TWI817107B

TWI817107B - 寡核苷酸共軛物及其製備與應用

Info

Publication number: TWI817107B
Application number: TW110113616A
Authority: TW
Inventors: 惠鈞王; 李政忠; 徐乃恕; 郭汶植
Original assignee: 中央研究院
Priority date: 2020-04-15
Filing date: 2021-04-15
Publication date: 2023-10-01
Also published as: WO2021211791A1; US20230233699A1; TW202203979A

Abstract

本發明係關於一種寡核苷酸共軛物及其製備及應用。具體而言，本發明係關於一種與生物分子（例如，抗體）及/或目標試劑（例如，藥物）接合的寡核苷酸。於某些具體實施例中，本發明之寡核苷酸為帶有生物分子的單鏈寡核苷酸以及帶有目標試劑的互補鏈寡核苷酸的雜交錯合物，其中該雜交的核苷酸區段係作為連接子，以在分子中連接該生物分子以及該目標試劑。

Description

寡核苷酸共軛物及其製備與應用

相關申請。本申請主張根據35 U.S.C. §119於2020年4月15日申請之美國臨時申請第63/010,167號之權益，其全部內容透過引用合併於此。

本發明係關於一種寡核苷酸共軛物及其製備及應用。具體而言，本發明係關於一種與生物分子（例如，抗體）及/或目標試劑（例如，藥物）接合之寡核苷酸。於某些具體實施例中，本發明之寡核苷酸為帶有生物分子的單鏈寡核苷酸與攜帶目標試劑的互補鏈寡核苷酸的雜交錯合物，其中該雜交的核苷酸區段作為連接子，以在分子中連接該生物分子以及該目標試劑。

抗體-藥物共軛物（Antibody-drug conjugates，ADCs）為一種新興的癌症治療劑，可將高效藥物特異性遞送至惡性細胞。然而，迄今為止，只有三種ADCs上市，分別為Adcetris（2011）、Kadcyla（2013），以及Besponsa（2017），這表示，儘管ADCs的概念很簡單，但其發展仍是一個主要挑戰。¹

於ADC中，細胞毒性有效負載（cytotoxic payload）透過連接子連接至抗體，這對ADCs的成功至關重要。^{2, 3} 理想情況下，連接子在循環過程中應在血漿中保持穩定，但在內化進入目標癌細胞後迅速釋放其藥物負載。³ 疏水性為連接子設計的另一個關鍵問題。具有疏水性連接子的ADCs傾向形成聚集體，由於藥物動力學特性的改變以及血流中的免疫原性，可能導致例如肝毒性之類的問題。^{3, 4} 此外，與疏水性連接子連接的藥物為多藥抗性（multidrug resistance，MDR）轉運蛋白的較佳基質，並失去對表現MDR的細胞株之功效。³ 為了解決這些困難，最近將帶電荷的殘基，例如，磺酸鹽或焦磷酸鹽與連接子合併的嘗試得到令人鼓舞的結果，這表示親水連接子對於新穎ADC型式是非常理想的。^{5, 6}

抗體-寡核苷酸共軛物（Antibody-oligonucleotide conjugates，AOCs）為雙功能分子，在包括治療、診斷，以及成像等各個領域的應用日益廣泛。⁷ 在Cantor等人的開創性工作中，透過聚合酶連鎖反應（polymerase chain reaction，PCR）可使寡核苷酸指數性擴增的能力與抗體的高抗原結合特異性完美地結合在一起，進而將傳統免疫吸附分析的靈敏度提高了幾個數量級。⁸ 這種被稱為「免疫PCR」的技術在開發後一直被積極探索中。^9-11 AOCs也已應用於癌症的放射治療。傳統上，透過與抗體的直接結合將放射性元素帶到腫瘤附近。然而，由於緩慢的清除率以及不良的抗體腫瘤滲透動力學，正常組織在此過程中會大量暴露於輻射中。¹² Constant等人的工作開啟了先以AOCs使腫瘤飽和，然後施用攜帶可與腫瘤結合的AOCs雜交的放射性元素的互補鏈的可能性。^{13, 14} 由於相較於抗體，寡核苷酸的清除速度快很多，因此這種兩步法或預先針對目標方法的優勢在於使正常組織的暴露量最小化。¹² 在癌症的放射治療中使用AOCs的臨床前結果令人鼓舞。^15,16 當以內在化抗體構築時，AOCs還可用於將功能性核酸，例如，反義寡核苷酸或小干擾RNA（small-interfering RNAs，siRNAs）遞送至細胞中。^{17, 18}

需要提供一種簡單而直接的方法以有效且快速地產生具有所需功能的寡核苷酸共軛物。

本發明至少部分基於發展一種彈性且模組化的連接子策略，以用於製造基於寡核苷酸鏈配對的寡核苷酸共軛物。據此，本發明提供一種寡核苷酸共軛物及其製備及應用。

於一方面，本發明提供一種寡核苷酸共軛物，包含（i）第一寡核苷酸共軛物，包含與生物分子接合的第一單鏈寡核苷酸，其中該第一單鏈寡核苷酸包含第一核苷酸序列；及/或（ii）第二寡核苷酸共軛物，包含與試劑接合的第二單鏈寡核苷酸，其中該第二單鏈寡核苷酸包含與該第一核苷酸序列互補的第二核苷酸序列；其中該第一及第二寡核苷酸共軛物形成雙鏈寡核苷酸共軛物，其在該第一核苷酸序列以及該第二核苷酸序列之間包含雜交的寡核苷酸橋區域，藉以該生物分子與該試劑在該雙鏈寡核苷酸共軛物中連接在一起。

於某些具體實施例中，該第一及第二核苷酸序列分別包含富含GC的序列。

於某些具體實施例中，該第一核苷酸序列及該第二核苷酸序列分別基本上不具有二級結構。

於某些具體實施例中，該第一及第二核苷酸序列具有至少38°C（例如，38°C至100°C）的解鏈溫度（melting temperature，Tm）。於某些情況下，該Tm為約40°C-70°C，例如，41°C-69°C、43°C-67°C、45°C-65°C、47°C-63°C、 49°C-60°C、51°C-59°C，或53°C-57°C。

於某些具體實施例中，該第一單鏈寡核苷酸在3'端接合至該標靶生物分子，及/或該第二單鏈寡核苷酸在3'端接合至該試劑。

於某些具體實施例中，該第一單鏈寡核苷酸在5'端接合至該標靶生物分子，及/或該第二單鏈寡核苷酸在5'端接合至該試劑。

於某些具體實施例中，該第一單鏈寡核苷酸、該第二單鏈寡核苷酸或兩者為DNAs、RNAs，或其雜合體。

於某些具體實施例中，該第一單鏈寡核苷酸、該第二單鏈寡核苷酸或兩者包含至少一個修飾的核苷酸殘基。

於某些具體實施例中，該富含GC的序列包含如SEQ ID NO: 1所示之核苷酸序列5'-SSWSSWSWSSSWWSSWSS-3'，其中每個S獨立地選自G或C，每個W獨立地選自A或T；或如SEQ ID NO: 2所示之核苷酸序列5'- SSWSSWWSSSWSWSSWSS-3'，其中每個S獨立地選自G或C，每個W獨立地選自A或T。

於特定的具體實施例中，該富含GC的序列包含如SEQ ID NO: 3所示之核苷酸序列5'-GGWCCWGWCCGWWGGWCC-3'，其中每個W獨立地選自A或T；或如SEQ ID NO: 4所示之核苷酸序列5'- GGWCCWWCGGWCWGGWCC-3'，其中每個W獨立地選自A或T。

於某些實施例中，該富含GC的序列包含核苷酸序列5'-GGACCAGACCGAAGGACC-3'（SEQ ID NO: 5）；或核苷酸序列5'-GGTCCTTCGGTCTGGTCC-3'（SEQ ID NO: 6）。

於某些具體實施例中，該（第一/第二）寡核苷酸中的每一個或兩者包含約12至80個核苷酸的長度，例如，約15至約60個核苷酸，約15至約50個核苷酸，約15至約40個核苷酸，約15至約30個核苷酸，約15至約25個核苷酸，或約15至約20個核苷酸。於某些實施例中，該一或兩個寡核苷酸可包含約15至約25個核苷酸，例如，約18個核苷酸。

於某些具體實施例中，該生物分子為胜肽、多胜肽、核酸或碳水化合物分子。

於某些具體實施例中，該生物分子為標靶分子，例如，抗體。

於某些具體實施例中，該（第一）寡核苷酸透過化學連接子與生物分子接合。該化學連接子的實例包括，但不限於，琥珀醯亞胺部分體、馬來醯亞胺部分體、聯胺部分體、酪胺酸部分體、腙部分體、疊氮化物部分體、末端炔烴部分體、應變末端炔烴部分體，或膦部分體。

於某些具體實施例中，該生物分子與該第一寡核苷酸之間的莫耳比為1∶1至1∶6（例如，1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5或1∶6）。

於某些具體實施例中，該接合至該第二寡核苷酸的試劑為治療劑或診斷劑。

於某些具體實施例中，該治療劑為細胞毒性劑。該細胞毒性劑之實例包括，但不限於，單甲基澳瑞他汀E（monomethyl auristatin E，MMAE）或美他素(Mertansine)（DM1）。

於某些具體實施例中，該診斷劑為螢光部分體、發光部分體或放射性部分體。

於另一方面，本發明提供一種製備寡核苷酸連接的分子之方法，該方法包含（a）提供第一寡核苷酸共軛物，其包含與生物分子接合的第一寡核苷酸，其中該第一寡核苷酸包含第一核苷酸序列；（b）提供第二寡核苷酸共軛物，其包含與試劑接合的第二寡核苷酸，其中該第二寡核苷酸包含與該第一核苷酸序列互補的第二核苷酸序列；以及（c）在允許該第一寡核苷酸及該第二寡核苷酸之間雜交的條件下，培育該第一寡核苷酸共軛物與該第二寡核苷酸共軛物，藉此產生攜帶該生物分子與該試劑兩者的寡核苷酸連接的分子。任選地，該方法可進一步包含（d）收穫在步驟（c）中產生的該寡核苷酸連接的分子。該第一寡核苷酸、該第一核苷酸序列、該欲結合至該第一寡核苷酸的生物分子、該第二寡核苷酸、該第二核苷酸序列，以及欲結合到該第二寡核苷酸的試劑之示例性特徵如上所述。

於某些具體實施例中，本文所公開之任何方法中的步驟（a）可透過以下方法進行：（a1）在該第一寡核苷酸的5'端添加第一官能柄，以形成反應性第一寡核苷酸；以及（a2）使該反應性第一寡核苷酸與該生物分子反應，以產生該第一寡核苷酸共軛物。於某些情況下，該第一官能柄為馬來醯亞胺部分體且該生物分子為包含游離–SH基團的多胜肽，例如，該多胜肽（例如，抗體）包含內部雙硫鍵，可透過還原劑進行處理，以產生該游離–SH基團。於某些情況下，步驟（a1）可透過使該第一寡核苷酸與琥珀醯亞胺基4-（N-馬來醯亞胺基甲基）環己烷-1-羧酸反應來進行。

於某些具體實施例中，本文所公開之任何方法中的步驟（b）可透過以下方法進行：（b1）在該第二寡核苷酸的5’端添加第二官能柄，以產生反應性第二寡核苷酸；以及（b2）於交聯劑存在下使該反應性第二寡核苷酸與該試劑作用，以產生與該第二寡核苷酸接合的該試劑。於某些情況下，該第二官能柄為–SH基團或–NH₂ 基團。替代地或另外地，該交聯劑為琥珀醯亞胺基4-（N-馬來醯亞胺基甲基）環己烷-1-羧酸或2,2’-二硫代二吡啶。

此外，本文提供一種用於在有此需要的個體中治療或診斷疾病之方法，該方法包括對該個體施用本文所公開之任何寡核苷酸共軛物。同樣在本發明內容的範圍內的是任何寡核苷酸共軛物或含此之醫藥組合物，其用於治療合適的目標疾病或病症，或用於製造用於治療該目標疾病或病症之藥物。

