DE69034218T2

DE69034218T2 - Impfstoff und Diagnostikum für den Schweine-Cholera-Virus

Info

Publication number: DE69034218T2
Application number: DE69034218T
Authority: DE
Inventors: Gregor Meyers; Tillmann Rümenapf; Heinz-Jürgen Thiel
Original assignee: Akzo Nobel NV
Current assignee: Intervet International BV
Priority date: 1989-03-19
Filing date: 1990-03-12
Publication date: 2006-12-28
Anticipated expiration: 2010-03-13
Also published as: CN1047531A; JPH03164181A; DK0389034T4; EP0713915A1; EP1087014B1; ES2063897T5; DK1087014T3; KR0179993B1; NZ232947A; ES2063897T3; EP0614979B1; DE69034218D1; DK0614979T3; DE69012386D1; AU5145190A; HU901571D0; EP0389034B2; DE69012386T3; AU632545B2; HUT56286A

Description

Technischer Hintergrund der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft eine Nukleinsäure-Sequenz, ein rekombinantes Nukleinsäuremolekül, umfassend solch eine Nukleinsäure-Sequenz, ein rekombinantes Expressionssystem, umfassend solch ein rekombinantes Nukleinsäuremolekül, ein Polypeptid, welches für den Schweine-Cholera-Virus charakteristisch ist, einen Impfstoff, umfassend solch ein Polypeptid oder ein rekombinantes Expressions-System, sowohl als auch ein Verfahren zur Herstellung solcher Impfstoffe.
Das klassische Schweine-Fieber oder Schweine-Cholera (HC = Hog Cholera) stellt eine ökonomisch wesentliche Krankheit bei Schweinen in vielen Ländern weltweit dar. Unter natürlichen Bedingungen ist das Schwein das einzig bekannte Tier, welches für HC empfindlich ist. Die Schweine-Cholera ist eine hochansteckende Krankheit, welche die Degeneration der Kapillarwände hervorruft, was zu schweren Blutungen und Nekrose der inneren Organe führt. Zuerst ist die Schweine-Cholera durch Fieber, Anorexie, Übergeben und Durchfall gekennzeichnet, was bei einem chronischen Verlauf der Krankheit gekennzeichnet sein kann durch Unfruchtbarkeit, Aborte und schwache Würfe der Säue. Allerdings sterben fast alle Schweine innerhalb von zwei Wochen, nachdem die ersten Symptome aufgetreten sind.
Das auslösende Agens, das Schweine-Cholera Virus (HCV), ist in struktureller und serologischer Weise mit dem bovinen viralen Diarrhö-Virus (BVDV) der Rinder und dem sogenannten Grenzkrankheitsvirus oder „Border Disease Virus" (BDV) der Schafe verwandt. Diese Viren werden zusammen gruppiert als die Gattung der Pestiviren innerhalb der Familie der Togaviridae. Die Natur des genetischen Materials der Pestiviren ist seit langem bekannt als RNS, d.h. positiv strängige RNS, die wesentliche Polyadenylierung vermissen lässt. Das HCV umfasst wahrscheinlich 3-5 Strukturproteine, von denen zwei möglicherweise glykosyliert sind. Die Anzahl von viralen Nichtstruktuproteinen ist unbekannt.
Modifizierte HCV-Impfstoffe (umfassend abgeschwächte oder getötete Viren) zum Bekämpfen von HC-Infektionen sind entwickelt worden und derzeit in Anwendung. Dennoch führt die Infektion von Gewebe-Kultur Zellen, um HCV Material zu erhalten, welches in diesen besagten modifizierten Virus-Impfstoffen eingesetzt wird, zu geringen Virus-Ausbeuten und die Virionen sind schwierig zu reinigen. Modifizierte Lebend-Virus-Impfstoffe umfassen immer das Risiko, die Tiere mit teilweise abgeschwächtem pathogenen HCV zu inokulieren, welches immer noch pathogen ist und zum Ausbruch der Krankheit in dem inokulierten Tier oder seiner Nachkommenschaft führen kann und zur Kontamination durch andere Viren im Impfstoff. Zusätzlich kann das abgeschwächte Virus in den virulenten Zustand zurückkehren.
Es bestehen auch mehrere Nachteile beim Einsatz von inaktivierten Impfstoffen, d.h. das Risiko einer nur teilweisen Inaktivierung der Viren, das Problem, dass nur eine geringer Grad von Immunität erreicht wird, was zusätzliches Immunisieren erfordert, und das Problem, dass antigene Determinanten durch die Inaktivierungs-Behandlung verändert werden, das inaktivierte Virus weniger immunogen lässt.
Weiterhin ist die Verwendung von modifizierten HCV-Impfstoffen nicht für Ausrottungs-Programme geeignet.
Bis jetzt sind – gemäss unserem Wissen – Diagnose-Tests für Schweine nicht verfügbar, die zwischen HCV oder BVDV Infektionen unterscheiden können. Dies ist wichtig, da die BVDV-Infektion bei Schweinen von geringerer Bedeutung als eine HCV-Infektion ist, was aussagt, dass BVDV infizierte Schweine nicht vernichtet werden müssen.
Impfstoffe, die nur das notwendige und relevante HCV-Immunogen-Material enthalten, welches fähig ist, eine Immun-Antwort gegen das Pathogen hervorzurufen, zeigen nicht die oben genannten Nachteile der modifizierten Impfstoffe.
Gemäss der vorliegenden Erfindung ist eine Nukleinsäure-Sequenz geschaffen worden, die ein Polypeptid kodiert, welches für das Schweine-Cholera Virus charakteristisch ist. Sowohl die Nukleinsäure-Sequenz als auch das Polypeptid oder Fragmente davon können eingesetzt werden zur Herstellung eines Impfstoffes, welcher nur das notwendigen und das relevante immunogene Material zur Immunisierung der Tiere gegen eine HCV-Infektion enthält. „Nukleinsäure-Sequenz" bezieht sich sowohl auf Ribonukleinsäure-Sequenz als auch auf Deoxy-Ribonukleinsäure-Sequenz.
