AT400724B - Virales polypeptid - Google Patents

Description

AT 400 724 B

Die Erfindung betrifft die Isolierung und Charakterisierung des viralen Agens, welches die nach Transfusionen auftretende non-A-non-B*Hepatitis (PT-NANBH) verursacht, und insbesondere PT-NANBH virale Polypeptide, diese viralen Polypeptide kodierenden DNA-Sequenzen und durch solche Expressionsvektoren transformierte Wirtszellen. Die Erfindung betrifft ferner die Verwendung PT-NANBH viraler Polypeptide oder polyklonaler oder monoklonaler Antikörper gegen solche Polypeptide in einem Immunotest zur Diagnose von PT-NANBH, oder die Verwendung in einem Präventivimpfstoff.

Non-A-non-B-Hepatitis (NANBH) ist per Definition eine durch Ausschluß gestellte Diagnose und dient im allgemeinen zur Beschreibung von Fällen viraler Hepatitisinfektioinen beim Menschen, die nicht auf Hepatitis A oder B Viren zurückzuführen sind. In der Mehrzahl dieser Fälle ist die Ursache der Infektion nicht festgestellt worden, obwohl man aus klinischen und epidemiologischen Gründen eine Anzahl dafür verantwortlicher Agenzien vermutet, siehe Übersicht in Shih et al (Prog. Liver Dis., 1986, 8, 433-452). Allein in den USA können bis zu 10 % der Bluttransfusionen eine NANBH zur Folge haben, was sie zu einem schwierigen Problem macht. Es können mindestens mehrere virale Agenzien eine PT-NANBH Infektion verursachen und in den letzten Jahren wurde vielfach die Identifizierung der Agenzien beansprucht, von denen jedoch keines substantiiert wurde.

Die EP 318 216 A1 gibt eine Beschreibung der Isolierung und Charakterisierung des verursachenden Agens, welches PT-NANBH auslöst, das in der Anmeldung auch als Hepatitis C Virus (HCV) bezeichnet wird. Eine cDNA-Bank, hergestellt aus viraler Nukleinsäure, die von einem mit PT-NANBH infizierten Schimpansen gewonnen wurde, wurde unter Verwendung humaner Antiseren gescreent. Es wurde eine Anzahl positiver Klone isoliert und sequenziert. Die erhaltenen Nukleinsäure- und Aminosäure-Sequenzdaten, die in der Anmeldung aufgeführt sind, repräsentierten ca. 70 % des lOkb viralen Genoms und sind vollständig von seinem 3’-Ende, was der nicht-strukturkodierenden Region entspricht, abgeleitet.

Die Erfinder haben jetzt PT-NANBH virale Polypeptide durch Klonierung und Expression der diese viralen Polypeptide kodierenden DNA-Sequenzen isoliert und charakterisiert. Überraschenderweise zeigen sowohl die Nukleinsäure- als auch die Aminsäure-Sequenzdaten bemerkenswerte Abweichungen zu den entsprechenden Daten aus der EP 318 216 A1. Insgesamt summieren sich diese Abweichungen auf ca. 20 % auf der Stufe der Nukleinsäuren und ca. 15 % auf der Stufe der Aminosäuren, manche Regionen in den Sequenzen zeigen sogar größere Unterschiede. Die Gesamtabweichung ist viel größer als man für zwei Isolierungen desselben Virus erwarten könnte, auch unter Berücksichtigung geographischer Faktoren. Dies ist wahrscheinlich auf einen der beiden folgenden möglichen Gründe zurückzuführen.

Erstens benutzten die vorliegenden Erfinder und jene der zuvor erwähnten europäischen Veröffentlichung verschiedene Quellen für die zur cDNA-Klonierung verwendeten Nukleinsäuren. Insbesondere beschreibt die europäische Veröffentlichung die Verwendung Schimpansenplasmas als Quelle des viralen Nukleinsäure-Ausgangsmaterials, wobei das Virus zweimal durch den Schimpansen gelangte. Natürlich ist PT-NANBH eine Krankheit des Menschen, und die Passage des Virus durch einen fremden Wirt, auch wenn dieser relativ nahe dem Menschen verwandt ist, verursacht wahrscheinlich eine extensive Mutation der viralen Nukleinsäure Demzufolge können die Sequenzdaten aus der EP 318 216 A1 nicht tatsächlich repräsentativ für das tatsächliche, PT-NANBH im Menschen verursachende virale Agens sein. Im Gegensatz hierzu haben die jetzigen Erfinder virale Nukleinsäuren, die aus menschlichem Plasma stammten, als Ausgangsmaterial für die cDNA-Klonierung verwendet. Die auf diese Weise erhaltenen Sequenzdaten entsprechen viel wahrscheinlicher der ursprünglichen Nukleinsäure- und Aminosäure-Sequenzen der PT-NANBH.

Zweitens kann es sein, daß das virale Agens in mehr als einem Subtyp existiert und die in der EP 318 216 A1 offenbarten Sequenzdaten und diejenigen, die von den jetzigen Erfindern ermittelt wurden, getrennten und unterschiedlichen Subtypen desselben viralen Agens entsprechen. Eine weitere Möglichkeit kann sein, daß der Grad der Abweichung zwischen den beiden Sätzen der Sequenzdaten auf eine Verbindung dieser zwei Faktoren zurückzuführen ist.

Die vorliegende Erfindung stellt ein PT-NANBH virales Polypeptid zur Verfügung, das ein Antigen mit einer Aminosäure-Sequenz enthält, die mindestens zu 90 % homolog mit der Aminosäure-Sequenz, wie dargestellt in SEQ ID Nr. 3, 4, 19, 20, 21 oder 22, oder als ein Antigen wirkendes Fragment davon ist. SEQ ID Nr. 3, 4, 5, 18, 19, 20, 21 oder 22 stellen die Aminosäure-Sequenz dar, wie sie aus der Nukleinsäure-Sequenz abgeleitet wurde. Die Aminosäure-Sequenz ist vorzugsweise wenigstens zu 95 oder sogar 98 % homolog mit der Aminosäure-Sequenz dargestellt in SEQ ID Nr. 3, 4, 19, 20, 21 oder 22. Die Antigene können wahlweise mit einem heterologen Polypeptid fusioniert werden.

Es können wahlweise zwei oder mehr Antigene zusammen entweder in Kombination oder zu einem einzelnen Polypeptid fusioniert verwendet werden. Die Verwendung eines oder mehrerer Antigene in einem Diagnosetest bietet auf diese Weise verläßliche Ergebnisse bei Verwendung des Tests zur Untersuchung von Blut auf PT-NANBH Viren. Vorzugsweise wird ein Antigen aus der strukturkodierenden Region (5'-Ende) 2

AT 400 724 B und ein anderes Antigen aus der nicht-strukturell kodierenden Region (3'-Ende) erhalten. Besonders bevorzugt werden die Antigene miteinander zu einem rekombinanten Polypeptid fusioniert. Die letztere Lösung bietet eine Reihe von Vorteilen dahingehend, daß individuelle Antigene in einem festen, vorbestimmten Verhältnis (im allgemeinen äquimolar) kombiniert werden und nur ein einziges Polypeptid hergestellt, gereinigt und charakterisiert werden muß.

Ein als Antigen wirkendes Fragment eines Antigens mit einer Aminosäure-Sequenz, die mindestens zu 90 % homolog mit der wie in SEQ ID Nr. 3, 4, 19, 20, 21 oder 22 dargestellt ist, umfaßt vorzugsweise mindestens fünf, sechs, sieben, acht, neun oder zehn, fünfzehn, zwanzig, dreißig, vierzig oder fünfzig Aminosäuren. Die antigenischen Bindungsstellen eines solchen Antigens können unter Verwendung von Standardverfahren identifiziert werden. Diese Verfahren umfassen Fragmentierung des Polypeptids mittels proteolytischer Enzyme oder chemischer Mittel und anschließende Untersuchung auf die Fähigkeit eines jeden Fragments, Antikörper zu binden, oder eine Immunantwort nach Impfung an einem Tier oder einem geeigneten in vitro Modellsystem (Strohmaier et al, J. Gen. Virol., 1982, 59, 205-306) hervorzurufen. Alternativ kann die das Polypeptid kodierende DNA durch Restriktionsenzymverdauung oder andere bekannte Verfahren fragmentiert werden und dann in ein Expressionssystem zur Herstellung von Fragmenten eingeschleust werden (die wahlweise an ein Polypeptid im allgemeinen bakteriellen Ursprungs fusioniert werden). Die entstehenden Fragmente können wie bereits beschrieben beurteilt werden (Spence et al, J. Gen. Virol., 1989, 70, 2843-51; Smith et al, Gene, 1984, 29, 263-269). Eine weitere Möglichkeit ist die chemische Synthese kurzer Peptidfragmente (3-20 Aminosäuren lang; im allgemeinen 6 Aminosäuren lang), welche die gesamte Sequenz des Polypeptids voller Länge umfassen, wobei jedes Peptid mit dem angrenzenden Peptid überlappt. (Dieser überlappende Bereich kann 1-10 Aminosäuren umfassen aber beträgt idealerweise n-1 Aminosäuren, wobei n die Länge des Peptids ist; Geysen et al, Proc. Natl. Acad. Sei., 1984, 8T 3998-4002). Jedes Peptid wird dann wie zuvor beschrieben beurteilt, mit der Ausnahme, daß das Peptid gewöhnlich zuerst an ein Trägermolekül gekoppelt wird, wodurch die Induktion einer Immunan-wort bewirkt wird. Schließlich gibt es eine Reihe zur Vorhersage geeigneter Methoden, die die Sequenzanalyse für bestimmte Merkmale, z.B. der Hydrophilität, wobei man annimmt, daß diese mit immunologisch wichtigen Stellen verknüpft ist, umfassen (Hopp und Woods, Proc. Natl. Acad. Sei., 1981, 78, 3824-3428; Berzofsky, Science, 1985, 229, 932-940). Diese Voraussagen können anschließend unter Einsatz rekombin-anter Polypeptid^ oder Peptidverfahren wie oben beschrieben überprüfen werden.

Das virale Polypeptid wird vorzugsweise in reiner Form, d.h. in einer Reinheit von mehr als 90 % oder sogar 95 % zur Verfügung gestellt.

Das PT-NANBH virale Polypeptid gemäß der vorliegenden Erfindung kann mittels eines Aminosäure-Synthesizers hergestellt werden, falls es ein Antigen mit nicht mehr als ca. dreißig Aminosäuren ist, oder durch rekombinante DNA-Techniken.

Die Erfindung stellt auch eine DNA-Sequenz zur Verfügung, die ein PT-NANBH virales Polypeptid wie hier definiert kodiert.

Die DNA-Sequenzen der vorliegenden Erfindung können synthetisch sein oder kloniert. Die bevorzugten DNA-Sequenzen sind in SEQ ID Nr. 3, 4, 19, 20, 21 oder 22 dargestellt.

Zur Gewinnung eines PT-NANBH viralen Polypeptids, umfassend multiple Antigene, wird bevorzugt die individuelle kodierende Sequenz in ein einzelnes offenes Leseraster fusioniert. Die Fusion sollte natürlich in einer solchen Weise durchgeführt werden, daß die antigene Aktivität eines jeden Antigens nicht wesentlich durch seine Stellung relativ zu einem anderen Antigen beeinträchtigt wird. Besondere Beachtung sollte natürlich der Natur der Sequenzen an der tatsächlichen Verknüpfungsstelle zwischen den Antigenen gewidmet werden. Die Verfahren zur Herstellung solcher einzelner Polypeptide sind aus dem Stand der Technik bekannt.

Die vorliegende Erfindung stellt auch einen Expressionsvektor zur Verfügung, der eine wie hier definierte DNA-Sequenz enthält, und in einem geeigneten Wirt zur Expression der DNA-Sequenz in der Lage ist unter Erzeugung eines PT-NANBH viralen Polypeptids.

Der Expressionsvektor enthält normalerweise Kontrollelemente der DNA, die die Expression der DNA-Sequenz in einem geeigneten Wirt bewirken. Diese Elemente können je nach Wirt verschieden sein, aber umfassen gewohnlicherweise einen Promotor, eine Ribosom-Bindungssteile, translationale Start-und Stopstellen und eine transkriptionale Terminationsstelle. Beispiele solcher Vektoren umfassen Plasmide und Viren. Die Expressionsvektoren der vorliegenden Erfindung schließen sowohl extrachromosomale Vektoren und in das Wirtszellenchromosom integrierte Vektoren mit ein. Zur Verwendung in E. coli kann der Ex press io ns vektor die DNA-Sequenz entsprechend der vorliegenden Verbindung wahlweise in Fusion entweder mit dem 5'- oder 3'-Ende einer DNA-Sequenz verknüpft enthalten, die z.B. mit der /S-Galactosida-se oder mit dem 3'-Ende der DNA-Sequenz verknüpft, die z.B. das trp E-Gen kodiert. Bei Verwendung im lnsekten-Baculovirus(AcNPV)-System wird die DNA-Sequenz wahlweise an die Polyhedrin kodierende 3

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Sequenz fusioniert.

Die vorliegende Erfindung stellt auch eine mit einem wie hier definierten Expressionsvektor transformierte Wirtszelle zur Verfügung.

Beispiele von Wirtszellen zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung umfassen prokaryontische und eukaryontische Zellen, z.B. Bakterien, Hefe, Säugetier- und Insektenzellen. Spezielle Beispiele solcher Zellen sind E. coli, S. cerevisiae, P. pastoris, Eizellen des chinesischen Hamsters und Mauszellen sowie Spodoptera frugiperda und Tricoplusia ni. Die Wahl der Wirtszellen kann von einer Reihe Faktoren abhängen aber, falls posttranslationale Modifikation des PT-NANBH viralen Polypeptids erforderlich ist, wird vorzugsweise eine eukaryontische Wirtszelle verwendet.

Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Herstellung PT-NANBH viralen Polypeptids zur Verfügung, welches die Schritte umfaßt: Klonieren oder Synthetisieren einer PT-NANBH virales Polypeptid kodierenden DNA-Sequenz wie hier definiert, Einfügen der DNA-Sequenz in ein Expressionsvektor, so daß sie in einen geeigneten Wirt exprimiert werden kann, Transformation einer Wirtszelle mit dem Expressionsvektor, Kultur der transformierten Wirtszelle und Isolierung des viralen Polypeptids.

Die Klonierung der DNA-Sequenz kann unter Verwendung bekannter Standardverfahren durchgeführt werden. Es ist jedoch besonders vorteilhaft, in diesen Verfahren die hier offenbarten Sequenzdaten zu verwenden, um so die Identifizierung und Isolierung der erwünschten klonierten DNA-Sequenzen durchzuführen. Die RNA wird vorzugsweise durch Pelletierung des Virus aus dem Plasma infizierter Menschen, die durch die Auswirkung einer PT-NANBH-Übertragung identifiziert wurden, isoliert. Die isolierte RNA wird revers in cDNA transkribiert, entweder unter Zufalls- oder oligo-dT-Priming. Die RNA kann wahlweise einem Vorbehandlungsschritt unterworfen werden, um andere Sekundärstrukturen, die mit der cDNA-Synthese interferieren könnten, zu entfernen, z.B. durch Erwärmung oder Reaktion mit Methylquecksilberhydroxid. Die cDNA wird im allgemeinen durch Zugabe von Linker mit nachfolgender Restriktionsenzym Verdauung modifiziert. Sie wird dann in einen Klonierungsvektor eingeschleust, z.B. pBR322 oder eines seiner Derivate oder dem lambda Vektoren gt10 und gt11 (Huynh et al, DNA Cloning, 1985, Vol. 1: A Practical Approach, Oxford, IRC Press) in geeignete Virionen gepackt und die erhaltenen rekombinanten DNA-Moleküle zur Transformation von E. coli verwendet, wobei auf diese Weise die erwünschte cDNA-Bank erzeugt wird.

Die cDNA-Bank kann unter Einsatz von Standardstrategien gescreent werden. Falls die Bank eine Expressionsbank ist, kann sie mittels immunologischer Methoden gescreent werden, wobei Antiseren aus demselben Plasma, das auch für das RNA-Ausgangsmaterial verwendet wurde, und ebenfalls Antiseren aus weiteren menschlichen Quellen erwartungsgemäß positiv für Antikörper gegen PT-NANBH sein sollten. Da humane Antiseren im allgemeinen Antikörper gegen E. coli enthalten, die zu einem hohen Hintergrund während des Screenens Anlaß geben könnten, werden vorzugsweise die Antiseren zunächst mit einem untransformierten E. coli Lysat behandelt, um auf diese Weise solche Antikörper zu entfernen. Vorteilhafterweise wird eine Negativkontrolle unter Verwendung von Antiseren überwachter menschlicher Spender, d.h. solche Spender, die wiederholt getestet wurden und bei denen keine Antikörper gegen virale Heptatitis gefunden wurden, durchgeführt. Als alternative Screeningstrategie können ein oder mehrere markierte Oligonucleotide als Hybridisierungssonden eingesetzt werden. Die Verwendung von Oligonucleotiden beim Screening einer cDNA-Bank ist im allgemeinen leichter durchzuführen und verläßlicher als das Screenen mit Antiseren. Die Oligonucleotide werden vorzugsweise unter Verwendung der DNA-Sequenzinformation, wie hier offenbart, synthetisiert. Es können eine oder mehrere Screeningrunden nach der einen oder anderen Methode durchgeführt werden, um positive Klone zu charakterisieren und zu identifizieren.

Nach Identifikation eines ersten positiven Klons kann die Bank nach zusätzlichen positiven Klonen unter Verwendung des ersten Klones als Hybridisierungssonde nochmals gescreent werden. Alternativ oder zusätzlich können weitere Banken hergestellt werden, wobei diese unter Verwendung von Immunoscreens oder Hybridisierungssonden gescreent werden können. Auf diese Weise können weitere DNA-Sequenzen erhalten werden.

Alternativ kann die DNA-Sequenz, welche das PT-NANBH virale Polypeptid kodiert, unter Verwendung von Standardverfahren synthetisiert werden, was unter gewissen Umständen der Klonierung der DNA vorzuziehen ist (Gait, Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, 1984, Oxord, IRL Press).

Die auf diese Weise klonierte oder synthetisierte DNA-Sequenz kann mittels bekannter und Standardtechniken in einen Expressionsvektor eingefügt werden. Der Expressionsvektor wird normalerweise mit Restriktionsenzymen geschnitten und die DNA-Sequenz mit glatt endender oder versetzt endender Ligasie-rung eingefügt. Der Schnitt wird gewöhnlicherweise an einer Restriktionsschnittstelle an einer geeigneten Position im Expressionsvektor gemacht, so daß die einmal eingefügte DNA-Sequenz von den funktionalen Elementen der DNA, welche seine Expression bewirken, gesteuert wird.

Die Transformation einer Wirtszelle kann unter Verwendung von Standardtechniken ausgeführt werden. Es werden im allgemeinen einige phenotypische Marker verwendet, um zwischen den Transformanten, die 4

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Spezifische Antikörper gegen erfindungsgemäßes PT-NANBH virales Polypeptid können mittels des Polypeptids erzeugt werden. Die Antikörper können polyklonal oder monoklonal sein. Die Antikörper können verwendet werden bei: der Qualitätskontrolle zum Test von PT-NANBH viralen Polypeptidchargen; bei der Reinigung eines PT-NANBH viralen Polypeptids oder viralen Lysats; bei der Epitopkartierung; falls markiert, als Konjugat in einem Test vom Verdrängungstyp zum Antikörpernachweis; und beim Test auf Antigene.

Polyklonale Antikörper gegen erfindungsgemäßes PT-NANBH virales Polypeptid können durch Injektion eines PT-NANBH viralen Polypeptids, wahlweise an einen Carrier gekoppelt, um eine Immunantwort zu beschleunigen, in ein Säugetier wie Maus, Ratte, Schaf oder Kaninchen erhalten werden, und durch Isolierung der auf diese Weise gebildeten Antikörper. Das PT-NANBH virale Polypeptid wird im allgemeinen in Form einer injizierbaren Formulierung, bei der das Polypeptid mit einem physiologisch annehmbaren Verdünnungsmittel vermischt ist, verabreicht. Adjuvanzien wie Freundsches komplettes Adjuvans (FKA) oder Freundsches inkomplettes Adjuvans (FIA) können in der Formulierung enthalten sein. Die Formulierung wird normalerweise dem Wirt über einen geeigneten Zeitraum injiziert, wobei Plasmaprobem zum Test auf anti-PT-NANBH virale Antikörper nach geeigneten Intervallen genommen werden. Sobald ein ausreichendes Aktivitätsniveau erreicht ist, wird das Wirtstier ausgeblutet. Anschließend werden die Antikörper aus dem Blutplasma extrahiert und gereinigt, wobei Standardmethoden zum Einsatz kommen, z.B. Protein A oder lonenaustauschchromatographie.

Monoklonale Antikörper gegen erfindungsgemäßes PT-NANBH virales Polypeptid können durch Fusionieren von Zellen einer unsterblichen Zellinie mit Antikörper gegen virales Polypeptid produzierenden Zellen und Kultur der fusionierten unsterblichen Zellinie erhalten werden. Typischerweise wird ein nicht-menschliches Saugetier, z.B. Maus oder Ratte, mit dem viralen Polypeptid geimpft. Nach ausreichender Zeit zum Anstieg der Antikörperantwort werden Antikörper produzierende Zellen, z.B. Splenocyten, entnommen. Die Antikörper produzierenden Zellen werden mit Zellen einer unsterblichen Zellinie, z.B. einer Mausoder Ratten-Myelomazellinie, fusioniert und die erhaltenen Fusionen zur Identifikation einer Hybridomazelli-nie gescreent, die die erwünschten monoklonalen Antikörper ausscheidet. Die fusionierte Zellinie kann kultiviert werden und die monoklonalen Antikörper können aus dem Kulturmedium in ähnlicher Weise wie bei der Reinigung der poiyklonalen Antikörper gereinigt werden.

Die Diagnosetestverfahren basierend auf der vorliegenden Erfindung können zum Nachweis der Anoder Abwesenheit einer PT-NANBH Infektion verwendet werden. Sie können auch zur Überwachung des Behandlungsverlaufs einer solchen Infektion eingesetzt werden, z.B. bei der Interferontherapie.

Es gibt grundsätzlich drei verschiedene Möglichkeiten zu einem Diagnosetest auf virale Infektion, wobei entweder virale Nukleinsäure, virales Antigen oder viraler Antikörper nachgewiesen wird. Virale Nukleinsäure wird im allgemeinen als bester Indikator auf Anwesenheit des Virus selbst angesehen und könnte Substanzen identifizieren, die wahrscheinlich infektiös sind. Der Nachweis von Nukleinsäure ist jedoch im allgemeinen nicht so einfach wie der Nachweis von Antigenen oder Antikörpern, da der Anteil der Zielsubstanz sehr gering sein kann. Man verwendet virales Antigen als Marker für die Anwesenheit des Virus und als einen Indikator für Infektiosität. Je nach Virus kann die Menge an Antigen in einer Probe sehr gering und damit schwierig nachzuweisen sein. Antikörpernachweis ist relativ einfach, weil im Endeffekt das Wirtsimmunsystem die Antwort auf eine Infektion durch Produktion großer Mengen im Blutstrom zirkulierender Antikörper verstärkt. Die Art der Antikörperantwort kann oft klinisch nützlich sein; so sind zum Beispiel eher Antikörper der IgM-Klasse als der IgG-Klasse ein geeigneter Indikator zum Nachweis einer kürzlichen Infektion oder die Antwort auf ein bestimmtes virales Antigen kann mit einer Clearance des Virus einhergehen. Daher hängt der beste Weg zum Nachweis einer viralen Infektion von besonderen Umständen und der gewünschten Information ab. Im Fall von PT-NANBH kann jeder der drei Wege als Diagnosetest beschritten werden.

Ein Testverfahren zur Diagnose auf PT-NANBH unter Nachweis der viralen Nukleinsäure umfaßt Hybridisierung in der Testprobe enthaltener viraler RNA oder aus dieser viralen RNA synthetisierter cDNA mit einer DNA-Sequenz, die den Nucleotid-Sequenzen von SEQ ID Nr. 3, 4, 19, 20, 21 oder 22 entspricht, und Screenen der erhaltenen Nukleinsäurehybride zur Identifikation PT-NANBH viraler Nukleinsäure. Die Anwendbarkeit dieses Verfahrens ist im allgemeinen beschränkt auf eine Testprobe eines geeigneten Gewebes, z.B. Leberbiopsie, in der die virale RNA wahrscheinlich in einem hohen Grad vorkommt. Die DNA-Sequenzen entsprechend den Nucleotid-Sequenzen von SEQ ID Nr. 3, 4, 19, 20, 21 oder 22 können in Form eines Oligonucleotids oder einer cDNA-Sequenz, wahlweise eingebaut in einem Plasmid, vorliegen. Die Nukleinsäurehybride werden vorzugsweise unter Verwendung einer markierten DNA-Sequenz gescre- 5

AT 400 724 B ent. Es können eine oder mehrere zusätzliche Screening-Runden nach dem einen oder anderen Verfahren durchgeführt werden, um die Hybride weiter zu charakterisieren und so jede PT-NANBH virale Nukleinsäure zu identifizieren. Die Hybridisierung und das Screening werden nach aus dem Stand der Technik bekannten Methoden durchgeführt.

