JPH10234383A

JPH10234383A - Ｅ型肝炎ウイルス中空粒子、それをコードする遺伝子及びそれらの遺伝子を含む組換えベクターの作製方法と利用方法

Info

Publication number: JPH10234383A
Application number: JP9062445A
Authority: JP
Inventors: Naokazu Takeda; 直和武田; Tensei Ri; 天成李; Tatsuo Miyamura; 達男宮村
Original assignee: KOKURITSU KANSENSHIYOU KENKYUSHO; Denka Seiken Co Ltd
Current assignee: KOKURITSU KANSENSHIYOU KENKYUSHO; Denka Seiken Co Ltd
Priority date: 1997-02-28
Filing date: 1997-02-28
Publication date: 1998-09-08

Abstract

(57)【要約】【課題】ＨＥＶの抗原性を有するＨＥＶ中空粒子、そ
れをコードするＤＮＡ及びそれを含む組換えベクター並
びに該組換えベクターにより形質転換された形質転換体
を提供すること。【解決手段】配列表の配列番号１で示されるアミノ酸
配列を有するポリペプチド又は該アミノ酸配列と８０％
以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、Ｅ型肝炎ウ
イルスの抗原性を有するポリペプチドから成るＥ型肝炎
ウイルスの中空粒子及び該中空粒子をコードするＤＮＡ
を提供した。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、Ｅ型肝炎ウイルス
の中空粒子、それをコードするＤＮＡ及びそれを含む組
換えベクター並びに該組換えベクターにより形質転換さ
れた形質転換体に関する。さらに、本発明は、新規なＥ
型肝炎ウイルス遺伝子及びそれによりコードされる新規
なポリペプチドに関する。

【０００２】

【従来の技術】Ｅ型肝炎はかつて経口型、水系、流行性
非Ａ非Ｂ型肝炎と呼ばれ、１９９０年、Ｒｅｙｅｓらに
よってその起因ウイルス遺伝子がクローニングされて以
来、Ｅ型肝炎と呼ばれるようになった。(Reyes et al:S
cience,vol.247 1335-1339.1990)また、Ｅ型肝炎ウイル
ス（以下、「ＨＥＶ」と呼ぶことがある）は最も最近そ
のウイルス遺伝子がクローニングされたウイルスでもあ
る。現在までのところ、ビルマ株、中国株、パキスタン
株、メキシコ株等でＨＥＶの全遺伝子の塩基配列が決定
されている。

【０００３】これらのＨＥＶ株の解析により、次のこと
がわかっている。すなわち、ＨＥＶ遺伝子はプラスセン
スの１本鎖ＲＮＡから成り立つ。全長は７１９４塩基で
更にこの３’端にポリＡ配列が付着している。読み取り
枠（ＯＲＦ）は３個あり、ＯＲＦ１、ＯＲＦ３、ＯＲＦ
２の順に一部重複しながら配列している。ＯＲＦ１は約
５０００塩基、ＯＲＦ２は約２０００塩基、ＯＲＦ３は
３６９塩基である。ＯＲＦ３は、ＯＲＦ１と１塩基重複
し、また、ＯＲＦ２とは３２８塩基重複している。非コ
ード領域は、５’端が２７塩基、３’端が６８塩基と短
い。ＯＲＦ１は非構造蛋白質をコードし、０ＲＦ２は
構造蛋白質をコードしている。ＯＲＦ３にコードされる
蛋白質の機能は不明である。ＯＲＦ１からコードされる
ペプチドのアミノ酸配列を解析すると、メチルトランス
フェラーゼ、パパイン様システインプロテアーゼ、ヘリ
カーゼ、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの各ドメイン
が存在する。これら非構造蛋白質の様々な酵素活性がＨ
ＥＶ遺伝子の複製や発現、粒子形成等に関与し、ウイル
ス増殖を可能にしている。ＯＲＦ２から発現する蛋白質
は構造蛋白質を形成するユニットになる。この構造蛋白
質には少なくとも２個のＢ細胞エピトープ（抗原決定
基）が存在する。ＯＲＦ３の配列は短く、わずか１２３
個のアミノ酸をコードするにすぎない。機能蛋白質とし
ては短いが、患者血清中にこの蛋白質と反応する抗体が
検出される事から何等かの機能を有するものと考えられ
る。

【０００４】一方、Ｅ型肝炎の診断は現在、酵素抗体法
（ＥＬＩＳＡ）による抗体測定法によって行われてい
る。Reyes らはAbbott社と共同して融合発現蛋白質(Yab
ough PO, et al:Hepatitis E virus:identification of
typecommon epitopes,J Viol65: 5790-5797,1991)、内
田らは化血研と共同して合成ペプチドを(Uchida T,et a
l:Anepidemic outbreak of hepatitis E in Yangon of
Myanmer:antibody assayand animaltransmmision of th
e virus:Acta Pathol Jpn 43.94-98,1993) をそれぞれ
抗原に使用した抗E 型肝炎ウイルス特異抗体検出系を構
築している。また、E型肝炎ウイルス構造蛋白質全長(ORF
2)をバキュロウイルスを用いて発現している例も存在し
ている。(Tsarev SA ,et al:ELISA forantibody to hepa
titis E virus (HEV) based on complete open
reading frame-2 protein expressed in insect cells:
identification of HEV infection in primates.J Inf
ectDis 168:369-378,1993) これらの各特異抗体検出系
にはそれぞれ問題点が存在している。

【０００５】まず、大腸菌による融合蛋白質を用いた抗
体検出系では、偽陽性が多すぎる事。一方、合成ペプチ
ドを用いた特異抗体検出系は偽陰性が検出される状況に
ある。（内田俊和：Ｅ型肝炎ウイルスの分子生物学的研
究：日本臨床５３巻９０１−９０５：１９９５増刊
号）ＨＥＶの感染はまた特異抗体のみの検出ではなく、
ＰＣＲ法によって直接遺伝子診断することも可能になっ
ている。ＨＥＶは血清中に潜伏期や肝機能の指標である
トランスアミナーゼが高値の間について高力価でウイル
ス血症状態にある事も知られている。(Uchida T,et al:
Virlence of hepatitis E virus with serial passage
to cynomolgus monkeys and identification of virem
ia.In:Viral Hepatitis and Liver Disease,p526-527,
Williams &Wilkins,Baltimore,1991.)

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】従来技術では、ＨＥＶ
の粒子を遺伝子工学的に生産することには成功していな
いし、ＨＥＶを感染させた細胞を培養することによりＨ
ＥＶ粒子を生産することにすら成功していない。すなわ
ち、従来のＨＥＶの検出のために行なわれているＥＬＩ
ＳＡ等は、粒子以外のウイルス由来のタンパク質を抗原
として用いている。このため、上記のように測定精度に
満足できない。また、人為的にＨＥＶ粒子を得ることに
成功していないため、ＨＥＶワクチンは開発のめどすら
立っていない。

【０００７】もし、ＨＥＶの中空粒子であってＨＥＶと
同等の抗原性を有するものが得られれば、安全なワクチ
ンとしての利用が可能であるし、また、ウイルス中空粒
子の抗原性は、粒子以外のタンパク質の抗原性と比較し
て、より天然のウイルス粒子の抗原性に近い又は天然の
ウイルス粒子の抗原性と同じであると考えられるので、
免疫測定のための試薬としても、従来のように粒子化し
ていないタンパク質を用いるよりも測定精度が高いと考
えられる。さらに、粒子化したタンパク質は粒子化して
いないタンパク質に比較して遥かに精製が容易である。
また、新規なＨＥＶの遺伝子をクローニングしてその塩
基配列を決定することにより、その新規なＨＥＶの診断
に有用なウイルス粒子を利用することが可能になる。

【０００８】従って、本発明の目的は、ＨＥＶの抗原性
を有するＨＥＶ中空粒子、それをコードするＤＮＡ及び
それを含む組換えベクター並びに該組換えベクターによ
り形質転換された形質転換体を提供することである。さ
らにまた、本発明の目的は、新規なＥ型肝炎ウイルス遺
伝子及びそれによりコードされる新規なポリペプチドを
提供することである。

【０００９】本願発明者らは、ミャンマーで発生したＥ
型肝炎の患者の便から新規なＨＥＶ株を分離し、その遺
伝子をクローニングし、塩基配列を決定した。さらに、
本願発明者らは、この新規なＨＥＶ遺伝子のＯＲＦ２の
うち３３６ｎｔ〜１９８０ｎｔの領域のみを発現させる
ことにより、ＨＥＶの抗原性を有する中空粒子を生産す
ることが可能であることを見出し本発明を完成した。

【００１０】すなわち、本発明は、配列表の配列番号１
で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド又は該ア
ミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列
を有し、Ｅ型肝炎ウイルスの抗原性を有するポリペプチ
ドから成るＥ型肝炎ウイルスの中空粒子を提供する。ま
た、本発明は、該中空粒子をコードするＤＮＡを提供す
る。さらに、本発明は、配列表の配列番号２、３、４又
は５に示される塩基配列を有するＤＮＡ及びそれにより
コードされるポリペプチドを提供する。

【００１１】

【発明の実施の形態】本願発明者らは、下記実施例で詳
述する方法により、ミャンマーで発生したＥ型肝炎の患
者の便から新規なＨＥＶ株を分離し、その遺伝子をクロ
ーニングし、塩基配列を決定した。該新規ＨＥＶ株の遺
伝子中のＯＲＦ１、ＯＲＦ２及びＯＲＦ３の塩基配列及
びそれによりコードされる推定アミノ酸配列並びに全遺
伝子の塩基配列をそれぞれ配列表の配列番号２、３、４
及び５に示す。

【００１２】さらに、本願発明者らは、この新規なＨＥ
Ｖ遺伝子のＯＲＦ２のうち３３６ｎｔ〜１９８０ｎｔの
領域（アミノ酸では第１１２〜第６６０番目のアミノ
酸）のみを発現させることにより、ＨＥＶの抗原性を有
する中空粒子を生産することが可能であることを見出し
た。この中空粒子のアミノ酸配列及びそれをコードする
ＤＮＡの塩基配列を配列表の配列番号１に示す。下記比
較例１に示すように、ＯＲＦ２の全長を発現させた場合
には粒子は形成されない。それにもかかわらず、ＨＥＶ
のＯＲＦ２によりコードされるポリペプチドのＮ末端側
１１１アミノ酸を欠失させることによりＨＥＶ中空粒子
が形成されるという知見は驚くべき知見であり、本願発
明はこの知見を基礎としている。

【００１３】なお、ＨＥＶの抗原性を有する中空粒子を
構成するポリペプチドは、配列番号１に示すアミノ酸配
列を有するものに限定されるものではなく、該アミノ酸
配列において１又は複数のアミノ酸が置換し、欠失し、
挿入され又は端部に付加されたアミノ酸配列であって、
配列番号１に記載のアミノ酸配列と８０％以上、好まし
くは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、さらに
好ましくは９８％以上の相同性を有する、ＨＥＶの抗原
性を有する中空粒子も本発明の範囲に含まれる。なお、
ここで、「ＨＥＶの抗原性を有する」とは、抗ＨＥＶ抗
体と検出可能な程度に免疫反応を起こすという意味であ
る。

【００１４】本発明は、上記ＨＥＶの中空粒子をコード
するＤＮＡを含み、宿主細胞中で該ＤＮＡを発現するこ
とができる組換えベクターをも提供する。この組換えベ
クターは、適当な宿主細胞中で中空粒子の生産が可能な
ものならば特に限定されないが、バキュロウイルス遺伝
子非必須領域内に上記本発明のＤＮＡが挿入されて得ら
れる組換えバキュロウイルスベクターであることが好ま
しい。この場合には宿主細胞は昆虫細胞が好ましく、特
にＴｎ５細胞（文献及び入手先：Wicham, T. J. et a
l., (1992) Biotechnol. Prog. 8:391-396; Davis, T.
R. et al., (1993)In Vitro Cell. & Dev. 29A:388-39
0; Invitrogen Corporationより市販）が好ましい。特
に、下記実施例で作製された組換えバキュロウイルスベ
クターを昆虫細胞であるＳｆ９細胞中で発現させると、
ＤＮＡの発現は確認されたが中空粒子は構築されなかっ
た。これに対し、Ｔｎ５細胞中では中空粒子が生産され
た。

【００１５】本発明のＨＥＶ中空粒子は、下記実施例に
おいて具体的に記載するように、ＨＥＶタンパクと同じ
抗原性を有している。従って、該中空粒子は、ＨＥＶ又
は抗ＨＥＶ抗体を測定する免疫測定のための試薬として
用いることができる。また、抗ＨＥＶ抗体を動物に生産
させるための免疫原として用いることもできる。さら
に、その精製が容易でかつ安全性が高いので、ＨＥＶに
対するワクチンとしても用いることができる。さらに、
クリオ電子顕微鏡或いはエックス線結晶解析による粒子
の三次構造解析が考えられる。更に、精製粒子をプロー
ブとして宿主細胞レセプター分子の分離同定、レセプタ
ー分子を高度に発現する形質転換細胞の樹立さらにま
た、レセプター分子を発現するトランスジェニックマウ
スの作出も考えられる。

【００１６】以下、本発明のＤＮＡのクローニング、該
遺伝子の発現方法及び得られた中空粒子に対する特異抗
体の作出等について、各工程毎により詳細に説明する。
もっとも、以下に記載する各方法はあくまで好ましい方
法を例として示すものであり、これらに限定されるもの
ではない。

【００１７】（１）Ｅ型肝炎ウイルスのＲＮＡを抽出す
る工程：この工程の技術は従来の公知の常法、例えばフ
ェノール抽出法等が例示される。今回は、０．５ｍｌの
サル胆汁からRNA extraction kitであるＲＮＡｚｏｌを
用いてＲＮＡを抽出した。次に、Oligotex-dT30(Super)
でｍＲＮＡを分離精製した。

【００１８】（２）Ｅ型肝炎ウイルスＲＮＡに相補的な
二本鎖ｃＤＮＡを調製する工程：この工程は例えば逆転
写酵素を用いる公知の常法により実施する事が可能であ
る。今回は、Oligo(dT)12-18をプライマーに、AMV(Avia
n Myeloblastosis Virus)(生化学工業社製) 由来逆転写
酵素でcDNAを調製した。

【００１９】（３）当該ウイルスｃＤＮＡをクローニン
グする工程：この工程で使用可能なクローニングベクタ
ーとしては、大腸菌に代表される原核細胞を宿主とする
プラスミド、及び、λファージ等に代表されるバクテリ
オファージ由来のベクター等公知のものを使用する事が
出来る。この工程に於いてはクローニングベクターとそ
の宿主細胞とを適当に組み合わせて使用する事が望まし
い。クローニングベクターの具体的な例としては、ｐＢ
Ｒ３２２，ｐＢＲ３２５，ｐＢＲ３２７，ｐＢＲ３２
８，ｐＵＣ７，ｐＵＣ８，ｐＵＣ９，ｐＵＣ１９等が例
示される。遺伝子の挿入方法は公知の常法に従えばよ
い。これらのベクターの構築にあたっては、遺伝子操作
の容易である大腸菌系を使用する事が望ましい。また、
使用するプラスミドベクターは特に限定されるものでは
ない。今回は、産生したＲＮＡ：ＤＮＡハイブリットを
鋳型として、以下のプライマーセットを用いてＰＣＲ法
によるウイルス遺伝子の増幅を試みた。

【００２０】 HEV-D2 5'- TGGGTTCGCGACCATGCGACCCTCG-3' 5134-5157 HEV-U2 5'- CAACAGAAAGAAGGGGGGCACAAG-3' 7138-7161

【００２１】これらの領域はＡｍｐｌｉｔａｑ（ＴＡＫ
ＡＲＡ社製）を用いてＯＲＦ２を含む２０２８塩基をＰ
ＣＲ法を用いて増幅した。また、ＰＣＲ法の条件は９６
℃１．５分間、７２℃３分間を１サイクルとして４０サ
イクル行った。増複産物はアガロースゲル電気泳動法に
よって分離精製し、クローニングベクターｐＣＲII（イ
ンビトロジェン社製）にＴＡクローニングを行った。こ
れらのクローンからｐＨＥＶ（Ｄ２Ｕ２）を得た。

【００２２】（４）（３）で示されたｐＨＥＶ（Ｄ２
Ｕ２）クローンに関して、Ｅ型肝炎ウイルスのＯＲＦ２
遺伝子全領域を発現させる工程：プラスミドクローンｐ
ＨＥＶ（Ｄ２Ｕ２）を制限酵素ＮｒｕＩ及びＸｂａＩ
で消化切断し、アガロースゲル電気泳動法によって分離
後、精製し、制限酵素ＳｍａＩ及びＸｂａＩで消化切断
したバキュロウイルストランスファーベクターｐＶＬ１
３９３と結合し、トランスファーベクターｐＶＬ（Ｄ２
Ｕ２）を作製した。

【００２３】クローニングされたＥ型肝炎ウイルスのＯ
ＲＦ２遺伝子内の領域を発現させる工程：この工程では
発現ベクターと当該ベクターが感染・増殖可能である宿
主細胞を選択し適宜組み合わせて使用する事が望まし
い。この工程で特に留意すべき点としてはＯＲＦ２をコ
ードする遺伝子と公知の発現ベクターとを単純に連結し
たのみでは抗原性を有するＨＥＶＯＲＦ２蛋白質の発
現は期待できない。Ｅ型肝炎ウイルスＯＲＦ２をコー
ドする遺伝子と公知の発現ベクターとの連結には概略的
に以下に示す様な工夫を必要とする。

