CN105452457A - 用于治疗高胱氨酸尿症的胱硫醚β-合酶 - Google Patents
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Abstract
本发明提供使用人胱硫醚β-合酶(CBS)、其同源物、变体或突变体以治疗高胱氨酸尿症和其它相关疾病和病症的用于酶替代疗法的试剂和方法。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求保护2013年1月29日提交的美国临时申请号61/758,138和2013年3月14日提交的美国非临时申请号13/803,804的权益，其各自的公开内容通过引用结合到本文中。
发明领域
本发明总体上涉及适于酶替代疗法的组合物，其包含人胱硫醚β-合酶(CBS)形式，其可以显著地降低血清高半胱氨酸(Hcy)浓度和增加下游代谢物例如胱硫醚和半胱氨酸的产生。这样的组合物可用于治疗病况或疾病例如高胱氨酸尿症和高半胱氨酸再次甲基化障碍。
发明背景
CBS，在转硫作用途径中的一种重要的酶，在真核生物的高半胱氨酸(Hcy)代谢中起重要作用(Mudd等人,2001,载于THEMETABOLICANDMOLECULARBASESOFINHERITEDDISEASE,第8版，第2007-2056页,McGraw-Hill,NewYork)。CBS酶催化丝氨酸和高半胱氨酸的吡哆醛-5’-磷酸(PLP；维生素B6)-依赖性缩合以形成胱硫醚，该胱硫醚随后用于通过另一种PLP-依赖性酶(胱硫醚γ-裂解酶)产生半胱氨酸。当CBS活性急剧降低或不存在时，作为某些基因突变的结果，Hcy在组织和血液中构建。在具有转硫作用途径的哺乳动物细胞中，CBS在Hcy再甲基化为甲硫氨酸或其在半胱氨酸的生物合成中的备选用途之间占据了关键的调节位置。
在健康的正常个体中，CBS介导的从Hcy到胱硫醚的转化为从甲硫氨酸(Met)代谢成半胱氨酸(Cys)的限速中间步骤。维生素B6为此过程的必需辅酶。在CBS酶中具有某些基因突变的个体中，从Hcy到胱硫醚的转化变慢或缺失，导致酶底物(Hcy)的血清浓度升高以及在酶产物(胱硫醚；Cth)的血清浓度相应降低。升高的Hcy血清水平及其并发的向尿中的排泄的临床病况，统称为高胱氨酸尿症。
对于高胱氨酸尿症的患病率的估计差异很大。新生儿筛查和临床确认的数据提供1:200,000-1:335,000活产的范围(Mudd等人,2001)。来自丹麦、德国、挪威和捷克共和国的新生儿DNA筛查研究的近期证据显示真实发病率可能高达~1:6,000(Gaustadnes等人,1999,NEnglJMed.1340:1513；Linnebank等人,2001,ThrombHaemost.85:986；Refsum等人,2004,Clin.Chem.50:3；Sokolova等人,2001,HumMutat.18:548)。另外，近期工作已经指示CBS-缺陷型高胱氨酸尿症(CBSDH)个体具有精神病学的或心血管的并发症，但目前未经诊断，因为缺乏典型地有助于诊断的特征性结缔组织缺陷(Li和Stewart,1999,Pathol.31:221；Linnebank等人,2003,J.InheritedMetabol.Dis.26:509；Maclean等人,2002,HumMutat.19:641)。与CBSDH相关的主要健康问题包括：具有易于血栓形成倾向的心血管疾病，导致未经治疗和经部分治疗的患者中的高死亡率；以进行性近视和晶状体异位影响视觉系统的结缔组织问题；影响骨骼的结缔组织问题，其特征为马方综合征、骨质疏松症和脊柱侧凸；以及中枢神经系统问题，其包括智力迟钝和癫痫。
CBS相关的高胱氨酸尿症的治疗解决方法取决于CBS基因中存在的突变类型。迄今为止在人类中已经鉴定出CBS基因的大约160种致病性突变。与CBSDH相关的致病性突变的性质中有功能性三分法(functionaltrichotomy)。一组突变被归类为“吡哆醇-响应的”，其中CBS酶功能可以被高剂量维生素B6治疗恢复。该治疗可以是有效的，但在这些个体中并非总能减轻病理事件，在这些个体中一些事件甚至随时间而发生。第二组功能突变以“C-末端CBS突变体”为代表，其缺乏响应由S-腺苷甲硫氨酸所致的翻译后上调的能力。具有这类突变的个体通常缺乏智力迟钝和结缔组织方面的表型。在40岁之前的特发性血栓形成事件后检测血浆Hcy水平后检测到这类突变(Maclean等人,2002,HumMutat.19:641-55)。最后一组CBSDH突变是“传统的高胱氨酸尿症”，代表该病的最严重的形式。对于这后两组个体，单独的维生素B6治疗不能有效降低血清Hcy水平。
纯合的CBS缺乏的病理生理学无疑是复杂的，但有这样的共识：终末器官损伤的根本诱因(instigator)就是血清Hcy极度升高。在Hcy的血液和组织浓度上的极大升高的毒性可因Hcy本身的分子反应性和生物效应而产生，或者可因其影响大量生物过程的代谢物(例如Hcy-硫代内酯)而产生(Jakubowski等，2008，FASEBJ22:4071-6)。慢性血小板聚集的异常、血管参数的改变以及内皮机能障碍均已在患有高胱氨酸尿症的个体中描述。
目前对于CBSDH的治疗存在三种治疗选项：
1)在维生素B6响应的患者中使用药理学剂量的维生素B6来增加CBS活性的残余活性；
2)通过严格限制Met摄入的饮食来降低血清Hcy；和
3)通过甜菜碱介导的将Hcy转化成Met来解毒，从而降低血清Hcy浓度。
这3种疗法各自的目的在于降低血清Hcy浓度。对于受维生素B6无响应的CBSDH所累的个体的标准治疗由补充以代谢配方和Cys(其在此情况下已成为条件必需氨基酸)的Met-限制饮食组成。肉、乳制品以及富含天然蛋白质的其它食物的摄入被禁止。需要每日消耗难吃的含氨基酸和微量营养物的合成代谢配方，以防止继发性营养不良。补充甜菜碱(商品名：CYSTADANE?，同义词：三甲基甘氨酸)亦是标准疗法。甜菜碱充当用于在肝中通过甜菜碱-高半胱氨酸甲基转移酶催化的将Hcy再甲基化成Met的甲基供体(Wilcken等，1983，N.Engl.J.Med.309:448-53)。即便在提供最佳护理和资源的医疗中心中，饮食遵从性通常亦很差，并且这种非遵从性主要牵涉到高胱氨酸尿症的威胁生命的并发症的发展。
以上部分所述的证据概述为以下要点：
未经治疗的高胱氨酸尿症在血管、结缔组织和中枢神经系统中具有高的并发症率。
降低血清Hcy的治疗，例如严格Met限制饮食和甜菜碱，如果执行良好的话，减少相关临床问题。认知表现上的改善需要在婴儿早期开始治疗。
对饮食的遵从性一律很差。在新生儿期开始治疗的个体中，遵从性的减少发生在青春期。在新生儿期之后开始治疗的个体中，遵从性在所有年龄段都很差。目前治疗方法的极端困难在经历可通过饮食预防的威胁生命的症状、但仍然不能坚持该治疗的个体中是很显然的。
饮食遵从性的失败导致血清Hcy增加，血管和结缔组织的并发症包括致命和失能事件再现，并冒着严重副反应例如脑水肿(由于过度血清Met浓度)或严重营养不良(由于缺乏必需氨基酸)的风险。
最有效的治疗策略是增加酶活性，当将吡哆醇给予维生素B6响应的高胱氨酸尿症时是明显的。该策略对维生素B6非响应的个体是无能为力的，因为这些个体中的突变状态和增加的酶活性将取决于外源酶的递送，即酶替代疗法(ERT)(从未企图治疗高胱氨酸尿症的一项策略)。
在这三种现有治疗策略中具有已证明的功效：(1)在维生素B6响应的个体中用吡哆醇增加酶活性；(2)通过Met限制饮食减少累积代谢物；和(3)在甜菜碱治疗中通过甜菜碱-高半胱氨酸甲基转移酶的酶活性的解毒，所有都共同减低血浆中的总Hcy(Walter,等人,1998,EurJPediatr157(Suppl2):S71-6)。
另外，对于用于人类患者的所有现有治疗策略(除了B6补充，其仅适合一部分高胱氨酸尿症)，高半胱氨酸的减少并不伴随Cth或Cys的增加。因为尚未确定过量Hcy(而不是缺乏下游代谢物)是临床症状的原因，因此限制在减少高半胱氨酸的现有治疗对于提供稳健和有效治疗选项而言可能是不适当的。
因此，本领域仍然需要对于高胱氨酸尿症的个体的更有效的治疗策略。
发明概述
如本文所述，本发明提供用于尤其在高胱氨酸尿症的个体中降低血清Hcy的组合物、尤其是组合物、和方法。也提供的是组合物、尤其是药物组合物，其恢复基本正常的代谢物水平，所述代谢物包括但不限于甲硫氨酸，例如半胱氨酸和胱硫醚。如本文中更具体描述的那样，提供了用于高胱氨酸尿症的酶替代疗法(ERT)的试剂和方法，其中已对天然酶的修饰形式进行重组工程改造，通过尤其提供改善的稳定性、活性和体内药物效用，以改善其药用可接受性。
在第一方面，本发明提供包含SEQIDNO:02的分离的CBS多肽，其中所述分离的CBS多肽包含化学修饰并且是全长人CBS蛋白在氨基端、羧基端或在其氨基端和羧基端这两端经遗传工程改造的截短物。在一个实施方案中，本发明提供人CBS的工程改造变体，其构成C-末端调节区已被除去的重组人CBS(例如，rhCBSΔC-该rhCBSΔC在羧基端具有截短的138残基并包含全长蛋白的551个氨基酸的氨基酸1-413)(SEQIDNO:3)。在某些实施方案中，该种rhCBSΔC是突变的，在一个优选的实施方案中，截短的突变CBS是rhCBSΔC-C15S(或缩写为“C15S”-该C15S在羧基端具有截短的138残基；与rhCBSΔC相同)(SEQIDNO:13)，其中CBS氨基酸序列的位置15的半胱氨酸残基变为丝氨酸。在具体的实施方案中本文公开的包括已经化学修饰的、尤其是通过与C-末端截短的重组人CBS(尤其是rhCBSΔC)的聚乙二醇(PEG)部分共价连接的截短的重组人CBS种类。这些聚乙二醇化的种类分别称为PEG-rhCBSΔC或PEG-C15S。这些组合物(修饰的重组酶)和使用方法、尤其是如本文给出的治疗用途，使得高胱氨酸尿症的个体可享受少得多的限制饮食(例如每日摄取2g或更多的蛋白质/kg)，并具有显著降低的Hcy血浆水平和基本正常的代谢物水平(包括但不限于甲硫氨酸，例如半胱氨酸和胱硫醚)，导致长期的临床改善。
