KR100262247B1 - 클로닝된 글루탐산 탈탄산 효소 - Google Patents

Abstract

본 발명은 자가 면역 질환을 개선하는데 사용되는 분리된 폴리펩티드에 관한 것이다.

Description

클로닝된 글루탐산 탈탄산 효소

제1도는 GAD₆₅및 GAD₆₇특이성 cDNA 프로브를 수득하기 위한 클로닝 전략이다.

제2도는 래트 GAD₆₅의 DNA 서열 및 대응 아미노산 서열이다.

제3도는 인간의 GAD₆₅의 DNA 서열 및 대응 아미노산 서열이다.

제4도는 래트 GAD₆₅와 인간의 GAD₆₅아미노산 서열을 비교한 것이다.

제5도는 GAD₆₅및 GAD₆₇의 cDNA들을 여러 크기의 RNA에 하이브리드화시킨 노던 블롯(Northern blot)이다.

제6도는 GAD₆₅및 GAD₆₇에 특이적인 cDNA 프로브를 하이브리드화시킨 서던 블롯(Southern blot)을 나타낸 것이다.

제7도는 GAD₆₅및 GAD₆₇를 면역학적으로 확인한 면역학적 블롯(immunoblot)을 나타낸 것이다.

본 발명은 1990.9.21에 출원된 미국 일련번호 07/586,536의 CIP 출원이다.

본 발명은 승인번호 NS22256호로서 미국 국립 위생연구소로부터 지원받았다. 따라서, 미국 정부는 본 발명에 대해 일정 권리를 갖고 있다.

본 발명은 GAD₆₅폴리펩티드의 발현을 위해 글루탐산 탈탄산효소₆₅(GAD₆₅)를 가지고 숙주 세포를 형질 전환하기 위해 재조합 DNA 기술을 사용하는 것에 관한 것이다. 또한 자가면역 질병에 GAD₆₅폴리펩티드를 진단적 치료요법적으로 사용하는 방법을 포함한다.

인슐린 의존적인 진성 당뇨병(IDDM:타입 I 당뇨병)은 가장 보편적인 대사질환중 하나이다. 미국에서, IDDM은 300 내지 400 명중 약 1명에게서 발병하며, 유행병학 연구에 의하면 그 빈도가 증가하고 있다고 보고되고 있다.

이 질병은 췌장의 인슐린-생성 β-세포의 자가면역 파괴에 의해 발병한다. 더욱 특이적으로, 개시전단계는 임파구가 췌장도에 침투하여 상기 β-세포를 선택적으로 파괴하는 "인슐린염"의 특징을 나타낸다. 고혈당증의 전형적인 IDDM 발현은 인슐린 생성 β-세포의 적어도 80%가 손상된 후에만 나타난다. 잔존 β-세포는 다음 몇년 동안에 파괴된다.

인슐린 요법은 대부분의 IDDM 환자들이 정상 생활을 할 수 있도록 할지라도, 이런 대치 요법은 불완전하고 대사 항상성을 완전하게 회복시킬 수 없다.

그러므로, 눈, 신장, 심장 및 다른 기관들의 기능부전을 초래하는 심각한 합병증이 인슐린 치료를 받는 IDDM 환자들에게 일반적이다.

이 때문에, β-세포 파괴의 시작시기와 인슐린 대치의 실제적인 요구시기(즉, 상기 β-세포의 80%가 파괴된 시기) 사이의 잠복 기간을 확장시키는 것(예, 면역 억제제의 투여)이 매우 바람직하다. 그러므로, β-세포가 파괴되기 시작하는 시기를 결정하는 진단 시험에 의해 임상의들이 상기 잠복기간을 연장하기 위해 면역 억제제를 투여할 것이며(Silverstein 등, New England Journal of Medicine, 319: 599-604, 1988)이로써 인슐린 대치 부작용 개시가 크게 지연될 것이다.

많은 IDDM 환자들은 64 kD 분자(Baekkeskov 등, J. Clin,Invest., 79: 926-934, 1987; Atkinson, 등, Lancet, 335: 1357-1360, 1990), 세포질도(islet cell cytoplasm: ICA)분자 또는 세포표면도(islet cell surface: ICSA) 분자(Bottazzo, 등, Lancet, 1: 668-672, 1980), 또는 인슐린(Palmer, 등, Science, 222: 1137-1139, 1983: Akinson, 등, Diabetes, 35 : 894-898, 1986)에 대한 항체를 포함하는 혈청을 가지고 있다. 애트킨슨(Atkinson) 및 공동연구자들은 인간의 혈청중에 상기 64kD 분자에 대한 항체의 존재가 IDDM 증상의 개시가 실제로 일어날 것임을 나타내는 가장 빠르고 가장 신뢰성이 있는 지시인자인 것으로 나타난다는 것을 증명했다(Atkinson, 등, Lancct, 335: 1357-1360, 1990).

최근, 베케스코브(Baekkeskov) 및 공동연구자들은 상기 64kD 분자 및 글루탐산 탈탄산효소(GAD)가 공통적으로 여러개의 항원성 에피토프를 가지므로 이들은 동일하거나 매우 유사한 분자일 것이라는 것을 확립했다. 이러한 증명이 중요한 발견일지라도, IDDM을 예측하는 진단적 도구로서 상기 정보를 사용하는 것은 GAD의 분자생물학 정보가 알려지지 않는 한 매우 성가시고 제한된 것이다. 결과적으로, 상기 64kD 분자 또는 64kD 분자와 항원성이 거의 동일한 GAD 분자의 클로닝 및 연속적인 다량 생산으로 IDDM을 예측하도록 설계된 진단 킷트를 개발할 수 있을 것이다. 본 발명은 이 결과를 수행하는 수단을 제공한다.

본 발명은 재조합 DNA 기술로 진핵성 GAD₆₅폴리펩티드를 생산할 수 있고 이 GAD₆₅폴리팹티드가 자가면역 환자들의 진단 및 치료법에 사용될 수 있다는 발견으로부터 시작되었다. 특히 인슐린 의존적인 진성 당뇨병(IDDM)을 가지고 있는, 또는 가질 위험성 있는 환자들의 진단에 클로닝된 진핵성 GAD₆₅폴리펩티드를 사용하는 것과 관련된 것이다.

본 발명의 주요한 장점은 천연원으로부터 정제된 진핵성 GAD₆₅폴리펩티드에 상응하는 진핵성 GAD₆₅폴리펩티드의 인공원을 제공함으로써 다른 진핵성 비-GAD₆₅폴리펩티드로부터 천연 진핵성 GAD₆₅폴리펩티드를 분리할 때 관련된 문제를 피할 수 있다는 점이다. 이러한 다른 진핵성 비-GAD₆₅폴리펩티드의 부재는 GAD₆₅폴리펩티드와 특이적으로 반응하는 항체만을 감지하는 테스트 시스템을 개발할 수 있다는 점에서 종요하다.

숙주 세포에 진핵성 GAD₆₅폴리펩티드를 제공하는 데 있어서 또 다른 장점은 그렇게함으로써, 현재 천연원으로부터 실제적으로 사용할 수 있는 것보다 더 많은 양의 폴리펩티드를 수득할 수 있다는 것이다. 결과적으로, 본 발명의 폴리펩티드를 사용하여 IDDM 같은 자가면역질환을 가진 환자를 더욱 신속하게 분류할 뿐만 아니라, 또한 현재 진단 시스템에 사용하기 위한 GAD₆₅폴리펩티드의 시판용 양을 제공하는 것이 가능하다.

본 발명은 재조합 기술에 의해 유전자 재료를 조작하여 글루탐산 탈탄산효소₆₅(GAD₆₅)에 대한 자가항체에 결합하는 하나 이상의 에피토프의 1차 구조중 부분 또는 전체를 포함하는 폴리펩티드를 생성하는 것에 관한 것이다.

이러한 자가항체들은 인슐린 의존적인 진성 당뇨병 및 "스티프 맨"("stiff man") 증상과 같은 자가 면역 질환의 지표이므로 이들 폴리펩티드들은 이들과 반응성이 있는 자가항체의 면역학적 감지에 매우 유용하다. 이들 폴리펩티드들은 GAD 기능을 변화시키는 것과 같은 선별약제용, 및 GAD₆₅를 검출하는데 진단용으로 사용할 수 있는 폴리클로날 항체 및 모노클로날 항체의 생성에 사용될 수 있다.

DNA 벡터내로 접목시키기 위한 진핵성 GAD₆₅폴리펩티드를 암호화하는 특이적인 DNA 서열의 개발은 다양한 기술방법으로 실시될 수 있다. 예를 들어, 사용할 수 있는 대안적인 방법은 (1) 진핵 세포의 게놈 DNA로부터 2본쇄 DNA 서열의 분리; (2) 목적하는 폴리펩티드를 위해 필요한 코돈을 제공하기 위한 DNA 서열의 화학적 제조; 및 (3) 진핵성 공급체 세포로부터 분리된 mRNA의 역전사에 의한 2본쇄 DNA 서열의 시험관내 합성을 포함한다. (3)의 경우에, 사실상 mRNA의 2본쇄 DNA 본체가 형성되며 일반적으로 cDNA라고 한다.

DNA 서열의 제조는 목적하는 폴리펩티드 생성물의 아미노산 잔기의 전체 서열이 알려져 있을 때 흔히 선택되는 방법이다. 목적하는 폴리펩티드의 전체 아미노산 잔기의 서열이 밝혀지지 않았을 때는, DNA 서열을 직접적으로 재조할 수는 없으며 선택할 수 있는 방법은 cDNA 서열을 제조하는 것이다. 목적하는 cDNA 서열 분리하는 표준 방법중에서 유전자 발현율이 높은 공여체 세포내에 풍부한 mRNA를 역전사하여 유도된 플라스미드-운반 cDNA 라이브러리를 제조하는 방법이 있다. 이 방법을 중합체 효소 연쇄 반응(polymerase chain reaction)의 방법과 함께 혼합하여 사용할 때, 발현율이 낮은 생성물도 클로닝될 수 있다. 상기 폴리펩티드의 아미노산 서열중 상당 부분이 공지된 경우에는, 표적 cDNA중에 존재할 것으로 추정되는 서열을 가지며 표지된 단일 또는 이중 가닥 DNA 또는 RNA 프로브 서열을 제조하여, 단일 가닥의 형태로 변성된 cDNA의 클로닝된 복제물에서 실시되는 DNA/DNA 하이브리드화 방법에서 사용할 수 있다(Jay 등, Nucleic Acid Research, 11: 2325, 1983).

하이브리드화 방법은 표지된 합성 올리고누클레오티드 프로프의 흔합물을 사용하여 재조합 클론을 선별하는데 사용되며 이때 각 프로브는 변성된 이중가닥 DNA의 헤테로성 혼합물을 포함하는 하이브리드화 시료중의 특정 DNA 서열의 완전한 보체일 것이다. 이런 선별 방법에서, 하이브리드화는 단일 가닥의 DNA 또는 변성된 이중 가닥의 DNA 중 어느 하나로 실시하는 것이 바람직하다. 이 방법들은 목적하는 폴리펩티드에 대한 mRNA 서열이 매우 소량 존재하는 근원으로부터 유도된 cDNA 클론을 검출하는 데 특히 유용하다. 즉, 비특이성 결합이 이루어지지 않도록 엄격한 하이브리드화 조건을 사용함으로써, 예를 들어 상기 표적 DNA가 이것의 완전 보체인 상기 혼합물중의 하나의 프로브와 하이브리드화함으로써 특정의 cDNA 클론을 자동방사선 사진으로 시각화시킬 수 있다(Wallace 등, Nucleic Acid Research, 9: 879, 1981).

