DE69737691T2

DE69737691T2 - Impfstoff, der peroxiredoxin enthält

Info

Publication number: DE69737691T2
Application number: DE69737691T
Authority: DE
Inventors: John Pius Dalton
Original assignee: Dalton John Pius Blackrock
Current assignee: Dalton John Pius Blackrock
Priority date: 1996-06-11
Filing date: 1997-06-11
Publication date: 2008-01-10
Anticipated expiration: 2017-06-12
Also published as: WO1997047740A3; US20030124137A1; ATE361363T1; NZ333265A; AU732807B2; DE69737691D1; BR9710849A; ES2287954T3; CN1221451A; AU3042497A; EP0953047B1; GB9612214D0; US6676944B2; CA2256710A1; WO1997047740A2; EP0953047A2

Description

Diese Erfindung betrifft die Verwendung eines Peroxiredoxins (ein Thiol-spezifisches Antioxidans) als ein protektives Antigen gegen Helminthen.
Jede Spezies von Haustier kann durch eine Anzahl von verschiedenen Helminthen-Spezies parasitiert werden, ein Prozess der gewöhnlich eine Krankheit auslöst. Der parasitäre Saugwurm Fasciola hepatica zum Beispiel ist dafür bekannt eine Ursache für die wirtschaftlich bedeutsame Krankheit Fascioliasis bei Wiederkäuern, wie Rind und Schaf, zu sein. Der Parasit dringt in den Säugetierwirt ein, indem er die Darmwand durchdringt und verbringt nahezu sieben Wochen damit, sich zu ernähren und sich durch das Lebergewebe zu fressen, bevor er schließlich in den Gallengang wandert. Nach der Infektion kann die Entwicklung von Immunität im Wirt schwach ausfallen und die Resistenz gegen Wiederinfektion bei bereits infizierten Wirten tritt nur teilweise oder gar nicht auf. Andere parasitäre Egel schließen Fasciola gigantica und Dicrocoelium spp., Paraphisomum spp und auch Schistosoma spp., z.B. S.bovis und S.mansoni, ein.
Probleme werden auch durch Fadenwürmer wie Hakenwürmer (z.B. Necator, Ancylostoma, Uncinaria und Bunostomum spp.) verursacht.
Von den blutsaugenden Fadenwürmern verursacht die Gattung Haemonchus Anaemie und Gewichtsverlust und führt unbehandelt häufig zum Tod. Tiere, die mit dem verwandten nicht-blutsaugenden Fadenwurm Ostertagia infiziert sind, hören in ähnlicher Weise auf zu wachsen und sterben ohne Behandlung.
Andere parasitäre Würmer von wirtschaftlicher Bedeutung schließen verschiedene Spezies von folgenden Gattungen von Helminthen ein:
Trichostrongylus, Nematodirus, Dictyocaulus, Cooperia, Ascaris, Dirofilaria, Trichuris und Strongylus. Zustätzlich zum Nutzvieh können auch andere Tiere und Menschen infiziert werden, nicht selten mit fatalen Folgen, und Helminthen-Infektionen und -Infestationen stellen ein Problem mit beachtlicher, weltweiter Signifikanz dar.
Die Kontrolle von parasitären Helminthen bei Weidevieh beruht derzeit vor allem auf der Verwendung von Antihelminthen-Medikamenten, kombiniert mit Weidewirtschaft. Solche Techniken sind oft unbefriedigend, erstens weil Antihelminthen-Medikamente regelmäßig verabreicht werden müssen, zweitens weil Resistenz gegen Antihelminthen-Medikamente zunehmend weit verbreitet ist und drittens weil angemessene Weidewirtschaft auf manchen Höfen nur selten möglich ist und wo sie sogar möglich ist, kann sie zu Einschränkungen bezüglich der optimalen Nutzung des zu Verfügung stehenden Weidelandes führen.
Zahlreiche Lösungsversuche sind unternommen worden, um parasitäre Helminthen bei Haustieren durch immunologische Mittel zu kontrollieren. Mit sehr wenigen Ausnahmen (z.B. dem Rinderlungenwurm, Dictyocaulus viviparus) hat sich das als nicht möglich herausgestellt.
Ein Vakzin gegen F. hepatica wurde in der WO90/08819 offenbart, das eine Glutathion-S-Transferase als antigenes Material umfasst. Weitere Vakzine gegen F. hepatica wurden in der WO94/09142 , der WO94/28925 und der WO96/10583 offenbart, die ein Cathepsin L, eine Dipeptidyl-Peptitase beziehungsweise eine Klasse von Hämoproteinen von F. hepatica als antigenes Material umfassen.
Bennett ( UK-Patent Nr. 2169606B ) extrahierte verschiedene Antigene aus Fasciola-Organismen mittels eines Prozesses, der Antigene mit Spezifität für die juvenile Phase von Antigenen trennt, die während der juvenilen und der adulten Phase vorliegen. Außerdem können in vitro ungereinigte exkretorische/sekretorische (E/S) Produkte unter manchen Umständen zur Immunität bei Ratten (Rajasekariah et al., Parasitol. 79 (1979), S. 393-400) führen.
Es wurde nun herausgefunden, dass Tiere, die gegen F. hepatica unter Verwendung eines relativ unreinen Hämoproteinpräparats, dessen gereinigtes Pendant in der WO96/10583 beschrieben ist, geimpft wurden, Antikörper gegen Peroxiredoxin-Moleküle aus Egeln bilden. Diese Erfindung eröffnet die Möglichkeit von Vakzinen gegen F. hepatica und andere Helminthen, basierend auf der Verwendung von Peroxiredoxin-Molekülen als Antigene.
Dementsprechend stellt die vorliegende Erfindung eine Vakzinzusammensetzung gemäß Anspruch 1 bereit.
Außerdem betrifft die Erfindung die Verwendung von Molekülen, wie in Anspruch 1 definiert, bei der Herstellung einer Vakzinzusammensetzung zur Bekämpfung einer parasitären Infestation durch Helminthen bei Säugetieren.
Das Säugetier ist bevorzugt ein Wiederkäuer, wie zum Beispiel Rind oder Schaf, aber das Vakzin dieser Erfindung kann ebenso bei Menschen, Begleittieren wie Hunde und Katzen, oder bei anderen Haustieren Anwendung finden.
Die F. hepatica Peroxiredoxinmoleküle, für die hierin gezeigt wird, dass sie cDNA-Sequenzen und vorhergesagte Aminosäuresequenzen, wie in 4 gezeigt, besitzen, sind besonders bevorzugt bei der Verwendung in dem Vakzin dieser Erfindung.
Die Peroxiredoxin-Moleküle, die in dem erfindungsgemäßen Vakzin enthalten sind, liegen in zumindest teilweise gereinigter Form vor. Vorzugsweise sind die erfindungsgemäßen Moleküle zumindest 75% rein, bevorzugter zumindest 95% rein. Es wird angenommen, dass, wenn einmal Peroxiredoxin-Moleküle mit einer Reinheit von mindestens 95% gewonnen wurden, sie mit einem oder mehreren weiteren gereinigten antigenen Proteinen zusammengemischt werden können, um ein polyvalentes Vakzin zu erhalten.
Eine bevorzugte Form des polyvalenten Vakzins gemäß der Erfindung wird Peroxiredoxin-Polypeptide, wie oben bezeichnet, enthalten, kombiniert mit einem Cathepsin L-Typ Antigen, wie in der Internationalen Patentanmeldung Nr. WO94/09142 näher beschrieben, oder mit einem Dipeptidyl-Peptidase Antigen, wie in der Internationalen Patentanmeldung Nr. WO94/28925 näher beschrieben, oder mit einer Gruppe von Hämoproteinmolekülen, wie in der Internationalen Patentanmeldung Nr. WO96/10583 näher beschrieben, oder einem β-Tubulin Antigen, wie hierin beschrieben. Folglich sind Cathepsin L und/oder die Depeptidyl Peptidase und/oder die Hämoproteine vorzugsweise aus Egeln, wie Fasciola oder Dicrocoelium, insbesondere dem Leberegel F. hepatica, abgeleitet. Solch ein polyvalentes Vakzin wird, durch Induzieren von Immunität im Wirt gegen zwei oder mehrere verschiedene Eigenschaften des eindringenden parasitären Helminthen, die Wahrscheinlichkeit eines Schutzes gegen Helminthen deutlich steigern und Wahrscheinlichkeit einer auftretenden Infestation deutlich senken.
Monovalente Vakzine können erfindungsgemäß eine fruchtbarkeitshemmende Wirkung auf parasitäre Helminthen haben, und diese Wirkung sollte durch polyvalente Vakzine noch mehr hervorgehoben werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das erfindungsgemäße polyvalente Vakzin Peroxiredoxin-Polypeptide zusammen mit einem Cathepsin Limit einem Molekulargewicht von 27 kDa, bestimmt durch Natrium-Dodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese, wie in der WO 94/09142 offenbart, und/oder einem Cathepsin L2 mit einem Molekulargewicht von 29,5 kDa gewonnen mit der gleichen Technik wie in der WO 94/09142 offenbart, und/oder eine Dipeptidyl-Peptidase mit einem Molekulargewicht von 200 kDa, bestimmt durch die gleiche Technik wie in der WO94/28925 beschrieben, oder einem oder mehreren einer Klasse von Hämoproteinen von zumindest 200 kDa, bestimmt durch Gelfiltrations-Chromatographie, wie in der WO96/10583 offenbart.
Die erfindungsgemäßen Vakzine können mit herkömmlichen Trägern und/oder Adjuvanzien hergestellt werden und die Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Herstellung der Vakzine bereit, wobei man gereinigte Peroxiredoxin- und/oder β-Tubulin-Moleküle, wie zuvor hierin beschrieben, mit einem oder mehreren Adjuvanzien oder Trägern in Verbindung bringt. Geeignete Adjuvanzien schließen Aluminiumhydroxid, Saponin (ISCOMs), Quil A und höher gereinigte Formen davon, Muramyl-Dipeptid, mineralische und pflanzliche Öle, DEAE Dextran, nicht-ionische Block-Copolymere oder Liposome wie Novasome (Handelsname von Micro Vesicular Systems Inc.), in Gegenwart von einem oder mehrerer pharmazeutisch verträglichen Trägern oder Lösungsmitteln, ein. Träger für Peptidsequenzen, entsprechend den Epitopen von Peroxiredoxin- oder β-Tubulin-Molekülen gemäß der Erfindung können Proteine sein, wie das Hepatitis B Core-Antigen, multiple antigene Peptide oder Lipopeptide, wie Tripalmitoyl-S-glycerylcysteinylserylserin (P₃CSS). Geeignete Lösungsmittel schließen flüssige Medien wie Kochsalz-Lösung, geeignet zur Verwendung als Vehikel, ein. Zusätzliche Komponenten wie Konservierungsstoffe können ebenso enthalten sein.
Die Verabreichung des Vakzins an den Wirt kann über alle herkömmlichen Wege erfolgen, wie z.B. oral oder parenteral, wie intramuskuläre Injektion, gegebenenfalls in Intervallen, wie z.B. 2 Injektionen in einem 7-35-tägigen Intervall. Eine geeignete Dosis bei Verabreichung als Injektion kann eine Menge im Bereich von 10-500 μg sein.
Gemäß einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung das F.hepatica Peroxiredoxin-Molekül bereit, das dadurch gekennzeichnet ist, dass es:

(a) eine Aminosäuresequenz, wie in 4 gezeigt, hat;
(b) von einer Nukleotidsequenz codiert wird, die zumindest teilweise im Wesentlichen zur Sequenz in 4 korrespondiert.

Während die Peroxiredoxin-Moleküle zur Verwendung im erfindungsgemäßen Vakzin durch Isolierung aus den Helminthen hergestellt werden können, kann es auch zweckmäßig sein, sie durch rekombinante DNA-Techniken zu gewinnen, mit den bekannten Vorteilen bezüglich höherem Ertrag und Reproduzierbarkeit. Folglich betrifft die Erfindung auch Peroxiredoxin-Moleküle, wie zuvor hierin beschrieben, die mit Mitteln der rekombinanten DNA-Technologie hergestellt wurden.
Folglich betrifft die vorliegende Erfindung auch die Nukleinsäuresequenzen, welche für die erfindungsgemäßen Peroxiredoxin-Moleküle kodieren und der kompletten oder teilweisen Nukleotidsequenz gemäß 4 entsprechen.
Eine Nukleinsäure gemäß der Erfindung kann ebenso eine einzel- oder doppelsträngige DNA, cDNA oder RNA sein.
Variationen in den Peroxiredoxin-kodierenden Nukleotidsequenzen können zwischen verschiedenen Helminthen-Stammen innerhalb einer Gattung, zwischen verschiedenen Phasen des Lebenszyklus eines Helminthen (z.B. zwischen Larven- und Erwachsenenphase), zwischen ähnlichen Stämmen unterschiedlicher geographischer Herkunft und auch innerhalb des gleichen Helminthen auftreten. Solche Variationen werden erfindungsgemäß mit umfasst.
Die Bereitstellung eines Nukleinsäuremoleküls gemäß der Erfindung macht somit rekombinantes Peroxiredoxin in bisher nicht zur Verfügung stehenden Mengen möglich, was die Entwicklung von Antihelminthen-Vakzinen erlaubt.
Zusätzliche Aspekte der Erfindung, die mit obigen in Verbindung stehen, schließen Vektoren ein, die eine oder mehrere Nukleotidsequenzen wie oben definiert enthalten; Wirtszellen, zum Beispiel Bakterien wie E. coli oder Hefezellen, wie Saccharomyces spp., oder bevorzugter Eukaryontenzellen, die durch solche Vektoren transformiert wurden, zum Beispiel durch einen Baculovirus-Vektor; und Verfahren zu Herstellung von rekombinanten Peroxiredoxin-Polypeptiden, was die Kultivierung solcher transformierter Wirtszellen und die Isolierung der genannten Peroxiredoxin-Polypeptide aus den kultivierten Zellen umfasst.
Eine alternative Lebendvakzin- oder inaktivierte Vakzinformulierung kann ein abgeschwächtes oder virulentes Virus enthalten, oder eine Wirtszelle, z.B. einen Mikroorganismus wie ein Bakterium, in welchen ein Nukleinsäuremolekül entsprechend der Erfindung gebracht wurde (z.B. ein DNA-Molekül) um eine Immunantwort gegen die Polypeptide, die durch das eingebrachte Nukleinsäuremolekül kodiert werden, zu stimulieren. Ein bakterieller Vektor, der in der Darmmukosa eine lokale Immunität gegen ein Egel-Antigen auslöst, wird besonders bevorzugt, vor allem invasive Arten wie die Art Salmonella.
Zusätzliches antigenes Material kann ebenso enthalten sein, wodurch ein verbesserter protektiver Effekt gegen parasitäre Helminthen, oder ein kombinierter protektiver Effekt gegen einen oder mehrere zusätzliche Parasiteninfestationen erzielt wird.
Kurzbeschreibung der Zeichnungen