有利的是，本发明使个体能达到对血清Hcy水平的良好控制，而不用极端限制饮食，后者具有不可接受的不遵从率。使用所述截短的种类，尤其是突变种类，尤其是所述C15S突变体(聚乙二醇化的或同时突变和聚乙二醇化的)可有利地伴随个体的改善的代谢，并因此改善临床结果，这体现在尤其与显著降低的血清Hcy浓度相关的发病率和死亡率降低。
如本文公开的，C15S突变的人CBS种类有利地采用了这样的结构：其显著增加了在体内的药物利用(例如，无可检测的聚集水平)。C15S突变的人CBS种类也表现出高度可重现的表达、纯化和聚乙二醇化模式，并且C15S突变减少了聚集的形成，因此通过改进回收而改善了收率，并且能够更一致和可重现的聚乙二醇化。这些方面也可用于质量问题，这对于在体内应用之前的步骤特别相关。
如本文公开的，相比非聚乙二醇化的截短变体、尤其是所述rhCBSΔC或C15S种类，聚乙二醇化的种类有利地具有增加的大小，其中聚乙二醇化的种类有减少的或延迟的清除。另外，用PEG的化学修饰掩蔽了蛋白质表面上的潜在的免疫原性表位和阻碍了蛋白水解酶接近该蛋白质。聚乙二醇化也有利地改变了rhCBSΔC蛋白的理化性质，因此改变了其生物分布、稳定性和溶解度，而不显著地损失其效力。
根据以下发明详述和所附权利要求书，将会更充分地理解本发明的这些和其它特征和优势。注意，权利要求书的范围受到其中的详述限定，而不受本描述中给出的特征和优势的具体论述限定。
本发明的附图简述
当结合下列附图阅读时，可最好地理解本发明的实施方案的下列详述。
图1阐明了在rhCBSΔC聚乙二醇化后，血浆酶在体内的保留时间增加的实验证据。图1提供了在单次给予rhCBSΔC和聚乙二醇化的rhCBSΔC后的药代动力学概况及其在体内的稳定性的证据。图1a是显示实验结果的柱状图，其中经由腹膜内(IP)、血管内(IV)或皮下(SQ)途径给C57BL/6J小鼠注射5mg/kg体重的人截短CBS(rhCBSΔC)。将两个实验组(称为1和2)的各5只小鼠用于每种注射途径(总共n=30)。对于每种注射途径，在注射后0、1、8和24小时从组1采血，在注射后1、4、10和48小时从组2采血。用放射活性测定法(如实施例1所述)分析血浆的CBS活性。图1b是在CBS从循环中清除后，如图1a所述的每组的2只代表性小鼠血浆中的CBS的蛋白质印迹分析结果的照片。CBS在12%凝胶上的SDS-PAGE分离和蛋白质印迹到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜后，将膜用兔多克隆抗hCBS抗体探测，然后用缀合到辣根过氧化物酶的第二抗兔抗体探测，然后条带用SuperSignalWestPico化学发光底物(Pierce目录号34077)显色。图1c是显示实验结果的柱状图，其中经由SQ途径给小鼠注射5mg/kg体重的ME020MA-或GL4-400MA-聚乙二醇化的rhCBSΔC或非聚乙二醇化的rhCBSΔC。ME020MA代表用ME020MA聚乙二醇化的rhCBSΔC酶，GL4-400MA代表用GL4-400MA聚乙二醇化的rhCBSΔC酶，和rhCBSΔC代表未经修饰的rhCBSΔC酶。每一治疗方式包括2组各5只小鼠，如实施例2所述和图1A所示(总共30只小鼠)将其在指定时间点放血。用放射活性测定法分析血浆的CBS活性。
图2是柱状图，显示在重复SQ给予后达到的稳定水平的CBS活性。注射聚乙二醇化的、但不注射非聚乙二醇化的rhCBSΔC，表现出CBS活性在体内建立。GL4-400MA代表用GL4-400MA聚乙二醇化的rhCBSΔC酶，和rhCBSΔC代表未经修饰的rhCBSΔC酶。在0、24、48小时(箭头)给C57BL/6J小鼠注射5mg/kg体重的非聚乙二醇化的rhCBSΔC(n=5)或GL4-400MArhCBSΔC(n=5)并在指定时间点放血。用实施例1c所述的放射活性测定法分析血浆的CBS活性。
图3阐明了实验证据，表明单次注射聚乙二醇化的rhCBSΔC在血浆中降低高半胱氨酸和增加胱硫醚。图3a是图表，显示在单次SQ给予经指定类型的活化PEG修饰的rhCBSΔC之后，rhCBSΔC的PEG修饰延长了CBS酶活性的系统性存在。该图表显示实验结果，其中将27只C57BL/6J小鼠分为9个实验组(n=3)。给各实验组经由SQ途径注射5mg/kg体重的用指定PEG分子聚乙二醇化的rhCBSΔC，或注射非聚乙二醇化的酶。ME020MA代表用ME020MA聚乙二醇化的rhCBSΔC酶，ME050GS代表用ME050GS聚乙二醇化的rhCBSΔC酶，ME200GS代表用ME200GS聚乙二醇化的rhCBSΔC酶，200MA0B代表用200MA0B聚乙二醇化的rhCBSΔC酶，ME400MA代表用ME400MA聚乙二醇化的rhCBSΔC酶，GL2400MA代表用GL2400MA聚乙二醇化的rhCBSΔC酶，GL4400MA代表用GL4400MA聚乙二醇化的rhCBSΔC酶，GL2800MA代表用GL2800MA聚乙二醇化的rhCBSΔC酶，和rhCBSΔC代表非聚乙二醇化的rhCBSΔC酶。在指定时间点抽取血液样品并用实施例1c所述的放射活性测定法测定CBS酶活性。数据表示为具有标准偏差(STD)的直方图，和散点图。图3b是柱状图，显示在HO小鼠血浆中的Hcy、Cth、Cys和Met水平的天然昼夜变化。结果是在整个24小时周期中在指定时间点对6只HO小鼠(高胱氨酸尿症HO小鼠模型，描述于Maclean等人,2010,Mol.Genet.Metab.101:153-62)抽血的平均值。在实施例1e所述的各时间点，通过稳定同位素稀释液相色谱–质谱检测血浆氨基酸水平。
图3c是用ME-400MA(道1)、GL4-400MA(道2)或ME-200MA0B(道3)聚乙二醇化的rhCBSΔC的电泳分析结果的照片，与非聚乙二醇化的酶(道4)一起电泳分析，并用考马斯蓝染色(M指示分子量标准)。每种聚乙二醇化的和非聚乙二醇化的rhCBSΔC的比活(S.A.)示于表中。
图3d和3e是显示实验结果的柱状图，其中在0时经由SQ途径给HO小鼠注射一次已被指定PEG分子聚乙二醇化的rhCBSΔC，并在0时(注射前)、注射后24、48和72小时放血。指示各组(n=5-6)的血浆高半胱氨酸(d)和胱硫醚(e)水平。对图3D和3E，ME-200MA0B代表用ME-200MA0B聚乙二醇化的rhCBSΔC酶，ME-400MA代表用ME-400MA聚乙二醇化的rhCBSΔC酶，和GL4-400MA代表用GL4-400MA聚乙二醇化的rhCBSΔC酶。
图4阐明了以下实验证据：中断CBS治疗让氨基酸水平回到治疗前水平，然后重新开始重复注射聚乙二醇化的rhCBSΔC显著地影响高半胱氨酸和胱硫醚血浆水平，并恢复正常半胱氨酸水平。在第0、1、2、3和4天，给6只HO小鼠注射用GL4-400MAPEG聚乙二醇化的rhCBSΔC，接着是10天清除期，然后在第14、15、16、17和18天(箭头所示)再次注射。在以下各天抽取血浆样品(都在注射前)：第0、2、4、5、11、14、16、18、19、24和31天。为了比较，相同注射方案在注射非聚乙二醇化的酶的5只HO小鼠中进行。如实施例1e所述测定血浆代谢物水平。图4a是显示各HO小鼠的高半胱氨酸血浆浓度的结果的图，和图4b是显示胱硫醚血浆浓度的结果的图。图4c是显示在本研究中经治疗的HO小鼠的血浆中的高半胱氨酸和胱硫醚的平均浓度的图。图4d是显示相比非聚乙二醇化的rhCBSΔC(表示为0时的百分率)，在本研究中聚乙二醇化的rhCBSΔC对血浆高半胱氨酸水平的效应的图。GL4-400MA代表用GL4-400MA聚乙二醇化的rhCBSΔC酶，和rhCBSΔC代表未经修饰的rhCBSΔC酶。图4e是显示相比非聚乙二醇化的rhCBSΔC，在本研究中聚乙二醇化的rhCBSΔC对血浆半胱氨酸水平的效应的图。GL4-400MA代表用GL4-400MA聚乙二醇化的rhCBSΔC酶，和rhCBSΔC代表未经修饰的rhCBSΔC酶。
图5显示人截短CBS制剂(rhCBSΔC)的聚集程度的变异性。图5A是用rhCBSΔC的不同批次(112、13、7、27和28)的经考马斯蓝染色的4-15%非变性凝胶。注意rhCBSΔC的四聚体形式(T)和rhCBSΔC的二聚体形式(D)、以及更高形式的聚集CBS之间的不同比例。M表示分子量标记。图5B是非变性凝胶的胶内(in-gel)CBS活性测定，表明对于图5A中的rhCBSΔC批次112和28显示的条带，确实是CBS相关的。另外，注意rhCBSΔC的四聚体形式(T)和rhCBSΔC的二聚体形式(D)、以及更高形式的聚集CBS之间的不同比例。图5C是SDSPAGE凝胶(12%)，显示用ME-200MA0B(+)聚乙二醇化的2个不同的rhCBSΔC批次，表明在聚乙二醇化后形成的两种聚乙二醇化的种类(在聚乙二醇化的(+)道)之间的不同比例，而当不加PEG试剂时仅未经修饰的rhCBSΔC亚基存在(在非聚乙二醇化的(-)道)。
