TR201910848T4 - İntraselüler olarak ayrilabi̇len bi̇r bağa sahi̇p i̇mmunokonjugatlar - Google Patents

Abstract

Bu buluş, bir hastalık tedavisinde kullanım için, MAb-CL2A-SN-38 yapısal formülüne sahip olan bir konjugat ile ilgilidir.

Description

TARIFNAME INTRASELULER OLARAK AYRILABILEN BIR BAGA SAHIP IMMUNOKONJUGATLAR BULUSUN ALANI Bu bulus, bir hastalik tedavisinde kullanim için, asagidaki formül ile gösterilen bir yapi ile MAb-CL2A-SN-38 yapisal formülüne sahip olan bir konjugat ile ilgilidir: NHgtaimin tiiizii olanak) BULUSUN ARKAPLANI Ozel hedefli ilaç terapisi alaninda çalisan bilim adamlari uzun yillardir monoklonal antikorlari (Mab'lar), toksik ajanlarin insan kanserlerine spesifik tesliminde kullanmayi amaçlamaktadir. Tümör ile iliskili MAb*Iar ve uygun toksik ajanlarin konjugatlari gelistirilmistir ancak kanser terapisinde karma basariya sahip olmustur ve enfeksiyonlu ve otoimmün hastaliklar gibi baska hastaliklarda ise neredeyse hiç uygulanamamistir. Toksik ajan, en yaygin olarak kemoterapötik bir ilaçtir ancak parça yayan radyonüklitler ya da bakteriyel veya bitkisel toksinler de özellikle kanser terapisi için MAbtIara (Sharkey ve Goldenberg, CA Cancer J Clin. 2006 Jul- Aug;56(4):226-243) ve daha yakin zamanda, belirli enfeksiyonlu hastaliklarin klinik öncesi terapisi için radyoimmunokonjugatlara (Dadachova ve Casadevall, Q J Nucl MAb-kemoterapötik ilaç konjugatlarini kullanmanin avantajlari (a) kemoterapbtik ilacin kendisinin yapisal olarak iyi tanimlanmis olmasi; (b) kemoterapötik ilacin, çogunlukla MAbtlarin antijen baglanma bölgelerinden uzaktaki spesifik alanlarda çok iyi tanimlanmis konjugasyon kimyalari kullanilarak MAb proteinine baglanmasi; (c) MAb-kemoterapötik ilaç konjugatlarinin, MAbtlar ve bakteriyel ya da bitkisel toksinler içeren kimyasal konjugatlara göre daha tekrarlanabilir sekilde yapilabilmesi ve bu nedenle ticari gelistirme ve ruhsatlandirma onayi için daha uygun olmasi ve (d) MAb-kemoterapötik ilaç konjugatlarinin, radyonüklit MAb konjugatlarindan sistematik olarak daha az toksik olmasidir.

Protein-ilaç konjugatlari ile ilgili önceki çalismalar, protein-kemoterapötik ilaç konjugatinin faydali bir terapötik olmasi için, bir ilacin, bir hedef hücrede içsellestirildigi zaman, tercihen kendi orijinal formunda salindigini göstermistir. birakmak için Iizozomal olarak ayrilan hedef grup ve ilaç arasinda spesifik peptit baglayicilar kullanmanin avantajini göstermistir. Ozellikle, tümörlerin içindeki pH degerinin çogunlukla normal fizyolojik pH degerinden düsük oldugu gözlemine dayanilarak, bir hidrazon içerenler gibi, hafif asit-ayrilabilir baglayicilar kullanilarak hazirlanan MAb kemoterapötik ilaç konjugatlari gelistirilmistir (Willner v. d., onaylanan MAb-ilaç konjugati, Gemtuzumab Ozogamisin, bir anti-CD33 antikoru, hümanize edilmis P67.6 ve etkili bir kalikeamisin türevi arasinda benzer bir asit- kemoterapötik ilaç konjugatlari, kemoterapötik ilaçlar ve MAb arasinda indirgen bir sekilde kararsiz engellenen disülfit baglar ile yapilmistir (Liu v. d., Proc Natl Acad Baska bir ayrilabilir baglayici, Trouet v.d.'nin, ilaç ve dipeptit arasinda açilip kapanabilir bir ara parçaya da sahip olan, bir ila dört amino asit içeren Iizozomal olarak kararsiz peptit ara parçalarina benzeyen, Phe-Lys ya da Val-Cit gibi katepsin B-kararsiz dipeptit ara parçalari içerir (Dubowchik, v. d., Bioconjugate kamptotesin immunokonjugatinin hazirlanmasinda da kullanilmistir (Walker v. d., ise antikor ve kemoterapötik ilaç arasindaki baglayiciya eklenen bir ester bagidir.

Gillimard ve Saragovi, bir paklitaksel esterinin anti-siçan p75 MAb, MC192 ya da anti-insan TrkA MAb, 5C3,e eklenmesi halinde konjugatin hedefe özgü toksisite Bu bulusun konjugatlari, birçok durumda, konjuge olmayan ya da “çiplak” antikorlardan veya antikor parçalarindan daha yüksek etkililige sahiptir; ancak bu tür konjuge olmayan hedefleyici moleküller spesifik durumlarda faydalidir. Ornegin, kanserde, çiplak antikorlar, Ienfomalar (CAMPATH® ve RlTUXAN®) tedavisinde, kolorektal veya diger kanserler (ERBITUX® ve AVASTIN®), gögüs kanserinin (HERECEPTlN®) tedavisinde ve su anda çok sayida klinik gelistirmede (ör., epratuzumab) önemli bir rol oynar hale gelmistir. Bu vakalarin çogunda, klinik kullanim, bu çiplak veya konjuge olmayan antikorlarin kemoterapi ya da radyasyon terapisi gibi baska terapiler ile birlestirilmesini içermistir. Çesitli antikorlar, artiritte tümör nekroz faktörü (TNF) ve B hücresi antikorlari gibi otoimmün ve diger immün düzensizlik (RlTUXAN®) hastaliklarinin tedavisinde kullanima da yöneliktir ve B hücresi antikorlari, RlTUXAN® ve epratuzumab gibi bu tür baska hastaliklarda, sistemik Iupus eritematoz ve Sjögren sendromunda ve çocukluk diyabeti ve multipl skleroz hastaliklarinda arastirilmaktadir. Çiplak antikorlar da sepsis ve septik sok, Alzheimer hastaligi ve enfeksiyonlu hastaliklarda da arastirilmaktadir. Anti-infektif monoklonal antikorlarin gelisimi, tarafindan incelenmistir ve antikor terapisi uygulanan öncelikli patojenler özetlenmistir ve bu patojenlerden yalniz 2 tanesinin, bunlarla mücadele eden antikorlarin Faz IIl klinik çalismalarinda oldugu ya da pazarlanmakta oldugu (solunum sinsisyal virüs ve metisillin dirençli sinsisyal) ve diger 25 tanesinin ise klinik çalismalarda oldugu ve 20 tanesinin klinik çalisma sirasinda birakildigi ortaya çikarilmistir.

Daha etkili anti-patojen ya da anti-kanser antikorlari ve baska baglayici gruplar gelistirilmesine ihtiyaç bulunmaktadir. Bu tür antikor aracili terapötikler, çiplak (konjuge olmayan), radyo etiketli ya da ilaç/toksin konjugatlari olarak, bakteriler, mantarlar, virüsler ve parazitler dahil olmak üzere birçok farkli patojenin tedavisi için gelistirilebilir. Kanser, patojenler ve diger hastaliklarin tedavisinde kullanim için, intraselüler olarak ayrilabilir baglayicilara sahip daha etkili antikor konjugatlari gelistirilmesine de ihtiyaç vardir. Ilaç/toksin ya da radyonüklit konjugatlarinin teslimi durumunda, bu, dogrudan antikor konjugasyonu ya da ön hedefleme olarak anilan dolayli yöntemler ile gerçeklestirilebilir ve bu ön hedefleme yönteminde, lezyonun hedef alinmasi için bispesifik bir antikor kullanilirken, terapötik ajan, patojen, kanser ya da tedavi edilen lezyon bölgesinde lokalize olmus olan bispesifik antikorun kollarindan birine baglanarak ikincil olarak hedef alinir bir antikor ya da antikor parçasi, bir baglayici ve bir kamptotesin gibi bir hedef grubunu içeren terapötik konjugatlar ile ilgilidir. polimerlere eklenirken, terapötik ajanlarin hedef hücreler, dokular ve organizmalara teslimine yönelik yöntem ve terkipler ile ilgilidir. yönelik kanser terapisi için 7- etil-10-hidroksikomptotesin (SN-38) antikor konjugatlarini raporlamaktadir. terap'otik grubun bir asit ayrilabilir bag ile baglanirken, bir antikor ve bir terapötik grup gibi hedefleyici bir grup içeren terapotik konjugatlar ile ilgilidir. terap'otik ve/veya tanisal grup ve bir ya da daha fazla triazol içeren baglayici ile birbirine baglanan bir ya da daha fazla fonksiyonel grup içeren bilesikler ile ilgilidir.

BULUSUN OZETI Bu bulusa yol açan problem, ekli bagimsiz istemlerin konusu ile çözülmektedir.

Tercih edilen somut örnekler, ekli bagimli istemlerden alinabilir.

Daha 'özel olarak, bu bulusa yol açan problem, asagidaki formül ile gösterilen bir yapi ile MAb-CL2A-SN-38 yapisal formülüne sahip olan bir konjugat ile çözülmektedir: NHz ::amin tuzu olarak; ve kanser ya da bir habislik tedavisinde kullanima yöneliktir; burada, MAb, kanser ya da habisligin habis bir hücresinde eksprese edilen bir epitop ya da bir antijeni hedef alir ve kanser, hematopoietik tümör, karsinom, sarkoma, melanoma ve gliyal tüm'or içeren grup içinden seçilir.

Bir somut örnekte, MAb ile hedef alinan antijen, CD74, CD22, EGP- 'I, musin, CD66a-e, CEA, CEACAMS, CEACAMG, CSAp, alfa-fetoprotein, CC49, PSMA, PSAM-dimer, karbonik anhidraz IX, tenassin ve HLA-DR arasindan seçilir.

Bir somut örnekte, kanser ya da habisligin habis bir hücresinde eksprese edilen antijen, CD74, CD22, EGP- 1, musin, CD66a-e, CEA, CEACAM5, CEACAMG, CSAp, alfa-fetoprotein, CC49, PSMA, PSAM-dimer, karbonik anhidraz IX, tenassin ve HLA-DR arasindan seçilir.

Bir somut örnekte, MAb, bir mürin antikoru, bir kimerik antikor, primatize bir antikor, hümanize edilmis bir antikor, bir insan antikoru, bir Fab antikor parçasi, bir Fab' antikor parçasi, bir F(ab)2 antikor parçasi, bir F(ab')2 antikor parçasi ve bir scFv antikor parçasi arasindan seçilir.

Bir somut örnekte, MAb, bir kimerik, primatize, hümanize edilmis ya da insan monoklonal antikorudur ve söz konusu antikor, sabit alanlara ve bir insan IgG1 ya da bir insan IgG4 antikorunun bir eklem alanina sahiptir.

Bir somut örnekte, MAb, sabit alanlara ve bir insan lgG4 antikorunun bir eklem alanina sahiptir ve eklemin serin 228'i yerinde bir prolin bulunur.

Bir somut örnekte, antikor, sabit alanlara ve bir insan IgG1 antikorunun bir eklem alanina sahiptir ve burada bir ya da daha fazla Fc amino asidi, antikorun kandaki yari Ömrünü artirmak için mutasyona ugratilir ya da Fc*nin bir ya da daha fazla grubu silinmistir ya da antikorun kandaki yari ömrünü artirmak için bir ya da daha Bir somut örnekte, MAb, multispesifiktir ve hedef hücrede bulunan en az iki farkli antijeni ya da epitopu hedef almak için birden çok baglanma koluna sahiptir ve bir ya da daha fazla hedefleyici kol, CPTiye konjugedir.

Bir somut örnekte, multispesifik MAb, CD74, CD22, EGP- 1, musin, CD66a-e, CEA, CEACAMS, CEACAMB, CSAp, alfa-fetoprotein, CC49, PSMA, PSAM-dimer, karbonik anhidraz IX, tenassin ve HLA-DR arasindan seçilen bir antijeni hedef alan bir ya da daha fazla antikor içeren bispesifik ve/veya bivalent bir antikor yapisina sahiptir.

Bir somut örnekte, bir ya da daha fazla antikor; hLL1, hLL2, RFB4, hA19, hA20, arasindan seçilir.

Bir somut örnekte, multispesifik antikor, karbonik anhidraz lX, B?, CCCL19, fetoprotein (AFP), VEGF, ED-B fibronektin, EGP-1, EGP-2, EGF reseptör (ErbB1), ErbBZ, ErbBß, Faktor H, FHL-1, Flt-3, folat reseptörü, Ga 733,GROB, HMGB-l, hipoksi uyarma faktörü (HlF), HM1.24, HER-2/neu, insülin benzeri büyüme faktörü gangliositler, HCG, HLA-DR, CD66a-d, MAGE, mCRP, MCP-1, MlP-1A, MlP-1B, makrofaj göç inhibe etme faktörü (MlF), MUC1, MUCZ, MUCS, MUC4, MUCÖ, plasenta büyüme faktörü (PIGF), PSA (prostat-spesifik antijen), PSMA, PSMA dimer, PAM4 antijen, NCA-95, NCA-90, A3, A33, Ep-CAM, KS-l, Le(y), mesotelin, 8100, tenassin, TAC, Tn antijen, Thomas-Friedenreich antijenleri, tumor nekroz antijenleri, tümor anjiyogenez antijenleri, TNF- d, TRAlL reseptörü (R1 ve R2), VEGFR, RANTES, T101, kanser kök hücre antijenleri, tamamlayici faktörler C3, C3a, C3b, C5a, C5 ve bir onkojen ürün arasindan seçilen iki ya da daha fazla antijene baglanir.

Bu açiklama, ilaç baglayici grup konjugatlarinin hazirlanmasina yönelik gelismis yöntemler ve terkipler saglayarak, teknikte süregelen ihtiyaci çözmektedir.

Açiklanan yöntemler ve terkipler, baska terapi sekillerine dirençli olan ya da az yanit veren çesitli hastalik ve rahatsizliklarin tedavisinde kullanima yöneliktir ve seçici hedefleme için uygun hedefleyici (baglayici) gruplar gelistirilebilen ya da mevcut olan ya da bilinen hastaliklari kapsayabilir. Tercihen, hedefleyici grup bir antikor, antikor parçasi, bispesifik ya da baska çok degerlikli antikor ya da baska antikor bazli molekül ya da bilesiktir. Antikor, çesitli izotoplari seklinde, tercihen lgG1, IgG2a, IgG3, lgG4 ya da lgA seklinde olabilir ve bir kimerik insan-fare, bir kimerik insan-primati hümanize edilmis (insan çerçevesi ve mürin hiper degisken (CDR) bölgeleri) ya da tamamen insan antikorlari ve van der Neut Kolfschoten ve digerleri tarafindan tarif edilen sekilde yarim-lgG4 antikorlari (“monokoklar”) aptamerler, avimerler ya da hedefleyici peptitler gibi teknikte bilinen baska baglayici gruplar da kullanilabilir. Bu tür hedefleyici gruplarin ise yaradigi tercih edilen hastaliklar ya da rahatsizliklar, örnegin, kanser, otoimmün hastaliklar ve enflamatuvar hastaliklar dahil olmak üzere immün düzenleme rahatsizliklari ve enfeksiyonlu organizmalardan kaynaklanan hastaliklardir.

Bu nedenle, açiklanan yöntemler ve terkipler, hedefleyici gruplarin sitotoksik ajanlarin teslimi için faydali oldugu hastaliklar ve rahatsizliklarin tedavisi için uygulanabilir. Bu tür hastaliklar ya da rahatsizliklar, kanserin ya da patojenik organizmalar içeren enfeksiyonun immün terapisi gibi, konjuge olmayan ya da çiplak hedefleyici gruplar kullanildigi zaman yeterince etkilenmeyen bir hedef molekül ya da hedef hücre varligi ile karakterize edilir. (Hastalik terapilerinde kullanim için izotoplar, ilaçlar ve toksinler ile antikorlarin immunokonjugatlarinin yapilmasina yönelik yöntemler için örnegin bkz., ABD Patent No. 4,699,784; Açiklama 0 kadar sinirli olmasa da kamptotesin (CPT) ve analoglari ve türevlerinin, tercih edilen kemoterapötik gruplar oldugu açiklanmistir. Açiklama kapsamina giren diger kemoterapötik gruplar söyledir: taksanlar (e.g, baksatin III, taksol), epotilonlar, antrasiklin ilaçlar (e.g., doksorubisin (DOX), epirubisin, morfolinodoksorubisin (morfolino-DOX), siyanomorfolino-doksorubisin (siyanomorfolino-DOX) ve 2-pirr0linodoksorubisin (2-PDOX); bkz. Priebe W (ed), ACS sempozyum dizileri 574, yayinci American Chemical Society, Washington geldanamisin ile örneklenen benzokuinoid ansamisinler (DeBoer v. d., Journal of ve benzerleri. Tercihen, istemlerde tanimlanan sekilde bu bulusun tercih edilen somut örneklerinin immunokonjugatlarinda, antikor, en az bir kemoterapötik gruba, tercihen 1 ila yaklasik 5 kemoterapötik gruba; en çok tercih edilen sekilde yaklasik 7 ila yaklasik 12 kemoterapötik gruba baglanir. ilaçlarin CPT gruplari ile ilgili olarak, sulu tamponlarda çözünmeme sorunlari ve bunlarin fizyolojik kosullar altinda yapilarinin E halkasinin ö-lakton grubunun asillenmesi ve amino asidin a-amino grubunun poli-L-glutamik asidi ile eslestirilmesi olmustur (Singer v. d., The Kampotesins: Unfolding Their Anticancer Potential, Liehr J.G., Giovanella, B.C. ve Verschraegen (ed), NY Acad Sci., NY difüzyonuna dayanir. Bu glisin konjugasyonu, suda çözünür bir CPT türevi hazirlama yöntemi olarak (Vishnuvajjala v. d., U.S. Patent No. 4,943,579) ve PEG türevli bir CPT hazirliginda da bildirilmistir (Greenwald, v. d. J. Med. Chem. 39: formlari gelistirme baglaminda icat edilmistir ve CPTjnin in vivo yari ömrü artirilmistir ve ilaç, in vivo dolasimdayken konjugatindan kademeli olarak salinmistir. Suda çözünür bir CPT türevinin bir örnegi CPT-11'dir. CPT-11'in farmakolojisi ve aktif SN-38,e in vivo dönüsümü ile ilgili olarak kapsamli klinik veriler mevcuttur (Iyer ve Ratain, Cancer Chemother Pharmacol. 42:S31-43 daha etkilidir.

Ilaç konjugatlari, terapbtik ilacin bakteriler, virüsler, mantarlar ve parazitler gibi patojenlere hedeflenmesi için kullanilabilir. Tercih edilen somut 'örneklerde, bu tür ilaç konjugatlari, anti-fungal, antibiyotikler ve anti-viral ilaçlar ve/veya çiplak antikorlar, immunomodülatorler (ön, interferonlar, interl'okinler ve/veya sitokinler) gibi baska terapotik formlar ile kombinasyon halinde kullanilabilir. Enfeksiyonlu organizmalarin tedavisi için radyoimmünoterapi kullanimi, örnegin 4,925,648; sayili ABD Patent Basvurusu Yayinlari içinde açiklanmaktadir.

Kanser tedavisinde, bulusun istemlerde tanimlanan ilaç konjugatlari, ameliyat, radyasyon terapisi, kemoterapi, çiplak antikorlar ile immünoterapi, radyoimmünoterapi, immunomodülatörler, asilar ve benzerleri ile bir arada kullanilabilir. Benzer kombinasyonlar, otoimmün hastaliklar gibi hedefleyici gruplara uyumlu baska hastaliklarin tedavisi için tercih edilir. Ornegin, bulusun istemlerde tanimlanan sekilde konjugatlari, TNF inhibitörleri, B hücresi antikorlari, interferonlar, interl'okinler ve romatoid artrit, sistemik lupus eritematoz, Sj'orgen sendromu, multipl skleroz, vaskülit ile tip l diyabet (gençlik diyabeti) gibi otoimmün hastaliklarin tedavisi için etkili olan diger ajanlar ile birlestirilebilir. Bu kombinasyon terapileri, bu tür kombinasyonlarda her bir terapötik ajanin daha düsük dozlarda kullanilmasina izin verir, dolayisiyla bazi ciddi yan etkileri azaltir ve potansiyel olarak gereken terapi seyirlerini azaltir. Viral hastaliklarda, ilaç immunokonjugatlari, baska terapötik ilaçlar, immunomodülatorler, çiplak MAb'Iar ya da asilar (br, hepatit, HlV ya da papilloma virüslerine karsi MAb'lar ya da bu virüslerin immünojenlerine dayali asilar) ile birlestirilebilir. Bunlara ve baska viral patojenlere karsi antikorlar ve antijen bazli asilar teknikte bilinmektedir ve bazi durumlarda halihazirda ticari kullanimdadir.

Açiklama, ayni zamanda, konjugatlari hazirlama prosesi ile de ilgilidir ve bu proseste, bir ilaç ilk önce birinci bir baglayici ile türevine dönüstürülür ve bu birinci baglayici, ilaveten bir hedefleyici grup eslestirme grubu içeren ikinci bir baglayici ile birlesebilen bir reaktif grup içerir; burada, birinci baglayici, ayni zamanda, suda çözünürlük için tanimli bir polietilen glikol (PEG) grubuna ve istege bagli olarak intraselüler peptidazlar ile ayrilabilen ya da endozomal ve lizozomal keseciklerin düsük pH ortami ile ayrilabilen intraselüler olarak ayrilabilir bir gruba ve istege bagli olarak ilaç ve birinci baglayici arasinda bir amino asit ara parçasina da sahiptir; burada, ikinci baglayici, bakir (+1) iyonu ile katalize asetilen-azit sikloadisyon reaksiyonu ile ilaç-(birinci baglayici) konjugat ile reaksiyona girebilen bir reaktif grup içerir; bu da “klik kimyasi” olarak adlandirilir. Tercihen, tanimli PEG grubu, asagida tartisilan sekilde tanimli sayida monomerik alt birimler ile düsük molekül agirligina sahip bir PEGidir.

Açiklama, ayni zamanda, yukaridaki paragrafta tartisilan konjugatlari hazirlamaya yönelik bir proses ile de ilgilidir; burada, ikinci baglayici, tek bir hedefleyici grup eslestirme grubuna ancak ilaç-(birinci baglayici) konjugati ile reaksiyona girebilen birkaç reaktif gruba sahiptir; dolayisiyla hedefleyici gruba konjuge olan ilaç Açiklama, ayrica, konjugatlari hazirlama prosesi ile de ilgilidir; bu proseste, baglayici, ilk önce bir ilaca konjuge olur, böylece bir ilaç-baglayici konjugati üretilir; burada sözü edilen ilaç-baglayici konjugatinin hazirlanisi, birden çok fonksiyonel grup içeren bir ilaçta daha reaktif bir grubun seçici olarak korumaya alinmasini ve korumasinin kaldirilmasini içerir; burada soz konusu ilaç-baglayici konjugatii müteakip olarak bir monoklonal antikora ya da parçaya konjuge edilir.

Ayni zamanda, bu belgede tarif edilen konjugatlar ile kanser (habislik), bir otoimmün hastalik, bir enfeksiyon ya da enfeksiyonlu bir lezyonu tedavi etme yöntemi de açiklanmaktadir. Ayrica, istemlerde anlatilan prosesler ve/veya istemlerdeki prosesleri gerçeklestirme setleri ile üretilen ilaç-hedefleyici grup konjugatlari da açiklanmaktadir.

Açiklama, ayrica, asagidakileri içeren bir immunokonjugat ile de ilgilidir: (a) bir hedefleyici grup; (b) bir kemoterap'otik grup; ve (o) bir hedefleyici grup-baglayici grup araciligiyla hedefleyici gruba ve intraselüler olarak ayrilabilir bir grup araciligiyla kemoterapötik gruba kovalent olarak baglanan bir baglayici. Baska bir somut örnekte, bulus, asagidakileri içeren bir immunokonjugat ile ilgilidir: (a) bir hedefleyici grup; (o) bir hedefleyici grup-baglayici grup araciligiyla hedefleyici gruba ve intrasel'üler olarak ayrilabilir bir grup araciligiyla kemoterapötik gruba kovalent olarak baglanan bir baglayici; burada sözü konusu terapötik gruba baglayici eklenmesi, bir L-amino asit ya da dört adede kadar L-amino asitten olusan bir polipeptit de içerir.

Bir `örnekte, intrasel'üler olarak ayrilabilir grup, kemoterapötik grubun ve sübstitüe edilmis bir etanolamin grubunun ya da bir 4-aminobenzil alkolün etkinlestirilmis bir hidroksil grubunu içeren bir karbonattir ve bunlardan sonuncusu, amino grubu araciligiyla, hedefleyici grup-baglayici grup içinde sonlanan bir çapraz baglayiciya eklenir ve burada, sübstit'ue edilmis etanolamin grubu, dogal bir L amino asidin karboksilik asit grubunun bir hidroksimetil grubu ile degistirilmesi araciligiyla dogal L amino asitten elde edilir ve 4-aminobenzil alkol, istege bagli olarak, benzilik pozisyonda bir Ci-Cio alkil grubu ile s'übstitüe edilir.

Baska bir 'örnekte, intraselüler olarak ayrilabilir grup, kemoterap'otik grubun ve sübstit'üe edilmis bir etanolamin grubunun etkinlestirilmis bir hidroksil grubunu içeren bir karbonattir ve bunlardan sonuncusu, amino grubu araciligiyla, bir L amino aside ya da dört adede kadar L amino asit grubu içeren bir polipeptide eklenir; burada, N-terminali, hedefleyici grup-baglayici grup içinde sonlanan bir çapraz baglayiciya eklenir ve burada, sübstitue edilmis etanolamin grubu, istege bagli olarak, bir L amino asidin karboksilik asit grubunun bir hidroksimetil grubu ile degistirilmesi araciligiyla L amino asitten elde edilir.

