DE69233685T2

DE69233685T2 - Klonierte Glutaminsäure-Decarboxylase

Info

Publication number: DE69233685T2
Application number: DE69233685T
Authority: DE
Inventors: Allan J. Los Angeles Tobin; Mark G. R.W. Johnson San Diego Erlander; Daniel L. Santa Monica Kaufman; Michael J. Los Angeles Clare-Salzler
Original assignee: University of California
Current assignee: University of California
Priority date: 1991-06-18
Filing date: 1992-06-17
Publication date: 2007-12-06
Anticipated expiration: 2012-06-18
Also published as: DE69232147T2; JP4072922B2; DK0519469T3; DE69232147D1; CA2070004C; EP1026238A3; ES2281317T3; EP0519469A1; KR100262247B1; AU661684B2; EP1026238A2; EP1026238B1; ATE355364T1; JPH0770182A; DE69233685D1; AU1516392A; EP0519469B1; CA2070004A1; KR930000684A; ATE207537T1

Description

Die Beschreibung der vorliegenden Erfindung betrifft die Anwendung der DNA-Rekombinationstechnik zur Transformation eines Wirtsorganismus mit Glutaminsäure-Decarboxylase₆₅ (GAD₆₅) zur Expression von GAD₆₅-abgeleiteten Polypeptiden. Ebenfalls beschrieben sind Verfahren zur diagnostischen und therapeutischen Verwendung von GAD₆₅-Polypeptiden bei Autoimmunkrankheiten.
Insulinabhängiger Diabetes mellitus (IDDM; Typ I-Diabetes) ist eine der häufigsten Stoffwechselstörungen. In den Vereinigten Staaten befällt IDDM etwa einen Mensch von 300 bis 400 Menschen, und epidemiologische Studien legen nahe, dass seine Häufigkeit zunimmt. Die Erkrankung wird durch die autoimmune Zerstörung der insulinproduzierenden β-Zellen der Bauchspeicheldrüse verursacht. Insbesondere ist das Stadium vor dem Ausbruch durch eine "Insulitis" gekennzeichnet, bei der Lymphocyten die Pankreasinseln infiltrieren und die β-Zellen selektiv zerstören. Die typische IDDM-Darstellung einer Hyperglykämie tritt nur auf, nachdem mindestens 80% der insulinproduzierenden β-Zellen untergegangen sind. Die restlichen β-Zellen werden dann innerhalb einiger Jahre zerstört.
Obwohl eine Insulintherapie den meisten IDDM-Patienten erlaubt, ein normales Leben zu führen, ist dieser Ersatz unzureichend und stellt die metabolische Homöostase nicht wieder vollständig her. So sind schwere Komplikationen, welche zu Fehlfunktionen des Auges, der Niere, des Herzens und anderer Organe führen, bei IDDM-Patienten häufig, die sich einer Insulintherapie unterziehen. Infolge dessen ist es besonders wünschenswert, die Latenzzeit (z.B. durch Verabreichung von immunsuppressiven Wirkstoffen) zwischen dem Beginn der β-Zellzerstörung und dem eigentlichen Erfordernis eines Insulinersatzes (d.h. wenn 80% der β-Zellen zerstört sind) zu verlängern. Daher würde ein diagnostischer Test, der den Beginn der β-Zellzerstörung feststellt, dem Kliniker erlauben, immunsuppressive Wirkstoffe zu verabreichen (Silverstein et al., New England Journal of Medicine 319 (1988), 599-604), um diese Latenzzeit zu verlängern und auf diese Weise das Auftreten von Nebenwirkungen infolge des Insulinersatzes erheblich zu verzögern.
Viele IDDM-Patienten weisen Seren auf, die Antikörper gegen ein 64 kD-Molekül (Baekkeskov et al., J. Clin. Invest. 79 (1987), 926-934; Atkinson et al., Lancet 335 (1990), 1357-1360) gegen cytoplasmatische Inselzellen (ICA)-Moleküle oder Inselzellenoberflächen (ICSA)-Moleküle (Bottazzo et al., Lancet 1 (1980), 668-672) oder gegen Insulin (Palmer et al., Science 222 (1983), 1137-1139; Atkinson et al., Diabetes 35 (1986), 894-898) enthalten. Atkinson und Mitarbeiter (Atkinson et al., Lancet 335 (1990), 1357-1360) haben gezeigt, dass die Anwesenheit von Antikörpern gegen das 64 kD-Molekül in menschlichen Seren der früheste und zuverlässigste Indikator für das anschließende Auftreten von IDDM-Symptomen zu sein scheint.
Vor kurzem wiesen Baekkeskov und Mitarbeiter nach, dass das 64 kD-Molekül und Glutaminsäure-Decarboxylase (GAD) mehrere Antigenepitope gemeinsam haben und es sich so bei ihnen um identische oder sehr ähnliche Moleküle handeln kann. Obwohl diese Identifizierung eine wichtige Entdeckung ist, ist die Verwendung dieser Information als ein diagnostisches Hilfsmittel zur Voraussage von IDDM sehr arbeitsintensiv und begrenzt, wenn die Molekularbiologie der GAD unbekannt ist. Folglich erlaubt die Clonierung und anschließende Herstellung großer Mengen des 64 kD-Moleküls oder eines GAD-Moleküls, das antigenisch mit dem 64 kD-Molekül im Wesentlichen identisch ist, die Entwicklung eines diagnostischen Kits, der zur Voraussage von IDDM bestimmt ist. Die vorliegende Erfindung stellt ein Mittel für das Erreichen dieses Ergebnisses bereit.
Die vorliegende Erfindung ging aus der Entdeckung hervor, dass die DNA-Rekombinationstechnik angewendet werden könnte, um eukaryontische GAD₆₅-Polypeptide herzustellen, und dass GAD₆₅-Polypeptide bei der Diagnose und Therapie von Patienten mit Autoimmunkrankheiten verwendet werden könnten. Besonders relevant ist die Verwendung von clonierten, eukaryontischen GAD₆₅-Polypeptiden bei der Diagnose bei Patienten, die an insulinabhängigem Diabetes mellitus (IDDM) leiden oder für die ein Risiko besteht, IDDM zu entwickeln.
Ein wesentlicher Vorteil der vorliegenden Erfindung besteht darin, dass sie der Fachwelt eine verfügbare Quelle eukaryontischer GAD₆₅-Polypeptide bereitstellt, die denen, die aus aus natürlichen Quellen gereinigt werden, entsprechen, während die Probleme vermieden werden, die mit der Isolierung natürlich vorkommender eukaryontischer GAD₆₅-Polypeptide verbunden sind, wenn diese von anderen eukaryontischen nicht-GAD₆₅-Polypeptiden getrennt werden. Die Abwesenheit anderer eukaryontischer nicht-GAD₆₅-Polypeptide ist in sofern von Bedeutung, als dies die Entwicklung von Testsystemen erlaubt, die nur solche Antikörper nachweisen, die spezifisch mit GAD₆₅-Polypeptiden reaktiv sind.
Ein weiterer Vorteil der Bereitstellung eukaryontischer GAD₆₅-Polypeptide in Wirtszellen ist, dass es auf diese Weise möglich ist, viel größere Mengen des Polypeptids zu erhalten, als gegenwärtig aus natürlichen Quellen praktisch verfügbar sind. Als Folge davon ist es nicht nur möglich, die erfindungsgemäßen Polypeptide zur genaueren Klassifizierung von Patienten mit solchen Autoimmunkrankheiten, wie IDDM, zu verwenden, sondern es ist nun auch möglich, kommerziell verwendbare Mengen von GAD₆₅-Polypeptiden zur Verwendung in diagnostischen Systemen bereitzustellen.
1: Clonierungsstrategie zum Erhalt von GAD₆₅- und GAD₆₇-spezifischen cDNA-Sonden.
2: DNA-Sequenz und entsprechende Aminosäuresequenz für Ratten-GAD₆₅.
3: DNA-Sequenz und entsprechende Aminosäuresequenz für menschliche GAD₆₅.
4: Vergleich der Aminosäuresequenzen von Ratten-GAD₆₅ und menschlicher GAD₆₅.
5: GAD₆₅- und GAD₆₇-cDNAs hybridisieren mit RNAs unterschiedlicher Größe.
6: Southern-Blots, hybridisiert mit cDNA-Sonden, die für GAD₆₅ und GAD₆₇ spezifisch sind.
7: Immunologische Identifizierung von GAD₆₅ und GAD₆₇.
Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung die verschiedenen Verwendungen eines Polypeptids, wie in den angefügten Ansprüchen definiert.
Die Beschreibung der vorliegenden Erfindung betrifft die Manipulation genetischer Materialien durch Rekombinationsverfahren, welche die Herstellung von Polypeptiden ermöglichen, die einen Teil der primären Strukturkonformation für eines oder mehrere der Epitope zur Bindung von Autoantikörpern gegen Glutaminsäure-Decarboxylase₆₅ (GAD₆₅) aufweisen. Diese Polypeptide sind zum immunologischen Nachweis von Autoantikörpern, die mit ihnen reaktiv sind, besonders nützlich, da solche Autoantikörper auf Autoimmunkrankheiten wie insulinabhängiger Diabetes mellitus und das "Stiff man"-Syndrom hinweisen. Diese Polypeptide können auch zur Durchmusterung von Wirkstoffen wie solchen, die die GAD-Funktion verändern, und zur Erzeugung von polyclonalen und monoclonalen Antikörpern, die wiederum diagnostisch zum Nachweis von GAD₆₅ verwendet werden können, verwendet werden.
Die Entwicklung spezifischer DNA-Sequenzen, die eukaryontische GAD₆₅Polypeptide codieren, zum Spleißen in DNA-Vektoren kann unter Anwendung einer Vielzahl von Techniken erreicht werden. Zum Beispiel schließen alternative Verfahren, die angewendet werden können, (1) die Isolierung einer doppelsträngigen DNA-Sequenz aus der genomischen DNA des Eukaryonten; (2) die chemische Herstellung einer DNA-Sequenz zur Bereitstellung der erforderlichen Codons für das Polypeptid von Interesse; und (3) die in vitro-Synthese einer doppelsträngigen DNA-Sequenz durch reverse Transkription einer mRNA, die aus einer eukaryontischen Donorzelle isoliert wurde, ein. Im letzteren Fall wird anschließend ein doppelsträngiger DNA-Komplementärstrang der mRNA gebildet, der im Allgemeinen als cDNA bezeichnet wird.
Die Herstellung von DNA-Sequenzen ist häufig das Verfahren der Wahl, wenn die gesamte Sequenz der Aminosäurereste des gewünschten Polypeptidprodukts bekannt ist. Wenn nicht die gesamte Sequenz der Aminosäurereste des gewünschten Polypeptidprodukts bekannt ist, ist die direkte Herstellung von DNA-Sequenzen nicht möglich, und das Verfahren der Wahl ist die Erzeugung von cDNA-Sequenzen. Unter den Standardverfahren zur Isolierung von cDNA-Sequenzen von Interesse befindet sich die Erzeugung plasmidtragender cDNA-Banken, die durch reverse Transkription von mRNA abgeleitet werden, die in Donorzellen, die eine hohe genetische Expressionsrate aufweisen, in großer Zahl vorhanden ist. Bei der Anwendung in Kombination mit der Polymerasekettenreaktionstechnik können auch seltene Expressionsprodukte cloniert werden. In solchen Fällen, wo wesentliche Teile der Aminosäuresequenz des Polypeptids bekannt sind, kann die Herstellung von markierten einzel- oder doppelsträngigen DNA- oder RNA-Sondensequenzen unter Vervielfältigung einer Sequenz, die vermutlich in der Ziel-cDNA vorhanden ist, in DNA/DNA-Hybridisierungsverfahren verwendet werden, die mit clonierten Kopien der cDNA ausgeführt werden, die zu einer einzelsträngigen Form denaturiert wurden (Jay et al., Nucleic Acids Research 11 (1983), 2325).
Hybridisierungsverfahren sind zur Durchmusterung von rekombinanten Clonen durch Verwendung von markierten, gemischten, synthetischen Oligonucleotidsonden nützlich, wobei jede möglicherweise den vollständigen Komplementärstrang einer spezifischen DNA-Sequenz in der Hybridisierungsprobe darstellt, die ein heterogenes Gemisch aus denaturierter doppelsträngiger DNA einschließt. Für eine solche Durchmusterung wird die Hybridisierung vorzugsweise mit entweder einzelsträngiger DNA oder denaturierter doppelsträngiger DNA durchgeführt. Diese Verfahren sind insbesondere beim Nachweis von cDNA-Clonen nützlich, die von Quellen stammen, wo eine äußerst geringe Menge der mRNA-Sequenzen, die mit dem Polypeptid von Interesse in Beziehung stehen, vorhanden ist. Anders ausgedrückt macht die Verwendung stringenter Hybridisierungsbedingungen, die auf die Vermeidung einer unspezifischen Bindung ausgerichtet sind, zum Beispiel die autoradiographische Sichtbarmachung eines spezifischen cDNA-Clons durch die Hybridisierung der Ziel-DNA mit der einzigen Sonde in dem Gemisch, die deren vollständigen Komplementärstrang darstellt, möglich (Wallace et al., Nucleic Acid Research 9 (1981), 879).
