BG61843B1 - Полипептиди на вируса на хепатит с (нсv) - Google Patents

Полипептиди на вируса на хепатит с (нсv) Download PDF

Info

Publication number
BG61843B1
BG61843B1 BG98332A BG9833293A BG61843B1 BG 61843 B1 BG61843 B1 BG 61843B1 BG 98332 A BG98332 A BG 98332A BG 9833293 A BG9833293 A BG 9833293A BG 61843 B1 BG61843 B1 BG 61843B1
Authority
BG
Bulgaria
Prior art keywords
hcv
polypeptide
immunoreactive
amino acid
segment
Prior art date
Application number
BG98332A
Other languages
English (en)
Other versions
BG98332A (bg
Inventor
David Y. Chien
William Rutter
Original Assignee
Chiron Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Chiron Corp filed Critical Chiron Corp
Publication of BG98332A publication Critical patent/BG98332A/bg
Publication of BG61843B1 publication Critical patent/BG61843B1/bg

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/24011—Flaviviridae
    • C12N2770/24211—Hepacivirus, e.g. hepatitis C virus, hepatitis G virus
    • C12N2770/24222—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • AIDS & HIV (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Description

Област на техниката
Изобретението се отнася до материали и методи за регулиране разпространението на хепатит С вирусната инфекция /HCV/. Поспециално, то се отнася до полипептиди, приложими като имунологични реагенти при откриването, предотвратяването и лечението на HCV инфекции.
Предшестващо състояние на техниката
HCV е идентифициран и охарактеризиран като причинител на нито-А, нито-В хепатит от Houghton et al., вследствие на което се откриват много общи и специфични полипептиди, приложими като имунологични реагенти. Виж напр. Houghton et al., ЕРО 318216: Houghton et al., EPO 388232, X Choo et al., Science /1989/ 244: 359 - 362: Kuo et al., Science /1989/ 244: 362 - 364: Houghton et al., Hepatology /1991/ 14: 381 - 388.
Тези публикации осигуряват екстензивно ниво на уменията в областта на HCV, а така също и получаването и приложението на HCV полипептидни имунологични реагенти.
Други прилагат наготово и доразширяват работата на Houghton et al., виж също и Highfield et al., UK Pat. описание 2239245 /The Wellcome Foundation Ltd./, Wang, EPO публ. № 442,394 /United Biomedical Inc./, Leung et al., EPO публ. № 445423 /Abbott Labor./, Habits et al., EPO публикация № 451891 /Akzo N.V./, Reyes et al., PCT публ. № WO 91/ 155516 /Genelabs Inc./, Maki et al., EPO публ. № 468 657 /Tonen Corp./, и Kamada et al., EPO публ. № 469348 /Shionogi Seiyaku K. K./.
Чувствителни специфични методи за скрининг и идентификация на носители на HCV и HCV контаминирана кръв или кръвни продукти са важно постижение на медицината. Посттрансфузионен хепатит /РТН/ се появява у приблизително 10 % от пациентите, на които е преливано кръв, като HCV се установява в близо 90 % от тези случаи. Най-големият проблем в това заболяване е честотата на прогресиране до хронично чернодробно увреждане /25 - 55 %/· Грижата за пациентите, например предотвратяване на кръвопреливане на замърсена с HCV кръв и кръвни продукти или тесен контакт на персонала, изисква надеждни диагностични и прогностични средства, като HCV полипептиди, за откриване на антитела, свързани с HCV. Такива полипептиди са приложими също и като ваксини и имунотерапевтични агенти за предотвратяване и/ или лечение на заболяването.
Доколкото HCV е сравнително нов причинител, съществува продължаваща нужда от определяне на допълнителни имунологични реагенти, които биха позволили по-нататъшно изследване на клиничния курс на заболяването и епидемиологията на HCV в популацията.
Техническа същност
Изобретението се отнася до охарактеризирането на нови HCV епитопи. Охарактеризирането на тези епитопи позволява получаване на полипептидни продукти, които реагират имунологично с антитела срещу HCV и/или продуцират анти HCV антитела in vivo. Тези полипептидни продукти са приложими като стандарти или реагенти в диагностични тестове и/или като компоненти на ваксини. Антитела, включително както моноклонални, така и поликлонални, насочени срещу HCV епитопи, съдържащи се вътре в полипептидните последователности, са също приложими, например в диагностични тестове, като терапевтични агенти, за скрининг на антивирусни агенти, и за изолирането на изолирани/пречистени HCV полипептиди или частици.
В най-широк смисъл настоящото изобретение е насочено към полипептиди, съдържащи новоохарактеризирани HCV епитопи, разкрити тук, методи за получаване на такива полипептиди /вкл. рекомбинантни и синтетични методи, методи за използване на такива полипептиди, като диагностични, ваксинални и терапевтични, и вещества за производство, състави или форми, адаптирани за такова използване, като полипептиди, закрепени към имунопроба или друга твърда повърхност, орален или инжекционен фармакологичен състав/. Аналогично, антитела, поликлонални, моноклонални, или еквиваленти като свързващи фрагменти, едноверижни антигенсвързващи протеини и други срещу HCV епитопите, разкрити тук, са също включени в обхвата на настоящото изобретение, а така също и методи за получаване на такива антитела, методи за използване на такива антитела в диагностиката, ваксините и терапията и обекти на производство, състав или фармацевтична форма, адаптирани към такива приложения, като антитела, фиксирани към имунопроба или друга повърхност, орален или инжекционен фармацевтичен състав.
Други аспекти на изобретението се отнасят до комплекти за анализ на проби с оглед присъствието на HCV антиген, включващи горните антитела в подходящ носител. Други аспекти на изобретението се отнасят до комплекти за анализ на проби за присъствие на антитела, насочени срещу HCV антиген, включващи полипептиди, както са описани погоре в подходящ носител.
Изобретението се отнася и до метод за получаване на полипептид, съдържащ новооткритите HCV епитопи, включващ инкубиране на гостоприемникови клетки, трансформирани с експресионен вектор, съдържащ последователност, кодираща полипептид, който има HCV епитопа при условия, позволяващи експресията на полипептида и до полипептид, съдържащ такъв HCV епитоп, получен по посочения метод.
Имунологичните изследвания са също включени в изобретението. Те предвиждат имунологично изследване за откриване на HCV антиген, включващо инкубиране на проба, за която се предполага, че съдържа HCV антиген с антитяло, както е описано по-горе, при условия, позволяващи формирането на ком5 плекс антиген-антитяло, и откриване на комплекса антиген-антитяло, съдържащ антитялото. Изследване за установяване на анти HCV антитела включва инкубиране на проба, която вероятно съдържа анти HCV антитела с поли10 пептид, както е описано по-горе, при условия, позволяващи формирането на комплекс антитяло-антиген, и откриване на комплекса антитяло-антиген, съдържащ полипептида.
Съгласно изобретението са предвидени 15 и ваксини за лечение на HCV инфекция, които включват имуногенен пептид, съдържащ HCV епитопа, описан по-горе.
Още един аспект на изобретението е метод за получаване на антитела срещу HCV, 20 включващ въвеждане у даден индивид на изолиран полипептид, който е имуногенен и съдържа HCV епитоп, описан тук, в количество, достатъчно да предизвика имунен отговор.
Изброените по-горе аспекти на изобре25 тението са осъществени чрез откриването на HCV епитопи от формулата аах - аау, в която аа означава аминокиселина, х и у са цяло число, така че у - х > 6, като аа - аа означава част от аминокиселинната последователност от фи30 гура 1, и х е подбран от групата, състояща се от:
23-34, 36, 66-79, 81-94,
96-98, 101-103, 186-189, 191, 206, 223, 232, 256, 286, 297-299, 321, 347, 357, 413, 414, 432, 465-471, 480484, 501, 502, 521, 540-549, 579, 594-599, 601613 , 641, 662-665, 685, 705, 706, 729, 782-789, 801, 851-855 , 893 , 916, 928, 946,952-954, 1026, 1072, 1109, 1112-1117, 1218, 1240, 1280-1285, 1322, 1338, 1371, 1384, 1410, 1411, 1454, 1492, 1493, 1532-1535, 1560, 1561, 1566-1568, 1571-1577, 1601-1607, 1615-1620, 1655, 1695, 1710-1712, 1728, 1729, 17581762, 1781, 1808, 1821, 1851, 1880, 1908-1913, 1925, 1940-1948, 1951, 19661969, 1999, 2001-2004, 2006-2014, 2024, 2048-2053, 2055-2057, 2071, 20882093, 2108, 2122-2148, 2165, 2187, 2226-2232, 2244-2249, 2267, 2281-2286, 2288, 2289, 2325-2327, 2346, 2347, 2349, 2382, 2401, 2417-2422, 2439-2444, 2446-2456, 2469, 2471-2476, 2495, 2533, 2534, 2573-2578, 2602-2604, 26062612, 2632-2638, 2660, 2676-2679, 2688-2693, 2707, 2721, 2757-2762, 2779, 2794, 2795, 2797-2799. 2801, 2802, 2817-2843, 2863-2867, 2878-2884, 28862895.
Посочените обекти се постигат също и с помощта на HCV епитопи от формулата: аам аау, в която аа означава аминокиселина, х и у са цяло число, различно от у - х > 6, аах - аа означава част от аминокиселинната последователност съгласно фигура 1 и х е подбран от група, състояща се от 35, когато у е по-малък от 45, 80, когато у по-малък от 90, 95, когато у е по-малък от 110, 99, когато у е по-малък от 210, 500, когато у е по-малък от 550, 600, когато у е по-малък от 625, 1260, когато у е помалък от 1280, 1569, когато у е по-малък от 1931, 1570, когато у е по-малък от 1590, 1694, когато у е по-малък от 1735, 1949, когато у е по-малък от 2124, 1950, когато у е по-малък от 1985, 2000, когато у е по-малък от 2050, 2005, когато у е по-малък от 2223, 2250, когато у е по-малък от 2330, 2287, когато у е помалък от 2385, 2290, когато у е по-малък от 2310, 2345, когато у е по-малък от 2375, 2348, когато у е по-малък от 2464, 2445, когато у е по-малък от 2475, 2470, когато у е по-малък от 2490, 2605, когато у е по-малък от 2620, 2780, когато у е по-малък от 2830, 2796, когато у е по-малък от 2886, 2800, когато у е помалък от 2850, и 2885, когато у е по-малък от 2905.
Във всяка от формулите, посочени погоре, х - у е по-малко или равно на 10, 20, 30, 40 или 50 в някои вариантни решения на изобретението.
Кратко описание на фигурите
Фигура 1 показва полипротеина на HCV прототипния изолат на HCV1;
фигура 2 - съставната сДНК последователност за HCV;
фигура 3 - нуклеотидната консенсус последователност на човешки изолат 23, вариантните последователности са показани под реда на последователността. Показани са също и аминокиселините, кодирани в консенсус последователностите;
фигура 4 - нуклеотидната консенсус последователност на човешки изолат 27, вариантните последователности са показани под реда на последователността. Показани са също и аминокиселините, кодирани в консенсус последователността;
фигура 5 - подравнените последователности на човешки изолати 23 и 27 и на HCV1.
Хомоложните последователности са обозначени със /*/. Нехомоложните последователности са изписани с малки букви;
фигура 6 - подравнените последователности на човешки изолати 23 и 27 и на HCV 1. Хомоложните последователности са изписани с малки букви;
фигура 7 - сравнение на подравнената съставна нуклеотидна последователност на изолатите Thorn, ЕС1,НСТ18 и HCV1;
фигура 8 - сравнение на нуклеотидните последователности на ЕС 10 и състава на HCV 1 последователността, ЕС 10 последователността е на линията над пунктира, а НСVI последователността е на линията под пунктира;
фигура 9 - сравнение на аминокиселинните последователности 117 - 308 /съответстващи на HCV1/, кодирани в Envl последователността на човешки изолати НСТ18, JH23, JH27, Thrn, ЕС1 и HCV1.
Методи за осъществяване на изобретението
I. Дефиниции “Хепатит С вирус” или HCV се отнася до известни вирусни видове, патогенни щамове от които причиняват NANBH /хепатит нито А нито В/, както и до атенюирани щамове или дефективни интерфериращи частици, получени от тях. Основно следва да се видят публикациите, цитирани в раздел “Предшестващо състояние на техниката”. HCV геномът е включен в РНК. Известно е, че вирусите РНК имат относително висока степен на спонтанна мутация, докладвани са стойности от 103 до 104 за инкорпориран нуклеотид /Fields - Knipe, 1986/. Поради това, доколкото хетерогенността и изменчивостта на генотипа се онаследява във вирусите РНК, налице са множество щамове/изолати, които могат да бъдат вирулентни или авирулентни, в рамките на HCV видовете. Размножаването, идентифицирането, откриването и изолирането на вирусните HCV щамове или изолати е добре документирано в литературата. Нещо повече, разкритото тук позволява получаване на диагностици и ваксини за вирусни щамове/ изолати, а така също и състави и методи, които са приложими в скрининговите процедури за антивирусни агенти за фармакологични нужди, както и агенти, които инхибират репликация61843 та на HCV.
В описанието на изобретението е предоставена и информация за различни щамове/изолати на HCV, по-специално за щам или изолат CDC/HCV1, наричан още HCV1. Информация от един щам или изолат като частична геномна или аминокиселинна последователност е достатъчна, за да позволи на специалиста в областта, като използва стандартни техники, да изолира нови щамове/изолати и да установи дали такива нови щамове/ изолати са HCV. Например няколко различни щама/изолата са описани по-долу. Тези щамове, които са получени от различни човешки серуми по отношение на принадлежност и географски произход, са изолирани с помощта на информация от геномната последователност на HCV1.
Информацията съгласно изобретението е показателна за това, че HCV е вероятно далечен родственик на Flaviviridae. Семейството на Flaviviridae съдържа много вируси, които са малки капсулирани патогени за човека. Морфологията и съставът на Flaviviridae частички са известни и са дискутирани в Brinton /1986/. Най-общо, по отношение на морфологията, Flavivirus съдържа централен нуклеокапсид, заобиколен от двуслоен липид. Вирионите са сферични и имат диаметър около 40 - 50 nm. Тяхната сърцевина е около 25 - 30 nm в диаметър. По продължение на външната повърхност от вирусната обвивка има израстъци, които са около 5 - 10 nm дълги с терминални изпъкналости около 2 nm в диаметър. Типични примери за семейството са Yellow Fever virus. West Nile virus u Dengue Fever virus. Те имат позитивно верижни РНК геноми /- 11000 нуклеотида/, които са малко по-дълги от тези на HCV и кодират полипротеинов предшественик около 3500 аминокиселини. Индивидуални вирусни протеини се разцепват от този предшественик на полипептида.
Геномната структура и нуклеотидната последователност на HCV геномната РНК са резултат на дедукция. Геномът е едноверижна РНК, съдържаща приблизително 10 000 нуклеотида. Геномът е позитивно верижен и има непрекъсната, транслационна отворена рамка на разчитане /ORF/, която кодира полипротеин от около 3 000 аминокиселини. В ORF, структурният протеин/и/, явно са кодирани в първата четвъртина на N-крайната област, с преобладаването на полипротеин, отговорен за неструктурните протеини. Когато се прави сравнение с всички известни последователности, се наблюдават малки, но значими колинеарни хомоложности с неструктурните протеини от семейството на Flavivirus, а така също и на пестивирусите /които сега се счита, че също принадлежат към семейство Flavivirus/.
На базата на предполагаемите аминокиселини, кодирани в нуклеотидните последователности на HCV1 и други доказателства, вероятните протеинови домени на кодираният HCV полипротеин, както и приблизителните граници, са следните:
Предполагаем домен Приблизителна граница
С /нуклеокапсиден 1 - 191
протеин/
Е1 /вирусен протеин 192 - 383
на обвивката/
Е2 /NS1 /обвивка/ 384 - 800
NS2 /неизвестна 800 - 1050
функция
NS3 /протеаза/ 1050 - 1650
NS4 /неизвестна 1651 - 2100
функция
NS5 /полимераза/ 2100-3011 /край/
Тези домени са обаче предварителни, експериментални. Например El - NS2 границата е приблизително в 750 - 810 областта, а NS3 - NS4 границата е около 1640 - 1650. Налице е също доказателство, че 191 аа версията на С е предшественик, който по-нататък претърпява процесинг /приблизително 170 аа в дължина/, a NS2, NS4 и NS5 протеините са получени всеки в два по-нататъшни зрели протеина.
Очаква се различните щамове, изолати или субтипове на HCV да съдържат вариации на аминокиселини и нуклеинови киселини, в сравнение с НСVI. За много изолати се очаква да покажат по-голяма хомоложност /т.е. повече от около 40 %/ в общата аминокиселинна последователност, сравнена с HCV1. Обаче, може да бъде намерено, че има други по-малко хомоложни изолати. Те биха могли да бъдат определени като HCV съгласно различни критерии, например една ORF с приб5 лизително 9 000 нуклеотида до приблизително
000 нуклеотида, кодираща полипротеин, сходен по размер на този на HCV1, кодиран полипротеин със сходна хидрофобна и/или антигенна характеристика на HCV1 и присъствието на ко-линеарни пептидни последователности, които са съхранени с HCV1. В допълнение геномът би бил позитивно верижна РНК.
