KR20040041612A - 합성 씨형 간염 바이러스 엔벨롭 단백질 및 그 백신 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 세계 각처로부터 유래된 77개의 다른 HCV 1b 분리물(isolates)의 E2에서 발견되는 가장 보존된(conserved) 아미노산인 컨센서스(consensus) 서열을 포함하는 합성 E2 단백질의 아미노산 서열 및 그에 따른 핵산 서열에 관한 것이다. 또한 본 발명은 HVR1이 결여된 E2 단백질의 절단된 버젼에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 E2 단백질을 포함하는 백신에 관한 것이다.
Description
C형 간염 바이러스(HCV)는 플라비비리데속(Flaviviridae)에 속하는 것으로 분류되는 단일가닥 포지티브 RNA 바이러스이다(Bartenschlager and Lohmann, 2000 J. Gen. Virology; 81 Pt 7:1631-48). 그것의 게놈은 극도로 보존된 5' 비코딩 영역으로 구성되어 있는데, 상기 영역 다음에는 3010-3033개의 아미노산의 폴리프로테인(polyprotein) 전구체로 번역되는 약 10,000개의 뉴클레오티드의 단일 오픈 리딩 프레임이 존재한다. 숙주 및 HCV-코딩된 프로테아제를 통한 후속의 효소적 절단을 통해(Hijikata et al., 1991 PNAS USA 88, 5547-51; Lin et al, 1994 J. Virology 68, 5063-73; Lin et al., 1994 J. Virology 68, 8147-57 Grakoui et al, 1993 PNAS USA 90, 10583-7; Grakoui et al, 1993 J. Virology 67, 2832-43), 적어도 10개의 다른 폴리펩티드가 생산되는데, 이는 구조적 단백질과 비구조적 단백질로 나뉘는데, 상기 구조적 단백질은 코어 및 엔벨롭 단백질이며, 상기 비구조적 단백질은 헬리케이즈, 프로테아제, RNA-의존적 RNA 폴리머라제이다. 상기와 같은 것들이 HCV 비리온을 구성한다(Miyamura and Matsuura, 1993 Trends Microbiology 1(6): 229-31; Bartenschlager and Lohmann, 2000 J. Gen. Virology; 81 Pt 7:1631-48). HCV는 만성 간 질환, 때때로, 간세포 암종을 유발하는 가혹한 감염을 일으키는 능력이 있기 때문에, 주요한 공중 건강의 관심사이다(Hoofnagel, 1997 Hepatology 26 (3 Suppl 1): 15S-20S). 현재에는 항-바이러스 치료법이 불충분하기 때문에, 더 향상된 치료법과 효과적인 HCV 백신의 개발이 더욱 요구되고 있다(Rosen and Gretch, 1999 Mol Med Today 5(9): 393-9 참조).
HCV가, 유전자형 1-6으로부터 유래되는 적어도 여섯개의 다른 단백질의 패널로서 존재한다는 사실로 인해, HCV 백신을 포함하는 효과적인 항-HCV 약제의 개발이 좌절되고 있다(Simmonds et al, 1993 J. of Gen. Virology 74, 2391-9). 더 복잡해지기 위해서 HCV로 감염된 개체는 한 주요 유전자형으로부터 유래된 다른 HCV 유사종의 스펙트럼을 함유하는 것으로 보인다(Forns et al, 1999 Trends Microbiology 7(10): 402-10). 이러한 HCV의 고유한 과도한 돌연변이능력은 HCV RNA 폴리머라제의 낮은 충실도(fidelity)에 기인한다(NS5B; Bartenschlager and Lohmann, 2000 J. Gen. Virology; 81 Pt 7:1631-48). 결과적으로, 자연적으로 친수성이고 표면-발현되는 것으로 추정되는 특정 HCV 펩티드 모티프는, 면역원성이지만 극도로 돌연변이성이기 때문에, 면역의 감시망으로부터 벗어날 수 있다. 이러한 펩티드에 합치되는 한 모티프가 과변이성 영역 I (HVR 1)을 만들며, 엔벨롭 단백질 E2의 N' 말단에서 27개의 아미노산 스트레치를 구성한다. 상기 HVR1은 많은 T 및 B 세포 에피토프를 포함하고(Weiner et al, 1992 PNAS U S A 89(8): 3468-72; Scarselli et al, 1995 J Virology 69(7): 4407-12; Zibert et al, 1995 Virology 208, 653-61), 이 도메인에 대한 항체가, 인간의 섬유아세포에 HCV가 결합하고 감염되는 것을 저해하며(Zibert et al, 1995 Virology 208, 653-61; Shimizu et al, 1996 Virology 223(2): 409-12), 부분적으로 NOB(Neutralization of binding) 분석에서 MOLT-4 세포에 E2 CHO가 결합하는 것을 방해하고(Rosa et al, 1996 PNAS USA 93, 1759-63), 면역-침전 분석에서 HCV를 포획하며(Esumi et al, 1996 J Virol Methods 59(1-2): 91-8), 침팬지에서 HCV 감염성을 적어도 부분적으로는 개선시키는 것으로 나타났다(Farci et al, 1994 PNAS USA 91(16):7792-6; Farci et al, 1996 PNAS USA 93, 15394-9; Shimuzu et al, 1996 Virology 223(2): 409-12).
백신 후보로서 HVR1을 연구하는 데에 많은 노력이 기울여져 왔는데, 예컨대 고토 등(Goto et al.)(2001 Hepatology Research 19:270-283)은 합성 HVR1 펩티드로 침팬지를 면역화시켰으며 보호를 달성하였다. 카를로스 등(Carlos et al.,)(2000, Vaccine Weekly, July 20 p. 17)은 상기 바이러스의 과변이영역에서 일반적으로 발견되는 많은 돌연변이를 통합시킨 합성 구조체를 고안하였음을 보고하였다. 이 펩티드 구조체는 상기 바이러스의 HVR1 및 HVR2에서 발견되는 것들을 포함하였다.