【００２４】ａ）ＨＥＶＯＲＦ２の一部を発現ベクタ
ー内に組み込むため、遺伝子の翻訳開始及び終止領域を
目的のフラグメントの前後にフレームを予め合わせた上
で補充する必要がある。

【００２５】ｂ）希望の抗原活性及び免疫原性を有する
発現産物を獲得するために、ＯＲＦ２遺伝子の一部また
どの部分を発現ベクター内に連結するのかを決定する。

【００２６】今回、ＯＲＦ２の１１２番目のアミノ酸
（塩基配列５４８０）からＣ末端まで（ＯＲＦ２のアミ
ノ酸配列６６０、塩基配列７１２６）を発現するた
め、プライマーセットを用いて、ＲＮＡ：ＤＮＡハイブ
リッドを鋳型にして約１．７ｋｂのＤＮＡをＰＣＲで増
幅した。以下に使用したプライマーセットを示す。

【００２７】HEV-D13 5'-AAGGATCCATGGCGGTCGCTCCAGCCC
ATGACACCCCGCCAGT-3' HEV-U14 5'-GGTCTAGACTATAACTCCCGAGTTTTACCCACCTTCATC
TT-3'

【００２８】このプライマーセットによって増幅された
産物は、制限酵素ＸｂａＩ及びＢａｍＨＩの配列を含む
為、これらの制限酵素サイトで消化切断し、アガロース
ゲル電気泳動法によって分離精製後、バキュロウイルス
トランスファーベクターｐＶＬ１３９３と結合しｐＶＬ
（Ｄ１３Ｕ１４）を作製した。

【００２９】ｃ）発現産物の抗原性並びに免疫原性を高
める為に発現する領域を限定する。ｄ）発現産物の収量を高める。ｅ）発現産物を細胞外へ分泌させ精製方法を容易にす
る。これらの工夫は主として発現ベクター側の改編によ
って達成可能である。

【００３０】(5) 組換えバキュロウイルスを作製する
工程：組換えバキュロウイルスの作製に当たっては、ま
ずバキュロウイルスの増殖に非必須な遺伝子領域内にＥ
型肝炎ウイルス抗原蛋白質をコードする遺伝子の一部分
を挿入する。ここでは一般に、トランスファーベクター
として、例えば、pAcYM1(J.General Virology,Vol.68,p
p.1233-1250,1987) などが例示され、市販のものを用い
ることもできる。

【００３１】これらのトランスファーベクターと野生株
バキュロウイルスを昆虫細胞、例えばＳｆ９細胞内にリ
ポフェクチン（ＧＩＢＣＯＢＲＬ社製）等の物質を用
いて導入し、昆虫細胞中に於て相同組換えがおこり組換
えバキュロウイルスの作製が可能となる。具体的には、
０．５μｇの直鎖状バキュロウイルスＤＮＡ（Ｂａｃｕ
ｌｏ−ＧｏｌｄＰＨＡＲＭＩＮＧＥＮ社製）と１μｇ
のトランスファーベクターを８μｌの蒸留水に溶解し、
２倍希釈した等量のリポフェクチンと混合して室温で１
５分間放置する。Ｅｘｃｅｌｌ４００培養液に懸濁
した１×１０⁵個のＳｆ９細胞を２６．５℃で３０分間
プラスティックシャーレ（直径３．５ｃｍ）内に吸着
後、ＤＮＡ混合液を細胞に滴下し２６．５℃で培養し
た。２４時間後、培養液を８％牛胎児血清を含むＴＣ１
００（ＧＩＢＣＯＢＲＬ社製）培地に交換し、更に、
培養を継続した。

【００３２】(6) 組換えウイルスの力価を測定する工
程：前項組換えウイルスを５日間培養した後、培養上清
を例えばＴＣ１００等の昆虫細胞培養用メディウムを用
いて１０倍に希釈した。その０．１ｍｌをとり、直径
３．５ｃｍのプラスチックシャーレに培養した３×１０
⁶ 個のＳｆ９細胞に接種した。２６．５℃、３０分間吸
着後１％アガロースＭＥ（低融点アガロース）を含むＴ
Ｃ１００培養液２ｍｌを重層し２６．５℃で培養し
た。更に、培養開始後４日目に０．００５％のニュート
ラルレッドを含むメディウム１ｍｌを重層して出現した
プラークを計測した。更に２代のプラーククローニング
を行って組換えウイルスを純化した。３代目のプラーク
をパスツールピペットで分離し、１ｍｌのＴＣ１００メ
ディウムに懸濁し、その０．１ｍｌを１０⁶ 個のＳｆ９
細胞に接種した。吸着後ＴＣ１００培養液を用いて５日
間培養し、その上清を種ウイルス（Ａｃ（Ｄ１３Ｕ１
４））とした。

【００３３】(7) 組換えバキュロウイルスを用いたＥ
型肝炎ウイルス抗原蛋白質の産生工程：宿主細胞として
は、昆虫細胞、例えば、Ｓｆ９及びＴｎ５細胞等が例示
される。これらの昆虫細胞に対して前記組換えバキュロ
ウイルスをＭＯＩ(Multiplicity of infection)10 で感
染させる。この時、組換えウイルス液を細胞に滴下さ
せ、靜かに振とうさせながら約30分程度吸着させた。そ
の後、例えば、TC100、ＥＸｃｅｌｌ４００等の昆虫細
胞用培地に１０％ＦＣＳ、２％ＢＴＢを添加し、２６．
５℃、７２ｈｒ培養後発現蛋白質即ちＥ型肝炎ウイルス
抗原蛋白質の回収を行う。

【００３４】(8) 発現蛋白質の同定方法：組換えウイ
ルス感染培養細胞及び培養上清を経時的に採取した。こ
れらの採取した感染培養細胞及び培養上清に関して、Ｓ
ＤＳ−ＰＡＧＥで分離後蛋白質をクマシーブルー染色で
検出し、予想される分子量の妥当性を検討した。また、
ＳＤＳ−ＰＡＧＥで蛋白質を分離後ニトロセルロース膜
に転写し、Ｅ型肝炎患者急性期及び回復期血清によるウ
エスターンブロッティング法で発現蛋白質を同定した。
培養細胞では上記血清と反応後蛍光標識した抗ＩｇＧ抗
体による蛍光抗体法で発現蛋白質を確認した。また、感
染細胞の電子顕微鏡用超薄切片を作製し、血清と反応後
金コロイド標識した抗ヒトＩｇＧ抗体によるイムノゴー
ルド法で発現蛋白質を同定した。培養上清に関しては上
清そのものを、或いは、ＰＥＧ６０００で沈殿濃縮した
ものをウラニル酢酸でネガティブ染色し、電子顕微鏡で
検鏡し直接ウイルス様粒子を検出した。

【００３５】目的のＥ型肝炎ウイルス中空化粒子抗原の
発現は昆虫細胞Ｔｎ５ｃｅｌｌを使用した。Ａｃ（Ｄ
１３Ｕ１４）をＭＯＩ：１０でＴｎ５ｃｅｌｌに接種
し、２６．５℃、３０分間吸着後、Ｅｘｃｅｌｌ４
０５培養液を加えて培養した。

【００３６】(9) 発現蛋白質即ちＥ型肝炎ウイルス抗
原蛋白質の精製に関する工程：Ｔｎ５ｃｅｌｌ培養上
清を１，０００ｘｇで１０分間遠心して夾雑物を取り除
き、更に、１０，０００ｘｇで、３０分間遠心してバキ
ュロウイルスを取り除いた。１０％蔗糖を含むリン酸緩
衝液（ｐＨ７．２）１０ｍｌに前出の上清を重層してベ
ックマンＳＷ２８ローターで１００，０００ｘｇ、３時
間遠心してウイルス様中空化粒子を沈査に回収した。１
ｍｌのリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）に懸濁して１０％〜
４０％蔗糖勾配に重層後ベックマンＳＷ４１ローターで
１００，０００ｘｇ、３時間遠心してウイルス様中空化
粒子を２０％と１０％蔗糖液の中間に回収した。白乳色
のバンドを回収しリン酸緩衝液で５倍希釈後、ベックマ
ンＳＷ５０．１ローターで１００，０００ｘｇ、３時
間遠心後、ウイルス様粒子化抗原を回収した。

【００３７】(10) 精製発現蛋白質の抗原性の確認工
程：精製ウイルス様中空粒子をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離
し、ニトロセルロース膜へ転写後Ｅ型肝炎患者回復期血
清を用いたウエスタンブロッティングを行った。精製ウ
イルス様中空化粒子抗原をＥ型肝炎患者回復期血清と混
合し、３７℃で１時間反応後、ベックマンＳＷ５０．１
ローターで１００，０００ｘｇ、３時間遠心し、沈査を
電子顕微鏡で検鏡してウイルス凝集像を検出した。

【００３８】(11) Ｅ型肝炎ウイルス特異抗体の作出工
程：初回免疫：１ｍｇの精製中空粒子を含む１ｍｌのリン酸
緩衝液（ｐＨ７．２）と１ｍｌのＦｒｅｕｎｄｉｎｃ
ｏｍｐｌｅｔｅアジュバントを混合し、２ｋｇのＮｅｗ
ＺｅａｌａｎｄＷｈｉｔｅウサギに皮下注射した。

【００３９】ブースター：一ヶ月後に０．５ｍｇの中空
粒子０．５ｍｌとＦｒｅｕｎｄｉｎｃｏｍｐｌｅｔｅ
アジュバント０．５ｍｌを混合して皮下に一回目を、更
に一週間後に同様に皮下に二回目を注射した。５日後に
全採血し、血清を分離した。塩化セシウム中に於ける浮
上密度は１．２９ｇ／ｃｍ³ である。

【００４０】以下、本発明を実施例に基づきより具体的
に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定され
るものではない。

【００４１】実施例１Ｅ型肝炎ウイルスの全塩基配列決定の為のＰＣＲとクロ
ーニング（１）Ｅ型肝炎ウイルスＲＮＡの抽出１９８６年ミャンマーの首都ヤンゴンでＥ型肝炎の散発
発生があり、患者１０名から糞便を得た。これらをプー
ルして１０％浮遊液（リン酸緩衝液）を調製し、６００
０ｒｐｍ１０分間、４℃の遠心法で部分精製後ポアサ
イズ０．２５ｕｍのミリポアフィルター（ミリポア社
製）を用いて濾過後、ｒｈｅｓｕｓｍｏｎｋｙに静脈
注射した。その後、肝炎発生後、胆汁を採取し、ミリポ
アフィルターを用いて精製し、ｒｈｅｓｕｓｍｏｎｋ
ｅｙを用いて継代した。そして、ＲＮＡ抽出には６代継
代後の胆汁を使用した。（ＭｉｃｒｏｖｉｏｌＩｍｍ
ｕｎｏｌ３６：６７−７９（１９９２））０．５ｍｌ
の胆汁に対して４００から８００μｌのＲＮＡｚｏｌ
（ＢｉｏｔｅｘＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製）を加
え、更にその１／５ｖｏｌｕｍｅのクロロホルムを加え
て十分撹拌したのち１０，５００×ｇで２０分間遠心沈
殿を行った。遠心後、上層部分を新しい遠心チューブに
移し、等量のイソプロパノールを加え−２０℃で一晩エ
タノール沈殿を行った。

【００４２】エタノール沈殿状態のサンプルを１０，５
００×ｇ、２０分の条件で遠心し、沈査を７５％エタ
ノールを用いて一回洗浄した。次にペレットを真空乾燥
させ、１００から２００μｌの分子生物学グレードの水
(Sigma Chemical Co.Ltd., Dorset,United Kingdom) に
再浮遊させた。５００μｌのサンプルに対して等量のｐ
ｈｅｎｏｌ及びクロロホルムを加え、ｍＲＮＡ抽出をお
こなった。

【００４３】抽出済みのＴｏｔａｌＲＮＡを用いてｍ
ＲＮＡを抽出し、Oligotex-dT30(Super)でｍＲＮＡを分
離精製した。

【００４４】（２）ｃＤＮＡの調製及びＰＣＲによる増
幅分離精製したＲＮＡとｏｌｉｇｏ（ｄＴ）１２−１８プ
ライマーを使用して、ＡＭＶ由来逆転写酵素（生化学工
業社製）でｃＤＮＡを調製した。さらに、これらのＲＮ
Ａ：ＤＮＡｈｙｂｒｉｄｅを鋳型としてプライマーＥ
Ｐ１／Ｐ５９，ＥＰ２／Ｐ４２，ＥＰ５／ＥＰ６，Ｄ２
／Ｕ２，Ｐ１２４／Ｐ１２６の各プライマーセットによ
ってそれぞれ２０６０，２５６６，２３８６，２０２
８，１０４０ｂｐを増幅した。ＰＣＲの増幅条件は、９
６℃ １．５分間、７２℃ ３分間を１サイクルとして
４０回繰り返した。

【００４５】（３）Ｅ型肝炎ウイルス遺伝子のクローニ
ング及び塩基配列の決定上記条件においてＰＣＲによって増幅された遺伝子は、
０．７％アガロースゲルを用いて分離後、増幅断片が単
一で有ることをエチジウムブロマイド染色によって確認
し、Ｂａｎｄｐｒｅｐ（ファルマシア製）を用いて回収
した。次に、回収した増幅断片の一部を用いて、クロー
ニングベクターｐＣＲ２．１（ストラタジーン社製）に
ＴＡ法によってクローニングし、ｐＨＥＶ（１−６）
（１−２０６０），ｐＨＥＶ（１３８）（１４５８−３
０２３），ｐＨＥＶ（１００−１０）（２９２５−５３
１０），ｐＨＥＶ（Ｄ２Ｕ２）（５１３４−７１６
１），ｐＨＥＶ（７）（６１６１−７２００）を得た。

【００４６】Ｅ型肝炎ウイルス遺伝子塩基配列の決定
は、各領域に全体で５３個のシークエンシングプライマ
ーを設定し、ｄｙｅｔａｒｍｉｎａｔｉｏｎ法により
サイクルシークエンシングキットＦＳ（パーキンエルマ
ー社製）を用いてラベリング反応を行った。この際使用
したＥ型肝炎ウイルス遺伝子のＤＮＡ濃度は０．２μｇ
／μｌであり、シークエンシングプライマーの濃度は
０．３ｐｍｏｌである。更に、反応終了後、セントリプ
レップスピンカラム（パーキンエルマー社）を用いて過
剰量の蛍光色素を除外した。

【００４７】この反応液を真空凍結乾燥機によって完全
に乾燥させ、専用のサンプルバッファー（パーキンエル
マー社製）２５μｌに浮遊させる。更に、攪拌後遠心沈
殿させ９５℃で２分間の加熱操作を行い、急冷後オート
シークエンサー（ＡＢＩＧｅｎｅｔｉｃａｎａｌｙ
ｚｅｒ３１０）で解析した。以下に今回使用したシー
クエンシングプライマーを記載する。

【００４８】 5'→ 3' DOWN PRIMER １． EP1-AGGCAGACCACATATGTGGT (1-24) ２． P109-TTGTTTTCCGCCCCGAGGTT (191-210) ３． P73-TTCCCGCCGAAACTGGCATC (491-510) ４． P128-CGGTCTACCGAGGTCTATGT (874-893) ５． P58-ATATTTGGGACCGTCTTATG (980-999) ６． P95-CCAGGCTATATCCAAGGGGA (1191-1210) ７． EP10-GATCCACGGGTGTTGGTTTT (1360-1379) ８． EP2-TGGTCAGGAGTGCACCTGTTTCCT (1458-1481) ９． P84-CTTGACCATCGGGCGGTT (1902-1920) １０． P137-CATTCGCTGACCGGTAACTT (2011-2030) １１． EP3-CTTAGGTCTTATGTCTGAGCCTTC (2181-2204) １２． P75-TACCAAAGGTACCCCGCCTC (2491-2510) １３． EP5-CGTTGTTCAGTACCAGTTTACTGC (2925-2948) １４． P112-CTTTGCTGCTTTTAACCCGC (3051-3070) １５． P97-CTTGGCGACCCGAACCAGAT (3181-3200) １６． P118-AGACCTGTCCCTGTT (3781-3795) １７． P129-CGCAAGGCCGTGCTGTCCAC (3931-3950) １８． P120-CATGGTCGAGAAGGGCC (4088-4105) ２０． P104-CAGGCCCCGAAGGAGTC (4534-4550) ２１． P99-CGCTCCCTGATGTTGTGCGCT (4820-4840) ２２． P138-TAACCTGATTGGTATGCTAC (5001-5020) ２３． EP11-ATGAATAACATGTCTTTTGCTGCGCC (5106-5131) ２４． P123-GCCTATGTTGCCCGCGCCAC (5188-5207) ２５． EP7-AGTGCCTGATGTCGACTCTCG (5509-5529) ２６． P116-CCCAAGTGAGCGCCTAC (5884-5900) ２７． P124-GCCGAGCTCACCACCACGGC (6161-6180) ２８． P21-GCGCCTTAAGATGAAGG (7089-7106) 3' → 5'REVERSE PRIMER ２９． P126-TTTTTTCAGGGAGCGCGGAA (7202-7181) ３０． HEVU2-CAACAGAAAGAAGGGGGGCACAAG (7161-7138) ３１． P94-CGGGACCAGCACCCAG (6933-6908) ３２． P140-GATGTATACAACTTAACAGT (6390-6371) ３３． EP8-TTACGGGTGAGCCATGTATGC (6002-5981) ３４． EP12-GTCATGGGCTGGAGCGACCGCGGTTA (5500-5475) ３５． EP6-TAGGGGATTGCGAAGGGCTGA (5310-5475) ３６． EP4-GCAAAAACATGAGGAGCAGCAACA (5189-5166) ３７． P127-GGAAATCCACCTTCAACTTC (4771-4751) ３８． P119-GCGGAAGTCATAACAGTG (4650-4633) ３９． P130-GAGAGAGTCGCGGACATCAG (4020-4001) ４０． P23-TGCGGCAGTGCACAATGTCTG (3913-3893) ４１． 98-GGCGCTGGTGACCAATTTCG (3670-3651) ４２． P106-GCGGGTTAAAAGCAGCAAAG (3070-3051) ４３． P61-GGCATTACGCAACTCACGCG (3036-3017) ４４． P42-TCACGCGTCGGGACCACGACA (3023-3003) ４５． P85-TGGGTTATGTTCCAACCTA (2619-2601) ４６． P76-GGCCGCGCCGTCGCGCATCAC (2550-2530) ４７． P114-CCGTCTGGTGGGTTATGGCC (2350-2331) ４８． P59-AGGCCAATGAGTCCCTCAGG (2060-2041) ４９． 96-TGACTGGCATCGAAGGAGAG (1820-1801) ５０． P57-GCCGCGAAGGTAGGTCATTAA (1065-1045) ５１． P132-CAGCATGGAAGGTCGACTTA (970-951) ５２． P122-CCAATTTCAAGACAACGGC (296-278) ５３． P105-AGAAAAGGCCTAACTACCAC (140-121)

