CN105348392B - 一种Nav1.7抑制剂及其改造方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种Nav1.7抑制剂及其改造方法，该抑制剂属于融合蛋白，包括两部分：以SEQ ID NO:2为模板的蛋白突变体和能阻断Nav1.7电流的多肽。所述以SEQ ID NO:2为模板的蛋白突变体为序列SEQ ID NO:2第14‑31位由氨基酸插入、删除和置换所形成的突变体。本发明还提供了一种改造方法：将具有能阻断NaV1.7电流的抑制多肽与上述以SEQ ID NO:2为模板的蛋白突变体连接在一起，与表达载体中的MBP标签蛋白融合后，能够在大肠杆菌胞内可溶表达出能阻断Nav1.7电流的融合蛋白。本发明的有益效果是：该融合蛋白能够在大肠杆菌胞内进行可溶表达，经纯化后的产物能够阻断背根神经节（DRG）细胞膜上的Nav1.7电流，效果与原始多肽相似，且结合时间更长，更难被洗脱，并在大鼠体内实验显示出显著的镇痛效果。

Description

一种Nav1.7抑制剂及其改造方法

技术领域

本发明属于药物开发领域，尤其是涉及一种Nav1.7抑制剂及其改造方法。

背景技术

接近25%的人会发生从生病起至少持续三个月的慢性疼痛，已有的镇痛药物主要作用于中枢神经系统，对慢性疼痛的治疗效果不明显。痛觉是机体受到伤害性刺激时的一种保护性反应，痛觉信号通过初级感觉神经传至脊髓后角，换元后通过感觉传导上行通路传至大脑皮层和边缘系统，引起痛觉。背根神经节（DRG）神经元作为躯体感觉传入的初级感受神经元，是介导痛觉、生理性体表感觉和位置等信号的最初感受器。

电压门控性钠（Nav）1.7主要表达在小型的DRG神经元和交感神经节的神经元，在疼痛信号的传导过程中起关键作用。在小型DRG痛觉受器，Nav1.7位于周围神经末梢、体细胞、中央轴突投射和突触前终端。具体来说，Nav1.7表达c-纤维神经末梢作为合并和放大小型的受体去极化的阈值通道,使膜电位达到动作电位阈值，因此在疼痛信号起始阶段起到重要作用。Nav1.7离子通道的选择性抑制剂几乎可用于各种疼痛的治疗。因此，Nav1.7离子通道的高度选择性抑制剂是目前镇痛药物研发的热点。

多肽毒素作为镇痛类药物是毒素类药物的一个主要研究方向，因为多肽毒素可作用于离子通道受体、乙酰胆碱受体、G-蛋白耦合受体等。目前已上市的药物中至少有7个是源于毒素的，比如ziconitide，一种选择性地阻断N-型电压门控钠通道的镇痛药物。

近年来研发了一系列针对Nav1.7选择性抑制的肽类毒素，如从狼蛛毒液中提取的Protx-II，GpTx-1，以及从少棘蜈蚣毒液中纯化得到的多肽毒素Ssm6a，在这些多肽中，Ssm6a最广泛地抑制Na⁺各亚型通道，Ssm6a是含有45个氨基酸的多肽，抑制Nav1.7的IC₅₀值是25nM，其对Nav1.7的抑制作用是Nav1.2的32倍，是其他亚型的Na⁺通道的150倍，因此是一种很有潜力的Nav1.7抑制剂类镇痛药物。动物实验均证明Ssm6a可特异性阻断Nav1.7电流并明显减轻外周神经痛，相关专利（CN201210453532.1）已公开Ssm6a具有很好的热稳定性和蛋白酶稳定性，在血浆中的稳定性也比较好，对福尔马林引起的疼痛的II相镇痛效果明显，但对酸、热引起的疼痛药效仅达4h，很可能是由于该多肽被肝脏和肾清除的速率较快，在体内容易降解失活而降低药效；而且生理活性方面的研究均是用少棘蜈蚣毒液中提取得到的多肽，这种获得方式工序复杂、成本较高，从而使这些肽类毒素的使用受到限制，故研发既保持高度生物活性，又能容易获取的生物稳定性的肽类毒素已成为下一步的研发目标，具有广泛的开发和应用前景。