부가적으로, GAD cDNA 라이브러리는 상기 다양한 cDNA를 난모세포로 주입하고, 상기 cDNA 유전자 생성물이 발현되기에 충분한 시간을 주고, 목적하는 cDNA 발현 생성물의 존재 여부를 시험하여, 예를 들어, GAD₆₅폴리펩티드에 특이적인 항체를 사용하거나 GAD₆₅효소 활성의 작용성을 측정함으로써, 선별할 수 있다.

대안적으로, 하나의 cDNA 라이브러리중에서 GAD₆₅에 대한 항체를 사용하여 적어도 하나의 에피토프를 가진 GAD₆₅펩티드를 간접적으로 선별할 수 있다(Chang 및 Gottlieb, J. Neurosic., 8: 2123, 1988). 이러한 항체들은 GAD₆₅cDNA 존재의 지표인 발현 생성물을 검출하는데 사용되며 폴리클론성이거나 모노클론성으로 유도될 수 있다. GAD₆₅의 N-말단 부위의 첫 100개의 아미노산중에서 찾을 수 있는 에피토프에 대한 항체들이 바람직하다.

재조합 방법중에서 사용하기 위한 특정의 DNA 서열을 개발하는 상기 설명된 3가지 방법중에서, 게놈 DNA 분리물의 사용방법이 가장 덜 일반적이다.

이것은 인트론의 존재로 인해 포유동물의 폴리펩티드를 미생물에 의해 발현시키고자 할 때 특히 일반적이지 않은 방법이다.

본 발명은 GAD₆₅의 항체에 대한 적어도 하나의 에피토프를 가진 1차 구조적 배열의 일부나 전체를 가진, 즉, 아미노산 잔기들의 연속적인 서열을 가진 GAD₆₅의 신규 폴리펩티드를 제공한다,

GAD₆₅의 자가항체를 검출하기 위해 완전한 GAD₆₅보다는 본 발명의 폴리펩티드 단편을 사용할 수 있다. GAD₆₅폴리펩티드에 사용된 것과 같이, "폴리펩티드"란 용어는, GAD₆₅의 자가항체에 대한 하나의 에피토프를 가진 아미노산의 임의의 서열을 의미하며, 이때 아미노산의 서열은 본 발명의 전체적 또는 부분적 cDNA 서열에 의해 암호화된다.

본 발명의 DNA 서열의 미생물성 발현으로부터 수득되는 폴리펩티드는 다른 진핵성 폴리펩티드 또는 생체 세포환경중이나 혈장 또는 소변과 같은 세포외 액체내의 GAD₆₅와 관련성이 있는 다른 오염물들과 관련성이 없어진다는 추가의 특징을 갖고 있다.

본원 발명가들의 연구에 의해 GAD₆₅와 GAD₆₇이 별도의 유전자에 의해 암호화되며 예를 들어, 공동 게놈 서열의 전사후 또는 번역후 변형에 의해 생성되지 않는다는 것이 명백해졌다. GAD₆₅와 GAD₆₇이 다른 유전자들에 의해 암호화 된다는 증거에는 다음과 같은 것을 포함한다; (a) GAD₆₅와 GAD₆₇cDNA 사이에서 정확히 동일한 가장 큰 인접(contiguous) 서열의 길이는 단지 17개의 누클레오티드이고, (b) GAD₆₅와 GAD₆₇로부터의 cDNA 들은 낮은 스트린젠시(stringency) 조건(2.0 XSSC, 0.01% SDS, 23℃) 하에서 서로 또는 각각의 mRNA와 하이브리드화하지 않고, 그리고(c) GAD₆₅및 GAD₆₇의 cDNA는 각각 GAD₆₇와 GAD₆₅를 암호화하는 분리된 게놈성 클론과 하이브리드화하지 않는다.

"숙주"라는 용어는 진핵성 GAD₆₅의 인트론 제거된 DNA 서열을 복제하고 발현할 수 있는 원핵 생물뿐만 아니라, 식물 및 동물 세포, 효모, 사상 곰광이와 같은 진핵 생물을 포함하는 것을 의미한다. 그러나, 원핵생물이 숙주로서 바람직하다.

"원핵생물"이란 용어는 GAD₆₅의 발현용 유전자로 형질 전환되거나 형질 감염될 수 있는 모든 세균을 의미한다. 원핵성 숙주는 예를 들어, 이.콜리. 에스. 티피뮤리움(S. typhimurium), 세라티마 마르세슨스(Serratia marcescens) 및 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)등의 그람 양성균, 그람 음성균을 포함한다.

GAD₆₅폴리펩티드를 암호화하는 재조합 DNA 분자는 본 발명의 기술분야의 전문가들에게 공지된 기술중 임의의 것을 사용하여 숙주를 형질전환하거나 형질 감염시키는데 사용할 수 있다. 특히 원핵 세포를 형질 전환하거나 형질감염시키고자 할때에는 각각 GAD₆₅코팅 서열을 포함하는 플라스미드 또는 비루스를 사용하는 것이 바람직하다.

유전자를 융합하거나 실시 가능하게 연결하는 방법 및 이들을 세균에서 발현하는 방법은 본 발명의 기술분야에 공지되어 있다(Maniatis, 등, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY,1989). 본원에서 설명된 유전자 구조체 및 방법들은 원핵성 숙주에서 GAD₆₅를 발현시키는데 사용될 수 있다.

일반적으로, 삽입된 진핵성 유전자 서열의 효과적인 전사를 용이하게 하기 위한 프로모터 서열을 포함하는 발현 벡터들은 숙주에 따라 사용될 수 있다.

상기 발현 벡터는 일반적으로 복제 오리진, 프로모터, 및 터미네이터를 포함하고 뿐만 아니라 형질전환 세포를 표현형으로 선별할 수 있게 하는 특정의 유전자를 포함한다. 이 형질전환된 원핵성 숙주를 발효기내에서 증식시키고 본 발명의 기술분야에 공지된 기술에 따라 최적의 세포 성장율에 도달할 때까지 배양한다. 다음 본 발명의 폴리펩티드를 성장 배지, 세포용해물, 또는 세포막 부분으로부터 분리할 수 있다.

본 발명의 미생물성 발현 폴리펩티드의 분리 및 정제는 예를 들어, 모노클론성 또는 폴리클론성 항체를 사용하는 것을 포함하는 것과 같은 면역학적 분리 및 정제용 크로마토그래피 분리와 같은 임의의 통상적인 방법을 사용하여 실시될 수 있다.

GAD₆₅의 아미노산 잔기의 서열을 제공함으로써, 본 발명은 자연적으로 생성되는 폴리펩티드 형태들의 에피토프들중 일부 또는 모든 에피토프를 공유하고 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기의 동일성 또는 위치에 의해 자연적으로 생성되는 형태와는 다른 GAD₆₅의 폴리펩티드 유도체나 유사체의 숙주 발현을 암호하는 DNA 서열을 제조하게 한다.

본 발명의 신규 DNA 서열은 GAD₆₅에 대한 자가항체와 반응할 수 있는 하나 이상의 에피토프의 1차 구조 배열중 적어도 일부분을 가지고 있는 폴리펩티드를 원핵성 또는 진핵성 숙주 세포내에서 발현시키는데 이용할 수 있는 모든 서열을 포함하고 다음과 같은 것을 내포한다; (a) 제2도 또는 제3도에 제시된 DNA 서열 또는 이것의 상보적 가닥; (b) (a)에 설명된 DNA 서열과 하이브리드화하는 DNA 서열 또는 이것의 단편; 및 (c) 유전자 코드의 축퇴현상을 고려하여, 상기 (a)와 (b)에 설명된 DNA 서열과 하이브리드화할 수 있는 DNA 서열 GAD₆₅의 대립 유전자 변이체형을 암호화하는 게놈 DNA 서열은 (b)에 특이적으로 포함된다. 상기(c)는 GAD₆₅, GAD₆₅단편 및 GAD₆₅유사체를 암호화하는 DNA 서열의 제조를 포함하며 여기에서 이들의 DNA 서열은 무척추성 숙주내에서 mRNA의 번역을 용이하게 하는 코돈을 포함할 수 있다.

본 발명의 cDNA 서열은 본질적으로 인간이나 래트 GAD₆₅전체 분자를 암호화하므로, 인간이나 래트 GAD₆₅에 대한 자가항체에 대한 하나의 에피토프를 암호화하는 상응하는 cDNA 서열이나 cDNA 단편으로부터 더 작은 폴리펩티드 단편을 제조, 서브 클론, 및 발현하는 것은 일상적인 일이다. 그리고나서 클로닝된 폴리펩티드상에 그러한 에피토프의 존재는 예를 들어, GAD₆₅에 대한 자가항체를 가진 환자들로부터 혈청을 사용하여 검증할 수 있다. 그러한 작은 펩티드의 예로는 GAD₆₅의 N-말단으로부터 처음의 약 100개의 아미노산이다(제3도). 이 아미노산 서열은 GAD₆₇에는 본질적으로 없다.

본 발명의 GAD₆₅는 액체상내에서나 고체상 담체(carrier)에 결합형으로서 사용될 수 있다는 점에서 면역 분석에 사용하기에 특히 적합하다. 또한, 이 분석에서 사용되는 GAD₆₅는 다양한 방법으로 검출 가능하게 표지될 수 있다.

본 발명의 GAD₆₅를 사용할 수 있는 면역 분석의 예로는 직접적 또는 간접적 형태의 경쟁적 및 비경쟁적 면역 분석법이 있다. 이러한 면역 분석의 예로는 방사선 면역 분석(RIA), 샌드위치(면역 측정 분석) 및 웨스턴 블롯 분석이 있다. 본 발명의 GAD₆₅에 결합하는 항체의 검출은 생리학적 시료에 대한 면역 조직화학적 분석을 포함하여, 전진, 후진, 또는 동시방식중 임의의 하나로 실시되는 면역 분석법을 사용하여 실시될 수 있다. 면역 분석법의 형태 및 사용되는 검출용 표지인자의 특성에 따라 GAD₆₅의 사용 농도가 변화할 것이다. 그러나, 사용되는 면역 분석의 형태에 관계없이, 사용된 GAD₆₅의 농도는 본 발명의 기술 분야의 전문가들에 의해 통상의 실험 방법을 사용하여 쉽게 결정될 수 있다.

본 발명의 GAD₆₅는 많은 다른 종류의 담체들에 결합될 수 있고 상기 폴리펩티드에 특이적으로 반응적인 항체의 존재를 검출하는데 사용될 수 있다. 공지된 담체의 예로는 유리, 폴리스티렌, 폴리비닐클로라이드, 폴리프로필렌, 폴리에틸렌, 폴리카보네이트, 덱스트란, 나일론, 아밀로오스, 천연 및 변형 셀롤로오스, 폴리아크릴아미드, 아가로오즈 및 마그네타이트를 포함한다.

상기 담체의 본질은 본 발명의 목적에 따라 수용성이거나 불용성일수도 있다. 본 기술분야의 전문가들은 GAD₆₅를 결합시키는데 적합한 담체들을 알고 있거나, 통상의 실험 방법을 사용하여 확인할 수 있을 것이다.

본 기술분야의 전문가들에게 공지된 많은 다른 표지인자 및 표지방법이 있다. 본 발명에서 사용될 수 있는 표지 형태의 예로는 효소, 방사성 동위원소, 콜로이드성 금속, 형광 화합물, 화학적 발광성 화합물 및 생체 발광성 화합물을 포함한다.

