JPH06107687A

JPH06107687A - 抗ウイルス剤

Info

Publication number: JPH06107687A
Application number: JP2419126A
Authority: JP
Inventors: Peter Edmund Highfield; エドマンドハイフィールドピーター; Brian Colin Rodgers; コリンロジャーズブライアン; Richard Seton Tedder; セトンテダーリチャード; John Anthony James Barbara; アンソニージェームスバーバラジョン
Original assignee: Wellcome Foundation Ltd
Current assignee: Wellcome Foundation Ltd
Priority date: 1989-12-18
Filing date: 1990-12-18
Publication date: 1994-04-19
Also published as: GB2239245A; FR2655990A1; AT400724B; AR243239A1; IE65172B1; IT9048588A1; FI906208A; SE9004010L; NO905438L; IT1242183B; NZ236491A; ATA257190A; IE904540A1; BR9006422A; CH684594A5; IT9048588A0; GB9027250D0; GB2239245B; NL9002779A; DE4040339C2

Abstract

(57)【要約】【目的】抗ウイルス剤を提供する。【構成】輸血後非Ａ型非Ｂ型肝炎ウイルスポリペプチ
ド、このようなウイルスポリペチドをコードするＤＮＡ
配列、このようなＤＮＡ配列を含む発現ベクター、およ
びこのような発現ベクターによって形質転換された宿主
に関する。本発明はこのようなペプチドの診断アッセイ
とワクチン製剤における使用にも関する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、輸血後、非Ａ非Ｂ肝炎
（ＰＴ−ＮＡＮＢＨ）の原因であるウイルス病源体の単
離と特性決定、そして、特にＰＴ−ＮＡＮＢＨウイルス
ポリペプチド、このようなウイルスポリペプチドをコー
ドしているＤＮＡ配列、このようなＤＮＡ配列を含む発
現ベクター、およびこのような発現ベクターで形質転換
された宿主細胞に関する。本発明は、ＰＴ−ＮＡＮＢＨ
の診断のための核酸ハイブリッド形成アッセイにおける
ＤＮＡ配列の使用にも関する。本発明は、さらに、ＰＴ
−ＮＡＮＢＨの診断についてのイムノアッセイ、また
は、それを予防するためのワクチンにおけるＰＴ−ＮＡ
ＮＢＨウイルスポリペプチド、または、かかるペプチド
に対するポリクローナル、または、モノクローナル抗体
の使用に関する。

【０００２】

【従来の技術】非Ａ非Ｂ肝炎（ＮＡＮＢＨ）は、定義に
よれば除外の診断であり、Ａ型肝炎またはＢ型肝炎ウイ
ルスによらないヒトにおけるウイルス感染の症例を記述
するのに、一般的に用いられてきた。このような症例の
大多数においては、Ｓｈｉｈら（Ｐｒｏｇ．Ｌｉｖｅｒ
Ｄｉｓ．，１９８６，８，４３３−４５２）において
総説されているように、臨床的および疫学的根拠に基い
て、多数の作用体が原因であると考えられているけれど
も、感染の原因は同定に至っていない。合衆国だけとっ
ても、輪血の１０％までもが、ＮＡＮＢＨを起す結果と
なっており、由々しい問題となっている。ＰＴ−ＮＡＮ
ＢＨについてさえ、該感染の原因となる少くとも数種の
ウイルス病源体の存在の可能性があり、多年にわたっ
て、病源体の同定について多くの主張がなされている
が、いずれも実証されていない。

【０００３】欧州特許出願８８３１０９２２．５は、そ
の出願において、Ｃ型肝炎ウイルスともいわれているＰ
Ｔ−ＮＡＮＢＨの原因となる病因体の単離と特性決定を
記述していることを主張している。ＰＴ−ＮＡＮＢＨで
感染したチンパンジーから得られたウイルスの核酸か
ら、ｃＤＮＡライブラリーを作成し、ヒト抗血清を用い
てスクリーニングを行った。多数の陽性のクローンが単
離され、塩基配列が決定された。出願において記述され
ている核酸とアミノ酸配列データは、１０Ｋｂのウイル
スゲノムの約７０％を表しており、すべて非構造コード
領域に相当するその３′末端から由来している。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】本発明者らは、このよ
うなウイルスポリペプチドをコードするＤＮＡ配列のク
ローニングと発現によって、ＰＴ−ＮＡＮＢＨウイルス
ポリペプチドを単離し、特性の決定を行った。驚くべき
ことに、核酸とアミノ酸の配列データは、ともに、欧州
特許出願８８３１０９２２．５に報告された、相当する
データと少なからぬ違いを示した。全体を通じて、これ
らの差は、核酸レベルで約２０％、そして、アミノ酸レ
ベルで約１５％に達しているが、ある領域の配列では、
さらに大きくさえある差が示された。全般的相違のレベ
ルは、地理的差を斟酌しても、同一ウイルスの２つの単
離体について期待されるよりもはるかに大きいものであ
り、２つの可能な理由のうちの１つによるものと考えら
れる。

【０００５】第１に、本発明者と欧州特許出願者とは、
ｃＤＮＡクローニングにおいて、異なる源の核酸を使用
した。特に、欧州特許出願は、ウイルス核酸出発物質に
ついての原料として、そのウイルスを２回の機会にチン
パンジーを通過させた後のウイルス感染チンパンジーの
血漿の使用を記載している。ＰＴ−ＮＡＮＢＨは、無論
ヒトの病気であり、ウイルスを異種宿主を通して継代す
ることは、たとえそれがヒトに近い近縁種であるにせ
よ、ウイルス核酸の広い変異が起るように思われる。し
たがって、欧州特許出願８８３１０９２２．５に含まれ
る配列データは、本当にヒトにおけるＰＴ−ＮＡＮＢＨ
の原因である実際のウイルス病源体を代表していない可
能性がある。それとは対照的に、本発明者は、ｃＤＮＡ
クローニングの出発物質として、ヒト血漿からのウイル
ス核酸を利用した。このようにして得られる配列データ
は、はるかによくＰＴ−ＮＡＮＢＨの自然の核酸とアミ
ノ酸配列に相当しているものと思われる。

【０００６】第２に、ウイルス病源体は、２つ以上のサ
ブタイプとして存在し、ヨーロッパ特許出願に記述され
ている配列データと、本発明によって解明された配列デ
ータは、同じウイルス病源体の別個の区別されるサブタ
イプに相当するということがあるかもしれない。さもな
ければ、配列データの２つのセットの間の差のレベル
は、これら２つの要因の組合せによるということがある
かもしれない。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明は、ＳＥＱＩＤ
ＮＯ：３，４，５，１８，１９，２０，２１，または
２２、または、それらの抗原断片において示されている
アミノ酸配列と、少くとも９０％相同であるアミノ酸配
列を有する抗原を含むＰＴ−ＮＡＮＢＨポリペプチドを
提供する。

【０００８】ＳＥＱＩＤＮＯ：３，４，５，１８，
１９，２０，２１または２２は、核酸配列から導き出し
たアミノ酸配列を示している。好ましくは、本アミノ酸
配列は、ＳＥＱＩＤＮＯ：３，４，５，１８，１
９，２０，２１または２２において、示されたアミノ酸
配列と、少くとも９５％，または９８％相同でさえあ
る。随意的に、抗原は、非相同ペプチドと融合させるこ
とができる。

【０００９】２つ以上の抗原が、随意的に併用か、単一
ポリペプチドとして融合させて一緒に使用することが可
能である。診断アッセイにおいて、この方法で２つ以上
の抗原の使用により、ＰＴ−ＮＡＮＢＨウイルスの血液
スクリーニングにおけるアッセイの使用において、より
信頼度の高い結果がもたらされる。より好ましくは、１
つの抗原が構造コード領域（５′末端）と他の抗原が非
構造コード領域（３′末端）から得られる。抗原が、遺
伝子組換えポリペプチドとして一緒に融合していること
が、特に望ましい。この後者の方法では、個々の抗原を
定った、あらかじめ決められた比率（通常等モルの）で
結合することができ、単一のポリペプチドだけを産生さ
せ、精製し、特性を決定すればよい。

【００１０】ＳＥＱＩＤＮＯ：３，４，５，１８，
１９，２０，２１または２２において、公表されたアミ
ノ酸配列と少くとも９０％相同であるアミノ酸配列をも
つ抗原の抗原断片は、好ましくは、５，６，７，８，９
または１０，１５，２０，３０，４０または５０のアミ
ノ酸を含んでいる。このような抗原の抗原部位は、標準
的方法を用いて同定することができる。これらの方法に
は、タンパク質分解酵素または化学薬品を用いてポリペ
プチド自身を分解し、断片とし、各断片の抗体と結合す
る能力または動物または適切なｉｎｖｉｔｒｏモデル
系（Ｓｔｒｏｈｍａｉｅｒら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏ
ｌ．，１９８２，５９，２０５−３０６）に接種したと
き、免疫応答を惹起する能力を決定することを含む。代
替法としては、ポリペプチドをコードしているＤＮＡ
を、制限酵素消化、または他のよく知られた技術によっ
て断片とし、それから発現系に導入し、断片を産生する
（随意にバクテリア起源のポリペプチドに融合させ
る）。その結果得られた断片は、以前に記述されたよう
に（Ｓｐｅｎｃｅら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，１９
８９，７０，２８４３−５１；Ｓｍｉｔｈら、Ｇｅｎ
ｅ，１９８４，２９，２６３−９）評価される。もう１
つの方法は、各ペプチドが、隣接ペプチドとオーバーラ
ップするようにして、全長のポリペプチドの全配列をカ
バーする短いペプチド断片（アミノ酸３−２０の長さ；
因襲的にはアミノ酸６この長さ）を合成することであ
る。（このオーバーラップは、１−１０このアミノ酸と
することができるが、理想的には、ｎがペプチドの長さ
とするとき、ｎ−１のアミノ酸である；Ｇｅｙｓｅｎ
ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１９８
４，８１，３９９８−４００２）。各ペプチドは、次
に、ペプチドが通常まず免疫反応を誘発することを容易
にするためにあるキャリヤー分子に結合させることを除
けば、以前に述べられたように評価される。最終的に、
配列を免疫学的に重要な部分と関連していると考えられ
る、きわ立った特徴、例えば親水性について分析するこ
とを含む予測的方法がある。（ＨｏｐｐとＷｏｏｄｓ，
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１９８１，
７８，３８２４−８；Ｂｅｒｚｏｆｓｋｙ，Ｓｃｉｅｎ
ｃｅ，１９８５，２２９，９３２−４０）。これらの予
測は次に前に述べた組換え体ポリペプチドまたはペプチ
ド法を使用して試験することができる。

【００１１】ウイルスポリペプチドは、純粋な形、すな
わち９０％，または９５％の純度で提供されるのが望ま
しい。

【００１２】本発明のＰＴ−ＮＡＮＢＨのウイルスポリ
ペプチドは、もしそれが３０この残基以下の抗原であれ
ば、アミノ酸シンセサイザーを使用して、または組換え
体ＤＮＡ技術によって得ることができる。

【００１３】本発明中で明確にされたように、本発明は
ＰＴ−ＮＡＮＢＨウイルスポリペプチドをコードするＤ
ＮＡ配列を提供する。

【００１４】本発明のＤＮＡ配列は、合成されるか、ク
ローニングされる。望ましくは、ＤＮＡ配列は、ＳＥＱ
ＩＤＮＯ：３，４，５，１８，１９，２０，２１ま
たは２２に明らかにされた通りである。

【００１５】複数の抗原を含むＰＴ−ＮＡＮＢＨのウイ
ルスポリペプチドを得るためには、個々のコーディング
配列を、単一の読みとり枠の中に融合させることが望ま
しい。融合は、勿論各抗原の抗原性活性が、他の抗原と
の相対的位置によって有意に損なわれないようなやり方
で行われるべきである。勿論、抗原間の実際の接合部に
おける配列の性質のために、特別な考慮が払われるべき
である。このような単一ポリペプチドを得ることができ
る方法は、この分野の技術でよく知られている。

【００１６】本発明は、本明細中で明確にされるＤＮＡ
配列を含み、適切な宿主中で、ＤＮＡ配列を発現して、
ＰＴ−ＮＡＮＢＨウイルスポリペプチドを産生すること
ができる発現ベクターも提供する。

【００１７】発現ベクターは、通常適切な宿主におい
て、ＤＮＡの発現を行うＤＮＡの制御要素を含んでい
る。これらの要素は、宿主によって変化するが、通常プ
ロモーター、リボゾーム結合部位、翻訳開始、停止部位
および転写終結部位が含まれる。このようなベクターの
例は、プラスミドとウイルスである。本発明の発現ベク
ターは、染色体外ベクターと宿主細胞の染色体中に組込
まれるベクターを包括している。Ｅ．ｃｏｌｉにおいて
使用するためには、発現ベクターは、随意に、例えばβ
−ガタクトシダーゼをコードしているＤＮＡ配列の５′
か３′末端のいずれかに、あるいは、例えばｔｒｐＥ
遺伝子をコードしているＤＮＡ配列の３′末端に連結し
た融合物として、本発明のＤＮＡ配列を含むことができ
る。昆虫のバキュロウイルス（ＡｃＮＰＶ）系における
使用については、ＤＮＡ配列は、ポリヘドリンコーディ
ング配列に、随意に融合させる。

【００１８】現在の発明は、また、本明細中に明確にし
たような発現ベクターで、形質転換した宿主細胞を提供
する。

【００１９】本発明に関して使用される宿主細胞の例は
バクテリア、酵母、哺乳類及び昆虫の細胞のような原核
および真核細胞が含まれる。このような細胞の顕著な例
は、Ｅ．ｃｏｌｉ，Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ，Ｐ．ｐ
ａｓｔｏｒｉｓ，チャイニーズハムスター卵巣細胞およ
びＳｐｏｄｏｐｔｅｒａｆｒｕｇｉｐｅｒｄａとＴｒ
ｉｃｏｐｌｕｓｉａｎｉである。宿主細胞の選択は、多
数の要因によるが、ＰＴ−ＮＡＮＢＨのウイルスポリペ
プチドの翻訳後の改変が重要であるならば、そのとき
は、真核細胞の方が望ましい。

【００２０】本発明は、ここに明確にされるように、Ｐ
Ｔ−ＮＡＮＢＨウイルスポリペプチドをコードするＤＮ
Ａ配列をクローニングまたは合成し、適切な宿主中にお
いて発現されることができるような発現ベクターに、該
ＤＮＡ配列を挿入し、該発現ベクターで宿主細胞を形質
転換し、形質転換した宿主細胞を培養し、ウイルスポリ
ペプチドを単離することを含むＰＴ−ＮＡＮＢＨウイル
スポリペプチドを調製する工程も提供する。

【００２１】ＤＮＡ配列のクローニングは、本分野の技
術で知られている標準操作手順を用いて行うことができ
る。しかし、このような操作手順においては、望まれる
クローニングしたＤＮＡ配列の同定と単離を容易にする
ように、ここに明らかにされる配列データを用いること
が特別に有益である。ＰＴ−ＮＡＮＢＨの伝播に関与し
ていることによって同定された感染ヒト血漿からのウイ
ルスをペレット化することによってＲＮＡを単離するの
が望ましい。単離されたＲＮＡはランダムまたはオリゴ
−ｄＴプライミングを用いて、ｃＤＮＡに逆転写され
る。随意的に、ＲＮＡは、前処理段階にかけて、例えば
加熱するかメチルマーキュリックハイドロキサイドで反
応させることによって、ｃＤＮＡ合成を妨害する可能性
がある二次構造を、すべて除く。ｃＤＮＡは、通常リン
カーを付加し、続いて制限酵素で消化することによって
改変される。それは、次にｐＢＲ３２２，またはその誘
導体、または、適切なようにウイルス粒子中につめ込ま
れたλベクターｇｔ１０とｇｔ１１（Ｈｕｙｎｈら、Ｄ
ＮＡＣｌｏｎｉｎｇ，１９８５，Ｖｏｌ．１：ＡＰｒ
ａｃｔｉｃａｌＡｐｐｒｏａｃｈ，ＯｘｆｏｒｄＩ
ＲＣＰｒｅｓｓ）に挿入され、結果として生じた遺伝
子組換え体ＤＮＡ分子を使用して、Ｅ．ｃｏｌｉを改変
し、かくして、望ましいライブラリーを生成させる。