또한 HCV 중화와 관련된 중요한 도메인은 HVR1의 외부에 존재하는 것으로 생각되어지는데, 그 이유는 E1/E2를 포함하는 보호성 백신이 HVR1에 대해 극도로 낮은 결합 역가를 갖는 고도면역 혈청을 생산하였기 때문이다(Choo et al., 1994 PNAS USA 90:1294-1298). 그러나, 추의 백신은 HCV의 상동적 균주에 대해서만 보호성이 있었다.
면역화를 위해 E2 단백질을 사용하려는 여러 시도가 있었다. 버크 등(Bukh et al)은 WO 200121807에서 HVR1이 없는 HCV 코딩 핵산 분자와 그것의 면역화 용도에 대해 개시하였다. 주첼리 등(Zucchelli et al.,)(2001 Hepatology 33: 692-703)은 강한 체액성 반응을 유도할 수 있었던 E2 단백질의 엑토도메인(ectodomain)에 융합된 특정 HVR1 펩티드 유사체(미모토프: mimotope)를 개시하고 있다.
따라서, E2 엔벨롭 단백질은 전반적으로 HCV 감염을 중화할 수 있는 가능한 표적 부위를 대표하는 것으로 보인다. 그러므로, 이종 기원의 HCV 서브타입들에 적합한, 치료적 백신 뿐만 아니라 예방적 백신으로서 적절한 E2 항체를 개발하는 것이 매우 중요하다.
본 발명은 간염 바이러스학 분야에 관한 것이다. 본 발명은 세계 각처로부터 유래된 77개의 다른 HCV 1b 분리물(isolates)의 E2에서 발견되는 가장 보존된(conserved) 아미노산인 컨센서스(consensus) 서열을 포함하는 합리적으로 고안된 합성 E2 단백질의 아미노산 서열에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, 본 발명은 합성 E2 단백질을 포함하는 백신에 관한 것이다.
도 1은 E2 다수, E2 다수 R9 및 E2 다수-w/o의 아미노산 서열이다. 추정된 글리코실레이션 부위가 밑줄쳐져 있다.
도 2는 다양한 E2 단백질에 대한 다른 HCV 혈청 유전자형의 반응성을 나타내는 웨스턴 블랏이다. 정제된 바큘로바이러스-생산된 HCV E2 단백질(제1 내지 4 레인), 포유동물인 챠이니즈 햄스터의 난소(CHO) 세포-생산된 E2 (제5레인), 및 비관련성 음성 대조군 단백질 씨오레독신 (제6레인)이 비환원 조건하에 SDS-PAGE 젤 상에 런닝되었고, HCV 유전자형 1a, 1b, 2a/2c, 3a, 4, 5 및 6을 대표하는 다른 인간의 혈청으로 프로빙되었다. 대조군은 하기를 포함하였다: 항-히스티딘 모노클로날 항체(α-His mAb), ABXTL68 인간 항-E2 mAb이 양성 대조군으로 사용되었고, 항-HCV 음성(αHCV-ve) 및 항-B형 간염 코어 포지티브 (αHBC +ve) 혈청이 음성 대조군으로서 포함되었다.
도 3은 다양한 E2 단백질에 대한 다른 HCV 혈청 유전자형의 반응성을 나타내는 웨스턴 블랏 사진이다. 정제된 바큘로바이러스-생산된 천연 E2 및 E2 다수 단백질(제1 및 제2레인), 비관련성 음성 대조군 단백질 씨오레독신(제3레인)이 비환원성 조건하에서 SDS-PAGE 상에 런닝되었고, HCV 유전자형 1b, 2a/2c, 3a 및 4를 대표하는 다른 인간의 혈청으로 프로빙되었다. ABXTL68 인간 항-E2 mAb가 양성 대조군으로 기능하였다.
도 4a 내지 도 4b는 다양한 E2 단백질을 갖는 나이브(naive) 마우스의 면역화에 의해 생산된 고도면역 혈청의 결합 특성을 나타내는 그래프이다. 도4a에서, 다양한 항원으로 코팅된 ELISA 플레이트를 이용하여 결합이 검사되었다. 각 박스는 코팅에 사용된 다른 항원을 나타낸다. 데이타는 혈청 희석의 함수로써 O.D. 측정값으로 표현된다. 도4b에서 결합은, 다양한 E2 제조물이 젤 상에서 런닝되고 다른 고도면역 혈청과 반응된 웨스턴 블랏을 이용하여 검사되었다.
도 5는 다양한 E2 제조물 및 씨오레독신 (이것은 음성 대조군으로 작용함)에 대한 마우스의 모노클로날 항체의 결합 특성을 나타낸다. mAb18을 천연 E2에 대해 발생시켰고, mAb21을 E2 다수 R9에 대해 발생시켰다. 결합은, 다양한 E2 제조물이 젤 상에 런닝되고 다른 모노클로날 항체와 반응된 웨스턴 블랏을 이용하여 검사되었다. 블랏 좌측의 숫자는 어림된 분자량을 kD로 나타낸 것이다.
도 6은 평균 바이러스 로드 및 이식후 19일째에 혈청 내에 양성 HCV RT-PCR 신호를 갖는 HCV-Trimera 마우스의 퍼센트(괄호안의 숫자)를 나타내는 그래프이다. 막대는 다른 실험 그룹: 이식된 간이 HCV 감염성 혈청 및 프리-면역 혈청(pre-immune serum)과 함께 미리 인큐베이션된(pre-incubated) 그룹(대조군); 및 이식된 간이 HCV 감염성 혈청 및 다양한 항 E2 IgG 제조물과 함께 미리 인큐베이션된 그룹을 나타낸다.
하기 실시예를 참조하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하나, 이는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명을 제한하고자 의도하는 것은 아니다.
