JPH08504421A - Ｈｃｖのｃ３３領域由来のペプチド、該ペプチドに対する抗体及びｈｃｖの検出方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、ＨＣＶに対する抗体に対して免疫化学的反応性を示すペプチドに係わる。好ましい本発明ペプチドはＮＳ−３タンパク質のＨＣＶ特異的エピトープを含む。本発明は更に、ＨＣＶのＮＳ−３タンパク質と特異的に反応する抗体に係わる。ＨＣＶまたはＨＣＶ抗体の検出方法、及びＮＳ−３抗原に対して特異的反応性を示す抗体の検出方法も本発明の一部である。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の名称：ＨＣＶのＣ３３領域由来のペプチド、該ペプチドに対する抗体及び ＨＣＶの検出方法 本発明はＣ型肝炎ウイルスに対する抗体と免疫化学的に反応するペプチド、及 び該ペプチドをコードする核酸配列に係る。 本発明は更に、試験流体中のＨＣＶ又は抗ＨＣＶの検出方法と、該検出方法を 実施するための免疫化学試薬及びテストキットにも係る。 Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）は、ＮＡＮＢ肝炎（非Ａ非Ｂ）の原因物質の１種 として認められている９．４ｋｂの１本鎖ポリアデニル化ＲＮＡウイルスである 。ＨＣＶは急性及び慢性肝疾患を誘発し、肝細胞癌に関与する。 肝細胞癌は、公知肝炎ウイルス、即ちＡ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）、Ｂ型肝炎 ウイルス（ＨＢＶ）及びδ型肝炎ウイルス（ＨＤＶ）を原因とするものや、サイ トメガロウイルス（ＣＭＶ）又はエプスタイン−バールウイルス（ＥＢＶ）によ り誘発される肝炎を含む他の形態のウイルス関連肝疾患から区別される。疎水性 プロット及び配列相同に基づく実証によると、ＨＣＶはフラビウイルス科と遠縁 にあ ると思われる（Ｈｏｕｇｈｔｏｎ Ｍ．ら，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，１４：３８ １，１９９１ ）。非Ａ非Ｂ型肝炎は輸血を受けた個体で最初に同定された。ヒト からチンパンジーへの伝播及びチンパンジーにおける連続継代の結果、非Ａ非Ｂ 型肝炎は伝播性感染物質に起因することが立証された。 疫学的実証によると、非Ａ非Ｂ型肝炎は水伝染性疫学型、血液又は注射針に関 連する型、及び散発発生（集団獲得）型の３種が存在すると考えられる。ＨＣＶ のウイルスゲノムは、広範な翻訳後プロセッシングを受ける約３０１０アミノ酸 のポリプロテインをコードする。ウイルス構造領域は非構造領域の上流に位置し 、高度に保存された１９ｋＤａヌクレオチドタンパク質と、２つの広範にグリコ シル化されたエンベロープポリペプチドｇｐ３３（Ｅ１）及びｇｐ７２（Ｅ２／ ＮＳ１）を含むと推定される。最近の研究によると、Ｅ２／ＮＳ１のＮ末端領域 ではほぼ全部のＨＣＶ単離体間に実質的な配列不均一性が存在することが示され ており、ＨＣＶエンベロープのこの領域は強い免疫選択下にあると考えられる。 膜結合２３ｋＤタンパク質であるＮＳ２と、ウイルスヘリカーゼに対応し、ＮＳ タンパク質 のプロセッシングに関与すると現在考えられているＮ末端セリンプロテアーゼド メインを含み得る約６０ｋＤａの可溶性タンパク質であるＮＳ３を含む種々の推 定非構造タンパク質がＨＣＶポリプロテインの残余からプロセッシングされる。 ＮＳ４タンパク質の機能は現時点では解明されていないが、該タンパク質は免疫 優性抗体結合部位を含む５−１−１フラグメントを含み（Ｋｕ Ｇ．ら，Ｓｃｉ ｅｎｃｅ ２４４：３６２，１９９１；Ｃｅｒｉｎｏ Ａ．ら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎ ｏｌ．，１４７：２６９２ ）、ＮＳ５はウイルスレプリカーゼを含む。臨床研究 によると、ＨＣＶに暴露後、ＮＳ３のＣ末端とＮＳ４タンパク質の一部を含む組 換えタンパク質であるｃ１００−３に対する抗体への血清変換の数週間前にウイ ルス核タンパク質及びＮＳ３の保存領域に対する抗体が出現し得ることが報告さ れている。 従って、高度に保存されたＨＣＶヌクレオキャプシドタンパク質及びＮＳ３を 使用する血清学的アッセイは、急性ＨＣＶ感染の有用な診断マーカーになると期 待される。 ＨＣＶ感染の種々の段階で確実な診断を可能にする特異的且つ高感度の方法を 開発するためには、この型の免疫優 性ウイルスエピトープを同定することが極めて重要である。 本発明の目的は、ＨＣＶ感染の診断及びモニターに有用な小さいペプチドを提 供することである。 推定ＨＣＶ ＮＳ３抗原の少なくとも一部をコードする長い組換え抗原はＨＣ Ｖに対する抗体に対して反応性であるが、上記に要約したような実質的な欠点を 有する。小さい合成ペプチドはこれらの欠点を解決できるが、十分に免疫反応性 ではない。本発明の目的は、小さい合成ペプチドの利点を有するように十分小さ く且つＨＣＶに対する抗体に対して免疫反応性であるように十分大きい長さを有 するペプチドを提供することである。 推定ＨＣＶ ＮＳ３遺伝子によりコードされる領域からの小さいペプチド（１ ２マー）はＨＣＶに対する抗体を検出するためには特に有用でないことが判明し た。大きいポリペプチドは融合タンパク質として容易に発現できず、内因性タン パク分解を受け易く、偽陽性反応の可能性が高いので非実用的である。大きいポ リペプチドは更に合成しにくく、精製しにくく、感染性であり得る。 本発明では、長さと免疫反応性を考慮した最適合成を可 能にするＨＣＶ ＮＳ３−ゲノムの領域が同定される。 Ｃ型肝炎ウイルスの抗原に対する抗体の存在について血清をスクリーニングす るためには、ＨＣＶゲノムの４領域がスクリーニングアッセイで使用するのに重 要であると現在では考えられている。これらの抗原はコア抗原、ＮＳ−３抗原、 ＮＳ−５抗原及びＮＳ−４抗原である。最近の研究（Ｌｅｌｉｅ Ｎ．，Ｃｕｙ ｐｅｒｓ Ｔ．，Ｚａａｙｅｒ Ｈ．，Ｂｒｅｓｔｅｒｓ Ｄ．，公表予定）に よると、スクリーニングアッセイにおいてＨＣＶ陽性であった供血者からの１１ ００血清のうちの約５０％はＲＩＢＡ（組換えイムノブロットアッセイ）では確 定されず、これらの血清が上記抗原の全部を認識する訳でない（実際には１種し か認識しない）ことを示している。これらの血清は、上記抗原の１種と反応する 抗体を含むが、必ずしもＣ型肝炎ウイルスに感染している訳ではない。供血者血 液のスクリーニングのために血液バンクにより現在使用されている試験によると 、これらの血清は感染しているとみなされ、従って、輸血目的には利用できない と考えられる一方で、そのほとんどは実際にはＨＣＶに全く感染していない可能 性も考えられる。従って、全てのＨＣＶ感染血清と非感染 血清を区別する確実且つ正確な確認試験が必要とされている。 １１００のスクリーニング陽性血清のうちの約５％（５１血清）はＮＳ−３領 域の一部であるＣ３３抗原しか認識しない。これらの血清を本明細書中では、Ｃ ３３抗原しか認識しないという意味で「Ｃ３３単独」血清と呼称する。 これらの血清が実際に感染しているか否かを判定するためには、ポリメラーゼ 連鎖反応（ＰＣＲ）等の核酸増幅法によりアッセイを実施し、ＨＣＶに由来する 核酸の存在を検出することができる。この方法を使用した処、Ｃ３３単独血清の うちで実際にＨＣＶに感染しているのは低百分率に過ぎないことが判明した。Ｃ ３３抗原に対するＰＣＲ陰性Ｃ３３単独血清の反応性は、Ｃ３３抗原上の交差反 応性エピトープの存在により説明することができる。