1 PCR-amplifizierte Inserts von immunselektierten λ gt11-Klonen. Positive wurden durch PCR mit universellen λ Vorwärts- und Rückwärtsprimern amplifiziert. Proben jeder PCR-Reaktion wurden durch eine Agarose-Gelelektrophorese analysiert.

Bahnen 1, 12, 23	pGem DNA-Marker
Bahn 2	Klon	D6
Bahnen 3 & 4	Klone	B5, D5
Bahnen 5-11	Klone	A1, A4, A5, B1, B4, B6, E3
Bahn 13	Klon	C4
Bahnen 14-17	Klone	C2, D1, D7, E2
Bahn 18	Klon	D8
Bahnen 19 & 20	Klone	C1, D3
Bahn 21	Klon	A8
Bahn 22	Klon	E4

2 Nukleotidsequenz und abgeleitete Aminosäuresequenz von β-Tubulin (Klon D6).
3 Alignment der vorhergesagten Aminosäuresequenz des Klons D6 und Toxoplasma β-Tubulin. Die abgeleitete Aminosäuresequenz der Teilsequenz von D6 wurde mit der des β-Tubulins aus Toxoplasma gondii (GenBank Zugangs- Nr. P10878, Nagel und Boothroyd, 1988) verglichen. Kästchen um homologe Abschnitte und Lücken wurden eingefügt, um ein größtmögliches Alignment zu erhalten. Z = nicht bestimmt.
4 Nukleotidsequenz und vorhergesagte Aminosäuresequenz von Peroxiredoxin (Klon B1).
5 Alignment der vorhergesagten Aminosäuresequenz von Klon B1. Die abgeleitete Aminosäuresequenz von Klon B1 wurde mit dem Ratten-Thiol-spezifischen Antioxidans (TSA, GenBank Zugangsnr. P35704), mit menschlichen, natürliche Killerzellen stimulierenden Faktor B (NKEF B, Zugangsnr. P31945), mit menschlichem Proliferation-assoziiertem Gen (PAG, Zugangsnr. X67951), mit menschlichem TSA (Lim et al., 1994, Zugangsnr. P35701), und mit Onchocerca volvulus TSA (Zugangsnr. U09385) verglichen. Kästchen markieren konservierte Reste und Lücken wurden eingefügt um ein bestmögliches Alignment zu erhalten. Die Cystein-Reste des aktiven Zentrums sind durch Pfeile gekennzeichnet.
6 Expression der Klon B1 Fusionspoteine

A. Plattenwäsche-Überstand des Wildtyp-Phagen (Bahn 1) und des Klon B-Phagen (Bahn 2) werden einer reduzierenden SDS PAGE und Silberfärbung unterzogen.
B. Nach der Elektrophorese wurden die SDS-Gele auf Nitrocellulose geblotted und mit Anti-β-Galactosidase Antikörpern behandelt. Bahn 1 enthält Wildtypphagen-Überstand und Bahn 2 enthält Klon B1-Überstand. Große Pfeile kennzeichnen die Position von β-Galactosidase. Kleine Pfeile kennzeichnen die Position des rekombinanten B1 Fusionsproteins.