於以下之描述中闡述本發明之一或多個具體實施例之細節。從以下附圖與數個具體實施例之詳細描述，以及從所附申請專利範圍，本發明之其他特徵或優點將變得顯而易見。

以下描述之目的僅在於說明本發明之各種具體實施例。如此，本文討論之特定具體實施例或修改不應被解釋為對本發明範圍之限制。對於本領域技術人員將顯而易見的是，在不脫離本發明的範圍之情況下，可做出各種改變或等同物。

為了提供對本發明的清楚及穩妥之理解，首先定義某些術語。於整個詳細描述中闡述附加定義。除非另有定義，否則本文所用之所有技術及科學術語具有與本發明所屬領域的技術人員通常所理解的相同含義。

本發明至少部分基於發展一種基於鏈雜交的連接子形式，該連接子形式用於接合生物分子及目標試劑，以形成生物分子-藥物共軛物。

具有磷酸酯主鏈的寡核苷酸為高度帶電荷的親水性分子，並可潛在地減輕由疏水性有效負載引起的問題，這是與藥物共軛物，例如，抗體-藥物共軛物（ADCs）的開發相關的常見問題。另外，寡核苷酸通常為非免疫原性的，並且只能透過受體調節的胞飲作用進入細胞，這被認為是效率很低的過程。如此一來，預期本文所公開之寡核苷酸共軛物具有最小的標靶毒性，標靶毒性是與常規ADCs有關的另一個常見問題。^{17, 19-22} 此外，互補鏈之間的雜交是一個非常快速的過程，對於典型的引子長度的寡核苷酸，速率常數預估為10⁶ M^-1s-1 。^{23, 24} 相較之下，大多數常用於共軛的雙正交「點擊化學」反應，例如，史陶丁格連接（Staudinger ligation）或銅催化的疊氮化物-炔烴環加成（Copper-catalyzed azide-alkyne cycloaddition，CuAAC），其速率常數在10^-4 至10² M^-1s-1 之間。²⁵

因此，預期本文提供之寡核苷酸共軛物至少具有以下潛在益處：高親水性、低免疫原性、模組化藥物附著、快速製備，或其組合。

如在工作實施例中所證明的，如透過在瓊脂凝膠上的遷移率移動分析所觀察到的，示例性抗體-寡核苷酸錯合物（或稱為抗體-寡核苷酸共軛物，AOCs）成功地快速且以序列特異性方式和與互補鏈接合的治療劑配對。間接ELISA顯示示例性ADC中的抗體部分體保留了其與其標靶抗原的結合能力。此外，共軛焦顯微鏡證實ADC所攜帶的治療劑已成功地內化到癌細胞中。本文所公開之體外細胞毒性測定表示，本文所公開之示例性AOC可作為一模組平台，用於透過與多種貨物接合的互補鏈雜交以進行藥物遞送。

這表示本文所公開之寡核苷酸共軛物系統將是用於例如治療或診斷目的之靈活的藥物遞送策略及平台。

1. 寡 核苷酸共軛物

於一方面，本發明公開第一寡核苷酸共軛物（生物分子-寡核苷酸共軛物），其包含與生物分子接合的第一單鏈寡核苷酸，其中該第一單鏈寡核苷酸包含第一核苷酸序列。本發明還公開第二寡核苷酸共軛物（試劑-寡核苷酸共軛物），其包含與試劑接合的第二單鏈寡核苷酸，其中該第二單鏈寡核苷酸包含與該第一核苷酸序列互補的第二核苷酸序列。本發明進一步提供雙鏈寡核苷酸共軛物（生物分子-寡核苷酸-試劑），其在該第一核苷酸序列以及該第二核苷酸序列之間包含雜交的寡核苷酸橋區域，由此該生物分子以及該試劑在該雙鏈寡核苷酸共軛物中連接在一起。

如本文所述，「多核苷酸」或「核酸」等詞係指由核苷酸單元所組成的聚合物。多核苷酸包括天然存在的核酸，例如，去氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，「DNA」）以及核糖核酸（ribonucleic acid，「RNA」）以及核酸類似物，包括具有非天然存在的核苷酸的核酸類似物。可使用例如自動DNA合成儀合成多核苷酸。多核苷酸或核酸可為單鏈的（例如，ssRNA或一單鏈的cDNA）或雙鏈的（例如，一RNA/DNA雙鏈體或dsDNA）。將理解的是，當一核苷酸序列由DNA序列（亦即，A、T、G、C）表示時，其還包括其中「U」替代「T」的RNA序列（亦即，A、U、G、C）。「寡核苷酸」乙詞係指相對較短的核酸片段，通常小於或等於150個核苷酸的長度。寡核苷酸可根據需要設計並合成。

如本文所述，關於核苷酸序列的「互補的」乙詞包括兩個多核苷酸的相互作用表面的拓撲相容性或匹配在一起的含義。因此，這兩個分子可被描述為互補的，此外，接觸表面特性彼此互補。若第一多核苷酸的核苷酸序列與第二多核苷酸的多核苷酸結合伴侶的核苷酸序列相同，則該第一多核苷酸與該第二多核苷酸互補。因此，序列5’-TATAC-3’的多核苷酸與序列5’-GTATA-3’的多核苷酸互補。

如本文所用，「基本上相同」乙詞係指兩個序列具有70%或更高，較佳為75%或更高，更佳為80%或更高，甚至更佳為85%或更高，再甚至更佳為90%或更高，最佳為95%或更高，或100%的同一性。

為了確定兩個序列的同一性百分比，將序列進行比對以達到最佳比較目的（例如，可在第一核苷酸序列的序列中引入缺口以與第二核苷酸序列最佳比對）。在計算同一性百分比時，通常會計算精確匹配。可使用本領域已知的數學演算法來確定兩個序列之間的同源性或同一性百分比，例如，BLAST以及缺口BLAST程式、NBLAST以及XBLAST程式，或ALIGN程式。

如本文所用，「解鏈溫度（Tm）」乙詞係指一半的核酸雙鏈體解離產生單鏈多核苷酸的溫度。

如本文所述，本文所用之「雜交」乙詞應包括核酸鏈透過鹼基配對與互補鏈結合的任何過程。相關方法為本領域所公知的，且例如描述於Sambrook等人，Molecular Cloning: A Laboratory Manual，第二版，冷泉港實驗室出版社（1989年），以及Frederick M.A.等人，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons公司（2001年）。通常，嚴格條件應選擇為比指定序列在定義的離子強度及pH下的熔點（Tm）低約5至30°C。更典型地，在確定的離子強度及pH下，嚴格條件被選擇為比指定序列的Tm低約5至15°C。例如，嚴格的雜交條件將是其中鹽濃度小於約1.0 M鈉（或其他鹽）離子，通常在約pH 7.0至約pH 8.3下約0.01至約1 M鈉離子濃度的條件。對於短寡核苷酸（例如，10至50個核苷酸）至少約25°C，對於長寡核苷酸（例如，大於50個核苷酸）至少約55°C。長寡核苷酸（例如，大於50個核苷酸）的示例性非嚴格或低嚴格條件將包含20 mM Tris，pH 8.5、50 mM KCl以及2 mM MgCl₂ 的緩衝液，反應溫度為25°C 。

於某些具體實施例中，本文所述之一個或兩個寡核苷酸可包含非天然存在的核鹼基、糖或共價核苷間鍵（主鏈）。這樣的修飾的寡核苷酸賦予期望的性質，例如，增強細胞攝取、改善的對標靶核酸的親和力，以及增加的體內穩定性。

於一實例中，本文所述之寡核苷酸具有修飾的骨架，包括保留磷原子的那些（參閱，例如，美國專利第3,687,808；4,469,863；5,321,131；5,399,676；以及5,625,050號）以及不含磷原子的那些（參閱，例如，美國專利第5,034,506；5,166,315；以及5,792,608號）。含磷的修飾主鏈的實例包括，但不限於，硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、胺基烷基磷酸三酯、甲基，以及其他烷基膦酸酯包括3'-亞烷基膦酸酯、5'-亞烷基膦酸酯以及手性膦酸酯、次膦酸酯、胺基磷酸酯，包括3'-胺基胺基磷酸酯以及胺基烷基胺基磷酸酯、硫代胺基磷酸酯、硫代烷基磷酸酯、硫代烷基磷酸三酯、硒代磷酸酯，以及具有3'-5'鍵或2'-5'鍵的硼酸磷酸酯。這樣的主鏈還包括極性相反的那些，即3'至3'，5'至5'或2'至2'連接。透過短鏈烷基或環烷基核苷間鍵，混合的雜原子與烷基或環烷基核苷間鍵或一個或多個短鏈雜原子或雜環核苷間鍵形成不包含磷原子的修飾主鏈。這類骨架包括具有嗎啉代鍵的骨架（部分由核苷的糖部分所形成）；矽氧烷主鏈；硫化物，亞碸和碸骨架；甲醯基以及硫代甲醯基的骨架；亞甲基甲醯基以及硫代甲醯基主鏈；核糖乙醯基骨架；含烯烴的主鏈；胺基磺酸鹽骨架；亞甲基亞胺基以及亞甲基聯胺基骨架；磺酸鹽以及磺醯胺骨架；醯胺主鏈；以及其他混合了N、O、S以及CH₂ 成分的化合物。於某些情況下，修飾的骨架可為N-2-胺基乙基甘胺酸骨架（胜肽核酸或PNA）。

於另一實例中，本文所述之寡核苷酸包括一個或多個取代的糖部分體。這樣的取代的糖部分體可在它們的2'位置包括下列基團之一：OH；F；O-烷基、S-烷基、N-烷基、O-烯基、S-烯基、N-烯基；O-炔基、S-炔基、N-炔基，以及O-烷基-O-烷基。在這些基團中，烷基、烯基以及炔基可為取代或未取代的C1至C10烷基或C2至C10烯基以及炔基。他們亦可在其2'位置包括雜環烷基、雜環烷基芳基、胺基烷基胺基、聚烷基胺基、取代的甲矽烷基、RNA裂解基團、報告基團、嵌入劑、用於改善一寡核苷酸的藥物動力學性質的基團，或用於改善一寡核苷酸的藥效學性質的基團。較佳的取代的糖部分體包括具有2'-甲氧基乙氧基、2'-二甲基胺基氧基乙氧基，以及2'-二甲基胺基乙氧基乙氧基的那些。參閱Martin等人，Helv. Chim. Acta, 1995, 78, 486-504。

替代地或另外，本文所述之寡核苷酸可包括一種或多種修飾的天然核鹼基（亦即，腺嘌呤、鳥嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶以及尿嘧啶）。修飾的核鹼基包括在美國專利第3,687,808號、The Concise Encyclopedia of Polymer Science and Engineering，第858-859頁、Kroschwitz, J.I.編輯，John Wiley＆Sons公司，1990年，Englisch等人，Angewandte Chemie，國際版，1991，30，613，以及Sanghvi，Y.S.，第15章，Antisense Research and Applications，第289-302頁，CRC Press出版社，1993年。

於某些具體實施例中，該第一及第二核苷酸序列各自包含富含GC的序列。於某些具體實施例中，該第一核苷酸序列以及該第二核苷酸序列各自基本上不具有二級結構。

如本文所述，如本文所之「富含GC的」乙詞係指在其結構或其結構的一部分或區域中具有相對高數量的G及/或C鹼基的多核苷酸或寡核苷酸。通常，具有大於約35% GC含量的核苷酸序列的寡核苷酸被認為是富含GC的序列。例如，富含GC的序列為GC含量為35%至75%，例如，40%至75%，45%至75%，50%至75%，55%至75%，60%至75%，或65%至75%的那些序列。

如本文所述，關於單鏈寡核苷酸，短語「基本上不具有二級結構」包括以下含義：該寡核苷酸不具有一大部分彼此反向互補（亦即，寡核苷酸的一個區域與另一個區域雜交），進而允許分子內鹼基配對的序列。「實質部分」乙詞可包括四（4）個或更多個連續核苷酸殘基的含義。具體而言，如本文所用之用於攜帶一生物分子或一目標試劑的單鏈寡核苷酸被設計為避免這種二級結構，例如，環結構。較佳地，本文所用之單鏈寡核苷酸僅執行其結合伴侶的互補，並且不包括自身產生二級結構的序列。

