DE10007234A1 - Peptid und dafür kodierende Nukleinsäure zur Bestimmung, Diagnostik und Therapie von Erkrankungen des Nervensystems - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein neues Peptid, das Peptid enthaltende Polypeptide und Fusionsproteine, Test-Kits und Verfahren zum Nachweis des Peptids, kodierende Nukleinsäuren und pharmazeutische Zusammensetzungen, die das Peptid enthalten oder auf der kodierenden Nukleinsäure beruhen. Das Peptid dient als Marker zur diagnostischen Bestimmung entzündlicher und/oder erregungshemmender Prozesse und Erkrankungen des Nervensystems sowie als Basis für pharmazeutische Zusammensetzungen zur Behandlung von Erkrankungen des Nervensystems oder von pharmazeutischen Zusammensetzungen mit anästhetischer Wirkung.

Description

Die Erfindung betrifft ein neues Peptid, das Peptid enthaltende Polypeptide und Fusionsproteine, Test-Kits und Verfahren zum Nachweis des Peptids, dafür kodierende Nukleinsäuren und pharmazeutische Zusammensetzungen, die das Peptid oder die kodierende Nukleinsäure enthalten. Die Erfindung betrifft weiter verschiedene Verwendungen des Peptids, Verfahren zu seiner Herstellung und gegen das Peptid gerichtete Antikörper.

Das Guillain-Barre-Syndrom (GBS) wird als eine Autoimmunerkrankung des peripheren Nervensystems angesehen. Die fortschreitende Gliedmaßenschwä­ che bis hin zur vollständigen Paralyse stellt ein Hauptmerkmal der Krankheit dar. Weiterhin werden oftmals Parästhesie, der Verlust der sensorischen Wahrnehmung und Störungen des autonomen Nervensystems beobachtet. Die maximale Ausprägung der Symptome wird innerhalb von ein bis zwei Wochen, in seltenen Fällen innerhalb von vier Wochen erreicht. Meist erfolgt die Rück­ bildung der Symptome innerhalb von Monaten, wobei ungefähr 80% der Patien­ ten keine oder nur schwache, nicht bewegungseinschränkende Defizite aufwei­ sen.

Eine dem GBS ähnelnde Krankheit, die jedoch durch einen chronischen Ver­ lauf gekennzeichnet ist, wird als chronische inflammatorische demyelinisieren­ de Polyradiculoneuropathie (CIDP) bezeichnet. Bisher gibt es keine allgemein gültige Definition für CIDP mit Ausnahme der Beobachtung, daß im Gegensatz zum GBS die progressive Phase länger als vier Wochen, oftmals länger als sechs Monate andauert, und daß häufig Defizite bei dem Patienten zurückblei­ ben. Der Mechanismus, der die schwere Parese bei GBS und CIDP verursacht, umfaßt möglicherweise eine T-Lymphozyten-vermittelte Immunreaktion und Entzündung, der eine Demyelinisierung peripherer Neuronen folgt. Diese An­ nahme wird bestätigt durch erhöhte Mengen an Komplement-Verbindungen und Cytokinen, die im Serum und der Cerebrospinalflüssigkeit von GBS- Patienten beobachtet wird. Gegenwärtig wird der Vorgang der Demyelinisie­ rung, insbesondere im Bereich der Nervenwurzeln, als der entscheidende Me­ chanismus bei der Entwicklung des Nervenleitungsblockes betrachtet. Eine These geht von einer Störung der Blut-/Cerebrospinalflüssigkeits(CSF)- Schranke als früherem, wichtigen Schritt der Krankheitsentstehung aus. Eine weitere These behauptet, daß sich als Folge der Krankheit Lecks der Blut- /CSF-Schranke ausbilden und den erhöhten Proteingehalt in der CSF verursa­ chen. In jedem Falle könnten unspezifische Serum-Bestandteile ohne direkten Bezug zum Immunsystem aus dem Blut in die CSF eindringen, neuronale oder gliale Dysfunktionen verursachen und/oder die neuronale Aktivität verändern. Ein alternativer Mechanismus ist eine verringerte Flußrate der CSF, die den erhöhten Proteingehalt der CSF erklären könnte. Diese Interpretation erfordert keine Beeinträchtigung oder veränderte Selektivität der Blut-/CSF-Schranke. Obwohl sämtliche erwähnten Effekte für den Verlauf von GBS und CIDP von Bedeutung sein könnten, ist ihr tatsächlicher Beitrag zu den Symptomen bisher nicht geklärt. Es konnte kein Zusammenhang hergestellt werden zwischen den erhöhten Protein-Konzentrationen in der CSF und spezifischen elektrophysio­ logischen Befunden oder dem klinischen Bild. Kürzlich wurden Faktoren in der CSF von GBS-Patienten und Multiple Sklerose-Patienten beschrieben, die mit spannungsabhängigen Natrium-Kanälen wechselwirken (Würz et al., Muscle and Nerve 18 (1995), 772-781). Brinkmeier et al., (Muscle and Nerve 19, (1996), 54-62) beschreiben, daß die Faktoren ein Molekulargewicht von weni­ ger als drei kDa, unter stringenteren Testbedingungen von weniger als einem kDa, aufweisen. Aufgrund dieser Beobachtung und der Tatsache, daß die Wirksamkeit der Faktoren auch nach Inkubation von CSF mit Proteasen nicht wesentlich verringert wurde, schlossen die Autoren, daß es sich bei den Fakto­ ren weder um Antikörper noch um Cytokine handelt. Die Stabilität der Faktoren gegenüber einer Hitzebehandlung legt nahe, daß diese keine Proteine sind. Ebenso konnten Hitze-labile und Komplement-abhängige antiexzitatorische Faktoren, die z. B. in Seren von Patienten mit Multiple Sklerose gefunden wer­ den, ausgeschlossen werden.

Alle bisher bekannten Forschungsergebnisse lassen keinen eindeutigen Rück­ schluß auf die Pathogenese der beiden genannten Erkrankungen zu. Genauso wenig wie für das GBS und die CIDP kann für die bekannteste durch Demyeli­ nisierung gekennzeichnete Erkrankung, die Multiple Sklerose (MS), eine ein­ zelne Ursache benannt werden. Auch MS gilt als eine Autoimmunerkrankung des Nervensystems.

Bei der Multiplen Sklerose gelten Immunreaktionen gegen Bestandteile der Myelinscheide als Ursache für die neurologischen Symptome. Zwar sind die genauen auslösenden Faktoren für die MS weiterhin ungeklärt, jedoch besteht Übereinstimmung, daß im Entzündungsherd Autoimmunreaktionen gegen Mye­ linproteine zur Ablösung des Myelins von den Axonen und zur Zerstörung Mye­ lin-bildender Zellen führen. Dadurch kommt es zu einer Beeinträchtigung der Impulsweiterleitung, zu axonalen Schäden und zum Verlust von Axonen und Nervenzellen.

Die Diagnose beruht heute auf klinisch-elektrophysiologischen Daten, bildge­ benden NMR-Analysen des Gehirns und allgemeinen wenig krankheits­ spezifischen liquordiagnostischen Untersuchungen.

Die Multiple Sklerose kann heute nicht geheilt werden, jedoch gibt es verschie­ dene Möglichkeiten, ihren Verlauf abzumildern. Im akuten Schub können ent­ zündungshemmende Cortikosteroide erfolgreich eingesetzt werden. Weiterhin wirken sich Immunsuppressiva und Immunmodulatoren (z. B. Interferon-β) günstig auf den Verlauf der Erkrankung aus. Interferon-β scheint die Substrate bei der schubförmig verlaufenden MS zu verringern. Neben den pharmakothe­ rapeutischen Ansätzen erweist sich auch die physikalische Therapie, d. h. ge­ zieltes Training der Muskulatur und Training von Bewegungsabläufen als günstig zur Verbesserung der Lebensqualität von MS-Patienten.

Je früher die Diagnose gestellt und mit der Behandlung begonnen wird, desto günstiger für die Prognose, denn Schädigungen, welche durch aktive Entzün­ dungsherde entstehen, lassen sich nicht vollständig revertieren.

Der vorliegenden Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, Mittel und Wege zur Verfügung zu stellen, die gezielt zur Diagnostik und/oder Behandlung ent­ zündlicher und/oder erregungshemmender Prozesse und Erkrankungen des Nervensystems, insbesondere bei demyelinsierenden Erkrankungen eingesetzt werden können. Weitere Aufgabe der Erfindung ist die Bereitstellung von Mit­ teln und Verfahren, die eine möglichst frühzeitige Diagnose und damit frühzei­ tige Therapie erlauben.

Diese Aufgaben werden erfindungsgemäß gelöst durch ein Peptid mit der Se­ quenz Gln-Tyr-Asn-Ala-Asp (SEQ ID No: 1) sowie Derivate davon, wobei die Derivate sich durch die Addition, Substitution, Inversion, Insertion und/oder Deletion wenigstens einer Aminosäure gegenüber der ursprünglichen Sequenz unterscheiden und wenigstens 10% der Natrium-Ionenkanal-Bindungsfähigkeit des Peptides (SEQ ID NO: 1) und/oder wenigstens 50% der neurotoxischen Aktivität aufweisen, oder Salze oder Ester davon.

Im folgenden werden einige Begriffe erläutert, um klarzustellen, wie sie im Zu­ sammenhang der vorliegenden Anmeldung verstanden werden sollen.

Der Begriff "Polypeptid", so, wie er nachfolgend in der Beschreibung verwendet wird, umfaßt aus 6 oder mehr Aminosäuren zusammengesetzte Peptide oder Proteine.

"Neurotoxische Aktivität" bedeutet hier die Fähigkeit einer Substanz, Natrium- Ionenkanäle zu blockieren. Die neurotoxische Aktivität kann in diesem Zusam­ menhang durch die Hemmung von Natrium-Ionenströmen durch spannungsab­ hängige Natrium-Ionenkanäle gemessen werden. (Übersichtsartikel Lehmann- Horn et al. in Rev. Physiol. Biochem. Pharmacol. 128; (1996), 198-268). Die experimentellen Bedingungen für die Messung der neurotoxischen Aktivität sind beispielsweise angegeben in (Brinkmeier et al., Muscle and Nerve 19 (1996), 54-62). Die neurotoxische Aktivität kann unter Verwendung von diffe­ renzierten NH15-CA2 [Neuroblastoma × Glioma] Zellen (Hamprecht et al., Meth. Enzymol. 109 (1985), 316-41; Brinkmeier et al., Muscle Nerve 19 (1996), 54-62) bestimmt werden. Beispiel 8 zeigt die Messung der neurotoxischen Ak­ tivität.