Eine Nukleinsäure-Sequenz gemäss der vorliegenden Erfindung ist in der 2 dargestellt (SEQ ID: Nr. 1). Wie es im Stand der Technik wohl bekannt ist, gestattet die Degenerierung des genetischen Codes die Substitution von Basen in einem Codon, welcher in einem anderen Codon resultiert, der immer noch dieselbe Aminosäure codiert, beispielsweise der Codon für die Aminosäure Glutaminsäure ist sowohl GAT als auch GAA. Daher ist es klar, dass für die Expression eines Polypeptids mit der in der 2 dargestellten Aminosäure-Sequenz (SEQ ID: Nr. 1-2) eine Nukleinsäure-Sequenz verwendet werden kann, die eine solche alternative Codon-Zusammensetzung aufweist, die sich von der Nukleinsäure-Sequenz, die in der 2 dargestellt ist (SEQ ID: Nr. 1), un terscheidet.
Die in der 2 dargestellte Nukleinsäure-Sequenz (SEQ ID: Nr. 1) ist eine cDNS Sequenz, welche von der genomischen RNS des HCV abgeleitet ist. Die fortlaufende Sequenz ist 12284 Nukleotide lang und enthält einen langen offenen Leserahmen (ORF = open reading frame), startend mit dem ATG-Codon an der Position 364-366 und endend mit einem TGA-Codon als ein translatorischer Stop-Codon an der Position 12058 bis 12060. Dieses ORF besteht aus 3898 Codonen, die fähig sind, 435 kDa von Protein zu codieren.
In vivo, während der HCV-Replikation in einer infizierten Zelle, wird dieses Protein als eine Polyprotein-Vorläufer-Molekül synthetisiert, welches nachfolgend durch (enzymatische) Zerschneidung des Vorläufer-Moleküls in Fragment-Polypeptide verarbeitet wird. Diese Fragmente bilden nach möglichen post-translationalen Modifikationen die Struktur- und Nichtstruktur-Proteine des Virus. Eine bevorzugte Nukleinsäure-Sequenz enthält die genetische Information für solch ein Fragment mit immunisierenden Eigenschaften gegen HCV oder immunologischen Eigenschaften, die charakteristisch für HCV sind, oder enthält die genetische Information für einen Teil von solch einem Fragment, welches immer noch die immunisierenden Eigenschaften der immunologischen Eigenschaften hat, welche für HCV charakteristisch sind.
Ein fragment-codierender Bereich ist innerhalb der Aminosäuren-Position um 1-249, 263-487, 488-688, oder 689-1067 angeordnet. Der 1-249 Bereich stellt im Wesentlichen das Kern-Protein dar, wohingegen die Bereiche 263-487, 488-688 und 689-1067 im wesentlichen Glykoproteine von 33 kD, 44/48 kD und 55 kD darstellen. Innerhalb des Rahmens der Erfindung sind auch Nukleinsäure-Sequenzen umfasst, welche die genetische Information für einen oder mehrere der Codier-Bereiche umfassen, die oben angegeben worden sind, oder Teile davon.
Ein bevorzugter Bereich, der in einen Impfstoff gegen HCV-Infektionen einzusetzen ist, ist der Bereich, der dem 55 kD Protein von HCV entspricht oder ein Teil davon, welcher immer noch immunisierende Aktivität aufweist.
Weiterhin kann eine Nukleinsäure-Sequenz von mindestens den Codier-Sequenzen des besagten 55 kD-Proteins oder Teilen davon in vorteilhafter Weise entsprechend der vorliegenden Erfindung angewandt werden.
Zusätzlich kann ein bevorzugter Anteil des 55kD-Proteins des HCV, welcher zur Immunisierung von Schweinen gegen die HCV-Infektion eingesetzt werden kann, durch Analysen der HCV Löschungs-Mutanten mit monoklonalen Antikörpern bestimmt werden, die eine virusneutralisierende Aktivität ausüben. Solch ein Abschnitt, umfassend ein Epitop, überspannt die Aminosäure-Sequenz um 812-859 und ist durch die Nukleotid-Sequenz um 2799-2938 codiert. Ein Polypeptid mit mindestens umfassend die besagte Aminsäure-Sequenz, oder eine Nukleinsäure-Sequenz, die mindestens die besagte Nukleotid-Sequenz umfasst, bilden einen Teil der vorliegenden Erfindung.
Eine Nukleinsäure-Sequenz gemäss der vorliegenden Erfindung kann für die Diagnose von HCV-Infektionen bei Schweinen eingesetzt werden, um HCV von BVDV zu unterscheiden, und kann aus dem Gen abgeleitet werden, welches das 55 kD Protein codiert.
Vorzugsweise wird eine solche Nukleinsäure-Sequenz aus den Nukleotid-Sequenzen 2587-2619 oder 2842-2880 abgeleitet werden, wobei beide Sequenzen Teil des Gens sind, das für das 55 kD- Protein codiert. Ein bevorzugtes Oligonukleotid für diagnostische Zwecke ist (SEQ ID: Nr. 3 und 4, respektive):
5' – CCT ACT AAC CAC GTT AAG TGC TGT GAC TTT AA – 3'
oder
5' – TTC TGT TCT CAA GGT TGT GGG GCT CAC TGC TGT GCA CTC – 3'
Weiterhin kann eine Nukleinsäure-Sequenz, die mindestens eine Untersequenz der besagten Oligonukleotide umfasst, und die immer noch eingesetzt werden kann, um zwischen HCV und BVDV zu unterscheiden, einen Teil der vorliegenden Erfindung bilden.
Die Erfindung betrifft auch ein Test-Kit, welches in einem Assay zu benutzen ist, wobei das Test-Kit eine Nukleinsäure-Sequenz gemäss der vorliegenden Erfindung umfasst.
Vorzugsweise umfasst das Test-Kit ein Oligonukleotid, welches oben beschrieben worden ist, oder eine Nukleinsäure-Sequenz, umfassend mindestens eine Subsequenz davon.
Variationen oder Modifikationen im Polypeptid, welches in der 2 dargestellt ist (SEQ ID: Nr. 1-2), oder Fragmente davon, sowie natürliche Variationen zwischen verschiedenen Stämmen oder anderen Abkömmlingen, sind möglich, wobei die gleichen immunologischen Eigenschaften beibehalten werden. Diese Veränderungen können durch eine oder mehrere Aminosäure-Unterschiede in der Gesamt-Sequenz oder durch Löschungen, Ersetzungen, Einfügungen, Umkehrungen oder Hinzufügungen von einer oder mehreren Aminsosäuren in dem besagten Polypeptid gezeigt werden.