7 Northern Blot-Analyse einer Gesamt-RNA aus F. hepatica und Rinderleber. Die Gesamt-RNA aus F. hepatica (Bahn 1) und aus Rinderleber (Bahn 2) wurde in einem Formaldehyd-Agarose-Gel elektrophoretisiert, auf einen Nitrozellulose-Filter übertragen und mit dem ³²P markierten 400 bp Fragment behandelt. RNA Größenmarker sind kenntlich gemacht.
8 Schutz der Glutamin-Synthetase durch Leberegel-Homogenat gegen das DTT/Fe³⁺-System. 0,5 U Glutamin-Synthetase (GS) wurde in Anwesenheit der inaktivierenden Lösung (IS), 15 μM FeCl₃ und 5 mM DTT, mit 0,3 mg, 0,6 mg und 0,9 mg Leberegel-Homogenat (LFH) 10 Minuten bei 37°C inkubiert. Die Reaktionen wurden dann auf verbliebende Glutamin-Synthetase-Aktivität untersucht.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
1. Materialien
Das Alpha ³²P dATP wurde bezogen von Amersham, das RNAzol^TM B von AMS Biotechnology Ltd., und der X-Omat Röntgenfilm, das FX 40 Fixiermittel, der LX 24 Entwickler 667 Polaroidfilm wurden alle von Kodak bezogen. Agarose, Anti-β Galactosidase Antikörper markiert mit alkalischer Phophatase (Maus), ApaI, 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-galactosidase (IPTG), pGem DNA-Marker, gGEM^® Vektorensystem, Prime-a-Gene^® System, SacI, Taq DNA Polymerase, Wizard^TM λ preps, Wizard^TM DNA clean-up System wurden alle bezogen von Promega. Adenindiphosphat (ADP), anti-Rinder IgG konjungiert mit alkalischer Phosphatase (Kaninchen), Diethylpyrocarbonat (DEPC), Dithiothreitol (DTT), Glutamin, Glutaminsynthetase, Lysozym, Proteinase K, Lachssperma-DNA wurden von Sigma Chemical Company bezogen.
2. Immunscreening der F. hepatica λ gt11 cDNA Expressionsgenbank
Herstellung der λ gt11 cDNA Genbank
Eine λ gt11 cDNA Genbank wurde durch die folgende Standardmethode (Promega Handbook) hergestellt. Die Gesamt-RNA wurde aus herangewachsenen adulten Egeln durch RNAzol^TM isoliert. Daraus wurde die mRNA durch Bindung an eine oligo dT-Säule isoliert. Die doppelsträngige cDNA wurde aus der mRNA mittels des Riboclone^® cDNA Synthesekits hergestellt. EcoRI Linkerarme wurden zur cDNA hinzugefügt, welche dann mit gt11 Linkerarmen verbunden wurde und in λ-Köpfe mittels des Packagene^®-Systems gepackt wurde. Die gepackte Phage wurde titriert und dann dadurch vermehrt, indem man Phagen-kompetente E. coli Y1090-Zellen (Übernachtkultur, gewachsen in LB-Medium mit 0,2% Maltose und 10 mM MgSO₄) mit Verdünnungen der Phagen infizierte, diese bei Raumtemperatur für 20 Minuten inkubierte und die Bakterien dann in Topagar auf LB-Agarplatten mit 100 μg ml^–1 Ampicillin ausstrich.
Herstellung der Hämoglobinfraktion
Reife F. hepatica-Egel wurden aus den Gallengängen von infizierten Lebern von befallenen Rindern eines örtlichen Schlachthofes in Irland entfernt. Die Egel wurden sechs mal in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS), pH 7,3, gewaschen, und in RPMI-1640, pH 7,3, enthaltend 2% Glucose, 30 mM HEPES und 25 mg ml^–1 Gentamycin bei 37°C für 18 Stunden gehalten. Auf diese Inkubationsperiode folgend, wurde das Kulturmedium entfernt, bei 12,000 × g für 30 Minuten zentrifugiert und der Überstand (ES Produkte) gesammelt und bei –20°C gelagert.
500 ml des ES Produkts wurden in einer Amicon 8400 Ultrafiltrationseinheit (Danvers, MA, USA) mit einer YM3-Membran (3,000 Mw Ausschlussgrenze) auf 15 ml aufkonzentriert. Die aufkonzentrierte Probe wurde bei 12,000 × g für 30 Minuten zentrifugiert und auf eine 340 ml Sephacryl S-200 Säule, die mit 0,1 M Tris-HCl, pH 7,0, bei 4°C äquilibriert wurde, aufgetragen. Fraktionen (5 ml) wurden, nachdem das Durchlaufvolumen durchgelaufen war, gesammelt. Die Extinktion des Eluats wurde mittels eines Atto UV Monitors bei 280 nm aufgezeichnet. Die Fraktionen, die Hämoprotein enthielten (gelbfarbig), wurden zusammengegeben und in einer Amicon 8050 Ultrafiltrationseinheit auf 5 ml aufkonzentriert. Dieses Konzentrat wurde als Hämoglobinfraktion (Hf) bezeichnet.
Herstellung der Seren zum Immunscreening
Die cDNA-Genbank wurde mittels eines Pools aus Seren von Tieren, die mit der Hämoglobinfraktion (Hf), wie oben beschrieben, geimpft wurden, immunologisch gescreent. Die Seren wurden auf drei Impfungen mit Hf und vor einem früheren Parasitenbefall erhalten. Vor der Verwendung wurden die Seren voradsorbiert, um alle Antikörper, die auf E.coli-Proteine reagieren, zu entfernen. Dies wurde erreicht, indem man die Seren mit Nitrozellulosedisks, die gebundene E.coli-Proteine enthielten, bei Raumtemperatur für 6 Stunden inkubierte. Dieses Adsorptionsverfahren wurde drei mal wiederholt. Die Disks wurden vorbereitet, indem man die Disks in ultraschallbehandeltem Extrakt aus E.coli-Zellen (10 × 30 Sekunden-Stöße, Arbeitszyklus 0,7 Sekunden) für 24 Stunden bei 4°C inkubierte, und dann die Überschussstellen mit 1%BSA/T-PBS blockte. Die Seren wurden mit Disks inkubiert, abgetrennt, zentrifugiert und bei 4°C bis zum Gebrauch gelagert.
Immunscreening der λ Genbank
Phagenkompentente E. coli Y1090 wurden mit einer 1:50 Verdünnung aus Phagen infiziert. Auf eine 20 minütige Inkubation bei Raumtemperatur folgte das Ausplattieren der Zellen in Topagar, auf LB Ampicillin-Platten und das Inkubieren bei 42°C, bis Plaques sichtbar wurden (ca. 3 Stunden). Nitrocelluosedisks, welche in 10 nM IPTG getaucht und luftgetrocknet wurden, wurden vorsichtig auf den Platten platziert und deren Ausrichtung wurde durch drei Nadelstiche markiert. Die Platten wurden 4 Stunden bei 37°C inkubiert, danach wurden die Disks vorsichtig entfernt und über Nacht in 1% BSA/T-PBS geblockt, bevor sie schließlich mit den vor-adsorbierten Rinderseren (1:500 Lösung) getestet wurden. Nach dem Waschen in T-PBS hin wurden gebundene Antikörper mittels mit alkalischer Phosphatase markierten anti-Rinder IgG mit NBT und BCIP als Substrat nachgewiesen. Positive Plaques erschienen als lila Ringe. Diese Plaques wurden als Agarpfropfen mittels einer sterilen Pasteurpipette entfernt, und in 1 ml Phagenpuffer (10 mM MgSO₄, 100 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl, pH 7,4) gebracht und man ermöglichte ihnen bei 4°C über Nacht zu diffundieren. Einzelne Phagen wurden wieder ausgestrichen und das Antikörperscreening wurde zweimal zusätzlich wiederholt oder bis man reine Plaques erhielt, z.B. wenn alle Plaques auf einer Platte mit dem Antikörper reaktiv waren.
3. Herstellung der λ-Lysate und Isolierung der DNA
Isolierte Plaques wurden in 200 μl 0,1 × SM Puffer (0,01% Gelatine, 8 mM MgSO₄, 100 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 7,5) aufgenommen und über Nacht bei 4°C inkubiert. 100 μl wurden dazu verwendet, um kompetente Y1090 Zellen zu infizieren, welche wie zuvor ausgestrichen wurden und bei 42°C inkubiert wurden, bis konfluente Lysis beobachtet werden konnte (ca. 5 Stunden) 4 ml 0,1 × SM Puffer wurde zu der Platte hinzugefügt, und nach einer Inkubation über Nacht bei 4°C wurde die Pufferlösung wieder entfernt. Chloroform wurde hinzugegeben (Endkonzentration 0,5%) und das Lysat wurde bei 4°C gelagert bis es benötigt wurde.
4. PCR-Analyse der λ DNA

Die Polymerase Kettenreaktion (PCR) wurde angewandt, um die Inserts aus der Phagen-Genbank mittels Universal-λ-Primer zu isolieren und deren Größe abzuschätzen. Diese Primer sind aus der Sequenz, die die EcoR1 Klonierungsstelle des λ gt11-Vektors flankiert, abgeleitet. 20 μl des aufbewahrten Lysates wurden zu 180 μl Wasser gegeben und 10 Minuten gekocht und anschließend wurde 1 μl pro 50 μl PCR verwendet. Jedes PCR-Gefäß beinhaltete folgende Mischung:

10 × Polymerase Puffer	5,0 μl
dNTP's (je 1 mM)	5,0 μl
MgCl₂ (25 mM)	6,0 μl
Steriles destilliertes Wasser	30,7 μl
λ Vorwärtsprimer (50 ng μl^–1)	1,0 μl
λ Rückwärtsprimer (50 ng μl^–1)	1,0 μl
Taq Polymerase (5U μl^–1)	0,3 μl
λ Lsyat DNA	1,0 μl