Wegen der beschränkten Anwendbarkeit dieses Verfahrens zum Test auf virale Nukleinsäure umfaßt eine bevorzugte und bequemere Methode die Synthese von cDNA von in einer Testprobe vorliegender viraler RNA, Amplifizierung einer zuvor ausgewähiten DNA-Sequenz entsprechend einer Untersequenz der Nucleotid-Sequenzen von SEQ ID Nr. 3, 4, 19, 20, 21 oder 22, und Identifikation der zuvor ausgewählten DNA-Sequenz. Die Testprobe kann ein geeignetes Gewebe oder eine physiologische Flüssigkeit sein und wird vorzugsweise für jede vorliegende virale RNA konzentiert. Beispiele für ein geeignetes Gewebe schließen eine Leberbiopsie mit ein. Beispiele einer geeigneten physiologischen Flüssigkeit umfassen Urin, Plasma, Blut, Serum, Sperma, Tränenflüssigkeit, Speichel oder zerebrospinale Flüssigkeit. Bevorzugte Beispiele sind Serum und Plasma.

Die Synthese der cDNA wird normalerweise durch reverse Transkription mittels eines Primers mit Zufallssequenz oder mit definiertem oder oligo-dT Primer durchgeführt. Der Primer ist vorteilhafterweise ein Oligonucleotid entsprechend der Nucleotid-Sequenz von SEQ ID Nr. 3, 4, 19, 20, 21 oder 22 und ist bestimmt, die cDNA, welche die ausgewählte Sequenz enthält, anzureichern.

Die Amplifikation der ausgewählten DNA-Sequenz wird vorzugsweise mit der polymerasen Kettenreaktion(PKR)-Technik durchgeführt (Saiki et al, Science, 1985, 230, 1350-1354). Bei diesem Verfahren wird ein Paar Oligonucleotidprimer verwendet, von denen der eine einem Teil der Nucleotid-Sequenz von SEQ ID Nr. 3, 4, 19, 20, 21 oder 22 entspricht und der andere, welcher auf der 3'-Seite des ersten lokalisiert ist, einem Teil der komplimentären Sequenz entspricht, und das Paar die dazwischenliegende ausgewählte DNA-Sequenz definiert. Die Oligonucleotide sind im allgemeinen mindestens 15, optimal 20 bis 26 Basen lang und, obwohl einige wenige Fehlpaarungen durch Variation der Reaktionsbedignungen toleriert werden können, sollte das 3’-Ende der Oligonucleotide perfekt komplimentär sein, um so wirksam als Primer arbeiten zu können. Der Abstand zwischen den 3'-Enden der Oligonucleotide kann zwischen 100 bis 2000 Basen groß sein. Ein Paar der bei dieser Technik verwendeten Oligonucleotide kann günstig auch zur cDNA-Synthese mittels Primer verwendet werden. Die PKR-Technik selbst wird mit der cDNA in Einzelstrangform mittels eines Enzyms, wie der Taq-Polymerase, und einem Überschuß der Oligonucleotidprimer über 20-40 Zyklen nach veröffentlichten Vorschriften durchgeführt (Saiki et al, Science, 1988, 239, 487-491).

Zur Verfeinerung des Verfahrens können mehrere Amplifikationszyklen durchgeführt werden, wobei jeder Zyklus mit einem verschiedenen Paar an Oligonucleotiden als Primern durchgeführt wird. Auf diese Weise kann nach dem ersten Amplifikationszyklus ein internes Oligonucleotidpaar, das eine kürze DNA-Sequenz (z.B. 50 bis 500 Basen lang) definiert, für den zweiten Amplifikationszyklus verwendet werden. Bei dieser etwas verläßlicheren Verbesserung, "Nested PKR" genannt, ist es natürlich die abschließend amplifizierte DNA-Sequenz, die die ausgewählte Sequenz ausmacht (Kemp et al, Proc. Natl. Acad. Sei., 1989, 86(7), 2423-2427 und Mullis et al, Methods in Enzymology, 1987, 155, 335-350).

Die Identifizierung der ausgewählten DNA-Sequenz kann durch Analyse der PKR-Produkte auf einem Agarosegel ausgeführt werden. Das Auftreten einer Bande mit dem für die ausgewählte Sequenz berechneten Molekulargewicht ist ein positiver Indikator der viralen Nukleinsäure in der Testprobe. Alternative Methoden zur Identifizierung umfassen Southern Blotting, Dot Blotting, Oligomerrestriktion und DNA-Sequenzierung.

Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Testkit zum Nachweis auf PT-NANBH virale Nukleinsäure zur Verfügung, das enthält: i) ein Paar Oligonucleotidprimer, von denen einer einem Teil der Nucleotidsequenz von SEQ ID Nr. 3, 4, 19, 20, 21 oder 22, und der andere, der auf der 3'-Seite des ersten Primers lokalisiert ist, einem Teil der Komplimentärsequenz entspricht, und das Primerpaar die zwischen ihm liegende ausgewählte DNA-Sequenz definiert: ii) reverse Transkriptase-Enzym zur Synthese von cDNA aus RNA der Testprobe stromaufwärts des Primers, der der komplimentären Nucleotidsequenz von SEQ ID Nr. 3, 4, 19, 20, 21 oder 22 entspricht; iii) ein Enzym, das in der Lage ist, die ausgewählte DNA-Sequenz zu amplifizieren; und wahlweise iv) Waschlösungen und Reaktionspuffer.

Das Testkit enthält vorteilhaft auch eine positive Kontrollprobe, um die Identifizierung der viralen Nukleinsäure durchzuführen.

Die charakteristischen Eigenschaften der Primer und der Enzyme sind vorzugsweise wie oben in Verbindung mit der PKR-Technik beschrieben. 6

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In einem Diagnosetest auf PT-NANBH unter Nachweis viralen Antigens oder viraler Antikörper kann das Verfahren die Schritte umfassen: Zusammenbringen einer Testprobe mit einem PT-NANBH viralen Polypeptid der vorliegenden Erfindung oder einem polyklonalen oder monoklonalen Antikörper gegen das Polypeptid, und Nachweis, ob Antigen-Antikörper-Bindung innerhalb der Testprobe stattfindet. Zu diesem Zweck kann ein Testkit zur Verfügung gestellt werden, das PT-NANBH virales Polypeptid, wie hier definiert, oder einen dagegen gerichteten monoklonalen oder polyklonalen Antikörper und Hilfsmittel zum Nachweis des Auftretens einer Antikörper-Antigen-Bindung in der Testprobe enthält. Die Testprobe kann aus jedem geeigneten Gewebe und physiologischen Flüssigkeiten, wie oben zum Nachweis auf virale Nukleinsäure erwähnt, entnommen werden. Falls eine physiologische Flüssigkeit entnommen wird, kann sie wahlweise für jedes vorhandene virale Antigen oder Antikörper konzentriert werden.

Es kann eine Vielzahl von Testaufbauten eingesetzt werden. Das PT-NANBH virale Polypeptid kann eingesetzt werden, um selektiv Antikörper gegen PT-NANBH aus der Lösung zu binden und die bereits gebundenen Antikörper selektiv zu markieren, oder um die Antikörper sowohl zu binden und zu markieren. Zusätzlich kann das virale Polypeptid bei einer Vielzahl homogener Testaufbauten verwendet werden, bei denen die mit dem Antigen reaktiven Antikörper aus der Lösung ohne Phasentrennung nachgewiesen werden.

Die Arten von Testverfahren, bei denen das PT-NANBH virale Polypeptid zur Bindung viraler Antikörper aus der Lösung eingesetzt wird, umfassen die Immobilisierung des Polypeptids auf einer festen Oberfläche. Dieser Oberfläche sollte abwaschbar sein. Beispiele geeigneter Oberflächen umfassen Polymere verschiedener Arten (eingegossen in Mikrotiterwells, Perlen, verschiedene Arten von Eintauchstäben, Ansaugstücke, Elektroden und optische Artikel), Teilchen (z.B. Latex, stabilisierte rote Blutzellen, Bakterien oder Pilzzellen, Sporen, Gold oder andere metallische oder Metall enthaltende Sole und proteinhaltige Kolloide) mit einer normalen Teilchengröße von 0,02 bis 5 um, Membranen (z.B. Nitrozellulose, Papier, Zelluloseacetat und Membran mit einer hohen Porosität und hoher Oberfläche aus organischem oder anorganischem Material).

Die Anheftung des PT-NANBH viralen Polypeptids auf der Oberfläche kann durch passive Adsorption aus einer optimal zusammengesetzten Lösung, die Benetzungsmittel, Lösungsmittel, Salze und/oder Chaot-ropen enthalten kann, oder durch aktive chemische Bindung geschehen. Aktive chemische Bindung kann durch eine Reihe von reaktiven oder aktivierbaren funktionellen Gruppen erfolgen, die auf der Oberfläche exponiert sein müssen (z.B. kondensierende Mittel, reaktive Säureester, Halogenide und Anhydride, Aminohydroxyl- oder Carboxylgruppen, Sulphydrylgruppen, CarbonyIgruppen, Diazogruppen oder ungesättigten Gruppen). Wahlweise kann die aktive Bindung über ein Protein geschehen (was selbst auf der Oberfläche passiv oder aktiv gebunden ist), wie Albumin oder Casein, mit dem das virale Polypeptid chemisch mit einer Reihe von Methoden verbunden werden kann. Die Verwendung eines Proteins in dieser Weise kann vorteilhaft sein im Hinblick auf isoelektrischen Punkt, Ladung, Hydrophilität oder andere physikalisch-chemische Eigenschaften. Das virale Polypeptid kann auch auf eine Oberfläche (im allgemeinen), aber nicht notwendigerweise eine Membran) aufgebracht werden mit anschließender elektrophoretischer Auftrennung der Reaktionsmischung, wie z.B. Immunpräzipitation.

Nach Zusammenbringen (Reaktion) der das PT-NANBH virale Polypeptid tragenden Oberfläche mit der Testprobe, Verstreichen der Reaktionszeit und, wo notwendig, Entfernen des Probenüberschusses nach einer Reihe von Methoden (wie Waschen, Zentrifugation, Filtration, Magnetismus oder Kapillareffekt) werden die gebundenen Antikörper nachgewiesen, wobei jedes Verfahren geeignet ist, das ein detektierbares Signal ergibt. Zum Beispiel kann dies erreicht werden unter Verwendung eines markierten Moleküls oder Teilchens wie oben beschrieben, das mit dem gebundenen Antikörper reagiert (z.B. Protein A oder Protein G und ähnliches: gegen die Art gerichtete oder Anti-Immunoglobuline-Subtypen; Rheumafaktor: oder Antikörper gegen das Antigen, wobei das kompetitive blockierende Verfahren eingesetzt werden kann), oder jedes Molekül, das ein Epitop aus dem Polypeptid enthält.

Das detektierbare Signal kann optisch, radioaktiv oder physikalisch-chemisch sein und kann direkt durch Markierung des Moleküls oder der Teilchen mit z.B. einem Farbstoff, einer radioaktiven Markierung, einem elektroaktiven Teilchen, einem magnetischen Teilchen oder einem Fluorophor, oder indirekt durch Markierung des Moleküls oder Teilchens mit einem Enzym, das selbst in der Lage ist, eine meßbare Veränderung irgendwelcher Art hervorzurufen, erzeugt werden. Wahlweise kann das detektierbare Signal mittels z.B. Agglutination oder durch Brechung oder Doppelbrechung erzeugt werden, falls die Oberfläche in Form von Teilchen vorliegt.

Testverfahren, bei denen ein PT-NANBH virales Polypeptid selbst zur Markierung eines bereits gebundenen Antikörpers verwendet wird, erfordern eine bestimmte Art der Markierung des Antigens, das einen Nachweis erlaubt. Die Markierung kann direkt durch chemische oder passive Bindung, z.B. als radioaktive Bindung, magnetisches Teilchen, Teilchen- oder Enzymmarkierung am Polypeptid, oder indirekt durch Anbindung irgendeiner Markierung an ein Molekül, das selbst mit dem Polypeptid reagiert, durchge- 7

AT 400 724 B führt werden. Die Art der chemischen Bindung einer Markierung an das PT-NANBH virale Polypeptid kann direkt durch eine im Polypeptid bereits vorhandene Gruppe, wie z.B. einer Aminogruppe, oder durch eine Zwischengruppe, wie eine Maleinimidgruppe, hergestellt werden. Bindung der Antikörper kann auf jeder der bereits erwähnten Oberflächen geschehen mittels eines jeden Mittels, einschließlich passiver oder aktivierter Adsorption, die zur Bindung spezifischer Antikörper oder Immunkomplexe führt. Insbesondere können die Antikörper durch gegen die Art gerichtete oder Anti-Immunogiobulin-Subtypen, durch Rheumafaktor, Protein A und G und ähnliche oder durch jedes Molekül, das ein Epitop aus dem Polypeptid enthält, gebunden werden.

Das markierte PT-NANBH Polypeptid kann zur kompetitiven Bindung verwendet werden, bei der seine Bindung an ein spezifisches Molekül an eine der oben dargesteilten Oberflächen durch das Antigen aus der Probe blockiert ist. Es kann wahlweise in einer nicht-kompetitiven Bindung verwendet werden, bei der das Antigen aus der Probe spezifisch oder nicht-spezifisch auf eine der obigen Oberflächen gebunden wird und auch an ein spezifisches bi- oder polyvalentes Molekül (z.B. einen Antikörper) gebunden wird, wobei die übrigen Valenzen zur Bindung des markierten Polypeptids verwendet werden.

In einem homogenen Test werden oft das PT-NANBH virale Polypeptid und die Antikörper getrennt markiert, so daß wenn der Antikörper mit dem viralen Polypeptid in der freien Lösung reagiert, die beiden Markierungen interagieren können und so z.B. ein nicht-strahlender Energietransfer von einer auf die andere Markierung mit einem geeigneten Nachweis der angeregten zweiten Markierung oder gequenchten ersten Markierung (z.B. durch Fluorometrie, magnetische Resonanz oder Enzymmessung) möglich wird. Zugabe von entweder viralem Polypeptid oder Antikörpern zu einer Probe führt zur Abnahme der Interaktion der gepaarten Markierungen und so auch zu einer unterschiedlichen Signalhöhe im Detektor.

Ein geeigneter Testaufbau zum Nachweis PT-NANBH-Antikörper ist der direkte Sandwich-Enzymimmunoassay(EIA)-Aufbau. Mikrotiterwells werden mit einer Schicht PT-NANBH viralen Polypeptids bedeckt. Eine Testprobe und ein PT-NANBH virales Polypeptid, an das ein Enzym gekoppelt ist, werden gleichzeitig zugegeben. Alle in der Testprobe vorhandenen PT-NANBH-Antikörper binden sowohl an das die Wells bedeckende virale Polypeptid wie auch an das Enzym gekoppelte virale Polypeptid. Typischerweise reagiert dasselbe virale Polypeptid an beiden Seiten des Sandwiches. Nach einem Waschvorgang wird das gebundene Enzym unter Verwendung eines spezifischen Substrats, welches eine Farbänderung bedingt, nachgewiesen. Ein für ein EIA geeignetes Testkit enthält: 1) ein PT-NANBH virales Polypeptid markiert mit einem Enzym; 2) ein Substrat für das Enzym; 3) Hilfsmittel, die eine Oberfläche zur Verfügung stellen, auf die PT-NANBH virales Polypeptid immobilisiert ist, und 4) wahlweise Waschlösungen und/oder Puffer.

Die erfindungsgemäßen viralen Polypeptide können Bestandteil einer Impfstofformulierung zur Immunitätserzeugung gegen PT-NANBH beim Menschen sein. Zu diesem Zweck wird das virale Polypeptid zusammen mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger dargereicht.

Zur Verwendung in einer Impfstofformulierung kann das virale Polypeptid wahlweise als Teil eines mit dem Hepatitis B-Kern verschmolzenes Teilchen vorliegen, wie beschrieben bei Clarke et al (Nature, 1987, 330, 381-384), oder als Polymer of Polylysinbasis, wie beschrieben in Tarn (PNAS, 1988, 85, 5409-5413). Alternativ kann das virale Polypeptid an particuläre Strukturen wie Liposomen oder ISCOMS gebunden werden.

Pharmazeutisch annehmbare Träger umfassen flüssige Medien, die zur Verwendung als Vehikel zur Einschleusung des viralen Polypeptids in einen Patienten geeignet sind. Ein Beispiel solcher flüssigen Media ist eine Salzlösung. Das virale Polypeptid kann selbst aufgelöst oder als Feststoff im Träger suspendiert werden.

Die Impfstofformulierung kann auch ein Adjuvans zur Stimulierung der Immunantwort enthalten, wobei hierdurch die Wirkung des Impfstoffes verstärkt wird. Beispiele von Adjuvantien umfassen Aluminiumhydroxid und Aluminiumphosphat.

Die Impfstofformulierung kann eine Endkonzentration an viralem Polypeptid im Bereich von 0,01 bis 5 mg/ml, vorzugsweise 0,03 bis 2 mg/ml enthalten. Die Impfstofformulierung kann in einen sterilen Behälter eingefüllt werden, der anschließend versiegelt und bei einer niedrigen Temperatur, z.B. 4*C, gelagert wird oder gefriergetrocknet werden kann.

Zur Induzierung der Immunität gegen PT-NANBH beim Menschen können eine oder mehrere Dosen der Impfstofformulierung verabreicht werden. Jede Dosis kann 0,1 bis 2 ml, vorzugsweise 0,2 bis 1 ml betragen. Ein Verfahren zur Immunitätsinduktion gegen PT-NANBH beim Menschen umfaßt die Verabreichung einer wirksamen Menge einer wie oben definierten Impfstofformulierung. 8

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Die vorliegende Erfindung umfaßt auch die Verwendung eines PT-NANBH viralen Polypeptids zur Herstellung eines Impfstoffes zur Induktion von Immunität gegen PT-NANBH beim Menschen.

Die erfindungsgemäßen Impfstoffe können nach jedem bequemen Verfahren zur Verabreichung von Impfstoffen, einschließlich oraler und parenteraler Injektion (z.B. intravenös, subkutan oder intramuskulär), verabreicht werden. Die Behandlung kann die Gabe einer Einzeldosis des Impfstoffes oder mehrere Gaben der Dosis über einen bestimmten Zeitraum umfassen.

Die folgenden transformierten Stämme von E. coli wurden am National Collection of Type Cultures (NCTC), Central Public Health Laboratory, 61, Colindale Avenue, London, NW9 5HT an den angegebenen Daten hinterlegt: i) E. coli TG1 transformiert durch pDX113 (WD001); Hinterlegungsnummer NCTC 12369; 7. Dezember 1989. ii) E. coli TG1 transformiert durch pDX128 (WD002); Hinterlegungsnummer NCTC 12382; 23. Februar 1990. iii) E. coli TG1 transformiert durch p136/155 (WD003); Hinterlegungsnummer NCTC 12428; 28. November 1990. iv) E. coli TG1 transformiert durch p156/92 (WD004); Hinterlegungsnummer NCTC 12429; 28. November 1990. v) E. coli TGl transformiert durch p129/164 (WD005); Hinterlegungsnummer NCTC 12430; 28. November 1990. vi) E. coli TG1 transformiert durch pDX136 (WD006); Hinterlegungsnummer NCTC 12431; 28. November 1990.

Figuren

Fig. 1 zeigt eine Darstellung der Herstellung von pDX122, wie beschrieben in Beispiel 7, Fig. 2 zeigt die Darstellung der Herstellung zwei alternativ fusionierter Sequenzen beschrieben in Beispiel 17, und Fig. 3 zeigt die Restriktionskarten SEQ ID Nr. 21 und 22.

In der Sequenzauflistung sind die Sequenzen SEQ ID Nr. 1 bis 25 aufgeführt, auf die in der Beschreibung und in den Ansprüchen Bezug genommen wird.

Die folgenden Beispiele dienen zur Beschreibung der Erfindung.

Beispiel 1. Synthese von cDNA

Gesammeltes Plasma (160 ml) zweier Patienten (bezeichnet als A und L), von denen bekannt war, daß sie an durch Transfusionen übertragener NANBH erkrankt waren, wurde mit Phosphat gepufferter Salzlösung (PBS) verdünnt (1:2,5) und anschließend bei 190.000 g (z.B. 30.000 upm in einem MSE 8x50 Rotor) 5 Std. bei 4 · C zentrifugiert. Der Überstand wurde als Quelle der spezifischen Antikörper für späteres Screening der cDNA-Banken zurückbehalten. Das Pellet wurde in 2 ml 20 mM Tris-Hydrochlorid, 2 mM EDTA 3 % SDS, 0,2 M NaCI (2xPK) resuspendiert, 3 mal mit dem gleichen Volumen an Phenol, 3 mal mit Chloroform und einmal mit Ether extrahiert, und anschließend mit dem 2,5-fachen Volumen an Ethanol bei -20’C ausgefällt. Das Präzipitat wurde in 10 U.I 10 mM Tris-Hydrochlorid, 1 mM EDTA bei pH 8,0 (TE) resuspendiert.

Die Nukleinsäure wurde als Matrize in einem cDNA-Synthesekit (Amersham International plc, Amers-ham, U.K.) unter Verwendung von sowohl oligo-dT wie auch Zufalls-Hexanucleotidprimer eingesetzt. Es wurden die vom Hersteller empfohlenen Reaktionsbedignungen verwendet. 1 ul der Nukleinsäure wurde für eine erste Strangsynthesereaktion, die mit [a -32P]dCTP (Amersham; spezifische Aktivität 3000Ci/mmol) in einem Endvolumen von 20 ul verwendet und bei 42‘C 1 Std. inkubiert. Die gesamte erste Strangreaktion wurde anschließend für die zweite Strangsynthesereaktion verwendet, die E. coli RNaseH (0,8 U) und DNA Polymerase I (23 U) in einem Endvolumen von 100 ul enthielt, wobei bei 12 *C 60 Min. und dann bei 22 *C für 60 Min. inkubiert wurde. Die gesamte Reaktion wurde anschließend bei 70 *C 10 Min. inkubiert, in Eis gestellt, 1 U von T4 DNA Polymerase wurde zugegeben und anschließend bei 37 *C für 10 Min. inkubiert. Die Reaktion wurde durch zugabe von 5 ul 0,2 M EDTA pH8 beendet.

Nicht-eingebaute Nucleotide wurden durch Durchtritt der Reaktionslösung durch eine Gelfiltrationschromatographiesäule enthaltend ein unmodifiziertes dreidimensional vernetztes Dextran-Gel (NICK-Säule (Pharmacia Ltd. Milton Keynes, U.K.)) entfernt. Die cDNA wurde dann zweimal mit Phenol, dreimal mit Chloroform und einmal mit Ether extrahiert und anschließend wurden 20 ug Dextran zugegeben, bevor mit dem 2,5-fachen Volumen an 100 %igem Ethanol präzipitiert wurde. 9

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Beispiel 2. Herstellung von Expressionsbanken

Das getrocknete cDNA-Pellet wurde in 5 ul sterilem TE resuspendiert und anschließend mit 500 ng EcoRI Linker (Pharmacia; GGAATTCC phosphoryliert) und 0,5 U T4 DNA Ligase (New England BioLabs, Beverley, MA, USA) in einem Endvolumen von 10 ul, enthaltend 20 mM Tris-HCI pH 7,5, 10 mM MgCte, 10 mM DTT, 1 mM ATP 3 Std. bei 15” C inkubiert. Die Ligase wurde durch Erhitzen auf 65 ”C für 10 Min. inaktiviert und die cDNA wurde mit 180 U von EcoRI (BCL, Lewes, U.K.) in einem Endvolumen von 100 ul bei 37” C 1 Std. lang verdaut. Es wurde EDTA zugegeben bis zum Erreichen einer Endkonzentration von 10 mM und die gesamte Reaktionslösung wurde auf eine AcA34 (LKB) Säule gegeben. Fraktionen (50 ul) wurden gesammelt und gezählt. Der Peak der cDNA im Ausschlußvolumen (980 cpm) wurde gesammelt, zweimal mit Phenol, dreimal mit Chloroform und einmal mit Ether extrahiert und anschließend mit Ethanol ausgefällt.

Die ds cDNA wurde in 5 ul TE resuspendiert und an lambda gt11 EcoRI Arme (Gibco, Paisley, Schottland) in einer 10 ul Reaktionslösung enthaltend 0,5 U T4 DNA Ligase, 66 mM Tris-Hydrochlorid, 10 mM MgCl2, 15 mM DTT pH 7,6 bei 15”C Übernacht ligasiert. Nach Inaktivierung der Ligase durch Erhitzen auf 65 ”C für 10 Min. wurden 5 ul Reaktionslösung zu einer Amersham Packreaktionslösung gegeben und bei 22”C 2 Std. inkubiert. Das gepackte Material wurde auf den E. coli Strang Y1090 (Huynh et al 1985) titriert und enthielt eine Gesamtmenge von 2,6x104 Rekombinanten.

Plattenkultivierbare Zellen (Y1090) wurden hergestellt durch Impfen von 10 ml L-Kulturbrühe mit einer einzelnen Kolonie von einer Agarplatte und Schütteln bei 37 ”C über Nacht. Am nächsten Tag wurden 0,5 ml der Übernachtkultur mit 10 ml frischer L-Kulturbrühe verdünnt und es wurden 0,1 ml 1 M MgSOt und 0,1 ml 20 % (w/v) Maltose zugefügt. Die Kultur wurde 2 Std. bei 37 ”C geschüttelt, die Bakterien durch Zentrifugation bei 5.000 g für 10 Min. geerntet und in 5 ml 10 mM MgSOt resuspendiert, wobei eine plattenkultivierbare Zellstocklösung erhalten wurde. Ein Teil (1 u.l) des gepackten Materials wurde mit 0,2 ml der plattenkultivierbaren Zellen vermischt, bei 37 ”C für 20 Min. inkubiert, dann wurden 3 ml Top-Agar zugefügt und die gesamte Mischung auf 90 mm L-Agarplatten gegossen. Nach Inkubation Übernacht bei 37 ”C wurden die Plaques gezählt und die gesamte Anzahl der rekombinanten Phagen bestimmt. Das übrige gepackte Material (500 ul) wurde bei 4” C aufbewahrt.