毒素多肽的分子量小，其大小一般少于60个氨基酸，二硫键富集，且二硫键为维持毒素多肽结构稳定的主要化学键，因此其生物活性受突变、重组产物工业生产和化学合成的影响很大，且很难对其进行优化，如ProTx-II需要不断地优化因为其在大鼠模型上对炎症疼痛的镇痛效果明显降低，且治疗浓度范围也较窄，在0.1mg/kg浓度时就会成为大鼠的致死浓度，但至今未见有对ProTx-II优化的突变体的报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种有效抑制Nav1.7离子通道的抑制剂，该抑制剂是能在原核胞内表达系统中大量表达的融合蛋白。

本发明的技术方案是：

一种Nav1.7抑制剂，该抑制剂为分子量大于10000Da的融合蛋白，包括以SEQ IDNO:2为模板的蛋白突变体和能阻断Nav1.7电流的多肽。

该抑制剂还可以包括连接肽，连接肽位于以SEQ ID NO:2为模板的蛋白突变体与能阻断Nav1.7电流的多肽之间。具体地，连接肽的序列包括但不限于：GGGGS，GGSGG，GS，PSTSTST，EIDKPSQ及其多聚体之一。

以SEQ ID NO:2为模板的蛋白突变体为SEQ ID NO:2第14-31位由氨基酸插入、删除和置换所形成的突变体，所述插入、删除和置换的氨基酸为天然氨基酸。具体地，SEQ IDNO:2第14-31位突变的序列为：XXDX_(m)SX_(n)AX_(i)，X为任一天然氨基酸，1≤m≤5,1≤n≤8,1≤i≤8,3≤m+n+i≤13。更具体地，所述SEQ ID NO:2的蛋白突变体的蛋白序列为SEQ IDNO:3。

所述能阻断Nav1.7电流的多肽为毒素多肽。

所述能阻断Nav1.7电流的多肽为氨基酸个数小于等于60的多肽。

所述能阻断Nav1.7电流的多肽为富含二硫键的多肽。具体地，所含二硫键的数量为含有3对以上二硫键。

所述能阻断Nav1.7电流的多肽其序列为SEQ ID NO:5。

本发明的抑制剂是序列为SEQ ID NO:1的融合蛋白，该融合蛋白能够在大肠杆菌中的胞内可溶表达。

本发明的抑制剂在1µM的浓度下能实现对于DRG细胞TTX-敏感的钠电流90%以上的抑制；该抑制剂在1µM的浓度下与DRG孵育后，在被冲洗的情况下能够至少在500s时间内保持钠电流抑制作用；

本发明还提供一种改造Nav1.7抑制多肽的方法：将能阻断NaV1.7电流的抑制剂多肽与上述以SEQ ID NO:2为模板的蛋白突变体连接在一起，能够在大肠杆菌胞内可溶表达出能阻断Nav1.7电流的融合蛋白。

该方法构建的融合蛋白还可以采用连接肽来连接Nav1.7抑制剂多肽和以SEQ IDNO:2为模板的蛋白突变体。

该方法中所述Nav1.7抑制剂多肽为毒素多肽；所述Nav1.7抑制剂多肽为氨基酸个数小于等于60的多肽；所述Nav1.7抑制剂多肽为含有3对以上二硫键的多肽；所述Nav1.7抑制剂多肽其序列为SEQ ID NO:5。

一种核酸，该核酸编码上述任一种蛋白或多肽序列。

一种表达载体，载体中包含上述核酸。

一种药物，该药物包含以上所述任一种蛋白序列。

本发明中，经过对M-FABP蛋白（SEQ ID NO:2）进行改造，与毒素多肽Ssm6a（SEQ IDNO:5）一起构建成一个新的融合蛋白SP-TOX(SEQ ID NO:1)，该融合蛋白能够在E.coli胞内高效表达，能选择性且有效地抑制大鼠DRG神经元的Nav1.7离子通道，且结合后的洗脱速率，与Ssm6a相比低10倍，有效地减少了大鼠的炎症疼痛，因此该方法能够用于一系列具有Nav1.7抑制作用的多肽的改造，尤其适合富含二硫键的毒素多肽的改造，适合于对序列的改造比较敏感且大量生产有困难的多肽。