"Natrium-Ionenkanal-Bindungsfähigkeit" bedeutet hier die Fähigkeit von Sub­ stanzen, an Natrium-Ionenkanäle, insbesondere spannungsabhängige Natri­ um-Ionenkanäle, zu binden. Die Natrium-Ionenkanal-Bindungsfähigkeit kann beispielsweise bestimmt werden, wie in Trainer et al., J. Biol. Chem. 271 (1996), 11261-11267 angegeben. Beispiel 9 zeigt exemplarisch die Messung der Natrim-Ionenkanal-Bindungsfähigkeit.

Der dem Fachmann bekannte Ausdruck "Homologie" bezeichnet den Grad der Verwandtschaft zwischen zwei oder mehr Peptiden oder Polypeptiden, der durch die Übereinstimmung zwischen den Sequenzen mittels bekannter Ver­ fahren, z. B. der computergestützten Sequenzvergleiche (Basic local alignment search tool, S. F. Altschul et al., J. Mol. Biol. 215 (1990), 403-410), bestimmt werden kann. Der Prozentsatz der "Homologie" ergibt sich aus dem Prozent­ satz identischer Bereiche in zwei oder mehr Sequenzen unter Berücksichtigung von Lücken oder anderen Sequenzbesonderheiten. In der Regel werden spe­ zielle Computerprogramme mit Algorithmen eingesetzt, die den besonderen Anforderungen Rechnung tragen.

Bevorzugte Verfahren zur Bestimmung der Homologie erzeugen zunächst die größte Übereinstimmung zwischen den untersuchten Sequenzen. Computer­ programme zur Bestimmung der Homologie zwischen zwei Sequenzen umfas­ sen, sind jedoch nicht eingeschränkt auf das GCG Programmpaket, einschließ­ lich GAP (Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research 12 (12): 387 (1984); Genetics Computer Group University of Wisconsin, Madison, (WI)); BLASTP, BLASTN, und FASTA (Altschul, S. et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410) (1999)). Das BLASTX Programm kann vom National Centre for Biotechnology Informa­ tion (NCBI) und aus weiteren Quellen bezogen werden (BLAST Handbuch, Alt­ schul S., et al., NCB NLM NIH Bethesda MD 20894; Altschul, S., et al., Mol. Biol. 215: 403-410 (1990)). Auch der bekannte Smith Waterman-Algorithmus kann zur Bestimmung von Homologien verwendet werden.

Bevorzugte Parameter für den Aminosäuresequenz-Vergleich umfassen die nachstehenden:
Algorithmus: Needleman und Wunsch, J. Mol. Biol 48: 443-453 (1970)
Vergleichsmatrix: BLOSUM 62 aus Henikoff und Henikoff, PNAS USA 89(1992), 10915-10919
Lücken-Wert (Gap Penalty): 12
Lückenlängen-Wert: (Gap Length Penalty): 4
Homologie-Schwellenwert (Threshold of Similarity): 0

Das GAP-Programm ist auch zur Verwendung mit den vorstehenden Parametern geeignet. Die vorstehenden Parameter sind die Fehler-Parameter (default parame­ ters) für Aminosäuresequenz-Vergleiche, wobei Lücken an den Enden den Homo­ logie-Wert nicht verringern. Bei sehr kurzen Sequenzen im Vergleich zur Referenz- Sequenz kann es weiterhin notwendig sein, den Erwartungswert auf bis zu 100.000 (expectation value) zu erhöhen und gegebenenfalls die Wortlänge (word size) auf bis zu 2 zu verkleinern.

Weitere beispielhafte Algorithmen, Lücken-Öffnungs-Werte (gap opening penal­ ties), Lückenausdehnungs-Werte (gap extension penalties), Vergleichsmatrizen einschließlich der im Programm-Handbuch, Wisconsin-Paket, Version 9, September 1997, genannten können verwendet werden. Die Auswahl wird von dem durchzu­ führenden Vergleich abhängen und weiterhin davon, ob der Vergleich zwischen Sequenzpaaren, wobei GAP oder Best Fit bevorzugt sind, oder zwischen einer Sequenz und einer umfangreichen Sequenz-Datenbank, wobei FASTA oder BLAST bevorzugt sind, durchgeführt wird.

Eine mit dem oben genannten Algorithmus ermittelte Übereinstimmung von 60% wird im Rahmen dieser Anmeldung als 60% Homologie bezeichnet. Entsprechen­ des gilt für höhere Homologiegrade.

"Klonierung" soll alle im Stand der Technik bekannten Klonierungsmethoden umfassen, die hier zum Einsatz kommen könnten, die jedoch nicht alle im ein­ zelnen beschrieben werden, weil sie zum selbstverständlichen Handwerkszeug des Fachmanns gehören.

Unter "Rekombinanter Expression in einer geeigneten Wirtszelle" sollen alle im Stand der Technik bekannten Expressionsmethoden in bekannten Expressi­ onssystemen verstanden werden, die hier zum Einsatz kommen könnten, je­ doch nicht alle im einzelnen beschrieben werden, weil sie zum selbstverständ­ lichen Handwerkszeug des Fachmanns gehören.

Überraschenderweise wurde nun gefunden, daß ein Peptid mit der Sequenz Gln-Tyr-Asn-Ala-Asp (SEQ ID NO: 1) in der cerebrospinalen Flüssigkeit von Patienten mit Multipler Sklerose und Guillain-Barré-Syndrom vorkommt. Das Peptid bindet an Natrium-Ionenkanäle und blockiert deren Natrium-Ströme. Im Vergleich zu dem bekannten Lokalanästhetikum Lidocain zeigt sich, daß die elektrophysiologische Wirkung von 10 µM des erfindungsgemäßen Peptides der Wirkung von 50 µM Lidocain auf neuronale Natrium-Kanäle entsprechen. Somit ist das Peptid ein deutlich potenteres Lokalanästhetikum als das thera­ peutisch verwendete Lidocain.

Die Bedeutung funktionierender Natrium-Ionenkanäle bei der MS zeigt sich auch darin, daß die Verabreichung geringer Dosen Lidocain an MS-Patienten mit subklinischen demyelinisierenden Läsionen neurologische Symptome bei Plasmaspiegeln von 2,7 µg/ml (10 µM) verursacht (Sakurai et al., Neurology 42 (1992), 2088-2093).

Ferner wurde festgestellt, daß das Peptid in einem Konzentrationsbereich von 8 bis 25 µM in den cerebrospinalen Flüssigkeitsproben aus GBS- und MS- Patienten vorkommt, jedoch in den Kontrollen gesunder Individuen nicht zu beobachten war. Ohne an eine Theorie gebunden zu sein, könnte das Peptid die neurologischen Symptome demyelinisierender Erkrankungen durch seine Bindung an die Natrium-Ionenkanäle in den Ranvier'schen Schnürringen und der Verstärkung der Hemmung der Impulsleitung weiter verschlimmern, insbe­ sondere bei Neuronen, die bereits von der Demyelinisierung betroffen sind.

Gegenstand der Erfindung ist somit ein Peptid mit der Sequenz Gln-Tyr-Asn- Ala-Asp (SEQ ID NO: 1) sowie Derivate davon, die sich durch die Addition, Substitution, Inversion, Insertion und/oder Deletion wenigstens einer Ami­ nosäure gegenüber der ursprünglichen Sequenz unterscheiden und wenig­ stens 10%, vorzugsweise 50%, besonders bevorzugt 90% der Natrium- Ionenbindungsfähigkeit des Peptides (SEQ ID NO: 1) und/oder wenigstens 50%, vorzugsweise 80%, besonders bevorzugt 90% der neurotoxischen Aktivi­ tät aufweisen. Derivate, die eine erhöhte neurotoxische Aktivität aufweisen, sind als wirksame Neurotoxine, wie sie beispielsweise in Anästhetika verwen­ det werden, von Interesse. Derivate, die an Natrium-Ionenkanäle binden, aber keine oder nur eine geringe neurotoxische Aktivität aufweisen, wirken als Anta­ gonisten des in der cerebrospinalen Flüssigkeit vorkommenden Peptides bzgl. des Natrium-Ionenkanals und sind somit von hoher therapeutischer Bedeutung.

In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Derivat wenigstens 60% homo­ log, vorzugsweise wenigstens 90% und besonders bevorzugt wenigstens 95% homolog zu der ursprünglichen Sequenz (SEQ ID NO: 1). Besonders bevorzugt wird das Derivat durch konservative Substitution wenigstens einer Aminosäure des Peptides (SEQ ID NO: 1) erhalten.

Unter konservativen Modifikationen werden solche verstanden, die auf dem Austausch von Aminosäuren beruhen und einen möglichst geringen Einfluß auf die (räumliche) Struktur des Peptids ausüben. Grundsätzlich werden vier phy­ siko-chemische Gruppen unterschieden, in die die natürlicherweise vorkom­ menden Aminosäuren eingeteilt werden. Zur Gruppe der basischen Aminosäu­ ren gehören Arginin, Lysin und Histidin. Zur Gruppe der sauren Aminosäuren gehören Glutaminsäure und Asparaginsäure. Die ungeladenen/polaren Ami­ nosäuren umfassen Glutamin, Asparagin, Serin, Threonin und Tyrosin. Die nichtpolaren Aminosäuren umfassen Phenylalanin, Tryptophan, Cystein, Gly­ cin, Alanin, Valin, Isoleucin, Leucin und Prolin. Eine konservative Substitution bedeutet in diesem Zusammenhang den Austausch einer gegebenen Ami­ nosäure durch eine Aminosäure, die zur gleichen physiko-chemischen Gruppe gehört.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist das Peptid ferner wenig­ stens an einer N-terminal intern und/oder C-terminal gelegenen Aminosäure modifiziert. Solche Modifikationen können dergestalt sein, daß die Peptidstruk­ tur an der C-terminalen Gruppe verlängert oder modifiziert ist und/oder an der N-terminalen Gruppe verlängert oder modifiziert ist und/oder an beiden Grup­ pen entsprechende Verlängerungen und/oder Modifikationen besitzt. Diese Modifikationen können im Liquor oder Serum natürlicherweise vorkommende Modifikationen sein; das Peptid jedoch auch synthetisch modifiziert werden, damit es beispielsweise funktionell an ein diagnostisches System angepaßt ist. Dies ist beispielsweise dann der Fall, wenn Aminosäuren oder andere chemi­ sche Strukturen als Spacer fungieren, um nach der Kopplung an ein Trägermo­ lekül möglichst in einem diagnostischen Testsystem optimal durch einen Anti­ körper erkannt werden zu können oder eine besondere Eignung zur Erkennung des Peptids bei der Präsentation als Antigen aufzuweisen.