本文所公開之寡核苷酸可具有合適的長度。於某些具體實施例中，該寡核苷酸中的一個或兩個可包含約12至約80個核苷酸（nts），例如，約15至約60 nts，約15至約50 nts，約15至約40 nts，約15至約30 nts，約15 nts至約25 nts，或約15至約20 nts。於某些實例中，該一個或兩個寡核苷酸可包含約15至約25 nts，例如，約18 nts。

本文所公開之雜交的寡核苷酸共軛物中的兩個寡核苷酸可具有相同的長度，或可具有不同的長度。於某些實例中，一寡核苷酸的整個序列與另一寡核苷酸的全部或部分互補。於其他實例中，一寡核苷酸的一部分與另一寡核苷酸的全部或部分互補。

於某些情況下，該兩個寡核苷酸包含完全互補的序列（亦即，沒有錯配的鹼基對）。或者，該兩個寡核苷酸可包含部分互補序列（亦即，包含一個或多個錯配的鹼基對），同時仍能夠形成雙鏈結構。不會影響特定序列的雙鏈結構形成的可容許錯配程度為本領域技術人員已知的。

於某些具體實施例中，該第一及第二核苷酸序列分別包含GC豐富的序列，其長度範圍為12個核苷酸（nts）至80 nts（例如，15至60 nts，15至50 nts，15至40 nts，15至30 nts，15至25 nts，15至20 nts，或18 nts）且基本上沒有二級結構。具體而言，該第一及第二核苷酸序列具有至少38°C，例如，40°C至70°C（例如，41°C-69°C，43°C-67°C，45°C-65°C，47°C-63°C，49°C-60°C，51°C-59°C或 53°C-57°C）的解鏈溫度（Tm）。

於某些特定的具體實施例中，該第一及第二核苷酸序列分別包含核苷酸序列，該核苷酸序列包含5'-SSWSSWSWSSSWWSSWSWSS-3'（SEQ ID NO: 1）的模體，其中每個S獨立地選自G或C，且每個W獨立地選自A或T。這樣的序列的實例包括5'-GGWCCWGWCCGWWGGWCC-3'（SEQ ID NO: 3），例如5'- GGACCAGACCGAAGGACC-3'（SEQ ID NO: 5）。如本文所述之第一核苷酸序列以及第二核苷酸序列還可包括與如本文所述之特定序列號基本相同的序列，例如，與SEQ ID NO: 1、3或5具有70%或更高，較佳為75%或更高，更佳為80%或更高，甚至更佳為85%或更高，再甚至更佳為90%或更高，最佳為95%或更高，或100%相同性的核苷酸序列。

於某些特定的具體實施例中，該第一及第二核苷酸序列分別包含富含GC的序列，該富含GC的序列包含5'- SSWSSWWSSSWSWSSWSS-3'（SEQ ID NO: 2）的模體，其中每個S獨立地選自G或C，且每個W獨立地選自A或T。這種富含GC的序列的實例包括5'- GGWCCWWCGGWCWGGWCC-3'（SEQ ID NO: 4），例如5'- GGTCCTTCGGTCTGGTCC-3'（SEQ ID NO: 6）。如本文所述之第一核苷酸序列以及第二核苷酸序列還可包括與如本文所述之特定序列號基本相同的序列，例如，與SEQ ID NO: 1、3或5具有70%或更高，較佳為75%或更高，更佳為80%或更高，甚至更佳為85%或更高，再甚至更佳為90%或更高，最佳為95%或更高，或100%相同性的核苷酸序列。

如本文所述，關於與寡核苷酸接合以產生生物分子-寡核苷酸共軛物的生物分子較佳為標靶分子，其在識別特定標靶（例如，疾病相關抗原，如腫瘤抗原）中具有作用，進而定位至標靶區域，進入標靶細胞及/或結合至標靶抗原或受體。於某些情況下，該標靶生物分子可為抗體、核酸（例如，適體）、凝集素、黏附分子、細胞激素、醣類、類固醇、激素、胜肽、蛋白質，以及酶。

如本文所述，關於與寡核苷酸接合以產生試劑-寡核苷酸共軛物的目標試劑可為具有期望效用，如治療用途、診斷用途或美容用途的任何類型之分子。於某些情況下，該目標試劑為治療劑，其可為對目標疾病或病症具有治療作用的任何分子。於某些實例中，該治療劑可為小分子細胞毒性劑，例如，抗癌藥，例如，單甲基澳瑞他汀E（monomethyl auristatin E，MMAE）或Mertansine（DM1）。於某些實例中，目標試劑可為基於胜肽或基於多胜肽的分子，例如，抗體或標靶胜肽。例如，抗癌抗體包括，但不限於，抗HER2抗體、抗VEGF抗體、抗CD20抗體、抗ErbB2抗體以及抗CD30抗體。於某些實例中，目標試劑可為診斷試劑，其可為具有可用於檢測目的之性質或功能的任何部分，例如，螢光部分體（例如，聚茀、螢光素，或Ru、Eu、Pt錯合物）、發光部分體（例如，辣根過氧化物酶標記）或放射性部分體（例如，氚（³ H）、³² P、³⁵ S或¹⁴ C，或共價結合的標記物，例如，與酪胺酸結合的¹²⁵ I、氟去氧葡萄糖內的¹⁸ F，或金屬有機錯合物，例如，⁹⁹ Tc-DTPA）。

根據本發明，如本文所述之寡核苷酸共軛物可在該生物分子/試劑與共軛物中的寡核苷酸之間具有不同的莫耳比，這可透過本領域已知的方法來測量，例如，SDS-PAGE。於某些情況下，該生物分子與該寡核苷酸共軛物中的該第一寡核苷酸之間的莫耳比可在1:1至1:6的範圍內（例如，1:1、1:2、1:3、1:4、1:5或 1:6）。

本文所公開之寡核苷酸共軛物系統作為靈活的藥物遞送策略及平台，以透過選擇合適的生物分子以及需要與寡核苷酸接合的目標試劑來製備具有所需功能的寡核苷酸共軛物。例如，待接合的生物分子及/或目標試劑為抗體，且當兩者皆為抗體時，它們可以不同的抗原為標靶，因此提供雙特異性抗體分子。根據本發明，本文所述之產生雙或多功能分子的寡核苷酸連接方法不限於抗體，而是可用於連接任何兩個分子，例如，黏附分子、細胞激素，或凝集素。

於特定的具體實施例中，當要與寡核苷酸接合的標靶分子為抗體時，本發明提供抗體-寡核苷酸共軛物（AOC）。於某些情況下，將AOC與試劑-寡核苷酸共軛物雜交，形成雙鏈抗體-藥物共軛物（ADC），每條鏈分別包含抗體及目標試劑，由該抗體及目標試劑透過基於雙鏈寡核苷酸的連接子接合。

如本文所用，抗體（與複數形式可互換使用）為一種免疫球蛋白分子，其能夠透過位於該免疫球蛋白分子的可變區的至少一個抗原識別位點特異性結合至目標，例如，碳水化合物、多核苷酸、脂質、多胜肽等。如本文所用，「抗體」乙詞不僅涵蓋完整的（亦即，全長）多株或單株抗體，還包括其抗原結合片段（例如，Fab、Fab'、F（ab'）2、Fv）、單鏈抗體（scFv）、包含抗體部分的融合蛋白、人源化抗體、嵌合抗體、雙抗體、單結構域抗體（例如，奈米抗體）、單結構域抗體（例如，僅V_H 抗體）、多特異性抗體（例如，雙特異性抗體）以及該免疫球蛋白分子的任何其他修飾構型，其包括具有所需特異性的抗原識別位點，包括抗體的醣基化變體、抗體的胺基酸序列變體，以及共價修飾的抗體。抗體包括任何類別的抗體，例如，IgD、IgE、IgG、IgA，或IgM（或其亞類），且該抗體不必為任何特定類別。根據其重鏈恆定結構域的抗體胺基酸序列，免疫球蛋白可分為不同類別。

典型的抗體分子包含重鏈可變區（V_H ）以及輕鏈可變區（V_L ），其通常與抗原結合有關。該V_H 與V_L 區域可進一步細分為高變區，亦稱為「互補決定區」（「complementarity determining regions」，「CDR」），散佈著較為保守的區域，即「框架區」（「framework regions」，「FR」）。每個V_H 與V_L 通常由三個CDRs以及四個FRs所組成，它們按以下順序從胺基端到羧基端排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。可使用本領域已知的方法，例如，透過Kabat定義，Chothia定義，AbM定義，及/或接觸定義來精確地識別框架區與CDRs的程度，所有這些在本領域中為眾所周知的技術。參閱，例如，Kabat, E.A.等人（1991年）Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第五版，美國衛生暨人力服務部，NIH出版編號91-3242, Chothia等人（1989年）Nature 342:877；Chothia, C.等人（1987年）J. Mol. Biol. 196:901-917, Al-lazikani等人（1997年）J. Molec. Biol. 273:927-948；以及Almagro, J. Mol. Recognit. 17:132-143（2004年）。亦參閱hgmp.mrc.ac.uk以及bioinf.org.uk/abs。

本文所公開之任何ADCs中的抗體可為全長抗體，其包含兩條重鏈及兩條輕鏈，每條均包含可變結構域以及恆定結構域。或者，該抗體可為全長抗體的抗原結合片段。在全長抗體的「抗原結合片段」乙詞中所涵蓋的結合片段的之實例包括（i）Fab片段，由V_L 、V_H 、C_L 以及C_H 1結構域所組成之單價片段；（ii）F（ab'）₂ 片段，一種二價片段，其包括透過鉸鏈區的雙硫鍵連接的兩個Fab片段；（iii）由V_H 以及C_H 1結構域組成的Fd片段；（iv）由抗體單臂的V_L 以及V_H 結構域所組成的Fv片段；（v）由V_H 結構域所組成的dAb片段（Ward等人，（1989年）Nature 341:544-546）；以及（vi）保留功能的分離的互補決定區（complementarity determining region，CDR）。此外，儘管Fv片段的兩個結構域V_L 以及V_H 由不同的基因編碼，但它們可使用重組方法透過合成的連接子連接起來，進而使它們成為一條蛋白鏈，其中V_L 與V_H 區配對以形成稱為單鏈Fv（scFv）的單價分子。參閱例如，Bird等人（1988年）Science 242:423-426；以及Huston等人（1988年）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883。

本文所述之抗體可來自合適的來源，例如，小鼠、大鼠，或人類。此類抗體為非天然存在的，即在沒有人為行為（例如，以所需抗原或其片段免疫此類動物，或自抗體庫分離出來）的情況下不會在動物中產生。本文所述之任何抗體可為單株的或多株抗體。「單株抗體」係指同質抗體群，「多株抗體」係指異質抗體群。這兩個術語並不限制抗體的來源或製備方式。

於某些具體實施例中，該抗體為人類抗體，其可從人類抗體文庫中分離或在轉基因小鼠中產生。於其他具體實施例中，該抗體可為人源化抗體或嵌合抗體。

2. 寡 核苷酸共軛物之製備

如本文所述之寡核苷酸共軛物可透過常規程序例如重組技術、雜交瘤技術、化學合成等來製備。

為了製備本文所公開之任何寡核苷酸共軛物，可透過本領域提供之常規實施或方法將寡核苷酸接合至生物分子上，以產生生物分子-寡核苷酸共軛物，並且可按照本領域已知的知識或本文提供之指導將互補的寡核苷酸接合至目標試劑。然後可在允許兩個寡核苷酸雜交以產生雜交雙鏈寡核苷酸共軛物的條件下，其中該生物分子及該試劑連接在一起，將該兩種寡核苷酸共軛物一起培育。

如本文所述，寡核苷酸與目標生物分子或試劑的接合可以共價或非共價進行。用於共價或非共價接合的方法為本領域可用的。非共價鍵可透過離子相互作用，例如，魚精蛋白電荷力方法以及親和力結合，例如，基於抗生物素蛋白的接合方法來進行。在生物分子/試劑部分體以及寡核苷酸之間存在共價鍵的情況下，該生物分子/試劑部分體或在該寡核苷酸上的活化基團與在該寡核苷酸或在該生物分子/試劑部分體上的官能基團可以直接反應，或透過異雙功能連接子分子，其首先與其中一個反應，然後與另一個結合配偶體反應。化學連接子的實例包括，但不限於，琥珀醯亞胺部分體、馬來醯亞胺部分體、聯胺部分體、酪胺酸部分體、腙部分體、疊氮化物部分體、末端炔烴部分體、應變末端炔烴部分體，或膦部分體。可在寡核苷酸的5’端或3’端接合目標生物分子或試劑。

