JPH0770182A - クローン化グルタミン酸デカルボキシラーゼ - Google Patents
クローン化グルタミン酸デカルボキシラーゼInfo
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- JPH0770182A JPH0770182A JP4158195A JP15819592A JPH0770182A JP H0770182 A JPH0770182 A JP H0770182A JP 4158195 A JP4158195 A JP 4158195A JP 15819592 A JP15819592 A JP 15819592A JP H0770182 A JPH0770182 A JP H0770182A
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- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C12N9/88—Lyases (4.)
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- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
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- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
- G01N2800/04—Endocrine or metabolic disorders
- G01N2800/042—Disorders of carbohydrate metabolism, e.g. diabetes, glucose metabolism
Abstract
(57)【要約】
【目的】 自己免疫疾患の診断及び治療に有用なグルタ
ミン酸デカルボキシラーゼポリペプチドを提供する。 【構成】 以下のアミノ酸配列を有する単離されたポリ
ペプチド、又はその類似体、化学誘導体、若しくは医薬
的に許容される塩。 Ｘ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｙ−Ｌｙｓ−Ｚ （式中、Ｘは１から１０個のアミノ酸から選択されるア
ミノ酸配列であるか、或いは省略されており；ＹはＴｈ
ｒ又はＧｌｕであり；そしてＺは１から８個のアミノ酸
から選択されるアミノ酸配列であるか、或いは省略され
ている）
ミン酸デカルボキシラーゼポリペプチドを提供する。 【構成】 以下のアミノ酸配列を有する単離されたポリ
ペプチド、又はその類似体、化学誘導体、若しくは医薬
的に許容される塩。 Ｘ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｙ−Ｌｙｓ−Ｚ （式中、Ｘは１から１０個のアミノ酸から選択されるア
ミノ酸配列であるか、或いは省略されており；ＹはＴｈ
ｒ又はＧｌｕであり；そしてＺは１から８個のアミノ酸
から選択されるアミノ酸配列であるか、或いは省略され
ている）
Description
【０００１】本出願は、１９９０年９月２１日出願の
Ｕ．Ｓ．Ｓｅｒｉａｌ Ｎｏ．０７／５８６，５３６の
一部継続出願である。
Ｕ．Ｓ．Ｓｅｒｉａｌ Ｎｏ．０７／５８６，５３６の
一部継続出願である。
【０００２】本発明はＮａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔ
ｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈからの基金ＮＳ２２２５
６によって支援されたものである。アメリカ合衆国政府
は、本発明に一定の権利を有する。
ｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈからの基金ＮＳ２２２５
６によって支援されたものである。アメリカ合衆国政府
は、本発明に一定の権利を有する。
【０００３】
【産業上の利用分野】本発明はグルタミン酸デカルボキ
シラーゼ65（ＧＡＤ65）ポリペプチドの発現のために、
ＧＡＤ65で宿主生物を形質転換する組み換えＤＮＡ手法
の使用に関する。また、ＧＡＤ65ポリペプチドを、自己
免疫疾患において診断的及び治療的に使用する方法も包
含する。
シラーゼ65（ＧＡＤ65）ポリペプチドの発現のために、
ＧＡＤ65で宿主生物を形質転換する組み換えＤＮＡ手法
の使用に関する。また、ＧＡＤ65ポリペプチドを、自己
免疫疾患において診断的及び治療的に使用する方法も包
含する。
【０００４】
【従来の技術】インシュリンー依存性真性糖尿病（ｉｎ
ｓｕｌｉｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｄｉａｂｅｔｅｓ
ｍｅｌｌｉｔｕｓ：ＩＤＤＭ；Ｉ型糖尿病）は、最も普
遍的な代謝性疾患の一つである。アメリカ合衆国では、
ＩＤＤＭはおよそ３００から４００人に１人の割合で見
られ、疫学的研究によると、この疾患は増加しているこ
とを示唆している。この疾患は膵臓のインシュリン生産
性β−細胞の自己免疫破壊の結果生じる。更に特定すれ
ば、この疾患の始まる前段階は、リンパ球が膵臓のラン
ゲルハンス島に浸潤し、βー細胞を選択的に破壊す
る、”インスリティス”という状態を特徴とする。典型
的なＩＤＤＭの過血糖症は、インシュリンー生産性βー
細胞の少なくとも８０％がうしなわれた後に、初めて現
れる。残りのβー細胞は次の数年間に破壊される。
ｓｕｌｉｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｄｉａｂｅｔｅｓ
ｍｅｌｌｉｔｕｓ：ＩＤＤＭ；Ｉ型糖尿病）は、最も普
遍的な代謝性疾患の一つである。アメリカ合衆国では、
ＩＤＤＭはおよそ３００から４００人に１人の割合で見
られ、疫学的研究によると、この疾患は増加しているこ
とを示唆している。この疾患は膵臓のインシュリン生産
性β−細胞の自己免疫破壊の結果生じる。更に特定すれ
ば、この疾患の始まる前段階は、リンパ球が膵臓のラン
ゲルハンス島に浸潤し、βー細胞を選択的に破壊す
る、”インスリティス”という状態を特徴とする。典型
的なＩＤＤＭの過血糖症は、インシュリンー生産性βー
細胞の少なくとも８０％がうしなわれた後に、初めて現
れる。残りのβー細胞は次の数年間に破壊される。
【０００５】インシュリン治療によって大半のＩＤＤＭ
患者は普通の生活を送ることができるが、この補充は不
完全なものであって、代謝恒常性を完全に元に戻すもの
ではない。従って、目、腎臓、心臓、及びその他の器官
の機能低下に至る深刻な合併症が、インシュリン治療を
受けているＩＤＤＭ患者には多い。このために、β−細
胞破壊の開始時と、実際にインシュリン補充が必要とな
る時（即ち、βー細胞の８０％が破壊されたとき）との
間の潜伏期間を伸ばすこと（例えば、免疫抑制剤の投与
によって）が極めて望ましい。従って、βー細胞破壊の
開始を決定する診断テストがあれば、医者が潜伏期間を
伸ばすための免疫抑制剤を投与することができ（Silver
stein et al., New England Journal of Medicine, 31
9:599-604, 1988) 、それによってインシュリン補充に
よる副作用の開始を遅らせることができる。
患者は普通の生活を送ることができるが、この補充は不
完全なものであって、代謝恒常性を完全に元に戻すもの
ではない。従って、目、腎臓、心臓、及びその他の器官
の機能低下に至る深刻な合併症が、インシュリン治療を
受けているＩＤＤＭ患者には多い。このために、β−細
胞破壊の開始時と、実際にインシュリン補充が必要とな
る時（即ち、βー細胞の８０％が破壊されたとき）との
間の潜伏期間を伸ばすこと（例えば、免疫抑制剤の投与
によって）が極めて望ましい。従って、βー細胞破壊の
開始を決定する診断テストがあれば、医者が潜伏期間を
伸ばすための免疫抑制剤を投与することができ（Silver
stein et al., New England Journal of Medicine, 31
9:599-604, 1988) 、それによってインシュリン補充に
よる副作用の開始を遅らせることができる。
【０００６】ＩＤＤＭ患者の多くは、６４ｋＤ分子（Ba
ekkeskov et al., J.Clin.Invest.79:926-934, 1987; A
tkinson et al., Lancet, 335:1357-1360, 1990) 、島
細胞細胞質（ｉｓｌｅｔ ｃｅｌｌ ｃｙｔｏｐｌａｓ
ｍｉｃ：ＩＣＡ）分子又は島細胞表面（ｉｓｌｅｔ ｃ
ｅｌｌ ｓｕｒｆａｃｅ：ＩＣＳＡ）分子（Bottazzoet
al., Lancet, 1:668-672, 1980) 、或いはインシュリ
ン（Palmer et al., Science, 222:1137-1139, 1983; A
tkinson et al., Diabetes, 35:894-898, 1986) に対す
る抗体を含む血清を有している。Ａｔｋｉｎｓｏｎとそ
の共同研究者ら（Atkinson et al., Lancet, 335:1357-
1360, 1990) は、ヒト血清中における６４ｋＤ分子に対
する抗体の存在が、ＩＤＤＭ症状が実際に起きる始まり
についての、最も初期でかつ最も信頼できる指標である
ことを示した。
ekkeskov et al., J.Clin.Invest.79:926-934, 1987; A
tkinson et al., Lancet, 335:1357-1360, 1990) 、島
細胞細胞質（ｉｓｌｅｔ ｃｅｌｌ ｃｙｔｏｐｌａｓ
ｍｉｃ：ＩＣＡ）分子又は島細胞表面（ｉｓｌｅｔ ｃ
ｅｌｌ ｓｕｒｆａｃｅ：ＩＣＳＡ）分子（Bottazzoet
al., Lancet, 1:668-672, 1980) 、或いはインシュリ
ン（Palmer et al., Science, 222:1137-1139, 1983; A
tkinson et al., Diabetes, 35:894-898, 1986) に対す
る抗体を含む血清を有している。Ａｔｋｉｎｓｏｎとそ
の共同研究者ら（Atkinson et al., Lancet, 335:1357-
1360, 1990) は、ヒト血清中における６４ｋＤ分子に対
する抗体の存在が、ＩＤＤＭ症状が実際に起きる始まり
についての、最も初期でかつ最も信頼できる指標である
ことを示した。
【０００７】最近になって、Ｂａｅｋｋｅｓｋｏｖとそ
の共同研究者らは、６４ｋＤ分子と、グルタミン酸デカ
ルボキシラーゼ（ＧＡＤ）とは幾つかの共通の抗原エピ
トープを有しており、従ってこれらは同じものである
か、或いは非常によく似た分子である、ということを確
立した。この同定は重要な発見ではあるが、ＧＡＤの分
子生物学に関する知識が未知である限りは、この情報を
ＩＤＤＭ予知の診断法として用いることは極めて厄介で
あり、かつ限定されている。
の共同研究者らは、６４ｋＤ分子と、グルタミン酸デカ
ルボキシラーゼ（ＧＡＤ）とは幾つかの共通の抗原エピ
トープを有しており、従ってこれらは同じものである
か、或いは非常によく似た分子である、ということを確
立した。この同定は重要な発見ではあるが、ＧＡＤの分
子生物学に関する知識が未知である限りは、この情報を
ＩＤＤＭ予知の診断法として用いることは極めて厄介で
あり、かつ限定されている。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】従って、大量の６４ｋ
Ｄ分子、又は６４ｋＤ分子と抗原的に実質的に同一なＧ
ＡＤ分子をクローニングし、次いで生産することができ
れば、ＩＤＤＭ予知のための診断キットの開発が可能と
なろう。本発明は、かかる結果を達成するための手段を
提供する。
Ｄ分子、又は６４ｋＤ分子と抗原的に実質的に同一なＧ
ＡＤ分子をクローニングし、次いで生産することができ
れば、ＩＤＤＭ予知のための診断キットの開発が可能と
なろう。本発明は、かかる結果を達成するための手段を
提供する。
【０００９】
【課題を解決するための手段】本発明は、組み換えＤＮ
Ａ手法を用いて真核性ＧＡＤ65ポリペプチドの生産が可
能であり、かつＧＡＤ65ポリペプチドを自己免疫疾患の
患者の診断及び治療に用い得るという知見に基づいてな
された。特定すれば、クローン化真核性ＧＡＤ65ポリペ
プチドを、インシュリン依存性真性糖尿病（ＩＤＤＭ）
を有する患者、或いは有する危険性のある患者の診断に
用いることに関する。
Ａ手法を用いて真核性ＧＡＤ65ポリペプチドの生産が可
能であり、かつＧＡＤ65ポリペプチドを自己免疫疾患の
患者の診断及び治療に用い得るという知見に基づいてな
された。特定すれば、クローン化真核性ＧＡＤ65ポリペ
プチドを、インシュリン依存性真性糖尿病（ＩＤＤＭ）
を有する患者、或いは有する危険性のある患者の診断に
用いることに関する。
【００１０】本発明の主な利点は、天然の真核性ＧＡＤ
65ポリペプチドをその他の真核性非−ＧＡＤ65ポリペプ
チドから分離する際に、その単離に関して生じる問題を
回避しつつ、天然源から精製したものに対応する真核性
ＧＡＤ65ポリペプチドの容易な生産源を当業界に提供す
ることである。その他の真核性非−ＧＡＤ65ポリペプチ
ドが存在しないということは、ＧＡＤ65ポリペプチドと
特異的に反応する抗体のみを検出する試験システムの開
発が可能となるので、重要なことである。
65ポリペプチドをその他の真核性非−ＧＡＤ65ポリペプ
チドから分離する際に、その単離に関して生じる問題を
回避しつつ、天然源から精製したものに対応する真核性
ＧＡＤ65ポリペプチドの容易な生産源を当業界に提供す
ることである。その他の真核性非−ＧＡＤ65ポリペプチ
ドが存在しないということは、ＧＡＤ65ポリペプチドと
特異的に反応する抗体のみを検出する試験システムの開
発が可能となるので、重要なことである。
【００１１】宿主細胞中において真核性ＧＡＤ65ポリペ
プチドを提供する他の利点は、そうすることによって天
然源から現在実際に得られているよりも、はるかに大量
のポリペプチドを得ることが可能となることである。そ
の結果、本発明のポリペプチドを用いてＩＤＤＭのよう
な自己免疫疾患を有する患者をより正確に分類すること
が可能となるばかりでなく、診断システムに使用するた
めの商業的に使用可能な量のＧＡＤ65ポリペプチドを提
供することも可能となる。
プチドを提供する他の利点は、そうすることによって天
然源から現在実際に得られているよりも、はるかに大量
のポリペプチドを得ることが可能となることである。そ
の結果、本発明のポリペプチドを用いてＩＤＤＭのよう
な自己免疫疾患を有する患者をより正確に分類すること
が可能となるばかりでなく、診断システムに使用するた
めの商業的に使用可能な量のＧＡＤ65ポリペプチドを提
供することも可能となる。
【００１２】本発明は、グルタミン酸デカルボキシラー
ゼ65（ＧＡＤ65）に対する自己抗体と結合するための、
１又はそれ以上のエピトープ（抗原決定基）の１次構造
コンホメーションの一部又は全てを有するポリペプチド
の生産を可能にする組み換え手法によって、遺伝的物質
を操作することに関する。これらのポリペプチドは、こ
れと反応する自己抗体を免疫学的に検出するのに極めて
有用である。なぜなら、このような自己抗体は、インシ
ュリン依存性真性糖尿病や”スティッフマン（ｓｔｉｆ
ｆ ｍａｎ）”症候群のような自己免疫疾患の指標とな
るからである。これらのポリペプチドは、ＧＡＤ機能を
変えるようなスクリーニング医薬として、また、ＧＡＤ
65を診断的に検出するために用いるポリクローナル及び
モノクローナル抗体の製造用としても使用できる。
ゼ65（ＧＡＤ65）に対する自己抗体と結合するための、
１又はそれ以上のエピトープ（抗原決定基）の１次構造
コンホメーションの一部又は全てを有するポリペプチド
の生産を可能にする組み換え手法によって、遺伝的物質
を操作することに関する。これらのポリペプチドは、こ
れと反応する自己抗体を免疫学的に検出するのに極めて
有用である。なぜなら、このような自己抗体は、インシ
ュリン依存性真性糖尿病や”スティッフマン（ｓｔｉｆ
ｆ ｍａｎ）”症候群のような自己免疫疾患の指標とな
るからである。これらのポリペプチドは、ＧＡＤ機能を
変えるようなスクリーニング医薬として、また、ＧＡＤ
65を診断的に検出するために用いるポリクローナル及び
モノクローナル抗体の製造用としても使用できる。
【００１３】ＤＮＡベクター中にスプライシングするた
めの真核性ＧＡＤ65ポリペプチドをコードする特異的Ｄ
ＮＡ配列の作製は各種の方法を用いて実施できる。例え
ば、（１）真核生物のゲノムＤＮＡから二本鎖ＤＮＡ配
列を単離する；（２）興味のあるポリペプチドにとって
必要なコドンを提供するためのＤＮＡ配列を化学的に製
造する；及び（３）真核生物ドナー細胞から単離したｍ
ＲＮＡの逆転写によってｉｎ ｖｉｔｒｏで二本鎖ＤＮ
Ａ配列を合成する、といった方法を含む各種の方法を用
いることができる。後者の場合、実際には、ｃＤＮＡと
一般に呼ばれる、ｍＲＮＡと相補的な二本鎖ＤＮＡが形
成される。
めの真核性ＧＡＤ65ポリペプチドをコードする特異的Ｄ
ＮＡ配列の作製は各種の方法を用いて実施できる。例え
ば、（１）真核生物のゲノムＤＮＡから二本鎖ＤＮＡ配
列を単離する；（２）興味のあるポリペプチドにとって
必要なコドンを提供するためのＤＮＡ配列を化学的に製
造する；及び（３）真核生物ドナー細胞から単離したｍ
ＲＮＡの逆転写によってｉｎ ｖｉｔｒｏで二本鎖ＤＮ
Ａ配列を合成する、といった方法を含む各種の方法を用
いることができる。後者の場合、実際には、ｃＤＮＡと
一般に呼ばれる、ｍＲＮＡと相補的な二本鎖ＤＮＡが形
成される。
【００１４】所望のポリペプチド産物のアミノ酸残基の
全配列が公知の場合には、ＤＮＡ配列の製造方法はしば
しば選択の問題である。所望のポリペプチドのアミノ酸
残基の全配列が公知でない場合には、ＤＮＡ配列の直接
製造は不可能で、選択しうる方法はｃＤＮＡ配列の形成
である。興味のあるｃＤＮＡ配列を単離するための標準
的方法には、高レベルでの遺伝子発現を有するドナー細
胞中に豊富にあるｍＲＮＡの逆転写に由来する、プラス
ミド運搬性のｃＤＮＡライブラリーを形成することがあ
る。ポリメラーゼ鎖反応法と組み合わせて用いると、ま
れな発現産物でもクローニングすることができる。ポリ
ペプチドのアミノ酸配列の重要な部分が公知の場合に
は、ターゲットのｃＤＮＡ中に存在すると推定される配
列と重複するような、ラベルした一本鎖又は二本鎖ＤＮ
Ａ又はＲＮＡプローブ配列を作成して、あらかじめ一本
鎖形に変性しておいたｃＤＮＡのクローン化コピー上で
行うＤＮＡ／ＤＮＡハイブリダイゼーション法を用いる
ことができる（Jay et al.,Nucleic Acid Research, 1
1:2325, 1983) 。
全配列が公知の場合には、ＤＮＡ配列の製造方法はしば
しば選択の問題である。所望のポリペプチドのアミノ酸
残基の全配列が公知でない場合には、ＤＮＡ配列の直接
製造は不可能で、選択しうる方法はｃＤＮＡ配列の形成
である。興味のあるｃＤＮＡ配列を単離するための標準
的方法には、高レベルでの遺伝子発現を有するドナー細
胞中に豊富にあるｍＲＮＡの逆転写に由来する、プラス
ミド運搬性のｃＤＮＡライブラリーを形成することがあ
る。ポリメラーゼ鎖反応法と組み合わせて用いると、ま
れな発現産物でもクローニングすることができる。ポリ
ペプチドのアミノ酸配列の重要な部分が公知の場合に
は、ターゲットのｃＤＮＡ中に存在すると推定される配
列と重複するような、ラベルした一本鎖又は二本鎖ＤＮ
Ａ又はＲＮＡプローブ配列を作成して、あらかじめ一本
鎖形に変性しておいたｃＤＮＡのクローン化コピー上で
行うＤＮＡ／ＤＮＡハイブリダイゼーション法を用いる
ことができる（Jay et al.,Nucleic Acid Research, 1
1:2325, 1983) 。
【００１５】ラベルした混合合成オリゴヌクレオチドプ
ローブを用いることによって（ここで各プローブは、変
性化二本鎖ＤＮＡの異種混合物を含むハイブリダイゼー
ションサンプル中において、特定のＤＮＡ配列の完全な
相補体である可能性がある）、ハイブリダイゼーション
法は組み換え体クローンをスクリーニングするのに有用
である。このようなスクリーニングのためには、ハイブ
リダイゼーションは、一本鎖ＤＮＡか、或いは変性化二
本鎖ＤＮＡのいずれかで実施するのが好ましい。このよ
うな方法は、興味のあるポリペプチドと関連するｍＲＮ
Ａ配列の量が極めて少ししか存在しない材料に由来する
ｃＤＮＡクローンを検出する際には特に有用である。言
い換えると、非−特異的な結合を避けるための緊縮的(s
tringent) ハイブリダイゼーション条件を用いることに
よって、例えば、ターゲットＤＮＡがその完全な相補体
である、混合物中の１個のプローブとハイブリダイゼー
ションすることによって、特定のｃＤＮＡクローンをオ
ートラジオグラフで可視化することができるようになる
（Wallace et al., Nucleic Acid Research, 9:879, 19
81) 。
ローブを用いることによって（ここで各プローブは、変
性化二本鎖ＤＮＡの異種混合物を含むハイブリダイゼー
ションサンプル中において、特定のＤＮＡ配列の完全な
相補体である可能性がある）、ハイブリダイゼーション
法は組み換え体クローンをスクリーニングするのに有用
である。このようなスクリーニングのためには、ハイブ
リダイゼーションは、一本鎖ＤＮＡか、或いは変性化二
本鎖ＤＮＡのいずれかで実施するのが好ましい。このよ
うな方法は、興味のあるポリペプチドと関連するｍＲＮ
Ａ配列の量が極めて少ししか存在しない材料に由来する
ｃＤＮＡクローンを検出する際には特に有用である。言
い換えると、非−特異的な結合を避けるための緊縮的(s
tringent) ハイブリダイゼーション条件を用いることに
よって、例えば、ターゲットＤＮＡがその完全な相補体
である、混合物中の１個のプローブとハイブリダイゼー
ションすることによって、特定のｃＤＮＡクローンをオ
ートラジオグラフで可視化することができるようになる
（Wallace et al., Nucleic Acid Research, 9:879, 19
81) 。
【００１６】更に、各種ｃＤＮＡをオーサイト(oocyte)
に注入して、ｃＤＮＡ遺伝子産物の発現が起きるのに十
分な時間をおき、そして所望のｃＤＮＡ発現産物の存在
を、例えばＧＡＤ65に, 特異的な抗体を用いるか、或い
はＧＡＤ65酵素活性の機能的ッセイを用いることによっ
て試験することにより、ＧＡＤ ｃＤＮＡライブラリー
をスクリーニングすることができる。
に注入して、ｃＤＮＡ遺伝子産物の発現が起きるのに十
分な時間をおき、そして所望のｃＤＮＡ発現産物の存在
を、例えばＧＡＤ65に, 特異的な抗体を用いるか、或い
はＧＡＤ65酵素活性の機能的ッセイを用いることによっ
て試験することにより、ＧＡＤ ｃＤＮＡライブラリー
をスクリーニングすることができる。
【００１７】若しくは、ＧＡＤ65に対する抗体を用い
て、少なくとも１個のエピトープを有するＧＡＤ65ペプ
チドに対して、ｃＤＮＡライブラリーを間接的にスクリ
ーニングすることができる（Chang and Gottlieb, J.Ne
urosci., 8:2123, 1988)。このような抗体は、ポリクロ
ーナル又はモノクローナル由来であり、ＧＡＤ65ｃＤＮ
Ａの存在を示す発現産物を検出するのに使用することが
できる。ＧＡＤ65のＮ−末端部分の最初の１００アミノ
酸にみられるエピトープに対する抗体が好ましい。
て、少なくとも１個のエピトープを有するＧＡＤ65ペプ
チドに対して、ｃＤＮＡライブラリーを間接的にスクリ
ーニングすることができる（Chang and Gottlieb, J.Ne
urosci., 8:2123, 1988)。このような抗体は、ポリクロ
ーナル又はモノクローナル由来であり、ＧＡＤ65ｃＤＮ
Ａの存在を示す発現産物を検出するのに使用することが
できる。ＧＡＤ65のＮ−末端部分の最初の１００アミノ
酸にみられるエピトープに対する抗体が好ましい。
【００１８】遺伝子組み換えにおいて使用できる、特定