Weitere Banken wurden im wesentlichen nach dem ähnlichen Verfahren hergestellt.

Beispiel 3. Screening der Expressionsbanken

Die ursprüngliche Bank, wie in Beispiel 2 beschrieben, wurden auf dem E. coli Strang Y109O mit einer Dichte von ca. 5x103 pfu pro 140 mm Platte ausplattiert und zum Wachstum bei 37”C 2 Std. stehengelassen, bis die Plaques sichtbar wurden. Sterile Nitrozellulosefilter, die mit IPTG (Isopropylthiogalactosid) imprägniert worden waren, wurden für 3 Std. mit der Platte in Kontakt gebracht und anschließend entfernt. Die Filter wurden zuerst durch Inkubation mit Blockierlösung [3%(w/v) bovines Serum-albumin/Tris-gepuffer-te Salz-Polysorbet-Lösung (BSA/TBS-Tween; 10mM Tris-HCI pH8, 150mM NaCI, 0,05%(v/v) Polyethoxysor-bitanlaurat (Tween 20)), enthaltend 0,05 % einer Lösung von 5-Brom-5-nitro-1,3-dioxan in 1,2 Propylenglykol (Bronidox)] (20 ml/Filter) blockiert und anschließend in einen Bindungspuffer überführt [1%(w/v)-BSA/TBS/Tween enthaltend 0,05% Bronidox], der (durch lonenaustauschchromatographie) gereinigte Antikörper aus dem gesammelten A & L Plasma (20 ug)ml) enthielt. Nach Inkubation bei Raumtemperatur für 2 Std. wurden die Filterdreimal mit TBS-Tween gewaschen und anschließend in Bindungspuffer der biotiny-lierte Schaf-anti-Mensch-Antikörper (1:250) enthielt, inkubiert. Nach 1 Std. bei Raumtemperatur wurden die Filter 3 mal mit TBS/Tween gewaschen und anschließend in Bindungspuffer der Streptavi-din/Peroxidasekomplex (1:100) enthielt, inkubiert. Das Signal wurde mit DAB entwickelt. Positive Signale erschienen als (gefärbte) Plaques.

Aus einer Gesamtzahl von 2,6 x 104 gescreenter Plaques wurden 8 positive Plaques aus dem ersten Screeningrunde erhalten. Unter Verwendung der Filter als Matrize wurden die Regionen der ursprünglichen Platten, die dem positiven Signal entsprachen, mittels einer sterilen Pasteur-Pipette ausgestochen. Die Agarstückchen wurden in 0,1 ml SM-Puffer suspendiert und man ließ den Phagen ausdiffundieren. Der Phagentiter aus jedem Agarstückchen wurde auf dem E. coli Stamm Y1090 bestimmt. Der Phagenstock aus jedem Agarstückchen wurde anschließend nochmal wie zuvor auf einzelne 90 mm Platten bei einer Dichte von ca. 1x103 pfu pro Platte gescreent. Von den 8 positiven Plaques der ersten Runde waren nach der zweiten Runde ein Plaque deutlich positiv, d.h. < 1 % , dieser Plaque wurde JG2 genannt. Dies entspricht einem Positiverhältnis von 40/106 in der Bank.

Diese und andere positive Phagen wurden in ähnlicher Weise aus den anderen cDNA-Banken, wie in Beispiel 2 beschrieben, identifiziert und anschließend durch wiederholte Plaque-Screeningrunden bei 10 ΑΤ 400 724 Β niederer Dichte (1-200 pfu/90 mm Platte) gereinigt, bis 100 % der Plaques im A & L Antikörperscreening positiv waren. Drei solcher rekombinanten Phagen waren JG1, JG2 und JG3.

Beispiel 4. Sekundärscreening von JG1, JG2 und JG3 mit Serumreihen

Die Plaques jeder der recombinanten Phagen JG1, JG2 und JG3 wurden gereinigt und als titrierte Stocklösungen in einem SM-Puffer bei 4*C aufbewahrt. Diese Phagen wurden mit einer Stocklösung von Phagen, die in Beispiel 3 als negativ identifiziert wurden , gemischt (1:1) und die Mischung zur Infektion eines E. coli Y1090 Stranges bei 1000 pfu pro Platte verwendet. Es wurden Plaqueproben entnommen, mit denen wie in Beispiel 3 beschrieben verfahren wurde, mit der Ausnahme, daß die Filter in Quadrate geschnitten wurden und jedes Quadrat mit einem verschiedenen Antikörper inkubiert wurde. Diese waren A & L Antikörper (20 ug)ml); A Plasma (1:500); L Plasma (1:500) und H IgG (20 u.g)ml). H ist ein Patient, der positiv auf PT-NANBH Antikörper sein sollte, da er als Bluterkranker keinen hitzebehandelten Faktor VIII erhalten hatte. Am Ende der Reaktion wurde jeder Filter als positiv grob geschätzt (wenn es eindeutig zwei Signalklassen gab) oder negativ (wenn alle Plaques dasselbe Signal zeigten). Dies konnte jedoch nur eine subjektive Bewertung sein, und daher wurden bei einem Vergleich der Ergebnisse nur diejenigen Filter als positiv gezählt, bei denen mehrheitlich eine Übereinstimmung gefunden wurde. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 dargestellt.

Tabelle 1 A & L A L H JG1 + + - - JG2 + + + + JG3 + + + + JG1 schien nur mit Antikörpern von Patient A und nicht von Patient L oder H zu reagieren; dieses sollte man nicht von einem echten PT-NANBH verwandten rekombinanten Polypeptid erwarten und daher wurde JG1 aus der Analyse genommen. Sowohl JG2 und JG3 ergaben eindeutig positive Reaktionen mit den drei PT-NANBH Seren A, L und H und wurden weiter analysiert.

Das obige Analyseverfahren wurde bei JG2 und JG3 wiederholt, mit der Ausnahme, daß die Filter in kleinere Teile geschnitten wurden und diese mit Testreihen positiver und negativer Seren inkubiert wurden. Die Testreihen der positiven Seren enthielten eine Reihe von 10 hämophilisehen Seren und eine Reihe von 9 Seren intravenös Drogenabhängiger (IVDA). Diese repräsentierten die beste Quelle positiver Seren, obwohl die tatsächliche positive Rate unbekannt war. Die Reihe negativer Seren wurde von überwachten Spendern erhalten, die über viele Jahre genau vom North London Blood Transfusion Centre, Deansbrook Road, Edgware, Middlesex, U.K. überwacht wurden und niemals Anzeichen einer Infektion von einer Reihe von Agenzien, einschließlich PT-NANBH zeigten. Die Ergebnisse sind in den Tabellen 2 und 3 dargestellt. 11

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Tabelle 2 I.D. JG2 JG3 IVDAs V19146 4/4 0/5 V27083 2/4 0/5 V29779 0/4 0/5 V12561 0/5 4/5 V15444 3/4 5/5 V18342 4/4 0/5 V8403 3/4 0/5 V20001 4/4 0/5 V21213 3/4 0/5 Hämophile M1582 4/4 4/5 M1581 5/5 5/5 M1575 3/5 0/5 M1579 5/5 5/5 M1585 3/5 0/5 M1576 1/5 1/5 M1580 1/5 0/5 M1578 1/5 0/5 M1587 1/5 3/5 M1577 2/5 1/5

Positive sind unterstrichen.

Tabelle 3 IVDA Hämophile überwachte Spender JG2 6/9(66%) 5/10(50%) 0/10(0%) JG3 2/9(22%) 4/10(40%) 0/10(0%) JG2+JG3 1/9(11%) 3/10(30%) 0/10(0%) JG2 or JG3 7/9(77%) 6/10(60%) 0/10(0%)

Diese Daten sind mit der Hypothese vereinbar, daß beide Rekombinanten Polypeptide exprimieren, die mit einem PT-NANBH auslösenden Agens assoziiert sind, und daß diese Polypeptide nicht identisch sind, jedoch gemeinsame antigene Bindungsstellen aufweisen können.

Beispiel 5. Restriktionskartierung und DNA-Sequenzierung von JG2 und JG3

Ein Teil (10 ul) der Phagenstocklösung sowohl von JG2 als auch JG3 wurde gekocht, um die Phagen zu denaturieren und die DNA freizulegen. Diese DNA wurde anschließend als Matrize in einer PKR-Amplifikation mittels Taq Polymerase verwendet; jede Reaktionslösung enthielt die folgenden Substanzen in einem Endvolumen von 50 ul: 10 mM Tris-HCI, 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl2, 0,01 % Gelatine, pH 8,3 bei 25’C zusätzlich Oligonucleotidprimer d19 und d20 (SEQ ID Nr. 1 und 2; jeweils 200 ng); diese Primer sind in den lambda-Sequenzen lokalisiert, die die EcoRl Klonierungsstelle flankieren, und bewirken daher die Amplifikation mittels Primer von allem, was in diese Stelle kloniert wurde.

Ein Anteil der Reaktion wurde auf. einem 1,0 %igem Agarosegel analysiert und mit Markern verglichen. Amplifikation von JG2 produzierte ein Fragment von ca. 2 Kb; JG3 eines von ca. 1 Kb. Die übrige Reaktionsmischung wurde mit Phenol/Chloroform in Anwesenheit von 10 mM EDTA und 1 % SDS extrahiert und die DNA durch Ethanolpräzipitation zurückgewonnen. Das amplifizierte Material wurde anschließend mit 20 U von EcoRl für 60 Min. bei 37 °C verdaut und auf einem 1,0 % LGT Agarosegel in TAE aufgetrennt. Die Fragmente waren wie erwartet in der Größe reduziert und wurden unter Verwendung von Elutips (S & S) eluiert und gereinigt. Die JG2 und JG3 Insertionssequenzen wurden mit EcoRl verdautem pUCl3 ligasiert und in den E. coli Stamm TG1 transformiert. Die Rekombinanten wurden als weiße Kolonien auf X-gal/L-Amp Platten identifiziert (L-Agarplatten ergänzt mit 100 u.g/ml Ampicillin, 0,5 mg/ml X-gal) und wurden 12

AT 400 724 B überprüft durch Plasmidpräparationen in kleinem Maßstab und EcoR1 Restriktionsenzymverdauung zur Größenbestimmung der Insertions-DNA. Das rekombinante Plasmid mit den JG2 Insertionssequenzen wurde DM415 genannt und dasjenige mit den JG3 Insertionssequenzen DM416.

Die Insertionssequenzen des JG2 wurden durch direkte doppelsträngige Sequenzierung der Plasmid DNA und Subklonierung in M13 Sequenzierungsvektoren wie mp18 und mp19 mit anschließender Einzelstrangsequenzierung bestimmt. Die Insertionssequenz von JG3 wurde ähnlich bestimmt. Die erhaltene DNA und die abgeleiteten Aminosäure-Sequenzen sind in SEQ ID Nr. 3 und 4 aufgeführt.

Beispiel 6. Expression von PT-NANBH Polypeptid in E. coli

Das Plasmid pDM416 (5 ug) wurde mit EcoR1 (20 U) in einem Endvolumen von 20 ul verdaut und die 1 Kb Insertionssequenz durch Elution von einem 1 %igen LGT Agarosegel gewonnen. Dieses Material wurde dann unter Verwendung des Klenow Fragments und einer dNTP Mischung zur Auffüllung der nach EcoR1-Schnitt überstehenden Enden glattgemacht. Die DNA wurde durch Ethanolpräzipitation mit anschließender Extraktion mit Phenol/Chloroform gewonnen. Die glatten Fragmente wurde in Smal gespalte-ne/phospatasierte pDEV107 ligasiert (ein Vektor, der Klonierung am 3'-Ende des lac Z erlaubt) und anschließend in E. coli TG1 Zellen transformiert. Es zeigte sich ein 30-facher Anstieg in den Kolonien gegenüber der bloßen Vektorkontrolle. Die Transformanten mit dem gewünschten rekombinanten Plasmid wurden durch Hybridisierung mit einer radioaktiven Sonde, hergestellt durch PKR-Amplifikation der JG3 Rekombinante, identifiziert. Zwölf Kolonien wurden durch Restriktionsenzymverdauung (Sali) von Miniplasmidpräparationen analysiert, um die Orientierung der Insertionssequenzen zu bestimmen. Ein Viertel dieser Rekombinanten waren in der korrekten Orientierung, um die PT-NANBH Sequenz als Fusionsprodukt mit ß-Galactosidase zu exprimieren. Eines dieser Rekombinanten (pDX113) wurde für weitere Analysen verwendet.

Eine Kolonie von pDX113, gewachsen bis zur mittleren Logphase bei 37 *C unter Schütteln, wurde verwendet, um 50 ml L-Kulturbrühe zu überimpfen und die Expression wurde durch Zugabe von 20 mM IPTG induziert. Nach 3 Std. wurden die Zellen durch Zentrifugation bei 5.000 g für 20 Min. geerntet, in 50 ml PBS resuspendiert und nochmals pelletiert. Die pelletierten Zellen wurde in 5 ml Puffer (25 mM Tris-HCI, 1 mM EDTA, 1 mg/ml Lysozym, 0,2 % (v/v) Nonidet-P40, pH 8,0) per Gramm Pellet resuspendiert und bei 0*C 2 Std. inkubiert. Die freigesetzte bakterielle DNA wurde durch Zugabe von DNase I und MgSO* bei einer Endkonzentration von 40 ng/ml und 2 mM verdaut, wobei die Viskosität herabgesetzt wurde.

Dieses rohe Lysat wurde durch PAGE analysiert und das Proteinmuster mit Coomassie blue gefärbt. Ein Protein von ca. 150 kD wurde in den Bakterien mit pDX113 induziert, wobei dieses Protein schätzungsweise 10-15 % des Gesamtproteinanteil ausmachte. Ähnliche Gele wurden auf PVDF Membran transferiert (GRI, Dunmow, Essex, U.K.) und die Membranen mit PT-NANBH positiven und negativen Seren inkubiert; das 150 kD Protein reagierte mit A und L Seren aber nicht mit normalem menschlichen Serum. Kontrollspuren, die Lysat aus E. coli, die 0-Galactosidase exprimierten, enthielt, reagierten nicht mit A, L oder normalen menschlichen Seren.

Zum rohen Lysat wurde Harnstoff bis zu einer Endkonzentration von 6 M zugegeben und das unlösliche Material durch Zentrifugation entfernt. Der 6 M Harnstoffextrakt wurde verwendet, um die Mikrotiterwells direkt für 1 Std. bei 37 °C zu beschichten. Die Wells wurden dreimal mit bi-destilliertem Wasser gewaschen und anschließend durch Zugabe von 0,25 ml 0,2 %igem BSA mit 0,02 % NaNe pro Well 20 Min. bei 37 *C blockiert. Dann wurden die Platten behaucht. Kontrollplatten, die mit einem Rohlysat eines jS-Galactosidase produzierenden E. coli Stranges (pXY461) beschichtet waren, wurden auf dieselbe Weise hergestellt. Diese Platten wurden in ELISA Tests, wie in Beispiel 10 beschrieben, verwendet.

Beispiel 7. Expression des PT-NANBH Polypeptids in Insektenzellen

Die PT-NANBH Insertionssequenz JG3, isoliert wie in Beispiel 5 beschrieben, wurde im Leseraster mit den ersten 34 Nucleotiden des Polyhydrins in den Vektor pAc360 (Luckow und Summers, Biotechnology, 1988, 6, 47-55) unter Anwendung unseres Wissens über das Leseraster des lacZ Gens im gt11 Vektor. Es wurden Oligonucleotide synthetisiert, die in der Lage waren, mit den die EcoR1 Klonierungsstelle flankierenden gt11 Sequenzen zu hybridisieren und die zur Amplifikation der Insertionssequenzen durch PKR fähig waren. Diese Oligonucleotide enthielten BamHl Restriktionsschnittstellen, die so plaziert waren, daß sie eine direkte Klonierung in die BamHl Schnittstelle von pAc360 erlaubten, und wobei das Insertionsgen im Leseraster mit den Sequenzen am aminoterminalen Ende des Polyhydrins eingefügt wurde.

Eine kleine Menge an gt11 Rekombinanten JG3 wurde gekocht, wobei die DNA freigelegt wurde und anschließend in einer PKR-Amplifikation mit den Oligonucleotidprimer d75 und d76 (SEQ ID Nr. 6 und 7; 13

AT 400 724 B 200 mg) und 0,5 U Taq Polymerase verwendet wurde.

Nach der Amplifikation wurde die Reaktionsmischung mit dem gleichen Volumenanteil Phe-nol/Chloroform extrahiert, mit Ethanol präzipitiert und mit 10 U BamH1 in einem Endvolumen von 30 ul verdaut. Das amplifizierte Fragment wurde auf einem 1 %igen Agarosegel aufgetrennt, eluiert und in BamH1-verdautem pAc360 ligasiert, wobei das Transferkonstrukt pDX119 erhalten wurde. Insektenzellen wurden mit dem rekombinanten Plasmid (2 ug) und Wildtyp AcNPV DNA (1 ug) durch Calciumphosphatpräzipitation kotransfiziert. Einschlußnegative rekombinante Viren wurden durch optisches Screening selektiert. Nach drei Runden der Plaquereinigung wurde das rekombinante Virus (BHC-5) vermehrt und die Expression des rekombinanten Proteins in den Insektenzellen durch SDS-PAGE, Western Blot und ELISA beurteilt. In den infizierten Zellen wurde im Überschuß exprimiertes Protein von ca. 70 kD produziert. Dieses Protein reagiert mit PT-NANBH Seren im Western Blot und ELISA.

Eine weitere Baculovirus Rekombinante (BHC-7) wurde konstruiert, wobei JG2 Sequenzen zusätzlich zu den im BHC-5 anwesenden JG3 Sequenzen, wie in Fig. 1 dargestellt, einschleust wurden. Die in JG2 vorliegenden PT-NANBH Sequenzen wurden amplifiziert und in pAc360 Vektoren kloniert, wie oben beschrieben, wobei pDX118 erhalten wurden und die geeigneten BamH1/Sall Fragmente von pDX119 und PDX118 wurden miteinander in dieser Reihenfolge in pAc360 verknüpft, wobei das Transferkonstrukt pDX122 hergestellt wurde.

Die rekombinanten Plasmide wurden durch Hybridisierung identifiziert und die Orientierung der Inser-tions-DNA wurde durch Restriktionsenzymanalyse bestimmt. Rekombinante Viren wurden wie oben beschrieben hergestellt und das exprimierte Protein durch SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese, Western Blot und ELISA analysiert. Es wurde ein 95 kDa Polypeptid in hohem Überschuß (40 % des gesamten Zellproteins) in den infizierten Zellen gefunden, das mit den PT-NANBH Seren reagierte.

Beispiel 8. Reinigung des DX113 Polypeptids

Der E. coli Stamm TG1 mit dem Plasmid pDX113 (bezeichnet als WDL001 Stamm) wurde in einem 1,5 I Fermenter (Modell SET002, SGI, Newhaven, East Sussex, U.K.) induziert und bei 37*C 5 Std. wachsen gelassen. Die Zellen wurden durch Zentrifugation bei 5.000 g für 20 Min. geerntet und wie folgt behandelt. a) Extraktion

Die nassen Zellen wurden in Puffer A (50 mM Tris-HCI, 50 mM NaCI, 1 mM EDTA, 5 mM DTT, 10 % (v/v) Glycerol, pH 8,0) resuspendiert (1:20 w/v). 5 mg festes Lysozym wurde pro ml der Suspension zugefügt und die Mischung bei 4*C stehengelassen. Nach 15 Min. wurde die Mischung im Eisbad mit Ultraschall behandelt (6 um Peak-zu-Peak Amplitude) für eine Gesamtzeit von 3 Min. (6 x 30 Sek. Schallung). 4 ug DNase I wurde pro ml Suspension zugefügt und die Mischung weitere 30 Min. stehengelassen. Die Suspension wurde 20 Min. bei 18.000 g (max) zentrifugiert und der Überstand dekandiert.

Das Pellet wurde in Puffer B (25 mM Hepes, 4 M Harnstoff, 4 mM DTT, pH 8,0) bei einem Verhältnis von 1:6 (w/v) unter Erhalt einer feinen Suspension resuspendiert. Diese wurde bei 18.000 g (max) 20 Min. zentrifugiert und der Überstand abdekandiert. Das Pellet wurde in Puffer C (25 mM Hepes, 8 M Harnstoff, 2 mM DTT, pH 8,0) in einem Verhältnis von 1:6 (w/v) resuspendiert: vor Suspendierung wurden die folgenden Substanzen zugegeben: Leupeptin (1 ug/ml), Pepstatin (1 ug/ml) und E64 (1 ug/ml). Die Suspension wurde bei 18.000 g (max) 30 Min. zentrifugiert, der Überstand abdekandiert und zurückbehalten. Das Pellet wurde in 25 mM Hepes, 1 % SDS pH 8,0 resuspendiert. b) Chromatographie

Der Überstand der 8 M Harnstofffraktion wurde 1:5 (v/v) mit 25 mM Hepes, 8 M Harnstoff, 2 mM DTT, pH 8,0 verdünnt und auf einer 7 ml Q-Sepharosesäule fraktioniert. Die Proteine wurde mittels eines Salzgradienten von 0-1 M NaCI eluiert. Die Chromatographie und die Datenverarbeitung wurde über eine FPLC-Anlage (Pharmacia) gesteuert. DX113 eluierte bei ca. 500 mM NaCI und war nahezu homogen bei der SDS-PAGE und Western Blot Analyse.

Beispiel 9. Reinigung des BHC-5 Polypeptids

Sf9 Zellen (2x109) wurden mit der Stocklösung des BHC-5 rekombinanten Virus (moi 5) infiziert. Nach 2-tägiger Inkubation bei 28 °C wurden die Zellen durch Zentrifugation geerntet und dann wie folgt verarbeitet, a) Extraktion

Die nasse Zellmasse (1,2 g) wurde in 6 ml Puffer A (25 mM Hepes, 5 mM DTT, Leupeptin 1 ug/ml, Pepstatin 1 ug/ml, E64 1 ug/ml pH 8,0) resuspendiert. Die resuspendierten Zellen wurden in ein Eisbad 14 ΑΤ 400 724 Β gestellt und 3x15 Sek. mit Ultraschall behandelt (6 um Peak-zu-Peak Amplitude), mit Ruhepausen von je 30 Sek.. Die beschallte Suspension wurde bei 18.000 g (max) 20 Min. zentrifugiert und der Überstand dekandiert. Das Pellet wurde in Puffer A plus 4 M Harnstoff (6 ml) resuspendiert und bei 18.000 g (max) 20 Min. zentrifugiert. Der Überstand wurde abdekandiert und das Pellet mit Puffer A plus 8 M Harnstoff (6 ml) reextrahiert. Nach 30-minütiger Zentrifugation bei 18.000 g (max) wurde der Überstand zurückbehalten und 1:6 im Puffer A plus 8 M Harnstoff verdünnt. Dieses Extrakt wurde auf einer mit demselben Puffer equilibrierten mono-Q-Säule chromatographiert. Die Säule wurde mit einem Salzgradienten (0-1,0 M NaCI) mit 12 Säulenvolumen eluiert. BHC-5 eluierte bei ca. 0,45 - 0,55 M NaCI and seine Reinheit bestimmt durch SDS-PAGE war größer als 90 %. Die Ausbeute betrug ca. 70 %.

Beispiel 10.

Einsatz von DX113 und BHC-5 und BHC-7 Polypeptiden in einem ELISA

Mikroelisaplatten (96 Wells, Nunc) wurden direkt in 50 mm Bikarbonatpuffer (50 mM Natriumbikarbonat und 50 mM Natriumkarbonat auf pH 9,5 titriert) mit entweder einem 6 M Harnstoff Rohlysat von HBC-5 oder mit gereinigten pDX113 beschichtet. Die Platten wurden mit 0,2 %iger BSA-Lösung blockiert und anschließend 30 Min. bei 37’C mit 1:20 verdünnten Seren (Baculo) oder 1:100 (E. coli) inkubiert. Die Platten wurden in einer Tween-Salzlösung (0,85 % Salzlösung, 0,05 % Tween 20, 0,01 % Bronidox) gewaschen und mit Peroxidase-konjugiertem Ziegen-anti-Mensch Immunoglobulin (1:2000) 30 Min. bei 37 *C inkubiert. Dann wurden die Platten in Tween-Salzlösung gewaschen und es entwickelte sich eine Farbe durch Zugabe des chromogenen Substrats TMB (Tetramethylbenzidin-HCI) (100 ul/Well) in 20-minütiger Inkubation bei Raumtemperatur. Die Reaktion wurde mit 50 ul 2 M Schwefelsäure abgestoppt und die OD450 bestimmt (Tabelle 4).