【００４９】その結果、ＯＲＦ１、ＯＲＦ２、ＯＲＦ３
の各遺伝子の塩基配列は既に報告されているＥ型肝炎ウ
イルス遺伝子の塩基配列と比較し、それぞれ以下の様な
相同性を示していた。更に、アミノ酸配列での相同性に
関しても同様に比較した。その結果、各領域の相同性
は、以下の表中の様であった。なお、表１中、本発明に
より単離されたＨＥＶは「Burma/86(Li)」と表示されて
いる。

【００５０】

【表１】

【００５１】(4) HEV(1-7200) の構築及び形質転換体
の作製実施例１−(3) 中に記載のpHEV(1-6)(1-2060), pHEV(13
8)(1458-3023), pHEV(100-10)(2925-5310), pHEVD2U2(5
134-7161), pHEV(7)(6161-7200) からpHEV(1-6)(1-20
60) を制限酵素EcoRI を用いて消化し、発現ベクターpG
EM-3のEcoRI 部位内に再クローニングした。このクロ
ーンを制限酵素ApaLI 及びBamHI を用いて部分消化を行
ない、前述のpGEM-3内にＨＥＶ遺伝子の1-1468の部分を
残し他の領域はアガロースゲルで分離した。pHEV(13
8)(1458-3023)のクローンに対して同様に制限酵素Apa
LI 及びBamHI を用いて部分消化を行ないＨＥＶ遺伝子
の1468-2960 の領域をアガロースゲルを用いて分離精製
した。の２つの領域を用いてライゲーション反
応を行ないで得られた発現ベクターpGEM-3内にＨＥＶ
遺伝子の1-2960の領域をクローニングした。さらにpH
EV(100-10)(2925-5310) を制限酵素BamHI を用いて消化
を行ないＨＥＶ遺伝子のうち2960-5310 を含む領域を切
り出しアガロースゲルを用いて精製単離した。この遺伝
子断片(2960-5310) とで得られたクローン化ＤＮＡと
を制限酵素BamHI 部位同士でライゲーションを行ない、
Ｅ型肝炎ウイルス遺伝子1-5310までを含むpGEM-3クロー
ンを得た(HEV-ORF1)。pHEV(D2U2)(5134-7161) 及びpH
EV(7)(6161-7200)を制限酵素KpnIで消化し、pHEV(D2U2)
(5134-7161) から単離した遺伝子断片とpHEV(7)(6161-7
200)から得られた発現ベクターを含む遺伝子断片同士の
ライゲーションを行ないクローン化した(1-5310)。前
述のクローンとpHEV(100-10)(2925-5310) を制限酵素Nu
rIを用いて消化しＥ型肝炎ウイルス遺伝子の(3600-720
0) までを含む領域をクローン化した(N-9クローン）。
HEV-ORF1及びN-9 の両クローンを制限酵素SfiI及びXb
aIを用いて消化し、HEV-ORF1から得られたＨＥＶ遺伝子
の(1-3966pGEM-3)とN-9 より得られたＨＥＶ遺伝子の(3
966-7200) を含む断片をそれぞれ単離精製した後ライゲ
ーションした。

【００５２】その結果、発現ベクターのpGEM-3のマルチ
クローニングサイト内にＥ型肝炎ウイルス全塩基配列を
包含するHEV(1-7200) を得た。

【００５３】これらのＥ型肝炎ウイルス全塩基配列を含
むHEV(1-7200) クローンは、GIBCOBRL 社製エレクトロ
ポレーションシステムを用い、さらに大腸菌ＤＨ１０Ｂ
細胞を宿主として形質転換した。

【００５４】上記方法により作製され、Ｅ型肝炎ウイル
ス全塩基配列を含むHEV(1-7200) クローンを有する大腸
菌ＤＨ１０Ｂ株は、工業技術院生命工学工業技術研究所
に寄託されており、その受託番号はFERM P-16072であ
る。

【００５５】実施例２バキュロウイルスを用いたＯＲＦ２ウイルス抗原蛋白質
の発現（１）組換え転移ベクターの作製実施例１−（３）で得たpHEV(D2U2)(5134-7161) （上記
プライマーＤ２及びＵ２を用いてＨＥＶ遺伝子全長（配
列番号５）の５１３４〜７１６１ｎｔの２０２８ｂｐの
増幅領域を組込んだもの）を、制限酵素ＢａｍＨＩ及び
ＸｂａＩそれぞれ２０ユニットで、３７℃、２時間消化
後、０．７％アガロースゲルを用いて電気泳動を行い挿
入遺伝子断片の分離精製を行った。更に、精製断片をア
ガロースゲルから切り出しＢａｎｄｐｒｅｐ（ファルマ
シア社製）によって目的のフラグメントを精製した。

【００５６】同様にして、バキュロウイルストランスフ
ァーベクターｐＶＬ１３９３（ストラタジーン社製）
５μｇを制限酵素ＳｍａＩ及びＸｂａＩ，或いはＢａｍ
ＨＩ及びＸｂａＩ２０ユニット３７℃ ２時間の条
件で消化した。そして、０．７％アガロースゲルを用い
て電気泳動法によって分離精製した。更にまた、プラス
ミドベクターをゲルから切り出しＢａｎｄｐｒｅｐ（フ
ァルマシア社製）によって精製した。

【００５７】前述までに得られたＥ型肝炎ウイルスの全
長ＯＲＦ２フラグメントはバキュロウイルストランスフ
ァーベクターｐＶＬ１３９３／ＳｍａＩ−ＸｂａＩｓと
５’欠損ＯＲＦ２フラグメント（転写開始コドン＋１
１２ａａ−６６０ａａ，５’末端にＢａｍＨＩを３’末
端にＸｂａＩを持つフラグメント）はバキュロウイルス
トランスファーベクターｐＶＬ１３９３／ＢａｍＨＩ−
ＸｂａＩとＴＡＫＡＲＡｌｉｇａｔｉｏｎｋｉｔ
ｖｅｒ．２を用いて結合した。ｌｉｇａｔｉｏｎ反応の
条件は、１５℃ ３０分間である。また、挿入遺伝子濃
度は、１２５ｎｇであり、ベクターＤＮＡ濃度は、２５
ｎｇであった。さらに、全反応液容量は、８μｌであっ
た。

【００５８】前項の反応液の全量を用いて、大腸菌Ｋ−
１２株系の例えばＤＨ１０Ｂ等の株を用いてGIBCO BRL
社製エレクトロポレーションシステムにより用いて形質
転換を行った。

【００５９】さらに、形質転換後、得られた形質転換体
を適当に２０個程度選択し、ＬＢ培地を用いて液体培養
を行う。それらの培養液から１．５ｍｌをサンプリング
してＦｌｅｘｉＰｒｅｐｋｉｔ（ファルマシア社製）
によりＰｌａｓｍｉｄＤＮＡの精製を行った。そし
て、それらのＤＮＡを用いて制限酵素によるマッピング
を行い、目的のプラスミドｐＶＬ（Ｄ１３Ｕ１４）を取
得した。

【００６０】（２）組換えウイルスの作製 φ３５ｍｍのプラスティック製ディッシュ（住友ベーク
ライト社製）を用いて、昆虫細胞Ｓｆ９細胞(Spodopter
a frugiperda) は、１０％牛胎児血清（ＦＣＳ）を含む
培地（ＴＣ１００あるいはＥｘｃｅｌｌ４００）
で、３〜４日培養した。次いで、φ３５ｍｍディッシュ
（住友ベークライト社製）を用いて、１×１０⁶ 個／デ
ィッシュ、培地量約１．５ｍｌになる様に細胞を調整し
た。この状態で３０〜４０分間静置した後、無菌的に上
記培地を除去し、１．５ｍｌの無血清培地例えば（Ｅｘ
ｃｅｌｌ４００またはＧｒａｃｅ’ｓｍｅｄｉｕ
ｍ）に交換した。

【００６１】ここにＢａｃｕｌｏＧｏｌｄｌｉｎｅａ
ｒｉｚｅｄＢａｃｕｌｏｖｉｒｕｓＤＮＡ０．５μ
ｇ（ＰｈａｒｍｉｎｇｅｎＣｏＬｔｄ）及び１μｇ
のｐＶＬ（Ｄ１３Ｕ１４）を８μｌの精製水に溶解し、
２倍希釈した等量のリポフェクチン（ＧｉｂｃｏＢＲ
ＬＣｏＬｔｄ）と混合後、室温で１５分間放置した。
このＤＮＡ混合物を上記無血清培地中に１滴ずつ静かに
全体に滴下した。（Ｃｏ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏ
ｎ）。そして、インキュベーター内に収納し、２６〜２
６．５℃で３日間培養した。

【００６２】Ｃｏ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ後、約３
日間経過した細胞培養上清約１ｍｌを１．５ｍｌ遠心チ
ューブに回収し、それらの各２０μｌを用いて１０^-1〜
１０^-3のウイルス力価まで無血清培地によって希釈し各
々の１００μｌを１×１０⁶個／ディッシュ（φ３５ｍ
ｍ）に調整した細胞に接種し、約１時間静置して吸着さ
せる。その後、組換えウイルス液を除去し、１％低融点
寒天ゲル（ＳｅａＰｌａｑｕｅ：宝酒造社製）２ｍｌ
を重層し、ゲルが凝固した後、更に、１ｍｌの培地を重
層し、２６〜２６．５℃で３〜４日間培養する。更に、
０．０１％（Ｗ／Ｖ）ニュートラルレッド（１０ｍＭリ
ン酸緩衝液）を１ｍｌ加え、プラークアッセイを行っ
た。（Ｊ．ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ；１９７７，３６，３６
１−３６４）ここで組換えウイルスである透明プラーク
を選択をした。

【００６３】プラークアッセイによって得られた組換え
体と思われるプラークをパスツールピペットによってゲ
ル諸とも採取し、それらを細胞培養用培地４００μｌに
浮遊し十分撹拌を行った。その後、アガロースゲルを３
０００ｒｐｍ５ｍｉｎの条件で遠心沈殿させた。この
時得られた上清をプラークアッセイ時同様に、１０^-1〜
１０^-3まで細胞培養用培地で希釈し、低融点寒天を用い
てＣｏ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ時同様にプラークア
ッセイを行いて組換えウイルスの精製を行った。

【００６４】プラーク純化（ｐｌａｑｕｅｐｕｒｉｆ
ｉｃａｔｉｏｎ）によって得られた組換え体の感染力価
を上昇させる為に更に昆虫細胞Ｓｆ９ｃｅｌｌに感染
させた。この時も上記までと同様に、φ３５ｍｍディッ
シュに約１×１０⁶ 個／ディッシュの昆虫細胞Ｓｆ９細
胞を用意し、約３０分間静置後、培地の大部分を除去
し、そこに得られた組換えウイルスを約１００μｌ加
え、約１５分間隔で穏やかに振とう混和を行う。この操
作は合計４回、約１時間に渡って行った。

【００６５】次に、昆虫細胞用培地を１．５ｍｌ加え、
３〜４日間培養を行ってその上清を採取した。この時、
得られた上清を用いて７５ｃｍ² 培養フラスコ２本を用
いて同様にＳｆ９ｃｅｌｌを準備し、上清１ｍｌを接
種し、３〜４日間の培養以後、得られた上清をＥ型肝炎
ウイルス構造蛋白質発現用高力価組換え体とした。

【００６６】（３）Ｅ型肝炎ウイルス構造蛋白質（ＯＲ
Ｆ２）の発現 φ３５ｍｍディッシュに昆虫細胞Ｔｎ５細胞（１×１０
⁶ ｃｅｌｌｓ／ディッシュ）室温で３０分間静置して吸
着させた培地の大部分を吸引除去した後、前項記載の高
力価組換えウイルス（１×１０⁷ ｐｆｕ／ｍｌ）をＭＯ
Ｉ５〜１０になるように接種し、約１５分間隔で穏やか
に振とうしながら計４回、一時間に渡り、この操作を続
けた。

【００６７】その後、昆虫細胞培養用培地を０．５〜１
ｍｌ添加し、３〜４日間、２６〜２６．５℃で培養を行
いＥ型肝炎ウイルス構造蛋白質（ＯＲＦ２）の発現を行
った。

【００６８】発現蛋白質は、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥを
用いて電気泳動後、クマシーブルーで染色後目的とする
蛋白質の分子量及び発現蛋白質量を観察した。その結
果、発現蛋白質は予想される分子量を持つ蛋白質である
ことが確認された。

【００６９】抗原性の確認は、実験的にＥ型肝炎ウイル
スを感染させたカニクイザルの回復期血清並びにＥ型肝
炎患者血清を用いたウエスタンブロッティング及び蛍光
抗体法で行った。その結果、発現蛋白質と特異的に反応
するバンドの存在と蛍光発色が確認され、発現蛋白質が
Ｅ型肝炎ウイルス構造蛋白質である事を確認した。精製
ウイルス様中空化粒子をＥ型肝炎回復機期患者血清と混
合し、３７℃で一時間反応後、ベックマンＳＷ５０．１
ローターで１００，０００ｘｇ、３時間遠心し、沈査
を４％Ｕｒａｎｉｃａｃｅｔａｔｅによる陰性染色
後、電子顕微鏡で検鏡してウイルス凝集像を確認した。
尚、倍率は約５０，０００倍で検鏡した。その結果、約
２５ｎｍの中空円型のウイルス様粒子構造物であるいわ
ゆる”Ｅｍｐｔｙｐａｒｔｉｃｌｅ ”の凝集像を確
認した。

【００７０】（４）Ｅ型肝炎ウイルス発現蛋白質の精製
と電子顕微鏡を用いたＥｍｐｔｙｐａｒｔｉｃｌｅの
確認昆虫細胞Ｔｎ５細胞を用いて、表面積１５０ｃｍ² のプ
ラスティック製細胞培養用ボトル５〜６本を用いて、大
量にＥ型肝炎ウイルス構造蛋白質（ＯＲＦ２）を発現さ
せ精製に供試した。Ｔｎ５ｃｅｌｌ培養上清を１，０
００ｘｇで１０分間遠心沈殿させて夾雑物を除き、更
に、１０，０００ｘｇで３０分間遠心してバキュロウイ
ルスを除外した。１０％蔗糖を含むリン酸緩衝液（ｐＨ
７．２）１０ｍｌに重層してベックマンＳＷ２８ロータ
ーで１００，０００ｘｇ３時間遠心し、ウイルス様中
空化粒子抗原を沈査として回収した。１ｍｌのリン酸緩
衝液（ｐＨ７．２）に懸濁してそれぞれ２ｍｌの２０％
及び１０％蔗糖液を重層したものにさらに、重層し、ベ
ックマンＳＷ５０．１ローターで１００，０００ｘｇ、
３時間遠心してウイルス様中空化粒子を２０％と１０％
蔗糖液の中間に回収した。さらに、乳白色のバンドを回
収しリン酸緩衝液で５倍希釈し、ベックマンＳＷ５０．
１ローターで１００，０００ｘｇ、３時間遠心沈殿を行
い、ウイルス様中空化粒子（Ｅｍｐｔｙｐａｒｔｉｃ
ｌｅ）抗原を回収し図中に示した様に電子顕微鏡下に確
認した。

【００７１】実施例３バキュロウイルス発現Ｅ型肝炎ウイルス中空化粒子抗原
を用いた抗Ｅ型肝炎ウイルス抗体の作製（１）１ｍｇの精製中空化粒子抗原を含む１ｍｌのリン
酸緩衝液（ｐＨ７．２）と１ｍｌのＦｒｅｕｎｄｉｎ
ｃｏｍｐｌｅｔｅアジュバントを混合し、２ＫｇのＮｅ
ｗＺｅａｌａｎｄＷｈｉｔｅウサギに皮下注射した。

