CN101232903A - 具有延长的血液半衰期的毒素肽 - Google Patents

Abstract

公开了式(X¹)_a－(F¹)_d－(X²)_b－(F²)_e－(X³)_c式的组合物及其多聚体，其中：F¹和F²是延长半衰期的部分，并且d和e各自独立地是0或1，前提是d和e中的至少一个是1；X¹、X²和X³各自独立地是－(L)_f－P－(L)_g－，并且f和g各自独立地是0或1；P是长度不超过约80个氨基酸残基的毒素肽，包含至少两个肽内二硫键；L是任选的接头；并且a、b和c各自独立地是0或1，前提是a、b和c中的至少一个是1。与延长半衰期的部分的连接增加了原本会迅速降解的毒素肽的体内半衰期。公开了包含上述组合物和药学接受载体的药物组合物。也公开了编码本发明的组合物的DNA、包含所述DNA的表达载体和包含所述表达载体的宿主细胞。也公开了治疗例如但不限于多发性硬化、1型糖尿病、牛皮癣、炎性肠病、接触介导的皮炎、类风湿关节炎、牛皮癣关节炎、哮喘、过敏、再狭窄、系统性硬化、纤维化、硬皮病、肾小球肾炎、干燥综合征、炎症性骨重吸收、移植物排斥、移植物抗宿主疾病和狼疮的自身免疫病的方法，和预防或减轻多发性硬化的症状复发的方法。

Description

具有延长的血液半衰期的毒素肽

本申请要求2006年4月17日提交的美国非临时申请(序列号未定)的优先权，该非临时申请要求2005年4月22日提交的美国临时申请No.60/672,342的优先权，在此引入这两个申请作为参考。

本申请通过引用的方式引入了磁盘上包含的所有主题，该磁盘文件建立于2006年4月17日，文件名为A-1006.ST25.txt，大小为744KB。

在本申请中，在圆括号或方括号引用了多个公开文件。在本申请中全文引入这些公开文件的公开内容作为参考，以便更完整描述本发明所属领域的状况。

                         发明背景

1.发明领域

本发明涉及生物化学领域，特别涉及治疗性肽和缀合物。

2.相关领域的讨论

离子通道是一组多样的分子，它们允许小的无机离子通过膜交换。所有细胞的功能都需要离子通道，但对于可以兴奋的细胞如存在于神经系统和心脏中的细胞来说尤其如此。通过离子通道协调的电信号控制思考中的脑、跳动的心脏和收缩的肌肉。离子通道在调节细胞体积中起重要作用，并且它们控制多种信号传递过程。

离子通道家族包括Na⁺、K⁺和Ca²⁺阳离子以及Cl^-阴离子通道。离子通道统一区分为配体门控的或电压门控的。配体门控的通道包括细胞外和细胞内配体门控的通道。细胞外配体门控的通道包括烟碱乙酰胆碱受体(nAChR)、血清素(5-羟色胺，5-HT)受体、甘氨酸和γ-受体(GABA)，以及谷氨酸激活的通道，包括kanate、α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异唑丙酸(AMPA)和N-甲基-D-天冬氨酸受体(NMDA)受体。(Harte and Ouzounis(2002)，FEBS Lett.514：129-34)。细胞内配体门控的通道包括由环状核苷酸(如cAMP、cGMP)、Ca²⁺和G蛋白激活的那些(Harte and Ouzounis(2002)，FEBS Lett.514：129-34)。电压门控的通道通过它们对无机离子种类的选择性而分类，包括钠、钾、钙和氯离子通道。(Harte and Ouzounis(2002)，FEBS Lett.514：129-34)。

最近提出了对电压门控的通道的统一分类名系统。(Catterall et al.(2000)，Pharmacol.Rev.55：573-4；Gutman et al.(2000)，Pharmacol. Rev.55，583-6；Catterall et al.(2000)Pharmacol.Rev.55：579-81；Catterall et al.(2000)，Pharmacol.Rev.55：575-8；Hofmann et al.(2000)，Pharmacol.Rev.55：587-9；Clapham et al.(2000)，Pbarmacol Rev.55：591-6；Chandy(1991)，Nature 352：26；Goldin et al.(2000)，Neuron 28：365-8；Ertel et al.(2000)，Neuron 25：533-5)。

K⁺通道构成了目前描述的最大和最佳表征的离子通道家族。钾通道细分为三个大组：6次跨膜(6TM)K⁺通道、2TM-2TM/渗漏K⁺通道和2TM/Kir内向整流通道(Tang et al.(2004)，Ann.Rev.Physiol.66，131-159)。这三组基于序列相似性进一步细分为家族。电压门控的K⁺通道，包括(Kv1-6，Kv8-9)，EAG，KQT和Slo(BKCa)，是6TM组的家族成员。2TM-2TM组包括TWIK，TREK，TASK，TRAAK和THIK，而2TM/Kir组由Kir1-7组成。两类额外的离子通道包括内向整流钾(IRK)通道和ATP门控的嘌呤能(P2X)通道。(Harte and Ouzounis(2002)，FEBS Lett.514：129-34)。

多种生物产生的毒素肽进化至靶定离子通道。蛇、蝎子、蜘蛛、蜜蜂、蜗牛和海葵是产生特定毒液的生物的一些实例，该毒液能够作为小的生物活性毒素肽或有效并且选择性靶定离子通道和受体的“毒素”的丰富来源。大多数情况下，这些毒素肽通过结合通道孔并且物理阻断离子传导途径而进化为离子通道的有效拮抗剂或抑制剂。在一些其它情况下，对于一些鸟蛛毒素肽，发现该肽通过结合孔外的区域(如电压传感器结构域)而拮抗通道功能。

毒素肽的长度通常是约20-约80个氨基酸残基，含有2-5个二硫键，并且形成非常致密的结构(参见例如图10)。已经分离了毒素肽(如分离自蝎子、海葵和芋螺)，并且表征了它们对离子通道的影响。所述肽似乎从相对小量的结构构架进化而来，所述结构构架特别适于解决效力和稳定性的关键问题。例如，蝎子和芋螺毒素肽的大多数含有10-40个氨基酸和最多5个二硫键，形成非常致密和受限制的结构(微蛋白)，其通常抗蛋白水解。芋螺毒素和蝎子毒素肽可以基于它们的二硫键连接和肽折叠分为一些超家族。很多所述毒素肽的溶液结构已经通过NMR质谱得到确定，表明它们的致密结构并且证实了它们的家族折叠的保持。(如Tudor et al.Ionisation behaviour and solution properties of thepotassium-channel blocker ShK toxin，Eur.J.Biochem.251(1-2)：133-41(1998)；Pennington et al.Role of disulfide bonds in the structure andpotassium channel blocking activity of ShK toxin，Biochem.38(44)：14549-58(1999)；Jaravine et al.Three-dimensional structure of toxin OSK1from Orthochirus scrobiculosus scorpion venom，Biochem.36(6)：1223-32(1997)；del Rio-Portillo et al.NMR solution structure of Cn12，a novel peptide from the Mexican scorpion Centruroides noxius with atypical beta-toxin sequence but with alpha-like physiological activity，Eur.J.Biochem.271(12)：2504-16(2004)；Prochnicka-Chalufouret al.Solution structure of discrepin，a new K+-channel blocking peptidefrom the alpha-KTx15 subfamily，Biochem.45(6)：1795-1804(2006))。

保守的二硫化物结构也可以反映毒素家族的个体药理学活性(Nicke et al.(2004)，Eur.J.Biochem.271：2305-19，表1；Adams(1999)，Drug Develop.Res.46：219-34)。例如，α-芋螺毒素具有明确的4个半胱氨酸/2个二硫环结构(Loughnan，2004)，并且抑制烟碱乙酰胆碱受体。相反，ω-芋螺毒素具有6个半胱氨酸/3个二硫环共有结构(Nielsen，2000)，并且阻断钙通道。毒素的结构亚型进化为抑制电压门控的通道或钙激活的钾通道。图9显示了一些产生毒液的动物，从蜜蜂到蜗牛和蝎子到蛇所共有的有限数目的保守二硫化物结构，其靶定离子通道。图7显示了α-蝎子毒素家族的比对，表明用保守的结构构架衍生靶定大量钾通道的毒素。

由于对特定离子通道的有效和选择性的阻断，多年来已经将毒素肽用作研究离子通道药理学的工具。除了心脏、肌肉和脑中存在的可兴奋的细胞和组织外，离子通道对于不可兴奋的细胞如免疫细胞也是重要的。因此，已经考虑了毒素肽用于治疗多种免疫病症的潜在治疗用途，特别是通过抑制钾通道，如Kv1.3和IKCal，因为这些通道间接控制淋巴细胞中的钙信号传递途径[如Kem et al.ShK toxin compositions andmethods of use，美国专利No.6,077,680；Lebrun et al.Neuropeptidesoriginating in scorpion，美国专利No.6,689,749；Beeton et al.Targetingeffector memory T cells with a selective peptide inhibitor of Kv1.3channnels for therapy of autoimmune diseases，Molec.Pharmacol.67(4)：1369-81(2005)；Mouhat et al.K⁺ channel types targeted bysynthetic OSK1，a toxin from Orthochirus scrobiculosus scorpion venom，Biochem.J.385：95-104(2005)；Mouhat et al.Pharmacological profilingof Orthochirus scrobiculosus toxin 1 analogs with a trimmed N-terminaldomain，Molec.Pharmacol.69：354-62(2006)；Mouhat et al.OsK1derivatives，WO 2006/002850 A2；B.S.Jensen et al.The Ca²⁺-activatedK+Channel of Intermediate Conductance：A Molecular Target forNovel Treatments？，Current Drug Targets 2：401-422(2001)；Rauer etal.Structure-guided Transformation of卡律蝎毒素Yields an AnalogThat Selectively Targets Ca²⁺-activated over Voltage-gated K⁺Channels，J.Biol.Chem.275：1201-1208(2000)；Castle et al.Maurotoxin：A Potent Inhibitor of Intermediate Conductance Ca²⁺-Activated PotassiumChannels，Molecular Pharmacol.63：409-418(2003)；Chandy et al.K⁺channels as targets for specific Immunomodulation，Trends in Pharmacol.Sciences 25：280-289(2004)；Lewis & Garcia，Therapeutic Potential ofVenom Peptides，Nat.Rev.Drug Discov.2：790-802(2003)]。

也已经开发了T细胞中的Kv1.3和IKCa1钾通道和主要钙进入通道的抑制剂CRAC，用于治疗免疫病症[A.Schmitz et al.(2005)Molecul.Pharmacol.68，1254；K.G.Chandy et al.(2004)TIPS 25，280；H.Wulffet al.(2001)J.Biol.Chem.276，32040；C.Zitt et al.(2004)J.Biol.Chem.279，12427]，但获得对这些靶中的一些具有选择性的小分子是困难的。

已知淋巴细胞中的钙动员是激活炎症反应的关键途径[M.W.Winslow et al.(2003)Current Opinion Immunol.15，299]。与其它细胞相比，T细胞显示出对细胞内钙的水平增加的独特敏感性，并且，离子通道直接和间接控制该过程。三磷酸肌醇(IP3)是天然的第二信使，其激活钙信号传递途径。IP3在配体诱导的T细胞受体(TCR)激活后产生，在结合于其细胞内受体(一种通道)后导致细胞内钙储存的卸载。内质网提供了一种关键的钙储存。毒胡萝卜素，即肌浆-内质网钙ATP酶(SERCA)的一种抑制剂，也导致淋巴细胞中的细胞内储存物的卸载和钙信号传递途径的激活。因此，毒胡萝卜素可以用作T细胞中钙信号传递途径的特异性刺激物。认为T细胞中的细胞内钙储存的卸载导致细胞表面上的钙通道激活，这使得钙能够从细胞外流入细胞内。T细胞上的这种储存物操作的钙通道(SOCC)称作“CRAC”(钙释放激活的通道)，并且已知通过该通道进行的钙的持续流入对于完全的T细胞激活是关键的[S.Feske et al.(2005)J.Exp.Med.202，651 and N.Venkatesh et al.(2004)PNAS 101，8969]。很多年以来，认为为了维持钙持续流入T细胞，细胞膜必须通过钾离子流出而保持在超极化状态。在T细胞中，通过电压门控的钾通道Kv1.3和钙激活的钾通道IKCa1完成钾流出[K.G.Chandy et al.(2004)TIPS 25，280]。因此，通过使得钙能够经CRAC持续流入的必要钾流出，这些钾通道间接控制钙信号传递途径。

细胞内钙的持续增加，激活T细胞中的多个途径，包括导致NFAT、NF-kB和AP-1激活的那些途径[Quintana-A(2005)Pflugers Arch.-Eur.J.Physiol.450，1]。这些事件导致多种T细胞应答，包括改变细胞大小和膜组织、激活细胞表面效应物分子、细胞因子产生和增殖。一些钙传感分子传递钙信号，并且协调细胞应答。钙调蛋白是一种结合钙的分子，但也已经鉴定了很多其它分子(M.J.Berridge et al.(2003)Nat.Rev.Mol.Cell.Biol.4，517)。在细胞内钙持续增加并且使胞质溶胶NFAT去磷酸化后，激活钙-钙调蛋白依赖性磷酸酶，即钙依赖磷酸酶。去磷酸化的NFAT迅速易位到细胞核，并且广泛接受为T细胞激活的关键转录因子(F.Macian(2005)Nat.Rev.Immunol.5，472 and N.Venkatesh et al.(2004)PNAS 101，8969)。钙依赖磷酸酶的抑制剂，如环孢菌素A(Neoral，SandImmune)和FK506(藤霉素)是用于治疗严重免疫病症如实体器官移植后排斥导致的免疫病症的主要支柱(I.M.Gonzalez-Pinto et al.(2005)Transplant.Proc.37，1713 and D.R.J.Kuypers(2005)Transplant International 18，140)。已经批准Neoral用于治疗移植物排斥、严重类风湿关节炎(D.E.Yocum et al.(2000)Rheumatol.39，156)和严重牛皮癣(J.Koo(1998)British J.Dermatol.139，88)。也提供了临床前和临床数据，表明钙依赖磷酸酶抑制剂可能用于治疗炎性肠病(IBD；Baumgart DC(2006)Am.J.Gastroenterol.Mar 30；Epub ahead ofprint)、多发性硬化(Ann.Neurol.(1990)27，591)和哮喘(S.Rohatagiet al.(2000)J.Clin.Pharmacol.40，1211)。狼疮代表了可能从阻断辅助T细胞激活的试剂获益的另一种病症。尽管钙依赖磷酸酶在调节T细胞中的NFAT中具有重要性，钙依赖磷酸酶也在其它组织(如肾)中表达，并且环孢菌素A和FK506由于基于代谢的毒性，具有窄的安全限。肾毒性和高血压是限制环孢菌素和FK506的前景的常见副作用。出于对毒性的考虑，钙依赖磷酸酶抑制剂最常用于仅仅治疗严重免疫疾病(Bissonnette-R et al.(2006)J.Am.Acad.Dermatol.54，472)。Kv1.3抑制剂提供了对用于治疗免疫病症的钙依赖磷酸酶抑制剂的更安全的替代方案。这是因为Kv1.3也操作控制T细胞中的钙信号传递途径，但确实通过与钙依赖磷酸酶抑制剂不同的机理，并且，Kv1.3表达和功能的证据表明，Kv1.3相对于钙依赖磷酸酶在T细胞生物学中具有更受限制的作用，钙依赖磷酸酶也在多种非淋巴细胞和组织中起作用。

免疫细胞中的钙动员也激活细胞因子白介素2(IL-2)和干扰素γ(IFNg)的产生，它们是炎症的关键介质。IL-2诱导从CD4⁺和CD8⁺T细胞的扩增和分化到B细胞的增殖和抗体分泌的多种生物反应，从而激活NK细胞[S.L Gaffen & K.D.Liu(2004)Cytokine 28，109]。IL-2的分泌在T细胞激活后迅速发生，并且T细胞代表该细胞因子的主要来源。激活后不久，高亲和力IL-2受体(IL2-R)在T细胞上上调，赋予它们反应于IL-2而增殖的能力。T细胞、NK细胞、B细胞和专门的抗原呈递细胞(APCs)都可以在激活后分泌IFNg。T细胞代表获得性免疫应答介导中的IFNg产生的主要来源，而天然杀伤(NK)细胞和APCs很可能是抗感染的宿主防御过程中的重要来源[K.Schroder et al.(2004)J.Leukoc.Biol.75，163]。IFNg最初称作巨噬细胞激活因子，它上调单核细胞、巨噬细胞和树突细胞的抗原加工和呈递。IFNg介导很多细胞类型中的多种生物活性[U.Boehm et al.(1997)Annu.Rev.Immunol.15，749]，包括生长和分化、NK细胞活性的增强和B细胞免疫球蛋白产生的调节，以及类型转换。

CD40L是在钙动员后在激活的T细胞上表达的另一种细胞因子，在结合于B细胞上的其受体后，提供关键辅助，使得B细胞生发中心形成、B细胞分化和抗体同种型转化得以实现。B细胞上CD40的CD40L介导的激活可以诱导生产免疫球蛋白(Ig)的B细胞的显著分化和克隆扩增[S.Quezada et al.(2004)Annu.Rev.Immunol.22，307]。CD40受体也可以存在于树突细胞上，CD40L信号传递也可以介导树突细胞激活和分化。B细胞和树突细胞的抗原呈递能力由CD40L结合促进，进一步表明该细胞因子在获得性免疫中的广泛作用。考虑到CD40信号传递对B细胞生物学的关键作用，在临床前和临床研究中检验了CD40L的中和性抗体在治疗系统性红斑狼疮(SLE)中的用途，SLE是一种特征在于抗体复合物在组织中沉积、炎症和器官损伤的病症[J.Yazdany and J Davis(2004)Lupus 13，377]。

毒素肽的产生是产生毒液的生物中的一种复杂过程，对于合成来说是一种甚至更复杂的过程。由于它们的保守二硫化物结构并且需要有效的氧化重新折叠，毒素肽给合成提出了挑战。尽管多年来已经将毒素肽用作离子通道的高度选择性药理学抑制剂，毒素肽合成和重新折叠的高花费和它们在体内的短半衰期，阻碍了这些肽作为治疗模式的尝试。与毒素肽自身相比，鉴定作为离子通道的治疗性拮抗剂的小分子抑制剂花费了远远更多的努力。一个例外是最近批准了小的ω-芋螺毒素MVIIA肽(Ziconotide^TM)用于治疗难处理的疼痛。但是，Ziconotide^TM的合成和重新折叠生产过程是昂贵的，并且仅仅得到了具有非常短的体内半衰期(约4小时)的小肽。

本发明按照愿望提供了生产治疗剂，包括但不限于离子通道抑制剂的经济的方法，其包括与运载体融合或以其它方式共价缀合的毒素肽。

                       发明概述

本发明涉及下式的组合物及其多聚体：

(X¹)_a-(F¹)_d-(X²)_b-(F²)_e-(X³)_c    (I)，

其中：

F¹和F²是延长半衰期的部分，并且d和e各自独立地是0或1，前提是d和e中的至少一个是1；

X¹、X²和X³各自独立地是-(L)_f-P-(L)_g-，并且f和g各自独立地是0或1；

P是长度不超过约80个氨基酸残基的毒素肽，包含至少两个肽内二硫键；

L是任选的接头(当f＝1和/或g＝1时存在)；并且

a、b和c各自独立地是0或1，前提是a、b和c中的至少一个是1。

因此，本发明涉及在式1上具有变异的分子，如下式所示及下述任何分子的任何多聚体：

(II)P-(L)_g-F¹(即b、c和e等于0)；

(III)F¹-(L)_f-P(即a、c和e等于0)；

(IV)P-(L)_g-F¹-(L)_f-P或(X¹)_a-F¹-(X²)_b(即c和e等于0)；

(V)F¹-(L)_f-P-(L)_g-F²(即a和c等于0)；

(VI)F¹-(L)_f-P-(L)_g-F²-(L)_f-P(即a等于0)；

(VII)F¹-F²-(L)_f-P(即a和b等于0)；

(VIII)P-(L)_g-F¹-F²(即b和c等于0)；

(IX)P-(L)_g-F¹-F²-(L)_f-P(即b等于0)；

其中肽的N末端按照常规认为在左侧。所有所述式II-IX的分子都在结构式I的含义范围内。在式I的含义范围内，如果存在一个以上的毒素肽(P)，它们可以独立地与本发明组合物中也存在的任何其它毒素肽相同或不同，并且如果存在接头部分((L)_f和/或(L)_g)，它们可以独立地与本发明组合物中可能存在的任何其它接头相同或不同。毒素肽与增强半衰期的部分的缀合可以通过毒素肽的N末端和/或C末端，或可以对于其一级氨基酸序列来说是插入的，连接F¹的位置比连接F²的位置更靠近毒素肽的N末端。有用的延长半衰期的部分(F¹或F²)包括免疫球蛋白Fc结构域、人血清白蛋白(HSA)或聚乙二醇(PEG)。这些和本文描述的其它延长半衰期的部分是单独或组合有用的。

本发明也涉及组合物，其包含缀合或未缀合的ShK、OSK1、ChTx或莫鲁蝎毒素的毒素肽类似物，它们是在天然序列的一个或多个氨基酸残基进行修饰得到的，与具有天然序列的ShK、OSK1或莫鲁蝎毒素(MTX)肽相比具有更强的Kv1.3或IKCa1拮抗剂活性。毒素肽类似物包含选自以下任何序列的氨基酸序列：

表2所示的SEQ ID NOS：88、89、92、148-200、548-561、884-949或1295-1300；或

表7所示的SEQ ID NOS：980-1274、1303或1308；或

表13所示的SEQ ID NOS：330-337、341、1301、1302、1304-1307、1309、1311、1312和1315-1336；或

表14所示的SEQ ID NOS：36、59、344-346或1369-1390。

本发明也涉及其它毒素肽类似物，它们包含选自以下任意序列的氨基酸序列：

表3所示的SEQ ID NOS：201-225；或

表4所示的SEQ ID NOS：242-248或250-260；或

表5所示的SEQ ID NOS：261-275；或

表6所示的SEQ ID NOS：276-293；或

表8所示的SEQ ID NOS：299-315；或

表9所示的SEQ ID NOS：316-318；或

表10所示的SEQ ID NO：319；或

表11所示的SEQ ID NO：327或328；或

表13所示的SEQ ID NOS：330-337、341、1301、1302、1304-1307、1309、1311、1312或1315-1336；

表14所示的SEQ ID NOS：1369-1390；或

表16所示的SEQ ID NOS：348-353；或

表19所示的SEQ ID NOS：357-362、364-368、370、372-385或387-398；或

表20所示的SEQ ID NOS：399-408；或

表22所示的SEQ ID NOS：410-421；或

表23所示的SEQ ID NOS：422、424、426或428；或

表24所示的SEQ ID NOS：430-437；或

表25所示的SEQ ID NOS：438-445；或

表26所示的SEQ ID NOS：447、449、451、453、455或457；或

表28所示的SEQ ID NOS：470-482或484-493；或

表29所示的SEQ ID NOS：495-506；或

表30所示的SEQ ID NOS：507-518。

本发明也涉及包含本发明的组合物和药学可接受载体的药物组合物。

可以通过常规合成方法、重组DNA技术或本领域公知的任何其它制备肽和融合肽的方法来制备本发明的组合物。当可以应用时，可以通过常规有机化学反应以及常规肽化学反应合成具有非肽部分的本发明的组合物。

考虑的主要用途是治疗和/或预防剂。掺入毒素肽的本发明的组合物可以具有与未缀合的肽相似或甚至更强的活性和/或离子通道靶选择性。

因此，本发明包括治疗自身免疫病症的方法，该方法包括给诊断患有自身免疫病症的患者施用治疗有效量的本发明的组合物(优选包含Kv1.3拮抗剂肽或IKCa1拮抗剂肽)，所述自身免疫病症如多发性硬化、1型糖尿病、牛皮癣、炎性肠病、接触介导的皮炎、类风湿关节炎、牛皮癣关节炎、哮喘、过敏、再狭窄、系统性硬化、纤维化、硬皮病、肾小球肾炎、干燥综合征、炎症性骨重吸收、移植物排斥、移植物抗宿主疾病或狼疮，其中患者中所述病症的至少一种症状减轻。

本发明进一步涉及预防或减轻多发性硬化的症状复发的方法，该方法包括给以前经历过多发性硬化的至少一种症状的患者施用预防有效量的本发明的组合物(优选包含Kv1.3拮抗剂肽或IKCa1拮抗剂肽)，使得能够防止多发性硬化的至少一种症状再次出现或使其减轻。

尽管大多数情况下考虑作为治疗剂，本发明的组合物也可以用于筛选治疗剂或诊断剂。例如，可以在使用抗Fc包被的平板的测定中使用Fc-肽。延长半衰期的部分，如Fc，可以使不溶性肽可溶，因此可以用于一些测定中。

参考本发明的附图和详述，可以明确本发明的许多其它方面和优点。

                      附图简述

图1显示了一些示例的Fc二聚体的示意图，这些二聚体可以来源于IgG1抗体。该图中的“Fc”代表本文中“Fc结构域”含义内的任何Fc变体。“X1”和“X2”代表下文定义的肽或接头-肽组合。具体二聚体如下：

图1A和图1D：单二硫键键合的二聚体；

图1B和图1E：双二硫键键合的二聚体；

图1C和图1F：非共价键二聚体。

图2显示本发明组合物的一些实施方案的示意结构，其显示单个单位的药理学活性毒素肽。图2A显示单链分子，并且也代表分子的DNA构建体。图2B显示一种二聚体，其中接头-肽部分仅仅存在于二聚体的一条链上。图2C显示在两条链上都具有肽部分的二聚体。图2C的二聚体在图2A所示的编码单链的DNA构建体上表达后，在某些宿主细胞中自发形成。在其它宿主细胞中，细胞可以置于有利于二聚体形成或可以体外形成二聚体的条件下。

图3显示为哺乳动物表达进行了优化，并且可以用于本发明的人IgG1 Fc的示例核酸和氨基酸序列(分别是SEQ ID NOS：1和2)。

图4显示为细菌动物表达进行了优化，并且可以用于本发明的人IgG1 Fc的示例核酸和氨基酸序列(分别是SEQ ID NOS：3和4)。

图5A显示成熟ShK肽的氨基酸序列(SEQ ID NO：5)，该序列可以由含有为在哺乳动物细胞、细菌或酵母中表达而进行了优化的密码子的核酸序列编码。

图5B显示由ShK肽(SEQ ID NO：10)内的6个半胱氨酸形成的3个二硫键(--S-S--)。

图6显示电压门控的钾通道抑制剂Stichodactyla helianthus(ShK)与海葵毒素家族的其它密切相关成员的比对。显示了分离自Stichodactyla helianthus的毒液的35个氨基酸的成熟ShK毒素的序列(编号P29187)与海葵家族的其它密切相关成员的比对。显示了共有序列和预测的二硫键，高度保守的残基加阴影。显示的HmK肽毒素序列(Swiss-Protein编号097436)是来自Magnificent海葵(Radianthus magnifica；Heteractis magnifica)的不成熟前体的序列，推定的信号肽加下划线。预测成熟HmK肽毒素的长度是35个氨基酸，并且跨残基40-74。AeK是分离自海葵Actinia equine的毒液的成熟肽毒素(编号P81897)。分别显示了分离自海葵Anemonia sulcata和Bunodosoma granulifera的毒液的成熟肽毒素AsKS(编号Q9TWG1)和BgK(编号P29186)的序列。图6A显示ShK的氨基酸(SEQ ID NO：10)与其它海葵家族成员的毒素HmK(SEQ ID NO：6(成熟肽)、(SEQ ID NO：542，信号和成熟肽部分))、AeK(SEQ ID NO：7)、AsKs(SEQ ID NO：8)和BgK(SEQ ID NO：9)的比对。显示了预测的二硫键，并且突出显示了保守残基(HmK，SEQ ID NO：543；ShK，SEQ ID NO：10；AeK，SEQID NO：544；AsKS，SEQ ID NO：545)。图6B显示了具有3个二硫键(C1-C6，C2-C4，C3-C5)的该家族的二硫键图谱。

图7显示了α-蝎子毒素家族的钾通道抑制剂的氨基酸比对(BmKK1，SEQ ID NO：11；BmKK4，SEQ ID NO：12；PBTx1，SEQ IDNO：14；Tc32，SEQ ID NO：13；BmKK6，SEQ ID NO：15；P01，SEQ IDNO：16；Pi2，SEQ ID NO：17；Pi3，SEQ ID NO：18；Pi4，SEQ ID NO：19；MTX，SEQ ID NO：20；Pi1，SEQ ID NO：21；HsTx1，SEQ ID NO：61；AgTx2，SEQ ID NO：23；KTX1，SEQ ID NO：24；OSK1，SEQ ID NO：25；BmKTX，SEQ ID NO：22；HgTX1，SEQ ID NO：27；MgTx，SEQ ID NO：28；C11Tx1，SEQ ID NO：29；NTX，SEQ ID NO：30；Tc30，SEQ ID NO：31；TsTX-Ka，SEQ ID NO：32；PBTx3，SEQ ID NO：33；Lqh 15-1，SEQ ID NO：34；MartenTx，SEQ ID NO：37；ChTx，SEQ ID NO：36；ChTx-Lq2，SEQ ID NO：42；IbTx，SEQ ID NO：38；SloTx，SEQ ID NO：39；BmTx1；SEQ ID NO：43；BuTx，SEQ ID NO：41；AmmTx3，SEQ ID NO：44；AaTX1，SEQ ID NO：45；BmTX3，SEQ ID NO：46；Tc1，SEQ ID NO：48；OSK2，SEQ ID NO：49；TsK，SEQ ID NO：54；CoTx1，SEQ ID NO：55；CoTx2，SEQ ID NO：871；BmPo5，SEQ ID NO：60；ScyTx，SEQ ID NO：51；P05，SEQ ID NO：52；Tamapin，SEQ ID NO：53；和TmTx，SEQ IDNO：691)。高度保守的残基用阴影表示，并且列出了共有序列。列出了α-KTx的亚家族，并且来自Rodriguez de la Vega，R.C.et al.(2003)TIPS 24：222-227。列出了一系列报道被拮抗的一些离子通道(IK＝IKCa，BK＝BKCa，SK＝SKCa，Kv＝电压门控的K+通道)。尽管该比对中的大多数家族成员代表成熟肽产物，但其中一些代表了肽的不成熟或修饰形式，这些包括：BmKK1，BmKK4，BmKK6，BmKTX，MartenTx，ChTx，ChTx-Lq2，BmTx1，AaTx1，BmTX3，TsK，CoTx1，BmP05。

图8显示本发明中转化为肽抗体(peptibody)的毒素肽的比对(蜂神经毒肽，SEQ ID NO：68；HaTx1，SEQ ID NO：494；ProTx1，SEQ IDNO：56；PaTx2，SEQ ID NO：57；ShK[2-35]，SEQ ID NO：92；ShK[1-35]，SEQ ID NO：5；HmK，SEQ ID NO：6；ChTx(K32E)，SEQ IDNO：59；ChTx，SEQ ID NO：36；IbTx，SEQ ID NO：38；OSK1(E16K，K20D)，SEQ ID NO：296；OSK1，SEQ ID NO：25；AgTx2，SEQ ID NO：23；KTX1，SEQ ID NO：24；MgTx，SEQ ID NO：28；NTX，SEQ ID NO：30；MTX，SEQ ID NO：20；Pi2，SEQ ID NO：17；HsTx1，SEQ ID NO：61；Anuroctoxin[AnTx]，SEQ ID NO：62；BeKm1，SEQ ID NO：63；ScyTx，SEQ ID NO：51；ωGVIA，SEQ ID NO：64；ωMVIIa，SEQ ID NO：65；Ptu1，SEQ ID NO：66；和CTX，SEQ ID NO：67)。指出了毒素的最初来源，以及每种毒素中的半胱氨酸数目。列出了靶定的关键离子通道。该比对显示了基于来源和离子通道靶影响的毒素肽的簇集。

图9显示毒素家族内的二硫键排列。指出了每个亚家族的二硫键数目和二硫键顺序。示出了落入每个二硫键分类中的毒素的部分列表。

图10说明了毒素的溶液结构揭示了致密结构。来自海葵(ShK)、蝎子(MgTx，MTX，HsTx1)、海芋螺(wGVIA)和鸟蛛(HaTx1)的天然毒素的溶液结构表明28-39个氨基酸的肽都形成致密结构。显示的毒素具有3或4个二硫键，并且属于图9所示的6个亚家族中的4个。来自海葵(ShK)、蝎子(MgTx，MTX，HsTx1)、海芋螺(wGVIA)和鸟蛛(HaTx1)的天然毒素的溶液结构来源于Protein Data Bank(PDB)编号1ROO(mmdbId：5247)，1MTX(mmdbId：4064)，1TXM(mmdbId：6201)，1QUZ(mmdbId：36904)，1OMZ(mmdbId：1816)和1D1H(mmdbId：14344)，其中采用MMDB Entrez 3D-结构数据库[J.Chen et al.(2003)Nucleic Acids Res.31，474]和阅读器。

图11A-C显示pAMG21ampR-Fc-pep的残基5131-6660的核酸(SEQ ID NO：69和SEQ ID NO：1358)以及编码的氨基酸(SEQ IDNO：70，SEQ ID NO：1359和SEQ ID NO：1360)序列。Fc结构域的序列(SEQ ID NOS：71和72)排除了5个C末端甘氨酸残基。该载体使得能够生产肽抗体，其中肽-接头部分位于Fc结构域的C末端。

图11D显示肽抗体细菌表达载体pAMG21ampR-Fc-pep的环状示意图，该载体的氯霉素乙酰转移酶基因(cat；“CmR”位点)被肽-接头序列代替。

图12A-C显示pAMG21ampR-Pep-Fc的残基5131-6319的核酸(SEQ ID NO：73和SEQ ID NO：1361)以及编码的氨基酸(SEQ IDNO：74，SEQ ID NO：1362和SEQ ID NO：1363)序列。Fc结构域的序列(SEQ ID NOS：75和76)排除了5个N末端甘氨酸残基。该载体使得能够生产肽抗体，其中肽-接头部分位于Fc结构域的N末端。

图12D显示一种肽抗体细菌表达载体的环状示意图，该载体的zeocin抗性(ble；“ZeoR”)位点被肽-接头序列代替。

图12E-F显示pAMG21ampR-Pep-Fc的核酸(SEQ ID NO：1339)和编码的氨基酸(SEQ ID NO：1340，SEQ ID NO：1341和SEQ IDNO：1342)序列。Fc结构域的序列(SEQ ID NOS：75和76)排除了5个N末端甘氨酸残基。该载体使得能够生产肽抗体，其中肽-接头部分位于Fc结构域的N末端。

图13A是哺乳动物表达载体pCDNA3.1(+)CMVi的环状示意图。

图13B是哺乳动物表达载体pCDNA3.1(+)CMVi-Fc-2xG4S-Activin RIIb的环状示意图，该载体含有来自人IgG1的Fc区、10个氨基酸的接头和激活蛋白RIIb基因。

图13C是含有Fc-L10-ShK[2-35]编码序列的CHO表达载体pDSRa22的环状示意图。

图14显示下文实施例1中鉴定为“Fc-L10-ShK[1-35]”的分子的核苷酸和编码的氨基酸序列(分别是SEQ.ID.NOS：77和78)。L10接头氨基酸序列(SEQ ID NO：79)加下划线。

图15显示下文实施例2中鉴定为“Fc-L10-ShK[2-35]”的分子的核苷酸和编码的氨基酸序列(分别是SEQ.ID.NOS：80和81)。Fc-L10-ShK[1-35]中使用的相同L10接头氨基酸序列(SEQ ID NO：79)加下划线。

图16显示下文实施例2中鉴定为“Fc-L25-ShK[2-35]”的分子的核苷酸和编码的氨基酸序列(分别是SEQ.ID.NOS：82和83)。L25接头氨基酸序列(SEQ ID NO：84)加下划线。

图17显示通过还原胺化，对ShK肽(SEQ ID NO：5和SEQ IDNO：10)进行N末端聚乙二醇化的方案，也描述于下文实施例32。

图18显示通过酰胺形成，对ShK肽(SEQ ID NO：5和SEQ IDNO：10)进行N末端聚乙二醇化的方案，也描述于下文实施例34。

图19显示通过化学选择性肟形成，对ShK肽(SEQ ID NO：5和SEQID NO：10)进行N末端聚乙二醇化的方案，也描述于下文实施例33。

图20A显示在214nm进行的反相HPLC分析，图20B显示折叠的ShK[2-35]，也描述为折叠的“Des-Arg1-ShK”(肽2)的电雾化质量分析。

图21显示N末端聚乙二醇化的ShK[2-35]，也称作N末端聚乙二醇化的“Des-Arg1-ShK”的214nm处的反相HPLC分析。

图22A显示折叠的ShK[1-35]，也称作“ShK”的214nm处的反相HPLC分析。

图22B显示折叠的ShK[1-35]，也称作“ShK”的电雾化质量分析。

图23显示通过还原胺化，对ShK[2-35](SEQ ID NO：92和SEQ IDNO：58，也称作“Des-Arg1-ShK”或“ShK d1”)进行N末端聚乙二醇化的方案，也描述于下文实施例31。

图24A显示用Fc-L10-ShK[1-35]瞬时转染的HEK 293细胞的条件培养基的蛋白印迹。泳道1：分子量标记物；泳道2：15μl Fc-L10-ShK；泳道3：10μl Fc-L10-ShK；泳道4：5μl Fc-L10-ShK；泳道5；分子量标记；泳道6：空白；泳道7：15μl无DNA对照；泳道8：10μl无DNA对照；泳道9：5μl无DNA对照；泳道10；分子量标记。

图24B显示用Fc-L-ShK[1-35]稳定转染的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞克隆的15μl条件培养基的蛋白印迹。泳道1-15按照如下加样：空白，BB6，分子量标记，BB5，BB4，BB3，BB2，BB1，空白，BD6，BD5，分子量标记，BD4，BD3，BD2。

图25A显示含有用Fc-L-SmIIIA瞬时转染的293T细胞的条件培养基的非还原SDS-PAGE凝胶的蛋白印迹。

图25B显示含有用Fc-L-SmIIIA瞬时转染的293T细胞的条件培养基的还原SDS-PAGE凝胶的蛋白印迹。

图26A显示在700μl PBS(空白缓冲液)中稀释的来自稳定转染的CHO细胞的10μl纯化的Fc-L10-ShK[1-35]产物的光谱扫描，该光谱扫描用Hewlett Packard 8453分光光度计和1-cm径长石英比色杯进行。

图26B显示终产物Fc-L10-ShK[1-35]的考马斯亮蓝染色的tris-甘氨酸4-20％SDS-PAGE。泳道1-12按照如下加样：NovexMark12宽范围蛋白标准物，0.5μg非还原产物，空白，2.0μg非还原产物，空白，10μg非还原产物，Novex Mark12宽范围蛋白标准物，0.5μg还原产物，空白，2.0μg还原产物，空白和10μg还原产物。

图26C显示20μg终产物Fc-L10-ShK[1-35]的大小排阻色谱，该终产物在50mM NaH₂PO₄，250mM NaCl，pH 6.9中以1ml/min注射到Phenomenex BioSep SEC 3000柱(7.8×300mm)上，在280nm观察吸光度。

图26D显示用配备氮激光(337nm，3ns脉冲)的Voyager DE-RP飞行时间质谱仪分析的最终Fc-L10-ShK[1-35]样品的MALDI质谱分析。采用了正离子/线性模式，加速电压是25kV。通过累积来自约200次激光发射的数据产生每个质谱。用已知分子量的纯化蛋白完成外部质量校准。

图27A显示来自稳定转染的CHO细胞的纯化的终产物Fc-L10-ShK[2-35]的考马斯亮蓝染色的tris-甘氨酸4-20％SDS-PAGE。泳道1-12按照如下加样：Novex Mark12宽范围蛋白标准物，0.5μg非还原产物，空白，2.0μg非还原产物，空白，10μg非还原产物，Novex Mark12宽范围蛋白标准物，0.5μg还原产物，空白，2.0μg还原产物，空白和10μg还原产物。

图27B显示50μg纯化的Fc-L10-ShK[2-35]的大小排阻色谱，其在50mM NaH₂PO₄，250mM NaCl，pH 6.9中以1ml/min注射到Phenomenex BioSep SEC 3000柱(7.8×300mm)上，在280nm观察吸光度。

图27C显示纯化自稳定转染的CHO细胞的Fc-L5-ShK[2-35]的考马斯亮蓝染色的tris-甘氨酸4-20％SDS-PAGE。泳道1-12按照如下加样：Novex Mark12宽范围蛋白标准物，0.5μg非还原产物，空白，2.0μg非还原产物，空白，10μg非还原产物，Novex Mark12宽范围蛋白标准物，0.5μg还原产物，空白，2.0μg还原产物，空白和10μg还原产物。

图27D显示纯化自稳定转染的CHO细胞的Fc-L25-ShK[2-35]的考马斯亮蓝染色的tris-甘氨酸4-20％SDS-PAGE。泳道1-12按照如下加样：Novex Mark12宽范围蛋白标准物，0.5μg非还原产物，空白，2.0μg非还原产物，空白，10μg非还原产物，Novex Mark12宽范围蛋白标准物，0.5μg还原产物，空白，2.0μg还原产物，空白和10μg还原产物。

图27E显示在700μl PBS(空白缓冲液)中稀释的10μl Fc-L10-ShK[2-35]产物的光谱扫描，该光谱扫描用Hewlett Packard 8453分光光度计和1-cm径长石英比色杯进行。

图27F显示用配备氮激光(337nm，3ns脉冲)的Voyager DE-RP飞行时间质谱仪分析的最终Fc-L10-ShK[2-35]样品的MALDI质谱分析。采用了正离子/线性模式，加速电压是25kV。通过累积来自约200次激光发射的数据产生每个质谱。用已知分子量的纯化蛋白完成外部质量校准。

图27G显示在700μl PBS(空白缓冲液)中稀释的10μl Fc-L5-ShK[2-35]产物的光谱扫描，该光谱扫描用Hewlett Packard 8453分光光度计和1-cm径长石英比色杯进行。

图27H显示50mg终产物Fc-L5-ShK[2-35]的大小排阻色谱，其在50mM NaH₂PO₄，250mM NaCl，pH 6.9中以1ml/min注射到Phenomenex BioSep SEC 3000柱(7.8×300mm)上，在280nm观察吸光度。

图27I显示用配备氮激光(337nm，3ns脉冲)的Voyager DE-RP飞行时间质谱仪分析的最终Fc-L5-ShK[2-35]样品的MALDI质谱分析。采用了正离子/线性模式，加速电压是25kV。通过累积来自约200次激光发射的数据产生每个质谱。用已知分子量的纯化蛋白完成外部质量校准。

图27J显示在700μl PBS(空白缓冲液)中稀释的20μl产物的光谱扫描，该光谱扫描用Hewlett Packard 8453分光光度计和1-cm径长石英比色杯进行。

图27K显示50μg终产物Fc-L25-ShK[2-35]的大小排阻色谱，其在50mM NaH₂PO₄，250mM NaCl，pH 6.9中以1ml/min注射到Phenomenex BioSep SEC 3000柱(7.8×300mm)上，在280nm观察吸光度。

图27L显示用配备氮激光(337nm，3ns脉冲)的Voyager DE-RP飞行时间质谱仪分析的最终Fc-L25-ShK[2-35]样品的MALDI质谱分析。采用了正离子/线性模式，加速电压是25kV。通过累积来自约200次激光发射的数据产生每个质谱。用已知分子量的纯化蛋白完成外部质量校准。

图28A显示从细菌细胞纯化并重新折叠的Fc-L10-KTX1的考马斯亮蓝染色的tris-甘氨酸4-20％SDS-PAGE。泳道1-12按照如下加样：Novex Mark12宽范围蛋白标准物，0.5μg非还原产物，空白，2.0μg非还原产物，空白，10μg非还原产物，Novex Mark12宽范围蛋白标准物，0.5μg还原产物，空白，2.0μg还原产物，空白和10μg还原产物。

图28B显示45μg纯化的Fc-L10-KTX1的大小排阻色谱，其在50mM NaH₂PO₄，250mM NaCl，pH 6.9中以1ml/min注射到PhenomenexBioSep SEC 3000柱(7.8×300mm)上，在280nm观察吸光度。

图28C显示在700μl PBS(空白缓冲液)中稀释的20μl Fc-L10-KTX1产物的光谱扫描，该光谱扫描用Hewlett Packard 8453分光光度计和1-cm径长石英比色杯进行。

图28D显示用配备氮激光(337nm，3ns脉冲)的Voyager DE-RP飞行时间质谱仪分析的最终Fc-L10-KTX1样品的MALDI质谱分析。采用了正离子/线性模式，加速电压是25kV。通过累积来自约200次激光发射的数据产生每个质谱。用已知分子量的纯化蛋白完成外部质量校准。

图29A显示从细菌细胞纯化并重新折叠的Fc-L-AgTx2的考马斯亮蓝染色的tris-甘氨酸4-20％SDS-PAGE。泳道1-12按照如下加样：Novex Mark12宽范围蛋白标准物，0.5μg非还原产物，空白，2.0μg非还原产物，空白，10μg非还原产物，Novex Mark12宽范围蛋白标准物，0.5μg还原产物，空白，2.0μg还原产物，空白和10μg还原产物。

图29B显示从细菌细胞纯化并重新折叠的Fc-L10-HaTx1的考马斯亮蓝染色的tris-甘氨酸4-20％SDS-PAGE。泳道1-12按照如下加样：Novex Mark12宽范围蛋白标准物，0.5μg非还原产物，空白，2.0μg非还原产物，空白，10μg非还原产物，Novex Mark12宽范围蛋白标准物，0.5μg还原产物，空白，2.0μg还原产物，空白和10μg还原产物，纯化的材料的光谱扫描。

图29C显示在700μl PBS(空白缓冲液)中稀释的20μl Fc-L10-AgTx2产物的光谱扫描，该光谱扫描用Hewlett Packard 8453分光光度计和1-cm径长石英比色杯进行。

图29D显示20μg终产物Fc-L10-AgTx2的大小排阻色谱，其在50mM NaH₂PO₄，250mM NaCl，pH 6.9中以1ml/min注射到PhenomenexBioSep SEC 3000柱(7.8×300mm)上，在280nm观察吸光度。

图29E显示用配备氮激光(337nm，3ns脉冲)的Voyager DE-RP飞行时间质谱仪分析的最终Fc-L10-AgTx2样品的MALDI质谱分析。采用了正离子/线性模式，加速电压是25kV。通过累积来自约200次激光发射的数据产生每个质谱。用已知分子量的纯化蛋白完成外部质量校准。

图29F显示在700μl PBS(空白缓冲液)中稀释的20μl Fc-L10-HaTx1产物的光谱扫描，该光谱扫描用Hewlett Packard 8453分光光度计和1-cm径长石英比色杯进行。

图29G显示20μg终产物Fc-L10-HaTx1的大小排阻色谱，其在50mM NaH₂PO₄，250mM NaCl，pH 6.9中以1ml/min注射到PhenomenexBioSep SEC 3000柱(7.8×300mm)上，在280nm观察吸光度。

图29H显示用配备氮激光(337nm，3ns脉冲)的Voyager DE-RP飞行时间质谱仪分析的最终Fc-L10-HaTx1样品的MALDI质谱分析。采用了正离子/线性模式，加速电压是25kV。通过累积来自约200次激光发射的数据产生每个质谱。用已知分子量的纯化蛋白完成外部质量校准。

图30A显示从CHO细胞纯化的Fc-L10-ShK[1-35]产生了从稳定表达人Kv1.3通道的HEK293细胞记录的外向钾电流的浓度依赖性阻断。

图30B显示多个浓度的Fc-L10-ShK[1-35]对钾电流阻断的时程。估计IC50是15±2pM(n＝4个细胞)。

图30C显示合成ShK[1-35](也单独称作“ShK”)产生了从稳定表达人Kv1.3通道的HEK293细胞记录的外向钾电流的浓度依赖性阻断。

图30D显示多个浓度的ShK[1-35]阻断的时程。估计IC50是12±1pM(n＝4个细胞)。

图31A显示合成肽类似物ShK[2-35]，其产生了从稳定表达人Kv1.3通道的HEK293细胞记录的外向钾电流的浓度依赖性阻断，IC50值是49±5pM(n＝3个细胞)。

图31B显示来源于CHO的Fc-L10-ShK[2-35]肽抗体，其产生了从稳定表达人Kv1.3通道的HEK293细胞记录的外向钾电流的浓度依赖性阻断，IC50值是115±18pM(n＝3个细胞)。

图31C显示Fc-L5-ShK[2-35]肽抗体产生从稳定表达人Kv1.3通道的HEK293细胞记录的外向钾电流的浓度依赖性阻断，IC50值是100pM(n＝3个细胞)。

图32A显示从细菌细胞纯化的Fc-L-KTX1肽抗体，其产生了从稳定表达人Kv1.3通道的HEK293细胞记录的外向钾电流的浓度依赖性阻断。

图32B显示多个浓度的Fc-L10-KTX1对钾电流阻断的时程。

图33通过免疫组化显示来源于CHO的Fc-L10-ShK[1-35]肽抗体使人Kv1.3稳定转染的HEK 293细胞染色(图33A)，而未转染的HEK 293细胞不被肽抗体染色(图33B)。

图34显示用固定的HEK 293细胞进行的酶免疫测定，所述细胞用人Kv1.3稳定转染。图34A显示来源于CHO的Fc-L10-ShK[1-35](在此简称为“Fc-L10-ShK”)肽抗体表现出反应性的剂量依赖性增加，而CHO-Fc对照(“Fc对照”)则未表现。图34B显示采用相似条件，Fc-L10-ShK[1-35]肽抗体(在此称作“Fc-ShK”)没有从未转染的HEK 293细胞引发反应，并且也显示了其它阴性对照。

图35显示来源于CHO的Fc-L10-ShK[1-35]肽抗体表现出对PMA和αCD3抗体刺激的人PBMCs产生IL-2(图35A)和IFNγ(图35B)的剂量依赖性抑制。肽抗体显示新的展示对反应的完全抑制的新药理学，而单独的合成ShK[1-35]肽仅仅显示部分抑制。

图36显示来源于哺乳动物的Fc-L10-ShK[1-35]肽抗体抑制来自CD3和CD28抗体刺激的两个正常供体的人PBMCs中的T细胞增殖(³H-胸苷掺入)。图36A显示供体1的反应，图36B显示供体2的反应。用抗-CD32(FcgRII)阻断性抗体预温育，不改变对肽抗体的敏感性。

图37显示纯化的来源于CHO的Fc-L10-ShK[1-35]肽抗体导致对αCD3和αCD28抗体刺激的人PBMCs产生IL-2(图37A)和IFNγ(图37B)的剂量依赖性抑制。

图38A显示聚乙二醇化ShK[2-35]合成肽对从稳定表达人Kv1.3通道的HEK293细胞记录的外向钾电流的浓度依赖性阻断，图38B显示多个浓度下钾电流阻断的时程。

图39A显示在700μl PBS(空白缓冲液)中稀释的50μl Fc-L10-ShK(1-35)产物的光谱扫描，该光谱扫描用Hewlett Packard 8453分光光度计和1-cm径长石英比色杯进行。

图39B显示终产物Fc-L10-ShK(1-35)的考马斯亮蓝染色的tris-甘氨酸4-20％SDS-PAGE。泳道1-12按照如下加样：Novex Mark12宽范围蛋白标准物，0.5μg非还原产物，空白，2.0μg非还原产物，空白，10μg非还原产物，Novex Mark12宽范围蛋白标准物，0.5μg还原产物，空白，2.0μg还原产物，空白和10μg还原产物。

图39C显示50μg终产物Fc-L10-ShK(1-35)的大小排阻色谱，其在50mM NaH₂PO₄，250mM NaCl，pH 6.9中以1ml/min注射到Phenomenex BioSep SEC 3000柱(7.8×300mm)上，在280nm观察吸光度。

图40A显示在700μl PBS(空白缓冲液)中稀释的20μl Fc-L10-ShK(2-35)产物的光谱扫描，该光谱扫描用Hewlett Packard 8453分光光度计和1-cm径长石英比色杯进行。

图40B显示终产物Fc-L10-ShK(2-35)的考马斯亮蓝染色的tris-甘氨酸4-20％SDS-PAGE。泳道1-12按照如下加样：NovexMark 12宽范围蛋白标准物，0.5μg非还原产物，空白，2.0μg非还原产物，空白，10μg非还原产物，Novex Mark12宽范围蛋白标准物，0.5μg还原产物，空白，2.0μg还原产物，空白和10μg还原产物。

图40C显示50μg终产物Fc-L10-ShK(2-35)的大小排阻色谱，其在50mM NaH₂PO₄，250mM NaCl，pH 6.9中以1ml/min注射到Phenomenex BioSep SEC 3000柱(7.8×300mm)上，在280nm观察吸光度。

图40D显示用配备氮激光(337nm，3ns脉冲)的Voyager DE-RP飞行时间质谱仪分析的Fc-L10-ShK(2-35)最终样品的MALDI质谱分析。采用了正离子/线性模式，加速电压是25kV。通过累积来自约200次激光发射的数据产生每个质谱。用已知分子量的纯化蛋白完成外部质量校准。

图41A显示在700μl制剂缓冲液中稀释的50μl Fc-L10-OSK1产物的光谱扫描，该光谱扫描用Hewlett Packard 8453分光光度计和1-cm径长石英比色杯进行。

图41B显示终产物Fc-L10-OSK1的考马斯亮蓝染色的tris-甘氨酸4-20％SDS-PAGE。泳道1-12按照如下加样：Novex Mark12宽范围蛋白标准物，0.5μg非还原产物，空白，2.0μg非还原产物，空白，10μg非还原产物，Novex Mark12宽范围蛋白标准物，0.5μg还原产物，空白，2.0μg还原产物，空白和10μg还原产物。

图41C显示123μg终产物Fc-L10-OSK1的大小排阻色谱，其在50mM NaH₂PO₄，250mM NaCl，pH 6.9中以1ml/min注射到PhenomenexBioSep SEC 3000柱(7.8×300mm)上，在280nm观察吸光度。

图41D显示用Vydac C₄柱进行的大约4μg最终Fc-L10-OSK1样品的液相色谱-质谱分析，其中部分流出液导向进入LCQ离子阱质谱仪。用质谱仪制造商提供的Bioworks软件对质谱解卷积。

图42A-B显示Fc-L10-OSK1的核苷酸和氨基酸序列(分别是SEQ ID NO：1040和SEQ ID NO：1041)。

图43A-B显示Fc-L10-OSK1[K7S]的核苷酸和氨基酸序列(分别是SEQ ID NO：1042和SEQ ID NO：1043)。

图44A-B显示Fc-L10-OSK1[E16K，K20D]的核苷酸和氨基酸序列(分别是SEQ ID NO：1044和SEQ ID NO：1045)。

图45A-B显示Fc-L10-OSK1[K7S，E16K，K20D]的核苷酸和氨基酸序列(分别是SEQ ID NO：1046和SEQ ID NO：1047)。

图46显示用抗人Fc抗体进行的蛋白印迹(来自tris-甘氨酸4-20％SDS-PAGE)。泳道1-6按照如下加样：15μl Fc-L10-OSK1[K7S，E16K，K20D]；15μl Fc-L10-OSK1[E16K，K20D]；15μl Fc-L10-OSK1[K7S]；15μl Fc-L10-OSK1；15μl“无DNA”对照；分子量标记。

图47显示用抗人Fc抗体进行的蛋白印迹(来自tris-甘氨酸4-20％SDS-PAGE)。泳道1-5按照如下加样：2μl Fc-L10-OSK1；5μl Fc-L10-OSK1；10μl Fc-L10-OSK1；20ng人IgG标准物；分子量标记。

图48显示用抗人Fc抗体进行的蛋白印迹(来自tris-甘氨酸4-20％SDS-PAGE)。泳道1-13按照如下加样：20ng人IgG标准物；D1；C3；C2；B6；B5；B2；B1；A6；A5；A4；A3；A2(泳道2-13中加入5μl克隆-条件培养基)。

图49A显示在700μl PBS(空白缓冲液)中稀释的50μl Fc-L10-OsK1产物的光谱扫描，该光谱扫描用Hewlett Packard 8453分光光度计和1-cm径长石英比色杯进行。

图49B显示终产物Fc-L10-OsK1的考马斯亮蓝染色的tris-甘氨酸4-20％SDS-PAGE。泳道1-12按照如下加样：Novex Mark12宽范围蛋白标准物，0.5μg非还原产物，空白，2.0μg非还原产物，空白，10μg非还原产物，Novex Mark12宽范围蛋白标准物，0.5μg还原产物，空白，2.0μg还原产物，空白和10μg还原产物。

图49C显示149μg终产物Fc-L10-OsK1的大小排阻色谱，其在50mM NaH₂PO₄，250mM NaCl，pH 6.9中以1ml/min注射到PhenomenexBioSep SEC 3000柱(7.8×300mm)上，在280nm观察吸光度。

图49D显示用配备氮激光(337nm，3ns脉冲)的Voyager DE-RP飞行时间质谱仪分析的Fc-L10-ShK(2-35)最终样品的MALDI质谱分析。采用了正离子/线性模式，加速电压是25kV。通过累积来自约200次激光发射的数据产生每个质谱。用已知分子量的纯化蛋白完成外部质量校准。

图50A显示在700μl PBS(空白缓冲液)中稀释的50μl Fc-L10-OsK1(K7S)产物的光谱扫描，该光谱扫描用Hewlett Packard 8453分光光度计和1-cm径长石英比色杯进行。

图50B显示终产物Fc-L10-OsK1(K7S)的考马斯亮蓝染色的tris-甘氨酸4-20％SDS-PAGE。泳道1-12按照如下加样：Novex Mark12宽范围蛋白标准物，0.5μg非还原产物，空白，2.0μg非还原产物，空白，10μg非还原产物，Novex Mark12宽范围蛋白标准物，0.5μg还原产物，空白，2.0μg还原产物，空白和10μg还原产物。

图50C显示50μg终产物Fc-L10-OsK1(K7S)的大小排阻色谱，其在50mM NaH₂PO₄，250mM NaCl，pH 6.9中以1ml/min注射到Phenomenex BioSep SEC 3000柱(7.8×300mm)上，在280nm观察吸光度。

图50D显示用配备氮激光(337nm，3ns脉冲)的Voyager DE-RP飞行时间质谱仪分析的终产物Fc-L10-OsK1(K7S)样品的MALDI质谱分析。采用了正离子/线性模式，加速电压是25kV。通过累积来自约200次激光发射的数据产生每个质谱。用已知分子量的纯化蛋白完成外部质量校准。

图51A显示在700μl PBS(空白缓冲液)中稀释的50μl Fc-L10-OsK1(E16K，K20D)产物的光谱扫描，该光谱扫描用Hewlett Packard8453分光光度计和1-cm径长石英比色杯进行。

图51B显示终产物Fc-L10-OsK1(E16K，K20D)的考马斯亮蓝染色的tris-甘氨酸4-20％SDS-PAGE。泳道1-12按照如下加样：Novex Mark12宽范围蛋白标准物，0.5μg非还原产物，空白，2.0μg非还原产物，空白，10μg非还原产物，Novex Mark12宽范围蛋白标准物，0.5μg还原产物，空白，2.0μg还原产物，空白和10μg还原产物。

图51C显示50μg终产物Fc-L10-OsK1(E16K，K20D)的大小排阻色谱，其在50mM NaH₂PO₄，250mM NaCl，pH 6.9中以1ml/min注射到Phenomenex BioSep SEC 3000柱(7.8×300mm)上，在280nm观察吸光度。

图51D显示用配备氮激光(337nm，3ns脉冲)的Voyager DE-RP飞行时间质谱仪分析的终产物Fc-L10-OsK1(E16K，K20D)样品的MALDI质谱分析。采用了正离子/线性模式，加速电压是25kV。通过累积来自约200次激光发射的数据产生每个质谱。用已知分子量的纯化蛋白完成外部质量校准。

图52A显示在700μl PBS(空白缓冲液)中稀释的50μl Fc-L10-OsK1(K7S，E16K，K20D)产物的光谱扫描，该光谱扫描用HewlettPackard 8453分光光度计和1-cm径长石英比色杯进行。

图52B显示终产物Fc-L10-OsK1(K7S，E16K，K20D)的考马斯亮蓝染色的tris-甘氨酸4-20％SDS-PAGE。泳道1-12按照如下加样：Novex Mark12宽范围蛋白标准物，0.5μg非还原产物，空白，2.0μg非还原产物，空白，10μg非还原产物，Novex Mark12宽范围蛋白标准物，0.5μg还原产物，空白，2.0μg还原产物，空白和10μg还原产物。

图52C显示50μg终产物Fc-L10-OsK1(K7S，E16K，K20D)的大小排阻色谱，其在50mM NaH₂PO₄，250mM NaCl，pH 6.9中以1ml/min注射到Phenomenex BioSep SEC 3000柱(7.8×300mm)上，在280nm观察吸光度。

图52D显示用配备氮激光(337nm，3ns脉冲)的Voyager DE-RP飞行时间质谱仪分析的终产物Fc-L10-OsK1(K7S，E16K，K20D)样品的MALDI质谱分析。采用了正离子/线性模式，加速电压是25kV。通过累积来自约200次激光发射的数据产生每个质谱。用已知分子量的纯化蛋白完成外部质量校准。

图53显示合成Osk1对从稳定表达人Kv1.3通道的HEK293细胞记录的外向钾电流的抑制，Osk1是亚洲蝎Orthochirus scrobiculosus毒液的具有38个残基的毒素肽。图53A显示合成Osk1毒素肽对从稳定表达人Kv1.3通道的HEK293细胞记录的外向钾电流的浓度依赖性阻断。图53B显示多个浓度的合成Osk1毒素肽阻断的时程。合成Osk1毒素肽的IC50估计是39±12pM(n＝4个细胞)。

图54显示通过与抗体的Fc片段融合对合成OSK1毒素肽的修饰(OSK1-肽抗体)保留了对人Kv1.3通道的抑制活性。图54A显示通过长度为10个氨基酸残基的接头连接于人IgG1 Fc-片段的OSK1(Fc-L10-OSK1)对从稳定表达人Kv1.3通道的HEK293细胞记录的外向钾电流的浓度依赖性阻断。融合构建体在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中稳定表达。图54B显示多个浓度的Fc-L10-OSK1阻断的时程。Fc-L10-OSK1的IC50估计是198±35pM(n＝6个细胞)，比合成OSK1毒素肽的效力低约5倍。

图55显示OSK1-肽抗体的单氨基酸残基取代物保留了对人Kv1.3通道的抑制活性。图55A显示具有单氨基酸取代(从N末端开始的第7位的赖氨酸取代为丝氨酸，[K7S])，并且通过链长为10个氨基酸残基的接头连接于人IgG1 Fc-片段的OSK1-肽抗体(Fc-L10-OSK1[K7S])对从稳定表达人Kv1.3通道的HEK293细胞记录的外向钾电流的浓度依赖性阻断。融合构建体在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中稳定表达。图55B显示多个浓度的Fc-L10-OSK1[K7S]阻断钾电流的时程。IC50估计是372±71pM(n＝4个细胞)，比合成OSK1毒素肽的效力低约10倍。

图56显示OSK1-肽抗体的两个氨基酸残基取代物保留了对人Kv1.3通道的抑制活性。图56A显示具有两个氨基酸取代(分别是从N末端开始的第16位的谷氨酸取代为赖氨酸和20位的赖氨酸取代为天冬氨酸，[E16KK20D])，并且通过链长为10个氨基酸残基的接头连接于人IgG1 Fc-片段的OSK1-肽抗体(Fc-L10-OSK1[E16KK20D])对从稳定表达人Kv1.3通道的HEK293细胞记录的外向钾电流的浓度依赖性阻断。融合构建体在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中稳定表达。图56B显示多个浓度的Fc-L10-OSK1[E16KK20D]阻断钾电流的时程。IC50估计是248±63pM(n＝3个细胞)，比合成OSK1毒素肽的效力低约6倍。

图57显示OSK1-肽抗体的三个氨基酸残基取代物保留了对人Kv1.3通道的抑制活性，但与合成OSK1毒素肽相比，抑制效力显著降低。图57A显示具有三个氨基酸取代(分别是从N末端开始的第7位的赖氨酸取代为丝氨酸，第16位的谷氨酸取代为赖氨酸和20位的赖氨酸取代为天冬氨酸，[K7SE16KK20D])，并且通过链长为10个氨基酸残基的接头连接于人IgG1 Fc-片段的OSK1-肽抗体(Fc-L10-OSK1[K7SE16KK20D])对从稳定表达人Kv1.3通道的HEK293细胞记录的外向钾电流的浓度依赖性阻断。融合构建体在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中稳定表达。图57B显示多个浓度的Fc-L10-OSK1[K7SE16KK20D]阻断钾电流的时程。IC50估计是812±84pM(n＝3个细胞)，比合成OSK1毒素肽的效力低约21倍。

图58显示ShK(图58A)和20K PEG-ShK[1-35](图58B)的标准曲线，其中含有给定血清浓度下每个标准物的线性回归方程。

图59显示IV注射20K PEG ShK[1-35]分子后的大鼠中的药代动力学曲线。

图60显示接受单次等摩尔IV注射Kv1.3抑制剂ShK与20K PEG-ShK[1-35]的大鼠的血清样品中的Kv1.3抑制活性(5％)。

图61说明过继转移EAE模型实验设计(n＝每个治疗组5只大鼠)。以毫克/千克(mg/kg)表示的剂量值是基于肽含量。

图62表示在过继转移EAE模型中，用PEG-ShK治疗改善了大鼠的疾病。临床评分：0＝无体征，0.5＝末梢尾无力，1.0＝尾无力，2.0＝轻度瘫痪，共济失调，3.0＝中度瘫痪，3.5＝-条后腿瘫痪，4.0＝后腿完全瘫痪，5.0＝后腿完全瘫痪和失禁，5.5＝四肢瘫痪，6.0＝垂死或死亡。达到5.5-6分的大鼠死亡或实施安乐死。示出了平均值±sem。(n＝每个治疗组5只大鼠)

图63显示在过继转移EAE模型中，用PEG-ShK治疗防止体重减轻。在1、4、6和8天给大鼠称重(给存活大鼠称重)。示出了平均值±sem。

图64显示Kv1.3通道抑制剂ShK[1-35]和Fc-L10-ShK[2-35]抑制人全血中的毒胡萝卜素诱导的IL-2产生。钙依赖磷酸酶抑制剂环孢菌素A也阻断该反应。BKCa通道抑制剂比利亚蝎毒素(IbTx)没有显示显著活性。来自两个独立供体的全血示于图64A和图64B。

图65显示Kv1.3通道抑制剂ShK[1-35]和Fc-L10-ShK[2-35]抑制人全血中的毒胡萝卜素诱导的IFN-g产生。钙依赖磷酸酶抑制剂环孢菌素A也阻断该反应。BKCa通道抑制剂比利亚蝎毒素(IbTx)没有显示显著活性。来自两个独立供体的全血示于图65A和图65B。

图66显示Kv1.3通道抑制剂ShK[1-35]和Fc-L10-ShK[2-35](Fc-ShK)抑制人全血中的毒胡萝卜素诱导的T细胞上的CD40L上调。钙依赖磷酸酶抑制剂环孢菌素A(CsA)也阻断该反应。图66A显示观察总CD4+T细胞反应的实验结果。图66B显示观察总CD4+T细胞，以及CD4+CD45+和CD4+CD45-T细胞的实验结果。在图66B中，BKCa通道抑制剂比利亚蝎毒素(IbTx)和Kv1.1通道抑制剂树眼镜蛇毒素-K(DTX-K)没有显示显著活性。

图67显示Kv1.3通道抑制剂ShK[1-35]和Fc-L10-ShK[2-35](Fc-ShK)抑制人全血中的毒胡萝卜素诱导的T细胞上的IL-2R上调。钙依赖磷酸酶抑制剂环孢菌素A(CsA)也阻断该反应。图67A显示观察总CD4+T细胞反应的实验结果。图67B显示观察总CD4+T细胞，以及CD4+CD45+和CD4+CD45-T细胞的实验结果。在图67B中，BKCa通道抑制剂比利亚蝎毒素(IbTx)和Kv1.1通道抑制剂树眼镜蛇毒素-K(DTX-K)没有显示显著活性。

图68显示用于纯化PEG-Shk(图68A)和纯化PEG-OSK-1(图68B)的SP Sepharose HP柱上的PEG-肽纯化的阳离子交换色谱图。

图69显示最终PEG-肽合并物的RP-HPLC色谱图，以证明PEG-Shk纯度＞99％(图69A)，PEG-Osk1纯度＞97％(图69B)。

图70显示示例的Fc环-L2-OsK1-L2的氨基酸序列(SEQ ID NO：976)，其具有三个连接的结构域：Fc N-末端结构域(氨基酸残基1-139)；OsK1(加下划线的氨基酸残基142-179)；和Fc C-末端结构域(氨基酸残基182-270)。

图71显示示例的Fc环-L2-ShK-L2的氨基酸序列(SEQ ID NO：977)，其具有三个连接的结构域：Fc N-末端结构域(氨基酸残基1-139)；ShK(加下划线的氨基酸残基142-176)；和Fc C-末端结构域(氨基酸残基179-267)。

图72显示示例的Fc环-L2-ShK-L4的氨基酸序列(SEQ ID NO：978)，其具有三个连接的结构域：Fc N-末端结构域(氨基酸残基1-139)；ShK(加下划线的氨基酸残基142-176)；和Fc C-末端结构域(氨基酸残基181-269)。

图73显示示例的Fc环-L4-OsK1-L2的氨基酸序列(SEQ ID NO：979)，其具有三个连接的结构域：Fc N-末端结构域(氨基酸残基1-139)；OsK1(加下划线的氨基酸残基144-181)；和Fc C-末端结构域(氨基酸残基184-272)。

图74显示通过HEK293/Kv1.3细胞上的全细胞膜片钳电生理确定的，20K聚乙二醇化ShK[1-35]提供了对人Kv1.3的有效阻断。数据代表峰电流的阻断。

图75显示本发明的组合物的一些其它示例性实施方案的示意结构。“X²”和“X³”代表本文定义的毒素肽或接头-毒素肽组合(即-(L)_f-P-(L)_g-)。如本文描述但没有在图75中示出的，其它实施方案中也包括额外的X¹结构域和一种或多种额外的PEG部分。本文示出的具体实施方案如下：

图75C，图75D，图75G和图75H：显示单链分子，也代表分子的DNA构建体。

图75A，图75B，图75E和图75F：显示由双二硫键键合的Fc二聚体(在位置F²)；图75A和图75B显示在位置X³，在两条链上都具有毒素肽部分的二聚体；图75E和图75F显示在位置X²，在两条链上都具有毒素肽部分的二聚体。

图76A显示在700μl PBS(空白缓冲液)中稀释的50μl ShK[2-35]-Fc产物的光谱扫描，该光谱扫描用Hewlett Packard 8453分光光度计和1-cm径长石英比色杯进行。

