DE69637078T2

DE69637078T2 - Polypeptid-fragmente die fähig sind mit dem antigen i/ii von streptococcus mutans zu konkurrieren

Info

Publication number: DE69637078T2
Application number: DE69637078T
Authority: DE
Inventors: Thomas Lehner; Charles Kelly
Original assignee: Kings College London
Current assignee: Kings College London
Priority date: 1995-01-31
Filing date: 1996-01-31
Publication date: 2008-01-10
Anticipated expiration: 2016-02-01
Also published as: US6500433B1; GB9501826D0; ATE361980T1; WO1996023886A1; EP0871734A1; AU4545096A; ES2285709T3; EP0871734B1; DE69637078D1; US6024958A

Description

Diese Erfindung betrifft Polypeptid-Fragmente des Streptococcus mutans I/II-Antigens, die zur Behandlung und Verhütung von Zahnkaries nützlich sind.
Bei Streptococcus mutans handelt es sich um den Hauptverursacher von Zahnkaries, einer Erkrankung, die Säuger, einschließlich des Menschen, befällt.
Das S. mutans I/II-Antigen (SA I/II) ist ein Zelloberflächenprotein mit einem M_r von etwa 185 kDa. Es wird angenommen, dass es mehrere antigene Epitope umfasst und zumindest teilweise für die Haftung von S. mutans an Zähnen verantwortlich ist.
SA I/II ist beschrieben in dem britischen Patent Nr. 2.060.647 , ebenso wie eine Anzahl der zugehörigen Antikörper. Ein putatives 3,5 bis 4,5 kDa Fragment von SA I/II, "Antigen X", ist ebenfalls in dem europäischen Patent Nr. 0 116 472 beschrieben worden. Siehe auch EP-A-0 280 576 mit dem Titel "Synthetic anti-caries vaccine".
Es ist nun allerdings klar geworden, dass "Antigen X" überhaupt kein Fragment von SA I/II ist. Vielmehr ist es ein separates Protein, das lediglich gemeinsam mit SA I/II ausgereinigt wird. Es wird davon ausgegangen, dass es durch ein separates Gen codiert ist.
Zwei große Fragmente von SA I/II, ein N-terminales Fragment (Reste 39 bis 481) und ein zentrales Fragment von 40 kDA (Reste 816 bis 1213) werden durch Humanserum-Antikörper erkannt. Innerhalb des zentralen Fragments erkennen 80 % der getesteten Seren Elemente innerhalb einer Prolin-reichen Region (Reste 839-955), die drei Tandem-Wiederholungen umfasst. Dies legt nahe, dass diese Region ein oder mehrere B-Zell-Epitope enthält. Gemäß Munro et al. (Infection and Immunity, Bd. 61, Nr. 11, November 1993, S. 4590-4598, wird vom zentralen Fragment (Re ste 816-1213) außerdem angenommen, dass es ein oder mehrere Adhäsionsstellen umfasst, die die Haftung von S. mutans am Zahn vermitteln. Evans et al. schlagen außerdem vor, dass Schutz- und Adhäsions-assoziierte Epitope innerhalb der Reste 855-1161 lokalisiert sind (J. Deut. Res. 71 (IADR Abstract 1753), 1992.
Das Ziel der oben genannten Arbeit ist die Entwicklung von Impfstoffen zur Immunisierung gegen Zahnkaries gewesen. Allerdings stellt die präzise Identifizierung der antigenen Epitope innerhalb SA I/II eine Voraussetzung für das Design der darauf basierenden synthetischen Impfstoffe dar. Ähnlich ist auch die präzise Identifizierung von Adhäsionsstellen für das Design von Arzneimitteln gegen Zahnkaries, die auf der Hemmung der Haftung von S. mutans am Zahn beruhen, wesentlich.
Keine antigenen Epitope (T-Zell- oder B-Zell-Epitope) oder Adhäsionsstellen innerhalb von SA I/II sind charakterisiert worden, noch ist die präzise Lokalisierung irgendwelcher dieser Regionen vorgeschlagen worden. Auch hat es keinen Hinweis auf die Lokalisation der T-Zell-Epitope von S. mutans gegeben, da sich die oben genannte Arbeit auf die Fähigkeit von S. mutans konzentriert hat, an Zähnen zu haften und eine B-Zellantwort zu generieren.
Die Erfinder haben eine Anzahl von T-Zell-Epitopen, B-Zell-Epitopen und Adhäsionsstellen innerhalb der Reste 803 bis 1114 von SA I/II identifiziert. Ein Teil der T-Zell- und B-Zell-Epitope überlappt oder sie sind zueinander und/oder zu einer oder mehrerer der Adhäsionsstellen benachbart.
Das Vorhandensein einer Anzahl antigener Epitope beider Typen und einer Anzahl von Adhäsionsstellen innerhalb derselben Region des SA I/II hätte nicht vorhergesagt werden können, und die Feststellung, dass einige der Adhäsionsstellen und der Epitope überlappen oder aneinander angrenzend sind, ist besonders überraschend.
Diese Feststellungen machen das Design wirksamer synthetischer Impfstoffe gegen Zahnkaries, als auch von Arzneimitteln möglich, die eine Resistenz gegenüber der Erkrankung verleihen oder vorbestehende Fälle davon abmildern, indem sie die Haftung von S. mutans an dem Zahn verhindern. Weiterhin macht der überraschende Befund, dass ein Teil der T-antigenen Epitope und die Adhäsionsstelle aneinander angrenzend oder überlappend sind, das Design bifunktioneller Arzneimittel möglich, die die Immunisierung gegen Zahnkaries bewirken als auch die Haftung von S. mutans an dem Zahn verhindern.
Demgemäß stellt die vorliegende Erfindung ein Polypeptid mit der Fähigkeit, eine T-Zellantwort zu stimulieren, und einer oder mehrerer der folgenden Eigenschaften bereit: (i) der Fähigkeit, an einem Säugerzahn in einer kompetitiven Weise mit natürlich vorkommendem Streptococcus mutans-Antigen I/II (SA I/II) zu haften, und somit die Haftung von S. mutans an dem Zahn zu verhindern oder zu vermindern; und (ii) der Fähigkeit, eine B-Zell-Reaktion zu stimulieren; und ausgewählt aus:

(a) einem Polypeptid, dessen Aminosäuresequenz wie in irgendeiner der SEQ ID Nrn. 2 bis 9 oder 11 dargestellt ist;
(b) einem Polypeptid, dessen Sequenz zu wenigstens 60 % Sequenzidentität zu der eines Polypeptids aus (a) aufweist; welches Polypeptid die biologischen Eigenschaften beibehält, die das Polypeptid aus (a) mit SA I/II gemeinsam hat;
(c) einem Polypeptid, umfassend eine Sequenz, welche von der eines Polypeptids aus (a) durch die Substitution, Deletion oder Insertion von ein bis zehn Aminosäuren abweicht; welches Polypeptid die biologischen Eigenschaften beibehält, die das Polypeptid aus (a) mit SA I/II gemeinsam hat;
(d) einem Polypeptid, umfassend die Sequenz der SEQ ID Nr. 3, 9 oder 11 und umfassend insgesamt bis zu 50 Aminosäuren, oder einem Polypeptid, umfassend die Sequenz der SEQ ID Nr. 2, 5, 7 oder 8 und umfassend insgesamt bis zu 100 Aminosäuren, oder einem Polypeptid, umfassend die Sequenz der SEQ ID Nr. 4 oder 6 und umfassend insgesamt bis zu 200 Aminosäuren; welches Polypeptid die biologischen Eigenschaften beibehält, die das Polypeptid der SEQ ID Nr. 2 bis 9 oder 11 mit SA I/II gemeinsam hat; und
(e) einem Polypeptid, umfassend ein Polypeptid aus (a) oder (b), das am C-Terminus durch eine Nicht-Wildtyp-Sequenz mit irgendeiner Sequenz, abgesehen von der, die C-terminal zu der Sequenz des Polypeptids aus (a) im nativen SA I/II ist, verlängert ist, und/oder das am N-Terminus durch eine Nicht-Wildtyp-Sequenz mit irgendeiner Sequenz, abgesehen von der, die N-terminal zu der Sequenz des Polypeptids aus (a) im nativen Sa I/II ist, verlängert ist; welches Polypeptid die biologischen Eigenschaften beibehält, die das Polypeptid aus (a) mit SA I/II gemeinsam hat. Ebenfalls bereitgestellt werden Nukleinsäuresequenzen, die auf die Expression in einer prokaryotischen oder eukaryotischen Wirtszelle hin für ein Polypeptid der Erfindung codieren.

Außerdem bereitgestellt wird eine Nukleinsäuresequenz, die auf die Expression in einer prokaryotischen oder eukaryotischen Wirtszelle hin für ein Polypeptid der Erfindung codiert.
Außerdem bereitgestellt wird ein Vektor, umfassend eine Nukleinsäuresequenz der Erfindung, die operativ geknüpft ist an einen Promotor, der zum Steuern ihrer Expression in einer Wirtszelle fähig ist.
Auch bereitgestellt wird eine isolierte Zelle, die einen Vektor der Erfindung beherbergt.
Außerdem bereitgestellt wird eine pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend ein Polypeptid der Erfindung und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger. Vorzugsweise ist diese Zusammensetzung eine Impfstoff-Zusammensetzung. Bevorzugt werden die pharmazeutischen Zusammensetzungen der Erfindung für die topische Anwendung über den Mund formuliert.
Ebenso bereitgestellt wird ein Polypeptid der Erfindung zur Verwendung in der Behandlung von Zahnkaries.
Außerdem bereitgestellt wird ein Polypeptid der Erfindung zur Verwendung in der Behandlung von Zahnkaries, oder in der Impfung eines Säugerwirts gegen Zahnkaries mittels der topischen Anwendung über den Mund.
Außerdem bereitgestellt wird die Verwendung eines Polypeptids der Erfindung in der Herstellung eines Medikaments für die Behandlung von Zahnkaries, oder in der Impfung eines Säugerwirts gegen Zahnkaries mittels der topischen Anwendung über den Mund.
Bevorzugte Polypeptide der Erfindung sind Polypeptide, deren Aminosäuresequenz die irgendeiner der SEQ ID Nrn: 1 bis 9 oder 11 ist. Ebenfalls bevorzugt ist ein Polypeptid, dessen Aminosäuresequenz die der Aminosäuren 2 bis 21 der SEQ ID NR: 9 ist.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1. Darstellung des Panels von überlappenden 20-meren, die zur Kartierung der T-Zell-, B-Zell- und Adhäsions-Epitope innerhalb von SA I/II verwendet sind.
2. Proliferative Reaktionen auf überlappende synthetische Peptide (20-mere) von SA I/II.

a) Mittlerer SI (± SEM) der PBMC von 30 Subjekten. Mittlere cpm mit lediglich Medium betrug 538 ± 112.
b) Frequenz der positiven Reaktionen (S.I. ≥ 3,0, cpm > 500).

3. MHC Klasse II-Abhängigkeit der proliferativen Reaktionen auf SA I/II.
4. Serumerkennung von SA I/II und rekombinanten Polypeptid-Fragmenten. Die Western Blots von 3 Subjekten sind gezeigt (Panels a-c), zusammen mit Kaninchen-Anti-SA I/II-Antiserum (Panel d). Bahnen 1, SA I/II; Bahn 5, rekombinantes 984-1161.
5. Humanserum-Erkennung von synthetischen Peptiden von SA I/II.

a) Titer wurden mittels ELISA bei 22 Subjekten gegen ausgewählte Peptide von SA I/II und einem irrelevanten Kontrollpeptid von SIVp27(SIV) bestimmt. Die Häufigkeiten der Serumbindung der Peptide mit einem Titer > Mittelwert + 2 S.A. und der Kontrollpeptide sind ebenfalls angegeben.