【００７２】（２）一ヶ月後に０．５ｍｇの中空化粒子
抗原を含むリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）０．５ｍｌとＦ
ｒｅｕｎｄｉｎｃｏｍｐｌｅｔｅアジュバント０．
５ｍｌを混合して皮下に一回目の注射をした。更に、一
週間後に、同様にして同じく皮下に二回目の注射を行っ
た。この５日後に全採血し、血清成分を分離した。

【００７３】（３）分離精製した血清は、バキュロウイ
ルス発現抗原（Ｅｍｐｔｙｐａｒｔｉｃｌｅ）を固相
した平底ポリスチレンプレートを用いてＥＬＩＳＡでボ
ックスタイトレーションを行い抗体力価を決定した。

【００７４】実施例４バキュロウイルス発現蛋白質（Ｅｍｐｔｙｐａｒｔｉ
ｃｌｅ）を用いた抗ＨＥＶＩｇＧ特異抗体の検出（１）バキュロウイルス発現蛋白質（Ｅｍｐｔｙｐａ
ｒｔｉｃｌｅ）固相プレートの作製実施例２−（３）に記載のバキュロウイルス発現蛋白質
（Ｅｍｐｔｙｐａｒｔｉｃｌｅ）を５０ｍＭ炭酸バ
ッファー（ｐＨ９．５）で各々０．１〜１０μｇ／ｍｌ
濃度に希釈し、ポリスチレン平型マイクロプレート（ダ
イナテック社製）に１００μｇ／ウエルで分注し、４℃
で１晩静置した。次にマイクロプレートを最終濃度０．
０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ２００μｌ／ウ
エルで３〜４回洗浄後、最終濃度０．０５％牛血清アル
ブミン（ＢＳＡ）と０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む１
０ｍＭＰＢＳ２００μｌ／ウエルを加えて４℃で一
晩静置し、バキュロウイルス発現抗原（Ｅｍｐｔｙｐ
ａｒｔｉｃｌｅ）固相マイクロプレートを作製した。

【００７５】（２）Ｅ型肝炎患者血清検体を用いた抗
ＨＥＶＩｇＧ抗体の検出前述のバキュロウイルス発現抗原（Ｅｍｐｔｙｐａｒ
ｔｉｃｌｅ）固相マイクロプレート中のプレート保存液
を除外し６回洗浄後、Ｅ型肝炎患者血清を０．５％ＢＳ
Ａと０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む１０ｍＭＰＢＳ
（ｐＨ７．２）で１００倍に希釈し、その１００μｌを
抗原固相マイクロプレートのウエルに加え、３７℃で一
時間反応させた。反応後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を
含む５ｍＭＰＢＳ２００μｌ／ウエルで６回洗浄し
た。ついで、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む５ｍＭ
ＰＢＳで約２０，０００〜４０，０００倍に希釈した抗
ヒトＩｇＧヤギパーオキシターゼ標識抗体（ＭＢＬ）を
１００μｌ／ウエル加え、３７℃で一時間反応させた。
反応後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む５ｍＭＰＢＳ
２００μｌ／ウエルで６回洗浄した。洗浄後、３．３
ｍｇ／ｍｌのＯ−フェニレンジアミンを含む、０．１Ｍ
クエン酸−リン酸緩衝液（ｐＨ５．０）に、０．０２
％過酸化水素を加えた基質を１００μｌ／ウエル加えて
室温で約３０分間反応させた。反応後、１．５Ｎ硫酸を
１００μｌ／ウエル加えて反応を停止させ、マイクロプ
レート用比色計を用いて、波長４９２ｎｍで各ウエルの
Ｏ．Ｄ．値を測定した。（表３）。

【００７６】

【表３】＊ＯＲＦ２全長発現蛋白質によるウエスタンブロッティング

【００７７】この結果より、Ｅ型肝炎ウイルスの０ＲＦ
２の全長を発現させた抗原とＥ型肝炎ウイルス中空化粒
子抗原を用いたＩｇＧ抗体検出ウエスタンブロッティン
グの成績を比較したところ陽性一致率及び陰性一致率共
に１００％の結果であった。以上の結果より、バキュロ
ウイルス発現蛋白質Ｅｍｐｔｙｐａｒｔｉｃｌｅを用
いた抗ＨＥＶ−ＩｇＧ特異抗体検出に於いて検出感度及
び特異性共に文献上の他のアッセイとの比較よりも高い
ことから今回発現させた中空化粒子抗原の有効性が示唆
される結果となった。

【００７８】実施例５バキュロウイルス発現蛋白質（Ｅｍｐｔｙｐａｒｔｉ
ｃｌｅ）を用いた抗Ｅ型肝炎ウイルスＩｇＭ特異抗体の
検出（１）抗バキュロウイルス発現蛋白質Ｅｍｐｔｙｐａ
ｒｔｉｃｌｅ抗体に対するパーオキシダーゼ標識実施例２−（３）記載のバキュロウイルス発現蛋白質Ｅ
ｍｐｔｙｐａｒｔｉｃｌｅの１０〜５００μｇ／ｍｌ
を１ｍｌとフロイントの完全アジュバント（Ｄｉｆｃｏ
社製）１ｍｌを等量混合し、エマルジョンを作製して、
モルモットに免疫した。次いで不完全アジュバント（Ｄ
ｉｆｃｏ社製）１ｍｌを前術の抗原溶液と等量混合しエ
マルジョンを作製して２回追加免疫した。追加免疫した
後、モルモットを全採血した。その血液から血清成分を
分離し、硫安分画後、５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ
７．６）で４℃、一晩透析した。次ぎに５０ｍＭＴｒｉ
ｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）で平衡化した。ＤＥＡＥセ
ファロースクロマトグラフィーにかけ、ＵＶ波長２８０
ｎｍでモニタリングし、Ｏ．Ｄ．のピークを集めてＤＥ
ＡＥ精製ＩｇＧ画分とした。

【００７９】このＩｇＧ抗体画分を過ヨーソ酸改良法
〔酵素免疫測定法，２：９１（１９８２）〕でパーオ
キシダーゼ標識した。即ちパーオキシターゼ４ｍｇ／ｍ
ｌになる様に蒸留水で溶解した。ついで、０．１Ｍ過ヨ
ーソ酸ナトリウム０．２ｍｌを加え、室温で約２０分間
反応させ、１ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．０）
で一晩透析した。透析後、０．２Ｍ炭酸ナトリウム緩衝
液（ｐＨ９．５）を０．０２ｍｌ加え、ｐＨ９〜９．５
にすると同時に前述したＩｇＧ抗体を８ｍｇ加えた。

【００８０】室温で２時間反応させ、４ｍｇ／ｍｌ水酸
化ホウ素ナトリウムを０．１ｍｌ加え、４℃で２時間反
応させた反応後、１０ｍＭリン酸バッファーを用いてセ
ファクリルＳ−２００によるゲル濾過を行い、ＵＶ波長
２８０ｎｍでモニタリングしてパーオキシダーゼ標識抗
体画分を集めた。

【００８１】（２）Ｅ型肝炎患者血清を用いた抗Ｅ型肝
炎ウイルスＩｇＭ特異抗体の検出抗ヒトＩｇＭモノクロナール抗体（ＭＩＬＳ社製）を５
０ｍＭ炭酸バッファー（ｐＨ９．５）で５００〜１００
０倍に希釈し、ダイナテック社製ポリスチレン平型分割
マイクロプレート（高結合タイプ）に１００μｌ／ウエ
ル分注し、４℃、１８時間以上静置した。静置後、マイ
クロプレートを０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む５ｍ
ＭＰＢＳ２００μｌ／ウエルで３〜４回洗浄後、
０．５％ＢＳＡと０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む５ｍ
ＭＰＢＳ２００μｌ／ウエル加えて４℃、一晩静置
後、抗ヒトＩｇＭモノクロナール抗体固相マイクロプレ
ートを用いて、抗Ｅ型肝炎ウイルスＩｇＭ特異抗体検出
試薬を試作した。

【００８２】次に、抗Ｅ型肝炎ウイルスＩｇＭ特異抗体
検出試薬のプレート中の保存液を除外した。ついで、Ｅ
型肝炎患者血清を０．２％ＢＳＡと０．０５％Ｔｗｅｅ
ｎ２０を含む１０ｍＭＰＢＳで２００倍に希釈し、
前述の抗ヒトＩｇＭモノクローナル抗体固相マイクロプ
レートに１００μｌ／ウエルに加え、室温で約１時間反
応させた。反応後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む５
ｍＭＰＢＳで０．０５〜５．０μｇ／ｍｌ濃度に希釈
し、それを１００μｌ／ウエル加え、室温で約１時間反
応させた。反応後、０．０５％ｔｗｅｅｎ２０を含む５
ｍＭＰＢＳ２００μｌ／ウエルで３〜４回洗浄した。
０．５％ＢＳＡと０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む５ｍ
ＭＰＢＳで２０００〜２００００倍に希釈した前述、
実施例２−（３）のバキュロウイルス発現蛋白質Ｅｍｐ
ｔｙｐａｒｔｉｃｌｅに対するパーオキシターゼ標識
モルモット抗体を１００μｌ／ウエル加え、室温で約１
時間反応させた。反応後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を
含む５ｍＭＰＢＳ２００μｌ／ウエルで３〜４回洗浄
した。洗浄後、３．３ｍｇ／ｍｌ０−フェニレンジア
ミンを含む０．１Ｍクエン酸−リン酸緩衝液（ｐＨ５．
０）に、最終濃度０．０２％の過酸化水素水を加えた基
質液を１００μｌ／ウエル加えて室温で約３０分間反応
させた。反応後、１．５Ｎ硫酸を１００ μｌ／ウエル
加えて反応を停止させ、マイクロプレート用比色計で波
長４９２ｎｍを用いて各ウエルのＯ．Ｄ．値を測定し
た。（表４）

【００８３】

【表４】＊ＯＲＦ２全長発現蛋白質によるウエスタンブロッティング

【００８４】この結果より、Ｅ型肝炎ウイルスＯＲＦ
２の全長とＥ型肝炎ウイルス中空化粒子抗原をもちいた
抗ＨＥＶ−ＩｇＭ特異抗体検出のウエスタンブロッティ
ングの成績を比較したところ、陽性一致率及び陰性一致
率ともに１００％であった。

【００８５】以上の結果より、バキュロウイルス発現蛋
白質（Ｅｍｐｔｙｐａｒｔｉｃｌｅ）を用いた抗ＨＥ
Ｖ−ＩｇＭ特異抗体の検出には、検出感度及び特異性共
に、文献等に示されているよりも、高いため、これらの
中空化粒子抗原の有効性が示唆された。

【００８６】実施例６Ｅ型肝炎ウイルス抗原の検出（１）Ｅ型肝炎ウイルス抗原に対する抗体固相マイクロ
プレートの作製実施例３記載の抗Ｅ型肝炎ウイルスウサギ抗体を５０ｍ
Ｍ炭酸バッファー（ｐＨ９．５）で０．１〜５．０μ
ｌ／ｍｌに希釈した。希釈後、ポリスチレン平型マイク
ロプレート（ダイナテック社製）に１００μｌ／ウエル
分注し、４℃で１８時間以上静置した。静置後、マイク
ロプレートを０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む５ｍＭ
ＰＢＳ２００μｌ／ウエルで３〜４回洗浄後、０．５
％ＢＳＡと０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む５ｍＭ
ＰＢＳを２００μｌ／ウエル加えて４℃一晩静置し、抗
体固相マイクロプレートを作製した。

【００８７】（２）Ｅ型肝炎患者便材料を用いたＥ型肝
炎ウイルス抗原の検出次に、抗体固相プレートを用いて、Ｅ型肝炎患者便材料
よりＥ型肝炎ウイルスの検出を行った。前記述の抗体固
相マイクロプレートウエル中のプレート保存液を除き、
ついで、Ｅ型肝炎患者便材料１０％ホモジネートを０．
２％ＢＳＡと０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含む１０ｍＭＰ
ＢＳで２００倍に希釈し、前記述の抗Ｅ型肝炎ウイルス
抗体固相マイクロプレートに１００μｌ／ウエル加え、
室温（１５〜２５℃）で約１時間反応させた。反応後、
０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む５ｍＭＰＢＳ２０
０μｌ／ウエルで６回洗浄した。

【００８８】０．０５％ＢＳＡと０．０５％Ｔｗｅｅｎ
２０を含む５ｍＭＰＢＳで２０００〜５０００倍に希釈
したＥ型肝炎ウイルス中空化粒子抗原に対するパーオキ
シダーゼ標識モルモット抗体を１００μｌ／ウエル加
え、室温で約一時間反応させた。反応後、０．０５％Ｔ
ｗｅｅｎ２０を含む５ｍＭＰＢＳ２００μｌ／ウエルで
６回洗浄した。

【００８９】洗浄後、３．３ｍｇ／ｍｌＯ−フェニレ
ンジアミンを含む０．１Ｍクエン酸−リン酸緩衝液（ｐ
Ｈ５．０）に、終濃度０．０２％の過酸化水素水を加
えた基質液を１００μｌ／ウエルを加えて、室温で約３
０分間反応させた。反応後、１．５Ｎ硫酸を１００μｌ
／ウエル加えて反応を停止させ、マイクロプレート用比
色計で波長４９２ｎｍを用いて各ウエルのＯ．Ｄ．値を
測定した。（表５）

【００９０】

【表５】表５Ｅ型肝炎患者便材料を用いたＥ型肝炎ウイルス抗
原に対する抗体固相マイクロプレートによるＥ型肝炎ウ
イルス抗原の検出

【００９１】この結果から、バキュロウイルス発現抗原
で免疫した抗Ｅ型肝炎ウイルス抗体を用いたＥ型肝炎ウ
イルス抗原検出系は有用である事が分かった。

【００９２】実施例７ＰＣＲ法によるＥ型肝炎ウイルス遺伝子の検出Ｅ型肝炎ウイルス感染患者血清中からＨＥＶＲＮＡを
ＲＮＡ抽出キットを用いて抽出した。

【００９３】次に抽出したＲＮＡを用いてｃＤＮＡ合成
キットにより、ｃＤＮＡを合成した。合成済みのｃＤＮ
ＡをＰＣＲｐｒｉｍｅｒを用いて遺伝子の増幅を試み
た。遺伝子増幅に際して選択した領域は、ＨＥＶＯＲ
Ｆ２の全領域をコードする１９８０ｂｐを含む領域であ
る。

【００９４】尚、以下にＥ型肝炎ウイルス遺伝子ＯＲＦ
２増幅用ＰＣＲプライマーの位置を示す。

【００９５】First PCR Primer HEV-D4 TGTAGAGAATGCTCAGCAAGGATAA (6391-6414) HEV-U4 TAACTCCCGAGTTTTACCCACCTT (7103-7126) Secondary PCR Primer HEV-D5 CTGCCGAGTATGACCAGTCCACTTA (6576-6600) HEX-U3 TTAAGGCGCTGAAGCTCAGCGA (7077-7098)

【００９６】

【表６】

【００９７】比較例１ＯＲＦ２全長の発現実施例１及び２と同様にして、ＯＲＦ２の全長を切り出
し、バキュロウイルスベクターに組込み、Ｔｎ５細胞で
発現させた。細胞内には全長と考えられる72 KDa及びcl
eavage productと思われる58 kDaと50 kDaのタンパク質
の産生が認められた。しかし、細胞培養上清中にはこれ
らのタンパク質の存在は認められなかった。また、細胞
ライセートについても電子顕微鏡で何度も観察したが粒
子は全く観察されなかった。さらに、培養上清について
ＰＥＧ濃縮を行なったり、超遠心方によって培養上清を
ペレットにしてこれらを同様に電子顕微鏡で観察したが
粒子は観察されなかった。これらの結果から、ＯＲＦ２
全長を発現させた場合にはウイルス粒子は形成されない
ものと考えられる。

【００９８】

【発明の効果】本発明により、ＨＥＶの中空粒子、それ
をコードするＤＮＡ及び該ＤＮＡを含み該ＤＮＡを宿主
細胞中で発現できる組換えベクターが初めて提供され
た。ＨＥＶの中空粒子はＨＥＶと抗原性が同一又は少な
くとも極めて近似していると考えられるので、ＨＥＶの
中空粒子を利用した免疫測定によりＨＥＶを従来よりも
正確に測定することが可能になる。また、本発明の中空
粒子により、安全なＨＥＶワクチンを開発することが可
能になった。さらに、本発明により、新規なＨＥＶ株の
ＤＮＡ及びそれを含む組換えベクターが初めて提供され
た。

