JP2016512241A - 改良された抗体検出のためのhcvns3組換え抗原およびこの突然変異体 - Google Patents
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Abstract
Description
野生型NS3ヘリカーゼのATP結合活性と比較して低下したATP結合活性
野生型NS3ヘリカーゼのATP結合活性と比較して、野生型NS3と比較して低下したATPase活性、および
野生型NS3ヘリカーゼの酸化還元安定性と比較して増大した酸化還元安定性。
本発明は、試験試料中の抗HCV抗体の検出のための試薬を提供する。明細書を通して特定の用語が頻繁に使用され、このようなものとして、以下のセクションはこれらの用語のさらなる定義を提供する。用語「抗体(antibody)」(Ab)および「抗体(antibodies)」(Abs)は以下を指す:モノクローナル抗体(mAb(単数形)またはmAbs(複数形))、ポリクローナル抗体(pAbs(複数形))、多重特異性抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体(完全にまたは部分的にヒト化されている;ヒト抗体の改変された可変領域を含有しているポリペプチド(ここでは、可変領域の一部が非ヒト配列由来の対応する配列により置換されており、改変された可変領域はヒト抗体の定常領域の少なくとも一部に連結されている。)、動物抗体(例えば、鳥類(例えば、アヒルまたはガチョウ)、サメ、クジラおよび非霊長類を含む哺乳動物(例えば、ウシ、ブタ、ラクダ、ラマ、ウマ、ヤギ、ウサギ、ヒツジ、ハムスター、モルモット、ネコ、イヌ、ラット、マウスなど)、または非ヒト霊長類(例えば、サル、チンパンジーなど)であるが、これらに限定されるわけではない。)、組換え抗体、キメラ抗体(cAb;別の宿主種由来の抗体定常領域の少なくとも一部に連結された1つの宿主種由来の抗体の重鎖および軽鎖可変領域全体またはこの一部を含有しているポリペプチド)、単鎖抗体、単一ドメイン抗体、Fab断片、F(ab’)断片、Fab’−SH断片、F(ab’)2断片、Fd断片、Fv断片、単鎖Fv断片(「scFv」)、ジスルフィド結合されたFv断片(「sdFv」)、dAb断片、二重特異性抗体、単離された相補性決定領域(CDR)および抗イディオタイプ(「抗Id」)抗体、二官能性または二重ドメイン抗体(例えば、二重可変ドメイン抗体、またはDVD−IgGs)、ならびに上記のいずれかの機能的に活性なエピトープ結合断片(または抗原的に反応性である断片)。特に、抗体は、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫学的に活性である(または抗原的に反応性である)断片、即ち、本明細書中で(n)にさらに記載されるような分析物結合部位を含む分子、および本明細書中で(ac)にさらに記載されるような変異体を含む。免疫グロブリン分子は任意のタイプ(例えば、IgG、IgE、IgM、IgD、IgAおよびIgY)、クラス(例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1およびIgA2)、またはサブクラスであり得る。バイオティスプレイを使用して調製された組み合わせ抗体ライブラリーのスクリーニングによりこの親和性(即ち、KD、kd、またはka)が増大しているまたは改善された抗体は、「親和性成熟抗体」と呼ばれる。わかりやすくするために、分析物に対する抗体は本明細書中では、頻繁に「抗分析物抗体」または単に「分析物抗体」(例えば、抗HCV抗体またはHCV抗体)のいずれかと呼ばれる。抗体の変異体は本明細書中で(x)に記載されるとおりである。
本明細書中に記載されるHCV NS3タンパク質およびこの突然変異体は主に2つの主要なタンパク質をいい、第1のタンパク質は、P26664のHCVポリタンパク質(Genbank、配列番号88として本明細書中で複製された;Choo et al.,PNAS 1991)のナンバリングに従うとアミノ酸1192−1457に相当し、C33(Chironにより最初に記載された。)として、または「9NB49H」としても知られている。第2の主要なNS3タンパク質はアミノ酸1192−1657に相当し、NS3ヘリカーゼまたは「NS3h」としても知られている。
本発明のNS3抗原分子は一般に、組換えにより生産される。様々なHCV抗原の組換えによる生産が記載されている。例えば、Houghton et al.,米国特許第5,350,671号明細書;Chien et al.,J.Gastroent.Hepatol.(1993)8:S33−39;Chien et al.,国際公開第93/00365号パンフレット;Chien,D.Y.,国際公開第94/01778号パンフレットを参照のこと。本発明がHCV検出分析に使用される特異的NS3抗原を記載していることを前提とし、HCV抗原の組換えによる生産のための技術が当業者に公知であることを前提とすると、このような技術が、ここでは、改良された免疫測定法のための抗原を有利に生産するために使用され得る。
特定の実施形態では、上記NS3抗原は免疫診断試薬としての使用が考えられる。本発明の抗原が増大した安定性、およびC33抗原と比較してNS3抗体との増大した免疫反応性を有することが本明細書中で示される。本発明の免疫診断試薬は、単独で、または、HCVの別の部分(HCVのNS3領域、HCVのコア抗原、HCVのNS4領域、またはこれらの組み合わせを含むがこれらに限定されるわけではない。)に特異的に結合する抗体と免疫反応性である1つ以上のエピトープを含有している他の単離されたまたは精製されたポリペプチドとの組み合わせにおいてのいずれかで、HCVのNS3領域に特異的に結合する抗体と免疫反応性であるエピトープを含有している上記抗原ポリペプチドからなるであろう。このポリペプチドが免疫診断試薬に含まれるポリペプチドは、例えば、微粒子(例えば、磁性粒子)、ビーズ、試験管、マイクロタイタープレート、キュベット、メンブレン、足場分子、薄膜、濾紙、ディスク、またはチップのような固体支持体にコーティングされ得るが、必ずしもそうである必要はない。これに関して、免疫診断試薬が本発明のNS3抗原をさらなる抗原との組み合わせにおいて含む場合は、本発明の抗原とさらなる抗原を同じ固体支持体上に一緒にコーティングすることができるか、または別の固体支持体上にコーティングすることができる(用語「固体支持体」と「固相」は本明細書中では互換的に使用される。)。抗原が同じ固体支持体上に一緒にコーティングされる場合は、好ましくは、本発明のNS3抗原とさらなる抗原は、約1:2から約1:6の比で一緒にコーティングされ、ここで、本発明のNS3抗原とさらなる抗原が約1:2の比で同じ固体支持体上に一緒にコーティングされる場合は、本発明のNS3抗原の濃度は少なくとも約40μg/mLであり、さらなる抗原の濃度は少なくとも約80μg/mLである。