所述融合蛋白SP-TOX(SEQ ID NO:1)包括176个氨基酸，分子量为19550.6Da，理论等电点为5.6。中间为编码连接多肽的序列（SEQ ID NO:4），连接多肽序列的上游为编码结构蛋白的序列（SEQ ID NO:3），下游为编码有镇痛活性多肽的序列（SEQ ID NO:5）。

M-FABP为人类肌肉脂肪酸结合蛋白的支架部分（The scaffold of human musclefatty acid binding protein，SCOP id: d1hmsa_），其序列为SEQ ID:2，其结构为10个β反平行链形成β折叠，折叠帽包括两个短的α-螺旋，位于第一条和第二条β链之间，经过与其结构同源的蛋白（SCOP Id：d1r0ua_）进行比对，可以看出其在折叠帽区的序列不一样，即折叠帽区是可以接受较大突变的，其可接受的范围跨度最少为20个氨基酸，因此我们选择在其折叠帽区域具体分析为第14-31位(FDDYMKSLGVGFATRQVA)进行突变，可保持其结构稳定，进一步分析，发现在固定位点进行突变（XXDX_(m)SX_(n)AX_(i)，X为任一天然氨基酸，1≤m≤5,1≤n≤8,1≤i≤8,3≤m+n+i≤13）更利于结构的稳定性。

本发明中用一段对结构稳定性影响较小的一段新的序列(WIDTYSGVPTYADDFEG)置换原始的螺旋结构序列第14-31位(FDDYMKSLGVGFATRQVA)，且通过连接肽GGSGG连接Ssm6a，形成融合蛋白SP-TOX。本发明中还构建了SP-TOX-cc2ss，即将Ssm6a部分的两个相邻的半胱氨酸置换为丝氨酸，阻断Ssm6a的天然二硫键的形成，作为对比蛋白，用来验证SP-TOX的活性。

由于毒素多肽通常由小于60个的氨基酸组成，且富含二硫键，二硫键为维持毒素多肽结构稳定的主要化学键，且其分子量较小，因此毒素多肽应用于临床有两个局限性，一是毒素多肽如Ssm6a依靠二硫键的折叠维持他们的结构稳定性和发挥生物学活性，合成或重组的多肽易产生二硫键错配或导致生物活性降低或丧失，例如，Ssm6a有3个二硫键可形成15个异构体，化学合成的Ssm6a，即使是折叠成热力学最稳定的异构体，在1uM的浓度下对Nav1.7没有活性；二是这些毒素多肽很难优化，因为其结构出现微小的改变都会引起生物活性的改变，因此难以直接对毒素多肽进行优化。例如，另一种蜘蛛毒素多肽GsAF1，与ProTx-II有着90%的同源性，仅有4个氨基酸的差异，但是他们对Nav1.7的抑制效果却相差10倍。因此对先导化合物的常规突变策略不适合于这些毒素多肽。

另外毒素多肽类的生产上，其生物提取的方法操作复杂且产量低，其在工程细胞中的表达则为首选的大量制备的方法，由于毒素多肽的二硫键在细胞质的还原环境中难以形成，导致毒素多肽在细胞质中的表达很困难，只能通过与信号肽形成融合蛋白转运到大肠杆菌的细胞周质中进行表达，细胞周质中的氧化环境有利于蛋白质的正确折叠，但其融合蛋白产量很低；本发明中实现了毒素多肽Ssm6a的融合蛋白在原核细胞的胞内高效大量表达，且其纯化产物保留了Ssm6a的活性，纯化产物与DRG孵育后，与生物提取的Ssm6a相比具有更长效的作用。