【００９９】

【配列表】

配列番号 : 1 配列の長さ : 1647 配列の型 :核酸配列 GCG GTC GCT CCA GCC CAT GAC ACC CCG CCA GTG CCT GAT GTC GAC TCT 48 Ala Val Ala Pro Ala His Asp Thr Pro Pro Val Pro Asp Val Asp Ser 1 5 10 15 CGC GGC GCC ATC TTG CGC CGG CAG TAT AAT CTA TCA ACA TCT CCC CTC 96 Arg Gly Ala Ile Leu Arg Arg Gln Tyr Asn Leu Ser Thr Ser Pro Leu 20 25 30 ACC TCT TCC GTG GCC ACC GGC ACT AAC CTG GTT CTT TAT GCC GCC CCT 144 Thr Ser Ser Val Ala Thr Gly Thr Asn Leu Val Leu Tyr Ala Ala Pro 35 40 45 CTT AGT CCG CTC TTA CCT CTT CAG GAC GGC ACC AAT ACC CAT ATA ATG 192 Leu Ser Pro Leu Leu Pro Leu Gln Asp Gly Thr Asn Thr His Ile Met 50 55 60 GCC ACG GAA GCT TCT AAT TAT GCC CAG TAC CGG GTT GCC CGT GCC ACA 240 Ala Thr Glu Ala Ser Asn Tyr Ala Gln Tyr Arg Val Ala Arg Ala Thr 65 70 75 80 ATC CGT TAC CGC CCG CTG GTC CCC AAT GCT GTC GGC GGT TAT GCC ATC 288 Ile Arg Tyr Arg Pro Leu Val Pro Asn Ala Val Gly Gly Tyr Ala Ile 85 90 95 TCC ATC TCA TTC TGG CCA CAG ACC ACC ACC ACC CCG ACG TCC GTT GAT 336 Ser Ile Ser Phe Trp Pro Gln Thr Thr Thr Thr Pro Thr Ser Val Asp 100 105 110 ATG AAT TCA ATA ACC TCG ACG GAT GTT CGT ATT TTA GTC CAG CCC GGC 384 Met Asn Ser Ile Thr Ser Thr Asp Val Arg Ile Leu Val Gln Pro Gly 115 120 125 ATA GCC TCT GAG CTT GTG ATC CCA AGT GAG CGC CTA CAC TAT CGT AAC 432 Ile Ala Ser Glu Leu Val Ile Pro Ser Glu Arg Leu His Tyr Arg Asn 130 135 140 CAA GGC TGG CGC TCC GTC GAG ACC TCT GGG GTG GCT GAG GAG GAG GCT 480 Gln Gly Trp Arg Ser Val Glu Thr Ser Gly Val Ala Glu Glu Glu Ala 145 150 155 160 ACC TCT GGT CTT GTT ATG CTT TGC ATA CAT GGC TCA CCC GTA AAT TCC 528 Thr Ser Gly Leu Val Met Leu Cys Ile His Gly Ser Pro Val Asn Ser 165 170 175 TAT ACT AAC ACA CCC TAT ACC GGT GCC CTC GGG CTG CTG GAC TTT GCC 576 Tyr Thr Asn Thr Pro Tyr Thr Gly Ala Leu Gly Leu Leu Asp Phe Ala 180 185 190 CTT GAG CTT GAG TTT CGC AAC CTT ACC CCC GGT AAC ACC AAT ACG CGG 624 Leu Glu Leu Glu Phe Arg Asn Leu Thr Pro Gly Asn Thr Asn Thr Arg 195 200 205 GTC TCC CGT TAT TCC AGC ACT GCT CGC CAC CGC CTT CGT CGC GGT GCG 672 Val Ser Arg Tyr Ser Ser Thr Ala Arg His Arg Leu Arg Arg Gly Ala 210 215 220 GAC GGG ACT GCC GAG CTC ACC ACC ACG GCC GCT ACC CGC TTT ATG AAG 720 Asp Gly Thr Ala Glu Leu Thr Thr Thr Ala Ala Thr Arg Phe Met Lys 225 230 235 240 GAC CTC TAT TTT ACT AGT ACT AAT GGT GTC GGT GAG ATC GGC CGC GGG 768 Asp Leu Tyr Phe Thr Ser Thr Asn Gly Val Gly Glu Ile Gly Arg Gly 245 250 255 ATA GCC CTC ACC CTG TTT AAC CTT GCT GAC ACT CTG CTT GGC GGC CTG 816 Ile Ala Leu Thr Leu Phe Asn Leu Ala Asp Thr Leu Leu Gly Gly Leu 260 265 270 CCG ACA GAA TTG ATT TCG TCG GCT GGT GGC CAG CTG TTC TAC TCC CGT 864 Pro Thr Glu Leu Ile Ser Ser Ala Gly Gly Gln Leu Phe Tyr Ser Arg 275 280 285 CCC GTT GTC TCG GCC AAT GGC GAG CCG ACT GTT AAG TTG TAT ACA TCT 912 Pro Val Val Ser Ala Asn Gly Glu Pro Thr Val Lys Leu Tyr Thr Ser 290 295 300 GTA GAG AAT GCT CAG CAG GAT AAG GGT ATT GCA ATC CCG CAT GAC ATT 960 Val Glu Asn Ala Gln Gln Asp Lys Gly Ile Ala Ile Pro His Asp Ile 305 310 315 320 GAC CTC GGA GAA TCT CGT GTG GTT ATT CAG GAT TAT GAC AAC CAA CAT 1008 Asp Leu Gly Glu Ser Arg Val Val Ile Gln Asp Tyr Asp Asn Gln His 325 330 335 GAA CAA GAT CGG CCG ACG CCT TCT CCA GCC CCA TCG CGC CCT TTC TCT 1056 Glu Gln Asp Arg Pro Thr Pro Ser Pro Ala Pro Ser Arg Pro Phe Ser 340 345 350 GTC CTT CGA GCT AAT GAT GTG CTT TGG CTC TCT CTC ACC GCT GCC GAG 1104 Val Leu Arg Ala Asn Asp Val Leu Trp Leu Ser Leu Thr Ala Ala Glu 355 360 365 TAT GAC CAG TCC ACT TAT GGC TCT TCG ACT GGC CCA GTT TAT GTT TCT 1152 Tyr Asp Gln Ser Thr Tyr Gly Ser Ser Thr Gly Pro Val Tyr Val Ser 370 375 380 GAC TCT GTG ACC TTG GTT AAT GTT GCG ACC GGC GCG CAG GCC GTT GCC 1200 Asp Ser Val Thr Leu Val Asn Val Ala Thr Gly Ala Gln Ala Val Ala 385 390 395 400 CGG TCG CTC GAT TGG ACC AAG GTC ACA CTT GAC GGT CGC CCC CTC TCC 1248 Arg Ser Leu Asp Trp Thr Lys Val Thr Leu Asp Gly Arg Pro Leu Ser 405 410 415 ACC ATC CAG CAG TAC TCG AAG ACC TTC TTT GTC CTG CCG CTC CGC GGT 1296 Thr Ile Gln Gln Tyr Ser Lys Thr Phe Phe Val Leu Pro Leu Arg Gly 420 425 430 AAG CTC TCT TTC TGG GAG GCA GGC ACA ACT AAA GCC GGG TAC CCT TAT 1344 Lys Leu Ser Phe Trp Glu Ala Gly Thr Thr Lys Ala Gly Tyr Pro Tyr 435 440 445 AAT TAT AAC ACC ACT GCT AGC GAC CAA CTG CTT GTC GAG AAT GCC GCC 1392 Asn Tyr Asn Thr Thr Ala Ser Asp Gln Leu Leu Val Glu Asn Ala Ala 450 455 460 GGG CAC CGG GTC GCT ATT TCC ACT TAC ACC ACT AGC CTG GGT GCT GGT 1440 Gly His Arg Val Ala Ile Ser Thr Tyr Thr Thr Ser Leu Gly Ala Gly 465 470 475 480 CCC GTC TCC ATC TCT GCG GTT GCT GTT TTA GCC CCC CAC TCT GCG CTA 1488 Pro Val Ser Ile Ser Ala Val Ala Val Leu Ala Pro His Ser Ala Leu 485 490 495 GCA TTG CTT GAG GAT ACC TTG GAC TAC CCT GCC CGC GCC CAT ACT TTT 1536 Ala Leu Leu Glu Asp Thr Leu Asp Tyr Pro Ala Arg Ala His Thr Phe 500 505 510 GAT GAT TTC TGC CCA GAG TGC CGC CCT CTT GGC CTC CAG GGC TGC GCT 1584 Asp Asp Phe Cys Pro Glu Cys Arg Pro Leu Gly Leu Gln Gly Cys Ala 515 520 525 TTC CAG TCT ACT GTC GCT GAG CTT CAG CGC CTT AAG ATG AAG GTG GGT 1632 Phe Gln Ser Thr Val Ala Glu Leu Gln Arg Leu Lys Met Lys Val Gly 530 535 540 AAA ACT CGG GAG TTA 1647 Lys Thr Arg Glu Leu 545

