５７８、１５８６、１５９４、１６０２、１６１０、１６１８、１６２６、１６３４、１６４２、１６６０、１６７４、１６８８、１７０２、１７１３、１７２４、１７３５、１７４３、１７５１、１７５９、１７７０、１７８１、１７９２、１８００、１８０８、１８１６、１８２７、１８３８、１８４９、１８５７、１８６５、１８７３、１８８４、１８９５、１９０６、１９１４、１９２２、１９３０、１９３８、１９４６、１９５４、１９６２、１９７０、１９７８、１９８６、１９９４、２００２、２０１０、２０１８、２０２６、２０３４、２０４２、２０５０、２０５８、２０６６、２０７４、２０８２、２０９０、２０９８、２１０６、２１１４、２１２２、２１３０、２１３８、２１４６、２１５４、２１６２、２１７０、２１７８、２１８６、２１９４、２２０２、２２１０、２２１８、２２３６、２２５０、２２６４、２２７８、２２８９、２３００、２３１１、２３１９、２３２７、２３３５、２３４６、２３５７、２３６８、２３７６、２３８４、２３９２、２４０３、２４１４、２４２５、２４３３、２４４１、２４４９、２４６０、２４７１、２４８２、２４９０、２４９８、２５０６、２５１４、２５２２、２５３０、２５３８、２５４６、２５５４、２５６２、２５７０、２５７８、２５８６、２５９４、２６０２、２６１０、２６１８、２６２６、２６３４、２６４２、２６５０、２６５８、２６６６、２６７４、２６８２、２６９０、２６９８、２７０６、２７１４、２７２２、２７３０、２７３８、２７４６、２７５４、２７６２、２７７０、２７７８、２７８６、２７９４、２８１０、２８２４、２８３５、２８４６、２８５７、２８６５、２８７３、２８８１、２８９２、２９０３、２９１４、２９２２、２９３０、２９３８、２９４６、２９５４、２９６２、２９７０、２９７８、２９８６、２９９４、３００２、３０１０、３０１８、３０２６、３０３４、３０４２、３０５０、３０５８、３０６６、３０７４、および３０８２から選択されるアミノ酸配列を含む、実施形態４９の組成物。
５３．配列番号３〜３０、３２〜７２、７４〜１３４、１３６〜１７８、１８０〜２１１、２１８〜２３９、２４１〜３０５、３０７〜３６３、３６６〜３８６、３８８〜４３２、４３４〜４７４、５１５〜５２７、５３２〜５８８、５９０、５９１、５９３〜７７５、７７７、７７８、７８０〜７８８、７９０〜１０４９、および１０６２〜３０８６から選択されるアミノ酸配列を含む、実施形態１の組成物。
５４．配列番号３〜１３４、１３６〜３０５、３０７〜３８６、３８８〜４７４、５１５〜５２７、５３２〜５８８、５９０、５９１、５９３〜１０４９、および１０６２〜３０８６から選択されるアミノ酸配列を含む、組成物。
５５．非標準アミノ酸を含まない、配列番号３〜１３４、１３６〜３０５、３０７〜３８６、３８８〜４７４、５１５〜５２７、５３２〜５８８、５９０、５９１、５９３〜１０４９、または１０６２〜３０８６のいずれかをコード化する単離された核酸。
５６．実施形態５５の核酸を含む発現ベクター。
５７．実施形態５６の発現ベクターを含む組換え宿主細胞。
５８．任意のリンカー部分および薬剤的に許容される共有結合した半減期延長部分を更に含む、実施形態１〜５４のいずれかの組成物。
５９．半減期延長部分が、約１０００Ｄａ〜約１０００００Ｄａの分子量のポリエチレングリコール、ＩｇＧ Ｆｃ領域、トランスサイレチン、またはヒト血清アルブミンである、実施形態５８の組成物。
６０．半減期延長部分が、ヒト免疫グロブリンもしくはヒト免疫グロブリンＦｃ領域、または両方を含む、実施形態５８の組成物。
６１．図１２Ａ〜Ｎ、または図８８〜９１のいずれかで記載される立体配置を有する実施形態６０の組成物。
６２．組成物が一価免疫グロブリンペプチドまたはＦｃ−ペプチド複合体を含む、実施形態６０の組成物。
６３．組成物が二価免疫グロブリンペプチドまたはＦｃ−ペプチド複合体を含む、実施形態６０の組成物。
６４．実施形態１〜５４または５８〜６３のいずれかの組成物、および薬剤的に許容される担体を含む、医薬組成物。
６５．疼痛を予防する方法であって、予防有効量の実施形態１〜５４または５８〜６３のいずれかの組成物を投与することを含む、方法。
６６．疼痛を治療する方法であって、治療有効量の実施形態１〜５４または５８〜６３のいずれかの組成物を投与することを含む、方法。
６７．疼痛が慢性疼痛、急性疼痛、または持続性疼痛である、実施形態６６の方法。
６８．慢性疼痛が、ガン、化学療法、骨関節炎、繊維筋痛、原発性肢端紅痛症、ヘルペス後神経痛、疼痛を伴う糖尿病性神経障害、突発性の疼痛を伴う神経障害、神経腫、発作性の極度の疼痛障害、偏頭痛、三叉神経痛、口腔顔面痛、群発性頭痛、複合性局所疼痛症候群（ＣＲＰＳ）、腰椎術後疼痛症候群、坐骨神経痛、間質性膀胱炎、骨盤痛、腰痛、炎症で誘発される疼痛、または関節痛と関連する、実施形態６７の方法。
６９．急性または持続性疼痛が外傷、熱傷、または外科手術と関連する、実施形態６７の方法。
７０．Ｘａａ ２９が酸性または中性親水性残基である、実施形態１〜３０の組成物。
７１．Ｘａａ ２９が、Ａｌａ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、ホスホセリン、ホスホチロシン、およびガンマ−カルボキシグルタミン酸残基から選択される、実施形態７０の組成物。
７２．配列番号１０７１〜２７９８から選択されるアミノ酸配列を含む、実施形態７０の組成物。
以下の実施例は例となるものであり、決して本発明の範囲を限定すると解釈されるべきではない。
実施例１：毒からのＧｐＴｘ−１の単離および精製
毒試料調製。タランチュラGammostola porteri由来の毒を麻酔下のクモの電気刺激によって抽出した。毒試料を集め、凍結乾燥し、そして水中０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）中に溶解させて、約１ｍｇ毒／ｍＬにした。粗毒溶液を、０．１％ＴＦＡ中で平衡化させたSep-PakＣ１８カートリッジ（Waters, Milford, MA, USA）での固相抽出（ＳＰＥ）によって脱塩し、６０％水性アセトニトリルで溶出させ、次いで蒸発させた。乾燥した物質を０．１％ＴＦＡ中に溶解させて、１ｍｇ毒／ｍＬ濃度にし、高分子成分を１０ｋＤａ分子量カットオフUltrafree-CL（Millipore）で除去した。１０ｋＤａ未満の毒抽出物を次いで真空下で乾燥し、−８０℃で貯蔵した。
分別。粗毒を逆相（ＲＰ）ＨＰＬＣによって分別し、８４の試料をタイムスライスで集めた。１０ｋＤａ未満の毒抽出物を０．１％ＴＦＡ中に溶解させて、約１ｍｇ毒／ｍＬにし、次いでＣ１８ＲＰＨＰＬＣクロマトグラフィーによって分離し、約１分幅の画分に集めた。ＨＰＬＣ法：１ｍＬ／分の緩衝液Ａ（水中０．１％ＴＦＡ）および緩衝液Ｂ（アセトニトリル９０％／０．１％のＴＦＡを含有する水１０％）と１％／分の勾配０〜１００％緩衝液Ｂ。画分を次いでプレートフォーマットに移し、真空下で乾燥し、次いで−８０℃で貯蔵した。
毒画分をＮａＶ１．７およびＮａＶ１．３ ＩｏｎＷｏｒｋｓ（登録商標）Ｑｕａｔｒｒｏ（ＩＷＱ）アッセイで活性についてスクリーンした。（実施例３よび図１を参照のこと）。有意な（対照の８０％超）Ｎａｖ１．７阻害活性を有するいくつかの画分を特定し、その第１のものは画分３１であった。画分３１の第２のアリコートをＮａＶ１．７、ＮａＶ１．３、およびＮａＶ１．５ＩＷＱアッセイで試験して、「ヒット」の活性を確認し、選択性を評価した。試料を次いで高分解能エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）およびマトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）質量分析法（ＭＳ）によって分析し、これによって、画分が少なくとも４つの異なるペプチド種の混合物であることが示された。（図２および図３を参照のこと）。画分３１を次いでＲＰ−ＨＰＬＣによって分離し、対応する副画分をＮａＶ１．７およびＮａＶ１．５アッセイで活性についてスクリーンした。副画分１１はＲＰ−ＨＰＬＣクロマトグラムにおける主ピークであり、ＮａＶ１．７活性の９０％超阻害を示した（図４を参照のこと）。副画分１１の解析によって、ＧｐＴｘ−１の原発性ペプチド配列が明らかになった。全てのタンパク質と同様に、ＧｐＴｘ−１は中枢神経系に本質的に全くアクセスできないことが予想される。
ＧｐＴｘ−２〜ＧｐＴｘ−７（配列番号：４６７〜４７４；表５Ａを参照のこと）を、発現配列タグ法を用いてGrammostola porteriの毒腺のトランスクリプトミック分析によって特定した（Siang AS, Doley R, Vonk FJ, Kini RM., “Transcriptomic analysis of the venom gland of the red-headed krait (Bungarus flaviceps) using expressed sequence tags”, BMC Molecular Biology 2010, 11:24; Jiang Y, Li Y, Lee W, Xu X, Zhang Y, Zhao R, Zhang Y, Wang W., “Venom gland transcriptomes of two elapid snakes (Bungarus multicinctus and Naja atra) and evolution of toxin genes”, BMC Genomics 2011, 12:1; Wagstaff SC, Sanz L, Juarez P, Harrison RA, Calvete JJ., “Combined snake venomics and venom gland transcriptomic analysis of the ocellated carpet viper, Echis ocellatus.”, J Proteomics. 2009 71(6):609-23; Magalhaes GS, Junqueira-de-Azevedo IL, Lopes-Ferreira M, Lorenzini DM, Ho PL, Moura-da-Silva AM. “Transcriptome analysis of expressed sequence tags from the venom glands of the fish Thalassophryne nattereri”, Biochimie 2006 88(6):693-9; Wagstaff SC, Harrison RA., “Venom gland EST analysis of the saw-scaled viper, Echis ocellatus, reveals novel alpha9beta1 integrin-binding motifs in venom metalloproteinases and a new group of putative toxins, renin-like aspartic proteases.” Gene 2006 377:21-32を参照のこと）。
ペプチド配列決定：エドマン分解およびデノボＭＳ／ＭＳ。ペプチドのＮ末端配列決定をエドマン分解によって実施した（参考文献：（１）Edman, P. (1950), "Method for determination of the amino acid sequence in peptides", Acta Chem. Scand. 4: 283-293（２）Niall, H.D. (1973). "Automated Edman degradation: the protein sequenator". Meth. Enzymol. 27: 942-1010）。フェニルチオヒダントイン（ＰＴＨ）−アミノ酸誘導体をＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ自動４７３Ａシーケンサーで分析した。
デノボペプチド配列決定をタンデム質量分析法によって実施した（参考文献：Vlado Dancik, Theresa A. Addona, Karl R. Clauser, James E. Vath, Pavel A. Pevzner., J. Comp. Biol., Volume 6, 3/4, (1999)；（２）Favreau, P., Menin, L., Michalet, S., Perret, F., Cheneval, Stocklin, M., Bulet, A. and Stocklin, R., Toxicon, 47(6),676-687, (2006)、（３）Favreau, P., Cheneval, O., Menin, L., Michalet, S., Gaertner, H., Principaud, F., Thai, R., Menez, A., Bulet, P. and Stocklin, R. (2007), The venom of the snake genus Atheris contains a new class of peptides with clusters of histidine and glycine residues. Rapid Communications in Mass Spectrometry, 21: 406-412）。
実施例２：ＧｐＴｘ−１ペプチドアナログの合成
小規模ペプチド合成。Ｎα−Ｆｍｏｃ固相ペプチド合成法を適切な直交保護（orthogonal protection）および樹脂リンカー法と用いてペプチドを組み立てた。ペプチドを０．０１２ミリモルスケールで、Rink Amide MBHA樹脂（１００〜２００メッシュ、１％ＤＶＢ、ＲＦＲ−１０６３−ＰＩ、０．５２ｍｅｑ／ｇ初期ローディング、４０８２９１、Peptides International, Louisville, KY）を用いて合成した。乾燥樹脂（１ウェルあたり１７ｍｇ）をPhenomenex深穴（深穴）タンパク質沈降プレート（ＣＥＯ−７５６５、３８７１０−１）に樹脂ローダー（Radley）を用いて添加した。アミノ酸を、自動ペプチド合成器（Intavis Multipep）で標準固相法を用いた段階的付加によって成長するペプチド鎖に付加した。アミノ酸（５モル当量、１２０μＬ、ＤＭＦ中０．５Ｍ）を（１−シアノ−２−エトキシ−２−オキソエチリデンアミノオキシ）ジメチルアミノ−モルホリノ−カルベニウムヘキサフルオロホスフェート（ＣＯＭＵ（登録商標）；５モル当量、１７０μＬ、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中０．３５Ｍ）およびＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ；７．５モル当量、７０μＬ、ジクロロメタン（ＤＣＭ）中１．２５Ｍ）でプレ活性化させた（１分）。プレ活性化アミノ酸を適切なウェルに移した。樹脂を３０分間インキュベートし、ドレインし、そしてサイクルを繰り返した。２回目のアミノ酸インキュベーション後に、プレートをドレインし、ＤＭＦで８回洗浄した（８ウェルのカラムあたり３ｍＬ）。Ｆｍｏｃ基を次いで、２０％のピペリジンのＤＭＦ中溶液５００μＬ中で２回連続してインキュベーションすることによって除去した。１回目のインキュベーションは５分であり、樹脂をドレインし、２回目のインキュベーションは２０分間であった。樹脂をドレインし、ＤＭＦで１０回洗浄した（８ウェルのカラムあたり３ｍＬ）。最終Ｆｍｏｃ保護基の除去後に、樹脂をＤＣＭで５回洗浄（８ウェルのカラムあたり３ｍＬ）して、空気乾燥させた。
切断。フィルタープレートの底に、排液口シーリングマット（ArcticWhite, AWSM-1003DP）を貼り付けた。各ウェル中の樹脂に、トリイソプロピルシラン（１００μＬ）、ＤＯＤＴ（１００μＬ）、および水（１００μＬ）を、多チャンネルピペットを使用して添加した。各ウェル中の樹脂に、Dispensette Organicディスペンサーを使用してＴＦＡ（１ｍＬ）を添加した。樹脂に、三角形のマイクロ撹拌棒を添加し、そして混合物を３時間撹拌した。シーリングマットを除去し、切断溶液を孔無し（solid bottom）９６ウェルの深穴プレート中に溶出させた。各ウェル中の樹脂をさらなる１ｍＬのＴＦＡで洗浄した。溶液を、ロータリーエバポレーション（Genevac）を用いて濃縮した。底部シーリングマットを貼り付けた新規９６ウェルフィルタープレート中の各ウェルに、Dispensette Organicディスペンサーを使用して１ｍＬの冷ジエチルエーテルを添加した。エーテルに、濃ペプチド溶液を、ワイドボアチップ（wide bore tip）を有する多チャンネルピペットを用いて添加した。溶液を、ピペットで撹拌して、完全な混合および沈降を保証した。白色固体をろ過し、第２の１ｍＬの冷エーテルで洗浄し、ろ過し、そして真空下で乾燥した。
フォールディング。各ウェル中の粗ペプチドに、０．９ｍＬの５０：５０水／アセトニトリルを多チャンネルピペットで添加し、マイクロ撹拌棒を添加した。混合物を１時間撹拌した。溶液を孔無し９６ウェルの深穴プレート中にろ過した。各ウェル中の粗ペプチドに、別の０．９ｍＬの５０：５０水／アセトニトリルを多チャンネルピペットで添加した。溶液を同じ孔無し９６ウェル深穴プレート中にろ過した。４Ｌのボトル中で、４．０Ｌのフォールディング緩衝液（３．３Ｌの水、３００ｍＬのアセトニトリル、２．０ｇの酸化グルタチオン、１．０ｇの還元グルタチオン、４００ｍＬの１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５）を調製した。９６個の５０ｍＬの遠心管に、Dispensetteディスペンサーを用いて４０ｍＬのペプチドフォールディング緩衝液を添加した。フォールディング緩衝液に、Tecan自動液体ハンドラーを用いて１．８ｍＬの溶解したペプチドを添加した。フォールディング溶液のｐＨを約７．７まで測定した。フォールディング反応を一晩静置した。各管に、１ｍＬの氷酢酸を添加した。９６ウェルフィルタープレートに、SP Sepharose High Performanceをスラリー（ウェルあたり１ｍＬ）として多チャンネルピペットで添加した。Tecan自動液体ハンドラーを使用して、ゲルをフォールディング緩衝液（３×０．９ｍＬ）で調整し、折り畳みペプチド溶液をロードし（５０×０．９ｍＬ、ｐＨ＝４．０、Tecan自動液体ハンドラー上）、洗浄し（４×０．９ｍＬ、２０ｍＭ ＮａＯＡｃ、ｐＨ＝４．０）、そして真空マニホールド上で、２×１ｍＬ（１ＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのＮａＯＡｃ、ｐＨ＝４．０）で孔無し９６ウェル深穴プレート中に手作業で溶出させた。
ペプチドのＰＥＧに対する複合体化。いくつかのＧｐＴｘ−１ペプチドアナログをアジド−ＮＰＥＧ１０に複合体化させた（例えば、以下の表３０、表３１、および表３２を参照のこと）。ＩＥＸ溶出緩衝液中１ｍＬの折り畳みペプチドに、３２−アジド−３，６，９，１２，１５，１８，２１，２４，２７，３０−デカオキサドトリアコンタン−１−アミン（７０μＬ、５０ｍＭ水性）、トリス（２−フェニル−１−（１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４−イル）エチル）アミン（ＴＢＴＡ；８８μＬ、ＤＭＳＯ中１０ｍＭ）、Ｌ−アスコルビン酸ナトリウム塩（４３８μＬ、７５ｍＭ水性）、および硫酸銅（ＩＩ）（無水粉末）（１８８μＬ、３５ｍＭ水性）を、その順で添加した。反応混合物はＴＢＴＡの添加後に若干白濁した。一晩インキュベーション後、プレートを１時間１６００ｒｐｍにて遠心分離して、沈殿物をペレット化させた。上清を９６ウェルフィルタープレートに多チャンネルピペットで移し、そして穴無し９６ウェルプレート中にろ過した。
分子の精製および特性化。折り畳み（複合体化）ペプチド（２ｍＬ）を、質量誘発半分取ＨＰＬＣ（Agilent/LEAP ‘Ariel’, Jupiter 5u C18 300A、１００×１０ｍｍ ５ミクロン）により１５〜３５％Ｂの勾配で４５分にわたって精製し、５分間フラッシュし、そして８ｍＬ／分で５分間平衡化させた。集められた画分をプールし、Ｔｅｃａｎ上のバイアル中で再フォーマットした。最終ＱＣ（Phenomenex Jupiter２０×２ｍｍ、１００Å、５ミクロンカラムを１０分にわたって１０〜６０％Ｂの勾配、０．７５０ｍＬ／分流速で溶出させ、２２０ｎｍで吸光度をモニターする）およびＣＬＮＤ定量化を実施した。９５％超の純度および正しい（ｍ／ｚ）比を有するペプチドをスクリーニングした。（合成ＧｐＴｘ−１のＬＣ−ＭＳ特性化に関しては、図５および６を参照のこと）。
大規模ペプチド合成。Rink Amide Chem Matrix樹脂（０．２ミリモル、０．４５ミリモル／ｇローディング、０．４４４ｇ、Matrix Innovation）をCS BIO反応容器中に計りとった。反応容器をCS BIO336X自動ペプチド合成器のチャンネルに接続し、そして樹脂を２×ＤＭＦで洗浄し、そしてＤＭＦ中で１５分間膨潤させた。Ｆｍｏｃ−アミノ酸（１．０ミリモル、Midwest BiotechまたはNovabiochem）をＤＭＦ中０．４Ｍの６−クロロ−１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（６−Ｃｌ−ＨＯＢｔ、Matrix Innovation）２．５ｍＬ中に溶解させた。溶液に、ＤＭＦ中１．０Ｍの１，３−ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ、Sigma-Aldrich）１．０ｍＬを添加した。窒素を吹き込みながら溶液を１５分間撹拌して、プレ活性化を達成し、次いで樹脂に添加した。混合物を２時間振とうした。樹脂をろ過し、３×ＤＭＦ、２×ＤＣＭ、および３×ＤＭＦで洗浄した。ＤＭＦ中２０％ピペリジン（５ｍＬ、２×１５分、Fluka）での処理によって、Ｆｍｏｃ除去を達成した。樹脂をろ過し、３×ＤＭＦで洗浄した。全ての残基は前述のＦｍｏｃ−アミノ酸カップリングおよびＦｍｏｃ除去ステップの繰り返しによって単結合される。
切断および直線状ペプチド精製。Ｎ末端残基からの最終Ｆｍｏｃ除去後、樹脂結合直線状ペプチド（０．２ミリモルスケール）を２５ｍＬの固相抽出（ＳＰＥ）ろ過管に移し、３×ＤＭＦおよび３×ＤＣＭで洗浄し、そして真空下で乾燥した。樹脂に、トリイソプロピルシラン（１．０ｍＬ）、３，６−ジオキサ−１，８−オクタン−ジチオール（ＤＯＤＴ、１．０ｍＬ）、水（１．０ｍＬ）、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ、１５ｍＬ）、および撹拌棒を添加し、そして混合物を３時間撹拌した。混合物を５０ｍＬ遠心管中にろ過した。樹脂をＴＦＡ（約５ｍＬ）で洗浄し、そして合わせたろ液をGenevac HT-12（３０℃チャンバー温度、４０分にわたって５００から５０ミリバールまでの圧力勾配および８ミリバール（８００Ｐａ）の最終圧力で２時間）中でロータリーエバポレーションによって濃縮した。残留物（約５ｍＬ）に４０ｍＬの冷ジエチルエーテルを添加した。白色沈殿物が形成した。固体をエーテル中で撹拌した。混合物を遠心分離し（４分、４，４００ｒｐｍ）、そしてエーテルをデカントした。管に、さらに４０ｍＬの冷エーテルを添加し、そして沈殿物を撹拌した。混合物を遠心分離し、そしてエーテルをデカントした。固体を真空下で一晩乾燥した。粗直線状ペプチドを分取ＬＣ−ＭＳによって精製した。ろ過された試料（１０ｍＬのＤＭＳＯ中５００ｍｇ）を分取ＨＰＬＣカラム（Jupiter 10u C18 300A、２５０×５０ｍｍ １０ミクロン）上に注入した。ペプチドを１０〜４０％Ｂの６０分にわたる勾配で５０ｍＬ／分にて溶出させ、続いて１０分間フラッシュし、そして１０分間平衡化させた。画分をＬＣ−ＭＳによって分析し、プールし、そして凍結乾燥して、純粋な直線状ペプチド前駆体を得た。
フォールディング。２ＬのＦＥＰビン中で、水（９４４ｍＬ）、アセトニトリル（５５．５ｍＬ）、トリス−ＨＣｌ ｐＨ７．５（１１１ｍＬ）、（−）−グルタチオン（酸化型）（６８０ｍｇ、１．１１０ミリモル）、および１−グルタチオン（還元型）（３４０ｍｇ、１．１１０ミリモル）でフォールディング緩衝液を調製した。純粋な直線状ペプチド（１１１ｍｇ、０．０２８ミリモル）に、２．５ｍＬのアセトニトリルおよび２．５ｍＬの水を添加した。混合物をボルテックスして、ペプチドを完全に溶解させた。ペプチド溶液をフォールディング緩衝液（０．１ｍｇ／ｍＬペプチド濃度、１ｍＭの酸化グルタチオン、１ｍＭの還元グルタチオン、１０％ｖ／ｖのアセトニトリル、０．１ＭのＴｒｉｓ ｐＨ７．５）に添加した。ｐＨ値は７．７と測定された。フォールディング混合物を８０ｒｐｍ、室温にて一晩攪拌した。小アリコートを除去し、試料をＬＣ−ＭＳによって分析して、フォールディングが完了したことを確認した。４ｍＬのＡｃＯＨおよび４ｍＬのＴＦＡ（ｐＨ＝２．５）の添加によって溶液をクエンチした。水溶液をろ過した（０．４５μＭセルロース膜）。