6. Hemmung der Adhäsion von S. mutans.

a) SA I/II und rekombinantes Fragment 984-1161.
b) Synthetische Peptide.

7. Proliferative Reaktionen auf murine Splenozyten nach einer Immunisierung mit rekombinantem 975-1044 (SEQ ID NR: 8)
8. Kompetitive Hemmung der SA I/II-Bindung durch verschiedene Polypeptide.
9. Abhängigkeit der kompetitiven Hemmung der SA I/II-Bindung von der Konzentration der beiden Peptide.
10. Auswirkungen der Substitution bestimmter Reste auf die kompetitive Hemmung.
11. Vergleich der verschiedenen rekombinanten Polypeptide bezüglich der Bindung.
Die Polypeptide der Erfindung können die Fähigkeit zur Haftung an einem Sängerzahn in einer kompetitiven Weise mit natürlich vorkommendem Streptococcus mutans-Antigen I/II aufweisen und somit die Haftung von S. mutans an dem Zahn verhindern oder vermindern. Von einigen Peptiden der Erfindung ist gezeigt worden, dass sie die Haftung von S. mutans an einem Zahnoberflächenmodell (menschlicher Vollspeichel, adsorbiert an den Vertiefungen von Polystyrol-Mikrotiterplatten oder Hydroxyapatit-Kügelchen) hemmen. Somit umfassen diese Peptide ein oder mehrere Adhäsionsstellen und werden an einem Säugerzahn in einer kompetitiven Weise mit natürlich vorkommendem SA I/II haften. Daher verhindern oder vermindern die Peptide gemäß der Erfindung, die die Adhäsionsstelle umfassen, die Haftung von S. mutans an dem Zahn. Zu Peptiden der Erfindung, die ein oder mehrere Adhäsionsepitope umfassen, zählen SEQ ID Nrn. 2 bis 6, 8 und 9.
Die Peptide gemäß der Erfindung weisen die Fähigkeit auf, eine T-Zellantwort zu stimulieren. Die Erfinder haben gezeigt, dass Reste 803 bis 854 und 925 bis 1114 von SA I/II eine Anzahl von T-Zell-Epitopen umfassen, die zumindest teilweise für die T-Zell-Antwort verantwortlich sind, die durch das intakte Protein stimuliert wird. Daher stimulieren die Peptide gemäß der Erfindung, die ein oder mehrere dieser T-Zell-Epitope umfassen, eine T-Zellantwort gegen eine S. mutans-Infektion. Zu den Peptiden der Erfindung, die ein T-Zellantwort stimulieren, zählen jene, die in SEQ ID Nrn. 2 bis 9 und 11 gezeigt sind.
Die Peptide der Erfindung können eine B-Zellantwort stimulieren. Die Erfinder haben gezeigt, dass die Reste 803 bis 854 und 925 bis 1114 von SA I/II eine Anzahl von B-Zell-Epitopen umfassen, und dass die Polypeptide gemäß der Erfindung, die ein oder mehrere B-Zell-Epitope umfassen, eine B-Zellreaktion gegen eine S. mutans-Infektion stimulieren. Zu Peptiden der Erfindung, die ein oder mehrere B-Zell-Epitope umfassen, zählen jene, die in SEQ ID Nrn. 2 und 3 bis 7 gezeigt sind.
Die Nukleinsäuresequenzen der Erfindung codieren die Polypeptide der Erfindung. Die Nukleinsäuresequenzen der vorliegenden Erfindung sind vorzugsweise DNA, obschon sie auch RNA sein können. Für Fachleute des Gebiets wird erkennbar sein, dass in den RNA-Sequenzen gemäß der Erfindung die in SEQ ID Nrn. 13 bis 20 und 22 gezeigten T-Reste durch U ersetzt sein werden. Die Nukleinsäuresequenzen der Erfindung werden typischerweise in isolierter oder im Wesentlichen isolierter Form vorliegen. Zum Beispiel werden bis zu 80, bis zu 90, bis zu 95 oder bis zu 100 % des Nukleinsäure-Materials in einer Präparierung einer Nukleinsäure der Erfindung typischerweise die Nukleinsäure gemäß der Erfindung sein.
Einige bevorzugte Nukleinsäuresequenzen der Erfindung sind die, die in SEQ ID Nrn. 13 bis 20 und 22 gezeigt sind. Die Nukleinsäuresequenzen der vorliegenden Erfindung sind jedoch nicht auf diese Sequenzen beschränkt. Vielmehr umfassen die Sequenzen der Erfindung solche Sequenzen, die eng mit diesen Sequenzen verwandt sind und die ein Polypeptid mit mindestens einer der biologischen Eigenschaften des natürlich vorkommenden SA I/II codieren. Diese Sequenzen können durch Verändern jener der SEQ ID Nrn. 13 bis 20 und 22 mittels irgendeiner herkömmli chen Methode präpariert werden oder können aus einem Organismus isoliert oder synthetisch hergestellt werden. Solche Alterationen, Isolationen oder Synthesen können mittels irgendeiner herkömmlichen Methode durchgeführt werden, zum Beispiel mittels den Methoden von Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laborstory Manual; 1989).
Zum Beispiel enthalten die Sequenzen der Erfindung Sequenzen, die zur selektiven Hybridisierung an jene der SEQ ID Nrn. 13 bis 22 oder den komplementären Strängen davon fähig sind und die ein Polypeptid mit einer oder mehreren der oben definierten Eigenschaften codieren. Die zur selektiven Hybridisierung an die DNA der SEQ ID Nrn. 13 bis 20 und 22 fähigen Sequenzen werden generell zu wenigstens 70 %, bevorzugt wenigstens 80 oder 90 %, und noch bevorzugter wenigstens 95 % homolog zu der DNA irgendeiner der SEQ ID Nrn. 13 bis 20 oder 22 über eine Region von wenigstens 10, bevorzugt wenigstens 20, 30, 40, 50 oder mehr benachbarten Nukleotiden, sein.
Solche Sequenzen, die an die in SEQ ID Nrn. 13 bis 20 oder 22 gezeigten Sequenzen hybridisieren, werden typischerweise von ähnlicher Größe wie diese sein, obschon sie länger oder kürzer sein können. Sind sie jedoch länger, so codieren sie möglicherweise nicht einfach große Fragmente der nativen SA I/II-Aminosäuresequenz. Auch müssen Sequenzen, die an jene der SEQ ID Nrn. 13 bis 20 oder 22 hybridisieren, dies über wenigstens 50 % ihrer Länge, zum Beispiel bis zu 60 % bis zu 70 %, bis zu 80 %, bis zu 90 %, bis zu 95 % oder bis zu 99 % ihrer Länge, tun.
Diese Hybridisierung kann unter jeglichen geeigneten, im Fachgebiet bekannten Bedingungen durchgeführt werden (siehe Sambrook et al., (1989): Molecular Cloning: A Laborstory Manual). Ist zum Beispiel eine hohe Stringenz erforderlich, so beinhalten geeignete Bedingungen 0,2 × SSC bei 60 °C. Ist eine geringere Stringenz erforderlich, so beinhalten geeignete Bedingungen 2 × SSC bei 60 °C.
Ebenfalls innerhalb des Rahmens der Erfindung erfasst sind Sequenzen, die von den oben definierten aufgrund der Degeneration des genetischen Codes abweichen, und die dasselbe Polypeptid mit ein oder mehreren der oben definierten Eigenschaf ten, nämlich das Polypeptid der SEQ ID Nrn. 2 bis 9 und 11, oder ein mit einem dieser Polypeptide in irgendeiner der nachstehend definierten Weisen verwandtes Polypeptid, codieren.
Somit enthalten die Nukleinsäuresequenzen der Erfindung Sequenzen, die, trotz der Degeneration des genetischen Codes, an solche, die in SEQ ID Nrn. 13 bis 20 oder 22 gezeigt sind, oder die komplementären Stränge davon hybridisieren würden. Solche Sequenzen codieren allerdings möglicherweise nicht einfach große Fragmente der nativen SA I/II-Aminosäuresequenzen. Auch müssen ihre Sequenzen derart sein, dass sie, trotz der Degeneration des genetischen Codes, an eine Sequenz, wie in SEQ ID Nrn. 13 bis 20 oder 22 gezeigt, über wenigstens 50 % ihrer Länge, zum Beispiel bis zu 60 %, bis zu 70 %, bis zu 80 %, bis zu 90 %, bis zu 95 % oder bis zu 99 % ihrer Länge, hybridisieren würden.
Außerdem enthalten die Nukleinsäuresequenzen der Erfindung die komplementären Stränge der oben definierten Sequenzen, zum Beispiel die komplementären Stränge der Nukleinsäuresequenzen, die in SEQ ID Nrn. 13 bis 20 oder 22 gezeigt sind.
Die Nukleinsäuresequenzen der Erfindung werden vorzugsweise wenigstens 50 Basen in der Länge betragen, zum Beispiel bis zu 100, bis zu 200, bis zu 300, bis zu 400, bis zu 500 oder bis zu 600 Basen.
Die Nukleinsäuresequenzen der Erfindung können an einem oder beiden der 5'- und 3'-Enden verlängert sein. Diese Extensionen können von beliebiger Länge sein. Zum Beispiel kann eine Extension bis zu 10, bis zu 20, bis zu 50, bis zu 100, bis zu 200 oder bis zu 500 oder mehr Nukleinsäuren umfassen. Eine 5'-Extension kann jegliche Sequenz aufweisen, abgesehen von der, die unmittelbar 5' zu der Sequenz der Erfindung (oder der nativen Sequenz, von der sie abgeleitet ist) in nativem SA I/II liegt. Eine 3'-Extension kann jegliche Sequenz aufweisen, abgesehen von der, die 3' zu der Sequenz der SEQ ID Nr. 13 in nativem SA I/II ist. Somit können die Nukleinsäuresequenzen der Erfindung an einem oder beiden der 5'- und 3'-Enden durch irgendeine Nicht-Wildtyp-Sequenz verlängert sein.
Die Polypeptide der Erfindung sind durch die oben beschriebenen DNA-Sequenzen codiert. Somit sind die Polypeptide der Erfindung nicht auf die Polypeptide der SEQ ID Nrn. 2 bis 9 und 11 beschränkt, obschon diese Sequenzen bevorzugte Polypeptide darstellen. Vielmehr enthalten die Polypeptide der Erfindung auch Polypeptide mit Sequenzen, die mit denen der SEQ ID Nrn. 2 bis 9 oder 11, welche eine oder mehrere der biologischen Eigenschaften des SA I/II aufweisen, eng verwandt sind. Diese Sequenzen können durch Verändern jener der SEQ ID Nrn. 2 bis 9 und 11 mittels irgendeiner herkömmlichen Methode präpariert oder aus einem Organismus isoliert oder synthetisch hergestellt werden. Solche Alterationen, Isolierungen oder Synthesen können mittels einer herkömmlichen Methode vorgenommen werden, zum Beispiel mittels der Methoden von Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laborstory Manual; 1989). Insbesondere können die Polypeptide, die mit denen der SEQ ID Nrn. 2 bis 9 und 11 verwandt sind, durch Modifizieren der DNA-Sequenzen, wie in SEQ ID Nrn. 13 bis 20 und 22 gezeigt, und rekombinantes Exprimieren hergestellt werden.
Die Polypeptide der Erfindung können durch Nukleinsäuresequenzen codiert sein, die weniger als 100 % Sequenzidentität zu jenen der SEQ ID Nrn. 13 bis 20 und 22 aufweisen. Somit können die Polypeptide der Erfindung Substitutionen, Deletionen oder Insertionen umfassen, die sie von SEQ ID Nrn. 2 bis 9 und 11 unterscheiden, solange diese die biologische Eigenschaft oder Eigenschaften, die die Polypeptide mit SA I/II gemeinsam haben, nicht zerstören.
Eine Substitution, Deletion oder Insertion kann geeigneterweise eine oder mehrere Aminosäuren einbeziehen, typischerweise von eins bis fünf, eins bis zehn oder eins bis zwanzig Aminosäuren, zum Beispiel eine Substitution, Deletion oder Insertion von eins, zwei, drei, vier, fünf, acht, zehn, fünfzehn oder zwanzig Aminosäuren. Typischerweise weist ein Polypeptid der Erfindung wenigstens 60 %, wenigstens 80 %, wenigstens 90 % oder wenigstens 95 % Sequenzidentität zu der Sequenz einer der SEQ ID Nrn. 2 bis 9 oder 11 auf.
Im Allgemeinen sollte die physikochemische Natur der Sequenz der SEQ ID Nrn. 2 bis 9 oder 11 in einem Polypeptid der Erfindung erhalten bleiben. Solche Sequenzen werden im Allgemeinen hinsichtlich der Ladung, Hydrophobizität und Größe denen der SEQ ID Nrn. 2 bis 9 oder 11 ähnlich sein. Beispiele der Substitutionen, die die physikochemische Natur der Aminosäuresequenzen nicht stark beeinträchtigen, sind solche, bei denen eine Aminosäure aus einer der folgenden Gruppen durch eine unterschiedliche Aminosäure aus derselben Gruppe substituiert ist:
H, R und K
I, L, V und M
A, G, S und T
D, E, Q und N.
Es mag jedoch erwünscht sein, die physikochemische Natur der Sequenz der SEQ ID Nrn. 1 bis 11 zu verändern, um ihre therapeutische Wirksamkeit zu erhöhen. Zum Beispiel sind viele der Aminosäuren in den Polypeptiden der Erfindung sauer. Zum Beispiel sind Reste 975 bis 1044 (SEQ ID NR. 8) als Ganzes von saurer Natur. Von dieser Azidität wird angenommen, dass sie die Bindung an einen Säugerzahn erleichtert. Somit mag es erwünscht sein, die Azidität der Polypeptide der Erfindung durch Hinzufügen von sauren Resten oder durch Substituieren der sauren Reste durch nicht-saure Reste zu erhöhen. Zu sauren Resten zählen Aspartinsäure und Glutaminsäure.
Wo die Polypeptide der Erfindung chemisch synthetisiert werden, können D-Aminosäuren (die in der Natur nicht vorkommen) in die Aminosäuresequenz an Stellen aufgenommen werden, an denen sie die biologischen Eigenschaften der Polypeptide nicht beeinträchtigen. Dies vermindert die Anfälligkeit der Polypeptide für eine Proteolyse durch die Proteasen des Empfängers.
Die Nukleinsäuresequenzen, die die Polypeptide der Erfindung codieren, können an einem oder beiden Enden durch eine Nicht-Wildtyp-Sequenz verlängert werden.
Somit können die Polypeptide der Erfindung an einem oder beiden der C- und N-Termini durch eine Aminosäuresequenz einer beliebigen Länge verlängert werden. Eine Extension kann zum Beispiel bis zu 5, bis zu 10, bis zu 20, bis zu 50 oder bis zu 100 oder 200 oder mehr Aminosäuren umfassen. Eine N-terminale Extension kann jegliche Sequenz aufweisen, abgesehen von der, die N-terminal zu der Sequenz der Erfindung (oder der nativen Sequenz, von der sie abgeleitet ist) in nativem SA I/II ist. Eine C-terminale Extension kann jegliche Sequenz aufweisen, abgesehen von der, die C-terminal zu der Sequenz der Erfindung (oder der nativen Sequenz, von der sie abgeleitet ist) in nativem SA I/II ist. Somit können die Polypeptide der Erfindung an einem oder beiden der C- und N-Termini durch irgendeine Nicht-Wildtyp-Sequenz verlängert sein.
Die Polypeptide der Erfindung können an andere Polypeptide oder Proteine angelagert sein, die ihre antigenen Eigenschaften verstärken. So können die Polypeptide der Erfindung an ein oder mehrere andere antigene Polypeptide angelagert sein. Diese zusätzlichen antigenen Polypeptide können von S. mutans oder von einem anderen Organismus abgeleitet sein. Zu möglichen weiteren antigenen Polypeptiden zählen heterologe T-Zell-Epitope, die von anderen S. mutans-Proteinen oder von anderen Spezies als S. mutans abgeleitet sind. Heterologe B-Zell-Epitope können ebenfalls verwendet werden. Solche heterologen T-Zell- und/oder B-Zell-Epitope können von beliebiger Länge sein, und Epitope von bis zu 5, bis zu 10 oder bis zu 20 Aminosäuren in der Länge sind besonders bevorzugt. Diese zusätzlichen antigenen Polypeptide können an die Polypeptide der Erfindung chemisch angelagert sein. Alternativ können ein oder mehrere zusätzliche antigene Sequenzen eine Extension an einem Polypeptid der Erfindung umfassen.