本发明所提供的毒素多肽的融合方法还可用于其他富含二硫键的多肽的临床应用的优化。

本发明中的序列：

SEQ ID NO:1

GSVDAFLGTWKLVWIDTYSGVPTYADDFEGTKPTTIIEKNGDILTLKTHSTFKNTEISFKLGVEFDETTADDRKVKSIVTLDGGKLVHLQKWDGQETTLVRELIDGKLILTLTHGTAVCTRTYEKEGGSGGADNKCNSLRREIACGQCRDKVKTDGYFYECCTSDSTFKKCQDLLH

SEQ ID NO:2

GSVDAFLGTWKLVFDDYMKSLGVGFATRQVATKPTTIIEKNGDILTLKTHSTFKNTEISFKLGVEFDETTADDRKVKSIVTLDGGKLVHLQKWDGQETTLVRELIDGKLILTLTHGTAVCTRTYEKE

SEQ ID NO:3

GSVDAFLGTWKLVWIDTYSGVPTYADDFEGTKPTTIIEKNGDILTLKTHSTFKNTEISFKLGVEFDETTADDRKVKSIVTLDGGKLVHLQKWDGQETTLVRELIDGKLILTLTHGTAVCTRTYEKE

SEQ ID NO:4

GGSGG

SEQ ID NO:5

ADNKCNSLRREIACGQCRDKVKTDGYFYECCTSDSTFKKCQDLLH

本发明具有的优点和积极效果是：由于采用上述技术方案，本Nav1.7抑制剂的融合蛋白能够在原核系统中表达，且表达方式为胞内可溶表达，在体外膜片钳实验中能选择性且有效地抑制大鼠DRG神经元的Nav1.7通道，且结合后的洗脱速率，与Ssm6a相比低10倍，在被冲洗的情况下能够至少在500s时间内保持钠电流抑制作用，说明比生物提取的Ssm6a对Nav1.7具有更长效的抑制作用，解决了Nav1.7抑制剂多肽改造的问题，在保持其高度生物活性的情况下降低了生产成本。

附图说明

图1是本发明中融合蛋白SP-TOX的表达载体质粒图谱。

图2是融合蛋白SP-TOX的设计、表达和纯化。其中（a）为M-FABP蛋白与其结构同源蛋白的重合结构示意图，圈出部分为在M-FABP中显示有，而其结构同源蛋白中没有的螺旋结构；（b）SP-TOX的氨基酸序列，第一个划线部分为新置换的序列，第二个划线部分为构建SP-TOX-cc2ss时突变的半胱氨酸；（c）融合蛋白MBP-SP-TOX在大肠杆菌表达位置的SDS-PAGE鉴定结果；其中1为总蛋白,2为胞内不溶蛋白；3为胞内可溶蛋白；4为纯化后的MBP-SP-TOX；（d）MBP-SP-TOX酶切和纯化后的SP-TOX蛋白的SDS-PAGE鉴定结果；其中1为MBP-SP-TOX经TEV酶酶切后的蛋白；2为纯化后的SP-TOX蛋白；（e）MALDI-TOF鉴定融合蛋白SP-TOX的分子量，右上为主峰的放大图。

图3 SP-TOX抑制成年大鼠DRG神经元的TTX-敏感的Na⁺通道。其中（a）代表1μM的SP-TOX完全抑制TTX-敏感的Na⁺通道；（b）SP-TOX对TTX-敏感的Na⁺通道的抑制率为93.6±5.2( n=6, p<0.01)；（c）对照肽对TTX-敏感的Na⁺通道没有抑制作用；（d）1μM的SP-TOX抑制TTX-敏感的Na ⁺通道和洗脱时解离的时间过程，证明SP-TOX能有效抑制成年大鼠DRG神经元的TTX-敏感的Na^＋通道。

图4 SP-TOX对福尔马林引起的大鼠疼痛第II时相的镇痛效果。其中（a）SP-TOX在第I时相对后爪的舔爪时间没有效果；（b）在注射2.5%福尔马林后，0.2 nmol和0.02 nmol的SP-TOX均显著地缩短了大鼠在第II时相的舔爪时间。

图中：阴性对照：缓冲液；Ctrl Peptide (H): 浓度为0.2nM的SP-TOX-cc2ss；SP-TOX(H):浓度为0.2nM的SP-TOX；SP-TOX (L):浓度为0.02nM的SP-TOX。