Außerdem kann eine GAD-cDNA-Bank durch Injizieren der verschiedenen cDNAs in Oocyten, Ermöglichen der Expression der cDNA-Genprodukte für einen ausreichenden Zeitraum und Testen auf die Anwesenheit des gewünschten cDNA-Expressionsprodukts, zum Beispiel durch Verwendung eines Antikörpers, der für das GAD₆₅-Polypeptid spezifisch ist, oder durch Verwendung funktioneller Tests auf eine GAD₆₅-Enzymaktivität, durchmustert werden.
In einer anderen Ausführungsform kann eine cDNA-Bank indirekt auf GAD₆₅-Peptide mit mindestens einem Epitop unter Verwendung von Antikörpern gegen GAD₆₅ durchmustert werden (Chang und Gottlieb, J. Neurosci. 8 (1988), 2123). Solche Antikörper können entweder polyclonal oder monoclonal abgeleitet und zum Nachweis eines Expressionsprodukts, das auf die Anwesenheit einer GAD₆₅-cDNA hinweist, verwendet werden. Bevorzugt werden Antikörper, die gegen ein Epitop gerichtet sind, das in den ersten 100 Aminosäuren des N-terminalen Teils von GAD₆₅ vorkommt.
Von den drei vorstehend angeführten Verfahren zur Entwicklung spezifischer DNA-Sequenzen zur Verwendung in Rekombinationsverfahren ist die Verwendung genomischer DNA-Isolate das am wenigsten gebräuchlichste. Dies trifft insbesondere zu, wenn es wünschenswert ist, die mikrobielle Expression von Säuger-Polypeptiden wegen der Anwesenheit von Introns zu erreichen.
Die Beschreibung der vorliegenden Erfindung betrifft neue Polypeptide von GAD₆₅, die einen Teil der primären Strukturkonformation oder die gesamte primäre Strukturformation, dass heißt eine zusammenhängende Sequenz von Aminosäureresten mit mindestens einem Epitop für Antikörper gegen GAD₆₅, aufweisen.
Es ist möglich, die erfindungsgemäßen Polypeptidfragmente eher als intakte GAD₆₅ zum Nachweis von Autoantikörpern gegen GAD₆₅ zu verwenden. Der Begriff "Polypeptid", so wie er auf ein GAD₆₅-Polypeptid angewendet wird, bezeichnet eine Sequenz von Aminosäuren mit einem Epitop für Autoantikörper gegen GAD₆₅, wobei die Sequenz von Aminosäuren von der gesamten erfondungsgemäßen cDNA-Sequenz oder einem Teil davon cDNA-Sequenzen codiert wird.
Die aus der mikrobiellen Expression der erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen resultierenden Polypeptide können ferner durch ihre Unabhängigkeit von der Assoziation mit anderen eukaryontischen Polypeptiden oder anderen Verunreinigungen, die sonst mit GAD₆₅ in deren natürlichen zellulären Umgebung oder in solchen extrazellulären Flüssigkeiten wie Plasma oder Urin assoziiert sein könnten, gekennzeichnet werden.
Studien der hier genannten Erfinder stellen eindeutig fest, dass GAD₆₅ und GAD₆₇ von verschiedenen Genen codiert werden und zum Beispiel nicht durch posttranskriptionelle oder posttranslationale Modifikation einer gemeinsamen genomischen Sequenz hergestellt werden. Die Beweise, die bestätigen, dass GAD₆₅ und GAD₆₇ von verschiedenen Genen codiert werden, umfassen: (a) die größte zusammenhängende Sequenz genauer Gleichartigkeit zwischen GAD₆₅- und GAD₆₇-cDNAs ist nur 17 Nucleotide lang, (b) cDNAs von GAD₆₅ und GAD₆₇ kreuzhybridisieren nicht miteinander oder mit mRNA von einander unter Bedingungen geringer Stringenz (2,0 × SSC, 0,01 % SDS, 23°C), und (c) GAD₆₅- und GAD₆₇-cDNAs kreuzhybridisieren nicht mit isolierten genomischen Clonen, die GAD₆₇ bzw. GAD₆₅ codieren.
Der Begriff "Wirt" soll nicht nur Prokaryonten, sondern auch solche Eukaryonten, wie Hefe, fadenförmige Pilze sowie pflanzliche und tierische Zellen, die eine intronfreie DNA-Sequenz einer eukaryontischen GAD₆₅ replizieren können, einschließen. Jedoch werden Prokaryonten als Wirtsorganismus bevorzugt.
Der Begriff "Prokaryonten" soll alle Bakterien einschließen, die mit dem Gen zur Expression von GAD₆₅ transformiert oder transfiziert werden können. Prokaryontische Wirte können Gram-negative sowie Gram-positive Bakterien, wie zum Beispiel E. coli, S. typhimurium, Serratia marcescens und Bacillus subtilis, einschließen.
Ein rekombinantes DNA-Molekül, das die GAD₆₅-Polypeptide codiert, kann zur Transformation oder Transfektion des Wirtes unter Anwendung eines beliebigen der dem Fachmann üblicherweise bekannten Verfahren verwendet werden. Besonders bevorzugt wird die Verwendung eines Plasmids oder eines Virus, das die GAD₆₅-codierende Sequenz enthält, zum Zwecke der prokaryontischen Transformation bzw. Transfektion.
Verfahren zur Herstellung von fusionierten, funktionell verbundenen Genen und zur ihrer Expression in Bakterien sind im Fachgebiet gut bekannt (Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1989). Die darin beschriebenen genetischen Konstrukte und Verfahren können zur Expression von GAD₆₅ in prokaryontischen Wirten verwendet werden.
Im Allgemeinen werden in Verbindung mit dem Wirt Expressionsvektoren verwendet, die Promotorsequenzen enthalten, welche die effiziente Transkription der inserierten, eukaryontischen, genetischen Sequenz ermöglichen. Der Expressionsvektor enthält typischerweise einen Replikationsursprung, einen Promotor und einen Terminator sowie spezifische Gene, die fähig sind, die phänotypische Selektion der transformierten Zellen vorzusehen. Die transformierten prokaryontischen Wirte können in Fermentern gezüchtet und gemäß den auf dem Fachgebiet bekannten Verfahren kultiviert werden, um ein optimales Zellwachstum zu erzielen. Die hier beschriebenen Polypeptide können dann aus dem Wachstumsmedium, aus Zelllysaten oder aus Zellmembranfraktionen isoliert werden.
Die Isolierung und Reinigung der hierin beschriebenen, mikrobiell exprimierten Polypeptide können durch ein herkömmliches Verfahren, wie zum Beispiel präparative chromatographische Trennungen und immunologische Trennungen, wie diejenigen, welche die Verwendung eines monoclonalen oder polyclonalen Antikörpers einschließen, erfolgen.
Durch die Bereitstellung der Sequenz von Aminosäureresten der GAD₆₅ beschreibt die Beschreibung der vorliegenden Erfindung die Herstellung von DNA-Sequenzen, die die Wirtsexpression von Polypeptidanaloga oder -derivaten von GAD₆₅ codieren, die sich von natürlich vorkommenden Formen im Hinblick auf die Übereinstimmung oder die Lage eines Aminosäurerestes oder mehrerer Aminosäurereste unterscheiden und die einige oder alle Epitope von natürlich vorkommenden Polypeptidformen gemeinsam haben.
Die neuen DNA-Sequenzen schließen alle Sequenzen ein, welche bei der Bereitstellung der Expression von Polypeptiden, die mindestens einen Teil der primären Strukturkonformation für ein Epitop oder für mehrere Epitope aufweisen, das oder die fähig ist oder sind, mit Autoantikörpern gegen GAD₆₅ zu reagieren, in prokaryontischen oder eukaryontischen Wirtszellen nützlich sind, umfassend: (a) die in 2 oder 3 angegebene DNA-Sequenz oder deren komplementären Stränge; (b) DNA-Sequenzen, die mit in (a) definierten DNA-Sequenzen hybridisieren, oder Fragmente davon; und (c) DNA-Sequenzen, die bis auf die degenerierten Stellen im genetischen Code mit den vorstehend in (a) und (b) definierten DNA-Sequenzen hybridisieren würden. Insbesondere eingeschlossen in (b) sind genomische DNA-Sequenzen, die allelische Variantenformen von GAD₆₅ codieren. Teil (c) schließt insbesondere die Herstellung von DNA-Sequenzen ein, die GAD₆₅, GAD₆₅-Fragmente und GAD₆₅-Analoga codieren, wobei die DNA-Sequenzen davon Codons einschließen können, welche die Translation von mRNA in Nicht-Wirbeltierwirten ermöglichen.
Da die hierin beschriebene cDNA-Sequenz im Wesentlichen das vollständige GAD₆₅-Molekül vom Menschen oder von der Ratte codiert, ist es nunmehr möglich, routinemäßig kleinere Polypeptidfragmente von dieser cDNA oder einer entsprechenden cDNA-Sequenzen herzustellen, zu subclonieren und zu exprimieren, die lediglich ein Epitop für Autoantikörper gegen GAD₆₅ des Menschen oder der Ratte codieren würden. Das Vorhandensein eines solchen Epitops auf einem clonierten Polypeptid kann zum Beispiel unter Verwendung von Seren von einem Patienten mit Autoantikörpern gegen GAD₆₅ bestätigt werden. Ein Beispiel eines kleinen Peptids sind die ersten etwa 100 Aminosäuren des N-Terminus von GAD₆₅ (in 3 gezeigt). Diese Aminosäuresequenz kommt in GAD₆₇ im Wesentlichen nicht vor.
Die hierin beschriebene GAD₆₅ ist insbesondere zur Verwendung in Immuntests geeignet, in denen sie in flüssiger Phase oder gebunden an einen Festphasenträger verwendet werden kann. Außerdem kann die in diesen Tests verwendete GAD₆₅ auf verschiedenartige Weise nachweisbar markiert werden.
Beispiele von Immuntests, die die GAD₆₅ verwenden können, sind kompetitive und nicht kompetitive Immuntests in entweder einer direkten oder indirekten Anordnung. Beispiele solcher Immuntests sind der Radioimmuntest (RIA), der Sandwich-Test (immunometrischer Test) und der Western-Blot-Test. Der Nachweis von Antikörpern, die an GAD₆₅ binden, kann unter Verwendung von Immuntests durchgeführt werden, die in entweder fortschreitender, umgekehrter oder gleichzeitiger Weise durchgeführt werden, einschließlich immunhistochemischer Tests bei physiologischen Proben. Die verwendete Konzentration der GAD₆₅ variiert in Abhängigkeit vom Typ des Immuntests und der Art des nachweisbaren Markers, der verwendet wird. Jedoch kann die verwendete Konzentration von GAD₆₅ unabhängig vom Typ des Immuntests, der verwendet wird, vom Fachmann in einfacher Weise durch routinemäßiges Experimentieren bestimmt werden.
Die GAD₆₅ kann an viele verschiedene Träger gebunden und zum Nachweis der Anwesenheit eines Antikörpers verwendet werden, der spezifisch mit dem Polypeptid reagiert. Beispiele gut bekannter Träger schließen Glas, Polystyrol, Polyvinylchlorid, Polypropylen, Polyethylen, Polycarbonat, Dextran, Nylon, Amylosen, natürliche und modifizierte Cellulosen, Polyacrylamide, Agarosen und Magnetit ein. Der Träger kann für die Zwecke der Erfindung entweder löslicher oder unlöslicher Art sein. Den Fachleuten sind andere geeignete Träger zur Bindung von GAD₆₅ bekannt, oder sie sind in der Lage, solche durch routinemäßiges Experimentieren festzustellen.
Es gibt viele verschiedene Markierungen und Markierungsverfahren, die den Fachleuten bekannt sind. Beispiele der Markierungsarten, die erfindungsgemäß verwendet werden können, schließen Enzyme, Radioisotope, kolloidale Metalle, fluoreszierende Verbindungen, chemolumineszierende Verbindungen und biolumineszierende Verbindungen ein.