HCV кодира поне един епитоп, който е имунологично идентифицируем с един епитоп в НСVI полипротеина. Епитопът е уникален за HCV, когато се сравнява с известните от по-рано Flavivirus. Уникалността на епитопа може да бъде определена чрез неговата имунологична реактивност с анти-HCV антитела и отсъствие на имунологична реактивност с антитела срещу известни видове от Flavivirus. Методи за определяне на имунологичната реактивност са известни в областта, например като радиоимунологично изпитване, изпитване по ELISA, хемаглутинация и различни примери за подходящи изследвания, осигурени чрез изобретението. По избор сравняването на последователността на HCV епитопа с познати от по-рано последователности на членове от семейството Flaviviridae може да бъде използвано за оценка на уникалността.
В допълнение към посоченото по-горе следващите параметри на нуклеиново киселинната хомоложност и аминокиселинната хомоложност са приложими както самостоятелно, така и в комбинация, за идентифициране на щама/изолата като HCV. Доколкото щамовете HCV и изолатите са еволюционно свързани, очаква се, че хомоложността по целия геном на нуклеотидно ниво може да е около 10 % или повече, като вероятно е около 40 % или повече, дори вероятно 60 % или повече и найвероятно около 80 % или повече, и в допълнение ще има кореспондиращи непрекъснати последователности по продължение на поне около нуклеотида. Следва да се отбележи, че са налице и вариабилни и хипервариабилни области в рамките на HCV генома, поради това хомоложността в тези области се очаква да бъде значително по-малка от тази на целия геном. Съответствието между предполагаемата геномна последователност на HCV щама и например CDC/HCV1 сДНК последователността, може да бъде определена, като се използват известни техники. Например те могат да бъдат определени чрез директно сравняване на сек венционната информация за полинуклеотида от предполагаемия HCV и HCV сДНК последователностите, описани тук. Освен това те могат да бъдат определени чрез хибридизация на полинуклеотидите при условия, които формират стабилни дуплекси между хомоложните области например онези, които биха били използвани преди S1 смилане, последвано от смилане с едноверижна специфична нуклеаза и, след което се определя размерът на разградените фрагменти.
Поради еволюционните взаимоотношения на щамовете или изолатите на HCV предполагаемите HCV щамове или изолати могат да бъдат идентифицирани на базата на тяхната хомоложност на полипептидно ниво. Най-общо HCV щамовете или изолатите се очаква да бъдат поне 10 % хомоложни, повече от 40 % хомоложни, вероятно повече от около 70 % хомоложни и дори по-вероятно повече от 80 % хомоложни, като някои дори може да са повече от 90 % хомоложни на полипептидно ниво. Техниките за определяне хомоложността на аминокиселинните последователности са известни. Например аминокиселинната последователност може да бъде определена директно и сравнена с последователностите, представени съгласно изобретението. Обратно нуклеотидната последователност на геномния материал от предполагаемия HCV може да бъде определен /обикновено чрез посредничеството на сДНК/, кодираната аминокиселинна последователност може да бъде определена и съответстващите области - сравнени.
Както се употребява тук “полинуклеотид, получен от определена последователност”, се отнася до полинуклеотидна последователност, която е обхваната от последователност с приблизително поне 6 нуклеотида, за предпочитане около 8 нуклеотида, още подобре от поне 10-12 нуклеотида и дори найдобре от приблизително поне 15-20 нуклеотида, съответстващи на областта от определената нуклеотидна последователонст. “Съответстващи” означава хомоложни на или комплементарни спрямо определена последователност. За предпочитане е последователностите от областта, от която е получен полинуклеотидът, да са хомоложни или комплементарни на последователността, която е уникална на HCV генома. Дали е или не е уникална за HCV генома, може да се определи чрез известни в областта техники. Например последователността може да бъде сравнена с тази от базата данни /както за приоритетна дата/, напр. Genebank, за да се определи дали тя присъства в неинфектиран гостоприемник или в други организми. Последователността освен това може да бъде сравнена с известни /до приоритетната дата/ последователности от други вирусни агенти, включително онези, които индуцират хепатит, напр. HAV, HBV и HDV и с членовете от семейство Flaviviridae. Съответствието или несъответствието на получената последователност спрямо други такива може също да бъде определено чрез хибридизиране при подходящи условия. Хибридизационните техники за определяне на комплементарността последователности на нуклеинови киселини са известни за специалистите в областта. Виж, напр. Maniatis et al., /1982/. В допълнение несъвпаденията на дуплексните полинуклеотиди, формирани чрез хибридизация, може да бъде определено по познати техники, включително разграждане с нуклеази като S1, която специфично разгражда едноверижните области в дуплексните полинуклеотиди. Области, от които могат да бъдат “получени” типични ДНК последователности, включват, но не са ограничени до, напр. областите, кодиращи специфични епитопи, като нетранскрибирани и/или нетранслирани области.
Полученият полинуклеотид се получава незадължително по физичен начин от нуклеотидна последователност, която е позната, но може да бъде продуциран по различен начин, например химичен синтез или ДНК репликация или обратна транскрипция или транскрипция. В допълнение комбинации от области, съответстващи на определените последователности, могат да бъдат модифицирани по начини, които са познати в областта с оглед предполагаемото приложение.
Аналогично “полипептид или аминокиселинна последователност, получена от определена аминокиселина или нуклеинова киселина”, се отнася до полипептид с идентична аминокиселинна последователност на тази на полипептид, който е кодират от последователността, или на негова част, като тази част се състои най-малко от 3 - 5 аминокиселини, за предпочитане поне 8-10 аминокиселини, и дори повече за предпочитане 11-15 аминокиселини, или които могат да бъдат идентифи цирани по имунологичен начин с полипептида, кодиран в последователността. Тази терминология включва също полипептид, експресиран от последователността на определената нуклеинова киселина.
Рекомбинантният или получен полипептид не е задължително транслиран от определената последователност на нуклеиновата киселина. Той може да бъде продуциран по който и да е начин, вкл. например химичен синтез или експресия на рекомбинантна експресионна система, или изолиране от HCV, вкл. мутация на HCV. Рекомбинантният или получен полипептид може да включва един или повече аналози на аминокиселини или несрещащи се в природата /синтетични/ аминокиселини в тяхната последователност. Методи за инсертиране на аналози на аминокиселини в последователностите са познати за специалистите в областта. Те могат да включват едно или повече маркери, които също са познати на специалистите.
Терминът “рекомбинантен полинуклеотид”, както се използва тук, означава полинуклеотид от геномна, сДНК, полусинтетична, или със синтетичен произход, постигнат благодарение на своя произход или обработка: 1 / не е асоцииран с всички или част от полинуклеотида, с които се асоциира в природата, 2/ присъединен е към полинуклеотид, различен от този, към който се присъединява в природата, или 3/ не се среща в природата.
Терминът “полинуклеотид”, както се употребява тук, се отнася до полимерна форма на нуклеотид с каквато и да е дължина, независимо рибонуклеотид или дезоксирибонуклеотид. Този термин се отнася само до първичната структура на молекулата. Така този термин включва двойно- или едноверижна ДНК или РНК. Той включва също типове на модификация, например, маркери, известни за специалистите, метилирания, “Кеп места”, заместване на един или повече от срещаните в природата нуклеотиди с даден аналог, интернуклеотидни модификации, например свързвания без заряд /като метил фосфонати, фосфотриестери, фосфорамидати, карбамати и други/ и със заредени връзки /например фосфоротиоати, фосфородитиоати и други/, тези съдържащи допълнително присъединени части, например протеини/ вкл. нуклеази, токсини, антитела, сигнални пептиди, поли-Ь-лизин и други/, тези с интеркалатори /напр. акридин. псорален и други/, тези, съдържащи хелатори /като метали, радиоактивни метали, бор, окисляващи метали/, тези, съдържащи алкилатори. тези с модифицирани връзки /като а-аномерни нуклеинови киселини и други/, както и немодифицирани форми на полинуклеотида.
“Пречистен” полипептид като термин се отнася до полипептида, който е в състояние, в което не е свързан с други полипептиди, т.е. в състав, който съдържа минимум от около 50% тегл. (желан полипептид/общо количество полипептид в състава), за предпочитане около 70% и дори около 90% от желания полипептид. без оглед на непротеиновите материали в състава. Техниките за пречистване на вирусните полипептиди са известни за специалистите в областта. Пречистените антитела се дефинират аналогично.
“Рекомбинантни клетки гостоприемници”, “клетки гостоприемници”, “клетки”, “клетъчни линии”, “клетъчни култури” и други подобни термини, обозначаващи микроорганизми или други еукариотни клетъчни линии, култивирани като едноклетъчни, се отнася до клетки, които могат да са, били са или ще бъдат използвани като реципиенти на рекомбинантен вектор или друг трансфер на ДНК, и включват потомство на изходната клетка, която е била трансфектирана.
Известно е, че потомството на отделна родителска клетка може да не бъде задължително идентично в морфологично геномно или ДНК отношение като изходната родителска клетка поради природни, случайни или насочени мутации.
“Репликон” е всеки генетичен елемент, например плазмид, хромозома, вирус, козмид и други, които се отнасят като автономни единици на полинуклеотидна репликация в рамките на клетката, т.е. те са способни на репликация под свой собствен контрол.
“Вектор” е репликон, в който други полинуклеотидни сегменти са присъединени, така че да допринесе за репликацията и/или експресията на присъединения сегмент.
“Контролна последователност” се отнася до полинуклеотидни последователности, които са необходими, за да въздействат на експресията на кодиращите последователности, към които те са свързани. Природата на такива контролни последователности се различава в зависимост от организма гостоприемник, в прокариотите подобни контролни последователности включват предимно промотори, рибозомен сайт за свързване и терминатори; в еукариотите контролните последователности включват промотори, терминатори и в някои случаи енхансери. Терминът “контролна последователност” включва като минимум всички компоненти, чието присъствие е необходимо за експресия, и може също да включва допълнителни компоненти, чието присъствие е преобладаващо, например, лидерни последователности.
Изразът “Оперативно свързан” обозначава съпоставяне, при което така описаните компоненти са във взаимоотношения, позволяващи им да функционират по очаквания начин. Контролна последователност, “оперативно свързана” към кодираща последователност, се лигатира по такъв начин, че експресията на кодиращата последователност се постига при условия, съвместими с контролната последователност.
“Отворена рамка на разчитане” (ORF) е област от полинуклеотидната последователност, която кодира полипептид; тази област може да представлява част от кодиращата последователност или цялата кодираща последователност.
“Кодираща последователност” е полинуклеотидна последователност, която се транскрибира в шРНК и/или се транслира в полипептид, като се поставя под контрола на подходящи регулаторни последователности. Границите на кодиращата последователност са определени чрез транслационен стартов кодон при 5'-края и транслационен стоп кодон при З-края. Кодиращата последователност може да включва, но не е ограничена до тРНК, сДНК и рекомбинантни полинуклеотидни последовател ности.
“Имунологично идентифицируем” с (като се отнася до присъствието на епитопи и полипептиди, които също присъстват в дадения полипептид/и), обикновено HCV протеини. Имунологична идентичност може да бъде определена чрез свързване с антитяло и/ или конкуренция при свързването; тези техники са известни за специалистите в областта.
Съгласно изобретението “епитоп” се отнася до антигенна детерминанта на полипептида. Един епитоп може да обхване 3 или по61843 вече аминокиселини, които определят сайта на свързване на даденото антитяло. Най-обсз един епитоп се състои от поне 5 аминокиселини и понякога от по 8 аминокиселини. Методите за картиране на епитопите са известни в областта.
Един полипептид е “имунологично реактивен” с дадено антитяло, когато то се свързва с това антитяло, вследствие на разпознаването на антитялото от специфичен епитоп. съдържащ се в полипептида. Имунологичната реактивност може да бъде определена чрез свързването на антитялото, по-специално чрез кинетиката на свързването на антитялото, и или чрез конкурентното свързване с помощта на познати полипептиди като конкуренти, които съдържат епитоп, срещу който е насочено антитялото. Техниките за определяне дали дадено антитяло е имунологично реактивно или не, са познати в областта.
Както е употребен тук, терминът “антитяло” се използва за полипептид или група от полипептиди, които са обхванати от поне един антитяло комбиниращ сайт. “Антитяло комбиниращ сайт” или “свързващ домен се формира от нагъването на вариабилните домени на молекулата/те/ на антитялото, за да се образуват триизмерни свързващи пространства с формата на вътрешната повърхност и разпределение на заряда, комплементарно на това в един епитоп на даден антиген и който създава възможност за имунологична реакция с антигена. Един антитяло комбиниращ сайт може да бъде образуван от домени на тежки и/или леки вериги (VH и Vt съответно), които образуват хипервариабилна бримка, способстваща на антигенното свързване. Терминът “антитяло” включва, например антитела от организми от разред гръбначни, хибридни антитела, химерни антитела, едновалентни антитела, изменени антитела, Fab протеините и антитела с единичен домен.
Съгласно изобретението “антитяло с единичен домен” (dAb) е антитяло, което се състои от VH домен, което реагира имунологично с определен антиген. dAb не съдържа VL област, но може да съдържа друг антиген свързваш домен, за който се знае, че съществува в антителата, например, κ и λ домени. Методите за получаване на dAb са известни в областта (Ward et al. /1989/).
Антителата могат също така да се със тоят от VH и VL домени, както и други известни свързващи домени. Примери за тези типове антитела и методи за тяхното получаване са известни в областта (патент на US 4 816 467), и включват следното.
Например “антитела от гръбначни животни” са такива антитела, които са тетрамери или техни агрегати, включващи леки и тежки вериги, обикновено агрегирали в У конфигурация и които може да са или да не са ковалентно свързани. Аминокиселините в тези антитела са хомоложни с аминокиселинните последователности, намерени в антитяло, продуцирано от лимфоцити, in situ, или in vitro (например в хибридоми). Антителата от гръбначни обикновено включват природни антитела, например пречистени поликлонални антитела и моноклонални такива. Примери за получаване на такива антитела са описани погоре.
“Хибридни антитела” са антителата, в които една двойка от тежките или леките вериги е хомоложна на тези от първото антитяло, докато друга двойка от тежката или леката верига е хомоложна на тези от различно второ антитяло. Типично е, че всяка от тези две двойки свързва различни епитопи, по-специално от различни антигени. Това води до свойството “бивалентност”, т.е. способността да свързва два антигена едновременно. Подобни хибриди могат да бъдат образувани с помощта на химерни вериги, както е посочено по-рано.