ＰＣＲ試験はＣ３３単独血 清中のＨＣＶの存在を検出するために確実な方法であるが、かなり労力を要する 手順である。全ての感染性血清と非感染性血清とを区別するスクリーニング試験 が開発されるならば、別途ＰＣＲ試験は不要になる。この目的のためには、非交 差反応性ＮＳ−３抗原、即ち真の抗ＨＣＶ ＮＳ−３免疫応答の原因となるＣ３ ３エピト ープを含み、交差反応性エピトープがもはや存在しないような抗原が必要であろ う。 本発明の別の目的は、ＨＣＶ特異的ＮＳ−３抗原配列を含むペプチドを提供す ることである。 本発明は、配列番号６、７、８、９及び１０に示す配列群とその組み合わせ又 は、ＨＣＶ抗体に対して免疫化学的に反応性である前記配列群のフラグメントも しくは前記配列群の類似体から選択されるアミノ酸配列を有するペプチドを含む 。 推定ＨＣＶ ＮＳ３遺伝子の全部ではないとしてもほとんどをカバーする抗原 をコードする組換えクローンからのＤＮＡフラグメントから構成されるライブラ リーを構築することができる。これらのフラグメントは約５０〜３００ヌクレオ チドサイズであり、適当な読み取り枠内で発現されると、約１７〜１００アミノ 酸のＨＣＶポリペプチドをコードするものであった。したがって、１７〜１００ アミノ酸の範囲の任意の可能なフラグメントが少なくとも１回含まれていること を保証するために十分相違する組換え体を含むライブラリーを構築することがで きる。プローブとしての適当な抗体及び格別反応性のペプチドをコードする ＤＮＡ配列を使用して、格別反応性の抗原を発現する組換え体を選択することが できる。 本発明のペプチドは、ＨＣＶゲノムの推定ＮＳ３領域に位置する。 本発明のペプチドは、ＨＣＶ抗体に対して格別免疫化学的に反応性であること が判明した。この反応性の利点は、本発明のペプチドの１種以上を使用すると、 大きい組換えフラグメントを使用した場合に比較して免疫アッセイの特異性が高 まるという点である。別の利点は、前記ペプチドの１種以上を使用すると、免疫 アッセイの感度が増加するという点である。 本発明は更に、ＨＣＶ抗体に対して免疫化学的に反応性である前記ペプチドの フラグメントを含む。 本明細書中で使用する「フラグメント」なる用語は、本発明のペプチドのサブ 配列（ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｃｅ）を含むアミノ酸配列を意味する。該フラグメン トは、ＨＣＶ ＮＳ３抗原の１個以上の免疫原決定基を有するペプチドである。 本発明は、配列番号７に示すようなアミノ酸配列を有する本発明のフラグメン トを含む特定ペプチドを非限定的に 含む。 これらのペプチドは配列番号６、８、９及び１０に示すようなアミノ酸配列を 含む。当然のことながら、ＨＣＶ患者血清に対して免疫化学反応性を有する本発 明のペプチドの他のフラグメントも本発明に含まれる。 フラグメントは特に、ＤＮＡには制限エンドヌクレアーゼ、ポリペプチドには プロテアーゼを使用して前駆物質分子の酵素切断により生成することができる。 他の方法としては、フラグメントの化学的合成又はＤＮＡフラグメントによるポ リペプチドフラグメントの発現も利用できる。 配列番号６〜１０のペプチドの類似体又は誘導体も本発明に含まれる。 「類似体」なる用語は例えば、ペプチドの発現後修飾、例えばグリコシル化、 アセチル化、リン酸化等を意味する。 請求の範囲には特に含まれないが、該当ペプチドの免疫化学活性に影響しない 限り、ＨＣＶの種々の単離株の株間変異の結果として、本発明のペプチド中の数 個のアミノ酸が欠失していてもよいし、他のアミノ酸又はアミノ酸類似体もしく は誘導体を挿入してもよいし、これらのアミノ酸等で置換してもよいことは自明 である。 更に、これらのペプチドの類似体は、ペプチドの酸付加塩、ペプチドのアミド （特にＣ末端アミド）、エステル（特にＣ末端エステル）、Ｎ−アシル誘導体（ 特にＮ末端アシル誘導体、特にＮ−アセチル誘導体）も意味する。 本発明のペプチドの製造は、公知有機化学ペプチド合成法の１種を応用するか 、又は組換えＤＮＡ技術を使用して実施することができる。後者方法によると、 該当ペプチドの１種以上をコードするポリヌクレオチド配列を含む適切なベクタ ーを用いて、このベクターを適切な宿主に導入することにより組換えポリペプチ ドを発現させ所望のペプチドを製造する。 考えうる有機化学ペプチド合成法は、均一相内又は所謂固相を使用して縮合反 応により必要なアミノ酸のカップリングを行うことである。縮合反応は次のよう に実施することができる。 ａ）縮合剤の存在下で、遊離カルボキシル基又は他の保護された反応基を有す る化合物（アミノ酸、ペプチド）を、遊離アミノ基及び他の保護された反応基を 有する化合物（アミノ酸、ペプチド）と縮合； ｂ）活性化カルボキシル基及び遊離又は他の保護された 反応基を有する化合物（アミノ酸、ペプチド）を、遊離アミノ基及び遊離又は他 の保護された反応基を有する化合物（アミノ酸、ペプチド）と縮合。 カルボキシル基の活性化は特に、カルボキシル基を酸ハロゲン化物、アジド、 酸無水物、イミダゾリド又は活性化エステル（例えばＮ−ヒドロキシスクシンイ ミド、Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール又はｐ−ニトロフェニルエステル）に 変換することにより実施することができる。 上記縮合反応のための最も一般的な方法は、Ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，Ａｎ ａｌｙｓｉｓ，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ．１−３（Ｇｒｏ ｓｓ，Ｅ．及びＭｅｉｅｎｈｏｆｅｒ，Ｊ．編）１９７９，１９８０， １９８ １（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）に記載されているようなカルボ ジイミド法、アジド法、混合酸無水物法及び活性化エステル類を使用する方法で ある。 あるいは、本発明のペプチドは組換えＤＮＡ技術を使用して製造される。 例えば、ペプチドを反復配列に（縦列に）組み込んでもよいし、（著しく大き い）タンパク質又はポリペプチドの成分として製造してもよい。この目的では、 本発明のペプ チドをコードする特定核酸配列を有するポリヌクレオチドを組換えＤＮＡの成分 として使用することができる。 本発明のペプチドをコードするこの型のポリヌクレオチド、及びこのポリヌク レオチドを同様に組み込んだ組換えＤＮＡも本発明の範囲に含まれる。 本発明は更に、Ｃ型肝炎ウイルスのＮＳ−３抗原のＨＣＶ特異的エピトープを 含むペプチド、好ましくは配列番号７に示すようなアミノ酸配列を含むペプチド にも係る。 このペプチドはＨＣＶに対して特異的な抗体と反応するＮＳ−３抗原のエピト ープを含むことが判明した。 従って、このペプチドをＨＣＶの検出のためのスクリーニング試験で使用する と、非ＨＣＶ抗体との交差反応性をなくすか、又は少なくとも最小限にすること ができる。従って、このペプチドを認識するＣ３３単独血清はＨＣＶウイルスに 感染している。この特定ペプチドを（他のＨＣＶ抗原と組み合わせた）アッセイ で使用すると、Ｃ３３単独血清が実際にＨＣＶに感染しているか否かを判定する ために付加的なＰＣＲに基づくアッセイが不要になるので、非常に有利である。 当然のことながら、感染及び非感染Ｃ３３単独血清を区 別するために現在使用されているＰＣＲ試験の代わりに、このペプチドの使用に 基づくイムノアッセイを使用することもできる。 