Ein Polypeptid der Erfindung kann einer oder mehreren chemischen Modifikationen unterzogen werden, wie etwa einer Glykosylierung, Sulfierung, COOH-Amidierung oder Acylierung. Insbesondere sind Polypeptide, die an dem N-Terminus acetyliert sind, bevorzugt, ebenso wie Polypeptide mit C-terminalen Amidgruppen. Bevorzugte Polypeptide können eine oder mehrere dieser Modifikationen aufweisen. Zum Beispiel können besonders bevorzugte Peptide eine C-terminale Amidgruppe und eine N-terminale Acetylierung aufweisen.
Ein Polypeptid der Erfindung kann einen Teil eines größeren Polypeptids bilden, das vielfache Kopien der Sequenz einer oder mehrerer der SEQ ID Nrn. 2 oder 9 bis 11 umfasst oder eine Sequenz, die in einer der hierin definierten Weisen damit verwandt ist.
Die Polypeptide der Erfindung umfassen typischerweise wenigstens 15 Aminosäuren, zum Beispiel 15 bis 20, 20 bis 50, 50 bis 100 oder 100 bis 200 oder 200 bis 300 Aminosäuren. Zu bevorzugten Polypeptiden zählen solche, die in SEQ ID Nrn. 2 bis 9 und 11 gezeigt sind. Ebenfalls bevorzugt ist ein Polypeptid, dessen Sequenz die der Aminosäuren 2 bis 21 der SEQ ID Nr. 9 ist.
Die Polypeptide gemäß der Erfindung können gereinigt oder im Wesentlichen gereinigt sein. Solch ein Polypeptid in im Wesentlichen gereinigter Form wird generell Teil einer Präparierung bilden, in welcher mehr als 90 %, zum Beispiel bis zu 95 %, bis zu 98 % oder bis zu 99 % des Peptidmaterials in der Präparierung solches von einem Polypeptid oder von Polypeptiden gemäß der Erfindung ist.
Die Nukleinsäuresequenzen und Polypeptide der Erfindung sind ursprünglich von S. mutans abgeleitet. Allerdings können die Nukleinsäuresequenzen und/oder Polypeptide der Erfindung auch von anderen Organismen erhalten werden, typischerweise von Bakterien, insbesondere von anderen Streptokokken. Sie können entweder durch herkömmliche Kloniertechniken oder durch Sondieren von genomischen oder cDNA-Bibliotheken mit Nukleinsäuresequenzen gemäß der Erfindung erhalten werden. Dies kann mittels jeglicher herkömmlicher Methode vorgenommen werden, wie etwa den Methoden von Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laborstory Manual; 1989).
Eine Nukleinsäuresequenz gemäß der Erfindung kann innerhalb eines Vektors enthalten sein, geeigneterweise eines replizierbaren Vektors, zum Beispiel eines replizierbaren Expressionsvektors.
Ein replizierbarer Expressionsvektor umfasst einen Replikationsursprung, sodass der Vektor in einer Wirtszelle, wie etwa einer bakteriellen Wirtszelle, repliziert werden kann. Ein geeigneter Vektor wird außerdem typischerweise die folgenden Elemente, gewöhnlich in einer 5' nach 3'-Anordnung, enthalten: einen Promotor zum Steuern der Expression der Nukleinsäuresequenz und wahlweise einen Regulator des Promotors, ein Translationsstartcodon und eine Nukleinsäuresequenz gemäß der Erfindung, die ein Polypeptid mit ein oder mehreren der biologischen Eigenschaften des SA I/II codiert. Einem nicht-replizierbaren Vektor fehlt ein geeigneter Replikationsursprung, wohingegen einem Nicht-Expressionsvektor ein wirksamer Promotor fehlt.
Der Vektor kann auch ein oder mehrere selektierbare Markergene enthalten, zum Beispiel ein Ampicillin-Resistenzgen für die Identifizierung von bakteriellen Transformanten. Ein besonders bevorzugtes Markergen ist das Kanamycin-Resistenzgen. Wahlweise kann der Vektor auch einen Enhancer für den Promotor umfassen. Soll die Nukleinsäuresequenz der Erfindung in einer eukaryotischen Zelle exprimiert werden, so kann der Vektor auch ein Polyadenylierungssignal umfassen, das 3' an die Nukleinsäure, die das funktionelle Protein codiert, operativ geknüpft ist. Der Vektor kann auch einen Transkriptionsterminator 3' zu der Sequenz, die das Polypeptid der Erfindung codiert, umfassen.
Der Vektor kann außerdem ein oder mehrere nicht-codierende Sequenzen 3' zu der Sequenz umfassen, die das Polypeptid der Erfindung codiert. Diese können von S. mutans (dem Organismus, von dem die Sequenzen der Erfindung abgeleitet sind) oder dem Wirtsorganismus, der mit dem Vektor zu transformieren ist, oder von einem anderen Organismus stammen.
In einem Expressionsvektor ist die Nukleinsäuresequenz der Erfindung operativ an einen Promotor geknüpft, der zur Exprimierung der Sequenz fähig ist. "Operativ geknüpft" bezieht sich auf eine Juxtaposition, bei der der Promotor und die Nukleinsäuresequenz, die das Polypeptid der Erfindung codiert, in einer Beziehung zueinander stehen, die die Exprimierung der Codierungssequenz unter der Kontrolle des Promotors erlaubt. Es können aber Elemente, wie etwa die 5'-nicht-codierende Sequenz, zwischen dem Promotor und der Codierungssequenz vorhanden sein. Diese Elemente können nativ sein entweder für S. mutans oder für den Organismus, oder für keinen Organismus. Solche Sequenzen können in dem Vektor enthalten sein, sofern sie die korrekte Kontrolle der Codierungssequenz durch den Promotor erhöhen oder nicht beeinträchtigen.
Der Vektor kann von jeglichem Typ sein. Der Vektor kann in linearer oder zirkulärer Form vorliegen. Zum Beispiel kann der Vektor ein Plasmidvektor sein. Fachleute des Gebiets werden in der Lage sein, geeignete Vektoren zu präparieren, die Nukleinsäuresequenzen umfassen, welche die Polypeptide der Erfindung codieren, ausgehend von breit verfügbaren Vektoren, die durch genverändernde Techniken modifiziert sein werden, wie etwa solchen, die durch Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laborstory Manual; 1989) beschrieben wurden. Zu bevorzugten Ausgangsvektoren zählen Plasmide, die eine Kanamycin-Resistenz verleihen und die Expression des Polypeptids der Erfindung über einen tac-Promotor steuern.
In einem Expressionsvektor kann jeglicher Promotor, der zum Steuern der Expression einer Sequenz der Erfindung in einer Wirtszelle fähig ist, operativ an die Nukleinsäuresequenz der Erfindung geknüpft sein. Zu geeigneten Promotoren zählen der tac-Promotor.
Solche Vektoren können zur Transfizierung oder Transformierung einer Wirtszelle verwendet werden. In Abhängigkeit von der Art des Vektors können diese als Klonierungsvektoren verwendet werden, um die DNA-Sequenzen gemäß der Erfindung zu amplifizieren oder um diese DNA in einer Wirtszelle zu exprimieren.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung stellt Wirtszellen bereit, die Vektoren der Erfindung beherbergen, d.h. Zellen, die mit Vektoren für die Replikation und/oder Expression der Nukleinsäuresequenzen gemäß der Erfindung, einschließlich der in SEQ ID Nrn. 13 bis 20 und 22 gezeigten Sequenzen, transformiert oder transfiziert sind. Die Zellen werden so ausgewählt, dass sie mit dem Vektor kompatibel sind, und können zum Beispiel bakterielle Zellen sein. Transformierte oder transfizierte Bakterienzellen, zum Beispiel E. coli-Zellen, werden besonders nützlich sein, um die Nukleinsäuresequenzen der Erfindung zu amplifizieren, als auch um sie als Polypeptide zu exprimieren.
Die Zellen können mittels jeglicher geeigneten Methode transformiert oder transfiziert werden, wie etwa den von Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laborstory Manual; 1989) beschriebenen Methoden. Zum Beispiel können Vektoren, die Nukleinsäuresequenzen gemäß der Erfindung umfassen, in infektiöse Viruspartikel, wie etwa retrovirale Partikel, verpackt werden. Die Konstrukte können auch zum Beispiel durch Elektroporation, Calciumphosphat-Präzipitation, biolistische Methoden oder durch Kontaktieren der nackte Nukleinsäure-Vektoren mit den Zellen in Lösung eingeführt werden.
Bei den Nukleinsäure-Vektoren, mit denen die Wirtszellen transformiert oder transfiziert werden, kann die Nukleinsäure DNA oder RNA sein, vorzugsweise DNA.
Die Vektoren, mit denen die Wirtszellen transformiert oder transfiziert werden, können von jedem geeigneten Typ sein. Die Vektoren können dazu in der Lage sein, die Integration der Nukleinsäuresequenzen der Erfindung in das Wirtszell-Genom zu bewirken oder sie können frei in dem Cytoplasma verbleiben. Zum Beispiel kann der für die Transformation verwendete Vektor ein Expressionsvektor sein, wie hierin definiert.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung der Polypeptide gemäß der Erfindung. Dieses Verfahren wird typischerweise das Transformieren oder Transfizieren von Wirtszellen mit Vektoren umfassen, die Nukleinsäuresequenzen gemäß der Erfindung umfassen, und das Exprimieren der Nukleinsäuresequenz in diesen Zellen. In diesem Fall wird die Nukleinsäuresequenz operativ an einen Promotor geknüpft, der zum Steuern ihrer Expression in der Wirtszelle fähig ist. Erwünschterweise wird solch ein Promotor ein "starker" Promotor sein, der zur Erzielung hoher Expressionsgrade in der Wirtszelle fähig ist. Es mag erwünscht sein, das Polypeptid gemäß der Erfindung in der Wirtszelle überzuexprimieren. Zu geeigneten Wirtszellen für diesen Zweck zählen Hefezellen und Bakterienzellen, zum Beispiel E. coli-Zellen, wobei ein besonders bevorzugter E. coli-Stamm E. coli K12 Stamm BL 21 ist. Weitere Expressionssysteme können ebenfalls verwendet werden, zum Beispiel Baculovirus-Systeme, in denen der Vektor ein Baculovirus ist, das in seinem Genom eine Nukleinsäure aufweist, die ein Polypeptid der Erfindung codiert, und wobei die Expression erfolgt, wenn dem Baculovirus ermöglicht wird, Insektenzellen zu infizieren.
Das derart produzierte Polypeptid der Erfindung kann mittels jeglicher geeigneten, im Fachgebiet bekannten Methode rückgewonnen werden. Wahlweise kann das derart rückgewonnene Polypeptid mittels jeglicher geeigneter Methode, zum Beispiel einer Methode gemäß Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laborstory Manual), ausgereinigt werden.
Die Polypeptide der Erfindung können auch unter Anwendung standardmäßiger Techniken der Peptidsynthese chemisch synthetisiert werden. Für kürzere Polypeptide kann die chemische Synthese der rekombinanten Expression vorzuziehen sein. Insbesondere Peptide von bis zu 20 oder bis zu 40 Aminosäure-Resten in der Länge können wünschenswerterweise chemisch synthetisiert werden.
Die Nukleinsäuresequenzen der Erfindung können zur Herstellung von Sonden und Primern verwendet werden. Diese werden zum Beispiel bei der Isolierung von Genen mit Sequenzen ähnlich der von SEQ ID Nr. 24 nützlich sein. Solche Sonden und Primer können von jeglicher geeigneten Länge sein, erwünschterweise von 10 bis 100, zum Beispiel von 10 bis 20, 20 bis 50 oder 50 bis 100 Basen in der Länge.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch Antikörper zu den Polypeptiden der Erfindung. Diese Antikörper können monoklonal oder polyklonal sein. Für die Zwecke dieser Erfindung umfasst der Begriff "Antikörper" Fragmente von ganzen Antikörpern, die ihre Bindungsaktivität für ein Zielantigen beibehalten. Zu solchen Fragmenten zählen Fv-, F(ab')- und F(ab')₂-Fragmente, als auch einzelkettige Antikörper.
Die Antikörper können mittels jeglicher im Fachgebiet bekannter Methode produziert werden, wie etwa den Methoden von Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laborstory Manual; 1989). Zum Beispiel können sie mittels herkömmlicher Hybridoma-Techniken hergestellt werden oder, im Falle von modifizierten Antikörpern oder Fragmenten, mittels rekombinanter DNA-Technologie, zum Beispiel durch die Expression in einem geeigneten Wirtsvektor eines DNA-Konstrukts, das den modifizier ten Antikörper oder ein Fragment, das operativ an einen Promotor geknüpft ist, codiert. Zu geeigneten Wirtszellen zählen Bakterien- (zum Beispiel E. coli), Hefe-, Insekten- und Sängerzellen. Polyklonale Antikörper können ebenfalls mittels herkömmlicher Methoden hergestellt werden, die das Beimpfen eines Wirtstiers, zum Beispiel einer Ratte oder eines Kaninchens, mit einem Peptid der Erfindung und das Rückgewinnen von Immunserum umfassen.
Die vorliegende Erfindung stellt auch pharmazeutische Zusammensetzungen bereit, die die Polypeptide der Erfindung umfassen. Drei Arten der pharmazeutischen Zusammensetzungen sind besonders bevorzugt. Erstens können Zusammensetzungen, umfassend Polypeptide der Erfindung, die T-Zell- und/oder B-Zell-Epitope enthalten, als Impfstoffe gegen Zahnkaries verwendet werden. Zweitens werden Zusammensetzungen, umfassend Polypeptide der Erfindung, die Adhäsionsstellen umfassen, die Haftung von S. mutans an dem Zahn verhindern oder vermindern und können in der Behandlung von vorbestehenden Fällen von Zahnkaries verwendet werden. Drittens können Zusammensetzungen, umfassend Polypeptide der Erfindung, die ein oder mehrere der beiden antigenen (T-Zell- oder B-Zell-) Epitope und ein oder mehrere Adhäsionsepitope enthalten, zur Bewirkung einer Impfung gegen Zahnkaries zum gleichen Zeitpunkt mit der Behandlung von vorbestehenden Fällen der Erkrankung verwendet werden. Eine ähnliche Wirkung kann durch Aufnahme in eine Zusammensetzung eines oder mehrerer Peptide, die ein oder mehrere antigene Epitope umfassen, und eines oder mehrerer Peptide, die ein oder mehrere Adhäsionsstellen umfassen, erzielt werden.
Ein Bereich der Sängerarten kann gegen Zahnkaries unter Verwendung der Polypeptide der Erfindung geimpft werden. Die Impfung von Menschen ist besonders erwünscht.
