KR960015513B1 - 한국형 c형 간염 진단시약 및 백신 - Google Patents

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한국형 C형 간염 진단시약 및 백신

제1도는 본 발명에서 제조한 각각의 한국형 C형 간염 바이러스 cDNA 클론 절편과 KHCV-LBC1에서의 상대적 위치를 나타낸다 .

제2-1도 내지 제2-16도는 KHCV-LBC1의 뉴클레오티드 서열 및 그에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 나타낸다.

제3도는 제1도의 각 cDNA 클론의 절편의 KHCV-LBC1에서의 위치를 뉴클레오티드 서열 번호로 표시한 것이다.

제4도는 한국형 C형 간염 바이러스(KHCV-LBC1), 미국형 C형 간염 바이러스(HCPT-CHIRON) 및 일본형 C형 간염 바이러스(JHCV-NCI, JHCV-OSAKA)의 핵산 뉴클레오티드 서열의 상사성(homology)을 비교한 결과를 나타낸다.

제5도는 한국형 C형 간염 바이러스(KHCV-LBC1), 미국형 C형 감염 바이러스(HCPT-CHIRON) 및 일본형 C형 간염 바이러스(JHCV-NCI, JHCV-OSAKA)의 핵산 뉴클레오티드 서열로부터 유추한 아미노산 서열의 상사성을 비교한 결과를 나타낸다.

제6도는 한국형, 미국형 및 일본형 C형 간염 바이러스 cDNA의 5'-말단 서열을 비교한 결과를 나타낸다.

제7도는 단편 NS2-LBC2의 뉴클레오티드 서열 및 이로부터 유추된 아미노산 서열을 나타낸 것이고,

제8도는 단편 NS2-LBC3의 뉴클레오티드 서열 및 이로부터 유추된 아미노산 서열을 나타낸 것이고,

제9도는 단편 NS2-LBC20의 뉴클레오티드 서열 및 이로부터 유추된 아미노산 서열을 나타낸 것이고,

제l0도는 단편 NS2-LBC21의 뉴클레오티드 서열 및 이로부터 유추된 아미노산 서열을 나타낸 것이고,

제11도는 단편 NS2-LBC23의 뉴클레오티드 서열 및 이로부터 유추된 아미노산 서열을 나타낸 것이고,

제12도는 단편 NS2-LBC25의 뉴클레오티드 서열 및 이로부터 유추된 아미노산 서열을 나타낸 것이고,

제13도는 단편 NS2-LBC26의 뉴클레오티드 서열 및 이로부터 유추된 아미노산 서열을 나타낸 것이고,

제14도는 단편 NS2-LBC27의 뉴클레오티드 서열 및 이로부터 유추된 아미노산 서열을 나타낸 것이고,

제15도는 단편 NS2-LBC28의 뉴클레오티드 서열 및 이로부터 유추된 아미노산 서열을 나타낸 것이고,

제16도는 단편 NS2-LBC29의 뉴클레오티드 서열 및 이로부터 유추된 아미노산 서열을 나타낸 것이고,

제17도는 단편 NS2-LBC30의 뉴클레오티드 서열 및 이로부터 유추된 아미노산 서열을 나타낸 것이고,

제18도는 단편 NS2-LBC31의 뉴클레오티드 서열 및 이로부터 유추된 아미노산 서열을 나타낸 것이고,

제l9도는 단편 NS2-LBC32의 뉴클레오티드 서열 및 이로부터 유추된 아미느산 서열을 나타낸 것이고,

제20도는 단편 NS5-LBC20의 뉴클레오티드 서열 및 이로부터 유추된 아미노산 서열을 나타낸 것이고,

제21도는 단편 NS5-LBC21의 뉴클레오티드 서열 및 이로부터 유추된 아미노산 서열을 나타낸 것이고,

제22도는 단편 NS5-LBC23의 뉴클레오티드 서열 및 이로부터 유추된 아미노산 서열을 나타낸 것이고,

제23도는 단편 NS5-LBC25의 뉴클레오티드 서열 및 이로부터 유추된 아미노산 서열을 나타낸 것이고,

제24도는 단편 NS5-LBC27의 뉴클레오티드 서열 및 이로부터 유추된 아미노산 서열을 나타낸 것이고,

제25도는 단편 NS5-LBC28의 뉴클레오티드 서열 및 이로부터 유추된 아미노산 서열을 나타낸 것이다.

제26도는 한국형 HCV 아형들의 NS2 지역의 아미노산 서열을 비교한 것이고,

제27도는 HCV 아형군 KHCV-L1에 속하는 한국형 HCV 아형들의 NS2 지역의 뉴클레오티드 서열을 비교한 것이고,

제28도는 HCV 아형군 KHCV-L2에 속하는 한국형 HCV 아형들의 NS2 지역의 뉴클레오티드 서열을 비교한 것이고,

제29도는 한국형 HCV 변종들의 NS5 지역의 뉴클레오티드 서열을 비교한 것이다.

제30도는 한국형 C형 간염 바이러스의 cDNA를 효모에서 발현시키기 위해 제조한 발현 벡터의 구조를 나타낸 것이다.

제31도는 효모 발현 벡터를 이용하여 한국형 C형 간염 바이러스의 cDNA를 발현시킨 후 SDS 폴리아크릴아미드 젤 전기 영동(A) 및 웨스턴 블럿팅(B)한 결과를 나타낸다.

제32도는 효모 세포내에서 HCV E2N 및 E2C 단백질의 생성을 확인한 SDS 폴리아크릴아미드 젤 전기영동(A) 및 웨스턴 블럿팅(B)한 결과를 나타낸다.

제33도는 합성한 유비퀴틴 유전자의 서열을 나타낸다.

제34도는 trp 프로모터를 이용하여 한국형 C형 간염 바이러스의 cDNA를 대장균에서 발현시키기 위한 발현 벡터의 구조를 나타낸 것이다.

제35도는 tac 프로모터를 이용하여 한국형 C형 간염 바이러스의 cDNA를 대장균에서 발현시키기 위한 발현 벡터의 구조를 나타낸다.

제36도 내지 제38도는 trp 프로모터를 갖는 발현 벡터를 사용하여 대장균내에서 KHCV cDNA를 발현시킨 후 SDS-PAGE한 결과를 나타내며,

제39도 내지 제41도는 상기 제36도 내지 제38도의 젤을 웨스턴 블럿팅한 결과를 나타낸다.

제42도는 tac 프로모터를 갖는 발현 벡터를 사용하여 MBP 유전자와 융합된 KHCV cDNA 단편을 대장균내에서 발현시킨 후 SDS-PAGE한 결과를 나타내며,

제43도는 상기 제42도의 젤을 웨스턴 블럿팅한 결과를 나타낸다.

제44도는 KHCV 항원을 하나씨 혹은 혼합하였을 때의 단백질 농도에 따른 C형 간염 바이러스 항체의 효소면역 측정법에 의한 표준 곡선이고,

제45도는 항원(KHCV 897) 단백질 농도에 따른 단일클론 항체의 샌드위치 효소면역 측정의 표준 곡선이다.

본 발명은 유전자 재조합 기술에 의하여 제조된 비 A 비 B형 간염 바이러스(Non-A, Non-B Hepatitis Virus, NANBHV) 또는 C형 간염 바이러스(Hepatitis C Virus, HCV)라 불리는 간염 바이러스(본 명세서에서는 C형 간염 바이러스, 즉 HCV로 통일하기로 함)의 cDNA 유전자 클론 및 그 뉴클레오티드 서열, 이에 의해 코딩되는 단백질, 이들 항원 단백질을 이용한 항체, 이들을 이용한 한국형 C형 간염 진단시약 및 백신에 관한 것이다.

보다 상세하게는 본 발명은 한국인 C형 간염환자가 보유하고 있는 혈액속의 바이러스 입자를 분리하여 RNA(리보핵산)를 추출한 다음, 이로부터 합성된 cDNA 클론 및 그의 뉴클레오티드 서열, 이를 대장균등의 원핵세포나 효모 및 동식물세포등의 진핵세포내에서 발현시켜 제조한 단백질을 이용하여 개발한 한국형 C형 간염 진단을 위한 진단시약 및 백신에 관한 것이다.

또한 본 발명은 상기 HCV 단백질을 이용하여 HCV 항원에 특이적으로 결합하는 항체를 제공하여 보다 정확하고 신속하게 C형 간염을 측정할 수 있는 진단시약에 관한 것이다.

일반적으로, 바이러스성 간염은 A형 바이러스(Hepatitis A Virus, HAV), B형 바이러스(Hepatitis B Virus, HBV), 델타 바이러스(Hepatitis Delta Virus, HDV), E형 바이러스(Hepatitis E Virus, HEV), 사이 토메갈로 바이러스(Cytomegalo Virus, CMV) 및 엡스틴바 바이러스(Epstein-Barr Virus, EBV) 등에 의하여 감염되어 발병하는 것으로 알려져 왔으며,1980년대에 이르러서야 이들의 각 유전자들이 규명됨으로써 진단시약 및 백신이 개발되어 각종 바이러스 질환의 진단 및 예방에 크게 기여하게 되었다.

그러나, 상기와 다른 형태의 간염, 즉 C형 간염이 수혈후 간염의 80 내지 90%를 차지함이 밝혀졌으며(Lancet, 838-841(1975)), C형 간염환자중 약 50%는 간경변증(Cirrhosis) 및 간암(hepatocellular carcinoma)으로 전이되는 것으로 알려지고 있다.

이 C형 간염은 C형 간염환자의 혈액내에 존재하는 바이러스의 수가 적고, 이들 바이러스의 항원 및 항체에 대하여 잘 알려져 있지 않았기 때문에 최근까지 그 작용기작이 밝혀지지 않았으며, 따라서 그 예방 및 치료제 개발에 커다란 어려움이 있었다.

그러나, 사람의 C형 바이러스가 침팬지에게도 감염될 수 있다는 사실이 밝혀지고(참조: Alter, H. J. et al., Lancet,459-463(1978) ; Tabor,E. et al.,Lancet,463-466(1978); Hollinger,F. B. et al.,InTErvirology, 60-68(1978); Wyke, R.J. et al., Lancet,520-524(1979); Bradley, D .W. et al., J. Med,Virol., 253-269(1979)), 그후 브래들리등(Bradley, D. W. et al., Gastroenterology,773-779(1985)) 이 C형 간염으로 진단받은 환자의 혈장을 침팬지에 감염시켜, 이로부터 간염 혈청을 대량 확보하고 바이러스를 분리, 회수하는 방법을 확립하여 바이러스의 생화학적 및 물리화학적 성질을 규명함으로써 유전 공학적 연구를 통한 분자수준에서의 분석 및 이에 따른 의약적 응용의 길이 열리게 되었다.

츄(Choo, Q. L.)등은 브래들리등의 상기 방법을 사용하여 침팬지 혈청으로부터 대량의 미국인 C형 간염 바이러스를 확보한 후 C형 간염 바이러스의 RNA를 추출하여 부분적인 cDNA를 클로닝하였고, 클로닝된 부분적인 유전자 절편을 대장균 및 효모에서 발현시켜 생성된 단백질이 C형 간염으로 진단된 환자 혈청으로부티 얻은 항체와 반응함을 입증하였다.(Science244,359-362(1989)).

쿠오등(Kuo. G., et al, Science244,362-364(1989))은 미합중국 카이론사가 동정한 C형 간염 바이러스의 부분적인 유전자 절편을 슈퍼옥사이드 디스뮤타제(SOD) 유전자와 융합하여 효모에서 재조합 SOD 융합단백질인 C100-3를 발현시켜, C형 환자의 혈청과 반응함을 증명하였고, 수혈성 감염(PTH)환자의 70% 이상의 혈청이 이 항원(C100-3)과 반응함을 밝혔다.

이어 미국 카이론사의 호튼 엠 등(PCT WO 89/04669; WO 90/11089)은 침팬지로부터 분리 및 동정된 HCV 유전자로부터 코딩되는 향원들의 백신 및 HCV 항체 진단시약 제조의 유용성을 기술하였다. 즉, HCV 항체 검정 진단시약에 사용된 항원은 C100-3로 명명된 항원으로서, HCV의 비구조 단백질을 코딩하는 부분(NS4)의 cDNA 절편을 인간 SOD 전체 유전자와 융합하여 효모에서 발현시킨 분자량 54,000달톤의 폴리펩티드이며 이를 이용하여 다음과 같은 면역 측정 방법 원리를 이용하여 시료내 HCV 항체를 검정함을 설명하였다..

측정 방법의 원리는 항원인 C100-3를 고체 지지체인 96웰 마이크로플레이트 각 웰에 피복시켜, 검정코자하는 시료내의 항체가 면역학적으로 반응하여 결합되게 반응시킨 후, 각 웰들을 세척하고 난 다음 방사능 또는 서양고추냉이 과산화효소가 표지된 항-인체 감마 면역글로블린(Anti-Human IgG)과 항원에 결합된 인체 항체(Anti-HCV)와 면역성 결합이 이루어지게 함으로써 최종 방사능 양이나 서양고추냉이 과산화효소 역가를 측정함으로써 인체 혈청내 C형 간염 바이러스 항체를 검정하는 진단 방법이다.

이를 이용하여 미합중국 오르토 다이어그노스틱 시스템스 인코포레이티드(Ortho Diagnostic Systems lnc.)는 HCV 항제 검정용 면역효소 진단시약을 1990년초 개발하여 HCV 연구에 널리 이용하게 하였다. 그러나 상기 진단 방법에 사용된 C100-3 항원은 만성으로 진행된 환자 혈청내의 항체와의 반응만 일어나 초기의 급성 C형 간염환자를 검정 못하는 점과 SOD 융합단백질로 인한 위양성이 문제점으로 지적되었다(Shimizu,Y. K.,et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA87, 6441(1990)).

한편, 일본의 여러 연구팀들은 C형 간염으로 진단된 일본인 혈청으로부터 상기의 방법과 동일한 방법으로 부분적인 cDNA를 클로닝하였으며(참조: Kubo, Y. et al., Nucl. Acid. Res.17, l0367-l0372(l989); Kato, N. et al., Proc. Japan. Acad.65, 219-223(1990); Kaneko, S. et al., Lancet335,976(1990); Takeuchi, K.et al., Gene.91, 287-291(1990); Takenchi, K. et al., Nucl Acid. Res.18, 4626(l990); Takamizawa, A. et al., J. Virol.65, 1105-1113(1991)), 간염 바이러스 5'-말단 부위 및 핵항원, 표면 항원을 코딩하는 구조 유전자(structural gene) 염기 서열을 밝혀내어, 미합중국 카이론사가 밝힌 침팬지 타입의 C형 간염 바이러스의 염기 서열 및 아미노산 서열과 약 10∼15% 차이가 나는 것을 밝힘으로써 아종의 C형 간염 바이러스 존재 및 이로 인한 백신 및 항체 진단시약용 항원의 특이성을 주장하였으며(Okamoto. H., et al., Jpn. J. Exp. Med,60, 167-177(1990)), 이로부터 유래되는 항원들을 진단시약 제조 및 백신 제조용 특이 항원으로 기술하고 있다.

그후 HCV의 5'-말단 부위의 구조 유전자에 위치한 핵항원(Core)을 사용하여 C형 간염 바이러스에 대한 항체(anti-HCV)를 진단한 결과, Cl00-3 경우보다 약 6∼8주 빨리 항체를 진단할 수 있다는 보고가 있었으며(Harada, S.,et al., J. Virol.65, 30l5(1991)) C100-3을 단독 사용한 제1세대 항체(Anti--HCV) 진단 시약의 또 다른 단점인 만성 C형 간염환자에만 항체 양성 반응을 보이는 것을 개선하고자, 핵항원(Core)이 함유된 제2세대 진단시약 개발을 많은 연구조 및 회사들이 하고 있는 상태이다. 예를 들면, 미합중국 애보트 라보러토리스(Abbott Lab.)는 기존의 C100-3 항원 단독 사용한 진단방법(제1세대)보다 특이도 및 민감도가 개선된 진단방법을 기술하고 있다(Lesniewski R. R., et al., EP 725354(1990)).

또한 미합중국 UBI사(United Biomed. Inc.)는 5개의 아미노산으로 구성된 상이한 10종의 HCV 항원 에피토프를 가진 15∼65개 아미노산으로 구성된 폴리펩티드를 화학 합성하여, 이들을 항체(Anti-HCV)진단의 항원으로 사용함으로써 개선된 진단 방법을 개발하였음을 기술하고 있다(Wang, C. Y., EP442394 (1991)).

즉, 상기 발명들은 제1세대 진단시약에서 C100-3 항원을 단독으로 사용하였을 때보다, HCV 항원 에피토프부위를 갖는 서로 상이한 폴리펩티드를 고유의 조합으로 혼합하여 HCV 항체 진단에 사용함으로써 진단방법을 개선시킬 수 있음을 개시하고 있다.

또한, 구조 단백질의 일종으로서 바이러스의 표면에 당 단백질의 형태로 존재하는 외피(envelope) 단백질은 백신개발의 일차적인 목표가 될 것으로 추측하고 있다. HCV와 비슷한 바이러스인 플라비바이러스(Flavivirus)의 경우 외피 단백질과 제1비구조 단백질이 숙주세포내에서 면역기작의 유도에 관여하는 것으로 알려져 있고, 또한 숙주 세포의 수용체 결합에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있으므로(F. Preugschart, J. Virol.65, 4749-4758(1991)), HCV의 경우도 이들 외피 또는 제1비구조 단백질이 바이러스 감염시 숙주 세포의 면역기작을 유도하는 에피토프를 가지고 있을 것으로 예견되어 왔다. 또한 이 단백질에 대한 항체의 형성은 C형 간염의 회복과 밀접한 관련이 있다는 보고가 있었다(Lesniewski, R. et al., p59; Watanabe et al., P.82 제 3 회 국제 HCV 심포지움, Strasbourg, France 1991). 호톤(Houghton)등은 외피 단백질중에서도 특히 외피 2 단백질의 아미노 말단 부분경우 종상이성(Species heterogeneity)이 두드러져 면역기작과 밀접한 관련이 있는 것으로 추정하고 백신개발에 일차적 목표가 될 가능성을 제시한 바 있다(제3회 국제 HCV 심포지움, p20, Strasbourg, France,1991).

예를 들면 일본형 HCV의 염기 서열과 미국형 HCV의 염기 서열을 비교했을때, 핵 단백질의 경우 91% 정도의 유사성을 보이나 외피 단백질의 경우 단지 74% 정도의 유사성을 보이는 것으로 밝혀졌는데, 이러한 사실은 외피 단백질의 경우 특히 높은 균주특이성을 보이는 것을 시사해준다(Takeuchi, K. et al., Journal of General Virology,71, 3027 -3033(1990) ) .

본 발명은 이러한 사실에 의거하여 한국인에 고유한 C형 간염 바이러스를 규명하여 미국형 및 일본형 C형 간염 바이러스에 의해 코딩되는 단백질을 이용한 진단시약 및 백신보다 한국인의 C형 간염에 대한 감지도 및 정확도가 높고 효과가 우수한 진단시약 및 백신을 개발하고자 브래들리등의 방법(Bradley, D. W. et al., Gastroenterology.88, 773-779(1985))에 의해, C형 감염 증세로 진단된 한국인 환자들의 혈청으로부터 바이러스 입자를 분리하여, 전체 바이러스 RNA을 추출한 다음 무작위 프라이머(random primer) 또는 올리고 d(t) 프라이머를 사용하여 C형 간염 바이러스 cDNA 라이브러리를 제조하였다.

그런 다음, C형 간염환자 혈청을 사용하여 C형 간염환자 혈청과 특이 반응을 나타내는 항원 클론을 면역 검색 방법(참조: Young ,R. A .& Davis, R. W.,Proc. Natl. Acid. Sci. U.S.A.,80, 1194(1983); Huynh, T. V. et al., DNA Cloning; A Practical Approach, Vol. 1(D. M. Glover, ed.) pp49-78, IRL Press, Oxford, UK(1985))으로 찾아내어 뉴클레오티드 서열을 결정하고 이를 이용해 나머지 부위의 cDNA 서열도 결정함으로써, 유전자 뉴클레오티드 서열이 미국 및 일본형과는 다르다는 것을 밝혀 새로운 한국형 C형 간염 바이러스(KHCV)가 존재함을 확인하였다..

이와 같이 HCV는 지역간에 서로 다른 동질성을 나타낼 뿐 아니라 같은 지역에서도 환자에 따라 약간의 차이를 나타내고 있다.(Kato et al., Proc. Japan. Acad.65, 219-233(1988) ; Kaneko et al., Lancet335, 976(1990)) 이러한 이질성은 진단시약이나 백신개발에 중요한 요인으로 작용할 수 있다.

따라서 본 발명자들은 한국형 C형 간염 바이러스의 뉴클레오티드 서열 및 아미노산 서열에 있는 특이한 그룹을 갖는데 노력을 한 결과, 상기 한국형 HCV의 뉴클레오티드 서열의 정보를 토대로 PCR을 위한 프라이머를 고안 합성하여, 이 프라이머를 이용하여 13명의 서로 다른 한국형 C형 간염환자로부터 HCV의 부분 cDNA들을 클로닝하여 그 뉴클레오티드 서열들을 밝혀내었으며, 이들 뉴클레오티드 서열의 비교결과 한국형 HCV 염기 서열은 NS2 지역에서 약 9% 정도, NS5 지역에서 약 4% 정도의 이질성을 나타내며, 또한 두가지 아형(subtype, 곧 KHCV-L1과 KHCV-L2, 실시예 2 참조)에 존재한다는 사실을 밝혀내게 되었다.

따라서, 본 발명은 한국형 C형 간염 바이러스의 cDNA를 제조하고 그 뉴클레오티드 서열을 밝힘으로써, 새로운 C형 간염 바이러스인 한국인 C형 바이러스와 그의 cDNA를 제공하며 상기 cDNA의 전체 또는 그 일부를 적절한 발현 벡터내에 도입하여 박테리아, 효모, 동물 및 식물 세포등의 숙주에서 발현시킴으로써 HCV 특이 단백질 및 항원을 제공하여 한국형, 나아가서는 이와 유사한 동남아를 비롯한 유사국가군에서 발생하는 C형 간염에 대해, 미국등에서 개발 또는 개발중인 제품보다 훨씬 성능이 뛰어난 진단시약 및 백신을 개발하여 제공하는 것을 그 목적으로 하며 또한, 상기 HCV 특이 단백질 및 항원을 이용하여 제조한 항체 및 이를 이용한 개선된 진단시약을 제공하는 것을 목적으로 한다.

이하, 본 발명을 더욱 상세히 설명하면 다음과 같다.

(KHCV cDNA의 클로닝)

우선 C형 간염 바이러스의 cDNA를 클로닝하기 위하여 C형 간염 증세로 진단된 한국 사람의 혈청에서 바이러스 입자를 초고속 원심 분리기로 침전시켜 분리한 다음, 바이러스를 구성하고 있는 리보핵산(RNA) 을 추출하여 이것을 무작위 프라이머 또는 올리고 d(t)프라이머를 이용하여 역전사효소로 cDNA를 이중나선으로 만든 후, Eco RI 연결자(adaptor)를 붙인 다음 UNI-ZAPXR 벡터에 직접 클로닝하거나 또는 중합 효소 연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)을 이용하여 합성된 cDNA 절편을 대량 증폭시킨 후 (Saiki, P. K. et al., Science,230, 1350(l985)) UNI-ZAPXR 벡터에 클로닝하여 cDNA 라이브러리를 제조한다.

일반적으로 간염 바이러스 입자는 간염환자 혈액 및 다른 감염된 침팬지의 혈액을 원심분리하거나 간조직으로부터 분리할 수 있으며, 본 발명에서는 C형 간염환자 혈청을 브래들리등의 방법에 따라서 초고속 원심 분리기로 침전시켜 바이러스 입자를 분리한 후 페놀추출법 및 에탄올 침전법에 의하여 전체 RNA를 분리 정제한다.

그후 이로부터 cDNA를 합성하기 위하여 위에서 분리 정제된 RNA를 주형(template)으로 하여 스트라타젠사(Stratagene사, 11099 N. Torrey Pines Rd., La Jolla, CA 92037, U.S.A.)의 Zap-cDNA 합성키트(Zap-cDNA Synthesis Kit, Cat. No. 200400))를 사용하여 cDNA를 제조한다.

이때 역전사 효소(reverse transcriptase)의 프라이머(primer)로는 RANPSHCV(5'-TTTTTCATGATTGGTGGTGGAACTGGACCGTCTCGAGNNNNNN-3,, 여기서 N은 A,G,T 또는 C를 의미함) 또는 올리고 d(T) 프라이머(5'-GAGAGAGAGAGAGAGAGAGAACTAGTCTCGAG(T)₁₈-3')를 사용하여, 이들은 3' 말단에 6개의 무작위로 조성된 염기(RANPSHCV) 또는 18개의 T(올리고 d(t) 프라이머), 제한효소 Xho I 인지 부위 및 PCR 반응을 시키기 위한 염기 서열로서 5' 말단쪽에 꼬리를 갖도록 고안되어 있다. 또한 합성된 cDNA가 제한효소 Eco RI 인지 부위(5'-GAATTC-3') 및 PCR 반응에 이용하기 위한 염기 서열을 갖도록 하기 위해 Eco RI연결자(Eco RI Adaptor, 5'-CCCCCCGAATTCGGCACGAG-3', 3'-GGGGGGCTTAAGCCGTGCtC-5')를 연결시킨 다음, PCR을 위한 프라이머, 즉 PSHCV(5'-TTTTCATGATTGGTGGTGGA-3')와 Eco RI 프라이머(Eco RI 연결자중 윗가닥 사슬, 5'-CCCCCCGAATTCGGCACGAG-3')를 이용하여 합성된 cDNA 절편들을 PCR로 대량 증폭시킨 다음, 제한효소 Eco RI과 Xho I으로 부분절단(partial digestion)시킨 후, 파아지 벡터 λgt 11의 변종인 "UNI-ZAPXR" 벡터의 Eco RI과 Xho I 부위에 접합시겨, 시험관()에서 포장(packaging) (Stratagene사, Gigapack II Gold Packaging Kit, Cat. No. 200,2l4, U.S.A.)시킨 후, 대장균에 감염 증폭시켜 cDNA 라이브러리를 제조한다.

이어 위와 같이 하여 제조된 파아지 플라크들(plaques)중 유전자 재조합된 플라크를 선별하기 위하여 후인(Huynh)등의 면역 검색 방법(DNA Cloning: A Practical Approach, Vol. 1, pp. 49-78, IRL Press, UK(1985); Young, R .A. & Davis, R. W, Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A.80, l194(1983))을 사용하여 선별한다. 이 방법을 좀 더 상세히 설명하면 다음과 같다.

cDNA 클로닝 벡터인 UNI-ZAPXR 벡터는 발현용 벡터 λgt 11의 변종으로서, 락토즈 오페론 작동 유전자(LacZ promoter)를 갖고 있어 IPTG(이소프로필-β-D-티오갈락토피라노시드)에 의해 Uni-Zap 벡터상의 부분 β-갈락토시다제(galactosidase) 유전자에 클로닝된 바이러스 cDNA가 융합 단백질로서 발현되므로, HCV 간염환자 혈청을 이용한 면역검색 방법(immunoscreening method)으로 양성인 플라크를 선별 할 수 있다.

여기서 면역검색 방법에 의해 양성(positive)으로 나타난 클론은 클로닝된 cDNA로부터 단백질이 합성되어 이것이 검색에 사용되는 항체와 항원-항체 반응이 일어나는 것이다. 항원-항체 반응이 일어나기 위해서는 클로닝된 cDNA가 리딩 프레임(reading frame)에 맞도록 벡터에 접합되어야 하고 또 제대로 접합되어 단백질이 생성되더라도 이 단백질이 검색에 사용되는 항체에 특이적으로 반응할 수 있는 구조를 갖고 있어야 한다. 따라서 면역검색으로 찾지 못한 C형 간염 바이러스 cDNA 클론을 검색하기 위해서는 면역 검색 방법으로부터 얻은 cDNA 뉴클레오티드 서열 정보를 이용하여 프로브를 만들어 플라크 하이브리디제이션(plaque hybridization)방법 및 중합 효소 연쇄 반응을 이용하여 C형 간염 바이러스 cDNA 클론을 선별한다.

한편, Uni-ZAPXR 벡터는 대장균 세포내에서 cDNA를 포함하고 있는 파아지미드(phagemid) pBluescript를 절제(excision)할 수 있으므로(Short, et al., Nucl. Acid. Res.16, 7583-7600(1988)) 보통 플라스미드처럼 다루기가 용이하다. 또한 pBluescript는 f1 복제 시작점(origin) 및 Col E1 복제 시작점을 갖고 있기 때문에 용이하게 외가닥 또는 두가닥의 핵산으로 추출할 수 있다. 이러한 pBluescript의 성질을 이용하여 cDNA의 제한 효소 지도에 대한 정보를 얻을 수 있으며, 직접 뉴클레오티드 서열 결정에 이용할 수 있다.

상기한 바와 같은 방법으로 양성으로 판별된 플라크들을 대장균내에서 pBluescript로 분리한 다음 제한효소 Eco RI과 Xho I으로 절단하여 cDNA의 크기와 cDNA내에 Eco RI 또는 Xho I 인지 부위의 존재 여부를 전기 영동으로 확인한 다음, 생거(Sanger)의 디데옥시 방법(Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A,74, 5463(l977))으로 cDNA의 뉴클레오티드 서열을 결정한다.

그리고 나서 결정된 뉴클레오티드 서열의 정보로부터 새로운 프로브를 합성하여 cDNA 라이브러리를 검색하여 새로운 중복된 cDNA 클론을 찻아 5' 또는 3' 말단 쪽으로 확장하여 다시 이 클론들로부터 새로운 프로브를 합성하여 상기와 같은 방법을 반복하여 서로 중복되는 cDNA 클론을 갖을 수 있으며, 일부 cDNA는 PCR 방법으로 찾을 수 있다.

서로 중복된 이들 클론들은 서로 연결하여 하나의 긴 HCV cDNA 뉴클레오티드 서열을 얻을 수 있으며 이 뉴클레오티드 정보로부터 유추해 볼 때 하나의 긴 오픈 리딩 프레임(open reading frame)을 형성하고 있음을 알 수 있다.

HCV cDNA 클론들로부터 cDNA 단편들을 분리하여 중복되는 부분을 이용하여 하나의 긴 뉴클레오티드 서열로 연결하였는데 이를 KHCV-LBC1으로 명명한다. 상기한 cDNA 라이브러리는 부다페스트 조약하의 국제기탁기관인 미합중국 종균협회(American type Culture Collection, ATCC)에 1991년 5월 14일자 기탁번호 ATCC 75008로 국제 기탁하였으며 클론된 C형 간염 바이러스 cDNA의 각 단편들의 길이 및 KHCV-LBC1 cDNA에서의 위치는 제1도 내지 제3도에 나타내었다.

KHCV-LBC1은 5'-말단에서 343번째 뉴클레오티드인 A로부터 시작하여 9372번째 뉴클레오티드 G까지 9030개의 뉴클레오티드가 하나의 긴 오픈 리딩 프래임을 형성하고 있다. 본 명세서상의 아미노산 번호는 상기 9030개의 뉴클레오티드에 의해 코딩된 폴리펩티드상에서의 아미노산 순서를 나타낸다. KHCV-LBC1의 뉴클레오티드 서열 및 그에 의해 코딩되는 아미노산 서열은 제2-1 내지 2-16도에 나타내었다.

또한 C형 간염 바이러스 5'-말단 뉴클레오티드 서열을 알아내기 위해, 제조한 클론중 가장 5' 말단쪽에 있는 cDNA 클론의 뉴클레오티드 서열의 정보를 사용하여 고안한 프라이머를 이용하여 단선의 cDNA를 합성한다. 이렇게 하여 제조된 단선의 cDNA 사슬 3'-말단에 폴리 d(A) 꼬리를 붙인 후 PCR 방법으로 합성된 cDNA를 증폭하고 M13 벡터에 클로닝(참조: Maniatis et al., Molecular Cloning. pp51-53, A Laboratory Mannual, Cold Spring Harbor Laboratory(l982))하여 뉴클레오티드 서열을 결정할 수 있다.

본 발명에서 밝힌 한국형 C형 간염 바이러스(이하 KHCV라고도 함)의 5' 말단의 뉴클레오티드 서열은 일본형 C형 감염 바이러스의 5'-말단(Kato, N. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A,87, 9524(1990)) 보다 13개의 뉴클레오티드를 더 발견한 것이며, 특히 미국 C형 간염 바이러스 뉴클레오티드 서열(Han, J., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A,88, 1711(1991))과 비교할때 바이러스의 유전자 발현 및 조절에 중요한 역할을 하는 5'-말단의 염기가 1개 더 있으며 5'-말단의 헤어핀(hairpin)구조를 이루는 22개의 뉴클레오티드중 3개가 미국형 HCV(HCPT-CHITRON)과 상이한 뉴클레오티드 서열임을 알 수 있다.(제6도 참조)

또한 본 발명에서 밝힌 한국형 HCV 간염 바이러스의 cDNA의 뉴클레오티드 서열을 기 보고된 침팬지에 C형 간염 사람 혈청을 감염시켜 얻은 미국형 뉴클레오티드 서열 및 일본형 뉴클레오티드 서열 비교 분석하였으며, 또한 한국형 C형 간염 바이러스 KHCV-LBCl 뉴클레오티드 서열로부터 유추한 아미노산 서열(제2-1도 내지 제2-16도)을 상기 미국형(침팬지에 감염시킨) 및 일본형 C형 바이러스의 아미노산 서열과 비교하였다..