Jede Mischung wurde mit 70 μl Mineralöl bedeckt, in einen Hybaid Omnigene Thermo Cycler gegeben, und die PCR wie folgt durchgeführt:

Stufe 1	(Denaturierung)	4 Minuten bei 94°C
Stufe 2	(Denaturierung)	30 Sekunden bei 94°C
	(Abkühlung)	1 Minute bei 55°C
	(Extension)	1 Minute 30 Sekunden bei 74°
	Stufe 2 wurde 35 Zyklen lang wiederholt
Stufe 3	(Extension)	4 Minuten bei 74°C

25 μl der PCR-Reaktionen wurden durch Agarose-Gelelektrophorese analysiert, wie in Sambrook et al (1989) genauer beschrieben.
5. Subklonieren der PCR-Fragmente
PCR-amplifizierte Genfragmente wurden aus dem Gel herausgeschnitten. Die Agarose wurde mittels Glaskügelchen zerstört, und die isolierte DNA wurde mittels dem Wizard^TM DNA Clean-up System (Promega) gereinigt. Die Fragmente wurden dann wie folgt direkt in das pGem^®-T-Plasmid subkloniert:
1 μl (25 ng) pGem^® T-Vektor, 8 μl Ligase-Puffer (10 mM ATP, 100 mM MgCl₂, 100 mM DTT, 300 mM Tris-HCl, pH 7,8), 1 U T4-DNA-Ligase und 100 ng Insert-DNA wurden behutsam gemischt und die Ligation konnte über Nacht bei 4°C erfolgen.
Kompetente Zellen wurden mittels einer der folgenden Methoden hergestellt:
(a) Calciumchlorid-Transformation
Eine E.coli-JM109-Zellkultur in der Log-Phase wurden aliquotiert, 5 Minuten auf Eis gegeben, bei 12,000 × g 2 Minuten zentrifugiert und der Überstand entfernt. Die Zellen wurden vorsichtig mit 1 ml kaltem CaCl₂ resuspendiert und auf Eis 30 Minuten inkubiert. Die Zellen wurden erneut zentrifugiert und in 0,5 ml kaltem CaCl₂ resuspendiert. 10 μl Ligations-Mischung wurden behutsam zu 50 μl-Aliquots der Zellen gegeben und für weitere 30 Minuten auf Eis gegeben. Die Zellen wurden dann bei 42°C 90 Sekunden Hitzeschock-behandelt und 2-5 Minuten zum Eis zurückgegeben. Sofort nach der Transformation wurden 950 μl vorgewärmtes LB-Medium hinzugegeben und die Zellen 1 Stunde bei 37°C inkubiert. Die Zellen wurden durch Zentrifugieren aufkonzentriert und auf LB-Platten mit 100 μg ml^–1 Ampicillin, 0,5 mM IPTG und 40 μg ml^–1 X-Gal (zur blau/weiß Selektion) ausgestrichen.
(b) Elektroporation
Eine Kultur aus elektrokompetenten E.coli XL1-Blau Zellen in der Log-Phase wurde durch Zentrifugieren aufkonzentriert und aliquotiert. 2,5 μl Ligations-Reaktionslösung wurde zu 300 μl Zellen gegeben, vorsichtig gemischt und in 0,2 μm Elektroporations-Küvetten gegeben. Die Zellen wurden dann durch Elektroporation unter folgenden Bedingungen transformiert: der Pulsgenerator wurde auf 25 μF, 2,48 kV und 200 Ω gestellt. Ein Impuls bei dieser Einstellung führt zu einem Impuls von 12,5 kV cm^–1 mit einer Zeitkonstante von ca. 4 Sekunden. 1 ml vorgewärmtes SOC-Medium (20 mM Glukose enthaltend) wurde sofort hinzugefügt und die Zellen wurden dann bei 37°C 1 Stunden inkubiert, bevor sie wieder wie zuvor konzentriert und ausgestrichen wurden. Die Platten mit den ausgestrichenen Zellen wurden über Nacht bei 37°C inkubiert.
6. Screening der rekombinanten Plasmide
Bei X-Gal und IPTG Farbscreening sollten rekombinante Kolonien weiß und Kolonien ohne Insert-DNA blau sein. Weiße Kolonien wurden in 2 ml LB mit 100 μg ml^–1 Ampicillin (und μg ml^–1 Tetracylin für XL-Blau Zellen) gegeben und über Nacht bei 37°C inkubiert. Plasmid-DNA aus 1 ml dieser präparierten Minikultur wurde isoliert durch Kochen oder durch die Alkali-Lyse-Methode, beschrieben von Sambrook et al (1989). Die DNA wurde zweifach verdaut mit den Restriktionsenzymen SacI und ApaI und die Insert mit Agarose-Gelelektrophorese untersucht.
7. Sequenzierung der Plasmid-DNA
Gereinigte Plasmid-DNA aus positiven Klonen wurde weiter mittels Wizard^TM λ preps gereinigt. Die DNA wurde zur Sequenzanalyse zum Department of Biological Sciences, Duham University oder BioResearch Ireland, Trinity College Dublin, geschickt.
8. Herstellung des Fusionsproteins
Die Sequenzanalyse ergab, dass Klon B1 ein neues Egelantioxidans-Protein (Peroxiredoxin) war und dazu weiter charakterisiert wurde. Das Fusions-Protein aus dem λ B1 Klon wurde durch die Plattenwasch-Überstandsmethode hergestellt. Phagen-kompetente E.coli Y1090 wurden mit 10,000 pfu rekombinanten Phagen infiziert und 20 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert, bevor sie auf LB-Ampicillin Platten in Topagar gegeben wurden. Die Platten wurden bei 42°C 3 Stunden inkubiert (Lyse fast konfluent), dann wurden 5 ml Phagenpuffer, der 1 mM EDTA, 1 mM PMSF, 1 mM Iodacetamid und 10 mM IPTG enthielt, zu den Platten hinzugegeben, welche dann über Nacht bei 37°C inkubiert wurden. Der Puffer wurde wieder entfernt und das Topagar wurde auch in ein Zentrifugationsröhrchen gegeben. Dieses wurde für 20 Sekunden verwirbelt, bevor es bei 10,000 × g 10 Minuten bei 4°C zentrifugiert wurde. Der Überstand wurde in Mikrozentrifugen-Röhrchen gegeben und noch einmal bei 12,000 × g zentrifugiert. Der Überstand wurde bei –20°C gelagert, bis er benötigt wurde.
Das Fusionsprotein wurde mittels reduzierender SDS Polyacrylamid-Gelelektrophorese, gefolgt von Silberfärbung und durch Immunoblotting mittels eines Anti-β Galactosidase Primärantikörpers analysiert.
9. Herstellung der radioaktiv-markierten DNA-Sonde
Ein 400 bp langes Fragment wurde mittels den folgenden Consensus-Primern, abgeleitet aus dem Vergleich von Proteinsequenzen der Peroxiredoxin-Antioxidansfamilie, aus Klon B1-DNA PCR-amplifiziert. Diese Primer kreuzten die Bereiche, die für die konservierten Bereiche des aktiven Zentrums codieren, Cys 47 (VCP 47) und Cys 168 (VCP 168).
VCP 47 Vorwärtsprimer (Shem F)
5'GAT TTY ACW TTY GTN TGT CCW ACW GAR-3'
VCP 168 Rückwärtsprimer (SmTSAR)
5' GGW CAN ACY TCW CCA TGY TC-3'
wobei Y = T oder C, W = A oder G und N = T C, A oder G ist