Die Zusammensetzungen der Erfindung können an Säuger, einschließlich des Menschen, auf jedem geeigneten Wege verabreicht werden. Zu geeigneten Wegen zählen die topische Anwendung über den Mund, die orale Verabreichung mittels Tabletten oder Kapseln und die parenterale Verabreichung, einschließlich der subkutanen, intramuskulären, intravenösen und intradermalen Verabreichung. Bevorzugte Verab reichungswege sind die topische Anwendung über den Mund und die Injektion, typischerweise die subkutane oder intramuskuläre Injektion, im Hinblick auf die Bewirkung einer systemischen Immunisierung.
Wie zuvor angegebenen, können die Polypeptide gemäß der Erfindung auch mit anderen Antigenen von unterschiedlicher Immunogenizität gemischt werden.
Die Zusammensetzungen der Erfindung können an ein Subjekt einzeln oder in einem Liposom oder verbunden mit anderen Transfermolekülen verabreicht werden. Die wirksame Dosis hängt von vielen Faktoren ab, zum Beispiel davon, ob ein Transfermolekül verwendet wird, dem Verabreichungsweg und der Größe des zu impfenden Säugers. Typische Dosen liegen im Bereich von 0,1 bis 100 mg des Polypeptids der Erfindung pro Dosis, zum Beispiel 0,1 bis 1 mg, und 1 bis 5 mg, 5 bis 10 mg und 10 bis 100 mg pro Dosis. Dosen von 1 bis 5 mg sind bevorzugt.
Die Dosierungsschemata werden in Abhängigkeit beispielsweise vom Verabreichungsweg, der Spezies des Empfängers und dem Zustand des Empfängers variieren. Allerdings sind Einzeldosen und Vielfachdosen, die sich über Zeiträume von Tagen, Wochen oder Monaten erstrecken, angestrebt. Ein Regime für die Verabreichung einer Impfstoff-Zusammensetzung der Erfindung an junge menschliche Patienten wird bequemerweise 16 Monate, 2 Jahre, 5 Jahre und 10 Jahre betragen, wobei die Anfangsdosis von Adjuvans begleitet ist und die nachfolgenden Dosen etwa die Hälfte bis ein Viertel der Menge des Polypeptids in der Anfangsdosis betragen. Die Häufigkeit der Verabreichung kann jedoch durch Überwachen der Antikörpermengen in dem Patienten bestimmt werden.
Wo die Peptide der Erfindung topisch über den Mund anzuwenden sind, besteht ein bevorzugtes Dosierungsschema in der Anwendung einer oder mehrerer Polypeptide der Erfindung bei zwei oder mehreren Gelegenheiten, zum Beispiel 2 bis 10 Gaben über einen Zeitraum von einigen wenigen Wochen, zum Beispiel ein bis sechs Wochen. Ein besonders bevorzugtes Schema dieses Typs bezieht sechs Anwendungen eines Polypeptids der Erfindung über einen Zeitraum von drei Wochen ein.
Typische Dosen für jede topische Anwendung liegen im Bereich von 0,1 bis 100 mg, zum Beispiel 0,1 bis 1 mg, 1 bis 10 mg und 10 bis 100 mg. Dosen von 1 bis 5 mg für jede Anwendung sind bevorzugt.
Zwar ist die Verabreichung der Polypeptide der Erfindung alleine möglich, doch ist es bevorzugt sie als pharmazeutische Formulierungen zu präsentieren. Die Formulierungen der vorliegenden Erfindung umfassen wenigstens einen aktiven Inhaltsstoff, ein Polypeptid der Erfindung, zusammen mit ein oder mehreren akzeptablen Trägern dafür und wahlweise weiteren therapeutischen Inhaltsstoffen. Der Träger oder die Träger müssen "akzeptabel" in dem Sinne sein, dass sie mit den anderen Inhaltsstoffen der Formulierung verträglich und nicht für deren Empfänger, zum Beispiel Liposomen, schädlich sind.
Zu für die parenterale Verabreichung geeigneten Formulierungen zählen wässrige und nicht-wässrige sterile Injektionslösungen, die Antioxidanzien, Puffer, Bakteriostatika, bakterizidale Antibiotika und Solute enthalten, die die Formulierung mit dem Blut des beabsichtigten Empfängers isotonisch machen; und wässrige und nicht-wässrige sterile Suspensionen, die Suspendierungsmittel und Verdickungsmittel enthalten können, und Liposome oder andere mikropartikuläre Systeme, die zur Zielung der Verbindung auf Blutkomponenten oder ein oder mehrere Organe designed sind.
Insbesondere können die Polypeptide der Erfindung an Lipide oder Kohlehydrate gekoppelt werden. Dies erhöht ihre Haftfähigkeit an Zähnen, entweder durch Verlängern der Haftdauer oder durch Erhöhen ihrer Affinität, oder durch beides. Dies ist insbesondere für kürzere Polypeptide der Erfindung wünschenswert, die bis zu etwa 40 Aminosäure-Resten umfassen.
Von den möglichen Formulierungen sind sterile Pyrogen-freie wässrige und nicht-wässrige Lösungen bevorzugt. Ebenfalls bevorzugt sind Formulierungen, bei denen die Polypeptide der Erfindung in Liposomen enthalten sind. Injektionslösungen und Suspensionen können spontan aus sterilen Pulvern, Granulaten und Tabletten der zuvor beschriebenen Art hergestellt werden.
Orale Verabreichungsmethoden können eine systemische oder lokale Wirkung im Mund erzeugen. Oral aktive Präparate können in jeglichem geeigneten Träger, wie etwa einem Gel, Zahnpasta, Mundwasser oder Kaugummi, formuliert werden.
Es sollte klar sein, dass über die oben im Besonderen erwähnten Inhaltsstoffe hinaus die Formulierungen dieser Erfindung weitere im Fachgebiet herkömmliche Mittel unter Bezugnahme auf die fragliche Art von Formulierung enthalten sein können.
Demgemäß betrifft die vorliegende Erfindung eine Methode zur Impfung eines Sängerwirts gegen Zahnkaries oder zur Behandlung von Zahnkaries, welche Methode das Verabreichen an den Wirt einer wirksamen Menge einer wie oben beschriebenen pharmazeutischen Zusammensetzung, zum Beispiel einer Impfstoff-Zusammensetzung, umfasst.
Antikörper, einschließlich monoklonaler Antikörper, können für die passive Immunisierung wie oben für die Formulierung der Polypeptide der Erfindung angegeben formuliert werden. Zu bevorzugten Formulierungen für die passive Immunisierung zählen feste oder flüssige Formulierungen, wie etwa Gele, Zahnpasten, Mundspülungen oder Kaugummi.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein Impfstoff mit nackter Nukleinsäure. Bei dieser Ausführungsform umfasst die Impfstoff-Zusammensetzung eine Nukleinsäure, typischerweise eine isolierte Nukleinsäure, vorzugsweise DNA, anstelle eines Polypeptids. Die Nukleinsäure wird in einen Sängerwirt injiziert und in vivo exprimiert, wodurch ein Polypeptid der Erfindung generiert wird. Dies stimuliert eine T-Zellantwort, was zu einer Schutzimmunität gegen Zahnkaries in derselben Weise wie die direkte Impfung mit einem Polypeptid der Erfindung führt.
Die Beimpfung mit nackter Nukleinsäure kann mit jeglicher Nukleinsäure gemäß der Erfindung vorgenommen werden, solange sie ein Polypeptid codiert, das eine T-Zell- und/oder B-Zellantwort stimuliert. Bevorzugte Polypeptide sind die in SEQ ID Nrn. 2 bis 9 und 11 gezeigten. Diese werden typischerweise in einen Expressionsvektor wie oben definiert aufgenommen. Bei solch einem Expressionsvektor wird die Nuklein säure gemäß der Erfindung typischerweise operativ an einen Promotor geknüpft sein, der zum Steuern ihrer Expression in einer Säugerwirtszelle in der Lage ist. Zum Beispiel sind Promotoren von viralen Genen, die in den Sängerzellen exprimiert werden, wie etwa der Cytomegalovirus (CMV) immediate early-Genpromotor geeignet. Ebenfalls geeignet sind Promotoren von Sängergenen, die in vielen oder allen Säugerzelltypen exprimiert werden, wie etwa die Promotoren der "Housekeeping"-Gene. Ein solcher Promotor ist der p-Hydroxymethyl-CoA-Reduktase-(HMG)-Promotor (Gautier et al. (1989); Nucleic Acids Research; 17, 8839).
Für die Impfung mit nackter Nukleinsäure ist es bevorzugt, dass die Nukleinsäuresequenz gemäß der Erfindung in einen Plasmidvektor aufgenommen wird, da festgestellt worden ist, dass kovalent geschlossene zirkuläre (covalent closed circle – CCC) Plasmid-DNA direkt durch Muskelzellen aufgenommen und ohne Integrierung in die genomische DNA der Zellen exprimiert werden kann (Ascadi et al. (1991): The New Biologist; 3, 71-81). Ein Impfstoff mit nackter Nukleinsäure kann als eine der Arten von Formulierung, die oben bezüglich der herkömmlichen, auf Polypeptid basierenden Impfstoffe erwähnt sind, hergestellt werden. Allerdings sind Formulierungen, die für die parenterale Injektion, insbesondere die intramuskuläre Injektion, geeignet sind, bevorzugt. Impfstoffe mit nackter Nukleinsäure können in irgendeiner der Weisen, die oben bezüglich der herkömmlichen, auf Polypeptid basierenden Impfstoffe erwähnt sind, verabreicht werden, doch ist die intramuskuläre Injektion bevorzugt.
Demgemäß stellt die vorliegende Erfindung eine Impfstoff-Zusammensetzung bereit, umfassend eine Nukleinsäuresequenz oder einen wie oben beschriebenen Vektor und einen akzeptablen Träger.
Die folgenden Beispiele veranschaulichen die Erfindung.
BEISPIELE
MATERIALIEN UND METHODEN
Materialien. Fmoc-Aminosäuren, Benzotriazol-1-yl-oxy-tris-pyrrolidinophosphoniumhexafluorphosphat (PyBOP) und Rink-Amid-MBHA-Harz wurden bezogen von Calbiochem-Novabiochem (UK) Limited, (Nottingham, UK). Dimethylforma mid, Trifluoressigsäure, Diethylether, Dichlormethan und Piperiden wurden bezogen von Romil Chemicals Ltd. (Loughborough, UK). Diisopropylethylamin stammte von Aldrich Chemical Co. (Dorset, UK). Oligonukleotide wurden bezogen von Oswel DNA Service (University of Edinburgh, Edinburgh, UK).
Bakterien und Wachstumsbedingungen
S. mutans Guy-Stamm (Serotyp c) wurde in 10 l Basalmedium, ergänzt wie zuvor beschrieben (Russel et al. (1978): Arch. Oral Biol., 2317; Russel et al. (1980): Infect., Immun. 61, 5490) bei 37 °C für 72 h für die SA I/II-Präparierung gezüchtet. Für den Adhäsions-Assay wurde S. mutans in Todd-Hewitt-Brühe (Difco Laborstories, Detroit, Mich.) gezüchtet. Escherichia coli BL21 (DE3) (Novagen Inc., Madison, Wis.), das pET15b beherbergte, wurde bei 37 °C in Luria-Bertani-Brühe, ergänzt mit Carbenicillin (50 μg/ml) gezüchtet, und die rekombinante Proteinexpression wurde mit Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (1 mM) induziert.
Antigene. SA I/II wurde aus S. mutans (Serotyp c, Guy-Stamm) präpariert, wie von Russel et al. beschrieben (1980: Infect. Immun. 28, 486). Unter Anwendung der Verfahrensweise von Munro et al. (1993: Infect. Immun. 51, 4590) wurde der Abschnitt des Gens, der Reste 984-1161 codiert, unter Verwendung folgender Oligonukleotid-Primer amplifiziert:
(5') ATACATATGCCAACTGTTCATTTCCATTACTTT (SEQ ID Nr. 25) und
(3') GCCATTGTCGACTCATTCATTTTTATTAACCTTAGT (SEQ ID Nr. 26), kloniert in pET15b (modifiziert durch die Zugabe einer Sal I-Stelle) und in E. coli exprimiert.
Synthetische Peptide. Peptidamide (20-mere, um 10 Reste überlappend) wurden auf Rink-Amid-MBHA-Harz in versiegelten porösen Polypropylenbeuteln mittels des manuellen Simultaneous Multiple Peptidsynthese-Verfahren (Houghten (1985) PNAS 892, 5131) unter Anwendung der Fmoc-Chemie synthetisiert. PyBOP wurde als Kopplungsmittel verwendet, und Fmoc-Aminosäuren wurden in situ durch Zugabe von Diisopropylethylamin aktiviert. Nach 20 Synthesezyklen wurde das Harz mit Dimethylformamid, gefolgt von Dichlormethan, gewaschen, und die Peptide wurden durch Inkubation in Trifluoressigsäure-Ethandithiol-Anisol-Phenol-H₂O (82,5:2,5:5:5:5; v/v/v/w/v) für 2 h bei Raumtemperatur gespalten. Die Peptide wurden durch die Zugabe von 5 Volumen Ether ausgefällt, durch Zentrifugation rückgewonnen und dreimal mit Ether gewaschen. Schließlich wurden die Peptide in Wasser gelöst und lyophilisiert. Der Maßstab der Synthese war 50 μmol. Teilmengen jedes Peptids wurden in 6 M HCl bei 110 °C für 24 h hydrolysiert, und die Zusammensetzungen wurden unter Verwendung des automatisierten Beckman 121 MB Analysegeräts (Beckman Instruments Ltd., Bucks, UK) bestimmt. In jedem Falle entsprach die Zusammensetzung dem vorhergesagten.
Antikörper. MAbs, L243 (Anti-MHC-Klasse II) und W6/32 (Anti-MHC-Klasse I) wurden aus Kulturen von Hybridomas produziert, die von der American Type Culture Collection (Rockville, MD, USA) erhalten waren. ID4, eine dem Isotyp (IgG2a) angeglichene Kontrolle von irrelevanter Spezifität, wurde zur Verfügung gestellt von Dr. P. Shepherd (Department of Immunology, UMDS, Guys Hospital, London, UK). Kaninchen-Anti-SA I/II-Antiserum wurde wie zuvor beschrieben hergestellt (Russel et al. (1980). Infect. Immun. 28, 486).
Lymphoproliferativer Assay. Defibriniertes Blut von freiwilligen Testpersonen wurde auf einem Ficoll-Gradienten aufgetrennt. Die Seren wurden für Antikörper-Assays (siehe unten) verwendet, wohingegen periphere mononukleäre Blutzellen (PBMCs) gewaschen und in RPMI 1640 (Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo, USA), ergänzt mit 2 mM L-Glutamin, Penicillin (100 IE/ml), Streptomycinsulfat (100 μg/ml) und 10 % wärmeinaktiviertem autologem Serum, resuspendiert wurden. Die PBMCs (10⁵ Zellen/Well) wurden in 96-Well-Rundbodenplatten (Costar, Cambridge, Mo, USA) in einem Gesamtvolumen von 200 μl kultiviert. Drei Replikate jeder Kultur wurden mit drei Konzentrationen (1, 10 und 40 μg/ml) an SA I/II, rekombinanten Fragmenten, nicht-rekombinanter Kontrolle oder synthetischen Peptiden inkubiert. Die Inkubation erfolgte bei 37 °C in einer mit 5 % CO₂ befeuchteten Atmosphäre für 6 Tage. Jede Kultur erhielt 0,2 μCi (7,4 kBq) an [³H]-Thymidin (Amersham International, Bucks, UK) 6 h vor der Ernte. Die Kulturen wurden auf Glasfaserfiltern unter Verwendung eines Dynatec (Chantilly, VA, USA) Minimal Cell-Harvesters geerntet, und der [³H]-Thymidin-Einbau wurde unter Verwendung des LKB Flüssigszintillationszählers (Bromma, Schweden) gemessen. Die Proliferation wurde als Stimulationsindex ausgedrückt, welcher die mittleren Zählungen pro Minute (cpm) der Antigen-stimulierten, dividiert durch die cpm der Antigen-freien, Kulturen darstellt. Concanavalin A (10 μg/ml) (Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo, USA) wurde mit jeder Kultur als einer positiven Kontrolle verwendet, doch sind die Ergebnisse nicht dargestellt.