本発明の抗原を含有している免疫診断試薬と、抗HCV抗体の検出のための免疫測定法における免疫診断試薬の使用についての説明書とを含有しているキットがなおさらに提供される。例えば、キットは、免疫測定法によりHCV抗体について試験試料をアッセイするための説明書を含み得る。好ましい実施形態は、試験試料をアッセイするために化学発光微粒子免疫測定法を利用するが、本発明の抗原が試験試料中のHCV抗体の存在を決定するための当業者に公知の任意の他の免疫測定法において使用され得ることが理解されるものとする。説明書は、書面の形態であってよく、または、ディスク、CD、DVDなどのようなコンピュータで読み取りが可能な形態であってもよい。代わりに、または加えて、キットは、検量用試料または対照、例えば、精製された、および場合により凍結乾燥させられた抗HCV抗体、ならびに/またはアッセイを実行するための少なくとも1つの容器(例えば、チューブ、マイクロタイタープレートまたは細片(これは免疫診断試薬ですでにコーティングされていてよい。))、ならびに/または緩衝液(例えば、アッセイ緩衝液または洗浄緩衝液(これらのいずれか一方は濃縮された溶液として提供され得る。))、検出可能な標識(例えば、酵素標識)の基質溶液、または停止液を含み得る。好ましくは、キットは、アッセイの実施に必要な全ての構成成分、即ち、試薬、標準物質、緩衝液、希釈剤などを含む。説明書はまた、検量線を作製するための説明書、または抗HCV抗体の定量化の目的のための参照基準を含み得る。
本開示は、試験試料中の抗HCV抗体の存在、量、または濃度を決定するための方法を提供する。当該分野で公知の任意の適切なアッセイを、このようなアッセイが1つ以上の本発明のNS3抗原を使用する限りは、本開示の方法において使用することができる。例として、サンドイッチ免疫測定法(例えば、放射性同位体の検出(放射免疫測定法(RIA)を含む。)および酵素検出(酵素免疫測定法(EIA)または酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)(例えば、Quantikine ELISA assay,R&D systems,Minneapolis,Minn.))を含むモノクローナル−ポリクローナルサンドイッチ免疫測定法)、競合阻害免疫測定法(例えば、正方向および逆方向)、蛍光分極免疫測定法(FPIA)、競合的酵素免疫分析法(EMIT)、生物発光共鳴エネルギー転移(BRET)およびホモジニアス化学発光定量法などのような免疫測定法が挙げられるが、これらに限定されるわけではない。
(i)本発明の組換えNS3抗原を含有している少なくとも単離または精製されたポリペプチドおよび少なくとも1つの検出可能な標識を含有している免疫診断試薬を利用する工程、ならびに試験試料中の抗HCV抗体の存在、量、または濃度の直接的または間接的指標としての検出可能な標識により生じたシグナルを、対照もしくは検量用試料(これは場合により、検量用試料のそれぞれが抗HCV抗体の濃度に関してこのシリーズ中の他の検量用試料とは異なる検量用試料のシリーズの一部である。)中の抗HCV抗体の存在、量、または濃度の直接的または間接的指標として生じたシグナルに対して比較する工程。上記方法は以下の工程を含み得る:
(i)試験試料中に存在し得るHCV抗体とともに第1の特異的結合パートナー/抗HCV抗体複合体を形成するように、試験試料を、本発明の1つ以上の組換えNS3抗原を含有している免疫診断試薬と接触させる工程、
(ii)第1の特異的結合パートナー/抗HCV抗体/第2の特異的結合パートナー複合体を形成するように、第1の特異的結合パートナー/抗HCV抗体複合体を、抗HCV抗体(例えば、抗IgG抗体および抗IgM抗体または本明細書中に記載されるポリペプチド)についての少なくとも1つの検出可能であるように標識されている第2の特異的結合パートナーと接触させる工程、および
(iii)(ii)で形成した第1の特異的結合パートナー/抗HCV抗体/第2の特異的結合パートナー複合体中の検出可能な標識により生じたシグナルを検出または測定することにより、試験試料中の抗HCV抗体の存在、量、または濃度を決定する工程。
(i)試験試料を、1つ以上の本発明の組換えNS3抗原を含有している免疫診断試薬と接触させる工程、および、同時にまたはいずれかの順序で連続して、試験試料を、第1の特異的結合パートナーの少なくとも1つの対に対する結合について抗HCV抗体と競合し得る、および検出可能であるように標識されている抗HCV抗体を含む少なくとも1つの検出可能であるように標識されている第2の特異的結合パートナーと接触させる工程であって、ここでは、試験試料中に存在する任意の抗HCV抗体と少なくとも1つの検出可能であるように標識されている第2の特異的結合パートナーとが、第1の特異的結合パートナー/抗HCV抗体複合体および第1の特異的結合パートナー/第2の特異的結合パートナー複合体をそれぞれ形成するように互いに競合する、工程、ならびに、
(ii)(ii)で形成した第1の特異的結合パートナー/第2の特異的結合パートナー複合体中の検出可能な標識により生じたシグナルを検出または測定することにより、試験試料中の抗HCV抗体の存在、量、または濃度を決定する工程であって、ここでは、第1の特異的結合パートナー/第2の特異的結合パートナー複合体中の検出可能な標識により生じたシグナルが、試験試料中の抗HCV抗体の量または濃度に反比例する、工程。免疫診断試薬に含まれる組換えNS3抗原が微粒子上にコーティングされ得る。これに関して、免疫診断試薬に含まれるNS3抗原を、さらなるHCV抗原として同じ微粒子上に一緒にコーティングすることができる。免疫診断試薬に含まれるポリペプチドが同じ微粒子上に一緒にコーティングされる場合は(例えば、4%の固形分を含有している微粒子懸濁液(4重量%/容積の微粒子または4grの微粒子/100mLの微粒子懸濁液))、好ましくは、ポリペプチドが、約1:2から約1:6の比で同じ微粒子上に一緒にコーティングされる。ここでは、ポリペプチドが約1:2の比で同じ微粒子上に一緒にコーティングされる場合は、本発明の単離または精製されたNS3抗原(例えば、表1に記載されるもの)の濃度は少なくとも約40μg/mLであり、他の単離または精製されたポリペプチドの濃度は少なくとも約80μg/mLである。試験試料が患者から得られた場合は、上記方法にはさらに、患者の治療的/予防的処置の有効性を診断する、予後判定する、または評価する工程が含まれ得る。上記方法が患者の治療的/予防的処置の有効性を評価する工程をさらに含む場合は、上記方法は、有効性を改善する必要がある患者の治療的/予防的処置を改変する工程をさらに含んでもよい。上記方法は、自動化システムまたは半自動化システムでの使用に適応させることができる。
