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Diese
Erfindung betrifft die Verwendung eines Peroxiredoxins (ein Thiol-spezifisches
Antioxidans) als ein protektives Antigen gegen Helminthen.
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Jede
Spezies von Haustier kann durch eine Anzahl von verschiedenen Helminthen-Spezies parasitiert werden,
ein Prozess der gewöhnlich
eine Krankheit auslöst.
Der parasitäre
Saugwurm Fasciola hepatica zum Beispiel ist dafür bekannt eine Ursache für die wirtschaftlich
bedeutsame Krankheit Fascioliasis bei Wiederkäuern, wie Rind und Schaf, zu
sein. Der Parasit dringt in den Säugetierwirt ein, indem er die
Darmwand durchdringt und verbringt nahezu sieben Wochen damit, sich
zu ernähren
und sich durch das Lebergewebe zu fressen, bevor er schließlich in
den Gallengang wandert. Nach der Infektion kann die Entwicklung
von Immunität im
Wirt schwach ausfallen und die Resistenz gegen Wiederinfektion bei
bereits infizierten Wirten tritt nur teilweise oder gar nicht auf.
Andere parasitäre
Egel schließen
Fasciola gigantica und Dicrocoelium spp., Paraphisomum spp und auch
Schistosoma spp., z.B. S.bovis und S.mansoni, ein.
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Probleme
werden auch durch Fadenwürmer
wie Hakenwürmer
(z.B. Necator, Ancylostoma, Uncinaria und Bunostomum spp.) verursacht.
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Von
den blutsaugenden Fadenwürmern
verursacht die Gattung Haemonchus Anaemie und Gewichtsverlust und
führt unbehandelt
häufig
zum Tod. Tiere, die mit dem verwandten nicht-blutsaugenden Fadenwurm Ostertagia
infiziert sind, hören
in ähnlicher
Weise auf zu wachsen und sterben ohne Behandlung.
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Andere
parasitäre
Würmer
von wirtschaftlicher Bedeutung schließen verschiedene Spezies von
folgenden Gattungen von Helminthen ein:
Trichostrongylus, Nematodirus,
Dictyocaulus, Cooperia, Ascaris, Dirofilaria, Trichuris und Strongylus.
Zustätzlich
zum Nutzvieh können
auch andere Tiere und Menschen infiziert werden, nicht selten mit
fatalen Folgen, und Helminthen-Infektionen und -Infestationen stellen
ein Problem mit beachtlicher, weltweiter Signifikanz dar.
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Die
Kontrolle von parasitären
Helminthen bei Weidevieh beruht derzeit vor allem auf der Verwendung von
Antihelminthen-Medikamenten, kombiniert mit Weidewirtschaft. Solche
Techniken sind oft unbefriedigend, erstens weil Antihelminthen-Medikamente
regelmäßig verabreicht
werden müssen,
zweitens weil Resistenz gegen Antihelminthen-Medikamente zunehmend
weit verbreitet ist und drittens weil angemessene Weidewirtschaft
auf manchen Höfen
nur selten möglich
ist und wo sie sogar möglich
ist, kann sie zu Einschränkungen bezüglich der
optimalen Nutzung des zu Verfügung
stehenden Weidelandes führen.
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Zahlreiche
Lösungsversuche
sind unternommen worden, um parasitäre Helminthen bei Haustieren durch
immunologische Mittel zu kontrollieren. Mit sehr wenigen Ausnahmen
(z.B. dem Rinderlungenwurm, Dictyocaulus viviparus) hat sich das
als nicht möglich
herausgestellt.
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Ein
Vakzin gegen F. hepatica wurde in der
WO90/08819 offenbart,
das eine Glutathion-S-Transferase als
antigenes Material umfasst. Weitere Vakzine gegen F. hepatica wurden
in der
WO94/09142 , der
WO94/28925 und der
WO96/10583 offenbart, die
ein Cathepsin L, eine Dipeptidyl-Peptitase beziehungsweise eine
Klasse von Hämoproteinen
von F. hepatica als antigenes Material umfassen.
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Bennett
(
UK-Patent Nr. 2169606B )
extrahierte verschiedene Antigene aus Fasciola-Organismen mittels eines Prozesses,
der Antigene mit Spezifität
für die
juvenile Phase von Antigenen trennt, die während der juvenilen und der
adulten Phase vorliegen. Außerdem
können
in vitro ungereinigte exkretorische/sekretorische (E/S) Produkte
unter manchen Umständen
zur Immunität
bei Ratten (Rajasekariah et al., Parasitol. 79 (1979), S. 393-400)
führen.
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Es
wurde nun herausgefunden, dass Tiere, die gegen F. hepatica unter
Verwendung eines relativ unreinen Hämoproteinpräparats, dessen gereinigtes
Pendant in der
WO96/10583 beschrieben
ist, geimpft wurden, Antikörper
gegen Peroxiredoxin-Moleküle
aus Egeln bilden. Diese Erfindung eröffnet die Möglichkeit von Vakzinen gegen
F. hepatica und andere Helminthen, basierend auf der Verwendung
von Peroxiredoxin-Molekülen
als Antigene.
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Dementsprechend
stellt die vorliegende Erfindung eine Vakzinzusammensetzung gemäß Anspruch
1 bereit.
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Außerdem betrifft
die Erfindung die Verwendung von Molekülen, wie in Anspruch 1 definiert,
bei der Herstellung einer Vakzinzusammensetzung zur Bekämpfung einer
parasitären
Infestation durch Helminthen bei Säugetieren.
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Das
Säugetier
ist bevorzugt ein Wiederkäuer,
wie zum Beispiel Rind oder Schaf, aber das Vakzin dieser Erfindung
kann ebenso bei Menschen, Begleittieren wie Hunde und Katzen, oder
bei anderen Haustieren Anwendung finden.
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Die
F. hepatica Peroxiredoxinmoleküle,
für die
hierin gezeigt wird, dass sie cDNA-Sequenzen und vorhergesagte Aminosäuresequenzen,
wie in 4 gezeigt, besitzen, sind besonders bevorzugt
bei der Verwendung in dem Vakzin dieser Erfindung.
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Die
Peroxiredoxin-Moleküle,
die in dem erfindungsgemäßen Vakzin
enthalten sind, liegen in zumindest teilweise gereinigter Form vor.
Vorzugsweise sind die erfindungsgemäßen Moleküle zumindest 75% rein, bevorzugter
zumindest 95% rein. Es wird angenommen, dass, wenn einmal Peroxiredoxin-Moleküle mit einer Reinheit
von mindestens 95% gewonnen wurden, sie mit einem oder mehreren
weiteren gereinigten antigenen Proteinen zusammengemischt werden
können,
um ein polyvalentes Vakzin zu erhalten.
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Eine
bevorzugte Form des polyvalenten Vakzins gemäß der Erfindung wird Peroxiredoxin-Polypeptide,
wie oben bezeichnet, enthalten, kombiniert mit einem Cathepsin L-Typ
Antigen, wie in der Internationalen Patentanmeldung Nr.