图6显示人C15S突变的CBS仅形成二聚体。图6A是非变性凝胶，其显示C15S突变的CBS仅形成二聚体，与形成二聚体(D)和四聚体(T)和更高寡聚体形式的重组人截短CBS(rhCBSΔC)相反。TCEP，一种还原剂，不影响C15S突变体的寡聚状态。M表示分子量标记。图6B是显示C15S突变的CBS的不同批次(51、60和73)的非变性凝胶，证明人C15S突变的CBS可重现地仅形成二聚体，与不用PEG(-)和用ME-200MA0B聚乙二醇化的(+)的rhCBSΔC和重组人双重截短物(批次RC-2-76；具有rhCBSΔC残基2-39额外缺失的构建体)相反。C15S或双重截短构建体的聚乙二醇化都产生一致的和可重现的条带，与rhCBSΔC相反，聚乙二醇化的条带之间具有类似比例。仅使用变性SDSPAGE，图6C与图6B相同。C15S产生可重现的聚乙二醇化模式，其不同于重组的人截短CBS(rhCBSΔC)。这也与图5C相当，显示不可重现的rhCBSΔC的聚乙二醇化模式。
图7显示rhCBSΔC(图7A)和C15S突变体(图7B)的大小排阻色谱(SEC)分析。图7提供额外指示，显示C15S突变体CBS仅以二聚体存在，因为来自5个不同纯化批次，产生可重现的单峰(图7B)。注意图7A中的rhCBSΔC的6种不同模式和图7B中的C15SCBS的单峰。
图8显示在2只HO小鼠中连续给予C15S突变体达20天，导致血浆高半胱氨酸的显著和持续减少。使用ALZET?泵给予C15S突变酶，将该酶连续给予小鼠，代替重复皮下注射。ALZET?泵,型号1002,平均泵速0.21微升/小时(母液浓度为26.2mg/mL)，平均填充体积106.6ul。在指定时间点给小鼠放血，然后分离血浆，通过质谱测定Hcy。
图9是显示实验结果的柱状图，其中在零时给HO小鼠注射单剂量(7.5mg/kg)的rhCBSΔC、C15S突变体(C15S)和双重截短构建体(双重截短)，其已用ME-200MA0B聚乙二醇化。在零时(注射前)和注射后24、48和72小时给小鼠放血。指示各组(n=5-6)的血浆高半胱氨酸水平。
发明详述
本文提供的是尤其适于药物组合物的人胱硫醚β-合酶(CBS)的形式、以及用于治疗高胱氨酸尿症的个体的方法，所述方法例如通过酶替代疗法(ERT)。
编码人CBS的核酸序列和编码它的氨基酸序列可得自GenBank检索号L19501，并且这些序列也公开于美国专利号5,523,225，其通过引用全部结合到本文中。CBS的编码序列在本文表示为SEQIDNO:1，是编码SEQIDNO:2的核酸序列，SEQIDNO:2是具有551个氨基酸残基的全长人CBS的氨基酸序列。编码CBS的基因组DNA的核酸序列也是通过序列数据库例如GenBank和科罗拉多-丹佛大学的Kraus实验室的网页(UniversityofColorado-DenverwebpageunderKrausLab)公开可得的。
本文使用的胱硫醚β-合酶蛋白(CBS蛋白)、尤其是人CBS蛋白的分离的截短形式，可包括但不限于，纯化的截短CBS蛋白、经化学切割和重组产生的截短CBS蛋白、和与其它蛋白缔合的分离的CBS蛋白。更具体地讲，本发明的分离的蛋白是已从其天然环境中移出(即已经经过人工操纵)的蛋白(包括多肽或肽)并且可包括例如纯化的蛋白、部分纯化的蛋白、重组产生的蛋白、和合成产生的蛋白。因此，“分离的”并不反映蛋白被纯化的程度。本发明的分离的截短CBS蛋白可以是在细胞例如细菌细胞中经重组而产生。另外，和举例说明，“人截短CBS蛋白”是指来自人(智人(Homosapiens))的截短CBS蛋白(如本文所述)或指这样的CBS蛋白：其已通过其它方式，根据结构(例如序列)的知识并且可能根据来自智人的天然存在的CBS蛋白的功能而产生。换句话说，人截短CBS蛋白包括如本文详述的有生物活性的截短人CBS蛋白。
本文使用的术语“变体”或“突变体”用于指不同于天然存在的蛋白或肽(即“原型”或“野生型”蛋白)的蛋白或肽，即通过改变天然存在的蛋白或肽，但其保留天然存在的形式的基本蛋白和侧链结构。这样的改变包括但不限于：在一个、几个或甚至若干个氨基酸侧链中的改变；在一个、几个或若干氨基酸中的改变(例如，位置15的半胱氨酸变为丝氨酸；C15S)；一个或几个原子立体化学的改变；和/或较小的衍生化，包括但不限于：甲基化、糖基化、磷酸化、乙酰化、肉豆蔻酰化、异戊烯化、棕榈酰化(palmitation)、酰胺化和/或添加糖基磷脂酰肌醇。与天然存在的蛋白或肽相比，“变体”或“突变体”可具有增强、减少、改变或基本上类似的性质。在具体的实施方案中，本发明提供截短CBS蛋白，其具有天然存在的CBS蛋白的C-末端缺失。
本文使用的术语“同源物”或“直向同源物”是指具有共同祖先的蛋白或DNA序列，并且可以是在不同物种中的基本相同的蛋白或DNA序列。同源和直向同源的蛋白和基因通常分别具有相似的氨基酸和核苷酸序列，或高度序列相似性(例如，同源蛋白可具有50%、60%、70%、80%、90%、95%或更高的氨基酸序列相似性)。
本发明的测定CBS蛋白表达水平的方法包括但不限于：在分离介质中的蛋白的考马斯蓝或银染，例如凝胶电泳、蛋白质印迹、免疫组织化学、其它基于免疫的测定法；基于蛋白质特性的测定法，包括但不限于，酶测定法、配体结合或与其它蛋白配偶体的相互作用。结合测定法也是本领域众所周知的。例如，BIAcore仪器可用于测定两种蛋白质之间的复合物的结合常数。当缓冲液通过芯片时，可通过监测折射率随时间的变化来测定复合物的离解常数。测定一种蛋白质与另一种的结合的其它合适的测定法包括，例如，免疫测定法例如酶联免疫吸附测定法(ELISA)和放射免疫测定法(RIA)，或通过荧光、紫外吸收、圆二色性或核磁共振(NMR)监测蛋白质的光谱学或光学性质的变化而测定结合。
在某些方面，CBS变体可包括N-末端缺失或修饰(例如，N-末端残基2-39或1-70的缺失)和C-末端缺失或修饰(例如，C-末端残基383-551、397-551、414-551、442-551、489-551、497-551、524-551、534-551或544-551的缺失)的任何组合，其描述于本文或美国专利号7,485,307和8,007,787，都通过引用结合到本文中。在另一实施方案中，额外修饰可以通过修饰其它氨基酸残基而实现，以提供与野生型CBS序列具有指定的%同一性。在具体的实施方案中，本发明的人CBS变体是截短的重组人CBS(rhCBSΔC)同型二聚体酶，其中C-末端调节区已被移除已被移除(SEQIDNO:3)。在其它实施方案中，本发明的人CBS变体是这样的rhCBSΔC：其中氨基酸位置15的半胱氨酸已突变为丝氨酸(C15S)(SEQIDNO:13)。
在本发明的其它实施方案中，本文所述的任何CBS变体在N-端具有不超过一个或两个非CBS氨基酸残基(即所述变体在N-端包含不超过一个或两个氨基酸残基，该残基不是天然存在的人胱硫醚β-合酶氨基酸序列在该位置的残基)。可以使用例如以下所述的重组CBS生产的新方法产生这样的变体。
在进一步的实施方案中，本发明的任何上述CBS变体、包括任何截短CBS蛋白，包含的氨基酸序列与SEQIDNO:2代表的野生型氨基酸序列或与其生物活性截短物具有至少大约50%同一性、或至少大约55%同一性、或至少大约60%同一性、或至少大约65%同一性、或至少大约70%同一性、或至少大约75%同一性、或至少大约80%同一性、或至少大约85%同一性、或至少大约90%同一性、或至少大约95%同一性、或至少大约96%同一性、或至少大约97%同一性、或至少大约98%同一性、或至少大约99%同一性；尤其包括非血红素-结合或非S-腺苷甲硫氨酸(AdoMet)结合，其中所述变体保留催化活性(例如，其中在AdoMet存在时某些截短形式的CBS的活性甚至可超过全长CBS)。在具体的实施方案中，本发明的人CBS变体是截短的重组人CBS(rhCBSΔC)同型二聚体酶，其中C-末端调节区已被移除(SEQIDNO:3)。在其它实施方案中，本发明的人CBS变体是截短的重组人CBS酶，其中氨基酸位置15的半胱氨酸已突变为丝氨酸(SEQIDNO:13)。
在某些实施方案中，本发明的CBS蛋白包含与SEQIDNO:2具有小于100%同一性的氨基酸序列，尤其是具有美国专利号8,007,787中给出的截短变体的氨基酸序列的其截短实施方案，和尤其是本文给出的SEQIDNO:3和SEQIDNO:13，和在具体的实施方案中在美国专利号8,007,787给出的截短变体的增长中具有小于99%序列同一性、小于98%序列同一性、小于97%序列同一性、小于96%序列同一性、小于95%序列同一性、小于94%序列同一性、小于93%序列同一性、小于92%序列同一性、小于91%序列同一性、小于90%序列同一性等等，和尤其是本文给出的SEQIDNO:3和SEQIDNO:13。
除非另有说明，否则本文使用的同一性百分率(%同一性)的提及是指使用包括但不限于以下的序列比对工具或程序而进行的对同源物的评价：(1)BLAST2.0BasicBLAST同源性搜索，对氨基酸搜索使用blastp，对核酸搜索使用blastn，用标准缺省参数，其中对于低复杂度区通过缺省来过滤查询序列；(2)BLAST2比对(使用下述参数)；(3)和/或PSI-BLAST，用标准缺省参数(位置-特异性重复BLAST)。注意，因为在BLAST2.0BasicBLAST和BLAST2之间的标准参数的一些差异，所以，两种特定序列在使用BLAST2程序时可能被识别为具有显著同源性，而在BLAST2.0BasicBLAST中使用所述序列中的一个作为查询序列进行搜索，可能不会确定该第二序列是最佳匹配。另外，PSI-BLAST提供了自动化、易于使用的“profile”搜索形式，这是寻找序列同源物的灵敏方式。该程序首先进行空位BLAST数据库搜索。PSI-BLAST程序采用来自任何重要比对的信息，返回构建位置特异性打分矩阵，其替代查询序列进行下一轮数据库搜索。因此，应当知道，可通过使用这些程序的任一种来确定%同一性。