Baska bir 'örnekte, intraselüler olarak ayrilabilir grup, kemoterapötik grubun etkinlestirilmis bir hidroksil grubunu ve bir 4-aminobenzil alkol ya da benzilik pozisyonda bir C1-C10 alkil grubu ile sübstit'ue edilmis bir sübstitüe edilmis 4- aminobenzil alkol içeren bir karbonattir ve bunlardan sonuncusu, amino grubu araciligiyla, bir L amino aside ya da dört adede kadar L amino asit grubu içeren bir polipeptide eklenir; burada, N-terminali, hedefleyici grup-baglayici grup içinde sonlanan bir çapraz baglayiciya eklenir.

Belirli örneklerde, kemoterapötik grubun bir amino grubu, sübstit'ue edilmis ve amin korumali bir etanolamin grubunun etkinlestirilmis bir hidroksil grubu ya da bir 4-amin0benzil alkol ile eslestirilir ve bunlardan sonuncusu, amino grubu araciligiyla, bir L amino aside ya da dört adede kadar L amino asit grubu içeren bir polipeptide eklenir; burada, N-terminali, hedefleyici grup-baglayici grup içinde sonlanan bir çapraz baglayiciya eklenir; burada, söz konusu sübstit'ue edilmis etanolamin grubu, istege bagli olarak, bir L amino asidin karboksilik asit grubunun bir hidroksimetil grubu ile degistirilmesi araciligiyla L amino asitten elde edilir ve burada, 4-aminobenzil alkol, istege bagli olarak, benzilik pozisyonda bir Ci-CiO alkil grubu ile sübstit'üe edilir. Çift fonksiyonlu ilaç türevi, daha sonra, yukarida anlatilan sekilde bir immunokonjugat elde edilmesi için bir hedefleyici gruba konjuge edilir. Hastalik bölgesinin immunokonjugat ile hedef alinmasi üzerine, immunokonjugat, ilaç-baglayici grubunu salmak 'üzere endositoza ugratilir ve katabolize edilir; burada, sübstit'ue edilmis etanolamin grubunun serbest amino grubu, karbamat grubunun karbonil grubunda nükleofilik saldiri ile serbest ilacin SEKILLERIN KlSA TARIFNAMESI SEKIL 1. MAb- CL2A-SN-38 konjugatlari ile Capan 1 insan pankreas karsinomu tasiyan atimik çiplak farelerin klinik öncesi in vivo terapisi.

SEKIL 2. MAb- CL2A-SN-38 konjugatlari ile BxPC3 insan pankreas karsinomu tasiyan atimik çiplak farelerin klinik oncesi in vivo terapisi.

SEKIL 3. HMN-14- CL2A-SN-38 konjugati ile LS174T insan kolon karsinomu tasiyan atimik çiplak farelerin klinik öncesi in vivo terapisi.

BULUSUN AYRINTILI TARIFNAMESI Tanimlar Asagidaki tarifnamede, birtakim terimler kullanilmaktadir ve istemlerin konusunun anlasilmasini kolaylastirmak için asagidaki tanimlar verilmektedir. Bu belgede açik bir sekilde tanimlanmayan terimler, sade ve olagan anlamlarina göre kullanilmaktadir.

Aksi belirtilmedigi takdirde, “bir” kelimesi, “bir ya da daha fazla” anlamina gelir.

Yaklasik terimi, bu belgede, bir degerin arti ya da eksi yüzde onu (% 10) anlamina gelir. Ornegin, “yaklasik 100”, 90 ve 110 arasinda herhangi bir sayidir.

Bu belgede, hedefleyici terimi, bir hedef molekül, hücre, parçacik, doku ya da agregaya spesifik ya da seçici olarak baglanan bir molekül, kompleks ya da agrega anlamina gelir. Teknikte uzman kisiler, spesifik baglanma ifadesinin, belirli bir hedefe, baska hedefler ile çapraz reaktiflik olmadan baglanma anlamina geldigini ve seçici baglanmanin, belirli bir hedefe tercihen baglanma anlamina geldigini anlayacaktir. Tercih edilen somut örneklerde, hedefleyici grup bir antikor, antikor parçasi, bispesifik antikor ya da baska antikor bazli molekül ya da bilesiktir.

Ancak, hedefleyici gruplarin, aptamerler, avimerler, reseptör baglayici Iigandlar, nükleik asitler, biyotin-avidin baglayici çiftler, baglayici peptitler ya da proteinler, vb. gibi baska örnekleri teknikte bilinmektedir ve kullanilabilir. “Hedefleyici grup” ve Bu belgede kullanildigi üzere, bir antikor, tam uzunluklu (yani, dogal yolla olusan ya da normal immünoglobulin gen parçasi rekombinasyon prosesleri ile olusan) bir immünoglobulin molekülünü (ör., bir IgG antikoru) ya da bir antikor parçasi gibi, bir immünoglobulin molekülünün antijen baglayici bir parçasini ifade eder. Bir antikor ya da antikor parçasi, istemlerin konusu kapsaminda konjuge edilebilir ya da baska sekilde türevlendirilebilir. Bu tür antikorlar, sinirlama olmaksizin lgG1, lgG2a, lgG3, lgG4 (ve lgG4 alt formlari) ile IgA izotiplerini kapsar.

Bir antikor parçasi, IgG47ün yukarida anilan yari molekülleri dahil olmak üzere, F(ab')2, F(ab)2, Fab,, Fab, Fv, scFv (tek zincirli Fv), tek alani antikorlar (DAB7Iar ya da VHH'Ier) ve benzerleri gibi bir antikor parçasidir (van der Neut Kolfschoten v. d. yönelik bir antikor parçasi, intakt antikor tarafindan taninan ayni antijene baglanir. antijene baglanarak bir antikor gibi hareket eden sentetik ya da genetik olarak tasarlanmis proteinleri de içerir. Ornegin, antikor parçalari, degisken bölgelerden olusan izole parçalari da içerir; Örnegin, agir ve hafif zincir degisken bölgelerinden olusan “Fv” parçalari, hafif ve agir degisken bölgelerin bir peptit baglayici ile baglandigi rekombinant tek zincirli polipeptit molekülleri (“scFv proteinler”) ve CDR'Ier gibi, hiper degisken bölgeyi taklit eden amino asit rezidülerinden olusan minimal tanima birimleri. Fv parçalari, çok degerlikli ve/veya multispesifik baglanma formlari elde etmek için farkli sekillerde yapilandirilabilir. Çok degerlik durumunda, bunlar, spesifik epitopa karsi birden fazla baglanma alanina sahip olurken. multispesifik formlarda, birden fazla epitop (ayni antijenin epitopu ya da bir antijene ve farkli bir antijene karsi bir epitop) baglanir. Bu belgede kullanildigi üzere, antikor bileseni terimi, tam bir antikoru, bir füzyon proteinini ve bunlarin parçalarini kapsar.

Bir çiplak antikor, genel olarak, terapotik bir ajana konjuge edilmemis bütün bir antikordur. Bunun nedeni, antikor molekülünün Fc parçasinin, tamamlayici sabitleme ve hücre Iizisine yol açabilecek mekanizmalari devreye sokan ADCC (antikora bagimli hücre sitotoksisitesi) gibi efekt'or ya da immünolojik fonksiyonlari saglamasidir. Ancak, Fc parçasi, antikorun terap'otik fonksiyonu için gerekli olmayabilir; ancak, apoptoz, anti-anjiyogenez, anti-metastatik etkinlik, anti- adezyon etkinligi, 'Örnegin heterotipik ya da homotipik adezyonun inhibisyonu ve sinyalizasyon yollarina müdahale gibi baska mekanizmalar devreye girebilir ve hastaligin ileremesine müdahalede bulunabilir. Çiplak antikorlar, hem poliklonal hem de monoklonal antikorlari ve bunlarin mürin antikorlari içeren parçalarinin yani sira, kimerik, hümanize edilmis ya da insan antikorlari gibi bazi rekombinant antikorlari ve bunlarin parçalari içerir. Bu nedenle, bazi durumlarda, bir “çiplak antikor”, bir “çiplak" antikor parçasini da ifade edebilir. Bu belgede tanimlandigi üzere, “çiplak”, “konjuge olmayan” anlamina gelir ve terapötik bir ajana bagli ya da konjuge olmamayi ifade eder.

Otoimmün Hastaliklar, vücudun, kendi dokularina karsi bir immün tepki üretmesinden kaynaklanan bozukluklardir. Bunlara Örnek olarak, 1 Mart 2002 tarihinde verilmis olan, 60/360259 seri numarali ABD Geçici Basvurusunda açiklanan sekilde sunlar verilebilir: Sinif III otoimmün hastaliklar; `Örnegin immün aracili trombositopeniler, akut idiyopatik trombositopenik purpura ve kronik idiyopatik trombositopenik purpura, dermatomiyosit, Sjögren sendromu, multipl skleroz, Sydenham kore, miyasteni gravis, sistemik lupus eritematoz, lupus nefrit, romatik ates, poliglandular sendromlar, bülloz pemfigoid, diabetes mellitus, Henoch-Schonlein purpura, post-streptokokkal nefrit, eritema nodosum, Takayasu artiriti, Addison hastaligi, romatoid artrit, sarkoyidoz, ülseratif kolit, eritema multiform, lgA nefropati, poliarteritis nodosa, ankilozan spondilit, Goodpasture sendromu, tromboangitis obliterans, Sjogren sendromu, primer biliyer siroz, Hashimoto tiroidi, tirotoksikoz, skleroderma, kronik aktif hepatit, romatoid artrit, polimiosit/dermatomiyosit, polikondrit, pemfigus vulgaris, Wegener granulomatozu, membranöz nefropati, amiyotropik lateral skleroz, tabes dorsalis, dev hücreli arterit/ polimiyalji, habis anemi, hizli ilerleyen glomerulonefrit ve fibrozan alveolit.

Bir kimerik antikor, tercihen bir kemirgen antikoru, daha çok tercih edilen sekilde bir mürin antikoru olan bir türden elde edilen bir antikorun tamamlayicilik belirleme bölgeleri (CDR°Ier) dahil olmak üzere hem agir hem de hafif antikor zincirlerinin degisken alanlarini içeren bir rekombinant proteindir ve antikor molekülünün sabit alanlari, bir insan antikorununkilerden elde edilir. Veterinerlik uygulamalari için, kimerik antikorun sabit alanlari, bir primat, kedi ya da köpek gibi baska türlerinkinden elde edilebilir.

Hümanize edilmis bir antikor, bir türden bir antikordan, ör., bir mürin antikorundan CDRerrin, mürin antikorunun agir ve hafif degisken zincirlerinden, insan agir ve hafif degisken alanlarina (çerçeve bölgeler) aktarildigi bir rekombinant proteindir.

Antikor molekülünün sabit alanlari, bir insan antikorundan elde edilir. Bazi durumlarda, hümanize edilmis çerçeve bölgenin spesifik rezidüleri, özellikle de CDR dizilimlerine dokunan ya da yakin olanlar, modifiye edilebilir; örnegin, orijinal mürin, kemirgen, insan olmayan primat ya da baska antikordan ilgili rezidüler ile degistirilebilir.

Bir insan antikoru, örnegin antijenik zorlamaya yanit olarak insan antikorlari üretecek sekilde “tasarlanmis” olan transgenik farelerden elde edilen bir antikordur. Bu teknikte, insan agir ve hafif zincir lokuslarinin elemanlari, endojen agir zincir ve hafif zincir lokuslarinin hedefe yönelik bozulmalarini iceren embriyonik kök hücre çizgilerinden elde edilen fare suslarina eklenir. Transgenik fareler, çesitli antijenler için spesifik olan insan antikorlarini sentezleyebilir ve fareler, insan antikoru salgilayan hibridomalar üretmek için kullanilabilir.

Transgenik farelerden insan antikorlari elde etme yöntemleri Green v.d., Nature lmmun. &579 (1994) çalismalarinda tarif edilmektedir. Bütünüyle insan antikoru, ayni zamanda, genetik ya da kromozomal transfeksiyon yöntemleri ve faj görüntüleme teknolojisi ile de yapilandirilabilir ve tüm bu yöntemler teknikte bilinmektedir. Ornegin, immünize edilmemis donörlerden immünoglobulin degisken alan geni repertuarlarindan, insan antikorlari ve bunlarin parçalarinin in vitro degisken alan genleri, bir filamentöz bakteriyofajin majör ya da minör bir kaplama protein genine çerçeve içinde klonlanir ve fazj parçaciginin yüzeyinde fonksiyonel antikor parçalari olarak görüntülenir. Filamentöz parçacik, faj genomunun tek sarmalli bir DNA kopyasini içerdigi için, antikorun fonksiyonel özelliklerine göre seçimler, bu özellikleri sergileyen antikoru kodlayan genin seçimine de yol açar.

Bu sekilde, faj, B hücresinin bazi özelliklerini taklit eder. Faj görüntüsü, çesitli formatlarda gerçeklestirilebilir; ör., bkz: Johnson and Chiswell, Current Opinion in Bu belgede kullanildigi üzere, enfeksiyonlu hastaliklar, bakteri, rickettsia, mikoplazma, protozoa, mantar, virüsler, parazitler ve diger mikrobiyal ajanlar gibi patojenler tarafindan enfeksiyonu içeren hastaliklardir. Bunlara örnek olarak sunlar verilebilir: AIDS hastaligina neden olan insan immün yetmezlik virüsü (HlV), Mycobacterium tuberculosis, Streptococcus agalactiae, methicillin-resistant Stafilococcus aureus, Legionella pneumophilia, Streptococcus pyogenes, Escherichia coli, Neisseria gonorrhosae, Neisseria meningitidis, Pneumococcus, Cryptococcus neoformans, Histoplasma capsulatum, Hemophilis influenzae B, Treponema pallidum, Lyme disease spirochetes, Bati Nil virüsü, Pseudomonas aeruginosa, Mycobacterium Ieprae, Brucella abortus, kuduz virüsü, grip virüsü, sitomegalovirüs, herpes simplex virüsü I, herpes simplex virüsü ll, insan serum parvo benzeri virüs, respiratuar sinsisyal virüs, varicella-zoster virüsü, hepatit B virüsü, hepatit C virüsü, kizamik virüsü, adenovirüs, insan T hücresi lösemi virüsleri, Epstein-Barr virüsü, mürin lösemi virüsü, kabakulak virüsü, veziküler stomatit virüsü, sindbis virüsü, lenfositik koriyomenenjit virüsü, sigil virüsü, mavi dil virüsü, Sendai virüsü, kedigiller lösemi virüsü, reo virüs, poIIo virüsü, simian virüsü 40, fare meme tümörü virüsü, denge virüsü, kizamikçik virüsü, Plasmodium falciparum, Plasmodium vivax, Toxoplasma gondii, Trypanosoma rangeli, Trypanosoma cruzi, Trypanosoma rhodesiensei, Trypanosoma brucei, Schistosoma mansoni, Schistosoma japanicum, Babesia bovis, Elmeria tenella, Onchocerca volvulus, Leishmania tropica, Trichinella spiralis, Theileria parva, Taenia hydatigena, Taenia ovis, Taenia saginata, Echinococcus granulosus, Mesocestoides corti, Mycoplasma arthritidis, M. hyorhinis, M. orale, M. arginini, Acholeplasma laidlawii, M. salivarium ve M. pneumoniae. Enfeksiy'oz organizmalara (antitoksin ve antiviral antikorlar) ile baska hedeflere karsi Bir terap'otik ajan, bir baglanma grubu, ör., bir antikor ya da antikor parçasi ya da bunlarin bir alt parçasi ile ayri olarak, birlikte veya art arda tatbik edilen bir molekül ya da atomdur ve bir hastaligin tedavisinde faydalidir. Terapötik ajanlara örnek olarak, sinirlama olmaksizin, antikorlar, antikor parçalari, konjugatlar, ilaçlar, sitotoksik ajanlar, proapopoptotik ajanlar, toksinler, nükleazlar (DNAzIar ve RNAzlar dahil olmak üzere), hormonlar, immunomodülatörler, selat ajanlari, bor bilesikleri, fotoaktif ajanlar ya da boyalar, radyoizotoplar ya da radyonüklitler, oligonükleotitler, interferans RNA, peptitler, anti-anjiyojenik ajanlar, kemoterapötik ajanlar, sitokinler, kemokinler, ön ilaçlar, enzimler, baglayici proteinler ya da peptitler ya da bunlarin kombinasyonlari verilebilir.

Bir konjugat, yukarida tarif edilenler gibi bir terap'otik ajana konjuge edilen bir antikor bileseni ya da baska hedefleyici bir gruptur. Bu belgede kullanildigi üzere, Bu belgede kullanildigi üzere, antikor füzyon proteini, rekombinant olarak üretilmis antijen baglayici bir moleküldür ve bu molekülde, bir ya da daha fazla dogal antikor, tek zincirli antikor ya da antikor parçasi, bir protein ya da peptit toksini, sitokin, hormon, vb. gibi baska bir gruba baglanir (kaynastirilir). Tercih edilen bazi somut örneklerde, füzyon proteini, ayni ya da farkli antikorlar, antikor parçalari ya da birbirine kaynastirilmis tek zincirli antikorlardan ikisi ya da daha fazlasini içerebilir ve bunlar, ayni epitopa, ayni antijen üzerindeki farkli epitoplara ya da farkli antijenlere baglanabilir. Bir antikor füzyon proteini, en az bir antijen baglanma alani içerir. Füzyon proteinlerinin valansi, füzyon proteininin antijen ya da epitopa baglanma kollarinin ya da bölgelerinin toplam sayisini belirtir; ör., tek degerlikli, çift degerlikli, üç degerlikli ya da çok degerlikli. Antikor füzyon proteininin çok degerlikli olmasi, bir antijene baglanirken birden çok etkilesim avantajini saglar ve dolayisiyla, antijene ya da farkli antijenlere baglanma gücünü artirir. Spesifiklik, bir antikor füzyon proteininin kaç farkli antijene ya da epitopa baglanabildigini gösterir; yani, monospesifik, bispesifik, tripesifik, multispesifik. Bu tanimlar kullanildiginda; bir dogal antikor, br., bir IgG, çift degerliklidir çünkü iki baglanma koluna sahiptir ancak monospesifiktir çünkü tek bir antijen ya da epitop türüne baglanir.

Monospesifik, çok degerlikli bir füzyon proteini, ayni antijen ya da epitop için birden çok baglanma alanina sahiptir. Örnegin, bir monospesifik diabody, ayni antijen ile reaktif olan iki baglanma alanina sahip bir füzyon proteinidir. Füzyon proteini, farkli antikor bilesenlerinin çok degerlikli ya da multispesifik bir kombinasyonunu ya da ayni antikor bileseninin birden çok kopyasini içerebilir. Füzyon proteini, ilaveten, bir terapötik ajan da içerebilir.

Bir immunomodülatör, mevcut oldugu zaman, vücudun immün sistemini degistiren, baskilayan ya da uyaran bir terapötik ajandir. Tipik olarak, kullanilan bir immunomodülatör, makrofajlar, dendritik hücreler, B hücreleri ve/veya T hücreleri gibi immün hücreleri uyararak, bir immün yanit kaskadinda çogalmalarini ya da aktif hale gelmelerini saglar. Ancak, bazi durumlarda, bir immunomodülatör, bir otoimmün hastaligin terap'otik tedavisinde oldugu gibi, immün hücrelerin çogalmasini ya da etkinlesmesini baskilayabilir. Bu belgede tarif edilen sekilde, bir immunomodülatör 'örnegi olarak, spesifik antijenler ile temas üzerine bir hücre popülasyonundan (ör., astarli T Ienfositler) salinan ve hücreler arasinda bir interselüler araci olarak çalisan yaklasik 5-20 kDa büyüklügünde çözünür bir küçük protein olan sitokin verilebilir. Teknikte uzman kisilerin anlayacagi üzere, sitokinlere örnek olarak lenfokinler, monokinler, interlökinler ve tümör nekroz faktörü (TNF) ve interferonlar gibi birkaç ilgili sinyalizasyon molekülü verilebilir.

Kemokinler, sitokinlerin bir alt kümesidir. Bazi interl'okinler ve interferonlar, T hücresi ya da diger immün hücre çogalmasini uyaran sitokinlerin örnekleridir.

CPT, kamptotesin kisaltmasidir ve bu basvuruda kullanildigi üzere, CPT, kamptotesinrin kendisini ya da kamptotesin'in bir analog ya da türevini ifade eder.

Kamptotesin ve bazi analoglarinin yapilari, asagida Çizelge ildeki formül 1Ide, gösterilen numaralandirma ve A-E harfleri ile etiketlenmis halkalar ile verilmistir. Çizelge 1 81 ilk ?s IO-Hidroksi -CP'I': R; = OH; R2 = R3 "' H 1:^.~if..ly°ç_\0s, CPTII'RI &go-r( >. R2=Etilili=H 3952 SN-38: R, non; Rgz Etil;ls=H (i) Topotekan : R - OH; R2 - H; R3 == CHz-N(CH3)2 Kamptotesin Konjugatlari Bir antikor (MAb) gibi hedefleyici gruplar (TM) ile kemoterapötik ilaçlarin konjugatlarini hazirlamak için asagidaki sekillerde yöntemler tasarlanmistir.

Açiklanan yöntemler, bulusun tercih edilen bir somut örnegini göstermektedir. (1) Ilacin çözünürlügü, ilaç ve hedefleyici vektör arasina tanimli bir polietilenglikol (PEG) grubu (yani, tanimli sayida monomerik birim içeren bir PEG) konularak artirilir; burada, tanimli PEG, molekül agirligi düsük olan, tercihen 1-30 monomerik birirn içeren, daha çok tercih edilen sekilde 1-12 monomerik birim içeren bir PEG'dir; (2) birinci bir baglayici, ilaci bir uçta baglar ve diger uçta bir asetilen ya da bir azit grubu ile sonlanir; bu birinci baglayici, bir uçta bir azit ya da asetilen grubu ve diger uçta karboksilik asit ya da hidroksil grubu gibi farkli bir reaktif grup içeren tanimli bir PEG grubu içerir ve söz konusu çift fonksiyonlu tanimli PEG, bir amino alkolün amin grubuna aglanir ve bunun hidroksil grubu, bir karbonat seklinde ilacin hidroksil rubuna eklenir; alternatif olarak, söz konusu tanimli çift fonksiyonlu PEG'nin azit disi (ya da asetilen disi) grubu, istege bagli olarak, bir L-amino asit ya da bir polipeptide eklenir ve C terminali ise amino alkolün amino grubuna baglanir ve bu sonuncusunun hidroksi grubu, sirasiyla karbonat ya da karbamat seklinde ilacin hidroksil grubuna eklenir; (3) bir hedefleyici grup-eslesme grubu ve birinci baglayicinin azit (ya da asetilen) grubuna tamamlayici olan bir reaktif grup içeren ikinci bir baglayici, yani asetilen (ya da azit), hastalik hedefleyici antikorlar gibi hastalik hedefleyici gruplara konjugasyon için faydali olan nihai çift fonksiyonlu müstahzari elde etmek için asetilen-azit sikloadisyon reaksiyonu araciligiyla ilaç- (birinci baglayici) konjugati ile reaksiyona girer; (4) antikor-eslestirme grubu, bir tiyol ya da bir tiyol-reaktif grup seklinde tasarlanir; (5) SN-38 gibi CPT analoglari içeren ilaç-baglayici öncülünün preparatlarinda C-20 karbonat varliginda 10- hidroksil grubunun seçici rejenerasyonu için yöntemler tasarlanir; (6) SN-38'de fenolik hidroksil, örnegin t-bütildimetilsilyl or t-bütildifenilsilyl gibi, ilaçlardaki reaktif hidroksil gruplar için diger koruyucu gruplar da kullanilir ve türevlenen ilacin, bir hedefleyici-vektör-eslestirme grubuna baglanmasindan önce tetrab'utilamonyum flor'ür ile bunlarin korumasi kaldirilir; ve (6) CPT analoglarinin 10-hidroksil grubu, alternatif olarak, '800 disinda. bir ester ya da karbonat olarak korumaya alinir; böylece, çift fonksiyonlu CPT, bu koruma grubunun korumasi kaldirilmadan Önce bir hedefleyici gruba konjuge edilir ve koruyucu grup, biyokonjugat tatbik edildikten sonra fizyolojik pH kosullari altinda kolayca kaldirilir. 'Klik kimyasi' olarak anilan asetilen-azit eslestirmesinde, azit kismi L2 'üzerinde ve asetilen kismi L3 'üzerinde olabilir. Alternatif olarak, L2, asetilen içerebilir ve L3 ise azit içerebilir. 'Klik kimyasi,, bir asetilen grubu ve bir azit grubu arasinda bir bakir (+1)-katalize sikloadisyon reaksiyonudur ve biyokonjugasyonlar alaninda nispeten yeni bir kimyasi, neredeyse nötr pH kosullarinda sulu çözelti içinde gerçeklesir ve u nedenle ilaç konjugasyonuna yatkindir. Klik kimyasinin avantaji, kemo-seçici olmasi ve tiyol-maleimit reaksiyonu gibi iyi bilinen baska konjugasyon kimyalarini tamamlamasidir. Asagidaki tartismada, bir konjugatin bir antikor ya da antikor parçasi içermesi durumunda, bir aptamer, avimer ya da hedefleyici peptit gibi baska tür bir baglayici grup sübstit'ue edilebilir.

Bir Örnek, bir ilaç türevinin bir konjugatina ve genel formül ?nin bir antikoruna yöneliktir, MAb-[L2]-[LI]-[AA]m-[A']-Ilaç (2) burada, MAb, hastalik hedefleyici bir antikordur; L2, bir antikor eslestirme grubu ve bir ya da daha fazla asetilen (ya da azit) grubu içeren bir çapraz baglayici bilesenidir; L1, L2ideki asetilen (ya da azit) grubuna tamamlayici olarak bir uçta azit (ya da asetilen) ile tanimli bir PEG ve diger uçta karboksilik asit ya da hidroksil grubu gibi bir reaktif grup içerir; AA, bir L-amino asittir; m, degeri 0, 1, 2, 3 ya da 4 olan bir tamsayidir ve A,, etanolamin, 4-hidr0ksibenzil alkol, 4-amin0benzil alkol ya da sübstit'ue edilmis ya da sübstit'ue edilmemis etilendiamin arasindan seçilen ek bir ara parçadir.°AA' L amino asitleri, alanin, arginin, asparagi, aspartik asit, sistein, glutamin, glutamik asit, glisini histidin, izolösin, Iösin, lizin, metiyonin, fenilalanin, prolin, serin, treonin, triptofan, tirozin ve valin arasindan seçilir. A' grubunun hidroksil içermesi halinde, bu grup, ilacin hidroksil grubuna ya da amino grubuna, sirasiyla bir karbonat ya da karbamat seklinde baglanir.