【００２２】ライブラリーは、標準スクリーニングの戦
略を用いてスクリーニングすることができる。ライブラ
リーが、発現ライブラリーであるならば、それは、ＲＮ
Ａ出発物質と同じ血漿源から得られた抗血清で、そして
またＰＴ−ＮＡＮＢＨに対する抗体が陽性であることが
期待される追加のヒトの源からの抗血清での免疫学的方
法を使用してスクリーニングすることができる。ヒトの
血清は、通常スクリーニング中に、高いバックグラウン
ドを生ずることがあるＥ．ｃｏｌｉに対する抗体を含ん
でいるので、このような抗体をすべて除くために、非形
質転換Ｅ．ｃｏｌｉの溶解物で、まず抗血清を処理する
ことが望ましい。保証されたすなわち、繰返し試験さ
れ、肝炎ウイルスに対する抗体をもっていないことが判
明したヒト供血者からの抗血清を使用して、負の対照を
用いることが有益である。これに変わるスクリーニング
戦略は、ハイブリッド形成プローブとして１つ以上の標
識オリゴヌクレオチドを使用することであろう。ｃＤＮ
Ａライブラリーのスクリーニングにおけるオリゴヌクレ
オチドの使用は、抗血清によるスクリーニングよりも一
般的により簡単で、もっと信頼性が高い。オリゴヌクレ
オチドは、ここにおいて明らかにされたＤＮＡ配列の情
報を用いて合成されるのが望ましい。１つ以上のさらな
る１，２の種類のスクリーニング法が、陽性のクローン
の特性を明らかにし、確認するために用いることができ
る。

【００２３】最初の陽性クローンを同定したならば、ラ
イブラリーは、最初のクローンを追加のハイブリッド形
成プローブとして使用して再スクリーニングすることが
できる。代替としてか、追加としてさらにライブラリー
を調製することがあり、これらは、イムノスクリーニン
グまたはハイブリッド形成プローブを使用してスクリー
ニングすることができる。このようにして、さらなるＤ
ＮＡ配列が得られると思われる。

【００２４】代替法として、ＰＴ−ＮＡＮＢＨウイルス
ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列は標準方法を用い
て合成することができ、これは、ある情況では、ＤＮＡ
をクローニングすることより望ましいことがある（Ｇａ
ｉｔ，ＯｒｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅＳｙｎｔｈｅ
ｓｉｓ；ＡＰｒａｃｔｉｃａｌＡｐｐｒｏａｃｈ，
１９８４，Ｏｘｆｏｒｄ，ＩＲＬＰｒｅｓｓ）。

【００２５】このように、クローニングされるか合成さ
れるかしてから、望ましいＤＮＡ配列は、既知のそして
標準的な技術によって発現ベクター中に導入される。発
現ベクターは、通常制限酵素を用いて切断され、ＤＮＡ
配列をブラント末端、または、付着端の連結を用いて挿
入する。切断は、通常、ひとたび挿入されたならば、そ
のＤＮＡ配列が発現を行うＤＮＡの機能要素の支配にお
かれるように、発現ベクター中の都合のよい位置の制限
部位においてなされる。

【００２６】宿主細胞の形質転換は、標準技術を使用し
て行うことができる。成功埋に、発現ベクターをとり込
んだ形質転換体とそうでなかった細胞を区別するため
に、ある表現型のマーカーが通常用いられる。形質変換
した宿主細胞の培養と、ＰＴ−ＮＡＮＢＨウイルスポリ
ペプチドの単離も標準技術を用いて行われる。

【００２７】本発明のＰＴ−ＮＡＮＢＨウイルスポリペ
プチドに特異的な抗体は、ポリペプチドを用いて作るこ
とができる。抗体は、ポリクローナルのこともあれば、
モノクローナルのこともある。抗体は、ＰＴ−ＮＡＮＢ
Ｈウイルスポリペプチドのバッチの品質管理、ＰＴ−Ｎ
ＡＮＢＨウイルスポリペプチドもしくはウイルス溶解液
の精製、標識されたときは、結合体として、競合型のア
ッセイ、抗体検出のため、そして、抗原検出アッセイに
おいて使用することができる。

【００２８】本発明のＰＴ−ＮＡＮＢＨウイルスに対す
るポリクローナル抗体は、ＰＴ−ＮＡＮＢＨウイルスポ
リペプチドを、免疫応答を促進するために、随意的に、
担体に結合して、マウス、ラット、ヒツジまたはウサギ
のような哺乳動物の宿主に注射し、このようにして生産
された抗体を回収することによって得ることができる。
ＰＴ−ＮＡＮＢＨウイルスポリペプチドは、一般的にポ
リペプチドが生理的に容認できる希釈剤と混合されてい
る注射製剤の形で投与される。フロイントの完全アジュ
バント（ＦＣＡ）またはフロイントの不完全アジュバン
ト（ＦＬＡ）が、製剤の中に含められることがある。製
剤は、通常、適切な期間にわたって宿主に注射され、血
漿試料は、抗ＰＴ−ＮＡＮＢＨウイルス抗体のアッセイ
のために、適切な間隔において採取される。適切なレベ
ルの活性が得られるとき、宿主から、全血を採取する。
次に、抗体を、例えばプロテインＡまたはイオン交換ク
ロマトグラフィーによる標準操作を使用して、血漿から
抽出精製する。

【００２９】本発明のウイルスポリペプチドに対するモ
ノクローナル抗体は、永続培養可能な細胞系とウイルス
ポリペプチドに対する抗体を産生する細胞とを融合し、
融合した永続培養可能な細胞を培養することによって得
られる。典型的には、マウスやラットのような、非ヒト
哺乳動物宿主に、ウイルスポリペプチドを接種する。宿
主が抗体応答を備えるために、十分時間が経過した後、
脾臓細胞のような抗体産生細胞を取出す。マウスやラッ
トの骨髄腫細胞のような永続培養可能な細胞系の細胞
を、抗体産生細胞と融合し、その結果、得られる融合細
胞を、望ましいモノクローナル抗体を分泌するハイブリ
ドーマのような細胞系を同定するためにスクリーニング
にかける。融合細胞は培養することができ、そして、モ
ノクローナル抗体は、ポリクローナル抗体の精製に対す
ると同じやり方で培地から精製される。本発明に基いた
診断アッセイは、ＰＴ−ＮＡＮＢＨウイルス感染がある
かないかを決定するのに使用できる。それらは、またこ
のような感染の例えばインターフェロン治療における処
置をモニターするのに使用できる。

【００３０】ウイルス感染の診断についてのアッセイに
おいては、ウイルスの核酸、ウイルス抗原、またはウイ
ルス抗体の検出を含む採用することができる基本的に異
っている３つの方法がある。一般的にウイルスの核酸
は、ウイルスそれ自身の存在の最善の指標とみなされ、
感染性であるらしい材料を同定するであろう。しかし、
核酸の検出は、通常は、標的のレベルが極めて低いこと
があり得るので、抗原や抗体の検出程直接的ではない。
ウイルスの抗原は、ウイルスの存在に対するマーカーと
して、そして、感染性の指標として使用される。ウイル
スによっては、試料に存在する抗原の量は極めて低く、
検出することが困難である。抗体の検出は、実際に、宿
主免疫システムが循環している多量の抗体を産生するこ
とによって感染に対する応答を増幅するので、比較的直
接的である。抗体の応答の性質は、臨床的に有用であり
得ることが多い。例えば、ＩｇＧクラスよりも、ＩｇＭ
クラスの方が、最近の感染を示し、または特別のウイル
ス抗原に対する応答が、ウイルス消失と結びつくことが
ある。このようにして、ウイルス感染の診断のために採
用される正確な方法は特別な事情や求められる情報次第
である。ＰＴ−ＮＡＮＢＨの場合には、診断アッセイ
は、これら３つの方法のうちのどの１つも態様化するこ
とができる。

【００３１】ウイルス核酸の検出を含むＰＴ−ＮＡＮＢ
Ｈの診断についての検出においては、その方法は試料中
に存在するウイルスＲＮＡ、またはこのようなウイルス
ＲＮＡから合成されたｃＤＮＡを、ＳＥＱＩＤＮ
Ｏ：３，４，５，１８，１９，２０，２１または２２の
ヌクレオチド配列に相当するＤＮＡとハイブリッド形成
を行い、そして、結果として生じた核酸ハイブリッド
を、いずれのＰＴ−ＮＡＮＢＨウイルス核酸も、同定す
るためにスクリーニングすることからなる。この方法の
適用は、通常、ウイルスＲＮＡが高いレベルで存在して
いるらしい肝臓の生検のような組織の試験試料に限られ
ている。ＳＥＱＩＤＮＯ：３，４，５，１８，１
９，２０，２１または２２のヌクレオチド配列に相当す
るＤＮＡ配列は、オリゴヌクレオチドまたは随意にプラ
スミド内に含まれるｃＤＮＡ配列の形をとることがあ
る。核酸ハイブリッドのスクリーニングは、標識ＤＮＡ
配列を使用することによって行うのが望ましい。１，２
種の１つ以上のスクリーニング法の追加が、さらにハイ
ブリッドの特性を明らかにし、ＰＴ−ＮＡＮＢＨウイル
ス核酸を同定するために行われることがある。ハイブリ
ッド形成およびスクリーニングの段階は、この分野の技
術において知られている操作にしたがって実行される。

【００３２】ウイルス核酸についてアッセイすることに
おけるこの方法の適用が限られているために、より好ま
しく、もっと便利な方法は検体中に存在するウイルスＲ
ＮＡからｃＤＮＡを合成し、核酸配列ＳＥＱＩＤ
ＮＯ：３，４，５，１８，１９，２０，２１または２２
のヌクレオチド配列に相当するあらかじめ選んだＤＮＡ
配列を増幅し、あらかじめ選んだＤＮＡ配列を同定する
ことからなる。検体は、どのような適切な組織または生
理的体液でもよく、望ましくは、存在するどんなウイル
スＲＮＡについても、濃縮されていることが望ましい。
適切な生理的体液の例には、尿、血漿、血液、血清、精
液、涙、唾液、脳脊髄液がある。望ましい例は、血清と
血漿である。

【００３３】ｃＤＮＡの合成は、通常ランダム、確定、
またはオリゴｄＴプライマーを用いて、プライミングさ
れた逆転写によって行われる。プライマーが、ＳＥＱ
ＩＤＮＯ：３，４，５，１８，１９，２０，２１または
２２に相当するオリゴヌクレオチドであり、あらかじめ
選ばれた配列を含むｃＤＮＡを高めるようにデザインさ
れている。

【００３４】あらかじめ選ばれたＤＮＡ配列の増幅は、
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術（Ｓａｉｋｉら、
Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８５，２３０，１３５０−４）を
用いて行うのがより好ましい。この技術においては、１
対のオリゴヌクレオチドプライマーが使用され、そのう
ちの１つは、ＳＥＱＩＤＮＯ：３，４，５，１８，
１９，２０，２１または２２のヌクレオチド配列の１部
に相当し、そのうちの他方は最初の３′側に位置してお
り、そして、相補的な配列の一部に相当し、この対の間
に、あらかじめ選ばれたＤＮＡ配列の挿入位置が決めら
れる。オリゴヌクレオチドは、通常、少くとも１５，最
適は２０から２６の塩基の長さがあり、２，３の誤った
対形成は、反応条件を変えることによって克服できるけ
れども、オリゴヌクレオチドの３′末端は、効果的にプ
ライムするためには、完全に相補性であるべきである。
オリゴヌクレオチド対の３′末端の間の距離は、約１０
０から約２０００の塩基であってよい。この技術におい
て使用されるオリゴヌクレオチドの対の１つは、ｃＤＮ
Ａの合成をプライムするのにも使用されると好都合であ
る。ＰＣＲの技術それ自身は、１本鎖型のｃＤＮＡにつ
いて、Ｔａｑポリメラーゼのような酵素とオリゴヌクレ
オチドプライマーの過剰を利用して、２０−４０周期に
わたって、公表されたプロトコール（Ｓａｉｋｉら、Ｓ
ｃｉｅｎｃｅ，１９８８，２３９，４８７−４９１）に
したがって行われる。

【００３５】この技術の改善のために、何ラウンドかの
増幅を行うことがあり、各ラウンドは、異なる対のオリ
ゴヌクレオチドによって反応をプライムする。このよう
にして、最初のラウンドの増幅の後、より短いＤＮＡ配
列を規定する内部のオリゴヌクレオチドの対（たとえ
ば、５０から５００の塩基長の）が、２番目のラウンド
の増幅のために使用されることがある。‘ネステッドＰ
ＣＲ’と呼ばれる、この幾分信頼度が高い改善において
は、あらかじめ選ばれた配列を構成するのは、勿論最終
の増幅されたＤＮＡ排列である。（Ｋｅｍｐら、Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１９８９，８６
（７），２４２３−７とＭｕｌｌｉｓら、Ｍｅｔｈｏｄ
ｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１９８７，１５５，３
３５−３５０）、

【００３６】あらかじめ選ばれたＤＮＡ配列の同定は、
アガロースゲル上で、ＰＣＲ生成物の分析によって行う
ことができる。あらかじめ選ばれた配列について計算さ
れた分子量におけるバンドの存在は、試験試料中におけ
るウイルス核酸の陽性指標である。同定の代替法には、
サザンブロッティング、ドットブロッティング、オリゴ
マー制限及びＤＮＡ配列決定に基く方法があげられる。

【００３７】本発明は、ＰＴ−ＮＡＮＢＨウイルス核酸
の検出のための試験用キットも提供し、それは、以下を
含む。ｉ）そのうちの１方が、ＳＥＱＩＤＮＯ：３，
４，５，１８，１９，２０，２１または２２のヌクレオ
チド配列の１部に相当し、他方が、最初の３′側に位置
していて相補的な配列の１部に相当し、この対の間にあ
らかじめ選ばれたＤＮＡ配列が、挿入位置を決められる
１対のオリゴヌクレオチドプライマー。ｉｉ）ＳＥＱＩＤＮＯ：３，４，５，１８，１
９，２０，２１または２２の相補ヌクレオチド配列に相
当するプライマーの上流の試験試料ＲＮＡからのｃＤＮ
Ａの合成のための逆転写酵素ｉｉｉ）あらかじめ選ばれたＤＮＡ配列を増幅するこ
とができる酵素、そして、随意的にｉｖ）洗じょう液と反応バッファー

【００３８】便利なように、試験用キットは、ウイルス
核酸の同定を容易にするために、陽性対照試料も含んで
いる。

【００３９】プライマーと酵素の特性は、望ましくは、
ＰＣＲ技術との関連において、上に述べた如くである。

【００４０】ウイルス抗原とウイルス抗体の検出を含む
ＰＴ−ＮＡＮＢＨの診断のためのアッセイにおいて、そ
の方法は、試験試料を、本発明のＰＴ−ＮＡＮＢＨウイ
ルスポリペプチド、または、そのポリペプチドに対する
ポリクローナルまたはモノクローナル抗体と接触させ、
そして、試験試料の中に含まれるなんらかの抗原抗体結
合があるかどうかを決定することを含む。この目的のた
めには、試験キットは、ここで明確にされたように、Ｐ
Ｔ−ＮＡＮＢＨウイルスポリペプチドか、それに対する
モノクローナルまたはポリクローナル抗体、および試験
試料中に含まれるそれぞれ抗体または抗原とのなんらか
の結合があるかどうかを決定する手段を含んだ形で提供
されることができる。試験試料はウイルスの核酸の検出
について上に述べた適切な組織および生理的溶液のいず
れからとられてもよい。生理学的体液が得られるなら
ば、それは、存在するいずれのウイルス抗原または抗体
についても随意に濃縮されることができる。

【００４１】多様なアッセイの様式を用いることができ
る。ＰＴ−ＮＡＮＢＨウイルスポリペプチドは、溶液Ｐ
Ｔ−ＮＡＮＢＨに対する抗体を選択的に捕獲し、そし
て、既に捕獲した抗体を選択的に標識するのに、または
抗体を捕獲して標識する両方のために使用することがで
きる。その上、ウイルスポリペプチドは、抗原と反応性
の抗体が相の分離なしの溶液において検出される種々の
均質アッセイにおいて使用することができる。