(i)提示される本発明の少なくとも1つのNS3抗原、少なくとも1つの検出可能な標識を含有している免疫診断試薬を利用する工程、および
(ii)試験試料中の抗HCV抗体の存在、量、または濃度の直接的または間接的指標としての検出可能な標識により生じたシグナルを、対照もしくは検量用試料(これは場合により、検量用試料のそれぞれが抗HCV抗体の濃度に関してこのシリーズ中の他の検量用試料とは異なる検量用試料のシリーズの一部である。)中の抗HCV抗体の存在、量、または濃度の直接的または間接的指標として生じたシグナルに対して比較する工程。上記方法は以下の工程を含み得る:
(i)第1の特異的結合パートナー/抗HCV抗体複合体を形成するように、試験試料を、本発明の少なくとも1つの組換えNS3抗原を含有している免疫診断試薬と接触させる工程、
(ii)第1の特異的結合パートナー/抗HCV抗体/第2の特異的結合パートナー複合体を形成するように、第1の特異的結合パートナー/抗HCV抗体複合体を、抗HCV抗体(例えば、抗IgG抗体および抗IgM抗体または本明細書中に記載されるポリペプチド)についての少なくとも1つの検出可能であるように標識されている第2の特異的結合パートナーと接触させる工程、および
(iii)(ii)で形成した第1の特異的結合パートナー/抗HCV抗体/第2の特異的結合パートナー複合体中の検出可能な標識により生じたシグナルを検出または測定することにより、試験試料中の抗HCV抗体の存在、量、または濃度を決定する工程。代わりに、上記方法は以下の工程を含み得る:
(i)試験試料を、少なくとも1つの本発明の組換えNS3抗原を含有している免疫診断試薬と接触させる工程、および、同時にまたはいずれかの順序で連続して、試験試料を、第1の特異的結合パートナーの少なくとも1つの対に対する結合について抗HCV抗体と競合し得る、および検出可能であるように標識されている抗HCV抗体を含む少なくとも1つの検出可能であるように標識されている第2の特異的結合パートナーと接触させる工程であって、ここでは、試験試料中に存在する任意の抗HCV抗体と少なくとも1つの第2の特異的結合パートナーとが、第1の特異的結合パートナー/抗HCV抗体複合体および第1の特異的結合パートナー/第2の特異的結合パートナー複合体をそれぞれ形成するように互いに競合する、工程、ならびに、
(ii)(ii)で形成した第1の特異的結合パートナー/第2の特異的結合パートナー複合体中の検出可能な標識により生じたシグナルを検出または測定することにより、試験試料中の抗HCV抗体の存在、量、または濃度を決定する工程であって、ここでは、第1の特異的結合パートナー/第2の特異的結合パートナー複合体中の検出可能な標識により生じたシグナルが、試験試料中の抗HCV抗体の量または濃度に反比例する、工程。免疫診断試薬に含まれるポリペプチドが微粒子上にコーティングされ得る。これに関して、免疫診断試薬に含まれるポリペプチドを同じ微粒子上に一緒にコーティングすることができる。免疫診断試薬に含まれるポリペプチドが同じ微粒子上に一緒にコーティングされる場合は(例えば、4%の固形分を含有している微粒子懸濁液(4重量%/容積の微粒子または4grの微粒子/100mLの微粒子懸濁液))、好ましくは、ポリペプチドが、約1:2から約1:6の比で同じ微粒子上に一緒にコーティングされる。ここでは、ポリペプチドが約1:2の比で同じ微粒子上に一緒にコーティングされる場合は、本発明の組換えNS3抗原を含有している単離または精製されたポリペプチドの濃度は少なくとも約40μg/mLであり、他の単離または精製されたポリペプチドの濃度は少なくとも約80μg/mLである。試験試料が患者から得られた場合は、上記方法にはさらに、患者の治療的/予防的処置の有効性を診断する、予後判定する、または評価する工程が含まれ得る。上記方法が患者の治療的/予防的処置の有効性を評価する工程をさらに含む場合は、上記方法は場合により、有効性を改善する必要がある患者の治療的/予防的処置を改変する工程をさらに含み得る。上記方法は、自動化システムまたは半自動化システムでの使用に適応させることができる。
(a)被験体由来の試験試料中の抗HCV抗体の濃度または量を(例えば、本明細書中に記載される方法または当該分野で公知の方法を使用して)決定する工程;および
(b)工程(a)で決定した抗HCV抗体の濃度またな量を予め決定したレベルと比較する工程であって、ここでは、工程(a)で決定した抗HCV抗体の濃度または量が予め決定されたレベルに対して好ましい場合には、被験体を、肝炎を有していないまたは肝炎のリスクがないと決定する。しかし、工程(a)で決定した抗HCV抗体の濃度または量が予め決定されたレベルに対して好ましくない場合は、被験体を、肝炎を有しているまたは肝炎のリスクがあると決定する。
(a)被験体由来の試験試料中の抗HCV抗体の濃度または量を決定する工程;
(b)被験体由来の後の時点の試験試料中の抗HCV抗体濃度または量を決定する工程;および
(c)工程(b)で決定した抗HCV抗体の濃度または量を、工程(a)で決定した抗HCV抗体の濃度または量と比較する工程であって、ここでは、工程(b)で決定した濃度または量が、工程(a)で決定した抗HCV抗体の濃度または量と比較して、変化していないかまたは望ましくない場合は、被験体の疾患を、継続している、進行している、または悪化していると決定する。比較により、工程(b)で決定した抗HCV抗体の濃度または量が工程(a)で決定した抗HCV抗体の濃度または量と比較して好ましい場合は、被験体の疾患を、継続していない、退行している、または改善していると決定する。
本明細書中に記載される免疫測定法により試験試料中の抗HCV抗体の濃度を決定するキット(またはこの構成成分)ならびに方法は、例えば、米国特許第5,089,424号明細書および同第5,006,309号明細書に記載されているような、ならびに例えば、ARCHITECT(R)としてAbbott Laboratories(Abbott Park,Ill.)市販されているような、様々な自動化システムおよび半自動化システム(固相が微粒子を含有するシステムを含む。)での使用に適応させることができる。