Formül 2inin tercih edilen bir örneginde, A,, bir L-amino asitten elde edilen sübstit'ue edilmis bir etanolaminrdir ve burada, amino asidin karboksilik asit grubu, bir hidroksimetil grubu ile degistirilir. A,, asagidaki L-amino asitlerden herhangi birinden elde edilebilir: alanin, arginin, asparagi, aspartik asit, sistein, glutamin, glutamik asit, glisin, histidin, izolösin, lösin, Iizin, metiyonin, fenilalanin, prolin, serin, treonin, triptofan, tirozin ve valin.

Formül 2'nin tercih edilen somut örneginin konjugatinin bir örneginde, m, O'dir; A,, L-valinolrdür ve ilaç, SN-38 le örneklenir. Elde edilen yapi, formül Site gösterilmektedir. 57”& m .1 n "w-r*** 1% g ss . 'î, as' % @Lirggî-gh'? gs` ...ß ..wmG-G&-Aw“yy“&G'M-WÃMa**GG<-›:›IGG“~«V=G“:.W” :: i: *2 .::î . ~ “4 ,ring-%2# ' ?525% GW'** ..41“3': Formül 2'nin tercih edilen somut örneginin konjugatinin baska bir örneginde, m, 1'dir ve türevli bir L-lizin ile gösterilir; A', L-valinol*d`ür ve ilaç, SN-38 Ie örneklenir.

Yapi, formül 4ite gösterilmektedir. 3,,“ {: 3th:: Bu örnekte, ilk olarak, Iizin gibi bir amino grubunun karboksilik asidi ve valinol amino grubu arasinda, lizin amino gruplari için ortogonal koruma gruplari kullanilarak bir amit bagi olusturulur. Liziniin N terminalindeki koruma grubu kaldirilir, Iizin yan zincirindeki koruma grubuna dokunulmaz ve N terminali, diger uçta azit (ya da asetilen) ile tanimli PEG üzerinde karboksil grubu ile eslestirilir.

Daha sonra, valinol hidroksil grubu, 10-hidr0ksi-korumali SN-38'in 20-klor0format türevine eklenir ve bu ara ürün, hedefleyici vekt'ore baglanan grup ile klik sikloadisyon kimyasina dahil olan tamamlayici asetilen (ya da azit) tasiyan bir L2 bileseni ile eslestirilir. Son olarak, hem Iizin yan zincirinde hem de SN-389de koruma gruplarinin kaldirilmasi, bu örnegin, formül 3'te gösterilen ürününü verir.

Teoriye bagli kalinmaksizin, küçük MW SN-38 ürünü, yani intraselüler proteolizis sonrasinda olusan valinol-SN-38 karbonat, valinol amino grubunu ve karbonat'in karbonilini içeren molekül içi siklizasyon yoluyla intakt SN-38iin serbest kalmasi için ilave bir yol saglar.

Baska bir örnekte, genel formül ?den A', A-OH'dir; burada, A-OH, 4-aminobenzil alkol ya da benzilik pozisyonda bir C1-C1O alkil grubu ile sübstitüe edilmis bir sübstitüe 4-aminobenzil alkol gibi çikarilabilir bir gruptur ve bunlardan sonuncusu, amino grubu araciligiyla, bir L amino aside ya da dört adede kadar L amino asit grubu içeren bir polipeptide eklenir; burada, N-terminali, hedefleyici grup-baglayici grup içinde sonlanan bir çapraz baglayiciya eklenir.

Asagida verilen `örnekte, genel formül (2)'deki A, için A-OH somut örnegi, sübstitüe edilmis 4-aminobenzil alkolden elde edilir ve 'AA7, genel formül (2)'de m = 1 olmak üzere tek bir L-amino asitten olusur ve ilaç, SN-38 ile orneklenir. Yapi, asagida gösterilmistir (formül 5, MAb-CLX-SN-38 olarak anilmaktadir). Tek bir AA amino asidi, asagidaki L-amino asitlerden herhangi biri olarak seçilebilir: alanin, arginini asparagin, aspartik asit, sistein, glutamin, glutamik asit, glisin, histidin, izolösini aminobenzil alkol grubu üzerindeki sübstitüen R (A' için A-OH somut örnegi), hidrojen ya da C1-C1O alkil gruplarindan seçilen bir alkil grubudur. 2 ya!' 3,3_ Rus.“ Formül 5rten MAb-CLX-SN-38 somut 'örneginde, tek amino asit AA, L-lizin'dir ve R = H'dir ve ilaç, SN-38 ile örneklenir (formül 6, MAb-CL2A-SN-38 olarak anilmaktadir).

NHa (amin tuzu olarak) SN-38 gibi, 10-hidr0ksi içeren kamptotesinler baglaminda baska somut örnekler de mümkündür. Ilaç olarak SN-38 örneginde, ilacin daha reaktif 10-hidr0ksi grubu, -hidroksil grubu etkilenmeden birakilarak türevlendirilir. Genel formül 2 içinde, A', sübstitüe edilmis etilendiamin'dir. Bunun bir Örnegi, asagidaki formül '7' ile gösterilmektedir ve bu formülde, SN-38 fenolik hidroksil grubu, sübstitüe edilmis etilendiamin ile bir karbamat olarak türevlendirilir ve diamin'in diger amini, bir 4- aminobenzil alkol ile bir karbamat olarak türevlendirilir ve bu alkolün amino grubu, Phe-Lys dipeptide eklenir. Bu yapida (formül 7), R ve R,, birbirinden bagimsiz olarak hidrojen ya da metil'dir. R = R' = metil oldugu zaman, MAb-CL17-SN-38 or MAb-CL2E-SN-38 olarak anilir. ofNÖ1î~^l°Wßgw°ßu 5%” @On RNJYO “:1 .Il-«J 53)? NHz(amin tuzu olarak) AA, intraselüler peptidaz ile ayrilabilen bir polipeptit grubu, tercihen bir di, tri ya da tetrapeptit grubu içerebilir. Bunlara 'örnek olarak sunlar verilebilir: Ala-Leu, Leu- Ala-Leu, and AIa-Leu-Ala-Leu (Trouet v.d., 1982).

Baska bir örnekte, konjugatin L1 bileseni, 1-30 tekrarlanan monomerik birime sahip olan tanimli bir polietilenglikol (PEG) ara parçasi içerir. Baska bir örnekte, PEG, 1-12 tekrarlanan monomerik birime sahip olan tanimli bir PEGadir. PEGinin eklenmesi, piyasadan satin alinabilen heterobifonksiyonel PEG türevlerinin kullanilmasini içerebilir. Heterobifonksiyonel PEG, bir azit ya da asetilen grubu içerebilir. Asagidaki formül 8'de, 'NHS' süksinimidil iken, 8 tekrarlanan monomerik birim içeren bir heterobifonksiyonel tanimli PEG 'örnegi gösterilmektedir. *ise “M" ;3 ””âMWMWg'Ewß' ”kesme Bir örnekte, L2, 2-40 arasinda, tercihen 2-20 arasinda ve daha çok tercih edilen sekilde 2-5 arasinda degisen sayida asetilen (ya da azit) grubu ve tek bir hedefleyici vektör-baglanma grubu içerir.

Birden çok ilaç molekülü ve tek bir hedefleyici vektör-baglanma grubu içeren bir antikorun temsili bir SN-38 konjugati asagida gösterilmektedir. Bu yapinin 'L2' bileseni, 2 asetilenik gruba eklenir ve u da iki azit bagli SN-38 molekülünün baglanmasina yol açar. MAb'ye baglanma, bir süksinimit olarak gösterilmistir.

MAD-«g J" r 7 H E? R R Rezidüsü asagidaki gibidir: 021:' `1 4,0 **ß-@Nvro/VNYO/Y t' u °w< 2 ~~; i.

Li 27A\7 NH; (Tut) `af-;1: Tercih edilen örneklerde, çift fonksiyonlu ilaç, antikor baglayici grup olarak bir tiyol reaktif grup içerir ve antikor üzerindeki tiyoller, bir tiyolasyon reaktifi kullanilarak antikorun Iizin gruplari üzerinde olusturulur. MAb*nin Iizin gruplarinin modifikasyonlari ile antikorlara tiyol grubu ekleme yöntemleri, teknikte iyi bilinmektedir (Wong, Chemistry of protein conjugation and cross-Iinking, CRC Press, Inc., Boca Raton, FL (1991), s. 20-22). Alternatif olarak, antikor üzerinde zincirler arasi disülfit baglarin, ditiyotreitol (DTT) gibi indirgeyici ajanlar kullanilarak üzerinde 7 ila 10 tiyol olusturabilir; bu durum, antijen baglanma bölgesinden uzakta MAb'nin zincirler arasi bölgesine birden çok ilaç grubu eklenmesi avantajina sahiptir.

Bir örnekte, kemoterapötik grup, doksorubisin (DOX), epirubisin, morfolinodoksorubisin (morfolino-DOX), siyanomorfolino-doksorubisin (siyanomorfolino-DOX), 2-pirrolinodoksorubisin (2-PDOX), CPT, 10-hidroksi kampotesin, topotekan, lurtotekan, 9-aminokampotesin, 9-nitrokampotesin, taksanlar, geldanamisin, ansamisinler ve epotilonlar arasindan seçilir. Istemlerde tanimlanan bulusa göre, kemoterapötik grup SN-38'dir. Tercihen, tercih edilen somut örneklerinin konjugatlarinda, antikor grubu, en az bir kemoterapötik gruba, tercihen 1 ila yaklasik 12 kemoterapötik gruba; en çok tercih edilen sekilde yaklasik 6 ila yaklasik 12 kemoterapötik gruba baglanir.

Ayrica, tercih edilen bir somut örnekte, baglayici bilesen 'L2,, söz konusu hedefleyici grubun bir ya da daha fazla Iizin yan zincir amino grubuna eklenen bir tiyoI-reaktif rezidü ile reaksiyona giren bir tiyol grubu içerir. Bu tür durumlarda, antikor, teknikte iyi bilinen prosedürler ile bir maleimit, vinilsulfone, bromoasetamit ya da iyodoasetamit gibi bir tiyol-reaktif grup ile ön türevlemeye tabi tutulur.

Bu somut örnekler baglaminda, CPTrnin ilaveten bir 10-hidroksil grubuna sahip oldugunda CPT ilaç-baglayicilarin hazirlanabildigi bir proses sasirtici bir sekilde kesfedilmistir. Bu proses, sinirlama olmaksizin, 10-hidroksil grubunun bir t- bütiloksikarbonil (BOC) türevi olarak korunmasini ve ardindan ilaç-baglayici konjugatinin sondan bir önceki ara maddesinin hazirlanmasini içerir. Genel olarak, BOC grubunun çikarilmasi, trifloroasetik asit (TFA) gibi güçlü bir asit ile islem gerektirir. Bu kosullar altinda, çikarilacak olan koruma gruplarini içeren CPT 20-O- baglayici karbonat da ayrilmaya duyarlidir ve bu da modifiye edilmemis CPTiye yol açar. Aslinda, teknikte bilinen sekilde, baglayici molekülün Iizin yan zinciri için hafif çikarilabilir metoksitritil (MMT) koruma grubu kullanma gerekçesi, tam olarak bu olasiligin Önlenmesi içindir (Walker v.d., 2002). Fenolik BOC koruma grubunun seçici olarak çikarilmasinin, reaksiyonlarin kisa süreler, optimal olarak 3 ila 5 dakika boyunca gerçeklestirilmesi ile mümkün oldugu kesfedilmistir. Bu kosullar altinda, baskin ürün, 10-hidr0ksil pozisyonunda “BOC, çikarilmis ve '20, pozisyonunda karbonat intakt kalmis ürün olmustur.

Alternatif bir yaklasim, CPT analogunun 10-hidr0ksi pozisyonunun, 'BOC' disinda bir grup ile korunmasini içerir ve bu durumda nihai ürün, 10-OH koruma grubunun korumasini kaldirmaya ihtiyaç olmadan antikorlara konjugasyon için hazirdir. 10- OH'yi bir fenolik karbonat ya da bir fenolik estere çeviren 10-hidroksi koruma grubunun korumasi, fizyolojik pH kosullari ile ya da konjugatin in vivo tatbiki sonrasinda esterazlar ile kolayca kaldirilir. 10 pozisyonunda bir fenolik karbonatin, fizyolojik kosullar altinda 10-hidroksikampotesin'in 20 pozisyonunda tersiyer karbonattan daha hizli çikarilmasi, He v.d. (He v.d., Bioorganic & Medicinal -hidroksi koruma grubu 'COR' olabilir; burada, R, “'N(CH3)2-(CH2)n-” gibi sübstitüe edilmis bir alkil olabilir ki burada n, 1-10 arasindadir ve terminal amino grubu, istege bagli olarak, yüksek suda çözünürlük için bir kuaterner tuz seklindedir ya da R, “CH3-(CH2)n-” gibi basit bir alkil rezidüsü olabilir ki burada ni 0-10 arasindadir ya da R, n degerinin 0-10 arasinda oldugu “CH3-(CH2)n-O-” gibi bir alkoksi grubu olabilir ya da n degerinin 2-10 arasinda oldugu “N(CH3)2-(CH2)n- O-” olabilir ya da “R10-(CH2-CH2-O)n-CH2-CH2-O-" olabilir ki burada R1, etil ya da metil'dir ve n, 0-10 arasinda bir tamsayidir. Bu 10-hidr0ksi türevleri, nihai türevin bir karbonat olmasi halinde seçilen reaktifin kloroformati ile islem yoluyla kolayca hazirlanir. Tipik olarak, SN-38 gibi 10-hidroksi içeren kamptotesin, baz olarak trietilamin kullanilarak dimetilformamit içinde kloroformat'in bir molar esdegeri ile islenir. Bu kosullar altinda, 20-OH pozisyonu etkilenmez. 10-O-esterler olusturmak için, seçilen reaktifin asit klorürü kullanilir.

Istatistiksel tanimlayicilar L2, L1, AA ve A-X'in Önceki bölümlerde tarif edilen sekilde oldugu genel formül ?nin bir ilaç türevinin ve bir antikorunun konjugatinin hazirlanmasinin örnek bir prosesinde, ilk olarak, çift fonksiyonlu ilaç grubu, [L2]- ilaç grubunun konjugasyonu gerçeklestirilir.

Istatistiksel tanimlayicilar L2, L1, AA ve A-OHyin önceki bölümlerde tarif edilen sekilde oldugu genel formül ?nin bir ilaç türevinin ve bir antikorunun konjugatinin hazirlanmasinin örnek bir prosesinde, ilk olarak A-OH'nin bir amit bagi araciligiyla AA'nin C terminaline baglanmasi yoluyla çift fonksiyonlu ilaç grubu hazirlanir ve ardindan AA'nin amin ucu, L1*in bir karboksilik asit grubuna eslestirilir. AA'nin mevcut olmamasi halinde (yani m :0), A-OH, bir amit bagi araciligiyla dogrudan L1'e eklenir. Çapraz baglayici, [L1]-[AA]m-[A-OH], ilacin hidroksil ya da amino grubuna eklenir ve bunun ardindan, klik kimyasi araciligiyla L1 ve L2'deki azit (ya da asetilen) ve asetilen (ya da azit) gruplari arasinda reaksiyona basvurularak L1 grubuna ekleme gelir.

Hedefleyici grubun bir 'örneginde, TM, monoklonal bir antikordur (MAb). Baska bir somut 'örnekte, hedefleyici grup, çok degerlikli ve/veya multispesifik bir MAb olabilir. Hedefleyici grup, bir mürin, kimerik, hümanize edilmis ya da insan monoklonal antikoru olabilir ve söz konusu antikor, intakt, parçali (Fab, Fab: F(ab)2, F(ab,)2) ya da alt parçali (tek zincirli yapilar) seklinde ya da IgG1, lgGZa, lgGS, lgG4, IgA izotipi ya da bunlarin alt molekülleri seklinde olabilir.

Baska bir örnekte, hedefleyici grup, bir kanser ya da habis hücre üzerinde eksprese edilen bir antijen ya da bir antijen epitopu ile reaktif olan bir monoklonal antikordur. Kanser hücresi, tercihen, bir hematopoietik tümör, karsinom, sarkoma, melanoma ya da bir gliyal tümörden bir hücredir. Bu bulusa göre tedavi edilecek olan tercih edilen bir habislik, habis bir kati tümör ya da hematopoietik neoplazmdir.

Tercih edilen bir somut `örnekte, intraselüler olarak ayrilabilir grup, MAb-ilaç konjugati ile bir reseptörüne baglanma ve özellikle esterazlar ve peptidazlar ile ayrilma üzerine hücre içine yerlestikten sonra ayrilabilir.

Antikor, tamamen insan, insan disi, hümanize edilmis ya da kimerik bir antikor ya da enzimatik olarak ya da rekombinant olarak üretilmis parçalar dahil olmak üzere bir antikor parçasi ya da antikorlar ya da antikor parçalarindan dizilimler içeren baglayici proteinler olabilir. Antikorlar, parçalar ve baglayici proteinler, yukarida tanimlanan sekilde çok degerlikli ve multispesifik ya da çok degerlikli ve monospesifik olabilir.

Genel Antikor Teknikleri Neredeyse her türlü hedef antijene karsi monoklonal antikorlar hazirlama teknikleri, teknikte iyi bilinmektedir. Ornegin, bkz. Kohler and Milstein, Nature 256: 495 (1975) ve Coligan v.d. (eds.), CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY, CILT. 1, sayfa 2.5.1-2.. Kisacasi, monoklonal antikorlar, farelere, bir antijen içeren bir terkip enjekte edilmesi, B-lenfositler elde etmek için dalagin çikarilmasi, hibridomalar üretmek için B-lenfositlere miyelom hücreleri kaynatilmasi, antijene karsi antikor üreten pozitif klonlarin seçilmesi, antijene karsi antikor üreten klonlarin kültürünün hazirlanmasi ve hibridoma kültürlerinden antikorlar izole edilmesi yoluyla elde edilebilir.

MAbilar, iyi bilinen çesitli tekniklerle hibridoma kültürlerinden izole edilebilir ve saflastirilabilir. Bu tür izolasyon teknikleri, Protein-A ya da Protein-G Sepharose ile afinite kromatografisini, boyut dislama kromatografisini ve iyon degisim 2.9.3. Ayrica, bkz. Baines v.d., “Purification of Immunoglobulin G (IgG),” METODS lN MOLECULAR BIOLOGY, CILT. 10, sayfa 79-104 (The Humana Press, Inc. 1992).

Immünojene karsi antikorlarin ilk çikarilmasindan sonra, antikorlar sekanslanabilir ve ardindan rekombinant teknikler ile hazirlanabilir. Mürin antikorlari ve antikor parçalarinin hümanizasyonu ve kimerizasyonu, asagida anlatilan sekilde, teknikte uzman kisiler tarafindan iyi bilinmektedir.

Teknikte uzman kisiler, istemlerde verilen yöntemler ve terkiplerin, teknikte bilinen çok çesitli antikorlardan yararlanabilecegini fark edecektir. Kullanilabilecek antikorlar, birçok bilinen kaynaktan satin alinabilir. Ornegin, hibridoma çizgilerini salgilayan birçok antikor çesidi, Amerikan Tip Kültür Koleksiyonu'nda (ATCC, Manassas, VA) bulunmaktadir. ATCC, tümör ile iliskili antijenler dahil olmak ancak bunlarla sinirli olmamak üzere, çesitli hastalik hedeflerine karsi çok sayida antikor bulundurmaktadir ve degisken bölge dizilimleri yayimlanmistir ve bunlar, istemlerdeki yöntemler ve terkiplerde kullanim için uygundur. `Ornegin, bkz: ABD Bunlar, yalniz ornek niteligindedir ve çok sayida baska antikor ve onlarin hibridomalari da teknikte bilinmektedir. Teknikte uzman kisiler, neredeyse her türlü hastalik ile iliskili antijene karsi antikor dizilimleri ya da antikor salgilayan hibridomalarin, ATCC, NCBI ve/veya USPTO veri tabanlarinda, ilgilenilen bir hastalik ile iliskili hedefe karsi antikorlar için basit bir arama yapilarak elde edilebilecegini takdir edecektir. Klonlanan antikorlarin antijen baglayici alanlari, artirilabilir, kesilip çikarilabilir, bir ekspresyon vektör'une baglanabilir, uyarlanan bir konak hücreye transfekte edilebilir ve teknikte iyi bilinen standart teknikler kullanilarak protein üretimi için kullanilabilir. Izole edilen antikorlar, bu belgede açiklanan teknikler kullanilarak kamptotesin gibi terapötik ajanlara konjuge edilebilir.

Kimerik ve Hümanize Edilmis Antikorlar Bir kimerik antikor, bir insan antikorunun degisken bölgelerinin, örnegin bir fare antikorunun, bu antikorun tamamlayicilik belirleme bölgeleri (CDR'ler) dahil olmak üzere degisken bölgeleri ile degistirildigi bir rekombinant proteindir. Kimerik antikorlar, bir denege tatbik edildikleri zaman düsük immünojenisite ve yüksek stabilite sergiler. Kimerik antikorlar üretme yöntemleri teknikte bilinmektedir (ör., Leung v.d., 1994, Hybridoma 13:469).

Bir kimerik monoklonal antikor, fare immünoglobuliniin agir ve hafif degisken zincirlerinden fare CDR'Ierinin, bir insan antikorunun onlara karsilik gelen degisken alanlarina aktarilmasi yoluyla hümanize edilebilir. Kimerik monoklonal antikordaki fare çerçeve bölgeleri (FR) de insan FR dizilimleri ile degistirilir. Hümanize edilmis monoklonalin stabilite ve antijen spesifisitesini korumak için, bir ya da daha fazla insan FR rezidüleri, fare emsal rezidüleri ile degistirilebilir. Hümanize edilmis monoklonal antikorlar, deneklerin terapötik tedavisi için kullanilabilir. Hümanize edilmis monoklonal antikorlarin üretimine yönelik teknikler, teknikte iyi 1502844.) Diger somut örnekler, insan disi primat antikorlari ile ilgili olabilir. Babunlarda terapötik olarak faydali antikorlar çikarmaya yönelik genel teknikler, örnegin su lnt. J. Cancer 46: 310 (1990). Baska bir somut örnekte, bir antikor, bir insan monoklonal antikoru olabilir. Bu tür antikorlar, yukarida anlatilan sekilde, antijenik zorlamaya yanit olarak spesifik insan antikorlari üretecek sekilde “tasarlanmis” olan transgenik farelerden elde edilen bir antikordur.

Insan Antikorlari Birlesimli yaklasimlar ya da insan immünoglobulin lokuslari ile dönüstürülmüs transgenik hayvanlar kullanilarak bütünüyle insan antikorlari üretmeye yönelik yöntemler teknikte bilinmektedir (ör., Mancini v.d., 2004, New Microbiol. 27:315- antikorlarinin, kimerik ya da hümanize edilmis antikorlardan bile daha az yan etki göstermesi ve in vivo olarak esasen endojen insan antikorlari gibi çalismasi beklenmektedir. Belirli somut örneklerde, istemlerin yöntemleri ve prosedürleri, bu tür tekniklerle üretilmis insan antikorlari kullanabilir.

Bir alternatifte, insan antikorlari üretmek için faj görüntüleme teknigi kullanilabilir normal insanlardan ya da kanser gibi belirli bir hastalik durumunu gösteren insanlardan üretilebilir (Dantas-Barbosa v.d., 2005). Hastalikli bir bireyden insan antikorlari üretmenin avantaji, dolasimdaki antikor repertuarinin, hastalik ile iliskili antijenlere karsi antikorlara yönelik olabilmesidir.

Bu yöntemin sinirlayici olmayan bir örneginde, Dantas-Barbosa v.d. (2005), osteosarkoma hastalarindan insan Fab antikor parçalarinin bir faj görüntüleme kütüphanesini olusturmustur. Genel olarak, toplam RNA, dolasimdaki kan lenfositlerinden elde edilmistir (yukarida belirtilen çalisma). Rekombinant Fab, |J, V ve K zincir antikor repertuarlarindan klonlanmis ve bir faj görüntüleme kütüphanesine eklenmistir (yukarida belirtilen çalisma). RNA'lar, cDNAiIara dönüstürülmüs ve agir ve hafif Zincirli immünoglobulin dizilimlerine karsi spesifik primerler kullanilarak Fab cDNA kütüphaneleri yapmak için kullanilmistir (Marks göre yapilmistir: Andris-Widhopf v.d. (2000, in: Phage Display Laboratory Manual, Barbas v.d. (ed.), 1. baski, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY 5. 9.1 ile 9.22). Son Fab parçalari, restriksiyon endonükleazlari ile sindirilmis ve faj görüntüleme kütüphanesini olusturmak için bakteriyofaj genomuna eklenmistir. Bu tür kütüphaneler, standart faj görüntüleme yöntemleri ile taranabilir. Teknikte yetkin kisiler, bu teknigin, yalniz örnek niteliginde oldugunu ve faj görüntüleme ile insan antikorlari ya da antikor parçalari üretmek ve taramak için bilinen her türlü yöntemin kullanilabilecegini takdir edecektir.

Baska bir alternatifte, yukarida anlatilan sekilde standart immünizasyon protokolleri kullanilarak esasen her türlü immünojenik hedefe karsi antikorlar üretmek için, genetik olarak insan antikorlari üretmesi tasarlanmis olan transgenik hayvanlar kullanilabilir. Transgenik farelerden insan antikorlari elde etme yöntemleri su çalismalarda tarif edilmistir: Green v.d., Nature Genet. 7:13 (1994), tür bir sistemin sinirlayici olmayan bir örnegi, XenoMouse®'tur (ör., Green v.d., benzer hayvanlarda, fare antikor genleri devre disi birakilmis ve fonksiyonel insan antikor genleri ile degistirilmistir ve fare immün sisteminin kalani intakt birakilmistir.