“Химерни антитела” са антитела, в които тежката и/или лека верига са слети протеини. Обикновено постоянната област от веригите е от един определен вид и/или клас, като вариабилните домени са от различни видове и/или клас. Към тази група се включва и което и да е антитяло, в което всяка или и двете вериги тежката или леката, са съставени от комбинация на последователности, имитираща секвенциите на антитела от различни източници, независимо дали тези източници са от различни класове, или различни видове по произход, и дали или не точката на сливане е на вариабилните/постоянни гранични места. Така, възможно е да се продуцират антитела, в които нито постоянната, нито вариабилната област имитират известни последователности на антитела. След това става възможно, например, да се конструират антитела, чиято вариабилна област има по-висок специфичен афинитет за определен антиген или чиято постоянна област може да покаже повишена фиксация на комплемента, или да създаде други подобрения в свойствата, постигнати с частично постоянната област.
“Изменени антитела” означават антитела, в които природно срещаната аминокиселинна последователност в антитяло от гръбначни варира. С помощта на рекомбинантни ДНК техники антитялото може да бъде реконструирано за получаване на желаната характеристика. Възможните варианти са много и граничат от изменение на една или повече аминокиселини до пълното реконструиране на дадена област, например константна област. Измененията в постоянната област най-общо за получаване на желана характеристика на клетъчни процеси, напр. изменение на фиксацията на комплемента, взаимодействия с мембраните, и други ефекторни функции. Измененията във вариабилната област могат да бъдат направени с оглед изменение на антигенните характеристики. Антитялото може да бъде реконструирано така, че да се постигне специфичното доставяне на молекула или вещество в специфична клетка или място в тъканите. Желаните изменения могат да се осъществят чрез известни техники в молекулярната биология, като рекомбинантни техники, сайт насочена мутагенеза и други.
Още един пример е “едновалентното антитяло”, което е агрегат, съставен от димер на тежка/лека верига. Този тип антитяло избягва антигенните модулации. Виж, напр. Glennie et al. (1982).
В определението за антителата са включени също и Fab фрагментите на антителата. Fab областите се отнасят до онези части на тежките и леки вериги на антителата, които са грубо еквивалентни, или аналози на последователностите, които обхващат разклонението на тежките или леките вериги, и които, както е известно, са имунологично свързани към специфичен антиген, но които не притежават ефекторната Fc част. Fab включва агрегати на една тежка и една лека верига (общоизвестна като Fab’) така, както тетрамери, съдържащи 2Н и 2L вериги (известни като F(ab)2), които са способни на селективна реакция с определен антиген или семейство антигени. Fab антителата може да бъдат разделени на субединици, подобно на тези, описани по-горе, напр. гръбначни Fab, хибридни Fab, химерни Fab и изменени Fab. Методи за получаване на Fab фрагменти на антителата са известни за специалистите в областта и включват например 5 протеолизис и синтез чрез рекомбинантни техники.
В термина “антитела” са включени също и едноверижни, свързващи антиген (SCA) протеини, като типа, описан в статията на 10 Schlom, J., в изданието от 15 юни 1992, Cancer Research (както статията, цитирана тук).
Както се употребява в текста, терминът “имуногенен полипептид” е полипептид, който проявява клетъчен и/или хуморален иму15 нен отговор, независимо дали е самостоятелен или е присъединен към носител в присъствието или отсъствието на аджувант.
Терминът “полипептид” се отнася до полимер от аминокиселини и не се отнася до 20 специфична дължина на продукта, като пептиди, олигопептиди и протеини са включени в рамките на дефиницията за полипептид. Този термин също така не се отнася до или изключва постекспресионните модификации на 25 полипептида, като гликозилиране, ацетилиране, фосфорилиране и други. В дефиницията са включени още, например полипептиди, съдържащи един или повече аналози на една аминокиселина, вкл. например несъществува30 ща в природата аминокиселина, полипептиди със заместени връзки, а така също и други модификации, познати в областта, както природно, така и неприродно срещащи се.
“Трансформация”, както се употребява 35 тук, се отнася до инсерция на екзогенен полинуклеотид в клетка гостоприемник, независимо от метода, който е използван за инсерция, напр. директно поглъщане, трансдукция, fкръстосване или електропорация. Екзогенният 40 полинуклеотид може да бъде съхраняван като неинтегриран вектор, например плазмид, или по желание, може да бъде интегриран в генома на гостоприемника.
“Лечение”, както се употребява тук, означава профилактика и/или терапия.
Понятието “индивид”, както се употребява тук, се отнася до гръбначни, по-специално до бозайници, като включва, но не се ограничава до животни като кучета, котки, овце, свине, плъхове, мишки, морски свинчета, рогати животни и други, също до примати, включително маймуни, шимпанзета, бабуини и до хора.
Както се употребява в текста, “смисловата верига” на нуклеинова киселина съдържа последователността, която има секвенционна хомоложност с тази на тРНК. “Обратната верига” съдържа последователност, която е комплементарна на тази от “смисловата верига .
Както се употребява в текста, “позитивно верижен геном” на даден вирус е този, който, независимо дали е РНК или ДНК, е едноверижен и кодира вирусен полипептид/и/. Примери за позитивно верижните РНК-ови вируси включват: Togaviridae, Coronaviridae, Picornaviridae и Caliciviridae. Тук се причисляват също 15 и Flaviviridae, които формално се отнасят към Togaviridae (Виж Fields & Knipe /1986/).
Както се употребява тук, “антитяло, съдържащо телесен компонент” се отнася до компонент от тялото на индивида, който е източ- 20 ник на интересуващите ни антитела. Антитела, съдържащи телесни компоненти, са известни в областта на техниката и включват, но не са ограничени до, например плазма, серум, гръбначна течност, лимфна течност, външните отдели на респираторния тракт, чревния и генитален тракт, сълзи, слюнка, мляко, бели кръвни телца и миеломи.
Както се употребява тук, “биологична 5 проба” се отнася до проба от тъкан или течност, изолирани от даден индивид, включително, но не ограничено до, например плазма, серум, гръбначномозъчна течност, лимфа, външни отдели на кожата, респираторния тракт, чрев10 ния и гениталния тракт, сълзи, слюнка, мляко, кръвни клетки, тумори, органи и така също и проби от in vitro клетъчни култури (включително, но не ограничаващо се до постоянна среда, получена от културалната клетъчна среда.
Техническа същност на изобретението
Съгласно изобретението се използват, доколкото не са указани други, конвенционални техники от молекулярната биология, микробиология, рекомбинантна ДНК, и имунология, които са известни за специалистите. Тези техники са обяснени напълно в литературата.
See e.g., Maniatit, Fitsch &.
Sambrook, ’Molecular Cloning; A Laboratory Manual (1982); DNA Cloning, Volumes I and П* (D.N Glover ed. 1985); ’Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait ed, 1984); ’Nucleic AUMiydiaaatuu (B.D. Hames & S.J. Higgins eds. 1984);
Transcription and Translation* (B.D. Hames & S.J. Higgins eds. 1984); ‘Animal Cell Culture (R.I. Freshney ed. 1986); Immobilized Cells And Enzymes* (TRL Press, 1986); B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning* (1984); the series, Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); ’Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells (J.H. Miller and M.P. Calos eds. 1987, Cold Spring Harbor Laboratory), Meth Enzvmol Vol. 154 and Vol. 155 (Wu and Grossman, and Wu, eds., respectively), Mayer and Walker, eds. (1987), ’Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology* (Academic Press, London); Scopes, (1987) ’Protein Purification: Principles and Practice, Second Edition (Springer-Veriag, N.Y.); and ’Handbook of Experimental Immunology, Volumes I-IV (D.M. Weir and C. C. Blackwell eds 1986). All patents, patent applications, and publications mentioned herein, both supra and infra, are hereby incorporated herein by reference.
II.A. Скъсени HCV полипептиди
Материалите и методите съгласно изобретението са осъществими чрез идентифицираните и описани по-нататък нови HCV епи топи. Познанията за тези епитопи (или антигенни области) позволяват конструирането на полипептиди, съдържащи скъсени (по-точно срязани) HCV последователности, които мо11 гат да бъдат използвани като имунологични реагенти.
Скъсените HCV аминокиселинни последователности, кодиращи поне един вирусен епитоп, са полезни имунологични реагенти. Например, полипептиди, съдържащи такива скъсени последователности, могат да бъдат използвани като реагенти в дадено имунологично изследване. Тези полипептиди са също кандидат субединици на антигените в състав за получаване на антисерум или ваксини. Доколкото тези скъсени последователности могат да бъдат получени чрез различни познати методики, включително третиране на нативен вирусен протеин, предпочита се да се получават по синтетичен или рекомбинантен път. Полипептиди, съдържащи тези скъсени HCV последователности, могат да бъдат получени до пълната HCV последователност (един или повече епитопи, както непрекъснати, така и прекъснати) или HCV последователности и хетероложни последователности на слети протеини. Полезните хетероложни последователности включват такива, които обезпечават секретирането на рекомбинантен гостоприемник, постигат имунологичната реактивност на HCV епитопа/те/ или улесняват удвояването на полипептида с имунологична повърхност или ваксинален носител. Виж ЕРО патент 116 201, патент US 4 722 840, ЕРО 259 149, патент US 4 629 783, включени в литературната справка.
Размерът на полипептидите, обхващащи скъсените HCV последователности, може да варира широко, като минималният размер на последователност трябва да е достатъчен да подсигури HCV епитоп, докато максималният размер не е ограничен. За удобство максималният размер обикновено е не по-голям от онзи, който се изисква за обезпечаване на желаните HCV епитопи и функции на хетероложната последователност, ако има такава. Обикновено скъсената HCV последователност е с дължина от около 5 (или 8) до около 100 аминокиселини. По-типично е, обаче, HCV последователността да бъде максимум от около 50 (или 40) аминокиселини дължина, и понякога максимум от около 20, 25 или 30 аминокиселини. Обикновено е желателно да се подберат HCV последователности от поне около 8, 10, 12 или 15 аминокиселини.
Примери за скъсени аминокиселинни последователности (октамери), които са при ложими така, както е описано тук, са дадени по-долу в примерните изпълнения. Следва да се разбере, че тези пептиди не винаги точно картират даден епитоп. Неимуногенни части от последователността могат да бъдат определени с помощта на конвенционални техники и след това да бъдат делетирани от нея.
Възможно е по-нататък да бъде идентифицирана друга следваща скъсена HCV аминокиселина по метода, който вече е описан.
Полипептидни продукти, съдържащи скъсените HCV аминокиселинни последователности, могат да бъдат изготвени като дискретни пептиди или да са инкорпорирани в подълъг полипептид, и може да намерят приложение както е описано вече. В предпочитания начин на приложение скъсените последователности от Е1 и/или Е2 областите намират приложение като ваксини или терапевтични продукти. Докато в повечето случаи всяка от областите може да има някаква диагностична приложимост, С, NS3, NS4 и NS5 са специално предпочитани в комбинация на С епитопи с епитопи от един или повече от NS3, NS4 и NS5.
II.В. Получаване на полипептиди
Наличността на ДНК последователности, кодиращи HCV аминокиселинни последователности, позволява конструирането на експресионни вектори, кодиращи антигенно активни области от полипептида (Виж напр. фиг.2). Тези антигенно активни области могат да бъдат получени от антигени на обвивката или капсулата или от антигени от вътрешността, които не са структурни, включително, например полинуклеотид свързващи протеини, полинуклеотид полимерази, и други вирусни протеини, необходими за репликацията и/или съставянето на вирусната частица. Фрагменти, кодиращи желаните полипептиди, се получават, например от вирусни сДНК клонове с помощта на конвенционални начини за рестрикционно смилане или чрез синтетични методи, и се лигират към вектори, които могат например да съдържат части от слети последователности като β-галактозидаза или супероксид дисмутаза (SOD), с предпочитание към SOD. Методи и вектори, които са приложими за получаване на полипептиди, които съдържат слети последователности на SOD, са описани в ЕР публикация № 0196056, публ. на 1 октомври 1986. Вектори, кодиращи слети по12 липептиди на SOD и HCV полипептиди, като ΝΑΝΒ3, р ΝΑΝΒβι и С|003, които са кодирани в структурата на HCV сДНК, са описани в разделите IV.B.l, IV.В.2 и IV.В.4, съответно. Всяка желана част на HCV сДНК, съдържаша отворена рамка на разчитане (или нейна синтетична версия), може да бъде използвана, за да експресира рекомбинантен полипептид. като зрял или слят протеин.
Обратно, полипептид, съдържащ HCV епитопи, може да бъде получен чрез химичен синтез с помощта на стандартни техники на базата на аминокиселинната последователност от фигурите и примерите.
ДНК, кодираща желания полипептид, независимо дали е в слята или неслята форма и дали съдържа или не съдържа сигнална последователност, за да позволи секретиране, може да бъде лигирана в експресионни вектори, подходящи за всеки подходящ гостоприемник. Както еукариотните, така и прокариотните системи гостоприемници по-рано са използвани за образуване на рекомбинантни полипептиди и клетъчните линии са посочени в патент на ЕРО 318 216. Полипептидът се изолира след това от лизирани клетки или от културалната среда и се пречиства до степен, необходима за приложението му. Пречистването може да е с техники, познати в областта, например, различни екстракции, фракциониране със соли, хроматография върху йонообменна смола, афинитетна хроматография, центрофугиране и други подобни. Виж, напр. Methods in Enzymology за различните методи за пречистване на протеини. Такива полипептиди могат да бъдат използвани като диагностици, или онези, които допринасят за неутрализирането на антитела, е възможно да бъдат формирани във ваксини. Антитела, действащи срещу тези полипептиди, е възможно също да бъдат използвани като диагностици или за пасивна имунотерапия. В допълнение, както е дискутирано по-горе, антителата срещу тези полипептиди са приложими например за изолиране и идентифициране на HCV частици.
HCV полипептидите могат също да бъдат изолирани от HCV вириони и да бъдат срязани (като дотогава не са). Вирионите могат да бъдат култивирани в HCV инфектирани клетки в тъканни култури или в инфектиран гостоприемник.
II.С. Получаване на антигенни полипептиди и конюгация с носител
Антигенна област на полипептид е обикновено сравнително малка с дължина от 8 до 10 аминокиселини или по-малка. Фрагменти толкова малки, колкото 5 аминокиселини, могат да характеризират дадена антигенна област. Тези сегменти могат да съответстват на HCV антигена. Съответно с това, използвайки сДНК на HCV като база, ДНК кодиращи къси сегменти на HCV полипептиди могат да бъдат експресирани рекомбинантно както като слети протеини, така и като изолирани полипептиди. В допълнение къси аминокиселинни последователности могат удобно да бъдат получени чрез химичен синтез. В случаите, когато синтезираният полипептид е с правилна конфигурация, така че да осигури правилния епитоп, но е твърде малък, за да е имуногенен, полипептидът може да бъде присъединен към подходящ носител.
Много техники за получаване на подобни връзки биха могли да бъдат използвани и те са познати за специалистите в областта. Това са формирането на дисулфидни мостове с помощта на М-сукцинимидил-3-(2-пиридилтио)пропионат (SPDP) и сукцинимидил-4-(Ммалеимидо-метил) циклохексан-1 -карбоксилат (SMCC), получен от Pierce Comp. Rockford, Illinois, (ако в пептида липсва сулфхидрилна група, тя може да бъде доставена с добавяне на цистеинов остатък). Тези реагенти създават дисулфидни мостове между себе си и пептидните цистеинови остатъци на един протеин и една амидна връзка чрез ε-амино на лизина, или друга свободна аминогрупа в другия. Известни са различни такива дисулфид/амидформиращи агенти. Виж, напр. Immun. Rey (1982) 62:185. Други бифункционални сдвоя- I ващи агенти образуват тиоетер вместо дисул-1 фидна връзка. Много от тези тиоетер-форми-1 ращи агенти са търговски достъпни и в ключ-1 ват реактивни естери на 6-малеимидокапро-1 нова киселина, 2-бромооцетна киселина, 2-йо-1 дооцетна киселина, 4-/Ц-малеимидо-метил/I циклохексан-1-карбоксилна киселина и другиI подобни. Карбоксилните групи могат да бъдат’ активирани чрез комбинирането им със сукцинимид или 1 -хидроксил-2-нитро-4-сулфонова киселина, натриева сол. Допълнителни методи за сдвояване на антигени с помощта на ротавирус/”пептидсвързваща система” е описана в патент на ЕРО 259 149, включен в ли- j тературната справка. Посочените методи не са изчерпателно описани, като могат да бъдат използвани и други варианти и модификации на посочените съединения.
