DE69033503T3

DE69033503T3 - Nukleotidsequenzen und polypeptide von pestivirus, im einzelnen vom schweine-cholera-virus

Info

Publication number: DE69033503T3
Application number: DE69033503T
Authority: DE
Inventors: Jacobus Robertus MOORMANN; Gert Wensvoort
Original assignee: Centraal Diergeneeskundig Instituut
Current assignee: Centraal Diergeneeskundig Instituut
Priority date: 1989-06-29
Filing date: 1990-06-29
Publication date: 2006-07-27
Anticipated expiration: 2010-06-30
Also published as: ES2146574T3; WO1991000352A1; HU906667D0; RO114347B1; AU5955190A; DE69033503T2; NL8901651A; ES2146574T5; ATE191504T1; HU220237B; HUT63194A; KR0183368B1; KR920702720A; EP0479866A1; EP0479866B2; DE69033503D1; EP0479866B1; JP3262273B2; JPH04506453A

Description

Die Erfindung betrifft Nucleotide und Polypeptide zum Schutz gegen und zur Diagnose einer Pestivirus-Infektion, insbesondere einer Schweine-Cholera-Virus Infektion.
Das Schweine-Cholera-Virus (Schweinefieber-Virus) in Schweinen und zwei andere Viren, das viralen Diarrhoea Rinder-Virus (BVDV) im Rind und das Border-Disease-Virus (BDV) im Schaf gehören zu einer Gattung, der Gattung der Pestiviren in der Familie von Togaviridae (Westaway et al., Intervirology, 24, 125–139 (1985)); diese Viren besitzen einen positiven Strang, d.h. infektiöses RNA-Genom. Die drei Viren sind eng miteinander verwandt hinsichtlich der Struktur und Antigenität: ein Antiserum, das gegen eines der drei gerichtet ist, reagiert im allgemeinen auch mit den anderen beiden. BVDV und BDV entsprechen einander so sehr, daß sie in der Tat als ein Virustyp angesehen werden (Terpstra, in : Progress in Veterinary Microbiology and Immunology, Hrsg.: R. Panday, Bd. 1, S. 175–198 (1985)). Obgleich jedes der drei Viren seinen eigenen Primärwirt hat, können BVDV und BDV andere Wiederkäuer und unter anderem auch Schweine infizieren. Eine Eigenschaft, die die drei Viren gemeinsam haben, ist daß sie erbliche Infektionen verursachen (Van Oirschont, Veterinary Microbiology 9, 113–120 (1983)). Die vollständige Nucleotidsequenz eines BVDV Stammes ist aus EP-A-208 672 bekannt, die vollständigen Nucleotidsequenzen von Schweine-Cholera-Virus und BDV sind bis jetzt unbekannt.
Eine Forschungsübersicht über Pestivirus (einschließlich HCV) Genome und Proteine wird in J. Gen. Virol. 70, 253–266 (1989) gegeben. Die am 26.09.1990 veröffentlichte EP-A-389 034, der zum Teil ein Prioritätsdatum vom 19.03.1998 zukommt, offenbart die Nucleotid- und Aminosäuresequenz des HCV-Alfort Stammes.
Die Impfung gegen Pestivirus-Infektionen wird im allgemeinen unter Verwendung von lebenden attenuierten Virusstämmen durchgeführt. Folglich wird die Impfung gegen Schweine-Cholera im allgemeinen mit der Hilfe von spezifischen Stämmen des Schweine-Cholera-Virus (HCV) durchgeführt, zum Beispiel mit dem sogenannten chinesischen Stamm. Obgleich solche Impfun gen im allgemeinen ausreichenden Schutz gegen Schweine-Cholera bieten, ist die Vermehrung der Vakzinvirusstämme häufig ein Problem. Außerdem können der chinesische Stamm und andere Vakzinstämme nach der Impfung die Plazenta von trächtigen Säuen passieren und auf diese Weise die Föten mit dem Vakzinvirus infizieren. Als Folge können die Föten sterben oder sie leiden nach der Geburt unter einer langwierigen Krankheit (Overby und Eskildsen, CEC Report Hog Cholera/Classical and African Swine Fever Europe 5904, 420–429 (1976)). Der chinesische Vakzinvirus wurde in den Mandeln bis zu 15 Tagen nach der Impfung festgestellt (Terpstra, Tijdschrift voor Diergeneeskunde, 103, 678–684 (1978)) und kann in Schweinen beständiger sein. Dies kann bei der Diagnose eines solchen geimpften Tieres zu Verwirrung führen; die Unterscheidung vom Feldvirus ist nur nach weiterer diagnostischer Untersuchung möglich.
Antikörper, die gegen den chinesischen Stamm und außerdem gegen andere HCV-Vakzinviren gerichtet sind, können nicht von solchen unterschieden werden, die gegen den Feldvirus gerichtet sind. Folglich ist die Impfung einer Schweinepopulation gegen Schweine-Cholera und der gleichzeitige Nachweis einer HCV-Feldinfektion in dieser Population durch serologisches Screenen nicht möglich.
Die bekannten Verfahren zum Schutz von Rind und Schaf jeweils gegen BVDV und BDV Infektionen weisen entsprechende Nachteile auf.
Es besteht daher ein Bedarf an verbesserten, einfacheren Mitteln zum Schutz gegen und zur Diagnose von Pestivirus-Infektionen, insbesondere von Schweine-Cholera.
Die vollständige RNA-Nucleotidsequenz des virulenten HCV Stammes Brescia wurde jetzt gefunden.
Es wurde außerdem gefunden, daß Sequenzen, die spezifische Teile von Strukturproteinen eines infektiösen Organismus codieren, besonders gut als Basismaterial zum Schutz gegen die Infektion geeeignet sind. Diese Teile sind in den Ansprüchen definiert.
Die Erfindung betrifft daher diese Nucleotidsequenzen, die sich zum Schutz gegen eine Virus-Infektion eignen.