具体实施方式

实施例1

融合蛋白的制备

（1）基因合成SP-TOX蛋白的基因序列，M-FABP的C末端通过连接肽连接到Ssm6a的N末端，然后构建到带有MBP标签的载体上，转入大肠杆菌。（2）在含30μg/ml kan的LB平板上挑取菌落后，37℃生长到OD₆₀₀达到0.5，用0.5 mM IPTG在28℃诱导5个小时。

（3）收集细胞，加入终浓度为0.2 mg/ml的溶菌酶，冰浴裂解30min，然后超声使细胞完全破碎。

（4）在4℃以15 000 g的离心力离心60 min，收集上清用Ni Sepharose 6 FastFlow 介质纯化。纯化后的蛋白在PBS缓冲液(137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na₂HPO₄,2 mM KH₂HPO₄ ,pH 7.4)中透析。

（5）用TEV蛋白酶酶切MBP标签，进一步用镍柱纯化，SP-TOX蛋白的纯度由SDS-PAGE检测。

经SDS-PAGE鉴定，融合蛋白SP-TOX与MBP标签融合后的表达方式为胞内（细胞质）可溶表达，分子量为65 kDa左右，切掉MBP标签后的融合蛋白SP-TOX的分子量为20 kDa左右，MALDI-TOF鉴定SP-TOX的分子量为19550.6Da，与理论计算分子量19560.0 Da基本一致，融合蛋白SP-TOX的摇瓶表达量约为10mg/L。

实施例2 2.1 DRG神经元的培养

（1）成熟雄性Sprague-Dawley大鼠(180-200g)用异氟醚吸入麻醉后，颈椎脱臼法处死。

（2）从脊柱分离DRG神经，利用显微解剖镊逐个摘出椎间孔内DRG，并尽量去除其连接纤维，保存在37℃的Hank’s平衡盐溶液中。

（3）全部摘除完毕后，移入1 ml胶原酶（1mg/ml,Sigma-Aldrich )和Dispeas (10mg/ml)消化液中消化30min，温和地磨碎神经结。

（4）洗2次后，加入2 ml含10%胎牛血清的DMEM完全培养基，用滴管轻轻吹散，以5×10⁵/ml密度接种于24孔培养板中预先用多聚赖氨酸和层粘连蛋白包被的盖玻片上，并置37℃、5% CO₂培养箱中培养48 h后使用。

2.2 膜片钳电生理实验

（1）在本实验中应用全细胞（whole-cell）膜片钳记录，记录在室温（20-25℃）下进行，所用膜片微电极为硼硅玻璃毛细管拉制而成，灌注电极内液后电极电阻为2-3 MΩ。应用串联电阻补偿，接近80%-90%的补偿能达到实验条件，在这种情况下，最大获得电阻为2MΩ，用Axon patch200B放大器和pClamp10.3软件(Axon Instruments, CA)记录电流，频率为10KHz。

（2）电压方法研究DRG神经元的钠离子电流如下：设置钳制电压为-70 mV，每3s给予1s脉冲至电势差为零。膜电流的采样率是10 KHz，化合物通过一个自制的置于细胞旁的膜片电极连接到细胞，恒温槽通过平衡液连续冷却。

（3）在膜片钳记录技术中，膜片钳内先填充电极内液，然后填充含两性霉素B(120ng/ml)的电极内液，电极外液用于记录DRG神经元的钠电流，电极外液为(mM)：NaCl 60,KCl 2.5, MgCl₂ 5, CaCl₂ 0.01, 氯化胆碱60, 四乙基氯化铵20, 葡萄糖5, HEPES 10,CdCl 0.1(用NaOH调整pH值到7.4)。用于钠电流记录的电极内液为(mM)：CsF 110, NaCl10, EGTA 11, MgCl₂ 5, HEPES 10(用CsOH调整pH值到7.3-7.4)。

