DE60307987T2 - Galectin aus milben - Google Patents
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Description
- GEBIET DER ERFINDUNG
- Die Erfindung betrifft ein Milbengalectin.
- STAND DER TECHNIK FÜR DIE ERFINDUNG
- Milben verursachen direkt oder indirekt umfangreiche Schäden bei Tieren oder Menschen. Beispiele für direkte Schäden sind Juckreiz oder Bluten, der/das von Bissen oder Blutsaugen hervorgerufen wird, und Lähmungserscheinungen oder allergische Erkrankungen, die von dem beim Blutsaugen abgesonderten Speichel oder dem Ausstoßen von Verdauungsinhalt ausgelöst werden. Beispiele für indirekte Schäden sind verschiedene Krankheiten bei Nutztieren, die von Viren, Rickettsien, Bakterien, Spirochäten, Protozoen, Nematoden oder dergleichen hervorgerufen werden. Diese Schäden verursachen enorme Verluste im In- und Ausland, und die Behandlung von auftretenden und erneut auftretenden von Milben ausgelösten Zoonosen ist ein ernsthaftes Problem geworden.
- Unter diesen Umständen werden verschiedene Verfahren zur Milbenvernichtung in vielen Ländern angewendet. Davon ist das wichtigste die Verwendung von Mitteln wie organischen Phosphorverbindungen, Carbamaten, Pyrethroiden oder Makrolid-Antibiotika und dergleichen. Jedoch hat sich durch das wiederholte oder stark dosierte Einsetzen von Mitteln bei einigen Mitteln eine Arzneimittelresistenz manifestiert, weshalb viele Mittel ihre mitizide Wirksamkeit verloren haben. weiterhin ist es erforderlich, wenn solche Mittel verwendet werden, Nebenwirkungen auf die Tiere zu berücksichtigen. Zusätzlich gibt es Probleme mit zurückbleibenden Mitteln, welche die Sicherheit von Lebensmitteln und Umwelt gefährden können, weshalb die Leute dazu neigen, die Verwendung solcher Mittel zu vermeiden. Außerdem erreicht die Verwendung dieser Mittel in Bezug auf die enormen Entwicklungskosten zusätzlich zu ihrer Wirksamkeit und dem Anwendungsgebiet ihre Grenzen. Wie weiter oben erwähnt, wird es als schwierig angesehen, das Parasitentum von Milben bei Menschen oder Tieren und die Schäden, die von Milbeninfektionen im 21. Jahrhundert verursacht werden, durch die Verwendung von Arzneimitteln zu verhüten.
- Bei blutsaugenden Gliederfüßern, einschließlich Milben, ist das Erwerben einer schützenden Immunantwort in einem Wirt gegen eine virale oder bakterielle Reinfektion bekannt und im Laborstadium bestätigt worden [Fujisaki, Nat. Inst. Anim. Hlth. Quart. (Tokio), 18, 27–38 (1978)]. Aufgrund des jüngsten Fortschritts bei Genrekombinationstechniken sind Gene, die für schützende Antigene, Enzyme, die mit der für blutsaugende Gliederfüßer spezifischen Metamorphose zusammenhängen, oder dergleichen in vielen Ländern intensiv kloniert worden, wobei Versuche zur Herstellung sicherer Impfproteine oder chemotherapeutischer Mittel unternommen worden sind.
- Ein solches Mittel in praktischer Verwendung ist jedoch ausschließlich dasjenige gegen Boophilus microplus, das von Willadesen entwickelt worden ist [Willadesen und Jogejan, Parasitology Today, 15, 258–262 (1999)]. Gegenwärtig wird nach einem Impfstoff gegen Ornithodoros moubata gesucht, die in Südeuropa und Afrika weit verbreitet ist und Zoonosen wie Rickettsiosen, Filariosen, Q-Fieber, Afrikanisches Rückfallfieber oder virale Enzephalitis überträgt, weshalb die schnelle Entwicklung und praktische Verwendung eines solchen Impfstoffs in hohem Maße erwünscht ist.
- Obwohl die Entwicklung und praktische Verwendung eines Impfstoffs gegen alle Milben in hohem Maße erwünscht ist, ist ein solcher Impfstoff, der gegen alle Milben wirksam ist, noch nicht entwickelt worden. Es wird angenommen, dass der Hauptgrund dafür darin besteht, dass das Züchten von Milben schwierig ist, und die Suche nach Kandidatenantigenen, die mit einer schützenden Immunität vor Parasitenbefall in Verbindung stehen, noch nicht vorangekommen ist. Unter diesen Umständen ist die Suche nach den hauptsächlichen Antigenen in Ornithodoros moubata und die Entwicklung eines wirksamen rekombinanten Impfstoffs, in welchem das hauptsächliche Antigen oder ein rekombinantes Protein davon als Antigen verwendet wird, erwünscht.
- Aus medizinischer Sicht ist bekannt, dass Galectin in einem entzündeten oder Tumorgewebe überexprimiert wird, weshalb es als Marker für eine Entzündung oder einen Tumor bekannt ist. Weiterhin ist bekannt, dass Galectin an der Apoptose der T-Zellen oder B-Zellen beteiligt ist und eine bedeutende Rolle bei der Selbsterkennung spielt. Versuche, Galectin oder einen Inhibitor davon als immunsuppressives Mittel für Autoimmunerkrankungen, entzündungshemmendes Mittel oder ein Metastasen bekämpfendes Mittel zu verwenden, sind unternommen worden, wobei große Hoffnungen bestehen, dass sie als Arzneimittel verwendet werden können.
- In BIOCHEM. MOL. BIOL., Bd. 30, Nr. 3, 195–205 (2000) ist die Isolation und Reinigung eines Lectins (Dorin M) aus Ornithodoros moubata offenbart, das aus zwei nicht kovalent verbundenen Untereinheiten besteht, die nahe bei etwa 37 kDa in SDS-PAGE migrieren. In DATABASE EMBL, 14. Oktober 2000, Hill, C.A. und Gutierrez, J.A., "EST, Amblyomma americanum", ist ein Polynucleotid offenbart, das aus der Amblyomma americanum isoliert wurde und eine 57,34%ige Identität in 429 nt, überlappend mit SEQ ID Nr. 1 dieser Patentanmeldung, zeigt.
- BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
- Von den Erfindern sind umfangreiche Untersuchungen durchgeführt worden, um ein neues Polypeptid, das als Kandidat für einen Impfstoff gegen Milben, insbesondere Ornithodoros moubata, nützlich ist, und ein für das Polypeptid codierendes Polynucleotid zu erhalten, wobei als Ergebnis ein neues Galectin und ein für dieses codierendes Polynucleotid erhalten wurde. Weiterhin impften die Erfinder Mäuse mit dem Galectin, um die Auslösung einer Antikörperproduktion zu beobachten, und bestätigten, dass das Galectin als ein Milbenimpfstoff nützlich ist. Die vorliegende Erfindung beruht auf diesen Feststellungen.
- Der Erfindung liegt als Aufgabe zugrunde, ein neues Galectin, das als Milbenimpfstoff nützlich ist, und ein für das Galectin codierendes Polynucleotid bereitzustellen.
- Diese Aufgabe wird durch ein erfindungsgemäßes Polypeptid gelöst, das heißt ein
- (1) Polypeptid, das aus der Aminosäuresequenz SEQ ID Nr. 2 besteht,
- (2) Polypeptid, das die Aminosäuresequenz SEQ ID Nr. 2 umfasst und eine Galectinaktivität aufweist,
- (3) Polypeptid, das eine Galectinaktivität aufweist und eine Aminosäuresequenz umfasst, in welcher eine bis zehn Aminosäuren an einer oder mehreren Positionen in der Aminosäuresequenz SEQ ID Nr. 2 substituiert, deletiert und/oder insertiert sind, oder
- (4) Polypeptid, das eine Aminosäuresequenz umfasst, die eine Homologie von 60 % oder mehr mit der Aminosäuresequenz SEQ ID Nr. 2 besitzt, und welches eine Galectinaktivität aufweist.
- Die Erfindung betrifft ein für das Polypeptid codierendes Polynucleotid.
- Die Erfindung betrifft einen das Polynucleotid umfassenden nicht-humanen Transformanten.
- Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung des Polypeptids, das die Stufe der Kultivierung des nicht-humanen Transformanten umfasst.
- Die Erfindung betrifft ein Arzneimittel, welches das Polypeptid oder ein Fragment davon, das Polynucleotid oder den Vektor umfasst. Das Arzneimittel kann einen Träger oder ein Verdünnungsmittel umfassen, der/das pharmazeutisch bzw. veterinärmedizinisch verträglich ist.
- Die Erfindung betrifft die Verwendung des Polypeptids oder eines Fragments davon, des Polynucleotids oder des Vektors zur Herstellung eines Arzneimittels für die Behandlung oder Verhütung einer von Milben verursachten Infektion.
- Die Erfindung betrifft einen Antikörper oder ein Fragment davon, welcher/welches an das Polypeptid bindet.
- Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Screening einer Substanz, die in der Lage ist, eine Galectinaktivität des Polypeptids zu modifizieren, welches die Stufen:
- – In-Berührung-Bringen des Polypeptids mit der zu untersuchenden Substanz und
- – Analyse der Galectinaktivität des Polypeptids umfasst.
- KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
-
1 zeigt das Ergebnis der Elektrophorese eines rekombinanten Galectinfusionsproteins. -
2 zeigt das Ergebnis der Elektrophorese durch Immunoblotting unter Verwendung eines monoklonalen Antikörpers gegen Hämolymphe von Nymphen im 4. Stadium. -
3 zeigt das Ergebnis der Elektrophorese durch Immunoblotting unter Verwendung eines anti-rekombinanten Galectinfusionsproteinmausserums. -
4 zeigt das Ergebnis eines Agglutinierungstestes des rekombinanten Galectinfusionsproteins gegen Mauserythrocyten. -
5 zeigt das Ergebnis der Elektrophorese in einem Galactose-Bindungs-Versuch für das rekombinante Galectinfusionsprotein. - BESTE AUSFÜHRUNGSFORM DER ERFINDUNG
- Die Erfindung wird anschließend näher erläutert.
- [1] Erfindungsgemäßes Polypeptid
- Das erfindungsgemäße Polypeptid umfasst:
- (1) ein Polypeptid, das aus der Aminosäuresequenz mit der SEQ ID Nr. 2 besteht,
- (2) ein Polypeptid, das die Aminosäuresequenz mit der SEQ ID Nr. 2 umfasst und eine Galectinaktivität aufweist,
- (3) ein Polypeptid, das eine Galectinaktivität aufweist und eine Aminosäuresequenz umfasst, in welcher eine oder mehrere Aminosäuren an einer oder mehreren Stellen in der Aminosäuresequenz mit der SEQ ID Nr. 2 substituiert, deletiert und/oder insertiert sind (anschließend als eine funktional äquivalente Variante bezeichnet), und
- (4) ein Polypeptid, das eine Aminosäuresequenz umfasst, die eine Homologie von 60 % oder mehr mit der Aminosäuresequenz mit der SEQ ID Nr. 2 besitzt, und welches eine Galectinaktivität aufweist (anschließend als ein homologes Polypeptid bezeichnet).
- Die hier benutzte Bezeichnung "Galectinaktivität" bedeutet die Aktivität der Bindung an das β-Galactosid. Ob ein zu untersuchendes Polypeptid die Galectinaktivität besitzt oder nicht, kann leicht nachgewiesen werden, beispielsweise durch ein bekanntes Verfahren zur Messung der Galectinaktivität, in welchem das zu untersuchende Polypeptid mit Galactose oder einem Derivat davon in Berührung gebracht und anschließend die Bindung zwischen dem Polypeptid und der Galactose oder einem Derivat davon und/oder ihr Grad analysiert wird. Die Vorgehensweise ist nicht besonders beschränkt, doch wird vorzugsweise durch das in Beispiel 12 beschriebene Verfahren nachgewiesen.
- Insbesondere wird beispielsweise ein zu untersuchendes Polypeptid durch eine Affinitätssäule geschickt (beispielsweise eine Lactosyl-Sepharose-Säule), die Galactose oder ein Derivat davon trägt, wonach analysiert wird, ob das zu untersuchende Polypeptid von der Säule adsorbiert worden ist. Wenn das zu untersuchende Polypeptid von der Säule adsorbiert worden ist, kann festgestellt werden, dass das zu untersuchende Polypeptid die Galectinaktivität aufweist. Umgekehrt, wenn das zu untersuchende Polypeptid nicht von der Säule adsorbiert worden ist, kann festgestellt werden, dass das zu untersuchende Polypeptid keine Galectinaktivität aufweist.
- Das "Polypeptid, das die Aminosäuresequenz mit der SEQ ID Nr. 2 umfasst und die Galectinaktivität aufweist" als das erfindungsgemäße Polypeptid umfasst beispielsweise ein Fusionspolypeptid, das aus einer Aminosäuresequenz besteht, welcher eine geeignete Markersequenz oder dergleichen an den N-Terminus und/oder den C-Terminus der Aminosäuresequenz mit der SEQ ID Nr. 2 hinzugefügt worden ist, und welches die Galectinaktivität aufweist, oder ein Fusionspolypeptid aus dem Polypeptid, das aus der Aminosäuresequenz mit der SEQ ID Nr. 2 besteht, und einem Partner für die Fusion, das die Galectinaktivität aufweist.
- Als Markersequenz kann beispielsweise eine Sequenz für die leichte Durchführung des Nachweises der Expression des Polypeptids, des Nachweises der intrazellulären Lokalisation davon, einer Reinigung davon oder dergleichen verwendet werden. Als Sequenz sind beispielsweise ein FLAG-tag, ein Hexahistidintag, ein Hämagglutinin-tag, ein Myc-Epitop oder dergleichen zu nennen.
- Als Partner für die Fusion sind beispielsweise ein Polypeptid für die Reinigung [beispielsweise Glutathion-S-Transferase (GST) oder ein Fragment davon], ein Polypeptid für den Nachweis [beispielsweise Hämagglutinin oder β-Galactosidase-α-Peptid (LacZ-α) oder ein Fragment davon], ein Polypeptid für die Expression (beispielsweise eine Signalsequenz) oder dergleichen zu nennen.
- In dieses Fusionspolypeptid kann eine Aminosäuresequenz, die mit einer Protease wie Thrombin oder Faktor Xa spezifisch verdaut werden kann, wahlweise zwischen dem Polypeptid, das aus der Aminosäuresequenz mit der SEQ ID Nr. 2 besteht, und der Markersequenz oder dem Partner für die Fusion insertiert werden.
- Die erfindungsgemäße funktional äquivalente Variante ist nicht besonders beschränkt, solange sie ein Polypeptid ist, das eine Aminosäuresequenz umfasst, in welcher 1 bis 10, vorzugsweise 1 bis 7, und am meisten bevorzugt 1 bis 5 Aminosäuren insgesamt (beispielsweise insgesamt eine bis einige Aminosäuren) an einer oder mehreren Stellen in der Aminosäuresequenz mit der SEQ ID Nr. 2 deletiert, substituiert und/oder insertiert sind, und welche die Galectinaktivität aufweist. Außerdem ist der Ursprung der funktional äquivalenten Variante nicht auf Ornithodoros moubata beschränkt.
- Die erfindungsgemäße funktional äquivalente Variante umfasst nicht nur Ornithodoros-moubata-Varianten des Polypeptids, das aus der Aminosäuresequenz mit der SEQ ID Nr. 2 besteht, sondern auch funktional äquivalente Varianten, die von anderen Organismen als Ornithodoros moubata [beispielsweise Argasidae (Lederzecken), die keine Ornithodoros moubata sind, oder Ixodidae (Schildzecken)] abgeleitet sind. Weiterhin umfasst sie Polypeptide, die unter Verwendung von Polynucleotiden hergestellt worden sind, die durch künstliche Modifizierung ihrer Aminosäuresequenzen, für welche durch gentechnische Methoden codiert wurde, auf der Basis von Polynucleotiden, die für diese nativen Polypeptide (das heißt Ornithodoros-moubata-Varianten oder funktional äquivalente Varianten, die von anderen Organismen als Ornithodoros moubata abgeleitet worden sind) codieren, oder auf der Basis von Polynucleotiden, die für die Aminosäuresequenz mit der SEQ ID Nr. 2 codieren, erhalten wurden. Dabei bedeutet die hier benutzte Bezeichnung "Variante" einen individuellen Unterschied zwischen denselben Polypeptiden in derselben Spezies oder einen Unterschied zwischen homologen Polypeptiden in verschiedenen Spezies.
- Ornithodoros-moubata-Varianten des Polypeptids bestehen aus der Aminosäuresequenz mit der SEQ ID Nr. 2 oder funktionaläquivalenten Varianten, die von anderen Organismen als Ornithodoros moubata abgeleitet sind, können vom Fachmann entsprechend den Informationen der Basensequenz (beispielsweise der Basensequenz von der 24. bis zur 1025. Base in der Basensequenz mit der SEQ ID Nr. 1) eines Polynucleotids, das für das Polypeptid codiert, das aus der Aminosäuresequenz mit der SEQ ID Nr. 2 besteht, erhalten werden. In diesem Zusammenhang können gentechnischen Verfahren im Allgemeinen entsprechend den bekannten Methoden (beispielsweise Sambrook et al., "Molecular Cloning, A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) durchgeführt werden, sofern nichts anderes festgestellt.
- So wird (werden) beispielsweise (eine) geeignete Sonde oder Primer entsprechend den Informationen der Basensquenz eines Polynucleotids, das für das Polypeptid codiert, das aus der Aminosäuresequenz mit der SEQ ID Nr. 2 besteht, entworfen. Es wird eine Polymerasekettenreaktion (PCR) (Saiki, R.K. et al., Science, 239, 487–491 [1988]) oder ein Hybridisierungsverfahren unter Verwendung einer Probe (beispielsweise gesamte RNA oder eine mRNA-Fraktion, eine cDNA-Bibliothek oder eine Phagen-Bibliothek), die von einem interessierenden Organismus [beispielsweise Argasidae (Lederzecken), die keine Ornithodoros moubata sind, oder Ixodidae (Schildzecken) abgeleitet ist, und der Primer oder der Sonde durchgeführt, um ein für das Polypeptid codierendes Polynucleotid zu erhalten. Das gewünschte Polypeptid kann durch Expression des resultierenden Polynucleotids in einem geeigneten Expressionssystem und Nachweis, dass das exprimierte Polypeptid die Galectinaktivität aufweist, beispielsweise durch das in Beispiel 6 beschriebene Verfahren erhalten werden.