【００４２】ＰＴ−ＮＡＮＢＨのウイルスポリペプチド
が、溶液から抗体を捕獲するのに使用されるアッセイの
型は、ポリペプチドを固体の表面に固定化することを含
む。この表面は、なんらかの方法で洗じょう可能である
べきである。適切な表面の例としては、種々の形のポリ
マー（ミクロタイターのウエルに型どる；ビーズ、種々
の型浸漬棒；吸引チップ、電極；及び光学的工夫）、通
常の粒径が、０．０２から５ミクロンである粒子（例え
ば、ラテックス；安定化赤血球細胞；バクテリアまたは
カビの細胞；胞子または他の金属または金属を含むゾ
ル；タンパク性のコロイド）、膜（例えば、ニトロセル
ローズ，ペーパー；セルロースアセテートの膜および有
機無機材料の多孔性／高表面積膜）があげられる。

【００４３】表面に対するＰＴ−ＮＡＮＢＨウイルスポ
リペプチドの付着は、表面活性剤、溶剤、塩そして／ま
たはｃｈａｏｔｒｏｐｅｓを含むことがある最適の組成
の溶液からの受動的吸着、もしくは能動的な化学結合に
よるかであり得る。能動的結合形成は、表面上に露出し
ていると思われる種々の反応性または活性化されうる官
能基を通してであることができる（例えば、縮合剤、活
性な酸のエステル、ハライド、そして無水物；アミノ、
ハイドロキシル、もしくはカルボキシル基；スルフヒド
リル基；カルボニル基；ジアゾ基；または不飽和基）。
随意的には、能動的結合形成は、それに対し、ウイルス
のポリペプチドが、種々の方法のいずれかによって化学
的に結合しているアルブミン、またはカゼインのような
タンパク質（それ自体、受動的または能動的結合形成に
よって表面に付着）を通じてであることができる。この
方法によるタンパク質の使用は、その等電点、荷電、親
水性または他の物理化学的性質のために利点も与えるこ
とができる。ウイルスのポリペプチドは、免疫沈澱物の
ような反応混合物の電気泳動的分離の後、表面（通常は
膜だが常に膜とは限らない）に付着させることもでき
る。

【００４４】ＰＴ−ＮＡＮＢＨウイルスポリペプチドを
担っている表面に試験試料を接触させ（反応させ）、反
応時間を与え、そして、必要な場合は、試料の過剰を、
種々な手段（洗じょう、遠心分離、濾過、磁気または毛
細管作用）のいずれかによって除いた後、捕獲した抗体
を検出し得るシグナルを与える手段によって検出する。
例えば、これは、捕獲された抗体と反応する（例えば、
プロテインＡ、またはプロテインＧなど；種特異抗体、
またはアイティ−イムノグロブリンサブ−タイプ；リュ
ーマチ因子；または競合的または遮断的に使用された抗
原に対する抗体）上述のような標識分子または粒子，も
しくはポリペプチド中に含まれるエピトープを含む分子
のいずれかの使用によって達成できる。

【００４５】検出し得るシグナルは、光学的、放射活性
物理化学的なものでありうる。そして、直接分子または
粒子を、例えば、色素、放射能標識、電気活性種、磁気
共鳴種、もしくは蛍光発色団で標識することにより、直
接的に、もしくは分子または粒子を、それ自身，どのよ
うな種類でも，測定しうる変化を生ずる能力がある酵素
で標識することによって、間接的に提供することができ
る。代替法としては、検出できるシグナルは、例えば、
凝集を使用することによって、または、表面が粒子の形
であれば、回折または複屈折効果を通じて検出し得るシ
グナルを得ることができる。

【００４６】ＰＴ−ＮＡＮＢＨウイルスポリペプチドそ
れ自身が、すでに捕獲された抗体を標識するのに使用さ
れるアッセイは、それが検出できるようにする抗原のあ
る形の標識を必要とする。標識づけは、化学的または受
動的に、例えば、ポリペプチドに対して放射線標識、磁
気共鳴種、粒子、または酵素標識を付けることによる直
接法、もしくは、それ自身ポリペプチドと反応する分子
に対して、何らかの形の標識を付けることによる間接法
であることができる。標識を、ＰＴ−ＮＡＮＢＨウイル
スポリペプチドに対して結合させる化学は、アミノ基の
ようにポリペプチドにすでに存在している部分を通じ
て、直接またはマレイミド基のような媒介官能基による
ものであることができる。抗体の捕獲は、その結果、特
定の抗体、または免疫複合体が結合を生ずる受身、また
は能動的吸着をはじめとするどのような試薬によるもの
であってもよく、すでに述べたいずれの表面上において
であってもよい。特に、抗体の捕獲は、抗−種または抗
イムノグロブリン−サブ−タイプ、リューマチ因子、プ
ロテインＡ，Ｇなど、もしくは、ポリペプチドに含まれ
るエピトープを含む分子のどれでもいずれかによるもし
れない。

【００４７】標識ＰＴ−ＮＡＮＢＨポリペプチドは、上
に例をあげた表面のいずれかの上におけるそのいずれの
特異的分子に対する結合も、試料中の抗原によって遮断
される競合的結合の仕方において使用される。代替法と
して、それは、試料中の抗原が、特異的または非特異的
に、上述の表面のいずれとでも結合し、特異的な２価ま
たは多価分子（例えば抗体）とも結合し、残りの結合手
が、標識ペプチドを捕獲するのに使用される非、競合的
なやり方で使用することができる。

【００４８】均質性アッセイにおいては、ＰＴ−ＮＡＮ
ＢＨウイルスポリペプチドと抗体が、別々に標識される
ことが多い。その結果、抗体が遊離溶液中でウイルスポ
リペプチドと反応するとき２つの標識が相互作用し、例
えば、１つの標識によって捕獲されたエネルギーの他の
標識への非放射的伝達が起り、第２の標識が励起されて
適切に検出されたり、最初の標識が消滅したりするよう
になる（例えば、蛍光分析、磁気共鳴または酵素測
定）。試料中のウイルスペプチドか抗体を加えると、そ
の結果、標識対の相互作用が制限され、そのようにして
検出器中に異なるレベルのシグナルを生ずる。

【００４９】ＰＴ−ＮＡＮＢＨ抗体を検出するための適
切なアッセイ型式は、直接サンドウイッチエンザイムイ
ムノアッセイ（Ｅ１Ａ）型式である。ＰＴ−ＮＡＮＢＨ
ウイルスポリペプチドが、ミクロタイターウエル上に被
覆される。試験試料と酵素がそれに結合しているＰＴ−
ＮＡＮＢＨウイルスポリペプチドが同時に加えられる。
試験試料に存在しているＰＴ−ＮＡＮＢＨ抗体は、ウエ
ルを被覆しているウイルスポリペプチドと、酵素が結合
しているウイルスポリペプチドとの両方と結合する。典
型的には、サンドウィッチの両側で、同じウイルスのポ
リペプチドが使用される。洗じょう後、色の変化を含む
特定の基質を使用して、結合酵素が検出される。このよ
うなＥ１Ａにおいて使用するための試験用キットは、以
下を含む。（１）酵素で標識したＰＴ−ＮＡＮＢＨウイルスポリペ
プチド（２）酵素の基質（３）ＰＴ−ＮＡＮＢＨウイルスポリペプチドが固定化
される表面を提供する手段（４）随意的に洗じょう液および／もしくはバッファー

【００５０】本発明のウイルスポリペプチドは、ヒトに
おけるＰＴ−ＮＡＮＢＨに対して免疫を誘発するための
ワクチン製剤の中に組込まれることができる。この目的
のためには、ウイルスのペプチドが、薬剤学上容認し得
る担体と結びついた形で提出される。

【００５１】ワクチン製剤に使用するためには、ウイル
スポリペプチドは、随意的に、Ｃｌａｒｋｅら（Ｎａｔ
ｕｒｅ，１９８７，３３０，３８１−３８４）において
記述されたように、Ｂ型肝炎コア融合粒子の１部とし
て、もしくは、Ｔａｍ（ＰＮＡＳ，１９８８，８５，５
４０９−５４１３）において記述されたように、ポリリ
ジンをベースとしたポリマーとして提出される。代替と
しては、ウイルスポリペプチドは、リポソームやＩＳＣ
ＯＭＳのような粒子構造に付着させることができる。

【００５２】薬剤学上容認し得る担体には、ウイルスポ
リペプチドを患者に導入するために、媒介物として使用
に適した液体媒体が含まれる。このような液体媒体の例
は、食塩溶液である。ウイルスのポリペプチドそれ自体
を、担体中に溶解させるか、固型物として懸濁させるこ
とがある。

【００５３】ワクチン製剤は、また、免疫応答を刺戟す
るためのアジュバントを含み、それによってワクチンの
効果を増強する。アジュバントの例には、水酸化アルミ
ニウムやリン酸アルミニウムがある。

【００５４】ワクチン製剤は、ウイルスペプチドの最終
濃度を、０．０１から５ｍｇ／ｎｌの範囲で、より好ま
しくは、０．０３から２ｍｇ／ｎｌの範囲で含んでい
る。ワクチンの製剤は、無菌の容器に入れ、次にそれを
封じ、低温、例えば４℃で貯蔵するか、または、凍結乾
燥する。

【００５５】ヒトにおいて、ＰＴ−ＮＡＮＢＨに対して
免疫を誘発するためには、ワクチン製剤の１つ以上の用
量が投与されることがある。各用量は、０．１から２ｍ
ｌ、より好ましくは、０．２から１ｍｌである。ヒトに
おいて、ＰＴ−ＮＡＮＢＨに対して免疫性を誘発する方
法は、上に明確にしたように、ワクチン製剤の効果的な
量を投与することを含む

【００５６】本発明は、ヒトにおいて、ＰＴ−ＮＡＮＢ
Ｈに対する免疫を誘発することにおける使用のために、
ＰＴ−ＮＡＮＢＨウイルスポリペプチドをワクチンの製
剤中に使用することを提供する。

【００５７】本発明のワクチンは、経口および非経口
（例えば、静脈、皮下または筋肉内）注射を含むワクチ
ンの投与のための方法ならば、どれによっても投与する
ことができる。処置は、ワクチンの単回投与、またはあ
る期間にわたっての複数回の投与からなることがある。

【００５８】Ｅ．ｃｏｌｉの以下の形質転換株を、Ｎａ
ｔｉｏｎａｌＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎｏｆＴｙｐｅ
Ｃｕｌｔｕｒｅ（ＮＣＴＣ），ＣｅｎｔｒａｌＰｕ
ｂｌｉｃＨｅａｌｔｈＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，６
１，ＣｏｌｉｎｄａｌｅＡｖｅｎｕｅ，Ｌｏｎｄｏ
ｎ，ＮＷ９５ＨＴに、示してある日時に寄託した。ｉ）ｐＤＸ１１３（ＷＤ００１）によって形質転換され
たＥ．ｃｏｌｉＴＧ１；寄託番号ＮＣＴＣ１２３６９；
１９８９年１２月７日ｉｉ）ｐＤＸ１２８（ＷＤ００２）によって形質転換さ
れたＥ．ｃｏｌｉＴＧ１；寄託番号ＮＣＴＣ１２３８
２；１９９０年２月２３日ｉｉｉ）ｐ１３６／１５５（ＷＤ００３）によって形質
転換されたＥ．ｃｏｌｉＴＧ１；寄託番号ＮＣＴＣ１２
４２８；１９９０年１１月２８日ｉｖ）ｐ１５６／９２（ＷＤ００４）によって形質転換
されたＥ．ｃｏｌｉＴＧ１；寄託番号ＮＣＴＣ１２４２
９；１９９０年１１月２８日ｖ）ｐ１２９／１６４（ＷＤ００５）によって形質転換
されたＥ．ｃｏｌｉＴＧ１；寄託番号ＮＣＴＣ１２４３
０；１９９０年１１月２８日ｖｉ）ｐＤＸ１３６（ＷＤ００６）によって形質転換さ
れたＥ．ｃｏｌｉＴＧ１；寄託番号ＮＣＴＣ１２４３
１；１９９０年１１月２８日

【００５９】図においては、図１は、例７において記さ
れるｐＤＸ１２２０の産生の表示を示し、図２は、例１
７において記述される２つの２者択１の融合配列の産生
の表示を示し、そして、図３は、ＳＥＤＩＤＮＯ：
２１と２２の制限酵素地図を示す。

【００６０】配列の表記中に、それに対して発明の詳細
な説明と請求項中に引用されているＳＥＱＩＤＮ
Ｏ：１から２５までが表記されている。

【００６１】以下の例は、本発明を具体的に説明するの
に役立つ。

【００６２】

【実施例】例１．ｃＤＮＡの合成輸血経由で伝播されたＮＡＮＢＨを有することが知られ
ている２人の個人（ＡおよびＬと呼ぶ）から集めて合し
た血漿（１６０ｍｌｓ）を、リン酸バッファー食塩水で
希釈（１：２．５）し、次に１９０，０００ｇ（例え
ば、ＭＳＥ８×５０ローター中３０，０００ｒｐｍ）
で、４℃で５時間遠心分離した。上清は、ｃＤＮＡライ
ブラリーのスクリーニングのための特異的坑体の源とし
て保存した。ペレットは、２ｍｌｓの２０ｍＭトリス−
塩酸、２ｍＭＥＤＴＡ３％ＳＤＳ，０．２ＭＮａ
Ｃｌ（２×ＰＫ）中に懸濁させ、等量のフエノールで３
回抽出し、クロロホルムで３回抽出し、エーテルで１回
抽出し、次に、２．５容量のエタノールを加えて−２０
℃で沈澱させた。沈澱は、１０μｌの１０ｍＭトリス−
塩酸，１ｍＭＥＤＴＡ中ｐＨ８．０（ＴＥ）中に再懸
濁した。

【００６３】ｃＤＮＡ合成キット（Ａｍｅｒｓｈａｍ
Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌｐｌｃ，Ａｍｅｒｓｈａ
ｍ，Ｕ．Ｋ．）中で、核酸をテンプレートとして、オリ
ゴ−ｄＴとランダムヘキサヌクレオチドでプライミング
を行った。反応条件は、キット供給者によって推奨され
た如くであった。具体的には、１μｌの核酸を、最初の
ＤＮＡ鎖の合成反応に使用した。反応物を、最終容量２
０μｌの〔α^３２−Ｐ〕ｄＣＴＰで標識し、４２℃で１
時間インキュベートした（Ａｍｅｒｓｈａｍ比活性３０
００Ｃｉ／ｍＭ）。最初のＤＮＡ鎖反応物全体を、２番
目のＤＮＡ鎖合成反応に使用した。反応液は、Ｅ．ｃｏ
ｌｉＲＮアーゼＨ（０．８Ｕ）とＤＮＡポリメラーゼ
Ｉ（２３Ｕ）を、最終容量１００μｌ中に含み、１２℃
で６０分、次に２２℃で６０分インキュベートした。全
反応物を、次に、７０℃で１０分インキュベートし、氷
上に置き、ＩＵのＴ４ＤＮＡポリメラーゼを加え、次に
３７℃で１０分間インキュベートした。反応は、ｐＨ８
の０．２７ＥＤＴＡを、５μｌ加えることによって停止
させた。

【００６４】組込まれなかったヌクレオチドは、反応液
をＮＩＣＫカラム（ＰｈａｒｍａｃｉａＬｔｄ，Ｍｉ
ｌｔｏｎＫｅｙｎｅｓ，Ｕ．Ｋ．）に通すことによっ
て除去した。ｃＤＮＡは、次に、フエノールで２回抽出
し、クロロホルムで３回抽出し、エーテルで１回抽出
し、次に２０μｇのデキストランを加えてから、１００
％エタノール２．５倍容で沈澱させた。