【０１００】配列番号 :２配列の長さ : 5082 配列の型 :核酸配列 ATG GAG GCC CAT CAG TTT ATT AAG GCT CCT GGC ATC ACT ACT GCT ATT 48 Met Glu Ala His Gln Phe Ile Lys Ala Pro Gly Ile Thr Thr Ala Ile 1 5 10 15 GAG CAG GCT GCT CTA GCG GCG GCC AAC TCT GCC CTG GCG AAT GCT GTG 96 Glu Gln Ala Ala Leu Ala Ala Ala Asn Ser Ala Leu Ala Asn Ala Val 20 25 30 GTA GTT AGG CCT TTT CTC TCT CAC CAG CAG ATT GAG ATC CTT ATT AAC 144 Val Val Arg Pro Phe Leu Ser His Gln Gln Ile Glu Ile Leu Ile Asn 35 40 45 CTA ATG CAA CCT CGC CAG CTT GTT TTC CGC CCC GAG GTT TTC TGG AAT 192 Leu Met Gln Pro Arg Gln Leu Val Phe Arg Pro Glu Val Phe Trp Asn 50 55 60 CAT CCC ATC CAG CGT GTC ATC CAT AAC GAG CTG GAG CTT TAC TGC CGC 240 His Pro Ile Gln Arg Val Ile His Asn Glu Leu Glu Leu Tyr Cys Arg 65 70 75 80 GCC CGC TCC GGC CGT TGT CTT GAA ATT GGC GCC CAT CCC CGC TCA ATA 288 Ala Arg Ser Gly Arg Cys Leu Glu Ile Gly Ala His Pro Arg Ser Ile 85 90 95 AAT GAT AAT CCT AAT GTG GTC CAC CGC TGC TTC CTC CGC CCT GTC GGG 336 Asn Asp Asn Pro Asn Val Val His Arg Cys Phe Leu Arg Pro Val Gly 100 105 110 CGT GAT GTT CAG CGC TGG TAT ACT GCT CCC ACT CGC GGG CCG GCT GCT 384 Arg Asp Val Gln Arg Trp Tyr Thr Ala Pro Thr Arg Gly Pro Ala Ala 115 120 125 AAT TGC CGG CGT TCC GCG CTG CGC GGG CTT CCC GCT GTT GAC CGC ACT 432 Asn Cys Arg Arg Ser Ala Leu Arg Gly Leu Pro Ala Val Asp Arg Thr 130 135 140 TAC TGC CTC GAC GGG TTT TCT GGC TGT AAC TTT CCC GCC GAA ACT GGC 480 Tyr Cys Leu Asp Gly Phe Ser Gly Cys Asn Phe Pro Ala Glu Thr Gly 145 150 155 160 ATC GCC CTC TAC TCC CTT CAT GAT ATG TCA CCA TCT GAT GTC GCC GAG 528 Ile Ala Leu Tyr Ser Leu His Asp Met Ser Pro Ser Asp Val Ala Glu 165 170 175 GCC ATG TTC CGC CAT GGT ATG ACG CGG CTC TAT GCT GCC CTC CAT CTT 576 Ala Met Phe Arg His Gly Met Thr Arg Leu Tyr Ala Ala Leu His Leu 180 185 190 CCG CCT GAG GTC TTG CTG CCT CCT GGC ACA TAT CGC ACC GCA TCG TAT 624 Pro Pro Glu Val Leu Leu Pro Pro Gly Thr Tyr Arg Thr Ala Ser Tyr 195 200 205 TTG CTG ATT CAT GAC GGT AGG CGC GTT GTG GTG ACG TAT GAG GGT GAT 672 Leu Leu Ile His Asp Gly Arg Arg Val Val Val Thr Tyr Glu Gly Asp 210 215 220 ACT AGT GCT GGT TAT AAC CAC GAC GTC TCC AAC TTG CGC TCC TGG ATT 720 Thr Ser Ala Gly Tyr Asn His Asp Val Ser Asn Leu Arg Ser Trp Ile 225 230 235 240 AGA ACC ACC AAG GTT ACC GGA GAC CAT CCC CTC GTT ATC GAG CGG GTT 768 Arg Thr Thr Lys Val Thr Gly Asp His Pro Leu Val Ile Glu Arg Val 245 250 255 AGG GCC ATT GGC TGC CAC TTT GTT CTC TTG CTC ACG GCA GCC CCG GAG 816 Arg Ala Ile Gly Cys His Phe Val Leu Leu Leu Thr Ala Ala Pro Glu 260 265 270 CCA TCA CCT ATG CCT TAT GTC CCT TAC CCC CGG TCT ACC GAG GTC TAT 864 Pro Ser Pro Met Pro Tyr Val Pro Tyr Pro Arg Ser Thr Glu Val Tyr 275 280 285 GTC CGA TCG ATC TTC GGC CCG GGT GGC ACC CCT TCC TTA TTC CCA ACC 912 Val Arg Ser Ile Phe Gly Pro Gly Gly Thr Pro Ser Leu Phe Pro Thr 290 295 300 TCA TGC TCC ACT AAG TCG ACC TTC CAT GCT GTC CCT GCC CAT ATT TGG 960 Ser Cys Ser Thr Lys Ser Thr Phe His Ala Val Pro Ala His Ile Trp 305 310 315 320 GAC CGT CTT ATG CTG TTC GGG GCC ACC TTG GAT GAC CAA GCC TTT TGC 1008 Asp Arg Leu Met Leu Phe Gly Ala Thr Leu Asp Asp Gln Ala Phe Cys 325 330 335 TGC TCC CGC TTA ATG ACC TAC CTT CGC GGC ATT AGC TAC AAG GTT ACT 1056 Cys Ser Arg Leu Met Thr Tyr Leu Arg Gly Ile Ser Tyr Lys Val Thr 340 345 350 GTT GGT ACC CTT GTG GCT AAT GAA GGC TGG AAT GCC TCT GAG GAC GCC 1104 Val Gly Thr Leu Val Ala Asn Glu Gly Trp Asn Ala Ser Glu Asp Ala 355 360 365 CTC ACA GCT GTC ATC ACT GCC GCT TAC CTT ACC ATT TGC CAC CAG CGG 1152 Leu Thr Ala Val Ile Thr Ala Ala Tyr Leu Thr Ile Cys His Gln Arg 370 375 380 TAT CTC CGC ACC CAG GCT ATA TCC AAG GGG ATG CGT CGT CTG GAA CGG 1200 Tyr Leu Arg Thr Gln Ala Ile Ser Lys Gly Met Arg Arg Leu Glu Arg 385 390 395 400 GAG CAT GCC CAG AAG TTT ATA ACA CCC CTC TAC AGC TGG CTC TTC GAG 1248 Glu His Ala Gln Lys Phe Ile Thr Pro Leu Tyr Ser Trp Leu Phe Glu 405 410 415 AAG TCC GGC CGT GAT TAC ATC CCT GGC CGC CAG TTG GAG TTC TAC GCC 1296 Lys Ser Gly Arg Asp Tyr Ile Pro Gly Arg Gln Leu Glu Phe Tyr Ala 420 425 430 CAG TGC AGG CGC TGG CTC TCC GCC GGC TTT CAT CTT GAT CCA CGG GTG 1344 Gln Cys Arg Arg Trp Leu Ser Ala Gly Phe His Leu Asp Pro Arg Val 435 440 445 TTG GTT TTT GAC GAG TCG GCC CCC TGC CGT TGT AGG ACC GCG ATC CGT 1392 Leu Val Phe Asp Glu Ser Ala Pro Cys Arg Cys Arg Thr Ala Ile Arg 450 455 460 AAG GCG CTC TCA AAG TTT TGC TGC TTC ATG AAG TGG CTT GGT CAG GAG 1440 Lys Ala Leu Ser Lys Phe Cys Cys Phe Met Lys Trp Leu Gly Gln Glu 465 470 475 480 TGC ACC TGT TTC CTC CAG CCT GCA GAA GGC GTC GTC GGC GAC CAG GGT 1488 Cys Thr Cys Phe Leu Gln Pro Ala Glu Gly Val Val Gly Asp Gln Gly 485 490 495 CAT GAT AAT GAA GCC TAT GAG GGG TCC GAT GTT GAC CCT GCT GAG TCT 1536 His Asp Asn Glu Ala Tyr Glu Gly Ser Asp Val Asp Pro Ala Glu Ser 500 505 510 GCC ATT AGT GAC ATA TCT GGG TCC TAT GTC GTC CCT GGC ACT GCC CTC 1584 Ala Ile Ser Asp Ile Ser Gly Ser Tyr Val Val Pro Gly Thr Ala Leu 515 520 525 CAG CCG CTC TAC CAG GCC CTC GAT CTC CCC GCT GAG ATT GTG GCT CGC 1632 Gln Pro Leu Tyr Gln Ala Leu Asp Leu Pro Ala Glu Ile Val Ala Arg 530 535 540 GCG GGT CGG CTG ACC GCC ACA GTA AAG GTC TCC CAG GTC GAT GGG CGG 1680 Ala Gly Arg Leu Thr Ala Thr Val Lys Val Ser Gln Val Asp Gly Arg 545 550 555 560 ATC GAC TGC GAG ACC CTT CTT GGT AAT AAA ACC TTT CGC ACG TCG TTC 1728 Ile Asp Cys Glu Thr Leu Leu Gly Asn Lys Thr Phe Arg Thr Ser Phe 565 570 575 GTT GAC GGG GCG GTC TTA GAG GCC AAT GGC CCA GAG CGC TAC AAT CTC 1776 Val Asp Gly Ala Val Leu Glu Ala Asn Gly Pro Glu Arg Tyr Asn Leu 580 585 590 TCC TTC GAT GCC AGT CAG AGC ACT ATG GCC GCT GGC CCT TTC AGT CCC 1824 Ser Phe Asp Ala Ser Gln Ser Thr Met Ala Ala Gly Pro Phe Ser Pro 595 600 605 ACC TAT GCC GCC TCT GCA GCT GGG CTG GAG GTA CGC TAT GTT GCT GCC 1872 Thr Tyr Ala Ala Ser Ala Ala Gly Leu Glu Val Arg Tyr Val Ala Ala 610 615 620 GGG CTT GAC CAT CGG GCG GTT TTT GCC CCC GGT GTT TCA CCC CGG TCA 1920 Gly Leu Asp His Arg Ala Val Phe Ala Pro Gly Val Ser Pro Arg Ser 625 630 635 640 GCC CCC GGC GAG GTT ACC GCC TTC TGC TCT GCC CTA TAC AGG TTC AAC 1968 Ala Pro Gly Glu Val Thr Ala Phe Cys Ser Ala Leu Tyr Arg Phe Asn 645 650 655 CGT GAG GCC CAG CGC CAT TCG CTG ACC GGT AAC TTA TGG TTC CAT CCT 2016 Arg Glu Ala Gln Arg His Ser Leu Thr Gly Asn Leu Trp Phe His Pro 660 665 670 GAG GGA CTC ATT GGC CTC TTC GCC CCG TTT TCG CCC GGG CAT GTT TGG 2064 Glu Gly Leu Ile Gly Leu Phe Ala Pro Phe Ser Pro Gly His Val Trp 675 680 685 GAG TCG GCT AAT CCA TTC TGT GGC GAG AGC ACA CTT TAC ACC CGT ACT 2112 Glu Ser Ala Asn Pro Phe Cys Gly Glu Ser Thr Leu Tyr Thr Arg Thr 690 695 700 TGG TCG GAG GTT GAT GCC GTC TCT AGT CCA GCC CGG CCT GAC TTA GGT 2160 Trp Ser Glu Val Asp Ala Val Ser Ser Pro Ala Arg Pro Asp Leu Gly 705 710 715 720 CTT ATG TCT GAG CCT TCT ATA CCT AGT AGG GCC GCC ACG CCT ACC CTG 2208 Leu Met Ser Glu Pro Ser Ile Pro Ser Arg Ala Ala Thr Pro Thr Leu 725 730 735 GCG GCC CCT CTA CCC CCC CTT GCA CCG GAC CCT CCC CCC CCT CCC TCT 2256 Ala Ala Pro Leu Pro Pro Leu Ala Pro Asp Pro Pro Pro Pro Pro Ser 740 745 750 GCC CCG GCG CTT GAT GAG CCG GCT TCT GGC GCT ACC GCC GGG GCC CCG 2304 Ala Pro Ala Leu Asp Glu Pro Ala Ser Gly Ala Thr Ala Gly Ala Pro 755 760 765 GCC ATA ACC CAC CAG ACG GCC CGG CAC CGC CGC CTG CTC TTC ACC TAC 2352 Ala Ile Thr His Gln Thr Ala Arg His Arg Arg Leu Leu Phe Thr Tyr 770 775 780 CCG GAT GGC TCT AAG GTA TTC GCC GGC TCG CTG TTC GAG TCC GCA TGC 2400 Pro Asp Gly Ser Lys Val Phe Ala Gly Ser Leu Phe Glu Ser Ala Cys 785 790 795 800 ACG TGG CTC GTT AAC GCG TCT AAT GTT GAC CAC CGC CCT GGT GGC GGG 2448 Thr Trp Leu Val Asn Ala Ser Asn Val Asp His Arg Pro Gly Gly Gly 805 810 815 CTC TGC CAT GCA TTT TAC CAA AGG TAC CCC GCC TCC TTT GAT GCT GCC 2496 Leu Cys His Ala Phe Tyr Gln Arg Tyr Pro Ala Ser Phe Asp Ala Ala 820 825 830 TCT TTT GTG ATG CGC GAC GGC GCG GCC GCG TAC ACA CTA ACC CCC CGG 2544 Ser Phe Val Met Arg Asp Gly Ala Ala Ala Tyr Thr Leu Thr Pro Arg 835 840 845 CCA ATA ATT CAC GCT GTC GCC CCT GAT TAT AGG TTG GAA CAT AAC CCA 2592 Pro Ile Ile His Ala Val Ala Pro Asp Tyr Arg Leu Glu His Asn Pro 850 855 860 AAG AGG CTT GAG GCT GCT TAT CGG GAA ACT TGC TCC CGC CTC GGC ACC 2640 Lys Arg Leu Glu Ala Ala Tyr Arg Glu Thr Cys Ser Arg Leu Gly Thr 865 870 875 880 GCT GCA TAC CCG CTC CTC GGG ACC GGC ATA TAC CAG GTG CCG ATC GGC 2688 Ala Ala Tyr Pro Leu Leu Gly Thr Gly Ile Tyr Gln Val Pro Ile Gly 885 890 895 CCC AGT TTT GAC GCC TGG GAG CGG AAC CAC CGC CCC GGG GAT GAG TTG 2736 Pro Ser Phe Asp Ala Trp Glu Arg Asn His Arg Pro Gly Asp Glu Leu 900 905 910 TAC CTT CCT GAG CTT GCT GCC AGA TGG TTT GAG GCC AAT AGG CCG ACC 2784 Tyr Leu Pro Glu Leu Ala Ala Arg Trp Phe Glu Ala Asn Arg Pro Thr 915 920 925 CGC CCG ACT CTC ACT ATA ACT GAG GAT GTT GCA CGG ACA GCG AAT CTG 2832 Arg Pro Thr Leu Thr Ile Thr Glu Asp Val Ala Arg Thr Ala Asn Leu 930 935 940 GCC ATC GAG CTT GAC TCT GCC ACA GAT GTC GGC CGG GCC TGC GCC GGC 2880 Ala Ile Glu Leu Asp Ser Ala Thr Asp Val Gly Arg Ala Cys Ala Gly 945 950 955 960 TGT CGG GTC ACC CCC GGC GTT GTT CAG TAC CAG TTT ACT GCA GGT GTG 2928 Cys Arg Val Thr Pro Gly Val Val Gln Tyr Gln Phe Thr Ala Gly Val 965 970 975 CCT GGA TCC GGC AAG TCC CGC TCT ATC ACC CAA GCC GAT GTG GAC GTT 2976 Pro Gly Ser Gly Lys Ser Arg Ser Ile Thr Gln Ala Asp Val Asp Val 980 985 990 GTC GTG GTC CCG ACG CGT GAG TTG CGT AAT GCC TGG CGC CGT CGC GGC 3024 Val Val Val Pro Thr Arg Glu Leu Arg Asn Ala Trp Arg Arg Arg Gly 995 1000 1005 TTT GCT GCT TTT ACC CCG CAT ACT GCC GCC AGA GTC ACC CAG GGG CGC 3072 Phe Ala Ala Phe Thr Pro His Thr Ala Ala Arg Val Thr Gln Gly Arg 1010 1015 1020 CGG GTT GTC ATT GAT GAG GCT CCA TCC CTC CCC CCT CAC CTG CTG CTG 3120 Arg Val Val Ile Asp Glu Ala Pro Ser Leu Pro Pro His Leu Leu Leu 1025 1030 1035 1040 CTC CAC ATG CAG CGG GCC GCC ACC GTC CAT CTT CTT GGC GAC CCA AAC 3168 Leu His Met Gln Arg Ala Ala Thr Val His Leu Leu Gly Asp Pro Asn 1045 1050 1055 CAG ATC CCA GCC ATC GAC TTT GAG CAC GCT GGG CTC GTA CCC GCC ATC 3216 Gln Ile Pro Ala Ile Asp Phe Glu His Ala Gly Leu Val Pro Ala Ile 1060 1065 1070 AGG CCC GAC CTA GCC CCC ACC TCC TGG TGG CAT GTT ACC CAT CGC TGC 3264 Arg Pro Asp Leu Ala Pro Thr Ser Trp Trp His Val Thr His Arg Cys 1075 1080 1085 CCA GCG GAT GTA TGT GAG CTC ATC CGT GGT GCA TAC CCC ATG ATC CAG 3312 Pro Ala Asp Val Cys Glu Leu Ile Arg Gly Ala Tyr Pro Met Ile Gln 1090 1095 1100 ACC ACT AGC CGG GTT CTC CGT TCG CTG TTC TGG GGT GAG CCT GCC GTC 3360 Thr Thr Ser Arg Val Leu Arg Ser Leu Phe Trp Gly Glu Pro Ala Val 1105 1110 1115 1120 GGG CAG AAA CTA GTG TTC ACC CAG GCG GCC AAG GCC GCC AAC CCC GGC 3408 Gly Gln Lys Leu Val Phe Thr Gln Ala Ala Lys Ala Ala Asn Pro Gly 1125 1130 1135 TCA GTG ACG GTC CAC GAG GCG CAG GGC GCT ACC TAC ACG GAG ACC ACT 3456 Ser Val Thr Val His Glu Ala Gln Gly Ala Thr Tyr Thr Glu Thr Thr 1140 1145 1150 ATC ATT GCC ACA GCA GAT GCC CGG GGC CTT ATT CAG TCG TCT CGG GCT 3504 Ile Ile Ala Thr Ala Asp Ala Arg Gly Leu Ile Gln Ser Ser Arg Ala 1155 1160 1165 CAT GCC ATT GTT GCT CTG ACG CGC CAC ACT GAG AAG TCG GTC ATC ATT 3552 His Ala Ile Val Ala Leu Thr Arg His Thr Glu Lys Ser Val Ile Ile 1170 1175 1180 GAC GCA TCA GGC CTG CTT CGC GAG GTG GGC ATC TCC GAT GCA ATC GTT 3600 Asp Ala Ser Gly Leu Leu Arg Glu Val Gly Ile Ser Asp Ala Ile Val 1185 1190 1195 1200 AAT AAC TTT TTC CTC GCT GGT GGC GAA ATT GGT CAC CAG CGC CCA TCA 3648 Asn Asn Phe Phe Leu Ala Gly Gly Glu Ile Gly His Gln Arg Pro Ser 1205 1210 1215 GTT ATT CCC CGT GGC AAC CCT GAC GCC AAT GTT GAC ACC CTG GCT GCC 3696 Val Ile Pro Arg Gly Asn Pro Asp Ala Asn Val Asp Thr Leu Ala Ala 1220 1225 1230 TTC CCG CCG TCT TGC CAG ATT AGT GCC TTC CAT CAG TTG GCT GAG GAG 3744 Phe Pro Pro Ser Cys Gln Ile Ser Ala Phe His Gln Leu Ala Glu Glu 1235 1240 1245 CTT GGC CAC AGA CCT GCC CTT GTT GCA GCT GTT CTA CCA CCC TGC CCT 3792 Leu Gly His Arg Pro Ala Leu Val Ala Ala Val Leu Pro Pro Cys Pro 1250 1255 1260 GAG CTC GTA CAG GGC CTT CTC TAC CTG CCC CAG GAG CTC ACC GCC TGT 3840 Glu Leu Val Gln Gly Leu Leu Tyr Leu Pro Gln Glu Leu Thr Ala Cys 1265 1270 1275 1280 GAT AGT GTC GTA ACA TTT GAA TTA ACA GAC GTT GTG CAC TGC CGC ATG 3888 Asp Ser Val Val Thr Phe Glu Leu Thr Asp Val Val His Cys Arg Met 1285 1290 1295 GCC GCC CCG AAC CAG CGC AAG GCC GTG CTG TCC ACA CTT GTG GGC CGC 3936 Ala Ala Pro Asn Gln Arg Lys Ala Val Leu Ser Thr Leu Val Gly Arg 1300 1305 1310 TAC GGC CGT CGC ACA AAG CTC TAT AAT GCT TCC CAC TCT GAT GTC CGC 3984 Tyr Gly Arg Arg Thr Lys Leu Tyr Asn Ala Ser His Ser Asp Val Arg 1315 1320 1325 GAC TCT CTC GCC CGT TTT ATC CCG GCC ATT GGC CCC GTA CAG GTT ACA 4032 Asp Ser Leu Ala Arg Phe Ile Pro Ala Ile Gly Pro Val Gln Val Thr 1330 1335 1340 ACT TGC GAA CTG TAC GAG CTA GTG GAG GCC ATG GTC GAG AAG GGC CAG 4080 Thr Cys Glu Leu Tyr Glu Leu Val Glu Ala Met Val Glu Lys Gly Gln 1345 1350 1355 1360 GAT GGC TCC GCC GTC CTT GAG CTC GAT CTT TGC AAC CGT GAC GTG TCC 4128 Asp Gly Ser Ala Val Leu Glu Leu Asp Leu Cys Asn Arg Asp Val Ser 1365 1370 1375 AGG ATC ACC TTC TTC CAG AAA GAT TGT AAC AAG TTC ACC ACA GGT GAG 4176 Arg Ile Thr Phe Phe Gln Lys Asp Cys Asn Lys Phe Thr Thr Gly Glu 1380 1385 1390 ACC ATC GCC CAT GGT AAA GTG GGC CAG GGC ATC TCG GCC TGG AGC AAG 4224 Thr Ile Ala His Gly Lys Val Gly Gln Gly Ile Ser Ala Trp Ser Lys 1395 1400 1405 ACC TTC TGC GCC CTC TTT GGC CCT TGG TTT CGC GCT ATT GAG AAG GCT 4272 Thr Phe Cys Ala Leu Phe Gly Pro Trp Phe Arg Ala Ile Glu Lys Ala 1410 1415 1420 ATT CTG GCC CTG CTC CCT CAG GGT GTG TTT TAC GGT GAT GCC TTT GAT 4320 Ile Leu Ala Leu Leu Pro Gln Gly Val Phe Tyr Gly Asp Ala Phe Asp 1425 1430 1435 1440 GAC ACC GTC TTC TCG GCG GCT GTG GCC GCA GCA AAG GCA TCC ATG GTG 4368 Asp Thr Val Phe Ser Ala Ala Val Ala Ala Ala Lys Ala Ser Met Val 1445 1450 1455 TTT GAG AAT GAC TTT TCT GAG TTT GAC TCC ACC CAG AAT AAC TTT TCT 4416 Phe Glu Asn Asp Phe Ser Glu Phe Asp Ser Thr Gln Asn Asn Phe Ser 1460 1465 1470 CTG GGC CTA GAG TGT GCT ATT ATG GAG GAG TGT GGG ATG CCG CAG TGG 4464 Leu Gly Leu Glu Cys Ala Ile Met Glu Glu Cys Gly Met Pro Gln Trp 1475 1480 1485 CTC ATC CGC TTG TAT CAC CTT ATA AGG TCG GCG TGG ATC TTG CAG GCC 4512 Leu Ile Arg Leu Tyr His Leu Ile Arg Ser Ala Trp Ile Leu Gln Ala 1490 1495 1500 CCG AAG GAG TCT CTG CGA GGG TTT TGG AAG AAA CAC TCC GGT GAG CCC 4560 Pro Lys Glu Ser Leu Arg Gly Phe Trp Lys Lys His Ser Gly Glu Pro 1505 1510 1515 1520 GGC ACT CTT CTA TGG AAT ACT ATC TGG AAT ATG GCC GTT ATT ACC CAC 4608 Gly Thr Leu Leu Trp Asn Thr Ile Trp Asn Met Ala Val Ile Thr His 1525 1530 1535 TGT TAT GAC TTC CGC GAT TTG CAG GTG GCT GCC TTT AAA GGT GAT GAT 4656 Cys Tyr Asp Phe Arg Asp Leu Gln Val Ala Ala Phe Lys Gly Asp Asp 1540 1545 1550 TCG ATA GTG CTT TGC AGT GAG TAT CGT CAG AGT CCA GGA GCT GCT GTC 4704 Ser Ile Val Leu Cys Ser Glu Tyr Arg Gln Ser Pro Gly Ala Ala Val 1555 1560 1565 CTG ATC GCC GGC TGT GGC TTG AAG TTG AAG GTG GAT TTC CGC CCG ATC 4752 Leu Ile Ala Gly Cys Gly Leu Lys Leu Lys Val Asp Phe Arg Pro Ile 1570 1575 1580 GGT TTG TAT GCA GGT GTT GTG GTG GCC CCC GGC CTT GGC GCG CTC CCT 4800 Gly Leu Tyr Ala Gly Val Val Val Ala Pro Gly Leu Gly Ala Leu Pro 1585 1590 1595 1600 GAT GTT GTG CGC TTC GCC GGC CGG CTT ACC GAG AAG AAT TGG GGC CCT 4848 Asp Val Val Arg Phe Ala Gly Arg Leu Thr Glu Lys Asn Trp Gly Pro 1605 1610 1615 GGC CCT GAG CGG GCG GAC GAG CTC CGC CTC GCT GTT AGT GAT TTC CTC 4896 Gly Pro Glu Arg Ala Asp Glu Leu Arg Leu Ala Val Ser Asp Phe Leu 1620 1625 1630 CGC AAG CTC ACG AAT GTA GCT CAG ATG TGT GTG GAT GTT GTT TCC CGT 4944 Arg Lys Leu Thr Asn Val Ala Gln Met Cys Val Asp Val Val Ser Arg 1635 1640 1645 GTT TAT GGG GTT TCC CCT GGG CTT GTT CAT AAC CTG ATT GGT ATG CTA 4992 Val Tyr Gly Val Ser Pro Gly Leu Val His Asn Leu Ile Gly Met Leu 1650 1655 1660 CAG GCT GTT GCT GAT GGC AAG GCA CAT TTC ACT GAG TCA GTA AAA CCG 5040 Gln Ala Val Ala Asp Gly Lys Ala His Phe Thr Glu Ser Val Lys Pro 1665 1670 1675 1680 GTG CTC GAC TTG ACA AAT TCA ATC TTG TGT CGG GTG GAA TGA 5082 Val Leu Asp Leu Thr Asn Ser Ile Leu Cys Arg Val Glu 1685 1690