精製。ろ過した溶液（１１１０ｍＬ、１１１ｍｇペプチド）を分取ＨＰＬＣカラム（Phenomenex Synergi 4u MAX-RP 80A AXIA、２５０×３０ｍｍ）上に３０ｍＬ／分にてAgilent分取ローディングポンプを使用してロードした。カラムを１０分間１０％Ｂで３０ｍＬ／分にてフラッシュして、ＡｃＯＨ／ＴＦＡを溶出させた。カラムを分取HPLC, Agilent/LEAP prep LC-MSに取り付け、ペプチドを１０〜４０％Ｂの勾配で６０分にわたって溶出させ、続いて１０分間フラッシュし、そして１０分間平衡化させた。画分をＬＣ−ＭＳによって分析し、プールし、そして凍結乾燥して、純粋な折りたたまれたペプチドを得た。
ペプチドｉｎ ｖｉｖｏ研究のための対イオン交換。VariPure IPE（Varian、PL-HCO3 MP-Resin、ポリマー担持炭酸水素塩、１．８ミリモル／ｇ、１００Ａ、１５０〜３００μｍ）を含む４ｍＬのＳＰＥ管を、２ｍＬのＭｅＯＨ、続いて２ｍＬの水でプレコンディショニングし、重力によって排出させた。５．０ｍＭ以下の精製された折り畳みペプチドの水中溶液２．０ｍＬを床に適用した。デバイスを４×２．０ｍＬの水で洗浄して、ペプチドの全部を溶出させた。溶離液に、５０μＬの酢酸を添加した。溶液をロータリーエバポレーション（Genevac）によって濃縮して、精製された折り畳みペプチドの酢酸塩を得た。５０ｍｇのトリフルオロエタノール（ＴＦＥ）を５ｍＬのメスフラスコ中に計り入れ、続いて５ｍＬの最終体積になるまで重水（Ｄ２Ｏ）を添加することによって、ＴＦＥのＤ２Ｏ中１００ｍＭストック溶液をあらたに調製した。１９Ｆ−ＮＭＲのための全試料を溶解させるために希釈することによって、ＴＦＥのＤ２Ｏ中５ｍＭ溶液を次いで調製した。溶液を使用して、ペプチドを１ｍＭの濃度まで溶解させ、そして試料を、フッ素長時間遅延（ｄｌ＝５秒）法を使用して１９Ｆ−ＮＭＲによって分析した。ＴＦＥ積分（−７６．７５ｐｐｍの三重項）を５に正規化し、ＴＦＡの積分（−７５．６の一重項）を記録した。ＮＭＲ管を切断し、試料をロータリーエバポレーション（Genevac）によって回収した。
実施例３：電気生理学
Ｎａｖチャンネルを発現する細胞系。ヒト（ｈ）電位依存性ナトリウム（Ｎａｖ）チャンネル（ＨＥＫ２９３−ｈＮａｖ１．２、ＣＨＯ−ｈＮａｖ１．３、ＨＥＫ２９３−ｈＮａｖ１．４、ＨＥＫ２９３−ｈＮａｖ１．５、およびＨＥＫ２９３−ｈＮａｖ１．７）を構成的に発現する安定な細胞系または誘導性プロモータ下でｈＮａｖ１．８を発現するＣＨＯ細胞を、実験のために使用した。
Ion-Works（登録商標）Quatro集団パッチクランプ電気生理学。１０分間の０．２５％トリプシン−ＥＤＴＡ処理を使用して接着細胞を単離し、１４０ｍＭのＮａＣｌ、５．０ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、２ｍＭのＣａＣｌ２、１ｍＭのＭｇＣｌ２、１０ｍＭのグルコースからなる外液（ｐＨ７．４）中に再懸濁させた。内液は、７０ｍＭのＫＣｌ、７０ｍＭのＫＦ、１０ ＨＥＰＥＳ、５ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．３から構成されていた。有孔パッチクランプ設定を室温（約２２℃）で使用して細胞を−１１０ｍＶに電圧固定し、試験化合物添加の前および５分後に−１０ｍＶまで脱分極させた。化合物希釈物は、非特異的結合を最小限に抑えるために０．１％ウシ血清アルブミンを含んでいた。ピーク内向き電流を各化合物濃度について異なる細胞から測定し、ＩＣ５０値をエクセルソフトウェアで算出した。全化合物を２連で試験した（ｎ＝２）。
PatchXpress（登録商標）7000A電気生理学。１：１０希釈０．２５％トリプシン−ＥＤＴＡ処理剤を２〜３分間使用して、接着細胞を組織培養フラスコから単離し、次いで１０％ウシ胎仔血清を含有する完全培養培地中で少なくとも１５分間インキュベートした後、７０ｍＭのＮａＣｌ、１４０ｍＭのＤ−マンニトール、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、２ｍＭのＣａＣｌ２、１ｍＭのＭｇＣｌ２（ＮａＯＨでｐＨ７．４にする）からなる外液中に再懸濁させた。内液は、６２．５ｍＭのＣｓＣｌ、７５ｍＭのＣｓＦ、１０ ＨＥＰＥＳ、５ｍＭのＥＧＴＡ、２．５ｍＭのＭｇＣｌ２（ＣｓＯＨでｐＨ７．２５にする）から構成されていた。細胞を、全細胞パッチクランプ設定を室温（約２２℃）で−１２５ｍＶの保持電位と試験電位にて使用して、−１０ｍＶ（ｈＮａｖ１．２、ｈＮａｖ１．３、ｈＮａｖ１．４、およびｈＮａｖ１．７）または−２０ｍＶ（ｈＮａｖ１．５）に電圧固定した。部分的に失活させたチャンネルから記録するために、細胞を、約２０％チャンネル失活をもたらす電圧に切り替えた。試験化合物を添加し、Ｎａｖ電流を０．１Ｈｚ、適切な試験電位にてモニターした。全ての化合物希釈物は、非特異的結合を最小限に抑えるために０．１％ウシ血清アルブミンを含んでいた。化合物ウォッシュアウト後に電流が出発値の８０％超まで回復した場合、細胞をさらなる化合物試験のために使用した。異なる化合物濃度での一点測定をプールし、結果として得られたデータセットをDataXpress2.0ソフトウェアでＨｉｌｌ（４−パラメータロジスティック）フィットと当てはめることによって、ＩＣ５０値を算出した。
全細胞パッチクランプ電気生理学。全細胞パッチクランプ設定を室温（約２２℃）で使用して、細胞を電圧固定した。ピペット抵抗は１．５〜２．０ＭΩであった。全細胞キャパシタンスおよび直列抵抗は補償されなかった。電流を５０ｋＨｚでデジタル化し、pClamp10.2を使用して１０ｋＨｚでフィルターにかけた（４ポール・ベッセル）。細胞を培養皿から持ちあげ、化合物潅流のための溶液交換マニホールドに接続されたマイクロピペットの真正面に配置した。非失活チャンネルから記録するために、細胞を−１４０ｍＶに保持し、−１０ｍＶ（ｈＮａｖ１．８については０ｍＶ）まで脱分極した。部分的に失活させたチャンネルから記録するために、細胞をまず−１４０ｍＶで保持し、次いで、約２０％チャンネル失活をもたらす電圧に切り替えた。１０ｍｓパルスを１０秒ごとに送達し、ピーク内向き電流を化合物添加の前後で記録した。化合物希釈物は、非特異的結合を最小限に抑えるために０．１％ウシ血清アルブミンを含んでいた。ｈＮａｖ１．８チャンネル記録のために、テトロドトキシン（ＴＴＸ、０．５ｕＭ）を添加して、内因性ＴＴＸ感受性電位依存性ナトリウムチャンネルを阻害し、Ｎａｖ１．８介在性ＴＴＸ抵抗電流のみを記録した。外液は：１４０ｍＭのＮａＣｌ、５．０ｍＭのＫＣｌ、２．０ｍＭのＣａＣｌ２、１．０ｍＭのＭｇＣｌ２、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、および１１ｍＭのグルコース、ｐＨ７．４（ＮａＯＨによる）から構成されていた。内液は：６２．５ｍＭのＣｓＣｌ、７５ｍＭのＣｓＦ、２．５ｍＭのＭｇＣｌ２、５ｍＭのＥＧＴＡ、および１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．２５（ＣｓＯＨによる）から構成されていた。上昇する化合物濃度を同じ細胞に関して分析し、Clampfit10.2ソフトウェアで、結果として得られるデータセットをOrigin Pro 8ソフトウェアのＨｉｌｌ（４−パラメータロジスティック）フィットに当てはめることによって、ＩＣ５０値を算出した。
ＤＲＧニューロン単離。成体オスおよびメスＣ５７ＢＬ／６マウス（Harlan Laboratories, Indianapolis, IN）をペントバルビタールナトリウム（ネンブタール、８０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．、Western Med Supply, Arcadia, CA）で安楽死させ、続いて断頭した。頸部、胸部および腰部からのＤＲＧを取り出し、Ｃａ２＋Ｍｇ２＋不含ハンクス液（Invitrogen, Carlsbad, CA）中に入れ、解剖顕微鏡下で付着した繊維を切り取った。ＤＲＧを連続して３７℃にてパパイン（２０Ｕ／ｍｌ、Worthington Biochemical Corporation, Lakewood, NJ）およびＣａ２＋Ｍｇ２＋不含ハンクス液（ｐＨ７．４）中Ｌ−システイン（２５μＭ）で２０〜３０分間消化し、次いでコラゲナーゼ２型（０．９％ｗ／ｖ、Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ 生化学Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）で２０〜３０分間消化した。１０％ウシ胎仔牛血清（Invitrogen）を追加したＤＭＥＭおよびHam's F-12 Nutrient混合物の１：１混合物（Invitrogen）で消化をクエンチし、そして細胞を先端熱加工したパスツールピペットで摩砕した後、ポリ−Ｄ−リジンでコートされたガラスカバースリップ（Ｃole-Parmer, Vernon Hills, IL）上に蒔いた。細胞を、加湿インキュベータ中、２８℃、５％ＣＯ２で３〜７日間１％ＮＳＦ−１（Lonza, Basel, Switzerland）の存在下で維持して、テトロドトキシン−感受性ナトリウムチャンネル電流の発現を増加させた。
ＤＲＧニューロンの手動パッチ−クランプ電気生理学。ＤＲＧニューロンを、全細胞パッチクランプ設定を用いて室温（２１〜２４℃）にてAxopatch200 BまたはMultiClamp 700 B増幅器およびDIGIDATA 1322AとpClAMPソフトウェア（Molecular Devices, Sunnyvale, CA）を使用して電圧固定した。ホウケイ酸ガラス毛細管（World Precision Instruments, Sarasota, FL）から取り出したピペットは、１．０〜３．０ＭΩの抵抗を有していた。８０％超直列抵抗補償を使用して電圧誤差を最小限に抑えた。Ｐ／４プロトコルを容量性電流の除去（leak subtraction）のために使用した。電流を５０ｋＨｚでデジタル化し、１０ｋＨｚでフィルターにかけた（４ポール・ベッセル）。細胞を培養皿から持ちあげ、化合物潅流のために溶液交換マニホールドに接続されたマイクロピペットの真正面に配置した。細胞を、−１４０ｍＶまたは約２０％失活をもたらす電圧で保持し、１０秒ごとに−１０ｍＶまで４０ミリ秒間脱分極させた。テトロドトキシン（TTX, Sigma）をペプチド添加後に使用して、残留ＴＴＸ感受性ナトリウム電流をブロックした。ピペット溶液は：６２．５ｍＭのＣｓＣｌ、７５ｍＭのＣｓＦ、２．５ＭｇＣｌ２、５ＥＧＴＡ、および１０ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．２５（ＣｓＯＨによる）を含んでいた。浴溶液は：７０ｍＭのＮａＣｌ、５．０ｍＭのＫＣｌ、２．０ｍＭのＣａＣｌ２、１．０ｍＭのＭｇＣｌ２、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、および１１ｍＭのグルコース、１４０ｍＭのマンニトール、ｐＨ７．４（NaＯＨによる）を含んでいた。データをClampfitおよびOrigin Pro8（OriginLab Corp, Northampton, MA）で分析した。
電気生理学研究の結果および構造−活性関係。電気生理学研究の結果を以下の表６〜表３２に示す。広範囲の系統的アナロギング（analoging）は、ＧｐＴｘ−１（配列番号１）内の個々の位置がいかにその全体的なＶＧＳＣ活性プロファイルに寄与するかに対する相当な洞察を与える。全体的な分子構成に関して、Ｃｙｓ９（またはＳｅＣｙｓ９）とＣｙｓ２３（またはＳｅＣｙｓ２３）との間（Ｃ２−Ｃ５）およびＣｙｓ１６（またはＳｅＣｙｓ１６）とＣｙｓ３０（またはＳｅＣｙｓ３０）との間（Ｃ３−Ｃ６）のジスルフィド結合（またはジセレニド結合）が、機能に必須である。しかしながら、（Ｃ１−Ｃ４）ジスルフィド結合を除去する、［２−Ａｂｕ２，１７］ＧｐＴｘ−１（配列番号１２５）におけるようなＣｙｓ２およびＣｙｓ１７の同時置換は、ＮａＶ１．７およびＮａＶ１．３に対して顕著な活性を保持し、Ｎａｖ１．４に対する活性が改善される可能性がある。（表２９を参照のこと）。
Ｎ末端、Ａｓｐ１、Ｌｅｕ３、およびＧｌｙ４を含むＧｐＴｘ−１のＮ末端部分は、ＧｐＴｘ−１と比較して、ＶＧＳＣ有効性または選択性のいずれにも影響を及ぼすことなく、修飾を受けやすい。（表７、表８、表９、および表１０を参照のこと）。さらなるアミノ酸（複数可）をＮ末端にカップリングすることによるポリペプチド鎖の伸長は耐容性良好である。（表７）。Ｎ末端アスパラギン酸残基をアセチル化してＡｃ−ＧｐＴｘ−１（配列番号１３２）を得ることで、ＮａＶ１．７での有効性を維持し、PatchXpress（登録商標）(PX)フォーマットにおけるＮａＶ１．３およびＮａＶ１．４に対する選択性を増大させる。（表３０を参照のこと）。ＧｐＴｘ−１のＡｓｐ１は、トランケートすることができるか、またはＮａＶ１．７およびＮａＶ１．３での有効性もしくはＮａＶ１．４およびＮａＶ１．５に反する選択性に対して影響を及ぼさない様々なアミノ酸で置換することができる。（表８を参照のこと）。ＧｐＴｘ−１中のＬｅｕ３およびＧｌｙ４を個々に疎水性または塩基性アミノ酸で置換することができ、それでもＮａＶ１．７およびＮａＶ１．３に対して有効性を保持するが、これらの位置は酸性残基での置換にあまり寛容でない。（表９および表１０を参照のこと）。しかしながら、Ｌｅｕ３のグルタミン酸の置換は、ＰＸアッセイフォーマットにおいてＮａｖ１．４に反する選択性を増大させる。（表３０を参照のこと）。
配列番号１に関して位置５および６の疎水性残基（ＧｐＴｘ−１中のＰｈｅ５およびＭｅｔ６）は、ＮａＶ１．７およびＮａＶ１．３阻害能力に必須である。（表１１および表１２を参照のこと）。ＧｐＴｘ−１（配列番号１）中の位置５のアミノ酸が何であるかも、ＮａＶ１．７、ＮａＶ１．３、およびＮａＶ１．４間のペプチドの選択性に対して多大な影響を及ぼす。天然のフェニルアラニンの脂肪族または芳香族疎水性残基の置換は、ＮａＶ１．７に対する有効性を維持または増大させ、一方、ＮａＶ１．４に反する選択性を増大させるが、ＮａＶ１．５に反する選択性は減少させない。（表１１を参照のこと）。アラニンの［Ａｌａ５］ＧｐＴｘ−１（配列番号２２）中への組み入れは、ＮａＶ１．７に対する有効性を保持し、一方、ＰＸフォーマットにおけるＮａＶ１．３およびＮａｖ１．４に反する選択性を大幅に増大させる。アラニンに加えて、限定されないが、グリシン、２−アミノ酪酸（Ａｂｕ）、２−アミノイソ酪酸（Ａｉｂ）、ノルバリン、バリン、ロイシン、およびイソロイシンを含む多くの他の脂肪族残基を位置５で組み入れて、Ｎａｖ１．４に反する選択性を改善することができる。（表３０を参照のこと）。２つのパラ置換されたフェニルアラニン誘導体、［ｐＩ−Ｐｈｅ５］ＧｐＴｘ−１（配列番号２４７）および［Ｂｉｐ５］ＧｐＴｘ−１（配列番号２４２）は、ＮａＶ１．３に対する有効性が増大し、ＮａＶ１．７に反して選択的である。（表３０を参照のこと）。位置６で疎水性残基を組み入れることによって、試験した４つのＮａＶサブタイプ全部に対する有効性がそれらのサイズに比例して増大する。（表１２を参照のこと）。ロイシンおよびフェニルアラニンを含む様々な疎水性残基を、位置６で位置５のアラニンと組み合わせて位置６で組み入れて、ＰＸアッセイフォーマットにおいてＮａｖ１．７に対する良好な有効性およびＮａｖ１．４に反する選択性を維持することができる。（表３０を参照のこと）。
各位置は認識可能な選好を有するが、Ａｒｇ８〜Ｔｈｒ２６のアミノ酸の配列は、配列番号１に関するＡｓｐ１４を除いては、個々の置換に対する耐容性が高い。ＧｐＴｘ−１の位置１４にアスパラギン酸残基なしで合成されたペプチドは、スクリーニングのために十分純粋な形態で単離されておらず、このことは、この残基がペプチドの正確なフォールディングのために重要である可能性があることを示す。塩基性または中性親水性アミノ酸は、ＮａＶ１．７およびＮａＶ１．３阻害能力を維持するための配列番号１に関するＡｒｇ７およびＬｙｓ８の置換として許容される。（表１３を参照のこと）。しかしながら、Ａｒｇ７についてのグルタミン酸の置換は、ＰＸアッセイフォーマットにおけるＮａｖ１．４に反する選択性を増大させる。（表３０を参照のこと）。配列番号１に関する、Ｉｌｅ１０、Ｐｒｏ１１、Ａｓｐ１２、Ａｓｎ１３、Ｌｙｓ１５、Ａｒｇ１８、およびＰｒｏ１９は、ＮａＶ１．７およびＮａＶ１．３に対する有効性にほとんど影響を及ぼさずに、様々なアミノ酸で置換することができる。（表１４、表１５、表１６、表１７、および表１８を参照のこと）。Ｐｒｏ１１と別の残基を、Ｎａｖ１．７活性に影響を及ぼすことなく置換する能力、すなわち、［Ｇｌｕ１１］ＧｐＴｘ−１（配列番号１４７）および［Ｔｒｐ１１］ＧｐＴｘ−１（配列番号１７１）は注目に値する。なぜなら、この残基はＨＷＴＸ−ＩＶ配列番号５２８）およびＨＷＴＸ−Ｉ（配列番号５２９）のペプチド配列中で保存されるからである。（表１５；図１５Ａ〜Ｂを参照のこと）。位置１０または１１の酸性残基の置換、すなわち、［Ａｓｐ１０］ＧｐＴｘ−１（配列番号１１９）、［Ｇｌｕ１０］ＧｐＴｘ−１（配列番号１４６）、および［Ｇｌｕ１１］ＧｐＴｘ−１（配列番号１４７）は、Ｎａｖ１．４に反する選択性を改善することができる。（表３０を参照のこと）。Ａｓｎ１３の置換は、おそらくはその後のＦｍｏｃ除去ステップ中のアスパルチミド形成の減少によって、ペプチドアナログのＦｍｏｃ固相合成を改善する。位置１８の置換は、Ｎａｖ１．４に反する選択性を改善すし得る。（表１８および表３０を参照のこと）。配列番号１に関する、Ａｓｎ２０、Ｌｅｕ２１、Ｖａｌ２２、Ｓｅｒ２４、Ａｒｇ２５、およびＴｈｒ２６は、個々に非酸性アミノ酸で置換されて、完全なＮａｖ１．７およびＮａｖ１．３阻害能力を保持する可能性がある。（表１９、表２０、表２１、および表２２を参照のこと）。ＧｐＴｘ−１（配列番号１）の位置２６のトレオニンは、ＨＷＴＸ−ＩＶ（配列番号５２８）およびＨＷＴＸ−Ｉ中の保存されたリジンとは異なる（配列番号５２９；図１５Ａ〜Ｂを参照のこと）。この位置での置換は、［Ｌｅｕ２６］ＧｐＴｘ−１（配列番号１２１）および［Ｇｌｕ２６］ＧｐＴｘ−１（配列番号１５２）においてのように、ＮａＶ１．４に反する選択性を増大させる。（表３０を参照のこと）。ＧｐＴｘ−１（配列番号１）中のＣｙｓ１７とＣｙｓ２３との間のループは、［Ｓｅｒ−Ｓｅｒ１９］ＧｐＴｘ−１（配列番号９３）および［Ｇｌｕ１８；ｄｅｓＡｓｎ２０］ＧｐＴｘ−１（配列番号１３４）により示されるように、１つのアミノ酸残基の挿入または欠失によって、試験したＶＧＳＣに対するペプチドの活性に対して実質的に影響を及ぼすことなく長さが増大または減少する可能性がある。（表１８および表２９を参照のこと）。
ＧｐＴｘ−１配列のＣ末端部分は、ＮａＶ１．７およびＮａＶ１．３に対するペプチドの活性にとって最も重要である。有効性および選択性を保持しながらのＧｐＴｘ−１（配列番号１）中のＨｉｓ２７の置換は、芳香族および塩基性残基で最もよく達成される。表２３を参照のこと）。配列番号１に関する残基Ｌｙｓ２８およびＶａｌ３３は、ＮａＶ１．７およびＮａＶ１．３阻害能力に影響を及ぼすことなく様々な異なるアミノ酸での置換に対して最も耐容性である。（表２３および表２６を参照のこと）。［Ａｒｇ２８］ＧｐＴｘ−１（配列番号７２）、［Ｇｌｕ２８］ＧｐＴｘ−１（配列番号１５３）、［Ａｓｐ２８］ＧｐＴｘ−１（配列番号７５０）、［Ｇｌｎ２８］ＧｐＴｘ−１（配列番号７６３）、および［Ｇｌｕ３３］ＧｐＴｘ−１（配列番号３３）は、ＮａＶ１．４に反して増大した選択性を示す。（表３０を参照のこと）。ＧｐＴｘ−１（配列番号１）の位置２９のトリトファン（trytophan）（またはチオトリプトファン）は、ＮａＶ１．７およびＮａＶ１．３に対する高レベルの有効性を得るために重要であるようである。（表２４を参照のこと）。大きな疎水性置換を有するアナログ、［１−Ｎａｌ２９］ＧｐＴｘ−１（配列番号７９）および［２−Ｎａｌ２９］ＧｐＴｘ−１（配列番号１２９）はほとんどの活性を保持するが、それでもＧｐＴｘ−１よりも５倍効力が低いが、Ｎａｖ１．４．に反して増大した選択性を有する可能性がある。（表３０）。配列番号１に関して、Ｌｙｓ３１も、ＧｐＴｘ−１によるＮａｖ１．７およびＮａＶ１．３の強力な阻害に重要であるようである。（表２５を参照のこと）。ＧｐＴｘ−１（配列番号１）の位置３２のチロシンは、ＮａＶ１．７およびＮａＶ１．３に対する有効性を保持して脂肪族または芳香族疎水性アミノ酸で置換することができるが、これらの置換は多くの場合、ＮａＶ１．５およびＮａＶ１．４に対する活性を増大させ、選択性の減少に至る。（表２５を参照のこと）。ＧｐＴｘ−１（配列番号１）の位置３４のフェニルアラニンは、ＮａＶ１．７およびＮａＶ１．３に対する有効性を失うことなく、他の疎水性アミノ酸で単に置換することができるが、大きな疎水性アミノ酸は有効性を増大させ、したがってＮａＶ１．４およびＮａＶ１．５に反する選択性を減少させる傾向がある。（表２７を参照のこと）。ＧｐＴｘ−１（配列番号１）のＣ末端は、ＮａＶ阻害活性を保持しつつ、少なくとも１つのアミノ酸によって伸長されやすいが、ＧｐＴｘ−１のＣ末端のトランケーションまたは天然のＣ末端アミドの遊離酸での置換は、ＮａＶ１．７およびＮａＶ１．３に対する有効性を減少させる。（表２８を参照のこと）。個々の置換を組み合わせるＧｐＴｘ−１（配列番号１）のさらなるアナログ、すなわち、［Ａｌａ５，Ｐｈｅ６，Ｌｅｕ２６，Ａｒｇ２８］ＧｐＴｘ−１（配列番号２６２）および［Ａｌａ５，Ｐｈｅ６，Ｇｌｕ１０，２−Ａｂｕ１３，Ｌｅｕ２６，Ａｒｇ２８］ＧｐＴｘ−１（配列番号１０３５）は、ＮａＶ１．４およびＮａＶ１．５に反する選択性ならびにＮａｖ１．７およびＮａｖ１．３に対する有効性においてさらなる改善を示した（表２９および表３０を参照のこと）。部分的に失活したｈＮａｖ１．２チャンネルに対する［Ａｌａ５］ＧｐＴｘ−１（１−３４）（配列番号２２）のＩＣ５０は０．２６５μＭであった。
手動の全細胞パッチクランプ電気生理学を、Ｎａｖ１．７、Ｎａｖ１．３、Ｎａｖ１．４、およびＮａｖ１．５のヒトクローンでＧｐＴｘ−１（配列番号１）および［Ａｌａ５］ＧｐＴｘ−１（配列番号２２）に関して実施した。１００ｎＭのＧｐＴｘ−１での試験は、Ｎａｖ１．７電流の完全阻害を示した。（図２０を参照のこと）。ＧｐＴｘ−１についてのＮａｖ１．７阻害のＩＣ５０値は７．４０ｎＭであった。（図２１を参照のこと）。濃度の増加におけるＧｐＴｘ−１添加の効果およびＮａｖ１．７電流に対するウォッシュアウトの効果を記録した。（図２２を参照のこと）。３００ｎＭのＧｐＴｘ−１での試験は、Ｎａｖ１．３電流の完全阻害を示した。（図２３を参照のこと）。ＧｐＴｘ−１についてのＮａｖ１．３阻害のＩＣ５０値は１６．８ｎＭであった。（図２４を参照のこと）。濃度の増加におけるＧｐＴｘ−１添加の効果およびＮａｖ１．３電流に対するウォッシュアウトの効果を記録した。（図２５を参照のこと）。３．０μＭのＧｐＴｘ−１での試験は、Ｎａｖ１．４電流の部分的阻害を示した。（図２６を参照のこと）。Ｎａｖ１．４阻害のＩＣ５０値は、それぞれ、ＧｐＴｘ−１について２．９μＭであり、閉鎖および部分的失活状態について０．２６μＭであった。（図２７および２８を参照のこと）。濃度の増加におけるＧｐＴｘ−１添加の効果およびＮａｖ１．４電流に対するウォッシュアウトの効果を、閉鎖および部分的失活状態に関してそれぞれ記録した。（図２９および３０を参照のこと）。ＧｐＴｘ−１は、チャンネルが部分的に失活される場合、ｈＮａｖ１．４に対してさらに強力である。３．０μＭＧｐＴｘ−１での試験は、Ｎａｖ１．５電流の弱い阻害を示した。（図３１を参照のこと）。ＧｐＴｘ−１についてのＮａｖ１．５阻害のＩＣ５０値は８．９μＭであった。（図３２を参照のこと）。濃度の増加におけるＧｐＴｘ−１添加の効果およびＮａｖ１．５電流に対するウォッシュアウトの効果を記録した。（図３３を参照のこと）。これらの結果は、ＧｐＴｘ−１（配列番号１）が、Ｎａｖ１．４およびＮａｖ１．５に反する選択性を有する、Ｎａｖ１．７およびＮａｖ１．３の強力な二重ペプチド阻害剤であることを示す。３００ｎＭの［Ａｌａ５］ＧｐＴｘ−１（配列番号２２）での試験は、Ｎａｖ１．７電流の完全な阻害を示した。（図３４を参照のこと）。［Ａｌａ５］ＧｐＴｘ−１についてのＮａｖ１．７阻害のＩＣ５０値は１３．２ｎＭであった。（図３５を参照のこと）。濃度の増加における［Ａｌａ５］ＧｐＴｘ−１添加の効果およびＮａｖ１．７電流に対するウォッシュアウトの効果を記録した。（図３６を参照のこと）。これらの結果は、［Ａｌａ５］ＧｐＴｘ−１（配列番号２２）もＮａｖ１．７の強力な阻害剤であることを示す。
手動パッチクランプ電気生理学を、単離されたマウスＤＲＧニューロンでＧｐＴｘ−１（配列番号１）および［Ａｌａ５］ＧｐＴｘ−１（配列番号２２）に関して実施した。濃度の増加におけるＧｐＴｘ−１添加の効果およびマウスＤＲＧニューロンにおけるナトリウムチャンネル電流に対するウォッシュアウトの効果を記録した。（図３７を参照のこと）。ＧｐＴｘ−１についてのＴＴＸ感受性ナトリウムチャンネル電流阻害のＩＣ５０値は７．１ｎＭであった。（図３８を参照のこと）。２００ｎＭのＧｐＴｘ−１での試験は、マウスＤＲＧニューロンにおけるＴＴＸ感受性ナトリウム電流のほぼ完全な阻害を示した。（図３９を参照のこと）。濃度の増加におけるＧｐＴｘ−１添加の効果および２０％失活をもたらす保持電圧でのマウスＤＲＧニューロンにおけるナトリウムチャンネル電流に対するウォッシュアウトの効果を記録した。（図４０を参照のこと）。ＧｐＴｘ−１について２０％失活をもたらす保持電圧でのＴＴＸ感受性ナトリウムチャンネル電流阻害のＩＣ５０値は４．７ｎＭであった。（図４１を参照のこと）。２００ｎＭのＧｐＴｘ−１での試験は、２０％失活をもたらす保持電圧でのマウスＤＲＧニューロンにおいてＴＴＸ感受性ナトリウム電流の完全な阻害を示した。（図４２を参照のこと）。濃度の増加における［Ａｌａ５］ＧｐＴｘ−１（配列番号２２）添加の効果およびマウスＤＲＧニューロンにおけるナトリウムチャンネル電流に対するウォッシュアウトの効果を記録した。（図４３を参照のこと）。［Ａｌａ５］ＧｐＴｘ−１（配列番号２２）についてのＴＴＸ感受性ナトリウムチャンネル電流阻害のＩＣ５０値は１７．０ｎＭであった。（図４４を参照のこと）。３００ｎＭのＧｐＴｘ−１での試験は、マウスＤＲＧニューロンにおいてＴＴＸ感受性ナトリウム電流のほぼ完全な阻害を示した。（図４５を参照のこと）。