또 대안적으로 본 발명의 폴리펩티드는 GAD의 효소적 활성을 측정함으로써 GAD₆₅에 대한 항체를 검출하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, GAD₆₅와 GAD₆₅에 대한 항체를 가지고 있는 것으로 추정되는 표본을 GAD₆₅항체 사이 결합이 형성되기에 충분한 조건하에서 일졍시간동안 배양할 수 있다. 반응생성물을 침전시키고 나서 GAD 효소 활성을 시험한다.

본 발명의 목적하에, 본 발명의 GAD₆₅에 결합하는 항체는 다양한 생물학적 유동액 및 조직내에 존재할 수 있다. GAD₆₅에 대한 검출 가능한 양의 항체를 포함하는 시료가 사용될 수 있다. 보통, 시료에는 소변, 타액, 뇌척수액, 혈액, 혈청등과 같은 액체 또는 조직, 분변 둥과 같은 고형물 또는 반고형물이 있다.

본 발명의 분석에 사용하는 재료는 킷트의 제조에 이상적으로 바람직하다.

이러한 킷트는 바이알(vial), 튜브 등과 같은 하나 이상의 용기 수단을 매우 제한적으로 수용하기 위해 격실화된 담체를 포함할 것이고, 상기 각각의 용기 수단은 본원의 방법상에 사용되는 별도의 인자들을 각각 하나씩 포함한다. 예를 들어, 상기 용기 수단중 하나는 담체에 결합된 GAD₆₅를 포함할 수 있다. 다른 용기에는 수용성이고, 검출가능하게 표지된 제2의 항체를 동결건조된 형태 또는 용액으로서 포함할 수 있다.

또한, 상기 담체 수단은 각각 다른 양의 GAD₆₅를 함유하고 있는 다수의 용기를 포함할 수 있다. 이들 용기들은 GAD₆₅에 대한 미지량의 자가 항체를 함유하는 시료로부터 수득되는 결과를 삽입할 수 있는 표준 곡선을 작도하는데 사용될 수 있다.

상기 킷트를 사용함에 있어서 사용자가 해야하는 것은, 검출되는 GAD₆₅에 대한 자가항체의 측정 가능한 미지량을 함유하는 시료의 소정의 양, 제1용기에 존재하는 담체결합된 GAD₆₅의 소정의 양 및 제2용기중에 존재하는 검출 가능하게 표지된 제2항체의 소정의 양을 용기에 첨가하는 것이다. 대안적으로, 검출 불가능하게 표지된 GAD₆₅를 시료와 검출 가능하게 표지된 제2항체가 첨가된 용기에 부착시켜 제공할 수 있다. 적당한 반응 시간후, 면역 복합물이 형성되어 상청액으로 부터 분리되며, 이 면역 복합물 또는 상청액은 방사선 활성 계수 또는 효소기질의 첨가, 및 발색에 의해 검출된다.

"개선하다"라는 용어는 치료를 받는 환자들에서 자가면역반응의 유해 효과가 경감되는 것을 의미한다. "치료에 효과적인"이란 용어는 사용된 GAD₆₅폴리펩티드의 양이 자가 면역 반응에 의한 질환의 원인을 개선하는데 충분한 양이라는 것을 의미한다.

본 발명의 재조합 GAD₆₅폴리펩티드는 또한 GAD₆₅에 자가면역 반응을 가진 환자들에게 치료요법적으로 사용될 수 있다. 이런 치료법은 예를 들어, 재조합 GAD₆₅폴리펩티드를 투여함으로서 실시될 수 있다. 이 투여법에는 표지된 GAD₆₅폴리펩티드뿐만 아니라 비표지된 것도 사용할 수 있다. 비표지된 GAD₆₅폴리펩티드는 예를 들어, GAD₆₅폴리펩티드는 면역 반응을 자극하기에 너무 작으나, 결합하거나 차단시키기에는 충분히 커서 자가 면역 반응을 지속시킬 수 있는 단편의 형태일 때 편리하게 사용될 것이다. 예를 들어, GAD₆₅는 에피토프 크기의 펩티드(주로 5-12개 아미노산 길이)로 효소에 의해 분해될 수 있고 이로써 자가면역 질환을 가진 환자의 체액, 또는 면역 세포의 표면상에 존재하는 Fab 결합 부위에 결합될 수 있다.

대안적으로, 본 발명의 재조합 GAD₆₅폴리펩티드는 치료제로 표지하여 투여될 수 있다. 이들 제제는 본 발명의 GAD₆₅폴리펩티드에 직접적 또는 간접적으로 결합될 수 있다. 간접적 결합의 한 예는 스페이서 부의 사용이다. 이 스페이서 부는 또한, 불용성이거나, 수용성일 수 있고(Diener 등, Science, 231: 148, 1986) 표적 부위에서 GAD₆₅폴리펩티드로부터 약제를 분리시킬 수 있는 것이 선택될 수 있다. 면역학적 치료를 위해 본 발명의 GAD₆₅폴리펩티드에 결합될 수 있는 치료제의 예에는, 약제, 방사성 동위 원소, 렉틴, 및 독소가 있다.

본 발명의 GAD₆₅폴리펩티드에 결합될 수 있는 약제에는 미토마이신 C, 다우노루비신, 및 빈블라스틴과 같은 약제로서 종래 언급된 화합물을 포함한다.

면역학적 치료법에서 본 발명의 방사성 동위원소와 결합된 GAD₆₅폴리펩티드를 사용함에 있어서 임의의 동위원소를 안정성 및 방사성뿐만 아니라 백혈구 분포와 같은 인자들에 따라 다른 동위 원소들보다 더욱 바람직할 수 있다. 상기 자가면역 반응에 따라, 임의의 방사체는 다른 것들보다 바람직할 수 있다. 일반적으로, α 및 β 입자-방출 방사성 동위원소들이 면역요법에 바람직하다.²¹²Bi와 같은 단거리, 고에너지성 α 방사체가 바람직하다. 치료용 목적으로 본 발명의 GAD₆₅폴리펩티드에 결합될 수 있는 방사성 동위원소의 예로는¹²⁵I,¹³¹I,⁹⁰Y,⁶⁷Cu,²¹²Bi,^21lAt,²¹²pb,⁴⁷Sc,¹⁰⁹pd 및¹⁸⁸Re가 있다.

렉틴은 보통 식물체로부터 분리되는 단백질로, 특이적인 당부위에 결합한다. 또한 많은 렉틴들이 세포를 점착시킬 수 있고 백혈구를 자극시킬 수 있다. 그러나, 리신(ricin)은 면역 요법적으로 사용되는 독성 렉틴이다. 이것은 독성의 원인인 리신의 α-펩티드 쇄를 독성 효과를 부위 특이성 전달에 사용할 수 있는 항체 분자에 결합시킴으로서 실시된다.

독소는 식물, 동물 또는 미생물에 의해 생성되는 독성 물질이고, 충분한 투여량으로 종종 치명적이다. 디프테리아 독소는 코리네박테리움 디프테리아(Corvnebacterium diphtheria)에 의해 생성되며 치료법에 사용될 수 있는 물질이다. 이 독소는 α와 β 서브 유니트로 구성되며 적합한 조건하에서 분리될 수 있다.

독소 A 성분은 GAD₆₅폴리펩티드에 결합될 수 있고 GAD₆₅폴리펩티드의 수용체를 발현하는 백혈구로의 부위특이성 전달에 사용될 수 있다. 생체외 및 생체내 조건하에서의 치료방법뿐만 아니라, 본 발명의 GAD₆₅폴리펩티드에 결합될 수 있는 다른 치료제들은 공지되어 있거나, 본 기술분야의 전문가들에 의해 쉽게 확인될 수 있다.

본 발명은 또한 상기 질환을 가진 환자, 또는 상기 질환의 위험이 있는 환자들에 있어서 상기 질환 상태를 개선하기 위해 치료학적으로 투여될 수 있는 폴리펩티드에 관한 것이다. 다양한 아미노산을 나타내는데 사용되는 통상의 단문자 코드는 다음과 같다:

본 발명의 상기 폴리펩티드 서열은 인간의 GAD₆₅, 인간의 GAD₆₇의 아미노산 서열과 피코마비루스(piconnvirus), 코작키비루스(coxsackie virus)의 P2-C 단백질의 아미노산 서열을 비교하여 동정되었다. 상기 P2-C 폴리누클레오티드는 상기 비루스 막에 결합된 복제 복합물에서 역할을 한다. 상기 분석에 의해 GAD₆₅분자와 상기 코작키비루스 서열 사이의 유사성이 매우 크다는 것을 확증하였다. 상기 GAD₆₅및 P2-C 폴리펩티드의 6개의 인접 아미노산 잔기인 중심 폴리펩티드는 그 서열이 동일하다. 즉, 상기 폴리펩티드내에 24개의 아미노산중, 19개가 동일하거나 보존적이었다. 또한, 상기 부위에는 전하 밀도가 높으며 프롤린 잔기의 존재는 상기 부위의 항원성을 증가시킨다(표 1 참조).

[표 1]

상기 표 1에서, 굵은 선은 동일한 아미노산을 나타내며 점선은 유사한 전하, 극성 또는 소수성을 가진 아미노산 잔기를 나타낸다.

상기 공통의 폴리펩티드 부위의 발견은 당뇨병의 침강 반응에 있어서 "분자적 유사성"에 의한 병인학적 역할을 나타낸다. 따라서, IDDM에 유전학적으로 민감한 환자들이 코자키비루스에 감염되었을 때, 상기 코작키비루스의 폴리펩티드에 대한 면역 반응은 상기 환자의 β-세포내의 유사 GAD 서열에 대해서도 교차 반응성 면역 반응을 일으킨다. 이로써 상기 면역 반응은 상기 β-세포의 실제적인 파괴 및 이어지는 IDDM의 발현을 일으키는 항원적으로 유사한 GAD 폴리펩티드에 의해 유지된다.

현재, 췌장 β-세포의 제거는 세포의 자가면역 반응에 의해 매개되는 것으로 생각된다. 결과적으로, 본 발명의 폴리펩티드는 상기와 같은 세포 자가 면역 반응에 대해 차단 능력을 가져야만 한다. 자가 면역 반응의 복합성 때문에, 본 발명의 폴리펩티드가 상기 질환을 개선하는데 사용되도록 하는 수많은 가능한 치료요법적 양상을 생각할 수 있다. 그러므로, 본 발명의 폴리펩티드는 항원 증여세포(APC)의 표면상에서 자가 면역 항원을 나타내는 특성의 T세포 수용체(TCR) 또는 MHC 수용체에 의한 인식을 차단시키는데 사용할 수 있다.

이러한 인식의 저해는 예를 들어, 상기 환자에게 상기 MHC 수용체의 항원 틈내에 존재할 자가면역 항원을 대체할 수 있는 본 발명의 폴리펩티드를 제공하거나, 또는 아마도, T-헬퍼세포 표면상의 적합한 TCR과 직접적으로 상호 작용함으로써 일어날 수 있다. 상기 후자와 같은 TCR과 직접적인 상호작용에 의한 치료요법적 접근 방식은 고농도의 가용성 폴리펩티드를 사용하여 고농도내성(high-zone tolerance)을 유도함으로써 치료될 수 있다.

대안적으로, 본 발명의 폴리펩티드는 T-억제 세포군을 자극하여 자가인지력을 회복시키고, 이로써 상기 자가 면역질환을 개선하는데 사용될 수 있다.

T-억제 세포군의 차극은, 예를 들어, MHC II 수용체의 틈내에 정착하는 자가면역 항원상에 존재하는 에피토프에 특이적인 제1의 가변부 및 상기 CD8⁺수용체상에 존재하는 에피토프에 특이적인 제2의 가변부를 가진 이중 특이성 항체를 사용함으로써 실시될 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드에 특이적인 항체의 생성은 2개 이상의 에피토프에 특이성을 갖는 이중 특이성 항체의 제조방법과 같이 본 기술분야의 전문가들에게 일상적인 방법이다.