WO94/09142 näher beschrieben,
oder mit einem Dipeptidyl-Peptidase Antigen, wie in der Internationalen
Patentanmeldung Nr.
WO94/28925 näher beschrieben,
oder mit einer Gruppe von Hämoproteinmolekülen, wie
in der Internationalen Patentanmeldung Nr.
WO96/10583 näher beschrieben, oder einem β-Tubulin
Antigen, wie hierin beschrieben. Folglich sind Cathepsin L und/oder
die Depeptidyl Peptidase und/oder die Hämoproteine vorzugsweise aus
Egeln, wie Fasciola oder Dicrocoelium, insbesondere dem Leberegel
F. hepatica, abgeleitet. Solch ein polyvalentes Vakzin wird, durch
Induzieren von Immunität
im Wirt gegen zwei oder mehrere verschiedene Eigenschaften des eindringenden
parasitären
Helminthen, die Wahrscheinlichkeit eines Schutzes gegen Helminthen
deutlich steigern und Wahrscheinlichkeit einer auftretenden Infestation
deutlich senken.
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Monovalente
Vakzine können
erfindungsgemäß eine fruchtbarkeitshemmende
Wirkung auf parasitäre Helminthen
haben, und diese Wirkung sollte durch polyvalente Vakzine noch mehr
hervorgehoben werden.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
umfasst das erfindungsgemäße polyvalente
Vakzin Peroxiredoxin-Polypeptide zusammen mit einem Cathepsin Limit
einem Molekulargewicht von 27 kDa, bestimmt durch Natrium-Dodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese,
wie in der
WO 94/09142 offenbart,
und/oder einem Cathepsin L2 mit einem Molekulargewicht von 29,5
kDa gewonnen mit der gleichen Technik wie in der
WO 94/09142 offenbart, und/oder eine
Dipeptidyl-Peptidase mit einem Molekulargewicht von 200 kDa, bestimmt durch
die gleiche Technik wie in der
WO94/28925 beschrieben,
oder einem oder mehreren einer Klasse von Hämoproteinen von zumindest 200
kDa, bestimmt durch Gelfiltrations-Chromatographie, wie in der
WO96/10583 offenbart.
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Die
erfindungsgemäßen Vakzine
können
mit herkömmlichen
Trägern
und/oder Adjuvanzien hergestellt werden und die Erfindung stellt
auch ein Verfahren zur Herstellung der Vakzine bereit, wobei man
gereinigte Peroxiredoxin- und/oder β-Tubulin-Moleküle, wie
zuvor hierin beschrieben, mit einem oder mehreren Adjuvanzien oder
Trägern
in Verbindung bringt. Geeignete Adjuvanzien schließen Aluminiumhydroxid,
Saponin (ISCOMs), Quil A und höher
gereinigte Formen davon, Muramyl-Dipeptid, mineralische und pflanzliche Öle, DEAE
Dextran, nicht-ionische
Block-Copolymere oder Liposome wie Novasome (Handelsname von Micro
Vesicular Systems Inc.), in Gegenwart von einem oder mehrerer pharmazeutisch
verträglichen
Trägern
oder Lösungsmitteln,
ein. Träger
für Peptidsequenzen,
entsprechend den Epitopen von Peroxiredoxin- oder β-Tubulin-Molekülen gemäß der Erfindung
können
Proteine sein, wie das Hepatitis B Core-Antigen, multiple antigene Peptide
oder Lipopeptide, wie Tripalmitoyl-S-glycerylcysteinylserylserin (P3CSS). Geeignete Lösungsmittel schließen flüssige Medien
wie Kochsalz-Lösung,
geeignet zur Verwendung als Vehikel, ein. Zusätzliche Komponenten wie Konservierungsstoffe
können
ebenso enthalten sein.
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Die
Verabreichung des Vakzins an den Wirt kann über alle herkömmlichen
Wege erfolgen, wie z.B. oral oder parenteral, wie intramuskuläre Injektion,
gegebenenfalls in Intervallen, wie z.B. 2 Injektionen in einem 7-35-tägigen Intervall.
Eine geeignete Dosis bei Verabreichung als Injektion kann eine Menge
im Bereich von 10-500 μg
sein.
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Gemäß einem
weiteren Aspekt stellt die Erfindung das F.hepatica Peroxiredoxin-Molekül bereit,
das dadurch gekennzeichnet ist, dass es:
- (a)
eine Aminosäuresequenz,
wie in 4 gezeigt, hat;
- (b) von einer Nukleotidsequenz codiert wird, die zumindest teilweise
im Wesentlichen zur Sequenz in 4 korrespondiert.
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Während die
Peroxiredoxin-Moleküle
zur Verwendung im erfindungsgemäßen Vakzin
durch Isolierung aus den Helminthen hergestellt werden können, kann
es auch zweckmäßig sein,
sie durch rekombinante DNA-Techniken zu gewinnen, mit den bekannten
Vorteilen bezüglich
höherem
Ertrag und Reproduzierbarkeit. Folglich betrifft die Erfindung auch
Peroxiredoxin-Moleküle,
wie zuvor hierin beschrieben, die mit Mitteln der rekombinanten
DNA-Technologie hergestellt wurden.
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Folglich
betrifft die vorliegende Erfindung auch die Nukleinsäuresequenzen,
welche für
die erfindungsgemäßen Peroxiredoxin-Moleküle kodieren
und der kompletten oder teilweisen Nukleotidsequenz gemäß 4 entsprechen.
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Eine
Nukleinsäure
gemäß der Erfindung
kann ebenso eine einzel- oder doppelsträngige DNA, cDNA oder RNA sein.
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Variationen
in den Peroxiredoxin-kodierenden Nukleotidsequenzen können zwischen
verschiedenen Helminthen-Stammen innerhalb einer Gattung, zwischen
verschiedenen Phasen des Lebenszyklus eines Helminthen (z.B. zwischen
Larven- und Erwachsenenphase), zwischen ähnlichen Stämmen unterschiedlicher geographischer
Herkunft und auch innerhalb des gleichen Helminthen auftreten. Solche
Variationen werden erfindungsgemäß mit umfasst.
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Die
Bereitstellung eines Nukleinsäuremoleküls gemäß der Erfindung
macht somit rekombinantes Peroxiredoxin in bisher nicht zur Verfügung stehenden
Mengen möglich,
was die Entwicklung von Antihelminthen-Vakzinen erlaubt.
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Zusätzliche
Aspekte der Erfindung, die mit obigen in Verbindung stehen, schließen Vektoren
ein, die eine oder mehrere Nukleotidsequenzen wie oben definiert
enthalten; Wirtszellen, zum Beispiel Bakterien wie E. coli oder
Hefezellen, wie Saccharomyces spp., oder bevorzugter Eukaryontenzellen,
die durch solche Vektoren transformiert wurden, zum Beispiel durch
einen Baculovirus-Vektor; und Verfahren zu Herstellung von rekombinanten
Peroxiredoxin-Polypeptiden, was die Kultivierung solcher transformierter
Wirtszellen und die Isolierung der genannten Peroxiredoxin-Polypeptide
aus den kultivierten Zellen umfasst.