Das PCR-Produkt wurde aus dem Agarosegel herausgeschnitten und wie zuvor gewaschen. Das Fragment wurde mit Alpha ³²P durch Zufallspriming mittels dem Promega Prime-a-Gene(R) Systems markiert. Folgende Reaktionsmischung wurde verwendet:

5 × Markierungspuffer	10 μl
(250 mM Tris-HCl, pH 8,0, 25 mM MgCl₂, 10 mM DTT,
1 mM HEPES, pH 6,6,
26 A₂₆₀ Einheiten ml^–1 Zufallshexadeoxyribonukleotide
Mischung aus dCTP, dGTP, dTTP (je 100 mM)	2 μl
Acetyliertes BSA 10 mg ml^–1	2 μl
Denaturierte DNA-Sonde	25 ng
Steriles Wasser	25 μl
Alpha ³²P dATP (50 μCi, 3,000 Ci mMol^–1)	5 μl
Klenow Enzym	5 U

Das Reaktionsgefäß wurde vorsichtig durchmischt und bei Raumtemperatur 1 Stunde inkubiert. 200 μl 0,5 M EDTA wurde hinzugegeben und die Reaktion durch 2 Minuten langes Kochen terminiert. Die Sonde war jetzt fertig zur Verwendung in Hybridisierungsreaktionen.
10. Isolierung der RNA und Northern-Blotting
(a) Isolierung von RNA aus adulten Egeln
Reife Egel wurden über Nacht in RPMI-1640, pH 7,3, enthaltend 2% Glukose, 30 mM HEPES und 25 mg/l Gentamycin kultiviert, um das Abscheiden von Darminhalt, welcher Wirtszellen enthalten könnte, zu ermöglichen. Annähernd 10 Egel (1 Gramm Gewebe) wurden in ein Zentrifugen-Röhrchen gegeben, 5 ml RNAzol^TM wurde hinzugegeben und die Egel wurden bei maximaler Geschwindigkeit 20 Sekunden mittels eines Thyristor Regler TR50 Homogenisator homogenisiert. 1 ml Chloroform wurde hinzugefügt und die Lösung wurde 15 Sekunden kräftig geschüttelt und für 5 Minuten auf Eis gegeben. Nach der Aliquotierung in Mikrozentrifugen-Röhrchen wurde die Lösung 15 Minuten bei 4°C und 13,000 × g zentrifugiert und zwei Schichten bildeten sich aus. Die obere, wässrige Phase wurde in ein neues Röhrchen gegeben, eine gleiche Menge Isopropanol wurde hinzugegeben und die Proben wurden bei 4°C 15 Minuten inkubiert (oder zur Langzeitlagerung bei –80°C aliquotiert). Sie wurden erneut für 15 Minuten zentrifugiert, der Überstand wurde entfernt und das RNA-Pellet mit 75% Ethanol gewaschen, bevor es getrocknet wurde und mit 200 μl 0,1% DEPC behandeltem Wasser rekonstituiert wurde. Rinder-RNA wurde mittels der gleichen Prozedur mit 1 g frischer Rinderleber als Startmaterial isoliert. Die RNA wurde durch Elektrophorese auf Agarosegel, Formaldehyd enthaltend, analysiert, wie in Sambrook et al (1989) genauer beschrieben.
(b) Northernblotting
Nach der Elektrophorese wurde das Gel mit DEPC-behandeltem Wasser gespült, um das Formaldehyd zu entfernen und die RNA wurde durch die Kapillar-Transfermethode, beschrieben durch Sambrook et al (1989), auf Nitrozellulosemembran übertragen. Die RNA-Fragmente werden vom Gel in einem Fluss aus Pufferlösung transportiert und auf der Oberflä che der Nitrozellulose abgeschieden. Nach dem Transfer wurde die RNA auf der Membran durch 2 Stunden langes Backen bei 80°C in einem Ofen fixiert.
(c) Hybridisierung mit einer radioaktiv-markierten Sonde
Der Nitrozellulosefilter wurde in 6 × SSC (0,9 M NaCl, 90 mM Natriumcitrat pH 7,0) getränkt, bis er gründlich befeuchtet war, und in einen hitzeversiegelbaren Beutel gegeben. Dann wurden 200 ml Vorhybridisierungslösung (6 × SSC, 5 × Denhardt-Reagenz, 0,5% SDS, 100 μl ml^–1 denaturierte, fragmentierte Lachssperma-DNA) in den Beutel gegeben. So viel Luft wie möglich wurde aus dem Beutel gedrückt, der dann versiegelt und über Nacht bei 68°C inkubiert wurde. Nach der Inkubation wurde der Beutel durch die Entfernung einer Ecke geöffnet und die radioaktiv-markierte Sonde wurde hinzugegeben. Der wiederversiegelte Beutel wurde in einen zweiten versiegelten Beutel gegeben und wieder 24 Stunden bei 68°C inkubiert. Die Hybridisierungslösung wurde vorsichtig in einen passenden Behälter gegossen und die Filter entfernt und sofort in 300 ml 2 × SSC und 0,1% SDS getaucht. Die Filter wurden unter leichter Bewegung bei Raumtemperatur 15 Minuten inkubiert. Die Waschlösung wurde zweimal ersetzt und die Inkubation wiederholt. Dann wurde 0,1 × SSC und 0,5% SDS zu den Filtern gegeben, welche dann weiter bei 68°C 1 Stunden inkubiert wurden. Die Filter wurden mit 0,1 × SSC gespült um SDS zu entfernen, kurz auf Papierhandtücher geblottet und in Frischhaltefolie gewickelt, und damit ein Röntgenfilm bei –80°C belichtet, um eine autoradiographische Abbildung zu erhalten. Eine 24 Stunden lange Belichtung bei 80°C mit einer Verstärkerfolie wurde benötigt, um ein Bild zu erhalten.
11. Assay eines Extrakts aus reifen Egeln auf neuartige Antioxidans-Aktivität
Die Antioxidans-Aktivität im Extrakt aus reifen Leberegeln wurde durch die Darstellung seiner Fähigkeit zur Inhibitierung der Thiol/Eisen/Sauerstoff-vermittelten Inaktivierung der Glutamin-Synthetase gemessen. Die Untersuchungen wurden in Mikrotiter-Platten in einem 100 μl Reaktionsvolumen, das 0,5 U Glutaminsynthetase (E. coli) enthält, bei Anwesenheit oder Abwesenheit von Inaktivierungslösungen und Potektorprotein (Leberegelhomogenat) durchgeführt. Die Inaktivierungslösungen bestanden aus 15 μM FeCl₃ und entweder 5 mM DTT oder 14 mM 2-Mercaptoethanol (Endkonzentrationen). Nach der 10-minütiger Inkubation bei 37°C wurde die verbliebene Glutaminsynthetase-Aktivität durch Zugabe von 100 μl γ Glutamyltransferase-Assaymischung gemessen. Diese enthielt 0,4 mM ADP, 150 mM Glutamin, 10 mM Kaliumarsenat, 0,4 mM Manganchlorid, 20 mM Hydroxylammoniumchlorid in 50 mM Imidazol-HCl, pH 7,0. Die Reaktion wurde 30 Minuten bei 37°C inkubiert und durch die Zugabe von 50 μl Stopmischung, bestehend aus 55 g FeCl₃ × 6H₂O, 20 g Trichloressigsäure und 21 ml konzentrierte HCl pro Liter, terminiert. Eine Extinktion, resultierend aus dem γ Glutamylhydroxamat-Fe³⁺-Korn plex, wurde bei 540 nm gemessen. In Abwesenheit des „Protektorproteins" unter diesen Bedingungen gingen 70 bis 100% der Glutaminsynthetase-Aktivität verloren.
12. Immunscreening der F. hepatica cDNA-Genbank und Analyse der isolierten Klone durch PCR und Restriktionsverdau
Rinderseren aus dem Vakzinversuch wurden dazu verwendet, eine F. hepatica cDNA-Genbank, konstruiert in einem λ gt11 Phagen, zu screenen. Den verwendeten Serumpool erhielt man am Tag des Parasitenexposition (Woche 11) von Tieren, die mit der Hämoglobinfraktion (Hf) immunisiert wurden. Diese Tiere zeigten einen mittleren Schutzgrad gegen Parasitenbefall von 43,8%. Diese Seren sollten Antikörper enthalten, die mit Hämoglobin und jedem anderen Antigen, das in der Immunisierungsfraktion enthalten ist, reagieren