本発明は更に、上記ペプチドの少なくとも１種を含む免疫化学試薬にも関する 。 本発明の「免疫化学試薬」は、本発明の１種以上のペプチドと適切な支持体又 は標識物質を含み得る。 使用可能な支持体は例えば、微量試験ウェルもしくはキュベット、管もしくは 毛管、膜、フィルター、試験ストリップの内壁又は、粒子（例えばラテックス粒 子、赤血球、染料ゾル、金属ゾルもしくはゾル粒子としての金属化合物、ＢＳＡ もしくはＫＬＨ等のキャリヤータンパク質）の表面である。 使用可能な標識物質は特に、放射性同位体、蛍光化合物、酵素、染料ゾル、金 属ゾル又はゾル粒子としての金属化合物である。 本発明は更に、本発明のペプチドをコードする核酸配列、好ましくは配列番号 １、２、３、４及び５に示すＤＮＡ配列の少なくとも一部を含む核酸配列を包含 する。 本明細書中に使用する「核酸配列」なる用語は、リボ核 酸配列及びデオキシリボ核酸配列の両者を含めた任意長のヌクレチオドのポリマ ー形態を意味する。原則として、この用語は分子の一次構造を意味する。即ち、 この用語は２本鎖及び１本鎖ＤＮＡ、２本鎖及び１本鎖ＲＮＡ、並びにその改変 体を含む。 本発明の核酸配列は、天然ではこのような配列が会合又は結合しない種々の複 製実施ＤＮＡ配列と連結することができ、その結果、適切な宿主の形質転換に使 用可能な所謂組換えベクター分子に導くことができる。有用な組換えベクター分 子は好ましくは例えばプラスミド、バクテリオファージ、コスミド又はウイルス に由来する。 本発明の核酸配列をクローニングするために使用可能な特定のベクター又はク ローニングベクターは当業者に公知であり、特にプラスミドベクター（例えばｐ ＢＲ３２２、、種々のｐＵＣ、ｐＧＥＭ及びＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔプラスミド） 、バクテリオファージ（例えばｋｇｔ−Ｗｅｓ、Ｃｈａｒｏｎ ２８及びＭ１３ に由来するファージ）、又はウイルスベクター（例えばＳＶ４０、アデノウイル ス又はポリオーマウイルス）を挙げることができる（Ｒｏｄｒｉｑｕｅｚ，Ｒ． Ｌ．及びＤ．Ｔ．Ｄｅｎｈａｒｄｔ編，Ｖ ｅｃｔｏｒｓ：Ａ ｓｕｒｖｅｙ ｏｆ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ ｖｅｃｔｏｒｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｕｓｅｓ，Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈｓ ，１９８８；Ｌｅｎｓｔｒａ，Ｊ．Ａ．ら，Ａｒｃｈ．Ｖｉｒｏｌ．１１０，１ −２４，１９９０も参照されたい）。本発明の組換えベクター分子の構築に使用 する方法は当業者に公知であり、特にＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．ら（Ｍｏｌｅｃｕ ｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版； Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８９）に 記載されている。 例えば、遺伝子及び所望のクローニングベクターが共に相補ＤＮＡ末端を生成 するのと同一の制限酵素で切断されていると、本発明の核酸配列をクローニング ベクターに容易に挿入することができる。 本発明の組換えベクター分子は更に、所望の形質転換細胞を選択するために使 用可能な１種以上のマーカー活性（例えばｐＵＣ８におけるアンピシリン耐性及 びβ−ガラクトシダーゼのα−ペプチド、例えばｐＢＲ３２２におけるアンピシ リン及びテトラサイクリン耐性）を含み得る。 本発明は更に、対応する核酸配列の発現により本発明のペプチドを産生するこ とが可能な、上記核酸配列又は組換え発現ベクター分子で形質転換された宿主細 胞も含む。 適切な宿主細胞は、ポリペプチドをコードする核酸配列又はこのような核酸配 列を含む組換えベクター分子により形質転換させることができ且つ、所望により 前記核酸配列によりコードされる前記ポリペプチドを発現させるために使用可能 な微生物又は細胞である。宿主細胞は例えば細菌（例えば大腸菌、枯草菌及びシ ュードモナス種）等の原核起源でもよいし、酵母（例えばＳａｃｃｈａｒｏｍｙ ｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）又は高等真核細胞（例えば昆虫、植物又は、Ｈ ｅＬａ細胞及びチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を含む哺乳動物細胞 ）等の真核起源でもよい。昆虫細胞はＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒ ｄａのＳｆ９細胞系を含む（Ｌｕｃｋｏｗら，Ｂｉｏ−ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６ ，４７−５５，１９８８）。 真核クローニング系における本発明の核酸配列のクローニング及び発現に関する 情報は、Ｅｓｓｅｒ，Ｋ．ら（Ｐｌａｓｍｉｄｓ ｏｆ Ｅｕｋａｒｙｏｔｅｓ ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，１９８６）に記載されている。 一般に、本発明で有用な組換えベクター分子を構築するためには原核細胞が好 適である。例えば、ＤＨ５α又はＭＣ１０６１ｋ等の大腸菌Ｋ１２株が特に有用 である。 発現のためには、本発明の核酸配列を発現ベクターに導入する。即ち前記配列 を発現調節配列に作動的に連結する。このような調節配列は、プロモーター、エ ンハンサー、オペレーター、インデューサー、リボソーム結合部位等を含み得る 。従って、本発明は発現制御配列に作動的に連結した上記ペプチドをコードする 核酸配列を含む組換えベクター分子を提供するものであり、該ベクター分子は、 形質転換宿主細胞において該ベクター分子に含まれるＤＮＡ配列を発現させるこ とが可能である。 当然のことながら、クローニングベクターの選択された部位に挿入されたヌク レオチド配列は、形質転換宿主が少なくとも１個の免疫原決定基を有するポリペ プチドを産生する限り、本発明のペプチドをコードする完全核酸配列のフラグメ ントのみを含み得ると理解されたい。 宿主が細菌であるとき、有用な発現調節配列の例としては、Ｔｒｐプロモータ ー及びオペレーター（Ｇｏｅｄｄｅｌら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．８， ４０５７，１ ９８０）；ｌａｃプロモーター及びオペレーター（Ｃｈａｎｇら，Ｎａｔｕｒｅ ２７５，６１５，１９７８）；外層膜タンパク質プロモーター（Ｎａｋａｍｕ ｒａ，Ｋ．及びＩｎｏｕｇｅ，Ｍ．，ＥＭＢＯ Ｊ．１，７７１−７７５，１９ ８２）；バクフリオファージｋプロモーター及びオペレーター（Ｒｅｍａｕｔ， Ｅ．ら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１１，４６７７−４６８８，１９８３ ）； α−アミラーゼ（枯草菌）プロモーター及びオペレーター、終結配列並びに、選 択された宿主細胞に適合可能な他の発現強化及び調節配列が挙げられる。宿主細 胞が酵母であるとき、有用な発現調節配列としては例えばα接合因子が挙げられ る。昆虫細胞の場合には、バキュロウイルスのポリヘドリン又はｐ１０プロモー ターを使用することができる（Ｓｍｉｔｈ，Ｇ．Ｅ．