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Eine
alternative Lebendvakzin- oder inaktivierte Vakzinformulierung kann
ein abgeschwächtes
oder virulentes Virus enthalten, oder eine Wirtszelle, z.B. einen
Mikroorganismus wie ein Bakterium, in welchen ein Nukleinsäuremolekül entsprechend
der Erfindung gebracht wurde (z.B. ein DNA-Molekül) um eine Immunantwort gegen
die Polypeptide, die durch das eingebrachte Nukleinsäuremolekül kodiert
werden, zu stimulieren. Ein bakterieller Vektor, der in der Darmmukosa
eine lokale Immunität
gegen ein Egel-Antigen auslöst,
wird besonders bevorzugt, vor allem invasive Arten wie die Art Salmonella.
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Zusätzliches
antigenes Material kann ebenso enthalten sein, wodurch ein verbesserter
protektiver Effekt gegen parasitäre
Helminthen, oder ein kombinierter protektiver Effekt gegen einen
oder mehrere zusätzliche
Parasiteninfestationen erzielt wird.
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Kurzbeschreibung der Zeichnungen
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1 PCR-amplifizierte
Inserts von immunselektierten λ gt11-Klonen.
Positive wurden durch PCR mit universellen λ Vorwärts- und Rückwärtsprimern amplifiziert. Proben
jeder PCR-Reaktion
wurden durch eine Agarose-Gelelektrophorese analysiert.
Bahnen
1, 12, 23 | pGem DNA-Marker |
Bahn
2 | Klon | D6 |
Bahnen
3 & 4 | Klone | B5,
D5 |
Bahnen
5-11 | Klone | A1,
A4, A5, B1, B4, B6, E3 |
Bahn
13 | Klon | C4 |
Bahnen
14-17 | Klone | C2,
D1, D7, E2 |
Bahn
18 | Klon | D8 |
Bahnen
19 & 20 | Klone | C1,
D3 |
Bahn
21 | Klon | A8 |
Bahn
22 | Klon | E4 |
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2 Nukleotidsequenz
und abgeleitete Aminosäuresequenz
von β-Tubulin
(Klon D6).
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3 Alignment
der vorhergesagten Aminosäuresequenz
des Klons D6 und Toxoplasma β-Tubulin. Die
abgeleitete Aminosäuresequenz
der Teilsequenz von D6 wurde mit der des β-Tubulins aus Toxoplasma gondii
(GenBank Zugangs- Nr. P10878, Nagel und Boothroyd, 1988) verglichen.
Kästchen
um homologe Abschnitte und Lücken
wurden eingefügt,
um ein größtmögliches
Alignment zu erhalten. Z = nicht bestimmt.
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4 Nukleotidsequenz
und vorhergesagte Aminosäuresequenz
von Peroxiredoxin (Klon B1).
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5 Alignment
der vorhergesagten Aminosäuresequenz
von Klon B1. Die abgeleitete Aminosäuresequenz von Klon B1 wurde
mit dem Ratten-Thiol-spezifischen Antioxidans (TSA, GenBank Zugangsnr. P35704),
mit menschlichen, natürliche
Killerzellen stimulierenden Faktor B (NKEF B, Zugangsnr. P31945),
mit menschlichem Proliferation-assoziiertem Gen (PAG, Zugangsnr.
X67951), mit menschlichem TSA (Lim et al., 1994, Zugangsnr. P35701),
und mit Onchocerca volvulus TSA (Zugangsnr. U09385) verglichen.
Kästchen markieren
konservierte Reste und Lücken
wurden eingefügt
um ein bestmögliches
Alignment zu erhalten. Die Cystein-Reste des aktiven Zentrums sind durch
Pfeile gekennzeichnet.
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6 Expression
der Klon B1 Fusionspoteine
- A. Plattenwäsche-Überstand
des Wildtyp-Phagen (Bahn 1) und des Klon B-Phagen (Bahn 2) werden
einer reduzierenden SDS PAGE und Silberfärbung unterzogen.
- B. Nach der Elektrophorese wurden die SDS-Gele auf Nitrocellulose
geblotted und mit Anti-β-Galactosidase
Antikörpern
behandelt. Bahn 1 enthält
Wildtypphagen-Überstand
und Bahn 2 enthält
Klon B1-Überstand.
Große
Pfeile kennzeichnen die Position von β-Galactosidase. Kleine Pfeile
kennzeichnen die Position des rekombinanten B1 Fusionsproteins.
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7 Northern
Blot-Analyse einer Gesamt-RNA aus F. hepatica und Rinderleber. Die
Gesamt-RNA aus F. hepatica (Bahn 1) und aus Rinderleber (Bahn 2)
wurde in einem Formaldehyd-Agarose-Gel elektrophoretisiert, auf
einen Nitrozellulose-Filter übertragen
und mit dem 32P markierten 400 bp Fragment
behandelt. RNA Größenmarker
sind kenntlich gemacht.
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8 Schutz
der Glutamin-Synthetase durch Leberegel-Homogenat gegen das DTT/Fe3+-System. 0,5 U Glutamin-Synthetase (GS)
wurde in Anwesenheit der inaktivierenden Lösung (IS), 15 μM FeCl3 und 5 mM DTT, mit 0,3 mg, 0,6 mg und 0,9
mg Leberegel-Homogenat (LFH) 10 Minuten bei 37°C inkubiert. Die Reaktionen
wurden dann auf verbliebende Glutamin-Synthetase-Aktivität untersucht.
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Detaillierte Beschreibung der Erfindung
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1. Materialien
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Das
Alpha 32P dATP wurde bezogen von Amersham,
das RNAzolTM B von AMS Biotechnology Ltd., und
der X-Omat Röntgenfilm,
das FX 40 Fixiermittel, der LX 24 Entwickler 667 Polaroidfilm wurden
alle von Kodak bezogen. Agarose, Anti-β Galactosidase Antikörper markiert
mit alkalischer Phophatase (Maus), ApaI, 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-galactosidase
(IPTG), pGem DNA-Marker, gGEM® Vektorensystem, Prime-a-Gene® System,
SacI, Taq DNA Polymerase, WizardTM λ preps, WizardTM DNA clean-up System wurden alle bezogen
von Promega. Adenindiphosphat (ADP), anti-Rinder IgG konjungiert
mit alkalischer Phosphatase (Kaninchen), Diethylpyrocarbonat (DEPC),
Dithiothreitol (DTT), Glutamin, Glutaminsynthetase, Lysozym, Proteinase
K, Lachssperma-DNA wurden von Sigma Chemical Company bezogen.