10 Platten mit je ca. 2,000 pfu wurden im ersten Screening mit einer 1:500 Lösung aus vor-adsorbierten Seren verwendet. 30 positive Plaques wurden ausgewählt und diese wurden drei oder vier weiteren Screeningrunden unterzogen, bis alle Plaques auf den Platten positiv waren, was auf reine Klone hinwies. Lysate aus positiven Plaques wurden dann hergestellt und die DNA durch PCR mittels λ Vorwärts- und Rückwärtsprimern analysiert. Von den 30 positiv ausgewählten produzierten nur 20 PCR-Produkte; die übrigen 10 wurden daher nicht weiter berücksichtigt. Die Klone wurden auf Basis der Größe des PCR-Fragments klassifiziert (Figur 1).

Gruppe	Größe des Fragments	Klone
1	~ 1700 bp	D6
2	~ 1600 bp	B5 & D5
3	~ 1400 bp	A1, A4, A5, B1, B4, B6, E3
4	~ 1100 bp	C4
5	~ 1000 bp	C2, D1, D7, E2
6	~ 900 bp	D8
7	~ 700 bp	C1 & D3
8	~ 650 bp	A8
9	~ 550 bp	E4

13. Subklonieren der Phageninserts
Das Subklonieren wurde mit D6 der Klongruppe 1 (1700 bp) und B1 der Gruppe 3 (1400 bp) durchgeführt. Die λ PCR-Produkte dieser beiden Klone wurden direkt in das pGem^®-T-Plasmid subkloniert. Weiße Kolonien wurden ausgewählt und durch Doppelverdau mit SacI- und ApaI-Restriktionsenzymen gescreent. Ein Klon mit einem 1600-1700 bp langem Insert wurde aus D6 isoliert und ein 1400-1500 bp langes Insert erhielt man aus Klon B6.
14. Sequenzanalyse von Klon D6
Die DNA der rekombinanten Plasmide wurden wie üblich sequenziert, anschließend folgte die Reinigung mit Wizard^TM λ Preps. Aus Klon D6 erhielt man eine Teilsequenz von ca. 420 Basen. Die abgeleitete 141 Aminosäuresequenz wurde mit den Sequenzen aus verfügbaren Datenbanken verglichen und es wurde beobachtet, dass diese eine deutliche Homologie mit dem C-terminalen Ende von β-Tubulinen aus verschiedenen Organismen aufweist. β-Tubuline sind Proteine mit einer Länge von 440-450 Aminosäuren, entsprechend ca. 1320 Basen, deshalb könnte Klon D6 mit ca. 1700 Basen das komplette F. hepatica β-Tubulin-Gen enthalten. 2 zeigt das Alignment der D6-Teilsequenz mit β-Tubulin aus Toxoplasma gondii. In der Überlappungsregion zeigt die D6-Sequenz 64% Identität und 73% Ähnlichkeit mit dem C-Ende des Protozoen-Tubulins.
15. Sequenzanalyse des Klons B1
Das Klon B1-Insert wurde durch PCR-Amplifikation mittels λ-Primern auf eine Länge von ca. 1400 bp geschätzt. Nahezu 1200 Basen des Inserts wurden in 5'-3'-Richtung sequenziert. Dies ergab einen Startcodon ATG und ein offenes Leseraster von ca. 580 Basen, endend mit dem Stop-Codon TAG im Raster. Abwärts des Stop-Codons befand sich ein Abschnitt von etwa 20 Adeninresten (Poly-A-Schwanz), gefolgt von zwei Polyadenylierungssequenzen, AAAATAAA und AATA, was zeigt, dass der Klon an seinem 3'-Ende komplett war. Die DNA hat eine nicht translatierte 5'-Region von ca. 200 Basen Länge und eine nicht translatierte 3'-Region von ca. 700 Basen Länge.
Für Klon B1 ist vorhersagbar, dass er für ein Protein von 194 Aminosäuren Länge, mit einem errechneten Molekulargewicht von 21,646 Da, kodiert. Wenn damit eine Proteinsequenzdatenbank gescreent wurde, zeigte die vorhergesagte Aminosäuresequenz eine höchst signifikante Übereinstimmung mit einer neuen Familie der Antioxidans-Proteine, der Peroxiredoxin-Familie. Das Alignment von Klon B1 mit Thiol-spezifischem Antioxidans der Ratte (TSA, GenBank Zugangsnr. P35704), menschlichem, natürliche Killerzellen stimulierendem Faktor B (NKEF B, Zugangsnr. P31945), mit menschlichem, Proliferation-assoziiertem Gen (PAG, Zugangsnr. X67951), mit menschlichem TSA (Lim et al., 1994, Zugangsnr. P35701), und mit Onchocerca volvulus TSA (Zugangsnr. 009385) wird in 3 gezeigt.
Das Protein mit der höchsten Identität ist Ratten-TSA; 57% und 74,6% Ähnlichkeit. Die anderen Übereinstimmungen sind wie folgt: menschlicher NKEF B 56,9% (71,5% Ähnlichkeit), menschliches PAG 53,8% (73,0% Ähnlichkeit), menschliches TAG 53,7% (71,0% Ähnlichkeit) und Onchocerca volvulus TSA 2,0% (33,7% Ähnlichkeit). Ähnlichkeit konnte über die gesamte Länge des Proteins beobachtet werden und zwei höchst konservierte Domänen wurden beobachtet. Die Erste von diesen ist eine 16 Aminosäurenabschnitt bei etwa den Positionen 40-60, – F Y P L D F T F V C P T E I I A –. Die zweite, kürzere Domäne – H G E V C P A – wurde bei etwa den Positionen 165-175 gefunden.
16. Die Expression des Fusionsproteins durch Klon B1
Die Plattenwäsche-Überstandsmethode wurde dazu verwendet, um Fusionsproteine aus Klon B1-Phagen zu machen. Der resultierende Überstand und Überstand von E. coli, infiziert mit Wildtyp-Phagen, wurden auf reduzierender SDS PAGE (4A) analysiert. In dem Wildtypversuch wurde ein Protein beobachtet, welches das gleiche Molekulargewicht wie β-Galactosidase hat (Bahn 1). Im B1-Überstand fehlte dieses Protein, aber ein größeres Protein mit einem Molekulargewicht von ca 160 kDa, das nicht beim Wildtyp gefunden wurde, konnte beobachtet werden (Bahn 2). Um zu bestimmen, ob dies das Fusionsprotein war, wurde das Gel auf Nitrocellulosepapier geblottet und mit anti-β-Galactosidase-Antikörpern (4B) sondiert. Die Bindung des Antikörpers an das große Protein bestätigte dessen Identität als β-Galactosidase-Fusionsprotein (Bahn 2). Der Antikörper band auch an das Wildtyp-β-Galactosidasemolekül (Bahn 1) und an zahlreiche andere Proteine, die beiden Überständen gemeinsam sind.
17. Northernanalyse
Die Primer, die man aus den erhaltenen Domänen der Antioxidans-Proteine (um die VCP-Motive etwa bei den Positionen 50 & 170) entwarf, wurden dazu verwendet, ein DNA-Fragment von ca. 400 bp Länge zu amplifizieren. Dieses wurde ³²P-markiert und dazu verwendet, sowohl F. hepatica- als auch Rinder-RNA zu sondieren, welche vor dem Blotten auf Agarosegel analysiert wurden. Ein einzelnes Transkript von ca. 750 kb Länge wurde in der F. hepatica-RNA gefunden (5 Bahn 1). Keine Peroxiredoxin-ähnliche Bindung konnte in der Rinder-RNA beobachtet werden (5 Bahn 2).
18. Antioxidansaktivität des Extrakts aus reifen Egeln
Antioxidansaktivität wurde als die Fähigkeit gemessen, einer Inaktivierung von Glutaminsynthetase durch ein gemischtes Eisen-Thiol-Inaktivierungssystem vorzubeugen. 6 zeigt die Inaktivierung von Glutaminsynthetase durch Eisen und DTT in Anwesenheit von verschiedenen Gehalten von Leberegelhomogenat (LFH). Die Inkubation von Glutaminsynthetase mit Eisen und DTT führt zu einer 70%igen Abnahme der Enzymaktivität. Die Anwesenheit von LFH stellt einen dosisabhängigen Schutz bereit, wobei 0,3 mg, 0,6 mg und 0,9 mg LFH, 50%, 61% bzw. 75% Glutaminsynthetaseaktivität wiederherstellten.
Bibliographie