Die Erfindung betrifft außerdem rekombinante Polypeptide, die durch solche Nucleotidsequenzen codiert sind, und ein Verfahren zur Herstellung solcher Polypeptide durch rekombinante Mittel. Außerdem betrifft die Erfindung Impfstoffe und diagnostische Kits, die solche Nucleotidsequen zen oder Polypeptide enthalten. Die Erfindung wird in den beiliegenden Ansprüchen definiert.
Die Nucleotidsequenz von HCV ist in 1 gezeigt. Die gezeigte Sequenz entspricht der des Brescia Stammes, Klon Nr. 111 (CDI, Lelystad). Es wurde festgestellt, daß Schweine-Cholera Virusstämme einen hohen Grad serologischer Homologie aufweisen; Schweine-Cholera Stämme können voneinander durch Kreuz-Neutralisierungstests nicht unterschieden werden, können aber vom BVDV (viralen Diarrhoea Rinder-Virus) und BDV (Border-Disease-Virus) unterschieden werden (Wensvoort et al., Vet. Microbiol., 20:291–306 (1989); Doktorarbeit, Universität von Utrecht (1989), Kapitel 3). Es wurde außerdem festgestellt, daß Schweine-Cholera Stämme in gleicher Weise von einer Gruppe von monoklonalen Antikörpern gegen das Hüllprotein E1 erkannt werden. Diese Gruppe monoklonaler Antikörper erkennt weder BVDV noch BDV Stämme (Wensvoort et al., Vet. Microbiol., 21: 9–20 (1989); Doktorarbeit (1989), Kapitel 4). Konservierte Epitope auf dem Hüllprotein E1 von HCV wurden in allen untersuchten 94 HCV Stämmen festgestellt (Wensvoort, Doktorarbeit 1989, Seiten 47 und 78). Die Sequenzen der HCV Stämme außer der von Brescia, die geringfügige Unterschiede mit der Sequenz in 1 zeigen, sind außerdem von der Erfindung umfaßt.
In dem nachfolgenden Text bezieht sich die Numerierung auf das Genom des HCV Stammes Brescia; die Positionen können in anderen Stämmen etwas unterschiedlich sein, aber diese Unterschiede sind erfindungsgemäß unbedeutend. Die gezeigte Sequenz umfaßt einen offenen Leserahmen von 11.694 Nucleotiden, der auf beiden Seiten von einem nicht-codierenden Bereich eingegrenzt ist. Dieser nicht-codierende Bereich hat eine Länge von 360 Nucleotiden am 5'-Ende und eine Länge von 229 Nucleotiden, beginnend mit dem Stopsignal TGA am 3'-Ende. Der offene Leserahmen ist daher numeriert (5') 361–12054 (3'). Der Abschnitt von Nucleotid 361 bis zum Nucleotid 3804 codiert Strukturproteine. Diese umfassen ein Capsidprotein, das von dem Bereich codiert wird, der sich ungefähr zwischen 361 und 1162 befindet, ein Hüllprotein, auch E2 genannt, das von den danebenliegenden Nucleotiden 1162–2070 codiert wird, ein Protein (bis jetzt nicht im Detail identifiziert), auch E3 genannt, das von den angrenzenden Nucleotiden 2071–2430 codiert wird, und ein Hüllprotein, auch E1 genannt, das von den angrenzenden Nucleotiden 2431–3804 codiert wird. Die Hüllproteine, die E2 und E1 genannt werden, haben folglich jeweils die ungefähren Positionen 267–570 und 691–1148 in der Aminosäuresequenz nach 1.
E1 scheint bei der Herstellung von Antikörpern, die Schutz gegen Pestivirus-Infektionen liefern, besonders wirksam zu sein. Immundominante Unterabschnitte der E1-Sequenz scheinen in dem Abschnitt von Leu 691 bis Glu 1030 vorhanden zu sein, während der hydrophobe Bereich, der von ungefähr Phe 1031 bis Asp 1148 reicht, ein anderer Unterabschnitt der E1-Sequenz zu sein scheint, der für die schützende Wirkung wesentlich ist. Der letztere Unterabschnitt enthält drei transmembranöse Bereiche (TMR), die es dem Peptid ermöglichen, sich an der Zellmembran zu verankern. Es wurde außerdem festgestellt, daß die Gegenwart von zumindest einem solchen transmembranösen Bereich in dem Peptid zum Erreichen eines hohen Schutzgrades gegen den Pestivirus sehr wichtig ist. Ein TMR befindet sich zwischen den Resten Phe 1031 und Leu 1063 und ist bevorzugt in der Sequenz vorhanden, die zum Schutz verwendet wird. Die Polypeptide, die ausschließlich einem E1-Abschnitt entsprechen und die einen transmembranösen Bereich umfassen, eignen sich außerdem, zur Schutzerlangung.
Eine weitere Sequenz, die zur Schutzerlangung wichtig ist, ist ein polar geladener Bereich, der ungefähr bei Tyr 1012 beginnt und bei Phe 1031 endet. Diese Sequenz zusammen mit dem transmembranösen Bereich, der von Phe 1031 bis Leu 1063 codiert wird, wie in E1, ist am meisten bevorzugt in der zum Schutz verwendeten Sequenz vorhanden. Die durch Tyr 1012 – Leu 1063 codierte Sequenz wird außerdem Stop-Transfer-Bereich genannt (und verankert ein Protein in der Membran des rauben endoplasmatischen Reticulums). Die Stop-Transfer-Sequenzen bestehen aus einer hydrophoben Domäne von 20–25 Resten (d.h. TMR) und einem polaren Bereich von 10–15 Resten (d.h. Tyr 1012 – Phe 1031) (E. Perara und V.R. Lingappa, R.C. Das und P.W. Robbins, Hrsg. Academic Press, New York, 1988, S. 3–47). Diese Sequenz kann außerdem gebunden werden an ein anderes Antigen, das durch die Pestivirus RNA codiert wird (d.h. E2, E3, p80), oder an ein heterologes Antigen (d.h. bakterielles Toxin, Peplomerantigen eines Coronavirus, d.h. TGE, Haemagglutin eines Grippevirus, d.h. Grippevirus des Schweins usw.) und dadurch die Immunogenität eines solchen Antigens erhöhen (unabhängig von dem Expressionssystem). Außerdem kann TMR abgesehen von dem polaren Bereich verwendet werden oder der polare Bereich kann abgesehen von TMR verwendet werden. TMR und der polare Bereich können außerdem jeweils in Verbindung mit einem heterologen polaren Bereich und TMR verwendet werden. Die Verwendung eines Stop-Transfer-Bereichs ist nicht auf solche Bereiche begrenzt, die vom Pestivirus stammen. Außerdem kann die Immunogenität eines Antigens vom Pestivirus aber auch von anderen Antigenen erhöht werden, wenn die das Antigen codierende Sequenz an einen heterologen Stop-Transfer-Bereich oder an einen Teil davon gebunden wird.