- Weiterhin kann das durch gentechnische Methoden künstlich modifizierte Polypeptid beispielsweise durch folgendes Verfahren erhalten werden. Ein für das Polypeptid codierendes Gen wird durch ein herkömmliches Verfahren wie die locusspezifische gerichtete Mutagenese (Mark, D.F, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 5662–5666 [1984]) erhalten. Das gewünschte Polypeptid kann durch Expression des resultierenden Polynucleotids in einem geeigneten Expressionssystem und Nachweis, dass das exprimierte Polypeptid die Galectinaktivität aufweist, beispielsweise durch das in Beispiel 6 beschriebene Verfahren, erhalten werden.
- Das erfindungsgemäße homologe Polypeptid ist nicht besonders beschränkt, solange es ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz, die 60 % oder mehr Homologie mit der Aminosäuresequenz mit der SEQ ID Nr. 2 besitzt, ist und die Galectinaktivität aufweist. Das erfindungsgemäße homologe Polypeptid kann eine Aminosäuresequenz mit einer Homologie von vorzugsweise 70 % oder mehr, besonders bevorzugt 80 % oder mehr, besonders bevorzugt 90 % oder mehr, noch bevorzugter 95 % oder mehr, und am meisten bevorzugt 98 % oder mehr, bezogen auf die Aminosäuresequenz mit der SEQ ID Nr. 2, besitzen. Dabei bedeutet die hier benutzte Bezeichnung "Homologie" einen Wert, der mit einem Clustal-Programm (Higgins und Sharp, Gene, 73, 237–244 [1988]) und Thompson et al., Nucleic Acid Res., 22, 4673–4680 [1994]) entsprechend einem voreingestellten Parameter erhalten wird.
- Das zuvor beschriebene erfindungsgemäße neue Polypeptid kann durch verschiedene bekannte Verfahren hergestellt werden, beispielsweise durch bekannte gentechnische Verfahren unter Verwendung des erfindungsgemäßen Polynucleotids, welches für das erfindungsgemäße Polypeptid codiert. Insbesondere kann das erfindungsgemäße Polypeptid durch Kultivierung des weiter unten beschriebenen erfindungsgemäßen nicht-humanen Transformanten (das heißt des nicht-humanen Transformanten, der das erfindungsgemäße Polynucleotid umfasst) unter Bedingungen, unter welchen das erfindungsgemäße neue Polypeptid exprimiert werden kann, und anschließendes Abtrennen und Aufreinigen des gewünschten Polypeptids aus der erhaltenen Kultur entsprechend einem herkömmlichen Verfahren für das Abtrennen und Aufreinigen eines Polypeptids hergestellt werden. Als Abtrennungs- und Aufreinigungsverfahren sind beispielsweise Aussalzen mit Ammoniumsulfat, Ionenaustauschsäulenchromatographie unter Verwendung von Ionenaustauschcellulose, Molekularsiebsäulenchromatographie unter Verwendung eines Molekularsiebgels, Affinitätssäulenchromatographie unter Verwendung einer Protein-A-Agarose, Dialyse, Gefriertrocknung oder dergleichen zu nennen.
- Die Erfindung umfasst ein Fragment des erfindungsgemäßen Polypeptids. Das erfindungsgemäße Fragment ist als Wirkstoff für das erfindungsgemäße Arzneimittel oder als Antigen zur Herstellung des erfindungsgemäßen Antikörpers nützlich.
- [2] Erfindungsgemäßes Polynucleotid
- Das erfindungsgemäße Polynucleotid ist nicht besonders beschränkt, solange es für das erfindungsgemäße Polypeptid codiert. Als erfindungsgemäßes Polynucleotid ist beispielsweise das Polynucleotid, das aus der 24. bis 1025. Base in der Basensequenz mit der SEQ ID Nr. 1 besteht, zu nennen. In diesem Zusammenhang umfasst die hier benutzte Bezeichnung "Polynucleotid" sowohl DNA als auch RNA.
- Die Erfindung umfasst ein Polynucleotid, das eine Basensequenz umfasst, die mit dem erfindungsgemäßen Polynucleotid hybridisieren kann, vorzugsweise ein Polynucleotid, das aus einer Basensequenz besteht, die mit dem erfindungsgemäßen Polynucleotid hybridisieren kann. Die Basensequenz, die in der Lage ist, mit dem erfindungsgemäßen Polynucleotid zu hybridisieren, ist vorzugsweise eine Basensequenz, die komplementär zu der Basensequenz (oder einer Teilsequenz davon) des erfindungsgemäßen Polynucleotids ist, und besonders bevorzugt eine Basensequenz, die komplementär zu der Basensequenz (oder einer Teilsequenz davon) ist, die aus der 24. bis 1025. Base in der Basensequenz der SEQ ID Nr. 1 besteht.
- [3] Erfindungsgemäßer Vektor und nicht-humaner Transformant
- Der erfindungsgemäße Vektor ist nicht besonders beschränkt, solange er das erfindungsgemäße Polynucleotid enthält. Als Vektor ist beispielsweise ein Vektor zu nennen, der durch Einführen des erfindungsgemäßen Polynucleotids in einen bekannten Expressionsvektor erhalten wird, der entsprechend der zu verwendenden Wirtszelle auf geeignete Weise ausgewählt worden ist.
- Der erfindungsgemäße nicht-humane Transformant ist nicht besonders beschränkt, solange er das erfindungsgemäße Polynucleotid umfasst. Der erfindungsgemäße nicht-humane Transformant kann beispielsweise eine Zelle, in welcher das Polynucleotid in ein Chromosom der Wirtszelle integriert ist, oder ein nicht-humaner Transformant, der das Polynucleotid als einen das Polynucleotid umfassenden Vektor enthält, sein. Weiterhin kann der erfindungsgemäße nicht-humane Transformant ein nicht-humaner Transformant, der das erfindungsgemäße Polypeptid exprimiert, oder ein nicht-humaner Transformant, der das erfindungsgemäße Polypeptid nicht exprimiert, sein. Der erfindungsgemäße nicht-humane Transformant kann per se beispielsweise durch Transfektion einer gewünschten Wirtszelle mit dem erfindungsgemäßen Vektor oder dem erfindungsgemäßen Polynucleotid erhalten werden.
- Die Wirtszelle kann beispielsweise ein bekannter üblicherweise verwendeter Mikroorganismus, beispielsweise Escherichia coli oder Hefe (Saccharomyces cerevisiae), oder eine bekannte kultivierte Zelle wie eine Tierzelle, beispielsweise eine CHO-Zelle, eine HEK-293-Zelle oder eine COS-Zelle, oder eine Insektenzelle wie eine BmN4-Zelle sein.
- Der bekannte Expressionsvektor kann beispielsweise pUC, pTv, pGEX, pKK oder pTrcHis für Escherichia coli, pEMBLY oder pYES2 für Hefe, pcDNA3 oder pMAMneo für die CHO-Zelle, pcDNA3 für die HEK-293-Zelle, pcDNA3 für die COS-Zelle und ein Vektor (wie pBK283), der einen Polyhedrinpromotor für den Seidenraupen-Nukleopolyheterovirus (BmNPV) enthält, für die BmN4-Zelle sein. Weiterhin umfasst der Expressionsvektor einen Virusvektor, der als Vektor für eine Gentherapie verwendet werden kann, wie ein Retrovirus, Adenovirus oder Sendaivirus.
- [4] Erfindungsgemäßes Arzneimittel
- Das erfindungsgemäße Arzneimittel (vorzugsweise ein Milbenimpfstoff) umfasst als Wirkstoff das erfindungsgemäße Polypeptid oder ein Fragment davon, das erfindungsgemäße Polynucleotid oder den erfindungsgemäßen Vektor. Erfindungsgemäß kann das erfindungsgemäße Polypeptid oder ein Fragment davon, das erfindungsgemäße Polynucleotid oder der erfindungsgemäße Vektor oral oder parenteral allein oder vorzugsweise zusammen mit einem pharmazeutisch bzw. veterinärmedizinisch verträglichen Träger oder Verdünnungsmittel einem Tier (vorzugsweise einem Säugetier, insbesondere einem Menschen) zur Vernichtung von Milben verabreicht werden.
- Wenn der Wirkstoff in dem erfindungsgemäßen Arzneimittel (das heißt das erfindungsgemäße Polypeptid oder ein Fragment davon, das erfindungsgemäße Polynucleotid oder der erfindungsgemäße Vektor) einem Tier als Milbenimpfstoff verabreicht wird, kann eine Antikörperproduktion ausgelöst werden, wonach die Milben durch Entwicklung einer schützenden Immunität vor erneuter Infektion im Wirtstier vernichtet werden können. Weiterhin ist es als Ergebnis möglich, von Milben verursachte Infektionen wie Rickettsiosen, Filariosen, Q-Fieber, Afrikanisches Rückfallfieber oder virale Enzephalitis zu behandeln oder zu verhüten.
