ES2281317T3 - Acido glutamico descarboxilasa clonada. - Google Patents
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Abstract
La utilización de un polipéptido o análogo, derivado químico o sal farmacéuticamente aceptable del mismo, que tiene la siguiente secuencia de aminoácidos: X - Pro - Glu - Val - Lys - Y - Lys - Z, donde X es una secuencia de uno a diez aminoácidos que puede o no estar presente; Y es Thr o Glu; y Z es una secuencia de uno a ocho aminoácidos que puede o no estar presente a) para diagnosticar diabetes mellitus dependiente de insulina (DMID); b) para detectar anticuerpos de GAD65 en una muestra; c) para clasificar pacientes con enfermedad autoinmunitaria; d) para realizar pruebas con fármacos que modifiquen la función de GAD; e) para generar un anticuerpo;
Description
Ácido glutámico descarboxilasa clonada.
La especificación de la presente invención se
refiere al uso de tecnología de DNA recombinante para la
transformación de un organismo huésped con la ácido glutámico
descarboxilasa_{65} (GAD_{65}) para la expresión de los
polipéptidos GAD_{65}. También se describen procedimientos de
utilización de los polipéptidos GAD_{65} en enfermedades
autoinmunitarias desde los puntos de vista diagnóstico y
terapéutico.
La diabetes mellitus dependiente de insulina
(DMID; diabetes de tipo I) es uno de los trastornos metabólicos más
corrientes. En Estados Unidos, la DMID afecta aproximadamente a uno
de cada 300 a 400 sujetos, y los estudios epidemiológicos sugieren
que su incidencia está aumentando. La enfermedad resulta de la
destrucción autoinmunitaria de las células \beta del páncreas
productoras de insulina. Más especialmente, la etapa anterior al
comienzo se caracteriza por "insulitis", en la que los
linfocitos infiltran los islotes pancreáticos y destruyen
selectivamente las células \beta. La presentación de la
hiperglucemia típica de la DMID aparece sólo después de que se
hayan perdido por lo menos el 80% de las células \beta productoras
de insulina. Las células que permanecen se destruyen durante los
primeros años.
Aunque el tratamiento con insulina permite a la
mayoría de los pacientes de DMID llevar una vida normal, esta
sustitución es imperfecta y no restablece completamente la
homeostasis metabólica. Así pues, son corrientes las complicaciones
graves que producen disfunciones del ojo, riñón, corazón y otros
órganos en pacientes de DMID que reciben el tratamiento con
insulina. A causa de esto, es sumamente deseable prolongar el
periodo de latencia (por ejemplo, mediante la administración de
fármacos inmunosupresores) entre el comienzo de la destrucción de
las células \beta y el requisito existente de la sustitución de
insulina (es decir, cuando se destruye el 80% de las células). Por
consiguiente, una prueba de diagnóstico que determinase el inicio
de la destrucción de las células \beta permitiría al médico
administrar fármacos inmunosupresores (Silverstein, et. al.,
New England Journal of Medicine, 319: 599-604, 1988)
para extender este periodo de latencia y de este modo retrasar
significativamente el comienzo de los efectos secundarios de la
sustitución de la insulina.
Muchos pacientes de DMID tienen un suero que
contiene anticuerpos frente a una molécula de 64 kDa (Baekkeskov,
et. al., J. Clin. Invest., 79:926-934, 1987;
Atkinson, et. al., Lancet, 335:1357-1360,
1990), frente a las moléculas citoplasmáticas de las células de los
islotes (ICA) o frente a las moléculas de la superficie de las
células de los islotes (ICSA) (Botazzo, et. al., Lancet,
1:668-672, 1980) o bien anticuerpos frente a la
insulina (Palmer et. al., Science,
222:1137-1139, 1983; Atkinson, et. al.,
Diabetes, 35:894-898, 1986). Atkinson y sus
colaboradores (Atkinson, et. al., Lancet,
335:1357-1360, 1990) han demostrado que la presencia
de anticuerpos en una molécula de 64 kDa en el suero humano parece
ser el indicador más precoz y más fiable que inicia los síntomas de
DMID que tendrán lugar finalmente.
Recientemente, Baekkeskov y sus colaboradores
demostraron que la molécula de 64 kDa y la ácido glutámico
descarboxilasa (GAD) tienen varios epítopos antigénicos en común y
de este modo puede tratarse de moléculas idénticas o muy similares.
Aunque esta identificación es un descubrimiento importante, se sabe
que la utilización de esta información como herramienta de
diagnóstico para predecir DMID es bastante incómoda y limitada, a
menos que se conozca la biología molecular de la GAD. Por
consiguiente, la clonación y posterior producción de grandes
cantidades de la molécula de 64 kDa, o de una molécula de GAD que
desde un punto de vista antigénico sea sustancialmente idéntica a
la molécula de 64 kDa, permitirán el desarrollo de un equipo de
diagnóstico diseñado para predecir la DMID. La presente invención
proporciona un procedimiento para poder obtener este resultado.
La presente invención surgió a raíz del
descubrimiento de que la tecnología del DNA recombinante se podía
utilizar para producir polipéptido GAD_{65} eucariótico y que el
polipéptido GAD_{65} se podía utilizar en el diagnóstico y el
tratamiento de pacientes con enfermedades autoinmunitarias. Es
particularmente relevante la utilización del polipéptido GAD_{65}
eucariótico clonado en el diagnóstico de pacientes que padecen, o
tienen riesgo de padecer, diabetes mellitus dependiente de insulina
(DMID).
Una de las ventajas principales de la presente
invención es que proporciona a la técnica una fuente disponible de
polipéptido GAD_{65} eucariótico que corresponde al purificado de
origen natural, mientras que evita los problemas relacionados con
el aislamiento del polipéptido GAD_{65} eucariótico que se
encuentra en la naturaleza al separarlo de otros polipéptidos
eucarióticos distintos de GAD_{65}. La ausencia de otros
polipéptidos eucarióticos distintos de GAD_{65} es importante
porque permite el desarrollo de sistemas de análisis que sólo
detectarán anticuerpos específicamente reactivos a polipéptidos
GAD_{65}.
Otra ventaja de proporcionar polipéptido
GAD_{65} eucariótico en células huésped es, que haciéndolo así,
es posible obtener cantidades de polipéptido mucho mayores que las
que están actualmente disponibles de un modo factible a partir de
fuentes naturales. Como consecuencia, no sólo es posible utilizar el
polipéptido de la invención para clasificar de una manera más
exacta a los pacientes de dichas enfermedades autoinmunitarias como
la DMID, sino que además en la actualidad es posible proporcionar
comercialmente cantidades útiles de polipéptido GAD_{65} para su
utilización en sistemas de diagnóstico.
Figura 1 Estrategia de clonación para obtener
sondas de cDNA específicas de GAD_{65} y GAD_{67}.
Figura 2 Secuencia de DNA y secuencia
correspondiente de aminoácidos para la GAD_{65} de rata.
Figura 3 Secuencia de DNA y secuencia
correspondiente de aminoácidos para la GAD_{65} humana.
Figura 4 Comparación de las secuencias de
aminoácidos de la GAD_{65} de rata y de la GAD_{65} humana.
Figura 5 Los cDNA de GAD_{65} y GAD_{67}
hibridan con RNA de diferente tamaño.
Figura 6 Transferencias Southern hibridadas con
sondas de cDNA específicas de GAD_{65} y GAD_{67}.
Figura 7 Identificación inmunológica de
GAD_{65} y GAD_{67}.
De forma particular, la presente invención hace
referencia a los distintos usos de un polipéptido, como se
especifica en las reivindicaciones adjuntas.
La especificación de la presente invención se
refiere a la manipulación de materiales genéticos mediante
procedimientos recombinantes que hacen posible la producción de
polipéptidos que poseen parte de la conformación estructural
primaria de uno o más de los epítopos para unir autoanticuerpos a la
ácido glutámico descarboxilasa_{65} (GAD_{65}). Estos
polipéptidos son sumamente útiles para la detección inmunológica de
autoanticuerpos reactivos a ellos, ya que dichos autoanticuerpos
son indicadores de enfermedades autoinmunitarias tal como la
diabetes mellitus dependiente de insulina y el síndrome del
"hombre rígido". Estos polipéptidos se pueden utilizar también
con el fin de identificar fármacos, tales como los que alteran la
función de GAD, y para la producción de anticuerpos policlonales y
monoclonales que, a su vez, se pueden utilizar a modo de diagnóstico
para identificar la GAD_{65}.
El desarrollo de secuencias específicas de DNA
que codifican el polipéptido GAD_{65} eucariótico para corte y
empalme en vectores de DNA se puede realizar utilizando varias
técnicas. Por ejemplo, los procedimientos alternativos que se
pueden emplear comprenden: (1) el aislamiento de una secuencia de
DNA bicatenario a partir del DNA genómico del organismo eucariota;
(2) la fabricación química de una secuencia de DNA para proporcionar
los codones necesarios para el polipéptido de interés; y (3) la
síntesis in vitro de una secuencia de DNA bicatenario por
transcripción inversa del mRNA aislado a partir de una célula
eucariótica donante. En este último caso, se forma finalmente un
DNA bicatenario complementario al mRNA al que se hace referencia
generalmente como cDNA.
La fabricación de secuencias de DNA es
frecuentemente el procedimiento de elección cuando se conoce la
secuencia completa de los residuos de aminoácidos del polipéptido
deseado. Cuando no se conoce la secuencia completa de los residuos
de aminoácidos del polipéptido deseado, no es posible la fabricación
directa de las secuencias de DNA y el procedimiento de elección es
la formación de secuencias de cDNA. Entre los procedimientos
estándar para el aislamiento de las secuencias de cDNA en cuestión
está la formación de bibliotecas de cDNA contenido en plásmidos,
que proceden de la trascripción inversa del mRNA que es abundante en
las células donantes que tienen un alto nivel de expresión génica.
Cuando se emplean junto con la tecnología de la reacción en cadena
de la polimerasa, se pueden clonar incluso productos de expresión
poco frecuentes. En aquellos casos en que se conocen partes
significativas de la secuencia de aminoácidos del polipéptido, la
producción de secuencias de sondas de DNA o RNA de cadena simple o
doble marcadas duplicando una secuencia supuestamente presente en
el cDNA diana se puede emplear en los procedimientos de hibridación
DNA/DNA que se llevan a cabo sobre copias clonadas del cDNA que han
sido desnaturalizadas para dar una forma de cadena simple (Jay,
et. al., Nucleic Acid Research, 11:2325,
1983).
1983).
Los procedimientos de hibridación son útiles
para la detección de clones recombinantes utilizando sondas
sintéticas de oligonucleótidos marcadas y mezcladas en las que cada
una es en potencia el complemento perfecto de una secuencia de DNA
específica de la muestra de hibridación que comprende una mezcla
heterogénea de DNA desnaturalizado bicatenario. Para dicha
detección, la hibridación se lleva a cabo preferentemente en DNA de
cadena simple o DNA bicatenario. Estos procedimientos son
particularmente útiles en la detección de clones de cDNA que
proceden de fuentes en las que está presente una cantidad
extremadamente baja de secuencias de mRNA en relación con el
polipéptido de interés. En otras palabras, utilizando condiciones
restrictivas de hibridación dirigidas a evitar las uniones no
específicas, es posible, por ejemplo, permitir la observación
autorradiográfica de un clon específico de cDNA mediante la
hibridación del DNA diana con esa sonda individual en la mezcla que
es su complemento perfecto (Wallace, et. al., Nucleic Acid
Research, 9:879, 1981).