Der hier verwendete Ausdruck Polypeptide soll Oligopeptide und Polypeptide bedeuten. Die Polypeptide können wahlweise glycosyliert oder anderweitig modifiziert sein.
Wichtige erfindungsgemäße Nucleotidsequenzen zum Schutz sind daher solche, die das Hüllprotein E1 und dessen Abschnitte codieren, einschließlich eine Stop-Transfer-Sequenz. Die erfindungsgemäße Sequenz kann daher bevorzugt zumindest einen Abschnitt der Nucleotidsequenz (5') 1–3804 (Numerierung gemäß 1) enthalten. Die besagten Gebiete sind gültig für HCV; für BVDV und BDV sind die Positionen etwas anders, aber die allgemeine Reihenfolge ist die gleiche; die Sequenzen der entsprechenden Hüllproteine und deren Abschnitte sind außerdem zum Schutz und zur Diagnostik besonders nützlich.
Die Bedeutung der Strukturproteine und der Polypeptide, die diesen vollständig oder teilweise entsprechen, für die schützende Wirkung gegen Pestivirus-Infektionen ist durch die Tatsache offensichtlich, daß Schweine, die mit einem rekombinanten Virus geimpft sind, der eine cDNA-Sequenz umfaßt, die ein Strukturprotein von HCV, insbesondere E1, codiert, Antikörper gegen E1 herstellen, neutralisierende Antikörper gegen HCV bilden und gegen die Infektion mit einem virulenten Schweine-Cholera-Virus geschützt sind.
Die Erfindung betrifft außerdem rekombinante RNA und DNA, in die eine oben beschriebenen Sequenzen eingeführt wird; ein rekombinantes Polypeptid dieses Typs hat zum Beispiel die Form eines rekombinanten Virus. Ein geeigneter Trägervirus dafür ist das Pseudo-Tollwutvirus (PRV), aber auch andere Viren, wie das Grippevirus, Adenovirus, Baculovirus, SV40, Retrovirus, Hepatitis B Virus und deren Derivate, können verwendet werden. Darüber hinaus können Zellen verwendet werden, bei denen eine stabile Transformation mit einem dieser Viren durchgeführt wurde, Zellen in denen sich diese Viren episomal oder lytisch replizieren und Zellen, bei denen eine stabile Transformation mit geeigneten Vektoren durchgeführt wurde und die ein Strukturprotein, insbesondere das E1 Protein oder ein Teil davon, wie in den Ansprüchen definiert, exprimieren, d.h. Untereinheiten, wie in den Ansprüchen definiert, die wahlweise über rekombinante DNA in prokaryontischen oder eukaryontischen Systemen erhalten werden. Ein solches rekombinantes System ist als Basis eines Impfstoffs gegen eine Pestivirus-Infektion, insbesondere gegen HCV, äußerst geeignet. Die Erfindung betrifft daher außerdem Vakzine, die die Nucleotidsequenz eines rekombinanten Virus oder in einer anderen Form enthalten.
Die Erfindung umfaßt des weiteren Vakzine, die Polypeptide enthalten, wie oben beschrieben.
Die Erfindung betrifft außerdem Mittel zur Diagnose einer Infektion, wobei ein antigenes Polypeptid, wie oben beschrieben, verwendet wird, sowie Kits, die solche Mittel als wesentliche Komponente enthalten.
Eine besonders nützliche Diagnose ist die, bei der es möglich ist, serologisch zwischen einem Tier, das erfindungsgemäß geimpft wurde, und einem infizierten Tier, insbesondere mit HCV, zu unterscheiden. In diesem Fall wird ein Polypeptid verwendet, das nicht das Polypeptid ist, welches die schützenden Antikörper herstellt: das Serum der infizierten Tiere enthält dann Antikörper gegen dieses zweite Polypeptid, während das Serum von geimpften Tieren sie nicht hat. Das E2 Protein ist ein geeignetes Polypeptid für diesen Zweck.
Im folgenden werden Verfahren zum Kultivieren der Viren, zum Isolieren und Klonieren von RNA, zum Bestimmen der Sequenz und zum Herstellen von Peptiden und Antisera beschrieben.
Zellen und Viren
SK-6 Zellen [Kasza et al., Research Vet. Siliciumcarbid. 13, 46–51 (1979)] wurden in Eagle's Basismedium, enthaltend 5% fetales Rinderserum (FBS) wachsen gelassen. FBS wurde mit Gammastrahlung bestrahlt und anschließend gründlich auf BVDV untersucht durch verlängertes Wachstum der fetalen epithelen Rinderzellen (FBE) in Media, die diese Sera enthalten. Die Zellen wurden auf BVDV in einem empfindlichen Immunperoxidase-Assay mit einer Monoschicht (IPMA) überprüft (Wensvoort et al., Vet. Microbiol. 12: 101–1108(1986)). FBS wurde außerdem auf BVDV Antikörper durch Messung des Neutralisierungsindex eines BVDV Standardvorrats in einem IPMA überprüft. Die einzigen verwendeten Sera waren solche, die frei von BVDV waren und keine BVDV Antikörper enthielten oder einen niedrigen BVDV Antikörpertiter aufwiesen.
Der HCV Stamm Brescia war nicht zytopathogen und wurde biologisch durch dreifache Endpunktverdünnung kloniert. Nach drei Amplifizierungsschritten wurde ein klonierter Virusvorrat (Brescia, Klon Nr. 111) mit einem Titer von 3,10⁷ TCID₅₀/ml erhalten.