그 결과 KHCV-LBC1과 미국형 C형 간염 바이러스(HCPT-CHIRON)는 염기 서열이 약 78.3%, 아미노산 서열이 약 84.2%의 유사성을 나타내고, 일본형 C형 간염 바이러스(JHCV-NCI, JHCV-OSAKA)와는 염기 서열이 약 90.9%, 아미노산 서열 약 93%의 유사성을 나타내는 새로운 C형 간염 바이러스 cDNA임을 밝히게 되었다.(제4도 내지 제6도 참조)

(HCV 부분 유전자 아종군의 cDNA 제조 및 분석)

서로 다른 13명의 C형 간염 한국인 환자 혈청 100㎕로부터 RNAzol B(Chomcyznski et al.,Anal, Biochem.162, 156-159(1987)) 방법으로 HCV의 RNA을 추출한 후, 20 단위체 리보핵산 분해효소 억제제 (RNase inhibitor; Promega, 2800 Woods Hollow Rd, Madison, WI 53711 U. S .A. ) 을 함유한 10㎕의 증류수에 녹여 이를 주형으로 하여 MMLV 역전사 효소(Molony Murine Leukemia Virus Reverse Transcriptass or MMLV-RT)을 이용하여 무작위 시발체를 사용하고 cDNA을 합성한 뒤 이 cDNA를 주형으로 PCR 반응을 실시한다. PCR 반응물을 아크릴아마이드 젤 전기영동하여 약 340염기쌍(NS2 지역)과 약 320염기쌍(NS5 지역)의 DNA 절편이 증폭되었음을 확인한 후, 이들 PCR 산물들은 뉴클레오티드 서열 결정용 벡터인 M13mp18(New England Biolabs, 32 Tozer Road Beverly, MA 01915-5599, U. S. A Cat. No. 408)에 클로닝한 후 생거의 디데옥시 방법(Sanger et al., Proc. Natl. Acad.Sci, U.S.A,74, 5463(1977))으로 뉴클레오티드 서열을 결정하여(제7도에서 제25도 참조), 이들의 뉴클레오티드 서열과 이로부터 유추된 아미노산서열을 서로 비교하였으며 그 결과 뉴클레오티드 서열은 NS2 지역은 91%에서 94%(제27도, 28도), NS5지역은 96%에서 99%의 동질성(제29도)을 보여주었으며, 아미노산 서열은 NS2 지역이 90%에서 94%(제26도 참조), NS5 지역이 93%에서 99%까지의 동질성을 보여주었다.

또한 이들 HCV 클론들은 NS2 지역의 동질성을 비교하여, 즉 842번째, 849번째 및 853번째의 아미노산에 의해 두개의 아종(KHCV-L1과 KHCV-L2: 제26도 참조)으로 나누어질 수 있음을 발견하였다. KHCV-L1은 842번째 아미노산이 페닐알라닌(Phe 또는 F), 849번째 아미노산이 루이신(Leu 또는 L), 853번째 아미노산이 트레오닌(Thr 또는 t)으로, KHCV-L1은 KHCV-LBC1, KHCV-LBC20, KHCV-LBC23, KHCV-LBC26 및 KHCV-LBC32을 포함하며 KHCV-L2은 842번째 아미노산이 루이신, 849번째 아미노산이 페닐알라닌, 853번째 아미노산이 알라닌(Ala 또는 A)으로, KHCV-LBC2, KHCV-LBC3, KHCV-LBC21, KHCV-LBC25, KHCV-LBC27, KHCV-LBC28, KHCV-LBC29, KHCV-LBC30 및 KHCV-LBC31을 포함하고 있음을 확인하였다(제26도 참조).

KHCV cDNA에서 볼 수 있는 상기와 같은 특정 위치의 특정 아미노산은 미국형 842번째 시스테인(Cys), 849번째 페닐알라닌(Phe), 853번째 발린(Val)과는 모두 다르고 일본형 842번째 루이신(Leu), 849번째 페닐알라닌(Phe), 853번째 알라닌(Ala)과 KHCV-L2의 특징이 같다는 것을 알 수 있었다.

본 명세서상의 한국형 C형 간염 바이러스, 즉 KHCV란 상기에서 언급한 아미노산 서열상의 특징을 갖는 2가지 아종군(KHCV-L1 및 KHCV-L2)에 포함되는 C형 간염 바이러스를 가르킨다.

아종군 KHCV-L1군에 속하는 KHCV-LBC20, KHCV-LBC23, KHCV-LBC26 및 KHCV-LBC32을 포함하는 M13 파아지군(M13mp18-NS2L1)를 1992년 3월 13일자로 미합중국 종균협회(ATCC)에 기탁번호 ATCC 75211호로 기탁하였고, 아종 KHCV-L2군에 속하는 KHCV-LBC2, KHCV-LBC3, KHCV-LBC21, KHCV-LBC25, KHCV-LBC27, KHCV-LBC28, KHCV-LBC29, KHCV-LBC30 및 LBC31를 함유하는 M13 파아지군(M13mp18-NS2L2)를 1992년 3월 13일자로 ATCC에 기탁번호 ATCC 75212로 부다페스트 조약하의 국제기탁을 하였다.

본 발명의 DNA들은 하기 실시예의 방법이외에도 각 도면에서 제공된 뉴클레오티드 서열 정보를 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 그런 화학 합성은 마테우치(Matteucci)등의 포스포아미다이트(phosphormdite) 고체 지지방법(J. Am. Chem. Soc.103: 3185(1981))등 알려진 여러 방법들 중 어느 것을 사용해서도 할 수 있다. 또한 본 발명의 DNA로부터 유추할 수 있는 단백질들은 상기 DNA를 이용한 재조합 DNA 방법, 완전 고체상 합성, 부분 고체상 합성(참조: Merrifield, J. Am, Chem. Soc.85, 2149(1963))등 당해 분야에서 알려진 여러 방법들을 사용하여 만들 수 있다.

또한 본 발명의 범위는 한국형 C형 간염 바이러스의 cDNA 및 그 염기 서열 뿐 아니라, 상기 cDNA에 의해 코딩되는 아미노산 서열의 전체 또는 일부를 포함하여, 유전암호(genetic codon)의 축퇴(degeneracy)로 인해 제2-1도 내지 제2-16도 및 제11도 내지 제25도에 나타낸 아미노산 서열을 코딩할 수 있는 많은 가능한 뉴클레오티드 서열도 포함한다.

(발현 벡터의 제조 및 단백질 생산)

또한 본 발명은 유전자 재조합 기술에 의해 한국형 C형 간염 바이러스의 cDNA와 유비퀴틴 유전자를 연결하여 제조한 단백질 발현 벡터 및 그에 의해 제조된 단백질을 제공하며, 보다 상세하게는 한국형 C형 간염 바이러스의 cDNA로부터 해독한 아미노산 서열을 이용하여 프라이머를 합성한 후 유전자를 대량 증폭시키고 리딩 프레임(reading frame)에 맞도록 발현 벡터에 클로닝시켜서 제조된 발현 벡더 및 상기 벡터에 의해 제조된 한국형 C형 감염 바이러스의 항원 단백질을 제공한다.

상기 발현 벡터를 제조하기 위해서는 여러 발현 시스템, 특히 다른 단백질 과의 다양한 융합 발현 시스템의 이용이 가능하다. 그중 효모의 유비퀴틴 시스템에서는 76개의 아미노산으로 구성된 유비퀴틴이 다른 형태의 유비퀴틴보다 세포내에서의 절단 공정이 매우 빠르며 알지닌-글리신-글리신 다음을 아주 효율적으로 절단하는 것으로 알려져 있다.(Ozkaynak, et al., Nature312, 663-666(1987)). 또한 바호메어(Bachmair)등은 세포내에 존재하는 효소에 의해 유비퀴틴에 결합된 외래 단백질이 알지닌-글리신-글리신 다음에서 아주 정확하게 절단된다고 보고하였다.(Bachmair, et a1., Science234, l78 -186(l986) ).

따라서 부분 KHCV 유전자들을 유비퀴틴 유전자와 결합시켜 효모내에서 발현시키면 유비퀴틴 유전자에 의해 KHCV 단백질의 대량 발현이 유도되며 세포내에 존재하는 효소에 의해 부분 KHCV 유전자 산물이 유비퀴틴 단백질과 분리되어 원하는 단백질을 대량 얻을 수 있다. 또한 유비퀴틴이 결합된 KHCV 단백질을 대장균내에서 발현 제조하는 것도 가능한데, 대장균내에서는 유비퀴틴 시스템의 결여로 세포내에서 유비퀴틴 융합 단백질로 발현된 유전자 산물이 분해됨이 없이 융합 단백질 그대로 세포내에 축적된다. 이러한 융합 단백질 시스템은 특히 발현시키고자 하는 단백질이 세포내에서 불안정하여 각 세포내 단백질 분해효소에 의해 분해가 용이하게 되는 경우에 융합된 유비퀴틴이 이를 보호하기 때문에 매우 유용하다.

유비퀴틴 유전자를 이용하는 발현 벡터는 유비퀴틴과 결합시킬 각 부분 KHCV 유전자를 제한효소로 절단한 후 이들 절단된 단편을 유비퀴틴 유전자를 포함하는 발현 벡터에 적절히 삽입함으로써 제조할 수 있다.

한편, 말토스 결합 단백질(MBP)과의 융합 발현 시스템도 사용할 수 있는데, 이 벡터시스템은 MBP를 코딩하는 대장균의 malE 유전자 뒤에 발현시키려는 유전자를 연결시키고(Guam, et al., Gene.67, 21-30, l987; Maina,et al., Gene.74, 369-373(1988)), 프로모터와 malE의 해독 시작신호(translation initiation signal)를 이용하여 MBP를 코딩하는 유전자와 함께 malE 유전자 뒤에 연결된 유전자의 발현을 유도하게 한다.(참고문헌 Amann, et al., Gene40, 183-190(l985); Duplay, et al., J. Biol. Chem.259, 10606-10613(1984) ).

이 시스템은 또한 과당에 대한 MBP의 친화력을 이용하여 융합 단백질을 간단하게 순수 분리할 수 있는 장점을 갖고 있으며(참고문헌 :Kallenman, et al., Methods in Enzymology90, 459-463(1982)), 상기 벡터내에는 프로모터를 억제할 수 있는 억제자(repressor)를 만드는 유전자가 존재할 수 있어서 적당한 유도제(inducer)에 의해 유전자의 발현을 조절할 수 있다.

또한 MBP의 C-말단쪽에 프르테아제 팩터(factor) Xa(참고문헌: Nagia, et al., Nature,309, 810-812(1984))에 의해 절단되는 부위를 갖고 있어 순수 분리된 융합 단백질로부터 원하는 단백질만을 순수 분리할 수도 있다. MBP 융합 벡터 제조를 위해서는 적절한 프라이머를 사용한 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)등에 의해 각 KHCV cDNA 절편을 증폭한 후 증폭된 cDNA들을 제한효소로 절단하여 적절한 벡터, 예를 들면 벡터 pMAL-CR1에 클로닝한다.

상기와 같이 제조한 발현 벡터로 숙주세포를 형질전환 시킨 다음 유전자를 발현시키고 발현 결과는 C형 간염환자로부터 분리한 면역글로불린 또는 항-MBP 혈청을 이용한 웨스턴 블롯팅(towbin, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA76, 4350-4354(l979))으로 확인한다.

한편, 발현시킬 KHCV cDNA 단편을 제조하기 위해 제한효소나 DNA 분해효소등을 사용할 수도 있고 프라이머를 사용하여 KHCV-LBC1 등의 cDNA를 주형으로 하여 증폭시킬 수도 있다. 본 발명에서 사용되는 프라이머의 길이와 서열은 발현시키고자 하는 KHCV cDNA 부분이 어디인가에 따라 결정되며 이들 프라이머는 KHCV cDNA의 양쪽 가닥중 어느 한 가닥에 상보적으로 결합할 수 있으나, 이는 완전히 상보적인 서열이 cDNA상에 존재해야 한다는 것을 의미하는 것은 아니고 적당한 조건하에서는 일부 서열만이 상보적인 프라이머도 사용할 수 있다. 또한 발현되는 KHCV cDNA 위치 및 길이는 사용되는 프라이머의 종류와 조합에 따라 특정되며, 따라서 이는 본 명세서의 실시예에 기재한 KHCV cDNA 부분에 한정되지 않고 KHCV cDNA의 어느 부분, 어느 길이의 cDNA 절편이든지 선택하여 발현시킬 수 있다.

본 발명의 KHCV cDNA를 발현시키기 위해서는 상기 발현 시스템의 어느 발현 시스템외의 어느 발현 시스템을 사용하는 것도 가능하며, 숙주세포 또한 대장균, 효모, 곤충 및 동식물 세포등을 다양하게 사용할 수 있다.

KHCV cDNA 단편을 발현시켜 생성할 수 있는 단백질을 핵단백질, 비구조 단백질 및 외피단백질 등을 모두 포함하여 이들은 단일, 또는 혼합되어 진단시약 및 백신제조에 사용될 수 있다.

상기와 같은 방법으로 발현된 KHCV 단백질들은 통상의 단백질 추출 및 정제 방법, 즉 세포파쇄, 원심분리, 염석, 투석, 크로마토그래피, 전기영동 및 용출등의 여러방법들을 다양하게 배합하여 사용함으로써 정제할 수 있다.

또한, 단백질에서 생물학적 면역학적 활성을 실질적으로 변화시키지 않는 아미노산 치환은 많이 알려져 있으며 뉴욕의 Academic Press에서 1979년 펴낸 "The Proteins"의 14쪽 그림 6에 특히 잘 나타나 있다 . 가장 빈번하게 관찰되는 아미노산 치환은 알라닌/세린, 발린/아이소루이신, 아스파르트산/글루탐산, 트레오닌/세린, 알라닌/ 글리신, 알라닌/트레오닌, 세린/아스파라진, 알라닌/발린, 세린/글리신, 티로신/페닐알라닌, 알라닌/프로린, 리신/아르기닌, 아스파르트산/아스파라진, 루이신/아이소루이신, 루이신/발린, 알라닌/글루탐산, 아스파르트산/글리신 등의 치환과 그 역방향의 치환이다. 상기의 아미노산 치환이 본 발명의 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 단백질의 면역학적 활성을 변화시키지 않는 한 본 발명의 범위를 벗어나지 않는다.

본 명세서 및 도면에서는 뉴클레오티드를 표준단일 약자로, 아미노산을 표준 단일 약자 또는 표준 3자 약자로 나타내고 있는데 이 약자의 의미는 통상의 생화학 교재, 예를 들면 1984년 뉴욕의 Worth Publisher, Inc.에서 출판된 레닌저 (Lehninger)의 "Principles of Biochemistry"" pp 96와 pp798에 나와 있다.

(항원 단백질을 이용한 진단시약의 제조)

또한 본 발명은 상기와 같은 제조한 KHCV 단백질을 이용하여 제조한 C형 간염 진단시약을 제공하여 보다 구채적으로는 기존의 C형 간염 진단시약보다 한국형 C형 간염에 대해 보다 특이적으로 정확하게 반응하며, C형 간염의 진단시 진단의 범위를 넓혀서 오진에 의한 피해를 감소시켜줄 수 있는, KHCV의 특이항원을 이용하는 진단시약을 제조하고 이를 이용하는 진단방법을 제공한다.

즉, 본 발명을 재조합 효모와 대장균등의 숙주세포내에서 발현된, KHCV 에피토프(면역원성 결정제)를 갖는 항원을 하나 이상 포함하는 진단시약을 제조하고 또한, 기존의 공지된 효소면역 측정법(Enzyme immunoassay,EIA)원리에 따라 인간 혈청으로부터 C형 간염 바이러스에 대한 항체 유무를 검정하는 개선된 진단 방법을 제공하여 보다 상세하게는 미국형 또는 일본형 HCV 단백질과 비교할때 아미노산 조성 및 서열이 상이한 재조합 항원을 포함하는 진단시약 및 이를 고체지지체의 일종인 96웰 플레이트의 각 웰에 흡착시킨 후 마이크로 웰 내에서 흡착시킨 HCV 항원파 시료 혈청내 HCV 항체를 다음과 같은 단계를 밟아 반응시켜 검정하는 진단 방법에 관한 것이다.

첫째, 시료 샘플을 시료희석액을 사용하여 희석시키고 항원이 흡착된 각 웰에 넣어 적정시간 및 적정온도에서 반응시킨다. 만약 시료 샘플내에 HCV에 대한 항체가 존재할 경우 항원-항체 결합체가 형성될 것이다. 항체가 존재하지 않을 경우, 항원-항체 결합체는, 형성되지 않는다.

둘째, 서양고추냉이 과산화효소(HRP)등의 효소가 접합된 항-인간 감마 면역글로블린 항체(Anti-human IgG-HRP)를 각 웰에 가함으로써, 첫번째 단계에서 형성된 항원-항체 결합체의 항체 부위에 특이적으로 결합되게 한다. 이때 항원-항체 결합체가 존재하지 않는 경우 결합이 일어나지 않아 발색 효소인 서양고추냉이 과산화효소(HRP)등의 효소가 접합된 2차 항체는 다음 세척단계에서 제거된다.

셋째, 기질, 예를 들면 과산화효소의 경우 O-페닐렌 디아민 이염산(OPD) 및 과산화수소로 구성된 발색용액을 가한다. 이때 첫째 단계에서 시료내 C형 간염 바이러스 항체가 존재함으로써 항원-항체 결합이 이루어지고 이어 이 항체에 과산화효소등 효소가 접합된 2차 항체가 결합되었을 경우, 효소와 기질과의 반응이 일어나 색깔이 나타난다. 다음 묽은 황산을 가하여 발색 반응을 종결시킨다. 이어 최종 발색 반응물의 색도를 마이크로 웰 리더로 측정한다. 이로써 시료 혈청내 C형 간염 바이러스 항체 존재를 판별할 수 있다.

상기 시술한 기존의 공지된 3단계 진단원리에 따라 시료 샘플내 C형 간염 바이러스 항체를 진단함에 있어서, 항원 부착용 고체 지지체로서는 폴리스티렌 비이드 또는 니트로셀룰로오스 스트립을 사용할 수 있다.

또한 본 발명은 고제 지지체에 부착된 하나 이상의 KHCV 항원을 포함하는 진단시약 이외에 상기 진단 원리에 따라 시료 샘플 내 C형 간염 바이러스 항체를 진단함에 필요한 시약들을 구성하고 있는 진단 키트를 포함한다.

본 발명에 사용한 KHCV 항원들은 다음과 같은 방법으로 선택되어질 수 있다. 한국형 HCV 유전자중 KHCV 에피토프를 갖는 항원을 코딩하는 것으로 예상되는 cDNA들을 유전자 재조합 방법으로 대장균 및 효모등에서 발현시킨 다음, 이들 단백질들의 C형 간염 바이러스 항체에 대한 면역학적 반응성을 HCV에 감염된 혈청과 반응시켜 확인한 다음, 그중 면역학적 반응성이 높은 부위를 선정하는 것이다.

(KHCV 항원 단백질에 대한 항체의 제조)

본 발명은 또한 KHCV 항원을 이용하여 제조한 항체를 제공한다.

보다 구체적으로 설명하면, 본 발명의 항체는 항원으로서 HCV 단백질을 생쥐에 면역시키고, 이 면역된 생쥐의 비장 세포와 마우스 골수종세포를 융합시켜 하이브리도마(hybridoma) 세포를 얻은 다음, 이 세포를 클로닝하여, 단백질을 인식할 수 있는 항체를 생산하는 단일클론을 선발한 후 이 클론을 배양하여 제조할 수 있다.

이러한 생쥐는 통상적인 방법에 따라 면역되어진다. 곧 정맥내, 피하내, 복강내로 항원을 투여하게 되며, 더욱 상세하게는 14 내지 21일마다 수차례에 걸쳐 항원을 투여하여 총 투여량이 100 내지 200㎍/생쥐가 되도록 한다. 통상적인 보조제로 프로인트(freund)의 완전보조제(complete adjuvant)와 불완전보조제(incomplete adjuvant)롤 필요에 따라 적절하게 사용할 수 있다. 면역항원의 최종 투여후 3일째에 비장세포를 제거하여 면역세포로 사용한다. 이와 융합시키기 위해 사용된 마우스 골수종 세포는 생존율 95% 이상이며 로그 단계(log phase)중인 것을 사용한다.

면역된 세포들과 골수종 세포사이의 융합은, 예를 들면 로브보그(Lovborg, U. Monoclonal antibodies: Production & maintenance, William Heinemann Medical Books. Ltd. 1982)의 방법과 같은 기본적으로 공지인 방법들에 의하여 수행되어진다. 면역된 세포들과 골수종 세포와 비율은 1 :10 내지 1 : 1의 비율로 사용하며, 융합을 촉진시키기 위해, 50%의 분자량 1450 정도의 폴리에틸렌 글리콜(Kodak,Cat No 840-4014)을 사용할 수 있고, 배지는 IMDM(Iscove's modified Dubleco's medium, Gibco) 배지등을 사용할 수 있다. 이러한 배지에는 일반적으로10%(v/v) 소테아 혈청(Fetal bovine serum)이 첨가되어 사용된다. 융합된 세포는 HAT 배지(하이포샨틴, 아미노프테린, 티미딘 함유)와 같은 통상적인 선별배지에서 배양하여 융합되지 않은 세포들은 소멸시키고, 융합된 세포들을 선별적으로 자라게 하여 분리할 수 있다.

이렇게 하여 얻어진 융합세포는 공지의 제한 희석법(inl991, Wiley Interscience)으로 처리하여 원하는 항체를 생산하는 개개의 클론을 획득하여, 결국 단일클론 항체를 생산할 수 있게 된다.

원하는 항체를 생산하는 클론은 효소면역 측정법(Enzyme Immounoassay, Antibiodies : A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY(1988))에 의해 검색할 수 있으며, 이외에 통상적인 방법, 즉 플라크 방법(plaque method), 스포트 방법(spot method), 응집 반응법, 오우터로니법(ouchterlony Method) 및 방사능표식 면역검정법등이 이용될 수도 있다.(Hybridoma methods & moncolonal antibodies, Presearch and Developmet사, pp 30-53,1982).

본 발명의 항체는 통상적인 방법으로 클론을 배양한 상등액 또는 원하는 클론을 Balb/c 마우스의 복강에 투여하여 배양한 후, 친화크로마토그라피등의 방법을 사용하여 용이하게 정제할 수 있다. 이렇게 하여 얻어진 본 발명의 단일 클론 항체들은 HCV 항원에 특이하게 반응성을 갖는다. 이러한 항체들은 혈액으로부터 C형 감염 항원의 정제에 이용될 수도 있으며, 또한 서로 다른 항체를 사용하여 샌드위치법과 같은 면역검정법에 대단히 유용하게 사용되어, 기존의 C형 감염 항체 진단방법을 보완하는 항원 진단방법의 개발에 이용될 수 있다.

(진단용 올리고뉴클레오티드 프로보의 제조)

제2-1도 내지 제2-16도 및 제7도 내지 제25도에 도시된 KHCV cDNA 뉴클레오티드 서열을 기초로 하여 8개 이상의 뉴클레오티드로 구성된 올리고 뉴클레오티드를 제조할 수 있다. 이러한 올리고 뉴클레오티드는 KHCV cDNA를 절단하거나 화학적으로 합성하여 제조할 수 있으며, 이를 방사선 표지시켜 프라이머로 사용하는 하이브리디제이션 또는 PCR 등의 방법에 의해 C형 간염 바이러스 cDNA 등을 증폭시킴으로써 C형 간염 바이러스의 검출을 용이하게 하여 HCV의 감염여부 진단에 유용하다.

이러한 목적을 위해 사용되는 올리고 뉴클레오티드의 길이와 서열은 다양하게 제조할 수 있으며 KHCV cDNA의 양쪽 가닥중 어느 한 가닥에 상보적으로 결합할 수 있으면 가능하고, 이는 올리고 뉴클레오티드와 완전히 상보적인 서열이 cDNA상에 존재해야 한다는 것을 의미하는 것은 아니고 조건에 따라서는 일부 서열만이 상보적인 올리고 뉴클레오티드도 사용가능하다. 이러한 올리고 뉴클레오티드의 길이는 8 뉴클레오티드 이상이면 가능하고 10 내지 12 뉴클레오티드가 바람직하여 20 뉴클레오티드 정도가 가장 바람직하나 그 이상도 가능하다.

올리고 뉴클레오티드의 서열은 HCV의 cDNA에 특이적으로 존재하여 다른 타입의 간염 바이러스와의 구별이 가능한 KHCV 유전자상의 서열과 결합할 수 있도록 제조하는 겻이 진단결과의 특이성을 위해 바람직하다.

(백신의 제조 및 투여)

백신은 제2-1도 내지 2-11도 및 제7도 내지 제25도의 cDNA 서열로부터 유도된 하나 또는 2 이상의 항원성 폴리펩리드로부터, 또는 KHCV를 이용하여 제조될 수 있다.

활성 성분으로 상기 물질들을 포함하는 백신의 제조는 통상의 전문가에게 자명하여 보통 그러한 백신은 액체용액 또는 현탁액의 어느 하나의 형태로서 주사가능한 것 또는 용액 또는 현탁액에 적당한 고체형태로 제조되며, 주사전의 액체가 또한 제조될 수 있다.

제제는 유화된 상태 또는 리포좀에 캡술화된 단백질일 수 있다.

활성 면역원 성분은 때로 약제학적으로 허용가능하고 활성성분과 부합하는 부형제와 혼합되며 적당한 부형제는 예를 들면 물, 식염수, 덱스트로스, 글리세롤, 에탄올, 등이며 그의 조합도 사용된다.

또한 필요한 경우, 백신은 습윤 또는 유화제, pH 완충제, 및/또는 백신의 효율성을 증진시키는 보조약같은 보조물질을 소량 함유할 수 있다.

백신은 1회용 제형과 부합하는 방식으로 예방학적 및/또는 치료학적으로 효과를 나타낼 만한 양으로 투여된다. 일반적으로 1회 용량당 항원을 5㎍ 내지 250㎍의 범위로 포하하며, 투여하고자 하는 양은 치료될 개체, 개체의 항체를 합성하는 면역 시스템의 능력, 및 바라는 면역의 정도에 따라 좌우된다. 투여시 필요한 유효성분의 정확한 양은 실시자의 판단에 따라 좌우되고 각 개체의 특성에 따라 특유할 것이다.

백신은 1회, 또는 바람직하게는 다중투여로 투여할 수 있다.

다중 투여는 예방접종의 1차 투여후 1 내지 10회의 별도 투여로 이루어지는데 면역반응을 유지하거나 강화시키기 위하여 필요한 연속적인 시간간격을 두고, 예를 들면 제2차 투여에 의해 1 내지 4개월후에 다른 투여를 하며, 필요하다면 수개월 후에 계속해서 투여를 행하는 것이다.

투여요법은 적어도 부분적으로는, 개체의 요구에 의해 결정될 것이고, 실시자의 판단에 따라 좌우될 것이다.

더불어, 면역원성 KHCV 항원(들)을 함유하고 있는 백신은 다른 면역 조절제, 예컨대 면역글로불린과 결합되어 투여될 수 있다.

하기 실시예에서 사용하는 백분율은 고체 혼합물에서의 고체 비율은 중량/중량으로, 액체에 대한 액체의 비율은 부피/부피로, 액체에서의 고체 비율은 중량/부피를 각각 기준으로 하고 있다. 다음의 실시예에서 사용된 방법들은 특별한 언급이 없는 한 다음의 참조예에 따라 실시하였다..

(참조예 1: 제한 효소를 이용한 DNA의 절단)

사용된 제한 효소와 반응 완충용액은 NEB(New England Biolabs, La Jolla, MA, U.S.A.)사로부터 구매하였으며, 멸균된 1.5ml 에펜돌프튜브에서 보통 반응 부피가 50㎕에서 100㎕가 되도록 하였고, 반응 온도는 37℃에서 1시간 내지 2시간 반응시켜, 반응이 완료된 후에는 65℃에서 15분간 열처리 하거나 또는 내열성인 제한효소는 페놀 추출과 에탄올 침전법을 사용하여 불활성화시켰다.

제한 효소 반응에 사용하는 10배 완충용액 조성은 다음과 같다.

10배 NEB 완충용액 1 : 100mM 비스 트리스 프로판- HCl, 100mM MgCl₂, 10mM DTT(dithiothreitol), pH 7.0

10배 NEB 완충용액 2 : l00mM 트리스- HCl,100mM MgCl₂, 500mM NaCl, 10mM DTT, pH 7.0

10배 NEB 완충용액 3 : 100mM 트리스- HCl, 100mM MgCl₂, 100mM NaCl, 10mM DTT, pH 7.0

10배 NEB 완충용액 4 : 200mM 트리스-아세데이트, 100mM 마그네슘 아세테이트, 500mM 칼륨 아세테이트, 10mM DTT, pH 7.0

(참조예 2: 페놀 추출 및 에탄올 침전)

페놀 추출은 제한효소 반응이 완료된 후 제한효소를 불활성화시키거나 DNA를 추출할때 사용하였다. 페놀은 10mM 트리스- HCl(pH 8.0), 1mM EDTA 용액으로 평형화시켜 사용하였다. 페놀 추출은 시료와 페놀을 1 : 1(부피/부피)의 비율로 섞은 후 강하게 흔들어 혼합시키고 원심분리(15,000rpm,5분)시켜 상등액을 새 튜브로 옮긴 다음, 동일 과정을 3번 반복하고 동일 부피의 클로로포름(클로로포름과 이소아민알콜 비율의 24 : 1인 용액)으로 추출하여 0.1 부피의 3M 나트륨아세테이트와 2.5배 부피의 에탄올을 가하여 -70℃에서 30분간 혹은 -20℃에서 약 l2시간 정치한 후 원심분리(15,000rpm,20분,4℃)하여 DNA를 침전시켰다.

(참조예 3: 연결반응)

연결 효소 반응은 NEB사의 T4 DNA 리가제와 10배 연결 완충용액(0.5M 트리스-HCl, 0.1M MgCl₂, 0.2M DTT, 10mM ATP, 0.5㎍/㎕ BSA(소혈청 알부민), pH 7.8)을 사용하였으며 보통 20㎕부피에서 10단위의 연결효소를 사용하고, 평활말단을 갖는 DNA 연결은 100단위의 연결효소를 사용하였다. 반응조건은 보통 16℃에서 적어도 5시간 이상 또는 4℃에서 14시간 이상 반응시켰으며 반응이 완료된 후에 65℃에서 15분간 가열하여 연결효소를 불활성화시켰다.

(참조예: 4 대장균의 형질전환)

대장균 숙주세포로는 국제기탁기관에서 용이하게 입수할 수 있는 공지의 대장균인HB101(ATCC33694), W3110(ATCC 27325), JMl01(ATCC 33876) 또는 JM105(ATCC 47016) 등을 사용하였다. 숙주세포를 100ml 액체 LB 배지(1% 박토 트립론, 0.5% 효모추출물, 0.5% 염화 나트륨)에 접종한 후 650nm에서의 광학 밀도 값이 0.25 내지 0.5에 달할때까지 37。에서 배양한 후 원심분리기로 세포들을 분리하였다. 그 침전물을 50ml 0.1M 염화 마그네슘(MgCl₂)를 가하여 세척한 후 다시 원심분리시켜 여기에 다시 0.1M CaCl₂및 0.05M MgCl₂용액 50ml을 가하여 얼음위에서 30분간 정지시켰다. 이들 세포를 다시 원심분리시켜 동일용액 5ml에 균일하게 분산시켰다. 위에서 사용한 모든 용액 및 용기는 0℃에서 냉각시켜 사용하였다. 형질전환은 위에서 얻은 세포 현탁액중 0.2ml을 취하여 연결반응 혼합물 l0㎕을 가하여 0℃에서 40분간 정지시키고, 42℃에서 1분 동안 열처리 한 후 2.0ml 액체 LB 배지를 가하여 37℃에서 1시간 동안 배양한 후 0㎍/ml 엠피실린을 함유하고 있는 고체 LB 배지에 도포하고 37℃에서 밤새 배양하였다.. M13 벡터 DNA는 열처리 후 100㎕ JM105 세포, 15㎕ 100mM IPTC(isopropyl-β-D-thiogalactopymaoside), 25㎕ 4% X-Ga1(5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactoside) 및 48t로 미리 데워놓은 3ml 2배 연성 고체 YT 배지(1% NaCl, 1% 효모 추출물, 1.6% 박토트립톤, 0.7% 박토아가)를 가하고 잘 섞어준 후 2배 고체 YT 배지(1% 효모 추출물, 1.6% 박토 트립톤,15% 박토 아가)에 도포하였다.

(참조예: 5 효모의 형질 전환)

재조합 플라스미드는 알칼라인 용해 방법(Alkaline lysis 방법: Ish-Horowicz, D., et al., Nuc1, Acid. Res. 9,2989(1981))으로 대량 추출하여 효모 전환에 이용하였다.

효모 세포를 재조합 플라스미드로 형질 전환시키는 데에는 베그스(Beggs)의 방법(Nature 275, 104 (1978))과 히넨(Hinnen)등의 방법(Proc. Natl. Acad, Sci, USA 75,1929(1978)을 기본으로 하였다..

밤새 배양한 효모(DC04,Yeast Genetic Stock Center, University of California, Berkely, CA, U.S.A.)액 12ml를 50ml의 세 YEPD(펩톤 2%, 효모 추출물 1%, 글루코스 2%)에 접종하여 650nm에서의 O.D.(Optical density) 값이 0.8 내지 1이 될때까지 30℃에서 진탕 배양하였다..상기 배양액을 5000rpm에서 5분간 원심분리하여 얻은 세포 침전물을 20ml의 물에 진탕한 후 다시 원심분리하였다. 20ml의 1M 솔비톨 용액으로 다시 세포 침전물을 진탕한 후 재원심분리 하였다..침전된 세포를 5ml의 SP 완충액(lM 솔비톨, 50mM 인산 칼륨, pH 7.5) 및 5㎕의 1M DTT에 잘 녹인후 50㎕의 자이몰라제(Zymolase, 50% 글리세롤/50% SP 완충액 중의 10mg/ml 효소 용액)를 넣어 주고 30℃에서 완만한 진탕 조전(150rpm)에서 30분 정도 배양하였고, 수시로 세포액을 추출하여 조사하여,1/10 부피의 0.1% SDS를 처리하여 광학 현미경 관찰하에 스피로플라스트(Spheroplast)의 형성 정도를 조사하여, 약 90% 이상의 효모 세포가 스피로플라스트가 되도록 배양한 후(보통 30분 정도), 원심분리(15,000rpm,3분)하여 스피로플라스트를 얻은 후 5ml 1M솔비톨 및 5ml의 STC(1M 솔비톨, 10mM Tris HCl, pH 7.5)에 각각 씻어준 후 최종 1ml STC에 녹인 후 이를 형질 전환에 사용하였다.