Weitere erfindungsgemäße Modifikationen umfassen Acetylierung, Glykosylie­ rung und/oder Amidierung von N-terminalen Amino-Gruppen, Seitenketten­ gruppen und/oder C-terminalen Carboxy-Gruppen. Weitere Modifikationen umfassen übliche N-terminale Schutzgruppen, wie die Benzyloxycarbonylgrup­ pe, und/oder C-terminale Schutzgruppen.

Weiterhin werden erfindungsgemäß die Salze des Peptides bereitgestellt. Hierbei sind physiologisch verträgliche Salze, wie z. B. Natriumsalze, Kalium­ salze, Magnesiumsalze, Bicarbonatsalze, Acetate, Citrate und Chloride bevor­ zugt. Ferner werden erfindungsgemäß auch die Ester des erfindungsgemäßen Peptides umfaßt, wobei Ester bevorzugt sind, die unter physiologischen Bedin­ gungen spaltbar sind. Solche Ester können Vorteile bei der galenischen Zube­ reitung und eine erhöhte Lagerstabilität aufweisen.

In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung ein Polypeptid bereit, das wenigstens ein erfindungsgemäßes Peptid umfaßt. Hierunter fallen sowohl natürlicherweise vorkommende Polypeptide, besonders bevorzugt das Vorläu­ ferprotein, aus dem durch Spaltung das erfindungsgemäße Peptid hervorgeht, als auch nicht natürlicherweise vorkommende Polypeptide, die durch chemi­ sche und/oder enzymatische Synthese bzw. durch gentechnologische Verfah­ ren erhalten werden können. Sofern gentechnologische Verfahren zur Herstel­ lung des Polypeptides verwendet werden, können sämtliche dem Fachmann bekannte Aufreinigungsverfahren einschließlich chromatographischer Verfah­ ren, wie Ionenaustauscher-, hydrophobe Interaktions-, Gelfiltrations- und Affini­ täts-Chromatographie verwendet werden.

Experimentell wurde festgestellt, daß ein Peptid mit der Sequenz Gln-Tyr-Asn- Asp-Ala (SEQ ID NO: 2), welches somit eine Inversion der letzten beiden Ami­ nosäuren gegenüber dem erfindungsgemäßen Peptid aufweist, keine neuro­ toxische Aktivität in Bezug auf Natrium-Ionenkanäle aufweist. Daraus ergibt sich, daß möglicherweise die beiden terminalen Carboxy-Gruppen der Ami­ nosäure Asparaginsäure für die neurotoxische Aktivität des Peptides essentiell sind. Somit sind gemäß einer Ausführungsform solche Polypeptide bevorzugt, die dadurch gekennzeichnet sind, daß das Peptid den C-Terminus des Poly­ peptids bildet.

Vorzugsweise ist das Polypeptid das natürliche Vorläuferprotein, aus dem durch posttranslationale Modifikation, insbesondere Prozessierungsvorgänge, das erfindungsgemäße Peptid mit der Sequenz Gln-Tyr-Asn-Ala-Asp hervor­ geht. Das Vorläuferprotein ist beispielsweise erhältlich durch Absuchen einer humanen cDNA-Bank aus Gehirn, Rückenmark, Lymphozyten, Makrophagen, Oligodendrocyten oder Gliazellen mit einer Sonde, die auf der Grundlage der erfindungsgemäßen Sequenz hergestellt wurde. Geeignete cDNA-Banken sind kommerziell erhältlich, ihre Herstellung gehört darüber hinaus zum allgemeinen Fachwissen, vgl. Maniatis et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Labo­ ratory Press 1989. Die Sequenz des Oligonukleotides, das als Sonde zum Ab­ suchen der cDNA-Bank geeignet ist, ergibt sich aufgrund des universellen ge­ netischen Codes. Hierbei sind jedoch Oligonukleotidsequenzen bevorzugt, die der Häufigkeit des humanen Codon-Gebrauchs entsprechen.

Die Aminosäure Glutamin wird allgemein durch die Codons CAA bzw. CAG, vorzugsweise aufgrund des humanen Codon-Gebrauchs durch CAG codiert. Die Aminosäure Tyrosin wird allgemein durch TAT oder TAC, vorzugsweise durch TAC codiert. Die Aminosäure Asparagin wird durch AAT, AAC, vorzugs­ weise durch AAC codiert. Die Aminosäure Alanin wird durch GCT, GCC, GCA bzw. GCG, vorzugsweise durch GCC codiert. Die Aminosäure Asparaginsäure wird durch GAT oder GAC, vorzugsweise durch GAC codiert. Der in diesem Zusammenhang wiedergegebene Codon-Gebrauch kann beispielsweise fol­ genden Literaturstellen entnommen werden: Grantham, R. et al., Nucleic Acids Res. 8 (1980), r49-r62; der gegenwärtigen Internetadresse FTP://ftp.es.embnet.org/pub/databases/codonusage/hum.cod.

Somit ergibt sich, daß die zum Absuchen der cDNA-Bank geeignete Sonde die allgemeine Sequenz aufweist: CARTAYAAYGCNGAY (SEQ ID NO: 3). R bedeutet hierbei A oder G; Y bedeutet T oder C; und N bedeutet A, G, C oder T. Vorzugsweise hat die Sonde die Sequenz CAGTACAACGCCGAC (SEQ ID NO: 4). Zum Absuchen der cDNA-Bank ist ebenfalls der Gegenstrang der vor­ stehend genannten Sequenzen geeignet. Das Oligonukleotid kann mit Hilfe bekannter Festphasen-Synthesetechniken hergestellt werden. Um als Sonde verwendet zu werden, wird das Oligonukleotid mit Hilfe bekannter Verfahren radioaktiv oder nicht-radioaktiv (z. B. Fluoreszenz) markiert. Die Sonde wird gemäß dem Fachmann bekannter Verfahren (Maniatis et al., supra) mit der cDNA-Bank in Kontakt gebracht. Das Inkontaktbringen wird vorzugsweise unter stringenten Bedingungen durchgeführt; stringente Bedingungen sind in diesem Zusammenhang eine Inkubation bei 68°C über Nacht in 0,5 × SSC; 1% Blockie­ rungsreagenz (Boehringer Mannheim), 0,1% Natriumlaurylsarkosinat, gefolgt von Waschen mit 2 × SSC, 0,1% SDS. Die auf diese Weise erhaltenen cDNA- Klone werden unter Verwendung bekannter Verfahren isoliert und sequenziert. Die Aminosäuresequenz des Vorläuferproteins läßt sich direkt aus der Nukleo­ tidsequenz in dem Fachmann bekannter Weise ableiten. Das erfindungsgemä­ ße Polypeptid bzw. Vorläuferprotein kann durch chemische und/oder enzymati­ sche Synthese oder durch gentechnologische Verfahren, insbesondere re­ kombinante Expression, in heterologen Expressionssystemen hergestellt wer­ den.

In einer weiteren Ausführungsform werden ferner Varianten des Vorläuferpro­ teins, die in diesem Zusammenhang auch als Polypeptide bezeichnet werden, bereitgestellt, die neurotoxische Aktivität aufweisen und/oder an einen Natrium- Ionenkanal binden. Vorzugsweise ist der Natrium-Ionenkanal ein Spannungs­ abhängiger Natrium-Ionenkanal. Die neurotoxische Aktivität ist bevorzugt die Hemmung eines Natrium-Ionenkanals. Die Bestimmung der Bindung an einen Natrium-Ionenkanal bzw. der neurotoxischen Aktivität kann wie vorstehend für das erfindungsgemäße Peptid durchgeführt werden. Die erfindungsgemäßen Polypeptide weisen in einer bevorzugten Ausführungsform 10%, vorzugsweise 50%, besonders bevorzugt 90% der Natrium-Ionenkanal-Bindungsfähigkeit des Peptides mit der Sequenz (SEQ ID NO: 1) auf und/oder wenigstens 50%, vor­ zugsweise 80% und besonders bevorzugt 90% der neurotoxischen Aktivität.

In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung ein Fusionsprotein be­ reit, das wenigstens ein erfindungsgemäßes Peptid und/oder Polypeptid und wenigstens ein biologisch aktives Polypeptid oder ein aktives Fragment davon enthält. In diesem Zusammenhang soll der Ausdruck "biologisch aktives Poly­ peptid" sämtliche Peptide oder Proteine mit biologischer Aktivität bedeuten. Es ist bevorzugt, daß die biologische Aktivität eine Aktivität ist, die an der Entwick­ lung und Regeneration von Zellen, Geweben und Organen des menschlichen und tierischen Körpers beteiligt ist. Es ist bevorzugt, daß die biologische Aktivi­ tät die Entwicklung und Differenzierung von Zellen des peripheren und zentra­ len Nervensystems und deren Versorgungszellen beeinflußt. Das erfindungs­ gemäße Fusionsprotein erfüllt hierbei die Aufgabe, die lokale Konzentration des biologisch aktiven Polypeptides in der Nähe von Natrium-Ionenkanälen, vorzugsweise spannungsabhängigen Natrium-Ionenkanälen aufgrund der in dem Fusionsprotein ferner enthaltenen erfindungsgemäßen Peptid oder Poly­ peptidsequenz zu erhöhen. Dies hat zur Folge, daß biologisch aktive Polypep­ tide, die selbst nur eine geringe oder mittlere Bindungsfähigkeit für diese Natri­ um-Ionenkanäle aufweisen, in ihrer Bindungsfähigkeit deutlich erhöht sind. Be­ vorzugte Fusionsproteine umfassen Ciliären neurotrophen Faktor (CNTF), "Brain-derived" neurotrophen Faktor (BDNF), Neurotrophin-3 (NT-3), Neurotro­ phin 4/5 (NT-4/5) und Gliazellenabgeleiteten neurotrophen Faktor (GDNF), je­ weils in Verbindung mit dem erfindungsgemäßen Peptid.

