HUT56883A - Process for producing virus polypeptides - Google Patents

Description

A jelen találmány vírus-eredetű anyagok izolálásával és jellemzésével foglalkozik, amely anyagok a transzfúzió utáni nem-A, nem-B hepatitiszért (PT-NANBH) felelősek, és különösen a PT-NANBH vírus polipeptidekkel, az ezeket a vírus polipeptideket kódoló DNS szekvenciákkal, az ilyen DNS szekvenciákat tartalmazó kifejező vektorokkal, valamint az ilyen kifejező vektorokkal transzformált gazdasejtekkel foglalkozik. A jelen találmány foglalkozik továbbá a PT-NANBH vírus polipeptidek vagy az ilyen polipeptidek elleni poliklonális vagy monoklonális antitestek alkalmazásával a PT-NANBH diagnózisához alkalmas immunassayban vagy vakcinaként a PT-NANBH megakadályozásra.

A nem-A, nem-B hepatitisz (NANBH) definíció szerint tulajdonképpen kizárásos diagnózis, és általában akkor alkalmazzák, amikor le akarnak írni vírusos hepatitisz fertőzéses esetet, amely nem tulajdonítható sem A hepatitisz, sem B hepatitisz vírusnak. Az ilyen esetek többségében a fertőzés okát nem azonosítják, bár klinikai vagy járványtan! alapon egy sor anyagról gondolják, hogy felelős ezért a betegségért [lásd Shih és munkatársai: Prog. Liver Dis._&, 433-452 (1986)]. Csak az Amerikai Egyesült Államokban egyedül a vértranszfúziók akár 10 %-a is eredményezhet NANBH-t, amely komoly problémát okoz. PT-NANBH-nál nagyon sokféle vírus anyag lehet felelős a fertőzésért, és bár az évek során nagyon sokan hirdették, hogy azonosították ezt az anyagot, ezek egyikét sem bizonyították.

A 88310922.5 számú európai szabadalmi bejelentés azt állítja, hogy leírta a PTNANBH-ért felelős etiológiai anyag izolálását és jellemzését; ezt az anyagot a bejelentésben hepatitisz C vírusnak (HCV) nevezik. Egy cDNS könyvtárat készítenek egy PT-NANBH-vel fertőzött csimpánzból kapott vírus nukleinsavból, és ezt a könyvtárat átvizsgálják humán antiszérumokat alkalmazva. Egy sor pozitív

-3klónt izoláltak, és szekvenciájukat elemezték. Az így létrejövő nukleinsav-szekvencia és aminosav-szekvencia adatok, amelyeket a bejelentésben leírtak, a 10 kb-s vírus genom mintegy 70 %-át képviselik és teljes egészében annak 3‘ végéből származnak, megfelelnek a nem szerkezeti kódoló területnek.

Nekünk sikerült most izolálnunk és jellemeznünk PT-NANBH vírus polipeptideket, ilyen vírus polipeptideket kódoló DNS szekvenciák klónozásával és kifejezésével. Meglepő módon mind a nukleinsav-szekvencia, mind az aminosav-szekvencia adatok jelentős különbségeket mutatnak a 88310922.5 számú európai szabadalmi bejelentésben leírt adatokhoz viszonyítva. Ezek a különbségek összességében 20 %ot tesznek ki nukleinsav szinten, de a szekvnciák bizonyos területei ennél is nagyobb különbségeket mutatnak. A különbségek összesített szintje az elvárhatónál nagyobb ugyanannak a vírusnak két izolátumánál, még ha a földrajzi tényezőket figyelembe is vesszük; úgy hisszük, hogy ez az alábbi két ok egyikének tulajdonítható.

Először: mi és a fentebb említett európai szabadalmi bejelentés feltalálói eltérő forrásokat alkalmazunk a cDNS klónozásban alkalmazott nukleinsavakhoz. Pontosabban az európai szabadalmi bejelentés csimpánz plazma alkalmazását írja le a vírus nukleinsav kiindulási anyaghoz, ahol a vírust két alkalommal vitték keresztül a csimpánzon. A PT-NANBH természetesen emberi betegség, és a vírus átvitele egy idegen gazdaszervezeten, még ha ez közeli rokona is az embernek, valószínűleg a vírus nukleinsav jelentős mutációját eredményezi. Következésképpen a 88310922.5 számú európai szabadalmi bejelentésben található szekvenciaadatok nem teljes valóságában képviselik a tényleges vírus anyagot, amely az emberekben a PTNANBH-ért felelős. Ezzel ellentétben mi a cDNS klónozáshoz kiindulási anyagként

-4• ····· · ·· • · · · · · · • · · · · ··· • · ··· · ·· * ··· · · ··· ·· humán plazma forrásból való vírus nukleinsavat alkalmazunk. Az így kapott szekvenciaadatok sokkal valószínűbben felelnek meg a PT-NANBH natív nukleinsavszekvenciáinak és aminosav szekvenciáinak.

Másodszor: lehetséges, hogy a vírus anyag több, mint egy altípusban létezik, és azok a szekvencia adatok, amelyeket az európai szabadalmi bejelentésben írnak le, és azok, amelyet mi világítottunk meg, ugyanannak a vírus anyagnak különböző és jól megkülönböztethető altípusaihoz tartoznak. Az sem kizárt, hogy a szekvencia adatok két sorozata közti különbség szintje a fenti két ok kombinációjának eredménye.

A jelen találmány egy antigént tartalmazó PT-NANBH vírus polipeptidet nyújt, amely antigén aminosavszekvenciája legalább 90 %-ban homológ a SEQ ID NO : 3, 4, 5, 18, 19, 20, 21 vagy 22 képletekben leírt aminosav szekvenciákkal, vagy ezek antigén tulajdonságú fragmentuma.

A SEQ ID NO : 3, 4, 5, 18, 19, 20, 21 vagy 22 képletek az aminosav-szekvenciákat a nukleinsav-szekvenciákból következtetve írják le. A tényleges aminosav-szekvencia előnyösen legalább 95 %-ban, de méginkább legalább 98 %-ban homológ a SEQ ID NO : 3, 4, 5, 18, 19, 20, 21 vagy 22 képletekben leírt aminosav szekvenciákkal, adott esetben az antigén fuzionálva lehet valamely heterológ polipeptidhez.

Kívánt esetben, két vagy több antigént együtt alkalmazhatunk vagy kombinálva, vagy egyetlen polipeptidként egymással fuzionálva. Két vagy több antigén alkalmazása egy diagnosztikai vizsgálatban ezen a módon reálisabb eredményeket nyújt,

-5amikor a vér átvizsgálására alkalmazzuk, a PT-NANBH vírus jelenlétének kimutatására. Előnyösen az egyik antigént a szerkezeti kódoló területből kapjuk (5’-vég), és egy másik antigént a nem-szerkezeti kódoló területből kapjuk (3’-vég).

Különösen előnyös, ha az antigének rekombináns polipeptidként vannak egymáshoz fuzionálva. Ez utóbbi megközelítés egy sor előnyt nyújt, amennyiben az egyedi antigéneket rögzített, előre meghatározott (általában ekvimoláris) arányban egyesíthetjük és csak egy egyedi polipeptidet kell termelni, tisztítani és jellemezni.

Egy antigénnek, amely legalább 90 %-ban homológ a SEQ ID NO : 3, 4, 5, 18, 19, 20, 21 vagy 22 képletű szekvenciákkal, antigén tulajdonságú fragmentuma legalább öt, hat, hét, nyolc, kilenc vagy tíz, illetve tizenöt, húsz, harminc, negyven vagy ötven aminosavat taratalmaz. Az ilyen antigének antigén-helyeit standard munkamenetekkel határozhatjuk meg. Ezek magukban foglalhatják magának a polipeptidnek a fragmentálását proteolítikus enzimekkel vagy kémiai szerekkel, majd az egyes fragmentumok azon képességének meghatározását, hogy kötődnek-e antitestekhez vagy váltanak-e ki immunválaszt, amikor egy állatba vagy megfelelő in vitro modell redszerbe inokuláljuk [Strohmaier és munkatársai: J. Gén. Virol. 59_r 205-306 (1982)]. Egy másik eljárás szerint a polipeptidet kódoló DNS-t restrikciós enzimes emésztéssel vagy más jól ismert technikával fragmentálhatjuk, majd bevezetjük valamely kifejező rendszerbe, hogy fragmentumokat állítsunk elő (adott esetben valamely polipeptidhez, általában bakteriális polipeptidhez fuzionálva). Az így létrejött fragmentumokat aztán felbecsülhetjük, ahogyan korábban leírták [Spence és munkatársai: J. Gén Virol: 70_r 2843-51 (1989); Smith és munkatársai: Gene 22, 263-269 (1984)]. Egy másik megközelítés az, hogy vegyi úton szintetizálnak rövid pepiid fragmentumokat (3-20 aminosav hosszúsággal; hagyományosan 6 aminosav

-6hosszúsággal), amelyek lefedik a teljes hosszúságú polipeptid teljes szekvenciáját olyan módon, hogy az egyik peptid átfedi a szomszédos pepiidet. [Ez az átfedés 1-10 aminosav közt lehet, de ideálisan n-1 aminosav, ahol n a peptid hossza; lásd Geysen és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci 81. 3998-4002 (1984)]. Az egyes peptideket azután felbecsüljük, amint korábban leírtuk, azzal a különbséggel, hogy a pepiidet először általában hozzákapcsoljuk valamely hordozó molekulához, hogy megkönnyítsük egy immunválasz indukcióját. Végül vannak előre jelző eljárások, amelyek magukban foglalják a szekvencia elemzését bizonyos vonásokra, pl. hidrofilicitásra, amelyekről úgy tudjuk, hogy kapcsolatban vannak immunológiailag fontos helyekkel [Hopp és Woods, Proc. Natl. Acad. Sci. 78, 3824-8 (1981); Berzofsky; Science 229, 932-40 (1985)]. Ezeket az előre jelzéseket azután megvizsgálhatjuk a korábban leírt rekombináns polipeptides vagy peptides megközelítést alkalmazva.

A vírus polipeptideket előnyösen tiszta formában, azaz 90 % -nál vagy még inkább 95 % -nál nagyobb tisztasággal szolgáltatjuk.

A jelen találmány szerinti PT-NANBH vírus polipeptidet megkaphatjuk aminosavszintetizátor alkalmazásával is, ha ez olyan antigén, amely mintegy 30 gyöknél nem tartalmaz többet, vagy megkaphatjuk rekombináns DNS technikával is.

A jelen találmány olyan DNS szekvenciákat is nyújt, amelyek PT-NANBH vírus polipeptideket kódolnak.

A jelen találmány szerinti DNS szekvencia lehet szintetikus vagy klónozott. A DNS szekvencia előnyösen az, amelyet a SEQ ID NO : 3, 4, 5, 18, 19, 20, 21, vagy 22 képletekben leírtunk.

-Ί Abból a célból, hogy többszörös antigént tartalmazó PT-NANBH vírus polipeptidet kapjunk, előnyös az egyes kódoló szekvenciákat egy egyedi nyitott leolvasó keretbe fuzionálni. A fúziót természetesen olyan módon kell elvégezni, hogy az egyes antigének antigenikus aktivitása szignifikánsan ne legyen veszélyeztetve egy másik antigénhez viszonyított elhelyezkedése miatt. Különösen tekintettel kell lenni természetesen az olyan szekvenciák természetére, amelyek az antigének közti tényleges csatlakozásoknál találhatók. Azok az eljárások, amelyek segítségével ilyen peptidek nyerhetők, jól ismertek a szakterületen.

A jelen találmány a fentebb meghatározott DNS szekvenciát tartalmazó kifejező vektorral is foglalkozik, amely képes a DNS szekvencia kifejezésére megfelelő gazdaszervezetben, és ezáltal képes PT-NANBH vírus polipeptidet termelni.

A kifejező vektor normálisan olyan DNS szabályozó elemeket tartalmaz, amelyek hatással vannak a DNS szekvencia kifejezésére, megfelelő gazdaszervezetben. Ezek az elemek változhatnak a gazdaszervezet szerint, de általában magukban foglalnak egy promotort, egy riboszóma kötőhelyet, transzlációs rajt- és stophelyeket és egy transzkripciós terminációs helyet. Az ilyen vektorokra példák lehetnek a plazmidok és vírusok. A jelen találmány szerinti kifejező vektorok körülölelik mind az extrakromoszomális vektorokat, mind azokat a vektorokat, amelyek a gazdasejt kromoszómájába vannak injektálódva. Az E. coliban való alkalmazáshoz a kifejező vektor a jelen találmány szerinti DNS szekvenciát fúziós anyagként tartalmazhatja pl. a p -galaktozidázt kódoló DNS szekvencia 3’- vagy 5’ végéhez kapcsolva, vagy pl. a trp E gént kódoló DNS szekvencia 3’ végéhez kapcsolva. A rovar baculo-virus (AcNPV) rendszerben való alkalmazáshoz a DNS szekvencia kívánt esetben a polihedrin kódoló szekvenciához van fuzionálva.

• · ·

-8A jelen találmány a fentebb definiált kifejező vektorral transzformált gazdasejtekkel is foglalkozik, például baktérium élesztő, emlős vagy rovar sejtekkel. Az ilyen sejtekre jó példák lehetnek az E. coli, S. cerevisiae, P.pastoris, kínai hörcsög petefészek vagy egérsejtek, valamint a Spodoptera frugiperda és a Tricoplusia ni. A gazdasejt kiválasztása számos tényezőtől függhet, de ha a PT-NANBH vírus polipeptid transzláció utáni módosítása fontos, akkor előnyösebbek az eukarióta gazdasejtek.

A jelen találmány továbbá eljárást nyújt PT-NANBH vírus polipeptid előállítására, amely eljárás magában foglalja az itt meghatározott PT-NANBH vírus polipeptidet kódoló DNS szekvencia klónozását vagy szintézisét, a DNS szekvencia beiktatását megfelelő kifejező vektorba olyan módon, hogy ez képes legyen megfelelő gazdaszervezetben kifejlődni, egy gazdaszervezet transzformálását a kifejező vektorral, a gazdaszervezet tenyésztését, és a vírus polipeptid izolálását.

A DNS szekvencia klónozását a szakterületen ismert standard munkameneteket alkalmazva hajtjuk végre. Az ilyen munkamenetekben azonban különösen előnyös az itt leírt szekvencia adatokat alkalmazni, hogy megkönnyítsük a kívánt klónozott DNS szekvenciák azonosítását és izolálását. Az RNS-t általában úgy izoláljuk, hogy a fertőzött emberek plazmájából való vírust üledékbe visszük, ahol a fertőzött embereket közvetve a PT-NANBH átvitellel azonosítjuk. Az izolált RNS-t fordított átírásnak vetjük alá cDNS-sé, vagy a véletlenszerű, vagy az oligo-dT beindítást alkalmazva. Kívánt esetben az RNS-t alávetjük egy előkezelési lépésnek is, hogy eltávolítsunk minden olyan szekunder szerkezetet, amely zavarhatja a cDNS szintézist; ilyen előkezelés lehet pl. a melegítés vagy a metil-merkuri-hidroxiddal végzett reakció. A cDNS-t általában módosítjuk úgy, hogy kapcsolókat adunk hozzá, majd valamely restrikciós enzimmel emésztjük. Ezt azután valamely klónozó vektorba iktatjuk be, pl. pBR322-be vagy származékába, vagy a megfelelő virionokba csomagolt gtlO vagy gtll lambda vektorokba [Huynh és munkatársai: DNA Cloning; 1.kötet. A Practical Approach. (1985). IRC Press, Oxford], és az igy létrejött rekombináns DNS molekulákat E. coli transzformálására alkalmazzuk, igy pedig a kívánt könyvtárat alakítjuk ki.

A könyvtárat standard átvizsgálás! stratégia szerint vizsgáljuk át. Ha a könyvtár kifejező könyvtár, ezt egy immunológiai eljárás alkalmazásával vizsgálhatjuk át ugyanazon plazma forrásból kapott antiszérumokkal, mint amely az RNS kiindulási anyaga, valamint olyan antiszérumokkal, amelyek a PT-NANBH elleni antitestekre pozitívnak vélt további humán forrásokból származnak. Mivel a humán antiszérumok általában tartalmaznak antitesteket E.coli ellen, amely nagy háttér-értéket idéz elő az átvizsgálás során, előnyösebb először kezelni az antiszérumokat nem transzformált E. coli lizátummal, hogy eltávolitsunk minden ilyen antitestet. Előnyös egy negatív kontrollt elvégezni kiválasztott humán donoroktól származó antiszérumokat alkalmazva, azaz olyan humán donoroktól, akiket ismételten megvizsgáltak és nem találtak bennük hepatitis vírus elleni antitesteket. Egy másik átvizsgálás! stratégia az lehet, hog hibridizációs vizsgáló mintaként egy vagy több jelzett oligonukleotidot alkalmazunk. Az oligonukleotidok alkalmazása valamely cDNS könyvtár átvizsgálására általában egyszerűbb és megbízhatóbb, mint az antiszérumokkal végzett átvizsgálás. Az oligonukleotidokat előnyösen az itt leirt DNS szekvencia információkat alkalmazva szintetizáljuk. Elvégezhetünk egy vagy több további átvizsgálási fordulót is egyik vagy másik fajta átvizsgálási formát alkalmazva, hogy pozitív kiónokat azonosítsunk és jellemezzünk.

Amikor megkaptuk az első pozitív kiónt, a könyvtárat olyan módon vizsgálhatjuk át újabb pozitív kiónokra, hogy hibridizáló vizsgáló mintaként ezt az első kiónt alkalmazzuk. Egy másik módszer szerint, vagy az első módszer után ismételve további • »···· « ·· • · · · · · · • · · · · ··· • · · · · · · ♦ ··· · · ··· ·· könyvtárakat állíthatunk elő és ezeket ismét átvizsgálhatjuk immunológiai átvizsgáló módszerekkel vagy hibridizáló vizsgáló mintákkal. Ezen a módon további DNS szekvenciákat kaphatunk.

Egy további módszert szerint a PT-NANBH vírus polipeptideket kódoló DNS szekvenciákat szintézissel is előállíthatjuk standard munkameneteket alkalmazva, és ez előnyös lehet a DNS klónozásához bizonyos körülmények között [Gait: Oligonucleotide Synthesis; A Practical Approach. IRL Press, Oxford (1984)].

Az ilyen módon klónozott vagy szintetizált DNS szekvenciát valamely kifejező vektorba iktathatjuk, ismert és standard technikákat alkalmazva. A kifejező vektort szokásos módon restrikciós enzimekkel hasítjuk és a DNS szekvenciákat tompa végű ligálással beleiktatjuk. A hasítást általában olyan restrikciós helynél végezzük, amely a kifejező vektorban alkalmas helyen van ahhoz, hogy a DNS szekvencia - beiktatás után - a vektor DNS-nek a kifejezésre hatással bíró funkcionális elemei szabályozása alá kerüljön.

Valamely gazdasejt transzformálását standard technikák alkalmazásával végezhetjük el. Általában alkalmazunk valamely fenotípusos markert is, hogy különbséget tudjunk tenni azok között a transzformánsok között, amelyek sikeresen felvették a kifejező vektort, és azok között, amelyek nem vették fel. A transzformált gazdasejtek tenyésztését, valamint a PT-NANBH vírus polipeptid izolálását szintén standard technikákat alkalmazva végezhetjük el.

A jelen találmány szerinti PT-NANBH vírus polipeptidekre fajlagos antitesteket is alakíthatunk ki magunknak a polipeptideknek az alkalmazásával. Az antitest lehet

• · ·

-11poliklonális vagy monoklonális. Az antitesteket az alábbi területeken alkalmazhatjuk: minőségi ellenőrzésekben a PT-NANBH vírus polipeptidek egyes tételeinek átvizsgálásakor; PT-NANBH vírus polipeptidek vagy vírus lizátumok tisztításában; epitop térképezésben; jelzett formában konjugátumként kompetitív típusú vizsgálatokban antitestek kimutatására; és antigén-kimutatási vizsgálatokban.

A jelen találmány szerinti PT-NANBH vírus polipeptidek elleni poliklonális antitesteket olyan módon kaphatunk, hogy valamely PT-NANBH vírus polipeptidet, kívánt esetben az immunválasz felerősítése céljából valamely hordozóhoz kapcsolva, valamely emlős gazdaszervezetbe, pl. egérbe, patkányba, juhba vagy nyúlba injektálunk, és az így kialakított antitesteket kinyeljük: A PT-NANBH vírus polipeptidet általában injektálható kiszerelés formájában vezetjük be, amelyben a polipeptid valamely fiziológiailag elfogadható hígítóval van összekeverve. A kiszerelésben lehetnek adjuvánsok is, pl. Freund-féle komplett adjuváns vagy Freud-féle inkomplett adjuváns. A megfelelő kiszerelési formában levő polipeptidet a gazdaszervezetbe általában megfelelő időközökben adjuk be, és megfelelő időközökben plazma mintákat is veszünk anti-PT-NANBH vírus antitestek jelenlétét megállapító vizsgálatokhoz. Amikor elérjük az aktivitás megfelelő szintjét, a gazdaszervezetből vért veszünk. A vérplazmából az antitesteket kivonjuk és tisztítjuk standard munkameneteket alkalmazva, pl. A fehérje- vagy ioncserélő kromatográfíával.

A jelen találmány szerinti PT-NANBH vírus polipeptidek elleni monoklonális antitesteket úgy kaphatunk, hogy valamely nem pusztuló sejtvonal sejtjeit fuzionáljuk olyan sejtekkel, amelyek antitesteket termelnek a vírus polipeptidek ellen, és a fuzionált, nem pusztulóvá (immortalizálttá) vált sejtvonalat tenyésztjük. Tipikusan valamely nem-ember emlős gazdaszervezetet, pl. egeret vagy patkányt, inokulálunk ··«« ·

- 12 a vírus polipeptiddel. Miután megfelelő idő eltelt, hogy a gazdaszervezetben antitest-válasz alakuljon ki, antitest termelő sejteket, pl. splenocitákat, emelünk ki a gazdaszervezetből. Nem-pusztuló sejtvonalak, pl. egér vagy patkány mielóma sejtvonalak sejtjeit fuzionáljuk az antitesteket termelő sejtekkel, és az igy keletkező fúziós termékeket átvizsgáluk olyan sejtvonalak, pl. hibridómák azonosítása céljából, amelyek a kívánt monoklonális antitesteket kiválasztják. A fuzionált sejtvonalat azután tenyésztjük és a tenyésztő tápközegből a monoklonális antitestet tisztítjuk a poliklonális antitest tisztításához hasonló módon.

A jelen találmányon alapuló diagnosztizált vizsgálatok a pt-nanbh fertőzés jelenlétének vagy hiányának meghatározására alkalmazhatók. Továbbá ezen fertőzések kezelésének ellenőrzésére is használhatók, például az interferon terápiában.

A vírusfertőzés diagnosztizálására szolgáló vizsgálatokban alapjában három különböző megközelítés lehetséges, amelyet kiválaszthatunk: a vírus nukleinsavak kimutatása, a vírus antigének kimutatása és a vírus antitestek kiválasztása. Általában a vírus nukleinsavakat

- 12a tekintik a vírus jelenléte legjobb indikátorának; ez azonosítja a valószínűleg fertőzőképes anyagokat. A nukleinsavak kimutatása azonban általában nem olyan egyértelmű, mint az antigének vagy antitestek kimutatása, mivel a célanyag szintje nagyon alacsony is lehet. A vírus antigént markerként használjuk a vírus jelenlétének kimutatásához és indikátorként használjuk a fertőzőképesség megállapításához. A vírustól függően a mintában jelen levő antigén mennyisége nagyon kicsiny és ezért nehezen kimutatható is lehet. Az antitestek kimutatása viszonylag egyértelmű, mivel a gazdaszervezet immunrendszere tulajdonképpen megsokszorozza a fertőzésre adott választ, nagy mennyiségű keringő antitestet termelve. Az antitest válasz természete gyakran a klinikai diagnózisban lehet hasznos; igy pl. az IgM osztály jelenléte IgG osztály helyett, jelzésértékű lehet a szóbanforgó fertőzés természetéről, vagy egy adott vírus antigénre adott válasz összekapcsolódhat a vírus kiürülésével. így egy vírusfertőzés diagnózisához alkalmazott pontos megközelítés az adott körülményektől és a már ismert információktól függ. PT-NANBH esetében egy diagnosztikus vizsgálat kiterjedhet a fenti három megközelítés bármelyikére.

A PT-NANBH diagnózisára szolgáló azon vizsgálatokban, amelyek a vírus nukleinsavainak kimutatásán alapulnak, az eljárás magában foglalhatja egy vizsgálati mintában jelen levő vírus RNS vagy egy ilyen vírus RNS-ből szintetizált cDNS hibridizálását olyan DNS szekvenciával, amelynek nukleotid-szekvenciája a SEQ ED NO : 3, 4, 5,18, 19, 20,21 vagy 22 képleteknek felelnek meg, majd az így keletkező nukleinsav hibridek átvizsgálását PT-NANBH vírus nukleinsavak azonosítására. Eimek az eljárásnak az alkalmazása általában olyan megfelelő szövet, pl. máj biopsziával kapott szövet vizsgálati mintájára korlátozódik, amely szövetben a vírus RNS nagy valószínűséggel magas szinten van jelen. A SEQ ED NO : 3, 4, 5, 18, 19, 20, 21 vagy 22 nukleotid szekvenciáknak megfelelő DNS szekvencia oligonukleotid vagy cDNS szekvencia formát vehet fel, amely adott esetben egy plazmidon belül helyezkedik el. A nukleinsav-hibridek átvizsgálását előnyösen jelzett DNS szekvencia alkamazásával végezzük. Elvégezhetünk egy vagy több további átvizsgálási fordulót is egyik vagy másik átvizsgálási formát alkalmazva, hogy tovább jellemezzük a hibrideket és így PT-NANBH vírus nukleinsavakat azonosítsunk. A hibridizációs és átvizsgálási lépéseket a szakterületen ismert eljárásokkal összhangban végezzük.

A jelen eljárás vírus nukleinsavak kimutatására való korlátozott alkalmazhatósága miatt ennél előnyösebb és alkalmasabb eljárás az, amely az alábbi lépésekből áll: a vizsgálati mintában jelen levő vírus RNS-ből cDNS szintetizálása, a SEQ ED NO : 3, 4, 5, 18, 19, 20, 21 vagy 22 nukleotid szekvenciák valamely alszekvenciájának megfelelő, előre kiválasztott DNS szekvencia sokszorozása és az előre kiválasztott DNS • · szekvencia azonosítása. A vizsgálati minta származhat bármely megfelelő szövetből vagy fiziológiai folyadékból, amely előnyösen fel van dúsulva a jelenlevő vírus RNSben. A megfelelő szövetekre példa lehet a májbiopsziával kapott szövet. A megfelelő fiziológiai folyadékokra példa lehet a vizelet, plazma, vér, szérum, ondó, könny, nyál vagy gerincfolyadék. Az előnyös példa a szérum és a plazma.

A cDNS szintézisét normálisan beindított reverz transzkripcióval hajtjuk végre, véletlenszerű, meghatározott vagy oligo-dT primereket alkalmazva. A primer előnyösen olyan oligonukleotid, amely a SEQ ID NO : 3, 4, 5, 18, 19, 20, 21 vagy 22 nukleotid-szekvenciák valamelyikének felel meg, és úgy van tervezve, hogy az előre kiválasztott szekvenciát taratalmazó cDNS-t feldúsítsa.