CBS衍生物包括在本发明范围中。这类衍生物是经化学修饰的CBS多肽组合物，其中CBS多肽与聚合物连接。所选的聚合物通常是水溶性的，使得与其连接的蛋白质在水性环境中不沉淀并使得CBS酶在生物液体例如生理环境中具有生物活性。所述聚合物可以是任何分子量，并且可以是分枝或不分枝的。CBS多肽聚合物的范围中包括聚合物混合物。在具体的实施方案中，对于终产物制剂的治疗用途，所述聚合物将是药学上可接受的。
所述水溶性聚合物或其混合物可以是选自例如，聚乙二醇(PEG)、单甲氧基-聚乙二醇、葡聚糖(例如低分子量葡聚糖，例如大约6kDa的低分子量葡聚糖)、纤维素、或其它基于碳水化合物的聚合物、聚-(N-乙烯吡咯烷酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、聚氧化丙烯/氧化乙烯共聚物、聚氧乙烯多元醇(例如，甘油)、聚水杨酸和聚乙烯醇。本发明也包括双功能PEG交联分子，其可用于制备共价连接的CBS多肽多聚体。在一个实施方案中，聚乙二醇分子选自不分枝的和分枝的聚乙二醇，其中聚乙二醇分子的分子量等于或大于2000道尔顿。在另一个实施方案中，聚乙二醇分子的分子量范围为2–100kD、5–80kD或10–40kD。在再一个实施方案中，聚乙二醇分子选自ME-200MA0B、ME-020MA、ME-400MA、GL2-400MA、GL4-400MA、GL2-800MA、ME-050GS、ME-200GS、ME-200AL或MEPA-20T。
在具体的实施方案中，本发明提供截短的重组人CBS(rhCBSΔC)同型二聚体酶，其中C-末端调节区已被移除(SEQIDNO:3)，所述酶已经通过与聚乙二醇(PEG)共价连接而化学修饰，所述酶包括本文给出的“聚乙二醇化种类”。在本发明的其它实施方案中，本发明的人CBS变体是截短的重组人CBS酶，其中氨基酸位置15的半胱氨酸已突变为丝氨酸(SEQIDNO:13)，所述酶已经通过与聚乙二醇(PEG)共价连接而化学修饰，所述酶包括本文给出的“聚乙二醇化种类”。
用于聚乙二醇化反应以产生修饰的聚乙二醇化种类的各种PEG试剂的具体的实施方案见表1。
表1
| PEG名称 | 靶基团 | 分子量(道尔顿) |
| ME-200MA0B | -SH | 20,000 |
| ME-020MA | -SH | 2,000 |
| ME-400MA | -SH | 40,000 |
| GL2-400MA | -SH | 40,000 |
| GL4-400MA | -SH | 40,000 |
| GL2-800MA | -SH | 80,000 |
| ME-050GS | -NH2, -OH, -OH | 5,000 |
| ME-200GS | -NH2, -OH, -SH | 20,000 |
| ME-200AL | -NH2 | 20,000 |
| MEPA-20T | -COOH | 20,000 |
CBS多肽的聚乙二醇化可通过本领域已知的任何聚乙二醇化反应来进行。聚乙二醇化可以经由与如下所述的反应性聚乙二醇分子(或类似的反应性水溶性聚合物)的酰化反应或烷基化反应来进行。对于酰化反应，所选聚合物应具有单一反应性酯基团。对于还原性烷基化，所选聚合物应具有单一反应性醛基团。反应性醛是例如，聚乙二醇丙醛，其是水稳定性的，或其单C1-C10烷氧基或芳氧基衍生物。在一个实施方案中，所述聚乙二醇分子经由选自以下的连接基团与CBS连接：N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、胺、和由单醛组成的醛、单酸的单酯、单胺、单硫醇、单二硫化物、单溴碳酸苯酯、单氯碳酸苯酯、单氟碳酸苯酯、单硝基碳酸苯酯、单羰基咪唑、单酰肼、单碘乙酰胺、单马来酰亚胺、单邻二硫吡啶(monoorthopyridyldisulfide)、单肟、单苯基乙二醛、单噻唑烷-2-硫酮、单硫酯、单三嗪和单乙烯砜。
本文使用的一种水溶性聚合物是聚乙二醇，缩写为PEG。本文使用的聚乙二醇意图包括已用于衍生其它蛋白质的任何形式的PEG，例如单-(C1-C10)烷氧基-或芳氧基-聚乙二醇。
一般而言，化学衍生可在用于使生物活性物与活化聚合物分子反应的任何合适条件下进行。制备聚乙二醇化的CBS多肽的方法通常包含以下步骤：(a)在使CBS多肽与一个或多个PEG基团连接的条件下使所述多肽与聚乙二醇(例如PEG的反应性酯、胺、醛或马来酰亚胺衍生物)反应，和(b)得到反应产物。一般而言，酰化反应的最佳反应条件是根据已知参数和所需结果而决定。例如，PEG:蛋白质的比例越大，聚-聚乙二醇化的产物的百分率就越大。在一个具体方面，CBS多肽衍生物将在氨基端具有单个PEG部分。在具体的实施方案中，本发明提供的聚乙二醇化的CBS酶具有共价连接在所述组合物中的每个酶亚基上的平均大约1至大约10、更尤其是2至大约5和更尤其是3至5个PEG分子。
本发明的蛋白优选地是以“基本纯的”形式而回收、获得、和/或使用。本文使用的“基本纯的”是指允许所述蛋白在体外、离体或在体内依照本发明而有效使用的纯度。对于依照本发明用于在体外、离体或在体内方法的蛋白而言，它基本上不含污染物、其它蛋白和/或可能干扰或将会干扰其在本发明公开方法中的用途的化学物质，或当用于本发明公开的方法时至少对包含CBS蛋白(包括同源物)是不合需要的化学物质。这样的方法包括酶促反应(例如，产生胱硫醚)、治疗用组合物的制备、治疗用组合物的给予、和本文公开的所有其它方法。本文提及的“基本纯的”蛋白，是可通过任何方法(即通过自天然来源直接纯化、经重组、或合成)产生的并且从其它蛋白组分中纯化的蛋白，使得在指定组合物中所述蛋白包含总蛋白重量的至少大约80%重量(例如，所述CBS蛋白在溶液/组合物/缓冲液中为大约80%蛋白)，和更优选地在指定组合物中总蛋白重量的至少大约85%，和更优选地至少大约90%，和更优选地至少大约91%，和更优选地至少大约92%，和更优选地至少大约93%，和更优选地至少大约94%，和更优选地至少大约95%，和更优选地至少大约96%，和更优选地至少大约97%，和更优选地至少大约98%，和更优选地至少大约99%重量。在重组细菌中产生的所述CBS蛋白或其截短变体的实施方案中，术语“纯化的”或“基本纯的”将被理解为包括从脂多糖和其它热原性化合物中纯化。
本领域技术人员将会知道，使用重组DNA技术可通过操纵以下方面而改善对转染的核酸分子的表达控制：例如通过操纵宿主细胞中的核酸分子的拷贝数、所述核酸分子转录的效率、所得转录本的翻译效率、和翻译后修饰效率。另外，可对启动子序列进行遗传工程改造以改善相比天然启动子而言的表达水平。
用于控制核酸分子表达的重组技术包括但不限于将核酸分子整合到一个或多个宿主细胞染色体，将载体稳定性序列加入质粒、转录控制信号(例如，启动子、操纵子、增强子)的取代或修饰，翻译控制信号(例如，核糖体结合位点、Shine-Dalgarno序列)的取代或修饰，将核酸分子修饰为符合宿主细胞的密码子使用，以及使破坏转录本稳定性的序列缺失。
又一方面，本发明涉及用于重组产生和纯化人胱硫醚β-合酶的方法。所述方法包括以下步骤：将编码人CBS酶或其截短的或突变的变体的核酸序列克隆到表达载体中，所述序列如美国专利号8,007,787给出的和尤其是本文的SEQIDNO:4。在某些实施方案中，人CBS-编码序列已经修饰以利用用于在微生物例如大肠杆菌中表达的经优化的密码子。在其它实施方案中，所述载体包括：(a)将融合配偶体(例如，谷胱甘肽S-转移酶或GST)与有待表达的核酸序列连接在一起的克隆位点，和(b)蛋白酶切割识别位点，用于人鼻病毒3C蛋白酶(例如，可得自GEHealthcare，是被称为PreScission蛋白酶的融合蛋白)或用于使用类似切割位点的蛋白酶，用于在重组融合蛋白表达后从CBS蛋白上切割融合配偶体。作为本发明的一部分，表达载体首先经遗传修饰，用于特别引入CBS-编码核酸序列，其将导致CBS-融合蛋白的表达，其可经人鼻病毒3C蛋白酶切割，使得产生仅具有一个额外的非CBS的N-末端氨基酸残基的CBS蛋白。该结果不可能使用市售载体中的未经修饰的多克隆位点。将CBS-编码核酸序列引入经遗传修饰的载体，表达重组融合蛋白并将其纯化，使用常规方法或适合CBS生产的那些方法(参见例如美国专利号5,635,375,出处同上)，最终，融合配偶体和除了非CBS氨基酸残基以外都从CBS蛋白中切割，得到高度纯化的几乎完整的人重组CBS蛋白，其对于人用治疗用途而言是理想的。在特别有利的实施方案中，编码人CBS蛋白的核苷酸经工程改造为重组细胞的密码子使用频率，所述重组细胞是经重组制备的。这类实施方案的非限制性实在本文作为SEQIDNO:4给出，其中CBS-编码核酸经改造以适合在大肠杆菌中优化重组表达。
本发明的一些方面包括组合物，其包含本文所述的任何CBS变体，用于体外的胱硫醚或半胱氨酸的产生，以便在体外移除或产生硫化氢，或用于体内的治疗用途(例如，治疗或预防高胱氨酸尿症和与其相关的病况)。因此，本发明的另一实施方案涉及组合物，其包含分离的CBS蛋白和尤其是美国专利号8,007,787给出的其截短变体和尤其是本文所述的SEQIDNO:3或SEQIDNO:13。所述组合物典型地也包含药学上可接受的载体。所述组合物及其组分可用于本文所述的本发明的任何体外或治疗性实施方案。
本文使用的“HO”小鼠是传统高胱氨酸尿症的一种新的小鼠模型，其中所述小鼠cbs基因被灭活并表现出在人CBS启动子控制下的低水平的人CBS转基因的表达。该小鼠模型的Hcy、甲硫氨酸、S-腺苷甲硫氨酸、和S-腺苷高半胱氨酸的血浆和组织水平同时表现出严重升高并伴有半胱氨酸的血浆和肝水平的减少。参见Maclean等人,2010Mol.Genet.Metab.101:153-62)。