於某些具體實施例中，可修飾用於製備本文所公開之寡核苷酸共軛物的寡核苷酸以添加官能柄，該官能柄可與該生物分子、目標試劑或連接子（例如，化學連接子）反應以形成共價鍵。官能柄可為包含可與另一個官能基團反應以形成共價鍵的官能基團的任何化學部分體。示例性的官能基團包括，但不限於，羥基（-OH）、甲基、羰基（-C=O）、羧基（-COOH）、胺基（-N）、磷酸基團，或硫醇基團（-SH）。可將官能柄添加至該寡核苷酸的5'端。或者，可以將其添加至該寡核苷酸的3’端。

於某些實例中，攜帶官能柄的寡核苷酸可直接連接至該抗體中胺基酸殘基所攜帶的官能基團。或者，該攜帶官能柄的寡核苷酸可透過化學連接子與該抗體中胺基酸殘基所攜帶的官能基團連接。該抗體中的官能基團的實例包括酪胺酸或絲胺酸中的–OH基、離胺酸、精胺酸或組胺酸中的–NH₂ 基，天門冬胺酸或麩胺酸中的–COOH基，或半胱胺酸中的–SH基。於某些實例中，該抗體可包含一個或多個內部雙硫鍵。可透過還原劑處理此類抗體，以直接或透過化學連接子釋放–SH官能基團以與該寡核苷酸接合。示例性化學連接子可包含，但不限於，琥珀醯亞胺部分體、馬來醯亞胺部分體、聯胺部分體、酪胺酸部分體，或腙部分體。

將寡核苷酸接合至抗體上的其他方法為本領域已知的，並且可用於本文提供之公開內容中。參閱，例如，PCT專利公開第WO2017/190020號，出於本文中引用之目的及主題，透過引用將其相關公開內容併入。

將寡核苷酸與目標試劑接合將取決於該目標試劑之性質，例如，其化學結構。於某些實例中，該目標試劑包含與本文所公開之寡核苷酸所攜帶的官能柄具有反應性的官能基團。在此情況下，可在該目標試劑以及該帶有官能柄的寡核苷酸之間發生直接反應，以使該目標試劑與該寡核苷酸接合。在其他情況下，可修飾該目標試劑以添加第二官能柄，該第二官能柄對與該寡核苷酸連接的官能柄具有反應性。於圖6中提供使用MMAE與DM1作為示例性細胞毒性劑之實例。

然後可在合適的雜交條件下使該生物分子-寡核苷酸共軛物與該目標寡核苷酸-共軛物作用，以允許在該互補寡核苷酸之間形成雙鏈結構，進而形成以雜交形式與如本文所述之該生物分子及該目標試劑連接的寡核苷酸共軛物。合適的雜交條件（例如，溫度、離子強度、作用時間等）將根據各種因素確定，例如，該寡核苷酸的長度、該寡核苷酸的解鏈溫度、互補程度等，這些在本領域技術人員的知識範圍內。

實施例1提供製備所公開之寡核苷酸共軛物的示例性方法。

3. 寡 核苷酸共軛物之用途

可將本文所述之任何寡核苷酸共軛物與醫藥上可接受的載體混合以形成醫藥組合物，該醫藥組合物用於例如，治療或診斷目標疾病或偵測標靶（例如，疾病相關抗原）。「可接受的」係指該載體必須與該組合物的活性成分相容（且較佳地能夠穩定該活性成分）且對該待治療的個體無害。醫藥上可接受之賦形劑（載體），包括緩衝劑，其為本領域習知。參閱，例如，Remington: The Science and Practice of Pharmacy 第20版（2000年）Lippincott Williams and Wilkins, Ed. K. E. Hoover。

本發明方法中使用之醫藥組合物可包含凍乾製劑或水溶液形式的醫藥上可接受之載體、賦形劑或穩定劑。參閱，例如，Remington: The Science and Practice of Pharmacy 第20版（2000年）Lippincott Williams and Wilkins, Ed. K. E. Hoover。可接受的載體、賦形劑或穩定劑在使用的劑量及濃度下對受體無毒，可包含緩衝劑，例如，磷酸鹽、檸檬酸鹽，以及其他有機酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸及甲硫胺酸；防腐劑（例如，十八烷基二甲基芐基氯化銨；六甲基氯化銨；苯扎氯銨、芐索氯銨；苯酚、丁醇或芐醇；對羥基苯甲酸烷基酯，如對羥基苯甲酸甲酯或對羥基苯甲酸丙酯；鄰苯二酚；間苯二酚；環己醇；3-戊醇：以及間甲酚）；低分子量（少於約10個殘基）多胜肽；蛋白質，例如，血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，例如，聚乙烯吡咯烷酮；胺基酸，例如，甘胺酸，麩醯胺酸、天門冬醯胺、組胺酸、精胺酸或離胺酸；單醣、雙醣以及其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或右旋糖酐；螯合劑，如EDTA；蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇等糖；成鹽的抗衡離子，例如鈉；金屬錯合物（例如，鋅蛋白錯合物）；及/或非離子界面活性劑，例如，TWEEN^TM 、PLURONICS^TM 或聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）。

用於體內施用的醫藥組合物必須為無菌的。這很容易透過例如，透過無菌過濾膜的過濾來完成。可將包含共軛物的組合物放入具有無菌進入口的容器中，例如，具有皮下注射針可刺穿的塞子的靜脈內溶液袋或小瓶。

本文所述之任何共軛物可用於將其中包含的目標試劑遞送至抗體組成分標靶的特定細胞及/或組織。為了實施本文所公開之方法，可透過合適的途徑將有效量的本文所述之醫藥組合物，其包含本文也公開的任何寡核苷酸共軛物，給予需要治療之個體（例如，人類），該合適的途徑例如為透過靜脈內給藥，例如以推注或一段時間內連續輸注的方式，透過肌肉內、腹膜內、脊髓內、皮下、關節內、滑膜內、鞘內、口服、吸入或局部途徑給藥。如本文所用，「有效量」係指單獨或與一種或多種其他活性劑組合賦予該個體治療效果所需的每種活性劑的量。對於本領域技術人員而言，確定本文所公開之寡核苷酸共軛物的量是否達到治療或診斷效果將是顯而易見的。如本領域技術人員所認識的，有效量取決於所治療的特定病症、病症的嚴重程度，包括年齡、身體狀況、大小、性別，以及體重的個體患者參數、治療持續時間、並行治療之性質（如果有的話）、特定的給藥途徑，以及衛生從業人員的知識及專長內的類似因素。這些因素為本領域普通技術人員習知的，且僅透過常規實驗即可解決。通常較佳使用單個組成分或其組合的最大劑量，亦即根據合理醫學判斷的最高安全劑量。

例如，半衰期之類的經驗因素通常會有助於確定劑量。施用頻率可在治療過程中確定並調整，且通常但非必要地基於目標疾病/病症之治療及/或抑制及/或改善及/或延遲。或者，本文所公開之共軛物的持續連續釋放製劑可能是合適的。用於實現持續釋放的各種製劑及裝置是本領域已知的。

為了本發明之目的，本文所述之寡核苷酸共軛物的合適劑量將取決於寡核苷酸共軛物中包含的特定治療劑或診斷劑、寡核苷酸共軛物中的生物分子組成分、疾病/病症的類型以及嚴重性、是否出於預防或治療目的、先前的治療、患者的臨床病史以及對拮抗劑的反應，以及主治醫師的判斷而施用該寡核苷酸共軛物。臨床醫生可施用寡核苷酸共軛物，直到達到期望結果的劑量為止。於某些具體實施例中，期望的結果為與目標疾病或病症有關的至少一種症狀的改善或與一目標疾病/病症有關的至少一種生物標記物的診斷。確定劑量是否產生期望結果的方法對本領域技術人員是顯而易見的。一種或多種寡核苷酸共軛物劑量的給藥可為連續的或間歇的，這取決於例如接受者的生理狀況、給藥的目的是治療性的還是預防性的，以及本領域技術人員已知的其他因素。寡核苷酸共軛物的施用可在預定的時段內基本上連續，或者可以一系列間隔的劑量進行，例如在發展目標疾病或病症之前、之中或之後。

如本文所用，「治療」乙詞係指將包含一種或多種活性劑的組合物施用或給予個體，其患有目標疾病或病症，該疾病/病症的症狀或對該疾病/病症的易感性的人，目的在於治療、治癒、減輕、緩解、改變、補救、改善、增進或影響疾病、疾病症狀或對疾病或疾病的易感性。

如本文所用，如本文所用之「診斷」乙詞通常包括關於確定個體是否可能受到指定疾病、病症或功能障礙的影響。本領域技術人員通常基於一種或多種診斷指標，亦即，標記物，進行診斷，該標記物的存在、不存在或數量指示疾病、病症或功能障礙的存在或不存在。

依照待治療或診斷的疾病類型或疾病部位，可使用醫學領域普通技術人員已知的常規方法將該醫藥組合物施用於個體。該組合物還可透過其他常規途徑施用，例如，口服、胃腸外、透過吸入噴霧、局部、直腸、鼻、頰、陰道或透過植入的儲存庫施用。如本文所用，「腸胃外」乙詞包括皮下、皮內、靜脈內、肌內、關節內、動脈內、滑膜內、胸骨內、鞘內、病變內，以及顱內注射或輸注技術。此外，亦可透過可注射的儲存庫給藥途徑，例如使用1、3、6個月的可儲存庫的可注射或可生物降解的材料及方法來施用於該個體。於某些實例中，該醫藥組合物以眼內或玻璃體內施用。

注射用組合物可包含各種載體，例如，植物油、二甲基乙醯胺、二甲基甲醯胺、乳酸乙酯、碳酸乙酯、肉荳蔻酸異丙酯、乙醇，以及多元醇（甘油、丙二醇、液態聚乙二醇等）。對於靜脈內注射，可透過滴注法施用水溶性共軛物，由此輸注包含該共軛物以及生理學上可接受的賦形劑之醫藥製劑。生理上可接受的賦形劑可包括，例如，5%葡萄糖、0.9%鹽水、林格氏溶液或其他合適的賦形劑。可將肌內製劑，例如寡核苷酸共軛物的合適的可溶性鹽類形式的無菌製劑，溶解並在醫藥賦形劑，如注射用水、0.9%鹽水，或5%葡萄糖溶液中施用。

於一具體實施例中，透過位點特異性或標靶的局部遞送技術施用共軛物。特定於位點或標靶的局部遞送技術之示例包括共軛物或局部遞送導管的各種可植入長效製劑來源，例如，輸液導管、留置導管或針導管、合成移植物、外膜、分流器以及支架或其他可植入設備、特定部位的載體、直接注射或直接施用。參閱，例如，PCT公開第WO 00/53211號以及美國專利第5,981,568號。

以本文所述方法治療之個體可為哺乳動物，例如，農場動物、運動動物、寵物、靈長類動物、馬、狗、貓、小鼠，以及大鼠。於一實例中，該個體為人類。含有共軛物的組合物可用於治療或診斷目標疾病或病症。於某些實例中，該個體可為患有、懷疑患有目標疾病或病症或處於例如癌症的風險中的人類患者。亦可透過常規醫療實踐來識別此類患者。

可透過常規醫學檢查，例如實驗室檢查、器官功能檢查、電腦斷層（CT）掃描或超音波來鑑定具有目標疾病或病症（例如，癌症）的個體。懷疑患有任何此類目標疾病/病症的個體可能顯示出該疾病/病症的一種或多種症狀。處於疾病/病症風險中的個體可為患有與該疾病/病症相關的一種或多種風險因素的個體。亦可透過常規醫學實踐來識別此類對象。

本文所述方法中使用之特定劑量方案，亦即劑量、時間以及施用次數，將取決於特定個體（例如，人類患者）以及該個體的病史。

於某些具體實施例中，本文所公開之共軛物可與用於目標疾病或病症的另一種合適的治療劑共同使用。替代地或另外，本文所公開之共軛物亦可與用於增強及/或補充該試劑效力的其他試劑聯合使用。