图76B显示终产物ShK[2-35]-Fc的考马斯亮蓝染色的tris-甘氨酸4-20％SDS-PAGE。泳道1-12按照如下加样：Novex Mark12宽范围蛋白标准物，0.5μg非还原产物，空白，2.0μg非还原产物，空白，10μg非还原产物，Novex Mark12宽范围蛋白标准物，0.5μg还原产物，空白，2.0μg还原产物，空白和10μg还原产物。

图76C显示70μg终产物ShK[2-35]-Fc的大小排阻色谱，该终产物在50mM NaH₂PO₄，250mM NaCl，pH 6.9中以1ml/min注射到Phenomenex BioSep SEC 3000柱(7.8×300mm)上，在280nm观察吸光度。

图76D显示用Agilent 1100HPCL流动反相色谱对最终ShK[2-35]-Fc样品进行的LC-MS分析，柱流出液直接连接到Thermo FinniganLCQ离子阱质谱仪的电雾化源。汇总相关质谱，用Bioworks软件包解卷积为质量数据。

图77A显示在700μl PBS(空白缓冲液)中稀释的20μl met-ShK[1-35]-Fc产物的光谱扫描，该光谱扫描用Hewlett Packard 8453分光光度计和1-cm径长石英比色杯进行。

图77B显示终产物met-ShK[1-35]-Fc的考马斯亮蓝染色的tris-甘氨酸4-20％SDS-PAGE。泳道1-12按照如下加样：Novex Mark12宽范围蛋白标准物，0.5μg非还原产物，空白，2.0μg非还原产物，空白，10μg非还原产物，Novex Mark12宽范围蛋白标准物，0.5μg还原产物，空白，2.0μg还原产物，空白和10μg还原产物。

图77C显示93μg终产物met-ShK[1-35]-Fc的大小排阻色谱，该终产物在50mM NaH₂PO₄，250mM NaCl，pH 6.9中以1ml/min注射到Phenomenex BioSep SEC 3000柱(7.8×300mm)上，在280nm观察吸光度。

图77D显示用配备氮激光(337nm，3ns脉冲)的Voyager DE-RP飞行时间质谱仪分析的最终met-ShK[1-35]-Fc样品的MALDI质谱分析。采用了正离子/线性模式，加速电压是25kV。通过累积来自约200次激光发射的数据产生每个质谱。用已知分子量的纯化蛋白完成外部质量校准。

              本发明实施方案的详细描述

术语的定义

本说明书中使用的术语如下，除非在具有场合有其它限定。如说明书和所附权利要求中用到的，单数形式“一个”、“一种”和“该”，包括复数形式，除非上下文明确指出其它意思。

术语“延长半衰期的部分”(即式I的F¹或F²)是指与毒素肽共价连接或缀合的药学可接受的部分、结构域或“运载体”，它防止或减少毒素肽的体内蛋白水解降解或其它减少活性的化学修饰，与毒素肽的未缀合形式相比，增加针对感兴趣的靶离子通道的毒素肽的半衰期或其它药代动力学特性，例如但不限于增加吸收速率、减少毒性、改进溶解度、增加生物活性和/或靶选择性，增加毒素肽的可制造性，和/或减少其免疫原性。

“聚乙二醇化肽”表示这样的肽或蛋白，它们具有与肽自身或与肽基或非肽基接头(包括但不限于芳香接头)的氨基酸残基共价结合的聚乙二醇(PEG)部分，所述接头共价结合于肽的残基。

“聚乙二醇”或“PEG”表示聚亚烷基二醇化合物或其衍生物，其具有或不具有偶联剂，或用偶联或活化部分(如醛、羟基琥珀酰亚胺基、酰肼、硫醇、三氟甲磺酸酯、三氟乙磺酸酯、氮丙啶、环氧乙烷、邻吡啶基二硫化物、乙烯砜、碘乙酰胺或马来酰亚胺部分)衍生。根据本发明，有用的PEG包括基本线性的、直链PEG、支链PEG或树枝状PEG(参见例如Merrill，美国专利No.5,171,264；Harris et al.Multiarmed，monofunctional，polymer for coupling to molecules and surfaces，美国专利No.5,932,462；Shen，N-maleimidyl polymer derivatives，美国专利No.6,602,498)。

术语“肽抗体”是指式I的分子，其中F¹和/或F²是免疫球蛋白Fc结构域或其部分，如Fc的CH2结构域，或其中毒素肽插入人IgG1 Fc结构域环，使得F¹和F²均是Fc结构域的一部分，在它们之间插入毒素肽(参见例如本文图70-73和实施例49)。本发明的肽抗体也可以如本文进一步描述进行聚乙二醇化，其发生在本发明组合物的Fc结构域或其部分，或发生在毒素肽部分，或在这两个位置都发生。

术语“天然Fc”是指包含从完整抗体的消化得到的非抗原结合片段的序列的分子或序列，它是单体或多聚体形式。天然Fc的最初免疫球蛋白来源优选是人来源，并且可以是任何免疫球蛋白，但IgG1或IgG2是优选的。天然Fc由单体多肽组成，这些多肽可以通过共价(即二硫键)和非共价缔合连接成二聚体或多聚体形式。天然Fc分子的单体亚基之间的分子间二硫键的数目取决于类(如IgG，IgA，IgE)或亚类(如IgG1，IgG2，IgG3，IgA1，IgGA2)可以是1-4。天然Fc的一个实例是由IgG的木瓜蛋白酶消化而得到的二硫键键合的二聚体(参见Ellisonet al.(1982)，Nucleic Acids Res.10：4071-9)。本文用到的术语“天然Fc”是单体、二聚体和多聚体形式的通称。

术语“Fc变体”是指对天然Fc进行修饰，但仍然包含补救受体(salvage receptor)FcRn的结合位点的分子或序列。一些公开的专利文件描述了示例的Fc变体，以及与补救受体的相互作用。参见国际申请WO 97/34631(1997年9月25日公开；WO 96/32478，相应于美国专利No.6,096,891，2000年8月1日授权，在此全文引入作为参考；和WO 04/110472。因此，术语“Fc变体”包括由非人天然Fc人源化的分子或序列。此外，天然Fc包含可以去除的位点，这是因为它们提供本发明的融合分子不需要的结构特征或生物活性。因此，术语“Fc变体”包括缺乏影响或参与以下行为的一个或多个天然Fc位点或残基的分子或序列：(1)二硫键形成，(2)与选定的宿主细胞不相容，(3)在选定的宿主细胞中表达后的N末端异质性，(4)糖基化，(5)与补体的相互作用，(6)结合于除补救受体外的Fc受体，或(7)抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。Fc变体更详细描述于下文。

术语“Fc结构域”包括上文定义的天然Fc和Fc变体分子。至于Fc变体和天然Fc，术语“Fc结构域”包括单体或多聚体形式的分子，它们是从完整抗体消化得到或由其它方式产生。

用于Fc结构域或包含Fc结构域的分子的术语“多聚体”是指具有通过共价、非共价或同时通过共价和非共价相互作用缔合的两条或多条多肽链的分子。IgG分子典型地形成二聚体；IgM，五聚体；IgD，二聚体；和IgA，单体、二聚体、三聚体或四聚体。本领域技术人员可以通过利用Fc的天然Ig来源的序列和得到的活性或通过对诸如天然Fc的衍生(如下文的定义)来形成多聚体。

用于Fc结构域或包含Fc结构域的分子的术语“二聚体”是指具有共价或非共价缔合的两条多肽链的分子。因此，本发明范围内的示例的二聚体如图2所示。

术语“衍生”和“衍生物”或“衍生的”分别包括方法和得到的化合物，其中(1)该化合物具有环部分；例如，化合物内半胱氨酰残基之间的交联；(2)化合物是交联的或具有交联位点；例如，化合物具有半胱氨酰残基，并且由此在培养中或体内形成交联的二聚体；(3)一个或多个肽键被非肽键替代；(4)N末端被-NRR¹、NRC(O)R¹、-NRC(O)OR¹、-NRS(O)₂R¹、-NHC(O)NHR、琥珀酰亚胺基团，或取代或未取代的苄氧羰基-NH-取代，其中R和R¹是下文定义的环取代基；(5)C末端被-C(O)R²或-NR³R⁴取代，其中R²、R³和R⁴在下文定义；和(6)各个氨基酸部分通过用能够与选定的侧链或末端残基反应的试剂处理而修饰的化合物。衍生物在下文进一步描述。

术语“肽”是指2-约80个氨基酸残基的分子，优选的是约10-约60个氨基酸残基的分子，最优选的是约30-约50个氨基酸残基的分子。可以通过在肽文库(如噬菌体展示文库)中进行的任何已知方法随机产生示例的肽，或通过消化蛋白而衍生。在本发明的组合物的任何肽部分，例如本文描述的毒素肽或肽接头部分中，可以在给定序列N或C末端中的一个或两个末端引入额外的氨基酸。当然，这些额外的氨基酸残基不应该显著干扰组合物的功能活性。“毒素肽”包括与可以从毒液分离的天然存在的药理学活性肽具有相同氨基酸序列的肽，并且也包括所述天然存在的分子的修饰的肽类似物。用于实施本发明的毒素肽的例子列于表1-32。毒素肽(“P”，或等同地显示为图2中的“P¹”)包含例如图9所示的至少两个肽内二硫键。因此，本发明涉及包含以下部分的分子：

a)C¹-C³和C²-C⁴二硫键，其中C¹、C²、C³和C⁴代表毒素肽的一级序列中存在的半胱氨酸残基的顺序，常规规定所述毒素肽的N末端在左侧，其氨基酸序列中的第1和第3个半胱氨酸形成二硫键，第2和第4个半胱氨酸形成二硫键。具有所述C¹-C³、C²-C⁴二硫键模式的毒素肽的实例包括但不限于蜂神经毒肽、α-芋螺肽、PnlA肽、PnlB肽和MII肽，以及前述任意肽的类似物。

b)C¹-C⁶、C²-C⁴和C³-C⁵二硫键，其中如上文所述，C¹、C²、C³、C⁴、C⁵和C⁶代表毒素肽的一级序列中存在的半胱氨酸残基的顺序，常规规定所述毒素肽的N末端在左侧，其氨基酸序列中的第1和第6个半胱氨酸形成二硫键，第2和第4个半胱氨酸形成二硫键，并且第3和第5个半胱氨酸形成二硫键。具有所述C¹-C⁶、C²-C⁴和C³-C⁵二硫键模式的毒素肽的实例包括但不限于ShK、BgK、HmK、AeKS、AsK和DTX1，以及前述任意肽的类似物。

c)C¹-C⁴、C²-C⁵和C³-C⁶二硫键，其中如上文所述，C¹、C²、C³、C⁴、C⁵和C⁶代表毒素肽的一级序列中存在的半胱氨酸残基的顺序，常规规定所述毒素肽的N末端在左侧，其氨基酸序列中的第1和第4个半胱氨酸形成二硫键，第2和第5个半胱氨酸形成二硫键，并且第3和第6个半胱氨酸形成二硫键。具有所述C¹-C⁴、C²-C⁵和C³-C⁶二硫键模式的毒素肽的实例包括但不限于ChTx、MgTx、OSK1、KTX1、AgTx2、Pi2、Pi3、NTX、HgTx1、BeKM1、BmKTX、P01、BmKK6、Tc32、Tc1、BmTx1、BmTX3、IbTx、P05、ScyTx、TsK、HaTx1、ProTX1、PaTX2、Ptu1、ωGVIA、ωMVIIA和SmIIIa，以及前述任意肽的类似物。

d)C¹-C⁵、C²-C⁶、C³-C⁷和C⁴-C⁸二硫键，其中C¹、C²、C³、C⁴、C⁵、C⁶、C⁷和C⁸代表毒素肽的一级序列中存在的半胱氨酸残基的顺序，常规规定所述毒素肽的N末端在左侧，其氨基酸序列中的第1和第5个半胱氨酸形成二硫键，第2和第6个半胱氨酸形成二硫键，第3和第7个半胱氨酸形成二硫键，并且第4和第8个半胱氨酸形成二硫键。具有所述C¹-C⁵、C²-C⁶、C³-C⁷和C⁴-C⁸二硫键模式的毒素肽的实例包括但不限于Anuoroctoxin(AnTx)、Pi1、HsTx1、MTX(P12A，P20A)和Pi4肽，以及前述任意肽的类似物。

e)C¹-C⁴、C²-C⁶、C³-C⁷和C⁵-C⁸二硫键，其中C¹、C²、C³、C⁴、C⁵、C⁶、C⁷和C⁸代表毒素肽的一级序列中存在的半胱氨酸残基的顺序，常规规定所述毒素肽的N末端在左侧，其氨基酸序列中的第1和第4个半胱氨酸形成二硫键，第2和第6个半胱氨酸形成二硫键，第3和第7个半胱氨酸形成二硫键，并且第5和第8个半胱氨酸形成二硫键。具有所述C¹-C⁴、C²-C⁶、C³-C⁷和C⁵-C⁸二硫键模式的毒素肽的实例包括但不限于氯毒素、Bm-12b，以及前述任意肽的类似物。

f)C¹-C⁵、C²-C⁶、C³-C⁴和C⁷-C⁸二硫键，其中C¹、C²、C³、C⁴、C⁵、C⁶、C⁷和C⁸代表毒素肽的一级序列中存在的半胱氨酸残基的顺序，常规规定所述毒素肽的N末端在左侧，其氨基酸序列中的第1和第5个半胱氨酸形成二硫键，第2和第6个半胱氨酸形成二硫键，第3和第4个半胱氨酸形成二硫键，并且第7和第8个半胱氨酸形成二硫键。具有所述C¹-C⁵、C²-C⁶、C³-C⁴和C⁷-C⁸二硫键模式的毒素肽的实例包括但不限于莫鲁蝎毒素及其类似物。

用于肽序列的术语“随机化的”是指完全随机的序列(如通过噬菌体展示方法选择的)和天然存在的分子的一个或多个残基被天然存在的分子中该位置上不存在的氨基酸残基取代的序列。用于鉴定肽序列的示例方法包括噬菌体展示、大肠杆菌展示、核糖体展示、基于酵母的筛选、RNA-肽筛选、化学筛选、合理设计、蛋白结构分析等。

术语“药理学活性”表示如此描述的物质确定为具有影响医学参数(如血压、血细胞计数、胆固醇水平)或疾病状态(如癌症、自身免疫病)的活性。因此，药理学活性肽包括如下文定义的激动肽、模拟肽和拮抗肽。

术语“模拟肽”和“激动剂肽”是指与天然存在的毒素肽分子，如天然存在的ShK毒素肽具有相似生物活性的肽。这些术语进一步包括间接模拟天然存在的毒素肽分子的活性的肽，所述模拟例如通过加强天然存在的分子的效果。

术语“拮抗剂肽”或“抑制剂肽”是指阻断或在某种程度上干扰感兴趣的受体的生物活性，或与感兴趣的受体(例如但不限于离子通道)的已知拮抗剂或抑制剂具有相似生物活性的生物活性的肽。

术语“酸性残基”是指具有包含酸性基团的侧链的D或L型氨基酸残基。示例的酸性残基包括D和E。

术语“酰胺残基”是指具有包含酸性基团的酰胺衍生物的侧链的D或L型氨基酸。示例的残基包括N和Q。

术语“芳香残基”是指具有包含芳香基团的侧链的D或L型氨基酸残基。示例的芳香残基包括F、Y和W。

术语“碱性残基”是指具有包含碱性基团的侧链的D或L型氨基酸残基。示例的碱性残基包括H、K、R、N-甲基-精氨酸、ω-氨基精氨酸、ω-甲基-精氨酸、1-甲基-组氨酸、3-甲基-组氨酸和高精氨酸(hR)残基。

术语“亲水残基”是指具有包含极性基团的侧链的D或L型氨基酸残基。示例的亲水残基包括C、S、T、N、Q、D、E、K和瓜氨酸(Cit)残基。

术语“非功能性残基”是指具有缺乏酸性、碱性或芳香基团的侧链的D或L型氨基酸残基。示例的非功能性氨基酸残基包括M、G、A、V、I、L和正亮氨酸(Nle)。

术语“中性极性残基”是指具有缺乏碱性、酸性或极性基团的侧链的D或L型氨基酸残基。示例的中性极性氨基酸残基包括A、V、L、I、P、W、M和F。

术语“极性疏水残基”是指具有包含极性基团的侧链的D或L型氨基酸残基。示例的极性疏水氨基酸残基包括T、G、S、Y、C、Q和N。

术语“疏水残基”是指具有缺乏碱性或酸性基团的侧链的D或L型氨基酸残基。示例的疏水氨基酸残基包括A、V、L、I、P、W、M、F、T、G、S、Y、C、Q和N。

在本发明的组合物的一些有用的实施方案中，相对于感兴趣的天然毒素肽序列，例如但不限于天然ShK或OSK1序列、它们的肽类似物或具有表1-32中任意一个表所示的氨基酸序列的任何其它毒素肽，以一种或多种方式对毒素肽的氨基酸序列进行了修饰。一种或多种有用的修饰可以包括通过已知化学技术实现的氨基酸添加或插入、氨基酸缺失、肽截短、氨基酸取代和/或氨基酸残基的化学衍生。这些修饰可以是例如为了增强效力、选择性和/或蛋白水解稳定性等目的。本领域技术人员了解设计具有所述增强的性质的肽类似物的技术，例如丙氨酸扫描、基于采用已知毒素肽序列和/或分子模拟进行的比对介导的诱变的合理设计。例如，可以设计ShK类似物，以便去除本发明的含有ShK肽或ShK类似物的组合物中的蛋白酶切割位点(如K或R残基处的胰蛋白酶切割位点和/或F、Y或W残基处的糜蛋白酶切割位点)，该设计是部分基于采用HmK(参见例如图6)和分子模拟的比对介导的诱变。(参见例如Kalman et al.ShK-Dap22，a potent Kv1.3-specificimmunosuppressive polypeptide，J.Biol.Chem.273(49)：32697-707(1998)；Kem et al.美国专利No.6,077,680；Mouhat et al.OsK1derivatives，WO 2006/002850 A2))。

术语“蛋白酶”与“肽酶”同义。蛋白酶包括两组酶：在蛋白内的位点切割肽键的内肽酶，和分别从N或C末端去除一个或多个氨基酸的外肽酶。术语“蛋白酶”也用作内肽酶的同义词。蛋白酶的四个从机理上区分的类别是：丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶和金属蛋白酶。除了这四个从机理上区分的类别外，酶命名法还有一部分涉及未鉴定出催化机理的蛋白酶。这表明没有鉴定出该催化机理。

切割亚位点命名法通常采纳自Schechter和Berger建立的方案(Schechter I.& Berger A.On the size of the active site in proteases.I.Papain，Biochemical and Biophysical Research Communication，27：157(1967)；Schechter I.& Berger A.On the active site of proteases.3.Mapping the active site of papain；specific inhibitor peptides of papain，Biochemical and Biophysical Research Communication，32：898(1968))。根据该模型，进行切割的底物中的氨基酸残基按照从切割的键开始的N末端方向，命名为P1、P2、P3、P4等。类似地，按照C末端方向的残基命名为P1′、P2′、P3′、P4′等。

技术人员了解许多鉴定感兴趣的蛋白酶结合或蛋白酶切割位点的工具。例如，可以从Swiss Institute of Bioinformatics(SIB；www.expasy.org/tools/peptidecutter)的ExPASy(Expert Protein AnalysisSystem)蛋白组服务器获得PeptideCutter软件工具。PeptideCutter从SWISS-PROT和/或TrEMBL数据库或用户输入的蛋白序列中检索蛋白酶切割位点。可以使用单个蛋白酶和化学物质、选定的蛋白酶和化学物质或蛋白酶和化学物质的整个列表。可以获得结果的不同形式的输出值：根据酶名称按照字母分组或根据氨基酸编号顺序分组的切割位点表。输出的第三种选择是切割位点图谱。将作图到图谱上的序列和切割位点分组成区块，可以由用户选择其大小。其它工具也是确定蛋白酶切割位点已知的。(例如Turk，B.et al.Determination of protease cleavagesite motifs using mixture-based oriented peptide libraries，NatureBiotechnology，19：661-667(2001)；Barrett A.et al.Handbook ofproteolytic enzymes，Academic Press(1998))。

丝氨酸蛋白酶包括糜蛋白酶家族，其包括哺乳动物蛋白酶如糜蛋白酶、胰蛋白酶或弹性蛋白酶或激肽释放酶。丝氨酸蛋白酶表现出不同的底物特异性，这与多种酶亚位点中的氨基酸取代相关，所述亚位点与底物残基相互作用。一些酶具有延伸的与底物的相互作用位点，而其它酶具有限制于P1底物残基的特异性。

胰蛋白酶优先切割位置P1的R或K。Keil(1992)进行的统计学研究描述了胰蛋白酶切割过程中围绕Arg-和Lys-键的残基(即分别是位置P2和P1′)的不利影响。(Keil，B.Specificity of proteolysis，Springer-Verlag Berlin-Heidelberg-NewYork，335(1992))。位置P1′的脯氨酸残基通常对胰蛋白酶切割施加很强的不利影响。类似地，R和K在P1′的定位导致抑制，以及位置P2和P1′的带负电的残基。

糜蛋白酶优先切割位置P1的W、Y或F(高特异性)，程度较低地优先切割位置P1的L、M或H残基(Keil，1992)。这些规则的例外如下：当W存在于位置P1时，当M或P同时存在于P1′时，切割被阻断。此外，位置P1′的脯氨酸残基几乎完全阻断切割，不依赖于位置P1存在的氨基酸。当M残基存在于位置P1时，Y残基在位置P1′的存在会阻断切割。最后，当H位于位置P1时，D、M或W残基的存在也阻断切割。

膜金属内肽酶(NEP；中性内肽酶，肾刷状缘中性蛋白酶，脑啡肽酶，EC 3.4.24.11)在疏水氨基酸残基的氨基侧切割肽。(Connelly，JC et al.Neutral Endopeptidase 24.11 in Human Neutrophils：Cleavage ofChemotactic Peptide，PNAS，82(24)：8737-8741(1985))。

凝血酶优先切割位置P1的R残基(Keil，1992)。凝血酶的天然底物是纤维蛋白原。最佳切割位点是R残基在位置P1，并且Gly在位置P2和位置P1′。同样，当疏水氨基酸残基在位置P4和P3，脯氨酸残基在位置P2，R残基在位置P1，非酸性氨基酸残基在位置P1′和位置P2′时也是最佳的。对于天然底物纤维蛋白原非常重要的一个残基是P10的D残基。

胱天蛋白酶是一种半胱氨酸蛋白酶家族，其携带具有保守氨基酸序列的活性位点，并且在D残基之后特异性切割肽(Earnshaw WC et al.Mammalian caspases：Structure，activation，substrates，and functions duringapoptosis，Annual Review of Biochemistry，68：383-424(1999))。

Arg-C蛋白酶优先切割位置P1的R残基。切割行为似乎仅仅受到位置P1′的残基的适当影响。(Keil，1992)。Asp-N内肽酶特异性地切割位置P1′处与D残基形成的键。(Keil，1992)。

前述内容仅仅是示例性的，不作为技术人员对蛋白酶结合和/或切割位点的知识的穷举，技术人员可能在实施本发明的过程中有兴趣排除。

在其它实例中，从天然存在的毒素肽氨基酸序列修饰得到的毒素肽氨基酸序列包括至少一个相对于感兴趣的天然毒素肽序列的氨基酸序列的氨基酸残基插入或取代，其中插入或取代的氨基酸残基具有包含亲核或亲电的反应性官能团的侧链，所述肽通过所述官能团缀合于接头或延长半衰期的部分。根据本发明，所述亲核或亲电的反应性官能团的有用实例包括但不限于硫醇、伯胺、硒代、酰肼、醛、羧酸、酮、氨基氧基、掩蔽的(保护的)醛、或掩蔽的(保护的)酮官能团。具有包含亲核的反应性官能团的侧链的氨基酸残基的实例包括但不限于赖氨酸残基、α，β-二氨基丙酸残基、α，γ-二氨基丁酸残基、鸟氨酸残基、半胱氨酸、高半胱氨酸、谷氨酸残基、天冬氨酸残基或硒代半胱氨酸残基。

在本文的毒素肽的进一步描述中，通常用一字母缩写系统表示通常掺入天然存在的肽和蛋白中的20个“规范”氨基酸残基的身份(表1A)。所述一字母缩写完全可以与三字母缩写或未缩写的氨基酸名称在含义上互换。在本文采用的一字母缩写系统中，大写字母表示L-氨基酸，小写字母表示D-氨基酸，除非本文指出其它意思。例如，缩写“R”表示L-精氨酸，缩写“r”表示D-精氨酸。

表1A.规范氨基酸的一字母缩写。三字母缩写见括号中。

丙氨酸(Ala)	A
		谷氨酰胺(Gln)	Q
亮氨酸(Leu)	L
		丝氨酸(Ser)	S
精氨酸(Arg)	R
		谷氨酸(Glu)	E
赖氨酸(Lys)	K
		苏氨酸(Thr)	T
天冬酰胺(Asn)	N
		甘氨酸(Gly)	G
甲硫氨酸(Met)	M
		色氨酸(Trp)	W
天冬氨酸(Asp)	D
		组氨酸(His)	H
苯丙氨酸(Phe)	F
		酪氨酸(Tyr)	Y
半胱氨酸(Cys)	C
		异亮氨酸(Ile)	I
脯氨酸(Pro)	P
		缬氨酸(Val)	V

氨基酸序列中的氨基酸取代在本文中典型地用特定位置的氨基酸残基的一字母缩写表示，后面是相对于感兴趣的天然毒素肽序列的氨基酸位置数，其后面是取代后的氨基酸残基的一字母符号。例如，“T30D”表示相对于假定的天然毒素肽序列，氨基酸位置30的苏氨酸残基被天冬氨酸残基取代。另一个例子，“R18hR”或“R18Cit”表示相对于假定的天然毒素肽序列，氨基酸位置18的精氨酸残基分别被高精氨酸或瓜氨酸残基取代。本文描述的任何特定毒素肽(或肽类似物)的氨基酸序列内的氨基酸位置可以与相对于天然序列的其位置，即在肽的氨基酸序列的N末端或C末端与合适的天然毒素肽序列的N末端或C末端的比对中所确定的其位置不同。例如，与天然ShK(1-35)(SEQ ID NO：5)的C末端比对的序列SCIDTIPKSRCTAFQCKHSMKYRLSFCRKTCGTC(ShK(2-35)；SEQ ID NO：92)，即天然ShK序列的N末端截短物的氨基酸位置1相应于相对于天然序列的氨基酸位置2，而SEQ IDNO：92的氨基酸位置34相应于相对于天然序列(SEQ ID NO：5)的氨基酸位置35的氨基酸。

在本发明的某些实施方案中，氨基酸取代包括非规范氨基酸残基，其可以包括天然(在肽或蛋白中)旱见的氨基酸残基或非天然氨基酸残基。非规范氨基酸残基可以通过化学肽合成而掺入肽，而不是通过生物系统如重组表达细胞中的合成，或者，技术人员可以采用已知的利用重组表达细胞的蛋白工程技术。(参见例如Link et al.Non-canonicalamino acids in protein engineering，Current Opinion in Biotechnology，14(6)：603-609(2003))。术语“非规范氨基酸残基”是指D-型或L-型氨基酸残基，它们不属于通常掺入天然存在的蛋白中的20个规范氨基酸，例如，β-氨基酸、高氨基酸、环状氨基酸和具有衍生的侧链的氨基酸。其实例包括(L-型或D-型)：瓜氨酸(Cit)、高瓜氨酸(hCit)、N-甲基瓜氨酸(NMeCit)、N-甲基高瓜氨酸(NMeHoCit)、鸟氨酸(Orn或O)、N-甲基鸟氨酸(NMeOrn)、肌氨酸(Sar)、高赖氨酸(hK or Hlys)、高精氨酸(hR或hArg)、高谷氨酰胺(hQ)、N-甲基精氨酸(NMeR)、N-甲基亮氨酸(NMeL)、N-甲基高赖氨酸(NMeHoK)、N-甲基谷氨酰胺(NMeQ)、正亮氨酸(Nle)、正缬氨酸(Nva)、1，2，3，4-四氢异喹琳(Tic)、硝基苯丙氨酸(nitrophe)、氨基苯丙氨酸(aminophe)、苄基苯丙氨酸(benzylphe)、γ-羧基谷氨酸(γ-carboxyglu)、羟脯氨酸(hydroxypro)、p-羧基-苯丙氨酸(Cpa)、α-氨基己二酸(Aad)、乙酰精氨酸(acetylarg)、α、β-二氨基丙酸(Dpr)、α、γ-二氨基丁酸(Dab)、二氨基丙酸(Dap)、β-(1-萘基)-丙氨酸(1Na1)、β-(2-萘基)-丙氨酸(2Na1)、环己基丙氨酸(Cha)、4-甲基-苯丙氨酸(MePhe)、β、β-二苯基-丙氨酸(BiPhA)、氨基丁酸(Abu)、4-苯基-苯丙氨酸(4Bip)、α-氨基-异丁酸(Aib)和上述任意这些氨基酸的衍生形式。以下文献中公开了UPAC-IUB Joint Commission on Biochemical Nomenclature(JCBN)制订的氨基酸和肽的命名法和符号：Biochem.J.1984，219，345-373；Eur.J.Biochem.1984，138，9-37；1985，152，1；1993，213，2；Internat.J.Pept.Prot.Res.1984，24，following p 84；J.Biol.Chem.1985，260，14-42；Pure Appl.Chem.1984，56，595-624；Amino Acids and Peptides，1985，16，387-410；Biochemical Nomenclatureand Related Documents，2nd edition，Portland Press，1992，39-69页]。

如本文所述，根据本发明，本发明组合物的肽部分，如毒素肽或肽接头，也可以在一个或多个氨基酸残基进行化学衍生。可以通过已知的有机化学技术合成含有衍生的氨基酸残基的肽。肽内容中的“化学衍生物”或“化学衍生的”是指具有通过功能性侧基的反应而化学衍生的一个或多个残基的目标肽。所述衍生的分子包括，例如，游离氨基衍生形成氢氧化胺、对甲苯磺酰基、苄酯基、叔丁氧羰基、氯乙酰基或甲酰基的分子。游离羰基可以衍生形成盐、甲基和乙基酯，或其它类型的酯或酰肼。游离羟基可以衍生形成O-酰基或O-烷基衍生物。组氨酸的咪唑氮可以衍生形成N-im-苄基组氨酸。化学衍生物也包括含有20个L或D型规范氨基酸的一个或多个天然存在的氨基酸衍生物的肽。例如，4-羟基脯氨酸可以取代脯氨酸；5-羟基赖氨酸可以取代赖氨酸；3-甲基组氨酸可以取代组氨酸；高丝氨酸可以取代丝氨酸；并且鸟氨酸可以取代赖氨酸。

在本发明的一些实施方案中，目标毒素肽的碱性残基(如赖氨酸)可以用其它残基(优选非功能性残基)取代。这些分子将比衍生它们的分子碱性弱，但仍然保留衍生它们的分子的活性，这可以得到稳定性和免疫原性的优点；但是，本发明不应该受该理论的限制。

此外，也包括本发明组合物的生理可接受的盐，包括本发明的组合物称作“分子”或“化合物”的情况。“生理可接受的盐”表示任何已知或后来发现是药学可接受的盐。一些实例是：乙酸盐；三氟乙酸盐；氢卤化物，如氢氯化物和氢溴化物；硫酸盐；柠檬酸盐；马来酸盐；酒石酸盐；乙醇酸盐；葡糖酸盐；琥珀酸盐；甲磺酸盐；besylate；和草酸盐。

化合物的结构：

概述。通过包括但不限于与延长半衰期的部分共价结合的方法，将重组蛋白开发为治疗剂。所述部分包括如用于Enbrel^(etanercept)的抗体的“Fc”结构域，以及如用于Neulasta^(pegfilgrastim)的生物适合的聚合物(如聚乙二醇，或“PEG”)。Feige等人在2003年12月9日授权的美国专利No.6,660,843(在此全文引入作为参考)中描述了肽的所述半衰期延长物的使用。

本发明人确定了本发明的分子(具有约80个或更少氨基酸，并且具有至少两个肽内二硫键的肽)当与延长半衰期的部分共价结合时具有治疗益处。本发明的分子可以进一步含有额外的药理学活性的共价结合的肽，其可以结合于延长半衰期的部分(F¹和/或F²)或肽部分(P)。本发明组合物的实施方案包括一个以上延长半衰期的部分(F¹和F²)，包括F¹和F²是相同或不同的延长半衰期的部分的那些。其实例(具有或不具有每个结构域之间的接头)包括图75和以下实施方案(和下文以及实施例中描述的其它实施方案)所示的结构：

20KPEG-毒素肽-Fc结构域，与式[(F¹)₁-(X²)₁-(F²)₁]一致；

20KPEG-毒素肽-Fc CH2结构域，与式[(F¹)₁-(X²)₁-(F²)₁]一致；

20KPEG-毒素肽-HSA，与式[(F¹)₁-(X²)₁-(F²)₁]一致；

20KPEG-Fc结构域-毒素肽，与式[(F¹)₁-(F²)₁-(X³)₁]一致；

20KPEG-Fc CH2结构域-毒素肽，与式[(F¹)₁-(F²)₁-(X³)₁]一致；和

20KPEG-HSA-毒素肽，与式[(F¹)₁-(F²)₁-(X³)₁]一致。

毒素肽。任何数目的毒素肽(即“P”，或等同地表示为图2中的“P¹”)可以用于本发明。特别感兴趣的是毒素肽ShK、HmK、MgTx、AgTx2、OsK1(也称作“OSK1”)，美洲蜘蛛毒素和HsTx1，以及这些毒素的修饰的类似物，和模拟这些毒素肽的活性的其它肽。如上文所述，如果本发明的组合物中存在一个以上毒素肽“P”，则“P”可以独立地与本发明的组合物中也存在的任何其它毒素肽相同或不同。例如，在具有式P-(L)_g-F¹-(L)_f-P的组合物中，这两个毒素肽“P”可以是ShK的相同肽类似物、ShK的不同肽类似物，或一个可以是ShK的肽类似物，另一个是OSK1的肽类似物。

在本发明的一些实施方案中，其它感兴趣的肽在与结构式I的分子相比具有额外特征的分子中特别有用。在所述分子中，式I的分子进一步包含额外的药理学活性的、共价结合的肽，其是激动肽、拮抗肽或靶定肽；该肽可以缀合于F¹或F²或P。所述激动肽具有激动毒素肽的活性，但不是必须通过与毒素肽相同的机理施加所述活性。肽拮抗剂也可以用于本发明的实施方案中，具有可以与毒素肽的活性互补的活性的那些是优选的。靶定肽也是感兴趣的，如指导分子到达特定细胞类型、器官等的肽。可以通过本说明书中引用的文献和其它文献中描述的方法发现这些类型的肽。具体地，噬菌体展示可以用于制备用于本发明的肽。从随机肽文库进行亲和力选择可以用于鉴定任何基因产物的任何位点的肽配体。Dedman et al.(1993)，J.Biol.Chem.268：23025-30。噬菌体展示特别适用于鉴定结合于作为细胞表面受体的所述感兴趣的蛋白或任何具有线性表位的蛋白的肽。Wilson et al.(1998)，Can.J.Microbiol.44：313-29；Kay et al.(1998)，Drug Disc.Today 3：370-8。所述蛋白在Herz et al.(1997)，J.Receptor and Signal Transduction Res.17(5)：671-776中有全面描述，在此全文引入作为参考。所述感兴趣的蛋白对用于本发明是优选的。

特别优选的肽见下表。这些肽可以通过本领域描述或下文描述的方法制备。采用单字母氨基酸缩写。除非特别指明，每个X独立地代表非功能性残基。

                           表1-Kv1.3抑制剂肽序列

序列/结构	缩写名称	SEQID NO：
			LVKCRGTSDCGRPCQQQTGCPNSKCINRMCKCYGC	Pi1	21
TISCTNPKQCYPHCKKETGYPNAKCMNRKCKCFGR	Pi2	17
			TISCTNEKQCYPHCKKETGYPNAKCMNRKCKCFGR	Pi3	18
IEAIRCGGSRDCYRPCQKRTGCPNAKCINKTCKCYGCS	Pi4	19
			ASCRTPKDCADPCRKETGCPYGKCMNRKCKCNRC	HsTx1	61
GVPINVSCTGSPQCIKPCKDAGMRFGKCMNRKCHCTPK	AgTx2	23
			GVPINVKCTGSPQCLKPCKDAGMRFGKCINGKCHCTPK	AgTx1	85
GVIINVKCKISRQCLEPCKKAGMRFGKCMNGKCHCTPK	OSK1	25
			ZKECTGPQHCTNFCRKNKCTHGKCMNRKCKCFNCK	Anuroctoxin	62
TIINVKCTSPKQCSKPCKELYGSSAGAKCMNGKCKCYNN	NTX	30
			TVIDVKCTSPKQCLPPCKAQFGIRAGAKCMNGKCKCYPH	HgTx1	27
QFTNVSCTTSKECWSVCQRLHNTSRGKCMNKKCRCYS	ChTx	36
			VFINAKCRGSPECLPKCKEAIGKAAGKCMNGKCKCYP	Titystoxin-Ka	86

VCRDWFKETACRHAKSLGNCRTSQKYRANCAKTCELC	BgK	9
			VGINVKCKHSGQCLKPCKDAGMRFGKCINGKCDCTPKG	BmKTX	26
QFTDVKCTGSKQCWPVCKQMFGKPNGKCMNGKCRCYS	BmTx1	40
			VFINVKCRGSKECLPACKAAVGKAAGKCMNGKCKCYP	Tc30	87
TGPQTTCQAAMCEAGCKGLGKSMESCQGDTCKCKA	Tc32	13

                      表2-ShK肽和ShK肽类似物序列

序列/结构	缩写名称	SEQID NO：
			RSCIDTIPKSRCTAFQCKHSMKYRLSFCRKTCGTC	ShK	5
RSCIDTIPKSRCTAFQSKHSMKYRLSFCRKTSGTC	ShK-S17/S32	88
			RSSIDTIPKSRCTAFQCKHSMKYRLSFCRKTCGTS	ShK-S3/S35	89
SSCIDTIPKSRCTAFQCKHSMKYRLSFCRKTCGTC	ShK-S1	90
			(N-acetylarg)SCIDTIPKSRCTAFQCKHSMKYRLSFCRKTCGTC	ShK-N-acetylargl	91
SCIDTIPKSRCTAFQCKHSMKYRLSFCRKTCGTC	ShK-d1	92
			CIDTIPKSRCTAFQCKHSMKYRLSFCRKTCGTC	ShK-d2	93
ASCIDTIPKSRCTAFQCKHSMKYRLSFCRKTCGTC	ShK-A1	94
			RSCADTIPKSRCTAFQCKHSMKYRLSFCRKTCGTC	ShK-A4	95
RSCADTIPKSRCTAAQCKHSMKYRLSFCRKTCGTC	SbK-A4/A15	96
			RSCADTIPKSRCTAAQCKHSMKYRASFCRKTCGTC	ShK-A4/A15/A25	97
RSCIDAIPKSRCTAFQCKHSMKYRLSFCRKTCGTC	ShK-A6	98
			RSCIDTAPKSRCTAFQCKHSMKYRLSFCRKTCGTC	ShK-A7	99
RSCIDTIAKSRCTAFQCKHSMKYRLSFCRKTCGTC	ShK-A8	100
			RSCIDTIPASRCTAFQCKHSMKYRLSFCRKTCGTC	ShK-A9	101
RSCIDTIPESRCTAFQCKHSMKYRLSFCRKTCGTC	ShK-E9	102
			RSCIDTIPQSRCTAFQCKHSMKYRLSFCRKTCGTC	ShK-Q9	103
RSCIDTIPKARCTAFQCKHSMKYRLSFCRKTCGTC	ShK-A10	104
			RSCIDTIPKSACTAFQCKHSMKYRLSFCRKTCGTC	ShK-A11	105
RSCIDTIPKSECTAFQCKHSMKYRLSFCRKTCGTC	ShK-E11	106
			RSCIDTIPKSQCTAFQCKHSMKYRLSFCRKTCGTC	ShK-Q11	107

RSCIDTIPKSRCAAFQCKHSMKYRLSFCRKTCGTC	ShK-A13	108
			RSCIDTIPKSRCTAAQCKHSMKYRLSFCRKTCGTC	ShK-A15	109
RSCIDTIPKSRCTAWQCKHSMKYRLSFCRKTCGTC	ShK-W15	110
			RSCIDTIPKSRCTAXs15QCKHSMKYRLSFCRKTCGTC	ShK-X15	111
RSCIDTIPKSRCTAAQCKHSMKYRASFCRKTCGTC	ShK-A15/A25	112
			RSCIDTIPKSRCTAFACKHSMKYRLSFCRKTCGTC	ShK-A16	113
RSCIDTIPKSRCTAFECKHSMKYRLSFCRKTCGTC	ShK-E16	114
			RSCIDTIPKSRCTAFQCAHSMKYRLSFCRKTCGTC	ShK-A18	115
RSCIDTIPKSRCTAFQCEHSMKYRLSFCRKTCGTC	ShK-E18	116
			RSCIDTIPKSRCTAFQCKASMKYRLSFCRKTCGTC	ShK-A19	117
RSCIDTIPKSRCTAFQCKKSMKYRLSFCRKTCGTC	ShK-K19	118
			RSCIDTIPKSRCTAFQCKHAMKYRLSFCRKTCGTC	ShK-A20	119
RSCIDTIPKSRCTAFQCKHSAKYRLSFCRKTCGTC	ShK-A21	120
			RSCIDTIPKSRCTAFQCKHSXs21KYRLSFCRKTCGTC	ShK-X21	121
RSCIDTIPKSRCTAFQCKHS(norleu)KYRLSFCRKTCGTC	ShK-Nle21	122
			RSCIDTIPKSRCTAFQCKHSMAYRLSFCRKTCGTC	ShK-A22	123
RSCIDTIPKSRCTAFQCKHSMEYRLSFCRKTCGTC	ShK-E22	124
			RSCIDTIPKSRCTAFQCKHSMRYRLSFCRKTCGTC	ShK-R22	125
RSCIDTIPKSRCTAFQCKHSMXs22YRLSFCRKTCGTC	ShK-X22	126
			RSCIDTIPKSRCTAFQCKHSM(norleu)YRLSFCRKTCGTC	ShK-Nle22	127
RSCIDTIPKSRCTAFQCKHSM(orn)YRLSFCRKTCGTC	ShK-Orn22	128
			RSCIDTIPKSRCTAFQCKHSM(homocit)YRLSFCRKTCGTC	ShK-Homocit22	129
RSCIDTIPKSRCTAFQCKHSM(diaminopropionic)YRLSFCRKTCGTC	ShK-Diamino-propionic22	130
			RSCIDTIPKSRCTAFQCKHSMKARLSFCRKTCGTC	ShK-A23	131
RSCIDTIPKSRCTAFQCKHSMKSRLSFCRKTCGTC	ShK-S23	132
			RSCIDTIPKSRCTAFQCKHSMKFRLSFCRKTCGTC	ShK-F23	133
RSCIDTIPKSRCTAFQCKHSMKXs23RLSFCRKTCGTC	ShK-X23	134
			RSCIDTIPKSRCTAFQCKHSMK(nitrophe)RLSFCRKTCGTC	ShK-Nitrophe23	135

RSCIDTIPKSRCTAFQCKHSMK(aminophe)RLSFCRKTCGTC	ShK-Aminophe23	136
			RSCIDTIPKSRCTAFQCKHSMK(benzylphe)RLSFCRKTCGTC	ShK-Benzylphe23	137
RSCIDTIPKSRCTAFQCKHSMKYALSFCRKTCGTC	ShK-A24	138
			RSCIDTIPKSRCTAFQCKHSMKYELSFCRKTCGTC	ShK-E24	139
RSCIDTIPKSRCTAFQCKHSMKYRASFCRKTCGTC	ShK-A25	140
			RSCIDTIPKSRCTAFQCKHSMKYRLAFCRKTCGTC	ShK-A26	141
RSCIDTIPKSRCTAFQCKHSMKYRLSACRKTCGTC	ShK-A27	142
			RSCDTIPKSRCTAFQCKHSMKYRLSXs27CRKTCGIC	ShK-X27	143
RSCIDTIPKSRCTAFQCKHSMKYRLSFCAKTCGTC	ShK-A29	144
			RSCIDTIPKSRCTAFQCKHSMKYRLSFCRATCGTC	ShK-A30	145
RSCIDTIPKSRCTAFQCKHSMKYRLSFCRKACGTC	ShK-A31	146
			RSCIDTIPKSRCTAFQCKHSMKYRLSFCRKTCGAC	ShK-A34	147
SCADTIPKSRCTAFQCKHSMKYRLSFCRKTCGTC	ShK-A4d1	148
			SCADTIPKSRCTAAQCKHSMKYRLSFCRKTCGTC	ShK-A4/A15d1	149
SCADTIPKSRCTAAQCKHSMKYRASFCRKTCGTC	ShK-A4/A15/A25d1	150
			SCIDAIPKSRCTAFQCKHSMKYRLSFCRKTCGTC	ShK-A6d1	151
SCIDTAPKSRCTAFQCKHSMKYRLSFCRKTCGTC	ShK-A7d1	152
			SCIDTIAKSRCTAFQCKHSMKYRLSFCRKTCGTC	ShK-A8d1	153
SCIDTIPASRCTAFQCKHSMKYRLSFCRKTCGTC	ShK-A9d1	154
			SCIDTIPESRCTAFQCKHSMKYRLSFCRKTCGTC	ShK-E9d1	155
SCIDTIPQSRCTAFQCKHSMKYRLSFCRKTCGTC	ShK-Q9d1	156
			SCIDTIPKARCTAFQCKHSMKYRLSFCRKTCGTC	ShK-A10d1	157
SCIDTIPKSACTAFQCKHSMKYRLSFCRKTCGTC	ShK-A11d1	158
			SCIDTIPKSECTAFQCKHSMKYRLSFCRKTCGTC	ShK-E11d1	159
SCIDTIPKSQCTAFQCKHSMKYRLSFCRKTCGTC	ShK-Q11d1	160
			SCIDTIPKSRCAAFQCKHSMKYRLSFCRKTCGTC	ShK-A13d1	161
SCIDTIPKSRCTAAQCKHSMKYRLSFCRKTCGTC	ShK-A15d1	162
			SCIDTIPKSRCTAWQCKHSMKYRLSFCRKTCGTC	ShK-W15d1	163
SCIDTIPKSRCTAXs15QCKHSMKYRLSFCRKTCGTC	ShK-X15d1	164

SCIDTIPKSRCTAAQCKHSMKYRASFCRKTCGTC	ShK-A15/A25d1	165
			SCIDTIPKSRCTAFACKHSMKYRLSFCRKTCGTC	ShK-A16d1	166
SCIDTIPKSRCTAFECKHSMKYRLSFCRKTCGTC	ShK-E16d1	167
			SCIDTIPKSRCTAFQCAHSMKYRLSFCRKTCGTC	ShK-A18d1	168
SCIDTIPKSRCTAFQCEHSMKYRLSFCRKTCGTC	ShK-E18d1	169
			SCIDTIPKSRCTAFQCKASMKYRLSFCRKTCGTC	ShK-A19d1	170
SCIDTIPKSRCTAFQCKKSMKYRLSFCRKTCGTC	ShK-K19d1	171
			SCIDTIPKSRCTAFQCKHAMKYRLSFCRKTCGTC	ShK-A20d1	172
SCIDTIPKSRCTAFQCKHSAKYRLSFCRKTCGTC	ShK-A21d1	173
			SCIDTIPKSRCTAFQCKHSXs21KYRLSFCRKTCGTC	ShK-X21d1	174
SCIDTIPKSRCTAFQCKHS(norleu)KYRLSFCRKTCGTC	ShK-Nle21d1	175
			SCIDTIPKSRCTAFQCKHSMAYRLSFCRKTCGTC	ShK-A22d1	176
SCIDTIPKSRCTAFQCKHSMEYRLSFCRKTCGTC	ShK-E22d1	177
			SCIDTIPKSRCTAFQCKHSMRYRLSFCRKTCGTC	ShK-R22d1	178
SCIDTIPKSRCTAFQCKHSMXs22YRLSFCRKTCGTC	ShK-X22d1	179
			SCIDTIPKSRCTAFQCKHSM(norleu)YRLSFCRKTCGTC	ShK-Nle22d1	180
SCIDTIPKSRCTAFQCKHSM(orn)YRLSFCRKTCGTC	ShK-Orn22d1	181
			SCIDTIPKSRCTAFQCKHSM(homocit)YRLSFCRKTCGTC	ShK-Homocit22d1	182
SCIDTIPKSRCTAFQCKHSM(diaminopropionic)YRLSFCRKTCGTC	ShK-Diamino-propionic22d1	183
			SCIDTIPKSRCTAFQCKHSMKARLSFCRKTCGTC	ShK-A23d1	184
SCIDTIPKSRCTAFQCKHSMKSRLSFCRKTCGTC	ShK-S23d1	185
			SCIDTIPKSRCTAFQCKHSMKFRLSFCRKTCGTC	ShK-F23d1	186
SCIDTIPKSRCTAFQCKHSMKXs23RLSFCRKTCGTC	ShK-X23d1	187
			SCIDTIPKSRCTAFQCKHSMK(nitrophe)RLSFCRKTCGTC	ShK-Nitrophe23d1	188
SCIDTIPKSRCTAFQCKHSMK(aminophe)RLSFCRKTCGTC	ShK-Aminophe23d1	189
			SCIDTIPKSRCTAFQCKHSMK(benzylphe)RLSFCRKTCGTC	ShK-Benzylphe23d1	190
SCIDTIPKSRCTAFQCKHSMKYALSFCRKTCGTC	ShK-A24d1	191
			SCIDTIPKSRCTAFQCKHSMKYELSFCRKTCGTC	ShK-E24d1	192
SCIDTIPKSRCTAFQCKHSMKYRASFCRKTCGTC	ShK-A25d1	193
			SCIDTIPKSRCTAFQCKHSMKYRLAFCRKTCGTC	ShK-A26d1	194

SCIDTIPKSRCTAFQCKHSMKYRLSACRKTCGTC	ShK-A27d1	195
			SCIDTIPKSRCTAFQCKHSMKYRLSXs27CRKTCGTC	ShK-X27d1	196
SCIDTIPKSRCTAFQCKHSMKYRLSFCAKTCGTC	ShK-A29d1	197
			SCIDTIPKSRCTAFQCKHSMKYRLSFCRATCGTC	ShK-A30d1	198
SCIDTIPKSRCTAFQCKHSMKYRLSFCRKACGTC	ShK-A31d1	199
			SCIDTIPKSRCTAFQCKHSMKYRLSFCRKTCGAC	ShK-A34d1	200
YSCIDTIPKSRCTAFQCKHSMKYRLSFCRKTCGTC	ShK-Y1	548
			KSCIDTIPKSRCTAFQCKHSMKYRLSFCRKTCGTC	ShK-K1	549
HSCIDTIPKSRCTAFQCKHSMKYRLSFCRKTCGTC	ShK-H1	550
			QSCIDTIPKSRCTAFQCKHSMKYRLSFCRKTCGTC	ShK-Q1	551
PPRSCIDTIPKSRCTAFQCKHSMKYRLSFCRKTCGTC	PP-ShK	552
			MRSCIDTIPKSRCTAFQCKHSMKYRLSFCRKTCGTC	M-ShK	553
GRSCIDTIPKSRCTAFQCKHSMKYRLSFCRKTCGTC	G-ShK	554
			YSCIDTIPKSRCTAFQCKHSMAYRLSFCRKTCGTC	ShK-Y1/A22	555
KSCIDTIPKSRCTAFQCKHSMAYRLSFCRKTCGTC	ShK-K1/A22	556
			HSCIDTIPKSRCTAFQCKHSMAYRLSFCRKTCGTC	ShK-H1/A22	557
QSCIDTIPKSRCTAFQCKHSMAYRLSFCRKTCGTC	ShK-Q1/A22	558
			PPRSCIDTIPKSRCTAFQCKHSMAYRLSFCRKTCGTC	PP-ShK-A22	559
MRSCIDTIPKSRCTAFQCKHSMAYRLSFCRKTCGTC	M-ShK-A22	560
			GRSCIDTIPKSRCTAFQCKHSMAYRLSFCRKTCGTC	G-ShK-A22	561
RSCIDTIPASRCTAFQCKHSMAYRLSFCRKTCGTC	ShK-A9/A22	884
			SCIDTIPASRCTAFQCKHSMAYRLSFCRKTCGTC	ShK-A9/A22d1	885
RSCIDTIPVSRCTAFQCKHSMKYRLSFCRKTCGTC	ShK-V9	886
			RSCIDTIPVSRCTAFQCKHSMAYRLSFCRKTCGTC	ShK-V9/A22	887
SCIDTIPVSRCTAFQCKHSMKYRLSFCRKTCGTC	ShK-V9d1	888
			SCIDTIPVSRCTAFQCKHSMAYRLSFCRKTCGTC	ShK-V9/A22d1	889
RSCIDTIPESRCTAFQCKHSMAYRLSFCRKTCGTC	ShK-E9/A22	890
			SCIDTIPESRCTAFQCKHSMAYRLSFCRKTCGTC	ShK-E9/A22d1	891
RSCIDTIPKSACTAFQCKHSMAYRLSFCRKTCGTC	ShK-A11/A22	892
			SCIDTIPKSACTAFQCKHSMAYRLSFCRKTCGTC	ShK-A11/22d1	893
RSCIDTIPKSECTAFQCKHSMAYRLSFCRKTCGTC	ShK-E11/A22	894

SCIDTIPKSECTAFQCKHSMAYRLSFCRKTCGTC	ShK-E11/A22d1	895
			RSCIDTIPKSRCTDFQCKHSMKYRLSFCRKTCGTC	ShK-D14	896
RSCIDTIPKSRCTDFQCKHSMAYRLSFCRKTCGTC	ShK-D14/A22	897
			SCIDTIPKSRCTDFQCKHSMKYRLSFCRKTCGTC	ShK-D14d1	898
SCIDTIPKSRCTDFQCKHSMAYRLSFCRKTCGTC	ShK-D14/A22d1	899
			RSCIDTIPKSRCTAAQCKHSMAYRLSFCRKTCGTC	ShK-A15/A22	900
SCIDTIPKSRCTAAQCKHSMAYRLSFCRKTCGTC	ShK-A15/A22d1	901
			RSCIDTIPKSRCTAIQCKHSMKYRLSFCRKTCGTC	ShK-I15	902
RSCIDTIPKSRCTAIQCKHSMAYRLSFCRKTCGTC	ShK-I15/A22	903
			SCIDTIPKSRCTAIQCKHSMKYRLSFCRKTCGTC	ShK-I15d1	904
SCIDTIPKSRCTAIQCKHSMAYRLSFCRKTCGTC	ShK-I15/A22d1	905
			RSCIDTIPKSRCTAVQCKHSMKYRLSFCRKTCGTC	ShK-V15	906
RSCIDTIPKSRCTAVQCKHSMAYRLSFCRKTCGTC	ShK-V15/A22	907
			SCIDTIPKSRCTAVQCKHSMKYRLSFCRKTCGTC	ShK-V15d 1	908
SCIDTIPKSRCTAVQCKHSMAYRLSFCRKTCGTC	ShK-V15/A22d1	909
			RSCIDTIPKSRCTAFRCKHSMKYRLSFCRKTCGTC	ShK-R16	910
RSCIDTIPKSRCTAFRCKHSMAYRLSFCRKTCGTC	ShK-R16/A22	911
			SCIDTIPKSRCTAFRCKHSMKYRLSFCRKTCGTC	ShK-R16d1	912
SCIDTIPKSRCTAFRCKHSMAYRLSFCRKTCGTC	ShK-R16/A22d1	913
			RSCIDTIPKSRCTAFKCKHSMKYRLSFCRKTCGTC	ShK-K16	914
RSCIDTIPKSRCTAFKCKHSMAYRLSFCRKTCGTC	ShK-K16/A22	915
			SCIDTIPKSRCTAFKCKHSMKYRLSFCRKTCGTC	ShK-K16d1	916
SCIDTIPKSRCTAFKCKHSMAYRLSFCRKTCGTC	ShK-K16/A22d1	917
			RSCIDTIPASECTAFQCKHSMKYRLSFCRKTCGTC	ShK-A9/E11	918
RSCIDTIPASECTAFQCKHSMAYRLSFCRKTCGTC	ShK-A9/E11/A22	919
			SCIDTIPASECTAFQCKHSMKYRLSFCRKTCGTC	ShK-A9/E11d1	920
SCIDTIPASECTAFQCKHSMAYRLSFCRKTCGTC	ShK-A9/E11/A22d1	921
			RSCIDTIPVSECTAFQCKHSMKYRLSFCRKTCGTC	ShK-V9/E11	922
RSCIDTIPVSECTAFQCKHSMAYRLSFCRKTCGTC	ShK-V9/E11/A22	923
			SCIDTIPVSECTAFQCKHSMKYRLSFCRKTCGTC	ShK-V9/E11d1	924
SCIDTIPVSECTAFQCKHSMAYRLSFCRKTCGTC	ShK-V9/E11/A22d1	925

RSCIDTIPVSACTAFQCKHSMKYRLSFCRKTCGTC	ShK-V9/A11	926
			RSCIDTIPVSACTAFQCKHSMAYRLSFCRKTCGTC	ShK-V9/A11/A22	927
SCIDTIPVSACTAFQCKHSMKYRLSFCRKTCGTC	ShK-V9/A11d1	928
			SCIDTIPVSACTAFQCKHSMAYRLSFCRKTCGTC	ShK-V9/A11/A22d1	929
RSCIDTIPASACTAFQCKHSMKYRLSFCRKTCGTC	ShK-A9/A11	930
			RSCIDTIPASACTAFQCKHSMAYRLSFCRKTCGTC	ShK-A9/A11/A22	931
SCIDTIPASACTAFQCKHSMKYRLSFCRKTCGTC	ShK-A9/A11d1	932
			SCIDTIPASACTAFQCKHSMAYRLSFCRKTCGTC	ShK-A9/A11/A22d1	933
RSCIDTIPKSECTDIRCKHSMKYRLSFCRKTCGTC	ShK-E11/D14/I15/R16	934
			RSCIDTIPKSECTDIRCKHSMAYRLSFCRKTCGTC	ShK-E11/D14/I15/R16/A22	935
SCIDTIPKSECTDIRCKHSMKYRLSFCRKTCGTC	ShK-E11/D14/I15/R16d1	936
			SCIDTIPKSECTDIRCKHSMAYRLSFCRKTCGTC	ShK-E11/D14/I15//R16A22d1	937
RSCIDTIPVSECTDIRCKHSMKYRLSFCRKTCGTC	ShK-V9/E11/D14/I15/R16	938
			RSCIDTIPVSECTDIRCKHSMAYRLSFCRKTCGTC	ShK-V9/E11/D14/I15/R16/A22	939
SCIDTIPVSECTDIRCKHSMKYRLSFCRKTCGTC	ShK-V9/E11/D14/I15/R16d1	940
			SCIDTIPVSECTDIRCKHSMAYRLSFCRKTCGTC	ShK-V9/E11/D14/I15/R16/A22d1	941
RSCIDTIPVSECTDIQCKHSMKYRLSFCRKTCGTC	ShK-V9/E11/D14/I15	942
			RSCIDTIPVSECTDIQCKHSMAYRLSFCRKTCGTC	ShK-V9/E11/D14/I15/A22	943
SCIDTIPVSECTDIQCKHSMKYRLSFCRKTCGTC	ShK-V9/E11/D14/I15d1	944

SCIDTIPVSECTDIQCKHSMAYRLSFCRKTCGTC	ShK-V9/E11/D14/I15/A22d1	945
			RTCKDLIPVSECTDIRCKHSMKYRLSFCRKTCGTC	ShK-T2/K4/L6/V9/E11/D14/I15/R16	946
RTCKDLIPVSECTDIRCKHSMAYRLSFCRKTCGTC	ShK-T2/K4/L6/V9/E11/D14/I15/R16/A22	947
			TCKDLIPVSECTDIRCKHSMKYRLSFCRKTCGTC	ShK-T2/K4/L6/V9/E11/D14/I15/R16d1	948
TCKDLIPVSECTDIRCKHSMAYRLSFCRKTCGTC	ShK-T2/K4/L6/V9/E11/D14/I15/R16/A22d1	949
			(L-Phosphotyrosine)-AEEARSCIDTIPKSRCTAFQCKHSMKYRLSFCRKTCGTC	ShK(L5)	950
QSCADTIPKSRCTAAQCKHSMKYRLSFCRKTCGTC	ShK Q1/A4/A15	1295
			QSCADTIPKSRCTAAQCKHSMAYRLSFCRKTCGTC	ShK Q1/A4/A15/A22	1296
QSCADTIPKSRCTAAQCKHSM(Dap)YRLSFCRKTCGTC	ShK Q1/A4/A15/Dap22	1297
			QSCADTIPKSRCTAAQCKHSMKYRASFCRKTCGTC	ShK Q1/A4/A15/A25	1298
QSCADTIPKSRCTAAQCKHSMAYRASFCRKTCGTC	ShK Q1/A4/A15/A22/A25	1299
			QSCADTIPKSRCTAAQCKHSM(Dap)YRASFCRKTCGTC	ShK Q1/A4/A15/Dap22/A25	1300

可以按照2000年6月20日授权给Kem等人的美国专利No.6,077,680中的描述制备表2描述的很多肽，在此全文引入该专利作为参考。可以通过本领域已知的技术制备表2的其它肽。例如，可以按照Beeton et al.Targeting effector memory T cells with a selective peptideinhibitor of Kv1.3 channels for therapy of autoimmune diseases，Molec.Pharmacol.67(4)：1369-81(2005)中的描述制备ShK(L5)(SEQ IDNO：950)，在此全文引入该文献作为参考。在表2和整个说明书中，X^s15、X^s21、X^s22、X^s23和X^s27各自独立地表示非功能性氨基酸残基。

                      表3-HmK、BgK、AeK和AsKS肽和肽类似物序列

序列/结构	缩写名称	SEQID NO：
			RTCKDLIPVSECTDIRCRTSMKYRLNLCRKTCGSC	HmK	6
ATCKDLIPVSECTDIRCRTSMKYRLNLCRKTCGSC	HmK-A1	201
			STCKDLIPVSECTDIRCRTSMKYRLNLCRKTCGSC	HmK-S1	202
TCKDLIPVSECTDIRCRTSMKYRLNLCRKTCGSC	HmK-d1	203
			SCKDLIPVSECTDIRCRTSMKYRLNLCRKTCGSC	HmK-d1/S2	204
TCIDLIPVSECTDIRCRTSMKYRLNLCRKTCGSC	HmK-d1/I4	205
			TCKDTIPVSECTDIRCRTSMKYRLNLCRKTCGSC	HmK-d1/T6	206
TCKDLIPKSECTDIRCRTSMKYRLNLCRKTCGSC	HmK-d1/K9	207
			TCKDLIPVSRCTDIRCRTSMKYRLNLCRKTCGSC	HmK-d1/R11	208
TCKDLIPVSECTAIRCRTSMKYRLNLCRKTCGSC	HmK-d1/A14	209
			TCKDLIPVSECTDFRCRTSMKYRLNLCRKTCGSC	HmK-d1/F15	210
TCKDLIPVSECTDIQCRTSMKYRLNLCRKTCGSC	HmK-d1/Q16	211
			TCKDLIPVSECTDIRCKTSMKYRLNLCRKTCGSC	HmK-d1/K18	212
TCKDLIPVSECTDIRCRHSMKYRLNLCRKTCGSC	HmK-d1/H19	213
			TCKDLIPVSECTDIRCRTSMKYRLSLCRKTCGSC	HmK-d1/S26	214
TCKDLIPVSECTDIRCRTSMKYRLNFCRKTCGSC	HmK-d1/F27	215
			TCKDLIPVSECTDIRCRTSMKYRLNLCRKTCGTC	HmK-d1/T34	216
TCKDLIPVSRCTDIRCRTSMKYRLNFCRKTCGSC	HmK-d1/R11/F27	217
			ATCKDLIPVSRCTDIRCRTSMKYRLNFCRKTCGSC	HmK-A1/R11/F27	218
TCIDTIPKSRCTAFQCKHSMKYRLSFCRKTCGSC	HmK-d1/Z1	219
			TCIDTIPKSRCTAFQCRTSMKYRLNFCRKTCGSC	HmK-d1/Z2	220
TCADLIPASRCTAIACRTSMKYRLNFCRKTCGSC	HmK-d1/Z3	221

TCADLIPASRCTAIACKHSMKYRLNFCRKTCGSC	HmK-d1/Z4	222
			TCADLIPASRCTAIACAHSMKYRLNFCRKTCGSC	HmK-d1/Z5	223
RTCKDLIPVSECTDIRCRTSMXh22YRLNLCRKTCGSC	HmK-X22	224
			ATCKDLXh6PVSRCTDIRCRTSMKXh22RLNXh26CRKTCGSC	HmK-X6，22，26	225
VCRDWFKETACRHAKSLGNCRTSQKYRANCAKTCELC	BgK	9
			ACRDWFKETACRHAKSLGNCRTSQKYRANCAKTCELC	BgK-A1	226
VCADWFKETACRHAKSLGNCRTSQKYRANCAKTCELC	BgK-A3	227
			VCRDAFKETACRHAKSLGNCRTSQKYRANCAKTCELC	BgK-A5	228
VCRDWFKATACRHAKSLGNCRTSQKYRANCAKTCELC	BgK-A8	229
			VCRDWFKEAACRHAKSLGNCRTSQKYRANCAKTCELC	BgK-A9	230
VCRDWFKETACAHAKSLGNCRTSQKYRANCAKTCELC	BgK-A12	231
			VCRDWFKETACRHAASLGNCRTSQKYRANCAKTCELC	BgK-A15	232
VCRDWFKETACRHAKALGNCRTSQKYRANCAKTCELC	BgK-A16	233
			VCRDWFKETACRHAKSAGNCRTSQKYRANCAKTCELC	BgK-A17	234
VCRDWFKETACRHAKSLGNCATSQKYRANCAKTCELC	BgK-A21	235
			VCRDWFKETACRHAKSLGNCRASQKYRANCAKTCELC	BgK-A22	236
VCRDWFKETACRHAKSLGNCRTSQKYAANCAKTCELC	BgK-A27	237
			VCRDWFKETACRHAKSLGNCRTSQKYRANCAATCELC	BgK-A32	238
VCRDWFKETACRHAKSLGNCRTSQKYRANCAKACELC	BgK-A33	239
			VCRDWFKETACRHAKSLGNCRTSQKYRANCAKTCALC	BgK-A35	240
VCRDWFKETACRHAKSLGNCRTSQKYRANCAKTCEAC	BgK-A37	241
			GCKDNFSANTCKHVKANNNCGSQKYATNCAKTCGKC	AeK	7
ACKDNFAAATCKHVKENKNCGSQKYATNCAKTCGKC	AsKS	8

在表3和整个说明书中，X^h6、X^h22、X^h26各自独立地代表非功能性残基。

表4-MgTx肽和MgTx肽类似物序列

序列/结构	缩写名称	SEQID NO：
			TIINVKCTSPKQCLPPCKAQFGQSAGAKCMNGKCKCYPH	MgTx	28
TIINVACTSPKQCLPPCKAQFGQSAGAKCMNGKCKCYPH	MgTx-A6	242
			TIINVSCTSPKQCLPPCKAQFGQSAGAKCMNGKCKCYPH	MgTx-S6	243
TIINVKCTSPAQCLPPCKAQFGQSAGAKCMNGKCKCYPH	MgTx-A11	244
			TIINVKCTSPKQCLPPCAAQFGQSAGAKCMNGKCKCYPH	MgTx-A18	245
TIINVKCTSPKQCLPPCKAQFGQSAGAACMNGKCKCYPH	MgTx-A28	246
			TIINVKCTSPKQCLPPCKAQFGQSAGAKCMNGACKCYPH	MgTx-A33	247
TIINVKCTSPKQCLPPCKAQFGQSAGAKCMNGKCACYPH	MgTx-A35	248
			TIINVKCTSPKQCLPPCKAQFGQSAGAKCMNGKCKCYPN	MgTx-H39N	249
TIINVACTSPKQCLPPCKAQFGQSAGAKCMNGKCKCYPN	MgTx-A6/H39N	250
			TIINVSCTSPKQCLPPCKAQFGQSAGAKCMNGKCKCYS	MgTx-S6/38/d39	251
TIITISCTSPKQCLPPCKAQFGQSAGAKCMNGKCKCYPH	MgTx-T4/I5/S6	252
			TISCTSPKQCLPPCKAQFGQSAGAKCMNGKCKCYPH	MgTx-d3/T4/I5/S6	253
TISCTSPKQCLPPCKAQFGQSAGAKCMNGKCKCFGR	MgTx-Pi2	254
			NVACTSPKQCLPPCKAQFGQSAGAKCMNGKCKCYPH	MgTx-d3/A6	255
QFTNVSCTSPKQCLPPCKAQFGQSAGAKCMNGKCKCYS	MgTx-ChTx	256
			QFTDVDCTSPKQCLPPCKAQFGQSAGAKCMNGKCKCYQ	MgTx-IbTx	257
IINVSCTSPKQCLPPCKAQFGQSAGAKCMNGKCKCYPH	MgTx-Z1	258
			IITISCTSPKQCLPPCKAQFGQSAGAKCMNGKCKCYPH	MgTx-Z2	259
GVIINVSCTSPKQCLPPCKAQFGQSAGAKCMNGKCKCYPH	MgTx-Z3	260

可以按照申请人为Merck & Co.Inc的1995年2月2日公开的WO95/03065中的描述制备表4中描述的很多肽。该申请相应于1993年7月22日提交的美国系列No.07/096,942。

表5-AgTx2肽和AgTx2肽类似物序列

序列/结构	缩写名称	SEQID NO：
			GVPINVSCTGSPQCIKPCKDAGMRFGKCMNRKCHCTPK	AgTx2	23
GVPIAVSCTGSPQCIKPCKDAGMRFGKCMNRKCHCTPK	AgTx2-A5	261
			GVPINVSCTGSPQCLAPCKDAGMRFGKCMNRKCHCTPK	AgTx2-A16	262
GVPINVSCTGSPQCIKPCADAGMRFGKCMNRKCHCTPK	AgTx2-A19	263
			GVPINVSCTGSPQCIKPCKDAGMAFGKCMNRKCHCTPK	AgTx2-A24	264
GVPINVSCTGSPQCIKPCKDAGMRFGACMNRKCHCTPK	AgTx2-A27	265
			GVPINVSCTGSPQCIKPCKDAGMRFGKCMNAKCHCTPK	AgTx2-A31	266
GVPINVSCTGSPQCIKPCKDAGMRFGKCMNRACHCTPK	AgTx2-A32	267
			GVPINVSCTGSPQCIKPCKDAGMRFGKCMNRKCHCTPA	AgTx2-A38	268
GVPIAVSCTGSPQCIKPCKDAGMRFGKCMNRKCHCTPA	AgTx2-A5/A38	269
			GVPINVSCTGSPQCIKPCKDAGMRFGKCMNGKCHCTPK	AgTx2-G31	270
GVPIIVSCKGSRQCIKPCKDAGMRFGKCMNGKCHCTPK	AgTx2-OSK_z1	271
			GVPIIVSCKISRQCIKPCKDAGMRFGKCMNGKCHCTPK	AgTx2-OSK_z2	272
GVPIIVKCKGSRQCIKPCKDAGMRFGKCMNGKCHCTPK	AgTx2-OSK_z3	273
			GVPIIVKCKISRQCIKPCKDAGMRFGKCMNGKCHCTPK	AgTx2-OSK_z4	274
GVPIIVKCKISRQCIKPCKDAGMRFGKCMNGKCHCTPK	AgTx2-OSK_z5	275