【００６５】例２．発現ライブラリーの産生乾燥したｃＤＮＡのペレットを５μｌの無菌ＴＥ中に再
懸濁し、次に、２０ｍＭのトリス−塩酸ｐＨ７．５，１
０ｍＭＭｇＣｌ_２，１０ｍＭＤＴＴ，１ｍＭＡＴ
Ｐを含む１０μｌの最終容量中の５００ｎｇのＥｃｏＲ
Ｉリンカー（Ｐｈａｒｍａｃｉａ；ＧＧＡＡＴＴＣＣ，
燐酸化されている）と０．５ＵのＴ４リガーゼ（Ｎｅｗ
ＥｎｇｌａｎｄＢｉｏＬａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｅ
ｙ，ＭＡ，ＵＳＡ）とともに、１５℃で３時間インキュ
ベートした。リガーゼは、６５℃まで１０分間加熱する
ことによって不活性化し、最終容量１００μｌのｃＤＮ
Ａを、１８０ＵのＥｃｏＲＩ（ＢＣＬ，Ｌｅｗｅｓ，Ｕ
Ｋ）で３７℃で１時間消化した。ＥＤＴＡを最終濃度が
１０ｍＭとなるまで加え、全反応液をＡｃＡ３４（ＬＫ
Ｂ）カラム上にのせた。フラクション（５０μｌ）を集
めカウントした。排除された容量中のｃＤＮＡのピーク
（９８０ｃｐｍ）をプールし、２回フエノールで抽出
し、クロロホルムで３回抽出し、エーテルで１回抽出
し、次に、エタノールで沈澱させた。

【００６６】ｄｓｃＤＮＡを５μｌＴＥ中に再懸濁
し、０．５４Ｔ４ＤＮＡリガーゼ，６６ｍＭトリス−塩
酸，１０ｍＭＭｇＣｌ_２，１５ｍＭＤＴＴｐＨ
７．６を含む１０μｌの反応液中で、１５℃で一夜かけ
てλｇｔｌｌＥｃｏＲＩの腕（Ｇｉｂｃｏ，Ｐａｉ
ｓｌｅｙ，Ｓｃｏｔｌａｎｄ）上に連結した。６５℃で
１０分間加熱することによってリガーゼを不活性化した
後、５μｌの反応液をＡｍｅｒｓｈａｍパッケージング
反応液に加え、２２℃で２時間インキュベートした。パ
ッケージしたＤＮＡをＥ．ｃｏｌｉ菌株Ｙ１０９０を宿
主として力価検定したところ（Ｈｙｙｎｈら１９８
５）、全量で２．６×１０^４の組換え体を含んでいた。

【００６７】プレート培養細胞（Ｙ１０９０）は、１０
ｍｌｓのＬ−ブロスに寒天プレートからの単一コロニー
を接種し、３７℃で一夜振とうすることによって調製し
た。次の日に、０．５ｍｌの一夜培養物を１０ｍｌのＬ
−ブロスで希釈し、０．１ｍｌの１ＭＭｇＳＯ_４と０．
１ｍｌの２０％（ｗ／ｖ）マルトースを加えた。培養物
は、３７℃で２時間振とうし、バクテリアを５，０００
ｇで１０分間遠心分離することによって収穫し、５ｍｌ
の１０ｍＭＭｇＳＯ_４中に再懸濁し、プレート培養細
胞のストックを作った。パックトファージの１部（１μ
ｌ）を０．２ｍｌの平板培養細胞と混合し、３７℃で２
０分間培養してから３ｍｌの上層寒天を加え、全体の混
合物を９０ｍｍのＬ−寒天プレートに注いだ。３７℃で
一夜インキュベートした後、プラークを数え、組換え体
ファージの全数を決定した。残りのパッケージしたファ
ージ（５００μｌ）は４℃で貯蔵した。

【００６８】本質的に同様な方法で、さらにライブラリ
ーを調製した。

【００６９】例３．発現ライブラリーのスクリーニング例２において記述された最初のライブラリーを、１４０
ｍｍプレートあたり約５×１０^３ｐｆｕの密度で、Ｅ．
ｃｏｌｉ株Ｙ１０９０上にひろげて入れた。そして、プ
ラークがみとめられる迄２時間、３７℃で培養した。Ｉ
ＰＴＧ（イソプロピルチオガラクトシド）を滲み込ませ
た無菌ニトロセルローズフィルターを、プレートと３時
間接触させ、次に取除いた。フィルターは、ブロッキン
グ溶液〔０．０５％ブロニドックスを含む３％（ｗ／
ｖ）ＢＳＡ／ＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎ（１０ｍＭＴｒｉｓ
−ＨＣｌｐＨ８，１５０ｍＭＮａＣｌ，０．０５％
（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０）〕（２０ｍｌｓ／フィルタ
ー）でインキュベートすることによって、最初にブロッ
クした。そして次に、プールされていたＡとＬの血漿
（２０μｌ／ｍｌ）からの精製抗体（イオン交換クロマ
トグラフィーによる）を含む結合バッファー〔０．０５
％ブロニドックスを含む１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ／ＴＢＳ
／Ｔｗｅｅｎ）に移した。室温で２時間インキュベート
した後、フィルターを、ＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎで３回洗
い、次にビオチン化した抗ヒト−ヒツジ血清（１：２５
０）を含む結合バッファー中でインキュベートした。室
温で１時間後、フィルターをＴＢＳ／Ｔｗｅｅｎで３回
洗い、次に、ストレプトアビジン／ペルオキシダーゼ複
合体（１：１００）を含む結合バッファー中でインキュ
ベートした。シグナルは、ＤＡＢで発現した。陽性のシ
グナルは（着色した）プラークとして現れた。

【００７０】全数２．６×１０^４のスクリーニングされ
たプラークから、８種の陽性プラークが、第一ラウンド
のスクリーニングにおいて得られた。フィルターをテン
プレートとして用い、これらの陽性シグナルに相当する
元のプレートの領域を、無菌パスツールピペットを用い
てつまみとった。寒天の小片を０．１ｍｌのＳＭバッフ
ァー中に懸濁させ、ファージを拡散放出させた。各小寒
天小片からのファージのタイターを、Ｅ．ｃｏｌｉ菌株
Ｙ１０９０について決定した。次に、各小片からのファ
ージのストックは、前と同様に、プレートあたり１×１
０^３ｐｆｕの密度で、各々の９０ｍｍプレート上で再ス
クリーニングにかけた。第一ラウンドの８つのうち、１
つが、第２ラウンドにおいて、明らかに陽性であった。
すなわち、７１％のプラーク陽性であった。これを、Ｊ
Ｇ２と呼んだ。これは、ライブラリー中４０／１０^６の
陽性率に相当する。

【００７１】このもの、および例２に記述した他のｃＤ
ＮＡライブラリーから、同様な方法で同定した他の陽性
ファージは、次に、より低密度（１−２００ｐｆｕ／９
０ｍｍプレート）で、ＡおよびＬの抗体スクリーニング
でプラークの１００％が陽性になるまで繰返しラウンド
のプラークスクリーニングを行うことによって精製し
た。このような３つの組換え体ファージが、ＪＧ１，Ｊ
Ｇ２およびＪＧ３であった。

【００７２】例４．ＪＧ１，ＪＧ２およびＪＧ３の血清
パネルを用いての２次スクリーニング組換え体ファージＪＧ１，ＪＧ２とＪＧ３のそれぞれを
プラークの形成により精製し、ＳＭバッファー中の力価
を検定したストックとして、４℃で貯蔵した。これらの
ファージは、例３において陰性であることが確認された
ファージのストックと混合（１：１）した。そして、混
合物をプレートあたり１０００ｐｆｕにおいてＥ．ｃｏ
ｌｉ株Ｙ１０９０を感染させるのに使用した。フィルタ
ーを、４半分ずつにきり、それぞれの４半分を、異なる
抗体〔これらは、ＡとＬ抗体（２０μｇ／ｍｌ）；Ａ血
漿（１：５００）；血漿（１：５００）と、ＨＩｇＧ
（２０μｇ／ｍｌ）であった〕とともにインキュベート
した以外は、例３において記述したように、プラークを
とり処理した。Ｈは、彼が熱処理を行わないＶＩＩＩ因
子を受けた血友病患者であったので、ＰＴ−ＮＡＮＢＨ
抗体陽性であることが予想される患者である。反応の終
りにおいて、各フィルターは、盲検により陽性（明らか
に２つの型のシグナルがあったとき）、または陰性（す
べてのプラークが同じシグナルを与えたとき）としてス
コアをつけた。これは、主観的判断であるかもしれな
い。それで、スコアを比較し、大多数が一致した場合の
フィルターだけを陽性とした。結果は、表１に提示され
ている。

【００７３】

【表１】

【００７４】ＪＧ１は、患者Ａからの抗体と反応し、Ｌ
またはＨからの抗体とは反応しないようであった。これ
は、真のＰＴ−ＮＡＮＢＨ関連組換え体ポリペプチドに
ついて期待されたことではない。それゆえ、ＪＧ１は分
析からはずした。しかし、ＪＧ２とＪＧ３は、ともに３
つのＰＴ−ＮＡＮＢＨ血清Ａ，ＬおよびＨと明らかに陽
性反応を与え、これらをさらに分析した。

【００７５】フィルターが、より小さい部分に切られ、
これらが複数のパネルの陽性および陰性の血清とともに
インキュベートされたことを除いて、上に述べた型の分
析が、ＪＧ２とＪＧ３について繰返された。陽性の血清
のパネルは、１０この血友病の血清の１つを含み、そし
て、９つの静脈薬常習者（ＩＶＤＡ）血清の１つを含ん
でいた。これらは、実際の陽性率が知られていないにせ
よ、陽性血清の最善の源をなしていた。陰性血清のパネ
ルは、ｔｈｅＮｏｒｔｈＬｏｎｄｏｎＢｌｏｏｄ
ＴｒａｎｓｆｕｓｉｏｎＣｅｎｔｒｅ，Ｄｅａｎｓ
ｂｒｏｏｋＲｏａｄ，Ｅｄｇｗａｒｅ，Ｍｉｄｄｌｅ
ｓｅｘ，Ｕ．Ｋ．によって、多年にわたり厳密にモニタ
ーされ、ＰＴ−ＮＡＮＢＨをはじめとする種々の病源体
による感染の徴候を、決して示さなかった、保証された
血液供与者から得られた。結果は、表２と表３に提示さ
れている。

【００７６】

【表２】

【００７７】

【表３】

【００７８】これらのデータは、両組換え体がＰＴ−Ｎ
ＡＮＢＨの原因である病源体と関連したポリペプチドを
発現しており、これらのペプチドは同一ではないが、あ
る坑原性部位を共有しているという仮説と矛盾しない。

【００７９】例５．ＪＧ２とＪＧ３の制限地図作成とＤ
ＮＡの配列決定ＪＧ２とＪＧ３の両者のファージストックの１部（１０
μｌ）を沸とうさせて、ファージを変性させ、そしてＤ
ＮＡを露出させた。このＤＮＡを、次に、Ｔａｑポリメ
ラーゼを用いるＰＣＲ増幅において、テンプレートとし
て使用した。各反応液は、最終容量５０μｌ中に以下を
含んでいた。：１０ｍＭトリス−塩酸，５０ｍＭＫＣ
ｌ，１．５ｍＭＭｇＣｌ_２，０．０１％ゼラチン，２
５℃でｐＨ８．３にオリゴヌクレオチドプライマーｄ１
９とｄ２０（ＳＥＱＩＤＮＯ：１と２それぞれ２０
０ｎｇずつ）が加わる；これらのプライマーは、Ｅｃｏ
ＲＩクローニング部位に隣接するλ配列中に位置してい
る。したがって、この位置にクローニングされたどのよ
うな配列の増幅も開始する。

【００８０】反応液の１部を、１．０％アガロースゲル
上で分析し、マーカーと比較した。ＪＧ２の増幅は、約
２Ｋｂの断片を産生し、ＪＧ３は、約１Ｋｂを産生し
た。残りの反応混合物を、１０ｍｍＭＥＤＴＡと１％Ｓ
ＤＳの存在で、フェノール／クロロホルムで抽出し、エ
タノール沈澱によってＤＮＡを回収した。次に、増幅し
た材料を、２０単位のＥｃｏＲＩで３７℃で６０分間消
化し、ＴＡＥ中の１．０％ＬＧＴアガロースゲル上で分
離した。断片は、予想されたように大きさが減少してお
り、Ｅｌｕｔｉｐｓ（Ｓ＆Ｓ）を使用して精製した。Ｊ
Ｇ２とＪＧ３の挿入部を、ＥｃｏＲＩで消化したｐＵＣ
１３に連結し、Ｅ．ｃｏｌｉ株ＴＧ１に導入し、形質転
換した。組換え体は、Ｘ−ｇａｌ／Ｌ−Ａｍｐプレート
（１００μｇ／ｍｌのアンピシリン、０．５ｍｇ／ｍｌ
のＸ−ｇａｌを補添したＬ−寒天プレート）上で白色コ
ロニーとして同定され、小規模のプラスミド調製と、Ｅ
ｃｏＲＩ制限酵素消化により挿入ＤＮＡの大きさを決定
した。ＪＧ２を含む組換え体プラスミドを、ＤＭ４１
５，そしてＪＧ３挿入部分を含むプラスミドを、ＤＭ４
１６と名付けた。

【００８１】ＪＧ２挿入部分の配列は、プラスミドＤＮ
Ａの直接２本鎖配列決定により、そして、ｍｐ１８やｍ
ｐ１９のようなＭ１３配列決定ベクター中にサブクロー
ニングし、続いて一本鎖配列決定を行うことによって決
定した。ＴＧ３の配列は、同様に決定された。その結果
得られたＤＮＡとそれから演繹されたアミノ酸配列は、
ＳＥＱＩＤＮＯ：３と４に明らかにされている。

【００８２】プラスミドｐＤＭ４１６（５μｇ）は、最終用量２０μ
ｌで、ＥｃｏＲＩ（２０Ｕ）で消化し、１Ｋｂの挿入部
分を、１％ＬＧＴアガロースゲルから溶出によって回収
した。この物質は、次にＫｌｅｎｏｗ断片とｄＮＴＰ混
合物を用いて“磨き”、ＥｃｏＲＩの突出している末端
を充足させた。ＤＮＡは、フェノール／クロロホルムで
抽出した後、エタノールで回収した。ブラント末端断片
を、ＳｍａＩで開裂し／ホスファターゼで処理したｐＤ
ＥＶ１０７（ｌａｃＺの３′末端でのクローニングを可
能にするベクター）に連結し、次に、Ｅ．ｃｏｌｉＴＧ
１細胞に導入して型質変換した。ベクター単独の対照よ
りも、コロニー数において３０倍の増加がみられた。必
要とされた組換え体プラスミドを含む形質転換体は、Ｊ
Ｇ３組換え体の増幅によって産生された放射活性プロー
ブでのハイブリッド形成によって同定された。１２のコ
ロニーは、プラスミドミニ調製物の製限酵素消化（Ｓａ
ｌＩ）によって分析され、挿入部の方向性を決定した。
これらの組換え体の１／４は、β−ガラクトシダーゼ融
合体として、ＰＴ−ＮＡＮＢＨ配列を発現するための正
しい配位をとっていた。これらのうちの１つ（ｐＤＸ１
１３）をとり上げ、さらに分析した。

【００８３】ｐＤＸ１１３のコロニーを使用して、５０
ｍｌｓのＬ−ブロスに接種し、対数期の中頃まで３７℃
で振とう培養し、２０ｍＭＩＰＴＧを添加して発現を
誘発させた。３時間後に、細胞を５，０００ｇで２０分
間の遠心分離によって収穫し、５０ｍｌｓのＰＢＳに再
懸濁し、再びペレットとした。ペレットにした細胞を、
１ｇのペレットあたり５ｍｌのバッファー（２５ｍＭト
リス−塩酸，１ｍＭＥＤＴＡ，１ｍｇ／ｍｌリゾチー
ム、０．２％（ｖ／ｖ）Ｎｏｎｉｄｅｔ−Ｐ４０，ｐＨ
８．０）に再懸濁した。放出されたバクテリアのＤＮＡ
を、ＤＮアーゼＩとＭｇＳＯ_４を、それぞれ最終濃度４
０μｇ／ｍｌと２ｍＭになるまで加えることによって消
化し、粘度を減らした。