Die MHC-Abhängigkeit der proliferativen Reaktionen auf SA I/II wurde durch Kultivieren der Zellen mit Antigen (10 μg/ml) wie oben in der Gegenwart von MAbs L235, W6/32 oder ID4 bei 1, 10 und 20 μg/ml bestimmt. Die Kulturen wurden mit [³H]-Thymidin inkubiert, geerntet, und die [³H]-Thymidin-Aufnahme wurde wie oben beschrieben bestimmt.
ELISA auf Serum-Antikörper. Die Antikörper-Erkennung der synthetischen Peptide wurde mittels ELISA bestätigt. Peptide (10 μg/ml) in Phosphat-gepufferter Saline (PBS) wurden an den Vertiefungen von Polystyrol-Mikrotiterplatten (Dynatech) für 2 h bei Raumtemperatur adsorbiert. Die Platten wurden gewaschen und die Vertiefungen wurden mit 1,5 % (w/v) Rinderserumalbumin (BSA) für 1 h bei Raumtemperatur behandelt, um die ungebundenen Stellen zu blockieren. Nach dem Waschen wurden die gebundenen Peptide mit reihenweise verdünnten Seren im Duplikat inkubiert. Gebundene IgG-Antikörper wurden durch Inkubation mit alkalische Phosphatase-konjugiertem Ziege-Anti-Human-Ig (Sigma Chemical Co.) und anschließender Reaktion mit Paranitrophenylphosphat (Sigma Chemical Co.) bestimmt. Die Platten wurden bei 405 nm unter Verwendung des Mikroplattenlesegeräts Modell 450 (Bio-Rad) ausgelesen. Nach dem Erstscreening wurde der Assay mindestens dreimal mit jedem Serum unter Verwendung eines restringierten Satzes an Peptiden wiederholt. SA I/II (2 μg/ml) wurde in jeden Assay aufgenommen, ebenso wie ein irrelevantes Peptid (HQAAMQIIRDIINEEAADWD (SEQ ID Nr. 27), abgeleitet von der Sequenz von SIV p27. Die Ergebnisse sind als die höchste Verdünnung ausgedrückt, die eine Extinktion von ≥ 0,2 ergibt.
Western Blotting. Die Serumantikörper-Reaktionen wurden ebenfalls mittels Western Blotting unter Verwendung von SA I/II, den rekombinanten Polypeptiden und einer Kontrollfraktion von E. coli BL21, die nicht-rekombinantes PET15b beherbergte, untersucht. Gereinigte Antigene wurden mittels Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) mit Gelen aus 10 % Acrylamid unter Verwendung eines Minigelsystems (Hoeffer Scientific Instruments, San Francisco, Ca., USA) aufgetrennt. Die Proteine wurden auf Nitrocellulose mit einem Semi-Dry-Blotter (Sartorius A.G., Göttingen, Deutschland) transferiert. Die Nitrocellulose-Streifen wurden mit 5 % (Gew./Vol.) fettfreiem Milchpulver, 2,5 % (Gew./Vol.) BSA in Tris-HCl-gepufferter Saline (pH 8,0), enthaltend 0,05 % (Gew./Vol.) an Tween 20, blockiert. Die Streifen wurden anschließend mit Humanseren (1 zu 20-Verdünnung) oder Kaninchen-Anti-SA I/II-Antiserum (10^-4 Verdünnung) inkubiert, und gebundener Antikörper wurde unter Verwendung von alkalische Phosphatase-konjugiertem sekundärem Antikörper mit 5-Brom-4-chlor-3-indolylphosphat und Nitroblau-Tetrazolium (Sigma Chemical Co.) als Substraten sichtbar gemacht. Jedes Serum wurde dreimal untersucht, und die Reaktionen wurden als positiv erachtet, wenn Banden bei mindestens zwei Assays sichtbar waren.
Bakterieller Adhärenzassay. Die SA I/II-vermittelte Adhärenz von S. mutans (Guy-Stamm) an Speichel wurde durch Bestimmen der Bindung von [³H]-Thymidin-markierten Bakterien an Speichel, der an Mikrotiter-Vertiefungen adsorbiert war, untersucht. Frisch entnommener menschlicher Speichel von einem einzelnen Spender wurde durch Zentrifugation für 10 min bei 3000 g geklärt, bei 60 °C für 30 min hitzeinaktiviert und schließlich durch Zentrifugation bei 17.000 g für 20 min geklärt. Der behandelte Speichel wurde mit einem gleichen Volumen an PBS verdünnt und an den Vertiefungen einer 96-Well-Flachboden-Polystyrol-Mikrotiterplatte (Immulon 4; Dynatech) für 2 h bei Raumtemperatur adsorbiert. Nach dem Beschichten wurden die Wells dreimal mit PBS gewaschen, und ungebundene Stellen wurden durch Inkubation mit 1,5 % (Gew./Vol.) BSA in PBS für 1 h bei Raumtemperatur blockiert. Die Platten wurden dann dreimal mit 50 mM KCl – 1 mM CaCl₂ – 38 mM MgCl₂ – 1 mM KH₂PO₄ – 1,2 mM K₂PO₄ gewaschen (pH 7,2; Adhärenz-Puffer). S. mutans-Zellen von einer Übernacht-Kultur in Todd-Hewitt-Brühe wurden zur Beimpfung (1/10 Volumen) einer weiteren Kultur in Todd-Hewitt-Brühe, enthaltend 100 μCi (3,7 MBq) [³H]-Thymidin (Amersham International plc) pro ml verwendet. Die Zellen wurden in einer späten Log-Phase (O.D. 700 nm annähernd 0,4) geerntet, durch Zentrifugation bei 1000 g für 10 min pelletiert und dreimal in Adhärenz-Puffer gewaschen. Die fertige Suspension wurde mit 0,5 Volumen Glaskügelchen gevortext, um die Ketten der Kokken aufzubrechen, was mikroskopisch überwacht wurde (Munro et al. (1993): Infect. Immun. 61, 4590). Die Zellen wurden zu 5 × 10⁴ cpm pro 50 μl resuspendiert, und BSA wurde zu 1,5 % (Gew./Vol.) zugesetzt. Die spezifische Aktivität der gewaschenen S. mutans-Zellen wurde als 1,3 × 10^-3 cpm pro Zelle ausgewertet (Munro et al. (1985): Infect. Immun. 61, 4590). Bei der kompetitiven Hemmung der Adhärenz wurden verschiedene synthetische Peptide den Wells (bei Endkonzentrationen 62,5-500 μM) in 50 μl Adhärenz-Puffer, enthaltend 1,5 % (Gew./Vol.) BSA, zusammen mit 50 μl radiomarkierter S. mutans-Suspension, zugegeben. Die Mikrotiterplatten wurden bei 37 °C für 2 h unter leichtem Schütteln inkubiert und wurden anschließend zehnmal mit Adhärenz-Puffer gewaschen. Gebundene S. mutans-Zellen wurden mit 1 % (Gew./Vol.) SDS eluiert und auf Glasfaserfilter unter Verwendung des Micromat 196-Cell Harvester (Canberra Packard, Berks, UK) übertragen. Die Filter wurden unter Verwendung des Matrix 96 Direkt-Beta-Zählers (Canberra Packard) ausgezählt. Die Hintergrund-Bindung wurde an den Wells bestimmt, an denen kein Speichel adsorbiert war. Die prozentuale Bindung von S. mutans an Speichel wurde anhand der Formel [(Test cpm) – (Kontroll cpm)/Gesamt cpm] × 100 berechnet. Die prozentuale Hemmung der Adhärenz wurde als [(prozentuale Adhärenz ohne Inhibitor – prozentuale Adhärenz mit Inhibitor)/prozentuale Adhärenz ohne Inhibitor] × 100 berechnet. Für die Proteine wurden die Bestimmungen der Streptokokken-Adhäsion im Triplikat oder Quadruplikat bei jeder Proteinkonzentration vorgenommen, wohingegen für die Peptide Duplikat-Bestimmungen erfolgten. In jedem Fall wurde der Assay mindestens dreimal durchgeführt.
Statistik
Der Student-t-Test wurde zur Analyse der Ergebnisse angewendet.
Beispiel 1
Herstellung eines Panels von überlappenden synthetischen Peptiden und Analyse ihrer Eigenschaften.
T-Zell-Epitop-Kartierung
Ein Panel von 32 überlappenden synthetischen Peptiden, die Reste 803-1174 von SA I/II durchspannten, wurde hergestellt, wie oben beschrieben (siehe 1). Die proliferativen Reaktionen der PBMCs von 30 Subjekten wurden durch Stimulation mit Peptiden bestimmt (siehe 2). Alle Subjekte reagierten auf mindestens ein Peptid mit einem Bandenbereich von 1-8 Peptiden und einem Mittelwert von 4,4 Peptiden. Auf der Basis der Frequenz der Reaktion auf jedes Peptid (SI ≥ 3,0 cpm > 500) wurden 3 immundominante Epitope identifiziert: Peptide 803-822, 975-994 und 985-1004, die jeweils Frequenzen > 50% ergaben (1). Da die meisten (13/15) Subjekte, die auf Peptid 975-994 reagierten, auch auf Peptid 985-1004 reagierten, ist es wahrscheinlich, dass ein einzelnes T-Zell-Epitop innerhalb der Reste 975-1004 vorhanden ist. Kleinere T-Zell-Epitope wurden ebenfalls innerhalb der Peptide 1005-1024, 1015-1034, 1085-1104 und 1115-1134 bei Häufigkeiten > 20% identifiziert, und einige der angrenzenden Peptide können einzelne T-Zell-Epitope repräsentieren.
MHC-Restriktion der lymphoproliferativen Reaktionen (siehe 3 und Tabelle 2)
Die HLA-Restriktion der T-Zellantwort wurde zunächst anhand der Dosis-abhängigen Hemmung mit MAb zu HLA Klasse I und II-Antigen untersucht (2). Die lymphoproliferative Reaktion war mit 1 μg des MAb zu HLA Klasse II (L243) um 50 % gehemmt, und 10 μg des MAb hemmten 100 % der Reaktionen (von SI 10,0 ± 3,2 bis SI 1,5 ± 0,4). Weder MAb zu HLA Klasse I (W6/32) noch die Isotyp-Kontrolle induzierten irgendeine Hemmung der lymphoproliferativen Reaktion.
Die HLA-DR von 17 Subjekten wurden bestimmt, und 6 von diesen waren homozygot. Die Reaktionen der immundominanten und kleineren Epitope wurden dann bei den 6 DR-homologen Subjekten untersucht (Tabelle 2). Lediglich Peptid 975-994 schien durch HLA-DR1 restringiert zu sein. Die anderen 6 Peptide stimulierten Lymphozyten von HLA-DR1, 2 (außer AA 1085-1104) und DR6 (außer AA 803-822). DR5 war durch Peptid 803-922 restringiert, obschon das letztere Lymphozyten mit DR1-, 2- und 3-Antigenen stimulierte. Lymphozyten mit DR3- oder 4-Antigen reagierten auf 3 oder 4 Peptide. Die Ergebnisse legen nahe, dass außer für Peptid 975-994 die verbliebenen 6 Peptide promisk zu sein scheinen, da sie Lymphozyten mit 3 bis 5 HLA-DR-Antigenen stimulierten.
B-Zell-Epitop-Kartierung (siehe 4)
Die Erkennung der rekombinanten Fragmente wurde mittels Western Blotting ausgewertet. Repräsentative Blots, die mit Seren von drei Individuen erhalten wurden, sind in 3 gezeigt, zusammen mit einer positiven Kontrolle unter Verwendung von Kaninchen-Anti-SA I/II-Antiserum. In Panel a wurden SA I/II und 984-1161 stark erkannt. Als einer positiven Kontrolle verwendetes Kaninchen-Anti-SA I/II-Antiserum (Panel d) erkannte rekombinantes 984-1161. Das rekombinante Polypeptid entsprechend den Resten 984-1161 wurde ebenfalls analysiert. SA I/II wurde ebenfalls durch alle Subjekte erkannt. B-Zell-Epitope wurden mittels ELISA unter Verwendung des Panels der synthetischen Peptide kartiert. Das Panel der Peptide wurde mit Seren von 22 Individuen gescreent, und 8 Peptide, die durch mehr als ein Individuum erkannt wurden, zusammen mit einem Peptid, das nicht erkannt wurde, wurden für weitere Analysen ausgewählt (5). SA I/II wurde durch alle Subjekte bei einem mittleren log₂-Titer von 7,6 ± 1,2 erkannt. Die Titer gegen die Peptide waren niedrig, wobei lediglich der gegen Peptid 824-843 (mittlerer log₂-Titer 4,7 ± 1,1) signifikant größer war als der Titer gegen das Kontroll-SIV p27-Peptid (t = 7,28 p < 0,01). Der Anteil der signifikanten Titer (> Mittelwert + 2 Standardabweichungen) wurde ebenfalls berechnet (5), und lediglich Peptid 824-843 zeigte eine hohe Häufigkeit (18/22). In der Tat ist ein immundominantes B-Zell-Epitop innerhalb des Peptids 824-843 vorhanden, das möglicherweise mit dem überlappenden Peptid 834-853 geteilt wird, wohingegen Peptide 925-944, 1035-1054 und 1085-1104 kleinere B-Zell-Epitope darstellen. Trotz der hohen Häufigkeit der Reaktionen auf das oben beschriebene rekombinante Polypeptid 984-1161 wurde eine sehr geringe Häufigkeit der Reaktionen auf Peptide innerhalb dieser Region beobachtet.
Speichelproben von den Subjekten wurden kultiviert, um die Mengen an S. mutans zu bestimmen. Bei 66 % der Individuen wurde S. mutans nachgewiesen (Bereich 10³- 10⁵ Kolonie-bildende Einheiten/ml). Es lag keine Korrelation zwischen den S. mutans-Mengen und der Erkennung der jeweiligen Epitope oder Titer gegen SA I/II vor.
Adhäsionsepitop-Kartierung
Die Adhärenz von S. mutans an Speichel-beschichteten Mikrotiter-Wells (ein Modell der Zahnoberfläche) wurde mit [³H]-Thymidin-markiertem S. mutans bestimmt. Der Anteil der haftenden Bakterien lag im Bereich von 1-5 %. In der Abwesenheit von Speichel betrug der Anteil der haftenden Bakterien < 0,1 %.
In einer Reihe von kompetitiven Inhibitionsassays wurde ein Panel synthetischer Peptide auf die Hemmung der Haftung von S. mutans an Speichel-beschichteten Mikrotiter-Wells untersucht. Peptide 1005-1024, 1025-1044 und 1085-1104 hemmten durchgehend die Haftung bei einer maximalen Inhibition ≥ 90 % bei Konzentrationen von 500 μM (6). Die angrenzenden Peptide 1015-1034 und 1095-1114 zeigten eine variablere und geringere Hemmung und können Teil der Adhäsionsepitope sein.
Beispiel 2
Konstruktion eines Expressionsvektors und Expression eines rekombinanten Polypeptids der Erfindung (SEQ ID Nr. 8).
Unter Verwendung der Oligonukleotid-Primer TAT CAT ATG CAA GAT CTT CCA ACA CCT CCA TCT ATA (5') (SEQ ID Nr. 29) und GTC GAC TCA TAC CAA GAC AAA GGA AGT TGT (3') (SEQ ID Nr. 30) wurde der Abschnitt des SA I/II-Gens, der Reste 975-1044 (SEQ ID Nr. 8) codiert, durch Polymerase-Kettenreaktion amplifiziert. Das amplifizierte Genfragment (mit eingeführten Nde I- und Sal I-Restriktionsenzymstellen) wurde unter Verwendung des Ta-Kloniersystems kloniert und wurde in das Plasmid pET15b subkloniert. Das rekombinante Polypeptid wurde in E. coli BL21 (DE3) exprimiert.
Beispiel 3
Stimulierung einer in vitro T-Zellantwort durch das rekombinante Polypeptid (SEQ ID Nr. 8).
Periphere Blutlymphopzyten von freiwilligen Versuchspersonen wurden wie oben beschrieben präpariert. Die Zellen wurden mit gereinigtem rekombinantem Polypeptid 975-1044 bei Konzentrationen von 40, 10 und 1 μg/ml inkubiert. Die Zellen wurden außerdem mit einer in derselben Weise präparierten Proteinfraktion von E. coli, die nicht-rekombinantes Plasmid beherbergte, inkubiert. Die proliferative Reaktionen von 17 Personen wurden bestimmt. Der mittlere Stimulationsindex (± SEM) betrug 11,6 ± 2,3, verglichen zu 2,4 ± 0,3 für die Kontrolle. Die Häufigkeit der reagierenden Personen (d.h. jene mit Stimulationsindex ≥ Kontrolle + 2 SA) betrug 15/17.
Beispiel 4
Immunisierung von Mäusen mit dem rekombinanten Polypeptid (SEQ ID Nr. 8) (siehe 7)