발명의 개요
본 발명은 77개의 다른 HCV 1b 분리물의 E2에서 발견되는 가장 보존된 아미노산의 컨센서스 서열을 포함하는 합성 E2 단백질("E2 다수")의 아미노산 및 그에 따른 핵산 서열에 관한 것이다. 본 발명은 또한 HVR1이 결여된 절단 E2 단백질("E2 다수 w/o")의 아미노산 및 그에 따른 뉴클레오티드 서열에 관한 것이며, HVR1이 R9미모토프로 치환된 E2 다수 단백질(Puntoriero et al., The EMBO Journal Vol. 17, No. 13 pp 3521-3533, 1998)("E2 다수 R9")의 아미노산 및 그에 따른 뉴클레오티드 서열에 관한 것이다.
본 발명은 또한 상기 개시된 서열과 적어도 98%의 상동성을 갖는 본 발명의 E2 다수 단백질의 변이체들에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 여기에 개시된 서열로부터 유래된 단백질에 관한 것이다. 이러한 단백질은 본 발명의 E2 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 발현 벡터에 삽입하고 숙주 세포에서 재조합 단백질을 발현시키는 재조합 방법으로 생산될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기한 단백질을 백신으로 이용하는 것에 관한 것이다.
또한 본 발명은 본 발명의 E2 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 발현 벡터를 핵산 기초 백신으로서 이용하는 것에 관한 것이다.
본 발명은 또한 한 개체에서 C형 간염을 예방하거나 치료하기 위해 본 발명에 의한 단백질을 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 의한 단백질은 또한 생물학적 샘플에서 HCV에 특이적인 항체를 검출하는 데에 이용될 수 있다. 따라서 HCV 감염, 질병 진행 및 HCV 감염을 치료하는 동안 치료제의 효율을 인식 및 모니터링하는 진단 수단으로 이용될 수 있다.
또한, 본 발명은 생물학적 샘플에서 HCV에 특이적인 항체를 검출하는 키트에 관한 것이며, 상기 키트는 본 발명에 의한 정제 및 분리된 단백질을 필수적으로 포함한다.
또한, 본 발명은 본 발명에 의한 E2 단백질에 대한 항체에 관한 것이며, 그러한 항체를 수동적 면역치료법 또는 예방법에 사용하는 것에 관한 것이다.
본 발명은 합성적, 비-천연의 변성된 E2 단백질("E2 다수", "E2 다수 R9" 및 "E2 다수 w/o")이, 다양한 HCV 유전자형에 감염된 환자들로부터 얻어진 혈청 및 다양한 형태의 E2로 면역화된 마우스의 고도면역 혈청에 의해 인식된다고 하는 놀라운 발견에 관한 것이다. 또한 이러한 합성 단백질은 동물 모델에서 HCV 감염을 중화시킬 수 있는 강한 면역 반응을 도출시킬 수 있다. 이러한 결과는, 합성 E2 단백질의 고유한 구조가, 다양한 형태의 E2에 대한 면역 반응을 도출하기 때문에 백신의 이상적인 후보가 됨을 제시한다.
재료 및 방법
모든 통상의 재료는 시그마사(이스라엘)로부터 구입하였다. 포유동물의 E2(CHO)는 Austral Biologicals(CA)로부터 구입하였다.
하기 기재된 발현 및 정제의 모든 방법은 천연 E2 뿐만 아니라 본 발명에 개시된 모든 유형의 E2(E2 다수, E2 다수 R9, E2 다수 w/o)에 관한 것이다.
합성 HCV E2 cDNA의 제조
1. E2-다수 R9
본 구조체는 2개의 분리된 PCR 반응(# 1 및 2)을 이용한 반복 PCR에 의해 합성하였다. PCR 반응 #1에서, 하기 5개의 센스 및 5개의 안티센스 프라이머를 단일튜브내에서 함께 혼합하였다.
프라이머 데이타는 삭제됨
상기 제1 PCR에서 모든 센스(제1 내지 5) 및 안티센스 프라이머(제1 내지 5)를 함께 25pmoles/㎕의 스톡 농도로 혼합하였다. 상기 혼합된 프라이머의 3㎕ 알리콧(aliquot)을 하기 프로그램을 이용한 PCR을 위해 채취하였다: Bio-X-Act DNA Polymerase(Bioline, London, UK)를 가지고 95℃ 3분, 94℃ 30초, 58℃ 30초, 72℃ 1분을 30회 하고 그 다음 72℃에서 5분간 연장함.
PCR #1 이후에, 1㎕의 알리콧을 외부 플랭킹(flanking)의 작은 올리고뉴클레오티드를 이용한 PCR#2를 위해 취하였다. 이 반응에서 센스 프라이머는 5' cgc-gga-tcc-cag-acc-acc-gtg-gtt-g 3' 및 안티센스 프라이머는 5' ccg-gaa-ttc-tta-tca-gtg-gtg-gtg-g 3'이었다. 사용된 PCR 조건은, 프로그램이 20 사이클로 구성된다는 점을 제외하고는 PCR #1과 동일하였다. PCR 단편들을 1% 아가로스 젤 상에서 전기영동하였고, UV 하에서 에씨디움 브로마이드로 가시화하고, 후속의 클로닝 전에 QIAquick 젤 추출 키트(Qiagen, Hilden, Germany)로 정제하였다. 정제된 단편들은 BamH1 및 EcoRI 제한효소로 효소적 절단을 하였고 바큘로바이러스 발현 플라스미드 pAcGP67B(Pharmingen, USA)(미리 BamH1 및 EcoRI으로 분해시킨) 안으로 라이게이션시켰다.