手動全細胞パッチクランプ電気生理学を、Ｎａｖ１．７およびＮａｖ１．５のヒトクローンに関するホモ二量体型複合体１に関して実施した（実施例５を参照のこと）。濃度の増加におけるホモ二量体型複合体１の添加の効果およびＮａｖ１．７電流に対するウォッシュアウトの効果を記録した。（図４６を参照のこと）。ホモ二量体型複合体１についてのＮａｖ１．７阻害のＩＣ５０値は１．２ｎＭであった。（図４７を参照のこと）。３ｎＭのホモ二量体型複合体１での試験は、化合物が長時間の洗浄（１０分）中のウォッシュアウトに時間がかかることを示し、３００ｎＭのホモ二量体型複合体１での試験は、化合物が長時間の洗浄（１０分）中にウォッシュアウトされなかったことを示した。（図４８を参照のこと）。３００ｎＭのホモ二量体型複合体１での試験は、Ｎａｖ１．７電流の完全な阻害をもたらした。（図４９を参照のこと）。濃度の増加におけるホモ二量体型複合体１添加の効果および約２０％失活をもたらす保持電位でのＮａｖ１．７電流に対するウォッシュアウトの効果を記録した。（図５０を参照のこと）。ホモ二量体型複合体１について約２０％失活をもたらした保持電位でのＮａｖ１．７阻害のＩＣ５０値は０．６６ｎＭであった。（図５１を参照のこと）。３ｎＭのホモ二量体型複合体１での試験は、約２０％失活をもたらした保持電位でＮａｖ１．７電流の完全な阻害をもたらした。（図５２を参照のこと）。濃度の増加におけるホモ二量体型複合体１添加の効果およびＮａｖ１．５電流に対するウォッシュアウトの効果を記録した。（図５３を参照のこと）。ホモ二量体型複合体１についてのＮａｖ１．５阻害のＩＣ５０値は７５．５ｎＭであった。（図５４を参照のこと）。２μＭホモ二量体型複合体１での試験は、Ｎａｖ１．５電流の完全な阻害をもたらした。（図５５を参照のこと）。濃度の増加におけるホモ二量体型複合体１添加の効果および約２０％失活をもたらした保持電位でのＮａｖ１．５電流に対するウォッシュアウトの効果を記録した。（図５６を参照のこと）。ホモ二量体型複合体１について約２０％失活をもたらした保持電位でのＮａｖ１．５阻害のＩＣ５０値は５７ｎＭであった。（図５７を参照のこと）。２μＭホモ二量体型複合体１での試験は、約２０％失活をもたらした保持電位でＮａｖ１．５電流の完全な阻害をもたらした。（図５８を参照のこと）。
カリウムチャンネル研究。後根神経節を成体Sprague-Dawleyラット（１４〜１５週齢）から収集し、結合組織を切り落とし、そしてパパイン（３ｍＬのカルシウム・マグネシウム不含ハンクス緩衝液＋１ｍｇＬ−システイン＋４ｕＬの飽和重炭酸ナトリウム＋６０マイクロリットルのパパイン、Worthington biochemical）で３０分間３７℃にて酵素により解離させた。調製物を１０００ｒｐｍにて２分間スピンさせ、そしてペレットを第２の酵素インキュベーションのためにコラゲナーゼ中およびディスパーゼ（４ｍＬのカルシウム・マグネシウム不含ハンクス緩衝液＋１２０マイクロリットルのコラゲナーゼ／ディスパーゼミックス１００ｍｇ／ｍＬ、Roche製）中に６０分間、１０分ごとに穏やかに摩砕しながら再懸濁させた。細胞を２０００ｒｐｍにて２分間再度スピンさせ、Ｆ−１２培地中に再懸濁させ、ポリ−Ｄ−ラミニンでコーティングされたカバースリップ上に蒔き、５％ＣＯ２の加湿された３７℃インキュベータ中に入れ、同じ日に電気生理学的記録のために使用した。
電気生理学的記録は、パッチ−クランプ技術の全細胞設定で作製し（Hamill OP et al., “Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches, Pfluger’s Archiv 391:85-100, 1981）、内部（ピペット）溶液は、７０ミリモル濃度のＫＦ、７０ミリモル濃度のＫＣｌ、１０ミリモル濃度のＨＥＰＥＳ、５ミリモル濃度のＨＥＤＴＡ（ＫＯＨでｐＨ７．２５にする）を含有していた。外液は、１４０ミリモル濃度のＮａＣｌ、５ミリモル濃度のＫＣｌ、２ミリモル濃度のＣａＣｌ２、１ミリモル濃度のＭｇＣｌ２、１０ミリモル濃度のＨＥＰＥＳ、１０ミリモル濃度のグルコース（ＮａＯＨでｐＨ７．４にする）を含んでいた。パッチクランプの全細胞設定の形成後、パッチピペットを動かすことによって細胞を皿の底から持ちあげ、電子制御（BioLogique）下の重力駆動微小潅流アレイの前に手作業で配置した。合わせられたナトリウムおよびカリウム電流を、−９０ｍＶの保持電位から０ｍＶまでの２０ｍｓの試験脱分極によって５秒ごとに発生させた。潅流管を切り替えることによって［Ａｌａ５］ＧｐＴｘ−１（配列番号２２；５００ｎＭ）ペプチドを添加し、一方、高速ナトリウム電流（おそらくはテトロドトキシン感受性で、Ｎａｖ１．７により少なくとも部分的にコード化）は着実に減少し、ペプチドによるブロックを反映し、外向きカリウム電流において変化はなかった。図９４で示される電流は、漏れを差し引いていないが、試験パルスが０ｍＶになったので、漏れ電流による汚染は最小であるはずである。図９４で示される結果は、５００ｎＭ［Ａｌａ５］ＧｐＴｘ−１（配列番号２２）が電位依存性カリウム電流をブロックしなかったことを示す。
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
実施例４：血漿安定性研究
ＧｐＴｘ−１ペプチドおよびＧｐＴｘ−１ペプチドアナログの安定性を、ヒト、ラットおよびマウス血漿で調査した。ペプチドストック溶液を５０／５０（ｖ／ｖ）メタノール／水中ＧｐＴｘ−１ペプチドおよびＧｐＴｘ−１ペプチドアナログ参照基準から作製し、−２０℃で貯蔵した。１ｍｇ／ｍＬのペプチドストック溶液を使用して、ＨＰＬＣグレード水中２０μｇ／ｍＬのペプチド希釈標準溶液を調製した。ペプチド希釈標準溶液を使用前に冷蔵庫中で２〜８℃にて貯蔵した。
２０μｇ／ｍＬのペプチド希釈標準溶液２５μｌを含むバイアル中に２２５μｌの血漿を添加することによって、安定性試料を調製し、３７℃でインキュベートした。初期濃度は、ヒト、ラット、またはマウス血漿中の各ペプチドについて２μｇ／ｍＬであった。５つの時点（０、２、４、８および２４時間）での２５μｌの血漿試料を９６ウェルプレートの適切なウェル中に等分し、続いて２５μｌの内部標準溶液（１００ｎｇ／ｍＬ、５０／５０のメタノール／水中で作製したＮＡＶペプチドアナログ）および１００μＬの０．１％ギ酸を添加し、試料をボルテックス混合した。Oasis HLBμElution９６ウェル固相抽出プレートを使用して、ＧｐＴｘ−１またはＧｐＴｘ−ペプチドアナログペプチドを前処理された血漿試料から抽出し、抽出物を分析のためにＬＣ−ＭＳ／ＭＳシステム上に注入した（１０μＬ）。
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳは、Turbo IonSpray（登録商標）イオン化源を有する5500QTRAP質量分析計（AB Sciex, Toronto, Canada）に連結されたAcquity UPLCシステム（Waters, Milford, MA）から構成されていた。分析カラムはAcquity UPLC BEHＣ１８２．１ｍｍ×５０ｍｍカラムであった。移動相は、アセトニトリル中０．１％ギ酸／水（５／９５、ｖ／ｖ、移動相Ａ）およびアセトニトリル中０．１％ギ酸／水（９５／５、ｖ／ｖ、移動相Ｂ）であった。データを集め、AB Sciex Analyst（登録商標）ソフトウェア（バージョン１．５）を使用して処理した。
試験したペプチドの血漿安定性を、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析から得られたペプチドおよび内部標準に相当するピーク面積比から誘導し、全データを０時間の時点での値に対して正規化した。結果を以下の表３３、表３４、および表３５に示す。試験したＧｐＴｘ−１およびＧｐＴｘ−１ペプチドアナログは、おそらくはそれらのコンパクトなジスルフィド安定化構造のために、ヒト、マウス、およびラット血漿中で顕著な安定性を示した。
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
実施例５：ＧｐＴｘ−１ペプチドアナログのＰＥＧ化された複合体の研究
半減期延長部分で修飾することができたＧｐＴｘ−１を有する部位を特定するために、各非システイン位置でプロパルギルグリシンを含む１組の位置アナログを調製した。フォールディング後、アルキン含有ペプチドを約５００ＤａのＭＷのアジドＰＥＧでの銅触媒による１，３−双極性環付加に付して、トリアゾール結合を有する部位特異的にＰＥＧ化されたペプチドを得、かくして配列中のプロパルギルグリシンすなわちＰｒａ残基を３−（１，２，３−トリアゾール−４−イル）アラニンすなわちＡｔｚ残基に変えた。この一連のアナログの電気生理学的スクリーニング（前記表３０、表３１、および表３２）は、ＮａＶ１．７またはＮａＶ１．３の有効性を有意に減少させることなく大きな化学部分を導入することができる、Ｎ末端ならびに配列番号１の位置１、１０、１２、１３、１５、２２、２８、および３３を含むＧｐＴｘ−１内のいくつかの位置を特定した。一般的に、これらの位置は、疎水性結合面から離れるか、または周囲のＧｐＴｘ−１の親水性表面上にある傾向がある。これらの位置が特定されたので、［Ｐｈｅ６；Ａｔｚ１３］ＧｐＴｘ−１（１−３４）（配列番号５９１）または［Ａｌａ５；Ｐｈｅ６；Ａｔｚ１３］ＧｐＴｘ−１（１−３４）（配列番号１０２８）またはビオチン−Ａｈｘ−−［Ａｌａ５，Ｐｈｅ６，Ａｔｚ１３，Ｌｅｕ２６，Ａｒｇ２８］ＧｐＴｘ−１（１−３４）（配列番号１０３１）の更に大きな分子量の複合体（２０ｋＤａのＰＥＧ；配列番号５９０）およびホモ二量体型構築物を調製し（図８１Ａを参照のこと）、試験した（表３０、および図４６〜５８を参照のこと）。天然のＧｐＴｘ−１配列（配列番号１）に対して、位置１３で２つのペプチドのそれぞれと共有結合した異なるサイズのＰＥＧリンカーを有するこれらのホモ二量体のうちの４つは次のように指定される（＊＝エチル）：
［Ｐｈｅ６，Ａｔｚ（２ｋＤａのＥｔＯ−ＰＥＧ＊−｛［Ｐｈｅ６，Ａｔｚ１３＊］ＧｐＴｘ−１（１−３４）｝）１３］ＧｐＴｘ−１（１−３４）（「ホモ二量体型複合体１」）（図８１Ａを参照のこと）；
［Ｐｈｅ６，Ａｔｚ（５００ＤａのＥｔＯ−ＰＥＧ＊−｛［Ｐｈｅ６，Ａｔｚ１３＊］ＧｐＴｘ−１（１−３４）｝）１３］ＧｐＴｘ−１（１−３４）（「ホモ二量体型複合体２」）；
［Ａｌａ５，Ｐｈｅ６，Ａｔｚ（２ｋＤａのＥｔＯ−ＰＥＧ＊−｛［Ａｌａ５，Ｐｈｅ６，Ａｔｚ１３＊，Ｌｅｕ２６，Ａｒｇ２８］ＧｐＴｘ−１（１−３４）｝）１３，Ｌｅｕ２６，Ａｒｇ２８］ＧｐＴｘ−１（１−３４）（「ホモ二量体型複合体３」）；
ビオチン−Ａｈｘ−［Ａｌａ５，Ｐｈｅ６，Ａｔｚ（２ｋＤａのＥｔＯ−ＰＥＧ＊−｛ビオチン−Ａｈｘ−［Ａｌａ５，Ｐｈｅ６，Ａｔｚ１３＊，Ｌｅｕ２６，Ａｒｇ２８］ＧｐＴｘ−１（１−３４）｝）１３，Ｌｅｕ２６，Ａｒｇ２８］ＧｐＴｘ−１（１−３４）（「ホモ二量体型複合体４」）。
実施例６：ＧｐＴｘ−１のＮＭＲ構造決定
ＧｐＴｘ−１の構造を、水中、ｐＨ約３およびＴ＝２９８Ｋの高分解能ＮＭＲ分光法によって得た。標準２Ｄ実験を用いてBruker Avance III８００ＭＨｚ分光計でデータを集めた。（Wutchrich, NMR of Proteins and Nucleic Acids, John Wiley & Sons, Canada, (1986)を参照のこと）。構造は、５００のＮＯＥ制限（２１６ロングレンジ(long range）、４５の二面角制限、１１の水素結合制限および３のジスルフィド結合制限から、Cyana２．１ソフトウェアを使用して算出した。骨格原子の最終ＲＭＳＤは０．１±０．０５Ａであり、全ての重原子について０．７４±０．１２Ａであった。（ペプチド骨格の２０の最低エネルギーコンフォメーションのオーバーレイについては図７、ペプチドの２０の最低エネルギーコンフォメーションからの重原子のオーバーレイについては図８、そしてペプチド骨格のリボン表示については図９を参照のこと）。構造は、ペプチドの阻害性シスチンノット（ＩＣＫ）ファミリーのＧｐＴｘ−１ａメンバーを作製するＣ２−Ｃ１７、Ｃ９−Ｃ２３、およびＣ１６−Ｃ３０またはＣ１−Ｃ４、Ｃ２−Ｃ５、Ｃ３−Ｃ６パターンのような６つのシステイン残基のジスルフィドジスルフィド結合性を裏付ける。
ＧｐＴｘ−１（配列番号１）の折り畳み構造は、本来は両親媒性であり、分子の片側に平坦な疎水性面と、反対側に親水性（主にカチオン性）面を有する。ＧｐＴｘ−１の系統的アナロギング、特にアラニンおよびグルタミン酸での位置スキャニングは、いくつかの残基をＮａＶ１．７およびＮａＶ１．３での活性について重要であるとして特定する。これらの残基、すなわち配列番号１に関してＰｈｅ５、Ｍｅｔ６、Ｈｉｓ２７、Ｔｒｐ２９、Ｌｙｓ３１、Ｔｙｒ３２、およびＰｈｅ３４はＧｐＴｘ−１の一面上で集まっている。配列番号１の残基２７〜３４はＣ末端β鎖を形成し、一方、Ｐｈｅ５およびＭｅｔ６はその鎖に隣接し、この疎水性面の残りを形成する。この面の性質を変える変化はＮａＶ１．７およびＮａＶ１．３に対する活性を阻害するので、これは、結合界面のＶＧＳＣと相互作用する分子の一部である可能性がある。（図１０および図１１を参照のこと）。
実施例７：マウスにおける予備薬物動態決定
薬物動態研究。予備薬物動態（ＰＫ）研究を実施した。１つのＰＫ研究は、Charles River Laboratoriesから得た７週令のオスＣＤ−１マウスで実施した。マウスは、業者によって頸動脈中にカテーテルが設置されていた。［Ａｌａ５］ＧｐＴｘ−１（配列番号２２）を、３匹のマウスに静脈内投与し、３匹のマウスに皮下投与した。ＧｐＴｘ−１（配列番号１）を３匹のマウスに皮下投与した。全ての用量は１ｍｇ／ｋｇであり、ｉ．ｖ．注射は外側尾静脈からおこなった。ｉ．ｖ．投与された動物の血液試料を、投与後３、１５、３０分ならびに１、２、４、６、８、および２４時間で採取し、投与された動物の血液試料を投与後１５、３０分ならびに１、２、４、６、８、および２４時間で採取した。各試料について、１５μＬの血液を頸動脈カテーテルから集め、３５μＬの０．１Ｍクエン酸塩緩衝液中で混合した。試料を次いで分析まで−８０℃で凍結した。
Taconicから得た７週令の未修飾オスＣＤ−１マウスで別のＰＫ研究を実施した。［Ａｌａ５］ＧｐＴｘ−１（配列番号２２）を１２匹のマウスに１ｍｇ／ｋｇで皮下投与し、１２匹のマウスに１ｍｇ／ｋｇで外側尾静脈から静脈内投与した。投与後０．５、１、２、４、８および２４時間で、各投与経路から２匹のマウスを安楽死させ、血液試料および脳を集めた。脳を秤量し、−８０℃で直ちに凍結させた。血液試料をＥＤＴＡ処理されたマイクロティナ中に集め、１３０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、その後、血漿を抽出し、−８０℃にて９６ウェルプレート中で凍結させた。
別のＰＫ研究をTaconicから得た７週令の未修飾ＣＤ−１マウスで実施した。［Ａｌａ５］ＧｐＴｘ−１（配列番号２２）を２１匹のマウスに５ｍｇ／ｋｇで皮下投与した。投与後０．５、１、１．２５、１．５、２、３、および４時間で、３匹のマウスを安楽死させ、血液試料および脳を集めた。脳を秤量し、−８０℃で直ちに凍結させた。血液試料をＥＤＴＡ処理されたマイクロティナ中に集め、１３０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、その後、血漿を抽出し、−８０℃にて９６ウェルプレート中で凍結させた。
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析手順。ペプチドストック溶液（１ｍｇ／ｍＬ）を５０／５０（ｖ／ｖ）メタノール／水中ペプチド参照基準から作製し、−２０℃で貯蔵した。１ｍｇ／ｍＬのペプチドストック溶液を使用して、５０／５０（ｖ／ｖ）メタノール／水中１００μｇ／ｍＬのペプチド希釈標準溶液を調製した。ペプチド希釈標準溶液を冷蔵庫中、２〜８℃で貯蔵した。
標準試料をクエン酸緩衝マウス血液（血液／０．１Ｍクエン酸塩緩衝液、３０／７０、ｖ／ｖ）中で調製した。５、１０、２５、５０、１００、２５０、５００および１０００ｎｇ／ｍＬの標準濃度は、１００μｇ／ｍＬペプチド希釈標準溶液を使用して、新しく調製された５０００ｎｇ／ｍＬのクエン酸緩衝マウス血液中溶液の連続希釈によって調製した。２５μｌの血液試料を９６ウェルプレートの適切なウェル中に等分し、続いて５０μｌの内部標準溶液（１００ｎｇ／ｍＬ、５０／５０メタノール／水中で作製されたペプチドアナログ）および１５０μＬの０．１Ｍ ＺｎＳＯ４を添加し、試料を５分間ボルテックス混合し、次いで１０分間４０００ｒｐｍで遠心分離した。上清を次いで、Oasis HLBμElution９６ウェル固相抽出プレートを用いて抽出して、ペプチドを抽出し、抽出物を分析のためにＬＣ−ＭＳ／ＭＳシステム上に注入した（１０μＬ）。
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳは、Turbo IonSpray（登録商標）イオン化源を有する5500QTRAP質量分析計（AB Sciex, Toronto, Canada）に連結されたAcquity UPLCシステム（Waters, Milford, MA）から構成されていた。分析カラムは、Acquity UPLC BEHＣ１８２．１ｍｍ×５０ｍｍカラムであった。移動相は、アセトニトリル中０．１％ギ酸／水（５／９５、ｖ／ｖ、移動相Ａ）およびアセトニトリル／水中０．１％ギ酸（９５／５、ｖ／ｖ、移動相Ｂ）であった。データを集め、AB Sciex Analyst（登録商標）ソフトウェア（バージョン１．５）を用いて処理した。
校正曲線は、対応するペプチド標準の濃度に対する面積比の１／ｘ２重み付き直線状最小二乗回帰を用いてピーク面積比（ペプチド／内部標準）から導いた。校正基準から得た回帰方程式を使用して、各標準および血液試料の測定された濃度を逆算した。
結果。薬物動態研究において、ＧｐＴｘ−１（配列番号１）は１ｍｇ／ｋｇおよび０．５ｍｇ／ｋｇのｉ．ｖ．用量でマウスにとって致死的であることが判明した。マウスに対して１ｍｇ／ｋｇのｓ．ｃ．用量のＧｐＴｘ−１（配列番号１）は耐容性であり、１時間測定可能な血漿濃度を示した。（図１６を参照のこと）。１ｍｇ／ｋｇのｉ．ｖ．用量の［Ａｌａ５］ＧｐＴｘ−１（配列番号２２）は１５分のおよそのｉｎ ｖｉｖｏ半減期でマウスにおいて耐容性であった。（図１７Ａおよび図１７Ｂを参照のこと）。１ｍｇ／ｋｇのｓ．ｃ．用量の［Ａｌａ５］ＧｐＴｘ−１（配列番号２２）も血液中で測定可能な暴露をもたらした。（図１７Ｂを参照のこと）。別の研究では、５ｍｇ／ｋｇのｓ．ｃ．用量は、血漿中で、PatchXpress（登録商標）(PX)によりｉｎ ｖｉｔｒｏＮａｖ１．７ＩＣ５０よりも４０倍高い約０．６μＭに３時間維持されたペプチド濃度をもたらし、計算されたｔ１／２＝０．６時間であり、１ｍｇ／ｋｇのｓ．ｃ．およびｉ．ｖ．用量よりも高く、さらなるｉｎ ｖｉｔｒｏ試験に適していた。（図１７Ｂを参照のこと）。
実施例８：イオンチャンネルカウンタースクリーン
心臓イオンチャンネルカウンタースクリーン（ｈＥＲＧおよびｈＮａｖ１．５）。
心臓イオンチャンネルカウンタースクリーン（ｈＥＲＧおよびｈＮａｖ１．５）を後述するように実施し、その代表的な結果を図１８および１９Ａ〜Ｂに示す。
PatchXpress（登録商標）システムを使用した、クローンされたヒトＮａｖ１．５ナトリウムチャンネルに対するカウンタースクリーン。
細胞系。ヒトｈＮａｖ１．５で安定にトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞をCytomyx, Inc.から購入した。
細胞外（ＨＢ−ＰＳ）記録溶液は、７０ｍＭのＮａＣｌ、６７ｍＭのＮ−メチル−Ｄ−グルカミン、４ｍＭのＫＣｌ、１．８ｍＭのＣａＣｌ２、１ｍＭのＭｇＣｌ２、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１０ｍＭのグルコースを含み、ＨＣｌでｐＨ７．４に調節されていた。内部記録溶液は、１３０ｍＭのＣｓＦ、１０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＥＧＴＡ、２ｍＭのＭｇＣｌ２、１０ｍＭのＨＥＰＥＳを含み、ＣｓＯＨでｐＨ７．２０に調節されていた。参照基準または被験物質のストック溶液を適用前にＨＢ−ＰＳ中に希釈した。被験物質は、本明細書中で記載されるペプチドまたはペプチド複合体のいずれかを含んでいた。標準化されたステッププロトコルを使用して、ｈＮａｖ１．５ナトリウムチャンネルを通ってイオン電流を発生させた。細胞を−８０ｍＶで保持する。被験物質によるｈＮａｖ１．５ナトリウム電流の開始および定常状態ブロックを、固定振幅のパルスパターンを使用して測定し（コンディショニングプレパルス：−１２０ｍＶで５０ｍｓ；脱分極ステップ −３０ｍＶまで２０ｍｓ）、１０秒間隔で繰り返した。電流を１０ｋＨｚで取得し、３ｋＨｚにて、間欠的にフィルターにかけた。細胞全体立体配置が確立されたら、細胞を３分間洗浄し、続いて対照ビヒクルを５分間適用した。PatchXpressスクリプトユーティリティのDataStable_PC関数によって、ベースライン電流が安定であるか、またはさらに５分経過した場合にのみ実験を開始させた。次いで、対照および各濃度の被験物質を５分間適用した。各濃度について１分間隔で３回添加した。ＩＣ５０を決定するために、１μＭ、３μＭ、１０μＭおよび３０μＭの被験物質を細胞に累積的に適用した被験物質濃度間でウォッシュアウトなし；ｎ＞３、ここでｎ＝細胞数）。電気生理学的データ取得は、PatchXpress Commander v1.4（Molecular Devices, Sunnyvale, CA）を使用して実施し、DataXpress v2.04（Molecular Devices, Sunnyvale, CA）を用いて分析を実施した。被験物質適用の前後で３つのピーク内向き電流を使用して、各濃度での電流阻害のパーセンテージを算出した。良好な記録の合格基準としては、以下のものが挙げられる：（１）シール抵抗＞２００ＭΩ、（２）アクセス抵抗＜１０ＭΩ、（３）ピークテール電流＞２００ｐＡ、（４）漏れ電流＜ピークテール電流の２５％（５）ランダウン 対照ビヒクル中＜２．５％／分。
PatchXpress（登録商標）システムを使用したヒトＩＫｒ（ｈＥＲＧ）カリウムチャンネルに対するカウンタースクリーン。
細胞培養。ヒトＥＲＧ（ｈＥＲＧ）カリウムチャンネルを安定して発現するＨＥＫ２９３細胞はMillipore（カタログ番号ＣＹＬ３０３９）から購入した。ＨＥＫ−ｈＥＲＧ細胞のための成長培地は、ＤＭＥＭ／Ｆ１２（Invitrogen＃１１３２０）、１×非必須アミノ酸（Gibco＃１１１４０）、１０％ウシ胎仔血清（Gibco＃１６０００）および４００μｇ／ｍｌのジェネティシン（Gibco＃１０１３１−０２７）を含む。細胞を３７℃にて加湿された９５％空気、５％ＣＯ２環境の培養中で維持した。T75 Corningフラスコの播種密度は４００万細胞であり、１：３の継代培養比を、１週間に２回または細胞密度が８０％の培養密度が達する場合はいつでも実施する。０．０５％トリプシン−ＥＤＴＡ（Sigma）を３分間３７℃にて使用することによってPatchXpress 7000A（登録商標）実験の当日に細胞をＴ７５フラスコから持ち上げる。それらを次いで少なくとも３０分間３７℃にて加湿された９５％空気、５％ＣＯ２雰囲気中、成長培地中に再懸濁させた後、SealChip記録チャンバー（AVIVA Biosciences）上にローディングする。
PatchXpress（登録商標）7000A（Molecular Devices）による電気生理学記録。全細胞パッチクランプ記録用の細胞内溶液は、（単位ｍＭ）塩化カリウム（７０）、フッ化カリウム（６０）、塩化マグネシウム（２）、エチレングリコール四酢酸（ＥＧＴＡ、１１）、アデノシン三リン酸マグネシウム（５）およびＨＥＰＥＳ（１０）を含んでいた。ＫＯＨでｐＨを7.2に調整し、最終オスモル濃度を２９５ｍＯｓｍに設定した。細胞外溶液は、（単位ｍＭ）塩化ナトリウム（１３５）、塩化カリウム（４）、塩化マグネシウム（１）、塩化カルシウム（１．８）、ＨＥＰＥＳ（１０）およびグルコース（１０）を含む。ｐＨをＮａＯＨで７．４に調節し、最終オスモル濃度を３０５ｍＯｓｍに設定した。
