KR101955054B1 - 리소좀 축적증의 개선된 치료를 위해 재조합 리소좀 효소상에 표적화 펩티드를 커플링시키는 방법 - Google Patents

리소좀 축적증의 개선된 치료를 위해 재조합 리소좀 효소상에 표적화 펩티드를 커플링시키는 방법 Download PDF

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Abstract

제1 가교제를 사용하여 재조합 인간 리소좀 효소상의 아미노 (N)-말단 및 하나 이상의 리신 잔기를 변형하여 제1 가교제-변형 재조합 인간 리소좀 효소를 생성하고, 제2 가교제를 사용하여 변이체 IGF-2 펩티드상의 아미노 (N)-말단에서 짧은 링커내 첫 번째 아미노산을 변형하여 제2 가교제-변형 변이체 IGF-2 펩티드를 생성한 다음, 짧은 링커를 함유하는 제2 가교제-변형 변이체 IGF-2 펩티드에 제1 가교제-변형 재조합 인간 리소좀 효소를 접합함으로써 재조합 리소좀 효소에 접합된 표적화 펩티드를 제조하는 방법이 본원에 기재된다. 본원 개시의 방법을 사용하여 합성된 IGF2/CI-MPR 수용체에 대한 좀더 높은 친화도와 좀더 높은 세포 흡수를 보유함을 특징으로 하는 접합체가 또한 본원에 기재된다. 개시된 접합체를 사용하는 치료 방법이 또한 본원에 기재된다.

Description

리소좀 축적증의 개선된 치료를 위해 재조합 리소좀 효소상에 표적화 펩티드를 커플링시키는 방법 {METHODS FOR COUPLING TARGETING PEPTIDES ONTO RECOMBINANT LYSOSOMAL ENZYMES FOR IMPROVED TREATMENTS OF LYSOSOMAL STORAGE DISEASES}
관련 출원에 대한 상호-참조
본 출원은 2011년 5월 27일자로 출원된 미국 가출원 61/490,957을 우선권 주장하며, 이 가출원은 그 전문이 본원에 참고로 포함된다.
기술 분야
기술 분야는 펩티드 화학에 관한 것이다. 기술 분야는 또한 리소좀 축적증의 치료에 있어서 리소좀에 대한 재조합 리소좀 효소의 표적화에 관한 것이다.
리소좀은 단백질, 다양한 지질(당지질과 콜레스테롤 포함) 및 탄수화물이 분해되어 새로운 단백질, 막 성분 및 기타 분자의 합성을 가능케 해주는 그들의 1차 구성성분으로 재순환되는 특수화한 세포내 소기관이다. 리소좀은 또한 리소좀 활성을 증가시켜 다양한 단백질(예를 들어, 항체 및 인터페론)의 증가한 생합성을 위한 부가적인 아미노산을 제공하고 영양 고갈 또는 바이러스 감염의 스트레스성 기간에 대처하기 위하여 에너지 생산을 위한 영양분을 공급하는 자식작용(autophagy)으로 알려져 있는 적응성 세포 과정을 통하여 항상성과 세포 건강의 유지에 도움을 주기 위하여 세포에 의하여 이용된다. 각각의 대사과정은 특이적인 상주성(resident) 리소좀 효소에 의해 촉매된다. 유전자 돌연변이는 대사과정을 변경하여 임상 질환으로 이끄는 리소좀 생물학적 활성의 결핍을 초래할 수 있다. 리소좀 축적 장애(LSD)는 엔도좀/리소좀 구획내에 다양한 물질의 축적을 초래하는 특이적 리소좀 단백질에 대한 결핍에 의해 유발되는 대략 50가지 상이한 인간 대사질환의 일종이다. 이들 질환중 다수는 결핍성 리소좀 단백질 및 결과로서 생기는 대사 결함을 파악하기 위하여 잘 특성해석되어 있다. 예를 들어, 변경된 당지질 이화작용의 몇몇 LSD, 예컨대 고셔(Gaucher)병, 파브리(Fabry)병, 및 테이-삭스(Tay-Sachs)병/샌드호프(Sandhoff)병이 존재한다. 니만-픽 시(Neimann-Pick C)는 손상된 지질 및 콜레스테롤 대사를 특징으로 하는 반면에, 변경된 탄수화물 대사의 질환, 예컨대 글리코겐 축적증 타입 II(폼페(Pompe)병) 및 타입 III(코레이-포브스(Corey-Forbes)병) 또한 특성해석되었다. 그 밖의 LSD는 골 또는 세포외 매트릭스의 대사[예를 들어, 뮤코폴리사카라이드증(MPS I-VII), 고셔병] 및 단백질 대사회전(신경 세로이드 리포푸스신증; Batten 등)을 변경한다. LSD는 비교적 희귀하지만, 그들은 유효적절하게 치료받지 않는 경우 중증 만성병 및 종종 사망을 초래할 수 있다.
리소좀 축적증에 대한 알려진 치료법은 없지만, 다양한 LSD에 대하여 골수 및 제대혈 이식, 효소 대체 요법(ERT), 기질 감소 요법(SRT) 및 약리학적 셰프론 요법을 비롯한 다수의 상이한 치료법이 연구되어 왔다. 유전자 요법이 또한 개발중에 있지만 임상적으로 시험되지는 않았다. 이들 치료법 가운데 ERT가 가장 잘 확립되어 있으며 다방면에 걸친 ERT이 고셔병, 파브리병, 폼페병, MPS I, MPS II 및 MPS VI을 포함한 다양한 LSD의 치료용으로 승인되어 있는 반면에 1종의 SRT 약물이 고셔병의 치료용으로 승인되어 있다.