表6-Heteromitrus spinnifer(HsTx1)肽和HsTx1肽类似物序列

序列/结构	缩写名称	SEQID NO：
			ASCRTPKDCADPCRKETGCPYGKCMNRKCKCNRC	HsTx1	61
ASCXTPKDCADPCRKETGCPYGKCMNRKCKCNRC	HsTx1-X4	276
			ASCATPKDCADPCRKETGCPYGKCMNRKCKCNRC	HsTx1-A4	277
ASCRTPXDCADPCRKETGCPYGKCMNRKCKCNRC	HsTx1-X7	278
			ASCRTPADCADPCRKETGCPYGKCMNRKCKCNRC	HsTx1-A7	279
ASCRTPKDCADPCXKETGCPYGKCMNRKCKCNRC	HsTx1-X14	280
			ASCRTPKDCADPCAKETGCPYGKCMNRKCKCNRC	HsTx1-A14	281
ASCRTPKDCADPCRXETGCPYGKCMNRKCKCNRC	HsTx1-X15	282

ASCRTPKDCADPCRAETGCPYGKCMNRKCKCNRC	HsTx1-A15	283
			ASCRTPKDCADPCRKETGCPYGXCMNRKCKCNRC	HsTx1-X23	284
ASCRTPKDCADPCRKETGCPYGACMNRKCKCNRC	HsTx1-A23	285
			ASCRTPKDCADPCRKETGCPYGKCMNXKCKCNRC	HsTx1-X27	286
ASCRTPKDCADPCRKETGCPYGKCMNAKCKCNRC	HsTx1-A27	287
			ASCRTPKDCADPCRKETGCPYGKCMNRXCKCNRC	HsTx1-X28	288
ASCRTPKDCADPCRKETGCPYGKCMNRACKCNRC	HsTx1-A28	289
			ASCRTPKDCADPCRKETGCPYGKCMNRKCXCNRC	HsTx1-X30	290
ASCRTPKDCADPCRKETGCPYGKCMNRKCACNRC	HsTx1-A30	291
			ASCRTPKDCADPCRKETGCPYGKCMNRKCKCNXC	HsTx1-X33	292
ASCRTPKDCADPCRKETGCPYGKCMNRKCKCNAC	HsTx1-A33	293

可以按照2004年2月10日授权给Lebrun等人的美国专利No.6,689,749中的描述制备表5中描述的肽，在此全文引入该文献作为参考。

表7-Orthochirus scrobiculosus(OSK1)肽和OSK1肽类似物序列

序列/结构	缩写名称	SEQID NO：
			GVIINVKCKISRQCLEPCKKAGMRFGKCMNGKCHCTPK	OSK1	25
GVIINVSCKISRQCLEPCKKAGMRFGKCMNGKCHCTPK	OSK1-S7	1303
			GVIINVKCKISRQCLKPCKKAGMRFGKCMNGKCHCTPK	OSK1-K16	294
GVIINVKCKISRQCLEPCKDAGMRFGKCMNGKCHCTPK	OSK1-D20	295
			GVIINVKCKISRQCLKPCKDAGMRFGKCMNGKCHCTPK	OSK1-K16，D20	296
GVIINVSCKISRQCLKPCKDAGMRFGKCMNGKCHCTPK	OSK1-S7，K16，D20	1308
			GVIINVKCKISPQCLKPCKDAGMRFGKCMNGKCHCTPK	OSK1-P12，K16，D20	297
GVIINVKCKISRQCLKPCKDAGMRFGKCMNGKCHCYPK	OSK1-K16，D20，Y36	298
			Ac-GVIINVKCKISPQCLKPCKDAGMRFGKCMNGKCHCTPK	Ac-OSK1-P12，K16，D20	562
GVIINVKCKISPQCLKPCKDAGMRFGKCMNGKCHCTPK-NH2	OSK1-P12，K16，D20-NH2	563

Ac-GVIINVKCKISPQCLKPCKDAGMRFGKCMNGKCHCTPK-NH2	Ac-OSK1-P12，K16，D20-NH2	564
			GVIINVKCKISRQCLKPCKDAGMRFGKCMNGKCHCYPK-NH2	OSK1-K16，D20，Y36-NH2	565
Ac-GVIINVKCKISRQCLKPCKDAGMRFGKCMNGKCHCYPK	Ac-OSK1-K16，D20，Y36	566
			Ac-GVIINVKCKISRQCLKPCKDAGMRFGKCMNGKCHCYPK-NH2	Ac-OSK1-K16，D20，Y36-NH2	567
GVIINVKCKISRQCLKPCKKAGMRFGKCMNGKCHCTPK-NH2	OSK1-K16-NH2	568
			Ac-GVIINVKCKISRQCLKPCKKAGMRFGKCMNGKCHCTPK	Ac-OSK1-K16	569
Ac-GVIINVKCKISRQCLKPCKKAGMRFGKCMNGKCHCTPK-NH2	Ac-OSK1-K16-NH2	570
			Ac-GVIINVKCKISRQCLEPCKDAGMRFGKCMNGKCHCTPK	Ac-OSK1-D20	571
GVIINVKCKISRQCLEPCKDAGMRFGKCMNGKCHCTPK-NH2	OSK1-D20-NH2	572
			Ac-GVIINVKCKISRQCLEPCKDAGMRFGKCMNGKCHCTPK-NH2	Ac-OSK1-D20-NH2	573
GVIINVKCKISRQCLEPCKKAGMRFGKCMNGKCHCTPK-NH2	OSK1-NH2	574
			Ac-GVIINVKCKISRQCLEPCKKAGMRFGKCMNGKCHCTPK	Ac-OSK1	575
Ac-GVIINVKCKISRQCLEPCKKAGMRFGKCMNGKCHCTPK-NH2	Ac-OSK1-NH2	576
			GVIINVKCKISRQCLKPCKDAGMRFGKCMNGKCHCTPK-NH2	OSK1-K16，D20-NH2	577
Ac-GVIINVKCKISRQCLKPCKDAGMRFGKCMNGKCHCTPK	Ac-OSK1-K16，D20	578

Ac-GVIINVKCKISRQCLKPCKDAGMRFGKCMMNGKCHCTPK-NH2	Ac-OSK1-K16，D20-NH2	579
			VIINVKCKISRQCLEPCKKAGMRFGKCMNGKCHCTPK	Δ1-OSK1	580
Ac-VIINVKCKISRQCLEPCKKAGMRFGKCMNGKCHCTPK	Ac-Δ1-OSK1	581
			VIINVKCKISRQCLEPCKKAGMRFGKCMNGKCHCTPK-NH2	Δ1-OSK1-NH2	582
Ac-VIINVKCKISRQCLEPCKKAGMRFGKCMNGKCHCTPK-NH2	Ac-Δ1-OSK1-NH2	583
			GVIINVKCKISRQCLEPCKKAGMRFGKCMNGKCACTPK	OSK1-A34	584
Ac-GVIINVKCKISRQCLEPCKKAGMRFGKCMNGKCACTPK	Ac-OSK1-A34	585
			GVIINVKCKISRQCLEPCKKAGMRFGKCMNGKCACTPK-NH2	OSK1-A34-NH2	586
Ac-GVIINVKCKISRQCLEPCKKAGMRFGKCMNGKCACTPK-NH2	Ac-OSK1-A34-NH2	587
			VIINVKCKISRQCLKPCKDAGMRFGKCMNGKCHCTPK	Δ1-OSK1-K16，D20	588
Ac-VIINVKCKISRQCLKPCKDAGMRFGKCMNGKCHCTPK	Ac-Δ1-OSK1-K16，D20	589
			VIINVKCKISRQCLKPCKDAGMRFGKCMNGKCHCTPK-NH2	Δ1-OSK1-K16，D20-NH2	590
Ac-VIINVKCKISRQCLKPCKDAGMRFGKCMNGKCHCTPK-NH2	Ac-Δ1-OSK1-K16，D20-NH2	591
			NVKCKISRQCLKPCKDAGMRFGKCMNGKCHCTPK	(Δ1-4)-OSK1-K16，D20	592
Ac-NVKCKISRQCLKPCKDAGMRFGKCMNGKCHCTPK	Ac-(Δ1-4)-OSK1-K16，D20	593

NVKCKISRQCLKPCKDAGMRFGKCMNGKCHCTPK-NH2	(Δ1-4)-OSK1-K16，D20-NH2	594
			Ac-NVKCKISRQCLKPCKDAGMRFGKCMNGKCHCTPK-NH2	Ac-(Δ1-4)-OSK1-K16，D20-NH2	595
KCKISRQCLKPCKDAGMRFGKCMNGKCHCTPK	(Δ1-6)-OSK1-K16，D20	596
			Ac-KCKISRQCLKPCKDAGMRFGKCMNGKCHCTPK	Ac-(Δ1-6)-OSK1-K16，D20	597
KCKISRQCLKPCKDAGMRFGKCMNGKCHCTPK-NH2	(Δ1-6)-OSK1-K16，D20-NH2	598
			Ac-KCKISRQCLKPCKDAGMRFGKCMNGKCHCTPK-NH2	Ac-(Δ1-6)-OSK1-K16，D20-NH2	599
CKISRQCLKPCKDAGMRFGKCMNGKCHCTPK	(Δ1-7)-OSK1-K16，D20	600
			Ac-CKISRQCLKPCKDAGMRFGKCMNGKCHCTPK	Ac-(Δ1-7)-OSK1-K16，D20	601
CKISRQCLKPCKDAGMRFGKCMNGKCHCTPK-NH2	(Δ1-7)-OSK1-K16，D20-NH2	602
			Ac-CKISRQCLKPCKDAGMRFGKCMNGKCHCTPK-NH2	Ac-(Δ1-7)-OSK1-K16，D20-NH2	603
GVIINVKCKISRQCLKPCKDAGMRNGKCMNGKCHCTPK	OSK1-K16，D20，N25	604
			GVIINVKCKISRQCLKPCKDAGMRNGKCMNGKCHCTPK-NH2	OSK1-K16，D20，N25-NH2	605
Ac-GVIINVKCKISRQCLKPCKDAGMRNGKCMNGKCHCTPK	Ac-OSK1-K16，D20，N25	606
			Ac-GVIINVKCKISRQCLKPCKDAGMRNGKCMNGKCHCTPK-NH2	Ac-OSK1-K16，D20，N25-NH2	607

GVIINVKCKISRQCLKPCKDAGMRFGKCMNRKCHCTPK	OSK1-K16，D20，R31	608
			GVIINVKCKISRQCLKPCKDAGMRFGKCMNRKCHCTPK-NH2	OSK1-K16，D20，R31-NH2	609
Ac-GVIINVKCKISRQCLKPCKDAGMRFGKCMNRKCHCTPK	Ac-OSK1-K16，D20，R31	610
			Ac-GVIINVKCKISRQCLKPCKDAGMRFGKCMNRKCHCTPK-NH2	Ac-OSK1-K16，D20，R31-NH2	611
GVIINVKCKISKQCLKPCRDAGMRFGKCMNGKCHCTPK	OSK1-K12，K16，R19，D20	612
			Ac-GVIINVKCKISKQCLKPCRDAGMRFGKCMNGKCHCTPK	Ac-OSK1-K12，K16，R19，D20	613
GVIINVKCKISKQCLKPCRDAGMRFGKCMNGKCHCTPK-NH2	OSK1-K12，K16，R19，D20-NH2	614
			Ac-GVIINVKCKISKQCLKPCRDAGMRFGKCMNGKCHCTPK-NH2	Ac-OSK1-K12，K16，R19，D20-NH2	615
TIINVKCKISRQCLKPCKDAGMRFGKCMNGKCHCTPK	Δ1-OSK1-T2，K16，D20	616
			Ac-TIINVKCKISRQCLKPCKDAGMRFGKCMNGKCHCTPK	Ac-Δ1-OSK1-T2，K16，D20	617
TIINVKCKISRQCLKPCKDAGMRFGKCMNGKCHCTPK-NH2	Δ1-OSK1-T2，K16，D20-NH2	618
			Ac-TIINVKCKISRQCLKPCKDAGMRFGKCMNGKCHCTPK-NH2	Ac-Δ1-OSK1-T2，K16，D20-NH2	619
GVKINVKCKISRQCLEPCKKAGMRFGKCMNGKCHCTPK	OSK1-K3	620
			Ac-GVKINVKCKISRQCLEPCKKAGMRFGKCMNGKCHCTPK	Ac-OSK1-K3	621
GVKINVKCKISRQCLEPCKKAGMRFGKCMNGKCHCTPK-NH2	OSK1-K3-NH2	622

Ac-GVKINVKCKISRQCLEPCKKAGMRFGKCMNGKCHCTPK-NH2	Ac-OSK1-K3-NH2	623
			GVKINVKCKISRQCLEPCKKAGMRFGKCMNGKCACTPK	OSK1-K3，A34	624
GVKINVKCKISRQCLKPCKDAGMRFGKCMNGKCHCTPK	OSK1-K3，K16，D20	625
			GVKINVKCKISRQCLKPCKDAGMRFGKCMNGKCACTPK	OSK1-K3，K16，D20，A34	626
Ac-GVKINVKCKISRQCLEPCKKAGMRFGKCMNGKCACTPK	Ac-OSK1-K3，A34	627
			GVKINVKCKISRQCLEPCKKAGMRFGKCMNGKCACTPK-NH2	OSK1-K3，A34-NH2	628
Ac-GVKINVKCKISRQCLEPCKKAGMRFGKCMNGKCACTPK-NH2	Ac-OSK1-K3，A34-NH2	629
			Ac-GVKINVKCKISRQCLKPCKDAGMRFGKCMNGKCACTPK	Ac-OSK1-K3，K16，D20，A34	630
GVKINVKCKISRQCLKPCKDAGMRFGKCMNGKCACTPK-NH2	OSK1-K3，K16，D20，A34-NH2	631
			Ac-GVKINVKCKISRQCLKPCKDAGMRFGKCMNGKCACTPK-NH2	Ac-OSK1-K3，K16，D20，A34-NH2	632
Ac-GVKINVKCKISRQCLKPCKDAGMRFGKCMNGKCHCTPK	Ac-OSK1-K3，K16，D20	633
			GVKINVKCKISRQCLKPCKDAGMRFGKCMNGKCHCTPK-NH2	OSK1-K3，K16，D20-NH2	634
Ac-GVKINVKCKISRQCLKPCKDAGMRFGKCMNGKCHCTPK-NH2	Ac-OSK1-K3，K16，D20-NH2	635
			GVIINVKCKISRQCLKPCKDAGMRFGKCMNGKCHCT	Δ36-38-OSK1-K16，D20	636
GVIINVKCKISRQCLOPCKDAGMRFGKCMNGKCHCTPK	OSK1-O16，D20	980

GVIINVKCKISRQCL[hLys]PCKDAGMRFGKCMNGKCHCTPK	OSK1-hLys 16，D20	981
			GVIINVKCKISRQCL[hArg]PCKDAGMRFGKCMNGKCHCTPK	OSK1-hArg 16，D20	982
GVIINVKCKISRQCL[Cit]PCKDAGMRFGKCMNGKCHCTPK	OSK1-Cit 16，D20	983
			GVIINVKCKISRQCL[hCit]PCKDAGMRFGKCMNGKCHCTPK	OSK1-hCit 16，D20	984
GVIINVKCKISRQCL[Dpr]PCKDAGMRFGKCMNGKCHCTPK	OSK1-Dpr16，D20	985
			GVIINVKCKISRQCL[Dab]PCKDAGMRFGKCMNGKCHCTPK	OSK1-Dab 16，D20	986
GVIINVKCKISRQCLOPCKDAGMRFGKCMNGKCHCYPK	OSK1-O16，D20，Y36	987
			GVIINVKCKISRQCL[hLys]PCKDAGMRFGKCMNGKCHCYPK	OSK1-hLys 16，D20，Y36	988
GVIINVKCKISRQCL[hArg]PCKDAGMRFGKCMNGKCHCYPK	OSK1-hArg 16，D20，Y36	989
			GVIINVKCKISRQCL[Cit]PCKDAGMRFGKCMNGKCHCYPK	OSK1-Cit 16，D20，Y36	990
GVIINVKCKISRQCL[hCit]PCKDAGMRFGKCMNGKCHCYPK	OSK1-hCit 16，D20，Y36	991
			GVIINVKCKISRQCL[Dpr]PCKDAGMRFGKCMNGKCHCYPK	OSK1-Dpr 16，D20，Y36	992
GVIINVKCKISRQCL[Dab]PCKDAGMRFGKCMNGKCHCYPK	OSK1-Dab 16，D20，Y36	993
			GVIINVKCKISRQCLKPCKDAGMRFGKCMNGKCACYPK	OSK1-K16，D20，A34，Y36	994
GVIINVKCKISRQCLKPCKDAGMRFGKCMNGKCGCYPK	OSK1-K16，D20，G34，Y36	995

GVIINVKCKISRQCLKPCKDAGMRFGKCMNGKCACFPK	OSK1-K16，D20，A34，F36	996
			GVIINVKCKISRQCLKPCKDAGMRFGKCMNGKCACWPK	OSK1-K16，D20，A34，W36	997
GVIINVKCKISRQCLKPCKEAGMRFGKCMNGKCACYPK	OSK1-K16，E20，A34，Y36	998
			GVIINVKCKISRQCLOPCKDAGMRFGKCMNGKCACTPK	OSK1-O16，D20，A34	999
GVIINVKCKISRQCL[hLys]PCKDAGMRFGKCMNGKCACTPK	OSK1-hLys 16，D20，A34	1000
			GVIINVKCKISRQCL[hArg]PCKDAGMRFGKCMNGKCACTPK	OSK1-hArg 16，D20，A34	1001
GVIINVKCKISRQCL[Cit]PCKDAGMRFGKCMNGKCACTPK	OSK1-Cit 16，D20，A34	1002
			GVIINVKCKISRQCL[hCit]PCKDAGMRFGKCMNGKCHCTPK	OSK1-hCit 16，D20，A34	1003
GVIINVKCKISRQCL[Dpr]PCKDAGMRFGKCMNGKCACTPK	OSK1-Dpr 16，D20，A34	1004
			GVIINVKCKISRQCL[Dab]PCKDAGMRFGKCMNGKCACTPK	OSK1-Dab 16，D20，A34	1005
GVIINVKCKISRQCLOPCKDAGMRFGKCMNGKCHC	Δ36-38，OSK1-O16，D20，	1006
			GVIINVKCKISRQCL[hLys]PCKDAGMRFGKCMNGKCHC	Δ36-38，OSK1-hLys 16，D20	1007
GVIINVKCKISRQCL[hArg]PCKDAGMRFGKCMNGKCHC	Δ36-38，OSK1-hArg 16，D20	1008
			GVIINVKCKISRQCL[Cit]PCKDAGMRFGKCMNGKCHC	Δ36-38，OSK1-Cit 16，D20	1009
GVIINVKCKISRQCL[hCit]PCKDAGMRFGKCMNGKCHC	Δ36-38，OSK1-hCit 16，D20	1010

GVIINVKCKISRQCL[Dpr]PCKDAGMRFGKCMNGKCHC	Δ36-38，OSK1-Dpr16，D20	1011
			GVIINVKCKISRQCL[Dab]PCKDAGMRFGKCMNGKCHC	Δ36-38，OSK1-Dab16，D20	1012
GVIINVKCKISRQCLOPCKDAGMRFGKCMNGKCAC	Δ36-38，OSK1-O16，D20，A34	1013
			GVIINVKCKISRQCL[hLys]PCKDAGMRFGKCMNGKCAC	Δ36-38，OSK1-hLys 16，D20，A34	1014
GVIINVKCKISRQCL[hArg]PCKDAGMRFGKCMNGKCAC	Δ36-38，OSK1-hArg 16，D20，A34	1015
			GVIINVKCKISRQCL[Cit]PCKDAGMRFGKCMNGKCAC	Δ36-38，OSK1-Cit 16，D20，A34	1016
GVIINVKCKISRQCL[hCit]PCKDAGMRFGKCMNGKCHC	Δ36-38，OSK1-hCit 16，D20，A34	1017
			GVIINVKCKISRQCL[Dpr]PCKDAGMRFGKCMNGKCAC	Δ36-38，OSK1-Dpr 16，D20，A34	1018
GVIINVKCKISRQCL[Dab]PCKDAGMRFGKCMNGKCAC	Δ36-38，OSK1-Dab 16，D20，A34	1019
			GVIINVKCKISRQCLKPCKDAGMRFGKCMNGKCGCYGG	OSK1-K16，D20，G34，Y36，G37，G38	1020
GVIINVKCKISRQCLOPCKDAGMRFGKCMNGKCHCYGG	OSK1-O16，D20，Y36，G37，G38	1021
			GVIINVKCKISRQCL[hLys]PCKDAGMRFGKCMNGKCHCYGG	OSK1-hLys 16，D20，Y36，G37，G38	1022
GVIINVKCKISRQCL[hArg]PCKDAGMRFGKCMNGKCHCYGG	OSK1-hArg 16，D20，Y36，G37，G38	1023
			GVIINVKCKISRQCL[Cit]PCKDAGMRFGKCMNGKCHCYGG	OSK1-Cit 16，D20，Y36，G37，G38	1024
GVIINVKCKISRQCL[hCit]PCKDAGMRFGKCMNGKCHCYGG	OSK1-hCit 16，D20，Y36，G37，G38	1025

GVIINVKCKISRQCL[Dpr]PCKDAGMRFGKCMNGKCHCYGG	OSK1-Dpr 16，D20，Y36，G37，G38	1026
			GVIINVKCKISRQCLKPCKDAGMRFGKCMNGKCACYGG	OSK1-K16，D20，A34，Y36，G37，G38	1027
GVIINVKCKISRQCLOPCKDAGMRFGKCMNGKCACYGG	OSK1-O16，D20，A34，Y36，G37，G38	1028
			GVIINVKCKISRQCL[hLys]PCKDAGMRFGKCMNGKCACYGG	OSK1-hLys 16，D20，A34，Y36，G37，G38	1029
GVIINVKCKISRQCL[hArg]PCKDAGMRFGKCMNGKCACYGG	OSK1-hArg 16，D20，A34，Y36，G37，G38	1030
			GVIINVKCKISRQCL[Cit]PCKDAGMRFGKCMNGKCACYGG	OSK1-Cit 16，D20，A34，Y36，G37，G38	1031
GVIINVKCKISRQCL[hCit]PCKDAGMRFGKCMNGKCHCYGG	OSK1-hCit 16，D20，A34，Y3，G37，G38	1032
			GVIINVKCKISRQCL[Dpr]PCKDAGMRFGKCMNGKCACYGG	OSK1-Dpr 16，D20，A34，Y36，G37，G38	1033
GVIINVKCKISRQCL[Dab]PCKDAGMRFGKCMNGKCACYGG	OSK1-Dab 16，D20，A34，Y36，G37，G38	1034
			GVIINVKCKISRQCLKPCKDAGMRFGKCMNGKCACYG	Δ38，OSK1-K16，D20，A34，Y36，G37	1035
GVIINVKCKISRQCLOPCKDAGMRFGKCMNGKCHCGGG	OSK1-O16，D20，G36-38	1036
			GVIINVKCKISRQCL[hLys]PCKDAGMRFGKCMNGKCHCGGG	OSK1-hLys 16，D20，G36-38	1037

GVIINVKCKISRQCL[hArg]PCKDAGMRFGKCMNGKCHCGGG	OSK1-hArg 16，D20，G36-38	1038
			GVIINVKCKISRQCL[Cit]PCKDAGMRFGKCMNGKCHCGGG	OSK1-Cit 16，D20，G36-38	1039
GVIINVKCKISRQCL[hCit]PCKDAGMRFGKCMNGKCHCGGG	OSK1-hCit 16，D20，G36-38	1040
			GVIINVKCKISRQCL[Dpr]PCKDAGMRFGKCMNGKCHCGGG	OSK1-Dpr 16，D20，G36-38	1041
GVIINVKCKISRQCLKPCKDAGMRFGKCMNGKCACFGG	OSK1-K16，D20，A34，F36，G37，G38	1042
			GVIINVKCKISRQCLOPCKDAGMRFGKCMNGKCACGGG	OSK1-O16，D20，A34，G36-38	1043
GVIINVKCKISRQCL[hLys]PCKDAGMRFGKCMNGKCACGGG	OSK1-hLys 16，D20，A34，G36-38	1044
			GVIINVKCKISRQCL[hArg]PCKDAGMRFGKCMNGKCACGGG	OSK1-hArg 16，D20，A34，G36-38	1045
GVIINVKCKISRQCL[Cit]PCKDAGMRFGKCMNGKCACGGG	OSK1-Cit 16，D20，A34，G36-38	1046
			GVIINVKCKISRQCL[hCit]PCKDAGMRFGKCMNGKCACGGG	OSK1-hCit 16，D20，A34，G36-38	1047
GVIINVKCKISRQCL[Dpr]PCKDAGMRFGKCMNGKCACGGG	OSK1-Dpr 16，D20，A34，G36-38	1048
			GVIINVKCKISRQCL[Dab]PCKDAGMRFGKCMNGKCACGGG	OSK1-Dab 16，D20，A34，G36-38	1049
GVIINVKCKISRQCLKPCKDAGMRFGKCMNGKCACGG	Δ38，OSK1-K16，D20，A34，G36-37	1050
			GVIINVKCKISRQCLKPCKDAGMRFGKCMNGKCACYG	Δ38，OSK1-K16，D20，A35，Y36，G37	1051
GVIINVKCKISRQCLOPCKDAGMRFGKCMNGKCACGG	Δ38，OSK1-O16，D20，A35，Y36，G37	1052

GVIINVKCKISRQCL[hLys]PCKEAGMRFGKCMNGKCHCTPK	OSK1-hLys 16，E20	1053
			GVIINVKCKISRQCL[hArg]PCKEAGMRFGKCMNGKCHCTPK	OSK1-hArg 16，E20	1054
GVIINVKCKISRQCL[Cit]PCKEAGMRFGKCMNGKCHCTPK	OSK1-Cit 16，E20	1055
			GVIINVKCKISRQCL[hCit]PCKEAGMRFGKCMNGKCHCTPK	OSK1-hCit 16，E20	1056
GVIINVKCKISRQCL[Dpr]PCKEAGMRFGKCMNGKCHCTPK	OSK1-Dpr 16，E20	1057
			GVIINVKCKISRQCL[Dab]PCKEAGMRFGKCMNGKCHCTPK	OSK1-Dab 16，E20	1058
GVIINVKCKISRQCLOPCKEAGMRFGKCMNGKCHCYPK	OSK1-O16，E20，Y36	1059
			GVIINVKCKISRQCL[hLys]PCKEAGMRFGKCMNGKCHCYPK	OSK1-hLys 16，E20，Y36	1060
GVIINVKCKISRQCL[hArg]PCKEAGMRFGKCMNGKCHCYPK	OSK1-hArg 16，E20，Y36	1061
			GVIINVKCKISRQCL[Cit]PCKEAGMRFGKCMNGKCHCYPK	OSK1-Cit 16，E20，Y36	1062
GVIINVKCKISRQCL[hCit]PCKEAGMRFGKCMNGKCHCYPK	OSK1-hCit 16，E20，Y36	1063
			GVIINVKCKISRQCL[Dpr]PCKEAGMRFGKCMNGKCHCYPK	OSK1-Dpr 16，E20，Y36	1064
GVIINVKCKISRQCL[Dab]PCKEAGMRFGKCMNGKCHCYPK	OSK1-Dab 16，E20，Y36	1065
			GVIINVKCKISRQCLOPCKEAGMRFGKCMNGKCACTPK	OSK1-O16，E20，A34	1066
GVIINVKCKISRQCL[hLys]PCKEAGMRFGKCMNGKCACTPK	OSK1-hLys 16，E20，A34	1067

GVIINVKCKISRQCL[hArg]PCKEAGMRFGKCMNGKCACTPK	OSK1-hArg 16，E20，A34	1068
			GVIINVKCKISRQCL[Cit]PCKEAGMRFGKCMNGKCACTPK	OSK1-Cit 16，E20，A34	1069
GVIINVKCKISRQCL[hCit]PCKEAGMRFGKCMNGKCHCTPK	OSK1-hCit 16，E20，A34	1070
			GVIINVKCKISRQCL[Dpr]PCKEAGMRFGKCMNGKCACTPK	OSK1-Dpr 16，E20，A34	1071
GVIINVKCKISRQCL[Dab]PCKEAGMRFGKCMNGKCACTPK	OSK1-Dab 16，E20，A34	1072
			GVIINVKCKISRQCLOPCKEAGMRFGKCMNGKCHC	Δ36-38，OSK1-O16，E20，	1073
GVIINVKCKISRQCL[hLys]PCKEAGMRFGKCMNGKCHC	Δ36-38，OSK1-hLys 16，E20	1074
			GVIINVKCKISRQCL[hArg]PCKEAGMRFGKCMNGKCHC	Δ36-38，OSK1-hArg 16，E20	1075
GVIINVKCKISRQCL[Cit]PCKEAGMRFGKCMNGKCHC	Δ36-38，OSK1-Cit 16，E20	1076
			GVIINVKCKISRQCL[hCit]PCKEAGMRFGKCMNGKCHC	Δ36-38，OSK1-hCit16，E20	1077
GVIINVKCKISRQCL[Dpr]PCKEAGMRFGKCMNGKCHC	Δ36-38，OSK1-Dpr16，E20	1078
			GVIINVKCKISRQCLOPCKEAGMRFGKCMNGKCAC	Δ36-38，OSK1-O16，E20，A34	1079
GVIINVKCKISRQCL[hLys]PCKEAGMRFGKCMNGKCAC	Δ36-38，OSK1-hLys 16，E20，A34	1080
			GVIINVKCKISRQCL[hArg]PCKEAGMRFGKCMNGKCAC	Δ36-38，OSK1-hArg 16，E20，A34	1081
GVIINVKCKISRQCL[Cit]PCKEAGMRFGKCMNGKCAC	Δ36-38，OSK1-Cit 16，E20，A34	1082

GVIINVKCKISRQCL[hCit]PCKEAGMRFGKCMNGKCHC	Δ36-38，OSK1-hCit 16，E20，A34	1083
			GVIINVKCKISRQCL[Dpr]PCKEAGMRFGKCMNGKCAC	Δ36-38，OSK1-Dpr 16，E20，A34	1084
GVIINVKCKISRQCL[Dab]PCKEAGMRFGKCMNGKCAC	Δ36-38，OSK1-Dab 16，E20，A34	1085
			GVIINVKCKISRQCLKPCKEAGMRFGKCMNGKCHCYGG	OSK1-K16，E20，Y36，G37，G38	1086
GVIINVKCKISRQCLOPCKEAGMRFGKCMNGKCHCYGG	OSK1-O16，E20，Y36，G37，G38	1087
			GVIINVKCKISRQCLKPCKEAGMRFGKCMNGKCHCYG	Δ38OSK1-K16，E20，Y36，G37	1088
GVIINVKCKISRQCLKPCKEAGMRFGKCMNGKCACYG	Δ38OSK1-K16，E20，A34，Y36，G37	1089
			GVIINVKCKISRQCL[hLys]PCKEAGMRFGKCMNGKCHCYGG	OSK1-hLys 16，E20，Y36，G37，G38	1090
GVIINVKCKISRQCL[hArg]PCKEAGMRFGKCMNGKCHCYGG	OSK1-hArg 16，E20，Y36，G37，G38	1091
			GVIINVKCKISRQCL[Cit]PCKEAGMRFGKCMNGKCHCYGG	OSK1-Cit 16，E20，Y36，G37，G38	1092
GVIINVKCKISRQCL[hCit]PCKEAGMRFGKCMNGKCHCYGG	Δ37-38，OSK1-hCit 16，E20，Y36，G37，G38	1093
			GVIINVKCKISRQCL[Dpr]PCKEAGMRFGKCMNGKCHCYGG	OSK1-Dpr 16，E20，Y36，G37，G38	1094
GVIINVKCKISRQCL[Dab]PCKEAGMRFGKCMNGKCHCYGG	OSK1-Dab 16，E20，Y36，G37，G38	1095
			GVIINVKCKISRQCLKPCKEAGMRFGKCMNGKCACYG	Δ38，OSK1-K16，E20，A34，Y36，G37	1096
GVIINVKCKISRQCLOPCKEAGMRFGKCMNGKCACYGG	OSK1-O16，E20，A34，Y36，G37，G38	1097

GVIINVKCKISRQCL[hLys]PCKEAGMRFGKCMNGKCACYGG	OSK1-hLys 16，E20，A34，Y36，G37，G38	1098
			GVIINVKCKISRQCL[hArg]PCKEAGMRFGKCMNGKCACYGG	OSK1-hArg 16，E20，A34，Y36，G37，G38	1099
GVIINVKCKISRQCL[Cit]PCKEAGMRFGKCMNGKCACYGG	OSK1-Cit 16，E20，A34，Y36，G37，G38	1100
			GVINVKCKISRQCL[hCit]PCKEAGMRFGKCMNGKCHCYGG	OSK1-hCit 16，E20，A34，Y3，G37，G38	1101
GVIINVKCKISRQCL[Dpr]PCKEAGMRFGKCMNGKCACYGG	OSK1-Dpr 16，E20，A34，Y36，G37，G38	1102
			GVIINVKCKISRQCL[Dab]PCKEAGMRFGKCMNGKCACYGG	OSK1-Dab 16，E20，A34，Y36，G37，G38	1103
GVIINVKCKISRQCLKPCKEAGMRFGKCMNGKCACFGG	OSK1-K16，D20，A34，F36，G37，G38	1104
			GVIINVKCKISRQCLOPCKEAGMRFGKCMNGKCHCGGG	OSK1-O16，E20，G36-38	1105
GVIINVKCKISRQCL[hLys]PCKEAGMRFGKCMNGKCHCGGG	OSK1-hLys 16，E20，G36-38	1106
			GVIINVKCKISRQCL[hArg]PCKEAGMRFGKCMNGKCHCGGG	OSK1-hArg 16，E20，G36-38	1107
GVIINVKCKISRQCL[Cit]PCKEAGMRFGKCMNGKCHCGGG	OSK1-Cit 16，E20，G36-38	1108
			GVIINVKCKISRQCL[hCit]PCKEAGMRFGKCMNGKCHCGGG	OSK1-hCit 16，E20，G36-38	1109

GVIINVKCKISRQCL[Dpr]PCKEAGMRFGKCMNGKCHCGGG	OSK1-Dpr 16，E20，G36-38	1110
			GVIINVKCKISRQCLOPCKEAGMRFGKCMNGKCACGGG	OSK1-O16，E20，A34，G36-38	1111
GVIINVKCKISRQCL[hLys]PCKEAGMRFGKCMNGKCACGGG	OSK1-hLys 16，E20，A34，G36-38	1112
			GVIINVKCKISRQCL[hArg]PCKEAGMRFGKCMNGKCACGGG	OSK1-hArg 16，E20，A34，G36-38	1113
GVIINVKCKISRQCL[Cit]PCKEAGMRFGKCMNGKCACGGG	OSK1-Cit 16，E20，A34，G36-38	1114
			GVIINVKCKISRQCL[hCit]PCKEAGMRFGKCMNGKCACTP	OSK1-hCit 16，E20，A34，G36-38	1115
GVIINVKCKISRQCL[Dpr]PCKEAGMRFGKCMNGKCACTP	OSK1-Dpr 16，E20，A34，G36-38	1116
			GVIINVKCKISRQCL[Dab]PCKEAGMRFGKCMNGKCACTP	OSK1-Dab 16，E20，A34，G36-38	1117
GVIINVKCKISRQCLOPCKDAGMRFGKCMNGKCHCTPK-NH2	OSK1-O16，D20-酰胺	1118
			GVIINVKCKISRQCL[hLys]PCKDAGMRFGKCMNGKCHCTPK-NH2	OSK1-hLys 16，D20-酰胺	1119
GVIINVKCKISRQCL[hArg]PCKDAGMRFGKCMNGKCHCTPK-NH2	OSK1-hArg 16，D20-酰胺	1120
			GVIINVKCKISRQCL[Cit]PCKDAGMRFGKCMNGKCHCTPK-NH2	OSK1-Cit 16，D20-酰胺	1121
GVIINVKCKISRQCL[hCit]PCKDAGMRFGKCMNGKCHCTPK-NH2	OSK1-hCit 16，D20-酰胺	1122
			GVIINVKCKISRQCL[Dpr]PCKDAGMRFGKCMNGKCHCTPK-NH2	OSK1-Dpr 16，D20-酰胺	1123
GVIINVKCKISRQCL[Dab]PCKDAGMRFGKCMNGKCHCTPK-NH2	OSK1-Dab 16，D20	1124

GVIINVKCKISRQCLOPCKDAGMRFGKCMNGKCHCYPK-NH2	OSK1-O16，D20，Y36-酰胺	1125
			GVIINVKCKISRQCL[hLys]PCKDAGMRFGKCMNGKCHCYPK-NH2	OSK1-hLys 16，D20，Y36-酰胺	1126
GVIINVKCKISRQCL[hArg]PCKDAGMRFGKCMNGKCHCYPK-NH2	OSK1-hArg 16，D20，Y36-酰胺	1127
			GVIINVKCKISRQCL[Cit]PCKDAGMRFGKCMNGKCHCYPK-NH2	OSK1-Cit 16，D20，Y36-酰胺	1128
GVIINVKCKISRQCL[hCit]PCKDAGMRFGKCMNGKCHCYPK-NH2	OSK1-hCit16，D20，Y36-酰胺	1129
			GVIINVKCKISRQCL[Dpr]PCKDAGMRFGKCMNGKCHCYPK-NH2	OSK1-Dpr 16，D20，Y36-酰胺	1130
GVIINVKCKISRQCL[Dab]PCKDAGMRFGKCMNGKCHCYPK-NH2	OSK1-Dab 16，D20，Y36-酰胺	1131
			GVIINVKCKISRQCLOPCKDAGMRFGKCMNGKCACTPK-NH2	OSK1-O16，D20，A34-酰胺	1132
GVIINVKCKISRQCL[hLys]PCKDAGMRFGKCMNGKCACTPK-NH2	OSK1-hLys 16，D20，A34-酰胺	1133
			GVIINVKCKISRQCL[hArg]PCKDAGMRFGKCMNGKCACTPK-NH2	OSK1-hArg 16，D20，A34-酰胺	1134
GVIINVKCKISRQCL[Cit]PCKDAGMRFGKCMNGKCACTPK-NH2	OSK1-Cit 16，D20，A34-酰胺	1135
			GVIINVKCKISRQCL[hCit]PCKDAGMRFGKCMNGKCACTPK-NH2	OSK1-hCit 16，D20，A34-酰胺	1136
GVIINVKCKISRQCL[Dpr]PCKDAGMRFGKCMNGKCACTPK-NH2	OSK1-Dpr 16，D20，A34-酰胺	1137
			GVIINVKCKISRQCL[Dab]PCKDAGMRFGKCMNGKCACTPK-NH2	OSK1-Dab 16，D20，A34-酰胺	1138
GVIINVKCKISRQCLOPCKDAGMRFGKCMNGKCHC-NH2	Δ36-38，OSK1-O16，D20，-酰胺	1139

GVIINVKCKISRQCL[hLys]PCKDAGMRFGKCMNGKCHC-NH2	Δ36-38，OSK1-hLys 16，D20-酰胺	1140
			GVIINVKCKISRQCL[hArg]PCKDAGMRFGKCMNGKCHC-NH2	Δ36-38，OSK1-hArg 16，D20-酰胺	1141
GVIINVKCKISRQCL[Cit]PCKDAGMRFGKCMNGKCHC-NH2	Δ36-38，OSK1-Cit 16，D20-酰胺	1142
			GVIINVKCKISRQCL[hCit]PCKDAGMRFGKCMNGKCHC-NH2	Δ36-38，OSK1-hCit16，D20-酰胺	1143
GVIINVKCKISRQCL[Dpr]PCKDAGMRFGKCMNGKCHC-NH2	Δ36-38，OSK1-Dpr 16，D20-酰胺	1144
			GVIINVKCKISRQCLOPCKDAGMRFGKCMNGKCAC-NH2	Δ36-38，OSK1-O16，D20，A34-酰胺	1145
GVIINVKCKISRQCL[hLys]PCKDAGMRFGKCM[NGKCAC-NH2	Δ36-38，OSK1-hLys16，D20，A34-酰胺	1146
			GVIINVKCKISRQCL[hArg]PCKDAGMRFGKCMNGKCAC-NH2	Δ36-38，OSK1-hArg16，D20，A34-酰胺	1147
GVIINVKCKISRQCL[Cit]PCKDAGMRFGKCMNGKCAC-NH2	Δ36-38，OSK1-Cit16，D20，A34-酰胺	1148
			GVIINVKCKISRQCL[hCit]PCKDAGMRFGKCMNGKCHC-NH2	Δ36-38，OSK1-hCit 16，D20，A34	1149
GVIINVKCKISRQCL[Dpr]PCKDAGMRFGKCMNGKCAC-NH2	Δ36-38，OSK1-Dpr16，D20，A34-酰胺	1150
			GVIINVKCKISRQCL[Dab]PCKDAGMRFGKCMNGKCAC-NH2	Δ36-38，OSK1-Dab16，D20，A34-酰胺	1151
GVIINVKCKISRQCLKPCKDAGMRFGKCMNGKCHCYGG-NH2	OSK1-O16，D20，Y36，G37，G38-酰胺	1152
			GVIINVKCKISRQCLOPCKDAGMRFGKCMNGKCHCYGG-NH2	OSK1-O16，D20，Y36，G37，G38	1153
GVIINVKCKISRQCL[hLys]PCKDAGMRFGKCMNGKCHCYGG-NH2	OSK1-hLys 16，D20，Y36，G37，G38-酰胺	1154

GVIINVKCKISRQCL[hArg]PCKDAGMRFGKCMNGKCHCYGG-NH2	OSK1-hArg 16，D20，Y36，G37，G38-酰胺	1155
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GVIINVKCKISRQCLKPCKDAGMRFGKCMNGKCHCFGG-NH2	OSK1-K16，D20，F36，G37，G38-酰胺	1159
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GVIINVKCKISRQCLKPCKDAGMRFGKCMNGKCACYG-NH2	Δ38-OSK1-K16，D20，A34，Y36，G37-酰胺	1161
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GVIINVKCKISRQCL[hLys]PCKDAGMRFGKCMNGKCACYGG-NH2	OSK1-hLys 16，D20，A34，Y36，G37，G38-酰胺	1163
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GVIINVKCKISRQCL[Cit]PCKDAGMRFGKCMNGKCACYGG-NH2	OSK1-Cit 16，D20，A34，Y36，G37，G38	1165

GVIINVKCKISRQCL[hCit]PCKDAGMRFGKCMNGKCACYGG-NH2	OSK1-hCit16，D20，A34，Y3，G37，G38-酰胺	1166
			GVIINVKCKISRQCL[Dpr]PCKDAGMRFGKCMNGKCACYGG-NH2	OSK1-Dpr 16，D20，A34，Y36，G37，G38-酰胺	1167
GVIINVKCKISRQCL[Dab]PCKDAGMRFGKCMNGKCACYGG-NH2	OSK1-Dab 16，D20，A34，Y36，G37，G38-酰胺	1168
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GVIINVKCKISRQCLOPCKDAGMRFGKCMNGKCHCGGG-NH2	OSK1-O16，D20，G36-38-酰胺	1170
			GVIINVKCKISRQCL[hLys]PCKDAGMRFGKCMNGKCHCGGG-NH2	OSK1-hLys 16，D20，G36-38-酰胺	1171
GVIINVKCKISRQCL[hArg]PCKDAGMRFGKCMNGKCHCGGG-NH2	OSK1-hArg 16，D20，G36-38-酰胺	1172
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GVIINVKCKISRQCL[hCit]PCKDAGMRFGKCMNGKCHCGGG-NH2	OSK1-hCit16，D20，G36-38-酰胺	1174
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GVIINVKCKISRQCLKPCKDAGMRFGKCMNGKCACGGG-NH2	OSK1-K16，D20，A34，G36-38-酰胺	1176
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GVIINVKCKISRQCLOPCKDAGMRFGKCMNGKCACGGG-NH2	OSK1-O16，D20，A34，G36-38-酰胺	1178
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GVIINVKCKISRQCL[hArg]PCKDAGMRFGKCMNGKCACGGG-NH2	OSK1-hArg 16，D20，A34，G36-38-酰胺	1180
			GVIINVKCKISRQCL[Cit]PCKDAGMRFGKCMNGKCACGGG-NH2	OSK1-Cit 16，D20，A34，G36-38-酰胺	1181
GVIINVKCKISRQCL[hCit]PCKDAGMRFGKCMNGKCACGGG-NH2	OSK1-hCit16，D20，A34，G36-38-酰胺	1182
			GVIINVKCKISRQCL[Dpr]PCKDAGMRFGKCMNGKCACGGG-NH2	OSK1-Dpr 16，D20，A34，G36-38-酰胺	1183
GVIINVKCKISRQCL[Dab]PCKDAGMRFGKCMNGKCACGGG-NH2	OSK1-Dab 16，D20，A34，G36-38-酰胺	1184
			GVIINVKCKISRQCLOPCKEAGMRFGKCMNGKCHCTPK-NH2	OSK1-O16，E20-酰胺	1185
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GVIINVKCKISRQCL[Dpr]PCKEAGMRFGKCMNGKCHCTPK-NH2	OSK1-Dpr 16，E20-酰胺	1190
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GVIINVKCKISRQCL[Dpr]PCKEAGMRFGKCMNGKCACTPK-NH2	OSK1-Dpr 16，E20，A34-酰胺	1204

GVIINVKCKISRQCL[Dab]PCKEAGMRFGKCMNGKCACTPK-NH2	OSK1-Dab 16，E20，A34-酰胺	1205
			GVIINVKCKISRQCLOPCKEAGMRFGKCMNGKCHC-NH2	Δ36-38，OSK1-O16，E20，-酰胺	1206
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GVIINVKCKISRQCL[Cit]PCKEAGMRFGKCMNGKCHC-NH2	Δ36-38，OSK1-Cit 16，E20-酰胺	1209
			GVIINVKCKISRQCL[hCit]PCKEAGMRFGKCMNGKCHC-NH2	Δ36-38，OSK1-hCit16，E20-酰胺	1210
GVIINVKCKISRQCL[Dpr]PCKEAGMRFGKCMNGKCHC-NH2	Δ36-38，OSK1-Dpr 16，E20-酰胺	1211
			GVIINVKCKISRQCLOPCKEAGMRFGKCMNGKCAC-NH2	Δ36-38，OSK1-O16，E20，A34-酰胺	1212
GVIINVKCKISRQCL[hLys]PCKEAGMRFGKCMNGKCAC-NH2	Δ36-38，OSK1-hLys16，E20，A34-酰胺	1213
			GVIINVKCKISRQCL[hArg]PCKEAGMRFGKCMNGKCAC-NH2	Δ36-38，OSK1-hArg16，E20，A34-酰胺	1214
GVIINVKCKISRQCL[Cit]PCKEAGMRFGKCMNGKCAC-NH2	Δ36-38，OSK1-Cit 16，E20，A34-酰胺	1215
			GVIINVKCKISRQCL[hCit]PCKEAGMRFGKCMNGKCHC-NH2	Δ36-38，OSK1-hCit 16，E20，A34-酰胺	1216
GVIINVKCKISRQCL[Dpr]PCKEAGMRFGKCMNGKCAC-NH2	Δ36-38，OSK1-Dpr 16，E20，A34-酰胺	1217

GVIINVKCKISRQCL[Dab]PCKEAGMRFGKCMNGKCAC-NH2	Δ36-38，OSK1-Dab 16，E20，A34-酰胺	1218
			GVIINVKCKISRQCLKPCKEAGMRFGKCMNGKCHCWGG-NH2	OSK1-O16，E20，W36，G37，G38-酰胺	1219
GVIINVKCKISRQCLOPCKEAGMRFGKCMNGKCHCYGG-NH2	OSK1-O16，E20，Y36，G37，G38-酰胺	1220
			GVIINVKCKISRQCL[hLys]PCKEAGMRFGKCMNGKCHCYGG-NH2	OSK1-hLys 16，E20，Y36，G37，G38-酰胺	1221
GVIINVKCKISRQCL[hArg]PCKEAGMRFGKCMNGKCHCYGG-NH2	OSK1-hArg 16，E20，Y36，G37，G38-酰胺	1222
			GVIINVKCKISRQCL[Cit]PCKEAGMRFGKCMNGKCHCYGG-NH2	OSK1-Cit 16，E20，Y36，G37，G38-酰胺	1223
GVIINVKCKISRQCL[hCit]PCKEAGMRFGKCMNGKCHCYGG-NH2	OSK1-hCit 16，E20，Y36，G37，G38-酰胺	1224
			GVIINVKCKISRQCL[Dpr]PCKEAGMRFGKCMNGKCHCYGG-NH2	OSK1-Dpr 16，E20，Y36，G37，G38-酰胺	1225
GVIINVKCKISRQCL[Dab]PCKEAGMRFGKCMNGKCHCYGG-NH2	OSK1-Dpr 16，E20，Y36，G37，G38-酰胺	1226
			GVIINVKCKISRQCLKPCKEAGMRFGKCMNGKCACYGG-NH2	OSK1-K16，E20，A34，Y36，G37，G38-酰胺	1227
GVIINVKCKISRQCLOPCKEAGMRFGKCMNGKCACYGG-NH2	OSK1-O16，E20，A34，Y36，G37，G38-酰胺	1228

GVIINVKCKISRQCL[hLys]PCKEAGMRFGKCMNGKCACYGG-NH2	OSK1-hLys 16，E20，A34，Y36，G37，G38-酰胺	1229
			GVIINVKCKISRQCL[hArg]PCKEAGMRFGKCMNGKCACYGG-NH2	OSK1-hArg 16，E20，A34，Y36，G37，G38-酰胺	1230
GVIINVKCKISRQCL[Cit]PCKEAGMRFGKCMNGKCACYGG-NH2	OSK1-Cit 16，E20，A34，Y36，G37，G38-酰胺	1231
			GVIINVKCKISRQCL[hCit]PCKEAGMRFGKCMNGKCHCYGG-NH2	OSK1-hCit 16，E20，A34，Y3，G37，G38-酰胺	1232
GVIINVKCKISRQCL[Dpr]PCKEAGMRFGKCMNGKCACYGG-NH2	OSK1-Dpr 16，E20，A34，Y36，G37，G38-酰胺	1233
			GVIINVKCKISRQCL[Dab]PCKEAGMRFGKCMNGKCACYGG-NH2	OSK1-Dab 16，E20，A34，Y36，G37，G38-酰胺	1234
GVIINVKCKISRQCLOPCKEAGMRFGKCMNGKCHCGGG-NH2	OSK1-O16，E20，G36-38-酰胺	1235
			GVIINVKCKISRQCL[hLys]PCKEAGMRFGKCMNGKCHCGGG-NH2	OSK1-hLys 16，E20，G36-38-酰胺	1236
GVIINVKCKISRQCL[hArg]PCKEAGMRFGKCMNGKCHCGGG-NH2	OSK1-hArg 16，E20，G36-38-酰胺	1237
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GVIINVKCKISRQCL[hCit]PCKEAGMRFGKCMNGKCHCGGG-NH2	OSK1-hCit 16，E20，G36-38-酰胺	1239
			GVIINVKCKISRQCL[Dpr]PCKEAGMRFGKCMNGKCHCGGG-NH2	OSK1-Dpr 16，E20，G36-38-酰胺	1240

GVIINVKCKISRQCLOPCKEAGMRFGKCMNGKCACGGG-NH2	OSK1-O16，E20，A34，G36-38-酰胺	1241
			GVIINVKCKISRQCL[hLys]PCKEAGMRFGKCMNGKCACGGG-NH2	OSK1-hLys 16，E20，A34，G36-38-酰胺	1242
GVIINVKCKISRQCL[hArg]PCKEAGMRFGKCMNGKCACGGG-NH2	OSK1-hArg 16，E20，A34，G36-38-酰胺	1243
			GVIINVKCKISRQCL[Cit]PCKEAGMRFGKCMNGKCACGGG-NH2	OSK1-Cit 16，E20，A34，G36-38-酰胺	1244
GVIINVKCKISRQCL[hCit]PCKEAGMRFGKCMNGKCACTP-NH2	Δ38OSK1-hCit16，E20，A34-酰胺	1245
			GVIINVKCKISRQCL[Dpr]PCKEAGMRFGKCMNGKCACGGG-NH2	OSK1-Dpr 16，E20，A34，G36-38-酰胺	1246
GVIINVKCKISRQCL[Dab]PCKEAGMRFGKCMNGKCACGGG-NH2	OSK1-Dab 16，E20，A34，G36-38-酰胺	1247
			GVIINVKCKISRQCLKPCK[Cpa]AGMRFGKCMNGKCACYGG-NH2	OSK1-K 16，CPA20，A34，Y36，G37，G38-酰胺	1248
GVIINVKCKISRQCLKPCK[Cpa]AGMRFGKCMNGKCACGGG-NH2	OSK1-K 16，CPA20，A34，G36-38-酰胺	1249
			GVIINVKCKISRQCLKPCK[Cpa]AGMRFGKCMNGKCACY-NH2	Δ37-38OSK1-K 16，CPA20，A34，Y36-酰胺	1250

Ac-GVIINVKCKISRQCLKPCKDAGMRFGKCMNGKCACYGG-NH2	Acetyl-OSK1-K16，D20，A34，Y36，G37，G38-酰胺	1251
			GVIINVKCKISRQCLKPCK[Aad]AGMRFGKCMNGKCACYGG-NH2	OSK1-K 16，Aad20，A34，Y36，G37，G38-酰胺	1252
GVIINVKCKISRQCLKPCK[Aad]AGMRFGKCMNGKCHCYGG-NH2	OSK1-K 16，Aad20，Y36，G37，G38-酰胺	1253
			GVIINVKCKISRQCLKPCK[Aad]AGMRFGKCMNGKCACYGG	OSK1-K 16，Aad20，A34，Y36，G37，G38	1254
GVIINVKCKISRQCLHPCKDAGMRFGKCMNGKCACYGG-NH2	OSK1-H 16，D20，A34，Y36，G37，G38-酰胺	1255
			GVIINVKCKISRQCLHPCKDAGMRFGKCMNGKCACYGG	OSK1-H 16，D20，A34，Y36，G37，G38	1256
GVIINVKCKISRQCLHPCKDAGMRFGKCMNGKCACY-NH2	Δ37-38-OSK1-H 16，D20，A34，Y36-酰胺	1257
			GVIINVKCKISRQCLHPCKDAGMRFGKCMNGKCHCYGG-NH2	OSK1-H 16，D20，A34，Y36，G37，G38-酰胺	1258
GVIINVKCKISRQCLHPCKDAGMRFGKCMNGKCHCYGG	OSK1-H 16，D20，A34，Y36，G37，G38	1259
			GVIINVKCKISRQCLHPCKDAGMRFGKCMNGKCHCYPK	OSK1-H 16，D20，A34，Y36，	1260
GVIINVKCKISRQCLHPCKDAGMRFGKCMNGKCAC	Δ36-38 OSK1-H16，D20，A34，Y36，	1261

GVIINVKCKISRQCLKPCKDAGMRFGKCMNGKCAC[1Nal]GG-NH2	OSK1-K 16，D20，A34，1Nal36，G37，G38-酰胺	1262
			GVIINVKCKISRQCLKPCKDAGMRFGKCMNGKCAC[1Nal]PK-NH2	OSK1-K 16，D20，A34，1Nal36-酰胺	1263
GVIINVKCKISRQCLKPCKDAGMRFGKCMNGKCAC[2Nal]GG-NH2	OSK1-K 16，D20，A34，2Nal36，G37，G38-酰胺	1264
			GVIINVKCKISRQCLKPCKDAGMRFGKCMNGKCAC[Cha]GG-NH2	OSK1-K 16，D20，A34，Cha36，G37，G38-酰胺	1265
GVIINVKCKISRQCLKPCKDAGMRFGKCMNGKCAC[MePhe]GG-NH2	OSK1-K 16，D20，A34，MePhe36，G37，G38-酰胺	1266
			GVIINVKCKISRQCLKPCKDAGMRFGKCMNGKCAC[BiPhA]GG-NH2	OSK1-K 16，D20，A34，BiPhA36，G37，G38-酰胺	1267
GVIINVKCKISRQCLKPCKDAGMRFGKCMNGKC[Aib]CYGG-NH2	OSK1-K 16，D20，Aib34，Y36，G37，G38-酰胺	1268
			GVIINVKCKISRQCLKPCKDAGMRFGKCM[NGKC[Abu]CYGG-NH2	OSK1-K 16，D20，Abu34，Y36，G37，G38-酰胺	1269
GVIINVKCKISRQCLKPCKDAGMRFGKCMNGKCAC[1Nal]	Δ37-38 OSK1-H16，D20，A34，1Nal36，-酰胺	1270
			GVIINVKCKISRQCLHPCKDAGMRFGKCMNGKCAC[1Nal]GG-NH2	OSK1-H 16，D20，A34，1Nal36，G37，G38-酰胺	1271

GVIINVKCKISRQCLKPCKDAGMRFGKCMNGKCAC[4Bip]-NH2	Δ37-38 OSK1-H 16，D20，A34，4Bip 36，-酰胺	1272
			GVIINVKCKISRQCLHPCKDAGMRFGKCMNGKCAC[4Bip]GG-NH2	OSK1-H 16，D20，A34，4Bip 36，G37，G38-酰胺	1273
GVIINVKCKISRQCLKPCKDAGMRFGKCMNGKCHCGGG	OSK1-K16，E20，G36-38	1274

表7所示的任何序列都可以在其N末端或C末端用具有4-10个碳原子和0-2个碳-碳双键的脂肪酸或其衍生物如ω-氨基-脂肪酸进行衍生。(例如Mouhat et al.WO 2006/002850 A2，在此全文引入作为参考)。所述脂肪酸的实例包括戊酸(用于C末端)或ω-氨基-戊酸。

表8-Pi2肽和PiP2s肽类似物序列

序列/结构	缩写名称	SEQID NO：
			TISCTNPKQCYPHCKKETGYPNAKCMNRKCKCFGR	Pi2	17
TISCTNPXQCYPHCKKETGYPNAKCMNRKCKCFGR	Pi2-X8	299
			TISCTNPAQCYPHCKKETGYPNAKCMNRKCKCFGR	Pi2-A8	300
TISCTNPKQCYPHCXKETGYPNAKCMNRKCKCFGR	Pi2-X15	301
			TISCTNPKQCYPHCAKETGYPNAKCMNRKCKCFGR	Pi2-A15	302
TISCTNPKQCYPHCKXETGYPNAKCMNRKCKCFGR	Pi2-X16	303
			TISCTNPKQCYPHCKAETGYPNAKCMNRKCKCFGR	Pi2-A16	304
TISCTNPKQCYPHCKKETGYPNAXCMNRKCKCFGR	Pi2-X24	305
			TISCTNPKQCYPHCKKETGYPNAACMNRKCKCFGR	Pi2-A24	306
TISCTNPKQCYPHCKKETGYPNAKCMNXKCKCFGR	Pi2-X28	307
			TISCTNPKQCYPHCKKETGYPNAKCMNAKCKCFGR	Pi2-A28	308
TISCTNPKQCYPHCKKETGYPNAKCMNRXCKCFGR	Pi2-X29	309
			TISCTNPKQCYPHCKKETGYPNAKCMNRACKCFGR	Pi2-A29	310
TISCTNPKQCYPHCKKETGYPNAKCMNRKCXCFGR	Pi2-X31	311

TISCTNPKQCYPHCKKETGYPNAKCMNRKCACFGR	Pi2-A31	312
			TISCTNPKQCYPHCKKETGYPNAKCMNRKCKCFGX	Pi2-X35	313
TISCTNPKQCYPHCKKETGYPNAKCMNRKCKCFGA	Pi2-A35	314
			TISCTNPKQCYPHCKKETGYPNAKCMNRKCKCFG	Pi2-d35	315

表9-Anuroctoxin(AnTx)肽和肽类似物序列

序列/结构	缩写名称	SEQID NO：
			ZKECTGPQHCTNFCRKNKCTHGKCMNRKCKCFNCK	Anuroctoxin(AnTx)	62
KECTGPQHCTNFCRKNKCTHGKCMNRKCKCFNCK	AnTx-d1	316
			XECTGPQHCTNFCRKNKCTHGKCMNRKCKCFNCK	AnTx-d1，X2	317
AECTGPQHCTNFCRKNKCTHGKCMNRKCKCFNCK	AnTx-d1，A2	318

表10-毒蝎毒素(NTX)肽和NTX肽类似物序列

序列/结构	缩写名称	SEQID NO：
			TIINVKCTSPKQCSKPCKELYGSSAGAKCMNGKCKCYNN	NTX	30
TIINVACTSPKQCSKPCKELYGSSAGAKCMNGKCKCYNN	NTX-A6	319
			TIINVKCTSPKQCSKPCKELYGSSRGAKCMNGKCKCYNN	NTX-R25	320
TIINVKCTSSKQCSKPCKELYGSSAGAKCMNGKCKCYNN	NTX-S10	321
			TIINVKCTSPKQCWKPCKELYGSSAGAKCMNGKCKCYNN	NTX-W14	322
TIINVKCTSPKQCSKPCKELYGSSGAKCMNGKCKCYNN	NTX-A25d	323
			TIINVKCTSPKQCSKPCKELFGVDRGKCMNGKCKCYNN	NTX-IbTx1	324
TIINVKCTSPKQCWKPCKELFGVDRGKCMNGKCKCYN	NTX-IBTX2	325

表11-卡利蝎毒素1(KTX1)肽和KTX1肽类似物序列

序列/结构	缩写名称	SEQID NO：
			GVEINVKCSGSPQCLKPCKDAGMRFGKCMNRKCHCTPK	KTX1	24
VRIPVSCKHSGQCLKPCKDAGMRFGKCMNGKCDCTPK	KTX2	326
			GVEINVSCSGSPQCLKPCKDAGMRFGKCMNRKCHCTPK	KTX1-S7	327
GVEINVACSGSPQCLKPCKDAGMRFGKCMNRKCHCTPK	KTX1-A7	328

表12-IKCa1抑制剂肽序列

序列/结构	缩写名称	SEQID NO：
			VSCTGSKDCYAPCRKQTGCPNAKCINKSCKCYGC	MTX	20
QFTNVSCTTSKECWSVCQRLHNTSRGKCMNKKCRCYS	ChTx	36
			QFTQESCTASNQCWSICKRLHNTNRGKCMNKKCRCYS	ChTx-Lq2	329

表13-莫鲁蝎毒素(MTx)肽和MTx肽类似物序列

序列/结构	缩写名称	SEQID NO：
			VSCTGSKDCYAPCRKQTGCPNAKCINKSCKCYGC	MTX	20
VSCAGSKDCYAPCRKQTGCPNAKCINKSCKCYGC	MTX-A4	330
			VSCTGAKDCYAPCRKQTGCPNAKCINKSCKCYGC	MTX-A6	331
VSCTGSADCYAPCRKQTGCPNAKCINKSCKCYGC	MTX-A7	332
			VSCTGSKDCAAPCRKQTGCPNAKCINKSCKCYGC	MTX-A10	333
VSCTGSKDCYAPCQKQTGCPNAKCINKSCKCYGC	MTX-Q14	334
			VSCTGSKDCYAPCRQQTGCPNAKCINKSCKCYGC	MTX-Q15	335
VSCTGSKDCYAPCQQQTGCPNAKCINKSCKCYGC	MTX-Q14，15	336
			VSCTGSKDCYAPCRKQTGCPNAKCINKSCKCYAC	MTX-A33	337
VSCTGSKDCYAPCRKQTGCPYGKCMNRKCKCNRC	MTX-HsTx1	338
			VSCTGSKDCYAACRKQTGCANAKCINKSCKCYGC	MTX-A12，20	339
VSCTGSKDCYAPCRKQTGXM19PNAKCINKSCKCYGXM34	MTX-X19，34	340
			VSCTGSKDCYAPCRKQTGSPNAKCINKSCKCYGS	MTX-S19，34	341

VSCTGSADCYAPCRKQTGCPNAKCINKSCKCYGC	MTX-A7	342
			VVIGQRCTGSKDCYAPCRKQTGCPNAKCINKSCKCYGC	TsK-MTX	343
VSCRGSKDCYAPCRKQTGCPNAKCINKSCKCYGC	MTX-R4	1301
			VSCGGSKDCYAPCRKQTGCPNAKCINKSCKCYGC	MTX-G4	1302
VSCTTSKDCYAPCRKQTGCPNAKCINKSCKCYGC	MTX-T5	1304
			VSCTASKDCYAPCRKQTGCPNAKCINKSCKCYGC	MTX-A5	1305
VSCTGTKDCYAPCRKQTGCPNAKCINKSCKCYGC	MTX-T6	1306
			VSCTGPKDCYAPCRKQTGCPNAKCINKSCKCYGC	MTX-P6	1307
VSCTGSKDCGAPCRKQTGCPNAKCINKSCKCYGC	MTX-G10	1309
			VSCTGSKDCYRPCRKQTGCPNAKCINKSCKCYGC	MTX-R11	1311
VSCTGSKDCYDPCRKQTGCPNAKCINKSCKCYGC	MTX-D11	1312
			VSCTGSKDCYAPCRKRTGCPNAKCINKSCKCYGC	MTX-R16	1315
VSCTGSKDCYAPCRKETGCPNAKCINKSCKCYGC	MTX-E16	1316
			VSCTGSKDCYAPCRKQTGCPYAKCINKSCKCYGC	MTX-Y21	1317
VSCTGSKDCYAPCRKQTGCPNSKCINKSCKCYGC	MTX-S22	1318
			VSCTGSKDCYAPCRKQTGCPNGKCINKSCKCYGC	MTX-G22	1319
VSCTGSKDCYAPCRKQTGCPNAKCINRSCKCYGC	MTX-R27	1320
			VSCTGSKDCYAPCRKQTGCPNAKCINKTCKCYGC	MTX-T28	1321
VSCTGSKDCYAPCRKQTGCPNAKCINKMCKCYGC	MTX-M28	1322
			VSCTGSKDCYAPCRKQTGCPNAKCINKKCKCYGC	MTX-K28	1323
VSCTGSKDCYAPCRKQTGCPNAKCINKSCKCNGC	MTX-N32	1324
			VSCTGSKDCYAPCRKQTGCPNAKCINKSCKCYRC	MTX-R33	1325
VSCTGSKDCYAPCRKQTGCPNAKCINKSCKCYGCS	MTX-S35	1326
			SCTGSKDCYAPCRKQTGCPNAKCINKSCKCYGC	MTX-d1	1327
SCTGSKDCYAPCRKQTGCPNAKCINKSCKCYGCS	MTX-S35d1	1328
			VSCTGSKDCYAPCAKQTGCPNAKCINKSCKCYGC	MTX-A14	1329
VSCTGSKDCYAPCRAQTGCPNAKCINKSCKCYGC	MTX-A15	1330
			VSCTGSKDCYAPCRKQTGCPNAACINKSCKCYGC	MTX-A23	1331
VSCTGSKDCYAPCRKQTGCPNAKCINASCKCYGC	MTX-A27	1332
			VSCTGSKDCYAPCRKQTGCPNAKCINKSCACYGC	MTX-A30	1333
VSCTGSKDCYAPCRKQTGCPNAKCINKSCKCAGC	MTX-A32	1334

ASCTGSKDCYAPCRKQTGCPNAKCINKSCKCYGC	MTX-A1	1335
			MSCTGSKDCYAPCRKQTGCPNAKCINKSCKCYGC	MTX-M1	1336

在表13和整个说明书中，X^m19和X^m34各自独立地代表非功能性残基。

表14-卡律蝎毒素(ChTx)肽和ChTx肽类似物序列

序列/结构	缩写名称	SEQID NO：
			QFTNVSCTTSKECWSVCQRLHNTSRGKCMNKKCRCYS	ChTx	36
QFTNVSCTTSKECWSVCQRLHNTSRGKCMNKECRCYS	ChTx-E32	59
			QFTNVSCTTSKECWSVCQRLHNTSRGKCMNKDCRCYS	ChTx-D32	344
CTTSKECWSVCQRLHNTSRGKCMNKKCRCYS	ChTx-d1-d6	345
			QFTNVSCTTSKECWSVCQRLFGVDRGKCMGKKCRCYQ	ChTx-IbTx	346
QFTNVSCTTSKECWSVCQRLHNTSRGKCMNGKCRCYS	ChTx-G31	1369
			QFTNVSCTTSKECLSVCQRLHNTSRGKCMNKKCRCYS	ChTx-L14	1370
QFTNVSCTTSKECASVCQRLHNTSRGKCMNKKCRCYS	ChTx-A14	1371
			QFTNVSCTTSKECWAVCQRLHNTSRGKCMNKKCRCYS	ChTx-A15	1372
QFTNVSCTTSKECWPVCQRLHNTSRGKCMNKKCRCYS	ChTx-P15	1373
			QFTNVSCTTSKECWSACQRLHNTSRGKCMNKKCRCYS	ChTx-A16	1374
QFTNVSCTTSKECWSPCQRLHNTSRGKCMNKKCRCYS	ChTx-P16	1375
			QFTNVSCTTSKECWSVCQRLHNTSAGKCMNKKCRCYS	ChTx-A25	1376
QFTNVACTTSKECWSVCQRLHNTSRGKCMNKKCRCYS	ChTx-A6	1377
			QFTNVKCTTSKECWSVCQRLHNTSRGKCMNKKCRCYS	ChTx-K6	1378
QFTNVSCTTAKECWSVCQRLHNTSRGKCMNKKCRCYS	ChTx-A10	1379
			QFTNVSCTTPKECWSVCQRLHNTSRGKCMNKKCRCYS	ChTx-P10	1380
QFTNVSCTTSKACWSVCQRLHNTSRGKCMNKKCRCYS	ChTx-A12	1381
			QFTNVSCTTSKQCWSVCQRLHNTSRGKCMNKKCRCYS	ChTx-Q12	1382
AFTNVSCTTSKECWSVCQRLHNTSRGKCMNKKCRCYS	ChTx-A1	1383
			TFTNVSCTTSKECWSVCQRLHNTSRGKCMNKKCRCYS	ChTx-T1	1384
QATNVSCTTSKECWSVCQRLHNTSRGKCMNKKCRCYS	ChTx-A2	1385