- Anders ausgedrückt umfasst die erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung (vorzugsweise pharmazeutische Zusammensetzung zur Vernichtung von Milben oder pharmazeutische Zusammensetzung zur Behandlung oder Verhütung einer von Milben verursachten Infektion) das erfindungsgemäße Polypeptid oder ein Fragment davon, das erfindungsgemäße Polynucleotid oder den erfindungsgemäßen Vektor als Wirkstoff und einen pharmazeutisch bzw. veterinärmedizinisch verträglichen Träger oder ein pharmazeutisch bzw. veterinärmedizinisch verträgliches Verdünnungsmittel. Der erfindungsgemäße Wirkstoff (das heißt das erfindungsgemäße Polypeptid oder ein Fragment davon, das erfindungsgemäße Polynucleotid oder der erfindungsgemäße Vektor) kann zur Herstellung dieses Arzneimittels (vorzugsweise Arzneimittel zur Vernichtung von Milben oder Arzneimittel zur Behandlung oder Verhütung einer von Milben verursachten Infektion) verwendet werden.
- Wird das erfindungsgemäße Arzneimittel als Impfstoff gegen Milben verwendet, ist das erfindungsgemäße Polypeptidfragment nicht besonders beschränkt, solange das Fragment, das einem Lebewesen verabreicht worden ist, Immunität gegen sie auslösen kann. Das Fragment kann vom Fachmann auf geeignete Art und Weise ausgewählt werden.
- Das erfindungsgemäße Arzneimittel (insbesondere der Impfstoff gegen Milben) kann beispielsweise durch Mischen des erfindungsgemäßen Polypeptids mit einem Adjuvans oder dergleichen und Impfen eines Tiers (beispielsweise eines Nutztiers) mit dem erhaltenen Gemisch in geeigneten Abständen als ein Impfstoff gegen Milben verwendet werden. Weiterhin kann es durch Lösen oder Suspendieren des erfindungsgemäßen Polypeptids direkt in einem geeigneten Lösungsmittel oder durch Umkapseln in Liposomen oder Integrieren einer für es codierenden DNA in einem geeigneten Vektor verwendet werden. Außerdem kann es in einer geeigneten Formulierung wie Injektion, Tabletten, Kapseln, Augentropfen, Cremes, Zäpfchen, Sprays, Umschläge oder dergleichen, wahlweise mit Zugabe eines pharmazeutisch verträglichen Trägers zu dem erfindungsgemäßen Polypeptid, verwendet werden.
- Als pharmazeutisch geeignete Träger können bekannte Lösungsmittel, Basen, Stabilisierungsmittel, antiseptische Mittel, Solubilisierungsmittel, Füllstoffe, Puffer und dergleichen verwendet werden. Wenn das erfindungsgemäße Polypeptid, das in dem erfindungsgemäßen Arzneimittel enthalten ist, in dieser Formulierung verwendet wird, können Verabreichungsverfahren und -dosis entsprechend beispielsweise dem Alter oder dem Geschlecht des Lebewesens oder der Art bzw. Schwere der Erkrankung festgelegt werden.
- Die orale Verabreichung umfasst eine Verabreichung unter der Zunge. Als parenterale Verabreichung kann beispielsweise Inhalieren, eine perkutane, ophthalmische, vaginale, intraartikuläre, rektale, intraarterielle, intravenöse, lokale, intramuskuläre, subkutane und intraperitoneale Verabreichung oder dergleichen gewählt werden.
- Es ist bekannt, dass Galectin in einem entzündeten oder einem Tumorgewebe überexprimiert wird, an der Apoptose von T-Zellen oder B-Zellen beteiligt ist und eine bedeutende Rolle bei der Selbsterkennung spielt [H. Leffler, Trends in Glycoscience and Glycotechnology, 6, 9–19 (1997)]. Deshalb ist das erfindungsgemäße Polypeptid, das erfindungsgemäße Polynucleotid, der erfindungsgemäße Vektor, der erfindungsgemäße Antikörper oder ein Fragment davon oder eine Substanz, die in der Lage ist, die Galectinaktivität zu modifizieren (beispielsweise zu unterdrücken oder zu verstärken), die durch das erfindungsgemäße Screeningverfahren erhalten werden kann, als Wirkstoff für ein immunsuppressives Mittel bei einer Autoimmunerkrankung, als entzündungshemmendes Mittel, Metastasen bekämpfendes Mittel oder Mittel zur Auslösung oder Unterdrückung der Apoptose nützlich.
- Die Erfindung umfasst ein immunsuppressives Mittel gegen Autoimmunerkrankungen, ein entzündungshemmendes Mittel, ein Metastasen bekämpfendes Mittel oder ein Mittel zum Auslösen oder Unterdrücken der Apoptose, das als Wirkstoff das erfindungsgemäße Polypeptid, das erfindungsgemäße Polynucleotid, den erfindungsgemäßen Vektor, den erfindungsgemäßen Antikörper oder ein Fragment davon oder eine Substanz, die in der Lage ist, die Galectinaktivität zu modifizieren (beispielsweise zu unterdrücken oder zu verstärken), die durch das erfindungsgemäße Screeningverfahren erhalten werden kann, umfasst.
- [5] Erfindungsgemäßer Antikörper und Fragment davon
- Ein Antikörper wie ein polyklonaler Antikörper oder ein monoklonaler Antikörper, der mit dem erfindungsgemäßen Polypeptid reagiert, kann durch direkte Verabreichung des erfindungsgemäßen Polypeptids oder eines Fragments davon an verschiedene Tiere erhalten werden. Alternativ kann er durch ein DNA-Impfverfahren (Raz, E. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, 9519–9523 [1994] oder Donnelly, J.J. et al., J. Infect. Dis., 173, 314–320 [1996]) unter Verwendung eines Plasmids, in welches ein für das erfindungsgemäße Polypeptid codierendes Polynucleotid insertiert worden ist, erhalten werden.
- Der polyklonale Antikörper kann aus einem Serum oder Ei eines Tiers wie eines Kaninchens, einer Ratte, einer Ziege oder eines Huhns hergestellt werden, wobei das Tier durch das erfindungsgemäße Polypeptid oder ein Fragment davon, das in einem geeigneten Adjuvans (beispielsweise Freundsches komplettes Adjuvans) emulgiert worden ist, durch intraperitoneale, subkutane oder intravenöse Verabreichung immunisiert und sensibilisiert worden ist. Der polyklonale Antikörper kann aus dem resultierenden Serum oder Ei durch herkömmliche Verfahren zur Polypeptidisolation und – aufreinigung abgetrennt und aufgereinigt werden. Beispiele für Abtrennungs- und Reinigungsverfahren umfassen beispielsweise Zentrifugenabtrennung, Dialyse, Aussalzen mit Ammoniumsulfat oder ein Chromatographieverfahren unter Verwendung von DEAE-Cellulose, Hydroxyapatit, Protein-A-Agarose und dergleichen.
- Der monoklonale Antikörper kann leicht vom Fachmann entsprechend beispielsweise dem Zellfusionsverfahren von Kohler und Milstein (Kohler, G. und Milstein, C., Nature, 256, 495–497 [1995]) hergestellt werden.
- Eine Maus wird intraperitoneal, subkutan oder intravenös einige Male in Abständen von einigen Wochen durch wiederholtes Impfen einer Emulsion, in welcher das erfindungsgemäße Polypeptid oder ein Fragment davon in einem geeigneten Adjuvans wie Freundschem komplettem Adjuvans emulgiert ist, immunisiert. Nach der letzten Immunisierung werden Milzzellen entnommen und mit Myelomzellen fusioniert, um Hybridome herzustellen.
- Als Myelomzelle zur Herstellung eines Hybridoms kann eine Myelomzelle mit einem Marker wie einem Defizit an Hypoxanthin-Guaninphosphoribosyltransferase oder Thymidinkinase (beispielsweise Mausmyelomzelllinie P3X63Ag8.U1) verwendet werden. Als Fusionsmittel kann Polyethylenglykol verwendet werden. Als Medium zur Herstellung von Hybridomen kann beispielsweise ein üblicherweise verwendetes Medium wie das Zellzüchtungsmedium nach Eagle (Eagle's minimum essential medium), Dulbecco's Modified Minimum Essential Medium oder RPMI-1640-Medium mit geeignetem Zusatz von 10 bis 30 % eines Rinderfötusserums verwendet werden. Die fusionierten Stämme können durch ein HAT-Selektionsverfahren ausgewählt werden. Der Kulturüberstand der Hybridome wird durch ein bekanntes Verfahren wie einen ELISA oder ein immunhistologisches Verfahren durchmustert, um die Hybridomklone zu finden, die den interessierenden Antikörper ausscheiden. Die Monoklonalität des ausgewählten Hybridoms wird durch wiederholtes Subklonieren mit einem begrenzenden Verdünnungsverfahren gewährleistet. Antikörper in einer Menge, die aufgereinigt werden kann, werden durch Kultivieren der resultierenden Hybridome in einem Medium 2 bis 4 Tage lang oder in der Bauchhöhle einer mit Pristan vorbehandelten Maus des BALB/c-Stammes 10 bis 20 Tage lang produziert.