【００８４】ＰＡＧＥを行い、クーマシーブルーで染色
したタンパク質のパターンによって、この粗溶解物を解
析した。ｐＤＸ１１３を含んでいるバクテリアにおい
て、約１５０ＫＤのタンパク質が誘導され、このタンパ
ク質は、全タンパク質の１０−１５％に相当することが
推定された。同様なゲルが、ＰＶＤＦ膜（ＧＲＩ，Ｄｕ
ｎｍｏｗ，Ｅｓｓｅｘ，Ｕ．Ｋ．）に移され、膜を、Ｐ
Ｔ−ＮＡＮＢＨ−陽性及び陰性血清とインキュベートし
た。この１５０ＫＤのタンパク質は、ＡとＬの血清と反
応したが、健常なヒトの血清とは反応しなかった。β−
ガラクトシダーゼを発現するＥ．ｃｏｌｉの溶解物を含
む対照の列は、Ａ，Ｌもしくは健常なヒトの血清と反応
しなかった。

【００８５】粗溶解物に尿素を最終濃度６Ｍになるまで
加え、不溶物質を遠心分離によって除去した。６Ｍの尿
素抽出物をミクロタイターウエルを３７℃で１時間直接
被覆するのに使用した。ウエルは、２度蒸留した水で３
回洗い、次に、０．０２％のＮａＮ_３を含む０．２％Ｂ
ＳＡを、１ウエルあたり０．２５ｍｌ加えることによっ
てブロックした。次に、プレートの液体を吸引した。β
−ガラクトシダーゼ産生Ｅ．ｃｏｌｉ株（ｐＸＹ４６
１）の粗溶解物で被覆した対照プレートは、同様にして
作った。これらのプレートは、例１０に記された加く、
ＥＬＩＳＡアッセイにおいて使用された。

【００８６】例７．昆虫細胞におけるＰＴ−ＮＡＮＢＨ
ポリペプチドの発現例５において記述された如く、単離されたＪＧ３からの
ＰＴ−ＮＡＮＢＨ挿入部分が、ｇｔ１１ベクターにおけ
るｌａｃＺ遺伝子の読取り枠の我々の知識を利用して、
ベクターｐＡｃ３６０（ＬｕｃｋｏｗとＳｕｍｍｅｒ
ｓ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９８８，６，４７
−５５）中のｐｏｌｙｈｅｄｒｉｎにおける最初の３４
このヌクレオチドにあわせた枠内でクローニングを行っ
た。ＥｃｏＲＩクローニング部位に隣接するｇｔ１１と
ハイブリッド形成ができ、そして、挿入部分をＰＣＲに
よって増幅することを可能にするであろうオリゴヌクレ
オチドが合成された。これらのオリゴヌクレオチドは、
挿入部位を、ｐＡｃ３６０のＢａｍＨＩ部位へ、直接ク
ローニングし、ｐｏｌｙｈｅｄｒｉｍのアミノ末端配列
と同一枠内に位置させることができるように適切に位置
したＢａｍＨＩ制限部位を含んでいた。

【００８７】ｇｔｌｌ組換え体ＪＧ３の小量を沸とうさ
せ、ＤＮＡを露出させ、それからオリゴヌクレオチドプ
ライマーｄ７５とｄ７６（ＳＥＱＩＤＮＯ：６と
７；２００ｍｇ）と０．５単位のＴａｑポリメラーゼを
含むＰＣＲ増幅に使用した。

【００８８】増幅後、反応液を等容量のフエノール／ク
ロロホルムで抽出し、エタノールで沈澱させ最終用量３
０μｌ中の１０ＵのＢａｍＨＩで消化した。増幅断片を
１％アガロースゲル上で分別し、溶出し、ＢａｍＨＩで
消化したｐＡｃ３６０に連結し、移送構築物ｐＤＸ１１
９を産成した。この組換え体プラスミド（２μｇ）と野
性型のＡｃＮＰＶＤＮＡ（１μｇ）をリン酸カルシウム
洗澱によって昆虫の細胞にコトランスフェクトさせた。
インクルージヨン陰性の組換え体ウイルスを目視スクリ
ーニングによって選んだ。３ラウンドのプラーク精製の
後、組換え体ウイルス（ＢＨＣ−５）を殖し、昆虫細胞
における組換え体タンパク質の発現を、ＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅ，ウエスターンブロットおよびエリザによって評価し
た。豊富に発現された約７０ＫＤのタンパク質が感染細
胞中で生産された。このタンパク質は、ウエスタンブロ
ットとエリザによってＰＴ−ＮＡＮＢＨ血清と反応性で
ある。

【００８９】さらなるバキュロウイルス組換え体（ＢＨ
Ｃ−７）が図１に示してあるように、ＢＨＣ−５に存在
するＪＧ３配列に加えて、ＪＧ２配列を含むように構築
された。ＪＧ２に存在するＰＴ−ＮＡＮＢＨは、上述の
如く、増幅し、ｐＡｃ３６０ベクターにクローニングし
て、ｐＤＸ１１８を産生した。そしてｐＤＸ１１９とｐ
ＤＸ１１８のそれぞれの適切なＢａｍＨ１／Ｓａｌ１断
片をｐＡＣ３６０中にその順番に互いに連結し、移送構
築物ｐＤＸ１２２を産生した。

【００９０】組換え体プラスミドは、ハイブリッド形成
により同定され、挿入されたＤＮＡの方向性は制限酵素
分析により決定された。組換え体ウイルスは、上述の如
く産生され、発現されたタンパク質は、ウエスターンブ
ロットとエリザによって分析された。極めて多量な（全
細胞タンパク質の４０％）ＰＴ−ＮＡＮＢＨ血清と反応
した９５ＫＤａのポリペプチドが感染細胞中に見出され
た。

【００９１】例８ＤＸ１１３ポリペプチドの精製プラスミドｐＤＸ１１３を含むＥ．ｃｏｌｉ株ＴＧＩ
（ＷＤＬ００１株と称する）を１．５ｌの発酵槽（モデ
ルＳＥＴ００２，ＳＧＩ，Ｎｅｗｈａｖｅｎ，Ｅａｓｔ
Ｓｕｓｓｅｘ，Ｕ．Ｋ．）で３７℃で５時間培養し、
誘導した。細胞は５，０００ｇで２０分間遠心分離によ
って収穫し、以下の如く処理した。

【００９２】ａ）抽出湿潤細胞をバッファーＡ（５０ｍＭトリス−塩酸、５０
ｍＭＮａＣｌ，１ｍＭＥＤＴＡ，５ｍＭＤＴＴ，
１０％（ｖ／ｖ）グリセロール，ｐＨ８．０）に再懸濁
（１：２０，ｗ／ｖ）する。リゾチームを１ｍｌの懸濁
液あたり５ｍｇの固形物の割合で加え、混合物を４℃で
放置した。１５分後に、混合物を氷上で全部で３分間
（６×３０秒バースト）超音波（６μｍピークからピー
クまでの振幅）処理した。１ｍｌ懸濁液あたり４μｇの
割合でＤＮアーゼＩを加え、混合物をさらに３０分間放
置した。懸濁液１８，０００ｇ（ｍａｘ）で２０分間遠
心分離して、上清液を捨てた。

【００９３】ペレットを、バッファーＢ（２５ｍＭヘー
ペス、４Ｍ尿素、５ｍＭＤＴＴ，ｐＨ８．０）中に、
１：６（ｗ／ｖ）の比率で再懸濁し、細い懸濁液を得
た。これを、１８，０００ｇ（最大）で２０分間遠心分
離し、上清を捨てた。ペレットをバッファーｃ（２５ｍ
Ｍヘーペス、８Ｍ尿素、２ｍＭＤＴＴ，ｐＨ８．０）
中に再懸濁したが、その前に以下を加えた。すなわちリ
ューペプチン（１μｇ／ｍｌ）、ペプスタチン（１μｇ
／ｍｌ）とＥ６４（１μｇ／ｍｌ）。懸濁液は、１８，
０００ｇ（最大）で３０分間遠心分離し、上清をデカン
トし保存した。ペレットを２５ｍＭヘーペス、１％ＳＤ
ＳｐＨ８．０中に再懸濁した。

【００９４】ｂ）クロマトグラフィー８Ｍ尿素分画からの上清を、２５ｍＭヘーペス、８Ｍ尿
素、２ｍＭＤＴＴ，ｐＨ８．０中に１：５（ｖ／ｖ）
に希釈し、７ｍｌのＱ−セファロースカラム上で分画し
た。タンパク質は、０−１Ｍの食塩グレーディエントで
溶出した。クロマトグラフィーとデータの処理操作は、
ＦＰＬＣ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）によって制御した。Ｄ
Ｘ１１３は、約５００ｍＭの食塩水で溶出し、ＳＤＳ
Ｐａｇｅとウエスターンブロット分析によって事実上均
質であった。

【００９５】例９ＢＨＣ−５ポリペプチドの精製ｓｆ９細胞（２×１０^９）をＢＨＣ−５組換え体ウイル
ス（ｍｏｉ５）のストックで感染させた。２８℃で２日
間インキュベートした後、細胞を遠心分離によって収穫
し、以下の如く操作した。

【００９６】ａ）抽出湿潤細胞の塊（１．２ｇ）を６ｍｌのバッファーＡ（２
５ｍＭヘーペス、５ｍＭＤＴＴ，リューペプチン１μ
ｇ／ｎｌ，ペプスタチン１μｇ／ｍｌ，Ｅ６４／μｇ／
ｍｌｐＨ８．０）に再懸濁した。再懸濁した液を氷上
に置き、３×１５秒バースト（ピークからピークまでの
振幅６μｍ）で超音波処理、間に３０秒の休みを散在さ
せた。超音波処理した懸濁液を、１８，０００ｇ（最
大）で２０分間遠心分離した。そして、上清を捨てた。
ペレットをバッファーＡに４Ｍ尿素（６ｍｌｓ）を加え
た混液に再懸濁して、１８，０００ｇ（最大）で２０分
間遠心分離した。上清を捨てペレットをバッファーＡに
８Ｍ尿素を加えた混液（６ｍｌ）で再抽出した。１８，
０００ｇ（最大で）３０分間遠心分離した後、上清を保
存し、バッファーＡに、８Ｍ尿素を加えた混液中で、
１：６に希釈した。この抽出液を、同じバッファーで平
衡させたｍｏｎｏ−Ｑカラム上でクロマトグラフィーを
行った。カラムは、食塩のグレーディエント（０−１．
０ＭＮａＣｌ）によって、カラム容量の１２倍の容量
にわたって溶出した。約０．４５−０．５５ｍＮａＣｌ
において溶出したＢＨＣ−５は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによ
り判定したところ、９０％を越える純度であった。収率
は、約７０％であった。

【００９７】例１０エリザにおけるＤＸ１１３とＢＨＣ−５と７のポリペプ
チドの性能ミクロエリザプレート（９６ウエル、Ｎｕｎｃ）を５０
ｍｍ重炭酸塩バッファ（５０ｍＭ重炭酸ナトリウムと５
０ｍＭ炭酸ナトリウム、滴定してｐＨ９．５に調節）
中、ＢＨＣ−５の６Ｍ尿素粗溶液または精製ｐＤＸ１１
３で直接被覆した。プレートは、０．２％のＢＳＡでブ
ロックし、次に、１：２０（ｂａｃｕｌｏ）もしくは
１：１００（Ｅ．ｃｏｌｉ）に希釈した血清とともに、
３７℃で３０分間インキュベートした。Ｔｗｅｅｎ−食
塩水（０．８５％食塩水、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０，
０．０１％ブロニドックス）中で洗った後、プレートを
ペルオキシダーゼ結合ヒツジ抗−ヒトイムノグロブリン
（１：２０００）とともに、３７℃で３０分間インキュ
ベートした。プレートは、次に、Ｔｗｅｅｎ−食塩水で
洗い、呈色性基質ＴＭＢ（テトラメチルベンジディン−
塩酸塩）（１００μｌ／ウエル）を加え、室温で２０分
間インキュベートすることによって呈色させた。反応
は、５０μｌの２Ｍ硫酸で停止しＯＤ４５０を定量した
（表４）。

【００９８】

【表４】

【００９９】ＰＴ−ＮＡＮＢＨ感染のリスクが高い患者
（ＩＶＤＡ′ｓ，血友病患者）からの血清を、記述した
さうにアッセイした。データは、すべてＯＤ４５０の読
みとして表現される。

【０１００】非感染を保証された供与者は、陰性対照と
して役立てる。この特殊な群の血清について１０／１９
が両方の固相において陽性である。

【０１０１】さらに、精製ＤＸ１１３をＳＡＴＡ／マレ
イミド還元を用いてアルカリ性ホスファターゼに結合さ
せ、イムノメトリックアッセイを確立した。既知のＮＡ
ＮＢＨ陽性ならびに陰性の血清を、非感染が保証された
供血者の血清において示されたように希釈し、ＢＨＣ−
７で被覆した固相に加えた。同時に、またはインキュベ
ーション（３７℃で３０分）の後、ＤＸ１１３結合体を
加えた（５０μｌ，１：２０００）。３７℃で３０分間
のインキュベーションの後、プレートは、５０ｍＭ重炭
酸バッファーで洗い、ＩＱＢｉｏ増幅系を使用して呈
色させ、ＱＤ４９２を定量した（表５）。

【０１０２】

【表５】

【０１０３】このようにして、抗グロブリン、イムノメ
トリックアッセイのいずれについても、高スクの検体
は、一致した結果を与えた。

【０１０４】例１１−ワクチン製剤ワクチンは、以下の成分を、表示した量を用いて、既存
の技術によって調製することができる。ＰＴ−ＮＡＮＢＨウイルスポリペプチド＞０．３６ｍｇＴｈｉｏｍｅｒｓａｌ０．０４−０．２ｍｇＮａＣｌ＜８．５ｍｇ水全体を１ｍｌに

【０１０５】例１２ＰＴ−ＮＡＮＢＨポリペプチドに対するモノクローナル
抗体の産生ＤＭ４１５からのＤＮＡ挿入部を、バキュロウイルス移
送ベクターへ再クローニングして、組換え体ウイルス
を、例７に記述したのと本質的に同様な方法によって産
生した。組換え体ウイルスをＢＨＣ−１と呼び、ＰＴ−
ＮＡＮＢＨ−特異的タンパク質の、極めて低レベルを発
現した。ＢＨＣ−１で感染させたｓｆ−９細胞（５×１
０^７細胞／ｍｌ）が、１％ＮＰ４０（ｖ／ｖ）を含むＰ
ＢＳ中で溶解させ、１３，０００ｇで２分間遠心分離し
た。上清を、Ｅｘｔｒａｃｔｉｇａｌ−Ｄ（Ｐｉｅｒｃ
ｅＣｈｅｍｉｃａｌｓ）上を通過させ、表面活性剤を
除き、フロイントの完全アジュバンドと１：１の乳化液
として混合した。マウスに０．１ｍｌの乳化液を皮下に
注射した（５×１０^６の細胞に相当する）。注射後１４
日か２８日後に、マウスをＢＨＣ−５感染ｓｆ−９細胞
の表面活性剤を含まない抽出物を、０．１ｍｌ（５×１
０^６の細胞に相当）腹腔内注射することによって強化し
た。ＢＨＣ−５は、ＤＭ４１６のＤＮＡ挿入部分を含ん
でいる。試験用の尾静脈血を採取し、エリザ（例１０）
で抗−ＰＴ−ＮＡＮＢＨ活性についてアッセイした。Ｐ
Ｔ−ＮＡＮＢＨに特異的な応答をもっていた２匹のマウ
スを、ＢＨＣ−７に感染したｓｆ−９細胞の表面活性剤
を含まない抽出物を、静脈注射することによってさらに
強化した。ＢＨＣ−７は、ＤＭ４１５とＤＭ４１６（例
７）のオーバーラップしている領域を、一緒に連結する
ことによって産生したＤＮＡの挿入部分を含んでいる。
脾臓は、３日後に取出した。

【０１０６】脾臓細胞は、標準的技術によって、ＰＥＧ
１５００の存在において、ＮＳｏ骨髄腫細胞と融合させ
た。その結果得られたハイブリドーマ細胞を、ＨＡＴ
（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）培地で
生育させることによって選択した。融合後、１０−１４
日において、上清をエリザによって抗−ＰＴ−ＮＡＮＢ
Ｈ活性についてスクリーニングした。ＤＸ１１３とＢＨ
Ｃ−７抗原（例１０）との反応性を示したウエルが同定
され、個々のコロニーを別のウエルに移し生育させ、再
試験した。この段階で、特異的な反応性を示したウエル
は、さらにモノクローナル性を確めるために、限界希釈
においてさらにクローニングを行った。