QITNVSCTTSKECWSVCQRLHNTSRGKCMNKKCRCYS	ChTx-I2	1386
			QFANVSCTTSKECWSVCQRLHNTSRGKCMNKKCRCYS	ChTx-A3	1387
QFINVSCTTSKECWSVCQRLHNTSRGKCMNKKCRCYS	ChTx-I3	1388
			TIINVKCTSPKQCLPPCKAQFGTSRGKCMNKKCRCYSP	ChTx-MgTx	1389
TIINVSCTSPKQCLPPCKAQFGTSRGKCMNKKCRCYSP	ChTx-MgTx-b	1390

表15-SKCa抑制剂肽序列

序列/结构	缩写名称	SEQID NO：
			CNCKAPETALCARRCQQHG	蜂神经毒肽	68
AFCNLRMCQLSCRSLGLLGKCIGDKCECVKH	ScyTx	51
			AVCNLKRCQLSCRSLGLLGKCIGDKCECVKHG	BmP05	50
TVCNLRRCQLSCRSLGLLGKCIGVKCECVKH	P05	52
			AFCNLRRCELSCRSLGLLGKCIGEECKCVPY	Tamapin	53
VSCEDCPEHCSTQKAQAKCDNDKCVCEPI	P01	16
			VVIGQRCYRSPDCYSACKKLVGKATGKCTNGRCDC	TsK	47

表16-蜂神经毒肽和肽类似物抑制剂序列

序列/结构	缩写名称	SEQ ID NO：
			CNCKAPETALCARRCQQHG	蜂神经毒肽(Ap)	68
CNCXAPETALCARRCQQHG	Ap-X4	348
			CNCAAPETALCARRCQQHG	Ap-A4	349
CNCKAPETALCAXRCQQHG	Ap-X13	350
			CNCKAPETALCAARCQQHG	Ap-A13	351
CNCKAPETALCARXCQQHG	Ap-X14	352
			CNCKAPETALCARACQQHG	Ap-A14	353

表17-Scyllatoxin(ScyTx)，BmP05、P05、

Tamapin、P01肽和肽类似物抑制剂序列

序列/结构	缩写名称	SEQ ID NO：
			AFCNLRMCQLSCRSLGLLGKCIGDKCECVKH	ScyTx	51
AFCNLRRCQLSCRSLGLLGKCIGDKCECVKH	ScyTx-R7	354
			AFCNLRMCQLSCRSLGLLGKCMGKKCRCVKH	ScyTx-IbTx	355
AFSNLRMCQLSCRSLGLLGKSIGDKCECVKH	ScyTx-C/S	356
			AFCNLRRCELSCRSLGLLGKCIGEECKCVPY	Tamapin	53

表18-BKCa抑制剂肽序列

序列/结构	缩写名称	SEQ ID NO：
			QFTDVDCSVSKECWSVCKDLFGVDRGKCMGKKCRCYQ	IbTx	38
TFIDVDCTVSKECWAPCKAAFGVDRGKCMGKKCKCYV	Slotoxin(SloTx)	39
			QFTDVKCTGSKQCWPVCKQMFGKPNGKCMNGKCRCYS	BmTx1	40
WCSTCLDLACGASRECYDPCFKAFGRAHGKCMNNKCRCYTN	BuTx	41
			FGLIDVKCFASSECWTACKKVTGSGQGKCQNNQCRCY	MartenTx	35
ITINVKCTSPQQCLRPCKDRFGQHAGGKCINGKCKCYP	CllTx1	29

表19-IbTx、Slotoxin、BmTx1、&BuTX(Slotoxin家族)肽和肽类似物抑制剂序列

序列/结构	缩写名称	SEQ ID NO：
			QFTDVDCSVSKECWSVCKDLFGVDRGKCMGKKCRCYQ	IbTx	38
QFTDVDCSVSXECWSVCKDLFGVDRGKCMGKKCRCYQ	IbTx-X11	357
			QFTDVDCSVSAECWSVCKDLFGVDRGKCMGKKCRCYQ	IbTx-A11	358
QFTDVDCSVSKECWSVCXDLFGVDRGKCMGKKCRCYQ	IbTx-X18	359
			QFTDVDCSVSKECWSVCADLFGVDRGKCMGKKCRCYQ	IbTx-A18	360
QFTDVDCSVSKECWSVCKDLFGVDXGKCMGKKCRCYQ	IbTx-X25	361
			QFTDVDCSVSKECWSVCKDLFGVDAGKCMGKKCRCYQ	IbTx-A25	362
QFTDVDCSVSKECWSVCKDLFGVDRGXCMGKKCRCYQ	IbTx-X27	363
			QFTDVDCSVSKECWSVCKDLFGVDRGACMGKKCRCYQ	IbTx-A27	364

QFTDVDCSVSKECWSVCKDLFGVDRGKCMGXKCRCYQ	IbTx-X31	365
			QFTDVDCSVSKECWSVCKDLFGVDRGKCMGAKCRCYQ	IbTx-A31	366
QFTDVDCSVSKECWSVCKDLFGVDRGKCMGKXCRCYQ	IbTx-X32	367
			QFTDVDCSVSKECWSVCKDLFGVDRGKCMGKACRCYQ	IbTx-A32	368
QFTDVDCSVSKECWSVCKDLFGVDRGKCMGKKCXCYQ	IbTx-X34	369
			QFTDVDCSVSKECWSVCKDLFGVDRGKCMGKKCACYQ	IbTx-A34	370
QFTDVKCTGSKQCWPVCKQMFGKPNGKCMNGKCRCYS	BmTx1	371
			QFTDVXCTGSKQCWPVCKQMFGKPNGKCMNGKCRCYS	BmTx1-X6	372
QFTDVACTGSKQCWPVCKQMFGKPNGKCMNGKCRCYS	BmTx1-A6	373
			QFTDVKCTGSXQCWPVCKQMFGKPNGKCMNGKCRCYS	BmTx1-X11	374
QFTDVKCTGSAQCWPVCKQMFGKPNGKCMNGKCRCYS	BmTx1-A11	375
			QFTDVKCTGSKQCWPVCXQMFGKPNGKCMNGKCRCYS	BmTx1-X18	376
QFTDVKCTGSKQCWPVCAQMFGKPNGKCMNGKCRCYS	BmTx1-A18	377
			QFTDVKCTGSKQCWPVCKQMFGXPNGKCMNGKCRCYS	BmTx1-X23	378
QFTDVKCTGSKQCWPVCKQMFGAPNGKCMNGKCRCYS	BmTx1-A23	379
			QFTDVKCTGSKQCWPVCKQMFGKPNGXCMNGKCRCYS	BmTx1-X27	380
QFTDVKCTGSKQCWPVCKQMFGKPNGACMNGKCRCYS	BmTx1-A27	381
			QFTDVKCTGSKQCWPVCKQMFGKPNGKCMNGXCRCYS	BmTx1-X32	382
QFTDVKCTGSKQCWPVCKQMFGKPNGKCMNGARCYS	BmTx1-A32	383
			QFTDVKCTGSKQCWPVCKQMFGKPNGKCMNGKCXYS	BmTx1-X34	384
QFTDVKCTGSKQCWPVCKQMFGKPNGKCMNGKCAYS	BmTx1-A34	385
			WCSTCLDLACGASRECYDPCFKAFGRAHGKCMNNKCRCYTN	BuTx	386
WCSTCLDLACGASXCYDPCFKAFGRAHGKCMNNKCRCYTN	BuTx-X14	387
			WCSTCLDLACGASACYDPCFKAFGRAHGKCMNNKCRCYTN	BuTx-A14	388
WCSTCLDLACGASRECYDPCFXFGRAHGKCMNNKCRCYTN	BuTx-X22	389
			WCSTCLDLACGASRECYDPCFAGRAHGKCMNNKCRCYTN	BuTx-A22	390

WCSTCLDLACGASRECYDPCFKAFGXHGKCMNNKCRCYTN	BuTx-X26	391
			WCSTCLDLACGASRECYDPCFKAFGAHGKCMNNKCRCYTN	BuTx-A26	392
WCSTCLDLACGASRECYDPCFKAFGRAHGXMNNKCRCYTN	BuTx-X30	393
			WCSTCLDLACGASRECYDPCFKAFGRAHGAMNNKCRCYTN	BuTx-A30	394
WCSTCLDLACGASRECYDPCFKAFGRAHGKCMNNXRCYTN	BuTx-X35	395
			WCSTCLDLACGASRECYDPCFKAFGRAHGKCMNNARCYTN	BuTx-A35	396
WCSTCLDLACGASRECYDPCFKAFGRAHGKCMNNKCXYTN	BuTx-X37	397
			WCSTCLDLACGASRECYDPCFKAFGRAHGKCMNNKCAYTN	BuTx-A37	398

表20-貂毒素(Martentoxin)肽和肽类似物抑制剂序列

序列/结构	缩写名称	SEQ ID NO：
			FGLIDVKCFASSECWTACKKVTGSGQGKCQNNQCRCY	MartenTx	35
FGLIDVXCFASSECWTACKKVTGSGQGKCQNNQCRCY	MartenTx-X7	399
			FGLIDVACFASSECWTACKKVTGSGQGKCQNNQCRCY	MartenTx-A7	400
FGLIDVKCFASSECWTACXKVTGSGQGKCQNNQCRCY	MartenTx-X19	401
			FGLIDVKCFASSECWTACAKVTGSGQGKCQNNQCRCY	MartenTx-A19	402
FGLIDVKCFASSECWTACKXVTGSGQGKCQNNQCRCY	MartenTx-X20	403
			FGLIDVKCFASSECWTACKAVTGSGQGKCQNNQCRCY	MartenTx-A20	404
FGLIDVKCFASSECWTACKKVTGSGQGXCQNNQCRCY	MartenTx-X28	405
			FGLIDVKCFASSECWTACKKVTGSGQGACQNNQCRCY	MartenTx-A28	406
FGLIDVKCFASSECWTACKKVTGSGQGKCQNNQCXCY	MartenTx-X35	407
			FGLIDVKCFASSECWTACKKVTGSGQGKCQNNQCACY	MartenTx-A35	408

表21-N型Ca²⁺通道抑制剂肽序列

序列/纯构	缩写名称	SEQID NO：
			CKGKGAKCSRLMYDCCTGSCRSGKC	MVIIA	65
CKSPGSSCSPTSYNCCRSCNPYTKRCY	GVIA	64
			CKSKGAKCSKLMYDCCTGSCSGTVGRC	CVIA	409
CKLKGQSCRKTSYDCCSGSCGRSGKC	SVIB	347
			AEKDCIAPGAPCFGTDKPCCNPRAWCSSYANKCL	Ptu1	66
CKGKGASCRKTMYDCCRGSCRSGRC	CVIB	1364
			CKGKGQSCSKLMYDCCTGSCSRRGKC	CVIC	1365
CKSKGAKCSKLMYDCCSGSCSGTVGRC	CVID	1366
			CLSXGSSCSXTSYNCCRSCNXYSRKCY	TVIA	1367

表22-ωMVIIA肽和肽类似物抑制剂序列

序列/结构	缩写名称	SEQ ID NO：
			CKGKGAKCSRLMYDCCTGSCRSGKC	MVIIA	65
CXGKGAKCSRLMYDCCTGSCRSGKC	MVIIA-X2	410
			CAGKGAKCSRLMYDCCTGSCRSGKC	MVIIA-A2	411
CKGXGAKCSRLMYDCCTGSCRSGKC	MVIIA-X4	412
			CKGAGAKCSRLMYDCCTGSCRSGKC	MVIIA-A4	413
CKGKGAXCSRLMYDCCTGSCRSGKC	MVIIA-X7	414
			CKGKGAACSRLMYDCCTGSCRSGKC	MVIIA-A7	415
CKGKGAKCSXLMYDCCTGSCRSGKC	MVIIA-X10	416
			CKGKGAKCSALMYDCCTGSCRSGKC	MVIIA-A10	417
CKGKGAKCSRLMYDCCTGSCXSGKC	MVIIA-X21	418
			CKGKGAKCSRLMYDCCTGSCASGKC	MVIIA-A21	419
CKGKGAKCSRLMYDCCTGSCRSGXC	MVIIA-X24	420
			CKGKGAKCSRLMYDCCTGSCRSGAC	MVIIA-A24	421

表23-ωGVIA肽和肽类似物抑制剂序列

序列/结构	缩写名称	SEQ ID NO：
			CKSPGSSCSPTSYNCCRSCNPYTKRCY	GVIA	64
CXSPGSSCSPTSYNCCRSCNPYTKRCY	GVIA-X2	422
			CASPGSSCSPTSYNCCRSCNPYTKRCY	GVIA-A2	423
CKSPGSSCSPTSYNCCXSCNPYTKRCY	GVIA-X17	424
			CKSPGSSCSPTSYNCCASCNPYTKRCY	GVIA-A17	425
CKSPGSSCSPTSYNCCRSCNPYTXRCY	GVIA-X24	426
			CKSPGSSCSPTSYNCCRSCNPYTARCY	GVIA-A24	427
CKSPGSSCSPTSYNCCRSCNPYTKXCY	GVIA-X25	428
			CKSPGSSCSPTSYNCCRSCNPYTKACY	GVIA-A25	429

表24-Ptu1肽和肽类似物抑制剂序列

序列/纯构	缩写名称	SEQ ID NO：
			AEKDCIAPGAPCFGTDKPCCNPRAWCSSYANKCL	Ptu1	66
AEXDCIAPGAPCFGTDKPCCNPRAWCSSYANKCL	Ptu1-X3	430
			AEADCIAPGAPCFGTDKPCCNPRAWCSSYANKCL	Ptu1-A3	431
AEKDCIAPGAPCFGTDXPCCNPRAWCSSYANKCL	Ptu1-X17	432
			AEKDCIAPGAPCFGTDAPCCNPRAWCSSYANKCL	Ptu1-A17	433
AEKDCIAPGAPCFGTDKPCCNPXAWCSSYANKCL	Ptu1-X23	434
			AEKDCIAPGAPCFGTDKPCCNPAAWCSSYANKCL	Ptu1-A23	435
AEKDCIAPGAPCFGTDKPCCNPRAWCSSYANXCL	Ptu1-X32	436
			AEKDCIAPGAPCFGTDKPCCNPRAWCSSYANACL	Ptu1-A32	437

表25-Thrixopelma pruriens(ProTx1)和ProTx1肽类似物以及其它T型Ca²⁺通道抑制剂肽序列

序列/结构	缩写名称	SEQID NO：
			ECRYWLGGCSAGQTCCKHLVCSRRHGWCVWDGTFS	ProTx1	56
ECXYWLGGCSAGQTCCKHLVCSRRHGWCVWDGTFS	ProTx1-X3	438
			ECAYWLGGCSAGQTCCKHLVCSRRHGWCVWDGTFS	ProTx1-A3	439

ECRYWLGGCSAGQTCCXHLVCSRRHGWCVWDGTFS	ProTx1-X17	440
			ECRYWLGGCSAGQTCCAHLVCSRRHGWCVWDGTFS	ProTx1-A17	441
ECRYWLGGCSAGQTCCKHLVCSXRHGWCVWDGTFS	ProTx1-X23	442
			ECRYWLGGCSAGQTCCKHLVCSARHGWCVWDGTFS	ProTx1-A23	443
ECRYWLGGCSAGQTCCKHLVCSRXHGWCVWDGTFS	ProTx1-X24	444
			ECRYWLGGCSAGQTCCKHLVCSRAHGWCVWDGTFS	ProTx1-A24	445
KIDGYPVDYW NCKRICWYNN KYCNDLCKGLKADSGYCWGW TLSCYCQGLP DNARIKRSGR CRA	Kurtoxin	1276

表26-BeKM1 M电流抑制剂肽和BeKM1肽类似物序列

序列/结构	缩写名称	SEQ ID NO：
			RPTDIKCSESYQCFPVCKSRFGKTNGRCVNGFCDCF	BeKM1	63
PTDIKCSESYQCFPVCKSRFGKTNGRCVNGFCDCF	BeKM1-d1	446
			XPTDIKCSESYQCFPVCKSRFGKTNGRCVNGFCDCF	BeKM1-X1	447
APTDIKCSESYQCFPVCKSRFGKTNGRCVNGFCDCF	BeKM1-A1	448
			RPTDIXCSESYQCFPVCKSRFGKTNGRCVNGFCDCF	BeKM1-X6	449
RPTDIACSESYQCFPVCKSRFGKTNGRCVNGFCDCF	BeKM1-A6	450
			RPTDIKCSESYQCFPVCXSRFGKTNGRCVNGFCDCF	BeKM1-X18	451
RPTDIKCSESYQCFPVCASRFGKTNGRCVNGFCDCF	BeKM1-A18	452
			RPTDIKCSESYQCFPVCKSXFGKTNGRCVNGFCDCF	BeKM1-X20	453
RPTDIKCSESYQCFPVCKSAFGKTNGRCVNGFCDCF	BeKM1-A20	454
			RPTDIKCSESYQCFPVCKSRFGXTNGRCVNGFCDCF	BeKM1-X23	455
RPTDIKCSESYQCFPVCKSRFGATNGRCVNGFCDCF	BeKM1-A23	456
			RPTDIKCSESYQCFPVCKSRFGKTNGXCVNGFCDCF	BeKM1-X27	457
RPTDIKCSESYQCFPVCKSRFGKTNGACVNGFCDCF	BeKM1-A27	458

表27-Na⁺通道抑制剂肽序列

序列/结构	缩写名称	SEQ ID NO：
			QRCCNGRRGCSSRWCRDHSRCC	SmIIIa	459
RDCCTOOKKCKDRQCKOQRCCA	μ-GIIIA	460
			RDCCTOORKCKDRRCKOMRCCA	μ-GIIIB	461

ZRLCCGFOKSCRSRQCKOHRCC	μ-PIIIA	462
			ZRCCNGRRGCSSRWCRDHSRCC	μ-SmIIIA	463
ACRKKWEYCIVPIIGFIYCCPGLICGPFVCV	μO-MrVIA	464
			ACSKKWEYCIVPIIGFIYCCPGLICGPFVCV	μO-MrVIB	465
EACYAOGTFCGIKOGLCCSEFCLPGVCFG	δ-PVIA	466
			DGCSSGGTFCGIHOGLCCSEFCFLWCITFID	δ-SVIE	467
WCKQSGEMCNLLDQNCCDGYCIVLVCT	δ-TxVIA	468
			VKPCRKEGQLCDPIFQNCCRGWNCVLFCV	δ-GmVIA	469

表28-Cl^-通道抑制剂肽序列

序列/结构	缩写名称	SEQID NO：
			MCMPCFTTDHQMARKCDDCCGGKGRGKCYGPQCLCR	CTX	67
MCMPCFTTDHQMAXKCDDCCGGKGRGKCYGPQCLCR	CTX-X14	470
			MCMPCFTTDHQMAAKCDDCCGGKGRGKCYGPQCLCR	CTX-A14	471
MCMPCFTTDHQMARXCDDCCGGKGRGKCYGPQCLCR	CTX-X15	472
			MCMPCFTTDHQMARACDDCCGGKGRGKCYGPQCLCR	CTX-A15	473
MCMPCFTTDHQMARKCDDCCGGXGRGKCYGPQCLCR	CTX-X23	474
			MCMPCFTTDHQMARKCDDCCGGAGRGKCYGPQCLCR	CTX-A23	475
MCMPCFTTDHQMARKCDDCCGGKGXGKCYGPQCLCR	CTX-X25	476
			MCMPCFTTDHQMARKCDDCCGGKGAGKCYGPQCLCR	CTX-A25	477
MCMPCFTTDHQMARKCDDCCGGKGRGXCYGPQCLCR	CTX-X27	478
			MCMPCFTTDHQMARKCDDCCGGKGRGACYGPQCLCR	CTX-A27	479
MCMPCFTTDHQMARKCDDCCGGKGRGKCYGPQCLCX	CTX-X36	480
			MCMPCFTTDHQMARKCDDCCGGKGRGKCYGPQCLCA	CTX-A36	481
MCMPCFTTDHQMARKCDDCCGGKGRGKCYGPQCLC	CTX-d36	482
			QTDGCGPCFTTDANMARKCRECCGGNGKCFGPQCLCNRE	Bm-12b	483
QTDGCGPCFTTDANMAXKCRECCGGNGKCFGPQCLCNRE	Bm-12b-X17	484
			QTDGCGPCFTTDANMAAKCRECCGGNGKCFGPQCLCNRE	Bm-12b-A17	485
QTDGCGPCFTTDANMARXCRECCGGNGKCFGPQCLCNRE	Bm-12b-X18	486
			QTDGCGPCFTTDANMARACRECCGGNGKCFGPQCLCNRE	Bm-12b-A18	487

QTDGCGPCFTTDANMARKCXECCGGNGKCFGPQCLCNRE	Bm-12b-X20	488
			QTDGCGPCFTTDANMARKCAECCGGNGKCFGPQCLCNRE	Bm-12b-A20	489
QTDGCGPCFTTDANMARKCRECCGGNGXCFGPQCLCNRE	Bm-12b-X28	490
			QTDGCGPCFTTDANMARKCRECCGGNGACFGPQCLCNRE	Bm-12b-A28	491
QTDGCGPCFTTDANMARKCRECCGGNGKCFGPQCLCNXE	Bm-12b-X38	492
			QTDGCGPCFTTDANMARKCRECCGGNGKCFGPQCLCNAE	Bm-12b-A38	493

表29-Kv2.1抑制剂肽序列

序列/结构	缩写名称	SEQ ID NO：
			ECRYLFGGCKTTSDCCKHLGCKFRDKYCAWDFTFS	HaTx1	494
ECXYLFGGCKTTSDCCKHLGCKFRDKYCAWDFTFS	HaTx1-X3	495
			ECAYLFGGCKTTSDCCKHLGCKFRDKYCAWDFTFS	HaTx1-A3	496
ECRYLFGGCXTTSDCCKHLGCKFRDKYCAWDFTFS	HaTx1-X10	497
			ECRYLFGGCATTSDCCKHLGCKFRDKYCAWDFTFS	HaTx1-A10	498
ECRYLFGGCKTTSDCCXHLGCKFRDKYCAWDFTFS	HaTx1-X17	499
			ECRYLFGGCKTTSDCCAHLGCKFRDKYCAWDFTFS	HaTx1-A17	500
ECRYLFGGCKTTSDCCKHLGCXFRDKYCAWDFTFS	HaTx1-X22	501
			ECRYLFGGCKTTSDCCKHLGCAFRDKYCAWDFTFS	HaTx1-A22	502
ECRYLFGGCKTTSDCCKHLGCKFXDKYCAWDFTFS	HaTx1-X24	503
			ECRYLFGGCKTTSDCCKHLGCKFADKYCAWDFTFS	HaTx1-A24	504
ECRYLFGGCKTTSDCCKHLGCKFRDXYCAWDFTFS	HaTx1-X26	505
			ECRYLFGGCKTTSDCCKHLGCKFRDAYCAWDFTFS	HaTx1-A26	506

表30-Kv4.3&Kv4.2抑制剂肽序列

序列/结构	缩写名称	SEQ ID NO：
			YCQKWMWTCDEERKCCEGLVCRLWCKRIINM	PaTx2	57
YCQXWMWTCDEERKCCEGLVCRLWCKRIINM	PaTx2-X4	507
			YCQAWMWTCDEERKCCEGLVCRLWCKRIINM	PaTx2-A4	508
YCQKWMWTCDEEXKCCEGLVCRLWCKRIINM	PaTx2-X13	509
			YCQKWMWTCDEEAKCCEGLVCRLWCKRIINM	PaTx2-A13	510
YCQKWMWTCDEERXCCEGLVCRLWCKRIINM	PaTx2-X14	511

YCQKWMWTCDEERACCEGLVCRLWCKRIINM	PaTx2-A14	512
			YCQKWMWTCDEERKCCEGLVCXLWCKRIINM	PaTx2-X22	513
YCQKWMWTCDEERKCCEGLVCALWCKRIINM	PaTx2-A22	514
			YCQKWMWTCDEERKCCEGLVCRLWCXRIINM	PaTx2-X26	515
YCQKWMWTCDEERKCCEGLVCRLWCARIINM	PaTx2-A26	516
			YCQKWMWTCDEERKCCEGLVCRLWCKXIINM	PaTx2-X27	517
YCQKWMWTCDEERKCCEGLVCRLWCKAIINM	PaTx2-A27	518

表31-nACHR通道抑制剂肽序列

序列/结构	缩写名称	SEQ ID NO：
			GCCSLPPCAANNPDYC	PnIA	519
GCCSLPPCALNNPDYC	PnIA-L10	520
			GCCSLPPCAASNPDYC	PnIA-S11	521
GCCSLPPCALSNPDYC	PnIB	522
			GCCSLPPCAASNPDYC	PnIB-A10	523
GCCSLPPCALNNPDYC	PnIB-N11	524
			GCCSNPVCHLEHSNLC	MII	525
GRCCHPACGKNYSC	α-MI	526
			RD(hydroxypro)CCYHPTCNMSNPQIC	α-EI	527
GCCSYPPCFATNPDC	α-AuIB	528
			RDPCCSNPVCTVHNPQIC	α-PIA	529
GCCSDPRCAWRC	α-ImI	530
			ACCSDRRCRWRC	α-ImII	531
ECCNPACGRHYSC	α-GI	532
			GCCGSY(hydroxypro)NAACH(hydroxypro)CSCKDR(hydroxypro)SYCGQ	αA-PIVA	533
GCCPY(hydroxypro)NAACH(hydroxypro)CGCKVGR(hydroxypro)(hydroxypro)YCDR(hydroxypro)SGG	αA-EIVA	534
			H(hydroxypro)(hydroxypro)CCLYGKCRRY(hydroxypro)GCSSASCCQR	ψ-PIIIE	535
GCCSDPRCNMNNPDYC	EpI	536

GCCSHPACAGNNQHIC	GIC	537
			IRD(γ-carboxyglu)CCSNACRVNN(hydroxypro)HVC	GID	538
GGCCSHPACAANNQDYC	AnIB	539
			GCCSYPPCFATNSDYC	AuIA	540
GCCSYPPCFATNSGYC	AuIC	541

表32-Agelenopsis aperta(美洲蜘蛛毒素)毒素肽和肽类似物以及其它Ca²⁺通道抑制剂肽

序列/结构	缩写名称	SEQID NO：
			KKKCIAKDYG RCKWGGTPCC RGRGCICSIMGTNCECKPRL IMEGLGLA	ω-Aga-IVA	959
EDNCIAEDYG KCTWGGTKCC RGRPCRCSMIGTNCECTPRL IMEGLSFA	ω-Aga-IVB	960
			SCIDIGGDCD GEKDDCQCCR RNGYCSCYSLFGYLKSGCKC VVGTSAEFQG ICRRKARQCYNSDPDKCESH NKPKRR	ω-Aga-IIIA	961
SCIDIGGDCD GEKDDCQCCR RNGYCSCYSLFGYLKSGCKC VVGTSAEFQG ICRRKARTCYNSDPDKCESH NKPKRR	ω-Aga-IIIA-T58	962
			SCIDFGGDCD GEKDDCQCCR SNGYCSCYSLFGYLKSGCKC EVGTSAEFRR ICRRKAKQCYNSDPDKCVSV YKPKRR	ω-Aga-IIIB	963
SCIDFGGDCD GEKDDCQCCR SNGYCSCYNLFGYLKSGCKC EVGTSAEFRRICRRKAKQCYNSDPDKCVSV YKPKRR	ω-Aga-IIIB-N29	964
			SCIDFGGDCD GEKDDCQCCR SNGYCSCYNLFGYLRSGCKC EVGTSAEFRR ICRRKAKQCYNSDPDKCVSV YKPKRR	ω-Aga-IIIB-N29/R35	965
NCIDFGGDCD GEKDDCQCCX RNGYCSCYNLFGYLKRGCKX EVG	ω-Aga-IIIC	966

SCIKIGEDCD GDKDDCQCCR TNGYCSXYXLFGYLKSG	ω-Aga-IIID	967
			GCIEIGGDCD GYQEKSYCQC CRNNGFCS	ω-Aga-IIA	968
AKAL PPGSVCDGNE SDCKCYGKWHKCRCPWKWHF TGEGPCTCEK GMKHTCITKLHCPNKAEWGL DW	ω-Aga-IA(major chain)	969
			ECVPENGHCR DWYDECCEGF YCSCRQPPKCICRNNNX	μ-Aga	970
DCVGESQQCA DWAGPHCCDG YYCTCRYFPKCICVNNN	μ-Aga-6	971
			ACVGENKQCA DWAGPHCCDG YYCTCRYFPKCICRNNN	μ-Aga-5	972
ACVGENQQCA DWAGPHCCDG YYCTCRYFPKCICRNNN	μ-Aga-4	973
			ADCVGDGQRC ADWAGPYCCS GYYCSCRSMPYCRCRSDS	μ-Aga-3	1275
ECATKNKRCA DWAGPWCCDG LYCSCRSYPGCMCRPSS	μ-Aga-2	974
			ECVPENGHCR DWYDECCEGF YCSCRQPPKCICRNNN	μ-Aga-1	975
AELTSCFPVGHECDGDASNCNCCGDDVYCGCGWGRWNCKCKVADQSYAYGICKDKVNCPNRHLWPAKVCKKPCRREC	Tx-1	1277
			GCANAYKSCNGPHTCCWGYNGYKKACICSGXNWK	Tx3-3	1278
SCINVGDFCDGKKDCCQCDRDNAFCSCSVIFGYKTNCRCE	Tx3-4	1279
			SCINVGDFCDGKKDDCQCCRDNAFCSCSVIFGYKTNCRCEVGTTATSYGICMAKHKCGRQTTCTKPCLSKRCKKNH	ω-PtXIIA	1280

AECLMIGDTSCVPRLGRRCCYGAWCYCDQQLSCRRVGRKRECGWVEVNCKCGWSWSQRIDDWRADYSCKCPEDQ	Dw13.3	1281
			GGCLPHNRFCNALSGPRCCSGLKCKELSIWDSRCL	Agelenin	1282
DCVRFWGKCSQTSDCCPHLACKSKWPRNICVWDGSV	ω-GTx-SIA	1283
			GCLEVDYFCG IPFANNGLCC SGNCVFVCTP Q	ω-芋螺毒素PnVIA	1284
DDDCEPPGNF CGMIKIGPPC CSGWCFFACA	ω-芋螺毒素PnVIB	1285
			VCCGYKLCHP C	λ-芋螺毒素CMrVIA	1286
MRCLPVLIIL LLLTASAPGV VVLPKTEDDVPMSSVYGNGK SILRGILRNG VCCGYKLCHP C	λ-芋螺毒素CMrVIB	1287
			KIDGYPVDYW NCKRICWYNN KYCNDLCKGLKADSGYCWGW TLSCYCQGLP DNARIKRSGRCRA	Kurtoxin	1276
CKGKGAPCRKTMYDCCSGSCGRRGKC	MVIIC	1368

本发明的分子是这样的分子，其中分子的至少一个毒素肽(P)部分包含Kv1.3拮抗剂肽。优选的是选自ShK、HmK、MgTx、AgTx1、AgTx2、Heterometrus spinnifer(HsTx1)、OSK1、Anuroctoxin(AnTx)、毒蝎毒素(NTX)、KTX1、Hongotoxin、ChTx、Titystoxin、BgK、BmKTX、BmTx、AeK、AsKS Tc30、Tc32、Pi1、Pi2和/或Pi3毒素肽和任何上述肽的肽类似物的氨基酸序列。有用的Kv1.3拮抗剂肽序列的实例包括具有上文表1、表2、表3、表4、表5、表6、表7、表8、表9、表10和/或表11所示的任何氨基酸序列的那些；

本发明组合物的其它实施方案包括至少一种作为IKCa1拮抗剂肽的毒素肽(P)。有用的IKCa1拮抗剂肽包括莫鲁蝎毒素(MTx)、ChTx肽，和上述任何肽的肽类似物，其实例包括具有表12、表13和/或表14所示的任何氨基酸序列的那些；

本发明组合物的其它实施方案包括至少一种作为SKCa抑制剂肽的毒素肽(P)。有用的SKCa抑制剂肽包括蜂神经毒肽、ScyTx、BmP05、P01、P05、Tamapin、TsK，和上述任何肽的肽类似物，其实例包括具有表15所示的任何氨基酸序列的那些；

本发明组合物的其它实施方案包括至少一种作为蜂神经毒肽的毒素肽(P)和蜂神经毒肽的肽类似物，其实例包括具有表16所示的任何氨基酸序列的那些；

本发明组合物的其它实施方案包括至少一种作为Scyllotoxin家族肽的毒素肽(P)和上述任何肽的肽类似物，其实例包括具有表17所示的任何氨基酸序列的那些；

本发明组合物的其它实施方案包括至少一种作为BKCa抑制剂肽的毒素肽(P)，其实例包括具有表18所示的任何氨基酸序列的那些；

本发明组合物的其它实施方案包括至少一种作为Slotoxin家族肽的毒素肽(P)和上述任何肽的肽类似物，其实例包括具有表19所示的任何氨基酸序列的那些；

本发明组合物的其它实施方案包括至少一种作为貂毒素肽的毒素肽(P)及其肽类似物，其实例包括具有表20所示的任何氨基酸序列的那些；

本发明组合物的其它实施方案包括至少一种作为N-型Ca²⁺通道抑制剂肽的毒素肽(P)，其实例包括具有表21所示的任何氨基酸序列的那些；

本发明组合物的其它实施方案包括至少一种作为ωMVIIA肽的毒素肽(P)及其肽类似物，其实例包括具有表22所示的任何氨基酸序列的那些；

本发明组合物的其它实施方案包括至少一种作为ωGVIA肽的毒素肽(P)及其肽类似物，其实例包括具有表23所示的任何氨基酸序列的那些；

本发明组合物的其它实施方案包括至少一种作为Ptu1肽的毒素肽(P)及其肽类似物，其实例包括具有表24所示的任何氨基酸序列的那些；

本发明组合物的其它实施方案包括至少一种作为ProTx1肽的毒素肽(P)及其肽类似物，其实例包括具有表25所示的任何氨基酸序列的那些；

本发明组合物的其它实施方案包括至少一种作为BeKM1肽的毒素肽(P)及其肽类似物，其实例包括具有表26所示的任何氨基酸序列的那些；

本发明组合物的其它实施方案包括至少一种作为Na⁺通道抑制剂肽的毒素肽(P)，其实例包括具有表27所示的任何氨基酸序列的那些；

本发明组合物的其它实施方案包括至少一种作为Cl^-通道抑制剂肽的毒素肽(P)，其实例包括具有表28所示的任何氨基酸序列的那些；

本发明组合物的其它实施方案包括至少一种作为Kv2.1抑制剂肽的毒素肽(P)，其实例包括具有表29所示的任何氨基酸序列的那些；

本发明组合物的其它实施方案包括至少一种作为Kv4.2/Kv4.3抑制剂肽的毒素肽(P)，其实例包括具有表30所示的任何氨基酸序列的那些；

本发明组合物的其它实施方案包括至少一种作为nACHR抑制剂肽的毒素肽(P)，其实例包括具有表31所示的任何氨基酸序列的那些；并且

本发明组合物的其它实施方案包括至少一种作为美洲蜘蛛毒素肽的毒素肽(P)、其肽类似物或其它钙通道抑制剂肽，其实例包括具有表32所示的任何氨基酸序列的那些。

延长半衰期的部分。本发明涉及通过N末端、C末端或嵌入的氨基酸残基之一的侧链连接于肽的至少一个延长半衰期的部分(式I中的F¹和/或F²)的存在。也可以使用多个延长半衰期的部分；如每个末端的Fc或一个末端的Fc和另一个末端或侧链的PEG基团。在其它实施方案中，Fc结构域可以聚乙二醇化(例如，根据式F¹-F²-(L)_f-P；P-(L)_g-F¹-F²；或P-(L)_g-F¹-F²-(L)_f-P)。

可以选择延长半衰期的部分，使得本发明的组合物达到足够的流体动力学大小，从而防止体内肾过滤清除。例如，可以选择延长半衰期的部分，该部分是聚合物大分子，其是基本直链的、支链的或树枝状形式。或者，可以选择延长半衰期的部分，使得本发明的组合物在体内结合血清蛋白，形成复合物，这样，由此形成的复合物避免了显著的肾清除。延长半衰期的部分可以是例如脂质；胆固醇基团(如类固醇)；碳水化合物或寡糖；或任何结合于补救受体的天然或合成蛋白、多肽或肽。

可以根据本发明使用的示例的延长半衰期的部分包括免疫球蛋白Fc结构域或其部分，或生物学合适的聚合物或共聚物，例如，聚亚烷基二醇化合物，如聚乙二醇或聚丙二醇。其它合适的聚亚烷基二醇化合物包括但不限于以下类型的带电的或中性聚合物：葡聚糖、聚赖氨酸、多聚乙酰神经氨酸或其它基于碳水化合物的聚合物、氨基酸的聚合物，和生物素衍生物。

根据本发明的延长半衰期的部分的其它实例包括乙二醇的共聚物、丙二醇的共聚物、羧甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1，3-二烷、聚-1，3，6-三烷、乙烯/马来酸酐共聚物、聚氨基酸(如聚赖氨酸)、葡聚糖n-乙烯吡咯烷酮、聚n-乙烯吡咯烷酮、丙二醇均聚物、环氧丙烷聚合物、环氧乙烷聚合物、聚氧乙烯化多元醇、聚乙烯醇、线性或支链的糖基化链、聚缩醛、长链脂肪酸、长链疏水脂族基团、免疫球蛋白Fc结构域或其部分(参见例如Feige et al.Modified peptides astherapeutic agents，美国专利No.6,660,843)、Fc的CH2结构域、白蛋白(如人血清白蛋白(HSA))；参见例如Rosen et al.Albumin fusionproteins，美国专利No.6,926,898和US 2005/0054051；Bridon et al.Protection of endogenous therapeutic peptides from peptidase activitythrough conjugation to blood components，US 6,887,470)、运甲状腺素蛋白(TTR；参见例如Walker et al.Use of transthyretin peptide/proteinfusions to increase the serum half-life of pharmacologically activepeptides/proteins，US 2003/0195154 A1；2003/0191056 A1)，或甲状腺素结合球蛋白(TBG)。因此，本发明组合物的示例的实施方案也包括HSA融合构建体，例如但不限于：HSA与ShK、OSK1或这些毒素肽的修饰类似物的融合体。实例包括HSA-L10-ShK(2-35)；HSA-L10-OsK1(1-38)；HSA-L10-ShK(2-35)；和HSA-L10-OsK1(1-38)。

根据本发明的延长半衰期的部分的一个实施方案包括在温度、pH和离子强度的生理条件下对长半衰期的血清蛋白具有结合亲和力的肽配体或小(有机)分子配体。实例包括白蛋白结合肽或小分子配体、运甲状腺素蛋白结合肽或小分子配体、甲状腺素结合球蛋白结合肽或小分子配体、抗体结合肽或小分子配体，或其它对长半衰期的血清蛋白具有亲和力的肽或小分子。(参见例如Blaney et al.Method and compositionsfor increasing the serum half-life of pharmacologically active agents bybinding to transthyretin-selective ligands，美国专利No.5,714,142；Sato etal.Serum albumin binding moieties，US 2003/0069395 A1；Jones et al.Pharmaceutical active coniugates，美国专利No.6,342,225)。“长半衰期血清蛋白”是数百种溶解于哺乳动物血浆的不同蛋白之一，包括所谓的“载体蛋白”(如白蛋白、运甲状腺素蛋白和触珠蛋白)、纤维蛋白原和其它凝血因子、补体成分、免疫球蛋白、酶抑制剂、诸如血管紧张素和缓激肽的物质的前体，以及很多其它类型的蛋白。本发明包括任何单个种类的药学可接受的延长半衰期的部分的用途，例如，但不限于本文描述的那些，或两种或多种不同的延长半衰期的部分的组合的用途，如PEG和免疫球蛋白Fc结构域或Fc的CH2结构域、白蛋白(如HSA)、白蛋白结合蛋白、运甲状腺素蛋白或TBG。

在本发明的一些实施方案中，Fc结构域或其部分，如Fc的CH2结构域，被用作延长半衰期的部分。Fc结构域可以融合于毒素肽的N末端(如根据式F¹-(L)_f-P)或C末端(如根据式P-(L)_g-F¹)，或融合在N和C末端这两个末端(如根据式F¹-(L)_f-P-(L)_g-F²或P-(L)_g-F¹-(L)_f-P)。按照本文的描述，Fc结构域和毒素肽之间可以任选包含肽接头序列。式F¹-(L)_f-P的实例包括：Fc-L10-ShK(K22A)[2-35]；Fc-L10-ShK(R1K/K22A)[1-35]；Fc-L10-ShK(R1H/K22A)[1-35]；Fc-L10-ShK(R1Q/K22A)[1-35]；Fc-L10-ShK(R1Y/K22A)[1-35]；Fc-L10-PP-ShK(K22A)[1-35]；以及本文描述的任何其它实施例。式P-(L)_g-F¹的实例包括：ShK(1-35)-L10-Fc；OsK1(1-38)-L10-Fc；Met-ShK(1-35)-L10-Fc；ShK(2-35)-L10-Fc；Gly-ShK(1-35)-L10-Fc；Osk1(1-38)-L10-Fc；以及本文描述的任何其它实施例。

Fc变体是本发明范围内的合适的延长半衰期的部分。根据本发明，天然Fc可以广泛修饰，以形成Fc变体，前体是保持与补救受体的结合；参见例如WO 97/34631，WO 96/32478和WO 04/110472。在这样的Fc变体中，可以去除天然Fc中提供本发明的融合分子不需要的结构特征或功能活性的一个或多个位点。可以通过例如取代或缺失残基、将残基插入位点或截短含有位点的部分而去除这些位点。插入或取代的残基也可以是改变的氨基酸，如肽模拟物或D-氨基酸。出于一些原因可能需要Fc变体，下文描述了一些原因。示例的Fc变体包括一些分子和序列，

其中：

1.去除了参与二硫键形成的位点。所述去除可以避免与用于生产本发明的分子的宿主细胞中存在的其它含半胱氨酸的蛋白反应。为此目的，N末端的含有半胱氨酸的区段可以截短，或半胱氨酸残基可以去除或用其它氨基酸(如丙氨酰基、丝氨酰基)取代。具体地，可以截短SEQID NO：2的N末端20个氨基酸的区段，或去除或取代SEQ ID NO：2的第7和10位的半胱氨酸残基。甚至当去除半胱氨酸残基时，单链Fc结构域仍然可以形成非共价保持在一起的二聚Fc结构域。

2.对天然Fc进行了修饰，使其与选定的宿主细胞更相容。例如，可以去除典型天然Fc的N末端附近的PA序列，其可以被大肠杆菌中的消化酶如脯氨酸亚氨基肽酶识别。也可以添加N末端甲硫氨酸残基，特别是当分子在细菌细胞如大肠杆菌中重组表达时。SEQ ID NO：2的Fc结构域(图4)是这样的Fc变体之一。

3.天然Fc的N末端的一部分被去除，以便当在选定的宿主细胞中表达时防止N末端异质性。为此目的，可以去除N末端的前20个氨基酸残基中的任何氨基酸残基，特别是第1、2、3、4和5位的那些。

4.去除了一个或多个糖基化位点。典型地糖基化的残基(如天冬酰胺)可以赋予溶胞反应。所述残基可以去除或用非糖基化残基(如丙氨酸)取代。

5.去除了参与与补体的相互作用的位点，如C1q结合位点。例如，可以去除或取代人IgG1的EKK序列。补体募集可能对本发明的分子不利，因此可以用这种Fc变体避免。

6.去除了影响与补救受体之外的Fc受体结合的位点。天然Fc可以具有与某些白细胞相互作用的位点，这些位点是本发明的融合分子不需要的，因此可以去除。

7.去除了ADCC位点。ADCC位点是本领域已知的；关于IgG1的ADCC位点，参见例如Molec.Immunol.29(5)：633-9(1992)。这些位点也是本发明的融合分子不需要的，因此可以去除。

8.当天然Fc来源于非人抗体时，天然Fc可以人源化。典型地，为了使天然Fc人源化，可以用正常存在于人天然Fc中的残基取代非人天然Fc中的选定的残基。抗体人源化的技术是本领域公知的。

优选的Fc变体包括以下这些：在SEQ ID NO：2中，第15位的亮氨酸可以被谷氨酸取代；第99位的谷氨酸被丙氨酸取代；第101和103位的赖氨酸被丙氨酸取代。此外，苯丙氨酸残基可以取代一个或多个酪氨酸残基。

替代的延长半衰期的部分是能够结合补救受体的蛋白、多肽、肽、抗体、抗体片段或小分子(如肽模拟化合物)。例如，可以用1998年4月14日授权给Presta等人的美国专利No.5,739,277中描述的多肽作为延长半衰期的部分。也可以通过噬菌体展示选择与FcRn补救受体结合的肽。所述补救受体结合化合物也包括在“延长半衰期的部分”的含义内，并且包含在本发明的范围内。应该选择所述延长半衰期的部分用于增加半衰期(如通过避免蛋白酶对序列的识别)和减少免疫原性(如通过有利于抗体人源化中发现的非免疫原性序列)。

如上文指出的，也可以将延长半衰期的聚合物部分用于F¹和F²。目前可以获得各种用于连接用作延长半衰期的部分的化学部分的方法，参见例如专利合作条约(“PCT”)国际公开No.WO 96/11953，名称为“N-Terminally Chemically Modified Protein Compositions and Methods”，在此全文引入作为参考。该PCT公开文献描述了将水溶性聚合物选择性连接于蛋白的N末端，以及其它内容。

在本发明组合物的一些实施方案中，延长半衰期的聚合物部分是聚乙二醇(PEG)，作为F¹和/或F²，但应该理解本发明组合物中，除位置F¹和/或F²外，也可以包括一个或多个缀合于分子中的其它位点，如毒素肽上的一个或多个位点的PEGs。因此，本发明组合物的一些实施方案进一步包括一个或多个缀合于非PEG的延长半衰期的部分(其是F¹和/或F²)或缀合于毒素肽(P)或缀合于上述任何这些的任何组合的一个或多个PEG部分。例如，本发明组合物的Fc结构域或其部分(作为F1和/或F2)可以通过还原烷基化的方法进行单聚乙二醇化、二聚乙二醇化，或多聚乙二醇化。

蛋白和肽与聚乙二醇(PEG)的共价缀合被广泛认为是显著延长治疗性蛋白的体内循环半衰期的方法。聚乙二醇化主要通过阻碍肾清除实现该作用，因为PEG部分给蛋白添加了显著的流体动力学半径。(Zalipsky，S.et al.Use of functionalized poly(ethylene glycol)s formodification of polypeptides.in poly(ethylene glycol)chemistry：Biotechnical and biomedical applications.J.M.Harris，Ed.Plenum Press：New York.347-370(1992))。通过蛋白和肽的聚乙二醇化通常赋予的其它益处包括增加溶解度、抗蛋白水解降解和减少治疗性多肽的免疫原性。通过一些聚乙二醇化蛋白的商业化证实了蛋白聚乙二醇化的优点，所述聚乙二醇化蛋白包括PEG-腺苷脱氨酶(Adagen^TM/EnzonCorp.)、PEG-L-天冬酰胺酶(Oncaspar^TM/Enzon Corp.)、PEG-干扰素α-2b(PEG-Intron^TM/Schering/Enzon)、PEG-干扰素α-2a(PEGASYS^TM/Roche)和PEG-G-CSF(Neulasta^TM/Amgen)以及临床试验中的很多其它聚乙二醇化蛋白。

简言之，通常通过PEG部分上的反应基团(如醛、氨基、硫醇或酯基团)的酰化或还原烷基化将PEG基团连接于本发明组合物的肽部分，连接于本发明化合物的反应基团(如醛、氨基或酯基团)。

合成肽的聚乙二醇化的有用策略是通过在溶液中形成缀合键，将各自携带彼此共同反应的特定官能度的肽和PEG部分进行组合。可以用常规固相合成容易地制备肽(参见例如图5和6以及所附文字)。在特定位点用合适的官能团使肽“预活化”。对前体进行纯化，并且完全表征，然后与PEG部分反应。肽与PEG的连接通常发生在水相，可以通过反相分析HPLC容易地监测。通过制备HPLC可以容易地纯化聚乙二醇化蛋白，并且通过分析HPLC、氨基酸分析和激光解析质谱表征。

PEG是公知的水溶性聚合物，其可以商购，或可以根据本领域公知的方法，通过乙二醇的开环聚合制备(Sandler and Karo，PolymerSynthesis，Academic Press，New York，Vol.3，138-161页)。在本申请中，广泛用术语“PEG”包括任何单、二或多官能形式的聚乙二醇分子，而无论大小或PEG末端的修饰如何，并且可以由下式表示：

X-O(CH₂CH₂O)_n-1CH₂CH₂OH，               (X)

其中n是20-2300，并且X是H或末端修饰，如C_1-4烷基。

在一些有用的实施方案中，用于本发明的PEG在一个末端以羟基或甲氧基终止，即X是H或CH₃(“甲氧基PEG”)。注意到PEG的另一个末端，即式(II)中以OH终止，通过醚氧键、胺键或酰胺键共价连接于活化部分。当用于化学结构中时，术语“PEG”包括上文式(II)，而没有示出羟基的氢，使得氧能够与接头的游离碳原子反应，形成醚键。更具体地，为了将PEG缀合于肽，肽必须与“活化”形式的PEG反应。活化的PEG可以由下式表示：

            (PEG)-(A)                 (XI)

其中PEG(上文定义)共价连接于活化部分(A)的碳原子，以形成醚键、酰胺键或酰胺键，并且(A)包含能够与肽或共价连接于肽的接头部分的氨基酸残基上的氨基、亚氨基或硫醇基团反应的反应性基团。

用于制备活化的PEG和将其缀合于生物活性肽的技术是本领域公知的。(例如参见美国专利Nos.5,643,575，5,919,455，5,932,462和5,990,237；Thompson et al.PEGylation of polypeptides，EP 0575545 B1；Petit，Site specific protein modification，美国专利Nos.6,451,986和6,548,644；S.Herman et al.Poly(ethylene glycol)with reactive endgroups：I.Modification of proteins，J.Bioactive Compatible Polymers，10：145-187(1995)；Y.Lu et al.Pegylated peptides III：Solid-phase synthesis withPEGylating reagents of varying molecular weight：synthesis of multiplyPEGylated peptides，Reactive Polymers，22：221-229(1994)；A.M.Felixet al.PEGylated Peptides IV：Enhanced biological activity of site-directed PEGylated GRF analogs，Int.J.Peptide Protein Res.46：253-264(1995)；A.M.Felix，Site-specific poly(ethylene glycol)ylation ofpeptides，ACS Symposium Series 680(poly(ethylene glycol))：218-238(1997)；Y.Ikeda et al.Polyethylene glycol derivatives，their modifiedpeptides，methods for producing them and use of the modified peptides，EP0473084 B1；G.E.Means et al.Selected techniques for the modification ofprotein side chains，in：Chemical modification of proteins，Holden Day，Inc.219(1971))。

可以通过已知方法化学合成活化的PEG，如PEG-醛或PEG-醛水合物，或者从商业来源获得，例如Shearwater Polymers，(Huntsville，A1)或Enzon，Inc.(Piscataway，N.J.)。

用于本发明目的的有用的活化PEG的一个实例是PEG-醛化合物(如甲氧基PEG-醛)，如PEG-丙醛，其可以商购自ShearwaterPolymers(Huntsville，A1)。PEG-丙醛由式PEG-CH₂CH₂CHO表示(参见例如美国专利No.5,252,714)。有用的活化的PEG的其它实例是PEG醛水合物和PEG二醛水合物，后者产生双功能活化的结构。(参见例如Bentley et al.Poly(ethylene glycol)aldehyde hydrates and relatedpolymers and applications in modifying amines，美国专利No.5,990,237)。

用于制备本发明的PEG缀合的肽的有用的活化PEG是PEG-马来酰亚胺化合物，例如但不限于甲氧基PEG-马来酰亚胺，如马来酰亚胺基单甲氧基PEG，它在制备本发明的PEG缀合的肽中特别有用。(例如Shen，N-maleimidyl polymer derivatives，美国专利No.6,602,498；C.Delgado et al.The uses and properties of PEG-linked proteins.Crit.Rev.Therap.Drug Carrier Systems，9：249-304(1992)；S.Zalipsky et al.Use of functionalized poly(ethylene glycol)s for modification ofpolypeptides，in：Poly(ethylene glycol)chemistry：Biotechnical andbiomedical applications(J.M.Harris，Editor，Plenum Press：New York，347-370(1992)；S.Herman et al.Poly(ethylene glycol)with reactiveendgroups：I.Modification of proteins，J.Bioactive Compatible Polymers，10：145-187(1995)；P.J.Shadle et al.Conjugation of polymer to colonystimulating factor-1，美国专利No.4,847,325；G.Shaw et al.Cysteineadded variants IL-3 and chemical modifications thereof，美国专利No.5,166,322和EP 0469074 B1；G.Shaw et al.Cysteine added variants ofEPO and chemical modifications thereof，EP 0668353 A1；G.Shaw et al.Cysteine added vari ants G-CSF and chemical modifications thereof，EP0668354 A1；N.V.Katre et al.Interleukin-2 muteins and polymerconjugation thereof，美国专利No.5,206,344；R.J.Goodson and N.V.Katre，Site-directed pegylation of recombinant interleukin-2 at itsglycosylation site，Biotechnology，8：343-346(1990))。

聚(乙二醇)乙烯砜是通过缀合于氨基酸残基如C残基的硫醇化氨基酸残基而制备本发明的PEG缀合的肽的另一种有用的活化PEG。(例如M.Morpurgo et al.Preparation and characterization of poly(ethyleneglycol)vinyl sulfone，Bioconj.Chem.7：363-368(1996)；也参见Harris，Functionalization of polyethylene glycol for formation of active sulfone-terminated PEG derivatives for binding to proteins and biologicallycompatible materials，美国专利Nos.5,446,090；5,739,208；5,900,461；6,610,281和6,894,025；以及Harris，Water soluble active sulfones of poly(ethylene glycol)，WO 95/13312 A1)。

在本发明中有用的另一种PEG的活化形式是PEG-N-羟基琥珀酰亚胺酯化合物，例如甲氧基PEG-N-羟基琥珀酰亚胺基(NHS)酯。

异双功能活化形式的PEG也是有用的。(参见例如Thompson et al.PEGylation reagents and biologically active compounds formed therewith，美国专利No.6,552,170)。

典型地，毒素肽或包含毒素肽的融合蛋白通过已知化学技术与活化的PEG化合物反应，所述活化的PEG化合物例如但不限于硫醇活化的PEG化合物、二醇活化的PEG化合物、PEG-酰肼化合物、PEG-羟基胺化合物或PEG-溴乙酰化合物。(参见例如S.Herman，Poly(ethyleneglycol)with Reactive Endgroups：I.Modification of Proteins，J.Bioactiveand Compatible Polymers，10：145-187(1995)；S.Zalipsky，Chemistryof Polyethylene Glycol Conjugates with Biologically Active Molecules，Advanced Drug Delivery Reviews，16：157-182(1995)；R.Greenwald etal.Poly(ethylene glycol)conjugated drugs and prodrugs：a comprehensivereview，Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems，17：101-161(2000))。

用于N末端聚乙二醇化的方法在本文实施例31-34、45和47-48中举例说明，但这些不以任何方式限制本领域技术人员可以采用的聚乙二醇化方法。

可以根据实际需要使用任何分子量的PEG，如约1,000或2,000道尔顿(Da)至约100,000Da(n是20-2300)。优选地，用于本发明的PEG缀合的肽中的PEG的组合或总分子量是约3,000Da或5,000Da-约50,000Da或60,000Da(总的n是70-1,400)，更优选约10,000Da-约40,000Da(总的n是约230-约910)。PEG的最优选的组合分子量是约20,000Da-约30,000Da(总的n是约450-约680)。PEG中的重复单元“n”的数目对于以道尔顿描述的分子量是近似的。优选地，活化的接头上的PEG的组合分子量适于药用。因此，PEG分子的组合分子量不应该超过约100,000Da。

多糖聚合物是可以用于蛋白修饰的另一类水溶性聚合物。葡聚糖是多糖聚合物，由主要通过α1-6键连接的葡萄糖的各个亚基组成。葡聚糖自身可以多个分子量范围获得，并且容易以约1kD-约70kD的分子量获得。葡聚糖是用于本发明的合适的水溶性聚合物，自身或与另一种延长半衰期的部分(如Fc)组合作为延长半衰期的部分。参见例如WO96/11953和WO 96/05309。已经报道了与治疗性或诊断性免疫球蛋白缀合的葡聚糖的使用；参见例如欧洲专利公开No.0 315 456，在此全文引入作为参考。当葡聚糖用作本发明的延长半衰期的部分的时候，约1kD-约20kD的葡聚糖是优选的。

接头。任何“接头”基团或部分(即式I-IX中的“-(L)_f-“或“-(L)_g-“)都是任选的。当存在时，其化学结构不是关键的，因为它主要起间隔基的作用。如本文所述，如果存在接头部分(-(L)_f-和/或-(L)_g-)，它可以独立地与可以存在于本发明的组合物中的任何其它接头相同或不同。例如，“(L)_f”可以与本发明的任何其它“(L)_f”或任何“(L)_g”代表相同部分或不同的部分。接头优选由肽键连接在一起的氨基酸组成。因此，在一些实施方案中，接头由肽键连接的1-约30个氨基酸组成，其中氨基酸选自20个天然存在的氨基酸。这些氨基酸中的一些可以糖基化，这是本领域技术人员充分理解的。例如，构成唾液酰化位点的有用接头序列是X₁X₂NX₄X₅G(SEQ ID NO：637)，其中X₁、X₂、X₄和X₅各自独立地是任何氨基酸残基。

在一些实施方案中，所述1-20个氨基酸选自甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺和赖氨酸。甚至更优选地，接头由空间不受阻碍的大部分氨基酸组成，如甘氨酸和丙氨酸。因此，优选的接头包括聚甘氨酸(特别是(Gly)₄、(Gly)₅)、聚(Gly-Ala)和聚丙氨酸。其它优选接头是在此鉴定为“L5”(GGGGS；SEQ ID NO：638)，“L10”(GGGGSGGGGS；SEQ ID NO：79)，“L25”GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS；SEQ ID NO：84)的那些，和用于下文实施例中的任何接头。但是，本文描述的接头是示例性的，本发明范围内的接头可以长得多，并且可以包括其它残基。

在本发明组合物的一些包括肽接头部分(L)的实施方案中，酸性残基，例如谷氨酸或天冬氨酸残基，置于接头部分(L)的氨基酸序列中。其实例包括以下肽接头序列：

GGEGGG(SEQ ID NO：639)；

GGEEEGGG(SEQ ID NO：640)；

GEEEG(SEQ ID NO：641)；

GEEE(SEQ ID NO：642)；

GGDGGG(SEQ ID NO：643)；

GGDDDGG(SEQ ID NO：644)；

GDDDG(SEQ ID NO：645)；

GDDD(SEQ ID NO：646)；

GGGGSDDSDEGSDGEDGGGGS(SEQ ID NO：647)；

WEWEW(SEQ ID NO：648)；

FEFEF(SEQ ID NO：649)；

EEEWWW(SEQ ID NO：650)；

EEEFFF(SEQ ID NO：651)；

WWEEEWW(SEQ ID NO：652)；或

FFEEEFF(SEQ ID NO：653)。

在其它实施方案中，接头构成磷酸化位点，如X₁X₂YX₃X₄G(SEQ IDNO：654)，其中X₁、X₂、X₃和X₄各自独立地是任何氨基酸残基；X₁X₂SX₃X₄G(SEQ ID NO：655)，其中X₁、X₂、X₃和X₄各自独立地是任何氨基酸残基；或X₁X₂TX₃X₄G(SEQ ID NO：656)，其中X₁、X₂、X₃和X₄各自独立地是任何氨基酸残基。

非肽接头也是可能的。例如，可以使用烷基接头如-NH-(CH₂)_s-C(O)-，其中s＝2-20。这些烷基接头可以进一步被任何非空间阻碍基团如低级烷基(如C₁-C₆)、低级酰基、卤素(如Cl、Br)、CN、NH₂、苯基等取代。示例的非肽接头是PEG接头，

其中n是使得接头的分子量为100-5000kD，优选100-500kD的数目。肽接头可以采用与上文描述相同的方式，改变形成衍生物。

衍生物。发明人也考虑对肽和/或化合物的延长半衰期的部分进行衍生。所述衍生物可以改进化合物的溶解度、吸收、生物半衰期等。可以以其它方式改变所述部分，消除或减少化合物的任何不良副作用等。示例的衍生物包括这样的化合物，其中：

1.化合物或其某部分是环状的。例如，可以修饰肽部分，使其含有2个或多个Cys残基(如，在接头中)，其可以通过二硫键形成而环化。

2.化合物是交联的，或使得能够在分子间交联。例如，可以修饰肽部分，使其含有一个Cys残基，从而能够与可能的分子形成分子间二硫键。化合物也可以通过其C末端交联，如下文所示分子。

(XIII)

3.非肽基键替代一个或多个肽基[-C(O)NR-]键。示例的非肽基键是-CH₂-氨基甲酸酯[-CH₂-OC(O)NR-]、膦酸酯、-CH₂-磺酰胺[-CH₂-S(O)₂NR-]、脲[-NHC(O)NH-]、-CH₂-仲胺和烷基化的肽[-C(O)NR⁶-，其中R⁶是低级烷基]。

4.N末端是化学衍生的。典型地，N末端可以酰基化或修饰为取代的胺。示例的N末端衍生物基团包括NRR¹(除-NH₂外)、-NRC(O)R¹、-NRC(O)OR¹、-NRS(O)₂R¹、-NHC(O)NHR¹、琥珀酰亚胺或苄氧羰基-NH-(CBZ-NH-)，其中R和R¹各自独立地是氢或低级烷基，并且其中苯环可以被1-3个选自C₁-C₄烷基、C₁-C₄烷氧基、氯和溴的取代基取代。

5.游离C末端是衍生的。典型地，C末端是酯化或酰胺化的。例如，可以采用本领域描述的方法将(NH-CH₂-CH₂-NH₂)₂添加到具有SEQ ID NOS：504-508的任何序列的本发明化合物的C末端。类似地，可以用本领域描述的方法将-NH₂添加到具有SEQ ID NOS：924-955、963-972、1005-1013或1018-1023的任何序列的本发明化合物的C末端。示例的C末端衍生物基团包括例如，-C(O)R²，其中R²是低级烷氧基或-NR³R⁴，其中R³和R⁴独立地是氢或C₁-C₈烷基(优选C₁-C₄烷基)。

6.用另一部分，优选更稳定的交联部分(如亚烷基)代替二硫键。参见例如Bhatnagar et al.(1996)，J.Med.Chem.39：3814-9；Alberts et al.(1993)Thirteenth Am.Pep.Symp.357-9。

7.修饰了一个或多个单个的氨基酸残基。已知多种衍生试剂与选定的侧链或末端残基特异性反应，如下文的详细描述。

赖氨酰残基和氨基末端残基可以与琥珀酸或其它羧酸酐反应，其反转赖氨酰残基的电荷。用于衍生含有α氨基的残基的其它合适试剂包括亚氨酸酯，如methyl picolinimidate；磷酸吡哆醛；吡哆醛；chloroborohydride；三硝基苯磺酸；O-甲基异脲；2，4戊二酮；和转氨酶催化的乙醛酸反应。

可以通过与一些常规试剂中的任何一种或其组合进行反应，修饰精氨酰残基，所述试剂包括苯基乙二醛、2，3-丁二酮、1，2-环己二酮和茚三酮。精氨酰残基的衍生需要反应在碱性条件下进行，这是因为胍官能团的高pKa。此外，这些试剂可以与赖氨酸的基团和精氨酸的ε-氨基反应。

已经全面研究了酪氨酰残基的特定修饰，特别感兴趣的是通过与芳香重氮化合物或四硝基甲烷的反应将光谱标记导入酪氨酰残基。最常见的是，分别用N-乙酰咪唑和四硝基甲烷形成O-乙酰酪氨酰种类和3-硝基衍生物。

可以通过与碳二亚胺(R′-N＝C＝N-R′)，如1-环己基-3-(2-吗啉基-(4-乙基)碳二亚胺或1-乙基-3-(4-氮-4，4-二甲基戊基)碳二亚胺的反应，选择性修饰羧基侧链基团(天冬氨酰基或谷氨酰基)。此外，天冬氨酰或谷氨酰残基可以通过与铵离子反应而转化为天冬酰胺酰和谷氨酰胺酰残基。

谷氨酰胺酰和天冬酰胺酰残基可以脱酰胺为相应的谷氨酰和天冬氨酰残基。或者，这些残基在弱酸性条件下脱酰胺。这些残基的任一形式都在本发明的范围内。

半胱氨酰残基可以被氨基酸残基或其它部分替代，以消除二硫键或相反地，使交联。参见例如Bhatnagar et al.(1996)，J.Med.Chem.39：3814-9。

用双功能试剂进行的衍生，可以用于使肽或它们的功能衍生物交联于不溶于水的支持基质，或交联于其它大分子的延长半衰期的部分。常用的交联剂包括例如1，1-二(二氮杂乙酰)-2-苯基乙烷、戊二醛、N-羟基琥珀酰亚胺酯，例如，与4-叠氮水杨酸形成的酯、同双功能亚氨酸酯，包括二琥珀酰亚胺酯，例如3，3′-二硫代二(琥珀酰亚胺基丙酸酯)，和双功能马来酰亚胺，如二-N-马来酰亚胺基-1，8-辛烷。衍生试剂如甲基-3-[(对-叠氮苯基)二硫代]propioimidate产生了可光活化的中间体，它们能够在光的存在下形成交联物。或者，将反应性的不溶于水的基质，如美国专利Nos.3,969,287；3,691,016；4,195,128；4,247,642；4,229,537；和4,330,440中描述的溴化氰活化的碳水化合物和反应性底物用于蛋白固定。

碳水化合物(寡糖)基团可以方便地连接于已知是蛋白中的糖基化位点的位点。通常，O-连接的寡糖连接于丝氨酸(Ser)或苏氨酸(Thr)残基，而N-连接的寡糖连接于天冬酰胺(Asn)残基，此时它们是序列Asn-X-Ser/Thr的一部分，其中X可以是除脯氨酸外的任何氨基酸。X优选是除脯氨酸外的19个天然存在的氨基酸之一。N-连接的和O-连接的寡糖的结构和每种类型中存在的糖残基是不同的。通常在两者中都存在的一种类型的糖是N-乙酰神经氨酸(称作唾液酸)。唾液酸通常是N-连接的和O-连接的寡糖的末端残基，并且，由于其负电性，可以给糖基化化合物赋予酸性特征。所述位点可以掺入本发明的化合物的接头，并且优选在多肽化合物的重组生产(例如在哺乳动物细胞如CHO、BHK、COS中)过程中由细胞糖基化。但是，所述位点可以通过本领域已知的合成或半合成程序进一步糖基化。

其它可能的修饰包括脯氨酸和赖氨酸的羟基化、丝氨酰或苏氨酰残基的羟基的磷酸化、Cys中硫原子的氧化、赖氨酸、精氨酸和组氨酸侧链的α-氨基的甲基化。Creighton，Proteins：Strucure and Molecule Properties(W.H.Freeman and Co.San Francisco)，pp.79-86(1983)。

本发明的化合物也可以在DNA水平改变。化合物任何部分的DNA序列可以改变为与选定的宿主细胞更相容的密码子。对于大肠杆菌(其是优选的宿主细胞)，优化的密码子是本领域已知的。可以取代密码子，以消除限制位点或引入沉默限制位点，这些位点能够辅助在选定的宿主细胞中加工DNA。可以修饰延长半衰期的部分、接头和肽DNA序列，以便引入任何上述序列改变。

也考虑制备缀合衍生物的方法。例如，肿瘤细胞具有在它们的正常对应物上不存在的表位。所述表位包括例如由它们的迅速增殖导致的不同的翻译后修饰。因此，本发明的一方面是包括下述步骤的方法：

a)选择至少一种特异性结合于靶表位的随机化肽；和

b)制备包含(i)至少一个延长半衰期的部分(Fc结构域是优选的)，(ii)选定的肽的至少一个氨基酸序列和(iii)效应物分子的药理剂。

靶表位优选是肿瘤特异性表位或病原生物特异的表位。效应物分子可以是任何上文指出的缀合配偶体，优选是放射性同位素。

制备方法

本发明也涉及用于生产本发明的多肽的核酸、表达载体和宿主细胞。宿主细胞可以是真核细胞，哺乳动物细胞是优选的，CHO细胞是最优选的。宿主细胞也可以是原核细胞，大肠杆菌细胞是最优选的。

大部分本发明的化合物可以用重组DNA技术在转化的宿主细胞中制备。为此，制备编码肽的重组DNA分子。制备所述DNA分子的方法是本领域公知的。例如，可以用合适的限制酶从DNA切除编码肽的序列。或者，可以用化学合成技术，如磷酰胺化法合成DNA分子。也可以采用这些技术的组合。

本发明也包括能够在合适的宿主中表达肽的载体。载体包含编码与合适的表达控制序列操作性连接的肽的DNA分子。在将DNA分子插入载体之前或之后实现该操作性连接的方法是公知的。表达控制序列包括启动子、激活子、增强子、操纵子、核糖体结合位点、起始信号、终止信号、加帽信号、聚腺苷酸化信号，和其它参与控制转录或翻译的信号。

用得到的具有DNA分子的载体转化合适的宿主。可以用本领域公知的方法进行转化。

可以用大量可获得和公知的宿主细胞中的任何一种来实施本发明。特定宿主的选择依赖于许多本领域公知的因素。这些包括，例如，与选定的表达载体的相容性、由DNA分子编码的肽的毒性、转化速度、回收肽的容易程度、表达特征、生物安全性和价格。必须寻求这些因素的平衡，并且理解并不是所有宿主都对特定DNA序列的表达同等有效。在这些普遍指导下，有用的微生物宿主包括细菌(如大肠杆菌物种)，酵母(如啤酒糖酵母物种)和培养的其它真菌、昆虫、植物、哺乳动物(包括人)细胞，或本领域已知的其它宿主。