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2. Immunscreening der F. hepatica λ gt11 cDNA
Expressionsgenbank
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Herstellung der λ gt11 cDNA Genbank
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Eine λ gt11 cDNA
Genbank wurde durch die folgende Standardmethode (Promega Handbook)
hergestellt. Die Gesamt-RNA wurde aus herangewachsenen adulten Egeln
durch RNAzolTM isoliert. Daraus wurde die
mRNA durch Bindung an eine oligo dT-Säule isoliert. Die doppelsträngige cDNA
wurde aus der mRNA mittels des Riboclone® cDNA
Synthesekits hergestellt. EcoRI Linkerarme wurden zur cDNA hinzugefügt, welche dann
mit gt11 Linkerarmen verbunden wurde und in λ-Köpfe mittels des Packagene®-Systems
gepackt wurde. Die gepackte Phage wurde titriert und dann dadurch
vermehrt, indem man Phagen-kompetente E. coli Y1090-Zellen (Übernachtkultur,
gewachsen in LB-Medium mit 0,2% Maltose und 10 mM MgSO4)
mit Verdünnungen
der Phagen infizierte, diese bei Raumtemperatur für 20 Minuten
inkubierte und die Bakterien dann in Topagar auf LB-Agarplatten
mit 100 μg
ml–1 Ampicillin
ausstrich.
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Herstellung der Hämoglobinfraktion
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Reife
F. hepatica-Egel wurden aus den Gallengängen von infizierten Lebern
von befallenen Rindern eines örtlichen
Schlachthofes in Irland entfernt. Die Egel wurden sechs mal in Phosphat-gepufferter
Kochsalzlösung
(PBS), pH 7,3, gewaschen, und in RPMI-1640, pH 7,3, enthaltend 2%
Glucose, 30 mM HEPES und 25 mg ml–1 Gentamycin
bei 37°C
für 18
Stunden gehalten. Auf diese Inkubationsperiode folgend, wurde das
Kulturmedium entfernt, bei 12,000 × g für 30 Minuten zentrifugiert
und der Überstand
(ES Produkte) gesammelt und bei –20°C gelagert.
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500
ml des ES Produkts wurden in einer Amicon 8400 Ultrafiltrationseinheit
(Danvers, MA, USA) mit einer YM3-Membran (3,000 Mw Ausschlussgrenze)
auf 15 ml aufkonzentriert. Die aufkonzentrierte Probe wurde bei
12,000 × g
für 30
Minuten zentrifugiert und auf eine 340 ml Sephacryl S-200 Säule, die
mit 0,1 M Tris-HCl, pH 7,0, bei 4°C äquilibriert
wurde, aufgetragen. Fraktionen (5 ml) wurden, nachdem das Durchlaufvolumen
durchgelaufen war, gesammelt. Die Extinktion des Eluats wurde mittels
eines Atto UV Monitors bei 280 nm aufgezeichnet. Die Fraktionen,
die Hämoprotein
enthielten (gelbfarbig), wurden zusammengegeben und in einer Amicon
8050 Ultrafiltrationseinheit auf 5 ml aufkonzentriert. Dieses Konzentrat
wurde als Hämoglobinfraktion
(Hf) bezeichnet.
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Herstellung der Seren zum Immunscreening
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Die
cDNA-Genbank wurde mittels eines Pools aus Seren von Tieren, die
mit der Hämoglobinfraktion (Hf),
wie oben beschrieben, geimpft wurden, immunologisch gescreent. Die
Seren wurden auf drei Impfungen mit Hf und vor einem früheren Parasitenbefall
erhalten. Vor der Verwendung wurden die Seren voradsorbiert, um
alle Antikörper,
die auf E.coli-Proteine reagieren, zu entfernen. Dies wurde erreicht,
indem man die Seren mit Nitrozellulosedisks, die gebundene E.coli-Proteine
enthielten, bei Raumtemperatur für
6 Stunden inkubierte. Dieses Adsorptionsverfahren wurde drei mal
wiederholt. Die Disks wurden vorbereitet, indem man die Disks in
ultraschallbehandeltem Extrakt aus E.coli-Zellen (10 × 30 Sekunden-Stöße, Arbeitszyklus
0,7 Sekunden) für 24
Stunden bei 4°C
inkubierte, und dann die Überschussstellen
mit 1%BSA/T-PBS blockte. Die Seren wurden mit Disks inkubiert, abgetrennt,
zentrifugiert und bei 4°C
bis zum Gebrauch gelagert.
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Immunscreening der λ Genbank
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Phagenkompentente
E. coli Y1090 wurden mit einer 1:50 Verdünnung aus Phagen infiziert.
Auf eine 20 minütige
Inkubation bei Raumtemperatur folgte das Ausplattieren der Zellen
in Topagar, auf LB Ampicillin-Platten und das Inkubieren bei 42°C, bis Plaques
sichtbar wurden (ca. 3 Stunden). Nitrocelluosedisks, welche in 10
nM IPTG getaucht und luftgetrocknet wurden, wurden vorsichtig auf
den Platten platziert und deren Ausrichtung wurde durch drei Nadelstiche
markiert. Die Platten wurden 4 Stunden bei 37°C inkubiert, danach wurden die
Disks vorsichtig entfernt und über
Nacht in 1% BSA/T-PBS geblockt, bevor sie schließlich mit den vor-adsorbierten Rinderseren
(1:500 Lösung)
getestet wurden. Nach dem Waschen in T-PBS hin wurden gebundene
Antikörper
mittels mit alkalischer Phosphatase markierten anti-Rinder IgG mit
NBT und BCIP als Substrat nachgewiesen. Positive Plaques erschienen
als lila Ringe. Diese Plaques wurden als Agarpfropfen mittels einer
sterilen Pasteurpipette entfernt, und in 1 ml Phagenpuffer (10 mM
MgSO4, 100 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl, pH 7,4)
gebracht und man ermöglichte
ihnen bei 4°C über Nacht
zu diffundieren. Einzelne Phagen wurden wieder ausgestrichen und
das Antikörperscreening
wurde zweimal zusätzlich
wiederholt oder bis man reine Plaques erhielt, z.B. wenn alle Plaques
auf einer Platte mit dem Antikörper
reaktiv waren.
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3. Herstellung der λ-Lysate und Isolierung der DNA
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Isolierte
Plaques wurden in 200 μl
0,1 × SM
Puffer (0,01% Gelatine, 8 mM MgSO4, 100
mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 7,5) aufgenommen und über Nacht
bei 4°C
inkubiert. 100 μl
wurden dazu verwendet, um kompetente Y1090 Zellen zu infizieren,
welche wie zuvor ausgestrichen wurden und bei 42°C inkubiert wurden, bis konfluente
Lysis beobachtet werden konnte (ca. 5 Stunden) 4 ml 0,1 × SM Puffer
wurde zu der Platte hinzugefügt,
und nach einer Inkubation über
Nacht bei 4°C
wurde die Pufferlösung
wieder entfernt. Chloroform wurde hinzugegeben (Endkonzentration
0,5%) und das Lysat wurde bei 4°C
gelagert bis es benötigt
wurde.