のＤＮＡ配列作製のための上記３つの方法のうちでは、
ゲノムＤＮＡ単離を用いる方法が最も一般的でない。こ
れは、哺乳動物ポリペプチドを微生物の発現で得たいと
いう場合には、イントロンの存在のために、特にそうで
ある。
のＤＮＡ配列作製のための上記３つの方法のうちでは、
ゲノムＤＮＡ単離を用いる方法が最も一般的でない。こ
れは、哺乳動物ポリペプチドを微生物の発現で得たいと
いう場合には、イントロンの存在のために、特にそうで
ある。
【００１９】本発明は、ＧＡＤ65に対する抗体への少な
くとも１個のエピトープを有する１次構造コンホメーシ
ョン、即ち、アミノ酸残基の連続的配列、の一部又は全
てを有する、ＧＡＤ65の新規ポリペプチドを提供する。
くとも１個のエピトープを有する１次構造コンホメーシ
ョン、即ち、アミノ酸残基の連続的配列、の一部又は全
てを有する、ＧＡＤ65の新規ポリペプチドを提供する。
【００２０】ＧＡＤ65に対する自己抗体を検出するため
には、完全なＧＡＤ65よりもむしろ本発明のポリペプチ
ド断片を用いることができる。ＧＡＤ65ポリペプチドに
用いる場合の”ポリペプチド”の語は、ＧＡＤ65に対す
る自己抗体へのエピトープを有するいかなるアミノ酸配
列をも示すが、ここで該アミノ酸配列は、本発明のｃＤ
ＮＡ配列の一部又は全てによってコードされる。
には、完全なＧＡＤ65よりもむしろ本発明のポリペプチ
ド断片を用いることができる。ＧＡＤ65ポリペプチドに
用いる場合の”ポリペプチド”の語は、ＧＡＤ65に対す
る自己抗体へのエピトープを有するいかなるアミノ酸配
列をも示すが、ここで該アミノ酸配列は、本発明のｃＤ
ＮＡ配列の一部又は全てによってコードされる。
【００２１】本発明のＤＮＡ配列の微生物発現から得ら
れるポリペプチドは、他の真核性ポリペプチド、或いは
天然の細胞環境中で、又は血漿(plasma)や尿のような細
胞外液体中で、さもなければＧＡＤ65と関連している他
の汚染物を含まない、という特徴を更に有している。
れるポリペプチドは、他の真核性ポリペプチド、或いは
天然の細胞環境中で、又は血漿(plasma)や尿のような細
胞外液体中で、さもなければＧＡＤ65と関連している他
の汚染物を含まない、という特徴を更に有している。
【００２２】本発明者による研究により、ＧＡＤ65とＧ
ＡＤ67とは別々の遺伝子でコードされるものであり、例
えば、共通のゲノム性配列が転写後、又は翻訳後に修飾
されることによって生産されるのではないことが明白に
確立された。ＧＡＤ65とＧＡＤ67とが別々の遺伝子によ
ってコードされることを示す証拠には以下のものが含ま
れる：（ａ）ＧＡＤ65及びＧＡＤ67ｃＤＮＡの間の正確
に一致する部分の最大の連続した配列は、たった１７ヌ
クレオチドの長さである、（ｂ）ＧＡＤ65及びＧＡＤ67
からのｃＤＮＡは、低い緊縮調節(stringency conditio
ns) 下で（２．０ｘＳＳＣ，０．０１％ＳＤＳ，２３
℃）お互いにクロスハイブリダイゼーションしないし、
またお互いのｍＲＮＡともクロスハイブリダイゼーショ
ンしない、そして（ｃ）ＧＡＤ65及びＧＡＤ67ｃＤＮＡ
は、それぞれＧＡＤ67及びＧＡＤ65をコードする単離し
たゲノム性クローンとクロスハイブリダイゼーションし
ない。
ＡＤ67とは別々の遺伝子でコードされるものであり、例
えば、共通のゲノム性配列が転写後、又は翻訳後に修飾
されることによって生産されるのではないことが明白に
確立された。ＧＡＤ65とＧＡＤ67とが別々の遺伝子によ
ってコードされることを示す証拠には以下のものが含ま
れる：（ａ）ＧＡＤ65及びＧＡＤ67ｃＤＮＡの間の正確
に一致する部分の最大の連続した配列は、たった１７ヌ
クレオチドの長さである、（ｂ）ＧＡＤ65及びＧＡＤ67
からのｃＤＮＡは、低い緊縮調節(stringency conditio
ns) 下で（２．０ｘＳＳＣ，０．０１％ＳＤＳ，２３
℃）お互いにクロスハイブリダイゼーションしないし、
またお互いのｍＲＮＡともクロスハイブリダイゼーショ
ンしない、そして（ｃ）ＧＡＤ65及びＧＡＤ67ｃＤＮＡ
は、それぞれＧＡＤ67及びＧＡＤ65をコードする単離し
たゲノム性クローンとクロスハイブリダイゼーションし
ない。
【００２３】”宿主”の語は、原核生物のみでなく、酵
母菌、糸状菌のような真核生物、また植物及び動物細胞
のように、複製可能で、かつ真核性ＧＡＤ65のイントロ
ンを含まないＤＮＡ配列を発現することのできるものを
意味する。しかしながら、宿主生物としては原核生物が
好ましい。
母菌、糸状菌のような真核生物、また植物及び動物細胞
のように、複製可能で、かつ真核性ＧＡＤ65のイントロ
ンを含まないＤＮＡ配列を発現することのできるものを
意味する。しかしながら、宿主生物としては原核生物が
好ましい。
【００２４】”原核生物”の語は、ＧＡＤ65の発現のた
めの遺伝子で形質転換又はトランスフェクションされる
全てのバクテリアを含む。原核生物宿主は、グラム陰性
菌や、例えばＥ．ｃｏｌｉ，Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕ
ｍ，Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ及びＢａ
ｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓなどのグラム陽性菌を
含む。
めの遺伝子で形質転換又はトランスフェクションされる
全てのバクテリアを含む。原核生物宿主は、グラム陰性
菌や、例えばＥ．ｃｏｌｉ，Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕ
ｍ，Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ及びＢａ
ｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓなどのグラム陽性菌を
含む。
【００２５】ＧＡＤ65ポリペプチドをコードする組み換
えＤＮＡ分子によって、当業者に公知の方法を用いて、
宿主を形質転換又はトランスフェクションすることがで
きる。特に好ましいのは、ＧＡＤ65コーディング配列を
含むプラスミド又はウィルスを、それぞれ原核生物の形
質転換又はトランスフェクションのために用いることで
ある。
えＤＮＡ分子によって、当業者に公知の方法を用いて、
宿主を形質転換又はトランスフェクションすることがで
きる。特に好ましいのは、ＧＡＤ65コーディング配列を
含むプラスミド又はウィルスを、それぞれ原核生物の形
質転換又はトランスフェクションのために用いることで
ある。
【００２６】融合し、作動的に(operably)連結した遺伝
子を調製し、またそれらをバクテリア中で発現させる方
法は当業者に公知である（Maniatis et al., Molecular
Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor
Laboratory, Cold Spring Harbor、 NY, 1989)。ここで
記載する遺伝的構築物及び方法は、原核生物宿主中での
ＧＡＤ65の発現に用いることができる。
子を調製し、またそれらをバクテリア中で発現させる方
法は当業者に公知である（Maniatis et al., Molecular
Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor
Laboratory, Cold Spring Harbor、 NY, 1989)。ここで
記載する遺伝的構築物及び方法は、原核生物宿主中での
ＧＡＤ65の発現に用いることができる。
【００２７】一般に、挿入された真核生物性遺伝子配列
の効率よい転写を容易にするプロモーター配列を含む発
現ベクターを、宿主との関連で使用する。発現ベクター
は典型的には複製起点、プロモーター、及びターミネー
ター、並びに形質転換細胞の表現型選択を与えることの
できる特定遺伝子を含む。形質転換された原核生物宿主
は、発酵槽中で成長させて、当業者に公知の方法によっ
て最適成長条件で培養することができる。次いで本発明
のポリペプチドを成育培地、細胞分解物、又は細胞膜分
画から単離することができる。
の効率よい転写を容易にするプロモーター配列を含む発
現ベクターを、宿主との関連で使用する。発現ベクター
は典型的には複製起点、プロモーター、及びターミネー
ター、並びに形質転換細胞の表現型選択を与えることの
できる特定遺伝子を含む。形質転換された原核生物宿主
は、発酵槽中で成長させて、当業者に公知の方法によっ
て最適成長条件で培養することができる。次いで本発明
のポリペプチドを成育培地、細胞分解物、又は細胞膜分
画から単離することができる。
【００２８】微生物で発現された本発明のポリペプチド
の単離及び精製は、例えば、プレパラティブクロマトグ
ラフ分離や、モノクローナル又はポリクローナル抗体の
使用を含む免疫的分離のようないかなる慣用的方法によ
ってもよい。
の単離及び精製は、例えば、プレパラティブクロマトグ
ラフ分離や、モノクローナル又はポリクローナル抗体の
使用を含む免疫的分離のようないかなる慣用的方法によ
ってもよい。
【００２９】ＧＡＤ65のアミノ酸残基の配列を既に提供
したことによって、本発明は、１又はそれ以上のアミノ
酸残基の種類又は位置において天然型と異なっており、
かつ天然型ポリペプチドの幾つかの又は全てのエピトー
プを共有する、ＧＡＤ65のポリペプチド類似体又は誘導
体の宿主発現をコードするＤＮＡ配列の製造を提供す
る。
したことによって、本発明は、１又はそれ以上のアミノ
酸残基の種類又は位置において天然型と異なっており、
かつ天然型ポリペプチドの幾つかの又は全てのエピトー
プを共有する、ＧＡＤ65のポリペプチド類似体又は誘導
体の宿主発現をコードするＤＮＡ配列の製造を提供す
る。
【００３０】本発明の新規なＤＮＡ配列は、ＧＡＤ65に
対する自己抗体と反応することができる１又はそれ以上
のエピトープのための１次構造コンホメーションの少な
くとも一部を有するポリペプチドを、原核生物又は真核
生物宿主細胞中で発現させるのに有用な全ての配列を含
み、該ＧＡＤ65は以下のものと理解される：（ａ）図２
〜４又は図５〜８に示されるＤＮＡ配列、又はその相補
的鎖；（ｂ）（ａ）で定義したＤＮＡ配列又はその断片
とハイブリダイズするＤＮＡ配列；及び（ｃ）遺伝暗号
の縮重のために、（ａ）及び（ｂ）で定義したＤＮＡ配
列とハイブリダイズするＤＮＡ配列。特に（ｂ）で定義
したものは、ＧＡＤ65の対立遺伝子変異型をコードする
ゲノムＤＮＡ配列と理解される。（ｃ）では特に、その
ＤＮＡ配列が、無脊椎動物宿主中でのｍＲＮＡの翻訳を
容易にするコドンを導入するような、ＧＡＤ65、ＧＡＤ
65断片、及びＧＡＤ65類似体をコードするＤＮＡ配列を
製造するものと理解される。
対する自己抗体と反応することができる１又はそれ以上
のエピトープのための１次構造コンホメーションの少な
くとも一部を有するポリペプチドを、原核生物又は真核
生物宿主細胞中で発現させるのに有用な全ての配列を含
み、該ＧＡＤ65は以下のものと理解される：（ａ）図２
〜４又は図５〜８に示されるＤＮＡ配列、又はその相補
的鎖；（ｂ）（ａ）で定義したＤＮＡ配列又はその断片
とハイブリダイズするＤＮＡ配列；及び（ｃ）遺伝暗号
の縮重のために、（ａ）及び（ｂ）で定義したＤＮＡ配
列とハイブリダイズするＤＮＡ配列。特に（ｂ）で定義
したものは、ＧＡＤ65の対立遺伝子変異型をコードする
ゲノムＤＮＡ配列と理解される。（ｃ）では特に、その
ＤＮＡ配列が、無脊椎動物宿主中でのｍＲＮＡの翻訳を
容易にするコドンを導入するような、ＧＡＤ65、ＧＡＤ
65断片、及びＧＡＤ65類似体をコードするＤＮＡ配列を
製造するものと理解される。
【００３１】本発明のｃＤＮＡ配列は本質的に全てのヒ
ト又はラットＧＡＤ65分子をコードするものであるの
で、これからｃＤＮＡの小さいポリペプチド断片、又は
ヒト又はラットＧＡＤ65に対する自己抗体のための少な
くとも１個のエピトープをコードする対応するｃＤＮＡ
配列を調製し、サブクローニングし、そして発現させる
ことは今や日常的なことである。次いでクローン化ポリ
ペプチド上にこのようなエピトープが存在することを、
例えばＧＡＤ65に対する自己抗体を有する患者からの血
清を用いて確認できる。このような小さいペプチドの例
としては、ＧＡＤ65のＮ−末端からの最初の約１００ア
ミノ酸がある（図５〜８に示す）。このアミノ酸配列に
は本質的にＧＡＤ67が欠けている。
ト又はラットＧＡＤ65分子をコードするものであるの
で、これからｃＤＮＡの小さいポリペプチド断片、又は
ヒト又はラットＧＡＤ65に対する自己抗体のための少な
くとも１個のエピトープをコードする対応するｃＤＮＡ
配列を調製し、サブクローニングし、そして発現させる
ことは今や日常的なことである。次いでクローン化ポリ
ペプチド上にこのようなエピトープが存在することを、
例えばＧＡＤ65に対する自己抗体を有する患者からの血
清を用いて確認できる。このような小さいペプチドの例
としては、ＧＡＤ65のＮ−末端からの最初の約１００ア
ミノ酸がある（図５〜８に示す）。このアミノ酸配列に
は本質的にＧＡＤ67が欠けている。
【００３２】本発明のＧＡＤ65はイムノアッセイに用い
るのに特に適しており、液相又は固相担体に結合して使
用できる。更に、これらのアッセイに用いるＧＡＤ65は
各種の方法で検出できるように標識することができる。
るのに特に適しており、液相又は固相担体に結合して使
用できる。更に、これらのアッセイに用いるＧＡＤ65は
各種の方法で検出できるように標識することができる。
【００３３】本発明のＧＡＤ65を用いるイムノアッセイ
の例としては、直接又は間接法における、競合的又は非
競合的イムノアッセイがある。このようなイムノアッセ
イの例としては、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、サ
ンドイッチイムノアッセイ及びウェスタンブロットアッ
セイがある。本発明のＧＡＤ65と結合する抗体の検出
は、生理学的サンプルでの免疫組織化学的アッセイを含
む、順相、逆相、又は同時モードのいずれかで行うイム
ノアッセイを用いて実施することができる。用いるＧＡ
Ｄ65の濃度は、イムノアッセイのタイプ及び使用する検
出可能な標識の性質に依って変化する。しかしながら、
どのようなタイプのイムノアッセイを用いるにせよ、使
用するＧＡＤ65の濃度は定法を用いて、当業者には容易
に決定できる。
の例としては、直接又は間接法における、競合的又は非
競合的イムノアッセイがある。このようなイムノアッセ
イの例としては、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、サ
ンドイッチイムノアッセイ及びウェスタンブロットアッ
セイがある。本発明のＧＡＤ65と結合する抗体の検出
は、生理学的サンプルでの免疫組織化学的アッセイを含
む、順相、逆相、又は同時モードのいずれかで行うイム
ノアッセイを用いて実施することができる。用いるＧＡ
Ｄ65の濃度は、イムノアッセイのタイプ及び使用する検
出可能な標識の性質に依って変化する。しかしながら、
どのようなタイプのイムノアッセイを用いるにせよ、使
用するＧＡＤ65の濃度は定法を用いて、当業者には容易
に決定できる。
【００３４】本発明のＧＡＤ65は多くの種類の担体と結
合させて、このポリペプチドと特異的に反応する抗体の
存在を検出することができる。よく知られた担体の例と
しては、ガラス、ポリスチレン、塩化ポリビニル、ポリ
プロピレン、ポリエチレン、ポリカーボネート、デキス
トラン、ナイロン、アミロース、天然及び修飾セルロー
ス、ポリアクリルアミド、アガロース、及びマグネタイ
トがある。担体の性質は本発明の目的のためには可溶性
又は不溶性のいずれであってもよい。当業者はＧＡＤ65
と結合するためのその他の適当な担体を知ることができ
るし、また定法によってこれを確認することができる。
合させて、このポリペプチドと特異的に反応する抗体の
存在を検出することができる。よく知られた担体の例と
しては、ガラス、ポリスチレン、塩化ポリビニル、ポリ
プロピレン、ポリエチレン、ポリカーボネート、デキス
トラン、ナイロン、アミロース、天然及び修飾セルロー
ス、ポリアクリルアミド、アガロース、及びマグネタイ
トがある。担体の性質は本発明の目的のためには可溶性
又は不溶性のいずれであってもよい。当業者はＧＡＤ65
と結合するためのその他の適当な担体を知ることができ
るし、また定法によってこれを確認することができる。
【００３５】多くの異なる標識及び標識法が当業者には
公知である。本発明に使用できる標識のタイプの例とし
ては、酵素、放射性同位体、コロイド金属、蛍光化合
物、化学発光化合物、及び生物的発光化合物がある。
公知である。本発明に使用できる標識のタイプの例とし
ては、酵素、放射性同位体、コロイド金属、蛍光化合
物、化学発光化合物、及び生物的発光化合物がある。
【００３６】更に、本発明のポリペプチドはＧＡＤ酵素
活性を測定することによって、ＧＡＤ65に対する抗体を
検出することができる。例えば、ＧＡＤ65と、ＧＡＤ65
に対する抗体を有している疑いのある標本とを、一定期
間、ＧＡＤ65と抗体との間に結合を起こさせるに十分な
条件下にインキュベーションする。反応生成物を沈殿化
して、このＧＡＤ酵素活性を試験する。
活性を測定することによって、ＧＡＤ65に対する抗体を
検出することができる。例えば、ＧＡＤ65と、ＧＡＤ65
に対する抗体を有している疑いのある標本とを、一定期
間、ＧＡＤ65と抗体との間に結合を起こさせるに十分な
条件下にインキュベーションする。反応生成物を沈殿化
して、このＧＡＤ酵素活性を試験する。
【００３７】本発明の目的のためには、本発明のＧＡＤ
65と結合する抗体は、各種の生物的液体及び組織中に存
在する。検出可能な量のＧＡＤ65に対する抗体を含むい
かなるサンプルも用いることができる。普通、サンプル
は尿、唾液、脳脊髄液、血液、血清などの液体である
か、或いは組織、糞などの固体又は半固体である。
65と結合する抗体は、各種の生物的液体及び組織中に存
在する。検出可能な量のＧＡＤ65に対する抗体を含むい
かなるサンプルも用いることができる。普通、サンプル
は尿、唾液、脳脊髄液、血液、血清などの液体である
か、或いは組織、糞などの固体又は半固体である。
【００３８】本発明のアッセイに用いる物質は、そのま
まキットの製造にも適している。このようなキットは、
バイアル、チューブなどの１又はそれ以上の容器手段を
密に閉じ込めるために仕切られた担体手段を含み、該容
器手段の各々はこの方法で使用する別々の要素のうちの
１つを含む。例えば、容器手段のうちの１つは担体と結
合したＧＡＤ65を含む。第２の容器は可溶化、検出可能
な第２の抗体を凍結乾燥又は溶液の形で含む。
まキットの製造にも適している。このようなキットは、
バイアル、チューブなどの１又はそれ以上の容器手段を
密に閉じ込めるために仕切られた担体手段を含み、該容
器手段の各々はこの方法で使用する別々の要素のうちの
１つを含む。例えば、容器手段のうちの１つは担体と結
合したＧＡＤ65を含む。第２の容器は可溶化、検出可能
な第２の抗体を凍結乾燥又は溶液の形で含む。
【００３９】更に、担体手段はまた複数の容器を含み、
各容器は異なる、所定量のＧＡＤ65を含む。次いでこの
後者の容器を用いて標準曲線を描き、これに未知の量の
ＧＡＤ65に対する自己抗体を含むサンプルから得られた
結果を挿入する。
各容器は異なる、所定量のＧＡＤ65を含む。次いでこの
後者の容器を用いて標準曲線を描き、これに未知の量の
ＧＡＤ65に対する自己抗体を含むサンプルから得られた
結果を挿入する。
【００４０】キットを使用するに当たって使用者がしな
ければならないことは、測定可能であるが、未知の量の
ＧＡＤ65に対する自己抗体を含む、あらかじめ測定した
量の検出用サンプルと、第１の容器中に存在するあらか
じめ測定した量の担体結合したＧＡＤ65と、第２の容器
中に存在するあらかじめ測定した量の検出可能な標識化
第２抗体とを容器に加えることである。若しくは、検出
不能な標識化ＧＡＤ65を容器に付けて提供し、これにサ
ンプルと、検出可能な標識化第２抗体とを加えることも
できる。適当な時間インキュベーションした後、免疫複
合体が形成され、これを上清液から分離し、免疫複合体
又は上清液を、放射能カウントするか、又は酵素基質を
加えて発色させるなどによって検出する。
ければならないことは、測定可能であるが、未知の量の
ＧＡＤ65に対する自己抗体を含む、あらかじめ測定した
量の検出用サンプルと、第１の容器中に存在するあらか
じめ測定した量の担体結合したＧＡＤ65と、第２の容器
中に存在するあらかじめ測定した量の検出可能な標識化
第２抗体とを容器に加えることである。若しくは、検出
不能な標識化ＧＡＤ65を容器に付けて提供し、これにサ
ンプルと、検出可能な標識化第２抗体とを加えることも
できる。適当な時間インキュベーションした後、免疫複
合体が形成され、これを上清液から分離し、免疫複合体
又は上清液を、放射能カウントするか、又は酵素基質を
加えて発色させるなどによって検出する。
【００４１】”改良する（ａｍｅｌｉｏｒａｔｅ）”の
語は、患者が受け取る治療において自己免疫応答の有害
な効果を減少することを意味する。”治療的に有効な”
の語は、使用するＧＡＤ65ポリペプチドの量が自己免疫
応答による疾患誘発を改良するのに十分な量であること
を意味する。
語は、患者が受け取る治療において自己免疫応答の有害
な効果を減少することを意味する。”治療的に有効な”
の語は、使用するＧＡＤ65ポリペプチドの量が自己免疫
応答による疾患誘発を改良するのに十分な量であること
を意味する。
【００４２】本発明の組み換えＧＡＤ65ポリペプチド
は、ＧＡＤ65に対する自己免疫応答を有する患者の治療
に用いることもできる。このような治療は、例えば、組
み換えＧＡＤ65ポリペプチドを投与することによって実
施できる。このような投与には非標識化又は標識化ＧＡ
Ｄ65ポリペプチドを用いることができる。非標識化ＧＡ
Ｄ65ポリペプチドを用いるのが有利な場合には、例え
ば、免疫応答を刺激するには小さすぎるが、自己免疫応
答の継続を束縛したりブロックしたりするには十分大き
い断片の形でＧＡＤ65ポリペプチドを投与する。例え
ば、ＧＡＤ65をエピトープーサイズのペプチド（典型的
には５−１２アミノ酸の長さ）に酵素的に消化して、自
己免疫疾患を有する患者の体液中、又は免疫細胞の表面
上に存在するＦａｂ結合部分に結合させる。
は、ＧＡＤ65に対する自己免疫応答を有する患者の治療
に用いることもできる。このような治療は、例えば、組
み換えＧＡＤ65ポリペプチドを投与することによって実
施できる。このような投与には非標識化又は標識化ＧＡ
Ｄ65ポリペプチドを用いることができる。非標識化ＧＡ
Ｄ65ポリペプチドを用いるのが有利な場合には、例え
ば、免疫応答を刺激するには小さすぎるが、自己免疫応
答の継続を束縛したりブロックしたりするには十分大き
い断片の形でＧＡＤ65ポリペプチドを投与する。例え
ば、ＧＡＤ65をエピトープーサイズのペプチド（典型的
には５−１２アミノ酸の長さ）に酵素的に消化して、自
己免疫疾患を有する患者の体液中、又は免疫細胞の表面
上に存在するＦａｂ結合部分に結合させる。
【００４３】或いは、本発明の組み換えＧＡＤ65ポリペ
プチドは、治療剤で標識して投与することができる。こ
れらの治療剤は本発明のＧＡＤ65ポリペプチドと直接又
は間接にカップリングさせることができる。間接的カッ
プリングの一例はスペーサー部分を用いることである。
このスペーサー部分は可溶性又は不溶性であることがで
き(Diener et al., Science, 231:148, 1986) 、ターゲ
ット部分でＧＡＤ65ポリペプチドから医薬の放出をでき
るように選択される。免疫治療用に本発明のＧＡＤ65ポ
リペプチドとカップリングすることができる治療剤の例
としては、医薬、放射性同位体、レクチン、及び毒素が
ある。
プチドは、治療剤で標識して投与することができる。こ
れらの治療剤は本発明のＧＡＤ65ポリペプチドと直接又
は間接にカップリングさせることができる。間接的カッ