2.3 SP-TOX对DRG神经元Nav1.7通道的作用

由于Nav1.7主要存在于小型的疼痛DRG神经元，研究SP-TOX是否可以阻止Nav1.7通道电流时，分离成年大鼠的小型疼痛DRG神经元，使用打孔的膜片钳进行全细胞记录。细胞电压先保持在-100 mV，然后以每秒10 mV的增量，使用60ms电压阶级脉冲刺激诱发-80mV和+40mV的瞬态Na⁺流。虽然成年大鼠的DRG神经元表达的是Nav1.1，Nav1.6，Nav1.8，Nav1.9的混合物，但Nav1.7引起的钠电流主要是TTX-敏感的电流。因此，将100nM的TTX添加到溶液中从总的Na⁺电流中分离TTX-敏感的Na⁺电流。

（1）1µM的SP-TOX,即Ssm6a的饱和浓度，抑制TTX敏感的Na⁺电流达到93.6%，与1µMSsm6a有类似的抑制率。

（2）对照肽显示了很低的抑制率3.8%，说明破坏了二硫键的融合蛋白SP-TOX-cc2ss没有抑制Nav 1.7的生物活性。

(3)与Ssm6a相比，融合蛋白SP-TOX在TTX敏感型钠通道方面，在洗脱液洗脱时显示了更慢的时间进程。尤其是1µM的SP-TOX在300s达到了完全抑制效应，且这种抑制效果在500s时没有显示任何被洗脱的信号。相比之下1µM的Ssm6a在40s时达到了最大的抑制效果且在50s时被完全洗脱。这些结果表明SP-TOX从靶向分离更慢，可发挥更长效的镇痛作用。

综上，已有的研究发现1µM的Ssm6a对大鼠DRG神经元的Nav1.7通道能达到100%抑制，但是要求的浓度比其他亚型的Nav抑制剂高30-600倍，本发明中的1µM SP-TOX对大鼠的DRG神经元的Nav1.7通道也能达到完全的抑制效果，表明结构蛋白与Ssm6a的融合蛋白在生物活性和靶向性方面都很好。

实施例3

3.1体内DRG-福尔马林大鼠镇痛实验

所有手术过程都是在腹腔内注射戊巴比妥钠(10-20mg/kg)的深麻醉下进行的，按照标准操作的方法对DRG神经细胞局部体内应用待测样品。在成年雄性Sprague-Dawley大鼠(180-200g)的L4-L6段脊髓的正中切口，L5段被确认是连接两个髂骨的中点。

（1）在L5的DRG横切一个0.8mm的洞：后爪附近神经节抽搐可以进行验证，此时停止打孔。

（2）不锈钢钝端套管(内径0.64mm，长度4mm)连接孔和聚丙烯管(内径0.41mm，长度4.5mm)，切口缝合和插管牢牢地固定在粘合剂上。

（3）术后给药，肌内注射青霉素(19 mg/0.1 mL)。将大鼠安置在带锯末的塑料笼子中，提供水和食物，实验进行前，大鼠们至少恢复24个小时。动物如有不适症状，用异氟烷麻醉后颈椎脱位实施安乐死。

（4）评估样品对疼痛过程中DRG神经元的局部作用，注射50μL的2.5%福尔马林后，5μL蛋白质溶液或缓冲液阴性对照立即通过DRG插管注入后爪足底。将大鼠放回鼠笼，观察30min。由操作员观察并分析注入药物后30min内的咬爪、舔爪时间以及程度。

（5）验证药物的有效性仅限于DRG神经细胞上的钠离子通道。通过插管（如上所述）的方法注射荧光染料5(6)-羧基荧光素二乙酸酯(N-琥珀酰亚胺)酯(Sigma; 20μM,5μL)。染料注入动物之前，不注射其他药液；注射后大约30min，处死动物，切除L5 DRG和近端下腰椎脊髓的一部分，浸于冷冻切片包埋剂（Tissue-Tek O.C.T.），冻结，使用冷冻切片机分段(15μm)，片段在染色后使用共焦显微镜分析。