全細胞記録様式を達成した後、細胞を−８０ｍＶの保持電位で保持する。５００ミリ秒間で−８０ｍＶの保持電圧から−５０ｍＶへの電圧ステップを使用して、ピーク外向きテール電流測定のためのベースラインまたは基準点を確立する。これに続いて２秒間＋３０ｍＶまでの脱分極ステップを行って、チャンネルを失活状態にする。２秒間−５０ｍＶに戻すステップによって失活を解除し、それによって最大ピーク外向きテール電流が明らかになる。電圧ステップは１０秒ごとに１回繰り返される。全ｈＥＲＧ外向きテール電流は、再分極−５０ｍＶステップでのピーク外向きテール電流とチャンネル活性化前の−５０ｍＶでの第１ベースライン電流との間の差によって決定される。
試験試料調製。本明細書中で記載されるペプチドおよびペプチド複合体を含む試験化合物（１０μＭまで）を、０．１％ｗ／ｖウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有する細胞外記録緩衝液中に連続的に希釈し、続いてガラス潅流容器に移した。３μＬの連続希釈物を次いで、アッセイ緩衝液中０．１％ｗ／ｖのＢＳＡを含有する９００μＬのアッセイ緩衝液に移した。
PatchXpress（登録商標）手順。累積濃度応答曲線を薬効測定のために４つの濃度（０．３、１、３、および１０μＭ）から作製する。各濃度の試験化合物を６０秒あけて３回添加して、記録チャンバー中でのアッセイ緩衝液の完全な交換を確実にする。その後の添加の間には３分の待ち時間がある。試験化合物添加前に、アッセイ緩衝液およびビヒクル対照（０．３％ＤＭＳＯ）を含む２つのガラスバイアルを対照（すなわち、１×アッセイ緩衝液、１×０．３％ＤＭＳＯ、および４つの増加する濃度の試験化合物）として使用する。
データ分析。全ての成功した全細胞記録からの外向きｈＥＲＧテール電流は、品質について目視検査しなければならない。良好な品質記録のための一般的基準は：１）−８０ｍＶでの保持電流は薬物添加処置の間３００ｐＡを超えてはならない、２）ピーク外向きテール電流は３００ｐＡより大きくなければならない、そして３）ピーク外向きテール電流は、０．３％ＤＭＳＯ中で８分の対照期間中に２．５％／分を超えて変化しない。有効性推定値は、非線形混合モデルを用いてProtocol Engine（Amgen）によって作製して、細胞ごとのアッセイの一貫性を定量化し、そして同じ細胞型の集団全体にわたる薬効の正確な測定を提供する（Miu et al., 2006, JALA 11:195）。
ｈＥＲＧに対するＧｐＴｘ−１（配列番号１）および［Ａｌａ５］ＧｐＴｘ−１（配列番号２２）のカウンタースクリーンの結果を図１８に示す。ｈＮａｖ１．５に対するＧｐＴｘ−１（配列番号１）および［Ａｌａ５］ＧｐＴｘ−１（配列番号２２）のカウンタースクリーンの結果を図１９Ａおよび１９Ｂに示す。
実施例９：ｉｎ ｖｉｖｏ疼痛モデル
本発明の組成物を任意の関連するｉｎ ｖｉｖｏ疼痛モデルで試験することができる。例としては以下のものが挙げられる：
接触性アロディニア−Von Frey試験。Von Freyフィラメントを使用して、齧歯類における機械的感受性を評価する。マウスを金網の床上に置き、個々の試験チャンバー中に入れ、落ち着くまで馴化させる。様々な曲げ力の目盛り付きフィラメントを次いでマウスの足に適用して、無害触覚（例えば、接触）刺激に対する応答を測定する。一連のフィラメントに対する応答および無応答のパターンは動物の機械的閾値を決定する。この閾値をアッセイの終点として使用する。
ラット神経因性疼痛モデル。Kim and Chung（An experimental model for peripheral neuropathy produced by segmental spinal nerve ligation in the rat. Pain 50:355-363, (1992)）によって最初に記載されたように、オスSprague-Dawleyラット（２００ｇ）をイソフルラン吸入麻酔で麻酔し、Ｌ５およびＬ６のレベルの左腰部脊髄神経を後根神経節の遠位で、坐骨神経に入る前にしっかりと結紮する（４−０絹糸縫合）。切り口を閉じ、ラットを回復させる。この処置の結果、病気に冒された足（神経損傷の部位に対して同側）を、金網観察ケージを通して足（足蹠間）の底面に対して垂直に適用された段階的な刺激（４．０から１４８．１ｍＮまで及ぶVon Freyフィラメント）から引っ込める圧力を記録することによって評価されるような、機械的（触覚）アロディニアが左後ろ足で生じる。足引き込み閾値（ＰＷＴ）は、刺激強度を連続して増加させ、減少させ、そしてChaplan, S.R., et al. (Quantitative assessment of tactile allodynia in the rat paw. J. Neurosci. Meth, 53:55-63 (1994))により記載されているようなDixon非パラメトリック検定を使用して引き込みデータを分析することによって決定される。
ラットＣＦＡ炎症性痛覚モデル。オスSprague-Dawleyラット（２００ｇ）に、左後足で完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）を注射する。この手順の結果、評価される、金網の観察ケージを通して足の底面（足蹠の間）に対して垂直に適用された段階的な刺激から病気に冒された足を引っ込める圧力（４．０から１４８．１ｍＮまで及ぶVon Freyフィラメント）を記録することによって、または放射熱を適用することによって評価されるような、機械的（触覚）および熱的アロディニアが左後足に生じる。ＰＷＴは、Chaplan et al.（１９９４）によって記載されるように、刺激強度を連続的に増加および減少させ、Ｄｉｘｏｎ非パラメトリック試験を使用して引き込みデータを分析することによって、決定する。ラットは、運動機能障害（例えば、足の引きずりもしくは垂下）または傷ついた皮膚を示さない場合のみ調査に含め、それらのＰＷＴは３９．２ｍＮ（４．０ｇに等しい）より低い。ＣＦＡ注射後の適切な時間で、ラットを試験ペプチドおよび／または試験ビヒクル結合ペプチド（通常、６０ｍｇ／ｋｇのスクリーニング用量）または対照溶液（ＰＢＳもしくは他のビヒクル）で１回ｓ．ｃ．注射によって処置し、ＰＷＴを測定する。平均足引き込み閾値（ＰＷＴ）は、以下の式を使用して、最大可能な効果率（％ＭＰＥ）に換算した：ＭＰＥ％＝１００＊（処置ラットのＰＷＴ−対照ラットのＰＷＴ）／（１５−対照ラットのＰＷＴ）。このように、１５ｇ（機械的アロディニアについて１４８．１ｍＮ）のカットオフ値は１００％のＭＰＥに等しく、対照応答は０％ＭＰＥに等しい。
本発明の好ましい分子は、標的に対するＩＣ５０と比較して、適切な暴露でのＰＤで抗侵害受容効果をもたらすと予想される。
マウスホルマリン疼痛モデル実験手順。齧歯類の足へのホルマリン注射は、動物がその足を引っ込める回数によって数量化される、疼痛のよく研究された形態を引き起こす。ホルマリン注射後の疼痛は、２つの特徴的な段階になる：第１段階は約１０分間続き、末梢ニューロンによって媒介される直後の痛みに対応する可能性が高い。第２段階は、ホルマリン注射後約１０分で始まり、さらに３０〜４０分間続き、脊髄におけるニューロンの感作および末梢性疼痛を感じるニューロンの機能亢進に対応する。本出願で表される化合物を試験して、それらがホルマリン応答の第ＩＩ段階における引き込み数を減少させるかどうか、したがって可能性のある鎮痛剤であるかどうかを確かめた。（Bregman H et al., “Identification of a potent, state-dependent inhibitor of Nav1.7 with oral efficacy in the formalin model of persistent pain.” J Med Chem 54(13):4427-4445, 2011）。
オスＣＤ−１マウス（８〜１２週齢、Harlan Laboratories, Frederick, MD）を全てのｉｎ ｖｉｖｏ有効性実験のために使用した。動物対象に食物（Teklad Global Soy Protein-Free Extruded Rodent Diet 2020X）および水を自由に摂取させ、全調査期間中１２時間の明／暗サイクルに維持した。全動物を、１ケージあたり４匹の動物の群でトウモロコシの穂軸を敷き詰めた標準的孔無しケージングで飼育した。動物コロニーを約２１℃および６０％の湿度に維持した。全ての実験を国際疼痛研究連合指針にしたがって実施した。
試験当日、馴化中または馴化前に、動物に試験研究中の化合物またはビヒクルのいずれかを投与した。用量投与後、全マウス（ｎ＝１２）をホルマリン注射前に行動解析チャンバー（寸法：ガラスの立ち上がりの最上部に蓋をした、直径１０ｃｍ、高さ１４ｃｍの円筒）に５分間ならす。ビデオカメラをマウス挙動の記録のために下に設置した（５分馴化および４０分試験期間）。試験時に、マウスを布製手袋中で軽く拘束し、インスリン用注射筒（Ｕ１００、０．３ｃｃ、２８−３０Ｇ）を使用して２０μＬの２％ホルマリン溶液を左後足の背面に注射した。ホルマリン注射直後に動物をチャンバーに戻し、４０分間観察した。足のリフティング／リッキング行動を５分間隔で記録し、その後、同側および対側足の幅を測定した。研究完了後、動物を直ちに安楽死させた。
第１のマウスホルマリン疼痛モデル研究において、［Ａｌａ５］ＧｐＴｘ−１（１−３４）（配列番号２２）を５ｍｇ／ｋｇのｓ．ｃ．の用量、１時間の前治療で投与し、１ｍｇ／ｋｇのｓ．ｃ．のモルヒネ、３０分の前治療を陽性対照として投与した。（図５９を参照のこと）。ペプチドは第１段階または急性段階（ホルマリン注射後０〜５分）で影響を及ぼさなかった（図６０を参照のこと）。ペプチドは、ビヒクル（ＰＢＳ）と比較して、第２段階（ホルマリン注射後５〜４０分）中で病気に冒された足のリフティングおよび／またはリッキングに費やされる時間を有意に減少させた。（図６１を参照のこと）。この実験で、陽性対照として使用された１ｍｇ／ｋｇのｓ．ｃ．用量のモルヒネは、動物における疼痛応答を有意に減少せず、次の研究では３ｍｇ／ｋｇまで増加した。ペプチドの終末血漿暴露（ホルマリン注射後４５分でのペプチド血漿濃度）は０．８０±０．２１μＭであった。ペプチドもモルヒネ陽性対照も、ホルマリン注射に起因する足浮腫をビヒクル（ＰＢＳ）と比べて有意に減少させなかった（図６２を参照のこと）。
マウスホルマリン疼痛モデルに、５、１．６７、および０．５ｍｇ／ｋｇのｓ．ｃ．の１時間前治療用量を繰り返して、［Ａｌａ５］ＧｐＴｘ−１（１−３４）（配列番号２２）の用量応答を測定した。（図６３を参照のこと）。ペプチドは、第１段階（ホルマリン注射後０〜５分）ではどの用量でも影響を及ぼさなかった。（図６４を参照のこと）。陽性対照である３ｍｇ／ｋｇのｓ．ｃ．用量のモルヒネは、第１段階で病気に冒された足のリフティング／リッキングに費やされる時間を有意に減少させた。５ｍｇ／ｋｇのｓ．ｃ．用量の［Ａｌａ５］ＧｐＴｘ−１（１−３４）（配列番号２２）は、モルヒネ陽性対照と同様に、研究の第２段階でリフティング／リッキングに費やされる時間の有意な減少を示した。（図６５を参照のこと）。しかしながら、更に低いペプチド用量（１．６７および０．５ｍｇ／ｋｇのｓ．ｃ．）は、第２段階でビヒクルと比較して有意な影響を及ぼさなかった。終末暴露（ホルマリン注射後４５分でのペプチド血漿濃度）は、５．０、１．６７、および０．５ｍｇ／ｋｇの用量について、それぞれ０．５８±０．２６μＭ、０．１５±０．０５μＭ、および０．０４±０．２μＭであった。ペプチドもモルヒネ陽性対照も、ビヒクル（ＰＢＳ）と比較してホルマリン注射に起因する足浮腫を有意に減少させなかった。（図６６を参照のこと）。最初の２つのマウスホルマリン実験において、［Ａｌａ５］ＧｐＴｘ−１（１−３４）（配列番号２２）は、０．６０〜０．８０μＭの血漿濃度で足のリフティング／リッキングの有意で再現可能な減少を示した。１つの他のペプチド［Ｇｌｕ２９］ＧｐＴｘ−１（１−３４）（配列番号３０）をホルマリン疼痛モデルで試験した。位置２９のトリプトファンのグルタミン酸置換は、Ｎａｖ１．７に対する有効性を大幅に低下させ、したがって、［Ｇｌｕ２９］ＧｐＴｘ−１を負の対照として調製し、試験した。５ｍｇ／ｋｇのｓ．ｃ．用量の［Ｇｌｕ２９］ＧｐＴｘ−１は、０．５０２±０．２７１μＭの終末平均ペプチド血漿濃度のマウスのホルマリン疼痛モデルにおいて、リフティング／リッキングに費やされる時間に対して有意な影響を及ぼさず、ペプチドＮａｖ１．７有効性がホルマリン疼痛モデルにおける有効性と相関することを示す。（図９５〜９８を参照のこと）。
マウスホルマリン疼痛モデルに、５、３、および１ｍｇ／ｋｇのｓ．ｃ．の１時間前治療用量を繰り返して、［Ａｌａ５］ＧｐＴｘ−１（１−３４）（配列番号２２）の用量応答をさらに調査した。（図６７を参照のこと）。ペプチドは、第１段階（ホルマリン注射後０〜５分）ではどの用量でも影響を及ぼさなかった。（図６８を参照のこと）。５ｍｇ／ｋｇのｓ．ｃ．用量のペプチドは、モルヒネ陽性対照と同様に、研究の第２段階でリフティング／リッキングに費やされる時間の有意な減少を示した。しかしながら、更に低いペプチド用量は第２段階において、ビヒクル対照と比較してリフティング／リッキング行動の減少を示さなかった。１ｍｇ／ｋｇのｓ．ｃ．群は、ビヒクル対照とは有意に異ならず、一方、３ｍｇ／ｋｇのｓ．ｃ．群は、リフティング／リッキングに費やされる時間を有意に増加させるようであった。（図６９を参照のこと）。終末暴露（ホルマリン注射後４５分でのペプチド血漿濃度）は、５、３、および１ｍｇ／ｋｇ用量について、それぞれ１．８４±０．１８μＭ、０．５３±０．２３μＭ、および０．２０±０．０５μＭであった。ペプチドもモルヒネ陽性対照も、ビヒクル（ＰＢＳ）と比較して、ホルマリン注射に起因する足浮腫を有意に減少させなかった。（図７０を参照のこと）。
マウスオープンフィールド分析実験プロトコル。試験化合物によってもたらされるホルマリンモデルにおける有効性が、鎮静剤の作用または動物に対する損傷によるものでないことを検証するために、化合物を、動物の全体的な運動に対するそれらの影響についても試験した（オープンフィールド試験）。ナイーブな動物に試験化合物を投与し、新しい環境に置き、新しい環境の探索中に動物が経験する運動を自動的に記録する。運動の５０％以上の低下は、ホルマリン試験における有効性が、真の痛覚脱失によるものではあり得ないことを意味する。
オスＣＤ−１マウス（８〜１２週齢、Harlan Laboratories, Frederick, MD）を全てのｉｎ ｖｉｖｏ有効性実験のために使用した。動物対象に食物（Teklad Global Soy Protein-Free Extruded Rodent Diet 2020X）および水を自由に摂取させ、調査の全期間中１２時間の明／暗サイクルに維持した。全動物を、１ケージあたり４匹の動物の群でトウモロコシの穂軸を敷き詰めた標準的な孔無しケージングで飼育した。動物コロニーを約２１℃および６０％湿度で維持した。全ての実験を国際疼痛研究連合指針にしたがって実施した。
試験当日に、動物に試験研究中の化合物またはビヒクルのいずれかを投与し、少なくとも３０分与えて、試験室に慣らせた。マウス（Ｎ＝８）を清浄なオープンフィールドチャンバー（Kinder Scientific Photobeam Activity System）中に投薬後の適切な時点で入れた。全体的な動物の運動における変化を消灯条件下、６０分間システムで記録した。以下のパラメータを評価した：全基本的運動、合計立ち上がり、合計立ち上がり時間、および全微細運動。
オープンフィールド分析の結果。１時間の前治療時間で３ｍｇ／ｋｇのｓ．ｃ．用量の［Ａｌａ５］ＧｐＴｘ−１（１−３４）（配列番号２２）は、ＣＤ−１マウスにおいて全基本的運動、全微細運動、合計立ち上がり、または合計立ち上がり時間に対して影響を及ぼさなかった。ペプチドのどの用量も、ビヒクル対照と比較して探索行動を有意に減少させなかった。しかしながら、５ｍｇ／ｋｇのｓ．ｃ．用量と１時間の前治療で、ペプチドは、ビヒクルと比較して、ＣＤ−１マウスにおける自発運動の全微細運動および合計立ち上がり時間成分を有意に減少させた。全基本的運動および合計立ち上がりも減少した。（図７１〜７４を参照のこと）。終末暴露（ペプチド注射２持間後のペプチド血漿濃度）は、５および３ｍｇ／ｋｇのｓ．ｃ．の用量について、それぞれ１．７９±０．３８μＭおよび０．８９±０．３３μＭであった。この実験では、自発運動に対して有意な影響を及ぼさなかった３ｍｇ／ｋｇ用量が、ホルマリン疼痛モデルにおいて再現可能な有功性を示したものと等しいペプチド血漿濃度をもたらした。更に高いペプチド血漿濃度（>１．５μＭ）の結果、５ｍｇ／ｋｇ用量の［Ａｌａ５］ＧｐＴｘ−１（１−３４）（配列番号２２）と２．１±０．４７μＭの終末暴露の反復オープンフィールド分析によって示されたように、自発運動に対して有意な影響が得られた。（図９９〜１０２を参照のこと）。３つの他のペプチドをオープンフィールド分析で試験した：［Ｇｌｕ２９］ＧｐＴｘ−１（１−３４）（配列番号３０）、［Ｇｌｕ２８］ＧｐＴｘ−１（１−３４）（配列番号１５３）、および［Ａｌａ５，Ｐｈｅ６，Ｇｌｕ１０，２−Ａｂｕ１３，Ｌｅｕ２６，Ａｒｇ２８］ＧｐＴｘ−１（配列番号１０３５）。位置２９のトリプトファンのグルタミン酸置換は、Ｎａｖ１．７に対する有効性を大幅に低下させ、したがって［Ｇｌｕ２９］ＧｐＴｘ−１（配列番号３０）を負の対照として調製し、試験した。５ｍｇ／ｋｇのｓ．ｃ．用量の［Ｇｌｕ２９］ＧｐＴｘ−１は、０．７７１±０．２７２μＭの終末平均ペプチド血漿濃度でのオープンフィールド分析でマウスの自発運動に対して有意な影響を及ぼさなかった。（図１０３〜１０６を参照のこと）。５ｍｇ／ｋｇ用量の［Ｇｌｕ２８］ＧｐＴｘ−１（１−３４）（配列番号１５３）は、５ｍｇ／ｋｇ用量の［Ａｌａ５］ＧｐＴｘ−１（配列番号２２）と同様に、１．２８±０．４０３μＭの終末平均ペプチド血漿濃度でのオープンフィールド分析において自発運動を有意に減少させた。（図１０７〜１１０を参照のこと）。オープンフィールド分析において、５ｍｇ／ｋｇ用量の［Ａｌａ５，Ｐｈｅ６，Ｇｌｕ１０，２−Ａｂｕ１３，Ｌｅｕ２６，Ａｒｇ２８］ＧｐＴｘ−１（配列番号１０３５）は１．７２±０．３１３μＭの終末平均ペプチド血漿濃度で動物において瀕死挙動または死をもたらした。
マウスベラトリジン疼痛モデル実験プロトコル。ベラトリジンは、齧歯類足に注射した場合に痛みを伴う引き込み（足リッキングおよびリフティングまたは防御）応答を引き起こす電位依存性ナトリウムイオンチャンネル（Hille B, Ion Channelss of Excitable Membranes, Sinauer Associates, Sunderland MA 2001）の非選択的活性化因子である。したがって、ナトリウムチャンネル阻害剤である本発明の化合物のような化合物を試験することによって、疼痛に対するそれらの影響だけでなく、ナトリウムチャンネル活性化によって引き起こされる疼痛に対する影響も定量化される。すなわち、ベラトリジンで誘発された足リフティングおよびリッキングに対する試験化合物の影響は、鎮静効果だけでなく、ナトリウムチャンネルのｉｎ ｖｉｖｏ受容体占有も測定する。
オスＣＤ−１マウス（８〜１２週齢、Harlan Laboratories, Frederick, MD）を全てのｉｎ ｖｉｖｏ有効性実験のために使用した。動物対象に食物（Teklad Global Soy Protein-Free Extruded Rodent Diet 2020X）および水を自由に摂取させ、全調査期間中、１２時間の明／暗サイクルで維持した。全動物を、１ケージあたり４匹の動物の群でトウモロコシの穂軸を敷き詰めた標準的孔無しケージングで飼育した。動物コロニーを約２１℃および６０％の湿度で維持した。全実験を国際疼痛研究連合指針にしたがって実施した。
試験当日、馴化中または馴化前に、動物に試験研究中の化合物またはビヒクルのいずれかを投与した。投薬後、全てのマウス（ｎ＝１２）を行動解析チャンバー（ガラスの立ち上がりの最上部に蓋をした、寸法：直径１０ｃｍ、高さ１４ｃｍの円筒）に５分間慣らした後に、ベラトリジンを注射した。マウスの行動を記録するためにビデオカメラを下に設置した（５分の馴化および２０分の試験期間）。試験時に、マウスを布製手袋中で軽く拘束し、リン酸緩衝生理食塩水懸濁液中１％エタノール中１μｇのベラトリジン（Sigma-Aldrich＃Ｖ１０９）２０μＬを、インスリン用注射筒（Ｕ１００、０．３ｃｃ、２８−３０Ｇ）を使用して左後足の背面に注射した。ベラトリジン注射直後に、動物をチャンバーに戻し、２０分間観察した。足のリフティング／リッキング行動を５分間隔で記録し、その後、同側および対側足幅を測定した。研究完了後、動物を直ちに安楽死させた。
第１のマウスベラトリジン疼痛モデルにおいて、［Ａｌａ５］ＧｐＴｘ−１（１−３４）（配列番号２２）を５ｍｇ／ｋｇのｓ．ｃ．にて１時間の前治療時間で投与し、メキシレチンを３０ｍｇ／ｋｇ腹腔内（「ｉ．ｐ．」）用量にて３０分の前治療時間で対照として投与した。抗侵害受容効果をＣＤ−１マウスにおいてベラトリジンで誘発された（後足に１μｇ注射）自発的侵害受容挙動に関して測定した。全体として、ビヒクル群から良好な足リフティング応答があり、これはメキシレチンで著しく逆転された。５ｍｇ／ｋｇで、［Ａｌａ５］ＧｐＴｘ−１（１−３４）（配列番号２２）はリフティング挙動を有意に減少させることができなかった。（図７５を参照のこと）。全ての群にわたって足浮腫の減少はない。（図７６を参照のこと）。しかしながら、実験の時間経過の調査で、ペプチドは１０〜１５分および１５〜２０分の時間瓶において若干の影響を及ぼすようであった。（図７７を参照のこと）。終末暴露（ペプチド注射後１．５時間でのペプチド血漿濃度）は５ｍｇ／ｋｇ用量について０．７０±０．１０μＭであった。
マウスベラトリジン疼痛モデルの繰り返しにおいて、［Ａｌａ５］ＧｐＴｘ−１（１−３４）（配列番号２２）を１ｍｇ／ｋｇのｓ．ｃ．および５ｍｇ／ｋｇのｓ．ｃ．にて１時間の前治療で投与し、メキシレチンを３０ｍｇ／ｋｇｉ．ｐ．用量にて３０分の前治療時間で対照として投与した。ビヒクル群では着実な足リフティング応答があり、これはメキシレチンで有意に逆転された。１ｍｇ／ｋｇおよび５ｍｇ／ｋｇで、［Ａｌａ５］ＧｐＴｘ−１（１−３４）（配列番号２２）はリフティング挙動の効果がなかった。（図７８を参照のこと）。いずれの群においても足浮腫の減少は無かった。（図７９を参照のこと）。ペプチド用量は、実験の時間経過全体にわたって有意な影響を及ぼさなかった。（図８０を参照のこと）。終末暴露（ペプチド注射後１．５時間でのペプチド血漿濃度）は、５ｍｇ／ｋｇおよび１ｍｇ／ｋｇ用量について、それぞれ０．７２±０．１３μＭおよび０．０９±０．０５μＭであった。
本発明の分子の治療実施形態のスクリーンのためのｉｎ ｖｉｖｏ疼痛モデルの前記実施例は非限定的である。当業者は他の関連する疼痛モデルを知っている。
実施例１０：予備心臓安全性評価
単離された潅流ウサギ心臓（ランゲンドルフ標本）。単離された潅流ウサギ心臓（ランゲンドルフ標本）アッセイにおける［Ａｌａ５］ＧｐＴｘ−１（１−３４）（配列番号２２）の効果を後述し、その結果を以下で表３６および表３７に示す。
表３６。単離された潅流ウサギ心臓アッセイ（ランゲンドルフ標本）における心電図記録法間隔に対する１μＭの［Ａｌａ５］ＧｐＴｘ−１（１−３４）（配列番号２２）の影響。ペプチドは、心室再分極（ＱＴｃまたはＪＴｃ間隔）に対して遅延効果を有しなかった。ペプチドは心拍数（ＨＲ）に対して影響を及ぼさなかった。ペプチドはさらに、心室脱分極および伝導（ＱＲＳおよびＰＲ間隔）に対しても影響を及ぼさなかった。（略語：ＨＲ、心拍数；ＰＲ間隔、心房性脱分極の開始（Ｐ波）から心室性脱分極の開始（ＱＲＳ群）までの時間間隔；ＱＲＳ期間、ＱＲＳ群の開始から終わりまでの時間間隔であって、心室性脱分極の期間である；ＱＴ間隔、ＱＲＳ群の開始からＴ波の終わりまでの時間間隔であって、心室性脱分極および再分極の期間である；ＱＴｃ間隔、ＨＲで補正されたＱＴ間隔；ＪＴ間隔、ＱＴ間隔とＱＲＳ期間との差（ＪＴ＝ＱＴ−ＱＲＳ）であって、心室再分極の期間である；ＪＴｃ間隔、ＨＲで補正されたＪＴ間隔。）
Figure 2017031157
表３７。単離された潅流ウサギ心臓アッセイ（ランゲンドルフ標本）における血行動態的パラメータに対する１μＭの［Ａｌａ５］ＧｐＴｘ−１（１−３４）（配列番号２２）の効果。ペプチドは、ＬＶ収縮性（ｄＰ／ｄｔ＋）に対して影響を及ぼさず、冠血流量（ＣＦ）に対しても影響を及ぼさなかった。ペプチドは冠血管系に対して直接的影響を及ぼさなかった。（略語：ＬＶＳＰ、左心室収縮期圧；ＬＶＤＰ、左心室拡張期圧；ｄＰ／ｄｔ＋、ＬＶ圧における最大増加率；ｄＰ／ｄｔ−、ＬＶ圧における最小減少率；ＬＶＤｅｖＰ、ＬＶ発生圧力、ＬＶＤｅｖＰ＝ＬＶＳＰ−ＬＶＤＰ；およびＣＦ、冠血流量。）
Figure 2017031157
取得および馴化。６匹のメスNew Zealand Whiteウサギ、１４〜２２週齢、２．５〜３．５ｋｇをHarlan Laboratoriesから入手した。受け取った時点で、ウサギを獣医が診察して、許容される健康状態を保証した。獣医やスタッフによって獣医医療が施された。ウサギを使用前に少なくとも７日間馴化させた。不健康なウサギは調査のために使用しなかった。