ら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．３，２１５６−６５，１９８３）。宿主細胞が哺乳動物起源である場 合には、有用な発現調節配列としては例えばＳＶ−４０プロモーター（Ｂｅｒｍ ａｎ，Ｐ．Ｗ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２２，５２４−５２７，１９８３）、メ タロチオネインプロモーター（Ｂｒｉｎｓｔｅｒ，Ｒ．Ｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ２ ９６ ，３９−４２，１９８２）又は熱ショ ックプロモーター（Ｖｏｅｌｌｍｙら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ．ＵＳＡ ８２，４９４９−５３，１９８５）が挙げられる。あるいは、ＨＣＶ 中に存在する発現調節配列も利用できる。発現を最大にするためには、Ｒｏｂｅ ｒｔｓ及びＬａｕｅｒ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ６８， ４７３，１９７９）も参照されたい。 ＨＣＶウイルスのＮＳ３タンパク質と特異的に反応し、臨床試料中のＨＣＶの 有無を検出するための免疫診断試験で特に有用な新規モノクローナル抗体は、参 考として本明細書の一部とする本出願人の同時係属ヨーロッパ特許出願第９２． ２０４．１０７．４号に記載されている。 この同時係属特許出願には、Ｃ型肝炎ウイルスのＮＳ３タンパク質のエピトー プと結合するモノクローナル抗体が記載されており、該エピトープは、Ｐｏｒｔ ｏｎ Ｄｏｗｎ（英国）のＥｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａ ｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓに寄託番号９２１２１６０９号で寄託 されたエプスタイン−バールウイルス形質転換ヒトＢリンパ球細胞系により分泌 されるモノクローナル抗体により認識される。 この同時係属出願に記載されている好適モノクローナル抗体は、Ｐｏｒｔｏｎ Ｄｏｗｎ（英国）のＥｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａｎｉ ｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓに寄託番号９２１２１６０９号で寄託され たエプスタイン−バールウイルス形質転換ヒトＢリンパ球細胞系により分泌され る。ＨＣＶＨＵ．ＯＴ３は１９７７年ブダペスト条約の規定に基づいて１９９２ 年１２月１６日にＥＣＡＣＣに寄託された。 このモノクローナル抗体（ＨＣＶＨＵ．ＯＴ３）は、配列番号７に示すような 配列を含む本発明のペプチドを認識する。この抗体を使用して、本発明者らは本 発明のペプチドがＮＳ−３抗原のＨＣＶ特異的エピトープを含むことを確認した 。 本発明は更に、試験流体中のＨＣＶに対する抗体の検出方法に係り、該方法に よると、本発明のペプチドを試験流体と接触させ、ペプチドと試験流体中の抗体 との間で形成された免疫複合体を検出する。 ペプチドと試験流体中の抗体との間で形成された免疫複合体の存在を検出し、 この検出により試験流体中のＨＣＶに対する抗体の存在を確認し、これを判定す ることができ る。 使用する免疫化学試薬の種類及び他の特性に依存して、実施される免疫化学反 応は所謂サンドイッチ反応、凝集反応、競合反応又は阻害反応であり得る。 試験流体中のＨＣＶの検出に特に適切な方法は、標識物質を備える本発明のペ プチドと（試験流体中に存在する）ＨＣＶ抗原との間の競合反応を利用し、ペプ チド及び抗原を固相に結合した抗ＨＣＶ抗体と競合させる。支持体に被覆した抗 体は例えば本発明のモノクローナル抗体であり得る。 本発明は更に、サンプル中のＣ型肝炎ウイルスの検出方法に係り、該方法は、 サンプルを本発明のモノクローナル抗体と接触させる段階と、モノクローナル抗 体とＣ型肝炎抗原との間で形成された免疫複合体を検出する段階とを含む。 試験サンプル中のＨＣＶの検出のために例えばサンドイッチ反応を実施する際 には、使用するテストキットは、例えば微量試験ウェルの内壁である固体支持体 に被覆した本発明のモノクローナル抗体と、結合体としての標識化モノクローナ ル抗体又はそのフラグメントを含む。 ＨＣＶの検出に使用可能なイムノアッセイの別の例は、標識化試薬としてヒト モノクローナル抗体を使用する阻害アッセイである。固相上の抗原とこの試薬と の結合を、テストサンプル中の抗体により競合させることができる。 上述のように、本発明のモノクローナル抗体は診断に非常に適しており、中和 性のこの抗体は受動免疫療法に非常に有用である。 試験流体中のＣ型肝炎ウイルスのＮＳ−３タンパク質のＨＣＶ特異的エピトー プに対する抗体の検出方法も本発明に含まれ、該方法によると、配列番号６〜１ ０に示す配列群とその組み合わせ又は、ＨＣＶ抗体に対して免疫化学的に反応性 である前記配列群のフラグメントもしくは前記配列群の類似体から選択されるア ミノ酸配列を含む本発明のペプチドを、試験流体と接触させ、ペプチドと試験流 体中の抗体との間で形成された免疫複合体を検出する。 本発明の方法を使用すると、Ｃ３３単独血清が実際に感染しているか否かを検 出するためのＰＣＲ試験はもはや不要である。本発明によると、ＮＳ−３タンパ ク質のＨＣＶ特異的エピトープに対する抗体の簡単で正確な検出方法が提供され る。 ＮＳ−３タンパク質のＨＣＶ特異的エピトープに対する抗体は、種々の方法で 検出することができる。本出願人の同時係属出願に記載されているような抗体と 、配列番号６〜１０及びその組み合わせ又は、ＨＣＶ抗体に対して免疫化学的に 反応性である前記配列群のフラグメントもしくは前記配列群の類似体から選択さ れるアミノ酸配列を含むペブチドを使用して、阻害又は競合試験を設計すること もできる。従って、試験流体中のＣ型肝炎ウイルスのＮＳ−３タンパク質のＨＣ Ｖ特異的エピトープに対する抗体の検出方法も本発明に含まれ、該方法によると 、配列番号６〜１０に示す配列群及びその組み合わせ又は、ＨＣＶ抗体に対して 免疫化学的に反応性である前記配列群のフラグメントもしくは前記配列群の類似 体から選択されるアミノ酸配列を含み且つ適切な支持体に被覆した本発明のペプ チドを、ラベル（標識）を備える本発明の抗体及び試験流体と接触させ、固相と 結合したラベルを検出する。 本発明は更に、イムノアッセイを実施するためのテストキットに係り、該テス トキットは少なくとも１種の本発明の免疫化学試薬を含む。 本発明のテストキットは、上記免疫化学試薬を必須成分 として含む。この免疫化学試薬は、本出願人の同時継続出願による抗体又は本発 明のペプチドを含み得る。本発明の種々の免疫化学試薬の組み合わせ、例えば固 体支持体に被覆したペプチドとラベルを備える抗体の組み合わせを含むテストキ ットは当然本発明の範囲に含まれる。 ＨＣＶ抗体を検出するためにサンドイッチ反応を実施する際には、テストキッ トは例えば固体支持体（例えば微量試験ウェルの内壁）に被覆した本発明のペプ チドと、本発明の標識ペプチド又は標識抗抗体を含み得る。別のサンドイッチ反 応試験方式はＨＣＶ抗原の検出であり、本発明のモノクローナル抗体を固体支持 体に被覆し、モノクローナル抗体を結合体として使用する。 例えばサンドイッチ反応は、酵素イムノアッセイに関する本出願人の米国特許 即ちＲＥ３１．００６及びＲＥ３２．６９６（Ｓｃｈｕｕｒｓら）に記載されて いる。 