XenoMouse®, aksesuar genler ve düzenleyici dizilimler boyunca, degisken bölgeli dizilimlerin çogunlugu dahil olmak üzere, insan lgH ve lg kappa lokus parçalarini içeren germ hatti yapilandirilmis YACtler (maya yapay kromozomlari) ile dönüstürülmüstür. Insan degisken bölge repertuari, bilinen teknikler ile hibridomalar içine islenebilen, B hücreleri üreten antikor olusturmak için kullanilabilir. Bir hedef antijen ile immünize edilmis bir XenoMouse®, normal immün tepki ile insan antikorlari üretir ve bunlar, yukarida anlatilan standart teknikler ile hasat edilebilir ve/veya üretilebilir. Çesitli XenoMouse® suslari mevcuttur ve bunlarin her biri, farkli bir antikor sinifi üretebilmektedir. Transgenik olarak üretilen insan antikorlarinin, terapötik potansiyele sahip oldugu ve normal insan antikorlarinin farmakokinetik özelliklerini de korudugu gösterilmistir (Green v.d., 1999). Teknikte yetkin kisiler, istemlerin terkipleri ve yöntemlerinin, XenoMouse® sistemi ile sinirli olmadigini ve insan antikorlari üretecek sekilde genetik olarak tasarlanmis her türlü transgenik hayvani kullanabilecegini takdir edecektir.

Antikor Parçalarinin Uretimi Istemlerin yöntemleri ve/veya terkiplerinin bazi somut örnekleri, antikor parçalari ile ilgilidir. Bu tür antikor parçalari, örnegin, tam antikorlarin klasik yöntemler ile pepsin ya da papain sindirimi ile elde edilebilir. Ornegin, antikor parçalari, F(ab')2 olarak gösterilen bir 58 parçasini saglamak için antikorlarin pepsin ile enzimatik olarak ayrilmasi yoluyla üretilebilir. Bu parça, 3.58 Fab, tek degerlikli parçalarini üretmek için, bir tiyol indirgeyici ajan ve istege bagli olarak, disülfit baglarin ayrilmasindan kaynaklanan sülfhidril gruplari için bir bloklama grubu kullanilarak da ayrilabilir. Alternatif olarak, pepsin kullanilarak enzimatik ayirma, iki tek degerlikli Fab parçasi ve bir PC parçasi üretir. Antikor parçalari üretmek için örnek yöntemler, su çalismalarda açiklanmistir: ABD Pat. No. 4,036,945; ABD Pat. No. lMMUNOLOGY, (John Wiley & Sons).

Tek degerlikli hafif-agir zincir parçalar olusturmak için agir zincirlerin ayrilmasi, parçalarin ilaveten ayrilmasi gibi antikorlari ayirmanin baska yöntemleri ve ya da diger enzimatik, kimyasal ya da genetik teknikler, parçalarin intakt antikor tarafindan taninan antijene baglanmasi sartiyla kullanilabilir. Ornegin, Fv parçalari, VH ve VL zincirlerinin bir iliskisini içerir. Bu iliski, “Inbar v.d., 1972, Proc. Nat*l.

Acad. Sci. USA, 69:2659” çalismasinda tarif edilen sekilde, kovalent olmayabilir.

Alternatif olarak, degisken zincirler, moleküller arasi bir disülfit bag ile baglanabilir ya da glutaraldehit gibi kimyasallar ile çapraz baglanabilir. Bkz. Sandhu, 1992, Crit. Rev. Biotech., 12:437.

Tercihen, Fv parçalari, bir peptit baglayici ile baglanan VH ve VL zincirler içerir. Bu tek zincirli antijen baglayici proteinler (scFv), bir oligonükleotit baglayici dizilim ile baglanan, VH ve VL alanlarini kodlayan DNA dizilimlerini içeren yapisal bir gen yapilandirilarak hazirlanir. Yapisal gen, bir ekspresyon vektörüne eklenir ve bu da müteakip olarak E. coli gibi bir konak hücreye eklenir. Rekombinant konak hücreler, iki V alani arasinda köprü kuran bir baglayici peptit içeren tek bir polipeptit zinciri sentezler. ScFv'leri üretme yöntemleri teknikte bilinmektedir. Bkz.

Whitlow v.d., 1991, Metods: A Companion to Metods iri Enzymology 2:97; Bird Bir antikor parçasinin baska bir formu, bazen tek zincirli antikor olarak da anilan tek alanli antikordur (dAb). Tek alanli antikorlari üretme yöntemleri teknikte iyi bilinmektedir (ör., bkz: Cossins v.d., Protein Expression and Purification, 2007, tamamlayicilik belirleme bölgesi (CDR) içerebilir. CDR peptitleri (“minimal tanima birimleri”), ilgili bir antikorun CDR”sini kodlayan genler yapilandirilarak elde edilebilir. Bu tür genler, örnegin, antikor üreten hücrelerin RNA'sindan degisken bölge sentezlemek için polimeraz zincir reaksiyonu kullanilarak hazirlanabilir. Bkz.

Larrick v.d., 1991, Metods: A Companion to Metods in Enzymology 22106; Ritter v.d. (ed), 1995, MONOCLONAL ANTIBODIES: PRODUCTlON, ENGINEERING AND CLlNlCAL APPLICATION, sayfa ; Birch v.d., (ed), 1995, MONOCLONAL ANTIBODIES: PRINCIPLES AND APPLICATIONS, sayfa Antikor Varyasyonlari Belirli somut örneklerde, antikorlarin dizilimleri, örnegin antikorlarin Fc kisimlari, serum içindeki yari ömrü gibi, konjugatlarin fizyolojik özelliklerini optimize etmek için çesitlendirilebilir. Proteinlerde amino asit dizilimlerini sübstitüe etme yöntemleri, ör., alana yönelik mutagenez, teknikte yaygin olarak bilinmektedir (ör., Sambrook v.d., Molecular Cloning, A Iaboratory manual, 2. Baski, 1989). Tercih edilen somut örneklerde, varyasyon, Fc diziliminde bir ya da daha fazla glikosilasyon alaninin eklenmesini ya da çikarilmasini içerebilir (ör., ABD Patent No. 6.254.868). Diger tercih edilen somut örneklerde, FC diziliminde spesifik amino Bispesifik ve Multispesifik Antikorlar Bispesifik antikorlar, çesitli biyo-medikal uygulamalarda faydalidir. Örnegin, bir tümör hücresi yüzey antijeni için ve bir T hücresi yüzey reseptörü için baglanma alanlarina sahip bir bispesifik antikor, T hücreleri ile spesifik tümör hücrelerinin lizisini yönlendirebilir. T hücrelerindeki gliyomlari ve CD3 epitopunu taniyan bispesifik antikorlar, insan hastalarda beyin tümörlerinin tedavi edilmesinde somut örneklerde, bu belgede açiklanan terapötik ajan konjugasyonu için teknikler ve terkipler, hedefleyici gruplar olarak bispesifik ya da multispesifik antikorlar ile kullanilabilir.

Bispesifik ya da multispesifik antikorlar üretmeye yönelik çesitli yöntemler bilinmektedir; örnegin, ABD Patent No. 7.405.320. Bispesifik antikorlar, kuadroma yöntemi ile üretilebilir ve bu yöntem, her biri farkli bir antijenik alani taniyan bir monoklonal antikor üreten iki farkli hibridomanin füzyonunu içerir (Milstein ve Bispesifik antikorlar üretmeye yönelik baska bir yöntem, iki farkli monoklonal antikoru kimyasal olarak baglamak için heterobifonksiyonel çapraz baglayicilar 316:354-356). Bispesifik antikorlar, ayni zamanda, iki ana monoklonal antikordan her birinin ilgili yari moleküllerine indirgenmesi, ardindan bunlarin karistirilmasi ve melez yapi elde etmek için yeniden oksitlenmesi ile de üretilebilir. Proc Natl Acad iki ya da üç ayri olarak saflastirilmis Fabi parçasinin kimyasal olarak çapraz baglanmasini içerir. (On, bkz: Avrupa Patent Basvurusu 0453082).

Diger yöntemler arasinda, retrovirüs türevli tasiyici vektörler araciligiyla ayri olarak seçilebilir markerlerin, müteakip olarak kaynastirilan ilgili ana hibridomalara gen transferi ile melez hibridomalar üretmenin verimliligini artirmayi (DeMonte, v.d. hafif zincirli genlerini içeren ekspresyon plazmitlerine bir hibridoma hücre çizgisi transfeksiyonunu içerir.

Akraba VH ve VL alanlari, baglayici etkinlige sahip tek zincirli bir Fv (scFv) olusturmak için uygun terkibe ve uzunluga (genellikle 12rden fazla amino asit rezidüsü içeren) sahip bir peptit baglayici ile birlestirilebilir. ScFvrleri üretme açiklanmaktadir. Peptit baglayici uzunlugunun 127den az amino asit rezidüsüne indirgenmesi, VH ve VL alanlarinin ayni zincir üzerinde eslesmesini önler ve VH ve VL alanlarini diger zincirler üzerindeki tamamlayici alanlar ile eslesmeye zorlar, böylece fonksiyonel multimerlerin olusumuna yol açar. 3 ve 12 amino asit rezidüsü arasinda baglayici ile birlestirilen VH ve VL alanlarinin polipeptit zincirleri, agirlikli olarak dimerler (diabody'ler olarak adlandirilir) olusturur. 0 ve 2 amino asit rezidüsü arasinda baglayiciyla, trimerler (tribody'ler olarak adlandirilir) ve tetramerler (tetrabody'ler olarak adlandirilir) öne çikar ancak oligomerizasyonun kesin örüntüleri, baglayici uzunluguna ek olarak, V alanlarinin (VH-baglayici ya da VL-baglayici-VH) terkibine ve yönelimine bagli görünmektedir. multispesifik ya da bispesifik antikorlari üretmeye yönelik bu teknikler, düsük verim, saflastirma geregi, düsük stabilite ya da teknigin emek yogunlugu bakimindan çesitli zorluklar göstermektedir. Daha yakin tarihte, neredeyse istenen her türlü antikor, antikor parçasi ve diger efektör molekülün kombinasyonlarinin üretilmesi için “kenetleme ve kilitleme” (dock and lock, DLA) olarak bilinen bir . Bu teknik, birbirine baglanan ve dimerler, trimerler, tetramerler, kuintamerler ve hekzamerlere kadar kompleks yapilarin düzenlenmesine imkan saglayan ankraj alanlari (AD) ve dimerizasyon ve kenetlenme alanlari (DDD) olarak adlandirilan tamamlayici protein baglanma alanlarindan yararlanmaktadir. Bunlar, kapsamli saflastirmaya gerek olmadan yüksek verimlerle kararli kompleksler olusturmaktadir. DNL teknigi, monospesifik, bispesifik ya da multispesifik antikorlarin düzenlenmesine imkan saglamaktadir.

Bu belgede istemlerin yöntemlerinin uygulamasinda, bispesifik ya da multispesifik antikorlarlar üretmek için teknikte bilinen yöntemlerden herhangi biri kullanilabilir. Çesitli somut örneklerde, bu belgede açiklanan sekilde bir konjugat, kompozit, multispesifik bir antikorun bir parçasi olabilir. Bu tür antikorlar, spesifisiteleri farklilik gösteren iki ya da daha fazla farkli antijen baglanma alani içerebilir.

Multispesifik kompozit, ayni antijenin farkli epitoplarina baglanabilir ya da alternatif olarak iki farkli antijene baglanabilir. Daha çok tercih edilen hedef kombinasyonlarin bazilari, Tablo 1'de siralananlari içerir. Bu, tercih edilen kombinasyonlarin örneklerinin bir listesidir ancak kapsamli degildir.

Tablo 1. Multispesifik antikorlarin bazi örnekleri.

Birinci hedef Ikinci hedef MIF Ikinci bir proinflamatuar efektör sitokin, özellikle HMGB-1, TNF-d, IL-1 ya da IL-6 MIF Proinflamatuar efektör kemokin, özellikle MCP-1, RANTES, MlP-1A ya da MIP-1B MIF Proinflamatuar efektör reseptör, özellikle lL-6R, lL-13R ve lL- MIF Koagülasyon faktörü, özellikle TF ya da trombin MIF Tamamlayici faktör, özellikle C3, CS, CSa ya da CSa MIF Tamamlayici düzenleyici protein, özellikle CD46, CD55, CD59 ve mCRP MIF Kanser ile iliskili antijen ya da reseptör HMGB-1 Ikinci bir proinflamatuar efektör sitokin, özellikle MIF, TNF-oi, lL-1 ya da IL-6 HMGB-1 Proinflamatuar efektör kemokin, özellikle MCP-1, RANTES, MlP-1A ya da MIP-1 B HMGB-1 Proinflamatuar efektör reseptör özellikle MCP-1, RANTES, MIP-1A ya da MIP-1 B HMGB-1 Koagülasyon faktörü, özellikle TF ya da trombin HMGB-1 Tamamlayici faktör, özellikle CS, C5, Cßa ya da CSa HMGB-1 Tamamlayici düzenleyici protein, özellikle CD46, CD55, CD59 ve mCRP HMGB-1 Kanser ile iliskili antijen ya da reseptör TNF-oi Ikinci bir proinflamatuar efektör sitokin, özellikle MIF, HMGB- 1, TNF-oi, IL-1 ya da IL-6 TNF-oi Proinflamatuar efektör kemokin, özellikle MCP-1, RANTES, MlP-1A ya da MIP-1 B TNF-a Proinflamatuar efektör reseptör, özellikle IL-6R, IL-13R ve IL- TNF-oi Koagülasyon faktörü, özellikle TF ya da trombin TNF-oi Tamamlayici faktör, özellikle C3, C5, Cßa ya da CSa TNF-oi Tamamlayici düzenleyici protein, özellikle CD46, CD55, CD59 ve mCRP TNF-d Kanser ile iliskili antijen ya da reseptör LPS Proinflamatuar efektör sitokin, özellikle MIF, HMGB-1, TNF-oii lL-1 ya da IL-6 LPS Proinflamatuar efektör kemokin, özellikle MCP-1, RANTES, MlP-1A ya da MIP-1 B LPS Proinflamatuar efektör reseptör, özellikle IL-GR, IL-13R ve IL- LPS Koagülasyon faktörü, özellikle TF ya da trombin LPS Tamamlayici faktör, özellikle CS, C5, CSa ya da C5a LPS Tamamlayici düzenleyici protein, özellikle CD46, CD55, CD59 ve mCRP TF ya da trombin Proinflamatuar efektör sitokin, özellikle MIF, HMGB-1, TNF-oi, lL-1 ya da IL-6 TF ya da trombin Proinflamatuar efektör kemokin, özellikle MCP-1, RANTES, MlP-1A ya da MlP-1 B TF ya da trombin Proinflamatuar efektör reseptör, özellikle IL-6R, IL-13R ve IL- TF ya da trombin Tamamlayici faktör, özellikle CS, C5, C3a ya da CSa TF ya da trombin Tamamlayici düzenleyici protein, özellikle CD46, CD55, CD59 ve mCRP TF ya da trombin Kanser ile iliskili antijen ya da reseptör Kanser terapileri için tercih edilenler gibi, baska kombinasyonlar sunlari içerir: CEACAM5 (CEA) + CEACAM6 (NCA) antikorlari, insülin benzeri büyüme faktörü (ILGF) + CEACAM5 antikorlari, EGP-1 (ön, RS-7) + lLGF antikorlari, CEACAM5 + antikorlar, kombinasyon halinde kullanilmanin yani sira, IgG, Fab, scFv ve benzerleri gibi çesitli füzyon proteini formlari olarak birlestirilebilir.

Hedef Antijenler ve Ornek Antikorlar Tercih edilen bir somut örnekte, hedef hücrelerde yüksek seviyelerde eksprese edilen ve normal dokulara göre agirlikli olarak ya da yalnizca hastalikli hücrelerde eksprese edilen markerler ya da tümör ile iliskili antijenleri taniyan ya da onlara baglanan antikorlar kullanilir. Bu bulus kapsaminda faydali olan antikorlar, yukarida tarif edilen özelliklere sahip olan (ve hücrelere ve mikroorganizmalara farkli seviyelerde yerlesme konusunda ayirt edici özellikler sergileyen) MAbtlari içerir ve kanserde, asagidaki MAb=Iarin kullanimini tasarlar: LL1 (anti-CD74), LL2 ve RFB4 (anti-CD22), RS7 (anti-epitel glikoprotein-1 (EGP-1)), PAM4 ve KC4 (her iki anti-musin), MN-14 (anti-karsinoembriyonik antijen (CEA, ayni zamanda CD66e olarak da bilinir), Mu-9 (anti-kolon-spesifik antijen-p), Immu 31 (anti-alfa- spesifik membran antijen)), AB-PG1-XG, D2/B (anti- PSMA), G. Bu tür Kullanilabilecek bilinen spesifik antikorlar sunlari içerir: hPAM4 (US. Patent No.

Tarif edilen konjugatlar kullanilarak hedef alinabilecek diger yararli antijenler sunlari içerir: karbonk anhidraz IX, B7, CCCL19, CCCL21, CSAp, HER-2/neu, fetoprotein (AFP), VEGF (e.g., AVASTIN®, fibronektin birlesme yeri varyanti), ED- B fibronektin (e.g., L19), EGP-1, EGP-2 (e.g., (e.g., ERBlTUX®), ErbB2, ErbB3, Faktör H, FHL-1, Fit-3, folat reseptörü, Ga benzeri büyüme faktörü (lLGF), IFN-y, IFN-d, lFN-ß, lL-2R, lL-4R, IL-6R, IL-13R, lGF-1R, la, HM1.24, gangliyositler, HCG, L243 baglanan HLA-DR antijeni, CD66 antijenleri, yani, CD66a-d ya da bunlarin bir kombinasyonu, MAGE, mCRP, MCP- 1, MIP-1A, MlP-1B, makrofaj göç inhibe etme faktörü (MlF), MUC1, MUC2, MUCS, MUC4, MUCS, plasental büyüme faktörü (PIGF), PSA (prostat-spesifik antijen), PSMA, PAM4 antijen, NCA-95, NCA-90, A3, A33, Ep-CAM, KS- 1, Le(y), mesotelin, 8100, tenassin, TAC, Tn antijeni, Thomas-Friedenreich antijenleri, tümor nekroz antijenleri, tümor anjiyogenez antijenleri, TNF-a, TRAlL reseptörü (R1 ve R2), VEGFR, RANTES, T101 ile kanser kök hücre antijenleri, tamamlama faktörleri 03, C3a, Cßb, C5a, C5 ve bir onkojen ürünü.

CD66 antijenleri, sirasiyla BCG, CGMG, NCA, CGM1 ve CEA olmak üzere, karsinoembriyonik antijen (CEA) gen ailesi üyeleri tarafindan kodlanan, benzer yapilara sahip (CDööa-e) bes farkli glikoproteinden olusur. Bu CD66 antijenleri (ön, CEACAM6) temel olarak granülositlerde, sindirim yolunun normal epitel hücrelerinde ve çesitli dokularin tümör hücrelerinde eksprese edilir. Kanserler için uygun hedefler olarak, NY-ESO-1 gibi kanser testis antijenleri (Theurillat v.d., Int.

CD79a da yer alir. Yukarida belirtilen antijenlerin bazilari, 15 Kasim 2002 tarihinde yapilan ESC/426.379 sayili ve “Use of Multispecific, Non-kovalent Complexes for Targeted Delivery of Therapeutics” balikli ABD Geçici Basvurusunda açiklanmaktadir. Terapiye daha dirençli habis hücre popülasyonlari olarak atifta bulunulan kanser kök hücreleri (Gan, J Cell Mol. Med. 5 Aralik 2007 [Epub yayin kanserinde CD133 (Maitland v.d., Ernst Schering Found. Sympos. Proc. 2006; :155-79), küçük hücreli akciger kanseri (Donnenberg v.d., J. Control Release ) ve kolorektal kanserde CD44 (Dalerba v.d., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2007; bas ve boyun skuamöz hücreli karsinom (Prince v.d., Proc. Natl. Acad. Sci. USA sahiptir.

Akis sitometrisi ile gösterildigi üzere ve ilaç-konjugat immünoterapisi için uygun antikorlari seçmek için bir rehber olarak, hematopoietik habis hücrelerdeki uygun antijen (Küme Belirtimi ya da CD) hedefleri ile ilgili yeni bir kapsamli analiz, “Craig ve Foon, Blood, 15 Ocak 2008 tarihinde online olarak yeniden yayimlanmistir; Baska bir tercih edilen somut örnekte, antikorlar, hizli bir sekilde içsellesen ve ardindan yeniden eksprese edilen, islenen ve hücre yüzeylerinde sunulan ve dolasimdaki konjugatin hücre tarafindan sürekli alimini ve biriktirilmesini saglayan antikorlar kullanilmaktadir. En çok tercih edilen antikor/antijen çiftine 'örnek olarak LL1, bir anti-CD74 MAb (degismez zincir, sinif II-spesifik saperon, li) ('or., bkz: melanomalar, kolon, akciger ve böbrek kanserleri, gliyoblastomalar ve belirli baska hastaliklarda yüksek oranda eksprese edilir. Kanserde CD74 antikorlarinin Tercihen anti-CD74 antikorlari ile tedavi edilen hastaliklar arasinda, sinirlama olmaksizin, non-Hodgkin lenfoma, Hodgkin hastaligi, melanoma, akciger, böbrek, kolon kanserleri, gliyoblastom multiform, histiyositomalar, miyeoid I'osemiler ve multipl miyelom yer alir. Hedef hücrelerin yüzeyinde kisa süreler için CD74 antijeninin sürekli ekspresyonu ve ardindan antijenin içsellesmesi ve antijenin yeniden ekspresyonu, hedefleyici LL1 antikorunun, tasidigi her türlü kemoterapotik grup ile uyumlu olarak içsellesmesini saglar. Bu, bu tür hücreler içinde, yüksek ve terap'otik bir LL1- kemoterapötik ilaç konjugati konsantrasyonunun birikmesini saglar. Içsellesen LL1-kemoterapötik ilaç konjugatlari, Iizozomlar ve endozomlardan dolasir ve kemoterapötik grup, hedef hücreler içinde aktif bir formda salinir.

Kenetleme ve Kilitleme (DNL) Belirli somut Örneklerde, kenetleme ve kilitleme (dock-and-lock) teknolojisi kullanilarak bispesifik ya da multispesifik antikorlar üretilebilir (ön, bkz: ABD Patent alt birimleri ve A-kinaz ankraj proteinleri (AKAPrlar) arasinda meydana gelen spesifik protein/protein etkilesimlerinden yararlanir (Baillie v.d., FEBS Letters. mesajci cAMP1nin R alt birimlerine baglanmasi ile tetiklenen, üzerinde en çok çalisilan sinyal transdüksiyon yollarindan birinde merkezi bir rol oynayan PKA, ilk olarak 1968 yilinda tavsan iskelet kasindan izole edilmistir (Walsh v.d., J. Biol. izozimleri, iki tür R alt birimi (RI ve RII) olarak bulunur ve her bir tür 0( ve [3 izoformlara sahiptir (Scott, Pharmacol. Ther. 1991;50:123). R alt birimleri, yalniz kararli dimerler olarak izole edilmistir ve dimerizasyon alaninin, ilk 44 amino terminal rezidüsünden olustugu gösterilmistir (Newlon v.d., Nat. Struct. Biol. 1999; 6222). CAMP'nin R alt birimlerine baglanmasi, PKA'nin AKAP'lar ile kenetlenmesi araciligiyla bölümlendirilmesi yoluyla seçilen substratlara dogru yönelen serin/treonin kinaz etkinliklerinin genis bir spektrumu için aktif katalitik alt birimlerin Birinci AKAP, mikrotübül ile iliskili protein-2 ilk olarak 1984 yilinda karakterize membrani, aktin sitoiskelet, nükleus, mitokondri ve endoplazmik retikulum dahil olmak üzere çesitli alt hücre alanlarina lokalize olan 50'den fazla AKAP, mayadan insanlara kadar birçok türde çesitli yapilarda tanimlanistir (Wong ve Scott, Nat. asit dizilimleri, münferit AKAP'Iar arasinda oldukça çesitlilik gösterir ve Rll dimerleri için baglanma afinitelerinin 2 ila 90 nM arasinda degistigi bildirilmistir yalniz dimerik R alt birimlerine baglanacaktir. Insan Rlloi için, AD, 23 amino- terminal rezidüsü tarafindan olusturulan bir hidrofobik yüzeye baglanir (Colledge ve Scott, Trends Cell Biol. 1999; 62216). Bu nedenle, insan Rlloi için dimerizasyon alani ve AKAP baglanma alani, ayni N-terminal 44 amino asit dizilimi içinde konumlanir (Newlon v.d., Nat. Struct. Biol. 1999;6:222; Newlon v.d., EMBO J.

Bundan sonra A ve B olarak adlandirilacak olan ve disülfit baglarin olusumunu kolaylastirmak için stratejik pozisyonlarda hem DDD hem de AD'ye sistein rezidüleri eklenmesi yoluyla kararli bir sekilde baglanmis bir yapiya da kilitlenebilen herhangi iki varligin kovalent olmayan bir komplekse kenetlenmesi için mükemmel bir baglayici modülü çifti olarak belirli bir amino asit diziliminin AD'si ve insan Rlloi DDD'sinden faydalanan bir platform teknolojisi gelistirdik. varligi, bir A öncülüne bir DDD dizilimi baglanmasi yoluyla yapilandirilir ve bundan sonra a olarak anilacak olan birinci bir bilesen ortaya çikar. DDD dizilimi, bir dimerin spontan olusumunu gerçeklestirecegi için, A, a21den olusacaktir. B varligi, bir B öncülüne bir AD dizilimi baglanmasi yoluyla yapilandirilir ve bundan sonra b olarak anilacak olan ikinci bir bilesen ortaya çikar. a2 içinde yer alan DDD*nin dimerik motifi, b içinde yer alan AD dizilimine baglanma için bir kenetlenme bölgesi olusturacaktir ve böylece a2b*den olusan ikili, trimerik bir kompleks olusturmak için 32 ve b'nin kolayca birlesmesini kolaylastiracaktir. Bu baglanma olayi, disülfit köprüler araciligiyla iki varligin kovalent olarak sabitlenmesi için müteakip bir reaksiyon ile geri çevrilemez hale getirilir ve baslangiçtaki baglanma etkilesimleri, hem DDD hem de AD üzerine yerlestirilen reaktif tiyol gruplarini bölgeye özgü baglanma için yakina getirmesi gerektigi için, bu baglanma olayi etkili lokal konsantrasyon ilkesine göre çok verimli bir sekilde gerçeklesir (Chimura v.d., Proc.