리소좀 축적증의 치료를 위한 ERT의 개념은 상당히 간단한 편인데, 여기서는 재조합 인간 리소좀 효소를 환자에게 투여하여 결핍된 생물학적 활성을 보충하고 임상증상을 개선한다. 그러나, 주로 세포 표면에서 또는 세포 외부에서 작용하는 다른 단백질 치료요법(예를 들어, 항-VEGF 및 그 밖의 항체, 에리트로포이에틴, 응고인자 등)과는 달리, 리소좀 효소는 세포 내부, 리소좀내에서 작용하여야 하고 그에 따라 외부에서 세포로의 진입 및 이들 내부 구획으로의 후속 전달을 위한 메커니즘을 요한다. 포유동물에서, 대부분의 가용성 리소좀 효소의 경우 단백질 골격상에서 특정 아스파라긴 잔기상의 분지형 탄수화물 구조(N-결합 올리고사카라이드; N-글리칸)는 번역후 변형되어 만노스 6-포스페이트(M6P)라 불리는 특수화한 탄수화물 구조를 형성한다. M6P는 막-결합 M6P 수용체를 통해 골지체로부터 리소좀으로의 신합성 리소좀 단백질의 수송과 식별을 위한 천연 생물학적 신호이다. 일 부류의 M6P 수용체(양이온-독립성 M6P 수용체; CI-MPR)는 또한 원형질막으로 순환하며 외인성 리소좀 단백질을 결합시키고 내재화하는 데에 기능적으로 활성을 띤다. CI-MPR은 (세포 밖으로의 분비를 통해) 세포에서 탈출한 리소좀 단백질을 재포획하도록 진화한 것으로 생각되며, 따라서 외인성 리소좀 단백질을 내재화하기 위한 표적화 메커니즘을 제공하며 다양한 LSD에 대한 효소 대체 요법을 위한 토대이다.
재조합 리소좀 효소 대체 요법은 일반적으로 안전한 것으로 나타났지만 임상증상을 감소시키는 그들의 유효성은 광범위하게 다양하다. 예를 들어: 격주 1 mg/kg 체중으로 복용한 파브라자임(Fabrazyme)TM(재조합 산 α-갈락토시다제 A; 겐자임 코포레이션(Genzyme Corp.)) ERT은 파브리병에서 내피세포로부터 축적 기질을 제거하기에 충분한 반면에, 격주로 복용한 40 mg/kg의 마이오자임(Myozyme)TM(재조합 인간 산 α-글루코시다제, rhGAA; 겐자임 코포레이션)은 폼페병에 보통 정도의 효과가 있을 뿐이다. 이종(disparate) 효능은 주로 M6P 함량의 차이에 원인이 있고 그에 따라 M6P의 낮은 수준은 불량한 약물 표적화 및 더 낮은 효능과 상관관계가 있다. 재조합 리소좀 효소의 제조는 그다지 간단치가 않은데 그 이유는 포유동물 발현 시스템에서 탄수화물 프로세싱, 특히 M6P의 수준을 제어하기가 지극히 어렵기 때문이다. 두 종류의 특수화한 골지 효소가 M6P 변형을 촉매하는데; N-아세틸글루코사민 포스포트랜스페라제는 특정 말단 만노스 잔기상에 포스페이트-결합 N-아세틸글루코사민을 부가하는 반면에 N-아세틸글루코사민-1-포스포디에스테르 α-N-아세틸글루코사미니다제("언커버링(Uncovering) 효소"로도 알려져 있음)는 커버링 N-아세틸글루코사민을 제거하여 M6P 신호를 드러낸다. 그러나, N-아세틸글루코사민 포스포트랜스페라제가 세포에서는 제한 인자이며(limiting), 이 생화학 반응은 다양한 리소좀 단백질에 대해 본질적으로 비능률적이다. 제조 과정중에 리소좀 단백질의 과발현은 이러한 문제점을 크게 악화시키며 M6P의 고도로 가변적인 양을 초래한다. 그 결과로서, 탄수화물 프로세싱은 전형적으로 불완전하고 M6P을 함유하는 N-글리칸, 비-M6P 구조의 고-만노스형 N-글리칸과 복합형 N-글리칸(분비 단백질에 전형적인)의 혼합물을 갖는 재조합 리소좀 효소의 생성을 초래한다. 일을 복잡하게 만드는 것으로, 사멸 또는 손상 세포는 세포 배양배지중으로 M6P을 제거하는 포스파타제와 같은 효소를 방출한다. 그 결과로서, 감소한 M6P 함량은 M6P 수용체에 대한 재조합 리소좀 효소의 결합 친화도를 저하시키고 그의 세포 흡수를 감소시키고 그에 따라 약효를 감소시킨다. 사멸 또는 손상 세포는 그 밖의 탄수화물(예를 들어, 시알산, 갈락토스 등)을 제거하여 일반적으로는 노출되지 않는 내부 탄수화물을 드러나게 하는 다른 글리코시다제를 방출하며 이들 N-글리칸은 변종으로서 손쉽게 확인된다. 이들 불완전 N-글리칸 구조는 순환으로부터 재조합 리소좀 단백질의 제거율을 증가시키는데 이 또한 약효를 감소시킬 수 있다. 따라서 감소한 효능을 벌충하기 위해서는 좀더 높은 약물 용량이 필요하다. 좀더 높은 약물 용량 요건은 그러나 다양한 부정적인 함의를 내포한다: (1) 좀더 높은 약물 용량은 이미 고가인 치료를 증가시킴으로써 비용이 엄청나게 들 수 있다; (2) 높은 약물 용량은 장기간의 주입시간을 요한다; (3) 다량의 순환 약물은 현저한 항체 반응(대부분의 폼페병 환자에서 보임)을 일으키고 다수의 환자는 주입중에 또한 알레르기 반응을 경험하였다. FDA에서는 마이오자임에 대하여 "검은색 테두리의 경고문구"를 내놓았으며 그 약물은 전형적으로 초기에는 매우 서서히 투여하지만 주입 경과중에 램프업(ramped up)된다. 이러한 전략은 알레르기 반응의 완화에는 도움을 주지만 12-hr 주입이 그다지 드문 일이 아닌 주입시간을 현저히 연장한다.