Az előre kiválasztott DNS szekvencia kibővítését előnyösen a polimeráz láncreakció (PCR) technika alkalmazásával hajtjuk végre [Saiki és munkatársai: 230. 1350-4 (1985)]. Ebben a technikában egy oligonukleotid primer párt alkalmazunk, amelyek egyike a SEQ ID NO : 3, 4, 5, 18, 19, 20, 21 vagy 22 nukleotid szekvencia egy részletének felel meg, másikra pedig az elsőnek a 3’ végén helyezkedik el és a komplementer szekvencia egy részletének felel meg; a pár tagjai között meghatározódik az előre kiválasztott DNS szekvencia. Az oligonukleotidok általában legalább 15, optimálisan 20-26 bázis hosszúságúak, és - bár néhány illeszkedési hiba tolerálható a reakciókörülmények változtatásával - az oligonukleotidok 3’ végének tökéletesen komplementernek kell lennie, hogy hatékonyan megtörténjék a beindítás (priming). A távolság az oligonukleotidok 3’ végei között mintegy 100 és mintegy 2000 bázispár között lehet. Hasznos, ha az ebben a technikában alkalmazott oligonukleotid párt alkalmazzuk a cDNS szintézis beindításában is. Magát a PCR technikát egyszálú formában levő cDNS-en hajtjuk ···· végre valamely enzim, pl. Taq polimeráz alkalmazásával, és az oligonukleotid primerek fölöslegének alkalmazásával, 20-40 cikluson keresztül, a publikált munkameneteknek megfelelően [Saiki és munkatársai: Science 239. 487-491 (1988)].

Ennek a technikának a finomításaként a kibővítést több menetben végezhetjük, minden menetet különböző oligonukleotid párral indítva be. így a kibővítés első menete után egy rövidebb DNS szekvenciát (pl. 50-500 bázispár hosszúságút) meghatározó oligonukleotid belső párt alkalmazhatunk a kibővítés második menetéhez. Ebben a valamivel megbízhatóbb finomításban, amelyet egymásba illesztett PCR -nek nevezünk, természetesen a végső, kibővített DNS szekvencia az, amely az előre kiválasztott szekvenciát alkotja [Kemp és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci._86, (7) (1989); Mullis és munkatársai: Methods in Enzymology 155, 335350 (1987)].

Az előre kiválasztott DNS szekvencia azonosítását a PCR termék agaróz gélen végzett elemzésével végezzük el. Az előre kiválasztott szekvenciára kalkulált molekulatömeg csíkjának megjelenése pozitív jelzője a vizsgálati mintában levő vírus nukleinsavnak. Az azonosításnak további eljárásai pl. a Southem foltképzésen, oligomer restrikción vagy DNS szekvencia elemzésen alapulhatnak.

A jelen találmány további vizsgáló készletet szolgáltat a PT-NANBH vírus nukleinsav kimutatására, amely az alábbiakat tartalmazza:

i./ egy oligonukleotid párt, amelynek egyike a SEQ ID NO : 3, 4, 5, 18, 19, 20, 21 vagy 22 nukleotid szekvencia egy részének felel meg, míg másika az elsőnek 3’ ···· · • ·

-16oldalán helyezkedik el és a komplementer szekvencia egy részének felel meg, és a pár tagjai között meghatározódik az előre kiválasztott DNS szekvencia;

ii. / valamely reverz transzkriptáz enzimet a cDNS szintéziséhez a vizsgálati minta

RNS-éből a SEQ ID NO : 3,4,5,18,19,20,21 vagy 22 komplementer nukleotid szekvenciának megfelelő primertől fölfelé;

iii. / valamely, az előre kiválasztott DNS szekvenciák kibővítésére képes enzimet; és kívánt esetben iv. / mosóoldatokat és reakciópuffereket.

A vizsgáló készlet tartalmaz továbbá egy pozitív kontroll mintát a vírus nukleinsav azonosításának megkönnyítésére,

A primerek és az enzimek jellemzői előnyösen olyanok, mint amelyeket fentebb a PCR technikával kapcsolatban leírtunk.

A PT-NANBH diagnózisára alkalmas vizsgálatban, amely egy vírus antigén vagy vírus antitest kimutatását foglalja magában, az eljárás abból állhat, hogy egy vizsgálati mintát érintkezésbe hozunk egy jelen találmány szerinti PT-NANBH vírus polipeptiddel, vagy e polipeptid elleni monoklonális vagy poliklonális antitesttel, és meghatározzuk, van-e bármiféle antigén-antitest kötés a vizsgálati mintán belül. Erre a célra egy olyan vizsgáló készlet szolgálhat, amely tartalmaz egy fentebb meghatározott PT-NANBH vírus polipeptidet, vagy ez elleni poliklonális vagy monoklonális antitestet, valamint olyan eszözöket, amelyek alkalmasak annak meghatározására, hogy van-e valamilyen kötés az antigénnel illetve • ···· 9 ··· • · ··♦· • · 9 ·

-17antitesttel a vizsgálati mintán belül. A vizsgálati mintát a vírus nukleinsav kimutatásához bármely korábban említett megfelelő szövetből vagy fiziológiai folyadékból vehetjük. Ha fiziológiai folyadékot kapunk a vizsgálathoz, ezt adott esetben lehet sűríteni a vírus antigén vagy antitest jelenlétének kimutatásához.

A vizsgálat sokféle formáját alkalmazhatjuk. A PT-NANBH vírus polipeptidet alkalmazhatjuk olyan módon, hogy szelektíven befogja az oldatból a PT-NANBH elleni antitestet, vagy, hogy szelektíven jelzi a már befogott antitestet, vagy, hogy mind befogja, mind jelzi az antitestet. Ezen kívül a vírus polipeptidet alkalmazhatjuk sokféle homogén vizsgálati formában, amelyekben az antigénnel reaktív antitestet oldatban mutatjuk ki a fázisok elkülönítése nélkül.

A vizsgálatoknak azon típusai, amlyekben a PT-NANBH vírus polipeptidet az antitest befogására alkalmazzuk az oldatból, magukban foglalják a polipeptid immobilizálását valamely szilárd felületre. Ennek a felületnek képesnek kell lennie arra, hogy valamilyen formában mosható legyen. Ilyen alkalmas felületekre példák lehetnek különböző típusú polimerek (mikrotitráló üregekbe öntve; gyöngyök formájában; különböző típusú pálcikák formájában; szívócsúcsok formájában; elektródák formájában; és optikai berendezések formájában); részecskék (pl. látex; stabilizált vörös vértestek; baktérium- vagy penészsejtek; spórák; arany- vagy más fém- vagy fémtartalmú szálak; és fehéije-kolloidok), ahol a részecskeméret általában 0,02 és 5 mikron között van; és membránok (pl. nitrocellulóz; papír; cellulóz-acetát; és szerves vagy szervetlen anyagú, nagy porozitású/nagy fajlagos felületű anyagok).

A PT-NANBH vírus polipeptid rögzítése a felületre történhet passzív adszorpcióval

-18egy optimális kompozíciójú oldatból, amely magában foglalhat felületaktív anyagokat, oldószereket, sókat és/vagy kaotrópokat, vagy történhet aktív kémiai kötéssel. Az aktív kötés történhet különböző reaktív vagy aktiválható funkciós csoportok révén, amelyek a felületen helyezkednek el (pl. kondenzáló szerek; aktív savészterek, halogenidek és anhidridek; amino-, hidroxi- vagy karboxil-csoportok; szulfhidril csoportok; karbonil csoportok; diazo csoportok; vagy telítetlen csoportok. Kívánt esetben az aktív kötés történhet valamely fehérje (amely maga a felülethez passzívan vagy aktív kötés révén rögzítődhet), pl. albumin vagy kazein révén, amelyhez a vírus polipeptid kémiai úton kötődhet bármely eljárással a sokféle eljárás közül. Valamely fehérje alkalmazása ilyen módon előnyt jelenthet annak izoelektromos pontja, töltése, hidrofilicitása vagy más fiziko-kémiai tulajdonsága miatt. A vírus-polipeptid rögzítődhet a felületre (amely általában, de nem szükségszerben valamely membrán) valamely reakciókeverék, pl. immun-csapadék, elektroforetikus elkülönítése után is.

Miután a PT-NANBH vírus polipeptidet hordozó felületet érintkezésbe hoztuk (reagáltattuk) egy vizsgálati mintával, megadtuk a megfelelő reakcióidőt és - ahol ez szükséges - eltávolítottak a minta fölöslegét a sokféle rendelkezésre álló módszer (pl. mosás, centrifugálás, szűrés, mágneses kezelés vagy kapilláris tevékenység) valamelyikével, a befogott antitestet bármely olyan módon kimutathatjuk, amely kimutatható jelet ad. Ezt elérhetjük pl. a fentebb leírtak szerint valamely jelzett molekula vagy részecske alkalmazásával, amely a befogott antitesttel reagálni képes (pl. A fehérje vagy G fehérje vagy hasonlóig; anti-faj vagy anti-immunglobulin altípus; reumatoid faktor; vagy az antigén elleni antitest, versengő vagy blokkoló formában alkalmazva), vagy valamely olyan molekula alkalmazásával, amely egy, a polipeptidben levő epitopot tartalmaz.

A kimutatható jel lehet optikai, radioaktív, vagy fizikakémiai, és szolgáltatható közvetlenül a molekula vagy részecske jelzésével pl. valamely festékkel, radioakív jelzéssel, elektroaktív jelzőanyaggal, mágneses rezonanciás jelzőanyaggal vagy fluorofórral, vagy szolgáltatható közvetve a molekula vagy részecske jelzésével olyan enzimmel, amely maga képes előidézni valamiféle mérhető változást. Egy másik eljárás szerint kimutatható jelzést kaphatunk pl. agglutináció alkalmazásával, vagy diffrakciós vagy kettős fénytörési hatás révén, ha a felület részecskék formájában van.

Azok a vizsgálatok, amelyekben a PT-NANBH vírus polipeptidet magát alkalmazzuk egy már befogott antitest jelzésére, annak az antigénnek bizonyos formájú jelzését igénylik, amely lehetővé teszi a kimutathatóságot. A jelzés lehet közvetlen, kémiai úton vagy passzívan rögzítve pl. radioaktív jelzést, mágneses rezonanciás jelzőanyagot, részecskéket vagy enzim-jelzést a polipeptidhez; vagy lehet közvetett, valamiféle jelzést rögzítve egy olyan molekulához, amely majd reagál a polipeptiddel. Egy jelzés kémiai kötése a PT-NANBH vírus polipeptidhez történhet közvetlenül egy olyan gyök segítségével, amely már jelen van a polipeptidben, ilyen pl. az aminocsoportd; vagy történhet egy köztes gyök révén, ilyen pl. egy maleimid csoport. Az antitestek befogása történhet a már említett felületek bármelyikén bármely olyan reagenssel, beleértve a passzív vagy aktivált adszopciót is, amely a fajlagos antitestek vagy immunkomplexek kötését eredményezik. Az antitestek befogása elsősorban anti-fajta- vagy anti-immunglobulin-altípussal, reumatoid faktorral, A és G fehérjékkel és hasonlókkal történhet, vagy bármely olyan molekulával, amelyik tartalmaz egy, a polipeptidben előforduló epitopot.

A jelzett PT-NANBH polipeptidet alkalmazhatjuk versengő kötési módban, amelyben ennek kötését bármely fajlagos molekulához vagy bármely, fentebb • ··· ···· • · · · · · ·· · ··· · · · · · ·· példaként megadott felülethez gátolni lehet a mintában lévő antigénnel. Egy másik eljárás szerint ezt alkalmazhatjuk nem versengő módon is, amelyben a mintában levő antigén fajlagosan vagy nem fajlagosan kötődik bármely fenti felületekhez és kötődik egy fajlagos bi- vagy polivalens molekulához is (pl. antitesthez), amelynek fennmaradó vegyértékét lehet alkalmazni a jelzett polipeptid befogására.

Homogén vizsgálatokban gyakran előfordul, hogy a PT-NANBH vírus polipeptidet és egy antitestet külön-külön jelzünk úgy, hogy amikor az antitest reagál a vírus polipeptiddel szabad oldatban, a két jelzés kölcsönhatásba lép, így lehetővé téve pl. az egyik jelzés által befogott energia nem/sugárzó átvitelével a másik jelzésre a gerjesztett második jelzés vagy az elfojtott első jelzés megfelelő kimutatását (pl. fluorometriával, mágneses rezonanciával vagy enzimes méréssel). A vírus polipeptid vagy az antitest hozzáadása a mintában a jelzett pár kölcsönhatásának korlátozását és így a detektorban a jel eltérő szintjét eredményezi

A PT-NANBH antitest kimutatására az egyik alkalmas forma a közvetlen szendvics enzim immunassay (EIA) forma. PT-NANBH vírus polipeptidekkel mikrotitráló üregeket burkolunk. Ezután egyidejűleg hozzáadunk egy vizsgálati mintát és egy PTNANBH vírus polipeptidet, amelyhez valamely enzim van kapcsolva. Bármely PTNANBH antitest, amely a vizsgálati mintában jelen van, kötődik mind az üreget burkoló vírus polipeptidhez, mind az enzimmel kapcsolt vírus polipeptidhez. Tipikusan ugyanazt a vírus polipeptidet alkalmazzuk a szendvics mindkét oldalán. Mosás után a kötött enzimet kimutatjuk valamely fajlagos szubsztrátum alkalmazásával, amely színváltozást idéz elő. Az ilyen EIA-hoz alkalmazott vizsgáló készlet az alábbiakat foglalja magában:

(1) valamely enzimmel jelzett PT-NANBH vírus polipeptid;

·«··· · ·· • · · · · • · · · · · · « · · · · · · (2) szubsztrátum az enzimhez;

(3) Eszköz, olyan felület szolgáltatására, amelyen a PT-NANBH vírus polipeptid immobilizálódik; és (4) kívánt esetben mosóoldatok és /vagy pufferek.

A jelen találmány szerinti vírus polipeptidet be lehet építeni vakcinákba, amelyek immunitást indukálnak PT-NANBH ellen emberekben. Erre a célra a vírus polipeptidet valamely gyógyászatilag elfogadható hordozóval együtt lehet kiszerelni.

A vakcina formájú kiszerelésben való alkalmazásnál a vírus polipeptidet adott esetben egy hepatitisz B belső fúziós részecske részeként , amint ezt Clarké és munkatársai leírták [Natúré 330. 381-384 (1987)], vagy polilizin alapú polimerként, amint ezt Tam leírta [PNAS 85. 5409-5413 (1988)], szolgáltahatjuk. Egy másik eljárás szerint a vírus polipeptidet kívánt esetben valamely szemcsés szerkezetbe, pl. liposzómákhoz vagy ISCOMS-hoz rögzíthetjük.

A gyógyászatilag elfogadható hordozók között találunk - folyékony közegeket, amelyek hordozóként alkalmasak a vírus polipeptid bevezetésére emberekbe. Az ilyen folyékony tápközegre példa lehet a fiziológiás konyhasóoldat. Maga a vírus polipeptid lehet oldott állapotban, vagy szilárd anyagként szuszpendálva lehet valamely hordozóban.

A vakcina kiszerelés tartalmazhat valamely adjuvánst is az immunválasz stimulálására és ilyen módon a vakciana hatásának fokozására. Az ilyen adjuvánsra példák lehetnek az alumínium-hidroxid és alumínium-foszfát.

·· · ·

-22A vakcina kiszerelés végső koncentrációként 0,01-5 mg/ml, előnyösen 0,03-2 mg/ml vírus polipeptidet tartalmazhat. A kiszerelt vakcinát steril tároló edénybe vezethetjük be, amelyet azután leforrasztunk és alacsony, pl 4° C hőmérsékleten tároljuk, vagy a vakcinát alávetjük fagyasztva szárításnak.

Abból a célból, hogy immunitást indukáljunk emberekben PT-NANBH ellen, a vakcina-kiszerelés egy vagy több adagját vezethetjük be. Az egyes dózisok 0,1 és 2 ml, előnyösen 0,2 és 1 ml között lehetnek. A PT-NANBH elleni immunitás indukálásának módszere emberekben azt jelenti, hogy a kiszerelt vakcina megfelelő mennyiségét, amelyet fentebb meghatároztunk, emberekbe bevezetjük.

A jelen találmány bemutatja továbbá PT-NANBH vírus polipeptidek alkalmazását is vakcinakészítményekben, amelyek arra hivatottak, hogy PT-NANBH elleni immunitás indukcióját idézzék elő emberekben.

A jelen találmány szerinti vakcinákat beadhatjuk bármely olyan alkalmas módon,amelyet vakcinák beadásánál alkalmazni szoktak, ideértve az orális vagy parentális (pl. intravénás, szubkután vagy intramuszkuláris) injekciókat egyaránt. A kezelés állhat a vakcina egyetlen dózisából, vagy több dózisból is állhat megfelelő időközökben beadva.

Az alábbi transzformált E. coli törzseket deponáltuk a National Collection of Type Cultures (NACTC) törzsgyűjteményben (Central Public Health Laboratory, 61, Colindale Avenue, London, NW9 5 HT), ahol a deponálás dátumát is jelezzük:

i./ E. coli TG 1 pDX113-mal transzformálva (WD 001); NCTC 12369;

1989. december 7.

-23ii/ E. coli TG1 pDX128-cal trnszformálva (WD002); NCTC 12382;

1990. február 23.

iii. / E. coli TG1 pl36/155-tel transzformálva (WD003); NTCT.....;Γ

1990. november 28.

iv. / E. coliTGl pl56/92-vel transzformálva (WD004); NCTC.....;

1990. november 28.

Í2.43O !

nJ E. coli TG1 pl29/164-gyel transzformálva (WD005); NCTC.....;

1990. november 28.

/2.4 34 3 vi./ E. coli TG1 pDX136-tal transzformálva (WD006); NCTC.....;

1990. november 28.

Az ábrák között az 1. ábra a pDX122-nek a 7. példában leírt előállítását mutatja be; a 2. ábra két alternatív fuzionált szekvencia előállítását mutatja be a 17. példa leírása alapján; és a 3. ábra a SEQ ID NO : 21 és 22 restrikciós térképeit mutatja be.

A szekvencialistában fel vannak sorolva a SEQ ID NO : 1-25 szekvenciák, amelyekre utalunk a leírásban és az igénypontokban.

Az alábbi példák a találmány részletesebb bemutatásának célját szolgálják.

1. PÉLDA. cDNS szintézise

Két egyéntől (akiket A -nak és L -nek nevezünk, és akikről ismert, hogy transzfúzió útján NANBH-val fertőzöttek), összegyűjtött plazmát hígítunk (1: 2,5) foszfáttal • · · · · · · • ··· · * ·

-24pufferolt fiziológiás konyhasóoldattal (PBS), majd 190000 g-nél centrifugáljuk (pl.3000 fordulat/percnél M5EU 8 x 50 rotorban) 5 órán át 4 ⁰ C hőmérsékleten. A felülúszókat félretesszük, mint fajlagos antitestek forrásait a cDNS könyvtárak későbbi átvizsgálásához. Az üledéket újra szuszpendáljuk 2 ml 20 mmól/1 trisz.

HCl-t, 2 mmól/lEDTA-t, 3 % SDS-t és 0,2 mól/1 NaCl-t tartalmazó oldattal (2 x PK), háromszor extraháljuk kloroformmal, egyszer extraháljuk éterrel, majd -20 ° C hőmérsékleten kicsapást végzünk 2,5 térfogat etanollal. A csapadékot újra szuszpendáljuk 10 ml, 10 mmól/1 trisz.HCL-t és 1 mól/1 EDTA-t tartalmazó (pH 8,0) oldatban (TE).

A nukleinsavat templátként használjuk cDNS szintézis készletben (Amersham International plc., Amersham, Egyesült Királyság), mind oligo-dT, mind véletlenszerű hexanukleotid beindítással. A reakciókörülmények azok, amelyeket a készlet forgalmazója javasol. Pontosabban 1/G nukleinsavat alkalmazunk egy első szál szintézis reakcióhoz, amely nukleinsav [«<- ³² P] dCTP -vei (Amersham; fajlagos aktivitás 3000 Ci/mmól) jelezve van; a reakciótérfogat 20/d, és 42 ° C hőmérsékleten 1 órán át inkubálunk. A teljes első szál reakciót azután felhasználjuk a második szál szintézis reakcióhoz, amely E. coli RN-áz H-t (0,8 egység) és DNS polimeráz I-et (23 egység) tartalmaz 100/d végső térfogatban, ezt a reakciókeveréket 12 ° C hőmérsékleten 60 percig, majd 22 ⁰ C hőmérsékleten további 60 percig inkubáljuk. Ezután a teljes reakciókeveréket 70 ° C inkubáljuk 10 percen át, jégre helyezzük, 1 egység T4 DNS polimerázt adunk hozzá, majd 37 ° C hőmérsékleten inkubáljuk 10 percen át. A reakciót 5j<10,2 mól-es EDTA (pH 8) hozzáadásával állítjuk le.

A be nem épült nukleotidokat olyan módon távolítjuk el, hogy a reakciókeveréket NICK oszlopon engedjük keresztül (Pharmacia Ltd., Milton Keyne, Egyesült • · 9 • ··· · · · · • · ···· · ♦ · * ♦»··»···*·

-25Királyság). A cDNS-t azután kétszer extraháljuk fenollal, háromszor extraháljuk kloroformmal, egyszer etraháljuk éterrel, majd 240/g dextránt adunk hozzá; ezután kicsapást végzünk 2,5 térfogat 100 % -os etanollal.

2. PÉLDA. Kifejező könyvtárak megalkotása

A szárított cDNS üledéket újra szuszpendáljuk 5 /ti steril TE oldatban, majd inkubáljuk 500 ng EcoRI kapcsolóval (Pharmacia; foszforilezett GGAATTCC) és 0,5 egység T4 DNS ligázzal (New England Biolabs, Beverley, Massachussets, Amerikai Egyesült Államok) 10/tl végső térfogathoz olyan oldatban, amely 20 mmól/1 trisz.HCl-t (pH 7,5), mmól/1 MgCh-t, 10 mmól/1 DTT-t és 1 mmól/1 ATP-t tartalmaz; az inkubálást 3 órán át 15 ° C hőmérsékleten végezzük. A ligázt 65 ° C hőmérsékleten 10 percen át végzett melegítéssel inaktíváljuk, és a cDNS-t 180 egység EcoRI-gyel (BCL, Lewes, Egyesült Királyság) emésztjük 100 /41 végső térfogatban, 37 ⁰ C hőmérsékleten 1 órán át. Ezután EDTA-t adunk hozzá 10 mmól/1 végső koncentrációig és a teljes reakciókeveréket AcA34 oszlopra (LKB) visszük fel. Frakciókat (50 ml) veszünk és ezeket számláljuk. A kizárt térfogatban (980 cpm) levő cDNS csúcsot összegyűjtjük, kétszer extraháljuk fenolal, háromszor extraháljuk kloroformmal, és egyszer extraháljuk éterrel, majd etanolos kicsapást végzünk (cpm = percenkénti beütések száma).

A ds (kettősszálú) cDNS-t újra szuszpendáljuk 5/ti TE-ben és lambda gtll EcoRI karokhoz (Gibco, Paisley, Skócia) ligáljuk olyan reakciókeverékben, amely 0,5 egység T4 DNS ligázt, 66 mmól/1 trisz.HCl-t, 10 mmól/1 MgCh-t, 15 mmól/1 DDT-t tartalmaz (pH 7,6); a ligálást 15 °C hőmérsékleten végezzük egy éjszakán át. Miután a ligázt inaktiváltuk 65 ° C hőmérsékleten 10 percen át végzett hőkezeléssel, 5x1 reakciókeveréket adunk egy Amersham csomagoló reakciókeverékhez, és

-26inkubálunk 22 ⁰ C hőmérsékleten 2 órán át. A csomagolt anyagot E. coli Y 1090 törzsön [Huynh és munkatársai (1985)] titráljuk; ez összesen 2,6.10⁴ rekombinánst tartalmaz.

A szélesztő lemezeket (Y1090) úgy állítjuk elő, hogy 10 ml-es L-tápközegeket beoltunk agar lemezről származó egyetlen teleppel, és ezt rázatjuk egy éjszakán át 37° C hőmérséketen. A következő napon az egy éjszakás tenyészetekből 0,5 ml-eket hígítunk 10 ml friss L-tápközeggel, és ehhez 0,1 ml 1 mól/l-es MgSO4 oldatot és 0,1 ml 20 %-os (tömeg/térfogat) maltóz oldatot adunk. A tenyészetet 2 órán át rázatjuk 37 ⁰ C hőmérséketen, majd a baktériumokat 50 g-nél 10 percen át végzett centrifugálással kinyerjük; ezután a baktériumokat 5 ml 100 mmól/literes MgSCU oldatban újra szuszpendáljuk, így kapjuk meg a szélesztő sejt törzsoldatot. A csomagolt anyag egy részletét ( 1/U) összekeverjük 0,2 ml szélesztő sejttel, 37 ° C hőmérsékleten inkubáljuk 20 percen át, majd 3 ml fedő agart adunk hozzá és az egész keveréket 90 mm-es L-agar lemezre öntjük. Miután egy éjszakán át inkubáltunk 37° C hőmérsékleten, a tarfoltokat megszámoljuk és a rekombináns fágok teljes számát meghatározzuk. A megmaradt csomagolt anyagot (500/d) 4 ⁰ C hőmérsékleten tároljuk.

A további könyvtárakat lényegében hasonló módon állítjuk elő.

3. PÉLDA. A kifejező könyvtárak átvizsgálása.

A 2. példában leírt kiindulási könyvtárat E. coli Y1090 törzs lemezeire szélesztjük mintegy 5.10 pfu /140 mm-es lemez sűrűséggel (pfu = tarfolt-képző egység), és 37 ° hőmérsékleten növesztünk 2 órán át, amíg a tarfoltok láthatóvá válnak. Steril nitrocellulóz szűrőket, amelyeket előzőleg IPTG-vel (izopropil-tiogalaktozid) impregnáltunk, érintkezésbe hozunk a lemezzel 3 órán át, majd eltávolítjuk.

• ····· · · · • · · · · · · • ··· · · · · • · ···· · · · ··· · · ··· ··

-27A szűrőket először blokkoljuk olyan módon, hogy blokkoló oldattal inkubáljuk {3 % (tömeg/térfogat) BSA/TBS - Tween [10 mmól/í trisz. HC1 (pH 8), 150 mmól/1 NaCl, 0,05 % (térfogat/térfogat) Tween 20], amely 0,05 % bro n-idoxot is tartalmaz} (20 ml/lemez, majd átvisszzük kötő pufferba [ 1 % (tömeg/térfogat) BSA/TBS - Tween, amely 0,05 % broKicfaw-t is tartalmaz], amely (ioncserélő kromatográfíával tisztított) antitesteket tartalmaz az egyesített A + L plazmából (20/g/ml). Miután 2 órán át szobahőmérsékleten inkubáltuk, a szűrőket háromszor mossuk TBS-Tweennel, majd inkubáljuk olyan kötő pufferban, amely biotinilezett juh anti-humán anyagot (1 : 250) tartalmaz. Miután 1 órán át szobahőmérsékleten inkubáltuk, a szűrőket háromszor mossuk TBS-Tween-nel, majd inkubáljuk olyan kötő pufferral, amely streptavidin/peroxidáz komplexet tartalmaz (1: 100). A szignált DAB-bal fejlesztjük ki. A pozitív szignálok (színes) tarfoltokként tűnnek fel.