HCV NS3 9NB49Hのクローニングおよび発現
HCVのアミノ酸1192−1457(配列番号2)をコードするヌクレオチド配列(配列番号1)を、大腸菌(E.coli)での発現のためにコドン最適化し、改変されたpET32aベクターにクローニングした。ここでは、チオレドキシン融合タンパク質をコードする配列を排除し、メチオニン(M)で置き換えた。加えて、カルボキシ末端のヘキサヒスチジンタグを固定化金属アフィニティークロマトグラフィー(IMAC)により精製を容易にするために含めた。大腸菌(E.coli) BL21(DE3)細胞を精製したプラスミドDNAで形質転換し、形質転換体をスクリーニングした。得られるプラスミドをp9NB49Hと命名し、これから発現されるタンパク質を9NB49Hと命名した。
HCV NS3 Nbt−9NB49Hのクローニングおよび発現
実施例1に記載したNS3 9NB49Hタンパク質をコードするヌクレオチド配列を、改変したpET32aプラスミドにサブクローニングした。ここでは、オープンリーディングフレームは、NS3をコードする配列の上流にGSGSNSMリンカー配列を持つアミノ末端のビオチニル化タグ(MSGLNDIFEAQKIEWHE)、後ろに続くカルボキシル末端のヘキサヒスチジンタグ、後ろに続く終結コドンをコードする。得られたプラスミドをpNbt−9NB49Hと命名した。Beckett et al.(Protein Science,8(4):921−929,1999)により記載されているビオチニル化タグは、大腸菌(E.coli) BirA遺伝子によりコードされるビオチンリガーゼ酵素を介する部位特異的ビオチンの取り込みを可能にする。大腸菌(E.coli) BL21(DE3)細胞に、pNbt−9NB49H発現プラスミドおよびIPTG誘導性プロモーターの制御下でビオチンリガーゼを発現する第2のプラスミド(pBirAcm)を同時に形質転換した。細胞を、振盪フラスコの中、37℃で、0.050mMの最終濃度になるようにビオチンを添加したTerrific Broth中で0.50のOD600nmまで増殖させ、その後、1mMのIPTGで誘導し、25℃で一晩増殖させた。その後、細胞を遠心分離により回収し、溶解緩衝液中に再懸濁し、超音波処理して細胞を破壊した。幾つかの場合には、高レベルの部位特異的ビオチニル化をさらに確実にするために、ATPおよびビオチンを溶解させた細胞に添加し(それぞれ、3mMおよび0.25mMの最終濃度)、室温で2時間インキュベートした。次に、組換えタンパク質を実施例1に記載したようにIMACにより精製した。
HCV NS3 9NB49H−Cbtのクローニングおよび発現
実施例1に記載したNS3 9NB49Hタンパク質をコードするヌクレオチド配列を、改変したpET32aベクターにサブクローニングした。ここでは、オープンリーディングフレームは、N末端のメチオニン、後ろに続くNS3、後ろに続くGSGSGリンカーとヘキサヒスチジンタグ、後ろに続くGGリンカーおよびビオチニル化タグ(GLNDIFEAQKIEWHE)、および最後に終結コドンをコードする。得られたプラスミドをp9NB49H−Cbtと命名した。タンパク質発現およびビオチニル化は、実施例1および2に記載したように行った。
HCV NS3 9NB49H−Cbt突然変異体のクローニングおよび発現
実施例3に記載した9NB49H−Cbtをコードするヌクレオチド配列を、システインコドンをセリンコドンで置換するために部位特異的に突然変異させた。突然変異させた位置を以下の表に記載する。ここでは、HCVポリタンパク質配列のコドン(アミノ酸)番号はKuiken et al.(Hepatology,2006,44(5):1355−1361)により記載されている番号に基づく。組換えタンパク質の発現、精製およびビオチニル化は、実施例1および2に記載したように行った。
HCV NS3hおよびこの変異体のクローニングおよび発現
組換えHCV NS3ヘリカーゼ変異体を、以下の表に記載するように、および図1に示すように、HCV NS3ヘリカーゼの様々な領域に融合させたp9NB49H(即ち、HCVポリタンパク質のアミノ酸1192−1215)により発現される同じアミノ末端を使用することにより構築した。ヘリカーゼ構築物をコードするヌクレオチド配列を、実施例1に記載したようなカルボキシル末端のGSGSG−ヘキサヒスチジンタグまたは実施例2に記載したようなカルボキシル末端のGSGSG−ヘキサヒスチジン−GG−ビオチニル化タグのいずれかを持つ改変したpET32aベクター(マイナスチオレドキシン融合体)にクローニングした。NS3ヘリカーゼの第3のドメインを含有している全ての構築物は、カルボキシル末端のSGSGSG−ヘキサヒスチジンタグ、またはカルボキシル末端のSGSGSG−ヘキサヒスチジン−GG−ビオチニル化タグを含む。ビオチニル化されているタンパク質またはビオチニル化されていないタンパク質の発現および精製を、実施例1および2に記載したように行った。
全長のHCV NS3ヘリカーゼ変異体のクローニングおよび発現
実施例5に記載した全長のNS3h(ヘリカーゼ)タンパク質をコードするプラスミド(pNS3h−Cbt)を、標準的な方法を使用して部位特異的に突然変異させて、選択したコドンを以下の表に記載するように置き換えた(即ち、置換した)突然変異体クローンを作製した。
改変されたC末端を持つHCV NS3ヘリカーゼ変異体のクローニングおよび発現
実施例5に記載した全長のNS3h(ヘリカーゼ)タンパク質をコードするプラスミド(pNS3h)を、NS3hをコードする領域(HCV aa1192−1657)の下流に、インフレームのSGSGSGに連結されたオクタヒスチジンタグ、この後ろに続く以下の表に記載するようなさらなるHCV NS3ヘリカーゼ配列、この後ろに続く終結コドンをコードする配列を含むように改変した。
発酵、タンパク質の発現、および精製
NS3組換えタンパク質(例えば、9NB49HもしくはNS3h、またはこれらの変異体)を、10Lの発酵槽で培養した大腸菌(E.coli)BL21(DE3)細胞中で発現させた。Superbroth(SB)Media(炭素源としてグリセロールを含む富化培地)を含有している振盪フラスコの中で増殖させた120mLの種培養物を使用して、SB培地を含有している10Lの発酵槽に接種した。細胞を、8から12の600nmでの光学密度に達するまで、37℃で増殖させた。タンパク質の発現をイソプロピルβ−D−1−チオガラクトピラノシド(IPTG)を、1mMの最終濃度になるように添加することにより誘導した。その後、培養物を25から37℃でさらに4時間増殖させた。その後、細胞を発酵槽から回収し、次に、中空繊維膜フィルターを通過させて、回収したものを10Lの容積で出発して1から2Lに濃縮した。その後、濃縮した細胞を遠心分離によりペレット状にし、上清を除去し、得られたペレットをタンパク質精製に使用するまで−80℃で保存した。