DDD ve AD, iki öncülün fonksiyonel gruplarindan uzaga eklenerek, bu bölgeye özgü baglanmalarin, iki öncülün orijinal etkinliklerini korumasi da beklenir. Bu yaklasim, niteligi itibariyle modülerdir ve potansiyel olarak, peptitler, proteinler, antikorlar, antikor parçalari ve çok genis bir etkinlik araligina sahip baska efektör gruplar dahil olmak üzere, çok çesitli maddelere bölgeye özgü ve kovalent olarak baglanma için uygulanabilir. AD ve DDD konjuge efektörleri yapilandirmaya yönelik füzyon proteini yöntemi kullanilarak, bir DNL yapisina neredeyse her türlü protein ya da peptit eklenebilir. Ancak, bu teknik, sinirlayici degildir ve baska konjugasyon yöntemleri de kullanilabilir.

Füzyon proteinleri üretmek için, nükleik asit sentezi, melezleme ve/veya ilgili bir füzyon proteinini kodlayan sentetik çift sarmalli bir nükleik asit üretmek için amplifikasyon dahil olmak üzere çesitli yöntemler bilinmektedir. Bu tür çift sarmalli nükleik asitler, standart moleküler biyoloji teknikleri ile füzyon proteini üretimi için ekspresyon vektörlerine eklenebilir (ör., bkz: Sambrook v.d., Molecular Cloning, A ve/veya DDD grubu, bir antikor ya da parçasi gibi bir efektör protein ya da peptidin N-terminal ya da C-terminal ucuna eklenebilir. Ancak, teknikte yetkin kisiler, bir AD ya da DDD grubunun bir efektör grubuna baglanma bölgesinin, efektör grubunun kimyasal niteligine ve fizyolojik etkinligine dahil olan efektör grubunun parça(lar)ina bagli olarak degisiklik gösterebilecegini takdir edecektir. Çesitli efektör gruplarinin bölgeye özgü baglanmasi, çift degerlikli çapraz baglanma reaktifleri ve/veya baska kimyasal konjugasyon teknikleri gibi, teknikte bilinen yöntemler kullanilarak gerçeklestirilebilir.

Tercih edilen bir somut örnekte, füzyon proteinleri, örnegin asagidaki çalismalarda açiklanan kenetleme ve kilitleme (DNL) teknikleri ile düzenlenebilir: Rossi EA, v.d., Sentetik kompleksler olusturmak için DNL yönteminde kullanilabilen örnek DDD ve AD dizilimleri asagida açiklanmistir.

SHIQlPPGLTELLQGYTVEVLRQQPPDLVEFAVEYFTRLREARA (SEQ lD No:1) CGHlQlPPGLTELLQGYTVEVLRQQPPDLVEFAVEYFTRLREARA (SEQ ID No:2) QIEYLAKQIVDNAIQQA (SEO ID No:3) CGQlEYLAKQIVDNAlQQAGC (SEQ lD No:4) DNL Dizilim Varyantlari Alternatif somut örneklerde, AD ve/veya DDD gruplarinin dizilim varyantlari, DNL komplekslerinin yapisinda kullanilabilir. AD ve DDD alanlarinin yapi-fonksiyon iliskileri, arastirma konusu olmustur. (Or., bkz: Burns-Hamuro v.d., 2005, Protein Ornegin, Kinderman v.d. (2006), AD-DDD baglanma etkilesiminin kristal yapisini incelemis ve insan DDD diziliminin, asagida SEQ lD NO: 1'de alti çizilen, dimer olusumu ya da AKAP baglanmasinda önemli olan birtakim korunmus amino asit rezid'uleri içerdigi sonucuna varmistir. (Bkz. Sekil 1, Kinderman v.d., 2006.) Teknikte yetkin kisiler, DDD diziliminin dizilim varyantlarinin tasariminda, alti çizili rezid'ulerden herhangi birinin degistirilmesinden kaçinilirken, dimerizasyon ve AKAP baglanmasi için daha az kritik olan reziduler için konservatif amino asit sübstitüsyonlari yapilabilecegini takdir edecektir.

Protein kinaz A'dan insan DDD dizilimi SHIQlPPGLTELLQGYTVEVLRQQPPDLVEFAVEYFTRLREARA (SEO lD NO:1) Alto v.d. ( olarak adlandirilan bir RII seçici AD dizilimi tasarlamak için çesitli AKAP proteinlerinin AD diziliminin biyoinformatik bir analizini yapmistir. AKAPIS dizilimi.

PKA'ya AKAP baglanmasinin bir peptit antagonisti olarak tasarlanmistir. AKAP-IS diziliminde, sübstitüsyonlarin DDDiye baglanmayi azaltma egiliminde oldugu rezid'uler, SEQ lD NO:3”te alti çizilerek vurgulanmistir.

AKAP-IS DIZILIMI QlEYLAKQIVDNAIQQA (SEQ ID No:3) Benzer sekilde, Gold (2006), Rl izoformuna kiyasla PKA'nin Rll izoformu için bes kat daha yüksek seçicilik gösteren bir Süper AKAP-IS dizilimi (SEQ ID NO: 5) gelistirmek için kristalografi ve peptit taramasi kullanmistir. Alti çizili rezidüler, AKAP-IS dizilimine göre, Rlloi'nin DDD grubuna baglanmasini artiran amino asit sübstit'üsyonlarinin pozisyonlarini göstermektedir. Bu dizilimde, N-terminal Q rezid'usü, rezid'u numarasi 4 olarak ve C-terminal A rezid'üs'ü ise rezid'ü numarasi olarak numaralandirilmistir. Rlloi için afiniteyi etkilemek için sübstit'usyon 2006). Belirli alternatif somut örneklerde, Süper AKAP-IS diziliminin, DNL yapilari hazirlamak için AKAP-IS AD grubu için sübstitüe edilebilecegi düsünülmektedir.

AKAP-IS AD için sübstitüe edilebilen baska alternatif dizilimler, SEQ ID NO: 6-8'de gösterilmektedir. AKAP-lS dizilimine göre s'übstitüsyonlarin alti çizilmistir. AKAP-IS diziliminde (SEQ ID NO: 3) oldugu gibi, AD grubunun, SEQ ID NO: 4'te gösterildigi sistein de içrebilecegi tahmin edilmektedir.

SüperAKAP-IS QlEYVAKQIVDYAIHQA (SEQ ID No:5) Alternatif AKAP dizilimleri QlEYKAKQIVDHAlHQA (SEQ ID No:6) QlEYHAKQlVDHAlHQA (SEQ ID No:7) QlEYVAKQIVDHAlHQA (SEQ ID No:8) Stokka v.d. (2006), SEQ ID NO: 9-11'de gösterilen PKA'ya AKAP baglanmasinin peptit rakiplerini de gelistirmistir. Peptit antagonistleri, as Ht31 (SEQ ID No:9), RIAD (SEQ ID NO:10) ve PV-38 (SEQ ID NO:11) olarak tasarlanmistir. Ht-31 peptit, PKA'nin RII izoformu için daha büyük afinite gösterirken, RIAD ve PV-38, Rl için daha yüksek afinite göstermistir.

DLlEEAASRIVDAVlEQVKAAGAY (SEQ ID No:9) LEQYANQLADQIlKEATE (SEQ ID NO:10) FEELAWKIAKMlWSDVFQQC (SEQ ID NO:11) Hundsrucker v.d. (2006), PKAiya AKAP baglanmasi için, PKA'nin RII formunun DDDisine 0,4 nM kadar düsük bir baglanma sabitine sahip baska peptit rakipleri gelistirmistir. Çesitli AKAP antagonistik peptitlerinin dizilimleri, Hundsrucker v.d. çalismasinda Tablo 1rde verilmistir. Farkli AKAP proteinlerinin AD alanlari arasinda yüksek oranda korunan rezid'üler, asagida AKAP IS dizilimine atifla alti çizilerek gösterilmistir. Bu rezid'uler, C-terminal alanin rezid'üs'u ilavesiyle, Alto v.d. (2003) tarafindan gözlemlenenlerle aynidir. (Bkz: SEKIL 4, Hundsrucker v.d. (2006)). RII DDD dizilimi için özellikle yüksek afinitelere sahip olan peptit antagonistlerinin dizilimleri, SEO ID NO: 12-14ite gösterilmistir.

QlEYLAKQIVDNAlQQA (SEO ID No:3) AKAP7ö-wt-pep PEDAELVRLSKRLVENAVLKAVQQY (SEO ID NO:12) AKAP7ö-L304T-pep PEDAELVRTSKRLVENAVLKAVQQY (SEQ ID NO:13) AKAP7ö-L308D-pep PEDAELVRLSKRDVENAVLKAVQQY (SEQ ID NO:14) Carr v.d. (2001), insan ve insan disi proteinlerden farkli AKAP-baglanma DDD dizilimleri arasindaki dizilim benzerligi derecesini incelemis ve DDD dizilimlerinde, farkli DDD gruplari arasinda en yüksek oranda korunmus görünen rezid'uleri belirlemistir. Bunlar, asagida, SEQ ID NO: 1'in insan PKA Rlloi DDD dizilimine atifla alti çizilerek gösterilmistir. Ozellikle korunan reziduler. ayrica italik olarak gösterilmistir. Rezid'uler, Kinderman v.d. (2006) tarafindan AKAP proteinlerine baglanma için önemli oldugu belirtilenler ile örtüsmektedir ancak onlarla ayni degildir.

SHIQlPPGLTELLOGYTVEVLRQQPPDLVEFAVEYFTRLREARA (SEQ lD No:1) Teknikte yetkin kisiler, genel olarak, farkli proteinlerden DDD ve AD dizilimlerinde yüksek oranda korunan amino asit dizilimlerinin, amino asit s'übstitüsyonlari yaparken sabit kalmasi tercih edilebilecek olanlar oldugunu ve daha az korumali rezidülerin ise bu belgede tarif edilen AD ve/veya DDD dizilimlerinin dizilim varyantlarini 'üretmek için daha kolay bir sekilde çesitlendirilebilecegini takdir edecektir.

Amino Asit S'übstitüsyonlari Alternatif somut örneklerde, açiklanan yöntemler ve terkipler, bir ya da daha fazla sübstitüe edilmis amino asit rezidüsüne sahip olan proteinler ya da peptitlerin üretimini ve kullanimini içerebilir. Ornegin, DNL yapilari olusturmak için kullanilan DDD ve/veya AD dizilimleri, yukarida anlatilan sekilde modifiye edilebilir.

Teknikte yetkin kisiler, genel olarak, amino asit sübstitüsyonlarinin tipik olarak, bir amino asidin, nispeten benzer &özelliklere sahip olan baska bir amino asit ile degistirilmesini içerdigini takdir edecektir (yani, konservatif amino asit sübstitüsyonlari). Çesitli amino asitlerin özellikleri ve amino asit sübstit'üsyonunun protein yapisi ve fonksiyonu 'üzerindeki etkisi, teknikte kapsamli çalismalar ve bilgilerin konusu olmustur.

Ornegin, amino asitlerin hidropatik indeksi dikkate alinabilir (Kyte & Doolittle, 1982, proteinin ikincil yapisina katkida bulunur ve bu da proteinin baska moleküller ile etkilesimini tanimlar. Her bir amino aside, hidrofobikligi ve yük özelliklerine bagli olarak bir hidropatik indeks atanir (Kyte & Doolittle, 1982); bunlar söyledir: izolbsin asparajin (-3,5); Iizin (-3,9) ve arjinin (-4,5). Konservatif sübstit'üsyonlar yapilirken, hidropatik indeksleri ± 2 dahilinde olan amino asitlerin kullanimi tercih edilir, ± dahilinde olanlar daha çok tercih edilir ve ± 0,5 dahilinde olanlar daha da çok tercih Amino asit sübstitüsyonu, amino asit rezidüsünün hidrofilisitesini de dikkate alabilir (ön, ABD Pat. No. 4,554,101). Amino asit rezidi'ilerine hidrofilisite degerleri atanmistir: arjinin (+3,0); Iizin (+3.,0); aspartat (+3,0); glutamat (+3,0); serin (+O,3); (-1,8); tirozin (-2,3); fenilalanin (-2,5); triptofan (-3,4). Amino asitlerin benzer hidrofilisiteye sahip baskalari ile degistirilmesi tercih edilir.

Diger hususlar, amino asit yan zincirinin boyutunu içerir. Örnegin, bir amino asidin, glisin ya da serin gibi kompakt bir yan zincire sahip bir amino asit ile ya da ör., triptofan a da tirozin gibi yigin bir yan zincire sahip bir amino asit ile degistirilmesi genel olarak tercih edilmez. Çesitli amino asit rezidülerinin protein ikincil yapisi rezidülerinin, protein alanlarinin alfa-sarmal, beta-katman ya da ters dönüslü ikincil yapiyi benimseme egilimi üzerindeki etkisi belirlenmistir ve teknikte bilinmektedir Bu tür hususlara ve kapsamli ampirik çalismaya göre, konservatif amino asit sübstitüsyonlarinin tablolari olusturulmustur ve teknikte bilinmektedir. Ornegin: arginin ve Iizin; glutamat ve aspartat; serin ve treonin; glutamin ve asparagin; ve valin, Iösin ve izol'osin. Alternatif olarak: Ala (A) Ieu; ile, val; Arg (R) gln, asn, Iys; Asn (N) his, asp, Iys, arg, gln; Asp (D) asn, glu; Cys (C) ala, ser; Gin (Q) glu, asn; Glu (E) gln, asp; Gly (G) ala; His (H) asn, gln, Iys, arg; Ile (I) val, met, ala, phe, leu; Leu (L) val, met, ala, phe, ile; Lys (K) gln, asn, arg; Met (M) phe, ile, Ieu; Phe (F) trp, phe, thr, ser; Val (V) ile, leu, met, phe, ala.

Amino asit sübstitüsyonlari için diger hususlar, rezidünün bir proteininin içinde konumlaniyor olup olmadigi ya da çözücüye maruz birakip birakilmadigidir. Dahili rezidüler için, konservatif sübstitüsyonlar asagidakileri içerecektir: Asp ve Asn; Ser ve Thr; Ser ve Ala; Thr ve Ala; Ala ve Gly; Ile ve Val; Val ve Leu; Leu ve Ile; Leu ve Met; Phe ve Tyr; Tyr ve Trp. (Or., bkz: rockefelleredu adresinde PROWL web sitesi) Çözücüye maruz birakilmis rezidüler için, konservatif sübstitüsyon sunlari içerecektir: Asp ve Asn; Asp ve Glu; Glu ve Gln; Glu ve Ala; Gly ve Asn; Ala ve Pro; Ala ve Gly; Ala ve Ser; Ala ve Lys; Ser ve Thr; Lys ve Arg; Val ve Leu; Leu ve ile; ile ve Val; Phe ve Tyr. (Yukarida belirtilen çalisma) Amino asit sübstitüsyonlarinin seçimine yardim etmek için, PAM25O puanlama matrisi, Dayhoff matrisi, Grantham matrisi, McLachlan matrisi, Doolittle matrisi, Henikoff matrisi, Miyata matrisi, Fitch matrisi, Jones matrisi, Rao matrisi, Levin matrisi ve Risler matrisi gibi çesitli matrisler yapilandirilmistir (Yukarida belirtilen çalisma).

Amino asit sübstitüsyonlari belirlenirken, pozitif yüklü rezidüler (ör, His, Arg, Lys) ve negatif yüklü rezidüler ('or., Asp, Glu) arasinda iyonik baglar (tuz köprüleri) olusumu ya da yakin sistein rezidüleri arasinda disülfit baglarin olusumu gibi moleküller arasi ya da molekül içi baglarin varligi da dikkate alinabilir. kodlanmis bir protein diziliminde herhangi bir amino asidi, herhangi bir baska amino asit için sübstitüe etme yöntemleri teknikte bilinmektedir ve yetkin kisiler için, örnegin bölgeye yönelik mutagenez teknigi ile ya da bir amino asit sübstitüsyonu kodlayan ve bir ekspresyon vektörü yapisinda birlestiren oligonükleotitlerin sentezi ve düzenlenmesi ile rutin bir deney konusudur.

Avimerler Belirli somut örneklerde, bu belgede tarif edilen baglanma gruplari, bir ya da daha fazla avimer dizilimi içerebilir. Avimerler, afiniteleri ve çesitli hedef moleküller için spesifisiteleri bakimindan antikorlara benzeyen bir baglanma proteini sinifidir.

Bunlar, in vitro ekson karistirma ve faj görüntüleme ile insan ekstraselüler reseptör Silverman v.d., 2006, Nat. Biotechnol. 24:220.) Ortaya çikan çok alanli proteinler, tek epitoplu baglanma proteinlerine göre gelismis afinite (bazi durumlarda sub- nanomolar) ve spesifisite sergileyebilen birden çok bagimsiz baglanma alani içerebilir. (Yukarida belirtilen çalisma) Çesitli somut örneklerde, avimerler, örnegin, istemlerin yöntemleri ve terkiplerinde kullanim için DDD ve/veya AD dizilimlerine eklenebilir. Avimerleri yapilandirma ve kullanma yöntemleri ile ilgili ilave ayrintilar Faj Görüntüleme istemlerin terkipleri ve/veya yöntemlerinin belirli somut örnekleri, çesitli hedef moleküller, hücreler ya da dokularin baglayici peptitleri ve/veya peptit mimetikleri ile ilgili olabilir. Baglayici peptitler, sinirlama olmaksizin faj görüntüleme teknigi dahil olmak üzere teknikte bilinen herhangi bir yöntem ile belirlenebilir. Çesitli faj görüntüleme yöntemleri ve çesitli peptit popülasyonlarini üretme teknikleri, teknikte kütüphanesi hazirlama yöntemlerini açiklamaktadir. Faj görüntüleme teknigi, bakteriyofajin genetik olarak manipüle edilmesini, böylece küçük peptitlerin, bunlarin yüzeylerinde eksprese edilebilmesinin saglanmasini içerir (Smith and 21:228-257). Peptitlere ek olarak, tek zincirli antikorlar gibi büyük protein alanlari da faj parçaciklarinin yüzeyinde görüntülenebilir (Arap v.d., 1998, Science 279z377-380).

Belirli bir organ, doku, hücre tipi ya da hedef molekül için seçici olan hedefleyici amino asit dizilimleri, kaydirma yoluyla izole edilebilir (Pasqualini ve Ruoslahti, 162). Kisacasi, varsayilan hedefleyici peptitleri içeren bir faj kütüphanesi, intakt bir organizmaya ya da izole edilmis organlara, dokulara, hücre tiplerine ya da hedef moleküllere uygulanir ve bagli faji içeren örnekler toplanir. Bir hedefe baglanan faj, bir hedef organ, doku, hücre tipi ya da hedef molekülden ayrilabilir ve ardindan konak bakteride büyütülerek amplifiye edilebilir.

Bazi somut örneklerde, faj, kaydirma turlari arasinda konak bakterilerde çogaltilabilir. Bakteriler, faj tarafindan parçalanmak yerine, belirli bir eki gösteren birden çok faj kopyasi salgilayabilir. istenirse, amplifiye edilen faj, hedef organlar, dokular, hücre tipleri ya da hedef moleküle tekrar maruz birakilabilir ve ilave kaydirma turlari için toplanabilir. Bir seçici ya da spesifik baglayicilar popülasyonu elde edilene kadar birden çok kaydirma turu gerçeklestirilebilir. Peptitlerin amino asit dizilimi, faj genomunda hedefleyici peptit ekine karsilik gelen DNA'nin sekanslanmasi yoluyla belirlenebilir. Belirlenen hedefleyici peptit, daha sonra, standart protein kimyasi teknikleri ile sentetik bir peptit olarak üretilebilir (Arap v.d., 1998, Smith v.d., 1985).

Bazi somut örneklerde, arka plan faj baglanmasini daha da azaltmak için bir çikarma protokolü kullanilabilir. Çikarmanin amaci, Ilgilenilen hedef disinda hedeflere baglanan fajin kütüphaneden çikarilmasidir. Alternatif somut örneklerde, faj kütüphanesi, bir kontrol hücresi, dokusu ya da organi için önden taranabilir.

Ornegin, tümör baglayici peptitler, bir kütüphanenin bir kontrol normal hücre çizgisi için önden taranmasi sonrasinda belirlenebilir. Çikarma isleminden sonra, kütüphane, ilgili molekül, hücre, doku ya da organ için taranabilir. Ornegin ABD çikarma protokollerinin baska yöntemleri de bilinmektedir ve bu yöntemler, istemlerin yöntemlerinin uygulamasinda kullanilabilir.

Aptamerler Belirli somut örneklerde, kullanilabilecek bir hedefleyici grup, bir aptamer olabilir.

Aptamerlerin baglanma özelliklerini yapilandirma ve belirleme yöntemleri teknikte ABD Patent dokümanlarinda tarif edilmektedir. Ilgili özel hedeflere baglanan aptamerleri hazirlama ve tarama yöntemleri iyi bilinmektedir; Örnegin ABD Pat. No.

Aptamerler, sentetik, rekombinant ve saflastirma yöntemleri dahil olmak üzere bilinen herhangi bir yöntemle hazirlanabilir ve tek baslarina ya da ayni hedefe özgü baska ligandlar ile birlikte kullanilabilir. Genel olarak, spesifik baglanmayi gerçeklestirmek için yaklasik 3 nükleotit, tercihen en az 5 nükleotit gerekir. 10 bazdan kisa dizilimli aptamerler elverisli olabilir ama yine de 10, 20, 30 ya da 40 n'ukleotitli aptamerler tercih edilir.

Aptamerler, klasik DNA ya da RNA molekülleri gibi izole edilebilir, sekanslanabilir ve/veya amplifiye edilebilir. Alternatif olarak, ilgili aptamerler, modifiye edilmis oligomerler içerebilir. Aptamerlerde normal olarak bulunan hidroksil gruplarindan herhangi biri, fosfonat gruplari, fosfat gruplari ile degistirilebilir, standart bir koruma grubu ile korunabilir ya da baska nükleotitlere ilave baglantilar hazirlamak için etkinlestirilebilir ya da kati desteklere konjuge edilebilir. Bir ya da daha fazla fosfodiester baglantisi, P(O)S, P(O)NR2, P(O)R, P(O)OR', CO ya da CNR2 ile degistirilmis P(O)O gibi alternatif baglanti gruplari ile degistirilebilir, ki burada R, H araciligiyla komsu nükleotitlere baglanabilir. Bir oligomerdeki t'um baglantilar ayni olmak zorunda degildir.

Konjugasyon Protokolleri Tercih edilen konjugasyon protokolü, nötr ya da asidik pH degerinde kolay olan bir tiyoI-maleimide, bir tiyoI-vinilsulfone, bir tiyoI-bromoasetamit ya da bir tiyol- iyodoasetamit reaksiyonuna dayanir. Bu, konjugasyon için, örnegin aktif esterler kullanilirken gereken yüksek pH kosullarina olan ihtiyaci ortadan kaldirir. Ayrica, örnek konjugasyon protokollerinin ayrintilari, asagida Ornekler kisminda tarif edilmistir.

Terapötik Tedavi Baska bir yönde, bulus, istemlerde tanimlanan bulusun konjugati ile ilgili olup, bu konjugat, terapötik konjugatin terapötik olarak etkili bir miktarinin bir denege tatbik edilmesini içeren, bir denegi tedavi etme yönteminde kullanima yöneliktir. Bu belgede tarif edilen terapötik konjugatlar ile tedavi edilebilecek hastaliklar arasinda, sinirlama olmaksizin, B hücresi habislikleri (örnegin non-Hodgkin Patent No. 6.183.744), endodermal türevli sindirim sistemi epiteli adenokarsinomalari, gögüs kanseri, küçük hücreli olmayan akciger kanseri gibi kanserler ve diger karsinomlar, sarkomalar, gliyal tümörler, miyeloid lösemiler, etc. yer alir. Ozellikle, ör., bir gastrointestinal, akciger, gögüs, prostat, yumurtalik, testis, beyin ya da Ienfatik tümör, bir sarkoma ya da bir melanoma gibi habis bir kati tümör ya da hematopoietik neoplazm tarafindan üretilen ya da onunla iliskili olan, ör., bir onkofetal antijen gibi bir antijene karsi antikorlar avantajli bir sekilde kullanilir. Bu tür terapötikler, hastalik durumuna ve konjugatin tolere edilebilirligine bagli olarak bir kez ya da tekrarli olarak verilebilir ve ayni zamanda, ameliyat, harici radyasyon, radyoimmünoterapi, immünoterapi, kemoterapi, antisens terapi, interferans RNA terapisi, gen terapisi ve benzerleri gibi baska terapötik modeller ile birlikte de optimal bir sekilde kullanilabilir. Her bir kombinasyon, tümör tipi, safhasi, hastanin durumu ve önceki tedavisi ve hekim tarafindan degerlendirilen baska faktörlere uyarlanacaktir.

Bu belgede kullanildigi üzere, “denek” terimi, insanlar dahil olmak üzere, memeliler dahil her türlü hayvani (yani, omurgalilar ve omurgasizlar) ifade eder.

Terimin belirli bir yas ya da cinsiyetle sinirlanmasi amaçlanmamaktadir. Bu nedenle, erkek ya da disi eriskin ve yeni dogmus denekler ile fetüsler, terimin kapsaminda girmektedir.

Tercih edilen bir somut örnekte, Mu-9 MAb içeren terapötik konjugatlar, 6.962.702 ve 7.387.772 sayili ABD patent dokümanlarinda açiklanan sekilde kolorektal kanser ve pankreas ve yumurtalik kanserlerinin tedavi edilmesi için kullanilabilir. sayili ABD patent dokümanlarinda açiklanan pankreas kanserinin tedavi edilmesi için kullanilabilir.

Baska bir tercih edilen somut örnekte, RS7 MAb içeren terapötik konjugatlar (epitel glikoprotein-1 [EGP-1] antijen), 7.238.785 sayili ABD Patent dokümaninda açiklanan sekilde, akciger, mide, idrar kesesi, gögüs, yumurtalik, rahim ve prostat karsinomlari gibi karsinomlari tedavi etmek için kullanilabilir.