Isolierung intrazellulärer RNA aus HCV
Monoschichten von SK-6 Zellen in 175 cm² Flaschen (Nunclon) wurden mit HCV mit einer Mehrfachinfektion (MOI) von 10 TCID₅₀ pro Zelle infiziert. Sie wurden 1,5 Stunden bei 37°C inkubiert und danach wurde frisches Medium auf ein Endvolumen von 40 ml zugegeben. Nach 7 Stunden wurde Actinomycin D zugegeben unter Erhalt einer Endkonzentration von 1 μg/ml. 24 Stunden nach der Infektion wurden die Zellen zweimal mit eiskaltem PBS gewaschen. Die Zellen wurden in einem eiskalten Lysepuffer (50 mM Tris-HCl, pH 8,2, 0,14 M NaCl, 2 mM MgCl₂, 5 mM DTT, 0,5% (V/V) NP-40, 0,5% Na-Deoxycholat und 10 mM Vanadylribonucleosidkomplexe (New England Biolabs)) lysiert.
Die Lysate wurden zentrifugiert (4°C, 5 min, 4000 Upm) und der Überstand wurde mit Proteinase K (Endkonzentration: 250 μg/ml) bei 37°C 30 Minuten behandelt, zweimal mit Phenol, Chloroform und Isoamylalkohol (49:49:2) und einmal mit Chloroform und Isoamylalkohol (24:1) extrahiert. Intrazelluläre RNA wurde durch Ausfällung mit Ethanol erhalten, über einem 5,7 M CsCl Kissen gereinigt und mit HCV-spezifischer RNA in einem denaturierenden, isokinetischen Sucrosegradienten von 5–29% (G/V), enthaltend 50% Formamid, angereichert. Der Sucrosegradient wurde 16 Stunden bei 200000 × g in einem Beckmann SW40 Ti Rotor bei 5°C zentrifugiert (Moormann und Hulst, Virus Res. 11, 281–291 (1988)).
Isolierung viraler RNA aus HCV
Brescia Virus wurde im wesentlichen wie von Moormann und Hulst (siehe oben) beschrieben gereinigt. Konfluente Monoschichten der SK-6 Zellen wurden mit einem MOI von 0,5 infiziert und in 200 ml Medium bei 37°C 48 Stunden wachsen gelassen. Die Zellen wurden anschließend in 50 ml Medium suspendiert und zweimal gefriergetrocknet. Die Zellsuspension wurde gereinigt und der Überstand wurde auf 0,5 M NaCl und 10 M/V Polyethylenglykol 6000 (BDH) aufgetragen. Der Virus wurde durch 20-minütiges Zentrifugieren bei 6000 × g bei 4°C pelletiert, in TNE (20 mM Tris-HCl, pH 7,2, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA) aufgelöst und in einem Gradienten aus 30–50% Glycerol/(0–50%) Na-K Tartrat gereinigt. Die Fraktionen des Gradienten wurden titriert, um zu bestimmen, ob der Virus in einem IPMA vorhanden war. Die zur Verwendung geeigneten Fraktionen wurden zusammengetragen, und der Virus wurde durch vierstündiges Zentrifugieren bei 150000 × g bei 4°C pelletiert. Die virale RNA wurde aus dem Pellet mit eiskaltem Lysepuffer und Proteinase K extrahiert, wie oben beschrieben. Die virale RNA wurde durch Ausfällung mit Ethanol gewonnen.
Klonierung der RNA vom HCV
Angereicherte intrazelluläre HCV-RNA (ungefähr 1,5 μg HCV-spezifische RNA) wurde 10 Minuten mit 10 mM Methylquecksilberhydroxid bei Raumtemperatur inkubiert. Die denaturierte RNA-Probe wurde bei 42°C mit 50 mM Tris-HCl, pH 7,8, 10 mM MgCl₂, 70 mM KCl, 0,5 mM dATP, dCTP, dGTP und dTTP, 0,6 μg Oligonucleotidprimer pd(N)6 der Kalbschilddrüse (Pharmacia) und 300 Einheiten Moloney-muriner Leukämievirus Reverse-Transkriptase (Bethesda Research Laboratories) in einem Gesamtvolumen von 100 μl inkubiert. 20 mM EDTA wurden nach 1 Stunde zugegeben, die Mischung wurde anschließend mit Phenol/Chloroform extrahiert, über eine Sephadex G50 Säule geleitet und mit Ethanol ausgefällt.
Zur Synthese des zweiten cDNA-Stranges wurden DNA Polymerase I (Boehringer) und RNAse H (Pharmacia) verwendet (Gübler und Hoffman, Gene 25, 263–269 81983)).
Die doppelsträngige cDNA wurde mit T4 DNA Polymerase (Pharmacia) in einer Reaktionsmischung, die 0,05 mM Desoxynucleotid-Triphosphate enthielt, inkubiert und mit EcoRI Methylase (New England Biolabs) methyliert. EcoRI Linker (New England Biolabs) wurden an die glatten Enden der cDNA mit T4 DNA Ligase (Pharmacia) angebracht. Nach dem Verdau mit EcoRI (New England Biolabs) wurde die cDNA auf einem 0,8% Agarosegel getrennt. Fragmente von 1 bis 4 kb wurden elektroeluiert, an die EcoRI-Stelle von pUC 19 ligiert und zur Transformation des E. coli Stammes JM83 (Vierira und Mesing, Gene 19, 259–269 (1982)) verwendet, wie von Hanahan, J. Mol. Biol. 166, 57–580 (1983) beschrieben. Die Filter der Kolonien wurden mit einer ³²p-markierten einzelsträngigen cDNA-Sonde hybridisiert. Die Sonde wurde von der HCV-RNA, die auf einem neutralen Agarosegel (Moormann und Hulst, siehe oben) fraktioniert worden war, umgekehrt transkribiert. Vor der Verwendung wurde die einzelsträngige DNA-Sonde mit der cytoplasmatischen RNA aus scheininfizierten SK-6 Zellen (mockinfected) inkubiert.
Die Beziehung zwischen den HCV-cDNA-Klonen wurde durch Restriktionsenzymanalyse und Hybridisierung der Southern-Blots (Southern, J. Mol. Biol. 89, 503–517 (1975)) der verdauten DNA Nick-translatierten cDNA-Sonden (Maniatis et al., "Molecular Cloning, A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Lab., Cold Spring Harbor, N.Y. 1982) bestimmt.
Die Klone, die aus der oben beschriebenen cDNA-Bibliothek isoliert wurden, stellen 90% der HCV-RNA dar. Die RNA-Sequenzen an dem 5'- und 3'-Ende wurden jedoch nicht kloniert.