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4. PCR-Analyse der λ DNA
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Die
Polymerase Kettenreaktion (PCR) wurde angewandt, um die Inserts
aus der Phagen-Genbank mittels Universal-λ-Primer zu isolieren und deren
Größe abzuschätzen. Diese
Primer sind aus der Sequenz, die die EcoR1 Klonierungsstelle des λ gt11-Vektors
flankiert, abgeleitet. 20 μl
des aufbewahrten Lysates wurden zu 180 μl Wasser gegeben und 10 Minuten
gekocht und anschließend
wurde 1 μl
pro 50 μl
PCR verwendet. Jedes PCR-Gefäß beinhaltete
folgende Mischung:
10 × Polymerase
Puffer | 5,0 μl |
dNTP's (je 1 mM) | 5,0 μl |
MgCl2 (25 mM) | 6,0 μl |
Steriles
destilliertes Wasser | 30,7 μl |
λ Vorwärtsprimer
(50 ng μl–1) | 1,0 μl |
λ Rückwärtsprimer
(50 ng μl–1) | 1,0 μl |
Taq
Polymerase (5U μl–1) | 0,3 μl |
λ Lsyat DNA | 1,0 μl |
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Jede
Mischung wurde mit 70 μl
Mineralöl
bedeckt, in einen Hybaid Omnigene Thermo Cycler gegeben, und die
PCR wie folgt durchgeführt:
Stufe
1 | (Denaturierung) | 4
Minuten bei 94°C |
Stufe
2 | (Denaturierung) | 30
Sekunden bei 94°C |
| (Abkühlung) | 1
Minute bei 55°C |
| (Extension) | 1
Minute 30 Sekunden bei 74° |
| Stufe
2 wurde 35 Zyklen lang wiederholt | |
Stufe
3 | (Extension) | 4
Minuten bei 74°C |
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25 μl der PCR-Reaktionen
wurden durch Agarose-Gelelektrophorese analysiert, wie in Sambrook
et al (1989) genauer beschrieben.
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5. Subklonieren der PCR-Fragmente
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PCR-amplifizierte
Genfragmente wurden aus dem Gel herausgeschnitten. Die Agarose wurde
mittels Glaskügelchen
zerstört,
und die isolierte DNA wurde mittels dem WizardTM DNA
Clean-up System (Promega) gereinigt. Die Fragmente wurden dann wie
folgt direkt in das pGem®-T-Plasmid subkloniert:
1 μl (25 ng)
pGem® T-Vektor,
8 μl Ligase-Puffer
(10 mM ATP, 100 mM MgCl2, 100 mM DTT, 300
mM Tris-HCl, pH 7,8), 1 U T4-DNA-Ligase und 100 ng Insert-DNA wurden
behutsam gemischt und die Ligation konnte über Nacht bei 4°C erfolgen.
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Kompetente
Zellen wurden mittels einer der folgenden Methoden hergestellt:
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(a) Calciumchlorid-Transformation
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Eine
E.coli-JM109-Zellkultur in der Log-Phase wurden aliquotiert, 5 Minuten
auf Eis gegeben, bei 12,000 × g
2 Minuten zentrifugiert und der Überstand
entfernt. Die Zellen wurden vorsichtig mit 1 ml kaltem CaCl2 resuspendiert und auf Eis 30 Minuten inkubiert.
Die Zellen wurden erneut zentrifugiert und in 0,5 ml kaltem CaCl2 resuspendiert. 10 μl Ligations-Mischung wurden
behutsam zu 50 μl-Aliquots
der Zellen gegeben und für
weitere 30 Minuten auf Eis gegeben. Die Zellen wurden dann bei 42°C 90 Sekunden
Hitzeschock-behandelt und 2-5 Minuten zum Eis zurückgegeben.
Sofort nach der Transformation wurden 950 μl vorgewärmtes LB-Medium hinzugegeben
und die Zellen 1 Stunde bei 37°C
inkubiert. Die Zellen wurden durch Zentrifugieren aufkonzentriert
und auf LB-Platten mit 100 μg
ml–1 Ampicillin,
0,5 mM IPTG und 40 μg
ml–1 X-Gal
(zur blau/weiß Selektion)
ausgestrichen.
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(b) Elektroporation
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Eine
Kultur aus elektrokompetenten E.coli XL1-Blau Zellen in der Log-Phase
wurde durch Zentrifugieren aufkonzentriert und aliquotiert. 2,5 μl Ligations-Reaktionslösung wurde
zu 300 μl
Zellen gegeben, vorsichtig gemischt und in 0,2 μm Elektroporations-Küvetten gegeben.
Die Zellen wurden dann durch Elektroporation unter folgenden Bedingungen
transformiert: der Pulsgenerator wurde auf 25 μF, 2,48 kV und 200 Ω gestellt. Ein
Impuls bei dieser Einstellung führt
zu einem Impuls von 12,5 kV cm–1 mit einer Zeitkonstante
von ca. 4 Sekunden. 1 ml vorgewärmtes
SOC-Medium (20 mM Glukose enthaltend) wurde sofort hinzugefügt und die
Zellen wurden dann bei 37°C
1 Stunden inkubiert, bevor sie wieder wie zuvor konzentriert und
ausgestrichen wurden. Die Platten mit den ausgestrichenen Zellen
wurden über
Nacht bei 37°C
inkubiert.
-
6. Screening der rekombinanten Plasmide
-
Bei
X-Gal und IPTG Farbscreening sollten rekombinante Kolonien weiß und Kolonien
ohne Insert-DNA blau sein. Weiße
Kolonien wurden in 2 ml LB mit 100 μg ml–1 Ampicillin
(und μg
ml–1 Tetracylin
für XL-Blau
Zellen) gegeben und über
Nacht bei 37°C
inkubiert. Plasmid-DNA
aus 1 ml dieser präparierten
Minikultur wurde isoliert durch Kochen oder durch die Alkali-Lyse-Methode, beschrieben
von Sambrook et al (1989). Die DNA wurde zweifach verdaut mit den
Restriktionsenzymen SacI und ApaI und die Insert mit Agarose-Gelelektrophorese
untersucht.
-
7. Sequenzierung der Plasmid-DNA
-
Gereinigte
Plasmid-DNA aus positiven Klonen wurde weiter mittels WizardTM λ preps
gereinigt. Die DNA wurde zur Sequenzanalyse zum Department of Biological
Sciences, Duham University oder BioResearch Ireland, Trinity College
Dublin, geschickt.
-
8. Herstellung des Fusionsproteins
-
Die
Sequenzanalyse ergab, dass Klon B1 ein neues Egelantioxidans-Protein
(Peroxiredoxin) war und dazu weiter charakterisiert wurde. Das Fusions-Protein
aus dem λ B1
Klon wurde durch die Plattenwasch-Überstandsmethode hergestellt.
