JP7090343B2 - 治療活性ペイロードの標的化送達のための送達システム - Google Patents
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Description
本発明は、一般に分子生物学及び治療法の分野に関する。より具体的には、本発明は受容体仲介型エンドサイトーシスによって真核生物細胞にRNAオリゴヌクレオチド、DNAオリゴヌクレオチド、及びタンパク質を含むモノビオチン化治療薬及びモノビオチン化診断用分子の選択的送達のための新規標的化生物コンジュゲートに関する。本発明は一般に、モノビオチン化ペイロード、例えば治療活性核酸にコンジュゲートされたアビジン又はニュートラビジンからなるコア、好ましくは抗体単鎖可変断片である少なくとも1つの抗体を含む診断用又は治療用分子の標的化送達のためのシステムに関する。本発明はさらに前記送達システムの組立て及び家族性高コレステロール血症などの代謝性疾患、ウイルス感染症、及び多形神経膠芽腫(GBM)のような原発性腫瘍又は転移性癌などの増殖性疾患の治療における前記送達システムの使用方法を提供する。
現在、治療用又は診断用分子(「ペイロード」)の真核生物細胞への送達のための標的化生物コンジュゲート、例えば免疫コンジュゲートを作製するための最も一般的な機構は、標的化装置をペイロードに安定に結合させるための化学修飾及び化学的カップリング反応を含む。しかし、標的化デバイスのペイロードとの化学結合を使用する場合、いくつかの問題点がある。第1に、そのようなコンジュゲートの作製は時間がかかり、比較的多くの量の物質を必要とする。第2に、化学修飾は標的化装置(細胞結合成分;すなわちリガンド、抗体、抗体誘導体)の結合親和性に影響を及ぼし得るものであり、標的細胞への再方向づけが不十分となる。第3に、標的化装置はペイロードの立体障害をもたらし、従ってその生物活性を制限し得る。第4に、標的化装置へのカップリング反応に先行するペイロードの非方向づけ化学修飾は、その生物学的活性に影響を及ぼし得る。第5に、手間のかかるカップリング手順を、新たな個別の標的化装置ごとに構築しなければならない。
腫瘍を治療するための有望なアプローチは、血管新生、転移、生存、抗アポトーシス、及び化学療法への抵抗性に関与する遺伝子のsiRNA仲介性サイレンシング(RNAi)である(総説についてはAshiharaらの文献[7]を参照されたい)。RNAiは多細胞生物間で保存された生物学的プロセスであり、ここで二本鎖RNA(dsRNA)は酵素ダイサーによっておよそ21~23 bpの二本鎖断片(低分子干渉RNA、siRNA)[2、3]へとプロセシングされる。いわゆるガイド鎖は続いて複合タンパク質「RNA誘導性サイレンシング複合体」(RISC)へと組み込まれ、RISCはmRNAを相同性について走査し、配列特異的結合に際して複合体中に組み込まれた酵素の活性を通して標的mRNAの破壊を促進する[4-6]。特異的な細胞mRNAの破壊は、化学合成され、RNAi経路に入るsiRNA分子の外因性の送達によって得ることもできる[5]。siRNA分子は血清ヌクレアーゼによる分解を受けやすく、そのサイズ及び正味の電荷が負であることのために膜を容易には横断することができず、腎排出を受けるため、siRNAの半減期を増加させ、細胞取り込みを可能にするためのいくつかの担体システムが確立された[8-10]。大部分の抗腫瘍siRNAは標的細胞を特異的に阻害するように設計されているが、siRNA担体システムの正常組織に対する非特異的かつ細胞傷害性ですらある作用は、軽視することができない。従って、標的外の器官への望まないsiRNA作用以外に、siRNAナノ担体の健常組織への非特異的な「ナノ毒性」を、RNAi治療において考慮しなくてはならない(総説[11]を参照されたい)。また、RNAiの性質が一過性であることは、治療のために頻繁な反復全身投与が必須であることを暗示し、累積される毒性のリスクが増加すると予想される[12]ため、このことは特に当てはまる。望まないオフターゲット効果を回避する1つのアプローチは、標的化装置、例えば標的細胞と特異的に結合する抗体及び細胞表面受容体のリガンドの導入であり、それにより標的化送達の概念がもたらされる。しかしながら、これには最適な標的化装置、それらの結合活性を保持するような様式でのそれらのsiRNA-担体複合体とのカップリング、及び標的以外の細胞による非特異的な取り込みを回避するさらなる修飾の同定が要求される。
(定義)
本明細書で使用する表現「細胞」、「細胞株」、及び「細胞培養物」は、互換的に使用され、そのような呼称は全て子孫細胞を含む。従って、単語「形質転換体」及び「形質転換細胞」は初代対象細胞及び伝達の回数にかかわらず該細胞に由来する培養物を含む。また、全ての子孫細胞は故意又は偶発的な突然変異のためにDNA内容が正確に同じでなくともよいことは理解されよう。最初の形質転換細胞をスクリーニングした際に同じ機能又は生物活性を有する突然変異体子孫細胞を含める。異なる呼称を意図する場合、このことは文脈から明らかとなろう。
本発明は、モノビオチン化細胞結合構成要素、四量体ビオチン結合要素、及び治療及び診断目的のモノビオチン化ペイロードを含むビオチン-ビオチン結合要素の複合体形成により排他的に組み立てられた新規標的化生物コンジュゲートのモジュール式設計及び組立てを提供する。本発明によるモノビオチン化治療用分子及びモノビオチン化診断用分子には、RNA分子、DNA分子、及びタンパク質がある。
・「低分子干渉RNA」(siRNA);
・マイクロRNA(miRNA);
・非コードRNA(ncRNA);
・野生型遺伝子又は毒素遺伝子治療のためのcDNA又はmRNA;及び
・細胞の遺伝子操作のためのcDNA又はmRNA(例えば、CRISPR/CAS、DNAリコンビナーゼ又はトランスポザーゼ)であり、ここで各成分はトランスフェクション不能なビオチン化オリゴヌクレオチド担体と任意に複合体を形成させることができる。
―アビジンコア;
―少なくとも1つの標的化分子、例えば天然又は人工タンパク質-リガンド、アプタマー、又は抗体単鎖可変断片;
―タンパク質、ペプチド、又は治療活性核酸からなる群から選択される少なくとも1つの治療活性ペイロード、を含み、前記標的化分子及び前記治療活性ペイロードが、アビジンコアと結合している、前記システムを提供する。
X2=L、V、I、W、F、又はY以外の任意のアミノ酸)を含む。
・DNA又はRNA又はXNAアプタマー。これらはオリゴヌクレオチド(通常、短)鎖からなる;
・ペプチドアプタマー。これらはタンパク質スキャフォールドの両端に結合された1つ(以上の)単鎖可変ペプチドドメインからなる、
として分類することができる。
・BIRC5/サバイビンmRNA
i) 核酸ベースの治療薬の標的化送達のための送達システムであって:
・アビジン、ニュートラビジン、又はストレプトアビジンからなるアビジンコア;
・天然又は人工のタンパク質リガンド、アプタマー、又は抗体単鎖可変断片(scFv)からなる群から選択される少なくとも1つの標的化分子、
・少なくとも1つの治療活性核酸、を含み、前記少なくとも1つの標的化分子及び前記少なくとも1つの治療活性核酸は、アビジンコアと結合している、前記送達システム。