プリングの一例はスペーサー部分を用いることである。
このスペーサー部分は可溶性又は不溶性であることがで
き(Diener et al., Science, 231:148, 1986) 、ターゲ
ット部分でＧＡＤ65ポリペプチドから医薬の放出をでき
るように選択される。免疫治療用に本発明のＧＡＤ65ポ
リペプチドとカップリングすることができる治療剤の例
としては、医薬、放射性同位体、レクチン、及び毒素が
ある。
【００４４】本発明のＧＡＤ65ポリペプチドと結合する
ことができる医薬には、マイトマイシンＣ、ダウノルビ
シン、及びビンブラスチンのような古典的に医薬と呼ば
れていたものを含む。
ことができる医薬には、マイトマイシンＣ、ダウノルビ
シン、及びビンブラスチンのような古典的に医薬と呼ば
れていたものを含む。
【００４５】免疫治療用に放射性同位体と結合した本発
明のＧＡＤ65ポリペプチドを使用する際には、白血球の
分布、安定性及び放射のような要因に依って、ある同位
体が他の同位体よりも好ましいことがある。自己免疫応
答に依って、ある放射体が他のものよりも好ましいこと
がある。一般に、免疫治療ではα及びβ粒子放射性の放
射性同位体が好ましい。 212Ｂｉのような近距離、高エ
ネルギーのα放射体が好ましい。本発明のＧＡＤ65ポリ
ペプチドと結合することができる放射性同位体の例とし
ては、 125Ｉ， 131Ｉ，90Ｙ，67Ｃｕ， 212Ｂｉ， 211
Ａｔ， 212Ｐｂ，47Ｓｃ， 109Ｐｄ及び 188Ｒｅがあ
る。
明のＧＡＤ65ポリペプチドを使用する際には、白血球の
分布、安定性及び放射のような要因に依って、ある同位
体が他の同位体よりも好ましいことがある。自己免疫応
答に依って、ある放射体が他のものよりも好ましいこと
がある。一般に、免疫治療ではα及びβ粒子放射性の放
射性同位体が好ましい。 212Ｂｉのような近距離、高エ
ネルギーのα放射体が好ましい。本発明のＧＡＤ65ポリ
ペプチドと結合することができる放射性同位体の例とし
ては、 125Ｉ， 131Ｉ，90Ｙ，67Ｃｕ， 212Ｂｉ， 211
Ａｔ， 212Ｐｂ，47Ｓｃ， 109Ｐｄ及び 188Ｒｅがあ
る。
【００４６】レクチンは通常植物から単離されるタンパ
ク質であって、特定の糖部分と結合する。多くのレクチ
ンが細胞を凝集させ、リンパ球を刺激することができ
る。しかし、リシン（ｒｉｃｉｎ）は免疫治療に用いら
れてきた毒性レクチンである。これは、毒性の原因であ
るリシンのαーペプチド鎖を、抗体分子と結合させて、
毒性効果を特異的に配給することによって達成できる。
ク質であって、特定の糖部分と結合する。多くのレクチ
ンが細胞を凝集させ、リンパ球を刺激することができ
る。しかし、リシン（ｒｉｃｉｎ）は免疫治療に用いら
れてきた毒性レクチンである。これは、毒性の原因であ
るリシンのαーペプチド鎖を、抗体分子と結合させて、
毒性効果を特異的に配給することによって達成できる。
【００４７】毒素は植物、動物、又は微生物によって産
出される毒性物質であって、十分な投与量でしばしば死
に至る。ジフテリア毒素は治療的に用い得るＣｏｒｙｎ
ｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａによって
産出される物質である。この毒素はα及びβサブユニッ
トからなっており、適当な条件下に分離できる。毒素Ａ
部分は、ＧＡＤ65ポリペプチドと結合させて、ＧＡＤ65
ポリペプチドに対するリセプターを発現する白血球への
部分特異的な配給に用いられる。
出される毒性物質であって、十分な投与量でしばしば死
に至る。ジフテリア毒素は治療的に用い得るＣｏｒｙｎ
ｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａによって
産出される物質である。この毒素はα及びβサブユニッ
トからなっており、適当な条件下に分離できる。毒素Ａ
部分は、ＧＡＤ65ポリペプチドと結合させて、ＧＡＤ65
ポリペプチドに対するリセプターを発現する白血球への
部分特異的な配給に用いられる。
【００４８】本発明のＧＡＤ65ポリペプチドとカップリ
ングすることができるその他の治療剤は、ｅｘ ｖｉｖ
ｏ及びｉｎ ｖｉｖｏの治療法共に、公知であり、又は
当業者によって容易に確認できる。
ングすることができるその他の治療剤は、ｅｘ ｖｉｖ
ｏ及びｉｎ ｖｉｖｏの治療法共に、公知であり、又は
当業者によって容易に確認できる。
【００４９】本発明はまた、この疾患を有する患者、又
は有する危険のある患者における疾患過程を改良するた
めに治療的に投与するすることのできるポリペプチドに
関する。各種アミノ酸を表すために用いる便宜的な一字
の記号は以下の通りである： Ｐｈｅ：Ｆ Ｌｅｕ：Ｌ Ｉｌｅ：Ｉ Ｍｅｔ：
Ｍ Ｖａｌ：Ｖ Ｓｅｒ：Ｓ Ｐｒｏ：Ｐ Ｔｈｒ：
Ｔ Ａｌａ：Ａ Ｔｒｙ：Ｙ Ｈｉｓ：Ｈ Ｇｌｎ：
Ｑ Ａｓｎ：Ｎ Ｌｙｓ：Ｋ Ａｓｐ：Ｄ Ｇｌｕ：
Ｅ Ｃｙｓ：Ｃ Ｔｒｐ：Ｗ Ａｒｇ：Ｒ Ｇｌｙ：
Ｇ
は有する危険のある患者における疾患過程を改良するた
めに治療的に投与するすることのできるポリペプチドに
関する。各種アミノ酸を表すために用いる便宜的な一字
の記号は以下の通りである： Ｐｈｅ：Ｆ Ｌｅｕ：Ｌ Ｉｌｅ：Ｉ Ｍｅｔ：
Ｍ Ｖａｌ：Ｖ Ｓｅｒ：Ｓ Ｐｒｏ：Ｐ Ｔｈｒ：
Ｔ Ａｌａ：Ａ Ｔｒｙ：Ｙ Ｈｉｓ：Ｈ Ｇｌｎ：
Ｑ Ａｓｎ：Ｎ Ｌｙｓ：Ｋ Ａｓｐ：Ｄ Ｇｌｕ：
Ｅ Ｃｙｓ：Ｃ Ｔｒｐ：Ｗ Ａｒｇ：Ｒ Ｇｌｙ：
Ｇ
【００５０】本発明のポリペプチド配列は、ヒトＧＡＤ
65、ヒトＧＡＤ67、及びピコマウィルス、コクサッキー
ウィルスのＰ２−Ｃタンパク質のアミノ酸配列を比較す
ることによって同定された。Ｐ２−Ｃポリヌクレオチド
は複製複合体と結合したウィルス膜中で一定の役割を演
じている。これらの分析によって、いずれのＧＡＤ65分
子とコクサッキーウィルスとの間にも広範な配列類似性
のあることが明らかとなった。ＧＡＤ65とＰ２−Ｃポリ
ペプチドの６個の隣接するアミノ酸残基からなる中心ポ
リペプチドは、そのアミノ酸配列が同一である。実際、
ポリペプチド中の２４アミノ酸のうち、１９個が同一で
あるか、又は保存されている(conserved) 。更に、高電
荷密度と、この領域に高い抗原性を与えているプロリン
残基の存在がある（表１）。
65、ヒトＧＡＤ67、及びピコマウィルス、コクサッキー
ウィルスのＰ２−Ｃタンパク質のアミノ酸配列を比較す
ることによって同定された。Ｐ２−Ｃポリヌクレオチド
は複製複合体と結合したウィルス膜中で一定の役割を演
じている。これらの分析によって、いずれのＧＡＤ65分
子とコクサッキーウィルスとの間にも広範な配列類似性
のあることが明らかとなった。ＧＡＤ65とＰ２−Ｃポリ
ペプチドの６個の隣接するアミノ酸残基からなる中心ポ
リペプチドは、そのアミノ酸配列が同一である。実際、
ポリペプチド中の２４アミノ酸のうち、１９個が同一で
あるか、又は保存されている(conserved) 。更に、高電
荷密度と、この領域に高い抗原性を与えているプロリン
残基の存在がある（表１）。
【００５１】
【表１】 表１において、実線は同一のアミノ酸を囲み、破線は類
似の電荷、極性、又は疎水性を有するアミノ酸残基を囲
む。
似の電荷、極性、又は疎水性を有するアミノ酸残基を囲
む。
【００５２】この共通のポリペプチド領域の発見は、糖
尿病の促進における”分子擬態（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
ｍｉｍｉｃｒｙ）”にとっての病原学的役割を裏付け
る。かくして、遺伝的にＩＤＤＭの疑いのある患者はコ
クサッキーウィルスで感染され、コクサッキーウィルス
ポリペプチドに対する免疫応答は、患者のβー細胞中の
類似のＧＡＤ配列に対する交差反応的免疫応答という結
果をもたらす。抗原的に類似のＧＡＤポリペプチドによ
って免疫応答は維持され、その結果βー細胞が実際に破
壊されて、次いでＩＤＤＭを呈するようになる。
尿病の促進における”分子擬態（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
ｍｉｍｉｃｒｙ）”にとっての病原学的役割を裏付け
る。かくして、遺伝的にＩＤＤＭの疑いのある患者はコ
クサッキーウィルスで感染され、コクサッキーウィルス
ポリペプチドに対する免疫応答は、患者のβー細胞中の
類似のＧＡＤ配列に対する交差反応的免疫応答という結
果をもたらす。抗原的に類似のＧＡＤポリペプチドによ
って免疫応答は維持され、その結果βー細胞が実際に破
壊されて、次いでＩＤＤＭを呈するようになる。
【００５３】現在のところ、膵臓β−細胞の消失は細胞
の自己免疫応答によって仲介されると信じられている。
その結果、本発明のポリペプチドはこのようになされる
細胞性の自己免疫応答をブロックする能力を有している
はずである。自己免疫疾患の複雑さのために、本発明の
ポリペプチドをこのような疾患の改良のために用いるこ
とのできる多くの治療様式を企画することが可能であ
る。従って、抗原提供細胞（ａｎｔｉｇｅｎ ｐｒｅｓ
ｅｎｔｉｎｇ ｃｅｌｌ：ＡＰＣ）表面上の自己免疫抗
原を提供する特定のＴ細胞リセプター（ＴＣＲ）又はＭ
ＨＣリセプターによる認識をブロックするために、本発
明のポリペプチドを用いることが可能である。例えば、
患者に本発明のポリペプチドを与えて、これがＭＨＣリ
セプターの抗原の裂け目(cleft) に存在している自己免
疫抗原と置き換わることによって、或いはＴ−ヘルパー
細胞の表面上の適当なＴＣＲとの直接的相互作用によっ
て、このような認識の阻害が起きるのかも知れない。こ
の後者のＴＣＲとの直接的相互作用による治療の試み
は、高濃度の可溶性ポリペプチドを用いることによる大
領域寛容(high-zone tolerance) の誘導によって達成す
ることができる。
の自己免疫応答によって仲介されると信じられている。
その結果、本発明のポリペプチドはこのようになされる
細胞性の自己免疫応答をブロックする能力を有している
はずである。自己免疫疾患の複雑さのために、本発明の
ポリペプチドをこのような疾患の改良のために用いるこ
とのできる多くの治療様式を企画することが可能であ
る。従って、抗原提供細胞（ａｎｔｉｇｅｎ ｐｒｅｓ
ｅｎｔｉｎｇ ｃｅｌｌ：ＡＰＣ）表面上の自己免疫抗
原を提供する特定のＴ細胞リセプター（ＴＣＲ）又はＭ
ＨＣリセプターによる認識をブロックするために、本発
明のポリペプチドを用いることが可能である。例えば、
患者に本発明のポリペプチドを与えて、これがＭＨＣリ
セプターの抗原の裂け目(cleft) に存在している自己免
疫抗原と置き換わることによって、或いはＴ−ヘルパー
細胞の表面上の適当なＴＣＲとの直接的相互作用によっ
て、このような認識の阻害が起きるのかも知れない。こ
の後者のＴＣＲとの直接的相互作用による治療の試み
は、高濃度の可溶性ポリペプチドを用いることによる大
領域寛容(high-zone tolerance) の誘導によって達成す
ることができる。
【００５４】若しくは、本発明のポリペプチドは、自己
認識を修復し、それによって自己免疫疾患を改良するた
めにＴ−サプレッサー細胞集団を刺激するために用いる
ことができる。Ｔ−サプレッサー細胞集団の刺激は、例
えば、ＭＨＣIIリセプターの裂け目にある自己免疫抗原
上に存在するエピトープに特異的な１個の可変領域と、
ＣＤ８+ リセプター上に存在するエピトープに特異的な
第２の可変領域とを有する二特異的（ｂｉ−ｓｐｅｃｉ
ｆｉｃ）抗体を用いることによって達成できる。本発明
のポリペプチドに特異的な抗体の生産は当業者には慣用
的であり、２又はそれ以上のエピトープに特異性を有す
る二特異的抗体の生産もまた当業者には慣用的である。
認識を修復し、それによって自己免疫疾患を改良するた
めにＴ−サプレッサー細胞集団を刺激するために用いる
ことができる。Ｔ−サプレッサー細胞集団の刺激は、例
えば、ＭＨＣIIリセプターの裂け目にある自己免疫抗原
上に存在するエピトープに特異的な１個の可変領域と、
ＣＤ８+ リセプター上に存在するエピトープに特異的な
第２の可変領域とを有する二特異的（ｂｉ−ｓｐｅｃｉ
ｆｉｃ）抗体を用いることによって達成できる。本発明
のポリペプチドに特異的な抗体の生産は当業者には慣用
的であり、２又はそれ以上のエピトープに特異性を有す
る二特異的抗体の生産もまた当業者には慣用的である。
【００５５】本発明のポリペプチド類似体は抗原提供の
レベルでの自己抗原の認識と競合するようにデザインで
きる。ＭＨＣ分子は１個のペプチド結合部位を含んでい
るので、疾患−関連性ＭＨＣ分子とは高い親和性で結合
するが、疾患−誘発性Ｔ−ヘルパー細胞を活性化しない
ポリペプチドをデザインすることが可能である。このよ
うなポリペプチドは自己−抗原認識のための拮抗剤とし
て作用する。このようなアプローチの先例は、それ自体
は非−免疫原性であるマウスリゾチームポリペプチド
が、ニワトリ卵白リゾチームからの免疫原性ポリペプチ
ドとのＭＨＣの結合と競合することができ、それによっ
てこのポリペプチドによるＴ細胞活性化を減少させるこ
とができる、という観察に由来する（Adorini et al.,
Nature, 334:623-624, 1988)。同様に、有効なポリペプ
チド類似体をスクリーニングするためのこのような治療
的アプローチは、実験的自己免疫脳脊髄炎（ｅｘｐｅｒ
ｉｍｅｎｔａｌ ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ ｅｎｃｅｐｈ
ａｌｏｍｙｅｌｉｔｉｓ：ＥＡＥ）のような自己免疫疾
患に用いられてきた（Wraith et al., Cell, 59:248,19
89; Urban et al., Cell, 59:257, 1989)。
レベルでの自己抗原の認識と競合するようにデザインで
きる。ＭＨＣ分子は１個のペプチド結合部位を含んでい
るので、疾患−関連性ＭＨＣ分子とは高い親和性で結合
するが、疾患−誘発性Ｔ−ヘルパー細胞を活性化しない
ポリペプチドをデザインすることが可能である。このよ
うなポリペプチドは自己−抗原認識のための拮抗剤とし
て作用する。このようなアプローチの先例は、それ自体
は非−免疫原性であるマウスリゾチームポリペプチド
が、ニワトリ卵白リゾチームからの免疫原性ポリペプチ
ドとのＭＨＣの結合と競合することができ、それによっ
てこのポリペプチドによるＴ細胞活性化を減少させるこ
とができる、という観察に由来する（Adorini et al.,
Nature, 334:623-624, 1988)。同様に、有効なポリペプ
チド類似体をスクリーニングするためのこのような治療
的アプローチは、実験的自己免疫脳脊髄炎（ｅｘｐｅｒ
ｉｍｅｎｔａｌ ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ ｅｎｃｅｐｈ
ａｌｏｍｙｅｌｉｔｉｓ：ＥＡＥ）のような自己免疫疾
患に用いられてきた（Wraith et al., Cell, 59:248,19
89; Urban et al., Cell, 59:257, 1989)。
【００５６】本発明のポリペプチドにおけるアミノ酸を
表すために用いる一字の記号は当業者に慣用的に用いら
れているものである。”類似体”の語は、ここで提供さ
れるポリペプチドと実質的に同一なアミノ酸配列を有
し、かつその１又はそれ以上のアミノ酸が化学的に類似
したアミノ酸で置換されたポリペプチドをいう。例え
ば、グリシンやセリンのような極性アミノ酸は、他の極
性アミノ酸で置換できるし；或いはアスパラギン酸のよ
うな酸性アミノ酸は、グルタミン酸のような他の酸性ア
ミノ酸で置換できるし；或いはリシン、アルギニンやヒ
スチジンのような塩基性アミノ酸は、他の塩基性アミノ
酸で置換できるし；或いはまたアラニン、ロイシンやイ
ソロイシンのような非極性アミノ酸は、他の非極性アミ
ノ酸で置換することができる。
表すために用いる一字の記号は当業者に慣用的に用いら
れているものである。”類似体”の語は、ここで提供さ
れるポリペプチドと実質的に同一なアミノ酸配列を有
し、かつその１又はそれ以上のアミノ酸が化学的に類似
したアミノ酸で置換されたポリペプチドをいう。例え
ば、グリシンやセリンのような極性アミノ酸は、他の極
性アミノ酸で置換できるし；或いはアスパラギン酸のよ
うな酸性アミノ酸は、グルタミン酸のような他の酸性ア
ミノ酸で置換できるし；或いはリシン、アルギニンやヒ
スチジンのような塩基性アミノ酸は、他の塩基性アミノ
酸で置換できるし；或いはまたアラニン、ロイシンやイ
ソロイシンのような非極性アミノ酸は、他の非極性アミ
ノ酸で置換することができる。
【００５７】”類似体”の語はまた、本発明のポリペプ
チドから１又はそれ以上のアミノ酸が欠失されたか、或
いはこれに付加されてはいるが、このようなペプチドと
実質的に相同なアミノ酸配列を保持しているポリペプチ
ドをも意味する。実質的な配列相同とは５０％以上のい
かなる相同をもいう。”断片”の語は、少なくとも６ア
ミノ酸残基を有する、ここで同定するポリペプチドのよ
り短い形のものをいい、この断片は小島侵潤性Ｔリンパ
球（ｉｓｌｅｔ ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｎｇＴ ｌｙｍ
ｐｈｏｃｙｔｅｓ：ＩＩＴＬｓ）の増殖を刺激すること
ができるか、或いは刺激性ポリペプチド断片によるこの
ような細胞の刺激を阻害することのできる断片である。
チドから１又はそれ以上のアミノ酸が欠失されたか、或
いはこれに付加されてはいるが、このようなペプチドと
実質的に相同なアミノ酸配列を保持しているポリペプチ
ドをも意味する。実質的な配列相同とは５０％以上のい
かなる相同をもいう。”断片”の語は、少なくとも６ア
ミノ酸残基を有する、ここで同定するポリペプチドのよ
り短い形のものをいい、この断片は小島侵潤性Ｔリンパ
球（ｉｓｌｅｔ ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｎｇＴ ｌｙｍ
ｐｈｏｃｙｔｅｓ：ＩＩＴＬｓ）の増殖を刺激すること
ができるか、或いは刺激性ポリペプチド断片によるこの
ような細胞の刺激を阻害することのできる断片である。
【００５８】”化学的誘導体”の語は、本発明のポリペ
プチドに由来するいかなるポリペプチドも意味し、ここ
でポリペプチド中に存在するアミノ酸残基の側鎖官能基
の反応によって、１又はそれ以上のアミノ酸を化学的に
誘導体化したものをいう。従って、”化学的誘導体”と
は、１又はそれ以上の化学的工程によってここで同定す
る配列又はポリペプチドから誘導されるポリペプチドで
ある。このような誘導体は、例えば、遊離のアミノ基を
誘導体化してアミン塩酸塩、ｐ−トルエンスルフォアミ
ド、ベンゾキシカルボアミド、ｔ−ブチルオキシカルボ
アミド、チオウレタンー型誘導体、トリフロロアセチル
アミド、クロロアセトアミド、又はフォルムアミドを形
成するような分子を含む。遊離のカルボキシル基は誘導
体化して、塩、メチル又はエチルエステル、又はその他
の型のエステル又はヒドラジドを形成する。遊離の水酸
基は誘導体化してＯ−アシル又はＯ−アルキル誘導体を
形成する。ヒスチジンのイミダゾール窒素を誘導体化し
てＮ−ｉｍ−ベンジルヒスチジンとすることができる。
２０の標準アミノ酸の天然に起きるアミノ酸誘導体を１
又はそれ以上含むポリペプチドも化学的誘導体に含まれ
る。例えば、４−ヒドロキシプロリンはプロリンと置換
でき；５−ヒドロキシリシンはリシンと置換でき；３−
メチルヒスチジンはヒスチジンと置換でき；ホモセリン
はセリンと置換でき、そしてオルニチンはリシンと置換
できる。
プチドに由来するいかなるポリペプチドも意味し、ここ
でポリペプチド中に存在するアミノ酸残基の側鎖官能基
の反応によって、１又はそれ以上のアミノ酸を化学的に
誘導体化したものをいう。従って、”化学的誘導体”と
は、１又はそれ以上の化学的工程によってここで同定す
る配列又はポリペプチドから誘導されるポリペプチドで
ある。このような誘導体は、例えば、遊離のアミノ基を
誘導体化してアミン塩酸塩、ｐ−トルエンスルフォアミ
ド、ベンゾキシカルボアミド、ｔ−ブチルオキシカルボ
アミド、チオウレタンー型誘導体、トリフロロアセチル
アミド、クロロアセトアミド、又はフォルムアミドを形
成するような分子を含む。遊離のカルボキシル基は誘導
体化して、塩、メチル又はエチルエステル、又はその他
の型のエステル又はヒドラジドを形成する。遊離の水酸
基は誘導体化してＯ−アシル又はＯ−アルキル誘導体を
形成する。ヒスチジンのイミダゾール窒素を誘導体化し
てＮ−ｉｍ−ベンジルヒスチジンとすることができる。
２０の標準アミノ酸の天然に起きるアミノ酸誘導体を１
又はそれ以上含むポリペプチドも化学的誘導体に含まれ
る。例えば、４−ヒドロキシプロリンはプロリンと置換
でき；５−ヒドロキシリシンはリシンと置換でき；３−
メチルヒスチジンはヒスチジンと置換でき；ホモセリン
はセリンと置換でき、そしてオルニチンはリシンと置換
できる。
【００５９】本発明は表１に示される例示的ポリペプチ
ドに限定されるものではなく、むしろ、あるポリペプチ
ドの実質的部分がコクサッキーウィルスＰ２−Ｃのアミ
ノ酸２８とアミノ酸５０との間の領域、ＧＡＤ65のアミ
ノ酸２５０とアミノ酸２７３との間の領域、又はＧＡＤ
67のアミノ酸２５８とアミノ酸２８１との間の領域から
のアミノ酸配列、又はそのセグメント、又はその組み合
わせによって特徴付けられるものである限り、そして該
ポリペプチドが自己免疫疾患に対して所望の免疫学的又
は生物学的活性を示すものである限り、本発明の範囲に
入るポリペプチドは上記の領域を越えて伸びるか、或い
はこれよりも少ないものからなることができる。更に、
本発明のポリペプチドは、そのようなポリペプチドが表
１に示すアミノ酸領域から実質的になっており、かつ免
疫学的又は生物学的活性を示すものである限り、表１に
示すポリペプチドのアミノ酸配列よりも長いか、或いは
短いアミノ酸配列、又はそのセグメント又はその組み合
わせからなるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含
む。更に、本発明のポリペプチドは、表１のＧＡＤ65ポ
リペプチドのアミノ酸配列よりも長いか、或いは短いア
ミノ酸配列、又は該ポリペプチドのセグメントからなる
アミノ酸配列で特徴付けられるポリペプチドであって、
自己免疫疾患に対する免疫学的又は生物学的活性を示す
ポリペプチドを含む。本発明のポリペプチドは全て、自
己免疫疾患を刺激したり、或いは増強するものであって
はならない。
ドに限定されるものではなく、むしろ、あるポリペプチ
ドの実質的部分がコクサッキーウィルスＰ２−Ｃのアミ
ノ酸２８とアミノ酸５０との間の領域、ＧＡＤ65のアミ
ノ酸２５０とアミノ酸２７３との間の領域、又はＧＡＤ
67のアミノ酸２５８とアミノ酸２８１との間の領域から
のアミノ酸配列、又はそのセグメント、又はその組み合
わせによって特徴付けられるものである限り、そして該
ポリペプチドが自己免疫疾患に対して所望の免疫学的又
は生物学的活性を示すものである限り、本発明の範囲に
入るポリペプチドは上記の領域を越えて伸びるか、或い
はこれよりも少ないものからなることができる。更に、
本発明のポリペプチドは、そのようなポリペプチドが表
１に示すアミノ酸領域から実質的になっており、かつ免
疫学的又は生物学的活性を示すものである限り、表１に
示すポリペプチドのアミノ酸配列よりも長いか、或いは
短いアミノ酸配列、又はそのセグメント又はその組み合
わせからなるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含
む。更に、本発明のポリペプチドは、表１のＧＡＤ65ポ
リペプチドのアミノ酸配列よりも長いか、或いは短いア
ミノ酸配列、又は該ポリペプチドのセグメントからなる
アミノ酸配列で特徴付けられるポリペプチドであって、
自己免疫疾患に対する免疫学的又は生物学的活性を示す
ポリペプチドを含む。本発明のポリペプチドは全て、自
己免疫疾患を刺激したり、或いは増強するものであって
はならない。
【００６０】従って、本発明のポリペプチドの中からい
ずれか１個のポリペプチドを特定して選択することは過
度の実験を含むものではない。多数のポリペプチドを調