4. 藥物輸送套組

本發明還提供使用本文公開之包含目標試劑的任何寡核苷酸共軛物用於將該目標試劑遞送給需要治療的個體之套組。此類套組可包括一個或多個包含寡核苷酸共軛物之容器，例如任何本文所述之那些。

於某些具體實施例中，該套組可包含用於根據如本文所述之任何方法的指示說明。所包括的指示說明可包含該共軛物的施用之描述，以治療、延緩發作或減輕如本文所述之目標疾病。該套組還可包含基於鑑定該個體是否具有該目標疾病來選擇適合於治療該個體之描述。在其他具體實施例中，該指示說明包含對一具有該目標疾病風險的個體施用該共軛物之描述。

關於使用寡核苷酸共軛物的指示說明，通常包括關於預期治療的劑量、給藥方法，以及給藥途徑的資訊。該容器可為單位劑量、批量包裝（例如，多劑量包裝）或次單位劑量。在本發明的套組中提供的指示說明通常是在標籤或包裝插頁（例如，套組中包括的紙張）上的書面指示，但是機器可讀取之指示（例如，磁性或光學存儲碟片上攜帶的指示）也是可以接受的。

標籤或包裝插頁指示該組合物用於治療、延緩，及/或減輕與癌症有關的疾病或病症的發作，例如本文所述之那些。可以提供說明以實施如本文所述之任何方法。

本發明之套組置於合適的包裝中。合適的包裝包括，但不限於，小瓶、瓶子、罐、軟性包裝（例如，密封的聚酯薄膜或塑膠袋）等。還包括用於與特定裝置組合使用的包裝，例如，吸入器、鼻部給藥裝置（例如，霧化器）或例如微型幫浦的輸注裝置。套組可具有無菌入口（例如，容器可為靜脈內溶液袋或具有可被皮下注射針刺穿之瓶塞的小瓶）。容器還可以具有無菌入口（例如，容器可為靜脈內溶液袋或具有可被皮下注射針刺穿之瓶塞的小瓶）。該組合物中的至少一種活性劑為如本文所述之寡核苷酸共軛物。

套組可選擇性地提供附加組件，例如，緩衝液以及解釋資訊。通常，該套組包括在容器上或與容器相關聯的標籤或包裝插頁。於一些具體實施例中，本發明提供了包含上述套組的內容物之製品。

5. 一般技術

除非另有說明，本發明的實踐將使用在本領域技術範圍內的分子生物學（包括重組技術）、微生物學、細胞生物學、生物化學，以及免疫學的常規技術。在文獻中完全解釋了這樣的技術，例如Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第二版（Sambrook等人，1989年）冷泉港出版社；寡核苷酸合成（M. J. Gait編輯，1984年）；Methods in Molecular Biology，Humana出版社；Cell Biology：A Laboratory Notebook（J. E. Cellis編輯，1989年）Academic出版社；動物細胞培養（R. I. Freshney編輯，1987年）；細胞與組織培養介紹（J. P. Mather與 P. E. Roberts，1998年）Plenum出版社；Cell and Tissue Culture：Laboratory Procedures（A. Doyle、J. B. Griffiths，以及D. G. Newell編輯，1993-8年）J. Wiley and Sons出版社；酵素學方法（Academic出版社公司）；Handbook of Experimental Immunology（D. M. Weir與C. C. Blackwell編輯）；哺乳動物細胞的基因轉移載體（J. M. Miller與M. P. Calos編輯，1987年）；Current Protocols in Molecular Biology（F. M. Ausubel，等人編輯，1987年）；PCR：聚合酶連鎖反應（Mullis等人編輯，1994年）；Current Protocols in Immunology（J. E. Coligan等人編輯，1991年）；Molecular Protocols in Molecular Biology（Wiley and Sons出版社，1999年）；免疫生物學（C. A. Janeway與P. Travers，1997年）；抗體（P. Finch，1997年）；抗體：一種實用的方法（D. Catty編輯，IRL出版社，1988-1989年）；單株抗體：一種實用的方法（P. Shepherd與C. Dean編輯，Oxford University 出版社，2000年）；使用抗體：實驗室手冊（E. Harlow與D. Lan（冷泉港實驗室出版社，1999年）；The Antibodies（M. Zanetti與J. D. Capra編輯，Harwood Academic出版社，1995年）；DNA Cloning: A practical Approach ，第I及II卷（D.N. Glover編輯，1985年）；Nucleic Acid Hybridization （ B.D. Hames與S.J. Higgins編輯，1985年）；Transcription and Translation （ B.D. Hames與S.J. Higgins編輯，1984年）；Animal Cell Culture （ R.I. Freshney編輯，1986年）；Immobilized Cells and Enzymes （ lRL出版社）（1986年）；以及B. Perbal,A practical Guide To Molecular Cloning （ 1984年）；F.M. Ausubel等人（編輯）。

無需進一步的闡述，相信本領域技術人員可基於上述描述最大限度地利用本發明。因此，以下具體實施例將被解釋為僅僅是說明性的，而非以任何方式限制本發明其餘之部分。本文所引用之所有出版物係透過引用方式併入，為了本文參考之目的或主題。

實施例

基於寡核苷酸鏈配對的抗體 - 藥物共軛物之靈活模組化連接子策略之開發

連接子設計對於抗體-藥物共軛物（ADCs）的成功相當重要。本實施例提供示例性的模組化連接子形式，用於基於互補寡核苷酸之間的鏈配對將分子貨物連接至抗體。簡言之，透過硫醇-馬來醯亞胺化學將18聚體寡核苷酸連接至抗HER2抗體作為實例，製備抗體-寡核苷酸共軛物（AOCs），該方法通常適用於具有內部雙硫鍵的任何免疫球蛋白。然後將由此產生之AOC跟與在該AOC中的寡核苷酸部分體互補的帶有藥物的寡核苷酸雜交，進而產生該ADC。此雜交過程是快速的、化學計量的，以及序列特異性的。

在本項工作中，我們呈現由抗HER2 IgG1抗體（HTA101，衍生自鼠類抗體庫，隨後進行人源化）以及共價結合的富含GC的18-mer ssDNA鏈（18N）所組成的AOCs之製備及特徵分析。²⁶ 18N的序列被設計為具有高於攝氏55度的解鏈溫度，且沒有可預測的二級結構。本發明之AOCs與帶有各種細胞毒性藥物，包括單甲基澳瑞他汀E（MMAE）以及Mertansine（DM1）的互補序列雜交，並評估針對過度表現HER2的癌細胞株的體外效能。

本文提供之結果顯示，由此產生的ADCs能夠選擇性以過度表現HER2的細胞株，例如，SK-BR-3以及N87為標靶，其體外效能與市售ADC Kadcyla（T-DM1）相似。

這項研究證明了將AOCs作為高度靈活的模組化平台之潛力，在該平台上，一系列特徵明確的帶有DNA、RNA或各種核酸類似物，例如，胜肽核酸的AOCs可與任何選擇的貨物輕鬆配對，以實現廣泛的診斷或治療應用。

縮寫：ACN，乙腈；ADC，抗體-藥物共軛物；AOC，抗體-寡核苷酸共軛物；CuAAC，銅催化的疊氮化物-炔烴環加成；DAR，藥物對抗體之比例；DIPEA，二異丙基乙胺；DM1，mertansine；DMSO，二甲基亞碸；HEPES，4-（2-羥乙基）-1-哌嗪乙烷磺酸；HEX，六氯螢光素；LAMP2，與溶酶體相關的膜蛋白2；LDH，乳酸去氫酶；OAR，寡核苷酸與抗體之比；PBS，磷酸鹽緩衝溶液；SMCC，琥珀醯亞胺基4-（N-馬來醯亞胺基甲基）環己基-1-羧酸；TCEP，參（2-羧乙基）膦；TEA：三甲胺；TEAA，乙酸三乙銨；Tris，參（羥甲基）胺基甲烷；vcMMAE：纈胺酸-瓜胺酸單甲基澳瑞他汀E。

1. 材料與方法

1.1 一般材料及儀器。

寡核苷酸從Integrated DNA technologies（IDT）公司訂購。包括vcMMAE以及DM1在內的細胞毒性藥物是從Medchem Express公司以及Medcoo Biosciences公司訂購的。大多數化學藥品及溶劑購自Thermo Fisher Scientific公司以及Sigma Aldrich公司。高效液相色層分析法在Dionex Ultimate 3000系統上進行。在Nanodrop 1000光譜儀上進行UV-可見光譜。質譜在裝有200 Hz SmartBean Laser陽離子模式的Bruker Autoflex III MALDI-TOF/TOF質譜儀上進行。瓊脂凝膠的螢光圖像在BioDoc-It Imaging System上捕獲。N87以及SK-BR-3細胞株購自美國典型培養物保藏中心（American Type Culture Collection，ATCC）。使用Prism數據分析軟體以及Origin數據分析軟體進行EC₅₀ 值的計算及曲線擬合。

1.2 18N-MCC 之製備

將在ddH₂ O（3.62 mM，15.70 μL）中具有5'端胺基修飾劑的18N寡核苷酸以ddH₂ O稀釋至20 μL，並與DIPEA（3.48 μL）充分混合。隨後添加新鮮溶解於DMSO中的SMCC交聯劑（100 mM，10 μL）。將反應物以DMSO稀釋至最終寡核苷酸濃度為500 μM，總體積為100 μL。將反應於室溫下攪拌2小時。完成後，透過在16000xg 下離心10分鐘去除顆粒物，並使用TEAA/ACN（0.1 M，pH 7.0）系統透過反相HPLC（Atlantis T3 5 μm 4.6 x 250 mm C18管柱）進一步純化粗製的18N-MCC寡核苷酸。將包含純18N-MCC的級分合併，濃縮並凍乾為白色固體，以備將來使用。

1.3 18NR-vcMMAE 之製備

將具有5’端雙硫鍵修飾劑的18NR寡核苷酸與磷酸鈉緩衝液（1 M，pH 7.2，20 μL）以及TCEP水溶液（100 mM，20 μL）混合。將反應物以去離子水稀釋至最終寡核苷酸濃度為266 μM，總體積為100 μL。在攪拌下於室溫下進行還原反應1小時。完成後，添加乙酸鈉（3 M，pH 5.2，40 μL）以及95%乙醇（280 μL），導致寡核苷酸渾濁沉澱。將沉澱物以16000xg 離心10分鐘，以75%乙醇（200 μL）洗滌一次，然後在去離子水（100 μL）中復溶。然後將寡核苷酸與新鮮製備的vcMMAE DMSO溶液（100 mM，20 μL）混合並進一步以DMSO（150 μL）稀釋。使混合物在室溫下靜置1小時。使用上述相同的方法，透過反相HPLC進一步純化粗製的寡核苷酸。將凍乾的固體以乙酸鈉再次沉澱以除去殘留的三乙基銨鹽，將其溶解在去離子水中，並儲存於4°C下作為儲備溶液。

1.4 18NR-SS-DM1 之製備

將新鮮溶解於DMSO（100 mM，20 μL）中的SMCC交聯劑合併並與DM1的DMSO溶液（100 mM，20 μL）充分混合。使混合物於室溫下靜置30分鐘。對該混合物中加入在去離子水（3.72 mM，53.76μL）以及磷酸鈉緩衝液（1 M，pH 7.2，40 μL）中的18NR寡核苷酸。將反應物進一步以去離子水（106.24 μL）以及ACN（160 μL）稀釋，並於室溫下攪拌2小時。加入Tris緩衝液（1M，pH 7.5，40 μL）以淬滅反應。將反應混合物過濾，並將粗製的18N-MCC-DM1透過反相HPLC進一步純化。除去三乙基銨鹽並隨後進行18NR-SS-DM1的儲存。