アクリジニウム−ウシ血清アルブミン(Acr−BSA)の調製
防腐剤として0.1%のアジ化ナトリウムを含有しているウシ血清アルブミン(BSA)の30%の溶液(300mg/mL)を、商業的な供給業者(Proliant Biologicals,Ankeny,IA)から購入した。1ml(300mg)の30%のBSA溶液を、2.0mLの0.1MのPBS(pH8.0)で希釈し、0.5から3.0mLのSlide−A−Lyzer透析カセット(ThermoFisher,Waltham,MA)に移し、2から8℃で一晩、0.1MのPBS(pH8.0)に対して透析した(2回の交換、600mL/交換)。透析したBSA溶液の濃度は、280nmでのUV吸光度に基づくと97.1mg/mLであった。200mg(2.060mL、3.0umol、1.0mol等量)の97.1mg/mLのBSA溶液を、10.181mLの0.1MのPBS(pH8.0)を含有している琥珀色のガラスバイアルに添加した。この混合物に対して、DMF[N,N−ジメチルホルムアミド]中の39mg(1.092mL、45umol、15.0モル等量)のSPSP−アクリジニウム活性エステルを添加した。反応バイアルに蓋をした。溶液を350rpmで30分間撹拌することにより混合し、その後、室温に一晩(20から26時間)置いた。インキュベーション後、遊離のアクリジニウムおよび凝集物をクロマトグラフィーにより(Sephacryl HR S−200カラム、GE Healthsciences,PA)、0.01MのPBS/0.1%のCHAPS(pH6.3)ランニング緩衝液を使用して除去した。単量体Acr−BSA結合体に対応する画分をプールし、UV分光測定法(240から600nmのスキャン)により特性決定した。280nmおよび370nmでの吸光度の値を使用して、タンパク質濃度を決定し、BSA分子あたりのアクリジニウムの取り込みを計算した。計算したタンパク質濃度は6.779mg/mLであり、BSA分子あたり6.2アクリジニウムの平均数を有していた。
アクリジニウム−BSA−9NB49H結合体の調製
マレイミド活性化Acr−BSAの調製。PBS/0.1%のCHAPS(pH6.3)中のAcr−BSA(実施例8;13.5mg、202nmol、1.0mol等量)1.99mLを琥珀色のガラスバイアルに添加し、0.254mLの0.4Mのホスフェート/8mMのEDTA/1.6%のCHAPS(pH7.4)で処理して、反応物のpHを7.4に調整した。均質な溶液に対して、0.040mL(0.35mg、4.0mol等量)の、スクシンイミジル4−(Nマレイミドメチル)−シクロヘキサン−1−カルボキシレート(Sulfo−SMCC,Pierce Chemical Co.,Rockford,Ill)の新鮮な0.02Mの水溶液を添加した。反応バイアルに蓋をした。溶液を発泡させずに20分間撹拌し、その後、暗所で60から90分間、室温で静的にインキュベートした。0.1MのPBS/0.1%のCHAPS/5mMのEDTA(pH6.7)で予め平衡化したZebaスピンカラム(Pierce,Rockford,Ill)を利用することにより、反応混合物を脱塩して取り込まれていないスルホ−SMCCを取り除いた。溶離させたAcr−BSA−Mal試薬の吸光度を280nmおよび370nmで測定してタンパク質濃度を概算した。計算したタンパク質濃度は6.28mg/mLであった。Acr−BSA−MalをHCV NS3抗原の結合にすぐに使用した。
アクリジニウム−BSA−NS3h結合体の調製
(LC)マレイミド活性化Acr−BSAの調製。PBS/0.1%のCHAPS(pH6.3)中のAcr−BSA(実施例8;3.0mg、0.443mL、45nmol、即ち1.0mol等量)を琥珀色のガラスバイアルに添加し、0.058mLの0.4Mのホスフェート/8mMのEDTA/1.6%のCHAPS(pH7.4)緩衝液で処理して、反応物のpHを7.4に調整した。均質な溶液に対して、0.018mL(0.080mg、180nmol、4.0mol等量)の、ジメチルスルホキシド(DMSO,Sigma Aldrich,St Louis,MO)中の0.01Mのスクシンイミジル4−(N−マレイミドメチル)シクロヘキサン−1−カルボキシ−(6−アミドカプロエート)(Lon ChainまたはLC−SMCC,Pierce Chemical Co.,Rockford,Ill)の新鮮な溶液を添加した。反応バイアルに蓋をした。溶液を発泡させずに20分間撹拌し、その後、暗所で60分間、室温で静的にインキュベートした。反応混合物を脱塩して、取り込まれていないLC−SMCCを、0.1MのPBS/0.1%のCHAPS/5mMのEDTA(pH6.7)で予め平衡化したZebaスピンカラム(Pierce,Rockford,Ill)を利用することにより取り除いた。溶離したAcr−BSA−Mal試薬の吸光度を280nmおよび370nmで測定してタンパク質濃度を概算した。計算したタンパク質濃度は5.25mg/mLであった。Acr−BSA−(LC)Malを次の結合工程にすぐに使用した。
磁性微粒子に基づく自動化された免疫測定法