製して、自己免疫疾患の改善におけるその免疫学的及び
生物学的活性を試験することによって、かかる選択を行
うことができる。糖尿病を改善することのできる本発明
のポリペプチドをスクリーニングするためには、ＮＯＤ
マウスが優秀でかつよく特徴付けられたモデルを提供し
てくれる。
ずれか１個のポリペプチドを特定して選択することは過
度の実験を含むものではない。多数のポリペプチドを調
製して、自己免疫疾患の改善におけるその免疫学的及び
生物学的活性を試験することによって、かかる選択を行
うことができる。糖尿病を改善することのできる本発明
のポリペプチドをスクリーニングするためには、ＮＯＤ
マウスが優秀でかつよく特徴付けられたモデルを提供し
てくれる。
【００６１】本発明のポリペプチドは、組み換え法、又
は固体支持体上での合成を含む公知のポリペプチド合成
法を用いる慣用的合成法によって生産することができ
る。適当な固相合成法の例は、Merriweather, J.Am.Che
m.Soc., 85:2149, 1963 に記載されている。その他のポ
リペプチド合成法は、例えば、Bodanszky et al., Pept
ide Synthesis, John Wiley & Sons, 2d ed., 1976 及
び当業者に公知のその他の文献に記載されているポリペ
プチド合成法の要約は、Stewart et al., SolidPhase P
eptide Synthesis, Pierce Chemical Company,Inc., Ro
ckford, III., 1984 に記載されている。例えば、The P
roteins, Vol. II, 3d ed., Neurath etal., eds., 10
5, Academic Press, New York, NY, 1976 に記載され
ている溶液法によるポリペプチド合成を使用してもよ
い。このような合成で使用する保護基は、上記の文献に
記載されているが、また J.McOmie, Protective Groups
in Organic Chemistry, Plenum Press, New York, NY,
1973 にも記載されている。
は固体支持体上での合成を含む公知のポリペプチド合成
法を用いる慣用的合成法によって生産することができ
る。適当な固相合成法の例は、Merriweather, J.Am.Che
m.Soc., 85:2149, 1963 に記載されている。その他のポ
リペプチド合成法は、例えば、Bodanszky et al., Pept
ide Synthesis, John Wiley & Sons, 2d ed., 1976 及
び当業者に公知のその他の文献に記載されているポリペ
プチド合成法の要約は、Stewart et al., SolidPhase P
eptide Synthesis, Pierce Chemical Company,Inc., Ro
ckford, III., 1984 に記載されている。例えば、The P
roteins, Vol. II, 3d ed., Neurath etal., eds., 10
5, Academic Press, New York, NY, 1976 に記載され
ている溶液法によるポリペプチド合成を使用してもよ
い。このような合成で使用する保護基は、上記の文献に
記載されているが、また J.McOmie, Protective Groups
in Organic Chemistry, Plenum Press, New York, NY,
1973 にも記載されている。
【００６２】本発明のポリペプチドは所望のポリペプチ
ドをコードするＤＮＡ配列で形質転換した適当な宿主中
で生産することもできる。例えば、あらかじめ形質転換
されており、かつ該ポリペプチドをコードするＤＮＡ配
列を発現する適当な宿主を発酵させることによってポリ
ペプチドを生産できる。若しくは、本発明のポリペプチ
ドのいくつかをコードするＤＮＡ配列を連結し、次いで
これらの配列を用いて自己免疫疾患に関与するポリペプ
チドを発現できるような適当な宿主を形質転換する。
ドをコードするＤＮＡ配列で形質転換した適当な宿主中
で生産することもできる。例えば、あらかじめ形質転換
されており、かつ該ポリペプチドをコードするＤＮＡ配
列を発現する適当な宿主を発酵させることによってポリ
ペプチドを生産できる。若しくは、本発明のポリペプチ
ドのいくつかをコードするＤＮＡ配列を連結し、次いで
これらの配列を用いて自己免疫疾患に関与するポリペプ
チドを発現できるような適当な宿主を形質転換する。
【００６３】本発明のＧＡＤ65ポリペプチドの投与量
は、自己免疫応答の症状又は細胞破壊が改善されるよう
な所望の効果を生じるのに十分な量である。投与量は、
好ましくない交差反応や、アナフィラキシー反応（過敏
症）などの副作用を引き起こす程大きいものであっては
ならない。一般に、投与量は年齢、症状、性別、及び患
者の病気の重症度によって変化し、当業者によって決定
される。万一何か好ましくない症状があった場合には、
投与量は個々の医師により調節される。投与量は、１回
の投与当たり、約０．１ｍｇ／ｍ2 から約２０００ｍｇ
／ｍ2 まで、好ましくは約０．１ｍｇ／ｍ2 から約５０
０ｍｇ／ｍ2 までで、１日に１回又は数回、１日又は数
日間投与する。
は、自己免疫応答の症状又は細胞破壊が改善されるよう
な所望の効果を生じるのに十分な量である。投与量は、
好ましくない交差反応や、アナフィラキシー反応（過敏
症）などの副作用を引き起こす程大きいものであっては
ならない。一般に、投与量は年齢、症状、性別、及び患
者の病気の重症度によって変化し、当業者によって決定
される。万一何か好ましくない症状があった場合には、
投与量は個々の医師により調節される。投与量は、１回
の投与当たり、約０．１ｍｇ／ｍ2 から約２０００ｍｇ
／ｍ2 まで、好ましくは約０．１ｍｇ／ｍ2 から約５０
０ｍｇ／ｍ2 までで、１日に１回又は数回、１日又は数
日間投与する。
【００６４】本発明のＧＡＤ65ポリペプチドは、注射又
は時間をかけた勾配還流によって非経口的に投与され
る。本発明のＧＡＤ65ポリペプチドは、静脈内、腹腔
内、筋肉内、皮下、空洞内、又は経皮的に投与される。
は時間をかけた勾配還流によって非経口的に投与され
る。本発明のＧＡＤ65ポリペプチドは、静脈内、腹腔
内、筋肉内、皮下、空洞内、又は経皮的に投与される。
【００６５】非経口的投与のための製剤は、滅菌水性、
又は非水性溶液、懸濁液、及びエマルジョンを含む。非
水性溶媒の例としては、プロピレングリコール、ポリエ
チレングリコール、オリーブ油のような植物油、及びエ
チルオレエートのような注射可能な有機エステルがあ
る。水性担体は、食塩水及び緩衝液を含む、水、アルコ
ール／水性溶液、エマルジョン、又は懸濁液を含む。非
経口的担体は、塩化ナトリウム溶液、リンガーのデキス
トロース、デキストロース及び塩化ナトリウム、乳酸化
リンガー液、又は固定油(fixed oil) を含む。静脈内担
体は、液体及び栄養補充物、電解補充物（リンガーのデ
キストロースに基づくようなもの）などを含む。保存
料、及びその他の添加物、例えば抗微生物剤、抗酸化
剤、キレート剤、及び不活性ガスなども存在する。
又は非水性溶液、懸濁液、及びエマルジョンを含む。非
水性溶媒の例としては、プロピレングリコール、ポリエ
チレングリコール、オリーブ油のような植物油、及びエ
チルオレエートのような注射可能な有機エステルがあ
る。水性担体は、食塩水及び緩衝液を含む、水、アルコ
ール／水性溶液、エマルジョン、又は懸濁液を含む。非
経口的担体は、塩化ナトリウム溶液、リンガーのデキス
トロース、デキストロース及び塩化ナトリウム、乳酸化
リンガー液、又は固定油(fixed oil) を含む。静脈内担
体は、液体及び栄養補充物、電解補充物（リンガーのデ
キストロースに基づくようなもの）などを含む。保存
料、及びその他の添加物、例えば抗微生物剤、抗酸化
剤、キレート剤、及び不活性ガスなども存在する。
【００６６】本発明はまた、本発明のＧＡＤ65ポリペプ
チドを含む医薬、又は医薬組成物の製造法にも関し、該
医薬はＧＡＤ65に対する自己免疫応答の治療に使用す
る。
チドを含む医薬、又は医薬組成物の製造法にも関し、該
医薬はＧＡＤ65に対する自己免疫応答の治療に使用す
る。
【００６７】上記の記載は本発明を一般的に述べたもの
である。以下の特定の実施例を参照することによって、
より完全な理解が得られるが、ここで述べる実施例は説
明のためのみになされるものであり、本発明の範囲を限
定するものではない。
である。以下の特定の実施例を参照することによって、
より完全な理解が得られるが、ここで述べる実施例は説
明のためのみになされるものであり、本発明の範囲を限
定するものではない。
【００６８】
【実施例】実施例１ ＧＡＤ65のクローニング及び発現 Ａ．組み換えＤＮＡ手法 ＧＡＤ65及びＧＡＤ67に特異的なｃＤＮＡプローブを得
るために、Chirgwin et al., Biochemistry, 18:5294,
1979の方法を用いて、成熟ラットの脳から、グアニジン
イソチオシアネートーセシウムグラジエントによって、
全ＲＮＡを抽出した。Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅｓｅａｒ
ｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（ＢＲＬ社）による実
験計画書を用いて、ポリ（Ａ）ＲＮＡをオリゴｄＴセル
ロース上で精製した。ポリｄ（Ｎ6 ）−ｍｅｒｓ（Ｐｈ
ａｒｍａｃｉａ社製）をプライマーとして用いた以外
は、指示された条件を用いて、ＭＭＬＶ−逆転写酵素
（ＢＲＬ社製）を用いて一本鎖合成を行った。このｃＤ
ＮＡ−ＲＮＡ混合物を６５℃で１５分間加熱して不活性
化して、−２０℃に貯蔵した。ＰＣＲのためには、サン
プルの１／５０を反応物１００μｌに加えた。ネコ（ｃ
ＤＮＡから）（Kobayashi et al., J.Neurosci., 7:276
8, 1987) 及びラット（ペプチドから）（Changand Got
tlieb, J.Neurosci., 8:2123, 1988) ＧＡＤ（図１）
の下線を施した共通のアミノ酸配列をコードするために
変性（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ）オリゴヌクレオチドを合
成した（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）。各
変性オリゴヌクレオチドの５’末端配列は、ＳｓｔI 及
びＨｉｎｄIII （５’末端オリゴ）又はＳｓｔI 及びＳ
ｓｔII（３’末端オリゴ）のいずれかによって認識され
るＤＮＡ配列の１本鎖を含む。これらのプライマーを用
いて、Gould et al., Proc.Natl.Acad.Sci.,USA, 86:19
34, 1989 に記載されたように、生じたｃＤＮＡ鋳型の
ポリメラーゼ鎖反応によって選択的増幅を行った。ＰＣ
Ｒ産物をＨｉｎｄIII／ＳｓｔI で二重消化されたＢｌ
ｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎ
ｅ）にサブクローニングし、ＤＨ５（ＢＲＬ社製）に形
質転換して、標準法（Maniatis et al., Molecular Clo
ning: A Laboratory Manual, Cold Spring Habor Labor
atory, Cold Spring Habor, NY, 1989) によって接種し
た。
るために、Chirgwin et al., Biochemistry, 18:5294,
1979の方法を用いて、成熟ラットの脳から、グアニジン
イソチオシアネートーセシウムグラジエントによって、
全ＲＮＡを抽出した。Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅｓｅａｒ
ｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（ＢＲＬ社）による実
験計画書を用いて、ポリ（Ａ）ＲＮＡをオリゴｄＴセル
ロース上で精製した。ポリｄ（Ｎ6 ）−ｍｅｒｓ（Ｐｈ
ａｒｍａｃｉａ社製）をプライマーとして用いた以外
は、指示された条件を用いて、ＭＭＬＶ−逆転写酵素
（ＢＲＬ社製）を用いて一本鎖合成を行った。このｃＤ
ＮＡ−ＲＮＡ混合物を６５℃で１５分間加熱して不活性
化して、−２０℃に貯蔵した。ＰＣＲのためには、サン
プルの１／５０を反応物１００μｌに加えた。ネコ（ｃ
ＤＮＡから）（Kobayashi et al., J.Neurosci., 7:276
8, 1987) 及びラット（ペプチドから）（Changand Got
tlieb, J.Neurosci., 8:2123, 1988) ＧＡＤ（図１）
の下線を施した共通のアミノ酸配列をコードするために
変性（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ）オリゴヌクレオチドを合
成した（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）。各
変性オリゴヌクレオチドの５’末端配列は、ＳｓｔI 及
びＨｉｎｄIII （５’末端オリゴ）又はＳｓｔI 及びＳ
ｓｔII（３’末端オリゴ）のいずれかによって認識され
るＤＮＡ配列の１本鎖を含む。これらのプライマーを用
いて、Gould et al., Proc.Natl.Acad.Sci.,USA, 86:19
34, 1989 に記載されたように、生じたｃＤＮＡ鋳型の
ポリメラーゼ鎖反応によって選択的増幅を行った。ＰＣ
Ｒ産物をＨｉｎｄIII／ＳｓｔI で二重消化されたＢｌ
ｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎ
ｅ）にサブクローニングし、ＤＨ５（ＢＲＬ社製）に形
質転換して、標準法（Maniatis et al., Molecular Clo
ning: A Laboratory Manual, Cold Spring Habor Labor
atory, Cold Spring Habor, NY, 1989) によって接種し
た。
【００６９】ネコＧＡＤ67に特異的な５’−32Ｐ末端標
識化オリゴヌクレオチドでコロニーハイブリダイゼーシ
ョンを行った（Kobayashi et al., J.Neurosci., 7:276
8, 1987)。ニトロセルロースフィルターを５０℃で１５
分間洗浄した以外は、文献（Wallace et al., in Guide
to Molecular Cloning Techniques; Berger et al.,Ed
s.in Methods of Enzymology; Abelson et al., Eds.Ac
ademic Press,Inc. San Diego, 432-442, 1987) 記載
のようにして、オリゴヌクレオチドの末端標識、ハイブ
リダイゼーション条件、及び洗浄条件を実施した。ハイ
ブリダイゼーションで陽性及び陰性であったコロニーを
個々に取り上げて、Ｔｅｒｒｉｆｉｃ液体培地中で一夜
成長させた（Tartof et al., Focus, 9:12, 1987) 。煮
沸法（Maniatis et al., Molecular Cloning: A Labora
tory Manual 、 Cold Spring Habor Laboratory 、 Col
d Spring Habor, NY, 1989) を用いてＤＮＡを単離し、
０．２Ｎ ＮａＯＨで鋳型を変性し、Ｓｅｐｈａｃｒｙ
ｌ Ｓ４００スパンカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）で精
製した。変性された二本鎖鋳型の配列決定は、Ｔ７−シ
ークエンスキット（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いて、鎖
−末端法（Sanger et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 7
4:5463, 1977) によって行った。
識化オリゴヌクレオチドでコロニーハイブリダイゼーシ
ョンを行った（Kobayashi et al., J.Neurosci., 7:276
8, 1987)。ニトロセルロースフィルターを５０℃で１５
分間洗浄した以外は、文献（Wallace et al., in Guide
to Molecular Cloning Techniques; Berger et al.,Ed
s.in Methods of Enzymology; Abelson et al., Eds.Ac
ademic Press,Inc. San Diego, 432-442, 1987) 記載
のようにして、オリゴヌクレオチドの末端標識、ハイブ
リダイゼーション条件、及び洗浄条件を実施した。ハイ
ブリダイゼーションで陽性及び陰性であったコロニーを
個々に取り上げて、Ｔｅｒｒｉｆｉｃ液体培地中で一夜
成長させた（Tartof et al., Focus, 9:12, 1987) 。煮
沸法（Maniatis et al., Molecular Cloning: A Labora
tory Manual 、 Cold Spring Habor Laboratory 、 Col
d Spring Habor, NY, 1989) を用いてＤＮＡを単離し、
０．２Ｎ ＮａＯＨで鋳型を変性し、Ｓｅｐｈａｃｒｙ
ｌ Ｓ４００スパンカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）で精
製した。変性された二本鎖鋳型の配列決定は、Ｔ７−シ
ークエンスキット（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いて、鎖
−末端法（Sanger et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 7
4:5463, 1977) によって行った。
【００７０】図１に示すように、ＰＣＲで生じたラット
ＧＡＤ65及びＧＡＤ67ｃＤＮＡをプローブとして用い
て、標準的手法（Maniatis et al., Molecular Clonin
g: A Laboratory Manual 、 Cold Spring Habor Labora
tory 、 Cold Spring Habor, NY, 1989) によって、
Ｓ．Ｈｅｉｎｅｍａｎｎ（Ｓａｌｋ Ｉｎｓｔｉｔｕｔ
ｅ）から供与されたラムダＺＡＰ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎ
ｅ）ラット海馬ライブラリーをスクリーニングした。２
４００ヌクレオチドのＧＡＤ65ｃＤＮＡ（最大クロー
ン）を単離して、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅに記載するよう
に”ザッピング（ｚａｐｐｉｎｇ）”によってサブクロ
ーニングした。手元に既にあった３．２ｋｂのラットＧ
ＡＤ67ｃＤＮＡクローンよりも小さいラットＧＡＤ67ｃ
ＤＮＡを得たら、より大きなｃＤＮＡの配列決定を行っ
た。ＧＡＤ65及びＧＡＤ67について両方の方向にＥｘｏ
III 削除（Henikoff, Gene, 28:351, 1984) を行って、
鋳型を調製し、上記のようにして配列決定を行った。ラ
イブラリースクリーニングにおいて単離された元のｃＤ
ＮＡクローン中には現れていなかったＧＡＤ65及びＧＡ
Ｄ67ｍＲＮＡの残りの５’末端をクローニングするため
に、アンカーＰＣＲを行った（Frohman et al., Proc.N
atl.Acad.Sci.USA, 85:8998, 1988)。これらのクローン
の配列決定を行ったところ、ＧＡＤ65又はＧＡＤ67ｍＲ
ＮＡのいずれも、フレーム中に元のｃＤＮＡクローンの
開始コドンであると以前に同定されたものと共に、更に
別の開始コドン（ＡＵＧ）をなんら含んでいないことが
明らかとなった。
ＧＡＤ65及びＧＡＤ67ｃＤＮＡをプローブとして用い
て、標準的手法（Maniatis et al., Molecular Clonin
g: A Laboratory Manual 、 Cold Spring Habor Labora
tory 、 Cold Spring Habor, NY, 1989) によって、
Ｓ．Ｈｅｉｎｅｍａｎｎ（Ｓａｌｋ Ｉｎｓｔｉｔｕｔ
ｅ）から供与されたラムダＺＡＰ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎ
ｅ）ラット海馬ライブラリーをスクリーニングした。２
４００ヌクレオチドのＧＡＤ65ｃＤＮＡ（最大クロー
ン）を単離して、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅに記載するよう
に”ザッピング（ｚａｐｐｉｎｇ）”によってサブクロ
ーニングした。手元に既にあった３．２ｋｂのラットＧ
ＡＤ67ｃＤＮＡクローンよりも小さいラットＧＡＤ67ｃ
ＤＮＡを得たら、より大きなｃＤＮＡの配列決定を行っ
た。ＧＡＤ65及びＧＡＤ67について両方の方向にＥｘｏ
III 削除（Henikoff, Gene, 28:351, 1984) を行って、
鋳型を調製し、上記のようにして配列決定を行った。ラ
イブラリースクリーニングにおいて単離された元のｃＤ
ＮＡクローン中には現れていなかったＧＡＤ65及びＧＡ
Ｄ67ｍＲＮＡの残りの５’末端をクローニングするため
に、アンカーＰＣＲを行った（Frohman et al., Proc.N
atl.Acad.Sci.USA, 85:8998, 1988)。これらのクローン
の配列決定を行ったところ、ＧＡＤ65又はＧＡＤ67ｍＲ
ＮＡのいずれも、フレーム中に元のｃＤＮＡクローンの
開始コドンであると以前に同定されたものと共に、更に
別の開始コドン（ＡＵＧ）をなんら含んでいないことが
明らかとなった。
【００７１】実施例２ クローン化ＧＡＤ65の特徴 Ａ．ノーザンブロットハイブリダイゼーション ＧＡＤ67及びＧＡＤ65ｃＤＮＡは２個の異なるｍＲＮＡ
に由来するのかどうかを決定するために、２個のＰＣＲ
−由来のｃＤＮＡプローブを、ラットの脳ＲＮＡを含む
ノーザンブロットにハイブリダイゼーションした。ＲＮ
Ａは実施例１に記載したように抽出した。ホルムアルデ
ヒド中の電気泳動によってポリ（Ａ）ＲＮＡを分離し、
Ｂｉｏｔｒａｎｓ（ＩＣＮ）膜上に移して、１００μｌ
／ｍｌのポリ（Ａ）を加えた以外は、Well et al., J.N
eurosci., 16:311, 1986 に記載の方法によってハイブ
リダイゼーションを行った。Feinberg and Vogelstein,
Anal.Biochem., 132:6, 1983 に記載のオリゴラベリン
グ法によって、プローブを約１０9 ｄｐｍ／μｇまで標
識した。次いでＧＡＤ65及びＧＡＤ67ｃＤＮＡの全長ク
ローンで同じ結果が得られた。
に由来するのかどうかを決定するために、２個のＰＣＲ
−由来のｃＤＮＡプローブを、ラットの脳ＲＮＡを含む
ノーザンブロットにハイブリダイゼーションした。ＲＮ
Ａは実施例１に記載したように抽出した。ホルムアルデ
ヒド中の電気泳動によってポリ（Ａ）ＲＮＡを分離し、
Ｂｉｏｔｒａｎｓ（ＩＣＮ）膜上に移して、１００μｌ
／ｍｌのポリ（Ａ）を加えた以外は、Well et al., J.N
eurosci., 16:311, 1986 に記載の方法によってハイブ
リダイゼーションを行った。Feinberg and Vogelstein,
Anal.Biochem., 132:6, 1983 に記載のオリゴラベリン
グ法によって、プローブを約１０9 ｄｐｍ／μｇまで標
識した。次いでＧＡＤ65及びＧＡＤ67ｃＤＮＡの全長ク
ローンで同じ結果が得られた。
【００７２】図１１に示すように、レーン１及び２は、
ラット小脳から抽出したポリ（Ａ）選択ＲＮＡ１μｇを
含む。レーン１はネコＧＡＤ67（Kobayashi et al., J.