【０１０７】例１３血清陽性患者におけるウイルス核
酸の検出血清：輪血後の肝炎の計画的研究に登録された１４００
人の献血者からの献血検体を、−２０℃で凍結した。２
６０人の被輸血者からの輸血前および輸血後の経時的検
体を、同時に貯蔵した。輸血後、検体を３か月迄は２週
間に１度、６か月迄は月に１度、その後は６か月に１
度、１８か月迄採取した。１９８１年に起ったＰＴ−Ｎ
ＡＮＢＨの３つの出来事からの供血者と受血者の凍結し
た血清も、研究用に利用できた。ＰＴ−ＮＡＮＢＨの診
断は、血清のアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬ
Ｔ）が、少くとも２つの別々の輸血後検体において、正
常の上限を２．５倍越えた上昇に基いていた。他の肝志
向性ウイルスは、血清学的試験によって除外され、そし
て、肝細胞傷害の非ウイルス性の原因は、在来の臨床な
らびに検査室の試験によって除外された。

【０１０８】イムノアッセイ：血清検体は、Ｏｒｔｈｏ
ＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓＥＬＩＳＡキットを、製造
業者の指針にしたがって使用して、ＨＣＶ（Ｃ１００抗
原）に対する抗体の存在について、遡及的に試験した。
反応性の血清は抗−Ｃ１００が陰性のヒト血清におい
て、終点まで繰返し滴定した。

【０１０９】ＰＴ−ＮＡＮＢＨウイルスの配列の検出：
血清または血漿ＲＮＡを抽出し、逆転写し、下記のよう
に増幅した。逆転写／ＰＣＲのオリゴヌクレオチドプラ
イマーは、例３において単離されたＪＧ２クローンのヌ
クレオチド配列から由来し、ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓ
ｙｓｔｅｍｓ３８１Ａシンセサイザー上で合成され
た。４つのオリゴヌクレオチドプライマーの配列は、以
下の如くであった。

【０１１０】名称ＳＥＱＩＤＮＯ：産生物の大きさｄ９４センス８７２９ｂｐｄ９５アンチセンス９Ｎ１センス１０４０２ｂｐＮ２アンチセンス１１

【０１１１】（ｉ）ＲＮＡ抽出５−５０μｌの血清（または血漿）を、無菌蒸留水を加
えることによって２００μｌとした。その２００μｌの
検体を、等量の２×ＰＫバッファー（２×ＰＫ＝０．２
ＭトリスＣｌ，ｐＨ７．５，２５ｍＭＥＤＴＡ，０．
３ＭＮａＣｌ，２％ｗ／ｖＳＤＳ，プロティナーゼＫ
２００μｇ／ｍｌ）に加え、混合し、３７℃で４０分間
インキュベートした。タンパク質を、フエノール／クロ
ロホルムで２回抽出し、クロロホルム単独で１回抽出す
ることによって除いた。水相に２０μｇのグリコーゲン
を加え、次にＲＮＡを３倍容の氷冷１００％エタノール
を加えることによって沈澱させた。−７０℃で１時間貯
蔵した後、ＲＮＡを、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ遠心機中で
（１５分、１４０００ｒｐｍ，４℃でペレットにした。
ペレットは、９５％エタノール中で１回洗い、真空乾燥
し、１０μｌの無菌蒸留水中に溶解した。ＲＮＡ溶液
は、−７０℃で貯蔵した。

【０１１２】（ｉｉ）ｃＤＮＡ合成２μｌのＲＮＡ溶液，５０ｎｇの合成オリゴヌクレオチ
ドｄ９５，１０ｍＭのヘーペス−ＨＣｌｐＨ６．９お
よび０．２ｍＭＥＤＴＡｐＨ８．０を含む１０μｌ
の混合物を調製した。この１０μｌの混液の上に２滴の
鉱物油を上層として加えた、油浴中９０℃で２分間加熱
し、氷の上で急激に冷却させた。反応液を、５０ｍＭト
リス−塩酸ｐＨ７．５，７５ｍＭＫＣｌ，３ｍＭＭ
ｇＣｌ_２，１０ｍＭＤＴＴ，各０．５ｍＭのｄＡＴ
Ｐ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰとｄＴＴＰ，２０単位のＲＮア
ーゼ阻害剤（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）および１５単位のク
ローンドＭＬＶ逆転写酵素（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を、
最終容量２０μｌにおいて含むように調節した後、ｃＤ
ＮＡ合成を遂行した。この２０μｌ混液を３７℃で９０
分間インキュベートした。合成の後、ｃＤＮＡは、−２
０℃で貯蔵した。

【０１１３】（ｉｉｉ）“ネステッド”ＰＣＲこの試験を通じて、偽陽性のＰＣＲの結果は、Ｋｗｏｋ
とＨｉｇｕｃｈｉ（Ｎａｔｕｒｅ，１９８９，３３９，
２３７−２３８）の雑菌混入をさける手段を、厳格に適
用することによって回避した。

【０１１４】ａ）ラウンド１ポリメラーゼ連鎖反応は、１０ｍＭトリス−塩酸ｐＨ
８．３，５０ｍＭＫＣｌ，１５ｍＭＭｇＣｌ_２，
０．０１％ゼラチン、１単位の組換え体ＴａｑＤＮＡポ
リメラーゼ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒＣｅｔｕ
ｓ）、各２００μＭのｄＮＴＰ，各３０ｎｇの‘アウタ
ー’プライマー（ｄ９４とｄ９５；ＳＥＱＩＤＮＯ：
それぞれ８と９）および５μｌのｃＤＮＡ溶液を含む５
０μｌの混合液中で遂行した。９４℃における最初の５
分間の変性の後、３５サイクルの、９５℃で２分、５６
℃で１分、７２℃で１分間の処理を行い、続いて最後は
７２℃で７分間延長して処理した（ＴｅｃｈｎｅＰＨ
Ｃ−１ＡｕｔｏｍａｔｅｄＴｈｅｒｍａｌＣｙｃ
ｌｅｒ）。

【０１１５】ｂ）ラウンド２反応混液は、ラウンド１について上述した如くであった
が、‘アウター’プライマーｄ９４とｄ９５の代りに、
‘インナー’プライマーＮ１とＮ２（それぞれＳＥＱ
ＩＤＮＯ：１０と１１）を使用した。ラウンド１のＰ
ＣＲ生成物の１μｌ分を、ラウンド２の５０μｌの反応
混液に移した。２５サイクルの９５％で１・２分、４６
℃で１分、７２℃で１分間の処理を行い、続いて、最後
は、７２℃で７分間延長して処理した。

【０１１６】ｃ）分析２０μｌのラウンド１とラウンド２のＰＣＲ生成物２％
のアガロースゲル上で電気泳動することによって分析し
た。バンドはエチジウムブロマイドで染色することによ
って可視化し、３０２ｎｍで写真をとった。

【０１１７】計画的試験における抗−ＨＣＶ血清学とＰ
ＣＲの予告的価値：計画的試験に登録された１４００人
の受容者（０．４３％）のうち６人が、彼等の血清中に
Ｃ−１００に対する抗体をもっていることが見出され
た。これら６人の抗体陽性供与者のうち、ただ１人だけ
（供与者Ｄ６）が、ＰＴ−ＮＡＮＢＨの発現と受容者
（受容者Ｒ６）におけるＣ−１００抗体陽性への血清変
換によって判断したところ、感染性であることが判明し
た。以下の表６を参照のこと。

【０１１８】ウイルス配列は、供与者Ｄ６の血清中にお
いてＲＣＲによって検出されたが、他の５人の血清陽性
患者の血清のいずれにおいても検出されなかった。ＰＴ
−ＮＡＮＢＨを発現した受容者Ｒ６は、７人の他の供与
者（Ｄ７からＤ１３）からも輸血を受けていた。これら
の供与者からの血清を試験し、抗体もＰＣＲも陰性であ
ることが見出された。

【０１１９】

【表６】

【０１２０】例１４さらなるＰＴ−ＮＡＮＢＨＤＮＡ配列の単離と発現例２において調製されたλｇｔｌｌライブラリーは、Ｐ
Ｔ−ＮＡＮＢＨに関して高いリスクをもっている患者か
らのウイルス抗原ＤＸ１１３，ＢＨＣ−５とＢＨＣ−７
と反応しなかった血清でスクリーニングを行った。その
理由づけは、それが異なる抗原を認識する抗体を含んで
いることが十分あり得るということである。血清ＰＪ−
５（ＴｈｅＮｅｗｃａｓｔｌｅＲｏｙａｌＩｎｆ
ｉｒｍａｒｙ，Ｎｅｗｃａｓｔｌｅ）、Ｂｉｒｍ−６４
（ＱｕｅｅｎＥｌｉｚａｂｅｔｈＭｅｄｉｃａｌ
Ｃｅｎｔｒｅ，Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ），ＰＧとＬｅ
（ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＣｏｌｌｅｇｅおよびＭｉｄ
ｄｌｅｓｅｘＳｃｈｏｏｌｏｆＭｅｄｉｃｉｎｅ，
Ｌｏｎｄｏｎ）は、この基準を満しており、例３と例４
に述べたと同じ操作手順にしたがってライブラリーをス
クリーニングするのに使用した。このようにして、多数
の組換え体が同定されたが、そのうち、１つとして、Ｊ
Ｇ２とＪＧ３から造られたプローブと交差ハイブリッド
形成を示すものはなかった。ＰＪ−５との反応によって
同定された組換え体の１つであるＢＲ１１がさらに分析
を行うために選ばれた。

【０１２１】クローン、ＢＲ１１は約９００ｂｐの挿入
部分を含んでおり、それは、例７で述べたように、プラ
イマー、ｄ７５とｄ７６〔ＳＥＱＩＤＮＯ；６と
７〕を使用して、ＰＣＲによって増幅した。増幅された
配列は、バキュロウイルスベクターｐＡｃ３６０中に、
直接クローニングし、ｐｏｌｙｈｅｄｒｉｎの最初の１
１このアミノ酸とあわせた読取り枠を含むｐＤＸ１２８
を形成した。組換え体バキュロウイルスのストック（Ｂ
ＨＣ−９と命名）は、例７に述べた手順にしたがって作
成した。昆虫の細胞を、精製組換え体ウイルスで感染さ
せ、約２２ＫＤのポリペプチドが、放射標識細胞抽出物
中に得られた。

【０１２２】ＢＲ１１の増幅挿入部分も配列を決定する
ためにｐＵＣ１３とＭ１３のファージ中にクローニング
を行った。ＤＮＡとアミノ酸配列データが、ＳＥＱＩ
ＤＮＯ：５に提示されている。挿入部はクローニング中
に付加されたＥｃｏＲＩリンカーを加えた８３４ｂｐを
含んでいる。

【０１２３】例１５−エリザにおけるＢＨＣ−９ポリペ
プチドの性能ＢＨＣ−９−感染細胞抽出物で被覆したミクロタイター
ウエルと、例１０において述べた手順にしたがった抗−
ヒトＩｇ結合体検出システムを用いてエリザを確立し
た。１組の高リスク血清をＢＨＣ−７とＢＨＣ−９に対
して平行してアッセイし、例１３に述べた手順を用い
て、ＰＣＲによっても検討した。結果は表７に示されて
おり、陽性検体は下線が引いてある。

【０１２４】

【表７】

【０１２５】これら２０の検体のうち、５０％は、明ら
かにＢＨＣ−７に関して陽性であるが、それに対し、８
５％は、ＢＨＣ−９に関して陽性である。ＢＨＣ−９に
境目程度に陽性の２つの検体（１１と１２）はＢＨＣ−
９に関して、明らかに陽性である。ＢＨＣ−７に関して
カットオフポイント以下の検体の若干は、ＢＨＣ−９に
関して陽性である。その上ＢＨＣ−７に関して境界程度
か陰性であるが、ＢＨＣ−９に関して陽性である２つの
検体（１１と１５）はＰＣＲ陽性である。全般を通じて
ポリペプチドとＰＣＲの両方について陰性な２つの検体
（１３と２０）がある。

【０１２６】例１６現存クローン中に重複しているＰＴ−ＮＡＮＢＨＤＮ
Ａ配列の単離例３，４と１４に述べられたｃＤＮＡの発現ライブラリ
ーの免疫学的スクリーニングによって、ウイルスの免疫
活性反応性領域を含むクローンだけが確認できる。ＰＴ
−ＮＡＮＢＨに特異的なクローンの産生に対する別の方
法は、ＰＣＲを使用して、存在するクローンに重複して
いるｃＤＮＡ分子を増幅することである。対のうちの一
方が、現存のクローニングされた配列の内部に存在し、
他方が外側に存在する幾組かのプライマーを作ることが
できる。このアプローチは、プライマーのネスティッド
ペアにも拡張することができる。

【０１２７】例１に述べたように、調製されたｃＤＮＡ
をプライマーの１対またはネステッドペアで、例１３で
述べた反応条件を用いて、ＰＣＲによって増強した。こ
の方法は、以下の対のプライマーの使用によって具体的
に説明される。すなわち、ｄ１６４（ＳＥＱＩＤＮ
Ｏ：１２）と、ｄ１３７（ＳＥＱＩＤＮＯ：１
３）；ｄ１３６（ＳＥＱＩＤＮＯ：１４）とｄ１５
５（ＳＥＱＩＤＮＯ：１５）；ｄ１５６（ＳＥＱ
ＩＤＮＯ：１６）とｄ９２（ＳＥＱＩＤＮＯ：１
７）。各対の一方は、存在しているクローニングされた
配列内でプライムするようデザインされている（ｄ１３
７とｄ１３６はＢＲ１１１のそれぞれ５′および３′末
端内で開始し、ｄ９２は、ＪＧ３の５′末端で開始す
る）。他方のプライマーは、他のＰＴ−ＮＡＮＢＨ作用
体にある配列に基いている。プライマーｄ１６４は、Ｏ
ｋａｍｏｔｏら、Ｊａｐａｎ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１
９９０，６０．１６７−１７７中の図２の１０から３１
の塩基に相当する。プライマーｄ１５５とｄ１５６は、
欧州特許出願８８３１０９２２．５の図４７における、
それぞれ４６２から４８９および３３１５から３３３７
の位置に相当する。Ｂｇ１２認識部位が導入されたｄ１
６４を除いて、プライマーの５′末端の近くに、Ｅｃｏ
ＲＩの認識部位を導入するために、１つ以上のヌクレオ
チド置換が行われた。これらの変化により、増幅産物の
その後のクローニングが容易となる。

【０１２８】ＰＣＲ産物を適切な制限酵素で消化し、ア
ガロースゲル電気泳動で分離し、予測された大きさのバ
ンドを切出し、例５に述べたようにプラスミドとバクテ
リオファージベクターにクローニングした。増幅したＤ
ＮＡｓ１６４／１３７（ＳＥＱＩＤＮＯ：１８），
１３６／１５５（ＳＥＱＩＤＮＯ：１９）と１５６
／９２（ＳＥＱＩＤＮＯ：２０）は、配列のリスト
に提示されている。これらの新しい配列は、ＰＴ−ＮＡ
ＮＢＨの包含範囲をイムノスクリーニング（ＳＥＱＩ
ＤＮＯ：３，４と５）によって得られるものよりも拡
大している。これらの配列は、すでに述べた領域内にあ
る他の配列とともに、ＰＴ−ＮＡＮＢＨゲノムの５′末
端（ＳＥＱＩＤＮＯ：２１）と３′末端（ＳＥＱ
ＩＤＮＯ：２２）における隣接配列の中に結合させる
ことができる。

【０１２９】例１７異なるＰＴ−ＮＡＮＢＨ抗原の単一組換え体ポリペプチ
ドへの融合表７に提示されているデータは、ＢＨＣ−７（１０／２
０）よりもＢＨＣ−９（１７／２０）を標的抗原として
用いると、より多くの血清検体が抗体陽性血清として検
出されるが、ＢＨＣ−７のみで、陽性である若干の検体
（例えば、＃４）があることを示している。この図は、
より広い検体の試験によって支持されている。したがっ
てＢＨＣ−７とＢＨＣ−９からの配列を用いて融合構築
物を誘導した。