2. E2-다수 w/o
E2 다수 R9 cDNA를 정착한 상기 언급한 재조합 플라스미드 pGP67B 상에서 하기 센스 및 안티센스 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였다
프라이머 데이타는 삭제됨
PCR 조건은 상기 반응 #1과 동일하였다. 그 결과 얻어진 PCR 단편들을 젤 정제하였고, BamH1 및 EcoRI으로 분해하고 동일하게 분해된 pAcGP67B 플라스미드 안으로 라이게이션시켰다.
3. E2 다수
제한효소 분해 및 반복 PCR의 조합을 통해 E2 다수를 제조하였다.
a) E2 다수 R9를 BamH1 및 AscI 제한효소로 완전히 분해하였다. 분해물은 1% 아가로스 젤 상에서 전기영동하였고, 10kb 이상의 단편들을 절제하고 정제하였다.
b) 25머(mer) 오버행(overhang)을 갖는 하기 19 x ~ 50 머(mer) 올리고뉴클레오티드를 이용하여 반응 #1에서와 같이 반복 PCR 반응을 수행하였다.
프라이머 데이타는 삭제됨
결과된 ~ 400bp 단편들을 1% 아가로스 젤 상에서 전기영동하고, 정제하고, BamH1/AscI으로 분해하고 재정제하였다. 그 후 그 단편을 상기 (a)에서와 같이 미리 제조된 효소분해된 E2 다수 R9 플라스미드 안으로 라이게이션시켰다. 이 콜라이(E. coli) 컴피턴트(competent) 세포 안으로 형질전환시킨 후에 박테리아 콜로니를 성장시키고 플라스미드 DNA를 분리하고 DNA 시퀀싱을 하였다. 예측된 DNA 서열과 매치된 클론을 더 성장시키고 플라스미드 DNA를 추출하여 재조합 플라스미드 pAcGP67B E2 다수를 제조하였다.
바큘로바이러스 세포주:
부착성 SF9(Spodoptera frugiperda) 세포를 이스토레이트(yeastolate), 락트알부민 가수분해물, 10% 태아 소 혈청 및 50㎍/ml 젠타마이신(TNM-FH 배지)로 보충된 Grace's Insect Media(Biological Industries, Beit Haemek, Israel)에 유지시켰다. 이러한 세포들은 트랜스펙션, 엔드 포인트 희석 분석(EPDA) 및 고 역가 재조합 바이러스의 제조에 관련된 프로토콜 만을 위해 사용되었다. 하이-파이브 세포(High-Five 세포(Trichoplusiani))를 부착성 또는 쉐이커 배양물로 유지시켰고 무혈청 배지에서 성장시켰다(Insect Xpress, BioWhittaker, MD; Ex-Cell 405 배지, JRH Biosciences, Andover UK). 이러한 세포들을 단백질 발현 연구를 위해 사용하였다. 모든 세포는 냉각된 인큐베이터에서 (VELP Scientific)내에서 27℃로 유지시켰다.
재조합 바큘로바이러스의 제조:
모든 재조합 바큘로바이러스는 리니어화된(linearized) BaculoGold 키트(Pharmingen, San Diego)를 이용하여 제조하였다. 고 역가 재조합 바이러스 역가 스톡(2×108pfu/ml)을 만들기 위해, EPDA 및 바이러스 증폭 절차를 Pharmingen의 지시 메뉴얼에 따라 수행하였다.
바큘로바이러스 E2 다수 단백질의 발현 및 정제:
하이-파이브 세포의 개조 및 감염
단백질 발현 연구에 앞서, 하이-파이브 세포를 쉐이커 플라스크에 적응시켰다. 요컨대, 플라스크(Corning Costar, MA)로부터 부착 세포(ml당 106개 세포)를 1L 에를린마이어 폴리카보네이트 플라스크(Corning, MA)로 옮기고 500ml 무혈청 배지에서 24시간동안 150rpm으로 교반하였다. 그 이후에 플라스크를 제거하고 조직 배양물 후드에 위치시키고 5분간 기울여서 비응집 세포들로부터 세포 응집물을 분리해냈다. 동종 단일 세포를 제거하고 새로운 에를린마이어 플라스크로 옮기고 ml당 1 x 106개의 세포 밀도로 시딩하고 E2 다수 재조합 바큘로바이러스의 패널로 감염의 다수다양성(Multiplicity of infection, MOI)=3으로 감염시켰다. 감염 후 3일째에 쉐이커 배양물을 수거하고 원심분리후 얻어진 상청액을 수거하여 멸균 여과하고 4℃ 또는 -70℃에서 저장하였다.
바큘로바이러스 E2 다수로 감염된 하이-파이브 세포 상에서의 RT-PCR
E2 다수 단백질의 발현 및 정제가 그것의 특이적 재조합 바큘로바이러스로부터 유래되었다는 것을 입증하기 위해, 몇몇 발현 실험 동안 5 x 106세포를 Tri-Reagent BD(Molecular Research Center, OH)를 이용하여 RNA 분리를 위해 취하였다. 올리고-dT(Promega, WI)를 이용하여 프라임된 역전사(RT)에 사용하기 위해 RNA의 한 알리콧을 취하고, AMV 및 MLV 역전사효소(Promega, WI)로 효소처리하였다. cDNA를 pAcGP67B 센스 및 안티센스 프라이머(상기에서 언급한)를 이용한 PCR을 위해 취하였다. PCR 프로그램은 94℃에서 3분간(1회), 94℃에서 1분간, 58℃에서 1분간, 72℃에서 1.5분간(33사이클)을 한 후 최종 연장 단계로서 72℃에서 5분간 수행하였다. PCR 단편들을 젤 정제하고 pAcGP67B 센스 및 안티센스 프라이머(상기 기재함)를 이용한 직접 DNA 시퀀싱을 하였다.