Az átvizsgált összesen 2,6 . 10 ⁴ tarfoltból 8 pozitív tarfoltot kapunk az átvizsgálás első fordulójában. A szűrőket templátként alkalmazva az eredeti lemezeknek azokat a területeit, amelyek ezeknek a pozitív szignáloknak felelnek meg, felvesszük, steril Pasteur pipettát alkalmazva. Az agar dugókat azután 0,1 ml SM pufferban szuszpendáljuk és a fágokat hagyjuk kidiffundálni. A fág-titert az egyes dugókból E. coli Y1090 törzsön határozzuk meg. Az egyes dugókból kapott fágtörzsoldatot azután az előzőek szerint újból átvizsgáljuk egyedi 90 mm-es lemezeken mintegy α . 10 pfu/lemez sűrűséggel. Az első vizsgálati forduló 8 pozitív tarfoltjából 1 lett világosan pozitív a második fordulóban, vagyis a pozitív tarfoltoknak > 1 %-a; az ennek a tarfoltnak megfelelő fágot JG2-nek nevezzük. Ez a pozitív fágok 40/10⁶ arányának felel meg a könyvtárban.

Ezt és más pozitív fágokat azonosítunk hasonló módon más, 2. példában leírtak • · · · ·

-28szerinti cDNS könyvtárakból, majd ezeket tisztítjuk tarfolt-átvizsgálás ismételt meneteivel kisebb sűrűségnél (1-200 pfu/ 90 mm-es lemez) mindaddig, amíg a tarfoltok 100 %-a pozitív az A + L antitest átvizsgálással. Végül három ilyen rekombináns fágot kapunk: a JG1 -et, JG2 -t és JG3 -at.

4, PÉLDA. A JG1, JG2 és JG3 másodlagos átvizsgálása szérum panelekkel.

A rekombináns fágok mindegyikét, a JGl-et, JG2-t és JG3-at tarfolt-tísztítjuk és titrált törzsoldatként tároljuk SM pufferban 4 ⁰ C hőmérsékleten. Ezeket a fágokat összekeverjük (1: 1) egy, a 3. példában negatívként azonosított fág törzsoldatával és ezt a keveréket alkalmazzuk E. coli Y 1090 törzs fertőzésére 1000 pfu/lemez sűrűséggel.Tarfoltokat emelünk ki és dolgozunk fel olyan módon, ahogyan ezt a 3. példában leírtuk, azzal a kivétellel, hogy a szűrőket körnegyedekre vágjuk és mindegyik körnegyedet különböző antitestekkel inkubáljuk; ezek a következők: A + L antitestek (20^g/ 1); A plazma (1: 500); L plazma (1:500) és H IgG (20_vHg/ml). A H olyan beteg, amelytől várható, hogy PT-NANBH-ra pozitív, mivel olyan hemofíliás beteg, aki korábban nem hőkezelt VIII. faktort kapott. A reakció végén az egyes szűrőket szemmel értékeljük pozitívnak (ahol a szignálok két osztálya világosan megtalálható) vagy negatívnak (ahol minden tarfolt azonos szignált ad). Ez meglehetősen szubjektív ítélet lehet, ezért az egyes értékeléseket összehasonlítjuk és csak azokat a szűrőket tekintjük pozitívnak, ahol az értékelések nagy része pozitív. Az eredményeket az 1. táblázatban mutajuk be.

1. TÁBLÁZAT

	A + L	A	L	H
JG1	+	+	-	-
JG2	+	+	+	+
JG3	+	+	+	+

········· ··· · · ♦ · · · ·

-29A JG1 - úgy tűnik - csak az A betegből való antitestekkel reagál, míg az L és H betegekből való antitestekkel nem; ezt viszont nem tekinthetjük valódi PT-NANBH rokon rekombináns polipeptidnek és így a JG1 -et a további elemzésekben nem vesszük figyelembe. Mind a JG2, mind JG3 viszont tisztán pozitív reakciót ad mind a három PT-NANBH szérummal (A, L és H); ezeket tovább elemezzük.

A fentebb leírt elemzés típusát megismételjük JG2 -vei és JG3 -mai azzal a kivétellel, hogy a szűrőket kisebb darabokra vágjuk és ezeket pozitív és negatív szérumok paneljeivel inkubáljuk. A pozitív szérumok paneljei állnak egy olyan panelból, amely 10 hemofíliás szérumot tartalmaz, és egy olyan panelből, amely 9 intravénás kábítószeres (ÍVDA) szérumot tartalmaz. Ezek képviselik a pozitív szérumok legjobb forrását még akkor is, ha a tényleges pozitívitási arány ismeretlen. A negatív szérumok paneljét olyan elismert donoroktól kapjuk, akik sok év óta szoros megfigyelés alatt állnak a North Blood Transfusion Centre-nél (Deansbrook Road, Edyware, Middlesex, Egyesült Királyság), és akik sohasem mutatták a fertőzés bármiféle jelét sokféle szerre, többek között PT-NANBH-ra vizsgálva. Az eredményeket a 2. és 3. táblázatok mutatják be.

• · « ·

30' • · · · ·· · ·

2. TÁBLÁZAT

	I.D.	JG2	JG3
IVDA	V19146	4/4	0/5
	V27O83	2/4	0/5
	V29779	0/4	0/5
	V12561	0/5	Uh
	V15444	2/4	Uh
	V18342	4>/4	0/5
	V8403		0/5
	V20001	4/4	0/5
	V21213	Uh	0/5
Hemofiliások	M1582	Uh	Uh
	M1581	Uh	Uh
	M1575	Uh	0/5
	M1579	Uh	Uh
	M1585	Uh	0/5
	M1576	1/5	1/5
	M1580	1/5	0/5
	M1578	1/5	0/5
	M1587	1/5	Uh
	M1577	2/5	1/5
A pozitív eredmények alá vannak	húzva.

3. TÁBLÁZAT

	IVDA	Hemofiliások	Éli smert donorok
JG2	6/9(66%)	5/10(50%)	0/10(0%)
JG3	2/9(22%)	4/10(40%)	0/10(0%)
JG2+JG3	1/9(11%)	3/10(30%)	0/10(0%)
Vagy jg3	7/9(77%)	6/10(60%)	0/10(0%)

• · ·

-31Ezek az adatok egybevágnak azzal a feltevéssel, hogy mindkét rekombináns olyan polipeptideket fejez ki, amelyek PT-NANBH -ért felelős anyagokkal rokonok, és hogy ezek a polipeptidek nem azonosak, de sok közös antigén helyük van.

5. PÉLDA AJG2 és JG3 restrikciós térképezése és DNS szekvencia elemzése. Mind a JG2, mind a JG3 fág törzsoldatainak egy részletét ( 10/^ 1) felforraljuk, hogy denaturáljuk a fágot és feltárjuk a DNS-t. Ezt a DNS-t használjuk azután templátként PCR kibővítésekben Taq polimerázt alkalmazva; minden reakciókeverék az alábbiakat tartalmazza 50/<l végső térfogatban 25° C hőmérsékleten: 10 mmól/1 trisz. HC1, 50 mmól/1 KC1, 1,5 mmól/1 MgC12, 0,01 % zselatin (pH 8,3), továbbá dl9 és d20 oligonukleotid primereket (SEQ ID NO : 1, illetve 2; 200-200 ng); ezek a primerek az EcoRI klónozó helyeket szegélyező lambda szekvenciákban helyezkednek el és ennél fogva bárminek a kibővítését beindítják, amely ebbe a helybe van klónozva.

A reakciókeverék egy részét 1 % -os agaróz gélen elemezzük és markerekkel hasonlítjuk össze. A JG2 kibővítése egy mintegy 2kb-s fragmentumot eredményez; a JG3-é egy mintegy 1 kb-s fragmentumot. A maradék reakciókeveréket fenol/ kloroformmal extraháljuk 10 mmól/1 EDTA és 1 %-os SDS jelenlétében és a DNS-t etanolos kicsapással kinyerjük. A kibővített anyagot ezután 20 egység EcoRI-gyel emésztjük 60 percen át 37° C hőmérsékleten, majd 1,0 %-os LGT agaróz gélen különítjük el TAE -ben. A fragmentumokat azután várhatóan méretében csökkentjük és eluáljuk, majd tisztítjuk Elutip alkalmazásával (S + S). A JG2 és JG3 beiktatásokat EcoRI -gyei emésztett pUC13 -mai ligáljuk és E. coli TG1 törzsbe transzformáljuk. A rekombinánsokat fehér telepekként azonosítjuk

X. gal/L-Amp lemezeken (L-agar lemezek 100/ig/ml ampicillinnel és

-320,5 mg/ml X. gal - lal kiegészítve), és ellenőrizzük kisléptékű plazmidpreparátumokkal, valamint EcoRI restrikciós enzimes emésztéssel, hogy meghatározzuk a DNS beiktatás méretét. A JG2 beiktatást tartalmazó rekombináns plazmidot DM415 -nek nevezzük, és a JG3 beiktatást tartalmazó rekombináns plazmidot DM416 -nak nevezzük.

A JG2 beiktatás szekvenciáját a plazmid DNS közvetlen kettős szálú szekvencia elemzésével, és M13 szekvenciaelemző vektorokba, pl. mpl8 és mpl9 vektorokba való szubklónozással és azt követő egyszálú szekveanciaelemzéssel határozzuk meg. A JG3 beiktatás szekvenciáját hasonló módon határozzuk meg. Az így kapott DNSés következtetett aminosav-szekvenciákat a SEQ ID NO : 3 illetve 4-nél mutatjuk be.

6. PÉLDA. A PT-NANBH polipeptidek kifejeződése E.coliban

A pDM416 plazmidot (5_vM.g) EcoRI-gyel emésztjük (20 egység) 20/41 végső térfogatban, és az 1 kb-s beiktatást 1 % agaróz gélről végzett eluálással kinyerjük. Ezt az anyagot azután kiegyenesítjük Klenow fragmentum és dNTP keverék alkalmazásával, hogy a túlnyúló EcoRI végeket betöltsük. A DNS-t etanolos kicsapással, majd ezt követően fenol/kloroformos extrahálással kinyerjük. A tompa végű fragmentumokat Smal-gyel hasított és foszfatázzal kezelt pDEV107-be ligáljuk (ez olyan vektor, amely lehetővé teszi lacZ klónozását a 3’ végen), majd E. coli TG1 sejtekbe transzformáljuk. Mintegy harmincszoros növekedés lép fel az egyedül vektort tartalmazó kontrollokhoz viszonyítva. A kívánt rekombináns plazmidot tartalmazó transzformánsokat hibridizálással azonosítjuk, a hibridizálást a JG3 rekombináns PCR kibővítésével kapott radioaktív vizsgáló mintával végezve. 12 telepet elemzünk plazmid minipreparátumok restrikciós enzimes (Sál I) elemzésével, hogy meghatározzuk a beiktatás orientációját. Ezeknek a rekombinánsoknak a negyede • ·<· ·

-33van korrekt orientációban a PT-NANBH kifejezéséhez β -galaktozidázzal képzett fúziós termékként. Ezek egyikét (pDX113) további elemzésnek vetjük alá.

A pDX113 egy telepét alkalmazzuk 50 ml L-tápközeg beoltásához, ezt 37° C hőmérsékleten növesztjük rázatás közben a közép-log fázisig, és a kifejeződést 20 mmól/1 IPTG hozzáadásával indukáljuk. 3 óra múlva a sejteket 20 percen át 5000 g-nél végzett centrifugálással kinyerjük, újra szuszpendáljuk, grammonként 5 ml pufferral [25 mmól/1 írisz. HC1, 1 mmól/1 EDTA, 1 mg/ml lizozim, 0,2 % (térfogat/térfogat) Nonidet-P40 (pH 8,0)], és 0° C hőmérsékleten inkubálunk 2 órán át. A kibocsátott bakteriális DNS-t emésztjük DN-áz I és MgSO4 hozzáadásával 40/tg/ml, illetve 2 mmól/1 koncentrációig, hogy a viszkozitást csökkentsük. Ezt a nyers lizátumot PAGE-val elemezzük és a fehérjék mintasorozatát Coomassiekékkel festjük. Egy mintegy 150 kD fehérje indukálódik a pDX113-at tartalmazó baktériumokban és erről a fehérjéről úgy becsüljük, hogy mintegy 10-15 %-át teszi ki az összes fehérjének. Hasonló géleket viszünk át PVDF membránra (GRI, Dunmow, Essex, Egyesült Királyság) és a membránokat PT-NANBH pozitív és negatív szérumokkal inkubáljuk; a 150 kD-s fehérje reagál az A és Az L szérumokkal, nem reagál viszont a normál humán szérummal. A y3 -galaktozidázt kifejező E. coliból való lizátumot tartalmazó kontroll vonalak nem reagálnak sem A, sem L, sem normál humán szérumokkal.

A nyers lizátumhoz 6 mól/1 végső koncentrációig karbamidot adunk, és az oldhatatlan anyagot centrifugálással eltávolítjuk. A 6 mól/literes karbamidos extraktumot mikrotitráló lemezek közvetlen burkolásához használjuk 1 órán át 37° C hőmérsékleten, Az üregeket háromszor mossuk kétszer desztillált vízzel, majd blokkoljuk 20 percen át 37° C hőmérsékleten üregenként 0,25 ml 0,2 %-os BSA

-34hozzáadásával, amely még 0,02 % NaN3 -at is tartalmaz. A lemezeket azután leszívatjuk. A kontroll lemezek egy -galaktozidáz-termelő E.coli törzs (pXY461) nyers lizátumával vannak burkolva, ezeket azonos módon állítjuk elő, mint ahogyan fentebb leírtuk. Ezeket a lemezeket alkalmazzuk az ELISA vizsgálatokhoz, amint ezt a 10. példában leírjuk.

7. PÉLDA: PT-NANBH polipeptid kifejeződése rovarsejtekben.

A JG3-ból az 5. példa szerint izolált PT-NANBH beiktatást keretben klónozzuk a pAc360 vektorban [Luckow és Summers: Biotechnology, 6, 47-55 (1988)] levő polihedrin első 34 nukleotidjával, hasznosítva a gtll vektorban levő lacZ gén leolvasó keretéről való ismereteinket. Olyan oligonukleotidokat szintetizálunk, amelyek képesek hibridizálni az EcoRI klónozó helyet szegéllyező gtll szekvenciákkal, és amelyek képesek a beiktatás kibővítésére PCR-rel. Ezek az oligonukleotidok foglalnak magukban megfelelően elhelyezett BamHI restrikciós helyeket, hogy lehetővé váljék a közvetlen klónozás a pAc360 BamHI helyébe, így helyezve el a beiktatott gént keretben a polihedrin amino-terminális szekvenciáival.

Kis mennyiségű gtll rekombináns JG3 -at forralunk, hogy feltárjuk a DNS-t, majd ezt PCR kibővítési reakcióban alkalmazzuk, amely d75 és d76 oligonukleotid primereket (SEQ ID NO : 6 és 7 ; 200 mg), és 0,5 egység Taq polimerázt tartalmaz.

A kibővítés után a reakciókeveréket azonos térfogatú fenol/kloroformmal extraháljuk, etanollal kicsapjuk, és 10 egység BamHI-gyel emésztjük 30//1 végső térfogatban. A kibővített fragmentumokat 1 % agaróz gélen elválasztjuk, eluáljuk, és BamHI -gyei emésztett pAc360-hoz ligáljuk, hogy a pDX119 transzfer konstrukciót megalkossuk. A rekombináns plazmidot (2/*g) és a vad típusú AcNPV DNS-t « · ·

-35(1./ g) együtt fertőzzük át rovarsejtekbe kalcium-foszfátos kicsapással. A zárvány negatív rekombináns vírusokat vizuális átvizsgálással kiszelektáljuk. A tarfolttisztítás három menete után a rekombináns vírust (BHC-5) tenyésztjük és a rekombináns fehérje kifejeződést a rovarsejtekben megbecsüljük SDS-PAGE-vel, Western foltképzéssel és ELISA-val. A fertőzött sejtekben mintegy 70 kDa-os, gazdagon kifejezett fehérje termelődik. Ez a fehéije a Western foltképzés és ELISA alapján PT-NANBH-val reaktív.

Egy további Baculovirus rekombinánst (BHC-7) alkotunk meg, amely a BHC-5 szekvenciában jelen levő JG3 szekvenciákon kívül magában foglal JG2 szekvenciákat is, amint ezt az 1. ábrában bemutatjuk. A JG2 -ben jelen levő PT-NANBH szekvenciákat kibővítjük és pAc360-ba klónozzuk, amint fentebb leírtuk, hogy előállítsuk a pDX118-at, és a pDX119 és pDX118megfelelő BamHI/Sall fragmentumait összekapcsoljuk egymással abból a célból a pAc360 -bán, hogy megalkossuk a pDX122 transzfer konstrukciót.

A rekombináns plazmidokat hibridizálással azonosítjuk, és a beiktatott DNS orientációját restrikciós enzimes elemzéssel meghatározzuk. A fentebb leírtak szerint rekombináns vírust állítunk elő, és a kifejezett fehérjét SDS-PAGE-val elemezzük. Nagyon bőségesen kapunk 95 kDa-os polipeptidet (a teljes sejtfehérje 40 % -a), a ferttozött sejtekben, amely polipeptid reagál a PT-NANBH szérummal.

8.PÉLDA. A DX119 polipeptid tisztítása.

E. coli TGA törzset, amely a pDX113 plazmidot tartalmazza, növesztünk és inkubálunk 1,5 literes fermentorban (SETOO2 modell, SGI, Newhaven, East Sussex, Egyesült Királyság) 37° C hőmérsékleten 5 órán át. A sejteket 5000 g-nél • · · • ········· ··· · · · · · ·· végzett 20 perces centrifugálással kinyerjük és az alábbi módon kezeljük.

a. / Extrahálás

A nedves sejteket újra szuszpendáljuk (1:20, tömeg/térfogat) A pufferban [50 mmól/1 trisz.HCl, 50 mmól/1 NaCl, 1 mmól/1 EDTA, 5 mmól/1 DTT, 10 % (térfogat/térfogat) glicerin (pH 8,0)]. 5 mg szilárd lizozimot adunk hozzá a szuszpenzió 1 ml-ére számítva és a keveréket 4° C hőmérsékleten állni hagyjuk. 15 perc múlva a keveréket ultrahangos kezelésnek vetjük alá (6/m csúcstól-csúcsig amplitúdó) jégen összesen három percig (6x30 másodperces löketek). 4 .-g DN-áz Iet adunk hozzá 1 ml szuszpenzióra számítva, és e keveréket állni hagyjuk további 30 percig. A szuszpenziót 20 percen át centrifugáljuk 18000 g-nél (maximum), és a felülúszót elöntjük.

Az üledéket újra szuszpendáljuk B pufferban [25 mmól/1 Hepes, 4mól/l karbamid, 5 mmól/1 DIT (pH 8,0)] 1:6 arányban (tömeg/térfogat), hogy finom szuszpenziót kapjunk. Ezt 18000 g-nél (maximum) centrifugáljuk 20 percen át, és a felülúszót elöntjük. Az üledéket újra szuszpendáljuk C pufferban [25 mmól/1 Hepes, 8 mól/1 karbamid, 2 mmól/1 DTT (pH 8,0)] 1:6 arányban (tömeg/térfogat); mielőtt szuszpenzióba vinnénk, a következőket adjuk hozzá: leupeptin (l.g/ml), pepsztatin (1/g/ml), és E64 (L··, g/ml). A szuszpenziót 18000 g-nél (maximum) centrifugáljuk 30 percen át, és a felülúszót dekantáljuk és tároljuk. Az üledéket újra szuszpendáljuk 25 mmól/1 Hepest és 1 % SDS-t tartalmazó oldatban (pH 8,0).

b. / Kromatográfía

A 8 mól/l-es karbamidos frakcióból kapott felülúszót 1:5 arányban (térfogat/térfogat) hígítjuk olyan pufferral, amley 25 mmól/1 Hepest, 8 mól/1 karbamidot és a 2 mmól/1 PTT-t (pH 9,0) tartalmaz, és frakcionáljuk 7 ml-es QSepharose oszlopon. A fehérjéket 0 — > 1 mól/1 NaCl só-gradiensen eluáljuk.

• · ·

-37A kromatográfiát és az adatok beállítását FPLC-vel (Pharmacia) szabályozzuk. A DX113 mintegy 500 mmól/1 NaCl-nél eluálódik, és SDS PAGE, valamint Western folt elemzés alapján gyakorlatilag homogén.

9. PÉLDA ABHC-5 polipeptid tisztítása

Sf9 sejteket (2 . 10⁹ ) fertőzünk BHC-5 rekombináns vírus (moi 5) törzs tenyészetével. 28° C hőmérsékleten 2 napon át végzett inkubálás után a sejteket kinyerjük és az alábbiak szerint dolgozzuk fel.

a./ Extrahálás

A nedves sejttömeget (1,2 g) újra szuszpendáljuk 6 ml A pufferban [25 mmól/1 Hepes, 5 mmól/1 DTT, 1 xg/ml leupeptin. 1/, g/ml pepsztetin, l/.-g/ml E64 (pH 8,0)].Az újra szuszpendált sejteket jégre helyezzük és ultrahangos kezelésnek vetjük alá 3 . 15 másodperces lökésekkel (6^ m csúcstól-csúcsig amplitúdó), amelyeket 30 másodperces nyugalmi időszakok szakítanak meg. Az ultrahangos kezelés utáni szuszpenziót 18000 g-nél (maximum) centrifugáljuk 20 percen át, és a felülúszót elöntjük. Az üledéket újra szuszpendáljuk 6 ml A pufferban, amely még 4 mól/1 karbamidot is tartalmaz, és centrifugáljuk 18000 g-nél (maximum) 20 percen át. A felülúszót elöntjük és az üledéket újra extraháljuk 6 ml A pufferban, amely még 8 mól/1 karbamidot is tartalmaz. 18000 g-nél (maximum) végzett 30 perces centrifugálás után a felülúszót elválasztjuk és 1:6 arányban olyan A pufferral hígítjuk, amely 8 mól/1 karbamidot is tartalmaz. Ezt a kivonatot Mono-Q oszlopon kromatografáljuk, amelyet előzőleg azonos pufferral egyensúlyoztunk ki. Az oszlopot 0 — > 1,0 mól/1 NaCl só-gradienssel eluáljuk, amelyet 12 oszloptérfogatban alakítunk ki. A BHC-5 mintegy 0,45 - 0,55 mól/1 NaCl között eluálódik, és SDSPAGE alapján tisztasága 90 % -nál nagyobb. A kitermelés mintegy 70 %.

• · ·

10, PÉLDA. A DX113, BHC-5 és BHC-7 polipeptldek átvizsgálása ELISA-ban Mikro-ELISA lemezeket (96 üreg; Nunc) közvetlenül burkolunk 50 mmól/l-es bikarbónát pufferral [50 mmól/1 nátrium-bikarbonát és 50 mmól/1 mátrium-karbonát, 9,5 pH-ra titrálva, amely vagy a BHC-5 nyers, 6 mól/literes karbamidos lizátumát, vagy a tisztított pDX113-at tartalmazza. A lemezeket 0,2 %-os BSA-val blokkoljuk, majd 30 percen át inkubáljuk 37° C hőmérsékleten 1:20 arányban (baculo) vagy 1:100 arányban (E. coli) hígított szérumokkal. Tween-konyhasó-oldatban (0,85 % konyhasó, 0,05 % Tween 20, 0,01 % Bronidox) végzett mosás után a lemezeket peroxidázzal konjugált kecske anti-humán immunglobulinnal (1:2000) inkubáljuk 30 percen át 37° C hőmérsékleten. A lemezeket ezután Tween-konyhasó oldatban mossuk, majd a szint kifej/eszTjúk a TMB (tetrametil-benzidin . HC1) kromogén szubsztrátum hozzáadásával (100/<1 /üreg) és 20 percen át szobahőmérsékleten végzett inkubálással. A reakciót 50 1 2 mól/literes kénsavoldat hozzáadásával leállítjuk, és az OD450 értéketet meghatározzuk.

4, TÁBLÁZAT

Közvetett anti-humán lg formájú ELISA NANBH antitestek kimutatására

	Baculo BHC-5 (szilárd fázis)	E. coli DX113 (szilárd fázis)
	>2	1.670
Nagy kockázati té-	1.855	1.531
nyezőjű betegek,	1.081	1.015
akik a'yWeJcömeJ	1.842	1.558
vizsgálat szerint	0.526	0.638
pozitívak	>2	1.516
	1.823	1.602
	1.779	1.318
	1.122	0.616
	1.686	1.441

··*· · «

-39(4. TÁBLÁZAT folytatása)

	Baculo BHC-5 (szilárd fázis)	E. coli DX113 (szilárd fázis)
	0.259	0.205
	0.158	0.120
	0.298	0.209
Nagy kockázati té-	0.194	0.111
nyezőjű betegek,	0.282	0.181
akik a	0.263	0.165
vizsgálat szerint	0.184	0.163
negatívak	0.121	0.099
	0.243	0.104
Elfogadott donor	0.224	0.119

A PT-NANBH fertőzés szempontjából nagy kockázati tényezőjű betegek (IVDA, hemofilia) szérumát is a leírtak szerint vizsgáljuk; az összes adatot OD450 leolvasásokban fejezzük ki az elfogadott donorral, mint egy negatív kontrollal.

(Az elfogadott donor szolgál negatív kontrolként)) Ebben a 19 tagú csoportban 10 pozitív eset van mindkét szilárd fázison.

További tisztított DX113 -at konjugálunk alkálikus foszfatázhoz SATA/maleimid redukciót alkalmazva, és negatívnak ismert szérumokat hígítunk, a hígítást az elfogadott donor szérumhoz igazítva, és hozzáadjuk BHC-7-tel burkolt szilárd fázishoz. Vagy ezzel egyidejűleg, vagy inkubálás után (30 perc, 37° C) hozzáadjuk a DX113 konjugátumot (50/;l, 1:2000). 37° C hőmérsékleten 30 percen át végzett

4ο inkubálás után a lemezeket 50 mmól/1 bikarbónát pufferral mossuk, a szint kifejlesztjük IQ Bio kibővítési rendszer alkalmazásával, és az OD492 értéket meghatározzuk (5. táblázat).

5. TÁBLÁZAT

Immunometriás (jelzett polipeptides) ELISA a NANB antitestek kimutatására.

Vizsgálatban	Vizsgálatban	Elfogadott donor
pozitív	negatív
>2	0.217	0.234
0.821	0.252
>2	0.214
0.542	0.257
0.876	0.308
1.583	0.278
>2	0.296
>2	0.273
1.830	0.262
>2	0.251

így akár formát-antiglobulin, akár immunometriás vizsgálatot végeztek, valamennyi nagy kockázatú mintavétel azonos eredményre vezetett.

11. PÉLDA. Vakcina kiszerelés

Hagyományos módon készítünk vakcina kiszerelést az alábbi összetételű és mennyiségű alkotószerekből:

PT-NANBH vírus polipeptid

Tiomerzal

Nátrium-klorid

Víz > 0.36 mg

0.04 -0,2 mg < 8.5 mg ml-ig

-4112. PÉLDA. PT-NANBH polipeptldek elleni monoklonális antitestek

A DM415-ből való DNS beiktatást a p36C Baculovirus transzfer vektorba szubklónozzuk, és rekombináns vírust állítunk elő lényegében hasonló módon, mint ahogyan a 7. példában leírtuk. A rekomnbináns vírust BHC-l-nek nevezzük; ez nagyon alacsony szinten fejez ki PT-NANBH-ra fajlagos fehérjét. BHC-l-gyel fertőzött SF-9 sejteket (5 . 10⁷ sejt/ml) lizálunk 1 % (térfogat/térfogat) NP40-et is tartalmazó PBS-ben, és 13000 g-nél centrifugáljuk 2 percen át. A felülúszót átengedjük Extactigel-D-n(Pierce Chemicals), hogy a detergenst eltávolítsuk, majd összekeverjük komplett Freund-féle adjuvánssal 1:1 arányú emulzió formájában. Egereket injektálunk szubkután 0,1 ml-es emulziókkal (ez 5.10⁶ sejtnek felel meg). Az injekció után 14 és 28 nappal az egereknek emlékeztető oltást adunk BHC-5-tel fertőzött Sf-9 sejtek detergens-mentes extraktumának 0,1 ml-e (amely 5.10⁶ sejtnek felel meg) formájában (a BHC-5 a DM416 DNS-beiktatását tartalmazza). A farkakból vérmintákat veszünk és ELISA-val megvizsgáljuk anti-PT-NANBH aktivitásra (10. példa). Két egérnek, amelyek PT-NANBH-ra fajlagos választ adnak, újabb emlékeztető oltást adunk BHC-7-tel fertőzött Sf-9 sejtek detergens-mentes extraktumának intravénás injekciója formájában [a BHC-7 egy olyan DNS beiktatást tartalmaz, amely a DM415 és DM416 átfedő területeinek együttes ligálásával alakult ki (7. példa)]. Három nappal később a lépeket kiemeljük.