Tercih edilen baska bir somut örnekte, anti-AFP MAb içeren terapötik konjugatlar, hepatoselüler karsinom, germ hücresi tümörleri ve diger AFP üreten tümörleri, 7.300.655 sayili ABD Patent dokümaninda açiklanan sekilde hümanize edilmis, kimerik ve insan antikor formlari kullanarak tedavi etmek için kullanilabilir.

Tercih edilen baska bir somut örnekte, anti-tenassin antikorlari içeren terapötik konjugatlar, hematopoietik ve kati tümörleri tedavi etmek için kullanilabilir ve tenassin'e karsi antikorlar içeren konjugatlar, kati tümörleri, tercihen gliyoblastomlar gibi beyin kanserlerini tedavi etmek için kullanilabilir.

Tercih edilen bir somut örnekte, insan hastaliginin tedavisinde kullanilan antikorlar, antikorlarin insan ya da hümanize edilmis (CDR greftli) versiyonlaridir; ama antikorlarin mürin ve kimerik versiyonlari da kullanilabilir. Immün tepkileri en aza indirmek için teslim ajanlari olarak en çok ayni tür IgG molekülleri tercih edilir.

Bu, tekrarli tedaviler düsünüldügünde özellikle önemlidir. Insanlar için, bir insan ya da hümanize edilmis lgG antikorunun, hastalarda bir anti-lgG immün tepkisi olusturma ihtimali düsüktür. hLL1 ve hLL2 gibi antikorlar, hedef hücreler üzerinde içsellesen antijene baglanma sonrasinda hizli bir sekilde içsellesir ki bu da kemoterapötik ilacin, hücrelerde de hizli içsellestigi anlamina gelir. Bununla birlikte, seçici terapiyi gerçeklestirmek için daha yavas içsellesme oranlarina sahip olan antikorlar da kullanilabilir.

Patojenlere karsi antikorlar bilindigi için, terapötik konjugatlarin patojenlere karsi kullanilabilecegi açiklanmistir. Ornegin, bakteri, rickettsia, mikoplazma, protozoa, mantar ve virüsler gibi patojenlerin neden oldugu viral, bakteriyel, fungal ve parazitik enfeksiyonlar dahil olmak üzere enfeksiyonlu lezyonlar ve antijenler ve bu tür mikroorganizmalar ile iliskili ürünler tarafindan üretilen ya da bunlarla iliskili olan markerleri spesifik olarak baglayan antikorlar ve antikor parçalari, diger çalismalarin yani sira, su çalismalarda açiklanmistir: Hansen v.d., ABD Pat. No. anilan çalisma. Tercih edilen bir somut örnekte, yukaridaki patojenler asagidakilerden olusan grup içinden seçilir: 6.440.416 sayili ABD Patent dokümaninda açiklandigi üzere; HlV virüsü, Mycobacterium tuberculosis, Streptococcus agalactiae, methicillin-resistant Stafilococcus aureus, Legionella pneumophilia, Streptococcus pyogenes, Esoherichia coli, Neisseria gonorrhosae, Neisseria meningitidis, Pneumococous, Cryptococcus neoformans, Histoplasma capsulatum, Hemophilis influenzae B, Treponema pallidum, Lyme disease spirochetes, Pseudomonas aeruginosa, Mycobacterium leprae, Brucella abortus, kuduz virüsü, grip virüsü, sitomegalovirüs, herpes simplex virüsü I, herpes simplex virüsü ll, insan serum parvo benzeri virüs, respiratuar sinsisyal virüs, varicella- zoster virüsü, hepatit B virüsü, hepatit C virüsü, kizamik virüsü, adenovirüs, insan T hücresi lösemi virüsleri, Epstein-Barr virüsü, mürin lösemi virüsü, kabakulak virüsü, veziküler stomatit virüsü, sindbis virüsü, Ienfositik koriyomenenjit virüsü, sigil virüsü, mavi dil virüsü, Sendai virüsü, kedigiller lösemi virüsü, reo virüs, polio virüsü, simian virüsü 40, fare meme tümörü virüsü, denge virüsü, kizamikçik virüsü, Bati Nil virüsü, Plasmodium falciparum, Plasmodium vivax, Toxoplasma gondii, Trypanosoma rangeli, Trypanosoma cruzi, Trypanosoma rhodesiensei, Trypanosoma brucei, Schistosoma mansoni, Schistosoma japanicum, Babesia bovis, Eimeria tenella, Onchocerca volvulus, Leishmania tropica, Trichinella spiralis, Theileria parva, Taenia hydatigena, Taenia ovis, Taenia saginata, Echinococcus granulosus, Mesocestoides corti, Mycoplasma arthritidis, M. hyorhinis, M. orale, M. arginini, Acholeplasma laidlawii, M. salivarium ve M. pneumoniae.

Bu belgede açiklanan sekilde, anti-gp120 ve bu tür baska anti-HIV antikorlari içeren ilaç konjugatlarinin, AIDS hastalarinda HlV için terapötik olarak kullanilabilecegi ve Mycobacterium tuberculosis antikorlarinin ilaç konjugatlarinin, ilaçla kirilan tüberküloz için terapötik olarak faydali oldugu açiklanmistir. Anti- gp ve Pseudomonas ekzootoksin gibi bir toksinin füzyon proteinleri, antiviral özellikleri bakimindan incelenmistir (Van Oigen v.d., J Drug Target, 5:75-91, 1998) AIDS hastalarinda HIV enfeksiyonunu tedavi etme denemeleri, muhtemelen yetersiz etkililik ya da kabul edilemez konak toksisitesi nedeniyle basarisiz olmustur. Bu bulusun ilaç konjugatlari, avantajli bir sekilde protein toksinlerin bu tür toksik yan etkilerini göstermemektedir ve bu nedenle AlDS hastalarinda HlV enfeksiyonunun tedavi edilmesinde avantajli bir sekilde kullanilmaktadir. Bu ilaç konjugatlari, tek baslarina ya da bu tür hastalara tek basina verildiklerinde etkili olan baska antibiyotikler ya da terapötik ajanlar ile birlikte verilebilir. Aday anti-HIV antikorlari, Johansson v.d. (AIDS. 3 Ekim (Viyana, Avusturya) tarafindan tarif edilen ve satilan ve ayni zamanda 5.831.034 1773-9) tarafindan tarif edilen anti-HIV antikorlarini kapsar. HIV için tercih edilen bir hedefleyici ajan, direncin üstesinden gelmek için bu antikorlarin çesitli kombinasyonlaridir.

Bu bulusun tercih edilen somut örneklerinin terapötik konjugatlari kullanilarak tedavi edilebilecek diger hastaliklara örnek olarak, asagidakiler dahil olmak üzere immün bozukluk hastaligi ve ilgili otoimmün hastaliklar verilebilir: 1 Mart 2002 tarihinde verilmis olan (süresi dolmustur), 60/360.259 seri numarali ABD Geçici Basvurusunda açiklanan sekilde; Sinif III otoimmün hastaliklar; örnegin immün aracili trombositopeniler, örnegin akut idiyopatik trombositopenik purpura ve kronik idiyopatik trombositopenik purpura, dermatomiyosit, Sjögren sendromu, multipl skleroz, Sydenham kore, miyasteni gravis, sistemik Iupus eritematoz, Iupus nefrit, romatik ates, poliglandular sendromlar, bülloz pemfigoid, diabetes mellitus, Henoch-Schonlein purpura, post-streptokokkal nefrit, eritema nodosum, Takayasu artiriti, Addison hastaligi, romatoid artrit, sarkoyidoz, ülseratif kolit, eritema multiform, lgA nefropati, poliarteritis nodosa, ankilozan spondilit, Goodpasture sendromu, tromboangitis obliterans, Sjogren sendromu, primer biliyer siroz, Hashimoto tiroidi, tirotoksikoz, skleroderma, kronik aktif hepatit, romatoid artrit, polimiosit/dermatomiyosit, polikondrit, pemfigus vulgaris, Wegener granulomatozu, membranöz nefropati, amiyotropik lateral skleroz, tabes dorsalis, dev hücreli arterit/ polimiyalji, habis anemi, hizli ilerleyen glomerulonefrit ve fibrozan alveolit ve ayni zamanda gençlik diyabeti. Bu hastaliklarda faydali olan tipik antikorlara örnek olarak, sinirlama olmaksizin, HLA-DR antijenleri, B hücresi ve plazma hücresi MUC1, la, HM, lL-6, lL-17. Bu otoimmün hastaliklarin çogu, anormal B hücresi popülasyonlari tarafindan olusturulan oto-antikorlar tarafindan gerçeklestirildigi için, bu B hücrelerinin, bu belgede tarif edilen antikor-terapötik ajan konjugatlarini içeren terapötik konjugatlar tarafindan tüketilmesi, özellikle de B hücresi antikorlarinin belirli durumlarda HLA-DR antikorlari ve/veya T hücresi antikorlari (anti-TAC antikoru gibi, bir antijen olarak IL-2Jyi hedef alanlar dahil olmak üzere) ile birlestirilmesi durumunda otoimmün hastalik terapisinin tercih edilen bir y'ontemidir. Tercih edilen bir somut 'örnekte, anti-B hücresi, anti-T hücresi ya da anti-makrofaj ya da otoimmün hastaliklari olan hastalarin tedavisinde kullanilabilen bu tür baska antikorlar da söz konusu otoimmün hastaliklara dahil olan konak tepkilerini kontrol altina almak için daha etkili terap'otiklere yol açacak sekilde konjuge edilebilir ve tek baslarina ya da TNF inhibitörleri ya da TNF antikorlari, konjuge olmayan B ya da T hücresi antikorlari ve benzerleri gibi baska terapötik ajanlar ile birlikte verilebilir.

Tercih edilen bir somut örnekte, çok degerlikli, multispesifik ya da çok degerlikli, monospesifik antikorlar kullanilarak hücrelere ve patojenlere daha etkili eklenme saglanabilir. Bu tür çift degerlikli ve bispesifik antikorlarin örnekleri, 7.387.772, Bu çok degerlikli ya da multispesifik antikorlar, birden çok antijen hedefi ve hatta ayni antijen hedefinin birden çok epitopunu eksprese eden ancak çogunlukla hücrede ya da patojende tek bir antijen hedefinin yetersiz ekspresyonu ya da mevcudiyeti nedeniyle antikor hedeflemesinden ve immünoterapi için yeterli baglanmadan kaçan kanserler ve enfeksiyonlu organizmalarin (patojenlerin) hedeflenmesinde `özellikle tercih edilir. Söz konusu antikorlar, birden çok antijen ya da epitopu hedefleyerek, hedef üzerinde daha yüksek baglanma ve kalma süresi gösterir, böylece bu bulusta hedeflenen ilaç ile daha yüksek Çözünme saglar.

Tercih edilen baska bir somut örnekte, bu bulusun kamptotesin konjugati ile birlikte kullanilan bir terapötik ajan, bir ya da daha fazla izotop içerebilir. Hastalikli dokuyu tedavi etmek için faydali olan radyoaktif izotoplar, sinirlama olmaksizin sunlari 211Pb. Terap'otik radyonüklit, bir Auger yayici için tercihen, 20 ila 6.000 kEV keV araliginda ve alfa yayici için 4.000 ila 6.000 keV araliginda bir bozunma enerjisine sahiptir. Faydali beta parçacigi yayan nüklitlerin maksimum bozunma enerjileri tercihen 20 ila 5.000 keV arasinda, daha çok tercih edilen sekilde 100 ila Ayni zamanda, Auger yayan parçaciklar ile büyük oranda bozunan radyon'uklitler nüklitlerin bozunma enerjileri tercihen <1.000 keV, daha çok tercih edilen sekilde <100 keV ve en çok tercih edilen sekilde <70 keV'dir. Ayni zamanda, alfa parçaciklari olusumu ile büyük oranda bozunan radyonüklitler de tercih edilir. Bu tür radyonuklitler, sinirlama olmaksizin sunlari içerir: Dy-152, At-21 1, Bi-212, Ra- alfa parçacigi yayan radyonüklitlerin bozunma enerjileri tercihen 2.000 ila 10.000 keV arasinda, daha çok tercih edilen sekilde 3.000 ila 8.000 keV arasinda ve en çok tercih edilen sekilde 4.000 ila 7.000 keV arasindadir. Kullanilan ilave Radyon'üklitler ve diger metaller, örnegin bir antikor ya da konjugata bagli selasyon gruplari kullanilarak teslim edilebilir. NOTA, DOTA ve TETA gibi makrosiklik selatlar, çesitli metaller ve radyometaller, özellikle de sirasiyla galyum, itriyum ve bakir radyonüklitleri ile faydalidir. Bu tür metal-selat kompleksleri, halka boyutunun ilgili metale ayarlanmasi ile çok kararli hale getirilebilir. 223Ra kompleksi için makrosiklik polieterler gibi baska halka tipi selatlar kullanilabilir.

Bu belgede tarif edilen kamptotesin konjugatlari ile birlikte kullanilan terapötik ajanlar, örnegin, vinka alkaloidler, antrasiklinler, epidofillotoksinler, taksanlar, antimetabolitler, alkilasyon ajanlari, antibiyotikler, Cox-2 inhibitörleri, antimitotikler, antianiyogenikler ve proapoptik ajanlar, özellikle de doksorubisin, metotreksat, taksol, diger kamptotesinler ve bu ve baska anti-kanser ajanlarindan digerleri ve bunlarin benzerlerini gibi kemoterapötik ilaçlari da içerir. Diger kanser kemoterapötik ilaçlari arasinda azot hardallari, alkil sülfonatlar, nitrosoüreler, triazenler, folik asit analoglari, pirimidin analoglari, pürin analoglari, platin koordinasyon kompleksleri, hormonlar ve benzerleri sayilabilir. Uygun kemoterapötik ajanlar, “REMINGTONG PHARMACEUTICAL SClENCES, 19.

Baski. (Mack Publishing Co. 1995)” ve “GOODMAN AND GILMAN'S THE PHARMACOLOGICAL BASIS OF THERAPEUTICS, 7. Baski. (Mac- Millan Publishing Co. 1985)” ve bu yayinlarin revize edilmis baskilarinda tarif edilmektedir. Deneysel ilaçlar gibi baska uygun kemoterapötik ajanlar, bu teknikte uzman kisiler tarafindan bilinmektedir.

Kullanilabilen ilaçlarin örnekleri; 5-floroürasil, aplidin, azaribin, anastrozol, anthrasiklinler, bendamustin, bleomisin, bortezomib, briyostatin-l, busülfan, kalikeamisin, kampotesin, karboplatin, 10-hidroksikamp0tesin, karmustin, selebreks, klorambusil, sisplatin (CDDP), Cox-2 inhibitörleri, irinotekan (CPT-11), SN-38, karboplatin, kladribin, kamptotekanlar, siklofosfamit, sitarabin, dakarbazin, dosetaksel, daktinomisin, daunorubisin, doksorubisin, 2- pirrolinodoksorubisin (2P- DOX), siyano-morfolino doksorubisin, doksorubisin glukuronit, epirubisin glukuronit, estramustin, epidofillotoksin, östrojen reseptör baglanma ajanlari, etoposit (VP16), etoposit glukuronit, etoposit fosfat, floxuridine (FUdR), 335,-0- dioleoyiI-FudR (FUdR-dO), fludarabin, flutamit, farnesiI-protein transferaz inhibitörleri, gemsitabin, hidroksi'L'ire, idarubisin, ifosfamit, L-asparaginaz, merkaptop'ürin, metotreksat, mitoksantron, mithramisin, mitomisin, mitotan, navelbin, nitros'üre, plikomisin, prokarbazin, paklitaksel, pentostatin, PSI-341, raloksifen, semustin, streptozosin, tamoksifen, taksol, temazolomit (sulu bir DTlC formu), transplatinyum, talidomit, tiyoguanin, tiyotepa, teniposide, topotekan, 'ürasil hardali, vinorelbin, bu belgede tarif edilen konjugatlari içerir ya da bunlar, alternatif olarak, konjugat öncesinde, es zamanli olarak ya da sonrasinda, tarif edilen konjugatlar ile birlikte tatbik edilebilir. Alternatif olarak, teknikte bilinen bir ya da daha fazla terapötik çiplak antikor, tarif edilen konjugatlar ile birlikte kullanilabilir.

Terapötik çiplak antikorlarin örnekleri önceki bölümde tarif edilmistir.

Kamptotesin konjugatlari ile uyum içinde kullanilabilen terapötik ajanlar, ayni zamanda, hedefleyici gruplara konjuge edilen toksinleri de içerebilir. Bu baglamda kullanilabilen toksinler arasinda ricin, abrin, ribonükleaz (RNaz), DNaz I, Stafilococcal enterotoksin-A, pokeweed antiviral protein, gelonin, diterin toksin, Pseudomonas ekzotoksin ve Pseudomonas endotoksin yer alir. (On, bkz: Pastan. v.d., Cell (1986), 47:641 ve Sharkey ve Goldenberg, CA Cancer J Clin. Tem-Agu kisiler tarafindan bilinmektedir ve 6.077.499 sayili ABD Patentinde açiklanmaktadir.

Terapötik ajanin baska bir sinifi, bir ya da daha fazla immunomodülatör içerebilir.

Kullanilan immunomodülatörler, bir sitokin, bir kök hücre büyüme faktörü, bir (IFN), eritropoietin, trombopoietin ve bunlarin bir kombinasyonu arasindan seçilebilir. Özel olarak faydali olanlar, tümör nekroz faktörü (TNF) gibi faktör (G-CSF) ya da granülosit makrofaj-koloni uyarici faktör (GM-GSF) gibi koloni uyarici faktörler, interferonlar -G, -B ya da -y gibi interferonlar ve “81 faktörü” olarak belirtilen gibi kök hücre büyüme faktörüdür. Sitokinler arasinda sunlar yer alir: insan büyüme hormonu, N-metionil insan büyüme hormonu ve bovin büyüme hormonu gibi büyüme hormonlari; paratiroid hormonu; tiroksin; insülin; proinsülin; relaksin; prorelaksin; glikoprotein hormonlari, örnegin folikül uyarici hormon (FSH), tiroid uyarici hormon (TSH) ve Iüteinizasyon hormonu (LH); hepatik büyüme faktörü; prostaglandin, fibroblast büyüme faktörü; prolaktin; plasental laktogen, OB protein; tümor nekroz faktörü-a ve - ß; mullerian-inhibe edici madde; fare gonadotropin ile iliskili peptit; inhibin; aktivin; vasküler endoteli büyüme faktörü; integrin; trombopoietin (TPO); sinir büyüme faktörleri, örnegin NGF-ß; platelet büyüme faktörü; dönüstürücü büyüme faktörleri (TGFiIer), örnegin TGF- 0( ve TGF- ß; insülin benzeri büyüme faktörü-I ve -ll; eritropoietin (EPO); osteoindüktif faktörler; interferonlar örnegin interferon-or, -B ve -v; koloni uyarici faktörler (CSF'Ier), örnegin makrofaj-CSF (MCSF); interlökinler (IL'Ier), örnegin lL-1, lL-1oi, trombospondin, endostatin, tümör nekroz faktörü ve LT. Bu belgede kullanildigi üzere, sitokin terimi, dogal kaynaklardan ya da rekombinant hücre kültüründen proteinleri ve natif dizilimli sitokinlerin biyolojik olarak aktif esdegerlerini kapsar.

Kullanilan kemokinler arasinda RANTES, MCAF, MlP1-alfa, MIP1-Beta ve IP-10 yer alir.

Formülasyon ve Tatbik Konjugatlari tatbik etmek için uygun yollar arasinda, sinirlama olmaksizin, oral, parenteral, rektal, transmukozal, intestinal tatbik, intramusküler, subkütanöz, intramedüller, intratekal, dogrudan intravertiküler, intravenöz, intravitreal, intraperitoneal, intranazal ya da intraoküler enjeksiyonlar yer alir. Tercih edilen tatbik yolu, parenteral tatbiktir. Alternatif olarak, bilesik, sistemik degil lokal bir sekilde, örnegin bilesigin dogrudan kati bir tümöre enjeksiyonu ile tatbik edilebilir.

Immunokonjugatlar, farmasötik olarak faydali terkipler hazirlamak için bilinen yöntemlere göre formüle edilebilir ve immunokonjugat, farmasötik olarak uygun bir yardimci madde ile bir karisim haline getirilir. Steril fosfat tamponlu salin, farmasötik olarak uygun bir yardimci madde örnegidir. Baska uygun yardimci maddeler teknikte iyi bilinmektedir. Ornegin, bkz: Ansel v.d., PHARMACEUTlCAL DOSAGE FORMS AND DRUG DELIVERY SYSTEMS, 5. Baski (Lea & Febiger 1990) ve Gennaro (ed.), REMINGTONiS PHARMACEUTlCAL SCIENCES, 18.

Baski (Mack Publishing Company 1990) ve bunlarin revize edilmis baskilari.

Immunokonjugat, örnegin bolus enjeksiyon ya da sürekli enjeksiyon yoluyla intravenöz tatbik için formüle edilebilir. Tercihen, bu bulusun antikoru, yaklasik 4 saatten kisa bir sürede infüze edilir ve daha çok tercih edilen sekilde, yaklasik 3 saat kisa bir sürede infüze edilir. Ornegin, birinci 25-50 mg, 30 dakika içinde, tercihen 15 dakika içinde infüze edilebilir ve kalan miktar izleyen 2-3 saat içinde infüze edilir. Enjeksiyon için formülasyonlar, birim dozaj formunda, örnegin ampuller içinde ya da çok dozlu konteynirlar içinde, ilave koruyucu ile birlikte sunulabilir. Terkipler, yagli ya da sulu araçlar içinde süspansiyonlar, çözeltiler ya da emülsiyonlar seklini alabilir ve askida tutucu, kararlilastirici ve/veya dagitici ajanlar gibi formüle edici ajanlar içerebilir. Alternatif olarak, etkin bilesen, kullanimdan önce uygun bir araç, örnegin steril pirojensiz su ile yapilandirma için toz seklinde olabilir.

Terapötik konjugatin etki süresini kontrol etmek için ilave farmasötik yöntemler kullanilabilir. Kontrollü salimli preparatlar, immunokonjugati komplekse almak ya da adsorbe etmek için polimerler kullanilarak hazirlanabilir. Ornegin, biyouyumlu polimerler arasinda poli(etilen-ko-vinil asetat) matrisleri ve bir stearik asit dimeri ve sebasik asit polianhidrür kopolimerinin matrisleri yer alir. Sherwood v.d., orani, immunokonjugatin molekül agirligina, immunokonjugatin matris içindeki miktarina ve dagilan parçaciklarin boyutuna baglidir. Saltzman v.d., Biophys. J. 55: 163 (1989); Sherwood v.d., yukarida geçen çalisma. Diger kati dozaj formlari su çalismalarda tarif edilmistir: Ansel v.d., PHARMACEUTICAL DOSAGE FORMS AND DRUG DELlVERY SYSTEMS, 5. Baski (Lea & Febiger 1990) ve Gennaro (ed), REMINGTON'S PHARMACEUTlCAL SCIENCES, 18. Baski (Mack Publishing Company 1990) ve bunlarin revize edilmis baskilari.

Genel olarak, insanlar için tatbik edilen bir immunokonjugatin dozaji, hastanin yasi, agirligi, boyu, cinsiyeti, genel tibbi durumu ve tibbi geçmisi gibi faktörlere bagli olarak degisiklik gösterecektir. Aliciya, tek bir intravenöz infüzyon olarak yaklasik mg/kg ila 25 mg/kg arasinda bir immunokonjugat dozaji verilmesi istenebilir ancak kosullarin gereklerine göre daha düsük ya da daha yüksek dozaj da uygulanabilir. 70 kg agirliginda bir hasta için 1-20 mg/kg'lik bir dozaj, örnegin, gerektigi ölçüde tekrar edilebilir; Örnegin, 4-10 hafta boyunca haftada bir, 8 hafta boyunca haftada bir ya da 4 hafta boyunca haftada bir olabilir. Sürdürme terapisinde gerektigi sekilde, daha uzun araliklarla da verilebilir; 'örnegin birkaç ay boyunca iki haftada bir ya da birkaç ay boyunca ayda bir ya da üç ayda bir olabilir.

Alternatif olarak, bir immunokonjugat, toplamda en az 3 dozaj tekrar edilmek üzere, her 2 ya da 3 haftada bir dozaj olarak tatbik edilebilir. 4-6 hafta boyunca haftada iki kez de tekrarlanabilir. Dozajin yaklasik 200-300 mg/mz'ye (1,7 m boyunda bir hasta için dozaj basina 340 mg ya da 70 kg agirliginda bir hasta için 4,9 mg/kg) indirilmesi halinde, ilaç 4 ila 10 hafta boyunca haftada bir ya da hatta iki kez tatbik edilebilir. Alternatif olarak, dozaj takvimi, 2-3 ay boyunca 2 ya da 3 haftada bir sefere düsürülebilir. Bununla birlikte, haftada bir kez 20 mg/kg ya da her 2-3 haftada bir gibi daha da yüksek dozlarin, tekrarlanan doz döngüleri boyunca, yavas i.v. infüzyon ile tatbik edilebildigi belirlenmistir. Doz takvimi, istege bagli olarak, baska zaman araliklarinda tekrarlanabilir ve dozaj, doz ve takvimin uygun sekilde ayarlanmasiyla çesitli parenteral yollardan verilebilir.