ii) 核酸ベースの治療薬の標的化送達のための送達システムであって、
・アビジン、ニュートラビジン、又はストレプトアビジンからなるアビジンコア;
・標的化分子としての少なくとも1つの抗体単鎖可変断片(scFv);
・CpGオリゴヌクレオチド、ssDNA、dsDNA、ssRNA、又はdsRNAからなる群から選択される少なくとも1つの治療活性核酸、を含み、前記少なくとも1つの標的化分子及び前記少なくとも1つの治療活性核酸は、アビジンコアと結合している、前記送達システム。
iii) 核酸ベースの治療薬の標的化送達のための送達システムであって:
・アビジン、ニュートラビジン、又はストレプトアビジンからなるアビジンコア;
・標的化分子としての少なくとも1つの抗体単鎖可変断片(scFV)―リンカー―BAP
・CpGオリゴヌクレオチド、ssDNA、dsDNA、ssRNA、又はdsRNAからなる群から選択される少なくとも1つの治療活性核酸、を含み、前記少なくとも1つの標的化分子及び前記少なくとも1つの治療活性核酸がアビジンコアと結合している、前記送達システム。
iv) 核酸ベースの治療薬の標的化送達のための送達システムであって:
・アビジン、ニュートラビジン、又はストレプトアビジンからなるアビジンコア;
・標的化分子としての少なくとも1つの抗体単鎖可変断片(scFV)―リンカーペプチド―BAPであって:
前記抗体単鎖可変断片(scFV)がscFv(h-AM-1)(配列番号:2)及びscFv(MR1.1)(配列番号:3又は配列番号:4)から選択され、
前記BAPが
X2=L、V、I、W、F、又はYを除く任意のアミノ酸である)
○2つのアミノ酸、例えばGS;
○6つのアミノ酸;及び
○10個のアミノ酸、例えば
・RIBOXXOL(登録商標)及びsiRNAからなる群から選択される少なくとも1つの治療活性核酸、を含み、前記少なくとも1つの標的化分子及び前記少なくとも1つの治療活性核酸がアビジンコアと結合する、前記送達システム。
v) 核酸ベースの治療薬の標的化送達のための送達システムであって:
・アビジン又はニュートラビジンからなるアビジンコア;
・標的化分子としての少なくとも1つの抗体単鎖可変断片(scFV)―リンカーペプチド―BAPであって:
前記少なくとも1つの抗体単鎖可変断片(scFV)がscFv(h-AM-1)(配列番号:2)及びscFv(MR1.1)(配列番号:3又は配列番号:4)から選択され、前記BAPが
・RIBOXXOL(登録商標)及びsiRNAからなる群から選択される少なくとも1つの治療活性核酸、を含み、前記少なくとも1つの標的化分子及び前記少なくとも1つの治療活性核酸がアビジンコアと結合する、前記送達システム。
vi) 核酸ベースの治療薬の標的化送達のための送達システムであって:
・アビジン又はニュートラビジンからなるアビジンコア;
・標的化分子としての少なくとも1つの抗体単鎖可変断片(scFV)―リンカーペプチド―BAPであって:
前記少なくとも1つの抗体単鎖可変断片(scFV)がscFv(h-AM-1)(配列番号:2)及びscFv(MR1.1)(配列番号:3又は配列番号:4)から選択され、前記BAPが
前記リンカーペプチドが
・RIBOXXOL(登録商標)及びsiRNAからなる群から選択される少なくとも1つの治療活性核酸、を含み、前記少なくとも1つの標的化分子及び前記少なくとも1つの治療活性核酸がアビジンコアと結合している、前記送達システム。
vii) 核酸ベースの治療薬の標的化送達のための送達システムであって:
・アビジンコアとしてのニュートラビジン;
・標的化分子としての少なくとも1つのscFv(h-AM-1)(配列番号:2)抗体単鎖可変断片(scFV)―リンカーペプチド―BAPであって、前記BAPが
・治療活性核酸としての少なくとも1つの分子RIBOXXOL(登録商標)、を含み、前記少なくとも1つの標的化分子及び前記少なくとも1つの治療活性核酸が、アビジンコアと結合している、前記送達システム。
viii) 核酸ベースの治療薬の標的化送達のための送達システムであって:
・アビジンコアとしてのニュートラビジン;
・標的化分子としての少なくとも1つのscFv(MR1.1)(配列番号:3又は配列番号:4)抗体単鎖可変断片(scFV)―リンカーペプチド―BAPであって、
前記BAPが
・治療活性核酸としての少なくとも1つの分子RIBOXXOL(登録商標)、を含み、前記少なくとも1つの標的化分子及び前記少なくとも1つの治療活性核酸が、アビジンコアと結合している、前記送達システム。
ix) 核酸ベースの治療薬の標的化送達のための送達システムであって:
・アビジンコアとしてのニュートラビジン;
・標的化分子としての少なくとも1つのscFv(h-AM-1)(配列番号:2)抗体単鎖可変断片(scFV)―リンカーペプチド―BAPであって:
前記BAPが
・治療活性核酸としての少なくとも1つの分子RIBOXXOL(登録商標)を含み、前記少なくとも1つの標的化分子及び前記少なくとも1つの治療活性核酸がアビジンコアと結合している、前記送達システム。
x) 核酸ベースの治療薬の標的化送達のための送達システムであって:
・アビジンコアとしてのニュートラビジン;
・標的化分子としての少なくとも1つのscFv(MR1.1)(配列番号:3又は配列番号:4)抗体単鎖可変断片(scFV)―リンカーペプチド―BAPであって、前記BAPが
・治療活性核酸としての少なくとも1つの分子RIBOXXOL(登録商標)、を含み、前記少なくとも1つの標的化分子及び前記少なくとも1つの治療活性核酸がアビジンコアと結合している、前記送達システム。
xi) 核酸ベースの治療薬の標的化送達のための送達システムであって:
・アビジンコアとしてのニュートラビジン;
・標的化分子としての少なくとも1つのscFv(h-AM-1)(配列番号:2)抗体単鎖可変断片(scFV)―リンカーペプチド―BAPであって、前記BAPが
・治療活性核酸としての少なくとも1つのsiRNA、を含み、前記少なくとも1つの標的化分子及び前記少なくとも1つの治療活性核酸がアビジンコアと結合している、前記送達システム。
xii) 核酸ベースの治療薬の標的化送達のための送達システムであって:
・アビジンコアとしてのニュートラビジン;
・標的化分子としての少なくとも1つのscFv(MR1.1)(配列番号:3又は配列番号:4)抗体単鎖可変断片(scFV)―リンカーペプチド―BAPであって、前記BAPが
・治療活性核酸としての少なくとも1つのsiRNA、を含み、前記少なくとも1つの標的化分子及び前記少なくとも1つの治療活性核酸がアビジンコアと結合している、前記送達システム。
xiii) 核酸ベースの治療薬の標的化送達のための送達システムであって:
・アビジンコアとしてのニュートラビジン;
・標的化分子としての少なくとも1つのscFv(h-AM-1)(配列番号:2)抗体単鎖可変断片(scFV)―リンカーペプチド―BAPであって、前記BAPが
・治療活性核酸としての少なくとも1つのsiRNA、を含み、前記少なくとも1つの標的化分子及び前記少なくとも1つの治療活性核酸がアビジンコアと結合している、前記送達システム。
xiv) 核酸ベースの治療薬の標的化送達のための送達システムであって:
・アビジンコアとしてのニュートラビジン;
・標的化分子としての少なくとも1つのscFv(MR1.1)(配列番号:3又は配列番号:4)抗体単鎖可変断片(scFV)―リンカーペプチド―BAPであって、前記BAPが
・治療活性核酸としての少なくとも1つのsiRNA、を含み、前記少なくとも1つの標的化分子及び前記少なくとも1つの治療活性核酸がアビジンコアと結合している、前記送達システム。
a) 1つの抗体単鎖可変断片及び3つの治療活性核酸、又は
b) 2つの抗体単鎖可変断片及び2つの治療活性核酸、又は
c) 3つの抗体単鎖可変断片及び1つの治療活性核酸、を含む。
a) scFv-BAP-ビオチンコンジュゲートを調製する工程;
b) scFv-BAP-ビオチンコンジュゲートをアビジン、ニュートラビジン、又はストレプトアビジンからなるアビジンコアとともにインキュベートする工程であって、scFv-BAP-アビジン又はscFv-BAP-ニュートラビジン又はscFv-BAP-ストレプトアビジン複合体が形成される、前記工程;
c) 治療活性核酸-ビオチンコンジュゲートを加え、scFv-BAP-アビジン又はscFv-BAP-ニュートラビジン又はscFv-BAP-ストレプトアビジン複合体をビオチン化治療活性核酸とともにインキュベートする工程;及び
d) ビオチン化治療活性核酸のscFv-BAP-アビジン又はscFv-BAP-ニュートラビジン又はscFv-BAP-ストレプトアビジン複合体のアビジン、ニュートラビジン、又はストレプトアビジンとの結合による、送達システムの形成、を含む本発明の送達システムの組立て方法を提供する。
X2=L、V、I、W、F、又はYを除く任意のアミノ酸である);
a) マルトース-PPI-ビオチンコンジュゲートを調製する工程;
b) 該マルトース-PPI-ビオチンコンジュゲートを該scFv-BAP-アビジン又はscFv-BAP-ニュートラビジン又はscFv-BAP-ストレプトアビジン複合体とともにインキュベートする工程であって、該マルトース-PPIが陽イオン電荷を有する、前記工程;
c) 該マルトース-PPI-ビオチン複合体を該scFv-BAP-アビジン又はscFv-BAP-ニュートラビジン又はscFv-BAP-ストレプトアビジン複合体のアビジン、ニュートラビジン、又はストレプトアビジンと結合させる工程;
d) 別個に、マルトース-PPIをsiRNAとともにインキュベートする工程であって、弱い陰イオン電荷を有するマルトース-PPI-siRNAデンドリプレックスが形成される、前記工程;
e) 工程c)から得られる複合体を工程d)の該マルトース-PPI-siRNAデンドリマーとともにインキュベートする工程;及び
f) イオン相互作用によってアビジン/ニュートラビジンコアと結合したscFv-BAP,マルトース-PPI-ビオチン/マルトース-PPI-siRNAデンドリマーを含む、腫瘍に標的化させた多要素集合体(polyplexes)を形成させる工程、を含む。
従来技術のこれらの障壁を克服するために、治療用siRNA分子の標的化送達のために単鎖抗体断片(scFv)により導かれる多要素集合体システムが、トランスフェクション不能なマルトース修飾第4世代ポリ-プロピレン-イミン-ビオチン(mal-PPI-ビオチン)をベースとして開発された。新エピトープEGFRvIIIを発現している腫瘍細胞への選択的なsiRNA送達のために、scFv(MR1.1)を、新規なカップリング戦略によって利用し、コンジュゲートした。より具体的には、ビオチン化アクセプターペプチド(BAP)配列と融合する改変scFv(MR1.1)が機能的なモノビオチン化scFvに至っているビオチンリガーゼBirA発現293T細胞において生産できることができることが示された。多要素集合体形成は定義された化学量論量でscFv-BAP生体分子をニュートラビジン及びモノビオチン化mal19-ビオチンと順次複合体形成させ、同時に望まない架橋を回避することによって達成された。非特異的な対照scFv-BAPにコンジュゲートされた多要素集合体と比較して、生成された腫瘍特異的多要素集合体は、EGFRvIII陽性の標的細胞と結合して、選択的受容体仲介型エンドサイトーシスによってのみsiRNAを送達することができた。これらの結果は、そうでなければ内在化されない多要素集合体の受容体仲介型取り込みが、癌のsiRNA療法を改善する有望な手段であり、タンパク質リガンドのナノ粒子との定義された高親和性のカップリングのための新規な戦略を導入することを示唆する。
以下の図は、さまざまな本発明の態様を例示するために提供する。そのためには、図のいくつかは、概略図面を含んで、必ずしも縮尺通りに描画されるというわけではない。
(実施例1)
(マルトース修飾PPI及びモノビオチン化されたmal19-PPI分子の合成)
四ホウ酸ナトリウム十水和物、ベンゾトリアゾール-1-イル-オキシ-トリス-(ジメチルアミノ)-ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート(BOP)、ジメチルスルホキシド(DMSO)、トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン(TRIS)及び塩化ナトリウム(NaCl)は、Sigma Aldrichから購入した。塩酸(Tritisol(登録商標))は、Merck KGaAから購入した。α-ビオチン-ω-(プロピオン酸)ドデカエ(dodecae)(エチレングリコール)(PEG12B)は、Iris Biotech社から得た。トリエチルアミン(NEt3) (D-(+)-マルトース一水和物、ボラン-ピリジン錯体) (THF中8M)(BH3・Pyr)は、Flukaから購入した。第4世代ポリ(プロピレンイミン)(PPI-G4、7168 g/mol)デンドリマーは、DAB-Am64としてSyMO-Chem(Eindhoven, Netherlands)によって供給された。
生成物は、固体として定量的に産生された。マルトース修飾第4世代PPIの合成は文献に記載の通り実施した[72]。 PPI-G4のマルトース修飾及びビオチン化PPI-G4デンドリマーについては、それぞれマルトース一水和物(360.31 g/mol)及びボラン-ピリジン錯体(BH3×Pyr、8M)を、ホウ酸ナトリウム緩衝液(25 ml、0.1 M)中に取った。mal7-PPIの合成については、100 mgのPPI-G4、64,6 mgマルトース一水和物、及び20 μl BH3×Pyr、mal19-PPIの合成については、129,1 mgマルトース一水和物、及び50 μl BH3×Pyr、mal33-PPIの合成については、100 mgのPPI-G4、258.3 mgのマルトース一水和物、及び90 μl BH3×Pyr、並びにmal90-PPIの合成については、 112 mgのPPI-G4、6,457 mgのマルトース一水和物、及び2.24 mlのBH3×Pyrを使用した。溶液は、7日間にわたり50℃で撹拌した。粗生成物は、不純物の捕捉を確実にするために、4日間にわたる脱イオン水を用いた透析によって、二回精製した。凍結乾燥により固体生成物を得た。マルトシル化の程度は、過去に記載されている1H NMRアプローチによって確認した[72]。