다양한 리소좀 ERT에 대한 약물 표적화를 개선하기 위한 하나의 잠재적 대책은 표적화 펩티드를 이용하여 전통적인 M6P 탄수화물 구조를 요구함이 없이 리소좀으로 ERT를 능률적으로 표적화한다. 이는 개념상으로는 실행 가능한데 이유는 양이온-독립성 M6P 수용체가 인슐린-유사 성장인자 2(IGF-2)라 불리는 소형 펩티드에 대한 독특한 결합 도메인을 함유하고 있기 때문이며 당해 수용체는 따라서 IGF-2/(IGF-2/CI-MPR)로서 알려져 있다. IGF-2/CI-MPR는 세포 표면상에 존재하고 거기에서 생물학적으로 활성을 띠기 때문에, 당해 수용체는 사실상 단독으로 외인성 M6P-보유 리소좀 단백질의 내재화를 담당한다. M6P 수용체의 다른 한 부류인 양이온-의존성 M6P 수용체(CD-MPR)는 세포내에서 리소좀 단백질의 수송에만 관여하는데, 그 이유는 CD-MPR는 세포 표면에서는 생물학적으로 활성을 띠지 않으며 IGF-2 펩티드 결합 도메인을 결여하고 있기 때문이다. IGF-2/CI-MPR은 M6P에 대하여 두 독립된 결합 부위(각각, 도메인 1-3 및 7-9)를 보유하고 있어서 모노-M6P N-글리칸(N-글리칸상에 1개 M6P 잔기)에는 보통의 친화도로 또는 비스-M6P N-글리칸(동일한 N-글리칸상에 2개 M6P 잔기)에는 대략 3000배 더 높은 친화도로 결합한다. 리소좀 단백질은 복합(M6P 없음), 모노- 및 비스-M6P N-글리칸의 혼합물을 함유하므로, IGF-2/CI-MPR에 대한 그들의 친화도는 M6P-보유 N-글리칸의 유형 및 양에 따라 광범위하게 변동한다. IGF-2 펩티드는 모노-M6P N-글리칸보다 대략 230,000배 더 높은 IGF-2/CI-MPR에 대한 최고 친화도를 갖는다. IGF-2/CI-MPR에 대한 다양한 리간드의 결합 친화도를 하기 표 1에 요약하였다.
Figure 112013117488670-pct00001
포유동물에서, IGF-2는 배발생중에 1차 성장 호르몬이다. 출생 후, IGF-2 수준은 비록 더 이상 성장을 조정하지는 않지만 비교적 일정하게 잔존한다(성장은 일생에 걸쳐서 인간 성장 호르몬에 의한 자극을 통해 IGF-1에 의해 조정된다). 출생 후 IGF-2의 역할은 잘 규명되어 있지는 않지만 당해 펩티드는 상처 치유 및 조직 복구를 보조하는 것으로 생각된다. IGF-2는 유리 IGF-2 펩티드의 수준을 조정하는 혈청 IGF 결합 단백질(IGFBP 1-6)에 의하여 순환중에 대부분 결합된다. 이들 IGFBP는 또한 인슐린과 IGF-1에도 결합하여 그들의 순환 수준을 조절한다. IGF-2/CI-MPR은 유리 IGF-2 펩티드에 대한 천연 제거 경로이다. IGF-2는 인슐린 및 IGF-1와 구조적으로 유사하기 때문에, IGF-2/CI-MPR와 비교하여 인슐린 수용체(약 100배 더 낮음) 및 IGF-1 수용체(약 230배 더 낮음)에 대한 친화도가 낮다. 이러한 특이성은 다양한 아미노산을 제거하거나 또는 특이적 아미노산 잔기(예를 들어, [Leu27] IGF-2 & [Leu43] IGF-2)를 치환시켜 IGF-2/CI-MPR에의 고-친화도 결합을 유지하되(표 1) 인슐린과 IGF-1 수용체에의 결합은 현저히 감소 또는 제거시킴으로써 상당히 향상될 수 있다. 마찬가지로, 초기 6개 아미노산 잔기가 결여되어 있는 IGF2 변이체 또는 위치 6에서 글루탐산 → 아르기닌으로의 치환은 IGFBP에 대한 IGF2 펩티드의 친화도를 현저히 감소시키는 것으로 나타났다. 중요하게는, IGF-2 펩티드는 임상 시험에서 안전한 것으로 나타났으며 특정 발육부전의 치료를 돕는 데 임상적으로 사용되고 있다. 이들 종합적인 데이터는 IGF-2 펩티드가 잠재적으로는 전통적인 M6P 탄수화물 구조 대신 표적화 모티프로서 사용되어 재조합 리소좀 효소의 세포 흡수와 리소좀으로의 수송을 촉진할 수 있음을 제시한다.
탄수화물 프로세싱 문제를 극복하면서 개선된 단백질 표적화를 위한 IGF-2-연결 단백질을 생성하는 전략을 개발할 필요성이 있다.
개요
본원에서는 제1 가교제를 사용하여 재조합 인간 리소좀 효소상의 아미노 (N)-말단 및 하나 이상의 리신 잔기를 변형하여 제1 가교제-변형 재조합 인간 리소좀 효소를 생성하는 단계; 제2 가교제를 사용하여 변이체 IGF-2 펩티드상의 아미노 (N)-말단에서의 짧은 연장 링커(short extension linker)의 첫 번째 아미노산을 변형하여 제2 가교제-변형 변이체 IGF-2 펩티드를 생성하는 단계; 및 이어서 제1 가교제-변형 재조합 인간 리소좀 효소를 짧은 연장 링커를 함유하는 제2 가교제-변형 변이체 IGF-2 펩티드에 접합시키는 단계를 포함하는, 재조합 리소좀 효소에 접합된 표적화 펩티드를 제조하는 방법이 제공된다.
또한 본원에서는 제1 가교제-변형 재조합 인간 리소좀 효소를 하나 이상의 제2 가교제-변형 변이체 IGF-2 펩티드에 접합시키는 단계를 포함하며, 여기서 제1 가교제-변형 재조합 리소좀 효소는 화학적으로 변형된 N-말단 및 하나 이상의 변형된 리신 잔기를 보유함을 특징으로 하는 재조합 리소좀 효소를 포함하고, 하나 이상의 제2 가교제-변형 변이체 IGF-2 펩티드는 아미노 (N)-말단에서의 짧은 링커에 변형된 아미노산을 포함하는 하나 이상의 변이체 IGF-2 펩티드를 포함하는 것인, 재조합 리소좀 효소에 접합된 표적화 펩티드를 제조하는 방법이 제공된다.
본원에서는 이종이관능성 가교제를 변이체 IGF-2 펩티드에 접합시키는 단계; 및 이어서 이종이관능성 가교제-변형 변이체 IGF-2 펩티드를 재조합 인간 리소좀 효소에 접합시키는 단계를 포함하는, 효소 대체 요법을 위한 분자의 제조 방법이 제공된다.
또한 본원에서는 이종이관능성 가교제를 재조합 인간 리소좀 효소에 접합시키는 단계; 및 이어서 이종이관능성 가교제-변형 재조합 인간 리소좀 효소를 변이체 IGF-2 펩티드에 접합시키는 단계를 포함하는, 효소 대체 요법을 위한 분자의 제조 방법이 제공된다.