In einer anderen Ausführungsform kann das hierin beschriebene Polypeptid zum Nachweis von Antikörpern gegen GAD₆₅ durch Messung der GAD-Enzymaktivität verwendet werden. Zum Beispiel können GAD₆₅ und eine Probe, die im Verdacht steht, Antikörper gegen GAD₆₅ aufzuweisen, für einen Zeitraum und unter Bedingungen inkubiert werden, die ausreichend sind, um die Bindung zwischen GAD₆₅ und den Antikörpern zuzulassen. Das Reaktionsprodukt wird ausgefällt und dann auf eine GAD-Enzymaktivität getestet.
Für die Zwecke der Erfindung kann der Antikörper, der an GAD₆₅ bindet, in verschiedenen biologischen Flüssigkeiten und Geweben vorhanden sein. Jede Probe, die eine nachweisbare Menge von Antikörpern gegen GAD₆₅ enthält, kann verwendet werden. Normalerweise ist die Probe eine Flüssigkeit, wie Urin, Speichel, Rückenmarksflüssigkeit, Blut, Serum oder ähnliches, oder eine feste oder halbfeste Probe, wie Gewebe, Kot und ähnliches.
Die Materialien zur Verwendung in dem erfindungsgemäßen Test sind idealerweise zur Herstellung eines Kits geeignet. Ein solcher Kit kann einen Träger umfassen, der in Kompartimente unterteilt ist, um ein Behältnis oder mehrere Behältnisse, wie Fläschchen, Röhrchen und ähnliches, auf engem Raum aufzunehmen, wobei jedes der Behältnisse eines der in dem Verfahren verwendeten verschiedenen Elemente umfasst. Zum Beispiel kann eines der Behältnisse GAD₆₅ gebunden an einen Träger umfassen. Ein zweites Behältnis kann einen löslichen, nachweisbar markierten Sekundärantikörper in gefriergetrockneter Form oder in Lösung umfassen.
Außerdem kann das Behältnis auch eine Vielzahl von Behältnissen enthalten, wobei jedes davon unterschiedliche, zuvor bestimmte Mengen von GAD₆₅ umfasst. Diese letzteren Behältnisse können dann verwendet werden, um eine Standardkurve aufzustellen, in die die Ergebnisse interpoliert werden können, die mit der eine unbekannte Menge an Autoantikörper gegen GAD₆₅ enthaltenden Probe erhalten werden.
Bei der Verwendung des Kits muss der Anwender nur eine vorher abgemessene Menge einer Probe, enthaltend eine messbare, noch unbekannte Menge von Autoantikörpern gegen GAD₆₅, die nachgewiesen werden soll, eine vorher abgemessene Menge einer trägergebundenen GAD₆₅, die in dem ersten Behältnis vorhanden ist, und eine vorher abgemessene Menge des nachweisbar markierten Sekundärantikörpers, der in dem zweiten Behältnis vorhanden ist, in ein Behältnis geben. In einer anderen Ausführungsform kann die nicht nachweisbar markierte GAD₆₅ gebunden an das Behältnis, zu dem die Probe und der nachweisbar markierte Sekundärantikörper zugegeben werden, bereitgestellt werden. Nach einem geeigneten Inkubationszeitraum bildet sich ein Immunkomplex, der von der Überstandsflüssigkeit abgetrennt wird, und der Immunkomplex oder die Überstandsflüssigkeit wird nachgewiesen, z.B. durch Messung der Radioaktivität oder durch Zugabe eines Enzymsubstrats und eine Farbentwicklung.
Der Begriff "bessern" bedeutet eine Linderung der schädlichen Wirkung der Autoimmunantwort in dem Patienten, der eine Therapie erhält. Der Begriff "therapeutisch wirksam" bedeutet, dass die verwendete Menge des GAD₆₅-Polypeptids von ausreichender Quantität ist, um die Krankheitsursache infolge der Autoimmunantwort zu bessern.
Die rekombinanten GAD₆₅-Polypeptide können bei Patienten mit einer Autoimmunantwort auf GAD₆₅ auch therapeutisch verwendet werden. Eine solche Therapie kann zum Beispiel durch die Verabreichung eines rekombinanten GAD₆₅-Polypeptids durchgeführt werden. Eine solche Verabreichung kann ein unmarkiertes sowie ein markiertes GAD₆₅-Polypeptid verwenden. Wenn ein unmarkiertes GAD₆₅-Polypeptid vorteilhaft verwendet wird, liegt es in einer Form vor, in der die GAD₆₅-Polypeptide zum Beispiel in Fragmenten vorliegen, die zu klein sind, um eine Immunantwort zu stimulieren, die aber groß genug sind, um die Fortdauer der Autoimmunantwort zu unterbinden oder zu blockieren. Beispielsweise könnte GAD₆₅ enzymatisch in Peptide von Epitopgröße (typischerweise 5-12 Aminosäuren lang) gespalten und auf diese Weise an Fab-bindende Abschnitte, die in den Körperflüssigkeiten vorhanden sind, oder an die Oberfläche von Immunzellen des Patienten mit einer Autoimmunkrankheit gebunden werden.
In einer anderen Ausführungsform könnten die rekombinanten GAD₆₅-Polypeptide markiert mit einem Therapeutikum verabreicht werden. Diese Mittel können entweder direkt oder indirekt an die GAD₆₅-Polypeptide gekoppelt werden. Ein Beispiel einer indirekte Kupplung ist die Verwendung einer Spacergruppe. Diese Spacergruppen können wiederum entweder unlöslich oder löslich sein (Diener et al., Science 231 (1986), 148) und können so gewählt sein, dass sie die Wirkstofffreisetzung von dem GAD₆₅-Polypeptid an der Zielstelle ermöglichen. Beispiele von Therapeutika, die an die erfindungsgemäßen GAD₆₅-Polypeptide zur Immuntherapie gekoppelt werden können, sind Wirkstoffe, Radioisotope, Lectine und Toxine.
Die Wirkstoffe, die an die erfindungsgemäßen GAD₆₅-Polypeptide konjugiert werden können, schließen Verbindungen ein, die klassisch als Wirkstoffe bezeichnet werden, wie Mitomycin C, Daunorubicin und Vinblastin.
Bei der Verwendung von radioisotopisch konjugierten erfindungsgemäßen GAD₆₅-Polypeptiden zur Immuntherapie können bestimmte Isotope in Abhängigkeit von solchen Faktoren, wie Leukocytenverteilung sowie Stabilität und Emission, stärker bevorzugt werden als andere. In Abhängigkeit von der Autoimmunantwort können einige Emitter gegenüber anderen bevorzugt werden. Im Allgemeinen werden α- und β-Teilchen emittierende Radioisotope bei der Immuntherapie bevorzugt. Bevorzugt werden energiereiche α-Emitter mit kurzer Reichweite, wie ²¹²Bi. Beispiele von Radioisotopen, die für therapeutische Zwecke an die erfindungsgemäßen GAD₆₅-Polypeptide gebunden werden können, sind ¹²⁵I, ¹³¹I, ⁹⁰Y, ⁶⁷Cu, ²¹²Bi, ²¹¹At, ²¹²Pb, ⁴⁷Sc, ¹⁰⁹Pd und ¹⁸⁸Re.
Lectine sind Proteine, üblicherweise isoliert aus Pflanzenmaterial, die an spezifische Zuckergruppen binden. Viele Lectine sind auch fähig, Zellen zu agglutinieren und Lymphocyten zu stimulieren. Jedoch ist Ricin ein toxisches Lectin, das immuntherapeutisch verwendet wurde. Dies wird durch die Bindung der α-Peptidkette von Ricin, die für die Toxizität verantwortlich ist, an das Antikörpermolekül erreicht, um die ortsspezifische Freisetzung der toxischen Wirkung zu ermöglichen.
Toxine sind giftige Stoffe, welche von Pflanzen, Tieren oder Mikroorganismen produziert werden, die in einer ausreichenden Dosis oft letal sind. Das Diphtherietoxin ist eine von Corynebacterium diphtheria produzierte Substanz, die therapeutisch verwendet werden kann. Dieses Toxin besteht aus einer α- und einer β-Untereinheit, die unter geeigneten Bedingungen getrennt werden können. Die toxische A-Komponente kann an das GAD₆₅-Polypeptid gebunden und zur ortsspezifischen Freisetzung an einen Leukocyten, der einen Rezeptor für das GAD₆₅-Polypeptid exprimiert, verwendet werden.
Andere Therapeutika, die an die GAD₆₅-Polypeptide gekoppelt werden können, sowie therapeutische ex vivo- und in vivo-Protokolle sind bekannt oder können von Fachleuten leicht ermittelt werden.
Die Beschreibung der vorliegenden Erfindung erwähnt auch, dass das hierin beschriebene Polypeptid therapeutisch verabreicht werden kann, um den Krankheitsverlauf in Patienten zu bessern, die an dieser Erkrankung leiden oder für die ein Risiko besteht, diese Krankheit zu entwickeln. Der zur Darstellung der verschiedenen Aminosäuren verwendete herkömmliche Ein-Buchstaben-Code stimmt wie folgt überein:
Die Polypeptidsequenz des hierin beschriebenen Polypeptids wurde durch Vergleich der Aminosäuresequenzen von menschlicher GAD₆₅, menschlicher GAD₆₇ und dem P2-C-Protein des zu den Picorna-Viren gehörenden Coxsackie-Virus identifiziert. Das P2-C-Polynucleotid übt in dem Virusmembran-gebundenen Replikationskomplex eine wichtige Funktion aus. Diese Analysen wiesen das Vorhandensein einer Sequenz mit weitgehender Übereinstimmung zwischen sowohl dem GAD₆₅-Molekül als auch dem Coxsackie-Virus nach. Ein Kernpolypeptid aus sechs aufeinanderfolgenden Aminosäureresten des GAD₆₅- und des P2-C-Polypeptids ist bezüglich der Aminosäuresequenz identisch. Tatsächlich sind von den 24 Aminosäuren in dem Polypeptid 19 identisch oder konserviert. Außerdem liegt auch eine hohe Ladungsdichte und ein Prolinrest vor, was diesen Bereich stark antigen machen würde (vgl. Tabelle 1).
Tabelle 1
In Tabelle 1 umschließt die durchgezogene Linie identische Aminosäuren, während die gestrichelte Linie Aminosäurereste mit ähnlicher Ladung, Polarität oder Hydrophobizität einschließt.
Die Entdeckung dieses gemeinsamen Polypeptidbereichs unterstützt eine ätiologische Rolle von "molekularer Mimikry" bei der Beschleunigung von Diabetes. Folglich, wenn ein Patient, der genetisch für IDDM anfällig ist, durch ein Coxsackie-Virus infiziert wird, hat die Immunantwort auf das Coxsackie-Virus-Polypeptid eine kreuzreaktive Immunantwort auf die ähnliche GAD-Sequenz in den β-Zellen des Patienten zur Folge. Die immunologische Reaktion wird durch die antigenisch ähnlichen GAD-Polypeptide aufrechterhalten, was letzten Endes zur Zerstörung der β-Zellen und zur anschließenden Darstellung von IDDM führt.
Gegenwärtig nimmt man an, dass die Eliminierung der pankreatischen β-Zellen durch eine zelluläre Autoimmunantwort vermittelt wird. Folglich sollte ein hierin beschriebenes Polypeptid die Fähigkeit besitzen, eine solche zelluläre Autoimmunantwort zu blockieren. Wegen der Komplexität von Autoimmunkrankheiten ist es möglich, zahlreiche mögliche therapeutische Modalitäten in Betracht zu ziehen, welche die Verwendung der Polypeptide zur Besserung solcher Erkrankungen erlauben würden. So kann es möglich sein, die erfindungsgemäßen Polypeptide zur Blockierung der Erkennung durch einen spezifischen T-Zellrezeptor (TCR) oder einen MHC-Rezeptor, der ein Autoimmunantigen auf der Oberfläche einer Antigen-präsentierenden Zelle (APC) präsentiert, zu verwenden. Die Hemmung einer solchen Erkennung könnte zum Beispiel durch Versorgen des Patienten mit dem erfindungsgemäßen Polypeptid, das wiederum das in der Antigenspalte präsentierte Autoimmunantigen verdrängen könnte, oder möglicherweise durch direkte Wechselwirkung mit dem geeigneten TCR auf der Oberfläche einer T-Helferzelle erfolgen. Dieser letztere therapeutische Ansatz der direkten Wechselwirkung mit dem TCR könnte durch Induktion einer high dose-Immuntoleranz durch Verwendung hoher Konzentrationen von löslichem Polypeptid erzielt werden.