12.5㎕의 5 내지 10㎍ 플라스미드와 12.5㎕의 2×STC(STC의 2배 농축액)을 잘 섞은 후 상기에 만든 스피로플라스트를 50㎕첨가하고 상온에서 l0분간 배양하였다. 500㎕의 PEG/TC 용액(40% 폴리에틸렌 글리콜 4000,10mM CaCl₂10mM Tris HCl, pH 7.5)에 첨가한 후 10분을 더 방치시켰다. 원심분리(Dynac Centrifuge로 3분간 1500rpm)하여 스피로플라스트 침전을 얻었고, 이것을 200㎕의 1M 솔비톨에 잘 녹였다. 7ml의 재생아가 (regeneration agar; 100ml당 3g 박토-아가, 50ml의 2M 솔비톨, 0.07g의 아미노산 없는 효모 질소기질, 루이신이 결핍된 0.lg의 아미노산 혼합물, 0.4ml의 50% 글루코스, 45ml의 물)와 잘 혼합한 후 루이신 결핍 고체 배지(1리터당 182g의 솔비톨, 20g 트레오닌, 40ml의 50% 글루코스 및 820ml의 물)에 부어 30℃에서 3 내지 5일간 배양한 후 재조합 플라스미드에 의해 형질 전환된 효모 콜로니를 얻었다.

(참조예 6: 올리고 뉴클레오티드의 합성)

올리고 뉴클레오티드는 자동화된 고체상 포스포아미다이트 케미스트리(Solid Phase Phosphoamidite Chemistry)를 이용하는 DNA 합성기(Applied Biosystems, 380 B, U.S.A.)로 합성한 후, 변성 폴리아크릴 아미이드겔(2M 우레아,12% 아크릴아미드: 비스(29 : 1, w/w), 50mM 트리스, 5mM 붕산, 1mM EDTA)을 이용한 전기 영동으로 분리하고 C₁₈컬럼인 SEP-PAK(Waters Inc,U.S.A.)에 부착시킨 후, 50 : 50%(v/v)의 아세토 니트릴 : 물 혼합액으로 용출하여 순수 정제하였고, 260nm에서의 흡광도를 측정하여 농도를 결정하였다..

(참조예 7: 중합효소 연쇄 반응(PCR))

주형 DNA(10ng 내지 100ng), 10㎕의 10배 농도 Taq 폴리머라제 완충 용액(10mM 트리스-HCl, 500mM KCl,15mM MgCl₂0.1%(w/v) 젤라틴, pH 8.3), 10㎕의 dNTP's의 혼합액(dGTP, dATP, DTTP,dCTP가 각각 2mM), 프라이머 2㎍씩(보통 2개의 프라이머릍 사용하며, 3개의 프라이머를 동시에 사용할때는 중간에 위치한 프라이머를 0.02㎍을 사용하였다). 0.5㎕의 앰프리타크(AmpliTaq) DNA 폴리머라제(Perkin Elmer Cetus,U.S.A.)에 증류수를 가하여 총 부피를 100㎕로 하였다. 여기에 용액의 증발을 막기 위해 50㎕의 미네랄 오일을 첨가하였다.. 온도 순환기(Perkin-Elmer Cetus, USA)를 이용하였으며, 순환프로그램은 95℃ 1분; 55℃ 1분; 72℃ 2분간의 순환을 25회 반복하고 마지막으로 72℃ 에서 10분간 추가 반응시켰다.

폴리머라제를 제거하기 위하여 반응 혼합물에 동일 부피의 페놀/클로로포름을 넣고 잘 섞은 후 원심분리 하였다. 상측액을 새 튜브에 옮기고 1/10 부피의 3M 나트륨 아세테이트, 2배 부피의 100% 에탄올을 넣고 혼합한 후 원심분리하여 이중 나선의 핵산을 얻었다. 이 핵산을 20㎕의 TE 완충액(10mM 트리스-HCl,1mM EDTA, pH 7.5)에 녹인 후 다음 실험에 이용하였다.

(실시예 1)

( HCV cDNA KHCV-LBC1의 제조)

(1-A) 한국인 C형 간염 환자의 혈청으로부터 간염 바이러스 분리 및 바이러스의 전체 리보핵산(RNA)의 추출

NANBH(Non-A, Non-B Hepatitis, C형 간염)로 진단된(ALT<60IU, A, B 간염에 대해 음성) 만성간염 환자의 혼합 혈청 50ml(고대 의대 내과 및 카톨릭 의대 내과 제공)을 초고속 원심분리기를 이용하여 브래들리(Bradley, D.W) 등의 방법(Gestroen-terology88, 773(1985))에 따라 바이러스 입자들을 침전시킨 후, C형 간염 바이러스 전체 RNA를 추출하였다.

즉, 혈청 50ml을 TENB(0. 05M Tris, pH 8.0 0.001M EDTA(ethylenediaminetetetraacetic acid), 0.1MNaCl) 완충액으로 6배 희석시킨 다음, 초고속 원심분리기(Beckman사, Model L8-80M, roTEr SW28)로 상온에서 약 6시간 동안 28,000rpm으로 원심분리하였다. 침전된 바이러스 입자로부터 전체 바이러스 RNA추출은 콜로진스키 (Cholozynski, P ) 와 사끼 (Sacchi, N) 의 방법 (Anal. Biochem162, 156-159(1987)) 에 따라 다음과 같이 수행하였다.. 침전된 바이러스 입자에 8ml의 RNA 추출액(4M guanidine thiocyanate; 25mM Na-citrate, pH 7.0 ; 0.5% sarcosyl, 0.1M 2-mercaptoethanol)을 가하고, 2M 나트륨아세데이트(pH 4.0) 0.8ml, 페놀 8ml(BRL사, U.S.A., 증류수로 포화시켰음, 클로로포름-이소아밀알콜(49 : 1, v/v) 1.6ml을 가하여, 잘 혼합한 후 12,000×G에서 15분간 4℃에서 원심분리하였다. 그런 다음, 상층의 수용액을 취하여 새 용기에 옮기고 같은 부피의 이소프로판올과 운반체로서 글리코겐(2㎍/ml 상등액)을 첨가하여 혼합한 후 -20℃ 냉장고에 약 1시간 동안 방치한 다음, 12,000×G, 4℃에서 20분간 원심분리하여 RNA의 침전물을 얻었다. 이 침전물을 75% 에탄올에 용존시킨 다음, 상기와 같이 원심분리하여 침전물을 세척하고 진공하에서 약 10분간 건조시킨 후, 400㎕의 TE 완충액(10mM Tris, pH 7.5, 1mM EDTA)에 용존시켜, -70℃에 보관하거나 계속하여 cDNA 합성을 수행하였다.

(1-B) : C형 간염 바이러스 RNA에 대한 상보적인 DNA 라이브러리(cDNA library)의 제조

(1-B-1) : cDNA제조

상기 (l-A)에서 얻은 간염 바이러스 RAN를 역전사 효소의 주형으로 하여, 스트라젠사의 Zap-cDNA 합성 키트(Cat, No .200400)를 사용하여 cDNA를 제조하였으며, 이때 역전사 효소의 프라이머로는 올리고 d(T) 프라이머(5'-GAGAGAGAGAGAGAGAGAGAACTAGTCTCGAG(T)₁₈-3') 및 무작위 프라이머(random primer, 이하 RNAPSHCV라 칭함)(5'-TTTTTCATGATTGGTGGTGGAACTGGACCGTCTCGAGNNN-NN-3')를 이용하여 핵산 합성기(Applied Biosystems Inc, U.S.A. Mode 380B)를 이용하여 합성하였다. 첫번째 cDNA 단선을 합성하기 위해 실시예 1에서 얻은 간염 바이러스 RNA 용액중 18㎕를 취하여 2㎕의 0.1M CH₃HgOH을 가한 다음, 상온에서 10분간 방치시켜 RNA의 2차 구조를 풀어준 후, 2㎕의 1M β-머캡토 에탄올을 가하여 상온에서 5분간 반응시켰다. 여기에 5㎕의 역전사 효모 반응 용액(500mM Tris-HCl, pH 8.3, 750mM KCl, 30mM MgCl₂,10mM dithiothreito1(DTT), 25㎕의 10mM dATP, dGTP, DTTP, 5-메틸-dCTP, 2㎕의 올리고 d(t) 프라이머(14㎍/㎕) 또는 2㎕의 무작위 프라이머(1.0㎍/㎕), 15㎕의 DEPC(diethylpyrocarbonate) 처리된 증류수, 1.0㎕의 RNase 억제제(RNase inhibitor,1U/㎕, Promega,U.S.A.)순으로 가하고, 잘 교반시켜 준 후, 상온에서 10분간 방치하여 RNA 주형과 프라이머가 잘 붙게 한 다음, 2.5ml의 MMLV 역전자 효소(18U/㎕, Superscript RNase H- reverse transcriptase,BRL, Cat, No. 8853SA)를 가하여 37℃에서 1시간 반응시켜 첫번째 cDNA 가닥을 합성하였다..

이중 나선의 cDNA를 합성하기 위하여 상기 단선의 cDNA 용액 45㎕에 40㎕의 10배 농도 2차 가닥 완충 용액(188mM Tris-HCl, pH 6.9, 906mM KCl, 46mM MgCl₂, 1.5mM β-NAD(Nicotinamide adenine dinucleotide), 100mM(NH₄)₂SO₄), 60㎕의 dNtP(dATP, dCTP, DTTP, dGTP 각각 10mM 농도) 및 298㎕의 증류수를 순서대로 가한 다음, 반응용기 벽에 10㎕의 RNA 분해 효소 H(RNase H)(4U/㎕), 10.0㎕의 DNA 폴리머라제 1(DNA polymerase 1,11U/㎕)를 떨어뜨린 후, 속히 반응 용액을 혼합하고 16℃에서 2시간 30분 반응시켰다.

그 후 이 반응 생성물을 같은 부피의 페놀 및 클로로포름 혼합 용액(1 : 1 혼합액, 페놀(0.5M Tris-HCl(pH 7.5), 0.1% β-머캡토에탄올(v/v)로 포화시켜 사용전에 만들었음))으로 3번 추출하여, 상층의 수용액상에 얻은 후, 1/10 부피의 3M 소디움 아세테이트와 2배 부피의 100% 에탄올을 첨가하여 -20℃에서 방치하고, 12,000×G로 4℃에서 20분간 원심분리하여 합성된 cDNA를 회수하였다..

((1-B-2) : cDNA 라이브러리의 제조)

상기에서 얻어진 이중나선 cDNA를 평활말단(blunt-end)으로 만들기 위해 상기 이중나선 cDNA 침전물에 43.5㎕의 증류수를 가하여 녹인 후, 이중 39㎕의 cDNA 용액에 5.0㎕의 t₄DNA 폴리머라제 완충 용액(670mM Tris-HCl, pH 8.8, 166mM(NH₄)₂SO₄, 67mM MgCl₂, 100mM β-머캡토에탄올, 67μM EDTA), 2.5㎕의 2.5mM dNTPs, 3.5㎕의 T₄DNA 중합효소(2.9U/㎕)를 첨가하고 37℃에서 30분간 반응시킨 후 이반응 생성물을 실시예(1-B-1)에서와 같은 방법으로 페놀 클로로포름 추출 및 에탄올 침전시켰다.

그후 이 평활말단 이중나선 cDNA 5'-말단에 Eco RI 부위와, 3'-말단에 Xho I 부위를 갖게 하기 위하여, 평활말단을 갖는 이중나선 cDNA 침전물에 7.0㎕의 Eco RI 연결자(adaptor)(Stratagene사, Zap-cDNA Synthesis Kit Cat. No. 200400, CA, U.S.A.)와 1.0의 10배 농도 연결 완충 용액, 1.0㎕의 T₄DNA 리가제(1000U/㎕), 1.0㎕의 l0mM ATP를 가하여 녹인 후 4℃에서 하룻밤 동안 반응시키고 반응액을 70℃에서 10분간 가열하여 리가제를 불활성화시켰다. 여기서 이 반응물을 제한 효소 Eco RI 및 Xho I으로 절단하여, 직접 UNI-ZAPXR 벡터를 클로닝하거나, 다음과 같이 PCR로 cDNA 양을 증가시켜, 라이브러리 제조에 이용하였다.

이 반응액을 10㎕의 10배 농도 PCR 완충 용액(200mM Tirs-HCl, pH 8.3, 15mM MgCl₂, 250mM KCl, 0.5% 트윈 20, 1mg/ml 젤라틴), 10㎕의 2mM dNTP(dATP, dGTP, DTTP, dCTP 각각), 5㎕의 각각의 PS-HCV 프라이머(5'-TTTTTCATGATTGGTGGTGGA-3')와 Eco RI 연결자중 윗가닥(5'-CCCCCCGAATTCGGCACGAG-3'), 1㎕(2.5units)의 Taq DNA 폴리머라제(Perkin Elmer-Cetus사, 76l Main Avenue, Norwalk, CT 06859-0010, U.S.A.), 69㎕의 증류수를 가하여 온도 순환기(Thermal Cycler, Perkin Elmer-Cetus사, U.S.A.)를 사용하여, 다음과 같은 조건으로 PCR을 실시하였다..

95℃에서 30초, 55℃에서 30초 및 72℃에서 2분간 연속적으로 25회 반복 반응을 시켰다. 그후 이 반응물을 센트리콘 100(Centricon 100, Amicon사, Cat. No. 4200, P. O. Box 91954, Chicago, IL 60693, U.S.A.)을 사용하여 잔여 프라이머 및 dNTP를 제거하였다..

그 후 반응액을 페놀/클로로포름 추출 및 에탄올 침전시겨 침전물을 얻은 후,16㎕의 TE 완충 용액에 용해시켰다. 그런 다음, 여기에 2㎕의 10배 농도 완충액(0.5M NaCl, 0.5M Tris-HCl, 50mM MgCl₂, 5mM DTT, pH 7.9)과 Eco RI과 Xho I(New England Biolabs, Inc , 30 Tozer Rd., Berverly, MA, U.S.A.) 을 각각 1㎕씩 첨가하여 잘 혼합하고, 37℃에서 10분간 반응시켜 cDNA를 부분절단 시켰다. 이 반응물을 상기한 바와 같이 페놀/클로로 포름 추출 후 에탄올 침전시켜, 이 침전물을 10㎕의 TE 완충액에 용해시켰다.

다음 이 cDNA를 UNI-ZAPXR 벡터(제한효소 Eco RI과 Xho I으로 처리한 후 정제된 벡터임)의 Eco RI/Xho I 부위에 클로닝하기 위하여, 상기와 같이하여 얻은 Eco RI/Xho I으로 처리된 cDNA 절편 l0㎕에 2.0㎕의 10배 농도 완충 용액, 2.0㎕의 10mM ATP, 4.0㎕의 UNI-ZAPXR 벡터(1㎍/㎕)와 2.0㎕의 T₄DNA 라가제(4Weiss U/㎕)를 가한 다음 16℃에서 약 10시간 접합 반응을 시켰다.

(1-B-3): cDNA 라이브러리를 파아지로 포장(packaging)한 후 대장균으로의 감염 및 증폭

상기 실시예(1-B-2)에서 얻어진 cDNA 라이브러리를 파아지에 포장시키기 위하여 지가팩 II 골드 패케징 추출물(Gigapack II Gold Packaging Extract, Stratagene사 U.S.A.)에 실시예 2B의 최종 반응액 10㎕를 가한 다음 상온에서 2시간 반응시키고 500㎕의 파이지 희석 용액(1리터당 5.8g NaCl, 2.0g MgSO₄7H₂O,50ml의 1M Tris-HCl, pH 7.5, 5ml 2% 젤라틴)을 가한 다음 20㎕의 클로로포름을 가하여 잘 혼합하였다.(Kretz, et al, Nucl. Acid, Res. 17,5409(1989)).

다음 이를 대장균에 감염 및 증폭시키기 위해 대장균 mcrA-, mcrB- 균주인 PLK-F'(Stratagene사 Zap-cDNA Synthesis Kit Cat No.200400)을 LB 액체 배지(1리터당 bactotryptone 10g, yeast extract 5g, NaCl 10g)에서 O.D.₆₀₀(600nm 파장에서의 광학농도(optical density))이 0.5가 될 때까지 배양한 다음 침전시켜 10mM MgSO₄용액에 녹여 O.D.₆₀₀이 1.0이 되도록 맞추고 그 중 600㎕에 상기 패케징 용액 20㎕를 가한 다음 37℃에서 15분간 반응시켜 파아지가 대장균에 감염되도록 하였다.

그 후 48℃로 녹여진 0.7% NZY 아가(1리터당 NZ 아민 7g, NaCl 5g, MgSO₄·7H₂O 2g, yeast extract 5g, bacto-agar 7g) 6.5ml를 가한 다음 150mm NZY 아가 플레이트(1리터당 bacto-agar 16g을 넣는 것 외에는 0.7% NZY 아가와 조성 동일)위에 도포한 후, 37℃배양기에서 5시간 내지 8시간 방치시켜 파아지 플라크가 생성되도록 하였다.

플라크 생성 후 10ml의 희석 용액을 각 플래이트에 부은 다음 4℃에서 흔들어 주면서 약 15시간 방치시켜 파아지가 용존되도록 하였다..

그 다음에 4,000×G에서 원심분리하여 대장균을 침전시켜 상등액을 분리한 다음 클로로포름을 최종 부피의 0.3% 되게 가하여 증폭된 간염 바이러스 cDNA 라이브러리를 만들어 4℃에 보판하면서, cDNA 라이브러리의 타이터(titer)를 조사한 후(약 10¹⁰내지 10¹³pfu(플라크 형성단위)/ml),100% DMSO(dimethyl-sulfoxide)를 최종농도 7%(v/v) 되게 첨가하여, -60℃ 에 보관하였다..

(1-C): 면역 검색방법에 의한 C형 간염 바이러스 cDNA 유전자를 지닌 파아지 선별 및 cDNA 뉴클레오티드 서열 결정

실시예(l-B)에서 얻어진 cDNA 라이브러리를 이용 C형 간염 바이러스 유전자를 지닌 파아지를 선별하기 위하여 면역 검색(immunoscreening)방법 (Huynh, T.V et al., DNA Cloning Techniques : A Practical Approach(D.M.Glover, ed.) pp.49-78, IRL Press, Oxford(1985))을 사용하여 파아지를 선별하였다..

이때 항체로는 실시예(1-A)에서 6배 희석된 혈청을 초고속 원심분리하여 얻은 상등액을 단백질 G 친화성 컬럼(Genex, U.S.A.)으로 정제하여 얻은 HCV 항체를 사용하였다.

상기 실시예(1-B-3)에서 제조한 cDNA 라이브러리 용액을 한 플레이트(직경 150mm)당 파아지 플라크가 약 50,000개가 생성되도록 희석한 다음 실시예(1-B-3)파 같은 방법으로 준비한 대장균 XL1-블루(Stratagene사, U. S .A. Zap-cDNA Syntheis Kit Cat. No. 200400) 배양액 600㎕(O.D.₆₀₀=0.5)와 혼합한 후, 6.5ml의 0.7% NZY 아가와 섞어 40개의 플레이트위에 각각 도포한 다음 37℃에서 12시간 배양하여 약 2×10⁶파아지 플라크가 생성되도록 하였다..

다음 직경 137mm 플라크 리프트 막(plaque lift membrane) 나일론 여과지(Bio-Rad사, Cat. No. 162-163, U. S. A. ) 를 10mM lPTG(isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside) 용액에 담근 후, 와트만(Whatman) 3MM 여과지에서 블럿(blot) 건조시키고, 각 플레이트의 파아지 플라크 위에 덮어 파아지가 필터에 붙게 한 다음 37℃에서 3시간 30분간 방치시킨 후 여과액 당 15ml 정도의 세척액(10mM Tris-HCl, pH 8.0, 150mM NaCl, 0.05% Tween 20)으로 간단하게 세척시키고, 각 여과지당 약 15ml의 차단 용액(1% BSA(bovine serum albumin),20mM Tris-HCl, pH 7.5, 150mM NaCl)을 첨가하여, 약하게 흔들면서 상온에서 1시간 방치하였다..

그런 다음 각각의 여과지를 15ml의 TBST 완충액(20mM Tris-HCl, pH 7.5, 150mM NaCl, 0.05%Tween-20(v/v))으로 5분씩 상온에서 약하게 혼들면서 5번 세척하고, 상기한 단백질 G 친화성 컬럼으로 정제한 HCV 항체(최종 단백질 농도 8.2mg/ml)를 약 200 : 1로 1% 소태 혈청(FBS)(w/v)이 첨가된 TBS 완충액(20mM Tris-HCl, pH 7.5,150mM NaCl)으로 희석한 후 각 여과지당 약 15ml씩 넣어, 상온에서 약하게 혼들면서 1시간 반응시켰다. 그 후 상기한 TBST 완충액을 넣어 상온에서 약하게 혼들면서, 5분 간격으로 5번 각각의 여과지를 세척하고, 1% FBS(w/v)가 첨가된 TBS 완충액으로 2000:1로 희석한 바이오티닐화된 염소 항-사람 IgG(biotinylated-goat anti-human IgG)와 아비딘 결합된-알칼리성 포스파타제(avidin cojugated-alkaline phosphatase)(Pierce, U. S. A, Cat. No. 31770C, 2132℃) 용액을 각 여과지당 15ml씩 첨가하여 약하게 흔들면서 상온에서 1시간 동안 반응을 시켰다. 그 후 각 여과지당 약 15ml의 TBST 완충액으로 약하게 혼들면서 상온에서 5분 간격으로 5번 세척하고, 15ml의 TBS 완충액으로 상기와 같이 세척한 다음, 와트만 3MM 여과지에 여분의 습기를 블럿 건조시켰다.

발색 반응을 시키기 위하여 상기와 같이 준비된 여과지를 15ml의 발색 용액(100mM Tris-HCl, pH 9.5, 100mM NaCl, 5mM MgCl₂, 5mg nitro blue-tetrazolium, 2.5mg의 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate)에 담가 상온의 암실에서 약 30분간 방치한 후 자주색으로 발색된, 유전자 재조합 항원을 발현한 것으로 짐작되는 양성 파아지 플라크를 눈으로 확인하고 TBS 용액으로 한번 세척하였다.. 그런 다음 발색 중단 용액(20mM Tris-HCl, pH 2.9, 1mM EDTA)에 담가 발색 반응을 중단시킨 후, 각각의 플라크 리프트 막 여과지를 상온에서 건조시킨 다음, 폴라로이드 필름으로 기록을 만들었다.

상기한 양성의 파아지 플라크를 원래 플레이트에서 분리하여 1ml의 파아지 희석액(10mM Tris-HCl, pH 7.5, 10mM MgCl₂)에 넣어 실온에서 약 1 내지 2시간 배양한 후, LB 아가 배지(LB 액체 배지 l리터당 15g 박토아가 첨가)가 들어있는 플레이트에 도포하여 상기한 바와 같이 면역 검색 실험을 반복하여 단일 파아지 플라크를 선별하였다..재조합 유전자가 함유된 것으로 확인된 각각의 파아지를 500㎕의 SM 완충액(1리터당 5.8g NaCl, 2.0g MgSO₄,50㎕의 1M Tris-HCl, pH 7.5,5ml의 2% gelatin)이 들어있는 멸균된 마이크로 원심분리관(microfuge tube)에 옮긴 후 20㎕의 클로로포름을 넣어 진탕한 다음, 상온에서 약 1 내지 2시간 배양하였다.. 그 다음에 O.D.₆₀₀=1.0인 대장균 XL-1 Blue 세포를 200㎕ 취하여, 상기한 HCV cDNA를 함유한 파아지 용액 200㎕(l×10⁵파아지 입자 이상)와 1㎕와 R408 헬퍼 파아지(1×10⁶pfu/ml 이상, Stratagene 사, U.S.A.)와 함께 50ml들이 멸균 튜브에 넣고 37℃에서 15분간 배양하였다. 이 배양액에 5ml의 2배 농도 YT배지(1리터당 10g NaCl, 10g yeast extract,16g bacto-tryptone)를 첨가하여 37℃에서 흔들면서 약 3시간 배양한 후, 70℃에서 20분간 열처리한 다음,100배로 희석한 후 200㎕를 취하여 200㎕의 대장균 XL1-Blue 세포(O.D.₆₀₀=1.0)와 섞어 37℃에서 l시간 배양한 후, 이중 100㎕를 앰피실린(50㎍/ml)을 첨가한 LB 플레이트에 도포하여,37℃에서 약 10시간 배양하여 이중 나선의 HCV cDNA틀 함유한 pBluescript 파아지미드(phagemid) 콜로니를 얻었다.

외가닥 DNA를 얻기 위해서는 먼저 위에서 얻은 pBluescript 콜로니를 항생제 테트라사이클린(12.5㎍/ml)을 함유하는 LB 고체 배지에서 배양하여 재차 콜로니를 선별한 다음, 이 단일 콜로니를 데트라사이클린LB 액체 배지(약 2 내지 3ml)에서 하루밤동안 배양하였다. 다음날 아침 이 배양액 약 0.3ml을 수퍼 액체배지(1리터당 35g bacto-tryptone, 20g yeast extract, 5g NaCl, NaOH로 pH 7.6가 되도록 조정하였음)에 접종하여 37℃에서 진탕 배양하였다. O.D.₆₀₀값이 될때까지 보조 파아지 R408을 감염시켜 8시간동안 계속해서 배양하였다.

보조 파아지를 감염시킬 때 파아지 : 세포의 비율은 pBluescript에 들어 있는 cDNA의 종류에 따라 변화될 수 있으며 보통 20 : 1, 10 : 1, 1 : 1, 1 : 10의 값중 하나를 선택하였다. 위에서 얻은 배양액으로부터 외가닥 DNA을 추출하였다.

각각의 재조합 파아지 DNA 추출 및 정제는 통장의 방법에 따랐다(Sambrook, J. et al, Mol. Cloning,Vol. 1, pp273-281, Cold Spring Hargor Lab, Cold Spring Harbor, N. Y.(1989)) 정제된 단일 가닥의 재조합 pBluescript 파이지미드를 주형으로 하거나, 이중나선의 pBluescript 파아지미드를 정제하여 M13-20mer, T7 프라이머, KS 프라이머, SK 프라이머 또는 T3 프라이머(Stratagene사, U.S.A.)를 사용하여 생거의 DNA 뉴클레오티드 서열 결정 방법(Proc. Natl, Acad, Sci, U.S.A, 74,5405(l977))으로 재조합 cDNA 뉴클레오티드 서열을 확인하여 그 명칭을 각각 KHCV 426, KHCV 652 및 KHCV 403로 명명하였다.(제1도 내지 제3도 참조).

(1-D) : 올리고 뉴클레오티드 프로브를 이용한 C형 간염 바이러스 cDNA를 함유한 재조합 파아지의 선별 및 그 뉴클레오티드 서열의 결정

(1-D-1) : DKCV 652와 중복되는 cDNA의 검색

실시예(1-B)에서 제조한 파아지 라이브러리로부터 면역 검색되지 않은 C형 간염 바이러스 cDNA를 지닌 재조합 파아지들을 선별하기 위해, 상기 실시예(1-C)에서 면역 검색에 의해 선별하여 뉴클레오티드 서열을 결정한 cDNA(KHCV 652)를 이용하여 프로브용 올리고 뉴클레오티드 P652a(5'-TTCATACCCGTTGAGTCTATGGAAACTACT-3')와 P652b(5'-GCCATTCCAAGAAGAAGTCTGACGAACTCG-3')를 합성하여 이것을 프로브로 사용하여 플라크 하이브리디제이션(Benton,W. D. et al., Science196, 180(l977); Connor, B. J. et al., Proc. Natl. Acad, Sci, U.S.A.80, 278(1983 ), Jacob, K. et al., Nature 313,806(l985))을 수행하였다.

즉 cDNA 라이브러리를 희석하여 직경 l50mm 플레이트 당 파아지 플라크가 약 50,000개 생성될 정도의 양을 취하여, 실시예(l-B-3)에서와 같은 방법으로 준비된 대장균 XL1-Blue(600nm에서 O.D. 값이 0.5가 되도록 희석하였음) 600㎕와 혼합하여 약 6.5ml의 0.7% NZY 아가와 섞어 NZY 플레이트위에 도포한 다음, 37℃에서 12시간 정도 배양하여 총 30장의 150mm 플레이트에서 약 1.5×10⁶의 파아지 플라크들을 얻었다. 그 다음 직경 137mm 나일론 여과지를 플레이트 위에 조심스럽게 올려놓고 약 10분간 여과지와 파아지가 접촉하도록 한 다음 들어내어 이를 약 20분간 공기중에서 건조시켰다.

건조된 여과지를 0.2M NaOH/1.5M NaCl로 포화된 와트만 3MM 종이(Whatman 3MM paper)위에서 1 내지 2분, 0.4M Tris-HCl, pH 7.6 및 2배 농도(2X)SSC(SSC: 1리터당 NaCl 17.53g, 나트륨 시트레이트 8.82g, pH 7.0)로 포화된 와트만 3MM 종이 위에서 1 내지 2분간을 차례대로 반응시킨 다음, 이 여과지들을 80℃ 진공오븐(acuum ovenml)에 넣고 약 2시간 동안 건조시켰다.

건조가 끝난 여과지들을 상온에서 약 500ml의 3배 농도 SSC/0.1% SDS 용액으로 3 내지 4번 세척하고, 65℃에서 동일 용액으로 약 2시간 동안 세척한 후 프리하이브리디제이션 용액(prehybridization solution :6X SSC, Denhardt 용액(1리터당 Fico11 0.2g, polyvinyrrolidone 0.2g, BSA 0.2g)의 5배 농도 용액, 0.05% sodium pyrophosphate,100㎍/ml의 끓인 청어 sperm DNA, 0.5% SDS)에 넣고 37℃에서 1시간 반응시키고, 다시 하이브리디제이션 용액(6배 농도 SSC, Denhardt 용액, 100㎍/ml yeast tRNA, 0.05% sodirm pyrophosphate)에 옮긴 후 약 30ng의³²P로 표지된 합성프로브 P652a와 P652b을 각각 첨가하여 48℃에서 약 24시간 동안 반응시켰다.

위에서 사용된³²P로 표지된 프로브들은 다음과 같이 제조하였다. 합성 프로브 약 30ng, 7.5㎕의 10배 농도 T₄키나제 완충 용액(0.5M Tris-HCl, pH 7.5, 0.1M MgCl₂, 50mM DTT, 0.5mg/ml BSA), 100μCi(γ-²³P)ATP, 50unit의 T₄폴리뉴클레오티드 키나제 및 증류수를 가하여 총 75㎕를 만든 후 37℃에서 30분간 반응시켰다.

하이브리디제이션 반응이 완료된 후 여과지들은 상온에서 6배 농도 SSC/0.05% 피로인산 나트륨(sodium pyrophosphate) 용액에서 10분씩 5번, 60℃에서 동일 용액으로 30분간 1번 세척한 후, 가이거 카운터(Ludlum Model3)로 검사하면서, 세척이 층분히 될 때까지 세척 용액의 온도를 약 2℃씩 높혀가며 약 15분간 세척하였다. 세척이 적당히 된 여과지들은 -70℃에서 약 24 내지 48시간 동안 X-선 필름(Kodak X-Omat AR)에 노출시켰다.

노출 결과 양성으로 나타난 프라크들은 상기한 바와 같은 방법으로 재차 검색하여 단일 파아지 플라크들을 선별하였다. 선별된 양성 플라크들은 다음과 같은 방법으로 대장균 XL1-Blue에서 Uni-ZAP 벡터로부터 cDNA를 함유하고 있는 파아지미드 pBluescript를 분리하였다..

먼저 선별된 양성 플라크를 멸균된 이쑤시게로 20㎕의 클로로포름을 포함하고 있는 500㎕의 SM 완충 용액에 옮긴 다음, 이중 100㎕에 200㎕의 XL1-Blue 세포(O.D.₆₀₀=1.0)와 1㎕의 R408 헬퍼 파아지(ZAP- cDNA Synthesis Kit)를 섞은 다음 37℃에서 15분간 정치시켰다. 여기에 5ml의 2배 농도 YT액체 배지(1ℓ당 10g NaCl, 10g yeast extract)를 가하고 다시 37℃에서 3시간동안 진탕 배양하였다. 이어서 20분간 70℃에서 가열한 후 4000×G에서 5분간 원심분리한 후, 상층액을 4℃에 보관하였다.

이 상층액을 이용하여 하기와 같은 방법으로 이중가닥의 파아지미드 DNA와 외가닥의 DNA을 추출할 수 있었다. 이중 가닥의 DNA는 제한효소등으로 cDNA를 분석하는데 사용했으며, 외가닥 DNA는 뉴클레오티드 서열 결정에 사용하였다.

이중 가닥 DNA을 함유하고 있는 콜로니(colony)를 만들기 위해, 위에서 얻은 상층액 200㎕와 O.D.₆₀₀값이 10인 대장균 XL1-Blue 세포 200㎕을 섞은 다음, 이중 10 내지 100㎕을 앰피실린을 함유하고 있는 LB고체 배지에 도포하고 나서 37℃에서 밤새 배양하였다. pBluescript의 이중가닥 파아지미드를 갖는 콜로니가 고체배지위에 나타나면 이것을 엠피실린이 50㎍/ml 들어있는 LB 액체배지에 접종한 후 통상의 방법으로 이중가닥 DNA를 추출하였다.

이중에서 KHCV652와 중복된 부분을 갖고 있는 cDNA을 각각 KHCV752와 KHCV675라고 명명하였으며 이들의 길이 및 위치, 그로부터 코딩되는 아미노산 서열은 제1도 내지 제3도에서 알 수 있다.

((1-D-2) : KHCV426과 중복되는 cDNA의 검색)

실시예(1-C)에서 제조한 KHCV426의 cDNA 뉴클레오티드 서열로부터 올리고 뉴클레오티드 P426a(5'-ACGAGACCTCCCGGGGCACTCGCAAGCACC-3')와 P426b(5'-CGTAATTTGGGTAAGGTCATCGACACCCTC-3')를 합성한 후 이것을 프로브로 사용하는 플라크 하이브리디제이션을 상기와 같은 방법으로 수행하여 KHCV426과 중복되는 cDNA를 가진 클론을 찾아 KHCV240이라고 명명하였으며 그 길이, 서열 및 위치, 이로부터 코딩되는 아미노산 서열은 제1도 내지 제3도에서 알 수 있다.

((1-D-3) : KHCV240과 중복되는 cDNA의 검색)

실시예(1-D-2)에서 제조한 KHCV240의 뉴클레오티드 서열 특히 KHCV240의 3'-말단쪽과 중복되는 뉴클레오티드 서열을 갖고 있는 cDNA를 검색하기 위해 다시 올리고 뉴클레오티드 P240b(5'-GTCCCGGGTGCTGGAGGACGGCGTGAACTA-3')를 합성한 후 이를 프로브로 사용하여 실시예(1-B)에서 제조한 라이브러리를 실시예(1-D-1)에서와 같은 방법으로 검색하였다. 그 결과 KHCV240과 약 110 뉴클레오티드가 중복되는 cDNA 클론 KHCV513을 얻었으며 그 뉴클레오티드 서열은 생거의 방법으로 결정하였으며, 그 서열, 위치 및 길이는 제1도 내지 제2도에서 알 수 있다. 또한 상기 뉴클레오티드에 의해 코딩되는 아미노산 서열 제2도 내지 제3도에서 알 수 있다.