- Die resultierenden monoklonalen Antikörper in dem Kulturüberstand oder Aszites können durch herkömmliche Polypeptidisolations- und -reinigungsverfahren abgetrennt und aufgereinigt werden. Beispiele für Trennungs- und Reinigungsverfahren umfassen beispielsweise Zentrifugenabtrennung, Dialyse, Aussalzen mit Ammoniumsulfat oder ein Chromatographieverfahren unter Verwendung von DEAE-Cellulose, Hydroxyapatit, Protein-A-Agarose und dergleichen.
- Weiterhin können die monoklonalen Antikörper oder die einen Teil davon enthaltenden Antikörperfragmente durch Insertieren des Ganzen oder eines Teils eines Gens, das für den monoklonalen Antikörper codiert, in einen Expressionsvektor und Einführen des resultierenden Expressionsvektors in geeignete Wirtszellen (wie E. coli, Hefe oder Tierzellen) produziert werden.
- Antikörperfragmente, die einen aktiven Teil des Antikörpers enthalten, wie F(ab')2, Fab, Fab' oder Fv, können durch ein herkömmliches Verfahren, beispielsweise Verdauen der abgetrennten und aufgereinigten Antikörper (einschließlich polyklonaler und monoklonaler Antikörper) mit einer Protease wie Pepsin, Papain und dergleichen und Abtrennen und Aufreinigen der resultierenden Fragmente durch Standardpolypeptidisolations- und -Reinigungsverfahren, erhalten werden.
- Weiterhin kann ein Antikörper, der mit dem erfindungsgemäßen Polypeptid reagiert, in Form eines einsträngigen Fv oder Fab entsprechend dem Verfahren von Clackson et al. oder dem Verfahren von Zebedee et al. (Clackson, T. et al., Nature, 352, 624–628 [1991] oder Zebedee, S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
- USA, 89, 3175–3179 [1992]) erhalten werden. Außerdem kann ein humanisierter Antikörper durch Immunisieren einer transgenen Maus erhalten werden, in welcher Mausantikörpergene durch humane Antikörpergene ersetzt worden sind (Lonberg, N. et al., Nature, 368, 856–859 [1994]).
- [6] Erfindungsgemäßes Screeningverfahren
- Es ist möglich, ob eine zu untersuchende Substanz die Galectinaktivität des erfindungsgemäßen Polypeptids modifiziert (beispielsweise unterdrückt oder verstärkt), unter Verwendung des erfindungsgemäßen Polypeptids zu bestimmen.
- Zu untersuchende Substanzen, auf welche das erfindungsgemäße Screeningverfahren angewendet werden kann, sind nicht besonders beschränkt, wobei beispielsweise verschiedene bekannte Verbindungen (einschließlich Peptiden), die in chemischen Dateien registriert sind, Verbindungen, die durch kombinatorische chemische Verfahren erhalten werden (Terrett, N.K. et al., Tetrahedron, 51, 8135–8137 [195]), Zufallspeptide, die durch Anwendung eines Phagenanzeigeverfahrens hergestellt werden (Felici, F. et al., J. Mol. Biol., 222, 301–310 [1991]), oder dergleichen genannt werden können. Außerdem können Kulturüberstände von Mikroorganismen, von Pflanzen oder marinen Organismen abgeleitete natürliche Komponenten oder Tiergewebeextrakte als Testsubstanzen für das Screening verwendet werden. Weiterhin können Verbindungen (einschließlich Peptiden), die durch chemisches oder biologisches Modifizieren von Verbindungen (einschließlich Peptiden) erhalten worden sind, die durch das erfindungsgemäße Screeningverfahren ausgewählt worden sind, verwendet werden.
- Das erfindungsgemäße Screeningverfahren kann durch ein Verfahren, das ähnlich dem weiter oben beschriebenen Verfahren zum Nachweis der Galectinaktivität ist, durchgeführt werden, außer dass anstelle des In-Berührung-Bringens des Testpolypeptids mit der Galactose oder einem Derivat davon das erfindungsgemäße Polypeptid, die Galactose oder ein Derivat davon mit der Testsubstanz in Berührung gebracht werden.
- Durch das erfindungsgemäße Screeningverfahren wird nachgewiesen, ob von der Testsubstanz die Galectinaktivität des erfindungsgemäßen Polypeptids modifiziert wird, indem das erfindungsgemäße Polypeptid, die Galactose oder ein Derivat davon mit der Testsubstanz in Berührung gebracht und anschließend, ob das erfindungsgemäße Polypeptid an die Galactose oder ein Derivat davon in Gegenwart der Testsubstanz bindet (oder der Bindungsgrad) bestimmt wird. Wenn das erfindungsgemäße Polypeptid nicht an die Galactose oder ein Derivat davon bindet oder der Bindungsgrad gesenkt wird, ist es möglich nachzuweisen, dass die Testsubstanz die Galectinaktivität des erfindungsgemäßen Polypeptids unterdrückt. Alternativ ist es möglich, wenn der Grad der Bindung zwischen dem erfindungsgemäßen Polypeptid und der Galactose oder einem Derivat davon sich erhöht, nachzuweisen, dass die Galectinaktivität des erfindungsgemäßen Polypeptids von der Testsubstanz verstärkt wird.
- BEISPIELE
- Die Erfindung wird anschließend anhand von Beispielen näher erläutert, ist aber keinesfalls auf diese beschränkt. Die in den folgenden Beispielen beschriebenen Prozeduren wurden entsprechend verschiedenen Verfahren durchgeführt, die üblicherweise in der Molekularbiologie, Akarologie, Arthropodologie, Immunologie oder Biochemie angewendet werden und beispielsweise in Sambrook et al., "Molecular Cloning, A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, oder ähnlichen Büchern beschrieben sind. Als Software für die DNA-Analyse wurde MacVectorTM (Oxford Molecular) angewendet.
- Beispiel 1: Herstellung von Hybridomen, die monoklonale Anti-Milbenhämolymphe-Antikörper produzieren
- Hämolymphe wurde von Ornithodoros-moubata-Nymphen im 4. Stadium nach 6 Tagen aus dem Verdauungsinhalt gewonnen und das Homogenat davon mit Ultraschall bestrahlt, um eine Hämolymphelösung zu erhalten. Nachdem 200 µl der Hämolymphelösung (100 µg als Proteinanteil) mit 200 µl komplettem Freund'schem Adjuvans (Adjuvant Complete Freund, Difco) vermischt worden waren, wurde eine 7 Wochen alte weibliche BALB/c-Maus intraperitoneal mit dem Gemisch geimpft. Nach 14, 21, 28, 42 und 56 Tagen nach dem intraperitonealen Impfen wurden 200 µl der Hämolymphelösung (100 µg als Proteinanteil) mit unvollständigem Freundschem Adjuvans (Adjuvant Incomplete Freund, Difco) vermischt und wurde jeweils eine beschleunigte Impfung durchgeführt. Nach 74 Tagen nach der intraperitonealen Impfung wurde die letzte Impfung mit 200 µl der Hämolymphelösung (100 µg als Proteinanteil) von der Schwanzvene durchgeführt. Nach 3 Tagen wurde die Milz aus der Maus entnommen.
- Die erhaltenen Milzzellen und SP2/0-Ag14-Myelomzellen wurden unter Verwendung von Polyethylenglykol fusioniert. Die fusionierten Zellen wurden in einem GIT-Medium, das 5 % Rinderfötusserum (FBS)/5 % BriClone (Arch Port Ltd., Dublin, Irland)/HAT enthielt, bei 37 °C unter 5%-CO2-Bedingungen kultiviert. Unter Verwendung des Überstandes der jeweiligen Kultur wurden einen Antikörper produzierende Klone durch eine indirekte fluoreszierende Antikörper-(IFA-)Methode durchmustert, in welcher die Hämolymphe von Ornithodorosmoubata-Nymphen im 4. Stadium nach 6 Tagen aus dem Verdauungsinhalt als Antigen, 10 % Natriumdodecylsulfat-(SDS-)Polyacrylamidgelelektrophorese [Laemmli et al., Nature, 227, 680–685 (1970)] und ein Western-Blot unter Anwendung eines Immunoblotting [Towbin et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76, 4350–4354 (1979)] angewendet wurden. Das Screening und die begrenzende Verdünnung wurden wiederholt, bis ein einzelner Klon erhalten wurde, um Hybridomzellen zu erhalten, die einen monoklonalen Antikörper gegen die Hämolymphe von Ornithodorosmoubata-Nymphen im 4. Stadium nach 6 Tagen aus dem Verdauungsinhalt produzieren.
- Beispiel 2: Isolieren des Gens n4E12-2, das für ein neues Milbengalectin codiert
- Die gesamte RNA wurde aus Ornithodoros-moubata-Nymphen im 4. Stadium nach 6 Tagen aus dem Verdauungsinhalt durch ein Säureguanidinium-Phenol-Chloroform-Verfahren [Chomczynski et al., Anal. Biochem., 162, 156–159 (1987)] extrahiert. Aus der erhaltenen gesamten RNA wurde Poly-A+-RNA unter Verwendung eines mRNA-Isolations-Kits [Oligotex-dT30 (Super), Nummer W9021B, Takara] entsprechend der dem Kit beigelegten Vorschrift aufgereinigt.