In einer anderen Ausführungsform könnten die hierin beschriebenen Polypeptide zur Stimulation einer T-Suppressorzellpopulation verwendet werden, um die Selbsterkennung wiederherzustellen und auf diese Weise die Autoimmunkrankheit zu bessern. Die Stimulation von T-Suppressorzellpopulationen könnte zum Beispiel durch Verwendung eines bispezifischen Antikörpers mit einer variablen Region, die für ein Epitop spezifisch ist, das auf dem in der Spalte des MHCII-Rezeptors liegenden Autoimmunantigen vorhanden ist, und einer zweiten variablen Region, die für ein Epitop spezifisch ist, das auf dem CD8⁺-Rezeptor vorliegt, erreicht werden. Die Herstellung eines Antikörpers, der für das hierin beschriebene Polypeptid spezifisch ist, ist für Fachleute eine Routineangelegenheit, wie auch die Herstellung bispezifischer Antikörper mit Spezifität für zwei oder mehrere Epitope.
Polypeptidanaloga des hierin beschriebenen Polypeptids können konstruiert werden, die auf der Ebene der Antigenpräsentation um die Erkennung von Autoantigenen konkurrieren. Da MHC-Moleküle eine einzige Peptidbindungsstelle enthalten, ist es möglich, Polypeptide zu konstruieren, die mit hoher Affinität an krankheitsassoziierte MHC-Moleküle binden, aber keine krankheitsauslösende T-Helferzellen aktivieren. Solche Polypeptide sind als Antagonisten zur Autoantigenerkennung wirksam. Ein Musterfall für einen solchen Ansatz ergibt sich aus der Beobachtung, dass ein Maus-Lysozym-Polypeptid, das selbst nicht immunogen ist, mit einem immunogenen Polypeptid aus Hühnereiweiß-Lysozym um die MHC-Bindung konkurrieren kann und auf diese Weise die T-Zellaktivierung durch das Polypeptid vermindert (Adorini et al., Nature 334 (1988), 623-625). In ähnlicher Weise wurde ein solcher therapeutischer Ansatz zur Durchmusterung wirksamer Polypeptidanaloga bei solchen Autoimmunkrankheiten wie der experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis (EAE) verwendet (Wraith et al., Cell 59 (1989), 248; Urban et al., Cell 59 (1989), 257).
Bei den zur Darstellung der Aminosäurereste in den erfindungsgemäßen Polypeptiden verwendeten Ein-Buchstaben-Symbolen handelt es sich um diejenigen Symbole, die im Allgemeinen auf dem Fachgebiet verwendet werden. Der Begriff "Analogon" bezieht sich auf ein Polypeptid mit einer im Wesentlichen identischen Aminosäuresequenz zu einem hier bereitgestellten Polypeptid und worin eine Aminosäure oder mehrere Aminosäuren durch chemisch ähnliche Aminosäuren substituiert wurden. Zum Beispiel kann eine polare Aminosäure, wie Glycin oder Serin, durch eine andere polare Aminosäure substituiert sein; oder eine saure Aminosäure, wie Asparaginsäure, kann durch eine andere saure Aminosäure, wie Glutaminsäure, substituiert sein; oder eine basische Aminosäure, wie Lysin, Arginin oder Histidin, kann durch eine andere basische Aminosäure substituiert sein; oder eine unpolare Aminosäure, wie Alanin, Leucin oder Isoleucin, kann durch eine andere unpolare Aminosäure substituiert sein.
Der Begriff "Analogon" bezieht sich auch auf ein Polypeptid, in dem eine Aminosäure oder mehrere Aminosäuren in einem erfindungsgemäßen Polypeptid deletiert oder hinzugefügt sind, aber das noch eine wesentliche Aminosäuresequenzhomologie zu einem solchen Peptid beibehält. Eine wesentliche Sequenzhomologie ist eine Homologie von mehr als 50%. Der Begriff "Fragment" bezieht sich auf eine kürzere Version der hier identifizierten Polypeptide mit mindestens 6 Aminosäureresten, wobei das Fragment in der Lage ist, die Proliferation von die Langerhans-Inseln infiltrierenden T-Lymphocyten (IITLs) zu stimulieren, oder ein Fragment darstellt, das fähig ist, die Stimulierung solcher Zellen durch ein stimulierendes Polypeptidfragment zu hemmen.
Der Begriff "chemisches Derivat" bezieht sich auf ein Polypeptid, das von einem hierin beschriebenen Polypeptid abgeleitet ist und worin eine Aminosäure oder mehrere Aminosäuren durch Umsetzung der funktionellen Seitengruppen der in dem Polypeptid vorhandenen Aminosäurereste chemisch derivatisiert wurden. So ist ein "chemisches Derivat" ein Polypeptid, das von den hier identifizierten Sequenzen oder Polypeptiden durch einen chemischen Schritt oder mehrere chemische Schritte abgeleitet ist. Solche derivatisierten Moleküle schließen zum Beispiel diejenigen Moleküle ein, in denen freie Aminogruppen unter Bildung von Aminhydrochloriden, p-Toluolsulfoamiden, Benzoxycarboamiden, t-Butyloxycarboamiden, Thiourethan-Typ-Derivaten, Trifluoracetylamiden, Chloracetylamiden oder Formamiden derivatisiert wurden. Freie Carboxylgruppen können unter Bildung von Salzen, Methyl- und Ethylestern oder anderen Arten von Estern oder Hydraziden derivatisiert werden. Freie Hydroxylgruppen können unter Bildung von O-Acyl- oder O-Alkylderivaten derivatisiert werden. Das Imidazolstickstoffatom von Histidin kann unter Bildung von N-Im-benzylhistidin derivatisiert werden. Als chemische Derivate ebenfalls eingeschlossen sind diejenigen Polypeptide, die eines oder mehrere der natürlicherweise vorkommenden Aminosäurederivate der 20 Standardaminosäuren enthalten. Zum Beispiel kann Prolin durch 4-Hydroxyprolin ersetzt sein; kann Lysin durch 5-Hydroxylysin ersetzt sein; kann Histidin durch 3-Methylhistidin ersetzt sein; kann Serin durch Homoserin ersetzt sein; und kann Lysin durch Ornithin ersetzt sein.
Es sollte selbstverständlich sein, dass die vorliegende Erfindung nicht auf die in Tabelle 1 zur Veranschaulichung gezeigten Polypeptide begrenzt ist; statt dessen kann ein Polypeptid, das in den Schutzumfang dieser Erfindung fällt, über den Bereich zwischen der Aminosäure 28 und der Aminosäure 50 des Coxsackie-Virus-P2-C oder zwischen der Aminosäure 250 und der Aminosäure 273 von GAD₆₅ oder zwischen der Aminosäure 258 und der Aminosäure 281 von GAD₆₇ hinaus verlängert sein bzw. kleiner sein, solange wie ein wesentlicher Teil eines bestimmten Polypeptids durch eine Aminosäuresequenz aus diesem Bereich oder Segmente oder Kombinationen davon gekennzeichnet ist und das Polypeptid die gewünschte immunologische oder biologische Aktivität gegen Autoimmunkrankheiten zeigt. Außerdem schließen die erfindungsgemäßen Polypeptide solche Polypeptide ein, die Aminosäuresequenzen aufweisen, die länger oder kürzer sind als die Aminosäuresequenzen der in Tabelle 1 veranschaulichten Polypeptide oder die Segmente oder Kombinationen davon umfassen, solange wie solche Polypeptide im Wesentlichen aus dem Bereich zwischen den in Tabelle 1 veranschaulichten Aminosäuren bestehen und eine immunologische oder biologische Aktivität zeigen. Außerdem schließen die erfindungsgemäßen Polypeptide solche Polypeptide ein, die durch eine Sequenz von Aminosäuren gekennzeichnet sind, die länger oder kürzer ist als die Sequenz des GAD₆₅-Polypeptids von Tabelle 1 oder die Segmente dieses Polypeptids umfassen und die eine immunologische oder biologische Aktivität gegen die Autoimmunkrankheit zeigen. Alle erfindungsgemäßen Polypeptide sollten die Autoimmunkrankheit nicht stimulieren oder verstärken.
Demgemäß sollte selbstverständlich sein, dass die spezifische Auswahl irgendeines Polypeptids aus den erfindungsgemäßen Polypeptiden nicht mit übermäßigem Experimentieren verbunden ist. Eine solche Auswahl kann durch Verwenden einer Anzahl von Polypeptiden und Testen derselben auf ihre immunologische oder biologische Aktivität bei der Besserung der Autoimmunkrankheit ausgeführt werden. Die NOD-Maus stellt ein ausgezeichnetes und gut charakterisiertes Modell zur Durchmusterung erfindungsgemäßer Polypeptide, die fähig sind, Diabetes zu bessern, dar.
Die hierin beschriebenen Polypeptide können durch Rekombinationsverfahren oder durch herkömmliche Synthese unter Anwendung bekannter Polypeptidsyntheseverfahren einschließlich der Synthese an einem festen Träger hergestellt werden. Ein Beispiel eines geeigneten Festphasensyntheseverfahrens ist das von Merriweather (J. Am. Chem. Soc. 85 (1963), 2149) beschriebene Verfahren. Andere Polypeptidsyntheseverfahren kann man zum Beispiel bei Bodanszky et al., Peptide Synthesis, John Wiley & Sons, 2. Auflage, 1976, sowie in anderen den Fachleuten bekannten Dokumenten finden. Eine Zusammenfassung von Polypeptidsyntheseverfahren kann man bei Stewart et al., Solid Phase Peptide Synthesis, Pierce Chemical Company, Inc., Rockford, III., 1984, finden. Die Synthese von Polypeptiden durch Lösungsverfahren kann ebenfalls angewendet werden, zum Beispiel wie in The Proteins, Bd. II, 3. Auflage, Neurath et al., Hrsg., 105, Academic Press, New York, NY, 1976, beschrieben ist. Geeignete Schutzgruppen zur Verwendung bei einer solchen Synthese kann man in den vorstehenden Dokumenten sowie bei McOmie J., Protective Groups in Organic Chemistry, Plenum Press, New York, NY, 1973, finden.
Die hierin beschriebenen Polypeptide können auch in einem geeigneten Wirt hergestellt werden, der mit DNA-Sequenzen transformiert wurde, die das gewünschte Polypeptid codieren. Zum Beispiel kann ein Polypeptid durch die Fermentierung geeigneter Wirte hergestellt werden, die mit einer das Polypeptid codierenden DNA-Sequenz transformiert wurden und diese exprimieren. In einer anderen Ausführungsform können DNA-Sequenzen, die mehrere der Polypeptide codieren, miteinander verknüpft werden, und solche Sequenzen können dann zur Transformation eines geeigneten Wirts verwendet werden, um die Expression von Polypeptiden zuzulassen, die mit der Autoimmunkrankheit im Zusammenhang stehen.
Die Dosierungsbereiche für die Verabreichung der hier beschriebenen GAD₆₅-Polypeptide sind diejenigen, die groß genug sind, um die gewünschte Wirkung zu erzielen, bei der die Symptome oder die Zellzerstörung der Autoimmunantwort gebessert werden. Die Dosierung sollte nicht so groß sein, dass sie unerwünschte Nebenwirkungen, wie unerwünschte Kreuzreaktionen, anaphylaktische Reaktionen und ähnliches, hervorruft. Im Allgemeinen variiert die Dosierung mit dem Alter, Zustand, Geschlecht und dem Ausmaß der Erkrankung in dem Patienten und kann vom Fachmann bestimmt werden. Die Dosierung kann durch den einzelnen Arzt im Falle irgendwelcher Gegenindikationen angepasst werden. Die Dosierung kann von etwa 0,1 mg/m² bis etwa 2.000 mg/m², vorzugsweise etwa 0,1 mg/m² bis etwa 500 mg/m²/Dosis, in einer oder mehreren täglichen Dosisverabreichungen für einen Tag oder mehrere Tage variieren.
Die GAD₆₅-Polypeptide können parenteral durch Injektion oder nach und nach durch Perfusion über die Zeit verabreicht werden. Die erfindungsgemäßen GAD₆₅-Polypeptide können intravenös, intraperitoneal, intramuskulär, subkutan, intrakavitär oder transdermal verabreicht werden.
Präparate zur parenteralen Verabreichung schließen sterile wässrige oder nichtwässrige Lösungen, Suspensionen und Emulsionen ein. Beispiele nichtwässriger Lösungsmittel sind Propylenglykol, Polyethylenglykol, pflanzliche Öle, wie Olivenöl, und injizierbare organische Ester, wie Ethyloleat. Wässrige Träger schließen Wasser, alkoholische/wässrige Lösungen, Emulsionen oder Suspensionen einschließlich Salzlösung und gepufferte Medien ein. Parenterale Vehikel schließen Natriumchloridlösung, Ringer-Dextroselösung, Dextrose und Natriumchlorid, lactathaltige Ringerlösung oder nichtflüchtige Öle ein. Intravenöse Vehikel schließen Flüssigkeits- und Nährstofflieferanten, Elektrolytlieferanten (wie diejenigen auf der Basis von Ringer-Dextroselösung) und ähnliche ein. Konservierungsmittel und andere Zusätze können ebenfalls vorhanden sein, wie zum Beispiel antimikrobielle Mittel, Antioxidationsmittel, Chelatbildner und inerte Gase und ähnliche.