識別方法。各ウサギは、納入業者により識別番号を割り当てられていた。識別番号を含む耳標が納入業者によって各ウサギに固定されていた。この識別番号は、ケージカード上に、ウサギの到着日、出生日、出所、性別とともに表示されていた。調査で使用したウサギの識別番号およびそれらの最終体重をノートに記録した。潅流培地の組成。潅流培地は（ｍＭ）：ＮａＣｌ（１２０）、ＫＣｌ（４．７）、ＭｇＳＯ４（１．２）、ＫＨ２ＰＯ４（１．２）、ｄ−グルコース（１１．１）、ＣａＣｌ２（１．８）、ＮａＨＣＯ３（２５）、およびピルビン酸ナトリウム（２．０）から構成される修飾酸素化Ｋｒｅｂｓ−Ｈｅｎｓｅｌｅｉｔ緩衝液（中心で３７℃）から構成される。この潅流培地に絶えず９５％Ｏ２／５％ＣＯ２を吹き込む。［Ａｌａ５］ＧｐＴｘ−１（１−３４）（配列番号２２）を試験するために、１％ＢＳＡを緩衝液中に添加した。
麻酔および心臓除去。各ウサギをペントバルビタール（５０ｍｇ／ｋｇ、ＩＶ；耳静脈）で麻酔した。疼痛の完全な抑制は、足をつまむことによって評価した（足引き込み反射）。動物や調査員のけがを回避するために、麻酔導入をおこないつつ、ウサギをウサギケージ保定器中で拘束した。
心臓の暴露：動物を麻酔した時点で、心臓を摘出した。経腹壁的切開によって隔膜にアクセスし、注意深く切断して、胸腔を露出させた。胸郭を最終肋骨から第１肋骨の下縁に沿った対称性切開により切り開き、胸郭を次いで動物の頭の上に後屈させ、心臓を露出させた。心臓を取り出すために、臓器を指の間でそっとかかえて損傷を回避し、大動脈、大静脈および肺血管を切開する前に少し持ち上げた。
ランゲンドルフ装置によって潅流された、単離された心臓標本。心臓を迅速に取り出し、ランゲンドルフ装置上に載せ、酸素化Krebs-Henseleit緩衝液で一定圧力下、潅流した。自然に拍動している（未調整）心臓が平衡化期間中に各パラメータ（機械的、心拍数、心拍間隔（ｈｅａｒｔ ｉｎｔｅｒｖａｌなど）について許容され、かつ安定なベースライン値を示す場合は調査に含めた。潅流緩衝液温度を実験期間中約３７℃に維持した。
実験計画。個々の心臓（全部でＮ＝４）を約３０〜６０分平衡化させた。この平衡化期間後、ベースライン測定値を約１０分間１％ＢＳＡ中で集めた。この期間後、心臓を［Ａｌａ５］ＧｐＴｘ−１（１−３４）（配列番号２２）に１μＭにて２０分間暴露した。心臓パラメータをこの調査期間中、コンピュータ化されたデータ取得システムを使用して連続して測定した。（Qu et al., BeKm-1, A Peptide Inhibitor of hERG pottasium currents, prolongs QTc intervals in isolated rabbit heart, J. Pharmacol. Exp. Ther. (337):2-8 (2011) for details and validation studies.を参照のこと）。
心電図測定。同時２鉛面接触心電図を心臓上に設置された柔軟な単極電極で記録し、１つは心室の心外膜上に配置し、もう一方は左心房の心外膜上に配置した。
血行動態的測定。左心室（ＬＶ）中のラテックスバルーンを水でふくらませて、約５〜１０ｍｍＨｇのＬＶＥＤＰを達成した。バルーンを圧力トランスデューサーにチューブで接続して、ＬＶＥＤＰおよびＬＶＳＰを測定した。冠動脈潅流圧（ＣＰＰ）を大動脈ブロックの横手のポートに接続された圧力トランスデューサーで測定した。
データ分析。分析のために、左心室圧（ＬＶＰ）およびＣＰＰをNotocordで自動的に実施した。平衡化期間の最後の３０秒および各用量被爆期間からの測定値を評価し、使用して効果を確認した。心電図（ＥＣＧ）をEMKA ecgAUTOソフトウェア（EMKA Technologies, Paris, France）で分析し、１分の連続的ＥＣＧ波形（次の事象マーカーの３０秒前）をＨＲ、ＰＲ、ＱＲＳおよびＱＴ間隔について分析した。個々の心臓からの値をプールして、各濃度での各変数の平均を決定した。ベースラインと各濃度との間の各変数の平均的変化率（パーセント）も決定した。ＱＴ間隔のＨＲ補正のために、Fridericia式を使用した（ＱＴｃＦ＝ＱＴ／ＲＲ１／３）。データをベースラインと各濃度との間の各変数の平均的変化率（パーセント）として提示する。ＨＲ、ＰＲ、ＱＲＳ、ＱＴｃ、およびＪＴｃにおける≧１０％の変化ならびに＋ｄＰ／ｄｔおよびＣＦにおける≧１５％の変化を薬物関連と見なす。全ての値を平均±標準偏差として提示する。
結果。１μＭ濃度で、［Ａｌａ５］ＧｐＴｘ−１（１−３４）（配列番号２２）は、単離された潅流ウサギ心臓アッセイ（ランゲンドルフ標本）において影響を及ぼさなかった。ペプチドは心室再分極（ＱＴｃまたはＪＴｃ間隔）に対して遅延効果を有さず、心拍数に対して影響を及ぼさなかった。ペプチドはさらに、心室脱分極および伝導（ＱＲＳおよびＰＲ間隔）に対しても影響を及ぼさなかった。ペプチドはＬＶ収縮性（ｄＰ／ｄｔ＋）に対して影響を及ぼさず、冠血流量（ＣＦ）に対して影響を及ぼさなかった。ペプチドは冠血管系に対して直接的影響を及ぼさなかった。
実施例１１：部位特異的ペプチド結合
以下のプロトコルを使用して、毒素ペプチドアナログ（毒素ペプチドアナログアミノ酸配列については表５Ａおよび表５Ｂを参照のこと）を重鎖（配列番号３０８７のＣ２７３）またはヒト免疫グロブリンＦｃ領域（配列番号３０８９のＣ５２）上のいずれかの結合部位のヒト免疫グロブリンに部位特異的に結合させた。
ペプチド−リンカー構築物の調製。アルキン含有ペプチドを、２つの異なる長さのアジド−ＰＥＧブロモアセトアミドでの銅触媒による１，３−双極性環付加に付して、トリアゾール結合を有する部位特異的にＰＥＧ化されたペプチドを得、かくして配列中のプロパルギルグリシンすなわちＰｒａ残基を３−（１，２，３−トリアゾール−４−イル）アラニンすなわちＡｔｚ残基に変えた。（図８１Ｂを参照のこと）。位置１３でプロパルギルグリシン（Ｐｒａ）またはＮ末端で４−ペンチノイル（４−Ｐｅｎ）のいずれかを含有するペプチド（６．７ｍＬの水中７．４ｍＭ）、アジド−ＰＥＧ１１−ブロモアセトアミド（１５０ｍＭ、水中０．９６４ｍＬ）、トリス（（１−ベンジル−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４−イル）メチル）アミン（ＴＢＴＡ、１０ｍＭ、ＤＭＳＯ中２．２ｍＬ）、アスコルビン酸ナトリウム（５０ｍＭ、水中１０．１ｍＬ）、および硫酸銅（ＩＩ）（３５ｍＭ、水中２．９ｍＬ）溶液を新しく調製した。ペプチドおよび試薬を以下の順序で５０ｍＬ遠心管に添加して、以下の最終濃度を達成した。３．７ｍＭの最終濃度を得るためにペプチドストック溶液（６．７ｍＬ）を添加し、続いて４．５ｍＭの最終濃度を得るためにアジド−ＰＥＧ１１−ブロモアセトアミド（０．４０２ｍＬ）を添加した。０．４５ｍＭの最終濃度を得るためにＴＢＴＡ（０．６０３ｍＬ）を添加し、よく混合した。１６．９ｍＭの最終濃度を得るためにアスコルビン酸ナトリウム（４．５２２ｍＬ）を次いで添加し、よく混合した。３．４ｍＭの最終濃度を得るためにＣｕＳＯ４（１．２９２ｍＬ）を添加した。溶液を１時間静置し、この時点で、ＬＣ−ＭＳによって完了したと判定された。２５ｍＬのＳＰＥろ過管に、SP Sepharose High Performanceをスラリー（８ｍＬ）としてピペットで添加した。ゲルを洗浄緩衝液（５０ｍＬの２０ｍＭ ＮａＯＡｃ、ｐＨ＝４．０）コンディショニングし、ペプチド溶液をロードし、洗浄し（５０ｍＬ、２０ｍＭのＮａＯＡｃ、ｐＨ＝４．０および５０ｍＬ、２０ｍＭのＮａＯＡｃ、ｐＨ＝４．０、０．１ＭのＮａＣｌ）、そして４５ｍｌの１Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭ ＮａＯＡｃ、ｐＨ＝４．０）で５０ｍＬの遠心管中に溶出させた。生成物混合物を、分取ＨＰＬＣカラム（Phenomenex Luna 5u C18(2)100A AXIA、２５０×３０ｍｍ）上に３０ｍＬ／分にてAgilent分取ローディングポンプを使用してローディングすることによって精製した。カラムを１０分間１０％Ｂでフラッシュした。カラムを分取ＨＰＬＣ（Agilent）に取り付け、そしてペプチドを１０〜４０％Ｂ勾配で６０分にわたって溶出させ、続いて１０分間フラッシュし、そして１０分間平衡化させた。画分をＬＣ−ＭＳによって分析し、プールし、そして凍結乾燥して、ＩｇＧまたはＦｃ領域に結合させるための純粋なペプチド−リンカー構築物を得た。
抗体調製／還元。抗ＤＮＰ ｍＡｂ（Ｅ２７３Ｃ、ｈＩｇＧ１）（カッパ／ＩｇＧ１ｚ）を約５ｍｇ／ｍｌまで反応緩衝液（２０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ ６．８、２ｍＭ ＥＤＴＡ）中で濃縮した。
使用されたヒトＩｇＧ重鎖モノマーのアミノ酸配列は以下のとおりであった（可変領域に下線が付されており；Ｃ２７３結合部位は斜体表示され、下線が付されている）：
Figure 2017031157
使用されたヒトＩｇＧカッパ軽鎖モノマーのアミノ酸配列は以下のとおりであった（可変領域に下線が付されている）：
Figure 2017031157
使用されたヒトＩｇＧ１ｚ Ｆｃ領域モノマーのアミノ酸配列は以下のとおりであった（Ｃ５２結合部位を斜体表示され、下線が付されている）：
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPCVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK／／配列番号３０８９。
表３８．作製した免疫グロブリンペプチド複合体およびＦｃ領域ペプチド複合体。「一価」複合体分子は、分子中に１つの毒素ペプチドを有していた（すなわち、１つのペプチドは、リンカーによって分子中の１つのＨＣまたはＦｃ領域モノマーと共有結合したが、他のＨＣまたはＦｃ領域モノマーと共有結合しなかった）；「二価」複合体分子は２つの毒素ペプチドを有していた（すなわち、１つのペプチド分子中の各ＨＣまたはＦｃ領域モノマーとリンカーによって共有結合した）。配列番号１０４６、１０４７、および１０４８は表５Ａで記載されるとおりである。
Figure 2017031157
Figure 2017031157
Figure 2017031157
改変されたシステインの還元は、ｍＡｂを１：１モル比のＴＣＥＰ対システイン（７２：１のＴＥＣＰ対ｍＡｂ）とともに室温にて３０分間インキュベートすることによって実施した。反応緩衝液で平衡化させたZebaスピン脱塩カラム（≧７ｋＤPierce）を用いてＴＣＥＰを除去した。アミコン超（１０，０００〜３０，０００ＭＷＣＯ）遠心濃縮器を用いてローディング前に大規模調製物を適量まで濃縮した。
ペプチド調製。ブロモアセトアミド官能基を含む凍結乾燥ペプチド−リンカーを共役結合反応の直前に２０ｍｇ／ｍｌで水中に再懸濁させた。
複合体化反応。ペプチドおよび還元されたｍＡｂを２．５：１モル比のペプチド対システイン（７５：１のペプチド対ｍＡｂ）で反応緩衝液中、５ｍｇ／ｍｌのｍＡｂ濃度にて混合し、そして１２〜１６時間４℃にてインキュベートした。免疫グロブリン中の改変された遊離システインはペプチドリンカー中のブロモアセトアミド官能基と反応して、安定なチオアセトアミド結合を有する部位特異的免疫グロブリンペプチド複合体を形成する。（図８１Ｂおよび図８２を参照のこと）。１つのシステインが反応する場合、結果として得られるのは一価免疫グロブリンペプチド複合体であり、そして両方のシステインが反応する場合、結果として得られるのは二価免疫グロブリンペプチド複合体である。
複合体の精製。インキュベーション後、共役結合反応を脱塩して、過剰の遊離ペプチドを除去し、そしてHiTrap SP-HPカラム（GE Healthcare；調製物＜１０ｍｇについては１ｍｌカラム、調製物＞１０ｍｇについては５ｍｌカラム）上にロードした。カラムを５カラム容積の９０％緩衝液Ａ（１０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ６．５、５％エタノール）１０％緩衝液Ｂ（１０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ６．５、５％エタノール、１Ｍ ＮａＣｌ）中ですすいだ。複合体（表３８を参照のこと）を１０％緩衝液Ｂから７０％緩衝液Ｂまでの２０カラム体積勾配で溶出させた。未修飾ｍＡｂがまず溶出し、続いて一価免疫グロブリンペプチド複合体（ｍＡｂあたり1つのペプチド）、二価免疫グロブリンペプチド複合体（ｍＡｂあたり２つのペプチド）が溶出する。ｍＡｂの過還元の結果生じる、さらに高次の複合体が後に溶出する。（ｍＡｂ免疫グロブリンペプチド複合体については図８３、Ｆｃ領域ペプチド複合体については図８４を参照のこと）。精製後、複合体をＡ５ＳＵ貯蔵緩衝液（１０ｍＭの酢酸ナトリウムｐＨ５．０、９％スクロース）中に配合し、そして１０ｍｇ／ｍｌまで濃縮し、−８０℃にて貯蔵した。
複合体の分析。複合体を還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけて、重鎖への複合体化（サイズが約５ｋＤ増加）を確認し、また非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけて、内部ジスルフィドがインタクトなままであることを確認した。（ｍＡｂ免疫グロブリンペプチド複合体については図８３そしてＦｃ領域ペプチド複合体については図８４を参照のこと）。複合体を分析的ＳＥＣにかけて、凝集が存在するかどうかを判定した（１００ｍＭリン酸ナトリウム、２５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６．８中Superdex-200 10/300カラム、定組成溶離−１ｍＬ／分で３５分間）。（図８５を参照のこと）。
複合体のＬＣ−ＭＳ−ＴＯＦ分析。ペプチド複合体のＬＣ／ＭＳ分光法は、Agilent 6224 TOF LC/MS分光計を用い、非還元法で記録した。校正後、５μｇのインタクト試料をZorbax 300SB C6カラム（１×５０ｍｍ、３．５μＭ、Agilent Technologies）操作に７５℃にて５０μｌ／分の流速でロードした。ペプチド複合体を、９０％のｎ−プロパノールと０．１％のＴＦＡ（緩衝液Ｂ）および水中０．１％ＴＦＡ（緩衝液Ａ）の勾配を使用してカラムから溶出させた。勾配条件は、１４分で２０％から９０％緩衝液Ｂであった。（二価ｍＡｂ−ペプチド複合体については図８６、そして二価Ｆｃ領域ペプチド複合体については図８７を参照のこと）。ＭＳスペクトルは、２つのペプチドのそれぞれ免疫グロブリンおよび免疫グロブリンＦｃ領域への付加を示す。複数のピークの存在は、異なるグリコシル化イソ型のためである。
特異的反応結果。１００ｍｇの抗ＤＮＰ ｍＡｂ（Ｅ２７３Ｃ、ｈＩｇＧ１）および１５ｍｇのペプチド−リンカー構築物（配列番号１０６２）から２２ｍｇの二価複合体（免疫グロブリンペプチド複合体２）および１１ｍｇの一価複合体（免疫グロブリンペプチド複合体１）を得た。試料をＡ５ＳＵ緩衝液中１０ｍｇ／ｍＬまで濃縮し、アリコートとして−８０℃で貯蔵した。
ペプチド複合体のモデル。例示説明のみの目的で、Ｆｃ−ペプチド複合体１、Ｆｃ−ペプチド複合体２、免疫グロブリンペプチド複合体１、および免疫グロブリンペプチド複合体２のモデルを作製した（MOE;Chemical Computing Group: Montreal, Quebec, Canada, 2010）。（図８８〜９１を参照のこと）。抗ＤＮＰ ｍＡｂ（Ｅ２７３Ｃ）ｈＩｇＧ１（免疫グロブリンモノマー配列番号３０８７；配列番号３０８８；配列番号３０８７；配列番号３０８８を含む）および抗ＤＮＰ ｍＡｂ（Ｅ５２Ｃ）ｈＩｇＧ１ Ｆｃ領域（配列番号３０８９のホモ二量体）のホモロジーモデルを、免疫グロブリン結晶構造（１ＨＺＨ．ｐｄｂ）からプログラムＭＯＥ（MOE;Chemical Computing Group: Montreal, Quebec, Canada, 2010）を使用して構築した。複合体化部位、免疫グロブリン中のＣｙｓ２７３および免疫グロブリンＦｃ領域中のＣｙｓ５２を示す。ＰＥＧ１１リンカーを免疫グロブリンおよび免疫グロブリンＦｃ領域中の適切なシステイン残基（複数可）をペプチド（複数可）中のＡｔｚ１３残基（複数可）と接続させる任意のコンフォメーションで示す。ペプチド（配列番号１０４６）のホモロジーモデルをＧｐＴｘ−１（MOE;Chemical Computing Group: Montreal, Quebec, Canada, 2010）のＮＭＲ構造から構築し、免疫グロブリンおよび免疫グロブリンＦｃ領域に対して任意の相対配向で表示する。１または２つのペプチドは、各ペプチド複合体の一価または二価特質を反映することが示される。
実施例１２：マウスにおけるペプチド複合体の予備薬力学
毒素ペプチド複合体の薬物動態（ＰＫ）研究。予備ＰＫ研究を、Taconicからの７週齢の未修飾ＣＤ−１マウスで実施した。Ｆｃ−Ｐ２（Ｆｃ−ペプチド複合体２）またはその対照Ｆｃ（配列番号１０６２）に１ｍｇ／ｋｇまたは１０ｍｇ／ｋｇにて１２匹のマウスの４つの独立した群に皮下投与した。別のコホートにおいて、Ａｂ−Ｐ２（免疫グロブリンペプチド複合体２）またはその対照Ａｂ（抗ＤＮＰ ｍＡｂ（Ｅ２７３Ｃ、ｈＩｇＧ１；免疫グロブリンモノマー配列番号３０８７；配列番号３０８８；配列番号３０８７；配列番号３０８８を含む）を１ｍｇ／ｋｇまたは１０ｍｇ／ｋｇで１２匹のマウスの４つの独立した群に皮下投与した。皮下注射を襟首に打った。投薬後０．５、１、２、４、８および２４時間に、４つの用量経路のそれぞれからの２匹のマウスを安楽死させ、血液試料および脳を集めた。脳を秤量し、−８０℃で直ちに凍結させた。血液試料をＥＤＴＡで処理したマイクロティナ中に集め、１３０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、その後、血漿を抽出し、−８０℃にて９６ウェルプレート中で凍結させた。
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析手順。ペプチド複合体（免疫グロブリンペプチド複合体２またはＦｃ−ペプチド複合体２）ストック溶液（１００μｇ／ｍＬ）を、１％ＢＳＡを有するＤＰＢＳ中複合体参照基準から作製し、−２０℃で保存した。標準試料をマウス血清中で調製した。２５、５０、１００、２５０、５００、１０００、２５００、５０００および１０，０００ｎｇ／ｍＬの標準濃度を、１００μｇ／ｍＬのペプチド複合体ストック溶液を使用して、新たに調製した１０，０００ｎｇ／ｍＬのマウス血清中溶液の連続希釈によって調製した。２５μｌの血清試料を９６ウェルプレートの適切なウェルに等分し、続いて２５μｌの内部標準溶液（１μｇ／ｍＬ、１％ＢＳＡを有するＤＰＢＳ中で作製した［１５Ｎ、１３Ｃ６］−Ｌｅｕで均一に標識されたαＤＡ−ＩｇＧ２）を添加した。血漿試料を次いで、抗ヒトＦｃマウス抗体で固定された磁性ビーズを用いて９６ウェルプレートフォーマット中で免疫親和性捕獲によって処理し、続いてトリプシン消化し、Oasis HLBμElution９６ウェル固相抽出プレートを使用して固相抽出して、抽出物トリプシンペプチドを抽出し、抽出物を分析のためにＬＣ−ＭＳ／ＭＳシステム上に注入した（１０μＬ）。
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳは、Turbo IonSpray（登録商標）イオン化源を有する5500QTRAP質量分析計（AB Sciex, Toronto, Canada）に接続されたAcquity UPLCシステム（Waters, Milford, MA）から構成されていた。分析カラムはAcquity UPLC BEHＣ１８（１００×２．１ｍｍ、１．７ｕｍ）であった。移動相は、アセトニトリル中０．１％ギ酸／水（５／９５、ｖ／ｖ、移動相Ａ）およびアセトニトリル中０．１％ギ酸／水（９５／５、ｖ／ｖ、移動相Ｂ）であった。ペプチド配列番号１０６２からのＮ末端ＤＣＬＧＡＦＲ（配列番号１０５０）をペプチド複合体（免疫グロブリンペプチド複合体２またはＦｃ−ペプチド複合体２）定量分析のための代理ペプチドとして使用した。
データを集め、AB Sciex Analyst（登録商標）ソフトウェア（バージョン１．５）を用いて処理した。
対応するペプチド複合体標準の濃度に対する面積比の１／ｘ２重み付き直線状最小二乗回帰を用いてピーク面積比（ペプチド／内部標準）から校正曲線を導いた。校正基準からの回帰方程式を用いて、各標準およびマウス血清試料の濃度測定値を逆算した。
予備ＰＫ研究の結果から、ペプチド複合体についての暴露は、それぞれ未修飾ＩｇＧおよびＦｃについてよりも若干低いことが示された。（図８８および図８９を参照のこと）。どちらの場合においても、１０ｍｇ／ｋｇのｓ．ｃ．用量の結果、２４時間で各ペプチド複合体のｉｎ ｖｉｔｒｏＮａｖ１．７ＩＣ５０またはその付近の血漿濃度が得られた。（Ｆｃ−ペプチド複合体２）のＣｍａｘは８〜２４時間に達したが、（免疫グロブリンペプチド複合体２）のＣｍａｘは２４時間以降に起こった。正確なｉｎ ｖｉｖｏｔ１／２は、実験が短いために計算することができなかった。免疫グロブリンペプチド複合体２およびＦｃ−ペプチド複合体２を、どちらも１０ｍｇ／ｋｇのｓ．ｃ．用量にて２４時間の前治療時間でのマウスのオープンフィールド分析において試験し、動物の自発運動に対して有意な影響を及ぼさなかった。（図１１１〜１１４を参照のこと）。免疫グロブリンペプチド複合体２およびＦｃ−ペプチド複合体２を、どちらも１０ｍｇ／ｋｇのｓ．ｃ．用量にて２４時間の前治療時間でマウスのホルマリン疼痛モデルにおいて試験し、調査の第１または第２段階のいずれかの間に病気に冒された足のリフティング／リッキングに費やされる時間に有意な影響を及ぼさなかった（図１１５〜１１７を参照のこと）。用量はｉｎ ｖｉｖｏで標的をカバーし、有効性が観察されるために十分ではなかった可能性が高い。
略語
特定の状況で別段の定義がされないかぎり、本明細書中全体にわたって使用される略語は以下で定義するとおりである。
Ａｃ アセチル（アセチル化残基を指すために使用される）
ＡｃＢｐａ アセチル化ｐ−ベンゾイル−Ｌ−フェニルアラニン
ＡＣＮ アセトニトリル
ＡｃＯＨ 酢酸
ＡＤＣＣ 抗体依存性細胞毒性
Ａｉｂ アミノイソ酪酸
ｂＡ ベータ−アラニン
Ｂｐａ ｐ−ベンゾイル−Ｌ−フェニルアラニン
ＢｒＡｃ ブロモアセチル（ＢｒＣＨ２Ｃ（Ｏ）
ＢＳＡ ウシ血清アルブミン
Ｂｚｌ ベンジル
Ｃａｐ カプロン酸
ＣＢＣ 全血球数
ＣＮＳ 中枢神経系
ＣＯＰＤ 慢性閉塞性肺疾患
ＣＴＬ 細胞傷害性リンパ球
ＤＣＣ ジシクロヘキシルカルボジイミド
Ｄｄｅ １−（４，４−ジメチル−２，６−ジオキソ−シクロヘキシリデン）エチル
ＤＯＰＣ １，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン
ＤＯＰＥ １，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン
ＤＰＰＣ １，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン
ＤＲＧ 後根神経節
ＤＳＰＣ １，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン
ＤＴＴ ジチオスレイトール
ＥＡＥ 実験的自己免疫性脳脊髄炎
ＥＣＬ 強化化学発光
ＥＳＩ−ＭＳ 電子スプレーイオン化質量分析
Ｅｔ エチル
ＦＡＣＳ 蛍光活性化細胞分類
Ｆｍｏｃ フルオレニルメトキシカルボニル
ＨＯＢｔ １−ヒドロキシベンゾトリアゾール
ＨＰＬＣ 高性能液体クロマトグラフィー
ＨＳＬ ホモセリンラクトン
ＩＢ 封入体
ＩＷＱ IonWorks（登録商標）Quattro
ＫＣａ カルシウム活性化カリウムチャンネル（ＩＫＣａ、ＢＫＣａ、ＳＫＣａを含む）
ＫＬＨ キーホールリンペットヘモシアニン
Ｋｖ 電位依存性カリウムチャンネル
Ｌａｕ ラウリン酸
ＬＰＳ リポ多糖
ＬＹＭＰＨ リンパ球
ＭＡＬＤＩ−ＭＳ マトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析
Ｍｅ メチル
ＭｅＯ メトキシ
ＭｅＯＨ メタノール
ＭＨＣ 主要組織適合遺伝子複合体
ＭＭＰ マトリックスメタロプロテイナーゼ
ＭＷ 分子量
ＭＷＣＯ 分子量カットオフ
１−Ｎａｐ １−ナフチルアラニン
Ｎａｖ、ＮａＶ 電位依存性ナトリウムチャンネル
ＮＥＵＴ 好中球
Ｎｌｅ ノルロイシン
ＮＭＰ Ｎ−メチル−２−ピロリジノン
ＯＡｃ アセテート
ＰＡＧＥ ポリアクリルアミドゲル電気泳動
ＰＢＭＣ 末梢血単核球
ＰＢＳ リン酸緩衝生理食塩水
Ｐｂｆ ２，２，４，６，７−ペンダメチルジヒドロベンゾフラン−５−スルホニル
ＰＣＲ ポリメラーゼ連鎖反応
ＰＤ 薬力学
Ｐｅｃ ピペコリン酸
ＰＥＧ ポリ（エチレングリコール）
Ｐｉｃ ピコリン酸
ＰＫ 薬物動態
ＰＮＳ 末梢神経系
ＰＸ PatchXpress（登録商標）
ｐＹ ホスホチロシン
ＲＢＳ リボソーム結合部位
ＲＴ 室温（２５℃）
Ｓａｒ サルコシン
ＳＤＳ ドデシル硫酸ナトリウム
ＳＴＫ セリン−トレオニンキナーゼ
ｔ−Ｂｏｃ ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル
ｔＢｕ ｔｅｒｔ−ブチル
ＴＣＲ Ｔ細胞受容体
ＴＦＡ トリフルオロ酢酸
ＴＧ 三叉神経節
ＴＨＦ 胸腺液性因子
Ｔｒｔ トリチル
ＴＴＸ テトロドトキシン