Además, se puede examinar una biblioteca de cDNA
de GAD inyectando los diversos cDNA en ovocitos, dejando tiempo
suficiente para que tenga lugar la expresión de los productos
génicos del cDNA, y probando la presencia del producto de la
expresión deseada del cDNA utilizando, por ejemplo, un anticuerpo
específico para el polipéptido GAD_{65} o utilizando análisis
funcionales sobre la actividad enzimática de la GAD_{65}.
Por otra parte, se puede examinar indirectamente
una biblioteca de cDNA en busca de péptidos GAD_{65} que tengan
por lo menos un epítopo empleando anticuerpos frente a GAD_{65}
(Chang y Gottlieb, J. Neurosci., 8:2123, 1988). Dichos anticuerpos
se pueden obtener policlonal o monoclonalmente y se pueden utilizar
para detectar el producto de expresión indicador de la presencia
del cDNA de GAD_{65}. Se prefieren los anticuerpos dirigidos a un
epítopo observado en los 100 primeros aminoácidos de la parte
N-terminal de GAD_{65}.
De los tres procedimientos indicados
anteriormente para desarrollar las secuencias específicas de DNA
para utilizarlas en procedimientos recombinantes, la utilización de
cepas de DNA genómico es la menos frecuente. Esto es especialmente
cierto cuando se desea obtener la expresión microbiana de
polipéptidos de mamíferos debido a la presencia de intrones.
La especificación de la presente invención hace
referencia a nuevos polipéptidos GAD_{65} que poseen parte de la
conformación estructural primaria o toda ella; esto es, una
secuencia continua de residuos de aminoácidos, que tienen por lo
menos un epítopo para anticuerpos frente a GAD_{65}.
Es posible utilizar los fragmentos de
polipéptido de la invención en lugar de la GAD_{65} intacta para
detectar anticuerpos frente a GAD_{65}. El término
"polipéptido", como se aplica al polipéptido GAD_{65},
comprende cualquier secuencia de aminoácidos que tenga un epítopo
para autoanticuerpos para GAD_{65} donde la secuencia de
aminoácidos se codifica mediante toda o parte de las secuencias de
cDNA de la invención.
Los polipéptidos que resultan de la expresión
microbiana de las secuencias de DNA de la invención se pueden
caracterizar además por su libertad de asociación con otros
polipéptidos eucarióticos u otros contaminantes que de otro modo
podrían estar relacionados con GAD_{65} en su medio celular
natural o en fluidos extracelulares tales como plasma u orina.
Los estudios por los presentes inventores
demuestran inequívocamente que GAD_{65} y GAD_{67} se codifican
mediante distintos genes y no se producen, por ejemplo, por
modificación postranscripcional o postraduccional de una secuencia
genómica común. Entre las evidencias que prueban que GAD_{65} y
GAD_{67} están codificadas por genes diferentes se encuentran las
siguientes: (a) la secuencia contigua más grande de identidad exacta
entre los cDNA de GAD_{65} y GAD_{67} tiene sólo 17 nucleótidos
de longitud; (b) los cDNA de GAD_{65} y GAD_{67} no sufren
hibridación cruzada, entre sí ni con los mRNA de cada uno, en
condiciones poco restrictivas (2,0 x SSC, 0,01% SDS, 23ºC); y (c)
los cDNA de GAD_{65} y GAD_{67} no sufren hibridación cruzada
con clones genómicos aislados que codifican a GAD_{67} y
GAD_{65}, respectivamente.
El término "huésped" comprende no sólo
organismos procariotas, sino también eucariotas tales como
levaduras, hongos filamentosos, células de plantas y animales,
además de células de insectos que pueden replicarse y expresar una
secuencia de DNA exenta de intrones de GAD_{65} eucariótica. No
obstante, los procariotas son preferidos como organismos
huésped.
El término "procariotas" comprende todas
las bacterias que se pueden transformar o transfectar con el gen
para la expresión de GAD_{65}. Los huéspedes procariotas pueden
comprender bacterias gram negativas, además de gram positivas tales
como, por ejemplo, E. coli, S. typhimurium, Serratia
marcescens y Bacillus subtilis.
Una molécula de DNA recombinante que codifica
los polipéptidos GAD_{65} se puede utilizar para transformar o
transfectar el huésped utilizando cualquiera de las técnicas
comúnmente conocidas por los expertos en la materia. Especialmente
preferida es la utilización de un plásmido o de un virus que
contiene la secuencia que codifica la GAD_{65} con fines de
transformación o transfección procariótica, respectivamente.
Los procedimientos para preparar genes
fusionados y ligados funcionalmente y expresarlos en bacterias son
bien conocidos en esta técnica (Maniatis, et. al., Molecular
Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold
Spring Harbor, NY, 1989). Las construcciones genéticas y los
procedimientos descritos en este manual se pueden utilizar para la
expresión de GAD_{65} en huéspedes procarióticos.
En general, los vectores de expresión que
contienen secuencias promotoras que facilitan la trascripción eficaz
de la secuencia genética eucariótica insertada que se utilizan
están relacionados con el huésped. El vector de expresión contiene
típicamente un origen de replicación, un promotor y un terminador,
además de genes específicos que son capaces de proporcionar la
selección fenotípica de las células transformadas. Los huéspedes
procarióticos transformados se pueden desarrollar en fermentadores
y se pueden cultivar según técnicas conocidas en la materia para
conseguir un crecimiento celular óptimo. Los polipéptidos aquí
descritos se pueden aislar a continuación a partir del medio de
crecimiento, de lisados celulares o de fracciones de membrana
celular.
El aislamiento y purificación de los
polipéptidos expresados de forma microbiana aquí descritos se pueden
realizar por cualquier medio convencional como, por ejemplo,
separaciones cromatográficas preparativas y separaciones
inmunológicas como las que implican la utilización de anticuerpos
monoclonales o policlonales.
Habiendo proporcionado la secuencia de residuos
de aminoácidos de GAD_{65}, la especificación de la presente
invención describe la preparación de secuencias de DNA que codifican
la expresión en el huésped de análogos o derivados polipeptídicos
de GAD_{65} que difieren de las formas que existen en la
naturaleza en términos de la identidad o la situación de uno o más
residuos de aminoácidos y que comparten alguno de los epítopos, o
todos ellos, de las formas que existen en la naturaleza.
Las nuevas secuencias de DNA comprenden todas
las secuencias que son útiles para proporcionar la expresión en las
células del huésped procariótico o eucariótico de polipéptidos que
tienen por lo menos una parte de la conformación estructural
primaria para uno o más epítopos capaces de reaccionar con
autoanticuerpos frente a GAD_{65} que están comprendidos por: (a)
la secuencia de DNA como se establece más adelante en las Figuras 2
o 3 o sus cadenas complementarias; (b) secuencias de DNA que
hibridan con las secuencias de DNA definidas en (a) o sus
fragmentos; y (c) secuencias de DNA que, si no fuera por la
degeneración del código genético, hibridarían con las secuencias de
DNA definidas anteriormente en (a) y (b). Específicamente, en (b)
están comprendidas secuencias de DNA genómico que codifican formas
variantes alélicas de GAD_{65}. La parte (c) comprende
específicamente la preparación de secuencias de DNA que codifican
GAD_{65}, fragmentos de GAD_{65} y análogos de GAD_{65},
pudiendo dichas secuencias de DNA incorporar codones que faciliten
la traducción del mRNA en huéspedes invertebrados.
Como la secuencia de cDNA aquí descrita codifica
esencialmente la molécula de GAD_{65} del hombre o de la rata,
actualmente es una cuestión rutinaria preparar, subclonar y expresar
fragmentos de polipéptido más pequeños de cDNA a partir de esta
secuencia o de una secuencia de cDNA correspondiente que codificaría
nada más que un epítopo para autoanticuerpos frente a GAD_{65}
humana o de rata. La presencia de dicho epítopo en un polipéptido
clonado se puede confirmar a continuación utilizando, por ejemplo,
suero de un paciente con autoanticuerpos para GAD_{65}. Un
ejemplo de dicho péptido más pequeño son los primeros 100
aminoácidos aproximadamente a partir del extremo
N-terminal de GAD_{65} (mostrado en la Figura 3).
Esta secuencia de aminoácidos está básicamente ausente de
GAD_{67}.
La GAD_{65} aquí descrita es particularmente
adecuada para su utilización en inmunoanálisis en los que se puede
utilizar en fase líquida o unida a un portador en fase sólida.
Además, la GAD_{65} utilizada en estos análisis puede estar
marcada de forma detectable de varias maneras.
Ejemplos de inmunoanálisis que pueden utilizar
GAD_{65} son inmunoanálisis competitivos y no competitivos, en
formato directo o indirecto. Algunos ejemplos de dichos
inmunoanálisis son el radioinmunoanálisis (RIA), el tipo sándwich
(inmunometría) y el ensayo de transferencia Western. La detección de
anticuerpos que se unen a la GAD_{65} de la invención se puede
hacer utilizando inmunoanálisis que se realizan en los modos
directo, inverso o simultáneo, que comprenden análisis
inmunohistoquímicos en muestras fisiológicas. La concentración de
GAD_{65} que se utilice variará dependiendo del tipo de
inmunoanálisis y de la naturaleza del marcador detectable que se
utilice. No obstante, independientemente del tipo de inmunoanálisis
que se utilice, la concentración de GAD_{65} utilizada la puede
determinar fácilmente cualquiera que posea experiencia en esta
materia mediante procedimientos rutinarios.
La molécula GAD_{65} se puede unir a muchos
portadores diferentes y utilizarse para detectar la presencia de un
anticuerpo específicamente reactivo al polipéptido. Algunos ejemplos
de portadores bien conocidos comprenden: vidrio, poliestireno,
cloruro de polivinilo, polipropileno, polietileno, policarbonato,
dextrano, nailon, amilosas, celulosas naturales y modificadas,
poliacrilamidas, agarosas y magnetita. Para los fines de la
invención la naturaleza del portador puede ser tanto soluble como
insoluble. Los expertos en la materia conocen otros portadores
adecuados para unir GAD_{65}, o serán capaces de descubrir dichos
portadores utilizando los métodos habituales de experimentación.
Existen muchos marcadores diferentes y
procedimientos de marcaje conocidos por cualquier experto en estas
técnicas. Ejemplos de los tipos de marcadores que se pueden utilizar
en la presente invención comprenden enzimas, radioisótopos, metales
coloidales, compuestos fluorescentes, compuestos quimioluminiscentes
y compuestos bioluminiscentes.
Por otra parte, el polipéptido aquí descrito
puede utilizarse para detectar anticuerpos para GAD_{65} midiendo
la actividad enzimática de GAD. Por ejemplo, GAD_{65} y una
muestra de la que se sospecha que contiene anticuerpos para
GAD_{65} se pueden incubar durante un periodo de tiempo y en
condiciones suficientes para permitir que tenga lugar la unión
entre GAD_{65} y los anticuerpos. Se precipita el producto de
reacción y a continuación se hace la prueba de la actividad
enzimática de GAD.