Phagen-kompetente E.coli Y1090 wurden mit 10,000 pfu rekombinanten
Phagen infiziert und 20 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert, bevor
sie auf LB-Ampicillin Platten in Topagar gegeben wurden. Die Platten
wurden bei 42°C
3 Stunden inkubiert (Lyse fast konfluent), dann wurden 5 ml Phagenpuffer,
der 1 mM EDTA, 1 mM PMSF, 1 mM Iodacetamid und 10 mM IPTG enthielt,
zu den Platten hinzugegeben, welche dann über Nacht bei 37°C inkubiert
wurden. Der Puffer wurde wieder entfernt und das Topagar wurde auch
in ein Zentrifugationsröhrchen
gegeben. Dieses wurde für
20 Sekunden verwirbelt, bevor es bei 10,000 × g 10 Minuten bei 4°C zentrifugiert
wurde. Der Überstand
wurde in Mikrozentrifugen-Röhrchen gegeben
und noch einmal bei 12,000 × g
zentrifugiert. Der Überstand
wurde bei –20°C gelagert,
bis er benötigt wurde.
-
Das
Fusionsprotein wurde mittels reduzierender SDS Polyacrylamid-Gelelektrophorese,
gefolgt von Silberfärbung
und durch Immunoblotting mittels eines Anti-β Galactosidase Primärantikörpers analysiert.
-
9. Herstellung der radioaktiv-markierten
DNA-Sonde
-
Ein
400 bp langes Fragment wurde mittels den folgenden Consensus-Primern,
abgeleitet aus dem Vergleich von Proteinsequenzen der Peroxiredoxin-Antioxidansfamilie,
aus Klon B1-DNA PCR-amplifiziert. Diese Primer kreuzten die Bereiche,
die für
die konservierten Bereiche des aktiven Zentrums codieren, Cys 47 (VCP
47) und Cys 168 (VCP 168).
VCP 47 Vorwärtsprimer (Shem F)
5'GAT TTY ACW TTY GTN
TGT CCW ACW GAR-3'
VCP
168 Rückwärtsprimer
(SmTSAR)
5' GGW
CAN ACY TCW CCA TGY TC-3'
wobei
Y = T oder C, W = A oder G und N = T C, A oder G ist
-
Das
PCR-Produkt wurde aus dem Agarosegel herausgeschnitten und wie zuvor
gewaschen. Das Fragment wurde mit Alpha
32P
durch Zufallspriming mittels dem Promega Prime-a-Gene(R) Systems markiert. Folgende Reaktionsmischung
wurde verwendet:
5 × Markierungspuffer | 10 μl |
(250
mM Tris-HCl, pH 8,0, 25 mM MgCl2, 10 mM
DTT, | |
1 mM
HEPES, pH 6,6, | |
26
A260 Einheiten ml–1 Zufallshexadeoxyribonukleotide | |
Mischung
aus dCTP, dGTP, dTTP (je 100 mM) | 2 μl |
Acetyliertes
BSA 10 mg ml–1 | 2 μl |
Denaturierte
DNA-Sonde | 25
ng |
Steriles
Wasser | 25 μl |
Alpha 32P dATP (50 μCi, 3,000 Ci mMol–1) | 5 μl |
Klenow
Enzym | 5
U |
-
Das
Reaktionsgefäß wurde
vorsichtig durchmischt und bei Raumtemperatur 1 Stunde inkubiert.
200 μl 0,5
M EDTA wurde hinzugegeben und die Reaktion durch 2 Minuten langes
Kochen terminiert. Die Sonde war jetzt fertig zur Verwendung in
Hybridisierungsreaktionen.
-
10. Isolierung der RNA und
Northern-Blotting
-
(a) Isolierung von RNA aus adulten Egeln
-
Reife
Egel wurden über
Nacht in RPMI-1640, pH 7,3, enthaltend 2% Glukose, 30 mM HEPES und
25 mg/l Gentamycin kultiviert, um das Abscheiden von Darminhalt,
welcher Wirtszellen enthalten könnte,
zu ermöglichen.
Annähernd
10 Egel (1 Gramm Gewebe) wurden in ein Zentrifugen-Röhrchen gegeben,
5 ml RNAzolTM wurde hinzugegeben und die
Egel wurden bei maximaler Geschwindigkeit 20 Sekunden mittels eines Thyristor
Regler TR50 Homogenisator homogenisiert. 1 ml Chloroform wurde hinzugefügt und die
Lösung
wurde 15 Sekunden kräftig
geschüttelt
und für
5 Minuten auf Eis gegeben. Nach der Aliquotierung in Mikrozentrifugen-Röhrchen wurde die Lösung 15
Minuten bei 4°C
und 13,000 × g
zentrifugiert und zwei Schichten bildeten sich aus. Die obere, wässrige Phase
wurde in ein neues Röhrchen
gegeben, eine gleiche Menge Isopropanol wurde hinzugegeben und die
Proben wurden bei 4°C
15 Minuten inkubiert (oder zur Langzeitlagerung bei –80°C aliquotiert).
Sie wurden erneut für
15 Minuten zentrifugiert, der Überstand
wurde entfernt und das RNA-Pellet mit 75% Ethanol gewaschen, bevor
es getrocknet wurde und mit 200 μl
0,1% DEPC behandeltem Wasser rekonstituiert wurde. Rinder-RNA wurde
mittels der gleichen Prozedur mit 1 g frischer Rinderleber als Startmaterial
isoliert. Die RNA wurde durch Elektrophorese auf Agarosegel, Formaldehyd
enthaltend, analysiert, wie in Sambrook et al (1989) genauer beschrieben.
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(b) Northernblotting
-
Nach
der Elektrophorese wurde das Gel mit DEPC-behandeltem Wasser gespült, um das
Formaldehyd zu entfernen und die RNA wurde durch die Kapillar-Transfermethode,
beschrieben durch Sambrook et al (1989), auf Nitrozellulosemembran übertragen.
Die RNA-Fragmente
werden vom Gel in einem Fluss aus Pufferlösung transportiert und auf
der Oberflä che
der Nitrozellulose abgeschieden. Nach dem Transfer wurde die RNA
auf der Membran durch 2 Stunden langes Backen bei 80°C in einem
Ofen fixiert.
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(c) Hybridisierung mit einer radioaktiv-markierten
Sonde
-
Der
Nitrozellulosefilter wurde in 6 × SSC (0,9 M NaCl, 90 mM Natriumcitrat
pH 7,0) getränkt,
bis er gründlich
befeuchtet war, und in einen hitzeversiegelbaren Beutel gegeben.