HCV NS3由来タンパク質を、常磁性微粒子および化学発光結合体を利用する自動化された免疫分析装置(ARCHITECT(R)システム;Abbott Laboratories;「Bulk Reagent Random−Access Analyzer:ARCHITECT i2000」Frank A.Quinn,pages 363−367,In The Immunoassay Handbook,第3版、David Ward編,Nature Publishing Group,London,UK;米国特許第5,795,784号明細書および米国特許第5,856,194号明細書を参照のこと)を使用して、抗HCV NS3抗体を検出するこれらの能力について試験した。試験したアッセイ形式には、2工程の形式または1工程の形式を含めた。一般的には、アッセイは、2つの形式:2工程および1工程(「疑」1工程とも記載される。)を含むと記載することができる。2工程の形式では、ヒト試料、アッセイ特異的希釈剤緩衝液、および組換え抗原をコーティングした常磁性微粒子を反応容器に混合し、ボルテックスし、18分間インキュベートする。ここでは、組換え抗原に特異的な抗体が微粒子によって捕捉される。このインキュベーション後、微粒子/免疫複合体を、磁石を使用して反応容器の側面に停止させ、反応上清を取り出した。その後、微粒子を水/界面活性剤溶液で洗浄した。第2の工程では、微粒子に結合した試料由来の抗体が、アクリジニウムで標識された結合体を含有している緩衝液中での粒子の懸濁およびインキュベーション(4分)により検出される。結合体は、ヒト免疫グロブリン(単数または複数)に特異的なアクリジニウムで標識された抗体、またはアクリジニウムで標識された組換え抗原であり得る。結合体とのインキュベーションの後に、第2の洗浄工程、ならびに最終的には、アクリジニウムの活性化、および光の出力の同時の測定(これは、微粒子上に結合した結合体の量に比例する。)を続いて行う。
免疫測定法の形式
以下のアッセイ形式を使用した:
陰性対照試料は、再石灰化した非反応性ヒト血漿(HBsAgに対して非反応性、および抗HCV、HIV−1 RNA、またはHIV−1 Ag、抗HIV 1/HIV−2および抗HTLV−I/HTLV−IIについては陰性)である。
9NB49HおよびCysからSerへの突然変異体の免疫反応性
9NB49H組換え体およびこの突然変異体の相対的な免疫反応性を、還元剤の存在下および非存在下で測定した。アッセイは、既知の抗HCV NS3陽性血漿プール(パネルB)およびHCV抗体陰性の正常なヒト血清を使用し、実施例13に記載したような様々なアッセイ形式を使用して行った。以下の表に示す結果は、シグナル対陰性比(S/N)として表す。システイン3のセリンでの置換により、野生型9NB49Hと比較してアッセイ形式2の感度が改善した。システイン4のセリンでの置換により、野生型9NB49Hと比較してアッセイ形式3の感度が改善した。システイン1または2のセリンでの置換によっては、全4種のアッセイ形式において感度に最大の負の影響があった。システイン3のセリンでの置換により、アッセイ形式2、3、および4においては、還元剤の存在下または非存在下の間で観察された相違が小さくなった。アッセイ形式3(直接的1工程/Fly上での捕捉)は、使用したHCVタンパク質とは無関係に最大の全体的な感度を示した。システイン3のセリンでの置換は、アッセイ形式3においては、感度を維持しつつ、還元剤の影響を低下させた。
HCV 9NB49H−Cbt対9NB49H−Cbt−C3Sのセロコンバージョンの感度
実施例14に示すように、アッセイ形式3(直接的1工程/Fly上での捕捉)は、HCV抗体陽性血漿プールを試験することにより得たS/N値により測定すると、最大の全体的な感度を示した。加えて、9NB49H突然変異体(ここでは、3番目のシステイン残基がセリンで置換されている。)は、還元剤に対して最大の耐性を示した。野生型およびC3S突然変異体の相対的な感度を、直接的1工程/Fly上での捕捉のアッセイ方法(形式3)を使用し、HCVに感染したヒト個体由来のセロコンバージョンパネル(パネル919および6228)を試験することにより決定した。10.0のS/Nを陽性についてのカットオフとして使用した。従って、S/N≧10.0を持つ試料を反応性と考え、S/N<10.0を持つ試料を非反応性と考える。各セロコンバージョンパネルによる血清学的陽性試料を(+)で、非反応性を(−)で示す。パネルBを陽性対照として使用した。結果を以下の表に示す。9NB49H−C3S−Cbtタンパク質は一般的には、より高いS/N値を生じ、さらなるパネルのメンバーもまた野生型タンパク質と比較して陽性であると検出した。
NS3hドメイン変異体のセロコンバージョンの感度
HCVに感染した個体の間で免疫反応性に寄与しているHCV NS3ヘリカーゼタンパク質(NS3h)のドメインを特定するために、組換えタンパク質のコレクションを実施例5に記載したように作製した。これらの部位特異的ビオチニル化タンパク質をアッセイ形式5(間接的2工程/Fly上での捕捉、実施例13)において使用して、HCVの陽性対照であるヒト血漿のプール(パネルB)と、HCVに感染したヒト個体由来のセロコンバージョンパネルのセット(パネル6224、6228、および9044)を使用することにより、それらの免疫反応性を測定した。10.0のS/Nを陽性についてのカットオフとして使用した。従って、S/N≧10.0を持つ試料を反応性と考え、S/N<10.0を持つ試料を非反応性と考える。パネルBを陽性対照として使用した。S/N比として表した結果を以下の表に示す。NS3h−Cbt−C3Sは最大のセロコンバージョンの感度を生じ(最も反応性が高い採血物)、NS3h−Cbtタンパク質がこの後に続く。NS3h−Cbt−C3Sは、9NB49H−Cbtと比較して、パネルのメンバーに応じて2から15倍大きいS/Nを生じた。NS3h−Cbtは、9NB49H−Cbtと比較して、パネルのメンバーに応じて3から10倍大きいS/Nを生じた。NS3h−d1−Cbt抗原は、9NB49Hがd1−Cbtと表される領域を含むという事実にもかかわらず、9NB49H−Cbtと比較して、パネルのメンバーに応じて、2倍大きいS/Nを示した。
9NB49H、NS3h、およびNS3h−C3Sの相対的免疫反応性
最も高い抗体検出アッセイ感度を提供したNS3タンパク質の組み合わせを特定するために、HCV NS3組換えタンパク質の様々な組み合わせをアッセイ形式3(直接的1工程/Fly上での捕捉、実施例13)を使用することにより試験した。HCV NS3タンパク質をAcr−BSA(アクリジニウムで標識されたBSA)で標識した、および/または部位特異的ビオチニル化捕捉タンパク質(即ち、C末端がビオチニル化されたタグ即ちCbtを保有している。)として使用した。後者を、3種類の濃度で試験した。HCVの陽性対照であるヒト血漿プール(パネルB)を陽性対照として使用し、HCV抗体について陰性であることがわかっている正常なヒト血漿のプールを陰性対照として使用した。結果を以下の表に示し、相対的な光の単位(RLU)として表す。HCV NS3タンパク質の全ての組み合わせが、陽性対照試料中に存在する抗体を検出した。しかし、NS3h−CbtとAcr−BSA−NS3hの組み合わせが最も高い感度を示した。
9NB49H、NS3h、およびNS3h−C3Sのセロコンバージョンの感度