Claims (72)

  1. 式：
    Xaa 1Xaa 2 Xaa 3Xaa 4Xaa 5Xaa 6Xaa 7Xaa 8Xaa 9Xaa 10Xaa 11Xaa 12Xaa 13Xaa 14Asp15 Xaa 16 Xaa 17 Xaa 18Xaa 19 Xaa 20 Xaa 21Xaa 22Xaa 23 Xaa 24Xaa 25 Xaa 26Xaa 27Xaa 28Xaa 29Xaa 30 Xaa 31Lys32Xaa 33Xaa 34Xaa 35 Xaa 36Xaa 37Xaa 38／／配列番号４７５
    のアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドを含む組成物またはその薬剤的に許容される塩であって、
    式中：
    Ｘａａ １Ｘａａ ２は存在しない；またはＸａａ １は任意のアミノ酸残基であり、Ｘａａ ２は任意のアミノ酸残基であり；またはＸａａ １は存在せず、Ｘａａ ２は任意のアミノ酸残基であり；
    Ｘａａ １８がＣｙｓである場合、Ｘａａ ３はＣｙｓであり；またはＸａａ １８がＳｅＣｙｓである場合、Ｘａａ ３はＳｅＣｙｓであり；またはＸａａ １８がアルキルアミノ酸残基である場合、Ｘａａ ３はアルキルアミノ酸残基であり；
    Ｘａａ ４は、酸性、疎水性、塩基性、または中性親水性アミノ酸残基であり；
    Ｘａａ ５は、Ｇｌｙ、Ａｌａ、疎水性、または塩基性アミノ酸残基であり；
    Ｘａａ ６は、Ｇｌｙ、Ａｌａ、２−Ａｂｕ、Ｎｌｅ、Ｎｖａ、または疎水性アミノ酸残基であり；
    Ｘａａ ７は、Ｇｌｙ、Ａｌａ、芳香族、または疎水性アミノ酸残基であり；
    Ｘａａ ８は、塩基性、酸性、もしくは中性親水性アミノ酸残基、またはＡｌａ残基であり；
    Ｘａａ ９は、塩基性または中性親水性アミノ酸残基であり；
    Ｘａａ ２４がＣｙｓである場合、Ｘａａ １０はＣｙｓであり；またはＸａａ ２４がＳｅＣｙｓである場合、Ｘａａ １０はＳｅＣｙｓであり；
    Ｘａａ １１は任意のアミノ酸残基であり；
    Ｘａａ １２は、Ｐｒｏ、酸性、中性、または疎水性アミノ酸残基であり；
    Ｘａａ １３は任意のアミノ酸残基であり；
    Ｘａａ １４は任意のアミノ酸残基であり；
    Ｘａａ １６は、塩基性、中性親水性、もしくは酸性アミノ酸残基、またはＡｌａ残基であり；
    Ｘａａ ３１がＣｙｓである場合、Ｘａａ １７はＣｙｓであり；またはＸａａ ３１がＳｅＣｙｓである場合、Ｘａａ １７はＳｅＣｙｓであり；
    Ｘａａ １８は、Ｃｙｓ、ＳｅＣｙｓ、またはアルキルアミノ酸残基であり；
    Ｘａａ １９は任意のアミノ酸残基であり；
    Ｘａａ ２０は、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、塩基性、または中性親水性残基であり；
    Ｘａａ ２１は、塩基性、疎水性、または中性親水性アミノ酸残基であり；
    Ｘａａ ２２は、疎水性または塩基性アミノ酸残基であり；
    Ｘａａ ２３は、疎水性、塩基性、または中性親水性アミノ酸残基であり；
    Ｘａａ ２４は、ＣｙｓまたはＳｅＣｙｓ残基であり；
    Ｘａａ ２５は、Ｓｅｒ、Ａｌａ、または中性親水性アミノ酸残基であり；
    Ｘａａ ２６は、Ａｌａ、酸性、塩基性、または中性親水性アミノ酸残基であり；
    Ｘａａ ２７は、酸性、塩基性、中性親水性または疎水性残基であり；
    Ｘａａ ２８は、芳香族または塩基性アミノ酸残基であり；
    Ｘａａ ２９は、酸性、塩基性、または中性親水性アミノ酸残基であり；
    Ｘａａ ３０は、Ｔｒｐ、５−ブロモＴｒｐ、６−ブロモＴｒｐ、５−クロロＴｒｐ、６−クロロＴｒｐ、１−Ｎａｌ、２−Ｎａｌ、またはチオＴｒｐ残基であり；
    Ｘａａ ３１は、ＣｙｓまたはＳｅＣｙｓであり；
    Ｘａａ ３３は、疎水性または芳香族アミノ酸残基であり；
    Ｘａａ ３４は任意のアミノ酸残基であり；
    Ｘａａ ３５は疎水性アミノ酸残基であり；
    Ｘａａ ３６、Ｘａａ ３７、およびＸａａ ３８のそれぞれは独立して存在しないか、または独立して中性、塩基性、もしくは疎水性アミノ酸残基であり；
    ならびに：
    Ｘａａ ３およびＸａａ １８がどちらもＣｙｓ残基である場合、残基Ｘａａ ３と残基Ｘａａ １８との間にはジスルフィド結合があり；またはＸａａ ３およびＸａａ １８がどちらもＳｅＣｙｓ残基である場合、残基Ｘａａ ３と残基Ｘａａ １８との間にはジセレニド結合があり；
    Ｘａａ １０およびＸａａ ２４がどちらもＣｙｓ残基である場合、残基Ｘａａ １０と残基Ｘａａ ２４との間にはジスルフィド結合があり；またはＸａａ １０およびＸａａ ２４がどちらもＳｅＣｙｓ残基である場合、残基Ｘａａ １０と残基Ｘａａ ２４との間にはジセレニド結合があり；
    Ｘａａ １７およびＸａａ ３１がどちらもＣｙｓ残基である場合、残基Ｘａａ １７と残基Ｘａａ ３１との間にはジスルフィド結合があり；またはＸａａ １７およびＸａａ ３１がどちらもＳｅＣｙｓ残基である場合、残基Ｘａａ １７と残基Ｘａａ ３１との間にはジセレニド結合があり；
    アミノ末端残基は場合によってアセチル化、ビオチニル化、または４−ペンチノイル化、またはＰＥＧ化されており；ならびに
    カルボキシ末端残基は場合によってアミド化されている、組成物。
  2. Ｘａａ ４が、Ａｌａ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｖａｌ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、ホモリジン、オルニチン、アルギニン、Ｎ−メチル−アルギニン、ω−アミノアルギニン、ω−メチル−アルギニン、１−メチル−ヒスチジン、３−メチル−ヒスチジン、ホモアルギニン、Ｎ−メチル−リジン、Ｎ−ε−メチルリジン、Ｄａｂ、シクロヘキシルグリシン（Ｃｈｇ）、シクロヘキシルアラニン（Ｃｈａ）、グリシン、ノルロイシン、ノルバリン、１−Ｎａｌ、２−Ｎａｌ、４−フェニル−フェニルアラニン（Ｂｉｐ）、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、ホスホセリン、ホスホチロシン、ガンマ−カルボキシグルタミン酸、およびＣｉｔ残基から選択される、請求項１記載の組成物。
  3. Ｘａａ ５が、Ａｌａ、Ｐｈｅ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｖａｌ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、ホモリジン、オルニチン、アルギニン、Ｎ−メチル−アルギニン、ω−アミノアルギニン、ω−メチル−アルギニン、１−メチル−ヒスチジン、３−メチル−ヒスチジン、ホモアルギニン、Ｎ−メチル−リジン、Ｎ−ε−メチルリジン、Ｄａｂ、グリシン、ノルロイシン、ノルバリン、１−Ｎａｌ、２−Ｎａｌ、１’ＮＭｅ−Ｔｒｐ、シクロヘキシルグリシン（Ｃｈｇ）、シクロヘキシルアラニン（Ｃｈａ）、および４−フェニル−フェニルアラニン（Ｂｉｐ）残基から選択される、請求項１記載の組成物。
  4. Ｘａａ ６が、Ａｌａ、Ｇｌｙ、２−Ａｂｕ、Ｐｈｅ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｖａｌ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、プロリン、チアプロリン、メチオニン、グリシン、ノルロイシン、ノルバリン、１−Ｎａｌ、２−Ｎａｌ、１’ＮＭｅ−Ｔｒｐ、シクロペンチルグリシン（Ｃｐｇ）、フェニルグリシン、Ｎ−メチルロイシン、Ｎ−メチルフェニルアラニン、Ｎ−メチルバリン、シクロヘキシルグリシン（Ｃｈｇ）、シクロヘキシルアラニン（Ｃｈａ）、２−クロロ−フェニルアラニン、４−クロロ−フェニルアラニン、３，４−ジクロロフェニルアラニン、４−トリフルオロメチル−フェニルアラニン、および４−フェニル−フェニルアラニン（Ｂｉｐ）残基から選択される、請求項１記載の組成物。
  5. Ｘａａ ７が、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｐｈｅ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｖａｌ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、ノルロイシン、ノルバリン、Ｐｒｏ、２−ピリジニルアラニン、１−Ｎａｌ、２−Ｎａｌ、１’ＮＭｅ−Ｔｒｐ、シクロヘキシルグリシン（Ｃｈｇ）、シクロヘキシルアラニン（Ｃｈａ）、２−クロロ−フェニルアラニン、４−クロロ−フェニルアラニン、３，４−ジクロロフェニルアラニン、４−トリフルオロメチル−フェニルアラニン、および４−フェニル−フェニルアラニン（Ｂｉｐ）残基から選択される、請求項１記載の組成物。
  6. Ｘａａ ８が、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、ホモリジン、オルニチン、Ｎ−メチル−アルギニン、ω−アミノアルギニン、ω−メチル−アルギニン、１−メチル−ヒスチジン、３−メチル−ヒスチジン、ホモアルギニン、Ｎ−メチル−リジン、Ｎ−ε−メチルリジン、Ｄａｂ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｃｉｔ、Ａｓｐ、ホスホセリン、ホスホチロシン、ガンマ−カルボキシグルタミン酸、およびＧｌｕ残基から選択される、請求項１記載の組成物。
  7. Ｘａａ ９が、Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｍｅｔ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、ホモリジン、オルニチン、アルギニン、Ｎ−メチル−アルギニン、ω−アミノアルギニン、ω−メチル−アルギニン、１−メチル−ヒスチジン、３−メチル−ヒスチジン、ホモアルギニン、Ｎ−メチル−リジン、Ｎ−ε−メチルリジン、Ｄａｂ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、およびＣｉｔ残基から選択される、請求項１記載の組成物。
  8. Ｘａａ １１が、Ａｌａ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｐｈｅ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、Ｐｒｏ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｒａ、Ａｔｚ、ホモリジン、オルニチン、Ｎ−メチル−アルギニン、ω−アミノアルギニン、ω−メチル−アルギニン、１−メチル−ヒスチジン、３−メチル−ヒスチジン、ホモアルギニン、Ｎ−メチル−リジン、Ｎ−ε−メチルリジン、Ｄａｂ、ノルロイシン、ノルバリン、１−Ｎａｌ、２−Ｎａｌ、シクロヘキシルグリシン（Ｃｈｇ）、シクロヘキシルアラニン（Ｃｈａ）、および４−フェニル−フェニルアラニン（Ｂｉｐ）残基から選択される、請求項１記載の組成物。
  9. Ｘａａ １２が、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、セリン、トレオニン、アスパラギン酸、グルタミン酸（glutamatic acid）、グリシン、ノルロイシン、ノルバリン、１−Ｎａｌ、２−Ｎａｌ、１’ＮＭｅ−Ｔｒｐ、Ｃｈａ、および４−フェニル−フェニルアラニン（Ｂｉｐ）、シクロヘキシルグリシン（Ｃｈｇ）、シクロヘキシルアラニン（Ｃｈａ）、アスパラギン、グルタミン、メチオニン、ヒドロキシプロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、およびチロシンから選択される、請求項１記載の組成物。
  10. Ｘａａ １３が、Ａｌａ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｐｈｅ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、Ｐｒｏ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｒａ、Ａｔｚ、ホモリジン、オルニチン、Ｎ−メチル−アルギニン、ω−アミノアルギニン、ω−メチル−アルギニン、１−メチル−ヒスチジン、３−メチル−ヒスチジン、ホモアルギニン、Ｎ−メチル−リジン、Ｎ−ε−メチルリジン、Ｄａｂ、ノルロイシン、ノルバリン、１−Ｎａｌ、２−Ｎａｌ、シクロヘキシルグリシン（Ｃｈｇ）、シクロヘキシルアラニン（Ｃｈａ）、および４−フェニル−フェニルアラニン（Ｂｉｐ）残基から選択される、請求項１記載の組成物。
  11. Ｘａａ １４が、Ａｌａ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｐｈｅ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、Ｐｒｏ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｒａ、Ａｔｚ、ホモリジン、オルニチン、Ｎ−メチル−アルギニン、ω−アミノアルギニン、ω−メチル−アルギニン、１−メチル−ヒスチジン、３−メチル−ヒスチジン、ホモアルギニン、Ｎ−メチル−リジン、Ｎ−ε−メチルリジン、Ｄａｂ、ノルロイシン、ノルバリン、１−Ｎａｌ、２−Ｎａｌ、シクロヘキシルグリシン（Ｃｈｇ）、シクロヘキシルアラニン（Ｃｈａ）、および４−フェニル−フェニルアラニン（Ｂｉｐ）残基から選択される、請求項１記載の組成物。
  12. Ｘａａ １６が、Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｍｅｔ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ｐｒａ、Ａｔｚ、ホモリジン、オルニチン、アルギニン、Ｎ−メチル−アルギニン、ω−アミノアルギニン、ω−メチル−アルギニン、１−メチル−ヒスチジン、３−メチル−ヒスチジン、ホモアルギニン、Ｎ−メチル−リジン、Ｎ−ε−メチルリジン、Ｄａｂ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｃｉｔ、Ａｓｐ、ホスホセリン、ホスホチロシン、ガンマ−カルボキシグルタミン酸、およびＧｌｕ残基から選択される、請求項１記載の組成物。
  13. Ｘａａ １９が、Ａｌａ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｐｈｅ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、Ｐｒｏ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、ホモリジン、オルニチン、Ｎ−メチル−アルギニン、ω−アミノアルギニン、ω−メチル−アルギニン、１−メチル−ヒスチジン、３−メチル−ヒスチジン、ホモアルギニン、Ｎ−メチル−リジン、Ｎ−ε−メチルリジン、Ｄａｂ、ノルロイシン、ノルバリン、１−Ｎａｌ、２−Ｎａｌ、シクロヘキシルグリシン（Ｃｈｇ）、シクロヘキシルアラニン（Ｃｈａ）、および４−フェニル−フェニルアラニン（Ｂｉｐ）残基から選択される、請求項１記載の組成物。
  14. Ｘａａ ２０が、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、Ｍｅｔ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、ホモリジン、オルニチン、アルギニン、Ｎ−メチル−アルギニン、ω−アミノアルギニン、ω−メチル−アルギニン、１−メチル−ヒスチジン、３−メチル−ヒスチジン、ホモアルギニン、Ｎ−メチル−リジン、Ｎ−ε−メチルリジン、Ｄａｂ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、およびＣｉｔ残基から選択される、請求項１記載の組成物。
  15. Ｘａａ ２１が、Ａｌａ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｖａｌ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、ホモリジン、オルニチン、アルギニン、Ｎ−メチル−アルギニン、ω−アミノアルギニン、ω−メチル−アルギニン、１−メチル−ヒスチジン、３−メチル−ヒスチジン、ホモアルギニン、Ｎ−メチル−リジン、Ｎ−ε−メチルリジン、Ｄａｂ、シクロヘキシルグリシン（Ｃｈｇ）、シクロヘキシルアラニン（Ｃｈａ）、グリシン、ノルロイシン、ノルバリン、１−Ｎａｌ、２−Ｎａｌ、４−フェニル−フェニルアラニン（Ｂｉｐ）、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、およびＣｉｔ残基から選択される、請求項１記載の組成物。
  16. Ｘａａ ２２が、Ａｌａ、Ｐｈｅ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｖａｌ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、ホモリジン、オルニチン、Ｎ−メチル−アルギニン、ω−アミノアルギニン、ω−メチル−アルギニン、１−メチル−ヒスチジン、３−メチル−ヒスチジン、ホモアルギニン、Ｎ−メチル−リジン、Ｎ−ε−メチルリジン、Ｄａｂ、グリシン、ノルロイシン、ノルバリン、１−Ｎａｌ、２−Ｎａｌ、１’ＮＭｅ−Ｔｒｐ、シクロヘキシルグリシン（Ｃｈｇ）、シクロヘキシルアラニン（Ｃｈａ）、および４−フェニル−フェニルアラニン（Ｂｉｐ）残基から選択される、請求項１記載の組成物。
  17. Ｘａａ ２３が、Ａｌａ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｖａｌ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ｐｒａ、Ａｔｚ、ホモリジン、オルニチン、Ｎ−メチル−アルギニン、ω−アミノアルギニン、ω−メチル−アルギニン、１−メチル−ヒスチジン、３−メチル−ヒスチジン、ホモアルギニン、Ｎ−メチル−リジン、Ｎ−ε−メチルリジン、Ｄａｂ、シクロヘキシルグリシン（Ｃｈｇ）、シクロヘキシルアラニン（Ｃｈａ）、グリシン、ノルロイシン、ノルバリン、１−Ｎａｌ、２−Ｎａｌ、４−フェニル−フェニルアラニン（Ｂｉｐ）、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、およびＣｉｔ残基から選択される、請求項１記載の組成物。
  18. Ｘａａ ２５が、Ａｌａ、ＧｌｙＰｒｏ、Ｍｅｔ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、およびＣｉｔ残基から選択される、請求項１記載の組成物。
  19. Ｘａａ ２６が、Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｍｅｔ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、ホモリジン、オルニチン、Ｎ−メチル−アルギニン、ω−アミノアルギニン、ω−メチル−アルギニン、１−メチル−ヒスチジン、３−メチル−ヒスチジン、ホモアルギニン、Ｎ−メチル−リジン、Ｎ−ε−メチルリジン、Ｄａｂ、グリシン、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、ホスホセリン、ホスホチロシン、ガンマ−カルボキシグルタミン酸、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、およびＣｉｔ残基から選択される、請求項１記載の組成物。
  20. Ｘａａ ２７が、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｓｅｒ、Ｍｅｔ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、ノルロイシン、ノルバリン、１−Ｎａｌ、２−Ｎａｌ、シクロヘキシルグリシン（Ｃｈｇ）、シクロヘキシルアラニン（Ｃｈａ）、４−フェニル−フェニルアラニン（Ｂｉｐ）、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、ホモリジン、オルニチン、アルギニン、Ｎ−メチル−アルギニン、ω−アミノアルギニン、ω−メチル−アルギニン、１−メチル−ヒスチジン、３−メチル−ヒスチジン、ホモアルギニン、Ｎ−メチル−リジン、Ｎ−ε−メチルリジン、Ｄａｂ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、ホスホセリン、ホスホチロシン、ガンマ−カルボキシグルタミン酸、およびＧｌｙ残基から選択される、請求項１記載の組成物。
  21. Ｘａａ ２８が、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、ホモリジン、オルニチン、Ｎ−メチル−アルギニン、ω−アミノアルギニン、ω−メチル−アルギニン、１−メチル−ヒスチジン、３−メチル−ヒスチジン、ホモアルギニン、Ｎ−メチル−リジン、Ｎ−ε−メチルリジン、Ｄａｂ、１−Ｎａｌ、２−Ｎａｌ、２−ピリジル−アラニン、３−ピリジル−アラニン、４−ピリジル−アラニン、４−ピペリジニル−アラニン、および４−フェニル−フェニルアラニン（Ｂｉｐ）残基から選択される、請求項１記載の組成物。
  22. Ｘａａ ２９が、Ａｌａ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、ホスホセリン、ホスホチロシン、ガンマ−カルボキシグルタミン酸、Ｐｈｅ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｓｎ、Ｐｒｏ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ、Ｐｒａ、Ａｔｚ、ホモリジン、オルニチン、Ｎ−メチル−アルギニン、ω−アミノアルギニン、ω−メチル−アルギニン、１−メチル−ヒスチジン、３−メチル−ヒスチジン、ホモアルギニン、Ｎ−メチル−リジン、Ｎ−ε−メチルリジン、およびＤａｂ残基から選択される、請求項１記載の組成物。
  23. Ｘａａ ３３が、Ｐｈｅ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｖａｌ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、ノルロイシン、ノルバリン、１−Ｎａｌ、２−Ｎａｌ、１’ＮＭｅ−Ｔｒｐ、シクロヘキシルグリシン（Ｃｈｇ）、シクロヘキシルアラニン（Ｃｈａ）、２−クロロ−フェニルアラニン、４−クロロ−フェニルアラニン、３，４−ジクロロフェニルアラニン、４−トリフルオロメチル−フェニルアラニン、２−ピリジル−アラニン、３−ピリジル−アラニン、４−ピリジル−アラニン、４−ピペリジニル−アラニン、および４−フェニル−フェニルアラニン（Ｂｉｐ）残基から選択される、請求項１記載の組成物。