【０１３０】ＢＨＣ−７とＢＨＣ−９は、諸種の方法に
おいて結合させることができる。いずれの配列も結果と
して生ずる融合物のアミノ末端に位置することができ、
結合している配列の性質も変化し得る。図２は、両配列
が結合される２つの可能な方法を図解している。

【０１３１】適切な制限酵素部位とリンカー配列を担っ
ている適切な制限酵素断片は、特異的プライマーを使用
するＰＣＲによるか、または存在するプラスミドの制限
酵素消化によって生成された。転送ベクターＤＸ１４３
は、プライマーｄ２４（ＳＥＱＩＤＮＯ：２３）と
ｄ１２６（ＳＥＱＩＤＮＯ：２４）を用いてＰｓｔ
１／ＢａｍＨ１断片として増幅されたＢＲ１１（ＳＥＱ
ＩＤＮＯ：７）の全コード領域の５′末端に結合し
たＤＸ１２２（図１；Ｐｓｔ部位は１５０４ＪＧ２，の
位置にある、ＳＥＱＩＤＮＯ：３）からのＢａｍＨ
１／Ｐｓｔ１から成立っている；連結領域は、ｄ１２６
プライマーと残りのバクテリオファージλ配列から由来
した６つのアミノ酸から成っている。転送ベクターＤＸ
１３６はＤＸ１４３とＢＲ１１断片が、ｄ２４（ＳＥＱ
ＩＤＮＯ：２３）とｄ１３２（ＳＥＱＩＤＮ
Ｏ：２５）を使用して作られ、したがって連結領域が５
このリジンを含んでいるという違いがある。これらの転
送ベクター（複数）を使用して、ＡｃＮＰＶＤＮＡと
ともに培養中のｓｆ９昆虫細胞をコトランスフエクトし
た。そして、組換え体バキュロウイルスのプラーク精製
を行ったストックを例７に述べたように作った。ＢＨＣ
−１０は、ＤＸ１４３でのトランスフェクションの結果
として産生され、ＢＨ−１１は、ＤＸ１３６でのトラン
スフエクションの結果として産生された。

【０１３２】これら２つのウイルによって発現された組
換え体ポリペプチドは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥとウエスター
ンブロッティングによって分析された。ＢＨＣ−１０
は、みかけ上の分子量１１８ＫＤａをもつポリペプチド
を産生し、ＢＨＣ−１１はみかけの分子量９６ＫＤａを
もつポリペプチドを産生した。ポリペプチドは、両方と
もＢＨＣ−７（例えば血清Ａ）とのみエリザで反応する
ことが分っている血清、またはＢＨＣ−９とのみ反応す
ることが分っている血清（血清Ｂ６４，例１４）のいず
れとも反応した。２つのポリペプチドは、リンカー配列
においてのみ異っており、これは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上
でのそれらの移動性または感染細胞において、それらが
いかに処理されるかに影響する可能性がある。

【０１３３】例１８エリザにおけるＰＴ−ＮＡＮＢＨ融合抗原の性能ＢＨＣ−９感染細胞抽出物でコートしたミクロタイター
ウエルと、抗−ヒトＩｇ結合体を用いて例１０で述べた
手順にしたがってエリザを確立した。表８は、２つの融
合体と他のＰＴ−ＮＡＮＢＨ組換え体抗原ＢＨＣ−７と
ＢＨＣ−９ならびにＨＣＵ組換え体タンパク質Ｃ−１０
０−３（ＯｒｔｈｏＤｉａｇｎｏｓｔｉｃＳｙｓｔ
ｅｍｓ，Ｒａｒｉｔａｎ，ＮｅｗＪｅｒｓｅｙ）との
比較からのデータを示している。血清は、ＢＨＣ−７、
ＢＨＣ−９とＣ−１００−３との反応のパターンによっ
て群分けしてある。群Ｉはすべての３つの抗原と強く反
応し、群ＩＩは、ＢＨＣ−７とのみ強く反応し；群ＩＩ
Ｉは、ＢＨＣ−９とのみ強く反応し、群ＩＶは、３つの
抗原のうち２つだけと強く反応する。

【０１３４】

【表８】＊これらの検体は、ＢＨＣ−１１についてのウエスター
ンブロッティングによってのみ試験された。

【０１３５】これらのデータは、ＢＨＣ−１０もＢＨＣ
−１１もこれらの血清について同様な反応性をもち、最
も重要なことには、両方の抗原活性とも融合によって保
持されたということを示している。それぞれＢＨＣ−７
またはＢＨＣ−９とのみ反応する群ＩＩ，群ＩＩＩにお
けるすべての血清は、融合体と明確な反応を与える。そ
の上、２つの抗原を一緒にもっていると、より敏感なア
ッセイを与えるという傾向がある。例えば検体ＫＴは、
ＢＨＣ−７とＢＨＣ−９とそれぞれＯＤｓの１．５７と
０．２７を与えるのに対し、融合体では、ＯＤは＞２．
０である。

【配列表】

【１３６】ＳＥＱＩＤＮＯ：１配列型：ヌクレオチド配列の長さ：２１塩基鎖の状態：１本鎖トポロジー：線状分子種：合成ＤＮＡ起源生物：バクテリオファージλｇｔｌｌ直接実験源：オリゴヌクレオチドシンセサイザー；オリ
ゴｄ１９特徴：バクテリオファージλｇｔｌｌのＥｃｏＲ１部位
に隣接するｌａｃＺ遺伝子の上流部分に相同な１から２
１番目の塩基特性：ファージベクターから、ＥｃｏＲ１部位において
挿入されたｃＤＮＡへのＤＮＡ合成を開始する。

【１３７】ＳＥＱＩＤＮＯ：２配列型：ヌクレオチド配列の長さ：２１塩基鎖の状態：一本鎖トポロジー：線状分子種：合成ＤＮＡ起源生物：バクテリオファージλｇｌｌ直接実源：オリゴヌクレオチドシンセサイザー；オリゴ
ｄ２０特徴：バクテリオファージλｇｌｌのＥｃｏＲ１部位に
隣接するｌａｃＺ遺伝子の下流部分に相同な１から２１
の塩基特性：ファージベクターからＥｃｏＲ１部位に挿入され
たｃＤＮＡへのＤＮＡ合成を開始する。

【１３８】ＳＥＱＩＤＮＯ：３配列型：ヌクレオチドと相当するタンパク質配列の長さ：１７７０塩基対鎖の状態：１本鎖トポロジー：線状分子種：ゲノムＲＮＡに対するｃＤＮＡ起源生物：ヒト；輪血後非Ａ型非Ｂ型肝炎に感染した血
清直接実験源：λｇｔｌｌにおけるｃＤＮＡライブラリー
からＪＧ２をクローニング特徴：ＰＴ−ＮＡＮＢＨポリプロテインの１から１７７
０ｂｐ部分特性：恐らくウイルスの非構造的タンパク質をコードす
るのであろう。

【１３９】ＳＥＱＩＤＮＯ：４配列型：ヌクレオチドと相当するタンパク質配列の長さ：１０３５塩基対鎖の状態：一本鎖トポロジー：線状分子種：ゲノムＲＮＡに対するｃＤＮＡ起源生物：ヒト；輸血後非Ａ型非Ｂ型肝炎に感染した血
清直接実験源：λｇｔｌｌにおけるｃＤＮＡライブラリー
からのＪＧ３のクローニング特徴：ＰＴ−ＮＡＮＢＨポリプロテインの１から１０３
５ｂｐ部分特性：恐らくウイルスの非構造タンパク質をコードして
いるのであろう。

【１４０】ＳＥＱＩＤＮＯ：５配列型：ヌクレオチドと相当するタンパク質配列の長さ：８３４塩基対鎖の状態：１本鎖トポロジー：線状分子種：ゲノムＲＮＡに対するｃＤＮＡ起原生物：ヒト；輸血後非Ａ型非Ｂ型肝炎に感染した血
清直接実験源：λｇｔｌｌにおけるｃＤＮＡライブラリー
からのＲＢ１１のクローニング特徴：ＰＴ−ＮＡＮＢＨポリプロテインの１から８３４
ｂｐ部分特性：恐らくウイルスの構造タンパク質をコードしてい
るのであろう。

【１４１】ＳＥＱＩＤＮＯ：６配列型：ヌクレオチド配列の長さ：３１塩基鎖の状態：１本鎖トポロジー：線状分子種：合成ＤＮＡ起源生物：バクテリオファージλｇｌｌ直接実験源：オリゴヌクレオチドシンセサイザー：オ
リゴｄ７５特徴：４番目から９番目の塩基ＢａｍＨ１の部位１０番目から３１番目の塩基は、バクテリアファージλ
ｇｔｌｌにおけるＥｃｏＲ１部位に隣接するｌａｃＺ遺
伝子に相同２６番目から３１番目の塩基はＥｃｏＲ１部位特性：ファージベクターからＥｃｏＲ１部位に挿入され
たｃＤＮＡへのＤＮＡ合成を開始し、その後の発現ベク
ターへクローニングに適切なＢａｍＨ１部位を導入す
る。

【１４２】ＳＥＱＩＤＮＯ：７配列型：ヌクレオチド配列の長さ：３０塩基鎖の状態：１本鎖トポロジー：線状分子種：合成ＤＮＡ起源生物：バクテリオファージλｇｔｌｌ直接実験源：オリゴヌクレオチドシンセサイザー；オ
リゴｄ７６特徴：４番目から９番目の塩基ＢａｍＨ１部位１０番目から３０番目の塩基は、バクテリオファージλ
ｇｔｌｌにおけるＥｃｏＲ１部位に隣接するｌａｃＺ遺
伝子の下流部分に相同である。特性：ファージベクターからＥｃｏＲ１部位に挿入され
たｃＤＮＡへのＤＮＡ合成を開始し、その後の発現ベク
ターへのクローニングに適したＢａｍＨ１部位を導入す
る。

【１４３】ＳＥＱＩＤＮＯ：８配列型：ヌクレオチド配列の長さ：１９塩基鎖の状態：１本鎖トポロジー：線状分子種：合成ＤＮＡ起源生物：ヒト；輸血後の非Ａ型非Ｂ型肝炎に感染した
ヒトの血清直接実験源：オリゴヌクレオチドシンセサイザー；オ
リゴｄ９４特徴：１番目から１９番目の塩基はＪＧ２（ＳＥＱＩ
ＤＮＯ：３）のセンス鎖塩基９１４から９３２までと
相同である。特性：ＰＴ−ＮＡＮＢＨゲノムＲＮＡ／ＤＮＡの負の鎖
上のＤＮＡ合成を開始する。

【１４４】ＳＥＱＩＤＮＯ；９配列型：ヌクレオチド配列の長さ：２４塩基鎖の状態：１本鎖トポロジー：線状分子種：合成ＤＮＡ起源生物：ヒト；輪血後、非Ａ型非Ｂ型肝炎に感染した
ヒトの血清直接実験源：オリゴヌクレオチド；オリゴｄ９５特徴：１から２４番目の塩基は、ＪＧ２（ＳＥＱＩＤ
ＮＯ：１３）のアンチ−センス鎖の１６２０から１６
４３と相同である。特性：ＰＴ−ＮＡＮＢＨゲノムＲＮＡ／ＤＮＡの正の鎖
の上のＤＮＡ合成を開始する。

【１４５】ＳＥＱＩＤＮＯ：１０配列型ヌクレオチド配列の長さ：１７塩基鎖の状態：１本鎖トポロジー：線状分子種：合成ＤＮＡ起源生物：ヒト；輪血後の非Ａ型非Ｂ型肝炎に感染した
ヒトの血清直接実験源：オリゴヌクレオチドシンセサイザー；オリ
ゴＮ１特徴：１から１７番目の塩基は、ＪＧ２（ＳＥＱＩＤ
ＮＯ：３）のセンス鎖の塩基１０３３から１０４９ま
でと相同である。特性：ＰＴ−ＮＡＮＢＨゲノムＲＮＡ／ＤＮＡの負の鎖
のＤＮＡの合成を開始する。

【１４６】ＳＥＱＩＤＮＯ：１１配列型：ヌクレオチド配列の長さ：１７塩基鎖の状態：１本鎖トポロジー：直線状分子種：合成ＤＮＡ起源生物：ヒト；輸血後、非Ａ型非Ｂ型肝炎に感染した
ヒトの血清直接実験源：オリゴヌクレオチドシンセサイザー；オリ
ゴＮ２特徴：１から１７番目の塩基は、ＪＧ２（ＳＥＱＩＤ
ＮＯ：３）のアンチ−センス鎖の塩基１４２１から１
４３７と相同である。特性：ＰＴ−ＮＡＮＢＨゲノムＲＮＡ／ＤＮＡの正の鎖
上のＤＮＡ合成を開始する。

【１４７】ＳＥＱＩＤＮＯ：１２配列型：ヌクレオチド配列の長さ：２２塩基鎖の状態：１本鎖トポロジー：線状分子種：合成ＤＮＡ起源生物：ヒト；輸血後に、非Ａ型非Ｂ型肝炎に感染し
たヒトの血清直接実験源：オリゴヌクレオチドシンセサイザー；オリ
ゴｄ１６４特徴：１から２２番目の塩基は、Ｏｋａｍｏｔｏら、Ｊ
ａｐａｎＪ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９９０，６０１６７
−１７７の図２における１０から３１の塩基２２は、Ｂ
ｇ１２認識部位を導入するためにＡからＴへ変えられて
いる。８から１３の塩基はＢｇ１２部位特性：ＰＴ−ＮＡＮＢＨゲノムＲＮＡ／ＤＮＡの負の鎖
上のＤＮＡ合成を開始しＢｇ１２部位を導入する。

【１４８】ＳＥＱＩＤＮＯ：１３配列型：ヌクレオチド配列の長さ：３０塩基鎖の状態：１本鎖トポロジー：線状分子種：合成ＤＮＡ起源生物：ヒト；輸血後非Ａ型非Ｂ型肝炎に感染したヒ
トの血清直接実験源：オリゴヌクレオチドシンセサイザー；オリ
ゴｄ１３７特徴：１から３０番目の塩基は、ＢＲ１１（ＳＥＱＩ
ＤＮＯ：５）の負の鎖の１５４から１８３の塩基と相
同である；塩基１７４，１７７および１７８は、Ｅｃｏ
Ｒ１認識部位を導入するために改変されている。５から
１０番目の塩基はＥｃｏＲ１認識部位特性：ＰＴ−ＮＡＮＢＨゲノムＲＮＡ／ＤＮＡの正の鎖
上のＤＮＡ合成を開始し、クローニングのためにＥｃｏ
Ｒ１部位を導入する。

【１４９】ＳＥＱＩＤＮＯ：１４配列型：ヌクレオチド配列の長さ：２７塩基鎖の状態：１本鎖ＤＮＡトポロジー：線状起源生物：ヒト；輸血後に非Ａ型非Ｂ型肝炎に感染した
ヒトの血清直接実験源：オリゴヌクレオチドシンセサイザー；オリ
ゴｄ１３６特徴：１から２７番目までの塩基は、ＢＲ１１（ＳＥＱ
ＩＤＮＯ：５）の塩基６７２から６９８までと相同
である；塩基６７５はＥｃｏＲ１認識部位を導入するた
めにＧへ変えられている。４から９までの塩基はＥｃｏ
Ｒ１認識部位である。特性：ＰＴ−ＮＡＮＢＨゲノムＲＮＡ／ＤＮＡの負の鎖
上のＤＮＡ合成を開始し、クローニングのためにＥｃｏ
Ｒ１部位を導入する。

【１５０】ＳＥＱＩＤＮＯ：１５配列の長さ：２８塩基鎖の状態：１本鎖トポロジー：線状分子種：合成ＤＮＡ生物起源：チンパンジー；輸血後非Ａ型非Ｂ型肝炎に感
染したチンパンジーの血清直接実験源：オリゴヌクレオチドシンセサイザー；オリ
ゴｄ１５５特徴：１から２８番目の塩基は、欧州特許出願８８３１
０９２２．５の図４７の負の鎖の塩基４６２から４８９
までと相同である；塩基４８３と４８５は、ＥｃｏＲ１
認識部位を導入するために変化させてある。５から１０
番目の塩基は、ＥｃｏＲ１認識部位である。特性：ＰＴ−ＮＡＮＢＨゲノムＲＮＡ／ＤＮＡの正の鎖
上のＤＮＡ合成を開始し、クローニングのためにＥｃｏ
Ｒ１部位を導入する。