Die Beschreibung der Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung eines Medikaments oder einer pharmazeutischen Zusammensetzung, umfassend die GAD₆₅-Polypeptide, wobei das Medikament zur Therapie einer Autoimmunantwort auf GAD₆₅ verwendet wird.
Die vorstehende Offenbarung beschreibt die vorliegende Erfindung allgemein. Ein besseres Verständnis kann unter Bezugnahme auf die folgenden spezifischen Beispiele erhalten werden, die hier nur zur Veranschaulichung angegeben werden und den Schutzumfang der Erfindung nicht begrenzen sollen.
BEISPIEL 1
CLONIERUNG UND EXPRESSION VON GAD₆₅
A. DNA-REKOMBINATIONSVERFAHREN
Um cDNA-Sonden zu erhalten, die für GAD₆₅ und GAD₆₇ spezifisch sind, wurde die gesamte RNA aus dem Gehirn einer erwachsenen Ratte mittels eines Guanidinisothiocyanat-Cäsiumgradienten unter Anwendung des Verfahrens von Chirgwin et al. (Biochemistry 18 (1979), 5294) extrahiert. Poly(A)-RNA wurde an Oligo-dT-Cellulose unter Verwendung des Protokolls der Bethesda Research Laboratories (BRL) gereinigt. Die Primärstrangsynthese wurde durch Verwendung der reversen Transkriptase des MMLV (BRL) unter den empfohlenen Bedingungen durchgeführt, außer dass Poly-d(N₆)-mere (Pharmacia) als Primer verwendet wurden. Dieses cDNA-RNA-Gemisch wurde bei 65°C 15 min hitzeinaktiviert und bei –20°C gelagert. Für die PCR wurden 1/50 der Probe zu einem 100 μl-Reaktionsansatz zugegeben. Degenerierte Oligonucleotide wurden synthetisiert (Applied Biosystems), um die unterstrichenen gemeinsamen Aminosäuresequenzen der GAD der Katze (von cDNA) (Kobayashi et al., J. Neurosci. 7 (1987), 2768) und der Ratte (von Peptiden) (Chang und Gottlieb, J. Neurosci. 8 (1988), 2123) zu codieren (1). Die Sequenz des 5'-Endes eines jeden degenerierten Oligonucleotids enthielt einen Strang der DNA-Sequenz, die von entweder SstI und HindIII (5'-Oligo) oder SstI und SstII (3'-Ende-Oligo) erkannt wird. Diese Primer wurden zur selektiven Amplifikation durch die Polymerasekettenreaktion der erzeugten cDNA-Matrize verwendet, wie bei Gould et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989), 1934) beschrieben ist. Die PCR-Produkte wurden in den mit HindIII/SstI zweifach gespaltenen Bluescript-SK-Vektor (Stratagene) subcloniert, in DH5 (BRL) transformiert und durch Standardverfahren plattiert (Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1989).
Die Koloniehybridisierung wurde mit einem 5'-³²P-endmarkierten Oligonucleotid durchgeführt, das für Katzen-GAD₆₇ spezifisch ist (Kobayashi et al., J. Neurosci. 7 (1987), 2768). Die Endmarkierung des Oligonucleotids, die Hybridisierungsbedingungen und die Waschbedingungen waren wie beschrieben (Wallace et al., in Guide to Molecular Cloning Techniques; Berger et al., Hrsg., in Methods of Enzymology; Abelson et al., Hrsg., Academic Press, Inc., San Diego (1987), 432-442), außer dass die Nitrocellulosefilter bei 50°C 15 min gewaschen wurden. Kolonien, die bei der Hybridisierung positiv bzw. negativ waren, wurden einzeln ausgewählt und über Nacht in Terrific-Nährmedium (Tartof et al., Focus 9 (1987), 12) gezüchtet. Die DNA wurde unter Anwendung eines Kochverfahrens isoliert (Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1989), und die Matrizen wurden mit 0,2 N NaOH denaturiert und mittels Sephacryl S400-Zentrifugensäulen (Pharmacia) gereinigt. Die Sequenzierung der denaturierten doppelsträngigen Matrize wurde durch das Kettenterminationsverfahren (Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74 (1977), 5463) unter Verwendung des T7-Sequenzierungskits (Pharmacia) durchgeführt.
Wie in 1 gezeigt, wurden mittels PCR erzeugte Ratten-GAD₆₅- und -GAD₆₇-cDNAs als Sonden zur Durchmusterung einer Lambda ZAP (Stratagene)-Ratten-Hippocampus-Bank, bereitgestellt von S. Heinemann (Salk Institute), durch Standardverfahren (Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1989) verwendet. Eine 2400 Nucleotide große GAD₆₅-cDNA (der größte Clon) wurde isoliert und durch "Zapping" subcloniert, wie bei Stratagene beschrieben ist. Wenn eine Ratten-GAD₆₇-cDNA erhalten wurde, die kleiner war als ein bereits verfügbarer 3,2 kb großer Ratten-GAD₆₇-cDNA-Clon, wurde die größere cDNA sequenziert. ExoIII-Deletionen (Henikoff, Gene 28 (1984), 351) wurden in beide Richtungen für GAD₆₅ und GAD₆₇ durchgeführt, und Matrizen wurden hergestellt und sequenziert, wie vorstehend beschrieben. Eine Anker-PCR (Frohman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 (1988), 8998) wurde durchgeführt, um die restlichen 5'-Enden von GAD₆₅- und GAD₆₇-mRNAs zu clonieren, die nicht in den ursprünglichen cDNA-Clonen vorhanden waren, welche bei der Durchmusterung der Bank isoliert wurden. Die Sequenzierung dieser Clone ergab, dass weder GAD₆₅- noch GAD₆₇-mRNAs irgendwelche weiteren Initiationscodons (AUGs) im Leseraster mit den bereits bestimmten Initiationscodons der ursprünglichen cDNA-Clone enthielten.
BEISPIEL 2
CHARAKTERISIERUNG DER CLONIERTEN GAD₆₅
A. NORTHERN-BLOT-HYBRIDISIERUNG
Zwei durch PCR abgeleitete cDNA-Sonden wurden mit Northern-Blots hybridisiert, die Rattenhirn-RNA enthielten, um zu bestimmen, ob die GAD₆₇- und GAD₆₅-cDNAs von zwei verschiedenen mRNAs abstammten. Die RNA wurde extrahiert, wie in Beispiel 1 beschrieben. Poly(A)-RNA wurde durch Elektrophorese in Formaldehyd getrennt und auf Biotrans (ICN)-Membranen übertragen, und die Hybridisierung wurde durchgeführt, wie von Well et al. beschrieben (J. Neurosci. 16 (1986), 311), außer dass 100 μl/ml Poly(A) zugegeben wurden. Die Sonden wurden mit etwa 10⁹ DpM/μg durch das Oligomarkierungsverfahren von Feinberg und Vogelstein (Anal. Biochem. 132 (1983), 6) markiert. Identische Ergebnisse wurden später mit Clonen vollständiger Länge von GAD₆₅- und GAD₆₇-cDNAs erhalten.
Wie in 5 gezeigt, enthalten die Bahnen 1 und 2 1 μg Poly(A)-selektierte RNA, die aus dem Kleinhirn einer Ratte extrahiert wurde. Bahn 1 wurde mit einer cDNA-Sonde für die mit Katzen-GAD₆₇ verwandte GAD der Ratte (Kobayashi et al., J. Neurosci. 7 (1987), 2768), und Bahn 2 mit einer cDNA-Sonde für die Ratten-Peptidsequenz (die GAD₆₅ entspricht) hybridisiert.
Die cDNA-Sonde für die Ratten-Peptidsequenz hybridisierte mit einer 5,7 kb großen RNA, während die cDNA-Sonde für die mit der Katzen-cDNA der Anmelder verwandte cDNA der Ratte mit einer 3,7 kb großen RNA hybridisierte. Dies zeigt, dass GAD₆₅ und GAD₆₇ nicht von der gleichen mRNA abgeleitet sind.
B. GENOMISCHE HYBRIDISIERUNG VON GAD₆₇ UND GAD₆₅
Um die Möglichkeit zu untersuchen, dass GAD₆₇ und GAD₆₅ aus verschiedenem Genen hervorgehen, wurden cDNAs von sowohl GAD₆₇ als auch GAD₆₅ mit DNA-Blots hybridisiert, die genomische DNA enthielten.
Für Southern-Blots wurde die genomische DNA wie beschrieben aus Rattenleber extrahiert (Kaiser et al., in DNA Cloning, Bd. I, A Practical Approach, Glover D.M., Hrsg., IRL Press, Oxford, 1985, 38-40). Die DNA (10 μg/Probe) wurde mit EcoRI und HindIII unter Verwendung der von den Lieferanten (BRL, Gaithersburg, MD) empfohlenen Bedingungen vollständig gespalten. Die DNA-Fragmente wurden durch Elektrophorese bei 1,5 V/cm 16 Std. in 0,8% Agarose aufgetrennt. Die DNA wurde dann auf Zeta-Probe-Membranen (Bio-Rad) übertragen, hybridisiert und gewaschen, wie bei Gatti et al. beschrieben (Biotechniques 2 (1984), 148), außer dass die Denhard-Lösung durch 5 μg/ml Carnation-Trockenmilchpulver ersetzt wurde. Die Sonden für die Southern-Blots wurden markiert, wie vorstehend in Beispiel 1 beschrieben wurde.
Wie in 6 gezeigt, befindet sich die mit HindIII und EcoRI gespaltene genomische DNA in den Bahnen 1 und 3 bzw. den Bahnen 2 und 4. Die GAD₆₇-cDNA wurde mit den Bahnen 1 und 2 hybridisiert, während die GAD₆₅-cDNA mit den Bahnen 3 und 4 hybridisiert wurde. Die Zahlen entlang der Seite des Gels entsprechen den DNA-Fragmentgrößen in Kilobasen.
Diese Daten zeigen, dass die zwei cDNAs mit genomischen Fragmenten unterschiedlicher Größen hybridisieren. Außerdem ist der größte zusammenhängende Bereich der identischen Nucleotidsequenz von GAD₆₅- und GAD₆₇-cDNAs nur 17 Nucleotidbasen lang. Folglich werden GAD₆₇ und GAD₆₅ von zwei verschiedenen Genen codiert.
C. ENZYMATISCHER VERGLEICH VON GAD₆₇ UND GAD₆₅
Studien wurden durchgeführt, um die Wirkung von PLP auf die Aktivität von GAD₆₇ und GAD₆₅ zu vergleichen. Dabei wurden beide cDNAs in Vektoren subcloniert, die deren Expression in Bakterien erlaubten (Studier et al., J. Mol. Biol. 189 (1986), 113). Die Überexpression einer "fusionslosen" GAD₆₅ und GAD₆₇ wurde durch die Subclonierung der GAD₆₅-cDNA in die NcoI-Stelle eines pET-8c-Vektors und der GAD₆₇-cDNA in die NheI-Stelle eines pET-5c-Vektors erzielt (Studier et al., J. Mol. Biol. 189 (1986), 113).
Um kompatible klebrige Enden zur korrekten Subclonierung im Leseraster beider cDNAs zu erhalten, wurde eine selektive Amplifikation mittels PCR unter Verwendung der von United States Biochemical (USB) empfohlenen Bedingungen mit 200 μM dNTPs und 1,5 mM MgCl₂ in dem Gemisch und eine Anelierung bei 55°C mit 20 Zyklen durchgeführt, um die Ungenauigkeit der AmpliTAQ (USB) zu verringern. Primer, die für GAD₆₅ und GAD₆₇ spezifisch waren, enthielten einen DNA-Strang der NcoI- bzw. Spel-Erkennungsstellen. Da eine NheI-Restriktionsstelle innerhalb des codierenden Bereichs von GAD₆₇ vorhanden ist, wurde SpeI (das mit NheI kompatibel ist) verwendet.
Die PCR-Produkte wurden wie beschrieben in ihre jeweiligen pET-Vektoren subcloniert, in DH5 transformiert und plattiert (Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1989). Kolonien wurden ausgewählt und über Nacht in LB-Nährmedium mit 50 μg/ml Ampicillin gezüchtet. Subclone mit der richtigen Orientierung wurden in den BL21(DE3)-Stamm (Studier et al., J. Mol. Biol. 189 (1986), 113) zur Überexpression transformiert. Als negative Kontrolle wurde der pET-8c-Vektor ohne Insertion transformiert und anschließend induziert. Einzelne Kolonien wurden wie beschrieben ausgewählt, gezüchtet, mit 1 mM Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG) induziert und auf SDS-PAGE-Gelen analysiert (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, 17.15-17.16, 1989).