随后，培养和纯化转化的宿主。可以在常规发酵条件下培养宿主细胞，以便表达需要的化合物。所述发酵条件是本领域公知的。最后，通过本领域公知的方法从培养物纯化肽。

也可以通过合成方法制备化合物。固相合成是制备单个肽的优选技术，因为它是制备小肽的最经济的方法。例如，公知的固相合成技术包括利用保护基团、接头和固相支持物，以及特定的保护和去保护反应条件、接头裂解条件、利用清除剂，和固相肽合成的其它方面。合适的技术是本领域公知的。(如Merrifield(1973)，Chem.Polypeptides，pp.335-61(Katsoyannis and Panayotis eds.)；Merrifield(1963)，J.Am.Chem. Soc.85：2149；Davis et al.(1985)，Biochem.Intl.10：394-414；Stewartand Young(1969)，Solid Phase Peptide Synthesis；U.S.Pat.No.3,941,763；Finn et al.(1976)，The Proteins(3rd ed.)2：105-253；andErickson et al.(1976)，The Proteins(3rd ed.)2：257-527；″ProtectingGroups in Organic Synthesis，″3rd Edition，T.W.Greene and P.G.M.Wuts，Eds.John Wiley & Sons，Inc.1999；NovaBiochem Catalog，2000；″Synthetic Peptides，A User′s Guide，″G.A.Grant，Ed.W.H.Freeman &Company，New York，N.Y.1992；″Advanced Chemtech Handbook ofCombinatorial & Solid Phase Organic Chemistry，″W.D.Bennet，J.W.Christensen，L.K.Hamaker，M.L.Peterson，M.R.Rhodes，and H.H.Saneii，Eds.Advanced Chemtech，1998；″Principles of Peptide Synthesis，2nd ed.″M.Bodanszky，Ed.Springer-Verlag，1993；″The Practice ofPeptide Synthesis，2nd ed.″M.Bodanszky and A.Bodanszky，Eds.Springer-Verlag，1994；″Protecting Groups，″P.J.Kocienski，Ed.GeorgThieme Verlag，Stuttgart，Germany，1994；″Fmoc Solid Phase PeptideSynthesis，A Practical Approach，″W.C.Chan and P.D.White，Eds.OxfordPress，2000，G.B.Fields et al.Synthetic Peptides：A User′s Guide，1990，77-183)。

无论本发明的组合物是通过合成还是重组技术制备，当可适用时，也可以包括合适的蛋白纯化技术。在本发明组合物的一些实施方案中，可以制备毒素肽部分和/或延长半衰期的部分，或任何其它部分，以包括合适的同位素标记(如¹²⁵I，¹⁴C，¹³C，³⁵S，³H，²H，¹³N，¹⁵N，¹⁸O，¹⁷O等)，使得容易定量或检测。

可以通过公知的有机化学技术合成包含衍生的肽或包含非肽基团的化合物。

化合物的用途

概述。本发明的化合物具有作为感兴趣的蛋白的天然配体的激动剂、模拟物或拮抗剂的药理活性，这是由于它们结合感兴趣的蛋白的能力。已知与离子通道有关的可遗传疾病(“通道病”)涉及多领域的医学，其中一些包括神经病学、肾病学、肌病学和心脏病学。归因于离子通道的一系列遗传病包括：

·囊性纤维化(Cl^-通道；CFTR)，

·Dent病(蛋白尿和高尿钙；Cl^-通道；CLCN5)，

·骨硬化病(Cl^-通道；CLCN7)，

·家族性高胰岛素血症(SUR1；KCNJ11；K通道)，

·糖尿病(KATP/SUR通道)，

·安德森综合征(KCNJ2，Kir2.1K通道)，

·Bartter综合征(KCNJ1；Kir1.1/ROMK；K通道)，

·遗传性失聪(KCNQ4；K通道)，

·遗传性高血压(利德尔综合征；SCNN1；上皮Na通道)，

·扩张性心肌病(SUR2，K通道)，

·长QT综合征或心律失常(心脏钾和钠通道)，

·Thymothy综合征(CACNA1C，Cav1.2)，

·肌无力综合征(CHRNA、CHRNB、CNRNE；nAChR)，和多种其它肌病，

·血钾过多性周期性麻痹(Na和K通道)，

·癫痫(Na⁺和K⁺通道)，

·偏瘫性偏头痛(CACNA1A，Cav2.1Ca²⁺通道和ATP1A2)，

·中央轴空病(RYR1，RyR1；Ca²⁺通道)，和

·副肌强直病和肌强直(Na⁺，Cl^-通道)

参见L.J.Ptacek and Y-H Fu(2004)，Arch.Neurol.61：166-8；B.A.Niemeyer et al.(2001)，EMBO reports 21：568-73；F.Lehmann-Horn and K.Jurkat-Rott(1999)，Physioll.Rev.79：1317-72。尽管前述列表涉及遗传病，靶定上述病症中提到的通道的分子也可以用于治疗其它或不确定来源的相关病症。

除了前述病症，也已经提供了证据来支持离子通道作为治疗靶：

·镰刀状细胞贫血(IKCa1)-在镰刀状细胞贫血中，红细胞的水份丧失，导致血红蛋白聚合和随后的溶血和血管阻塞。水份丧失是钾通过所谓的Gardos通道，即IKCa1流出的结果。因此，IKCa1的阻断是用于镰刀状细胞贫血的潜在治疗性处理。

·青光眼(BKCa)，-在青光眼中，眼内压过高，导致视神经破坏、眼功能异常，并且可能失明。BKCa钾通道的阻断可以减少眼内流体分泌并增加平滑肌收缩，可能导致眼内压降低和眼的神经保护。

·多发性硬化(Kv，KCa)，

·牛皮癣(Kv，KCa)，

·关节炎(Kv，KCa)，

·哮喘(KCa，Kv)，

·过敏(KCa，Kv)，

·COPD(KCa，Kv，Ca)，

·过敏性鼻炎(KCa，Kv)，

·肺纤维化，

·狼疮(IKCa1，Kv)，

·移植，GvHD(KCa，Kv)，

·炎性骨重吸收(KCa，Kv)，

·牙周病(KCa，Kv)，

·I型糖尿病(Kv)，-I型糖尿病是一种自身免疫病，其特征在于葡萄糖、蛋白和脂代谢异常，并且与胰岛素缺乏或抗性相关。在该疾病中，表达Kv1.3的T淋巴细胞攻击和破坏胰岛，导致β细胞丧失。Kv1.3的阻断减少炎性细胞因子。此外，Kv1.3的阻断促进GLUT4转运到质膜，从而增加胰岛素敏感性。

·肥胖(Kv)，-Kv1.3似乎在控制能量平衡和抗饮食诱导的肥胖中起关键作用。因此，Kv1.3阻断剂可以增加代谢速度，导致更高的能力利用，并且减轻体重。

·再狭窄(KCa，Ca²⁺)，-血管平滑肌细胞的增殖和迁移导致新血管内膜增厚和血管再狭窄。过量的新血管内膜平滑肌细胞增殖与IKCa1的表达升高相关。因此，IKCa1的阻断可以代表防止血管成形术后的再狭窄的治疗策略。

·局部缺血(KCa，Ca²⁺)，-在神经元和心肌局部缺血中，细胞膜的去极化导致电压门控的钠和钙通道开放。随后这导致钙过度负荷，这是细胞毒性的。电压门控的钠和/或钙通道的阻断会减少钙过度负荷，并且提供细胞保护作用。此外，由于在控制和稳定细胞膜电位中的关键作用，电压和钙活化的钾通道的调节剂也可以减少钙过度负荷和保护细胞。

·肾性尿失禁(KCa)，-肾性尿失禁与过度活跃的膀胱平滑肌细胞相关。钙激活的钾通道在膀胱平滑肌细胞中表达，其中它们控制膜电位，并间接控制细胞收缩力和频率。因此，钙激活的钾通道的开放剂提供减少膀胱的电活性和收缩活性的机理，导致减少对排尿的刺激。

·骨质疏松(Kv)，

·疼痛，包括偏头痛(Na_v，TRP[瞬时受体电位通道]，P2X，Ca²⁺)，N-型电压门控的钙通道是脊髓中伤害性神经传递的关键调节剂。齐可替定，即一种N型钙通道的肽阻断剂可以减少伤害性神经传递，并且在世界范围内批准用于症状性缓解人的严重慢性疼痛。伤害感受器特异性的N型钙通道的新阻断剂将是副作用谱减少的改进的镇痛剂。

·高血压(Ca²⁺)，-L型和T型电压门控的钙通道在血管平滑肌细胞中表达，其中它们控制兴奋-收缩偶联和细胞增殖。具体地，T型钙通道活性与高血压过程中的新血管内膜形成相关。L型和T型钙通道的阻断剂可用于高血压的临床治疗，因为它们减少钙流入，并且抑制平滑肌细胞收缩。

·创伤愈合-细胞迁移在创伤愈合中起关键作用。细胞内钙梯度被认为是角质形成细胞和成纤维细胞中的细胞迁移机制的重要调节剂。此外，跨细胞膜的离子流动与细胞体积改变相关。通过控制细胞体积，离子通道导致操作细胞迁移机制所需的细胞内环境。具体地，IKCa1似乎对于细胞迁移是普遍需要的。此外，Kv1.3、Kv3.1、NMDA受体和N型钙通道与淋巴细胞和神经元的迁移相关。

·卒中，

·阿尔茨海默病

帕金森病(nACHR，Nav)

双极情感障碍(Nav，Cav)

·癌症-在很多癌症状况中，很多钾通道基因扩增，蛋白亚基上调。与钾通道上调的病理生理作用一致，显示了钾通道阻断剂抑制子宫癌细胞和肝癌细胞的增殖，可能是通过抑制钙流入和对钙依赖性基因表达的作用。

·多种神经、心血管、代谢和自身免疫疾病。

离子通道的激动剂和拮抗剂都能够达到治疗益处。治疗益处可以来自例如拮抗Kv1.3、IKCa1、SKCa、BKCa、N型或T型Ca²⁺通道等。已经表明这些通道的小分子和肽拮抗剂在体外和体内有用。但是，生产效率和药代动力学的限制很大程度阻碍了离子通道的抑制剂肽的临床研究。

本发明的掺入电压门控的钾通道Kv1.3的肽拮抗剂的组合物可以用作具有针对自身免疫病的治疗价值的免疫抑制剂。例如，所述分子可以用于治疗多发性硬化、1型糖尿病、牛皮癣、炎性肠病和类风湿关节炎(参见例如H.Wulff et al.(2003)J.Clin.Invest.111，1703-1713和H.Rus et al.(2005)PNAS 102，11094-11099；Beeton et al.Targetingeffector memory T cells with a selective inhibitor peptide of Kv1.3channnels for therapy of autoimmune diseases，Molec.Pharmacol.67(4)：1369-81(2005)；1 Beeton et al.(2006)，Kv1.3：therapeutic targetfor cell-mediated autoimmune disease，电子未定稿版在//webfiles.uci.edu/xythoswfs/webui/2670029.1)。已经在炎症的多种临床前动物模型中检验了电压门控的钾通道Kv1.3的抑制剂。已经显示Kv1.3的小分子和肽抑制剂阻断对卵清蛋白[C.Beeton et al.(2005)Mol.Pharmacol.67，1369]和破伤风类毒素[G.C.Koo et al.(1999)Clin.Immunol.197，99]的延迟型过敏反应。除了抑制皮肤炎症，抑制剂也减少抗体的产生[G.C.Koo et al.(1997)J.Immunol.158，5120]。Kv1.3拮抗剂已经在多发性硬化(MS)的大鼠过继转移实验性自身免疫性脑脊髓炎(AT-EAE)模型中表现出效力。Kv1.3通道在来自MS患者的髓磷脂特异性T细胞上超量表达，进一步支持Kv1.3抑制剂可以在治疗MS中提供的用途。在牙周病的临床前过继转移模型中，Kv1.3抑制剂也抑制炎性骨重吸收[P.Valverde et al.(2004)J.Bone Mineral Res.19，155]。在该研究中，抑制剂额外地阻断抗体产生为细菌外膜蛋白，即细菌的一个用于诱导齿龈炎症的成分。最近在临床前大鼠模型中，显示了Kv1.3抑制剂在治疗降植烷诱导的关节炎和糖尿病中的效力[C.Beeton et al.(2006)，定稿前版本可以从//webfiles.uci.edu/xythoswfs/webui/_xy-2670029_1获得]。Kv1.3通道在T细胞和B细胞的所有亚基上表达，但效应记忆T细胞和类型转换的记忆B细胞特别依赖于Kv1.3[H.Wulff et al.(2004)J.Immunol.173，776]。来自患有新起病的1型糖尿病的患者的Gad5/胰岛素特异性T细胞、来自MS患者的髓磷脂特异性T细胞和来自类风湿关节炎患者滑膜的T细胞都超量表达Kv1.3[C.Beeton et al.(2006)，未定稿版本在//webfiles.uci.edu/xythoswfs/webui/_xy-2670029_1.]。由于Kv1.3缺陷的小鼠摄入高脂肪饮食时体重增加较少[J.Xu et al.(2003)Human Mol.Genet.12，551]并且显示葡萄糖利用改变[J.Xu et al.(2004)Proc.Natl.Acad.Sci.101，3112]，也正在研究Kv1.3用于治疗肥胖和糖尿病。也已经表明乳腺癌标本[M.Abdul et al.(2003)Anticancer Res.23，3347]和前列腺癌细胞系[S.P.Fraser et al.(2003)Pflugers Arch.446，559]表达Kv1.3，并且Kv1.3的阻断可能可以用于治疗癌症。可以根据本发明的包括Kv1.3抑制剂毒素肽的治疗自身免疫病的方法治疗的病症包括多发性硬化、1型糖尿病、牛皮癣、炎性肠病、接触性皮炎、类风湿关节炎、牛皮癣关节炎、哮喘、过敏、再狭窄、系统性硬化、纤维化、硬皮病、肾小球肾炎、干燥综合征、炎性骨重吸收、移植排斥、移植物抗宿主疾病和系统性红斑狼疮(SLE)，以及其它形式的狼疮。

一些表达中间电导率的钙激活的钾通道IKCa1的细胞包括T细胞、B细胞、肥大细胞和红细胞(RBCs)。来自IKCa1缺陷小鼠的T细胞和RBCs表现出体积调节的缺陷[T.Begenisich et al.(2004)J.Biol.Chem.279，47681]。临床前和临床研究证明IKCa1抑制剂在治疗镰刀状细胞贫血中的用途[J.W.Stocker et al.(2003)Blood 101，2412；www.icagen.com]。也已经证明IKCa1通道的阻断剂阻断EAE，表明它们可能在治疗MS中有用[E.P.Reich et al.(2005)Eur.J.Immunol.35，1027]。IgE介导的肥大细胞的组胺产生也被IKCa1抑制剂阻断[S.Mark Duffy et al.(2004)J.Allergy Clin.Immunol.114，66]，因此它们可能在治疗哮喘中有益。IKCa1通道在激活的T和B淋巴细胞上超量表达[H.Wulff et al.(2004)J.Immunol.173，776]，因此它们可能在治疗广泛的免疫病中表现出作用。除免疫系统外，IKCa1也在血管再狭窄的大鼠模型中表现出效力，因此可能代表防止血管成形术后再狭窄的新治疗策略[R.Kohler et al.(2003)Circulation 108，1119]。也认为IKCa1拮抗剂在治疗肿瘤血管发生中有用，因为抑制剂在体内阻抑内皮细胞增殖和血管发生[I.Grgic etal.(2005)Arterioscler.Thromb.Vasc.Biol.25，704]。IKCa1通道在胰腺肿瘤中上调，抑制剂阻断胰腺肿瘤细胞系的增殖[H.Jager et al.(2004)Mol Pharmacol.65，630]。IKCa1拮抗剂也代表一种减轻创伤性脑损伤导致的急性脑损害的方法[F.Mauler(2004)Eur.J.Neurosci.20，1761]。可以用IKCa1抑制剂治疗的病症包括多发性硬化、哮喘、牛皮癣、接触性皮炎、类风湿关节炎和牛皮癣关节炎、炎性肠病、移植排斥、移植物抗宿主疾病、狼疮、再狭窄、胰腺癌、肿瘤血管发生和创伤性脑损伤。

因此，掺入中间电导率的钙激活的钾通道IKCa的肽拮抗剂的本发明的分子可以用于治疗免疫功能障碍、多发性硬化、1型糖尿病、牛皮癣、炎性肠病、接触性皮炎、类风湿关节炎、牛皮癣关节炎、哮喘、过敏、再狭窄、系统性硬化、纤维化、硬皮病、肾小球肾炎、干燥综合征、炎性骨重吸收、移植排斥、移植物抗宿主疾病和狼疮。

因此，本发明包括治疗自身免疫病的方法，包括给诊断患有自身免疫病的患者施用治疗有效量的本发明的组合物，其中患者中所述病症的至少一种症状缓解，所述自身免疫病例如多发性硬化、1型糖尿病、牛皮癣、炎性肠病、接触性皮炎、类风湿关节炎、牛皮癣关节炎、哮喘、过敏、再狭窄、系统性硬化、纤维化、硬皮病、肾小球肾炎、干燥综合征、炎性骨重吸收、移植排斥、移植物抗宿主疾病或狼疮。“缓解”表示减弱、减轻、减少、弱化、缩减(即使其更轻或更弱)、静息、缓和、除去、解除、使其无效或削弱，而无论特定患者中感兴趣的症状是否完全清除、根除、消除或防止。

本发明进一步涉及预防或减轻多发性硬化的症状复发的方法，该方法包括给以前经历过多发性硬化的至少一种症状的患者施用预防有效量的本发明的组合物，以便防止或减轻多发性硬化的至少一种症状复发。

优选用于实施本发明的治疗自身免疫病的方法和预防或减轻多发性硬化的症状复发的方法中的本发明的组合物包括P(如式I中缀合)、Kv1.3或IKCa1拮抗剂肽，如Sh肽、OSK1肽、ChTx肽和/或莫鲁蝎毒素(MTx)肽，或任何上述肽的肽类似物。

例如，缀合的ShK肽或ShK肽类似物可以包含选自下组的氨基酸序列：表2中所示的SEQ ID NOS：5、88-200、548-561、884-950或1295-1300。

缀合的OSK1肽或OSK1肽类似物可以包含选自下组的氨基酸序列：表7中所示的SEQ ID NOS：25、294-298、562-636、980-1274、GVIINVSCKISRQCLEPCKKAGMRFGKCMNGKCHCTPK(OSK1-S7)(SEQ ID NO：1303)或GVIINVSCKISRQCLKPCKDAGMRFGKCMNGKCHCTPK(OSK1-S7，K16，D20)(SEQ ID NO：1308)。

也作为举例，缀合的MTX肽、MTX肽类似物、ChTx肽或ChTx肽类似物可以包含选自下组的氨基酸序列：表13中所示的SEQ ID NOS：20、330-343、1301、1302、1304-1307、1309、1311、1312或1315-1336；或表14中所示的SEQ ID NOS：36、59、344-346或1369-1390。

也在这些方法中有用的是缀合或未缀合的、包含选自下组的氨基酸序列的Kv1.3或IKCa1抑制剂毒素肽类似物：表2中所示的SEQ ID NOS：88、89、92、148-200、548-561、884-949或1295-1300；或表7中所示的SEQ ID NOS：980-1274、GVIINVSCKISRQCLEPCKKAGMRFGKCMNGKCHCTPK(OSK1-S7)(SEQ ID NO：1303)或GVIINVSCKISRQCLKPCKDAGMRFGKCMNGKCHCTPK(OSK1-S7，K16，D20)(SEQID NO：1308)；或表13中所示的SEQ ID NOS：330-337、341、1301、1302、1304-1307、1309、1311、1312和1315-1336。

根据这些发明方法，诊断患有自身免疫病的患者或以前经历过多发性硬化的至少一种症状的患者是熟悉自身免疫病和它们的症状的技术从业者如医生可以充分认识和/或诊断的，所述自身免疫病例如但不限于多发性硬化、1型糖尿病、牛皮癣、炎性肠病、接触性皮炎、类风湿关节炎、牛皮癣关节炎、哮喘、过敏、再狭窄、系统性硬化、纤维化、硬皮病、肾小球肾炎、干燥综合征、炎性骨重吸收、移植排斥、移植物抗宿主疾病或狼疮。

例如，多发性硬化的症状可以包括以下这些：

视觉症状，如视神经炎(视力模糊、眼痛、色觉丧失、失明)；复视(双视觉)；眼球震颤(眼急速运动)；眼辨距障碍(恒定的眼运动距离不足或过度)；核间眼肌麻痹(两眼之间缺乏协调、眼球震颤、复视)；运动和声音光幻视(当眼运动时或反应于突然的噪音而闪光)；传入性瞳孔缺陷(异常瞳孔反应)；

运动症状，如轻瘫、单肢轻瘫、下肢轻瘫、轻偏瘫、四肢轻瘫(肌肉无力-部分或轻度瘫痪)；瘫痪、下肢瘫痪、偏瘫、四肢麻痹、四肢瘫痪(瘫痪-肌肉强度完全或几乎完全丧失)；痉挛状态(丧失肌肉张力，导致受影响肢体的僵硬、疼痛和自由运动受限)；构音障碍(语言模糊和相关的语言问题)；肌肉萎缩(由于缺乏使用而肌肉消耗)；痉挛、抽筋(肌肉的不自主收缩)；张力过低、阵挛(姿势问题)；肌阵挛、肌纤维颤搐(肌肉急速运动和颤动、抽搐)；下肢不宁综合征(不自主的腿运动，特别是在夜晚令人麻烦)；足下垂(行走时足沿着地板拖曳)；反射功能障碍(MSRs、巴彬斯基反射、霍夫曼反射、查多克反射)。

感觉问题，如感觉异常(部分麻木、剌痛、嗡鸣和振动感)；感觉缺乏(完全麻木/丧失感觉)；神经痛、神经病性和神经源性疼痛(没有传入原因的疼痛、灼热、痒和电休克感)；L′Hermitte′s(当运动头部时的电休克和嗡鸣感)；本体感受功能障碍(失去身体部分的定位知觉)；三叉神经痛(面部疼痛)；

协调和平衡症状，例如，共济失调(丧失协调)；意向性震颤(进行精细运动时颤动)；辨距障碍(恒定的肢体运动距离不足或过度)；前庭性共济失调(内耳的平衡功能异常)；眩晕(由于前庭共济失调导致的恶心/呕吐/晕车)；语言共济失调(协调语言有问题、口吃)；肌张力障碍(肢体位置反射障碍)；轮替动作障碍(失去产生快速轮替运动，例如节律运动的能力)；

肠、膀胱和性症状，例如尿频、膀胱痉挛状态(尿急和尿失禁)；膀胱无力、排尿肌-括约肌协调障碍(尿不净和尿渚留)；勃起功能障碍(男性和女性性功能障碍)；性高潮缺乏(不能达到性高潮)；逆向射精(射精到膀胱)；性冷淡(不能达到性冲动)；便秘(稀少或不规律的肠蠕动)；便急(肠急)；大便失禁(肠失禁)。

认知症状，例如抑郁；认知功能障碍(短期和长期记忆问题、健忘、回想语句缓慢)；痴呆；情绪波动、情绪不稳定、欣快症；双极综合征；焦虑；失语症、言语障碍症(语言理解和产生受损)；以及

其它症状，如疲乏；Uhthoff综合征(症状的严重性增加，伴有发热)；胃食管反流(酸反流)；味觉和嗅觉受损；癫痫发作；吞咽问题、呼吸问题；和睡眠障碍。

上文列举的多发性硬化的症状仅仅是举例性的，不意欲作为本发明针对的单个患者或几个患者综合经历的所有可能症状的完全描述。本领域技术人员了解个体患者经历的自身免疫病的多种临床症状和症状的集合，本发明的治疗自身免疫病或预防或减轻多发性硬化的症状复发的方法也针对那些症状。

本发明的治疗自身免疫病或预防或减轻多发性硬化的症状复发的方法中涉及的治疗有效量、预防有效量和剂量方案将由参加的医生确定，其考虑多种改变治疗剂的作用的因素，如患者的年龄、状况、体重、性别和饮食、治疗的状况的严重性、施用时间和其它临床因素。一般地，每日量或方案应该是每千克(kg)体重约1-约10,000微克(μg)运载体缀合的肽，优选每千克体重约1-约5000μg，最优选每千克体重约1-约1000μg。

掺入电压门控的钾通道Kv2.1的肽拮抗剂的本发明的分子可以用于治疗II型糖尿病。

掺入M电流(如BeKm-1)的肽拮抗剂的本发明的分子可以用于治疗阿尔茨海默病和增强认知。

掺入电压门控的钾通道Kv4.3的肽拮抗剂的本发明的分子可以用于治疗阿尔茨海默病。

掺入小电导率的钙激活的钾通道SKCa的肽拮抗剂的本发明的分子可以用于治疗癫痫、记忆、认知、神经心理、神经、神经肌肉和免疫障碍、精神分裂症、双极情感障碍、睡眠呼吸暂停、神经退化和平滑肌障碍。

掺入N型钙通道拮抗剂肽的本发明的分子可以用于缓解疼痛。已经临床验证了具有所述活性的肽(如Ziconotide^TM、ω-芋螺毒素-MVIIA)。

掺入T型钙通道拮抗剂肽的本发明的分子可以用于缓解疼痛。一系列证据表明背根神经节中Cav3.2的抑制可以缓解慢性疼痛。T型钙通道在DRG中的一个神经元亚型的细胞体中以非常高的水平存在；这些可能是适用于检测慢移动刺激的机械刺激感受器(Shin et al.NatureNeuroscience 6：724-730，2003)，并且T细胞通道活性可能负责爆发刺激(Nelson et al.J Neurosci 25：8766-8775，2005)。米非地尔或乙琥胺对T型通道的抑制逆转了神经损伤(Dogrul et al.Pain 105：159-168，2003)或化疗(Flatters and Bennett，Pain 109：150-161，2004)诱导的动物中的机械性疼痛异常。Cav3.2(而不是Cav3.1或Cav3.3)的反义分子增加了动物的疼痛阈值，并且也减少DRG中Cav3.2蛋白的表达(Bourinet et al.EMBO J 24：315-324，2005)。类似地，局部注射的还原剂产生疼痛并且增加Cav3.2电流，氧化剂减少疼痛并且抑制Cav3.2电流，外周施用的神经类固醇是镇痛的，并且抑制来自DRG的T型电流(Todorovic et al.Pain 109：328-339，2004；Pathirathna et al.Pain114：429-443，2005)。因此，认为抑制DRG神经元细胞体中的Cav3.2可以抑制这些与慢性疼痛状态相关的神经元的反复刺激。

掺入L型钙通道拮抗剂肽的本发明的分子可以用于治疗高血压。具有所述活性的小分子(如DHP)已经得到临床验证。

掺入Na_V1(TTX_S型)通道的肽拮抗剂的本发明的分子可以用于缓解疼痛。具有所述活性的局部麻醉剂和三环抗抑郁药已经得到临床验证。本发明的所述分子可以特别用作肌肉松弛剂。

掺入Na_V1(TTX_R型)通道的肽拮抗剂的本发明的分子可以用于缓解神经或组织损伤导致的疼痛。

掺入神经胶质细胞和上皮细胞Ca²⁺激活的氯通道的肽拮抗剂的本发明的分子可以用于治疗癌症和糖尿病。

掺入NMDA受体的肽拮抗剂的本发明的分子可以用于治疗疼痛、癫痫、脑和脊髓损伤。

掺入烟碱受体的肽拮抗剂的本发明的分子可以用作肌肉松弛剂。所述分子可以用于治疗疼痛、胃运动障碍、尿失禁、尼古丁成瘾和情绪障碍。

掺入5HT3受体的肽拮抗剂的本发明的分子可以用于治疗恶心、疼痛和焦虑。

掺入去甲肾上腺素转运蛋白的肽拮抗剂的本发明的分子可以用于治疗疼痛、抗抑郁、认知、记忆和尿失禁。

掺入神经降压肽受体的肽拮抗剂的本发明的分子可以用于治疗疼痛。

除了治疗用途，本发明的化合物可以用于诊断特征在于感兴趣的它们的相关蛋白的功能障碍的疾病。在一种实施方案中，检测生物样品中的能够被激活的感兴趣蛋白(如受体)的方法包括以下步骤：(a)使样品接触本发明的化合物；和(b)检测化合物对感兴趣的蛋白的激活。生物样品包括组织标本、完整细胞或其提取物。本发明的化合物可以用作诊断试剂盒的一部分，所述试剂盒用于检测感兴趣的所述化合物的相关蛋白在生物样品中的存在。所述试剂盒采用连接了标记物的本发明的化合物，使得能够进行检测。所述化合物用于鉴定正常或异常的感兴趣蛋白。

本发明的治疗方法、组合物和化合物也可以单独或与其它分子组合用于治疗疾病。

药物组合物

概述。本发明也提供包含本发明的组合物和药学可接受载体的药物组合物。所述药物组合物可以配制用于通过多种送递途径给患者施用，例如血管内送递途径，如通过注射或输注、皮下、肌内、腹膜内、硬膜外或鞘内送递途径，或用于口服、肠道、肺(例如吸入)、鼻内、经粘膜(如舌下施用)、经皮或其它送递途径和/或本领域已知的施用形式。本发明的药物组合物可以制备为液体形式，或可以是干粉形式，如冻干形式。对于口服或肠道使用，药物组合物可以配制为例如片剂、锭剂、糖锭、水性或油性悬浮液、可分散的粉末或颗粒、乳状液、硬或软胶囊、糖浆、酏剂或肠制剂。

在本发明的实施中，“药学可接受的载体”是任何本领域技术人员已知的用于配制药物组合物的生理耐受的物质，包括任何药学可接受的稀释剂、赋形剂、分散剂、粘合剂、填料、助流剂、抗摩擦剂、压片辅助物、药片崩解剂(崩解剂)、助悬剂、润滑剂、香料、添味剂、增甜剂、渗透或穿透增强剂、防腐剂、表面活性剂、增溶剂、乳化剂、增稠剂、佐剂、染料、包衣、胶囊材料和/或其它添加剂，它们是单独或组合的。所述药物组合物可以包括具有各种缓冲液成分(如Tris-HCl、乙酸盐、磷酸盐)、pH和离子强度的稀释剂；诸如去污剂和增溶剂(如Tween^80、Polysorbate 80)的添加剂、抗氧化剂(如抗坏血酸、偏亚硫酸氢钠)、防腐剂(如Thimersol^、苯甲醇)和膨胀剂(如乳糖、甘露醇)；将这些材料掺入聚合化合物如聚乳酸、聚乙醇酸等的颗粒制剂中或掺入脂质体中。也可以使用透明质酸，它具有促进循环中的持续时间的作用。所述组合物可以影响本发明蛋白和衍生物的物理状态、稳定性、体内释放速率和体内清除速率。参见例如Remington′s Pharmaceutical Sciences，18th Ed.(1990，Mack Publishing Co.Easton，PA 18042)1435-1712页，在此全文引入作为参考。所述组合物可以制备为液体形式或可以是干粉，如冻干形式。也可以使用可植入的持续释放制剂，作为经皮或经粘膜制剂。此外(或者)，本发明提供用于本领域技术人员已知的任何缓释或持续释放制剂或微粒制剂中的组合物，例如，用于持续释放的微粒制剂，其可以通过肺、鼻内或皮下送递途径施用。

可以用惰性材料稀释本发明的组合物或增加本发明的药物组合物的体积。所述稀释剂可以包括碳水化合物，特别是甘露醇、α-乳糖、无水乳糖、纤维素、蔗糖、改性的葡聚糖和淀粉。某些无机盐也可以用作填料，包括磷酸钙、碳酸镁和氯化钠。一些可商购的稀释剂是Fast-Flo、Emdex、STA-Rx 1500、Emcompress和Avicell。

用于药物组合物的霜、油膏、栓剂和凝胶制剂中的多种常规增稠剂也可以用于本发明药物组合物的所述制剂中。也可以采用渗透或穿透增强剂，如聚乙二醇单月桂酸酯、二甲亚砜、N-乙烯基-2-吡咯烷酮、N-(2-羟乙基)-吡咯烷酮或3-羟基-N-甲基-2-吡咯烷酮。用于制备水凝胶基质的有用技术是已知的(E.g.Feijen，Biodegradablehydrogel matrices for the controlled release of pharmacologically activeagents，美国专利No.4,925,677；Shah et al.BiodegradablepH/thermosensitive hydrogels for sustained delivery of biologically activeagents，WO 00/38651 A1)。例如可以通过以下方法形成所述生物可降解的凝胶基质：使蛋白成分与多糖或粘多糖成分交联，然后加入本发明的组合物，用于送递。

无菌溶液或悬浮液形式的本发明的液体药物组合物可以通过注射，例如肌内、鞘内、硬膜外、血管内(如静脉内或动脉内)、腹膜内或皮下注射给患者施用。(参见例如Goldenberg et al.Suspensions for thesustained release of proteins，美国专利No.6,245,740和WO 00/38652A1)。也可以通过静脉内输注施用无菌溶液。本发明的组合物也可以包含在无菌固体药物组合物如冻干的粉末中，其可以在施用于患者前方便的时间用无菌水、盐水、缓冲盐水或其它合适的无菌可注射介质溶解或悬浮。

可植入的持续释放制剂也可以用于本发明的药物组合物的实施方案中。例如，药学可接受的载体(植入人或非人脊椎动物体内或皮肤下的生物可降解的基质)可以是与上文描述的那些相似的水凝胶。或者，它可以由聚α-氨基酸成分形成(Sidman，Biodegradable，implantable drugdelivery device，and process for preparing and using same，美国专利No.4,351,337)。制备用于送递药物的植入物的其它技术也是已知的，并且根据本发明是有用的。

粉末形式的药学可接受的载体是精细分割的固体，其与精细分割的活性成分，包括本发明的组合物混合。例如，在一些实施方案中，当药物组合物配制为吸入物时，粉末形式是有用的。(参见，例如Zeng et al.Method of preparing dry powder inhalation compositions，WO2004/017918；Trunk et al.Salts of the CGRP antagonist BIBN4096 andinhalable powdered medicaments containing them，美国专利No.6,900,317)。

可以用惰性材料稀释本发明的化合物或增加其体积。这些稀释剂包括碳水化合物，特别是甘露醇、α-乳糖、无水乳糖、纤维素、蔗糖、改性葡聚糖和淀粉。某些无机盐也可以用作填料，包括磷酸钙、碳酸镁和氯化钠。一些可商购的稀释剂是Fast-Flo^TM、Emdex^TM、STA-Rx^TM1500、Emcompress^TM和Avicell^TM。

崩解剂可以包含在药物组合物的制剂中，成为固体形式。用作崩解剂的材料包括但不限于淀粉，包括商购的基于淀粉的崩解剂Explotab^TM。乙醇酸淀粉钠、Amberlite^TM、羧甲基纤维素钠、ultramylopectin、藻酸钠、明胶、柑橘皮、酸性羧甲基纤维素、天然海绵和斑脱土都可以使用。不溶性阳离子交换树脂是另一种形式的崩解剂。粉末状树胶可以用作崩解剂和粘合剂，这些可以包括粉末树胶，如琼脂、刺梧桐树胶或黄蓍胶。藻酸及其钠盐也可以用作崩解剂。

也可以用粘合剂使治疗剂保持在一起，形成硬片剂，并且包括来自天然产物的材料如阿拉伯树胶、黄蓍胶、淀粉和明胶。其它包括甲基纤维素(MC)、乙基纤维素(EC)和羧甲基纤维素(CMC)。聚乙烯吡咯烷酮(PVP)和羟丙基甲基纤维素(HPMC)都可以用于醇溶液中使治疗剂粒化。

治疗制剂中也可以包含抗摩擦剂，以防止配制过程中的粘性。润滑剂可以用作治疗剂和模具壁之间的一层，这些可以包括但不限于：硬脂酸，包括其镁盐和钙盐、聚四氟乙烯(PTFE)、液体石蜡、植物油和蜡。也可以使用可溶性润滑剂，如十二烷基硫酸钠、十二烷基硫酸镁、各种分子量的聚乙二醇、Carbowax 4000和6000。

也可以加入助流剂，其改进配制过程中药物的流动特定，并且有助于压片过程中的重新调整。助流剂可以包括淀粉、滑石粉、氧化硅和水合硅铝化合物。

为了有助于本发明的化合物溶解到水性环境中，可以加入表面活性剂作为润湿剂。表面活性剂可以包括阴离子去污剂如十二烷基硫酸钠、琥珀酸二辛酯磺酸钠和二辛基磺酸钠。可以使用阳离子去污剂并且可以包括苯扎氯铵或苯索氯铵。可能包含在制剂中作为表面活性剂的可能的一系列非离子去污剂是lauromacrogol 400、polyoxyl 40 stearate、聚氧乙烯氢化蓖麻油10、50和60，一硬脂酸甘油，polysorbate 40、60、65和80，蔗糖脂肪酸酯、甲基纤维素和羧甲基纤维素。这些表面活性剂可以单独或作为不同比例的混合物存在于蛋白或衍生物的制剂中。

口服剂型。本发明组合物的口服剂型也是有用的。如果必要，组合物可以是化学修饰的，使得口服送递有效。一般地，考虑的化学修饰是将至少一个部分连接于分子自身，其中所述部分使得能够(a)抑制蛋白水解；和(b)从胃或肠摄取进入血流。也需要增加化合物的总体稳定性，并且增加在身体中的循环时间。在本发明中用作共价连接的延长半衰期的部分也可以用于此目的。所述部分的实例包括：PEG、乙二醇和丙二醇的共聚物、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮和聚脯氨酸、参见例如Abuchowski and Davis(1981)，Soluble Polymer -Enzyme Adducts，Enzymes as Drugs(Hocenberg and Roberts，eds.)，Wiley-Interscience，New York，NY，pp 367-83；Newmark，et al.(1982)，J.Appl.Biochem.4：185-9。可以使用的其它聚合物是聚-1，3-二烷、聚-1，3，6-三烷。优选用于上文所述的制药用途的是PEG部分。

对于口服送递剂型，也可以采用修饰的α氨基酸的盐，如N-(8-[2-羟基苯甲酰基]氨基)辛酸钠(SNAC)作为载体，增强本发明的治疗性化合物的吸收。已经在Emisphere Technologies进行的II期试验中证明了采用SNAC的肝素制剂的临床效力。参见美国专利No.5,792,451，“Oral drug delivery composition and methods”。

在一种实施方案中，药学可接受的载体可以是液体，并且药物组合物制备为溶液、悬浮液、乳状液、糖浆、酏剂或加压密封的组合物。活性成分(如本发明的组合物)可以溶解、稀释或悬浮于药学可接受的液体载体如水、有机溶剂、前两者的混合物或药学可接受的油或脂肪中。液体载体可以包含其它合适的药物添加剂，如去污剂和/或增溶剂(如Tween 80、Polysorbate 80)、乳化剂、合适pH的缓冲液(如Tris-HCl、乙酸盐、磷酸盐)、佐剂、抗氧化剂(如抗坏血酸、偏亚硫酸氢钠)、防腐剂(如Thimersol、苯甲醇)、增甜剂、调味剂、助悬剂、增稠剂、膨胀物质(如乳糖、甘露醇)、颜料、粘度调节剂、稳定剂、电解液、渗透压调节物质(osmolutes)或渗透压调节剂。制剂中也可以包含添加剂，以增加本发明组合物的摄取。可能具有该特性的添加剂例如是脂肪酸-油酸、亚油酸和亚麻酸。

有用的是口服固体形式，其概述于上文引用的Remington′s Pharmaceutical Sciences(1990)第89章，在此全文引入作为参考。固体剂型包括片剂、胶囊、丸剂、锭剂或糖锭、扁胶囊或小球。同样，可以用脂质体或类蛋白包囊来使本发明的组合物制剂化(例如，类蛋白微球报道于美国专利No.4,925,673)。可以使用脂质体包囊，并且脂质体可以用多种聚合物衍生(如美国专利No.5,013,556)。用于治疗的可能的固体剂型的描述参见G.S.Banker和C.T.Rhodes编的Marshall，K.Modern Pharmaceutics(1979)第10章，在此全文引入作为参考。概言之，该制剂包括本发明的化合物和使其避开胃环境并且在肠内释放生物活性物质的惰性成分。

本发明的组合物可以作为精细的多颗粒包含在制剂中，以大约1mm粒度的颗粒或小球形式存在。用于施用胶囊的材料的制剂可以是粉末、轻度压缩的塞子或甚至作为片剂。可以通过压制，制备治疗剂。

也可以包含着色剂和调味剂。例如，可以使蛋白(或衍生物)制剂化(例如通过脂质体或微球包囊)，然后进一步包含在可食用的产品中，如含有着色剂和调味剂的冷饮。

在片剂形式中，活性成分与合适比例的具有必须的压制特性的药学可接受的载体混合，并且压制为需要的性状和大小。

粉末和片剂优选含有最多99％的活性成分。合适的固体载体包括例如磷酸钙、硬脂酸镁、滑石粉、糖类、乳糖、糊精、淀粉、明胶、纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、低熔点蜡和离子交换树脂。

控释制剂可能是理想的。本发明的组合物可以掺入允许通过扩散或沥滤机理进行释放的惰性基质，如树胶。可以将缓慢降解的基质掺入制剂中，如藻酸盐、多糖。本发明组合物的另一种形式的控释是通过基于Oros^TM治疗系统(Alza Corp.)的方法，即，药物包封在一种半透膜中，使水进入，由于渗透作用，推动药物通过单个小孔。一些肠衣也具有延迟的释放作用。

制剂可以采用其它包衣。这些包括多种可以用于包衣盘中的糖类。可以在膜包衣的片剂中给予治疗剂，用于这种情况的材料分为两组。第一组是非肠衣材料，包括甲基纤维素、乙基纤维素、羟乙基纤维素、甲羟基-乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基-甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、providone和聚乙二醇。第二组由通常是邻苯二甲酸酯的肠衣材料组成。

可以用材料的混合物提供最优的膜包衣。可以在盘式包衣器或流化床中，或通过压制包衣而进行膜包衣。

肺送递形式。本发明组合物的肺送递也是有用的。将蛋白(或衍生物)送递到哺乳动物的肺中，同时吸入并且通过肺上皮被覆进入血流。(其它关于此的报道包括Adjei et al.Pharma.Res.(1990)7：565-9；Adiei et al.(1990)，Internatl.J.Pharmaceutics 63：135-44(醋酸亮丙瑞林)；Braquet et al.(1989)，J.Cardiovasc.Pharmacol.13(suppl.5)：s.143-146(内皮素-1)；Hubbard et al.(1989)，Annals Int.Med.3：206-12(α1-抗胰蛋白酶)；Smith et al.(1989)，J.Clin.Invest.84：1145-6(α1-蛋白酶)；Oswein et al.(March 1990)，″Aerosolization ofProteins，″Proc.Symp.Resp.Drug Delivery II，Keystone，Colorado(重组人生长素)；Debs et al.(1988)，J.Immunol.140：3482-8(干扰素-γ和肿瘤坏死因子α)和Platz et al.美国专利No.5,284,656(粒细胞集落刺激因子)。本发明的实施中有用的是各种设计用于肺部送递治疗产品的机械装置，包括但不限于喷雾器、计量的药剂吸入器和粉末吸入器，所有这些都是本领域技术人员熟悉的。适于实施本发明的可商购装置的一些具体实例是Mallinckrodt，Inc.St.Louis，Missouri制造的Ultravent喷雾器；Marquest Medical Products，Englewood，Colorado制造的Acorn II喷雾器；Glaxo Inc.Research Triangle Park，North Carolina制造的Ventolin计量药剂吸入器；和Fisons Corp.Bedford，Massachusetts制造的Spinhaler粉末吸入器(参见例如Helgesson et al.Inhalationdevice，美国专利No.6,892,728；McDerment et al.Dry powder inhaler，WO 02/11801 A1；Ohki et al.Inhalant medicator，美国专利No.6,273,086)。

所有所述装置都需要使用适于分散本发明化合物的制剂。典型地，每种制剂对采用的装置类型是特异性的，可以包括使用合适的推进剂材料，以及在治疗中有用的稀释剂、佐剂和/或载体。

本发明的化合物应该最有利地制备为颗粒形式，平均粒度是小于10μM(或微米)，最优选0.5-5μM，以便最有效地送递到远端肺。

药学可接受的载体包括碳水化合物，如海藻糖、甘露醇、木糖醇、蔗糖、乳糖和山梨糖醇。用于制剂中的其它成分可以包括DPPC、DOPE、DSPC和DOPC。可以使用天然或合成表面活性剂。可以使用PEG(除了其用于衍生蛋白或类似物之外)。可以使用葡聚糖，如环状葡聚糖。也可使用胆盐和其它相关增强剂。可以使用纤维素和纤维素衍生物。可以使用氨基酸，如用于缓冲液制剂中。

同样，也考虑使用脂质体、微胶囊或微球、包含体复合物，或其它类型的载体。

适用于喷射或超声喷雾器的制剂典型地包含以每mL溶液约0.1-25mg生物活性蛋白的浓度溶解于水中的本发明的化合物。制剂也可以包含缓冲液和简单的糖(如用于稳定蛋白和调节渗透压)。喷雾器制剂也可以包含表面活性剂，以减少或防止由于溶液在形成气溶胶过程中的雾化导致的表面诱导的蛋白聚集。

用于计量的药剂吸入器装置的制剂通常包含精细分割的粉末，其中包含悬浮于表面活性剂辅助的推进剂中的本发明的化合物。推进剂可以是用于此目的的任何常规材料，如含氯氟烃、含氢氯氟烃、含氢氟烃或烃，包括三氯氟甲烷、二氯二氟甲烷、二氯四氟乙烷和1，1，1，2-四氟乙烷或其组合。合适的表面活性剂包括三油酸山梨聚糖和大豆卵磷脂。油酸也可以用作表面活性剂。(参见例如Bckstrm et al.Aerosol drugformulations containing hydrofluoroalkanes and alkyl saccharides，美国专利No.6,932,962)。

用于从粉末吸入器装置分散的制剂包含精细分割的干粉，其中含有本发明的化合物，也包含膨胀剂，如乳糖、山梨糖醇、蔗糖、甘露醇、海藻糖或木糖醇，其量促进粉末从装置中分散，如制剂的50-90重量％。

鼻送递形式。根据本发明，鼻内送递本发明的组合物和/或药物组合物也是有用的，这允许其在适用于鼻内后直接通过鼻进入血流，而不必使产物在肺中沉积。适用于鼻内施用的制剂包括具有葡聚糖或环状葡聚糖的那些，并且鼻内送递装置是已知的。(参见例如Freezer，Inhaler，美国专利No.4,083,368)。

经皮和经粘膜(如颊)送递形式。在一些实施方案中，本发明的组合物配制为药学可接受的经皮或经粘膜贴剂或锭剂的一部分。经皮贴剂药物送递系统，如基质型经皮贴剂是已知的，并且用于实施本发明药物组合物的一些实施方案(如Chien et al.Transdermal estrogen/progestindosage unit，system and process，美国专利Nos.4,906,169和5,023,084；Cleary et al.Diffusion matrix for transdermal drug administration andtransdermal drug delivery devices including same，美国专利No.4,911,916；Teillaud et al.EVA-based transdermal matrix system for theadministration of an estrogen and/or a progestogen，美国专利No.5.605,702；Venkateshwaran et al.Transdermal drug delivery matrix forcoadministering estradiol and another steroid，美国专利No.5,783,208；Ebert et al.Methods for providing testosterone and optionally estrogenreplacement therapy to women，美国专利No.5,460,820)。多种用于经皮送递治疗剂的药学可接受系统也是本领域已知的，并且与本发明的实施相容。(如Heiber et al.Transmucosal delivery of macromoleculardrugs，美国专利Nos.5,346,701和5,516,523；Longenecker et al.Transmembrane formulations for drug administration，美国专利No.4,994,439)。

经颊送递本发明的组合物也是有用的。经颊送递制剂在本领域已知可用于肽。例如，配制用于通过口腔粘膜(如舌下粘膜)进行药物送递的已知片剂或贴剂系统包括一些实施方案，其包括含有药物的内层、渗透增强剂，如胆盐或梭链孢酸盐，和亲水聚合物，如羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羟乙基纤维素、葡聚糖、果胶、聚乙烯吡咯烷酮、淀粉、明胶或任何其它已知可用于此目的的聚合物。这种内层可以具有一个适于接触的表面，并且粘附于口腔中潮湿的粘膜组织，并且可以具有粘附于覆盖的非粘附惰性层的相对表面。任选地，所述经粘膜送递系统可以是双层片剂形式，其中内层也含有额外的结合剂、调味剂或填料。一些有用的系统利用非离子去污剂和渗透增强剂。经粘膜送递装置可以是游离形式，如霜、凝胶或油膏，或可以包含确定的形式，如片剂、贴剂或锭剂。例如，本发明组合物的送递可以通过经粘膜送递系统，该系统包含例如由以下材料组成的层状复合材料：粘附层、背衬层、限定含有本发明组合物的容器的可渗透膜、膜下的剥落密封盘、一个或多个热密封材料和一个可除去的释放衬垫(如Ebert et al.Transdermal deliverysystem with adhesive overlay and peel seal disc，美国专利No.5,662,925；Chang et al.Device for administering an active agent to the skin ormucosa，美国专利Nos.4,849,224和4,983,395)。这些实例仅仅是可得到的经皮粘膜送递技术的举例，并不限制本发明。

剂量。用于治疗上文描述的状况的方法的剂量方案将由医生确定，考虑改变药物作用的各种因素，如患者的年龄、状况、体重、性别和饮食、任何感染的严重程度、施用时间和其它临床因素。通常，每日方案应该是每千克体重0.1-1000微克本发明的化合物，优选每千克0.1-150微克。

实施例

上文描述的方法可以按照下文制备。这些实施例不以任何方式解释为限制本发明的范围。

                          实施例1

             Fc-L10-ShK[1-35]的哺乳动物表达

Fc-L10-ShK[1-35]也称作“Fc-2xL-ShK[1-35]”，是Kv1.3的抑制剂。按照下文的描述构建编码人IgG1的Fc区的DNA序列，其与接头序列和Kv1.3抑制剂肽ShK[1-35]的单体框内融合。本文公开了用于从哺乳动物细胞(HEK 293和中国仓鼠卵巢细胞)表达和纯化肽抗体的方法。

通过用CMV启动子加内含子(Invitrogen)替代pcDNA3.1(+)中MluI和HindIII之间的CMV启动子，构建表达pcDNA3.1(+)CMVi(图13A)。通过克隆含有5’Kozak序列、信号肽和具有HindIII-NotI消化的pcDNA3.1(+)CMVi的大片段的人Fc-接头-ActivinRIIB融合蛋白的HindIII-NotI消化的PCR产物，制备表达载体pcDNA3.1(+)CMVi-hFc-ActivinRIIB(图13B)。pcDNA3.1(+)CMVi-hFc-ActivinRIIB中的人IgG1 Fc区的核苷酸和氨基酸序列示于图3。该载体也具有通过BamHI位点分开的GGGGSGGGGS(“L10”；SEQ ID NO：79)接头，由此使得下文的寡聚物形成Fc和ShK[1-35]肽之间的10个氨基酸的接头(参见图14)，得到最终的Fc-L10-ShK[1-35]核苷酸和氨基酸序列(图14和SEQ ID NO：77和SEQ ID NO：78)。

用PCR方法构建Fc-L10-ShK[1-35]表达载体，以便制备下文所示的与四个甘氨酸和一个丝氨酸接头连接的全长ShK基因(下文的小写字母表示L型氨基酸残基的接头序列)，其具有两个终止密码子，侧翼是BamHI和NotI限制位点。

BamHI

GGATCCGGAGGAGGAGGAAGCCGCAGCTGCATCGACACCATCCCCAAGAGCCGCTGCACCGCCTTCCAG

      g  g  g  g  S  R  S  C  I  D  T  I  P  K  S  R  C  T  A  F  Q

TGCAAGCACAGCATGAAGTACCGCCTGAGCTTCTGCCGCAAGACCTGCGGCACCTGCTAATGAGCGGCCGC//SEQ ID NO：657

C  R  H  S  M  K  Y  R  L  S  F  C  R  R  T  C  G  T  C          NotI

//SEQ ID NO：658

具有下文描述的序列的两个寡聚物被用于PCR反应，该反应采用Herculase^TM聚合酶(Stratagene)，进行30个循环的94℃-30秒，50℃-30秒，和72℃-1分钟。

cat gga tcc gga gga gga gga agc cgc agc tgc atc gac acc atc ccc aag

agc cgc tgc acc gcc ttc cag tgc aag cac  //SEQ ID NO：659

cat gcg gcc gct cat tag cag gtg ccg cag gtc ttg cgg cag aag ctc agg

cgg tac ttc atg ctg tgc ttg cac tgg aag g  //SEQ ID NO：660

得到的PCR产物在1％琼脂糖凝胶上分辨为150bp的条带。用BamHI和NotI(Roche)限制酶消化150bp的PCR产物，用凝胶纯化试剂盒(Qiagen)纯化琼脂糖凝胶。同时，用BamHI和NotI限制酶消化pcDNA3.1(+)CMVi-hFc-ActivinRIIB载体(图13B)，用凝胶纯化试剂盒纯化大片段。将凝胶纯化的PCR片段连接于纯化的大片段，并且转化到XL-1blue细菌(Stratagene)中。分离来自转化的细菌菌落的DNA，用BamHI和NotI限制酶消化，在1％琼脂糖凝胶上分辨。对得到预计图样的DNA进行测序。尽管分析克隆的一些序列得到与上文序列的100％匹配，仅仅选择了1个克隆用于大规模质粒纯化。对来自pcDNA3.1(+)CMVi克隆中的Fc-2xL-ShK的DNA进行重新测序，以证明Fc和接头区，以及序列与预测的编码序列具有100％同一性，如图14所示。

在含有高葡萄糖的DMEM(Gibco)、10％胎牛血清(来自Gibco的FBS)和1X非必须氨基酸(来自Gibco的NEAA)的生长培养基中培养HEK-293细胞，该细胞用于pcDNA3.1(+)CMVi蛋白中Fc-2xL-ShK[1-35]的瞬时转染表达。用Fugene 6(Roche)将苯酚/氯仿萃取的5.6ug pcDNA3.1(+)CMVi质粒中的Fc-2xL-ShK[1-35]转染到HEK-293细胞中。回收细胞24小时，然后置于高葡萄糖的DMEM和1x NEAA培养基中持续48小时。通过使30ml条件培养基通过CentriprepYM-10过滤器(Amicon)并且通过Centricon YM-10(Amicon)过滤器进一步浓缩，将条件培养基浓缩50倍。将各种量的浓缩培养基与内部的4x加样缓冲液(不含B-巯基乙醇)混合，并且在Novex 4-20％tris-甘氨酸凝胶上电泳，该电泳中使用Novex Xcell II装置，在5x Tank缓冲液(0.123Tris碱，0.96M甘氨酸)中与10ul BenchMark预染色的蛋白梯(Invitrogen)一起在101V/46mA下进行2小时。然后，将凝胶在电印迹缓冲液(35mM Tris碱，20％甲醇，192mM甘氨酸)中浸渍30分钟。将来自Novex(目录号LC2002，0.2um孔径)的PVDF膜在甲醇中浸渍30秒，以活化PVDF，用去离子水冲洗，并且浸渍在电印迹缓冲液中。根据制造商的说明书(Novex)在40mA用XCell II印迹组件将预先浸渍的凝胶印迹到PVDF膜上2小时。然后，首先在室温下将印迹浸渍在Tris缓冲的盐水溶液pH7.5(TBS)中的5％乳(Carnation)中，并且在含有0.1％Tween-20(TBST Sigma)的TBS和HRP-缀合的鼠抗人Fc抗体(Zymed Laboratores目录号05-3320)的1％乳缓冲液中以1∶500稀释进行温育。然后，室温下在TBST中洗涤印迹3次，每次洗涤15分钟。根据制造商的说明书用AmershamPharmacia Biotech的ECL蛋白印迹检测试剂检测第一抗体。检测后，蛋白印迹分析在非还原凝胶条件下展示66kDa的预期大小(图24A)。

在含有高葡萄糖的DMEM、10％胎牛血清、1x次黄嘌呤/胸苷(来自Gibco的HT)和1X NEAA的AM1 CHOd生长培养基中培养用于稳定表达Fc-L10-ShK[1-35]的AM1 CHOd-(Amgen Proprietary)细胞。用Fugene 6将6.5ug pcDNA3.1(+)CMVi-Fc-ShK质粒转染到AM1 CHOd-细胞中。次日，将转染的细胞铺板到20个15cm的培养皿，并且用高葡萄糖的DMEM、10％FBS、1xHT、1xNEAA和庆大霉素(800ug/ml来自Gibco的G418)选择13天。将48个存活菌落挑选到2个24孔板中。使平板生长1周，然后复制以进行冷冻。将一组每个板转移到不含10％的AM1 CHOd-生长培养基上48小时，收获条件培养基。将用相同的抗人Fc抗体检测到与瞬时蛋白印迹分析相似的蛋白印迹分析用于筛选15ul条件培养基中稳定CHO克隆的表达。在48个稳定克隆中，超过50％的克隆得到预期大小为66kDa的ShK表达。选择BB6、BD5和BD6克隆，BD5和BD6作为主要克隆BB6的背景(图24B)。

用AM1 CHOd-生长培养基将BB6克隆扩充到10个滚瓶(Corning)中，并且在显微镜下判断生长到铺满。然后，用含有50％高葡萄糖DMEM和50％Ham’s F12(Gibco)以及1xHT和1xNEAA的无血清培养基更换培养基，温育一周。在一周温育时间后收获条件培养基，通过0.45μm过滤器(Corning)过滤，并且冷冻。加入新的无血清培养基，再温育一周。按照第一次那样收获无血清的条件培养基，并且冷冻。

室温下在水浴中融化大约4L条件培养基。室温下用SatoriusSartocon Polysulfon 10切向流超滤盒(0.1m²)将培养基浓缩至约450ml。然后通过带有预滤膜的0.22μm醋酸纤维素滤膜过滤保留物。然后7℃下以5ml/min将保留物加入5ml Amersham HiTrap蛋白A柱，用数倍柱体积的不含二价阳离子的Dulbecco磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤柱子，用达到100mM甘氨酸pH 3.0的梯度洗脱样品。用水将蛋白A洗脱合并物(约9ml)稀释到50ml，7℃下在S-缓冲液A(20mMNaH₂PO₄，pH 7.0)中以5ml/min加入5ml Amersham HiTrap SP-HP柱。然后用数倍柱体积的S-缓冲液A洗涤柱子，然后7℃下以5ml/min用25％-75％S-缓冲液B(20mM NaH₂PO₄，1M NaCl，pH7.0)的线性梯度，随后用达到100％S-缓冲液B的梯度进行显影。然后用考马斯亮蓝染色的tris-甘氨酸4-20％SDS-PAGE分析级分，基于这些数据合并含有需要的产物的级分。然后用Pall Life SciencesMacrosep 10K Omega离心超滤装置将合并的材料浓缩至约3.4ml，然后通过Costar 0.22μm醋酸纤维素注射器滤膜过滤。

然后用Hewlett Packard 8453分光光度计对稀释于700μl PBS中的10μl过滤的材料进行光谱扫描(图26A)。用计算分子量32,420g/mol和消光系数47,900M^-1cm^-1确定过滤的材料的浓度是5.4mg/ml。然后用考马斯亮蓝染色的tris-甘氨酸4-20％SDS-PAGE评估过滤的材料的纯度(图26B)。然后用Charles River Laboratories Endosafe-PTS系统(0.05-5EU/ml灵敏度)，采用样品在PBS中的108倍稀释液确定内毒素水平，得到＜1EU/mg蛋白的结果。然后用大小排阻色谱确定20μg产物的大分子状态，该产物在50mM NaH₂PO₄，250mMNaCl，pH 6.9中以1ml/min注射到Phenomenex BioSep SEC 3000柱(7.8×300mm)上，在280nm观察吸光度(图26C)。通过将1μl样品稀释到10μl芥子酸(在0.05％三氟乙酸，50％乙腈中是10mg/ml)中，对产物进行质谱分析。将得到的溶液(1μl)点样到MALDI样品板上。使样品干燥，然后用配备氮激光(337nm，3ns脉冲)的VoyagerDE-RP飞行时间质谱仪分析。采用了正离子/线性模式，加速电压是25kV。通过累积来自约200次激光发射的数据产生每个质谱。用已知分子量的纯化蛋白完成外部质量校准(图26D)并且证实(在实验误差内)纯化的肽抗体的完整性。然后将产物在-80℃下储存。

通过电生理(参见实施例36)确定纯化的Fc-L10-ShK[1-35]有效地阻断人Kv1.3(图30A和图30B)。纯化的Fc-L10-ShK[1-35]分子也阻断T细胞增殖(图36A和图36B)和细胞因子IL-2(图35A和图37A)和IFN-g(图35B和图37B)的产生。

                     实施例2

          Fc-L-ShK[2-35]的哺乳动物表达

用标准PCR技术构建与Kv1.3抑制剂肽ShK[2-35]的单体框内融合的人IgG1的Fc区的编码DNA序列。用最初的pcDNA3.1(+)CMVi中的Fc-2xL-ShK[1-35]作为模板(实施例1，图14)在PCR反应中制备ShK[2-35]和分子的5、10或25个氨基酸的接头部分。所有ShK构建体都应该具有以下氨基酸序列

SCIDTIPKSRCTAFQCKHSMKYRLSFCRKICGIC

           (SEQ ID NO：92)

其中野生型序列的第一个氨基酸被去除。

用于制备Fc-L5-ShK[2-35]，也称作“Fc-1xL-ShK[2-35]”的引物的序列如下所示：

cat gga tcc agc tgc atc gac acc atc//SEQ ID NO：661；

cat gcg gcc gct cat tag c//SEQ ID NO：662；

用于制备Fc-L10-ShK[2-35]，也称作“Fc-2xL-ShK[2-35]”的引物的序列如下所示：

cat gga tcc gga gga gga gga agc agc tgc a//SEQ ID NO：663；

cat gcg gcc gct cat tag cag gtg c//SEQ ID NO：664；

用于制备Fc-L25-ShK[2-35]，也称作“Fc-5xL-ShK[2-35]”的引物的序列如下所示：

cat gga tcc ggg ggt ggg ggt tct ggg ggt ggg ggt tct gga gga gga gga agcgga gga gga gga agc agc tgc a//SEQ ID NO：665；

cat gcg gcc gct cat tag cag gtg c//SEQ ID NO：666；

用BamHI和NotI(Roche)限制酶消化PCR产物，用凝胶纯化试剂盒纯化琼脂糖凝胶。同时，用BamHI和NotI限制酶消化pcDNA3.1(+)CMVi-hFc-ActivinRIIB载体，用凝胶纯化试剂盒纯化大片段。将每个纯化的PCR产物连接于大片段，并且转化到XL-1blue细菌中。分离来自转化的细菌菌落的DNA，用BamHI和NotI限制酶消化，在1％琼脂糖凝胶上分辨。对得到预计图样的DNA进行测序。尽管分析克隆的一些序列得到与上文序列的100％匹配，仅仅选择了1个克隆用于大规模质粒纯化。对来自该克隆的DNA进行重新测序，以证明Fc和接头区，以及序列与预测的序列具有100％同一性。

用Xbal和Xhol(Roche)限制酶消化含有pcDNA3.1(+)CMVi载体中的Fc-1xL-Shk[2-35]、Fc-2xL-Shk[2-35]和Fc-5xL-Shk[2-35]插入片段的质粒并且进行凝胶纯化。将插入片段单独连接到Notl和SalI(Roche)消化的pDSRα-22(Amgen Proprietary)表达载体中。通过DNA测序证实得到的构建体的完整性。最终的质粒DNA表达载体构建体是pDSRα-22-Fc-1xL-Shk[2-35]、pDSRα-22-Fc-2xL-Shk[2-35](图13C和图15)和pDSRα-22-Fc-5xL-Shk[2-35](图16)，并且分别含有5、10和25个氨基酸组成的接头。

转染前24小时，将1.2e7AM-1/D CHOd-(Amgen Proprietary)细胞铺板到T-175cm无菌组织培养瓶中，使得在转染当天达到70-80％铺满。将细胞维持在含有高葡萄糖的DMEM、5％FBS、1X谷氨酰胺青霉素/链霉素(Gibco)、1X HT、1X NEAA’s和1X丙酮酸钠(Gibco)的AM-1/D CHOd-培养基中。次日，将线性化的pDSRα22：Fc-1xL-ShK[2-35]、pDSRα22：Fc-2xL-ShK[2-35]和pDSRα22：Fc-5xL-ShK[2-35](RDS的#20050037685，20050053709，20050073295)质粒各18微克与72μg线性化的Selexis MAR质粒和pPAGO1(RDS20042009896)混合，在50ml锥形试管中稀释到6ml OptiMEM中，温育5分钟。将LF2000(210μl)加入6ml OptiMEM，温育5分钟。将稀释的DNA和LF2000混合在一起，室温下温育20分钟。同时，用PBS将细胞洗涤一次，然后在细胞中加入30ml无抗生素的OptiMEM。吸去OptiMEM，37℃下在温育器中振荡下用12ml DNA/LF2000混合物将细胞温育6小时或过夜。转染后24小时，将细胞1∶5分配到AM-1/D CHOd-培养基中，并且采用不同的稀释度，以进行菌落选择。转染后72小时，用含有高葡萄糖的DMEM中的10％渗析的FBS(Gibco)，加上1X谷氨酰胺青霉素/链霉素、1X NEAA’s和1X Na Pyr的DHFR选择培养基更换细胞培养基，使得蛋白能够表达和分泌到细胞培养基中。每周两次更换选择培养基，直到菌落大到能够挑选。pDSRa22表达载体含有DHFR表达盒，使转染的细胞能够在缺乏次黄嘌呤和胸苷的条件下生长。将得到的菌落的5个T-175合并物扩充到滚瓶中，在无血清条件下培养。收获条件培养基，以一周的间隔更换。通过0.45um醋酸纤维素滤膜(Corning，Acton，MA)过滤得到的3升条件培养基，并且转移到Protein Chemistry进行纯化。作为背景，在DHFR选择培养基上10-14天后从10cm的平板选择12个菌落，采用HRP缀合的抗人IgGFc作为探针，通过蛋白印迹评估表达水平。扩增三个最佳克隆，冷冻备用，所述克隆表达最高水平的各种具有不同接头长度的Fc-L-ShK[2-35]融合蛋白。

Fc-L10-ShK(2-35)的纯化。室温下在水浴中融化大约1L条件培养基。7℃下以5ml/min将培养基加入5ml Amersham HiTrap蛋白A柱，用数倍柱体积的不含二价阳离子的Dulbecco磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤柱子，用达到100mM甘氨酸pH 3.0的梯度洗脱样品。将蛋白A洗脱合并物(约8.5ml)与71μl 3M的醋酸钠混合，然后用水稀释到50ml。然后将稀释的材料7℃下在S-缓冲液A(20mM NaH₂PO₄，pH7.0)中以5ml/min加入5ml Amersham HiTrap SP-HP柱。然后用数倍柱体积的S-缓冲液A洗涤柱子，然后7℃下以5ml/min用25％-75％S-缓冲液B(20mM NaH₂PO₄，1M NaCl，pH 7.0)的线性梯度，随后用达到100％S-缓冲液B的梯度进行显影。然后用考马斯亮蓝染色的tris-甘氨酸4-20％SDS-PAGE分析级分，基于这些数据合并含有需要的产物的级分。然后将合并的材料通过0.22μm醋酸纤维素滤膜过滤，用Pall Life Sciences Macrosep 10K Omega离心超滤装置浓缩至约3.9ml。然后室温下以2ml/min通过具有0.22μm，25mm Mustang E膜的Pall Life Sciences Acrodisc过滤浓缩的材料。然后用Hewlett Packard 8453分光光度计对稀释于700μl PBS中的10μl过滤的材料进行光谱扫描(图27E)。用计算分子量30,008g/mol和消光系数36,900M^-1cm^-1确定过滤的材料的浓度是2.76mg/ml。由于材料存在于通透物中，用新的Macrosep滤筒对通透物重复浓缩步骤。然后室温下以2ml/min通过具有0.22μm，25mm Mustang E膜的Pall Life Sciences Acrodisc过滤新一批的浓缩材料。将两批浓缩材料合并为一个合并物。

然后用Hewlett Packard 8453分光光度计对稀释于700μl PBS中的10μl混合的合并物进行光谱扫描。用计算分子量30,008g/mol和消光系数36,900M^-1cm^-1确定过滤的材料的浓度是3.33mg/ml。然后用考马斯亮蓝染色的tris-甘氨酸4-20％SDS-PAGE评估过滤的材料的纯度(图27A)。然后用Charles River Laboratories Endosafe-PTS系统(0.05-5EU/ml灵敏度)，采用样品在PBS中的67倍稀释液确定内毒素水平，得到＜1EU/mg蛋白的结果。然后用大小排阻色谱确定50μg产物的大分子状态，该产物在50mM NaH₂PO₄，250mM NaCl，pH 6.9中以1ml/min注射到Phenomenex BioSep SEC 3000柱(7.8×300mm)上，在280nm观察吸光度(图27B)。通过将1μl样品稀释到10μl芥子酸(在0.05％三氟乙酸，50％乙腈中是10mg/ml)中，对产物进行质谱分析。将得到的溶液(1μl)点样到MALDI样品板上。使样品干燥，然后用配备氮激光(337nm，3ns脉冲)的Voyager DE-RP飞行时间质谱仪分析。采用了正离子/线性模式，加速电压是25kV。通过累积来自约200次激光发射的数据产生每个质谱。用已知分子量的纯化蛋白完成外部质量校准(图27F)并且证实(在实验误差内)纯化的肽抗体的完整性。然后将产物在-80℃下储存。

图31B显示纯化的Fc-L10-ShK[2-35]有效地阻断人Kv1.3电流(电生理按照实施例36的描述进行)。纯化的Fc-L10-ShK[2-35]分子也阻断人全血中IL-2(图64A和图64B)和IFN-g(图65A和图65B)的产生，以及T细胞上的CD40L(图66A和图66B)和IL-2R(图67A和图67B)的上调。

Fc-L5-ShK(2-35)的纯化。7℃下以5ml/min将大约1L条件培养基加入5ml Amersham HiTrap蛋白A柱，用数倍柱体积的不含二价阳离子的Dulbecco磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤柱子，用达到100mM甘氨酸pH 3.0的梯度洗脱样品。将蛋白A洗脱合并物(约9ml)与450μl1M的tris HCl pH 8.5混合，然后与230μl 2M的乙酸混合，然后用水稀释到50ml。然后将调节了pH的材料7℃下在S-缓冲液A(20mMNaH₂PO₄，pH 7.0)中以5ml/min加入5ml Amersham HiTrap SP-HP柱。然后用数倍柱体积的S-缓冲液A洗涤柱子，然后7℃下以5ml/min用25％-75％S-缓冲液B(20mM NaH₂PO₄，1M NaCl，pH 7.0)的线性梯度，随后用达到100％S-缓冲液B的梯度进行显影。然后用考马斯亮蓝染色的tris-甘氨酸4-20％SDS-PAGE分析级分，基于这些数据合并含有需要的产物的级分。然后用Pall Life Sciences Macrosep 10KOmega离心超滤装置将合并的材料浓缩至约5.5ml。然后室温下以2ml/min通过具有0.22μm，25mm Mustang E膜的Pall Life SciencesAcrodisc过滤浓缩的材料。