A lépsejteket fuzionáljuk NSo mielóma sejtekkel PEG1500 jelenlétében, standard technikákat alkalmazva. Az így létrejövő hibridóma sejteket HAT tápközegen (Hipoxantin, Aminopterin, Timidin) végzett növesztés segítségével választjuk ki.

10-11 nappal a fúzió után a felülúszókat ELISA-val átvizsgáljuk anti-PT-NANBH aktivitásra. Azokat az üregeket, amelyek reaktivitást mutatnak mind DX113, mind BHC-7 antigénekkel (10. példa), azonosítjuk és az egyes telepeket külön-külön

-42• ··· ···· • · ···· ·· · ··· · · ··· · · üregekbe átvisszük, növesztjük és átvizsgáljuk. Azokat az üregeket, amelyek ebben a stádiumban fajlagos aktivitást mutatnak, tovább klónozzuk korlátozott hígitásos módszerrel, hogy biztosítsuk a monoklonalitást.

13. PÉLDA PT-NANBH vírus nukleinsav kimutatása szeropozitív betegekben Szérumok: 1400 donorból, akiket a várható transzfúzió utáni hepatitisz tanulmányozásához berendeltünk, vett vérmintákat -20° C hőmérsékleten lefagyasztjuk. Hasonlóképpen tároljuk 260 befogadóból transzfúzió előtt és transzfúzió után vett mintákat. Transzfúzió utáni mintákat a 3. hónapig két heteként, majd a 6. hónapig havonta, ezután pedig 6 havonként egészen a 18. hónapig veszünk. Fagyasztott donor- és befogadó szérumok is állnak rendelkezésre a tanulmányhoz az 1981. évben előfordult 3 PT-NANBH esetből. A PT-NANBH diagnózisa a szérum alanin-amino-transzferáz (ALT) emelkedésén alapul; ez akkor pozitív, ha legalább két külön mintában a mért érték meghaladja a normális érték 2,5-szörösét. Szerológiai vizsgálatokkal kizárjuk az egyéb hepatotropikus vírusokat, és hagyományos klinikai és laboratóriumi tanulmányokkal kizárjuk a nem vírus-okozta májsejt-sérüléseket.

Immunassay. Szérum-mintákat vizsgálunk HCV (C100 antigén) jelenlétére az Őrt Diagnostics ELISA készlet segítségével, a gyártó útmutatásaival összhangban. Az ismételten reaktív szérumokat a végpontig titráljuk anti-ClOO-ra negatív humán szérumban PT-NANBH vírus szekvenciák kimutatására. Szérum vagy plazma RNS-t extrahálunk, reverz átírásnak vetjük alá, és az alább leírtak szerint kiterjesztjük. A fordított átírási/PCR oligonukleotid primerek a 3. példa szerint izolált JG2 klón nukleotid szekvenciájából származnak; ezeket Applied Biosystems 381 A szintetizáló berendezésen állítjuk elő. A négy oligonukleotid primer szekvenciája az alábbi:

Jelölés d94 sense d95 antisense

NI sense

N2 antisense

SEQ ID NO:

A termék mérete

729bp

402bp (i) RNS extrahálás.

5-50 1 szérumot (vagy plazmát) 200 fi. 1-re töltünk fel steril desztillált víz hozzáadásával. A 200 1-es mintát hozzáadjuk azonos térfogat 2XPK pufferhoz [2XPK = 0,2 mól/1 trisz.HCl(pH 7,5), 25mmól/l EDTA, 0,3 mól/1 NaCl, 2 % (tömeg/térfogat) SDS, 200 f g/ml K proteináz], összekeverjük, és 37° C hőmérsékleten 40 percig inkubáljuk. A fehérjéket eltávolítjuk kétszer extrahálva fenol/kloroformmal és egyszer extrahálva csak kloroformmal. A vizes fázishoz 20/· g glikogént adunk, majd az RNS-t 3 térfogat jéghideg abszolút etanol hozzáadásával kicsapjuk. -70° C hőmérsékleten 1 órán át végzett tárolás után az RNS-t Eppendorfcentrifugában üledékbe visszük (15 perc, 14000 fordulat/perc, 4° C). Az üledéket egyszer mossuk 95 %-os etanollal, vákuumban kiszárítjuk, és feloldjuk 10 ytl steril desztillált vízben. Az RNS oldatot -70° C hőmérsékleten tároljuk.

(ii) cDNS szintézis χΐ keveréket állítunk elő, amely 2 fi 1 RNS oldatot, 50 ng d95 szintetikus oligonukleotidot, 10 mmól/1 Hepes . HCl-t (pH 6,9) és 0,2 mmól/1 EDTA-t (pH 8,0) tartalmaz. Ezt a 10 1 keveréket felülrétegezzük 2 csepp ásványolajjal, 2 percen át

-44• · · · · • · • · • · melegítjük 90° C hőmérsékletű vízfürdőben és gyorsan lehűtjük jégen. cDNS szintézist végzünk 20/ \ 1 végső térfogatban, miután a reakciókeveréket úgy állítottuk be, hogy 50 mmól/1 trisz. HCl-t (pH 7,5), 75 mmól/1 KCl-t, 3 mmól/1 MgCh-t, 10 mmól/1 DTT-t, 0,5-0,5 mmól/1 dATP-t, dCTP-t, dGTP-t és dTTP-t, 20 egység RNáz inhibitort (Pharmacia) és 15 egység klónozott MLV reverz transzkriptázt (Pharmacia) tartalmazzon. A 20 /< 1-es keveréket 37° C hőmérsékleten inkubáljuk 90 percen át. A szintézis után a cDNS-t -20° C hőmérsékleten tároljuk.

(iii) Illesztett PCR

Ennek a tanulmánynak a keretében a téves pozitív PCR eredményeket úgy kerülhetjük el, hogy szigorúan alkalmazzuk Kwok és Higuchi fertőzés elkerülésére szolgáló intézkedéseit [Natúré 339. 237-238 (1989)].

a./ 1. menet.

A polimeráz láncreakciót 50/:1 keverékben hajtjuk végre, amely a következőket tartalmazza: 10 mmól/1 trisz.HCl (pH 8,3), 50 mmól/1 KC1,1,5 mmól/1 MgCh, 0,01 % (tömeg/térfogat) zselatin, 1 egység rekombináns Taq DNS polimeráz (Perkin Elmer Cetus), és 200-200 h mól/1 az egyes dNTP-kből, 30-30 ng az egyes külső primerekből (d94 és d95, SEQ ID NO : 8, illetve 9), és 5/í 1 cDNS oldat. 5 perces, 94° C hőmérsékleten végzett denaturálás után 35 ciklust végzünk az alábbi munkamenet szerint: 95° C 1,2 percig, 56° C 1 percig, 72 ° C 1 percig; ezt egy 7 perces időtartam követi 72 ° C hőérsékleten (Techne PHC-1 Automated Thermal óycler) • · · · « • «

b. / 2. menet.

A fenti 1. menetnél leírt reakciókeveréket alkalmazzuk, de a d94 és d95 külső primerek helyett 125-125 ng belső prímért, Nl-et és N2-t (SEQ ED NO : 10 ületve 11) alkalmazunk. Az 1. menet PCR termékének 1 ^J-eíalikvotját átvisszük a 2. menet 50/J-es reakciókeverékébe. 25 ciklust végzünk az alábbi munkamenet szerint: 95° C

1,2 percig, 46° C 1 percig, 72° C 1 percig, majd ezután következik egy 7 perces időtartam 72° C hőmérsékleten.

c. / Elemzés

20-20 /1 1. menet és 2. menet PCR terméket elemzünk elektroforézissel 2 %-os agaróz gélen. A csíkokat etídium-bromidos festéssel tesszük láthatóvá, és 302 nmnél besugározzuk.

Az anti-HCV szerológia és PCR jósolt értéke az áttekintő tanulmányban: az áttekintő tanulmányba bevont 14000 donorból 6-ról (0,43 %) derült ki, hogy szérumában antitestek vannak Cloo ellen. Ebből a 6 antitest-pozitív donorból csak egy donor (D6 donor) bizonyul fertőzőnek, amint ezt egy befogadóban (R6 befogadó) a PT-NANBH és cioo szerokonverzió kifejlődésével igazoljuk -lásd a 6. táblázatot. Vírus szekvenciákat mutatunk ki a PCR-rel a D6 donor szérumában, de a további 5 szeropozitív donor szérum egyikében sem. Az R6 befogadó, aki PTNANBH-t fejleszt ki, korábban hét más donortól is kapott vért (D7->D13). Az ezektől a donoroktól vett vért megvizsgáljuk és mind antitest-negatívnak, mind PCR negatívnak találjuk.

• « « · ·

6. TÁBLÁZAT DONQR/BEFOGADÓ ADATOK ÖSSZEFOGLALÁSA: ÁTTEKINTŐ TANULMÁMY

DONOROK

BEFOGADÓK

Donor	anti-HCV	PCR	Befogadó	PT-NANBH Anti-HCV
				szerokon verzió

Dl	+	RÍ	Nem	Nem
D2	+	R2	Nem	Nem
D3	+	R3	Nem	Nem
D4	+	R4	Nem	Nem
D5	+	R5	Nem	Nem
D6	+	+
D7	-
D8	-
D9	-
		R6	Igen*	Igen*
D10	-
Dll	-
D12	-
D13

* 1 hónap ínkubálási idő + A szerokonverzió 5 hónappal a transzfúzió után történik.

• · · · · ·» • ···· · · ·

-47A 2. példában előállított lambda gtll könyvtárakat is átvizsgáljuk a PT-NANBH-ra nagy kockázatú betegekből számazó szérumokkal, amelyek azonban nem reagálnak a DX113, BHC-5 és BHC-7 vírus antigénekkel; ennek oka bizonyára az, hogy ezek ezektől eltérő antigéneket ismernek fel. A PJ-5 (The Newcastle Royal Infirmary, Newcastle), Birm-64 (Quen Elizabeth Medical Centre, Birmingham), PG és Le (University College and Middesex Schod of Medicine, London) szérumok kielégítik ezeket a követelményeket és alkalmasak e könyvtárak átvizsgálására ugyanazt a munkamenetet követve, mint amelyet a 3. és 4. példában leírtunk. Ilyen módon egy sor rekombinánst azonosítunk, amelyek egyike sem kereszt-hibridizál a JG2 -s JG3ból készített vizsgáló mintákkal. A rekombinánsok egyikét, a BRll-et, amelyet a PJ-5-tel végzett reakcióval azonosítunk, választjuk ki a további elemzésre.

A BR11 klón tartalmaz egy mintegy 900 bp-s beiktatást, amelyet PCR-rel kibővítünk d75 és d76 primereket alkalmazva (SEQ ID NO: 6 és 7), amint ezt a 7. példában leírtuk. A kibővített szekvenciát közvetlenül klónozzuk a pAc360 Baculovirus vektorba, hogy kialakítsuk pDX128-at, amely egy nyitott, a polihedrin első 11 aminosavával fázisban levő leolvasó keretet tartalmaz. Rekombináns Baculovirus törzsoldatokat (amelyet BHC-9-nek nevezünk) állítunk elő azt a munkamenetet követve, amelyet a 7. példában leírtunk. Rovarsejteket fertőzünk a tisztított rekombináns vírussal, és egy mintegy 22 kD-s polipeptidet kapunk a radioaktívan jelzett sejtkivonatokban.

A BR11 kibővített beitatását pUC13 és M13 fág vektorokba is klónozzuk szekvencia elemzés céljából: a DNS- és aminosav szekvencia-adatokat a SEQ ID NO : 5-ben mutatjuk be. A beiktatás 843 bp-t tartalmaz, továbbá tartalmazza az EcoRI kapcsolókat, amelyeket a klónozás során adtunk hozzá.

- 4S -

15. PÉLDA, A BHC-9 polipeptid teljesítménye ELISA-ban.

ELISA mérést alakítunk ki BHC-9-cel fertőzött sejtek kivonataival burkolt mikrotitráló lemezeket és egy anti-humán lg konjugátum kimutatható rendszert alkalmazva, és a 10. példában leirt munkamenetet követve. Nagy kockázatú szérumok sorozatát párhuzamosan vizsgáljuk BHC-7 és BHC-9 ellen, és megvizsgáljuk PCR-rel is, a 13. példában leirt munkamenetet alkalmazva. Az eredményeket a 7. táblázatban mutatjuk be, amelyben a pozitív mintákat aláhúzzuk.

7, TÁBLÁZAT

	PCR	BHC-2	BHC-9
1	+	2.09	2.00
2	+	2.09	2.00
3	+	1.89	L2Z
4	+	K52	0.27
5	+	1.26	2.00
6	+	0.91	2.00
7	-		0.51
8	+	0.84	L12
9	-	0^	0.43
10	-	0.45	2,00
11	+	0.37	KfiZ
12		0.32	2.00
13		0.23	0.30
14		0.15	0.43
15	+	0.16	0.76
16		0.09	1.74
17		0.27
18		0.15	2J&
19		0.12	2.00
20		0.08	0.05
határ-		0.27	0.29
helyzet

• · · · · • · · • · · · · • · · ·

A 20 minta mintegy 50 %-a világosan pozitiv BHC-7-tel, mig 85 %-a pozitiv BHC-9-cel. Két minta (11. és 12.; , a mely a pozitivitás pozitiv BHC-9-cel, határértékén van BHC-7-tel, világosan és néhány minta, amely határhelyzetben

BHC-7-tel, pozitív 3HC-9-cel. Ezen kívül két minta a polipeptidekkel, mind PCR-rel.

16. PÉLDA. Meglevő kiónokat átfedő PT-1TANBH DITS szekvenciák izolálása.

A cDITS kifejező könyvtáraknak a 3, 4, és 14. példákban le irt immunológiai átvizsgálása csak azokat a kiónokat szóno vitésére, amelyek átfedik a meglevő kiónokat. Primerek kész létéit készíthetjük el, ahol a pár egyik tagja a meglevő klónozott szekvenciákon belül fekszik, mig a másik azon kívül dé párjaira is

1. példa szerint előállított cDNS-t PCR-rel kibővítünk vagy egyedi, vagy illeszkedő párokban levő primerekkel, a

13. példában leirt reakciókörülményeket alkalmazva. A megkö zelítéseket a következő primer-párok alkalmazásával szemléltétjük • ··· ···· • · ···· ·· · ··· · · ··· ··

- 51 dl64 (_^SEQ ^ID ^^T0 · 12J θθ dl37 (sEQ ID NO : 13) ; dl36 <SEQ ID NO : 14) és dl55 [SEQ ^{ID N0 :} !5) ; dl56(SBQ ID NO : 16/ és d92 [SEQ ID NO : 17j. Az egyes párok egyik tagját’ úgy tervezzük, hogy beindítsanak a meglevő klónozott szekvenciákon belül (a dl37 és dl3ő beindítanak a BR11 5’ illetve 3’ végein belül; a d92 beindít a JG3 5’ végénél) . A további primerek olyan szekvenciákon alapulnak, amelyek más PT-NANBH anyagoknál állnak rendelkezésre. A dl64 primer Okamoto és munkatársai közleményében [japan J. Sxp. Med. 60, 167-177J szereplő 2. ábra 10-31 bázisainak felel meg. A d!55 és dl% a 88310922.5. számú európai szabadalmi bejelentés 47. ábrájában levő 462—489·, illetve 3315—3337. helyeknek felelnek meg. Egy vagy több nukleotid helyettesítést hajtunk végre, hogy bevezessünk egy EcoRI felismerő helyet a primerek 5’ végénél, kivéve a dl64-et, ahol egy BglII felismerő helyet vezetünk be; ezek a változtatások megkönnyítik a kibővített termék ezt követő klónozását.

A POR terméket a megfelelő restrikciós enzimmel vagy enzimekkel emésztjük, agaróz gél elektrolízissel szétválasztjuk, és a várt méretű csikókat kimetsszük, és klónozzuk mind plazmid, mind bakteriofág vektorokba, amint ezt az 5. példában leírtuk. A kibővített DNS-ek szekvenciáit (164/137 : SEQ ID NO : 18) [136/155 : SEQ ID NO : 19)^156/92 : SEQ ID

NO : 20) a szekvencialistában mutatjuk be. Ezek az új szekvenciák kiterjednek a PT-NANBH genom átfedésén túl az immunátvizsgálással kapott szekvenciákig ( SEQ ID NO : 3, 4, és 5^·

• · ·

- 52 Ezek a szekvenciák más szekvenciákkal együtt amelyek a már leirt területeken belül fekszenek, kombinálhatok összefüggő szekvenciává a PT-NANBH genom 5* végén. ^SEQ ID NO : 21) és 3’ végén ^SSQ ID NO : 22;.

17» PÉLDA. Különböző PT-NANBH antigének fúziója egyetlen rekombináns aolipeptiddé.

A 7· táblázatban bemutatott adatok azt jelzik, hogy bár több szérum-minta mutatható ki antitest-pozitivként BHC-9, mint cél-antigén alkalmazásával ( 17/20j, mint BHC-7 alkalmazásával 1^10/20), van néhány minta ^pl. a 4./ , amely csak BHC-7-tel pozitív. Ezt a képet a minták szélesebb körű átvizsgálása alátámasztja.

Következésképpen egy íuzios

zékot alakítunk ki BHC-7-ből és ciákat alkalmazva.

A BHC7-ből és a BHC-9-ből származó szekvenciákat sokféle úton kombinálhatjuk. Bármelyik szekvenciát elhelyezhetjük a keletkező fúziós termék amino-terminálisán, es a kapcsoló szekvencia természetét is változtathatjuk. A 2. ábra mutatja be azt a két lehetséges útat, amelyben a szekvenciák kombinálhatok.

A megfelelő restrikciós enzimhelyeket és kapcsoló szekvenciákat hordozó megfelelő restrikciós fragmentumokat kialakíthatjuk vagy PCR-rel speciális primereket alkalmazva, vagy meglevő plazmidok restrikciós enzimes emésztésével. A DX143 transzfer vektor egy, a DX122-ből származó BamHI/PstI fragmentumból í 1. ábra; a PstI hely a JC-2 1504· helyénél • · · • · ···· ·· 4 ··· 4 4 Λ 4 · 4 4

- 53 van; SEQ IE NO : 3^ áll a ERII teljes kódoló területének

SEQ ID NO : 7J 5* végéhez kapcsolva, amely vektor

Pstl/BamHI fragmentumként ki van bővítve d24 (_SEQ ID NO : 23/ és d!26 \ SEQ ID NO : 24] nrimerek alkalmazásával; a kapcsoló /

terület hat aminosavból áll, amelyek a dlPő primerből és a maradék bakteriofág lambda szekvenciákból származnak. A DXI36 transzfer vektor annyiban különbözik a DX143-tól, hogy a BR11 fragmentumot d24 (SEQ ID NO : 23y és dl32 fSEQ ID NO : 25 j alkalmazásával alakítjuk ki és igy a kapcsolási terület 5 lizint tartalmaz. Ezeket a transzfer vektorokat alkalmazzuk Sf9 rovarsejtek együtt-transzformálására AcNPV DNS-sel megfelelő környezetben, és rekombináns Baculovirusok tarfolt-tisztitott készleteit állítjuk elő, amint ezt a 7. példában leírtuk. A BHC-lO-et úgy alakítjuk, ki, mint a DNl43-nal végzett átfértőzés eredményét; a BHC-ll-et pedig, mint a DX136-tal végzett átfertőzés eredményét.

Az ez által a két vírus által kifejezett rekombináns polipeptideket SDS PAGE-vel és Testem folt képzéssel elemezzük. A BHC-1O egy 118 kD-a látszólagos molekula tömegű polipeptidet termel. A BHC-11 egy 95 kD látszólagos molekulatömegű polipeptidet termel. Mindkét polipeptid reagál olyan szérumokkal, amelyekről ismert, hogy ELISA-ban vagy csak BEC-7-tel l^pl. A szérűin/ vagy csak BHC-9-cel Bő4 szérum,

14. példa reagálnak. A két polipentid csak a kapcsoló székj venciában különbözik, ás ez hatással lehet vagy esek mobilitására SDS-PAGE-on, vagy arra, hogy ezek hogyan dolgozódnak fel a fertőzött sejtekben.

- 54 18. PÉLDA.

A PT-NANBH fúziós antigének teljesítménye

ELISA-ban.

ELISA összeállítást alakítunk ki BHC-9-cel fertőzött sejtek extraktumával burkolt mikrotitráló lemezek és anti-humán lg konjugátum alkalmazásával, a 10. példában leirt munkamenetet követve. A 8. táblázat adja meg a két fúziós termék összehasonlításának adatait a további

PT-NANBH rekombináns antigénekkel \JBHC-7 es BHC-9^ , valamint a C-100-3 HCV rekombináns feherjevel (Ortho Diagnostic Systems, Bariton, New Yerseyj.

A szérumokat a BHC-7-tel, BHC-9-cel és C-100-3-mal végzett reakció-minták szerint csoportosítjuk. Az 1. csoport széru mai erősen reagálnak mindhárom antigénnel; a II. csoport tag jai csak a BHC-9-cel reagálnak erősen, és a IV. csoport tagjai a három antigén közül csak kettőnél reagálnak erősen.

• ··

	8.	TÁBLÁZAT
SZÉRUM	BHC-7	BHC-9	C-100-3	BHC-10	BHC-11
I. csQ.pnrt
AH	>2.0	>2.0	>2.0	>2.0	>2.0
AC	>2.0	>2.0	>2.0	>2.0	>2.0
57	>2.0	>2.0	>2.0	>2.0	>2.0
77	>2.0	>2.0	>2.0	>2.0	>2.0
84	1.4	>2.0	>2.0	>2.0	>2.0
II. csoport
805-6	>2.0	0.261	0.1	1.78	* +
805-17	>2.0	0.181	0.12	1.37	* +
805-149	>2.0	0.651	0.084	1.57	k ++
III. csoport
JS	0.32	>2.0	0.17	>2.0	>2.0
805-57	0.069	1.403	0.25	1.9	k +
805-82	0.116	1.272	0.4	1.85	★ ++
805-94	0.353	1.675	0.2	>2.0	* +
PJ1	0.27	>2.0	0.2	>2.0	1.85
IV. csoport
A	>2.0	0.14	>2.0	>2.0	>2.0
KT	1.57	0.27	>2.0	>2.0	>2.0
Le	0.152	>2.0	>2.0	>2.0	>2.0
PJ5	0.123	>2.0	>2.0	>2.0	>2.0
303-923	>2.0	0.9	0.37	1.9	* +
303-939	>2.0	1.55	0.268	2.0	* +

* Ezeket a mintákat csak Jestern foltképzéssel vizsgáltuk

BHC-ll-en

- 56 Ezek az adatok azt mutatják, hogy mind a BHC-10, mind a

BHC-11 hasonló reaktivitással bírnak ezekhez a szérumokhoz és főleg, hogy mindkét antigenikus aktivitás, úgy tűnik, a fúzióval megőrződik. A II. és III. csoportban levő összes szérum, amely csak BHC-7-tel, illetve csak BHC-9-cel reaa KT minta 1,57 és 0,27 OD-értékeket

OD érték 2,0.

- 57 SZEKVENCIALISTA

SEQ ID NO : 1

A SZEKVENCIA TÍPUSA : Nukleotid

A SZEKVENCIA HOSSZÚSÁGA: 21 bázis

A SZÁL TÍPUSA: egyes

TOPOLÓGIA: lineáris

A MOLEKULA TÍPUSA: szintetikus DNS

EREDETI FORRÁS ORGANIZMUS: lambda gtll bakteriofág

KÖZTES KÍSÉRLETI FORRÁS: oligonukleotid szintetizáló berendezés;

oligo dl9

JELLEMZŐ VONÁSOK: Az 1.-21. bázis között homológ a lambda gtll bakteriofágban az EcoRI helyet szegélyező lacZ gén fölfelé levő részével.

TULAJDONSÁGOK: DNS szintézist indít be a fág vektorból az EcoRI helynél beiktatott cDNS-be.

GGTGGCGACG ACTCCTGGAG C

SEQ ID NO : 2

A SZEKVENCIA TÍPUSA: Nukleotid

A SZEKVENCIA HOSSZÚSÁGA: 21 bázis

A SZÁL TÍPUSA: egyes

TOPOLÓGIA: lineáris

A MOLEKULA TÍPUSA: szintetikus DNS

EREDETI FORRÁS ORGANIZMUS: lambda gtll bakteriofág KÖZVETLEN KÍSÉRLETI FORRÁS: oligonukleotid szintetizáló berendezés; oligo d20

JELLEMZŐ VONÁSOK: Az 1.-21. bázis között homológ a landa gtll bakteriofágban az EcoRI helyet szegélyező lacZ gén lefelé levő részével.

TULAJDONSÁGOK: DNS szintézist indit be a fág vektorból az EcoRI helynél beiktatott cDNS-be

TTGACACCAG ACCAACTGGT A

SEQ ID NO : 3

A SZEKVENCIA TÍPUSA: Nukleotid az annak megfelelő fehérjével együtt

A SZEKVENCIA HOSSZÚSÁGA: 1770 bázispár

A SZÁL TÍPUSA: egyes

TOPOLÓGIA: lineáris

A MOLEKULA TÍPUSA: cDNS genomikus RNS-bol

EREDETI FORRÁS ORGANIZMUS: ember; transzfúz^ó utáni, nem-A,

Θ nem-B hepatitis fertőzött szérum

KÖZVETLEN KÍSÉRLETI FORRÁS: JG2 klón lambda gtll-ben levő cDNS könyvtárból

JELLEMZŐ VONÁSOK: a PT-NANBH poliprotein 1.-1770 bp részlete

TULAJDONSÁGOK: valószínűleg kódol nem-szerkezeti vírus fehér j éket.