NS3組換え抗原の様々な組み合わせを、HCVに感染した個体由来のセロコンバージョンパネルのセット由来の個々の血清試料の間で、抗体を検出するそれらの能力について試験した。データはアッセイ形式3(直接的1工程/Fly上での捕捉、実施例13)を使用して作成した。10.0のS/Nを陽性についてのカットオフとして使用した。従って、S/N≧10.0を持つ試料を反応性と考え、S/N<10.0を持つ試料を非反応性と考える。パネルBを陽性対照として使用した。S/N比として表した結果を以下の表に示す。Acr−BSA−NS3hおよびNS3h−Cbtを使用したアッセイが、最大のセロコンバージョンの感度を生じた、即ち、最高のS/N値で検出された最も反応性が高いパネルのメンバーであった。
NS3h変異体の相対的な免疫反応性
ヒト抗NS3抗体に対する実施例6に記載したNS3h変異体の相対的な免疫反応性を比較するために、以下の方法を、ビオチニル化NS3タンパク質のストレプトアビジン微粒子捕捉における可能性がある相違を管理するために使用した。上記方法では、実施例13に記載したアッセイ形式5を使用し、ここでは、試験しようとする精製されたNS3組換え抗原を、試験前に同じタンパク質濃度になるように検体希釈剤緩衝液中に希釈した。希釈した抗原の同じセットを2つのアッセイで、いずれもアッセイ形式5を使用して試験する。ここでは、第1のアッセイ工程においてストレプトアビジン微粒子により捕捉されたNS3タンパク質を、(a)NS3に特異的な抗体を含むことがわかっている抗HCV NS3陽性ヒト血漿プール(即ち、実施例14に記載したパネルB)および(b)この配列が存在し、NS3組換えタンパク質とこの変異体(即ち、9NB49HおよびNS3h)の間で保存されているアミノ末端の直鎖エピトープに特異的な抗NS3マウスモノクローナル抗体により、試験する/調べる。結合した抗NS3ヒト抗体の量を、アクリジニル化抗ヒトIgG結合体を使用することにより決定した。粒子に結合した抗NS3モノクローナル抗体の量を同じアッセイ形式により決定したが、抗ヒトIgG結合体を、ヤギで惹起させ、アクリジニウムで標識した抗マウスポリクローナル抗体で置き換えた。2つのアッセイの間でのRLUの比は、常磁性微粒子上のNS3組換え抗原の量に対する抗NS3ヒト抗体免疫反応性の正規化のための手段を提供する。正規化された免疫反応性は、33×抗マウスアッセイによるRLUのlog10で抗ヒトアッセイによるRLUのものを割り算することにより計算される。データのこの変換により、2つのアッセイの間での直接的な線形相関を確立することができた。
NS3hタンパク質の直接的標識対間接的標識の相対的感度
NS3h組換え抗原を「間接的に」、即ち、実施例11に記載したようなアクリジニウムで標識されたBSAのシステイニル−チオールへの結合により、または実施例11に記載したようなアクリジニウム−マレイミドを使用することにより「直接的に」標識した。
Claims (55)
- ヘリカーゼのドメインI、IIおよびIIIのそれぞれを含むNS3ヘリカーゼ配列を含有している組換えHCV NS3抗原であって、ここでは、前記抗原が、C33抗原と比較して試験試料由来のHCV抗体に対して増大した免疫反応性を有し、ここでは、前記組換えHCV NS3抗原が:
野生型NS3ヘリカーゼのATP結合活性と比較して低下したATP結合活性
野生型NS3ヘリカーゼのATP結合活性と比較した野生型NS3と比較して低下したATPase活性、および
野生型NS3ヘリカーゼの酸化還元安定性と比較して増大した酸化還元安定性
からなる群より選択される1つ以上の特徴を含む、
組換えHCV NS3抗原。 - 前記抗原が、前記NS3ヘリカーゼのC末端に少なくとも1つのシステイン残基の付加をさらに含む、請求項1に記載の組換えHCV NS3抗原。
- 前記抗原が、前記NS3ヘリカーゼのC末端に2つのシステイン残基の付加を含む、請求項2に記載の組換えHCV NS3抗原。
- 前記野生型HCV NS3が配列番号87の配列を含み、前記抗原が配列番号87の配列と比較して少なくとも1つの突然変異を含む、請求項1に記載の組換えHCV NS3抗原。
- 前記突然変異が、前記配列番号87の1つ以上のシステイン残基の任意の他のアミノ酸への突然変異を含む、請求項4に記載の組換えHCV NS3抗原。
- 前記突然変異が、前記1つ以上のシステイン残基の対応するセリン残基への突然変異を含む、請求項4に記載の組換えHCV NS3抗原。
- 前記突然変異が、HCV NS3ヘリカーゼのドメインIII由来のシステイン残基の1つ以上の突然変異を含む、請求項6に記載の組換えHCV NS3抗原。
- 前記システイン残基の突然変異が、配列番号87のC292、C368、C374、C499およびC525からなる群より選択される1つ以上のシステイン残基の突然変異を含む、請求項5に記載の組換えHCV NS3抗原。
- 前記抗原が、少なくとも2つの前記システイン残基が対応するセリン残基によって置き換えられているHCV NS3突然変異体である、請求項5に記載の組換えHCV NS3抗原。
- 前記抗原が、前記NS3ヘリカーゼのC末端に少なくとも1つのシステイン残基の付加をさらに含む、請求項5に記載の組換えHCV NS3抗原。
- ATP結合を減少させるかまたはATPase活性を低下させる前記突然変異が、配列番号87のK210、S211、T212、Y241、D290、E291、H293、T419、Q460、R464、R467およびW501からなる群より選択される1つ以上のアミノ酸残基の任意の他のアミノ酸残基での置き換えである、請求項4に記載の組換えHCV NS3抗原。
- 前記突然変異が、配列番号87と比較してK210N、S211A、T212E、Y241S、D290N、E291Q、H293A、T419G、Q460H、R464A、R467KおよびW501Aからなる群より選択される、請求項11に記載の組換えHCV NS3抗原。
- 前記抗原が、前記配列番号87の1つ以上のシステイン残基の任意の他のアミノ酸への突然変異をさらに含む、請求項11に記載の組換えHCV NS3抗原。
- 前記配列番号87の1つ以上のシステイン残基の前記突然変異が、配列番号87のC292、C368、C374、C499およびC525からなる群より選択される1つ以上のシステイン残基の突然変異を含む、請求項13に記載の組換えHCV NS3抗原。
- 前記抗原が、前記NS3ヘリカーゼのC末端に少なくとも1つのシステイン残基の付加をさらに含む、請求項11に記載の組換えHCV NS3抗原。
- 前記抗原が、前記NS3ヘリカーゼのC末端に少なくとも1つのシステイン残基の付加をさらに含む、請求項14に記載の組換えHCV NS3抗原。