然后用Hewlett Packard 8453分光光度计对稀释于700μl PBS中的10μl混合的合并物进行光谱扫描(图27G)。用计算分子量29,750g/mol和消光系数36,900M^-1cm^-1确定过滤的材料的浓度是4.59mg/ml。然后用考马斯亮蓝染色的tris-甘氨酸4-20％SDS-PAGE评估过滤的材料的纯度(图27C)。然后用Charles River Laboratories Endosafe-PTS系统(0.05-5EU/ml灵敏度)，采用样品在Charles Rivers内毒素特异性缓冲液BG120中的92倍稀释液确定内毒素水平，得到＜1EU/mg蛋白的结果。然后用大小排阻色谱确定50μg产物的大分子状态，该产物在50mM NaH₂PO₄，250mM NaCl，pH 6.9中以1ml/min注射到PhenomenexBioSep SEC 3000柱(7.8×300mm)上，在280nm观察吸光度(图27H)。通过将1μl样品稀释到10μl芥子酸(在0.05％三氟乙酸，50％乙腈中是10mg/ml)中，对产物进行质谱分析。将得到的溶液(1μl)点样到MALDI样品板上。使样品干燥，然后用配备氮激光(337nm，3ns脉冲)的Voyager DE-RP飞行时间质谱仪分析。采用了正离子/线性模式，加速电压是25kV。通过累积来自约200次激光发射的数据产生每个质谱。用已知分子量的纯化蛋白完成外部质量校准(图27I)并且证实(在实验误差内)纯化的肽抗体的完整性。然后将产物在-80℃下储存。

图31C显示纯化的Fc-L5-ShK[2-35]是高度有活性的，并且阻断人Kv1.3，这是通过全细胞膜片钳电生理确定的(参见实施例36)。

Fc-L25-ShK(2-35)的纯化。7℃下以5ml/min将大约1L条件培养基加入5ml Amersham HiTrap蛋白A柱，用数倍柱体积的不含二价阳离子的Dulbecco磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤柱子，用达到100mM甘氨酸pH 3.0的梯度洗脱样品。将蛋白A洗脱合并物(约9.5ml)与119μl 3M的醋酸钠混合，然后用水稀释到50ml。然后将调节了pH的材料7℃下在S-缓冲液A(20mM NaH₂PO₄，pH 7.0)中以5ml/min加入5ml Amersham HiTrap SP-HP柱。然后用数倍柱体积的S-缓冲液A洗涤柱子，然后7℃下以5ml/min用25％-75％S-缓冲液B(20mMNaH₂PO₄，1M NaCl，pH 7.0)的线性梯度，随后用达到100％S-缓冲液B的梯度进行显影。合并含有色谱图上的主峰的级分，通过0.22μm的醋酸纤维素滤膜过滤。

然后用Hewlett Packard 8453分光光度计对稀释于700μl PBS中的20μl混合的合并物进行光谱扫描(图27J)。用计算分子量31,011g/mol和消光系数36,900M^-1cm^-1确定过滤的材料的浓度是1.40mg/ml。然后用考马斯亮蓝染色的tris-甘氨酸4-20％SDS-PAGE评估过滤的材料的纯度(图27D)。然后用Charles River Laboratories Endosafe-PTS系统(0.05-5EU/ml灵敏度)，采用样品在Charles Rivers内毒素特异性缓冲液BG120中的28倍稀释液确定内毒素水平，得到＜1EU/mg蛋白的结果。然后用大小排阻色谱确定50μg产物的大分子状态，该产物在50mM NaH₂PO₄，250mM NaCl，pH 6.9中以1ml/min注射到PhenomenexBioSep SEC 3000柱(7.8×300mm)上，在280nm观察吸光度(图27K)。通过将1μl样品稀释到10μl芥子酸(在0.05％三氟乙酸，50％乙腈中是10mg/ml)中，对产物进行质谱分析。将得到的溶液(1μl)点样到MALDI样品板上。使样品干燥，然后用配备氮激光(337nm，3ns脉冲)的Voyager DE-RP飞行时间质谱仪分析。采用了正离子/线性模式，加速电压是25kV。通过累积来自约200次激光发射的数据产生每个质谱。用已知分子量的纯化蛋白完成外部质量校准(图27L)并且证实(在实验误差内)纯化的肽抗体的完整性。然后将产物在-80℃下储存。

通过HEK293/Kv1.3细胞上的全细胞膜片钳电生理，测量出纯化的Fc-L25-ShK[2-35]以约150pM的IC₅₀抑制人Kv1.3(实施例36)。

                     实施例3

             Fc-L-ShK[1-35]的细菌表达

细菌肽抗体表达载体以及克隆和表达肽抗体的程序的说明。用于细菌表达的克隆载体(实施例3-30)是基于pAMG21(最初描述于美国专利2004/0044188)。已经对其进行了修饰，其中用氨苄青霉素抗性代替了卡那霉素抗性成分，这是通过以下步骤完成的：切除载体的独特BstBI和NsiI位点之间的DNA，采用PCR引物CCA ACA CAC TTC GAAAGA CGT TGA TCG GCA C(SEQ ID NO：667)和CAC CCA ACAATG CAT CCT TAA AAA AAT TAC GCC C(SEQ ID NO：668)，用pUC19 DNA作为赋予氨苄青霉素抗性的β-内酰胺酶基因的模板来源，用携带β-内酰胺酶基因的合适消化的PCR片段代替切除的DNA。新的版本称作pAMG21ampR。

用于实施例3-30(实施例15和16除外)中的克隆载体pAMG21ampR-Fc-Pep的说明。图11A-C和图11D(示意图)显示在基础载体pAMG21ampR中加入了ds-DNA，使得能够将肽融合体克隆到Fc基因的C末端。将DNA导入了pAMG21ampR载体中的独特NdeI和BamHI位点之间。DNA的完整区域示于图11A-C。Fc的编码区从核苷酸5134延伸到5817，蛋白序列显示于DNA序列下面。读码框内其后是glyX5接头(核苷酸5818-5832)。BsmBI位点(GAGACG)跨核苷酸5834-5839。DNA切割发生在上DNA链的核苷酸5828和5829之间，以及下DNA链的核苷酸5832和5833之间。消化产生了此处所示的4bp的粘端。BsmBI位点加下划线。

AGGTGG            TGGTTGAGACG SEQ ID NO：683

TCCACCACCA            ACTCTGC

SEQ IO NO：684

第二个BsmBI位点存在于核苷酸6643-6648；即CGTCTC。DNA切割发生在上DNA链的核苷酸6650-6651之间和下链的6654-6655之间。

CGTCTCT            TAAGGATCCG SEQ ID NO：685

GCAGAGAATTC             CTAGGC

SEQ ID NO：686

两个BsmBI位点之间是组成型表达氯霉素乙酰转移酶的不是必须的链霉素抗性盒(cat基因)。cat蛋白序列：

  1 MEKKITGYTT VDISQWHRKE HFEAFQSVAQ CTYNQTVQLD ITAFLKTVKK

 51 NKHKFYPAFI NILARLMNAH PEFRMAMKDG ELVIWDSVHP CYTVFHEQTE

101 TFSSLWSEYH DDFRQFLHIY SQDVACYGEN LAYFPKGFIE NMFFVSANPW

151 VSFTSFDLNV ANMDNFFAPV FTMGKYYTQG DKVLMPLAIQ VHHAVCDGFH

201 VGRMLNELQQ YCDEWQGGA  //SEQ ID NO：1337

如图11A-C所示，并且从核苷酸5954延伸到6610。在每个实施例(实施例15和16除外)中编码肽的双链体携带与载体中存在的粘端互补的粘端。

用于实施例15和16中的克隆载体pAMG21ampR-Pep-Fc的说 明。图12A-C和图12D中的示意图显示在基础载体pAMG21ampR中加入了ds-DNA，使得能够将肽融合体克隆到Fc基因的C末端。将DNA导入了pAMG21ampR载体中的独特NdeI和BamHI位点之间。Fc的编码区从核苷酸5640延伸到6309，蛋白序列显示于DNA序列下面。读码框内其前面是glyX5接头(核苷酸5614-5628)。BsmBI位点跨核苷酸5138-5143；即GAGACG。切割发生在上DNA链的核苷酸5132-5133之间和下DNA链的5136-5137之间。

消化产生了所示的4bp的粘端。BsmBI位点加下划线。

AATAACA                TATGCGAGACG SEQ ID NO：687

TTATTGTATAC                GCTCTGC

SEQ ID NO：688

第二个BsmBI位点存在于核苷酸5607-5612；即CGTCTC。DNA切割发生在上DNA链的核苷酸5613-5614之间和下链的5617-5618之间。

CGTCTCA                        GGTGGTGGT

GCAGAGTCCAC                        CACCA

SEQ ID NO：689

两个BsmBI位点之间是组成型表达志贺氏菌ble蛋白的不是必须的zeocin抗性盒。ble蛋白序列：

  1 MAKLTSAVPV LTARDVAGAV EFWTDRLGFS RDFVEDDFAG VVRDDVTLFI

 51 SAVQDQVVPD NTLAWVWVRG LDELYAEWSE VVSTNFRDAS GPAMTEIGEQ

101 PWGREFALRD PAGNCVHFVA EEQD  //SEQ ID NO：1338

在图12A-C中显示为从核苷酸5217延伸到5588。实施例15和16中编码肽的双链体携带与载体中存在的粘端互补的粘端。

用于实施例52和53中的克隆载体pAMG21ampR-Pep-Fc的说 明。图12E-F显示在基础载体pAMG21ampR中加入了ds-DNA，使得能够将肽融合体克隆到Fc基因的C末端，其中肽的前两个密码子是met-gly。将DNA导入了pAMG21ampR载体中的独特NdeI和BamHI位点之间。Fc的编码区从核苷酸5632延伸到6312，蛋白序列显示于DNA序列下面。读码框内其前面是glyX5接头(核苷酸5617-5631)。BsmBI位点跨核苷酸5141-5146；即GAGACG。切割发生在上DNA链的核苷酸5135-5136之间和下DNA链的5139-5140之间。

消化产生了所示的4bp的粘端。BsmBI位点加下划线。

AATAACATAT            GGGTCGAGACG SEQ ID NO：1344

SEQ ID NO：1343

TTATTGTATACCCA            GCTCTGC

SEQ ID NO：1345

第二个BsmBI位点存在于核苷酸5607-5612；即CGTCTC。DNA切割发生在上DNA链的核苷酸5613-5614之间和下链的5617-5618之间。

CGTCTCA    GGTGGTGGT

GCAGAGTCCAC    CACCA

SEQ ID NO：1346

两个BsmBI位点之间是组成型表达志贺氏菌ble蛋白的不是必须的zeocin抗性盒。上文所述的ble蛋白序列从核苷酸5220延伸到5591。实施例52和53中编码肽的双链体携带与载体中存在的粘端互补的粘端。

对于实施例3-30(其中都是细菌表达)，克隆的肽序列都来源于寡核苷酸的退火，从而产生直接连接于合适载体中的DNA双链体。两个寡聚物对于实施例20是足够的，其它实施例都需要4个。当双链体插入Fc的N末端(参见本文实施例15、16、52和53)时，设计如下，其中序号与每个实施例中的寡聚物列表匹配：

当双链体插入Fc的C末端(实施例3、4、5、10、11、12、13和30)时，设计如下：

所有其余实施例具有插入Fc的C末端的双链体，并且利用以下设计：

任何一种寡聚物的磷酸化都不需要激酶步骤。双链体的成功插入导致替代了可有可无的抗生素抗性盒(对于pAMG21ampR-Pep-Fc是Zeocin抗性，对于pAMG21ampR-Fc-Pep是氯霉素抗性)。导致的表型改变可以用于区分重组和非重组克隆。

以下描述给出了用于实施本文举例说明的所有30种细菌表达的重组蛋白的克隆的统一方法。仅有寡核苷酸组和载体是不同的。下文在每个实施例中给出这些说明。

通过使每个实施例中列出的寡核苷酸退火，形成含有给定肽的编码区的寡核苷酸双链体。将10皮摩尔每种寡聚物混合于10μl终体积，其中含有1X连接缓冲液和先前用限制性内切核酸酶BsmBI消化的0.3μg合适的载体。将混合物加热到80℃，使其以0.1度/秒冷却到室温。在其中加入10μl 1X连接酶缓冲液，加上400个单位的T4DNA连接酶。样品在14℃温育20分钟。通过在65℃加热10分钟，灭活连接酶。随后，加入10个单位的限制性内切核酸酶BsmBI，然后在55℃温育1小时，以切割任何重新形成的亲本载体分子。加入50ul化学感受态大肠杆菌细胞，2℃下保持20分钟，然后在42℃下热激5秒。将整个体积涂布到补加了200ug/ml羧苄青霉素的Luria Agar板上，37℃下温育过夜。测试菌落对可替代的抗生素抗性标记的丧失。可以用标准PCR测试证实双链体插入片段的预期大小。获得质粒制备物，通过DNA测序证实重组的插入片段。在Terrific培养液中生长半升序列证实的构建体的培养物，通过加入50ng/ml N-(3-氧代-己酰)-高丝氨酸内酯诱导肽抗体的表达，37℃下振荡4-6小时后，离心细胞，细胞糊在-20℃下储存。

以下针对每个实施例给出克隆载体和用于构建每个融合蛋白的寡核苷酸组。也示出了DNA/蛋白图。

Kv1.3的Fc-L-ShK[1-35]抑制剂的细菌表达。上文描速了用于克隆和表达肽抗体的方法。使用的载体是pAMG21ampR-Fc-Pep，用下文列出的寡聚物制备用于在细菌中克隆和表达Fc-L-ShK[1-35]的双链体(如下)。

用于形成双链体的寡聚物：

TGGTTCCGGTGGTGGTGGTTCCCGTTCCTGCATCGACACCAT  //SEQID NO：669；

CCCGAAATCCCGTTGCACCGCTTTCCAGTGCAAACACTCCATGAAATACCGTCTGTCCTTCTGCCGTAAAACCTGCGGTACCTGC  //SEQ IDNO：670；

CTTAGCAGGTACCGCAGGTTTTACGGCAGAAGGACAGACGGT//SEQID NO：671；

ATTTCATGGAGTGTTTGCACTGGAAAGCGGTGCAACGGGATTTCGGGATGGTGTCGATGCAGGAACGGGAACCACCACCACCGGA  //SEQ IDNO：672；

寡聚物双链体如下所示：

    TGGTTCCGGTGGTGGTGGTTCCCGTTCCTGCATCGACACCATCCCGAAATCCCGTTGCAC

  1 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 60

        AGGCCACCACCACCAAGGGCAAGGACGTAGCTGTGGTAGGGCTTTAGGGCAACGTG

     G  S  G  G  G  G  S  R  S  C  I  D  T  I  P  K  S  R  C  T  -

    CGCTTTCCAGTGCAAACACTCCATGAAATACCGTCTGTCCTTCTGCCGTAAAACCTGCGG

 61 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 120

    GCGAAAGGTCACGTTTGTGAGGTACTTTATGGCAGACAGGAAGACGGCATTTTGGACGCC

     A  F  Q  C  K  H  S  M  K  Y  R  L  S  F  C  R  K  T  C  G  -

    TACCTGC  //SEQ ID NO：673

121 -------

    ATGGACGATTC //SEQ ID NO：675

    T C     - //SEO ID NO：674

肽抗体的细菌表达描述于实施例3，并且冷冻储存细菌糊。下文实施例38进一步描述细菌表达的Fc-L10-ShK(1-35)的纯化。

                     实施例4

              Fc-L-ShK[2-35]的细菌表达

Fc-L-ShK[2-35]的细菌表达。用于在细菌中克隆和表达肽抗体的方法描述于实施例3。使用的载体是pAMG21ampR-Fc-Pep，用下文列出的寡聚物制备用于在细菌中克隆和表达Fc-L-ShK[2-35]的双链体(如下)。

用于形成双链体的寡聚物如下所示：

TGGTTCCGGTGGTGGTGGTTCCTGCATCGACACCATCCCGAAATCC

CGTTGCACCGCTTTCCAGTGCAAACACTCCATGAAAT  //SEQ ID

NO：676；

ACCGTCTGTCCTTCTGCCGTAAAACCTGCGGTACCTGC  //SEQ ID

NO：677；

CTTAGCAGGTACCGCAGGTTTTACGGCAGAAGGACAGACGGTATTT

CATGGAGTGTTTGCACTGGAAAGCGGTGCAACGGGA  //SEQ ID

NO：678；

TTTCGGGATGGTGTCGATGCAGGAACCACCACCACCGGA  //SEQ ID

NO：679；

形成的寡聚物双链体如下所示：

    TGGTTCCGGTGGTGGTGGTTCCTGCATCGACACCATCCCGAAATCCCGTTGCACCGCTTT

  1 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 60

        AGGCCACCACCACCAAGGACGTAGCTGTCCTAGGGCTTTAGGGCAACGTGGCGAAA

     G  S  G  G  G  G  S  C  I  D  T  I  P  K  S  R  C  T  A  F  -

    CCAGTGCAAACACTCCATGAAATACCGTCTGTCCTTCTGCCGTAAAACCTGCGGTACCTG

 61 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 120

    GGTCACGTTTGTGAGGTACTTTATGGCAGACAGGAAGACGGCATTTTGGACGCCATGGAC

    Q  C  K  H  S  M  K  Y  R  L  S  F  C  R  K  T  C  G  T  C  -//SEQ ID NO：681

    C //SEQ ID NO：680

121 -

    GATTC //SEQ ID NO：682

肽抗体的细菌表达描述于实施例3，并且冷冻储存细菌糊。下文实施例39进一步描述细菌表达的Fc-L10-ShK(2-35)的纯化。

                      实施例5

                 Fc-L-HmK的细菌表达

Fc-L-HmK的细菌表达。用于在细菌中克隆和表达肽抗体的方法描述于实施例3。使用的载体是pAMG21ampR-Fc-Pep，用下文列出的寡聚物制备用于在细菌中克隆和表达Fc-L-HmK的双链体(如下)。

用于形成双链体的寡聚物如下所示：

TGGTTCCGGTGGTGGTGGTTCCCGTACCTGCAAAGACCTGAT  //SEQ

ID NO：690；

CCCGGTTTCCGAATGCACCGACATCCGTTGCCGTACCTCCATGAAA

TACCGTCTGAACCTGTGCCGTAAAACCTGCGGTTCCTGC SEQ ID

NO：692；

CTTAGCAGGAACCGCAGGTTTTACGGCACAGGTTCAGACGGT  //SEQ

ID NO：693；

4142-94

ATTTCATGGAGGTACGGCAACGGATGTCGGTGCATTCGGAAAC

CGGGATCAGGTCTTTGCAGGTACGGGAACCACCACCACCGGA

//SEQ ID NO：694

形成的寡聚物双链体如下所示：

    TGGTTCCGGTGGTGGTGGTTCCCGTACCTGCAAAGACCTGATCCCGGTTTCCGAATGCAC

  1 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 60

        AGGCCACCACCACCAAGGGCATGGACGTTTCTGGACTAGGGCCAAAGCGTTACGTG

     G  S  G  G  G  G  S  R  T  C  K  D  L  I  P  V  S  E  C  T  -

    CGACATCCGTTGCCGTACCTCCATGAAATACCGTCTGAACCTGTGCCGTAAAACCTGCGG

 61 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 120

    GCTGTAGGCAACGGCATGGAGGTACTTTATGGCAGACTTGGACACGGCATTTTGGACGCC

     D  I  R  C  R  T  S  M  K  Y  R  L  N  L  C  R  K  T  C  G  -//SEQ ID NO：696

    TTCCTGC //SEQ ID NO：695

121 -------

    AAGGACGATTC //SEQ ID NO：697

     S  C   -

肽抗体的细菌表达描述于实施例3，并且冷冻储存细菌糊。

                          实施例6

                     Fc-L-KTX1的细菌表达

Fc-L-KTX1的细菌表达。用于在细菌中克隆和表达肽抗体的方法描述于实施例3。使用的载体是pAMG21ampR-Fc-Pep，用下文列出的寡聚物制备用于在细菌中克隆和表达Fc-L-KTX1的双链体(如下)。

用于形成双链体的寡聚物如下所示：

TGGTTCCGGTGGTGGTGGTTCCGGTGTTGAAATCAACGTTAAATGC

T //SEQ ID NO：698；

CCGGTTCCCCGCAGTGCCTGAAACCGTGCAAAGACGCTGGTATGCG

TTTCGGTAAATGCATGAACCGTAAATGCCACTGCACCCCGAAA

//SEQ ID NO：699；

CTTATTTCGGGGTGCAGTGGCATTTACGGTTCATGCATTTACCGAA

A //SEQ ID NO：700；

CGCATACCAGCGTCTTTGCACGGTTTCAGGCACTGCGGGGAACCGG

AGCATTTAACGTTGATTTCAACACCGGAACCACCACCACCGGA

//SEQ ID NO：701；

形成的寡聚物双链体如下所示：

    TGGTTCCGGTGGTGGTGGTTCCGGTGTTGAAATCAACGTTAAATGCTCCGGTTCCCCGCA

  1 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 60

        AGGCCACCACCACCAAGGCCACAACTTTAGTTGCAATTTACGAGGCCAAGGGGCGT

     G  S  G  G  G  G  S  G  V  E  I  N  V  K  C  S  G  S  P  Q  -

    GTGCCTGAAACCGTGCAAAGACGCTGGTATGCGTTTCGGTAAATGCATGAACCGTAAATG

 61 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 120

    CACGGACTTTGGCACGTTTCTGCGACCATACGCAAAGCCATTTACGTACTTGGCATTTAC

     C  L  K  P  C  K  D  A  G  M  R  F  G  K  C  M  N  R  K  C  -

    CCACTGCACCCCGAAA //SEQ ID NO：702

121 ---------+------

    GGTGACGTGGGGCTTTATTC  //SEQ ID NO：704

     H  C  T  P  K   - //SEQ ID NO：703

肽抗体的细菌表达描述于实施例3，并且冷冻储存细菌糊。

细菌中表达的Fc-L-KTX1的纯化和重折叠。将冷冻的大肠杆菌糊(28g)与室温下的210ml 50mM tris HCl，5mM EDTA，pH 8.0混合，并且加入约0.1mg/ml的鸡蛋清溶菌酶。12,000PSI下使悬浮的糊通过冷微流化床两次。然后4℃下以22,000g将细胞裂解物离心20分钟。然后用组织研磨器将沉淀重悬于200ml 1％脱氧胆酸中，然后4℃下以22,000g离心20分钟。然后用组织研磨器将沉淀重悬于200ml水中，然后4℃下以22,000g离心20分钟。然后将沉淀(4.8g)溶解于48ml 8M盐酸胍，50mM tris HCl，pH 8.0中。然后通过将30μl 1M二硫苏糖醇加入3ml溶液中，还原溶解的沉淀，37℃下温育30分钟。然后室温下以14,000g将还原的沉淀溶液离心5分钟，然后4℃下剧烈搅拌下将2.5ml上清液转移到250ml重折叠缓冲液(2M脲，50mM tris，160mM盐酸精氨酸，5mM EDTA，1mM盐酸胱胺，4mM半胱氨酸，pH 8.5)中。然后降低搅拌速度，4℃下继续温育2天。然后使重折叠溶液通过0.22μm醋酸纤维素膜过滤，4℃下储存3天。

然后用1L水稀释储存的重折叠物，用1M H₃PO₄将pH调节到7.5。然后7℃下在S-缓冲液A(20mM NaH₂PO₄，pH 7.3)中以10ml/min将pH调节的材料加入10ml Amersham SP-HP HiTrap柱。然后用数倍柱体积的S-缓冲液A洗涤柱子，然后7℃下以5ml/min用0％-60％S-缓冲液B(20mM NaH₂PO₄，1M NaCl，pH 7.3)的线性梯度，随后用达到100％S-缓冲液B的梯度洗脱。然后用考马斯亮蓝染色的tris-甘氨酸4-20％SDS-PAGE分析级分，基于这些数据合并含有需要的产物的级分(45ml)。然后7℃下在PBS中以2ml/min将合并物加入1ml Amersham rProtein A HiTrap柱。然后用数倍柱体积的PBS洗涤柱子，用100mM甘氨酸pH 3.0洗脱。在洗脱峰(2.5ml)中加入62.5μl 2M tris碱，然后室温下使pH调节的材料以2ml/min通过具有0.22μm，25mmMustang E膜的Pall Life Sciences Acrodisc进行过滤。

然后用Hewlett Packard 8453分光光度计对稀释于700μl PBS中的20μl混合的合并物进行光谱扫描(图28C)。用计算分子量30,504g/mol和消光系数35,410M^-1cm^-1确定过滤的材料的浓度是2.49mg/ml。然后用考马斯亮蓝染色的tris-甘氨酸4-20％SDS-PAGE评估过滤的材料的纯度(图28A)。然后用Charles River Laboratories Endosafe-PTS系统(0.05-5EU/ml灵敏度)，采用样品在Charles Rivers内毒素特异性缓冲液BG120中的50倍稀释液确定内毒素水平，得到＜1EU/mg蛋白的结果。然后用大小排阻色谱确定45μg产物的大分子状态，该产物在50mM NaH₂PO₄，250mM NaCl，pH 6.9中以1ml/min注射到PhenomenexBioSep SEC 3000柱(7.8×300mm)上，在280nm观察吸光度(图28B)。通过将1μl样品稀释到10μl芥子酸(在0.05％三氟乙酸，50％乙腈中是10mg/ml)中，对产物进行质谱分析。将得到的溶液(1μl)点样到MALDI样品板上。使样品干燥，然后用配备氮激光(337nm，3ns脉冲)的Voyager DE-RP飞行时间质谱仪分析。采用了正离子/线性模式，加速电压是25kV。通过累积来自约200次激光发射的数据产生每个质谱。用已知分子量的纯化蛋白完成外部质量校准(图28D)并且证实(在实验误差内)纯化的肽抗体的完整性。然后将产物在-80℃下储存。

通过电生理测定(方法描述于实施例36)发现纯化的Fc-L-KTX1以剂量依赖性方式阻断人Kv1.3电流(图32A和图32B)。

                     实施例7

              Fc-L-HsTx1的细菌表达

Fc-L-HsTx1的细菌表达。用于在细菌中克隆和表达肽抗体的方法描述于实施例3。使用的载体是pAMG21ampR-Fc-Pep，用下文列出的寡聚物制备用于在细菌中克隆和表达Fc-L-HsTx1的双链体(如下)。

用于形成双链体的寡聚物如下所示：

TGGTTCCGGTGGTGGTGGTTCCGCTTCCTGCCGTACCCCGAAAGAC

//SEQ ID NO：705；

TGCGCTGACCCGTGCCGTAAAGAAACCGGTTGCCCGTACGGTAAAT

GCATGAACCGTAAATGCAAATGCAACCGTTGC //SEQ ID NO：706；

CTTAGCAACGGTTGCATTTGCATTTACGGTTCATGCATTTACCGTAC

G //SEQ ID NO：707；

GGCAACCGGTTTCTTTACGGCACGGGTCAGCGCAGTCTTTCGGGGT

ACGGCAGGAAGCGGAACCACCACCACCGGA //SEQ ID NO：708；

由寡聚物形成的双链体如下所示：

    TGGTTCCGGTGGTGGTGGTTCCGCTTCCTGCCGTACCCCGAAAGACTGCGCTGACCCGTG

  1 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 60

        AGGCCACCACCACCAAGGCGAAGGACGGCATGGGGCTTTCTGACGCGACTGGGCAC

     G  S  G  G  G  G  S  A  S  C  R  T  P  K  D  C  A  D  P  C  -

    CCGTAAAGAAACCGGTTGCCCGTACGGTAAATGCATGAACCGTAAATGCAAATGCAACCG

 61 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 120

    GGCATTTCTTTGGCCAACGGGCATGCCATTTACGTACTTGGCATTTACGTTTACGTTGGC

     R  K  E  T  G  C  P  Y  G  K  C  M  N  R  K  C  K  C  N  R  -

    TTGC SEQ ID NO：709

121 ---- 124

    AACGATTC SEQ ID NO：711

     C   - SEQ ID NO：710

肽抗体的细菌表达描述于实施例3，并且冷冻储存细菌糊。

                         实施例8

                  Fc-L-MgTx的细菌表达

Fc-L-MgTx的细菌表达。用于在细菌中克隆和表达肽抗体的方法描述于实施例3。使用的载体是pAMG21ampR-Fc-Pep，用下文列出的寡聚物制备用于在细菌中克隆和表达Fc-L-MgTx的双链体(如下)。

用于形成双链体的寡聚物如下所示：

TGGTTCCGGTGGTGGTGGTTCCACCATCATCAACGTTAAATGCACC

TC //SEQ ID NO：712；

CCCGAAACAGTGCCTGCCGCCGTGCAAAGCTCAGTTCGGTCAGTCC

GCTGGTGCTAAATGCATGAACGGTAAATGCAAATGCTACCCGCAC

//SEQ ID NO：713；

CTTAGTGCGGGTAGCATTTGCATTTACCGTTCATGCATTTAGCACC

AG //SEQ ID NO：714；

CGGACTGACCGAACTGAGCTTTGCACGGCGGCAGGCACTGTTTCGG

GGAGGTGCATTTAACGTTGATGATGGTGGAACCACCACCACCGGA

//SEQ ID NO：715；

上文的寡聚物用于形成下文所示的双链体：

    TGGTTCCGGTGGTGGTGGTTCCACCATCATCAACGTTAAATGCACCTCCCCGAAACAGTG

  1 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 60

        AGGCCACCACCACCAAGGTGGTAGTAGTTGCAATTTACGTGGAGGGGCTTTGTCAC

     G  S  G  G  G  G  S  T  I  I  N  V  K  C  T  S  P  K  Q  C  -

    CCTGCCGCCGTGCAAAGCTCAGTTCGGTCAGTCCGCTGGTGCTAAATGCATGAACGGTAA

 61 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 120

    GGACGGCGGCACGTTTCGAGTCAAGCCAGTCAGGCGACCACGATTTACGTACTTGCCATT

     L  P  P  C  K  A  Q  F  G  Q  S  A  G  A  K  C  H  N  G  K  -

    ATGCAAATGCTACCCGCAC SEQ ID NO：716

121 ---------+---------

    TACGTTTACGATGGGCGTGATTC SEQ ID NO：718

     C  K  C  Y  P  H   - SEQ ID NO：717

肽抗体的细菌表达描述于实施例3，并且冷冻储存细菌糊。

                        实施例9

                 Fc-L-AgTx2的细菌表达

Fc-L-AgTx2的细菌表达。用于在细菌中克隆和表达肽抗体的方法描述于实施例3。使用的载体是pAMG21ampR-Fc-Pep，用下文列出的寡聚物制备用于在细菌中克隆和表达Fc-L-MgTx的双链体(如下)。

用于形成双链体的寡聚物如下所示：

TGGTTCCGGTGGTGGTGGTTCCGGTGTTCCGATCAACGTTTCCTGC

ACCGGT //SEQ ID NO：719；

TCCCCGCAGTGCATCAAACCGTGCAAAGACGCTGGTATGCGTTTCG

GTAAATGCATGAACCGTAAATGCCACTGCACCCCGAAA //SEQ ID

NO：720；

CTTATTTCGGGGTGCAGTGGCATTTACGGTTCATGCATTTACCGAA

ACGCATA //SEQ ID NO：721；

CCAGCGTCTTTGCACGGTTTGATGCACTGCGGGGAACCGGTGCAGG

AAACGTTGATCGGAACACCGGAACCACCACCACCGGA //SEQ ID

NO：722；

上文的寡聚物用于形成下文所示的双链体：

    TGGTTCCGGTGGTGGTGGTTCCGGTGTTCCGATCAACGTTTCCTGCACCGGTTCCCCGCA

  1 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 60

        AGGCCACCACCACCAAGGCCACAAGGCTAGTTGCAAAGGACGTGGCCAAGGGGCGT

     G  S  G  G  G  G  S  G  V  P  I  N  V  S  C  T  G  S  P  Q  -

    GTGCATCAAACCGTGCAAAGACGCTGGTATGCGTTTCGGTAAATGCATGAACCGTAAATG

 61 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 120

    CACGTAGTTTGGCACGTTTCTGCGACCATACGCAAAGCCATTTACGTACTTGGCATTTAC

     C  I  K  P  C  K  D  A  G  M  R  F  G  K  C  M  N  R  K  C  -

    CCACTGCACCCCGAAA_SEQ ID NO：723

121 ---------+------

    GGTGACGTGGGGCTTTATTC SEQ ID NO：725

     H  C  T  P  K   - SEQ ID NO：724

肽抗体的细菌表达描述于实施例3，并且冷冻储存细菌糊。

细菌中表达的Fc-L-AgTx2的纯化和重折叠。将冷冻的大肠杆菌糊(15g)与室温下的120ml 50mM tris HCl，5mM EDTA，pH 8.0混合，并且加入约0.1mg/ml的鸡蛋清溶菌酶。12,000PSI下使悬浮的糊通过冷微流化床两次。然后4℃下以22,000g将细胞裂解物离心20分钟。然后用组织研磨器将沉淀重悬于200ml 1％脱氧胆酸中，然后4℃下以22,000g离心20分钟。然后用组织研磨器将沉淀重悬于200ml水中，然后4℃下以22,000g离心20分钟。然后将沉淀(4.6g)溶解于46ml 8M盐酸胍，50mM tris HCl，pH 8.0中。然后通过将30μl 1M二硫苏糖醇加入3ml溶液中，还原溶解的沉淀，37℃下温育30分钟。然后室温下以14,000g将还原的沉淀溶液离心5分钟，然后4℃下剧烈搅拌下将2.5ml上清液转移到250ml重折叠缓冲液(2M脲，50mM tris，160mM盐酸精氨酸，5mM EDTA，1mM盐酸胱胺，4mM半胱氨酸，pH 8.5)中。然后降低搅拌速度，4℃下继续温育2天。然后使重折叠溶液通过0.22μm醋酸纤维素膜过滤，-70℃下储存。

使储存的重折叠物解冻，然后用1L水稀释，用1M H₃PO₄将pH调节到7.5。然后通过0.22μm的醋酸纤维素滤膜过滤pH调节的材料，7℃下在S-缓冲液A(20mM NaH₂PO₄，pH 7.3)中以10ml/min加入10ml Amersham SP-HP HiTrap柱。然后用数倍柱体积的S-缓冲液A洗涤柱子，然后7℃下以5ml/min用0％-60％S-缓冲液B(20mMNaH₂PO₄，1M NaCl，pH 7.3)的线性梯度，随后用达到100％S-缓冲液B的梯度洗脱。然后用考马斯亮蓝染色的tris-甘氨酸4-20％SDS-PAGE分析级分，基于这些数据合并含有需要的产物的级分(15ml)。然后7℃下在PBS中以2ml/min将合并物加入1ml Amersham rProtein AHiTrap柱。然后用数倍柱体积的20mM NaH₂PO₄ pH 6.5，1M NaCl洗涤柱子，用100mM甘氨酸pH 3.0洗脱。在洗脱峰(1.5ml)中加入70μl 1M tris HCl pH 8.5，然后使pH调节的材料通过0.22μm的醋酸纤维素滤膜。

然后用Hewlett Packard 8453分光光度计对稀释于700μl PBS中的20μl混合的合并物进行光谱扫描(图29C)。用计算分子量30,446g/mol和消光系数35,410M^-1cm^-1确定过滤的材料的浓度是1.65mg/ml。然后用考马斯亮蓝染色的tris-甘氨酸4-20％SDS-PAGE评估过滤的材料的纯度(图29A)。然后用Charles River Laboratories Endosafe-PTS系统(0.05-5EU/ml灵敏度)，采用样品在Charles Rivers内毒素特异性缓冲液BG120中的33倍稀释液确定内毒素水平，得到＜4EU/mg蛋白的结果。然后用大小排阻色谱确定20μg产物的大分子状态，该产物在50mM NaH₂PO₄，250mM NaCl，pH 6.9中以1ml/min注射到PhenomenexBioSep SEC 3000柱(7.8×300mm)上，在280nm观察吸光度(图29D)。通过将1μl样品稀释到10μl芥子酸(在0.05％三氟乙酸，50％乙腈中是10mg/ml)中，对产物进行质谱分析。将得到的溶液(1μl)点样到MALDI样品板上。使样品干燥，然后用配备氮激光(337nm，3ns脉冲)的Voyager DE-RP飞行时间质谱仪分析。采用了正离子/线性模式，加速电压是25kV。通过累积来自约200次激光发射的数据产生每个质谱。用已知分子量的纯化蛋白完成外部质量校准(图29E)并且证实(在实验误差内)纯化的肽抗体的完整性。然后将产物在-80℃下储存。

                      实施例10

                 Fc-L-OSK1的细菌表达

Fc-L-OSK1的细菌表达。用于在细菌中克隆和表达肽抗体的方法描述于实施例3。使用的载体是pAMG21ampR-Fc-Pep，用下文列出的寡聚物制备用于在细菌中克隆和表达Fc-L-OSK1的双链体(如下)。

用于形成双链体的寡聚物如下所示：

TGGTTCCGGTGGTGGTGGTTCCGGTGTTATCATCAACGTTAAATGC

AAAATCTCCCGTCAGTGCCTGGAACCGTGCAAAAAAG //SEQ ID

NO：726；

CTGGTATGCGTTTCGGTAAATGCATGAACGGTAAATGCCACTGCAC

CCCGAAA //SEQ ID NO：727；

CTTATTTCGGGGTGCAGTGGCATTTACCGTTCATGCATTTACCGAA

ACGCATACCAGCTTTTTTGCACGGTTCCAGGCACTGA //SEQ ID

NO：728；

CGGGAGATTTTGCATTTAACGTTGATGATAACACCGGAACCACCAC

CACCGGA //SEQ ID NO：729；

上文的寡聚物用于形成下文所示的双链体：

    TGGTTCCGGTGGTGGTGGTTCCGGTGTTATCATCAACGTTAAATGCAAAATCTCCCGTCA

  1 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 60

        AGGCCACCACCACCAAGGCCACAATAGTAGTTGCAATTTACGTTTTAGAGGGCAGT

     G  S  G  G  G  G  S  G  V  I  I  N  V  K  C  K  I  S  R  Q  -

    GTGCCTGGAACCGTGCAAAAAAGCTGGTATGCGTTTCGGTAAATGCATGAACGGTAAATG

 61 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 120

    CACGGACCTTGGCACGTTTTTTCGACCATACGCAAAGCCATTTACGTACTTGCCATTTAC

     C  L  E  P  C  K  K  A  G  M  R  F  G  K  C  M  N  G  K  C  -

    CCACTGCACCCCGAAA SEQ ID NO：730

121 ---------+------

    GGTGACGTGGGGCTTTATTC SEQ ID NO：732

     H  C  T  P  K   - SEQ ID NO：731

肽抗体的细菌表达描述于实施例3，并且冷冻储存细菌糊备用。下文实施例40描述了从大肠杆菌糊纯化Fc-L10-OSK1。

                          实施例11

              Fc-L-OSK1(E16K，K20D)的细菌表达

Fc-L-OSK1(E16K，K20D)的细菌表达。用于在细菌中克隆和表达肽抗体的方法描述于实施例3。使用的载体是pAMG21ampR-Fc-Pep，用下文列出的寡聚物制备用于在细菌中克隆和表达Fc-L-OSK1(E16K，K20D)的双链体(如下)。

用于形成双链体的寡聚物如下所示：

TGGTTCCGGTGGTGGTGGTTCCGGTGTTATCATCAACGTTAAATGC

AAAATCTCCCGTCAGTGCCTGAAACCGTGCAAAGACG //SEQ ID

NO：733；

CTGGTATGCGTTTCGGTAAATGCATGAACGGTAAATGCCACTGCAC

CCCGAAA //SEQ ID NO：734；

CTTATTTCGGGGTGCAGTGGCATTTACCGTTCATGCATTTACCGAA

ACGCATACCAGCGTCTTTGCACGGTTTCAGGCACTGA //SEQ ID

NO：735；

CGGGAGATTTTGCATTTAACGTTGATGATAACACCGGAACCACCAC

CACCGGA //SEQ ID NO：736；

上文的寡聚物用于形成下文所示的双链体：

    TGGTTCCGGTGGTGGTGGTTCCGGTGTTATCATCAACGTTAAATGCAAAATCTCCCGTCA

  1 ---------+---------+---------+---------+---------+---------T 60

        AGGCCACCACCACCAAGGCCACAATAGTAGTTGCAATTTACGTTTTAGAGGGCAGT

     G  S  G  G  G  G  S  G  V  I  I  N  V  K  C  K  I  S  R  Q  -

    GTGCCTGAAACCGTGCAAAGACGCTGGTATGCGTTTCGGTAAATGCATGAACGGTAAATG

 61 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 120

    CACGGACTTTGGCACGTTTCTGCGACCATACGCAAAGCCATTTACGTACTTGCCATTTAC

     C  L  K  P  C  K  D  A  G  M  R  F  G  K  C  M  N  G  K  C  -

    CCACTGCACCCCGAAA SEQ ID NO：737

121 ---------+------

    GGTGACGTGGGGCTTTATTC SEQ ID NO：739

     H  C  T  P  K   - SEQ ID NO：738

肽抗体的细菌表达描述于实施例3，并且冷冻储存细菌糊备用。

                            实施例12

                   Fc-L-Anuroctoxin的细菌表达

Fc-L-Anuroctoxin的细菌表达。用于在细菌中克隆和表达肽抗体的方法描述于实施例3。使用的载体是pAMG21ampR-Fc-Pep，用下文列出的寡聚物制备用于在细菌中克隆和表达Fc-L-Anuroctoxin的双链体(如下)。

用于形成双链体的寡聚物如下所示：

TGGTTCCGGTGGTGGTGGTTCCAAAGAATGCACCGGTCCGCAGCAC

TGCACCAACTTCTGCCGTAAAAACAAATGCACCCACG //SEQ ID

NO：740；

GTAAATGCATGAACCGTAAATGCAAATGCTTCAACTGCAAA //SEQ

ID NO：741；

CTTATTTGCAGTTGAAGCATTTGCATTTACGGTTCATGCATTTACCG

TGGGTGCATTTGTTTTTACGGCAGAAGTTGGTGCAG //SEQ ID

NO：742；

TGCTGCGGACCGGTGCATTCTTTGGAACCACCACCACCGGA //SEQ

ID NO：743；

上文的寡聚物用于形成下文所示的双链体：

    TGGTTCCGGTGGTGGTGGTTCCAAAGAATGCACCGGTCCGCAGCACTGCACCAACTTCTG

  1 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 60

        AGGCCACCACCACCAAGGTTTCTTACGTGGCCAGGCGTCGTGACGTGGTTGAAGAC

     G  S  G  G  G  G  S  K  E  C  T  G  P  Q  H  C  T  N  F  C  -

    CCGTAAAAACAAATGCACCCACGGTAAATGCATGAACCGTAAATGCAAATGCTTCAACTG

 61 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 120

    GGCATTTTTGTTTACGTGGGTGCCATTTACGTACTTGGCATTTACGTTTACGAAGTTGAC

     R  K  N  K  C  T  H  G  K  C  M  N  R  K  C  K  C  F  N  C  -

    CAAA SEQ ID NO：744

121 ----

    GTTTATTC SEQ ID NO：746

    K    - SEQ ID NO：745

肽抗体的细菌表达描述于实施例3，并且冷冻储存细菌糊备用。

                       实施例13

               Fc-L-毒蝎毒素的细菌表达

Fc-L-毒蝎毒素的细菌表达。用于在细菌中克隆和表达肽抗体的方法描述于实施例3。使用的载体是pAMG21ampR-Fc-Pep，用下文列出的寡聚物制备用于在细菌中克隆和表达Fc-L-毒蝎毒素的双链体(如下)。

用于形成双链体的寡聚物如下所示：

TGGTTCCGGTGGTGGTGGTTCCACCATCATCAACGTTAAATGCACC

TCCCCGAAACAGTGCTCCAAACCGTGCAAAGAACTGT //SEQ ID

NO：747；

ACGGTTCCTCCGCTGGTGCTAAATGCATGAACGGTAAATGCAAATG

CTACAACAAC //SEQ ID NO：748；

CTTAGTTGTTGTAGCATTTGCATTTACCGTTCATGCATTTAGCACCA

GCGGAGGAACCGTACAGTTCTTTGCACGGTTTGGAG //SEQ ID

NO：749；

CACTGTTTCGGGGAGGTGCATTTAACGTTGATGATGGTGGAACCAC

CACCACCGGA //SEQ ID NO：750；

上文的寡聚物用于形成下文所示的双链体：

    TGGTTCCGGTGGTGGTGGTTCCACCATCATCAACGTTAAATGCACCTCCCCGAAACAGTG

  1 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 60

        AGGCCACCACCACCAAGGTGGTAGTAGTTGCAATTTACGTGGAGGGGCTTTGTCAC

     G  S  G  G  G  G  S  T  I  I  N  V  K  C  T  S  P  K  Q  C  -

    CTCCAAACCGTGCAAAGAACTGTACGGTTCCTCCGCTGGTGCTAAATGCATGAACGGTAA

 61 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 120

    GAGGTTTGGCACGTTTCTTGACATGCCAAGGAGGCGACCACGATTTACGTACTTGCCATT

     S  K  P  C  K  E  L  Y  G  S  S  A  G  A  K  C  M  N  G  K  -

    ATGCAAATGCTACAACAAC SEQ ID NO：751

121 ---------+---------

    TACGTTTACGATGTTGTTGATTC SEQ ID NO：753

     C  X  C  Y  N  N   - SEQ ID NO：752

肽抗体的细菌表达描述于实施例3，并且冷冻储存细菌糊备用。

                         实施例14

                    Fc-L-Pi2的细菌表达

Fc-L-Pi2的细菌表达。用于在细菌中克隆和表达肽抗体的方法描述于实施例3。使用的载体是pAMG21ampR-Fc-Pep，用下文列出的寡聚物制备用于在细菌中克隆和表达Fc-L-Pi2的双链体(如下)。

用于形成双链体的寡聚物如下所示：

TGGTTCCGGTGGTGGTGGTTCCACCATCTCCTGCACCAACCCG

//SEQ ID NO：754；

AAACAGTGCTACCCGCACTGCAAAAAAGAAACCGGTTACCCGAAC

GCTAAATGCATGAACCGTAAATGCAAATGCTTCGGTCGT //SEQ ID

NO：755；

CTTAACGACCGAAGCATTTGCATTTACGGTTCATGCATTTAGCG

//SEQ ID NO：756；

TTCGGGTAACCGGTTTCTTTTTTGCAGTGCGGGTAGCACTGTTTCGG

GTTGGTGCAGGAGATGGTGGAACCACCACCACCGGA //SEQ ID

NO：757；

上文的寡聚物用于形成下文所示的双链体：

    TGGTTCCGGTGGTGGTGGTTCCACCATCTCCTGCACCAACCCGAAACAGTGCTACCCGCA

  1 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 60

        AGGCCACCACCACCAAGGTGGTAGAGGACGTGGTTGGGCTTTGTCACGATGGGCGT

     G  S  G  G  G  G  S  T  I  S  C  T  N  P  K  Q  C  Y  P  H  -

    CTGCAAAAAAGAAACCGGTTACCCGAACGCTAAATGCATGAACCGTAAATGCAAATGCTT

 61 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 120

    GACGTTTTTTCTTTGGCCAATGGGCTTGCGATTTACGTACTTGGCATTTACGTTTACGAA

     C  K  K  E  T  G  Y  P  N  A  K  C  M  N  R  K  C  K  C  F  -

    CGGTCGT SEQ ID NO：758

121 -------

    GCCAGCAATTC SEQ ID NO：760

     G  R   - SEQ ID NO：759

肽抗体的细菌表达描述于实施例3，并且冷冻储存细菌糊备用。

                       实施例15

               ShK[1-35]-L-Fc的细菌表达

ShK[1-35]-L-Fc的细菌表达。用于在细菌中克隆和表达肽抗体的方法描述于实施例3。使用的载体是pAMG21ampR-Fc-Pep，用下文列出的寡聚物制备用于在细菌中克隆和表达ShK[1-35]-L-Fc的双链体(如下)。

用于形成双链体的寡聚物如下所示：

TATGCGTTCTTGTATTGATACTATTCCAAAATCTCGTTGTACTGCTT

TTCAATGTAAACATTCTATGAAATATCGTCTTTCTT //SEQ ID

NO：761；

TTTGTCGTAAAACTTGTGGTACTTGTTCTGGTGGTGGTGGTTCT

//SEQ ID NO：762；

CACCAGAACCACCACCACCAGAACAAGTACCACAAGTTTTACGAC

AAAAAGAAAGACGATATTTCATAGAATGTTTACATTGA //SEQ ID

NO：763；

AAAGCAGTACAACGAGATTTTGGAATAGTATCAATACAAGAACG

//SEQ ID NO：764；

上文的寡聚物用于形成下文所示的双链体：

    TATGCGTTCTTGTATTGATACTATTCCAAAATCTCGTTGTACTGCTTTTCAATGTAAACA

  1 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 60

        GCAAGAACATAACTATGATAAGGTTTTAGAGCAACATGACGAAAAGTTACATTTGT

     M  R  S  C  I  D  T  I  P  K  S  R  C  T  A  F  Q  C  K  R  -

    TTCTATGAAATATCGTCTTTCTTTTTGTCGTAAAACTTCTGGTACTTGTTCTGGTGGTGG

 61 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 120

    AAGATACTTTATAGCAGAAAGAAAAACAGCATTTTGAACACCATGAACAAGACCACCACC

     S  M  K  Y  R  L  S  F  C  R  K  T  C  G  T  C  S  G  G  G  -

    TGGTTCT SEQ ID NO：765

121 ------- 127

    ACCAAGACCAC SEQ ID NO：767

     G  S   - SEQ ID NO：766

肽抗体的细菌表达描述于实施例3，并且冷冻储存细菌糊备用。met-ShK[1-35]-Fc的纯化描述于下文实施例51。

                         实施例16

               ShK[2-35]-L-Fc的细菌表达

ShK[2-35]-L-Fc的细菌表达。用于在细菌中克隆和表达肽抗体的方法描述于实施例3。使用的载体是pAMG21ampR-Fc-Pep，用下文列出的寡聚物制备用于在细菌中克隆和表达ShK[2-35]-L-Fc的双链体(如下)。

用于形成双链体的寡聚物如下所示：

TATGTCTTGTATTGATACTATTCCAAAATCTCGTTGTACTGCTTTTC

AATGTAAACATTCTATGAAATATCGTCTTTCTT //SEQ ID NO：768；

TTTGTCGTAAAACTTGTGGTACTTGTTCTGGTGGTGGTGGTTCT

//SEQ ID NO：769；

CACCAGAACCACCACCACCAGAACAAGTACCACAAGTTTTACGAC

AAAAAGAAAGACGATATTTCATAGAATGTTTACATTGA //SEQ ID

NO：770；

AAAGCAGTACAACGAGATTTTGGAATAGTATCAATACAAGA SEQ

ID NO：771；

上文的寡聚物用于形成下文所示的双链体：

    TATGTCTTGTATTGATACTATTCCAAAATCTCGTTGTACTGCTTTTCAATGTAAACATTC

  1 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 60

        AGAACATAACTATGATAAGGTTTTAGAGCAACATGACGAAAAGTTACATTTGTAAG

     M  S  C  I  D  T  I  P  K  S  R  C  T  A  F  Q  C  K  H  S  -

    TATGAAATATCGTCTTTCTTTTTGTCGTAAAACTTGTGGTACTTGTTCTGGTGGTGGTGG

 61 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 120

    ATACTTTATAGCAGAAAGAAAAACAGCATTTTGAACACCATGAACAAGACCACCACCACC

     M  K  Y  R  L  S  F  C  R  K  T  C  G  T  C  S  G  G  G  G  -

    TTCT SEQ ID NO：772

121 ----

    AAGACCAC SEQ ID NO：774

     S   - SEQ ID NO：773

肽抗体的细菌表达描述于实施例3，并且冷冻储存细菌糊备用。ShK[2-35]-Fc的纯化描述于下文实施例50。

                    实施例17

              Fc-L-ChTx的细菌表达

Fc-L-ChTx的细菌表达。用于在细菌中克隆和表达肽抗体的方法描述于实施例3。使用的载体是pAMG21ampR-Fc-Pep，用下文列出的寡聚物制备用于在细菌中克隆和表达Fc-L-ChTx的双链体(如下)。

用于形成双链体的寡聚物如下所示：

TGGTTCCGGTGGTGGTGGTTCCCAGTTCACCAACGTT //SEQ ID

NO：775；

TCCTGCACCACCTCCAAAGAATGCTGGTCCGTTTGCCAGCGTCTGC

ACAACACCTCCCGTGGTAAATGCATGAACAAAAAATGCCGTTGCTA

CTCC //SEQ ID NO：776；

CTTAGGAGTAGCAACGGCATTTTTTGTTCATGCATTTA //SEQ ID

NO：777；

CCACGGGAGGTGTTGTGCAGACGCTGGCAAACGGACCAGCATTCTT

TGGAGGTGGTGCAGGAAACGTTGGTGAACTGGGAACCACCACCAC

CGGA //SEQ ID NO：778；

上文的寡聚物用于形成下文所示的双链体：

    TGGTTCCGGTGGTGGTGGTTCCCAGTTCACCAACGTTTCCTGCACCACCTCCAAAGAATG

  1 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 60

        AGGCCACCACCACCAAGGGTCAAGTGGTTGCAAAGGACGTGGTGGAGGTTTCTTAC

     G  S  G  G  G  G  S  Q  F  T  N  V  S  C  T  T  S  K  E  C  -

    CTGGTCCGTTTGCCAGCGTCTGCACAACACCTCCCGTGGTAAATGCATGAACAAAAAATG

 61 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 120

    GACCAGGCAAACGGTCGCAGACGTGTTGTGGAGGGCACCATTTACGTACTTGTTTTTTAC

     W  S  V  C  Q  R  L  H  N  T  S  R  G  K  C  M  N  K  K  C  -

    CCGTTGCTACTCC SEQ ID NO：779

121 ---------+---

    GGCAACGATGAGGATTC SEQ ID NO：781

     R  C  Y  S   - SEQ ID NO：780

肽抗体的细菌表达描述于实施例3，并且冷冻储存细菌糊备用。

                   实施例18

              Fc-L-MTX的细菌表达

Fc-L-MTX的细菌表达。用于在细菌中克隆和表达肽抗体的方法描述于实施例3。使用的载体是pAMG21ampR-Fc-Pep，用下文列出的寡聚物制备用于在细菌中克隆和表达Fc-L-MTX的双链体(如下)。

用于形成双链体的寡聚物如下所示：

TGGTTCCGGTGGTGGTGGTTCCGTTTCCTGCACCGGT //SEQ ID

NO：782；

TCCAAAGACTGCTACGCTCCGTGCCGTAAACAGACCGGTTGCCCGA

ACGCTAAATGCATCAACAAATCCTGCAAATGCTACGGTTGC //SEQ

ID NO：783；

CTTAGCAACCGTAGCATTTGCAGGATTTGTTGATGCAT //SEQ ID

NO：784；

TTAGCGTTCGGGCAACCGGTCTGTTTACGGCACGGAGCGTAGCAGT

CTTTGGAACCGGTGCAGGAAACGGAACCACCACCACCGGA //SEQ

ID NO：785；

上文的寡聚物用于形成下文所示的双链体：

    TGGTTCCGGTGGTGGTGGTTCCGTTTCCTGCACCGGTTCCAAAGACTGCTACGCTCCGTG

  1 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 60

        AGGCCACCACCACCAAGGCAAACGACGTGGCCAAGGTTTCTGACGATGCGAGGCAC

     G  S  G  G  G  G  S  V  S  C  T  G  S  K  D  C  Y  A  P  C  -

    CCGTAAACAGACCGGTTGCCCGAACGCTAAATGCATCAACAAATCCTGCAAATGCTACGG

 61 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 120

    GGCATTTGTCTGGCCAACGGGCTTGCGATTTACGTAGTTGTTTAGGACGTTTACGATGCC

     R  K  Q  T  G  C  P  N  A  K  C  I  N  K  S  C  K  C  Y  G  -

    TTGC SEQ ID NO：786

121 ----

    AACGATTC SEQ ID NO：788

    C    - SEQ ID NO：787

肽抗体的细菌表达描述于实施例3，并且冷冻储存细菌糊备用。

                     实施例19

            Fc-L-ChTx(K32E)的细菌表达

Fc-L-ChTx(K32E)的细菌表达。用于在细菌中克隆和表达肽抗体的方法描述于实施例3。使用的载体是pAMG21ampR-Fc-Pep，用下文列出的寡聚物制备用于在细菌中克隆和表达Fc-L-ChTx(K32E)的双链体(如下)。

用于形成双链体的寡聚物如下所示：

TGGTTCCGGTGGTGGTGGTTCCCAGTTCACCAACGTTTCCTG //SEQ

ID NO：789；

CACCACCTCCAAAGAATGCTGGTCCGTTTGCCAGCGTCTGCACAAC

ACCTCCCGTGGTAAATGCATGAACAAAGAATGCCGTTGCTACTCC

//SEQ ID NO：790；

CTTAGGAGTAGCAACGGCATTCTTTGTTCATGCATTTACCACG

//SEQ ID NO：791；

GGAGGTGTTGTGCAGACGCTGGCAAACGGACCAGCATTCTTTGGAG

GTGGTGCAGGAAACGTTGGTGAACTGGGAACCACCACCACCGGA

//SEQ ID NO：792；

上文的寡聚物用于形成下文所示的双链体：

    TGGTTCCGGTGGTGGTGGTTCCCAGTTCACCAACGTTTCCTGCACCACCTCCAAAGAATG

  1 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 60

        AGGCCACCACCACCAACCCTCAAGTGCTTCCAAACGACCTGGTGGAGGTTTCTTAC

     G  S  G  G  G  G  S  Q  F  T  N  V  S  C  T  T  S  K  E  C  -

    CTGGTCCGTTTGCCAGCGTCTGCACAACACCTCCCGTGGTAAATGCATGAACAAAGAATG

 61 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 120

    GACCAGGCAAACGGTCGCAGACGTGTTGTGGAGGGCACCATTTACGTACTTGTTTCTTAC

     W  S  V  C  Q  R  L  H  N  T  S  R  G  K  C  M  N  K  E  C  -

    CCGTTGCTACTCC SEQ ID NO：793

121 ---------+---

    GGCAACGATGAGGATTC SEQ ID NO：795

     R  C  Y  S   - SEQ ID NO：794

肽抗体的细菌表达描述于实施例3，并且冷冻储存细菌糊备用。

                      实施例20

           Fc-L-蜂神经毒肽的细菌表达

Fc-L-蜂神经毒肽的细菌表达。用于在细菌中克隆和表达肽抗体的方法描述于实施例3。使用的载体是pAMG21ampR-Fc-Pep，用下文列出的寡聚物制备用于在细菌中克隆和表达Fc-L-蜂神经毒肽的双链体(如下)。

用于形成双链体的寡聚物如下所示：

TGGTTCCGGTGGTGGTGGTTCCTGCAACTGCAAAGCTCCGGAAACC

GCTCTGTGCGCTCGTCGTTGCCAGCAGCACGGT //SEQ ID NO：796；

CTTAACCGTGCTGCTGGCAACGACGAGCGCACAGAGCGGTTTCCGG

AGCTTTGCAGTTGCAGGAACCACCACCACCGGA //SEQ ID NO：797；

上文的寡聚物用于形成下文所示的双链体：

   TGGTTCCGGTGGTGGTGGTTCCTGCAACTGCAAAGCTCCGGAAACCGCTCTGTGCGCTCG

 1 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 60

       AGGCCACCACCACCAAGGACGTTGACGTTTCGAGGCCTTTGGCGAGACACGCGAGC

    G  S  G  G  G  G  S  C  N  C  R  A  P  E  T  A  L  C  A  R  -

   TCGTTGCCAGCAGCACGGT SEQ ID NO：798

61 ---------+---------

   AGCAACGGTCGTCGTGCCAATTC SEQ ID NO：800

    R  C  Q  Q  H  G   - SEQ ID NO：799

肽抗体的细菌表达描述于实施例3，并且冷冻储存细菌糊备用。

                          实施例21

                 Fc-L-Scyllatoxin的细菌表达

Fc-L-Scyllatoxin的细菌表达。用于在细菌中克隆和表达肽抗体的方法描述于实施例3。使用的载体是pAMG21ampR-Fc-Pep，用下文列出的寡聚物制备用于在细菌中克隆和表达Fc-L-Scyllatoxin的双链体(如下)。

用于形成双链体的寡聚物如下所示：

TGGTTCCGGTGGTGGTGGTTCCGCTTTCTGCAACCTGCG //SEQ ID

NO：801；

TATGTGCCAGCTGTCCTGCCGTTCCCTGGGTCTGCTGGGTAAATGC

ATCGGTGACAAATGCGAATGCGTTAAACAC //SEQ ID NO：802；

CTTAGTGTTTAACGCATTCGCATTTGTCACCGATGCATTT //SEQ ID

NO：803；

ACCCAGCAGACCCAGGGAACGGCAGGACAGCTGGCACATACGCAG

GTTGCAGAAAGCGGAACCACCACCACCGGA //SEQ ID NO：804；

上文的寡聚物用于形成下文所示的双链体：

   TGGTTCCGGTGGTGGTCGTTCCGCTTTCTGCAACCTGCGTATGTGCCAGCTGTCCTGCCG

 1 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 60

       AGGCCACCACCACCAAGGCGAAAGACGTTGGACGCATACACGGTCGACAGGACGGC

    G  S  G  G  G  G  S  A  F  C  N  L  R  M  C  Q  L  S  C  R  -

   TTCCCTGGGGTTGCTGGGTAAATGCATCGGTGACAAATGCGAATGCGTTAAACAC SEQ ID NO：805

61 ---------+---------+---------+---------+---------+-----

   AAGGGACCCAGACGACCCATTTACGTAGCCACTGTTTACGCTTACGCAATTTGTGATTC SEQ ID NO：807

    S  L  G  L  L  G  K  C  I  G  D  K  C  E  C  V  K  H   - SEQ ID NO：806

肽抗体的细菌表达描述于实施例3，并且冷冻储存细菌糊备用。

                       实施例22

                 Fc-L-IbTx的细菌表达

Fc-L-IbTx的细菌表达。用于在细菌中克隆和表达肽抗体的方法描述于实施例3。使用的载体是pAMG21ampR-Fc-Pep，用下文列出的寡聚物制备用于在细菌中克隆和表达Fc-L-IbTx的双链体(如下)。

用于形成双链体的寡聚物如下所示：

TGGTTCCGGTGGTGGTGGTTCCCAGTTCACCGACGTTGACTGCTCC

GT //SEQ ID NO：808；

TTCCAAAGAATGCTGGTCCGTTTGCAAAGACCTGTTCGGTGTTGAC

CGTGGTAAATGCATGGGTAAAAAATGCCGTTGCTACCAG //SEQ ID

NO：809；

CTTACTGGTAGCAACGGCATTTTTTACCCATGCATTTACCACGGTC

AA //SEQ ID NO：810；

CACCGAACAGGTCTTTGCAAACGGACCAGCATTCTTTGGAAACGGA

GCAGTCAACGTCGGTGAACTGGGAACCACCACCACCGGA //SEQ ID

NO：811；

上文的寡聚物用于形成下文所示的双链体：

    TGGTTCCGGTGGTGGTGGTTCCCAGTTCACCGACGTTGACTGCTCCGTTTCCAAAGAATG

  1 ----------+---------+---------+---------+---------+---------+ 60

        AGGCCACCACCACCAAGGGTCAAGTGGCTGCAACTGACGAGGCAAAGGTTTCTTAC

     G  S  G  G  G  G  S  Q  F  T  D  V  D  C  S  V  S  K  E  C  -

    CTGGTCCGTTTGCAAAGACCTGTTCGGTGTTGACCGTGGTAAATGCATGGGTAAAAAATG

 61 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 120

    GACCAGGCAAACGTTTCTGGACAAGCCAGAACTGGCACCATTTACGTACCCATTTTTTAC

     W  S  V  C  K  D  L  F  G  V  D  R  G  K  C  M  G  K  K  C  -

    CCGTTGCTACCAG SEQ ID NO：812

121 ---------+---

    GGCAACGATGGTCATTC SEQ ID NO：814

     R  C  Y  Q   - SEQ ID NO：813

肽抗体的细菌表达描述于实施例3，并且冷冻储存细菌糊备用。

                          实施例23

                   Fc-L-HaTx1的细菌表达

Fc-L-HaTx1的细菌表达。用于在细菌中克隆和表达肽抗体的方法描述于实施例3。使用的载体是pAMG21ampR-Fc-Pep，用下文列出的寡聚物制备用于在细菌中克隆和表达Fc-L-HaTx1的双链体(如下)。

用于形成双链体的寡聚物如下所示：

TGGTTCCGGTGGTGGTGGTTCCGAATGCCGTTACCTGTTCGGTGGT

TG //SEQ ID NO：815；

CAAAACCACCTCCGACTGCTGCAAACACCTGGGTTGCAAATTCCGT

GACAAATACTGCGCTTGGGACTTCACCTTCTCC //SEQ ID NO：816；

CTTAGGAGAAGGTGAAGTCCCAAGCGCAGTATTTGTCACGGAATTT

GC //SEQ ID NO：817；

AACCCAGGTGTTTGCAGCAGTCGGAGGTGGTTTTGCAACCACCGAA

CAGGTAACGGCATTCGGAACCACCACCACCGGA //SEQ ID NO：818；

上文的寡聚物用于形成下文所示的双链体：

    TGGTTCCGGTGGTGGTGGTTCCGAATGCCGTTACCTGTTCGGTGGTTGCAAAACCACCTC

  1 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 60

        AGGCCACCACCACCAAGGCTTACGGCAATGGACAAGCCACCAACGTTTTGGTGGAG

     G  S  G  G  G  G  S  E  C  R  Y  L  F  G  G  C  K  T  T  S  -

    CGACTGCTGCAAACACCTGGGTTGCAAATTCCGTGACAAATACTGCGCTTGGGACTTCAC

 61 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 120

    GCTGACGACGTTTGTGGACCCAACGTTTAAGGCACTGTTTATGACGCGAACCCTGAAGTG

     D  C  C  K  H  L  G  C  K  F  R  D  R  Y  C  A  W  D  F  T  -

    CTTCTCC SEQ 1D NO：819

121 -------

    GAAGAGGATTC SEQ ID NO：821

     F  S   - SEQ ID NO：820

肽抗体的细菌表达描述于实施例3，并且冷冻储存细菌糊备用。

细菌中表达的Fc-L-HaTx1的纯化和重折叠。将冷冻的大肠杆菌糊(13g)与室温下的100ml 50mM tris HCl，5mM EDTA，pH 8.0混合，并且加入约0.1mg/ml的鸡蛋清溶菌酶。12,000PSI下使悬浮的糊通过冷微流化床两次。然后4℃下以22,000g将细胞裂解物离心20分钟。然后用组织研磨器将沉淀重悬于200ml 1％脱氧胆酸中，然后4℃下以22,000g离心20分钟。然后用组织研磨器将沉淀重悬于200ml水中，然后4℃下以22,000g离心20分钟。然后将沉淀(2.6g)溶解于26ml 8M盐酸胍，50mM tris HCl，pH 8.0中。然后通过将30μl 1M二硫苏糖醇加入3ml溶液中，还原溶解的沉淀，37℃下温育30分钟。然后室温下以14,000g将还原的沉淀溶液离心5分钟，然后4℃下剧烈搅拌下将2.5ml上清液转移到250ml重折叠缓冲液(2M脲，50mM tris，160mM盐酸精氨酸，5mM EDTA，1mM盐酸胱胺，4mM半胱氨酸，pH 8.5)中。然后降低搅拌速度，4℃下继续温育2天。然后使重折叠溶液通过0.22μm醋酸纤维素膜过滤，-70℃下储存。

使储存的重折叠物解冻，然后用1L水稀释，用1M H₃PO₄将pH调节到7.5。然后通过0.22μm的醋酸纤维素滤膜过滤pH调节的材料，7℃下在S-缓冲液A(20mM NaH₂PO₄，pH 7.3)中以10ml/min加入10ml Amersham SP-HP HiTrap柱。然后用数倍柱体积的S-缓冲液A洗涤柱子，然后7℃下以5ml/min用0％-60％S-缓冲液B(20mMNaH₂PO₄，1M NaCl，pH 7.3)的线性梯度，随后用达到100％S-缓冲液B的梯度洗脱。然后用考马斯亮蓝染色的tris-甘氨酸4-20％SDS-PAGE分析级分，基于这些数据合并含有需要的产物的级分(15ml)。然后7℃下在PBS中以2ml/min将合并物加入1ml Amersham rProtein AHiTrap柱。然后用数倍柱体积的20mM NaH₂PO₄ pH 6.5，1M NaCl洗涤柱子，用100mM甘氨酸pH 3.0洗脱。在洗脱峰(1.4ml)中加入70μl 1M tris HCl pH 8.5，然后使pH调节的材料通过0.22μm的醋酸纤维素滤膜。

然后用Hewlett Packard 8453分光光度计对稀释于700μl PBS中的20μl混合的合并物进行光谱扫描(图29F)。用计算分子量30,469g/mol和消光系数43,890M^-1cm^-1确定过滤的材料的浓度是1.44mg/ml。然后用考马斯亮蓝染色的tris-甘氨酸4-20％SDS-PAGE评估过滤的材料的纯度(图29B)。然后用Charles River Laboratories Endosafe-PTS系统(0.05-5EU/ml灵敏度)，采用样品在Charles Rivers内毒素特异性缓冲液BG120中的33倍稀释液确定内毒素水平，得到＜4EU/mg蛋白的结果。然后用大小排阻色谱确定20μg产物的大分子状态，该产物在50mM NaH₂PO₄，250mM NaCl，pH 6.9中以1ml/min注射到PhenomenexBioSep SEC 3000柱(7.8×300mm)上，在280nm观察吸光度(图29G。通过将1μl样品稀释到10μl芥子酸(在0.05％三氟乙酸，50％乙腈中是10mg/ml)中，对产物进行质谱分析。将得到的溶液(1μl)点样到MALDI样品板上。使样品干燥，然后用配备氮激光(337nm，3ns脉冲)的Voyager DE-RP飞行时间质谱仪分析。采用了正离子/线性模式，加速电压是25kV。通过累积来自约200次激光发射的数据产生每个质谱。用已知分子量的纯化蛋白完成外部质量校准(图29H)并且证实(在实验误差内)纯化的肽抗体的完整性。然后将产物在-80℃下储存。

                     实施例24

               Fc-L-PaTx2的细菌表达

Fc-L-PaTx2的细菌表达。用于在细菌中克隆和表达肽抗体的方法描述于实施例3。使用的载体是pAMG21ampR-Fc-Pep，用下文列出的寡聚物制备用于在细菌中克隆和表达Fc-L-PaTx2的双链体(如下)。