Neurosci., 7:2768, 1987) のラット起源のｃＤＮＡプ
ローブとハイブリダイゼーションさせたものであり、レ
ーン２はラットペプチド配列（ＧＡＤ65と対応する）の
ｃＤＮＡプローブとハイブリダイゼーションさせたもの
である。
ラット小脳から抽出したポリ（Ａ）選択ＲＮＡ１μｇを
含む。レーン１はネコＧＡＤ67（Kobayashi et al., J.
Neurosci., 7:2768, 1987) のラット起源のｃＤＮＡプ
ローブとハイブリダイゼーションさせたものであり、レ
ーン２はラットペプチド配列（ＧＡＤ65と対応する）の
ｃＤＮＡプローブとハイブリダイゼーションさせたもの
である。
【００７３】ラットペプチド配列のｃＤＮＡプローブは
５．７ｋｂのＲＮＡとハイブリダイゼーションし、一方
ネコｃＤＮＡのラット起源のｃＤＮＡプローブは３．７
ｋｂのＲＮＡとハイブリダイゼーションした。これは、
ＧＡＤ65とＧＡＤ67が同じｍＲＮＡに由来するものでは
ないことを示している。
５．７ｋｂのＲＮＡとハイブリダイゼーションし、一方
ネコｃＤＮＡのラット起源のｃＤＮＡプローブは３．７
ｋｂのＲＮＡとハイブリダイゼーションした。これは、
ＧＡＤ65とＧＡＤ67が同じｍＲＮＡに由来するものでは
ないことを示している。
【００７４】Ｂ．ＧＡＤ67及びＧＡＤ65のゲノム性ハイ
ブリダイゼーション ＧＡＤ67及びＧＡＤ65が別々の遺伝子に由来する可能性
を調べるために、ＧＡＤ67及びＧＡＤ65の両方のｃＤＮ
Ａを、ゲノム性ＤＮＡを含むＤＮＡブロットとハイブリ
ダイゼーションした。
ブリダイゼーション ＧＡＤ67及びＧＡＤ65が別々の遺伝子に由来する可能性
を調べるために、ＧＡＤ67及びＧＡＤ65の両方のｃＤＮ
Ａを、ゲノム性ＤＮＡを含むＤＮＡブロットとハイブリ
ダイゼーションした。
【００７５】サザンブロットのために、ＤＮＡはKaiser
et al., in DNA Cloning, vol.1,A Practical Approac
h, D.M.Glover ed., IRL Press, Oxford, 38-40, 1985
の記載に従って、ラット肝臓から抽出した。製造者
（ＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）の指示す
る条件を用いて、ＤＮＡ（１０μｇ／サンプル）をＥｃ
ｏＲI 及びＨｉｎｄIII で完全に消化した。０．８％ア
ガロース中、１．５ｖ／ｃｍで１６時間、電気泳動を行
ってＤＮＡ断片を分離した。次いで、Ｄｅｎｈａｒｄｔ
溶液の代わりにＣａｒｎａｔｉｏｎドライミルク５μｇ
／ｍｌを用いた以外は、Gatti et al., Biotechniques,
2:148, 1984 の記載に従って、ＤＮＡをＺｅｔａ−Ｐ
ｒｏｂｅ膜（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に移して、ハイブリダイ
ゼーションし、洗浄した。サザンブロットのためのプロ
ーブは、上記実施例１に記載したように標識した。
et al., in DNA Cloning, vol.1,A Practical Approac
h, D.M.Glover ed., IRL Press, Oxford, 38-40, 1985
の記載に従って、ラット肝臓から抽出した。製造者
（ＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）の指示す
る条件を用いて、ＤＮＡ（１０μｇ／サンプル）をＥｃ
ｏＲI 及びＨｉｎｄIII で完全に消化した。０．８％ア
ガロース中、１．５ｖ／ｃｍで１６時間、電気泳動を行
ってＤＮＡ断片を分離した。次いで、Ｄｅｎｈａｒｄｔ
溶液の代わりにＣａｒｎａｔｉｏｎドライミルク５μｇ
／ｍｌを用いた以外は、Gatti et al., Biotechniques,
2:148, 1984 の記載に従って、ＤＮＡをＺｅｔａ−Ｐ
ｒｏｂｅ膜（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に移して、ハイブリダイ
ゼーションし、洗浄した。サザンブロットのためのプロ
ーブは、上記実施例１に記載したように標識した。
【００７６】図１２に示すように、ＨｉｎｄIII 及びＥ
ｃｏＲI で消化したゲノム性ＤＮＡは、それぞれレーン
１、３とレーン２、４にある。ＧＡＤ67ｃＤＮＡはレー
ン１及び２とハイブリダイゼーションさせ、一方ＧＡＤ
65ｃＤＮＡはレーン３及び４とハイブリダイゼーション
させた。ゲル横にある数字はキロベースで表したＤＮＡ
断片サイズである。
ｃｏＲI で消化したゲノム性ＤＮＡは、それぞれレーン
１、３とレーン２、４にある。ＧＡＤ67ｃＤＮＡはレー
ン１及び２とハイブリダイゼーションさせ、一方ＧＡＤ
65ｃＤＮＡはレーン３及び４とハイブリダイゼーション
させた。ゲル横にある数字はキロベースで表したＤＮＡ
断片サイズである。
【００７７】このデータは、２個のｃＤＮＡは、異なる
サイズのゲノム断片とハイブリダイズすることを示して
いる。更に、ＧＡＤ65とＧＡＤ67ｃＤＮＡとの同一のヌ
クレオチド配列のうち最大の連続した配列は、たった１
７ヌクレオチド塩基の長さである。従って、ＧＡＤ67と
ＧＡＤ65とは２個の異なる遺伝子によってコードされて
いる。
サイズのゲノム断片とハイブリダイズすることを示して
いる。更に、ＧＡＤ65とＧＡＤ67ｃＤＮＡとの同一のヌ
クレオチド配列のうち最大の連続した配列は、たった１
７ヌクレオチド塩基の長さである。従って、ＧＡＤ67と
ＧＡＤ65とは２個の異なる遺伝子によってコードされて
いる。
【００７８】Ｃ．ＧＡＤ67及びＧＡＤ65の酵素的比較 ＧＡＤ67及びＧＡＤ65の活性におけるＰＬＰの効果を比
較する研究を行った。そのために、両方のｃＤＮＡをバ
クテリア中でその発現ができるようなベクター中にサブ
クローニングした（Studier et al., J.Mol.Biol., 18
9:113, 1986) 。ＧＡＤ65ｃＤＮＡをｐＥＴ−８ｃベク
ターのＮｃｏI 部位にサブクローニングし、かつＧＡＤ
67ｃＤＮＡをｐＥＴ−５ｃベクターのＮｈｅI 部位にサ
ブクローニングすることによって、”融合しない（ｆｕ
ｓｉｏｎｌｅｓｓ）”ＧＡＤ65及びＧＡＤ67の過発現を
実施した（Studier et al., J.Mol.Biol., 189:113, 19
86)。
較する研究を行った。そのために、両方のｃＤＮＡをバ
クテリア中でその発現ができるようなベクター中にサブ
クローニングした（Studier et al., J.Mol.Biol., 18
9:113, 1986) 。ＧＡＤ65ｃＤＮＡをｐＥＴ−８ｃベク
ターのＮｃｏI 部位にサブクローニングし、かつＧＡＤ
67ｃＤＮＡをｐＥＴ−５ｃベクターのＮｈｅI 部位にサ
ブクローニングすることによって、”融合しない（ｆｕ
ｓｉｏｎｌｅｓｓ）”ＧＡＤ65及びＧＡＤ67の過発現を
実施した（Studier et al., J.Mol.Biol., 189:113, 19
86)。
【００７９】両方のｃＤＮＡを正しいフレーム内でサブ
クローニングするための両立性の付着末端を得るため
に、Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃ
ａｌ（ＵＳＢ）の指示する条件を用いて、混合物中にお
ける２００μＭ ｄＮＴＰと１．５ｍＭ ＭｇＣｌ
2 で、ＰＣＲによる選択的増幅を行い、ＡｍｐｌｉＴＡ
Ｑ（ＵＳＢ）の不確実さを減少するために５５℃、２０
サイクルでアニーリングした。ＧＡＤ65及びＧＡＤ67に
特異的なプライマーは、それぞれＮｃｏI 及びＳｐｅI
制限酵素切断部位の１本のＤＮＡ鎖を含んでいた。ＧＡ
Ｄ67のコーディング領域にはＮｈｅI 切断部位があるの
で、ＳｐｅI （ＮｈｅI と両立性）を用いた。
クローニングするための両立性の付着末端を得るため
に、Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃ
ａｌ（ＵＳＢ）の指示する条件を用いて、混合物中にお
ける２００μＭ ｄＮＴＰと１．５ｍＭ ＭｇＣｌ
2 で、ＰＣＲによる選択的増幅を行い、ＡｍｐｌｉＴＡ
Ｑ（ＵＳＢ）の不確実さを減少するために５５℃、２０
サイクルでアニーリングした。ＧＡＤ65及びＧＡＤ67に
特異的なプライマーは、それぞれＮｃｏI 及びＳｐｅI
制限酵素切断部位の１本のＤＮＡ鎖を含んでいた。ＧＡ
Ｄ67のコーディング領域にはＮｈｅI 切断部位があるの
で、ＳｐｅI （ＮｈｅI と両立性）を用いた。
【００８０】ＰＣＲ産物をそれぞれのｐＥＴベクターに
サブクローニングし、ＤＨ５に形質転換して、上記のよ
うに接種した（Maniatis et al., Molecular Cloning:
A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laborator
y, Cold Spring Harbor、 NY,1989)。コロニーを取り出
して、アンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ液体培地
中で一夜成育させた。正しい方向性を有するサブクロー
ンを過発現のためにＢＬ２１（ＤＥ３）株（Studier et
al., J.Mol.Biol. 189:113, 1986) に形質転換した。
ネガティブコントロールとして、挿入物をもたないｐＥ
Ｔ−８ｃベクターを形質転換して、誘導した。１個のコ
ロニーを取り出して、成育し、１ｍＭのイソプロピルー
Ｂ−Ｄ−チオガラクトーピラノシド（ＩＰＴＧ）で誘導
して、文献（Sambrook et al., Molecular Cloning a L
aboratory Manual, Cold SpringHarbor Laboratory Pre
ss, Cold Spring Harbor, 17.15-17.16, 1989) 記載
のようにＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で分析した。
サブクローニングし、ＤＨ５に形質転換して、上記のよ
うに接種した（Maniatis et al., Molecular Cloning:
A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laborator
y, Cold Spring Harbor、 NY,1989)。コロニーを取り出
して、アンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ液体培地
中で一夜成育させた。正しい方向性を有するサブクロー
ンを過発現のためにＢＬ２１（ＤＥ３）株（Studier et
al., J.Mol.Biol. 189:113, 1986) に形質転換した。
ネガティブコントロールとして、挿入物をもたないｐＥ
Ｔ−８ｃベクターを形質転換して、誘導した。１個のコ
ロニーを取り出して、成育し、１ｍＭのイソプロピルー
Ｂ−Ｄ−チオガラクトーピラノシド（ＩＰＴＧ）で誘導
して、文献（Sambrook et al., Molecular Cloning a L
aboratory Manual, Cold SpringHarbor Laboratory Pre
ss, Cold Spring Harbor, 17.15-17.16, 1989) 記載
のようにＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で分析した。
【００８１】ＧＡＤ活性を測定するために、ＯＤ600 −
０．５のバクテリア培養物１０ｍｌをＩＰＴＧ１ｍＭで
誘導した。誘導後２時間で、バクテリアを遠心して、ホ
モジェナイズ用バッファー（１ｍＭフッ化フェニルメチ
ルスルホニル（ＰＭＳＦ）、１ｍＭ 臭化２−アミノエ
チルイソチオウロニウム（ＡＥＴ）、及び６０ｍＭリン
酸カリウム、ｐＨ７．１）１ｍｌ中に再懸濁して、超音
波処理した。超音波処理後、細胞カスを遠心で除去し、
上清（少量の上清をー７０℃で貯蔵した）中のタンパク
質濃度を測定した（Bradford, Anal.Biochem., 72:248,
1986)。文献（Legay et al., J.Neurochem., 46:1478
、 1986) 記載のように脳のホモジネートを調製し
た。Krieger et al., J.Neurochem., 33:299, 1984 の
記載に従って、０．２ｍＭ ＰＬＰの存在下、又は不存
在下に、インキュベーション混合物中に脳ホモジェネー
ト又はバクテリア溶菌物２０μｌを入れて、ＧＡＤ活性
を測定した。バクテリア溶菌物中の14ＣＯ2 の生産量
は、インキュベーション時間及びタンパク質濃度に比例
していた。
０．５のバクテリア培養物１０ｍｌをＩＰＴＧ１ｍＭで
誘導した。誘導後２時間で、バクテリアを遠心して、ホ
モジェナイズ用バッファー（１ｍＭフッ化フェニルメチ
ルスルホニル（ＰＭＳＦ）、１ｍＭ 臭化２−アミノエ
チルイソチオウロニウム（ＡＥＴ）、及び６０ｍＭリン
酸カリウム、ｐＨ７．１）１ｍｌ中に再懸濁して、超音
波処理した。超音波処理後、細胞カスを遠心で除去し、
上清（少量の上清をー７０℃で貯蔵した）中のタンパク
質濃度を測定した（Bradford, Anal.Biochem., 72:248,
1986)。文献（Legay et al., J.Neurochem., 46:1478
、 1986) 記載のように脳のホモジネートを調製し
た。Krieger et al., J.Neurochem., 33:299, 1984 の
記載に従って、０．２ｍＭ ＰＬＰの存在下、又は不存
在下に、インキュベーション混合物中に脳ホモジェネー
ト又はバクテリア溶菌物２０μｌを入れて、ＧＡＤ活性
を測定した。バクテリア溶菌物中の14ＣＯ2 の生産量
は、インキュベーション時間及びタンパク質濃度に比例
していた。
【００８２】
【表２】 表２に示すように、ＧＡＤ65又はＧＡＤ67を含むバクテ
リア溶菌物は［１−14Ｃ］ーグルタミン酸と、ＧＡＢＡ
及び14ＣＯ2 との変換を触媒する。
リア溶菌物は［１−14Ｃ］ーグルタミン酸と、ＧＡＢＡ
及び14ＣＯ2 との変換を触媒する。
【００８３】ＰＬＰは、ＧＡＤ67よりもＧＡＤ65の酵素
活性を刺激する。このより大きな刺激は多分、Ｍａｒｔ
ｉｎ及びその共同研究者（Martin, Cell.Mol.Neurobio
l., 7:237, 1987) が提唱した不活性サイクルを通し
て、ＧＡＤ65がより速く循環することを示している。こ
のより速い循環は、ｉｎ ｖｉｖｏで存在するａｐｏ−
ＧＡＤのプールに、ＧＡＤ65がより貢献していることを
示している（Miller et al., Brain Res.Bull., 5(Supp
l.2):89, 1980)。従って、ｉｎ ｖｉｖｏではＰＬＰ
は、ＧＡＤ67活性よりもＧＡＤ65活性をより制御してい
ると考えられる。
活性を刺激する。このより大きな刺激は多分、Ｍａｒｔ
ｉｎ及びその共同研究者（Martin, Cell.Mol.Neurobio
l., 7:237, 1987) が提唱した不活性サイクルを通し
て、ＧＡＤ65がより速く循環することを示している。こ
のより速い循環は、ｉｎ ｖｉｖｏで存在するａｐｏ−
ＧＡＤのプールに、ＧＡＤ65がより貢献していることを
示している（Miller et al., Brain Res.Bull., 5(Supp
l.2):89, 1980)。従って、ｉｎ ｖｉｖｏではＰＬＰ
は、ＧＡＤ67活性よりもＧＡＤ65活性をより制御してい
ると考えられる。
【００８４】バクテリア溶菌物中のＧＡＤ65活性は、ラ
ット黒質から調製したシナプトソーム中に見られるＧＡ
Ｄ活性の５倍のＰＬＰ刺激にほぼ等しい（Miller et a
l., J.Neurochem., 33:533, 1979)。いずれのＧＡＤ
も、粗ラット脳ホモジネート中のＧＡＤ活性よりもバク
テリア中に加えたＰＬＰにより依存するので、バクテリ
ア溶菌物の内在ＰＬＰ濃度は、ラット脳ホモジネートよ
りも少ないかも知れない。
ット黒質から調製したシナプトソーム中に見られるＧＡ
Ｄ活性の５倍のＰＬＰ刺激にほぼ等しい（Miller et a
l., J.Neurochem., 33:533, 1979)。いずれのＧＡＤ
も、粗ラット脳ホモジネート中のＧＡＤ活性よりもバク
テリア中に加えたＰＬＰにより依存するので、バクテリ
ア溶菌物の内在ＰＬＰ濃度は、ラット脳ホモジネートよ
りも少ないかも知れない。
【００８５】Ｄ．ＧＡＤ65及びＧＡＤ67の免疫学的同定 上記のようにしてラット脳ホモジェネートとバクテリア
溶菌物を抽出した。Harlow et al., Antibodies, A Lab
ratory Manual, Cold Spring Harbor Labratory 、 Col
d Spring Harbor, NY, 1988 に記載されたように、各サ
ンプルに等量の電気泳動用バッファーを加えた。ＳＤＳ
中の１０％アクリルアミドゲルで電気泳動を行って、タ
ンパク質を分離し、電気泳動的にニトロセルロースに移
した（Harlow et al., Antibodies 、 A Labratory Man
ual 、 Cold Spring Harbor Labratory 、 Cold Spring
Harbor, NY, 1988)。未反応部分を、２％ウシ血清アル
ブミン（フラクションＶ）、１％ゼラチン、及び１％ト
リトンーＸ−１００を含むリン酸バッファー溶液（ＰＢ
Ｓ）を用いて、４２℃で、１時間ブロックした。洗浄
後、ニトロセルロースフィルターを３つの部分に切断
し、以下の一次抗体と共にインキュベーションした：レ
ーン１から４は、ＧＡＤ67及びＧＡＤ65の両方を認識す
るOertel et al., Neuroscience, 6:2689, 1981 の抗血
清の１／２０００希釈と共に；レーン５から８は、ＧＡ
Ｄ67のみを認識するＫ−２抗血清の１／２０００希釈と
共に；レーン９から１２は、ＧＡＤ65に特異的なＧＡＤ
−６モノクローナル抗体（Chang et al., J.Neurosci.,
8:2123, 1988)の１／２０００希釈と共にインキュベー
ションした。全てのフィルターをよく洗浄して、適当な
二次抗体をインキュベーションして、洗浄した。結合し
た抗体は、 125Ｉ−標識タンパク質Ａ及びオートラジオ
グラフィーにより検出した。各レーンは以下のものを含
んでいた：レーン１、５及び９は、ＢＬ２１（ＤＥ３）
＋ｐＥＴ−ＧＡＤ67；レーン２、６及び１０は、ＢＬ２
１（ＤＥ３）＋ｐＥＴ−ＧＡＤ65；レーン３、７及び１
１は、ラット脳ホモジネート；そしてレーン４、８及び
１２は、ＢＬ２１（ＤＥ３）＋ｐＥＴ−８ｃ。
溶菌物を抽出した。Harlow et al., Antibodies, A Lab
ratory Manual, Cold Spring Harbor Labratory 、 Col
d Spring Harbor, NY, 1988 に記載されたように、各サ