【０１０１】配列番号 :３配列の長さ : 1983 配列の型 :核酸配列 ATG CGC CCT CGG CCT ATT TTG TTG CTG CTC CTC ATG TTT TTG CCT ATG 48 Met Arg Pro Arg Pro Ile Leu Leu Leu Leu Leu Met Phe Leu Pro Met 1 5 10 15 TTG CCC GCG CCA CCG CCC GGT CAG CCG TCT GGC CGC CGT CGT GGG CGG 96 Leu Pro Ala Pro Pro Pro Gly Gln Pro Ser Gly Arg Arg Arg Gly Arg 20 25 30 CGC AGC GGC GGT TCC GGC GGT GGT TTC TGG GGT GAC CGG GTT GAT TCT 144 Arg Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Phe Trp Gly Asp Arg Val Asp Ser 35 40 45 CAG CCC TTC GCA ATC CCC TAT ATT CAT CCA ACC AAC CCC TTC GCC CCC 192 Gln Pro Phe Ala Ile Pro Tyr Ile His Pro Thr Asn Pro Phe Ala Pro 50 55 60 GAT GTC ACC GCT GCG GCC GGG GCT GGA CCT CGT GTT CGC CAA CCA GCC 240 Asp Val Thr Ala Ala Ala Gly Ala Gly Pro Arg Val Arg Gln Pro Ala 65 70 75 80 CGA CCA CTC GGC TCC GCT TGG CGT GAC CAG GCC CAG CGC CCC GCC GTT 288 Arg Pro Leu Gly Ser Ala Trp Arg Asp Gln Ala Gln Arg Pro Ala Val 85 90 95 GCC TCA CGT CGT AGA CCT ACC ACA GCT GGG GCC GCG CCG CTA ACC GCG 336 Ala Ser Arg Arg Arg Pro Thr Thr Ala Gly Ala Ala Pro Leu Thr Ala 100 105 110 GTC GCT CCA GCC CAT GAC ACC CCG CCA GTG CCT GAT GTC GAC TCT CGC 384 Val Ala Pro Ala His Asp Thr Pro Pro Val Pro Asp Val Asp Ser Arg 115 120 125 GGC GCC ATC TTG CGC CGG CAG TAT AAT CTA TCA ACA TCT CCC CTC ACC 432 Gly Ala Ile Leu Arg Arg Gln Tyr Asn Leu Ser Thr Ser Pro Leu Thr 130 135 140 TCT TCC GTG GCC ACC GGC ACT AAC CTG GTT CTT TAT GCC GCC CCT CTT 480 Ser Ser Val Ala Thr Gly Thr Asn Leu Val Leu Tyr Ala Ala Pro Leu 145 150 155 160 AGT CCG CTC TTA CCT CTT CAG GAC GGC ACC AAT ACC CAT ATA ATG GCC 528 Ser Pro Leu Leu Pro Leu Gln Asp Gly Thr Asn Thr His Ile Met Ala 165 170 175 ACG GAA GCT TCT AAT TAT GCC CAG TAC CGG GTT GCC CGT GCC ACA ATC 576 Thr Glu Ala Ser Asn Tyr Ala Gln Tyr Arg Val Ala Arg Ala Thr Ile 180 185 190 CGT TAC CGC CCG CTG GTC CCC AAT GCT GTC GGC GGT TAT GCC ATC TCC 624 Arg Tyr Arg Pro Leu Val Pro Asn Ala Val Gly Gly Tyr Ala Ile Ser 195 200 205 ATC TCA TTC TGG CCA CAG ACC ACC ACC ACC CCG ACG TCC GTT GAT ATG 672 Ile Ser Phe Trp Pro Gln Thr Thr Thr Thr Pro Thr Ser Val Asp Met 210 215 220 AAT TCA ATA ACC TCG ACG GAT GTT CGT ATT TTA GTC CAG CCC GGC ATA 720 Asn Ser Ile Thr Ser Thr Asp Val Arg Ile Leu Val Gln Pro Gly Ile 225 230 235 240 GCC TCT GAG CTT GTG ATC CCA AGT GAG CGC CTA CAC TAT CGT AAC CAA 768 Ala Ser Glu Leu Val Ile Pro Ser Glu Arg Leu His Tyr Arg Asn Gln 245 250 255 GGC TGG CGC TCC GTC GAG ACC TCT GGG GTG GCT GAG GAG GAG GCT ACC 816 Gly Trp Arg Ser Val Glu Thr Ser Gly Val Ala Glu Glu Glu Ala Thr 260 265 270 TCT GGT CTT GTT ATG CTT TGC ATA CAT GGC TCA CCC GTA AAT TCC TAT 864 Ser Gly Leu Val Met Leu Cys Ile His Gly Ser Pro Val Asn Ser Tyr 275 280 285 ACT AAC ACA CCC TAT ACC GGT GCC CTC GGG CTG CTG GAC TTT GCC CTT 912 Thr Asn Thr Pro Tyr Thr Gly Ala Leu Gly Leu Leu Asp Phe Ala Leu 290 295 300 GAG CTT GAG TTT CGC AAC CTT ACC CCC GGT AAC ACC AAT ACG CGG GTC 960 Glu Leu Glu Phe Arg Asn Leu Thr Pro Gly Asn Thr Asn Thr Arg Val 305 310 315 320 TCC CGT TAT TCC AGC ACT GCT CGC CAC CGC CTT CGT CGC GGT GCG GAC 1008 Ser Arg Tyr Ser Ser Thr Ala Arg His Arg Leu Arg Arg Gly Ala Asp 325 330 335 GGG ACT GCC GAG CTC ACC ACC ACG GCC GCT ACC CGC TTT ATG AAG GAC 1056 Gly Thr Ala Glu Leu Thr Thr Thr Ala Ala Thr Arg Phe Met Lys Asp 340 345 350 CTC TAT TTT ACT AGT ACT AAT GGT GTC GGT GAG ATC GGC CGC GGG ATA 1104 Leu Tyr Phe Thr Ser Thr Asn Gly Val Gly Glu Ile Gly Arg Gly Ile 355 360 365 GCC CTC ACC CTG TTT AAC CTT GCT GAC ACT CTG CTT GGC GGC CTG CCG 1152 Ala Leu Thr Leu Phe Asn Leu Ala Asp Thr Leu Leu Gly Gly Leu Pro 370 375 380 ACA GAA TTG ATT TCG TCG GCT GGT GGC CAG CTG TTC TAC TCC CGT CCC 1200 Thr Glu Leu Ile Ser Ser Ala Gly Gly Gln Leu Phe Tyr Ser Arg Pro 385 390 395 400 GTT GTC TCG GCC AAT GGC GAG CCG ACT GTT AAG TTG TAT ACA TCT GTA 1248 Val Val Ser Ala Asn Gly Glu Pro Thr Val Lys Leu Tyr Thr Ser Val 405 410 415 GAG AAT GCT CAG CAG GAT AAG GGT ATT GCA ATC CCG CAT GAC ATT GAC 1296 Glu Asn Ala Gln Gln Asp Lys Gly Ile Ala Ile Pro His Asp Ile Asp 420 425 430 CTC GGA GAA TCT CGT GTG GTT ATT CAG GAT TAT GAC AAC CAA CAT GAA 1344 Leu Gly Glu Ser Arg Val Val Ile Gln Asp Tyr Asp Asn Gln His Glu 435 440 445 CAA GAT CGG CCG ACG CCT TCT CCA GCC CCA TCG CGC CCT TTC TCT GTC 1392 Gln Asp Arg Pro Thr Pro Ser Pro Ala Pro Ser Arg Pro Phe Ser Val 450 455 460 CTT CGA GCT AAT GAT GTG CTT TGG CTC TCT CTC ACC GCT GCC GAG TAT 1440 Leu Arg Ala Asn Asp Val Leu Trp Leu Ser Leu Thr Ala Ala Glu Tyr 465 470 475 480 GAC CAG TCC ACT TAT GGC TCT TCG ACT GGC CCA GTT TAT GTT TCT GAC 1488 Asp Gln Ser Thr Tyr Gly Ser Ser Thr Gly Pro Val Tyr Val Ser Asp 485 490 495 TCT GTG ACC TTG GTT AAT GTT GCG ACC GGC GCG CAG GCC GTT GCC CGG 1536 Ser Val Thr Leu Val Asn Val Ala Thr Gly Ala Gln Ala Val Ala Arg 500 505 510 TCG CTC GAT TGG ACC AAG GTC ACA CTT GAC GGT CGC CCC CTC TCC ACC 1584 Ser Leu Asp Trp Thr Lys Val Thr Leu Asp Gly Arg Pro Leu Ser Thr 515 520 525 ATC CAG CAG TAC TCG AAG ACC TTC TTT GTC CTG CCG CTC CGC GGT AAG 1632 Ile Gln Gln Tyr Ser Lys Thr Phe Phe Val Leu Pro Leu Arg Gly Lys 530 535 540 CTC TCT TTC TGG GAG GCA GGC ACA ACT AAA GCC GGG TAC CCT TAT AAT 1680 Leu Ser Phe Trp Glu Ala Gly Thr Thr Lys Ala Gly Tyr Pro Tyr Asn 545 550 555 560 TAT AAC ACC ACT GCT AGC GAC CAA CTG CTT GTC GAG AAT GCC GCC GGG 1728 Tyr Asn Thr Thr Ala Ser Asp Gln Leu Leu Val Glu Asn Ala Ala Gly 565 570 575 CAC CGG GTC GCT ATT TCC ACT TAC ACC ACT AGC CTG GGT GCT GGT CCC 1776 His Arg Val Ala Ile Ser Thr Tyr Thr Thr Ser Leu Gly Ala Gly Pro 580 585 590 GTC TCC ATC TCT GCG GTT GCT GTT TTA GCC CCC CAC TCT GCG CTA GCA 1824 Val Ser Ile Ser Ala Val Ala Val Leu Ala Pro His Ser Ala Leu Ala 595 600 605 TTG CTT GAG GAT ACC TTG GAC TAC CCT GCC CGC GCC CAT ACT TTT GAT 1872 Leu Leu Glu Asp Thr Leu Asp Tyr Pro Ala Arg Ala His Thr Phe Asp 610 615 620 GAT TTC TGC CCA GAG TGC CGC CCT CTT GGC CTC CAG GGC TGC GCT TTC 1920 Asp Phe Cys Pro Glu Cys Arg Pro Leu Gly Leu Gln Gly Cys Ala Phe 625 630 635 640 CAG TCT ACT GTC GCT GAG CTT CAG CGC CTT AAG ATG AAG GTG GGT AAA 1968 Gln Ser Thr Val Ala Glu Leu Gln Arg Leu Lys Met Lys Val Gly Lys 645 650 655 ACT CGG GAG TTA TAG 1983 Thr Arg Glu Leu 660

【０１０２】配列番号 :４配列の長さ : 372 配列の型 :核酸配列 ATG AAT AAC ATG TCT TTT GCT GCG CCC ATG GGT TCG CGA CCA TGC GCC 48 Met Asn Asn Met Ser Phe Ala Ala Pro Met Gly Ser Arg Pro Cys Ala 1 5 10 15 CTC GGC CTA TTT TGT TGC TGC TCC TCA TGT TTT TGC CTA TGT TGC CCG 96 Leu Gly Leu Phe Cys Cys Cys Ser Ser Cys Phe Cys Leu Cys Cys Pro 20 25 30 CGC CAC CGC CCG GTC AGC CGT CTG GCC GCC GTC GTG GGC GGC GCA GCG 144 Arg His Arg Pro Val Ser Arg Leu Ala Ala Val Val Gly Gly Ala Ala 35 40 45 GCG GTT CCG GCG GTG GTT TCT GGG GTG ACC GGG TTG ATT CTC AGC CCT 192 Ala Val Pro Ala Val Val Ser Gly Val Thr Gly Leu Ile Leu Ser Pro 50 55 60 TCG CAA TCC CCT ATA TTC ATC CAA CCA ACC CCT TCG CCC CCG ATG TCA 240 Ser Gln Ser Pro Ile Phe Ile Gln Pro Thr Pro Ser Pro Pro Met Ser 65 70 75 80 CCG CTG CGG CCG GGG CTG GAC CTC GTG TTC GCC AAC CAG CCC GAC CAC 288 Pro Leu Arg Pro Gly Leu Asp Leu Val Phe Ala Asn Gln Pro Asp His 85 90 95 TCG GCT CCG CTT GGC GTG ACC AGG CCC AGC GCC CCG CCG TTG CCT CAC 336 Ser Ala Pro Leu Gly Val Thr Arg Pro Ser Ala Pro Pro Leu Pro His 100 105 110 GTC GTA GAC CTA CCA CAG CTG GGG CCG CGC CGC TAA 372 Val Val Asp Leu Pro Gln Leu Gly Pro Arg Arg 115 120