用于形成双链体的寡聚物如下所示：

TGGTTCCGGTGGTGGTGGTTCCTACTGCCAGAAATGGA //SEQ ID

NO：822；

TGTGGACCTGCGACGAAGAACGTAAATGCTGCGAAGGTCTGGTTTG

CCGTCTGTGGTGCAAACGTATCATCAACATG //SEQ ID NO：823；

CTTACATGTTGATGATACGTTTGCACCACAGACGGCAAA //SEQ ID

NO：824；

CCAGACCTTCGCAGCATTTACGTTCTTCGTCGCAGGTCCACATCCA

TTTCTGGCAGTAGGAACCACCACCACCGGA //SEQ ID NO：825；

上文的寡聚物用于形成下文所示的双链体：

   TGGTTCCGGTGGTGGTGGTTCCTACTGCCAGAAATGGATGTGGACCTGCGACGAAGAACG

 1 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 60

       AGGCCACCACCACCAAGGATGACGGTCTTTACCTACACCTGGACGCTGCTTCTTGC

    G  S  G  G  G  G  S  Y  C  Q  K  W  M  W  T  C  D  E  E  R  -

   TAAATGCTGCGAAGGTCTGGTTTGCCGTCTGTGGTGCAAACGTATCATCAACATG SEQ ID NO：826

61 ---------+---------+---------+---------+---------+-----

   ATTTACGACGCTTCCAGACCAAACGGCAGACACCACGTTTGCATAGTAGTTGTACATTC SEQ ID NO：828

    K  C  C  E  G  L  V  C  R  L  W  C  K  R  I  I  N  M   -SEQ ID NO：827

肽抗体的细菌表达描述于实施例3，并且冷冻储存细菌糊备用。

                         实施例25

              Fc-L-wGVIA的细菌表达

Fc-L-wGVIA的细菌表达。用于在细菌中克隆和表达肽抗体的方法描述于实施例3。使用的载体是pAMG21ampR-Fc-Pep，用下文列出的寡聚物制备用于在细菌中克隆和表达Fc-L-wGVIA的双链体(如下)。

用于形成双链体的寡聚物如下所示：

TGGTTCCGGTGGTGGTGGTTCCTGCAAATCCCCGGGTT //SEQ ID

NO：829；

CCTCCTGCTCCCCGACCTCCTACAACTGCTGCCGTTCCTGCAACCC

GTACACCAAACGTTGCTACGGT SEQ ID NO：830；

CTTAACCGTAGCAACGTTTGGTGTACGGGTTGCAGGAA //SEQ ID

NO：831；

CGGCAGCAGTTGTAGGAGGTCGGGGAGCAGGAGGAACCCGGGGAT

TTGCAGGAACCACCACCACCGGA //SEQ ID NO：832；

上文的寡聚物用于形成下文所示的双链体：

   TGGTTCCGGTGGTGGTGGTTCCTGCAAATCCCCGGGTTCCTCCTGCTCCCCGACCTCCTA

 1 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 60

       AGGCCACCACCACCAAGGACGTTTAGGGGCCCAAGGAGGACGAGGGGCTGGAGGAT

    G  S  G  G  G  G  S  C  K  S  P  G  S  S  C  S  P  T  S  Y  -

   CAACTGCTGCCGTTCCTGCAACCCGTACACCAAACGTTGCTACGGT SEQ ID NO：833

61 ---------+---------+---------+---------+------

   GTTGACGACGGCAAGGACGTTGGCCATGTGGTTTGCAACGATGCCAATTC SEQ ID NO：835

    N  C  C  R  S  C  N  P  Y  T  K  R  C  Y  G  SEQ ID NO：834

肽抗体的细菌表达描述于实施例3，并且冷冻储存细菌糊备用。

                       实施例26

               Fc-L-ωMVIIA的细菌表达

Fc-L-ωMVIIA的细菌表达。用于在细菌中克隆和表达肽抗体的方法描述于实施例3。使用的载体是pAMG21ampR-Fc-Pep，用下文列出的寡聚物制备用于在细菌中克隆和表达Fc-L-ωMVIIA的双链体(如下)。

用于形成双链体的寡聚物如下所示：

TGGTTCCGGTGGTGGTGGTTCCTGCAAAGGTAAA //SEQ ID

NO：836；

GGTGCTAAATGCTCCCGTCTGATGTACGACTGCTGCACCGGTTCCT

GCCGTTCCGGTAAATGCGGT //SEQ ID NO：837；

CTTAACCGCATTTACCGGAACGGCAGGAACCGGT //SEQ ID

NO：838；

GCAGCAGTCGTACATCAGACGGGAGCATTTAGCACCTTTACCTTTG

CAGGAACCACCACCACCGGA //SEQ ID NO：839；

上文的寡聚物用于形成下文所示的双链体：

   TGGTTCCGGTGGTGGTGGTTCCTGCAAAGGTAAAGGTGCTAAATGCTCCCGTCTGATGTA

 1 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 60

       AGGCCACCACCACCAAGGACGTTTCCATTTCCACGATTTACGAGGGCAGACTACAT

    G  S  G  G  G  G  S  C  K  G  K  G  A  K  C  S  R  L  M  Y  -

   CGACTGCTGCACCGGTTCCTGCCGTTCCGGTAAATGCGGT SEQ ID NO：840

61 ---------+---------+---------+---------+

   GCTGACGACGTGGCCAAGGACGGCAAGGCCATTTACGCCAATTC SEQ ID NO：842

    D  C  C  T  G  S  C  R  S  G  K  C  G   - SEQ ID NO：841

肽抗体的细菌表达描述于实施例3，并且冷冻储存细菌糊备用。

                          实施例27

                    Fc-L-Ptu1的细菌表达

Fc-L-Ptu1的细菌表达。用于在细菌中克隆和表达肽抗体的方法描述于实施例3。使用的载体是pAMG21ampR-Fc-Pep，用下文列出的寡聚物制备用于在细菌中克隆和表达Fc-L-Ptu1的双链体(如下)。

用于形成双链体的寡聚物如下所示：

TGGTTCCGGTGGTGGTGGTTCCGCTGAAAAAGACTGCATC //SEQ ID

NO：843；

GCTCCGGGTGCTCCGTGCTTCGGTACCGACAAACCGTGCTGCAACC

CGCGTGCTTGGTGCTCCTCCTACGCTAACAAATGCCTG //SEQ ID

NO：844；

CTTACAGGCATTTGTTAGCGTAGGAGGAGCACCAAGCACG //SEQ ID

NO：845；

CGGGTTGCAGCACGGTTTGTCGGTACCGAAGCACGGAGCACCCGG

AGCGATGCAGTCTTTTTCAGCGGAACCACCACCACCGGA //SEQ ID

NO：846；

上文的寡聚物用于形成下文所示的双链体：

    TGGTTCCGGTGGTGGTGGTTCCGCTGAAAAAGACTGCATCGCTCCGGGTGCTCCGTGCTT

  1 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 60

        AGGCCACCACCACCAAGGCGACTTTTTCTGACGTAGCGAGGCCCACGAGGCACGAA

     G  S  G  G  G  G  S  A  E  K  D  C  I  A  P  G  A  P  C  F  -

    CGGTACCGACAAACCGTGCTGCAACCCGCGTGCTTGGTGCTCCTCCTACGCTAACAAATG

 61 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 120

    GCCATGGCTGTTTGGCACGACGTTGGGCGCACGAACCACGAGGAGGATGCGATTGTTTAC

     G  T  D  K  P  C  C  N  P  R  A  N  C  S  S  Y  A  N  K  C  -

    CCTG SEQ ID NO：847

121 ----

    GGACATTC SEQ ID NO：849

     L   - SEQ ID NO：848

肽抗体的细菌表达描述于实施例3，并且冷冻储存细菌糊备用。

                      实施例28

               Fc-L-ProTx1的细菌表达

Fc-L-ProTx1的细菌表达。用于在细菌中克隆和表达肽抗体的方法描述于实施例3。使用的载体是pAMG21ampR-Fc-Pep，用下文列出的寡聚物制备用于在细菌中克隆和表达Fc-L-ProTx1的双链体(如下)。

用于形成双链体的寡聚物如下所示：

TGGTTCCGGTGGTGGTGGTTCCGAATGCCGTTACTGGCTGG //SEQ

ID NO：850；

GTGGTTGCTCCGCTGGTCAGACCTGCTGCAAACACCTGGTTTGCTC

CCGTCGTCACGGTTGGTGCGTTTGGGACGGTACCTTCTCC //SEQ ID

NO：851；

CTTAGGAGAAGGTACCGTCCCAAACGCACCAACCGTGACGA //SEQ

ID NO：852；

CGGGAGCAAACCAGGTGTTTGCAGCAGGTCTGACCAGCGGAGCAA

CCACCCAGCCAGTAACGGCATTCGGAACCACCACCACCGGA //SEQ

ID NO：853；

上文的寡聚物用于形成下文所示的双链体：

    TGGTTCCGGTGGTGGTGGTTCCGAATGCCGTTACTGGCTGGGTGGTTGCTCCGCTGGTCA

  1 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 60

        AGGCCACCACCACCAAGGCTTACGGCAATGACCGACCCACCAACGAGGCGACCAGT

     G  S  G  G  G  G  S  E  C  R  Y  W  L  G  G  C  S  A  G  Q  -

    GACCTGCTGCAAACACCTGGTTTGCTCCCGTCGTCACGGTTGGTGCGTTTGGGACGGTAC

 61 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 120

    CTGGACGACGTTTGTGGACCAAACGAGGGCAGCAGTGCCAACCACGCAAACCCTGCCATG

     T  C  C  K  R  L  V  C  S  R  R  H  G  W  C  V  W  D  G  T  -

    CTTCTCC SEQ ID NO：854

121 -------

    GAAGAGGATTC SEQ ID NO：856

     F  S   - SEQ ID NO：855

肽抗体的细菌表达描述于实施例3，并且冷冻储存细菌糊备用。

                        实施例29

                  Fc-L-BeKM1的细菌表达

Fc-L-BeKM1的细菌表达。用于在细菌中克隆和表达肽抗体的方法描述于实施例3。使用的载体是pAMG21ampR-Fc-Pep，用下文列出的寡聚物制备用于在细菌中克隆和表达Fc-L-BeKM1的双链体(如下)。

用于形成双链体的寡聚物如下所示：

TGGTTCCGGTGGTGGTGGTTCCCGTCCGACCGACATCAAATG //SEQ

ID NO：857；

CTCCGAATCCTACCAGTGCTTCCCGGTTTGCAAATCCCGTTTCGGT

AAAACCAACGGTCGTTGCGTTAACGGTTTCTGCGACTGCTTC //SEQ

ID NO：858；

CTTAGAAGCAGTCGCAGAAACCGTTAACGCAACGACCGTTGG //SEQ

ID NO：859；

TTTTACCGAAACGGGATTTGCAAACCGGGAAGCACTGGTAGGATTC

GGAGCATTTGATGTCGGTCGGACGGGAACCACCACCACCGGA

//SEQ ID NO：860；

上文的寡聚物用于形成下文所示的双链体：

    TGGTTCCGGTGGTGGTGGTTCCCGTCCGACCGACATCAAATGCTCCGAATCCTACCAGTG

  1 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 60

        AGGCCACCACCACCAAGGGCAGGCTGGCTGTAGTTTACGAGGCTTAGGATGGTCAC

     G  S  G  G  G  G  S  R  P  T  D  I  K  C  S  E  S  Y  Q  C  -

    CTTCCCGGTTTGCAAATCCCGTTTCGGTAAAACCAACGGTCGTTGCGTTAACGGTTTCTG

 61 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 120

    GAAGGGCCAAACGTTTAGGGCAAAGCCATTTTGGTTGCCAGCAACGCAATTGCCAAAGAC

     F  P  V  C  K  S  R  F  G  K  T  N  G  R  C  V  N  G  F  C  -

    CGACTGCTTC SEQ ID NO：861

121 ---------+

    GCTGACGAAGATTC SEQ ID NO：863

     D  C  F   - SEQ ID NO：862

肽抗体的细菌表达描述于实施例3，并且冷冻储存细菌糊备用。

                       实施例30

                  Fc-L-CTX的细菌表达

Fc-L-CTX的细菌表达。用于在细菌中克隆和表达肽抗体的方法描述于实施例3。使用的载体是pAMG21ampR-Fc-Pep，用下文列出的寡聚物制备用于在细菌中克隆和表达Fc-L-CTX的双链体(如下)。

用于形成双链体的寡聚物如下所示：

TGGTTCCGGTGGTGGTGGTTCCATGTGCATGCCGTGCTTCAC //SEQ

ID NO：864；

CACCGACCACCAGATGGCTCGTAAATGCGACGACTGCTGCGGTGGT

AAAGGTCGTGGTAAATGCTACGGTCCGCAGTGCCTGTGCCGT //SEQ

ID NO：865；

CTTAACGGCACAGGCACTGCGGACCGTAGCATTTACCACGAC //SEQ

ID NO：866；

CTTTACCACCGCAGCAGTCGTCGCATTTACGAGCCATCTGGTGGTC

GGTGGTGAAGCACGGCATGCACATGGAACCACCACCACCGGA

//SEQ ID NO：867；

上文的寡聚物用于形成下文所示的双链体：

    TGGTTCCGGTGGTGGTGGTTCCATGTGCATGCCGTGCTTCACCACCGACCACCAGATGGC

  1 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 60

        AGGCCACCACCACCAAGGTACACGTACGGCACGAAGTGGTGGCTGGTGGTCTACCG

     G  S  G  G  G  G  S  M  C  M  P  C  F  T  T  D  H  Q  M  A  -

    TCGTAAATGCGACGACTGCTGCGGTGGTAAAGGTCGTGGTAAATGCTACGGTCCGCAGTG

 61 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 120

    AGCATTTACGCTGCTGACGACGCCACCATTTCCAGCACCATTTACGATGCCAGGCGTCAC

     R  K  C  D  D  C  C  G  G  K  G  R  G  K  C  Y  G  P  Q  C  -

    CCTGTGCCGT SEQ ID NO：868

121 ---------+

    GGACACGGCACCAC SEQ ID NO：870

     L  C  R   - SEQ ID NO：869

肽抗体的细菌表达描述于实施例3，并且冷冻储存细菌糊备用。

                      实施例31

           N末端聚乙二醇化的Des-Arg1-ShK

还原的Des-Arg1-ShK的肽合成。具有序列

SCIDTIPKSRCTAFQCKHSMKYRLSFCRKTCGTC

(肽1，SEQ ID NO：92)的Des-Arg1-ShK是在Symphony^TM多-肽合成仪上，在Tentagel^TM-S PHB Fmoc-Cys(Trt)-树脂上以0.1mmol当量树脂的规模，用2-(1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基六氟磷酸(HBTU)/N-甲基吗啉(NMM)/N，N-二甲基-甲酰胺(DMF)偶联化学，通过固相肽合成(SPPS)，以逐步方式合成的。从Midwest Biotech Incorporated购买N-α-(9-芴基甲氧羰基)-和侧链受保护的氨基酸。从Fluka购买Fmoc-Cys(Trt)-Tentagel^TM树脂。采用以下侧链保护策略：Asp(O^tBu)，Arg(Pbf)，Cys(Trt)，Gln(Trt)，His(Trt)，Lys(N^ε-Boc)，Ser(O^tBu)，Thr(O^tBu)和Tyr(O^tBu)。将两种唑烷二肽，即Fmoc-Gly-Thr(^ψMe，MePro)-OH和Fmoc-Leu-Ser(^ψMe，MePro)-OH，用于链组装，并且获自NovaBiochem，并且用于合成序列。将受保护的氨基酸衍生物(20mmol)溶解于100ml DMF中的20％(v/v)二甲亚砜(DMSO)。用DMF中的20％DMSO中的20mM HBTU，400mM NMM活化受保护的氨基酸，用两次处理进行偶联，即用20％DMF/DMSO中的0.5mmol受保护的氨基酸，0.5mmol HBTU，1mmolNMM处理25分钟，然后处理40分钟。用DMF溶液中的20％(v/v)哌啶进行Fmoc去保护反应10分钟，然后进行15分钟。合成后，流干树脂，用DCM，DMF，DCM洗涤，然后真空中干燥。通过用TFA/EDT/TIS/H₂O(92.5∶2.5∶2.5∶2.5(v/v))溶液在室温下处理1小时，使肽-树脂去保护，并且从树脂释放。然后用氮气流除去易挥发物，用冷二乙醚使粗肽沉淀两次，通过离心收集。然后在Waters 2795分析RP-HPLC系统上，用线性梯度(0-60％缓冲液B，12分钟，A：水中的0.1％TFA，B：乙腈中的0.1％TFA)在Jupiter 4μm Proteo^TM 90柱上分析粗肽。用PE-Sciex^TM API电雾化质谱仪证实正确的肽产物质量。以143mg的产量获得粗肽，纯度为约70％，这是通过分析性RP-HPLC分析估计的。还原的Des-Arg1-ShK(肽1)保留时间(Rt)＝5.31分钟，计算分子量＝3904.6917Da(平均值)；实验观察的分子量是3907.0Da。

Des-Arg1-ShK的折叠(二硫键形成)。TFA裂解和肽沉淀后，随后使还原的Des-Arg1-ShK在空气中氧化，得到折叠的肽。用20％AcOH/水(v/v)萃取粗的裂解的肽，然后用水稀释到每mL大约0.15mg还原的Des-Arg1-ShK的浓度，然后用NH₄OH(28-30％)将pH调节到大约8.0，室温下轻柔搅拌36小时。通过LC-MS分析监测折叠过程。此后，采用1”Luna 5μm C18 100Proteo^TM柱，以120分钟内的线性梯度0-40％缓冲液B(A＝水中的0.1％TFA，B＝乙腈中的0.1％TFA)用反相HPLC纯化折叠的Des-Arg1-ShK肽。在较早的时间(与其还原形式的洗脱时间相比)，用大约25％缓冲液B洗脱折叠的Des-Arg1-ShK粗肽。以23.2mg的产量获得折叠的Des-Arg1-ShK(肽2)，纯度为＞97％，这是通过分析性RP-HPLC分析估计的(图20)。计算分子量＝3895.7693Da(单同位素)；实验观察的分子量＝3896.5Da(在Waters LCT Premier Micromass MS Technologies上分析)。Des-Arg1-ShK二硫键连接是C1-C6，C2-C4，C3-C5。

              (肽2，SEQ ID NO：58)

折叠的Des-Arg1-ShK的N末端聚乙二醇化。将折叠的Des-Arg1-ShK(肽2)以1mg/ml的浓度溶解于水中。新制备2M MeO-PEG-醛，即CH₃O-[CH₂CH₂O]n-CH₂CH₂CHO(平均分子量20kDa)在50mM NaOAc，pH 4.5中的溶液和单独的1M NaCNBH₃溶液。然后将肽溶液加入含有MeO-PEG-醛的溶液，然后加入NaCNBH₃溶液。反应化学计量分别是肽∶PEG∶NaCNBH3(1∶2∶0.02)。使反应静置48小时，在Agilent 1100RP-HPLC系统上，40℃下用Zorbax^TM 300SB-C8 5μm柱，以线性梯度(6-60％B，16分钟，A：水中的0.1％TFA，B：水中的0.1％TFA/90％ACN)分析。通过分析性RP-HPLC，得出单聚乙二醇化的折叠Des-Arg1-ShK占粗产物的大约58％。然后4℃下用HiTrap^TM 5ml SP HP阳离子交换柱在AKTA FPLC系统上以1mL/min用25倍柱体积中的0-50％B的梯度分离单聚乙二醇化的Des-Arg1-ShK(缓冲液：A＝20mM醋酸钠pH 4.0，B＝1M NaCl，20mM醋酸钠，pH 4.0)。用4-20tris-Gly SDS-PAGE凝胶和RP-HPLC分析级分(如对粗产物的描述)。125V，35mA，5W条件下SDS-PAGE凝胶电泳1.5小时。然后4℃下在更换3次的1L A4S缓冲液(10mM NaOAc，5％山梨糖醇，pH 4.0)中渗析合并的产物。然后在10K微量离心滤器中将渗析的产物浓缩为2mL体积，用0.2μM注射器滤器灭菌过滤，得到终产物。通过分析性RP-HPLC分析，评估以1.7mg的产量分离了N末端聚乙二醇化的Des-Arg1-ShK(肽3)，纯度是85％(图23)。

通过膜片钳电生理确定N末端聚乙二醇化的Des-Arg1-ShK，也称作“PEG-ShK[2-35]”，具有阻断人Kv1.3的活性(图38A和图38B)。

                   实施例32

              N末端聚乙二醇化的ShK

本实施例的实验程序相应于图17所示结果。

还原的ShK的肽合成。具有氨基酸序列

RSCIDTIPKSRCTAFQCKHSMKYRLSFCRKTCGTC

(肽4，SEQ ID NO：5)的ShK是在Symphony^TM多-肽合成仪上，在Tentagel^TM-S PHB Fmoc-Cys(Trt)-树脂上以0.1mmol当量树脂的规模，用2-(1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基六氟磷酸(HBTU)/N-甲基吗啉(NMM)/N，N-二甲基-甲酰胺(DMF)偶联化学，通过固相肽合成(SPPS)，以逐步方式合成的。从Midwest Biotech Incorporated购买N-α-(9-芴基甲氧羰基)和侧链受保护的氨基酸。从Fluka购买Fmoc-Cys(Trt)-Tentagel^TM树脂。采用以下侧链保护策略：Asp(O^tBu)，Arg(Pbf)，Cys(Trt)，Gln(Trt)，His(Trt)，Lys(N^ε-Boc)，Ser(O^tBu)，Thr(O^tBu)和Tyr(O^tBu)。将两种唑烷二肽，即Fmoc-Gly-Thr(^ψMe，MePro)-OH和Fmoc-Leu-Ser(^ψMe，MePro)-OH，用于链组装，并且获自NovaBiochem，并且用于合成序列。将受保护的氨基酸衍生物(20mmol)溶解于100ml DMF中的20％(v/v)二甲亚砜(DMSO)。用DMF中的20％DMSO中的20mM HBTU，400mMNMM活化受保护的氨基酸，用两次处理进行偶联，即用20％DMF/DMSO中的0.5mmol受保护的氨基酸，0.5mmol HBTU，1mmolNMM处理25分钟，然后处理40分钟。用DMF溶液中的20％(v/v)哌啶进行Fmoc去保护反应10分钟，然后进行15分钟。合成后，流干树脂，用DCM，DMF，DCM洗涤，然后真空中干燥。通过用TFA/EDT/TIS/H₂O(92.5∶2.5∶2.5∶2.5(v/v))溶液在室温下处理1小时，使肽-树脂去保护，并且从树脂释放。然后用氮气流除去易挥发物，用冷二乙醚使粗肽沉淀两次，通过离心收集。然后在Waters 2795分析RP-HPLC系统上，用线性梯度(0-60％缓冲液B，12分钟，A：水中的0.1％TFA，B：乙腈中的0.1％TFA)在Jupiter 4μm Proteo^TM 90柱上分析粗肽。用PE-Sciex^TM API电雾化质谱仪证实正确的肽产物质量。以170mg的产量获得粗肽，纯度为约45％，这是通过分析性RP-HPLC分析估计的。还原的ShK(肽4)保留时间(Rt)＝5.054分钟，计算分子量＝4060.8793Da(平均值)；实验观察的分子量是4063.0Da。

ShK的折叠(二硫键形成)。TFA裂解和肽沉淀后，随后使还原的ShK在空气中氧化，得到折叠的肽。用20％AcOH/水(v/v)萃取粗的裂解的肽，然后用水稀释到每mL大约0.15mg还原的ShK的浓度，然后用NH₄OH(28-30％)将pH调节到大约8.0，室温下轻柔搅拌36小时。通过LC-MS分析监测折叠过程。此后，采用1”Luna 5μm C18100Proteo^TM柱，以120分钟内的线性梯度0-40％缓冲液B(A＝水中的0.1％TFA，B＝乙腈中的0.1％TFA)用反相HPLC纯化折叠的ShK肽。在较早的时间(与其还原形式的洗脱时间相比)，用大约25％缓冲液B洗脱折叠的ShK粗肽。以25.5mg的产量获得折叠的ShK(肽5)，纯度为＞97％，这是通过分析性RP-HPLC分析估计的。参见图60。计算分子量＝4051.8764Da(单同位素)；实验观察的分子量＝4052.5Da(在Waters LCT Premier Micromass MS Technologies上分析)。ShK二硫键连接是C1-C6，C2-C4和C3-C5。

              (肽5，SEQ ID NO：10)

折叠的ShK的N末端聚乙二醇化。具有氨基酸序列

RSCIDTIPKSRCTAFQCKHSMKYRLSFCRKTCGTC

              (SEQ ID NO：5)的折叠的ShK可以以1mg/ml的浓度溶解于水中。新制备2M MeO-PEG-醛，即CH₃O-[CH₂CH₂O]n-CH₂CH₂CHO(平均分子量20kDa)在50mM NaOAc，pH 4.5中的溶液和单独的1M NaCNBH₃溶液。可以将肽溶液加入含有MeO-PEG-醛的溶液，然后可以加入NaCNBH₃溶液。反应化学计量可以是肽∶PEG∶NaCNBH3(1∶2∶0.02)。可以使反应静置48小时，可以在Agilent 1100RP-HPLC·系统上，40℃下用Zorbax^TM300SB-C8 5μm柱，以线性梯度(6-60％B，16分钟，A：水中的0.1％TFA，B：水中的0.1％TFA/90％ACN)分析。然后可以4℃下用HiTrap^TM 5ml SP HP阳离子交换柱在AKTA FPLC系统上以1mL/min用25倍柱体积中的0-50％B的梯度分离单聚乙二醇化的ShK(缓冲液：A＝20mM醋酸钠pH 4.0，B＝1M NaCl，20mM醋酸钠，pH 4.0)。可以用4-20tris-Gly SDS-PAGE凝胶和RP-HPLC分析级分。可以在125V，35mA，5W条件下SDS-PAGE凝胶电泳1.5小时。然后可以4℃下在更换3次的1L A4S缓冲液(10mM NaOAc，5％山梨糖醇，pH 4.0)中渗析合并的产物。然后可以在10K微量离心滤器中将渗析的产物浓缩为2mL体积，用0.2μM注射器滤器灭菌过滤，得到终产物。

                      实施例33

        通过形成肟而进行N末端聚乙二醇化的ShK

还原的ShK的肽合成。具有氨基酸序列

RSCIDTIPKSRCTAFQCKHSMKYRLSFCRKTCGTC

              (SEQ ID NO：5)的ShK可以在Symphony^TM多-肽合成仪上，在Tentagel^TM-S PHB Fmoc-Cys(Trt)-树脂上以0.1mmol当量树脂的规模，用2-(1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基六氟磷酸(HBTU)/N-甲基吗啉(NMM)/N，N-二甲基-甲酰胺(DMF)偶联化学，通过固相肽合成(SPPS)，以逐步方式合成。可以从Midwest Biotech Incorporated购买N-α-(9-芴基甲氧羰基)和侧链受保护的氨基酸。可以从Fluka购买Fmoc-Cys(Trt)-Tentagel^TM树脂。可以采用以下侧链保护策略：Asp(O^tBu)，Arg(Pbf)，Cys(Trt)，Gln(Trt)，His(Trt)，Lys(N^ε-Boc)，Ser(O^tBu)，Thr(O^tBu)和Tyr(O^tBu)。可以将两种唑烷二肽，即Fmoc-Gly-Thr(^ψMe，MePro)-OH和Fmoc-Leu-Ser(^ψMe，MePro)-OH，用于链组装，并且可以获自NovaBiochem，并且用于合成序列。可以将受保护的氨基酸衍生物(20mmol)溶解于100mlDMF中的20％(v/v)二甲亚砜(DMSO)。可以用DMF中的20％DMSO中的20mM HBTU，400mM NMM活化受保护的氨基酸，可以用两次处理进行偶联，即用20％DMF/DMSO中的0.5mmol受保护的氨基酸，0.5mmol HBTU，1mmol NMM处理25分钟，然后处理40分钟。可以用DMF溶液中的20％(v/v)哌啶进行Fmoc去保护反应10分钟，然后进行15分钟。Shk肽的链组装后，可以用DMF中的0.5M HBTU使Boc-氨基氧基乙酸(1.2当量)在N末端与4当量的可力丁偶联5分钟。合成后，可以流干树脂，用DCM，DMF，DCM洗涤，然后真空中干燥。可以通过用TFA/EDT/TIS/H₂O(92.5∶2.5∶2.5∶2.5(v/v))溶液在室温下处理1小时，使肽-树脂去保护，并且从树脂释放。然后可以用氮气流除去易挥发物，用冷二乙醚使粗肽沉淀两次，通过离心收集。然后可以在Waters 2795分析RP-HPLC系统上，用线性梯度(0-60％缓冲液B，12分钟，A：水中的0.1％TFA，B：乙腈中的0.1％TFA)在Jupiter 4μm Proteo^TM 90柱上分析氨基氧基-ShK肽(肽7)。

反相HPL纯化。可以在C18，5μm，2.2cm×25cm)柱上进行制备性反相高效液相色谱。可以用缓冲液B在A中的线性梯度(A＝0.1％含水TFA；B＝90％含水ACN，其中含有0.09％TFA和0.1％氨基氧基乙酸)，典型是90分钟内5-95％，以15mL/min完成色谱分离。可以通过ESMS和发光二极管阵列(PDA)HPLC表征制备性HPLC级分，并且冻干。

通过形成肟对ShK进行N末端聚乙二醇化。可以将冻干的氨基氧基-ShK(肽7)溶解于50％HPLC缓冲液A/B(5mg/mL)，加入两倍摩尔过量的MeO-PEG-醛，即CH₃O-[CH₂CH₂O]_n-CH₂CH₂CHO(平均分子量20kDa)中。可以使反应静置24小时，可以在Agilent 1100RP-HPLC系统上，40℃下用Zorbax^TM 300SB-C8 5μm柱，以线性梯度(6-60％B，16分钟，A：水中的0.1％TFA，B：水中的0.1％TFA/90％ACN)分析。然后可以4℃下用HiTrap^TM 5ml SP HP阳离子交换柱在AKTA FPLC系统上以1mL/min用25倍柱体积中的0-50％B的梯度分离单聚乙二醇化(形成肟盐)的ShK(肽8)(缓冲液：A＝20mM醋酸钠pH 4.0，B＝1M NaCl，20mM醋酸钠，pH 4.0)。可以用4-20tris-Gly SDS-PAGE凝胶和RP-HPLC分析级分。可以在125V，35mA，5W条件下SDS-PAGE凝胶电泳1.5小时。然后可以4℃下在更换3次的1L A4S缓冲液(10mM NaOAc，5％山梨糖醇，pH4.0)中渗析合并的产物。然后可以在10K微量离心滤器中将渗析的产物浓缩为2mL体积，用0.2μM注射器滤器灭菌过滤，得到终产物。

ShK的折叠(二硫键形成)。可以将单聚乙二醇化(形成肟盐)的ShK溶解于20％AcOH/水(v/v)，然可以用水稀释到每mL大约0.15mg肽的浓度，用NH₄OH(28-30％)将pH调节到大约8.0，室温下轻柔搅拌36小时。可以通过LC-MS分析监测折叠过程。此后，可以采用1”Luna 5μm C18 100Proteo^TM柱，以120分钟内的线性梯度0-40％缓冲液B(A＝水中的0.1％TFA，B＝乙腈中的0.1％TFA)用反相HPLC纯化折叠的单聚乙二醇化(形成肟盐)的ShK。单聚乙二醇化(形成肟盐)的ShK二硫键连接可以是C1-C6，C2-C4和C3-C5。

             (肽9，SEQ ID NO：10)

                  实施例34

       N末端聚乙二醇化的ShK(酰胺化)

本实施例的实验程序相应于图18所示的结果。

通过酰胺形成对ShK进行N末端聚乙二醇化。可以在室温下将10mg/mL折叠ShK(肽5)在100mM N-二(羟乙基)甘氨酸pH 8.0中的溶液加入20kDa PEG丙酸(mPEG-SPA；CH₃O-[CH₂CH₂O]n-CH₂CH₂CO-NHS)的固体琥珀酰亚胺基酯，其中采用相对于Shk 1.5倍摩尔过量的mPEG-SPA。轻柔搅拌1小时后，可以用水将混合物稀释到2mg/mL，可以用稀HCl将pH调节到4.0。可以用0.05M NaH₂PO₄，0.05M Na₂HPO₄，0.15M NaCl，0.01M NaN₃，pH 6.8，以1mL/min洗脱的Superdex^TM 75HR10/30柱(Amersham)，通过SEC HPLC确定单聚乙二醇化的Shk(肽10)、一些二聚乙二醇化的ShK或三聚乙二醇化的ShK、未修饰的ShK和琥珀酰亚胺基酯水解的程度。可以用4-20tris-Gly SDS-PAGE凝胶和RP-HPLC分析级分。可以在125V，35mA，5W条件下SDS-PAGE凝胶电泳1.5小时。然后可以4℃下在更换3次的1L A4S缓冲液(10mM NaOAc，5％山梨糖醇，pH 4.0)中渗析合并的产物。然后可以在10K微量离心滤器中将渗析的N末端聚乙二醇化(酰胺化)的ShK(肽10)浓缩为2mL体积，用0.2μM注射器滤器灭菌过滤，得到终产物。

           (肽10，SEQ ID NO：10)

                实施例35

               Fc-L-SmIIIA

Fc-L-SmIIIA表达载体。用重叠引物3654-50和3654-51，通过PCR组装含有部分接头序列和人高频密码子编码的SmIIIA肽的104bp BamHI-NotI片段，并且克隆到7.1kb NotI-BamHI主链中，得到实施例1描述的pcDNA3.1(+)CMVi-hFc-SmIIIA。

BamHI

5′GGATCCGGAGGAGGAGGAAGCTGCTGCAACGGCCGCCGCGGCTGCAGCAGCCGCTGG

                        C  C  N  G  R  R  G  C  S  S  R  W

TGCCGCGACCACAGCCGCTGCTGCTGAGCGGCCGC3′//SEQ ID NO：872

C  R  D  H  S  R  C  C       NotI

SEQ ID NO：873

Forward 5′-3′：

GGAGGAGGATCCGGAGGAGGAGGAAGCTGCTGCAACGGCCGCCGCGGCTGCAGCAGC CGC //SEQ IDNO：874

Reverse 5′-3′：

ATTATTGCGGCCGCTCAGCAGCAGCGGCTGTGGTCGCGGCACCAGCGGCTGCTGCAG CCGC SEQ IDNO：875

通过测序证实最终构建体中BamHI到NotI片段的序列。

Fc-L-SmIIIa的瞬时表达。用FuGENE 6作为转染试剂，将7.5ug毒素肽Fc融合构建体pcDNA3.1(+)CMVi-hFc-SmIIIA转染到10cm组织培养板中的293-T细胞中。在转染后24小时，用无血清的培养基更换培养基，在转染后5天收获条件培养基。通过抗hFc抗体探测的蛋白印迹分析293-T细胞的Fc-SmIIIA瞬时表达(图25A和图25B)。显示了还原和非还原样品中具有估计MW的表达蛋白的单条带。通过ELISA进一步确定Fc-SmIIIA的瞬时表达水平是73.4μg/ml。

                    实施例36

                   电生理实验

细胞培养。表达人K_v1.3通道的稳定细胞系从Biofocus批准。使细胞置于37℃，5％CO₂的环境。培养基含有添加GlutaMax^TM(Invitrogen)的DMEM、1X非必须氨基酸、10％胎牛血清和500μg/mL遗传霉素。在电生理实验前，将细胞铺板在35mm培养皿上在低汇合下生长至少24小时。

通过膜片钳记录电生理。通过使用膜片钳技术的紧密密封构造，从单细胞记录全细胞电流。在用含有135mM NaCl，5mM KCl，1.8mMCaCl₂，10mM HEPES和5mM葡萄糖的记录缓冲液冲洗和更换培养基后，将35mm培养皿转移到记录阶段。用NaOH将pH调节到7.4，摩尔渗透压浓度设置为300mOsm。通过平行排列并且连接于运动杆上的玻璃毛细管之一，连续用记录缓冲液灌注细胞，该运动杆将玻璃毛细管直接置于记录的细胞顶端。用于记录的移液管溶液含有90mM葡糖醛酸钾，20mM KF，10mM NaCl，1mM MgCl₂-6H₂O，10mM EGTA，5mM K₂-ATP和10mM HEPES。用KOH将内部溶液的pH调节至7.4，摩尔渗透压浓度设置为280mOsm。在室温下(20-22℃)进行实验，用Multiclamp^TM 700A放大器(Molecular Devices Inc.)记录。移液管阻抗一般是2-3MΩ。

对Kv1.3电流的蛋白毒素效力测定：在-80mV的保持电位，对稳定表达人Kv1.3通道的HEK293细胞进行电压钳制。通过从-80mV的保持电位给予200msec长去极化步骤到达+30mV，并且在3kHz滤波，激活外向K_v1.3电流。每个去极化步骤与后面的去极化步骤间隔10秒。通过Digidata^TM 1322A数字转换器(Molecular Devices)对模拟信号进行数字转换，并且随后存储在计算机磁盘上，用Clampfit^TM 9(MolecularDevices Inc.)进行离线分析。在所有研究中，以递增浓度，在开始灌注蛋白毒素前，建立稳定的基线K_v1.3电流振幅4分钟。总是在开始灌注随后浓度的蛋白毒素开始前达到稳态阻断。

数据分析。基于以下公式计算占对照的百分比(POC)：(添加蛋白毒素后的K_v1.3电流/对照中的K_v1.3电流)*100。用至少5个浓度的蛋白毒素(如0.003，0.01，0.03，0.1，0.3，100nM)计算IC₅₀值。用XLfit软件(Microsoft Corp.)的四参数对数拟合，估计IC₅₀值和曲线拟合。IC₅₀值表示为平均值±s.e.m.(平均值的标准误)。

药物制备。将蛋白毒素(典型是10-100μM)溶解于蒸馏水中，在-80℃保持冷冻。将存储蛋白毒素的系列稀释液混合到含有0.1％牛血清白蛋白(BSA)的记录缓冲液中，随后转移到玻璃灌注容器中。电子收缩阀门控制蛋白毒素从容器向记录细胞上的流动。

                      实施例37

                免疫生物和通道结合

抑制PBMCs的PMA和抗CD3抗体刺激后的T细胞因子产生。先前从正常人供体白细胞提取包中分离了PBMCs，通过密度梯度离心(Ficoll Hypaque)纯化，在CPZ完全冷冻保存培养基(CryopreservationMedium Complete)(INCELL，MCPZF-100+终浓度10％的DMSO)中冷冻保存。使PBMCs解冻(95％存活率)，洗涤，以2×10⁵个细胞/孔种植到96孔平底组织培养板中的培养基(RPMI培养基1640；GIBCO)中，该培养基补加了10％胎牛血清、100U/ml青霉素、100mg/ml链霉素、2mM L-谷氨酰胺、100uM非必须氨基酸和20uM 2-ME。用连续稀释的(终浓度100nM-0.001nM)ShK[1-35]、Fc-L10-ShK[1-35]或fc对照预先温育细胞90分钟，然后用PMA/抗-CD3(分别是1ng/ml和50ng/ml)以200ul的最终测定体积刺激48小时。用Meso ScaleDiscovery(MSD)SECTOR^TM成像仪6000(Meso Scale Discovery，Gaithersbury，MD)进行测定样品的分析，以便利用电化学发光(ECL)测量IL-2和IFNg蛋白水平。将条件培养基(50ul)加入MSD多点96孔板(每个孔含有三种捕获抗体；IL-2，TNF，IFNγ)。密封平板，包裹在锡箔中，在板振荡器上室温下温育2小时。用200ul PBST(BIOTEK，Elx405 Auto Plate Washer)洗涤孔1次。对于每个孔，加入20ul钌标记的检测抗体(在抗体稀释缓冲液中的终浓度是1ug/ml；IL-1，TNF，IFNγ)和130ul 2X MSD读数缓冲液，终体积150ul。密封平板，包裹在锡箔中，在板振荡器上室温下温育1小时。然后在SECTOR^TM成像仪6000上对板读数。图35A和35B显示CHO来源的Fc-L10-ShK[1-35]肽抗体以剂量依赖性方式有效抑制T细胞产生IL-2和IFNg。与天然ShK[1-35]肽相比，肽抗体产生了更大程度的抑制(POC＝不存在抑制剂时占应答对照的百分比)。

抗CD30和抗CD28抗体刺激PBMCs后抑制T细胞因子产生。先前从正常人供体白细胞提取包中分离了PBMCs，通过密度梯度离心(Ficoll Hypaque)纯化，用INCELL冷冻培养基冷冻保存。使PBMCs解冻(95％存活率)，洗涤，以2×10⁵个细胞/孔种植(在含有血清替代品PSG的RPMI完全培养基中)到96孔平底组织培养板中。用连续稀释的(终浓度100nM-0.003nM)ShK[1-35]、Fc-L10-ShK[1-35]或Fc对照预先温育细胞1小时，然后加入200mL最终测定体积中的CD3和CD28(分别是2.5ng/ml和100ng/ml)。48小时后收集上清液，用Meso Scale Discovery(MSD)SECTOR^TM成像仪6000(Meso ScaleDiscovery，Gaithersbury，MD)进行分析，以便利用电化学发光(ECL)测量IL-2和IFNg蛋白水平。将20mL上清液加入MSD多点96孔板(每个孔含有IL-2，TNFa和IFNg捕获抗体)。密封平板，在板振荡器上室温下温育1小时。然后加入20mL钌标记的检测抗体(在抗体稀释缓冲液中的终浓度是1ug/ml；IL-2，TNFα和IFNγ)和110mL 2XMSD读数缓冲液。密封平板，盖上锡箔，在板振荡器上室温下温育1小时。然后在SECTOR^TM成像仪6000上对板读数。图37A和37B显示CHO来源的Fc-L10-ShK[1-35]肽抗体以剂量依赖性方式有效抑制T细胞产生IL-2和IFNg。与仅仅显示部分抑制的天然ShK[1-35]肽相比，肽抗体产生了对炎性细胞因子应答的几乎完全的抑制(POC＝不存在抑制剂时占应答对照的百分比)。

抗CD30和抗CD28抗体刺激PBMCs后抑制T细胞增殖。先前从正常人供体白细胞提取包中分离了PBMCs，通过密度梯度离心(FicollHypaque)纯化，在CPZ完全冷冻保存培养基(INCELL，MCPZF-100+终浓度10％的DMSO)中冷冻保存。使PBMCs解冻(95％存活率)，洗涤，以2×10⁵个细胞/孔种植到96孔平底组织培养板中的培养基(RPMI培养基1640；GIBCO)中，该培养基补加了10％胎牛血清、100U/ml青霉素、100mg/ml链霉素、2mM L-谷氨酰胺、100uM非必须氨基酸和20uM 2-ME。用抗人CD32(FcyRII)阻断抗体(按照制造商的说明，用EASY SEP人生物素选择试剂盒#18553，StemCell TechnologiesVancouver，BC)或Fc-L10-ShK(终浓度100nM-0.001nM)预先温育细胞45分钟。然后将Fc-L10-ShK(终浓度100nM-0.001nM)加入含有抗人CD32阻断抗体的细胞，同时将培养基加入含有Fc-L10-ShK的细胞。这两组都温育额外的45分钟，然后用CD3/aCD28(分别是0.2ng/ml和100ng/ml)刺激48小时。最终测定体积是200ul。加入[3H]TdR(1uCi/孔)，将板再温育16小时。然后将细胞收获到玻璃纤维滤器上，在B-闪烁计数器上测量放射性。图36A和36B显示CHO来源的Fc-L10-ShK[1-35]肽抗体以剂量依赖性方式抑制T细胞增殖。用抗CD32(FcR)阻断抗体预先阻断，对肽抗体抑制T细胞增殖的能力几乎没有影响，表明Kv1.3抑制(而不是FcR结合)是观察到的抑制作用的机理(POC＝不存在抑制剂时占应答对照的百分比)。

Fc-L10-ShK[1-35]结合于超量表达人Kv1.3的HEK 293细胞的 免疫组化分析。从BioFocus plc(Cambridge，UK)获得超量表达人Kv1.3的HEK 293细胞(HEK Kv1.3)，按照制造商的推荐维持。将亲本HEK293细胞系用作对照。将细胞铺板在聚-D-赖氨酸24孔板(#35-4414；Becton-Dickinson，Bedford，MA)上，使其生长到大约70％汇合。以0.5×10e5个细胞/孔，在1ml/孔的培养基中对HEK KV1.3进行铺板。以1.5×10e5个细胞/孔的密度，在1ml/孔的培养基中对HEK 293细胞进行铺板。染色前，通过除去细胞生长培养基，加入0.2ml/孔福尔马林溶液，用福尔马林(Sigma HT50-1-1福尔马林溶液，使用前用PBS/0.5％BSA进行1∶1稀释)固定细胞，在室温下温育10分钟。通过室温下用0.2ml/孔的PBS/BSA中的5ug/ml Fc-L10-ShK[1-35]温育30分钟，对细胞进行染色。吸出Fc-L10-ShK[1-35]，然后用PBS/0.5％BSA洗涤细胞一次。以在PBS/0.5％BSA中5ug/ml的浓度将检测抗体(山羊F(ab)2抗人IgG-藻红蛋白；Southern Biotech Associates，Birmingham，AL)加入孔中，室温下温育30分钟。用PBS/0.5％BSA洗涤细胞一次，用共焦显微镜(LSM 510 Meta共焦显微镜；Carl ZeissAG，Germany)检查。图33B显示Fc-L10-ShK[1-35]肽抗体保持与超量表达Kv1.3的HEK 293细胞结合，但与未转染的细胞很少结合(图33A)，表明Fc-L10-ShK[1-35]肽抗体可以用作检测超量表达Kv1.3通道的细胞的试剂。据报道，在疾病情况下，激活的T效应记忆细胞超量产生Kv1.3，这种试剂可以用于靶定这些细胞，并且用于它们的检测中。

ELISA测定证明Fc-L10-ShK[1-35]结合于超量表达Kv1.3的固 定的HEK293细胞。图34A显示肽抗体与超量表达Kv1.3的固定细胞的结合的剂量依赖性增加，证明肽抗体显示与其靶的高亲和力结合和Fc-L10-ShK[1-35]分子在检测表达该通道的细胞中的用途。已经通过全细胞膜片钳电生理(一种烦琐的方法)表明导致多发性硬化患者的疾病的抗原特异性T细胞超量表达Kv1.3。我们的肽抗体试剂可以是一种用于监测患者中的Kv1.3通道表达并且可以用于诊断应用中的有用和方便的工具。以下是图34A和34B中显示的程序。

图34A。进行了全细胞免疫测定，以显示完整Fc-L10-ShK[1-35]与Kv1.3转染的HEK 293细胞(BioFocus plc，Cambridge，UK)的结合。以3×10e4个细胞/孔将亲本HEK 293细胞或HEK Kv1.3细胞铺板在聚-D-赖氨酸包被的96孔板(#35-4461；Becton-Dickinson，Bedford，MA)上。通过除去细胞生长培养基，加入0.2ml/孔福尔马林溶液，用福尔马林(Sigma HT50-1-1福尔马林溶液，使用前用PBS/0.5％BSA进行1∶1稀释)固定细胞，在室温下温育25分钟，然后用100ul/孔的PBS/0.5％BSA洗涤细胞一次。通过加入0.3ml/孔BSA封闭剂(50-61-00；KPL 10％BSA稀释液/封闭溶液，用PBS 1∶1稀释；KPL，Gaithersburg，MD)封闭孔，然后室温振荡下温育3小时。用1x KP洗涤缓冲液(50-63-00；KPL)洗涤平板2次。在稀释缓冲液(PBS/0.5％Tween-20)或含有1％雄性Lewis大鼠血清(RATSRM-M；Bioreclamation Inc.Hicksville，NY)的稀释缓冲液中稀释样品，在封闭的板中加入0.1ml/孔，室温振荡下温育1小时。用1xKP洗涤缓冲液洗涤平板3次，然后室温振荡下用1∶5000稀释于PBS/0.1％Tween-20中的HRP-山羊抗人IgG Fc(#31416；Pierce，Rockford，IL)温育1小时。用1xKP洗涤缓冲液洗涤平板3次，然后加入0.1ml/孔TMB底物(52-00-01；KPL)。通过加入0.1ml/孔2N硫酸终止反应。在MolecularDevices SpectroMax 340(Sunnyvale，CA)上450nm处读出吸光度。

图34B。按照上文进行全细胞免疫测定，进行以下修改。将HEK 293细胞以1×10e5个细胞/孔，HEK Kv1.3细胞以6×10e4个细胞/孔铺板在聚-D-赖氨酸包被的96孔板中。以0.05ml/孔的体积以500ng/ml加入Fc对照。HRP-山羊抗人IgG Fc(#31416；Pierce，Rockford，IL)以1∶10,000稀释于PBS/0.1％Tween-20中。ABTS(50-66-00，KPL)用作底物。通过加入0.1ml/孔1％SDS终止反应后，在405nm处读出吸光度。

                   实施例38

            Fc-L10-ShK(1-35)的纯化

按照上文实施例3的描述表达Fc-L10-ShK[1-35]。将冷冻的大肠杆菌糊(18g)与室温下的200ml 50mM tris HCl，5mM EDTA，pH8.0混合，并且加入约0.1mg/ml的鸡蛋清溶菌酶。12,000PSI下使悬浮的糊通过冷微流化床两次。然后4℃下以22,000g将细胞裂解物离心15分钟。然后用组织研磨器将沉淀重悬于200ml 1％脱氧胆酸中，然后4℃下以22,000g离心15分钟。然后用组织研磨器将沉淀重悬于200ml水中，然后4℃下以22,000g离心15分钟。然后将沉淀(3.2g)溶解于32ml 8M盐酸胍，50mM tris HCl，pH 8.0中。然后室温下以27,000g将沉淀溶液离心15分钟，然后4℃下剧烈搅拌下将5ml上清液转移到500ml重折叠缓冲液(3M脲，20％甘油，50mM tris，160mM盐酸精氨酸，5mM EDTA，1mM盐酸胱胺，4mM半胱氨酸，pH 8.5)中。然后降低搅拌速度，4℃下继续温育2天。然后-70℃下储存重折叠溶液。

使储存的重折叠物解冻，然后用2L水稀释，用1M H₃PO₄将pH调节到7.3。然后通过0.22μm的醋酸纤维素滤膜过滤pH调节的材料，7℃下在S-缓冲液A(20mM NaH₂PO₄，pH 7.3)中以20ml/min加入60ml Amersham SP-FF(2.6cm内径)柱。然后用数倍柱体积的S-缓冲液A洗涤柱子，然后7℃下以10ml/min用0％-60％S-缓冲液B(20mM NaH₂PO₄，1M NaCl，pH 7.3)的线性梯度，随后用达到100％S-缓冲液B的梯度洗脱。然后用考马斯亮蓝染色的tris-甘氨酸4-20％SDS-PAGE分析级分，基于这些数据合并含有需要的产物的级分。然后7℃下在PBS中以1ml/min将合并物加入1ml Amersham rProtein AHiTrap柱。然后用数倍柱体积的20mM NaH₂PO₄pH 6.5，1M NaCl洗涤柱子，用100mM甘氨酸pH 3.0洗脱。在洗脱峰中加入0.0125倍体积(25ml)的3M醋酸钠。

然后用Hewlett Packard 8453分光光度计对稀释于700μl PBS中的50μl混合的合并物进行光谱扫描(图46A)。用计算分子量30,410g/mol和消光系数36,900M^-1cm^-1确定过滤的材料的浓度是2.56mg/ml。然后用考马斯亮蓝染色的tris-甘氨酸4-20％SDS-PAGE评估过滤的材料的纯度(图46B)。然后用大小排阻色谱确定20μg产物的大分子状态，该产物在50mM NaH₂PO₄，250mM NaCl，pH 6.9中以1ml/min注射到Phenomenex BioSep SEC 3000柱(7.8×300mm)上，在280nm观察吸光度(图46C)。通过将1μl样品稀释到10μl芥子酸(在0.05％三氟乙酸，50％乙腈中是10mg/ml)中，对产物进行质谱分析。将得到的溶液(1μl)点样到MALDI样品板上。使样品干燥，然后用配备氮激光(337nm，3ns脉冲)的Voyager DE-RP飞行时间质谱仪分析。采用了正离子/线性模式，加速电压是25kV。通过累积来自约200次激光发射的数据产生每个质谱。用已知分子量的纯化蛋白完成外部质量校准。然后将产物在-80℃下储存。

纯化的大肠杆菌来源的Fc-L10-ShK[1-35]，也称作“Fc-L-ShK[1-35]”阻断人Kv1.3的IC₅₀示于表35(在下文实施例50中)。

                  实施例39

         细菌表达的Fc-L10-ShK(2-35)的纯化

按照上文实施例4的描述表达Fc-L10-ShK[2-35]。将冷冻的大肠杆菌糊(16.5g)与室温下的200ml 50mM tris HCl，5mM EDTA，pH 8.0混合，并且加入约0.1mg/ml的鸡蛋清溶菌酶。12,000PSI下使悬浮的糊通过冷微流化床两次。然后4℃下以22,000g将细胞裂解物离心15分钟。然后用组织研磨器将沉淀重悬于200ml 1％脱氧胆酸中，然后4℃下以22,000g离心15分钟。然后用组织研磨器将沉淀重悬于200ml水中，然后4℃下以22,000g离心15分钟。然后将沉淀(3.9g)溶解于39ml 8M盐酸胍，50mM tris HCl，pH 8.0中。然后室温下以27,000g将沉淀溶液离心15分钟，然后4℃下剧烈搅拌下将5ml上清液转移到500ml重折叠缓冲液(3M脲，20％甘油，50mM tris，160mM盐酸精氨酸，5mM EDTA，1mM盐酸胱胺，4mM半胱氨酸，pH 8.5)中。然后降低搅拌速度，4℃下继续温育2天。然后-70℃下储存重折叠溶液。

使储存的重折叠物解冻，然后用2L水稀释，用1M H₃PO₄将pH调节到7.3。然后通过0.22μm的醋酸纤维素滤膜过滤pH调节的材料，7℃下在S-缓冲液A(20mM NaH₂PO₄，pH 7.3)中以20ml/min加入60ml Amersham SP-FF(2.6cm内径)柱。然后用数倍柱体积的S-缓冲液A洗涤柱子，然后7℃下以10ml/min用0％-60％S-缓冲液B(20mM NaH₂PO₄，1M NaCl，pH 7.3)的线性梯度，随后用达到100％S-缓冲液B的梯度洗脱。合并含有需要的产物的级分，通过0.22μm的醋酸纤维素滤膜过滤。然后7℃下在PBS中以2ml/min将合并物加入1mlAmersham rProtein A HiTrap柱。然后用数倍柱体积的20mM NaH₂PO₄pH 6.5，1M NaCl洗涤柱子，用100mM甘氨酸pH 3.0洗脱。在洗脱峰中加入0.0125倍体积(18ml)的3M醋酸钠，样品通过0.22μm的醋酸纤维素滤膜过滤。

然后用Hewlett Packard 8453分光光度计对稀释于700μl PBS中的20μl混合的合并物进行光谱扫描(图40A)。用计算分子量29,282g/mol和消光系数36,900M^-1cm^-1确定过滤的材料的浓度是3.20mg/ml。然后用考马斯亮蓝染色的tris-甘氨酸4-20％SDS-PAGE评估过滤的材料的纯度(图40B)。然后用大小排阻色谱确定50μg产物的大分子状态，该产物在50mM NaH₂PO₄，250mM NaCl，pH 6.9中以1ml/min注射到Phenomenex BioSep SEC 3000柱(7.8×300mm)上，在280nm观察吸光度(图40C)。通过将1μl样品稀释到10μl芥子酸(在0.05％三氟乙酸，50％乙腈中是10mg/ml)中，对产物进行质谱分析。将得到的溶液(1μl)点样到MALDI样品板上。使样品干燥，然后用配备氮激光(337nm，3ns脉冲)的Voyager DE-RP飞行时间质谱仪分析。采用了正离子/线性模式，加速电压是25kV。通过累积来自约200次激光发射的数据产生每个质谱。用已知分子量的纯化蛋白完成外部质量校准。然后将产物在-80℃下储存。

纯化的大肠杆菌来源的Fc-L10-ShK[2-35]，也称作“Fc-L-ShK[2-35]”阻断人Kv1.3的IC₅₀示于表35(在下文实施例50中)。

                    实施例40

              细菌表达的Fc-L10-OsK1的纯化

将冷冻的大肠杆菌糊(129g，参见实施例10)与室温下的1290ml 50mM tris HCl，5mM EDTA，pH 7.8混合，并且加入约0.1mg/ml的鸡蛋清溶菌酶。12,000PSI下使悬浮的糊通过冷微流化床两次。然后4℃下以17,700g将细胞裂解物离心15分钟。然后用组织研磨器将沉淀重悬于1290ml 1％脱氧胆酸中，然后4℃下以17,700g离心15分钟。然后将8g沉淀(总共16.3g)溶解于160ml 8M盐酸胍，50mM tris HCl，pH8.0中。然后37℃下用1ml 1M的DTT将100ml沉淀溶液温育60分钟。然后4℃下剧烈搅拌下以2ml/min将还原的材料转移到5000ml重折叠缓冲液(1M脲，50mM tris，160mM盐酸精氨酸，2.5mM EDTA，1.2mM盐酸胱胺，4mM半胱氨酸，pH 10.5)中。然后降低搅拌速度，4℃下继续温育3天。

用醋酸将重折叠物的pH调节到8.0。通过0.22μm的醋酸纤维素滤膜过滤pH调节的材料，8℃下在Q-缓冲液A(20mM Tris，pH 8.5)中以10ml/min加入50ml Amersham Q Sepharose-FF(2.6cm内径)柱，其带有内嵌的50Amersham蛋白A柱(2.6cm内径)。加样后，从循环中去除Q Sepharose柱，其余的色谱在蛋白A柱上进行。用数倍柱体积的Q-缓冲液A洗涤柱子，然后用达到100mM甘氨酸pH 3.0的步骤洗脱。合并含有需要的产物的级分，立即8℃下在S缓冲液A(20mMNaH₂PO₄，pH 7.0)中以20ml/min加入50ml Amersham SP-Sepharose HP(2.6cm内径)柱。然后用数倍柱体积的S-缓冲液A，然后用5％-60％S-缓冲液B(20mM NaH₂PO₄，1M NaCl，pH 7.0)的线性梯度，随后用达到100％S-缓冲液B的步骤洗涤柱子。然后用考马斯亮蓝染色的tris-甘氨酸4-20％SDS-PAGE分析级分。合并含有大量需要的产物的级分，然后8℃下在MEP缓冲液A(20mM tris，200mM NaCl，pH 8.0)中以5ml/min加入75ml MEP Hypercel柱(2.6cm内径)。用5％-50％MEP缓冲液B(50mM柠檬酸钠pH4.0)的线性梯度，随后用达到100％MEP缓冲液B的步骤洗脱。然后用考马斯亮蓝染色的tris-甘氨酸4-20％SDS-PAGE分析级分，合并含有大量需要的产物的级分。

然后用具有10kDa膜的Pall Jumbo-Sep，随后通过采用相同膜，用制剂缓冲液(20mM NaH₂PO₄，200mM NaCl，pH 7.0)进行缓冲液交换，从而将MEP合并物浓度至约20ml。然后用Hewlett Packard 8453分光光度计对稀释于700μl制剂缓冲液中的50μl混合的合并物进行光谱扫描(图41A)。用计算分子量30,558g/mol和消光系数35,720M^-1cm^-1确定材料的浓度是4.12mg/ml。然后用考马斯亮蓝染色的tris-甘氨酸4-20％SDS-PAGE评估材料的纯度(图41B)。然后用大小排阻色谱确定123μg产物的大分子状态，该产物在50mM NaH₂PO₄，250mMNaCl，pH 6.9中以1ml/min注射到Phenomenex BioSep SEC 3000柱(7.8×300mm)上，在280nm观察吸光度(图41C)。然后经RP-HPLC柱(Vydac C₄，1×150mm)，通过对大约4μg样品进行色谱，从而对产物进行质谱分析。溶剂A是0.1％的三氟乙酸水溶液，溶剂B是在90％乙腈，10％水中的0.1％三氟乙酸。以80μl/min的流速，在10％溶剂B中使柱子预平衡。用10％-90％溶剂B的线性梯度，在30分钟内洗脱蛋白。将部分洗脱液导入LCQ离子阱质谱仪。用质谱仪制造商提供的Bioworks软件对质谱解卷积(图41D)。通过0.22μm醋酸纤维素膜过滤产物，然后在-80℃储存。

大肠杆菌表达的Fc-L10-OSK1制备物的产量是从40g细胞糊(129g×(8g/16.3g)×(100ml/160ml)＝39.6g，近似到40g)得到的81mg，通过SDS-PAGE判断纯度大于80％，通过SEC-HPLC判断是预期的二聚物，质量在用MS判断的预期分子量范围内。

纯化的大肠杆菌来源的Fc-L10-OSK1，也称作“Fc-L-OSK1”阻断人Kv1.3的IC₅₀示于表35(在下文实施例50中)。

                     实施例41

哺乳动物细胞表达的Fc-L10-OSK1、Fc-L10-OSK1[K7S]、 Fc-L10-OSK1[E16K，K20D]和Fc-L10-OSK1[K7S，E16K，K20D]

在哺乳动物细胞中表达Fc-L10-OSK1、Fc-L10-OSK1[K7S]、Fc-L10-OSK1[E16K，K20D]和Fc-L10-OSK1[K7S，E16K，K20D]，它们都是Kv1.3的抑制剂。按照下文的描述构建编码与接头序列和Kv1.3抑制剂肽OSK1、OSK1[K7S]、OSK1[E16K，K20D]或OSK1[K7S，E16K，K20D]的单体框内融合的人IgG1 Fc区的DNA序列。本文公开了用于从哺乳动物细胞(HEK 293和中国仓鼠卵巢细胞)表达和纯化肽抗体的方法。

为了构建Fc-L10-OSK1、Fc-L10-OSK1[K7S]、Fc-L10-OSK1[E16K，K20D]和Fc-L10-OSK1[K7S，E16K，K20D]表达载体，用PCR策略制备全长基因OSK1、OSK1[K7S]、OSK1[E16K，K20D]和OSK1[K7S，E16K，K20D]，每一个都连接于由4个甘氨酸和1个丝氨酸组成的接头，具有两个终止密码子，侧翼是BamHI和NotI限制位点，如下文所示。

针对具有下文描述的序列的OSK1、OSK1[K7S]、OSK1[E16K，K20D]和[K7S，E16K，K20D]OSK1中的每一个的两个寡聚物被用于PCR反应，该反应用PfuTurbo HotStart DNA聚合酶(Stratagene)，以35个循环的95℃-30秒，55℃-30秒，75℃-45秒进行；BamHI(ggatcc)和NotI(gcggccgc)限制位点加下划线。

OSK1：

正向引物：cat gga tcc gga gga gga gga agc ggc gtg atc atc aac gtgaag tgc aag atc agc cgc cag tgc ctg gag ccc tgc aag aag gcc g(SEQID NO：876)；

反向引物：cat gcg gcc gct tac tac ttg ggg gtg cag tgg cac ttg ccg ttcatg cac ttg ccg aag cgc atg ccg gcc ttc ttg cag ggc tcc a(SEQ IDNO：877)；

OSK1[K7S]：

正向引物：cat gga tcc gga gga gga gga agc ggc gtg atc atc aac gtgagc tgc aag atc agc cgc cag tgc ctg gag ccc tgc aag aag gcc g(SEQID NO：878)；

反向引物：cat gcg gcc gct tac tac ttg ggg gtg cag tgg cac ttg ccg ttcatg cac ttg ccg aag cgc atg ccg gcc ttc ttg cag ggc tcc a(SEQ IDNO：879)；

OSK1[E16K，K20D]：

正向引物：cat gga tcc gga gga gga gga agc ggc gtg atc atc aac gtgaag tgc aag atc agc cgc cag tgc ctg aag ccc tgc aag gac gcc g(SEQID NO：880)；

反向引物：cat gcg gcc gct tac tac ttg ggg gtg cag tgg cac ttg ccg ttcatg cac ttg ccg aag cgc atg ccg gcg tcc ttg cag ggc ttc a(SEQ IDNO：881)；

OSK1[K7S，E16K，K20D]：

正向引物：cat gga tcc gga gga gga gga agc ggc gtg atc atc aac gtgagc tgc aag atc agc cgc cag tgc ctg aag ccc tgc aag gac gcc g(SEQID NO：882)；

反向引物：cat gcg gcc gct tac tac ttg ggg gtg cag tgg cac ttg ccg ttcatg cac ttg ccg aag cgc atg ccg gcg tcc ttg cag ggc ttc a(SEQ IDNO：883)。

 将得到的PCR产物在4％的琼脂糖凝胶上分辨为155bp的条带。用PCR纯化试剂盒(Qiagen)纯化155bp的PCR产物，然后用BamHI和NotI(Roche)限制酶消化，通过凝胶提取试剂盒(Qiagen)纯化琼脂糖凝胶。同时，用BamHI和NotI限制酶消化pcDNA3.1(+)CMVi-hFc-Shk[2-35]载体，通过凝胶提取试剂盒纯化大片段。将凝胶纯化的PCR片段连接到纯化的大片段，并且转化到One Shot^Top10F’(Invitrogen)中。分离来自转化的细菌菌落的DNA，用BamHI和NotI限制酶消化，在2％的琼脂糖凝胶上分辨。对得到预期模式的DNA进行测序。尽管对克隆的一些序列的分析得出与上述序列的100％匹配，从每种基因只选择了一个克隆进行大规模质粒纯化。对pCMVi载体中的Fc-L10-OSK1、Fc-L10-OSK1[K7S]、Fc-L10-OSK1[E16K，K20D]和Fc-L10-OSK1[K7S，E16K，K20D]的DNA进行重新测序，证实Fc和接头区，并且证实该序列与上述序列的同一性是100％。Fc-L10-OSK1、Fc-L10-OSK1[K7S]、Fc-L10-OSK1[E16K，K20D]和Fc-L10-OSK1[K7S，E16K，K20D]的序列和图示分别描述于图42A-B、图43A-B、图44A-B和图45A-B。

在含有高葡萄糖的DMEM(Gibco)、10％胎牛血清(来自Gibco的FBS)、1X非必须氨基酸(来自Gibco的NEAA)和1X青霉素/链霉素/谷氨酰胺(来自Gibco的Pen/Strep/Glu)的生长培养基中培养用于在pCMVi蛋白中瞬时转染表达Fc-L10-OSK1、Fc-L10-OSK1[K7S]、Fc-L10-OSK1[E16K，K20D]和Fc-L10-OSK1[K7S，E16K，K20D]的HEK-293细胞。用FuGENE 6(Roche)将苯酚/氯仿提取的pCMVi质粒中的Fc-L10-OSK1、Fc-L10-OSK1[K7S]、Fc-L10-OSK1[E16K，K20D]和Fc-L10-OSK1[K7S，E16K，K20D]各5.6μg转染到HEK-293细胞中。回收细胞24小时，然后置于高葡萄糖的DMEM、1x NEAA和1X青霉素/链霉素/谷氨酰胺培养基中持续48小时。用下文实施例50描述的方案从这些转染的HEK-293细胞调节的培养基纯化Fc-L10-OSK1[K7S]、Fc-L10-OSK1[E16K，K20D]和Fc-L10-OSK1[K7S，E16K，K20D]。

将15μl条件培养基与内部4x加样缓冲液(不含β-巯基乙醇)混合，用Novex Xcell II设备以101V/46mA在1x凝胶电泳溶液(25mMTris碱，192mM甘氨酸，3.5mM SDS)中与20μl BenchMark预染色的蛋白梯(Invitrogen)一起在Novex 4-20％tris-甘氨酸凝胶上电泳。然后，将凝胶在电印迹缓冲液(25mM Tris碱，192mM甘氨酸，20％甲醇)中浸渍5分钟。将来自Invitogen(目录号LC200，0.2um孔径)的硝酸纤维素膜浸渍在电印迹缓冲液中。根据制造商的说明书(Bio-RadLaboratories)，在300mA用Mini Trahs-Blot Cell组件将预先浸渍的凝胶印迹到硝酸纤维素膜上2小时。用含有0.1％Tween20(TBST)的Tris缓冲的盐溶液pH7.5冲洗印迹。然后，首先在室温下将印迹浸渍在TBST中的5％乳(Camation)中，然后，在TBST中洗涤3次，每次洗涤10分钟。然后，室温振荡下用HRP-缀合的山羊抗人IgG，(Fcγ)抗体(Pierece Biotechnology Cat.no.31413)在含有5％乳缓冲液的TBST中的1∶1000稀释液温育。然后，室温下在TBST中洗涤印迹3次，每次洗涤15分钟。根据制造商的说明书用Amersham Pharmacia Biotech的ECL蛋白印迹检测试剂检测第一抗体。ECL检测后，蛋白印迹分析在非还原凝胶条件下展示66kDa的预期大小(图46)。

用XbaI和NotI(Roche)限制酶消化含有pCMVi载体中的Fc-L10-OSK1、Fc-L10-OSK1[K7S]、Fc-L10-OSK1[E16K，K20D]和Fc-L10-OSK1[K7S，E16K，K20D]插入片段的质粒。单独将插入片段连接到SpeI和NotI(Roche)消化的pDSRα24(Amgen Proprietary)表达载体中。通过DNA测序证实得到的构建体的完整性。尽管克隆的一些序列的分析得到了与上述序列的100％匹配，仅选择了一个克隆用于大规模质粒纯化。

在含有高葡萄糖的DMEM、10％胎牛血清、1x次黄嘌呤/胸苷(来自Gibco的HT)、1X NEAA和1X青霉素/链霉素/谷氨酰胺的AM1 CHOd-生长培养基中培养用于稳定表达Fc-L10-OSK1蛋白的AM1 CHOd-(Amgen Proprietary)细胞。用FuGene 6将5.6μg pDSRα-24-Fc-L10-OSK1质粒转染到AM1 CHOd-细胞中。转染后24小时，细胞以1∶11分裂到DHFR选择培养基(高葡萄糖的DMEM+10％渗析的胎牛血清(dFBS)，1x NEAA和1X青霉素/链霉素/谷氨酰胺)中，以1∶50稀释，用于菌落选择。在DHFR选择培养基中选择细胞13天。将得到的菌落的10个10-cm²合并物扩增到10个T-175烧瓶中，然后放大到10个滚瓶中，在AM1 CHOd-生产培养基(DMEM/F12(1∶1)，1X NEAA，1X丙酮酸钠(Na Pyruvate)，1X青霉素/链霉素/谷氨酰胺和1.5％DMSO)中培养。收获条件培养基，以1周的间隔更换。通过0.45μm醋酸纤维素滤膜(Corning，Acton，MA)过滤得到的6升条件培养基，通过SDS-PAGE分析表征，如图47所示。然后，转移到Protein Chemistry进行纯化。

在DHFR选择培养基上培养13天后选择12个菌落，挑选到一个24孔板上。使平板生长1周，然后转移到AM1 CHOd-生产培养基上持续48-72小时，收获条件培养基。通过类似于瞬时蛋白印迹分析的蛋白印迹，用相同的HRP缀合的山羊抗人IgG，即(Fcγ)抗体筛选5μl条件培养基而进行检测，从而评估表达水平。所有12个稳定克隆表现出以66kDa的预期大小表达。选择了两个克隆，即A3和C2，扩增到T175烧瓶中进行冷冻，A3作为原代克隆C2的备份(图48)。

用选择培养基将C2克隆放大到50个滚瓶(Corning)中，生长到汇合。然后，用生产培养基更换培养基，温育1周。收获条件培养基，以1周的间隔更换。通过0.45μm醋酸纤维素滤膜(Corning，Acton，MA)过滤得到的50升条件培养基，通过SDS-PAGE分析表征(数据未示出)。按照下文实施例42的描述完成进一步的纯化。