Lim., Y.S., Cha, M.K., Kim, H.K. und Kim, I.H. 1994. The thiol-specific antioxidant protein from human brain: gene cloning and analysis of conserved cysteine regions. Gen 140, 279-284.
Nagel, S.D. und Boothroy, J.C. 1988. The a and b tubulins of Toxoplasma gondii are encoded by single copy genes containing multiple copy introns. Molecular and Biochemical Parasitology 29, 261-273.
Rajasekariah et al. (1979), Parasitology 79, 393-400.
Sambrook, J., Fritsch, E.F. und Maniatis, T. 1989. In☐ Molecular Cloning: A Laboratory Manua. 2. Edition Cold Spring Harbour Laboratory Press.
UK Patent-Nr. 2169606B
WO94/09142
WO94/28925
WO96/10583

SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Vakzinzusammensetzung zur Verwendung bei der Bekämpfung einer Parasiteninfestation von Helminthen in einem Säuger, wobei das antigene Material ein Peroxiredoxinmolekül aus Fasciola hepatica, das im Wesentlichen der in 4 gezeigten Aminosäuresequenz entspricht, in zumindest teilweise gereinigter Form, zusammen mit einem Träger und/oder Adjuvans umfasst.
Vakzin nach Anspruch 1, worin die in dem Vakzin enthaltenen antigenen Moleküle zu wenigstens 75% rein sind.
Vakzin nach Anspruch 2, worin die in dem Vakzin enthaltenen antigenen Moleküle zu wenigstens 95% rein sind.
Vakzin nach einem der Ansprüche 1 bis 3, außerdem umfassend eine oder mehrere zusätzliche antigene Determinanten zur Bildung eines polyvalenten Vakzins.
Vakzin nach Anspruch 4, worin die zusätzlichen antigenen Determinanten Cathepsin-L-Typ-Antigen und/oder Dipeptidylpeptidase-Antigen und/oder ein Haemoprotein-Antigen und/oder ein β-Tubulin-Antigen sind.
Verwendung von Peroxiredoxinmolekülen gemäß der Definition in Anspruch 1 zur Herstellung einer Vakzinzusammensetzung zur Bekämpfung einer Parasiteninfestation von Helminthen in einem Säuger.
Verfahren zur Herstellung eines Vakzins gemäß der Definition in einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei man das gereinigte Peroxiredoxin und ein oder mehrere Adjuvantien oder Träger miteinander kombiniert.
DNA-Molekül, kodierend für ein Peroxiredoxinmolekül, dessen Nukleinsäuresequenz in 4 gezeigt ist.
Protein mit der Aminosäuresequenz gemäß 4.
Vektor, umfassend eine oder mehrere Nukleotidsequenzen gemäß der Definition in Anspruch 8.
Transformierte Wirtszelle, umfassend den Vektor gemäß Anspruch 10.
Verfahren zur Herstellung von rekombinanten Peroxiredoxinpolypeptiden, wobei man transformierte Wirtszellen gemäß Anspruch 11 kultiviert und die Peroxiredoxinpolypeptide aus den kultivierten Zellen isoliert.
Formulierung eines Lebendvakzins oder inaktivierten Vakzins, umfassend ein attenuiertes oder virulentes Virus oder eine Wirtszelle, worin ein Nukleinsäuremolekül gemäß der Definition in Anspruch 8 insertiert ist, welches die Fähigkeit besitzt, eine Immunantwort gegen Polypeptide hervorzurufen, welche von dem insertierten Nukleinsäuremolekül kodiert werden.