Може да бъде използван какъвто и да е носител, който сам по себе си не индуцира продуцирането на вредни за гостоприемника антитела. Подходящите носители са обикновено големи, бавно метаболизирани макромолекули, като протеините; полизахариди, агароза, целулоза, целулозни зърна и други подобни; полимерни аминокиселини, като полиглутаминова киселина, полилизин и други, аминокиселинни кополимери и инактивирани вирусни частици, виж раздел II.D. Особено полезни протеинови субстрати са серумните албумини, хемоцианин, имуноглобулинови молекули, тироглобулин, овалбумин и други протеини, добре познати на специалистите в областта.
II.D. Получаване на хибридни имуногенни частички, съдържащи HCV епитопи
Имуногенността на епитопите на HCV може да бъде постигната също чрез получаването им в дрождеви или бозайникови системи, които са слети с или комбинирани с формиращи частички протеини, като например онези, асоцииращи се с повърхностния антиген на хепатит В. Виж напр. US патент 4 722 840. Структурите, в които HCV епитопът е свързан директно към кодиращите последователности за протеина, формиращ частици, продуцират хибриди, които са имуногенни що се касае до HCV епитопа. В допълнение всички от векторите, които са получени, включват епитопи, специфични за HCV, и имат различна степен на имуногенност, например npe-S пептида. Така частици, конструирани от формиращия частици протеин, който включва HCV последователности, са имуногенни що се касае до HCV и HBV.
Хепатитният повърхностен антиген (HBSAg), както е известно, е формиран и включен в частици на S. cerevisiae (Р. Valenzuela et al. /1984/). Формирането на такива частици постига имуногенността на мономерна субединица. Структурата може също да включва имунодоминантния епитоп на HBSAg, включвайки 55-те аминокиселини на преповърхностнаTa/npe-S/област. Neurath et al. /1984/. Структурата на npe-S-HBSAg частица, експресируема в дрожди, е разкрита в патент на ЕРО 174 444 от 19 март 1986; хибриди, включващи хете роложни вирусни последователности за експресия в дрожди са разкрити в ЕРО 175 261, публ. 26 март 1966. Тези структури могат да бъдат експресирани в клетки на бозайници, например клетки от яйчник на китайски хамстер (СНО) с помощта на 8У40-дихидрофолат редуктазен вектор (Michelle et al. /1984/).
В допълнение, части от кодиращата последователност за протеина, формиращ частици, могат да бъдат заместени с кодони, кодиращи HCV епитоп. В това заместване областите, които не е задължително да медиират агрегацията на единиците за формиране на имуногенни частици, в дрожди или бозайници, могат да бъдат делетирани, като по този начин се елиминират допълнителните HBV антигенни сайтове от конкуренция с HCV епитопа.
II.Е. Получаване на ваксини
Ваксини могат да бъдат получени от един или повече имуногенни полипептиди, получени от своя страна от HCV. Тези полипептиди могат да бъдат експресирани в различни клетки-гостоприемници /напр. клетки от бактерии, дрожди, насекоми или бозайници/, или обратно, възможно е да бъдат изолирани от вирусни препарати или да са синтетично създадени. Едно-или мултивалентните ваксини срещу HCV могат да са съставени от един или повече епитопи на един или повече структурни протеини, и/или един или повече епитопи от един или повече неструктурни протеини. Тези ваксини могат да обхващат напр.рекомбинантни HCV полипептиди и/или полипептиди, изолирани от вириони. По-специално ваксините включват един или повече от следните HCV протеини, или субединици на антигени, получени от тях: El, Е2, С, NS2, NS3, NS4 и NS5. Специално предпочитани са ваксини, включващи Е1 и/или Е2, или техни субединици.
В допълнение към посоченото по-горе възможно е да се създаде и жива ваксина от атенюирани микроорганизми, които експресират един или повече рекомбинантни HCV полипептиди. Подходящи атенюирани микроорганизми са известни за специалистите в областта и включват, например вируси /като Vaccinia вируси, виж Brown et al., 1986/, a така също и бактерии.
Получаването на ваксини, които съдържат имуногенен полипептид като активен ингредиент, е известно за специалистите в областта. Обикновено такива ваксини се изготвят за инжекционно приложение, както като течни разтвори, така и като суспензии. Твърди форми, подходящи за разтваряне или суспендиране в течност преди инжектирането също могат да бъдат изготвени. Препаратите могат да бъдат емулгирани или протеинът да бъде капсулиран в липозоми. Активните имуногенни ингредиенти често се смесват с пълнители, които са фармакологично подходящи й конкуриращи с активните ингредиенти. Подходящи пълнители са например вода, сол, декстроза, глицерол, етанол и други подобни и комбинации от тях. В допълнение, по желание ваксината може да съдържа малки количества спомагателни вещества, например омокрящи или емулгиращи, буфери и/или аджуванти които повишават ефективността на ваксината. Примери за аджувантите, които могат да бъдат ефективни, са следните /без да се ограничават до тях/: алуминиев хидроокис, 1Ч-ацетил-мурамил-Е-треонил-О-изоглутамин /thr-MDP/, N-ацетил-нор.-муламил-Е-аланилD-изоглутамин /CGP 11637, отнасящ се като нор.-MDP/, М-ацетилмурамил-Е-аланил-Оизоглутаминил-Ь-аланин-2-/Г-2'-дипалмитоил-$п-глицеро-3-хидроксифосфорилокси/-етиламин/ CGP 19835А, отнасящ се като МТР-РЕ/ и RIBI, които съдържат три компонента, екстрахирани от бактерии, монофосфорил липид А, трепхалоза димиколат и скелет на клетъчни стени /MPL + TDM + CWS/ в 2% сквален /Tween“ 80 емулсия. Ефективността на аджуванта може да бъде определена чрез измерване на количеството антитела, насочено срещу имуногенен полипептид, съдържащ HCV антигенна последователност, получена в резултат от въвеждането на този полипептид във ваксини, които са включени също в различни аджуванти.
Ваксините се въвеждат конвенционално - по парентерален път, инжекционно, напр. подкожно или мускулно. Допълнителни форми, които са подходящи за други начини на въвеждане, предвиждат супозитории, и в някои случаи, орални форми. В супозиториумите, традиционните свързващи и носещи вещества могат да включват, например, полиалкилен гликоли или триглицериди; такива супозитории могат да бъдат формирани от смеси, съдържащи активни ингредиенати в интервала от 0,5% до 10%, за предпочитане 1-2%.
Оралните форми включват такива обикновени ексципиенти, например фармацевтични по качества манитол, лактоза, нишесте, магнезиев стеарат, натриев захарид, целулоза, магнезиев карбонат и други подобни. Тези състави са във форма на разтвори, суспензии, таблетки, прахове, капсули, преносими освобождаващи форми или прахове и съдържат 10-95% от активния ингредиент, за предпочитане 25-70%.
Протеините могат да бъдат включени във ваксината като неутрални или солеви форми. Фармацевтично подходящи соли са тези, включващи допълнително количество киселинни соли /формиращи три аминогрупи от пептида/ и които се формират в неорганични киселини например хидрохлорна или фосфорна киселина, или такива органични киселини като оцетна, оксалова, малеинова, тартарова и други. Соли, формирани със свободните карбоксилни групи, могат да бъдат получени също от неорганични основи например, натрий, калий, амоний, калций или железен хидроксид, както и такива органични основи като изопропиламин, триметиламин, 2-етиламино етанол, хистидин, прокаин и други подобни.
И. F. Дозиране и прилагане на ваксините
Ваксините се прилагат по начин, съобразен с дозите във формите, и в такива количества, че да е профилактично и/или терапевтично ефективна. Количеството за въвеждане, което обикновено е от 5 Ц£ до 250 μg антиген за доза, зависи от субекта на лечение, капацитета на имунната му система или синтезираните антитела и степента на желаната защита. Необходимите количества активен ингредиент за въвеждане зависят от съображенията на практикуващия и са различни за всеки субект.
Ваксината може да бъде прилагана в единична доза по схема или в повече дози също по схема. Схемата за мултиплено приложение предвижда намален курс от 1 до 10 в единични дози, последвани от други дози, давани в следващи интервали от време, необходимо за поддържане и подсилване на имунния отговор, например от 1 до 4 месеца за втората доза, и ако е необходимо, други дози след няколко месеца. Режимът на дозите ще бъде, поне отчасти, определен от необходимостта на индивида и би зависел от съображенията на лекуващия лекар.
В допълнение ваксината, съдържаща имуногенните HCV антигени, може да бъде прилагана в комбинация с други имунорегулаторни агенти, например, имуноглобулини.
II. С. получаване на антитела срещу’ HCV епитопи
Имуногенните полипептиди, описани съгласно изобретението, се използват за получаване на антитела, вкл. моноклонални и поликлонални. Ако се цели получаване на поликлонални антитела /като миши, плъхови, кози, конски и други/, подбраните животни се имунизират с имуногенен колипептид, носещ HCV епитоп/и/. Серумът от имунизираните животни се събира и третира съобразно известни процедури. Ако серумът, съдържащ поликлонални антитела срещу HCV епитоп, съдържа антитела за други антигени, поликлоналните антитела могат да бъдат пречистени чрез имуноафинитетна хроматография. Техниките за продуциране и обработване на поликлонален антисерум са известни в областта, виж напр. Mayer и Walker /1987/. Обратно, поликлоналните антитела могат да бъдат изолирани от бозайници, които преди това са били инфектирани с HCV.
Моноклоналните антитела, насочени срещу HCV епитопи, могат да бъдат получени от специалиста в областта. Основната методология за получаване на моноклонални антитела чрез хибридоми е добре известна. Важни антитяло продуциращи клетъчни линии могат да бъдат създадени чрез фузия на клетки, а също и чрез други техники като директна трансформация на В лимфоцити с онкогенна ДНК, или трансфекция с вируса на Epstein-Barr. Виж, напр. M.Schreier et al. /1980/, Hammerfing et al., /1981/, Kennet et al., /1980/, виж също US патент №№ 4 341 761, 4 399 121, 4 427 783. 4 444 887, 4 466 917, 4 472 500, 4 491 632 и 4 493 890, Моноклоналните антитела, продуцирани срещу HCV епитопите може да бъде скринирани за различни свойства, като напр. изотип, афинитет на епитопа и други.
Антитела, както моноклонални, така и поликлонални, които са насочени срещу HCV епитопи, са специално приложими в диагностиката, а онези, които са неутрализиращи, са приложими в пасивната имунотерапия. Моноклонални антитела могат да бъдат използвани и за получаване на антиидиотипните антитела.
Антиидиотипните антитела са имуноглобулини, които носят “вътрешен имидж” на антигена от инфекционния агент, срещу който е желана защита. Виж напр. Nisonoff, А., et al., /1981/ и Dreesman et al., /1985/. Техниките за получаване на антиидиотипни антитела са известни в областта, виж, напр. Crzych /1985/, MacNamara et al. /1984/ и Vytdehaag et al. /1985/. Тези антиидиотипни антитела могат също така да бъдат използвани за лечение, ваксиниране и/или диагностика на NANBH, както и за изясняване на имуногенните области на HCV антигените.
II. Н. Имуноизследване и диагностични комплекти
Полипептидите и антителата съгласно изобретението са приложими за откриване на присъствието на HCV антитела или присъствието на вируса, или HCV полипептиди /или епитопи/ в например биологични проби. Схемата на имунноизследването е обект на множество вариации, като са познати много форми за специалистите. Имунноизследването използва поне един вирусен епитоп, получен от HCV. В едно изпълнение имунноизследването съдържа комбинация от вирусни епитопи, получени от HCV. Тези епитопи могат да бъдат получени от различни вирусни полипептиди и могат да са в различни рекомбинантни или природни полипептиди, или заедно в същите рекомбинантни полипептиди. Едно имуноизследване може да използва например моноклонално антитяло, насочено срещу вирусни епитопи, комбинация от моноклонални антитела, насочена срещу епитопите на един вирусен антиген, моноклонални антитела, насочени срещу епитопите от един вирусен антиген, многоклонални антитела, насочени срещу епитопите от различни вирусни антигени, поликлонални антитела, насочени срещу различни вирусни антигени, методиката може да се базира например на конкурентни или насочени реакции, или изследвания от типа сандвич. Методиките могат също например да използват твърд носител или имунопреципитация. Повечето от изследванията използват белязани антитела или полипептиди. Маркерите могат да бъдат например, ензимни, флуоресцентни, хемилуминисцентни, радиоактивни или оцветяващи молекули. Изследвания, които засилват сигналите от пробата, също са познати, примери за които са изследвания, използващи биотин и авидин и ензимбелязани и медиирани имунопроби, като
ELISA /описани по-рано/.
Обикновено едно изследване за антиHCV антитела включва подбор и изготвяне на тестови проби, за които се счита че съдържат антителата, например биологична проба, след това се инкубират с антигетет /т.е. съдържащ епитоп/ HCV полипептид при условия, позволяващи формирането на комплекси антигенантитяло, и след това откриване формираните комплекси. Подходящите условия за инкубация са добре известни на специалистите. Имунноизследването може да бъде без ограничения, в хетерогенна или хомогенна форма и от стандартен или конкурентен тип.
В хетерогенната си форма полипептидът е обикновено свързан с твърд носител, за да улесни разделянето на пробата от полипептида след инокулацията. Примери за твърди носители, които могат да бъдат използвани, са нитроцелулоза, например в мембранна или микротитърни блюда с ямки, поливинил хлорид като лист или микротитърни кладенчета, полистиренов латекс, например перли или микротитърни панични, поливинил флуорид. известен като ImmulonR, диазотирана хартия, найлонова мембрана, активирани перли и протеин А перли. Например Dynatech ImmulonR 1 или ImmulonR 2 микротитърни панички или 0,25-инчови полистиренови перли /Precision Plastic Ball/ могат да бъдат използвани за хетерогенната форма. Твърдите носители, съдържащи антигенния полипептид, обикновено се промиват след разделянето от тестовите проби и преди определянето на свързаните антитела. Както стандартните, така и конкурентните форми, са известни за специалистите.
В хомогенната форма тестовите проби се инкубират с антиген в разтвор. Например това може да стане при условия, които да доведат до утаяване на всеки образуван комплекс антиген-антитяло, както стандартните, така и конкурентните форми, са известни са специалистите в областта.
В стандартната форма количеството на антителата, образуващи комплекса антитялоантиген, може да се наблюдава директно, това може да се осъществи чрез определяне дали белязаните анти-ксеногенни (античовешки) антитела, които разпознават епитоп от антиHCV антителата, ще се свържат благодарение на образуването на комплекси. В конкурентната форма количеството на HCV антителата в пробата се определя дедуктивно чрез наблюдаване ефекта на конкуренция при свързването на известно количество от белязаното антитяло или други конкуриращи лиганди в комплекса.
Комплексите, в които при образуването им е включено анти-HCV антитяло или в случаите на конкурентно изпитване на количеството от конкурентно антитяло, се определят по която и да е от познатите техники, в зависимост от формата. Например, набелязани HCV антитела в комплекса могат да бъдат открити с помощта на конюгат на антиксеногенен Ig, свързан в комплекс с маркер, например ензимен маркер.
В имунологичните изпитания, при които HCV полипептиди са подложени на анализ, тестовата проба, обикновено биологична проба, се инкубира с анти-HCV антитела при условия, които да позволят формирането на комплекси антиген-антитяло. Могат да бъдат използвани различни форми, например сандвичпроба, в която антитяло, прикрепено към твърд носител, се инкубира с тестовата проба, промива се, инкубира се с второ белязано антитяло за анализ и носителят се промива отново. Анализираното вещество се открива чрез определяне дали второто антитяло е свързано с носителя. В конкурентната форма, която може да бъде както хетерогенна, така и хомогенна, тестовата проба обикновено се инкубира с антитяло и се маркира, а конкуриращият антиген също се инкубира както последователно, така и едновременно. Тези и други форми са добре познати на специалистите в областта.