競合反応を実施するためには、テストキットは固体支持体に被覆した本発明の ペプチドと、ＨＣＶに対する標識抗体、好ましくは前記ペプチドに対するモノク ローナル抗体を含み得る。 凝集反応では、テストキットは粒子又はゾルに被覆した 本発明のペブチドを含み得る免疫化学試薬を含む。 テストキットの別の態様は例えば、固体支持体に被覆したＨＣＶに対する抗体 上の結合部位を被検出ＨＣＶ抗原と競合させる競合反応における免疫化学試薬と しての本発明の標識ペプチドの使用である。 例えば米国特許第４，６８３，２０２号及びヨーロッパ特許第３２９，８２２ 号に夫々記載されているようなポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）又は核酸配列に 基づく増幅（ＮＡＳＢＡ）等の核酸増幅法によりＨＣＶ ＤＮＡ又はＲＮＡを検 出するための試験の基本物質として、本発明のアミノ酸配列をコードする新規ヌ クレオチド配列又はその部分を所謂プライマーとして使用することも本発明の範 囲に含まれる。 上記増幅及び検出法を実施するための試験増幅キットも本発明に含まれる。 更に、ＮＡＮＢ肝炎病の予防及び／又は治療における適切な医薬剤形で使用可 能な本発明のペプチド又はそのフラグメントも本発明に含まれる。このようなペ プチド又はそのフラグメントを活性成分として使用して得られるワクチンの製造 は、当業者にとって容易に実施することができる。 図面の簡単な説明 図１は、ＮＳ３タンパク質に対するモノクローナル抗体（参照により本明細書 の一部を構成するものとする本出願人名義の同時係属欧州特許出願第９２．２０ ４．１０７．４号明細書に記載のＨＣＶＨＵ．ＯＴ３）の結合特異性を示すグラ フである。 図２は、組換えイムノブロットアッセイの写真であり、文字Ａ〜Ｇは次のタン パク質を表わす： Ａ：高Ｉｇ対照 Ｄ：ｃ３３ｃ（ＮＳ−３） Ｂ：５−１−１（ＮＳ−４） Ｅ：ｃ２２−３（コア） Ｃ：ｃ１００−３（ＮＳ−４） Ｆ：スーパーオキシドジスムターゼ Ｇ：低Ｉｇ対照。 レーン１は陰性対照血清を表わし、 レーン２は抗ＮＳ−３モノクローナル抗体（本出願人名義の同時係属欧州特許 出願第９２．２０４．１０７．４号明細書に記載のＨＣＶＨＵ．ＯＴ３）を表わ し、 レーン３は抗コアモノクローナル（ＨＣＶＨＵ．ＯＴ２） を表わし、 レーン４はＨＣＶ感染患者由来のポリクローナル血清を表わす。 図３は、ヒト血清中の抗体とＨＣＶＨＵ．ＯＴ３との競合を判定すべく実施さ れる競合アッセイの概略図である。 特異的Ｃ３３エピトープは三角形で表わされており、Ｃ３３上の交差反応性部 位は四角形で表わされている。 以下、実施例によって本発明を更に説明する。 実施例１は、モノクローナル抗体ＨＣＶＨＵ．ＯＴ３の特異的免疫反応性を更 に例証するものである。 実施例２は、Ａにおいては本発明のペプチドを生成するλｇｔ−１１ライブラ リーの構築及びスクリーニングを記載し、Ｂにおいては、ヒト血清及びヒトモノ クローナル抗体（ＨＣＶＨＵ．ＯＴ３）に反応性を示す、ファージλにコードさ れるβ−ガラクトシダーゼＨＣＶ（Ｃ３３誘導）ハイブリッドタンパク質の単離 を記載する。 実施例３は、ＨＣＶＨＵ．ＯＴ３の特異性を説明する。 実施例４においては、ＨＣＶに対する抗体に対する本発明ペプチドの特異的反 応性を、本発明ペプチドを使用したＰＣＲの結果とＥＬＩＳＡの結果との相関を 示すことによ り例証する。 実施例実施例１：Ｂ細胞系の抗ＮＳ−３産生試験 オリゴクローナル及びモノクローナルＩｇＧを含む上清の特異性を下記の試薬 を用いて更に試験した： １）Ｅ．ｃｏｌｉ（Ｏｒｇａｎｏｎ Ｔｅｋｎｉｋａ）中で発現された組換え 精製ＨＣＶ核タンパク質； ２）Ｅ．ｃｏｌｉ（Ｏｒｇａｎｏｎ Ｔｅｋｎｉｋａ）中で発現された組換え 精製ＮＳ３タンパク質； ３）Ｅ．ｃｏｌｉ中で発現された組換え精製ＮＳ−５タンパク質； ４）４種の組換えＨＣＶ抗原： −ＮＳ−４タンパク質から誘導されたｃ１００−３、 −ｃ１００−３の４２アミノ酸フラグメントである５−１−１、 −ＮＳ３タンパク質から誘導されたｃ３３ｃ、及び −ウイルス核タンパク質から誘導されたｃ２２−３を含むニトロセルロース ベースのアッセイである組換えイムノブロットアッセイ（ＲＩＢＡ II ｇｅｎ ｅｒａｔｉｏｎ，Ｏｒｔｈｏ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）。 ニトロセルロースストリップ上には対照としてヒトスーパーオキシドジスムタ ーゼ（ＳＯＤ）も存在した。 結果： ＨＣＶＨＵ．ＯＴ３クローン由来の上清の特異性を上記方法において分析した 。 図１は、本発明の抗体の特異的結合能を示す。モノクローナル抗体ＨＣＶＨＵ ．ＯＴ３の種々のＨＣＶ誘導タンパク質への結合を、それぞれＨＣＶコア及びＮ Ｓ４タンパク質に対して特異的な抗体の結合と比較した。図１から判るように、 モノクローナル抗体ＨＣＶＨＵ．ＯＴ３は組換えＮＳ３タンパク質調製物を認識 し、ＯｒｔｈｏII ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎアッセイにおいて明らかな陽性反応を 示したが、組換えＨＣＶコア及びＮＳ−５タンパク質に対する結合は示さなかっ た。組換えイムノブロット（ＲＩＢＡ II ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）によるＨＣ ＶＨＵ．ＯＴ３上清の分析は、ｃ３３ｃポリペプチドのみへの明らかな結合を示 し、更に、レーン２が本出願人名義の同時係属欧州特許出願第９２．２０４．１ ０７．４号明細書に記載の抗体（ＨＣＶＨＵ．ＯＴ３）を表わす図２から判るよ うに、ｍＡｂの特異性を証明している。実施例２： Ａ．λｇｔ−１１ライブラリーの構築及びスクリーニング Ｂ．ヒト血清及びヒトモノクローナル抗体（ＨＣＶＨＵ．ＯＴ３）に反応性を示 す、ファージλにコードされるβ−ガラクトシダーゼＨＣＶ（Ｃ３３誘導）ハイ ブリッドタンパク質の単離 Ａ．ＨＣＶのＮＳ−３遺伝子の一部をコードする配列（ヌクレオチド３５７３ 〜４８９０）を特異的プライマーを使用してＰＣＲによって増幅した。出発材料 は、原型ＨＣＶ株に感染させたチンパンジー血清からｒｔ−ＰＣＲによって構築 したクローンから得た。ＰＣＲ産物をＴＢＥ−ポリアクリルアミドゲル（８％Ｐ ＡＧＥ）から電気溶離（ｅｌｅｃｔｒｏｅｌｕｔｉｏｎ）によって単離した。こ のＰＣＲ材料の一部（８０μｌのうちの２０μｌ）を制御条件下で消化した（２ ５℃、１０〜６０分間、１ｍＭ ＭｎＣｌ₂， ２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ ｐＨ７.５）及びＤＮＡｓｅ−１（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ ２６３５単位／ｍ ｇ，終濃度：０.６単位）を含む終容積２５μｌ中）。 フェノール／クロロホルム−イソアミルアルコール中で消化を止め、抽出した。 ＤＮＡｓｅ消化はニックトランスレ ーションによって制御した。長さ約５０〜２００塩基対のフラグメントを８％Ｐ ＡＧＥ後に拡散（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｔ．Ｍａｎ ｉａｔｉｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，第二版，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒ ｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８９）によっ て単離した。