3.2 SP-TOX的体内镇痛实验结果

由于DRG神经元上的Nav1.7通道对于外周神经疼痛起关键作用，且SP-TOX能高效地抑制Nav1.7通道，我们检测了SP-TOX对福尔马林诱导的炎症疼痛的体内镇痛效果，在后爪注射2.5%福尔马林诱导两个时相的疼痛反应，I相（0-5min）主要与兴奋C类伤害性纤维TRPA1受体的定向活性有关，II相（15-30min）主要与中枢敏感性有关，在每个动物的脊髓囊内通过腰椎穿刺迅速地分别注射两个浓度（0.2nmol(4.5ug)和0.02nmol(0.45ug)）的SP-TOX，可以减少II相疼痛反应。

（1）注射0.2nmol的对照肽(SP-TOX-cc2ss)没有发现明显的镇痛效果，注射阴性对照或0.2nmol对照肽的大鼠的II相舔爪时间分别持续了320s和303s（不配对t检验，双侧P值：0.8）；

（2）然而注射0.2nmol或0.02nmol SP-TOX的舔爪时间持续149s和171s（与阴性对照相比分别减少了53%和47%；不配对t-检验，双侧P值:0.0048, 0.044）。SP-TOX没有改变I相总的舔爪持续时间(阴性对照: 110s, 0.2 nmol对照肽: 98s, 0.2 nmol SP-TOX:113s, 0.02 nmol SP-TOX: 102s)。

（3）已有的公开文献指出，3.5 nmol (1ug)鞘内的吗啡不管是在I相还是II相都不能产生镇痛效果，而10nmol (3ug) 吗啡缓解70%的II相疼痛，对I相疼痛没有效果。

综上，鞘内注射SP-TOX迅速地减少了II相炎症性疼痛，对I相疼痛没有作用，更高剂量的SP-TOX产生更强的镇痛效果，SP-TOX在减少II相疼痛方面比吗啡更有效（在摩尔水平上接近50倍）。

总结，本实施例中的融合蛋白SP-TOX与Ssm6a相比，结合/解离动力学更慢，原因可能为SP-TOX的大小为Ssm6a的三倍，与Nav1.7结合有更大的阻碍，然而一旦结合，融合蛋白以SEQ ID NO:2为模板的蛋白突变体部分的结构与DRG神经元的结合力更强，因此解离也就更慢。基于此动力学的改变，可以减少注射次数和剂量，因此也就减少了副作用，这是与Ssm6a相比的另一优势。

以上对本发明的一个实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，不能被认为用于限定本发明的实施范围。凡依本发明申请范围所作的均等变化与改进等，均应仍归属于本发明的专利涵盖范围之内。

Claims (9)

1.一种Nav1.7抑制剂，其特征在于：该抑制剂是序列为SEQ ID NO:1的融合蛋白。

2.根据权利要求1所述的一种Nav1.7抑制剂，其特征在于：该抑制剂在1μM的浓度下与DRG孵育后，在被冲洗的情况下至少能够在500s时间内保持钠电流抑制作用。

3.根据权利要求1所述的一种Nav1.7抑制剂，其特征在于：该融合蛋白能够在大肠杆菌胞内可溶表达，并保持生物学活性。

4.一种核酸，其特征在于：该核酸编码权利要求1所述的蛋白序列。

5.一种表达载体，其特征在于：载体中包含有权利要求4所述的核酸。

6.一种药物，其特征在于：该药物包含权利要求1所述的蛋白。

7.一种改造Nav1.7抑制剂多肽的方法，其特征在于：将能阻断Nav1.7电流的多肽SEQID NO:5与以SEQ ID NO:2为模板的蛋白突变体SEQ ID NO:3连接在一起，能够在大肠杆菌胞内可溶表达出能阻断Nav1.7电流的融合蛋白。

8.根据权利要求7所述的一种改造Nav1.7抑制剂多肽的方法，其特征在于：还采用了连接肽来连接Nav1.7抑制剂多肽SEQ ID NO:5和蛋白突变体SEQ ID NO:3。

9.根据权利要求8所述的一种改造Nav1.7抑制剂多肽的方法，其特征在于：连接肽的序列为GGGGS、GGSGG、GS、PSTSTST、EIDKPSQ及其多聚体之一。