Um die GAD-Aktivität zu messen, induzierten die Anmelder 10 ml-Kulturen von Bakterien bei OD₆₀₀ –0,5 mit 1 mM IPTG. Zwei Stunden nach der Induktion wurden die Bakterien abzentrifugiert und in 1 ml Homogenisierungspuffer (1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF), 1 mM 2-Aminoethylisothiouroniumbromid (AET) und 60 mM Kaliumphosphat, pH 7,1) resuspendiert und mit Ultraschall behandelt. Nach der Ultraschallbehandlung wurden Zelltrümmer durch Zentrifugation entfernt, und die Proteinkonzentration wurde im Überstand (der Überstand wurde in Aliquots bei –70°C gelagert) gemessen (Bradford, Anal. Biochem. 72 (1986), 248). Hirnhomogenate wurden wie beschrieben hergestellt (Leggy et al., J. Neurochem. 46 (1986), 1478). Die GAD-Aktivität wurde wie beschrieben (Krieger et al., J. Neurochem. 33 (1984), 299) mit oder ohne 0,2 mM PLP und 20 μl Hirnhomogenat oder Bakterienlysat in dem Inkubationsgemisch gemessen. Die Produktion von ¹⁴CO₂ in Bakterienlysaten war im Hinblick auf den Inkubationszeitraum und die Proteinkonzentration linear. Tabelle 2

^a CpM ¹⁴CO₂/μg Protein/Std. von drei Ausfertigungen ± Standardabweichung des Mittelwerts ("SEM")

Wie in Tabelle 2 gezeigt, katalysieren Bakterienlysate, die GAD₆₅ oder GAD₆₇ enthalten, die Umwandlung von [1-¹⁴C]-Glutamat in GABA und ¹⁴CO₂.
PLP stimuliert die Enzymaktivität von GAD₆₅ stärker als die von GAD₆₇. Diese größere Stimulierung spiegelt wahrscheinlich den schnelleren Durchlauf von GAD₆₅ durch den von Martin und Mitarbeitern (Martin, Cell. Mol. Neurobiol. 7 (1987), 237) angenommenen Inaktivierungszyklus wieder. Dieser schnellere Durchlauf legt nahe, dass GAD₆₅ mehr zu dem in vivo existierenden apo-GAD-Pool beiträgt (Miller et al., Brain Res. Bull. 5 (Suppl. 2) 89 (1980), 89). So scheint PLP in vivo die GAD₆₅-Aktivität stärker als die GAD₆₇-Aktivität zu regulieren.
Die GAD₆₅-Aktivität in Bakterienlysaten ist mit der fünffachen PLP-Stimulierung der GAD-Aktivität vergleichbar, die in Synaptosomen festgestellt wurde, welche aus der Substantia nigra der Ratte präpariert wurden (Miller et al., J. Neurochem. 33 (1979), 533). Da beide GADs von dem zugegebenen PLP in Bakterien stärker abhängig sind als die GAD-Aktivität in Rattenhirnrohhomogenaten, kann die endogene PLP-Konzentration von Bakterienlysaten geringer sein als die von Rattenhirnhomogenaten.
D. IMMUNOLOGISCHE IDENTIFIZIERUNG VON GAD₆₅ UND GAD₆₇
Rattenhirnhomogenate und Bakterienlysate wurden wie vorstehend beschrieben extrahiert. Gleiche Volumina an Ladepuffer wurden wie beschrieben zu jeder Probe zugegeben (Harlow et al., Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1988). Die Proteine wurden durch Elektrophorese in einem 10%-igen Acrylamidgel in SDS aufgetrennt und elektrophoretisch auf Nitrocellulose übertragen (Harlow et al., Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1988). Die nicht umgesetzten Stellen wurden mit phosphatgepufferter Salzlösung (PBS), enthaltend 2% Rinderserumalbumin (Fraktion V), 1 % Gelatine und 1 % Triton X-100, bei 42°C eine Stunde blockiert. Nach dem Waschen wurde der Nitrocellulosefilter dann in drei Teile geschnitten und mit den folgenden Primärantikörpern inkubiert: Bahnen 1 bis 4 mit einer 1/2.000-Verdünnung des Antiserums von Oertel et al. (Neuroscience 6 (1981), 2689), das sowohl GAD₆₇ als auch GAD₆₅ erkennt; Bahnen 5 bis 8 mit einer 1/2.000-Verdünnung des K-2-Antiserums, das nur GAD₆₇ erkennt; Bahnen 9 bis 12 mit einer 1/2.000-Verdünnung des monoclonalen GAD-6-Antikörpers, der für GAD₆₅ spezifisch ist (Chang et al., J. Neurosci. 8 (1988), 2123). Alle Filter wurden gründlich gewaschen, geeignete Sekundärantikörper wurden inkubiert, und es wurde gewaschen. Gebundene Antikörper wurden mittels ¹²⁵I-markiertem Protein A und Autoradiographie nachgewiesen. Jede Bahn enthielt das folgende: Bahnen 1, 5 und 9 sind BL21(DE3) + pET-GAD₆₇; Bahnen 2, 6 und 10 sind BL21(DE3) + pET-GAD₆₅; Bahnen 3, 7 und 11 sind Rattenhirnhomogenat; und Bahnen 4, 8 und 12 sind BL21(DE3) + pET-8c.
Die Immunoblots von bakteriell produzierter GAD₆₅ und GAD₆₇ zeigten, dass GAD₆₅ tatsächlich der kleineren GAD in Hirnextrakten und GAD₆₇ der größeren Form entspricht (7). Frühere Arbeiten haben die Übereinstimmung von GAD₆₇ mit der größeren GAD für Katzen-GAD₆₇ und für Maus-GAD₆₇ gezeigt (Katarova et al., Eur. J. Neurosci. 2 (1990), 190; 235 (1987)). Die Beweglichkeiten der bakteriell produzierten GAD₆₅ und GAD₆₇ (nachgewiesen mit dem Antiserum von Oertel et al. (Neuroscience 6 (1981), 2689)) sind mit der in Rattenhirnhomogenat beobachteten immunreaktiven Doppelbande identisch.
Die Formen von GAD mit einem kleineren Molekulargewicht bzw. mit einem größeren Molekulargewicht in Rattenhirn sind folglich bezüglich der Antigenität und der Größe mit den Produkten der GAD₆₅- bzw. GAD₆₇-cDNAs identisch. Folglich handelt es sich bei den zwei GADs in Rattenhirn um GAD₆₅ und GAD₆₇. Aus diesen Daten kann auch geschlossen werden, dass die von Tapia (Bayon et al., J. Neurochem. 29 (1977), 519) beschriebenen PLP-abhängigen und PLP-unabhängigen GADs auf molekularer Ebene mit GAD₆₅ bzw. GAD₆₇ identisch sind. Martin und Mitarbeiter (Spink et al., Brain Res. 421 (1987), 235) berichteten über die Existenz von vier kinetisch unterschiedlichen Formen von Rattenhirn-GAD. Jedoch wurde über Immunblot-Experimente (mit den hier verwendeten Antiseren) dieser Form nicht berichtet.
E. Verteilung von GAD₆₅ und GAD₆₇ in RNAs in Hirngewebe
Experimente wurden durchgeführt, um die Verteilung von GAD₆₅ und GAD₆₇ in RNAs im Kleinhirn unter Anwendung der in situ-Hybridisierung zu bestimmen.
Transkripte von 3,2 kb bzw. 2,3 kb von GAD₆₅- und GAD₆₇-cDNAs wurden mit ³⁵S gemäß dem Verfahren von Wuenschell et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83 (1986), 6193) radioaktiv markiert. Hydrolysierte Fragmente von 200 bp wurden mit Koronalschnitten des Kleinhirns einer Ratte hybridisiert. Die Tiere wurden unter Halothan betäubt und dekapitiert. Das Gehirn wurde schnell in Trockeneis eingefroren, und Koronalgefrierschnitte (12 μm) wurden 30 min in frisch hergestelltem 4%igem Formaldehyd in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS; 130 mM NaCl, 10 mM Na-Phosphat, pH 7,0) fixiert. Das Gewebe wurde durch abgestufte Ethanollösungen dehydratisiert und bei –70°C gelagert.
Um die Gewebepermeabilität zu erhöhen, wurden die Schnitte den folgenden Vorbehandlungen unterworfen: Rehydratisierung durch abgestufte Ethanollösungen (jeweils 5 min in 95%, 85%, 70%, 50% und 30% Ethanol); PBS (5 min); 0,02 N HCl (10 min); PBS (5 min); 0,01 % Triton N-101 in PBS (1 min); PBS (2 × 5 min); 1 μg/ml Proteinase K (7,5 min); und Glycin (zur Hemmung der Proteinase K) in PBS (3 × 5 min). Die Proteinase K wurde vor dem Gebrauch 30 min bei 37°C abgebaut. Die Schnitte wurden dann bei 37°C in 50% Formamid, 750 mM NaCl, 25 mM EDTA, 0,2% SDS, 0,02% BSA, 0,002% Ficoll, 0,02% Polyvinylpyrrolidon, 250 μg/ml Hefe-tRNA, 250 μg/ml Poly(A) und 25 mM PPES (pH 6,8) inkubiert.
Für die Hybridisierung wurden 100 mM DTT, 10% Dextransulfat und Sense- oder Antisense-³⁵S-RNA zu der Vorhybridisierungslösung zugegeben. Ein Aliquot (50 μl) der Hybridisierungslösung, enthaltend etwa 3 ng (10⁶ CpM) der Probe (Sense oder Antisense), wurde auf die Objektträger gegeben. Jeder Objektträger wurde mit einem Deckglas bedeckt und 16 Std. bei 50°C inkubiert, anschließend wurden die silikonisierten Deckgläser durch kurzes Waschen in 4× SSC (1× SSC – 150 mM NaCl, 60 mM Na-Citrat, pH 7,0) entfernt.
Die Schnitte wurden dann mit Ribonuclease A (50 μg/ml in 0,5 M NaCl, 10 mM Na-Thiosulfat, 1 mM EDTA, 10 mM Tris-HCl, pH 8,0) 20 min bei 37°C behandelt und 2 Std. bei Raumtemperatur in 2× SSC und 30 min bei 55°C in 10 mM Na-Thiosulfat gespült. Die Schnitte wurden in Ethanol dehydratisiert, in Xylol entfettet, mit Kodak NTB2-Emulsion bedeckt und 10 Tage bei 4°C exponiert. Die Emulsion wurde mit Kodak D19 entwickelt, und das Gewebe wurde mit Kresylviolett gegengefärbt.
Autoradiographische Körnchen wurden unter Verwendung von polarisiertem Licht nachgewiesen, und die Körnchenzahlen, Dichten und Zellflächen wurden mit einem Analytic Imaging Concepts-Bildanalysesystem bestimmt. Wegen der geringen Hintergrundstärke wurden die Kriterien für die Definition einer "markierten" Zelle auf das Vorhandensein von mehr als 5 zusammengeballten Körnchen festgelegt. Die GAD-markierten Zellen wurden verstreut im ganzen Gehirn gefunden, was die Messung der Anzahl der Körnchen über einzelne Zellen hinaus ermöglichte. Die Begrenzung der Zelle und die durch ein Körnchen abgedeckte Fläche erlaubten die Berechnung der Anzahl der Körnchen pro Zelle. Diese Analyse wurde bei hoher Vergrößerung (800×) unter Verwendung von sowohl polarisiertem Auflicht als auch Durchlicht durchgeführt, um gleichzeitig die gefärbte Zelle und die darüberliegenden Körnchen sichtbar zu machen. Die Anzahl ist als Mittelwert ± SEM von "n" Zellen angegeben. Tabelle 3

^a ± SEM (n)

In allen Neuronentypen sind die GAD₆₇-mRNA-Spiegel höher. Die Beobachtungen bei der in situ-Hybridisierung stimmen mit früheren Erkenntnissen überein (Nitsch, J. Neurochem. 34 (1980), 822; Denner et al., J. Neurochem. 44 (1985), 957; Itoh et al., Neurochem. Res. 6 (1981), 1283), dass das Verhältnis von PLP-abhängigen zu PLP-unabhängigen GAD-Aktivitäten im Kleinhirn eines der geringsten Verhältnisse in den getesteten Hirnregionen ist. Außerdem, wie in Tabelle 3 gezeigt, ist die Reihenfolge der Mengen für GAD₆₇-mRNA Purkinje-Zellen > Golgi II-Zellen > Korbzellen > Sternzellen; im Gegensatz dazu ist diese Reihenfolge für GAD₆₅-mRNA Golgi II-Zellen > Purkinje-Zellen > Korbzellen > Sternzellen.