Der Ausdruck "Fusionsprotein" bedeutet in diesem Zusammenhang, daß we­ nigstens ein erfindungsgemäßes Peptid und/oder Polypeptid an die Aminosäu­ resequenz des biologisch aktiven Polypeptides oder ein aktives Fragment da­ von addiert ist, und/oder in die Aminosäuresequenz des biologisch aktiven Po­ lypeptides inseriert ist, und/oder wenigstens eine natürlicherweise in der Ami­ nosäuresequenz des biologisch aktiven Polypeptides vorkommende Oligopeptidsequenz durch ein erfindungsgemäßes Peptid oder Polypeptid substituiert ist.

Weiterhin ist bevorzugt, daß das erfindungsgemäße Peptid, Polypeptid oder Fusionsprotein ferner eine für die rekombinante Expression relevante Sequenz einen N-terminus umfaßt, wobei die für die rekombinante Expression relevante Sequenz M oder MX ist, und M Methionin und X eine oder mehrere beliebige Aminosäuren bedeutet. MX kann beispielsweise eine Signalsequenz darstel­ len, die dem Fachmann für zahlreiche prokaryontische und eukaryontische Proteine bekannt ist.

Die Erfindung stellt ferner Nukleinsäuremoleküle bereit, die eine für ein erfin­ dungsgemäßes Peptid, Polypeptid oder Fusionsprotein kodierende Nukleinsäu­ re umfassen.

Die im erfindungsgemäßen Nukleinsäuremolekül enthaltene Nukleinsäure kann genomische DNA oder synthetische DNA sein, wobei unter synthetischer DNA auch solche verstanden werden, die modifizierte Internukleosid-Bindungen enthalten. Weiterhin kann es sich bei den Nukleinsäuren um RNA-Moleküle handeln, was z. B. für die Expression mittels rekombinanter RNA- Vektorsysteme erforderlich sein kann.

Erfindungsgemäß wird ein Nukleinsäuremolekül bereitgestellt, das eine Nu­ kleinsäure umfaßt, die ausgewählt ist aus:

• a) einer für ein Peptid, Polypeptid oder Fusionsprotein kodierenden Nu­ kleinsäure;
• b) einer zu der Nukleinsäure nach (i) komplementären Nukleinsäure; und
• c) einer Nukleinsäure, die mit einer Nukleinsäure nach (i) oder (ii) hybri­ disiert und für ein Polypeptid kodiert, das an einen Natrium-Ionenkanal bindet und/oder neurotoxische Aktivität aufweist.

Die Nukleinsäuren gemäß (iii) sind beispielsweise erhältlich durch Verwenden einer nachweisbar markierten Sonde, die einer Nukleinsäure gemäß (i) oder (ii) entspricht, zum Absuchen von cDNA-genomischen DNA-Bibliotheken. Hierbei sind allgemein cDNA-/genomische DNA-Banken aus Vertebraten, vorzugswei­ se aus Säugern und besonders bevorzugt aus Menschen verwendbar. Die der cDNA-Bank zugrunde liegende mRNA ist vorzugsweise aus Gehirn, Rücken­ mark, Lymphozyten, Makrophagen, Oligodendrocyten oder Gliazellen zu erhal­ ten. Die Identifizierung positiver cDNA-/genomischer DNA-Klone erfolgt gemäß Standardverfahren; vgl. Maniatis et al., supra.

In einer bevorzugten Ausführungsform wird die unter (iii) angegebene Hybridi­ sierung unter stringenten Bedingungen durchgeführt. Stringente Hybridisie­ rungsbedingungen sind z. B. eine Inkubation bei 68°C über Nacht in 0,5 × SSC; 1% Blockierungsreagenz (Boehringer Mannheim); 0,1% Natriumlaurylsarko­ sinat, gefolgt von Waschen mit 2 × SSC; 0,1% SDS.

In einer bevorzugten Ausführungsform umfaßt das erfindungsgemäße Nuklein­ säuremolekül einen zur Expression geeigneten Promotor, wobei die Nuklein­ säuresequenz unter der Kontrolle des Promotors steht. Die Wahl des Promo­ tors hängt vom zur Expression verwendeten Expressionssystem ab. Generell sind konstitutive Promotoren bevorzugt, jedoch sind auch induzierbare Promo­ toren, wie z. B. der Metallothionein-Promotor, möglich.

In einer weiteren Ausführungsform werden Vektoren bereitgestellt, die das er­ findungsgemäße Nukleinsäuremolekül enthalten. Im Stand der Technik sind zahlreiche Klonierungs- und Expressions-Vektoren bekannt, vgl. Recombinant Gene Expression Protocols, Meth. Mol. Biol. Vol. 62, Humana Press, New Jer­ sey, USA. Der verwendete Vektor sollte einen Replikationsursprung und gegebenenfalls weitere regulatorische Regionen enthalten. Der Vektor kann ausge­ wählt sein aus Bakteriophagen wie λ-Derivaten, Adenoviren, Vacciniaviren, Baculoviren, SV40-Virus, Retroviren; Plasmiden, wie Ti-Plasmide von Agrobacterium tumefaciens, YAC-Vektoren und BAC-Vektoren.

Ferner stellt die Erfindung Wirtszellen bereit, die das Nukleinsäuremolekül oder den Vektor enthalten und die zur Expression des Nukleinsäuremoleküls geeignet sind. Im Stand der Technik sind zahlreiche prokaryontische und eu­ karyontische Expressionssysteme bekannt, wobei die Wirtszellen beispielswei­ se ausgewählt sind aus prokaryontischen Zellen, wie E. coli oder B. subtilis, aus eukaryontischen Zellen, wie Hefezellen, Pflanzenzellen, Insektenzellen und Säugerzellen, z. B. CHO-Zellen, COS-Zellen oder HeLa-Zellen, sowie De­ rivaten davon. Im Stand der Technik sind beispielsweise bestimmte CHO- Produktionslinien bekannt, deren Glykosylierungsmuster im Vergleich zu CHO- Zellen verändert sind.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ferner ein Verfahren zum Herstellen des Peptides, Polypeptides oder Fusionsproteins, das das Kultivieren einer Wirtszelle unter zur Expression geeigneten Bedingungen und gegebenenfalls das Aufreinigen des exprimierten Peptides, Polypeptides oder Fusionsproteins umfaßt.

Alternativ können die erfindungsgemäßen Peptide, Polypeptide und Fusions­ proteine auch durch chemische und enzymatische Synthese, wie beispielswei­ se Merrifield-Synthese, und/oder Fragmentkondensation erhalten werden. Hierbei können auch Kombinationen von chemischen, enzymatischen und re­ kombinanten Herstellungsverfahren in Betracht kommen.

Die Erfindung stellt weiterhin Reagenzien bereit, die für die erfindungsgemä­ ßen Peptide und/oder Polypeptide spezifisch sind. Ein Beispiel solcher spezifi­ schen Reagenzien sind Antikörper, Antikörperfragmente, z. B. Fab oder F(ab)₂- Fragmente oder Antikörperderivate. Die Antikörper, Antikörperfragmente, z. B. Fab oder F(ab)₂-Fragmente oder Antikörperderivate können monoklonalen oder polyklonalen Ursprungs sein. Allgemein sind spezifische Antikörper er­ hältlich, indem Versuchstiere, wie z. B. Mäuse oder Kaninchen, mit den erfin­ dungsgemäßen Peptiden oder Polypeptiden, die vorzugsweise an geeignete hochmolekulare Trägermoleküle (häufig Proteine) gekoppelt sind, oder Fusi­ onsproteinen immunisiert werden. Das Immunisieren kann hierbei durch den Zusatz geeigneter Adjuvanzien erleichtert werden, die im Stand der Technik bekannt sind. Monoklonale Antikörper sind üblicherweise durch Fusionieren von Milzzellen, die aus einer immunisierten Maus entnommen wurden, mit Tu­ morzellen und Selektionieren der dabei entstehenen Hybridome erhältlich. Diejenigen Hybridome, die effizient spezifische Antikörper sezernieren, können hierbei durch Absuchen des Überstandes bestimmt werden. Alternativ können Antikörper rekombinant hergestellt werden; bei der Herstellung rekombinanter Antikörper wird die mRNA aus Hybridomazellen oder B-Lymphozyten isoliert, die als Grundlage für die Synthese der entsprechenden cDNA fungiert und über PCR amplifiziert wird. Nach der Ligation in einen geeigneten Vektor und der Einführung in eine geeignete Wirtszellkultur läßt sich der Antikörper aus den Zellkulturüberständen oder den Zellysaten gewinnen. Rekombinante Anti­ körper erlauben eine "Humanisierung" des Antikörpers und sind dadurch weni­ ger immunogen. Die diesbezüglichen Verfahren sind im Stand der Technik be­ kannt.

Weitere Reagenzien, die für ein erfindungsgemäßes Peptid oder Polypeptid spezifisch sind, sind Natrium-Ionenkanal-Proteine, bevorzugt spannungs­ abhängige Natrium-Ionenkanal-Proteine und Peptid- und/oder Polypeptid­ spezifische Fragmente davon. Spannungsgesteuerte humane Natriumkanäle sind z. B. CIN1_HUMAN, P35498, CIN2_HUMAN, P99250, CIN4_HUMAN, P35499, CIN5_HUMAN, P14524, CIN6_HUMAN, P01118 aus der Datenbank unter der Internetadresse http://www.expasy.ch/sprot-top.html.