Ефективни системи за откриване на HCV инфекции са тези, които включват употребата на пластини от епитопи, както е описано погоре. Епитопите в пластината могат да бъдат конструирани в един или мулти пептиди. Изпитването на вариращите епитопи може да е последователно или едновременно.
Ензимсвързващ имуносорбентен тест /ELISA/ може да бъде използван за измерване концентрацията както на антигена, така и на антитялото. Този метод е в зависимост от конюгацията на даден ензим с антиген или антитяло и използва свързаната ензимна активност като количествена мярка. За измерване на антитялото познатият антиген се фиксира към твърда фаза /като микроблюдо или пластмасова чаша/, инкубира се с тест серумно разреждане, промива се, инкубира се с антиимунноглобулин, белязан с ензим, и отново се промива. Ензимите, подходящи за маркиране, са известни на специалистите и включват например пероксидаза от хрян. Ензимната активност се измерва чрез добавяне на специфични субстрати и се определя формираният продукт или асимилираният субстрат по колориметричен начин. Степента на активност е директна функция на количеството на антитялото.
За да се измери антиген, известно специфично антитяло се фиксира към твърда фаза, добавя се тестуваният материал, съдържащ антиген, след инкубация твърдата фаза се промива и се добавя второ ензимно маркирано антитяло. След промиване се добавя субстрат, ензимната активност се оценява колориметрично и се свързва с концентрацията на антигена. Подходящите за имунодиагностика комплекти, съдържащи подходящите белязани реагенти, са конструирани чрез опаковане в подходящи материали, включително полипептиди от изобретението, съдържащи HCV епитопи или антитела, срещу HCV епитопи в подходящи контейнери, заедно с постоянните реагенти и материали, необходими за осъществяване на изследването, както и инструкции за провеждане на изследването.
III. Основни методи
Основните методи, използвани в практиката на настоящото изобретение, могат да бъдат намерени например в приложената литературна справка, по-специално в патенти на ЕРО 318 216 и 388 232.
Примери за изпълнение на изобретението
Примерите поясняват изобретението, без да го ограничават. В светлината на изложеното за специалиста в областта биха били очевидни множество примерни изпълнения в рамките на предявените патентни претенции.
V. Картиране на епитопите от HCV генома
Следващите примери са резултат от картирането на епитопите в експеримент, проведен с HCV 1 полипротеинова последователност, показана на фиг. 1. Както е показано на фигурите от 3 до 11, налице е хетерогенност сред
HCV изолатите, показваща, че тези замествания на аминокиселините може да бъдат осъществени в октамера, описан по-долу. Като допълнение към заместванията с аминокиселини от съответстващи локализации в други HCV изолати, замествания със синтетични аналози на специфични аминокиселини или консервативни замествания на базата на заряда, по-специално, когато заместването не разрушава свързването на антитялото, са в обхвата на изобретението.
IV. А.1. Синтез на препокриващи се пептиди
Полиетиленови игли, оформени в блок с размер 8 х 12 /Coselco Mimetopes, Victoria, Australia/, се приготвят чрез поставянето им в баня /20% об./об. пиперидин в диметилформамид /DMF/ 30 за min на стайна температура. След това полиетиленовите игли се отстраняват, промиват се с DMF за 5 min, промиват се в метанол четирикратно /2 min/ промиване/, оставят се да изсъхнат на въздуха за поне 10 min, след което се промиват за последен път в DMF /5 min/. 1-хидроксибензотриазол /HOBt, 367 mg/ се разтваря в DMF /80 ml/ за използване при сдвояването на Fmoc-защитените аминокиселина: Fmoc-L-AlaOPfp, Fmoc-L-Cys/Trt/-OPfp, Fmoc-L-Asp/0tBu/-OPfp, Fmoc-L-Clu/0-tBu/-OPfp, Fmoc-LPhe-OPfp, Fmoc-Cly-OPfp, Fmoc-L-His/Boc/OPfp, Fmoc-L-Ile-OPfp, Fmoc-L-Lys/Bos/OPfp, Fmoc-L-Leu-OPfp, Fmoc-L-Met-OPfp, Fmoc-L-Asn-OPfp, Fmoc-L-Pro-OPfp, Fmoc-LGlu-OPfp, Fmoc-L-Arg/Mtr/-OPfp, Fmoc-LSer/t-Bu/-ODhbt, Fmoc-L-Ther/t-Bu/-ODlbt, Fmoc-L-Val-OPfp и Fmoc-L-Tvr-OPfp.
Защитените аминокиселини се поставят в микротитърни панички с HOBt и игличките се потапят в ямките, след което се оставят да реагират на 25°С за 18 h. Игличките се промиват с DMF /2 min/, MeOH /4x2 min/ и отново с DMF /2 min/ за промиване и отстраняване на защитените групи на свързаните аминокиселини. Процедурата се повтаря за всяко допълнително сдвояване на аминокиселини, докато се получат всички октамери.
Свободните N-краища след това се ацетилират, за да се компенсира свободният амид, тъй като повечето епитопи не се откриват при N-края и поради това нямат понижен заряд. Ацетилирането се съпровожда със запълване на ямките от микротитърната панич18 ка с DMF /оцетен анхидрид/ триетиламин/ 5:2:1 V/V/V, което позволява на игличките да реагират в ямките за 90 min при 20°С. След това те се промиват с DMF /2 min/ и МеОН /4x2 min/, изсушават се на въздуха за поне 10 min.
Защитните групи от страничните вериги се отстраняват чрез третиране с флуорооцетна киселина /фенол/ дитиоетан /95: 2,5:2,5/ /V/V/ в полипропиленови торби за 4 h при стайна температура. След това игличките се промиват в дихлорометан /2x2 min/, 5% ди-изопропилетиламин/дихлорометан /2 х 5 min/, дихлорометан /5 min/ и се изсушават на въздуха за 10 min. След това игличките се промиват с вода /2 min/, МеОН /18 h/, сушат се под вакуум и се съхраняват в пластмасови торби върху силикагел.
IV. А.2. Изследване на пептиди
Носещите октамери иглички, изготвени, както е описано по-горе, най-напред се третират с ултразвук за 30 min в буфер за разрушаване /1% натриев додецил сулфат, 0,1% 2меркаптоетанол, 0,1 М NaH2PO4 на 60°С. След това игличките се потапят във вода /60°С/, варят се в МеОН /2 min/ и се оставят да се изсушат на въздуха. Игличките след това се покриват отново за 1 h при 25°С в микротитьрни ямки, съдържащи 200 μΐ блокиращ буфер /1% овалбумин, 1% BSA, 0,1% Туин и 0,05% NaN3 в PBS/ при разклащане. След това игличките се потапят в микротитърни ямки, съдържащи 175 μΐ антисерум, получен от хора, диагностицирани като носители на HCV, и се оставят да се инкубират на 4®С за една нощ. След това игличките се изпитват срещу антисерум от три различни пациента. Проба # РАА 3663 /”А”/, проявяваща силна реактивност към HCV Western blott, HCV конкурентна ELISA, HCV ELISA към клон C100-3 /при 1:1000 разреждане/ и RIBA отговори от > 4 + до С100, 5-1-1, и СЗЗс /С22 не се дава/. /Антигенните клонове са същите, както са дадени в патентите на ЕРО 318 216, 388 232, както онези, описани в литературата, отнасяща се до HCV имунологични изпитвания, предоставени от Ortho Diagnostic System, Inc./. Heразредената плазма се разрежда 1:500 в блокиращ буфер. Проба #РАА 33028 /”В”/, проявяваща силна реактивност при Vestem blott.
HCV конкурентна ELISA, HCV ELISA за клон C100-3 /при 1:500 разреждане/ и RIBA отговори от > 4 + С100, 5-1-1, СЗЗС и С22. Поликлонален антисерум се пречиства на части чрез пропускане през колона с протеин А и се използва при разреждане от 1:200 в блокиращ буфер. Проба #РАА 32931 /”С”/ проявява умерена реактивност към HCV Vestern blott /3+/, HCV конкурентна ELISA, HCV ELISA към клон C100-3 /при разреждане 1:64/ и RIBA отговори от 3+ и 4+ до С100 и 5-1-1, съответно /СЗЗс и С22 не са дадени/. Поликлонален антисерум се пречиства на части чрез пропускане през колона с протеин А и се използва при разреждане 1:500 в блокиращ буфер.
Игличките се промиват с PBS/Tween 20 /4 х 10 min/ на стайна температура, след което се инкубират в микротитърни ямки, съдържащи пероксидаза от хрян-белязан кози античовешки Ig антисерум /175 μΐ, 1:2000 разреждане в блокиращ буфер без NaN3/ за един час при 25°С с разклащане. Античовешкият антисерум е специфичен за човешки Ig леки и тежки вериги, и реагира с IgG и IgM-класове. Игличките отново се промиват в PBS /Tween 20 /4 х 10 min/ на стайна температура. Приготвя се субстратен разтвор чрез разреждане на NaH2PO4 /1М, 200 ml/ и лимонена киселина /1М, 160 ml/ до 2 1 с дистилирана вода, довеждайки pH до 4,0. Азино-З-етилбензтиазодинсулафонат /ABTS, 50 mg/ и хидроген перокси /0,3 Ι/ml/ се добавя към 100 ml буфер, непосредствено преди използването за допълване на субстратния разтвор. Субстратният разтвор /150 μΐ/ след това се прибавя към всяка ямка от микротитърната паничка, игличките се потапят в ямките и се инкубират при 25°С на тъмно. След появяване на оцветяването реакцията се прекратява чрез отстраняване на игличките и абсорбцията на разтворите се отчита при 405 nm.
Изброените по-нататък октамери са имунореактивни с анти-HCV антисерум. Пептидите, реагиращи с всичките три антисерума, са изброени като епитопи, докато пептидите, реагиращи само с един или два антисерума, са посочени като слаби епитопи /означени с “-“/. Силните епитопи са маркирани с букви, вместо с номера /напр. ЕрАА/.
AA# последователност AA# последователност
23 KEPGGGQA 87 GNEGCGWA
24 EPGGGQAV Ep2
25 PGGGQAVG 88 NEGCGWAG
26 GGGQAVGG 89 EGCGWAGW
27 GGQAVGGV 90 GCGWAGWL
28 GQAVGGVY 91 CGWAGWLL
29 QAVGGVYL - 92 GWAGWLLS
30 AVGGVYLL 93 WAGWLLSP
31 VGGVYLLP 94 AGWLLSPR
32 GGVYLLPR 95 GWLLSPRG
33 GVYLLPRR 96 WLLSPRGS
34 VYLLPRRG 97 LLSPRGSR
35 YLLPRRGP 98 LSPRGSRP
36 LLPRRGPR 99 SPRGSRPS
66 PKARRPEG Epl 100 PRGSRPSW Ep3
67 KARRPEGR 101 RGSRPSWG
68 ARRPEGRT 102 GSRPSWGP
69 RRPEGRTW 103 SRPSWGPT
70 RPEGRTWA
71 PEGRTWAQ 186 TVPASAYQ Ep4
72 EGRTWAQP 187 VPASAYQV
73 GRTWAQPG EpA 188 PASAYQVR
74 RTWAQPGY 189 ASAYQVRN
75 TWAQPGYP 190 SAYQVRNS
76 WAQPGYPW 191 AYQVRNST
77 AQPGYPWP
78 QPGYPWPL 206 DCPNSSIV -
79 PGYPWPLG
80 GYPWPLYG 223 TPGCVPCV -
81 YPWPLYGN
82 PWPLYGNE 232 EGNASRCW Ep5
83 WPLYGNEG
84 PLYGNEGC 256 TQLRRHID -
85 LYGNEGCG
86 YGNEGCGW 286 LVGQLFTF ~
297 RHWTTQGC Ep6
298 HWTTQGCN
299 WTTQGCNC
321 MMMNWSPI -
347 DMIAGAHW Ep7
357 LAGIAYFS Ep8
AA# последователност AA# последователност
413 UNTNGSW EpB 594 YSRCGSGP FA
414 INTNGSWH 595 SRCGSGPW
596 RCGSGPWL
432 SLNTGWLA - 597 CGSGPWLT
598 GSGPWLTP
465 FDQGWGPI EpC 599 SGPWLTPR
466 DQGWGPIS 600 GPWLTPRC
467 QGWGPISY 601 PWLTPRCL
468 GWGPISYA 602 WLTPRCLV
469 WGPISYAN 603 LTPRCLVD EpF
470 GPISYANG 604 TPRCLVDY
471 HSYANGS 605 PRCLVDYP
606 RCLVDYPY
480 PDQRPYCW EpD 607 CLVDYPYR
481 DQRPYCWH 608 LVDYPYRL
482 QRPYCWHY 609 VDYPYRLW
483 RPYCWHYP 610 DYPYRLWH
484 PYCWHYPP 611 YPYRLWHYF,
612 PYRLWHYP
500 KSVCGPVY Ep9 613 YRLWHYPC
501 SVCGPVYC
502 VCGPVYCE 641 EAACNWTR
Epl2
521 RSGAPTYS EplO
662 LSPLLLH Epl3
540 NNTRPPLG EpE 663 SPI.TJJTT
541 NTRPPLGN 664 ΡΤΤΤΠΤΩ
542 TRPPLGNW 665 LLLHIQW
543 RPPLGNWF
544 PPLGNWFG 685 LSTGLIHL -
545 PLGNWFGC
546 LGNWFGCT 705 VGSSIASW ~
547 GNWFGCTW 706 GSSIASWA
548 NWFGCTWM
549 WFGCTWMN 729 ARVCSCIW Epl4
579 LHCPTDCF - 782 WVPGAVYT
EpG
783 VPGAVYTF
784 PGAVYTFY
785 GAVYTFYG
786 AVYTFYGM
787 VYTFYGMW
788 YTFYGMWP
789 TFYGMWPL
801 LALPQRAY 21
AA# последователност
AA# последователност
851 RVEAQLHV EpH 1384 VIKGGRHL Ep20
852 VEAQLHVW
853 EAQLHVWI 1410 LGINAVAY Ep21
854 AQLHVWIP 1411 GENAVAYY
855 QLHVWIPP
1454 CNTCVIQT -
893 LAVFGPLW -
1492 GRGKPGIY Ep22
916 QGLLRFCA ~ 1493 RGKPGIYR
928 MIGGHYVQ Ep 15 1532 PAETTVRL Ep23
1533 AETTVRLR
946 TGTYVYNH Epi 1534 ETTVRLRA
1535 TTVRLRAY
952 NHLTPLRD EpJ
953 HLTPLRDW 1560 GVFIGLIH Ep24
954 LTPLRDWA 1561 VFIGUHI
1026 LAPITAYA - 1581 ENLPYLVA
Ep25
1072 TCINGVCW EpK 1567 NLPYLVAY
1568 LPYLVAYQ
1109 LVGWPAPQ Epl6 1569 PYLVAYQA
1570 YLVAYQAT
1171 CPAGHAVG Epl7 1571 LVAYQATV
1113 PAGHAVGI 1572 VAYQATVC
1114 AGHAVGIF 1573 AYQATVCA
1115 GHAVGEFR 1574 YQATVCAR
1116 HAVGIFRA 1575 QATVCARQ
1117 AVGIFRAA 1576 ATVCARQA
1577 TVCARQAP
1218 WPQSEQV EpL
1601 PPSWDQMW
1240 VPAAYAAQ - Ep26
1602 PSWDQMWK
1260 ATLGFGAY - 1603 SWDQMWKC
- 1604 WDQMWKCL
1280 GVRITTGS Epl 8 1605 DQMWKCU
1281 VRTTTGSP 1606 QMWKCLER
1282 RITTGSPI 1607 MWKCLTRL
1283 ITTGSPIT
1284 TTGSPTTY 1615 KPTLHGPI Ep27
1285 TGSPITYG 1616 PILHGPIP
1617 TLHGPIPL
1322 DATSILGI - 1618 LHGPEPLL
1619 HGPEPLLY
1338 TAGARLW - 1620 GPLPLLYR
1371 GEIPFYGK Epl 9 1655 WTSTWVL -
AA# последователност AA# последователност
1694 UPDREVL ЕрМ 1966 SECTIPCS EpS
1695 IPDREVLY 1967 ECTIPCSG
1968 CTIPCSGS
1710 ECSQHLPY EpN 1969 HPCSGSW
1711 CSQHLPYI
1712 SQHLPYIE 1999 LMPQLPGIEpT
2000 MPQLPGIP
1728 EKQKALGLEpO 2001 PQLPGIPE
1729 KQKALGLL 2002 QLPGIPEV
2003 LPGIPEVS
1758 EIEWAKLM EpP 2004 PGIPEVSC
1759 EEWAKLMW 2005 GIPEVSCQ
1760 EWAKLMWN 2006 IPEVSCQR
1761 WAKLMWNE 2007 PEVSCQRG
1762 AKLMWNEI 2008 EVSCQRGY
2009 VSCQRGYK
1781 LPGNPA1A - 2010 SCQRGYKG
2011 CQRGYKGV
1808 LFNELGGW Ep28 2012 QRGYKGVW
2013 RGYKGVWR
1821 AAPGAATA - 2014 GYKGVWRG
1851 ILAGYGAG Ep29 2024 IMHTRCHC
Ep31
1880 VNLLPAIL -
2048 VGPRICRN EpU
1908 PGEGAVQW EpG 2049 GPRICRNY
1909 GEGAVQWM 2050 PRICRNYW
1910 EGAVQWMN 2051 RICRNYWS
1911 GAVQWMNR 2052 ICRNYWSG
1912 AVQWMNRL 2053 CRNYWSGT
1913 VQWMNRLI 2054 RNYWSGTE
2055 NYWSGTEP
1925 RGNHVSPI EpR 2056 YWSGTEPI
2057 WSGTEPIN
1940 AAARVTAI Ep30
1941 AARVTAIL 2071 TPLPAPNY Ep32
1942 AR VTAILS
1943 RVTAILSS 2088 EEYVLRQV EpV
1944 VTATLSSL 2089 EYVIRQVG
1945 TAELSSLV 2090 YVIRQVGD
1946 AILSSLVT 2091 VIRQVGDF
1947 ILSSLVTQ 2092 ERQVGDFH
1948 LSSLVTQL 2093 RQVGDFHY
1949 SSLVTQLL
1950 SLVTQLLR 2108 DNLKCPCQ -
1951 LVTQULRR
AA# последователност
AA# последователност
2122 EELDGVREpW 2280 REAQALPV EpZ
2123 IELDGVRL 2281 EAQALPVW
2124 ELDGVRLH 2282 AQ ALP VW A
2125 LDGVRLHR 2283 QALPVWAR
2126 DGVRLHRF 2284 ALP VW ARP
2127 GVRLHRFA 2285 LPVWARPD
2128 VRLHRFAP 2286 PVWARPDY
2129 RLHRFAPP 2287 VWARPDYN
2130 LHRFAPPC 2288 WARPDYNP
2131 HRFAPPCK 2289 ARPDYNPP
2132 RFAPPCKP 2290 RPDYNPPL
2133 FAPPCKPL
2134 APPCKPLL 2325 PPPRKKRT Ep35
2135 PPCKPLLR 2326 PPRKKRTV
2136 PCKPLLRE 2327 PRKKRTW
2137 CKPLLREE
2138 KPLLREEV 2345 AELASRSE Ep36
2139 PLLREEVS 2346 ELASRSEG
2140 LLREEVSF EpX 2347 LASRSEGS
2141 LREEVSFR 2348 ASRSEGSS
2142 REEVSFRV 2349 SRSEGSSS
2143 EEVSFRVG
2144 EVSFRVGL 2382 AESYSSMP Ep37
2145 VSFRVGLH
2146 SFRVGLHE 2401 SDGSWSTV
2147 FRVGLHEY Ep38
2148 RVGLHEYP 2417 WCCSMSY
2165 EPEPDVAV - EpAA 2418 VCCSMSYW
2187 GRRLARGS - 2419 CCSMSYWI
2420 CSMSYWIG
2226 UEANLLWEpY 2421 SMSYWIGA
2227 IEANLLWR 2422 MSYWIGAL
2228 EANLLWRQ
2229 ANLLWRQE
2230 NLLWRQEM
2231 LLWRQEMG
2232 LWRQEMGG
2244 VESENKW Ep33
2245 ESENKWI
2246 SENKWIL
2247 ENKWILD
2248 NKWILDS
2249 KWELDSF
2250 WILDS FD
2267 EISVPAH Ep34
AA# последователност
AA# последователност
2439 QKLPINAL ΕρΒΒ 2602 LPLAVMGS
2440 KLPINALS EpDD
2441 LPINALSN 2603 PLAVMGSS
2442 PINALSNS 2604 LAVMGSSY
2443 INALSNSL 2605 AVMGSSYG
2444 NALSNSLL 2606 VMGSSYGE
2445 ALSNSLLR 2607 MGSSYGEQ
2446 LSNSLLRH 2608 GSSYGEQR
2447 SNSLLRHH 2609 SSYGEQRV
2448 NSLLRHHN 2610 SYGEQRVE
2449 SLLRHHNL 2611 YGEQRVEE
2450 LLRHHNLV 2612 GEQRVEEL
2451 LRHHNLVY
2452 RHHNLVYS 2632 KTPMGFSY
2453 HHNLVYST Ep41
2454 HNLVYSTI 2633 TPMGFSYD
2455 NLVYSTIS 2634 PMGFSYDT
2456 LVYSTISR 2635 MGFSYDTR
2636 GFSYDTRC
2469 QKKVTFDR Ep39 2637 FSYDTRCE
2470 KKVTFDRL 2638 SYDTRCED
2471 KVTFDRLQ
2472 VTFDRLQV 2660 YQCCDLDP -
2473 TTDRLQVL
2474 FDRLQVLD 2676 LTERLYVG
2475 DRLQVLDS EpEE
2476 RLQVLDSH 2677 IERLYVGG
2678 ERLYVGGP
2495 ASKVKANL - 2679 RLYVGGPL
2533 RKAVTHIN EpCC 2688 NSRGENCG
2534 KAVTHINS EpFF
2689 SRGENCGY
2573 GRKPARU Ep40 2690 RGENCGYR
2574 RKPARUV 2691 GENCGYRR
2575 KPARLIVF 2692 ENCGYRRC
2576 PARUVFP 2693 NCGYRRCR
2577 ARLIVFPD
2578 RLTVFPDL 2707 TSCGNTLI Ep42
2721 AACRAAGL -
2757 AFTEAMTR
Ep43
2758 FTEAMTRY
2759 TEAMTRYS
2760 EAMTRYSA
2761 AMTRYSAP
2762 MTRYSAPP
AA# последователност
AA# последователност
Ep45
EpGG
2779 DI.ElJISC Ep44 2878 DLPPHQR Ep47
2780 i reuses 2879 LPPIIQRL
2880 PPHQRLH
2794 HDGAGKRV 2881 PIIQRLHG
2882 HQRLHGL
2795 DGAGKRVY 2883 IQRLHGLS
2796 GAGKRVYY 2884 QRLHGLSA
2797 AGKRVYYL 2885 RLHGLSAF
2798 GKRVYYLT 2886 LHGLSAFS
2799 KRVYYLTR 2887 HGLSAFSL
2800 RVYYLTRD 2888 GLSAFSLH
2801 VYYLTRDP 2889 LSAFSLHS
2802 YYLTRDPT 2890 SAFSLHSY
2891 AFSLHSYS
2817 WETARHTP 2892 FSLHSYSP
2893 SLHSYSPG
2818 ETARHTPV 2894 LHSYSPGE
2819 TARHTPVN 2895 HSYSPGH
2820 ARHTPVNS 2912 LGVPPLRA
2821 RHTPVNSW 2913 GVPPLRAW
2822 HTPVNSWL
2823 TPVNSWLG 2914 VPPLRAW R
2824 PVNSWLGN 2938 AAICGKYL
2825 VNSWLGNI 2939 A1CGKYLE
2826 NSWLGNU 2940 ICGKYLEN
2827 SWLGNIIM 2966 DLSGWETA
2828 WLGNUME EpHH
2829 LGNUMEA VSHARPRW
2830 GNHMEAP 2984
2831 ΝΠΜΕΑΡΤ
2832 DMEAPTL
2833 IMEAPTLW
2834 MEAPTLWA
2835 EAPTLWAR
2836 APTLWARM
2837 PTLWARMI
2838 TLWARMIL
2839 LWARMILM
2840 WARMHMT
2841 ARMILMTH
2842 RMELMTHF
2843 MILM IHEb
2863 LDCEIYGA Ep46
2864 DCEIYGAC
2865 CETYGACY
2866 EIYGACYS
2867 IYGACYS1
Ep48
Ep49
Epi I
IV. В. Диференциално изследване
Следващото изследване се провежда, за да бъдат отличени ранните антигени от покъсните. Антителата срещу ранните антигени могат да бъдат открити и използвани за диагностициране на HCV инфекцията много побързо.