Darüber hinaus besteht ein Potential bei der Benutzung der rekombinanten DNS-Technologie in der Herstellung von verschiedenen Derivaten des in der 2 dargestellten Polypeptids (SEQ ID: Nr. 1-2) oder Fragmenten davon, verschiedentlich verändert durch resultierende einzelne oder multiple Aminosäure-Substitutionen, -Löschungen, -Additionen oder -Ersetzungen, beispielsweise mittels der ortsgerichteten Mutagenese der zugrunde liegenden DNS. Alle solche Modifizierungen resultieren in Derivaten des Polypeptids, welches in der 2 dargestellt ist (SEQ ID: Nr. 1-2), oder Fragmente davon, die im Rahmen der vorliegenden Erfindung eingeschlossen, solange die wesentliche charakteristische Aktivität des besagten Polypeptids oder eines Fragmentes davon im Wesentlichen unbeeinflusst bleibt.
RNS, isoliert aus gefällten Virionen, wurde isoliert und zur Synthese von cDNS verwendet. Diese cDNS wurde in den Phagen λgt11 kloniert und die entsprechende Genbibliothek vermehrt und mit anti-HCV-Antiserum aus der Ziege getestet. Zwei positive Klone konnten identifiziert werden und es konnte gezeigt werden, dass sie Insertionen in den Grössen 0, 8 kB und 1,8 kB besitzen. Die 0,8 kB-Insertion λgt11 wurde teilweise sequenziert (siehe 3, SEQ ID: Nr. 8-9) und etwa zwischen 1,2 und 2,0 kB des HCV-Genoms lokalisiert (siehe 2).
Eine der Erfindung gemässe Nukleinsäuresequenz, die zur Diagnose von HCV in infizierten Tieren verwendet werden kann und die überraschenderweise angewendet werden kann, um HCV von BVDV zu unterscheiden, wird durch die in 2 (SEQ ID: Nr. 1) dargestellte Nukleotidsequenz 5551-5793 repräsentiert.
Darüberhinaus ist eine Nukleinsäuresequenz, die mindestens eine Subsequenz der besagten Nukleotidsequenz umfasst und die noch verwendet werden kann, um zwischen HVT und BVDV zu unterscheiden, Teil der Erfindung.
Die Erfindung bezieht sich auch auf ein in einem Assay zu verwendendes Testkit, wobei das Testkit eine Nukleinsäuresequenz gemäss der Erfindung umfasst.
Das Testkit umfasst vorzugsweise die Nukleinsäuresequenz, die in 2 (SEQ ID: Nr. 1) durch die Nukleotidsequenz 5551-5793 dargestellt ist, oder eine Nukleinsäuresequenz, die mindestens eine, wie oben genannte, Subsequenz davon umfasst.
RNS, isoliert aus den gefällten Virionen, wurde isoliert und zur Synthese von cDNS verwendet. Diese cDNS wurde in den Phagen λgt11 kloniert, und die entsprechende Genbibliothek wurde vermehrt und mit anti-HCV-Antiserum aus der Ziege getestet. Zwei positive Klone wurden identifiziert und es konnte gezeigt werden, dass sie Insertionen in den Grössen 0,8 kB und 1,8 kB besitzen. Die 0,8 λgt11 kB-Insertion wurde teilweise sequenziert (siehe 3 SEQ ID: Nr. 8-9) und etwa zwischen 1, 2 und 2, 0 kB des HCV-Genoms lokalisiert (siehe 2).
Eine Nukleinsäuresequenz gemäss der vorliegenden Erfindung kann an verschiedene Vektor-Nukleinsäuren-Moleküle wie Plasmid-DNS, Bakteriophagen-DNS oder virale DNS ligiert werden, um ein rekombinantes Nukleinsäuremolekül zu bilden. Die Vektornukleinsäuremoleküle enthalten vorzugsweise DNS-Sequenzen zum Initiieren, Kontrollieren und Terminieren der Transkription und Translation. Ein rekombinantes Expressionssystem, das einen Wirt umfasst, der ein solches rekombinantes Nukleinsäuremolekül enthält, kann verwendet werden, um von einer Nukleinsäuresequenz gemäss der vorliegenden Erfindung ein von besagter Nukleinsäuresequenz codiertes Polypeptid zu exprimieren. Der Wirt des obengenannten rekombinanten Expressionssystems kann prokaryotischen Ursprungs sein, z. B. Bakterien wie E. coli, B. subtilis und Pseudomonas, Viren wie Vaccinia und Geflügelpockenviren oder eukaryotischen Ursprungs wie Hefen oder höhere eukaryotische Zellen wie Insekten-, Pflanzen- oder Tierzellen.
Immunisierung von Tieren gegen HCV kann zum Beispiel durch Verabreichung eines Polypeptids gemäss der Erfindung an ein Tier als sogenannter "Untereinheits"-Impfstoff erreicht werden. Der Untereinheitsimpfstoff gemäss der Erfindung umfasst ein im grossen und ganzen in reiner Form vorliegendes Polypeptid, gegebenenfalls in Gegenwart eines pharmazeutisch annehmbaren Trägers.
Kleine Fragmente werden vorzugsweise an Trägermoleküle gebunden um ihre Immunogenität zu erhöhen. Für diesen Zweck geeignete Träger sind Makromoleküle wie natürliche Polymere (Proteine, wie das Hämocyan der Napfschnecke, Albumin, Toxine), synthetische Polymere wie Polyaminosäuren (Polylysin, Polyalanin) oder Mizellen von wasseranziehenden Verbindungen wie Seifen. Als andere Möglichkeit können diese Fragmente als Polymere davon zur Verfügung gestellt werden, vorzugsweise als lineare Polymere. Polypeptide, die in solchen Untereinheitsimpfstoffen verwendet werden sollen, können durch in der Fachwelt bekannte Verfahren hergestellt werden, z. B. durch Isolierung besagter Polypeptide aus dem Schweinepestvirus, durch rekombinante DNS-Techniken oder durch chemische Synthese.
Falls erforderlich können die Polypeptide gemäss der Erfindung, die in einem Impfstoff verwendet werden sollen, in vivo oder in vitro modifiziert werden, zum Beispiel durch Glykosilierung, Amidbildung, Carboxylierung oder Phosphorylierung.