본원에서는 또한 재조합 인간 리소좀 효소에 화학적으로 접합된 하나 이상의 변이체 IGF-2 펩티드를 포함하는 접합체가 제공된다.
재조합 인간 리소좀 효소에 접합된 이종이관능성 가교제-변형 변이체 IGF-2 펩티드를 포함하는 접합체가 또한 제공된다.
본원에서는 변형된 재조합 인간 리소좀 효소에 화학적으로 접합된 하나 이상의 변이체 IGF-2 펩티드를 포함하는 접합체를 리소좀 축적증을 앓고 있는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 상기 대상체를 치료하는 방법이 제공된다.
또한 본원에서는 재조합 인간 리소좀 효소에 접합된 이종이관능성 가교제-변형 변이체 IGF-2 펩티드를 포함하는 접합체를 리소좀 축적증을 앓고 있는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 상기 대상체를 치료하는 방법이 제공된다.
또한 본원에서는 재조합 리소좀 효소에 화학적으로 접합된 하나 이상의 변이체 IGF-2 펩티드 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 조성물을 폼페병, 파브리병, 고셔병, MPS I, MPS II, MPS VII, 테이-삭스병, 샌드호프병, α-만노시드축적증, 또는 월만(Wolman)병의 치료에 충분한 양으로 그의 치료를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 상기 질환을 앓고 있는 환자를 치료하는 방법이 제공된다.
재조합 인간 리소좀 효소에 접합된 이종이관능성 가교제-변형 변이체 IGF-2 펩티드 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 조성물을 폼페병, 파브리병, 고셔병, MPS I, MPS II, MPS VII, 테이-삭스병, 샌드호프병, α-만노시드축적증, 또는 월만병의 치료에 충분한 양으로 그의 치료를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 상기 질환을 앓고 있는 환자를 치료하는 적합한 방법이 또한 제공된다.
본원에서는 서열 1을 포함하는, 이. 콜라이에서의 발현에 최적화된 변이체 IGF-2 펩티드를 코딩하는 DNA 서열이 제공된다.
또한 본원에서는 서열 2를 포함하는, 변이체 IGF-2 펩티드를 나타내는 아미노산 서열이 제공된다.
서열 3을 포함하는, 연장 링커를 나타내는 아미노산 서열이 또한 제공된다.
본 발명의 전술한 측면 및 그 밖의 측면은 첨부 도면과 함께 고려할 때 본 발명의 하기 상세한 설명으로부터 명백해진다. 발명의 설명 목적상, 도면에는 현재 바람직한 실시양태가 도시되어 있지만, 본 발명은 개시된 특정 수단에 한정되지 않는 것으로 이해된다. 도면은 반드시 일정 비례로 제도되는 것은 아니다.
도 1(A)는 히드라지드-변형 리소좀 효소와 벤즈알데히드-변형 변이체 IGF2 펩티드의 접합에 대한 개략도를 도시한다. 당해 접합 반응에 앞서, 리소좀 효소는 리소좀 효소상의 아미노 말단과 하나 이상의 리신 잔기를 변형하여 화학적 활성 히드라지드 관능기를 도입하는 N-숙신이미딜 6-히드라지노니코틴아미드 아세톤(S-Hynic)과 같은 제1 가교제로 화학적으로 변형된다. 개별 반응에서, 변이체 IGF2 펩티드중 짧은 연장 링커 영역내 N-말단 아미노산 잔기는 PEG4-펜타플루오로벤진 벤조에이트(PEG4-PFB)와 같은 제2 가교제로 화학적으로 변형하여 특허출원에 기재된 바와 같이 벤즈알데히드 관능기를 도입시킨다. 히드라지드-변형 리소좀 효소와 벤즈알데히드-변형 변이체 IGF2 펩티드의 정제 후, 이들 단백질을 아닐린을 함유하는 산성 완충제에서 함께 인큐베이션하여 IGF2 펩티드-접합 리소좀 효소를 형성한다. 당해 접합 반응에서, 화학적 활성 히드라지드 화학기는 알데히드기와 반응하여 안정한 공유 (히드라존) 결합을 형성한다. 도 1(B)는 사용될 수 있는 다른 적합한 제1 가교제(숙신이미딜 6-히드라지노니코티네이트 아세톤(S-Hynic), 숙신이미딜 4-히드라지도테레프탈레이트 히드로클로라이드(SHTH), 숙신이미딜 4-히드라지늄 니코티네이트 히드로클로라이드(SHNH), 및 N-히드록시숙신이미드 에스테르-(PEG)n-히드라지드; 여기서 n= 3 내지 24개 PEG 단위) 및 제2 가교제(PEG4-펜타플루오로벤진 벤조에이트(PEG4-PFB), 숙신이미딜 4-포르밀벤조에이트(SFB), 및 C6-숙신이미딜 4-포르밀벤조에이트(C6-SFB))를 도시한다.
도 2(A)는 스타우딩거(Staudinger) 연결반응을 통한 포스핀-변형 리소좀 효소와 아지드-변형 변이체 IGF2 펩티드의 접합에 대한 개략도를 도시한다. 당해 접합 반응에 앞서, 리소좀 효소는 리소좀 효소상의 아미노 말단과 하나 이상의 리신 잔기를 변형하여 화학적 활성 포스핀 관능기를 도입하는 술포-NHS-포스핀과 같은 제1 가교제로 화학적으로 변형된다. 개별 반응에서, 변이체 IGF2 펩티드중 짧은 연장 링커 영역내 N-말단 아미노산 잔기는 NHS-(PEG)n-아지드와 같은 제2 가교제로 화학적으로 변형되어 아지드 관능기를 도입시킨다. 포스핀-변형 리소좀 효소와 아지드-변형 변이체 IGF2 펩티드의 정제 후, 이들 단백질을 약산성 완충제에서 함께 인큐베이션하여 IGF2 펩티드-접합 리소좀 효소를 형성한다. 당해 접합 반응에서, 화학적 활성 아지드 화학기는 포스핀기와 반응하여 안정한 공유 (아미드) 결합을 형성한다. 도 2(B)는 사용될 수 있는 다른 적합한 제1 가교제(N-히드록시숙신이미드 에스테르-포스핀(NHS-포스핀) 및 술포-N-히드록시숙신이미드 에스테르-포스핀(술포-NHS-포스핀) 및 제2 가교제(N-히드록시숙신이미드 에스테르-아지드(NHS-아지드), N-히드록시숙신이미드 에스테르-(PEG)n-아지드; 여기서 n=3 내지 24개 PEG 단위, 및 NHS-PEG3-S-S-아지드)를 도시한다.