Die Erfindung stellt ferner Test-Kits bereit, die Peptid- oder Polypeptid­ spezifische Reagenzien enthalten. Der Test-Kit kann weiterhin Komponenten enthalten, die notwendig sind zur Durchführung von Nachweis-Verfahren oder Puffersubstanzen zur entsprechenden Verdünnung und pH-Einstellung des Peptid- und/oder Polypeptid spezifischen Reagenzes. Der Test-Kit ist insbe­ sondere für diagnostische Zwecke geeignet. Der erfindungsgemäße Test-Kit wird zur Bestimmung des erfindungsgemäßen Peptids oder Polypeptids vor­ zugsweise in einer aus dem menschlichen Körper stammenden Körperflüssig­ keit verwendet. Es können jedoch auch Bestimmungen mit aus einem tieri­ schem Körper stammender Körperflüssigkeit für diagnostische Zwecke durch­ geführt werden.

Die Erfindung umfaßt ferner die Verwendung der Reagenzien, die für ein erfin­ dungsgemäßes Peptid oder Polypeptid spezifisch sind, in Verfahren zum Nachweisen des Peptides und/oder Polypeptides in einer Körperflüssigkeit. Vorzugsweise ist die Körperflüssigkeit aus cerebrospinaler Flüssigkeit oder Blut bzw. Blutprodukten oder Blutbestandteilen ausgewählt.

Ferner wird ein Verfahren zum Nachweisen des erfindungsgemäßen Peptides und/oder Polypeptides bereitgestellt, daß das Durchführen wenigstens eines chromatographischen Verfahrens, wie Hochleistungsflüssigkeitschromatogra­ phie (HPLC) und/oder Affinitätschromatographie umfaßt. Die Hochleistungs­ flüssigkeitschromatographie, insbesondere bei Verwendung von Umkehrpha­ sen, ist hervorragend geeignet zum Abtrennen relativ kurzer Peptide oder Po­ lypeptide. Die Verwendung von Säulen mit geringem Durchmesser ist hierbei besonders vorteilhaft. Die Affinitätschromatographie wird unter Verwendung des vorstehend erwähnten Antikörpers durchgeführt, der spezifisch für das Peptid und/oder Polypeptid ist. Die Affinitätschromatographie zeichnet sich durch ihre besonders hohe Spezifität aus.

Die Erfindung stellt ferner Test-Kits bereit, die zum Nachweisen eines Antikör­ pers geeignet sind, der spezifisch für das erfindungsgemäße Peptid und/oder Polypeptid ist, wobei der Test-Kit wenigstens ein erfindungsgemäßes Peptid und/oder Polypeptid umfaßt. Der Test-Kit kann ferner im Stand der Technik bekannte Puffersubstanzen enthalten, die zur Verwendung des Test-Kits in Bestimmungs- und diagnostischen Verfahren geeignet sind.

Die Erfindung umfaßt ferner die Verwendung des Peptides und/oder Polypepti­ des in Verfahren zum Bestimmen von Peptid- und/oder Polypeptid spezifischen Autoantikörpern in einer Körperflüssigkeit. Vorzugsweise ist die Körperflüssig­ keit aus cerebrospinaler Flüssigkeit oder Blut bzw. Blutprodukten ausgewählt. Der Nachweis der Autoantikörper in den genannten Körperflüssigkeiten ist von besonderem Interesse, da er als Marker für die vermutlich durch das Peptid vermittelten demyelinisierenden Erkrankungen verwendbar ist. Für Bestim­ mungszwecke vorteilhafte Verfahren sind hierbei Immunoassays, ELISA, RIA, Membrangebundene Teststreifen, Rezeptorbindungtests oder biosensorische Bestimmungen, deren Durchführung dem Fachmann bekannt sind. Beim Nachweis von Autoantikörpern sollen vorzugsweise das Peptid, das Polypeptid oder geeignete Peptid-Konjugate zur spezifischen Bindung der Autoantikörper herangezogen werden. In einem ELISA-Nachweis würde beispielsweise das Peptid auf einer Mikrotiterplatte immobilisiert werden. Im Test binden die spezi­ fischen Autoantikörper und werden dann durch entsprechend markierte Anti- Immunglobulin-Antikörper durch bekannte Verfahren in ein Signal umgesetzt.

Die Erfindung stellt ferner Test-Kits zum Nachweisen der die erfindungsgemä­ ßen Peptide und/oder Polypeptide kodierenden Nukleinsäure bereit. Die Test- Kits umfassen in diesem Falle wenigstens ein erfindungsgemäßes Nukleinsäu­ remolekül, vorzugsweise umfaßt das Nukleinsäuremolekül die Sequenz (SEQ ID NO: 3) und besonders bevorzugt die Sequenz (SEQ ID NO: 4).

Erfindungsgemäß werden die Nukleinsäuremoleküle in Verfahren zum Nach­ weisen einer das erfindungsgemäße Peptid und/oder Polypeptid kodierenden Nukleinsäure in einer biologischen Probe verwendet, wobei das Verfahren das Inkontaktbringen der Probe mit einem eine nachweisbare Markierung tragen­ den Nukleinsäuremolekül und das Nachweisen der Markierung umfaßt. Zum Einsatz können hierbei Hybridisierungsverfahren, und ferner gegebenenfalls Northern Blot- und Southern Blot-Verfahren kommen. Das Nachweisen einer radioaktiven Markierung des Nukleinsäuremoleküls kann hierbei in einfacher Weise durch Autoradiographie erfolgen.

Die Erfindung stellt weiterhin ein Verfahren zum Entfernen des Peptides oder Polypeptides aus einer Körperflüssigkeit bereit. Das Peptid oder Polypeptid kann allgemein aufgrund der Kenntnis seiner molekularen Struktur durch phy­ sikalische, chemische oder biologische Verfahren entfernt werden. Diese Ver­ fahren können beispielswweise Ultra- bzw. Diafiltration sein. In einer bevorzug­ ten Ausführungsform umfaßt das Verfahren das Inkontaktbringen der Körper­ flüssigkeit mit einem Reagenz, das spezifisch für das Peptid oder Polypeptid ist und das Entfernen des Komplexes, der das Peptid oder Polypeptid und das spezifische Reagenz enthält. Bevorzugte spezifische Reagenzien sind hierbei Antikörper oder Natrium-Ionenproteine und deren spezifische Fragmente. Be­ sonders bevorzugt ist, daß das Peptid- oder Polypeptid spezifische Reagenz an eine feste Matrix gebunden ist, und daß das Verfahren das Adsorbieren des Peptides oder Polypeptides an die Matrix umfaßt. Hierbei sind insbesondere Immunadsorptionsverfahren von Interesse, die durch eine hohe Effizienz des Entfernens charakterisiert sind.

In einer weiteren Ausführungsform werden pharmazeutische Zusammenset­ zungen bereitgestellt, die mindestens ein erfindungsgemäßes Peptid, Polypep­ tid und/oder Fusionsprotein und gegebenenfalls einen pharmakologisch ver­ träglichen Träger und/oder Verdünnungsmittel enthalten. Geeignete Träger und/oder Verdünnungsmittel sind im Stand der Technik bekannt. Bevorzugt sind die pharmazeutischen Zusammensetzungen zur intravenösen, subkutanen oder intramuskulären Verabreichung geeignet. Alternativ kann die pharmazeu­ tische Zusammensetzung in Form eines Aerosols unter Verwendung geeigne­ ter Erosolstabilisierender Verbindungen vorliegen.

In Test-Versuchen zeigte sich, daß das Peptid eine starke neurotoxische Aktivi­ tät aufweist. Die beobachtete neurotoxische Aktivität war deutlich höher als die neurotoxische Aktivität des allgemein verwendeten Lokalanästhetikums Lidoca­ in. Somit ist erfahrungsgemäß auch die Verwendung der pharmazeutischen Zusammensetzungen als Anästhetikum vorgeschrieben.

Wie vorstehend ausgeführt, wurde das erfindungsgemäße Peptid im Liquor von MS-Patienten und GBS-Patienten, jedoch nicht bei gesunden Probanden be­ obachtet. Die beiden genannten Erkrankungen gehören zu den demyelinisie­ renden Erkrankungen, die durch eine Auflösung der Myelin-Scheiden, die die Nervenzellen umgeben, charakterisiert sind. Einige Symptome der MS deuten darauf hin, daß MS als Autoimmunerkrankung zu betrachten ist. Erfindungs­ gemäße Peptide und Polypeptide, die eine erhöhte Bindungsfähigkeit für Natri­ um-Ionenkanäle, jedoch keine oder nur geringe neurotoxische Aktivität aufwei­ sen, sind als Antagonisten bzgl. des natürlicherweise vorkommenden Penta­ peptides mit der Sequenz SEQ ID NO: 1 wirksam. Pharmazeutische Zusam­ mensetzungen, die diese Peptide und/oder Polypeptide enthalten, werden somit erfindungsgemäß zum Behandeln von demyelinisierenden Erkrankungen und allgemein zum Behandeln von Autoimmunerkrankungen vorgeschlagen. Weitere Anwendungsgebiete wären die Diagnostik und Therapie von neurode­ generativen Erkrankungen, Alzheimerscher Erkrankung und amyotropher Late­ ralsklerose.

Erfindungsgemäß sind somit sowohl Agonisten als auch Antagonisten des Peptides mit der Sequenz (SEQ ID No: 1) von therapeutischen Interesse bei der Behandlung von Krankheiten, die durch Lymphozyten vermittelt werden, vorzugsweise Autoimmunkrankheiten und Allergien.