(マルトース修飾PPIの毒性)
特に癌治療のためのsiRNA担体として反復して陽イオン性PPIデンドリマーを適用する場合、それらの毒性は1つの主要な問題である。従って、漸増濃度のmal7-PPI、mal19-PPI、3mal-33PPI又はmal90-PPIとともにインキュベートした 293T細胞の細胞生存度を調べた。2×104 293T細胞を96ウェルプレートに播種し、70%コンフルエントとなるまで補充されたDMEM中で増殖させ、その後様々な濃度のmal7-PPI、mal19-PPI、mal33-PPI、及びmal90-PPIを加えた。24時間後、アラマーブル―溶液(Thermo Fisher Scientific社、Waltham、USA)をアッセイのすべてのウェルに加え(200 μl培地 当たり20 μl)、プレートをさらに5時間インキュベートした。陽性対照として、細胞を、5% Triton X-100(Sigma-Aldrich)によって溶解した。未処理の細胞を、陰性対照として含めた。その後、還元されたAlamarBlueの蛍光強度は、蛍光イメージングシステム(Synergy 2(商標)、BioTek、Winooski、USA)及び560EX nm/590EM nmフィルタ設定を使用して測定した。細胞表面のPPI-グリコデンドリマーの細胞毒性を未処理の対照に対して正規化した。当該対照を100%生存度に設定した。図4は、周縁第一級アミノ表面基にマルトースユニットを枝状に連結させることによる遮蔽の程度がより高いPPI-G4グリコデンドリマーの細胞毒性が減少したことを実証する。mal7-PPI及びmal19-PPIについて算出したLD50値は、それぞれ3 μM及び1.6 μMであった。mal90-PPI及びmal33-PPIデンドリマーは、80 μMの濃度でさえ、無毒であった。
(蛍光分極及びアガロースゲルシフトアッセイを使用したデンドリプレックス形成の分析)
mal-PPI/siRNAデンドリプレックスは、複合体形成緩衝液(10mM Hepes(PAA、Dartmouth、USA) 、150mM NaCl (pH 7.4; Merck KGaA、Darmstadt、Germany)中に適当な量のmal-PPIを1 μg siRNAを含む溶液に加えることにより、様々なモル比(1:1~40:1)で調製した。
30分のインキュベーションの後、確立したデンドリプレックスを、6×ローディング緩衝液(Thermo Fisher Scientific社、Waltham、USA)を含む3%アガロースゲルに装荷した。
混合物は0.5×TAE(トリス(Carl Roth GmbH & Co. KG、Karlsruhe、Germany)/酢酸/EDTA(Merck KGaA、Darmstadt、Germany))緩衝液中、200Vで30分間分離した。siRNAバンドは紫外線(UV)イメージングシステム(AlphaImager(登録商標)、Alphainnotech、San Leandro、USA)を使用して可視化した。
ΔFP =(FP1-ブランク1)-(FP0-ブランク0)
(式中、FP0はsiLuc3-Cy3のFP値であり、かつFP1はマルトース修飾PPIデンドリマーと混合した後に得たFP値である)によって算出した。図5bは、Cy3標識siRNAの漸増量のmal7-PPI、mal-19-PPI、及びmal-33-PPIデンドリマーとの結合を実証する蛍光分極分析を示す。ここでも、mal90-PPIはsiRNAを結合することに完全に失敗した。デンドリプレックスとの複合体形成は、mal7-PPI、mal19-PPI、及びmal33-PPIについてのPPI/siRNA比率が等モルとなるときにはすでに開始し、ゼロとして設定するCy3標識siRNA単独と比較して、ΔFP値は初め減少した。
(マルトース修飾PPIのsiRNAトランスフェクション効率)
受容体仲介型エンドサイトーシスのみによる腫瘍細胞に対する選択的なsiRNAの送達のためのマルトース修飾PPI担体の開発のため、マルトース置換による表面アミンの遮蔽の増加により、生体適合性の向上[25]の他に、残存するプロトン化され得るアミン基を介したsiRNAのデンドリプレックスへの複合体形成がなお可能となり、同時に正味の陽イオン電荷の損失がmal-PPI/siRNAデンドリプレックスの非特異的な取り込みを妨害するはずであるとの仮説が立てられた。続く標的化装置、例えば腫瘍特異的scFv分子のアビジン-ビオチン複合体形成を介したマルトース修飾PPI-(モノ)ビオチンとのカップリングにより、同族の細胞受容体を発現する腫瘍細胞にのみsiRNAが取り込まれることが可能となるはずである(図2を参照されたい)。mal7-PPI、mal19-PPI、及びmal33-PPIデンドリマーを用いたトランスフェクション実験について、920 μlのD10培地(10% v/v熱非働化FBS(Gibco) 、 10mM HEPES(Gibco) 、100 U ml-1ペニシリン、及び0.1mg ml-1ストレプトマイシン(Gibco)を補充したDMEM培地)中の7×104個の293TEGFRvIII/c-Luc細胞)を12ウェルプレートに三連で播種した。複合体形成について、0.8 μg Luc3-siRNA(siLuc3:
ノックダウン効率(%) = 100-RLUsiLuc3/RLUsiRFP1 × 100
を使用しているそれらの対応するsiRFP処理対照に対して正規化した。
(ビオチン化タンパク質の生産のための293TBirA細胞株の生成)
ビオチン化scFvの生産のために、293ThuBirAプロデューサ細胞株は、コドン最適化されたビオチンリガーゼの形質導入によって生成した。コドン最適化されたN末端Igκリーダーペプチド及びC末端VSV-G-タグを含むビオチンリガーゼBirAのヌクレオチド配列を化学合成した(Eurofins MWG Operon Germany、Ebersberg、Germany)。コドン最適化されたN末端Igκリーダーペプチド及びC末端VSV-タグを含むビオチンリガーゼhuBirAのアミノ酸配列は、配列番号:30の配列からなる。形質導入された細胞をハイグロマイシンBによって選択し、加湿インキュベータ内で37℃、5% CO2の下D10培地又は100 μM N-(+)ビオチニル-6-アミノヘキサン酸(C6-ビオチン、Sigma-Aldrich、St. Louis、USA)をさらに含むD10培地中で維持した。図7は、huBirA導入遺伝子の概略図を表し、かつモノクローナル抗VSV-G(Sigma)を使用したウェスタンブロット分析を示し、293TBirA細胞においてVSV-Gエピトープタグ付加ビオチンリガーゼが発現していることを実証している。huBirAビオチンリガーゼは分泌経路中に分泌されるため、主に細胞培養上清(SN)に見出される。
(組換えscFvの生産及びビオチンアクセプターペプチドを含むビオチン化scFv)
プロピオニバクテリウム・シャーマニイトランスカルボキシラーゼ由来のビオチンアクセプターペプチド(P-BAPと呼ぶ)のDNA配列は、Pin Point XA-1プラスミド(Promega)から誘導され、プライマー