본 발명의 폴리펩티드 유사체는 상기 항원증여의 수준에서 자가 항원을 인지하는데 경쟁적이도록 제조될 수 있다. MHC 분자는 하나의 펩티드 결합 부위를 포함하므로, 질환 관련성 MHC 분자에 대해 높은 친화성을 가지고 결합하는 폴리펩티드를 제조할 수 있으나, 이것은 질환 유발성 T-헬퍼세포를 활성화시킬 수는 없다. 이러한 폴리펩티드들은 자가항원 인식에 대해 길항제로서 작용한다. 상기와 같은 접근 방식의 선례는 그 자체는 비면역적인 마우스의 라이소자임(lysozyme) 폴리펩티드가 암닭의 난백 라이소자임으로부터의 면역원성 폴리펩티드와 MHC 결합에 대하여 경쟁적이며 이르써 상기 면역원성 폴리펩티드에 의한 T 세포 활성화를 경감시킨다는 발견으로부터 생겼다(Adorini, 등, Nature, 334: 623-625, 1988). 유사하게, 상기와 같은 효과적인 폴리펩티드 유사체를 선별하는데에 대한 치료요법적 접근 방식이 자가면역 뇌척수염(EAE)과 같은 자가면역 질환에 실험적으로 사용되었다(Wraith 등, Cell, 59: 248, 1989; Urban 등, Cell, 59: 257, 1989).

본 발명의 폴리펩티드중에 아미노산 잔기를 나타내는 상기 단문자 기호는 본기술분야에서 통상적으로 사용되는 기호들이다. "유사체"란 용어는 본원에서 제시된 폴리펩티드와 거의 동일한 아미노산 서열을 가지며 이중 하나 이상의 아미노산이 화학적으로 유사한 아미노산으로 치환된 임의의 폴리펩티드를 의미한다. 예를 들어, 글리신 또는 세린과 같은 하나의 극성 아미노산은 또 다른 극성 아미노산으로 치환될 수 있고; 또는 아스파르트산과 같은 하나의 산성 아미노산이 글루탐산과 같은 다른 산성 아미노산으로 치환될 수 있으며; 또는 리신, 아르기닌, 또는 히스티딘과 같은 염기성 아미노산이 또 다른 염기성 아미노산으로 치환될 수 있으며; 또는 알라닌, 로이신, 또는 이소로이신과 같은 비극성 아미노산이 또 다른 비극성 아미노산으로 치환될 수 있다.

"유사체"란 용어는 또한 본 발명의 폴리펩티드로부터 하나 이상의 아미노산이 재거되었거나 또는 첨가되었으나 상기 펩티드에 대해 실질적인 아미노산 서열 상동성을 보유한 임의의 폴리펩티드를 의미한다, 실질적인 서열 상동성은 50% 이상의 동일성을 나타내는 것이다. "단편"이란 용어는 본원에서 동정된 상기 폴리펩티드의 임의의 짧은 서열로서 적어도 6개의 아미노산 잔기를 가진 서열을 의미하여, 상기 단편은 침윤성 T-임파구도(IITLs)의 증식을 자극할 수 있고, 또는 자극성 폴리펩티드 단편에 의해 상기 세포의 자극을 저해할 수 있는 단편이다.

"화학적 유도체"란 용어는 본 발명의 폴리펩티드로부터 유도된 임의의 폴리펩티드를 의미하며 즉 상기 폴리펩티드 내에 존재하는 하나 이상의 아미노산이 아미노산 잔기의 작용성 측쇄기의 반응에 의해 화학적으로 유도체화된 임의의 잔기의 작용성 측쇄기의 반응에 의해 화학적으로 유도체화된 임의의 폴리펩티드를 의미한다. 그러므로 "화학적 유도체"는 하나 이상의 화학적 단계에 의해 본원에서 동정된 폴리펩티드의 서열로부터 유도된 폴리펩티드이다. 이러한 유도체화된 분자들로서 예를 들어, 자유아미노기가 유도체화된 아민 염산염, P-톨루엔 술포아미드, 벤즈옥시카르보아미드, T-부틸옥시카르보아미드, 티오우레탄형 유도체, 트리플루오로아세틸아미드, 클로로아세트아미드, 또는 포름아미드 형태의 분자를 포함한다. 자유 카르복실기는 염, 메틸 및 에틸에스테르의 형태 또는 다른형의 에스테르 또는 히드라자이드로 유도체화될 수 있다. 자유 히드록실기는 0-아실 또는 0-알킬 유도체를 형성할 수 있다. 히스티딘의 이미다졸기의 질소는 N-im-벤질히스티딘의 형태로 유도체화될 수 있다. 또한 화학적 유도체로서 상기 20개의 표준 아미노산의 자연발생적 아미노산 유도체를 하나이상 포함하는 폴리펩티드가 포함된다. 예를 들어 4-히드록시프롤린은 프롤린을 대체할 수 있고; 5-히드록시리신은 리신을 대체할 수 있으며; 3-메틸히스티딘은 히스티딘을 대체할 수 있고; 호모세린은 세린을 대체할 수 있으며, 오르니틴은 리신을 대체할 수 있다.

본 발명은 표1에 설명된 폴리펩티드에 제한되지 않으며, 본 발명의 범위에 속하는 폴리펩티드는 코작키 비루스 P2-C의 아미노산 28과 아미노산 50 사이의 부위, 또는 GAD₆₅의 아미노산 250과 아미노산 273 사이의 부위, 또는 GAD₆₇의 아미노산 258과 아미노산 281 사이 부위의 그 이상 또는 그 이하를 포함할 수 있으며, 이때 주어진 폴리펩티드의 상당 부분이 상기 부위, 또는 부분 또는 이것의 혼합부의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 폴리펩티드는 자가면역 질환에 대하여 목적하는 면역학적 또는 생물학적 활성을 갖고 있어야 한다. 또한, 본 발명에 따른 폴리펩티드는 표1에 제시된 폴리펩티드보다 길이가 길거나 짧은 아미노산 서열을 갖거나, 또는 이것의 단편이나 조합을 포함하는 아미노산 서열을 함유할 수 있으며, 이때 상기 폴리펩티드는 실질적으로 표1에 설명된 상기 아미노산들 사이의 부위로 이루어지고 면역학적 또는 생물학적 활성을 나타내야만 한다. 또한 본 발명의 폴리펩티드는 표1의 GAD₆₅폴리펩티드보다 더 길거나 짧은 아미노산 서열 또는 상기 폴리펩티드의 일부를 포함하는 아미노산 서열을 가질 수 있으며 이들 폴리펩티드는 자가 면역 질환에 대하여 면역학적 또는 생물학적 활성을 나타낸다. 본 발명의 모든 폴리펩티드는 상기 자가면역 질환을 자극하거나 향상시켜서는 안된다.

따라서, 본 발명의 폴리펩티드중에 임의의 하나의 폴리펩티드를 선별하는 것은 과도한 실험을 필요로 하지 않는다. 이러한 선별은 다수의 폴리펩티드를 취하여 자가 면역 질환을 개선하는데 있어서 이들의 면역학적 및 생물학적 활성을 측정함으로써 실시될 수 있다. 상기 NOD 마우스는 당뇨병을 개선시킬 수 있는 본 발명의 폴리펩티드를 선별하는데 있어서 우수하고 특성 규명이 잘된 모델이다.

본 발명에 의한 상기 폴리펩티드는 재조합 기술이나 고체 지지체상에서의 합성법을 포함한 공지된 폴리펩티드 합성 방법을 사용하여 종래의 합성 방법에 의해 제조될 수 있다. 고체상 합성 기술의 적합한 예로서 Merriweather(J.Am.Chem. Soc., 85; 2149, 1963)에 의해 설명된 방법이 있다.

다른 폴리펩티드 합성 기술로서 예를 들어, Bodanszky 등(펩티드 합성, John Wiley ＆ Sons,2d ed., 1976)의 방법뿐만 아니라, 본 기술분야의 전문가들에게 공지된 다른 방법들이 있다. 폴리펩티드 합성 기술이 Stewart 등(펩티드 고상 합성법, Pierce Chemical Company, Inc., Rockford, III., 1984)에 요약되어 있다. 상기 폴리펩티드 합성법중 용액법이 예를 들어, The Proteins, Vol. III. 3d. ed., Neurath, 등, eds., 105, Academic Press, 뉴욕, NY, 1976에 설명된 방법에 따라 사용될 수 있다. 이러한 합성법중에서 사용하기에 적합한 보호기로서 상기 참고문헌외에도 J. McOmie, 유기화학의 보호기, Plenum Press, 뉴욕, NY,1973에 설명되어 있다.

본 발명의 폴리펩티드는 또한 목적하는 폴리펩티드를 암호화하는 DNA 염기서열로 형질전환된 적합한 숙주에서 제조될 수 있다. 예를 들어, 상기 폴리펩티드를 암호화하는 DNA 염기 서열로 형질전환되고 발현하는 적합한 숙주를 발효 배양하여 폴리펩티드룰 제조할 수 있다. 대안적으로, 본 발명의 여러가지 폴리펩티드를 암호화하는 DNA 서열은 함께 연결될 수 있고 그 다음 상기 서열로 적합한 숙주를 형질전환시켜 자가면역질환에 관련된 폴리펩티드를 발현시킬 수 있다.

본 발명의 GAD₆₅폴리펩티드의 처방용 투여량의 범위는 자가면역 반응의 증상이나 세포 파괴가 개선되는 바람직한 효과를 나타내기에 충분히 많은 양이다. 이 투여량은 원하지 않은 교차 반응, 아나필락시성 반응등과 같은 해로운 부작용을 일으킬만큼 많은 양이어서는 안된다. 일반적으로, 투여량은 환자의 연령, 상태, 성별 및 질병 졍도에 따라 다르며, 본 기술분야의 전문가에 의해 결정될 수 있다. 이 투여량은 임의의 역효과가 나타날 경우에는 개인의사에 의해 조정될 수 있다. 투여량은 1일 또는 몇일 동안 매일 1회 또는 그 이상의 투여로, 약 O.1mg/m²내지 약 2OOOmg/m², 바람직하게는 약 O.1mg/m²내지 약 5OOmg/m²/투여량 범위일 수 있다.

본 발명의 GAD₆₅폴리펩티드는 주사 또는 여러 시간 동안 점전적인 관류로 비경구적으로 투여될 수 있다. 본 발명의 GAD₆₅폴리펩티드는 정맥내로, 복강내로, 근육내로, 피하적으로, 공동내로 또는 경피적으로 투여될 수 있다.

비경구 투여용 제제는 멸균 수성 또는 비수성용액, 현탁액 및 유탁액을 포함한다. 비수성 용매의 예로서 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 을리브유와 같은 식물성 오일 및 에틸 올레이트와 같은 주사용 유기 에스테르가 있다. 수성 캐리어는 물, 알콜성/수성용액, 유탁액 또는 현탁액외에도 식염 및 완층용 배지를 포함한다. 비경구적 담체에는 염화나트륨 용액, 링거 덱스트로오스, 덱스트로오스 및 염화나트륨, 링거 젖산염 또는 고정 오일을 포함한다.

정맥내 투여용 담체에는 영양보층제, 전해질 보충제(링거 덱스트로오즈에 의거한 것과 같은)등을 포함한다. 방부제 및 다른 첨가제들로는 예를 들어, 항미생물제, 항산화제, 킬레이트화제 및 불활성 기체등을 포함한다.