  24. Ｘａａ ３４が、Ａｌａ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｐｈｅ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、Ｐｒｏ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｒａ、Ａｔｚ、ホモリジン、オルニチン、Ｎ−メチル−アルギニン、ω−アミノアルギニン、ω−メチル−アルギニン、１−メチル−ヒスチジン、３−メチル−ヒスチジン、ホモアルギニン、Ｎ−メチル−リジン、Ｎ−ε−メチルリジン、Ｄａｂ、ノルロイシン、ノルバリン、１−Ｎａｌ、２−Ｎａｌ、１’ＮＭｅ−Ｔｒｐ、シクロヘキシルグリシン（Ｃｈｇ）、シクロヘキシルアラニン（Ｃｈａ）、２−クロロ−フェニルアラニン、４−クロロ−フェニルアラニン、３，４−ジクロロフェニルアラニン、４−トリフルオロメチル−フェニルアラニン、２−ピリジル−アラニン、３−ピリジル−アラニン、４−カルボキシ−フェニルアラニン、および４−フェニル−フェニルアラニン（Ｂｉｐ）残基から選択される、請求項１記載の組成物。
  25. Ｘａａ ３５が、Ｐｈｅ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｖａｌ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、ノルロイシン、ノルバリン、１−Ｎａｌ、２−Ｎａｌ、１’ＮＭｅ−Ｔｒｐ、シクロヘキシルグリシン（Ｃｈｇ）、シクロヘキシルアラニン（Ｃｈａ）、２−クロロ−フェニルアラニン、４−クロロ−フェニルアラニン、３，４−ジクロロフェニルアラニン、４−トリフルオロメチル−フェニルアラニン、および４−フェニル−フェニルアラニン（Ｂｉｐ）残基から選択される、請求項１記載の組成物。
  26. Ｘａａ ３６、Ｘａａ ３７、およびＸａａ ３８のそれぞれが独立して存在しないか、またはＡｌａ、Ｐｈｅ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、Ｐｒｏ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、ホモリジン、オルニチン、Ｎ−メチル−アルギニン、ω−アミノアルギニン、ω−メチル−アルギニン、１−メチル−ヒスチジン、３−メチル−ヒスチジン、ホモアルギニン、Ｎ−メチル−リジン、Ｎ−ε−メチルリジン、Ｄａｂ、ノルロイシン、ノルバリン、１−Ｎａｌ、２−Ｎａｌ、シクロヘキシルグリシン（Ｃｈｇ）、シクロヘキシルアラニン（Ｃｈａ）、および４−フェニル−フェニルアラニン（Ｂｉｐ）残基から独立して選択される、請求項１記載の組成物。
  27. Ｘａａ ３およびＸａａ １８がアルキル残基である、請求項１記載の組成物。
  28. Ｘａａ ３およびＸａａ １８が独立してＡｌａまたは２−Ａｂｕ残基である、請求項２７記載の組成物。
  29. カルボキシ末端残基がアミド化されている、請求項１記載の組成物。
  30. 単離されたポリペプチドが、式：
    Xaa 1Xaa 2 Cys3Xaa 4 Xaa 5Ala6 Xaa 7Xaa 8Xaa 9Cys10Xaa 11Xaa 12Xaa 13Xaa 14Asp15 Xaa 16 Cys17Cys18Xaa 19 Xaa 20 Xaa 21Xaa 22Xaa 23 Cys24Xaa 25 Xaa 26Xaa 27Xaa 28Xaa 29Xaa 30 Cys31Lys32Xaa 33Xaa 34Xaa 35 Xaa 36Xaa 37Xaa 38／／配列番号４７６
    のアミノ酸を含む、請求項１記載の組成物。
  31. Ｘａａ ６がＡｌａである、請求項１記載の組成物。
  32. Ｘａａ ２７がＧｌｕである、請求項３１記載の組成物。
  33. Ｘａａ ２９がＡｓｐ、Ｇｌｕ、またはＧｌｎである、請求項３１記載の組成物。
  34. 配列番号２２、２５２〜２６３、４１９〜４３９、５１８〜５２１、５２４、５２５、５６２〜５８０、６０２、６９１、６９２、６９６〜７０３、７１５、７２１〜７３５、７３７〜７４９、７５６、７５７、７６１、７６２、７６４〜７７１、７８７〜７９６、７９８、８００、８０２、８０３、８０９〜８１２、１０２８、１０３０〜１０４０、１０４３〜１０４７、１０６２〜１０６５、および１０６８〜１０７０から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項３１記載の組成物。
  35. 配列番号１０８２、１０９６、１１１０、１１２４、１１３５、１１４６、１１５７、１１６５、１１７３、１１８１、１１９２、１２０３、１２１４、１２２２、１２３０、１２３８、１２４９、１２６０、１２７１、１２７９、１２８７、１２９５、１３０６、１３１７、１３２８、１３３６、１３４４、１３５２、１３６０、１３６８、１３７６、１３８４、１３９２、１４００、１４０８、１４１６、１４２４、１４３２、１４４０、１４４８、１４５６、１４６４、１４７２、１４８０、１４８８、１４９６、１５０４、１５１２、１５２０、１５２８、１５３６、１５４４、１５５２、１５６０、１５６８、１５７６、１５８４、１５９２、１６００、１６０８、１６１６、１６２４、１６３２、１６４０、１６５８、１６７２、１６８６、１７００、１７１１、１７２２、１７３３、１７４１、１７４９、１７５７、１７６８、１７７９、１７９０、１７９８、１８０６、１８１４、１８２５、１８３６、１８４７、１８５５、１８６３、１８７１、１８８２、１８９３、１９０４、１９１２、１９２０、１９２８、１９３６、１９４４、１９５２、１９６０、１９６８、１９７６、１９８４、１９９２、２０００、２００８、２０１６、２０２４、２０３２、２０４０、２０４８、２０５６、２０６４、２０７２、２０８０、２０８８、２０９６、２１０４、２１１２、２１２０、２１２８、２１３６、２１４４、２１５２、２１６０、２１６８、２１７６、２１８４、２１９２、２２００、２２０８、２２１６、２２３４、２２４８、２２６２、２２７６、２２８７、２２９８、２３０９、２３１７、２３２５、２３３３、２３４４、２３５５、２３６６、２３７４、２３８２、２３９０、２４０１、２４１２、２４２３、２４３１、２４３９、２４４７、２４５８、２４６９、２４８０、２４８８、２４９６、２５０４、２５１２、２５２０、２５２８、２５３６、２５４４、２５５２、２５６０、２５６８、２５７６、２５８４、２５９２、２６００、２６０８、２６１６、２６２４、２６３２、２６４０、２６４８、２６５６、２６６４、２６７２、２６８０、２６８８、２６９６、２７０４、２７１２、２７２０、２７２８、２７３６、２７４４、２７５２、２７６０、２７６８、２７７６、２７８４、２７９２、２８０８、２８２２、２８３３、２８４４、２８５５、２８６３、２８７１、２８７９、２８９０、２９０１、２９１２、２９２０、２９２８、２９３６、２９４４、２９５２、２９６０、２９６８、２９７６、２９８４、２９９２、３０００、３００８、３０１６、３０２４、３０３２、３０４０、３０４８、３０５６、３０６４、３０７２、および３０８０から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項３１記載の組成物。
  36. 配列番号５９７〜６０１および８１３〜１０２７から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項３１記載の組成物。
  37. Ｘａａ ６がＧｌｙである、請求項１記載の組成物。
  38. Ｘａａ ２７がＧｌｕである、請求項３７記載の組成物。
  39. Ｘａａ ２９がＡｓｐ、Ｇｌｕ、またはＧｌｎである、請求項３７記載の組成物。
  40. 配列番号２６５、７５１、７５２、７５４、７５５、１０８１、１０９５、１１０９、１１２３、１１３４、１１４５、１１５６、１１６４、１１７２、１１８０、１１９１、１２０２、１２１３、１２２１、１２２９、１２３７、１２４８、１２５９、１２７０、１２７８、１２８６、１２９４、１３０５、１３１６、１３２７、１３３５、１３４３、１３５１、１３５９、１３６７、１３７５、１３８３、１３９１、１３９９、１４０７、１４１５、１４２３、１４３１、１４３９、１４４７、１４５５、１４６３、１４７１、１４７９、１４８７、１４９５、１５０３、１５１１、１５１９、１５２７、１５３５、１５４３、１５５１、１５５９、１５６７、１５７５、１５８３、１５９１、１５９９、１６０７、１６１５、１６２３、１６３１、１６３９、１６５７、１６７１、１６８５、１６９９、１７１０、１７２１、１７３２、１７４０、１７４８、１７５６、１７６７、１７７８、１７８９、１７９７、１８０５、１８１３、１８２４、１８３５、１８４６、１８５４、１８６２、１８７０、１８８１、１８９２、１９０３、１９１１、１９１９、１９２７、１９３５、１９４３、１９５１、１９５９、１９６７、１９７５、１９８３、１９９１、１９９９、２００７、２０１５、２０２３、２０３１、２０３９、２０４７、２０５５、２０６３、２０７１、２０７９、２０８７、２０９５、２１０３、２１１１、２１１９、２１２７、２１３５、２１４３、２１５１、２１５９、２１６７、２１７５、２１８３、２１９１、２１９９、２２０７、２２１５、２２３３、２２４７、２２６１、２２７５、２２８６、２２９７、２３０８、２３１６、２３２４、２３３２、２３４３、２３５４、２３６５、２３７３、２３８１、２３８９、２４００、２４１１、２４２２、２４３０、２４３８、２４４６、２４５７、２４６８、２４７９、２４８７、２４９５、２５０３、２５１１、２５１９、２５２７、２５３５、２５４３、２５５１、２５５９、２５６７、２５７５、２５８３、２５９１、２５９９、２６０７、２６１５、２６２３、２６３１、２６３９、２６４７、２６５５、２６６３、２６７１、２６７９、２６８７、２６９５、２７０３、２７１１、２７１９、２７２７、２７３５、２７４３、２７５１、２７５９、２７６７、２７７５、２７８３、２７９１、２８０７、２８２１、２８３２、２８４３、２８５４、２８６２、２８７０、２８７８、２８８９、２９００、２９１１、２９１９、２９２７、２９３５、２９４３、２９５１、２９５９、２９６７、２９７５、２９８３、２９９１、２９９９、３００７、３０１５、３０２３、３０３１、３０３９、３０４７、３０５５、３０６３、３０７１、および３０７９から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項３７記載の組成物。
  41. Ｘａａ ６が２−Ａｂｕである、請求項１記載の組成物。
  42. Ｘａａ ２７がＧｌｕである、請求項４１記載の組成物。
  43. Ｘａａ ２９がＡｓｐ、Ｇｌｕ、またはＧｌｎである、請求項４１記載の組成物。
  44. 配列番号６０５、６３６、６４９、７０６、７０７、７１８、７５３、７５８、７９７、７９９、８０１、８０４、８０７、８０８、１０２９、１０４１、１０４２、１０４８、１０６６、１０６７、１０８３、１０９７、１１１１、１１２５、１１３６、１１４７、１１５８、１１６６、１１７４、１１８２、１１９３、１２０４、１２１５、１２２３、１２３１、１２３９、１２５０、１２６１、１２７２、１２８０、１２８８、１２９６、１３０７、１３１８、１３２９、１３３７、１３４５、１３５３、１３６１、１３６９、１３７７、１３８５、１３９３、１４０１、１４０９、１４１７、１４２５、１４３３、１４４１、１４４９、１４５７、１４６５、１４７３、１４８１、１４８９、１４９７、１５０５、１５１３、１５２１、１５２９、１５３７、１５４５、１５５３、１５６１、１５６９、１５７７、１５８５、１５９３、１６０１、１６０９、１６１７、１６２５、１６３３、１６４１、１６５９、１６７３、１６８７、１７０１、１７１２、１７２３、１７３４、１７４２、１７５０、１７５８、１７６９、１７８０、１７９１、１７９９、１８０７、１８１５、１８２６、１８３７、１８４８、１８５６、１８６４、１８７２、１８８３、１８９４、１９０５、１９１３、１９２１、１９２９、１９３７、１９４５、１９５３、１９６１、１９６９、１９７７、１９８５、１９９３、２００１、２００９、２０１７、２０２５、２０３３、２０４１、２０４９、２０５７、２０６５、２０７３、２０８１、２０８９、２０９７、２１０５、２１１３、２１２１、２１２９、２１３７、２１４５、２１５３、２１６１、２１６９、２１７７、２１８５、２１９３、２２０１、２２０９、２２１７、２２３５、２２４９、２２６３、２２７７、２２８８、２２９９、２３１０、２３１８、２３２６、２３３４、２３４５、２３５６、２３６７、２３７５、２３８３、２３９１、２４０２、２４１３、２４２４、２４３２、２４４０、２４４８、２４５９、２４７０、２４８１、２４８９、２４９７、２５０５、２５１３、２５２１、２５２９、２５３７、２５４５、２５５３、２５６１、２５６９、２５７７、２５８５、２５９３、２６０１、２６０９、２６１７、２６２５、２６３３、２６４１、２６４９、２６５７、２６６５、２６７３、２６８１、２６８９、２６９７、２７０５、２７１３、２７２１、２７２９、２７３７、２７４５、２７５３、２７６１、２７６９、２７７７、２７８５、２７９３、２８０９、２８２３、２８３４、２８４５、２８５６、２８６４、２８７２、２８８０、２８９１、２９０２、２９１３、２９２１、２９２９、２９３７、２９４５、２９５３、２９６１、２９６９、２９７７、２９８５、２９９３、３００１、３００９、３０１７、３０２５、３０３３、３０４１、３０４９、３０５７、３０６５、３０７３、および３０８１から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項４１記載の組成物。
  45. Ｘａａ ６がＮｌｅである、請求項１記載の組成物。
  46. Ｘａａ ２７がＧｌｕである、請求項４５記載の組成物。
  47. Ｘａａ ２９がＡｓｐ、Ｇｌｕ、またはＧｌｎである、請求項４５記載の組成物。
  48. 配列番号６０７、６３８、６５１、１０８５、１０９９、１１１３、１１２７、１１３８、１１４９、１１６０、１１６８、１１７６、１１８４、１１９５、１２０６、１２１７、１２２５、１２３３、１２４１、１２５２、１２６３、１２７４、１２８２、１２９０、１２９８、１３０９、１３２０、１３３１、１３３９、１３４７、１３５５、１３６３、１３７１、１３７９、１３８７、１３９５、１４０３、１４１１、１４１９、１４２７、１４３５、１４４３、１４５１、１４５９、１４６７、１４７５、１４８３、１４９１、１４９９、１５０７、１５１５、１５２３、１５３１、１５３９、１５４７、１５５５、１５６３、１５７１、１５７９、１５８７、１５９５、１６０３、１６１１、１６１９、１６２７、１６３５、１６４３、１６６１、１６７５、１６８９、１７０３、１７１４、１７２５、１７３６、１７４４、１７５２、１７６０、１７７１、１７８２、１７９３、１８０１、１８０９、１８１７、１８２８、１８３９、１８５０、１８５８、１８６６、１８７４、１８８５、１８９６、１９０７、１９１５、１９２３、１９３１、１９３９、１９４７、１９５５、１９６３、１９７１、１９７９、１９８７、１９９５、２００３、２０１１、２０１９、２０２７、２０３５、２０４３、２０５１、２０５９、２０６７、２０７５、２０８３、２０９１、２０９９、２１０７、２１１５、２１２３、２１３１、２１３９、２１４７、２１５５、２１６３、２１７１、２１７９、２１８７、２１９５、２２０３、２２１１、２２１９、２２３７、２２５１、２２６５、２２７９、２２９０、２３０１、２３１２、２３２０、２３２８、２３３６、２３４７、２３５８、２３６９、２３７７、２３８５、２３９３、２４０４、２４１５、２４２６、２４３４、２４４２、２４５０、２４６１、２４７２、２４８３、２４９１、２４９９、２５０７、２５１５、２５２３、２５３１、２５３９、２５４７、２５５５、２５６３、２５７１、２５７９、２５８７、２５９５、２６０３、２６１１、２６１９、２６２７、２６３５、２６４３、２６５１、２６５９、２６６７、２６７５、２６８３、２６９１、２６９９、２７０７、２７１５、２７２３、２７３１、２７３９、２７４７、２７５５、２７６３、２７７１、２７７９、２７８７、２７９５、２８１１、２８２５、２８３６、２８４７、２８５８、２８６６、２８７４、２８８２、２８９３、２９０４、２９１５、２９２３、２９３１、２９３９、２９４７、２９５５、２９６３、２９７１、２９７９、２９８７、２９９５、３００３、３０１１、３０１９、３０２７、３０３５、３０４３、３０５１、３０５９、３０６７、３０７５、および３０８３から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項４５記載の組成物。
  49. Ｘａａ ６がＮｖａである、請求項１記載の組成物。
  50. Ｘａａ ２７がＧｌｕである、請求項４９記載の組成物。
  51. Ｘａａ ２９がＡｓｐ、Ｇｌｕ、またはＧｌｎである、請求項４９記載の組成物。
  52. 配列番号６０６、６３７、６５０、７０５、７０８、７１７、７５９、７６０、８０５、８０６、１０８４、１０９８、１１１２、１１２６、１１３７、１１４８、１１５９、１１６７、１１７５、１１８３、１１９４、１２０５、１２１６、１２２４、１２３２、１２４０、１２５１、１２６２、１２７３、１２８１、１２８９、１２９７、１３０８、１３１９、１３３０、１３３８、１３４６、１３５４、１３６２、１３７０、１３７８、１３８６、１３９４、１４０２、１４１０、１４１８、１４２６、１４３４、１４４２、１４５０、１４５８、１４６６、１４７４、１４８２、１４９０、１４９８、１５０６、１５１４、１５２２、１５３０、１５３８、１５４６、１５５４、１５６２、１５７０、１５７８、１５８６、１５９４、１６０２、１６１０、１６１８、１６２６、１６３４、１６４２、１６６０、１６７４、１６８８、１７０２、１７１３、１７２４、１７３５、１７４３、１７５１、１７５９、１７７０、１７８１、１７９２、１８００、１８０８、１８１６、１８２７、１８３８、１８４９、１８５７、１８６５、１８７３、１８８４、１８９５、１９０６、１９１４、１９２２、１９３０、１９３８、１９４６、１９５４、１９６２、１９７０、１９７８、１９８６、１９９４、２００２、２０１０、２０１８、２０２６、２０３４、２０４２、２０５０、２０５８、２０６６、２０７４、２０８２、２０９０、２０９８、２１０６、２１１４、２１２２、２１３０、２１３８、２１４６、２１５４、２１６２、２１７０、２１７８、２１８６、２１９４、２２０２、２２１０、２２１８、２２３６、２２５０、２２６４、２２７８、２２８９、２３００、２３１１、２３１９、２３２７、２３３５、２３４６、２３５７、２３６８、２３７６、２３８４、２３９２、２４０３、２４１４、２４２５、２４３３、２４４１、２４４９、２４６０、２４７１、２４８２、２４９０、２４９８、２５０６、２５１４、２５２２、２５３０、２５３８、２５４６、２５５４、２５６２、２５７０、２５７８、２５８６、２５９４、２６０２、２６１０、２６１８、２６２６、２６３４、２６４２、２６５０、２６５８、２６６６、２６７４、２６８２、２６９０、２６９８、２７０６、２７１４、２７２２、２７３０、２７３８、２７４６、２７５４、２７６２、２７７０、２７７８、２７８６、２７９４、２８１０、２８２４、２８３５、２８４６、２８５７、２８６５、２８７３、２８８１、２８９２、２９０３、２９１４、２９２２、２９３０、２９３８、２９４６、２９５４、２９６２、２９７０、２９７８、２９８６、２９９４、３００２、３０１０、３０１８、３０２６、３０３４、３０４２、３０５０、３０５８、３０６６、３０７４、および３０８２から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項４９記載の組成物。
  53. 配列番号３〜３０、３２〜７２、７４〜１３４、１３６〜１７８、１８０〜２１１、２１８〜２３９、２４１〜３０５、３０７〜３６３、３６６〜３８６、３８８〜４３２、４３４〜４７４、５１５〜５２７、５３２〜５８８、５９０、５９１、５９３〜７７５、７７７、７７８、７８０〜７８８、７９０〜１０４９、および１０６２〜３０８６から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１記載の組成物。
  54. 配列番号３〜１３４、１３６〜３０５、３０７〜３８６、３８８〜４７４、５１５〜５２７、５３２〜５８８、５９０、５９１、５９３〜１０４９、および１０６２〜３０８６から選択されるアミノ酸配列を含む、組成物。
  55. 非標準アミノ酸を含まない、配列番号３〜１３４、１３６〜３０５、３０７〜３８６、３８８〜４７４、５１５〜５２７、５３２〜５８８、５９０、５９１、５９３〜１０４９、または１０６２〜３０８６のいずれかをコードする単離された核酸。
  56. 請求項５５記載の核酸を含む、発現ベクター。
  57. 請求項５６記載の発現ベクターを含む組換え宿主細胞。
  58. 任意のリンカー部分および薬剤的に許容される共有結合した半減期延長部分をさらに含む、請求項１、３０、３１、３７、４１、４５、４９、５３、または５４のいずれかに記載の組成物。
  59. 半減期延長部分が、約１０００Ｄａ〜約１０００００Ｄａの分子量のポリエチレングリコール、ＩｇＧ Ｆｃ領域、トランスサイレチン、またはヒト血清アルブミンである、請求項５８記載の組成物。
  60. 半減期延長部分が、ヒト免疫グロブリンもしくはヒト免疫グロブリンＦｃ領域、または両方を含む、請求項５８記載の組成物。
  61. 図１２Ａ〜Ｎ、または図８８〜９１のいずれかに記載される立体配置を有する、請求項６０記載の組成物。
  62. 組成物が一価免疫グロブリンペプチドまたはＦｃ−ペプチド複合体を含む、請求項６０記載の組成物。
  63. 組成物が二価免疫グロブリンペプチドまたはＦｃ−ペプチド複合体を含む、請求項６０記載の組成物。
  64. 請求項１、３０、３１、３７、４１、４５、４９、５３、５４、または５９〜６３のいずれかに記載の組成物、および薬剤的に許容される担体を含む、医薬組成物。
  65. 予防有効量の、請求項１、３０、３１、３７、４１、４５、４９、５３、５４、または５９〜６３のいずれかに記載の組成物を投与することを含む、疼痛を予防する方法。
  66. 治療有効量の、請求項１、３０、３１、３７、４１、４５、４９、５３、５４、または５９〜６３のいずれかに記載の組成物を投与することを含む、疼痛を治療する方法。
  67. 疼痛が、慢性疼痛、急性疼痛、または持続性疼痛である、請求項６６記載の方法。
  68. 慢性疼痛が、ガン、化学療法、骨関節炎、繊維筋痛、原発性肢端紅痛症、ヘルペス後神経痛、疼痛を伴う糖尿病性神経障害、突発性の疼痛を伴う神経障害、神経腫、発作性の極度の疼痛障害、偏頭痛、三叉神経痛、口腔顔面痛、群発性頭痛、複合性局所疼痛症候群（ＣＲＰＳ）、腰椎術後疼痛症候群、坐骨神経痛、間質性膀胱炎、骨盤痛、腰痛、炎症で誘発される疼痛、または関節痛と関連する、請求項６７記載の方法。
  69. 急性または持続性疼痛が、外傷、熱傷、または外科手術と関連する、請求項６７記載の方法。
  70. Ｘａａ ２９が、酸性または中性親水性残基である、請求項１または３０記載の組成物。
  71. Ｘａａ ２９が、Ａｌａ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、ホスホセリン、ホスホチロシン、およびガンマ−カルボキシグルタミン酸残基から選択される、請求項７０記載の組成物。
  72. 配列番号１０７１〜２７９８から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項７０記載の組成物。
JP2016161682A 2011-03-16 2016-08-22 １７ｎａｖ１．３およびｎａｖ１．７の強力かつ選択的阻害剤 Pending JP2017031157A (ja)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201161453492P 2011-03-16 2011-03-16
US61/453,492 2011-03-16
US201261608088P 2012-03-07 2012-03-07
US61/608,088 2012-03-07