감염된 바큘로바이러스 E2 다수 상청액의 농도:
다양한 부피의 바큘로바이러스 E2 다수 상청액(250ml 내지 7L)을 Vivaflow 50,200(Vivascience, UK) 또는 Pellicon-XL 50(Millipore, MA) 재생 셀룰로스 농축기 유니트를 이용하여 ~10배 농축하였다. 농축물을 50mM NaHPO4, 300mM NaCl, 10mM 이미다졸로 구성된 PBS 또는 네이티브 용균 버퍼(NLB, pH=8)에 대해 4℃에서 밤새 투석하였다. NLB에 대한 투석 이후에는 그 물질에 NLB 중의 10% Triton-X-100의 1/20 희석을 추가하였다. 모든 투석된 물질은 그 이후에 멸균 여과하고 정제하였다.
바큘로바이러스 E2 다수 상청액의 FPLC 정제 :
니켈(Ni-NTA) 아가로스 컬럼에 의한 정제:
4.5 내지 30 ml 범위의 컬럼, Nickel-NTA Agarose (Qiagen, Hilden)를 Pharmacia C 컬럼에 준비하였다. 컬럼을 AKTA Explorer(Pharmacia, NJ)에 연결하고 NLB의 세 컬럼 볼륨으로 분당 3ml의 유속으로 세척하였다. E2 다수 상청액을 분당 1-2ml의 유속으로 로딩하고 컬럼들을 분당 3ml로 20mM 이미다졸을 함유하는 NLB의 5 컬럼 볼륨으로 세척하였다. E2 다수를 300mM 이미다졸을 함유하는 NLB의 5 컬럼 볼륨으로 분당 3ml의 유속으로 용출하였다. 용출된 분획의 광학 밀도를 280nm에서 측정하고 풀화하고 PBS에 대해 4℃에서 극도로 투석하였다.
스트렙트아비딘-세파로오스 부착 항-E2 mAb 18 컬럼의 정제:
25mg의, 정제된 mAb 18(하기 참조)을 1.25mg의 비오틴(Pierce, Rockville, IL)에 접합시키고 PBS에 대해 극도로 투석하였다. 부드럽게 교반한 후 HR 10/10-컬럼(Pharmacia, NJ) 상에 로딩함으로써 실온에서 30분간 비오틴화된 mAb 18(22mg)을 10ml 스트렙트아비딘 세파로오스 고성능(Pharmacia, NJ)에 접합시켰다. 결합된 비오틴화된 mAb 18을 물질을 통한 흐름의 분광광도 결정(A280nm)으로 확인하였고, 컬럼은 PBS로 세척하였다. PBS에 대해 미리 투석된 농축 E2 상청액을 컬럼상에 분당 2ml의 속도로 로딩시켰다. PBS로 5 컬럼 볼륨 세척을 한 후 결합된 물질을 0.1M 글리신(pH=3)의 1ml 분획으로 용출하고 1M Tris-base (pH=9) 50㎕으로 즉시 중화사켰다. 용출된 분획의 광학 밀도를 280nm에서 측정하였고 풀화시키고 PBS에 대해 4℃에서 극도로 투석시켰다.
단백질 농도의 결정:
정제된 단백질 농도를 Bradford 분석(Bio-Rad, CA)에 의해 결정하였다.
이뮤노블랏 분석:
LDS-로딩 버퍼로 보충된 비환원 조건(β-머캡토에탄올의 부존재하에서 37℃에서 10분간) 또는 환원 조건(360mM β-머캡토에탄올의 존재하에서 95℃에서 5분간 가열) 하에서, 조 단백질 또는 정제된 단백질 샘플(100-200 ng)을 4-12% NuPAGE 젤 상에 로딩시켰고 MES 러닝 버퍼(Novex, San Diego)에서 전기영동시켰다. 단백질을 XCell II Blot 모듈(Novex, San Diego)을 이용하여 습식 전달을 통해 니트로셀룰로스 멤브레인으로 전기블랏팅시키고 블록킹 버퍼(PBS-0.04% Tween-0.3% 우유 단백질)로 4℃에서 하룻밤 블록킹시켰다. penta-His (Qiagen, Hilden), 마우스 또는 인간의 항-E2 mAb를 실온에서 3시간동안 0.02-2㎍/ml로 첨가한 후 블랏을 후레쉬 블록킹 버퍼로 인큐베이션시켰다. 동일한 프로토콜을 HCV 환자의 혈청을 이용하여 다양한 희석으로 수행하였다. 블록 버퍼 중에서 3회의 분리된 5분 세척 이후에 블롯을 퍼옥시다아제 접합된 염소 항-마우스(1:10,000) 또는 염소의 항-인간 IgG(1:20,000; Zymed Incorporation, South San Francisco)로 인큐베이셔키키고 향상된 화학발광(ECL)을 시켰다.
마우스의 항-E2 mAb의 제조:
면역화:
항-E2 mAb 18:
풋패드(footpad)를 통해 BALB/C (5주령)를 완전 프룬트 보조제(Complete Freund's Adjuvant)(Difco Laboratories, Detroit, MI) 1:1 볼륨 중의 10㎍ E2로 면역화시켰다. 마우스를 2주마다 2회 불완전 프룬트 보조제(Incomplete Freund's adjuvant(Difco Laboratories, Detroit, MI)) 1:1 볼륨 중에서 5㎍ E2로 풋패드를 통해 추가면역시켰다. 마우스를 후속 융합을 위해 지라를 수확하기 3일 전에 1㎍ E2(i.v.)로 추가면역시켰다.
고도면역 혈청 및 항-E2 다수 R9 mAb 21:
BALB-C 마우스(5주령)을 CpG (5' tcc-atg-acg-ttc-ctg-acg-tt 3'; Genset, France) 및 25㎕의 2% Alum (Sigma, MO)을 함유하는 100㎍의 포스포로티오에이트와 함께 10㎍의 E2 또는 E2 다수 R9로 면역화시켰다. 이 항원 혼합물을 교반하고 i.p. 면역화 전에 30분간 얼음 상에 위치시켰다. 융합을 위해 이자를 수거하기 3일전에마우스를 2㎍ 항원 i.v.로 더욱 면역화하였다.