Zum Erhalt der cDNA-Klone des 3'-Endes wurden 20 μg virale RNA in vitro polyadenyliert mit E. coli polyA-Polymerase (Pharmacia) in 300 μl Reaktionsmischung, enthaltend 50 mM Tris-HCl, pH 7,8, 2,5 mM MnCl₂, 10 mM MgCl₂, 250 NaCl, 5 mM DTT, 800 μg/ml BSA, 180 Einheiten RNasin (Promega Biotech), 0,2 mM ATP, 4 μCi ³H-ATP und 2 Einheiten Polymerase. Die Reaktion dauerte bei 37°C 90 Minuten und wurde durch Extraktion mit Phenol beendet (siehe oben). Die mit polyA adenylierte RNA wurde mit Ethanol gewonnen und zur Synthese des erste cDNA-Stranges wurde als Primer Oligo-dT (12–18) (Pharmacia) verwendet. Zum Erhalt der cDNA-Klone des 5'-Endes wurde ein synthetisches Oligonucleotid, das mit der Nucleotidsequenz 308–347 (1) komplementär ist, synthetisiert und als Primer zur Synthese des ersten cDNA-Stranges auf einer viralen RNA Matrize verwendet. Die Bedingungen zur Synthese des ersten und zweiten cDNA-Stranges von den 5'- und 3'-Enden erfolgte wie oben beschrieben.
Doppelsträngige cDNA wurde mit T4 Polymerase (siehe oben) inkubiert, auf einem 0,8% Agarosegel fraktioniert und in die SmaI-Stelle von pGEM-4 blau (Promega Biotech) ligiert. Die ligierte DNA wurde zur Transformation von E. coli oH5-α (Hanahan in DNA Cloning Bd. l, A Practical Approach, Kapitel 6, S. 109–135, 1985) verwendet.
Sequenzierung der cDNA-Klone
Die Sequenzanalyse wurde im wesentlichen nach dem Subklonieren geeigneter Restriktionsfragmente in M13mp18 und mp19 durchgeführt (Yanisch-Perron et al., Gene 33, 103–119 (1985)). Der zurückbleibende Abschnitt der Sequenz wurde durch direkte Sequenzbestimmung der doppelsträngigen DNA aus den Plasmidklonen mit einem Sequenzkit, das auf T7 Polymerase (Pharmacia) basiert, bestimmt. Zusätzlich zu dem universellen M13 Primer, der 15 Nucleotide lang ist (Boehringer), wurde die Sequenzierung außerdem unter Verwendung von Oligonucleotidprimern durchgeführt, die in einem Cyclon DNA Synthetisierer (New Brunswick Scientific) hergestellt wurden. Die Nucleotidsequenzen der subklonierten HCV-spezifischen Restriktionsfragmente wurden durch das Didesoxykettenendverfahren unter Verwendung der Klenow DNA-Polymerase (Pharmacia) oder der Reverse Transkriptase (Life Sciences) (Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 54–67 (1977), Smith, DNA Sequence Analysis by Primed Synthesis in "Methods in Enzymology", Bd. 65, S. 560–580, Academic Press, New York) und α-³⁵S-dATP (Amersham) bestimmt.
Die Sequenzierungsreaktionen wurden auf einem 6% Acrylamidgel mit 8 M Harnstoff untersucht. Die Daten wurden mit einem M24 Rechner von Olivetti unter Verwendung eines PCGene Sequenzanalyse-Programms, (Genofit, Genf, Schweiz) und mit einem Macintosh SE Rechner von Apple unter Verwendung von DNA "Strider" (Marck, Nucl. Acids Res. 16, 1829–1836 (1988)) untersucht.
Herstellung dar synthetischen Peptide und der Antipeptidsera in Kaninchen.
Die Peptide wurden durch bekannte Verfahren unter Verwendung einer Festphase und eines BOP [Benzotriazol-1-yloxy-tris(dimethylamino)phosphoniumhexafluorphosphat] Reagens synthetisiert (Fournier et al., Int. J. Peptide Protein Res. 31, 86–97 (1988)).
Antisera gegen die Peptide wurden durch Immunisieren von Kaninchen mit 1 mg Peptid, das mit dem Keyhole Limpet Haemocyanin (KLH) (KLH: Peptid = 1:1) konjugiert ist, in vollständigem Freund-Adjuvans hergestellt. Den Kaninchen wurde 70 Tage nach der Immunisierung Blut entnommen.
Analyse der Antipeptidsera unter Verwendung von Western Blots
Das Hüllprotein E1 von HCV Brescia wurde durch Immunoaffinität gereinigt, durch Natriumdodecylsulfat/Polyacrylamid-Gelelektrophorese fraktioniert und auf Nitrocellulosepapier (Blots) übertragen, wie von Wensvoort beschrieben (Doktorarbeit: Epitopes on Structural Proteins of Swine Fever (Hog cholera) Virus. Universität von Utrecht, S. 71–85). Die Blots wurden 30 Minuten bei 37°C in PBS + 0,85 M NaCl + 0,05% Tween 80 und 5% Pferdeserum (Blottingpuffer) eingeweicht und anschließend 60 Minuten bei 37°C mit den Antipeptidsera, die mit 1:10 Blottingpuffer verdünnt sind, inkubiert. Nach viermaligem Waschen in PBS + 0,05% Tween 80 wurden die gebundenen Immunglobuline vom Kaninchen bestimmt durch eine zweite Inkubation für 60 Minuten bei 37°C mit einem HRPO Konjugat, das gegen Kaninchen IgG und IgM gerichtet ist. Die Blots wurden anschließend wie oben gewaschen und mit einer Substratlösung, wie von Wensvoort beschrieben (siehe oben), inkubiert. Als positive Kontrollen wurden E1 Blots mit Concanavalin-A und mit monoklonalem Antikörper-HRPO Konjugat 8 (Wensvoort, siehe oben) gefärbt.
Expression von E1 in einer Zellkultur