Tabelle 4

Indirekter Anti-Mensch Ig-ELISA Aufbau zum Nachweis von NANB Antikörper Baculo BHC-5 (feste Phase) E.coli DX113 (feste Phase) Seren von positiven Hochrisiko-Patienten im Test >2 1.670 1.855 1.531 1.081 1.015 1.842 1.558 0.526 0.638 >2 1.516 1.823 1.602 1.779 1.318 1.122 0.616 1.686 1.441 Seren von negativen Hochrisiko-Patienten im Test 0.259 0.205 0.158 0.120 0.298 0.209 0.194 0.111 0.282 0.181 0.263 0.165 0.184 0.163 0.121 0.099 0.243 0.104 überwachter Spender 0.224 0.119

Seren von Patienten mit einem hohen Risiko für die PT-NANB Infektion (IVDA's, Bluter) wurden wie beschrieben getestet. Alle Werte sind als OD450 Angaben ausgedrückt mit den überwachten Spendern als Negativkontrolle. Von dieser besonderen Gruppe sind 10/19 Seren positiv auf beiden festen Phasen. 15

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Zusätzlich wurde gereinigtes DX113 an alkalische Phosphateise mittels SATA/Maleinimid-Reduktion konjugiert und ein immunometrischer Test aufgebaut. Bekannte NANB positive und negative Seren wurden verdünnt, wie beim überwachten Spenderserum angegeben, und zu einer BHC-7 beschichteten festen Phase gegeben. Das DX113 Konjugat wurde entweder gleichzeitig oder nach Inkubation (30 Min. bei 37 *C) zugegeben (50 ul, 1:2000). Nach 30-minütiger Inkubation bei 37 *C wurden die Platten mit 50 mM Bikarbonatpuffer gewaschen, und es fand Farbentwicklung statt bei Verwendung des IQ Bio-Amplifizierungs-systems und es wurde die OD492 bestimmt (Tabelle 5).

Tabelle 5

Immunometrischer ELISA (markiertes Polypeptid) zum Nachweis von NANB Antikörper Positiv im Test Negativ im Test überwachter Spender >2 0.217 0.234 0.821 0.252 >2 0.214 0.542 0.257 0.876 0.308 1.583 0.278 >2 0.296 >2 0.273 1.830 0.262 >2 0.251

Sowohl der Antiglobulin- wie auch der immunometrische Testaufbau ergab bei allen Hochrisikoproben ein übereinstimmendes Ergebnis.

Beispiel 11. Impfstofformulierung

Eine Impfstofformulierung wurde hergestellt durch konventionelle Techniken unter Verwendung der folgenden Bestandteile in den angegebenen Mengen: PT-NANBH virales Polypeptid > 0,36 mg Thiomersal 0,04-0,2 mg Natriumchlorid < 8,5 mg Wasser bis 1 ml

Beispiel 12

Herstellung monoklonaler Antikörper gegen PT-NANBH Polypeptide

Die DNA-Insertionssequenzen aus DM415 wurden im Baculovirus Transfervektor p36C subkloniert und rekombinante Viren nach einer im wesentlichen in Beispiel 7 beschriebenen Methode hergestellt. Das rekombinante Virus wurde BHC-1 genannt und exprimierte in sehr geringem Ausmaß PT-NANBH-spezifi-sches Protein. Sf-9 Zellen (5x107 Zellen/ml), infiziert mit BHC-1, wurden in PBS mit 1 % (v/v) NP40 lysiert und bei 13.000 g 2 Min. zentrifugiert. Der Überstand wurde über Extractigel-D (Pierce Chemicals) gegeben, wobei das Detergens entfernt wurde und anschließend als 1:1 Emulsion mit Freundschem kompletten Adjuvans gemischt. Mäuse wurden subkutan mit 0,1 ml der Emulsion (entspricht 5x106 Zellen) injiziert. 14 und 28 Tage nach der Injektion wurden die Mäuse durch intraperitoneale Injektion von 0,1 ml (entspricht 5x1ο6 Zellen) eines Detergens-freien Extrakes von BHC-5-infizierter Sf-9 Zellen geboostet; BHC-5 enthält die DNA Insertionssequenzen von DM416. Blutproben vom Schwanz wurden genommen und auf anti-PT-NANBH Aktivität in einem ELISA (Beispiel 10) getestet. Zwei Mäuse mit einer PT-NANBH-spezifischen Antwort wurden nochmals durch i.v. Injektion mit einem Detergens-freien Extrakt von BHC-7-infizierten Sf-9 Zellen geboostet: BHC-7 enthält die DNA Insertionssequenzen, die durch Ligasierung der überlappenden 16

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Regionen von DM415 und DM416 (Beispiel 7) hergestellt wurden. Die Milz wurde drei Tage später entnommen.

Die Milzzellen wurden mit NSo-myelomazellen in Gegenwart von PEG1500 nach Standardverfahren fusioniert. Die erhaltenen Hybridomazellen wurden durch Wachstum in HAT (Hypoxanthin, Aminopterin, Thymidin) Medium selektiert. 10-14 Tage nach Fusion wurden die Überstände auf anti-PT-NANBH Aktivität durch ELISA gescreent. Wells, die Reaktivität sowohl mit DX113 und HBC-7 Antigenen (Beispiel 10) zeigten, wurden identifiziert und einzelne Kolonien in separate Wells transferiert, kultiviert und nochmals getestet. Wells, die eine spezifische Reaktivität in diesem Stadium zeigten, wurden weiter bis zur limitierenden Verdünnung kloniert, um Monokionalität sicherzustellen.

Beispiel 13

Nachweis von PT-NANBH viraler Nukleinsäure in serumpositiven Patienten

Seren: Spenderproben von 1400 Spendern, die an einer Übersichtstudie zur posttransfusionalen Hepatitis teilnahmen, wurden bei -20 * C eingefroren. Die prätransfusionalen Proben und Reihen posttransfu-sionaler Proben von 260 Empfängern wurden in gleicher Weise gelagert. Die posttransfusionalen Proben wurden in 14-tätigem Abstand bis zu 3 Monaten, dann im monatlichen Abstand bis zu 6 Monaten und 6-monatlich danach bis zu 18 Monaten gesammelt. Gefrorene Spender- und Empfängerseren von drei Fällen von PT-NANBH, die 1981 auftraten, standen auch für die Untersuchung zur Verfügung. Die Diagnose auf PT-NANBH basierte auf einem Anstieg in der Serumalaninaminotransferase (ALT) bis zu 2,5 mal über den normalen oberen Grenzwert bei wenigstens zwei verschiedenen getrennten posttransfusionalen Proben. Andere hepatotrope Viren wurden durch serologische Tests ausgeschlossen und nicht-virale Ursachen einer hepatozellulärer Verletzung wurde durch konventionelle klinische oder Laboruntersuchungen ausgeschlossen.

Immunoassay: Die Serumproben wurden auf die Anwesenheit von gegen HCV gerichteter Antikörper (C100 Antigen) mit dem Ortho Diagnostics ELISA Kit entsprechend den Herstellerangaben getestet. Wiederholt reaktive Seren wurden titriert bis zu einem Endpunkt in einem menschlichen Serum, das negativ auf anti-ClOO war.

Nachweis der PT-NANBH viralen Sequenzen: Serum oder Plasma RNA wurde extrahiert, revers transkribiert und, wie unten beschrieben, amplifiziert. Die reserse Transkription/PKR Oligonukleotidprimer wurden aus der Nucleotidsequenz des JG2 Klons, wie in Beispiel 3 isoliert, abgeleitet und auf einem Applied Biosystems 381A Synthesizer synthetisiert. Die Sequenzen der vier Oligonucleotidprimer sind wie folgt:

Designierung SED ID Nr. Produktgröße d94 Sinn 8 729bp D95 Antisinn 9 N1 Sinn 10 402bp N2 Antisinn 11 i) RNA Extraktion 5-50 ul Serum (oder Plasma) wurden auf 200 ul durch Zugabe sterilen destillierten Wassers verdünnt. Die 200 ul Probe wurde zu einem gleichen Volumen an 2 x PK Puffer (2 x PK = 0.2 M TrisHCl, pH 7,5, 25 mM EDTA, 0,3 M NaCI, 2 % w/v SDS, Proteinase K 200 ug/ml) zugegeben, gemischt und bei 37’C 40 Min. inkubiert. Die Proteine wurden durch Extraktion zweimal mit Phenol/Chloroform und einmal mit Chloroform allein entfernt. Es wurden 20 ug Glycogen zur wäßrigen Phase zugegeben und die RNA durch Zusatz des 3-fachen Volumens an eiskalten absoluten Ethanol aufgefällt: Nach 1-stündiger Lagerung bei -70'C wurde die RNA in einer Eppendorf-Zentrifuge (15 Min. 14.000 Upm, 4’C) pelletiert. Das Pellet wurde einmal in 95 %igem Ethanol gewaschen, im Vakuum getrocknet und in 10 ul sterilem destilliertem Wasser aufgelöst. Die RNA Lösungen wurden bei -70 ”C gelagert. ii) cDNA Synthese

Es wurde eine 10 ul Mischung hergestellt, die 2 ul RNA Lösung, 50 ng des synthetischen Oligonucleo-tids d95, 10 mM Hepes-HCI pH 6,9 und 0,2 mM EDTA pH 8,0 enthielt. Diese 10 ul Mischung wurde mit 2 Tropfen Mineralöl überschichtet, 2 Min. in einem Wasserbad bei 90 "C erhitzt und rasch in Eis 17

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abgekühlt. Die Reaktionslösung wurde auf 50 mM Tris-HCI pH 7,5, 75 mM KCl, 3 mM MgCh, 10 mM DTT, jeweils 0,5 mM von dATP, dCTP, dGTP und dTTP, 20 U des RNase Inhibitors (Pharmacia) und 15 U der klonierten MLV reversen Transkriptase (Pharmacia) bei einem Endvolumen von 20 ul eingestellt und die cDNA Synthese durchgeführt. Die 20 ul Mischung wurde 90 Min. bei 37’C inkubiert. Nach der Synthese wurde die cDNA bei -20 * C gelagert, iii) "Nested" PKR

Falsch positive PKR Ergebnisse im Rahmen dieser Studie wurden vermieden, indem strenge Maßnahmen nach Kwok und Higuchi (Nature, 1989, 339, 237-238) zur Vermeidung von Kontamination ergriffen wurden. a) Runde 1

Die Polymerase-Kettenreaktion wurde in einer 50 ul Mischung enthaltend 10 mM Tris-HCI pH 8,3, 50 mM KCl, 1,5 mM MgCk, 0,01 % w/v Gelatine, 1 U rekombinanter Taq DNA Polymerase (Perkin Eimer Cetus), 200 UM von jedem dNTP, 30 ng von jedem "äußeren" Primer (d94 und d95; SEQ ID Nr. 8 und 9) und 5 ul der cDNA Lösung durchgeführt. Nach einer ersten 5-minütigen Denaturierung bei 94 *C wurden 35 Zyklen bei 95 *C für 1,2 Min., bei 56 *C für 1 Min. und bei 72 "C für 1 Min. durchgeführt, gefolgt von einer abschließenden 7-minütigen Verlängerung bei 72 °C (Techne PHC-1 Automated Thermal Cycler). b) Runde 2

Es wurde dieselbe Reaktionsmischung wie für Schritt 1 beschrieben verwendet, jedoch wurden 125 ng eines jeden "inneren” Primers N1 und N2 (SEQ ID Nr. 10 und 11) anstelle der "äußeren" Primer d94 und d95 eingesetzt. Ein Aliquot von 1 ul der PKR-Produkte aus Runde 1 wurde in 50 ul Reaktionsmischung von Runde 2 überführt. Es wurden 25 Schritte bei 95'C für 1,2 Min., bei 46*C für 1 Min., bei 72 *C für 1 Min. durchgeführt, an die sich eine 7-minütige Verlängerung bei 72 *C anschloß. c) Analyse 20 ul der PKR-Produkte aus Runde 1 und Runde 2 wurden durch Elektrophorese auf einem 2 %igen Agarosegel analysiert. Die Banden wurden durch Ethidiumbromidfärbung sichtbar gemacht und bei 302 nm fotografiert.

Vorhergesagter Wert der anti-HCV Serologie und PKR in der Übersichtsstudie: Sechs der 1400 Spender (0,43 %), die an der Übersichtsstudie teilnahmen, zeigten gegen C100 gerichtete Antikörper in ihrem Serum. Von diesen sechs Antikörper-positiven Spendern erwies sich nur einer (Spender D6) als infektiös, wie durch Ausbruch von PT-NANBH und C100 Serumkonversion in einem Empfänger (Empfänger R6) nachgewiesen werden konnte - siehe unten Tabelle 6. Im Serum des Spenders D6 wurden durch PKR virale Sequenzen nachgewiesen, jedoch in keinem anderen der fünf serumpositiven Spenderseren. Der Empfänger R6, bei dem PT-NANBH auftrat, hatte ebenfalls Blut von sieben anderen Spendern (D7 bis D13) erhalten. Überprüfung der Seren von diesen Spendern ergab, daß sie sowohl Antikörper-negativ und PKR-negativ waren. 18

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Tabelle 6

Spender/Empfänger Datenzusammenfassung: Übersichtsstudie Spender Empfänger Spender anti-HCV PKR Empfänger PT-NANBH anti-HCV Serumkonversion D1 + - R1 nein nein D2 + - R2 nein nein D3 + - R3 nein nein D4 + - R4 nein nein D5 + - R5 nein nein D6 + + D7 - - D8 - - D9 - - R6 ja* ja + D10 - - D11 - - D12 - - D13 - - ’ Inkubationszeit 1 Monat + Serumkonversion trat 5 Monate nach der Transfusion auf

Beispiel 14

Isolierung und Expression zusätzlicher PT-NANBH DNA-Sequenzen

Die Banken aus lambda gtn aus Beispiel 2 wurden ebenfalls gescreent mit Seren von PT-NANBH Hochrisiko-Patienten, die aber nicht mit den viralen Antigenen DX113, BHC-5 und BHC-7 reagierten. Der Grund dafür mag sein, daß sie auch Antikörper, die verschiedene Antigene erkennen können, enthalten. Die Seren PJ-5 (The Newcastle Royal Infirmary, Newcastle), Birm-64 (Queen Elizabeth Medical Centre, Birmingham), PG und Le (University College and Middlesex School of Medicine, London) erfüllten dieses Kriterium und wurden zum Screenen der Banken nach denselben Verfahren, wie in Beispiel 3 und Beispiel 4 beschrieben, eingesetzt. Es wurde auf diese Weise an Zahl Rekombinanten identifiziert, von denen keine mit aus JG2 und JG3 hergestellten Sonden kreuzhybridisierte. Eine der Rekombinanten, BR11, identifiziert durch Reaktion mit PJ-5, wurde für eine weitere Analyse ausgewählt.

Der Klon BR11 enthielt eine Insertionssequenz von ca. 900 BP, die durch PKR mittels der d75 und d76 Primer (SEQ ID No. 6 und 7), wie in Beispiel 7 beschrieben, amplifiziert wurden. Die amplifizierte Sequenz wurde direkt in den Baculovirus Vektor pAc360 unter Bildung des pDX128 kloniert, der ein offenes Leseraster in Phase mit den ersten 11 Aminosäuren des Polyhydrins enthielt. Stocklösungen des rekombin-anten Baculovirus (bezeichnet BHC-9) wurden nach den Verfahren wie in Beispiel 7 beschrieben hergestellt. Insektenzellen wurden mit gereinigten rekombinanten Viren infiziert und ein Polypeptid von ca. 22 kD wurde aus radioaktiv markierten Zellextrakten erhalten.

Die amplifizierte Insertionssequenz von BR11 wurde auch in pUC13 und M13 Phagenvektor zur Sequenzierung kloniert; die DNA und die Aminosäure-Sequenzdaten sind in SEQ ID Nr. 5 dargestellt. Die Insertionssequenz enthält 834 BP plus die EcoR1 Linker, die während der Klonierung hinzukamen.

Beispiel 15. Einsatz des BHC-9 Polypeptides in einem ELISA

Es wurde ein Elisa aufgebaut unter Verwendung von Mikrotiterwells, die mit Extrakten aus BHC-9-infizierten Zellen beschichtet waren, und einem anti-human lg konjugiertem Nachweissystem entsprechend dem Verfahren aus Beispiel 10. Eine Testreihe von Hochrisiko-Seren wurden parallel gegen BHC-7 und BHC-9 getestet und wurden auch durch PKR gemäß dem in Beispiel 13 beschriebenen Verfahren überprüft. Die Ergebnisse sind in Tabelle 7 dargestellt, wobei die positiven Proben unterstrichen sind. 19

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Tabelle 7

Nummer PKR BHC-7 BHC-9 1 + 2.09 2.00 2 + 2.09 2.00 3 + 1.89 1.37 4 + 1.57 0.27 5 + 1.26 2.00 6 + 0.91 2.00 7 - 0.90 0.51 8 + 0.84 1.19 9 - 0.53 0.43 10 - 0.45 2.00 11 + 0.37 1.07 12 - 0.32 2.00 13 - 0.23 0.30 14 - 0.15 0.43 15 + 0.16 0.76 16 - 0.09 1.74 17 - 0.27 2.00 18 - 0.15 2.00 19 - 0.12 2.00 20 - 0.08 0.05 Nachweisgrenze 0.27 0.29 50 % der 20 Proben waren eindeutig BHC-7 positiv, wohingegen 85 % BHC-9 positiv waren. Zwei Proben (11 & 12), die ganz knapp BHC-7 positiv waren, waren eindeutig BHC-9 positiv und einige der Proben an der BHC-7 Nachweisgrenze oder darunter waren BHC-9 positiv. Zusätzlich waren zwei Proben (11 & 15) PKR positiv, die Grenzfälle waren, oder BHC-7 negativ aber BHC-9 positiv. Insgesamt fanden sich nur zwei Proben (13 & 20), die negativ auf beide Polypeptide und PKR waren.

Beispiel 16

Isolierung überlappender PT-NANBH DNA-Sequenzen in existierenden Klonen

Das immunologische Screening der cDNA-Expressionsbanken, wie in den Beispielen 3, 4 und 14 beschrieben, kann nur solche Klone identifizieren, die eine immunoreaktive Region des Virus enthalten. Eine andere Möglichkeit zur Produktion von PT-NANBH-spezifischer Klone ist die Verwendung von PKR zur Amplifikation von cDNA-Molekülen, die existierende Klone überlappen. Es können Sets von Primer hergestellt werden, bei denen ein Partner eines Paares innerhalb bestehender klonierter Sequenzen liegt und der andere außerhalb liegt; dieses Verfahren kann auch auf "nested" Paaren von Primern angewandt werden.

Die in Beispiel 1 beschriebene cDNA wurde durch PKR amplifiziert, mit entweder einem einzelnen oder einem "nested" Paar von Primern unter Einsatz der Reaktionsbedingungen wie in Beispiel 13 beschrieben. Dieses Verfahren läßt sich durch Verwendung der folgenden Primerpaare darstellen; d164 (SEQ ID No. 12) und d137 (SEQ ID No. 13); d136 (SEQ ID Nr. 14) und d155 (SEQ ID Nr. 15); d156 (SEQ ID Nr. 16) und d92 (SEQ ID Nr. 17). Ein Partner eines jeden Paares ist bestimmt, den Primevorgang innerhalb der existierenden klonierten Sequenzen zu bewerkstelligen (d137 und dl36 innerhalb der 5’- und 3'-Enden des BR11, d92 am 5'-Ende von JG3). Die anderen Primer basieren auf Sequenzen, wie sie für andere PT-NANBH Agenzien erhältlich sind. Primer d164 entspricht den Basen 10 bis 31 aus Figur 2 in Okamoto et al, Japan J. Exp. Med., 1990, 60, 167-177. Die Primer d155 und d156 entsprechen den Positionen 462 bis 489 und 3315 bis 3337 in Figur 47 der europäischen Patentanmeldung 88 310 922.5. Um eine EcoR1 Erkennungsstelle nahe dem 5'-Ende des Primers einzuführen, wurde eine oder mehrere Nucleotidsubstitutionen gemacht, ausgenommen für d164, wo eine Bg12 Erkennungsstelle eingeführt wurde; diese Veränderungen ermöglichen die anschließende Klonierung des amplifizierten Produkts. PKR-Produkte wurden mit geeigneten Restriktionsenzym(en) verdaut, durch Agarosegel-Elektrophorese aufgetrennt, die Banden mit der erwarteten Größe wurden ausgeschnitten und sowohl in Plasmid wie auch 20

AT 400 724 B bakteriophagen Vektoren wie in Beispiel 5 beschrieben kloniert. Die Sequenzen der amplifizierten DNAs 164/137 (SEQ ID Nr. 18), 136/155 (SEQ ID Nr. 19) und 156/92 (SEQ ID Nr. 20) sind in der Sequenzauflisting dargestellt. Diese neuen Sequenzen übersteigen die Größe des PT-NANBH Genoms, wie es durch Immunoscreening (SEQ ID Nr. 3, 4 & 5) erhalten wurde. Diese Sequenzen zusammen mit anderen, die 5 innerhalb der bereits beschriebenen Regionen liegen, können zu einer zusammenhängenden Sequenz am 5'-Ende (SEQ ID Nr. 21) und am 3'-Ende (SEQ ID Nr. 22) des PT-NANBH Genoms geknüpft werden.

Beispiel 17 jo Fusion verschiedener PT-NANBH Antigene in ein einzelnes rekombinantes Polypeptid

Die Daten aus Tabelle 7 deuten darauf hin, daß es einige Proben (z.B. Nr. 4) gibt, die nur BHC-7 positiv sind, während mehr Serumproben als Antikörper-positiv bei Verwendung von BHC-9 als Zielantigen (17/20) statt BHC-7 (10/20) nachgewiesen wurden. Diese Zahlen werden durch umfangreichere Probentests js bestätigt. Es wurde daher entsprechend ein Fusionskonstrukt unter Verwendung der Sequenzen von BHC-7 und BHC-9 abgeleitet.

Sequenzen aus BHC-7 und BHC-9 können nach einer Vielzahl von Methoden verknüpft werden; jede Sequenz kann an den aminoterminalen Enden des erhaltenen Fusionsprodukts positioniert werden, und die Art der Bindungssequenzen kann ebenfalls variiert werden. Fig. 2 beschreibt zwei mögliche Wege, nach 20 denen die Sequenzen verknüpft werden können.

Geeignete Restriktionsfragmente, die passende Restriktionsenzym-Schnittstellen und Linkersequenzen tragen, wurden entweder mittels PKR unter Verwendung spezifischer Primer oder durch Restriktionsenzym-Verdauung bestehender Plasmide erzeugt. Der Transfervektor DX143 besteht aus einem BamH1/Pst1 Fragment von DX122 (Fig. 1; die Pst Schnittstelle ist an der Position 1504 JG2, SEQ ID Nr. 3) verknüpft mit 25 dem 5'-Ende der gesamten kodierenden Region von BR11 (SEQ ID Nr. 7), die als ein Pstl/BamHl Fragment unter Verwendung der Primer d24 (SEQ ID Nr. 23) und d126 (SEQ ID Nr. 24) amplifiziert wurde; die Verknüpfungsregion besteht aus sechs Aminosäuren abgeleitet vom dl26 Primer und restlichen bakteriophagen lambda Sequenzen. Der Transfervektor DX136 unterscheidet sich von DX142 darin, daß das BR11 Fragment unter Verwendung von d24 (SEQ ID Nr. 23) und d132 (SEQ ID Nr. 25) erzeugt wurde und 30 daher die Verknüpfungsregion fünf Lysinreste enthält. Diese Transfervektoren wurden verwendet zur Kotransfizierung von Sf9 Insektenzellen in einer Kultur mit AcNPV DNA und es wurden gereinigte Plaque Stocklösung von rekombinanten Baculoviren, wie in Beispiel 7 beschrieben, hergestellt. BHC-10 wurde erzeugt als Ergebnis der Transfektion mit DX143; BHC-11 war das Ergebnis der Transfektion mit DX136.

Die durch diese zwei Viren exprimierten rekombinanten Polypeptide wurden durch SDS-PAGE und 35 Western Blotting analysiert. BHC-10 produzierte ein Polypeptid mit einem scheinbaren Molekulargewicht von 118 kDa. BHC-11 produzierte ein Polypeptid mit einem scheinbaren Molekulargewicht von 96 kDa. Beide Polypeptide reagierten mit Seren, die bekannterweise im ELISA nur mit BHC-7 (z.B. Serum A) oder nur mit BHC-9 (Serum B64, Beispiel 14) reagierten. Die beiden Polypeptide unterscheiden sich nur in der Verküpfungssequenz, was einen Einfluß entweder auf ihre Mobilität während der SDS-PAGE oder ihre 40 Prozessierung in den infizierten Zellen hat.

Beispiel 18

Einsatz von PT-NANBH Fusionantigenen in einem ELISA 45

Es wurde ein ELISA aufgebaut unter Verwendung von Mikrotiterwells, die mit Extrakten BHC-9-infizierter Zellen beschichtet waren, und einem anti-human lg Konjugat nach dem Verfahren aus Beispiel 10. Tabelle 8 enthält die Daten aus dem Vergleich der zwei Fusionierungsprodukte mit den anderen PT-NANBH rekombinanten Antigenen BHC-7 und BHC-9 wie auch dem HCV rekombinanten Protein C-100-3 (Ortho so Diagnostic Systems, Raritan, New Jersey). Diese Seren sind zu Gruppen zusammengefaßt nach ihrer Reaktion mit BHC-7, BHC-9 und C-100-3. Seren der Gruppe I reagieren stark mit allen drei Antigenen; Seren der Gruppe II reagieren stark nur mit BHC-7; Seren der Gruppe III zeigen eine starke Reaktion nur mit BHC-9 und Seren der Gruppe IV reagieren stark nur mit zwei der drei Antigene. 21 55

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Tabelle 8 SEREN BHC-7 BHC-9 C-100-3 BHC-10 BHC-11 Gruppe 1 AH >2.0 >2.0 >2.0 >2.0 >2.0 AC >2.0 >2.0 >2.0 >2.0 >2.0 57 >2.0 >2.0 >2.0 >2.0 >2.0 77 >2.0 >2.0 >2.0 >2.0 >2.0 84 1.4 >2.0 >2.0 >2.0 >2.0 Gruppe II 805-6 >2.0 0.261 0.1 1.78 + ' 805-17 >2.0 0.181 0.12 1.37 + * 805-149 >2.0 0.651 0.084 1.57 + +* Gruppe III JS 0.32 >2.0 0.17 >2.0 >2.0 805-57 0.069 1.403 0.25 1.9 + * 805-82 0.116 1.272 0.4 1.85 + +* 805-94 0.353 1.675 0.2 >2.0 + ’ PJ1 0.27 >2.0 0.2 >2.0 1.85 Gruppe IV A >2.0 0.14 >2.0 >2.0 >2.0 KT 1.57 0.27 >2.0 >2.0 >2.0 Le 0.152 >2.0 >2.0 >2.0 >2.0 PJ5 0.123 >2.0 >2.0 >2.0 >2.0 303-923 >2.0 0.9 0.37 1.9 + ' 303-939 >2.0 1.55 0.268 2.0 + ' ' Diese Proben sind nur durch Western Blotting auf BHC-11 getestet worden.