本发明的组合物可用于在体外产生胱硫醚和半胱氨酸或用于治疗可从增加的CBS活性获益的个体(例如，患有高胱氨酸尿症的个体)。
依照本发明，“药学上可接受的载体”包括药学上可接受的赋形剂和/或药学上可接受的递送媒介物，其适用于所述组合物给予至合适的体外、离体或体内部位。合适的体外、体内或离体部位优选包含其中需要调节CBS活性的任何部位。药学上可接受的载体能够将本发明蛋白或重组核酸分子保持这样的形式：在蛋白或重组核酸分子到达培养物或个体中的靶细胞或组织时，所述蛋白或重组核酸分子能够与其靶(例如，CBS的底物)相互作用。
本发明的合适的赋形剂包括转运或有助于转运、但不会将组合物特异性靶向细胞的赋形剂或制剂(在本文中也称为非靶向载体)。药学上可接受的赋形剂的实例包括但不限于水、磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液、葡萄糖溶液、含血清的溶液、Hank's溶液、其它水性的生理平衡溶液、油、酯和二醇。水性载体可包含接近受者的生理条件所需的合适的辅助物质，例如通过增强化学稳定性和等渗性来接近。本发明的组合物可通过常规方法来灭菌和/或冻干。
一类药学上可接受的载体包括控制释放制剂，其能够将本发明组合物缓慢释放到个体或培养基中。本文使用的控制释放制剂包含在控制释放媒介物中的本发明的化合物(例如，蛋白(包括同源物)、抗体、核酸分子、或模拟物)。合适的控制释放媒介物包括但不限于生物相容性聚合物、其它聚合物基质、胶囊、微胶囊、微粒、推注制剂、渗透泵(例如，ALZET?渗透泵)、扩散装置、脂质体、脂质球、和透皮递送系统。本发明的其它载体包括液体，当将其给予个体后，在原位形成固体或凝胶。在具体的实施方案中，载体也是生物可降解的(即生物可溶蚀的)。当所述化合物是重组核酸分子时，合适的载体包括但不限于脂质体、病毒载体或其它载体，包括核酶、金颗粒、聚-L-赖氨酸/DNA-分子缀合物、和人工染色体。含天然脂质的载体包括细胞和细胞膜。含人工脂质的载体包括脂质体和胶束。
本发明的载体可以经修饰以靶向个体的特定位点，从而靶向和将本发明蛋白用于该位点。能够靶向的药学上可接受的载体在本文中可也称为“递送媒介物”或“靶向载体”。合适的修饰包括操纵递送媒介物脂质部分的化学式和/或将能够将递送媒介物特异性靶向优选位点或靶位点(例如优选的细胞类型)的靶向剂引入媒介物。“靶位点”是指希望将组合物递送到的个体中的位点。或者，所述药学上可接受的载体可包含适合将所述CBS蛋白递送到动物(优选人)的血浆或血清中的试剂。合适的靶向化合物包括能够在特定位点选择性地(即特异性地)结合另一分子的配体。这类配体的实例包括抗体、抗原、受体和受体配体。操纵递送媒介物脂质部分的化学式，可调节递送媒介物的胞外或胞内靶向。例如，可将化学物加入到脂质体的脂质分子式中，这改变脂质体的脂双层的电荷，使脂质体与具有特定电荷特征的特定细胞融合。在具体的实施方案中，本发明的脂质体包括本领域技术人员已知的常用于例如蛋白质递送方法的那些脂质体。可使用本领域标准方法，实现将脂质体与本发明蛋白复合。
再一方面，本发明涉及通过调节CBS的表达和/或活性而调节生物过程包括胱硫醚产生的方法。该实施方案通常可包括使用(例如，给予)治疗用组合物，其包含一种或多种CBS变体，尤其美国专利号8,007,787给出的其截短CBS变体和尤其是本文所述的SEQIDNO:3或SEQIDNO:13，其可用于调节胱硫醚产生的方法，其可通过CBS的表达和生物活性介导或与CBS的表达和生物活性有关。
因此，在一个实施方案中，本发明的方法在动物和人类个体中调节胱硫醚产生，其中保护所述个体免患以下疾病或治疗所述疾病：所述疾病与胱硫醚产生的调节有关，例如高胱氨酸尿症和与其相关的病况/症状(例如，异位的眼睛晶状体、骨骼障碍、智力迟钝和早产动脉硬化和血栓形成)。本文使用的词语“保护...免患疾病”是指减少疾病症状；减少疾病的发生率，和/或降低疾病的严重程度。保护个体可以指本发明的治疗用组合物在给予个体时预防疾病发生和/或通过减轻疾病症状、征兆或原因而治愈或治疗疾病的能力。因此，保护个体免患疾病同时包括预防疾病的发生(预防性的治疗)和治疗患有疾病或经历疾病的最初症状或晚期症状的个体(治疗性治疗)。术语“疾病”是指个体正常健康的任何偏离并包括当疾病症状存在的状态，以及发生了偏离(例如，在非限制性实例中包括感染、基因突变、和遗传缺陷等)、但症状尚未显现的状况(例如，疾病前状况)。
更具体地讲，本文所述的治疗用组合物当通过本发明的方法给予个体时，优选地产生一个结果，其可包括减轻疾病(例如，减少疾病的至少一种症状或临床表现)，消除疾病，减轻由原发性疾病的发生所致的继发性疾病，或预防疾病。在另外的方面，给予治疗用组合物可以产生一个结果，其可包括在哺乳动物中增加转硫作用的下游代谢物的积累。
依照本发明，有效给药方案(即以有效方式给予治疗用组合物)包括合适的剂量参数和给药模式，其在个体中产生所需效果(例如，在个体中胱硫醚β-合酶活性增加或者丝氨酸和高半胱氨酸缩合以形成胱硫醚增加)，优选地保护个体免患疾病(例如，通过疾病预防或通过减轻进行中的疾病的一种或多种症状)。可使用本领域用于具体疾病的标准方法确定有效剂量参数。这样的方法包括例如确定生存率、副作用(即毒性)和疾病的进程或消退。
依照本发明，合适的单剂量大小是这样的剂量：当在合适时间段给予一次或多次时，导致正常蛋白质摄入的个体的CBS活性增加或控制Hcy水平或个体的胱硫醚或半胱氨酸形成的剂量，或导致个体病况的至少一种症状的改善的剂量。剂量可以不同，取决于所治疗的疾病。根据个体大小和给药途径，本领域技术人员可以容易地确定对于指定个体的合适的单剂量大小。
在本发明的某些实施方案中，本发明治疗用组合物的合适的单剂量是这样的量：当通过任何给药途径给予时，与未给予本发明治疗用组合物的个体相比(即预定对照个体或测定)，与给予所述组合物之前的个体相比，或与为具体疾病、个体类型和组合物而建立的标准相比，所述量如上所述地增加CBS活性。所给予的治疗用组合物在延长时间段具有酶活性。该时间段优选超过24小时。经化学修饰治疗用组合物在24小时后保留所给予组合物的起始活性的70%或更高。更优选所给予的治疗用组合物的酶促有效活性时间段超过48小时。甚至更优选所给予的治疗用组合物的酶促有效活性时间段超过72小时。在某些实施方案中，所述治疗用组合物可以在每天给予若干次(例如，2次、3次或更多次)或更低频率，包括但不限于每周一次、每两周一次、每月一次、每两月一次或更低频率。在其它实施方案中，所述治疗用组合物可以在数天、数周或数月连续给予。在本发明的另一实施方案中，合适剂量的本发明的治疗用组合物可以与甜菜碱(例如CYSTADANE?)、更松弛的蛋白质限制饮食、抗凝剂或他汀联合给予。
如上所述，将本发明的治疗用组合物给予个体，其方式能将所述组合物有效递送到细胞、组织和/或系统给予个体，藉此达到给予所述组合物的所需结果。合适的给予方案包括任何体内或离体给予方案。优选的给药途径是本领域技术人员显而易见的，取决于所预防或治疗的病症类型；所述组合物是否是基于核酸、基于蛋白质或基于细胞；和/或靶细胞/组织。对于蛋白质，体内给予方法包括胃肠外给予，尤其是包括但不限于，渗透泵给予、静脉内给予、腹膜内给予、肌内给予、节内给予、冠状动脉内给予、动脉内给予(例如，到颈动脉)、皮下给予、关节内给予、心室内给予、和直接注射到组织。可以采用递送途径的组合，并且在某些情况下这类组合可增强组合物的疗效。
许多上述给药途径，包括静脉内、腹膜内、皮内、肌内给予或通过渗透泵，可使用本领域标准方法来进行。
局部给药的一种方法是通过直接注射。直接注射技术尤其可用于将组合物给予到细胞或组织(其是通过外科手术可进入的)，和尤其是在体表上或其附近。将组合物局部给予靶细胞区内，是指将组合物注射到距离靶细胞或组织几厘米、和优选几毫米处。
局部给药的另一种方法是通过使用一个或多个渗透泵(例如，ALZET?渗透泵)，其允许在延长时间段(例如数周或数月)内稳定地递送药物。植入的渗透泵尤其可用于将组合物递送到细胞、组织或受试者(其是通过外科手术可进入的)，和尤其是在体表上或其附近。将组合物局部给予受试者的靶细胞或组织区内，是指将含有组合物的渗透泵植入到距离靶细胞或组织几厘米、和优选几毫米处。
在本发明的方法中，可将治疗用组合物给予脊椎动物类的哺乳动物的任何成员，包括但不限于灵长类、啮齿类、家畜和宠物。家畜包括消耗型哺乳动物或生产有用产物的哺乳动物(例如，用于生产羊毛的绵羊)。优选需要保护的个体包括人。
本发明的一些方面包括使用分离的CBS多肽或本文所述的任何CBS变体，用于制备非聚集的CBS衍生物。
本文所描述和/或引用的各参考文献均通过引用全部结合到本文中。
提供下列实施例是以说明为目的而无意限制本发明的范围。
实施例
实施例1:在细菌中产生截短的CBS蛋白质
a.在细菌中重组表达截短的CBS蛋白
构建缺少非保守区的特定部分的截短的人CBS变体(rhCBSΔC；SEQIDNo:3)并使用先前所述的基于大肠杆菌的表达系统过量表达(Kozich和Kraus，1992，出处同上)。编码所述截短的人CBS蛋白变体rhCBSΔC的构建体(编码rhCBSΔC的DNA示于SEQIDNO:4)通过修饰先前所述的pHCS3CBS表达构建体(Kozich和Kraus,1992,Hum.Mutat.1:113-123)来产生，所述构建体含有克隆到pKK388.1中的CBS全长编码序列(SEQIDNO:1)。为了产生C端缺失构建体，使用将SphI和KpnI位点分别掺入PCR产物的5’和3’各端的引物扩增跨越所需核苷酸残基的CBScDNA片段。然后使用SphI和KpnI切开所有PCR产物并通过连接到经SphI和KpnI消化的pHCS3载体来克隆。在CBScDNA中天然存在一个SphI位点，恰位于反义引物杂交位点的上游(碱基对位置1012，根据CBScDNA编号SEQIDNO:1)。然后使用NcoI和SphI消化如此产生的PCR产物并连接到经相同的酶切开的pHCS3质粒中。