ンプルに等量の電気泳動用バッファーを加えた。ＳＤＳ
中の１０％アクリルアミドゲルで電気泳動を行って、タ
ンパク質を分離し、電気泳動的にニトロセルロースに移
した（Harlow et al., Antibodies 、 A Labratory Man
ual 、 Cold Spring Harbor Labratory 、 Cold Spring
Harbor, NY, 1988)。未反応部分を、２％ウシ血清アル
ブミン（フラクションＶ）、１％ゼラチン、及び１％ト
リトンーＸ−１００を含むリン酸バッファー溶液（ＰＢ
Ｓ）を用いて、４２℃で、１時間ブロックした。洗浄
後、ニトロセルロースフィルターを３つの部分に切断
し、以下の一次抗体と共にインキュベーションした：レ
ーン１から４は、ＧＡＤ67及びＧＡＤ65の両方を認識す
るOertel et al., Neuroscience, 6:2689, 1981 の抗血
清の１／２０００希釈と共に；レーン５から８は、ＧＡ
Ｄ67のみを認識するＫ−２抗血清の１／２０００希釈と
共に；レーン９から１２は、ＧＡＤ65に特異的なＧＡＤ
−６モノクローナル抗体（Chang et al., J.Neurosci.,
8:2123, 1988)の１／２０００希釈と共にインキュベー
ションした。全てのフィルターをよく洗浄して、適当な
二次抗体をインキュベーションして、洗浄した。結合し
た抗体は、 125Ｉ−標識タンパク質Ａ及びオートラジオ
グラフィーにより検出した。各レーンは以下のものを含
んでいた：レーン１、５及び９は、ＢＬ２１（ＤＥ３）
＋ｐＥＴ−ＧＡＤ67；レーン２、６及び１０は、ＢＬ２
１（ＤＥ３）＋ｐＥＴ−ＧＡＤ65；レーン３、７及び１
１は、ラット脳ホモジネート；そしてレーン４、８及び
１２は、ＢＬ２１（ＤＥ３）＋ｐＥＴ−８ｃ。
【００８６】バクテリア産出性のＧＡＤ65及びＧＡＤ67
のイムノブロットは、ＧＡＤ65が脳抽出物中の小さいＧ
ＡＤとよく対応し、そしてＧＡＤ67は大きい形とよく対
応することを示している（図１３）。これまでの研究
は、ＧＡＤ67がネコＧＡＤ67及びマウスＧＡＤ67にとっ
ての大きいＧＡＤと対応することを示している（Kataro
va et al., Eur.J.Neurosci., 2:190, 1990; 235, 198
7) 。バクテリア産出性のＧＡＤ65及びＧＡＤ67の可動
性（Oertel et al., Neuroscience, 6:2689, 1981の抗
血清で検出した場合）は、ラット脳ホモジネートに見ら
れる免疫反応ダブレット(immunoreactive doublet)と同
じである。
のイムノブロットは、ＧＡＤ65が脳抽出物中の小さいＧ
ＡＤとよく対応し、そしてＧＡＤ67は大きい形とよく対
応することを示している（図１３）。これまでの研究
は、ＧＡＤ67がネコＧＡＤ67及びマウスＧＡＤ67にとっ
ての大きいＧＡＤと対応することを示している（Kataro
va et al., Eur.J.Neurosci., 2:190, 1990; 235, 198
7) 。バクテリア産出性のＧＡＤ65及びＧＡＤ67の可動
性（Oertel et al., Neuroscience, 6:2689, 1981の抗
血清で検出した場合）は、ラット脳ホモジネートに見ら
れる免疫反応ダブレット(immunoreactive doublet)と同
じである。
【００８７】ラット脳中のＧＡＤの低分子量及び高分子
量形は、それぞれＧＡＤ65及びＧＡＤ67ｃＤＮＡの産物
と、抗原的にまた大きさ的に同じものである。その結
果、ラット脳中の２つのＧＡＤは、ＧＡＤ65とＧＡＤ67
である。このデータから、既に報告されているタピア
（Ｔａｐｉａ）によるＰＬＰ−依存性ＧＡＤと、ＰＬＰ
−非依存性ＧＡＤ（Bayon et al., J.Neurochem., 29:5
19, 1977) は、それぞれＧＡＤ65及びＧＡＤ67と分子的
に同じものである、と結論付けることができる。Ｍａｒ
ｔｉｎ及びその共同研究者（Spink et al., Brain Re
s., 421:235, 1987)は、ラット脳ＧＡＤには４つの運動
力学的に異なる形が存在することを報告している。しか
しながら、これらの形のイムノブロッティング（ここで
用いたような抗血清を用いる）については報告されてい
ない。
量形は、それぞれＧＡＤ65及びＧＡＤ67ｃＤＮＡの産物
と、抗原的にまた大きさ的に同じものである。その結
果、ラット脳中の２つのＧＡＤは、ＧＡＤ65とＧＡＤ67
である。このデータから、既に報告されているタピア
（Ｔａｐｉａ）によるＰＬＰ−依存性ＧＡＤと、ＰＬＰ
−非依存性ＧＡＤ（Bayon et al., J.Neurochem., 29:5
19, 1977) は、それぞれＧＡＤ65及びＧＡＤ67と分子的
に同じものである、と結論付けることができる。Ｍａｒ
ｔｉｎ及びその共同研究者（Spink et al., Brain Re
s., 421:235, 1987)は、ラット脳ＧＡＤには４つの運動
力学的に異なる形が存在することを報告している。しか
しながら、これらの形のイムノブロッティング（ここで
用いたような抗血清を用いる）については報告されてい
ない。
【００８８】Ｅ、脳組織中のＲＮＡにおけるＧＡＤ65及
びＧＡＤ67の分布 その場での（ｉｎ ｓｉｔｕ）ハイブリダイゼーション
を用いて、小脳のＲＮＡにおけるＧＡＤ65及びＧＡＤ67
の分布を決定するための実験を行った。
びＧＡＤ67の分布 その場での（ｉｎ ｓｉｔｕ）ハイブリダイゼーション
を用いて、小脳のＲＮＡにおけるＧＡＤ65及びＧＡＤ67
の分布を決定するための実験を行った。
【００８９】ＧＡＤ65及びＧＡＤ67ｃＤＮＡからの、そ
れぞれ３．２ｋｂ及び２．３ｋｂの転写物を、Wuensche
ll et al., Proc.Natl.Acad.Sci.,USA, 83:6193, 1986
の方法に従って、35Ｓで放射性標識した。２００ｂｐの
加水分解断片を、ラット小脳の冠状セクションとハイブ
リダイズさせた。動物はハロタンで麻酔して断首した。
脳をドライアイス中で急速に冷凍して、冠状凍結セクシ
ョン（１２μｍ）を、新たに調製したリン酸緩衝液（Ｐ
ＢＳ；１３０ｍＭ ＮａＣｌ，１０ｍＭ リン酸ナトリ
ウム、ｐＨ７．０）中の４％ホルムアルデヒド中で、３
０分間固定した。組織を勾配化エタノール溶液中で脱水
し、−７０℃で貯蔵した。
れぞれ３．２ｋｂ及び２．３ｋｂの転写物を、Wuensche
ll et al., Proc.Natl.Acad.Sci.,USA, 83:6193, 1986
の方法に従って、35Ｓで放射性標識した。２００ｂｐの
加水分解断片を、ラット小脳の冠状セクションとハイブ
リダイズさせた。動物はハロタンで麻酔して断首した。
脳をドライアイス中で急速に冷凍して、冠状凍結セクシ
ョン（１２μｍ）を、新たに調製したリン酸緩衝液（Ｐ
ＢＳ；１３０ｍＭ ＮａＣｌ，１０ｍＭ リン酸ナトリ
ウム、ｐＨ７．０）中の４％ホルムアルデヒド中で、３
０分間固定した。組織を勾配化エタノール溶液中で脱水
し、−７０℃で貯蔵した。
【００９０】組織の透過性を増加するために、セクショ
ンを以下の前処理に付した：勾配化エタノール溶液（９
５％、８５％、７０％、５０％及び３０％エタノール中
に各５分）中での再水和；ＰＢＳ（５分）；０．００２
Ｎ ＨＣｌ（１０分）；ＰＢＳ（５分）；ＰＢＳ中の
０．０１％トリトンＮ−１０１（１分）；ＰＢＳ（２ｘ
５分）；１μｇ／ｍｌプロテナーゼＫ（７．５分）；及
びＰＢＳ中のグリシン（プロテナーゼＫを阻害するた
め）（３ｘ５分）。プロテナーゼＫは使用前に３７℃で
３０分間消化した。次いでセクションを３７℃、５０％
ホルムアミド、７５０ｍＭ ＮａＣｌ、２５ｍＭ ＥＤ
ＴＡ，０．２％ ＳＤＳ，０．０２％ ＢＳＡ、０，０
０２％ フィコル(Ficol) 、０．０２％ ポリビニルピ
ロリドン、２５０μｇ／ｍｌ イーストｔＲＮＡ、２５
０μｇ／ｍｌ ポリＡ、及び２５ｍＭＰＰＥＳ（ｐＨ
６．８）中でインキュベーションした。
ンを以下の前処理に付した：勾配化エタノール溶液（９
５％、８５％、７０％、５０％及び３０％エタノール中
に各５分）中での再水和；ＰＢＳ（５分）；０．００２
Ｎ ＨＣｌ（１０分）；ＰＢＳ（５分）；ＰＢＳ中の
０．０１％トリトンＮ−１０１（１分）；ＰＢＳ（２ｘ
５分）；１μｇ／ｍｌプロテナーゼＫ（７．５分）；及
びＰＢＳ中のグリシン（プロテナーゼＫを阻害するた
め）（３ｘ５分）。プロテナーゼＫは使用前に３７℃で
３０分間消化した。次いでセクションを３７℃、５０％
ホルムアミド、７５０ｍＭ ＮａＣｌ、２５ｍＭ ＥＤ
ＴＡ，０．２％ ＳＤＳ，０．０２％ ＢＳＡ、０，０
０２％ フィコル(Ficol) 、０．０２％ ポリビニルピ
ロリドン、２５０μｇ／ｍｌ イーストｔＲＮＡ、２５
０μｇ／ｍｌ ポリＡ、及び２５ｍＭＰＰＥＳ（ｐＨ
６．８）中でインキュベーションした。
【００９１】ハイブリダイゼーションのためには、１０
０ｍＭ ＤＴＴ、１０％ 硫酸デキストラン、及びセン
ス(sense) 又はアンチセンス(antisense) の35Ｓ−ＲＮ
Ａを、ハイブリダイゼーション溶液に加えた。プローブ
（センス又はアンチセンス）約３ｎｇ（１０6 ｃｐｍ）
を含むハイブリダイゼーション溶液の少量（５０μｌ）
をスライド上に加えた。各スライドのカバーをして、５
０℃で１６時間インキュベーションし、次いでシリコン
処理したカバーを４ｘＳＳＣ（１ｘＳＳＣ−１５０ｍＭ
ＮａＣｌ，６０ｍＭ クエン酸ナトリウム、ｐＨ７．
０）で短時間洗浄した。
０ｍＭ ＤＴＴ、１０％ 硫酸デキストラン、及びセン
ス(sense) 又はアンチセンス(antisense) の35Ｓ−ＲＮ
Ａを、ハイブリダイゼーション溶液に加えた。プローブ
（センス又はアンチセンス）約３ｎｇ（１０6 ｃｐｍ）
を含むハイブリダイゼーション溶液の少量（５０μｌ）
をスライド上に加えた。各スライドのカバーをして、５
０℃で１６時間インキュベーションし、次いでシリコン
処理したカバーを４ｘＳＳＣ（１ｘＳＳＣ−１５０ｍＭ
ＮａＣｌ，６０ｍＭ クエン酸ナトリウム、ｐＨ７．
０）で短時間洗浄した。
【００９２】次いでセクションをリボヌクレアーゼＡ
（０．５Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭ チオ硫酸ナトリウ
ム、１ｍＭ ＥＤＴＡ，１０ｍＭ ＴｒｉｓＨＣｌ、ｐ
Ｈ８．０中、５０μｇ／ｍｌ）で、３７℃、２０分間処
理して、２ｘＳＳＣ中、室温で２時間リンスし、１０ｍ
Ｍ チオ硫酸ナトリウム中、５５℃で３０分間リンスし
た。セクションをエタノール中で脱水し、キシレン中で
脱脂して、Ｋｏｄａｋ ＮＴＢ２エマルジョンでコーテ
ィングし、４℃で１０日間露光した。エマルジョンをＫ
ｏｄａｋ Ｄ１９で現像して、組織をクレシルバイオレ
ットで対比染色した。
（０．５Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭ チオ硫酸ナトリウ
ム、１ｍＭ ＥＤＴＡ，１０ｍＭ ＴｒｉｓＨＣｌ、ｐ
Ｈ８．０中、５０μｇ／ｍｌ）で、３７℃、２０分間処
理して、２ｘＳＳＣ中、室温で２時間リンスし、１０ｍ
Ｍ チオ硫酸ナトリウム中、５５℃で３０分間リンスし
た。セクションをエタノール中で脱水し、キシレン中で
脱脂して、Ｋｏｄａｋ ＮＴＢ２エマルジョンでコーテ
ィングし、４℃で１０日間露光した。エマルジョンをＫ
ｏｄａｋ Ｄ１９で現像して、組織をクレシルバイオレ
ットで対比染色した。
【００９３】反射偏光を用いてオートラジオグラフ粒子
を検出し、粒子数、密度、ｎｄ細胞領域をＡｎａｌｙｔ
ｉｃ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｃｏｎｃｅｐｔｓイメジアナラ
イザーシステムで測定した。バックグラウンドレベルが
低いために、細胞が”標識された”と定義するための基
準を、５以上の集団化した粒子の存在においた。ＧＡＤ
標識された細胞が脳中に分散して見受けられ、個々の細
胞上の粒子数の測定を可能とした。細胞と、粒子によっ
て覆われた領域との境界によって、１細胞当たりの領域
数の計算が可能となった。染色された細胞と、上におか
れた粒子とを同時に見ることができるように、反射偏光
と透過光との両方を用いて、高倍率（８００ｘ）で分析
を行った。数は、”ｎ”細胞の平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．であ
る。
を検出し、粒子数、密度、ｎｄ細胞領域をＡｎａｌｙｔ
ｉｃ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｃｏｎｃｅｐｔｓイメジアナラ
イザーシステムで測定した。バックグラウンドレベルが
低いために、細胞が”標識された”と定義するための基
準を、５以上の集団化した粒子の存在においた。ＧＡＤ
標識された細胞が脳中に分散して見受けられ、個々の細
胞上の粒子数の測定を可能とした。細胞と、粒子によっ
て覆われた領域との境界によって、１細胞当たりの領域
数の計算が可能となった。染色された細胞と、上におか
れた粒子とを同時に見ることができるように、反射偏光
と透過光との両方を用いて、高倍率（８００ｘ）で分析
を行った。数は、”ｎ”細胞の平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．であ
る。
【００９４】
【表３】 全ての神経性細胞タイプにおいて、ＧＡＤ67ｍＲＮＡレ
ベルの方が大きい。ｉｎ ｓｉｔｕでのハイブリダイゼ
ーションにおける観察は、小脳中の非依存性ＧＡＤ活性
に対するＰＬＰの依存率は、試験した脳領域中で最も低
いものの一つである、という従来の知見（Nitsch, J.Ne
urochem., 34:822, 1980; Denner et al., J.Neuroche
m., 44:957, 1985; Itoh et al., Neurochem.Res. 6:12
83, 1981)と一致している。更に、表３に示すように、
ＧＡＤ67ｍＲＮＡに対する量は、プルキニエ＞ゴルジII
＞籠＞星細胞の順であり、一方ＧＡＤ65に対する量は、
ゴルジII＞プルキニエ＞籠＞星細胞の順である。
ベルの方が大きい。ｉｎ ｓｉｔｕでのハイブリダイゼ
ーションにおける観察は、小脳中の非依存性ＧＡＤ活性
に対するＰＬＰの依存率は、試験した脳領域中で最も低
いものの一つである、という従来の知見（Nitsch, J.Ne
urochem., 34:822, 1980; Denner et al., J.Neuroche
m., 44:957, 1985; Itoh et al., Neurochem.Res. 6:12
83, 1981)と一致している。更に、表３に示すように、
ＧＡＤ67ｍＲＮＡに対する量は、プルキニエ＞ゴルジII
＞籠＞星細胞の順であり、一方ＧＡＤ65に対する量は、
ゴルジII＞プルキニエ＞籠＞星細胞の順である。
【００９５】このようにＧＡＤ65及びＧＡＤ67ｍＲＮＡ
の発現はニューロンのクラスによって異なる。つまり、
全ＧＡＤに対するそれぞれの貢献度は、いかにＧＡＢＡ
生産が制御されているかに影響している。例えば、黒質
は、ＰＬＰ−非依存性ＧＡＤ活性に対して、最も高いＰ
ＬＰ−依存率の一つを含む（Nitsch, L.Neurochem.,34:
822, 1980) 。ＧＡＢＡ異化作用の阻害剤を局部的に注
射することによって、黒質におけるＧＡＢＡ濃度を増加
させることは、捕獲感受性（ｓｅｉｚｕｒｅｓｕｓｃｅ
ｐｔｉｂｉｌｉｔｙ）の減少に特に有効である（Gala,
Fed.Proc., 44:2414, 1985) 。従って、ＰＬＰ−アンタ
ゴニストによって誘導される捕獲を受ける実験動物は、
特に黒質内の神経末端におけるＧＡＤ65の阻害のため
に、捕獲の伝達を阻害することができない。
の発現はニューロンのクラスによって異なる。つまり、
全ＧＡＤに対するそれぞれの貢献度は、いかにＧＡＢＡ
生産が制御されているかに影響している。例えば、黒質
は、ＰＬＰ−非依存性ＧＡＤ活性に対して、最も高いＰ
ＬＰ−依存率の一つを含む（Nitsch, L.Neurochem.,34:
822, 1980) 。ＧＡＢＡ異化作用の阻害剤を局部的に注
射することによって、黒質におけるＧＡＢＡ濃度を増加
させることは、捕獲感受性（ｓｅｉｚｕｒｅｓｕｓｃｅ
ｐｔｉｂｉｌｉｔｙ）の減少に特に有効である（Gala,
Fed.Proc., 44:2414, 1985) 。従って、ＰＬＰ−アンタ
ゴニストによって誘導される捕獲を受ける実験動物は、
特に黒質内の神経末端におけるＧＡＤ65の阻害のため
に、捕獲の伝達を阻害することができない。
【００９６】Ｆ．ＧＡＤ65及びＧＡＤ67の無細胞系配置 ＧＡＤ65及びＧＡＤ67の分布をＳ2 及びシナプトソーム
無細胞分画において評価した。Ｓ2 は、脳中の全細胞の
細胞質ゾルからなる高速上清であり、一方シナプトソー
ム分画は、主として神経終末からなる（Gray et al.,
J.Anat., Lond,96:79, 1962)。これらの研究のために
は、全ラット脳分画を、Booth and Clark,Biochem.J.,
176:365, 1978 の記載するように行った。タンパク質
濃度をSchaffner and Weissman (Schaffner et al., An
al.Biochem. 56:502, 1973) の方法によって測定した。
Kaise et al., DNA Cloning, Vil.1, A Practical Appr
oach, D.M. Glover ed.,IRL Press, Oxford, 1985, pp.
38-40 に記載の方法でサンプルを調製し、ＧＡＤ−６モ
ノクローナル抗体及びＫ−２抗血清を用いて上記のよう
にしてイムノブロッティングを行った。等量のタンパク
質（１６μｇ）を各レーンに加えた。オートラジオグラ
フィーは、１、３、１０、３０、１００μｇのタンパク
質濃度で、Ｋ−２抗血清及びＧＡＤ−６モノクローナル
抗体の両方と抗体結合した 125Ｉ−タンパク質Ａの量が
線状に増加する応答を示している（データ示さず）。
無細胞分画において評価した。Ｓ2 は、脳中の全細胞の
細胞質ゾルからなる高速上清であり、一方シナプトソー
ム分画は、主として神経終末からなる（Gray et al.,
J.Anat., Lond,96:79, 1962)。これらの研究のために
は、全ラット脳分画を、Booth and Clark,Biochem.J.,
176:365, 1978 の記載するように行った。タンパク質
濃度をSchaffner and Weissman (Schaffner et al., An
al.Biochem. 56:502, 1973) の方法によって測定した。
Kaise et al., DNA Cloning, Vil.1, A Practical Appr
oach, D.M. Glover ed.,IRL Press, Oxford, 1985, pp.