【０１０３】配列番号 :５配列の長さ : 7194 配列の型 :核酸配列 AGGCAGACCA CATATGTGGT CGATGCCATG GAGGCCCATC AGTTTATTAA GGCTCCTGGC 60 ATCACTACTG CTATTGAGCA GGCTGCTCTA GCGGCGGCCA ACTCTGCCCT GGCGAATGCT 120 GTGGTAGTTA GGCCTTTTCT CTCTCACCAG CAGATTGAGA TCCTTATTAA CCTAATGCAA 180 CCTCGCCAGC TTGTTTTCCG CCCCGAGGTT TTCTGGAATC ATCCCATCCA GCGTGTCATC 240 CATAACGAGC TGGAGCTTTA CTGCCGCGCC CGCTCCGGCC GTTGTCTTGA AATTGGCGCC 300 CATCCCCGCT CAATAAATGA TAATCCTAAT GTGGTCCACC GCTGCTTCCT CCGCCCTGTC 360 GGGCGTGATG TTCAGCGCTG GTATACTGCT CCCACTCGCG GGCCGGCTGC TAATTGCCGG 420 CGTTCCGCGC TGCGCGGGCT TCCCGCTGTT GACCGCACTT ACTGCCTCGA CGGGTTTTCT 480 GGCTGTAACT TTCCCGCCGA AACTGGCATC GCCCTCTACT CCCTTCATGA TATGTCACCA 540 TCTGATGTCG CCGAGGCCAT GTTCCGCCAT GGTATGACGC GGCTCTATGC TGCCCTCCAT 600 CTTCCGCCTG AGGTCTTGCT GCCTCCTGGC ACATATCGCA CCGCATCGTA TTTGCTGATT 660 CATGACGGTA GGCGCGTTGT GGTGACGTAT GAGGGTGATA CTAGTGCTGG TTATAACCAC 720 GACGTCTCCA ACTTGCGCTC CTGGATTAGA ACCACCAAGG TTACCGGAGA CCATCCCCTC 780 GTTATCGAGC GGGTTAGGGC CATTGGCTGC CACTTTGTTC TCTTGCTCAC GGCAGCCCCG 840 GAGCCATCAC CTATGCCTTA TGTCCCTTAC CCCCGGTCTA CCGAGGTCTA TGTCCGATCG 900 ATCTTCGGCC CGGGTGGCAC CCCTTCCTTA TTCCCAACCT CATGCTCCAC TAAGTCGACC 960 TTCCATGCTG TCCCTGCCCA TATTTGGGAC CGTCTTATGC TGTTCGGGGC CACCTTGGAT 1020 GACCAAGCCT TTTGCTGCTC CCGCTTAATG ACCTACCTTC GCGGCATTAG CTACAAGGTT 1080 ACTGTTGGTA CCCTTGTGGC TAATGAAGGC TGGAATGCCT CTGAGGACGC CCTCACAGCT 1140 GTCATCACTG CCGCTTACCT TACCATTTGC CACCAGCGGT ATCTCCGCAC CCAGGCTATA 1200 TCCAAGGGGA TGCGTCGTCT GGAACGGGAG CATGCCCAGA AGTTTATAAC ACCCCTCTAC 1260 AGCTGGCTCT TCGAGAAGTC CGGCCGTGAT TACATCCCTG GCCGCCAGTT GGAGTTCTAC 1320 GCCCAGTGCA GGCGCTGGCT CTCCGCCGGC TTTCATCTTG ATCCACGGGT GTTGGTTTTT 1380 GACGAGTCGG CCCCCTGCCG TTGTAGGACC GCGATCCGTA AGGCGCTCTC AAAGTTTTGC 1440 TGCTTCATGA AGTGGCTTGG TCAGGAGTGC ACCTGTTTCC TCCAGCCTGC AGAAGGCGTC 1500 GTCGGCGACC AGGGTCATGA TAATGAAGCC TATGAGGGGT CCGATGTTGA CCCTGCTGAG 1560 TCTGCCATTA GTGACATATC TGGGTCCTAT GTCGTCCCTG GCACTGCCCT CCAGCCGCTC 1620 TACCAGGCCC TCGATCTCCC CGCTGAGATT GTGGCTCGCG CGGGTCGGCT GACCGCCACA 1680 GTAAAGGTCT CCCAGGTCGA TGGGCGGATC GACTGCGAGA CCCTTCTTGG TAATAAAACC 1740 TTTCGCACGT CGTTCGTTGA CGGGGCGGTC TTAGAGGCCA ATGGCCCAGA GCGCTACAAT 1800 CTCTCCTTCG ATGCCAGTCA GAGCACTATG GCCGCTGGCC CTTTCAGTCC CACCTATGCC 1860 GCCTCTGCAG CTGGGCTGGA GGTACGCTAT GTTGCTGCCG GGCTTGACCA TCGGGCGGTT 1920 TTTGCCCCCG GTGTTTCACC CCGGTCAGCC CCCGGCGAGG TTACCGCCTT CTGCTCTGCC 1980 CTATACAGGT TCAACCGTGA GGCCCAGCGC CATTCGCTGA CCGGTAACTT ATGGTTCCAT 2040 CCTGAGGGAC TCATTGGCCT CTTCGCCCCG TTTTCGCCCG GGCATGTTTG GGAGTCGGCT 2100 AATCCATTCT GTGGCGAGAG CACACTTTAC ACCCGTACTT GGTCGGAGGT TGATGCCGTC 2160 TCTAGTCCAG CCCGGCCTGA CTTAGGTCTT ATGTCTGAGC CTTCTATACC TAGTAGGGCC 2220 GCCACGCCTA CCCTGGCGGC CCCTCTACCC CCCCTTGCAC CGGACCCTCC CCCCCCTCCC 2280 TCTGCCCCGG CGCTTGATGA GCCGGCTTCT GGCGCTACCG CCGGGGCCCC GGCCATAACC 2340 CACCAGACGG CCCGGCACCG CCGCCTGCTC TTCACCTACC CGGATGGCTC TAAGGTATTC 2400 GCCGGCTCGC TGTTCGAGTC CGCATGCACG TGGCTCGTTA ACGCGTCTAA TGTTGACCAC 2460 CGCCCTGGTG GCGGGCTCTG CCATGCATTT TACCAAAGGT ACCCCGCCTC CTTTGATGCT 2520 GCCTCTTTTG TGATGCGCGA CGGCGCGGCC GCGTACACAC TAACCCCCCG GCCAATAATT 2580 CACGCTGTCG CCCCTGATTA TAGGTTGGAA CATAACCCAA AGAGGCTTGA GGCTGCTTAT 2640 CGGGAAACTT GCTCCCGCCT CGGCACCGCT GCATACCCGC TCCTCGGGAC CGGCATATAC 2700 CAGGTGCCGA TCGGCCCCAG TTTTGACGCC TGGGAGCGGA ACCACCGCCC CGGGGATGAG 2760 TTGTACCTTC CTGAGCTTGC TGCCAGATGG TTTGAGGCCA ATAGGCCGAC CCGCCCGACT 2820 CTCACTATAA CTGAGGATGT TGCACGGACA GCGAATCTGG CCATCGAGCT TGACTCTGCC 2880 ACAGATGTCG GCCGGGCCTG CGCCGGCTGT CGGGTCACCC CCGGCGTTGT TCAGTACCAG 2940 TTTACTGCAG GTGTGCCTGG ATCCGGCAAG TCCCGCTCTA TCACCCAAGC CGATGTGGAC 3000 GTTGTCGTGG TCCCGACGCG TGAGTTGCGT AATGCCTGGC GCCGTCGCGG CTTTGCTGCT 3060 TTTACCCCGC ATACTGCCGC CAGAGTCACC CAGGGGCGCC GGGTTGTCAT TGATGAGGCT 3120 CCATCCCTCC CCCCTCACCT GCTGCTGCTC CACATGCAGC GGGCCGCCAC CGTCCATCTT 3180 CTTGGCGACC CAAACCAGAT CCCAGCCATC GACTTTGAGC ACGCTGGGCT CGTACCCGCC 3240 ATCAGGCCCG ACCTAGCCCC CACCTCCTGG TGGCATGTTA CCCATCGCTG CCCAGCGGAT 3300 GTATGTGAGC TCATCCGTGG TGCATACCCC ATGATCCAGA CCACTAGCCG GGTTCTCCGT 3360 TCGCTGTTCT GGGGTGAGCC TGCCGTCGGG CAGAAACTAG TGTTCACCCA GGCGGCCAAG 3420 GCCGCCAACC CCGGCTCAGT GACGGTCCAC GAGGCGCAGG GCGCTACCTA CACGGAGACC 3480 ACTATCATTG CCACAGCAGA TGCCCGGGGC CTTATTCAGT CGTCTCGGGC TCATGCCATT 3540 GTTGCTCTGA CGCGCCACAC TGAGAAGTCG GTCATCATTG ACGCATCAGG CCTGCTTCGC 3600 GAGGTGGGCA TCTCCGATGC AATCGTTAAT AACTTTTTCC TCGCTGGTGG CGAAATTGGT 3660 CACCAGCGCC CATCAGTTAT TCCCCGTGGC AACCCTGACG CCAATGTTGA CACCCTGGCT 3720 GCCTTCCCGC CGTCTTGCCA GATTAGTGCC TTCCATCAGT TGGCTGAGGA GCTTGGCCAC 3780 AGACCTGCCC TTGTTGCAGC TGTTCTACCA CCCTGCCCTG AGCTCGTACA GGGCCTTCTC 3840 TACCTGCCCC AGGAGCTCAC CGCCTGTGAT AGTGTCGTAA CATTTGAATT AACAGACGTT 3900 GTGCACTGCC GCATGGCCGC CCCGAACCAG CGCAAGGCCG TGCTGTCCAC ACTTGTGGGC 3960 CGCTACGGCC GTCGCACAAA GCTCTATAAT GCTTCCCACT CTGATGTCCG CGACTCTCTC 4020 GCCCGTTTTA TCCCGGCCAT TGGCCCCGTA CAGGTTACAA CTTGCGAACT GTACGAGCTA 4080 GTGGAGGCCA TGGTCGAGAA GGGCCAGGAT GGCTCCGCCG TCCTTGAGCT CGATCTTTGC 4140 AACCGTGACG TGTCCAGGAT CACCTTCTTC CAGAAAGATT GTAACAAGTT CACCACAGGT 4200 GAGACCATCG CCCATGGTAA AGTGGGCCAG GGCATCTCGG CCTGGAGCAA GACCTTCTGC 4260 GCCCTCTTTG GCCCTTGGTT TCGCGCTATT GAGAAGGCTA TTCTGGCCCT GCTCCCTCAG 4320 GGTGTGTTTT ACGGTGATGC CTTTGATGAC ACCGTCTTCT CGGCGGCTGT GGCCGCAGCA 4380 AAGGCATCCA TGGTGTTTGA GAATGACTTT TCTGAGTTTG ACTCCACCCA GAATAACTTT 4440 TCTCTGGGCC TAGAGTGTGC TATTATGGAG GAGTGTGGGA TGCCGCAGTG GCTCATCCGC 4500 TTGTATCACC TTATAAGGTC GGCGTGGATC TTGCAGGCCC CGAAGGAGTC TCTGCGAGGG 4560 TTTTGGAAGA AACACTCCGG TGAGCCCGGC ACTCTTCTAT GGAATACTAT CTGGAATATG 4620 GCCGTTATTA CCCACTGTTA TGACTTCCGC GATTTGCAGG TGGCTGCCTT TAAAGGTGAT 4680 GATTCGATAG TGCTTTGCAG TGAGTATCGT CAGAGTCCAG GAGCTGCTGT CCTGATCGCC 4740 GGCTGTGGCT TGAAGTTGAA GGTGGATTTC CGCCCGATCG GTTTGTATGC AGGTGTTGTG 4800 GTGGCCCCCG GCCTTGGCGC GCTCCCTGAT GTTGTGCGCT TCGCCGGCCG GCTTACCGAG 4860 AAGAATTGGG GCCCTGGCCC TGAGCGGGCG GACGAGCTCC GCCTCGCTGT TAGTGATTTC 4920 CTCCGCAAGC TCACGAATGT AGCTCAGATG TGTGTGGATG TTGTTTCCCG TGTTTATGGG 4980 GTTTCCCCTG GGCTTGTTCA TAACCTGATT GGTATGCTAC AGGCTGTTGC TGATGGCAAG 5040 GCACATTTCA CTGAGTCAGT AAAACCGGTG CTCGACTTGA CAAATTCAAT CTTGTGTCGG 5100 GTGGAATGAA TAACATGTCT TTTGCTGCGC CCATGGGTTC GCGACCATGC GCCCTCGGCC 5160 TATTTTGTTG CTGCTCCTCA TGTTTTTGCC TATGTTGCCC GCGCCACCGC CCGGTCAGCC 5220 GTCTGGCCGC CGTCGTGGGC GGCGCAGCGG CGGTTCCGGC GGTGGTTTCT GGGGTGACCG 5280 GGTTGATTCT CAGCCCTTCG CAATCCCCTA TATTCATCCA ACCAACCCCT TCGCCCCCGA 5340 TGTCACCGCT GCGGCCGGGG CTGGACCTCG TGTTCGCCAA CCAGCCCGAC CACTCGGCTC 5400 CGCTTGGCGT GACCAGGCCC AGCGCCCCGC CGTTGCCTCA CGTCGTAGAC CTACCACAGC 5460 TGGGGCCGCG CCGCTAACCG CGGTCGCTCC AGCCCATGAC ACCCCGCCAG TGCCTGATGT 5520 CGACTCTCGC GGCGCCATCT TGCGCCGGCA GTATAATCTA TCAACATCTC CCCTCACCTC 5580 TTCCGTGGCC ACCGGCACTA ACCTGGTTCT TTATGCCGCC CCTCTTAGTC CGCTCTTACC 5640 TCTTCAGGAC GGCACCAATA CCCATATAAT GGCCACGGAA GCTTCTAATT ATGCCCAGTA 5700 CCGGGTTGCC CGTGCCACAA TCCGTTACCG CCCGCTGGTC CCCAATGCTG TCGGCGGTTA 5760 TGCCATCTCC ATCTCATTCT GGCCACAGAC CACCACCACC CCGACGTCCG TTGATATGAA 5820 TTCAATAACC TCGACGGATG TTCGTATTTT AGTCCAGCCC GGCATAGCCT CTGAGCTTGT 5880 GATCCCAAGT GAGCGCCTAC ACTATCGTAA CCAAGGCTGG CGCTCCGTCG AGACCTCTGG 5940 GGTGGCTGAG GAGGAGGCTA CCTCTGGTCT TGTTATGCTT TGCATACATG GCTCACCCGT 6000 AAATTCCTAT ACTAACACAC CCTATACCGG TGCCCTCGGG CTGCTGGACT TTGCCCTTGA 6060 GCTTGAGTTT CGCAACCTTA CCCCCGGTAA CACCAATACG CGGGTCTCCC GTTATTCCAG 6120 CACTGCTCGC CACCGCCTTC GTCGCGGTGC GGACGGGACT GCCGAGCTCA CCACCACGGC 6180 CGCTACCCGC TTTATGAAGG ACCTCTATTT TACTAGTACT AATGGTGTCG GTGAGATCGG 6240 CCGCGGGATA GCCCTCACCC TGTTTAACCT TGCTGACACT CTGCTTGGCG GCCTGCCGAC 6300 AGAATTGATT TCGTCGGCTG GTGGCCAGCT GTTCTACTCC CGTCCCGTTG TCTCGGCCAA 6360 TGGCGAGCCG ACTGTTAAGT TGTATACATC TGTAGAGAAT GCTCAGCAGG ATAAGGGTAT 6420 TGCAATCCCG CATGACATTG ACCTCGGAGA ATCTCGTGTG GTTATTCAGG ATTATGACAA 6480 CCAACATGAA CAAGATCGGC CGACGCCTTC TCCAGCCCCA TCGCGCCCTT TCTCTGTCCT 6540 TCGAGCTAAT GATGTGCTTT GGCTCTCTCT CACCGCTGCC GAGTATGACC AGTCCACTTA 6600 TGGCTCTTCG ACTGGCCCAG TTTATGTTTC TGACTCTGTG ACCTTGGTTA ATGTTGCGAC 6660 CGGCGCGCAG GCCGTTGCCC GGTCGCTCGA TTGGACCAAG GTCACACTTG ACGGTCGCCC 6720 CCTCTCCACC ATCCAGCAGT ACTCGAAGAC CTTCTTTGTC CTGCCGCTCC GCGGTAAGCT 6780 CTCTTTCTGG GAGGCAGGCA CAACTAAAGC CGGGTACCCT TATAATTATA ACACCACTGC 6840 TAGCGACCAA CTGCTTGTCG AGAATGCCGC CGGGCACCGG GTCGCTATTT CCACTTACAC 6900 CACTAGCCTG GGTGCTGGTC CCGTCTCCAT CTCTGCGGTT GCTGTTTTAG CCCCCCACTC 6960 TGCGCTAGCA TTGCTTGAGG ATACCTTGGA CTACCCTGCC CGCGCCCATA CTTTTGATGA 7020 TTTCTGCCCA GAGTGCCGCC CTCTTGGCCT CCAGGGCTGC GCTTTCCAGT CTACTGTCGC 7080 TGAGCTTCAG CGCCTTAAGA TGAAGGTGGG TAAAACTCGG GAGTTATAGT TTATCTGCTT 7140 GTGCCCCCCT TCTTTCTGTT GCTTATTTCT TATTTCTGCG TTCCCGGCTC CCTG 7194

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者宮村達男東京都新宿区戸山一丁目23番１号国立予防衛生研究所内

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】配列表の配列番号１で示されるアミノ酸
配列を有するポリペプチド又は該アミノ酸配列と８０％
以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、Ｅ型肝炎ウ
イルスの抗原性を有するポリペプチドから成るＥ型肝炎
ウイルスの中空粒子。
【請求項２】配列表の配列番号１で示されるアミノ酸
配列を有するポリペプチドから成る請求項１記載の中空
粒子。
【請求項３】請求項１又は２記載の中空粒子をコード
するＤＮＡ。
【請求項４】配列表の配列番号１で示される塩基配列
を有する請求項３記載のＤＮＡ。
【請求項５】請求項３又は４記載のＤＮＡを含み、宿
主細胞中で該ＤＮＡを発現することができる組換えベク
ター。
【請求項６】前記ＤＮＡが、バキュロウイルス遺伝子
非必須領域内に挿入されて得られる組換えバキュロウイ
ルスベクターである請求項５記載の組換えベクター。
【請求項７】請求項５又は６記載の組換えベクターに
より形質転換され、前記中空粒子を産生することができ
る形質転換体。
【請求項８】前記組換えベクターが請求項６記載の組
換えベクターであり、前記形質転換体の宿主細胞が昆虫
細胞である請求項７記載の形質転換体。
【請求項９】昆虫細胞がＴｎ５細胞である請求項８記
載の形質転換体。
【請求項１０】配列表の配列番号２に示されるアミノ
酸配列を有するポリペプチド。
【請求項１１】配列表の配列番号２に示されるアミノ
酸配列をコードするＤＮＡ。
【請求項１２】配列表の配列番号２に示される塩基配
列のうち１ｎｔ〜５０７９ｎｔの領域を含むＤＮＡ。
【請求項１３】配列表の配列番号３に示されるアミノ
酸配列を有するポリペプチド。
【請求項１４】配列表の配列番号３に示されるアミノ
酸配列をコードするＤＮＡ。
【請求項１５】配列表の配列番号３に示される塩基配
列のうち１ｎｔ〜１９８０ｎｔの領域を含むＤＮＡ。
【請求項１６】配列表の配列番号４に示されるアミノ
酸配列を有するポリペプチド。
【請求項１７】配列表の配列番号４に示されるアミノ
酸配列をコードするＤＮＡ。
【請求項１８】配列表の配列番号４に示される塩基配
列のうち１ｎｔ〜３６９ｎｔの領域を含むＤＮＡ。
【請求項１９】請求項１１、１２、１４、１５、１７
又は１８記載のＤＮＡを含み、宿主細胞中で該ＤＮＡを
発現することができる組換えベクター。
【請求項２０】前記ＤＮＡが、バキュロウイルス遺伝
子非必須領域内に挿入されて得られる組換えバキュロウ
イルスベクターである請求項１９記載の組換えベクタ
ー。
【請求項２１】請求項１９又は２０記載の組換えベク
ターにより形質転換された形質転換体。
【請求項２２】前記組換えベクターが請求項２０記載
の組換えベクターであり、前記形質転換体の宿主細胞が
昆虫細胞である請求項２１記載の形質転換体。
【請求項２３】配列表の配列番号５に示される塩基配
列を有するＥ型肝炎ウイルス遺伝子。