도 3(A)는 클릭(Click) 화학반응을 통한 아세틸렌-변형 리소좀 효소와 아지드-변형 IGF2 펩티드의 접합에 대한 개략도를 도시한다. 당해 접합 반응에 앞서, 리소좀 효소는 리소좀 효소상의 아미노 말단과 하나 이상의 리신 잔기를 변형하여 화학적 활성 아세틸렌 관능기를 도입하는 NHS-(PEG)n-아세틸렌과 같은 제1 가교제로 화학적으로 변형된다. 개별 반응에서, 변이체 IGF2 펩티드중 짧은 연장 링커 영역내 N-말단 아미노산 잔기는 NHS-(PEG)n-아지드와 같은 제2 가교제로 화학적으로 변형되어 아지드 관능기를 도입시킨다. 아세틸렌-변형 리소좀 효소와 아지드-변형 IGF2 펩티드의 정제 후, 이들 단백질을 약산성 완충제에서 구리(I) 이온과 함께 인큐베이션하여 IGF2 펩티드-접합 리소좀 효소를 형성한다. 당해 접합 반응에서, 화학적 활성 아지드 화학기는 알킨기와 반응하여 안정한 공유 (트리아졸) 결합을 형성한다. 도 3(B)는 사용될 수 있는 다른 적합한 제1 가교제(N-히드록시숙신이미드 에스테르-테트라옥사펜타데칸 아세틸렌(NHS-PEG4-아세틸렌), N-히드록시숙신이미드 에스테르-(PEG)n-아세틸렌; 여기서 n=3 내지 24개 PEG 단위, 및 NHS-PEG3-S-S-아세틸렌) 및 제2 가교제(N-히드록시숙신이미드 에스테르-아지드(NHS-아지드), N-히드록시숙신이미드 에스테르-(PEG)n-아지드; 여기서 n=3 내지 24개 PEG 단위, 및 NHS-PEG3-S-S-아지드)를 도시한다.
도 4(A)는 m-말레이미도벤조일-N-히드록시숙신이미드 에스테르(MBS)와 같은 단일 가교제를 사용하는 리소좀 효소와 IGF2 펩티드의 접합 개략도를 도시한다. 제1 반응에서, 화학 반응성 말레이미드기는 IGF2 펩티드 변이체중 C-말단 시스테인 잔기의 유리 술프히드릴기와 반응한다. 이어서 MBS-변형 IGF2 펩티드는 정제된 다음, 화학 반응성 N-히드록시숙신이미드 에스테르기와 리소좀 효소상의 아미노 말단과 하나 이상의 리신 잔기의 가교를 통해 리소좀 효소에 접합시켜 안정한 공유 (아미드) 결합을 형성한다. 도 4(B)는 사용될 수 있는 다른 적합한 가교제(m-말레이미도벤조일-N-히드록시숙신이미드 에스테르(MBS), 술포-m-말레이미도벤조일-N-히드록시숙신이미드 에스테르(술포-MBS), 및 술포숙신이미딜-4-(N-말레이미도메틸)시클로헥산-1-카르복실레이트(SMCC))를 도시한다.
도 5는 C4 역상 크로마토그래피에 의한 IGF2 펩티드의 특성해석을 도시한다. 4.6 x 150 mm C4 역상 분석 칼럼을 야생형 및 변이체 IGF2 펩티드의 순도와 단백질 구조 평가에 사용하였다. 펩티드 샘플을 0.1% 트리플루오르아세트산(TFA)과 25% 아세토니트릴로 평형시킨 C4 칼럼상에 로딩하였다. 2분 후, 칼럼을 25-35% 아세토니트릴 직선 구배를 사용하여 10 min에 걸쳐서 전개시켰다. 도 5(A)는 재조합 야생형 인간 IGF2 펩티드가 30% 아세토니트릴에 상응하는 대략 7.5 min에서 용출함을 도시한다. 도 5(B)는 재조합 변이체 인간 IGF2 펩티드 또한 30% 아세토니트릴에 상응하는 대략 7.5 min에서 용출함을 도시한다. 도 5(C)는 PEG4-PFB 변형 변이체 인간 IGF2 펩티드가 31% 아세토니트릴에 상응하는 대략 8 min에서 용출함을 도시한다. 이들 데이터는 야생형 및 변이체 IGF2 펩티드는, 그들이 C4 역상 크로마토그래피상에서 거의 동일하게 행동하므로, 매우 유사한 단백질 구조를 보유함을 표시한다. PEG4-PFB 변형 변이체 인간 IGF2 펩티드에 대한 체류시간의 변동은 변이체 IGF2 펩티드가 C4 칼럼상에서의 그의 상호작용을 변경시킨 화학적 가교제로 완전히 변형되었음을 표시한다.
도 6은 수용체 결합과 세포 흡수에 대한 변이체 IGF2 펩티드-접합 rhGAA의 평가를 도시한다. 변이체 IGF2 펩티드를 가교제 PEG4-PFB로 변형하고 그 다음에 S-Hynic-변형 rhGAA에 커플링시켰다. 생성되는 변이체 IGF2 펩티드-접합 rhGAA("vIGF2-rhGAA"로 명명)을 이어서 크기 배제 크로마토그래피로 정제하였다. 변이체 IGF2 펩티드의 화학적 접합이 IGF2/CI-MPR 수용체에 대한 rhGAA 친화도를 개선하는지를 측정하기 위하여, 비-접합 rhGAA와 vIGF2-rhGAA의 결합을 수용체 플레이트 결합 검정으로 다양한 단백질 농도에서(0.012-42 nM rhGAA에 상응하는 0.003-10 ㎍/ml) 직접 비교하였다(도 6(A)). 이들 IGF2/CI-MPR 수용체 플레이트 결합 검정에서 시험된 모든 단백질 농도에서 비-접합 rhGAA에 대해서 보다는 vIGF2-rhGAA에 대해서 현저히 더 많은 양의 포획된 효소 활성이 관찰되었다. 이들 결과는 IGF2 펩티드의 접합이 IGF2/CI-MPR 수용체에 대한 rhGAA 친화도를 증가시킴을 확인시켜 준다. 더욱이, 유리 야생형 IGF2 펩티드의 포함은 이들 플레이트 검정에서 vIGF2-rhGAA 포획을 대폭 감소시켰으며, 이는 결합이 IGF2 펩티드에 좌우되었음을 표시한다. 이들 수용체 플레이트 검정에서 vIGF2-rhGAA 결합을 완전히 제거하기 위해서는 훨씬 더 많은 양의 유리 야생형 IGF2 펩티드가 요구될 것 같다. 증가한 수용체 친화도가 vIGF2-rhGAA에 대한 개선된 세포 흡수를 이끌어낼 것인지를 측정하기 위하여, 세포외 비-접합 rhGAA 및 vIGF2-rhGAA의 내재화를 L6 래트 골격근 근모세포에서 평가하였다(도 6(B)). vIGF2-rhGAA는 시험된 모든 단백질 농도에서 L6 근모세포에서 비-접합 rhGAA보다 실질적으로 더 양호하게 내재화된 것으로 나타났다. 이들 결과는 표적 세포에서 외인성 리소좀 효소의 내재화와 전달 증진을 위한 수용체 결합 친화도를 개선하는 기능적 이득을 입증해 보여준다.