pKKCBSΔ414-551
有义:5’-CGTAGAATTCACCTTTGCCCGCATGCTGAT(SEQIDNO:5)
(SphI限制位点为黑体)
反义:5’-TACGGGTACCTCAACGGAGGTGCCACCACCAGGGC(SEQIDNO:6)
(KpnI限制位点为黑体)
最后，将所述构建体转化到大肠杆菌BL21(Stratagene)中。按照制造商的说明书，通过使用ThermoSequenaseCy5.5测序试剂盒(AmershamPharmaciaBiotech)和VisibleGeneticsLong-ReadTowerSystem-V3.1DNA测序仪的DNA测序来验证构建体的可靠性。
对于CBS缺失突变体的细菌表达分析，依照先前所述(Maclean等人,2002,Hum.Mutat.19:641-55)，培养含CBS截短突变构建体的大肠杆菌BL21细胞，诱导表达并产生粗细胞裂解物。
也使用一种替代方法，在pET28a(+)载体中制备序列-优化的、截短的人CBS酶(rhCBSΔC；SEQIDNo:3)。对于细菌表达而优化全长(551aa)人CBS编码序列并将该序列克隆到pUC57载体，然后用GenScriptUSAInc.(NJ,USA)的EcoRV限制酶消化。再将CBS序列通过PCR扩增，使用引物A1和A2，产生编码截短酶的序列(aa1-413)：
引物:
A1
5’agtcgcCCATGGcgtcagaaaccccgcag3’(SEQIDNO:7)
NcoI限制位点在帽子(CAP)中。黑体G突变为C(对于脯氨酸)。
A2
5’atcgcgCTCGAGttagcgcaggtgccaccac3’(SEQIDNO:8)
XhoI限制位点在帽子(CAP)中，接着是TTA，是终止密码子。
再将PCR产物用限制酶NcoI和XhoI消化，并连接到已经相同酶消化的pET-28a(+)载体(可购自EMDMillipore,Billerica,MA)。克隆到pET-28a(+)的优化NcoI位点，相比CBS野生型序列，导致G→C突变(编码丙氨酸替代脯氨酸)。因此，使用引物B1和B2的定点诱变试剂盒(Stratagene,CA,USA)用于再次产生野生型序列，以编码脯氨酸：
B1
5’GGAGATATACCATGCcgtcagaaaccccgc3’(SEQIDNO:9)
B2
5’GCGGGGTTTCTGACGGCATGGTATATCTCC3’(SEQIDNO:10)
相同策略用于产生C15S突变体(T→A突变)，通过使用引物：
C15’-TGGGTCCGACGGGTAGCCCGCAC-3’(SEQIDNO:11)和
C25’-GTGCGGGCTACCCGTCGGACCCA–3’(SEQIDNO:12)。
通过测序证实经优化的rhCBSΔC和C15S突变体多核苷酸构建体的完整序列。
在pET-28a(+)载体中，截短CBS的表达受到上游T7启动子的控制，并且需要转化到DE3细菌中并通过IPTG诱导。
b.序列-优化的、截短的人CBS酶的表达
将携带编码截短的人CBS的序列的pET-28a(+)载体转化到DE3细菌，即HMS174(DE3)或BL-21(DE3)，并选择卡那霉素抗性克隆并作为母液甘油维持在-80℃，供进一步使用。
在37℃，将来自母液甘油的细菌在含有30ug/ml卡那霉素的5mlLuria-Bertani(LB)培养基中在275RPM旋转摇床上培养过夜。第二天早上，将1ml过夜培养物加入到含有30ug/ml卡那霉素的100mlTerrificBroth(TB)培养基中并如上所述地培养过夜。再将10ml过夜培养物加入到含有以下补充剂的1升TB培养基中：
0.001%盐酸硫胺素pH8.0
0.0025%盐酸吡哆醇pH8.0
0.3mMδ-(氨基乙酰丙酸)(δ-ALA)pH8.0
150μM氯化铁
30ug/ml卡那霉素
然后将1升培养物在30℃在275RPM旋转摇床上培养直到OD600值达到~0.6-0.7并通过加入1mMIPTG诱导蛋白质表达。再继续发酵额外16小时。然后通过在4℃在6000RCF离心10分钟收获细胞，用冰冷0.9%NaCl洗涤，如上所述再次离心，并在-80℃冷冻。
对于每克沉淀物，将等分试样的4.45ml裂解缓冲液(20mMNaH2PO4,pH=7.2,40mMNaCl,0.1mMPLP)加入到细胞沉淀物中，然后在杜恩斯匀浆器中匀浆直到看不见细胞团块。然后将匀浆用溶菌酶(最终2mg/ml)处理，在4℃在摇动平台上孵育1小时，经超声处理以降低粘度，并在53,000RCF离心。然后将包含可溶部分的上清液贮存于-80℃。
通过凝胶电泳、再通过考马斯凝胶染色证实表达水平，通过放射活性测定法测定比活。
c.CBS测定
通过先前所述的放射性同位素测定法，使用[14C]丝氨酸为标记底物，测定CBS活性(Kraus,1987,MethodsEnzymol.143,388-394)。通过Bradford程序(Bradford,1976,Anal.Biochem.72,248-254)，使用牛血清白蛋白(BSA)作为标准，测定蛋白质浓度。一个单位的活性定义为在1小时在37℃催化1μmol胱硫醚形成的CBS的量。
d.变性和非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和蛋白质印迹
如先前所述(Majtan等人,2010JBiolChem.2010；285(21):15866-73)，在变性和非变性条件下进行CBS样品的蛋白质印迹分析。
e.血浆代谢物的测定
基本上按照Allen等人(1993,SerumbetaineN,N-dimethylglycineandN-methylglycinelevelsinindividualswithcobalaminandfolatedeficiencyandrelatedinbornerrorsofmetabolism(在钴胺素和叶酸缺陷和相关先天性代谢缺陷个体中的血清甜菜碱N,N-二甲基甘氨酸和N-甲基甘氨酸水平),Metabolism42:1448–1460)所公开的，将稳定同位素稀释液相色谱–质谱方法用于测定小鼠血浆中的含硫氨基酸代谢化合物的水平。
实施例2
在rhCBSΔC聚乙二醇化后，增加了体内的血浆保留时间。
为了评价rhCBSΔC在血液循环中的保留时间和活性，进行了实验，其中经由腹膜内(IP)、血管内(IV)或皮下(SQ)途径给C57BL/6J小鼠注射5mg/kg体重的rhCBSΔC。为了避免过多出血，将两个实验组(称为1和2)的各5只小鼠用于每种注射途径(总共n=30)。对于每种注射途径，在注射后0、1、8和24小时从组1采血，在注射后1、4、10和48小时从组2采血。通过一次性使用的柳叶刀在下颌下给动物放血并将血液收集到CapijectT-MLHG肝素锂(12.5IU)管中，其中含有凝胶(TerumoMedicalCorporation,NJ,USA)。再将各管在1200G离心10min，然后将血浆收集到1.5ml管中并贮存于-80℃。
用实施例1给出的放射活性测定法分析血浆的CBS活性。对于注射酶在指定时间点的CBS酶活性见图1a。对于IP和IV途径，在注射后1小时记录到峰活性，而对于SQ途径，在注射后4小时记录到峰活性，因为从SQ区室较缓慢释放到循环中。引人关注的是，注射后8-10小时，对于所有注射途径，活性都相当，在注射后24-48小时几乎无活性。
为了监测rhCBSΔC从循环中清除是否可有助于如上所示的体内活性的快速损失，来自上述每组各2只代表性小鼠的血浆蛋白经过电泳分离，转移到PVDF膜上并与抗人CBS抗体反应，以追踪CBS从循环中的清除。如图1b所示，rhCBSΔC从循环中的逐渐清除是随注射后时间的推移而发生，早在注射后24小时就检测不到酶了。因此，rhCBSΔC的清除有助于所观察的体内活性的快速损失。
为了延长rhCBSΔC的保留时间，该酶经聚乙二醇(PEG)分子修饰(聚乙二醇化)，用ME-020MA或GL4-400MAPEG。活化的PEG衍生物购自NOFCorporation(Tokyo,Japan)。按照制造商的说明进行聚乙二醇化。例如，在4℃，在100mM磷酸盐缓冲液(pH=6)中过夜进行PEG马来酰亚胺衍生物与CBS(5mg/ml)的SH基团的偶联。PEG分子与CBS蛋白的摩尔比是10:1或5:1，取决于活化的PEG衍生物。
为了评价聚乙二醇化的rhCBSΔC的活性，经由SQ途径给C57BL/6J小鼠注射5mg/kg体重的ME020MA-或GL4-400MA-聚乙二醇化的rhCBSΔC或非聚乙二醇化的rhCBSΔC。每一治疗方式包括2组各5只小鼠(总共30只小鼠)，如上所述给其放血。用实施例1给出的放射活性测定法分析血浆的CBS活性。在注射后24h和48h，对于两种形式的聚乙二醇化的酶检出了显著活性，在24h具有GL4-400MA聚乙二醇化的rhCBSΔC活性峰，如图1c所示。这与非聚乙二醇化的rhCBSΔC形成强烈对比，表明在这些相同时间点低活性或无活性。这些结果指示rhCBSΔC酶的聚乙二醇化能有效延长其在体外和体内的活性。
实施例3
用聚乙二醇化的、但不用非聚乙二醇化的rhCBSΔC的重复注射方案，显示CBS活性在体内积累。