(ヒト化scFv(AM1)の結合親和性)
結合親和性を決定するために、マウスscFv(AM1)及びヒト化scFv(h-AM1)を、293TPSCA細胞とともに漸減濃度でインキュベートした。抗myc-PE-二次抗体による検出の後、MFIをMACSQuant Cytometer(Miltenyi Biotech)及びFlowJoソフトウェアを使用して決定し、かつKd値はPRISMソフトウエアプログラムによって算出した。図9は、KD値算出のためのグラフを表す。
(PSCA及びEGFRvIII受容体内在化)
EGFRvIII及びPSCA内在化の研究のために、293TEGFRvIII及び293TPSCA細胞は、それぞれ、トリプシン/EDTA溶液(Sigma/Aldrich)によって、慎重に剥離した。1mg/mlのBSA/PBS中での繰返し洗浄の後、2x105細胞に、新鮮な培地を供給して、96穴丸底のウェル中に播種した。受容体の架橋は、同族の受容体に特異的な1 μgの誘導元のscFvとともに4℃で1時間インキュベートし、続いてPBSによる徹底的な洗浄、及び0.5 μgのビオチン標識抗myc抗体(Miltenyi Biotech)による4℃で10分間の処理、続くPBSによる徹底的な洗浄、及び新鮮な培地の供給を行うことにより達成した。受容体の一価の結合を達成するために、293TEGFRvIII及び293TPSCA細胞をそれぞれscFv(MR1.1)及びscFv(AM1)のみとともに4℃で1時間インキュベートし、続いてPBSによる徹底的な洗浄及び新鮮な培地の供給を行った。37℃、加湿CO2インキュベータ中での2h、4h、8h、24h、及び48h後の架橋された受容体のための抗ビオチン-PE抗体(Miltenyi Biotech)を利用したインキュベーション、並びに受容体の一価の結合を有する細胞のための4℃で10分間のビオチン化抗myc抗体でのインキュベーションとそれに続く4℃、10分間の抗ビオチン-PE抗体染色の後に、EGFRvIIIの表面発現をモニタリングした。すべての得られたデータは、FlowJoソフトウェアバージョン7.6.5(TreeStar社、Ashland、USA)によって分析した。図10は、受容体架橋によるPSCA及びEGFRvIIIの内在化のFACS分析の結果を示す。図10aは、293TPSCA細胞表面のPSCAの架橋の効果を示す。図10bは、293TEGFRvIII細胞表面のEGFRvIIIの架橋の効果を示す。驚くべきことに、表面受容体のscFv(h-AM1)+抗myc抗体及びscFv(MR1.1)+抗myc抗体との架橋により、それぞれ時間依存的なPSCA及びEGFRvIIIの内在化がもたらされる一方、scFvによる一価の結合は両方の実験において受容体内在化をほとんど誘導しない。
(scFv-BAPの部位特異的なビオチン化)
scFv(MR1.1)-P-BAPの同族の表面受容体の異所的な発現を有するEGFRvIII-293T標的細胞との結合を調べるために、それぞれ、2×105個の細胞を、1 μgの組換えscFv及びscFv-P-BAPとともにインキュベートした。結合した抗体は、抗myc/FITC抗体を使用してそれらのmycエピトープを介して、又は抗ビオチン/PE抗体(1:10; Miltenyi Biotec、Bergisch Gladbach、Germany)を使用してそれらのビオチン残基を介して検出した。二次抗体のみを用いて染色した細胞を、対照として含めた。追加の陰性対照として、異所的に発現された表面受容体を認識しなかったscFv(AM1)及びscFv(AM1)-P-BAPによる細胞の染色を含めた。少なくとも10,000個の染色した細胞は、フローサイトメトリー(MACSQuant、Miltenyi Biotec、Bergisch Gladbach、Germany)で測定して、FlowJoソフトウェアバージョン7.6.5(TreeStar社、Ashland、USA)によって分析した。
(scFv-P-BAP及びscFv-BAPのアビジンとの複合体形成)
組換えビオチン化単鎖抗体の複合体形成は、ウェスタンブロット実験において調べた。このため、10.7 pmolの組換えscFv-P-BAP及びscFv-BAPは漸減量のアビジン分子(21.4 pmol~1.35 pmolの範囲にわたる)を用いて室温で30分間インキュベートした。これは、scFv(MR1.1)-P-BAPについて図11cに、scFv(MR1.1)-BAP及びscFv(h-AM1)-BAPについて図12に図示するように、2:1~1:8の範囲の様々なモル比のscFv(MR1.1)-BAP:アビジンを構成した。アビジン/scFv-BAP複合体は、非還元SDS-PAGEに付した。Westran PVDF膜(Whatman社、Dassel、Germany)の上のタンパク質転写の後、タンパク質がモノクローナルマウスc-myc特異的抗体(1:5,000、Invitrogen、Carlsbad、USA)及びHRP標識ウサギ抗マウス二次抗体(1:1,000; Dako、Glostrup、Denmark)によって、及び膜を色抜きした後にHRPコンジュゲートビオチン特異的抗体(1:8,000; Sigma-Aldrich、St. Louis、USA)によって検出した。膜は、Luminata Classico Western HRP基質(Merck Millipore、Darmstadt、Germany)及びイメージングシステムLAS3000(FujiFilm Europe、Dusseldorf、Germany)を使用して可視化し、文書化した。
(腫瘍特異的多要素集合体の構築及びサイズによる特性評価)
デンドリプレックスを、mal19-PPIをsiRNAと複合体形成緩衝液中4:1のモル比で4、1時間混合することにより生成させた。並行して、scFv(MR1.1)-P-BAP及びscFv(AM1)-P-BAPを、それぞれ2:1のモル比で含む1×複合体形成緩衝液中30分間、室温で、ニュートラビジン(Thermo Fisher Scientific社、Waltham、USA)を用いることにより、mal19-PPI-ビオチンとコンジュゲートさせた。図13に図示するように、scFv-P-BAP-アビジンコンジュゲートを、1:1のモル比のmal19-PPI-ビオチンとともに30分間、室温でインキュベートした。ニュートラビジンの残る結合に使われていないビオチン結合部位を室温で5分間0.3 mMのD-ビオチンにより飽和させた後、コンジュゲートを予め形成させたデンドリプレックスと混合し、多要素集合体を生成させた。結果として得たscFv-P-BAPのPPI-グリコデンドリマー及びsiRNAに対するモル比は2:5:1であった。多要素集合体のサイズ及び安定性は、インサイチュ原子間力顕微鏡検査によって分析した。このAFMのため、Siウェーハを、多要素集合体を吸着させる親水性表面を得るために、O2-プラズマで処理した。流体中のAFM測定(上記の通りに1 mlの溶液として製造した多要素集合体を使用する)は、Dimension ICON(Bruker-Nano、Santa Barbara、CA)による、ピークフォースタッピングモードで実施した。公称ばね定数が0.7 N/mかつ先端半径が5 nmである窒化ケイ素センサSCANASYST-FLUID+(Bruker-Nano)を、測定に使用した。粒径分布は、ソフトウェアNanoScope Analysis(Bruker-Nano)によって算出した。図13は凝集効果の欠如及び多要素集合体が製造から24時間後も依然として安定であることを実証する。多要素集合体の直径は110~444 nmの範囲に見いだされた。算出された複合体の平均径は150 nmである。