Monoschichten der 3 × 106 SK-6 Zellen wurden mit HCV, M203, M204, M205 oder M206 durch eine Mehrfachinfektion von 10 infiziert. Die Zellen wurden mit ³⁵S 6 bis 10 Stunden nach der Infektion durch Inkubation in 2 ml cysteinfreiem Eagle's Basismedium, das mit Glutamin, Antibiotika, 5% dialysiertem fetalem Kalbsserum und 100 μCi [³⁵S]-Cystein pro ml ergänzt worden war, markiert. 18 Stunden nach der Infektion wurden die Zellen und Überstände getrennt geerntet. Die Zellen wurden in 1 ml PBS-TDS (1% (V/V) Triton X-100, 0,5% (G/V) Na-Desoxycholat, 0,1% (G/V) Na-Dodecylsulphat in phosphatgepufferter Kochsalzlösung) lysiert. Die Lysate wurden mit Ultraschall behandelt und durch 10-minütige Zentrifugation bei 80000 × g gereinigt. Die Überstände wurden durch 2-stündige Zentrifugation bei 80000 × g gereinigt. 100 μl Proben der Lysate oder 200 μl Proben der Überstände wurden 16 Stunden bei 4°C mit 2 μg einer 1:1:1 Mischung aus E1-spezifischen MAbs 3, 6 und 8 inkubiert (Wensvoort, J. Gen. Virol. 70, 2865 (1989)). Diese Mischungen wurden anschließend 2 Stunden bei 4°C mit 1 mg Protein A Sepharose inkubiert und 1 Minute bei 1000 × g zentrifugiert. Die ausgefällten Proteine wurden viermal mit PBS-TDS gewaschen, 5 Minuten bei 100°C in Probenpuffer (60 mM Tris-HCl, pH 6,8, 2% Na-Dodecylsulphat, 10% Glycerin, 5% 2-Mercaptoethanol, 0,01 Bromphenolblau) inkubiert und durch Elektrophorese auf 10% SDS-Polyacrylamidgelen analysiert.
Beschreibung der Figuren
1 Die vollständige Nucleotidsequenz der DNA-Kopie der Schweine-Cholera-Virus RNA vom Stamm Brescia.
Der Methioninrest, der durch die Nucleotide 361–363 codiert ist, entspricht der ersten Aminosäure des offenen Leserahmens, der in der Sequenz von dem Nucleotid 361 bis zum Nucleotid 12054 reicht.
Die unterstrichenen Bereiche deuten auf die Sequenz der synthetischen Peptide (18mer) 1–3 hin, die zur Herstellung von Peptidantisera in Kaninchen verwendet werden (siehe oben).
Die vertikalen Pfeile weisen hin auf Leu an der Aminosäureposition 691, Phe an der Position 1031, Leu an der Position 1063 und Asp an der Position 1148 (siehe außerdem 4).
2 Western-Blot Analyse der Antisera vom Kaninchen, die gegen die Peptide 1–3 (siehe 1) hergestellt wurden.
Die Blots wurden analysiert mit (von links nach rechts):
Concanavalin-A, monoklonalem Antikörper 8 (Wensvoort, 1989, siehe oben), Antisera gegen die Peptide 1–3.
Das Doublett gp54–51 bildet die E1 Glycoprotein-Fraktion vom HCV-Stamm Brescia; die Beschaffenheit von gp31 wurde bisher nicht ermittelt. 3 Karte der Nucleotide 1–4440 der in 1 gezeigten Sequenz für die Restriktionsenzyme AccI, EcoRI, EcoRIV und NaeI: Die Position des ersten Nucleotids einer Erkennungstelle für ein Restriktionsenzym in der Sequenz (1) ist in der Sequenz (1) angezeigt.
Die Stellen der E1-Restriktionsfragmente M203 (NaeI-EcoRI), M204 (NaeI-AccI) und M205 (NaeI-EcoRIV) sind in dieser Sequenz unterstrichen. Diese Fragmente wurden in pHBdelta2.4 subkloniert (siehe 4).
4 Herstellung von Rekombinanten zwischen HCV-E1 und pHBdelta2.4. Die Herstellung von pHBdelta2.4 wurde von Quint et al., J. Gen. Virol. 68, 523–534 (1987) beschrieben. Das Dreieck weist auf eine Deletion von ungefähr 2,05 kb in dem einzigartigen kurzen Bereich von pHBdelta2.4 hin (Van Zijl, zu veröffentlichen). Die BamHI-Stellen sind mit B gekennzeichnet. Die gX-Sequenz wurde von Rea et al., J. Virol. 54, 21–29 (1985) beschrieben, die gp50-Sequenz von Petrovskis et al., J. Virol. 59, 216–223 (1986) und die gp63-Sequenz von Petrovskis et al., J. Virol. 60, 185–193 (1986). Rekombinante wurden durch Deletion des Restriktionsfragmentes BalI-NdeI aus pHBdelta2.4 hergestellt. Dieses Restriktionsfragment umfaßt den größten Teil des codierenden Bereiches (1380 Nucleotide) von gX (Rea et al., siehe oben). Die NdeI-Stelle wurde mit der Klenow-Polymerase aufgefüllt, und die E1-Sequenzen M203, M204 und M205, die in 3 gezeigt sind, wurden in pHBdelta2.4 eingeführt.
Am 5'-Ende besitzen alle E1-Sequenzen ein glattes Ende (von NaeI), das mit GG beginnt. Dieses Ende wird direkt ligiert an das glatte Ende von pHBdelta2.4, das nach dem BalI Verdau hergestellt wird. Die Fusion an dem 5'-Ende führt zu einem Gly Codon an der Ligationsstelle in allen pHBdelta2.4-E1 Konstrukten. Das Leu Codon stromabwärts von diesem Gly codiert für die Aminosäure 691 in der HCV-Sequenz (1).
Am 3'-Ende wurden Stopcodone in die Konstrukte durch die Verwendung von spezifischen Oligonucleotidlinkern eingeführt. Das Codon, das direkt stromaufwärts von dem Stopcodon im Konstrukt M203 liegt, codiert die Aminosäure 1031 in der HCV-Sequenz (1). In den Konstrukten M204 und M205 codieren diese Codone jeweils die Aminosäuren 1063 und 1148 (1).
Die Startpunkte der gX-Sequenzen entlang des E1 Inserts an den 5'- und 3'-Enden sind durch Pfeile angezeigt. Die Stopcodone und Sequenzen bis zu den gX Startpunkten an den 3'-Enden der Konstrukte stammen von den verwendeten Oligonucleotidlinkern.
Die molekularen Klonierungsverfahren wurden wie von Maniatis et al., (1982, siehe oben) beschrieben durchgeführt.
5 Regenerierung des Pseudo-Tollwutvirus (PRV) rekombinanten aus überlappenden Subgenom-PRV-Fragmenten (Van Zijl et al., J. Virol. 62, 2191–2195 (1988)).
pMZ66 enthält das E1 Fragment M203, pMZ65 enthält das E1 Fragment M204 und pMZ263 enthält das E1 Fragment M205.
Die Positionen der transfizierten Klone auf der physikalischen Karte des PRV Stammes NIA-3 (siehe 5a) sind durch vertikale Striche (siehe 5b) gekennzeichnet.