도 7은 변이체 IGF2 펩티드-접합 I2S의 특성해석을 도시한다. 변이체 IGF2 펩티드를 가교제 NHS-PEG4-아지드로 변형하고 그 다음에 포스핀-변형 I2S에 커플링시켰다. 생성되는 변이체 IGF2 펩티드-접합 I2S("vIGF2-I2S"로 명명)을 크기 배제 크로마토그래피로 정제하였다. 변이체 IGF2 펩티드의 화학적 접합이 IGF2/CI-MPR 수용체에 대한 I2S 친화도를 개선하는지를 측정하기 위하여, 비-접합 I2S와 vIGF2-I2S의 결합을 수용체 플레이트 결합 검정으로 다양한 단백질 농도(0.03-10 ㎍/ml)에서 직접 비교하였다(도 7(A)). 이들 IGF2/CI-MPR 수용체 플레이트 결합 검정에서 시험된 모든 단백질 농도에서 비-접합 I2S보다 실질적으로 더 많은 양의 vIGF2-I2S가 포획되었다. 이들 수용체 결합 결과는 vIGF2-rhGAA에 대한 것들과 일치하며, 동일한 변이체 IGF2 펩티드를 상이한 리소좀 효소에 화학적으로 커플링시켜 IGF2/CI-MPR 수용체에 대한 그들의 결합 친화도를 증가시킬 수 있음을 보여준다. 다수의 변이체 IGF2 펩티드가 리소좀 효소에 화학적으로 접합될 수 있는지 여부를 측정하기 위하여, 비-접합 I2S와 vIGF2-I2S의 분자량을 나트륨 도데실술페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE)에 의하여 비교하였다(도 7(B)). 비-접합 I2S는 SDS-PAGE상에서 대략 80 kDa(레인 1)의 겉보기 분자량을 가진 반면에 vIGF2-I2S는 대략 120 kDa(레인 2)의 훨씬 더 높은 겉보기 분자량을 가졌다. 이들 데이터는 변이체 IGF2 펩티드에 대한 분자량이 겨우 약 8 kDa(레인 3)에 불과하므로, 대략 40 kDa의 증가를 위해서는 다수의 변이체 IGF2 펩티드가 I2S에 화학적으로 접합되었음이 분명함을 나타낸다. 이들 결과는 또한, SDS-PAGE상에서의 광역 단백질 밴드에 의해 입증되듯이 I2S이 다양한 양의 변이체 IGF2 펩티드를 가지고서 vIGF2-I2S로 완전히 전환되었음을 보여준다.
당해 주제는 본원 개시의 일부를 형성하는 첨부 도면 및 실시예와 관련하여 취한 하기 상세한 설명을 참조하여 좀더 수월하게 이해될 수 있다. 본 발명은 본원에 기재되고/되거나 예시된 특정 장치, 방법, 적용, 조건 또는 파라미터에 한정되지 않으며, 본원에 사용되는 용어는 단지 예로서 특정 실시양태의 설명을 목적으로 하는 것이지 청구 발명을 제한하는 것으로 의도되지 않음을 이해하여야한다.
또한, 첨부 특허청구범위를 포함하여 명세서에서 사용되는 바와 같이, 단수형 "a", "an" 및 "the"는 복수형을 포함하며, 특정 수치에 대한 언급은, 문맥상 명백히 달리 지시하지 않는 한, 적어도 그 특정 값을 포함한다. 본원에서 사용되는 용어 "복수개"는 1개보다 많음을 의미한다. 값의 범위가 표현될 때, 또 다른 실시양태는 하나의 특정 값으로부터 및/또는 다른 하나 특정 값까지를 포함한다. 마찬가지로, 값이 근사치로서 표현될 때, 선행사 "약(about)"의 사용에 의하여, 그 특정 값은 또 다른 실시양태를 형성하는 것으로 이해된다. 모든 범위는 포함성이고(inclusive) 조합가능하다.
실시예는 발명의 좀더 상세한 이해에 도움을 주기 위해 제공된다. 사용된 특정 재료, 프로토콜 및 조건은 발명의 좀더 상세한 설명적인 것으로 의도되며 그의 정당한 범위를 제한하는 것으로 이해되지 않아야 한다.
표적화 펩티드를 재조합 리소좀 효소에 접합시키는 적합한 방법은 제1 가교제를 사용하여 재조합 인간 리소좀 효소상의 아미노 (N)-말단 및 하나 이상의 리신 잔기를 변형하여 제1 가교제-변형 재조합 인간 리소좀 효소를 생성하는 단계, 제2 가교제를 사용하여 변이체 IGF-2 펩티드에 선행하는 짧은 연장 링커 영역의 아미노 (N)-말단을 변형하여 제2 가교제-변형 변이체 IGF-2 펩티드를 생성하는 단계, 및 이어서 제1 가교제-변형 재조합 인간 리소좀 효소를 짧은 연장 링커를 함유하는 제2 가교제-변형 변이체 IGF-2 펩티드에 접합시키는 단계를 포함한다.