(EGFRvIII特異的多要素集合体の受容体仲介型エンドサイトーシス)
siRNA取り込みを可視化するために、2×105個の293TEGFRvIII及び293T野生型細胞を、Cyanin3 (Cy3)-標識多要素集合体とともに3時間培養した。その後、細胞を0.1% ヘパリン/PBS(Sigma-Aldrich Chemie社、St. Louis、USA)で洗浄し、フローサイトメトリー(MACSQuant)によって測定した。
(EGFRvIII特異的多要素集合体を使用するEGFRvIII陽性細胞へのsiRNAの標的化送達)
EGFRvIII陽性細胞におけるscFv-P-BAPによって導かれた多要素集合体の特異的ノックダウンを評価するために、2×104の293TEGFRvIII/c-Luc細胞を、96ウェルプレートに三連で播種し、70%コンフルエントになるまで補充されたDMEM 200μl中で増殖させた。ルシフェラーゼ活性の決定の前に、様々なEGFRvIII特異的scFv(MR1.1)-p-BAPを含む多要素集合体又は結合しないscFv(AM1)-P-BAP-多要素集合体とともに、細胞を72hインキュベートした。RNAi陽性対照として、トランスフェクション試薬Interferin(登録商標)を使用して、細胞にsiLuc3をトランスフェクションした。内在化の経路を調べるために、エンドサイトーシス阻害剤である0.6 μg/mlフィリピンIII及び6 μg/mlクロルプロマジン(両方ともSigma Aldrich)を、細胞へのトランスフェクションの4時間前に追加した。非特異的な毒性(すなわちエンドサイトーシス阻害剤による)に対するルシフェラーゼノックダウン効率の正規化するために、赤色蛍光タンパク質に特異的な対照siRNA(siRFP1)を使用して比較用の複合体を生成させた。すべての試料のルシフェラーゼ活性は、上記の通りに細胞培養培地を事前に交換することなくトランスフェクションの開始から72時間後に測定した。多要素集合体の特異的ルシフェラーゼノックダウン効率は、式:
ノックダウン効率(%) = 100-RLUsiLuc3/RLUsiRFP1×100
を使用してそれらの対応するsiRFP処理対照に対して正規化した。図15aは、EGFRvIII特異的多要素集合体の受容体仲介型エンドサイトーシスによる293TEGFRvIII/cLuc細胞におけるルシフェラーゼのノックダウンを実証し、一方で293TEGFRvIII/cLuc細胞表面に存在しないPSCAを標的化している多要素集合体は効果を有さない。さらに、図15bは、EGFRvIII特異的多要素集合体の送達が主にFilipin IIIによって阻害されるEGRvIIIのカベオラ仲介型エンドサイトーシスを通じて仲介されることを実証する。
(dsRNA-送達及びサイズによる特性評価のための腫瘍特異的免疫コンジュゲートの構築)
TLR3アゴニストRiboxxol(登録商標)を含むBICは、室温で30分間PBS中2:1のモル比でモノビオチン化scFv-BAPを四量体ニュートラビジン分子と混合することにより生成させた。続いて室温で30分間1:2のモル比で、scFv-BAP-ニュートラビジンコンジュゲートに、Riboxxol(登録商標)を負荷した。ニュートラビジンのあらゆる残る結合に使われていないビオチン結合部位は、室温で5分間0.3 mM D-ビオチンによってブロッキングした。結果として得たニュートラビジン及びTLR3アゴニストに対するscFv-P-BAPのモル比は、2:1:2であった。多要素集合体のサイズ及び安定性は、インサイチュ原子間力顕微鏡検査によって分析した。このAFMのため、Siウェーハを、多要素集合体を吸着させる親水性表面を得るために、O2-プラズマで処理した。AFM測定は、実施例11に記載の通りに実施した。図16は進行中の凝集効果の不存在を実証し、ビオチン-免疫コンジュゲートは製造から24時間後も安定なままだった。TLR3アゴニストを含むBICの直径は、およそ42 nmの範囲に見出された。
(TL3アゴニスト(dsRNA)の標的化送達のためのPSCA特異的免疫コンジュゲートの受容体仲介型エンドサイトーシスの分析)
PSCA受容体仲介型エンドサイトーシスを介したRIBOXXOL(登録商標)取り込みを実証するために、RIBOXXOL(登録商標)dsRNAを1:2のモル比のmal20-PPI-FITCで標識した。実験のため、カバーグラス表面で増殖させた6×105個の293TPSCA細胞を、内在化されたBICを可視化するために、加湿CO2インキュベータ中37℃でRIBOXXOL(登録商標)及びscFv(h-AM1)-BAPを含むFITC標識BICで処理した。対照として、293TPSCA細胞をRIBOXXOL(登録商標)及び293TPSCA細胞と結合しないscFv(MR1.1)-BAPを含むFITC標識BICで処理した。24時間後、細胞膜及び核は、コムギ胚芽レクチン(WGA)のTexas Red(登録商標)-Xコンジュゲート及びHoechst(Invitrogen、Waltham、USA)を用い、製造業者のプロトコルに従って染色した。その後、スライドに1滴の標本化媒体(Vector Laboratories、CA、USA)中でカバーグラスを載せ、共焦点レーザー走査顕微鏡(LSM 510 Meta、Leica、Wetzlar、Germany)によって調べた。
(TLR3アゴニストの標的化送達及びNFκBの活性化及びPSCSA陽性細胞におけるアポトーシスの誘導)
BIC送達システムの使用によるTLR3アゴニストRiboxxol(登録商標)のPSCA陽性細胞のエンドソーム区画への標的送達並びに結果として生じるNFκBの活性化及びアポトーシスの誘導を、293T-BlueTLR3/PSCAレポーター細胞を使用して調べた。200 μl HEKBlue検出培地中の50,000個の293T-BlueTLR3/PSCA細胞を96ウェルプレートに播種し、漸増濃度のRIBOXXOL(登録商標)及びscFv(h-AM1)-BAPを含むBICで処理し、又はPSCA陽性の標的細胞と結合するはずのないRiboxxol(登録商標)及びscFv(MR1.1)-BAPを含むBICで処理した。レポーターSEAPの分泌の誘導、すなわちHEKBlue培地中でのその酵素活性を、24時間後にELISAリーダーにおいて655 nmで測定した。内在化の経路を調べるために、エンドサイトーシス阻害剤である0.6 μg/mlフィリピンIII及び6 μg/mlクロルプロマジン(両方ともSigma Aldrich)を、細胞へのトランスフェクションの4時間前に追加した。分析のために比較実験を実施し、細胞死をアネキシンV及びヨウ化プロピジウム標識細胞のFACS支援測定によって調べた。