- Die folgenden Vorgänge, das heißt die Konstruktion einer cDNA-Bibliothek, Immunoscreening und Insertion eines cDNA-Klons in ein Plasmid (in-vivo-Exzision), wurden unter Verwendung von kommerziell erhältlichen Reagenzkits (Stratagene) entsprechend den ihnen beigelegten Vorschriften durchgeführt.
- Insbesondere wurde cDNA unter Verwendung von 5 µg Ornithodorosmoubata-mRNA als Template und einem cDNA-Synthese-Kit (ZAP-cDNA Synthesis Kit, Katalognummer 200401-5, Stratagene) synthetisiert. Die erhaltene cDNA wurde durch Größenfraktionierung mit einer Sepharose-CL-2B-Gel-Säule fraktioniert, in einen Vektor (Uni-ZAP XR Vector, Katalognummer 237211, Stratagene) insertiert und unter Verwendung eines Verpackungsreagens (GigapackIII Gold packaging extract, Stratagene) verpackt. Escherichia coli (E. coli XL1-Blue MRF'-Stamm) wurde mit dem verpackten Produkt transfektiert, um eine Bibliothek zu erhalten, die etwa 500 000 cDNA-Klone enthielt.
- Es wurde ein Immunoscreening der cDNA-Bibliothek unter Verwendung des monoklonalen Antikörpers, der in Beispiel 1 erhalten worden war, gegen die Hämolymphe aus Ornithodorosmoubata-Nymphen im 4. Stadium nach 6 Tagen aus dem Verdauungsinhalt durchgeführt, um drei überlappende positive Klone zu erhalten. Diese Klone wurden in das Plasmid durch ein in-vivo-Exzisionsverfahren insertiert (das heißt in ein pBluescript konvertiert).
- Jedes ein cDNA-Fragment enthaltende Plasmid wurde unter Verwendung eines Plasmid-Reinigungs-Kits (Katalognummer 12125, Qiagen) aufgereinigt, anschließend wurde eine PCR unter Verwendung eines Sequenzierungskits (Dye Primer Cycle Sequencing Kit, Artikelnummer 4303153, Perkin Elmer) entsprechend der dem Kit beigelegten Vorschrift durchgeführt. Die erhaltenen PCR-Produkte wurden mit einem DNA-Sequenzer (ABI PRISM 3100 Genetic Analyzer, Perkin Elmer) analysiert, um die Basensequenz eines jeden cDNA-Fragments zu bestimmen.
- Als Ergebnis wurde festgestellt, dass alle drei Klone sich von einem einzigen Gen ableiteten. Der längste Klon wurde für die folgenden Analysen verwendet.
- Die Gesamtlänge der cDNA betrug 1094 bp, und deren Basensequenz war diejenige der SEQ ID Nr. 1. Es wurde nachgewiesen, dass die Basensequenz einen offenen Leserahmen enthält, der aus 1002 by besteht (Basensequenz, die aus der 24. bis 1025. Base in der Basensequenz der SEQ ID Nr. 1 besteht). Die Aminosäuresequenz eines Proteins, das von dem offenen Leserahmen abgeleitet worden war, war die Aminosäuresequenz mit der SEQ ID Nr. 2, die aus 333 Aminosäureresten besteht, und das abgeleitete Molekulargewicht betrug 36,6 kDa.
- Anschließend wird das Gen als das Gen n4E12-2 bezeichnet. Die Homologiesuche der Aminosäuresequenz, die sich von dem Gen n4E12-2 ableitet, wurde durch ein BLAST-Verfahren durchgeführt (Basic local alignment search tool, Altschul, S.F. et al., J. Mol. Biol., 215, 403–410 [1990], erhältlich von National Center for Biotechnology Information). Als Ergebnis wurde nachgewiesen, dass die Aminosäuresequenz eine hohe Homologie mit einem bekannten Galectinprotein hatte. So hatte sie beispielsweise eine Homologie von etwa 27 % mit dem Mausprostatakrebsantigengalectin.
- Anschließend wird das Protein, für welches das Gen n4E12-2 codiert, als "Galectin" bezeichnet. In diesem Zusammenhang wurde in den Beispielen 11 und 12 bestätigt, dass das Protein Galectin war.
- Beispiel 3: Konstruktion eines Vektors zum Exprimieren von Milbengalectinfusionsprotein
- Das in Beispiel 2 erhaltene pBluescript-Plasmid, in welches das cDNA-Fragment, das das Ornithodoros-moubata-n4E12-2-Gen enthielt, insertiert worden war, wurde mit den Restriktionsenzymen EcoRI und Xho2 verdaut. Das das Gen n4E12-2 enthaltende resultierende cDNA-Fragment wurde zwischen dem EcoRI-locus und dem XhoI-locus des Vektors pGEMEX-4T-3 (Promega) für die Expression in Escherichia coli insertiert, anschließend wurden die rekombinanten Klone, in welche das Galectin-ORF-Fragment in derselben Richtung wie derjenigen der Glutathion-S-Transferase (GST) in den Vektor insertiert worden war, ausgewählt. Das rekombinante Plasmid pGEMEX-4T-3/n4E12-2 wurde unter Verwendung eines Plasmidreinigungskits (Qiagen) aufgereinigt.
- Beispiel 4: Expression des rekombinanten Milbengalectinproteins in Escherichia coli
- Escherichia coli JM109 (DE3) (Promega) wurde mit dem in Beispiel 3 hergestellten rekombinanten Plasmid transformiert, anschließend wurden die Transformanten in einem Ampicillin enthaltenden LB-Medium bei 37 °C kultiviert. Nachdem OD600nm der Kultur 0,3 bis 0,5 geworden war, wurde Isopropylthiogalactosid (IPTG) derart zu der Kultur hinzugegeben, dass die Endkonzentration 0,01 mmol/l betrug, wonach die Transformanten weitere 4 Stunden lang kultiviert wurden.
- Die Expression des rekombinanten Milbengalectinproteins wurde durch Durchführung einer 10%-SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese [Laemmli et al., Nature, 227, 680–685 (1970)], anschließendes Immunoblotting [Towbin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76, 4350–4354 (1979)] und nachfolgendes Anfärben mit Amidoschwarz nachgewiesen.
- Als Ergebnis wurde die Expression des rekombinanten Proteins mit einem Molekulargewicht von etwa 63 kDa festgestellt und nachgewiesen, dass das rekombinante Protein ein Fusionsprotein aus einem GST-Leader-Protein (26 kDa) und dem Milbengalectinprotein (36,6 kDa) (siehe
1 ) war. - Beispiel 5: Aufreinigung des rekombinanten Milbengalectinproteins und Herstellung eines Antiserums
- Das rekombinante Galectinfusionsprotein, das in Escherichia coli durch das in Beispiel 4 beschriebene Verfahren exprimiert worden war, wurde entsprechend der Vorschrift aufgereinigt, die dem kommerziell erhältlichen Kit (Bulk GST Purification Module, Amersham Bioscience) beigelegt ist. Insbesondere wurde mit IPTG indizierte Escherichia coli durch Zentrifugieren gesammelt. Es wurde der erhaltene Zentrifugenrückstand in einem Lysozym enthaltenden TNE-Puffer mit Ultraschall bestrahlt und das Ganze bei 5000 U/min zentrifugiert, um den Zentrifugenrückstand zu erhalten. Der erhaltene Zentrifugenrückstand (unlösliche Fraktion) wurde mit Triton x-100 solubilisiert und anschließend das Ganze bei 5000 U/min zentrifugiert, um den Überstand zu erhalten. Der erhaltene Überstand wurde mit Glutathionharz vermischt und das Gemisch bei 5000 U/min zentrifugiert. Der erhaltene Zentrifugenrückstand wurde mit 16 mmol/l Glutathionlösung eluiert, um eine "lösliche Fraktion" zu reinigen.
- Das Ergebnis der Elektrophorese des aufgereinigten rekombinanten Galectinfusionsproteins ist in
1 gezeigt. In diesem Zusammenhang wurden Elektrophorese, Blotting und Anfärben auf eine Weise durchgeführt, die ähnlich der in Beispiel 4 beschriebenen war. In1 ist die Spur auf der linken Seite das Ergebnis von Molekulargewichtsmarkern, Spur 1 ist das Ergebnis der unlöslichen Fraktion und Spur 2 ist das Ergebnis der löslichen Fraktion. Die Zahl "63" auf der rechten Seite von Spur 2 bedeutet das Molekulargewicht (63 kDa) des rekombinanten Galectinfusionsproteins. - Durch Mischen von 50 µl einer Lösung, die 100 µg des aufgereinigten rekombinanten Galectinfusionsproteins enthielt, mit 50 µl komplettem Freund'schem Adjuvans (Adjuvant Complete Freund, Difco) wurde eine Emulsion hergestellt. Eine 6 Wochen alte weibliche BALB/c-Maus wurde intraperitoneal mit der Emulsion geimpft. Nach 2, 4, 6 und 8 Wochen nach der intraperitonealen Impfung wurden 100 µg des rekombinanten Galectinfusionsproteins mit 50 µl Titer Max (Gold, CytRx) vermischt und wurde jeweils eine beschleunigte Impfung durchgeführt. 2 Wochen nach der letzten Impfung wurde Blut entnommen und das erhaltene Serum bei –30 °C aufbewahrt.