본 발명은 또한 본 발명의 GAD₆₅폴리펩티드를 포함하는 약제 또는 약제학적 조성물을 제조하는 방법에 관한 것으로, 상기 약제는 GAD₆₅에 대한 자가면역반응의 치료에 사용될 수 있다.

상기 개시된 것은 본 발명을 일반적으로 설명한 것이다. 하기 특성의 실시예에 설명된 것으로. 더욱 상세히 이해될 수 있고 이것은 단지 설명을 하기 위한 것이며 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니다.

[실시예 1]

GAD₆₅의 클로닝 및 발현

A. 재조합 DNA 방법

GAD₆₅및 GAD₆₇에 특이적인 cDNA 프로브를 수득하기 위해서, 총 RNA를 성숙한 래트의 뇌로부터 셔윈등(Chirgwin, 등, Biochemisty, 18: 5294, 1979)의 방법을 사용하여 구아니딘 이소치오시아네이트-세슘 구배로 추출했다· 폴리(A) RNA는 올리고 dT 셀룰로오즈 상에서, 베테스다 연구실(Bethesda Research Laboratories(BRL))의 프로토콜을 사용하여 정제했다. 제1가닥 합성은mMLV-역전사 효소(BRL)를 사용하여 폴리 d(N₆)-mer(Pharmacia)를 프라이머로서 사용한 것을 제외하고는 제시된 조건으로 실시했다. 이 cDNA-RNA 혼합물을 65℃에 15분 동안 가열로 불활성화한 후 -20℃에서 저장했다. PCR을 하기 위해, 이 시료의 1/50을 100㎕ 반응액에 첨가했다. 펠라인(feline)의 GAD(cDNA로부터) (Kobayashi 등, J. Neurosci., 7; 2768, 1978) 및 래트의 GAD(펩티드로부터) (Chang과 Gottlieb, J. Neurosci., 8: 2123, 1988)의 밑줄친 공통 아미노산 서열을 암호화하는 축퇴성 올리고누클레오티드를 합성했다(Applied Biosystems)(제1도). 축퇴성 올리고누클레오티드 각각의 5'-말단 서열은 SstI 및 HindIII(5'올리고) 또는 SstI 및 SstII(3' 말단 올리고)에 의해 인식되는 한가닥의 DNA 서열을 포함했다. 이 프라이머들을 골드 등(Gould 등, Proc, Natl. Acad. Sci., USA, 86: 1934, 1989)에 의해 개시된 것과 같이 생성된 cDNA 주형의 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)에 의한 선택적 증폭에 사용했다. PCR 생성물을 HindIII/SstI 이중 분해된 블루스크립트 SK 벡터(Stratagene)내로 서브클로닝하여, DH5(BRL)로 형질전환한 다음, 표준 방법으로 평판 배양했다(Maniatis, 등, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY,1989).

콜로니 하이브리드화를 폘라인의 GAD₆₇에 특이적인 5'-³²P 말단 표지된 올리고누클레오티드로 실시했다(Kobayashi 등, J. Neurosci., 7: 2768, 1987). 올리고누클레오티드의 말단 표지화, 하이브리드화 조건, 및 세정 조건들은 니트로셀룰로오즈 필터가 50℃에서 15분 동안 세정되는 것을 제외하고, 종래 개시된 바와 같이 실시되었다(Wallace 등, in Guide to Molecular C1oning Techniques; Berger 등, Eds. in Methods of Enzymology; Abelson 등, Eds. Academic Press,Inc., San Diego, 432-442, 1987). 하이브리드화에서 양성과 음성인 콜로니를 각각 취하여 테리픽 브로쓰(Terrific BrothL Tartof, 등, Focus, 9: 12, 1987)에서 밤새 배양했다. DNA는 비등법을 사용하여 분리했고(Maniatis 등, Moleculr Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY 1989) 주형을 0.2N NaOH로 변성시킨뒤 세파크릴 S400 스펀 컬럼(Pharmacia)으로 정제했다. 변성된 이중가닥 주형의 서열 결정은 T7-서열 결정용 킷트(Pharmacia)를 사용하여 체인 종지법으로 실시했다(Sanger 등, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 74: 5463, 1977).

제1도에 나타낸 바와 같이, PCR-생성된 래트 GAD₆₅및 GAD₆₇DNA를 프로브로서 사용하여 표준 방법(Maniatis 등, Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold SpringHarbor, NY, 1989)으로 S. Heinemann(Salk Institute)에 의해 제공된 람다 ZAP(Stratagene) 래트 히포캠퍼스 라이브러리를 선별하였다. 2400 누클레오티드 길이의 GAD₆₅cDNA(가장 큰 클론)를 분리하여 스트레타진에 의해 설명된 바와 같이 "잽핑(Zapping)"으로 서브 클로닝했다. 이미 얻어진 3.2Kb 래트 GAD₆₇cDNA 클론보다 더 작은 래트 GAD₆₇cDNA를 수득했을 때, 보다 큰 cDNA를 서열결정했다. ExoIII 결실법(Henikoff, Gene, 28 L 351, 1984)을 GAD₆₅와 GAD₆₇의 양쪽 방향으로 실시했고 주형을 상기 제시된 바와 같이 제조 및 서열 결정하였다. 고착된 PCR(Anchored PCR: Frohnmn 등, Proc, Natl. Acal. Sci., USA, 85: 8998, 1988)을 상기 라이브러리 선별시 분리된 본래의 cDNA 클론중에서 나타나지 않은 GAD₆₅와 GAD₆₇mRNA의 나머지 5'-말단을 클로닝하는데 사용했다. 이들 클론의 서열 결정에 의해, GAD₆₅와 GAD₆₇mRNA는 본래의 cDNA 클론의 개시 코돈과 인 프레임(in frame)인 임의의 추가 개시 코든(AUGs)을 포함하지 않는다는 것이 밝혀졌다.

[실시예 2]

클로닝된 GAD₆₅의 특성 규명

A. 노던 블롯 하이브리드화

2개의 PCR 유도된 cDNA 프로브를 래트 뇌 RNA를 포함하는 노던 블롯에 하이브리드화시켜 GAD₆₇와 GAD₆₅cDNA가 2개의 다른 mRNA들로부터 유도된 것인지를 결정했다. RNA를 실시예 1에 설명한 바와 같이 추출했다. 폴리(A) RNA를 포름알데히드내에서 전기 영동으로 분리하고 바이오트란스(ICN) 막위로 전이시킨 후, 100㎕/㎖ 폴리(A)를 첨가하는 것을 제외하고 Well 등(J. Neurosci., 16 : 311, 1986)에 의해 개시된 바와 같이 하이브리드화를 실시했다. 프로브는 Feinberg와 Vogelstein(Anal. Biochem., 132 : 6, 1983)의 올리고 표지 방법에 의해 약 10⁹dpm/㎍으로 표지되었다. GAD₆₅와 GAD₆₇cDNA의 총길이 클론으로도 동일한 결과가 연속적으로 수득되었다.

제5도에 나타낸 바와 같이, 제1과 2레인은 래트 소뇌로부터 추출된 폴리(A)선별된 RNA 1㎍을 포함한다. 1레인은 팰라인 GAD₆₇과 동종인 래트 GAD₆₇의 cDNA 프로브로 하이브리드화되었고(Kobayashi emd, J. Neurosci. 7: 2768, 1987, 1987) 2레인은 래트 펩티드 서열(GAD₆₅에 상응하는 서열)의 cDNA 프로브로 하이브리드화되었다.

상기 래트 펩티드 서열의 cDNA 프로브는 5.7 Kb RNA와 하이브리드화했고, 반면 상기 팰라인 cDNA의 래트 동족물의 cDNA 프로브는 3.7 Kb RNA에 하이브리드화하였다. 이것은 GAD₆₅와 GAD₆₇이 동일한 mRNA로부터 유도된 것이 아니라는 것을 증명한다.

B. GAD₆₇와 GAD₆₅의 게놈 하이브리드화

GAD₆₇와 GAD₆₅가 별도의 유전자로부터 생성된다는 가능성을 연구하기 위해서, GAD₆₇와 GAD₆₅의 cDNA를 게놈 DNA를 포함하는 DNA 블롯에 하이브리드화시켰다.

서던 블롯(Southern blot)을 하기 위해서, 게놈 DNA를 개시된 바와 같이 래트 간으로부터 추출했다(Kaiser 등, in DNA Cloning, vol. I, A Practical Approach, D.M. Glover ed. IRL Press, Oxford, 38-40, 1985). 이 DNA(10㎍/시료)를 EcoRI과 HindIII로 공급자(BRL, Gaithersburg, MD)가 추천한 조건을 사용하여 완전하게 분해시켰다. DNA 단편을 0.8% 아가로오즈에서 1.5v/cm로 16시간동안 전기 영동하여 분리했다. 다음 이 DNA를 Denhardt's 용액을 5㎍/㎖ 카네이션 건조 밀크로 대체한 것을 제외하고 Gatti등(Biotechniques, 2 : 148, 1984)에 의해 개시된 것과 같이, 제타-프로브막(Bio-Rad)으로 전이시 키고, 하이브리드화한 다음, 세정했다. 서던 블릇용 프로브는 상기 실시예 1에 개시한 바와 같이 표지되었다.

제6도에 나타낸 바와 같이, HindIII와 EcoRI으로 분해된 게놈 DNA는 각각 레인 1과 3 및 레인 2와 4이다. GAD₆₇cDNA는 레인 1과 2에 하이브리드화 되었고, 반면 GAD₆₅cDNA는 레인 3과 4에 하이브리드화되었다. 겔의 측면을 따라 기재된 번호는 DNA 단편의 킬로베이스 크기를 나타낸다.

상기 데이타는 2개의 cDNA가 여러 크기의 게놈 단편에 하이브리드화한다는 것을 나타낸다. 또한, GAD₆₅와 GAD₆₇cDNA 사이 동일한 누클레오티드 서열의 가장 큰 연속 스트레치는 단지 17 누클레오티드 염기 길이이다. 이로써, GAD₆₇와 GAD₆₅는 24개의 다른 유전자에 의해 암호화된다.

C. GAD₆₇와 GAD₆₅의 효소학적 비교

GAD₆₇와 GAD₆₅의 활성에 PLP의 효과를 비교 연구했다. 이때, 상기 2개의 cDNA를 세균내에서 발현 가능한 벡터로 서브클로닝했다(Studier 등, J. Mol. Biol. 189: 113, 1986). "융합되지 않은" GAD₆₅와 GAD₆₇의 과잉 발현은 GAD₆₅cDNA를 pET-8c 벡터의 NcoI 부위에 서브 클로닝하고 GAD₆₇cDNA를 pET-5c 벡터의 NheI 부위로 서브 클로닝하여 실시되었다(Studier, 등, J. Mol. Biol., 189: 113, 1986).

상기 2개의 cDNA를 정확한 인-프레임으로 서브클로닝하기에 적합한 점착성 말단을 수득하기 위해 선택적 증폭을 200μM dNTPs와 1.5mM MgCl₂를 포함하는 혼합물중에서 엠플리테크(AmpliTAQ)(USB)의 오류를 감소시키기 위해 55℃에서 20회 어닐링하는 United States Biochemical(USB)에 의해 제시된 조건을 사용하여 POR로서 실시하였다. GAD₆₅와 GAD₆₇에 특이적인 프라이머들은 각각 NcoI과 SpeI 인식 부위를 가진 하나의 DNA 가닥을 포함했다. GAD₆₇의 코딩 부위내에 NheI 제한 부위가 있으므로, SpeI(NheI에 융합성이 있는)을 사용했다.