Die spannungsabhängigen Natrium-Ionenkanäle werden von einer Multigen- Familie codiert. Die verschiedenen Isoformen von spannungsabhängigen Na­ trium-Ionenkanälen sind heterotrimere Proteine, die aus einer großen, stark glycosylierten α-Untereinheit und einer oder zwei kleinen β-Untereinheiten be­ stehen. Bisher sind acht unterschiedliche Gene (SCN1A bis SCH8A) bekannt, die für die α-Untereinheit kodieren, wobei die meisten von ihnen im Gehirn, peripheren Nervensystem und Muskel exprimimiert werden. Es ist ferner be­ kannt, daß bestimmte Erbkrankheiten mit bestimmten Natrium-Ionenkanal ko­ dierenden Genen assoziiert sind. So wurde befunden, daß die hyperkalämi­ sche periodische Paralyse, eine erbliche humane Muskelerkrankung mit SCH4A assoziiert ist. Die erblichen Erkrankungen Paramyotonia congenita und Kalium-verstärkte Myotonia sind ebenfalls mit SCH4A assoziiert. Die erbliche Herz-Arrhythmie zeigt eine Assoziierung mit SCH5A. Die "motorische Endplat­ ten-Krankheit" ist in der Maus mit SCH8A assoziiert. Somit können Agonisten bzw. Antagonisten bzgl. des Peptides der Sequenz (SEQ ID No: 1) zur Behand­ lung von erblichen Muskelerkrankungen und Herz-Arrhythmien verwendet wer­ den.

Sofern die pharmazeutischen Zusammensetzungen Fusionsproteine enthalten, ist deren Verwendung abhängig von dem dem Fusionsprotein zugrunde lie­ genden weiteren biologisch aktiven Polypeptid. Vorzugsweise ist das biolo­ gisch aktive Polypeptid ein solches, das die Entwicklung und/oder Differenzie­ rung von Zeilen des peripheren bzw. zentralen Nervensystems oder der sie versorgenden Zellen beeinflußt, wie z. B. Nervenwachstumsfaktor (NGF). CNTF, Ciliärer neurotropher FaKtor, BDNF, "brain-derived" neurotropher Fak­ tor, NT-3, Neurotrophin-3, NT-4/5, Neurotrophin-4/5, GDNF, Gliazellen abgelei­ teter neurotropher Faktor. Generell sind diese pharmazeutischen Zusammen­ setzungen sinnvoll zur Behandlung von neurodegenerativen Erkrankungen, bei denen die biologisch aktiven Polypeptide nur eine geringe Affinität für neurona­ le Strukturen aufweisen und deren Konzentration durch die Erhöhung der neu­ ronalen Affinität somit deutlich erhöht werden kann. In diesem Zusammenhang ist besonders die Behandlung der Alzheimer'schen Erkrankung von Interesse, die durch eine fortschreitende Degeneration neuronaler Strukturen charakteri­ siert ist.

Die Erfindung stellt ferner pharmazeutische Zusammensetzungen bereit, die mindestens ein Reagenz enthalten, das für ein erfindungsgemäßes Peptid und/oder Polypeptid spezifisch ist, und gegebenenfalls einen pharmakologisch verträglichen Träger und/oder Verdünnungsmittel. Solche spezifischen Rea­ genzien sind vorzugsweise ausgewählt aus spezifischen Antikörpern und Na­ trium-Ionenkanal Proteinen bzw. bindenden Fragmenten davon Pharmakolo­ gisch verträgliche Träger und/oder Verdünnungsmittel sind im Stand der Technik bekannt. Peptid- und/oder Polypeptid spezifische Reagenzien, die die Bindung des Peptides oder Polypeptides an den Natrium-Ionenkanal blockie­ ren, sind zur Behandlung von demyelinisierenden und neurodegenerativen Er­ krankungen verwendbar. Die pharmazeutischen Zusammensetzungen sind bei geeigneter Markierung der spezifischen Reagenzien, beispielsweise radioaktiv oder nicht-radioaktiv, als Diagnostika verwendbar. Diese Diagnostika sind auch in NMR- oder Kernspintomographie-Verfahren verwendbar.

Ferner stellt die Erfindung pharmazeutischen Zusammensetzungen bereit, die mindestens ein erfindungsgemäßes Nukleinsäuremolekül und gegebenenfalls einen pharmakologisch verträglichen Träger und/oder Verdünnungsmittel ent­ halten. Diese pharmazeutischen Zusammensetzungen sind sowohl zur Ver­ wendung in diagnostischen als auch in therapeutischen Verfahren geeignet. Die diagnostischen Verfahren umfassen hierbei die in situ-Hybridisierung. Die Erfindung zieht als mögliche therapeutischen Anwendungen die somatische Gentherapie in Betracht, die die Unterdrückung der Expression eines Krank­ heitsvermittelnden Gens bzw. den Ersatz eines defekten Gens durch eine kor­ rekte Kopie bedeutet. Die hierbei zum Einsatz kommenden Verfahren sind un­ ter anderem die Anti-sense- und Sense-Therapie, wobei geeignete Vektoren und Verfahren dem Fachmann bekannt sind. (Weiss et al., Cell Mol. Life Sci 55 (1999), 334-358).

Es ist beabsichtigt, mit den nachfolgenden Beispielen die Erfindung zu erläu­ tern, diese jedoch in keiner Weise einzuschränken. Dem Fachmann sind auf­ grund der Beschreibung der Beispiele weitere Ausführungsformen zugänglich, die ebenfalls umfaßt sind.

Fig. 1 zeigt die Dosis/Wirkungskurve des synthetischen Peptides Gln-Tyr-Asn- Ala-Asp (SEQ ID No: 1) auf die "steady-state"-Inaktivierungskurven. Die Figur zeigt die durchschnittliche Links-Verschiebung der h ∞-Kurve, die gegen die Peptid-Konzentration aufgetragen ist.

Beispiele Beispiel 1 Anwendung von Nachweisverfahren des Peptides und dessen Modifikationen zur Diagnostik

Das Peptid sowie Modifikationen oder Derivate davon werden erfindungsge­ mäß als Marker zur medizinischen Diagnostik von Erkrankungen, vorzugsweise von Erkrankungen des Nervensystems, wie beispielsweise GBS oder MS beim Menschen angewendet. Es kann in dieser Funktion auch zur Therapiekontrolle eingesetzt werden. Veterinärmedizinische Anwendungen sind ebenfalls mög­ lich.

Der Einsatz des Peptides als Marker erfolgt vorzugsweise in üblichen diagno­ stischen Verfahren, wie Blotting-Verfahren, Immunoassays, biosensorischen Verfahren oder vergleichbaren Verfahren. Dabei wird das Peptid oder dessen Modifikationen und Derivate in entsprechenden Bindungstests, beispielsweise in Immunoassays, eingesetzt. Hierbei kann das Peptid auch, vorzugsweise über seinen C-Terminus, seinen N-Terminus oder andere geeignete funktionel­ le Einheiten an Träger- oder Markerproteine, insbesondere auch Enzyme, oder auch Kolloide mit Hilfe bekannter Verfahren, vorzugsweise kovalent oder ad­ sorptiv, gekoppelt bzw. gebunden werden. Diese Konjugate können in den dia­ gnostischen Verfahren ebenfalls verwendet werden und stellen einen Bestand­ teil der Erfindung dar.

Durch Kopplung des Peptids oder dessen abgeleiteter Struktur an Proteine oder andere Trägerstrukturen und anschließende Immunisierung mit diesen Konjugaten lassen sich Antikörper gewinnen, die die Peptidstruktur spezifisch erkennen und somit zur diagnostischen Bestimmung des Peptids, beispielswei­ se in Immunoassays, eingesetzt werden können. Auch diese Antikörper, die durch Immunisieren mit Hilfe des Peptids, dessen Konjugaten oder davon ab­ geleiteten Strukturen gewonnen werden, fallen in den Bereich der Erfindung. In einem vorzugsweise verwendeten diagnostischen System werden vorzugswei­ se gegen das Peptid gerichtete Antikörper beispielsweise auf adsorbierenden Mikrotiterplatten nach etablierten Verfahren immobilisiert. In einem kompetiti­ ven Immunoassay konkurriert die freie Peptidstruktur aus der Liquor- oder Serumprobe mit einer konstanten Menge zugegebenen, beispielsweise en­ zymmarkierten Peptids um die Bindungsstellen der Antikörper, wodurch schließlich ein quantifizierbares Signal zur quantitativen Bestimmung des Pep­ tides erzielt wird. Bei der Herstellung der Peptid-Protein bzw. Peptid-Enzym- Konjugate, wird das Peptid üblicherweise so modifiziert, meist durch Einbrin­ gung eines Spacerarms zum Trägerprotein, daß eine optimale Präsentation des Peptids möglichst effizient gewährleistet ist. Auch andere denkbare Assays mit unterschiedlichen Markern oder Strategien zur Präsentation des Peptids im diagnostischen System sind Bestandteil der Erfindung.

Das Peptid kann in dieser Funktion auch zur Therapiekontrolle eingesetzt wer­ den.

Die erstgenannte Diagnostik ist bei den verschiedenen Arten demyelinisieren­ der Erkrankungen wie GBS und Multipler Sklerose indiziert. Durch die Bestim­ mung der zu analysierenden Strukturen in den entsprechenden Körperflüssig­ keiten, vorzugsweise cerebrospinaler Flüssigkeit oder Serum, die entweder das Peptid selbst betrifft oder Strukturen betrifft, die endogen in den Körperflüssig­ keiten vorhanden sein können und spezifisch an das Peptid binden, wie bei­ spielsweise Rezeptoren oder Autoantikörper, werden diagnostische Aussagen in Bezug auf mögliche Erkrankungen ermöglicht. Diese Aussagen können im Zusammenhang mit der Diagnostik zur Identifizierung von Erkrankungen ste­ hen oder beispielsweise auch zur Verlaufskontrolle der betreffenden Erkran­ kungen herangezogen werden.

Die zweitgenannte Diagnostik betrifft Applikationen der mit der Peptidstruktur in Zusammenhang stehenden Methoden zu Forschungszwecken, wobei insbe­ sondere die Aufklärung molekularer Abläufe im Zusammenhang mit physiologi­ schen Vorgängen besonders unter pathophysiologischen Gesichtspunkten be­ troffen sind. Auch bei der Evaluierung im Zusammenhang mit der Entwicklung von Arzneimitteln kann die offenbarte Struktur als diagnostischer Marker zur Anwendung kommen.