((l-D-4) :KHCV13과 중복되는 cDNA의 검색)

실시예(1-D-3)에서 제조한 KHCV513의 뉴클레오티드 서열, 특히 KHCV513의 3'-말단 뉴클레오티드 서열과 중복되는 cDNA를 검색하기 위해 KHCV513의 3'-말단쪽 뉴클레오티드 서열 P513b(5'-CGCATGGCCTGGGATATGATGATGAACTGG-3')를 합성하여 이를 프로브로 사용하여 실시예(1-B)에서 라이브러리를 실시예(1-D-1)에서와 같은 방법으로 검색하고 뉴클레오티드 서열을 결정하였다. 그 결과 약 130bp(base pairs)가 중복되는 약 8l0bp 크기의 새로운 HCV cDNA 클론을 찾아 KHCV810이라 명명하였고 그 뉴클레오티드 서열 및 상대적 위치, 그로부터 코딩되는 아미노산 서열은 제1도 내지 제3도에서 알 수 있다.

((1-D-5) : KHCV810과 중복되는 cDNA의 검색)

실시예(1-D-4)에서 찾은 KHCV810의 뉴클레오티드 서열, 특히 KHCV810의 3'-말단과 중복되는 뉴클레오티드 서열을 갖고 있는 cDNA를 검색하기 위해 KHCV810의 3'-말단쪽 뉴클레오티드 서열 p810b(5'-AAATGAGACGGACGTGCTGCTCCTTAAC-3')을 합성하여 실시예(1-B)에서 얻은 라이브러리를 실시예(1-D-1)에서와 같은 방법으로 검색하였다. 그 결과 KHCV810과 약 65bp가 중복되는 KHCV98을 찾았으며 그 뉴클레오티드 서열 및 상대적 위치, 그로부터 코딩되는 아미노산 서열은 제1도 내지 제3도에서 알 수 있다.

((1-D-6) : KHCV403과 중복되는 cDNA의 검색)

실시예(l-C)에서 갖는 KHCV403과 일부가 중복되는 cDNA를 찾기 위해 KHCV403으로부터 올리고 뉴클레오티드 P403A(5'-GTGAAGAATTCGGGGGCCGGAACCTGGCAT-3')와 P403B(5'-GCTGACCTCATTGAGGCCCAACCTCTTGT-3')를 합성하여 이것을 프로브로 사용하여 실시예(l-B)에서 얻은 라이브러리를 실시예(1-D-1)에서와 같은 방법으로 검색하여 뉴클레오티드 서열을 결정하였다. 그 결과 KHCV403과 약 160pb가 중복되는 KHCV932를 찾았으며 그 위치 및 뉴클레오티드 서열, 그로부터 코딩되는 아미노산서열은 제1도 내지 제3도에서 알 수 있다.

((1-D-7): KHCV932와 중복되는 cDNA의 검색)

실시예(1-D-6)에서 찾은 KHCV932의 뉴클레오티드 서열, 특히 KHCV932의 3'-말단쪽과 중복되는 뉴클레오티드 서열을 갖고 있는 cDNA를 검색하기 위해 KHCV932의 3'말단의 뉴클레오티드 서열 정보로부터 P932b(5'-CCGGGACGTGCTTAAGGAGATGAAGGCGAA-3')를 합성하였다. 이를 포로브로 사용하여 실시예(1-B)에서 얻은 라이브러리를 실시예(l-D-1)에서와 같은 방법으로 플라크 하이브리디제이션 분석하여 양성으로 확인된 플라크를 찾아 클로닝된 cDNA의 뉴클레오티드 서열을 결정하였다. 그 결과 KHCV 932의 3'-말단과 약 185bp가 중복되는 새로운 cDNA 절편을 찾았으며 이를 KHCV496이라 명명하였고 그 위치 및 뉴클레오티드 서열, 그로부터 코딩되는 아미노산 서열은 제1도 내지 제3도에서 알 수 있다.

((1-D-8): DHCV496과 중복되는 cDNA의 검색)

KHCV496과 중복되는 cDNA를 찾기 위해 KHCV496의 3'-말단 뉴클레오티드 서열 정보를 이용하여 p496b(5'-CGTGTATGCGAGAAGATGGCCCTTTATGAC-3')를 합성하여 실시예(1-D-1)에서와 같은 방법으로 cDNA를 검색하여 KHCV496의 3-말단쪽과 약 160bp기 중복되는 847bp 크기의 cDNA를 제조하였으며 이 cDNA를 KHCV847이라고 명명하였다. 이 cDNA의 상대적 위치 및 뉴클레오티드 서열, 그로부터 코딩되는 아미느산 서열은 제1도 내지 제3도에서 알 수 있다.

((l-D-9): KHCV847과 중복되는 cDNA의 검색)

KHCV847과 중복되는 cDNA를 찾기 위해 KHCV847의 3' 말단의 뉴클레오티드 서열 정보로부터 P847b(5'-TGCGTGGGAGACAGCTAGACACACTCCAG-3')를 합성하여 실시예(l-D-1)에서 실시한 방법과 같은 방법으로 cDNA를 검색하였다. 그 결과 KHCV847의 3'-말단 부위와 94bp가 중복되는 494bp 크기의 cDNA를 찾았으며 이를 KHCV494라 명명하고 그 상대적 위치, 뉴클레오티드 서열 및 그에 의해 코딩되는 아미노산 서열은 제1도 내지 제3도에서 알 수 있다.

((1-E): PCR에 의한 cDNA 제조)

(1-E-1) KHCV798과 KHCV752 사이의 HCV cDNA의 제조

실시예(1-D-5)에서 제조한 KHCV798의 3'-말단과 실시예(1-D-1)에서 제조한 KHCV752 5'-말단 사이에 남아 있는 cDNA를 찾기 위해 KHCV798의 3'-말단의 뉴클레오티드 서열의 정보로부터 P798b(5'-CTGGTTCCCGGAGCGGCATAC-3')를 합성하고 KHCV752의 5'-말단의 뉴클레오티드 서열의 정보로부터 P752a(5'-CCAGGTGATGACTTTGGTCTCCAT-3')를 합성하여 실시예 1에사와 같이 무작위 프라이머(RANPSHCV)로 만든 cDNA 라이브러리를 주형으로 사용하여 참조예 7과 같은 방법으로 중합효소 연쇄반응(PCR)을 실시하였다.

반응이 끝난 후 이중 일부를 5% 폴리아크릴아미드 젤 전기영동을 통하여 HCV cDNA가 증폭된 것을 확인한 후, 나며지 반응액에서 DNA 폴리머라제의 일종인 클리나우(Klenow) 절편 10units을 가한 후 37℃에서 30분간 반응시켜 증폭된 DNA의 양말단을 평활 말단(blunt end)으로 만들고 역시 5% 폴리아크릴 아미드 젤에서 전기영동으로 분리한 후 전기 용출시켜 순수 분리하였다. 이어 순수 분리된 DNA를 염기 결정용 파아지인 M13mp18에 클로닝하여 염기 서열을 결정하였으며, 이를 KHCV570이라 명명하였으며, 이 뉴클레오티드 및 그에 의해 코딩되는 아미노산 서열은 제l도 내지 제3도에서 알 수 있다.

실시예(1-D-2)에서 얻은 KHCV240과 실시예(1-D-3)에서 얻은 KHCV513, 실시에(1-D-4)에서얻은 KHCV810, 실시예(1-D-5)에서 얻은 KHCV798 및 위에서 얻은 KHCV570는 서로 중복이 되어 하나의 긴 오픈리딩 프레임(open reading frame)을 형성하고 있으며, 이들을 연결한 하나의 긴 염기 서열을 KHCV2661이라 명명하였다.

((1-E-2) : KHCV403과 KHCV675 사이의 HCV cDNA의 제조)

실시예(1-C)에서 제조한 KHCV403과 실시예(1-D-1)에서 제조한 KHCV675 사이에 남아 있는 cDNA 를 클로닝하기 위하여, KHCV675의 3'-말단의 염기 서열 정보로부터 P675b(5'-TCGATTCTTCGGTCCTGTGTGAGTGT-3)와 P675b(5'-AAAAAGAATTCGGATCCATGACGCGGTTGTGCGTGGTAC-3') 실시예(1-C)에서 찾은 cDNA 클론 KHCV403의 5'-말단 염기 서열 정보를 이용하여 p403a₂(5'-CCCCCTCAGAGTCGACTCACTTCACGTTGTCAGTGGTCAT-3')를 제조하고 실시예(1-D-6)에서 제조한 P403a를 이용하여,1차 및 2차 PCR 반응을 다음과 같이 실시하였다.

프라이머 P675b 0.2㎍, 프라이머 P403a 0.2㎍, 실시예(1-B-1)에서 얻은 무작위 프라이머(RANPSHCV)로 만든 cDNA 2㎕, 10배 농도 PCR 완충용액 10㎕, 2mM dNTP 10㎕, Taq 폴리머라제 2.5 단위 및 증류수를 가하여 총 부피를 100㎕로 만든 후 95℃에서 2분,55℃에서 2분, 72℃에서 3분으로 구성된 PCR 반응 연쇄과정을 10회 반복 순환시킨 다음, 이 반응물에 상기한 프라이머 P675b₂2㎍, p403a₂2㎍을 첨가한 후, 상기 반응 조건에서 20회 더 PCR 반응을 하였다.

반응이 끝난 다음 실시예(1-E-1)와 같은 방법으로 cDNA 증폭을 확인한 후, 상기와 같이 양말단을 평활말단으로 만든 후 분리하여 순수분리된 cDNA를 뉴클레오티드 결정용 파아지인 M13mp18에 클로닝하여 뉴클레오티드 서열을 걸정하였으며, 이 클론을 KHCV1774라 명명하였다. 이 클론의 상대적 위치, 뉴클레오티드 서열 및 이에 의해 코딩되는 아미노산 서열은 제1도 내지 제3도에 나타내었다.

((1-E-3) : C형 간염 바이러스의 3'-말단 cDNA 클로닝 및 뉴클레오티드 서열의 결정)

HCV 바이러스 게놈의 3'-말단 부위의 cDNA을 찾기 위해 PCR을 이용하였다. 3'-말단의 cDNA을 찾기 위하여 프라이머 RANPSHCV와 DA17PSHCV(5'-TGGTGGTGGAACTGGACCGTA-3') 를 사용하여 제조한 cDNA를 이용하였다.

무작위 프라이머 RANPSHCV는 27개 뉴클레오티드로 되어 있으며 그중 3'-말단쪽 6개 뉴클레오티드 무작위로 되어 있으나 나머지 21개 뉴클레오티드는 무작위가 아니기 때문에 프라이머 RANPSHCV 또는 DA17PSHCV의 고정된 21개의 뉴클레오티드와 실시예(1-D-9)에서 얻은 KHCV494의 3'-말단의 뉴클레오티드 서열 정보을 이용하여 다음과 같은 2개의 PCR용 프라이머 PSHCVSL과 KHCVR60을 합성하였다.

프라이머 PSHCVSL은 RANPSHCV의 뉴클레오티드 서열중 고정된 21개의 뉴클레오티드와 제한효소 Sal I (인지부위 5'-GTCGAC-3')을 포함하고 있으며 그 뉴클레오티드 서열은 5'-AAAAGTCGACTGGTGGTGGAACTGGACCGT-3'이었으며, 한편 KHCVR60은 KHCV494의 3'-말단쪽 뉴클레오티드 서열로부터 고안하였고, 그 서열은 5,-GTGTCCGCGCTAAGCTACTGTCC-3'이었다. 프라이머 PSHCV과 프라이머 KHCVR60을 이용하여 참조예 7과 같은 방법으로 PCR 반응을 실시하였다.

상기의 PCR 반응물은 특정한 길이의 DNA가 증폭되는 것이 아니므로 전반적으로 폴리아크릴아미드 잴에서 다양한 크기로 분포되어 나타나므로 다음과 같은 PCR 반응을 통하여 HCV 바이어스 cDNA를 특이적으로 증폭하였다. 2차 PCR 반응을 위한 프라이머로 KHCVR61(5'-TGTGGCAAGTACCTCTTCAACTGG-3')을 합성하였으며 이 프라이머 KHCV494의 3'-말단에 상보적인 뉴클레오티드 서열로 이루어져 있으며 KHCVR60보다 3'-말단쪽에 치우쳐 있다. 따라서 1차 PCR에서 증폭된 cDNA가 다시 2차 PCR 반응을 통하여 재차 증폭되도록 고안하였다.

2차 PCR 반응은 1차 반응액 10㎕에 프라이머 KHCVR61 2.0㎍과 프라이머 PSHCVSL 20㎕을 사용하여 위에서와 같은 방법으로 25회 PCR 반응을 실시하였다.

2차 PCR 반응이 끝난 후 증폭된 DNA를 상기와 같이 평활말단으로 만든 후 폴리 아크릴 아미드 젤에서 분리하여 뉴클레오티드 결정용 벡터인 N13mp18에 클로닝하여, 뉴클레오티드 서열을 결정하였다. 여기시 얻어진 266 뉴클레오티드 크기의 cDNA를 KHCV266라 명명하였다. 이 클론의 상대적 위치, 뉴클레오티드 서열 및 그에 의해 코딩되는 아미노산 서열은 제1도 내지 제3도에서 알 수 있으며, 여기서 두 곳의 아미노산 종료 코돈(TGA,TAA)를 발견하였으나, Poly(A) 꼬리의 존재 여부는 확인하지 못하였다.

((1-E-4): 한국형 C형 바이러스의 5'-말단 cDNA 클로닝 및 그 뉴클레오티드 서열)

실시예(1-C)에서 제조한 C형 간염 바이러스 cDNA 클론 KHCV426의 말단 뉴클레오티드 서열 정보로부터 고안한 KHCVL69(5'-GTCCTGTGGGCGGCGGTTGGTGTTACG-3')를 사용하여 실시예(1-B-1) 중에서와 같은 방법으로 제조한 단선의 cDNA 반응물 50㎕에 1ml TE 완충용액(10mM Tris-HCl, pH 7.5,1mm EDTA)을 첨가하여 희석한 다음 센트리콘 100 (Centricon l00, Amicon사, U. S.A , #4200)을 사용하여 잔여 역전사 효소 프라이머 및 잔여 dNTP를 제거시키면서, 반응액을 10㎕로 농축시켰다.

그런 다음, 폴리 d(T) 꼬리 또는 폴리 d(G) 꼬리가 불어 있는 cDNA를 만들기 위해 4㎕의 5배 농도 테일링 완충용액(5X tailing buffer, 0.5M potassium cacodylate, pH7.2, 10mM CoCl₂,1mM DTT), 4㎕ 1mM dATP와 10단위의 말단 데옥시 뉴클레오티드 트렌스퍼라제(terminal deoxynucleotide transferase, BRL, U.S.A,#80085B)를 상기의 cDNA 용액 10㎕에 첨가한 후 증류수로 최소 부피가 50㎕가 되도록 희석한 다음,37℃에서 30분간 반응시키고 나서, 이어 65℃에서 5분간 열처리 하였다.

폴리 d(T) 꼬리(또는 폴리 d(G) 꼬리)가 붙어있는 상기한 cDNA를 다음과 같은 두개의 프라이머를 합성하여, PCR로 cDNA를 증폭하였다. 즉 실시예(1-C)에서 제조한 cDNA 클론 KHCV426으로부터 고안한 프라이머 KHCVL70(5'-TTGAGGTTTAGGATTCGTGCTCAT-3')(또는 DC12RlR0: 5'-AAGGATCCGTCGACATCGATAATACGACTCACTAAGGGA(C)_l2-3'), dT17RlR0(5'-AAGGATCCGTCGACATCGATAATACGACTCACTATAGGGA(T)₁₇,-3), R0 프라이머(5'-AAGGATCCGTCGACATC-3') 및 R1 프라이머(5'-GACATCGATAATACGACTCAC-3')를 합성하여, 다음과 같은 조건에서 PCR 방법로 cDNA를 증폭하였다.

즉, 상기에서 얻은 cDNA 2㎕에 5㎕의 10배 농도 Taq 폴리머라제 완충용액(100mM Tris-HCl, pH 8.3,500mM KCl, 15mM MgCl₂, 0.1%(gelatin), 5㎕의 15mM dNTP,2.0㎍ 프라이머 KHCVL69 및 2.0㎍ dT17R1R0 프라이머를 가한 다음 증류수로 최종 반응부피를 50㎕로 하였다. 다음 95℃에서 7분간 가열하고 75℃까지 냉각시켜, 2.5단위의 Taq DNA 폴리미라제를 넣고 잘 혼합시킨 후 용액의 증발을 방지하기 위하여 30㎕의 미네랄 오일을 첨가한 후, 반응액을 45℃로 2분간 냉각시켜 프라이머가 단일가닥 cDNA에 상보적으로 결합하게 한 다음, 다시 72℃로 올려 22분간 반응시켰다. 다음 1차 중합 효소 연쇄 반응을 연쇄 온도 순환기(Thermal Cycler, Perking-Elmer Cetus사)를 사용하여 온도 순환 프로그램 95℃, 45초 ; 50℃, 25초 ; 72℃, 2분간 순환을 30회 반복하고 마지막으로 72℃에서 15분간을 추가 반응시켰다.

이 반응물 10㎕에 2차 PCR을 위하여, R0 프라이머(또는 R1 프라이머) 2㎍ 및 KHCVL70 2㎍을 가한다음 상기와 동일한 방법으로 폴리머라제 연쇄 반응을 30회 반복순환시켜 최종 증폭된 핵산을 상기한 같이 평활말단으로 만든 후 폴리아크릴 아미드젤 전기 영동으로 분리하여, 약 380bp 크기의 cDNA을 추출, 정제하였다.

그 다음 M13mp18에 클로닝시켜 생거의 디데옥시 방법(Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.74, 5463(1977))으로 DNA 뉴클레오티드 서열을 경정하였고, 이 cDNA 클론을 KHCV366이라 명명하였으며, 이 클론의 상대적 위치, 그 뉴클레오티드 서열 및 유추된 아미노산 서열은 제1도 내지 제3도에서 알 수 있다.

(실시예 2)

(HCV 아종군 cDNA 제조)

((2-A) : RNA의 추출)

C형 간염 환자 13명의 한국인 환자혈청(시료 #2, 시료 #3, 시료 #20, 시료 #21, 시료 #23, 시료 25, 시료 #26, 시료 #27, 시료 #28, 시료 #29, 시료 #30, 시료 #31 및 시료 #32) 각각 100㎕에 300㎕의 RNA_zol B(Cinna/Biotecx; P.O. Box 1421, Friendswood, Texas. U. S.A.)을 가하여 세포를 용해시켜 상기 실시예(1-A)와 같은 방법으로 HCV RNA를 추출하였다. 이하 시료 #2, 시료 #3, 시료 #20, 시료 #21, 시료 #23, 시료 #25, 시료 #26, 시료 #27, 시료 #28, 시료 #29, 시료 #30, 시료 #31 및 시료 #32부터 추출된 HCV RNA을 각각 LBC2, LBC3, LBC20, LBC21, LBC23, LBC25, LBC26, LBC27, LBC28, LBC29, LBC30, LBC31 및 LBC32이라 칭한다.

((2-B) : cDNA의 제조)

실시예(2-A)에서 얻은 각각의 RNA를 3 내지 4㎕를 역전사 효소의 주형으로 하여 상기 실시예(1-B-1)과 같은 방법으로 cDNA를 제조하였으며 이때 역전사 효소의 시발체로는 무작위 시발체(5,-NNNNNN-3',N은 염기 G, A, T, C가 동일한 비율로 섞여있음을 의미함)를 사용하였다. 이들 합성된 cDNA를 각각 KHCV-LBC2 cDNA, KHCV-LBC3 cDNA, KHCV-LBC20 cDNA, KHCV-LBC21 cDNA, KHCV-LBC23 cDNA, KHCV-LBC25 cDNA, KHCV-LBC26 cDNA, KHCV-LBC27 cDNA, KHCV-LBC28 cDNA, KHCV-LBC29 cDNA, KHCV-LBC30 cDNA, KHCV-LBC31 cDNA 및 KHCV-LBC32 cDNA이라 명명하였다.

((2-C): 중합효소 연쇄반응에 의한 HCV cDNA 증폭)

(2-C-1) : 프라이머의 고안

NS2 지역과 NS5 지역의 HCV cDNA를 증폭하기 위한 프라이머는 기존에 발표된 일본형 뉴클레오티드 서열(Kato et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. ,9524-9528(l990) ;Takamizawaetal, J. Virol.65, 1105-1113(1991))과 미국형 뉴클레오티드 서열(Choo et al., Science244, 359-363(1989)) 및 상기 실시예1에서 제조한 KHCV-LBC1의 뉴클레오티드 서열을 참조로 하여 뉴클레오티드 서열이 비교적 보존된 부분을 선택하여 다음과 같은 프라이머를 고안하였다. 제조된 뉴클레오티드 서열 위치는 실시예 1에서 제조한 KHCV-LBC1의 뉴클레오티드 서열을 기준으로 한 것이다.

(NS2 지역을 증폭하기 위한 프라이머)

NS2S1(5'-CGGGATGAGGCCGCATCGTG-3')은 KHCV-LBC1의 2776번째 뉴클레오티드로부터 2795째뉴클레오티드의 윗가닥 뉴클레오티드 서열이고, NS2Nl(5'-ACCTGCTAGTGCGGCCAGCTTCAT-3')은 KHCV-LBC1의 3180번째로부터 3157번째 뉴클레오티드의 아랫 가닥 뉴클레오티드 서열이며 제1차 PCR을 위한 프라이머이며, NS2S2(5'-TTTTGGATCCGCGGTTTTTGTAGGTCTGGT-3')는 KHCV-LBC1의 2803번째 뉴클레오티드로부터 2822번째 뉴클레오티드 윗 가닥 뉴클레오티드 서열로 구성되어 있으며, 클로닝을 용이하게 하기 위해 5'-말단에 제한효소 BamH I의 인식부위를 갖고 있으며, NS2N2(5'-AAAGTCGACATGAAGACCATTTGGAC-3')는 KHCV-LBC1의 3159번째 뉴클레오티드로부터 3142번째 뉴클레오티드의 아랫 가닥 뉴클레오티드 서열로 구성되어 있으며, 클로닝을 용이하게 하기 위해 5' 말단에 재한 효소 Sal I의 인식부위를 갖고 있는, 제2차 PCR을 위한 프라이머이다.

(NS5 지역을 증폭하기 위한 프라이머)

NS5S1(5'-ATGGGGATCCATATGACACCCGCTG(T/C)TTTGA-3')(T/C은 뉴클레오티드 T와 C가 동일농도로 혼합되어 있음을 의미한다)의 뉴클레오티드 10(뉴클레오티드 N은 5' 말단부터 N번째 뉴클레오티드를 의미함)부터 3' 말단까지는 KHCV-LBC1의 8252번째 뉴클레오티드로부터 8273번째 뉴클레오티드의 윗 가닥 뉴클레오티드로 서열이고, NS5N1(5'-CCCCGTCGACCTAGTCATAGCCTCCGTGAA-3')의 뉴클레오티드 9부터 3' 말단까지는 KHCV-LBC1의 8635번째 뉴클레오티드로부터 8614번째 뉴클레오티드의 아랫 가닥 뉴클레오티드 서열이며 제1차 PCR을 위한 프라이머이다.

한편 NS5S2(5'-TTTGAGGATCCACGGTCACTGAGAA(T/C)GACAT-3')의 뉴클레오티드 12로부터 3' 말단까지는 KHCV-LBC1의 8278번째 뉴클레오티드로부터 8297번째 뉴클레오티드의 윗 가닥 뉴클레오티드 서열로 구성되어 있으며, 클로닝을 용이하게 하기 의해 5' 말단에 제한효소 BamH I의 인식부위를 갖고 있으며 제2차 PCR을 위한 시발체이다.

위와 같이 고안된 프라이머들은 자동화된 고체상 포스포 아미다이트 화학(Solid Phase Phosphoamidite Chemist)반응을 이용하는 DNA 합성기(Applied Biosystems, Inc, model 380 B, U.S.A.)로 합성한 후, 변성 폴리아크릴아미이드 젤(2M Urea, 12% Acrylamide; Bis(29: 1, w/w) in 50mM Tris,50mM Boric Acid, 1mM EDTA-Na₂)을 이용한 전기 영동으로 분리한 후 C18 컬럼인 SEP- PAK(Waters Inc, U.S.A.)에 부착시킨 후 50% : 50%의 아세토니트릴(Acetonitrile) : 물혼합액으로 용출하여 순수정제하였고,260nm에서의 흡광도를 측정하여 농도를 결정하였다.

((2-C-2) : NS2 지역의 HCV cDNA의 증폭을 위한 중합효소 연쇄 반응(PCR))

제1차 PCR 반응은 다음과 같이 실시하였다. 주형으로 (2-B)에서 얻은 HCV cDNA(KHCV-LBC2 cDNA, KHCV-LBC3 cDNA, KHCV-LBC20 cDNA, KHCV-LBC21 cDNA, KHCV-LBC23 cDNA, KHCV-LBC25 cDNA, KHCV-LBC26 cDNA, KHCV-LBC27 cDNA, KHCV-LBC28 cDNA, KHCV-LBC29 cDNA, KHCV-LBC30 cDNA, KHCV-LBC31 cDNA 및 KHCV-LBC32 cDNA), 5㎕, 10㎕의 10X Taq 중합효소 완충 용액(10mM Tris-Cl pH 8.3, 500mM KCl,15mM MgCl₂, 0.1%(w/v) 젤라틴), 10㎕의 dNTP's 혼합액(dGTP, dATP, dTTP, dCTP가 각각 2mM), 프라이머 NS2S1, NS2N1 0.2㎍/씩, 0.5㎕의 AmpliTaq DNA 중합효소(Perkin Elmer Cetus, U.S.A.)에 증류수를 가하여 총부피를 100㎕로 하였다. 여기에 용액의 증발을 막기 위해 50㎕의 미네랄 오일을 첨가하였다. 온도 순환기(Perkin-Elmer Cetus, U.S.A.)를 이용하였으며 순환 프로그램은 95℃, 2분, 55℃, 2분; 72℃, 3분간의 순환을 40회 반복하였다. 제2차 PCR 반응은 제1차 PCR 반응 산물 1ml와 2㎍ of 시발체 NS2S2, NS2N2을 이용하여 제1차 PCR 반응과 동일하게 반응 혼합물을 준비한 후 95℃, 1분; 55, 1분; 72℃, 1분간의 순환을 25회 반복하였다.

중합효소를 제거하기 위하여 반응 혼합물에 동일 부피의 페놀/클로로포름(Phenol/Chloroforn)을 넣고 잘 섞은 후 원심분리하였다. 상층액을 새 튜브에 옮기고 1/10 부피의 3M 소디움 아세테이트, 2.5배 부피의 100% 에탄올을 넣고 혼합한 후 원심 분리하여 약 340 염기쌍의 이중 나선 DNA 절편을 얻었으며 이들은 각각 단편 NS2-LBC2, 단편 NS2-LBC3, 단편 NS2-LBC20, 단편 NS2-LBC21, 단편 NS2-LBC23, 단편 NS2-LBC25, 단편 NS2-LBC26, 단편 NS2-LBC27, 단편 NS2-LBC28, 단편 NS2-LBC29, 단편 NS2-LBC30, 단편 NS2-LBC31 및 단편 NS2-LBC32라 명명하였으며 이 상기의 헥산을 20㎕의 TE 완충용액(10mM Tris-HCl, pH 7.5,1mM EDTA)에 녹였다.

((2-C-3) : NS5 지역의 HCV cDNA의 증폭을 위한 PCR)

제1차 PCR용 프라이머로 NS5S1과 NS5N1, 제2차 PCR용 프라이머로 NS5S2과 NS5S1을 사용하였으며 다른 조건은 (2-C-2)와 동일하게 하였다.

RCR 결과 KHCV-LBC20 cDNA, KHCV-LBC21 cDNA, KHCV-LBC23 cDNA, KHCV-LBC25 cDNA, KHCV-LBC26 cDNA, KHCV-LBC27 cDNA, KHCV-LBC28 cDNA, KHCV-LBC29 cDNA, KHCV-LBC30 cDNA, KHCV-LBC31 cDNA 및 KHCV-LBC32 cDNA로부터 각각 약 320 염기쌍의 증폭된 이중 나선 DNA 절편들을 얻었으며 이들을 각각 단편 NS5-LBC20, 단편 NS5-LBC21, 단편 NS5-LBC23, 단편 NS5-LBC25, 단편 NS5-LBC27 및 단편 NS5-LBC28, NS5-LBC29, NS5-LBC30, NS5-LBC31 및 NS5-LBC32라 명명하였다.

이들 각각의 단편들을 제한효소 Sal I과 BamH I으로 절단한 뒤 M13mp18 또는 M13mp19에 클로닝한 후 생거의 디데옥시 방법 따라 뉴클레오티드 서열을 결정하였다(제7도부터 제26도 참조).

(실시예 3)

효모내에서 KHCV cDNA 단편을 발현시키기 위한 발현 벡터 제조 및 단백질 생성 확인

(3-A) : 한국형 C형 간염 바이러스 cDNA 단편의 증폭

(3-A-1) : 단편 K384, K510, K573, K897, K403 및 K590의 제조

(단계 1)

상기 실시예(1-C),(1-D) 및 (l-E)에서 클로닝한 한국형 HCV의 cDNA 단편을 유리퀴딘 유전자와 연결시켜(이하, 유비퀴틴과 한국형 HCV cDNA 단편이 연결된 것을 'UB-KHCV'라 칭한다), 이를 효모 발현 벡터에 클로닝하기 위하여 다음과 같은 프라이머를 합성하였다.

프라이머 PCOREUBI(5'-CTTGGTGTTGAGACTCCGCGGTGGTATGAGCACGAATCCTAAACC-3')는 5'-말단의 25개 염기가 유비퀴틴 유전자의 3'-말단의 25개 염기와 서로 중복되며 나머지 부위는 HCV cDNA인 KHCV-LBC1의 343번째 염기부터 362번째 염기를 포함하고 있다.

프라이머 PSALCORE14(5'-GGGGTCGACTATTAGCATGTGAGGGTGTCGATGAC-3')은 KHCV-LBC1의 726번째 염기뒤에 해독이 종료되도록 종료 코오돈을 갖고 있으며, 동시에 제한효소 Sal I 인지부위를 갖고 있다.

프라이머 PSALCORE17(5'-GGGGTCGACTATTAGGGCAGATTCCCTGTTGCATA-3')은 KHCV-LBC1의 852번째 염기뒤에 해독이 종료되도록 종료 코오돈을 갖고 있으며 동시에 제한효소 Sal I 인식부위를 갖고 있다.

프라이머 PSALCORE22(5'-GGGGTCGACTATTAAGCGGAACTGGGGATGGTCAA-3')는 KHCV-LBC1의 915번째 염기뒤에 해독이 종료되도록 종료 코오돈을 갖고 있으며 동시에 제한효소 Sal I 인식부위를 갖고 있다.

프라이머 PK403UBI(5'-CTTGGTGTTGAGACTCCGGTGGTACGGGCATGACCACTGACAA-3')는5'-말단의 25개의 염기는 PCOREUBI와 동일하며 나머지 염기는 KHCV-LBC1의 6649번째 염기부터 해독이 되도록 설계되어 있으며 프라이머 PK573UBI(5'-CTTGGTGTTGAGACTCCGCGGTGGTACATGGACA-GGCGCCCTGA-3')는 5'-말단의 25개 염기는 PCOREUBI와 동일하며 나머지 염기는 KHCV-LBC1의 7612번째 염기로부터 해독이 되도록 설계되어 있으며, 프라이머 PK403SAL(5'-GACTGGTCGACTATTACTCTTGCCGCCACAAGAGGTTT-3')은 KHCV-LBC1의 7050번째 염기에서 해독이 끝나도록 설계되어 있으며 동시에 제한효소 Sal I 인식부위와 2개의 종료 코오돈(TAATAG)을 포함하도록 설계되었다.

프라이머 PK897UBI(5'-CTTGGTGTTGAGACTCCGCGGTGGTGCGGTGGAATTCATACCCG-3')는 5'-말단의 25개 염기는 PCOREUBI와 동일하며 나머지 염기는 KHCV-LBC1의 3916변째 염기부터 해독이 되도록 설계되어 있으며, 프라이머 PK897SAL(5'-GACTGGTCGACTATTAACACGTATTACAGTCGATCAC-3')은 KHCV-LBC1의 4713번째 염기에서 해독이 끝나도록 설계되어 있으며 동시에 제한효소 Sal I 인식부위와 2개의 종료 코오돈(TAATAG)을 포함하도록 설계되었다.

프라이머 PK573SAL(5'-GACTGGTCGACTATTAGTACTGGAATCCGTATGAGGAG-3')은 KHCV-LBC1의 8184번째 염기에서 해독이 끝나도록 설계되어 있으며 동시에 제한효소 Sal I 인식부위와 2개의 종료 코오돈(TAATAG)을 포함하도록 설계되었다.

프라이머 P426B(5'-GGGTGGGCAGGATGGCTCCTG-3')는 KHCV-LBC1의 616번째와 636번째 사이의 염기서열로 구성 되 어 있으며, 프라이머 P240B(5'-CCTGTTGCATAGTTCACGCCGT-3') 는 KHCV-LBC1의 842번째와 821번째 사이의 염기 서열(아랫 가닥 염기 서열)로 구성되어 있으며, 프라이머 P652B(5'-GTCATTCCAAGAAGAAATGTGACGAGCTCGCTGCAAAG-3')는 KHCV-LBC1의 4523번째와 4560번째 사이의 염기 서열로 구성되어 있으며, 프라이머 P403B(5'-GCTGACCTCATTGAGGCCAACCTCTTTGT-3')는 KHCV-LBC1의 7012번째와 7039번째 사이의 염기 서열로 구성되어 있다.