配列番号７のペプチドをコードするポリヌクレオチド（それぞれ配 列番号６を有するペプチドに対しても同一の方法が使用される）に、供給者（Ｇ ＩＢＣＯ／ＢＲＬ）の推奨に従ってオリゴ−ｄＧをテール付加した。末端Ｅｃｏ Ｒ１部位を結合させたポリＣをプライマーとして使用し、テール付加産物にＰＣ Ｒを実施した。ＥｃｏＲ１消化及びフェノール抽出後、産物をλｇｔ−１１アー ム中にクローニングし、供給者（Ｐｒｏｍｅｇａ）により詳述されているように Ｅ．ｃｏｌｉ中にトランスフェクトした。λｇｔ−１１プライマーを使用してラ イブラリーをＰＣＲすると、長さが挿入フラグメントと一致する塗抹が現れた。 ライブラリーを、ｄｕｐｌｏフィルターにおいてヒトモノクローナル抗体（１： ５０）を用いて標準方法に従ってスクリーニングし、反応をアルカリ性ホスファ ターゼ結合ヤギ抗ヒトＩｇＧを用い て検出した。陽性ファージを再度スクリーニングし、それらの内容を陽性である と同定し、次いでそれらの挿入物をベクターｐＧＥＭ７Ｚｆ（＋）（Ｐｒｏｍｅ ｇａ）に移入した。このベクター中の挿入物の配列を市販キット（Ｐｈａｒｍａ ｃｉａ Ｔ７−配列決定キット）を使用して供給者推奨に従って決定した。 Ｂ．陽性ファージの挿入物を、市販試験により特性分析した選択血清を用いて ウェスターンブロットにかけた（ｃｈａｌｌｅｎｇｅｄ）。このために、以下の ような溶菌増殖（ｌｙｔｉｃ ｇｒｏｗｔｈ）を実施した：接種材料は１ｍｌの ＳＭ緩衝液（１００ｍＭ ＮａＣｌ，８ｍＭ ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ， ５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７.５，０.０１％ゼラチン）中で溶離した単一プラー クであった。これから５０μｌを、４ｍｌ ＬＢ培地（１０ｇ／ｌバクトトリプ トン（Ｂａｃｔｏ−ｔｒｙｐｔｏｎｅ），５ｇ／ｌ酵母抽出物，５ｇ／ｌ Ｎａ Ｃｌ）、４μｌアンピシリン（５０ｍｇ／ｍｌ）、及び２００μｌの、Ｙ１０９ ０一晩培養物を２回濃縮して１０ｍＭ ＭｇＳＯ₄中に溶解したものに加えた。 混合物を３７℃で２時間インキュベートし、２５０ｒｐ ｍで混合し、終濃度１０ｍＭ ＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクト ピラノシド，Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）を用いてβ−ガラクトシダーゼ融合タンパ ク質産生を誘導し、３時間継続した。培養物をエッペンドルフ遠心機において１ ２０００ｇで５分間遠心し、ペレットを１００μｌ試料緩衝液（６２.５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ６.８，２％ＳＤＳ，１０％グリセロール，０.０１％ブ ロモフェノールブルー）中に溶解し、５分間煮沸した。これから５μｌを、まず ウェスターンブロット、次いで標準方法（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒ ｉｔｓｃｈ，Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，第 二版，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅ ｓｓ，１９８９）によって分析した。 １種または数種の市販ＨＣＶ試験において陽性を示し、従ってＣ３３に対する 抗体を含む血清についての結果を表１に示す。かかる試験において陰性の血清も 対照として含まれている。 クローンの配列は配列番号６及び７に与える。 更に、（配列番号７に示したアミノ酸配列を含むペプチドをコードする）配列 番号２に示した配列を、このフラグ メントの末端に特異的なプライマーを使用したＰＣＲによって増幅した。ＰＣＲ フラグメントを制御条件下で消化した（２５℃、３、５及び１０分間、１ｍＭ ＭｎＣｌ₂，２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７.５）及びＤＮＡｓｅ−１（Ｗ ｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ ２６３５単位／ｍｇ，終濃度：０.６単位）を含む終容 積２５μｌ中）。フェノール／クロロホルム−イソアミルアルコール中で消化を 止め、抽出した。フラグメントにオリゴ−ｄＧのテールを供給者推奨に従って付 加した（０.５μｌのＤＮＡ、２μｌの５＊ＴｄＴ緩衝液，２μｌの１ｍＭ ｄ ＧＴＰ、５.２μｌのＨ₂Ｏ、０.３μｌのターミナルトランスフェラーゼ、５単 位／μｌ；Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）。電気泳動によって制御して約１００〜２５０ 塩基対の長さのフラグメントを含むフラクションをプールした。末端ＥｃｏＲ１ 部位を結合させたポリＣをプライマーとして使用し、テール付加産物にＰＣＲを 実施した。ＥｃｏＲ１消化及びフェノール抽出後、産物をλｇｔ−１１アーム中 にクローニングし、供給者（Ｐｒｏｍｅｇａ）により詳述されているようにＥ． ｃｏｌｉ中にトランスフェクトした。λｇｔ−１１プライマーを使用してライブ ラリーをＰＣＲすると、長さが挿入フラ グメントと一致する塗抹が現れた。（それぞれ配列番号６及び７に示したアミノ 酸配列を含むペプチドをコードする）配列番号１及び２の単離に関して記載した ような数種の市販試験によって判定したところでは抗ＨＣＶ（Ｃ３３）抗体を含 む（１：１０００に希釈した）同じ患者の血清を用い、ライブラリーをｄｕｐｌ ｏフィルターにおいて標準方法を使用してスクリーニングした。固定したファー ジにコードされたタンパク質に対する反応は、アルカリ性ホスファターゼ結合ヤ ギ抗ヒトＩｇＧを用いて検出した。陽性ファージを再度スクリーニングし、それ らの内容を陽性として同定し、次いでそれらの挿入物をベクターｐＧＥＭ７Ｚｆ （＋）（Ｐｒｏｍｅｇａ）に移入した。このベクター中の挿入物の配列を市販キ ット（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｔ７−配列決定キット）を使用して供給者推奨に従 って決定した。 宿主細胞層上に個々に独立したファージの斑点が形成された。これらを、数種 の市販試験によって判定したところではＨＣＶ陰性及び陽性の患者の一連の血清 を使用し、標準条件下でイムノスクリーニングした。結果は表２に示す。 更に、陽性ファージの溶菌物にウェスターンブロットによるイムノスクリーニ ングを実施した。溶菌増殖は以下の ように実施した：接種材料は１ｍｌのＳＭ緩衝液（１００ｍＭ ＮａＣｌ，８ｍ Ｍ ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ），５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７.５，０.０１ ％ゼラチン）中で溶離した単一プラークであった。これから５０μｌを、４ｍｌ ＬＢ培地（１０ｇ／ｌ バクトトリプトン，５ｇ／１酵母抽出物，５ｇ／ｌ ＮａＣｌ）、４μｌアンピシリン（５０ｍｇ／ｍｌ）、及び２００μｌの、Ｙ１ ０９０一晩培養物を２回濃縮して１０ｍＭ ＭｇＳＯ₄中に溶解したものに加え た。