                    实施例42

哺乳动物细胞表达的Fc-L10-OSK1、Fc-L10-OSK1(K7S)、

           Fc-L10-OSK1(E16K，K20D)和

      Fc-L10-OSK1(K7S，E16K，K20D)的纯化

Fc-L10-OSK1的纯化。7℃下以10ml/min将大约6L CHO(AM1CHOd-)细胞条件培养基(参见上文实施例41)加入35ml MAb选择柱(GE Healthcare)，用数倍柱体积的不含二价阳离子的Dulbecco磷酸缓冲液(PBS)洗涤，用达到100mM甘氨酸pH 3.0的步骤洗脱样品。7℃下以10ml/min直接将MAb选择洗脱液在S-缓冲液A(20mMNaH₂PO₄，pH 7.0)中加入串联的65ml SP-HP柱(GE Healthcare)。与MAb选择柱分开后，随后用数倍柱体积的S-缓冲液A洗涤SP-HP柱，然后7℃下以10ml/min用5％-60％S-缓冲液B(20mM NaH₂PO₄，1M NaCl，pH 7.0)的线性梯度，随后用达到100％S-缓冲液B的梯度进行显影。然后用考马斯亮蓝染色的tris-甘氨酸4-20％SDS-PAGE分析级分，基于这些数据合并含有需要的产物的级分。然后用PallLife Sciences Jumbosep 10K Omega离心超滤装置将合并的材料浓缩至约20ml。然后通过用20ml的20mM NaH₂PO₄，pH 7.0稀释，对浓缩的材料进行缓冲液交换，并且用Jumbosep 10K Omega滤器重新浓缩到20ml。然后用20ml 20mM NaH₂PO₄，200mM NaCl，pH 7.0稀释材料，然后浓缩到22ml。然后室温下以1ml/min通过带有0.22μm，25mm Mustang E膜的Pall Life Sciences Acrodisc过滤缓冲液交换的材料。然后用Hewlett Packard 8453分光光度计对稀释于700μl PBS中的50μl过滤的材料进行光谱扫描(图49A，黑色痕迹)。用计算分子量30,371g/mol和消光系数35,410M^-1cm^-1确定过滤的材料的浓度是4.96mg/ml。然后用考马斯亮蓝染色的tris-甘氨酸4-20％SDS-PAGE评估过滤的材料的纯度(图49B)。然后用Charles RiverLaboratories Endosafe-PTS系统(0.05-5EU/ml灵敏度)，采用样品在Charles Rivers Laboratories内毒素特异性缓冲液中的30倍稀释液确定内毒素水平，得到1.8EU/mg蛋白的结果。然后用大小排阻色谱确定149μg产物的大分子状态，该产物在50mM NaH₂PO₄，250mM NaCl，pH 6.9中以1ml/min注射到Phenomenex BioSep SEC 3000柱(7.8×300mm)上，在280nm观察吸光度(图49C)。通过将1μl样品稀释到10μl芥子酸(在0.05％三氟乙酸，50％乙腈中是10mg/ml)中，对产物进行质谱分析。将得到的溶液(1μl)点样到MALDI样品板上。使样品干燥，然后用配备氮激光(337nm，3ns脉冲)的Voyager DE-RP飞行时间质谱仪分析。采用了正离子/线性模式，加速电压是25kV。通过累积来自约200次激光发射的数据产生每个质谱。用已知分子量的纯化蛋白完成外部质量校准(图49D)。然后将产物在-80℃下储存。

哺乳动物Fc-L10-OSK1制备物的产率是来自6L的115mg，通过SDS-PAGE判断纯度＞90％；通过SEC-HPLC判断Fc-L10-OSK1是预期的二聚体，通过MS判断质量具有预期范围。

纯化的Fc-L10-OSK1阻断人Kv1.3和人Kv1.1的活性描述于下文实施例43。

Fc-L10-OSK1(K7S)、Fc-L10-OSK1(E16K，K20D)和Fc- L10-OSK1(K7S，E16K，K20D)的纯化。由转染的HEK-293调节的约500mL培养基(参见上文实施例41)与65％的MAb选择树脂(1.5ml)(GE Healthcare)和500μl 20％NaN₃浆液混合。然后4℃下将浆液轻柔搅拌3天，然后4℃下不采用制动器的条件下以1000g离心5分钟。然后吸出大部分上清液，沉淀中剩余的浆液转移到14ml锥形试管中，与12ml不含二价阳离子的Dulbecco磷酸缓冲液(PBS)混合。4℃下采用低制动器以2000g将浆液离心1分钟，吸出上清液。PBS洗涤循环重复额外的3次。然后通过加入1ml 100mM甘氨酸pH 3.0洗脱结合的蛋白，室温下轻柔搅拌5分钟。然后4℃下采用低制动器以2000g将浆液离心1分钟，吸出上清液作为第一洗脱液。洗脱循环再重复2次，将所有3份上清液合并成单个合并物。将醋酸钠(37.5μl 3M溶液)加入洗脱合并物，以提高pH，然后采用10kDa SlideAlyzer(Pierce)，用10mM醋酸，5％山梨糖醇，pH 5.0室温下渗析2小时。更换渗析缓冲液，渗析在4℃下持续过夜。然后使渗析的材料通过0.22μm醋酸纤维素滤膜注射器滤器过滤。用计算分子量30,330g/mol和消光系数35,410M^-1cm^-1确定过滤的材料的浓度是1.27mg/ml(图50A)。然后用考马斯亮蓝染色的tris-甘氨酸4-20％SDS-PAGE评估过滤的材料的纯度(图50B)。然后用Charles River Laboratories Endosafe-PTS系统(0.05-5EU/ml灵敏度)，采用样品在Charles RiversLaboratories内毒素特异性缓冲液中的25倍稀释液确定内毒素水平，得到＜1EU/mg蛋白的结果。然后用大小排阻色谱确定50μg产物的大分子状态，该产物在50mM NaH₂PO₄，250mM NaCl，pH 6.9中以1ml/min注射到Phenomenex BioSep SEC 3000柱(7.8×300mm)上，在280nm观察吸光度(图50C)。通过将1μl样品稀释到10μl芥子酸(在0.05％三氟乙酸，50％乙腈中是10mg/ml)中，对产物进行质谱分析。将得到的溶液(1μl)点样到MALDI样品板上。使样品干燥，然后用配备氮激光(337nm，3ns脉冲)的Voyager DE-RP飞行时间质谱仪分析。采用了正离子/线性模式，加速电压是25kV。通过累积来自约200次激光发射的数据产生每个质谱。用已知分子量的纯化蛋白完成外部质量校准(图50D)。然后将产物在-80℃下储存。

图51A-D显示纯化和分析Fc-L10-OsK1(E16K，K20D)的结果，其采用与Fc-L10-OsK1(K7S)分子(上文所述)相同的方案，只是有以下例外：用计算分子量30,357g/mol和计算的消光系数35,410确定浓度是1.59mg/ml；用32倍稀释液确定致热原水平＜1EU/mg。

图52A-D显示纯化和分析Fc-L10-OsK1(K7S，E16K，K20D)的结果，其也采用与Fc-L10-OsK1(K7S)分子(上文所述)相同的方案，只是有以下例外：用计算分子量30,316g/mol和计算的消光系数35,410确定浓度是0.81mg/ml；用16倍稀释液确定致热原水平＜1EU/mg。

纯化的Fc-L10-OSK1[K7S]、Fc-L10-OSK1[E16K，K20D]和Fc-L10-OSK1[K7S，E16K，K20D]阻断人Kv1.3和人Kv1.1的活性描述于下文实施例43。

                     实施例43

          OSK1和OSK1肽抗体类似物的电生理

合成亚洲蝎Orthochirus scrobiculosus毒液的38个残基的肽毒素(OSK1)(参见实施例41)，以评估其对人Kv1.1和Kv1.3通道的影响，Kv1.1和Kv1.3是钾通道家族的亚型。采用HEK293细胞表达系统和电生理评估合成OSK1抑制人Kv1.1和Kv1.3通道的效力和选择性(图53)。稳定表达的Kv1.3通道的全细胞膜片钳记录发现，与Kv1.1相比，合成OSK1肽更有效抑制人Kv1.3(表33)。

OSK1肽毒素与抗体融合，以产生OSK1肽抗体。为了改进OSK1肽毒素的血浆半衰期，并且防止其穿透CNS，按照本文实施例41的描述通过链长为10个氨基酸残基的接头使OSK1肽毒素与人抗体IgG1的Fc片段融合(Fc-L10-OSK1)。与合成OSK1肽相比，该融合使得Kv1.3的效力减少5倍。但是，与单独的合成肽(4倍)相比，其使OSK1对Kv1.1的选择性显著改进了210倍(表33和图54)。

OSK1-肽抗体(Fc-L10-OSK1)的修饰。OSK1与统称为α-KTx3的蝎毒素的其它成员具有60-80％序列同源性。OSK1和α-KTx3家族的其它成员的序列比对发现第12、16、20和36位的4个独特的结构差异。推测OSK1的这些结构差异在抗其它钾通道的多种活性中起重要作用，这在α-KTx3家族的其它成员中没有观察到。因此，将OSK1序列内的第16和20位的两个氨基酸残基恢复为更保守的氨基酸残基，以评估它们对针对诸如Kv1.1的其它钾通道的选择性的影响，Kv1.1主要存在于CNS中作为与Kv1.2的异四聚体。通过分别用保守的赖氨酸和天冬氨酸取代第16位的谷氨酸和第20位的赖氨酸(即Fc-L10-OSK1[E16K，K20D])，当与Fc-L10-OSK1相比时，我们没有观察到效力的显著改变(1.3倍差异；图56和表33)。但是，这种双突变除去了对Kv1.1的阻断活性。Kv1.1/Kv1.3的选择性比是403倍，这相对于Fc-L10-OSK1的选择性比(210倍)是显著的改进。当与Fc-L10-OSK1相比时，第7位从赖氨酸到丝氨酸的单氨基酸突变(Fc-L10-OSK1[K7S])分别使效力产生了2和1.3倍的微小改变(图55和表33)。当所有三个残基都突变以产生Fc-L10-OSK1[K7S，E16K，K20D]时，效力和选择性都有显著减少(图57和表33)。

如表33中的结果所证明的，我们通过将OSK1肽毒素与人抗体gG1的Fc片段融合，显著改进了对Kv1.1的选择性，但减少了对Kv1.3的靶效力。当关键位置的两个残基恢复为α-KTx3家族其它成员中存在的保守残基时，对Kv1.1的选择性进一步改进。

表33显示OSK1和OSK1类似物对hKv1.3和hKv1.1通道的IC50值的概括。所有的类似物是基于它们对hKv1.3的效力排序。表中也示出了所有OSK1类似物的hKv1.1/hKv1.3选择性比。

化合物	hKv1.3：IC50[pM]	hKv1.1：IC50[pM]	hKv1.1/hKv1.3
				合成的OSK1	39	160	4
Fc-L10-OSK1	198	41600	210
				Fc-L10-OSK1[E16K，K20D]	248	100000	403
Fc-L10-OSK1[K7S]	372	100000	269
				Fc-L10-OSK1[K7S，E16K，K20D]	812	10000	12

                    实施例44

    PEG-ShK[1-35]分子在大鼠中的药代动力学研究

在Spraque Dawley大鼠中确定大约24-kDa的20K PEG-ShK[1-35]分子和约4-kDa的天然小ShK肽的静脉内(IV)药代动力学曲线。天然ShK肽和我们的新20K PEG-ShK[1-35]分子的IV剂量是1mg/kg。该剂量代表等摩尔量的这两种分子。大鼠的平均体重是大约0.3kg，每个剂量和分子采用两只大鼠。在IV注射后的多个时间，取血，并且收集约0.1ml血清。在-80℃下冷冻储存血清样品直到分析。

用于电生理的测定板制备。冷冻状态下获取来自药代动力学研究的含有20K PEG-ShK[1-35]分子或天然ShK肽的大鼠血清样品。实验前，室温下使每个样品解冻，将一等份(70-80μl)转移到96孔聚丙烯板的孔中。为了制备测定板，从药代动力学血清样品制备一些稀释液，得到测试溶液。来自药代动力学研究的血清样品的稀释是在10％磷酸缓冲液(PBS，含有Ca²⁺和Mg²⁺)中。为了测定我们的新20K PEG-ShK[1-35]分子在来自药代动力学研究的血清样品中的量，测试溶液中的最终血清浓度是90％、30％、10％、3.3％和1.1％。也在测定板中制备纯化的20K PEG-Shk[1-35]标准抑制曲线。为此，在90％、30％、10％、3.3％或1.1％的大鼠血清中制备纯化的20K PEG-ShK[1-35]分子(标准物)的8个点的系列稀释液，标准物的终浓度是50、16.7、5.5、1.85、0.62、0.21、0.068和0.023nM。

用于电生理的细胞制备。在实验前2天，将稳定表达电压激活的K⁺通道K_v1.3的CHO细胞铺板在T-175组织培养烧瓶中(以5×10⁶的密度)，使其生长到约95％汇合。在即将开始实验前，用PBS洗涤细胞，然后用胰蛋白酶(0.25％)和维尔烯(1∶5000)的2ml混合物37℃下使其脱离(3分钟)。随后，将细胞重悬于烧瓶中的10ml含有10％FBS、1x NEAA和750μg/ml G418的组织培养基(含有Glutamax的HAM’s F-12，InVitrogen，Cat#31765)中，以约1000rpm离心1分钟。以3-5×10⁶个细胞/ml将得到的细胞沉淀重悬于PBS中。IonWorks电生理和数据分析。用自动化电生理系统IonWorks Quattro研究血清中的测试溶液或标准物抑制CHO-K_v1.3细胞中的K⁺电流的能力。将重悬的细胞、测定板、群体膜片钳(PPC)膜片板和合适的细胞内(90mMK-葡糖酸盐，20mMKF，2mM NaCl，1mM MgCl2，10mM EGTA，10mMHEPES，pH 7.35)和细胞外(PBS，含有Ca²⁺和Mg²⁺)缓冲液置于IonWorksQuattro上。用基于两性霉素的多孔膜片钳方法从CHO-K_v1.3细胞得到电生理读数。采用IonWorks Quattro的电压钳制电路，使细胞保持在-80mV的膜电位，通过使膜电位步进到+30mV维持400ms，激发电压激活的K⁺电流。在对照条件下，即在实验开始时不存在抑制剂的条件下，和在测试溶液或标准物存在下温育10分钟后，激发K⁺电流。测量出平均K⁺电流振幅是430-440ms，并且将数据输出到Microsoft Excel表格软件。每个浓度的测试溶液或标准物存在下K⁺电流的振幅表示为相同孔中对照条件下K⁺电流的百分比。

针对各个大鼠水清水平的每个标准物生成标准抑制曲线，表示为对照电流的百分比(POC)对nM浓度的对数作图。对照的百分比(POC)与抑制成反比，其中100POC是无抑制，0POC是100％抑制。用曲线选定区域的线性回归推导能够计算测试溶液中的药物浓度的公式。仅仅用标准曲线的线性部分内的电流值计算测试溶液中的药物浓度。当计算药物水平时，总是将给定血清水平的相应标准物曲线与测试溶液的相同血清水平进行比较。ShK和20K PEG-ShK[1-35]的标准曲线分别示于图58A和图58B，每个图都包含给定血清百分比时每种标准物的线性回归公式。对于20K PEG-ShK[1-35]标准曲线，标准曲线的线性部分是20POC-70POC，仅仅用落入该范围的得自测试溶液的电流值计算测试溶液中的药物浓度。

IV注射后我们的新20K PEG ShK[1-35]分子的药代动力学曲线示于图59。从该曲线估计该分子的终末半衰期(t_1/2b)是6-12小时。超过48小时后，药物水平落在标准曲线的线性范围外，并且没有计算。我们的新20K PEG-ShK[1-35]分子的计算的6-12小时半衰期显著长于早期由C.Beeton等人[C.Beeton et al.(2001)Proc.Natl Acad.Sci.98，13942-13947]报道的天然ShK分子的大约0.33小时(或20分钟)的半衰期，并且是治疗分子的需要特征。IV注射等摩尔的ShK与20K PEG-ShK[1-35]后，Kv1.3抑制剂的相对水平的比较示于图60。从该图可以看出，在检验5％血清测试溶液时，20K PEG-ShK[1-35]分子显示出超过24小时的显著Kv1.3电流抑制(＜70POC)，而天然ShK肽仅仅在第1小时显示显著的Kv1.3电流抑制水平，超过1小时后，没有显示显著阻断。这些数据再次证明20K PEG ShK[1-35]作为治疗自身免疫疾病的治疗剂的需要的特征。

                    实施例45

聚乙二醇化的毒素肽抑制动物模型中的严重自身免疫性脑脊髓炎

Kv1.3的20KPEG-ShK抑制剂显示出抑制大鼠中的严重自身免疫性脑脊髓炎的效力改进。采用以前描述的[C.Beeton et al.(2001)J.Immunol.166，936]多发性硬化的过继转移实验自身免疫性脑脊髓炎(AT-EAE)模型，我们检验了我们的新20KPEG-ShK分子的体内活性，并且将其效力与单独的ShK毒素肽的活性进行比较。研究设计示于图61。该体内研究的结果提供于图62和图63。第1-3天以每日10μg/kg皮下送递(SC)的20KPEG-ShK分子显著减少疾病严重程度，并且增加存活，而用等摩尔剂量(10μg/kg)的小ShK肽处理的动物发生严重疾病并且死亡。

从Bachem Bioscience公司购买35个氨基酸的毒素肽ShK(Stichodactyla helianthus神经毒素)，通过电生理证实有效阻断Kv1.3(参见本文实施例36)。按照上文的描述进行20KPEG ShK分子的合成、聚乙二醇化和纯化。对髓磷脂碱性蛋白(MBP)具有特异性的脑脊髓来源的CD4+大鼠T细胞系PAS获自Evelyne Beraud博士。这些细胞的体外维持和它们在AT-EAE模型中的使用以前已经有过描述[C.Beeton et al.(2001)PNAS 98，13942]。通过用MBP和刺激的胸腺细胞(2天)进行交替的抗原刺激或激活循环，体外维持PAS T细胞，并且用T细胞生长因子增殖(5天)。PAS T细胞(3×10⁵/ml)的激活包括用10μg/ml MBP和15×10⁶/ml同基因的辐射的(3500rad)胸腺细胞温育细胞2天。在体外激活后第2天，通过尾静脉内注射，将10-15×10⁶个存活的PAS T细胞注射到6-12周龄的雌性Lewis大鼠(Charles RiverLaboratories)中。第1-3天，给予运载体(PBS中的2％Lewis大鼠血清)、20KPEG-ShK或ShK(图61)，其中第1天代表注射PAS T细胞(第0天)前1天。在运载体处理的大鼠中，注射PAS T细胞后4-5天发生急性EAE(图62)。通过第4天眶后取血和通过第8天(研究结束时)心脏穿刺，收集血清，用于分析抑制剂水平。在第1、4、6和8天对大鼠称重。从细胞转移当天(第0天)-第3天，每日一次对动物进行评分，第4天-第8天，每日评分两次。将临床体征评估为每个肢体和尾的局部麻痹程度。临床评分：0＝无体征，0.5＝末梢尾无力，1.0＝尾无力，2.0＝轻度瘫痪，共济失调，3.0＝中度瘫痪，3.5＝一条后腿瘫痪，4.0＝后腿完全瘫痪，5.0＝后腿完全瘫痪和失禁，5.5＝四肢瘫痪，6.0＝垂死或死亡。对达到5.5分的大鼠实施安乐死。

在EAE开始前用Kv1.3阻断剂PEG-ShK处理大鼠，以剂量依赖性方式导致疾病发病延迟，抑制疾病进展，并且防止死亡(图62)。用单独的运载体、10μg/kg ShK或1μg/kg PEG-ShK处理的大鼠的起病是在第4天观察到，而用10μg/kg PEG-ShK或100μg/kg PEG-ShK处理的大鼠是在第4.5天观察到。此外，用单独的运载体、10μg/kg ShK或1μg/kg PEG-ShK处理的大鼠在研究结束时发生严重疾病，EAE评分为5.5或以上。相反，用10μg/kg PEG-ShK或100μg/kg PEG-ShK处理的大鼠达到了平均＜2的峰值临床严重程度评分，并且除了一只大鼠外，所有大鼠存活到研究结束时。此外，我们发现大鼠体重与疾病严重程度相关(图63)。用单独的运载体、10μg/kg ShK或1ug/kg PEG-ShK处理的大鼠分别减少了平均31g、30g和30g，而用10μg/kg PEG-ShK或100μg/kg PEG-ShK处理的大鼠分别减少了18g和11g。后两组的大鼠看起来在研究结束时体重也增加，这是恢复的体征。应该注意到用10μg/kg ShK和10μg/kg PEG-ShK处理的大鼠接受等摩尔量的ShK肽。PEG-ShK分子相对于未缀合的ShK的效力显著更高，很可能是由于PEG-ShK分子更强的稳定性和更长的体内半衰期(参见实施例44)。

                    实施例46

    包含Kv1.3拮抗剂肽的组合物阻断人全血中的炎症

检验Kv1.3拮抗剂对IL-2和IFN-g分泌的影响的离体测定。人全血是用肝素真空容器获自健康的未服药的供体。DMEM完全培养基是含有0.1％人白蛋白(Bayer#68471)，55μM 2-巯基乙醇(Gibco)和1X Pen-Strep-Gln(PSG，Gibco，Cat#10378-016)的Iscoves DMEM(含有L-谷氨酰胺和25mM Hepes缓冲液)。毒胡萝卜素获自AlomoneLabs(以色列)。用DMEM完全培养基将毒胡萝卜素在100％DMSO中的10mM储液稀释为40μM，4X溶液，提供用于钙动员的4X毒胡萝卜素刺激物。Kv1.3抑制剂肽ShK(Stichodacytla helianthus毒素，Cat#H2358)和BKCa1抑制剂肽IbTx(伊比利亚蝎毒素，Cat#H9940)购自Bachem Biosciences，而Kv1.1抑制剂肽DTX-k(树眼镜蛇毒素-K)购自Alomone Labs(以色列)。按照本文实施例4和实施例39的描述获得Kv1.3的CHO来源的Fc-L10-ShK[2-35]肽抗体抑制剂。钙依赖磷酸酶抑制剂环孢菌素A获自Amgen样品库，但也可以从多个销售商购买。在DMEM完全培养基中以4X终浓度制备抑制剂的3倍系列稀释液，将每种各50μl加入96孔Falcon 3075平底微量滴定板的孔中。而微量滴定板的1-5和7-11列含有抑制剂(每行含有独立的抑制剂稀释系列)，将50μl单独的DMEM完全培养基加入第6列的8个孔中，将100μl单独的DMEM完全培养基加入第12列的8个孔。为了开始实验，将100μl全血加入微量滴定板的每个孔。然后将平板在37℃，5％CO₂温育1小时。1小时后，取出平板，将50μl 4X毒胡萝卜素刺激物(40μM)加入平板的每个孔，第12列的8个孔除外。将平板在37℃，5％CO₂放置48小时。为了确定全血中分泌的IL-2和IFN-g的量，将来自96孔板的每个孔的100μl上清液(条件培养基)转移到储存板上。为了对细胞因子的产生进行MSD电化学发光分析，将20μl上清液(条件培养基)加入MSD Multi-Spot Custom包被的板(www.meso-scale.com)。这些板上的工作电极提前用四种捕获抗体(hIL-5，hIL-2，hIFNg和hIL-4)包被。在MSD板上加入20μl条件培养基后，在每孔中加入150μl检测抗体鸡尾酒和P4缓冲液。150μl鸡尾酒含有各1μg/ml的20ul四种检测抗体(hIL-5，hIL-2，hIFNg和hIL-4)和130ul 2X P4缓冲液。覆盖平板，放置在振荡的平台上过夜(黑暗中)。第二天早晨，在MSD Sector成像仪上对平板读数。由于每个板的第6列中的8个孔仅仅接受毒胡萝卜素刺激而没有抑制剂，用平均MSD反应来计算平板的“高”值。平板的计算的“低”值来源于第12列的8个孔中的平均MSD反应，其中不含毒胡萝卜素刺激物和抑制剂。对照的百分比(POC)是相对于未刺激与刺激的对照的反应的测量值，其中100PCO相当于单独的毒胡萝卜素刺激物的平均反应或“高”值。因此，100POC代表反应的0％抑制。相反，0POC代表反应的100％抑制，并且相当于没有给予刺激物时的反应或“低”值。为了计算对照的百分比(POC)，采用以下公式：[(MSD孔的反应)-(“低”)]/[(“高”)-(“低”)]×100。在从抑制曲线(IC)进行曲线拟合后，计算全血中分子的效力，用标准曲线拟合软件推导IC50。尽管我们在此描述了用高通量MSD电化学发光测定测量细胞因子的产生，本领域技术人员可以容易预见到较低通量的ELISA测定可以相同地用于测量细胞因子产生。

证明Kv1.3抑制剂阻断CD40L和IL-2R的细胞表面激活的离体测 定。人全血是用肝素真空容器获自健康的未服药的供体。DMEM完全培养基是含有0.1％人白蛋白(Bayer#68471)，55μM 2-巯基乙醇(Gibco)和1X Pen-Strep-Gln(PSG，Gibco，Cat#10378-016)的Iscoves DMEM(含有L-谷氨酰胺和25mM Hepes缓冲液)。毒胡萝卜素获自Alomone Labs(以色列)。用DMEM完全培养基将毒胡萝卜素在100％DMSO中的10mM储液稀释为40μM，4X溶液，提供用于钙动员的4X毒胡萝卜素刺激物。Kv1.3抑制剂肽ShK(Stichodacytlahelianthus毒素，Cat#H2358)和BKCal抑制剂肽IbTx(伊比利亚蝎毒素，Cat#H9940)购自Bachem Biosciences，而Kv1.1抑制剂肽DTX-k(树眼镜蛇毒素-K)购自Alomone Labs(以色列)。按照本文实施例4和实施例39的描述获得Kv1.3的CHO来源的Fc-L10-ShK[2-35]肽抗体抑制剂。钙依赖磷酸酶抑制剂环孢菌素A获自Amgen样品库，但也可以从多个销售商购买。将离子通道抑制剂ShK、IbTx或DTK-k稀释到DMEM完全培养基中，达到需要的终浓度(终浓度＝50或100nM)的4倍。钙依赖磷酸酶抑制剂环孢菌素A也稀释到DMEM完全培养基中，达到需要的终浓度(终浓度＝10μM)的4倍。在96孔Falcon3075平底微量滴定板的合适的孔中加入50μl DMEM完全培养基或4X抑制剂溶液。然后，加入100μl人全血，将平板在37℃，5％CO₂温育1小时。1小时后，取出平板，将50μl 4X毒胡萝卜素刺激物(40μM)加入平板的所有含有抑制剂的孔。在一些不含抑制剂但仅仅含有DMEM完全培养基的孔中加入毒胡萝卜素，而仅仅含有DMEM完全培养基的其它孔加入额外的50μl DMEM培养基。不含抑制剂并且不含毒胡萝卜素刺激物的孔代表未处理的“低”对照。不含抑制剂但接受毒胡萝卜素刺激物的孔代表最大刺激的对照或“高”对照。将平板放回37℃，5％CO₂持续24小时。24小时后，取出平板，对孔进行处理，以进行FACS分析。从孔中取出细胞，用染色缓冲液(含有2％热灭活的胎牛血清的磷酸缓冲液)洗涤。按照制造商的指导，用含有1.5％甲醛的BD FACS裂解溶液(BD Biosciences)裂解红细胞。细胞以每试管每100微升染色缓冲液1百万个细胞的浓度分布。首先用1微升生物素标记的抗人CD40对细胞进行染色，洗涤，然后同时用链霉亲和素-APC、FITC标记的抗人CD45RA和藻红素(PE)标记的抗人CD25(IL-2Ra)或PE标记的抗人CD40L各1微升进行染色。在加入抗体的步骤之间用染色缓冲液洗涤细胞。所有抗体都获自BD Biosciences(San Diego，CA)。在BectonDickinson FACSCaliber(Mountain View，CA)流式细胞仪上收集每个样品的2-5万个活事件，用FlowJo软件(Tree StarInc.San Carlos，CA)进行分析。基于正向和侧向散射特性，从分析中排除死细胞、单核细胞和粒细胞。

图64和图67证明Kv1.3抑制剂ShK和Fc-L10-ShK[2-35]有效阻断人全血中的IL-2分泌，并且抑制CD4+T细胞上的IL-2R激活。Kv1.3抑制剂Fc-L10-ShK[2-35]在人全血中阻断IL-2产生的效力比环孢霉素A高200倍以上(图64)，这是通过IC50反映出来的。图65显示Kv1.3抑制剂也有效阻断人全血中的IFNg分泌，图66证明T细胞上CD40L的上调也额外被阻断。图64-67中的数据表明Fc-L10-ShK[2-35]分子37℃下在全血中保持稳定高达48小时，提供了炎症反应的有效阻断。认为靶定Kv1.3的并且具有延长的半衰期的毒素肽治疗剂随时间提供这些体内反应的持续阻断。相反，尽管Kv1.3抑制剂肽ShK也显示在全血中的有效阻断，ShK肽具有短(约20分钟)的体内半衰期(C.Beeton et al.(2001)Proc.Natl.Acad.Sci.98，13942)，因此不能提供延长的阻断。全血代表预测动物中的反应的生理相关测定。本文描述的全血测定也可以用作药代动力学(PD)测定，以测量对患者给药后的靶范围和药物暴露。这些人全血数据支持本发明的组合物用于治疗多种免疫病症的治疗用途，例如多发性硬化、1型糖尿病、牛皮癣、炎性肠病、接触介导的皮炎、类风湿关节炎、牛皮癣关节炎、哮喘、过敏、再狭窄、系统性硬化、纤维化、硬皮病、肾小球肾炎、干燥综合征、炎症性骨重吸收、移植物排斥、移植物抗宿主疾病和狼疮。

                       实施例47

                  聚乙二醇化的肽抗体

作为举例，通过以下方法制备本发明的聚乙二醇化的肽抗体。用38mg PEG醛(MW 20kDa；3x，批号104086)处理19.2ml A5S，20mMNaBH₃CN，pH 5中的CHO表达的FcL10-OsK1(19.2mg；MW 30,371Da，0.63微摩尔)。在冷室中搅拌密封的反应混合物过夜。采用Superose6HR 10/30柱(Amersham Pharmacia Biotech)，通过SEC HPLC监测反应过程中蛋白修饰的程度，所述柱子用0.05M磷酸缓冲液，0.5M NaCl，pH 7.0，以0.4ml/min洗脱。用A5S，pH 5将反应混合物渗析过夜。然后将渗析的材料加入SP HP FPLC柱(16/10)中的A5S pH 5中，用1MNaCl梯度洗脱。通过SEC HPLC分析收集的级分，合并成三份合并物，交换到DPBS中，浓缩并且进行功能测试(表34)。

在另一实例中，用44mg PEG醛(MW 20kDa；4x，批号104086)处理16.5ml A5S，20mM NaBH₃CN，pH 5中的FcL10-ShK1(16.5mg；MW 30,065Da，0.55微摩尔)。采用Superose 6HR 10/30柱(AmershamPharmacia Biotech)，通过SEC HPLC监测反应过程中蛋白修饰的程度，所述柱子用0.05M磷酸缓冲液，0.5M NaCl，pH 7.0，以0.4ml/min洗脱。用A5S，pH 5将反应混合物渗析过夜。然后将渗析的材料加入SP HPFPLC柱(16/10)中的A5S pH 5中，用1M NaCl梯度洗脱。通过SECHPLC分析收集的级分，合并成三份合并物，交换到DPBS中，浓缩并且进行功能测试(表34)。

表34中的数据证明聚乙二醇化的肽抗体分子作为Kv1.3抑制剂的效力。

表34显示如上文实施例36的描述，用HEK细胞，通过全细胞膜片钳电生理进行的IC50测定。持续的IC50由-80mV到+30mV的电压坡度后400毫秒的电流得到。2号合并物样品包含二聚乙二醇化的肽抗体，3号合并物样品包含单聚乙二醇化的肽抗体。

聚乙二醇化的肽抗体	合并物#	持续的IC50(nM)
			PEG-Fc-L10-SHK(2-35)	3	0.175(n＝4)
PEG-Fc-L10-SHK(2-35)	2	0.158(n＝4)
			PEG-Fc-L10-OSK1	3	0.256(n＝3)
PEG-Fc-L10-OSK1	2	0.332(n＝3)

                   实施例48

               聚乙二醇化的毒素肽

Shk和Osk-1聚乙二醇化、纯化和分析。通过在N末端还原烷基化，对合成的Shk或OSK1-1毒素肽进行选择性聚乙二醇化。采用50mMNaH₂PO₄，pH 4.5反应缓冲液中的2mg/ml的Shk或OSK-1毒素肽和2摩尔过量的20kDa单甲氧基-PEG-醛(Nektar Therapeutics，Huntsville，AL)完成缀合，所述缓冲液含有20mM氰基硼氰化钠。室温下将缀合反应搅拌过夜，通过RP-HPLC监测它们的过程。通过20mMNaOAc，pH 4的4倍稀释，猝灭完成的反应，调节到pH 3.5，冷却到4℃。然后4℃下通过色谱纯化PEG-肽；其中采用SP Sepharose HP柱(GEHealthcare，Piscataway，NJ)，该柱子用20mM NaOAc，pH 4.0中的线性0-1M NaCl梯度洗脱(图68A和图68B)。通过SDS-PAGE和RP-HPLC分析洗脱的峰级分，通过＞97％的纯度确定合并。观察到的主要污染物是二-聚乙二醇化的毒素肽和未修饰的毒素肽。通过用3kDaMWCO膜离心过滤，并且渗析到含有5％山梨糖醇的10mM NaOAc，pH4中，将选择的合并物浓缩到2-5mg/ml。然后通过0.2微米的滤器无菌过滤渗析的合并物，通过SDS-PAGE和RP-HPLC确定纯度＞97％(图69A和图69B)。在Agilent 1100型HPLC中，Zorbax 5μm 300SB-C8 4.6×50mm柱(Phenomenex)上以1ml/min流动的0.1％TFA/H₂O中进行反相HPLC，柱温保持在40℃。在线性6-60％梯度中注射并洗脱PEG-肽的样品(20μg)，同时在215nm和280nm监测波长。

通过完整细胞上的膜片钳进行的电生理(参见实施例36)得到的峰值IC50对于PEG-OSK1是1.285nM，对于PEG-ShK[1-35]是0.169nM(图74)，它们以浓度依赖性方式阻断从稳定表达人Kv1.3通道的HEK293细胞记录的外向钾电流。纯化的PEG-ShK[1-35]分子也称作“20K PEG-ShK[1-35]”和“PEG-ShK”，它们比小ShK肽具有长得多的体内半衰期(图59和图60)。PEG-ShK[1-35]抑制大鼠中的严重自身免疫性脑脊髓炎(实施例45，图61-63)，并且表现出比小的天然ShK肽更强的效力。

                     实施例49

              ShK和OSK1毒素肽的Fc环插入

如图70、图71、图72和图73所示，根据Gegg et al.Modified Fcmolecules，WO 2006/036834 A2[PCT/US2005/034273])中实施例1公开的方法，将二硫键限制的毒素肽插入确定为序列D₁₃₇E₁₃₈L₁₃₉T₁₄₀K₁₄₁的人IgG1Fc-环结构域。使示例的Fc环-L2-OsK1-L2、Fc环-L2-ShK-L2、Fc环-L2-ShK-L4和Fc环-L4-OsK1-L2具有三个连接的结构域。收集、纯化，并且进行功能测试。

这些实例的肽插入是在Fc残基Leu₁₃₉和Thr₁₄₀之间，并且包括2-4个Gly残基作为侧翼于插入的肽任意一侧的接头。但是，人IgG1 Fc序列的替代插入位点，或不同的接头，也可以用于实施本发明，如本领域公知的那些，如Gegg et al.Modified Fc molecules，WO 2006/036834A2[PCT/US2005/034273])实施例13中的描述。

                       实施例50

               从大肠杆菌纯化ShK(2-35)-L-Fc

将按照上文实施例16的描述获得的冷冻的大肠杆菌糊(117g)与室温下的1200ml 50mM tris HCl，5mM EDTA，pH 7.5混合，并且加入约0.1mg/ml的鸡蛋清溶菌酶。12,000PSI下使悬浮的糊通过冷微流化床两次。然后4℃下以17,700g将细胞裂解物离心30分钟。然后用组织研磨器将沉淀重悬于1200ml1％脱氧胆酸中，然后4℃下以17,700g离心30分钟。然后用组织研磨器将沉淀重悬于1200ml水中，然后4℃下以17,700g离心30分钟。然后将6.4g沉淀(总共14.2g)溶解于128ml8M盐酸胍，50mM tris HCl，pH 8.0中。然后37℃下用0.67ml 1M DTT将120ml沉淀溶液温育60分钟。4℃下剧烈搅拌下以2ml/min将还原的材料转移到5500ml重折叠缓冲液(3M脲，50mM tris，160mM盐酸精氨酸，2.5mM EDTA，2.5mM盐酸胱胺，4mM半胱氨酸，pH 9.5)中。然后降低搅拌速度，4℃下继续温育3天。

用5.5L水稀释重折叠物，用醋酸将pH调节到8.0，然后通过0.22μm的醋酸纤维素滤膜过滤溶液，8℃下在Q-缓冲液A(20mM Tris，pH8.5)中以10ml/min加入35ml Amersham Q Sepharose-FF(2.6cm内径)柱，其带有内嵌的35ml Amersham Mab选择柱(2.6cm内径)。加样后，从循环中去除Q Sepharose柱，其余的色谱在Mab选择柱上进行。用数倍柱体积的Q-缓冲液A洗涤柱子，然后用达到100mM甘氨酸pH 3.0的步骤洗脱。合并含有需要的产物的级分，立即8℃下在S缓冲液A(10mM NaH₂PO₄，pH 7.0)中以5.0ml/min加入5.0ml AmershamSP-Sepharose HP柱。然后用数倍柱体积的S-缓冲液A，然后用5％-60％S-缓冲液B(10mM NaH₂PO₄，1M NaCl，pH 7.0)的线性梯度，随后用达到100％S-缓冲液B的步骤洗涤柱子。然后用考马斯亮蓝染色的tris-甘氨酸4-20％SDS-PAGE分析级分。合并含有大量需要的产物的级分，然后8℃下在MEP缓冲液A(20mM tris，200mM NaCl，pH 8.0)中以10ml/min加入50ml MEP Hypercel柱(2.6cm内径)。用5％-50％MEP缓冲液B(50mM柠檬酸钠pH4.0)的线性梯度，随后用达到100％MEP缓冲液B的步骤洗脱。然后用考马斯亮蓝染色的tris-甘氨酸4-20％SDS-PAGE分析级分，合并含有大量需要的产物的级分。

然后用具有10kDa膜的Pall Jumbo-Sep，将MEP合并物浓度至约10ml。然后用Hewlett Packard 8453分光光度计对稀释于700μl制剂缓冲液中的50μl混合的合并物进行光谱扫描(图76A)。用计算分子量30,253g/mol和消光系数36,900M^-1cm^-1确定材料的浓度是3.7mg/ml。然后用考马斯亮蓝染色的tris-甘氨酸4-20％SDS-PAGE评估材料的纯度(图76B)。然后用大小排阻色谱确定70μg产物的大分子状态，该产物在50mM NaH₂PO₄，250mM NaCl，pH 6.9中以1ml/min注射到Phenomenex BioSep SEC 3000柱(7.8×300mm)上，在280nm观察吸光度(图76C)。然后经RP-HPLC柱(Vydac C₄，1×150mm)，通过对大约4μg样品进行色谱，从而对产物进行质谱分析。溶剂A是0.1％的三氟乙酸水溶液，溶剂B是在90％乙腈，10％水中的0.1％三氟乙酸。以80μl/min的流速，在10％溶剂B中使柱子预平衡。用10％-90％溶剂B的线性梯度，在30分钟内洗脱蛋白。将部分洗脱液导入LCQ离子阱质谱仪。用质谱仪制造商提供的Bioworks软件对质谱解卷积(图76D)。通过0.22μm醋酸纤维素膜过滤产物，然后在-80℃储存。

在表35中，将纯化的大肠杆菌来源的ShK[2-35]-L-Fc的IC50数据与本发明组合物的一些其它实施方式进行比较。

表35.在N末端或C末端含有Fc的大肠杆菌来源的重组Fc-L-ShK[1-35]、Fc-L-ShK[2-35]、Fc-L-OSK1、Shk[1-35]-L-Fc和ShK[2-35]-L-Fc肽抗体显示出有效阻断人Kv1.3。也显示了CHO来源的Fc-L10-ShK[1-35]R1Q突变体的活性。用HEK293/Kv1.3细胞进行实施例36描述的方法进行的全细胞膜片钳电生理(WCVC)，示出的IC50是来自3个或更多个细胞的剂量反应曲线的平均值。在CHO/Kv1.3细胞上进行实施例44描述的方法进行的IonWorks^TM(IWQ)平面膜片钳电生理，示出了平均IC50。按照指出的实施例描述的方法获得本发明的分子：大肠杆菌来源的Fc-L-ShK[1-35](实施例3和实施例38)、大肠杆菌来源的Fc-L-ShK[2-35](实施例4和实施例39)、大肠杆菌Fc-L-OSK1(实施例10和实施例40)、ShK[1-35]-L-Fc(实施例15和实施例51)和ShK[2-35]-L-Fc(实施例16和本实施例50)。用类似于针对CHO来源的Fc-L10-ShK[1-35]描述的方法制备CHO来源的Fc-L10-ShK[1-35]R1Q分子。

分子	通过WCVC测量的Kv1.3IC50(nM)	通过IWQ测量的Kv1.3IC50(nM)
			大肠杆菌来源的Fc-L-ShK[1-35]	1.4
大肠杆菌来源的Fc-L-ShK[2-35]	1.3	2.8
			大肠杆菌来源的Fc-L-OSK1	3.2
大肠杆菌来源的Shk[1-35]-L-Fc		2.4
			大肠杆菌来源的ShK[2-35]-L-Fc		4.9
CHO来源的Fc-L10-ShK[1-35]R1Q		2.2

                     实施例51

           从大肠杆菌纯化Met-ShK(1-35)-Fc

将按照上文实施例15的描述获得的冷冻的大肠杆菌糊(65g)与室温下的660ml 50mM tris HCl，5mM EDTA，pH 7.5混合，并且加入约0.1mg/ml的鸡蛋清溶菌酶。12,000PSI下使悬浮的糊通过冷微流化床两次。然后4℃下以17,700g将细胞裂解物离心30分钟。然后用组织研磨器将沉淀重悬于660ml 1％脱氧胆酸中，然后4℃下以17,700g离心30分钟。然后用组织研磨器将沉淀重悬于660ml水中，然后4℃下以17,700g离心30分钟。然后将13g沉淀溶解于130ml 8M盐酸胍，50mM trisHC1，pH 8.0中。然后37℃下用0.1ml 1M DTT将10ml沉淀溶液温育60分钟。4℃下剧烈搅拌下以2ml/min将还原的材料转移到1000ml重折叠缓冲液(2M脲，50mM tris，160mM盐酸精氨酸，2.5mM EDTA，1.2mM盐酸胱胺，4mM半胱氨酸，pH 8.5)中。然后降低搅拌速度，4℃下继续温育3天。

用1L水稀释重折叠物，通过0.22μm的醋酸纤维素滤膜过滤溶液，然后8℃下在Q-缓冲液A(20mM Tris，pH 8.5)中以10ml/min加入35ml Amersham Q Sepharose-FF(2.6cm内径)柱，其带有内嵌的35mlAmersham Mab选择柱(2.6cm内径)。加样后，从循环中去除QSepharose柱，其余的色谱在Mab选择柱上进行。用数倍柱体积的Q-缓冲液A洗涤柱子，然后用达到100mM甘氨酸pH 3.0的步骤洗脱。合并含有需要的产物的级分，立即8℃下在S缓冲液A(10mMNaH₂PO₄，pH 7.0)中以5.0ml/min加入5.0ml Amersham SP-SepharoseHP柱。然后用数倍柱体积的S-缓冲液A，然后用5％-60％S-缓冲液B(10mM NaH₂PO₄，1M NaCl，pH 7.0)的线性梯度，随后用达到100％S-缓冲液B的步骤洗涤柱子。然后用考马斯亮蓝染色的tris-甘氨酸4-20％SDS-PAGE分析级分。

然后用具有10kDa膜的Pall Jumbo-Sep，将S合并物浓度至约10ml。然后用Hewlett Packard 8453分光光度计对稀释于700μl制剂缓冲液中的20μl混合的合并物进行光谱扫描(图77A)。用计算分子量30,409和消光系数36,900M^-1cm^-1确定材料的浓度是3.1mg/ml。然后用考马斯亮蓝染色的tris-甘氨酸4-20％SDS-PAGE评估材料的纯度(图77B)。然后用大小排阻色谱确定93μg产物的大分子状态，该产物在50mM NaH₂PO₄，250mM NaCl，pH 6.9中以1ml/min注射到PhenomenexBioSep SEC 3000柱(7.8×300mm)上，在280nm观察吸光度(图77C)。然后通过MALDI质谱对产物进行质谱分析。将样品的等分物与MALDI基质芥子酸一起点样在样品板上。用配备氮激光(337nm，3ns脉冲)的Voyager DE-RP飞行时间质谱仪收集质谱。采用了正离子/线性模式，加速电压是25kV。通过累积来自约200次激光发射的数据产生每个质谱(图77D)。用已知分子量的纯化蛋白完成外部质量校准。

纯化的大肠杆菌来源的Met-ShK(1-35)-Fc也称作“ShK[1-35]-L-Fc”，其阻断人Kv1.3的IC₅₀示于上文表35。

                      实施例53

           Kv1.3的OsK1-L-Fc抑制剂的细菌表达

用于在细菌中克隆和表达肽抗体的方法描述于实施例3。使用的载体是pAMG21amgR-pep-Fc，用下文列出的寡聚物制备用于在细菌中克隆和表达OsK1-L-Fc的双链体(如下)。

用于形成双链体的寡聚物如下所示：

GGGTGTTATCATCAACGTTAAATGCAAAATCTCCCGTCAGTGCCTG

GAACCGTGCAAAAAAGCTGGTATGCGT //SEQ ID NO：1347；

TTCGGTAAATGCATGAACGGTAAATGCCACTGCACCCCGAAATCTG

GTGGTGGTGGTTCT //SEQ ID NO：1348；

CACCAGAACCACCACCACCACCAGATTTCGGGGTGCAGTGGCATTT

ACCGTTCATGCATTTACCGAAACGCAT //SEQ ID NO：1349；

ACCAGCTTTTTTGCACGGTTCCAGGCACTGACGGGAGATTTTGCAT

TTAACGTTGATGATAAC //SEQ ID NO：1310；

上文的寡聚物用于形成下文所示的双链体：

    GGGTGTTATCATCAACGTTAAATGCAAAATCTCCCGTCAGTGCCTGGAACCGTGCAAAAA

  1 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 60

        CAATAGTAGTTGCAATTTACGTTTTAGAGGGCAGTCACGGACCTTGGCACGTTTTT

     G  V  I  I  N  V  K  C  K  I  S  R  Q  C  L  E  P  C  K  K  -

    AGCTGGTATGCGTTTCGGTAAATGCATGAACGGTAAATGCCACTGCACCCCGAAATCTGG

 61 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 120

    TCGACCATACGCAAAGCCATTTACGTACTTGCCATTTACGGTGACGTGGGGCTTTAGACC

     A  G  M  R  F  G  K  C  M  N  G  K  C  H  C  T  P  K  S  G  -

    TGGTGGTGGTTCT //SEQ ID NO：1350

121 ---------+------- 137

    ACCACCACCAAGACCAC    //SEQ ID NO：1352

     G  G  G  S  G    -  //SEQ ID NO：1351

肽抗体的细菌表达描述于实施例3，并且冷冻储存细菌糊。

                     实施例53

        Kv1.3的Gly-ShK(1-35)-L-Fc抑制剂的细菌表达

用于在细菌中克隆和表达肽抗体的方法描述于实施例3。使用的载体是pAMG21amgR-pep-Fc，用下文列出的寡聚物制备用于在细菌中克隆和表达Gly-ShK(1-35)-L-Fc的双链体(如下)。

用于形成双链体的寡聚物如下所示：

GGGTCGTTCTTGTATTGATACTATTCCAAAATCTCGTTGTACTGCTT

TTCAATGTAAACATTCTATGAAATATCGTCTTTCTT //SEQ ID

NO：1313；

TTTGTCGTAAAACTTGTGGTACTTGTTCTGGTGGTGGTGGTTCT

//SEQ ID NO：1314；

CACCAGAACCACCACCACCAGAACAAGTACCACAAGTTTTACGAC

AAAAAGAAAGACGATATTTCATAGAATGTTTACATTGA //SEQ ID

NO：1353；

AAAGCAGTACAACGAGATTTTGGAATAGTATCAATACAAGAACG

//SEQ ID NO：1354

上文的寡聚物用于形成下文所示的双链体：

    GGGTCGTTCTTGTATTGATACTATTCCAAAATCTCGTTGTACTGCTTTTCAATGTAAACA

  1 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 60

        GCAAGAACATAACTATGATAAGGTTTTAGAGCAACATGACGAAAAGTTACATTTGT

     G  R  S  C  I  D  T  I  P  K  S  R  C  T  A  F  Q  C  K  H  -

    TTCTATGAAATATCGTCTTTCTTTTTGTCGTAAAACTTGTGGTACTTGTTCTGGTGGTGG

 61 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 120

    AAGATACTTTATAGCAGAAAGAAAAACAGCATTTTGAACACCATGAACAAQACCACCACC

     S  M  K  Y  R  L  S  F  C  R  K  T  C  G  T  C  S  G  G  G  -

    TGGTTCT    //SEQ ID NO：1355

121 ---------+- 131

    ACCAAGACCAC  //SEQ ID NO：1357

     G  S  G    -  //SEQ ID NO：1356

肽抗体的细菌表达描述于实施例3，并且冷冻储存细菌糊。

                         缩写

在本说明书中使用的缩写的定义如下，除非在特定环境中有另外的定义。

Ac            乙酰基(用于表示乙酰化的残基)

AcBpa         乙酰化的对-苯甲酰基-L-苯丙氨酸

ADCC          抗体依赖性细胞毒性

Aib           氨基异丁酸

bA            β-丙氨酸

Bpa           对-苯甲酰基-L-苯丙氨酸

BrAc          溴乙酰基(BrCH2C(O)

BSA           牛血清白蛋白

Bzl           苄基

Cap           己酸

COPD          慢性阻塞性肺疾病

CTL           细胞毒性T淋巴细胞

DCC           二环己基碳二亚胺

Dde           1-(4，4-二甲基-2，6-二氧代-环亚己基)乙基

ESI-MS        电雾化电离质谱

Fmoc          芴基甲氧羰基

HOBt          1-羟基苯并三唑

HPLC          高效液相色谱

HSL            高丝氨酸内酯

IB             包含体

KCa            钙激活的钾通道(包括IKCa，BKCa，SKCa)

Kv             电压门控的钾通道

Lau            月桂酸

LPS            脂多糖

LYMPH          淋巴细胞

MALDI-MS       基质辅助的激光解吸电离质谱

Me             甲基

MeO            甲氧基

MHC            主要组织相容性复合物

MMP            基质金属蛋白酶

1-Nap          1-萘基丙氨酸

NEUT           中性粒细胞

Nle            正亮氨酸

NMP            N-甲基-2-吡咯烷酮

PAGE           聚丙烯酰胺凝胶电泳

PBMC           外周血单核细胞

PBS            磷酸缓冲液

Pbf            2，2，4，6，7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰基

PCR            聚合酶链反应

Pec            2-哌啶酸

PEG            聚乙二醇

pGlu           焦谷氨酸

Pic            吡啶甲酸

pY             磷酸酪氨酸

RBS            核糖体结合位点

RT             室温(25℃)

Sar            肌氨酸

SDS            十二烷基硫酸钠

STK            丝氨酸-苏氨酸激酶

t-Boc          叔-丁氧羰基

tBu            叔-丁基

THF            胸腺体液因子

Trt            三苯甲基

Claims (134)

1.式(X¹)_a-(F¹)_d-(X²)_b-(F²)_e-(X³)_c的组合物及其多聚体，其中：

F¹和F²是延长半衰期的部分，并且d和e各自独立地是0或1，前提是d和e中的至少一个是1；

X¹、X²和X³各自独立地是-(L)_f-P-(L)_g-，并且f和g各自独立地是0或1；

P是长度不超过约80个氨基酸残基的毒素肽，包含至少两个肽内二硫键；

L是接头；并且

a、b和c各自独立地是0或1，前提是a、b和c中的至少一个是1。

2.权利要求1的组合物，其具有式P-(L)_g-F¹。

3.权利要求1的组合物，其具有式F¹-(L)_f-P。

4.权利要求1的组合物，其具有式P-(L)_g-F¹-(L)_f-P。

5.权利要求1的组合物，其具有式F¹-(L)_f-P-(L)_g-F²。

6.权利要求1的组合物，其具有式F¹-(L)_f-P-(L)_g-F²-(L)_f-P。

7.权利要求1的组合物，其具有式F¹-F²-(L)_f-P。

8.权利要求1的组合物，其具有式P-(L)_g-F¹-F²。

9.权利要求1的组合物，其具有式P-(L)_g-F¹-F²-(L)_f-P。

10.权利要求1的组合物，其中F¹或F²或这两者是聚乙二醇、乙二醇的共聚物、聚丙二醇、丙二醇的共聚物、羧甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1，3-二烷、聚-1，3，6-三烷、乙烯/马来酸酐共聚物、聚氨基酸、葡聚糖n-乙烯吡咯烷酮、聚n-乙烯吡咯烷酮、丙二醇均聚物、环氧丙烷聚合物、环氧乙烷聚合物、聚氧乙烯化多元醇、聚乙烯醇、线性或支链的糖基化链、聚缩醛、长链脂肪酸、长链疏水脂族基团、免疫球蛋白Fc结构域或其部分、Fc的CH2结构域、Fc结构域环、白蛋白、白蛋白结合蛋白、运甲状腺素蛋白、或甲状腺素结合球蛋白或对长半衰期的血清蛋白具有亲和力的配体，所述配体选自肽配体和小分子配体；或任何这些成员的组合。

11.权利要求1的组合物，其中F¹或F²或这两者包含人IgG Fc结构域或其部分。

12.权利要求11的组合物，其中所述人IgG Fc结构域包含人IgG1Fc结构域。

13.权利要求11的组合物，其中所述人IgG Fc结构域包含人IgG2Fc结构域。

14.权利要求1的组合物，其中F¹和F²是不同的延长半衰期的部分。

15.权利要求1的组合物，其中F¹或F²或这两者包含选自图3、4、11A-C、12A-C和12E-F所示SEQ ID NOS：2、4、70、71、72、74、75、76、1340-1342和1359-1363的序列。

16.权利要求1的组合物，其中F¹或F²或这两者包含人血清白蛋白结构域。

17.权利要求1的组合物，其中F¹或F²或这两者包含运甲状腺素蛋白结构域。

18.权利要求1的组合物，其中F¹或F²或这两者包含生物学合适的聚合物或共聚物。

19.权利要求18的组合物，其中生物学合适的聚合物是聚乙二醇(PEG)。

20.权利要求19的组合物，其中所述PEG选自5kD和20kD PEG。

21.权利要求5、6、8或9的任一项的组合物，其中F¹是人IgG Fc结构域或HSA，并且F²是PEG。

22.权利要求5、6、7或9的任一项的组合物，其中F²是人IgG Fc结构域或HSA，并且F¹是PEG。

23.权利要求1的组合物，进一步包含与非PEG F¹或非PEG F²缀合，或与P缀合，或与任何上述部分的任何组合缀合的一个或多个PEG部分。

24.权利要求1的组合物，其中毒素肽插入人IgG1 Fc结构域环。

25.权利要求1的组合物，其中至少一个P包括Kv1.3拮抗剂肽。

26.权利要求25的组合物，其中所述Kv1.3拮抗剂肽选自ShK、HmK、MgTx、AgTx1、AgTx2、HsTx1、OSK1、Anuroctoxin、Noxiustoxin、Hongotoxin、HsTx1，ChTx、Titystoxin、BgK、BmKTX、BmTx、Tc30、Tc32、Pi1、Pi2和Pi3毒素肽，或上述任何物质的类似物。

27.权利要求25的组合物，其中所述Kv1.3拮抗剂肽包含选自表1所示SEQ ID NOS：21、17、18、19、61、23、85、25、62、30、27、36、86、9、26、40、87和13的氨基酸序列。

28.权利要求1的组合物，其中至少一个P包含ShK肽或ShK肽类似物。

29.权利要求28的组合物，其中所述ShK肽或ShK肽类似物包含选自表2所示SEQ ID NOS：5、88-200、548-561、884-950和1295-1300的氨基酸序列。

30.权利要求1的组合物，其中至少一个P包含HmK肽、BgK肽、AeK肽或AsKS肽，或上述任何肽的肽类似物。

31.权利要求30的组合物，其中所述HmK肽、BgK肽、AeK肽或AsKS肽或肽类似物包含选自表3所示SEQ ID NOS：6-9、201-241的氨基酸序列。

32.权利要求1的组合物，其中至少一个P包含MgTx肽或MgTx肽类似物。

33.权利要求32的组合物，其中所述MgTx肽或MgTx肽类似物包含选自表4所示SEQ ID NOS：28和242-260的氨基酸序列。

34.权利要求1的组合物，其中至少一个P包含AgTx2肽或AgTx2肽类似物。

35.权利要求34的组合物，其中所述AgTx2肽或AgTx2肽类似物包含选自表5所示SEQ ID NOS：23和261-275的氨基酸序列。

36.权利要求1的组合物，其中至少一个P包含HsTx1肽或HsTx1肽类似物。

37.权利要求36的组合物，其中所述HsTx1肽或HsTx1肽类似物包含选自表6所示SEQ ID NOS：61和276-293的氨基酸序列。

38.权利要求1的组合物，其中至少一个P包含OSK1肽或OSK1肽类似物。

39.权利要求38的组合物，其中所述OSK1肽或OSK1肽类似物包含选自表7所示SEQ ID NOS：25、294-298、562-636、980-1274、1303和1308的氨基酸序列。

40.权利要求1的组合物，至少一个P包含Pi2肽或Pi2肽类似物。

41.权利要求40的组合物，其中所述Pi2肽或Pi2肽类似物包含选自表8所示SEQ ID NOS：17和299-315的氨基酸序列。

42.权利要求1的组合物，其中至少一个P包含AnTx肽或AnTx肽类似物。

43.权利要求42的组合物，其中所述AnTx肽或AnTx肽类似物包含选自表9所示SEQ ID NOS：62和316-318的氨基酸序列。

44.权利要求1的组合物，其中至少一个P包含NTX肽或NTX肽类似物。

45.权利要求44的组合物，其中所述NTX肽或NTX肽类似物包含选自表10所示SEQ ID NOS：30和319-325的氨基酸序列。

46.权利要求1的组合物，其中至少一个P包含KTX1肽或KTX1肽类似物。

47.权利要求46的组合物，其中所述KTX1肽或KTX1肽类似物包含选自表11所示SEQ ID NOS：24和326-328的氨基酸序列。

48.权利要求1的组合物，其中至少一个P包含IKCa1拮抗剂肽。

49.权利要求48的组合物，其中所述IKCa1拮抗剂肽包含MTx肽、ChTx肽或这两种肽中任何一种肽的肽类似物。

50.权利要求49的组合物，其中所述MTx肽、ChTx肽或这两种肽中任何一种肽的类似物包含选自表12所示SEQ ID NOS：20、36和329的氨基酸序列。

51.权利要求1的组合物，其中至少一个P包含MTX肽或MTX肽类似物。

52.权利要求51的组合物，其中所述MTX肽或MTX肽类似物包含选自表13所示SEQ ID NOS：20、330-343和1301、1302、1304-1307、1309、1311、1312和1315-1336的氨基酸序列。

53.权利要求1的组合物，其中至少一个P包含ChTx肽或ChTx肽类似物。

54.权利要求53的组合物，其中所述ChTx肽或ChTx肽类似物包含选自表14所示SEQ ID NOS：36、59、344-346和1369-1390的氨基酸序列。

55.权利要求1的组合物，其中至少一个P包含SKCa拮抗剂肽。

56.权利要求55的组合物，其中所述SKCa拮抗剂肽包括蜂神经毒肽、ScyTx肽、BmP05肽、P05肽、tamapin肽、P01肽或TsK肽，或上述任何肽的肽类似物。

57.权利要求55的组合物，其中所述SKCa拮抗剂肽包含选自表15所示SEQ ID NOS：16、47、50-53和68的氨基酸序列。

58.权利要求1的组合物，其中至少一个P包含蜂神经毒肽或蜂神经毒肽类似物。

59.权利要求58的组合物，其中所述蜂神经毒肽或蜂神经毒肽类似物包含选自表16所示SEQ ID NOS：68和348-353的氨基酸序列。

60.权利要求56的组合物，其中所述ScyTx肽、tamapin肽或肽类似物包含选自表17所示SEQ ID NOS：51、53和354-356的氨基酸序列。

61.权利要求1的组合物，其中至少一个P包含BKCa拮抗剂肽。

62.权利要求61的组合物，其中BKCa拮抗剂肽包含选自表18所示SEQ ID NOS：29、35和38-41的氨基酸序列。

63.权利要求61的组合物，其中至少一个P包含IbTx肽、Slotoxin肽、BmTx1肽或BuTx肽，或上述任何肽的肽类似物。

64.权利要求63的组合物，其中所述IbTx肽、Slotoxin肽、BmTx1肽、BuTx肽或肽类似物包含选自表19所示SEQ ID NOS：38和357-398的氨基酸序列。

65.权利要求1的组合物，其中至少一个P包含貂毒素肽或貂毒素肽类似物。

66.权利要求65的组合物，其中所述貂毒素肽或貂毒素肽类似物包含选自表20所示SEQ ID NOS：35和399-408的氨基酸序列。

67.权利要求1的组合物，其中至少一个P包含N型钙通道抑制剂肽。

68.权利要求67的组合物，其中所述N型钙通道抑制剂肽包含选自表21所示SEQ ID NOS：64-66、347、409、1364-1367的氨基酸序列。

69.权利要求1的组合物，其中至少一个P包含ωMVIIA肽或ωMVIIA肽类似物。

70.权利要求69的组合物，其中ωMVIIA肽或ωMVIIA肽类似物包含选自表22所示SEQ ID NOS：65和410-421的氨基酸序列。

71.权利要求1的组合物，其中至少一个P包含GVIA肽或GVIA肽类似物。

72.权利要求71的组合物，其中所述GVIA肽或GVIA肽类似物包含选自表23所示SEQ ID NOS：64和422-429的氨基酸序列。

73.权利要求1的组合物，其中至少一个P包含Ptu1肽或Ptu1肽类似物。

74.权利要求73的组合物，其中所述Ptu1肽或Ptu1肽类似物包含选自表24所示SEQ ID NOS：66和430-437的氨基酸序列。

75.权利要求1的组合物，其中至少一个P包含T型钙通道、P2X或TRP抑制剂肽。

76.权利要求1的组合物，其中至少一个P包含ProTx1肽或ProTx1肽类似物。

77.权利要求76的组合物，其中所述ProTx1是包含选自表25所示SEQ ID NOS：56和438-445的氨基酸序列的肽。

78.权利要求1的组合物，其中至少一个P包含BeKM1肽或BeKM1肽类似物。

79.权利要求78的组合物，其中所述BeKM1肽或BeKM1肽类似物包含选自表26所示SEQ ID NOS：63和446-458的氨基酸序列。

80.权利要求1的组合物，其中至少一个P包含钠通道抑制剂肽。

81.权利要求80的组合物，其中所述钠通道抑制剂肽包含选自表27所示SEQ ID NOS：459-469的氨基酸序列。

82.权利要求1的组合物，其中至少一个P包含氯通道抑制剂肽。

83.权利要求82的组合物，其中所述氯通道抑制剂肽包含选自表28所示SEQ ID NOS：67和470-493的氨基酸序列。

84.权利要求1的组合物，其中至少一个P包含Kv2.1抑制剂肽。

85.权利要求84的组合物，其中所述Kv2.1抑制剂肽包含选自表29所示SEQ ID NOS：494-506的氨基酸序列。

86.权利要求1的组合物，其中至少一个P包含Kv4.3和Kv4.2的抑制剂肽。

87.权利要求86的组合物，其中所述Kv4.3和Kv4.2的抑制剂肽包含选自表30所示SEQ ID NOS：57和507-518的氨基酸序列。

88.权利要求1的组合物，其中至少一个P包含nACHR通道抑制剂肽。

89.权利要求88的组合物，其中所述nACHR通道抑制剂肽包含选自表31所示SEQ ID NOS：519-541的氨基酸序列。

90.权利要求1的组合物，其中至少一个P包含美洲蜘蛛毒素肽或美洲蜘蛛毒素肽类似物。

91.权利要求1的组合物，其中至少一个P包含选自表32所示SEQID NOS：959-975、1275-1287和1368的氨基酸序列。

92.编码权利要求1的组合物的DNA。

93.包含权利要求92的DNA的表达载体。

94.包含权利要求93的表达载体的宿主细胞。

95.权利要求94的宿主细胞，其中所述细胞是真核细胞。

96.权利要求94的宿主细胞，其中所述细胞是哺乳动物细胞。

97.权利要求94的宿主细胞，其中所述细胞是CHO细胞。

98.权利要求94的宿主细胞，其中所述细胞是原核细胞。

99.权利要求94的宿主细胞，其中所述细胞是大肠杆菌细胞。

100.权利要求1的组合物，进一步包含额外的药理学活性的、共价结合的肽。

101.权利要求100的组合物，其中所述额外的肽结合于F¹或F²。

102.权利要求100的组合物，其中所述额外的肽结合于P。

103.权利要求1的组合物，进一步包含与毒素肽的活性相关的激动肽或拮抗肽，或靶定肽。

104.包含毒素肽类似物的组合物，所述毒素肽类似物包含选自表2所示SEQ ID NOS：88、89、92、148-200、548-561、884-949和1295-1300的氨基酸序列。

105.包含毒素肽类似物的组合物，所述毒素肽类似物包含选自表3所示SEQ ID NOS：201-225的氨基酸序列。

106.包含毒素肽类似物的组合物，所述毒素肽类似物包含选自表4所示SEQ ID NOS：242-248和250-260的氨基酸序列。

107.包含毒素肽类似物的组合物，所述毒素肽类似物包含选自表5所示SEQ ID NOS：261-275的氨基酸序列。

108.包含毒素肽类似物的组合物，所述毒素肽类似物包含选自表6所示SEQ ID NOS：276-293的氨基酸序列。

109.包含毒素肽类似物的组合物，所述毒素肽类似物包含选自表7所示SEQ ID NOS：980-1274、1303和1308的氨基酸序列。

110.包含毒素肽类似物的组合物，所述毒素肽类似物包含选自表8所示SEQ ID NOS：299-315的氨基酸序列。

111.包含毒素肽类似物的组合物，所述毒素肽类似物包含选自表9所示SEQ ID NOS：316-318的氨基酸序列。

112.包含毒素肽类似物的组合物，所述毒素肽类似物包含表10所示的氨基酸序列SEQ ID NO：319。

113.包含毒素肽类似物的组合物，所述毒素肽类似物包含选自表11所示SEQ ID NO：327-328的氨基酸序列。

114.包含毒素肽类似物的组合物，所述毒素肽类似物包含选自表13所示SEQ ID NOS：330-337、341、1301、1302、1304-1307、1309、1311、1312和1315-1336的氨基酸序列。

115.包含毒素肽类似物的组合物，所述毒素肽类似物包含选自表14所示SEQ ID NOS：1369-1390的氨基酸序列。

116.包含毒素肽类似物的组合物，所述毒素肽类似物包含选自表16所示SEQ ID NOS：348-353的氨基酸序列。

117.包含毒素肽类似物的组合物，所述毒素肽类似物包含选自表19所示SEQ ID NOS：357-362、364-368、370、372-385和387-398的氨基酸序列。

118.包含毒素肽类似物的组合物，所述毒素肽类似物包含选自表20所示SEQ ID NOS：399-408的氨基酸序列。

119.包含毒素肽类似物的组合物，所述毒素肽类似物包含选自表22所示SEQ ID NOS：410-421的氨基酸序列。

120.包含毒素肽类似物的组合物，所述毒素肽类似物包含选自表23所示SEQ ID NOS：422、424、426和428的氨基酸序列。

121.包含毒素肽类似物的组合物，所述毒素肽类似物包含选自表24所示SEQ ID NOS：430-437的氨基酸序列。

122.包含毒素肽类似物的组合物，所述毒素肽类似物包含选自表25所示SEQ ID NOS：438-445。

123.包含毒素肽类似物的组合物，所述毒素肽类似物包含选自表26所示SEQ ID NOS：447、449、451、453、455和457的氨基酸序列。

124.包含毒素肽类似物的组合物，所述毒素肽类似物包含选自表28所示SEQ ID NOS：470-482和484-493的氨基酸序列。

125.包含毒素肽类似物的组合物，所述毒素肽类似物包含选自表29所示SEQ ID NOS：495-506的氨基酸序列。

126.包含毒素肽类似物的组合物，所述毒素肽类似物包含选自表30所示SEQ ID NOS：507-518的氨基酸序列。

127.一种药物组合物，包含权利要求1、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125或126的任一项的组合物和药学可接受的载体。

128.预防或减轻多发性硬化的症状复发的方法，该方法包括给以前经历过多发性硬化的至少一种症状的患者施用预防有效量的权利要求1、38、39、48、49、50、51、52、53、54、104、109、114或115的任一项的组合物，使得能够防止多发性硬化的至少一种症状再次出现或使其减轻。

129.权利要求128的方法，其中所述组合物包含Kv1.3拮抗剂肽。

130.权利要求128的方法，其中所述组合物包含ShK肽、OSK1肽、ChTx肽或莫鲁蝎毒素肽，或上述任何肽的类似物。

131.治疗自身免疫病症的方法，该方法包括给诊断患有自身免疫病症的患者施用治疗有效量的权利要求1、38、39、48、49、50、51、52、53、54、104、109、114或115的组合物，所述自身免疫病症选自多发性硬化、1型糖尿病、牛皮癣、炎性肠病、接触介导的皮炎、类风湿关节炎、牛皮癣关节炎、哮喘、过敏、再狭窄、系统性硬化、纤维化、硬皮病、肾小球肾炎、干燥综合征、炎症性骨重吸收、移植物排斥、移植物抗宿主疾病或狼疮，其中患者中所述病症的至少一种症状减轻。

132.权利要求131的方法，其中所述组合物包含Kv1.3拮抗剂肽或IKCa1拮抗剂肽。

133.权利要求131的方法，其中所述组合物包含ShK肽、OSK1肽、ChTx肽或莫鲁蝎毒素肽，或上述任何肽的类似物。

134.权利要求1的组合物，其中任何f或任何g是1，并且L是包含选自SEQ ID NOS：79、84和637-656的氨基酸序列的肽接头。

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