1.5 IgG-18N 之製備以及 OAR 之測定

向HTA101抗-HER2抗體（2 mg/mL，50 mM HEPES，150 mM NaCl）的原液（450 μL）中加入EDTA溶液（0.5M，pH 8.0，9 μL）以及TCEP溶液（10 mM，關於鏈間二硫鍵的數量的10當量）。在旋轉混合器上進行還原反應，並於室溫下反應2小時。將溶解在超純水中的18N-MCC以各種當量（2至8）添加至還原的抗體中，並在旋轉混合器上進行過夜接合。未接合的抗體及其他雜質透過陰離子交換色層分析法（蛋白-pak Hi-res Q，5 μm，4.6 x 100 mm，0至2 M NaCl梯度）除去，然後透過粒徑篩析層析法（Ultrahydrogel 250）除去殘留的未接合的寡核苷酸。使用以下方程式及消光係數，透過測量260 nm以及280 nm波長的紫外可見吸收度以確定寡核苷酸與抗體的比率： CIgG ∙ E260nm, IgG + C18N ∙ E260nm, 18N = A260 CIgG ∙ E280nm, IgG + C18N ∙ E280nm, 18N = A280 E260nm, IgG = 115972M-1cm-1; E280nm, IgG = 218404M-1cm-1 E260nm, 18N = 181100M-1cm-1; E280nm, 18N = 99396M-1cm-1 其中C_IgG 以及C_18N 分別為抗體及寡核苷酸的各個莫耳濃度。純化的具有各種OAR的HTA101-18N透過0.22 μm膜過濾，並於4^o C下儲存於磷酸鹽緩衝鹽水（pH 7.2）中。

1.6 HTA101-18N 與含毒素的互補鏈配對

將載有藥物的互補寡核苷酸與AOCs的雜交反應於室溫下於PBS緩衝液（pH 7.4）中作用30分鐘。

1.7 細胞培養及細胞毒性測定

使N87以及SK-BR-3細胞在補充有10%胎牛血清的RPMI 1640以及DMEM培養基（Invitrogen公司）中，於37^o C下含5%二氧化碳的潮濕氣氛中生長。SK-BR-3以及N87分別以10⁴ 個細胞/孔以及3x10⁴ 個細胞/孔的密度接種。將細胞附著到孔中後，將AOCs與帶有毒素的互補鏈配對，然後進行連續稀釋並添加。然後將細胞於37°C下培養2-3天。在合適的時間點，按照製造商關於活力測定的說明，收集細胞用於LDH（Thermo Fisher Scientific公司）或WST-1測定（Roche公司）。活力或細胞死亡定義為相對於未處理的對照細胞或酶的百分比。

1.8 共軛焦顯微鏡成像

將SK-BR-3細胞接種在玻璃蓋玻片上16小時，然後在無血清培養基中飢餓2小時。將與18NR-HEX配對的AOCs（OAR 4.7）添加到細胞中，使其最終濃度達到35 nM（就抗體而言），然後培養12小時。然後將細胞於室溫下以3.7%甲醛固定15分鐘，並在隨後根據製造商之方法進行NucBlec Live ReadyProbes 405（Thermo Fisher Scientific公司）、CD107b-Akexa Fluor 488（Thermo Fisher Scientific公司），以及Alexa Fluor 633 Phalloidin（Thermo Fisher Scientific公司）染色。在配備有LD-Achroplan物鏡的Zeiss LSM 510 META共軛焦顯微鏡（20x/0.4 korrPh2 X 63x，1.3xoil）上進行螢光觀察。

2. 結果

2.1 HTA101-18N 抗體 - 寡 核苷酸共軛物之製備及特徵描述。

化學修飾沒有任何基因編碼標籤的抗體的兩種最簡單方法為透過表面離胺酸形成醯胺鍵，並透過減少鏈間雙硫鍵形成麥克加成（Michael-addition）。已經認識到，透過巰基製備的共軛物由於與抗體上的離胺酸殘基相比相對缺乏，因此異質性要低得多，進而導致更有利的特性。²⁷ 首先將本發明之18N序列的5'端一級胺以SMCC進行官能化，以生成巰基反應性馬來醯亞胺柄。使所得的18N-MCC與TCEP處理的HTA101抗體以各種莫耳當量反應，以產生具有各種寡核苷酸與抗體比率（OARs，圖 1 ）的AOCs（HTA101-18N）。透過陰離子交換色層分析法純化反應混合物以除去未修飾的抗體，然後透過粒徑篩析層析法（size-exclusive chromatography, SEC）純化任何未反應的18N-MCC。隨後透過還原SDS-PAGE進行的分析顯示，該重鏈與三個不同的條帶相關，這是由於在IgG1的可用巰基位點上添加了多達三個18N鏈（圖 2 ，圖 A ）。另一方面，觀察到30k Da附近的單個條帶，這良好地對應了與單個18N-MCC（6k Da）與輕鏈（23k Da）的接合。總體而言，這些結果證實了寡核苷酸與HTA101 IgG的成功共價接合。

2.2 IgG-18N 的兩個組成分均具有保留的功能活性

要作為藥物傳遞平台，本發明之HTA101-18N的抗體成分以及寡核苷酸成分都必須在功能上不受影響。抗原結合親和力以及穩定且特異性地與互補序列（18NR）雜交的能力必須不受結合過程的阻礙。在瓊脂凝膠上進行了遷移率遷移分析，以評估HTA101-18N與互補序列18NR-HEX進行鏈配對的能力，其互補序列的5'端經六氯螢光素螢光團（HEX）修飾後可見（圖 2 ，圖 B ）。為了檢查寡核苷酸與本發明之AOC之間發生非特異性相互作用的可能性，加入了另一個富含GC的15 mer序列（15N-HEX）作為對照。未經修飾的HTA101 IgG不會與任何一條螢光鏈發生相互作用（泳道2及3），而帶有各種OARs的HTA101-18N於室溫下短暫培養後（泳道4至10）可以化學計量地與18N-HEX雜交。此外，15N-HEX根本不與HTA101-18N結合（泳道11），表示18N-HEX與本發明之AOC的結合以鏈特異性方式發生。透過間接ELISA評估了HTA101-18N與各種OARs對其標靶抗原HER2的相對結合親和力（圖 7 ）。儘管如預期，修飾抗體的EC₅₀ 值略有增加，但HTA101-18N的整體親和力，無論其OARs為何，仍與未修飾IgG的含量非常相似，這證實了這種接合方法並未耗費掉抗體與標靶抗原牢固結合的能力。EC₅₀ 值的輕微減少也可能在實際上反映，或部分地產生來自HTA101-18N的Fc結構域與ELISA中使用的次級抗體之間的稍微受阻相互作用，而非真正的親和損失。總之，這些結果表示本發明之AOCs的標靶及攜帶成分均保持功能性，因此滿足了透過鏈雜交作為藥物遞送平台的前提條件。

2.3 攜帶互補鏈的 HTA101-18N 進入 HER2 過度表現細胞的內在化

可對攜帶其互補的過客鏈的AOCs進行研究，使其被有效地內在化至HER2過度表現的細胞，以釋放出針對細胞質標靶的有效負載。將HTA101-18N（OAR 4.7）與18NR-HEX預培養以形成雙鏈錯合物，然後將其用於治療SK-BR-3乳腺癌細胞。HEX的螢光使我們能夠使用共軛焦顯微鏡檢查過客鏈的空間分佈（圖 3 ）。網格蛋白依賴性受體調節的胞飲作用為ADCs進入細胞的主要機制。²⁸ 肌動蛋白細胞骨架在哺乳動物細胞的胞吞過程中具有相當重要的作用，例如，細胞膜的分裂以及游離於膜的囊泡的運動。²⁹ 與螢光團接合的鬼筆環胜肽共染色顯示18NR-HEX過客鏈的細胞內分佈與肌動蛋白細胞骨架的緊密吻合。此外，對LAMP2的共染色顯示18NR-HEX不與溶酶體共定位，這與HER2在細胞表面以及早期胞內體之間不斷循環而不進入溶酶體途徑此一事實吻合。²⁸ 總之，這些數據表示，透過HER2內吞途徑攝取了18NR-HEX。由於HEX螢光團透過DNA雙鏈體形成非共價結合至該抗體，因此只有在抗原結合及受體調節的胞飲作用過程中整個雙鏈錯合物保持完整的情況下，AOC輔助的攝取才會發生。這些結果證實利用鏈配對進行貨物附著及遞送的可行性，為進一步測試本發明之AOC作為靈活的藥物遞送平台奠定了基礎。

2.4 HTA101-18N 與含毒素的互補鏈配對顯示出對過度表現 HER2 的癌細胞具有強大的體外效能及選擇性。

作為概念驗證，進行體外WST-1細胞存活力測定，以評估HTA101-18N AOC與帶有藥物的互補鏈配對對過度表現HER2的癌細胞的效力。結果總結於圖 5 中。傳統的ADCs常用的強效細胞毒性藥物包括單甲基澳瑞他汀E（MMAE）以及Mertansine（DM1），透過各種連接子形式共價鍵接合至該互補鏈（18NR）的5'端（圖 4 ，圖 A 以及圖 6 ）。具有蛋白酶可裂解的纈胺酸-瓜胺酸間隔子以及反應性馬來醯亞胺基團的市售MMAE（vcMMAE）可在一個步驟中透過巰基修飾連接到18NR互補鏈上（18NR-vcMMAE）；DM1以不可裂解的形式（18NR-MCC-DM1）或可裂解的雙硫鍵形式（18NR-SS-DM1）與18NR接合。純化的寡核苷酸已透過反相HPLC分析以及MALDI-TOF質譜進行了全面特徵描述（圖 8 ）。為了確認互補鏈透過與HTA101-18N雜交而被內化到HER2陽性細胞中，評估HTA101-18N與18NRvcMMAE配對在不存在或存在過量18NR競爭鏈且無毒素修飾的情況下的效力（圖 4 ，圖 B ）。雖然HTA101-18N以及18NR-vcMMAE的組合顯示出針對過度表現HER2的SK-BR-3以及N87細胞株的次奈莫耳EC₅₀ 值，但由於雜化阻斷劑大大降低了其活性，因此18NR競爭者增加了十倍之多，證明透過與AOC的鏈配對將細胞毒性貨物內在化。重要的是，未經修飾的抗體以及18N-vcMMAE的物理混合物處理過的HER2過度表現細胞的對照實驗顯示出與劑量過高的阻斷劑非常相似的劑量反應曲線，表示存在一種與HER2無關的效率低很多的吸收18NR-vcMMAE途徑。相較之下，沒有HER2過度表現的對照細胞株HEK293T在所有三種組合中顯示出幾乎相同的劑量反應曲線。還研究OAR對HTA101-18N/18NR-vcMMAE體外效力的影響（圖 4 ，圖 C ）。一如預期，更高的OAR導致效力增加，N87細胞對載藥量的敏感性比SK-BR-3細胞高得多。如圖 5 的EC₅₀ 值所示，儘管在較高的OARs下非特異性攝取引起的細胞毒性變得更加突出，但在各種濃度範圍內，對照細胞HEK293T的活力均未受到影響。這些數據表示，選擇適當平衡功效以及潛在全身毒性的OAR對我們策略的進一步發展相當重要。將模組化的AOC藥物遞送平台與市售的ADC Kadcyla進行了比較，後者的DM1作為有效負載以3.5的藥物對抗體比例（DAR）共價連接（圖 4 ，圖 D ）。在所有情況下，HTA101-18N與18NR-SS-DM1或18NR-MCC-DM1的結合均顯示出與Kadcyla相似的效價，表示藥物透過非共價鏈配對與抗體的結合不會對其遞送產生負面影響。一如預期，相較於18NR-MCC-DM1不可切割的配對物，與AOC配對的18NR-SS-DM1產生了更大的效力，因為18-mer寡核苷酸鏈的空間位阻可能會對DM1有效負載的可及性產生某些影響。最後，透過乳酸去氫酶（LDH）分析評估的SK-BR-3細胞的劑量反應實驗得出的EC₅₀ 值與WST-1分析獲得的EC₅₀ 值非常相似，進而證實了存活力的喪失是由真正的細胞死亡所導致的（圖 9 ）。總體而言，這些結果表示，寡核苷酸鏈配對允許HTA101-18N以及18NR-藥物的組合有效地並選擇性地向過度表現HER2抗原的癌細胞遞送各種細胞毒性有效負載。