Die Expression von GAD₆₅- und GAD₆₇-mRNAs unterscheidet sich folglich innerhalb der Neuronenklassen. Der Beitrag jeder Klasse zur GAD-Gesamtaktivität beeinflusst wiederum, wie die GABA-Produktion reguliert wird. Zum Beispiel enthält die Substantia nigra eines der höchsten Verhältnisse von PLP-abhängigen zu PLP-unabhängigen GAD-Aktivitäten (Nitsch, J. Neurochem. 34 (1980), 822). Eine durch die örtliche Injektion von Inhibitoren des GABA-Katabolismus ansteigende GABA-Konzentration in der Substantia nigra ist insbesondere bei der Verringerung der Anfälligkeit für einen Krampfanfall wirksam (Gale, Fed. Proc. 44 (1985), 2414). Versuchstiere, die Krampfanfälle durchmachen, welche durch PLP-Antagonisten induziert werden, können daher außerstande sein, die Ausbreitung des Krampfanfalls wegen der Hemmung von GAD₆₅ insbesondere an Nervenenden innerhalb der Substantia nigra zu hemmen.
F. Subzelluläre Lokalisierung von GAD₆₅ und GAD₆₇
Die Verteilung von GAD₆₅ und GAD₆₇ wurde in den subzellulären S₂- und Synaptosomen-Fraktionen bewertet. S₂ ist ein Hochgeschwindigkeitsüberstand, der aus dem Cytosol aller Zellen im Gehirn besteht, während die synaptosomale Fraktion überwiegend aus Nervenenden besteht (Gray et al., J. Anat., Lond, 96 (1962), 79). Für diese Studien wurde eine Fraktionierung des gesamten Rattenhirns durchgeführt, wie bei Booth und Clark (Booth et al., Biochem. J. 176 (1978), 365) beschrieben ist. Die Proteinkonzentrationen wurden durch das Verfahren von Schaffner und Weissman bestimmt (Schaffner et al., Anal. Biochem. 56 (1973), 502). Die Proben wurden wie beschrieben hergestellt (Kaiser et al., DNA Cloning, Bd. I, A Practical Approach, Glover D.M., Hrsg. (IRL Press, Oxford, 1985, S. 38-40), und ein Immunblot-Verfahren wurde wie vorstehend beschrieben unter Verwendung des monoclonalen GAD-6-Antikörpers und des K-2-Antiserums durchgeführt. Gleiche Mengen von Protein (16 μg) wurden zu jeder Bahn zugegeben. Eine Autoradiographie zeigte eine lineare Reaktion mit einer ansteigenden Menge an ¹²⁵I-Protein A, gebunden an einen Antikörper, bei Proteinkonzentrationen von 1, 3, 10, 30 und 100 μg mit sowohl dem K-2-Antiserum als auch mit dem monoclonalen GAD-6-Antikörper (Daten nicht aufgeführt).
Die Ergebnisse zeigten, dass GAD₆₇ in beiden Fraktionen in gleichen Mengen vorhanden war. Da die S₂-Fraktion die Cytosolproteine von Gliazellen (sowie anderen nicht neuronalen Zellen) und neuronalen Zellen enthält, muss die Konzentration von GAD₆₇ in neuronalen Zellkörpern größer sein als in Nervenendigungen. Im Gegensatz dazu war die Konzentration von GAD₆₅ in den Synaptosomen größer als in der S₂-Fraktion. Diese subzellulären Fraktionierungsexperimente legen nahe, dass im Gegensatz zu GAD₆₅ eine viel größere Fraktion von GAD₆₇ in den Zellkörpern von Neuronen als in den Nervenenden vorhanden ist. So zeigt die subzelluläre Fraktionierung ähnlich wie die Immunhistochemie, dass GAD₆₅ und GAD₆₇ unterschiedliche subzelluläre Verteilungen aufweisen.
In vivo-Experimente unter Verwendung von Inhibitoren der GABA-Synthese und des GABA-Abbaus legten nahe, dass der GABA-Pool in den neuronalen Zellkörpern von dem in den Nervenenden verschieden ist (Ladarola et al., Mol. Cell. Biochem. 39 (1981), 305). Die durch GAD₆₇ produzierte GABA kann stärker am Zellstoffwechsel (zum Beispiel am GABA-Shunt) und in dendrodentrischen Synapsen beteiligt sein. Die Dendrite von Körnerzellen im Riechkolben, welche dendrodentrische Synapsen mit mitralen Dendriten bilden (Shepard, Physiol. Rev. 52 (1972), 864) und wahrscheinlich GABA freisetzen (McLennan, Brain Res. 29 (1971), 177-184), werden mit dem K-2-Antiserum intensiv markiert. Obwohl hier nicht aufgeführt, wurden im Riechkolben auch mRNA-Spiegel von GAD₆₇ festgestellt, die höher (um das 2-3fache) als die GAD₆₅-mRNA-Spiegel waren. Diese Verteilung steht im Einklang mit der berichteten Feststellung, dass der überwiegende Teil der GAD-Aktivität im Riechkolben in den S₂- und P₁ (Kernrohpellet)-Fraktionen und nicht in den Synaptosomen vorhanden ist (Quinn et al., J. Neurochem. 35 (1980), 583).
Die sich unterscheidenden subzellulären Verteilungen von GAD₆₅ und GAD₆₇ könnten von der Cytoskelettverankerung oder unbekannten Proteinzielsteuerungsmechanismen herrühren. Einige Cytoskelettproteine weisen Verteilungen auf, die GAD₆₅ und GAD₆₇ ähnlich sind. Zum Beispiel zeigten Peng et al. (J. Cell. Biol. 102 (1986), 252) in gezüchteten sympathischen Neuronen, dass 84% des tau-Proteins in den Axonen vorliegen, während 100% des MAP-2-Proteins in Zellkörpern und Dendriten zu finden sind. Außerdem nimmt man an, dass ein 43 kD-Protein, ein Cytoskelettprotein, den Acetylcholinrezeptor an das darunterliegende Membrancytoskelett verankert (Flucher et al., Neuron. 3 (1989), 163).
BEISPIEL 3
NACHWEIS VON GAD-AUTOANTIKÖRPERN IN KLINISCHEN PROBEN
A. MATERIAL UND METHODEN
1. Patientenproben
Seren von vier Gruppen von Individuen wurden aus einer früheren Studie von Atkinson und Mitarbeitern (Atkinson et al., Lancet 335 (1990), 1357-1360) ausgewählt. Diese Gruppen bestanden aus: Gruppe (1): 1 neuer Ausbruch bei IDD-Patienten, diagnostiziert gemäß den etablierten Kriterien der National Diabetes Data Group (NDDG) (Gleichman et al., Diabetes 36 (1987), 578-584), der an die University of Florida, Diabetes Clinics, weitergeleitet worden war; Gruppe (2): 5 zufällig ausgewählte Nicht-Diabeteskontrollen ohne eine bekannte Familienanamnese von Autoimmunkrankheiten, die bezüglich des cytoplasmatischen Inselzellen-Antikörpers (ICA) negativ waren; Gruppe (3): 13 Individuen, deren Seren 3 bis 66 Monate vor ihren dokumentierten klinischen IDD-Ausbrüchen gesammelt wurden; Gruppe (4); Nicht-Diabeteskontrollen und Verwandte und solche Individuen, die vor dem IDD-Ausbruch untersucht wurden; und Gruppe (5): 3 Patienten, für die ein Risiko für IDDM besteht, aber bei denen noch kein Ausbruch erfolgt ist. Diese letztere Gruppe war durch laufende prospektive ICA-Durchmusterungsstudien von mehr als 5000 Verwandten ersten Grades von IDD-Probanden und 8200 Individuen der Gesamtbevölkerung (davon waren 4813 Schulkinder) ermittelt worden.
2. Inselzellen-Autoantikörper
Auf ICAs wurden durch indirekte Immunfluoreszenz von Gefrierschnitten der Bauchspeicheldrüse von Blutgruppe 0-Individuen untersucht (Atkinson et al., Lancet 335 (1990), 1357-1360). Alle Ergebnisse wurden bei codierten Proben interpretiert, wobei in jeder Charge negative und positive Kontrollseren eingeschlossen waren. Der Grad der ICA-Positivität wurde mit den vom Immunology Diabetes Workshop (IDW) für die Standardisierung von ICAs etablierten Richtlinien analysiert (Gleichman et al., Diabetes 36 (1987), 578-584). Alle positiven Seren wurden durch Endpunktverdünnung titriert, und die Juvenile Diabetes Foundation (JDF)-Einheiten wurden unter Bezugnahme auf ein Standardserum bestimmt, das vorher auf den Internationalen JDF-Standard von 80 Einheiten geeicht worden war. In den Studien, über die hier berichtet wird, war ein positives ICA-Ergebnis durch wiederholte Titer von 10 JDF-Einheiten oder mehr definiert.
3. HLA-DR-Tygisierung
Die HLA-DR-Typisierung wurde, angepasst an das von Van Rood und Van Leuwen (Nature 262 (1976), 795-797) beschriebene Verfahren, unter Verwendung von DR-Platten (One Lamda Laboratories, Los Angeles, CA) durchgeführt.
4. Menschliche Inselzellen
Menschliche Pankreasinseln wurden aus Kadaverbauchspeicheldrüsen isoliert und in vitro aufrechterhalten, wie bereits beschrieben wurde (Ricordi et al., Diabetes 37 (1988), 413-420). Die Inselzellen wurden mit ³⁵S-Methionin (Amersham, Arlington Heigths, IL) in vitro (95% Luft/5% CO₂) stoffwechselmarkiert.
5. Inselzellenextrakte und Immunpräzipitationen
Inselzellen wurden wie bereits von Atkinson et al. beschrieben (Lancet 335 (1990), 1357-1360) mit den folgenden Modifikationen extrahiert. Für Immunpräzipitationsstudien wurden die Inselzellenlysate für alle 1000 Inseln durch Inkubation (2 Std., 4°C) mit entweder Kontrollserum, IDD-Serum (100 μl) oder GAD-6 (Chang et al., J. Neuro. 8 (1988), 2123-2130) (1 μl in 99 μl Tris-Puffer (Atkinson et al., Lancet 335 (1990), 1357-1360)) zweimal vorgeklärt. Die Immunkomplexe wurden dann an einen Überschuss von Protein A-Sepharose CL-4B (Pharmacia, NJ) absorbiert (1 Std., 4°C). Aliquotvolumina, die 1000 Inselzellen entsprechen, enthaltend nicht gebundenes Lysat (vorgeklärt), wurden dann mit entweder IDD-Serum oder Kontrollserum (25 μl) oder GAD-6 (Chang et al., J. Neuro. 8 (1988), 2123-2130) (1 μl in 25 μl Tris-Puffer) inkubiert (12 Std., 4°C). Nach einer weiteren Inkubation mit Protein A-Sepharose CL-4B (1 Std., 4°C) wurden die Komplexe dann 5mal mit 50 mM Tris-HCl (pH 7,4) mit 0,1% SDS, 1,0% Triton X-114 und 2 mM EDTA gewaschen und anschließend noch einmal in zweifach destillierten Wasser gewaschen. Die Protein A-Sepharose CL-4B wurde dann in Laemmli-Probenpuffer (Laemmli, Nature 227 (1970), 680-685) gekocht, und die Proben wurden einer SDS-PAGE und einer Fluororadiographie (Kodak, X-omat AR5) unter Verwendung von Enhancer (New England Nuclear) unterworfen. In einer anderen Ausführungsform wurden die Autoradiogramme durch ein BETAGEN-Analysengerät (Boston, MA) analysiert. In jedem Test wurden sowohl positive als auch negative 64KA-Seren verwendet, die als interne Kontrollen des Tests dienten. Alle Fluororadiogramme wurden analysiert und nach dem Vergleich mit den bekannten internen Kontrollen des Tests als positiv oder negativ bewertet. Positive Serumproben wurden mit 1 bezeichnet, wenn eine Probe bei der Immunpräzipitation eine 64.000 M_x-Bande geringer Intensität ergab; mit 2, wenn eine Bande mittlerer Intensität beobachtet wurde, und mit 3, wenn die Intensität des immunpräzipitierten Proteins groß war. Ein ähnliches Bewertungsverfahren wurde für die Intensität von Banden angewendet, die immunpräzipitierter ³⁵S-GAD₆₅ und ³⁵S-GAD₆₇ entsprachen.
6. Immunpräzipitationen
Die Immunpräzipitation von Bakterienlysaten, enthaltend ³⁵S-GAD₆₅ oder ³⁵S-GAD₆₇, und GAD aus einem menschlichen Hirnhomogenat wurde vervollständigt, wie vorstehend bei den Immunpräzipitationsstudien menschlicher Inselzellenextrakte beschrieben wurde.