(단계 2)

KHCV426, KHCV240, KHCV513의 세 cDNA 클론들은 서로 중복된 부분을 갖고 있기 때문에 다음과 같이 하나의 연속된 cDNA 절편으로 만들었다. 먼저 프라이머 PCOREUBI 2.0㎍, P426B0.02㎍, P240B 2㎕, KHCV-LBC1 DNA 50ng에 10㎕의 10배 Taq 폴리머라제 완충용액,10㎕의 10mM dNTP,2.5단위 Taq 폴리머라제를 가하고 증류수를 가하여 100㎕로 만든 다음 상기 참조예 7의 중합효소연쇄 반응을 25회 실시하였다. 반응이 끝난 후 5% 폴리아크릴아미드 젤 전기영동으로 약 500 염기쌍 PCR 산물(이하, 'PCR산물 A'라 칭함)을 분리정제한 후, 다음과 같이 제2차 PCR을 실시하였다. 먼저 주형으로 상기 PCR 산물 A 약 50ng과 KHCV-LBC1 DNA 50ng에 프라이머 PCOREUBI 2㎍ 및 PSALCORE22 2㎍을 섞은 후, 위와 동일한 조건으로 PCR을 실시하였다.

반응이 끝난 뒤 약 580 염기쌍(이하, 'PCR 산물 B'라 칭한다)의 최종산물을 5% 폴리아크릴아미드 젤에서 분리 정제하여 50㎕의 TE에 용존시켰다

(단계 3)

상기 (단계 2)에서 얻은 50ng의 단편 PCR 산물 B를 주형으로 0.5ml 반응튜브에 다음과 같은 반응 혼합물을 준비하였다. 튜브 A에 프라이머 PCOREUBI 2㎍, 프라이머 PSALCORE14 2㎍을, 튜브 B에 프라이머 PCOREUBI 2㎍, 프라이머 PSALCORE17 2㎕을, 튜브 C에 프라이머 PCOREUBI 2㎍, PSALCORE22 2ag을, 그리고 50ng의 KHCV-LBCl DNA를 주형으로 튜브 D에 프라이머 PK897SAL 2㎍, P652B 0.02㎍, PK897UBI 2㎍을 넣고 튜브 E에 프라이머 PK403SAL 2㎍, PK403UBI 2㎍, 튜브 F에 프라이머 PK573 SAL 2㎍, P403B 0.02㎍, PK573UBI 2㎍을 넣은 다음 각 튜브에 10㎕ 10배 Taq 폴리머라제 완충용액, 10㎕ 10mM dNTP, 25단위 Taq 폴리머라제와 증류수를 가하여 총 부피를 100㎕로 한 후 상기 단계 2와 같이 PCR을 실시하였다.

(단계 4)

상기 (단계 3)에서 얻은 PCR 산물을 5% 폴리아크릴 아마이드 젤에서 분리한 결과 튜브 A에서는 384염기쌍이, 튜브 B에서는 510 염기쌍이, 튜브 C에서는 573 염기쌍이, 튜브 D에서는 798 염기쌍, 튜브 E에서는 402 염기쌍이, 튜브 F에서는 573 염기쌍의 DNA가 증폭되었으며 동일조건의 폴리아크릴 아마이드 젤로 분리 정제하였다.(이하,이 DNA 단편들을 각각 단편 K384, 단편 K510, 단편 K573, 단편 K897, 단편 K403,단편 K590이라 칭한다.)

(3-A-2): 한국형 C형 간염 바이러스의 외피 2N 유전자 및 외피 2C 유전자 cDNA 단편의 제조

(단계 1)

KHCV LBC1의 cDNA중 일부인 외피 2N 유전자(KHCV-LBC1상에서의 뉴클레오티드 서열번호 1510내지 2010) 및 외피 2C유전자(뉴클레오티드 서열번호 2011 내지 2529) 각각을 인공합성한 유비퀴틴 유전자와 결합시키고 이를 효모 발현벡터에 클로닝하기 위하여 다음과 같은 프라이머를 합성하였다.

프라이머 PE2NUBI(5'-CTTGGTGTTGAGACTCCGCGGTGGTGGGGCGCAAGGTCGGGCCGCT-3')는 5'-말단의 25개의 염기가 유비퀴틴 유전자의 3'-말단의 25개 염기와 서로 중복되며 나머지 부위는 HCV cDNA인 KHCV-LBC1의 1510번째 염기부터 1530번째 염기를 포함하고 있다.

프라이머 PE2NSAL(5'-GACTGGACTATTAATTCATCCAGGTACAACCGAACCA-3')는 KHCV-LBC1의 2010번째 염기뒤에 해독이 종료되도록 종료 코오돈을 갖고 있으며 동시에 제한효소 Sal I 인식부위를 갖고 있다.

프라이머 PE2CUBI(5'-CTTGGTGTTGAGACTCCGCGGTGGTGGCACTGGGTTCACCAAGACA-3')는 5'-말단의 25개 염기와 서로 중폭되며 나머지 부위는 HCV cDNA인 KHCV-LBC1의 2011번째 염기부터 2031번째 염기를 포함하고 있다.

프라이머 PE2CSAL(5'-GACTGGACTATTACGCGTCCGCCAGAAGAAGGAAGAG3')는 KHCV-LBC1의 2529번째 염기뒤에 해독이 종료되도록 종료 코오돈을 갖고 있으며 동시에 제한효소 Sal I 인식부위를갖고 있다.

(단계 2)

반응튜브 A에 프라이머 PE2NUBI 2㎍ 및 PE2NSAL 2㎍을, 튜브 B에 프라이머 PE2CUBI 2㎍ 및 프라이머 PE2CSAL 2㎍을 넣은 다음, 각 튜브에 주형으로 KHCV-LBC1 50ng,10㎕의 10배 중합 완충용액, 100㎕ 10mM dNTP(dATP, dGTP, dCTP, dTTP 각각 10mM) 2.5단위체 Taq 중합효소와 증류수를 가하여 총 부피를 100㎕로 한 후 참조예 7과 같이 PCR 반응을 25회 실시하였다.

(단계 3)

상기 (단계 2)에서 얻은 PCR 산물을 5% 폴리아크릴 아마이드 젤에서 분리한 결과 튜브 A에서는 501염기쌍의 DNA가, 튜브 B에서는 519 염기쌍의 DNA가 증폭되었으며 동일 조건의 폴리아크릴 아마이드 젤로부터 분리 정제하였다(이하 이 단편들을 각각 단편 E2N, 단편 E2C라 칭한다).

(3-B) : 효모용 발현벡터의 제조

(3-B-1) : pYLBC-A/G-UB-CORE14, pYLBC-A/G-UB-CORE17, pYLBC-A/G-UB-CORE22, pYLBC-A/G-UB-KHCV897, pYLBC-A/G-UB-KHCV403 및 pYLBC-A/G-UB-KHCV573의제조

플라스미드 pYLBC-A/G-UB-HGH(ATCC74071) 2㎍을 제한효소 Pst I 과 Sal I 로 NEB 완충용액3의 조건하에서 완전 절단하며 또한 동일 플라스미드 2㎍을 제한효소 Pat I과 제한효소 Sac II로 NEB 완충용액 4의 조건하에서 완전 절단하여 0.7% 아가로오스 젤로 분리하여 약 9.84Kb와 3.4Kb 단편을 각각 분리정제 하였다. 이하 이들 단편을 각각 단편 PL2, 단편 PT2이라 칭한다.

실시예 (3-A-1)의 (단계 4)에서 얻은 단편들(단편 K384, 단편 K510, 단편 K573, 단편 K897, 단편K403, 단편 K590)중 단편 K897, 단편, K403, 단편 K590은 제한효소 Sal I 과 제한효소 Sac II로 NEB 완충용액 3의 조건하에서 완전 절단하였고, 단편 K384, 단편 K510, 단편 K573은 제한효소 Sa1 I으로 NEB 완충용액 3의 조건하에서 완전절단 한 후 이들을 폐놀/클로로포름으로 추출하여 20㎍의 TE 용액에 용존시켰다 .이중 단편 K384, 단편 K510, 단편 K573은 제한효소 Sac II로 NEB 완충용액 4의 조건하에서 10분간 부분 절단한 후 이들을 페놀/클로로포름으로 추출하여 20㎕의 TE 용액에 용존하여 이들을 이용하여 다음과 같이 연결반응을 실시하였다. 연결반응 튜브 A에 100ng의 단편 K384, 연결반응 튜브 B에 약 100ng의 단편 K510, 연결반응 튜브 C에 약 100ng의 단편 K573, 연결반응 튜브 D에 약 100ng의 단편 K897, 연결반응 튜브 E에 약 100ng의 단편 K403, 연결반응 튜브 F에 약 100㎍의 단편 K573을 넣고 각 튜브에 100ng의 단편 PL2, 약 100ng의 단편 PT2, 2㎍의 10배의 연결용액,10단위치의 T4 DNA 리가제와 총 부피가 20㎕가 되도록 증류수를 가한 다음 16℃에서 12시간 반응시켰다.

반응이 끝난뒤 대장균 HB101(ATCC 33694)에 형질전환시켜 단편 K384를 함유하고 있는 pYLBC-A/G-UB-CORE14, 단편 K510을 함유하고 있는 pYLBC-A/G-UB-CORE17, 단편 K573을 함유하고 있는 pYLBC-A/G-UB-CORE22, 단편 K897을 함유하고 있는 pYLBC-A/G-UB-KHCV897, 단편 K403을 함유하고 있는 pYLBC-A/G-UB-KHCV403, 단편 K590을 함유하고 있는 pYLBC-A/G-UB-KHCV573을 얻었다(제30도 참조).

(3-B-2) : pYLBC-A/G-UB-E2N 및 pYLBC-A/G-UB-E2C의 제조

발현벡턴 제조과정은 다음과 같이 실시하였다. 플라스미드 pYLBC-A/G-UB-HGH(ATCC 74071) 2㎍을 제한효소 Pst I과 Sal I으로 NEB 완충용액 3조건하에서 완전 절단하였으며 동일 플라스미드 2㎍을 제한효소 Pst I와 제한효소 Sac II로 NEB 완충용액 4의 조건하에서 완전절단하여 0.7% 아가로오스 젤로 분리하여 약 9.8kb와 3.4kb 단편을 각각 분리정제하였다. 이하 이들 단편을 각각 단편 PL2, 단편 PT2이라 칭한다.

실시예(3-A-2)에서 얻은 단편 E2N과 E2C를 각각 제한효소 Sac II로 NEB 완충용액 4의 조건하에서 완전 절단한 후 제한효소 Sal I으로 NEB 완충용액 3의 조건하에서 부분절단한 후 이들을 페놀/클로로포름으로 추출하여 20㎕의 TE 용액에 용존하여 다음과 같이 절합반응을 실시하였다. 이를 각각 단편 E2N-T2/L, 단편 E2C-T2/L이라 한다.

접합 반응 튜브 G에 상기에서 얻은 100ng의 단편 E2N-T2/L, 튜브 F에 100ng의 단편 E2C-T2/L을 각각 넣고 각각의 튜브에 100ng의 단편 PL2, 약 100ng의 단편 PT2,2㎕의 10배 접합반응용액,10단위체의 T4 DNA 리가제와 총 부피가 20㎕가 되도록 증류수를 가한 다음 16℃에서 12시간 반응시켰다. 반응이 끝난 뒤 대장균 HB101(ATCC 33694)에 형질전환시켜 단편 E2N-T2/L을 함유하고 있는 pYLBC-A/G-UB-E2N, 단편 E2C-T2/L를 함유한 pYLBC-A/G-UB-E2C를 얻었다(제30도 참조)

(3-C) : 효모의 형질전환 및 단백질 생성 확인

상기에서 제조한 발현벡터를 사용하여 참조예 5의 방법으로 형질전환시킨 효모중 pYLBC-A/G-UB-KHCV403에 의해 형질전환된 효모DC 04(DC 04-UB-KHCV403)는 ATCC 74079로 1991년 6월 27일자 국제기탁되었으며 pYLBC-A/G-UB-CORE 14에 의해 형질 절환된 효모(DC 04-UB-CORE 14)는 ATCC 74081로 1991년 7될 1일자 국제기탁되었다. 또한 pYLBC-A/G-UB-E2C에 의해 형질 전환된 효모(DC 04-UB--E2C)는 ATCC 74117로 1991년 12될 11일자 국제기탁되었다.

형질 전환된 효모 균주를 3ml의 루이신(Leucine)이 결핍된 배양액(배양액 1리터당 아미노산이 없는 효모 질소 기질(yeast nitrogen base without amino acids, Difco, U. S.A.) 6.7g과 루이신 결핍된 아미노산 혼합물 0.25g 및 5% 클루코스 함유)에서 24시간 동안 30℃에서 배양시킨 후 이를 100ml의 YEPD 배양액(2% 펩톤,1% 효모추출물,2% 클루코스)에 접종하여 30℃에서 24시간 배양하였다.

이때 최종 흡광도는 O.D.₆₅₀에서 25 정도였으며, 여기서 O.D. 10에 해당하는 양을 원심분리시켜,400㎕ 완충용액(10mM Tris-HCl, pH 7.5, 1mM EDTA, 2mM PMSF(페닐메틸설포닐 플무오라이드), 8M 우레아)에 현탁시키고, 직경 0.4mm의 유리구슬을 같은 부피로 첨가하고 강하게 진탕시켜 세포벽을 파괴하여서 효모 추출물을 얻었다. 10㎕의 효모 추출물을 램리(Laemmli,et al., Nature, 277,680(1970))의 방법에 따라 15% SDS-폴리아크릴아마이드 겔 전기영동시킨 후, 코마시블루(Coomassie brilliant blue R250)로 염색하여 목적 단백질이 생성되는 것을 확인하였다.(제31-A도 참조)

이후 겔상에서 분리된 단백질을 니트로 셀룰로스 필터로 전달(blot)시켰다. 이 필터를 0.2% 트윈 20이 함유된 PBS(10mM 인산, pH 7.0,0.15M 염화나트륨)에 넣고 상온에서 2시간 동안 약하게 흔들어주어 면역 글로불린과 단백질의 비특이적 결합을 차단(blocking)시켰다. 이후 0.5% 젤라틴과 0.05% 트윈을 함유한 PBS에 한국인 C형 간염 환자의 혈청으로부터 친화성 분리한 면역 글로불린(IgG,8.2mg/ml)을 1 :200으로 희석시켜 첨가하고 상온에서 1시간 동안 약하게 혼들면서 반응시킨 다음 , 0.2% 트윈 20을 함유한 PBS로 5분씩 4회 세척하였다. 이 필터에 0.5% 젤라틴과 0.05% 트윈 20을 함유한 PBS에 양고추냉이 퍼옥시다제(horsera-dish peroxidase)로 표지된 항-사람 면역 글로불린(Bio-Rad Lab., Anti-Human IgG-HRP) 을 1: 200으로 희석시켜 첨가한 다음 상온에서 1시간 동안 진탕시켜 반응시키고 0.2% 트윈 20을 함유한PBS로 5분씩 4회 세척한 다음 50mM 트리스 완충액(pH 7.0)으로 2회 세척하였다.

이 필터를 400㎍/ml 4-클로로-1-나프톨과 0.03% 과산화수소수가 함유된 50mM 트리스 완충액을 가하여 발색시켰다. 상기 웨스턴 블롯팅 결과를 제31-B도에 나타내었으며, 제31도의 제2열(lane)은 KHCV 코아(Core) 단백질이 생성된 효모 추출물, 제3열은 KHCV 897 단백질이 생성된 효모 추출물, 제5열은 KHCV 403 단백질이 생성된 효모 추출물, 제6열은 KHCV 573 단백질이 생성된 효모 추출물을 각각 나타 내고 제1열 및 제4열은 음성 대조군으로 한국형 C형 간염 바이러스 유전자률 포함하지 않는 벡터를 함유하는 효모 추출물을 사용한 것이며 M 열은 분자량 표시로 단위는 킬로 달톤이다. 또한 제32도는 E2N 및 E2C 단백질의 생성을 확인한 SDS-PAGE 및 웨스턴 블럿팅 결과로 제1열은 플라스미드를 함유하지 않은 효모 추출물, 제2열은 pYLBC-A/G-UG-E2N을 함유한 효모 추출물, 제3,4 및 5열은 pYLBC-A/G-UB-E2C를 함유한 효모이며 제6열을 표준 분자량 단백질로 위로부터 200,97,72,43,29,18 및 14킬로 달톤을 나타낸다.

(실시예 4)

대장균내에서 KHCV cDNA 단편을 발현시키기 위한 발현 벡터의 제조 및 단백질의 생성

(4-A) : trp 프로모터를 갖는 발현 벡터의 제조

(4-A-1) : KHCV cDNA 단편의 제조

상기 실시예(3-A-1) 및 (3-A-2)에서 제조한 단편 K384, K510, K573, K897, E2N 및 E2C를 사용하였다.

한편 한국형 C형 간염 바이러스의 cDNA의 KHCV-LBCl의 일부인 외피 1(El) 유전자 절편(KHCV-LBC1상의 뉴클레오티드 번호 916 내지 1509, 이하 단편 E1이라 함)은 다음의 프라이머를 사용하여 실시예(3-A-1)과 같이 PCR에 의해 제조하였다.

프라이머 PEIUBI(5'-CTTGGTGTTGAGACTCCGCGGTGGTTATGAAGTGGGCAACGCGTCC-3')은 5'-말단의 25개 염기가 유비퀴틴 유전자의 3'-말단의 25개 염기와 서로 중복되며 나미지 부위는 KHCV cDNA인 KHCV-LBC1의 916번째 염기부터 936번째 염기를 포함하고 있다.

프라이머 PEISAL(5'-GACTGGACTATTACCCTGTCACGTGGGTGGTGGTTCC-3')은 KHCV-LBC1의 1509번째 염기뒤에 해독이 종료되도록 종료 코오돈을 갖고 있으며 동시에 제한효소 Sal I 인식부위를 갖고 있다.

(4-A-2) : 유비퀴틴유전자의 합성

(단계 1)

기존에 공지된 유비퀴틴 유전자의 염기서열 정보(Ozkaynak, et al.,EMBO J.6, 1429-1439(1987))를 이용하여 다음과 같은 3개의 올리고뉴클레오티드를 DNA 합성기로 합성하였다.

UBI1:

5'-CCCCATATGCAAATTTTCGTCAAAACTCTAACAGGGAAGACTATAACCCTAGAGGTTGAATCTTCCGACACTATTGACAACGTCAA-3'

UBI2:

5'-TAGTTGCTTACCAGCAAAAATCAATCTCTGCTGATCCGGAGGGATACCTTCTTTATCTTTGAATTTTACTTTTGACGTTGTCAATAGTCTC-3'

UBI3:

5' -ACCACCGCGGAGTCTCAACACCAAGTGAAGAGTAGATTCCTTTTGGATGTTGTAGTCAGACAAGGTTCTACCATCTTCTAGTTGCTTACCAGCAAAAA-3'

올리고뉴클레오티드 UBI1은5'-말단에 제한효소 Nde I 인식부위(5'-CATATG-3')를 갖도록 인위적으로 설계하였으며, 올리고뉴클레오티드 UBI2와 약 20개 염기가 서로 중복되어 있다. 올리고뉴클레오디드 UBI3는 3'-말단의 아미노산 염기서열은 변하지 않도록 하면서 제한효소 Sac II 인식부위(5'-CCGCGC-3')를 갖도록 하였다(제33도).

(단계 2)

PCR에 의해 상기 (단계 1)에서 합성한 3개의 올리고뉴클레오티드, 즉 2㎍의 UBI1, 0.02㎍의 UBI2, 2㎍의 UBI3에 10㎕의 10배 PCR 완충용액, 10㎕의 10mM dNTP, 0.5㎕의 Taq 중합 효소를 넣고 총 부피가 100㎕가 되도록 증류수를 가한 다음 참조예 7에서 기술한 대로 실시하였다. 이후 PCR 반응 산물을 5% 폴리아크릴아마이드 겔에서 분리하여 약 240 염기쌍의 DNA(이하, '단편 Ub'라 칭함)를 추출 정제한 후 20㎕ 의 TE 용액에 용존시켰다.

(4-A-3) : 유비퀴틴 유전자와 KHCV cDNA의 연결

상기 (4-A-1)에서 얻은 부분 KHCV cDNA 단편의 5'-말단과 단편 Ub의 3'-말단은 25개의 염기가 서로 중복되기 때문에 이들을 다음과 같이 PCR 반응으로 서로 결합시켰다. 하기에서 사용한 프라이머는 상기 (단계 1) 및 실시예(3-A-1)의 (단계 1)에서 제조한 것을 사용하였다.

먼저 다음과 같이 7개의 반응튜브(A,B,C,D,E,F,G)를 준비하였다.

반응튜브 A에 50ng의 단편 K384, 50ng의 단편 Ub, 2㎍의 프라이머 UBI1, 2㎍의 프라이머 PSALCORE 14를

반응튜브 B에 50ng의 단편 K510, 50ng의 단편 Ub, 2㎍의 프라이머 UBI1, 2㎍의 프라이머 PSALCORE 17을,

반응튜브 C에 50ng의 단편 K573, 50ng의 단편 Ub, 2㎍의 프라이머 UBI1, 2㎍의 프라이머 PSALCORE 22를,

반응튜브 D에 50ng의 단편 K897, 50ng의 단편 Ub, 2㎍의 프라이머 UBI1, 2㎍의 프라이머 PKHCV897 SAL을 넣고,

반응튜브 E에 50ng의 단편 E2N,50ng의 단편 Ub, 2㎍의 프라이머 UBl1,2㎍의 프라이머 PE2NSAL을 넣고,

반응튜브 F에 50ng의 단편 E2C,50ng의 단편 Ub, 2㎍의 프라이머 UBl1, 2㎍의 프라이머 PES2CSAL을 넣고,

반응튜브 G에 50ng의 단편 E1, 50ng의 단편 Ub, 2㎍의 프라이머 UBI1,2㎍의 프라이머 PElSAL을 넣고,

각 반응튜브에 10㎕의 10배 농도 중합효소 완충용액,10㎕ 2Mm dNTP, 0.5㎕ Taq 폴리머라제를 넣고 총부피가 100㎕가 되도록 증류수를 가한 다음 참조예 7의 조건으로 PCR을 실시하여 PCR 산물을 분리정제한 후 각 PCR 산물을 NEB 완충용액 3의 조건하에서 제한효소 Nde I과 Sal I으로 절단하였다. 이하 이들을 각각 단편 UBCORE14, 단편 UBCORE17, 단편 UBCORE22, 단편 UBKHCV897, 단편 UBE2N, 단편UBE2C 및 단편 UBE1이라 칭한다.

(4-A-4): 발현 벡터의 제조

(단계 1)

플라스미드 ptrp322-HGH(KFCC l0667, 선특허출원공고 제91-457호 참조) 2㎍을 제한효소 pst I과 제한효소 Sal I 으로 완전 절단하고, 또한 동일 플라스미드 2㎍을 제한효소 Pst I 과 제한효소 Nde I 으로 NEB 완충용액 4의 조건하에서 완전 절단한 다음,0.7% 아가로오스 겔로 분리하여 약 1.5Kb와 0.8Kb 단편을 각각 분리 정제하였다. 이하 이들 단편을 각각 단편 PB 및 단편 PS라 칭한다.

(단계 2)

상기 실시예(4-A-3)에서 얻은 단편들을 사용하여 다음과 같이 연결 반응을 실시하였다. 연결반응튜브A에 100ng의 단편 UBCORE14, 연결반응튜브 B에 약 100ng의 단편 UBCORE17, 연결반응튜브 C에 약 100ng의 단편 UBCORE22, 연결반응튜브 D에 약 100ng의 단편 UBKHCV897, 연결반응튜브 E에 100ng의 단편 UBE2N, 연결반응튜브 F에 약 100ng의 단편 UBE2C, 연결반응튜브 G에 약 100ng의 단편 UBE1을 넣고 각 튜브에 상기 단계 2에서 얻은 100ng의 단편 PB, 약 100ng의 단편 PS,2㎕의 10배 농도 연결반응용액, 10 단위체 T4 DNA 리가제를 넣고 총 부피가 20㎕가 되도록 증류수를 가한 다음 16℃에서 12시간 반응 시켰다.

반응이 끝난뒤 대장균 HB101(ATCC 33694)에 형질전환시켜 단편 UBCORE14을 함유하고 있는 ptrpH-UB-CORE14, 단편 UBCORE17을 함유하고 있는 ptrpH-UB-CORE17, 단편 UBCORE22을 함유하고 있는 ptrpH-UB-CORE22, 단편 UBKHCV897을 함유하고 있는 ptrpH-UB-KHCV897, 단편 UBE2N을 함유하고 있는 ptrpH-UB-E2N, 단편 UBE2C를 함유하고 있는 ptrpH-UB-E2C, 단편 UB-E1을 함유하고 있는 ptrpH-UB-E1을 얻었다(제34도 참조).

(4-B) : tac 프로모터를 갖는 pMAL-KHCV 벡터들의 제조

(4-B-1) : 한국형 C형 간염 바이러스 부분 cDNA 유전자의 대량 증폭

(단계 1)

KHCV의 cDNA 단편을 강력한 대장균의 프로모터인 tac 프로모터를 이용하여 MBP 융합 단백질로 발현시키기 위하여 다음과 같은 프라이머들을 DNA 합성기로 합성하였다.

프라이머 PK426R : 5'-CTCCGAATTCGGTGCTTGCGAGTGCCCC-3'

프라이머 PK426X : 5'-CACGCTCGAGGCATGTGAGGGTGTCGATGAC-3'

프라이머 PSALCORE17 : 5'-GGGGTCGACTATTAGGGCAGATTCCCTGTTGC-3'

프라이머 P426B : 5'-GGGTGGGCAGGATGGCTCCTG-3'

프라이머 PK513R : 5'-CTCCGAATTCGGCACGAGGCTGGAGGACGGCGTGAACT-3'

프라이머 PK513X :5'-CACGCTGAGAGGCGACCAGTTCATCATCAT-3'

프라이머 PK810R :5'-CTCCGAATTCGGCACGAGGGTTTCCCAGCTGTTCACCTT-3'

프라이머 PK810X : 5'-CACGCTCGAGATTCATCCAGGTACAACGAACC-3'

프라이머 PK798R : 5'-CTCCGAATTCGGCACGAGGACGTGCTGCTCCTTAAC-3'

프라이머 PK798X :5'-CACGCTCGAGCAGAAGCAGCGGCCATACGCC-3'

프라이머 PK754R :5'-AAAAAGAATTCGGCACGAGGCTGCGAGATTGGGCTCACA-CG-3'

프라이머 PK754X : 5'-AAAAACTCGAGCCGCATAGTAGTTTCCATAGACTCAACGGGTATGAATT-3'

프라이머 PK652R : 5'-AAAAAGAATTCGGCACGAGGTTCATACCCGTTGAGTCTATGGAA-3'

프라이머 PK652X : 5'-ATTATTGTCGACTATCTATCTACTCGAGTCACAGCTTTGCAGCGAGCTCGT-3'

프라이머 PK403R : 5'-AAAAAGAATTCACGGGCATGACCACTGAC-3'

프라이머 PK403X : 5'-ATTATTCTCGAGTATCACTCTTGCCGCCACAAGAG-3'

프라이머 PK27lR : 5'-AAAAAGAATTCACTAGCCTTACAGGCCGG-3'

프라이머 PK271X : 5'-CACGCTCGAGTCACGTGACCAGGTAAAGGTC-3'

프라이머 PK495R : 5'-CCCCCGAATTCGGCACGAGCGCTGCGGAGGAAAGCAAGTT-3'

프라이머 PK495X : 5'-AAAAACTCGAGGACCACGTCATAAAGGGCCA-3'

프라이머 PK494R : 5'-AAAAGAATTCGGCACGAGCGATGCATCTGGTAAAAGGGT-3'

프라이머 PK494X : 5'-AAAACTCGAGATTGGAGTGAGTTTGAGCTT-3'

(단계 2)

이들 합성된 프라이머들과 프라이머에 대한 주형을 다음과 같은 조합으로 사용하여 중합효소 연쇄반응(참조예 7 참조)을 다음과 같이 실시하였다.

조합 1 : 프라이머 PK426R 2㎍, 프라이머 PK426X 2㎍

조합 2 : 프라이머 PK426R 2㎍, 프라이머 PK426B 20ng, PSALCORE17 2㎍

조합 3 : 프라이머 PK513R 2㎍, 프라이머 PK513X 2㎍,

조합 4 : 프라이머 PK810R 2㎍, 프라이머 PK810X 2㎍,

조합 5 : 프라이머 PK798R 2㎍, 프라이머 PK798X 2㎍,

조합 6 : 프라이머 PK754R 2㎍, 프라이머 PK754X 2㎍,

조합 7 : 프라이머 PK652R 2㎍, 프라이머 PK652X 2㎍,

조합 8 : 프라이머 PK403R 2㎍, 프라이머 PK403X 2㎍,

조합 9 : 프라이머 PK271R 2㎍, 프라이머 PK271X 2㎍,

조합 10 : 프라이머 PK495R 2㎍, 프라이머 PK495X 2㎍,

조합 11 : 프라이머 PK494R 2㎍, 프라이머 PK494X 2㎍

을 만든 다음 각 조합에 한국형 HCV cDNA(KHCV-LBC1;ATCC 75008, 이하 KHCV-LBCl DNA로함) 10ng,10㎕의 10배 중합효소 완충용액,10㎕의 10mM dNTP, 0.5㎕(2 단위체)의 Taq 폴리머라제를 가하고 총 부피가 100㎕가 되도록 증류수를 가한 다음 미네랄 오일 50㎕를 각 혼합물 위에 가한 다음 온도순환기로 순환 프로그램을 25회 반복 수행하였다.

(4-B-2) : 발현 벡터의 제조

2㎍의 플라스미드 pMAL-CR1(New England Biolabs, Inc. Cat. No. 800,11099 North Torrey Pines Road, La Jolla,U.S.A.)을 NEB 완충용액 3(참조예 1)에서 제한효소 Eco RI과 Sal I으로 절단하여 페놀과 페놀/클로로포름으로 추출하여 에탄올 침전시킨 후 40㎕의 TE 용액에 용존시켰다.

상기 (4-B-1)의 (단계 2)에서 얻은 PCR 산물들을 제한효소 Eco RI과 Xho I 으로 다음과 같이 절단하였다. 프라이머 조합 1,3,6-8 및 10-13의 PCR 산물 약 1㎍은 제한효소 Eco RI과Xho I 으로 완전 절단하였으며, 프라이머 조합 7 및 9의 PCR 산물 약 3㎍은 제한효소 Xho I으로 완전 절단시킨 후 제한효소 EcoR I 으로 부분 절단하였으며 ; 프라이머 조합 3은 Eco RI과 Sal I 으로 완전 절단하여 참조예 1에서와 같은 과정으로 20㎕의 TE 용액에 용존시켰다.

이들 Eco RI과 Xho I 및 Eco RI과 Sal I 으로 절단된 각각의 cDNA 5㎕에 10배 접합 완충용액 2㎕와, 제한효소 Eco RI과 Sal I 으로 절단한 pMal-CRl 1㎕(약 50ng)와 T₄DNA 리가제 10 단위체에 총 부피 20㎕가 되도록 증류수를 가한 다음,16℃에서 12시간 동안 반응시켰다.

이어서 대장균HB 101(ATCC 33694)에 형질전환시켜 원하는 각 재조합 벡터들을 찾았으며 이들을 다음과 같이 명명하였다. 즉,

프라이머 조합 1의 cDNA를 함유한 클론을 pMAL-KHCV 426,

프라이머 조합 2의 cDNA를 함유한 클론을 pMAL-KHCV 555,

프라이머 조합 3의 cDNA를 함유한 클론을 pMAL-KHCV 5l3,

프라이머 조합 4의 cDNA롤 함유한 클론을 pMAL-KHCV 810,

프라이머 조합 5의 cDNA를 함유한 클론을 pMAL-KHCV 798,

프라이머 조합 6의 cDNA를 함유한 클론을 pMAL-KHCV 754,

프라이머 조합 7의 cDNA를 함유한 클론을 pMAL-KHCV 652,

프라이머 조합 8의 cDNA를 함유한 클론을 pMAL-KHCV 403,

프라이머 조합 9의 cDNA를 함유한 클론을 pMAL-KHCV 271,

프라이머 조합 10의 cDNA를 함유한 클론을 pMAL-KHCV 495,

프라이머 조합 11의 cDNA를 함유한 클론을 pMAL-KHCV 494

로 명명하였다. 증폭된 KHCV의 cDNA 부분을 클로닝하는데 사용한 벡터 pMAL-CR1을 제35도에 나타내었다.

(4-C) : 한국형 C형 간염 바이러스 부분 cDNA들의 발현 유도

(4-C-1) : trp 프로모터를 갖는 벡터의 발현 유도

(단계 1)

상기 실시예(4-A)에서 얻은 각 한국형 HCVcDNA를 함유하고 있는 플라스미드를 발현용 대장균인W3110(ATCC 37335)에 형질전환시켰다. 형질전환된중 ptrpH-UB-KHCV 897, ptrpH-UB-CORE17, ptrpH-UB-CORE14, ptrpH-UB-E1 및 ptrpH-UB-E2N에 의해 각각 형질전환된W3110을 ATCC(미합중국 종균협회)에 국제기탁하였으며 기탁번호는 각각 ATCC 69640(1991. 6 .27.일자 기탁), ATCC 68641(l991.6.27일자 기탁) 및 ATCC 68642(l991.7.1일자 기탁) ATCC 68878(1991.12. 11일자 기탁) 및 ATCC 68966(1992년 4월 22일자 기탁)이다.

형질전환된 대장균을 50㎍/ml의 엠피실린이 함유된 액체 LB 배지(1% 박토트립톤,0.5% 효모 추출물, 1% NaCl)에서 12시간 동안 진탕 배양한 다음, 이중 5ml을 1ℓ의 M9 배지(40mM K₂HPO₄, 22mM KH₂PO₄, 8.5mM NaCl, 18.7mM NH₄Cl, 1% 클루코스,0.1mM MgSO₄, 0.1mM CaCl₂, 0.4% 카사미노산, 10㎍/ml Vit B₁, 40㎍/ml 엠피실린)으로 옮겨서 37℃에서 약 3-4시간 동안 진탕 배양하여 배양액의 O.D.(광학밀도)값이 650nm에서 0.5 정도가 될때 인돌 아크릴산(IAA)을 최종 농도 1.4mM이 되게 첨가하여 재조합된 KHCV 유전자들이 발현되도록 하였다. IAA를 첨가한지 약 5시간 후에 세포 배양액을 원심분리기(Beckman J6 B, Rotor JS 4.2)를 이용하여 3000rPm으로 25분간 원심분리하여 박테리아 세포 침전물을 수집 하였다.