i) Gruppen von Mäusen (3-4 pro Gruppe) wurden mit 975-1044 (SEQ ID Nr. 8) auf zwei Wegen immunisiert: a) intraperitoneal mit 50 μg Polypeptid in inkomplettem Freund-Adjuvans mit einer Auffrischung nach 4 Wochen (ebenfalls 50 μg in inkomplettem Freund-Adjuvans und intraperitoneal). b) subkutan. Eine einzige Immunisierung mit 50 μg Polypeptid in inkomplettem Freund-Adjuvans.
ii) Drainierende Lymphknoten wurden 10 bis 14 Tage nach der Immunisierung entfernt, gepoolt und homogenisiert, was eine Einzelzell-Suspension in RPMI 1640-Kulturmedium, ergänzt mit 2 mM Glutamin, 1 mM Pyruvat, 50 mM 2-Mercaptoethanol, 100 μ/ml Penicillin, 100 μg/ml Streptomycin, 100 mM HEPES und 5 % fötalem Kälberserum, ergab. Die Zellen (2 × 10⁵/Well) wurden mit Antigen kultiviert, und die Proliferation wurde durch Aufnahme von [³H]-Thymidin wie oben beschrieben gemessen. Die Antigene waren SA I/II-rekombinante Polypeptide, Peptide, die Reste 975-1044 durchspannten, und eine Kontrollproteinfraktion von E. coli, die nicht-rekombinantes Plasmid beherbergte.