PCR 생성물을 각각의 pET 벡터중으로 서브클로닝하여 DH5로 형질전환한 다음 상기 설명한 바와 같이 평판배양했다(Maniatis, 등, Moleular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1989). 콜로니를 취하여 50㎍/㎖ 암피실린을 포함하는 LB 브로쓰내에서 밤새동안 배양했다. 정방향성 서브클론들을 과잉 발현용 BL21(DE3) 균주로 형질전환했다(Studier 등, J. Mol. Biol., 189 : 113, 1986). 음성대조군으로서, 삽입물이 없는 pET-8C 벡터를 형질 전환하고 이어서 유도했다. 하나의 콜로니 각각을 취하여, 증식시키고, 1mM 이소프로필-B-D-티오갈락토-피라노사이드(IPTG)로 유도하여, 개시된 바와 같이 SDS-PAGE겔 상에서 분석했다(Sambrook, 등, Molecular Cloing a Laboratory Manual, Cold, Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor,17.15-17.16 1989).

GAD 활성을 측정하기 위해, OD₆₀₀0.5의 세균 배양액 10㎖를 1mM IPTG로 유도했다. 유도한지 2시간 후, 세균을 침전시키고 재현탁하여 1㎖의 균질화용 완층액(1mM 페닐메틸술포닐 플루오라이드(PMSF), 1mM 2-아미노 에틸 이소티오우로늄 브로마이드(AET), 및 60mM 인산칼륨, pH 7.1)내에서 초음파 처리했다. 초음파 처리후, 세포 잔해를 원심분리로 제거하고 상청액(이것은 -70℃에서 일정량씩 저장된다)내의 단백질 농도를 측정했다(Bradford, Anal. Bio chem., 72 : 248, 1986). 뇌균질물을 종래 개시된 바와 같이 제조했다(Legay, 등, J. Neurochem., 46 : 1478, 1986). GAD 활성을 첨가 반응 혼합액에 뇌균질액 또는 용균액 20㎕와 0.2mM PLP 첨가 또는 무첨가하여 종래 개시된 바와 같이 측정했다(Krieger 등, J. Neurochem., 33 : 299, 1984). 용균액중에¹⁴CO₂생성은 배양시간 및 단백질 및 농도에 대해 직선 기울기였다.

[표 2]

표 2에 나타낸 바와 같이, GAD₆₅또는 GAD₆₇을 포함하는 용균액은 [1-¹⁴C]-글루타메이트를 GABA 및¹⁴CO₂로의 전환을 촉매한다.

PLP는 GAD₆₇보다 GAD₆₅의 효소적 활성을 더욱 촉진시킨다. 이러한 더욱 증대된 촉진은 Martin와 공동 연구자들에 의해 제안(Martin, Cell. Mol. Neurbiol., 7 : 237, 1987)된 불활성화 회로를 통한 GAD₆₅의 더욱 빠른 순환을 반영할 것이다. 이러한 빠른 순환은 GAD₆₅가 생체중에 존재하는 아포-GAD의 저장소에 더욱 기여한다는 것을 의미한다(Miller, 등, Brain Res. Bull., 5(Supp1. 2) : 89, 1980). 이로써, 생체중에 PLP는 GAD₆₇활성보다는 GAD₆₅의 활성을 더욱 조절한다는 것을 알 수 있다.

용균액중의 GAD₆₅활성은 흑질 래트로부터 제조된 시냅토솜내에서 발견된 PLP에 의해 5배 자극된 GAD 활성과 유사하다(Miller, 등, J. Neurochem., 33 : 533, 1979). 상기 2개의 GAD는 미정제 래트 뇌균질액중의 GAD 활성보다 세균내 첨가된 PLP에 더욱 의존적이므로, 용균액의 내인성 PLP 농도는 래트 뇌균질액 중의 농도보다 적을 수도 있다.

D. GAD₆₅와 GAD₆₇의 면역학적 동정

래트뇌 균질액 및 용균액을 상술한 바와 같이 추출했다. 동등부피량의 로딩완충액을 종래 개시된 바와 같이 각 시료에 첨가했다(Harlow, 등, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 19889). 단백질을 SDS중에 10% 아크릴아미드 겔상에서 전기영동으로 분리하고 니트로셀룰로오즈로 전기영동적으로 전이했다(Harlow, 등, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1988). 상기 비반응성 부위는 2% 소혈청 알부민(V 분획), 1% 젤라틴, 및 1% 트리톤-X-100을 포함하는 인산염완충화된 식염(PBS) 용액으로 42℃에서 1시간 동안 차단되었다. 세정후, 상기 니트로셀룰로오 필터를 3부분으로 절단한 다음 하기 제1항체와 함께 항온처리했다: 레인 1에서 4는 GAD₆₇와 GAD₆₅둘다를 인지하는 Oertel 등(Neuroscience, 6 : 2689, 1981)의 항혈청의 1/2000 희석액과 반응시키고; 레인 5-8은 GAD₆₇만을 인지하는 K-2 항혈청의 1/2000 희석액과 반응시키고; 레인 9-12는 GAD₆₅에 특이적인 GAD-6 모노클로날 항체의 1/2000 희석액과 반응시켰다(Chang, 등, J. Neurosci., 8 : 2123, 1988). 모든 필터를 충분히 세정하고 적합한 제2항체를 반응시키고 세정한다. 결합된 항체를¹²⁵I-표지된 단백질 A와 자동 방사능 측정기로 검출했다. 각 레인은 다음의 것들을 포함하고 있다: 레인 1,5 및 9는 BL21(DE3) + pET-GAD₆₇; 레인 2,6 및 10은 BL21(DE3) + pET-GAD₆₅; 레인 3,7 및 11은 래트 뇌 균질액; 및 레인 4,8 및 12는 BL21(DE3) + pET-8C.

세균에 의해 생성된 GAD₆₅와 GAD₆₇의 면역학적 블롯은 GAD₆₅는 뇌추출액중의 더 작은 GAD에 상응하고, GAD₆₇은 더 큰 GAD에 상응한다는 것을 증명했다(제7도). 종래의 연구는 펠라인의 GAD₆₇및 마우스 GAD₆₇를 가지고 더 큰 GAD에 대한 GAD₆₇의 상응성을 증명했다(Katarova, 등, Eur. J. Neurosci, 2 : 190, 1990 ; 235, 1987). 세균에 의해 생성된 GAD₆₅와 GAD₆₇의 이동성은 래트뇌 균질액내에서 나타나는 면역 반응성 이중체와 동일하다.

그러므로 래트뇌중의 GAD의 작은 분자량과 큰 분자량 형태는 각각 GAD₆₅와 GAD₆₇cDNA의 생성물에 대해 항원성 및 크기에서 동일하다. 결과적으로, 래트뇌중의 2개의 GAD는 GAD₆₅와 GAD₆₇이다. 이 데이타로부터 또한 Tapia에 의해 보고된 PLP-의존성 및 PLP-독립성 GAD(Bayon, 등, J. Neurochem., 29 : 519, 1977)의 분자석 실체는 각각 GAD₆₅와 GAD₆₇이라는 것을 결론지을 수 있다. Martin과 공동연구자(Spink 등, Brain Res., 421 : 235, 1987)들은 래트 뇌 GAD의 4가지 동역학적으로 다른 형태의 존재를 보고했다. 그러나 이들 형태의 면역학적 블롯 실험(본원에서 사용된 항혈청으로)은 보고되지 않았다.

E. 뇌조직중의 RNA내에서 GAD₆₅와 GAD₆₇의 분포

인시추 하이브리드화(in situ hybridization)을 사용하여 소뇌중의 RNA내에서의 GAD₆₅와 GAD₆₇의 분포를 결정하는 실험을 실시했다.

GAD₆₅와 GAD₆₇cDNA로부터 각각 3.2Kb 및 2.3Kb의 전사체를 Wuenschell등(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83 : 6193, 1986)의 방법에 따라³⁵S로 방사능 표지했다. 2OObp의 가수분해된 단편을 래트 소뇌의 관상절단면에 하이브리드화시켰다. 동물을 할로탄으로 마취시키고 참수했다. 그 뇌를 드라이아이스로 빠르게 냉동하고 냉동관상 절단면(12㎛)을 새로 제조된 인산염 완층화된 식염용액(PBS: 130mM NaCl, 10mM Na 인산염, pH 7.0)내 4% 포름알데히드중에서 30분 동안 고정시켰다. 이 조직을 각 등급의 에탄올 용액을 통해 탈수시키고 -70℃에서 저장했다.

조직 투과성을 증가시키기 위해, 상기 절단면을 다음과 같이 전처리를 한다:각 등급의 에탄올 용액(95%, 85%, 70%, 50% 및 30% 에탄올중에 각각 5분씩)중에서 재수화; PBS(5분); 0.02N HC1(10분); PBS(5분); PBS중에 0.01% 트리톤 N-101(1분); PBS(2×5분); 1㎍/㎖ 프로테나아제 K(7.5분); 및 PBS중의 글리신(프로테나아제 K를 억제) (3×5분). 프로테나아제 K는 사용전에 37℃에서 30분 동안 분해시켰다. 다음 상기 절단면을 50% 포름아마이드, 750mM NaCl, 25mM EDTA, 0.2% SDS, 0.02% BSA, 0.002% 피콜, 0.02% 폴리비닐피롤디돈, 250㎍/㎖ 효모 tRNA, 250㎍/㎖ 폴리 A, 및 25mM PPES(pH 6.8)의 혼합액중에서 37℃로 반응시켰다.

하이브리드화를 위해, 100mM DTT, 10% 덱스트란 황산염, 및 센스(sense) 또는 안티센스(antisense)³⁵S-RNA를 예비 하이브리드화 용액에 첨가했다. 프로브(센스 또는 안티센스) 약 3ng(1O⁶cpm)을 포함하는 하이브리드화용액일정량(50㎕)을 상기 슬라이드위에 첨가했다. 각 슬라이드를 커버로 덮고 50℃에서 16시간 배양한 다음, 실리콘화된 커버슬립을 4XSSC(1XSSC-150mM NaC1, 60mM 구연산 나트륨, pH 7.0)로 순간 세정하여 제거했다.

다음 절단면을 리보누클레아제 A(0.5M NaCl, 10mM Na 티오설페이트, 1mM EDTA, 10mM 트리스 HCl 용액중에 50㎍/㎖, pH 8.0)로 37℃에서 20분동안 처리하고 2XSSC, 10mM Na 티오설페이트중에서 2시간 동안 실온에서 세정하고 55℃에서 30분 동안 처리했다. 절단면을 에탄올로 탈수하고, 자일렌중에서 탈지질화하고 코닥 NTB2 유탁액으로 코팅하고 4℃에서 10일동안 방치했다.

이 유탁액을 코닥 D19르 현상하고, 이 조직을 크레실 비올렛으로 대비 염색했다.

자동 방사능 측정용 염색은 반사된 편광을 사용하여 검출되었고 그레인(grain) 수, 밀도, Nd 세포 면적은 Analytic Imaging Concepts 영상 분석기 시스템으로 결정되었다. 낮은 배경 수준에 의해, "표지된" 세포로 정의하는 기준은 5개 이상의 응집된 그레인(grains)의 존재에 의거했다. 상기 GAD 표지된 세포는 뇌를 통해 분산되어 존재하여 개개의 세포에 대한 그레인의 수를 측정할 수 있었다. 하나의 그레인으로 피복된 세포의 경계선과 면적은 세포당 그레인수를 계산 가능케했다. 이러한 분석은 반사된 편광 및 투과광을 사용하여 염색된 세포와 층적된 그 레인을 동시에 시각화하기 위해, 고배율(800X)에서 실시되었다. 숫자는 "n"세포의 평균 ±S.E.M이다.