(단계 2)

상기 (단계 1)에서 얻은 세포 균질액을 램리의 방법(Laemmli,680(1970))에 따라 12% 나트륨 도데실 설페이트 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동(SDS-PAGE)하여 유전자 산물을 발현시킨 결과 KHCV 유전자 산물들이 유비퀴딘 단백질과 융합되어 발현되었으며 이를 제36도 내지 제38도에 나타내었다.

제36도에서, M열은 단백질 표준 분자량으로서 위로부터 72,43,29 및 18킬로(K) 달톤을 나타내고,

제1열은 플라스미드를 함유하지 않은 대장균이며,

제 2 열은 ptrpH-UB-CORE14를 함유한 대장균으로서 분자량이 약 23K 달톤인 단백질이 발현되었고,

제3열은 ptrpH-UB-CORE17를 함유한 대장균으로서 분자량이 약 27K 달톤인 단백질이 발현되었으며,

제 4 열은 ptrpH-UB-CORE22를 함유한 대장균으로서 분자량이 약 29K 달톤인 단백질이 발현되었고,

제5열은 ptrpH-UB-KHCV897을 함유한 대장균으로서 분자량이 약 40K 달톤인 단백질이 발현되었으며,

제 6 열은 정제한 KHCV UB 897 단백질을 나타낸다.

또한 제37도에서,

제1열은 플라스미드들을 함유하지 않은 대장균이며 ;

제2열은 ptrpH-UB-E1을 함유한 대장균으로서 인돌 아크릴산을 첨가하여 2시간 후에 채취된 시료이며,

제3열을 ptrpH-UB-E1을 함유한 대장균으로서 인돌 아크릴산을 첨가하여 4시간 후에 채취된 시료이며,

제4열을 ptrpH-UB-E1을 함유한 대장균으로서 인돌 아크릴산을 첨가하여 6시간 후에 채취된 시료이며,

제 5 열을 ptrpH-El을 함유한 대장균으로서 인돌 아크릴산을 첨가하여 12시간 후에 채취된 시료이며,

제6열을 단백질 표준 분자량으로서 위로부터 72,43,29,18,14킬로 달톤을 나타낸다.

또한 제38도에서,

제 1열은 플라스미드를 함유하지 않은 대장균이고,

제 2 열은 ptrpH-UB-E2C을 함유한 대장균이며,

제 3 열은 ptrpH-UB-2CN를 함유한 대장균을 각각 나타낸다.

또한 상기 겔 상에서 분리된 단백질을 상기 실시예(3-C)와 같은 방법으로 웨스턴 블럿팅하였으며 그 결과를 제39도 내지 제41도에 나타내었는 바, 발현된 단백질이 한국인 C형 간염에 감염된 환자의 항체에 특이하게 반응함을 확인할 수 있었다.

(4-C-2) : tac 프로모터를 갖는 벡터의 발현 유도

(단계 1)

상기 (4-B)에서 얻은 각 한국형 HCV cDNA를 함유하는 플라스미드들을 사용하여 참조예 4의 방법에 따라 발현용 대장균인D1210(ATCC 27325)을 형질전환시킨 후(이들 중 pMAL-KHCV555로 형질전환시킨D1210 pMAL-KHCV555는 ATCC 68639로 1991년 6월 27일자로 미합중국 종균협회(ATCC)에 기탁하였음) 이들을 50㎕/ml의 엠피실린이 함유된 액체 LB 배지에서 12시간 동안 진탕 배양하고, 이중 5ml를 1ℓ의 M9 배지(1ℓ당 Na₂HPO₄6g, KH₂PO₄3g, NaCl 0.5g, NH₄Cl 1g, 1M MgSO₄2㎕, 20% 글루코스 100㎕, 1M CaCl₂0.1ml)로 옮겨서 37℃에서 약 3 내지 4시간 동안 진탕 배양하여 대장균의 광학밀도가 650nm에서 0.5 정도의 흡광도에 이를때 IPTG(Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoslde) 을 최종 농도 0.2mM이 되게 첨가하여 재조합된 KHCV 유전자들이 발현되도록 하였다. IPTG를 첨가한지 약 5시간 후에 세포 배양액을 원심분리기(Beckman J6-B,Rotor JS 4.2)를 이용하여 3000rpm에서 25분간 원심분리하여 박테리아 세포 침전물을 수집하였다.

(단계 2)

(단계 1)에서 얻은 세포의 침전물을 램리(Laemmli)의 방법(Nature227, 680(1970))에 따라 SDS(sodium dodecyl sufate)의 존재하에서 12% 폴리아크릴아마이드 겔에서 전기영동하여 유전자 산물의 생성을 확인하였으며 이를 제42도에 나타내었다. 제2도에서, M열은 표준 단백질 분자량을 나타내고,

제1열은 pMAL-CR1을 함유한 대장균인데 분자량이 약 40K(킬로) 달톤인 단백질이 생성되었으며,

제2열은 pMAL-KHCV 426를 함유한 대장균인데 분자량이 약 65K 달톤인 단백질(MBP-KHCV 426단백질)이 생성되있으며,

제3열은 pMAL-KHCV 555를 함유한 대장균인데 분자량이 약 70K 달톤인 단백질(MBP-KHCV 555단백질)이 생성되었으며,

제4열은 pMAL-KHCV 513을 함유한 대장균인데 분자량이 약 65K 달톤인 단백질(MBP-KHCV 513단백질)이 생성되었으며,

제5열은 pMAL-KHCV 810을 함유한 대장균인데 분자량이 약 75K 달톤인 단백질(MBP-KHCV 810단백질)이 생성되었으며,

제6열은 pMAL-KHCV 798을 함유한 대장균인데 분자량이 약 72K 달톤인 단백질(MBP-KHCV 798단백질)이 생성되었으며,

제7열은 pMAL-KHCV 271을 함유한 대장균인데 분자량이 약 50K 달톤인 단백질(MBP-KHCV 271단백질)이 생성되었으며,

제8열은 pMAL-KHCV 754을 함유한 대장균인데 분자량이 약 72K 달톤인 단백질(MBP-KHCV 754단백질)이 생성되었으며,

제9열은 pMAL-KHCV 652를 함유한 대장균인데 분자량이 약 70K 달톤인 단백질(MBP-KHCV 652단백질)이 생성되었으며,

제10열은 pMAL-KHCV 403을 함유한 대장균인데 분자량이 약 65K 달톤인 단백질(MBP-KHCV 403단백질)이 생성되었으며,

제11열은 pMAL-KHCV 495를 함유한 대장균인데 분자량이 약 70K 달톤인 단백질(MBP-KHCV 495단백질)이 생성되었으며,

제12열은 pMAL-KHCV 494를 함유한 대장균인데 분자량이 약 70K 달톤인 단백질(MBP-KHCV 494단백질)이 생성되었다.

그런후에, 상기 겔상에서 분리된 단백질을 실시예 (3-C)와 같은 방법으로 웨스턴 블럿팅을 수행하여 그결과는 제43도에 나타내었다.

(4-C-3) : MBP 융합 단백질의 절단

먼저 MBP 융합 단백질 약 20㎍을 일종의 단백질 분해 효소인 팩터(factor) Xa의 완충용액(20mM Tris-HCl, pH 8.0,100mM NaCl, 2mM CaCl₂, 1mM azide)에 대하여 24시간 동안 투석한 후 투석된 MBP 융합 단백질 약 2㎍(lmg/ml 농도)에 0.2㎍의 팩터 Xa(New England Biolabs, Cat. # 800-10L)를 잘 혼합하고 상온에서 24시간 동안 반응시켰다

반응이 끝난 후 시료를 5분간 100℃에서 가열한뒤 실시예(1-C)와 같은 방법으로 SDS-폴리아크릴아마이드 겔에서 전기영동하여 MBP 단백질과 각 KHCV 단백질 분리되는 것을 확인하였다. MBP 단백질이 분리된 KHCV 단백질을 각각 KHCV 426 단백질, KHCV 555 단백질, KHCV 513 단백질, KHCV 810 단백질, KHCV 798 단백질, KHCV 271 단백질, KHCV 754 단백질, KHCV 652 단백질, KHCV 403 단백질,KHCV 495 단백질 및 KHCV 494 단백질이라고 명명하였다.

상술한 바와 같이, 본 발명의 재조합 발현 벡터의 제조에 있어서, 본 발명의 PCR 방법에 의해 증폭되는 KHCV cDNA는 도입되는 프라이머의 조합에 의해 다양한 길이와 뉴클레오티드 서열을 갖도록 제조될 수 있으며 이는 당해 분야에서 통상의 지식을 가진 사람에게는 자명하다. 또한 다양한 제한 효소, DNA 분해효 소 및/또는 링커를 사용하여도 마찬가지로 상기의 목적이 달성될 수 있다는 것 또한 당해 분야에서 자명한 사실이다. 또한 발현 벡터에 포함되는 KHCV cDNA의 서열과 길이에 따라 그로부터 생성되는 단백질의 아미노산 서열과 길이가 결정되므로 다양한 종류의 KHCV 항원 단백질의 생성이 가능하다. 상기 방법에 의해 제조될 수 있는 모든 KHCV cDNA 발현 벡터 및 그에 의해 생성되는 KHCV 항원 단백질은 본 발명의 범위를 벗어나지 않는다.

(실시예 5)

효모 세포에서 발현된 KHCV 단백질의 정제

(5-A) : KHCV 403 단백질의 정제

(단계 1) : 유전자 재조합 효모 세포의 배양

한국형 C형 간염 바이러스의 특이항원인 KHCV 403 cDNA와 유비퀴틴 유전자를 포함하는 벡터(pYLBC-A/G-UB-KHCV 403)에 의해 형질전환된 효모 세포(DCO4-UB-KHCV403)를 4% 포도당이 첨가된 루이신 결핍 배지(0.67% 아미노산이 없는 효모 질소기질, 5% 포도당, 루이신결핍된 아미노산 혼합물 0.25%) 10ml에서 30℃에서 12시간 배양한 다음, 5%의 포도당을 함유하는 100ml의 YEPD 배지(2% 펩톤,1% 효모 추출물,5% 포도당)에 약 100ml를 옮겨 30℃에서 약 6시간 동안 진탕 배양하여 발효시킨 다음 5%의 포도당을 함유한 1ℓ의 YEPD 배지로 옮겨 30℃에서 약 6시간 동안 진탕 배양하여서 발효를 위한 종자균을 얻었다.

14ℓ 용량의 발효조(Bench Top Fermentor: NBS 사, U.S.A.)에 10ℓ의 YEPD(2% 포도당) 배지를 채우고 상기 종균 배양액을 접종한 다음, 250rpm의 진탕속도 및 30℃의 온도조건에서 약 48시간 동안 진탕 배양하였다. 배양액을 원심분리기(Beckman J-6B, Rotor JS 4.2)를 사용하여 2500rpm의 속도로 20분간 원심분리하여 재조합 효모 세포 페이스트를 얻었다.

(단계 2) 효모 세포의 파괴

상기 (단계 1)에서 얻어진 재조합 효모 조합 패이스트를 500ml의 완충액(50mM 트리스 5mM EDTA, pH 8.0,10mM β-머캅토에탄올, 1mM 페닐메틸설포닐플루오라이드 1㎍/ml 펩스타틴 A)에 현탁시킨 다음, 직경 0.4℃의 유리구술을 총 부피의 50%(v/v)까지 첨가하고 균질분쇄기로 0.4mm의 유리구슬을 총 부피의 50%(v/v)까지 첨가하고 균질분쇄기로 4℃의 온도에서 5분간 분쇄하여 세포막을 파괴시켰다 .파괴된세포액을 여과막(whatman, 3MM, U.S.A.)을 이용하여 진공 여과시켜서 유리구슬을 제거하고 효모 균질액을 얻었다.

(단계 3) 특이항원 단백질의 확인

상기 (단계 2)에서 얻어진 효모 균질액중 소량을 15% SDS-폴리아크릴 아미이드 겔에서 전기영동하고, 여기서 유비퀴틴이 세포내에서 단리되고 KHCV403 cDNA로부터 발현된 단백질은 약 17,000달톤(dalton) 정도의 크기로 생성됨을 확인하였다(이하 이를 KHCV403 단백질이라 함).

그런 다음, 젤상으로부터 분리된 단백질을 니트로셀룰로스 필터로 전달(blot)시킨 다음, 이 필터를 0.5% 트윈-20이 함유된 인산염수 완충액(PBS : 10mM 인산 0.15M NaCl, pH 7.0)에 넣고 상온에서 2시간 동안 약하게 혼들어 주어 단백질에 하기 면역글로불린 G가 비특이적으로 결합되는 겻을 차단(blocking)하였다. 이어서, 0.5% 젤라틴과 0.05% 트윈 20을 함유하는 PBS에 한국인 C형 간염 환자의 혈청으로부터 분리한 면역글로불린 G(8.2mg/ml)를 1/200(v/v)로 희석시켜 첨가하고 상온에서 1시간 동안 약하게 흔들면서 반응시킨 다음, 0.05% 트윈-20을 함유한 PBS로 5분씩 4회 세척하였다. 이 필터에 0.5% 젤라틴과 0.05% 트윈-20을 함유하는 PBS에 양고추냉이 퍼옥시다제(horseradish peroxidase)로 표지된 항-사람 면역글로불린 G(Bio-Rad Lab, Goat Anti-Human IgG-HRP)을 1/20(v/v)로 희석시켜 첨가한 다음, 상온에서 1시간동안 약하게 흔들면서 반응시켰다.이 필터를 0.05% 트윈 20을 함유하는 PBS로 5분씩 4회 세척하고,50mM 트리스 완충액(pH 7.0)으로 2회 세척한 다음, 400㎍/ml 4-클로로-1-나프톨과 0.03% 과산화수소수가 함유된 50mM 트리스 완충액(pH 7.0)을 첨가하여 발색시켰으며 이때 총 효모 균질액 중에서 KHCV403단백질만이 C형 간염 환자의 혈청과 면역학적으로 반응하여 가시적 밴드로 나타났다.

(단계 4) : 용해된 단백질의 제거

상기 (단계 2)에서 얻어진 효모 균질액을 11,000rpm에서 원심분리(Beckman J2-21, Rotor JA l4 이용)하여 상등액을 제거하고 KHCV403 단백질을 포함하는 불용성 침전물을 얻었다.

(단계 5) : 8M 우레아를 사용한 침전물의 용해와 우레아 분별 분획

상기 (단계 4)에서 얻어진 침전물을 8M 우레아가 함유된 완충액(50mM 트리스, pH 8.5, 5mM EDTA, 10mM β-머캅토에탄올, 1mM 페닐메틸설포닐플루오라이드,1㎍/ml 펩스타틴 A) 750ml에 용해시킨 다음,원심분리하여 용해되지 않은 침전물을 제거하고 상등액만을 취하였다. 이 상등액을 2M 우레아가 포함된 완충액(10mM 트리스, pH 9.0, 2mM EDTA, 5mM β-머캅토에탄올)으로 투석시킨 뒤, 원심분리하여 침전물을 제거하고 KHCV403 단백질이 함유된 상등액만을 얻었다.

(단계 6) : 1차 DEAE-이온 교환 크로마토그래피

상기 (단계 5)에서 얻어진 상등액을 2M 우레아가 함유된 완충액(10mM 트리스, pH 9.0, 2mM EDTA, 5mM β-머캅토에탄올)으로 평형시킨 DEAE-세파로즈 컬럼(Pharmacia FF, 5cm×15cm, U.S.A.)에 통과시킨 후, 결합된 단백질에 0.2M 염화나트륨을 함유하는 동일 완충액(10mM 트리스, pH 9.0, 2mM EDTA, 5mM β-머캅토에탄올) 750ml를 가하여 분리되는 단백질 분획을 수집하였다.

(단계 7): 2차 DEAE 이온 교환 크로마토그래피

상기 (단계 6)에서 수집된 단백질 분획을 완충액(10mM 트리스, 2mM EDTA, 5mM β-머캅토에탄올,pH 9.0)으로 투석시켜 우레아를 제거한 다음 동일 완충액으로 평형시킨 DEAE-세파로즈 컬럼에 통과시켰다. 0.1M 염화나트륨을 함유하는 완충액(10mM 트리스, pH 9.0, 2mM EDTA, 5mM β-머캅토에탄올)을 가하여 분리되는 단백질을 제거한 다음, 염화나트륨을 0.1M 내지 0.2M 농도 구배로 갖는 완충액(10mM 트리스, pH 9.0, 2mM EDTA, 5mM β-머캅토에탄올) 500ml를 가하여 분리되는 단백질 분획들을 얻었다. 이 분획들을 SDS-PAGE한 다음 고순도의 KHCV403 단백질을 포함하는 특정분획을 수집하였다.

(단계 8) :FPLC-페닐 크로마토그래피

상기 (단계 7)에서 수집한 단백질 용액을 1.5M 염화나트륨을 함유하는 완충액(50mM 트리스, pH 7.4, 2mM EDTA,5mM β-머캅토에탄올)으로 투석시킨 다음, 동일 완충액으로 평형시킨 FPLC-페닐 수퍼로스 컬럼(Pharmacia, HR 10/10,1cm×8cm, U.S.A.)에 통과시키고 염화나트륨을 1.5 내지 OM의 농도구배로 갖는 완충액(50mM 트리스, pH 7.4, 2mM EDTA, 5mM β-머캅토에탄올) 160ml을 가하여 분리되는 분획을 얻었다. 이들 분획들을 SDS-PAGE 하여 순도를 확인하고, 이로부터 고순도의 KHCV403 단백질을 포함하는 특징분획을 별도로 수집하여 95% 이상의 순도를 가진 KHCV403 단백질을 얻었다.

(5-B): KHCV CORE14 단백질의 정제

(단계 1) :재조합 효모 세포의 배양

C형 감염 바이러스의 특이항원인 CHCV CORE14 단백질을 코딩하는 유전자와 유비퀴틴 유전자를 포함하는 벡터 (pYLBC-A/G-UB-CORE 14) 에 의해 형질전환된 효모(DCO4 -UB-CORE14)를 상기 실시예(5-A)의 (단계 1)과 유사한 방법으로 5% 포도당이 첨가된 루이신 걸핍배지에서 24시간 배양 후 그중 20ml를 0.1/ℓYEPD 배지(2% 펩톤,1% 효모 추출물,4% 포도당)로 옮겨,30℃에서 약 6시간 진탕배양후 1ℓ의 2% 포도당을 함유한 YEPD 배지로 옮겨 24-48 시간 배양한 후 원심분리하여 효모 세포 침전물을 얻었다.

(단계 2) : 효모 세포의 파괴

상기 (단계 1)에서 수득한 재조합 효모 세포 침전물을 30ml의 완충액(50mM 트리스, pH 7.5, 5mM EDTA, 10mM β-머캅토에탄올, 1mM 페닐 메틸 술포닐 플루오라이드,1㎍/ml 펩스타틴)으로 현탁시킨 다음, 직경 0.4mm의 유리구술(glass bead)을 부피의 50%가 되도록 첨가하고 균질분쇄기(Bead Beater, Biospec Product, U.S.A.)로 4℃의 온도에서 5분간 3번 분쇄하여 세포막을 파괴시키고, 효모 균질액을 수득하였다.

(단계 3) : 특이항원 단백질 생성의 확인

(단계 2)에서 얻은 효모 균질액 중 소량을 15% SDS-폴리아크릴 아미이드 젤에서 전기영동한 후 코마시 블루(coomasie brilliant blue) 염색하여 유비퀴틴은 세포내에서 단리되고 KHCV cDNA로부터 발현된 단백질은 약 16,000달톤(dalton) 정도의 크기로 발현되는 것을 확인하였다(이하 KHCV CORE14 단백질이라 함).

웨스턴 블롯팅은 상기 실시예(5-A)의 (단계 3)과 같은 방법으로 수행하였다.

그 결과 총 효모 균질액 중에서 KHCV CORE14 단백질만이 C형 간염 감염환자의 혈청과 면역학적으로 반응하여 가시적 밴드로 나타남을 알 수 있다.

(단계 4) : 용해시 단백질의 제거 및 불용성 침전물의 세척

상기 (단계 3)에서 얻은 효모 균질액을 원심분리기(Beckman J2-21, Rotor JA-14)에서 11,000rpm으로 원심분리하여 용해된 단백질을 제거하고 KHCV 코아 14 단백질을 포함하는 불용성 침전물을 얻었다. 이 침전물을 0.5ℓ의 1% 트리톤 X-100, 1mM EDTA,10mM 베타머캅토에탄올이 함유된 PBS에 현탁시켜 10분간 교반한 후 원심분리하였다. 이 침전물을 다시 10mM 인산염 용액(pH 6.5)으로 씻어 주었다.

(단계 5) : 8M 우레아를 사용한 침전물의 용해

상기 (단계 4)에서 얻은 불용성 침전물을 8M 우레아, 1mM EDTA,10mM 베타머캅토에탄올이 함유된 10mM 인산나트륨 용액(pH 6.5)에 현탁시킨 후 4℃에서 12시간동안 교반시켰다. KHCV CORE14 단백질은 이 조건에서 용해되었다. 이 용액을 원심분리기(Beckman J2-21, Rotor JA20)에서 15,000rpm으로 20분간 원심분리한 후 상등액을 취하였다.

(단계 6) : CM-이온 교환 수지 크로마토그래피

25ml의 CM(carboxymethyl) -세파로스 수지(Pharmacia, Sweden) 가 있는 컬럼(크기 : 2.5cm×10cm)을 6M 우레아, 1mM EDTA, 10mM 베타머캅토에탄올,10mM 인산염 용액(pH 6.5)으로 평형시킨 후 단계 5에서 얻어진 KHCV CORE14 단백질을 함유한 용액을 분당 1ml 유속으로 통과시킨 다음 컬럼내에 유리된 상태로 남아있는 물질들을 상기 평형 용액으로 완전히 세척하였다. 이 평형 완충 용액에 0 내지 0.5M 염화나트륨 농도구배를 준 500ml의 용액으로 컬럼에 부착된 단백질을 용출시켰다. 이때의 유속은 3ml/분으로 하였다. SDS 폴리아크릴아미이드 겔 전기영동 결과 KHCV CORE14 단백질은 0.3M 염화나트륨 근처에서 용출되었으며 이 분획들을 모았다.

(단계 7) : S-200 젤 투과 크로마토그래피

상기 (단계 6)에서 얻은 분획들을 모아 YM5 한외여과막(Amicon, USA)으로 10ml로 농축하였다. 이 농축된 용액을 6M 우레아, 1mM EDTA,10mM 베타머캅토에탄올을 포함하는 PBS 용액으로 평형된 S-200 세파크릴(Pharmacia, Sweden) 컬럼(크기: 2.5cm×100cm)에 분당 0.5ml의 유속으로 통과시켜 분자량 크기에 따라 분리하였다. 단백질의 분획을 수집하고 15% SDS-폴리아크릴 아미아드 겔 전기영동으로 확인한 다음, 고순도의 KHCV CORE14 단백질을 포함하는 특징분획을 모아 4℃에서 PBS 완충액을 투석하여 우레아를 제거하였다. 이러한 정제 방법으로 고순도의 KHCV CORE14 단백질 4mg을 얻었다.

효모 세포에서 발현된, 다른 DHCV cDNA 절편에 의해 코딩된 단백질들 예를 들면 KHCV897 단백질등도 상기와 유사한 방법으로 정제할 수 있으며 상기 방법을 통상의 전문가에게 자명한 방법으로 변형시켜 사용할 수도 있다.

(실시예 6)

대장균에서 발현된 DHCV 단백질의 정제

(6-A) : KHCV UB 897 단백질의 정제

(단계 1) : 유전자 재조합 대장균 세포의 배양

한국형 C형 간염 바이러스의 특이항원인 KHCV897의 유전자와 유비퀴틴의 유전자를 포함하는 벡터(ptrpH-UB-KHCV897)에 의해 형질전된 대장균 균주(W3110 ptrpH-UB-KHCV897, ATCC68640)를 50㎍/ml의 앰피실린이 함유된 LB 배지(1리터당 박토-트립톤 10g, 효모 추출물,5g, NaCl 10g)에서 12시간 동안 진탕 배양한 다음, 이중 5ml를 앰피실린(40㎍/ml)을 함유하는 1ℓ의 M9 배지(40mM K₂HPO₄, 22mM KH₂PO₄, 8.5mM NaCl, 18.7mM NH₄Cl, 1% 글루코스, 0.1mM MgSO₄, 0.1mM CaC1₂, 0.4%카사미노산, 10㎕/ml Vit B₁)로 옮겨서 37℃에서 약 3 내지 4시간동안 진탕 배양하였다. 이때, 배양도중 대장균의 배양액의 O.D.(광학 밀도) 값이 650nm에서 0.5 정도가 될때 인돌아크릴산(IAA)을 최종 농도 0.14M이 되게 첨가하여 KHCV UB 897 단백질이 생성되도록 하였다. IAA를 첨가한 지 약 5시간 후에 세포배양액을 원심분리기(Beckman J-6B, Rotor JS 4.2)로 2,500rpm에서 20분간 원심분리하여 대장균 세포 침전물을 얻었다. 이 침전물을 인산염수 완충액(10mM 인산, pH 7.0, 0.15M 염화나트륨)으로 1회 세척하였다.

(단계 2) : 세포파괴

상기 (단계 1)에서 얻어진 대장균 세포 침전물 3g을 40ml의 완충액(50mM 트리스, pH 8.5,5mM EDTA, 2mM β-머캅토에탄올, 1mM 페닐메틸설포닐플루오라이드, 1㎍/ml 펩스타틴 A) 에 현탁시킨 후, 50mg/ml의 리소자임 용액 0.3ml을 첨가하여 37℃에서 1시간동안 방치하였다. 이어서, 얼음위에서 초음파분쇄기(HEAT SYSTEMAS-ULTRASONICS, INC, W225, USA)로 70%의 출력에서 약 5분 간격으로 초음파 처리하여 세포를 파괴시키서 대장균 세포 균질액을 얻었다.

(단계 3): 특이항원 단백질의 확인

상기 (단계 2)에서 얻어진 대장균 세포 균질액중 소량을 12% SDS-PAGE하고, 여기서 상기 벡터에 의해 발현된 단백질이 약 39,000달톤(dalton) 정도의 크기로 발현됨을 확인하였다.(이하 KHCV UB897 단백질이라 함).

그런 다음, 젤상으로부터 분리된 단백질을 니트로셀룰로스 필터로 전달(blot)시킨 다음 상기 실시예 5의(5-A)의 (단계 3)과 같은 방법으로 웨스턴 블럿팅하였다.

그 결과 총 대장균 세포 균질액 중에서 KHCV UB 897 단백질만이 C형 간염 환자의 혈청과 면역학적으로 반응하여 가시적 밴드로 나타남을 알 수 있었다.

(단계 4) : 가용성 단백질의 제거

상기 (단계 2)에서 얻어전 세포 균질액을 원심분리기(Beckman J2-21, Rotor JA 14)로 l1,000rpm에서 25분간 원심분리하여 용해된 상태의 단백질을 제거하고 불용성 침전물을 얻었다.

(단계 5) : 트리톤 X-100과 트리스 완충액을 이용한 불용성 침전물의 세척

상기 (단계 4)에서 얻어진 침전물을 1% 트리톤 X-100을 함유하여 완충액(50mM 트리스, pH 8.5, 5mM EDTA, 2mM β-머캅토에탄올) 50ml로 현탁시키고 상온에서 30분간 교반시킨 다음, 원심분리기(Beckman J2-21, JA 14)로 11,000rpm에서 25분간 원심분리하여 상등액을 제거하고 불용성 침전물을 얻었다. 이어서, 이 침전물을 완충액(50mM 트리스, pH 8.5,5mM EDTA, 2mM β-머캅토에탄올) 50ml로 현탁시키고 교반시킨 다음 재 원심분리하여 상등액을 제거하고 불용성 침전물을 얻었다.

상기와 같은 간단한 세척 과정만으로도 순도 60% 이상의 KHCV UB 897 단백질을 얻을 수 있다.

(단계 6) : 8M 우레아를 이용한 불용성 침전물의 용해

상기 (단계 5)에서 얻어진 KHCV UB 897 단백질을 포함하는 불용성 침전물을 8M 우레아를 함유하는 완충액(20mM 인산, pH 6.0, 2mM EDTA, 2mM β-머캅토에탄올) 50ml에 현탁시킨 다음, 상온에서 1시간동안 교반시켜 용해시켰다.이를 원심분리하여 용해되지 않는 침전물을 제거하고 그 상등액만을 얻었다.

(단계 7) : S-세파로스 이온 교환 크로마토그래피

상기 (단계 6)에서 얻어진 상등액을 4M 우레아를 함유한 완충액(20mM 인산염, pH 6.0, 2mM EDTA, 2mM β-머캅토에탄올) 으로 평형시킨 S-세파로스 컬럼(Pharmacia, FF, 2.5cm×7cm, USA)에 통과시키고, 염화 나트륨을 0에서부터 0.2M까지의 농도구배로 함유하는 600ml의 완충액을 가하여 용출시켰다 .이들 단백질 분획들을 SDS-PAGE 하여 순도를 확인한 후 고순도의 KHCV UB 897 단백질을 포함하는 특정 분획을 별도로 수집하였다.

(단계 8) : 우레아의 제거 및 FPLC-모노 Q 이온 교환 크로마토그래피

상기 (단계 7)에서 수집된 KHCV UB 897 단백질을 포함하는 단백질 용액을 완충액(10mM 트리스, pH 8.5, 2mM EDTA, 2mM β-머캅토에탄올)으로 투석시켜서 우레아를 제거한 다음, 동일 완충액으로 평형시킨 FPLC-모노 Q 이온 교환 수지 컬럼(Pharmacia, HR 5/5)에 통과시키고, 염화나트륨을 0에서부터 0.4M까지의 농도 구배로 함유하는 40ml의 완충액을 가하여 용출시켰다.이들 단백질 분획을 SDS-PAGE하여 순도틀 확인하고, 이로부터 고순도의 KHCV UB 897 단백질을 포함하는 특정분획을 별도로 수집하여 90% 이상의 순도를 가진 KHCV UB 897 단백질을 얻었다.

(6-B) : KHCV UB CORE17 단백질의 정제

(단계 1) : 제조합 대장균 세포의 배양

C형 간염 바이러스의 cDNA와 유비퀴틴 유전자가 클로닝된 벳터(ptrpH-UB-CORE17)에 의해 형질 전환된 대장균(W3110 ptrpH-UB-CORE17, ATCC 68641)을 50㎍/ml 앰피실린,100㎍/ml 트립토판을 함유하는 LB 배지에서 12시간동안 37℃에서 배양한 후 상기 실시예(6-A)의 (단계 1)과 같은 방법으로 세포 침전물을 수집하였다.

(단계2) : 세포파괴

상기 (단계 1)에서 얻은 대장균 세포 침전물 3g을 4℃의 완충액(50mM 트리스, pH 7.5, 5mM 에틸랜디아민테트라아세트산(EDTA), 10mM 베타머캅토에탄올, 1mM 페닐메틸술포니리 플루오라이드,1㎍/ml 펩스타틴) 20ml에 현탁시킨 다음, 리소자임 3mg을 첨가하고 5분간 교반시켰다. 이 현탁액을 얼음조에서 초음파분쇄기(Heat Systemas-Ultrasonics, Inc, W225, U. S. A.) 로 20분간 초음파 처리하여 세포를 파괴시켜 세포 균질액을 얻었다.

(단계 3) : 특이항원 단백질의 생성 확인

상기 (단계 2)에서 얻은 대장균 세포 균질액을 15% SDS-폴라아크릴 아마이드젤에서 전기영동하여 코마시블루로 염색해 본 결과, 약 27,000달톤 정도의 크기의 단백질이 생성됨을 확인하였다(이하 이를 KHCV UB CORE17 단백질이라 함).

이어서, 젤상에서 분리된 단백질을 니트로 셀룰로스 필터로 전달(blot)시키고, 이 필터를 실시예 5의 (5-A)의 (단계 3)과 같은 방법으로 웨스턴 블럿팅하였다. 그 결과, 전체 대장균 세포 균질액중에서 KHCV UB-CORE17 단백질만이 C형 간염 환자의 혈청과 면역학적으로 반응하여 가시적인 밴드로 나타났다.

(단계 4) : 우레아 처리

상기 (단계 2)에서 얻은 세포 균질액을 원심분리기(Beckman J2-21, Rotor JA2)에서 12,000rpm으로 20분간 원심분리하여 불용성 물질을 제거하고 상등액을 취하였다. 이 상등액에 9M 우레아 용액을 첨가하어 최종 농도가 6M이 되도록 한 다음 4℃에서 12시간 동안 교반하였다.

(단계5) : 산처리

(단계 4)에서 얻은 용액에 1M 초산나트륨 용액(pH 4.5)을 첨가하여 10mM이 되도록 하고 1M 초산용액을 가하여 pH 5.0으로 한 후 1시간 동인 교반시켰다.이 용액을 원심분리기(BackmanJ2-21, Rotor JA14)로 1l,000rpm에서 원심분리하여 침전물을 제거하고 상등액을 취하였다.

(단계 6) : 모노-S 크로마토그래피

(단계 5)에서 얻은 상등액을 FPLC 모노-S 컬럼(HR 5/5)(Pharmacia, Sweden)에 통과시켜 정제하는데, 이때 A용액은 8M 우레아, 1mM DTA, 1mM 베타머캅토에탄올,10mM 초산을 함유하는 완충 용액(pH 5.0)이고., B용액은 A용액에 1M 염화나트륨이 함유된 A용액이며, A용액으로 먼저 컬럼을 평형시킨 후 UB-코아 17 단백질 용액을 통과시킨 다음 다시 A용액으로 컬럼을 씻어주었다. 그런 후에, 점차로 B용액의 양을 처음 5분간은 17.5%, 이어서 55분간 35%가 되도록 증가시키다가, 최종적으로 10분간 100%에 도달 되도록 하여 단백질을 용출시켰다.이때 유속은 모두 0.8ml/분으로 하였다. KHCV UB-CORE l7 단백질은 B용액의 양이 25%에 도달할 때, 즉 염화 나트륨 농도가 0.25M일 때 용출되었다.