CAA Gin

AAT Asn

GAC TTC

CCA Pro 5

GAC GCT Asp Alá

GAC Asp

CTC ATC GAG GCC AAC CTC

CTG Leu 15

TGG Trp

48

Asp

Phe

Leu

Ile 10

Glu

Alá

Asn

Leu

CGG

CAT

GAG

ATG

GGC

GGG

GAC

ATT

ACC

CGC

GTG

GAG

TCA

GAG

AAC

AAG

96

Arg

His

Glu

Met

Gly Gly Asp

Ile

Thr

Arg

Val

Glu

Ser

Glu

Asn

Lys

20

25

30

GTA

GTA

ATC

CTG

GAC

TCT

TTC

GAC

CCG

CTC

CGA

GCG

GAG

GAG

GAT

GAG

144

Val

Val

Ile

Leu

Asp

Ser

Phe

Asp

Pro

Leu

Arg

Alá

Glu

Glu

Asp

Glu

35

40

45

CGG

GAA

GTG

TCC

GTC

CCG

GCG

GAG

ATC

CTG

CGG

AAA

TCC

AAG

AAA

TTC

192

Arg

Glu

Val

Ser

Val

Pro

Alá

Glu

Ile

Leu

Arg Lys

Ser

Lys

Lys

Phe

‘ 55 60 • · • · · ···« · • · • · · • · · · · • ·

CCA Pro 65

CCA GCG ATG Pro Alá Met

CCC GCA

TGG GCA CGC CCG GAT TAC AAC CCT

CCG Pro

CTG Leu 80

240

Pro

Alá 70

Trp

Alá

Arg Pro

Asp 75

Tyr

Asn

Pro

CTG

GAG

TCC

TGG

AAG

GCC

CCG

GAC

TAC

GTC

CCT

CCA

GTG

GTA

CAT

GGG

288

Leu

Glu

Ser

Trp

Lys

Alá

Pro

Asp

Tyr

Val

Pro

Pro

Val

Val

His

Gly

85

90

95

TGC

CCA

CTG

CCA

CCT

ACT

AAG

ACC

CCT

CCT

ATA

CCA

CCT

CCA

CGG

AGA

336

Cys

Pro

Leu

Pro

Pro

Thr

Lys

Thr

Pro

Pro

Ile

Pro

Pro

Pro

Arg Arg

100

105

110

AAG

AGG

ACA

GTT

GTT

CTG

ACA

GAA

TCC

ACC

GTG

TCT

TCT

GCC

CTG

GCG

384

Lys

Arg

Thr

Val

Val

Leu

Thr

Glu

Ser

Thr

Val

Ser

Ser

Alá

Leu

Alá

115

120

125

GAG

CTT

GCC

ACA

AAG

GCT

TTT

GGT

AGC

TCC

GGA

CCG

TCG

GCC

GTC

GAC

432

Glu

Leu

Alá

Thr

Lys

Alá

Phe

Gly

Ser

Ser

Gly

Pro

Ser

Alá

Val

Asp

130

135

140

AGC

GGC

ACG

GCA

ACC

GCC

CCT

CCT

GAC

CAA

TCC

TCC

GAC

GAC

GGC

GGA

480

Ser

Gly

Thr

Alá

Thr

Alá

Pro

Pro

Asp

Gin

Ser

Ser

Asp

Asp

Gly Gly

145

150

155

160

GCA

• GGA

TCT

GAC

GTT

GAG

TCG

TAT

TCC

TCC

ATG

CCC

CCC

CTT

GAG

GGG

528

Alá

Gly

Ser

Asp

Val

Glu

Ser

Tyr

Ser

Ser

Met

Pro

Pro

Leu

Glu

Gly

165

170

175

GAG

CCG

GGG

GAC

CCC

GAT

CTC

AGC

GAC

GGG

TCT

TGG

TCT

ACC

GTG

AGT

576

Glu

Pro

Gly

Asp

Pro

Asp

Leu

Ser

Asp

Gly

Ser

Trp

Ser

Thr

Val

Ser

180

185

190

GAG

GAG

GCC

GGT

GAG

GAC

GTC

GTC

TGC

TGC

TCG

ATG

TCC

TAC

ACA

TGG

624

Glu

Glu

Alá

Gly

Glu

Asp

Val

Val

Cys

Cys

Ser

Met

Ser

Tyr

Thr

Trp

195

200

205

··· ·

ACA GGC Thr Gly

GCT CTG

ATC Ile

ACG CCA TGC

GCT GCG GAG GAA AGC AAG

CTG Leu

CCC Pro

672

Alá

Leu

Thr

Pro Cys 215

Alá

Alá

Glu

Glu 220

Ser Lys

210

ATC

AAC

GCG

TTG

AGC

AAC

TCT

TTG

CTG

CGT

CAC

CAC

AAC

ATG

GTC

TAC

720

Ile

Asn

Alá

Leu

Ser

Asn

Ser

Leu

Leu

Arg

His

His

Asn

Met

Val

Tyr

225

230

235

240

GCT

ACC

ACA

TCC

CGC

AGC

GCA

AGC

CAG

CGG

CAG

AAG

AAG

GTC

ACC

TTT

768

Alá

Thr

Thr

Ser

Arg

Ser

Alá

Ser

Gin

Arg

Gin

Lys

Lys

Val

Thr

Phe

245

250

255

GAC

AGA

CTG

CAA

ATC

CTG

GAC

GAT

CAC

TAC

CAG

GAC

GTG

CTC

AAG

GAG

816

Asp

Arg

Leu

Gin

Ile

Leu

Asp

Asp

His

Tyr

Gin

Asp

Val

Leu

Lys

Glu

260

265

270

ATG

AAG

GCG

AAG

GCG

TCC

ACA

GTT

AAG

GCT

AAG

CTT

CTA

TCA

GTA

GAG

864

Met

Lys

Alá

Lys

Alá

Ser

Thr

Val

Lys

Alá

Lys

Leu

Leu

Ser

Val

Glu

275

280

285

GAA

GCC

TGC

AAG

CTG

ACG

CCC

CCA

CAT

TCG

GCC

AAA

TCT

AAA

TTT

GGC

912

Glu

Alá

Cys

Lys

Leu

Thr

Pro

Pro

His

Ser

Alá

Lys

Ser

Lys

Phe

Gly

290

295

300

TAT

GGG

GCA

AAG

GAC

GTC

CGG

AAC

CTA

TCC

AGC

AAG

GCC

ATT

AAC

CAC

960

Tyr

Gly

Alá

Lys

Asp

Val

Arg

Asn

Leu

Ser

Ser

Lys

Alá

Ile

Asn

His

305

310

315

320

ATC

CGC

TCC

GTG

TGG

GAG

GAC

TTG

TTG

GAA

GAC

ACT

GAA

ACA

CCA

ATT

1008

Ile

Arg

Ser

Val

Trp

Glu

Asp

Leu

Leu

Glu

Asp

Thr

Glu

Thr

Pro

Ile

325

330

335

GAC

ACC

ACC

ATC

ATG

GCA

AAA

AAT

GAG

GTT

TTC

TGC

GTC

CAA

CCA

GAG

1056

Asp

Thr

Thr

Ile

Met

Alá

Lys

Asn

Glu

Val

Phe

Cys

Val

Gin

Pro

Glu

340

345

350

• · ···· · • · • · ·

AGA Arg

GGA GGC CGC AAG

CCA Pro

GCT CGC CTT ATC GTG TTC

CCA GAC TTG GGG

1104

Gly

Gly 355

Arg Lys

Alá

Arg 360

Leu

He

Val

Phe

Pro 365

Asp

Leu

Gly

GTC

CGT

GTG

TGC

GAG

AAA

ATG

GCC

CTC

TAT

GAC

GTG

GTC

TCC

ACC

CTC

1152

Val

Arg

Val

cys

Glu

Lys

Met

Alá

Leu

Tyr

Asp

Val

Val

Ser

Thr

Leu

370

375

380

CCT

CAG

GCT

GTG

ATG

GGC

TCC

TCG

TAC

GGA

TTC

CAG

TAT

TCT

CCT

GGA

1200

Pro

Gin

Alá

Val

Met

Gly

Ser

Ser

Tyr

Gly

Phe

Gin

Tyr

Ser

Pro

Gly

385

390

395

400

CAG

CGG

GTC

GAG

TTC

CTG

GTG

AAC

GCC

TGG

AAA

TCA

AAG

AAG

ACC

CCT

1248

Gin

Arg

Val

Glu

Phe

Leu

Val

Asn

Alá

Trp

Lys

Ser

Lys

Lys

Thr

Pro

405

410

415

ATG

GGC

TTT

GCA

TAT

GAC

ACC

CGC

TGT

TTT

GAC

TCA

ACA

GTC

ACT

GAG

1296

Met

Gly

Phe

Alá

Tyr

Asp

Thr

Arg

Cys

Phe

Asp

Ser

Thr

Val

Thr

Glu

420

425

430

AAT

GAC

ATC

CGT

GTA

GAG

GAG

TCA

ATT

TAT

CAA

TGT

TGT

GAC

TTG

GCC

1344

Asn

Asp

He

Arg

Val

Glu

Glu

Ser

He

Tyr

Gin

Cys

Cys

Asp

Leu

Alá

435

440

445

CCC

GAA

GCC

AGA

CAG

GCC

ATA

AGG

TCG

CTC

ACA

GAG

CGG

CTT

TAT

ATC

1392

Pro

Glu

Alá

Arg

Gin

Alá

He

Arg

Ser

Leu

Thr

Glu

Arg

Leu

Tyr

He

450

455

460

GGG

GGT

CCC

CTG

ACT

AAT

TCA

AAA

GGG

CAG

AAC

TGC

GGC

TAT

CGC

CGG

1440

Gly

Gly

Pro

Leu

Thr

Asn

Ser

Lys

Gly

Gin

Asn

Cys

Gly

Tyr

Arg Arg

465

470

475

480

TGC

CGC

GCG

AGC

GGC

GTG

CTG

ACG

ACT

AGC

TGC

GGT

AAT

ACC

CTC

ACA

1488

Cys

Arg

Alá

Ser

Gly

Vál

Leu

Thr

Thr

Ser

Cys

Gly

Asn

Thr

Leu

Thr

485

490

495

TGT TAC Cys Tyr

TTG AAG Leu Lys 500

GCC TCT

GCA Alá

GCC TGT CGA GCT GCA AAG CTC CAG GAC

Alá

Ser

Alá Cys 505

Arg

Alá

Alá

Lys

Leu Gin Asp 510

TGC

ACG

ATG

CTC

GTG

TGC

GGA

GAC

GGC

CTT

GTC

GTT

ATC

TGT

GAG

AGC

Cys

Thr

Met

Leu

Val

Cys

Gly Asp

Asp

Leu

Val

Val

Ile

Cys

Glu

Ser

515

520

525

GCG

GGA

ACC

CAG

GAG

GAC

GCG

GCG

AGC

CTA

CGA

GTC

TTC

ACG

GAG

GCT

Alá

Gly

Thr

Gin

Glu

Asp

Alá

Alá

Ser

Leu

Arg

Val

Phe

Thr

Glu

Alá

530

535

540

ATG

ACT

AGG

TAC

TCT

GCC

CCC

CCC

GGG

GAC

CCG

CCC

CAA

CCA

GAA

TAC

Met

Thr

Arg

Tyr

Ser

Alá

Pro

Pro

Gly

Asp

Pro

Pro

Gin

Pro

Glu

Tyr

545

550

555

560

GAC

CTG

GAG

TTG

ATA

ACA

TCA

TGC

TCC

TCC

AAT

GTG

TCG

GTC

GCG

CAC

Asp

Leu

Glu

Leu

Ile

Thr

Ser

Cys

Ser

Ser

Asn

Val

Ser

Val

Alá

His

565

570

575

GAT

GCA

TCT

GGC

AAA

AGG

GTA

TAC

TAC

CTC

ACC

CGT

GAC

CCG

nSp

Alá

Ser

Gly

Lys

Árg

Val

Tyr

Tyr

Leu

Thr

Arg

Asp

Pro

580

585

590

1536

1584

1632

1680

1728

1770 ···· ·

SEQ ID NO : 4

A SZEKVENCIA TÍPUSA: Nukleotid az annak megfelelő fehérjével együtt

A SZEKVENCIA HOSSZÚSÁGA: 1035 bázispár

A SZÁL TÍPUSA: egyes

TOPOLÓGIA: lineáris

A MOLEKULA TÍPUSA: cDNS genomikus RNS-ből

EREDETI FORRÁS ORGANIZMUS: ember; transzfúzió utáni, nem-A, nem-B hepatitisszel fertőzött szérum

KÖZVETLEN KÍSÉRLETI FORRÁS: JG3 klón lambda gtll-ben levő cDNS könyvtárból

JELLEMZŐ VONÁSOK: a PT-NANBH poliprotein 1.-1035. bp részlete

TULAJDONSÁGOK: valószínűleg kódol nem-szerkezeti vírus fehér j éket

ACA GAA GTG GAT GGG GTG CGG CTG CAC AGG TAC GCT CCG GCG TGC AAA

48

Thr Glu Val Asp Gly Val Arg Leu His Arg

Tyr

Alá

Pro

A'la

Cys 15

Lys

5

10

CCT

CTC

CTA

CGG

GAG

GAG

GTC

ACA

TTC

CAG

GTC

GGG

CTC

AAC

CAA

TAC

96

Pro

Leu

Leu

Arg

Glu

Glu

Val

Thr

Phe

Gin

Val

Gly

Leu

Asn

Gin

Tyr

20

25

30

CTG

GTT

GGG

TCG

CAG

CTC

CCA

TGC

GAG

CCC

GAA

CCG

GAT

GTA

GCA

GTG

144

Leu

Val

Gly

Ser

Gin

Leu

Pro

Cys

Glu

Pro

Glu

Pro

Asp

Val

Alá

Val

35

40

45

CTC

ACT

TCC

ATG

CTC

ACC

GAC

CCC

TCC

CAC

ATC

ACA

CCA

GAG

ACG

GCT

192

Leu

Thr

Ser

Met

Leu

Thr

Asp

Pro

Ser

His

Ile

Thr

Alá

Glu

Thr

Alá

50

•

55

60

AAG Lys 65

CGC AGG CTG Arg Arg Leu

GCC AGG

GGG TCT CCC CCC TCC TTG GCC AGC

TCT Ser

TCA Ser 80

240

Alá

Arg 70

Gly

Ser

Pro Pro

Ser 75

Leu

Alá

Ser

GCT

AGC

CAG

TTG

TCT

GGC

CCT

TCC

TCG

AAG

GCG

ACA

TAC

ATT

ACC

CAA

288

Alá

Ser

Gin

Leu

Ser

Gly

Pro

Ser

Ser

Lys

Alá

Thr

Tyr

Ile

Thr

Gin

85

90

95

AAT

GAC

TTC

CCA

GAC

GCT

GAC

CTC

ATC

GAG

GCC

AAC

CTC

CTG

TGG

CGG

l 336

Asn

Asp

Phe

Pro

Asp

Alá

Asp

Leu

Ile

Glu

Alá

Asn

Leu

Leu

Trp

Arg

100

105

110

CAT

GAG

ATG

GGC

GGG

GAC

ATT

ACC

CGC

GTG

GAG

TCA

GAG

AAC

AAG

GTA

384

His

Glu

Met

Gly Gly

Asp

Ile

Thr

Arg

Val

Glu

Ser

Glu

Asn

Lys

Val

115

120

125

GTA

ATC

CTG

GAC

TCT

TTC

GAC

CCG

CTC

CGA

GCG

GAG

GAG

GAT

GAG

CGG

432

Val

Ile

Leu

Asp

Ser

Phe

Asp

Pro

Leu Arg

Alá

Glu

Glu

Asp

Glu

Arg

130

135

140

GAA

GTG

TCC

GTC

CCG

GCG

GAG

ATC

CTG

CGG

AAA

TCC

AAG

AAA

TTC

CCA

480

Glu

Val

Ser

Val

Pro

Alá

Glu

Ile

Leu

Arg

Lys

Ser

Lys

Lys

Phe

Pro

145

150

155

160

CCA

GCG

ATG

CCC

GCA

TGG

GCA

CGC

CCG

GAT

TAC

AAC

CCT

CCG

CTG

CTG

528

Pro

Alá

Met

Pro

Alá

TiP

Alá

Arg

Pro

Asp

Tyr

Asn

Pro

Pro

Leu

Leu

165

170

175

GAG

TCC

TGG

AAG

GCC

CCG

GAC

TAC

GTC

CCT

CCA

GTG

GTA

CAT

GGG

TGC

576

Glu

Ser

Trp

Lys

Alá

Pro

Asp

Tyr

Val

Pro

Pro

Val

Val

His

Gly

Cys

180

185

190

CCA

CTG

CCA

CCT

ACT

AAG

ACC

CCT

CCT

ATA

CCA

CCT

CCA

CGG

AGA

AAG

624

Pro

Leu

Pro

Pro

Thr

Lys

Thr

Pro

Pro

Ile

Pro

Pro

Pro

Arg Arg

Lys

195

200

205

• · · · ·

- 66 » · ·

AGG ACA Arg Thr

GTT GTT

CTG Leu

ACA GAA TCC

ACC GTG TCT TCT GCC CTG

GCG Alá

GAG Glu

672

Val

Val

Thr

Glu Ser 215

Thr

Val

Ser

Ser 22Ó

Alá Leu

210

CTT

GCC

ACA

AAG

GCT

TTT

GGT

AGC

TCC

GGA

CCG

TCG

GCC

GTC

GAC

AGC

720

Leu

Alá

Thr

Lys

Alá

Phe

Gly

Ser

Ser

Gly

Pro

Ser

Alá

Val

Asp

Ser

225

230

235

240

GGC

ACG

GCA

ACC

GCC

CCT

CCT

GAC

CAA

TCC

TCC

GAC

GAC

GGC

GGA

GCA

768

Gly

Thr

Alá

Thr

Alá

Pro

Pro

Asp

Gin

Ser

Ser

Asp

Asp

Gly Gly

Alá

245

250

255

GGA

TCT

GAC

GTT

GAG

TCG

TAT

TCC

TCC

ATG

CCC

CCC

CTT

GAG

GGG

GAG

816

Gly

Ser

Asp

Val

Glu

Ser

Tyr

Ser

Ser

Met

Pro

Pro

Leu

Glu

Gly

Glu

260

265

270

CCG

GGG

GAC

CCC

GAT

CTC

AGC

GAC

GGG

TCT

TGG

TCT

ACC

GTG

AGT

GAG

864

Pro

Gly

Asp

Pro

Asp

Leu

Ser

Asp

Gly

Ser

Trp

Ser

Thr

Val

Ser

Glu

275

280

285

GAG

GCC

GGT

GAG

GAC

GTC

GTC

TGC

TGC

TCG

ATG

TCC

TAC

ACA

TGG

ACA

912

Glu

Alá

Gly

Glu Asp

Val

Val

Cys

Cys

Ser

Met

Ser Tyr

Thr

Trp

Thr

290

295

300

GGC

GCT

CTG

ATC

ACG

CCA

TGC

GCT

GCG

GAG

GAA

AGC

AAG

CTG

CCC

ATC

960

Gly

Alá

Leu

He

Thr

Pro

Cys

Alá

Alá

Glu

Glu

Ser

Lys

Leu

Pro

Ile

305

310

315

320

AAC

GCG

TTG

AGC

AAC

TCT

TTG

CTG

CGT

CAC

CAC

AAC

ATG

GTC

TAC

GCT

1008

Asn

Alá

Leu

Ser

Asn

Ser

Leu

Leu

Arg

His

His

Asn

Met

Val

Tyr

Alá

325

330

335

ACC

ACA

TCC

CGC

AGC

GCA

AGC

CAG

CGG

1035

Thr

Thr

Ser

Arg

Ser

Alá

Ser

Gin

Arg

340

345

SEQ ID NO: 5

A SZEKVENCIA TÍPUSA: Nukleotid az annak megfelelő fehérjével együtt

A SZEKVENCIA HOSSZÚSÁGA: 834 bázispár

A SZÁL TÍPUSA: egyes

TOPOLÓGIA: lineáris

A MOLEKULA TÍPUSA: cDNS genomikus RNS-ből

EREDETI FORRÁS ORGANIZMUS: ember; transzfúzió utáni, nem-A nem-B hepatitisszel fertőzött szérum

KÖZVETLEN KÍSÉRLETI FORRÁS: BR11 klón lambda gtll-ben levő cDNS könyvtárból

JELLEMZŐ VONÁSOK: a PT-NANBH poliprotein 1-834 bp részlete TULAJDONSÁGOK: valószínűleg kódol szerkezeti vírus fehérj éket

AGA AAA ACC AAA CGT AAC ACC AAC CTC CGC CCA CAG GAC GTC AGG TTC

48

Arg Lys Thr Lys Arg Asn Thr Asn Leu Arg

Pro

Gin

Asp

Val

Arg 15

Phe

5

10

CCG

GGC

GGT

GGT

CAG

ATC

GTT

GGT

GGA

GTT

TAC

CTG

TTG

CCG

CGC

AGG

96

Pro

Gly Gly Gly

Gin

Ile

Val

Gly Gly

Val

Tyr

Leu

Leu

Pro

Arg Arg

20

25

30

GGC

CCC

AGG

TTG

GGT

GTG

CGC

GCG

ACT

ACG

AAG

ACT

TCC

GAG

CGG

TCG

144

Gly

Pro

Arg

Leu

Gly

Val

Arg

Alá

Thr

Arg Lys

Thr

Ser

Glu

Arg

Ser

35

40

45

CAA

CCT

CGT

GGA

AGG

CGA

CAA

CCT

ATC

CCC

AAG

GCT

CGC

CAG

CCC

GAG

192

Gin

Pro

Arg

Gly Arg Arg

Gin

Pro

Ile

Pro Lys

Alá

Arg

Gin

Pro

Glu

50

55

60

• · · ·· · ·

GGC AGG

GCC TGG GCT CAG

CCC GGG TAC CCT TGG CCC CTC TAT GGC AAC

240

Gly 65

Arg

Alá Trp

Alá Gin 70

Pro

Gly Tyr Pro Trp Pro Leu Tyr Gly Asn

75

80

GAG

GGC

ATG

GGG

TGG

GCA

GGA

TGG

CTC

CTG

TCA

CCC

CGT

GGC

TCC

CGG

288

Glu

Gly

Met

Gly Trp

Alá

Gly

Trp

Leu

Leu

Ser

Pro

Arg Gly

Ser

Arg

85

90

95

CCT

AGT

TGG

GGC

CCC

ACT

GAC

CCC

CGG

CGT

AGG

TCG

CGT

AAT

TTG

GGT

336

Pro

Ser

Trp

Gly

Pro

Thr

Asp

Pro

Arg Arg Arg

Ser

Arg

Asn

Leu

Gly

100

105

110

AAA

GTC

ATC

GAT

ACC

CTC

ACA

TGC

GGC

TTC

GCC

GAC

TCT

CAT

GGG

GTA

384

Lys

Vei

Ile

Asp

Thr

Leu

Thr

Cys

Gly

Phe

Alá

Asp

Ser

His

Gly

Val

115

120

125

CAT

TCC

GCT

CGT

CGG

CGC

TCC

CTT

AGG

GGC

GCT

GCC

AGG

GCC

CTG

GCG

432

His

Ser

Alá

Arg Arg Arg

Ser

Leu

Arg

Gly

Alá

Alá

Arg

Alá

Leu

Alá

130

135

140

CAT

GGC

GTC

CGG

CTT

CTG

GAG

GAC

GGC

CTG

AAC

TAT

GCA

ACA

GGG

AAT

480

His

Gly

Val

Arg

Val

Leu

Glu

Asp

Gly

Val

Asn

Tyr

Alá

Thr

Gly

Asn

145

150

155

160

TTA

CCC

GGT

TGC

TCT

TTC

TCT

ATC

TTC

CTC

TTG

GCT

TTG

CTG

TCC

TGT

528

Leu

Pro

Gly

Cys

Ser

Phe

Ser

Ile

Phe

Leu

Leu

Alá

Leu

Leu

Ser

cys

165

170

175

TTG

ACC

ATT

CCA

GCT

TCC

GCT

TAT

GAA

GTG

CGC

AAC

GTG

TCC

GGG

ATC

576

Leu

Thr

Ile

Pro

Alá

Ser

Alá

Tyr

Glu

Val

Arg

Asn

Val

Ser

Gly

Ile

180

185

190

TAC

CAT

GTC

ACG

AAC

GAT

TGC

TCC

AAC

TCA

AGC

ATC

GTG

TAC

GAG

ACA

624

Tyr

His

Val

Thr

Asn

Asp

Cys

Ser

Asn

Ser

Ser

Ile

Val

Tyr

Glu

Thr

195 200 205

- 69 • ··

GCG GAC ATG

ATC ATG CAC

ACC Thr 215

CCC GGG TGT

GTG CCC TGT GTC CGG

GAG Glu

672

Alá Asp 210

Met

Ile Met

His

Pro

Gly

Cys

Val

Pro Cys 220

Val

Arg

GGT

AAT

TCC

TCC

CGC

TGC

TGG

GTA

GCG

CTC

ACT

CCC

ACG

CTC

GCG

GCC

720

Gly

Asn

Ser

Ser

Arg

Cys

Trp

Val

Alá

Leu

Thr

Pro

Thr

Leu

Alá

Alá

225

230

235

240

AAG

GAC

GCC

AGC

ATC

CCC

ACT

GCG

ACA

ATA

CGA

CGC

CAC

GTC

GAT

TTG

768

Lys

Asp

Alá

Ser

Ile

Pro

Thr

Alá

Thr

Ile

Arg Arg

His

Val

Asp

Leu

245

250

255

CTC

GTT

GGG

GCG

GCT

GCC

TTC

TCG

TCC

GCT

ATG

TAC

GTG

GGG

GAT

CTC

816

Leu

Val

Gly

Alá

Alá

Alá

Phe

Ser

Ser

Alá

Met Tyr

Val

Gly Asp

Leu

260

265

270

TGC

GGA

TCT

GTT

TTC

CCG

834

Cys

Gly

Ser

Val

Phe

Pro

275 t

- 70 SEQ ID NO : 6.

A SZEKVENCIA TÍPUSA: nukleotid

A SZEKVENCIA HOSSZÚSÁGA: 31 bázis

A SZÁL TÍPUSA: egyes

TOPOLÓGIA: lineáris

A MOLEKULA TÍPUSA: szintetikus DNS

EREDETI FORRÁS ORGANIZMUS: lambda gtll bakteriofág

KÖZVETLEN KÍSÉRLETI FORRÁS: oligonukleotid szintetizáló berendezés; oligo d75

JELLEMZŐ VONÁSOK:.

4.-től 9. bázisig; BamHI hely,

10.-től 31.bázisig homológ a lambda gtll bakteriofágban levő EcoRI helyet szegélyező lacZ gén fölfelé levő részletével

26.-tól 31. bázisig EcoRI hely

TULAJDONSÁGOK: beindítja a DNS szintézist a fág vektorból az EcoRI helynél beiktatott cDNS-be, és e.gy BamHI helyet vezette, amely alkalmas az ezt követő klónozáshoz kifejező vektorokba

TAAGGATCCC CCGTCAGTAT CGGCGGAATT C

- 71 SEQ ID NO; 7

A SZEKVENCIA TÍPUSA: nukleotid

A SZEKVENCIA HOSSZÚSÁGA: 30 bázis

A SZÁL TÍPUSA: egyes

TOPOLÓGIA: lineáris

A MOLEKULA TÍPUSA: szintetikus DNS

EREDETI FORRÁS ORGANIZMUS: lambda gtll bakteriofág

KÖZVETLEN KÍSÉRLETI FORRÁS: oligonukleotid szintetizáló berendezés, oligo d?6

JELLEMZŐ VONÁSOK:.

4.rtől 9. bázisig BamHI hely

10.-től 30. bázisig homológ a lambda gtll bakteriofágban levő EcoRl helyet szegélyező lacZ

gén lefelé levő részletével.

beindítja a DNS szintézist a fág vektorból az EcoRl helynél beiktatott cDNS-be és egy

BamHI helyet vezet be, amely alkalmas az ezt követő klónozáshoz kifejező vektorokba.