Diese Werte zeigen, daß sowohl BHC-10 und BHC-11 eine vergleichbare Reaktivität mit diesen Seren zeigen und, was sehr wichtig ist, daß beide Antigenaktivitäten in den Fusionsprodukten offensichtlich erhalten blieben. Alle Seren der Gruppen II und III, die jeweils nur mit BHC-7 oder BHC-9 reagieren, zeigen eine deutliche Reaktion mit den Fusionsprodukten. Zusätzlich findet sich der Hinweis, daß die beiden Antigene zusammen einen empfindlicheren Test ermöglichen. Zum Beispiel ergibt die Probe KT OD-Werte von 1,57 und 0,27 mit BHC-7 und BHC-9, wohingegen bei den Fusionsprodukten der OD-Wert > 2,0 ist. 22

AT 400 724 B

Seqiien^orotokoll SEQ ID Nr. 1 ART DER SEQUENZ: Nucleotid SEQUENZLÄNGE: 21 Basen STRANGFORM: Einzelstrang TOPOLOGIE: linear

ART DES MOLEKÜLS: synthetische DNA URSPRÜNGLICHER HERKUNFTSORGANISMUS: Bakteriophage lamhda gtll UNMITTELBARE EXPERIMENTELLE HERKUNFT: Oligonucleotid-Synthesizer; oligo dl9 MERKMALE: von 1 bis 21 Basen homolog zum stromaufwärts gelegenen Teil des lacZ Gens, der die ECORl Schnittstelle im Bakteriophagen lambda gtll flankiert EIGENSCHAFTEN: startet DNA-Synthese vom Phagenvektor in cDNA, eingefügt an der EcoRl Schnittstelle 21

GGTGGCGACG ACTCCTGGAG C 23

AT 400 724 B SEQ ID Nr. 2 ART DER SEQUENZ: Nucleotid SEQUENZLÄNGE: 21 Basen STRANGFORM: Einzelstrang TOPOLOGIE: linear

ART DES MOLEKÜLS: synthetische DNA URSPRÜNGLICHER HERKUNFTSORGANISMUS: Bakteriophage lambda gtll UNMITTELBARE EXPERIMENTELLE HERKUNFT: Oligonucleotid-Synthesizer; oligo d20 MERKMALE: von 1 bis 21 Basen homolog zum stromabwärts gelegenen Teil des lacZ Gens, der die EcoRl Schnittstelle im Bakteriophagen lambda gtll flankiert EIGENSCHAFTEN: startet DNA-Synthese vom Phagenvektor in cDNA, eingefügt an der EcoRl Schnittstelle 21

TTGACACCAG ACCAACTGGT A 24

AT 400 724 B SEQ ID Nr. 3 ART DER SEQUENZ: Nucleotid mit entsprechendem Protein SEQUENZLÄNGE: 1770 Basenpaare STRANGFORM: Einzelstrang TOPOLOGIE: linear

ART DES MOLEKÜLS: cDNA zu Genom-RNA URSPRÜNGLICHER HERKUNFTSORGANISMUS: Mensch; für posttransfusionale non-A, non-B-Hepatitis infektiöses Serum UNMITTELBARE EXPERIMENTELLE HERKUNFT: Klon JG2 aus der cDNA-Bank in lambda gtll MERKMALE: von 1 bis 1770 BP Teil des PT-NANBH-Polyproteins EIGENSCHAFTEN: kodiert wahrscheinlich virale nicht-strukturelle Proteine CAA AAT CAC TTC CCA GAC GCT GAC CTC ATC GAG GCC AAC CTC CTG TGG Gin Asn Asp Phe Pro Asp Ala Asp Leu Ile Glu Ala Asn Leu Leu Trp 5 10 15 CGG CAT GAG ATG GGC CGG GAC ATT ACC CGC GTG GAG TCA GAG AAC AAC Arg His Glu Met Gly Gly Asp Ile Thr Arg Val Glu Ser Glu Asn Lys 20 25 30 GTA GTA ATC CTG CAC TCT TTC GAC CCG CTC CGA GCG GAG GAG GAT GAG Val Val Ile Leu Asp Ser Phe Asp Pro Leu Arg Ala Glu Glu Asp Glu 35 40 45 CGG GAA CTC TCC GTC CCG GCG GAG ATC CTG CGG AAA TCC AAC AAA TTC Arg Glu Val Ser Val Pro Ala Glu Ile Leu Arg Lys Ser Lys Lys Phe 50 55 60 25

AT 400 724 B CCA CCA GCG ATG ccc GCA TGG GCA Pro Pro Ala Mer Pro Ala Trp Ala 65 70 CTG GAG TCC TGG AAG GCC CCG GAC Leu Glu Ser Tr? Lys Ala Pro r.sp 55 TGC CCA CTG CCA CCT ACT AAG ACC Cvs Pro Leu Pro Pro Thr Lys Thr 100 AAG AGG ACA GTT GTT CTG ACA GAA Lys Arg Thr Val Val Leu Thr Glu 115 120 GAG CTT GCC ACA AAG GCT TTT GGT Glu Leu Ala Thr Lys Ala Phe Gly 130 135 ACC GGC ACG GCA ACC GCC CCT CCT Ser Gly Thr Ala Thr Ala Pro Pro 145 150 GCA GGA TCT GAC GTT GAG TCG TAT Ala Gly Ser Asp Val Glu Ser Tyr 165 GAG CCG GGG GAC CCC GAT CTC AGC Glu Pro Gly Asp Pro Asp Leu Ser 180 GAG GAG GCC GGT GAG GAC GTC GTC Glu Glu Ala Gly Glu Asp Val Val 195 200 CGC CCC GAT TAC AAC CCT- CCG CTG Arg Pro AS? Tyr Asn Pro Pro Leu 75 80 TAC GTC CCT CCA GTG G i A CAT GGG Tyr Val Pro Pro Val Val His Gly 90 95 CCT CCT • A Λ 1Λ CCA CCT CCA CGG AGA Pro Pro Ile Pro Pro Pro Arg Arg 105 110 TCC ACC GTG TCT TCT GCC CTG GCG Ser Thr Val Ser Ser Ala Leu Ala 125 AGC TCC GGA CCG TCG GCC GTC GAC Ser Ser Gly Pro Ser Ala Val Asp 140 GAC CAA TCC TCC GAC GAC GGC GGA Asp Gin Ser Ser Asp Asp Gly Gly 155 160 TCC TCC ATG CCC CCC CTT GAG GGG Ser Ser Met Pro Pro Leu Glu Gly 170 175 GAC GGG TCT TGG TCT ACC GTG AGT Asp Gly Ser Trp Ser Thr Val Ser 185 190 TGC TGC TCG ATG TCC TAC ACA TGG Cys Cys Ser Met Ser Tyr Thr Trp 26 205

AT 400 724 B ACA GGC GCT CTG ATC ACG CCA TGC GCT GCG GAG GAA AGC AAG CTG CCC 672 7'nr Gly Als Leu Ile Thr Pro Cys Ala Ala Glu Glu Ser Lys Leu Pro 210 215 220 A7C AAC GCG TTG AGC AAC TCT TTG CTG CGT CAC CAC AAC ATG GTC TAC 720 Ile Asn Al a Leu Ser Asn Ser Leu Leu Arg His His Asn Mer Val Tyr 225 220 235 240 GCT ACC ACA TCC CGC AGC GCA AGC CAG CGG CAG AAG AAG GTC ACC TTT 76S Ala Ihr Thr Ser Arg Ser Ala Ser Glr. Arg Gin Lvs Lys Val Thr Phe 245 250 255 GAC AGA CTG CAA ATC CTG GAC GAT CA C TAC CAG GAC GTG CTC AAG GAG 816 Asp Arg Leu Gin Ile Leu Asp A.sp His Tyr Gin Asp Val Leu Lys Glu 260 265 270 A7G AAG GCG AAG GCG TCC ACA GTT AAG GCT AAG crr CTA TCA GTA GAG 864 Met Lys Ala Lys Ala Ser Thr Val Lys Ala Lys Leu Leu Ser Val Glu 275 2S0 285 GAA GCC TGC AAG CTG ACG CCC CCA CAT TCG GCC AAA TCT AAA TTT GGC 912 Glu Ala Cys Lys Leu Thr Pro Pro His Ser Ala Lys Ser Lys Phe Gly 290 295 200 7AT GGG GCA AAG GAC GTC CGG AAC CTA TCC AGC AAG GCC ATT AAC CAC 960 7yr Gly Ala Lys Asp Val Arg Asn Leu Ser Ser Lys Ala Ile Asn His 305 310 315 320 ATC CGC TCC GTG TGG GAG GAC TTG TTG GAA GAC ACT GAA ACA CCA ATT 1008 Ile Arg Ser Val Trp Glu Asp Leu Leu Glu Asp Thr Glu Thr Pro Ile 325 330 335 GAC ACC ACC ATC ATG GCA AAA AAT GAG GTT TTC TGC GTC CAA CCA GAG 1056 Asp Thr Thr Ile Mer Ala Lys Asn Glu Val Phe Cys Val Gin Pro Glu 340 345 350 27

AT 400 724 B AGA GGA GGC CCC AAG CCA GCT CGC CTT A7C GTG TTC CCA GAC TTG GGG 1104 •“•r5 Gly Gly Arg Lys Pro Ala Arg Leu Ile Val Phe Pro Asp Leu Gly 355 260 365 G7C CGT GTG TGC GAG AAA ATG GCC CTC TAT GAC GTG GTC TCC ACC CTC 1152 Val Arg Val Cys Glu Lvs Mer Ala Leu Tvr Asp Val Val Ser Thr Leu 370 3 75 380 CCT CAG GCT GTG ATC GGC TCC TCG 7»r C-GA TIC CAG TAT TCT CCT GGA 1200 ?ro Gin Ala Val Mer Gly Ser Ser Tvr Clv Phe Gin Tyr Ser Pro Gly 3 S 5 390 355 400 CAG CGG GTC GAG TIC CTG GTG AAC r· rr· TGG AAA TCA AAG AAG ACC CCT 1248 Gin Arg Val Glu P’ne Leu Val Asn Ala Trp Lys Ser Lys Lys Thr Pro 405 410 415 A7G GGC TTT GCA TAT GAC ACC CGC TGT TTT GAC TCA ACA GTC ACT GAG 1256 Mer Gly Phe Ala Tyr Asp Thr Arg Cys ?he Asp Ser Thr Val Thr Glu 420 425 430 AAT GAC ATC CGT GTA GAG GAG TCA ATT TAT CAA TGT TGT GAC TTG GCC 1344 Asn Asp Ile Arg Val Glu Glu Ser Ile Tyr Gin Cys Cys Asp Leu Ala 435 440 445 ccc GAA GCC AGA CAG GCC ATA AGG TCG CTC ACA GAG CGG CTT TAT ATC 1392 Pro Glu Ala Arg Gin Ala Ile Arg Ser Leu Thr Glu Arg Leu Tyr Ile 450 455 460 GGG GGT CCC CTG ACT AAT TCA AAA GGG CAG AAC TGC GGC TAT CGC CGG 1440 eiy Gly Pro Leu Thr Asn Ser Lys Gly Gin Asn Cys Gly Tyr Arg Arg 465 470 475 480 TGC CCC GCG AGC GGC GTG CTG ACG ACT ACC TGC CGT AAT ACC CTC ACA 148S CVS Arg Ala Ser Gly Val Leu Thr Thr Ser Cys Gly Asn Thr Leu Thr iSS 490 495 28

AT 400 724 S 7GT TA C T7G AAG GCC TCT GCA GCC TGT CGA GCT GCA AAG CTC CAG GAC Cys Tyr Leu Lys Ala Ser Ala Ala Cys Arg Ala Ala Lys Leu Gin Asp 500 505 510 7GC ACG ATG CTC G7G TGC GGA GAC GGC CTT GTC GTT ATC TCT GAG AC-C Cys T'nr Mer Leu Val Cys Gly Asp Asp Leu Val Val Ile Cys Glu Ser 515 520 525 GCG GGA ACC CAG GAG GAC GCG GCG AC-C CTA CGA GTC TTC ACG GAG GCT Ala Gly Thr Gin Glu Asp Ala Ala Ser Leu Arg Val Phe Thr Glu Ala 530 535 5LQ A7G ACT AGG TAC TCT GCC CCC CCC GGG GAC CCG CCC CAA CCA GAA TAC Mer T'nr Arg Tyr Ser Ala Pro Pro Gly Asp Pro Pro Gin Pro Glu Tyr 5^5 550 555 560 GAC CTG GAG TTG ATA ACA TCA TGC TCC TCC AAT GTG TCG GTC GCG CA.C Asp Leu Glu Leu Ile Thr Ser Cys Ser Ser A.sn Val Ser Val Ala His 565 570 575 GAT GCA TCT GGC AAA AGG GTA TAC TAC CTC ACC CGT GAC CCG .-.sp Ala Ser Gly Lys Arg Val Tyr Tyr Leu Thr Arg Asp Pro 580 585 590 29

AT 400 724 B SEQ ID Nr. 4 ART DER SEQUENZ: Nucleotid mit entsprechendem Protein SEQUENZLÄNGE: 1035 Basenpaare STRANGFORM: Einzelstrang TOPOLOGIE: linear

ART DES MOLEKÜLS: cDNA zu Genom-RNA URSPRÜNGLICHER HERKUNFTSORGANISMUS: Mensch; für posttrans£usionale non-A, non-B-Hepatitis infektiöses Serum UNMITTELBARE EXPERIMENTELLE HERKUNFT: Klon JG3 aus der cDNA-Bank in lambda gtll MERKMALE: von 1 bis 1035 BP Teil des PT-NANBH-Polyproteins EIGENSCHAFTEN: kodiert wahrscheinlich virale nicht-strukturelle Proteine ACA GAA GTG GAT GGG GTG CGG CTG CAC AGG TAC GCT CCG GCG TGC AAA Thr Glu Val Asp Gly Val Arg Leu His Arg Tyr Ala Pro Ala Cys Lys 5 10 15 CCT CTC CTA CGG GAG GAG GTC ACA TTC CAG GTC GGG CTC AAC CAA TAC Pro Leu Leu Arg Glu Glu Val Thr Phe Gin Val Gly Leu Asn Gin Tyr 20 25 30 CTG GTT GGG TCG CAG CTC CCA TGC GAG CCC GAA CCG GAT GTA GCA GTG Leu Val Gly Ser Gin Leu Pro Cys Glu Pro Glu Pro Asp Val Ala Val 35 40 45 CTC ACT TCC ATG CTC ACC GAC CCC TCC CAC ATC ACA CCA GAG ACG GCT Leu Thr Ser Met Leu Thr Asp Pro Ser His Ile Thr Ala Glu Thr Ala 50 55 60 30

260AT 400 724 B AAG CGC AGC CTG CCC AGG GGG Lys Arg Arg Leu Ala Arg Gly 5 65 70 GCT AGC CAG TTG TCT GGC CCT 10 Ala Ser Gin Leu Ser Gly Pro 85 AAT GAC TTC CCA GAC GCT GAC 15 Asn Asp Phe Pro A.s? Ala Asp 100 20 CAT GAG ATG GGC GGG GAC ATT His Glu Mer Gly Gly Asp Ile 115 25 GTA ATC CTG GAC TCT TTC GAC Val Ile Leu Asp Ser Phe Asp 130 135 30 GAA GTG TCC GTC CCG GCG GAG Glu Val Ser Val Pro Ala Glu 35 165 150 CCA GCG ATG CCC GCA TGG GCA Pro Ala Met Pro Ala Trp Ala 40 165 GAG TCC TGG AAG CCC CCG GAC Glu Ser Trp Lys Ala Pro Asp 45 180 CCA CTG CCA CCT ACT AAG ACC Pro Leu Pro Pro Thr Lys Thr 195 TCT CCC CCC TCC TTG GCC AGC TCT TCA Ser Pro Pro Ser Leu Ala Ser Ser Ser 75 80 TCC TCG AAG GCG ACA TAC ATT ACC CAA Ser Ser Lys Ala Thr Tyr Ile Thr Gin 90 95 CTC ATC GAG GCC AAC CTC CTG TGG CGG Leu Ile Glu Ala Asn Leu Leu Trp Arg 105 110 ACC CGC GTG GAG TCA GAG AAC AAG GTA Thr Arg Val Glu Ser Glu Asn Lys Val 120 125 CCG CTC CGA GCG GAG GAG GAT GAG CGG Pro Leu Arg Ala Glu Glu Asp Glu Arg 140 ATC CTG CGG AAA TCC AAG AAA TTC CCA Ile Leu Arg Lys Ser Lys Lys Phe Pro 155 160 CGC CCG GAT TAC AAC CCT CCG CTG CTG Arg Pro Asp Tyr Asn Pro Pro Leu Leu 170 175 TAC GTC CCT CCA GTG GTA CAT GGG TGC Tyr Val Pro Pro Val Val His Gly Cys 185 190 CCT CCT ATA CCA CCT CCA CGG AGA AAG Pro Pro Ile Pro Pro Pro Arg Arg Lys 200 205 288 336 284 432 480 528 576 31 624 56

AT 400 724 B AGG ACA GTT GTT CTG ACA GAA TCC ACC GTG TCT TCT GCC CTG GCG GAG 672 Arg Ihr Val Val Leu Thr Clu Ser Thr Val Ser Ser Ala Leu Ala Glu 5 210 215 220 CT7 GCC ACA AAG GCT TTT GGT AGC TCC GuA CCG TCG GCC GTC GAC AGC 720 70 Leu Ala Tnr Lys Ala ?he Gly Ser Ser Gly Pro Ser Ala Val Asp Ser 225 220 235 210 GGC ACG GCA ACC GCC CCT CCT GAC CAA TCC TCC GAC GAC GGC GGA GCA 768 75 Giy T- — Ala Thr Ala Pro Pro Asp Clr. Ser Ser Asp Asp Gly Gly Ala 245 250 255 20 GGA TCT GAC GTT GAG TCG TAT TCC TCC AT G CCC CCC CTT GAG GGG GAG 816 Gly Ser Asp Val Glu Ser Tyr Ser Ser Me“ Pro Pro Leu Glu Gly Glu 260 265 270 25 CCG GGG GAC CCC GAT CTC AGC GAC GGG TCT TGG TCT ACC GTG AGT GAG 864 Pro Gly Asp Pro Asp Leu. Ser A.sp Gly Ser Trp Ser Thr Val Ser Glu 275 280 285 30 GAG GCC GGT GAG GAC GTC GTC TGC TGC TCG ATG TCC TAC ACA TGG ACA 912 Glu Ala Gly Glu Asp Val Val Cys Cys Ser Met Ser Tyr Thr Trp Thr 290 295 300 35 GGC GCT CTG ATC ACG CCA TGC GCT GCG GAG GAA AGC AAG CTG CCC ATC 960 Gly Ala Leu Ile Thr Pro Cys Ala Ala Glu Glu Ser Lys Leu Pro Ile 40 305 310 315 320 AAC GCG TTG AGC AAC TCT TTG CTG CGT CAC CAC AAC ATG GTC TAC GCT 1008 Asn Ala Leu Ser Asn Ser Leu Leu Arg His His Asn Met Val Tyr Ala 45 325 330 335 ACC ACA TCC CGC ACC GCA ACC CAC CGG 1035 Thr Thr Ser Arg Ser Ala Ser Gin Arg 340 345 32

AT 400 724 B SEQ ID Nr. 5 ART DER SEQUENZ: Nucleotid mit entsprechendem Protein SEQUENZLÄNGE: 834 Basenpaare STRANGFORM: EinzelStrang TOPOLOGIE: linear

ART DES MOLEKÜLS: cDNA zu Genom-RNA URSPRÜNGLICHER HERKUNFTSORGANISMUS: Mensch; £ür posttransfusionale non-A, non-B-Hepatitis infektiöses Serum UNMITTELBARE EXPERIMENTELLE HERKUNFT: Klon BR11 aus der cDNA-Bank in lamhda gtll MERKMALE: von 1 bis 834 BP Teil des PT-NANBH-Polyproteins EIGENSCHAFTEN: kodiert wahrscheinlich virale Strukturproteine AGA AAA ACC AAA CGT AAC ACC AAC CTC CGC CCA CAG GAC GTC AGG i iC 48 Arg Lys Thr Lys Arg Asn Thr Asn Leu Arg Pro Gin Asp Val Arg Phe 5 10 15 CCG GGC GGT GGT CAG ATC GTT GGT GGA GTT TAC CTG TTG CCG CGC AGG 56 Pro Gly Gly Gly Gin Ile Val Gly Gly Val Tyr Leu Leu Pro Arg Arg 20 25 30 GGC CCC AGG TTG GGT GTG CGC GCG ACT ACG AAG ACT TCC GAG CCG TCG 144 Gly Pro Arg Leu Gly Val Arg Ala Thr Arg Lys Thr Ser Glu Arg Ser 35 40 45 CAA CCT CGT GGA AGG CGA CAA CCT ATC CCC AAG GCT CGC CAG CCC GAG 192 Gin Pro Arg Gly Arg Arg Gin Pro Ile Pro Lys Ala Arg Gin Pro Glu 50 55 60 33

260AT 400 724 B CGC AGG CCC TGG Gly Arg Ala Trp 65 5 GAG GGC ATG GGG Glu Gly Met Gly 10 CCT AGT TGG GGC Pro Ser Tr? Gly 15 100 GTC ATC GAT 20 Lys Val I le Asp 115 CAT TCC GCT CGT 25 Kis Ser Ala Arg 130 30 CAT GGC GTC CGG His Gly Val Arg 165 35 TTA CCC GGT TGC Leu Pro Gly Cys 40 TTC ACC ATT CCA Leu Thr Ile Pro 45 180 TAC CAT GTC ACG Tyr His Val Thr 50 195 GCT CAG CCC GGG TAC CCT Ala Gin Pro Gly Tyr Pro 70 TGG GCA GGA TGG CTC CTG Tr? Ala Gly Trp Leu Leu SO CCC ACT GAC CCC CGG CGT Pro Ihr AS? Pro Arg Arg 105 ACC CTC ACA TGC GGC TTC Thr Leu Thr Cys Gly Phe 120 CGG CGC TCC CTT AGG GGC Arg Arg Ser Leu Arg Gly 135 GTT CTG GAG GAC GGC GTG Val Leu Glu Asp Gly Val 150 TCT TTC TCT ATC TTC CTC Ser Phe Ser Ile Phe Leu 165 170 GCT TCC GCT TAT GAA GTG Ala Ser Ala Tyr Glu Val 185 AAC GAT TGC TCC AAC TCA Asn Asp Cys Ser Asn Ser 200 TGG CCC CTC TAT GGC AAC Trp Pro Leu Tyr Gly Asn 7 5 80 TCA CCC CGT GGC TCC CGG Ser Pro Arg Gly Ser Arg 95 AGG TCG CGT AAT TTG GGT Arg Ser Arg Asn LeU Gly 110 GCC GAC TCT CAT GGG GTA Ala Asp Ser His Gly Val 125 GCT GCC AGG GCC CTG GCG Ala Ala Arg Ala Leu Ala 160 AAC TAT GCA ACA GGG AAT Asn Tyr Ala Thr Gly Asn 155 160 TTG GCT TTG CTG TCC TGT Leu Ala Leu Leu Ser Cys 175 CGC AAC GTG TCC GGG ATC Arg Asn Val Ser Gly Ile 190 AGC ATC GTG TAC GAG ACA Ser Ile Val Tyr Glu Thr 205 288 326 386 632 680 528 576 626 34 55

AT 400 724 B GCG GAC ATG atc ATG CAC ACC CCC GGG TGT GTG CCC TGT GTC CCG GAG 672 Ala Asp Met Ile Mer His Thr Pro Gly Cys Val Pro Cys Val Arg Glu 5 210 215 220 GGT AAT TCC TCC CGC TGC TGG GTA GCG CTC ACT CCC ACG CTC GCG GCC 720 Gly Asn Ser Ser Arg Cys Trp Val Ala Leu Thr Pro Thr Leu Ala Ala 10 223 230 235 240 AAG GAC GCC AGC ATC CCC ACT GCG ACA ATA CGA CGC CAC GTC GAT TTG 76S 75 Lys Asp Ala Ser Ile Pro Thr Ala TVr Ile Arg Arg His Val Asp Leu 245 250 255 CTC GTT GGG GCG GCT GCC TTC TCG TCC GCT ATG TAC GTG GGG GAi CTC 816 20 Leu Val Gly Ala Ala Ala Phe Ser Ser Ala Met Tyr Val Gly Asp Leu 260 265 270 25 TGC GGA TCT GTT TTC CCG 834 Cys Gly Ser Val ?he Pro 275 30 35 40 45 60 35 55

AT 400 724 B SEQ ID Nr. 6 ART DER SEQUENZ: Nucleotid SEQUENZLÄNGE: 31 Basen STRANGFORM: Einzelstrang TOPOLOGIE: linear