- 前記NS3ヘリカーゼのC末端でのシステイン残基の前記付加が、GGCSGGA、DECHSTDおよびSKKKCDEからなる群より選択される配列の前記NS3ヘリカーゼのC末端への付加を含む、請求項15に記載の組換えHCV NS3抗原。
- 前記NS3ヘリカーゼのC末端でのシステイン残基の前記付加が、GGCSGGA、DECHSTDおよびSKKKCDEからなる群より選択される配列の前記NS3ヘリカーゼのC末端への付加を含む、請求項16に記載の組換えHCV NS3抗原。
- 前記NS3ヘリカーゼのC末端での少なくとも1つのシステイン残基の前記付加が、GSGSGHHHHHHHHGGCSGGARSGC、GSGSGHHHHHHHHDECHSTDRSGCおよびGSGCGHHHHHHHHGGCSGGAからなる群より選択される配列の付加を含む、請求項15に記載の組換えHCV NS3抗原。
- 前記NS3ヘリカーゼのC末端での少なくとも1つのシステイン残基の前記付加が、GSGSGHHHHHHHHGGCSGGARSGC、GSGSGHHHHHHHHDECHSTDRSGCおよびGSGCGHHHHHHHHGGCSGGAからなる群より選択される配列の付加を含む、請求項16に記載の組換えHCV NS3抗原。
- 前記C末端配列が、シグナルを発生する部分への結合により修飾されている、請求項18、19、または20のいずれか一項に記載の組換えHCV NS3抗原。
- 前記抗原がヒスチジンタグをさらに含む、請求項15に記載の組換えHCV NS3抗原。
- 前記抗原がヒスチジンタグをさらに含む、請求項16に記載の組換え体。
- 前記ヒスチジンタグが配列番号87のC末端と前記付加された配列のN末端との間に配置されている、請求項22に記載の組換えHCV NS3抗原。
- 前記ヒスチジンタグが配列番号87のC末端と前記付加された配列のN末端との間に配置されている、請求項23に記載の組換えHCV NS3抗原。
- 前記抗原がビオチニル化されている、請求項1から25のいずれかに記載の組換えHCV NS3抗原。
- 前記ビオチニル化が前記抗原のN末端にある、請求項26に記載の組換えHCV NS3抗原。
- 前記ビオチニル化が前記抗原のC末端にある、請求項26に記載の組換えHCV NS3抗原。
- 前記ビオチニル化が部位特異的ビオチニル化である、請求項26に記載の組換えHCV NS3抗原。
- 請求項1から29のいずれかに記載の組換えHCV抗原をコードする単離された核酸。
- 請求項30に記載の単離された核酸を含有している発現ベクター。
- 請求項31に記載の発現ベクターで形質転換されたかまたはトランスフェクトされた宿主細胞。
- 前記宿主細胞が大腸菌(E.coli)細胞である、請求項32に記載の宿主細胞。
- 請求項1から29のいずれかに記載の組換えHCV抗原を含有している免疫診断試薬。
- 固体支持体をさらに含有している、請求項34に記載の免疫診断試薬。
- 前記固体支持体が微粒子であり、前記組換え抗原が前記微粒子に結合させられている、請求項34に記載の免疫診断試薬。
- 前記組換え抗原が蛍光標識で検出可能であるように標識されている、請求項34に記載の免疫診断試薬。
- 請求項34に記載の免疫診断試薬を含有しており、抗HCV抗体と免疫反応性であるエピトープを含有しているさらなる単離されたHCV抗原をさらに含有している、キット。
- 前記さらなるHCV抗原がHCVコア抗原である、請求項38に記載のキット。
- 前記組換えHCV NS3抗原と前記さらなるHCV抗原が同じ固相上に一緒にコーティングされる、請求項38に記載のキット。
- 前記組換えHCV NS3抗原と前記コア抗原が別の固相上にコーティングされる、請求項38に記載のキット。
- ヒト抗体の検出のための抗体をさらに含有している、請求項41に記載のキット。
- 検出可能な標識を含有してもよい抗HCV抗体をさらに含有している、請求項41に記載のキット。
- 試験試料中の抗HCV抗体の存在を決定する免疫測定法であって、前記試験試料中の前記組換えHCV NS3抗原と前記抗HCV抗体との間で複合体を形成させる条件下で、前記試験試料を請求項34に記載の免疫診断薬と接触させる工程、および前記複合体の存在を検出する工程を含み、ここでは、前記複合体の存在が前記試験試料中の抗HCV抗体の指標となる、免疫測定法。
- 前記複合体の形成の前記検出が、標識された抗ヒト抗体の前記複合体に対する結合の決定により検出される、請求項44に記載の免疫測定法。
- 前記標識された抗ヒト抗体が蛍光標識で標識される、請求項45に記載の免疫測定法。
- 前記標識された抗ヒト抗体がアクリジニウムで標識される、請求項45に記載の免疫測定法。
- 組換えHCV NS3抗原が微粒子上にコーティングされる、請求項44に記載の免疫測定法。
- 前記方法が、HCVコア抗原に対する抗体の存在を決定するために前記試験試料をアッセイする工程をさらに含む、請求項44に記載の免疫測定法。
- 前記組換えHCV NS3抗原と前記HCVコア抗原が同じ微粒子上に一緒にコーティングされる、請求項49に記載の免疫測定法。
- 前記組換えHCV NS3抗原と前記HCVコア抗原が別の微粒子上にコーティングされる、請求項49に記載の免疫測定法。
- 試験試料が患者から得られ、方法が、患者の治療的/予防的処置の有効性を診断、予後判定、または評価する工程をさらに含み、ここでは、方法が患者の治療的/予防的処置の有効性を評価する工程をさらに含む場合は、方法は、有効性を改善することが必要な患者の治療的/予防的処置を改変する工程をさらに含んでもよい、請求項49に記載の免疫測定法。
- 方法が、自動化システムまたは半自動化システムでの使用に適合させられる、請求項49に記載の免疫測定法。
- ヘリカーゼのドメインI、IIおよびIIIのそれぞれを含む、NS3ヘリカーゼ配列を含有している組換えHCV NS3抗原であって、前記抗原が、C33抗原と比較して血清由来のHCV抗体に対して増大した免疫反応性を有し、前記組換えHCV NS3抗原が、野生型NS3ヘリカーゼの酸化還元安定性と比較して増大した酸化還元安定性を含む、組換えHCV NS3抗原。
- ヘリカーゼのドメインIおよびIIのそれぞれを含む、NS3ヘリカーゼ配列を含有している組換えHCV NS3抗原であって、前記抗原が、C33抗原と比較して血清由来のHCV抗体に対して増大した免疫反応性を有し、前記組換えHCV NS3抗原が、野生型NS3ヘリカーゼの酸化還元安定性と比較して増大した酸化還元安定性を含む、組換えHCV NS3抗原。
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