Dann wurden 200 ml Vorhybridisierungslösung (6 × SSC, 5 × Denhardt-Reagenz, 0,5% SDS,
100 μl ml–1 denaturierte,
fragmentierte Lachssperma-DNA) in den Beutel gegeben. So viel Luft
wie möglich
wurde aus dem Beutel gedrückt,
der dann versiegelt und über
Nacht bei 68°C
inkubiert wurde. Nach der Inkubation wurde der Beutel durch die
Entfernung einer Ecke geöffnet
und die radioaktiv-markierte Sonde wurde hinzugegeben. Der wiederversiegelte
Beutel wurde in einen zweiten versiegelten Beutel gegeben und wieder
24 Stunden bei 68°C
inkubiert. Die Hybridisierungslösung
wurde vorsichtig in einen passenden Behälter gegossen und die Filter
entfernt und sofort in 300 ml 2 × SSC und 0,1% SDS getaucht.
Die Filter wurden unter leichter Bewegung bei Raumtemperatur 15 Minuten
inkubiert. Die Waschlösung
wurde zweimal ersetzt und die Inkubation wiederholt. Dann wurde
0,1 × SSC
und 0,5% SDS zu den Filtern gegeben, welche dann weiter bei 68°C 1 Stunden
inkubiert wurden. Die Filter wurden mit 0,1 × SSC gespült um SDS zu entfernen, kurz
auf Papierhandtücher
geblottet und in Frischhaltefolie gewickelt, und damit ein Röntgenfilm
bei –80°C belichtet,
um eine autoradiographische Abbildung zu erhalten. Eine 24 Stunden
lange Belichtung bei 80°C
mit einer Verstärkerfolie
wurde benötigt,
um ein Bild zu erhalten.
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11. Assay eines Extrakts aus reifen Egeln
auf neuartige Antioxidans-Aktivität
-
Die
Antioxidans-Aktivität
im Extrakt aus reifen Leberegeln wurde durch die Darstellung seiner
Fähigkeit
zur Inhibitierung der Thiol/Eisen/Sauerstoff-vermittelten Inaktivierung
der Glutamin-Synthetase gemessen. Die Untersuchungen wurden in Mikrotiter-Platten
in einem 100 μl
Reaktionsvolumen, das 0,5 U Glutaminsynthetase (E. coli) enthält, bei
Anwesenheit oder Abwesenheit von Inaktivierungslösungen und Potektorprotein (Leberegelhomogenat)
durchgeführt.
Die Inaktivierungslösungen
bestanden aus 15 μM
FeCl3 und entweder 5 mM DTT oder 14 mM 2-Mercaptoethanol
(Endkonzentrationen). Nach der 10-minütiger Inkubation bei 37°C wurde die
verbliebene Glutaminsynthetase-Aktivität durch Zugabe von 100 μl γ Glutamyltransferase-Assaymischung gemessen.
Diese enthielt 0,4 mM ADP, 150 mM Glutamin, 10 mM Kaliumarsenat,
0,4 mM Manganchlorid, 20 mM Hydroxylammoniumchlorid in 50 mM Imidazol-HCl,
pH 7,0. Die Reaktion wurde 30 Minuten bei 37°C inkubiert und durch die Zugabe
von 50 μl
Stopmischung, bestehend aus 55 g FeCl3 × 6H2O, 20 g Trichloressigsäure und 21 ml konzentrierte
HCl pro Liter, terminiert. Eine Extinktion, resultierend aus dem γ Glutamylhydroxamat-Fe3+-Korn plex, wurde bei 540 nm gemessen. In
Abwesenheit des „Protektorproteins" unter diesen Bedingungen
gingen 70 bis 100% der Glutaminsynthetase-Aktivität verloren.
-
12. Immunscreening der F. hepatica cDNA-Genbank
und Analyse der isolierten Klone durch PCR und Restriktionsverdau
-
Rinderseren
aus dem Vakzinversuch wurden dazu verwendet, eine F. hepatica cDNA-Genbank, konstruiert
in einem λ gt11
Phagen, zu screenen. Den verwendeten Serumpool erhielt man am Tag
des Parasitenexposition (Woche 11) von Tieren, die mit der Hämoglobinfraktion
(Hf) immunisiert wurden. Diese Tiere zeigten einen mittleren Schutzgrad
gegen Parasitenbefall von 43,8%. Diese Seren sollten Antikörper enthalten,
die mit Hämoglobin
und jedem anderen Antigen, das in der Immunisierungsfraktion enthalten
ist, reagieren
-
10
Platten mit je ca. 2,000 pfu wurden im ersten Screening mit einer
1:500 Lösung
aus vor-adsorbierten Seren verwendet. 30 positive Plaques wurden
ausgewählt
und diese wurden drei oder vier weiteren Screeningrunden unterzogen,
bis alle Plaques auf den Platten positiv waren, was auf reine Klone
hinwies. Lysate aus positiven Plaques wurden dann hergestellt und
die DNA durch PCR mittels λ Vorwärts- und
Rückwärtsprimern
analysiert. Von den 30 positiv ausgewählten produzierten nur 20 PCR-Produkte;
die übrigen
10 wurden daher nicht weiter berücksichtigt.
Die Klone wurden auf Basis der Größe des PCR-Fragments klassifiziert
(Figur 1).
Gruppe | Größe des Fragments | Klone |
1 | ~
1700 bp | D6 |
2 | ~
1600 bp | B5 & D5 |
3 | ~
1400 bp | A1,
A4, A5, B1, B4, B6, E3 |
4 | ~
1100 bp | C4 |
5 | ~
1000 bp | C2,
D1, D7, E2 |
6 | ~
900 bp | D8 |
7 | ~
700 bp | C1 & D3 |
8 | ~
650 bp | A8 |
9 | ~
550 bp | E4 |
-
13. Subklonieren der Phageninserts
-
Das
Subklonieren wurde mit D6 der Klongruppe 1 (1700 bp) und B1 der
Gruppe 3 (1400 bp) durchgeführt.
Die λ PCR-Produkte
dieser beiden Klone wurden direkt in das pGem®-T-Plasmid subkloniert.
Weiße
Kolonien wurden ausgewählt
und durch Doppelverdau mit SacI- und
ApaI-Restriktionsenzymen gescreent. Ein Klon mit einem 1600-1700
bp langem Insert wurde aus D6 isoliert und ein 1400-1500 bp langes
Insert erhielt man aus Klon B6.
-
14. Sequenzanalyse von Klon D6
-
Die
DNA der rekombinanten Plasmide wurden wie üblich sequenziert, anschließend folgte
die Reinigung mit WizardTM λ Preps. Aus
Klon D6 erhielt man eine Teilsequenz von ca. 420 Basen. Die abgeleitete
141 Aminosäuresequenz
wurde mit den Sequenzen aus verfügbaren
Datenbanken verglichen und es wurde beobachtet, dass diese eine
deutliche Homologie mit dem C-terminalen Ende von β-Tubulinen
aus verschiedenen Organismen aufweist. β-Tubuline sind Proteine mit
einer Länge
von 440-450 Aminosäuren,
entsprechend ca. 1320 Basen, deshalb könnte Klon D6 mit ca. 1700 Basen
das komplette F. hepatica β-Tubulin-Gen
enthalten. 2 zeigt das Alignment der D6-Teilsequenz
mit β-Tubulin
aus Toxoplasma gondii. In der Überlappungsregion
zeigt die D6-Sequenz 64% Identität
und 73% Ähnlichkeit
mit dem C-Ende des Protozoen-Tubulins.