ART DES MOLEKÜLS: synthetische DNA URSPRÜNGLICHER HERKUNFTSORGANISMUS: Bakteriophage lambda gtll UNMITTELBARE EXPERIMENTELLE HERKUNFT: Oligonucleotid-Synthesizer; oligo d75 MERKMALE: von 4 bis 9 Basen BamHl Schnittstelle von 10 bis 31 Basen homolog zum stromaufwärts gelegenen Teil des lacZ Gens, der die EcoRl Schnittstelle im Bakteriophagen lambda gtll flankiert von 26 bis 31 Basen EcoRl Schnittstelle EIGENSCHAFTEN: startet DNA-Synthese vom Phagenvektor in cDNA, eingefügt an der EcoRl Schnittstelle, und führt eine BamHl Schnittstelle ein, die geeignet ist zur nachfolgenden Klonierung in Expressionsvektoren 31

TAAGGATCCC CCGTCAGTAT CGGCGGAATT C 36

AT 400 724 B SEQ ID Nr. 7 ART DES SEQUENZ: Nucleotid SEQUENZLÄNGE: 30 Basen STRANGFORM: Einzelstrang TOPOLOGIE: linear

ART DES MOLEKÜLS: synthetische DNA URSPRÜNGLICHER HERKUNFTSORGANISMUS: Bakteriophage lambda gtll UNMITTELBARE EXPERIMENTELLE HERKUNFT: Oligonucleotid-Synthesizer; oligo d76 MERKMALE: von 4 bis 9 Basen BamHl Schnittstelle von 10 bis 30 Basen homolog zum stromabwärts gelegenen Teil des lacZ Gens, der die EcoRl Schnittstelle im Bakteriophagen lambda gtll flankiert EIGENSCHAFTEN: startet DNA-Synthese vom Phagenvektor in cDNA, eingefügt an der EcoRl Schnittstelle, und führt eine BamHl Schnittstelle ein, die geeignet ist zur nachfolgenden Klonierung in Expressionsvektoren 30

TATGGATCCG TAGCGACCGG CGCTCAGCTG 37

AT 400 724 B SEQ ID Nr. 8 ART DER SEQUENZ: Nucleotid SEQUENZLÄNGE: 19 Basen STRANGFORM: Einzelstrang TOPOLOGIE: linear

ART DES MOLEKÜLS: synthetische DNA URSPRÜNGLICHER HERKUNFTSORGANISMUS: Mensch; für posttransfusionale non-A, non-B-Hepatitis infektiöses Serum UNMITTELBARE EXPERIMENTELLE HERKUNFT: Oligonucleotid-Synthesizer; oligo d94 MERKMALE: von 4 bis 19 Basen homolog zu den Basen 914 bis 932 des Sinn-Stranges von JG2 (SEQ ID Nr. 3) EIGENSCHAFTEN: startet DNA-Synthese am Negativ-Strang der PT-NANBH Genom

RNA/DNA ATGGGGCAAA GGACGTCCG 19 38

AT 400 724 B SEQ ID Nr. 9 ART DER SEQUENZ: Nucleotid SEQUENZLÄNGE: 24 Basen STRANGFORM: Einzelstrang TOPOLOGIE: linear

ART DES MOLEKÜLS: synthetische DNA URSPRÜNGLICHER HERKUNFTSORGANISMUS: Mensch; für posttransfusionale non-A, non-B-Hepatitis infektiöses Serum UNMITTELBARE EXPERIMENTELLE HERKUNFT: Oligonucleotid-Synthesizer; oligo d95 MERKMALE: von 1 bis 24 Basen homolog zu den Basen 1620 bis 1643 des Antisinn-Stranges von JG2 (SEQ ID Nr. 3)

EIGENSCHAFTEN: startet DNA-Synthese am Positiv-Strang der PT-NANBH Genom RNA/DNA 24

TACCTAGTCA TAGCCTCCGT GAAG 39

AT 400 724 B SEQ ID Nr. 10 ART DER SEQUENZ: Nucleotid SEQUENZLÄNGE: 17 Basen STRANGFORM: Einzelstrang TOPOLOGIE: linear

ART DES MOLEKÜLS: synthetische DNA URSPRÜNGLICHER HERKUNFTSORGANISMUS: Mensch; für posttransfusionale non-A, non-B-Hepatitis infektiöses Serum

UNMITTELBARE EXPERIMENTELLE HERKUNFT: Oligonucleotid-Synthesizer; oligo NI MERKMALE: von 1 bis 17 Basen homolog zu den Basen 1033 bis 1049 des Sinn-Stranges von JG2 (SEQ ID Nr. 3)

EIGENSCHAFTEN: startet DNA-Synthese am Negativ-Strang der PT-NANBH Genom RNA/DNA GAGGTTTTCT GCGTCCA 17 40

AT 400 724 B SEQ ID Nr. 11 ART DER SEQUENZ: Nucleotid SEQUENZLÄNGE: 17 Basen STRANGFORM: Einzelstrang TOPOLOGIE: linear

ART DES MOLEKÜLS: synthetische DNA URSPRÜNGLICHER HERKUNFTSORGANISMUS: Mensch; für posttransfusionale non-A, non-B-Hepatitis infektiöses Serum UNMITTELBARE EXPERIMENTELLE HERKUNFT: Oligonucleotid-Synthesizer; oligo N2 MERKMALE: von 1 bis 17 Basen homolog zu den Basen 1421 bis 1437 des Antisinn-Stranges von JG2 (SEQ ID Nr. 3)

EIGENSCHAFTEN: startet DNA-Synthese am Positiv-Strang der PT-NANBH Genom RNA/DNA GCGATAGCCG CAGTTCT 17 41

5AT 400 724 B SEQ ID Nr. 12 ART DER SEQUENZ; Nucleotid SEQUENZLÄNGE: 22 Basen STRANGFORM: Einzelstrang TOPOLOGIE: linear

ART DES MOLEKÜLS: synthetische DNA URSPRÜNGLICHER HERKUNFTSORGANISMUS: Mensch; für posttransfusionale non-A, non-B-Hepatitis infektiöses Serum UNMITTELBARE EXPERIMENTELLE HERKUNFT: Oligonucleotid-Synthesizer; oligo MERKMALE: von 1 bis 22 Basen homolog zu den Basen 10 bis 31 der Sequenz in Fig. 2 von Okamoto ££ Al, Japan. J. Ezo. Med., 1990, 167-177, Base 22 geändert von A nach T um Bgl2 Erkennungsstelle einzuführen von 8 bis 13 Basen Bgl2 Erkennungsstelle EIGENSCHAFTEN: startet DNA-Synthese am Negativ-Strang der PT-NANBH Genom RNA/DNA und führt eine Bgl2 Schnittstelle ein 22

CCACCATAGA TCTCTCCCCT GT 35 40 45

SO 55

AT 400 724 B SEQ ID Nr. 13 ART DER SEQUENZ: Nucleotid SEQUENZLÄNGE: 30 Basen STRANGFORM: Einzelstrang TOPOLOGIE: linear

ART DES MOLEKÜLS: synthetische DNA URSPRÜNGLICHER HERKUNFTSORGANISMUS: Mensch; für posttransfusionale non-A, non-B-Hepatitis infektiöses Serum UNMITTELBARE EXPERIMENTELLE HERKUNFT: Oligonucleotid-Synthesizer; oligo dl37 MERKMALE: von 1 bis 30 Basen homolog zu den Basen 154 bis 183 des Negativ-Stranges von BR11 (SEQ ID Nr. 5); Basen 174, 177 und 178 verändert, um eine EcoRl Erkennungsstelle einzuführen von 5 bis 10 Basen EcoRl Erkennungsstelle EIGENSCHAFTEN: startet DNA-Synthese am Positiv-Strang der PT-NANBH Genom RNA/DNA und führt eine EcoRl Schnittstelle zur Klonierung ein 30

GCGAGAATTC GGGATAGGTT GTCGCCTTCC 43

AT 400 724 B SEQ ID Nr. 14 ART DER SEQUENZ: Nucleotid SEQUENZLÄNGE: 27 Basen STRANGFORM: Einzelstrang TOPOLOGIE: linear

ART DES MOLEKÜLS: synthetische DNA URSPRÜNGLICHER HERKUNFTSORGANISMUS: Mensch; für posttransfusionale non-A, non-3-Hepatitis infektiöses Serum UNMITTELBARE EXPERIMENTELLE HERKUNFT: Oligonucleotid-Synthesizer; oligo dl36 MERKMALE: von 1 bis 27 Basen homolog zu den Basen 672 bis 698 des Positiv-Stranges von BR11 (SEQ ID Nr. 5); Base 675 geändert zu G, um eine EcoRl Erkennungsstelle einzuführen von 4 bis 9 Basen EcoRl Erkennungsstelle EIGENSCHAFTEN: startet DNA-Synthese am Negativ-Strang der PT-NANBH Genom RNA/DNA und führt eine EcoRl Schnittstelle zur Klonierung ein 27

GGGGAATTCC TCCCGCTGCT GGGTAGC 44

AT 400 724 B SEQ ID Nr. 15 AST DER SEQUENZ: Nucleotid SEQUENZLÄNGE: 28 Basen STRANGFORM: Einzelstrang TOPOLOGIE: linear

ART DES MOLEKÜLS: synthetische DNA URSPRÜNGLICHER HERKUNFTSORGANISMUS: Schimpanse; für posttransfusionale non-A, non-B-Hepatitis infektiöses Serum

UNMITTELBARE EXPERIMENTELLE HERKUNFT: Oligonucleotid-Synthesizer; oligo dlSS MERKMALE: von 1 bis 26 Basen homolog zu den Basen 462 bis 489 des Negativ-Stranges in Fig. 47, EP-A1-318 216

Basen 483 und 485 geändert, um eine EcoRl Erkennungsstelle einzuführen von 5 bis 10 Basen EcoRl Erkennungsstelle EIGENSCHAFTEN: startet DNA-Synthese am Positiv-Strang der PT-NANBH Genom RNA/DNA und führt eine EcoRl Schnittstelle zur Klonierung ein 28

ACGGGAATTC GACCAGGCAC CTGGGTGT 45

AT 400 724 B SEQ ID Nr. 16 ART DER SEQUENZ: Nucleotid SEQUENZLÄNGE: 23 Basen STRANGFORM: Einzelstrang TOPOLOGIE: linear

ART DES MOLEKÜLS: synthetische DNA URSPRÜNGLICHER HERKUNFTSORGANISMUS: Schimpanse; für posttransfusionale non-A, non-B-Hepatitis infektiöses Serum UNMITTELBARE EXPERIMENTELLE HERKUNFT: Oligonucleotid-Synthesizer; oligo dl56 MERKMALE: von 1 bis 23 Basen homolog zu den Basen 3315 bis 3337 des Positiv-Stranges in Fig. 47, EP —A1—318 216

Base 3323 geändert zu C, um eine EcoRl Erkennungsstelle einzuführen von 4 bis 9 Basen EcoRl Erkennungsstelle EIGENSCHAFTEN: startet DNA-Syntbese am Negativ-Strang der PT-NANBH Genom RNA/DNA und führt eine EcoRl Schnittstelle zur Klonierung ein 23

CTTGAATTCT GGGAGGGCGT CTT 46

AT 400 724 B SEQ ID Nr. 17 ART DER SEQUENZ: Nucleotid SEQUENZLÄNGE: 29 Basen STRANGFORM: Einzelstrang TOPOLOGIE: linear

ART DES MOLEKÜLS: synthetische DNA URSPRÜNGLICHER HERKUNFTSORGANISMUS: Mensch; für posttransfusionale non-A, non-B-Hepatitis infektiöses Serum UNMITTELBARE EXPERIMENTELLE HERKUNFT: Oligonucleotid-Synthesizer; oligo d92 MERKMALE: von 1 bis 29 Basen homolog zu den Basen 36 bis 64 des Negativ-Stranges von JG2 (SEQ ID Nr. 3); Basen 57, 58 und 60 geändert, um eine EcoRl Erkennungsstelle einzuführen von 5 bis 10 Basen EcoRl Erkennungsstelle EIGENSCHAFTEN: startet DNA-Synthese am Positiv-Strang der PT-NANBH Genom RNA/DNA und führt eine EcoRl Schnittstelle zur Klonierung ein 29

CGCCGAATTC ATGCCGCCAC AGGAGGTTG 47 ΑΤ 400 724 Β SEQ ID Nr. 18 ART DER SEQUENZ: Nucleotid mit entsprechendem Protein SEQUENZLÄNGE: 504 Basenpaare STRANGFORM: EinzelStrang TOPOLOGIE: linear

ART DES MOLEKÜLS: cDNA zu Genom-RNA URSPRÜNGLICHER HERKUNFTSORGANISMUS: Mensch; für posttransfusionale non non-B-Hepatitis infektiöses Serum UNMITTELBARE EXPERIMENTELLE HERKUNFT: Klon 164/137 MERKMALE: von 308 bis 504 BP Anfang des PT-NANBH-Polyproteins EIGENSCHAFTEN: kodiert wahrscheinlich virale Strukturproteine

GATCACTCCC CTGTGAGGAA CTACTGTCTT CACGCAGAAA GCGTCTAGCC ATGGCGTTAG TA7GAGTGTC GTGCAGCCTC C-AGGACCCCC CCTCCCGGGA GAGCCATAGT GGTCTGCGGA ACCGGTGAGT ACACCGGAAT TGCCAGGACG ACCGGGTCCT TTCTTGGATT AACCCGCTCA ATGCCTGGAG ATTTGGGCGT GCCCCCGCAA GACTGCTAGC CGAGTAGTGT TGGGTCGCGA AAGGCCTTGT GGTACTGCCT GATAGGGTGC TTGCGAGTGC CCCGGGAGGT CTCGTAGACC GTGCACC ATG AGC ACG AAT CCT AAA CCT CAA AGA AAA ACC AAA CGT AAC Me: Ser Thr Asn Pro Lys Pro Gin Arg Lys Thr Lys Arg Asn 5 10 ACC AAC CGC CGC CCA CAG GAC GTC AAG TTC CCG GGC GGT GGT CAG ATC Thr Asn Pro Arg Pro Gin Asp Val Lys Phe Pro Gly Gly Gly Gin Ile 15 20 25 30 GTT GGT GGA GTT TAC CTG TTG CCG CGC AGG GGC CCC AGG TTG GGT GTG Val Gly Gly Val 7>t Leu Leu Pro Arg Arg Gly Pro Arg Leu Gly Val 40 45 35 60 120 180 240 300 349 397 445 48

5AT 400 724 B 10 CGC GCG ACT AGG AAG ACT Arg Ala Thr ArS Lys Thr 50 CAA CCT ATC CC Gin Pro Ile Pro 63 TCC GAG CGG TCG CAA CCT Ser Glu Arg Ser Gin Pro 55 CGT GGA AGG CGA 453 Arg Gly Arg Arg 60 504 15 20 25 30 35 40 45 50 49 55

AT 400 724 B SEQ ID Nr. 19 ART DER SEQUENZ: Nucleotid mit entsprechendem Protein SEQUENZLÄNGE: 1107 Basenpaare STRANGFORM: Einzelstrang TOPOLOGIE: linear

ART DES MOLEKÜLS: cDNA zu Genom-RNA non-A, URSPRÜNGLICHER HESKUNFTSORGANISMUS: Mensch; für posttransfusionale non-B-Hepatitis infektiöses Serum UNMITTELBARE EXPERIMENTELLE HERKUNFT: Klon 136/155 MERKMALE: von 1 bis 1107 BP Teil des PT-NANBH-Polyproteins EIGENSCHAFTEN: kodiert wahrscheinlich virale Strukturproteine TCC TCC CGC TGC TGG GTA G CG o H o ACT CCC ACC CTC GCG GCC AAG GAC Ser Ser Arg Cys Tr? Val Ala Leu Thr Pro Thr Leu Ala Ala Lys Asp 5 10 15 GCC AGC ATC CCC ACT GCG ACA ATA CGA CGC CAC GTC GAT TTG CTC GTT Ala Ser Ile Pro Ihr Ala Thr Ile Arg Arg His Val Asp Leu Leu Val 20 25 30 GGG GCG GCT GCC TIC TGC TCC GCT ATG TAC GTG GGG GAT CTC TGC GGA Gly Ala Ala Ala Phe Cys Ser Ala Met Tyr Val Gly Asp Leu Cys Gly 35 40 45 TCT GTT ITC CTC CTC TCT CAG CTG TTC ACC TTC TCG CCT CGC CGA CaT Ser Val Phe Leu Val Ser Gin Leu Phe Thr Phe Ser Pro Arg Arg His 50 55 60 96 192 50

AT 400 724 B CAG ACG GTA CAG GAC TGC AAT TGT Gin Thr Val Gin Asp Cys Asn Cys 5 65 70 GGT CA C CGC ATG GCT TGG GAT ATG 10 Gly His Arg Met Ala 85 Trp Asp Met GCC CTA GTG GTA TCG CAG CTA CTC 15 Ala Leu Val Val Ser Glr. Leu Leu 100 ATG GTG GCG GGG GCC CAC TGG GGA 20 Met Val Ala Gly Ala His Trp Gly 115 120 25 TCC ATG GTG GGG AAC TGG GCT AAG Ser Met Val Gly Asn Trp Ala Lys 130 135 30 GCC GGC GTT GAC GGG GAA CCT TAC Ala Gly Val Asp Gly Glu Pro Tyr 145 150 35 GCC GCC CAC GGG CTT ACA TCC CTC Ala Ala His Gly Leu Thr Ser Leu 40 165 ATC CAG CTT GTA AAC ACC AAC GGC 45 Ile Gin Leu Val Asn Thr Asn Gly 180 TTG AAC TGC AAT GAC TCC CTC CAA SO Leu Asn Cys Asn Asp Ser Leu Gin 195 200 TCA ATC i A 1 CCC GGC CAC GTA TCA 240 Ser Ile Tyr Pro Gly His Val Ser 75 80 ATG ATG AAC TGG TCA CCT ACA CCA 288 Met Met Asn Trp Ser Pro Thr Ala 90 95 CGG ATC CCA CAA GCT GTC GTG GAC 336 Ile Pro Gin Ala Val Val Asp 105 110 GTC CTG GCG GGC CTT GCC TAC TAT 284 Val Leu Ala Gly Leu Ala Tyr Tyr 125 GTC TTG GTT GTG ATG CTA CTC TTT 432 Val Leu Val Val Met Leu Leu Phe 140 ACG ACA GGG GGG ACA CAC GGC CGC 480 Thr Thr Gly Gly Thr His Gly Arg 155 160 ITC ACA CCT GGG CCG GCT CAG AAA 528 Phe Thr Pro Gly Pro Ala Gin Lys 170 175 AGC TGG CAC ATC AAC AGA ACT GCC 576 Ser Trp His Ile Asn Arg Thr Ala 185 190 ACT GGG TTC CTT GCC GCG CTG TTC 624 Thr Glv Phe Leu Ala Ala Leu Phe 51 55 205

AT 400 724 B TAC ACG CAC AGG TTC r_A i GCG TCC Tyr Thr His Arg Phe Asn Ala Ser 5 210 215 TGC CGC CCC ATT GAC CAC TTC GAT Cys Arg Pro Ile Asp Gin Phe Asp 10 225 230 AAT GAG TCC CAC GGC TTG GAC CAG IS Asn Glu Ser His Gly Leu -Asp Gin 245 CCT CAA CCG TGT GGT ATC GTG CCC 20 Pro Gin Pro Cys Gly Ile Val Pro 260 25 TAC TGT TTC ACT CCA AGC CCT GTT Tyr Cys Phe Thr Pro Ser Pro Val 275 280 30 GGC GCC CCT ACG TAC AGA TGG GGT Gly Ala Pro Thr Tyr Arg Trp Gly 290 295 35 CTC AAC AAC ACG CCG CCG CCA CGG Leu Asn Asn Thr Arg Pro Pro Arg 40 305 310 ATG AAT AGC ACC GGG TTC ACC AAG Mer Asn Ser Thr Gly Phe Thr Lys 45 325 ATC GGG GGG GTC GGC AAC AAC ACT SO Iie Gly Gly Val Gly Asn Asn Thr 340 GGA TGC TCA GAG CGC ATG GCC AGC 672 Gly Cys Ser Glu Arg Met Ala Ser 220 CAG GGG TGG GGT CCC ATC ACT TAT 720 Gin Gly Trp Gly Pro Ile Thr Tyr 235 240 AGG CCC TAT TGC TGG CAC TAC CCA 76S Arg Pro Tyr Cys Trp His Ala 250 255 GCG TTG CAG GTG TGT GGC CCA GTG 816 Ala Leu Gin Val Cys Gly Pro Val 265 270 GTG GTG GGG ACG ACC Ga i CGT TTC 864 Val Val Gly Thr Thr Asp Arg Phe 285 GAG· AAT GAG ACG GAC GTG CTG CTT 512 Glu Asn Glu Thr Asp Val Leu Leu 300 GGC AAC TGG TTC GGC TGT ACA TGG 960 Gly Asn Trp Phe Gly Cys Thr Trp 315 320 ACG TGT GGG GGC CCC CCG TGC AAC 1008 Thr Cys Gly Gly Pro Pro Cys Asn 330 335 TTG ATC TGC CCC ACG GAC TGC TTC 1056 Leu Ile Cys Pro Thr Asp Cys Phe 345 350 52 55 1104

AT 400 724 B CGG AAG CAT CCC GAG GCC ACT TAC ACC AAA TGC GGT TCG GGG CCT TGG Arg Lys His Pro Glu Ala Thr Tyr Thr Lys Cys Gly Ser Gly Pro Trp 355 260 265

TTG 1107

Leu 53

AT 400 724 B SEQ ID Nr. 20 ART DER SEQUENZ: Nucleotid mit entsprechendem Protein SEQUENZLÄNGE: 2043 Basenpaare STRANGFORM: Einzelstrang TOPOLOGIE: linear

ART DES MOLEKÜLS: cDNA zu Genom-RNA URSPRÜNGLICHER HERKUNFTSORGANISMUS: Mensch; für posttransfusionale non-A, non-B-Hepatitis infektiöses Serum UNMITTELBARE EXPERIMENTELLE HERKUNFT: Klon 155/92 MERKMALE: von 1 bis 2043 BP Teil des PT-NANBH-Polyproteins EIGENSCHAFTEN: kodiert wahrscheinlich virale nicht-strukturelle Proteine TGG GAG GGC GTC TTC ACA GGC CTC ACC CAC GTG GAT GCC CAC TTC CTG Trp Glu Gly Val Phe Thr Gly Leu Thr His Val Asp Ala His Phe Leu 5 10 15 TCC CAA ACA AAG CAG GCA GGA GAC AAC TTC CCC TAC CTG GTG GCG TAC Ser Gin Thr Lys Gin Ala Gly Asp Asn Phe Pro Tyr Leu Val Ala Tyr 20 25 30 CAG GCT ACT GTC TGC GCT AGG GCC CAG GCC CCA CCT CCA TCA TGG GAT Gin Ala Thr Val Cys Ala Arg Ala Gin Ala Pro Pro Pro Ser Trp Asp 35 40 45 CAA ATG TGG AAG TGT CTC ATA CGG CTA AAG CCT ACT CTG CGC GGG CCA Gin Met Trp Lys Cys Leu Ile Arg Leu Lys Pro Thr Leu Arg Gly Pro 50 55 60 48 96 144 1S2 54

AT 400 724 B ACA CCC TTG CTG TAT AGG CTG GGA GCC GTC CAA AAC GAG GTC ACC CTC 240 Thr Pro Leu Leu Tyr Arg Leu Gly • ^ . Val Gin Asn Glu Val Thr Leu 65 — r\ / U 73 SO ACA CAC CCC ATA ACC AAA TTC ATC ATG GCA TGC ATG TCA GCC GAC CTG 288 Thr His Pro Ile Thr Lys Phe Ile Mer Ala Cys Met Ser Ala Asp Leu S5 90 95 GAG GTC GTC ACG AGC ACC TGG GTG CTG GTG GGC GGG GTC CTT GCA GCT 336 Glu Val Val Thr Ser Thr Tr? Val Leu Val Gly Gly Val Leu Ala Ala 100 105 110 CTG GCT GCG TAT TC-C TTG ACA ACA C-GC AGC GTG GTC ATT GTG GGT AGG 384 Leu Ala Ala Tyr Cys Leu Thr Thr Gly S s r Val Val Ile Val Gly Arg 115 120 125 ATC ATC TTG TCC GGG CGG CCG GCT ATT GTT CCC GAC AGG GAA GTC CTC 432 Ile Ile Leu Ser Gly Arg Pro Ala Ile Val Pro Asp Arg Glu Val Leu 130 135 140 TAC CAG GAG TTC GAT GAG ATG GAA GAG TGC GCG TCG CAC CTC CCT TAC 4S0 Tyr Gin Glu Phe Asp Glu Mer Glu Glu Cys Ala Ser His Leu Pro Tyr 145 150 155 160 ATC GAG CAG GGA ATG CAG CTC GCC GAG CAG TTC AAG CAA AAA GCG CTC 528 Ile Glu Gin Gly Met Gin Leu .Ala Glu Gin Phe Lys Gin Lys Ala Leu 165 170 175 GGG TTG CTG CAG ACA GCC ACC AAG CAA CCG GAG GCC GCT GCT CCC CTG 576 Gly Leu Leu Gin Thr Ala Thr Lys Gin Ala Glu Ala Ala Ala Pro Val 180 185 190 GTG GAG TCC AAG TGG CGA GCC CTT GAG ACC TTC TCG GCG AAA CAC ATC 624 Val Glu Ser Lys Trp Arg Ala Leu Glu Thr Phe Trp Ala Lys His Met 195 200 205 55