38-40 に記載の方法でサンプルを調製し、ＧＡＤ−６モ
ノクローナル抗体及びＫ−２抗血清を用いて上記のよう
にしてイムノブロッティングを行った。等量のタンパク
質（１６μｇ）を各レーンに加えた。オートラジオグラ
フィーは、１、３、１０、３０、１００μｇのタンパク
質濃度で、Ｋ−２抗血清及びＧＡＤ−６モノクローナル
抗体の両方と抗体結合した 125Ｉ−タンパク質Ａの量が
線状に増加する応答を示している（データ示さず）。
【００９７】この結果は、どちらの分画にも等量のＧＡ
Ｄ67が存在することを示している。Ｓ2 分画は神経膠
（及びその他の非ニューロン性）の細胞質ゾルタンパク
質と、ニューロン細胞とを含んでいるので、ＧＡＤ67の
濃度は、神経末端よりもニューロン細胞体部における方
が大きいに違いない。これとは対照的に、ＧＡＤ65の濃
度はＳ2 よりもシナプトソームにおける方が大きい。こ
れらの無細胞分画実験は、ＧＡＤ65とは対照的に、神経
末端よりもニューロンの細胞体部において、はるかに大
きいＧＡＤ67分画が存在することを示唆している。従っ
て、免疫組織化学的研究におけるのと同様に、無細胞分
画化は、ＧＡＤ65及びＧＡＤ67が異なる無細胞分布を有
していることを示している。
Ｄ67が存在することを示している。Ｓ2 分画は神経膠
（及びその他の非ニューロン性）の細胞質ゾルタンパク
質と、ニューロン細胞とを含んでいるので、ＧＡＤ67の
濃度は、神経末端よりもニューロン細胞体部における方
が大きいに違いない。これとは対照的に、ＧＡＤ65の濃
度はＳ2 よりもシナプトソームにおける方が大きい。こ
れらの無細胞分画実験は、ＧＡＤ65とは対照的に、神経
末端よりもニューロンの細胞体部において、はるかに大
きいＧＡＤ67分画が存在することを示唆している。従っ
て、免疫組織化学的研究におけるのと同様に、無細胞分
画化は、ＧＡＤ65及びＧＡＤ67が異なる無細胞分布を有
していることを示している。
【００９８】ＧＡＢＡの合成及び分解阻害剤を用いるｉ
ｎ ｖｉｖｏ実験において、ニューロン細胞体部におけ
るＧＡＢＡプールは、神経末端におけるＧＡＢＡプール
とは異なることを示唆している（Iadarola et al., Mo
l.Cell.Biochem., 39:305, 1981) 。ＧＡＤ67によって
生産されるＧＡＢＡは細胞代謝において（例えばＧＡＢ
Ａシャント(shunt) において）、そして神経細胞樹状突
起シナプスにおいて、より係わっている。僧帽樹状突起
と共に神経細胞樹状突起シナプスを形成し（Shepard, P
hysiol.Rev., 52:864, 1972)、そして多分ＧＡＢＡを放
出している（McLennan, Brain Res., 29:177-184, 197
1) 嗅神経球にある顆粒細胞の樹状突起は、Ｋ−２抗血
清で強く標識する。ここに示してはいないが、嗅神経球
においてはＧＡＤ65よりもＧＡＤ67ｍＲＮＡレベルの方
が大きい（２−３倍）ことが見いだされている。この分
布は、嗅神経球におけるＧＡＤ活性のほとんどがシナプ
トソームにではなく、Ｓ2 及びＰ1 （粗核ペレット）に
存在する、という知見（Quinnet al., Neurochem., 35:
583, 1980) と一致している。
ｎ ｖｉｖｏ実験において、ニューロン細胞体部におけ
るＧＡＢＡプールは、神経末端におけるＧＡＢＡプール
とは異なることを示唆している（Iadarola et al., Mo
l.Cell.Biochem., 39:305, 1981) 。ＧＡＤ67によって
生産されるＧＡＢＡは細胞代謝において（例えばＧＡＢ
Ａシャント(shunt) において）、そして神経細胞樹状突
起シナプスにおいて、より係わっている。僧帽樹状突起
と共に神経細胞樹状突起シナプスを形成し（Shepard, P
hysiol.Rev., 52:864, 1972)、そして多分ＧＡＢＡを放
出している（McLennan, Brain Res., 29:177-184, 197
1) 嗅神経球にある顆粒細胞の樹状突起は、Ｋ−２抗血
清で強く標識する。ここに示してはいないが、嗅神経球
においてはＧＡＤ65よりもＧＡＤ67ｍＲＮＡレベルの方
が大きい（２−３倍）ことが見いだされている。この分
布は、嗅神経球におけるＧＡＤ活性のほとんどがシナプ
トソームにではなく、Ｓ2 及びＰ1 （粗核ペレット）に
存在する、という知見（Quinnet al., Neurochem., 35:
583, 1980) と一致している。
【００９９】ＧＡＤ65とＧＡＤ67の無細胞分布の相違
は、細胞体質の係留性（ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔａｌ ａ
ｎｃｈｏｒｉｎｇ）又は未知のタンパク質標的機構によ
るものかも知れない。いくつかの細胞体質タンパク質で
は、ＧＡＤ65とＧＡＤ67で似た分布を有している。例え
ば、培養交感神経細胞において、Peng et al., J.Cell.
Biol., 102:252, 1986は、タウ(tau) の８４％は軸索に
存在するが、一方ＭＡＰ−２の１００％が細胞体及び樹
状突起に存在することを示した。更に、細胞体質タンパ
ク質である、４３ｋｄのタンパク質が、アセチルコリン
レセプターをその下にある膜細胞体質に係留するための
ものである、と考えられている（Flucheret al., Neuro
n, 3:163, 1989)。
は、細胞体質の係留性（ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔａｌ ａ
ｎｃｈｏｒｉｎｇ）又は未知のタンパク質標的機構によ
るものかも知れない。いくつかの細胞体質タンパク質で
は、ＧＡＤ65とＧＡＤ67で似た分布を有している。例え
ば、培養交感神経細胞において、Peng et al., J.Cell.
Biol., 102:252, 1986は、タウ(tau) の８４％は軸索に
存在するが、一方ＭＡＰ−２の１００％が細胞体及び樹
状突起に存在することを示した。更に、細胞体質タンパ
ク質である、４３ｋｄのタンパク質が、アセチルコリン
レセプターをその下にある膜細胞体質に係留するための
ものである、と考えられている（Flucheret al., Neuro
n, 3:163, 1989)。
【０１００】実施例３ 臨床標本中のＧＡＤ自己抗体の検出 Ａ．材料及び方法 １．患者標本： Ａｔｋｉｎｓｏｎ及びその共同研究者
（Atkinson et al., Lacet, 335:1357-1360, 1990) の
以前の研究から、４グループの患者の血清を選択した。
このグループは以下のものからなる：グループ（１）以
前にはＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｆｌｏｒｉｄａ，
Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｃｌｉｎｉｃｓと呼ばれていた権威
あるＮａｔｉｏｎａｌ Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｄａｔａ
Ｇｒｏｕｐ（ＮＤＤＧ）の基準（Gleichman et al., Di
abetes, 36:578-584, 1987) に従って診断された、１人
の新規発病ＩＤＤ患者；グループ（２）家族に自己免疫
疾患の病歴をなんら持たない、５人の無作為に選択され
た小島細胞細胞質抗体（ｉｓｌｅｔ ｃｅｌｌ ｃｙｔ
ｏｐｌａｓｍｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ：ＩＣＡ）陰性の
非−糖尿病性コントロール；グループ（３）ＩＤＤの発
病が記録される前の３から６６カ月間、血清が収集され
てきた１３人；グループ（４）非−糖尿病性コントロー
ル及び親族、及びＩＤＤ発病前に研究された人達；及び
グループ（５）ＩＤＤＭの危険があるが、まだ発病には
至っていない３人の患者。この後者のグループは、ＩＤ
Ｄ発端者(probands)の第１級親族５０００人以上、及び
一般人８２００人（このうち４８１３人が学童である）
の継続的ＩＣＡスクリーニングによって確認した。
（Atkinson et al., Lacet, 335:1357-1360, 1990) の
以前の研究から、４グループの患者の血清を選択した。
このグループは以下のものからなる：グループ（１）以
前にはＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｆｌｏｒｉｄａ，
Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｃｌｉｎｉｃｓと呼ばれていた権威
あるＮａｔｉｏｎａｌ Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｄａｔａ
Ｇｒｏｕｐ（ＮＤＤＧ）の基準（Gleichman et al., Di
abetes, 36:578-584, 1987) に従って診断された、１人
の新規発病ＩＤＤ患者；グループ（２）家族に自己免疫
疾患の病歴をなんら持たない、５人の無作為に選択され
た小島細胞細胞質抗体（ｉｓｌｅｔ ｃｅｌｌ ｃｙｔ
ｏｐｌａｓｍｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ：ＩＣＡ）陰性の
非−糖尿病性コントロール；グループ（３）ＩＤＤの発
病が記録される前の３から６６カ月間、血清が収集され
てきた１３人；グループ（４）非−糖尿病性コントロー
ル及び親族、及びＩＤＤ発病前に研究された人達；及び
グループ（５）ＩＤＤＭの危険があるが、まだ発病には
至っていない３人の患者。この後者のグループは、ＩＤ
Ｄ発端者(probands)の第１級親族５０００人以上、及び
一般人８２００人（このうち４８１３人が学童である）
の継続的ＩＣＡスクリーニングによって確認した。
【０１０１】２．小島細胞自己抗体： 血液型Ｏのクリ
オカット（ｃｒｙｏｃｕｔ）膵炎を間接免疫蛍光法でＩ
ＣＡアッセイした（Atkinson et al., Lancet, 335:135
7-1360, 1990) 。全ての結果をコードしたサンプルで、
各バッチにおける陰性及び陽性コントロール血清と比較
しつつ解釈した。ＩＣＡ陽性の程度はＩＣＡ標準化（Gl
eichman et al., Diabetes, 36:578-584, 1987) のため
のＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙＤｉａｂｅｔｅｓ Ｗｏｒｋｓ
ｈｏｐ（ＩＤＷ）によって確立されたガイドラインに沿
って分析した。全ての陽性な血清を端点希釈によって滴
定し、あらかじめ８０ユニットの国際若年層糖尿病協会
（Ｊｕｖｅｎｉｌｅ ＤｉａｂｅｔｅｓＦｏｕｎｄａｔ
ｉｏｎ：ＪＤＦ）標準に調整しておいた標準血清との比
較によって、ＪＤＦユニットを測定した。ここで報告す
る研究においては、陽性なＩＣＡ結果とは１０ＪＤＦユ
ニット又はそれ以上の応答力価で定義される。
オカット（ｃｒｙｏｃｕｔ）膵炎を間接免疫蛍光法でＩ
ＣＡアッセイした（Atkinson et al., Lancet, 335:135
7-1360, 1990) 。全ての結果をコードしたサンプルで、
各バッチにおける陰性及び陽性コントロール血清と比較
しつつ解釈した。ＩＣＡ陽性の程度はＩＣＡ標準化（Gl
eichman et al., Diabetes, 36:578-584, 1987) のため
のＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙＤｉａｂｅｔｅｓ Ｗｏｒｋｓ
ｈｏｐ（ＩＤＷ）によって確立されたガイドラインに沿
って分析した。全ての陽性な血清を端点希釈によって滴
定し、あらかじめ８０ユニットの国際若年層糖尿病協会
（Ｊｕｖｅｎｉｌｅ ＤｉａｂｅｔｅｓＦｏｕｎｄａｔ
ｉｏｎ：ＪＤＦ）標準に調整しておいた標準血清との比
較によって、ＪＤＦユニットを測定した。ここで報告す
る研究においては、陽性なＩＣＡ結果とは１０ＪＤＦユ
ニット又はそれ以上の応答力価で定義される。
【０１０２】３．ＨＬＡ ＤＲタイピング： ＤＲトレ
イ（Ｏｎｅ Ｌａｍｄａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，
Ｌｏｓ Ａｎｇｅｌｅｓ社製，ＣＡ）を用いて、Van Ro
od andVan Leuwen, Nature, 262:795-797, 1976 に記
載の方法でＨＬＡ ＤＲタイピングを実施した。
イ（Ｏｎｅ Ｌａｍｄａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，
Ｌｏｓ Ａｎｇｅｌｅｓ社製，ＣＡ）を用いて、Van Ro
od andVan Leuwen, Nature, 262:795-797, 1976 に記
載の方法でＨＬＡ ＤＲタイピングを実施した。
【０１０３】４．ヒト小島細胞： ヒト膵臓小島をカダ
ベリン性（ｃａｄａｖｅｒｉｃ）膵炎から単離し、上記
したように（Ricoedi et al., Diabetes, 37:413-420,
1988)ｉｎ ｖｉｔｒｏで維持した。小島細胞をｉｎ
ｖｉｔｒｏで（９５％空気／５％ＣＯ2 ）35Ｓメチオニ
ン（Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ Ｈｅｉｇ
ｈｔｓ，ＩＬ）で代謝的に標識した。
ベリン性（ｃａｄａｖｅｒｉｃ）膵炎から単離し、上記
したように（Ricoedi et al., Diabetes, 37:413-420,
1988)ｉｎ ｖｉｔｒｏで維持した。小島細胞をｉｎ
ｖｉｔｒｏで（９５％空気／５％ＣＯ2 ）35Ｓメチオニ
ン（Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ Ｈｅｉｇ
ｈｔｓ，ＩＬ）で代謝的に標識した。
【０１０４】５．小島細胞の抽出及び免疫沈降： Atki
nson et al., Lancet, 1357-1360, 1990 に記載の方法
で、以下の修飾を用いて小島細胞を抽出した。免疫沈降
の研究のためには、小島細胞溶解物を、各１０００小島
細胞毎にコントロール、ＩＤＤ血清（１００μｌ）、又
はＧＡＤ−６（Chang et al., J.Neuro., 8:2123-2130,
1988)（トリスバッファー９９μｌ中に１μｌ) （Atkin
son et al., Lancet, 335:1357-1360, 1990) のいずれ
かと共にインキュベーションする（２時間、４℃）こと
によって、２度前処理した。次いで免疫複合体を、過剰
のタンパク質ＡセファロースＣＬ−４Ｂ（Ｐｈａｒｍａ
ｃｉａ，ＮＪ）に吸着させた。次いで、非結合性（前処
理した）溶解物を含む１０００個の小島細胞を含む少量
を、ＩＤＤ又はコントロール血清（２５μｌ）、又はＧ
ＡＤ−６（Chang et al., J.Neuro., 8:2123-2130, 198
8)（トリスバッファー９９μｌ中に１μｌ) でインキュ
ベーションした。タンパク質ＡセファロースＣＬ−４Ｂ
でもう一度インキュベーションした（１時間、４℃）
後、複合体を０．１％ ＳＤＳ、１．０％ トリトンＸ
−１１４、及び２ｍＭ ＥＤＴＡを含む５０ｍＭ トリ
ス塩酸（ｐＨ７．４）で５回洗浄し、次いで二重蒸留水
で１回洗浄した。タンパク質ＡセファロースＣＬ−４Ｂ
を次いでＬａｅｍｍｌｉサンプルバッファー（Laemmli,
Nature, 227:680-685, 1970) 中で煮沸し、そのサンプ
ルをＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びＥｎｈａｎｃｅ（Ｎｅｗ Ｅ
ｎｇｌａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒ社製）を用いる蛍光ラジ
オグラフィー（Ｋｏｄａｋ社製，Ｘ−ｏｍａｔ ＡＲ
５）に付した。或いは、オートラジオグラフをＢＥＴＡ
ＧＥＮ（Ｂｏｓｔｏｎ社製，ＭＡ）アナライザーによっ
て分析した。６４ＫＡの陽性又は陰性の血清を各アッセ
イで用いて、アッセイ内コントロールとした。全ての蛍
光ラジオグラフィーを分析して、既知のアッセイ内コン
トロールと比較して陽性又は陰性と区分けした。陽性な
血清サンプルは、もしもサンプルが６４，０００Ｍx バ
ンドの低い強度の免疫沈降であったなら、これを１と
し、もしも中程度の強度のバンドが観察されたら２と
し、そしてもしも免疫沈降タンパク質の強度が大きいと
きは、これを３とした。免疫沈降した35Ｓ−ＧＡＤ65及
び35Ｓ−ＧＡＤ67に対応するバンドの強度についても同
様の区分けを用いた。
nson et al., Lancet, 1357-1360, 1990 に記載の方法
で、以下の修飾を用いて小島細胞を抽出した。免疫沈降
の研究のためには、小島細胞溶解物を、各１０００小島
細胞毎にコントロール、ＩＤＤ血清（１００μｌ）、又
はＧＡＤ−６（Chang et al., J.Neuro., 8:2123-2130,
1988)（トリスバッファー９９μｌ中に１μｌ) （Atkin
son et al., Lancet, 335:1357-1360, 1990) のいずれ
かと共にインキュベーションする（２時間、４℃）こと
によって、２度前処理した。次いで免疫複合体を、過剰
のタンパク質ＡセファロースＣＬ−４Ｂ（Ｐｈａｒｍａ
ｃｉａ，ＮＪ）に吸着させた。次いで、非結合性（前処
理した）溶解物を含む１０００個の小島細胞を含む少量
を、ＩＤＤ又はコントロール血清（２５μｌ）、又はＧ
ＡＤ−６（Chang et al., J.Neuro., 8:2123-2130, 198
8)（トリスバッファー９９μｌ中に１μｌ) でインキュ
ベーションした。タンパク質ＡセファロースＣＬ−４Ｂ
でもう一度インキュベーションした（１時間、４℃）
後、複合体を０．１％ ＳＤＳ、１．０％ トリトンＸ
−１１４、及び２ｍＭ ＥＤＴＡを含む５０ｍＭ トリ
ス塩酸（ｐＨ７．４）で５回洗浄し、次いで二重蒸留水
で１回洗浄した。タンパク質ＡセファロースＣＬ−４Ｂ
を次いでＬａｅｍｍｌｉサンプルバッファー（Laemmli,
Nature, 227:680-685, 1970) 中で煮沸し、そのサンプ
ルをＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びＥｎｈａｎｃｅ（Ｎｅｗ Ｅ
ｎｇｌａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒ社製）を用いる蛍光ラジ
オグラフィー（Ｋｏｄａｋ社製，Ｘ−ｏｍａｔ ＡＲ
５）に付した。或いは、オートラジオグラフをＢＥＴＡ
ＧＥＮ（Ｂｏｓｔｏｎ社製，ＭＡ）アナライザーによっ
て分析した。６４ＫＡの陽性又は陰性の血清を各アッセ
イで用いて、アッセイ内コントロールとした。全ての蛍
光ラジオグラフィーを分析して、既知のアッセイ内コン
トロールと比較して陽性又は陰性と区分けした。陽性な
血清サンプルは、もしもサンプルが６４，０００Ｍx バ
ンドの低い強度の免疫沈降であったなら、これを１と
し、もしも中程度の強度のバンドが観察されたら２と
し、そしてもしも免疫沈降タンパク質の強度が大きいと
きは、これを３とした。免疫沈降した35Ｓ−ＧＡＤ65及
び35Ｓ−ＧＡＤ67に対応するバンドの強度についても同
様の区分けを用いた。
【０１０５】６．免疫沈降： 35Ｓ−ＧＡＤ65又は35Ｓ
−ＧＡＤ67、及びヒト脳ホモジネートからのＧＡＤを含
むバクテリア溶解物の免疫沈降を、上記のヒト小島細胞
抽出物の免疫沈降研究で記載したのと同様に行った。
−ＧＡＤ67、及びヒト脳ホモジネートからのＧＡＤを含
むバクテリア溶解物の免疫沈降を、上記のヒト小島細胞
抽出物の免疫沈降研究で記載したのと同様に行った。
【０１０６】７．ＧＡＤアッセイ： ヒト脳ホモジネー
トを、上記のヒト小島細胞で記載したように、患者血清
と共にインキュベーションした。吸着及び洗浄後、タン
パク質Ａアガローススラリーの少量を３回、等量で採取
し、ＧＡＤ活性をKrieger et al., Neurochem. 33:299,
1984 に記載のように測定した。簡単に言うと、タンパ
ク質Ａアガロースビーズを（１−14Ｃ）−グルタミン酸
（Ａｍｅｒｓｈａｍ）と共に、指定のインキュベーショ
ン混合物（Krieger et al., Neurochem. 33:299,1984
）中でインキュベーションし、液体シンチレーション
カウンターで14ＣＯ2 の生産を定量した。
トを、上記のヒト小島細胞で記載したように、患者血清
と共にインキュベーションした。吸着及び洗浄後、タン
パク質Ａアガローススラリーの少量を３回、等量で採取
し、ＧＡＤ活性をKrieger et al., Neurochem. 33:299,
1984 に記載のように測定した。簡単に言うと、タンパ
ク質Ａアガロースビーズを（１−14Ｃ）−グルタミン酸
（Ａｍｅｒｓｈａｍ）と共に、指定のインキュベーショ
ン混合物（Krieger et al., Neurochem. 33:299,1984
）中でインキュベーションし、液体シンチレーション
カウンターで14ＣＯ2 の生産を定量した。
【０１０７】８． 35Ｓ−ＧＡＤ65及び35Ｓ−ＧＡＤ67の
生産： ラットＧＡＤ65及びＧＡＤ67ｃＤＮＡを上記し
たようにバクテリア発現系にサブクローンした。35Ｓ−
ＧＡＤの標識は、ＩＰＴＧ誘導化バクテリア（最小培地
で成育）をＴＲＡＮ35Ｓ−ラベル（ＩＣＮ）で１５分間
パルスすることによって行った。次いで培養物を遠心し
て、ホモジナイズバッファー［１ｍＭ フェニルメチル
スルホニルフロリド（ＰＭＳＦ），１ｍＭ ２−アミノ
エチルイソチオウロニウムブロミド（ＡＥＴ）及び６０
ｍＭ リン酸カリウム、ｐＨ７．１］中に再懸濁して、
超音波処理した。超音波処理の後、遠心によって細胞カ
スを除去し、上清（上清はー７０℃で少量貯蔵した）中
のタンパク質濃度を測定した（Bradford, Anal.Bioche
m., 72:248,1986)。
生産： ラットＧＡＤ65及びＧＡＤ67ｃＤＮＡを上記し
たようにバクテリア発現系にサブクローンした。35Ｓ−
ＧＡＤの標識は、ＩＰＴＧ誘導化バクテリア（最小培地
で成育）をＴＲＡＮ35Ｓ−ラベル（ＩＣＮ）で１５分間
パルスすることによって行った。次いで培養物を遠心し
て、ホモジナイズバッファー［１ｍＭ フェニルメチル
スルホニルフロリド（ＰＭＳＦ），１ｍＭ ２−アミノ
エチルイソチオウロニウムブロミド（ＡＥＴ）及び６０
ｍＭ リン酸カリウム、ｐＨ７．１］中に再懸濁して、
超音波処理した。超音波処理の後、遠心によって細胞カ
スを除去し、上清（上清はー７０℃で少量貯蔵した）中
のタンパク質濃度を測定した（Bradford, Anal.Bioche
m., 72:248,1986)。
【０１０８】Ｂ．ＩＤＤＭ標本の免疫反応性 ＩＤＤＭを有する患者からの血清を用いて、ヒト脳ホモ
ジネートからのＧＡＤを沈降させる能力を試験した。
ジネートからのＧＡＤを沈降させる能力を試験した。
【０１０９】
【表４】 表４に示すように、ＩＤＤＭの危険があるか、或いはＩ
ＤＤＭ患者の（５例のうち）４例の血清は、コントロー
ル患者の血清よりも、有意に大量のヒト脳抽出物の酵素
的に活性なＧＡＤと結合している。更に、患者のうちの
１人からの血清は前−ＩＤＤＭ時期に採取されており、
従ってＧＡＤに対する自己抗体はＩＤＤＭ症状の発病前
に存在していたことになる（下記のＣ参照）。
ＤＤＭ患者の（５例のうち）４例の血清は、コントロー
ル患者の血清よりも、有意に大量のヒト脳抽出物の酵素
的に活性なＧＡＤと結合している。更に、患者のうちの
１人からの血清は前−ＩＤＤＭ時期に採取されており、
従ってＧＡＤに対する自己抗体はＩＤＤＭ症状の発病前
に存在していたことになる（下記のＣ参照）。
【０１１０】更に別の実験（結果を示さず）では、ＩＤ
ＤＭの危険がある患者２人（ＤＡ，ＤＣ）からの血清
は、組み換え法で生産された35Ｓ−ＧＡＤ65を免疫沈降
させるが、一方組み換え法で生産された35Ｓ−ＧＡＤ67
は、患者ＤＡの血清のみによって認識された（そしてこ
れは35Ｓ−ＧＡＤ65よりも弱い）ことを示した。またそ
れ以後の研究で、神経病の合併症を有するＩＤＤＭ患者
の血清中には、ＧＡＤ65よりもＧＡＤ67自己抗体の力価
が大きいことが見いだされた（ここでは示さず）。
ＤＭの危険がある患者２人（ＤＡ，ＤＣ）からの血清
は、組み換え法で生産された35Ｓ−ＧＡＤ65を免疫沈降