Няколко кръвни проби са получени от хора с повишени стойности на ALT,но отрицателни за анти-С 100-3 антитяло. Пет кръвни проби, получени преди пълната сероконверсия /С100-3 позитивно/, се използват за изследване при разреждане 1:2000. Изследването се провежда, както е описано в раздел IV.А. по горе. Успоредно с това, се провежда инкубиране на дубликат от иглички с пероксидазно белязан кози анти-човешки IgM специфичен антисерум. Епитопите, имунореактивни с IgM антитела, са равни епитопи.
Резултатите показват, че най-ранните епитопи са намерени в областта, отстояща на около аминокиселина 480 от аминокиселина 650. Изключително силни епитопи са октамери с начало аминокиселини с номера 506, 510, 523, 553,562, 580 и областта от 590 до 620. Изследвания, които използват антигени, носещи епитопи от тази област, позволяват диагностициране на HCV инфекция на един ранен етап, в сравнение с изследвания, използващи други антигени.
Допълнително са изследвани серия от плазмени проби, взети от петима пациенти, страдащи от пострансфузионен NANB хепатит, които изследвания се провеждат от 3 до 12 години. Първите данни от кръвни проби се вземат по-малко от веднъж седмично. Всяка проба се тестува за IgG и IgM чрез ELA срещу един антиген от сърцевината /С22/, два повърхностни антигена /Е1 и Е2/ и три антигена от неструктурни области /СЗЗс, С100/ и NS5/. Установи се, че IgM отговорът на С22 и СЗЗс предшества IgG отговора за тези антигени. NS-5 също индуцира IgM отговор, на този отговор не предшества IgM отговора за този антиген. Така, може да се приготви проба, способна да определи много ранен етап от инфекцията, чрез използване на епитопи, получени от С22 и СЗЗс области и изпитване на IgM свързване. Антитела срещу СЗЗс областта се съхраняват за много дълъг период от време, което предполага, че диагностични проби, насочени срещу СЗЗс биха били най надеждни.
IV. С. Секвенционни-варианти в HCV изолати от различни индивиди.
Изолати от HCV, които съдържат последователности, отклоняващи се от CDC/HCV1, са идентифицирани у хора, някои от които са серологично познати за анти-С 100-3 антитела /ЕС10 е антитяло негативен/. Идентифицирането на тези нови изолати се съпътства от клониране и секневиране на сегменти от HCV генома, които са амплифицирани чрез PCR техника с помощта на CDC/HC1 последователности. Методът използва праймери и проби, основани на HCV сДНК последователностите, описани тук. Първият етап в метода е синтезът на сДНК за всеки от HCV генома или неговия репликативен заместител с помощта на обратна транскриптаза. След синтеза на HCV сДНК и преди амплификацията РНК в пробата се разгражда по познати методи. Разграденият сегмент от HCV сДНК след това се амплифицира чрез използването на подходящи праймери. Амплифицираните последователности се клонират и клоновете, съдържащи амплифицираните последователности, се откриват с проба, която е комплементарна на последователността, която лежи между праймерите, но не се припокрива с тях.
IV.C.1. Н С V изолати, изолирани от хора в САЩ
Кръвните проби, които са използвани като източник на HCV вириони, са получени от American Red Goss in Charlotte, North Carolina и от Community Blood Center of Kansas, Kansas City, Missouri.
Пробите се скринират за антитела срещу HCV С100-3 антиген с помощта на ELISA изследване и се подлагат на Western ЬюП анализ с помощта на кози анти-човешки KRP за измерване на анти-HCV антитела. Две проби #23 и #27 от American Red Cross и от Community Blood Center, съответно се определят като HCV позитивни съгласно това изследване.
Вирусните частички, намиращи се в серума от тези проби, се изолират чрез ултрацентрофугиране при условията, описани от Bradeley et al. /1985/. РНК се екстрахира от частичките чрез разграждане с протеиназа К и SDS при крайна концентрация 10gg/ml протеиназа К и 0,1 % SDS; разграждането се осъществява 1 h при 37°С. Вирусната РНК понататък се пречиства чрез екстракция с хло27 роформ-фенол.
HCV РНК от препарата на РНК се транскрибира обратно в сДНК. След като се синтезират двете вериги на сДНК, получената сДНК се амплифицира по PCR метода. HCV 5 сДНК-те в три клона, получени от всеки HCV изолат, се подлага на секвенционен анализ. Анализът се провежда главно чрез метода, описан от Chen и Seeburg /1985/.
Консенсус последователности от 10 клоновете, получени от HCV в пробите 23 и 27, са показани на фигурите 3 и 4, съответно. Променливите последователности също са показани на тези фигури, доколкото са аминокиселини, кодирани в консенсус последовател- 15 ности.
Фигури 5 и 6 изобразяват сравнение на позитивните вериги на нукелотидните последователности /фиг.5/ и предполагаемите аминокиселинни последователности /фиг.6/ от 20 пробите 23,27 и HCV1. Аминокиселинните последоавтелности от НСVI на фиг.6 представят аминокиселинните с номера 129-467 от HCV полипротеина, кодиран от голямата OPF в HCV геномната РНК. Изучаването на фиг.5 и фиг.6 показва, че има вариации в последователностите на трите изолирани клона. Вариациите в последователностите на нуклеотидно ниво и на аминокиселинно ниво са обобщени на таблицата, която следва непосредствено подолу. В таблицата полипептидите, означени като S и NS1, представят аминокиселинните номера от 130 до 380 и от 380 до 470, съответно, като тези домени са известни от литературата. Номерацията е от предполагаемия иницииращ метоинин. Наименованието S и NS1 се основава на позиционирането на последователностите, кодиращи полипептидите, с помощта на модела на Flavivirus. Както е посочено по-рано, последните доказателства показват, че няма пълна корелация между HCV и Fravivirus по отношение на вирусните полипептидни домени, по-специално в предполагаемите E/NS1 домени. Наистина, HCV полипептидите и техните кодиращи домени могат да показват съществени отклонения от модела на Flavivirus.
Таблица
Хомоложност на последователностите в %
цялата S NS1 цялата S NS1
HCV1/HCV23 93 95 91 92 95 87
HCV1/HCV27 89 93 84 89 95 82
HCV23/HCV27 89 93 85 90 93 84
Независимо че са налице вариации в новоизолираните HCV последователности, клонираните последоавтелности от проби 23 и 27 /наречени HCV и HCV27/, всеки съдържа 1019 нуклеотида, показвайки отсъствие на мутанти с делеции и добавяне в тази област в подбраните клонове. Последователностите на фиг.5 и 6 също показват, че изолираните последователности не са преустроени в тази област.
Сравнението на консенсус последователностите от НСVI и другите изолати HCV е обобщено в таблицата, представена по-горе. Секвенционните вариации между изолата
HCV1 от шимпанзе и HCVs, изолиран от хора, са почти еднакви с тези, наблюдавани между HCVs с човешки произход.
Интересно е да се знае, че секвенционните вариации в два от предполагаемите домени не са еднородни. Последователността в препдолагаемата S област очевидно е относително постоянна и понякога пръсната по тази област. Обратно, предполагаемата NS1 област има по-висока степен на променливост, отколкото цялостната последователност, като вариациите очевидно са поместени в един хипервариабилен джоб от около 28 аминокисе28 лини, който е локализран около 70 аминокиселини в посока downstream от вероятния Nкрай от предполагаемия полипротеин.
Независимо че може да се спори, че откритите вариации са въведени по време на амплификационния процес, като че не всички вариации са резултат на това. Установено е, че Tag полимеразата въвежда грешки в последователността при приблизително 1 база за 10 килобази от ДНК матрицата за един цикъл /Saiki et. al., 1988/. На основата на тази оценка могат да бъдат въведени до 7 грешки по време на амплификационния РСР процес в 1019 Ьр ДНК фрагмент. Независимо от това трите субклона на HCV-23 и HCV-27 дават вариации за 29 и 14 бази, съответно. Това предполага, че тези вариации са природно срещащи се. Около 60% от измененията в базите на Silent мутации, които не променят аминокиселинната последователност. Вариации, въведени от Taq полимераза по време на PCR амплификацията, би следвало да се очаква, че се проявяват само понякога, обаче резултатите показват, че последователностите с вариации се струпват при поне една специфична област.
IV.С.2. HCV изолати от хора в Италия и САЩ
Сегменти от HCV РНК, представени в различни изолати, се амплифицират чрез HCV/cPCR метода. Тези сегменти обхващат област от -0,6 Кв до -1,6 Кв в посока downstream от метионинкодиращия старт кодон от предполагаемия HCV полипротеин. Изолатите са от биологични проби, получени от инфектирани с HCV индивиди. По-специално, изолат HCV # 18 е от човешка плазма от индивид от САЩ, ЕС1, и ЕС10 са от чернодробна биопсия на пациент от Италия, и Th е от мононуклеотитидна фракция на периферна кръв от американски пациент. Сравними сегменти на HCV РНК са изолирани от шимпанзе.
РНК се изолира от проби човешка плазма с помощта на фенол: СНС13: изоамил алкохолна екстракция. 0,1 mL или 0,101 ml плазма се разрежда до крайния обем 1,0 ml, с TENB/протеиназа K/SDS разтвор /0,05 М Трис-HCI, pH 8,0, 0,001 М ЕДТА, 0,1 М NaCl, lmg/ml протеиназа К и 0,5% SDS/, съдържащ 10 до 40 pg/ml полиаденилова киселина и се инкубира на 37°С за 60 min. След това протеиназно разграждане получената в резул тат плазмена фракция се депротеинира посредством екстрахира с ТЕ /50 mM Трис-НС1, pH 8,0, 1 mM ЕДТА/наситен фенол, pH 6,5. Фенолната фаза се отделя чрез центрофугиране и се реекстрахира с TEN В, съдържащ 0,1 % SDS. Получените в резултат водни фази от всяка екстракция се обединяват и се екстрахират двукратно с еднакъв фенол/хлороформ/изоамилов алкохол [1:1 (99:1)] и след това двукратно с еднакъв обем от смес 99:1 от хлороформ /изоамилов алкохол. След разделянето на фазите чрез центрофугиране водната фаза се довежда до крайна концентрация от 0,2 М Na-ацетат и нуклеиновите киселини се утаяват чрез добавяне на два обема етанол. Утаените нуклеинови киселини се получават чрез ултрацентрофугиране в SW 41 ротор при 38К, за 60 min при 4°С или в микрофужна епруветка за 10 min при 10 К, 4°С.
РНК, екстрахирана от чернодробна биопсия, е осигурена от др. F.Bonino, Ospedale Maggiore di S. Giovanni Battista, Torino, Италия. Мононуклеоцитната фракция е получена чрез седиментация на еднакви количества кръв от хора чрез Flcoll - PaqueR /Pharmacia Corp./ при спазване на инструкциите на производителя. Общото количество РНК се екстрахира от фракцията с чрез гунидин-тиоцианатната процедура, описана от Choo et.al., 1989.
Синтезът на HCV сДНК от пробите се осъществява посредством участието на обратна транскриптаза. След утаяване с фенол утаената РНК или фракция на нуклеинова киселина се изсушава и се ресуспендира в третирана с DEPC дестилирана вода. Вторичните структури в неклуиновите киселини се разрушават чрез нагряване при 65°С за 10 min и пробите се охлаждат незабавно върху лед. сДНК се синтезира при използване на 1 до 3 gg от общата РНК от черен дроб или от нуклеинова киселина /или РНК/, екстрахирана от 10 до 100 μΐ плазма. При синтезата се използва обратна транскриптаза и се провежда в 25 L реакционна смес, както е указанието на произовдителя, BRL. Всички реакционни смеси за сДНК синтезата съдържат 23 единици инхибитор на РНК-аза Rnasin, /Fisher / Promega/. След синтезата на сДНК реакционните смеси се разреждат с вода, варенето се поддържа 10 min и бързо се охлаждат върху лед.
Всеки набор от проби се подлага на два цикъла PCR амплификация. Праймерите за амплификация са подбрани така, че да амплифицират области, означени като EnvL и EnvR. Първата обхваща нуклеотиди 669-1243 и предполагаемите аминокиселини 117 до 308: втората област EnvR обхваща нуклеотиди 12151629 и кодира предполагаемите аминокиселини от 300 до 408 /предполагаемите аминокиселини са номерирани, започвайки от предполагаемия метионинов иницииращ кодон.
PCR реакциите се провеждат предимно според инструкциите на производителя /Cetus - Perkin - Elmer/, с изключение на добавянето на 1 pg РНК-аза. А. Реакциите се провеждат в краен обем 100 pl. PCR се осъществява за 30 цикъла, при режим от 94°С /1 min/, 37°С / 2 min/ и 72°С /3 min/, със 7-минутно продължение при 72°С за последният цикъл. След това пробите се екстрахират с фенол:СНС13, двукратно утаяване с етанол, ресуспендиране в 10 тМ Трие НС1, pH 8,0 и концентриране с помощта на Центрикон-30 /Амикон/ филтрация. При тази процедура успешно се отстраняват олигонукелотиди, по-малки от 30 нукелотида по размер; по този начин се отстраняват траймерите от първия кръг на PCR-амплификацията.
Концентрираните с Центрикон-30 проби се подлагат на втори кръг PCR амплификация. Тя се повтаря 35 цикъла при режим 94°С /1 min/, 60°С /1 min/ и 72°С /2 min/ със
7-минутно удължение при 72°С за последния цикъл. След това пробите се екстрахират с фенол: СНС13, утаяват се двукратно и се разграждат с EcoRI. PCR реакционните продукти се анализират чрез електрофоретично разделяне на продуктите върху 6% полиакриламидни гелове. ДНК с приблизителен размер като този на очаквания PCR продукт, се подлага на електроелюация от теловете и се субклонира или в pGEM-4 плазмиден вектор или в Agtll. Очакваният размер на продукта за EnvL и EnvR след първия кръг на амплификация е 615 Ьр и 683 Ьр, съответно, след втория кръг на амплификацията очакваният размер на продукта за EnvL и EnvR е 414 bp и 575 Ьр, съответно. Плазмидите, съдържащи амплифицираните продукти, се използват за трансформиране на клетки на гостоприемника. Използва се pGEM4 плазмидът за трансформиране на DH5-a, и Agtl 1 се използва за трансформиране на С600 Δ-HFL. Подбират се клоновете на трасформи раните клетки, които хибридизират към подходящи HCV проби или пък които имат инсерти с подходящ размер. След това инсертите се клонират в М13 и се секвенират. Пробите за всички HCV/cPCR продукти се състоят от 32Р белязани вектори от HCV сДНК, получени чрез PCR амплификация.
Информация за последователностите на вариантите на EnvL областта е получена от 3 клона от НСТ # 18, 2 клона от ТН,3 клона от ЕС1 и от НСVI клоновете. Сравнение на структурата на нуклеотидната последователност от всеки изолат, получен от тези клонове, е показано на фиг.7. На фигурата всяка последователност е показана от 5' към 3' за смисловата верига за EnvL областта и последователностите са подредени. Вертикалните линии и главните букви показват хомоложност на последователностите, отсъствието на линия и малките букви показват липса на хомоложност. Последователностите, показани на линиите, са следните: линия 1, Thom; линия 2, EClq линия 3, НСТ #18; линия 4, HCV1.
Информация за последователностите на вариантите в EnvR областта е получена от два клона на ЕС 10, и от НСVI клоновете. Двата ЕС 10 клона се отличават само по един нуклиотид. Сравнение на нуклеотидните последоавтелности на ЕС10 /клон2/ и състава на HCV1 последователностите е показано на фиг.8; всяка последователност е показана от 5' към 3' края за смисловата верига на EnvR областта и последователностите са подравнени. Двойният пунктир между последователностите обозначава хомоложност между последовател ностите.
Сравнение на аминокиселинните последователности ,клонирани в EnvL /аминокиселини # 117-308/ и EnvR областта /аминокиселини 300-438/ за всеки от изолатите е показано на фиг.9 и фиг.10, съответно. Във фигурите са включени последователностите за изолатите LH23 и LH27, описани по-горе. Освен това, са означени последователностите за японския изолат, които последователности са предоставени от др.Т. Mlyamura, Япония. На фигурите, аминокиселинните последователности за областта са дадени в тяхната цялост за НСVI и нехомоложните аминокиселини в различните изолати са означени.
Както се вижда на фиг.9, в областта
EnvL навсякъде има хомоложност около 93% между HCV1 и другите изолати. НСТ18, Th и ЕС1 имат около 97% хомоложност с HCV1; JH23 и JH27 имат около 96% и около 95% хомоложност, съответно, с HCV1. На фиг. 10 е показано, че хомоложността в EnvR областта е значително по-малко от EnvL областта; нещо повече, една субобласт се явява хипервариалбилна /т.е. от аминокиселини 383-405/.
Тези данни са обобщени на следващата 5 таблица.
Таблица
Хомоложност на EnvR областта
Изолат Процент хомоложност с HCV1
ААЗЗО - АА438 А АЗ 83 - АА405
IH23 /US/ 83 57
IH27 /US/ 80 39
Японски 73 48
ЕСЮ/Италия/ 84 48
VI. Индустриална приложимост
Идентифицираните епитопити тук могат да бъдат използвани за получаване на полипептидни продукти, както е описано по-горе, за приложения, като скрининга на кръв за HIV инфекция, клинична HCV диагностика, получаването на антитела и медикаменти. Други приложения са описани по-горе, а други са очевидни за специалистите в областта.