AT 400 724 B TCC AAC TTC ATC AGC GGG ATA CAG TAC TTA GCA GGC TTG TCC ACT CTG 672 Trp Asn Phe Ile Ser Gly Ile Gin Tyr Leu Ala Gly Leu Ser Thr Leu 5 210 215 220 CCT GGG AAT CCC GCG ATT GCA TCA CTG ATG GCG TTC ACA GCC TCT GTC 720 Pro Gly Asn Pro Ala Ile Ala Ser Leu Mec Ala Phe Thr Ala Ser Val 10 225 230 235 240 ACT AGC CCG CTC ACC ACC CAA TCT ACC CTC CTG CTT AAC ATC CTC GGG 763 Thr Ser Pro Leu Thr Thr Gin Ser Thr Leu Leu Leu Asn Ile Leu Gly 15 245 250 255 GGA TGG GTA GCC GCC CAA CTC GCT CCC CCC AGT GCT GCT TCA GCT TTC 816 20 Gly Trp Val Ala Ala Gin Leu Ala Pro Pro Ser Ala Ala Ser Ala Phe 260 265 270 25 GTA GGC GCC GGC ATT GCT GGT GCG GCT GTT GGC AGC ATA GGC CTT GGG 664 Val Gly Ala Gly Ile Ala Gly Ala Ala Val Gly Ser Ile Gly Leu Gly 275 2S0 285 30 AAG GTG CTT GTG GAC ATC TTG GCG GGC TAT GGA GCA GGA GTG GCA GGC 912 Lys Val Leu Val Asp Ile Leu Ala Gly Tyr Gly Ala Gly Val Ala Gly 290 295 300 35 GCG CTC GTG GCC TTT AAG GTC ATG AGC GGC GAA ATG CCC TCC ACC GAG 960 Ala Leu Val Ala Phe Lys Val Met Ser Gly Glu Met Pro Ser Thr Glu 305 310 315 320 40 GAC CTG GTT AAC TTA CTC CCT GCC ATC CTC TCT CCT GGT GCC CTG GTC 1008 Asp Leu Val Asn Leu Leu Pro Ala Ile Leu Ser Pro Gly Ala Leu Val 45 325 330 335 GTC GGG GTC GTG TGC GCA GCG ATA CTG CGT CGG CAC GTG GGT CCA GGG 1056 Val Gly Val Val Cys Ala Ala Ile Leu Arg Arg His Val Gly Pro Gly 50 340 345 350 56 55

AT 400 724 B GAG GGG GCT G7G CAG Glu Gly Ala Val Gin 5 355 GGT AAC CAT GTT TCC Gly Asn His Val Ser 70 370 GCA CC7 GTC ACT CAG 75 Als Arg Val Thr Gin 285 AAG AGG CTC CAC CAG 20 Lys Arg Leu His Gin 405 25 GGC TCG 7GG CTA AGG Gly Ser Trp Leu Arg 420 30 GAC ITC AAG ACC TGG Asp Phe Lys Thr Trp 435 35 GTC ccc TTT TTC tca Val Pro P'ne Phe Ser 40 450 GAC GGC ATC ATG CAG Asp Gly Ile Mec Gin 45 465 CAT GTC AAA AAC GCT 50 His Val Lys Asn Gly 485 TGG Ai G AAC CGG CTG ATA Trp Mer A.sn Arg Leu Ile 260 CCC acg CAC T;T GIG CCA Pro Thr His Tyr Val Pro 375 ATC CTC TCC GAC CTT ACT Ile Leu Ser Asp Leu Thr 390 395 TGG ATT AAC GAG GAC TGC Trp Ile A.sn Glu .Asp Cys 410 GAT GTT TGG GAC TGG ATA Asp Val Trp Asp Trp Ile 425 CTC CAG TCC AAG CTC CTG Leu Gin Ser Lys Leu Leu 440 TGC CAA CGT GGG TAC AAG Cys Gin Arg Gly Tyr Lys 455 ACC ACC TGC TCA TGT GGA Thr Thr Cys Ser Cys Gly 470 475 TCC ATG AGG ATC GTT GGG Ser Met Arg Ile Val Gly 490 GCG TTC GCC TCG CGG 1104 Ala Phe Ala Ser Arg 365 GAG AGC GAC GCC GCA 1152 Glu Ser Asp Ala Ala 380 ATC ACC CAA CTG TTG 1200 Ile Thr Gin Leu Leu 400 TCC ACG CCC TGC TCC 1248 Ser Thr Pro Cys Ser 415 TGC ACA GTT TTG GCT 1296 Cys Thr Val Leu Ala 430 CCG CGA TTA CCG GGA 1344 Pro Arg Leu Pro Gly 445 GGG GTC TGG CGG GGA 1392 Gly Val Trp Arg Gly 460 GCA CAG ATC ACC GGA 1440 Ala Gin Ile Thr Gly 480 CCT AAG ACC TGT AGT 1488 Pro Lys Thr Cys Ser 495 57 55

AT 400 724 B AAC ATG TGG CAT GGA ACA TTC CCC ATC AAC GCA TAC ACC ACG GGC CCC Asn Mec Trp His Gly Thr Phe Pro Ile Asn Ala Tyr Thr Thr Gly Pro 500 505 510 7CC ACG CCC TCC CCA CCG CCA AAC TAT TCC AGG GCG CTG TGG CGG GTG Cys Thr Pro Ser Pro Ala Pro Asn Tyr Ser Arg Ala Leu Trp Arg Val 515 520 525 GCT GCT GAG GAG TAC GTG GAG GTT ACG CGG GTG GGG GAT TTC CAC TAC Ala Ala Glu Glu Tyr Val Glu Val Thr Arg Val Gly Asp Phe His Tyr 530 535 540 GIG ACG AGC ATG ACC ACT GAC AAC GTA AAA TGC CCG TGC CAG GTT CCA Val Thr Ser Mer TV. Thr Asp Asn Val Lys Cys Pro Cys Gin Val Pro 545 550 555 560 GCC ccc GAA TTC TTC ACA GAA GTG GAT GGG GTG CGG CTG CAC AGG TAC Ala Pro Glu Phe Phe Thr Glu Val Asp Gly Val Arg Leu His Arg Tyr 565 570 575 GCT CCG CCC TGC AAA CCT CTC CTA CGG GAG GAG GTC ACA TTC CAG GTC Ala Pro Ala Cys Lys Pro Leu Leu Arg Glu Glu Val Thr Phe Gin Val 580 585 590 GGG CTC AAC CAA TAC CTG GTT GGG TCG CAG CTC CCA TGC GAG CCC GAA Gly Leu Asn Gin Tyr Leu Val Gly Ser Gin Leu Pro Cys Glu Pro Glu 595 600 605 CCG GAT GTA GCA GTG CTC ACT TCC ATG CTC ACC GAC CCC TCC CAC ATC Pro Asp Val Ala Val Leu Thr Ser Mer Leu Thr Asp Pro Ser His Ile 610 615 620 ACA GCA GAG ACG GCT AAG CGC AGG CTG GCC AGG GGG TCT CCC CCC TCC Thr Ala Glu Thr Ala Lys Arg Arg Leu Ala Arg Gly Ser Pro Pro Ser 625 630 635 640 58

AT 400 724 B TTG GCC AGC TCT TCA GCT AGC CAG TTG TCT GCG CCT TCC TCG AAG Leu Ala Ser Ser Ser Ala Ser Gin Leu Ser Ala Pro Ser Ser Lys 6ώ5 650 655 ACA TAC ATT ACC CAA aat GAC TTC CCA GAC GCT GAC CTC ATC GAG Thr Tyr Ile Thr Gin Asn As? ?he Pro As? Ala As? Leu Ile Glu 660 665 670 AAC CTC CTG TGG CGG CAT GAG ATG GC-C Asn Leu Leu Tr? Arg His Glu Met Cly 675 6S0 59

AT 400 724 B SEQ ID Nr. 21 ART DES SEQUENZ: Nucleotid mit entsprechendem Protein SEQUENZLANGE: 2116 Basenpaare STRANGFORM: Einzelstrang TOPOLOGIE: linear

ART DES MOLEKÜLS: cDNA zu Genom-RNA URSPRÜNGLICHER HERKUNFTSORGANISMUS: Mensch; für posttransfusionale non-A, non-B-Hepatitis infektiöses Serum UNMITTELBARE EXPERIMENTELLE HERKUNFT: Contig gebildet von cDNA Klone vom 5' Ende des Genoms MERKMALE: von 308 bis 2116 BP Anfang des PT-NANBH-Polyproteins EIGENSCHAFTEN: virale Struktur und nicht-strukturelle Proteine GATCACTCCC ctgtgaggaa ctactgtctt CACGCAGAAA GCGTCTAGCC ATGGCGTTAG 60 TATGAGTGTC GTGCAGCCTC CAGGACCCCC CCTCCCGCGA GäGCCATAGT GGTCTGCGGA 120 ACCGGTGAGT ACACCGGAAT TGCCAGGACG ACCGGGTCCT TTCTTGGATT AACCCGCTCA 180 ATGCCTGGAG ATTTGGGCGT GCCCCCGCAA GACTGCTAGC CGAGTAGTGT TGGGTCGCGA 240

AAGGCCTTGT GGTACTGCCT GATAGGGTGC TTGCGAGTGC CCCGGGAGGT CTCGTAGACC 3CO GTGCACC ATG AGC ACG AAT CCT AAA CCT CAA AGA AAA ACC AAA CGT AAC Met Ser Thr Asn Pro Lys Pro Gin Arg Lys Thr Lys Arg Asn 5 10 ACC AAC CGC CGC CCA CAG GAC GTC AAG TTC CCG GGC GGT GGT CAG ATC Thr Asn Pro Arg Pro Gin Asp Val Lys Phe Pro Gly Gly Gly Gin Ile 15 20 25 30 GTT GGT GGA GTT TAC CTG TTG CCG CGC ACG CGC CCC ACG TTG GGT GTG Val Gly Gly Val Tyr Leu Leu Pro Arg Arg Gly Pro Arg Leu Gly Val 35 40 45 349 397 60 *45

AT 400 724 B

CCC CCG ACT AGG AAG Arg Ala Thr Arg Lys 5 50 CAA CCT ATC CCC AAG Gin Pro Ile Pro Lys 10 65 CCC GGG TAC CCT TGG 15 Pro Gly Tyr Pro Trp 80 GGA TGG CTC CTG TCA 20 Gly Tr? Leu Leu Ser 100 25 GAC CCC CGG CGT AGG Asp Pro Arg Arg Arg 120 30 ACA TGC GGC TTC GCC Thr Cys Gly Phe Ala 135 35 CCC TTA GGG GGC GCT Pro Leu Gly Gly Ala 40 150 GAG GAC GGC GTG AAC Glu Asp Gly Val Asn 45 165 TCT ATC TTC CTC TTG 50 Ser Ile Phe Leu Leu ISO ACT ICC GAC CGG TCG CAA Thr Ser Glu Arg Ser Gin 55 GCT CGC CAG CCC GAG GGC Ala Arg Gin Pro Glu Gly 70 CCC CTC TAT GGC AAC GAG Pro Leu Tyr Gly A. s π Glu 85 CCC CGT GGC TCC CGG CCT Pro Arg Gly Ser Arg Pro 105 110 TCG CGT AAT TTG GGT AAA Ser Arg Asn Leu Gly Lys 125 GAC CTC ATG GGG TAC ATT Asp Leu Mer Gly Tyr Ile 140 GCC AGG GCC CTG GCG CAT Ala Arg Ala Leu Ala His 155 TAT GCA ACA GGG AAT TTA Tyr Ala Thr Gly Asn Leu 170 GCT TTC CTG TCC TGT TTG Ala Leu Leu Ser Cys Leu 185 190 CCT CGT GGA AGG CCA 493 Pro Arg Gly Arg Arg 60 AGG GCC TGG GCT CAG 541 Arg Ala Trp Ala Gin 75 GGC 4 7Λ AlU GGG TCG GCA 5S9 Gly Mer Gly Tr? Ala 90 AGT TGG GGC CCC ACT 637 Ser Trp Gly Pro Thr 115 GTC ATC GAT ACC CTC 685 Val Ile Asp Thr Leu 130 CCG CTC GTC GGC GCT 733 Pro Leu Val Gly Ala 145 GGC GTC CGG GTT CTG 781 Gly Val Arg Val Leu 160 CCC GGT TGC TCT TTC 829 Pro Gly Cys Ser Phe 175 ACC ATT CCA GCT TCC 877 Thr Ile Pro Ala Ser 195 61 55

AT 400 724 B GCT TAT C-AA GTG CGC AAC GTG TCC GGG ATC TAC CAT GTC ACG AAC GAT Ala Tyr Glu Val Arg Asn Val Ser Gly Ile Tyr His Val Thr Asn Asp 200 205 210 TGC TCC AAC TCA AGC ATC GTG TAC GAG ACA GCG GAC ATG ATC ATG CAC Cys Ser Asn Ser Ser Ile Val Tyr Glu Thr Ala Asp Met Ile Mec His 215 220 225 ACC CCC GGG TGT GTG CCC TGT GTC CGG GAG GCT AAT TCC TCC CGC TGC T« V Pro Gly Cys Val Pro Cys Val Arg Glu Gly Asn Ser Ser Arg Cys 230 235 240 TGG G lA GCG CTC ACT CCC ACG CTC GCG GCC AAG GAC GCC AGC ATC CCC Trp Val Ala Leu Ihr Pro Thr Leu Ala Ala Lys Asp Ala Ser Ile Pro 245 250 255 ACT GCG ACA ATA CGA CGC CAC GTC GAT TTG CTC GTT GGG GCG GCT GCC Thr Ala Thr Ile Arg Arg His Val Asp Leu Leu Val Gly Ala Ala Ala 260 265 270 275 ITC TGC TCC GCT ATG TAC GTG GGG GAT CTC TGC GGA TCT GTT TTC CTC ?he Cys Ser Ala Mer Tyr Val Gly Asp Leu Cys Gly Ser Val Phe Leu 280 285 290 GTC TCT CAG CTG TTC ACC TTC TCG CCT CGC CGA CAT CAG ACG GTA CAG Val Ser Gin Leu Phe Thr Phe Ser Pro Arg Arg His Gin Thr Val Gin 295 300 305 GAC TGC AAT TGT TCA ATC TAT CCC GGC CAC GTA TCA GGT CAC CGC ATG Asp Cys Asn Cys Ser Ile Tyr Pro Gly His Val Ser Gly His Arg Met 310 315 320 GCT TGG GA i ATG ATG ATG AAC TGG TCA CCT ACA GCA GCC CTA GTG GTA Ala Trp Asp Met Mer Mer Asn Trp Ser Pro Thr Ala Ala Leu Val Val 325 330 335 62

AT 400 724 B GTC GTG GAC A i G GTG GCG GGG 1357 Val Val Asp Mer Val Ala Gly 250 355 GCC TAC TAT TCC ATG GTG GGG 1405 Al a Tyr Tyr Ser Mer Val Gly 265 37C CTA CTC TTT GCC GGC GTT GAC 1453 Leu Leu Phe Als Gly Val AS? 335 CAC GGC CGC GCC GCC CAC GGG 1501 His Gly Arg Ala Ala His Gly 400 GCT CAG AAA ATC CAG CTT CTA 1549 Ala Gin Lys Ile Gin Leu Val 415 AGA ACT GCC TTG AAC TGC AAT 1597 Arg Thr Ala Leu Asn Cys Asn 430 435 GCG CTG TTC TAC ACG CAC AGG 1645 Ala Leu Phe Tyr Thr His Arg 445 450 ATG GCC AGC TGC CGC CCC ATT 1693 Met Ala Ser Cys Arg Pro Ile 465 ATC ACT TAT AAT GAG TCC CAC 1741 Ile Thr Tyr Asn Glu Ser His TCG CAG CTA CTC CCG ATC CCA CAA GCT Ser Gin Leu Leu Arg Ile Pro Gin Ala 5 340 24 5 GCC CAC TGG GGA GTC CTG GCG GGC CTT 10 Ala Kis Trp Gly Val 260 Leu Ala Gly Leu AAC TGG GCT AAG GTC TTG GTT GTG ATG 15 Asn Trp Ala Lys V e 1 Leu Val Val Mer 375 380 20 GGG GAA CCT TAC ACG ACA GGG GGG ACA Gly Glu Pro Tyr T->~ Ihr Gly Gly Thr 390 395 25 CTT ACA TCC CTC TTC ACA CCT GGG CCG Leu Thr Ser Leu Phe Thr Pro Gly Pro 405 410 30 AAC ACC AAC GGC AGC TGG CAC ATC AAC Asn Tnr Asn Gly Ser Trp His Ile Asn 420 425 35 GAC TCC CTC CAA ACT GGG TTC CTT GCC Asp Ser Leu Gin Thr Gly Phe Leu Ala 40 440 TTC AAT CCG TCC GGA TGC TCA GAG CGC Phe Asn Ala Ser Gly Cys Ser Glu Arg 45 455 460 GAC CAG TTC GAT CAG GGG TGG GGT CCC 50 Asp Gin Phe Asp Gin Gly Trp Gly Pro 470 475 63 480 55

AT 400 724 B GGC TTG GAC CAG AGG CCC TAT TGC TGG CAC TAC GCA CCT CAA CCG TGT 1789 Gly Leu Asp Gin Arg Pro Tyr Cys Trp His Tyr Ala Pro Gin Pro Cys 5 4S5 450 495 GGT ATC GTG ccc GCG TTG CAG GTG TGT GGC CCA GTG TAC TGT TTC ACT 1837 10 Gly Ile Val Pro Ala Leu Gin Val Cys Gly Pro Val Tyr Cys Phe Thr 500 505 510 515 CCA AGC CCT GTT GTG GTG GGG ACG ACC GAT CGT TTC GGC GCC CCT ACG 1885 IS Pro Ser Pro Val Val Val Gly Thr Thr Asp Arg Phe Gly Ala Pro Thr 520 525 530 20 TAC AGA TGG GGT GAG AAT GAG ACG GAC GTG CTG CTT CTC AAC AAC ACG 1933 Tyr Arg Trp Gly Glu Asn Glu Thr Asp Val Leu Leu Leu Asn Asn Thr 535 540 545 25 CGG CCG CCA CGG GGC AAC TGG TTC GGC TGT ACA TGG ATG AAT AGC ACC 1981 Arg Pro Pro Arg Gly Asn Trp Phe Gly Cys Thr Trp Met Asn Ser Thr 30 550 555 560 GGG ITC ACC AAG ACG TGT GGG GGC CCC CCG TGC AAC ATC GGG GGG GTC 2029 Gly Phe Thr Lys Thr Cys Gly Gly Pro Pro Cys Asn Ile Gly Gly Val 35 565 570 575 GGC AAC AAC ACT TTG ATC TGC CCC ACG GAC TGC TTC CGG AAG CAT CCC 2077 40 Gly Asn Asn Thr Leu Ile Cys Pro Thr Asp Cys Phe Arg Lys His Pro 580 585 590 595 45 GAG GCC ACT TAC ACC AAA TGC GGT TCG GGG CCT TGG TTG 2116 Glu Ala Thr Tyr Thr Lys Cys Gly Ser Gly Pro Trp Leu 600 605 50 64 55

AT 400 724 B SEQ ID Nr. 22 ART DER SEQUENZ: Nucleotid mit entsprechendem Protein SEQUENZLÄNGE: 3750 Basenpaare STRANGFORM: Einzelstrang TOPOLOGIE: linear

ART DES MOLEKÜLS: cDNA zu Genom-RNA URSPRÜNGLICHER HERKUNFTSORGANISMUS: Mensch; für posttransfusionale non-A, non-B-Hepatitis infektiöses Serum UNMITTELBARE EXPERIMENTELLE HERKUNFT: Contig gebildet von cDNA Klonen vom 3' Ende des Genoms MERKMALE: von 1 bis 3750 BP Teil des PT-NANBH-Polyproteins EIGENSCHAFTEN: virale nicht-strukturelle Proteine TGG GAG GGC GTC ITC ACA GGC CTC ACC CAC GTG GAT GCC CAC ITC CTG Trp Glu Gly Val Phe Thr Gly Leu Thr His Val Asp Ala His Phe Leu 5 10 15 ICC CAA ACA AAG CAG GCA GGA GAC AAC TTC CCC TAC CTG GTG GCG TAC Ser Gin Tnr Lys Gin Ala Gly Asp Asn Phe Pro Tyr Leu Val Ala Tyr 20 25 30 CAG GCT ACT GTG TGC GCT AGG GCC CAG GCC CCA CCT CCA TCA TGG GAT Gin Ala Thr Val Cys Ala Arg Ala Gin Ala Pro Pro Pro Ser Trp Asp 35 40 45 CAA ATG TGG AAG TGT CTC ATA CGG CTA AAG CCT ACT CTG CGC GGG CCA Gin Met Trp Lys Cys Leu Ile Ar8 Leu Lys Pro Thr Leu Arg Gly Pro 50 55 60 48 96 144 192 65

AT 400 724 B ACA CCC TTG CTG TAT AGG CTG GGA Thr Pro Leu Leu Tyr Arg Leu Gly 5 65 70 ACA CAC CCC ATA ACC AAA TTC ATC Thr His Pro Ile Tnr Lys ?he Ile 10 85 GAG GTC GTC ACG AGC ACC TGG GTG 15 Glu Val Val Thr Ser Thr Trp Val 100 CTG GCT GCG TAT TGC TTG ACA ACA 20 Leu Ala Ala Tyr Cys Leu Thr Thr 115 120 25 ATC ATC TTG TCC GGG CGG CCG GCT Ile Ile Leu Ser Gly Arg Pro Ala 130 135 30 TAC CAG GAG ITC GAT GAG ATG GAA Tyr Gin Glu ?he Asp Glu Mec Glu 145 150 35 ATC GAG CAG GGA ATG CAG CTC GCC Ile Glu Gin Gly Met Gin Leu Ala 40 165 GGG TTG CTG CAG ACA GCC ACC AAG Gly Leu Leu Gin Thr Ala Thr Lys 45 180 CTG GAG TCC AAG TGG CGA GCC CTT 50 Val Glu Ser Lys Trp Arg Ala Leu 195 200 GCC GTC CAA AAC GAG GTC ACC CTC 240 Ala Val Gin Asn Glu Val Thr Leu 75 80 ATG GCA TGC ATG TCA GCC GAC CTG 28S Mec Ala Cys Met Ser Ala Asp Leu 90 55 CTG GTG GGC GGG GTC CTT GCA GCT 336 Leu Val Gly Gly Val Leu Ala Ala 1C5 110 GGC AGC GTG GTC ATT GTG GGT AGG 384 Gly Ser Val Val Ile Val Gly Arg 125 ATT GTT CCC GAC AGG GAA GTC CTC 432 Ile Val Pro Asp Arg Glu Val Leu 140 GAG TGC GCG TCG CAC CTC CCT TAC 4S0 Glu Cys Ala Ser His Leu Pro Tyr 155 160 GAG CAG TTC AAG CAA AAA GCG CTC 528 Glu Gin Phe Lys Gin Lys Ala Leu 170 175 CAA GCC GAG GCC GCT GCT CCC GTG 576 Gin Ala Glu Ala Ala Ala Pro Val 185 190 GAG ACC TTC TGG GCG AAA CAC AiG 624 Glu Thr Phe Trp Ala Lys His Met 66 205 55

AT 400 724 B TGG AAC TTC ATC AGC GGG ATA CAG Trp Asn Phe Ile Ser Gly Ile Gin 210 215 CCT GGG AAT ccc GCG ATT GCA TCA Pro Gly Asn Pro Ala Ile Ala Ser 225 230 ACT AGC CCG CTC ACC ACC CAA TCT Ihr Ser Pro Leu Thr Ihr Gin Ser 245 GGA TGG GTA GCC GCC CAA CTC GCT Gly Trp Val Ala Ala Gin Leu Ala 260 GTA GGC GCC GGC ATT GCT GGT GCG Val Gly Ala Gly Ile Ala Gly Ala 275 280 AAG GTG CTT GTG GAC ATC TTG GCG Lys Val Leu Val Asp Ile Leu Ala 290 295 CCG CTC GTG GCC TTT AAG GTC ATG Ala Leu Val Ala Phe Lys Val Hec 305 310 GAC CTG GTT AAC TTA CTC CCT GCC ASp Leu Val Asn Leu Leu Pro Ala 325 GTC GGG GTC GTG TGC GCA GCG ATA Val Gly Val Val Cys Ala Ala Ile 340 TAC TTA GCA GGC TTG TCC ACT CTG Tyr Leu Ala Gly Leu Ser Thr Leu 220 CTG ATG GCG TTC ACA GCC TCT GTC Leu Met Ala Phe Thr Ala Ser Val 235 240 ACC CTC CTG CTT AAC ATC CTG GGG Thr Leu Leu Leu Asn Ile Leu Gly 250 255 CCC CCC AGT GCT GCT TCA GCT TTC Pro Pro Ser Ala Ala Ser Ala Phe 265 270 GCT GTT GGC AGC ATA GGC CTT GGG Ala Val Gly Ser Ile Gly Leu Gly 285 GGC TAT GGA GCA GGA GTG GCA GGC Gly Tyr Gly Ala Gly Val Ala Gly 300 AGC GGC GAA ATG CCC TCC ACC GAG Ser Gly Glu Mec Pro Ser Thr Glu 315 320 ATC CTC TCT CCT GGT GCC CTG GTC Ile Leu Ser Pro Gly Ala Leu Val 330 335 CTG CGT CGG CAC GTG GGT CCA GGG Leu Arg Arg His Val Gly Pro Gly 345 350 67