させるが、一方組み換え法で生産された35Ｓ−ＧＡＤ67
は、患者ＤＡの血清のみによって認識された（そしてこ
れは35Ｓ−ＧＡＤ65よりも弱い）ことを示した。またそ
れ以後の研究で、神経病の合併症を有するＩＤＤＭ患者
の血清中には、ＧＡＤ65よりもＧＡＤ67自己抗体の力価
が大きいことが見いだされた（ここでは示さず）。
【０１１１】患者ＤＡの血清を用いる別の研究におい
て、ヒト膵臓小島細胞で生産される特異的ポリペプチド
を認識する抗体の存在が示された。結合ポリペプチドの
電気泳動分析によって、他の研究者によって以前にヒト
ＩＤＤＭ（Baekkeskov et al.,Nature, 298:167-169, 1
982) 及び動物モデル(Baekkeskov et al., Science, 22
4:1348-1350, 1984; Atkinson et al., Diabetes, 37:1
587-1590, 1988) で示されたような、６４ｋＤの成分
に対する自己抗体の存在が明らかとなった。ＧＡＤ65を
認識するが、ＧＡＤ67は認識しない、ＧＡＤ−６モノク
ローナルで、或いはバクテリアで生産されるＧＡＤ65で
これらの血清をあらかじめ吸着させると、６４ｋＤの膵
炎ポリペプチドを血清が認識する能力が失われる。従っ
て６４ｋＤの自己抗原に対する自己抗体によって認識さ
れるエピトープがＧＡＤ65中に存在し、このことは該自
己抗原がＧＡＤ65であることを示唆している。ＧＡＤ65
の予測される価値を研究するために、ＩＤＤＭの臨床的
発現の発病前の患者から血清を採取して、このＧＡＤ65
に対する自己抗体を調べた。
て、ヒト膵臓小島細胞で生産される特異的ポリペプチド
を認識する抗体の存在が示された。結合ポリペプチドの
電気泳動分析によって、他の研究者によって以前にヒト
ＩＤＤＭ（Baekkeskov et al.,Nature, 298:167-169, 1
982) 及び動物モデル(Baekkeskov et al., Science, 22
4:1348-1350, 1984; Atkinson et al., Diabetes, 37:1
587-1590, 1988) で示されたような、６４ｋＤの成分
に対する自己抗体の存在が明らかとなった。ＧＡＤ65を
認識するが、ＧＡＤ67は認識しない、ＧＡＤ−６モノク
ローナルで、或いはバクテリアで生産されるＧＡＤ65で
これらの血清をあらかじめ吸着させると、６４ｋＤの膵
炎ポリペプチドを血清が認識する能力が失われる。従っ
て６４ｋＤの自己抗原に対する自己抗体によって認識さ
れるエピトープがＧＡＤ65中に存在し、このことは該自
己抗原がＧＡＤ65であることを示唆している。ＧＡＤ65
の予測される価値を研究するために、ＩＤＤＭの臨床的
発現の発病前の患者から血清を採取して、このＧＡＤ65
に対する自己抗体を調べた。
【０１１２】
【表５】 表５に示すように、１２標本中の９標本（７５％）は35
Ｓ−ＧＡＤ65と免疫反応性であった。更に、２人の患者
（ＶＡ及びＶＣ）はこの条件下でＧＡＤ67と免疫反応性
であったが、ＧＡＤ65とは免疫反応性でなかった。従っ
て、組み合わせると、これらの患者の血清の１２例中、
１１例（９１％）にＧＡＤ65及びＧＡＤ67に対する自己
抗体が存在した。このことは、ＧＡＤ65に対する自己抗
体はＧＡＤ67に対する自己抗体よりも一般的であるが、
アッセイにおいて両方の組み換えＧＡＤ（ＧＡＤ65及び
ＧＡＤ67）を用いると、ＩＤＤＭをより広く予測できる
ようになることを示唆している。これらの血清について
の以前の試験（Atkinson et al., Langet, 335:1357-13
60, 1990) は、１２例のうちの１１例、又は９２％がヒ
ト膵臓小島細胞からの35Ｓ−６４ｋＤ分子と免疫反応性
であることを示している。６４ｋＤ分子に対する検出可
能な自己抗体を含むが、ＧＡＤ65に対する自己抗体は含
んでいない血清は、６４ｋＤ分子にとって最低の力価
（又は”１”）を含む血清であった。従って、ここで得
られた誤りの陰性はこのアッセイの感度が低いために起
きたことである。更に、このアッセイは、６４Ｋに対し
て陰性な１人の患者（ＢＲ）にＩＤＤＭを予測してい
る。
Ｓ−ＧＡＤ65と免疫反応性であった。更に、２人の患者
（ＶＡ及びＶＣ）はこの条件下でＧＡＤ67と免疫反応性
であったが、ＧＡＤ65とは免疫反応性でなかった。従っ
て、組み合わせると、これらの患者の血清の１２例中、
１１例（９１％）にＧＡＤ65及びＧＡＤ67に対する自己
抗体が存在した。このことは、ＧＡＤ65に対する自己抗
体はＧＡＤ67に対する自己抗体よりも一般的であるが、
アッセイにおいて両方の組み換えＧＡＤ（ＧＡＤ65及び
ＧＡＤ67）を用いると、ＩＤＤＭをより広く予測できる
ようになることを示唆している。これらの血清について
の以前の試験（Atkinson et al., Langet, 335:1357-13
60, 1990) は、１２例のうちの１１例、又は９２％がヒ
ト膵臓小島細胞からの35Ｓ−６４ｋＤ分子と免疫反応性
であることを示している。６４ｋＤ分子に対する検出可
能な自己抗体を含むが、ＧＡＤ65に対する自己抗体は含
んでいない血清は、６４ｋＤ分子にとって最低の力価
（又は”１”）を含む血清であった。従って、ここで得
られた誤りの陰性はこのアッセイの感度が低いために起
きたことである。更に、このアッセイは、６４Ｋに対し
て陰性な１人の患者（ＢＲ）にＩＤＤＭを予測してい
る。
【０１１３】これらの結果は、ヒト膵臓のβー細胞中に
同定された６４ｋＤは、ラットＧＡＤ65とサイズ及び抗
原性が同一であることを示している。更に、ＩＤＤＭ発
病前の患者から採取した血清は、ＧＡＤ65に対する自己
抗体を含んでいる。結論として、ＧＡＤ65組み換え分子
は、ＩＤＤＭ予測の診断手段として非常に有用である。
実際に症状がでる前に医師がＩＤＤＭを診断できるとい
うことは、疑いもなくインシュリン治療が必要となるま
での時間がおおいに伸びる結果となる。このような免疫
アッセイの感度は、膵臓のβー細胞に存在するＧＡＤ形
を表すヒト由来の組み換えＧＡＤ65を用いて改良される
であろう。
同定された６４ｋＤは、ラットＧＡＤ65とサイズ及び抗
原性が同一であることを示している。更に、ＩＤＤＭ発
病前の患者から採取した血清は、ＧＡＤ65に対する自己
抗体を含んでいる。結論として、ＧＡＤ65組み換え分子
は、ＩＤＤＭ予測の診断手段として非常に有用である。
実際に症状がでる前に医師がＩＤＤＭを診断できるとい
うことは、疑いもなくインシュリン治療が必要となるま
での時間がおおいに伸びる結果となる。このような免疫
アッセイの感度は、膵臓のβー細胞に存在するＧＡＤ形
を表すヒト由来の組み換えＧＡＤ65を用いて改良される
であろう。
【０１１４】実施例４ ポリペプチドへの免疫増殖応答 自動合成機（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社
製）と標準条件とを用いてポリペプチドを合成した。次
いでこれらのポリペプチドの、脾臓リンパ球及び小島侵
潤性Ｔリンパ球（ＩＩＴＬ）の増殖を刺激する相対的能
力を比較するために、これらのポリペプチドを試験し
た。この研究においては、ＧＡＤ65コア配列に由来する
ポリペプチドと、ポリオウィルスの相同領域に由来する
ポリペプチドとを比較した。適当な細胞をそれぞれのポ
リペプチドと共に５日間、５ｘ１０4 の照射脾臓細胞の
存在下に培養した。培養の最後の１６時間に 3Ｈ−チミ
ジンを加えた。
製）と標準条件とを用いてポリペプチドを合成した。次
いでこれらのポリペプチドの、脾臓リンパ球及び小島侵
潤性Ｔリンパ球（ＩＩＴＬ）の増殖を刺激する相対的能
力を比較するために、これらのポリペプチドを試験し
た。この研究においては、ＧＡＤ65コア配列に由来する
ポリペプチドと、ポリオウィルスの相同領域に由来する
ポリペプチドとを比較した。適当な細胞をそれぞれのポ
リペプチドと共に５日間、５ｘ１０4 の照射脾臓細胞の
存在下に培養した。培養の最後の１６時間に 3Ｈ−チミ
ジンを加えた。
【０１１５】
【表６】 これらの研究において、脾臓リンパ球の培養物の増殖活
性においては、ポリオウィルス又はＧＡＤ65ポリペプチ
ドのいずれと接触させたものにも有意の差は見られなか
った。しかしながら、いずれのポリペプチドも、コント
ロール培地に見られた応答よりも高いＴ細胞応答を刺激
した。脾臓細胞集団における差異がないことは、Ｔ細胞
に特異的なＧＡＤポリペプチドの頻度が低いことによる
ものかも知れない。
性においては、ポリオウィルス又はＧＡＤ65ポリペプチ
ドのいずれと接触させたものにも有意の差は見られなか
った。しかしながら、いずれのポリペプチドも、コント
ロール培地に見られた応答よりも高いＴ細胞応答を刺激
した。脾臓細胞集団における差異がないことは、Ｔ細胞
に特異的なＧＡＤポリペプチドの頻度が低いことによる
ものかも知れない。
【０１１６】同様の方法で評価したときのＩＩＴＬ集団
は、細胞増殖において顕著な差異を示した。このシステ
ムにおいては、ＧＡＤ65ポリペプチドに対する応答は、
培地又はポリオウィルスポリペプチドのいずれの応答よ
りも９倍大きかった。このデータはＧＡＤ65がＩＩＴＬ
集団におけるＴ細胞応答のための重要な抗原であること
を強く示唆している。このデータは糖尿病の病原学にお
いて分子擬態(mimicry) が一定の役割を果たしているこ
とを示唆している。
は、細胞増殖において顕著な差異を示した。このシステ
ムにおいては、ＧＡＤ65ポリペプチドに対する応答は、
培地又はポリオウィルスポリペプチドのいずれの応答よ
りも９倍大きかった。このデータはＧＡＤ65がＩＩＴＬ
集団におけるＴ細胞応答のための重要な抗原であること
を強く示唆している。このデータは糖尿病の病原学にお
いて分子擬態(mimicry) が一定の役割を果たしているこ
とを示唆している。
【０１１７】今や本発明は十分に説明されたので、当業
界で通常の知識をもった人には、本発明の範囲を逸脱す
ることなく、多くの変更や修飾が可能であることが明ら
かであろう。
界で通常の知識をもった人には、本発明の範囲を逸脱す
ることなく、多くの変更や修飾が可能であることが明ら
かであろう。
【図１】ＧＡＤ65及びＧＡＤ67特異的ｃＤＮＡプローブ
を得るためのクローニング計画を示す図である。
を得るためのクローニング計画を示す図である。
【図２】ラットＧＡＤ65のＤＮＡ配列及び対応するアミ
ノ酸配列を示す図である。（図３に続く）
ノ酸配列を示す図である。（図３に続く）
【図３】ラットＧＡＤ65のＤＮＡ配列及び対応するアミ
ノ酸配列を示す図である。（図４に続く）
ノ酸配列を示す図である。（図４に続く）
【図４】ラットＧＡＤ65のＤＮＡ配列及び対応するアミ
ノ酸配列を示す図である。
ノ酸配列を示す図である。
【図５】ヒトＧＡＤ65のＤＮＡ配列及び対応するアミノ
酸配列を示す図である。（図６に続く）
酸配列を示す図である。（図６に続く）
【図６】ヒトＧＡＤ65のＤＮＡ配列及び対応するアミノ
酸配列を示す図である。（図７に続く）
酸配列を示す図である。（図７に続く）
【図７】ヒトＧＡＤ65のＤＮＡ配列及び対応するアミノ
酸配列を示す図である。（図８に続く）
酸配列を示す図である。（図８に続く）
【図８】ヒトＧＡＤ65のＤＮＡ配列及び対応するアミノ
酸配列を示す図である。
酸配列を示す図である。
【図９】ラットＧＡＤ65とヒトＧＡＤ65アミノ酸配列の
比較を示す図である。（図１０に続く）
比較を示す図である。（図１０に続く）
【図１０】ラットＧＡＤ65とヒトＧＡＤ65アミノ酸配列
の比較を示す図である。
の比較を示す図である。
【図１１】ＧＡＤ65及びＧＡＤ67ｃＤＮＡの異なるサイ
ズのＲＮＡへのハイブリダイズを示す図である。
ズのＲＮＡへのハイブリダイズを示す図である。
【図１２】ＧＡＤ65及びＧＡＤ67に特異的なｃＤＮＡプ
ローブでハイブリダイズしたサザンブロットを示す図で
ある。
ローブでハイブリダイズしたサザンブロットを示す図で
ある。
【図１３】ＧＡＤ65及びＧＡＤ67の免疫学的同定を示す
図である。
図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ０７Ｋ 14/00 Ｃ１２Ｎ 9/04 Ｚ 9359−4Ｂ Ｃ１２Ｐ 21/08 9161−4Ｂ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ 33/573 Ａ // Ａ６１Ｋ 38/00 ＡＢＣ (Ｃ１２Ｎ 9/04 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 マーク ジー アーランダー アメリカ合衆国、カリフォルニア州 92024、エンシィニタス、ヴィア テラッ サ 1352 (72)発明者 ダニエル エル カーフマン アメリカ合衆国、カリフォルニア州 90404、サンタモニカ、エーピーティー. Ｃ、センティネラ 1453 (72)発明者 マイケル ジェイ クラレ−サルズラー アメリカ合衆国、カリフォルニア州 90068、ロサンジェルス、フロイド テラ ス 3333
Claims (11)
- 【請求項１】 以下のアミノ酸配列を有する単離された
ポリペプチド、又はその類似体、化学誘導体、若しくは
医薬的に許容される塩。 Ｘ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｙ−Ｌｙｓ−Ｚ （式中、Ｘは１から１０個のアミノ酸から選択されるア
ミノ酸配列であるか、或いは省略されており；ＹはＴｈ
ｒ又はＧｌｕであり；そしてＺは１から８個のアミノ酸
から選択されるアミノ酸配列であるか、或いは省略され
ている） - 【請求項２】 ＸがＬｙｓを含み、ＹがＧｌｕであり、
そしてＺがＬｅｕを含む、請求項１に記載のポリペプチ
ド。 - 【請求項３】 Ｘが更にＭｅｔを含み、そしてＺが更に
Ａｒｇ及びＬｅｕを含む、請求項２に記載のポリペプチ
ド。 - 【請求項４】 ＸがＬｙｓを含み、ＹがＴｈｒであり、
そしてＺがＬｅｕを含む、請求項１に記載のポリペプチ
ド。 - 【請求項５】 Ｘがアミノ酸配列Ａｌａ−Ｍｅｔ−Ｍｅ
ｔ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ｍｅｔ
−Ｐｈｅであり、そしてＺがアミノ酸配列Ｇｌｙ−Ｍｅ
ｔ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ
である、請求項３に記載のポリペプチド。 - 【請求項６】 Ｘがアミノ酸配列Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｍｅ
ｔ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ
−Ｐｈｅ−であり、そしてＺがアミノ酸配列Ｇｌｙ−Ｍ
ｅｔ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｌｅ
ｕである、請求項４に記載のポリペプチド。 - 【請求項７】 請求項１に記載のポリペプチドをコード
する単離されたポリヌクレオチド配列。 - 【請求項８】 ＤＮＡである、請求項７に記載のポリヌ
クレオチド。 - 【請求項９】 ｃＤＮＡである、請求項８に記載のポリ
ヌクレオチド。 - 【請求項１０】 請求項１のポリペプチドに対する抗
体。 - 【請求項１１】 モノクローナル抗体である、請求項１
０に記載の抗体。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US71690991A | 1991-06-18 | 1991-06-18 | |
| US716909 | 1991-06-18 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0770182A true JPH0770182A (ja) | 1995-03-14 |
| JP4072922B2 JP4072922B2 (ja) | 2008-04-09 |
Family
ID=24879950
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP15819592A Expired - Lifetime JP4072922B2 (ja) | 1991-06-18 | 1992-06-17 | クローン化グルタミン酸デカルボキシラーゼ |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (2) | EP0519469B1 (ja) |
| JP (1) | JP4072922B2 (ja) |
| KR (1) | KR100262247B1 (ja) |
| AT (2) | ATE207537T1 (ja) |
| AU (1) | AU661684B2 (ja) |
| CA (1) | CA2070004C (ja) |
| DE (2) | DE69233685T2 (ja) |
| DK (1) | DK0519469T3 (ja) |
| ES (2) | ES2281317T3 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH07285996A (ja) * | 1994-01-20 | 1995-10-31 | Boehringer Mannheim Gmbh | 抗原特異的活性化ｔリンパ球、その検出及び使用 |
Families Citing this family (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5674978A (en) * | 1990-09-21 | 1997-10-07 | The Regents Of The University Of California | Peptides derived from glutamic acid decarboxylase |
| DK88093D0 (da) * | 1993-07-28 | 1993-07-28 | Novo Nordisk As | Stabilt praeparat |
| DE19525784A1 (de) * | 1995-07-14 | 1997-01-16 | Boehringer Mannheim Gmbh | Autoreaktive Peptide aus der humanen Glutamin-Decarboxylase (GAD) |
| EP0869815A1 (en) * | 1995-09-21 | 1998-10-14 | University Of Utah Research Foundation | Targeting of conjugates of poly(ethylene glycol) and antibodies against glutamic acid decarboxylase to islet cells |
| CA2601208C (en) * | 2000-04-17 | 2009-12-15 | Loma Linda University | Method of preventing or treating type 1 diabetes by gene therapy with a secreted form of glutamic acid decarboxylase. |
| GB0105360D0 (en) * | 2001-03-03 | 2001-04-18 | Glaxo Group Ltd | Chimaeric immunogens |
| US20030054414A1 (en) * | 2001-09-17 | 2003-03-20 | George Jackowski | Diagnosis and treatment of early pre-type-1 diabetes utilizing glial fibrillary acidic protein |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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| ES2093714T3 (es) * | 1990-08-17 | 1997-01-01 | Univ Florida | Metodos y composiciones para la deteccion y el tratamiento precoces de la diabetes mellitus insulinodependiente. |
| DK0547164T3 (da) * | 1990-09-07 | 2004-10-25 | Univ California | Fremgangsmåder til diagnosticering og behandling af diabetes |
| EP0572478B1 (en) * | 1991-02-22 | 2005-09-07 | The Walter And Eliza Hall Institute Of Medical Research | Hbgad and higad polypeptides and nucleic acids and their use for the diagnosis and treatment of gad autoantigen associated diseases |
-
1992
- 1992-04-24 AU AU15163/92A patent/AU661684B2/en not_active Expired
- 1992-06-01 CA CA002070004A patent/CA2070004C/en not_active Expired - Lifetime
- 1992-06-17 ES ES00102229T patent/ES2281317T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1992-06-17 DK DK92110308T patent/DK0519469T3/da active
- 1992-06-17 EP EP92110308A patent/EP0519469B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1992-06-17 EP EP00102229A patent/EP1026238B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1992-06-17 JP JP15819592A patent/JP4072922B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1992-06-17 AT AT92110308T patent/ATE207537T1/de active
- 1992-06-17 DE DE69233685T patent/DE69233685T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1992-06-17 ES ES92110308T patent/ES2165350T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1992-06-17 AT AT00102229T patent/ATE355364T1/de not_active IP Right Cessation
- 1992-06-17 KR KR1019920010714A patent/KR100262247B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1992-06-17 DE DE69232147T patent/DE69232147T2/de not_active Expired - Lifetime
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH07285996A (ja) * | 1994-01-20 | 1995-10-31 | Boehringer Mannheim Gmbh | 抗原特異的活性化ｔリンパ球、その検出及び使用 |
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