可以通过增加注射次数以维持较高血浆浓度而忽略蛋白质从循环中的快速清除率。因此，用非聚乙二醇化的和聚乙二醇化的rhCBSΔC测试了重复注射方案。在0、24、48小时(图2中的箭头)给C57BL/6J小鼠注射5mg/kg体重的非聚乙二醇化的rhCBSΔC(n=5)或GL4-400MArhCBSΔC(n=5)并在指定时间点放血。用实施例1所述的放射活性测定法分析血浆的CBS活性。如图2所示，非聚乙二醇化的酶的重复注射不导致循环中积累酶活性，结果在每次注射后24小时几乎无活性。相比之下，聚乙二醇化的酶的活性在两次注射后达到峰值，并达到高原。
实施例4
单次注射聚乙二醇化的rhCBSΔC在血浆中降低了高半胱氨酸和增加了胱硫醚。
在野生型小鼠中进行前述实施例并集中在所注射rhCBSΔC的清除和活性的表征上，以及聚乙二醇化的和非聚乙二醇化的酶之间的比较上。一旦确定聚乙二醇化延长了循环时间，首先在野生型小鼠中测试不同的一组聚乙二醇化的CBS酶分子，然后在高胱氨酸尿症小鼠模型中评价这些酶分子。
在野生型小鼠中测试了用不同PEG分子修饰的一组rhCBSΔC酶，以测定最佳聚乙二醇化策略。将27只C57BL/6J小鼠分为9个实验组(n=3)。每一实验组经由SQ途径注射5mg/kg体重的用图3中指定的PEG分子聚乙二醇化的rhCBSΔC，或注射非聚乙二醇化的酶。在图3所示的时间点采取血液样品和用实施例1给出的放射活性测定法测定聚乙二醇化的rhCBSΔC活性。数据见图3A，作为直方图，具有标准偏差(STD)，并且作为散点图。通常，用较高分子量的PEG(GL2800MA,80kDa；ME-400MA和GL2-400MA,40kDa；和ME200-MA0B,20kDa)进行聚乙二醇化，导致相比用大小小于20kDa的分子进行聚乙二醇化所观察到的更大的暴露，并且使用靶向半胱氨酸残基的化学的聚乙二醇化(称为“MA”以指示马来酰亚胺反应性基团的使用)通常导致相比用其它化学的聚乙二醇化所观察到的更大的暴露。
除了前述对HO小鼠的研究外，在这些小鼠中测定了高半胱氨酸、胱硫醚、半胱氨酸和甲硫氨酸的每日波动，以确定在这些动物中的这些氨基酸的日变化。因此，在24小时的周期内在图3B指定的时间点给6只HO小鼠抽血并对每一指定时间点测定血浆代谢物水平。如图3B所示，胱硫醚和半胱氨酸的水平在24小时的周期内大部分是恒定的。高半胱氨酸和甲硫氨酸水平倾向于自早上7:00到上午稍晚时间-下午的早期减少。这符合晚上进食和缺乏经由转硫途径的高半胱氨酸代谢能力的动物。因此，所有注射和放血都在15:00(3PM)进行，此时Hcy水平最低，从而测定是否治疗导致Hcy和其它代谢物的进一步减少。
聚乙二醇化的rhCBSΔC的分子量和比活(S.A.)是要表征的主要性质。在用ME-400MA(道1,图3C)、GL4-400MA(道2)或ME-200MA0B(道3)聚乙二醇化后，产物通过在12%SDS-PAGE凝胶上电泳分离并与非聚乙二醇化的酶(道4)进行比较。所得凝胶用考马斯蓝染色。每种聚乙二醇化的和非聚乙二醇化的rhCBSΔC的S.A.(U/mg)如图3C所附的表中所示。正如所示，聚乙二醇化对S.A.值无显著影响，并且所述酶仍保留与聚乙二醇化之前一样的活性。根据表观分子量，在本实验所用的条件下rhCBSΔC的聚乙二醇化产生二-和三-聚乙二醇化的rhCBSΔC。
本文所述的实验的总体目标是评价所给予的聚乙二醇化的rhCBSΔC的药效动力学参数。特别强调的是在CBS缺陷的高胱氨酸尿症动物模型中降低血浆高半胱氨酸和增加血浆胱硫醚。喂食正常鼠饮食的HO小鼠被选作模型系统，用于测试此类酶替代疗法(ERT)。在零时给HO小鼠一次注射用PEG分子(GL4-400MA、ME-400MA、ME-200MA0B)聚乙二醇化的rhCBSΔC，并在零时(注射前)、24、48和72小时放血。指出了每组(n=5-6)的血浆高半胱氨酸(图3D)和胱硫醚(图3E)水平。如图3D所示，相比零时，对于所用的每种聚乙二醇化的形式，高半胱氨酸水平都显著减少，而且胱硫醚水平(图3E)增加大约6至7倍。因此，发现在体内给予聚乙二醇化的rhCBSΔC显著地和确实地影响了高半胱氨酸和胱硫醚水平。
实施例5
重复注射聚乙二醇化的rhCBSΔC显著地影响了高半胱氨酸和胱硫醚血浆水平，并恢复了正常半胱氨酸水平。
如下进行了具有清除期的重复注射方案，比较了非聚乙二醇化的和聚乙二醇化的rhCBSΔC减少和维持低水平的高半胱氨酸以及增加胱硫醚和半胱氨酸水平的能力。在第0、1、2、3和4天给6只HO小鼠注射(箭头,图4)用GL4-400MAPEG聚乙二醇化的rhCBSΔC，接着是10天清除，然后在第14、15、16、17和18天再次注射。在图4所示的时间点抽取血浆样品(总是在注射之前)。为了比较，在注射了非聚乙二醇化的酶的5只HO小鼠中进行了相同注射方案。如实施例1e所述通过稳定同位素稀释液体色谱-质谱测定血浆代谢物水平。指出每只小鼠的高半胱氨酸(结果见图4a)和胱硫醚(图4b)血浆浓度。同样给出了每一实验组的高半胱氨酸和胱硫醚的平均值(在图4c中)。如图4a-4c所示，平均高半胱氨酸浓度在48小时内从182μM减少到38μM并在低值停留一整周。胱硫醚从零时的起始4.7μM开始，在48小时达到42μM的浓度，并在第一周保留高值。在清除期间，代谢物恢复到它们的起始值。随后CBS注射再次导致高半胱氨酸水平的急剧下降和胱硫醚水平的升高。然后，再次停止治疗导致这些参数恢复到未经治疗的水平。
相比非聚乙二醇化的rhCBSΔC，也测定了聚乙二醇化的rhCBSΔC对血浆高半胱氨酸水平的影响，如图4d所示作为在零时的百分率。图4d阐明了，当血液样品是在注射后24小时或更长时间时，相比聚乙二醇化的rhCBSΔC，非聚乙二醇化的酶对高半胱氨酸浓度无明显影响。这符合实施例2和3所示的结果，显示非聚乙二醇化的酶从循环中被快速清除掉，在注射后24小时和48小时无显著活性存在。
相比非聚乙二醇化的rhCBSΔC，使用相同实验方法，也测定了聚乙二醇化的rhCBSΔC对血浆半胱氨酸水平的影响。如图4E所示，在聚乙二醇化的酶注射期间，半胱氨酸水平正常化(与零时相比加倍)，而使用非聚乙二醇化的酶未观察到半胱氨酸水平的任何变化。
这些结果表明经SQ给予HO小鼠的聚乙二醇化的rhCBSΔC酶，显著地和确实地影响了高半胱氨酸和胱硫醚浓度，并在同时恢复半胱氨酸水平到它们的正常值。后一实验结果指示了在给予rhCBSΔC后活化了胞内转硫途径。
实施例6
人截短CBS制剂(rhCBSΔC)的聚集度的变异性。
用不同的批次(112、13、7、27和28)rhCBSΔC进行非变性PAGE凝胶(4-15%，即未加变性剂例如十二烷基硫酸钠)电泳。图5A所示结果表明不同制剂具有不同的四聚体(T)和二聚体(D)、和更高形式的聚集CBS的比例。在非变性聚丙烯酰胺凝胶(通过活性染色)中，通过在蛋白质样品上，在4℃进行电泳，测定胶内CBS活性(图5B)。然后将凝胶浸入活性染色液中(参见表A)并在37℃孵育大约15分钟。大约15分钟后，出现深灰色条带(1-413CBS种类的~45kDa二聚体)，取决于加载量。在长得多时间后可见四聚体；长达1小时或室温过夜。用该胶内活性方法分析非变性凝胶，如图5B所示，证实了四聚体(T)、二聚体(D)和其它更高聚集形式的rhCBSΔC的条带，表明在图5A中的批次112和28是CBS相关的。
表A.活性染色液
批次28和112及其聚乙二醇化的产物的SDSPAGE分析显示，用ME-200MA0B聚乙二醇化的rhCBSΔC批次显示出在聚乙二醇化后形成的两个聚乙二醇化的条带(P)之间的不同比例(参见图5C)。因此，找到了降低聚集和增加再现性的工具。
实施例7
人C15S突变体CBS仅形成二聚体。
在rhCBSΔC的位置15的半胱氨酸，是未偶联的，所以认为它是导致聚集形成的可能因素。因此，制备了一种新的重组质粒，用于产生rhCBSΔC突变蛋白，在本文中称为C15S。与实施例1b中用于制备rhCBSΔC的相同的策略用于产生C15S突变体CBS酶(T至A核苷酸突变)，通过使用引物：
C15’-TGGGTCCGACGGGTAGCCCGCAC–3’(SEQIDNO:11)和
C25’–GTGCGGGCTACCCGTCGGACCCA–3’(SEQIDNO:12)。
通过核苷酸测序证实C15S突变体CBS截短酶的完整核苷酸序列(SEQIDNO:14)。描述于实施例1的用于重组人CBS截短物的相同方法用于C15S突变体CBS酶的表达和分离。
分离的C15SCBS酶的非变性PAGE证明C15SCBS仅以二聚体存在(参见图6A)，不同于形成二聚体(D)和四聚体(T)、以及更高寡聚体形式的重组人截短CBS(rhCBSΔC)所得的结果。C15S突变体CBS的多个批次(51、60和73)和重组人双重截短物(批次RC-2-76)证明它们两者都仅形成二聚体，不同于重组人截短CBS(rhCBSΔC)(参见图6B)。用ME-200MA0B聚乙二醇化的C15S产生一致的和可重现的条带，在聚乙二醇化的条带之间具有相似比例。变性SDSPAGE显示C15S产生可重现的聚乙二醇化模式，其类似于重组人双重截短物(批次RC-2-76)并且这两者都不同于使用重组人截短CBS(rhCBSΔC)所获得的模式(图6C)。这也与图5C相当，显示非可重现的rhCBSΔC聚乙二醇化模式。
进行了CBS制剂的HPLC大小排阻色谱。重组人截短CBS(rhCBSΔC)(图7A)和C15S突变体(图7B)两者都在YarraSEC-3000,300x7.8mm大小排阻柱(Phenomenex,CA,USA)上分离。在室温下，将柱子在100mM磷酸钠pH=6.8中校准并操作，流速1ml/分钟。图7显示rhCBSΔC(图7A)和C15S突变体(图7B)的大小排阻色谱(SEC)分析。这些分析提供额外证据，证明C15S突变体CBS仅以二聚体存在，因为对于5个不同的批次都给出了可重现的单峰(参见图7B)。为了比较，注意图7A中的6种不同的模式的rhCBSΔC和图7B中的C15S突变体CBS的单峰。