마우스 지라의 융합:
지라 세포를 인간-마우스 이종골수종(heteromyeloma) HMMA2.11TG/0과 3:1의비율로 혼합하였다. 50%(w/v) PEG 1500 (Boehringer Mannheim GmbH, Mannheim, Germany)로 융합을 수행하고 융합된 세포를 하이포크산틴, 아미노프테린 및 티미딘(HAT) 보충물(1X)(Biological Industries, Beit Haemek, Israel)을 함유하는 완전 RPMI 배지에 96웰 U-바닥 미세적정 플레이트(Nunc. Inc)에서 웰당 30,000 세포의 농도로 시딩하였다. 1주일 후에 세포들에게 신선한 HAT 배지를 제공하였다. 융합 후 2주일 지나서 특이적 항체의 존재를 위한 각 이뮤노겐에 대한 ELISA를 위해 상청액을 수거하였다. 배지를 신선한 하이포크산틴, 티미딘 (HT)-함유 배지로 채웠다. 특이적 항-E2 또는 항-E2 다수 R9 mAb를 분비하는 하이브리도마 배양물을 96 U-바닥 미세적정 플레이트 내에서 0.5셀/웰로 제한희석에 의해 클로닝하였다.
클론 18 및 21의 복수(ascites) 제조:
BALB-C 마우스를 500㎕ Pristane(Sigma, MO)로 i.p. 주사하였다. 10일후에 5x106의 특이적 마우스 모노클로날 항체를 i.p. 주사하였다. 3-4주후에 복막을 세척하고 복수액을 수거하였다.
복수액의 정제:
복수액을 PBS로 1:1 희석하였고 5ml Hi-트랩 프로테인 G 컬럼(Pharmacia, NJ) 상에서 분당 5ml로 로딩하였다. 40ml의 PBS로 세척한 후에 결합된 mAb를 30ml의 0.1M 글리신(pH=2.7)으로 용출하였고 PBS에 대해 극도로 투석하였다. MAb를 -20℃에서 1mg/ml의 농도로 저장하였다.
ELISA:
MaxiSorp ELISA 플레이트(Nunc, Inc)를 PBS(웰당 50㎕) 중에서 2㎍/ml E2 항원으로 4℃에서 하룻밤 코팅하였다. 37℃에서 2시간동안 웰당 200㎕의 PBS/1% BSA로 블록킹 한 후 마우스 혈청의 일련의 희석물(1:100-1:200,000) 또는 정제된 mAb(1㎍/ml)를 37℃에서 2시간동안 웰에 첨가하였다. PBS/0.04% Tween-20으로 세척한 후 퍼옥시다제-접합된 염소 항-마우스 IgG(H+L)의 1:10,000 희석물을 37℃에서 1시간동안 첨가한 다음 기질로서 3,3',5,5'-테트라메틸-벤지딘 디히드로클로라이드(TMB, Sigma, MO)을 사용하여 450nm에서 색채계로 측정하였다.
실시예1
77개의 다른 E2 단백질(Genebank에 기탁된 서열로 부터 얻어진)의 아미노산 서열을 비교하여 E2 다수를 제작하였다. 각 위치에서 가장 자주 발생하는 아미노산을 선택하고 그에 따라 구조체를 합성하였다. E2 다수 w/o는 HVR1을 포함하는 처음 27개 아미노산이 결여된 E2 다수의 절단된 버젼이다. E2 다수 R9는 HVR1 영역 위치에 이전에 언급된 HVR1 미모토프 (R9로 명명된)(27 아미노산 길이)를 함유한다. 그 외에는 E2 다수, E2 다수 w/o 및 E2 다수 R9는 동일하다(도 1; 서열목록 서열번호 1은 E2 다수를, 서열번호 2는 E2 다수 w/o를, 서열번호 3은 E2 다수 R9를 나타낸다). 위치 31의 아미노산(X로 지정)은 페닐알라닌(F) 또는 이소루신(I)일 수 있다.
합성 구조체를 반복적 PCR 방법론을 통해 제조하였다. 샷건(shotgun) 접근법을 이용하여 전체 코딩 다수 서열을 둘러싸는 20머 5' 및 3' 오버행을 갖는 각 프라이머(~100mer)를 혼합하고 PCR을 수행하였다(방법 참조). pAcGP67B 안으로 클로닝하기 위한 최종 PCR 산물을 생산하기 위해 더 작은 5' 및 3' 프라이머를 설계하였고, 5' BamHI 및 3' EcoRI 코딩 부위를 포함하였다. 상기 3' 프라이머는 정제를 위한 히스티딘 태그를 장착하고 있다.
배양물을 교반하면서 하이-파이브 세포를 성장시키고 재조합 E2(다수, 다수 R9 또는 다수 w/o) 바큘로바이러스로 3 MOI(Multiplicity of Infection)로 감염시켰다. 상청액 샘플을 후속의 72시간에 걸쳐 취하고 단백질 젤 상에서 항-His 또는 항-E2 mAb로 프로빙하였다. 72시간 후-감염까지 증가된 감염 후 8시간만큼 빨리 면역반응성 E2(Mw=50kD)를, 비록 매우 희미하긴 하지만, 관찰하였다. 이 시점은 상청액 수거를 위해 잇따라 선택되었다.
순수한 E2 다수 단백질을 얻기 위하여, 상기 단백질을 함유하는 상청액은 농축되고 투석되고 상기 기재된 Nickel-NTA 아가로스 컬럼 또는 항-E2 mAb 친화도 컬럼(방법 참조) 상에 로딩될 수 있다. 동일한 플로우-쓰루(Flow-Through, FT), 세척 및 용출(Eln) 분획을 분리된 SDS-PAGE 상에 로딩하고 정제 효율을 테스트하기 위해 각각 항-His mAb 반응성 및 쿠마시에 블루 염색을 진행할 수 있다.