-
15. Sequenzanalyse des Klons B1
-
Das
Klon B1-Insert wurde durch PCR-Amplifikation mittels λ-Primern
auf eine Länge
von ca. 1400 bp geschätzt.
Nahezu 1200 Basen des Inserts wurden in 5'-3'-Richtung
sequenziert. Dies ergab einen Startcodon ATG und ein offenes Leseraster
von ca. 580 Basen, endend mit dem Stop-Codon TAG im Raster. Abwärts des Stop-Codons
befand sich ein Abschnitt von etwa 20 Adeninresten (Poly-A-Schwanz),
gefolgt von zwei Polyadenylierungssequenzen, AAAATAAA und AATA,
was zeigt, dass der Klon an seinem 3'-Ende komplett war. Die DNA hat eine
nicht translatierte 5'-Region
von ca. 200 Basen Länge
und eine nicht translatierte 3'-Region
von ca. 700 Basen Länge.
-
Für Klon B1
ist vorhersagbar, dass er für
ein Protein von 194 Aminosäuren
Länge,
mit einem errechneten Molekulargewicht von 21,646 Da, kodiert. Wenn
damit eine Proteinsequenzdatenbank gescreent wurde, zeigte die vorhergesagte
Aminosäuresequenz
eine höchst
signifikante Übereinstimmung
mit einer neuen Familie der Antioxidans-Proteine, der Peroxiredoxin-Familie.
Das Alignment von Klon B1 mit Thiol-spezifischem Antioxidans der
Ratte (TSA, GenBank Zugangsnr. P35704), menschlichem, natürliche Killerzellen
stimulierendem Faktor B (NKEF B, Zugangsnr. P31945), mit menschlichem,
Proliferation-assoziiertem Gen (PAG, Zugangsnr. X67951), mit menschlichem
TSA (Lim et al., 1994, Zugangsnr. P35701), und mit Onchocerca volvulus TSA
(Zugangsnr. 009385) wird in 3 gezeigt.
-
Das
Protein mit der höchsten
Identität
ist Ratten-TSA; 57% und 74,6% Ähnlichkeit.
Die anderen Übereinstimmungen
sind wie folgt: menschlicher NKEF B 56,9% (71,5% Ähnlichkeit),
menschliches PAG 53,8% (73,0% Ähnlichkeit),
menschliches TAG 53,7% (71,0% Ähnlichkeit)
und Onchocerca volvulus TSA 2,0% (33,7% Ähnlichkeit). Ähnlichkeit
konnte über
die gesamte Länge
des Proteins beobachtet werden und zwei höchst konservierte Domänen wurden
beobachtet. Die Erste von diesen ist eine 16 Aminosäurenabschnitt
bei etwa den Positionen 40-60, – F
Y P L D F T F V C P T E I I A –.
Die zweite, kürzere
Domäne – H G E
V C P A – wurde
bei etwa den Positionen 165-175 gefunden.
-
16. Die Expression des Fusionsproteins
durch Klon B1
-
Die
Plattenwäsche-Überstandsmethode
wurde dazu verwendet, um Fusionsproteine aus Klon B1-Phagen zu machen.
Der resultierende Überstand
und Überstand
von E. coli, infiziert mit Wildtyp-Phagen, wurden auf reduzierender
SDS PAGE (4A) analysiert. In dem Wildtypversuch
wurde ein Protein beobachtet, welches das gleiche Molekulargewicht
wie β-Galactosidase hat
(Bahn 1). Im B1-Überstand
fehlte dieses Protein, aber ein größeres Protein mit einem Molekulargewicht
von ca 160 kDa, das nicht beim Wildtyp gefunden wurde, konnte beobachtet
werden (Bahn 2). Um zu bestimmen, ob dies das Fusionsprotein war,
wurde das Gel auf Nitrocellulosepapier geblottet und mit anti-β-Galactosidase-Antikörpern (4B) sondiert. Die Bindung des Antikörpers an
das große
Protein bestätigte
dessen Identität
als β-Galactosidase-Fusionsprotein (Bahn
2). Der Antikörper
band auch an das Wildtyp-β-Galactosidasemolekül (Bahn
1) und an zahlreiche andere Proteine, die beiden Überständen gemeinsam
sind.
-
17. Northernanalyse
-
Die
Primer, die man aus den erhaltenen Domänen der Antioxidans-Proteine
(um die VCP-Motive etwa bei den Positionen 50 & 170) entwarf, wurden dazu verwendet,
ein DNA-Fragment
von ca. 400 bp Länge
zu amplifizieren. Dieses wurde 32P-markiert
und dazu verwendet, sowohl F. hepatica- als auch Rinder-RNA zu sondieren,
welche vor dem Blotten auf Agarosegel analysiert wurden. Ein einzelnes
Transkript von ca. 750 kb Länge
wurde in der F. hepatica-RNA gefunden (5 Bahn 1).
Keine Peroxiredoxin-ähnliche
Bindung konnte in der Rinder-RNA beobachtet werden (5 Bahn
2).
-
18. Antioxidansaktivität des Extrakts aus reifen Egeln
-
Antioxidansaktivität wurde
als die Fähigkeit
gemessen, einer Inaktivierung von Glutaminsynthetase durch ein gemischtes
Eisen-Thiol-Inaktivierungssystem vorzubeugen. 6 zeigt
die Inaktivierung von Glutaminsynthetase durch Eisen und DTT in
Anwesenheit von verschiedenen Gehalten von Leberegelhomogenat (LFH).
Die Inkubation von Glutaminsynthetase mit Eisen und DTT führt zu einer
70%igen Abnahme der Enzymaktivität.
Die Anwesenheit von LFH stellt einen dosisabhängigen Schutz bereit, wobei
0,3 mg, 0,6 mg und 0,9 mg LFH, 50%, 61% bzw. 75% Glutaminsynthetaseaktivität wiederherstellten.
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Bibliographie
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thiol-specific antioxidant protein from human brain: gene cloning
and analysis of conserved cysteine regions. Gen 140, 279-284.
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Toxoplasma gondii are encoded by single copy genes containing multiple
copy introns. Molecular and Biochemical Parasitology 29, 261-273.
- Rajasekariah et al. (1979), Parasitology 79, 393-400.
- Sambrook, J., Fritsch, E.F. und Maniatis, T. 1989. In☐ Molecular
Cloning: A Laboratory Manua. 2. Edition Cold Spring Harbour Laboratory
Press.
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UK Patent-Nr. 2169606B
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WO94/09142
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WO94/28925
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WO96/10583
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