Para los fines de la invención, el anticuerpo
que se une a GAD_{65} puede estar presente en diversos fluidos y
tejidos biológicos. Se puede utilizar cualquier muestra que contenga
una cantidad detectable de anticuerpos para GAD_{65}.
Normalmente, la muestra es un líquido, como orina, saliva, líquido
cefalorraquídeo, sangre, suero y similares, o un sólido o
semisólido como tejido, heces y similares.
Los materiales de utilización en el análisis de
la invención son perfectamente adecuados para la preparación de un
equipo. Dicho equipo puede comprender un portador que se
compartimenta para admitir en un estuche compacto uno o más
recipientes tales como viales, tubos o similares, comprendiendo cada
recipiente uno de los elementos separados para ser utilizados en
este procedimiento. Por ejemplo, uno de los recipientes puede
contener GAD_{65} unida a un portador. Un segundo recipiente
puede comprender un segundo anticuerpo soluble, marcado de forma
detectable, en forma liofilizada o en solución.
Además, el portador también puede contener una
variedad de recipientes, comprendiendo cada uno de los cuales
diferentes cantidades predeterminadas de GAD_{65}. Estos últimos
recipientes pueden ser utilizados a continuación para preparar una
curva patrón de la que se pueden interpolar los resultados obtenidos
a partir de la muestra que contiene la cantidad desconocida de
autoanticuerpos para GAD_{65}.
Al utilizar el equipo, lo que tiene que hacer
todo usuario es añadir a un recipiente una cantidad medida
previamente de una muestra que contiene una cantidad medible,
aunque desconocida, de autoanticuerpos para GAD_{65} a detectar;
una cantidad medida previamente de GAD_{65} unida al portador
presente en el primer recipiente; y una cantidad medida previamente
del segundo anticuerpo marcado de forma detectable presente en el
segundo recipiente. Por otra parte, la GAD_{65} marcada de forma
no detectable se puede proporcionar unida al recipiente al que se
añaden la muestra y el segundo anticuerpo marcado de forma
detectable. Después de un tiempo de incubación apropiado, se forma
un complejo inmunitario que se separa del fluido sobrenadante y se
detecta el complejo inmunitario o el fluido sobrenadante, por
contaje radioactivo o adición de un sustrato enzimático y desarrollo
del color.
El término "mejorar" indica una disminución
del efecto perjudicial de la respuesta autoinmunitaria en el
paciente que recibe el tratamiento. El término "terapéuticamente
eficaz" significa que la cantidad de polipéptido GAD_{65}
utilizada es una cantidad suficiente para mejorar la causa de la
enfermedad gracias a la respuesta autoinmunitaria.
Los polipéptidos GAD_{65} recombinantes se
pueden utilizar terapéuticamente en pacientes que tienen una
respuesta autoinmunitaria relacionada con GAD_{65}. Dicho
tratamiento se puede realizar, por ejemplo, mediante la
administración de polipéptido GAD_{65} recombinante. Dicha
administración puede utilizar tanto polipéptido GAD_{65} sin
marcar como marcado. Cuando se utiliza convenientemente polipéptido
GAD_{65} sin marcar, debería estar en una forma en la que, por
ejemplo, los polipéptidos GAD_{65} estén en fragmentos que sean
demasiado pequeños para estimular una respuesta inmunitaria, pero lo
suficiente grandes para unirse, o bloquear, la continuación de la
respuesta autoinmunitaria. Por ejemplo, GAD_{65} se debería
digerir enzimáticamente en péptidos del tamaño de un epítopo
(típicamente de 5 a 12 aminoácidos de longitud) y unirse por esa
razón a porciones de unión a Fab presentes en los fluidos
corporales, o en la superficie de células inmunitarias, del paciente
con una enfermedad autoinmunitaria.
Por otra parte, los polipéptidos GAD_{65}
recombinantes se pueden administrar marcados con un agente
terapéutico. Estos agentes pueden estar acoplados directa o
indirectamente a los polipéptidos GAD_{65}. Un ejemplo de
acoplamiento indirecto es por utilización de un grupo separador.
Estos grupos separadores, a su vez, pueden ser insolubles o
solubles (Diener, et. al., Science, 231:148, 1986) y se
pueden seleccionar para permitir la liberación del fármaco del
polipéptido GAD_{65} en el sitio diana. Ejemplos de agentes
terapéuticos que se pueden acoplar a los polipéptidos GAD_{65} de
la invención para inmunoterapia son: fármacos, radioisótopos,
lectinas y toxinas.
Los fármacos con los que se pueden combinar los
polipéptidos GAD_{65} de la invención comprenden compuestos, a
los que clásicamente se hace referencia como fármacos, tales como
mitomicina C, daunorrubicina y vimblastina.
Al utilizar los polipéptidos GAD_{65}
conjugados radioisotópicamente de la invención para inmunoterapia,
determinados isótopos pueden ser más preferibles que otros
dependiendo de factores como la distribución leucocitaria, así como
la estabilidad y la emisión. Dependiendo de la respuesta
autoinmunitaria, algunos emisores pueden ser preferibles a otros.
En general, en inmunoterapia se prefieren los radioisótopos emisores
de partículas \alpha y \beta. Se prefieren los emisores
\alpha de banda estrecha y de alta energía tal como el ^{212}Bi.
Ejemplos de radioisótopos que se pueden unir a los
poli-
péptidos GAD_{65} de la invención con fines terapéuticos son ^{125}I, ^{131}I, ^{90}Y, ^{67}Cu, ^{212}Bi, ^{211}At, ^{212}Pb, ^{47}Sc, ^{109}Pd y ^{188}Re.
péptidos GAD_{65} de la invención con fines terapéuticos son ^{125}I, ^{131}I, ^{90}Y, ^{67}Cu, ^{212}Bi, ^{211}At, ^{212}Pb, ^{47}Sc, ^{109}Pd y ^{188}Re.
Las lectinas son proteínas, aisladas
generalmente de plantas, que se unen a grupos glucídicos
específicos. Muchas lectinas son además capaces de aglutinar
células y estimular linfocitos. Sin embargo, el ricino es una
lectina tóxica que se ha utilizado inmunoterapéuticamente. Esto se
realiza uniendo la cadena \alpha-péptido del
ricino, que es responsable de la toxicidad, a la molécula de
anticuerpo para permitir la administración dirigida del efecto
tóxico.
Las toxinas son sustancias venenosas producidas
por plantas, animales o microorganismos que, en dosis suficientes,
son con frecuencia letales. La toxina de la difteria es una
sustancia producida por Corynebacterium diphteria que se
puede utilizar terapéuticamente. Esta toxina consta de subunidades
\alpha y \beta que se pueden separar en condiciones apropiadas.
El componente tóxico A puede estar unido al polipéptido GAD_{65} y
ser utilizado para la administración dirigida en un linfocito que
exprese un receptor para el polipéptido GAD_{65}.
Se conocen, o pueden ser fácilmente descubiertos
por los expertos en la materia, otros agentes terapéuticos que se
pueden acoplar a los polipéptidos GAD_{65}, así como a protocolos
terapéuticos ex vivo e in vivo.
La especificación de la presente invención se
refiere a que el polipéptido que aquí se describe se puede
administrar terapéuticamente para mejorar, o ser utilizado a modo
de diagnóstico para identificar, el proceso patológico en pacientes
que padecen, o con riesgo de padecer, esta enfermedad. El código
convencional de una única letra utilizado para representar los
distintos aminoácidos se establece como sigue:
Se identificó la secuencia polipeptídica del
polipéptido aquí descrito comparando las secuencias de aminoácido
de la GAD_{65} humana, GAD_{67} humana y la proteína
P2-C del picornavirus virus coxsackie. El
polipéptido P2-C desempeña una función en el
complejo de replicación ligado a la membrana del virus. Estos
análisis demostraron la presencia de una gran similitud de
secuencia entre las moléculas de GAD_{65} y el virus coxsackie. La
secuencias de aminoácidos en un núcleo de polipéptido de seis
residuos de aminoácidos contiguos de GAD_{65} y en el polipéptido
P2-C son idénticas. En efecto, de los 24 aminoácidos
del polipéptido, 19 son idénticos o conservados. Además, también
existe una alta densidad de carga y la presencia de un residuo de
prolina que convertiría esta zona en sumamente antigénica (véase la
Tabla 1).
En la Tabla 1, la línea continua engloba los
aminoácidos idénticos en tanto que la línea discontinua comprende
los residuos de aminoácidos con carga, polaridad o hidrofobicidad
similares.
El descubrimiento de esta zona polipeptídica
común apoya una función etiológica para el "mimetismo
molecular" en el desencadenamiento de la diabetes. Por eso, allí
donde un paciente genéticamente susceptible de padecer DMID es
infectado por un virus coxsackie, la respuesta inmunitaria al
polipéptido de virus coxsackie da lugar a una respuesta inmunitaria
cruzada a la secuencia de GAD similar en las células \beta del
paciente. La respuesta inmunológica es mantenida por los
polipéptidos GAD antigénicamente similares que resultan de la
destrucción consiguiente de las células \beta y la posterior
presentación de la DMID.
Actualmente, se cree que la destrucción de las
células \beta pancreáticas está mediada por una respuesta celular
autoinmunitaria. Por lo tanto, un polipéptido como aquí se describe
debería tener la capacidad de bloquear dicha respuesta celular
autoinmunitaria. Debido a la complejidad de la enfermedad
autoinmunitaria, es posible prever numerosas modalidades
terapéuticas posibles que permitirían utilizar los polipéptidos de
la invención para mejorar dichas enfermedades. De esta manera, sería
posible utilizar los polipéptidos para bloquear el reconocimiento
mediante un receptor de linfocitos T (TCR) específico o un receptor
del MHC que presenta un antígeno autoinmunitario en la superficie
de una célula presentadora de antígeno (APC). La inhibición de
dicho reconocimiento puede suceder, por ejemplo, proporcionando al
paciente el polipéptido de la invención que, a su vez, puede
desplazar al antígeno autoinmunitario que se presenta en la
hendidura para antígeno del receptor del MHC o, posiblemente, por
interacción directa con el TCR apropiado en la superficie de un
linfocito T colaborador. Este último planteamiento terapéutico de
interacción directa con el TCR se pudo conseguir provocando la
tolerancia de dosis alta mediante la utilización de grandes
concentraciones de polipéptido soluble.
Por otra parte, los polipéptidos aquí descritos
podrían utilizarse para estimular una población de linfocitos T
supresores para restablecer el autorreconocimiento y, de este modo,
mejorar la enfermedad autoinmunitaria. La estimulación de las
poblaciones de linfocitos T supresores se podría conseguir, por
ejemplo, utilizando un anticuerpo biespecífico que tuviera una zona
específica variable para un epítopo presente en el antígeno
autoinmunitario que reside en la hendidura del receptor MHCII y, una
segunda zona específica variable para un epítopo presente en el
receptor CD8^{+}. La producción de anticuerpo específico para el
polipéptido aquí descrito es una cuestión rutinaria para los
expertos en la materia, igual que la preparación de anticuerpos
biespecíficos que tienen especificidad para 2 o más epítopos.