總而言之，在本研究中觀察到的結果表示，在接合後，標靶抗體組成分以及用於藥物附著的寡核苷酸組成分均保持完全功能。最重要的是，體外細胞毒性試驗顯示，透過鏈雜交裝載藥物的AOC本質上與市售ADC Kadcyla一樣有效，後者以傳統的共價方式鍵合了DM1，進而證明了利用鏈配對攜帶藥物以用於內部化。該遞送平台證實非常通用，能夠接受具有不同結構以及不同連接子格式的藥物。如遷移率變動分析所證明，寡核苷酸藥物與本文所公開之AOC之間形成雙鏈體是快速且具有序列特異性的，有可能在治療前將AOC與藥物進行現場結合。

本發明之特徵還在於以下各項。 1. 一種寡核苷酸共軛物，包含（i）第一寡核苷酸共軛物，包含與生物分子接合的第一單鏈寡核苷酸，其中該第一單鏈寡核苷酸包含第一核苷酸序列；及/或（ii）第二寡核苷酸共軛物，包含與試劑接合的第二單鏈寡核苷酸，其中該第二單鏈寡核苷酸包含與該第一核苷酸序列互補的第二核苷酸序列；其中該第一及第二寡核苷酸共軛物形成雙鏈寡核苷酸共軛物，其在該第一核苷酸序列以及該第二核苷酸序列之間包含一雜交的寡核苷酸橋區域，該生物分子與該試劑在該雙鏈寡核苷酸共軛物中連接在一起。 2. 如第1項之寡核苷酸共軛物，其中該第一核苷酸序列以及該第二核苷酸序列分別包含富含GC的序列。 3. 如第1或2項之寡核苷酸共軛物，其中該第一核苷酸序列以及該第二核苷酸序列分別基本上不具有二級結構。 4. 如第1至3項中任一項之寡核苷酸共軛物，其中該第一核苷酸序列以及該第二核苷酸序列分別包含約12個核苷酸至約80個核苷酸的長度。 5. 如第1至4項中任一項之寡核苷酸共軛物，其中該第一核苷酸序列以及該第二核苷酸序列具有至少38°C的解鏈溫度（melting temperature，Tm）。 6. 如第5項之寡核苷酸共軛物，其中該Tm為40°C至70°C。 7. 如第1至6項中任一項之寡核苷酸共軛物，其中該第一單鏈寡核苷酸在5'端接合至該生物分子，及/或該第二單鏈寡核苷酸在5'端接合至該試劑；或該第一單鏈寡核苷酸在3’端接合至該生物分子，及/或該第二單鏈寡核苷酸在3’端接合至該試劑。 8. 如第1至7項中任一項之寡核苷酸共軛物，其中該第一單鏈寡核苷酸、該第二單鏈寡核苷酸或兩者為DNAs、RNAs，或其雜合體。 9. 如第1至8項中任一項之寡核苷酸共軛物，其中該第一單鏈寡核苷酸、該第二單鏈寡核苷酸或兩者包含至少一個修飾的核苷酸殘基。 10. 如第2至9項中任一項之寡核苷酸共軛物，其中該富含GC的序列包含如SEQ ID NO: 1所示之核苷酸序列5'-SSWSSWSWSSSWWSSWSS-3'，其中每個S獨立地選自G或C，每個W獨立地選自A或T；或如SEQ ID NO: 2所示之核苷酸序列5'- SSWSSWWSSSWSWSSWSS-3'，其中每個S獨立地選自G或C，每個W獨立地選自A或T。 11. 如第10項之寡核苷酸共軛物，其中該富含GC的序列包含如SEQ ID NO: 3所示之核苷酸序列5'-GGWCCWGWCCGWWGGWCC-3'，其中每個W獨立地選自A或T；或如SEQ ID NO: 4所示之核苷酸序列5'- GGWCCWWCGGWCWGGWCC-3'，其中每個W獨立地選自A或T。 12. 如第11項之寡核苷酸共軛物，其中該富含GC的序列包含核苷酸序列5'-GGACCAGACCGAAGGACC-3'（SEQ ID NO: 5）；或核苷酸序列5'-GGTCCTTCGGTCTGGTCC-3'（SEQ ID NO: 6）。 13. 如第1至12項中任一項之寡核苷酸共軛物，其中該生物分子為胜肽、多胜肽、核酸或碳水化合物分子。 14. 如第1至12項中任一項之寡核苷酸共軛物，其中該生物分子為抗體。 15. 如第1至14項中任一項之寡核苷酸共軛物，其中該第一單鏈寡核苷酸透過化學連接子與該生物分子接合，以形成該第一寡核苷酸。 16. 如第15項之寡核苷酸共軛物，其中該化學連接子包含琥珀醯亞胺部分體、馬來醯亞胺部分體、聯胺部分體、腙部分體、疊氮化物部分體、末端炔烴部分體、應變末端炔烴部分體，或膦部分體。 17. 如第1至16項中任一項之寡核苷酸共軛物，其中在該第一寡核苷酸共軛物中該生物分子與該第一單鏈寡核苷酸之間的莫耳比為1:1至1:6。 18. 如第1至17項中任一項之寡核苷酸共軛物，其中該第二寡核苷酸共軛物中的該試劑為治療劑或診斷劑。 19. 如第18項之寡核苷酸共軛物，其中該治療劑為細胞毒性劑。 20. 如第19項之寡核苷酸共軛物，其中該細胞毒性劑為單甲基澳瑞他汀E（MMAE）或Mertansine（DM1）。 21. 如第18項之寡核苷酸共軛物，其中該診斷劑為螢光部分體、發光部分體或放射性部分體。 22. 一種製備寡核苷酸連接的分子之方法，該方法包含（a）提供第一寡核苷酸共軛物，其包含與生物分子接合的第一寡核苷酸，其中該第一寡核苷酸包含第一核苷酸序列；（b）提供第二寡核苷酸共軛物，其包含與試劑接合的第二寡核苷酸，其中該第二寡核苷酸包含與該第一核苷酸序列互補的第二核苷酸序列；以及（c）在允許該第一寡核苷酸及該第二寡核苷酸之間雜交的條件下，使該第一寡核苷酸共軛物與該第二寡核苷酸共軛物作用，進而產生同時攜帶該生物分子與該試劑的一寡核苷酸連接的分子。 23. 如第22項之方法，其中該第一核苷酸序列與該第二核苷酸序列如第2至12項中任一項所定義。 24. 如第22或23項之方法，其中該生物分子為胜肽、多胜肽、核酸或碳水化合物分子。 25. 如第22至24項中任一項之方法，其中該生物分子為抗體。 26. 如第22至25項中任一項之方法，其中在該第二寡核苷酸共軛物中的該試劑為治療劑或診斷劑。 27. 如第26項之方法，其中該治療劑為細胞毒性劑。 28. 如第27項之方法，其中該細胞毒劑為單甲基澳瑞他汀E（MMAE）或Mertansine（DM1）。 29. 如第22至28項中任一項之方法，其中，該第一寡核苷酸在5'端接合至該生物分子，及/或該第二寡核苷酸在5'端接合至該試劑；或該第一寡核苷酸在3’端接合至該生物分子，及/或該第二寡核苷酸在3’端接合至該試劑。 30. 如第22至29項中任一項之方法，進一步包含收穫在步驟（c）中產生的該寡核苷酸連接的分子。 31. 如第22至30項中的任一項之方法，其中步驟（a）透過以下方法進行：（a1）在該第一寡核苷酸的5'端添加第一官能柄，以形成反應性第一寡核苷酸；以及（a2）使該反應性第一寡核苷酸與該生物分子反應，以產生該第一寡核苷酸共軛物。 32. 如第31項之方法，其中該第一官能柄為馬來醯亞胺部分體，且該生物分子為包含游離-SH基團的多胜肽。 33. 如第32項之方法，其中步驟（a1）係透過使該第一寡核苷酸與琥珀醯亞胺基4-（N-馬來醯亞胺基甲基）環己烷-1-羧酸反應來進行。 34. 如第32或33項之方法，其中該多胜肽生物分子係透過還原劑處理，以產生該游離的-SH基團。 35. 如第22至34項中任一項之方法，其中步驟（b）透過以下方法進行：（b1）在該第二寡核苷酸的5’端添加第二官能柄，以產生反應性第二寡核苷酸；以及（b2）於交聯劑存在下使該反應性第二寡核苷酸與該試劑作用，以產生與該第二寡核苷酸接合的該試劑。 36. 如第35項之方法，其中該第二官能柄為-SH基團或-NH₂ 基團。 37. 如第35或36項之方法，其中該交聯劑為琥珀醯亞胺基4-（N-馬來醯亞胺基甲基）環己烷-1-羧酸或2,2’-二硫代二吡啶。 38. 一種用於在有此需要的個體中治療或診斷疾病之方法，該方法包含對該個體施用如第1至21項中任一項之寡核苷酸共軛物。 39. 一種醫藥組合物，包含如第1至21項中任一項之寡核苷酸共軛物以及醫藥上可接受的載體。

其他實施例

本說明書中公開的所有特徵可以任何組合形式來進行組合。本說明書中公開的每個特徵可以由作用於相同、等同或相似目的之替代特徵所代替。因此，除非另有明確說明，否則所公開的每個特徵僅僅為等效或類似特徵的通用系列之示例。

從上面的描述中，本領域技術人員可以輕易地確定本發明的基本特徵，並且在不脫離本發明的精神及範圍之情況下，可以對本發明進行各種改變與修改，以使其適應各種用途及條件。因此，其它實施例也在申請專利範圍內。

等同

雖然本文已描述並闡明了幾個發明實施例，但是本領域普通技術人員將容易想出用於執行功能及/或獲得結果的各種其他手段及/或結構及/或所述之一或多個優點，且這些變化及/或修改中的每一個被認為包含在本文所述之發明實施例的範圍內。更一般地，本領域技術人員將容易理解到，如本文所述之所有參數、尺寸、材料及配置目的為示例性的，且實際參數、尺寸、材料及/或配置將取決於具體應用或應用使用本發明之教示。本領域技術人員將認識到或能夠使用不超過常規實驗來確定如本文所述之具體創造性實施例的許多等同物。因此，應當理解的是，前述實施例僅以示例之方式呈現，且在所附之申請專利範圍及其等同物的範圍內，發明實施例可以不同於具體描述及請求保護之方式實施。本發明的發明實施例涉及如本文所述之每個單獨特徵、系統、製品、材料、套組及/或方法。此外，如果這些特徵、系統、物品、材料、套組及/或方法不相互矛盾，則二個或更多個這樣的特徵、系統、製品、材料、套組及/或方法的任何組合都包括在本發明之發明範圍內。

本文定義及使用之所有定義應理解為掌控字典定義、透過引用併入之文獻中的定義，及/或定義術語之普通含義。

本文中公開的所有參考文獻、專利及專利申請均透過引用方式併入本文，並涉及每個被引用的主題，於某些情況下其可包含整個文件。

在本說明書及申請專利範圍中使用之定冠詞「一」以及「一個」，除非明確指出相反意思，否則應理解為「至少一個」。

在本說明書及申請專利範圍中使用之片語「及/或」應被理解為係指所結合的元件中的「一個或二個」，亦即，於某些情況下該些元件結合存在，而在另一情況下則分開存在。以「及/或」列出的多個元件應該以相同之方式來解釋，亦即，「一個或多個」元件如此地連接。除了以「及/或」子句特別標識之元件外，其他元件可選擇性地存在，不論與這些特別標識之元件相關或不相關。因此，作為非限制性的示例，當結合例如「包含」的開放式語言使用時，對「A及/或B」的引用可以於一實施例中僅指A（選擇性地包括除了B之外的元件）；在另一具體實施例中，則僅指B（選擇性地包括除了A之外的元件）；在另一具體實施例中，則指A與B（選擇性地包括其它元件）；等等。

如本說明書及申請專利範圍中所使用的，「或」應理解為具有與上述定義之「及/或」相同的含義。例如，當於一列表中分離項目時，「或」或「及/或」應被解釋為包括的，亦即，包括數量或元件列表中的至少一個，但也包括多於一個，以及選擇性地，額外未列出之項目。只有明確指示出相反的意思，例如「只有一個」或「確切為一個」，或，當用於申請專利範圍中，「由...組成」時，將指的是僅列出之一或多個元件。一般而言，當前面放有排他性術語，例如「任一」、「之一」、「只有之一」或「確切為一個」時，本文所用之術語「或」應僅被解釋為表示排他性的替代品（亦即，「一個或另一個，但不是二者」）。當「主要由...組成」用於申請專利範圍中時，應具有其在專利法領域所使用之普通含義。