Eine Alternative zu Untereinheitsimpfstoffen sind "Vektor"-Impfstoffe. Eine Nukleinsäuresequenz gemäss der Erfindung wird mit Hilfe rekombinanter Techniken in das genetische Material eines anderen Mikroorganismus (z. B. ein Virus oder ein Bakterium) eingebaut, wobei der Mikroorganismus befähigt wird, ein Polypeptid gemäss der Erfindung zu exprimieren. Dieses rekombinante Ex pressionssystem wird einem zu immunisierenden Tier verabreicht, worauf es in dem geimpften Tier repliziert und das Polypeptid exprimiert, was in der Stimulierung des Immunsystems des Tieres resultiert. Geeignete Beispiele von Impfvektoren sind Pockenviren (wie Vaccinia, Kuhpocken, Kaninchenpocken), aviäre Pockenviren (wie Geflügelpockenviren), Pseudorabiesviren, Adenoviren, Influenzaviren, Bakteriophagen oder Bakterien (wie Escherichia coli und Salmonella).
Das rekombinante Expressionssystem, in dessen Nukleinsäuresequenz eine Nukleinsäuresequenz gemäss der Erfindung eingesetzt ist, kann zum Beispiel in einer Zellkultur gezüchtet werden und, falls erwünscht, aus den infizierten Zellen geerntet und zu einem Impfstoff, gegebenenfalls in lyophilisierter Form, verarbeitet werden. Besagte genetisch manipulierte Mikroorganismen können auch von lebenden Tieren, die mit besagtem Mikroorganismus infiziert wurden, geerntet werden. Obengenanntes rekombinantes Expressionssystem kann auch in einer Zellkultur vermehrt werden, die ein Polypeptid gemäss der Erfindung exprimiert, wonach das Polypeptid aus der Kultur isoliert wird.
Ein Impfstoff, der ein Polypeptid oder ein rekombinantes Expressionssystem gemäss der Erfindung umfasst, kann durch in der Fachwelt bekannte Verfahren für solche Impfstoffe hergestellt werden. Ein Impfstoff gemäss der Erfindung kann unter anderem aus einem ganzen Wirt, Wirtsextrakt, teilweise oder vollständig gereinigten Polypeptiden oder einem teilweise oder, wie oben beschrieben, vollständig gereinigtem rekombinanten Expressionssystem bestehen.
Der Impfstoff gemäss der Erfindung kann in einem konventionellen aktiven Immunisierungsschema verabreicht werden: Einzelne oder wiederholte Verabreichungen in einer Art und Weise, die mit der Dosiszusammensetzung verträglich ist und in einer solchen Menge, die therapeutisch wirksam und immunogen ist. Die Verabreichung des Impfstoffes kann zum Beispiel intradermal, subkutan, intramuskulär, intravenös oder intranasal erfolgen. Für eine parenterale Verabreichung können die Impfstoffe einen geeigneten Träger enthalten, z.B. Wasser, Salzlösung oder Pufferlösungen mit oder ohne Adjuvantien, Stabilisatoren, Lösungsmittel, Emulgatoren usw.. Um einen multivalenten Impfstoff herzustellen, kann der Impfstoff zusätzlich Immunogene enthalten, die sich auf andere Krankheiten oder für diese Immunogene codierende Nukleinsäuresequenzen beziehen, wie Antigene des Parvovirus, des Pseudorabiesvirus, des Schweineinfluenzavirus, des TGE-Virus, des Rotavirus, Escherichia coli, Bordetella, Pasteurella, Erysipelas usw..
Polypeptide gemäss der vorliegenden Erfindung können auch in diagnostischen Verfahren angewendet werden, um die Anwesenheit eines HCV-Antigens oder Antikörpers in einem Tier nachzuweisen. Darüber hinaus können Nukleinsäuresequenzen gemäss der Erfindung angewendet werden, um Polypeptide herzustellen, die in den oben genannten diagnostischen Verfahren oder als eine Hybridisierungssonde zum Nachweis von HCV-Nukleinsäuren in einer Probe verwendet werden.
Beispiel 1
Immunologische Identifizierung von cDNS-Klonen
Infektion der Zellen und Virusernte. PK15- und 38A₁D-Zellen wurden in DMEM mit 10% FCS gezüchtet und mit dem virulenten HCV--Stamm Alfort in einem Volumen von 20-30 Milliliter bei einer Zellkonzentration von 5 × 10⁷/Milliliter 90 Minuten bei 37 Grad Celsius mit i.E. von 0,01 bis 0,001 (wie durch Immunfluoreszenzassay bestimmt) in Suspension infiziert. Danach wurden die PK15-Zellen auf Gewebekulturplatten (150 Millimeter Durchmesser) ausgesät, während die 38A₁D-Suspensionszellen in Flaschen unter schwachem Rühren inkubiert wurden (Tecnomara, Schweiz). Für die cDNS-Synthese wurde der Gewebekultursupernatant 48 Stunden nach der Infektion geerntet, bei 12.000 g gereinigt, worauf das Virus in einem TFA 20-Rotor (Contron, Italien) 12 Stunden mit 54.000 g gefällt worden ist.
Herstellung von anti-HCV-Serum aus der Ziege. Ein Fibroblastenzellstamm wurde aus einer Hautbiopsie einer jungen Ziege mittels herkömmlicher Zellkulturtechniken hergestellt. Die Zellen wurden zunächst in F-10-Medium mit 10% FCS und später in DMEM mit 10% FCS gezüchtet. Ziegenfibroblasten wurden mit HCV infiziert. Während der ersten 26 Stunden nach der Infektion wurden die Zellen alle 8 Stunden 3 mal mit PBS gewaschen und danach in DMEM mit 10% Präimmunziegenserum (PGS) inkubiert. 48 Stunden nach der Infektion wurde der Gewebekulturüberstand geerntet und als Impfvirus verwendet. Vor der Immunisierung wurden Ziegenzellen für 30 Gewebekulturplatten (150 Millimeter Durchmesser) während 3 Passagen in Medium mit 10% PGS gehalten und dann mit dem Impfvirus infiziert. 48 Stunden nach der Infektion wurde die Ziege mit durch Röntgenstrahlen inaktiviertem gefällten Virus und infizierten Zellen immunisiert. Beide wurden in Freund'schem Adjuvans (vollständig im Fall der Basisimmunisierung, unvollständig im Fall der Wiederholungsimpfung) emulgiert und subcutan injiziert. Um Antikörper zu erhalten, die denaturierte Moleküle erkennen, wurden die Antigenpräparate 5 Minuten vor der Injektion in 0,2% SDS, 3 mM DTT bei 95°C inkubiert.