この混合物を３７℃で２時間インキュベートし、２５０ｒｐｍで混合し、終 濃度１０ｍＭ ＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド；Ｂ ｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）を用いてβ−ガラクトシダーゼ融合タンパク質産生を誘導 し、３時間継続した。培養物をエッペンドルフ遠心機において１２０００ｇで５ 分間遠心し、ペレットを１００μｌ試料緩衝液（６２.５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ ｌ，ｐＨ６.８，２％ＳＤＳ，１０％グリセロール，０.０１％ブロモフェノール ブルー）中に溶解し、５分間煮沸した。これから５μｌを、まずウェスターンブ ロット、次いで標準方法（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｔ ．Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃ ｌｏｎｉｎｇ，第二版，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａ ｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８９）によって分析した。これらのイムノブロット にかけた血清（１：１００希釈物）は１種または数種の市販ＨＣＶ試験において 陽性であったが、かかる試験において陰性の血清（１：１００希釈物）も対照と して使用した。この分析結果を表３に示す。 Ａ及びＢ：上述のごとく得られた組換え体によってコードされるβ−ガラクト シダーゼ融合タンパク質を、抗β−ガラクトシダーゼアフィニティーカラムを使 用して標準方法に従って精製した。かかる精製抗原を酵素結合イムノ吸着アッセ イ（ＥＬＩＳＡ）プレート上にコートさせ、非Ａ非Ｂ型肝炎患者由来の血清と反 応させた。このＥＬＩＳＡの使用により、かかる患者の血清と正常ヒト血清対照 とを区別し得る。方法は更に後述する。 配列番号７の配列に従うペプチド（配列番号６、８〜１０をもつペプチドに対 しても同一の方法が使用される）を１００ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ９.６中に７.５ μｇ／ｍｌで溶解し、このペプチド溶液１３５μｌをＮＵＮＣマイクロタイター プレートの各ウェルに仕込んだ。４℃で一晩、ペ プチドをマイクロタイタープレートへ結合させた。 次いでプレートを、０.２Ｍ Ｔｒｉｓ ｐＨ７.４／０.２Ｍ ＮａＣｌ中の ０.０５％Ｔｗｅｅｎ ２０^(R)溶液を用いて室温で５分間ブロックした。次いで プレートを２５０μｌ／ウェルの０.２Ｍ Ｔｒｉｓ ｐＨ７.４／０.２Ｍ Ｎ ａＣｌで１回、０.０４Ｍ Ｔｒｉｓ ｐＨ７.４で２回洗浄し、乾燥した。非Ａ 非Ｂ型肝炎ウイルスに特異的な抗体を測定するため、血清試料を試料希釈液（リ ン酸緩衝塩水溶液（ＰＢＳ）／２０％正常ヤギ血清／１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１０ ０）で希釈し、ウェルにピペット添加し（１００μｌ／ウェル）、３７℃で１時 間インキュベートした。ウェルをＰＢＳ／０.０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０^(R)で洗 浄してから、結合ヒト抗体を、試料希釈液で希釈したペルオキシダーゼ標識ヤギ 抗ヒト免疫グロブリンを用いて検出した（１００μｌ／ウェル、３７℃で１時間 ）。プレートをＰＢＳ／０.０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０^(R)で４回洗浄した。ＴＭ Ｂをペルオキシダーゼ酵素の基質として添加し、室温で３０分間反応させた。各 ウェルに１００μｌの２Ｍ Ｈ₂ＳＯ₄を添加することにより反応を停止させた。 Ｏｒｇａｎｏｎ Ｔｅｋｎｉｋａマイクロエリザ読取り装置において ４５０ｎｍで黄色を読み取った。 非Ａ非Ｂ型肝炎患者由来の血清では陽性結果が得られるが、２０人の正常ヒト 血清の結果は陰性である。 対照として、２つの未関連ペプチドを用いて上記方法を繰り返し得る。いずれ のケースも、正常ヒト血清とＮＡＮＢＨ患者由来の血清試料とで得られる特異的 認識に有意な差は認められない。上記結果から、本発明の前記ポリペプチドはＨ ＣＶ抗体に対して免疫化学的に極めて反応性であり、単独で、または診断試験キ ットと組み合わせて使用し得るという結論は正しいと見られる。 非Ａ非Ｂ型肝炎患者由来の血清においては特異的認識は陽性であるが、２０人 の正常ヒト血清の結果は陰性である。 実施例３：Ｈｕ ＯＴ３競合アッセイ 組換えＣ３３抗原（Ｃｈｉｒｏｎ，欧州特許出願公開第３１８．２１６号明細 書）を精製し、炭酸緩衝液ｐＨ９.６中の濃度１μｇ／ｍｌでＥＬＩＳＡプレー ト上にコートした。（本出願人名義の同時係属欧州特許出願第９２．２０４．１ ０７．４号明細書に従う抗体である）ＨｕＯＴ３を標準方法を使用してＨＲＰで 標識した。 概要：培養上清をプロテインＡ−セファロースカラムにＡＴで添加した。カラ ムを洗浄し（３Ｍ ＮａＣｌ １.５ＭグリシンｐＨ８.９）、次いで４Ｍ Ｎａ ＯＨを含む０.１Ｍクエン酸緩衝液ｐＨ４.０を使用して溶出した。フラクション を飽和Ｔｒｉｓ中に最終ｐＨ７.０まで回収した。フラクションをＡｍｉｃｏｎ マイクロ濃縮機において濃縮し、ＰＤ−１０カラムにおいて脱塩した。マイクロ ＢＣＡアッセイを使用してＩｇＧ濃度を測定した。Ｎａｋａｎｅの結合体形成方 法を使用し、ＨＲＰ：ＩｇＧモル比＝４：１でモノクローナル抗体をＨＲＰに結 合した。 ＨＣＶ患者由来の血清がＨｕＯＴ３と競合する抗体を含むかどうか判定するた め、Ｃ３３組換え抗原をコートさせたＥＬＩＳＡプレートを、ＰＢＳ／Ｔｗｅｅ ｎ ２０で１ ０倍に希釈したヒト血清と、約１.０のＡ４９２（Ｃ_t）をもたらすＨＲＰ標識Ｈ ｕＯＴ３の適当な希釈液との混合物と一緒にインキュベートした。 競合アッセイの概略を図３に示す。特異的Ｃ３３エピトープは三角形で示され ており、Ｃ３３上の交差反応部位は四角形で示されている。Ｃ３３は認識するが ＰＣＲ陰性であるＣ３３のみの血清は、図３に示したような「四角形」の交差反 応性エピトープに対する抗体を含み得る。 上述のＣ３３ＥＬＩＳＡのマイクロタイターウェルを、検査対象の特定の未標 識競合血清と一緒にプレインキュベートした。３０分後、ＨＲＰ標識ＨｕＯＴ３ を添加し、標識抗体及び未標識抗体を更に３０分間、結合について競合させる。 １００％競合を判定するため、１００倍モル過剰量のヒトモノクローナル抗体を 使用した。 以下のパラメータを測定した： Ａ：競合抗体を存在させずに特定のＨＲＰ標識モノクローナル抗体をＣｔで試 験したときに得られるＡ４９２：０％競合。 Ｂ：マイクロタイターウェルを１００倍過剰量の同じモノクローナル抗体（未 標識）と一緒にプレインキュベート したときに得られるＡ４９２：１００％競合。 Ｃ：マイクロタイターウェルを競合抗体（未標識）と一緒にプレインキュベー トしたときに得られるＡ４９２。 特定の競合血清の競合率は以下のように計算した： 競合率％＝［１−（Ｃ−Ｂ）／（Ａ−Ｂ）］×１００％ このアッセイは、１０個の正常対照血清と、１０個の、ＰＣＲ陽性及びＲＩＢ Ａ陽性であることが判っていたＨＣＶ患者由来の血清とで有効性が証明された。 全てのＰＣＲ陽性血清はＨｕＯＴ３抗体と競合したが、対照は競合せず、この ことから、ＨｕＯＴ３抗体はＮＳ−３抗原上の重要な免疫優勢エピトープを認識 すると結論し得る。 前述のごとき方法を使用する競合アッセイにより、７９個のＣ３３のみの血清 を試験し、得られた結果を、ＰＣＲ試験においてかかる血清によって得られた結 果と比較した。