实施例8
在2只HO小鼠中连续给予聚乙二醇化的C15S达20天，导致血浆高半胱氨酸减少。
ALZET?渗透泵允许在延长时间段稳定可控地递送C15S酶。使用ALZET?泵(Micro-osmoticALZET?泵,型号1002.批号10268-12)给予C15SCBS酶，以将C15SCBS酶连续递送给小鼠，代替重复皮下注射。在这些实验中，平均泵速为0.21ul/hr；平均填充体积为106.6ul；给泵装载大约106ul聚乙二醇化的C15SCBS酶，浓度为26.2ug/ul。在2只HO小鼠中连续给予C15SCBS达20天，导致血浆高半胱氨酸的起始的显著减少和随后的持续减少(参见图8)。
为了在操作前后减轻疼痛，在手术植入ALZET?泵前后48小时，动物随意接受在水瓶中的TYLENOL?(2mg/ml)。此外，在手术前48小时，每24小时经皮下给予动物卡洛芬5mg/kg。
对于动物麻醉和手术，通过吸入给予异氟烷。小鼠用5%异氟烷诱导并维持在2-3%。在小鼠被麻醉时，它们各自在生物安全橱中在无菌条件下接受植入医学级的ALZET?渗透泵。在颈部腹侧的松弛皮肤区中经皮下植入泵。植入泵之前，用BETADINE?给小鼠剃毛和备皮。泵的植入需要用无菌剪刀剪出一个小的手术切口(5mm)。切口用伤口夹封闭。在1周后当皮肤完全愈合时去掉夹子。就在泵植入前和在图8所示的时间，采集血液样品，用于测定高半胱氨酸水平。结果表明这种给予模式降低了高半胱氨酸水平，其方式类似于通过每日rhCBSΔC给予所达到的方式。使用非聚乙二醇化的C15S突变体CBS进行类似实验，结果是Hcy血浆水平无明显减少(结果未显示)。
实施例9
三种聚乙二醇化的截短人CBS酶的比较。
图9是显示实验结果的柱状图，其中在零时给HO小鼠注射单剂量(7.5mg/kg)的rhCBSΔC、C15S突变体(C15S)和双重截短构建体(双重截短物)，其已用ME-200MA0B聚乙二醇化。在零时(注射前)和注射后24、48和72小时给小鼠放血。指示各组(n=5-6)的血浆高半胱氨酸水平。结果显示所有3种酶形式都导致Hcy血浆浓度的相当的减少。
表2:CBS序列
已经详细地描述了本发明并参考其具体的实施方案，显然，修饰和变动是可能的，只要不违背所附权利要求书中定义的本发明的范围。更具体地讲，尽管本发明的一些方面在本文中被认为是尤其有利的，但预计本发明不必限制在本发明的这些具体方面。
Claims (46)
1.包含SEQIDNO:02的分离的胱硫醚-β-合酶(CBS)多肽或其同源物、变体或突变体，其中所述分离的CBS多肽经化学修饰并包含全长人CBS蛋白在氨基端、羧基端或在氨基和羧基末端这两端的截短物。
2.权利要求1的分离的CBS多肽，其中所述分离的CBS多肽是经遗传工程改造的截短物，其缺失C-末端残基383-551、397-551、414-551、442-551、489-551、497-551、524-551、534-551或544-551。
3.权利要求2的分离的CBS多肽，其中所述分离的CBS多肽包含C-末端残基414-551的缺失。
4.权利要求1-3中任一项的分离的CBS多肽，其中所述分离的CBS多肽是经遗传工程改造的截短物，其选自N-末端残基2-39或1-70缺失。
5.权利要求1的分离的CBS多肽，其中所述分离的CBS多肽包含氨基酸位置15的半胱氨酸至丝氨酸的改变。
6.权利要求5的分离的CBS多肽，其中所述包含氨基酸位置15的半胱氨酸至丝氨酸的改变的分离的CBS多肽是经遗传工程改造的截短物，其选自C-末端残基383-551、397-551、414-551、442-551、489-551、497-551、524-551、534-551或544-551的缺失。
7.权利要求6的分离的CBS多肽，其中所述包含氨基酸位置15的半胱氨酸至丝氨酸的改变的分离的CBS多肽也包含C-末端残基414-551缺失(SEQIDNO:13)。
8.包含SEQIDNO:02的分离的CBS多肽或其同源物，其中所述分离的CBS多肽包含氨基酸位置15的半胱氨酸至丝氨酸的改变，和其中所述分离的CBS多肽经化学修饰。
9.权利要求1-8中任一项的分离的CBS多肽，其中所述CBS多肽与一个或多个聚乙二醇分子共价连接。
10.权利要求9的分离的CBS多肽，其中所述聚乙二醇分子选自不分枝和分枝的聚乙二醇。
11.权利要求10的分离的CBS多肽，其中所述聚乙二醇分子的分子量等于或大于2000道尔顿。
12.权利要求11的分离的CBS多肽，其中所述聚乙二醇分子的分子量范围为5–80kD。
13.权利要求11的分离的CBS多肽，其中所述聚乙二醇分子优选具有的分子量范围为10–40kD。
14.权利要求11的分离的CBS多肽，其中所述聚乙二醇分子是ME-200MA0B、ME-020MA、ME-400MA、GL2-400MA、GL4-400MA、GL2-800MA、ME-050GS、ME-200GS、ME-200AL或MEPA-20T。
15.权利要求8-14中任一项的分离的CBS多肽，其中所述聚乙二醇分子经由选自以下的连接基团与CBS连接：NHS、胺、和由单醛组成的醛、单酸的单酯、单胺、单硫醇、单二硫化物、单溴碳酸苯酯、单氯碳酸苯酯、单氟碳酸苯酯、单硝基碳酸苯酯、单羰基咪唑、单酰肼、单碘乙酰胺、单马来酰亚胺、单邻二硫吡啶(monoorthopyridyldisulfide)、单肟、单苯基乙二醛、单噻唑烷-2-硫酮、单硫酯、单三嗪和单乙烯砜。
16.权利要求1-15中任一项的分离的CBS多肽，其中所述CBS多肽在S-腺苷甲硫氨酸(AdoMet)不存在时具有活性。
17.包含权利要求1-16中任一项的分离的CBS多肽的药物组合物，其包含治疗有效量的所述多肽、其同源物、变体或突变体以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
18.权利要求1-17的药物组合物，其在24小时后保留所给予组合物的起始活性的70%或更高。
19.权利要求17的药物组合物，其在24小时后保留所给予组合物的起始活性的70%或更高。
20.权利要求17-19中任一项的药物组合物，其中所述CBS多肽与一个或多个聚乙二醇分子共价连接。
21.用于在有需要的个体中降低高半胱氨酸的方法，包括给予权利要求1-20中任一项的分离的CBS多肽。
22.权利要求21的方法，其中所述分离的CBS多肽经植入的渗透泵、静脉内注射、皮下注射、或腹膜内注射给予。
23.权利要求21的方法，其中所述分离的CBS多肽经皮下注射给予。
24.权利要求21的方法，其中所述分离的CBS多肽经植入的渗透泵给予。
25.权利要求21-24中任一项的方法，其中所述分离的CBS多肽包含其中给予0.1mg/kg–20mg/kg的所述分离的CBS多肽的量。
26.用于在有需要的个体中升高胱硫醚或半胱氨酸的方法，包括给予权利要求1-20中任一项的分离的CBS多肽。
27.权利要求26的方法，进一步包括给予抗凝剂、他汀或松弛的蛋白质限制饮食、茴香脑二硫杂环戊二烯硫酮(anetholedithiolethione)或甜菜碱中的一种或多种。
28.权利要求26的方法，其中所述分离的CBS多肽经植入的渗透泵、静脉内注射、皮下注射、或腹膜内注射给予。
29.权利要求26的方法，其中所述分离的CBS多肽经静脉内注射给予。
30.权利要求26的方法，其中所述分离的CBS多肽经渗透泵给予。
31.权利要求26-30中任一项的方法，其中所述分离的CBS多肽包含其中给予有需要的个体至多20mg/kg的所述分离的CBS多肽的量。
32.用于治疗或改善与升高的高半胱氨酸、甲硫氨酸、S-腺苷甲硫氨酸和S-腺苷高半胱氨酸以及低胱硫醚和半胱氨酸水平相关的疾病、病症或病况的方法，包括给予有需要的个体药用有效量的权利要求1-20中任一项的分离的CBS多肽。
33.权利要求32的方法，其中所述与升高的高半胱氨酸相关的疾病、病症或病况是智力迟钝、骨质疏松症、晶状体异位、脊柱后侧凸、中风、心肌梗塞、或肺栓塞。
34.权利要求32的方法，其中所述分离的CBS多肽包含其中经胃肠外注射给予至多20mg/kg的所述分离的CBS多肽的量。
35.权利要求32的方法，其中所述分离的CBS多肽包含其中经植入的渗透泵给予至多20mg/kg的所述分离的CBS多肽的量。
36.权利要求32的方法，进一步包括给予茴香脑二硫杂环戊二烯硫酮或甜菜碱。
37.权利要求32的方法，其中每天2次给予甜菜碱。
38.用于预防与升高的高半胱氨酸相关的疾病、病症或病况的方法，包括给予有需要的个体药用有效量的权利要求1-20中任一项的分离的CBS多肽。
39.权利要求38的方法，其中所述与升高的高半胱氨酸相关的疾病、病症或病况是智力迟钝、骨质疏松症、晶状体异位、脊柱后侧凸、中风、心肌梗塞、或肺栓塞。
40.权利要求38的方法，其中所述分离的CBS多肽包含其中给予有需要的个体至多20mg/kg的所述分离的CBS多肽的量。
41.权利要求38的方法，进一步包括给予茴香脑二硫杂环戊二烯硫酮或甜菜碱。
42.权利要求38的方法，其中每天2次给予甜菜碱。
43.权利要求1-20中任一项的分离的CBS多肽在制备用于治疗或改善与升高的高半胱氨酸相关的疾病、病症或病况的药物中的用途。
44.权利要求43的用途，其中所述与升高的高半胱氨酸相关的疾病、病症或病况是智力迟钝、骨质疏松症、晶状体异位、脊柱后侧凸、中风、心肌梗塞、或肺栓塞。
45.权利要求43的用途，其中所述药物进一步包含茴香脑二硫杂环戊二烯硫酮或甜菜碱。
46.权利要求43的用途，进一步包括对松弛的蛋白质限制饮食的限制。
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