【１５１】ＳＥＱＩＤＮＯ：１６配列型：ヌクレオチド配列の長さ：２３塩基鎖の状態：１本鎖トポロジー：線状分子種：合成ＤＮＡ生物起源：チンパンジー；輸血後非Ａ型非Ｂ型肝炎に感
染したチンパンジーの血清直接実験源：オリゴヌクレオチドシンセサイザー；オリ
ゴｄ１５６特徴：１から２３番目の塩基は欧州特許出願８８３１０
９２２．５の図４７の正の鎖の塩基３３１５から３３３
７までの塩基と相同である。塩基３３２３はＥｃｏＲ１
認識部位を導入するためにＣに変えてある。４から９番
目の塩基は、ＥｃｏＲ１認識部位である。特性：ＰＴ−ＮＡＮＢＨゲノムＲＮＡ／ＤＮＡの負の鎖
上のＤＮＡ合成を開始し、クローニングのためにＥｃｏ
Ｒ１部位を導入する。

【１５２】ＳＥＱＩＤＮＯ：１７配列型：ヌクレオチド配列の長さ２９塩基鎖の状態：１本鎖トポロジー：線状分子種：合成ＤＮＡ生物起源：ヒト；輸血後に非Ａ型非Ｂ型肝炎に感染した
ヒトの血清直接実験源：オリゴヌクレオチドシンセサイザー；オリ
ゴｄ９２特徴：１から２９番目の塩基は、ＪＧ２（ＳＥＱＩＤ
ＮＯ：３）の負の鎖の３６から６４までの塩基と相同
である；塩基５７，５８と６０は、ＥｃｏＲ１認識部位
を導入するために変えてある。５から１０番目の塩基は
ＥｃｏＲ１認識部位である。特性：ＰＴ−ＮＡＮＢＨゲノムＲＮＡ／ＤＮＡの正の鎖
上のＤＮＡ合成を開始し、クローニングのためにＥｃｏ
Ｒ１部位を導入する。

【１５３】ＳＥＱＩＤＮＯ：１８配列型：ヌクレオチドと相当するタンパク質配列の長さ：５０４の塩基対鎖の状態：１本鎖トポロジー：線状分子種：ゲノムＲＮＡに対するｃＤＮＡ生物起源：ヒト；輸血後非Ａ型非Ｂ型肝炎に感染したヒ
トの血清直接実験源：クローン１６４／１３７特徴：３０８から５０４ｂｐまではＰＴ−ＮＡＮＢＨポ
リプロテインの出発点である特性：恐らくウイルスの構造タンパク質をコードしてい
るのであろう。

【１５４】ＳＥＱＩＤＮＯ：１９配列型：ヌクレオチドの相当するタンパク質配列の長さ：１１０７の塩基対鎖の状態：１本鎖トポロジー：鎖状分子種：ゲノムＲＮＡに対するｃＤＮＡ生物起源：ヒト；輸血後の非Ａ型非Ｂ型肝炎に感染した
ヒトの血清直接実験源：クローン１３６／１５５特徴：ＰＴ−ＮＡＮＢＨのポリプロテインの１から１１
０７ｂｐの部分特性：おそらくウイルスの構造タンパク質をコードして
いるのであろう。

【１５５】ＳＥＱＩＤＮＯ：２０配列型：ヌクレオチドと相当するタンパク質配列の長さ：２０４３の塩基対鎖の状態：１本鎖トポロジー：線状分子種：ゲノムＲＮＡに対するｃＤＮＡ生物起源：輸血後に非Ａ型非Ｂ型肝炎に感染したヒトの
血清直接実験源：クローン１５６／９２特徴：ＰＴ−ＮＡＮＢＨのポリプロテインの１から２０
４３ｂｐ部分特性：恐らくウイルスの非構造タンパク質をコードして
いるのであろう。

【１５６】ＳＥＱＩＤＮＯ：２１配列型：ヌクレオチドと相当するタンパク質配列の長さ：２１１６の塩基対鎖の状態：１本鎖トポロジー：線状生物起源：ヒト；輸血後非Ａ型非Ｂ型肝炎に感染したヒ
トの血清直接実験源：ゲノムの５′末端からのｃＤＮＡにより形
成されたｃｏｎｔｉｇ．特徴：ＰＴ−ＮＡＮＢＨポリプロテインの３０８から２
１１６ｂｐの出発点特性：ウイルスの構造および非構造タンパク質

【１５７】ＳＥＱＩＤＮＯ：２２配列型：ヌクレオチドと相当するタンパク質配列の長さ：３７５０の塩基対トポロジー：線状分子種：ゲノムＲＮＡに対するｃＤＮＡ生物起源：ヒト；輸血後非Ａ型非Ｂ型肝炎に感染したヒ
トの血清直接実験源：ゲノムの３′末端からのｃＤＮＡクローン
によって形成されるｃｏｎｔｉｇ特徴：ＰＴ−ＮＡＮＢＨポリプロテインの１から３７５
０ｂｐ部分特性：ウイルスの非構造タンパク質

【１５８】ＳＥＱＩＤＮＯ：２３配列型：ヌクレオチド配列の長さ：２３塩基鎖の状態：一本鎖トポロジー：線状分子量：合成ＤＮＡ生物起源：ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓＡｕｔｏｇｒａｐ
ｈａｃａｌｉｆｏｒｎｉａＮｕｃｌｅａｒＰｏｌ
ｙｈｅｄｒｏｓｉｓウイルス（ＡｃＮＰＶ）直接実験源：オリゴヌクレオチドシンセサイザー；オリ
ゴｄ２４特徴：１から３番目の塩基はｐＡｃ３６０や類似のベク
ターにおけるＢａｍＨ１クローニング部位の下流のＡ
ｃＮＰＶポリヘドリン遺伝子の部分に相同である。特性：ＢａｍＨ１部位に挿入されるＤＮＡに並ぶバキュ
ロウイルスの転送ベクターからの配列のＤＮＡ合成を開
始する。

【１５９】ＳＥＱＩＤＮＯ：２４配列型：ヌクレオチド配列の長さ：３１塩基鎖の状態：１本鎖トポロジー：線状分子種：合成ＤＮＡ生物起源：ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓＡｕｔｏｇｒａｐ
ｈａｃａｌｉｆｏｒｎｉａＮｕｃｌｅａｒＰｏｌ
ｙｈｅｄｒｏｓｉｓウイルス（ＡｃＮＰＶ）直接実験源：オリゴヌクレオチドシンセサイザー；オリ
ゴｄ１２６特徴：１から３１番目の塩基はｄ７５（ＳＥＱＩＤ
５）によって増幅されたｃＤＮＡがｐＡｃ３６０および
同様なベクター中のＢａｍＨ１クローニング部位にクロ
ーニングされるときに生ずる上流の接合部配列に相同で
ある；塩基１３と１４における不適性塩基対形成はＰｓ
ｔ１部位を導入する。１から１０番目の塩基はｐＡｃ３
６０および同様なベクターのＢａｍＨ１部位の領域に相
同である。４から９の塩基はＢａｍＨ１部位である１２
から１７番目の塩基はＰｓ＋１部位である。特性：バキュロウイルス転送ベクター配列とオリゴｄ７
５によって前もって増幅された配列の接合部におけるＤ
ＮＡ合成を開始する。その後のクローニング作業のため
にＰｓｔ１認識部位を導入する。

【１６０】ＳＥＱＩＤＮＯ：２５配列型：ヌクレオチド配列の長さ：４５塩基鎖の状態：１本鎖トポロジー：線状分子種：合成ＤＮＡ生物起源：Ｎ／Ａ直接実験源：オリゴヌクレオチドシンセサイザー；オリ
ゴｄ１３２特徴：５から１０番目の塩基はＰｓｔ１認識部位１３から２７番目の塩基は５このリジン残基をコードす
るリンカー２８から４５番目の塩基はＢＲ１１（ＳＥＱＩＤ
７）の４から２１番目の塩基に相同である。特性：ＢＲ１１の５′末端におけるＤＮＡ合成を開始
し、その後のクローニング作業のためのＰｓｔ１認識部
位および５つのリジンをコードする合成配列を導入す
る。

【図面の簡単な説明】

【図１】プラスミドｐＤＸ１２２の構築を示す。

【図２】例１７で示した２つの融合配列の構築を示す。

【図３】ＳＥＱＩＤＮＯ２１及び２２の制限酵素地
図を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｃ０７Ｋ 13/00 8517−4ＨＣ１２Ｎ 1/21 7236−4Ｂ 15/51 ＺＮＡＣ１２Ｐ 21/02 Ｃ 8214−4Ｂ 21/08 8214−4ＢＧ０１Ｎ 33/53 Ｄ 8310−2Ｊ 33/576 Ｚ 9015−2Ｊ //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19）Ｃ０７Ｋ 99:00 (72)発明者ブライアンコリンロジャーズイギリス国ケント，ベッケンハム，ラングリィコート（番地なし）ザウェルカムファウンデーションリミテッド気付 (72)発明者リチャードセトンテダーイギリス国ケント，グラベセンド，ラデスダウン，ヘンリィストリートウェストバックランド（番地なし) (72)発明者ジョンアンソニージェームスバーバライギリス国ハートフォードシャー，ヘメルヘムプステッド，パンケーキレーン９

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ＳＥＱＩＤＮＯ：３，４，５，１
８，１９，２０，２１または２２において示されるアミ
ノ酸配列と、少くとも９０％相同であるアミノ酸配列を
持つ抗原か、その抗原性断片を含むＰＴ−ＮＡＮＢＨウ
イルスポリペプチド。
【請求項２】アミノ酸配列がＳＥＱＩＤＮＯ：
３，４または５に示されるアミノ酸配列と少くとも９０
％相同であるか、もしくはその抗原性断片である請求項
１によるＰＴ−ＮＡＮＢＨウイルスポリペプチド。
【請求項３】アミノ酸配列が、ＳＥＱＩＤＮＯ：
３または４において示されるアミノ酸配列と、少くとも
９０％相同であるか、もしくは、その抗原性断片である
請求項２によるＰＴ−ＮＡＮＢＨウイルスポリペプチ
ド。
【請求項４】アミノ酸配列が、ＳＥＱＩＤＮＯ：
５に示されるアミノ酸配列と、少くとも９０％相同であ
るか、もしくは、その抗原性断片である請求項２による
ＰＴ−ＮＡＮＢＨウイルスポリペプチド。
【請求項５】アミノ酸配列が、ＳＥＱＩＤＮＯ．
３，４，５，１８，１９，２０，２１または２２に示さ
れるアミノ酸配列と、少くとも９５％相同であるか、も
しくは、その抗原性断片である前項迄の請求項のいずれ
か１つによるＰＴ−ＮＡＮＢＨウイルスポリペプチド。
【請求項６】アミノ酸配列が、ＳＥＱＩＤＮＯ．
３，４，５，１８，１９，２０，２１または２２に示さ
れるアミノ酸配列と、少くとも９８％相同であるか、も
しくは、その抗原性断片である請求項５によるＰＴ−Ｎ
ＡＮＢＨウイルスポリペプチド。
【請求項７】ウイルスゲノムの構造コード領域からの
抗原とウイルスゲノムの非構造コード領域からの抗原を
含むＰＴ−ＮＡＮＢＨウイルスポリペプチド。
【請求項８】構造コード領領からの抗原がＳＥＱＩ
ＤＮＯ：５に示されるアミノ配配列と少くとも９０％
相同であるアミノ配配列を持っているか、もしくはその
抗原性断片であり、そして非構造コード領域からの抗原
がＳＥＱＩＤＮＯ：３または４に示されるアミノ酸配
列と、少くとも９０％相同であるアミノ酸配列をもって
いるか、もしくは、その抗原性断片である請求項７によ
るＰＴ−ＮＡＮＢＨウイルスポリペプチド。
【請求項９】請求項１から８までのいずれか１つによ
るＰＴ−ＮＡＮＢＨウイルスポリペプチドをコードして
いるＤＮＡ配列。
【請求項１０】ＳＥＱＩＤＮＯ：３，４，５，１
８，１９，２０，２１または２２に示される請求項９に
よるＤＮＡ配列。
【請求項１１】請求項９および１０のいずれかによる
ＤＮＡ配列を含み、宿主において、ＤＮＡ配列を発現し
て、ＰＴ−ＮＡＮＢＨウイルスポリペプチドを産生する
ことができる発現ベクター。
【請求項１２】請求項１１による発現ベクターで形質
転換された宿主細胞。
【請求項１３】請求項１から８迄のいずれか１つによ
るＰＴ−ＮＡＮＢＨウイルスポリペプチドをコードして
いるＤＮＡ配列をクローニングするか、合成し、適切な
宿主中で発現されることができるような発現ベクターの
中に、そのＤＮＡ配列を挿入し、発現ベクターで、宿主
細胞を形質転換し、形質転換した宿主細胞を培養し、ウ
イルスポリペプチドを単離することからなるＰＴ−ＮＡ
ＮＢＨウイルスポリペプチドを調製する工程。
【請求項１４】請求項１から６までのいずれか１つに
よるＰＴ−ＮＡＮＢＨウイルスポリペプチドに対するポ
リクローナルまたはモノクローナル抗体。
【請求項１５】ｉ）検体に存在するウイルスＲＮＡ、ま
たは、このようなＲＮＡから合成されるｃＤＮＡを、Ｓ
ＥＱＩＤＮＯ：３，４，５，１８，１９，２０，２
１または２２に相当するＤＮＡ配列とハイブリッドを形
成し、その結果得られる核酸ハイブリッドをスクリーニ
ングして、ＰＴ−ＮＡＮＢＨウイルス核酸を同定するこ
と、もしくは、ｉｉ）検体に存在するウイルスＲＮＡからｃＤＮＡを合
成し、ＳＥＱＩＤＮＯ：３，４，５，１８，１９２
０，２１または２２のサブ配列に相当する、あらかじめ
選ばれたＤＮＡ配列を増幅し、そして、そのあらかじめ
選ばれたＤＮＡ配列を同定すること、からなるＰＴ−Ｎ
ＡＮＢＨウイルス核酸を検出するための方法。
【請求項１６】ｉ）その一方が、ＳＥＱＩＤＮＯ：
３，４，５，１８，１９，２０，２１，もしくは２２の
１部に相当し、その他方は、最初の一方の３′側に位置
しており、相補的配列の１部に相当し、その１対が、そ
れらの間にあらかじめ選ばれたＤＮＡ配列を位置づける
１対のオリゴヌクレオチドプライマーｉｉ）ＳＥＱＩＤＮＯ：３，４，５，１８，１９，
２０，２１または２２の相補的なヌクレオチド配列に相
当するプライマーの上流の検体ＲＮＡからｃＤＮＡを合
成するための逆転写酵素；ｉｉｉ）あらかじめ選ばれたＤＮＡ配列を増幅すること
ができる酵素；そして、随意的にｉｖ）洗じょう液と反応用バッファーからなるＰＴ−Ｎ
ＡＮＢＨウイルス核酸の検出のための試験用キット。
【請求項１７】検体を、請求項１から８までのいずれ
か１つによるＰＴ−ＮＡＮＢＨウイルスポリペプチド
か、請求項１４によるポリクローナルかモノクローナル
抗体と接触させ、検体中に含まれるなんらかの抗原−抗
体結合があるかどうかを決定することからなるＰＴ−Ｎ
ＡＮＢＨウイルス抗原、またはウイルス抗体の検出のた
めの方法。
【請求項１８】請求項１から８までのいずれかによる
ＰＴ−ＮＡＮＢＨのウイルス抗原または請求項１４によ
るポリクローナルまたはモノクローナル抗体、ならび
に、検体中に含まれる抗原抗体結合があるかどうかを決
定する手段を含むＰＴ−ＮＡＮＢＨウイルス抗原また
は、ウイルス抗体を検出するための試験キット。
【請求項１９】薬剤学的に容認し得る担体を配合した
請求項１から８までのいずれかによるＰＴ−ＮＡＮＢＨ
ウイルスポリペプチドを含むワクチン製剤。
【請求項２０】請求項１９によるワクチン製剤の効果
的な量を投与することからなるＰＴ−ＮＡＮＢＨに対す
る免疫を、ヒトにおいて誘発する方法。