Se pueden diseñar análogos polipeptídicos del
polipéptido aquí descrito que competirán por el reconocimiento de
autoantígenos al nivel de presentación del antígeno. Como las
moléculas de MHC contienen un único sitio de unión del péptido, es
posible diseñar polipéptidos que se unirán con gran afinidad a las
moléculas de MHC relacionadas con la enfermedad, pero no activarán
los linfocitos T colaboradores que producen la enfermedad. Dichos
polipéptidos actúan como antagonistas en el reconocimiento del
autoantígeno. El precedente para dicho planteamiento surge de la
observación de que un polipéptido de lisozima de ratón, no
inmunógeno, puede competir por la unión del MHC con un polipéptido
inmunógeno de la lisozima de la clara de huevo de gallina y reducir
de este modo la activación del linfocito T mediante este polipéptido
(Adorini, et. al., Nature, 334:623-625,
1988). Igualmente, dicho planteamiento para detectar análogos de
polipéptido eficaces se ha utilizado en enfermedades
autoinmunitarias como la encefalomielitis autoinmunitaria
experimental (EAE) (Wraith, et. al., Cell, 59:248, 1989;
Urban, et. al., Cell, 59:257, 1989).
Los símbolos de letra única empleados para
representar los residuos de aminoácidos de los polipéptidos de la
presente invención son los símbolos de uso común en el ámbito. El
término "análogo" hace referencia a cualquier polipéptido que
presente una secuencia de aminoácidos sustancialmente idéntica a un
polipéptido aquí proporcionado y en el que se ha sustituido uno o
varios aminoácidos por otros químicamente similares. Por ejemplo, un
aminoácido polar, como glicina o serina, puede sustituirse por otro
aminoácido polar; o un aminoácido ácido, como el ácido aspártico,
puede sustituirse por otro aminoácido ácido, como el ácido
glutámico; o un aminoácido básico, como lisina, arginina o
histidina, puede sustituirse por otro aminoácido básico; o bien un
aminoácido no polar, como alanina, leucina o isoleucina, puede
sustituirse por otro aminoácido no polar.
El término "análogo" también significa
cualquier polipéptido que contiene una o varias deleciones de
aminoácidos o bien una o varias adiciones a un polipéptido de la
presente invención, pero que todavía mantiene una homología de
secuencia aminoacídica sustancial con dicho péptido. Una homología
de secuencia sustancial es aquella mayor del 50%. El término
"fragmento" significa cualquier versión más corta de los
polipéptidos aquí identificados que presenta al menos 6 residuos de
aminoácidos, siendo un fragmento capaz de estimular la proliferación
de linfocitos T infiltradores de islotes (IITL) o bien un fragmento
capaz de inhibir la estimulación de dichas células mediante un
fragmento polipeptídico estimulador.
El término "derivado químico" significa
cualquier polipéptido procedente de un polipéptido como aquí se
describe y en el que uno o más aminoácidos han derivado
químicamente por reacción de los grupos funcionales secundarios de
los residuos de aminoácido presentes en el polipéptido. Así pues, un
"derivado químico" es un polipéptido que procede de las
secuencias o polipéptidos identificados en esta memoria en una o más
etapas químicas. Dichas moléculas derivadas comprenden, por
ejemplo, aquellas moléculas en que se han obtenido derivados de los
grupos amino libres para formar hidrocloruros de amina,
P-tolueno sulfonamidas, benzoxicarboamidas,
T-butiloxicarboamidas, derivados de tipo
tiouretano, trifluoroacetilamidas, cloroacetilamidas o formamidas.
Se pueden obtener derivados de los grupos carboxilo libres para
formar sales, ésteres de metilo y etilo u otros tipos de ésteres o
hidrazidas. Se pueden obtener derivados de los grupos hidroxilo
libres para formar derivados de O-acilo u
O-alquilo. Se puede obtener un derivado a partir
del nitrógeno del grupo imidazol de la histidina para formar
N-im-bencilhistidina. También se
incluyen como derivados químicos los polipéptidos que contienen uno
o más aminoácidos que existen en la naturaleza derivados de los 20
aminoácidos estándar. Por ejemplo, prolina se puede sustituir por
4-hidroxiprolina; lisina se puede sustituir por
5-hidroxilisina; histidina se puede sustituir por
3-metilhistidina; serina se puede sustituir por
homoserina y lisina se puede sustituir por ornitina.
Se debería entender que la presente invención no
se limita a los polipéptidos ilustrativos descritos en la Tabla 1;
en cambio, un polipéptido comprendido en el alcance de la invención
puede extenderse fuera de, o comprender menos de, la zona entre el
aminoácido 28 y el aminoácido 50 de P2-C del virus
coxsackie, o entre el aminoácido 250 y el aminoácido 273 de
GAD_{65}, o entre el aminoácido 258 y el aminoácido 281 de
GAD_{67}, siempre y cuando una parte sustancial de un polipéptido
dado esté caracterizada por una secuencia de aminoácidos de esta
zona, o sus segmentos o combinaciones, y el polipéptido demuestre la
actividad inmunológica o biológica deseada frente a la enfermedad
autoinmunitaria. Además, los polipéptidos según la invención
comprenden los que tienen secuencias de aminoácidos que son de
longitud mayor o menor que los de los polipéptidos ilustrados en la
Tabla 1, o que comprenden sus segmentos o combinaciones, siempre y
cuando dichos polipéptidos consistan sustancialmente en la zona
entre los aminoácidos ilustrados en la Tabla 1 y demuestren
actividad inmunológica o biológica. Además, los polipéptidos de
acuerdo con la esta invención incluyen aquellos caracterizados por
una secuencia de aminoácidos que será más corta o más larga que
aquella del polipéptido GAD_{65} de la Tabla 1, o aquella que
contiene segmentos de aquel polipéptido y que manifiesta una
actividad inmunológica o biológica contra la enfermedad
autoinmunitaria. Ninguno de los polipéptidos de la invención debería
estimular o intensificar la enfermedad autoinmunitaria.
Así pues, debería entenderse que la selección
específica de cualquier polipéptido dentro de los polipéptidos de
la invención no implica experimentación excesiva. Dicha selección se
puede realizar tomando un número de polipéptidos y probando su
actividad inmunológica y biológica en la mejoría de la enfermedad
autoinmunitaria. El ratón NOD representa un modelo excelente y bien
caracterizado para detectar polipéptidos de la invención capaces de
mejorar la diabetes.
Los polipéptidos aquí descritos se pueden
preparar mediante técnicas recombinantes o mediante síntesis
convencional utilizando procedimientos conocidos de síntesis de
polipéptidos, incluyendo la síntesis sobre soporte sólido. Un
ejemplo de técnica de síntesis en fase sólida adecuada es la
descrita por Merriweather (J. Am. Chem. Soc., 85:2149, 1963). Se
pueden hallar otras técnicas de síntesis de polipéptidos, por
ejemplo, en Bodanszky, et. al., Peptide Synthesis, John
Wiley & Sons, 2ª ed., 1976; además de otras referencias
conocidas por los expertos en la materia. Se puede hallar un
resumen de las técnicas para la síntesis de polipéptidos en Stewart,
et. al., Solid Phase Peptide Synthesis, Pierce Chemical
Company, Inc., Rockford, III., 1984. Se puede utilizar también la
síntesis de polipéptidos por procedimientos en solución, por
ejemplo, como se describe en The Proteins, Vol. II, 3ª ed.,
Neurath, et. al., eds., 105, Academic Press, New York, NY,
1976. Se pueden hallar grupos protectores apropiados para su
utilización en dicha síntesis en las referencias anteriores así como
en J. McOmie, Protective Groups in Organic Chemistry, Plenum
Press, New York, NY, 1973.
Los polipéptidos aquí descritos se pueden
preparar también en un huésped apropiado transformado con secuencias
de DNA que codifican el polipéptido deseado. Por ejemplo, se puede
preparar un polipéptido por fermentación de huéspedes apropiados
que han sido transformados con una secuencia de DNA que codifica el
polipéptido y que la expresan. Por otra parte, una secuencia de DNA
que codifica varios polipéptidos de la invención puede estar
acoplada y esas secuencias se pueden utilizar a continuación para
transformar un huésped apropiado para permitir la expresión de
polipéptidos implicados en la enfermedad autoinmunitaria.
Los intervalos de dosis para la administración
de los polipéptidos GAD_{65} aquí descritos son lo suficientemente
amplios para producir el efecto deseado en el que se mejoran los
síntomas o la destrucción celular de la respuesta autoinmunitaria.
La dosis no debería ser tan grande como para producir efectos
secundarios adversos, tal como reacciones cruzadas indeseables,
reacciones anafilácticas y similares. Generalmente, la dosis variará
con la edad, la enfermedad, el sexo y el alcance de la enfermedad
en el paciente y puede determinarla un experto en la materia. El
médico puede ajustar la dosis en caso de cualquier contraindicación.
La dosis puede variar desde aproximadamente 0,1 mg/m^{2}/dosis
hasta aproximadamente 2000 mg/m^{2}/dosis, preferentemente desde
aproximadamente 0,1 mg/m^{2}/dosis a aproximadamente 500
mg/m^{2}/dosis, en una o más administraciones de dosis al día,
durante uno o
varios días.
varios días.
Los polipéptidos GAD_{65} se pueden
administrar por vía parenteral mediante inyección o mediante
infusión intravenosa gradual a lo largo del tiempo. Los
polipéptidos GAD_{65} de la invención se pueden administrar por
vía intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, subcutánea,
intracavitaria, transcutánea, intranasal o parenteral.
Los preparados para administración parenteral
comprenden soluciones acuosas o no acuosas estériles, suspensiones
y emulsiones. Ejemplos de disolventes no acuosos son propilenglicol,
polietilenglicol, aceites vegetales tal como el aceite de oliva y
ésteres orgánicos inyectables tal como oleato de etilo. Los
excipientes acuosos comprenden agua, soluciones
alcohólicas/acuosas, emulsiones o suspensiones, inclusive medios
salinos y tamponados. Los vehículos parenterales comprenden
solución de cloruro sódico, dextrosa de Ringer, dextrosa y cloruro
sódico, solución de Ringer lactato o aceites tratados. Los
vehículos intravenosos comprenden fluidos y nutrientes de relleno,
rellenos de electrolito (tal como los basados en la dextrosa de
Ringer) y similares. Además pueden estar presentes conservantes y
otros aditivos tal como, por ejemplo, antimicrobianos,
antioxidantes, quelantes, gases inertes y similares.
La especificación de la invención también se
refiere a un procedimiento para preparar un medicamento o
composición farmacéutica que comprende los polipéptidos GAD_{65},
siendo utilizado el medicamento para el tratamiento de la respuesta
autoinmunitaria a GAD_{65}.
La exposición anterior describe en general la
presente invención. Se puede obtener una comprensión más completa
haciendo referencia a los siguientes ejemplos específicos que se
proporcionan en esta memoria sólo con fines de ilustración y no
tienen la intención de limitar el alcance de la invención.