실시예2
합성 다수 단백질의 기능성을 조사하기 위해, 비환원 이뮤노블랏을 수행하고다양한 HCV 유전자형으로부터의 혈청으로 프로빙하였다(도2 및 3). 도 2에 도시된 웨스턴 블랏에서 다양한 바큘로바이러스 발현된 E2 제조물, 등가량(100ng)의 E2 CHO 및 씨오레독신을 젤 상에 런닝시켰다. 적절한 혈청 희석 범위(1:2,500-1:10,000)를 사용하여, 테스트된 대부분의 혈청 유형에 있어 E2 다수 R9 및 E2 다수 w/o(제3 및 제4레인)에 대한 강한 신호가 관찰되었다. 다른 E2 단백질 또한 다른 혈청에 대해 반응성을 나타내었다. 제2레인의 E2 w/o HVR1 제조물은 E2의 N-말단에 31개의 아미노산, 즉 HVR1+부가적인 4개의 아미노산이 결여되어 있는데, 이것이 혈청 중 어느 것과도 반응하지 않은 유일한 E2 제조물이었다. 이를 통해 이러한 4개의 아미노산이 항체 인지를 가능케 하는 E2의 올바른 구조를 보존하는 데에 매우 중요하다는 것을 간접적으로 유추할 수 있다. ABXTL68(0.5㎍/ml), 완전한(fully) 인간의 항-E2 mAb가 양성 대조군으로 작용하였고, α-HCV 네거티브 및 α-HBC 포지티브 혈청(둘다 1:2,500 희석)은 음성 대조군으로 작용하였다. 별개의 실험에서 비환원 이뮤노블랏을 수행하고 HCV 유전자형 1-4로부터 유래된 혈청으로 프로빙하였다(도3). E2 다수는 모든 혈청 유형 및 ABXTL68에 의해 인지되었다.
실시예 3
마우스를 천연 E2, E2 다수 R9 및 E2 다수 w/o로 면역화시켰다. 상기 마우스로부터 고도면역 혈청을 얻어 ELISA에 의해 고정된 항원에 대한 반응성을 평가하였다. E2 다수 R9 및 E2 다수 w/o로 면역화된 마우스로부터 유래된 고도면역 혈청은모든 4개의 바큘로바이러스 생산된 E2 단백질에 대해 가장 높은 반응성을 나타내었다(도4a 참조). 흥미롭게도, 상기 반응성은 포유동물 E2 (E2 CHO)에 대해서는 역시 관찰되었으나, 천연 E2로 면역화된 마우스의 고도면역 혈청에서는 관찰되지 아니하였다. 씨오레독신에 대해서는 어떠한 고도면역 혈청의 반응도 관찰되지 않았다(도4a). 이러한 데이타를 지지하여, 환원 SDS-PAGE에서, E2 다수 R9 및 E2 다수 w/o로 면역화된 마우스의 고도면역 혈청은 E2 CHO 뿐만 아니라 모든 바큘로바이러스-발현된 E2 항원에 대해 특이적이면서도 넓은 반응성을 나타내었다(도4b). 반대로 천연 E2로 면역화된 마우스의 고도면역 혈청은 제한된 패턴의 반응성을 나타냈을 뿐이다(도4b). 이러한 결과들을 통해 상기 다수 단백질이 천연 E2(이는 단지 주입된 항원에 대해서만 특이적 반응을 일으킬 수 있다)에 비해 넓은 범위의 E2 단백질에 대해 면역 반응을 유도할 수 있다는 것을 알 수 있다. 상기와 같은 넓은 범위의 면역 반응의 관점에서, 다수 단백질은 백신에 있어서 천연 E2 이상의 장점을 가진 것으로 예상된다.
유사하게, E2 다수 R9에 대해 제조된 모노클로날 항체(mAb)는 몇몇 유형의 E2와 반응하는 반면, 천연 E2에 대해 발생한 mAb는 그들의 인지 범위내에 더욱 제한되어 있다. E2 또는 E2 다수 R9에 의한 마우스의 면역화 및 뒤따르는 지라의 융합 이후에, 두개의 다른 mAb가 제조되었다. 이러한 mAb의 결합 특성을 환원 SDS-PAGE 상에서 테스트하였는데, α-E2 mAb 18은 단지 천연 E2(또는 w/o HVR1)만을 인지한 반면, 항-E2 다수 R9 mAb 21은 E2 CHO 뿐만 아니라 모든 바큘로바이러스-발현된 E2 항원을 인지하였다(도5).
실시예4
다양한 E2 제조물에 대한 혈청의 생물학적 활성을 하기 HCV-Trimera 동물 모델을 이용하여 특징을 알아보았다: 마우스에 인간 간 단편이 안정되게 주입되도록 처리하였다. 상기 처리는 극도의 방사선 조사 이후에 스키드(scid: severe combined immuno deficient) 마우스 골수의 이식을 포함하였다. 인간 간 단편의 바이러스 감염은 HCV 포지티브 인간 혈청을 이용하여 생체외에서 수행하였다(미국특허 제5,849,987호).
검출가능한 항 E2 IgG가 없는 7.5×105HCV-RNA 카피/ml를 함유하는 인간 혈청 샘플 0.5ml를 하기에 따른 다양한 항 혈청과 함께 실온에서 3시간동안 프리인큐베이션시켰다:
천연 E2로 면역화된 마우스의 IgG 분획(300㎍);
E2 다수 R9로 면역화된 마우스의 IgG 분획(300㎍);
E2 다수 w/o로 면역화된 마우스의 IgG 분획(300㎍);
음성 대조군으로서 프리-면역(pre-immune) 혈청.