(단계 7) : S-200젤 투과 크로마토그래피

(단계 6)에서 얻은 단백질 용액을, 6M 우레아, 1mM EDTA, 1mM 베타머캅토에탄올을 함유하는 PBS 용액으로 평형된 S-2OO 세파크릴(Sephacryl; Pharmacia, Sweden)컬럼(크기 ; 2.5cm×100cm)에 분당 0.5ml의 유속으로 통과시켜 분자량 크기에 따라 분리하였다. 단백질 분획물을 수집하고 SDS-폴리아크릴 아마이드젤 전기영동으로 확인한 다음 KHCV UB-CORE17 단백질을 포함하는 특정 분획물을 모았다.이 분획물을 4℃의 PBS 용액에 투석하였다. 이러한 방법으로 정제하여 KHCVUB-CORE17 단백질 4mg을 90% 이상의 순도로 얻었다.

(6-C) : UB-E1 단백질의 정제

(단계 1) : 재조합 박테리아 세포의 배양

C형 간염 비루스의 특히항원인 KHCV E1 단백질과 유비퀴틴(UB)의 융합 단백질을 발현시키는 재조합균주(W3110, ptrpH-UB-E1, ATCC 68878)을 상기 (6-A)의 (단계 l)과 같은 방법으르 배양 수집하였다.

(단계2) : 세포파괴

(단계 1)에서 얻은 박테리아 세포 침전물을 50ml의 완충액 1(20mM 트리스, pH 7.5, 1mM EDTA, 2mM 베타머캅토에탄올, 1mM 페닐 메틸 술포닐 플루오라이드,1㎍/ml 펩스타틴 A)에 현탁시킨 후, 리소자임 용액을 최종 농도 0.2mg/ml이 되게 가한 뒤 37℃에서 30분 동안 배양하고 이후 얼음위에서 초음파분쇄기(HEAT SYSTEMS-ULTRASONICS, INC, W225, USA)로 70%의 출력에서 약 5분 간격으로 초음파를 처리하여 세포를 파괴시켜서 박테리아 균질액을 얻었다.

(단계 3) : 특이항원 발현의 확인

(단계 2)의 세포 균질액을 SDS의 존재하에서 15% 폴리아크릴 아마이드 겔에서 전기영동하였고, 여기서 약 27,000달톤(dalton) 정도의 크기의 단백질이 벡터로부터 발현되는 것을 확인하였다(이하 UB-El 단백질이라 함).

또한, 겔상에서 분리된 단백질을 임모빌른 P필터(MILLIPORE, Cat, No.IPUH 00010, pore size 0.45㎛) 로 전달(blot)시켰다. 상기 실시예 5의 (5-A)의 (단계 3)과 같은 방법으로 웨스턴 블럿팅하였다.

그 결과, 총 세포 균질액 중에서 UB-E1 단백질만이 C형 간염 환자의 혈청과 면역학적으로 반응하여 가시적 밴드로 나타남을 알 수 있다. 이 웨스턴-블롯팅의 결과를 통해, 발현된 UB-E1 단백질이 KHCV의 특이항원임을 확인하였다.

(단계 4) : 가용성 단백질의 제거

상기 (단계 2)의 세포 균질액을 원심분리기(Beckman J2-21, Rotor JA14)로 11,000rpm에서 25분간 원심분리하여 용해 가능 단백질을 제거하고 불용성 침전물을 얻었다.

(단계 5) : 불용해 침전물의 세척

(단계 4)의 침전물을 1% 트리톤 X-100을 함유한 30ml의 완충액(20mM 트리스, pH 7.5,1mM EDTA, 2mM 베타머캅토에탄올)로 현탁시킨 후 상온에서 30분간 교반시킨 다음, 원심분리기(Beckman J2-021, JA 14)로 11,000rpm에서 25분간 원심분리하여 1% 트리톤 X-100에 용해 가능한 단백질을 제거하고 침전 단백질을 얻은 뒤, 다시 이 침전물을 30ml의 완충액 1만으로 현탁시켜시 교반시킨 다음 재원심분리하여 불용해 침전 단백질을 얻었다.

상기와 같은 불용해 침전 단백질에 대한 간단하나 세척 과정만으로도 순도 60% 이상의 UB-E1 단백질을 얻을 수 있었다.

(단계 6) : 불용해 침전물의 용해 및 분별분획

(단계 5)의 UB-E1 단백질을 포함하는 불용해 침전물을 5ml의 8M 구아니딘 염산을 함유한 50ml의 완충액 2(50mM 트리스, pH 9.0, 1mM EDTA, 2mM 베타-머캅토에탄올)로 현탁시킨 후 상온에서 30분간 교반시킨 후 원심분리기로 11,000rpm에서 25분간 원심분리하여 용해되지 않는 침전물을 제거하고 그 상등액만을 얻었다. 상기의 상등액을 구아니딘 염산의 최종 농도가 0.5M이 되게 완충액 2로 희석시킨 다음 원심분리하여 상등액을 제거하고 UB-E1 단백질이 함유된 침전물만을 얻었다.

(단계 7) : 불용해 침전물의 용해

(단계 6)의 UB-E1 단백질을 포함하는 불용성 침전물을 8M 우레아를 함유한 20ml의 완충액 3(50mM 소듐 카보네이트, pH 9.5, 1mM EDTA, 2mM 베타-머캅토에탄올)으로 현탁시킨 다음, 상온에서 1시간동안 교반시켜 용해시키고 11,000rpm에서 25분간 원심분리하여(Beckman J2-21, Rotor JA14) 용해되지 않는 침전물을 제거하고 그 상등액만을 얻었다.

(단계 8) :Q-세파로스 이온교환 크로마토그래피

(단계 7)의 상등액을 완충액 3으로 평형시킨 Q-세파로스 컬럼(Pharmacia FF,1.2cm×7cm)에 통과시키고 0 내지 0.4M 염화나트륨의 농도구배를 포함하는 100ml의 완충액을 가하여 분리되는 단백질 분획을 1.5ml/튜브로 수집하였고, 이를 15% SDS-폴리아크릴 아미이드 겔에서 전기영동하여 UB-E1 단백질을 포함하는 특징분획을 별도로 수집함으로써 90% 이상의 순도를 가진 UB-E1 단백질을 대량으로 얻을 수 있었다.

(6-D) : KHCV UB-CORE14 단백질의 정제

(단계 1) : 재조합 대장균 세포의 배양

C형 간염 바이러스의 cDNA 단편 및 유비퀴틴 유전자를 포함하는 벡터(ptrpH-UB-CORE14)에 의해 형질 전환된 대장균(W3l10 ptrpH-UB-CORE 14, ATCC 68642)을 50㎍/ml의 앰피실린과 100㎍/ml의 트립토판이 함유된 LB 배지에서 12시간동안 배양한 다음(광학밀도 값이 650nm에서 4.0 이상일 때)이중 50ml을 M9 배지에 옮겨 6-8 시간동안 배양한 후 (6-A)의 (단계 1)과 같은 방법으로 대장균 세포를 수집하였다.

(단계 2) : 세포파괴

상기 (단계 1)에서 수득한 대장균 세포 4g을 4℃의 20ml 완충액(50mM 트리스, pH 7.5, 5mM 에틸렌 디아민테트라아세트산(EDTA), 10mM 베타머캅토에탄올,1mM 페닐 메틸 설포닐 플루오라이드,1㎍/ml 펩스타틴)으로 현탁시킨 다음, 리소자임(Lysozyme)을 4mg 첨가하고 5분간 교반시켰다. 현탁액을 얼음조서 초음파분쇄기 (Heat Systemas-Ultrasonics, Inc , W225, U. S. A.) 로 20분간 초음파 처리하여 세포를 파괴 하였다.

(단계 3) : 특이항원 단백질의 확인

상기 (단계 2)에서 얻은 대장균 균질액 소량을 15% SDS-폴리아크릴아마이드 겔에서 전기영동하여 코마시블루(Coomassie brilliant blue)로 염색해본 결과, 약 23,000달톤 정도의 크기의 단백질이 상기 발현 벡터에 의해 발현되는 것을 확인하였다(이하 KHCV UB-CORE 14 단백질이라 함).

이어서, 겔상에서 분리된 단백질을 니트로 셀룰로스 필터로 전달(blot)시키고, 이 필터를 상기 실시예 5의 (5-A)의 (단계 3)과 같은 방법으로 웨스턴 블럿팅하였다.

그 결과, 전체 대장균 균질액중에서 KHCV UB-CORE 14 단백질만이 C형 간염 환자의 혈청과 면역학적으로 반응하여 가시적인 밴드로 나타남을 알 수 있었다.

(단계 4) : 우레아처리

상기 (단계 2)에서 얻은 세포 균질액을 원심분리기(Beckman J2-21, Rotor JA20)에서 l2,000rpm으로 20분간 원심분리하여 불용성 물질을 제거하고 상등액을 취하였다. 이 상등액에 9M 우레아를 가하여 최종 농도가 8M이 되도록 한 다음 실온에서 12시간 동안 교반시켰다.

(단계 5) : 산처리

(단계 4)에서 얻은 용액에 1M 초산나트륨 용액(pH 4.5)을 첨가하여 농도가 10mM이 되도록 한 후 1M초산 용액을 가하여 pH 5.0으로 한 후 실온에서 1시간 동안 교반시켰다. 이 용액을 원심분리기(Beckman J2-21, Rotor JA14)로 11,000rpm에서 원심분리하여 침전물을 제거하고 상등액을 취하였다.

(단계 6) : CM-이온 교환 크로마토그래피

25ml의 CM-세파로스 수지(Pharmacia, Sweden)를 함유하는 컬럼(크기 2.5cm×10cm)을 8M 우레아, 1mM EDTA,10mM 베타 머캅토에탄올,10mM 초산염을 함유하는 용액(pH 5.0)으로 평형시킨 후 (단계 5)에서 수득한 KHCV UB-CORE 14 단백질을 함유한 용액을 분당 1ml의 유속으로 통과시켜 컬럼내에 유리된 상태로 남아있는 물질들을 상기 평형 용액으로 완전히 세척하였다. 이 평형 완충용액에 0 내지 0.5M 염화나트륨 농도 구배를 준 500ml의 용액으로 컬럼에 부착된 단백질을 용출시켰다.이때의 유속은 3ml/분으로 하였다. SDS-폴리아크릴아마이드 젤 전기영동으로 확인한 결과, KHCV UB-CORE 14 단백질은 대략 0.3M에서 용출되었으며 이 분획들을 모았다.

(단계 7) : S-200 겔 투과 크로마토그래피

(단계 6)에서 얻은 단백질 용액을 YM 5 한의 여과막(Amicon, U.S.A.)을 사용하여 l0ml로 농축하였다. 이 농축된 용액을 6M 우레아, 1mM EDTA, 1mM 베타 머캅토에탄올을 함유하는 PBS 용액으로 평형된 S-200 세파크릴(Sephacryl; Pharmacia, Sweden) 컬럼(크기 , 2.5cm×100cm) 에 분당 0.5ml의 유속으로 통과시켜 분자량 크기에 따라 분리하였다. 단백질 분획물을 수집하고 SDS-폴리아크릴아마이드 겔 전기영동으로 확인한 다음 KHCV UB-CORE 14 단백질을 포함하는 분획물을 따로 모았다.

(단계 8) : 모노-S 크로마토그래피

상기 (단계 7)에서 얻은 KHCV UB-코아 14 단백질 용액을 FPLC(Pharmacia, Sweden) 모노-S 컬럼(HR5/5)을 이용하여 더욱 정제하였다. 이때 A 용액은 6M 우레아, 1mM EDTA, 1mM 베타머캅토에탄올, 10mM 인산염을 함유하는 완충용액(pH 7.0)이고, B 용액은 A 용액에 0.4M 염화나트륨이 함유된 용액으로, A 용액으로 컬럼을 평형시킨 후 동일 부피의 완충용액 A로 희석시킨 KHCV UB-CORE 14 단백질 용액을 통과시킨 다음 다시 A 용액으로 컬럼을 세척하였다. 그런 다음, 점차로 B 용액의 양을 처음 5분간은 35%, 이어서 55분간은 70%로 증가시키다가, 최종적으로 10분간은 100%에 도달하도록 하여 단백질을 용출시켰다. 이때 유속은 모두 0.8ml/분으로 하였다. KHCV UB-CORE 14 단백질은 B 용액의 양이 60%에 도달할 때, 즉 염화나트륨 농도가 0.25M일 때 용출되었다.

이 분획물을 4℃의 PBS 용액에 투석하였다. 이러한 방법으로 KHCV UB-CORE 14 단백질을 90% 이상의 순도로 4mg을 수득하였다.

(6-E) : UB-E2N 단백질의 정제 방법

(단계 1) : 재조합 박테리아 세포의 배양

C형 간염 바이러스의 특이항원인 KHCV E2N 단백질과 유비퀴딘(UB)의 융합 단백질을 발현시키는 재조합 균주(, W3110, ptrpH-UB-E2N, ATCC 69866)을 50㎍/ml의 앰피실린이 함유된 LB 배지에서 12시간 동안 진탕 배양한 다음, 이중 10ml을 2% 카스아미노산과 l0㎍/ml의 트립토판이 함유된 1ℓ의 M9 배양액으로 옮겨서 37℃에서 약 3시간 동안 진탕 배양하여 박테리아의 성장속도가 650nm에서 흡광도가 0.2정도가 될때 인돌 아크릴산(lAA)을 최종 농도 50㎕/ml이 되게 첨가하여 재조합된 UBE2N 단백질이 발현 되도록 하였다. IAA를 첨가한지 약 5시간 후에 세포 배양액을 원심분리기(Becknnn J-6B, Rotor JS42)를 이용하여 3,500rpm에서 25분간 원심분리하여 박테리아 세포 침전물을 수집한 뒤, 이 침전물을 PBS(10mM 인산, 0.15M 염화나트륨, pH 7.0)로 1회 세척한 다음 단계의 단백질 정제 과정에 사용되었다.

(단계 2) : 특이항원 발현의 확인

(단계 1)의 세포 균질액을 15% SDS-폴리아크릴아마이드 겔에서 전기영동하였고, 여기서 UBE-2N 단백질은 약 28,000달톤(dalton) 정도의 크기로 발현되는 것을 확인하였다.

이후 겔상에서 분리된 단백질을 임모빌론 P 필터(MILLIPORE,Cat. No. IPUH 00010, pore size 0.45㎛)로 전달(blot)시켰다.이 필터를 0.5% 트윈 20이 함유된 PBS(10mM 인산, pH 7.0, 0.15M 염화나트륨)에 넣고 상온에서 2시간 동안 약하게 흔들면서 폐쇄(blocking)시켰다.이후 0.5% 젤라틴과 0.05% 트윈을 함유한 PBS에 한국인 C형 간염 환자의 혈청을 1 : 20으로 희석시킨 용액 10ml를 첨가하고 상온에서 1시간 동안 약하게 흔들면서 반응시킨 다음, 0.2% 트윈 20을 함유한 PBS로 5분씩 4회 세척하였다. 이 필터에 0.5% 젤라틴과 0.05% 트윈 20을 함유한 PBS에 알카라인 포스파타제(alkaline phosphatase)로 표지된 항-사람 면역 글로불린 G(Boeringer Manheim, Cat. No. 605 415, Anti-Human IgG-ALP)를 1 : 1000으로 희석시킨 용액 10ml를 첨가한 다음 상온에서 1시간 동안 진탕 배양시켜 반응시키고, 0.05% 트윈 20을 함유한 PBS로 5분씩 4회세척한 다음 트리스 완충액(10mM 트리스, pH 9.5,5mM 염화마그네슘,100mM 염화 나트륨)으로 2회 세척하였다.

이 필터를 125㎍/ml 니트로 블루 테트라조리움(Pierce, NBT)와 25㎍/ml 브로모 클로로 인돌 포스페이트(Pierce, BCIP)가 함유된 100mM 트리스 완충액을 가하여 발색시켰다. 그 결과 총 세포 균질액 중에서 UBE-2N 단백질만이 C형 간염 환자의 혈청과 면역학적으로 반응하여 가시적 밴드로 나타났다.

(단계 3) : 세포파괴 및 용해가능 단백질의 제거

UB-E2N이 발현된 약 3g의 박테리아 세포 침전물을 50ml의 완충액 1(20mM 트리스, pH 7.5, 1mM EDTA, 2mM β-머캅토에탄올, 1mM 페닐메틸술포닐 플루오라이드,1㎍/ml 페스타틴 A)에 현탁시킨 후, 리소자임 용액을 최종 농도 0.2mg/ml이 되게 가한뒤 37℃에서 30분 동안 반응시키고, 이후 얼음위에서 초음파분쇄기(HEAT SYSTEMS-ULTRASONICS, INC, W 225, USA)로 70%의 출력에서 약 5분 간격으로 초음파를 처리하여 세포를 파괴시켜서 박테리아 균질액을 얻었다. 상기의 세포 균질액을 원심분리기(Beckman J2-21, Rotor JA14)로 11,000rPm에서 25분간 원심분리하여 용해가능 단백질을 제거하고 불용해 침전물을 얻었다.

(단계 4) : 트리톤 X-100과 트리스 완충액을 이용한 불용성 침전물의 세척

(단계 3)의 침전물을 1% 트리톤 X-100을 함유한 30ml의 완충액 1(20mM 트리스, pH 7.5, 1mM EDTA, 2mM β-머캅토에탄올)에 현탁시킨 후 상온에서 30분간 교반시킨 다음, 원심분리기(Beckman J2-21, JA14)로 11,000rpm에서 25분간 원심분리하여 1% 트리톤에 용해가능한 단백질을 제거하고 침전 단백질을 얻은뒤, 다시 이 침전물을 30ml의 완충액 1만으로 현탁시켜서 교반시킨 다음 재원심분리하여 불용해 침전 단백질을 얻었다.

상기와 같은 불용성 침전 단백질에 대한 간단한 세척 과정만으로도 순도 70% 이상의 UB-E2N 단백질을 얻을 수 있었다.

(단계 5) : 8M 우레아를 이용한 불용성 침전물의 용해

(단계 4)의 UB-E2N을 포함하는 불용성 침전물을 8M 우레아를 함유한 40ml의 완충액 2(50mM 트리스 pH 9.0, 1mM EDTA, 2mM β-머캅토에탄올)으로 현탁시킨 다음, 상온에서 1시간 동안 교반시켜 용해시키고 원심분리하여 용해되지 않는 침전물을 제거하고 그 상등액만을 얻었다.

(단계 6) : S-200 겔 투과 크로마토그래피

(단계 5)의 UB-E2N을 포함하는 8M 우레아 용액 40ml을 YM10 한외 여과막 농축기(Amicon)를 사용하여 5ml까지 농축한 다음 4M 우레아를 함유한 완충액 2로 평형시킨 S-200 수지 컬럼(Pharmacia, 2.5cm×90cm)에 시간당 40ml의 속도로 통과시키면서 2ml의 분획들을 수집하였고 이를 SDS 폴리아크릴아마이드 겔에서 전기영동하여 UB-E2N을 포함하는 특징 분획들만을 별도로 수집하였다.

(단계 7) : Q-세파로스 이온 교환 크로마토그래피

(단계 6)의 UB-E2N을 포함하는 용액을 동일 완충액으로 평형시킨 Q-세파로스 컬럼(Pharmacia, FF, 1.2cm×7cm, USA)에 통과시키고 O-1.0M 염화나트륨의 농도 구배를 포함하는 150ml의 완충액을 가하여 분리되는 단백질 분획을 수집하였고, 이를 SDS-폴리아크릴아마이드 겔에서 전기영동하여 UB-E2N의 순도가 80% 이상되는 특징 분획만을 별도로 수집하였다.

(단계 8) : 우레아의 제거 및 FPLC-페닐 크로마토그래피

(단계 7)의 UB-E2N을 포함하는 4M 우레아 용액을 YM10 한외 여과막 농축기로 8ml까지 농축한 다음 투석막(Spectrum Medical Industries, INC, m.w. cut off 6,000-8,000)을 이용하여 완충액 3(20mM 트리스, pH 9.0, 1mM EDTA, 2mM β-머캅토에탄올,0.2M 염화나트륨)에 대해 투석함으로써 우레아를 제거한다음 이 용액에 염화나트륨을 최종 농도 1M이 되게 가하고 1M 염화나트륨이 함유된 완충액 3으로 평형시킨 FPLC-페닐수퍼로스, 컬럼(Pharmacia, HR 5/5,0.5cm×5cm)에 통과시키고 1.0M-0M 염화나트륨 농도 구배를 함유하는 40ml에 완충액을 가하여 분리되는 분획들을 SDS-폴리아크릴아마이드 전기영동 겔에서 UBE2N을 포함하는 분획들만을 수집함으로써 95% 이상의 순도를 가진 UBE2N 단백질을 대량으로 얻을 수 있었다.

(6-F) : UB-E2C 단백질의 정제방법

( 단계 1) : 재조합 박테리아 세포의 배양

C형 간염 바이러스의 특이 항원인 KHCV E2C 단백질과 유비퀴틴(UB)의 융합 단백질을 발현시키는 재조합 균주(E coli, W3110)를 50㎍/ml의 엠피실린이 함유된 루리아(Luria) 배치에서 12시간 동안 진탕 배양한 다음, 이중 20ml을 2% 카스아미노산과 10㎍/ml의 트립토판이 함유된 1L의 M9 배양액으로 옮겨서 37℃에서 약 2시간 동안 진탕 배양하여 박테리아의 성장속도가 650nm에서 흡광도가 0.3 정도가 될때 IAA를 최종 농도가 50㎍/ml가 되게 첨가하여 재조합된 UB-E2C 단백질이 발현되도록 하였다. IAA를 첨가한 지 약 3시간후에 세포 배양액을 원심분리기(Beckman J6, Rotor HS4)를 이용하여 3,500rpm에서 25분간 원심분리하고 박테리아 세포 침전물을 수집한뒤, 이 침전물을 PBS(10mM 인산,0.15M 염화나트륨, pH 7.0)로 1회 세척한 후, 다음 단계의 단백질 정제 과정에 사용하였다.

(단계 2) : 특이항원 발현의 확인

(단계 1)의 세포 균질액을 15% SDS-폴리아크릴아마이드 겔에서 전기영동하였고, 여기서 UB-E2C 단백질은 약 25,000달톤(daltion) 정도의 크기로 발현되는 것을 확인하였다.

이후 겔상에서 분리된 단백질을 임모빌론 P 필터(MILLIPORE, cat. #. IPUH 00010, pore size 0.45㎛)로 전달(blot)시켰다.이 필터를 0.5% 트윈 20이 함유된 PBS(10mM 인산, pH 7.0, 0.15M 염화나트륨)에 넣고 상온에서 2시간 동안 약하게 흔들면서 페쇄(blocking)시켰다.이후 0.5% 젤라틴과 0.05% 트윈을 함유한 PBS에 한국인 C형 간염 환자의 혈청을 1 : 20으로 희석시킨 용액 10ml를 첨가하고 상온에서 1시간 동안 약하게 흔들면서 반응시킨 다음, 0.05% 트윈 20을 함유한 PBS로 5분씩 4회 세척하였다. 이 필터에 0.5%젤라틴과 0.05% 트윈 20을 함유한 PBS에 과산화 효소(horseradish peroxidase)로 표지된 항-사람 면역 글로불린 G(Bio-Rad Lab, Anti-Human IgG-HRP)을 1 : 500으로 희석시킨 용액 10ml를 첨가한 다음 상온에서 1시간 동안 진탕시켜 반응시키고 0.05% 트윈 20을 함유한 PBS로 5분씩 4회 세척한 다음 50mM트리스 완충액(pH 7.0)으로 2회 세척하였다.

이 필터를 400㎍/ml 4-클로로-1-나프톨과 0.03% 과산화수소수가 함유된 50mM 트리스 완충액을 가하여 발색시켰다.그 결과 총 세포 균질액 중에서 UB-E2C 단백질만이 C형 간염 환자 혈청과 면역학적으로 반응하여 가시적 밴드로 나타났다.

(단계 3) : 세포파괴 및 용해가능 단백질의 제거

UB-E2C 단백질이 발현된 약 1g의 박테리아 세포 침전물을 50ml의 용존 완충액(20mM 트리스, pH 7.5, 1mM EDTA, 2mM β-머캅토에탄올, 1mM 페닐메틸술포닐 플루오라이드,1㎍/ml 펩스타틴 A)에 현탁시킨 후, 리소자임 용액을 최종 농도 0.5mg/ml이 되게 가한 뒤 37℃에서 30분 동안 배양하고, 이후 얼음위에서 초음파분쇄기(HEAT SYSTEMS-ULTRASONICS, INC, W 225, USA)로 70%의 출력에서 5분 간격으로 초음파를 처리하여 세포를 파괴시켜서 박테리아 균질액을 얻었다. 상기의 세포 균질액을 원심분리기(Beckman j2-21, Rotor JA14)로 11,000rpm에서 25분간 원심분리하여 용해가능 단백질을 제거하고 불용해 침전물을 얻었다.

(단계 4) : 트리톤 X-100과 트리스 완충액을 이용한 불용해 침전물의 세척

(단계 3)의 침전물을 1% 트리톤 X-100을 함유한 20ml의 완충액 l(20mM 트리스, pH 7.5, 1mM EDTA, 2mM β-머캅토에탄올)로 현탁시킨 후 상온에서 30분간 교반시킨 다음, 원심분리기(Beckman J2-21, JA14)로 11,000rpm 25분간 원심분리하여 1% 트리톤에 용해가능한 단백질을 제거하고 침전 단백질을 얻은뒤, 다시 이 침전물을 30ml의 완충액 1만으로 현탁시켜시 교반시킨 다음 재원심분리하여 불용해 침전 단백질을 얻었다.

(단계 5) : 8M 우레아를 이용한 불용해 침전물의 용해

(단계 4)의 UB-E2C를 포함하는 불용해 침전물을 8M 우레아를 함유한 20ml의 완충액 2(50mM 카보네이트 pH 9.5, 1mM EDTA, 2mM β-머캅토에탄올)에 현탁시킨 다음, 상온에서 1시간 동안 교반시켜 용해시키고 원심분리하여 용해되지 않는 침전물을 제거하고 그 상등액만을 얻었다.

(단계 6) : FPLC-모노 Q 이온 교환 크로마토그래피

(단계 5)의 상등액을 동일 완충액으로 평형시킨 FPLC-모노 Q 컬럼(Pharmacia, HR 5/5, 0.5cm×5cm)에 통과시키고 0.1M 염화나트륨을 포함하는 완충액을 가하여 분리되는 단백질을 분리한 다음,0.1-0.4M의염화나트륨 농도 구배를 포함하는 40ml의 완충액을 가하여 분리되는 단백질 분획을 수집하였고, 이를 SDS-폴리아크릴아마이드 겔에서 전기영동하여 UB-E2C 단백질의 순도가 80% 이상 되는 특정 분획들만을 별도로 수집하였다.

(단계 7) : 우레아의 제거 및 FPLC-페닐 크로마토그래피

(단계 6)의 UBE2C를 포함하는 8M 우레아 용액을 YM10 한외 여과막 농축기(Amicon)로 14ml까지 농축한 다음 투석막(Spectrum Medical Industries, INC, m.w. cut off 6,000-8,000)을 이용하여 완충액 3(20mM 트리스, pH 9.0, 1mM EDTA, 2mM β-머캅토에탄올, 0.2M 염화나트륨)에 대해 투석하여 우레아를 제거한 다음 염화나트륨을 최종 농도 1M이 되게 가하고 1M 염화나트륨이 함유된 완충액 3으로 평형시킨 FPLC-페닐 수퍼로즈 컬럼(Pharmacia, HR 5/5, 0.5cm×5cm)에 통과시키고, 1.0M-0M의 염화나트륨 농도 구배를 함유하는 40ml의 완충액을 가하여 분리되는 분획들을 SDS-폴리아크릴아마이드 전기영동 겔에서 순도를 확인하고 UB-E2C를 포함하는 특정 분획물만을 별도로 수집함으로써 90% 이상의 순도를 가진 UB-E2C 단백질을 대량으로 얻을 수 있었다. 대장군 세포에서 발현된, 다른 KHCV cDNA 절편에 의해 코딩된 단백질들도 상기와 유사한 방법으로 정제할 수 있으며 상기 방법을 통상의 전문가에게 자명한 방법으로 변형시켜 사용할 수도 있다.

(실시예 7)

KHCV 재조합 단백질을 이용한 한국형 C형 간염에 대한 항체의 검색

(7-A) : 항원 농도에 따른 혼합된 양성 및 음성 시료 혈청의 반응성

개개의 항원 KHCV 403, KHCV 897 및 KHCV UB-CORE 14 단백질을 각각 50mM 붕산나트륨 완충용액(pH 9.0)에 각각 0.25㎍/ml, 2.0㎕/ml 및 2.0㎍/ml 농도로부터 2배씩 연속적으로 희석한 후 미세 역가판(Dynatech. Immulon type 1 microtitre plate)에 각 웰당 200㎕씨 넣어준 후 37℃에서 두시간 동안 피복하였다. 이때 파라 필름을 적당하게 덜어주어 수분의 증발을 최소화하였으며, 이후 이 과정은 모든 반응에서 동일하게 행하였다.

2시간 동안 피복된 플레이트를 0.05%(v/v) 트윈-20이 함유된 인산염 완충 생리식염수(Phosphate buffered saline, pH 7.4, 이하 세척액이라 함)로 일회 세척한 후 미세 역가판에 담아 있는 단백질 흡착 부위에 0.1%젤라틴(w/v)이 들어 있는 인산염 완충 생리식염수를 210㎕씩 각 웰에 첨가하여,37℃에서 2시간 동안 반응시켰다. 이를 다시 상기의 세척액 300㎕씩으로 2회 세척한 후,0.25% 젤라틴, 1mM EDTA, 1.0%(v/v) 트리톤 X-100,0.02% 티메로살(w/v)이 들어있는 인산염 생리식염수를 각 웰당 190㎕썩 넣어준 후, 혼합된 양성 HCV 환자 및 음성 정상 시료 혈청을 10㎕씩 각각의 웰에 넣어 수초간 서서히 잘 섞이도록 한 후,37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 이때 사용한 혼합된 양성 HCV 환자 시료 혈청은 Ortho 사의 C-100 항원을이용한 C형 간염 진단 키트(Ortho Diagnostic Systems, Raritan, N. J, 88869, U.S.A.)를 이용해 미리 확인해 양성 시료 혈청을 혼합 사용하였으며, 혼합된 음성 시료 혈청도 상기의 방법으로 음성으로 확인된 시료를 모아 혼합하여 사용하였다. 이러한 시료 혈청은 연세대 의대 세브란스병원으로부터 제공받았다.

37℃에서 1시간 반응시킨 상기의 미세 역가판을 세척 용액 300㎕으로 5회 세척한 후 서양 고추냉이 과산화 효소(HRP)로 표지된 항 인간 IgG 감마 사슬 특이 면역 글로불린(Bio-Rad 사, Richmond, CA 94804, U.S.A, anti-human IgG(γ) -HRP 0.1mg protein/ml)을 10% 소태아 혈청(v/v), 1% 피콜(Sigma, v/v) 0.02% 티메로살, 0.05% 트윈-20이 들어있는 인산염 완충 생리식염수로 5000배 희석한 후, 각 웰당 200㎕씩 넣은 다음 37℃에서 1시간 반응시킨 후, 다시 상기의 세척 용액으로 5회 세척후 O-페닐렌디아민 이염산(OPD, Sigma,10mg/ml)를 200㎕씩 각 웰에 넣어준 후, 상온의 어두운 곳에서 30분 동안 반응시켰다.

각 웰에 4N 황산을 50㎕씩을 첨가하여 발색 반응을 중지시킨 후, 파장 492mm에서 미세 역가판 흡광도 측정기(Dynatech Microtiter Plate Reader)로 각 웰의 흡광도를 측정하였다.(제19도 참조).OPD 희석액의 조성은 50mM 시트레이트 완충액에 인산염(phosphate)를 사용하여 pH를 5.5로 조성한 것이었다.

(7-B) : 진단키트제조

진단시약 및 키트제조에 사용되는 항원은 정제된 KHCV UB-CORE 14, KHCV 897, KHCV 403 단백질 중 하나, 또는 둘 이상의 혼합 항원을 사용하였다.항원을 10mM 소디움 카보네이트 완충용액(pH 9.5) 또는 50mM 붕산나트륨 완충용액(pH 9.0)에 적정 농도로 희석시킨 후 96 웰 마이크로플레이트(Dynatech, Immulontype 1 microtitre plate)에 각 웰당 150∼200㎕씩 넣어준 후 4℃에서 12∼18시간 동안 반응시켜 항원을 흡착시켰다.이때 각 항원들의 적정 피복 농도는 항원의 조합방법에 따라, KHCVUB-CORE 14의 경우 0.18∼075㎍/ml, KHCV 897 경우 0.06∼0.3㎍/ml, KHCV 403 경우 0.12∼0.5㎍/ml 범위에서 정할 수 있으며 본 실시에에서는 세가지 항원을 각각 0.3㎍/ml 농도로 사용하였다.

이후 각 웰의 내용물을 흡입장치로 제거한 후,0.05%(v/v) 트윈-20이 함유된 인산염 완충 생리식염수(PBS, pH 7.4)로 세척한 후, 37℃에서 2시간 동안 0.1%(w/v)의 젤라틴을 함유하는 PBS(20㎍/well)(pH7.4)로 차단시킨 후 다시 세척액으로 3번 세척한 다음 웰내의 잔존 수분은 흡습장치를 사용하여 제거함으로써 항원들이 흡착된 플레이트를 건조시켰다.

각 웰에 시료 희석액 l90㎕를 분주하고 이어 검체 시료 10㎕를 가하여 잘 섞은 다음,37℃에서 1시간 반응시켜 검체내 HCV 항체와 웰에 흡착된 항원들과 결합 반응이 일어나게 하였다. 이때 시료 희석액은 1%(v/v) 소혈청 함유 완충용액(10mM Tris, pH 7.5,150mM NaCl,0.2% 트리톤 X-100,0.1mM EDTA,0.02% 티메로살)으로 구성된다. 이어 0.05%(v/v) 트윈 20 함유 인산염 완충 생리식염수(PBS, pH 7.4)로 5회 세척후, 각 웰에 서양 고추냉이 과산화 효소(HRP) 표지로 된 항 인간 IgG 항체 용액(Anti-Human IgG-HRP, Bio-Rad Lab,USA)을 200㎕씩 분주한 다음,37℃에서 l시간 반응시켰다.이때 효소 표지항체 희석액은 10%(v/v) 소혈청 알부민 함유 완충용액(10mM Tris pH 7.5,150mM NaCl, 0.02% 티메로살, 1% 피콜)을 사용하였다. 이어 0.05%(v/v) 트윈 20 함유 인산염 완충 생리식염수(PBS, pH 7.4)로 5회 세척후,OPD 용액을 200㎕씩 가한 다음 상온에서 30분간 발색시킨 다음 웰당 4N 황산을 50㎕씩 가하여 반응을 정지시켰다. 이때 발색도는 492nm에서 흡광도를 측정하였다. 결과 판정의 기준치인 컷오프치(cut off value)는 음성 표준 시료 흡광도 평균값에 0.4를 더한 값으로 하였다.