표적화 펩티드를 재조합 리소좀 효소에 접합시키는 다른 적합한 방법은 제1 가교제-변형 재조합 인간 리소좀 효소를 하나 이상의 제2 가교제-변형 변이체 IGF-2 펩티드에 접합시키는 단계를 포함하며, 여기서 제1 가교제-변형 재조합 리소좀 효소는 화학적으로 변형된 N-말단 및 하나 이상의 변형된 리신 잔기를 보유함을 특징으로 하는 재조합 리소좀 효소를 포함하고, 하나 이상의 제2 가교제-변형 변이체 IGF-2 펩티드는 짧은 연장 링커-선행 IGF2 펩티드의 변형된 N-말단 아미노산을 포함하는 하나 이상의 변이체 IGF-2 펩티드를 포함한다.
적합한 짧은 연장 링커는 5 내지 20 아미노산 잔기 길이일 수 있다. 짧은 연장 링커는 또한 약 10 아미노산 길이일 수 있다. 적합한 짧은 연장 링커는 서열 3의 아미노산 서열로 나타낼 수 있다. 다른 적합한 짧은 연장 링커는 5-아미노산 가요성 GS 연장 링커(글리신-글리신-글리신-글리신-세린), 2개 가요성 GS 링커를 포함하는 10-아미노산 연장 링커, 3개 가요성 GS 링커를 포함하는 15-아미노산 연장 링커, 4개 가요성 GS 링커를 포함하는 20-아미노산 연장 링커, 또는 그들의 임의 조합을 사용하여 제공될 수 있다.
재조합 리소좀 효소에 접합된 표적화 펩티드를 제조하는 적합한 방법에서 제1 가교제-변형 재조합 리소좀 효소는 제1 가교제를 사용하여 변형되는 화학적으로 변형된 N-말단 및 하나 이상의 변형된 리신 잔기를 보유함을 특징으로 하는 재조합 인간 리소좀 효소를 사용하는 것을 포함한다. 적합한 재조합 인간 리소좀 효소는 인간 산 α-글루코시다제(rhGAA), 인간 산 α-갈락토시다제 A(GLA), 인간 산 β-글루쿠로니다제(GUS), 인간 산 α-이두로니다제 A(IduA), 인간 산 이두로니데이트 2-술파타제(I2S), 인간 β-헥소스아미니다제 A(HexA), 인간 β-헥소스아미니다제 B(HexB), 인간 산 α-만노시다제 A, 인간 β-글루코세레브로시다제(GlcCerase), 인간 산 리파제(LPA), 및 그들의 임의 조합을 포함한다. 재조합 인간 리소좀 효소상 하나 이상의 리신 잔기가 또한 변형될 수 있다. 적합한 제1 가교제는 반응성 알데히드기를 함유하는 표적화 펩티드에의 화학적 커플링을 위한 리소좀 효소상에 히드라지드 모이어티를 도입하기 위하여 숙신이미딜 6-히드라지노니코티네이트 아세톤(S-Hynic), 술포-숙신이미딜 6-히드라지노니코티네이트 아세톤(술포-S-Hynic), 또는 C6-숙신이미딜 6-히드라지노-니코틴아미드(C6-S-Hynic), 또는 숙신이미딜 4-히드라지도테레프탈레이트 히드로클로라이드(SHTH), 또는 숙신이미딜 4-히드라지늄 니코티네이트 히드로클로라이드(SHNH) 또는 그들의 임의 조합을 포함한다. 이와 달리, 리소좀 효소는 반응성 아지드기를 함유하는 화학적으로 변형된 표적화 펩티드에 화학적으로 변형된 리소좀 효소를 커플링시키기 위하여 N-히드록시숙신이미드 에스테르-포스핀(NHS-포스핀), 술포-NHS-포스핀, N-히드록시숙신이미드 에스테르-테트라옥사펜타데칸 아세틸렌(NHS-PEG4-아세틸렌), 다른 NHS-(PEG)n-아세틸렌 이종이관능성 가교제(여기서, "n"은 3 내지 24개 불연속 PEG 단위 범위일 수 있다), 또는 절단가능한 이종이관능성 가교제, 예컨대 NHS-PEG3-S-S-아세틸렌, 또는 디플루오로시클로옥틴(DIFO) 및 디벤조시클로옥틴(DIBO)과 같은 시클로옥틴을 함유하는 이종이관능성 가교제 또는 그들의 임의 조합으로 변형될 수 있다. 표적화 펩티드의 변형을 위한 적합한 제2 가교제는 반응성 히드라지드기를 함유하는 리소좀 효소에의 접합을 위한 표적화 펩티드상에 반응성 알데히드기를 도입하기 위하여 PEG4-펜타플루오로벤젠-4-포르밀벤조에이트(PEG4-PFB), 또는 숙신이미딜 4-포르밀벤조에이트(SFB), 또는 C6-숙신이미딜 4-포르밀벤조에이트(C6-SFB)를 포함한다. 표적화 펩티드는 또한, 반응성 포스핀, 또는 알킨 또는 시클로옥틴기를 함유하는 리소좀 효소에의 접합을 위한 표적화 펩티드상에 반응성 아지드기를 도입하기 위하여 이종이관능성 가교제, 예컨대 N-히드록시숙신이미드 에스테르-아지드(NHS-아지드) 또는 N-히드록시숙신이미드 에스테르-테트라옥사펜타데칸-아지드(NHS-PEG4-아지드) 또는 다른 NHS-(PEG)n-아지드 가교제(여기서, n은 3 내지 24개 불연속 PEG 단위 범위일 수 있다), 또는 절단가능한 이종이관능성 가교제, 예컨대 NHS-PEG3-S-S-아지드, 또는 그들의 임의 조합으로 변형될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 제1 가교제는 N-숙신이미딜 6-히드라지노니코티네이트 아세톤(S-Hynic)일 수 있고 제2 가교제는 PEG4-펜타플루오로벤젠-4-포르밀벤조에이트(PEG4-PFB)일 수 있다.
재조합 인간 리소좀 효소상의 N-말단 및 하나 이상의 리신 잔기는 1급 아민 부재하에 약 pH 7.3의 완충제에서 약 실온에서 약 30분 동안 변형될 수 있다. 재조합 인간 리소좀 효소는 재조합 인간 리소좀 효소상의 N-말단 및 리신 잔기가 변형된 후 산성 완충제내로 신속히 교환될 수 있다. 예를 들어, 산성 완충제는 50 mM 나트륨 아세테이트이고 약 pH 5.0일 수 있다. 산성 완충제는 0.1M 나트륨 아세테이트, 칼륨 아세테이트, 나트륨 시트레이트, MES, 나트륨 포스페이트 또는 칼륨 포스페이트이고 약 pH 5.0일 수 있다. 산성 완충제내로의 교환은 크기 배제 크로마토그래피를 이용하여 수행될 수 있고, 산성 완충제내로의 교환은 투석을 이용하여 수행될 수 있다.