Para obtener sondas de cDNA específicas para
GAD_{65} y GAD_{67}, se extrajo RNA completo del cerebro de
rata adulta por gradiente de isotiocianato de cesio guanidina
utilizando el procedimiento de Chirgwin, et. al.,
(Biochemistry, 18:5294, 1979). Se purificó RNA Poli(A) en
oligo dT celulosa, utilizando el protocolo de los Laboratorios de
Investigación de Bethesda (BRL). La síntesis de la primera cadena se
llevó a cabo utilizando transcriptasa inversa de MMLV (BRL), en las
condiciones sugeridas, salvo que se utilizaron polímeros de
d(N_{6}) como cebadores (Pharmacia). Esta mezcla de
cDNA-RNA se inactivó por calor a 65ºC durante 15
minutos y se guardó a -20ºC. Para PCR, se añadió 1/50 de la muestra
a 100 \mul de reacción. Se sintetizaron oligonucleótidos
degenerados (Applied Biosystems) para codificar las secuencias de
aminoácidos comunes subrayadas de GAD de felino (a partir de cDNA)
(Kobayashi, et. al., J. Neurosci., 7:2768, 1987) y de rata (a
partir de péptidos) (Chang y Gottlieb, J. Neurosci., 8:2123, 1988)
(Figura 1). La secuencia del extremo 5' de cada oligonucleótido
degenerado contenía una cadena de la secuencia de DNA reconocida por
SstI y HindIII (oligo 5') o SstI y SstII (oligo extremo 3'). Estos
cebadores se utilizaron para la amplificación selectiva por reacción
en cadena de polimerasa del molde de cDNA generado como
describieron Gould, et. al., (Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
86:1934, 1989). Los productos de PCR se subclonaron en un vector
Bluescript SK (Stratagene) de doble digestión HindIII/SstI que se
utilizó para transformar células DH5 (BRL) y estas se cultivaron en
placas por procedimientos estándar (Maniatis, et. al.,
Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor
Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1989).
La hibridación de la colonia se hizo con un
oligonucleótido marcado en el extremo terminal
5'-^{32}P específico de GAD_{67} de felino
(Kobayashi, et. al., J. Neurosci., 7:2768, 1987). El marcaje
del extremo terminal del oligonucleótido, las condiciones de
hibridación y las condiciones de lavado se hicieron según se
describe (Wallace, et. al., en Guide to Molecular Cloning
Techniques; Berger, et. al., Eds. en Methods of Enzymology;
Abelson, et. al., Eds. Academis Press, Inc., San Diego,
432-442, 1987), excepto que los filtros de
nitrocelulosa se lavaron a 50ºC durante 15 min. Las colonias que
fueron positivas y negativas en la hibridación se seleccionaron una
a una y se desarrollaron toda la noche en Caldo Terrific (Tartof,
et. al., Focus, 9:12, 1987). Se aisló el DNA utilizando un
procedimiento a ebullición (Maniatis, et. al., Molecular
Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold
Spring Harbor, NY, 1989) y las plantillas se desnaturalizaron con
NaOH 0,2 N y se purificaron en columnas para centrifugación
Sephacryl S400 (Pharmacia). La obtención de la secuencia del molde
bicatenario desnaturalizado se hizo por el procedimiento de
terminación de cadena (Sanger, et. al., Proc. Natl. Acad.
Sci. USA, 74:5463, 1977) utilizando el equipo de secuenciado T7
(Pharmacia).
Como se muestra en la Figura 1, se utilizaron
cDNA de GAD_{65} y GAD_{67} de rata producidos por PCR como
pruebas para cribar una biblioteca de lambda ZAP (Stratagene) de
hipocampo de rata proporcionada por S. Heinemann (Salk Institute)
mediante técnicas estándar (Maniatis, et. al., Molecular
Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold
Spring Harbor, NY, 1989). Se aisló un cDNA de GAD_{65} de 2400
nucleótidos (el clon mayor) y se subclonó mediante "zapping"
según describió Stratagene. Cuando ya se dispuso de un cDNA de
GAD_{67} de rata que era más pequeño que un clon de cDNA de
GAD_{67} de rata de 3,2 kb del que a se disponía, se obtuvo la
secuencia del mayor cDNA. Las deleciones de Exo III (Henikoff, Gene,
28:351, 1984) para GAD_{65} y GAD_{67} se hicieron en ambas
direcciones, los moldes se prepararon y se obtuvieron las
secuencias como se describió anteriormente. Se realizó una
anchor PCR (Forman, et. al., Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, 85:8998, 1988) para clonar los extremos 5' de los mRNA de
GAD_{65} y GAD_{67} que no fueron representados en los clones
de cDNA original aislados en el cribado de la biblioteca. La
obtención de la secuencia de estos clones dio a conocer que ni los
mRNA de GAD_{65} ni los mRNA de GAD_{67} contenían ningún codón
adicional de iniciación (AUG) que coincidiera con el marco de
lectura de los codones de iniciación designados previamente de los
clones de cDNA originales.
\vskip1.000000\baselineskip
Se hibridaron dos sondas de cDNA derivadas de
PCR por transferencias Northern que contenían RNA de cerebro de
rata para determinar si los cDNA de GAD_{67} y GAD_{65}
procedían de dos mRNA diferentes. Se extrajo el RNA como se
describió en el Ejemplo 1. Se separó el RNA de poli (A) por
electroforesis en formaldehído, se transfirió a membranas Biotrans
(ICN) y se realizó la hibridación como describe Well, et. al.
(J. Neurosci., 16:311, 1986), excepto que se añadieron 100
\mul/ml de poli (A). Se marcaron las sondas a aproximadamente
10^{9} dpm/\mug por el procedimiento de oligomarcaje de Feinberg
y Vogelstein (Anal. Biochem., 132:6, 1983). Se obtuvieron
resultados idénticos posteriormente con clones completos de cDNA de
GAD_{65} y GAD_{67}.
Como se muestra en la Figura 5, los carriles 1 y
2 contienen 1 \mug de poli (A) de RNA seleccionado extraído de
cerebelo de rata. El carril 1 se hibridó con una sonda de cDNA para
el polipéptido de rata afín al GAD_{67} de felino (Kobayashi,
et. al., J. Neurosci., 7:2768, 1987) y el carril 2 con una
sonda de cDNA para la secuencia del péptido de rata (que corresponde
a GAD_{65}).
La sonda de cDNA para la secuencia del péptido
de rata hibridó con un RNA de 5,7 kb, mientras que la sonda de cDNA
para el polipéptido de rata afín al cDNA de felino hibridó con un
RNA de 3,7 kb. Esto demuestra que GAD_{65} y GAD_{67} no
proceden del mismo mRNA.
Para investigar la posibilidad de que GAD_{67}
y GAD_{65} provengan de genes separados, se hibridaron cDNA de
GAD_{65} y GAD_{67} en manchas de DNA que contenían DNA
genómico.
Para las transferencias Southern, se extrajo DNA
genómico del hígado de rata según se describió (Kaiser, et.
al., en DNA Cloning, vol. I, A Practical Approach, D.M. Glover
ed., IRL Press, Oxford, págs. 38-40, 1985). El DNA
(10 \mug/muestra) se digirió completamente con EcoRI y HindIII
utilizando las condiciones recomendadas por los suministradores
(BRL, Gaithersburg, MD). Los fragmentos de DNA se separaron por
electroforesis a 1,5 v/cm durante 16 horas en agarosa al 0,8%. El
DNA se transfirió a continuación a las membranas
Zeta-Probe (Bio-Rad), se hibridaron
y se lavaron, como describieron Gatti, et. al.
(Biotechniques, 2:148, 1984), excepto que 5 \mug/ml de leche en
polvo Carnation se sustituyeron por solución de Denhardt. Se
marcaron las sondas para la transferencia Southern como se ha
descrito anteriormente en el Ejemplo 1.
Según se muestra en la Figura 6, el DNA genómico
digerido con HindIII y EcoRI están en los carriles 1 y 3 y en los
carriles 2 y 4 respectivamente. El cDNA de GAD_{67} hibridó en los
carriles 1 y 2, mientras que el cDNA de GAD_{65} hibridó en los
carriles 3 y 4. Los números a lo largo de los lados del gel son las
dimensiones de los fragmentos de DNA en kilobases.
Estos datos demuestran que los dos cDNA hibridan
con fragmentos genómicos de diferentes dimensiones. Además, el
mayor tramo contiguo de secuencia idéntica de nucleótido de los cDNA
de GAD_{65} y GAD_{67} tiene sólo 17 bases nucleotídicas de
longitud. Así que, GAD_{67} y GAD_{65} están codificadas por dos
genes distintos.
Se hicieron estudios comparando el efecto de PLP
en la actividad de GAD_{67} y GAD_{65}. Con este fin, se
subclonaron ambos cDNA en vectores que permitieron su expresión en
bacterias (Studier, et. al., J. Mol. Biol., 189:113, 1986).
La sobreexpresión de GAD_{65} y GAD_{67} "sin fusión" se
realizó subclonando cDNA de GAD_{65} en el sitio NcoI de
pET-8c y el cDNA de GAD_{67} en el sitio NheI de
los vectores pET-5c (Studier, et. al., J.
Mol. Biol., 189:113, 1986).
Para obtener extremos adhesivos compatibles para
una correcta subclonación correcta dentro del marco de lectura de
ambos cDNA, se llevó a cabo la amplificación selectiva por PCR
utilizando las condiciones sugeridas por United States Biochemical
(USB), con dNTPs 200 \muM y MgCl_{2} 1,5 mM en la mezcla y
hibridando a 55ºC con 20 ciclos para disminuir la infidelidad de
AmpliTAQ (USB). Los cebadores específicos para GAD_{65} y
GAD_{67} contenían una cadena de DNA de los sitios de
reconocimiento NcoI y SpeI, respectivamente. Como existe un sitio
de restricción NheI en la zona codificadora de GAD_{67}, se
utilizó SpeI (que es compatible con NheI).
Se subclonaron los productos de PCR en sus
respectivos vectores pET, se transformaron células DH5 con ellos y
se cultivaron en placas como se ha descrito (Maniatis, et.
al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor
Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1989). Se seleccionaron las
colonias y se cultivaron toda la noche en caldo LB con 50 \mug/ml
de ampicilina. Los subclones con orientación correcta se emplearon
para transformar la cepa BL21(DE3) (Studier, et. al.,
J. Mol. Biol., 189:113, 1986) para sobreexpresión. Como control
negativo, el vector pET-8C sin ninguna inserción fue
transformado y estimulado posteriormente. Se seleccionaron colonias
individuales, se cultivaron, se estimularon mediante
isopropil-B-D-tiogalactopiranósido
(IPTG) 1 mM y se analizaron sobre geles de SDS-PAGE
del modo descrito en Sambrook, et. al., Molecular Cloning: A
Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring
Harbor, 17.15-17.16, 1989.
Para medir la actividad de GAD, se estimularon
cultivos de 10 ml de bacterias a DO_{600}-0,5 con
IPTG 1 mM. Dos horas después de la estimulación, las bacterias se
centrifugaron, se resuspendieron y se expusieron a ultrasonidos en
1 ml de tampón homogeneizador (fluoruro de fenilmetilsulfonilo 1 mM
(PMSF), bromuro de aminoetilisotiouronio 1 mM (AET) y 60 mM de
fosfato potásico, pH 7,1). Después de los ultrasonidos, se retiraron
los desechos celulares por centrifugación y se midió la
concentración de proteínas (Bradford, Anal. Biochem., 72:248, 1986)
en el sobrenadante (el sobrenadante se guardó en alícuotas a
-70ºC). Se prepararon homogenados de cerebro del modo descrito
(Legay, et. al., J. Neurochem., 46:1478, 1986). La actividad
de GAD se midió del modo descrito (Krieger, et al., J.