- Beispiel 6: Identifizierung von natürlichem Galectin (Wildtypus) durch Immunoblotting unter Verwendung eines monoklonalen Anti-Milbenhämolymphe-Antikörpers
- In diesem Beispiel wurde das Galectinprotein vom Wildtypus durch Immunoblotting [Towbin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76, 4350–4354 (1979)] unter Verwendung des in Beispiel 1 erhaltenen monoklonalen Antikörpers gegen die Hämolymphe von Ornithodoros-moubata-Nymphen im 4. Stadium nach 6 Tagen aus dem Verdauungsinhalt identifiziert. Als Proben wurden die Hämolymphe von Ornithodoros-moubata-Nymphen im 4. Stadium nach 6 Tagen aus dem Verdauungsinhalt, die auf ähnliche Weise wie die in Beispiel 1 beschriebene hergestellt worden war, und das Lysat eines Milbenfettkörpers verwendet. Das Lysat wurde durch Zerschneiden von Milben in PBS (Phosphatpuffer), Homogenisieren der erhaltenen den Fettkörper enthaltenden Tracheen in PBS und Bestrahlen des Homogenats mit Ultraschall unter Eiskühlung hergestellt.
- Das Ergebnis ist in den Spuren 5 und 6 in
2 gezeigt. In diesem Zusammenhang zeigen die Spuren 1 bis 4 das in Beispiel 7 erhaltene Ergebnis. - In
2 ist Spur 5 das Ergebnis der Hämolymphe von Ornithodoros-moubata-Nymphen im 4. Stadium nach 6 Tagen aus dem Verdauungsinhalt und Spur 6 das Ergebnis des Fettkörperlysats. Die Zahlen "63" und "43" an der Seite von Spur 6 bedeuten das Molekulargewicht (63 kDa) des rekombinanten Galectinfusionsproteins bzw. das Molekulargewicht (43 kDa) des Galectinproteins vom Wildtypus. - Wie von den Spuren 5 und 6 in
2 gezeigt, wurde das spezifische Band mit 43 kDa in der Hämolymphe von Ornithodorosmoubata-Nymphen im 4. Stadium nach 6 Tagen aus dem Verdauungsinhalt und dem Fettkörperlysat detektiert. Der Grund dafür, warum das gemessene Molekulargewicht des Galectinproteins vom Wildtypus höher als das theoretische Molekulargewicht (36,6 kDa) war, scheint auf eine Differenz aus einer posttranslationalen Modifizierung zurückzuführen zu sein. - Beispiel 7: Nachweis der Reaktivität eines monoklonalen Anti-Milbenhämolymphe-Antikörpers gegenüber dem rekombinanten Galectinfusionsprotein
- In diesem Beispiel wurde die Reaktivität des in Beispiel 1 erhaltenen monoklonalen Antikörpers gegen die Hämolymphe von Ornithodoros-moubata-Nymphen im 4. Stadium nach 6 Tagen aus dem Verdauungsinhalt gegenüber dem rekombinanten Galectinfusionsprotein durch Immunoblotting untersucht. Als Proben wurden die lösliche und die unlösliche Fraktion, die von Escherichia coli abgeleitet waren, die mit dem Plasmid pGEMEX-4T-3/n4E12-2 transformiert worden war und das rekombinante Galectinfusionsprotein exprimierte (siehe Beispiel 5), und die lösliche und die unlösliche Fraktion, die von Escherichia coli abgeleitet waren, die mit dem Vektor pGEMEX-4T-3 transformiert worden war und das GST-Protein exprimierte, verwendet.
- Das Ergebnis ist in den Spuren 1 bis 4 in
2 gezeigt. - In
2 sind die Spuren 1 und 2 die Ergebnisse der löslichen bzw. unlöslichen Fraktion, die von Escherichia coli abgeleitet waren, die mit dem Vektor pGEMEX-4T-3 transformiert worden war und das GST-Protein exprimierte, und die Spuren 3 und 4 die Ergebnisse der löslichen bzw. unlöslichen Fraktion, die von Escherichia coli abgeleitet waren, die mit dem Plasmid pGEMEX-4T-3/n4E12-2 transformiert worden war und das rekombinante Galectinfusionsprotein exprimierte. - Wie in Spur 4 in
2 gezeigt, wurde nachgewiesen, dass das rekombinante Galectinfusionsprotein (etwa 63 kDa) mit dem monoklonalen Antikörper gegen die Hämolymphe von Ornithodorosmoubata-Nymphen im 4. Stadium nach 6 Tagen aus dem Verdauungsinhalt reagiert. Dem Ergebnis ist zu entnehmen, dass das rekombinante Galectinfusionsprotein einer der Kandidaten für einen Milbenimpfstoff ist. In diesem Zusammenhang reagierte das normale Mausserum nicht mit dem rekombinanten Galectinfusionsprotein. - Beispiel 8: Identifizierung von natürlichem Galectin (Wildtypus) durch Immunoblotting unter Verwendung eines antirekombinanten Galectinfusionsproteinmausserums
- In diesem Beispiel wurde das Galectinprotein vom Wildtypus durch Immunoblotting [Towbin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76, 4350–4354 (1979)] unter Verwendung des antirekombinanten Galectinfusionsproteinmausserums, das in Beispiel 5 erhalten worden war, identifiziert. Als Proben wurde die Hämolymphe von Ornithodoros-moubata-Nymphen im 4. Stadium nach 6 Tagen aus dem Verdauungsinhalt und das Fettkörperlysat, welche dieselben wie die in Beispiel 6 verwendeten waren, verwendet.
- Die Ergebnisse sind in den Spuren 2 und 3 in
3 gezeigt. Die Spuren 1 und 4 sind die in Beispiel 9 erhaltenen Ergebnisse. - In
3 ist Spur 2 das Ergebnis der Hämolymphe von Ornithodoros-moubata-Nymphen im 4. Stadium nach 6 Tagen aus dem Verdauungsinhalt und Spur 3 das Ergebnis des Fettkörperlysats. Die Zahlen "63" und "37" an der Seite von Spur 4 bedeuten das Molekulargewicht (63 kDa) des rekombinanten Galectinfusionsproteins bzw. das Molekulargewicht (37 kDa) des Galectinproteins vom Wildtypus. - Wie den Spuren 2 und 3 in
3 zu entnehmen, wurden zwei spezifische Banden mit 37 kDa und 43 kDa in der Hämolymphe von Ornithodoros-moubata-Nymphen im 4. Stadium nach 6 Tagen aus dem Verdauungsinhalt und in dem Fettkörperlysat detektiert. Die 37-kDa-Bande stimmt mit dem theoretischen Wert (36,6 kDa) für das Galectinprotein überein. In diesem Zusammenhang scheint der Grund dafür, warum die 43-kDa-Bande detektiert wurde, die 37-kDa-Bande in Beispiel 6 jedoch nicht detektiert wurde, auf die für die Elektrophorese verwendete kleine Probenmenge zurückzuführen zu sein. - Beispiel 9: Nachweis der Reaktivität des anti-rekombinanten Galectinfusionsproteinmausserums gegenüber dem rekombinanten Galectinfusionsprotein
- In diesem Beispiel wurde die Reaktivität des in Beispiel 5 erhaltenen anti-rekombinanten Galectinfusionsproteinmausserums gegenüber dem rekombinanten Galectinfusionsprotein durch Immunoblotting untersucht. Als Proben wurden das aufgereinigte rekombinante Galectinfusionsprotein, das von Escherichia coli abgeleitet war, die mit dem Plasmid pGEMEX-4T-3/n4E12-2 transformiert worden war und das rekombinante Galectinfusionsprotein exprimierte (siehe Beispiel 5) und die unlösliche Fraktion (vor der Reinigung), die von Escherichia coli abgeleitet war, die mit dem Vektor pGEMEX-4T-3 transformiert worden war und das GST-Protein exprimierte, verwendet.
- Die Ergebnisse sind in den Spuren 1 und 4 in
3 gezeigt. - In
3 ist Spur 1 das Ergebnis des aufgereinigten rekombinanten Galectinfusionsproteins und Spur 4 das Ergebnis des (unlöslichen) GST-Proteins vor der Aufreinigung. - Wie Spur 1 in
3 zu entnehmen, wurde nachgewiesen, dass das rekombinante Galectinfusionsprotein (etwa 63 kDa) mit dem anti-rekombinanten Galectinfusionsproteinmausserum reagierte. Den Ergebnissen ist zu entnehmen, dass das rekombinante Galectinfusionsprotein einer der Kandidaten für einen Milbenimpfstoff ist. In diesem Zusammenhang reagierte das normale Mausserum mit dem rekombinanten Galectinfusionsprotein nicht. - Beispiel 10: Nachweis der Antigenität des rekombinanten Galectinfusionsproteins gegen Maus
- In diesem Beispiel wurde untersucht, ob das in Beispiel 5 hergestellte rekombinante Galectinfusionsprotein in einer Maus eine Antikörperproduktion auslösen kann.