TATGGATCCG TAGCGACCGG CGCTCAGCTG

- 72 SEQ ID NO : 8

A SZEKVENCIA TÍPUSA: nukleotid

A SZEKVENCIA HOSSZÚSÁGA: 19 bázis

A SZÁL TÍPUSA: egyes

TOPOLÓGIA: lineáris

A MOLEKULA TÍPUSA: szintetikus DNS

EREDETI FORRÁS ORGANIZMUS: ember; transzfúzió után nem-A, nem-B hepatitisszel fertőzött szérum

KÖZVETLEN KÍSÉRLETI FORRÁS: oligonukleotid szintetizáló berendezés; oligo d94

JELLEMZŐ VONÁSOK:

1.-től 19.· bázisig homológ a JG2 (SEQ ID NO : 3) sense szálának 914.-932. bázisaival

TULAJDONSÁGOK: beindítja a DNS szintézist a PT-NANBH genomikus RNS/DNS negatív szálán

ATGGGGCAAA GGACGTCCG

- 73 SEQ ID NO : 9

A SZEKVENCIA TÍPUSA: nukleotid

A SZEKVENCIA HOSSZÚSÁGA: 24 bázis

A SZÁL TÍPUSA: egyes

TOPOLÓGIA: lineáris

A MOLEKULA TÍPUSA: szintetikus DNS

EREDETI FORRÁS ORGANIZMUS: ember; transzfúzió után nem-A, nem-B hepatitisszel fertőzött szérum

KÖZVETLEN KÍSÉRLETI FORRÁS: oligonukleotid szintetizáló berendezés; oligo d95

JELLEMZŐ VONÁSOK:

1.-től 24» bázisig homológ a JG2(SEQ ID NO: 3') anti-sense szálának 1620-1643· bázisaival

TULAJDONSÁGOK: beindítja a DNS szintézist a PT-NANBH genomikus RNS/DNS pozitív szálán

TACCTAGTCA TAGCCTCCGT GAAG

- 74 SEQ ID NO : 10

A SZEKVENCIA TÍPUSA: nukleotid

A SZEKVENCIA HOSSZÚSÁGA: 17 bázis

A SZÁL TÍPUSA: egyes

TOPOLÓGIA: lineáris

A MOLEKULA TÍPUSA: szintetikus DNS

EREDETI FORRÁS ORGANIZMUS: ember; transzfúzió után nem-A, nem-B hepatitisszel fertőzött szérum

KÖZVETLEN KÍSÉRLETI FORRÁS: oligonukleotid szintetizáló berendezés; oligo NI

JELLEMZŐ VONÁSOK: ,

1.-től 24. bázisig homológ a JG2 (SEQ ID NO : 3) sense szálának 1O33.-1O49. bázisaival

TULAJDONSÁGOK: beindítja a DNS szintézist a PT-NANBH genomikus RNS/DNS negatív szálán

GAGGTTTTCT GCGTCCA

SEQ ID NO : 11

A SZEKVENCIA TÍPUSA: nukleotid

A SZEKVENCIA HOSSZÚSÁGA: 17 bázis

A SZÁL TÍPUSA: egyes

TOPOLÓGIA: lineáris ember; transzfúzió után nem-A,

r.em-B

sz árum

oligonukleotid szintetizáló berendezés; oligo N2

1.-től 17. bázisig homológ a JG2 ( SEQ ID NO anti-sense szálának 1421.-1437. bázisaival

3)

TULAJDONSÁGOK beindítja a DNS szintézist a PT-NANBH genomikus RNS/DNS pozitív szálán.

GCGATAGCCG CAGTTCT

SEQ ID NO : 12

A SZEKVENCIA TÍPUSA: nukleotid

A SZEKVENCIA HOSSZÚSÁGA: 22 bázis

A SZÁL TÍPUSA: egyedi

TOPOLÓGIA: lineáris

A MOLEKULA TÍPUSA: szintetikus DNS

EREDETI FORRÁS ORGANIZMUS: ember; transzfúzió után nem-A, nem-B hepatitisszel fertőzött szérum

KÖZVETLEN KÍSÉRLETI FORRÁS:

oligonukleotid szintetizáló berendezés; oligo dlő4

JELLEMZŐ VONÁSOK;

1.-től 22. bázisig homológ az Okamoto és munkatársai közleményében [Japan J. Exp. Med. 60, 167-177 (199O)J szereplő 2. ábra szekvenciájának 10.-tői

31. bázisáig terjedő területével; a 22. bázis A-ról T-re van cserélve, hogy BglII felismerő helyet ve- zessünk be;

a 8.-tól 13. bázisig BglII felismerő hely TULAJDONSÁGOK: beindítja a DNS szintézist a PT-NANBH genomi kus RNS/DNS negatív szálán, és bevezet egy

BglII helyet

CCACCATAGA TCTCTCCCCT GT

SEQ ID NO ί 13

A SZEKVENCIA TÍPUSA: nukleotid

A SZEKVENCIA HOSSZÚSÁGA: 30 bázis

A SZÁL TÍPUSA: egyes

TOPOLÓGIA: lineáris

A MOLEKULA TÍPUSA: szintetikus DNS

EREDETI FORRÁS ORGANIZMUS: ember; transzfúzió után nem-A, nem-B hepatitisszel fertőzött szérum

KÖZVETLEN KÍSÉRLETI FORRÁS: oligonukleotid szintetizáló berendezés; oligo dl37

JELLEMZŐ VONÁSOK:

1.-től 30. bázisig homológ a BR11 (SEQ ID NO : 5) negatív szálának 154.-től 183. bázisáig terjedő részével; a 174, 177. és 178. bázisok úgy vannak módosítva, hogy egy EcoRI felismerő helyet vezessünk be;

5.-től 10. bázisig EcoRI felismerő

TULAJDONSÁGOK:

beindítja a DNS szintézist a hely

PT-NANBH genomikus RNS/DNS pozitív szálán, és EcoRI helyet ve ezt be a klónozáshoz.

GCGAGAATTC GGGATAGGTT GTCGCCTTCC ···· ·

SEQ ID NO : 14

A SZEKVENCIA TÍPUSA: nukleotid

A SZEKVENCIA HOSSZUSÁG/L: 27 bázis

A SZÁL TÍPUSA: egyes

TOPOLÓGIA: lineáris

A MOLEKULA TÍPUSA: szintetikus DNS

ERDETI FORRÁS ORGANIZMUS: ember; transzfúzió után nem-A, nem-B hepatitisszel fertőzött szérum

KÖZVETLEN KÍSÉRLETI FORRÁS: oligonukleotid szintetizáló berendezés; oligo dl36

JELLEMZŐ VONÁSOK: .

1.-től 27. bázisig homológ a BR11 (SEQ ID NO : 5$ pozitív szálának 672. és 698. bázisai közti területtel; a 675 bázis G-re van cserélve, hogy bevezessünk egy EcoRI felismerő helyet;

4.-től 9. bázisig EcoRI felismerő hely TULAJDONSÁGOK: beindítja a DNS szintézist a PT-NANBH genomikus RNS/DNS negatív szálán, és E.coRI helyet vezet be a klónozáshoz.

GGGGAATTCC TCCCGCTGCT GGGTAC-C 27

I,

- 79 SEQ ID NO : 15

A SZEKVENCIA TÍPUSA: nukleotid

A SZEKVENCIA HOSSZÚSÁGA: 28 bázis

A SZÁL TÍPUSA: egyes

TOPOLÓGIA: lineáris

A MOLEKULA TÍPUSA: szint etikus DNS , . csimEREDETI FORRÁS ORGANIZMUS: pánz ; transzfúzió után nem-A, nem-B hepatitisszel fertőzött szérum

KÖZVETLEN KÍSÉRLETI FORRÁS: oligonukleotid szintetizáló berendezés; oligo dl55

JELLEMZŐ VONÁSOK: .

1.-től 28. bázisig homológ a.88310922.5 számú európai szabadalmi bejelentés 47. ábrája negatív szálának. 462.-489 . bázisai közti területtel; a 483· és 485. bázisok úgy vannak megváltoztatva, hogy bevezessünk egy EcoRI felismerő helyet;

5.-től 10. bázisig EcoRI felismerő hely TULAJDONSÁGOK: beindítja a DNS szintézist a PT-NANBH genomikus RNS/DNS pozitív szálán, és EcoRI helyet vezet be a klónozáshoz

ACGGGAATTC GACCAGGCAC CTGGGTGT ♦ · · · ·

SEQ ID NO 16

A

A

A .

TOPOLÓGIA

A MOLEKULA TÍPUSA

EREDETI FORRÁS ORGANIZMUS

SZEKVENCIA TÍPUSA: nukleotid

SZEKVENCIA HOSSZÚSÁGA: 23 bázis

SZÁL TÍPUSA: egyes i lineáris szintetikus DNS csimpánz; transzfúzió után nem-A, nem-B hepatitisszel fertőzött szérum

KÖZVETLEN KÍSÉRLETI FORRÁS: oligonukleotid szintetizáló berendezés; oligo d!56

JELLEMZŐ VONÁSOK:

1.-től 23. bázisig homológ a.88310922.5 számú európai szabadalmi bejelentés 47. ábrája negatív szálának 3315.-3337. bázisai közti területtel; a 3323. bázis C-re van változtatva, hogy bevezessünk egy ScoRI felismerő helyet;

4.-től 9. bázisig EcoRI felismerő hely TULAJDONSÁGOK: beindítja a DNS szintézist a PT-NANBH genomikus RNS/DNS negatív szálán, és EcoRI helyet vezet be a klónozáshoz.

CTTGAATTCT GGGAGGGCGT CTT _ 81

SEQ ID NO : 17

A SZEKVENCIA TÍPUSA: nukleotid

A SZEKVENCIA HOSSZÚSÁGA: 29 bázis

A SZÁL TÍPUSA: egyedi

TOPOLÓGIA: lineáris

A MOLEKULA TÍPUSA: szintetikus DNS

EREDETI FORRÁS ORGANIZMUS: ember; transzfúzió után nem-A, nem-B hepatitisszel fertőzött szérum

KÖZVETLEN KÍSÉRLETI FORRÁS: oligonukleotid szintetizáló berendezés; oligo d92

JELLEMZŐ VONÁSOK:

1.-től 29. bázisig homológ,a JG2 (SEQ ID NO : 3) negatív szálának 36. és 64. bázisai közti területtel; az 57., 58. és 60. bázisok úgy vannak megváltoztatva, hogy bevezessünk egy EcoRI felismerő

TULAJDON helyet;

5.-től 10. bázisig EcoRI felismerő hely ⁿ-0K: beindítja a DNS szintézist a PT-NANBH genomikus RNS/DNS pozitív szálán és EcoRI helyet vezet be a klónozáshoz.

CGCCGAATTC ATGCCGCCAC AGGAGGTTG

SEQ ID NO : 18

A SZEKVENCIA TÍPUSA: nukleotid az ennek megfelelő fehérjével

A SZEKVENCIA HOSSZÚSÁGA: 504 bázispár

A SZÁL TÍPUSA: egyes

TOPOLÓGIA: lineáris

A MOLEKULA TÍPUSA: cDNS genomikus RNS-hez

EREDETI FORRÁS ORGANIZMUS: ember; transzfúzió után nem-A, nem-B hepatitisszel fertőzött szérum

KÖZVETLEN KÍSÉRLETI FORRÁS: 164/137 klón

JELLEMZŐ VONÁSOK:

308.-tól 504. bp-ig a PT-NANBH polipeptid. kezdete TULAJDONSÁGOK: valószínűleg a vírus szerkezeti fehérjéket kódolja

GATCACTCCC CTGTGAGGAA CTACTGTCTT CACGCAGAAA GCGTCTAGCC ATGGCGTTAG 60

TATGAGTGTC GTGCAGCCTC CAGGACCCCC CCTCCCGGGA GAGCCATAGT GGTCTGCGGA 120

ACCGGTGAGT ACACCGGAAT TGCCAGGACG ACCGGGTCCT TTCTTGGATT AACCCGCTCA 180

ATGCCTGGAG ATTTGGGCGT GCCCCCGCAA GACTGCTAGC CGAGTAGTGT TGGGTCGCGA 240

AAGGCCTTGT GGTACTGCCT GATAGGGTGC TTGCGAGTGC CCCGGGAGGT CTCGTAGACC 300

GTGCACC

ATG

AGC

ACG

AAT

CCT

AAA

CCT

CAA

AGA

AAA ACC

AAA

CGT

AAC

349

Met

Ser

Thr

Asn

Pro

Lys

Pro

Gin

Arg

Lys Thr

Lys

Arg

Asn

5

10

ACC

AAC

CGC

CGC

CCA

CAG

GAC

GTC

AAG

TTC

CCG

GGC GGT

GGT

CAG

ATC

397

Thr

Asn

Pro

Arg

Pro

Gin

Asp

Val

Lys

Phe

Pro

Gly Gly

Gly

Gin

Ile

15

20

25

30

GTT

GGT

GGA

GTT

TAC

CTG

TTG

CCG

CGC

AGG

GGC

CCC AGG

TTG

GGT

GTG

445

Val

Gly Gly

Val

Tyr

Leu

Leu

Pro

Arg Arg

Gly Pro Arg

Leu

Gly

Val

40 45

CGG AAG CAT CCC GAG GCC ACT TAC ACC AAA TGC GGT TCG GGG CCT TGG

Arg Lys His Pro Glu Alá Thr Tyr Thr Lys Cys Gly Ser Gly Pro Trp

355 360 365

TTG

1107

Leu

1104

- 84 • · ·

SEQ ID NO : 19

A SZEKVENCIA TÍPUSA: nukleotid. az ennek megfelelő fehérjével A SZEKVENCIA HOSSZÚSÁGA: 1107 bázispár

A SZÁL TÍPUSA: egyes

TOPOLÓGIA: lineáris

A MOLEKULA TÍPUSA: cRNS genomikus RNS-hez

EREDETI FORRÁS	ORGANIZMUS: ember; transzfúzió után nem-A, nem-B hepatitisszel fertőzött szérum
KÖZVETLEN Kisál	3LETI' FORRÁS: 135/155 klón

JELLEMZŐ VONÁSOK:

1.-től 1107, bázispárig a PT-NANBH poliprotein részlete.

TULAJDONSÁGOK:

valószínűleg a vírus szerkezeti fehérjéket kódolj a

TCC Ser

TCC Ser

CGC TGC

TGG Trp 5

GTA Val

GCG CTC ACT CCC ACG CTC GCG GCC AAG GAC

Arg

Cys

Alá Leu

Thr

Pro Thr 10

Leu Alá Alá *

Lys 15

Asp

GCC

AGC

ATC

CCC

ACT

GCG

ACA

ATA

CGA

CGC

CAC

GTC

GAT

TTG

CTC

GTT

Alá

Ser

Ile

Pro

Thr

Alá

Thr

Ile

Arg Arg

His

Val

Asp

Leu

Leu

Val

20

25

30

GGG

GCG

GCT

GCC

TTC

TGC

TCC

GCT

ATG

TAC

GTG

GGG

GAT

CTC

TGC

GGA

Gly

Alá

Alá

Alá

Phe

Cys

Ser

Alá

Hét

Tyr

Val

Gly

Asp

Leu

Cys

Gly

35

40

45

TCT

GTT

TTC

CTC

GTC

TCT

CAG

CTG

TTC

ACC

TTC

TCG

CCT

CGC

CGA

CAT

Ser

Val

Phe

Leu

Val

Ser

Gin

Leu

Phe

Thr

Phe

Ser

Pro

Arg Arg

His

144

192

···· ·

• · • ··

CAG Gin 65

ACG GTA CAG Thr Val Gin

GAC TGC

AAT TGT TCA ATO TAT CCC GGC CAC

GTA Val

TCA Ser 80

240

Asp

Cys 70

Asn

cys

Ser Ile

Tyr 75

Pro

Gly

His

GGT

CAC

CGC

ATG

GCT

TGG

GAT

ATG

ATG

ATG

AAC

TGG

TCA

CCT

ACA

GCA

288

Gly

His

Arg

Met

Alá

Trp

Asp

Met

Met

Met

Asn

Trp

Ser

Pro

Thr

Alá

85

90

95

GCC

CTA

GTG

GTA

TCG

CAG

CTA

CTC

CGG

ATC

CCA

CAA

GCT

GTC

GTG

GAC

336

Alá

Leu

Val

Val

Ser

Gin

Leu

Leu

Arg

Ile

Pro

Gin

Alá

Val

Val

Asp

100

105

110

ATG

GTG

GCG

GGG

GCC

CAC

TGG

GGA

GTC

CTG

GCG

GGC

CTT

GCC

TAC

TAT

384

Met

Val

Alá

Gly

Alá

His

Trp

Gly

Val

Leu

Alá

Gly

Leu

Alá

Tyr

Tyr

115

120

125

TCC

ATG

GTG

GGG

AAC

TGG

GCT

AAG

GTC

TTG

GTT

GTG

ATG

CTA

CTC

TTT

432

Ser

Met

Val

Gly

Asn Trp

Alá

Lys

Val·

Leu

Val

Val

Met

Leu

Leu

Phe

130

135

140

GCC

GGC

GTT

GAC

GGG

GAA

CCT

TAC

ACG

ACA

GGG

GGG

ACA

CAC

GGC

CGC

480

Alá

Gly

Val

Asp

Gly

Glu

Pro

Tyr

Thr

Thr

Gly Gly

Thr

His

Gly

Arg

145

150

155

160

GCC

GCC

CAC

GGG

CTT

ACA

TCC

CTC

TTC

ACA

CCT

GGG

CCG

GCT

CAG

AAA

528

Alá

Alá

His

Gly

Leu

Thr

Ser

Leu

Phe

Thr

Pro

Gly

Pro

Alá

Gin

Lys

165

170

175

ATC

CAG

CTT

GTA

AAC

ACC

AAC

GGC

AGC

TGG

CAC

ATC

AAC

AGA

ACT

GCC

576

Ile

Gin

Leu

Val

Asn

Thr

Asn

Gly

Ser

Trp

His

Ile

Asn

Arg

Thr

Alá

180

185

190

TTG

AAC

TGC

AAT

GAC

TCC

CTC

CAA

ACT

GGG

TTC

CTT

GCC

GCG

CTG

TTC

624

Leu

Asn

Cys

Asn

Asp

Ser

Leu

Gin

Thr

Gly

Phe

Leu

Alá

Alá

Leu

Phe

195

200

205

··· · • 9

TAC ACG Tyr Thr

CAC AGG

TTC Phe

AAT GCG TCC

GGA TGC TCA GAG CGC ATG GCC AGC

672

His

Arg

Asn

Alá Ser 215

Gly

Cys

Ser Glu 220

Arg Met Alá Ser

210

TGC

CGC

CCC

ATT

GAC

CAG

TTC

GAT

CAG

GGG

TGG

GGT

CCC

ATC

ACT

TAT

720

Cys

Arg

Pro

Ile

Asp

Gin

Phe

Asp

Gin

Gly Trp

Gly

Pro

Ile

Thr

Tyr

225

230

235

240

AAT

GAG

TCC

CAC

GGC

TTG

GAC

CAG

AGG

CCC

TAT

TGC

TGG

CAC

TAC

GCA

768

Asn

Glu

Ser

His

Gly

Leu

Asp

Gin

Arg

Pro

Tyr

Cys

Trp

His

Tyr

Alá

245

250

255

CCT

CAA

CCG

TGT

GGT

ATC

GTG

CCC

GCG

TTG

CAG

GTG

TGT

GGC

CCA

GTG

816

Pro

Gin

Pro

Cys

Gly

Ile

Val

Pro

Alá

Leu

Gin

Val

Cys

Gly

Pro

Val

260

265

270

TAC

TGT

TTC

ACT

CCA

AGC

CCT

GTT

GTG

GTG

GGG

ACG

ACC

GAT

CGT

TTC

864

Tyr

Cys

Phe

Thr

Pro

Ser

Pro

Val

Val

Val

Gly

Thr

Thr

Asp

Arg

Phe

275

280

285

GGC

GCC

CCT

ACG

TAC

AGA

TGG

GGT

GAG

AAT

GAG

ACG

GAC

GTG

CTG

CTT

912

Gly

Alá

Pro

Thr

Tyr

Arg

Trp

Gly

Glu

Asn

Glu

Thr

Asp

Val

Leu

Leu

290

295

300

CTC

AAC

AAC

ACG

CGG

CCG

CCA

CGG

GGC

AAC

TGG

TTC

GGC

TGT

ACA

TGG

960

Leu

Asn

Asn

Thr

Arg

Pro

Pro

Arg Gly

Asn

Trp

Phe

Gly

Cys

Thr

Trp

305

310

315

320

ATG

AAT

AGC

ACC

GGG

TTC

ACC

AAG

ACG

TGT

GGG

GGC

CCC

CCG

TGC

AAC

1008

Met

Asn

Ser

Thr

Gly

Phe

Thr

Lys

Thr

Cys

Gly Gly

Pro

Pro

Cys

Asn

325

330

335

ATC

GGG

GGG

GTC

GGC

AAC

AAC

ACT

TTG

ATC

TGC

CCC

ACG

GAC

TGC

TTC

1056

Ile

Gly Gly

Val

Gly

Asn

Asn

Thr

Leu

Ile

Cys

Pro

Thr

Asp

Cys

Phe

340

345

350

• ·

CGC

GCG

ACT

AGG

AAG

ACT

TCC

GAG

CGG

TCG

CAA

CCT

CGT

GGA

AGG

CGA 493

Arg

Alá

Thr

Arg

Lys

Thr

Ser

Glu

Arg

Ser

Gin

Pro

Arg

Gly

Arg

Arg

50

55

60

CAA

CCT

ATC

CC

504

Gin

Pro

Ile

Pro

65

SEQ ID NO : 20

A SZEKVENCIA TÍPUSA: nukleotid az ennek megfelelő fehérjével A SZEKVENCIA HPSSZUSAGA: 2043 bázispár

A SZÁL TÍPUSA:.egyes

TOPOLÓGIA: lineáris

A MOLEKULA TÍPUSA: cDNS genomikus DNS-hez EREDETI FORRÁS ORGANIZMUS: ember; transzfúzió után nem-A, nem-B hepatitisszel fertőzött szérum

KÖZVETLEN KÍSÉRLETI FORRÁS: 156/92 klón

JELLEMZŐ : VONÁSOK:

1.-től 2043· bp-ig a PT-NANBH .poliprotein részlete

TULAJDONSÁGOK: valószínűleg a vírus nem-szerkezeti fehérjéket kódolja

Ser

Gin

Thr

Lys

Gin

Alá

Gly

Asp

Asn

Phe

Pro

Tyr

Leu

Val

Alá

Tyr

20

25

30

CAG

GGT

ACT

CTG

TGC

GCT

AGG

GCC

CAG

GCC

CCA

CCT

CCA

TCA

TGG

GAT

144

Gin

Alá

Thr

Val

Cys

Alá

Arg

Alá

Gin

Alá

Pro

Pro

Pro

Ser

Trp

Asp

35

40

45

CAA

ATG

TGG

AAG

TGT

CTC

ATA

CGG

CTA

AAG

CCT

ACT

CTG

CGC

GGG

CCA

192

Gin

Met

Trp

Lys

Cys

Leu

He

Arg

Leu

Lys

Pro

Thr

Leu

Arg

Gly

Pro

50

55

60

• · · · ·

ACA Thr 65

CCC TTG CTG

TAT AGG CTG GGA GCC GTC’CAA AAC GAG GTC ACC CTC

240

Pro

Leu Leu

Tyr

Arg Leu 70

Gly Alá

Val

Gin 75

Asn

Glu Val Thr Leu 80

ACA

CAC

CCC

ATA

ACC

AAA

TTC

ATC

ATG

GCA

TGC

ATG

TCA

GCC

GAC

CTG

288

Thr

His

Pro

He

Thr

Lys

Phe

Ile

Met

Alá

Cys

Met

Ser

Alá

Asp

Leu

85

90

95

GAG

GTC

GTC

ACG

AGC

ACC

TGG

GTG

CTG

GTG

GGC

GGG

GTC

CTT

GCA

GCT

336

Glu

Val

Val

Thr

Ser

Thr

Trp

Val

Leu

Val

Gly Gly

Val

Leu

Alá

Alá

100

105

110

CTG

GCT

GCG

TAT

TGC

TTG

ACA

ACA

GGC

AGC

GTG

GTC

ATT

GTG

GGT

AGG

384

Leu

Alá

Alá

Tyr

Cys

Leu

Thr

Thr

Gly

Ser

Val

Val

He

Val

Gly Arg

115

120

125

ATC

ATC

TTG

TCC

GGG

CGG

CCG

GCT

ATT

GTT

CCC

GAC

AGG

GAA

GTC

CTC

432

Ile

He

Leu

Ser

Gly

Arg

Pro

Alá

He

Val

Pro

Asp

Arg

Glu

Val

Leu

130

135

140

TAC

CAG

GAG

TTC

GAT

GAG

ATG

GAA

GAG

TGC

GCG

TCG

CAC

CTC

CCT

TAC

480

Tyr

Gin

Glu

Phe

Asp

Glu

Met

Glu

Glu

Cys

Alá

Ser

His

Leu

Pro

Tyr

145

150

155

160

ATC

GAG

CAG

GGA

ATG

CAG

CTC

GCC

GAG

CAG

TTC

AAG

CAA

AAA

GCG

CTC

528

Ile

Glu

Gin

Gly

Met

Gin

Leu

Alá

Glu

Gin

Phe

Lys

Gin

Lys

Alá

Leu

165

170

175

GGG

TTG

CTG

CAG

ACA

GCC

ACC

AAG

CAA

GCG

GAG

GCC

GCT

GCT

CCC

GTG

576

Gly

Leu

Leu

Gin

Thr

Alá

Thr

Lys

Gin

Alá

Glu Alá

Alá

Alá

Pro

Val

180

185

190

GTG

GAG

TCC

AAG

TGG

CGA

GCC

CTT

GAG

ACC

TTC

TGG

GCG

AAA

CAC

ATG

624

Val

Glu

Ser

Lys

Trp

Arg

Alá

Leu

Glu

Thr

Phe Trp

Alá

Lys

His

Met

195 200 205 • · · · · • · • · · • ·· · · • ·

TGG AAC Trp Asn

TTC Phe

ATC AGC GGG ATA CAG TAC TTA'GCA GGC TTG TCC ACT CTG

672

Ile Ser

Gly

Ile Gin 215

Tyr Leu

Alá

Gly Leu Ser 220

Thr Leu

210

CCT

GGG

AAT

CCC

GCG

ATT

GCA

TCA

CTG

ATG

GCG

TTC

ACA

GCC

TCT

GTC

720

Pro

Gly

Asn

Pro

Alá

Ile

Alá

Ser

Leu

Met

Alá

Phe

Thr

Alá

Ser

Val

225

230

235

240

ACT

AGC

CCG

CTC

ACC

ACC

CAA

TCT

ACC

CTC

CTG

CTT

AAC

ATC

CTG

GGG

768

Thr

Ser

Pro

Leu

Thr

Thr

Gin

Ser

Thr

Leu

Leu

Leu

Asn

Ile

Leu

Gly

245

250

255

GGA

TGG

GTA

GCC

GCC

CAA

CTC

GCT

CCC

CCC

AGT

GCT

GCT

TCA

GCT

TTC

816

Gly

Trp

Val

Alá

Alá

Gin

Leu

Alá

Pro

Pro

Ser

Alá

Alá

Ser

Alá

Phe

260

265

270

GTA

GGC

GCC

GGC

ATT

GCT

GGT

GCG

GCT

GTT

GGC

AGC

ATA

GGC

CTT

GGG

864

Val

Gly

Alá

Gly

Ile

Alá

Gly

Alá

Alá

Val

Gly

Ser

Ile

Gly

Leu

Gly

275

280

285

AAG

GTG

CTT

GTG

GAC

ATC

TTG

GCG

GGC

TAT

GGA

GCA

GGA

GTG

GCA

GGC

912

Lys

Val

Leu

Val

Asp

Ile

Leu

Alá

Gly

Tyr

Gly

Alá

Gly

Val

Alá

Gly

290

295

300

GCG

CTC

GTG

GCC

TTT

AAG

GTC

ATG

AGC

GGC

GAA

ATG

CCC

TCC

ACC

GAG

960

Alá

Leu

Val

Alá

Phe

Lys

Val

Met

Ser

Gly

Glu

Met

Pro

Ser

Thr

Glu

305

310

315

320

GAC

CTG

GTT

AAC

TTA

CTC

CCT

GCC

ATC

CTC

TCT

CCT

GGT

GCC

CTG

GTC

1008

Asp

Leu

Val

Asn

Leu

Leu

Pro

Alá

Ile

Leu

Ser

Pro

Gly

Alá

Leu

Val

325

330

335

GTC

GGG

GTC

GTG

TGC

GCA

GCG

ATA

CTG

CGT

CGG

CAC

GTG

GGT

CCA

GGG

1056

Val

Gly

Val

Val

Cys

Alá

Alá

Ile

Leu

Arg Arg

His

Val

Gly

Pro

Gly

340 345 350 • · ·

GAG GGG GCT GTG CAG

TCG Trp

ATG Met

AAC CGG CTG-ATA GCG TTC GCC TCG CGG

1104

Glu

Gly

Alá Val 355

Gin

Asn Arg 360

Leu Ile

Alá

Phe Alá Ser Arg 365

GCT

AAC

CAT

GTT

TCC

CCC

ACG

CAC

TAT

GTG

CCA

GAG

AGC

GAC

GCC

GCA

1152

Gly

Asn

His

Val

Ser

Pro

Thr

His

Tyr

Val

Pro

Glu

Ser

Asp

Alá

Alá

370

375

380

GCA

CGT

GTC

ACT

CAG

ATC

CTC

TCC

GAC

CTT

ACT

ATC

ACC

CAA

CTG

TTG

1200

Alá

Arg

Val

Thr

Gin

Ile

Leu

Ser

Asp

Leu

Thr

Ile

Thr

Gin

Leu

Leu

385

390

395

400

AAG

AGG

CTC

CAC

CAG

TGG

ATT

AAC

GAG

GAC

TGC

TCC

ACG

CCC

TGC

TCC

1248

Lys

Arg

Leu

His

Gin

Trp

Ile

Asn

Glu

Asp

Cys

Ser

Thr

Pro

Cys

Ser

405

410

415

GGC

TCG

TGG

CTA

AGG

GAT

GTT

TGG

GAC

TGG

ATA

TGC

ACA

GTT

TTG

GCT

1296

Gly

Ser

Trp

Leu

Arg

Asp

Val

Trp

Asp

Trp

Ile

Cys

Thr

Val

Leu

Alá

420

425

430

GAC

TTC

AAG

ACC

TGG

CTC

CAG

TCC

AAG

CTC

CTG

CCG

CCA

TTA

CCG

GGA

1344

Asp

Phe

Lys

Thr

Trp

Leu

Gin

Ser

Lys

Leu

Leu

Pro· Arg

Leu

Pro

Gly

435

440

445

GTC

CCC

TTT

TTC

TCA

TGC

CAA

CGT

GGG

TAC

AAG

GGG

GTC

TGG

CGG

GGA

1392

Val

Pro

Phe

Phe

Ser

Cys

Gin

Arg Gly Tyr

Lys

Gly

Val

Trp

Arg

Gly

450

455

460

GAC

GGC

ATC

ATG

CAG

ACC

ACC

TGC

TCA

TGT

GGA

GCA

CAG

ATC

ACC

GGA

1440

Asp

Gly

Ile

Met

Gin

Thr

Thr

Cys

Ser

Cys

Gly

Alá

Gin

Ile

Thr

Gly

465

470

475

480

CAT

GTC

AAA

AAC

GGT

TCC

ATG

AGG

ATC

GTT

GGG

CCT

AAG

ACC

TGT

AGT

1488

His

Val

Lys

Asn

Gly

Ser

Met

Arg

Ile

Val

Gly

Pro

Lys

Thr

Cys

Ser

485 490 495 • · ·

AAC ATG

TGG CAT

GGA ACA

TTC CCC Phe Pro

ATC AAC’GCA TAC ACC ACG GGC CCC

1536

Asn

Met

Trp

His 500

Gly

Thr

Ile 505

Asn Alá

Tyr

Thr Thr 510

Gly Pro

TGC

ACG

CCC

TCC

CCA

GCG

CCA

AAC

TAT

TCC

AGG

GCG

CTG

TGG

CGG

GTG

1584

Cys

Thr

Pro

Ser

Pro

Alá

Pro

Asn

Tyr

Ser

Arg

Alá

Leu

Trp

Arg

Val

515

•

520

525

GCT

GCT

GAG

GAG

TAC

GTG

GAG

GTT

ACG

CGG

GTG

GGG

GAT

TTC

CAC

TAC

1632

Alá

Alá

Glu

Glu

Tyr

Val

Glu

Val

Thr

Arg

Val

Gly Asp

Phe

His

Tyr

530

535

540

GTG

ACG

AGC

ATG

ACC

ACT

GAC

AAC

GTA

AAA

TGC

CCG

TGC

CAG

GTT

CCA

1680

Val

Thr

Ser

Met

Thr

Thr

Asp

Asn

Val

Lys

Cys

Pro

Cys

Gin

Val

Pro

545

550

555

560

GCC

CCC

GAA

TTC

TTC

ACA

GAA

GTG

GAT

GGG

GTG

CGG

CTG

CAC

AGG

TAC

1728

Alá

Pro

Glu

Phe

Phe

Thr

Glu

Val

Asp

Gly

Val

Arg

Leu

His

Arg Tyr

565

570

575

GCT

CCG

GCG

TGC

AAA

CCT

CTC

CTA

CGG

GAG

GAG

GTC

ACA

TTC

CAG

GTC

1776

Alá

Pro

Alá

Cys

Lys

Pro

Leu

Leu

Arg

Glu

Glu

Val

Thr

Phe

Gin

Val

580

585

590

GGG

CTC

AAC

CAA

TAC. CTG

GTT

GGG

TCG

CAG

CTC

CCA

TGC

GAG

CCC

GAA

1824

Gly

Leu

Asn

Gin

Tyr

Leu

Val

Gly

Ser

Gin

Leu

Pro

Cys

Glu

Pro

Glu

595

600

605

CCG

GAT

GTA

GCA

GTG

CTC

ACT

TCC

ATG

CTC

ACC

GAC

CCC

TCC

CAC

ATC

1872

Pro

Asp

Val

Alá

Val

Leu

Thr

Ser

Met

Leu

Thr

Asp

Pro

Ser

His

Ile

610

615

620

ACA

GCA

GAG

ACG

GCT

AAG

CGC

AGG

CTG

GCC

AGG

GGG

TCT

CCC

CCC

TCC

1920

Thr

Alá

Glu

Thr

Alá

Lys

Arg

Arg

Leu

Alá

Arg Gly

Ser

Pro

Pro

Ser

625 630 635 640

• «

TTG

GCC

AGC

TCT

TCA

GCT

AGC

CAG

TTG

TCT* GCG

CCT

TCC

TCG

AAG

GCG 1968

Leu

Alá

Ser

Ser

Ser

Alá

Ser

Gin

Leu

Ser Alá

Pro

Ser

Ser

Lys

Alá

645

650

655

ACA

TAC

ATT

ACC

CAA

AAT

GAC

TTC

CCA

GAC GCT

GAC

CTC

ATC

GAG

GCC 2016

Thr

Tyr

Ile

Thr

Gin

Asn

Asp

Phe

Pro

Asp Alá

Asp

Leu

Ile

Glu

Alá

660

665

670

AAC

CTC

CTG

TGG

CGG

CAT

GAG

ATG

GGC

2043

Asn

Leu

Leu

Trp

Arg

His

Glu

Met

Gly

675

680

SEQ ID NO : 21

A SZEKVENCIA TÍPUSA: nukleotid az ennek megfelelő fehérjével

A SZEKVENCIA HOSSZÚSÁGA: 2116 bázispár

A SZÁL TÍPUSA: egyes

TOPOLÓGIA: lineáris

A MOLEKULA TÍPUSA: cDNS genomikus RNS-hez

EREDETI FORRÁS ORGANIZMUS: ember; transzfúzió után nem-A, nem-B hepatitisszel fertőzött szérum

KÖZVETLEN KÍSÉRLETI FORRÁS: a cDNS kiónok által képzett folyamatos szakasz a genom 5’ végéből

JELLEMZŐ VONÁSOK: , ΐ

308,—tol 2116, bp.-ig a PT—NANBH poliprotein ki.η rdi.j— lása

TULAJDONSÁGOK: vírus szerkezeti - és nem-szerkezeti - fehérjék

GATCACTCCC CTGTGAGGAA CTACTGTCTT CACGCAGAAA GCGTCTAGCC ATGGCGTTAG 60

TATGAGTGTC GTGCAGCCTC CAGGACCCCC CCTCCCGGGA GAGCCATAGT GGTCTGCGGA 120

ACCGGTGAGT ACACCGGAAT TGCCAGGACG ACCGGGTCCT TTCTTGGATT AACCCGCTCA 180

ATGCCTGGAG ATTTGGGCGT GCCCCCGCAA GACTGCTAGC CGAGTAGTGT TGGGTCGCGA 240

AAGGCCTTGT GGTACTGCCT GATAGGGTGC TTGCGAGTGC CCCGGGAGGT CTCGTAGACC 300

GTGCACC ATG

AGC ACG AAT CCT AAA CCT CAA AGA AAA ACC AAA CGT AAC

349

Met

Ser Thr

Asn

Pro 5

Lys Pro Gin Arg

Lys 10

Thr Lys Arg Asn

ACC

AAC

CGC

CGC

CCA

CAG

GAC

GTC

AAG

TTC

CCG

GGC

GGT GGT

CAG

ATC

397

Thr

Asn

Pro

Arg

Pro

Gin

Asp

Val

Lys

Phe

Pro

Gly Gly Gly

Gin

He

15

20

25

30

GTT

GGT

GGA

GTT

TAC

CTG* TTG

CCG

CGC

AGG

GGC

CCC

AGG TTG

GGT

GTG

445

Val

Gly Gly

Val

Tyr

Leu

Leu

Pro

Arg Arg

Gly Pro Arg Leu Gly

Val

40 45

CGC GCG

ACT AGG

AAG ACT TCC GAG

CGG TCG’

CAA CCT Gin Pro

CGT GGA AGG

CGA Arg

493

Arg

Alá

Thr

Arg 50

Lys Thr Ser

Glu

Arg 55

Ser

Arg

Gly 60

Arg

CAA

CCT

ATC

CCC

AAG

GCT

CGC

CAG

CCC

GAG

GGC

AGG

GCC

TGG

GCT

CAG

541

Gin

Pro

Ile

Pro

Lys

Alá

Arg

Gin

Pro

Glu

Gly

Arg

Alá

Trp

Alá

Gin

65

70

75

CCC

GGG

TAC

CCT

TGG

CCC

CTC

TAT

GGC

AAC

GAG

GGC

ATG

GGG

TGG

GCA

589

Pro

Gly Tyr

Pro

Trp

Pro

Leu

Tyr

Gly

Asn

Glu

Gly

Met

Gly Trp

Alá

80

85

90

GGA

TGG

CTC

CTG

TCA

CCC

CGT

GGC

TCC

CGG

CCT

AGT

TGG

GGC

CCC

ACT

637

Gly

Trp

Leu

Leu

Ser

Pro

Arg

Gly

Ser

Arg

Pro

Ser

Trp

Gly

Pro

Thr

100

105

110

115

GAC

CCC

CGG

CGT

AGG

TCG

CGT

AAT

TTG

GGT

AAA

GTC

ATC

GAT

ACC

CTC

685

Asp

Pro

Arg

Arg

Arg

Ser

Arg

Asn

Leu

Gly

Lys

Val

He

Asp

Thr

Leu

120

125

130

ACA

TGC

GGC

TTC

GCC

GAC

CTC

ATG

GGG

TAC

ATT

CCG

CTC

GTC

GGC

GCT

733

Thr

Cys

Gly

Phe

Alá

Asp

Leu

Met

Gly

Tyr

He

Pro

Leu

Val

Gly

Alá

135

140

145

CCC

TTA

GGG

GGC

GCT

GCC

AGG

GCC

CTG

GCG

CAT

GGC

GTC

CGG

GTT

CTG

781

Pro

Leu

Gly Gly

Alá

Alá

Arg

Alá

Leu

Alá

His

Gly

Val

Arg

Val

Leu

150

155

160

GAG

GAC

GGC

GTG

AAC

TAT

GCA

ACA

GGG

AAT

TTA

CCC

GGT

TGC

TCT

TTC

829

Glu

Asp

Gly

Val

Asn

Tyr

Alá

Thr

Gly

Asn

Leu

Pro

Gly

Cys

Ser

Phe

165

170

175

TCT

ATC

TTC

CTC

TTG

GCT

TTG

CTG

TCC

TGT

TTG

ACC

ATT

CCA

GCT

TCC

877

Ser

Ile

Phe

Leu

Leu

Alá

Leu

Leu

Ser

Cys

Leu

Thr

Ile

Pro

Alá

Ser

180 185 190 195

GCT Alá

TAT GAA GTG CGC AAC GTG TCC GGG ATC TAC CAT GTC ACG AAC GAT

925

Tyr Glu Val Arg Asn 200

Val

Ser

Gly Ile Tyr 205

His

Val Thr

Asn Asp 210

TGC

TCC

AAC

TCA

AGC

ATC

GTG

TAC

GAG

ACA

GCG

GAC

ATG

ATC

ATG

CAC

973

Cys

Ser

Asn

Ser

Ser

Ile

Val

Tyr

Glu

Thr

Alá

Asp

Met

Ile

Met

His

215

220

225

ACC

CCC

GGG

TGT

GTG

CCC

TGT

GTC

CGG

GAG

GGT

AAT

TCC

TCC

CGC

TGC

1021

Thr

Pro

Gly

Cys

Val

Pro

Cys

Val

Arg

Glu

Gly

Asn

Ser

Ser

Arg

Cys

230

235

240

TGG

GTA

GCG

CTC

ACT

CCC

ACG

CTC

GCG

GCC

AAG

GAC

GCC

AGC

ATC

CCC

1069

Trp

Val

Alá

Leu

Thr

Pro

Thr

Leu

Alá

Alá

Lys

Asp

Alá

Ser

Ile

Pro

245

250

-

255

ACT

GCG

ACA

ATA

CGA

CGC

CAC

GTC

GAT

TTG

CTC

GTT

GGG

GCG

GCT

GCC

1117

Thr

Alá

Thr

Ile

Arg Arg

His

Val

Asp

Leu

Leu

Val

Gly

Alá

Alá

Alá

260

265

270

275

TTC

TGC

TCC

GCT

ATG

TAC

GTG

GGG

GAT

CTC

TGC

GGA

TCT

GTT

TTC

CTC

1165

Phe

Cys

Ser

Alá

Met

Tyr

Val

Gly

Asp

Leu

Cys

Gly

Ser

Val

Phe

Leu

280

285

290

GTC

TCT

CAG

CTG

TTC

ACC

TTC

TCG

CCT

CGC

CGA

CAT

CAG

ACG

GTA

CAG

1213

Val

Ser

Gin

Leu

Phe

Thr

Phe

Ser

Pro

Arg Arg

His

Gin

Thr

Val

Gin

295

300

305

GAC

TGC

AAT

TGT

TCA

ATC

TAT

CCC

GGC

CAC

GTA

TCA

GGT

CAC

CGC

ATG

1261

Asp

Cys

Asn

Cys

Ser

Ile

Tyr

Pro

Gly

His

Val

Ser

Gly

His

Arg

Met

310

315

320

GCT

TGG

GAT

ATG

ATG

ATG

AAC

TGG

TCA

CCT

ACA

GCA

GCC

CTA

GTG

GTA

1309

Alá

Trp Asp

Met

Met

Met

Asn

Trp

Ser

Pro

Thr

Alá

Alá

Leu

Val

Val

325 330 335

• · ·

TCG Ser 340

CAG CTA CTC

CGG ATC CCA CAA GCT GTC· GTG GAC ATG GTG GCG GGG

1357

Gin

Leu Leu

Arg

Ile 345

Pro

Gin Alá

Val

Val Asp Met Val Alá Gly

350

355

GCC

CAC

TGG

GGA

GTC

CTG

GCG

GGC

CTT

GCC

TAC

TAT

TCC

ATG

GTG

GGG

1405

Alá

His

Trp

Gly

Val

Leu

Alá

Gly

Leu

Alá

Tyr

Tyr

Ser

Met

Val

Gly

360

365

370

AAC

TGG

GCT

AAG

GTC

TTG

GTT

GTG

ATG

CTA

CTC

TTT

GCC

GGC

GTT

GAC

1453

Asn

Trp

Alá

Lys

Val

Leu

Val

Val

Met

Leu

Leu

Phe

Alá

Gly

Val

Asp

375

380

385

GGG

GAA

CCT

TAC

ACG

ACA

GGG

GGG

ACA

CAC

GGC

CGC

GCC

GCC

CAC

GGG

1501

Gly

Glu

Pro

Tyr

Thr

Thr

Gly Gly

Thr

His

Gly

Arg

Alá

Alá

His

Gly

390

395

400

CTT

ACA

TCC

CTC

TTC

ACA

CCT

GGG

CCG

GCT

CAG

AAA

ATC

CAG

CTT

GTA

1549

Leu

Thr

Ser

Leu

Phe

Thr

Pro

Gly

Pro

Alá

Gin

Lys

Ile

Gin

Leu

Val

405

410

415

AAC

ACC

AAC

GGC

AGC

TGG

CAC

ATC

AAC

AGA

ACT

GCC

TTG

AAC

TGC

AAT

1597

Asn

Thr

Asn

Gly

Ser

Trp

His

Ile

Asn

Arg

Thr

Alá

Leu

Asn

Cys

Asn

420

425

430

435

GAC

TCC

CTC

CAA

ACT

GGG

TTC

CTT

GCC

GCG

CTG

TTC

TAC

ACG

CAC

AGG

1645

Asp

Ser

Leu

Gin

Thr

Gly

Phe

Leu

Alá

Alá

Leu

Phe

Tyr

Thr

His

Arg

440

445

450

TTC

AAT

GCG

TCC

GGA

TGC

TCA

GAG

CGC

ATG

GCC

AGC

TGC

CGC

CCC

ATT

1693

Phe

Asn

Alá

Ser

Gly

Cys

Ser

Glu

Arg

Met

Alá

Ser

Cys

Arg

Pro

Ile

455

460

465

GAC

CAG

TTC

GAT

CAG

GGG

TGG

GGT

CCC

ATC

ACT

TAT

AAT

GAG

TCC

CAC

1741

Asp

Gin

Phe

Asp

Gin

Gly Trp

Gly

Pro

Ile

Thr

Tyr

Asn

Glu

Ser

His

470 475 480

• ··

GGC TTC GAC Gly Leu Asp

CAG AGG CCC

TAT TGC TGG

CAC’TAC CCA CCT CAA CCG TGT

1789

Gin

Arg Pro

Tyr 490

cys

Trp

His

Tyr Alá 495

Pro

Gin Pro

Cys

485

GGT

ATC

GTG

CCC

GCG

TTG

CAG

GTG

TGT

GGC

CCA

GTG

TAC

TGT

TTC

ACT

1837

Gly

Ile

Val

Pro

Alá

Leu

Gin

Val

Cys

Gly

Pro

Val

Tyr

Cys

Phe

Thr

500

505

510

515

CCA

AGC

CCT

GTT

GTG

GTG

GGG

ACG

ACC

GAT

CGT

TTC

GGC

GCC

CCT

ACG

1885

Pro

Ser

Pro

Val

Val

Val

Gly

Thr

Thr

Asp

Arg

Phe

Gly

Alá

Pro

Thr

520

525

530

TAC

AGA

TGG

GGT

GAG

AAT

GAG

ACG

GAC

GTG

CTG

CTT

CTC

AAC

AAC

ACG

1933

Tyr

Arg

Trp

Gly

Glu

Asn

Glu

Thr

Asp

Val

Leu

Leu

Leu

Asn

Asn

Thr

535

540

545

CGG

CCG

CCA

CGG

GGC

AAC

TGG

TTC

GGC

TGT

ACA

TGG

ATG

AAT

AGC

ACC

1981

Arg

Pro

Pro

Arg

Gly

Asn

Trp

Phe

Gly Cys

Thr

Trp

Met

Asn

Ser

Thr

550

555

560

GGG

TTC

ACC

AAG

ACG

TGT

GGG

GGC

CCC

CCG

TGC

AAC

ATC

GGG

GGG

GTC

2029

Gly

Phe

Thr

Lys

Thr

Cys

Gly

Gly

Pro

Pro

Cys

Asn

Ile

Gly

Gly

Val

565

570

575

GGC

AAC

AAC

ACT

TTG

ATC

TGC

CCC

ACG

GAC

TGC

TTC

CGG

AAG

CAT

CCC

2077

Gly

Asn

Asn

Thr

Leu

Ile

Cys

Pro

Thr

Asp

Cys

Phe

Arg

Lys

His

Pro

580

585

590

595

GAG

GCC

ACT

TAC

ACC

AAA

TGC

GGT

TCG

GGG

CCT

TGG

TTG

2116

Glu

Alá

Thr

Tyr

Thr

Lys

Cys

Gly

Ser

Gly

Pro

Trp

Leu

600

605

- 99 SEQ. ID NO : 22

A SZEKVENCIA TÍPUSA: nukleotid az ennek megfelelő fehérjével A SZEKVENCIA HOSSZÚSÁGA: 3750 bázispár

A SZÁL TÍPUSA: egyes

TOPOLÓGIA: lineáris

A MOLEKULA TÍPUSA: cDNS genomikus RNS-hez bREDETI FORRÁS ORGANIZMUS: ember; transzfúzió után nem-A, nem-B hepatitisszel fertőzött szérum

KÖZVETLEN KÍSÉRLETI FORRÁS a cDNS kiónok által kéozett

JELLEMZŐ VONÁSOK:

lyamatos szakasz a genom 3* géből.

fővé—

Az 1.-től a 3750 b_P-ig a PT-NANBH poliprotein részlete

TULAJDONSÁGOK: vírus nem-szerkezeti fehérjék

TGG GAG GGC GTC TTC ACA GGC CTC ACC CAC GTG GAT GCC CAC

Trp Glu Gly Val Phe Thr Gly Leu Thr His Val Asp Alá His

10

TTC CTG

Phe Leu

TCC CAA ACA AAG CAG GCA GGA GAC AAC TTC CCC TAC CTG GTG GCG TAC

Ser Gin Thr Lys Gin Alá Gly Asp Asn Phe Pro Tyr Leu Val Alá Tyr

25 30

CAG GCT ACT GTG TGC GCT AGG GCC CAG GCC CCA CCT Gin Alá Thr Val Cys Alá Arg Alá Gin Alá Pro Pro