Wie in 7, reagierten alle Mausstämme auf SA I/II und das rekombinante Polypepetid 975-1044 (SEQ ID Nr. 8). Positive Reaktionen auf die Peptide waren die mit einem Stimulationsindex ≥ 3,0 (cpm > 500). Die SJL-Mäuse reagierten auf Peptid 985-1004 und die DBA/-a-Mäuse reagierten auf Peptid 975-995 und 985-1004. Für BALB/c-Mäuse wurden keine signifikanten Reaktionen auf die Peptide beobachtet, obschon die Reaktion auf Peptid 985-1004 größer war als die Reaktionen auf die verbliebenen Peptide.
iii) Antikörper-Erkennung (siehe Tabelle 2)
Seren von intraperitoneal mit Polypeptid 975-1044 immunisierten Mäusen erkannten intakte Zellen von S. mutans, intaktes SA I/II und rekombinantes 975-1044. Peptide 995-1014 und 1025-1044 wurden ebenfalls erkannt. Der Titer für jeden Stamm war wie in Tabelle 2 gezeigt, welche log₂-Titer zeigt, bei denen die Anfangsverdünnung 1 zu 50 betrug (Titer = 1).
Beispiel 5
Analyse der Interaktion zwischen Streptokokken-Antigen I/II und Speichel-Rezeptor unter Verwendung von BIAcore
ZIELE
Bei dieser Untersuchung haben wir die Oberflächen-Plasmonresonanz (spr) zum Analysieren der Wechselwirkung zwischen gereinigtem SA I/II und menschlichem Vollspeichel oder gereinigtem Speichel-Rezeptor angewandt. Außerdem haben wir die Calciumabhängigkeit der Bindung, identifizierte einzelne Aminosäure-Reste, die an der Bindung beteiligt sein können, untersucht und die Affinität der Wechselwirkung zwischen SA I/II und Speichel-Rezeptor bestimmt.
METHODEN
Materialien
SA I/II und rekombinante Polypeptide wurden wie oben beschrieben präpariert. Der Speichel-Rezeptor wurde durch Absorption des Vollspeichels mit intakten Zellen von S. mutans präpariert (Lee et al. (1989) Infect. Immun. 57:3306-3313). Die Zellen wurden mit KPBS (2,7 mM KCl, 137 mM NaCl in 1,5 mM KH₂PO₄, 6,5 mM Na₂HPO₄, pH 7,2) gewaschen, und das adsorbierte Material wurde mit 1 mM EDTA in KPBS eluiert. Die Analyse des gereinigten Materials mittels Polyacrylamid-Gelelektrophorese in der Gegenwart von Na-Dodecylsulfat ergab das Vorhandensein von Komponenten von Mr > 200.000 und etwa 40.000. Die Peptide wurden mittels des Simultaneous Multiple Peptidsynthese-Verfahrens (Houghten (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 5131-5135) wie oben präpariert. Außerdem wurde eine Reihe von Peptiden entsprechend den Resten 1025-1044 synthetisiert, worin wiederum jeder Rest durch Alanin substituiert war.
Bindungsanalysen
Gereinigtes SA I/II oder Speichel-Rezeptor wurde an der Sensorchip-Oberfläche bei einer Konzentration von 100 μg/ml in 10 mM Na-Format pH 3,5 unter Verwendung des Aminkopplungskits (Pharmacia Biosensor) immobilisiert.
i. Inhibitionsstudien
Die Bindung des immobilisierten SA I/II an Rezeptoren in Vollspeichel wurde in der Abwesenheit und der Gegenwart von Inhibitoren (bei variierenden Konzentrationen) bestimmt. Die Hemmung durch Alanin-substituierte Peptide wurde bei einer Peptidkonzentration von 50 μM analysiert. Der Laufpuffer war HEPES-gepufferte Saline (HBS), und die Oberfläche wurde mit 100 mM HCl regeneriert.
ii. Direkte Bindung
Gereinigter Speichel-Rezeptor wurde an dem Sensorchip immobilisiert, und die Bindung von SA I/II oder gereinigten rekombinanten Polypeptid-Fragmenten wurde bestimmt.
ERGEBNISSE
i. Calciumabhängigkeit
Bei separaten Bestimmungen mit Vollspeichel variierte die Bindung an immobilisiertes SA I/II von etwa 250 Resonanz-Einheiten (RU) – 800 RU. In der Gegenwart von EDTA war die Bindung bei einer maximalen Hemmung von 95 % bei einer Konzentration von 10 mM EDTA gehemmt. Anschließende Bindungsassays wurden in der Gegenwart von 5 mM Calcium vorgenommen.
ii. Hemmung der Bindung
Gereinigtes SA I/II oder rekombinante Polypeptid-Fragmente 1 (Reste 39-481), 2 (Reste 475-824), 3 (Reste 816-1213), 4 (Reste 1155-1538) und rekombinantes 984-1161 wurden zu Speichel in der Flüssigphase als kompetitive Inhibitoren bei von 0-20 μM variierenden Konzentrationen gegeben. SA I/II hemmte die Bindung bei etwa 90 % Hemmung bei einer Konzentration von 6 μM am wirksamsten (8). Von den rekombinanten Fragmenten hemmte lediglich Fragment 3 und r984-1161 die Bindung an Speichel-Rezeptoren in einem signifikant größeren Umfang als die Kontrolle (Rinderserumalbumin) mit einer maximalen Hemmung von 65 % bzw. 50 % (8).
Ein Panel von synthetischen Peptiden (20-mere, überlappend um 10), die die Reste 803-1174 durchspannten, wurde auf die inhibitorische Aktivität untersucht. Peptid 1025-1044 war der wirksamste Inhibitor, obschon 10- bis 20-fach höhere Konzentrationen erforderlich waren als für die Polypeptide (9). Ein Panel von Peptiden, in welchem jeder der Reste 1025-1044 wiederum durch Alanin substituiert war (dort, wo Alanin natürlich vorkam, war es durch Serin substituiert), wurde ebenfalls auf die inhibitorische Aktivität analysiert. Die Substitution von Glu (1037) hob durchgehend die durch das Peptid vermittelte Inhibition auf (10). In ähnlicher Weise verminderte die Substitution von Gln 1025, Thr 1039, Phe 1041, Val 1042, Leu 1043 und Val 1044 die Inhibition der Bindung, die durch das Peptid 1025-1044 vermittelt war.
iii. Direkte Bindung
Für diese Analysen wurde gereinigter Speichel-Rezeptor an dem Sensorchip immobilisiert und die Bindung von SA I/II der flüssigen Phase oder von rekombinanten Polypeptide bestimmt. Bei einer Konzentration von etwa 5 μM banden sowohl SA I/II als auch rekombinantes SA I/II an Speichel-Rezeptor in dem Bereich von 500-600 RU (11). Die Bindung von rekombinanten Polypeptiden wurde bei einer Konzentration von etwa 20 μM bestimmt, und die höchste Bindung wurde mit Fragment 3 (1256 RU) erhalten (11). Die Bindung der anderen Fragmente, obschon signifikant höher als die Myosin-Kontrolle, war nicht höher als die Rinderserumalbumin-Kontrolle und scheint somit nicht spezifisch zu sein. Die Zugabe von EDTA (10 μM) bei diesem Assay hemmte die Bindung des SA I/II der flüssigen Phase vollständig.
Die Affinitäts- und Ratenkonstanten für die Adhäsinrezeptor-Interaktion wurden für SA I/II, reombinantes SA I/II und Fragment 3 bestimmt (Tabelle 3). Die Werte zeigen eine Interaktion von geringer Affinität mit einer langsamen Assoziationsratenkonstante und einer relativ schnellen Dissoziationskonstante an.
Schlussfolgerungen
Diese Analysen bestätigen, dass Reste 816-1213 von SA I/II eine Adhäsionsbindungsregion bilden und dass innerhalb dieser Region das Peptid 1025-1044 ein Adhäsionsepitop bildet. Wir haben diese Befunde nun durch die Identifizierung spezifischer Reste erweitert, die für die Bindung an Speichel-Rezeptor wesentlich sein können, nämlich Reste 1025, 1037, 1039 und 1041-1045. Die Bindung ist EDTA-empfindlich und ist, unter den Assay-Bedingungen, von relativ geringer Affinität.
TABELLE 3