[표 3]

모든 신경 단위의 형태에서 GAD₆₇mRNA 수준이 더욱 크다. 인시추하이 브리드화의 결과는 소뇌의 PLP 독립적 GAD 활성에 대한 PLP 의존적 GAD 활성의 비율은 시험된 뇌부위중 가장 낮은 부위중의 하나라는 종래의 보고(Nitsch, J. Neurochem., 34 : 822, 1980 ; Denner 등, J. Neurochem., 44 : 957, 1985; Itoh, 등, Neurochem. Res. 6 : 1283, 1981)와 일치한다.

또한, 표3에 나타낸 것과 같이, GAD₆₇mRNA 함량의 순서는 푸르키니에 ＞ 골지 II ＞ 농세포 ＞ 성상세포이고; 반대로, GAD₆₅mRNA 함량의 순서는 골지 II ＞ 푸르키니에 ＞ 농세포 ＞ 성상세포이다.

그러므로 GAD₆₅및 GAD₆₇mRNA의 발현은 신경단위의 종류에 따라 다르다. 또한 총 GAD 활성에 대한 각각의 기여도는 GABA 생성이 조절되는 방법에 영향을 준다. 예를 들어, 상기 흑질은 PLP-독립적 GAD 활성에 대한 PLP-의존적 GAD 활성의 비율이 가장 높은 것중 하나이다(Nitsch, J. Neurochem., 34 : 822, 1980). GABA 이화작용의 저해제를 국소주사하여 상기 흑질중에 GABA 농도를 증가시키는 것이 간질 발작의 민감성을 감소시키는데 특히 바람직하다(Gale, Fed. Proc., 44 : 2414, 1985). 그러므로 PLP-길항물질로 유도된 간질발작을 겪고 있는 실험 동물은 특히 상기 흑질내 신경말단에서의 GAD₆₅의 억제때문에 간질발작의 전달을 저지할 수 없다.

F. GAD₆₅와 GAD₆₇의 아세포내의 위치

GAD₆₅와 GAD₆₇의 분포는 S₂와 시냅토솜 아세포부분에서 측정되었다. S₂는 뇌중의 모든 세포들의 사이토솔을 포함하는 고속 상청액인 반면 시냅토솜의 부분은 주로 신경 말단을 포함한다(Gray 등, J. Anat, Lond, 96 : 79, 1962). 이런 연구를 위해, 충 래트 뇌의 분획화를 부쓰(Booth)와 클라크(Clark) (Booth 등, Biochem. J., 176 : 365, 1978)에 의해 개시된 바와 같이 실시했다. 단백질의 농도는 샤프너와 바이스만(Schaffher 등, Anal. Biochem. 56 : 502, 1973)방법으르 결정되었다. 시료는 카이저(Kaiser, 등, DNA Cloning, Vol. I, A Practical D.M. Glover ed.(IRL Press, Oxford, 1985, pp. 38-40))에 의해 설명된 방법으로 제조되었고, 그리고 면역학적 블롯팅은 GAD-6 모노클로날 항체 및 K-2 항혈청을 사용하여 상술한 바와 같이 실시되었다. 단백질의 동일량(16㎍)을 각 레인에 첨가했다. 자동방사능 측정기에 의해 K-2 항혈청 및 GAD-6 모노클로날 항체와 함께 단백질 농도를 1, 3, 10, 30, 100㎍으로 반응시켜 항체에 결합된¹²⁵I-단백질 A의 증가량이 직선 반응을 나타내는 것으로 관찰되었다(제시되지 않은 자료).

상기 결과들은 GAD₆₇이 상기 2개의 분획내에서 동량으로 존재한다는 것을 나타냈다. 상기 S₂분획은 신경교(다른 비신경원성 세포뿐만 아니라) 및 신경원세포의 사이토솔 단백질을 포함하므로, GAD₆₇의 농도는 신경말단부보다 신경원 세포체내에 더 많을 것이다. 반면 GAD₆₅의 농도는 S₂에 보다 시냅토솜 내에 더 많다. 이들 아세포 분획화 실험으로서, GAD₆₅와 반대로, GAD67은 신경말단부보다 신경원세포체에 더 많은 비율로 존재한다고 제안되었다. 이로써, 면역 조직 화학에서와 같이, 아세포 분획화는 GAD₆₅와 GAD₆₇의 아세포내 분포 비율이 다르다는 것을 나타낸다.

GABA 합성 및 분해 저해제를 사용하는 생체내 실험에서 신경원 세포채내의 GABA 저장량은 신경말단의 함량과 다르다는 것이 제안되었다(Iadarola, 등, Mol, Cell, Biochem., 39 : 305, 1981). GAD₆₇에 의해 생성되는 GABA는 세포대사(예를 들어, GABA 션트내) 및 수상수상돌기 시냅스내에 더 많이 관여될 수 있다. 승모상의 수상돌기(Shepard, Physiol. Rev., 52 : 864, 1972)를 갖는 수상수상돌기 시냅스를 형성하며, 아마도 GABA(McLennan, Brain Res., 29 : 177-184, 1971)를 방출하는 후각구내 과립 세포의 수상 돌기는 K-2 항혈청으로 강하게 표지된다. 본원에 제시되지는 않았으나, 후각구내 GAD₆₅mRNA 함량보다는 GAD₆₇mRNA 함량이 더 많은 것으로 밝혀졌다(2-3배). 이런 분포도는 후각구내 대부분의 GAD 활성이 S₂및 P₁(미정제 핵펠렛)내에 존재하고 시냅토솜에는 존재하지 않는다는 종래 보고(Quinn, 등, J. Neurochem., 35 : 583, 1980)와 일치한다.

GAD₆₅와 GAD₆₇의 아세포내 분포도가 다른 것은 셰포골격내 고착성 또는 어떤 미지의 단백질 타겟팅(targeting) 기작으로부터 초래될 수 있다. 일부 세포 골격내 단백질은 GAD₆₅와 GAD₆₇과 유사한 분포를 갖는다. 예를 들어, 교감 신경계의 신경원 배양물내에는 타우(tau)의 84%가 액손내에 있는 반면 MAP-2는 100%가 세포체와 수상돌기내에 존재한다는 것이 Peng등(J. Cell. Biol., 102 : 252, 1986)에 의해 증명되었다. 또한, 세포 골격내 단백질인 43Kd 단백질은 막세포골격 하부에 있는 아세틸 콜린 수용체에 고착하는 것으로 추정된다(Flucher, 등, Neuron, 3:163, 1989).

[실시예 3]

임상적 표본중에 GAD 자가항체의 검출

A. 재료 및 방법

1. 환자의 표본

4군의 개개인들로부터 혈청을 Atkinson 및 공동연구자(Atkinson, 등, Lancet, 335 : 1357-1360, 1990)에 의해 종래 연구된 방법으르 선별했다.

이들 군들은 다음과 같이 구성된다: (1)군, 플로리다 대학교의 당뇨 임상학부에서 연구되어 설정된 국립 당뇨병 데이타 그룹(NDDG) 기준(Gleichman 등, Diabetes, 36 : 578-584, 1987)에 따라 진단된 새로운 개시 IDD 환자 1명; (2)군, 임의의 가계 자가면역 질환이 알려지지 않은 5명의 임의로 선택된 세포도 세포질 항체(ICA) 음성 무당뇨병 대조군; (3)군, IDD의 임상적 개시 기록이전 3 내지 66개월 동안 혈청을 수거한 13명: (4)군, IDD가 개시되기 전에 연구되었던 무당뇨병 대조군 및 관련자들; 및 (5)군, IDDM의 위험이 있으나 아직 발병되지 않은 환자 3명, 이 마지막 군은 IDD 발단자에 비해 1급인 5000명 이상과, 일반인 8200명(이중 4813명은 학생이다)에 대한 진행 예상용 ICA 선별연구를 통해 확인되었다.

2. 세포도 자가항체

O형 혈액형의 췌장을 저온 절단하여 간접 면역형광법에 의해 ICA를 측정하였다(Atkinson, 등, Lancet, 335 : 1357-1360, 1990). 모든 결과들은 각 배치내에 양성 및 음성 혈청 대조군과 함께, 코드화된 시료 상에 기록하였다. ICA 양성의 정도는 ICA 표준화를 위한 Immuno1ogy Diabetes Workshop(IDW)에 의해 설립된 가이드라인에 따라 분석되었다(Gleichman 등, Diabetes, 36 : 578-584, 1987). 모든 양성 혈청을 종점 희석율로 적정하였고, 청소년 당뇨병 협회(Juvenile Diabetes Foundation: JDF) 유니트는 종래 국제 JDF 표준 80유니트로 조정된 표준 혈청을 비교군으로하여 결졍되었다. 본원에서 보고된 연구에 있어서, 양성 ICA 결과는 10 JDF 유니트 이상의 반복 적정량으로서 정의된다.

3. HLA DR 유형 결정

HLA DR 유형결정 DR 트레이를 사용하여(One Lamda Laboratories, Los Angeles, CA), Van Rood와 Van Leuwen에 의해 개시된 방법(Nature, 262 : 795-797, 1976)으로부터 적용된 것과 같이 실시되었다.

4. 인간의 세포도

인간의 췌장도는 사체의 췌장으로부터 분리되었고 개시된 바와 같이(Ricordi, 등, Diabetes, 37 : 413-420, 1988) 시험관내에서 유지되었다. 이세포도는 시험관내에서(95% 공기/5O% CO₂)³⁵S 메티오닌으로 대사적으로 표지되었다.

5. 세포도 추출 및 면역침강반응

세포도를 종래 Atkinson 둥에 의해 개시된 방법(Lancet, 335 : 1357-1360, 1990)에 하기와 같이 변형을 가하여 추출했다. 면역 침강반응 연구를 위해, 세포도 용해물을 1000 세포도마다 대조군, IDD 혈청(100㎕), 또는 GAD-6(Chang 등, J. Neuro, 8 : 2123-2130, 1988) (트리스 완충액 99㎕에 1㎕: Atkinson 등, Lancet, 335 : 1357-1360, 1990)와 반응(2h, 4℃)시켜 2회 예비 세정하였다. 이어서 면역 복합체를 과량의 단백질 A 세파르오즈 CL-4B(Pharmacia, NJ)에 흡수시켰다(1H, 4℃). 이어서 결합되지 않은(예시 세정된) 용해물을 포함하는 1000 세포도를 포함하는 일정부피량을 IDD 또는 혈청 대조군(25㎕), 또는 GAD-6(Chang, 등, J. Neuro, 8 : 2123-2130, 1988) (25㎕ 트리스 완충액내 1㎕)와 함꼐 반응시켰다(12h, 4℃). 또 한번 단백질 A 세파로즈 CL-4B와 반응시킨 후(1h, 4℃), 상기 혼합물을 0.1% SDS, 1.0% 트리톤 X-114 및 2mM EDTA를 포함하는 50mM Tris HCl(pH 7.4)로 5회 세정한 다음 2차 증류수로 또 한번 세정했다. 이어서 상기 단백질 A 세포로즈 CL-4B를 Laemmli 시료 완충액(Laemmli, Nature, 227 : 680-685, 1970)내에서 비등시키고, 이 시료를 SDS-PAGE하여 Enhance(New England Nuclear)를 사용하여 형광 방사능 측정기(Kodak, X-moat AR₅)로 측정했다. 대안적으로, 상기 방사선 사진은 BETAGEN(Boston, MA) 분석기로 분석되었다. 64KA 양성 및 음성 혈청이 상호 측정시의 대조군으로서 각 측정에 사용되었다. 모든 형광 방사능 측정은 공지된 상호 측정시 대조군과 비교후 양성 또는 음성으로서 분석 및 평가되었다. 양성 혈청 시료들은 시료가 낮은 농도의 64,000Mx 밴드의 면역 침강반응을 나타낼 때는 1로서, 중간 농도의 밴드가 관찰되었다면 2로서, 면역 침강된 단백질의 농도가 높으면 3으로 표기되었다. 면역 침강된³⁵S-GAD₆₅와³⁵S-GAD₆₇에 대응하는 밴드의 농도에 있어서 유사한 평가 방법이 사용되었다.