CCA TCA TGG GAT

Pro Ser Trp Asp

144

CAA ATG TGG AAG TGT CTC ATA CGG CTA AAG CCT ACT

Gin Hét Trp Lys Cys Leu Ile Arg Leu Lys Pro Thr - 50 55 60

CTG CGC GGG CCA

Leu Arg Gly Pro

192

100

ACA Thr 65

CCC TTG CTG

TAT AGG CTG GGA GCC GTC'CAA AAC GAG GTC ACC CTC

240

Pro

Leu Leu

Tyr

Arg Leu 70

Gly Alá

Val

Gin 75

Asn

Glu Val Thr Leu 80

ACA

CAC

CCC

ATA

ACC

AAA

TTC

ATC

ATG

GCA

TGC

ATG

TCA

GCC

GAC

CTG

288

Thr

His

Pro

Ile

Thr

Lys

Phe

Ile

Met

Alá

Cys

Met

Ser

Alá

Asp

Leu

85

90

95

GAG

GTC

GTC

ACG

AGC

ACC

TGG

GTG

CTG

GTG

GGC

GGG

GTC

CTT

GCA

GCT

336

Glu

Val

Val

Thr

Ser

Thr

Trp

Val

Leu

Val

Gly Gly

Val

Leu

Alá

Alá

100

105

110

CTG

GCT

GCG

TAT

TGC

TTG

ACA

ACA

GGC

AGC

GTG

GTC

ATT

GTG

GGT

AGG

384

Leu

Alá

Alá

Tyr

Cys

Leu

Thr

Thr

Gly

Ser

Val

Val

Ile

Val

Gly Arg

115

120

125

ATC

ATC

TTG

TCC

GGG

CGG

CCG

GCT

ATT

GTT

CCC

GAC

AGG

GAA

GTC

CTC

432

Ile

Ile

Leu

Ser

Gly

Arg

Pro

Alá

Ile

Val

Pro

Asp

Arg

Glu

Val

Leu

130

135

140

TAC

CAG

GAG

TTC

GAT

GAG

ATG

GAA

GAG

TGC

GCG

TCG

CAC

CTC

CCT

TAC

480

Tyr

Gin

Glu

Phe

Asp

Glu

Met

Glu

Glu

Cys

Alá

Ser

His

Leu

Pro

Tyr

145

150

155

160

ATC

GAG

CAG

GGA

ATG

CAG

CTC

GCC

GAG

CAG

TTC

AAG

CAA

AAA

GCG

CTC

528

Ile

Glu

Gin

Gly

Met

Gin

Leu

Alá

Glu

Gin

Phe

Lys

Gin

Lys

Alá

Leu

165

170

175

GGG

TTG

CTG

CAG

ACA

GCC

ACC

AAG

CAA

GCG

GAG

GCC

GCT

GCT

CCC

GTG

576

Gly

Leu

Leu

Gin

Thr

Alá

Thr

Lys

Gin

Alá

Glu

Alá

Alá

Alá

Pro

Val

180

185

190

GTG

GAG

TCC

AAG

TGG

CGA

GCC

CTT

GAG

ACC

TTC

TGG

GCG

AAA

CAC

ATG

624

Val

Glu

Ser

Lys

Trp

Arg

Alá

Leu

Glu

Thr

Phe

Trp

Alá

Lys

His

Met

195 200 205 ····

101 • · ·

TGG AAC TTC ATC AGC GGG

ATA CAG TAC TTA’ GCA GGC TTG TCC ACT CTG

672

Trp Asn

Phe

Ile Ser

Gly

Ile 215

Gin

Tyr

Leu

Alá

Gly 220

Leu

Ser

Thr

Leu

210

CCT

GGG

AAT

CCC

GCG

ATT

GCA

TCA

CTG

ATG

GCG

TTC

ACA

GCC

TCT

GTC

720

Pro

Gly

Asn

Pro

Alá

Ile

Alá

Ser

Leu

Met

Alá

Phe

Thr

Alá

Ser

Val

225

230

235

240

ACT

AGC

CCG

CTC

ACC

ACC

CAA

TCT

ACC

CTC

CTG

CTT

AAC

ATC

CTG

GGG

768

Thr

Ser

Pro

Leu

Thr

Thr

Gin

Ser

Thr

Leu

Leu

Leu

Asn

Ile

Leu

Gly

245

250

255

GGA

TGG

GTA

GCC

GCC

CAA

CTC

GCT

CCC

CCC

AGT

GCT

GCT

TCA

GCT

TTC

816

Gly

Trp

Val

Alá

Alá

Gin

Leu

Alá

Pro

Pro

Ser

Alá

Alá

Ser

Alá

Phe

260

265

270

GTA

GGC

GCC

GGC

ATT

GCT

GGT

GCG

GCT

GTT

GGC

AGC

ATA

GGC

CTT

GGG

864

Val

Gly

Alá

Gly

Ile

Alá

Gly

Alá

Alá

Val

Gly

Ser

Ile

Gly

Leu

Gly

275

280

285

AAG

GTG

CTT

GTG

GAC

ATC

TTG

GCG

GGC

TAT

GGA

GCA

GGA

GTG

GCA

GGC

912

Lys

Val

Leu

Val

Asp

Ile

Leu

Alá

Gly

Tyr

Gly

Alá

Gly

Val

Alá

Gly

290

295

300

GCG

CTC

GTG

GCC

TTT

AAG

GTC

ATG

AGC

GGC

GAA

ATG

CCC

TCC

ACC

GAG

960

Alá

Leu

Val

Alá

Phe

Lys

Val

Met

Ser

Gly

Glu

Met

Pro

Ser

Thr

Glu

305

310

315

320

GAC

CTG

GTT

AAC

TTA

CTC

CCT

GCC

ATC

CTC

TCT

CCT

GGT

GCC

CTG

GTC

1008

Asp

Leu

Val

Asn

Leu

Leu

Pro

Alá

Ile

Leu

Ser

Pro

Gly

Alá

Leu

Val

325

330

335

GTC

GGG

GTC

GTG

TGC

GCA

GCG

ATA

CTG

CGT

CGG

CAC

GTG

GGT

CCA

GGG

1056

Val

Gly

Val

Val

Cys

Alá

Alá

Ile

Leu

Arg Arg

His

Val

Gly

Pro

Gly

340

345

350

102 • · «

GAG GGG GCT GTG CAG

TGG Trp

ATG Met

AAC CGG CTG· ATA GCG TTC GCC TCG CGG

1104

Glu

Gly

Alá Val 355

Gin

Asn Arg 360

Leu Ile

Alá

Phe 365

Alá Ser Arg

GGT

AAC

CAT

GTT

TCC

CCC

ACG

CAC

TAT

GTG

CCA

GAG

AGC

GAC

GCC

GCA

1152

Gly

Asn

His

Val

Ser

Pro

Thr

His

Tyr

Val

Pro

Glu

Ser

Asp

Alá

Alá

370

375

380

GCA

CGT

GTC

ACT

CAG

ATC

CTC

TCC

GAC

CTT

ACT

ATC

ACC

CAA

CTG

TTG

1200

Alá

Arg

Val

Thr

Gin

Ile

Leu

Ser

Asp

Leu

Thr

Ile

Thr

Gin

Leu

Leu

385

390

395

400

AAG

AGG

CTC

CAC

CAG

TGG

ATT

AAC

GAG

GAC

TGC

TCC

ACG

CCC

TGC

TCC

1248

Lys

Arg

Leu

His

Gin

Trp

Ile

Asn

Glu

Asp

Cys

Ser

Thr

Pro

Cys

Ser

405

410

415

GGC

TCG

TGG

CTA

AGG

GAT

GTT

TGG

GAC

TGG

ATA

TGC

ACA

GTT

TTG

GCT

1296

Gly

Ser

Trp

Leu

Arg Asp

Val

Trp

Asp

Trp

Ile

Cys

Thr

Val

Leu

Alá

420

425

430

GAC

TTC

AAG

ACC

TGG

CTC

CAG

TCC

AAG

CTC

CTG

CCG

CGA

TTA

CCG

GGA

1344

Asp

Phe

Lys

Thr

Trp

Leu

Gin

Ser

Lys

Leu

Leu

Pro

Arg

Leu

Pro

Gly

435

440

445

GTC

CCC

TTT

TTC

TCA

TGC

CAA

CGT

GGG

TAC

AAG

GGG

GTC

TGG

CGG

GGA

1392

Val

Pro

Phe

Phe

Ser

Cys

Gin

Arg Gly Tyr

Lys

Gly

Val

Trp Arg Gly

450

455

460

GAC

GGC

ATC

ATG

CAG

ACC

ACC

TGC

TCA

TGT

GGA

GCA

CAG

ATC

ACC

GGA

1440

Asp

Gly

Ile

Met

Gin

Thr

Thr

Cys

Ser

Cys

Gly

Alá

Gin

Ile

Thr

Gly

465

470

475

480

CAT

GTC

AAA

AAC

GGT

TCC

ATG

AGG

ATC

GTT

GGG

CCT

AAG

ACC

TGT

AGT

1488

His

Val

Lys

Asn

Gly

Ser

Met

Arg

Ile

Val

Gly

Pro

Lys

Thr

Cys

Ser

485 490 495

- 103 ··*

AAC ATG

TGG CAT

GGA ACA TTC CCC

ATC AAG

GCA TAC Alá Tyr

ACC ACG GGC

CCC Pro

1536

Asn

Mer

Trp

His 500

Gly Thr Phe

Pro

He 505

Asn

Thr

Thr 510

Gly

TGC

ACG

CCC

TCC

CCA

GCG

CCA

AAC

TAT

TCC

AGG

GCG

CTG

TGG

CGG

GTG

1584

Cys

Thr

Pro

Ser

Pro

Alá

Pro

Asn

Tyr

Ser

Arg

Alá

Leu

Trp Arg

Val

515

520

525

GCT

GCT

GAG

GAG

TAC

GTG

GAG

GTT

ACG

CGG

GTG

GGG

GAT

TTC

CAC

TAC

1632

Alá

Alá

Glu

Glu

Tyr

Val

Glu

Val

Thr

Arg

Val

Gly

Asp

Phe

His

Tyr

530

535

540

GTG

ACG

AGC

ATG

ACC

ACT

GAC

AAC

GTA

AAA

TGC

CCG

TGC

CAG

GTT

CCA

1680

Val

Thr

Ser

Met

Thr

Thr

Asp

Asn

Val

Lys

Cys

Pro

Cys

Gin

Val

Pro

545

550

555

560

GCC

CCC

GAA

TTC

TTC

ACA

GAA

GTG

GAT

GGG

GTG

CGG

CTG

CAC

AGG

TAC

1728

Alá

Pro

Glu

Phe

Phe

Thr

Glu

Val

Asp

Gly

Val

Arg

Leu

His

Arg

Tyr

565

570

575

GCT

CCG

GCG

TGC

AAA

CCT

CTC

CTA

CGG

GAG

GAG

GTC

ACA

TTC

CAG

GTC

1776

Alá

Pro

Alá

Cys

Lys

Pro

Leu

Leu

Arg

Glu

Glu

Val

Thr

Phe

Gin

Val

580

585

590

GGG

CTC

AAC

CAA

TAC

CTG

GTT

GGG

TCG

CAG

CTC

CCA

TGC

GAG

CCC

GAA

1824

Gly

Leu

Asn

Gin

Tyr

Leu

Val

Gly

Ser

Gin

Leu

Pro

Cys

Glu

Pro

Glu

595

600

605

CCG

GAT

GTA

GCA

GTG

CTC

ACT

TCC

ATG

CTC

ACC

GAC

CCC

TCC

CAC

ATC

1872

Pro

Asp

Val

Alá

Val

Leu

Thr

Ser

Met

Leu

Thr

Asp

Pro

Ser

His

He

610

615

620

ACA

GCA

GAG

ACG

GCT

AAG

CGC

AGG

CTG

GCC

AGG

GGG

TCT

CCC

CCC

TCC

1920

Thr

Alá

Glu

Thr

Alá

Lys

Arg Arg

Leu

Alá

Arg

Gly

Ser

Pro

Pro

Ser

625 630 635 640

- 104 • ·

TTG Leu

GCC AGC TCT TCA GCT AGC CAG

TTG TCT’gCG CCT TCC TCG AAG GCG

1968

Alá Ser Ser Ser Alá 645

Ser Gin

Leu

Ser 650

Alá

Pro Ser Ser

Lys 655

Alá

ACA

TAC

ATT

ACC

CAA

AAT

GAC

TTC

CCA

GAC

GCT

GAC

CTC

ATC

GAG

GCC

2016

Thr

Tyr

Ile

Thr

Gin

Asn

Asp

Phe

Pro

Asp

Alá

Asp

Leu

Ile

Glu

Alá

660

665

670

AAC

CTC

CTG

TGG

CGG

CAT

GAG

ATG

GGC

GGG

GAC

ATT

ACC

CGC

GTG

GAG

2064

Asn

Leu

Leu

Trp

Arg

His

Glu

Met

Gly Gly

Asp

Ile

Thr

Arg

Val

Glu

675

680

685

TCA

GAG

AAC

AAG

GTA

GTA

ATC

CTG

GAC

TCT

TTC

GAC

CCG

CTC

CGA

GCG

2112

Ser

Glu

Asn

Lys

Val

Val

Ile

Leu

Asp

Ser

Phe

Asp

Pro

Leu

Arg

Alá

690

695

700

GAG

GAG

GAT

GAG

CGG

GAA

GTG

TCC

GTC

CCG

GCG

GAG

ATC

CTG

CGG

AAA

2160

Glu

Glu

Asp

Glu

Arg

Glu

Val

Ser

Val

Pro

Alá

Glu

Ile

Leu

Arg

Lys

705

710

715

720

TCC

AAG

AAA

TTC

CCA

CCA

GCG

ATG

CCC

GCA

TGG

GCA

CGC

CCG

GAT

TAC

2208

Ser

Lys

Lys

Phe

Pro

Pro

Alá

Met

Pro

Alá

Trp

Alá

Arg

Pro

Asp

Tyr

725

730

735

AAC

CCT

CCG

CTG

CTG

GAG

TCC

TGG

AAG

GCC

CCG

GAC

TAC

GTC

CCT

CCA

2256

Asn

Pro

Pro

Leu

Leu

Glu

Ser

Trp

Lys

Alá

Pro

Asp

Tyr

Val

Pro

Pro

740

745

750

GTG

GTA

CAT

GGG

TGC

CCA

CTG

CCA

CCT

ACT

AAG

ACC

CCT

CCT

ATA

CCA

2304

Val

Val

His

Gly Cys

Pro

Leu

Pro

Pro

Thr

Lys

Thr

Pro

Pro

Ile

Pro

755

760

765

CCT

CCA

CGG

AGG

AAG

AGG

ACA

GTT

GTT

CTG

ACA

GAA

TCC

ACC

GTG

TCT

2352

Pro

Pro

Arg Arg Lys

Arg

Thr

Val

Val

Leu

Thr

Glu

Ser

Thr

Val

Ser

770 775 780

105

TCT Ser 785

GCC CTG CCG

GAG CTT GCC ACA AAG GCT TTC GGT AGC TCC GAA CCG

2400

Alá

Leu Alá

Glu

Leu Alá 790

Thr Lys

Alá

Phe 795

Gly Ser Ser

Glu Pro 800

TCG

GCC

GTC

GAC

AGC

GGC

ACG

GCA

ACC

GCC

CCT

CCT

GAC

CAA

CCC

TCC

2448

Ser

Alá

Val

Asp

Ser

Gly

Thr

Alá

Thr

Alá

Pro

Pro

Asp

Gin

Pro

Ser

805

810

815

GAC

GAC

GGC

GGA

GCA

GGA

TCT

GAC

GTT

GAG

TCG

TAT

TCC

TCC

ATG

CCC

2496

Asp

Asp

Gly

Gly

Alá

Gly

Ser

Asp

Val

Glu

Ser

Tyr

Ser

Ser

Met

Pro

820

825

830

CCC

CTT

GAG

GGG

GAG

CCG

GGG

GAC

CCC

GAT

CTC

AGC

GAC

GGG

TCT

TGG

2544

Pro

Leu

Glu

Gly

Glu

Pro

Gly Asp

Pro

Asp

Leu

Ser

Asp

Gly

Ser

Trp

835

840

845

TCT

ACC

GTG

AGT

GAG

GAG

GCC

GGT

GAG

GAC

GTC

GTC

TGC

TGC

TCG

ATG

2592

Ser

Thr

Val

Ser

Glu

Glu

Alá

Gly

Glu

Asp

Val

Val

Cys

Cys

Ser

Met

850

855

860

TCC

TAC

ACA

TGG

ACA

GGC

GCT

CTG

ATC

ACG

CCA

TGC

GCT

GCG

GAG

GAA

2640

Ser

Tyr

Thr

Trp

Thr

Gly

Alá

Leu

Ile

Thr

Pro

Cys

Alá

Alá

Glu

Glu

865

870

875

880

AGC

AAG

CTG

CCC

ATC

AAC

GCG

TTG

AGC

AAC

TCT

TTG

CTG

CGT

CAC

CAC

2688

Ser

Lys

Leu

Pro

Ile

Asn

Alá

Leu

Ser

Asn

Ser

Leu

Leu

Arg

Hls

Hls

885

890

895

AAC

ATG

GTC

TAC

GCT

ACC

ACA

TCC

CGC

AGC

GCA

AGC

CAG

CGG

CAG

AAG

2736

Asn

Met

Val

Tyr

Alá

Thr

Thr

Ser

Arg

Ser

Alá

Ser

Gin

Arg

Gin

Lys

900

905

910

AAG

GTC

ACC

TTT

GAC

AGA

CTG

CAA

ATC

CTG

GAC

GAT

CAC

TAC

CAG

GAC

2784

Lys

Val

Thr

Phe

Asp

Arg

Leu

Gin

Ile

Leu

Asp

Asp

Hls

Tyr

Gin

. Asp

915 920 925 • · · · ·

- 106>• · ·· · ·

GTG CTC Val Leu

AAG Lys

GAG ATG AAG

GCG AAG GCG TCC-ACA GTT AAG GCT AAG CTT

2832

Glu Met

Lys

Alá Lys 935

Alá Ser

Thr

Val Lys Alá Lys Leu 940

930

CTA

TCA

GTA

GAG

GAA

GCC

TGC

AAG

CTG

ACG

CCC

CCA

CAT

TCG

GCC

AAA

2880

Leu

Ser

Val

Glu

Glu

Alá

Cys

Lys

Leu

Thr

Pro

Pro

His

Ser

Alá

Lys

945

950

955

960

TCT

AAA

TTT

GGC

TAT

GGG

GCA

AAG

GAC

GTC

CGG

AAC

CTA

TCC

AGC

AAG

2928

Ser

Lys

Phe

Gly

Tyr

Gly

Alá

Lys

Asp

Val

Arg

Asn

Leu

Ser

Ser

Lys

965

970

975

GCC

ATT

AAC

CAC

ATC

CGC

TCC

GTG

TGG

GAG

GAC

TTG

TTG

GAA

GAC

ACT

2976

Alá

Ile

Asn

His

Ile

Arg

Ser

Val

Trp

Glu

Asp

Leu

Leu

Glu

Asp

Thr

980

985

990

GAA

ACA

CCA

ATT

GAC

ACC

ACC

ATC

ATG

GCA

AAA

AAT

GAG

GTT

TTC

TGC

3024

Glu

Thr

Pro

Ile

Asp

Thr

Thr

Ile

Met

Alá

Lys

Asn

Glu

Val

Phe

Cys

995

1000

1005

GTC

CAA

CCA

GAG

AGA

GGA

GGC

CGC

AAG

CCA

GCT

CGC

CTT

ATC

GTG

TTC

3072

Val

Gin

Pro

Glu

Arg

Gly Gly

Arg

Lys

Pro

Alá

Arg

Leu

Ile

Val

Phe

1010

1015

1020

CCA

GAC

TTG

GGG

GTC

CGT

GTG

TGC

GAG

AAA

ATG

GCC

CTC

TAT

GAC

GTG

3120

Pro Asp

Leu

Gly

Val

Arg

Val

Cys

Glu

Lys

Met

Alá

Leu

Tyr

Asp

Val

1025

1030

1035

1040

GTC

TCC

ACC

CTC

CCT

CAG

GCT

GTG

ATG

GGC

TCC

TCG

TAC

GGA

TTC

CAG

3168

Val

Ser

Thr

Leu

Pro

Gin

Alá

Val

Met

Gly

Ser

Ser

Tyr Gly

Phe

Gin

1045

1050

1055

TAT

TCT

CCT

GGA

CAG

CGG

GTC

GAG

TTC

CTG

GTG

AAC

GCC

TGG

AAA

. TCA

3216

Tyr

Ser

Pro

Gly Gin Arg

Val

Glu

Phe

Leu

Val

Asn

Alá Trp Lys

Ser

1060 1065 1070 • · ·

- 107 -

AAG AAG

ACC

CCT

ATG

GGC

TTT

GCA

TAT

GAC’ ACC

CGC

TGT

TTT

GAC

TCA

3264

Lys Lys

Thr

Pro

Met

Gly

Phe

Alá

Tyr

Asp

Thr

Arg Cys

Phe

Asp

Ser

1075

1080

1085

ACA GTC

ACT

GAG

AAT

GAC

ATC

CGT

GTA

GAG

GAG

TCA

ATT

TAT

CAA

TGT

3312

Thr Val

Thr

Glu

Asn

Asp

Ile

Arg

Val

Glu

Glu

Ser

Ile

Tyr

Gin

Cys

1090

1095

1100

TGT GAC

TTG

GCC

CCC

GAA

GCC

AGA

CAG

GCC

ATA

AGG

TCG

CTC

ACA

GAG

3360

Cys Asp

Leu

Alá

Pro

Glu

Alá

Arg

Gin

Alá

Ile

Arg

Ser

Leu

Thr

Glu

1105

1110

1115

1120

CGG CTT

TAT

ATC

GGG

GGT

CCC

CTG

ACT

AAT

TCA

AAA

GGG

CAG

AAC

TGC

3408

Arg Leu

Tyr

Ile

Gly Gly

Pro

Leu

Thr

Asn

Ser

Lys

Gly

Gin

Asn

Cys

1125

1130

1135

GGC TAT

CGC

CGG

TGC

CGC

GCG

AGC

GGC

GTG

CTG

ACG

ACT

AGC

TGC

GGT

3456

Gly Tyr

Arg Arg

Cys

Arg

Alá

Ser

Gly

Val

Leu

Thr

Thr

Ser

Cys

Gly

1140

1145

1150

AAT ACC

CTC

ACA

TGT

TAC

TTG

AAG

GCC

TCT

GCA

GCC

TGT

CGA

GCT

GCA

3504

Asn Thr

Leu

Thr

Cys

Tyr

Leu

Lys

Alá

Ser

Alá

Alá

Cys

Arg

Alá

Alá

1155

1160

1165

AAG CTC

CAG

GAC

TGC

ACG

ATG

CTC

GTG

TGC

GGA

GAC

GGC

CTT

GTC

GTT

3552

Lys Leu

Gin

Asp

Cys

Thr

Met

Leu

Val

Cys

Gly Asp

Asp

Leu

Val

Val

1170

1175

1180

ATC TGT

GAG

AGC

GCG

GGA

ACC

CAG

GAG

GAC

GCG

GCG

AGC

CTA

CGA

GTC

3600

Ile Cys

Glu

Ser

Alá

Gly

Thr

Gin

Glu

Asp

Alá

Alá

Ser

Leu

Arg

Val

1185

1190

1195

1200

TTC ACG

GAG

GCT

ATG

ACT

AGG

TAC

TCT

GCC

CCC

CCC

GGG

GAC

CCG

CCC

3648

Phe Thr

Glu

Alá

Met

Thr

Arg Tyr

Ser

Alá

Pro

Pro

Gly

Asp

Pro

Pro

1205

1210

1215

• · ·

- 108 -

CAA Gin

CCA GAA TAC

GAC CTG Asp Leu

GAG TTG ATA ACA TCA TGC TCC TCC AAT GTG

3696

Pro

Glu Tyr 1220

Glu Leu Ile 1225

Thr Ser Cys

Ser Ser Asn Val 1230

TCG

GTC

GCG CAC

GAT

GCA

TCT

GGC AAA

AGG

GTA

TAC

TAC CTC

ACC

CGT

3744

Ser

Val

Alá His

Asp

Alá

Ser

Gly Lys

Arg

Val

Tyr

Tyr Leu

Thr

Arg

1235 1240 1245

GAC CCG

Asp Pro

1250

3750

- 109 SEQ ID NO : 23

A SZEKVENCIA TÍPUSA: nukleotid

A SZEKVENCIA HOSSZÚSÁGA: 23 bázis

A SZÁL TÍPUSA: egyes

TOPOLÓGIA: lineáris

A MOLEKULA 'TÍPUSA: szintetikus DNS

EREDETI FORRÁS ORGANIZMUS: Autographa californica Baculovirus nukleáris polihedrózis vírus ÍAcNPVj

KÖZVETLEN KÍSÉRLETI FORRÁS: oligonukleotid szintetizáló berendezés; oligo d24

JELLEMZŐ VONÁSOK:

1.-től 23· bázisig homológ az AcNPV polihedrin gén egy részletével, amely a pAc3őO-ban es hasonló vektorokban levő BamHI klónozó helytől lefelé fekszik.

TULAJDONSÁGOK: beindítja a DNS szintézist a Baculovirus transzfer vektor szekvenciákból, amelyek szegélyezik a BamHI helynél beiktatott DNS-t

CGGGTTTAAC ATTACGGATT TCC

- 110 SEQ Π) NO : 24

A SZEKVENCIA TÍPUSA: nukleotid, az ennek megfelelő aminosavakkal ábrázolva

A SZEKVENCIA HOSSZÚSÁGA: 31 bázis

A SZÁL TÍPUSA: egyes TOPOLÓGIA: lineáris

A MOLEKULA TÍPUSA: szintetikus DNS

EREDETI FORRÁS ORGANIZMUS: Autographa californica Baculovirus nukleáris polihedrózis virus (AcNPV) KÖZVETLEN KÍSÉRLETI FORRÁS: oligonukleotid szintetizáló berendezés; oligo dl26

JELLEMZŐ VONÁSOK: .

1.-től 31· bázisig homológ a fölfelé levő ggatlakozási szekvenciákkal, amelyek akkor keletkeznek, amikor a d75-tel (SEQ ID : 5) kibővített cDNS-t a pAc36O-ban és,hasonló vektorokban levő BamHI helybe klónozzuk; a 13· és 14· bázisoknál levő hibás” változtatások PstI helyet vezetnek be;

1.-től 10. bázisig homológ a pAc36O-ban és hasonló vektorokban levő BamHI hely területtel

4.vtől 9.-bázisig BamHI hely

12.-től 17. bázisig PstI hely beindítja a DNS szintézist a Baculovirus-transzfer vektorok csatlakozásánál és olyan szekvenciák csatlakozásánál, amelyek előzőleg oligo d75-tel lettek kibővítve; PstI felismerő helyet vezet be az ezt követő klónozási munkához

GCA GTA TCG GCG GAA TTC 31

Alá Val Ser Alá Glu Phe

TULAJDONSÁGOK:

TAAGGATCCC CCT

Ser

- 111 • ·* • « • ·

SEQ ID NO : 2 5

A SZEKVENCIA TÍPUSA: nukleotid, az ennek megfelelő aminosavakkal ábrázolva

A SZEKVENCIA HOSSZÚSÁGA: 45 bázis

A SZÁL TÍPUSA: egyes

TOPOLÓGIA: lineáris

A MOLEKULA TÍPUSA: szintetikus DNS

EREDETI FORRÁS ORGANIZMUS: ^/A

KÖZVETLEN KÍSÉRLETI FORRÁS: oligonukleotid szintetizáló berendezés; oligo dl32 JELLEMZŐ VONÁSOK: .

5,-tői 10, bázisig PstI felismerő hely

13,-'tói 27, bázisig kapcsoló, amely 5 Lys gyököt kódol

28.-tól 45. bázisig homológ a BR11 (SEQ ID NO : 7)

4. és 21«, bázisok közti terülétével

beindítja a DNS szintézist a BR11 5’ végénél és olyan szintetikus szekvenciát vezet be, amely 5 lizint kódol, valamint bevezet egy PstI felismerő helyet az ezt követő klónozási munkához .

CTGCCTGCA GTA AAG AAG AAG AAG AAG AAA ACC AAA

CGT AAC ACC A

Val Lys Lys Lys Lys Lys Lys Thr Lys Arg Asn Leu

Claims (9)

1./ Eljárás PT-NANBH vírus polipeptid. előállitására, azzal jellemezve, hogy klónozunk vagy szintetizálunk egy olyan antigént kódoló DNS szekvenciát, amelynek aminosav-szekvenciája legalább 90 %-ban homológ a SEQ ID NO : 3, 4, 5, 18, 19, 20, 21 vagy 22-ben bemutatott aminosavszekvenciával vagy ennek valamely antigén tulajdonságú fragmentumával, ezt a DNS szekvenciát valamely kifejező vektorba iktatjuk olyan módon, hogy ez képes legyen megfelelő gazdaszervezetben leifejeződni, a kifejező vektorral valamely gazdasejtet transzformálunk, a transzformált gazdasejtet tenyésztjük, és a ví rus polipeptidet izoláljuk.

2./ Az 1. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy a SEQ ID NO : 3, 4, vagy 5-ben bemutatott aminosav-szekvenciával vagy ennek valamely antigén tulajdonságú fragmentumával legalább 90 ^-ban homológ ami no sav- s z e Írve ne iát kódoló DNS szekvenciát szintetizálunk vagy klónozunk.

3./ A 2o igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy a Sn'Q ID NO : 3 vagy 4-ben bemutatott aminosav-szekvenciával vagy annak valamely antigén tulajdonságú fragmentumával legalább 90 %-ban homológ aminosav-szekvenciát kódoló DNS szekvenciát szintetizálunk vagy klónozunk..

4./ A 2. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy a SEQ ID NO : 5-ben bemutatott aminosav-szekvenciával vagy

90 M-ban homológ aminosav-szekvenciát kódoló DNS szekvenciát szintetizálunk vagy klónozunk.

• · ···

-113-

5./ Az 1. - 4· igénypontok bármelyike szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy az ezekben az igénypontokban megnevezett SEQ ID NO ι aminosav-szekvenciákkal vagy azok vala- mely antigén tulaj donságú fragmentumával legalább 95 %-ban homológ aminosav-szekvenciákat szekvenciákat szintetizálunk vagy klónozunk.

6./ Az 1.-5· igénypontok bármelyike szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy az ezekben az igénypontokban megnevezett

SEQ ID NO. aminosav-szekvenciákkal vagy azok valamely anti gén tulajdonságú fragmentumával legalább 98 %-ban homológ lünk vagy kódolunk.

7./

Eljárás PT-NANBH vírus polipeptid előállítására azzal jellemezve, hogy klónozunk vagy szintetizálunk egy olyan DNS szekvenciát, amely egy antigént kódol a vírus genom szervezeti kódoló területéből és egy antigént kódol a vírus genom nem-szerkezeti kódoló területéből, ezt a DNS szekvenciát valamely kifejező vektorba iktatjuk olyan módon, hogy ez képes legyen valamely megfelelő gazdaszervezetben kifejeződni, a kifejező vektorral valamely gazdasejtet transzformálunk, a transzformált gazdasejtet tenyésztjük, és a vírus polipeptidet izoláljuk.

8./ A 7. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy olyan DNS szekvenciát klónozunk vagy szintetizálunk, amely a vírus genom szerkezeti kódoló területéből olyan antigént kódol, amelynek ami no sav-sz eleve nci áj a legalább 90 %-ban ho- • ··« ·

114 ··· •· V •? ·· ··· mológ a SnQ ID NO.: 5-ben bemutatott aminosav-szekvenciával, vagy én tulaj ionságú fragmentumávirus genom nem-szerkezeti kódoló területéből olyan ö' lább

90 Y ban homológ a SEQ ID NO : 3, vagy 4.-ben bemutatott olyan DNS szekvenciát klónozunk vagy szintetizálunk, a SEQ ID

a./ /z az ebből

20, 21 vagy 22-ben van bemutatva, és a létrejövő nukleinsav sitása céljából; vagy

b./ a vizsgálati mintában j elen levő vírus RNS-ből át, amely megfelel a SEQ ID NO

3, 4, 5, 18, 19, 20, 21 vagy kibővítünk, es az előre kiválasztott DNS szekvenciát azono sitjuk.

- 115 -

V

I r‘

11./ Eljárás PT-NANBH vírus antigén vagy vírus antitest kimutatására azzal jellemezve, hogy a vizsgálati mintát érintkezésbe hozzuk valamely, az 1.-8. igénypontok bármelyike szerint előállított ΡΤ-1ΪΑΝΒΗ polipepiiddel, vagy valamely ez ellen kialakított poliklonális vagy monokionális