RNS-Herstellung, cDNS-Svnthese und Klonierunq. RNS aus Virionen wurde durch Anwendung des Guanidinthiocyanat-Verfahrens, von Chirgwin et al. (1979) beschrieben, isoliert. RNS von gefällten Virionen (5 Mikrogramm Gesamt-RNS, ungefähr 0,5 Mikrogramm HCV-RNS) und 0,1 Mikrogramm willkürliche Hexanukleotidprimer (Pharmacia, Schweden) in 20 Mikroliter Wasser wurden 10 Minuten auf 65 Grad Celsius erhitzt, auf Eis gekühlt und an den Puffer für die Synthese des ersten Stranges (50 mM Tris-HCl, pH-Wert 8,3; 3 0 mM KCl; 8 mM MgCl₂; 1 mM DTT, jeweils 1 mM dATP, dCTP, dGTP, dTTP und 500 Einheiten RNSguard (Pharmacia,Schweden) pro Milliliter) in einem Endvolumen von 32 Mikroliter angepasst. 35 Einheiten Reverse Transkriptase von AMV (Life Sciences Inc., USA) wurden hinzugegeben. Nach 1 Stunde bei 43 Grad Celsius wurde das Reaktionsgemisch in ein Gefäss mit dem Reaktionsgemisch für die Synthese des zwei-ten Stranges (Pharmacia, Schweden) gegeben. Synthese des zweiten Stranges, Herstellung der stumpfen Enden (blunt ends), EcoRI-Adapterligierung und Phosphorylierung wurde wie vom Hersteller empfohlen durchgeführt.
Die cDNS wurde durch präparative Gelelektrophorese der Grösse entsprechend fraktioniert. Der Teil des Gels, der DNS-Moleküle kleiner als 0,5 kB enthielt, wurde verworfen. Die übrige DNS wurde konzentriert, indem das Gel 15 Minuten in entgegengesetzter Richtung laufen gelassen wurde, und wurde aus der Agarose nach 3 Zyklen Gefrieren und Tauen mit Phenol extrahiert.
Mit Äthanol koausgefällte cDNS und λgt11-DNS (1 Mikrogramm EcoRI-geschnittene entphosphorylierte Arme, Promega, USA) wurden mit 3 Einheiten T4-DNS-Ligase (Pharmacia, Schweden) in einem Gesamtvolumen von 10 Mikroliter Ligasepuffer (30 mM Tris-HCl, pH-Wert 7,4; 10 mM MgCl₂; 10 mM DTT; 1 mM ATP) ligiert. In vitro-Verpackung mit einem im Handel erhältlichen Extrakt (Packagene, Promega, USA) und Infektion von E.coli K12-Zellen, Stamm Y 1090 mit resultierenden Phagen wurde wie vom Hersteller empfohlen durchgeführt. Die Genbibliothek wurde einmal vermehrt. wie beschrieben (Davis et al., 1986).
Uberprüfung der λtgll-Genbibliothek. Die Überprüfung wurde im wesentlichen durchgeführt wie beschrieben Young und Davis, 1983) unter Verwendung des von Promega, USA (Huyn et al., 1985) erworbenen Protoblot Systems und einer Serumverdünnung von 10^–3. Zur Reduktion des Hintergrundes wurde das anti-HCV-Serum der Ziege mit 0,8 Milligramm/Milliliter E.coli-Lysat (Stamm Y1090) behandelt (Huynh et al., 1985). Zwei positive Klone mit Insertionen von jeweils 0,8 kB und 1,8 kB konnten identifiziert werden.
Nick-Translation und Northern Hybridisierunq. 50 Mikrogramm der 0,8 kB HCV-Nukleinsäuresequenz, die mit (a³²P)dCTP (3000 Ci pro mMol, Amersham Buchler, BRD) durch Nick-Translation (Nick-Translationsgarnitur, Amersham Buchler, BRD) markiert wurden, wurden auf Northern-Filter in einer Konzentration von 5 Mikrogramm pro Milliliter der Hybridisierungsmischung (5 × SSC; 1 × Denhardt'sche Lösung, 20 mM Natriumphosphat, pH-Wert 6,8, 0,1% SDS und 100 Mikrogramm tRNS aus Hefe (Boehringer-Mannheim, BRD) pro ml) 12 bis 14 Stunden bei 68 Grad Celsius hybridisiert. Die Membranen wurden gewaschen wie beschrieben (Keil et al., 1984) und auf Kodak X-Omat AR-Filmen bei –70°C unter Verwendung von Agfa Curix MR 800-Intensivierungsschirmen unterschiedlich lang belichtet.
Die 0,8 kB-Nukleinsäuresequenz hybridisierte nicht nur mit der intakten HCV-RNS, sondern auch mit deren Abbauprodukten. Die 0,8 kB-Nukleinsäuresequenz hybridisierte nicht mit der 1,8 kB Nukleinsäuresequenz, was darauf hinweist, dass die beiden Nukleinsäuresequenzen mit Fragmenten des HCV-Genoms korrespondieren, die nicht in der gleichen Region der genomischen RNS liegen.
Nukleotidsequenzierung. Subklonierung HCV-spezifischer Insertionen in Phagen-DNS in dem Plasmid pEMBL 18 plus wurde gemäss Standardverfahren durchgeführt (Maniatis et al., 1982). Einzelstrang-DNS wurde wie beschrieben aus rekombinanten pEMBL Plasmiden hergestellt (Dente et al., 1985). Didesoxysequenzierreaktio nen (Sanger et al., 1977) wurden wie von dem Lieferanten (Pharmacia, Schweden) beschrieben, durchgeführt.
Beispiel 2
Molekulare Klonierung und Nukleotidseauenz des HCV-Genoms RNS-Herstellung, cDNS-Synthese und Klonierung. RNS-Herstellung, cDNS-Synthese, Grössenselektion und Ligierung koausgefällter cDNS und λLgt10-DNS (1 Mikrogramm EcoRI-geschnittene, entphosphorylierte Arme, Promega, USA) wurden wie oben beschrieben durchgeführt. In vitro Verpackung der Phagen-DNS unter Verwendung von Packagene (Promega, USA) und Titrierung der Phagen auf E.coli-Stamm C 600 HFL wurde wie vom Lieferanten vorgeschlagen durchgeführt. Die Genbibliothek wurde einmal vermehrt (Davis et al., 1986) und Replikas, die auf Nitrocellulosemembranen (Amersham Buchler, BRD) (Benton und Davis, 1977) übertragen wurden, wurden mit Oligonukleotiden wie oben für Northern-Hybridisierung beschrieben, hybridisiert. Überprüfung mit cDNS-Fragmenten, die mit (a³²P)dCDP durch Nick-Translation (Nick-Translationsgarnitur, Amersham Buchler, BRD) markiert waren, wurde, wie von Benton und Davis (1977) beschrieben, durchgeführt. Positive Klane wurden plaquegereinigt und Insertionen in pEMBL-Plasmide subkloniert (Maniatis et al., 1982; Dente et al., 1985; Davis et al., 1986).