6. 면역침강 반응

³⁵S-GAD₆₅또는³⁵S-GAD₆₇및 인간의 뇌 균질물로부터 GAD를 포함하는 세균 용해물의 면역 침강반응은 상기 인간의 세포도 추출물의 면역침강 반응연구에서 설명한 것과 같이 완료되었다.

7. GAD 분석

인간의 뇌 균칠물을 상기 인간의 세포도에서 상술한 바와 같이 환자의 혈청과 함께 반응시켰다. 흡수 및 세정 후, 상기 단백질 A 아가로오즈 슬러리를 3개의동등부피량으로 분할하고 GAD 활성을 종래 개시된 방법(Krieger, 등, Neurochem. 33 : 299, 1984)에 따라 측정되었다. 간단히 말하면, 단백질 A 아가로오즈 비드를(1-¹⁴C)-글루타메이트(Amersham)과 함께 소정의 반응 혼합물(Krieger 등, Neurochem. 33 : 299, 1984)에서 반응시켰고,¹⁴CO₂의 생성 량을액체 신틸레이션 계수기로 졍량 분석했다.

8.³⁵S-GAD₆₅와³⁵S-GAD₆₇의 생성

래트 GAD₆₅와 GAD₆₇cDNA를 전술한 바와 같은 세균의 발현 시스템에 서브 클로닝했다.³⁵S-GAD의 표지는 IPTG 유도된 세균(최소배지에서 증식한)을 TRAN³⁵S-표지(ICN)로 15분 동안 펄싱하여 완결되었다. 이어서 배양액을 침강시키고 재현탁시켜 1ml 균질화용 완충액(1mM 페닐메틸술폰일 플루오라이드(PMSF), 1mM 2-아미노에릴이소티오우로늄 브로마이드(AET)와 60mM 인산칼륨, pH 7.1)중에서 초음파처리하였다. 초음파처리한 후, 세포잔여물을 원심분리로 제거하고 상청액(상청액은 -70℃에서 일정량 보관)내의 단백질 농도를 측정했다(Bradford, Anal. Biochem., 72 : 248, 1986).

B. IDDM 표본의 면역 반응성

IDDM 환자로부터의 혈청을 인간의 뇌 균질믈로부터 GAD를 침전시키는 능력에 대해 특정하였다.

[표 4]

표4에 나타낸 바와 같이,IDDM 환자들이나 IDDM의 위험성이 있는 4명(5명중)의 혈청에는 대조군 환자들로부터의 혈청보다 인간의 뇌 추출물중 더 많은 양의 효소적 활성 GAD가 결합되었다. 또한, 상기 환자들중 1명의 혈청은 IDDM전단계중에 수득되어, GAD에 대한 자가항체가 IDDM 증상의 개시전에 존재한다는 것이 밝혀졌다(하기 C 참조).

추가의 실험(결과는 제시하지 않음)은 IDDM 위험이 있는 환자(DA, CD)2명의 혈청이 재조합적으로 생성된³⁵S-GAD₆₅을 면역침강시키는 반면 재조합적으로 생성된³⁵S-GAD₆₇은 DA 환자의 혈청에 의해서만 인식된다(그리고³⁵S-GAD₆₅보다 더 낮은 정도로)는 것을 나타내었다. 연속적인 연구에 의해 GAD₆₅보다 GAD₆₇자가항체의 적정량이 신경병질 합병증을 가진 IDDM 환자들의 혈청내에 더 많은 양 존재한다는 것이 밝혀졌다(본원에 제시하지 않음).

DA 환자의 혈청을 사용한 추가의 연구에 의해 인간의 췌장도 세포내에서 생성되는 특정 폴리펩티드를 인식하는 항체가 존재한다는 것이 밝혀졌다. 이 결합된폴리펩티드를 전기영동으로 분석하여 64kD 성분에 대한 자가항체의 존재를 증명했고, 이것은 종래 인간의 IDDM(Baekkeskov, 등, Nature, 298 : 167-169, 1982) 및 동물 모델(Baekkeskov, 등, Science, 224 : 1348-1350, 1984; Atkinson 등, Diabetes, 37 : 1587-1590, 1988)내에서 다른 사람들에 의해 밝혀진 바 있다. GAD₆₇이 아닌 GAD₆₅를 인식하는 GAD-6 모노클로날 또는 세균에 의해 생성된 GAD₆₅를 가지고 상기 헐청을 우선적 흡수시킴으로써 상기 64kD 췌장성 폴리펩티드를 인식하는 혈청의 능력을 폐지했다. 이로서 64kD 자가항원에 대한 자가항체에 의해 인식되는 에피토프는 GAD₆₅내에 존재하며, 이것은 상기 자가항원은 확실히 GAD₆₅라는 것을 나타낸다. GAD₆₅의 예비값을 연구하기 위해, IDDM의 임상적 표현의 개시전에 환자로부터 뽑아낸 혈청으로 GAD₆₅에 대한 자가항체를 시험했다.

[표 5]

표5에 나타낸 바와 같이, 12명의 표본중 9명은³⁵S-GAD₆₅와 면역 반응성이 있었다. 또한, 2명의 환자(JA 및 VC)는 이들 조건하에서 GAD₆₇에 면역 반응성이 있고, GAD₆₅에 대한 면역반응성은 나타나지 않았다. 그러므로, GAD₆₅및 GAD₆₇에 대한 자가항체는 상기 12환자들의 혈청중 11명의 혈청내에 존재하였다(91%). 이런 발견은 GAD₆₅에 대한 자가항체가 GAD₆₇에 대한 자가항체보다 더욱 공통적일지라도, 분석 측졍시 재조합 GAD(GAD₆₅및 GAD₆₇)를 사용함으로서, IDDM의 예측성을 증가시킬 수 있을 것이라는 것을 제시했다. 이들 혈청에 대한 종래 시험(Akkinson, 등, Langet, 335 : 1357-1360, 1990)은 12명중 11명의 혈청이, 즉 92%가 인간의 췌장도 세포로부터의³⁵S-64KD 분자와 면역 반응성이 있다는 것을 증명했다. GAD₆₅가 아닌 64kD 분자에 대한 감응성 자가항체를 포함하는 혈청은 64kD 분자에 대한 가장 낮은 적정량(또는 "1")을 포함하는 혈청이었다. 그러므로, 얻어진 그릇된 음성은 상기 분석의 민감도가 낮기 때문이다. 또한, 상기 분석은 64K에 대해 음성인 한 환자(BR)에서 IDDM를 예상했다.

상기 결과는 인간의 췌장 내 β-세포에서 동정된 64kD 분자는 래트 GAD₆₅와 크기 및 항원성이 동일하다는 것을 나타낸다. 또한, IDDM 개시전에 환자로부터 뽑아낸 혈청은 GAD₆₅에 대한 자가항체를 포함한다. 결과적으로, GAD₆₅재조합 분자는 IDDM의 예비 진단용 도구로서 매우 유용하다. 실제적인 증상이 나타나기전 IDDM을 진단하는 의사들의 능력은 인슐린 치료법이 필요하기 전의 기간을 크게 연장시킬 것이라는 것은 의심의 여지가 엾다. 이러한 면역 검정법의 민감성은 인간의 췌장 β-세포내에 존재하는 GAD형을 나타내는 인간으로부터의 재조합 GAD₆₅를 사용함으로써 증진될 것이다.

[실시예 4]

폴리펩티드애 대한 면역 증식 반응

폴리펩티드는 자동장치(Applied Biosystems) 및 표준 조건을 사용하여 합성하였다. 이어서 비장 임파구 및 침윤성 T 임파구도(IITL)의 증식을 자극하는 상기 폴리펩티드들의 상대적인 활성을 비교하였다. 이 시험에서, GAD₆₅중심 서열 및 폴리오 비루수의 상동성 부위로부터 유도된 폴리펩티드를 비교하였다. 적합한 세포를 5×10⁴방사선 조사된 비장세포의 존재중에 상기 각각의 폴리펩티드와 함께 5일 동안 배양하였다. 3H-티미딘을 배양 마지막 16시간중에 첨가했다.

[표 6]

상기 실험에서, 상기 폴리올 또는 상기 GAD₆₅폴리펩티드에 노출된 비장 임파구 배양물의 증식 활성에 커다란 차이는 없다. 그러나, 상기 2가지 폴리펩티드는 배지 자체의 대조군보다 더 높게 세포 반응을 자극하였다.

상기 비장 세포중에서 증식 차이가 적은 것은 GAD 폴리펩티드 특이적인 T세포의 비율이 낮은 것에 기인한 것이다.

상기와 동일한 방법으로 상기 IITL 군을 측정시, 세포종식에 커다란 차이를 나타내었다. 이 시스템에서, 상기 GAD₆₅폴리펩티드에 대한 반응은 배양용 배지나 폴리오 폴리펩티드에 대한 반응보다 9배 정도 높았다. 이 결과는 GAD₆₅가 상기 IITL 군중의 T 세포반응에 대한 항원으로서 중요하다는 것을 강하게 나타내는 것이다. 이러한 당뇨병의 병인론적 측면에서 분자적 유사성이 중요한 역할을 한다는 것이 제안된다.

여기서 본 발명을 완전하게 설명하였으며, 많은 변화와 변형이 본 발명의 취지와 영역을 벗어남이 없이 실시될 수 있음이 본 발명의 기술분야의 전문가들에게 명백할 것이다.

Claims (11)

1. 하기 아미노산 서열을 가지며, 인체 GAD₆₅로부터 유도되고 인체 T-림프구의 생체외(in vitro) 증식을 자극하는 분리된 폴리펩티드 또는 이것의 유사체, 화학적유도체, 또는 약학적 허용성 염:

   X-Pro-Glu-Val-Lys-Y-Lys-Z

   상기 서열중에서 X는 1 내지 10개의 아미노산 중에서 선택된 아미노산 서열이거나 생략되며; Y는 Thr 또는 Glu이고; 그리고 Z는 1 내지 8개의 아미노산 중에서 선택된 아미노산 서열이거나 생략된다.
2. 제1항에 있어서, X는 Lys을 포함하고, Y는 Glu이며, 그리고 Z는 Leu을 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
3. 제2항에 있어서, X는 추가로 Met을 포함하고 Z는 추가로 Arg 및 Leu을 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
4. 제1항에 있어서, X는 Lys을 포함하고, Y는 Thr이며 Z는 Leu을 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
5. 제3항에 있어서, X는 Ala-Met-Met-Ile-Ala-Arg-Phe-Lys-Met-Phe인 아미노산 서열이고, Z는 Gly-Met-Ala-Ala-Leu-Pro-Arg-Leu인 아미노산서열인 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
6. 제4항에 있어서, X는 Ser-Ile-Met-Ala-Ala-Arg-Tyr-Lys-Tyr-Phe-인 아미노산 서열이고, Z는 Gly-Met-Ala-Ala-Val-Pro-Lys-Leu인 아미노산 서열인 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
7. 제1항의 폴리펩티드를 암호화하는 분리된 폴리누클레오티드.
8. 제7항에 있어서, DNA인 것을 특징으로 하는 폴리누클레오티드.
9. 제8항에 있어서, cDNA인 것을 특징으로 하는 폴리누클레오티드.
10. 제1항의 폴리펩티드에 대한 항체.
11. 제10항에 있어서, 모노클론성 항체인 것을 특징으로 하는 항체.