SA I/II rekomb. SA I/II FRAG 3

k_a (M^-1 s^-1) n.b. 20,9 × 10³ 1,5 × 10³

k_d (s^-1) 2 × 10^-2 4,2 × 10^-3 8,1 × 10^-3

k_c (M^-1) n.b. 5,0 × 10⁶ 0,2 × 10⁶

n.b. nicht bestimmt

SEQUENZINFORMATION
Als ein Ergebnis der oben ausgeführten Experimente sind die folgenden Sequenzen als von besonderem Interesse identifiziert worden.

Claims

Polypeptid mit der Fähigkeit, eine T-Zell-Reaktion zu stimulieren, und einer oder mehrerer der folgenden Eigenschaften: (i) der Fähigkeit, an einem Sängerzahn in einer kompetitiven Weise mit natürlich vorkommendem Streptococcus mutans-Antigen I/II (SA I/II) zu haften, und somit die Haftung von S. mutans an dem Zahn zu verhindern oder zu vermindern; und (ii) der Fähigkeit, eine B-Zell-Reaktion zu stimulieren; und ausgewählt aus: (a) einem Polypeptid, dessen Aminosäuresequenz wie in irgendeiner der SEQ ID Nrn. 2 bis 9 oder 11 dargestellt ist; (b) einem Polypeptid, dessen Sequenz zu wenigstens 60 % Sequenzidentität zu der eines Polypeptids aus (a) aufweist; welches Polypeptid die biologischen Eigenschaften beibehält, die das Polypeptid aus (a) mit SA I/II gemeinsam hat; (c) einem Polypeptid, umfassend eine Sequenz, welche von der eines Polypeptids aus (a) durch die Substitution, Deletion oder Insertion von ein bis zehn Aminosäuren abweicht; welches Polypeptid die biologischen Eigenschaften beibehält, die das Polypeptid aus (a) mit SA I/II gemeinsam hat; (d) einem Polypeptid, umfassend die Sequenz der SEQ ID Nr. 3, 9 oder 11 und umfassend insgesamt bis zu 50 Aminosäuren, oder einem Polypeptid, umfassend die Sequenz der SEQ ID Nr. 2, 5, 7 oder 8 und umfassend insgesamt bis zu 100 Aminosäuren, oder einem Polypeptid, umfassend die Sequenz der SEQ ID Nr. 4 oder 6 und umfassend insgesamt bis zu 200 Aminosäuren, welches Polypeptid die biologischen Eigenschaften beibehält, die das Polypeptid der SEQ ID Nr. 2 bis 9 oder 11 mit SA I/II gemeinsam hat; und (e) einem Polypeptid, umfassend ein Polypeptid aus (a) oder (b), das am C-Terminus durch eine Nicht-Wildtyp-Sequenz mit irgendeiner Sequenz, abgesehen von der, die C-terminal zu der Sequenz des Polypeptids aus (a) im nativen SA I/II ist, verlängert ist, und/oder das am N-Terminus durch eine Nicht-Wildtyp-Sequenz mit irgendeiner Sequenz, abgesehen von der, die N-terminal zu der Sequenz des Polypeptids aus (a) im nativen Sa I/II ist, verlängert ist; welches Polypeptid die biologischen Eigenschaften beibehält, die das Polypeptid aus (a) mit SA I/II gemeinsam hat;
Polypeptid nach Anspruch 1, worin, in Teil (b), der Grad an Sequenzidentität wenigstens 80 %, wenigstens 90 % oder wenigstens 95 % beträgt.
Polypeptid nach Anspruch 1, worin, in Teil (c), eine Substitution, Deletion oder Insertion von ein bis fünf Aminosäuren vorliegt.
Polypeptid nach Anspruch 1, dessen Aminosäuresequenz die aus irgendeiner der SEQ ID Nrn. 2 bis 9 oder 11 ist.
Polypeptid nach Anspruch 4, dessen Aminosäuresequenz die der SEQ ID Nr. 9 ist.
Polypeptid nach Anspruch 4 oder 5, doch sich davon unterscheidend durch die Deletion einer Aminosäure.
Polypeptid nach einem der vorangehenden Ansprüche, dessen Aminosäuresequenz die der Aminosäuren 2 bis 21 der SEQ ID Nr. 9 ist.
Polypeptid nach einem der vorangehenden Ansprüche, welches glykosyliert oder sulfiert ist; oder eine C-terminale Amidgruppe und/oder N-terminale Acetylierung ausweist.
Nukleinsäuresequenz, welche auf die Expression in einer prokaryotischen oder eukaryotischen Wirtszelle hin für ein Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 7 codiert.
Vektor, umfassend eine Nukleinsäuresequenz nach Anspruch 9, die operativ geknüpft ist an einen Promotor, der zum Steuern ihrer Expression in einer Wirtszelle fähig ist.
Isolierte Zelle, die einen Vektor nach Anspruch 10 beherbergt.
Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend ein Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 8 und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger.
Zusammensetzung nach Anspruch 12, die eine Impfstoffzusammensetzung ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 12 oder 13, die zur topischen Anwendung über den Mund formuliert ist.
Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 8 zur Verwendung in der Behandlung von Zahnkaries.
Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 8 zur Verwendung in der Behandlung von Zahnkaries, oder in der Impfung eines Sängerwirts gegen Zahnkaries mittels der topischen Anwendung über den Mund.
Verwendung eines Polypeptids nach einem der Ansprüche 1 bis 8 in der Herstellung eines Medikaments für die Behandlung von Zahnkaries, oder in der Impfung eines Sängerwirts gegen Zahnkaries mittels der topischen Anwendung über den Mund.