- Von 11 Mäusen, die mit dem rekombinanten Galectinfusionsprotein von Beispiel 5 immunisiert worden waren, wurden 11 Mausantiseren erhalten. Es wurde das jeweilige Mausantiserum mit einer Membran umgesetzt, auf welche zuvor das aufgereinigte rekombinante Galectinfusionsprotein transferiert worden war, und anschließend der an das Antigen gebundene Antikörper durch Western-Blot detektiert. In diesem Zusammenhang wurden zwei Mausantiseren, die aus zwei mit einem Adjuvans immunisierten Mäusen hergestellt worden waren, als Kontrolle verwendet.
- Als Ergebnis wurde ein Antikörper gegen das rekombinante Galectinfusionsprotein in allen Antiseren detektiert, die von Mäusen abgeleitet waren, die mit dem rekombinanten Galectinfusionsprotein immunisiert worden waren, während in den Kontrollmausantiseren kein Antikörper nachgewiesen wurde.
- Mit diesem Ergebnis wurde nachgewiesen, dass die Produktion eines Antikörpers gegen das rekombinante Galectinfusionsprotein durch Immunisieren einer Maus mit dem Fusionsprotein ausgelöst wurde und das rekombinante Galectinfusionsprotein als ein Antimilbenimpfstoff nützlich ist.
- Beispiel 11: Nachweis der Agglutininaktivität des rekombinanten Galectinfusionsproteins gegenüber Mauserythrocyten
- In diesem Beispiel wurde die Agglutinierung des rekombinanten Galectinfusionsproteins gegenüber Mauserythrocyten untersucht.
- Insbesondere wurde, nachdem die Mauserythrocyten mit PBS gewaschen worden waren, das aufgereinigte rekombinante Galectinfusionsprotein verdünnt und zu den Erythrocyten zugegeben, um deren effektive Konzentration zu bestimmen. Auf der Basis der bestimmten effektiven Konzentration wurde Lactose, die ein Galectininhibitor ist, derart zugegeben, dass die Endkonzentration 10 mmol/l betrug. Ferner wurde unter Verwendung des in Beispiel 5 hergestellten Anti-Galectinmausserums der Einfluss des Serums auf die Unterdrückung der Agglutinierung durch Galectin untersucht.
- Das Ergebnis ist in
4 gezeigt. In4 sind die Vertiefungen 1 bis 4 die Ergebnisse, nachdem 5 µg, 0,25 µg, 0,025 µg bzw. 0,0025 µg des rekombinanten Galectinfusionsproteins zugegeben worden waren, Vertiefung 5 ist das Ergebnis, das erhalten wurde, nachdem 0,25 µg des rekombinanten Galectinfusionsproteins und 10 mmol/l Lactose zugegeben worden waren, und Vertiefung 6 ist dar Ergebnis, das erhalten wurde, nachdem 0,25 µg des rekombinanten Galectinfusionsproteins und 10 µl des in Beispiel 5 hergestellten Anti-Galectinmausserums zugegeben worden waren. - Wie in
4 gezeigt, agglutinierte das rekombinante Galectinfusionsprotein die Mauserythrocyten dosisabhängig. Weiterhin wurde die Reaktion von dem in Beispiel 5 hergestellten anti-rekombinanten Galectinfusionsproteinmausserum oder von 10 mmol/l Lactose inhibiert. - Den Ergebnissen ist zu entnehmen, dass das rekombinante Galectinfusionsprotein eine Lectinaktivität besitzt.
- Beispiel 12: Nachweis der Galactosebindungsaktivität in rekombinantem Galectinfusionsprotein
- In diesem Beispiel wurde die Galactosebindungsaktivität in dem rekombinanten Galectinfusionsprotein durch ein diskontinuierliches Verfahren unter Verwendung von Lactosyl-Sepharose untersucht.
- Insbesondere wurden das aufgereinigte rekombinante Galectinfusionsprotein und Lactosyl-Sepharose in einem 1,5-ml-Mikroröhrchen vermischt und bei 5000 U/min zentrifugiert. Der erhaltene Zentrifugenrückstand wurde dreimal mit PBS-T gewaschen und mit 100 mmol/l Lactose eluiert.
- Das Ergebnis ist in
5 gezeigt. In5 ist Spur 1 das Ergebnis, das erhalten wurde, nachdem das rekombinante Galectinfusionsprotein vor dem Mischen mit Lactosyl-Sepharose (anschließend als vorzeitig verwendete Probe bezeichnet) einer Elektrophorese unterworfen wurde, Spur 2 ist das Ergebnis, das erhalten wurde, nachdem der Überstand, der durch Zentrifugieren des suspendierten Gemischs aus dem rekombinanten Galectinfusionsprotein und Lactosyl-Sepharose erhalten worden war, einer Elektrophorese unterworfen wurde, Spuren 3 bis 5 sind die Ergebnisse, nachdem die erste, zweite bzw. dritte Waschflüssigkeit einer Elektrophorese unterworfen wurde, und Spur 6 ist das Ergebnis, das mit dem Überstand nach Elution mit Lactose erhalten wurde. Die Zahl "63" an der Seite von Spur 6 bedeutet das Molekulargewicht (63 kDa) des rekombinanten Galectinfusionsproteins. - Wie in
5 gezeigt, wurde das Galectin mit Lactose (Spur 6) eluiert, wobei die Galectinmenge fast gleich derjenigen des in der vorzeitig verwendeten Probe (Spur 1) enthaltenen rekombinanten Galectinfusionsproteins war. Weiterhin besaß das rekombinante Galectinfusionsprotein die Eigenschaft der Bindung an Lactosyl-Sepharose und wurde mit 100 mmol/l Lactose eluiert. - Den Ergebnissen ist zu entnehmen, dass das rekombinante Galectinfusionsprotein eine Galactosebindungsaktivität besitzt.
- INDUSTRIELLE VERWENDBARKEIT
- Mit dem erfindungsgemäßen Polypeptid, Polynucleotid, Vektor, nicht-humanen Transformanten und Antikörper kann ein erfindungsgemäßes Arzneimittel, insbesondere ein Impfstoff gegen Milben, bereitgestellt werden.
- Weiterhin ist es mit dem erfindungsgemäßen Arzneimittel, insbesondere einem Impfstoff gegen Milben, möglich, beispielsweise Milben zu vernichten oder von diesen verursachte Infektionen wie Rickettsiosen, Filariosen, Q Fieber, Afrikanisches Rückfallfieber oder virale Enzephalitis zu behandeln oder zu verhüten.
- Obwohl die vorliegende Erfindung unter Bezugnahme auf spezielle Ausführungsformen beschrieben worden ist, sind für den Fachmann selbstverständlich verschiedene Veränderungen und Modifizierungen möglich, ohne den Umfang der Patentansprüche zu verlassen.
Claims (12)
- (1) Polypeptid, das aus der Aminosäuresequenz SEQ ID Nr. 2 besteht, (2) Polypeptid, das die Aminosäuresequenz SEQ ID Nr. 2 umfasst und eine Galectinaktivität aufweist, (3) Polypeptid, das eine Galectinaktivität aufweist und eine Aminosäuresequenz umfasst, in welcher eine bis zehn Aminosäuren an einer oder mehreren Positionen in der Aminosäuresequenz SEQ ID Nr. 2 substituiert, deletiert und/oder insertiert sind, oder (4) Polypeptid, das eine Aminosäuresequenz umfasst, die eine Homologie von 60 % oder mehr mit der Aminosäuresequenz SEQ ID Nr. 2 besitzt, und welches eine Galectinaktivität aufweist.
- Polynucleotid, das für das Polypeptid nach Anspruch 1 codiert.
- Vektor, der das Polynucleotid nach Anspruch 2 umfasst.
- Transformant, der das Polynucleotid nach Anspruch 2 umfasst und kein menschliches Wesen ist.
- Verfahren zur Herstellung des Polypeptids nach Anspruch 1, das die Stufe der Kultivierung des Transformanten nach Anspruch 4 umfasst.
- Arzneimittel, welches das Polypeptid nach Anspruch 1 oder ein Fragment davon, das eine Galectinaktivität aufweist, das Polynucleotid nach Anspruch 2 oder den Vektor nach Anspruch 3 umfasst.
- Arzneimittel nach Anspruch 6, das einen Träger oder ein Verdünnungsmittel umfasst, der/das pharmazeutisch bzw. veterinärmedizinisch verträglich ist.
- Arzneimittel nach Anspruch 6 oder 7, das ein Impfstoff gegen Milben ist.
- verwendung des Polypeptids nach Anspruch 1 oder eines Fragments davon, das eine Galectinaktivität aufweist, des Polynucleotids nach Anspruch 2 oder des Vektors nach Anspruch 3 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Vernichtung von Milben.
- Verwendung des Polypeptids nach Anspruch 1 oder eines Fragments davon, das eine Galectinaktivität aufweist, des Polynucleotids nach Anspruch 2 oder des Vektors nach Anspruch 3 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung oder Verhütung einer von Milben übertragenen Infektion.
- Antikörper oder ein Fragment davon, der/das an das Polypeptid nach Anspruch 1 bindet.
- Verfahren zum Screening einer Substanz, die in der Lage ist, eine Galectinaktivität des Polypeptids nach Anspruch 1 zu modifizieren, welches die Stufen: – In-Berührung-Bringen des Polypeptids mit der zu untersuchenden Substanz und – Analyse der Galectinaktivität des Polypeptids umfasst.
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