Beispiel 2 Gewinnung von Antikörpern gegen das Peptid für die An­ wendung in immunologischen Test (Diagnostik)-Verfahren

Die Antikörper werden dadurch gewonnen, daß das Peptid oder davon abgelei­ tete Strukturen, vorzugsweise Protein-Peptid-Konjugate, zur Immunisierung herangezogen werden. Üblicherweise werden das Peptid oder dessen Derivate vor deren Kopplung an Trägerstrukturen (Trägerprotein) beispielsweise mit Spacern modifiziert, um eine bessere Erkennung durch das Immunsystem zu fördern und damit effizientere Antikörper zu gewinnen. Antikörper bilden häufig die Grundlage zu einem diagnostischen Verfahren, das die routinemäßige Er­ fassung von Peptidstrukturen in diagnostischen Tests ermöglicht. Als Matrix hierfür dienen insbesondere humane Liquorproben, aber auch humanes Serum oder andere Körperflüssigkeiten humanen oder tierischen Ursprungs.

Beispiel 3 Nachweis von Autoantikörpern, die gegen das Peptid ge­ richtet sind, zur Diagnostik von Autoimmunerkrankungen

Das Peptid und dessen abgeleitete Strukturen werden erfindungsgemäß auch herangezogen, um Autoantikörper, die gegen die Peptidstruktur gerichtet sind, in Körperflüssigkeiten nachzuweisen. Sie dienen insofern als Markerstruktur für autoimmune Erkrankungen, und werden als Zielantigen in diagnostischen Ver­ fahren eingesetzt. Darüber hinaus wird erfindungsgemäß auch der diagnostische Einsatz das Peptid spezifisch bindender Moleküle, beispielsweise von Rezeptorstrukturen, erfaßt. Hierfür wird das Peptid, vorzugsweise nach kova­ lenter Kopplung an einen makromolekularen Träger adsorptiv, oder direkt kova­ lent, beispielsweise an aktivierten und kommerziell verfügbaren Mikrotiterplat­ ten immobilisiert. Auf diesen Oberflächen, beispielsweise in Mikrotiterplatten werden die zu bestimmenden Liquor- oder Serumproben inkubiert. Eventuell vorhandene, gegen das Peptid gerichtete Autoantikörper werden gebunden und können dann beispielsweise durch enzymmarkierte Anti-human-Antikörper detektiert und quantifiziert werden.

Beispiel 4 Anwendungen des Peptids für diagnostische Zwecke mit therapeutischen Zielsetzungen

Anwendungsmöglichkeiten bestehen beispielsweise bei der Evaluierung von Arzneimitteln, wobei beispielsweise im Rahmen der Wirkstoffevaluierung oder in klinischen Studien neuer Therapeutika, der Krankheitsverlauf mittels auf dem Peptid beruhender diagnostischen Maßnahmen bestimmt werden kann.

Beispiel 5 Anwendungen des Peptids in der Therapie

Zielsetzungen bestehen auch darin, das Peptid gezielt durch den Einsatz ge­ eigneter Techniken (beispielsweise durch gezielte Liquorfiltration oder den the­ rapeutischen Einsatz von peptidspezifischen Antikörpern) aus den entspre­ chenden Körperflüssigkeiten zu eliminieren. Die Kenntnis des Peptids dient als Grundlage für dessen gezielte Eliminierung durch physikalische, chemische oder biologische Verfahren zur gezielten Entfernung aus der biologischen Ma­ trix oder zur Unterbindung der biologischen Wirksamkeit des Peptids, bei­ spielsweise dadurch, daß durch die Bindung an andere Moleküle, beispiels­ weise an Antikörper oder Rezeptormoleküle, dessen Wirksamkeit einge­ schränkt oder gänzlich unterbunden wird.

Eine weitere Möglichkeit besteht in der Verdrängung des Peptids von den Zielstrukturen beispielsweise durch den Einsatz strukturverwandter Peptide in der Therapie.

Beispiel 6 Anwendung der kodierenden DNA in der medizinischen Diagnostik von Erkrankungen des Nervensystems

Für diagnostische und therapeutische Zwecke kann auch die das Peptid bzw. dessen Derivate kodierende Nukleinsäure herangezogen werden. Etablierte Methoden zur selektiven Bestimmung bestimmter Nukleinsäuresequenzen, wie DNA-Sonden, dienen einer über die Peptidanalytik hinausgehende Diagnostik. Die Leistungsfähigkeit der Peptid- und der Nukleinsäurediagnostik werden in Abhängigkeit von den jeweils spezifischen Testanforderungen eingesetzt.

Beispiel 7 Anwendung der kodierenden DNA in der Therapie von Er­ krankungen des Nervensystems

Auch therapeutische Möglichkeiten sind auf der Grundlage der Kenntnis der Nukleinsäuresequenz denkbar. Diese therapeutischen Möglichkeiten sind bei­ spielsweise unter Anwendung der Anti-Sense-Sequenzen auf der Ebene der kodierten RNA nötig und können somit einen künftigen Ansatz in der Genthe­ rapie darstellen.

Beispiel 8 Neurotoxischer Assay Bestimmung der neurotoxischen Aktivität

Die neurotoxische Aktivität wurde durch die Hemmung von Natrium- Ionenkanälen unter Verwendung von differenzierten NH15-CA2 Neuroblasto­ ma-x-Glioma-Zellen bestimmt. Die Kulturbedingungen, morphologischen und physiologischen Parameter der Differenzierung dieser Zellen sind bekannt (Hamprecht et al., Meth. Enzymol. 109 (1985), 316-41). Für den Assay wurden die Zeilen in eine hydrophobe Testschale überführt, die mit Standard- Außenflüssigkeit (140 mM NaCl; 3,5 mM KCl; 1,0 mM CaCl₂; 1,0 mM MgCl₂; 2 mM HEPES, pH 7,4) gefüllt war. Die Schale befand sich auf der Ablage eines invertierten Mikroskops zur Beobachtung der Zellen, während diese mit Pipet­ ten behandelt wurden, die mit Innen-Lösung (140 mM CsCl₂; 1,4 mM MgCl₂; 10 mM EGTA und 10 mM HEPES (Spitzenwiderstände: 300 bis 500 kΩ)) gefüllt waren. Die Natrium-Ströme wurden ausgelöst und im Ganzzell-(whole-cell)- Modus aufgezeichnet. Als Schnelltest für die neurotoxische Aktivität kann die Bestimmung der maximalen Stromamplitude als Antwort auf repetitive 8-ms dauernde Rechteckpulse von -85 nach -20 mv vor, während und nach der Ver­ abreichung der Testlösung verwendet werden. Die Abnahme des Stroms wurde in drei bis fünf Zellen registriert und die Mittelwerte bestimmt. Ein ausgedehnter Test bestand in der Bestimmung der "steady-state"-Aktivierungs- und Inaktivie­ rungs-Parameter von Natrium-Ionenkanälen. Um die Spannungs-Abhängigkeit der Aktivierung zu bestimmen, wurde ein zyklisches Pulsprogramm verwendet, das aus Präpulsen bestand, die die Zeilen von einem HP (Haltepotential) von -85 mV bis -135 mV über 100 ms, und nachfolgende Variable Testpulse, die 8 ms in 4 mV-Schritten von -65 bis +31 mV depolarisierte. Für die Spannungs- Abhängigkeit der inaktivierung wurde ein ähnliches Programm verwendet, das aus einem festen 100 ms-konditionierenden Puls auf -135 mV, einem variablen 32 ms Präpuls im Verlauf von -135 auf -19 mv in 4 mV-Schritten, und einen konstanten Testpuls, der die Zellen auf -20 mV depolarisierte, bestand. Die Größe der Links-Verschiebung der h-Kurve bei Vorhandensein von Testlösun­ gen wurde als Maß für die Hemmung der Natrium-Ionenkanäle verwendet.

Die neurotoxische Aktivität des synthetischen Peptides mit der Sequenz (SEQ ID No: 1) wurde bestimmt durch die Hemmung der Natrium-Ströme durch Io­ nenkanäle, die durch 1-Hz-Rechteckpulse von 85 nach -10 mV induziert wur­ den. Fig. 1 zeigt das Ergebnis von sieben Messungen, die an NH15-CA2 Neu­ roblastoma-x-Glioma-Zeilen durchgeführt wurden. Es ist jeweils der Mittelwert mit der Standardabweichung wiedergegeben. Es zeigte sich, daß eine Peptid­ konzentration von weniger als 10 µM die Natrium-Ionenströme halbmaximal hemmte. Die Peptid-vermittelte Blockierung des Ionenkanals war rasch und reversibel.

Beispiel 9 Bestimmung der Natrium-Ionenkanal-Bindungsfähigkeit

Die Natrium-Ionenkanal-Bindungsfähigkeit eines gegebenen Peptides, Poly­ peptides oder Fusionsproteins kann allgemein durch die Kompetition mit trity­ liertem Batrachotoxinin-A 20-α-benzoat, [benzoyl-2,5-] [³H] BTXB an aufgerei­ nigten und rekonstituierten Natrium-Ionenkanälen bestimmt werden (Trainer et al., J. Biol. Chem. 271 (1996), 11261-11267). Die Bindungsreaktionen werden mit einer vierfachen Verdünnung von 50 µl aufgereinigten und rekonstituierten Natrium-Ionenkanälen (5-10 pmol) in Standard-Bindungsmedium gestartet (Sharkey et al., Mol. Pharmacol. 31 (1986), 273-278). Die rekonstituierten Ka­ näle werden bei 25°C über 16 Stunden mit [³H] BTXB und gegebenenfalls den erfindungsgemäßen Peptiden, Polypeptiden oder Fusionsproteinen inkubiert. Die Bindungsreaktionen werden durch Zusatz von Cholin-Waschmedium ge­ stoppt. Die Proben werden durch GF/F-Filter filtriert (Tamkon et al., J. Biol. Chem. 259 (1984), 1676-1688). Die unspezifische Bindung wird in Gegenwart von 300 µM Veratridin bestimmt.