Claims (28)

  1. Патентни претенции
    1. Полипептид, имунореактивен с HCV антитяло, чиято имунореактивна част, реактивна с HCV антитяло, се състои по същество от сегмент на HCV полипептид, съдържащ аминокиселина 413 до аминокиселина 427 (АА413-АА427), както е показано на фиг.1, като този сегмент има максимална дължина, приблизително 30 аминокиселини.
  2. 2. Имунореактивен полипептид съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че сегментът има максимална дължина, приблизително 25 аминокиселини.
  3. 3. Имунореактивен полипептид съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че сегментът има максимална дължина, приблизително 15 аминокиселини.
  4. 4. Имунореактивен полипептид съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че сегментът има максимална дължина, приблизително 12 аминокиселини.
    25
  5. 5. Полипептид, имунореактивен с HCV антитяло, чиято имунореактивна част, реактивна с HCV антитяло, се състои по същество от сегмент на HCV полипептид, съдържащ аминокиселина 413 до аминокиселина 427 (АА413-АА427), както е показано на фиг.1.
  6. 6. Клетка, трансформирана с рекомбинантната експресионна система съгласно претенция 5.
  7. 7. Полипептид, имунореактивен с HCV антитяло, чиято имунореактивна част, реактивна с HCV антитяло, се състои по същество от сегмент на HCV полипептид, съдържащ аминокиселина 2281 до аминокиселина 2300 (АА2281-АА2300), както е показано на фиг.1, като този сегмент има максимална дължина, приблизително 50 аминокиселини.
  8. 8. Имунореактивен полипептид съгласно претенция 7, характеризиращ се с това, че сегментът има максимална дължина, приблизително 30 аминокиселини.
  9. 9. Имунореактивен полипептид съгласно претенция 7, характеризиращ се с това, че сегментът има максимална дължина, приблизително 25 аминокиселини.
  10. 10. Полипептид, имунореактивен с HCV антитяло, чиято имунореактивна част, реактивна с HCV антитяло, се състои по същество от сегмент на HCV полипептид, съдържащ аминокиселина 2281 до аминокиселина 2300 (АА2281-АА2300), както е показано на фиг. 1.
  11. 11. Полипептид, имунореактивен с HCV антитяло, чиято имунореактивна част, реактивна с HCV антитяло, се състои по същество от сегмент на HCV полипептид. съдържащ аминокиселина 66 до аминокиселина 85 (АА66АА85), както е показано на фиг.1.
  12. 12. Полипептид, имунореактивен с HCV антитяло, чиято имунореактивна част, реактивна с HCV антитяло, се състои по същество от сегмент на HCV полипептид, съдържащ аминокиселина 540 до аминокиселина 554 (АА540АА554), както е показано на фигура. 1, като този сегмент има максимална дължина, приблизително 100 аминокиселини.
  13. 13. Имунореактивен полипептид съгласно претенция 12, характеризиращ се с това, че сегментът има максимална дължина, приблизително 50 аминокиселини.
  14. 14. Имунореактивен полипептид съгласно претенция 12, характеризиращ се с това, че сегментът има максимална дължина, приблизително 30 аминокиселини.
  15. 15. Имунореактивен полипептид съгласно претенция 12, характеризираш се с това, че сегментът има максимална дължина, приблизително 25 аминокиселини.
  16. 16. Имунореактивен полипептид съгласно претенция 12, характеризираш се с това, че сегментът има максимална дължина, приблизително 20 аминокиселини.
  17. 17. Полипептид, имунореактивен с HCV антитяло, чиято имунореактивна част, реактивна с HCV антитяло, се състои по същество от сегмент на HCV полипептид, съдържащ аминокиселина 540 до аминокиселина 554 (АА540АА554), както е показано на фиг. 1
  18. 18. Полипептид, имунореактивен с HCV антитяло, чиято имонореактивна част, реактивна с HCV антитяло, се състои по същество от сегмент на HCV полипептид, съдържащ аминокиселина 1218 до аминокиселина 1267 (АА1218-АА1267), както е показано на фиг.1.
  19. 19. Полипептид, имунореактивен с HCV антитяло, чиято имунореактивна част, реактивна с HCV антитяло, се състои по същество от сегмента на HCV полипептид, съдържащ аминокиселина 465 до аминокиселина 480 (АА465-АА480), както е показано на фиг.1, като този сегмент има максимална дължина, приблизително 20 аминокиселини.
  20. 20. Полипептид, имунореактивен с HCV антитяло, чиято имунореактивна част, реактивна с HCV антитяло, се състои по същество от сегмент на HCV полипептид, съдържащ аминокиселина 465 до аминокиселина 480 (АА465-АА480), както е показано на фиг.1.
  21. 21. Полипептид, имунореактивен с HCV антитяло, чиято имунореактивна част, реактивна с HCV антитяло, се състои по същество от сегмента на HCV полипептид, съдържащ аминокиселина 2244 до аминокиселина 2258 (АА2244-АА2258), както е показано на фигура. 1, като този сегмент има максимална дължина, приблизително 25 аминокиселини.
  22. 22. Имунореактивен полипептид съгласно претенция 21, характеризиращ се с това, че сегментът има дължина, приблизително 20 аминокиселини.
  23. 23. Полипептид, имунореактивен с HCV антитяло, чиято имунореактивна част, реактивна с HCV антитяло, се състои по същество от сегмент на HCV полипептид, съдържащ аминокиселина 2244 до аминокиселина 2258 (АА2244-АА2258), както е показано на фиг.1.
  24. 24. Полипептид, имунореактивен с HCV антитяло, чиято имунореактивна част, реактивна с HCV антитяло, се състои по същество от сегмент на HCV полипептид, съдържащ аминокиселина 1940 до аминокиселина 1959 (АА1940-АА1959), както е показано на фиг.1.
  25. 25. Реагент за имуноанализ, съдържащ полипептид съгласно която и да е от претенциите от 1 до 24.
  26. 26. Метод за откриване наличието на антитела, имунореактивни с вирусни протеини (HCV) на хепатит С в проба, характеризиращ се с това, че имобилизиран реагент за имуноанализ съгласно претенция 25 взаимодейства с тази проба и се откриват антителата, свързани с реагента.
  27. 27. Състав на моноклонално или поликлонално антитяло, характеризиращ се с това, че антителата са свързани с имунореактивната част на полипептидите съгласно която и да е от претенциите от 1 до 24.
  28. 28. Метод за получаване на полипептид съгласно която и да е от претенциите от 1 до 24, характеризиращ се с това, че полипептидът се получава чрез рекомбинантна експресия или химичен синтез.
BG98332A 1991-06-24 1993-12-23 Полипептиди на вируса на хепатит с (нсv) BG61843B1 (bg)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US72248991A 1991-06-24 1991-06-24
PCT/US1992/005388 WO1993000365A2 (en) 1991-06-24 1992-06-24 Hepatitis c virus (hcv) polypeptides