Related Parent Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2013558223A Division JP2014509859A (ja) 2011-03-16 2012-03-16 １７ｎａｖ１．３およびｎａｖ１．７の強力かつ選択的阻害剤

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JP2017031157A true JP2017031157A (ja) 2017-02-09

Family

ID=45895479

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2013558223A Pending JP2014509859A (ja) 2011-03-16 2012-03-16 １７ｎａｖ１．３およびｎａｖ１．７の強力かつ選択的阻害剤
JP2016161682A Pending JP2017031157A (ja) 2011-03-16 2016-08-22 １７ｎａｖ１．３およびｎａｖ１．７の強力かつ選択的阻害剤

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2013558223A Pending JP2014509859A (ja) 2011-03-16 2012-03-16 １７ｎａｖ１．３およびｎａｖ１．７の強力かつ選択的阻害剤

Country Status (23)

Country Link
US (2) US9340590B2 (ja)
EP (1) EP2686340A2 (ja)
JP (2) JP2014509859A (ja)
KR (1) KR20140145947A (ja)
CN (1) CN103930437A (ja)
AP (1) AP2013007173A0 (ja)
AR (1) AR088413A1 (ja)
AU (1) AU2012228990B2 (ja)
BR (1) BR112013023674A2 (ja)
CA (1) CA2830065A1 (ja)
CL (1) CL2013002673A1 (ja)
CO (1) CO6821886A2 (ja)
CR (1) CR20130533A (ja)
EA (1) EA201391331A1 (ja)
HK (1) HK1198173A1 (ja)
MA (1) MA35385B1 (ja)
MX (1) MX2013010497A (ja)
PE (1) PE20140593A1 (ja)
SG (2) SG10201601789TA (ja)
TW (1) TW201300407A (ja)
UY (1) UY33959A (ja)
WO (1) WO2012125973A2 (ja)
ZA (1) ZA201306920B (ja)

Families Citing this family (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10344060B2 (en) * 2013-03-12 2019-07-09 Amgen Inc. Potent and selective inhibitors of Nav1.7
US9636418B2 (en) 2013-03-12 2017-05-02 Amgen Inc. Potent and selective inhibitors of NAV1.7
ES2759061T3 (es) * 2013-03-15 2020-05-07 Biomolecular Holdings Llc Inmunoglobulina híbrida que contiene unión no peptidílica
HRP20221233T1 (hr) 2014-03-14 2022-12-09 Biomolecular Holdings Llc Spojevi korisni u pripravi hibridnog imunoglobina koji sadrži nepeptidilnu vezu
CN105348392B (zh) * 2015-11-18 2019-08-02 北京华金瑞清生物医药技术有限公司 一种Nav1.7抑制剂及其改造方法
US20170239183A1 (en) * 2016-02-23 2017-08-24 PixarBio Corporation COMPOSITIONS COMPRISING NAv1.7 SELECTIVE INHIBITORS FOR TREATING ACUTE, POST-OPERATIVE, OR CHRONIC PAIN AND METHODS OF USING THE SAME
EP3512870B1 (en) * 2016-09-16 2022-08-03 Olipass Corporation Scn9a antisense oligonucleotides
WO2018138585A1 (en) * 2017-01-24 2018-08-02 Olipass Corporation Scn9a antisense pain killer
CN109517041B (zh) * 2018-11-14 2019-09-17 青海芬陀利华生物科技有限公司 Gptx-1毒素及其应用
US20230374084A1 (en) 2020-09-23 2023-11-23 Aldevron, Llc Potent and selective inhibitors of nav1.7
CN113429463B (zh) * 2021-05-18 2022-08-23 湖南百尔泰克生物医药有限公司 一种具有镇痛作用的多肽及其应用
US20230382910A1 (en) 2022-04-22 2023-11-30 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Heteroaryl compounds for the treatment of pain
US20230373925A1 (en) 2022-04-22 2023-11-23 Vertex Pharma Heteroaryl compounds for the treatment of pain
WO2023205465A1 (en) 2022-04-22 2023-10-26 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Heteroaryl compounds for the treatment of pain
WO2023205468A1 (en) 2022-04-22 2023-10-26 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Heteroaryl compounds for the treatment of pain

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2008000011A (ja) * 2006-06-20 2008-01-10 National Institute Of Advanced Industrial & Technology カルシウムチャネルを遮断するグラモストラ・スパチュラタ由来のポリペプチドおよびその遺伝子
WO2010104114A1 (ja) * 2009-03-10 2010-09-16 独立行政法人産業技術総合研究所 ポリペプチドライブラリーを調製する方法
WO2011033358A2 (en) * 2009-09-15 2011-03-24 Biosearch (2007) Ltd Novel peptides isolated from spider venom, and uses thereof

Family Cites Families (129)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3691016A (en) 1970-04-17 1972-09-12 Monsanto Co Process for the preparation of insoluble enzymes
CA1023287A (en) 1972-12-08 1977-12-27 Boehringer Mannheim G.M.B.H. Process for the preparation of carrier-bound proteins
US4351337A (en) 1973-05-17 1982-09-28 Arthur D. Little, Inc. Biodegradable, implantable drug delivery device, and process for preparing and using the same
US3941763A (en) 1975-03-28 1976-03-02 American Home Products Corporation PGlu-D-Met-Trp-Ser-Tyr-D-Ala-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2 and intermediates
US4195128A (en) 1976-05-03 1980-03-25 Bayer Aktiengesellschaft Polymeric carrier bound ligands
US4083368A (en) 1976-09-01 1978-04-11 Freezer Winthrop J Inhaler
US4330440A (en) 1977-02-08 1982-05-18 Development Finance Corporation Of New Zealand Activated matrix and method of activation
CA1093991A (en) 1977-02-17 1981-01-20 Hideo Hirohara Enzyme immobilization with pullulan gel
US4229537A (en) 1978-02-09 1980-10-21 New York University Preparation of trichloro-s-triazine activated supports for coupling ligands
US5002936A (en) 1985-04-12 1991-03-26 Seymour Lieberman Lipophilic complexes of pharmacologically active inorganic mineral acid esters of organic compounds
US5206344A (en) 1985-06-26 1993-04-27 Cetus Oncology Corporation Interleukin-2 muteins and polymer conjugation thereof
US4925673A (en) 1986-08-18 1990-05-15 Clinical Technologies Associates, Inc. Delivery systems for pharmacological agents encapsulated with proteinoids
EP0281604B1 (en) 1986-09-02 1993-03-31 Enzon Labs Inc. Single polypeptide chain binding molecules
US5260203A (en) 1986-09-02 1993-11-09 Enzon, Inc. Single polypeptide chain binding molecules
US4946778A (en) 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
AU607172B2 (en) 1986-12-22 1991-02-28 Cygnus, Inc. Diffusion matrix for transdermal drug administration
US4906169A (en) 1986-12-29 1990-03-06 Rutgers, The State University Of New Jersey Transdermal estrogen/progestin dosage unit, system and process
US5023084A (en) 1986-12-29 1991-06-11 Rutgers, The State University Of New Jersey Transdermal estrogen/progestin dosage unit, system and process
US4849224A (en) 1987-11-12 1989-07-18 Theratech Inc. Device for administering an active agent to the skin or mucosa
US4983395A (en) 1987-11-12 1991-01-08 Theratech Inc. Device for administering an active agent to the skin or mucosa
US4847325A (en) 1988-01-20 1989-07-11 Cetus Corporation Conjugation of polymer to colony stimulating factor-1
EP0387319B1 (en) 1988-07-23 1996-03-06 Delta Biotechnology Limited Secretory leader sequences
US4925677A (en) 1988-08-31 1990-05-15 Theratech, Inc. Biodegradable hydrogel matrices for the controlled release of pharmacologically active agents
US4994439A (en) 1989-01-19 1991-02-19 California Biotechnology Inc. Transmembrane formulations for drug administration
US5166322A (en) 1989-04-21 1992-11-24 Genetics Institute Cysteine added variants of interleukin-3 and chemical modifications thereof
DE3920358A1 (de) 1989-06-22 1991-01-17 Behringwerke Ag Bispezifische und oligospezifische, mono- und oligovalente antikoerperkonstrukte, ihre herstellung und verwendung
US5013556A (en) 1989-10-20 1991-05-07 Liposome Technology, Inc. Liposomes with enhanced circulation time
US5171264A (en) 1990-02-28 1992-12-15 Massachusetts Institute Of Technology Immobilized polyethylene oxide star molecules for bioapplications
US6552170B1 (en) 1990-04-06 2003-04-22 Amgen Inc. PEGylation reagents and compounds formed therewith
JP3051145B2 (ja) 1990-08-28 2000-06-12 住友製薬株式会社 新規なポリエチレングリコール誘導体修飾ペプチド
US5252714A (en) 1990-11-28 1993-10-12 The University Of Alabama In Huntsville Preparation and use of polyethylene glycol propionaldehyde
CA2082951C (en) 1991-03-15 1999-12-21 Robert M. Platz Pulmonary administration of granulocyte colony stimulating factor
EP0575545B1 (en) 1991-03-15 2003-05-21 Amgen Inc. Pegylation of polypeptides
AU3178993A (en) 1991-11-25 1993-06-28 Enzon, Inc. Multivalent antigen-binding proteins
US5792451A (en) 1994-03-02 1998-08-11 Emisphere Technologies, Inc. Oral drug delivery compositions and methods
JPH0640945A (ja) 1992-07-23 1994-02-15 Kureha Chem Ind Co Ltd Ｆｃフラグメント結合抗腫瘍剤
AU5171293A (en) 1992-10-14 1994-05-09 Regents Of The University Of Colorado, The Ion-pairing of drugs for improved efficacy and delivery
US5346701A (en) 1993-02-22 1994-09-13 Theratech, Inc. Transmucosal delivery of macromolecular drugs
US5514774A (en) 1993-06-29 1996-05-07 University Of Utah Research Foundation Conotoxin peptides
US5432155A (en) 1993-06-29 1995-07-11 The Salk Institute For Biological Studies Conotoxins I
US5460820B1 (en) 1993-08-03 1999-08-03 Theratech Inc Method for providing testosterone and optionally estrogen replacement therapy to women
US6342225B1 (en) 1993-08-13 2002-01-29 Deutshces Wollforschungsinstitut Pharmaceutical active conjugates
US5643575A (en) 1993-10-27 1997-07-01 Enzon, Inc. Non-antigenic branched polymer conjugates
US5919455A (en) 1993-10-27 1999-07-06 Enzon, Inc. Non-antigenic branched polymer conjugates
US5446090A (en) 1993-11-12 1995-08-29 Shearwater Polymers, Inc. Isolatable, water soluble, and hydrolytically stable active sulfones of poly(ethylene glycol) and related polymers for modification of surfaces and molecules
CA2184002A1 (en) 1994-02-23 1995-08-31 Jeffrey M. Blaney Method and compositions for increasing the serum half-life of pharmacologically active agents
FR2717688B1 (fr) 1994-03-28 1996-07-05 Lhd Lab Hygiene Dietetique Système matriciel transdermique d'administration d'un oestrogène et/ou un progestatif à base d'EVA.
US5824784A (en) 1994-10-12 1998-10-20 Amgen Inc. N-terminally chemically modified protein compositions and methods
WO1996019205A1 (en) 1994-12-21 1996-06-27 Theratech, Inc. Transdermal delivery system with adhesive overlay and peel seal disc
MX9704550A (es) 1994-12-22 1997-10-31 Astra Ab Formulaciones de medicamentos en aerosol.
US5932462A (en) 1995-01-10 1999-08-03 Shearwater Polymers, Inc. Multiarmed, monofunctional, polymer for coupling to molecules and surfaces
US5739277A (en) 1995-04-14 1998-04-14 Genentech Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US6096871A (en) 1995-04-14 2000-08-01 Genentech, Inc. Polypeptides altered to contain an epitope from the Fc region of an IgG molecule for increased half-life
US5776896A (en) 1996-01-03 1998-07-07 Zeneca Limited Analgesic peptides from venom of grammostola spatulata and use thereof
US5756663A (en) 1996-01-03 1998-05-26 Zeneca Limited Antiarrhythmic peptide from venom of spider Grammostola spatulata
EP0904107B1 (en) 1996-03-18 2004-10-20 Board Of Regents, The University Of Texas System Immunoglobin-like domains with increased half lives
US5783208A (en) 1996-07-19 1998-07-21 Theratech, Inc. Transdermal drug delivery matrix for coadministering estradiol and another steroid
US6077680A (en) 1996-11-27 2000-06-20 The University Of Florida ShK toxin compositions and methods of use
US6689749B1 (en) 1996-12-19 2004-02-10 Suntory Limited Neuropeptides originating in scorpion
US6548644B1 (en) 1997-03-10 2003-04-15 Immunex Corporation Site protected protein modification
US5990237A (en) 1997-05-21 1999-11-23 Shearwater Polymers, Inc. Poly(ethylene glycol) aldehyde hydrates and related polymers and applications in modifying amines
JP3530004B2 (ja) 1998-02-06 2004-05-24 株式会社日立ユニシアオートモティブ 吸入式投薬器
US6022952A (en) 1998-04-01 2000-02-08 University Of Alberta Compositions and methods for protein secretion
US6451986B1 (en) 1998-06-22 2002-09-17 Immunex Corporation Site specific protein modification
AUPP589598A0 (en) 1998-09-14 1998-10-08 University Of Queensland, The Novel peptides
US6660843B1 (en) 1998-10-23 2003-12-09 Amgen Inc. Modified peptides as therapeutic agents
CA2350226C (en) 1998-11-20 2012-04-24 Fuso Pharmaceutical Industries, Ltd. Protein expression vector and utilization thereof
WO2000038652A1 (en) 1998-12-23 2000-07-06 Amgen Inc. Polyol/oil suspensions for the sustained release of proteins
US6245740B1 (en) 1998-12-23 2001-06-12 Amgen Inc. Polyol:oil suspensions for the sustained release of proteins
JP2002538841A (ja) 1999-03-18 2002-11-19 ヒューマン ジノーム サイエンシーズ， インコーポレイテッド ２７個のヒト分泌タンパク質
US6887470B1 (en) 1999-09-10 2005-05-03 Conjuchem, Inc. Protection of endogenous therapeutic peptides from peptidase activity through conjugation to blood components
DE1252330T1 (de) 1999-11-26 2003-11-27 Univ Montreal Mcgill Loci der idiopathischen epilepsie, mutationen derselben und verfahren zu deren verwendung zur feststellung, prognose und behandlung von epilepsie
WO2001055317A2 (en) 2000-01-31 2001-08-02 Human Genome Sciences, Inc. Nucleic acids, proteins, and antibodies
WO2001062827A2 (en) 2000-02-22 2001-08-30 Shearwater Corporation N-maleimidyl polymer derivatives
SE0000935D0 (sv) 2000-03-21 2000-03-21 Astrazeneca Ab An inhalation device
US7125847B1 (en) 2000-04-07 2006-10-24 The Research Foundation Of State University Of New York At Buffalo Mechanically activated channel blocker
CN1133461C (zh) 2000-04-11 2004-01-07 厦门北大之路生物工程有限公司 虎纹捕鸟蜘蛛毒素提取物在制备镇痛药物中的应用
AU2001266557A1 (en) 2000-04-12 2001-10-23 Human Genome Sciences, Inc. Albumin fusion proteins
ATE301190T1 (de) 2000-05-10 2005-08-15 Centre Nat Rech Scient Protonen-abhängiges na+kanal hemmendes polypeptid
EP1177806A1 (en) 2000-08-04 2002-02-06 The Technology Partnership Public Limited Company Dry powder inhaler
GB0021617D0 (en) 2000-09-02 2000-10-18 Imp College Innovations Ltd Diagnosis and treatment of cancer
JP5013152B2 (ja) 2001-02-28 2012-08-29 株式会社ビーエムジー 蛋白質複合体形成剤
AU2002335930B2 (en) 2001-03-09 2005-07-28 Morphosys Ag Serum albumin binding moieties
US20050054051A1 (en) 2001-04-12 2005-03-10 Human Genome Sciences, Inc. Albumin fusion proteins
EP1377680B1 (en) 2001-04-12 2011-10-05 Imperial Innovations Limited Diagnosis and treatment of breast cancer based upon scn5a
GB0120238D0 (en) 2001-08-20 2001-10-10 Univ College Of London Sodium channel regulators and modulators
JP4850390B2 (ja) 2001-10-19 2012-01-11 アイデックス ラボラトリーズ インコーポレイテッド 薬理学的に活性な化合物の制御送達のための注射用組成物
US6900317B2 (en) 2002-02-19 2005-05-31 Boehringer Ingelheim Pharma Gmbh & Co. Kg Salts of the CGRP antagonist BIBN4096 and inhalable powdered medicaments containing them
AU2003219933A1 (en) 2002-02-25 2003-09-09 Vanderbilt University Expression system for human brain-specific voltage-gated sodium channel, type 1
US20030191056A1 (en) 2002-04-04 2003-10-09 Kenneth Walker Use of transthyretin peptide/protein fusions to increase the serum half-life of pharmacologically active peptides/proteins
KR101138643B1 (ko) 2002-05-30 2012-04-26 더 스크립스 리서치 인스티튜트 구리 촉매 작용하에서의 아지드와 아세틸렌과의 리게이션
GB0219512D0 (en) 2002-08-21 2002-10-02 Norton Healthcare Ltd Inhalation compositions with high drug ratios
ATE447025T1 (de) 2003-03-26 2009-11-15 Pharmadesign Inc Ionenkanalaktivität hemmende niedrigmolekulare peptide
DE602004011770T2 (de) 2003-06-12 2009-02-05 Eli Lilly And Co., Indianapolis Fusionsproteine
MXPA06001494A (es) 2003-08-05 2007-05-11 Vertex Pharma Compuestos de piramidina condensados como inhibidores de canales ionicos gatillados por tension.
US7615563B2 (en) 2003-08-08 2009-11-10 Gonzalez Iii Jesus E Compositions useful as inhibitors of voltage-gated sodium channels
TW200524888A (en) 2003-08-08 2005-08-01 Vertex Pharma Compositions useful as inhibitors of voltage-gated ion channels
US7125908B2 (en) 2003-08-29 2006-10-24 Allergan, Inc. Treating pain using selective antagonists of persistent sodium current
US7060723B2 (en) 2003-08-29 2006-06-13 Allergan, Inc. Treating neurological disorders using selective antagonists of persistent sodium current
EP1711517A4 (en) 2004-01-21 2008-02-13 Univ Utah Res Found MUTANT SODIUM CHANNEL NAv1.7 AND ASSOCIATED METHODS
WO2005118614A1 (en) 2004-04-08 2005-12-15 Avigen, Inc. Methods and compositions for treating neuropathic pain
CN1997356A (zh) 2004-04-23 2007-07-11 安姆根有限公司 持续释放制剂
WO2006000116A1 (de) 2004-06-23 2006-01-05 Huber+Suhner Ag Breitband-patchantenne
GB0414272D0 (en) 2004-06-25 2004-07-28 Cellpep Sa OsK1 derivatives
WO2006014493A2 (en) 2004-07-07 2006-02-09 The Research Foundation Of State University Of New York Stor Mechanically activated channel blocker
EA011879B1 (ru) 2004-09-24 2009-06-30 Эмджин Инк. МОЛЕКУЛЫ С МОДИФИЦИРОВАННЫМ Fc ФРАГМЕНТОМ
EP2474316B1 (en) 2004-10-07 2016-04-06 The Regents of The University of California Analogs of shk toxin and their uses in selective inhibition of kv1.3 potassium channels
EP1809290A2 (en) 2004-11-03 2007-07-25 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Pyrimidine derivatives as ion channel modulators and methods of use
US20060199812A1 (en) 2005-01-24 2006-09-07 Amgen Inc. Method of conjugating aminothiol containing molecules to vehicles
US7531523B2 (en) 2005-02-17 2009-05-12 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Sodium channel protein type III alpha-subunit splice variant
US7833979B2 (en) 2005-04-22 2010-11-16 Amgen Inc. Toxin peptide therapeutic agents
GB0517487D0 (en) 2005-08-26 2005-10-05 Isis Innovation Antibodies
US7972813B2 (en) 2005-09-30 2011-07-05 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Tetrodotoxin-resistant sodium channel alpha subunit
US20120087969A1 (en) 2005-11-08 2012-04-12 Centre National De La Recherche Scientifique (C.N.R.S.) Mu-Conotoxin Peptides and Use Thereof as a Local Anesthetic
WO2007109324A2 (en) 2006-03-21 2007-09-27 Xenon Pharmaceuticals, Inc. Potent and selective nav 1.7 sodium channel blockers
EP2628749A3 (en) 2006-06-20 2013-12-04 Los Angeles Biomedical Research Institute at Harbor-UCLA Medical Center Antimicrobial kinocidin compostions and methods of use
US7825093B2 (en) * 2006-10-25 2010-11-02 Amgen Inc. Methods of using OSK1 peptide analogs
US8183221B2 (en) 2007-09-05 2012-05-22 Medtronic, Inc. Suppression of SCN9A gene expression and/or function for the treatment of pain
CN101480393A (zh) * 2008-01-07 2009-07-15 云南昊邦制药有限公司 草乌甲素作为制备治疗Nav1.7疼痛病症药物的应用
WO2009097530A2 (en) 2008-01-30 2009-08-06 Baylor College Of Medicine Peptides that target dorsal root ganglion neurons
ES2640817T3 (es) 2009-02-02 2017-11-06 Chromocell Corporation Líneas celulares que expresan Nav y métodos para su utilización
JPWO2010104115A1 (ja) * 2009-03-10 2012-09-13 独立行政法人産業技術総合研究所 膜タンパク質を特異的に認識するポリペプチドの調製方法
MX347291B (es) 2009-03-20 2017-04-17 Amgen Inc Inmunoglobulinas portadoras y usos de las mismas.
WO2011051350A1 (en) 2009-10-27 2011-05-05 Ucb Pharma S.A. Function modifying nav 1.7 antibodies
GB0922434D0 (en) 2009-12-22 2010-02-03 Ucb Pharma Sa antibodies and fragments thereof
GB0922435D0 (en) 2009-12-22 2010-02-03 Ucb Pharma Sa Method
US8871996B2 (en) 2010-06-09 2014-10-28 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Mice expressing human voltage-gated sodium channels
US9279003B2 (en) 2010-07-07 2016-03-08 Purdue Pharma L.P. Analogs of sodium channel peptide toxin
EP3973981A1 (en) 2012-05-18 2022-03-30 Janssen Biotech, Inc. Huwentoxin-iv variants and methods of use

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2008000011A (ja) * 2006-06-20 2008-01-10 National Institute Of Advanced Industrial & Technology カルシウムチャネルを遮断するグラモストラ・スパチュラタ由来のポリペプチドおよびその遺伝子
WO2010104114A1 (ja) * 2009-03-10 2010-09-16 独立行政法人産業技術総合研究所 ポリペプチドライブラリーを調製する方法
WO2011033358A2 (en) * 2009-09-15 2011-03-24 Biosearch (2007) Ltd Novel peptides isolated from spider venom, and uses thereof

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
MOLECULAR PHARMACOLOGY, vol. 69, no. 2, JPN6017026242, 2006, pages 419 - 429, ISSN: 0003766835 *
TOXICON, vol. 58, JPN6017026241, 2011, pages 265 - 276, ISSN: 0003598959 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN103930437A (zh) 2014-07-16
EP2686340A2 (en) 2014-01-22
US9796766B2 (en) 2017-10-24
JP2014509859A (ja) 2014-04-24
PE20140593A1 (es) 2014-05-10
CL2013002673A1 (es) 2014-07-25
MX2013010497A (es) 2013-12-16
HK1198173A1 (en) 2015-03-13
TW201300407A (zh) 2013-01-01
AU2012228990A1 (en) 2013-09-19
AR088413A1 (es) 2014-06-11
ZA201306920B (en) 2014-05-28
SG10201601789TA (en) 2016-04-28
US20160304570A1 (en) 2016-10-20
US20140073577A1 (en) 2014-03-13
AU2012228990B2 (en) 2017-04-06
UY33959A (es) 2012-09-28
NZ615242A (en) 2016-03-31
US9340590B2 (en) 2016-05-17
EA201391331A1 (ru) 2014-02-28
BR112013023674A2 (pt) 2016-12-13
CR20130533A (es) 2014-01-09
WO2012125973A3 (en) 2013-01-03
CO6821886A2 (es) 2013-12-31
AP2013007173A0 (en) 2013-10-31
KR20140145947A (ko) 2014-12-24
MA35385B1 (fr) 2014-09-01
SG193434A1 (en) 2013-10-30
CA2830065A1 (en) 2012-09-20
WO2012125973A2 (en) 2012-09-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US9796766B2 (en) Potent and selective inhibitors of NAV1.3 and NAV1.7
JP5220915B2 (ja) 延長された血液半減期を有するトキシンペプチド
US10344060B2 (en) Potent and selective inhibitors of Nav1.7
AU2010226392B9 (en) Selective and potent peptide inhibitors of Kv1.3
US7820623B2 (en) Conjugated toxin peptide therapeutic agents
US9636418B2 (en) Potent and selective inhibitors of NAV1.7
CN101232903A (zh) 具有延长的血液半衰期的毒素肽
NZ615242B2 (en) Potent and selective inhibitors of nav1.3 and nav1.7
Murray et al. Potent and selective inhibitors of NA V 1.7

Legal Events

Date Code Title Description
A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20170718

A02 Decision of refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02

Effective date: 20180403