(a): Physikalische Karte von NIA-3 (Quint et al., J. Gen. Virol. 68, 523–534, (1987)). Das Genom besteht aus einem linearen doppelsträngigen DNA-Molekül, das in einen einzigartigen kurzen Bereich innerhalb der insertierten Wiederholungen (durch offene Rechtecke dargestellt) und einen einzigartigen langen Bereich unterteilt werden kann. Die BamHI-, HindIII- und KpnI-Stellen sind gezeigt.
(b): Eine Reihe von 5 überlappenden Klonen

Die Cosmidklone c-179, c-1 und c-443 wurden von Van Zijl et al. (siehe oben) beschrieben. Der Klon pMZ64 enthält das BglII B Fragment vom Stamm 783 (Moormann et al., Abstract 12. Int. Herpes Virus Workshop, S. 255 (1987)) in einem Plasmidvektor. Das Tk-Gen im Stamm 783 (pMZ64) wurde durch Einführung einer Deletion von 19 Basenpaaren inaktiviert (Moormann et al., siehe oben). Die Position dieser Deletion in pMZ64 ist durch ein Dreieck gekennzeichnet. Die Herstellung der Klone pMZ63/65 und 66 ist in 4 beschrieben. Die Regenerierung von PRV-E1 Rekombinanten wurde wie von Van Zijl et al. (siehe oben) beschrieben durchgeführt. Entsprechend dem eingeführten E1 Bereich (4 und 4) wurden die rekombinanten PRV-E1 Stämme PRV-M203, PRV-M204 und PRV-M205 genannt.
Die Herstellung von PRV-M206 war gleich wie die der Stämme PRV-M203 bis einschließlich PRV-M205, der Stamm PRV-M206 ist identisch mit diesen Stämmen, ihm fehlt aber die spezifische E1-Sequenz von HCV.
6 Expression des E1 Proteins in einer Zellkultur. Autoradiographie eines SDS-Polyacrylamidgels, das die Immunpräzipitate von Lysaten und Überständen (Medium) von M203-, M204-, M205- und M206-infizierten Zellen mit einer Mischung aus E1-spezifischen MAbs zeigt. Wildtyp E1 (Molekularmasse: 51 bis 54 kD), das aus den Lysaten der HCV-infizierten Zellen ausgefällt wurde, wurde parallel laufen gelassen. Ein 31-kD Glycoprotein wurde immer mit E1 co-ausgefällt.
Beispiel
Die nachfolgenden Versuche wurden durchgeführt, um zu bestimmen, ob die mit einem der drei PRV-Konstrukte M203, M204 und M205 oder mit dem PRV-Konstrukt M206 geimpften Schweine neutralisierende Antikörper gegen Pseudo-Tollwutvirus und Schweine-Cholera-Virus und HCV-E1-spezifische Antikörper bilden.
Es wurde außerdem bestimmt, ob die Impfung der Schweine mit einem der drei Konstrukte PRV-M203, -M204 und -M205 zum Schutz dieser Schweine gegen eine virulende Infektion mit Schweine-Cholera-Virus führt. Die verwendeten Testtiere bildeten vier Gruppen (A–D), und es handelte sich um 10 Wochen alte SPF Schweine, die keine Antikörper gegen HCV und BVDV aufwiesen. Jede Testgruppe umfaßte vier Schweine.
Am Tag 0 wurde die vier Schweine in der Gruppe A intramuskulär mit 10^7,3 PFU von PRV-M203 (siehe 4) geimpft, diejenigen in der Gruppe B mit 10^7,3 PFU von PRV-M204, diejenigen in der Gruppe C mit 10^7,3 PFU von PRV-M205 und diejenigen in der Gruppe D mit 10^7,3 PFU von PRV-M206.
Die Impfung wurde am Tag 28 wiederholt. Am Tag 42 wurden alle Schweine in den vier Gruppen intranasal mit einer 100 LD₅₀ Dosis virulenten HCV Brescia 456610 (Terpstra und Wensvoort,. Microbiol. 16, 123–128 (1988)) infiziert.
Serumblutproben wurden an den Tagen -3, 28, 42 und 63 entnommen. Die Sera wurden in dem Serumneutralisierungstest (SNT-PRV) (De Leeuw et al., Vet. Quarterly 4, 49–56 (1982) untersucht, um neutralisierende Antikörper gegen PRV nachzuweisen. Die Sera wurden außerdem in dem Peroxidase-gebundenen Assay (NPLA) (Terpstra et al., Vet. Microbiol. 9, 113–120 (1984)) untersucht, um neutralisierende Antikörper gegen HCV nachzuweisen. Die Sera wurden auch durch Complex Trapping Blocking ELISA (CTB) (Wensvoort et al., Vet. Microbiol. 17, 129–140 (1988)) untersucht, um HCV-E1 spezifische Antikörper nachzuweisen.
EDTA Blutproben wurden an den Tagen 42, 45, 47, 49, 52, 56 und 63 entnommen. Die Zahl der Erythrozyten, Thrombozyten und Leukozyten in diesen Proben wurde gezählt. Außerdem wurden die Leukozyten aus diesen Proben isoliert, und die HCV-Titer der Leukozyten-Fraktionen wurden durch Titration von log-Verdünnungen der Fraktionen in PK-15 Zellen bestimmt. Die Zellen wurden anschließend 4 Tage bei 37°C und in 5% CO₂ kultiviert, woraufhin die Virus-Gegenwart in einem IPMA mit monoklonalen Antikörpern, die gegen den HCV-Virusstamm gezüchtet sind (Wensvoort et al., Vet. Microbiol. 12, 101–108 (1986)), bestimmt wurde.
Die rektalen Temperaturen aller Schweine wurden täglich gemessen, und die Schweine wurde täglich auf Anzeichen von Krankheiten untersucht.
Tabelle 1
Antikörper Antworten der Gruppen A bis D. Die Sera wurden an den Tagen -3, 28, 42 und 63 entnommen und doppelt untersucht durch SNT-PRV, NPLA und CTB. Für SNT-PRV und NPLA wurden die Titer als log der reziprokalen Verdünnung ausgedrückt, die die Vervielfältigung von 100–3000 TCID50 Virus verhinderten. Für CTB wurden die Titer als prozentuale Hemmung eines negativen Standardsignals ausgedrückt (Wensvoort et al., Vet. Microbiol. 17, 129–140 (1988)).