Publications (2)

Publication Number Publication Date
BG98332A BG98332A (bg) 1995-02-28
BG61843B1 true BG61843B1 (bg) 1998-07-31

Family

ID=24902063

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
BG98332A BG61843B1 (bg) 1991-06-24 1993-12-23 Полипептиди на вируса на хепатит с (нсv)

Country Status (16)

Country Link
US (2) US6346375B1 (bg)
EP (1) EP0591431B1 (bg)
JP (9) JP3516681B2 (bg)
KR (1) KR0185426B1 (bg)
AT (1) ATE229543T1 (bg)
BG (1) BG61843B1 (bg)
CA (1) CA2110058C (bg)
DE (1) DE69232871T2 (bg)
ES (1) ES2188583T3 (bg)
FI (2) FI110099B (bg)
HU (1) HU227547B1 (bg)
NO (1) NO309528B1 (bg)
RO (1) RO117329B1 (bg)
RU (1) RU2148587C1 (bg)
UA (1) UA40572C2 (bg)
WO (1) WO1993000365A2 (bg)

Families Citing this family (85)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6861212B1 (en) 1987-11-18 2005-03-01 Chiron Corporation NANBV diagnostics and vaccines
US5712088A (en) * 1987-11-18 1998-01-27 Chiron Corporation Methods for detecting Hepatitis C virus using polynucleotides specific for same
US5714596A (en) * 1987-11-18 1998-02-03 Chiron Corporation NANBV diagnostics: polynucleotides useful for screening for hepatitis C virus
US5698390A (en) * 1987-11-18 1997-12-16 Chiron Corporation Hepatitis C immunoassays
US6171782B1 (en) 1987-11-18 2001-01-09 Chiron Corporation Antibody compositions to HCV and uses thereof
US6027729A (en) * 1989-04-20 2000-02-22 Chiron Corporation NANBV Diagnostics and vaccines
US5639594A (en) * 1990-02-16 1997-06-17 United Biomedical, Inc. Linear and branched peptides effective in diagnosing and detecting non-A, non-B hepatitis
US5582968A (en) * 1990-02-16 1996-12-10 United Biomedical, Inc. Branched hybrid and cluster peptides effective in diagnosing and detecting non-A, non-B hepatitis
GB9204274D0 (en) * 1992-02-28 1992-04-08 Wellcome Found Novel peptides
US6667387B1 (en) 1996-09-30 2003-12-23 N.V. Innogenetics S.A. HCV core peptides
US6709828B1 (en) 1992-03-06 2004-03-23 N.V. Innogenetics S.A. Process for the determination of peptides corresponding to immunologically important epitopes and their use in a process for determination of antibodies or biotinylated peptides corresponding to immunologically important epitopes, a process for preparing them and compositions containing them
DE4240980A1 (de) * 1992-08-07 1994-02-10 Boehringer Mannheim Gmbh HCV Peptidantigene und Verfahren zur Bestimmung von HCV
US7255997B1 (en) 1993-04-27 2007-08-14 N.V. Innogenetics S.A. Sequences of hepatitis C virus genotypes and their use as therapeutic and diagnostic agents
ATE551423T1 (de) 1993-04-27 2012-04-15 Innogenetics Nv Sequenzen von hepatitis c virus-genotypen sowie ihre verwendungen als therapeutika und diagnostika
ATE281647T1 (de) 1993-05-10 2004-11-15 Chiron Corp Verfahren zur typisierung von hepatitis c viren und dafür zu verwendende reagenzien
CA2162557C (en) 1993-05-12 2004-09-28 Amy J. Weiner Conserved motif of hepatitis c virus e2/ns1 region
US5514539A (en) * 1993-06-29 1996-05-07 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Nucleotide and deduced amino acid sequences of the envelope 1 gene of 51 isolates of hepatitis C virus and the use of reagents derived from these sequences in diagnostic methods and vaccines
US5639856A (en) 1993-09-13 1997-06-17 The Regents Of The University Of California Semaphorin gene family
AU8003894A (en) * 1993-10-29 1995-05-22 Srl Inc. Antigen peptide compound and immunoassay method
ATE290592T1 (de) * 1993-11-04 2005-03-15 Innogenetics Nv Von menschlichen t-zellen immunodominante epitopen des virus der c-hepatitis
US5709995A (en) * 1994-03-17 1998-01-20 The Scripps Research Institute Hepatitis C virus-derived peptides capable of inducing cytotoxic T lymphocyte responses
PT804584E (pt) * 1994-10-21 2002-11-29 Innogenetics Nv Sequencias de virus da hepatite c genotipo 7 e sua utilizacao como agentes profilacticos terapeuticos e de diagnostico
GB2294690B (en) * 1994-11-01 1998-10-28 United Biomedical Inc Peptides effective for diagnosis and detection of hepatitis C infection
JPH08333390A (ja) * 1995-04-07 1996-12-17 Hoechst Japan Ltd ペプチド及びそれからなる自己免疫疾患治療剤
US6034064A (en) * 1995-04-07 2000-03-07 Hoechst Pharmaceuticals & Chemicals K.K. Peptides and therapeutic agent for autoimmune diseases containing the same
EP0829488A4 (en) * 1995-04-28 1999-04-07 Srl Inc ANTIGENIC PEPTIDE COMPOUND AND IMMUNOLOGICAL ASSAY METHOD
GB9513261D0 (en) * 1995-06-29 1995-09-06 Smithkline Beecham Biolog Vaccines
US6127116A (en) 1995-08-29 2000-10-03 Washington University Functional DNA clone for hepatitis C virus (HCV) and uses thereof
ES2251028T3 (es) * 1996-05-24 2006-04-16 Chiron Corporation Proteina de fusion de epitopos multiples.
US6514731B1 (en) 1996-05-24 2003-02-04 Chiron Corporation Methods for the preparation of hepatitis C virus multiple copy epitope fusion antigens
US7338759B1 (en) 1997-03-04 2008-03-04 Washington University HCV variants
US7049428B1 (en) 1998-03-04 2006-05-23 Washington University HCV variants
AU9498098A (en) 1997-09-22 1999-04-12 Chiron Corporation Buffers for stabilizing antigens
DK1471074T3 (da) * 1998-04-17 2008-11-17 Innogenetics Nv Fremgangsmåder til forbedring af konformationen af proteiner ved hjælp af reduktionsmidler
US7052830B1 (en) * 1998-06-09 2006-05-30 Branch Andrea D Hepatitis C virus peptides and uses thereof
US7052696B2 (en) * 1998-07-10 2006-05-30 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Antigenic epitopes and mosaic polypeptides of hepatitis C virus proteins
US6191256B1 (en) * 1998-11-20 2001-02-20 Bayer Corporation Recombinant factor VIII binding peptides
JP2003509465A (ja) * 1999-07-19 2003-03-11 エピミューン， インコーポレイテッド ペプチドおよび核酸組成物を使用する、ｃ型肝炎ウイルスに対する細胞性免疫応答の誘導
ATE368221T1 (de) 2000-06-15 2007-08-15 Novartis Vaccines & Diagnostic Immunoassays für anti-hcv-antikörper
US6680059B2 (en) * 2000-08-29 2004-01-20 Tripep Ab Vaccines containing ribavirin and methods of use thereof
WO2002013855A2 (en) 2000-08-17 2002-02-21 Tripep Ab Vaccines containing ribavirin and methods of use thereof
US6858590B2 (en) * 2000-08-17 2005-02-22 Tripep Ab Vaccines containing ribavirin and methods of use thereof
US7022830B2 (en) * 2000-08-17 2006-04-04 Tripep Ab Hepatitis C virus codon optimized non-structural NS3/4A fusion gene
EP1195381A1 (de) * 2000-09-28 2002-04-10 Immusystems GmbH CD4+ T-Lymphozyten spezifische Hepatitis C Virus-Epitope
SK13142003A3 (en) 2001-04-24 2004-11-03 Innogenetics Nv Core-glycosylated HCV envelope proteins
US20030152942A1 (en) * 2001-05-09 2003-08-14 Lance Fors Nucleic acid detection in pooled samples
US7196183B2 (en) 2001-08-31 2007-03-27 Innogenetics N.V. Hepatitis C virus genotype, and its use as prophylactic, therapeutic and diagnostic agent
US20030100467A1 (en) * 2001-09-12 2003-05-29 Wolfgang Aehle Binding phenol oxidizing enzyme-peptide complexes
AR045702A1 (es) * 2001-10-03 2005-11-09 Chiron Corp Composiciones de adyuvantes.
US7332269B2 (en) * 2001-11-11 2008-02-19 Ortho-Clinical Diagnostics, Inc. HCV core protein sequences
EP1483575A2 (en) * 2002-02-28 2004-12-08 Intercell AG Methods for isolating ligands e.g. t cell epitopes
DK1947104T3 (da) * 2002-03-11 2012-08-06 Lab 21 Ltd Fremgangsmåder og sammensætninger til identifikation og karakterisering af hepatitis C
WO2004041842A2 (en) * 2002-05-16 2004-05-21 The General Hospital Corporation Epitopes of hepatitis c virus
FR2839722A1 (fr) * 2002-05-17 2003-11-21 Bio Merieux Nouvelles compositions peptidiques et leur utilisation notamment dans la preparation de compositions pharmaceutiques actives contre le virus de l'hepatite c
CA2484941A1 (en) * 2002-07-24 2004-02-05 Intercell Ag Antigens encoded by alternative reading frame from pathogenic viruses
PL209710B1 (pl) 2002-09-09 2011-10-31 Chiron Corp Sposób wykrywania infekcji wirusem zapalenia wątroby typu C (HCV)
EP2402026A3 (en) 2002-09-13 2012-04-18 Intercell AG Method for isolating hepatitis C virus peptides
ATE441715T1 (de) 2003-03-04 2009-09-15 Intercell Ag Streptococcus pyogenes antigene
CN100355453C (zh) * 2003-03-24 2007-12-19 英特塞尔股份公司 改进的疫苗
ES2562456T3 (es) 2003-03-24 2016-03-04 Valneva Austria Gmbh Uso de un adyuvante que induce una respuesta inmune Th1 para mejorar las respuestas inmunes
EP2311989A1 (en) 2003-04-15 2011-04-20 Intercell AG S. pneumoniae antigens
US7731967B2 (en) 2003-04-30 2010-06-08 Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. Compositions for inducing immune responses
EP1648502B1 (en) 2003-07-11 2010-12-01 Intercell AG Hcv vaccines
WO2005010035A2 (en) * 2003-07-22 2005-02-03 Branch Andrea D Alternate reading frame polypeptides derived from hepatitis c and methods of their use
US8124747B2 (en) 2003-08-29 2012-02-28 Innogenetics HCV clade and prototype sequences thereof
FR2859909B1 (fr) 2003-09-22 2007-09-07 Biomerieux Sa Procede de preparation de microparticules bioresorbables, microparticules obtenues et utilisation
CA2558963A1 (en) * 2004-04-16 2005-12-15 Genentech, Inc. Omi pdz modulators
ATE542140T1 (de) * 2004-08-27 2012-02-15 Novartis Vaccines & Diagnostic Nichtstrukturelle hcv-proteinmutanten und verwendungsmöglichkeiten dafür
KR101312339B1 (ko) * 2005-04-20 2013-09-27 주식회사 바이로메드 융합 단백질 분리를 위한 조성물 및 방법
WO2007031867A2 (en) * 2005-05-25 2007-03-22 Tripep Ab A hepatitis c virus non-stru tural ns3/4a fusion gene
US8216590B2 (en) 2006-08-25 2012-07-10 Novartis Ag HCV fusion polypeptides
JP4975600B2 (ja) * 2007-03-16 2012-07-11 シスメックス株式会社 Ｈｃｖ抗体測定用試薬キット及びｈｃｖ抗体測定方法
EP2185195A2 (en) 2007-08-16 2010-05-19 Tripep Ab Immunogen platform
JP2011506334A (ja) 2007-12-07 2011-03-03 ノバルティス アーゲー 免疫応答を誘導するための組成物
WO2009130588A2 (en) * 2008-04-22 2009-10-29 Tripep Ab Immunogen platform
US20100104555A1 (en) * 2008-10-24 2010-04-29 The Scripps Research Institute HCV neutralizing epitopes
EP3424495A1 (en) 2011-07-06 2019-01-09 GlaxoSmithKline Biologicals S.A. Oil-in-water emulsions that contain nucleic acids
RU2649133C2 (ru) 2011-07-06 2018-03-29 Новартис Аг Катионные эмульсии масло-в-воде
FR2984328B1 (fr) 2011-12-20 2016-12-30 Bio-Rad Innovations Procede de detection d'une infection par le virus de l'hepatite c
WO2013150450A1 (en) * 2012-04-02 2013-10-10 Universidade Do Porto Hcv homolog fragments, cell-lines and applications thereof
CN105378099B (zh) 2013-03-14 2021-05-11 雅培制药有限公司 Hcv核心脂质结合结构域单克隆抗体
JP2016512241A (ja) 2013-03-14 2016-04-25 アボット・ラボラトリーズＡｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ 改良された抗体検出のためのｈｃｖｎｓ３組換え抗原およびこの突然変異体
US9194873B2 (en) 2013-03-14 2015-11-24 Abbott Laboratories HCV antigen-antibody combination assay and methods and compositions for use therein
ES2832335T3 (es) 2015-03-27 2021-06-10 Ortho Clinical Diagnostics Inc Polipéptidos NS4A/NS3 modificado del VHC y usos de los mismos
CN111153963B (zh) * 2020-01-19 2021-08-10 华南理工大学 抗炎五肽及其提取分离方法和在改善记忆中的应用

Family Cites Families (50)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4861588A (en) * 1985-02-05 1989-08-29 New York Blood Center, Inc. Pre-S gene coded peptide hepatitis B immunogens, vaccines, diagnostics, and synthetic lipid vesicle carriers
HU220204B (hu) * 1987-11-18 2001-11-28 Chiron Corp. HCV polipeptidek és HCV polinukleotidok, ilyen polinukleotidokat tartalmazó vektorok és ezekkel transzformált gazdasejtek, valamint HCV fertőzés kimutatására szolgáló diagnosztikumok és immunvizsgálati készlet
GB2212511B (en) 1987-11-18 1992-01-22 Chiron Corp Hepatitis c virus
US5350671A (en) * 1987-11-18 1994-09-27 Chiron Corporation HCV immunoassays employing C domain antigens
US5312737A (en) 1988-03-11 1994-05-17 Abbott Laboratories CKS method of HCV protein synthesis
WO1990011089A1 (en) * 1989-03-17 1990-10-04 Chiron Corporation Nanbv diagnostics and vaccines
EP0416725A3 (en) 1989-07-14 1991-03-20 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Blood-borne non-a, non-b hepatitis specific protein, dna encoding it, and process for its production
JP2818761B2 (ja) 1989-09-14 1998-10-30 財団法人化学及血清療法研究所 非ａ非ｂ型肝炎ウイルス抗原をコードする核酸断片およびその利用法
US5372928A (en) 1989-09-15 1994-12-13 Chiron Corporation Hepatitis C virus isolates
WO1991004262A1 (en) * 1989-09-15 1991-04-04 National Institute Of Health Of Japan New hcv isolates
DE4040339C2 (de) * 1989-12-18 1999-07-08 Wellcome Found Virales Agens
JPH03190898A (ja) 1989-12-21 1991-08-20 Shima Kenkyusho:Kk 合成ポリペプチド及びそれを用いたｈｃｖ抗体測定試薬
AU638304B2 (en) * 1989-12-22 1993-06-24 Abbott Laboratories Hepatitis c assay
EP0435229A1 (en) 1989-12-27 1991-07-03 Sanwa Kagaku Kenkyusho Co., Ltd. DNA of non-A, non-B hepatitis virus gene, its clone and use thereof
KR940000755B1 (ko) * 1990-02-16 1994-01-29 유나이티드 바이오메디칼 인코오포레이티드 Hcv에 대한 항체 검출, hcv 감염의 진단 및 백신으로서의 그 예방에 특히 적합한 합성 펩티드
US5106726A (en) * 1990-02-16 1992-04-21 United Biomedical, Inc. Synthetic peptides specific for the detection of antibodies to HCV
DK0527788T3 (da) 1990-04-04 2004-09-06 Chiron Corp Hepatitis C virus protease
ATE194844T1 (de) * 1990-04-06 2000-08-15 Genelabs Tech Inc Hepatitis c-virus-epitope
JPH044880A (ja) 1990-04-20 1992-01-09 Terumasa Arima 非ａ非ｂ型肝炎抗原をコードするｄｎａ及びポリペプチド
JP3268502B2 (ja) 1990-06-12 2002-03-25 徹雄 中村 非ａ非ｂ型肝炎ウイルス関連ポリヌクレオチド、ポリペプ タイド
JPH0446196A (ja) 1990-06-13 1992-02-17 Kuraray Co Ltd 抗原蛋白質およびそれをコードしているｄｎａ断片
NZ238681A (en) 1990-06-25 1992-03-26 Univ Osaka Res Found Non-a, non-b hepatitis virus particles and their production
EP0464287A1 (en) 1990-06-25 1992-01-08 The Research Foundation for Microbial Diseases of Osaka University Non-A, non-B hepatitis virus genomic cDNA and antigen polypeptide
EP0468657A3 (en) 1990-07-09 1992-02-05 Tonen Corporation Non-a non b hepatitis-specific antigen and its use in hepatitus diagnosis
JPH04126086A (ja) 1990-07-12 1992-04-27 Yamanouchi Pharmaceut Co Ltd 非ａ非ｂ型肝炎ウイルス抗原ポリペプチド、該抗原ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、及びそれらを用いた非ａ非ｂ型肝炎の診断法
CA2047792C (en) 1990-07-26 2002-07-02 Chang Y. Wang Synthetic peptides specific for the detection of antibodies to hcv, diagnosis of hcv infection and prevention thereof as vaccines
CZ282573B6 (cs) 1990-08-10 1997-08-13 Chiron Corporation Způsob detekce HCV sekvence, souprava a reakční činidlo pro detekci HCV
CA2049679C (en) 1990-08-24 2005-06-21 Sushil G. Devare Hepatitis c assay utilizing recombinant antigens
KR920004577A (ko) 1990-08-24 1992-03-27 원본미기재 단백질 합성의 cks 방법
KR930702365A (ko) 1990-08-25 1993-09-08 존 더블유. 아담슨 비-a형, 비-b형 간염 바이러스 항원, 진단 방법 및 백신
JP3055793B2 (ja) 1990-09-07 2000-06-26 財団法人化学及血清療法研究所 非ａ非ｂ型肝炎ウイルス融合ペプチドおよびその製法
JPH04144686A (ja) 1990-10-04 1992-05-19 Kunitada Shimotoono 構造蛋白質遺伝子、組換えベクター、それにより形質転換された大腸菌、ポリペプチドおよびポリペプチドの製造方法
JPH04159298A (ja) 1990-10-19 1992-06-02 Olympus Optical Co Ltd Ｈｃｖペプチド
ATE318309T1 (de) 1990-11-03 2006-03-15 Dade Behring Marburg Gmbh Hcv-spezifische peptide, mittel dazu und ihre verwendung
EP0485209A1 (en) 1990-11-08 1992-05-13 Immuno Japan Inc. Non A, non B hepatitis virus related antigen, antibody detection systems, polynucleotides and polypeptides
JPH04179482A (ja) 1990-11-11 1992-06-26 Kunitada Shimotoono Ｃ型肝炎ウイルス由来の遺伝子
JPH04187090A (ja) 1990-11-22 1992-07-03 Toshio Shikata 非ａ非ｂ型肝炎抗原をコードするｄｎａ及びポリペプチド
KR920703640A (ko) 1990-11-29 1992-12-18 테루카츄 아리마 비a비b형 간염 바이러스 항원 단백질
EP0489968B1 (en) 1990-12-14 1996-11-06 Innogenetics N.V. Synthetic antigens for the detection of antibodies to hepatitis C virus
CA2101534C (en) 1991-01-31 2004-01-20 Mary S. Gibadlo Monoclonal antibodies to putative hcv envelope region and methods for using same
JP3244284B2 (ja) 1991-02-14 2002-01-07 武田薬品工業株式会社 Ｃ型肝炎ウイルス関連抗体および抗原の測定法
US5574132A (en) 1991-04-05 1996-11-12 Biochem Immunosystems Inc. Peptides and mixtures thereof for detecting antibodies to hepatitis C virus (HCV)
JPH0568562A (ja) 1991-05-30 1993-03-23 Sanwa Kagaku Kenkyusho Co Ltd ヒトＣ型肝炎ウイルスのｃＤＮＡ、そのクローン及びこれらの利用法
JP3055964B2 (ja) 1991-05-31 2000-06-26 株式会社トクヤマ Ｈｃｖ 抗原活性ポリペプチド、ポリペプチドの製造方法、形質転換された大腸菌、および抗ｈｃｖ 抗体の検出方法
FR2677372B1 (fr) 1991-06-06 1994-11-10 Pasteur Institut Sequences nucleotidiques et peptidiques d'un isolat de virus de l'hepatite c, applications diagnostiques et therapeutiques.
TW360711B (en) 1991-06-10 1999-06-11 Lucky Ltd CDNAs of Korean hepatitis C virus and polypeptides encoded thereby
CA2070952A1 (en) 1991-06-11 1992-12-12 Makoto Seki Gene of hepatitis c virus or fragment thereof, polypeptide encoded by the same
EP0544861A4 (en) 1991-06-13 1997-06-04 Baxter Diagnostics Inc Immunoassay for non-a non-b hepatitis
JP3103180B2 (ja) 1992-01-30 2000-10-23 昭和電工株式会社 軟質性合成樹脂製シート
JP3190898B2 (ja) 1998-11-09 2001-07-23 米沢日本電気株式会社 ノート型パーソナルコンピュータ

Also Published As

Publication number Publication date
JP3926817B2 (ja) 2007-06-06
HU9303703D0 (en) 1994-04-28
CA2110058C (en) 2001-09-25
JP3514751B2 (ja) 2004-03-31
JP2009084285A (ja) 2009-04-23
AU671594B2 (en) 1996-09-05
RU2148587C1 (ru) 2000-05-10
EP0591431B1 (en) 2002-12-11
JP2007077168A (ja) 2007-03-29
JP2000139485A (ja) 2000-05-23
JP2005053920A (ja) 2005-03-03
JP3619827B2 (ja) 2005-02-16
FI935808A0 (fi) 1993-12-22
EP0591431A1 (en) 1994-04-13
RO117329B1 (ro) 2002-01-30
WO1993000365A3 (en) 1993-04-29
KR0185426B1 (ko) 1999-04-01
JP2003277396A (ja) 2003-10-02
ES2188583T3 (es) 2003-07-01
FI20021626A (fi) 2002-09-11
JP4456596B2 (ja) 2010-04-28
FI111645B (fi) 2003-08-29
JPH06508837A (ja) 1994-10-06
BG98332A (bg) 1995-02-28
JP2007131629A (ja) 2007-05-31
WO1993000365A2 (en) 1993-01-07
CA2110058A1 (en) 1993-01-07
DE69232871D1 (de) 2003-01-30
UA40572C2 (uk) 2001-08-15
NO309528B1 (no) 2001-02-12
JP2008001716A (ja) 2008-01-10
JP4456595B2 (ja) 2010-04-28
AU2305392A (en) 1993-01-25
HU227547B1 (en) 2011-08-29
JP3514680B2 (ja) 2004-03-31
NO934542D0 (no) 1993-12-10
US6150087A (en) 2000-11-21
US6346375B1 (en) 2002-02-12
DE69232871T2 (de) 2003-05-08
ATE229543T1 (de) 2002-12-15
FI935808A (fi) 1994-02-21
JP3516681B2 (ja) 2004-04-05
HUT73098A (en) 1996-06-28
FI110099B (fi) 2002-11-29
JP2004115533A (ja) 2004-04-15
NO934542L (no) 1994-02-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
BG61843B1 (bg) Полипептиди на вируса на хепатит с (нсv)
US5372928A (en) Hepatitis C virus isolates
ES2020152T3 (es) Diagnosticos y vacunas para nanbv.
CA2065287C (en) New hcv isolates
US5728520A (en) Immunoreactive polypeptide compositions
AU671594C (en) Hepatitis C virus (HCV) polypeptides