如本說明書及申請專利範圍中所使用的，片語「至少一個」對於一個或多個元件的列表，應當被理解為係指從元件列表中的任何一個或多個元件選擇出的至少一個元件，但不一定包括具體列在元件列表中的各個及每個元件中的至少一個，且並不排除元件列表中的元件之任何組合。該定義還允許選擇性地存在除了在片語「至少一個」所指的元件列表中具體標識的元件之外的元件，無論是與這些特定標識的元件相關或不相關的元件。因此，作為非限制性的實施例，「A和B中的至少一個」（或等效地，「A或B中的至少一個」或等同地「A及/或B中的至少一個」），於一具體實施例中，可以指至少一個，選擇性地包括多於一個，A，而沒有B的存在（且任選地包括除了B之外的元件）；在另一個具體實施例中，指至少一個，選擇性地包括多於一個，B，而沒有A的存在（且選擇性地包括除了A之外的元件）；在另一具體實施例中，指至少一個，選擇性地包括多於一個，A，以及至少一個，選擇性地包括多於一個，B（且選擇性地包括其它元件）；等等。

還應當理解的是，除非明確地指出相反者，否則在本文所要求的任何包括多於一個步驟或作用的方法中，方法的步驟或動作之順序不一定限於在所述之該方法的步驟或動作之順序。

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當結合附圖閱讀時，將更好理解前述發明內容以及以下對本發明之詳細描述。為了說明本發明，在附圖中展示目前較佳之具體實施例。然而，應當理解的是，本發明不限於所示之精確佈置及手段。

於圖式中：

圖 1 為顯示基於寡核苷酸鏈配對的示例性抗體-藥物共軛物（antibody-drug conjugate，ADC）之設計及製備的示意圖。該寡核苷酸連接子18N包括如SEQ ID NO: 5所示之核苷酸序列，而該寡核苷酸連接子18NR包括如SEQ ID NO: 6所示之核苷酸序列。

圖 2A-2B 包括顯示示例性HTA101-18N抗體-寡核苷酸共軛物的特徵的圖。圖 2A ：顯示以所示之各種寡核苷酸對抗體之比例（oligonucleotide-to-antibody ratios，OARs）對純化的HTA101-18N進行SDS-PAGE分析之還原結果的照片。M：分子量標記；U：未修飾的IgG；OAR：寡核苷酸對抗體之比例；H：重鏈；L：輕鏈；每個泳道包含5.5 μg抗體（不包括寡核苷酸的重量）；以InstantBlue Coomassie染色顯影凝膠。圖 2B ：顯示HTA101-18N ADCs的遷移漂移分析之照片。18NR-HEX：與六氯螢光素接合的互補序列；15NR-HEX：非互補對照序列。泳道1：單獨的HTA101 IgG；泳道2：HTA101 + 15NR- HEX；泳道3：HTA101 + 18NR-HEX；泳道4-10：HTA101-18N（OAR 1.5、1.9、2.5、2.9、3.7、4.6、6.4）+ 18NR-HEX；泳道11：HTA101-18N（OAR 6.4）+ 15NR-HEX。每個泳道含有40 nmol的IgG以及256 nmol（6.4當量）的任何一種寡核苷酸；2%瓊脂凝膠，0.5X TBE緩衝液；蛋白質含量以Instant Blue Coomassie染色顯示。

圖 3 包括顯示透過共軛焦顯微鏡觀察與18NR-HEX配對的HTA101-18N內化到SK-BR-3細胞中的照片。染色前，將以配對的HTA101-18N/18NR-HEX（35 nM IgG）處理的細胞以3.7%甲醛固定。紅色：六氯螢光素（hexachlorofluorescein，HEX）；綠色：以CD107b Alexa Fluor488接合抗體染色的溶酶體相關膜蛋白2（lysosomal associated membrane protein 2，LAMP2）；白色：以Alexa Fluor633接合的鬼筆環胜肽染色的肌動蛋白；藍色：被DAPI染色的核。

圖 4A-4D 包括說明透過WST-1細胞存活力分析測量的本發明之模組化AOC/藥物系統的效力之劑量反應曲線圖。劑量-反應曲線與標準的4-參數邏輯模型相符。SK-BR-3與N87：過度表現HER2的細胞株；HEK293T：陰性對照細胞株。對於每種抗體/藥物組合，根據其各自的OARs製備AOC與ssDNA-藥物的等莫耳混合物。圖 4A ：作為有效負載的所有ssDNA-藥物共軛物的化學結構。圖 4B ：顯示本發明之AOC/ssDNA-藥物錯合物的HER2標靶活性的對照實驗依賴於鏈雜交作用。未修飾 + 18NR-vcMMAE：未修飾的HTA101抗體與18NR-vcMMAE的物理混合物；阻斷劑：18NR互補鏈過量十倍，無毒性。圖 4C ：不同OARs對我們AOC/藥物組合效力之影響。圖 4D ：本發明之AOC/藥品組合與市售ADC Kadcyla之比較。

圖 5 為總結自WST-1細胞存活力分析獲得的EC₅₀ 值的表。用於AOC/藥物組合（上半部分）以及ssDNA-藥物對照（下半部分）的單位之差。

圖 6 包括顯示與18 NR鏈接合的各種藥物化合物的結構之圖。

圖 7 包括顯示HTA101-18N抗體-寡核苷酸共軛物結合親和力的ELISA分析圖。抗原：HER2胞外結構域（0.3 μg/孔）；阻隔劑：5%脫脂牛奶；盤：Nunc Maxisorp 96孔盤。訊號是由辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）接合的抗人類Fc抗體以3,3’,5,5’-四甲基聯苯胺（3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine，TMB）為基質產生的。以標準的四參數邏輯模型擬合結合曲線。左圖。EC₅₀ 值顯示於右圖中。

圖 8A-8B 包括顯示用於本研究中的所有寡核苷酸的HPLC以及MALDI-TOF質譜分析的圖。圖 8A ：透過反相色層分析法（Atlantis T3 5 μm 4.6 x 250 mm C18管柱）純化的寡核苷酸的純度檢查（左圖）以及流洗條件（右圖）。圖 8B ：所示之純化的寡核苷酸接合的藥物化合物的MALDI-TOF質譜。

圖 9A-9B 包括顯示來自以本發明之AOC/藥物組合以及市售ADC Kadcyla處理的SK-BR-3細胞的乳酸去氫酶（Lactate dehydrogenase，LDH）細胞死亡分析的結果圖。圖 9A ：各種AOC/藥物組合的劑量反應曲線。以比色法以相對於LDH酶陽性對照的百分比報告細胞死亡。以標準的四參數邏輯模型擬合曲線。圖 9B ：自LDH分析獲得的EC₅₀ 值的總結。

Claims

一種寡核苷酸共軛物，包含(i)第一寡核苷酸共軛物，包含與生物分子接合的第一單鏈寡核苷酸，其中該第一單鏈寡核苷酸包含第一核苷酸序列，該第一單鏈寡核苷酸在5’端接合至該生物分子；及(ii)第二寡核苷酸共軛物，包含與試劑接合的第二單鏈寡核苷酸，其中該第二單鏈寡核苷酸包含與該第一核苷酸序列互補的第二核苷酸序列，該第二單鏈寡核苷酸在5’端接合至該試劑；其中該第一及第二寡核苷酸共軛物形成雙鏈寡核苷酸共軛物，其在該第一核苷酸序列以及該第二核苷酸序列之間包含雜交的寡核苷酸橋區域，藉此該生物分子與該試劑在該雙鏈寡核苷酸共軛物中連接在一起；其中該第一核苷酸序列由核苷酸序列5'-GGACCAGACCGAAGGACC-3'(SEQ ID NO：5)所組成，以及該第二核苷酸序列由核苷酸序列5'-GGTCCTTCGGTCTGGTCC-3'(SEQ ID NO：6)所組成；以及其中該生物分子為抗體。
如請求項1之寡核苷酸共軛物，其中該第一單鏈寡核苷酸透過化學連接子與該生物分子接合以形成該第一寡核苷酸。
如請求項2之寡核苷酸共軛物，其中該化學連接子包含琥珀醯亞胺部分體、馬來醯亞胺部分體、聯胺部分體、腙部分體、疊氮化物部分體、末端炔烴部分體、應變末端炔烴部分體，或膦部分體。
如請求項1至3中任一項之寡核苷酸共軛物，其中在該第一寡核苷酸共軛物中該生物分子與該第一單鏈寡核苷酸之間的莫耳比為1：1至1：6。
如請求項1至3中任一項之寡核苷酸共軛物，其中該第二寡核苷酸共軛物中的該試劑為治療劑或診斷劑。
如請求項5之寡核苷酸共軛物，其中該治療劑為細胞毒性劑。
如請求項6之寡核苷酸共軛物，其中該細胞毒性劑為單甲基澳瑞他汀E(monomethyl auristatin E，MMAE)或Mertansine(DM1)。
如請求項5之寡核苷酸共軛物，其中該診斷劑為螢光部分體、發光部分體或放射性部分體。
一種製備寡核苷酸連接的分子之方法，該方法包含(a)提供第一寡核苷酸共軛物，其包含與生物分子接合的第一寡核苷酸，其中該第一寡核苷酸包含第一核苷酸序列，該第一單鏈寡核苷酸在5’端接合至該生物分子；(b)提供第二寡核苷酸共軛物，其包含與試劑接合的第二寡核苷酸，其中該第二寡核苷酸包含與該第一核苷酸序列互補的第二核苷酸序列，該第二單鏈寡核苷酸在5’端接合至該試劑；以及(c)在允許該第一寡核苷酸及該第二寡核苷酸之間雜交的條件下，培育該第一寡核苷酸共軛物與該第二寡核苷酸共軛物，藉此產生攜帶該生物分子與該試劑兩者的寡核苷酸連接的分子其中該第一核苷酸序列由核苷酸序列5'-GGACCAGACCGAAGGACC-3'(SEQ ID NO：5)所組成；以及該第二核苷酸序列由核苷酸序列5'-GGTCCTTCGGTCTGGTCC-3'(SEQ ID NO：6)所組成；以及其中該生物分子為抗體。
如請求項9之方法，其中在該第二寡核苷酸共軛物中的該試劑為治療劑或診斷劑。
如請求項10之方法，其中該治療劑為細胞毒性劑。
如請求項11之方法，其中該細胞毒性劑為單甲基澳瑞他汀E(MMAE)或Mertansine(DM1)。
如請求項9之方法，進一步包含收穫在步驟(c)中產生的該寡核苷酸連接的分子。
如請求項9之方法，其中步驟(a)透過以下方法進行：(a1)在該第一寡核苷酸的5'端添加第一官能柄，以形成反應性第一寡核苷酸；以及(a2)使該反應性第一寡核苷酸與該生物分子反應，以產生該第一寡核苷酸共軛物。
如請求項14之方法，其中該第一官能柄為馬來醯亞胺部分體，且該生物分子為包含游離-SH基團的多胜肽。
如請求項15之方法，其中步驟(a1)係透過使該第一寡核苷酸與琥珀醯亞胺基4-(N-馬來醯亞胺基甲基)環己烷-1-羧酸反應來進行。
如請求項15或16之方法，其中該多胜肽生物分子係透過還原劑處理以產生該游離的-SH基團。
如請求項9之方法，其中步驟(b)透過以下方法進行：(b1)在該第二寡核苷酸的5’端添加第二官能柄，以產生反應性第二寡核苷酸；以及(b2)於交聯劑存在下使該反應性第二寡核苷酸與該試劑作用，以產生與該第二寡核苷酸接合的該試劑。
如請求項18之方法，其中該第二官能柄為-SH基團或-NH₂基團。
如請求項18或19之方法，其中該交聯劑為琥珀醯亞胺基4-(N-馬來醯亞胺基甲基)環己烷-1-羧酸或2,2’-二硫代二吡啶。
一種如請求項1至8中任一項所述之寡核苷酸共軛物用於製備治療或診斷疾病之藥物之用途。
一種醫藥組合物，包含如請求項1至8中任一項之寡核苷酸共軛物以及醫藥上可接受的載體。