7. GAD-Tests
Menschliche Hirnhomogenate wurden mit Patientenseren inkubiert, wie vorstehend bei den menschlichen Inselzellen beschrieben wurde. Nach der Absorption und den Waschschritten wurde die Protein A-Agarose-Aufschlämmung in drei gleiche Volumina aufgeteilt, und die GAD-Aktivität wurde wie beschrieben gemessen (Krieger et al., Neurochem. 33 (1984), 299). Kurz zusammengefaßt wurden Protein A-Agarose-Kügelchen mit [1-¹⁴C]-Glutamat (Amersham) in einem bestimmten Inkubationsgemisch (Krieger et al., Neurochem. 33 (1984), 299) inkubiert, und die Produktion von ¹⁴CO₂ wurde mittels eines Flüssigszintillationszählers quantitativ bestimmt.
8. Produktion von ³⁵S-GAD₆₅ und ³⁵S-GAD₆₇
Ratten-GAD₆₅- und -GAD₆₇-cDNAs wurden in ein bakterielles Expressionssystem subcloniert, wie vorstehend beschrieben wurde. Die Markierung der ³⁵S-GADs wurde mittels Pulsmarkierung eines IPTG-induzierten Bakteriums (gezüchtet in Minimalmedium) für 15 Minuten mit einem TRAN-³⁵S-Marker (ICN) durchgeführt. Die Kulturen wurden dann abzentrifugiert und in 1 ml Homogenisierungspuffer (1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF), 1 mM 2-Aminoethylisothiouroniumbromid (AET) und 60 mM Kaliumphosphat, pH 7,1) resuspendiert und mit Ultraschall behandelt. Nach der Ultraschallbehandlung wurde Zelltrümmer durch Zentrifugation entfernt, und die Proteinkonzentration wurde in dem Überstand (der Überstand wurde in Aliquots bei –70°C gelagert) gemessen (Bradford, Anal. Biochem. 72 (1986), 248).
B. Immunreaktivität von IDDM-Proben
Seren von Patienten mit IDDM wurden auf die Fähigkeit getestet, GAD aus menschlichen Hirnhomogenaten auszufällen.
Wie in Tabelle 4 gezeigt, banden die Seren von vier (von fünf) Patienten, für die ein Risiko bestand, IDDM zu entwickeln, oder die an IDDM litten, erheblich größere Mengen der enzymatisch aktiven GAD menschlicher Hirnextrakte als Seren von Kontrollpatienten. Außerdem wurden Seren von einem der Patienten in einem Prä-IDDM-Zeitraum abgenommen; folglich sind Autoantikörper gegen GAD vor dem Auftreten von IDDM-Symptomen vorhanden (vgl. nachstehend C).
Weitere Experimente (Ergebnisse nicht wiedergegeben) zeigten, dass die Seren von zwei Patienten, für die ein Risiko für IDDM bestand (DA und DC), rekombinant hergestelltes ³⁵S-GAD₆₅ immunpräzipitierten, während rekombinant hergestelltes ³⁵S-GAD₆₇ nur von Seren des Patienten DA (und in einem geringeren Ausmaß als ³⁵S-GAD₆₅) erkannt wurde. Spätere Untersuchungen ergaben für GAD₆₇-Autoantikörper größere Titer als für GAD₆₅-Autoantikörper in den Seren von IDDM-Patienten mit neuropathischen Komplikationen (hier nicht aufgeführt).
Weitere Studien unter Verwendung von Seren des Patienten DA zeigten das Vorhandensein von Antikörpern, die spezifische Polypeptide erkennen, welche in menschlichen Pankreasinselzellen produziert werden. Die elektrophoretische Analyse der gebundenen Polypeptide wies das Vorhandensein von Autoantikörper gegen eine 64 kD-Komponente nach, wie bereits durch andere bei menschlichem IDDM (Baekkeskov et al., Nature 298 (1982), 167-169) und in Tiermodellen (Baekkeskov et al., Science 224 (1984), 1348-1350; Atkinson et al., Diabetes, 37 (1988), 1587-1590) gezeigt wurde. Vorherige Absorption dieser Seren an den monoclonalen GAD-6-Antikörper, der GAD₆₅, aber nicht GAD₆₇ erkennt, oder an bakteriell produzierte GAD₆₅ setzte die Fähigkeit der Seren außer Kraft, das 64 kD-Pankreaspolypeptid zu erkennen. Die von den Autoantikörpern gegen das 64 kD-Autoantigen erkannten Epitope liegen folglich in GAD₆₅ vor, was zeigt, dass das Autoantigen tatsächlich GAD₆₅ ist. Um den prädiktiven Wert von GAD₆₅ zu untersuchen, wurden Seren, die von Patienten vor dem Ausbruch der klinischen Manifestation von IDDM abgenommen wurden, auf Autoantikörper gegen GAD₆₅ getestet.
Wie in Tabelle 5 gezeigt, waren 9 von 12 Proben (75%) mit ³⁵S-GAD₆₅ immunreaktiv. Außerdem waren zwei Patienten (JA und VC) unter diesen Bedingungen mit GAD₆₇, aber nicht mit GAD₆₅ immunreaktiv. Daher waren zusammengenommen Autoantikörper gegen GAD₆₅ und GAD₆₇ in 11 von 12 (91%) dieser Patientenseren vorhanden. Diese Feststellung legt nahe, dass, obwohl Autoantikörper gegen GAD₆₅ häufiger sind als Autoantikörper gegen GAD₆₇, die Verwendung beider rekombinanter GADs (GAD₆₅ und GAD₆₇) in einem Test eine größere Vorhersagbarkeit von IDDM erlauben würde. Frühere Tests dieser Seren (Atkinson et al., Lancet 335 (1990), 1357-1360) zeigten, dass 11 von 12 oder 92% mit dem ³⁵S-64 kD-Molekül aus menschlichen Pankreasinselzellen immunreaktiv waren. Das Serum, das nachweisbare Autoantikörper gegen das 64 kD-Molekül und keine GAD₆₅ enthielt, war ein Serum, das den niedrigsten Titer (oder "1") für das 64 kD-Molekül enthielt. Folglich war das erhaltene falsch negative Ergebnis auf eine ungenügende Empfindlichkeit in diesem Test zurückzuführen. Außerdem sagte dieser Test IDDM für einen Patienten (BR) voraus, der für das 64 K-Molekül negativ war.
Diese Ergebnisse zeigen, dass das in β-Zellen der menschlichen Bauchspeicheldrüse identifizierte 64 kD-Molekül im Hinblick auf die Größe und die Antigenität mit Ratten-GAD₆₅ identisch ist. Außerdem enthalten Seren, die von Patienten vor einem IDDM-Ausbruch abgenommen wurden, Autoantikörper gegen GAD₆₅. Folglich ist das rekombinante GAD₆₅-Molekül als Diagnoseinstrument bei der IDDM-Prognose von großem Nutzen. Die Möglichkeit eines Arztes, IDDM vor Einsetzen der Symptome zu diagnostizieren, wird zweifellos die Zeitspanne, bevor eine Insulintherapie erforderlich wird, vergrößern. Mit der Verwendung rekombinanter GAD₆₅ menschlichen Ursprungs, die die in Pankreas-β-Zellen vorhandene GAD-Form darstellt, wird die Empfindlichkeit solcher Immuntest verbessert werden.
BEISPIEL 4
IMMUNPROLIFERATIVE ANTWORT AUF POLYPEPTIDE
Polypeptide wurden unter Verwendung einer automatischen Vorrichtung (Applied Biosystems) und Standardbedingungen synthetisiert. Diese Polypeptide wurden dann getestet, um ihre relative Fähigkeit zu vergleichen, die Proliferation von Lymphocyten aus der Milz und von Inselzellen infiltrierenden T-Lymphocyten (ITTLs) zu stimulieren. In dieser Studie wurden Polypeptide verglichen, die von der GAD₆₅-Kernsequenz und von dem homologen Bereich des Polio-Virus abgeleitet wurden. Geeignete Zellen wurden 5 Tage mit dem jeweiligen Polypeptid in Gegenwart von 5 × 10⁴ bestrahlten Milzzellen gezüchtet. ³H-Thymidin wurde während den letzten 16 Stunden der Züchtung zugegeben. Tabelle 6

^a Inselzellen infiltrierende T-Lymphocyten (3 × 10⁴ Zellen/Vertiefung)
^b 1 × 10⁵ Zellen/Vertiefung

In diesen Studien gab es keinen signifikanten Unterschied in Bezug auf die proliferative Aktivität der Kulturen von Milzzellen, die entweder dem Polio-Polypeptid oder dem GAD₆₅-Polypeptid ausgesetzt wurden. Jedoch stimulierten beide Polypeptide eine T-Zellantwort, die stärker war als die, die in der Mediumkontrolle festgestellt wurde. Der fehlende Unterschied hinsichtlich der Proliferation in der Milzzellenpopulation kann auf eine geringere Häufigkeit von GAD-Polypeptidspezifischen T-Zellen zurückzuführen sein.
Die IITL-Population zeigte bei gleicher Auswertung einen deutlichen Unterschied in Bezug auf die Zellproliferation. In diesem System war die Antwort auf das GAD₆₅-Polypeptid um das 9fache größer als die des Kulturmediums oder die des Polio-Polypeptids. Diese Daten deuten stark darauf hin, dass die GAD₆₅ ein wichtiges Antigen für T-Zellantworten in der IITL-Population ist. Diese Daten legen nahe, dass die molekulare Mimikry bei der Pathogenese von Diabetes eine Rolle spielt.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Verwendung eines Polypeptids oder Analogs, eines chemischen Derivats oder eines pharmazeutisch verträglichen Salzes davon, welches folgende Aminosäuresequenz hat: X-Pro-Glu-Val-Lys-Y-Lys-Z, wobei X eine Aminosäuresequenz ausgewählt aus einer bis zehn Aminosäuren ist oder weggelassen wird; Y Thr oder Glu ist; und Z eine Aminosäuresequenz ist ausgewählt aus einer bis acht Aminosäuren oder weggelassen wird (a) zur Diagnose von insulinabhängigem Diabetes mellitus (IDDM); (b) zum Nachweis von Antikörpern gegen GAD₆₅ in einer Probe; (c) zur Klassifikation von Patienten mit Autoimmunerkrankungen; (d) zum Screenen nach Arzneistoffen, welche die GAD-Funktion ändern; (e) zur Erzeugung eines Antikörpers.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei X Lys umfasst, Y Thr ist und Z Leu umfasst.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei X Lys umfasst, Y Glu ist und Z Leu umfasst.
Verwendung nach Anspruch 3, wobei X ferner Met umfasst und Z ferner Arg und Leu umfasst.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei X die Aminosäuresequenz Ser-Ile-Met-Ala-Ala-Arg-Tyr-Lys-Tyr-Phe ist und Z die Aminosäuresequenz Gly-Met-Ala-Ala-Val-Pro-Lys-Leu ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei X die Aminosäuresequenz Ala-Met-Met-Ile-Ala-Arg-Phe-Lys-Met-Phe ist und Z die Aminosäuresequenz Gly-Met-Ala-Ala-Leu-Pro-Arg-Leu ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1(b) oder 2 bis 6, wobei die Antikörper Autoantikörper sind.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1(c) oder 2 bis 6, wobei die Autoimmunerkrankung insulinabhängiger Diabetes mellitus (IDDM) ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1(e) oder 2 bis 6, wobei der Antikörper ein polyclonaler oder monoclonaler Antikörper ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1(b) oder 2 bis 7, wobei das Polypeptid in einem kompetitiven oder nicht-kompetitiven Immunoassay in einem direkten oder indirekten Format eingesetzt ist.
Verwendung nach Anspruch 10, wobei der Immunoassay ein Radioimmunoassay (RIA), ein immunometrischer Assay vom Sandwichtyp oder ein Western-Blot-Assay ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1(b) oder 2 bis 7 oder 10, wobei die Antikörper gegen GAD₆₅ durch Messung der GAD-Enzymaktivität nachgewiesen werden.
Verwendung eines Antikörpers gegen das Polypeptid wie in einem der vorangegangenen Ansprüche definiert zum Nachweis vom GAD₆₅.
Verwendung nach Anspruch 13, wobei der Antikörper ein monoclonaler Antikörper ist.
Verwendung nach Anspruch 13 oder 14, wobei der Antikörper an ein Lectin, vorzugsweise Ricin, gebunden ist.
Arzneimittel umfassend das Polypeptid wie in einem der vorangegangenen Ansprüche definiert, wobei das Polypeptid markiert ist.
Arzneimittel nach Anspruch 16, wobei das Polypeptid mit einem therapeutischen Mittel oder einem Radioisotop markiert ist.