SEQUENZPROTOKOLL

Claims (43)

1. Peptid mit der Sequenz Gln-Tyr-Asn-Ala-Asp (SEQ ID NO: 1) sowie Deri­ vate davon, wobei die Derivate sich durch die Addition, Substitution, Inversion, Insertion und/oder Deletion wenigstens einer Aminosäure gegenüber der ur­ sprünglichen Sequenz unterscheiden und wenigstens 10% der Natrium- Ionenkanal-Bindungsfähigkeit des Peptides (SEQ ID NO: 1) und/oder wenig­ stens 50% der neurotoxischen Aktivität aufweisen, oder Salze oder Ester da­ von.

2. Peptid gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Derivat wenigstens 80% homolog zu der ursprünglichen Sequenz (SEQ ID NO: 1) ist.

3. Peptid gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Derivat durch konservative Substitution wenigstens einer Aminosäure des Pep­ tides (SEQ ID NO: 1) erhalten wird.

4. Peptid gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Peptid ferner wenigstens an einer N-terminal, intern und/oder C- terminal gelegenen Aminosäure modifiziert ist.

5. Peptid gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Modifika­ tion eine Acetylierung, Glykosylierung und/oder Amidierung ist.

6. Polypeptid, umfassend wenigstens ein Peptid gemäß einem der Ansprü­ che 1 bis 5.

7. Polypeptid gemäß Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß das Peptid am C-Terminus des Polypeptides liegt.

8. Polypeptid gemäß Anspruch 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, daß das Polypeptid an einen Natrium-Ionenkanal bindet und/oder neurotoxische Aktivität aufweist.

9. Polypeptid gemäß Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die neu­ rotoxische Aktivität die Hemmung eines Natrium-Ionenkanals ist.

10. Polypeptid gemäß einem der Ansprüche 7 bis 9, dadurch gekenn­ zeichnet, daß das Polypeptid wenigstens 10% der Natrium-Ionenkanal- Bindungsfähigkeit des Peptides (SEQ ID NO: 1) und/oder wenigstens 50% der neurotoxischen Aktivität aufweist.

11. Fusionsprotein, umfassend wenigstens ein Peptid oder Polypeptid ge­ mäß einem der Ansprüche 1 bis 10 und wenigstens ein biologisch aktives Po­ lypeptid, oder ein aktives Fragment davon.

12. Nukleinsäuremolekül, umfassend eine Nukleinsäure ausgewählt aus:

• a) einer für ein Peptid oder Polypeptid gemäß einem der Ansprüche 1 bis 10 kodierenden Nukleinsäure;
• b) einer zu der Nukleinsäure nach (i) komplementären Nukleinsäure; und
• c) einer Nukleinsäure, die mit einer Nukleinsäure nach (i) oder (ii) hybridi­ siert und für ein Polypeptid kodiert, das an einen Natrium-Ionenkanal bindet und/oder neurotoxische Aktivität aufweist.

13. Nukleinsäuremolekül gemäß Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß die Hybridisierung nach (iii) unter stringenten Bedingungen durchgeführt wird.

14. Nukleinsäuremolekül gemäß Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß stringente Bedingungen 0,5 × SSC bei 68°C sind.

15. Nukleinsäuremolekül gemäß einem der Ansprüche 12 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß die Nukleinsäure genomische DNA, cDNA, synthetische DNA oder RNA ist.

16. Nukleinsäuremolekül gemäß einem der Ansprüche 12 bis 15, weiterhin umfassend einen zur Expressionskontrolle geeigneten Promotor, wobei die für ein Peptid oder Polypeptid kodierende Nukleinsäure unter der Kontrolle eines Promotors steht.

17. Vektor, umfassend ein Nukleinsäuremolekül gemäß einem der Ansprü­ che 12 bis 16.

18. Wirtszelle, enthaltend ein Nukleinsäuremolekül gemäß einem der An­ sprüche 12 bis 16 und/oder einen Vektor gemäß Anspruch 17, wobei die Wirts­ zelle eine zur Expression des Nukleinsäuremoleküls geeignete prokaryontische oder eukaryontische Zelle ist.

19. Verfahren zum Herstellen eines Peptides und/oder Polypeptides gemäß einem der Ansprüche 1 bis 10, umfassend das Kultivieren einer Wirtszelle ge­ mäß Anspruch 18 unter zur Expression geeigneten Bedingungen und gegebe­ nenfalls das Aufreinigen des exprimierten Peptides oder Polypeptides.

20. Antikörper, der für ein Peptid oder Polypeptid gemäß einem der Ansprü­ che 1 bis 20 spezifisch ist.

21. Antikörper gemäß Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß der An­ tikörper, das Antikörperfragment oder Antikörperderivat monoklonal, polyklonal oder rekombinant ist.

22. Test-Kit zum Nachweisen eines Peptides oder Polypeptides gemäß ei­ nem der Ansprüche 1 bis 10, umfassend wenigstens ein Reagenz, das für das Peptid und/oder Polypeptid spezifisch ist.

23. Test-Kit gemäß Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, daß das Pep­ tid- und/oder Polypeptid spezifische Reagenz ausgewählt ist aus einem Anti­ körper gemäß Anspruch 20 oder 21, einem Natrium-Ionenkanalprotein, und Peptid- und/oder Polypeptid spezifischen Fragmenten davon.

24. In vitro-Verfahren zum Nachweisen eines Peptides und/oder Polypepti­ des gemäß einem der Ansprüche 1 bis 10 in einer biologischen Probe, umfas­ send das Inkontaktbringen der Probe mit einem für das Peptid und/oder Poly­ peptid-spezifischen Reagenz und das Nachweisen der Bindung.

25. Verfahren zum Nachweisen eines Peptides und/oder Polypeptides ge­ mäß einem der Ansprüche 1 bis 10, umfassend das Durchführen wenigstens eines chromatographischen Verfahrens wie Hochleistungsflüssigkeitschroma­ tographie (HPLC) und/oder Affinitätschromatographie.

26. Verwendung eines für ein Peptid- und/oder Polypeptid gemäß einem der Ansprüche 1 bis 10 spezifischen Reagenzes zum Bestimmen des Peptides und/oder Polypeptides in einer Körperflüssigkeit.

27. Verwendung gemäß Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, daß die Körperflüssigkeit ausgewählt ist aus cerebrospinaler Flüssigkeit, Blut bzw. Blutprodukten oder Blutbestandteilen.

28. Verfahren zum Entfernen eines Peptides oder Polypeptides gemäß ei­ nem der Ansprüche 1 bis 10 aus einer Körperflüssigkeit, umfassend das Inkon­ taktbringen mit einem für das Peptid- oder Polypeptid spezifischen Reagenz und das Entfernen des gebildeten Komplexes.

29. Verfahren gemäß Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet, daß das Peptid- oder Polypeptid spezifische Reagenz an eine feste Matrix gebunden ist und das Verfahren das Absorbieren des Peptides oder Polypeptides umfaßt.

30. Test-Kit zum Nachweisen eines für das Peptid- und/oder Polypeptid ge­ mäß einem der Ansprüche 1 bis 10 spezifischen Antikörpers, umfassend we­ nigstens ein Peptid und/oder Polypeptid gemäß einem der Ansprüche 1 bis 10.

31. In vitro-Verfahren zum Nachweisen eines für das Peptid- und/oder Poly­ peptid gemäß einem der Ansprüche 1 bis 10 spezifischen Antikörpers in einer biologischen Probe, umfassend das Inkontaktbringen der Probe mit einem Peptid und/oder Polypeptid gemäß einem der Ansprüche 1 bis 10, das eine nachweisbare Markerung trägt, und das Nachweisen der Markierung.

32. Verwendung des Peptides und/oder Polypeptides gemäß einem der An­ sprüche 1 bsi 10 zum Bestimmen von Peptid- und/oder Polypeptid spezifischen Autoantikörpern in einer Körperflüssigkeit.

33. Verwendung nach Anspruch 32 zur Bestimmung von Autoantikörpern, dadurch gekennzeichnet, daß die Körperflüssigkeit ausgewählt ist aus cere­ brospinaler Flüssigkeit, Blut bzw. Blutprodukten.

34. Test-Kit zum Nachweis einer für ein Peptid- und/oder Polypeptid gemäß einem der Ansprüche 1 bis 10 kodierenden Nukleinsäure, umfassend wenig­ stens ein Nukleinsäuremolekül gemäß einem der Ansprüche 12 bis 16.

35. In vitro-Verfahren zum Nachweis einer ein Peptid und/oder Polypeptid gemäß einem der Ansprüche 1 bis 10 kodierenden Nukleinsäure in einer bio­ logischen Probe, umfassend das Inkontaktbringen der Probe mit einem Nu­ kleinsäuremolekül gemäß einem der Ansprüche 12 bis 16, das eine nachweis­ bare Markierung trägt; und das Nachweisen der Markierung.

36. Verwendung eines Nukleinsäuremoleküls gemäß einem der Ansprüche 12 bis 16 als Sonde zum Nachweisen einer ein Peptid und/oder Polypeptid gemäß einem der 1 bis 10 kodierenden Nukleinsäure in einer biologischen Probe.

37. Pharmazeutische Zusammensetzung, gekennzeichnet durch mindestens ein Peptid und/oder Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 10 und gege­ benenfalls einem pharmakologisch verträglichen Träger und/oder Verdün­ nungsmittel.

38. Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 37 zur therapeu­ tischen Anwendung als Anästhetikum.

39. Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 37 zur therapeu­ tischen Anwendung bei demyelinisierenden Erkrankungen oder neurodegene­ rativen Erkrankungen.

40. Pharmazeutische Zusammensetzung, gekennzeichnet durch minde­ stens ein für ein Peptid und/oder Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 10 spezifisches Reagenz und gegebenenfalls einen pharmakologisch verträgli­ chen Träger und/oder Verdünnungsmittel.

41. Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 40 zur diagnosti­ schen oder therapeutischen Anwendung bei demyelinisierenden oder neuro­ degenerativen Erkrankungen.

42. Pharmazeutische Zusammensetzung, gekennzeichnet durch minde­ stens ein Nukleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 12 bis 16 und gege­ benenfalls einen pharmakologisch verträglichen Träger und/oder Verdün­ nungsmittel.

43. Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 42 zur diagnosti­ schen oder therapeutischen Anwendung bei demyelinisierenden oder neuro­ degenerativen Erkrankungen.