Istemlerde tanimlanan bulusa göre, immunokonjugatlar, kanser tedavisinde kullanima yöneliktir. Kanserlere Örnek olarak, sinirlama olmaksizin, karsinom, habislikler verilebilir. Daha özel olarak, bu tür kanserlerin belirli örnekleri asagida verilmistir: skuamöz cell kanser (ör., epitel skuamöz hücre kanseri), Ewing sarkomu, Wilms tümörü, astrositomlar, küçük hücreli akciger kanseri, küçük hücreli olmayan akciger kanseri gibi akciger kanseri, akciger adenokarsinomu ve akciger skuamöz karsinomu, periton kanseri, hepatoselüler kanser, gastrointestinal kanser, dahil olmak üzere gastrik ya da mide kanseri, pankreatik kanser, gliyoblastoma multiform, servikal kanser, yumurtalik kanseri, karaciger kanseri, mesane kanseri, hepatoma, hepatoselüler karsinom, nöroendokrin tümörleri, medüller tiroid kanseri, farklilasmis tiroid karsinomu, gögüs kanseri, yumurtalik kanseri, kolon kanser, rektal kanser, endometriyal kanser ya da rahim karsinomu, tükrük bezi karsinomu, böbrek ya da renal kanser, prostat kanseri, vulvar kanser, anal karsinom, penil karsinom ve bas ve boyun kanseri. “Kanser” terimi, birincil habis hücreler ya da tümörleri (ör., hücreleri, denegin vücudunda orijinal habislik ya da tümörün alanindan baska alanlara göç etmemis olanlar) ve ikincil habis hücreler ya da tümörleri (ör., habis hücrelerin ya da tümörlerin, orijinal tümör alanindan farkli ikincil alanlara göçü olan metastazdan kaynaklananlar) kapsar.

Diger kanser ya da habislik örnekleri söyledir: Akut Çocukluk Lenfoblastik Lösemi, Akut Lenfoblastik Lösemi, Akut Lenfositik Lösemi, Akut Miyeloid Lösemi, Adrenokortikal Karsinom, Eriskin (Birincil) Hepatoselüler Kanser, Eriskin (Birincil) Karaciger Kanseri, Eriskin Akut Lenfositik Lösemi, Eriskin Akut Miyeloid Lösemi, Eriskin Hodgkin Lenfoma, Eriskin Lenfositik Lösemi, Eriskin Non-Hodgkin Lenfoma, Eriskin Birincil Karaciger Kanseri, Eriskin Yumusak Doku Sarkomu, AlDS Ile Iliskili Lenfoma, AlDS Ile Iliskili Habislikler, Anal Kanser, Astrositom, Safra Kanali Kanseri, Mesane Kanseri, Kemik Kanseri, Beyin Kökü Gliyom, Beyin Tümörleri, Gögüs Kanseri, Kanser of te Renal Pelvis ve Ureter, Merkezi Sinir Sistemi (Birincil) Lenfomu, Merkezi Sinir Sistemi Lenfomu, Serebellar Astrositom, Serebral Astrositom, Servikal Kanser, Çocukluk (Birincil) Hepatoselüler Kanseri, Çocukluk (Birincil) Karaciger Kanseri, Çocukluk Akut Lenfoblastik Lösemisi, Çocukluk Akut Miyeloid Lösemisi, Çocukluk Beyin Kökü Gliyomu, Çocukluk Serebellar Astrositomu, Çocukluk Serebral Astrositomu, Çocukluk Ekstrakraniyal Germ Hücresi Tümörleri, Çocukluk Hodgkin Hastaligi, Çocukluk Hodgkin Lenfomu, Çocukluk Hipotalamik ve Görme Yolu Gliyomu, Çocukluk Lenfoblastik Lösemisi, Çocukluk Medulloblastomu, Çocukluk Non-Hodgkin Lenfomu, Çocukluk Pineal ve Supratentoriyal Primitif Nöroectodermal Tümörleri, Çocukluk Birincil Karaciger Kanseri, Çocukluk Rabdomyosarkomu, Çocukluk Yumusak Doku Sarkomu, Çocukluk Görme Yolu ve Hipotalamik Gliyom, Kronik Lenfositik Lösemisi, Kronik Miyelogenöz Lösemi, Kolon Kanseri, Kutanöz T Hücresi Lenfomu, Endokrin Pankreas Adacik Hücre Karsinomu, Endometrial Kanser, Ependimoma, Epitelyal Kanser, Osofageal Kanser, Ewing Sarkomu ve Ilgili Tümörleri, Eksocrine Pankreatik Kanser, Ekstrakraniyal Germ Hücresi Tümörü, Ekstragonadal Germ Hücresi Tümörü, Ekstrahepatik Safra Kanali Kanseri, Göz Kanser, Disi Gögüs Kanseri, Gaucher Hastaligi, Safra Kesesi Kanseri, Gastrik Kanser, Gastrointestinal Karsinoid Tümörü, GastroIntestinal Tümörleri, Germ Hücresi Tümörleri, Gestational Trofoblastik Tümörü, Tüylü Hücreli Lösemi, Bas ve Boyun Kanser, Hepatoselüler Kanser, Hodgkin Lenfoma, Hipergammaglobulinemi, Hipofaringeal Kanser, Intestinal Kanserler, Intraoküler Melanoma, Adacik Hücre Karsinomu, Adacik Hücre Pankreatik Kanseri, Kaposi Sarkomu, Böbrek Kanseri, Laringeal Kanser, Dudak ve Agiz Boslugu Kanseri, Karaciger Kanseri, Akciger Kanseri, Lenfoproliferatif Bozukluklar, Makroglobulinemi, Erkek Gögüs Kanseri, Habis Mezoteliyom, Habis Tiymom, Medulloblastom, Melanom, Mezotelyiom, Metastatik Gizli Birincil Skuamöz Boyun Kanseri, Metastatik Birincil Skuamöz Boyun Kanseri, Metastatik Skuamöz Boyun Kanseri, Multipl Miyelom, Multipl Miyelom/Plazma Hücre Neoplazmi, Miyelodisplastik Sendrom, Miyelogenöz Lösemi, Miyeloid Lösemi, Miyeloproliferatif Bozukluklar, Burun Bslugu ve Paranazal Sinüs Kanseri, Nazofaringeal Kanser, Nöroblastom, Non-Hodgkin Lenfoma, Nonmelanoma Cilt Kanseri, Küçük Hücreli Olmayan Akciger Kanseri, Gizli Birincil Metastatik Skuamöz Boyun Kanseri, Orofaringeal Kanser, Osteo- /Habis Fibröz Sarkoma, OsteoSarkoma/Habis Fibröz Histiyositom, Osteosarkom/Habis Fibröz Emi Histiositomu, Yumurtalik Epitelyal Kanseri, Yumurtalik Germ Hücresi Tümörü, Yumurtalik Düsük Habis Potansiyelli Tümörü, Pankreatik Kanser, Paraproteinemi, Polisitemi vera, Paratiroid Kanseri, Penil Kanser, Feokromositom, Hipofiz Tümörü, Birincil Merkezi Sinir Sistemi Lenfoma, Birincil Karaciger Kanseri, Prostat Kanser, Rektal Kanser, Renal Hücre Kanseri, Renal Pelvis ve Ureter Kanser, Retinoblastom, Rabdomiyosarkom, Tükürük Bezi Kanseri, Sarkoidoz Sarkomlar, Sezary Sendromu, Cilt Kanseri, Küçük Hücreli Akciger Kanseri, Küçük Bagirsak Kanseri, Yumusak Doku Sarkomu, Skuamöz Boyun Kanseri, Mide Kanser, Supratentoriyal Primitif Nöroektodermal ve Pineal Tümörleri, T Hücresi Lenfomu, Testiküler Kanser, Timom, Tiroid Kanseri, Renal Pelvis ve Ureterde Geçici Hücreli Kanser, Geçici Renal Pelvis ve Ureter Kanseri, Trofoblastik Tümörleri, Ureter ve Renal Pelvis Hücre Kanseri, Uretral Kanser, Rahim Kanseri, Rahim Sarkomu, Vajinal Kanser, Görme Yolu ve Hipotalamik Gliyom, Vulvar Kanser, Waldenstrom Makroglobulinemi, Wilms Tümörü ve yukarida siralanan bir organ sisteminde bulunan neoplazi'nin yani sira her türlü baska Hiperproliferatif Hastalik.

Bu belgede açiklanan yöntemler ve terkipler, habis ya da pre-habis rahatsizliklari tedavi etmek için ve sinirlama olmaksizin yukarida tarif edilen bozukluklar dahil olmak üzere neoplastik ya da habis bir duruma ilerlemeyi önlemek için kullanilabilir. Bu tür kullanimlar, neoplazi ya da kansere ilerlemis oldugu bilinen ya da süphesi bulunan durumlarda, özellikle de hiperplazi, metaplazi ya da daha özel olarak displaziden olusan non-neoplastik hücre büyümesi gerçeklesen durumlarda endikedir (bu tür anormal büyüme rahatsizliklarinin incelemesi için bkz: Robbins ve Angell, Basic Pathology, 2. Baski., W. B. Saunders Co., Philadelphia, s. 68-79 (1976)).

Displazi, bir kanser habercisidir ve genel olarak epitelyum da bulunur. Non- neoplastik hücre büyümesinin, münferit hücre bütünlügünde ve hücrelerin mimari yöneliminde kayip içeren en düzensiz formudur. Dizplazi, karakteristik olaraki kronik iritasyon ya da enflamasyon bulunan durumlarda meydana gelir. Tedavi edilebilen displastik bozukluklar, sinirlama olmaksizin sunlari içerir: anhidrotik ektodermal displazi, anterofasiyal displazi, bogucu torasik displazi, atriyodijital displazi, bronkopulmoner displazi, serebral displazi, servikal displazi, kondroektodermal displazi, kleidokraniyal displazi, kongenital ektodermal displazi, kraniyodiafisiyal displazi, kraniyocarpotarsal displazi, kraniyometafisiyal displazi, dentin displazi, diafisiyal displazi, ektodermal displazi, enamel displazi, ensefalo- oftalmik displazi, displazi epifisiyalis hemimelia, displazi epifisiyalis multipleks, displazi epifisiyalis punktata, epitelial displazi, fasiyodigitogenital displazi, ailesel fibröz çene displazisi, ailesel beyaz katli displazi, fibromusküler displazi, fibröz kemik displazisi, florür kemik displazisi, kalitsal renal-retinal displazi, hidrotik ektodermal displazi, hipohidrotik ektodermal displazi, Ienfopenik timik displazi, meme displazisi, mandibulofasiyal displazi, metafisiyal displazi, Mondini displazi, monostotik fibröz displazi, mukoepitelial displazi, multipl epifisiyal displazi, okuloaurikulovertebral displazi, okulodentodijital displazi, okulovertebral displazi, odontogenik displazi, optalmomandibulomelik displazi, periapikal semental displazi, poliostotik fibröz displazi, psödoakondroplastik spondiloepifisiyal displazi, retinal displazi, septo-optik displazi, spondiloepifisiyal displazi ve ventrikuloradial displazi.

Tedavi edilebilen baska pre-neoplastik bozukluklar, sinirlama olmaksizin sunlari içerir: iyi huylu disproliferatif bozukluklar (ör., iyi huylu tümörler, fibrosistik rahatsizliklar, doku hipertropisi, bagirsak polipleri ya da adenomlari ve özofageal displazi), Iökoplasi, keratozlar, Bowen hastaligi, Farmer hastaligi, Cilt, solar siliti ve solar keratoz.

Mevcut açiklamaya göre, bulusun yöntemi, yukarida sayilanlar basta olmak üzere, kanserlerin büyümesini, ilerlemesini ve/veya metastazini inhibe etmek için kullanilir.

Ilave hiperproliferatif hastaliklar, bozukluklar ve/veya rahatsizliklar, sinirlama olmaksizin asagidakiler gibi habislikler ve ilgili bozukluklarin ilerlemesi ve/veya metastazini kapsar: lösemi (including akut lösemiler (ör., akut Ienfositik lösemi, akut miyelositik lösemi (including miyeloblastik, promiyelositik, miyelomonositik, monositik ve eritrolösemi)) ve kronik Iösemiler (ör., kronik miyelositik (granulositik) lösemi ve kronik lenfositik Iösemi)), polisitemi vera, Ienfomalar (ör., Hodgkin hastaligi ve non-Hodgkin hastaligi), multipl miyelom, Waldenstrom makroglobulinemi, agir zincir hastaligi ve sarkomlar ve karsinomlar dahil olmak üzere kati tümörler, örnegin fibrosarkom, miyksosarkom, Iiposarkom, kondrosarkom, osteogenik sarkom, kordoma, anjiyosarkom, endoteliyosarkom, tümörü, Ieyomiyosarkom, rabdomiyosarkom, kolon karsinomu, pankreatik kanser, gögüs kanseri, yumurtalik kanseri, prostat kanseri, skuamöz hücreli karsinom, bazal hücreli karsinom, adenokarsinom, ter bezi karsinomi, yag bezi karsinomu, papiller karsinom, papiller adenokarsinomlar, sistadenokarsinom, medüller karsinom, bronkogenik karsinom, renal hücre karsinomu, hepatom, safra kanali karsinomu, koryokarsinom, seminom, embriyonal karsinom, Wilm tümörü, servikal kanser, testiküler tümörü, akciger karsinom, küçük hücreli akciger karsinomu, mesane karsinomu, epitelyal karsinom, gliyom, astrositom, medulloblastom, kraniyofarinjiyom, ependimom, pinealom, emanjiyoblastom, akustik nöroma, oligodendrogliyom, meninjiyom, melanom, nöroblastom ve retinoblastoma.

Kitler Ayni zamanda, bir hastada hastalikli dokunun tedavi edilmesi için uygun olan bilesenler içeren setler de açiklanmaktadir. Ornek setler, en az bir konjuge antikor ya da bu belgede tarif edilen sekilde baska hedefleyici grubu içerebilir. Tatbike yönelik bilesenler içeren terkibin, sindirim yolundan teslim, Örnegin oral teslim için formüle edilmis olmamasi halinde, set bilesenlerini baska yollardan teslim edebilen bir cihaz dahil edilebilir. Parenteral teslim gibi uygulamalar için bir cihaz türü, terkibin bir denegin vücuduna enjekte edilmesi için kullanilan bir enjektördür.

Inhalasyon cihazlari da kullanilabilir.

Set bilesenleri, bir arada paketlenebilir ya da iki ya da daha fazla konteynere ayrilabilir. Bazi somut örneklerde, konteynerler, yeniden yapilandirma için uygun olan birterkibin steril, Iiyofilize edilmis formülasyonlarini içeren flakonlar olabilir. Bir set, ayni zamanda, baska reaktiflerin yeniden yapilandirilmasi ve/veya dilüsyonu için uygun olan bir ya da daha fazla tampon da içerebilir. Kullanilabileoek diger konteynerler, sinirlama olmaksizin, kese, tepsi, kutu, tüp ya da benzerlerini içerir.

Set bilesenleri, konteynerler içinde steril olarak paketlenebilir ve saklanabilir.

Eklenebilecek baska bir bilesen, bir seti kullanacak olan kisi için talimatlardir.

Bu bulusun çesitli somut örnekleri, asagidaki örnekler ile tarif edilmektedir.

Asagida kullanilan kisaltmalar s'oyledir: DCC, disiklohekzilkarbodiimit; NHS, N- hidroksisüksinimit, DMAP, 4-dimetilaminopiridin; EEDQ, 2-et0ksi-1-etoksikarbonil- 1,2-dihidrokuinolin; MMT, monometoksitritil; PABOH, p-aminobenzil alkol; PEG, polietilen glikol; SMCC, süksinimidil 4-(N-maleimidometil)sikl0hekzan-1- karboksilat; TBAF, tetrabütilamonyum florür; TBDMS, tert-bütildimetilsilyl kloride.

Asagidaki örneklerdeki hidroksi bilesiklerinin kloroformatlari, Moon v.d. (J. trifosgen ve DMAP kullanilarak hazirlanmistir. Ekstrate edici hazirlik, kloroform, diklorometan ya da etil asetat ile ekstraksiyon ve istege bagli olarak doymus bikarbonat, su ve doymus sodyum klorür ile yikamayi ifade eder. Flas kromatografisi, aksi belirtilmedigi takdirde, %15 h/h oranina kadar metanol- diklorometan kullanilarak, 230-400 gözenekli silika jel ve metanoldiklorometan gradyani kullanilarak yapilmistir. Ters fazli HPLC, bir ön kolon filtresi takili olan, dakika içinde % 100 çözücü A ila % 100 çözücü B çözücü gradyani kullanilarak ve ya da 10 dakika boyunca dakikada 4,5 ml akis hizinda % 100 çözücü B orani korunarak A Yöntemi ile ya da bir ön kolon filtresi takili olan, 4,6330 mm Xbridge C18, 2,5 mm kolon kullanilarak ve 4 dakika boyunca dakikada 1,5 ml akis hizinda boyunca dakikada 2 ml akis hizinda % 100 çözücü B orani korunarak B Yöntemi ile yapilmistir. Çözücü A, pH degeri 4,46 olan % 0,3 sulu amonyum asetat iken, çözücü B, pH degeri 4,46 olan 921 oraninda asetonitril-sulu amonyum asetat (% 0,3) olmustur. HPLC, 360 nm ve 254 nm olarak ayarlanan bir çiftli hat içi emilim detektörü ile izlenmistir.

CL6-SN-38, Çizelge 1'de gösterilmektedir. Piyasadan satin alinabilen O-(2- azidoetil)-O,-(N-diglikoliI-2-aminoetil) heptaetilenglikol ('PEG-NB'; 227 mg), 10 dakika boyunca DCC ( ve 10 ml diklorometan içinde katalitik miktarda DMAP ile etkinlestirilmistir. Bu karisima, L-valinol (46,3 mg) eklenmis ve reaksiyon karisimi, 1 saat boyunca ortam sicakliginda karistirilmistir.

Filtreleme, ardindan çözücüyü uzaklastirma ve flas kromatografisi, 214 mg berrak yagli materyal vermistir. Bu ara madde (160 mg), 10-O-BOC-SN-38-20-O- kloroformat bilesigi ile reaksiyona sokulmustur ve söz konusu bilesik, trifosgen ve DMAP kullanilarak 10-O-BOC-SN-38'den (123 mg) elde edilmistir. Eslestirme reaksiyonu, 10 dakika boyunca 4 ml diklorometan içinde yapilmis ve reaksiyon karisimi, flas kromatografi ile saflastirilarak, köpüklü malzeme seklinde 130 mg (% 45 verim) ürün elde edilmistir. HPLC: tR 11,80 dak.; elektrosprey kütle spektrumu: Maleimid içeren asetilenik reaktif, yani klik sikloadisyonu için gereken 4-(N- maleimidometil)-N-(2-propinil)sikl0hekzan-1- karboksamit, 1,1 esd. 9; 1,01 esd.) diklorometan içinde reaksiyona sokulmasi yoluyla hazirlanmistir. 1 saat sonra, çözücü uzaklastirilmis ve ürün flas kromatografi ile saflastirilarak, 83 mg ürün (renksiz toz) elde edilmistir. ElektrOSprey kütle Spektrumu, m/e degerinde pikler ve pozitif iyon modunda m/e 192 degerinde bir baz pik göstermistir ve bu da C15H18N203 için hesaplanan yapi ile uyumludur: .

Yukarida tarif edilen azido ara maddesi ( içinde çözülmüs ve 60 mg 4-(N-maleimidometil)-N-(2-propinil)siklohekzan-1- karboksamit ve 15 mg bakir bromür ile reaksiyona sokulmus ve 30 dakika boyunca ortam sicakliginda karistirilmistir. Reaksiyon karisiminin hazirlanmasindan sonra, flas kromatografisi, 116 mg (% 75 verim) sikloadisyon ürünü vermistir. HPLC: tR 11,20 dak.; elektrosprey kütle spektrumu: M+H ve M+Na, sirasiyla m/z 1433 ve su (0,05 ml) karisimi ile korumanin kaldirilmasi, ardindan eter ile ç'oktürme ve müteakip olarak flas kromatografisi, yapiskan bir materyal seklinde CL6-SN-38 ürününü vermistir. HPLC: tR 9,98 dak.; elektrosprey kütle spektrumu: M+H ve M-H (negatif iyon mod), sirasiyla m/z 1333 ve 1356 degerlerinde.

N'wO'YnY`O/YOM 1 MIO" W:: _ *wc/"Af “rw/I& trifosgen :Ç _s/ -Hv woman-si . - 3:.. l 1 !my/x& %nLm/îgoi i, :- CL6-SN-38 Öncülü Sentez, Çizelge 2'de sematik olarak verilmistir. L-Valinol (40 mg), 3 saat boyunca, argon altinda, ortam sicakliginda 10 ml susuz diklorometan için piyasada satilan Fmoc-Lys(MMT)-OH ( ile reaksiyona sokulmustur.

Ekstraksiyon hazirligi ve ardindan flas kromatografisi, Fmoc-Lys(MMT)-valin0l ürününü soluk sari renkli bir sivi seklinde vermistir (200 mg; ~ % 70 verim). HPLC: mg) korumasi, dietilamin (10 ml) kullanilarak kaldirilmis ve ürün (135 mg), flas kromatografisi sonrasinda ~% 90 verimle elde edilmistir. HPLC: tR 10,91 dak.; elektrosprey kütle spektrumu: M+Na, m/z 527 degerinde. Bu ürün (135 mg), 10 ml diklorometan içinde EEDQ (72 mg, 1,1 esd.) varliginda, piyasada satilan O-(2- azidoetil)-O,-(N-diglikoliI-2-aminoetil)heptaetilenglik0l ('PEG-NS'; 150 mg, 1,1 esd.) ile eslestirilmis ve gece boyunca ortam sicakliginda karistirilmistir. Ham malzeme flas kromatografisi ile saflastirilarak, açik sari renkli bir yag seklinde 240 mg saflastirilmis ürün elde edilmistir (~% 87 verim). HPLC: tR 11,55 dak.; elektrosprey kütle spektrumu: M+H ve M+Na, sirasiyla m/z 1041 ve 1063 degerlerinde.

Bu ara madde (240 mg), 10-O-TBDMS-SN-38-20-O-kloroformat bilesigi ile reaksiyona sokulmustur ve söz konusu bilesik, trifosgen ve DMAP kullanilarak 10- O-TBDMS-SN-Ssiden (122 mg) elde edilmistir. Eslestirme reaksiyonu, 10 dakika boyunca 5 ml diklorometan içinde yapilmis ve reaksiyon karisimi, flas kromatografi ile saflastirilarak, soluk sari köpük seklinde 327 mg ürün elde edilmistir.

Elektrosprey kütle spektrumu: M+H, m/z 1574 degerinde. Ürünün tamami, 5 dakika boyunca 10 ml diklorometan içinde 0,25 mmol TBAF ile reaksiyona sokulmus ve reaksiyon karisimi, 100 ml'ye seyreltilmis ve tuzlu su ile yikanmistir.

Ham ürün ( içinde çözülmüs ve 114 mg 4-(N- maleimidometil)- N-(2-pr0pinil)siklohekzan-1-karboksamit (Ornek 1ide tarif edilen sekilde hazirlanan) ve 30 mg bakir bromür ile reaksiyona sokulmus ve ortam sicakliginda 1 saat boyunca karistirilmistir. Flas kromatografisi, sondan bir önceki ara maddeden 150 mg saglamistir. Son olarak, diklorometan (5 ml) içinde TFA (0,5 ml) ve anisol (0,05 ml) karisimi ile 3 dakika boyunca MMT grubunun korumasinin kaldirilmasi, ardindan flas kromatografisi ile saflastirma, yapiskan bir materyal seklinde 69 mg CL7-SN-38 ürününü vermistir. HPLC: tR 9,60 dak.; elektrosprey kütle spektrumu: M+H ve M-H (negatif iyon modu), sirasiyla m/z 1461 ve 1459 degerlerinde. n n 4 1 OH . i ' 100W.

MW- rw: ' n “* .:10 ' Ana; *WNHN `g u °1° .w 2, icin& w g &www `Amnr`oz`g'v _ ' N tango _ 1.

SÄWÜNVRN'NrG/In ; E 'Izi/01° E ' b' ' Ornek 1'deki CL6-SN-38 (55,4 mg), diklorometan (5 ml) içinde çözülmüs ve reaksiyona sokulmus ve argon altinda 20 dakika boyunca karistirilmistir.

Reaksiyon karisimi, 100 ml diklorometan ile seyreltilmis ve her biri, sodyum bikarbonat ve tuzlu su ile yari doygun 100 ml 0,1 M HCI ile yikanmis ve kurutulmustur. Çözücünün uzaklastirilmasindan sonra, flas kromatografisi, baslik ürününden 59 mg vermistir. HPLC: tR 10,74 dak.; tam kütle: hesaplanan.

Ornek 2ideki CL7-SN-38 Öncülü (80 mg), Ornek 3'te tarif edilen prosedür ve saflastirma kullanilarak 10-O-kloroformatra dönüstürülmüstür. Verim: 60 mg.

HPLC: tR 12,32 dak.; elektrosprey kütle spektrumu: M+H ve M-H (negatif iyon modu), sirasiyla m/z 1806 ve 1804 degerlerinde. Dikloroasetik asit ve diklorometan içinde anisol kullanilarak bu materyalin korumasinin kaldirilmasi baslik ürününü vermistir. HPLC: tR 10,37 dak.; elektrosprey kütle spektrumu: M+H, m/z 1534 degerinde.

Bu Ornek, SN-38'in 10-OH grubunun 'BOC' yerinde bir karbonat ya da bir ester olarak korundugunu göstermektedir; bu sayede, nihai ürün, 10-OH koruma grubunun korumasini kaldirmaya ihtiyaç olmadan antikorlara konjugasyon için hazirdir. Bu grubun korumasi, protein konjugatinin in vivo tatbiki sonrasinda fizyolojik pH kosullari altinda kolayca kaldirilir. Bu konjugatlarda, 'Rr, n degeri 2-10 arasinda olan (CH2)n-N(CH3)2 gibi sübstitüe edilmis bir alkil ya da n degeri 0-10 arasinda olan (CH2)n-CH3 gibi bir basit alkil olabilir ya da n degeri 0-10 arasinda olan “CH3-(CH2)n-O-” gibi bir alkoksi grubu ya da n degeri 2-10 arasinda olan 0- (CH2)n-N(CH3)2 gibi sübstitüe edilmis bir alkoksi grubu olabilir ve burada, terminal amino grubu, istege bagli olarak, yüksek suda çözünürlük için kuaterner bir tuz ya da “R1O-(CH2-CH2-0)n-CH2-CH2-O-” seklindedir ve bu formülde R1, etil ya da metil'dir ve n, 0-10 arasinda bir tamsayidir. Son kategorinin en basit versiyonunda, R = “- O-(CH2)2-OCH3” seklindedir. Bu 10-hidroksi türevleri, nihai türevin bir karbonat olmasi halinde seçilen reaktifin kloroformati ile islem yoluyla kolayca hazirlanir. Tipik olarak, SN-38 gibi 10-hidr0ksi içeren kamptotesin, baz olarak trietilamin kullanilarak dimetilformamit içinde kloroformat'in bir molar esdegeri ile islenir. Bu kosullar altinda, 20-OH pozisyonu etkilenmez. 10-O-esterler olusturmak için, seçilen reaktifin asit klorürü kullanilir. Bu tür türevler, Ornekler 3 ve 45teki basit etil karbonatlar için gösterilen gelismis ara maddeler kullanilarak uygun sekilde gerçeklestirilebilir.