정상 인간 간 단편을 생체외에서 감염시키기 위해 상기 프리인큐베이션된 혈청을 사용하였다. 감염 후 상기 간 단편을 마우스에 이식하고 19일 후 혈청 내 HCV-RNA를 결정하였다. 도 6은 HCV-RNA 포지티브 마우스의 퍼센트 및 평균 바이러스 로드 둘다에 의해 입증되는 바와 같이, 다양한 항 E2 항체 제조물이 HCV에 의한간 감염을 저해하는 효과를 나타낸다. 천연, E2, E2-다수 R9 및 E2-다수 w/o에 대해 생산된 혈청은 감염된 동물의 퍼센트 및 평균 바이러스 로드를 현저히 감소시켰다.
Claims (30)
- 서열번호 1 내지 3으로 구성된 군으로부터 선택된 서열 또는 그 변이체를 갖는 정제 및 분리된 E2 단백질.
- 제1항에 있어서, 상기 단백질은 또다른 폴리펩티드가 더 결합된 것을 특징으로 하는 정제 및 분리된 E2 단백질.
- 제1항 또는 제2항에 따른 E2 단백질 및 담체를 포함하는 조성물.
- 제1항 또는 제2항에 따른 E2 단백질을 코딩하는 정제 및 분리된 핵산.
- 제1항에 따른 E2 단백질을 코딩하는 정제 및 분리된 핵산으로서, 상기 핵산은 서열번호 4 내지 6으로 구성된 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 정제 및 분리된 핵산.
- 제4항 또는 제5항에 따른 핵산을 포함하는 발현 벡터.
- 제6항에 따른 발현 벡터로 형질전환 또는 트랜스펙션된 숙주 유기체.
- 제7항의 숙주 유기체에 의해 생산된 E2 단백질.
- 제3항의 조성물을 충분한 수준의 보호적 항체 생산을 자극할 수 있는 양으로 개체에 투여하는 것을 포함하는 C형 간염의 예방방법.
- 제3항의 조성물을 HCV에 대한 면역 반응을 유발할 수 있는 양으로 HCV 보균자에게 투여하는 것을 포함하는 C형 간염의 치료방법.
- 제1항 또는 제2항에 따른 E2 단백질을 약제학적으로 허용되는 담체 내에 포함하는 것을 특징으로 하는, C형 간염에 대해 개체를 면역화하기 위한 백신.
- 제6항에 따른 발현 벡터를 포함하는 조성물.
- 제12항의 조성물을 충분한 수준의 보호적 항체 생산을 자극할 수 있는 양으로 개체에 투여하는 것을 포함하는 C형 간염의 예방방법.
- 제12항의 조성물을 HCV에 대한 면역 반응을 유발할 수 있는 양으로 HCV 보균자에게 투여하는 것을 포함하는 C형 간염의 치료방법.
- 제6항에 따른 발현 벡터를 약제학적으로 허용되는 담체 내에 포함하는 것을특징으로 하는 C형 간염에 대해 개체를 면역화하기 위한 백신.
- 서열번호 1 내지 3으로 구성된 군으로부터 선택된 E2 아미노산 서열에 대해 특이적 결합 친화도를 갖는 항 E2 항체.
- 제16항의 항체를 HCV 공격으로부터 한 개체를 보호하기 위한 효과적인 양으로 상기 개체에 투여하는 것을 포함하는 C형 간염 예방방법.
- HCV 백신 조성물을 제조하기 위한 제1항 또는 제2항에 따른 E2 단백질의 용도.
- 만성 HCV 보균자에 있어 HCV에 대한 면역성을 유도하기 위한 제1항 또는 제2항에 따른 E2 단백질의 용도.
- 제19항에 있어서, 다른 치료법 이전, 동시 또는 이후에 만성 HCV 보균자에 있어 HCV에 대한 면역성을 유도하기 위한 E2 단백질의 용도.
- 간 이식 이전 또는 이후, 또는 예측된 감염 이후에 HCV-감염 개체에 HCV에 대한 면역성을 유도하기 위한 제1항 또는 제2항에 따른 E2 단백질의 용도.
- HCV에 대한 면역성을 예방적으로 유도하기 위한 제1항 또는 제2항에 따른 E2 단백질의 용도.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, HCV 백신으로의 용도를 위한 것임을 특징으로 하는 E2 단백질 또는 조성물.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 만성 HCV 보균자에 있어 HCV에 대한 면역성을 유도하기 위한 것임을 특징으로 하는 E2 단백질 또는 조성물.
- 제24항에 있어서, 다른 치료법 이전, 동시 또는 이후에 만성 HCV 보균자에 있어 HCV에 대한 면역성을 유도하기 위한 것임을 특징으로 하는 E2 단백질 또는 조성물.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 간 이식 이전 또는 이후 또는 추측된 감염 이후에 HCV-감염 개체에 있어 HCV에 대한 면역성을 유도하기 위한 것임을 특징으로 하는 E2 단백질 또는 조성물.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, HCV에 대한 면역성을 예방적으로 유도하기 위한 것임을 특징으로 하는 E2 단백질 또는 조성물.
- HCV 감염을 치료 또는 예방하기 위한 제16항에 따른 특이적 항체의 용도.
- 제1항 또는 제2항에 따른 E2 단백질을 적합한 용기 내에 포함하는 것을 특징으로 하는 생물학적 샘플에 존재하는 HCV 항체의 검출을 위한 키트.
- HCV 항체를 검출하기 위한 면역분석법으로서,(1) 제1항 또는 제2항에 따른 E2 단백질을 제공하는 단계;(2) 항체-항원 복합체 형성을 위한 조건 하에서 생물학적 샘플을 상기 E2 단백질과 함께 인큐베이션하는 단계; 및(3) 상기 E2 단백질을 포함하는 상기 항체-항원 복합체가 형성되었는지 여부를 결정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 면역분석법.
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