Neurochem.,33:299, 1984) con o sin PLP 0,2 mM y 20 \mul de
homogenado de cerebro o lisado bacteriano en la mezcla de
incubación. La producción de ^{14}CO_{2} en lisados bacterianos
fue lineal con relación al tiempo de incubación y a la concentración
de proteína.
Como se muestra en la Tabla 2, los lisados
bacterianos que contienen GAD_{65} o GAD_{67} catalizan la
conversión de [1-^{14}C]-glutamato
a GABA y ^{14}CO_{2}.
El PLP estimula la actividad enzimática de
GAD_{65} más que la de GAD_{67}. Esta mayor estimulación refleja
probablemente la ciclación más rápida de GAD_{65} mediante el
ciclo de inactivación propuesto por Martin y colaboradores (Martin,
Cell. Mol. Neurobiol., 7:237, 1987). Esta ciclación más rápida
sugiere que GAD_{65} contribuye más a la reserva de
apo-GAD que existe in vivo (Miller, et.
al., Brain Res. Bull., 5(Supl. 2):89, 1980). Así pues,
in vivo, PLP parece regular más la actividad de GAD_{65}
que la actividad de GAD_{67}.
La actividad de GAD_{65} en lisados
bacterianos es similar a cinco veces la estimulación de PLP de la
actividad hallada en sinaptosomas preparados a partir de sustancia
negra de rata (Miller, et. al., J. Neurochem., 33:533,
1979). Debido a que ambos GAD son más dependientes del PLP añadido
en las bacterias de lo que es la actividad de GAD en homogenados
crudos de cerebro de rata, la concentración de PLP endógeno de
lisados de bacterias puede ser inferior a la de los homogenados de
cerebro de rata.
Los homogenados de cerebro de rata y los lisados
bacterianos se extrajeron como se describió anteriormente. Se
añadieron volúmenes iguales de tampón de carga a cada muestra como
describió Harlow, et. al., Antibodies, A Laboratory Manual,
Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1988. Las
proteínas se separaron por electroforesis en gel de acrilamida al
10% en SDS y se transfirieron electroforéticamente a nitrocelulosa
(Harlow, et. al., Antibodies, A Laboratory Manual, Cold
Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1988). Los sitios
sin reaccionar se bloquearon con una solución salina tamponada con
fosfato (PBS) que contenía albúmina de suero bovino al 2% (fracción
V), gelatina al 1% y Triton-X-100 al
1% a 42ºC durante una hora. Después del lavado, se cortó a
continuación el filtro de nitrocelulosa en tres secciones y se
incubó con los anticuerpos primarios siguientes: bandas 1 a 4 a una
dilución 1/2000 de antisuero de Oertel, et. al.
(Neuroscience, 6:2689, 1981), que reconoce a GAD_{67} y
GAD_{65}; bandas 5 a 8 a una dilución 1/2000 de antisuero
K-2, que reconoce sólo a GAD_{67}; bandas 9 a 12
con una dilución 1/2000 de anticuerpo monoclonal
GAD-6, que es específico para GAD_{65} (Chang,
et. al., J. Neurosci., 8:2123, 1988). Todos los filtros se
lavaron extensamente y se incubaron y se lavaron anticuerpos
secundarios apropiados. Los anticuerpos unidos se detectaron con
proteína A marcada con ^{125}I y autorradiografía. Cada carril
contenía lo siguiente: los carriles 1, 5 y 9 son BL21(DE3) +
pET-GAD_{67}; los carriles 2, 6 y 10 son
BL21(DE3) + pET-GAD_{65}; los carriles 3, 7
y 11 son homogenados de cerebro de rata y los carriles 4, 8 y 12 son
BL21(DE3) + pET-8c.
Las inmunotransferencias de GAD_{65} y
GAD_{67} producidos mediante bacterias demostraron que GAD_{65}
corresponde realmente al GAD más pequeño de los extractos de cerebro
y GAD_{67} a la forma mayor (Figura 7). Trabajos anteriores han
demostrado la correspondencia entre GAD_{67} y el GAD mayor en el
caso tanto de GAD_{67} de felino como de GAD_{67} de ratón
(Karatova, et. al., Eur. J. Neurosci., 2:190, 1990; 235,
1987). La capacidad de difusión de GAD_{65} y GAD_{67}
producidas por bacterias (como se detectó con el antisuero de
Oertel, et. al. Neuroscience, 6:2689, 1981) es idéntica a la
del doblete inmunorreactivo observado en el homogenado de cerebro de
rata.
Las formas de GAD de mayor y menor peso
molecular en el cerebro de rata son así pues idénticas en
antigenicidad y tamaño para los productos de los cDNA de GAD_{65}
y GAD_{67}, respectivamente. Por consiguiente, los dos GAD en el
cerebro de rata son GAD_{65} y GAD_{67}. A partir de estos datos
puede concluirse también que la identidad molecular de los GAD
dictaminados dependientes de PLP e independientes de PLP por Tapia
(Bayon, et. al., J. Neurosci., 29:519, 1977) son GAD_{65}
y GAD_{67} respectivamente. Martin y colaboradores (Spink, et.
al., Brain Res., 421:235, 1987) han informado de la existencia
de cuatro formas cinéticamente diferentes de GAD del cerebro de
rata. Sin embargo, no se han publicado experimentos de
inmunotransferencia (con el antisuero utilizado aquí) de estas
formas.
Se hicieron experimentos para determinar la
distribución de GAD_{65} y GAD_{67} en RNA en el cerebelo
utilizando hibridación in situ.
Los transcritos de 3,2 kb y 2,3 kb de cDNA de
GAD_{65} y GAD_{67} respectivamente, se radiomarcaron con
^{35}S según el procedimiento de Wuenschell, et. al. (Proc.
Natl. Acad. Sci. USA, 83:6193, 1986). Los fragmentos hidrolizados
de 200 pb se hibridaron en secciones frontales del cerebelo de rata.
Se anestesiaron los animales con halotano y se decapitaron. El
cerebro se congeló rápidamente en hielo seco y las secciones
frontales congeladas (12 \mum) se fijaron durante 30 min en
formaldehído al 4% recientemente preparado en solución salina
tamponada de fosfato (PBS; NaCl 130 mM, fosfato de Na 10 mM, pH
7,0). El tejido se deshidrató mediante soluciones de etanol graduado
y se guardó a -70ºC.
Para aumentar la permeabilidad del tejido, se
sometieron las secciones a los pretratamientos siguientes:
rehidratación mediante soluciones de etanol graduado (5 min cada
una en etanol al 95%, 85%, 70%, 50% y 30%); PBS (5 min); HCl 0,02 N
(10 min); PBS (5 min); Triton N-101 al 0,01% en PBS
(1 min); PBS (2 x 5 min); 1 \mug/ml de proteinasa K (7,5 min) y
glicina (para inhibir la proteinasa K) en PBS (3 x 5 min). Se
digirió la proteinasa K durante 30 min a 37ºC antes de su
utilización. Se incubaron a continuación las secciones a 37ºC en
formamida al 50%, NaCl 750 mM, EDTA 25 mM, SDS al 0,2%, BSA al
0,02%, Ficoll al 0,002%, polivinilpirrolidona al 0,02%, 250
\mug/ml de tRNA de levadura, 250 \mug/ml de poli A y PPES 25 mM
(pH 6,8).
Para la hibridación se añadieron a la solución
de prehidratación DTT 100 mM, sulfato de dextrano al 10% y ^{35}S
-RNA sentido y antisentido. Se añadieron sobre los portaobjetos una
alícuota (50 \mul) de la solución de hibridación que contenía
aproximadamente 3 ng (10^{6} cpm) de sonda (sentido o
antisentido). Cada portaobjetos se cubrió con el cubreobjetos y se
incubó durante 16 horas a 50ºC, después de lo cual los portaobjetos
con silicona se retiraron mediante un breve lavado en 4 x SSC (1 x
SSC - NaCl 150 mM, citrato de Na 60 mM, pH 7,0).
Las secciones se trataron a continuación con
ribonucleasa A (50 \mug/ml en NaCl 0,5 M, tiosulfato de Na 10 mM,
EDTA 1 mM, TrisHCL 10 mM, pH 8,0) durante 20 min a 37ºC y se
enjuagaron durante 2 horas a temperatura ambiente en 2 x SSC,
tiosulfato de Na 10 mM, durante 30 min a 55ºC. Las secciones se
deshidrataron en etanol, se desengrasaron en xileno, se cubrieron
con emulsión Kodak NTB2 y se expusieron durante 10 días a 4ºC. Se
reveló la emulsión con Kodak D19 y se tiñó por contraste el tejido
con violeta de cresil.
Se detectaron granos autorradiográficos
utilizando luz polarizada reflejada y se determinó el número de
granos, la densidad y las superficies celulares con un sistema
analizador de imagen Analytic Imaging Concepts. Debido al bajo
ruido de fondo, los criterios para definir una célula "marcada"
se basaron en la presencia de más de 5 granos agrupados. Las
células marcadas con GAD se hallaron dispersadas por el cerebro,
permitiendo la medición del número de granos en células
individuales. El límite de la célula y la superficie cubierta por
un grano permitió el cálculo del número de granos por célula. Este
análisis se hizo a un gran aumento (800X), utilizando luz
polarizada reflejada y luz transmitida para observar simultáneamente
la célula teñida y los granos superpuestos. Los números son medias
\pm S.E.M. de "n" células.
En el mRNA de GAD_{67} de todos los tipos
neuronales las concentraciones son mayores. Las observaciones con
hibridación in situ son consecuentes con los descubrimientos
anteriores (Nitsch, J. Neurochem., 34:822, 1980; Denner, et.
al., J. Neurochem., 44:957, 1985; Itoh, et. al.,
Neurochem. Res, 6:1283, 1981) en los que la relación de las
actividades de GAD dependientes de PLP a independientes de PLP en el
cerebelo es una de las más bajas en las regiones del cerebro
probadas. Además, como se muestra en la Tabla 3, el orden de
cantidades para el mRNA de GAD_{67} es: células Purkinje >
Golgi II > cesto > estrelladas; por el contrario, para el
mRNA de GAD_{65}, este orden es: células Golgi II > Purkinje
> cesto > estrelladas.
La expresión de los mRNA de GAD_{65} y
GAD_{67} diferencia de este modo entre las clases de neuronas. La
contribución de cada una a la actividad total de GAD afecta a su vez
a cómo se regula la producción de GABA. Por ejemplo, la sustancia
negra contiene una de las relaciones más altas de las actividades de
GAD dependientes de PLP respecto a independientes de PLP (Nitsch,
J. Neurochem., 34:822, 1980). El aumento de la concentración de
GABA en la sustancia negra mediante inyección local de los
inhibidores del catabolismo de GABA es especialmente eficaz en la
reducción de la susceptibilidad a las crisis (Gale, Fed. Proc.,
44:2414, 1985). Los animales experimentales que sufren crisis
producidas por antagonistas de PLP pueden por lo tanto ser incapaces
de inhibir la propagación de la crisis debido a la inhibición de
GAD_{65} particularmente en los terminales del nervio dentro de la
sustancia negra.