Valinol, `Ornek 1'de tarif edilen prosedüre göre, Çizelge 1rdeki 'PEG-NS, ile eslestirilir. Urün, diklorometan içinde 0,4 mol esdegeri trifosgen, 3,1 mol esdegeri DMAP ile reaksiyona sokulur. 5 dakika sonra, bu sekilde olusan kloroformat, ortam sicakliginda 15 dakika boyunca esit mol miktarinda paklitaksel ile reaksiyona sokulur. Paklitaksel'in reaktif 2'-hidroksil grubu (yan zincir ikincil hidroksil grubu), çapraz baglayicinin kloroformati ile reaksiyona girer. Urün, flas kromatografisi ile izole edilir. Bu ara madde ( içinde çözülmüs ve 60 mg 4-(N-maleimidometiI)-N-(2-propinil)siklohekzan-1-karboksamit (Ornek 1rde tarif edilen sekilde hazirlanan) ve 15 mg bakir bromür ile reaksiyona sokulmus ve 30 dakika boyunca ortam sicakliginda karistirilmistir. Reaksiyon karisiminin hazirlanmasindan sonra, flas kromatografisi, çift fonksiyonlu paklitaksel, yani CL6-paklitaksel verir.

L-Valinol (40 mg), piyasada satilan Fmoc-Lys(MMT)-OH ile reaksiyona sokulur ve ürün, bunun ardindan, Ornek 2'de tarif edilen sekilde, O-(2-azidoetiI)-O,-(N- diglikoIiI-2-aminoetiI)heptaetilenglikol ('PEG-N3*) ile reaksiyona sokulur. Bu türevin kloroformati, Ornek 6'nin yöntemi ile olusturulur ve esdeger mol miktarinda paklitaksel ile reaksiyona sokulur. Paklitaksel'in reaktif 2'-hidr0ksil grubu (yan zincir ikincil hidroksil grubu), çapraz baglayicinin kloroformati ile reaksiyona girer.

Daha sonra, 4-(N-maleimidometiI)-N-(2-pr0pinil)sikl0hekzan-1-karboksamit (Ornek 1*de tarif edilen sekilde hazirlanan) kullanilarak, Ornek Gida tarif edilene benzer sekilde kIik sikloadisyonu yapilir ve ürün, son olarak, dikloroasetik asit ve anisol ile islenerek, ilimli kosullar altinda 'MMT' grubunun uzaklastirilmasi gerçeklestirilir. Bu proses, CL7-paklitaksel saglar.

Valinol, Ornek 1'de tarif edilen prosedüre göre, Çizelge 17deki 'PEG-N3, ile eslestirilir. Urün, diklorometan içinde 0,4 mol esdegeri trifosgen, 3,1 mol esdegeri DMAP ile reaksiyona sokulur. 5 dakika sonra, bu sekilde olusan kloroformat, ortam sicakliginda 15 dakika boyunca esit mol miktarinda morfolino doksorubisin ile reaksiyona sokulur. Morfolino doksorubisin'in birincil hidroksil grubu, çapraz baglayicinin kloroformati ile reaksiyona girer. Urün, flas kromatografisi ile izole edilir. Bu ara madde ( içinde çözülmüs ve 60 mg 4-(N-maleimidometil)-N-(2-propinil)siklohekzan-1-karboksamit (Ornek 1'de tarif edilen sekilde hazirlanan) ve 15 mg bakir bromür ile reaksiyona sokulmus ve dakika boyunca ortam sicakliginda karistirilmistir. Reaksiyon karisiminin hazirlanmasindan sonra, flas kromatografisi, çift fonksiyonlu paklitaksel, yani CL6- Ornek 9: CL7-[morfolino doksorubisin] Hazirlanisi L-Valinol (40 mg), piyasada satilan Fmoc-Lys(MMT)-OH ile reaksiyona sokulur ve ürün. bunun ardindan, Ornek 2'de tarif edilen sekilde, O-(2-azid0etil)-Or-(N- diglikoliI-2-amin0etil)heptaetiIenglikol (:PEG-Nsl) ile reaksiyona sokulur. Bu türevin kloroformati, Ornek 6'nin yöntemi ile olusturulur ve esdeger mol miktarinda morfolino doksorubisin ile reaksiyona sokulur. Morfolino doksorubisinrin birincil hidroksil grubu, çapraz baglayicinin kloroformati ile reaksiyona girer. Daha sonra, 4-(N-maleimid0metil)-N-(2-pr0pinil)sikl0hekzan-1-karboksamit (Ornek 1*de tarif edilen sekilde hazirlanan) kullanilarak, Ornek 6'da tarif edilene benzer sekilde klik sikloadisyonu yapilir ve ürün, son olarak, dikloroasetik asit ve anisol ile islenerek, iIimIi kosullar altinda “MMT' grubunun uzaklastirilmasi gerçeklestirilir. Bu proses, CL7-[m0rfolino doksorubisin] saglar.

Metilen klorür (10 ml) içinde piyasada satilan Fmoc-Lys(MMT)-OH (0,943 9), p- aminobenzil alkol ( eklenmis ve 4 saat boyunca karistirilmistir. Ekstraksiyon hazirligi ve ardindan flas kromatografisi, beyaz köpük seklinde 1,051 9 materyal vermistir. Tüm HPLC analizleri, 0148 bölümünde 'Genel' altinda belirtilen Yöntem B ile gerçeklestirilmistir. HPLC tut. süresi: 3,53 dak. Elektrosprey kütle spektrumui yapiyla uyumlu bir sekilde, m/e degerlerinde pikler göstermistir. Bu ara madde (0,93), dietilamin (10 ml) içinde çözülmüs ve 2 saat boyunca karistirilmistir. Çözücünün uzaklastirilmasindan sonra, kalinti, hekzan içinde yikamis ve renksiz bir çökelti seklinde 0,6 9 ara madde (Çizelge 3'te (2)) elde edilmistir. HPLC tut. süresi: 2,06 dak. Elektrosprey kütle spektrumu, m/e degerlerinde pikler göstermistir.

Bu ham ara madde (0,565 9), metilen klorür (10 ml) içinde EEDQ kullanilarak, piyasada satilan O-(2-azidoetil)-O'-(N-diglik0lil-2- amin0etil)heptaetilenglikol ('PEG-NS', 0,627 9) ile eslestirilmistir. Çözücünün uzaklastirilmasi ve flas kromatografisi, 0,99 9 ürün saglamistir (Çizelge &te (3); açik sari yag; % 85 verim). HPLC tut. süresi: 2,45 dak. Elektrosprey kütle spektrumu, m/e degerlerinde pikler göstermistir.

Bu ara madde (0,92 9), argon altinda 10 dakika boyunca metilen klor`ur içinde 10- O-TBDMS-SN-38-20-O-kloroformat (Çizelge 39te (5)) ile reaksiyona sokulmustur.

Karisim, flas kromatografisi ile saflastirilmis ve açik sari yag seklinde 0.944 9 elde edilmistir (Çizelge 3*te (6); verim = % 68). HPLC tut. süresi: 4,18 dakika. Metilen klor'ur (10 ml) içinde bu ara maddeye (0,94 9), metilen klor'ur (3 ml) içinde TBAF boyunca karistirilmistir. Karisim, metilen klorür (100 ml) ile seyreltilmis ve 0,25 M sodyum sitrat ve tuzlu su ile yikanmistir. Çözücünün uzaklastirilmasi, 0,835 9 sari yag ürünü vermistir. HPLC tut. süresi: 2,80 dakika; (% 99 saflik). Elektrosprey k'utle spektrumu, yapiyla uyumlu bir sekilde, m/e , m/e degerlerinde pikler göstermistir. 4-(N-maleimidometil)-N-(2-pr0pinil)siklohekzan- 1-karboksamit (0,233 9) ile reaksiyona sokulmustur. ile yikama dahil olmak 'üzere, ekstraksiyon hazirligi ve flas kromatografisi, sari köpük seklinde 0,891 9 saglamistir. (verim = % 93), HPLC tut. süresi: 2,60 dak. Elektrosprey kütle spektrumu, yapiyla uyumlu bir sekilde, m/e , degerlerinde pikler göstermistir. Son olarak, sondan bir önceki ara maddenin (0,22 g) korumasinin, metilen klor'ür (3 ml) içinde dikloroasetik asit (0,3 ml) ve anisol (0,03 ml) karisimi ile kaldirilmasi, ardindan eter ile çöktürme, saglamistir. HPLC tut. süresi: 1,88 dak. Elektrosprey kütle spektrumu, yapiyla uyumlu bir sekilde, m/e degerlerinde pikler göstermistir. Çizelge 3: CL2A-SN-38 Hazirlanisi Fm' /M women M L trifosgen ` o `, uzatmanin www::.. ***gg ~,°"; ' HL , _A_ ;3 "-0^1--n ° nitro” *53 i ' o› N, 2 n 9 ,CB/`”55 " N 2.

Vfoag Y`°^ ' I: I i araci; * mt“, ` im” (Klik Sikloadisyonl mr, DCNanisol m N ` ”Âs aga-«(4 H 1 CLIA- SN-JI 1 t Nida (amin tuzu olarak› Metilen klorür (50 ml) içinde N,N'-dimetiletilendiamin (3 ml), monometoksitritil kloride (1,7 9) ile reaksiyona sokulmustur. 1 saat karistirma sonrasinda, çözücü, düsük basinç,` altinda uzaklastirilmis ve ham 'ürün, ekstraksiyon hazirlama ile geri kazanilmistir (sari yag; 2,13 9). Tüm HPLC analizleri, 0148 bölümünde 'Genel, altinda belirtilen Yöntem B ile gerçeklestirilmistir. HPLC tut. süresi: 2,28 dakika. Bu ara madde (Çizelge 4*te (1), 0,93 9), bulundugu yerde, etkinlestirilmis SN-38 içine eklenmis ve söz konusu 'ürün (Çizelge 4'te (2)), SN-38'in (0,3 9) 1 saat boyunca DMF içinde p-nitrofenilkloroformat ( ile reaksiyona sokulmasi yoluyla hazirlanmistir. Çözücün'ün uzaklastirilmasindan sonra, kalinti, deaktif silika jel `üzerinde saflastirilmis ve beyaz kati seklinde 0,442 9 'ürün elde edilmistir.

Bu ara maddenin (0,442 9) korumasi, metilen klorür (5 ml) içinde bir trifloroasetik asit (1 ml) ve anisol (0,1 ml) karisimi ile kaldirilmis, ardindan eter ile çöktürme yapilmis ve beyaz kati seklinde 0,197 9 ürün (Çizelge 4'te (3)) elde edilmistir. Bu ara madde ((3); 0,197 9), aktive edilmis azit içeren dipeptit eklenmis PEG baglayici (Çizelge 4'te (5) ile eslestirilmistir) ve söz konusu aktivasyon, PEG baglayicinin (Çizelge Me (4); 0,203 9), metilen klorür (8 ml) içinde bis(4- nitrofenil) karbonat ( ile reaksiyona sokulmasi yoluyla yapilmistir. Flas kromatografisi, oamsi kati seklinde 0,2 9 azit türevli SN-38 ara ürününü (Çizelge Me (6)) vermistir. HPLC tut. süresi: 2,8 dak. Elektrosprey kütle spektrumu, yapiyla uyumlu bir sekilde, mle , m/e degerlerinde pikler göstermistir. Bu ara madde (Çizelge 4'te (6); and trifenilfosfin (0,012 9) varliginda, metilen klorür içinde 4-(N-maleimidometiI)-N-(2- propinil)sikl0hekzan-1-karboksamit (0,067 9) ile kIik sikloadisyonuna tabi tutulmustur. Reaksiyon karisiminin, 0,1 M EDTA ile islem içeren hazirligi, ardindan flas kromatografisi, sondan bir önceki ara maddeyi 0,08 9 açik sari köpük seklinde vermistir. HPLC : tR = 2,63 dak. Elektrosprey kütle spektrumu, yapiyla uyumlu bir sekilde, m/e degerlerinde pikler göstermistir. Son olarak, bu ara maddenin (0,08 9) korumasinin metilen klorür (2 ml) içinde bir trifloroasetik asit (0,2 ml), anisole (0,12 mi) ve su (0,06 ml) karisimi ile kaldirilmasi, ardindan eter ile çöktürme, açik sari toz seklinde 0,051 9 ürün, CL17-SN-38 (CL2E-SN-38 olarak da anilir) vermistir (verim = % 69). HPLC tut. süresi: 1,95 dakika; ~% 99 saflik. Elektrosprey kütle spektrumu, yapiyla uyumlu bir sekilde, m/e degerlerinde pikler göstermistir. izel e 4: CL2E-SN-38 Hazirlani i ..1 n) "i/ww# LÜ) M Üûßîoûuçß” , PEO biglapci i.. t N M“âubfrs:: qqnwüîooßvni Sîûgfjf ,, “` konjugasyonu Bu çalismalarda, anti-CEACAMS hümanize edilmis MAb, hMN-14, anti-CD22 hümanize edilmis MAb, hLL2, anti-CD2O hümanize edilmis MAb, hA20, anti-EGP- 1 hümanize edilmis MAb, hR87 ve anti-musin hümanize edilmis MAb, hPAM4 kullanilmistir. Her bir antikor, 45 dakika boyunca, 37 “C sica kIikta (banyo), 5,4 mM EDTA içeren, pH degeri 7,4 olan, 40 mM PBS içinde, 50 ila 70 kat mol fazlasiyla kullanilan ditiyotreitol (DTT) ile indirgenmistir. Indirgenmis `ürün, boyut dislama kromatografisi ve/veya diafiltrasyon ile saflastirilmis ve pH degeri 6,5 olan uygun bir tampon içine tampon degisimi yapilmistir. Tiyol içerigi, Ellman tayini ile belirlenmistir ve 6,5 ila 8,5 SH/lgG araliginda olmustur. Alternatif olarak, antikorlar, pH degeri 5-7 araliginda olan fosfat tamponu içinde Tris (2-karboksietil) fosfin (TCEP) ile indirgenmis ve ardindan yerinde konjugasyona tabi tutulmustur.

Indirgenen MAb, es çözücü olarak % 7-15 h/h oraninda DMSO kullanilarak, Ornek 1tdeki 'CL6-SN-38' ya da Ornek 2rdeki 'CL7-SN-38' ya da Ornek Siteki 'CL6- SN- sokulmus ve ortam sicakliginda 20 dakika boyunca ink'übe edilmistir. Konjugat, santrifüjlenmis SEC, hidrofobik bir kolondan pasaj ve son olarak ultrafiltrasyon- diafiltrasyon ile saflastirilmistir. Urün, standart degerler ile iliskilendirilerek 366 nm emilim ile SN-38 için analiz edilmistir ve protein konsantrasyonu, 280 nm'de emilimden çikarilmis ve bu dalga boyunca SN-38 emiliminin saçilmasi için düzeltilmistir. Bu sekilde, SN-38/MAb sübstit'üsyon oranlari belirlenmistir.

Saflastirilan konjugatlar, cam flakonlar içinde Iiyofilize formülasyonlar olarak saklanmis ve bu flakonlar, vakum altinda kapatilmis ve -20 CC dondurucuya konulmustur. Bu konjugatlardan bazilari için elde edilen ve tipik olarak 5 ila 7 arasinda olan SN-38 molar sübstit'üsyon oranlari (MSR), Tablo 2'de gösterilmistir.

Tablo 2: Bazi konjugatlarda SN-38/MAb Molar sübstit'i'isyon oranlari (MSR) MAb Konjugat MSR hMN-14-[CL2A-SN-38], Ornek loidaki ilaç-baglayici 6 1 kullanilarak , hMN-14-[CL6-SN-381, Ornek 1'deki ilaç-baglayici 6 8 kullanilarak , hMN- 14-[CL7-SN-381, Ornek 2*deki ilaç-baglayici 5 9 kullanilarak ' baglayici kullanilarak ' hMN-14-[CL2E-SN-38], Ornek 11tdeki ilaç-baglayici 5 9 kullanilarak , hRS7-CL2A-SN-38, Ornek 10'daki ilaç-baglayici 5 8 kullanilarak , hRSY-CLT-SN-38, Ornek 2tdeki ilaç-baglayici kullanilarak hRS7-CL7-SN-38 (Et), Ornek 4*teki ilaç-baglayici 6 1 kullanilarak , hA20-CL2A-SN-38, Ornek 10'daki ilaç-baglayici hA20 5,8 kullanilarak hLL2-CL2A-SN-38, Ornek 10'daki ilaç-baglayici kullanilarak hPAM4-CL2A-SN-38, Ornek 10tdaki ilaç-baglayici kullanilarak modellerinde in vivo terapötik etkililikler Subkütanöz insan pankreas ya da kolon tümörü ksenogreftleri tasiyan bagisikligi zayif atimik çiplak fareler (disi), ya CL2A-SN-38 konjugati veya kontrol konjugati ile tedavi edilmis ya da tedavi edilmeden birakilmistir. Spesifik konjugatlarin terapötik etkililikleri gözlenmistir. Sekil 1, bir Capan 1 pankreas tümör modeli göstermektedir ve bu modelde, hR87 (anti-EGP-1), hPAM4 (anti-musin) ve hMN- 14 (anti-CEACAMS) antikorlarinin spesifik CL2A-SN-38 konjugatlari, hA20-CL2A- SN-38 kontrol konjugatindan (anti-CDZO) ve tedavi edilmemis kontrolden daha iyi etkililikler göstermistir. Benzer sekilde, bir BXPCS insan pankreas kanseri modelinde, spesifik hRST-CL2A-SN-38, kontrol tedavilerinden daha iyi terapötik etkililik göstermistir (Sekil 2). Benzer sekilde, insan kolon karsinomunun agresif bir L8174T modelinde, spesifik hMN-14-CL2A-SN-38 ile tedavi, tedavi edilmeyenlere göre daha etkili olmustur (Sekil 3).

Ornek 16: Bir anti-gp120 MAb'in bir SN-38 konjugati ile tedavi yoluyla HIV enfeksiyonunun eliminasyonu HIV kilif proteini gp120rye hedeflenen bir MAb, P4/D10 gibi anti-gp120 antikoru.

Ornek 7'de tarif edilen kosullar kullanilarak indirgenmistir ve indirgene MAb, Ornek 2rde tarif edilen sekilde olan, ilac baglayici CL7-SN-38'in 20 kat molar fazlasiyla reaksiyona sokulmustur. Antikor basina ~8 ilaç molekülünün bir sübstitüsyonu ile bir anti-gp120-SN-38 konjugati elde edilmistir. Sözü edilen konjugat ile bir in vitro HIV inhibisyon tayini, enfekte olmayan Jurkat T hücreleri ve tamamen HIV ile enfekte Jurkat T hücrelerinin çesitli karisimlari kullanilarak (99,802 ila 95:5 oranlarinda) ve konjugat, spesifik olmayan hRS7-CL7-SN38 konjugat kontrolü, çiplak antikor ve HlV negatif serumun 100 ila 0,00001 mg/ml arasinda degisen seri dilüsyonlari ile islenerek yapilmistir. Bu sekilde islenen hücreler, yedi gün boyunca 37 °C sicaklikta RPMI 1640 kültür ortaminda inkübe edilmis ve ardindan ELISA testi ile HIV inhibisyonu bakimindan analiz edilmistir. Bu deney, spesifik ilaç konjugati ile HIV virüsünün hücre içinde yayilmasinin güçlü ve spesifik bir sekilde inhibe edildigini göstermektedir. Farelere, izolog HIV ile enfekte hücreler ile birlikte spesifik ve spesifik olmayan SN-38 konjugatlari tatbik edilerek in vivo etkililik test edilmistir. Bunun için, HIV-1/MuLV psodotip virüsü ile enfekte primer mürin splenositleri, fare gruplarina immunokonjugat tatbiki ile es zamanli olarak intraperitoneal yoldan transfer edilmistir. Peritoneal hücreler, 10 gün sonra hasat edilmistir. Kontrol farelerinde enfeksiyonlu HIV varligi görülürken, 100 ug ya da daha az anti-gp120-SN-38 konjugat ile tedavi edilen farelerde enfeksiyonlu HlV tespit edilmemistir. Kontrol konjugatlari ile tedavi edilen farelerde koruma görülmemistir.

Claims (1)

1. ISTEMLER Asagidaki formül ile gösterilen bir yapiya sahip olan, MAb-CL2A-SN-38 yapisal formülüne sahip olan bir konjugat olup: mâ“.wnvgümwnrwgu ,. NHz &gm -° tozu :lara-c; özelligi; kanser ya da bir habislik tedavisinde kullanima yönelik olmasi ve MAbrnin, kanser ya da habisligin habis bir hücresinde eksprese edilen bir epitop ya da bir antijeni hedef almasi ve kanserin, hematopoietik tümör, karsinom, sarkoma, melanoma ve gliyal tümör içeren grup içinden seçilmesidir. Istem 1'dki gibi kullanima yönelik konjugat olup, özelligi; MAb ile hedef alinan antijenin, CD74, CD22, EGP-1, musin, CDBöa-e, CEA, CEACAMS, CEACAM6, CSAp, alfa-fetoprotein, CC49, PSMA, PSAM-dimer, karbonik anhidraz IX, tenassin ve HLA-DR arasindan seçilmesidir. Istem 1 ya da 2*den herhangi birindeki gibi, tercihen Istem ?deki gibi kullanima yönelik konjugat olup, özelligi; kanser ya da habisligin habis bir hücresinde eksprese edilen antijenin, CD74, CD22, EGP- 1, musin, CDööa- e, CEA, CEACAMS, CEACAMG, CSAp, alfa-fetoprotein, C049, PSMA, PSAM-dimer, karbonik anhidraz IX, tenassin ve HLA-DR arasindan seçilmesidir. Istem 17deki gibi kullanima yönelik konjugat olup, özelligi; MAb'in, bir mürin antikoru, bir kimerik antikor, primatize bir antikor, hümanize edilmis bir antikor, bir insan antikoru, bir Fab antikor parçasi, bir Fab* antikor parçasi, bir F(ab)2 antikor parçasi, bir F(ab')2 antikor parçasi ve bir scFv antikor parçasi arasindan seçilmesidir. Istem 1'deki gibi kullanima yönelik konjugat olup, özelligi; MAb'in, bir kimerik, primatize, hümanize edilmis ya da insan monoklonal antikoru olmasi ve söz konusu antikorun, sabit alanlara ve bir insan IgG1 ya da bir insan lgG4 antikorunun bir eklem alanina sahip olmasidir. Istem 5'teki gibi kullanima yönelik konjugat olup, özelligi; MAb'in, sabit alanlara ve bir insan lgG4 antikorunun bir eklem alanina sahip olmasi ve eklemin serin 2284 yerinde bir prolin bulunmasidir. Istem Siteki gibi kullanima yönelik konjugat olup, özelligi; antikorun, sabit alanlara ve bir insan lgG1 antikorunun bir eklem alanina sahip olmasi ve bir ya da daha fazla Fc amino asidinin, antikorun kandaki yari ömrünü artirmak için mutasyona ugratilmasi ya da Fc*nin bir ya da daha fazla grubunun silinmis olmasi ya da antikorun kandaki yari ömrünü artirmak için bir ya da daha fazla seker grubu eklenmis olmasidir. Istem 3*deki gibi kullanima yönelik konjugat olup, özelligi; MAb'in; hLL1, CC49, hL243, D2/B ve hlmmu-31 arasindan seçilmesidir. Istem 1ideki gibi kullanima yönelik konjugat olup, özelligi; MAb'in, multispesifik olmasi ve hedef hücrede bulunan en az iki farkli antijeni ya da epitopu hedef almak için birden çok baglanma koluna sahip olmasi ve bir ya da daha fazla hedefleyici kolun, CPT'ye konjuge olmasidir. Istem 9*daki gibi kullanima yönelik konjugat olup, özelligi; multispesifik MAb*in, CD74, CD22, EGP- 1, musin, CD66a-e, CEA, CEACAM5, CEACAMö, CSAp, alfa-fetoprotein, CC49, PSMA, PSAM-dimer, karbonik anhidraz lX, tenassin ve HLA-DR arasindan seçilen bir antijeni hedef alan bir ya da daha fazla antikor içeren bispesifik ve/veya bivalent bir antikor yapisina sahip olmasidir. Istem 10'daki gibi kullanima yönelik konjugat olup, özelligi; bir ya da daha fazla antikorun; hLL1, hLL2, RFB4, hA19, hA20, hRS?, hPAM4, hMN-3, seçilmesidir. Istem 9 ila 11 arasindaki istemlerden herhangi birindeki gibi kullanima yönelik konjugat olup, özelligi; söz konusu multispesifik antikorun, karbonik anhidraz CD, VEGF, ED-B fibronektin, EGP-1, EGP-2, EGF reseptör (ErbBl), ErbBZ, ErbBS, Faktor H, FHL-1, Fit-3, folat reseptörü, Ga 733,GROB, HMGB-l, hipoksi uyarma faktörü (HIF), HM, gangliositler, HCG, HLA-DR, CDGöa-d, MAGE, mCRP, MCP-1, MIP-1A, MIP- 1B, makrofaj göç inhibe etme faktörü (MIF), MUC1, MUC2, MUC3, MUC4, MUC5, plasenta büyüme faktörü (PlGF), PSA (prostat-spesifik antijen), PSMA, PSMA dimer, PAM4 antijen, NCA-95, MCA-90, A3, A33, Ep-CAM. KS-1. Le(y), mesotelin, 8100, tenassin, TAC, Tn antijen, Thomas- Friedenreich antijenleri, tümor nekroz antijenleri, tümor anjiyogenez antijenleri, TNF- or, TRAIL reseptörü (R1 ve R2), VEGFR, RANTES, T101, kanser kök hücre antijenleri, tamamlayici faktörler C3, C3a, Cßb, C5a, CS ve bir onkojen ürün arasindan seçilen iki ya da daha fazla antijene baglanmasidir.