*: = < 0,3, in dem SNT-PRV bedeutet diese Zahl ein negatives Ergebnis;
#: = < 0,8, in dem NPLA bedeutet diese Zahl ein negatives Ergebnis;
@: in dem PCT bedeutet eine prozentuale Hemmung von < 30 ein negatives Ergebnis, während eine prozentuale Hemmung von > 50 als positives Ergebnis angesehen wird.
d: = bedeutet gestorben.

Tabelle 2
Schweine-Cholera-Virus Titer in Leukozytenfraktionen der Schweine aus den Grupppen A, B, C und D, nachdem die Schweine am Tag 42 mit 100 LD₅₀ virulentem Schweine-Cholera-Virus, Stamm Brescia 456610 geimpft wurden.

*<: = kein Virus nachgewiesen, Titer sind als log TCID50 ausgedrückt.
d: = gestorben; Schweine 13, 14 und 15 wurden am Tag 56 notgeschlachtet
–: = nicht zutreffend

Tabelle 3
Mittelwerte der klinischen Daten der Schweine aus den Gruppen A, B, C und D, nachdem die Schweine am Tag 42 mit 100 LD₅₀ des virulenten Schweine-Cholera-Virus, Stamm Brescia 456610, geimpft wurden.

• Durchschnittl. Temp.: = Die rektale Durchschnittstemperatur ungefähr um 10 Uhr morgens.
#Durchschnittl. Ery.: = Die durchschnittliche Erythrozytenzahl (× 10¹²) pro Liter
@ Durchschnittl. Thr.: = Die durchschnittliche Thrombozytenzahl (× 10⁹) pro Liter
– Durchschnittl. Leuk.: = Die durchschnittliche Leukozytenzahl (× 10⁹) pro Liter

Schlußfolgerung
Schweine, die mit einem der drei Konstrukte PRV-M203, PRV-M204 und PRV-M205 geimpft wurden, entwickelten neutralisierende Antikörper gegen PRV und HCV und Antikörper spezifisch für HCV-E1. Die Schweine, die mit PRV-M206 geimpft wurden, entwickelten neutralisierende Antikörper gegen PRV, aber keine neutralisierenden Antikörper gegen HCV oder Antikörper spezifisch für HCV-E1 (Tabelle 1). Die gesamte zusätzliche genetische Information, die in den drei PRV-HCV Konstrukten enthalten ist, entspricht der Genom-Sequenz, die HCV-E1 oder Abschnitte von HCV-E1 codiert: dies bedeutet, daß die Schweinesera, die gegen HCV-E1 gerichtet sind, HCV neutralisieren können.
Schweine, die mit PRV-M203 geimpft sind, sind teilweise gegen eine virulente HCV-Infektion geschützt. Die Schweine, die mit dem PRV-HCV Konstrukten M204 oder M205 geimpft sind, sind vollständig gegen eine virulente HCV-Infektion geschützt.
Schweine, die mit PRV-M206 geimpft sind, sind nicht gegen eine virulente HCV-Infektion geschützt (Tabellen 2 und 3). Die Schweine können daher gegen eine virulente Schweine-Cholera-Virusinfektion geschützt werden durch Impfung mit einer Vakzine, die die genetische Information von HCV-E1 oder Teilen von HCV-E1 oder durch Impfung mit einer Vakzine, bei der das genetische Produkt von HCV-E1 oder Teile von HCV-E1 verwendet werden, als einziges Polypeptid, gegen das eine Antikörper Antwort auf HCV gerichtet ist oder durch Impfung mit Polypeptiden, die irgendwie von der genetischen Information abstammen, die für HCV-E1 oder Teile von HCV-E1 codiert.

Claims

Nucleotidsequenz, die einen Teil der Aminosäuresequenz von dem Schweine-Cholera-Virus (HCV) Stamm Brescia codiert, wobei dieser Teil eine oder mehrere Aminosäuresequenzen 1–1148, 1–267, 268–570, 571–690, 691–1148, 691–1030, 1012–1031, 1012–1063, 1031–1148 und 1031–1063 der in 1 gezeigten Aminosäuresequenz umfaßt.
Nucleotidsequenz, umfassend einen Teil des Genoms eines Pestivirus, wobei der Teil, der ein Polypeptid codiert, aus einer Aminosäuresequenz besteht, die den in 1 gezeigten Aminosäuresequenzen 268–570, 691–1148, 691–1030 oder 1031–1063, entspricht.
Rekombinantes Polynucleotid, enthaltend eine Nucleotidsequenz gemäß Anspruch 1 oder 2.
Rekombinantes Polynucleotid nach Anspruch 3, wobei die Sequenz einen Pseudo-Tollwutvirusvektor enthält.
Expressionssystem, das ein rekombinantes Polynucleotid nach einem der Ansprüche 3 bis 4 enthält, und das die Nucleotidsequenz exprimieren kann.
Rekombinantes Polypeptid, umfassend einen Teil der Aminosäuresequenz des Schweine-Cholera-Virus (HCV) vom Stamm Brescia, wobei dieser Teil eine der Aminosäuresequenzen 1–1148, 1–267, 268–570, 571–690, 691–1148, 691–1030, 1012–1031, 1012–1063, 1031–1148 und 1031–1063 der in 1 gezeigten Aminosäuresequenz aufweist, wobei das Polypeptid wahlweise glycosyliert ist.
Rekombinantes Polypeptid, umfassend einen Teil der Aminosäuresequenz des Schweine-Cholera-Virus (HCV), wobei der Teil aus den in 1 gezeigten Aminosäuresequenzen 268–570, 691–1148, 691–1030 oder 1031–1063, besteht.
Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten Polypeptids, das einen Teil der Aminosäuresequenz des HCV Stammes Brescia umfasst, umfassend den Schritt des Exprimierens einer Aminosäuresequenz, die eine der Aminosäuresequenzen 1–267, 268–570, 571–690, 691–1148, 691–1030, 1012–1031, 1012–1063, 1031–1148 und 1031–1063 der 1 umfaßt, unter Verwendung einer DNA, die die zu exprimierende Aminosäuresequenz codiert.
Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten Polypeptids, das einen Teil der Aminosäuresequenz von dem Schweine-Cholera-Virus (HCV) um faßt, wobei der Teil aus einer Aminosäuresequenz besteht, die den in 1 gezeigten Aminosäuresequenzen 268–570, 691–1148, 691–1030 oder 1031–1063 entspricht, und das Verfahren den Schritt des Exprimierens des Polypeptids unter Verwendung einer DNA, die das zu exprimierende Polypeptid codiert, umfasst.
Vakzine zum Schutz gegen eine Pestivirus-Infektion, die eine Nucleotidsequenz nach Anspruch 1 oder 2 enthält.
Vakzine zum Schutz gegen eine Pestivirus-Infektion, die ein nach Anspruch 6 oder 7 hergestelltes Polypeptid oder ein nach Anspruch 8 oder 9 hergestelltes Polypeptid enthält.
Diagnostisches Kit, wobei das Kit zumindest ein Polypeptid, das nach Anspruch 6 oder 7 hergestellt wird, oder ein Polypeptid, das nach Anspruch 8 oder 9 hergestellt wird, enthält.
Diagnostisches Kit nach Anspruch 12 zur Diagnose von Schweine-Cholera, enthaltend ein Polypeptid, das eine Aminosäuresequenz umfaßt, die der Aminosäuresequenz 268–570 der 1 entspricht.