これらの７９個の血清のうち１１の血清がＰＣＲ陽性であり、６ ８の血清がＰＣＲ陰性であった。（１つを除いて）全てのＰＣＲ陰性血清は競合 アッセイにおいてＨｕＯＴ３抗体と競合せず、全てのＰＣＲ陽性血清は競合アッ セイに おいてＨｕＯＴ３抗体と競合した。この競合結果を表４に示す。 実施例４：クローン化エピトープを用いたＥＬＩＳＡ 本実施例においては、配列番号７に示したアミノ酸配列を有するペプチドを使 用したＥＬＩＳＡにより、ＰＣＲ陽性及びＰＣＲ陰性血清由来のＣ３３抗体を区 別する能力を更に示す。 配列番号７に示した配列をもつペプチドをコードする核酸配列を含むクローン を、溶原性λｇｔ１１ファージによりβ−ガラクトシダーゼ融合タンパク質とし て発現させた。融合タンパク質を抗β−ｇａｌアフィニティーカラム（Ｐｒｏｍ ｅｇａ）を使用して製造業者指示に従って精製した。精製融合タンパク質を炭酸 緩衝液で１μｇ／ｍｌに希釈し、マイクロタイターＥＬＩＳＡプレートにコート させた。血清を１：３４に希釈し、標準ＥＬＩＳＡ法により試験した。 特異的抗体の結合を、ヤギ抗ヒトペルオキシダーゼ結合体を用いて測定した。カ ットオフ値は、２０個の正常血清によって得られた平均値＋標準偏差の５倍とし て統計的に決定した。 ３０個のＣ３３のみの血清を上述のごとく試験し、結果を、Ｃ３３ ＲＩＢＡ （組換えイムノブロットアッセイ）を使用して得られた結果と比較した。結果は 表５に示す。この表から明らかなように、ＲＩＢＡ抗原はＰＣＲ陽性血清とＰＣ Ｒ陰性血清とを区別せず、特異的抗体も非特異的抗体も検出した。ＯＴ３抗原は 、９個のＰＣＲ陽性血清のうち９個を識別し、２１個のＰＣＲ陰性血清では１つ と反応しただけであった。 配列表 配列番号：１ 配列の長さ：241 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA ハイポセチカル：No アンチセンス：No 起源 ・生物名：Escherichia coli ・株名：JM101 配列： 配列番号：２ 配列の長さ：274 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA ハイポセチカル：No アンチセンス：No 起源 ・生物名：Escherichia coli ・株名：JM101 配列： 配列番号：３ 配列の長さ：201 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA ハイポセチカル：No アンチセンス：No 起源 ・生物名：Escherichia coli ・株名：JM101 配列： 配列番号：４ 配列の長さ：195 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA ハイポセチカル：No アンチセンス：No 起源 ・生物名：Escherichia coli ・株名：JM101 配列： 配列番号：５ 配列の長さ：153 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA ハイポセチカル：No アンチセンス：No 起源 ・生物名：Escherichia coli ・株名：JM101 配列： 配列番号：６ 配列の長さ：79 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 卜ポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド ハイポセチカル：No 配列： 配列番号：７ 配列の長さ：90 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド ハイポセチカル：No フラグメント型：中間部フラグメント 配列： 配列番号：８ 配列の長さ：67 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド ハイポセチカル：No フラグメント型：中間部フラグメント 配列： 配列番号：９ 配列の長さ：65 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド ハイポセチカル：No フラグメント型：中間部フラグメント 配列： 配列番号：10 配列の長さ：51 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド ハイポセチカル：No フラグメント型：中間部フラグメント 配列：

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ｃ１２Ｎ 7/00 8931−4Ｂ 15/09 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 9282−4Ｂ 21/08 9358−4Ｂ // Ａ６１Ｋ 39/395 Ｓ 9284−4Ｃ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ 8310−2Ｊ 33/576 Ｚ 8310−2Ｊ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＡＵ，ＣＡ，ＦＩ，ＪＰ，Ｋ Ｒ，ＵＳ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．ＨＣＶ抗体に対して免疫化学的反応性を示す配列番号７に示したアミノ酸配 列を有するペプチド、またはそのフラグメントもしくは類縁体。 ２．ＨＣＶ抗体に対して免疫化学的反応性を示す配列番号６、８、９、１０に示 した配列群及びそれらの組合せ、または前記配列群のフラグメントもしくは前記 配列群の類縁体から選択されるアミノ酸配列を有するペプチド。 ３．請求項１または２に記載のペプチドを含む免疫化学試薬。 ４．請求項１または２に記載のペプチドをコードする核酸配列。 ５．配列番号２に示したＤＮＡ配列の少なくとも一部を含む、請求項４に記載の 核酸配列。 ６．配列番号１、３、４、５に示したＤＮＡ配列の少なくとも一部を含む、請求 項４に記載の核酸配列。 ７．請求項４から６のいずれか一項に記載の核酸配列を含む組換えベクター分子 。 ８．請求項７に記載のベクターを用いて形質転換された宿主細胞。 ９．請求項１または２に記載のペプチドに対するモノクローナル抗体。 １０．請求項９に記載の抗体を分泌し得る不死化細胞系。 １１．請求項９に記載のモノクローナル抗体を含む免疫診断試薬。 １２．検査液中のＨＣＶに対する抗体を検出する方法であって、請求項１または ２に記載のペプチドを検査液と接触させ、前記ペプチドと該検査液中の抗体とで 形成された免疫複合体の存在を検出する方法。 １３．試料中のＣ型肝炎ウイルスを検出する方法であって、試料を、請求項９に 記載のモノクローナル抗体と接触させ、前記モノクローナル抗体とＣ型肝炎抗原 とで形成された免疫複合体を検出することからなる方法。 １４．検査液中のＣ型肝炎ウイルスのＮＳ−３タンパク質のＨＣＶ特異的エピト ープに対する抗体を検出する方法であって、請求項１または２に記載のペプチド を検査液と接触させ、前記ペプチドと該検査液中の抗体とで形成された免疫複合 体の存在を検出する方法。 １５．検査液中のＣ型肝炎ウイルスのＣ３３タンパク質のＨＣＶ特異的エピトー プに対する抗体を検出する方法であっ て、適当な支持体上に塗層した請求項１または２に記載のペプチドを、検査液と 、標識化した請求項９に記載の抗体とに接触させ、固相に結合した標識を検出す ることからなる方法。