La distribución de GAD_{65} y GAD_{67} se
evaluó en las fracciones subcelulares de S_{2} y del sinaptosoma.
S_{2} es un sobrenadante de alta velocidad que se compone del
citosol de todas las células del cerebro, en tanto que la fracción
sinaptosomal se compone principalmente de terminaciones nerviosas
(Gray, et. al., J. Anat., Lond. 96:79, 1962). Para estos
estudios, se efectuó la división de todo el cerebro de la rata como
describen Booth y Clark (Booth, et. al., Biocchem. J.,
176:365, 1978). Las concentraciones de proteína se determinaron
según Schaffner y Weissman (Schafner, et. al., Anal. Biochem.
56:502, 1973). Se prepararon las muestras como describen Kaiser,
et. al. (DNA Cloning, Vol. I, A practical Approach, D.M.
Glover ed. IRL Press, Oxford, 1985, págs. 38-40) y
se hizo la inmunotransferencia como se describió anteriormente
utilizando anticuerpo monoclonal GAD-6 y antisuero
K-2. Se añadieron cantidades iguales de proteína (16
\mug) a cada carril. La autorradiografía mostró una respuesta
lineal de cantidad creciente de ^{125}I-proteína A
unida a concentraciones de proteína con anticuerpo de 1, 3, 10, 30
y 100 \mugs con antisuero K-2 y anticuerpo
monoclonal GAD-6 (datos no mostrados).
Los resultados mostraron que GAD_{67} estuvo
presente en cantidades iguales en ambas fracciones. Como la
fracción S_{2} contiene las proteínas citosólicas de las células
de la glía (así como otras células no neuronales) y de las células
neuronales, la concentración de GAD_{67} debe ser mayor en los
cuerpos neuronales que en las terminaciones nerviosas. Por el
contrario, la concentración de GAD_{65} fue mayor en los
sinaptosomas que en S_{2}. Estos experimentos de división
subcelular sugieren que, al contrario que en GAD_{65}, está
presente una fracción mucho mayor de GAD_{67} en los cuerpos de
las neuronas que en las terminales nerviosas. Así pues, la división
subcelular, como la inmunohistoquímica, demuestra que GAD_{65} y
GAD_{67} tienen diferentes distribuciones subcelulares.
Los experimentos in vivo que utilizan
inhibidores de la síntesis y degradación de GABA han sugerido que la
reserva de GABA en los cuerpos de las neuronas es diferente de los
de las terminales nerviosas (Iadarola, et. al., Mol. Cell.
Biochem., 39:305, 1981). El GABA producido por GAD_{67} puede
estar más implicado en el metabolismo celular (por ejemplo, en el
shunt GABAérgico) y en las sinapsis dendrodendríticas. Las dendritas
de las células granulares del bulbo olfativo, que forman sinapsis
dendrodendríticas con las dendritas mitrales (Shepard, Physiol.
Rev., 52:864, 1972) y probablemente liberan GABA (Mc Lennan, Brain
Res., 29:177-184, 1971), marcan intensamente con
antisuero K-2. Aunque no se ha mostrado en esta
memoria, se han observado mayores concentraciones de mRNA de
GAD_{67} que de GAD_{65} (2 a 3 veces) en el bulbo olfativo.
Esta distribución es coherente con el descubrimiento publicado de
que la mayor parte de la actividad de GAD en el bulbo olfativo está
presente en S_{2} y P_{1} (pellet nuclear bruto) y no en
sinaptosomas (Quinn, et. al., J. Neurochem., 35:583,
1980).
Las diferentes distribuciones subcelulares de
GAD_{65} y GAD_{67} podrían proceder del anclaje citoesquelético
o de algunos mecanismos desconocidos dirigidos a las proteínas.
Algunas proteínas citoesqueléticas tienen distribuciones que
recuerdan a GAD_{65} y GAD_{67}. Por ejemplo, en neuronas
simpáticas cultivadas, Peng, et. al. ( J. Cell. Biol.,
102:252, 1986) demostraron que el 84% de tau está en axones mientras
que el 100% de MAP-2 está en cuerpos celulares y
dendritas. Además, la proteína de 43 kDa, proteína citoesquelética,
se cree que ancla el receptor de la acetilcolina al citoesqueleto de
la membrana que le sirve de base (Flucher, et. al., Neuron,
3:163, 1989).
1. Muestras de los pacientes. Se
seleccionaron sueros de cuatro grupos individuales a partir de un
estudio previo de Atkinson y colaboradores (Atkinson, et.
al., Lancet, 335:1357-1360, 1990). Estos grupos
constan de: Grupo (1), un grupo de pacientes de comienzo reciente
de la diabetes dependiente de insulina (IDD, siglas en inglés)
diagnosticados según criterios establecidos por el Grupo nacional de
datos de diabetes (NDDG) (Gleichman, et. al., Diabetes,
36:578-584, 1987) que fueron dirigidos a la
Universidad de Florida, Clínicas de diabetes; Grupo (2), 5
controles no diabéticos negativos para anticuerpos citoplasmáticos
de las células de los islotes (ICA) seleccionados al azar sin
historial familiar conocido de enfermedad autoinmunitaria; Grupo
(3), 13 individuos cuyos sueros se han recogido de 3 a 66 meses
antes del comienzo clínico documentado de la IDD; Grupo (4),
controles no diabéticos y parientes, y aquellos que se estudiaron
antes del comienzo de la IDD; y Grupo (5), 3 pacientes con riesgo
de padecer DMID, pero en los que aún no ha comenzado. Este último
grupo se ha establecido mediante estudios prospectivos en continuo
de detección de ICA en más de 5000 parientes de primer grado de
probandos con IDD y 8200 individuos de la población general (de los
que 4813 eran escolares).
2. Autoanticuerpos de células de los
islotes. Se analizaron los ICA por inmunofluorescencia indirecta
en secciones realizadas con criomicrotomo de muestras pancreáticas
del grupo sanguíneo 0 (Atkinson, et. al., Lancet,
335:1357-1360, 1990). Todos los resultados se
interpretaron sobre muestras codificadas, con sueros de control
positivos y negativos en cada lote. Los grados de positividad de ICA
se analizaron con las pautas establecidas por el Grupo de trabajo
Diabetes de Inmunología (IDW) para la estandarización de los ICA
(Gleichman, et. al., Diabetes, 36:578-584,
1984). Todos los sueros positivos se titularon por dilución de punto
final y las unidades de la Fundación de Diabetes Juvenil (JDF, del
inglés) se determinaron en referencia a un suero patrón previamente
calibrado según el patrón internacional JDF de 80 unidades. En los
estudios que aquí se indican, se definió un resultado positivo de
ICA mediante réplicas de titulación de 10 unidades JDF o
superiores.
3. Caracterización de
HLA-DR. La caracterización de
HLA-DR se realizó por adaptación del procedimiento
descrito por Van Rood y Van Leuwen (Nature,
262:795-797, 1976), utilizando placas DR (One Lamda
Laboratories, Los Ángeles, CA).
4. Células de los islotes humanos. Se
aislaron islotes pancreáticos humanos a partir de páncreas de
cadáveres y se mantuvieron in vitro como se describió
anteriormente (Ricordi, et. al., Diabetes,
37:413-420, 1988). Las células de los islotes se
marcaron metabólicamente con metionina ^{35}S (Amersham, Arlington
Heights, IL) in vitro (95% de aire/5% de CO_{2}).
5. Extracción e inmunoprecipitación de
células de los islotes. Se extrajeron células de los islotes
como describieron anteriormente Atkinson, et. al., (Lancet,
335:1357-1360, 1990) con las siguientes
modificaciones. Para estudios de inmunoprecipitación, los lisados
de las células de los islotes se purificaron previamente por
incubación dos veces (2 h, 4ºC) bien con control, suero IDD (100
\mul) o GAD-6 (Chang, et. al., J. Neuro,
8:2123-2130, 1988) (1 \mul en 99 \mul de tampón
Tris [Atkinson, et. al., Lancet,
335:1357-1360, 1990]) por cada 1000 islotes. Los
complejos inmunitarios se absorbieron a continuación (1 h, 4ºC) con
proteína A Sepharose CL-4B en exceso (Pharmacia,
NJ). A continuación se incubaron (12 h, 4ºC) volúmenes de alícuotas
que representaban 1000 células de los islotes que contenían lisado
no ligado (prepurificado) con suero IDD o de control (25 \mul), o
GAD-6 (Chang, et. al., J. Neuro,
8:2123-2130, 1988) (1 \mul en 25 \mul de tampón
Tris). Después de otra incubación con proteína A Sepharose
CL-4B (1 h, 4ºC), se lavaron los complejos 5 veces
con HCL Tris (pH 7,4) con SDS al 0,1%, Triton X-114
al 1% y EDTA 2 mM y a continuación se lavaron de nuevo una vez en
agua bidestilada. La proteína A Sepharose CL-4B se
hirvió a continuación en tampón muestra de Laemmli (Laemmli,
Nature, 227:680-685, 1970), y las muestras se
sometieron a SDS-PAGE y fluororradiografía (Kodak,
X-omat AR5) utilizando Enhance (New England
Nuclear). Por otra parte, se analizaron las autorradiografías
mediante un analizador BETAGEN (Boston MA). Se utilizaron sueros
positivos y negativos de 64KA en cada análisis para que sirvieran
como controles interanálisis. Se analizaron todas las
fluororradiografías y se clasificaron en positivas y negativas
después de la comparación con los controles interanálisis conocidos.
Las muestras de suero positivo se denominaron 1 cuando la muestra
producía inmunoprecipitación de una banda de baja intensidad de
64.000 M_{x}, 2 si se observaba una banda de intensidad moderada y
3 si la intensidad de la proteína inmunoprecipitada era alta. Un
procedimiento de clasificación similar se empleó para la intensidad
de las bandas correspondientes a
^{35}S-GAD_{65} y
^{35}S-GAD_{67} inmunoprecipitadas.
6. Inmunoprecipitaciones. La
inmunoprecipitación de lisados bacterianos que contienen
^{35}S-GAD_{65} y
^{35}S-GAD_{67} y GAD de homogenados de cerebro
humano, se completó como se describió anteriormente en estudios de
inmunoprecipitación de extracciones de células de los islotes
humanas.
7. Análisis de GAD. Se incubaron
homogenados de cerebro humano con sueros de paciente como se
describió anteriormente para las células de los islotes humanas.
Después de la absorción y de los lavados, la suspensión de agarosa
en proteína A se dividió en tres volúmenes iguales y se midió la
actividad de GAD como describió (Krieger, et. al.,
Neurochem. 33:299, 1984). En resumen, gotas de agarosa con proteína
A se incubaron con
(1-14C)-glutamato (Amersham) en una
mezcla de incubación al efecto (Krieger, et. al., Neurochem.
33:299, 1984) y se cuantificó la producción de ^{14}CO_{2}
mediante un contador de centelleo líquido.