図18aに図示するように、RIBOXXOL(登録商標)を含む抗PSCA免疫コンジュゲートによる293T-BlueTLR3/PSCA細胞の処理により、驚くべきことに細胞炎症の誘導(NF-κBの活性化)に至った。活性化のプラトーには、抗PSCA免疫コンジュゲートの濃度25 nMで到達する。選択的な抗PSCA免疫コンジュゲートのIC50値は、12.5 nMである。それらのscFv部分で293T-BlueTLR/PSCA細胞と結合することができない抗EGFRvIII免疫コンジュゲートは、弱い免疫反応を引き起こすのみであることに留意されたい。これはおそらくTLR3-アゴニストを含む免疫コンジュゲートの細胞膜に局在するTLR3との相互作用によるものであろう。図18bは、フィリピンIII及びクロルプロマジンによるエンドサイトーシスの阻害を示す。0.3 μg/mlフィリピンIII(カベオラ仲介型エンドサイトーシスを阻害する)により、レポーターSEAPの誘導がわずかに弱まり、31 μg/mlクロルプロマジンにより、クラスリン仲介型エンドサイトーシスが効果的に阻害された。図18cは、アネキシンV-FITC/ヨウ化プロピジウムで染色された細胞のFACS支援分析によって得られた定量的結果である、アポトーシス誘導の結果を示す。処理細胞のアポトーシスレベルは、処理群における誘導アポトーシスレベルから基礎アポトーシスレベルを減算することによって、未処理の293T-BlueTLR3/PSCA細胞に対して正規化した。抗PSCA免疫コンジュゲートによる処理は、アポトーシス又は死細胞の顕著な増加をもたらす。驚くべきことに、抗EGFRvIII免疫コンジュゲートはアポトーシスを誘発せず、「オフターゲット」効果を除外することができる。
(TLR3アゴニストの標的化送達及びEGFRvIII陽性細胞におけるNFκBの活性化)
BIC送達システムの使用によるTLR3アゴニストRiboxxol(登録商標)のエンドソーム区画への標的送達及び結果としてのNFκBの活性化も、標的細胞株として293T-BlueTLR3/EGFRvIIIを使用して、実証した。実験は、実施例16に記載の通りに実施した。実験設定の唯一の違いは、RIBOXXOL(登録商標)及びscFv(MR1,1)-BAPを含むEGFRvIII特異的BICの標的として、293T-BlueTLR3/EGFRvIII及び誘導元の293TBlueTLR3細胞株を使用したことであった。その逆に、scFv(h-AM1)-BAPは、293T-BlueTLR3/EGFRvIII及び293TBlueTLR3細胞と結合し得ない陰性対照としての役割を果たした。
(態様1)
治療活性ペイロードの標的化送達のための送達システムであって:
・アビジン、ニュートラビジン、又はストレプトアビジンからなるアビジンコア;
・抗体単鎖可変断片(scFv)及びアプタマーからなる群から選択される少なくとも1つの標的化分子;並びに
・タンパク質、ペプチド、及び治療活性核酸からなる群から選択される少なくとも1つの治療活性ペイロードを含み、
・該少なくとも1つの標的化分子及び該少なくとも1つの治療活性ペイロードが、該アビジンコアと結合しており;
・該抗体単鎖可変断片が、以下の構造を有するコンストラクト中に含まれており:
抗体単鎖可変断片―BAP;又は
抗体単鎖可変断片―リンカー―BAP;かつ
・このコンストラクトが、BAPでモノビオチン化されている、前記送達システム。
(態様2)
a. 1つの抗体単鎖可変断片及び3つの治療活性核酸、又は
b. 2つの抗体単鎖可変断片及び2つの治療活性核酸、又は
c. 3つの抗体単鎖可変断片及び1つの治療活性核酸、
を含む、態様1記載の送達システム。
(態様3)
前記抗体単鎖可変断片が、scFv(AM1)(配列番号:1)、scFv(h-AM-1)(配列番号:2)、及びscFv(MR1.1)(配列番号:3又は配列番号:4)から選択される、態様1又は2記載の送達システム。
(態様4)
前記BAPが、
(化1)
(ここで、X 1 =任意のアミノ酸;及び
X 2 =L、V、I、W、F、又はYを除く任意のアミノ酸である);
(化2)
からなる群から選択される、態様1~3のいずれか1項記載の送達システム。
(態様5)
前記リンカーペプチドが:
・2つのアミノ酸、例えばGS;
・6つのアミノ酸;及び
・10個のアミノ酸、例えば
(化3)
のアミノ酸配列を有するc-mycタグ
からなる群から選択される、態様1~4のいずれか1項記載の送達システム。
(態様6)
前記治療活性ペイロードが、CpGオリゴヌクレオチド、ssDNA、dsDNA、ssRNA、又はdsRNA、好ましくはdsRNAからなる群から選択される治療活性核酸、態様1~5のいずれか1項記載の送達システム。
(態様7)
前記治療活性ペイロード、好ましくは治療活性核酸が、ビオチン化されている、態様1~6のいずれか1項記載の送達システム。
(態様8)
前記治療活性核酸が、グリコデンドリマーを含む担体中に含まれているsiRNAである、態様1~7のいずれか1項記載の送達システム。
(態様9)
前記グリコデンドリマーが、トランスフェクション不能なヌクレオチド担体であり、該グリコデンドリマーが、siRNAと複合体形成する際に1つのビオチン分子を含む、好適にはmal19-PPIに基づくマルトース-ポリプロピレン-イミン(mal-PPI)デンドリマーを含む、態様8記載の送達システム。
(態様10)
少なくとも1つの抗体単鎖断片を介して、癌細胞の細胞膜に又はその中に特異的に発現する表面抗原と結合する、態様1~9のいずれか1項記載の送達システム。
(態様11)
a) scFv-BAP-ビオチンコンジュゲートを調製する工程;
b) 該scFv-BAP-ビオチンコンジュゲートをアビジン、ニュートラビジン、又はストレプトアビジンからなる前記アビジンコアとともにインキュベートする工程であって、scFv-BAP-アビジン又はscFv-BAP-ニュートラビジン又はscFv-BAP-ストレプトアビジン複合体が形成される、前記工程;及び
c) 治療活性核酸-ビオチンコンジュゲートを加え、かつ該scFv-BAP-アビジン又はscFv-BAP-ニュートラビジン又はscFv-BAP-ストレプトアビジン複合体をビオチン化治療活性核酸とともにインキュベートする工程;及び
d) 該ビオチン化治療活性核酸を該scFv-BAP-アビジン又はscFv-BAP-ニュートラビジン又はscFv-BAP-ストレプトアビジン複合体のアビジン、ニュートラビジン、又はストレプトアビジンと結合させることにより、前記送達システムを形成させる工程、を含む態様1~10のいずれか1項記載の送達システムの組立て方法。
(態様12)
前記治療活性成分がsiRNAであり、かつ該siRNAを予め形成されたscFv-BAP-アビジン/ニュートラビジン/ストレプトアビジン複合体とコンジュゲートさせる、態様11記載の方法であって:
a) マルトース-PPI-ビオチンコンジュゲートを調製する工程;
b) 該マルトース-PPI-ビオチンコンジュゲートを該scFv-BAP-アビジン又はscFv-BAP-ニュートラビジン又はscFv-BAP-ストレプトアビジン複合体とともにインキュベートする工程であって、該マルトース-PPIが陽イオン電荷を有する、前記工程;