KHCV 항원을 한 종류씩 사용한 전단 방법에 의한 KHCV 항체 분석 결과 및 혼합 항원을 사용한 경우는 표 1에 나타내었다. 기존에 시판되는 HCV 진단 시약은 오르토(Ortho)사의 것을 사용하였으며 사용방법 은 제조자의 지침에 따랐다.

[표 1]. 효소 면역 측정법에 의한 C형 간염 항체 반응성

주:1) ++++:컷 오프값+1.5≤ 흡광도

+++:컷 오프값+1.0 ≤흡광도＜ 컷 오프값+1.5

++:컷 오프값+0.5 ≤흡광도 ＜ 컷 오프값+1.0

+:컷 오프값 ≤ 흡광도 ＜ 컷 오프값+0.5

-:흡광도 ＜ 컷 오프값

2) 컷 오프값은 항원 KHCV 897, KHCV UB-CORE 14, KHCV 403 및 혼합항원에 대해, 각각 0.32,0.27,0.35 및 0.483이었으며, 오르토 간염 진단키트의 경우는 0.453이었다.

3) 오르토(Ortho) HCV 진단키트는 오르토 다이아그노스틱 시스템(Ortho Diagnostic Systems, U.S.A)사로부터 구입하여 제조사의 지시방법에 따라 사용하였다.

(7-C) : 진단 결과의 정확도 확인

본 발명의 진단방법에 의한 진단 결파의 정확성을 증명하기 위해, 오르토사의 제1세대 C형 간염진단 키트로 측정한 결과 양성으로 진단된 17개의 혈청시료액(대한 적십자 대전 혈액원으로부터 구입)을 본 발명의 진단 방법 및 오르토사의 제2세대 C형 간염 항체진단용 제조할 면역 블롯팅 킷트(Chiron RIBA HCV TEST-System, 2nd Generation,Ortho Diagnostic Systems, USA, Productcode 933491)로 측정하였다. 오르토사의 제2세대 C형 감염 항체 진단용 제조합 면역 블롯팅 킷트는 제조자의 지시 방법에 따라 행하였다. 그 결과를 표 2에 나타내었다.

상기에서 이용된 오르토사의 제2세대의 C형 간염 항체 진단용 제조합 면역 블롯팅 킷트는 효소 면역측정법(ElA) 결과를 확인키 위한 실험방법(Confirmation assay)으로 제시되고 있는 바(Van der poe1, C.L., et al., Lancet337, 317-319(1991)), 이 결과는 본 밤령에 의한 진단방법이 오르토사의 1세대 C형 간염 진단 킷트보다 훨씬 위양성(false positive)이 적다는 것을 보여 주어, 진단시 오진으로 인한 피해를 경감할수 있으며, 오로소(Ortho)의 진단시약 보다 정확한 진단을 가능하게 한다.

[표2]. 오르토 제2세대 C형 간염 진단용 제조합 면역 블롯팅 킷트와 본 발명의 진단방법에 의한 진단 결과도

주) 오르토 제2세대 C형 간염 제조합 면역 블롯팅 킷트의 반응결과 판정은 제조사의 지시 방법에 따라 SOD 대조 항원을 제외한 2개 이상의 항원에서 +가 1개 이상인 시료를 양성으로 정하였다.

(실시예 8)

프로브를 이용한 중합효소연쇄방응(PCR) 법에 의한 C형 간염 바이러스의 존재 확인

(8-A): 시료 혈청으로부터 C형 간염 바이러스 RNA 추출

혈청 100㎕에 2개의 TNE 용액(100mM Tris HCl, pH 8.0,0.2mM EDTA,0.2M NaCl) 100㎕를 가한후, 다시 300㎕ RNA_zo1용액(TM Cinna Scientific,Inc,Texas 77546 USA)을 첨가한 후 잘 섞어 주었다. 여기에 다시 300㎕의 클로로프름을 가하여 새게 진탕하면서 섞어준 후 소형 고속원심분리기(Eppendorf microfuge)로 15,000rpm,4℃에서 5분간 침전시킨 다음, 상층액을 모았다 .이 상동액을 동일 부피의 페놀로 1회, 클로로포름으로 1회 더 추출하여 에탄올로 침전시켜 그 침전물을 10㎕ TE(10mM Tris HCl, pH 8.0, 0.1mM EDTA) 완충액에 녹여 -70℃에 보관하였다.

(8-B) : 중합효소연쇄 반응에 의한 C형 간염 바이러스 존재 확인

상기 방법으로 추출한 RNA에 4㎕의 증류수,1㎕의 0.1M CH₃HgOH을 가하고 혼합하여 상온에 10분간 방치한 후, 여기에 0.5㎕ 1M β-머캡토에탄올,10㎕ RNasin,5㎕ 5배 RT완충용액(BRL, Gaithersburg, MD, 20877, U.S.A), 125㎕ dNTP(dGTP, dTTP, dCTP, dATP가 각각 10mM), 무작위 프라이머(Random primer) 1㎍, 역전사효소(Superscript H- Reverse Transcriptase, BRL사, U. S. A. ) 1.25㎕(18unit/㎕) 를 넣고 총 부피 25㎕가 되토록 증류수를 가한 다음 42℃에서 1시간 반응시켰다.반응이 끝난 뒤 65℃에서 15분간 가열하여 효소들을 불활성화시킨 뒤 중합효소 연쇄반응에 이용하였다.

제1차 중합효소 연쇄반응은 10㎕의 10-배 Taq 폴리머라제 완충용액(10mM Tris-HCl, pH8.3, 500mM KCl,15mM MgCl₂, 0.1%(w/v) 젤라틴),10㎕의 dNTPs 혼합액(각 1.25mM), 2㎍ 프라이머 A,5'-CATAGTGGTGTGCGGAACCG-3',2㎍ 프라이머 B,5'-TTGAGGTTTAGGATTCGTGC-3',75㎕의 증류수에 0.5㎕의 Amplitaq DNA polymerase(Perkin Elmer Cetus, U.S.A)를 넣고 잘 혼합시켰다. 여기에 용액의 증발을 막기 위하여 50㎕의 미네랄 오일을 첨가한 후, 제1차 PCR을 온도 순환기를 이용하여 95℃에서 2분,55℃에서 2분,72℃에서 3분간의 온도 순환을 40회 반복하여 실시하였다.

제2차 PCR은 제1차 PCR 산물 1㎕와 프라이머 C(5'-TACACCGGAATTGCCAGGAC-3'), 프라이머D(5'-TCATGGTGCACGGTCTACGAG-3')를 각각 1㎍씩 가하고 제l차 PCR과 동일 조건으로 20회 반복하였다. 다음, PCR 산물들 약 5㎕를 7% 폴리아크릴 아미드 젤 전기 영동으로 확인하여, C형 간염 바이러스의 존재 여부를 판명하였다. KHCV가 존재할 경우 182bp의 DNA 밴드를 확인할 수 있었다.

(실시예 9)

C형 간염 항원 KHCV 단백질에 대한 특이항체의 제조

(9-A) : 면역

생리 식염수에 녹아 있는 KHCV 897 단백질을 동량의 Freund 완전보조제(Freund complete adjuvant)에 잘 혼합한 후 생후 8-12주 된 Balb/c 마우스에 마우스당 50㎍/0.2㎕이 되도록 복강내에 주사하였다. 2-3주 간격으로 프로인트(Freund)의 불완전 보조제와 혼합된 단백질을 30㎍ 정도 투여하였다. 2차 주사 후 2주일 후에 꼬리로부터 소량의 혈액을 취하여 효소면역 검정법으로 항체의 역가를 측정하였다. 역가가 10,000 이상이 되면 50-100㎍/0.5ml 생리식염수의 항원을 추가로 투여한 후 3-4일후에 이 마우스의 비장세포를 융합시켜 단일항체 제조에 사용하였다.

(9-B) : 세포융합

생쥐의 골수종세포인 P3×63-Ag8.653(ATCC CRL 1580)을 면역된 비장 세포와의 융합 대상 세포로 선정하였다. 융합을 위해 참고문헌(Monoclonal antibodies ,production &maintenance, william Heinemann Medical Books, London,1982)에 제시된 방법을 참고로 면역된 생쥐의 5×10⁷비장세포와 2×10⁷P3×63-Ag 8653 마이엘로마 세포를 혼합하고 300g에서 10분간 원심분리한다. 다시 세포를 IMDM 배지(Gibco사)로 세척한 후 원심분리하여 상등액은 버리고, 세포침전물을 50% PEG 용액(Kodak, 분자량 1450달톤) 1ml을 한방을 한방울씩 l분간에 걸쳐 넣으면시 잘 섞어주었다. 이를 다시 200g에 총 2분간에 걸쳐 다시 원심분리한 후,5ml의 IMDM 배지를 3분간에 걸쳐서 서서히 넣은 다음, 다시 10% 우태아 혈청(FBS)이 함유된 IMDM 배지 5ml을 5분간에 걸쳐서 잘 섞이도록하면서 서서히 첨가하였다.

여기에 최종적으로 50ml이 되도록 10% 소태아 혈청이 함유된 IMDM 배지를 넣어주 후 300g에서 l0분간 원심분리하여 세척하였다. 상등액은 버리고 P3×63-Ag, 8.653의 수가 5×10⁵/ml개가 되도록 IMDM에 10% 우태아 혈청,10㎛하여 포크산틴, 0.4μM아미노프태린 및 16μM티미딘이 함유된 IMDM-HAT 배지 0.1ml를 넣어준 후 조직 배양용 96 웰 플레이트에 웰당 0.1ml씩 넣어주었다. 이 플래이트는 융합하루전에 1×10⁵/ml 농도의 마우스의 복강내 거식 세포를 IMDM-HAT배지에 넣어 미리 배양시켰다.마이엘로마 세포 및 융합되지 않은 비장세포는 HAT 배지에서 성장하지 못한다.

따라서 이 배지에서 성장하는 세포는 융합이 이루어진 융합세포로 생각할 수 있다. 하이브리도마의 성장이 10 내지 50% 정도 웰내에 자랐을 때 상등액을 따시 항체환성의 효력검정을 실시하였다.

(9-C) : 단일 클론 항체 역가검색(Screeing)

하기의 효소 면역 검정방법에 따라 항체역가를 검색하였다.

(단계 1)

50mM 붕산 나트륨 완충용액(pH 9.0)에 KHCV897 단백질을 2㎍/ml 농도로 조정하여 용해시킨 후 미세적정 역가판(Dynatech,Immulon type I plate)에 각 웰당 l00㎕씩 넣어준 후 37℃에서 2시간 동안 흡착시켰다.

(단계 2)

상기의 역가판을 0.05% 트윈-20(v/v)이 함유된 연산염 완충 생리식염수(Phosphate buffered saline,PBS, pH 7.4 이하 세척액으로 명기함)로 1회 세척 후 미세역가판에 남아 있는 단백질 흡착부위를 0.1% 젤라틴(w/v)을 함유하는 인산염 완충 식염수를 200㎕씩 넣어 37℃에서 1시간 동안에 걸쳐 피복(blocking)시켰다.

(단계 3)

상기 (단계 2)의 역가판을 다시 2회 세척액으로 세척후 각 공당 50㎕씩 0.25% gelatin(w/v),10mM EDTA,1% Triton X-100(v/v),0.02% 티메로살(Thimerosal)이 들어 있는 인산염 완충 생릭식 염수를 넣어준 후 융합세포가 자라고 있는 웰의 상등액을 50㎕씩 취하여, 각 웰에 더하여 준 후 37℃에서 1시간 반응시켰다.

(단계 4)

그 후 상기 (단계 3)의 역가판을 세척액으로 5회 세척 후 서양고주 냉이 과산화효소(Horse Radish Peroxidase, HRP)가 접합된 anti-mouse Ig G-HRP(Boehringer Manheim Cat No. 605-250)를 1 :5,000으로 희석한 후 웰당 100㎕씩 넣어 37℃에서 1시간 더 반응시켰다. 희석시 사용한 용액은 10% 소태아혈청(v/v),1% Fico11(v/v) 0.02% 티메로살,0.05% Tween-20(v/v)이 들어있는 인산염 완충 생리식염수있다. 반응이 완료된 역가판은 다시 세척액으로 5회 세척하였다.

(단계 5)

상기 웰에 50mM 시트레이트/인산염 완충액(pH 5.5)에 O.P.D.(Sigma Chemical Co.)를 10mg/5ml 농도로 넣어 만들어 웰에 100㎕씩 넣어준 후 상온의 어두운 곳에서 30분간 반응시킨 다음, 더 이상의 반응이 진행되지 못하도록 2N 황산을 50㎕씩 넣어준 후 492nm에서 흡광도를 측정하였다. 원하는 항체활성을 나타내는 하이브리도마가 자라는 웰은 24웰 프레이트나,6웰 프레이트에 옮겨주어 증식시켰다 .또한 필요에 따라 마우스의 복강내 거식 세포를 적절히 배양시켜 피터 층(feeder layer)으로 사용하였으며, 이로써 융합세포의 성장에 필요한 성장인자를 제공하였다.

( 9-D) : 항체의획득

본 발명의 항체는 통상적인 방법으로 클론을 배양한 상등액 또는 클론을 Balb/c 마우스의 복강내에서 증식시켜 복수액으로부터 얻어질 수 있다.

복수액을 얻기 위해 0.5ml 프리스테인(Pristane, Sigma)으로 7-14일전에 선 처리된 Balb/c 마우스에 2.5×10⁶융합 세포를 복강내에 주입하였다. 그로부터 1 내지 2주후 복수를 얻을 수 있고 이들로부터 통상적인 방법에 따라 항체를 분리하였다.

(9-E) : 단일 클론 항체의 특성조사

상기 (9-D)에서 얻은 각각의 클론으로부터 제조한 항체의 특성을 다음의 방법으로 측정하였다.

(단계 1) : 항체의 아강(Subtyping)

쥐의 항체 아강 분석키트(Cal Biochem Co, Cat. No. 386445, U.S.A.)를 사용하여 측정하였다. 그 결과를 표 3에 나타내었다.

(단계 2) : 효소면역검사(Enzyme Immunoassay, 이하 EIA라 함)

50mM 붕산 나트륨 완충용액에 2ug/ml 농도로 조절된 KHCV897 단백질을 210㎕씩 미세역가판(Dynatech Immunolon type 1)에 넣고 37℃에서 2시간 반응시킨 후, 플레이트를 0.05% 트윈-20(v/v)인 들어있는 인산염 완충 생리식염수로 세척한 비특이적인 흡착을 차단키위해 플레이트에 0.1% 젤라틴을 포함하는 인산염 완충용액 210㎕씩 넣고 다시 1시간 동안 37℃에서 반응시킨다. 즉 상기의 세척액으로 세척 후 각 클론으로부터 얻은 항체를 통상의 방법에 따라 정제하여 1mg/ml 농도로 조절한 후 이로부터 2배씩 연속적으로 희석하여 200㎕씩 각 웰에 넣어 주었다. 사용된 희석액은 0.25% 젤라틴(v/v),1.0% 트리톤 X-100,0.02% 티메로살, 1mM EDTA가 들어있는 인산염 완충 생리식염수 였다. 상기의 플레이트를 1시간,37℃에서 더 반응시킨 후 세척액으로 씻어낸다. 과산화효소가 접합된 항마우스 IgG(Bcehringer Mannheim Cat No. 605-250)를 10% FBS(v/v) 1% 피콜(v/v) 0.05% 트윈-20을 함유한 인산염완충 식염수로 적정농도로 희석후 200㎕씩 각 웰에 가한 다음 37℃에서 1시간 반응시켰다. 이하 색깔 반응은 실시예<9-C> 항체 활성의 확인에서와 같이 실시하였다. 항체역가는 492nm에서의 흡광도가 1.0 이상인 희석 배수의 역수로 정하였다. 그 결과는 표 3에 나타내었다.

(단계 3) : 분자량 측정

각 클론을 플레이트 또는 쥐의 복막내에서 배양하고 얻은, 상등액 또는 북수액으로부터 단백질-G 세파로스 컬럼(Pharmacia) 친화성 크로마토그래피를 사용하여 IgG를 분리한 후 SDS-PAGE로 무거운 사슬과 가벼운 사슬의 분자량의 합을 측정하여 결정하였다. 그 결과는 표 3에 나타내었다.

(단계 4) : 에피토프(epitope : 면역원성 결정부위, 즉 항체 형성 부위)의 측정

본 발명자들이 고안한 KHCV897 유전자의 일부분을 서로 다르게 삭제시킨, 하기의 변종들을 만들어 각각의 단일클론 항제와의 반응성을 조사였다.

(1) KHCV897 단백질 : KHCV-LBC1에 코딩되는 아미노산 서열의 1192-1457까지로 이루어진 단백질

(2) KHCV290 단백질 : 상기 아미노산 서열의 1192-1289까지로 이루어진 단백질

(3) KHCV430 단백질 : 상기 아미노산 서열의 1l92-1335까지로 이루어진 단백질

(4) KHCV570 단백질 : 상기 아미노산 서열의 1192-1382까지로 이루어진 단백질

(5) KHCV652 단백질 : 상기 아미노산 서열의 1192-1407까지로 이루어진 단백질

(6) KHCV150 단백질 : 상기 아미노산 서열의 1408-1457까지로 이루어진 단백질

(7) KHCV257 단백질 : 상기 아미노산 서열의 1371-1457까지로 이루어진 단백질

(8) KHCV518 단백질 : 상기 아미노산 서열의 1285-1457까지로 이루어진 단백질들이 사용되었다.

즉 각각의 절편들을 발현하는 대장균에 SDS 전기영동 시료완충액(Laemmli, U.K, Nature277, 680(1970))를 넣고 용액으로 만든 다음,100℃에서 5분간 끊어서 전기영동용 시료를 얻었다. 이렇게 제조한 시료들은 면역 블럿팅(Towbin, H, J. Immunol Methods72, 313-340(1984))으로 항체와의 반응성을 조사하였다.

결과는 표 3과 표 4에 나타내었다. 항체 Lucky 1.1은 C형 간염의 아미노산 서열 1192-1289에 대한 연식부위를 갖고, 항체 Lucky 1.2, 1.3 및 1.4는 1371-1407의 서열에 대한 연식 부위를 가짐을 알 수 있다. 각 항체들의 항원 결합 부위를 측정한 다음, 항원 결합 부위 에피토프가 상이한 두 단일 항체를 이용하여 샌드위치 효소면역 측정법으로 시료 혈청에 있는 항원을 측정할 수 있는 키트개발에 유용하게 사용할 수 있다.

[표 3]. 단일 클론 항체 특성

[표4]. 삭제 돌연변이종과의 면역 블롯팅 반응성

본 발명의 단일클론 항체 생산 세포인 Lucky 1.1세포주와 Lucky 1.2 세포주는 91. 12. 18일자로 ATCC(American type Culture Collection)에 Lucky 1.1 세포주는 기탁번호 ATCC 10949, Lucky 1.2는 ATCC 0950으로 각각 부다페스트하의 국제기탁 되었다.

(실시예 10)

KHCV 항원에 대한 항체를 이용한 진단 시약 및 진단

(단계 1) : Lucky 1.1 단일 클론 항체의 서양 고추냉이 과산화효소의 표지

본 발명에서 사용된 단일 클론 항체중의 하나인 Lucky 1.1 단일 클론 항체에 과산화효소를 표지하는 방법은 공지된 바와 같은 과요오드산 나트륨(periodate method, Nakane et al, J. Histochemcytochem.22, 1084(1974)) 방법을 이용하였다. 5mg의 과산화효소를 1.2ml의 증류수에 녹인 후 여기에 10mM 인산 나트륨 완충액(pH 7.0)에 0.1M 농도로 조정된 과요오드산 나트륨 0.3ml를 첨가하여 상온에서 20분 동안 반응시켰다. 상기의 반응액을 1mM 아세트산 나트륨 완충액으로 16시간 동안 투석시켰다.

과산화효소를 표지하려는 Lucky 1.1 단일 클론 항체는 10mg/ml 농도로 20mM 탄산 나트륨(pH 9.5)에 미리 준비한 후 이 항체 1ml에 상기의 과산화효소 용액을 1.5ml을 섞은 후, 상온에서 2시간 동안 반응시켰다. 이 후 반응이 일어나지 않은 쉬프 염기(Schiff base)는 4mg/ml로 증류수에 녹아 있는 나트륨 일수소화물 100㎕를 넣어 환원시켜 제거하였다. 다음에 이는 인산염 완충생기식염수(phosphate buffered saline, pH7.4)로 밤새워 투석한 후 과산화효소가 접합되지 않은 단일 클론 항체나, 과산화효소는 세파크릴 S 300 크로마토그래피 컬럼을 통과시켜 분리하여 제거한 후 사용하였다.

(단계 2) : Lucky 1.2 단일 클론 항체의 미세역가판으로의 흡착과정

인산염 완충 생리식염수에 5㎍/ml 농도로 희석된 Lucky 1.2 단일클론 항체를 만든 후, 미세역가판의 각 웰에 200㎕씩 넣어 37℃에서 2시간 동안 흡착시켰다.

(단계 3) : 비특이성 결합의 차단과정

상기 (단계 2)에서 준비된 미세역가판을 0.05% 트윈-20 및 0.02% 티메로살이 들어 있는 인산염 완충생리식염수(이하 ''세척액''으로 명기함)로 1회 세척후 0.1% 젤라틴-인산염완충 용액 210㎕씩을 각 웰에 넣어 남아 있는 단백질 흡착 부위를 1시간에 걸쳐 모두 피복시킨 후, 다시 상기의 세척액으로 2회 세척하였다.

(단계 4) : 항원 존재 여부 진단 과정

KHCV897 항원 단백질을 200ng/ml 농도로부터 연속으로 2배씩 희석하여 상기 (단계 3)에서 제조한 미세역가판의 각각의 웰에 200㎕씩 넣어주었다. 이때 사용된 희석용 완충용액은 0.25%(w/v) 젤라틴, 1.0%(v/v) 트리톤 x-100, 1mM EDTA,0.02% 티메로살을 함유한 인산염 완충용액이있다. 이와 비교하기 위해 정상인의 혈액에 제조합 항원은 400ng/ml 농도가 되도록 첨가하여 2배씩 연속적으로 희석한 후, 상기의 희석용 완충용액 100㎕에 각각의 제조합 항원이 함유되어 있는 정상인 혈액 100㎕씩을 섞어 최종 200㎕를 만든 후 이들을 각 웰에 넣어 주었다. 이는 혈액내에서 C형 감염의 항원이 존재할 경우 본 발명의 샌드위치 효소 면역에 의해 측정이 가능하다는 것을 보여주기 위함이다. 본 발명의 샌드위치 효소 면역법의 양성반응이 C형 간염항원을 인식함으로써 일어나고 있다는 것을 나타내기 위하여 임의로 KHCV897 단백질 항원을 넣어 주지 않은 정상 혈액을 음성대조군으로 사용하였다 .상기의 미세적정역가판을 37℃에서 1시간 반응시킨 후, 세척액으로 5회 세척하였다.

(단계 5) : 과산화효소 표지된 Lucky 1.1 단일클론 항체를 이용한 항원 검색

상기 (단계 4)의 역가판에 과산화효소가 표지된 Lucky 1.1 단일 클론 항체를 5㎍/ml 농도로 10%(v/v) 우대아 혈청,1% 피콜,0.05% 트윈-10,0.02% 티메로살이 함유된 인산염 생리 식염수로 희석 후 이 용액 200㎕씩을 각 웰에 넣어준 후 37℃에서 1시간 반응시켰다.

(단계 6) : 발색 반응

상기 (단계 5)의 역가판을 세척액으로 5회 세척한 다음,O.P.D. 색깔 반응시약을 200㎕씩 각 웰에 넣어 준 후 상온의 어두운 곳에서 30분간 방치하여 발색반응을 시켰으며,4N 황산 50㎕을 넣어 반응을 정지시킨 다음 492nm 흡광도를 측정하여 반응 결과를 얻었다. 색깔 반응 시약은 50mM 시트레이트/인산염 완충액(pH 5.5)에 O.P.D.(O-phenylenediamine, Sigma)를 20mg/ml 농도로 포함하도록 제조하였다. 결과는 제43도에 나타내었다.

(실시예 11)

샌드위치 효소면역 검정법을 이용한 C형 간염 환자 혈청에서의 항원 검색

실시예 103에서와 같은 방법으로 단일클론 항체가 흡착된 미세역 가판을 제조하여, 웰 당 100㎕씩 들어있는 희석용 완충용액에 100㎕씩의 분석하고자 하는 사람 혈청을 넣어주어 항원 검색을 상기의 실시예 10과 같은 방법으로 실시하였다. 그 결과는 표 5에 나타내었다. 조사된 231개의 시료혈청의 492nm에서의 흡광도 범위를 보면 220개의 시료(22/231)가 0.15 이하로 나타났다. 나머지 11개의 시료는 0.15-0.8 사이의 흡과도를 나타내었으며, 이를 항원양성으로 간주하였다. 여기서는 할버트등의 방법에 따라(Halbert,SP et al, Clin Chim, Acta.129. 69(1983)) 흡광도 0.15를 컷오프값(cut-off value)을 정하였으며, 상기 l1개의 시료를 포함하는 15개의 시료에 대해 상기 실시예 7에서와 같은 방법으로 HCV에 대한 항체를 진단하였다. 그 결과는 표 6에 나타내었다. 이는 KHCV 항원 검출을 위한 샌드위치 ELISA가 유용하여 KHCV 감염초기에 이용될 수 있응을 시사한다. 항원 검출을 외한 ElA에 따르면, 항원 검출을 위한 ELISA는 HCV 단백질 치료와 예방에 유용함이 확실하다.

[표 5]. 샌드위치 효소 면역 측정법에 의해 분석된 시료의 흡광도 분포

[표 6]. 분석된 시료들의 C형 간염 항체 검출 및C형 간염 항원 검출

주) 컷 오프 값은 항원 진단 방법의 경우는 492nm에서 흡광도 0.15로 하였고, 항체 진단의 경우는 KHCV897 항원을 이용하여 항체 존재 여부를 측정하였으며, 이때의 컷 오프 값은 0.32로 정하였다.

Claims (33)

1. C형 간염 바이러스의 비구조 단백질 NS2 영역의 842번째 아미노산이 페닐알라닌이고 849번째 아미노산이 루이신이고 853번째 아미노산이 트레오닌이거나, 또는 842번째 아미노산이 루이신이고 849번째 아미노산이 페닐알라닌이고 853번째 아미노신이 알라닌인 한국형 C형 간염 바이러스(KHCV)를 코딩하는 cDNA.
2. 제1항에 있어서, 제2-1 내지 2-16도의 아미노산 서열을 갖는 한국형 C형 간염 바이러스(KHCV)를 코딩하는 cDNA인 KHCV-LBC1.
3. KHCV를 코딩하는 cDNA의 제343∼726번, 제343∼852번, 제343∼915번, 제916∼1509번, 제1510∼2010번, 제2011∼2529번, 제3916∼4713번, 제6649∼7050번 및 제7612∼8184번 폴리 뉴클레오티드로 구성되는 그룹으로부터 선택된 적어도 히나로 되는, KHCV의 항원 결정체 부분을 암호화하는 폴리뉴클레오티드.
4. 제3항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제조합 발현 벡터
5. 제4항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드가 유비퀴틴 유전자와 연결된 발현 벡터
6. 제5항에 있어서, 효모 발현 벡터인 pYLBC-A/G-UB-CORE 14, pYLBC-A/G-UB-CORE 17, pYLBC-A/G-UB-CORE 22, pYLBC-A/G-UB-KHCV 897, pYLBC-A/G-UB-KHCV 403, pYLBC-A/G-UB-KHCV 573, pYLBC-A/G-UB-E2N 및 pYLBC-A/G-UB--E2C로 구성되는 그룹으로부터 선택된 하나의 벡터.
7. 제5항에 있어서, 대장균 발현 벡터인 ptrpH-UB-CORE14, ptrpH-UB-CORE 22, ptrpH-UB- KHCV 897, ptrpH-UB-E1, ptrpH-UB-E2N 및 ptrpH-UB-E2C로 구성되는 그룹으로부터 선택된 하나의 벡터
8. 제4항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드가 말토오스 결합 단백질(MBP) 유전자와 연결된 발현 벡터.
9. 제8항에 있어서, 대장균 발현 벡터인 pMAL-KHCV 426, pMAL-KHCV 555, pMAL-KHCV513, pMAL-KHCV 810, pMAL-KHCV 798, pMAL-KHCV 754, pMAL-KHCV 652, pMAL-KHCV403, pMAL-KHCV 271, pMAL-KHCV 495 및 pMAL-KHCV 494로 구성되는 그룹으로부터 선택된 하나의 벡터.
10. 제6항의 발현 벡터에 의해 형질 전환된 사카로마이세스속 효모.
11. 제7항의 발현 벡터에 의해 형질 전환된 대장균(Escherichia coli).
12. 제8항의 발현 벡터에 의해 형질 전환된 대장균(Escherichia coli).
13. 제3항의 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는, 한국형 C형 간염 진단 및 백신 제조용 폴리펩티드.
14. 제13항의 폴리펩티드에 유비퀴딘 또는 말토즈가 융합된 융합 폴리펩티드.
15. 제13항에 있어서, 제10항 내지 제12항의 어느 한 항의 효모 또는 대장균에 의해 생산된 폴리펩티드.
16. 제15항에 있어서, KHCV UB 897 단백질, KHCV 897 단백질, UB E1 단백질, KHCV 403 단백질, KHCV CORE 14 단백질, KHCV 573 단백질, KHCV UB CORE 17 단백질, E2N 단백질, E2C 단백질, UB-E2N 단백질, UB-E2C 단백질, KHCV 426 단백질, KHCV 555 단백질, KHCV 513 단백질, KHCV 810 단백질, KHCV 798 단백질, KHCV 271 단백질, KHCV 754 단백질, KHCV 652 단백질, KHCV 403 단백질, KHCV 495 단백질 및 KHCV 494 단백질로 구성되는 그룹으로부터 선택된 하나의 단백질.
17. 제13항의 폴리펩티드를 유효성분으료 포함하는, 한국형 C형 감염 바이러스에 대한 항체의 존재여부를 판별하기 위한 진단 시약.
18. 제l7항에 있어서, 상기 폴리펩티드를 두 종류 이상 포함하는 것을 특징으로 하는 진단 시약.
19. 제17항에 있어서, KHCV UB-COIE 14 단백질, KHCV 897 단백질 및 KHCV 403 단백질의 적어도 하나를 포함하는 진단 시약.
20. 제17항의 진단 시약을 포함하는 진단 키트.
21. 제13항의 폴리펩티드에 대해 면역학적 활성을 갖는, 한국형 C형 간염 바이러스 항원의 정제 및 검출용 단일 클론 항체.
22. 제21항에 있어서, IgG 아강인 단일 클론 항체.
23. 제21항에 있어서, KHCV 897 단백질에 대해 면역학적 활성을 갖는 단일 콜론 항체.
24. 제23항에 있어서, 하기 아미노산 서열에 대해 면역학적으로 반응하는 것을 특징으로 하는 단일 클론항체:

    1 Ala Val Glu Phe lle Pro Val Glu Ser Met

    1l Glu Thr Thr Met Arg Ser Pro Val Phe Thr

    21 Asp Asn Pro Ser Pro Pro Ala Val Pro Gln

    31 Thr Phe Gln Val Ala Hls Leu His Ala Pro

    41 Thr Gly Ser Gly Lys Ser Thr Arg Val Pro

    51 Ala Ala Tyr Ala Ala Gln Gly Tyr Lys Va1

    61 Leu Val Leu Asn Pro Ser Val Ala Ala Thr

    71 Leu Gly Phe Gly Ala Tyr Met Ser Lys Ala

    81 His Gly Ile Asp Pro Asn Leu Arg Thr Gly

    91 Val Arg Thr lle Thr Thr Gly Ala
25. 제23항에 있어서, 하기 아미노산 서열에 대해 면역학적으로 반응하는 것을 특징으로 하는 단일 클론항체.

    1 Gly Glu lle Pro Phe Tyr Gly Lys Ala lle

    11 Pro Ile Glu Ala Ile Lys Gly Gly Arg His

    21 Leu Ile Phe Cys His Ser Lys Lys Lys Cys

    31 Asp Glu Leu Ala Ala Lys Leu
26. 제13항의 폴리펩티드로 면역된 동물의 비장세포와 골수종 세포를 융합시킨, 한국형 C형 간염 바이러스 항원에 대한 단일 클론 항체를 생성하는 세포주.
27. 제26항에 있어서, Lucky 1.1 세포주인 ATCC 10949 또는 Lucky 1.2 세포주인 ATCC 10950.
28. 제21항 내지 제25항의 어느 한 항의 단일 클론 항체를 한 종류 이상 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 한국형 C형 간염 진단 시약.
29. C형 간염 바이러스의 비구조 단백질 NS2 영역의 842번째 아미노산이 페닐알라닌이고 849번째 아미노산이 루이신이고 853번째 아미노산이 트레오닌이거나, 또는 842번째 아미노산이 루이신이고 849번째 아미노산이 페닐알라닌이고 853번께 아미노산이 알라닌인 한국형 C형 간염 바이러스(KHCV)를 불활성화 및 정제시킨 것을 포함하는 한국형 C형 간염 백신.
30. 제13항의 폴리펩티드를 유효성분으로 포함하는 한국형 C형 간염 백신.
31. 제30항에 있어서, E1 단백질, E2N 단백질 및 E2C 단백질의 적어도 하나를 유효성분으로 포함하는 한국형 C형 간염 백신.
32. 제1항의 cDNA에 상보적으로 결합하는 8개 이상의 뉴클레오티드를 포함하는 한국형 C형 간염 진단키트.
33. 제1항에 있어서, C형 간염 바이러스의 비구조 단백질 NS2 영역이 제7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18 또는 l9도의 아미노산 서열을 포함하는 한국형 C형 간염 바이러스(KHCV)를 코딩하는 cDNA.