8. Producción de
^{35}S-GAD_{65} y
^{35}S-GAD_{67}. Se subclonaron cDNA de
GAD_{65} y GAD_{67} de rata en un sistema de expresión
bacteriana como se describió anteriormente. Se completó el marcaje
de las ^{35}S-GAD sometiendo las bacterias
inducidas con IPTG (crecimiento en medio mínimo) a un pulso durante
15 minutos con TRAN ^{35}S-marcador (ICN). A
continuación se dio la vuelta a los cultivos, se volvieron a poner
en suspensión y se sometieron a ultrasonidos en 1 ml de tampón de
homogeneización (fluoruro de fenilmetilsulfonil 1 mM (PMSF),
bromuro de 2-aminoetilisotiouronio 1 mM (AET) y
fosfato potásico 60 mM, pH 7,1). Después de los ultrasonidos, se
separaron los residuos celulares por centrifugación y se midió la
concentración de proteína (Bradford, Anal. Biochem., 72:248, 1986)
en el sobrenadante (se guardó el sobrenadante en alícuotas a
-70ºC).
Se analizaron sueros de pacientes de DMID para
probar la capacidad de precipitar GAD de los homogenados de cerebro
humano.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
Como se muestra en la Tabla 4, los sueros de
cuatro (de cada cinco) pacientes de DMID o con riesgo de IDDM
ligaron cantidades significativamente mayores de GAD enzimáticamente
activa de extractos de cerebro humano que los sueros de pacientes
de control. Además, los sueros de uno de los pacientes se extrajeron
en un periodo pre-DMID, de este modo los
anticuerpos para GAD están presentes antes del comienzo de los
síntomas de DMID (véase C más atrás).
Experimentos adicionales (resultados no
presentados) demostraron que los sueros de dos pacientes con riesgo
de DMID (DA, DC) produjeron ^{35}S-GAD_{65}
inmunoprecipitada de forma recombinante mientras la
^{35}S-GAD_{67} producida de forma recombinante
fue sólo reconocida por los sueros del paciente DA (y en un grado
inferior que ^{35}S-GAD_{67}).
Estudios adicionales que utilizaban suero del
paciente DA demostraron la presencia de anticuerpos que reconocen
polipéptidos específicos producidos en las células de los islotes
pancreáticos humanos. Los análisis electroforéticos de los
polipéptidos ligados demostraron la presencia de anticuerpos frente
a un componente de 64 kDa, como demostraron previamente otros en
modelos de DMID humana (Baekkeskov, et. al., Nature,
298:167-169, 1982) y animales (Baekkeskov, et.
al., Science, 224:1348-1350, 1984; Atkinson,
et. al., Diabetes, 37:1587-1590, 1988).
Antes de la absorción de estos sueros con GAD-6
monoclonal, que reconoció a GAD_{65} pero no a GAD_{67}, o con
GAD_{65} producida por bacterias, se suprimió la capacidad de los
sueros para reconocer el polipéptido pancreático de 64 kDa. Los
epítopos reconocidos por autoanticuerpos para el autoantígeno de 64
kDa están presentes de este modo en GAD_{65}, indicando que el
autoantígeno de 64 kDa es realmente GAD_{65}. Para investigar el
valor predictivo de GAD_{65}, se probaron los sueros extraídos de
pacientes antes del comienzo de la manifestación clínica de DMID
para los anticuerpos frente a GAD_{65}.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
Como se muestra en la Tabla 5, 9 de cada 12
muestras (75%) fueron inmunorreactivas a
^{35}S-GAD_{65}. Además, dos pacientes (JA y
VC) fueron inmunorreactivos a GAD_{67}, pero no a GAD_{65} en
estas condiciones. Por consiguiente los autoanticuerpos de
GAD_{65} y GAD_{67} en combinación estuvieron presentes en 11
de cada 12 (91%) de estos sueros de pacientes. Este descubrimiento
sugiere que aunque los anticuerpos de GAD_{65} son más corrientes
que los anticuerpos de GAD_{67}, la utilización de ambos GAD
recombinantes (GAD_{65} y GAD_{67}) en un análisis permitiría
mayor predictibilidad de DMID. Las pruebas anteriores de estos
sueros (Atkinson, et. al., Lancet,
335:1357-1360, 1990) demostraron que 11 de cada 12,
o el 92%, inmunorreacionaron a la molécula de 64 kDa marcada con
^{35}S de las células de los islotes pancreáticos humanos. El
suero que contenía anticuerpos detectables de la molécula de 64 kDa
y no GAD_{65} era un suero que contenía el valor más bajo (o
"1") para la molécula de 64 kDa. Así pues, el falso negativo
obtenido era debido a una falta de sensibilidad en este análisis.
Además, este análisis predijo la DMID en un paciente (BR) que era
negativo para 64K.
Estos resultados demuestran que la molécula de
64 kDa identificada en las células \beta del páncreas humano es
idéntica en tamaño y antigenicidad a la GAD_{65} de la rata.
Además, los sueros extraídos de pacientes antes del comienzo de
DMID contienen autoanticuerpos de GAD_{65}. Por consiguiente, la
molécula recombinante es de gran utilidad como herramienta de
diagnóstico para predecir la DMID. La capacidad de un médico para
diagnosticar la DMID antes de los síntomas reales dará
indudablemente como resultado una mayor prolongación del tiempo
previo a necesitar el tratamiento con insulina. La sensibilidad de
dichos inmunoanálisis mejorará con la utilización de una GAD_{65}
recombinante de origen humano que represente la forma GAD presente
en las células \beta del páncreas.
Se sintetizaron polipéptidos utilizando un
instrumento automático (Applied Biosystems) y condiciones estándar.
Estos polipéptidos se probaron a continuación para comparar su
capacidad relativa para estimular la multiplicación de linfocitos
esplénicos y de linfocitos T infiltradores de los islotes (IITL). En
este estudio, se compararon los polipéptidos procedentes de la
secuencia del núcleo de GAD_{65} y de la región homóloga del virus
de la poliomielitis. Se cultivaron células apropiadas durante 5
días con el polipéptido respectivo en presencia de 5 x 10^{4}
células de bazo irradiadas. Se añadió
^{3}H-timidina durante las últimas 16 horas de
cultivo.
En estos estudios, no había diferencia
significativa entre la actividad proliferativa de los cultivos de
linfocitos de bazo expuestos a los polipéptidos de poliovirus o de
GAD_{65}. No obstante, ambos polipéptidos estimularon una
respuesta de linfocitos T que era mayor que la observada en el medio
control. La ausencia de diferencia en la multiplicación de la
población de células del bazo puede ser debida a una frecuencia
inferior de linfocitos T específicos del polipéptido GAD.
Cuando se calculó la población de IITL de la
misma manera, mostró una marcada diferencia en la proliferación
celular. En este sistema, la respuesta al polipéptido GAD_{65} fue
9 veces mayor que la del medio de cultivo o la del polipéptido de
poliovirus. Estos datos sugieren intensamente que GAD_{65} es un
antígeno importante para las respuestas de los linfocitos T en la
población de IITL. Estos datos sugieren que el mimetismo molecular
desempeña un papel en la patogenia de la diabetes.
<110> The Regents of the University of
California
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Ácido Glutámico Descarboxilasa
Clonada
\vskip0.400000\baselineskip
<130> C 773 EP/I
\vskip0.400000\baselineskip
<140>
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.1
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ser Ile Met Ala Ala Arg Tyr Lys Tyr Phe Pro
Glu Val Lys Thr Lys}
\sac{Gly Met Ala Ala Val Pro Lys Leu}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ala Met Met Ile Ala Arg Phe Lys Met Phe Pro
Glu Val Lys Glu Lys}
\sac{Gly Met Ala Ala Leu Pro Arg Leu}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus coxsackie
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Phe Ile GLu Trp Leu Lys Val Lys Ile Leu Pro
Glu Val Lys Glu Lys}
\sac{His Glu Phe Leu Ser Arg Leu}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Poliovirus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Met Lys Ser Met Cys Pro Gln Ala Gln Leu Lys
Val Lys Tyr Leu}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 60
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Felis catus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1966
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus rattus
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (75)..(1829)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 585
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus rattus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2400
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (53)..(1810)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 585
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (17)
1. La utilización de un polipéptido o análogo,
derivado químico o sal farmacéuticamente aceptable del mismo, que
tiene la siguiente secuencia de aminoácidos:
X-Pro-Glu-Val-Lys-Y-Lys-Z,
donde X es una secuencia de uno a
diez aminoácidos que puede o no estar presente; Y es Thr o Glu; y Z
es una secuencia de uno a ocho aminoácidos que puede o no estar
presente
a) para diagnosticar diabetes mellitus
dependiente de insulina (DMID);
b) para detectar anticuerpos de GAD_{65} en
una muestra;
c) para clasificar pacientes con enfermedad
autoinmunitaria;
d) para realizar pruebas con fármacos que
modifiquen la función de GAD;
e) para generar un anticuerpo;
2. La utilización de la reivindicación 1, donde
X contiene Lys, Y es Thr y Z contiene Leu.
3. La utilización de la reivindicación 1, donde
X contiene Lys, Y es Glu y Z contiene Leu.
4. La utilización de la reivindicación 3, donde
X además contiene Met y Z además contiene Arg y Leu.
5. La utilización de cualquiera de las
reivindicaciones de la 1 a la 3, donde X es la secuencia de
aminoácidos
Ser-Ile-Met-Ala-Ala-Arg-Tyr-Lys-Tyr-Phe
y Z es la secuencia de aminoácidos
Gly-Met-Ala-Ala-Val-Pro-Lys-Leu.
6. La utilización de cualquiera de las
reivindicaciones de la 1 a la 4, donde X es una secuencia de
aminoácidos
Ala-Met-Met-Ile-Ala-Arg-Phe-Lys-Met-Phe
y Z es una secuencia de aminoácidos
Gly-Met-Ala-Ala-Leu-Pro-Arg-Leu.
7. La utilización de cualquiera de las
reivindicaciones 1(b), o de la 2 a la 6, donde dichos
anticuerpos son autoanticuerpos.
8. La utilización de cualquiera de las
reivindicaciones 1(c), o de la 2 a la 6, donde dicha
enfermedad autoinmunitaria es diabetes mellitus dependiente de
insulina (DMDI).
9. La utilización de cualquiera de las
reivindicaciones 1 (e), o de la 2 a la 6, donde el anticuerpo es
policlonal o monoclonal.
10. La utilización de cualquiera de las
reivindicaciones 1(b), o de la 2 a la 7, donde el polipéptido
se emplea en inmunoanálisis competitivos y no competitivos en
formato directo o indirecto.
11. La utilización de la reivindicación 10,
donde dicho inmunoanálisis es un radioinmunoanálisis (RIA), un
análisis de inmunometría en sándwich y una transferencia
Western.
12. La utilización de cualquiera de las
reivindicaciones 1(b), de la 2 a la 7 o 10, donde se detectan
los anticuerpos para GAD_{65} midiendo la actividad enzimática de
GAD.
13. La utilización de un anticuerpo para un
polipéptido como se define en cualquiera de las reivindicaciones
anteriores para la detección de GAD_{65}.
14. La utilización de la reivindicación 13,
donde dicho anticuerpo es monoclonal.
15. La utilización de la reivindicación 13 o 14,
donde dicho anticuerpo está unido a una lectina, preferiblemente al
ricino.
16. Una composición farmacéutica que comprende
el polipéptido como se define en cualquiera de las reivindicaciones
anteriores, donde el polipéptido está marcado.
17. La composición farmacéutica de la
reivindicación 16, donde el polipéptido está marcado con un agente
terapéutico o un radioisótopo.
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