Ein am 32P 5'-Ende markiertes 17 Basen langes Oligonukleotid, das komplementär zu der RNS-Sequenz ist, die für die Aminosäuresequenz Cys Gly Asp Asp Gly Phe codiert, wurde zur Überprüfung einer λgtlO-cDNS-Genbibliothek verwendet. Dieses Oligonukleotid, das mit der ungefähr 12 kB grossen genomischen RNS des HCV hybridisiert, identifizierte unter anderem einen Klon mit einer Insertion von 0,75 kB, welche auch mit HCV-RNS hybridisierte. Diese 0,75 kB Nukleinsäuresequenz, die ein Fragment des HCV-Genom zusammen mit der 0,8 kB λgtll Nukleinsäuresequenzinsertion darstellt, wurde für eine weitere Überprüfung der Genbibliothek verwendet, die in einem Satz von überlappenden HCV-Nukleinsäuresequenzen resultierte, von denen die relativen Positionen und Restriktionstellenkarten in 1 dargestellt sind. Diese Nukleinsäuresequenzfragmente des HCV-Genom befinden sich zwischen den folgenden Nukleotidpositionen
und innerhalb der folgenden Nukleinsäurepositionen
Nukleotidsequenzierunq. Für eine vollständige Nukleotidesequenzbestimmung wurde Exonuklease III und Nuklease S1 (Enzyme von Boehringer Mannheim, BRD) verwendet, um Löschungsgenbibliotheken von HCV abstammenden cDNS-Insertionen herzustellen, die in pEMBL 18+ oder 19+ Plasmide subkloniert wurden (Hennikoff, 1987). Dideoxysequenzierung (Sanger et al., 1977) von Einzelstrang- (Dente et al., 1985) oder Doppelstrang-DNS-Matrizen wurde unter Verwendung des T7-Polymerase-Sequenziergarnitur (Pharmacia, Schweden) durchgeführt.
Von den cDNS-Fragmenten konnte eine fortlaufende Sequenz von 12284 Nukleotiden Länge, wie in 2 (SEQ ID: Nr. 1) dargestellt, bestimmt werden. Diese Sequenz enthält einen langen, offenen Leserahmen (ORF), der mit dem ATG-Codon bei Position 364-366 beginnt und mit TGA als translationales Stop-Condon von 12058 bis 12060 endet. Dieser ORF besteht aus 3898 Codons, die fähig sind, für ein 435 kD-Protein mit einer, in 2 (SEQ ID: Nr. 1-2) gezeigten Aminosäuresequenz zu codieren. Drei Nukleotidaustausche wurden als Ergebnis von Unterschieden in der Nukleotidensequenz nachgewiesen, die durch eine mögliche Heterogenität der Viruspopulation verursacht werden, zwei von diesen resultierten in einem Austausch der abgeleiteten Aminosäuresequenz (2 SEQ ID: Nr. 1-2).
Es wird daraus geschlossen, dass nahezu das vollständige HCV-Genom mit dem oben beschriebenen Verfahren kloniert und sequenziert worden ist.
Die 0,8 kB λgt11-Nukleinsäuresequenz, die ein immunogenes HCV-Polypeptidcodiert, welches mit anti-HCV-Serum identifiziert worden ist, wurde teilweise sequenziert (siehe SEQ ID: Nr. 8-9), was zeigte, dass diese Sequenz innerhalb 1,2 und 2,0 kB auf der HCV-RNS liegt.
Beispiel 3
Klonierung und Expression der Fusionsproteine von HCV
Von zwei Regionen des HCV-Genoms stammende cDNS-Fragmente, d.h. die 0,8 kB λgt11-Insertion von Beispiel 1, die für Aminosäuren 262-546 (siehe 2 SEQ ID: Nr. 1-2) codiert, und die Nukleinsäuresequenz, die für Aminosäuren 747-1071 (2 SEQ ID: Nr. 1-2) codiert, werden als Fusionsproteine in den pEx-System exprimiert (Strebel, K. et al., 1986).
Bakterielle Extrakte wurden durch SDS-PAGE getrennt und gemäss Standardverfahren gefärbt und dann auf ihre Reaktivität mit Ziegen-anti-HCV-Serum aus Beispiel 1 in einem Western Blot getestet.
Die HCV-spezifischen Fusionsproteine wurden teilweise durch SDS- PAGE gereinigt und auf Nitrocellulose übertragen und mit.dem Ziegen-anti-HCV-Serum inkubiert. Spezifische Antikörper gegen besagte Fusionsproteine wurden nach Elution erhalten.
Spezifische Antikörper gegen die oben genannten Fusionsproteine wurden in einem Radioimmunpräzipitationsassay angewendet.
Ergebnisse.
Beide in dem pEx-System exprimierten Fusionsproteine wurden eindeutig nach Reaktion mit dem Ziegen-anti-HCV-Serum als HCV spezifisch erkannt.
Monospezifisches Antiserum, das gegen beide Fusionsproteine hergestellt wurde, fällte HCV-Glykoproteine.
Spezifische Antikörper gegen das 262-546-Fusionsprotein fällten das 44/48 kD- und 33 kD-Protein, spezifische Antikörper gegen das 747-1071-Fusionsprotein fällten das 55 kDProtein von virusinfizierten Zellen.
Beispiel 4
Molekulare Klonierung und Expression von Strukturproteinen, mit Hilfe des Vaccinia-Virus
sEin Fragment des in 1 gezeigten 4,0 kB-Klons (pHCK11) wird an der HinfI-Restriktionsstelle (Nukleotid 372) beginnend und an einer künstlichen EcoRI-Stelle (Nukleotid 4000) endend, hergestellt (Maniatis et al., 1982). Für das 5'-Ende wurde ein Oligonukleotidadapter synthetisiert, der einen mit BamHI kompatiblen Überhang, das ursprüngliche ATG (364-366) als translationales Startcodon und ein überstehendes mit Hinfl kompatibles Ende am 3'-Ende enthielt (SEQ ID: Nr. 5 und 6).
5' GATCCACCATGGAGTT HinfI
BamHI GTGGTACCTCAACTTA 5'
Am 3'-Ende des Konstrukts wurde ein translationales Stop-Codon durch Löschung des überstehenden EcoRI-Endes mit Mungbean-Nuklease und Ligation in einen StuI/EcoRI-Adapterrest (SEQ ID: Nr. 7) mit stumpfem Ende eingeführt:

5' GCCTGAATTC 3'-EcoRI

CGGACTTAAG

(Maniatis et al., 1982).

Vor dem Einsetzen oben genannter HCV-Sequenzen in Vaccinia-Virus wird das heterologe Gen in einen rekombinanten Vektor kloniert. Zu diesem Zweck wurde ein pGS62-Plasmid (Cranage, M.P. et al., 1986) verwendet, das eine Klonierungsstelle abwärts vom P7.5K-Promotor innerhalb der 4,9 kB Thymidinkinase-Sequenz enthält. Die Klonierungsstelle umfasst drei einzigartige Restriktionsstellen, BamHI, SmaI und EcoRI. Der Rekombinationsvektor pGS62-3.8 wurde durch Ligation der beschriebenen HCV-Sequenz (372-4000) zusammen mit den Adaptoren in das mit BamHI/EcoRI geschnittene pGS62 hergestellt.
Ein Satz von 15 auf dem Plasmid basierenden Löschungsmutanten wurde hergestellt. Durch Behandlung mit Exonuklease III (Hennikof et al., 1987) wurde eine anschliessende Kürzung der HCV-DNS von dem 3'-Ende durchgeführt. Alle Löschungen befinden sich innerhalb der für das 55 kD-Protein von HCV codierenden Region durch Entfernung von ungefähr 100 bp; der grösste Teil des 55 kD-Proteins ist in der Mutanten 15 verloren gegangen, die bei Nukleotid 2589 endet. Mit ExoIII gekürzte cDNS-Klone wurden in das pGS62 kloniert, wodurch pGS62-3.8Exo 1-15 entstanden (4).
CVI-Zellen wurden mit Vaccinia (Stamm Kopenhagen, Mutante TS7) mit einer i.E. von 0,1 infiziert. Drei Stunden nach Infektion wurde sowohl pGS62-3.8-DNS als auch Vaccinia WR-DNS durch Ca₃(PO₄)₂-Fällung transfektiert und zwei Tage inkubiert. Virusnachkommenschaft wurde geerntet und auf tk-Phänotype auf 143 tk-Zellen in der Gegenwart von Bromdeoxy-Uridin (100 Mikrogramm/Milliliter) selektiert. Diese Selektion wurde mindestens zweimal durchgeführt, gefolgt von zwei weiteren Zyklen Plaquereinigung.
Charakterisierung von Vaccinia-HCV Rekombinanten
CVI-Zellen wurden mit einer i.E. zwischen 2 und 10 mit Vaccinia-HCV-Rekombinanten infiziert und 8-16 Stunden inkubiert. Nach Fixierung der Zellen wurde indirekte Immunfloureszens durchgeführt, indem entweder ein für das HVC-55 kD Protein spezifischer Antikörper oder polyvalente anti-HCV-Seren verwendet wurden. In allen Fällen konnte eine cytoplasmatische Fluoreszenz nachgewiesen werden.
Nach Radioimmunoausfällung und Western Blot-Analyse von mit Vaccinia-Rekombinanten infizierten Zellen wurden vier HCV-spezifische Proteine nachgewiesen. Bei dem Markieren mit [³H]-Glukosamin konnte gezeigt werden, dass drei dieser Proteine glykosiliert sind. Die offensichtlichen Molekulargewichte dieser Proteine waren mit denen identisch, die in HCV-spezifischen Seren HCV-infizierten Zellen gefunden wurden, nämlich 20 kD (Kern), 44/48 kD, 33 kD und 55 kD.
Proteolytische Behandlung und Modifizierung scheinen authentisch zu sein, da HCV Proteine die durch Expression mittels Vaccina-Virus hergestellt wurden, das gleiche offensichtliche Molekulargewicht wie in mit HCV infizierten Zellen haben.
Induktion von neutralisierenden Antikörpern gegen HVC in Mäusen
Vier Gruppen von Mäusen (3 Mäuse/Gruppe) wurden einmal durch intraperitoneale Injektion mit gereinigtem Virus infiziert:
Die Mäuse wurden drei Wochen später ausgeblutet. Die Reaktivität der Seren wurde in einem Virusneutralisationsassay mit HCV (Alfort) auf PK(15)-Zellen nach Serienverdünnung untersucht (Rümenapf, T. et al., 1989). Neutralisationstiter
Aus dem Obengenannten kann geschlossen werden, dass das Vaccinia Virus eine die genetische Information für alle Strukturproteine (VAC3.8) umfassende Nukleinsäuresequenz enthält, die fähig ist, virusneutralisierende Antikörper in Mäusen zu induzieren, während die unvollständigen Konstrukte VAC3.8Exo5-15 und WR dies nicht können.
Da alle Löschungen innerhalb der für das 55 kD-Protein von HCV codierenden Region liegen (der grösste Teil des 55 kD-Proteins fehlt in der Mutante 15, die bei Nukleotid 2589 endet) und die anderen Strukturproteine noch durch das rekombinante Vaccinia Virus exprimiert werden, wird klar, dass das 55 kD-Protein für die Induzierung der HCV neutralisierenden Antikörper verantwortlich ist.
Beispiel 5
Immunisierung von Schweinen mit VAC3.8
Von drei Ferkeln (ungefähr 20 kg schwer) wurde ein Tier (Nr. 28) mit dem Wildtyp des Vaccinia Virus (WR-Stamm) und die anderen zwei (Nr. 26 und 27) mit rekombinantem VAC3.8 (i.p., i.v. beziehungsweise i.d.) infiziert. Jedem Tier wurden zur Infektion 1 × 10⁸ PbE des Vaccinia Virus verabreicht.
Klinische Zeichen im Verlauf der Vaccinia-Infektion waren als Erythema auf der Seite der Narbenbildung und Fieber (41°C) am Tag 6 nach der Infektion sichtbar.
Titer gegen Vaccinia- und Schweinepestvirus:
Drei Wochen nach der Infektion wurde die Reaktvität der jeweiligen Seren gegen Vaccinia (WR auf CVI-Zellen) und HCV (Alfort auf PK15-Zellen) untersucht.
Neutralisation wurde, nach Serienverdünnung der Seren, durch Untersuchung der vollständigen Abwesenheit von CPE (Vaccinia) oder spezifischen Signalen, bei Immunfluoreszenz (HCV) geprüft (Rümenapf, T. et al., 1989). Neutralisationstiter gegen Vaccinia:

Schwein 28 (WR) 1:8

Schwein 26 (VAC3.8) 1:16

Schwein 27 (VAC3.8) 1:16

Neutralisationstiter gegen HCV:

Schwein 28 (WR) < 1:2

Schwein 26 (VAC3.8) 1:32

Schwein 27 (VAC3.8) 1:16
Herausforderung mit HCV:
Vier Wochen nach der Immunisierung mit Vaccinia wurde jedes Schwein durch Infektion mit 5 × 10⁷ TCID₅₀ HCV Alfort herausgefordert. Virus wurde oronasal, dem natürlichen Impfweg entsprechend, verabreicht. Diese Virusmenge wurde experimentell als für Schweine obligatorisch tödlich bestimmt.
Am Tag 5 nach der Herausforderungsinfektion zeigte Schwein 28 41,5°C Fieber und hielt diese Temperatur bis zum Tag 12. Das moribunde Tier wurde an dem Tag getötet, an dem es typische klinische Zeichen akuter Schweinepest zeigte.
Beide mit VAC3.8 immunisierten Schweine (26, 27) zeigten nach der Herausforderungsimpfung mit HCV während mehr als 14 Tagen keine Anzeichen einer Erkrankung.
Beispiel 6
Konstruktion eines Expressionsvektors für das 55 kD-Protein
Klon pHCK11 wird mit den Restriktionsenzymen SacI und HpaI gemäss Standardverfahren geschnitten.
Das daraus resultierende, sich zwischen den Nukleotiden 2672 (AGCTC) und 3971 (GTT) befindliche 1,3 kB-Fragment, das den grössten Teil des 55 kD-Proteins des HCV umfasst, wird isoliert und in das gX-Gen des Pseudorabies Virus (PRV) kloniert (Maniatis et al., 1982).
Kurz, die klonierte gX-Sequenz wurde mit SacI und ApaI geschnitten. Die vorstehenden 5'-Enden von ApaI wurden mit Klenow-Fragment zu stumpfen Enden aufgefüllt. Nach der Ligierung befand sich die für das vermeintliche gX-"Leader"-Peptid codierende Sequenz gerade stromaufwärts der eingefügten 55 kD-Sequenz des HCV.
Ein stromabwärts der HCV-Sequenz befindliches translationales Stop-Codon wurde durch Schneiden mit BgI II (BgI II-Stelle: 3936-3941) und Religierung nach Auffüllen der überstehenden Enden mit Klenow-Fragment eingeführt. Dieses Konstrukt wurde stromabwärts des gX-Promotors des PRV plazziert (Klon 16/4-1.3). Klon 16/4-1.3 wurde in MDBK-Zellen mit Hilfe des DEAE-Dextran-Verfahrens (Maniatis et al., 1989) transfektiert. 16 Stunden danach wurden die Zellen mit PRV (i. E = 1) infiziert. 4 Stunden post infectionem wurden die Zellen mit einer Mischung aus kaltem (–20°C) Methanol/Aceton fixiert. Indirekte Immunfluoreszenz mit monoklonalen Antikörpern (MAB) gegen das 55 kD-Protein des HCV zeigte ein spezifisches Signal in 5-10% der Zellen. PRV-infizierte Zellen ohne Transfektion und Zellen, die nur mit Klon 16/4-1.3 transfektiert worden waren, zeigten gar kein Signal in diesem Assay.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 zeigt physikalische Karten verschiedener von HCV abstammender Klone und ihre Position im Verhältnis zu dem RNS-Genom (obere Zeile). Zwei von HCV abstammende cDNS-Klon, die nach Überprüfung entweder mit der Antikörpersonde (0,8 kB-Klon) oder der degenerierten Oligonukleotidsonde (0,75 kB-Klon) isoliert wurden, sind in der zweiten Zeile gezeigt. Die für die Nukleotidsequenzierung ausgewählten cDNS-Fragmente sind unten angezeigt. Alle Zahlen stehen für die Grösse der DNS-Fragmente in kB.
Restriktionsstellen: B = BgI II; E = EcoRI; H = Hind III; K = Kpn I; S = Sal I; Sm = Sma I.
2 stellt eine Nukleinsäuresequenz des HCV und die abgeleitete Aminosäuresequenz des langen offenen Leserahmens dar. Nukleotidaustausche zwischen verschiedenen cDNS-Klonen und daraus resultierende Unterschiede in der Aminosäuresequenz sind angezeigt. Der Teil der Sequenz, der den Oligonukleotiden ent spricht, die für die Überprüfung verwendet wurden, ist unterstrichen.
3 zeigt die cDNS-Sequenz eines Teils der 0,8 kB Einfügung des HCV in einem λgt11-Klon und die davon abgeleitete Aminosäurensequenz in dem Einbuchstabencode.
4 zeigt die Länge der in den pGS62-Vektor klonierten HCV-DNS. Ein Satz von 15 Löschungsmutanten, die von dem cDNS-Klon pHCK11 abstammen, wurde durch Behandlung mit Exonuklease III hergestellt und in den pGS62-Vektor kloniert, wodurch pGS62-3.8Exo 1-15 entstanden. Nukleotide des 3'-Endes sind angezeigt.
Druckschriften

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Sequenzlisting

Claims

Ein Schweine-Cholera-Virus (HCV) Polypeptid mit einem Molekulargewicht von 44/48 kD, welches mit monospezifischem Antiserum reagiert, hergestellt gegen ein Fusionsprotein, welches von den Aminosäuren 262-546 der SEQ ID Nr. 1 existiert.
Das Polypeptid nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es eine oder mehrere post-translationale Modifikationen enthält.
Eine Nukleinsäuresequenz, welche ein Fragment des HCV-Genoms ist, kodierend das Polypeptid nach Anspruch 1.
Ein rekombinantes Nukleinsäuremolekül, umfassend ein Vektornukleinsäuremolekül und eine Nukleinsäuresequenz nach Anspruch 3.
Eine Hostzelle, fähig, ein Polypeptid nach Anspruch 1 herzustellen, umfassend ein rekombinantes Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 4.
Die Hostzelle nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Hostzelle eine Bakterie ist.
Ein rekombinanter Virus, umfassend ein rekombinantes Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 4.
Ein Impfstoff zum Schutz von Tieren gegen eine HCV-Infektion, dadurch gekennzeichnet, dass es eine Hostzelle nach Anspruch 6 oder einen rekombinanten Virus nach Anspruch 7 umfasst.
Ein Verfahren zur Herstellung eines HCV-Impfstoffes, dadurch gekennzeichnet, dass eine Hostzelle nach Anspruch 5 oder 6 oder ein rekombinanter Virus nach Anspruch 7 in einer Kultur propagiert wird, wonach die Hostzelle oder der rekombinante Virus geerntet und in ein pharmazeutisches Präparat mit immunisierender Aktivität ausgebildet wird.
In-vitro-Verwendung eines Polypeptids nach Anspruch 1 in einem diagnostischen Verfahren zur Feststellung der Gegenwart von einem HCV-Antigen oder -Antikörper.