c) 該マルトース-PPI-ビオチン複合体を該scFv-BAP-アビジン又はscFv-BAP-ニュートラビジン又はscFv-BAP-ストレプトアビジン複合体のアビジン、ニュートラビジン、又はストレプトアビジンと結合させる工程;
d) 別個に、マルトース-PPIをsiRNAとともにインキュベートする工程であって、弱い陰イオン電荷を有するマルトース-PPI-siRNAデンドリマーが形成される、前記工程;
e) 工程c)から得られる複合体を工程d)の該マルトース-PPI-siRNAデンドリマーとともにインキュベートする工程;及び
f) アビジン/ニュートラビジンコアと結合したscFv-BAP,マルトース-PPI-ビオチン/マルトース-PPI-siRNAデンドリマーを含む、腫瘍標的化多要素集合体を形成させる工程、を含む、前記方法。
(態様13)
・チロシンキナーゼ阻害剤又はモノクローナル抗体;
・ゲフィチニブ、エルロチニブ、アファチニブ、及びオシメルチニブ及びセツキシマブ;並びに
・CimaVax-EGF
から選択されるEGF受容体阻害剤を任意にさらに含む、態様1~10のいずれか1項記載の送達システムを含む医薬組成物。
(態様14)
家族性高コレステロール血症などの代謝性疾患、ウイルス感染症、及び多形神経膠芽腫(GBM)のような原発性腫瘍又は転移性癌などの増殖性疾患の治療における使用のための態様1~10のいずれか1項記載の送達システム又は態様1~10のいずれか1項記載の送達システムを含む医薬組成物。
Claims (13)
- 治療活性ペイロードの標的化送達のための送達システムであって:
・アビジン、ニュートラビジン、又はストレプトアビジンからなるアビジンコア;
・抗体単鎖可変断片(scFv)からなる群から選択される少なくとも1つの標的化分子;並びに
・タンパク質、ペプチド、及び治療活性核酸からなる群から選択される少なくとも1つの治療活性ペイロードを含み、
・該少なくとも1つの標的化分子及び該少なくとも1つの治療活性ペイロードが、該アビジンコアと結合しており;
・該抗体単鎖可変断片が、以下の構造を有するコンストラクト中に含まれており:
抗体単鎖可変断片―ビオチン化アクセプターペプチド(BAP);又は
抗体単鎖可変断片―リンカー―BAP;かつ
・このコンストラクトが、BAPでモノビオチン化されており、
該BAPが、
X 2 =L、V、I、W、F、又はYを除く任意のアミノ酸である);
- a. 1つの抗体単鎖可変断片及び3つの治療活性核酸、又は
b. 2つの抗体単鎖可変断片及び2つの治療活性核酸、又は
c. 3つの抗体単鎖可変断片及び1つの治療活性核酸、
を含む、請求項1記載の送達システム。 - 前記抗体単鎖可変断片が、scFv(AM1)(配列番号:1)、scFv(h-AM-1)(配列番号:2)、及びscFv(MR1.1)(配列番号:3又は配列番号:4)から選択される、請求項1又は2記載の送達システム。
- 前記治療活性ペイロードが、CpGオリゴヌクレオチド、ssDNA、dsDNA、ssRNA、又はdsRNA、好ましくはdsRNAからなる群から選択される治療活性核酸である、請求項1~4のいずれか1項記載の送達システム。
- 前記治療活性ペイロード、好ましくは治療活性核酸が、ビオチン化されている、請求項1~5のいずれか1項記載の送達システム。
- 前記治療活性核酸が、グリコデンドリマーを含む担体中に含まれているsiRNAである、請求項1~6のいずれか1項記載の送達システム。
- 前記グリコデンドリマーが、トランスフェクション不能なヌクレオチド担体であり、該グリコデンドリマーが、siRNAと複合体形成する際に1つのビオチン分子を含む、好適にはmal19-PPIに基づくマルトース-ポリプロピレン-イミン(mal-PPI)デンドリマーを含む、請求項7記載の送達システム。
- 少なくとも1つの抗体単鎖断片を介して、癌細胞の細胞膜に又はその中に特異的に発現する表面抗原と結合する、請求項1~8のいずれか1項記載の送達システム。
- a) scFv-BAP-ビオチンコンジュゲートを調製する工程;
b) 該scFv-BAP-ビオチンコンジュゲートをアビジン、ニュートラビジン、又はストレプトアビジンからなる前記アビジンコアとともにインキュベートする工程であって、scFv-BAP-アビジン又はscFv-BAP-ニュートラビジン又はscFv-BAP-ストレプトアビジン複合体が形成される、前記工程;及び
c) 治療活性核酸-ビオチンコンジュゲートを加え、かつ該scFv-BAP-アビジン又はscFv-BAP-ニュートラビジン又はscFv-BAP-ストレプトアビジン複合体をビオチン化治療活性核酸とともにインキュベートする工程;及び
d) 該ビオチン化治療活性核酸を該scFv-BAP-アビジン又はscFv-BAP-ニュートラビジン又はscFv-BAP-ストレプトアビジン複合体のアビジン、ニュートラビジン、又はストレプトアビジンと結合させることにより、前記送達システムを形成させる工程、を含む請求項1~9のいずれか1項記載の送達システムの組立て方法。 - 前記治療活性成分がsiRNAであり、かつ該siRNAを予め形成されたscFv-BAP-アビジン/ニュートラビジン/ストレプトアビジン複合体とコンジュゲートさせる、請求項1~9のいずれか1項記載の送達システムの組立て方法であって:
a) マルトース-PPI-ビオチンコンジュゲートを調製する工程;
b) 該マルトース-PPI-ビオチンコンジュゲートを該scFv-BAP-アビジン又はscFv-BAP-ニュートラビジン又はscFv-BAP-ストレプトアビジン複合体とともにインキュベートする工程であって、該マルトース-PPIが陽イオン電荷を有する、前記工程;
c) 該マルトース-PPI-ビオチン複合体を該scFv-BAP-アビジン又はscFv-BAP-ニュートラビジン又はscFv-BAP-ストレプトアビジン複合体のアビジン、ニュートラビジン、又はストレプトアビジンと結合させる工程;
d) 別個に、マルトース-PPIをsiRNAとともにインキュベートする工程であって、弱い陰イオン電荷を有するマルトース-PPI-siRNAデンドリマーが形成される、前記工程;
e) 工程c)から得られる複合体を工程d)の該マルトース-PPI-siRNAデンドリマーとともにインキュベートする工程;及び
f) アビジン/ニュートラビジンコアと結合したscFv-BAP,マルトース-PPI-ビオチン/マルトース-PPI-siRNAデンドリマーを含む、腫瘍標的化多要素集合体を形成させる工程、を含む、前記方法。 - ・チロシンキナーゼ阻害剤又はモノクローナル抗体;
・ゲフィチニブ、エルロチニブ、アファチニブ、及びオシメルチニブ及びセツキシマブ;並びに
・CimaVax-EGF
から選択されるEGF受容体阻害剤を任意にさらに含む、請求項1~9のいずれか1項記載の送達システムを含む医薬組成物。 - 家族性高コレステロール血症などの代謝性疾患、ウイルス感染症、及び多形神経膠芽腫(GBM)のような原発性腫瘍又は転移性癌などの増殖性疾患の治療における使用のための請求項1~9のいずれか1項記載の送達システム又は請求項1~10のいずれか1項記載の送達システムを含む医薬組成物。
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