AT 400 724 B GAG GGG GCT GTG CAG TGG ATG AAC CGG CTG ATA GCG TTC CCC TCG CGG 1104 Glu Gly Ala Val Gin Trp Met Asn Arg Leu Ile Ala Phe Ala Ser Arg 5 355 360 365 CCT AAC CAT GTT TCC CCC ACG CAC TAT GTG CCA GAG AGC GAC GCC GCA 1152 Gly Asn His Val Ser Pro Thr His Tyr Val Pro Glu Ser Asp Ala Ala 70 370 375 3S0 GCA CGT GTC ACT CAG ATC CTC TCC GAC CTT ACT ATC ACC CAA CTG TTG 1200 75 Aid Arg Val Ihr Gin Ile Leu Ser Asp Leu Thr Ile Thr Gin Leu Leu 385 390 395 400 20 AAG AGG CTC CAC CAG TGG ATT AAC GAG GAC TGC TCC ACG CCC TGC TCC 1248 Lys Arg Leu His Gin Trp Ile Asn Glu Asp Cys Ser Thr Pro Cys Ser 405 410 415 25 GGC TCG TGG CTA AGG GAT GTT TGG GAC TGG ATA TGC ACA GTT TTC GCT 1296 Gly Ser Trp Leu Arg Asp Val Trp Asp Trp Ile Cys Thr Val Leu Ala 420 425 430 30 GAC ITC AAG ACC TGG CTC CAG TCC AAG CTC CTG CCG CGA TTA CCG GGA 1344 Asp Phe Lys Thr Trp Leu Gin Ser Lys Leu Leu Pro Arg Leu Pro Gly 435 440 445 35 GTC CCC TTT TTC TCA TGC CAA CGT GGG TAC AAG GGG GTC TGG CGG GGA 1392 Val Pro Phe Phe Ser Cys Gin Arg Gly Tyr Lys Gly Val Trp Arg Gly 40 450 455 460 GAC GGC ATC ATG CAG ACC ACC TGC TCA TGT GGA GCA CAG ATC ACC GGA 1440 Asp Gly Ile Met Gin Thr Thr Cys Ser Cys Gly Ala Gin Ile Thr Gly 45 465 470 475 480 CAT GTC AAA AAC CGT TCC ATG ACG ATC GTT GGG CCT AAG ACC TGT AGT 1488 50 His Val Lys Asn Gly Ser Met Arg Ile Val Gly Pro Lys Thr Cys Ser 485 490 495 68 55

AT 400 724 B AAC ATG TGG CAT GGA ACA TTC CCC ATC AAC GCA TAC ACC ACG GGC CCC Asn Me“ Trp His Gly Thr Phe Pro Ile Asn Al a Tyr Thr Thr Gly Pro 500 505 510 TGC ACG CCC TCC CCA GCG CCA AAC TAT TCC AGG GCG CTG TGG CGG GTG Cys Thr Pro Ser Pro Ala Pro Asn Tyr Ser Arg Ala Leu Trp Arg Val 515 320 525 GCT GCT GAG GAG TAC GTG GAG GTT ACG CGG GTG GGG GAT TTC CAC TAC Ala Ala Glu Glu Tyr Val Glu Val Thr Arg Val Gly Asp Phe His Tyr 530 535 540 GTG ACG AGC ATG ACC ACT GAC AAC GTA AAA TGC CCG TGC CAG GTT CCA Val Thr Ser Met Thr Thr Asp Asn Val Lys Cys Pro Cys Gin Val Pro 545 550 535 560 GCC ccc GAA TTC TTC ACA GAA GTG GAT GGG GTG CGG CTG CAC AGG TAC Ala Pro Glu Phe Phe Thr Glu Val Asp Gly Val Arg Leu Kis Arg Tyr 565 570 575 GCT CCG GCG TGC AAA CCT CTC CTA CGG GAG GAG GTC ACA TTC CAG GTC Ala Pro Ala Cys Lys Pro Leu Leu Arg Giu Glu Val Thr Phe Gin Val 580 585 590 GGC CTC AAC CAA TAC CTG GTT GGG TCG CAG CTC CCA TGC CAG CCC GAA Glv Leu Asn Gin Tyr Leu Val Gly Ser Gin Leu Pro Cys Glu Pro Glu 595 600 605 CCG GAT GTA GCA GTG CTC ACT TCC ATG CTC ACC GAC CCC TCC CAC ATC Pro Asp Val Ala Val Leu Thr Ser Mec Leu Thr Asp Pro Ser His Ile 610 615 620 ACA GCA GAG A CG GCT AAG CGC AGG CTG GCC AGG GGG TCT CCC CCC TCC Ihr Ala Glu Thr Ala Lys Arg Arg Leu Ala Arg Gly Ser Pro Pro Ser 625 630 635 640 69

AT 400 724 B TTG GCC ACC TCT TCA GCT AGC CAG TTG TCT GCG CCT TCC TCG AAG GCG 1968 Leu Ala Ser Ser Ser Ala Ser Gin Leu Ser Ala Pro Ser Ser Lys Ala 5 645 650 655 ACA TAC ATT ACC CAA AAT GAC TTC CCA GAC GCT GAC CTC ATC GAG GCC 2016 Thr Tyr Ile Thr Gin Asn Asp ?he Pro Asp Ala Asp Leu Ile Glu Ala 70 660 665 670 AAC CTC CTG TGG CGG CAT GAG ATC GGC GGG GAC ATT ACC CGC GTG GAG 2064 75 Asn Leu Leu Trp Arg His Glu y.e- Gly Gly Asp Ile Thr Arg Val Glu 675 6S0 685 TCA GAG AAC AAG GTA GTA ATC CTG GAC TCT TTC GAC CCG CTC CGA GCG 2112 20 Ser Glu Asn Lys Val Val Ile Leu Asp Ser P'ne As? Pro Leu Arg Ala 6S0 6S5 700 25 GAG GAG GAT GAG CGG GAA GTG TCC C-TC CCG GCG GAG ATC CTG CGG AAA 2160 Glu Glu Asp Glu Arg Glu Val Ser Val Pro Ala Glu Ile Leu Arg Lys 705 710 715 720 30 TCC AAG AAA TTC CCA CCA GCG AiG ccc uCA- TGG GCA CGC CCG GAT TAC 220S Ser Lys Lys ?he Pro Pro Ala Mer Pro Ala Trp Ala Arg Pro Asp Tyr 725 730 735 35 AAC CCT CCG CTG CTG GAG TCC TGG AAG GCC CCG GAC TAC GTC CCT CCA 2256 Asn Pro Pro Leu Leu Glu Ser Trp Lys Ala Pro Asp Tyr Val Pro Pro 40 740 745 750 G7G GTA CAT GGG TGC CCA CTG CCA CCT ACT AAG ACC CCT CCT ATA CCA 2304 Val Val His Gly Cys Pro Leu Pro Pro Thr Lys Thr Pro Pro Ile Pro 45 755 760 765 CCT CCA CGG AGG AAG AGG ACA GTT GTT CTG ACA GAA TCC ACC GTG TCT 2352 50 Pro Pro Arg Arg Lys Arg Thr Val Val Leu Thr Glu Ser Thr Val Ser 770 775 780 70 55 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50

AT 400 724 B TCT GCC CTG GCG GAG CTT GCC ACA AAG GCT TTC GGT AGC TCC CAA CCG Ser Ala Leu Ala Glu Leu Ala Thr Lys Ala Phe Gly Ser Ser Glu Pro 785 790 795 800 TCG GCC GTC GAC AGC GGC ACG GCA ACC GCC CCT CCT GAC CAA CCC TCC Ser Ala Val Asp Ser Gly Thr A.la Thr Ala Pro Pro Asp Gin Pro Ser 805 310 815 CAC GAC GGC GGA GCA GGA TCT GAC GTT GAG TCG TAT TCC TCC ATG CCC Asp Asp Glv Gly Ala Gly Ser Asp Val Glu Ser Tyr Ser Ser Met Pro 820 825 830 ccc CTT GAG GGG GAG CCG rrr* υυυ GAC CCC GAT CTC AGC GAC GGG TCT TGG Pro Leu Glu Gly Glu Pro Gly AS? Pro Asp Leu Ser Asp Gly Ser Trp 835 840 845 TCT ACC GTG AGT GAG GAG GCC GGT GAG GAC GTC GTC TGC TGC TCG ATG Ser Thr Val Ser Glu Glu Ala Gly Glu As? 'v'al Val Cys Cys Ser Mec 850 855 860 TCC TAC ACA TGG ACA GGC GCT CTG ATC ACG CCA TGC GCT GCG GAG GAA Ser Tyr Thr Tr? Thr Gly Ala Leu Ile Thr Pro Cys Ala Ala Glu Glu 865 870 875 880 AGC AAG CTG CCC ATC AAC GCG TTG AGC AAC TCT TTG CTG CGT CAC CAC Ser Lvs Leu Pro Ile Asn Ala Leu Ser Asn Ser Leu Leu Arg His His 885 890 895 AAC ATG GTC TAC GCT ACC ACA TCC CGC AGC GCA AGC CAG CGG CAG AAG Asn Mec Val Tyr Ala Thr Thr Ser Arg Ser Ala Ser Gin Arg Gin Lys 900 905 910 aag GTC ACC TTT GAC AGA CTG CAA ATC CTG CAC GAT CAC TAC CAG GAC Ly* Val Thr Phe Asp Arg Leu Gin Ile Leu Asp Asp His Tyr Gin Asp 915 920 925 2400 2448 2496 2544 2592 2640 2688 2736 2784 71 55

AT 400 724 B GTG CTC AAC GAG ATG AAG GCG AAG GCG TCC aca GTT AAG GCT AAG CTT Val Leu Lys Glu Met Lys Ala Lys Ala Ser Thr Val Lys Ala Lys Leu 5 930 935 940 CTA TCA GTA GAG GAA GCC TGC AAG CTG ACG CCC CCA CAT TCG GCC AAA 10 Leu Ser Val Glu Glu Ala Cys Lys Leu Thr Pro Pro His Ser Ala Lys 945 550 955 960 TCT AAA ITT GGC TAT GGG CCA AAG GAC GTC CGG AAC CTA TCC AGC AAG 15 Ser Lys P'ne Gly Tvr Gly Ala Lys Asp Val Arg Asn Leu Ser Ser Lys 2832 2680 2928 963 970 975 20 GCC Ala ATT Ile AAC Asn CAC His ATC T * . ile CCC A-g TCC Ser GTG Val TGG Trp GAG Glu GAC Asp TTG Leu TTG Leu GAA Glu GAC Asp ACT Thr 560 985 590 25 GAA ACA CCA ATT GAC ACC ACC ATC ATG GCA AAA AAT GAG GTT TTC TGC Glu Thr Pro Ile Asp Thr Thr Ile Met Ala Lys Asn Glu Val Phe Cys 995 1000 1005 30 GTC CAA CCA GAG AGA GGA GGC CCC AAG CCA GCT CGC CTT ATC GTG TTC Val Gin Pro Glu Arg Gly Gly Arg Lys Pro Ala Arg Leu Ile Val Phe 1010 1015 1020 35 CCA GAC TTG GGG GTC CGT GTG TGC GAG AAA ATG GCC CTC TAT GAC GTG Pro Asp Leu Gly Val Arg Val Cys Glu Lys Met Ala Leu Tyr Asp Val 40 1025 1030 1035 1040 GTC TCC ACC CTC CCT CAG GCT GTG ATG GGC TCC TCG TAC GGA TTC CAG Val Ser Thr Leu Pro Gin Ala Val Met Gly Ser Ser Tyr Gly Phe Gin 45 1045 1050 1055 TAT TCT CCT GGA CAG CGG GTC GAG TTC CTG GTG AAC GCC TGG AAA TCA 50 Tyr Ser Pro Gly Gin Arg Val Glu Phe Leu Val Asn Ala Trp Lys Ser 2976 3024 3072 3120 3168 3216 1060 1065 1070 72 55 ΑΤ 400 724 Β AAG AAG ACC CCT ATG GGC TTT GCA TAT GAC ACC CGC TGT TTT GAC TCA Lys Lys Thr Pro Me r Gly Phe Ala Tyr Asp Thr Arg Cys Phe Asp Ser i.075 1 .080 1085 ACA GTC ACT GAG AAT GAC ATC CGT GTA GAG GAG TCA ATT TAT CAA TGT Thr Val Thr Glu Asn Asp Ile A^g Val Glu Glu Ser Ile Tyr Gin Cys 1090 .095 1100 7GT GAC TTC GCC CCC GAA GCC AGA CAG GCC ATA AGG TCG CTC ACA GAG Cys Asp Leu Ala Pro Glu Ala Arg Gin Ala Ile Arg Ser Leu Thr Glu 1105 1 1110 1115 1120 CGG CTT TAT ATC ΓΛΛ UVVJ GGT CCC CTG ACT AAT TCA AAA CGG CAG AAC TGC Arg Leu Tyr Ile Gly Gly Pro Leu Thr Asn Ser Lys Gly Gin Asn Cys 1125 L130 1135 GGC TAT CGC CGG TGC CGC GCG AGC GGC GTG CTG ACG ACT AGC TGC GGT Gly Tyr Arg Arg Cys Arg Ala Ser Gly Val Leu Thr Thr Ser Cys Gly 1140 ] :145 1150 AAT ACC CTC ACA TGT TAC TTG AAG GCC TCT GCA GCC TGT CGA GCT GCA Asn Thr Leu Thr Cys Tyr Leu Lys Ala Ser Ala Ala Cys Arg Ala Ala 1155 1160 1165 AAG CTC CAG GAC TGC ACG ATG CTC GTG TGC GGA GAC GGC CTT GTC GTT Lys Leu Gin Asp Cys Thr Met Leu Val Cys Gly Asp Asp Leu Val Val 1170 1175 1180 ATC TGT GAG AGC GCG GGA ACC CAG GAG GAC GCG GCG AGC CTA CGA GTC Ile Cys Glu Ser Ala Gly Thr Gin Glu Asp Ala Ala Ser Leu Arg Val 1185 1190 1195 1200 TTC ACG GAG GCT ATG ACT AGG TAC TCT CCC CCC CCC GGG GAC CCG CCC Phe Thr Glu Ala Mec Thr Arg Tyr Ser Ala Pro Pro Gly Asp Pro Pro 1205 1210 1215 73

AT 400 724 B CAA CCA GAA TAC GAC CTG GAG TTC ATA ACA TCA TGC TCC TCC AAT GTC 3696 Gin Pro Glu Tyr Asp Leu Glu Leu Ile Thr Ser Cys Ser Ser Asn Val 1220 1225 1230 TCG GTC GCG CAC GAT GCA TCT GCC AAA AGG GTA TAC TAC CTC ACC CGT 3744 Ser Val Ala His Asp Ala Ser Gly Lys Arg Val Tyr Tyr Leu Thr Arg 1235 1240 1245 CAC CCG 3750

Asp Pro 1250 SEQ ID Nr. 23 ART DER SEQUENZ: Nucleotid SEQUENZLÄNGE: 23 Basen STRANGFORM: Einseistrang TOPOLOGIE: linear

ART DES MOLEKÜLS: synthetische DNA URSPRÜNGLICHER HERKUNFTSORGANISMUS: Baculovirus Autographa California Nuclear Polyhedrosis virus (AcNPV) UNMITTELBARE EXPERIMENTELLE HERKUNFT: Oligonucleotid-Synthesizer; oligo d24 MERiQiALE: von 1 bis 23 Basen homolog zum Teil des AcNPV Polyhedringens stromabwärts der BamHl Klonierungsstelle im pAc360 und ähnlichen Vektoren EIGENSCHAFTEN: startet DNA-Synthese von

Baculovirustransfervektorseguenzen, die die an der BamHl Schnittstelle eingefügte DNA flankieren 23

CGGGTTTAAC ATTACGGATT TCC 74

AT 400 724 B SEQ ID Nr. 24 ART DER SEQUENZ: Nucleotid SEQUENZLÄNGE: 31 Basen STRANGFORM: Einzelstrang TOPOLOGIE: linear

ART DES MOLEKÜLS: synthetische DNA URSPRÜNGLICHER HERKUNFTSORGANISMUS: Baculovirus Autographa California Nuclear Polyhedrosis virus (AcNPV) UNMITTELBARE EXPERIMENTELLE HERKUNFT: Oligonucleotid-Synthesizer; oligo dl26 MERKMALE: von I bis 31 Basen homolog zu den stromaufwärts Verknüpfungssequenzen hergestellt durch Klonierung der durch d75 (SEQ ID 5} amplifizierten cDNA in die BamHl Klonierungsstelle in pAc360 und ähnlichen Vektoren; Fehlpaarungen an den Basen 13 und 14 führt eine Pstl Schnittstelle ein von 1 bis 10 Basen homolog zur Region der BamHl Schnittstelle in pAc360 und ähnlichen Vektoren von 4 bis 9 Basen BamHl Schnittstelle von 12 bis 17 Basen Pstl Schnittstelle EIGENSCHAFTEN: startet DNA-Synthese an der Verknüpfung der Baculovirustransfervektorsequenzen und der zuvor durch oligo d75 amplifizierten Sequenzen; führt eine Pstl Erkennungsstelle für anschließende Klonierung ein 31 TAAGGATCCC CCT GCA GTA TCG GCG GAA TTC Ser Ala Val Ser Ala Glu Phe 5 75

Claims (19)

1. AT 400 724 B SEQ ID Nr. 25 ART DER SEQUENZ: Nucleotid SEQUENZLÄNGE: 45 Basen STRANGFORM: Einzelstrang TOPOLOGIE: linear ART DES MOLEKÜLS: synthetische DNA URSPRÜNGLICHER HERKUNFTSORGANISMUS: N/A UNMITTELBARE EXPERIMENTELLE HERKUNFT: Oligonucleotid-Synthesizer; oligo d!32 MERKMALE: von 5 bis 10 Basen Pstl Erkennungsstelle von 13 bis 27 Basen Linker, kodierend für fünf Lysinreste von 28 bis 45 Basen homolog zu den Basen 4 bis 21 von BR11 (SEQ ID 7) EIGENSCHAFTEN: startet DNA-Synthese am 5' Ende des BR11 und führt eine synthetische, fünf Lysinreste kodierende Sequenz ein, wie auch eine Pstl Erkennungsstelle für anschließende Klonierung CTGCCTGCA GTA AAG AAG AAG AAG AAG AAA ACC AAA CGT AAC ACC A 45 Val Lys Lys Lys Lys Lys Lys Thr Lys Arg Asn Leu 5 10 Patentansprüche 1. PT-NANBH virales Polypeptid, gekennzeichnet durch ein Antigen mit einer Aminosäure-Sequenz, die mindestens zu 90 % homolog mit der Aminosäure-Sequenz der SEQ ID Nr. 3, 4, 19, 20, 21 oder 22 ist oder ein als Antigen wirkendes Fragment davon ist.
2. 2. PT-NANBH virales Polypeptid nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Aminosäure-Sequenz mindestens zu 90 % homolog mit der Aminosäure-Sequenz der SEQ ID Nr. 3 oder 4 ist oder ein als Antigen wirkendes Fragment davon ist.
3. 3. PT-NANBH virales Polypeptid nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Aminosäure-Sequenz mindestens zu 95 % homolog mit der Aminosäure-Sequenz der SEQ ID Nr. 3, 4, 19, 20, 21 oder 22 ist oder ein als Antigen wirkendes Fragment davon ist.
4. 4. PT-NANBH virales Polypeptid nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Aminosäure-Sequenz mindestens zu 98 % homolog mit der Aminosäure-Sequenz der SEQ ID Nr. 3, 4, 19, 20, 21 oder 22 ist oder ein als Antigen wirkendes Fragment davon ist.
5. 5. PT-NANBH virales Polypeptid, gekennzeichnet durch ein Antigen aus der strukturkodierenden Region des viralen Genoms und ein Antigen aus der nicht-strukturkodierenden Region des viralen Genoms. 76 ΑΤ 400 724 Β
6. 6. ΡΤ-ΝΑΝΒΗ virales Polypeptid nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Antigen aus der strukturkodierenden Region eine Aminosäure-Sequenz hat, die mindestens zu 90 % homolog mit der Aminosäure-Sequenz der SEQ ID Nr. 5 ist oder ein als Antigen wirkendes Fragment davon ist, und das Antigen aus der nicht-strukturkodierenden Region eine Aminosäure-Sequenz hat, die mindestens zu 90 % homolog mit der Aminosäure-Sequenz der SEQ ID Nr. 3 oder 4 ist oder ein als Antigen wirkendes Fragment davon ist.
7. 7. DNA-Sequenz, kodierend ein PT-NANBH virales Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 6.
8. 8. DNA-Sequenz nach Anspruch 7 der SEQ ID Nr. 3, 4, 19, 20, 21 oder 22.
9. 9. Expressionsvektor, gekennzeichnet durch eine DNA-Sequenz nach einem der Ansprüche 7 oder 8, der in einem geeigneten Wirt zur Expression der DNA-Sequenz unter Produktion PT-NANBH viralen Polypeptides in der Lage ist.
10. 10. Wirtszelle, transformiert mit einem Expressionsvektor nach Anspruch 9.
11. 11. Verfahren zur Herstellung PT-NANBH viralen Polypeptids, gekennzeichnet durch die folgenden Schritte: Klonierung oder Synthetisierung einer das PT-NANBH virale Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 6 kodierenden DNA-Sequenz, Einschleusen der DNA-Sequenz in einen Expressionsvektor, so daß dieser in einem geeigneten Wirt exprimiert werden kann, Transformierung der Wirtszelle mit dem Expressionsvektor, Kultivierung der transformierten Wirtszelle und Isolierung des viralen Polypeptids.
12. 12. Polyklonaler oder monoklonaler Antikörper gegen PT-NANBH virales Polypeptid erhältlich durch die Verwendung eines PT-NANBH viralen Polypeptids nach einem der Ansprüche 1 bis 6.
13. 13. Verfahren zum Nachweis PT-NANBH viraler Nukleinsäure, gekennzeichnet durch i) die Hybridisierung der in einer Testprobe vorhandenen viralen RNA oder aus einer solchen RNA synthetisierten cDNA mit einer DNA-Sequenz der SEQ ID Nr. 3, 4, 19, 20, 21 oder 22 und Screenen der erhaltenen Nukleinsäurehybride zur Identifikation aller PT-NANBH viraler Nukleinsäuren; oder ii) die cDNA-Synthese aus in einer Testprobe vorhandener viraler RNA, Amplifikation einer ausgewählten DNA-Sequenz entsprechend den Subsequenzen der SEQ ID Nr. 3, 4, 19, 20, 21 oder 22 und Identifikation der ausgewählten DNA-Sequenz.
14. 14. Testkit zum Nachweis PT-NANBH viraler Nukleinsäure, gekennzeichnet durch i) ein Paar Oligonucleotidprimer, von denen einer einem Teil der Nucleotid-Sequenz der SEQ ID Nr. 3, 4, 19, 20, 21 oder 22 entspricht und der andere der auf der 3’-Seite des ersteren lokalisiert ist und einem Teil der Komplimentärsequenz entspricht, wobei das Paar die dazwischenliegende ausgewählte DNA-Sequenz definiert; ii) ein reverse Transkriptase-Enzym zur cDNA-Synthese aus RNA in der Testprobe stromaufwärts des Primers, entsprechend der komplimentären Nucleotid-Sequenz der SEQ ID Nr. 3, 4, 19, 20, 21 oder 22; iii) ein Enzym, das zur Amplifikation der ausgewählten DNA-Sequenz in der Lage ist; und gegebenenfalls iv) Waschlösungen und Reaktionspuffer.
15. 15. Verfahren zum Nachweis PT-NANBH viralen Antigens oder viralen Antikörpers, gekennzeichnet durch das Zusammenbringen einer Testprobe mit einem PT-NANBH viralen Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 6 oder einem polyklonalen oder monoklonalen Antikörper nach Anspruch 12 und der Bestimmung, ob Antigen-Antikörper Bindung innerhalb der Testprobe auftritt.
16. 16. Testkit zum Nachweis PT-NANBH viralen Antigens oder viralen Antikörpers, gekennzeichnet durch ein PT-NANBH virales Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 6 oder einen polyklonalen oder monoklonalen Antikörper nach Anspruch 12 und Hilfsmittel zum Nachweis, ob Antigen-Antikörper Bindung innerhalb der Testprobe auftritt.
17. 17. Impfstofformulierung, gekennzeichnet durch ein PT-NANBH virales Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 6 in Verbindung mit einem pharmazeutischen annehmbaren Träger. 77 ΑΤ 400 724 Β
18. 18. Verfahren zum Nachweis eines PT-NANBH viralen Antikörpers, gekennzeichnet durch Kontaktieren einer Testprobe mit einem oder mehreren PT-NANBH viralen Polypeptiden, wobei diese viralen Polypeptide zwei oder mehr PT-NANBH virale Antigene in Kombination enthalten oder in einem einzigen Polypeptid fusioniert sind und wenigstens eines dieser Antigene aus der strukturkodierenden Region des Virus abgeleitet ist und wenigstens ein weiteres dieser Antigene aus der nicht-strukturko-dierenden Region abgeleitet ist, und Bestimmen, ob Antigen-Antikörperbindung innerhalb der Testprobe auftritt.
19. 19. Testkit zur Bestimmung eines PT-NANBH viralen Antikörpers, gekennzeichnet durch ein oder mehrere PT-NANBH virale Polypeptide, wobei diese(s) virale(n) Polypeptid(e) zwei oder mehr PT-NANBH virale Antigene in Kombination enthalten oder in einem einzigen Polypeptid fusioniert sind und wenigstens eines dieser Antigene aus der strukturkodierenden Region des Virus abgeleitet ist und wenigstens ein weiteres dieser Antigene aus der nicht-strukturkodierenden Region abgeleitet ist, und Hilfsmittel zum Nachweis, ob Antigen-Antikörper Bindung innerhalb der Testprobe auftritt. Hiezu 3 Blatt Zeichnungen 78