짧은 링커를 함유하는 제2 가교제-변형 변이체 IGF-2 펩티드는 제1 가교제-변형 재조합 인간 리소좀 효소에의 접합 전에 정제될 수 있다. 정제는 겔 여과, 투석 또는 역상 크로마토그래피를 이용하여 수행될 수 있다.
짧은 링커를 함유하는 알데히드-변형 변이체 IGF-2 펩티드에 히드라지드-변형 재조합 인간 리소좀 효소의 접합은 아닐린의 존재하에 약 pH 5.0의 산성 완충제에서 수행될 수 있다. 짧은 링커를 함유하는 아지드-변형 변이체 IGF-2 펩티드에 포스핀- 또는 아세틸렌- 또는 시클로옥틴-변형 재조합 인간 리소좀 효소의 접합은 pH 5.0 내지 7.0 범위의 완충제에서 수행될 수 있다. 짧은 링커 접합체를 함유하는 재조합 인간 리소좀 효소-변형 IGF-2 펩티드는 크기 배제 크로마토그래피 또는 투석을 이용하여 정제될 수 있다.
적합한 제1 가교제는 반응성 알데히드기를 함유하는 표적화 펩티드에의 화학적 커플링을 위한 리소좀 효소상에 히드라지드 모이어티를 도입하기 위하여 숙신이미딜 6-히드라지노니코티네이트 아세톤(S-Hynic), 술포-숙신이미딜 6-히드라지노니코티네이트 아세톤(술포-S-Hynic), 또는 C6-숙신이미딜 6-히드라지노-니코틴아미드(C6-S-Hynic), 또는 숙신이미딜 4-히드라지도테레프탈레이트 히드로클로라이드(SHTH), 또는 숙신이미딜 4-히드라지늄 니코티네이트 히드로클로라이드(SHNH) 또는 그들의 임의 조합을 포함한다. 이와 달리, 리소좀 효소는 반응성 아지드기를 함유하는 표적화 펩티드에 이들 화학적으로 변형된 리소좀 효소를 커플링시키기 위하여 N-히드록시숙신이미드 에스테르-포스핀(NHS-포스핀), 술포-NHS-포스핀, N-히드록시숙신이미드 에스테르-테트라옥사펜타데칸 아세틸렌(NHS-PEG4-아세틸렌), 다른 NHS-(PEG)n-아세틸렌 이종이관능성 가교제(여기서, "n"은 3 내지 24개 불연속 PEG 단위 범위일 수 있다), 또는 절단가능한 이종이관능성 가교제, 예컨대 NHS-PEG3-S-S-아세틸렌, 또는 디플루오로시클로옥틴(DIFO) 및 디벤조시클로옥틴(DIBO)과 같은 시클로옥틴을 함유하는 이종이관능성 가교제 또는 그들의 임의 조합으로 변형될 수 있다. 표적화 펩티드를 변형하기 위한 적합한 제2 가교제는 PEG4-펜타플루오로벤젠-4-포르밀벤조에이트(PEG4-PFB), 또는 숙신이미딜 4-포르밀벤조에이트(SFB), 또는 C6-숙신이미딜 4-포르밀벤조에이트(C6-SFB), 또는 N-히드록시숙신이미드 에스테르-테트라옥사펜타데칸-아지드(NHS-PEG4-아지드), 또는 다른 NHS-(PEG)n-아지드 이종이관능성 가교제(여기서, "n"은 3 내지 24개 불연속 PEG 단위 범위일 수 있다), 또는 절단가능한 이종이관능성 가교제, 예컨대 NHS-PEG3-S-S-아지드를 포함한다. 또 다른 적합한 실시양태에서, 제1 가교제는 N-히드록시숙신이미드 에스테르-포스핀(NHS-포스핀) 또는 술포-NHS-포스핀일 수 있고 제2 가교제는 N-히드록시숙신이미드 에스테르-테트라옥사펜타데칸-아지드(NHS-PEG4-아지드)일 수 있다. 또 다른 적합한 실시양태에서, 제1 가교제는 N-히드록시숙신이미드 에스테르-테트라옥사펜타데칸 아세틸렌(NHS-PEG4-아세틸렌) 또는 다른 NHS-(PEG)n-아세틸렌 이종이관능성 가교제(여기서, "n"은 3 내지 24개 PEG 단위 범위일 수 있다), 또는 절단가능한 이종이관능성 가교제, 예컨대 NHS-PEG3-S-S-아세틸렌일 수 있고, 제2 가교제는 N-히드록시숙신이미드 에스테르-테트라옥사펜타데칸-아지드(NHS-PEG4-아지드)일 수 있다. 또 다른 적합한 실시양태에서, 제1 가교제는 시클로옥틴, 예컨대 디플루오로시클로옥틴(DIFO) 및 디벤조시클로옥틴(DIBO)일 수 있고, 제2 가교제는 N-히드록시숙신이미드 에스테르-테트라옥사펜타데칸-아지드(NHS-PEG4-아지드)일 수 있다.
재조합 인간 리소좀 효소상의 N-말단 및 하나 이상의 리신 잔기는 1급 아민이 결여되어 있는 약 pH 7.3의 완충제에서 약 실온에서 약 30분 동안 변형될 수 있다. 재조합 인간 리소좀 효소는 재조합 인간 리소좀 효소상의 N-말단 및 리신 잔기가 변형된 후 산성 완충제내로 신속히 교환될 수 있다. 적합한 산성 완충제는 50 mM 나트륨 아세테이트를 포함하고 약 pH 5.0이다. 산성 완충제는 0.1M 나트륨 아세테이트, 칼륨 아세테이트, 나트륨 시트레이트, MES, 나트륨 포스페이트 또는 칼륨 포스페이트이고 약 pH 5일 수 있다. 산성 완충제내로의 교환은 크기 배제 크로마토그래피 또는 투석을 이용하여 적당하게 수행될 수 있다.
짧은 링커를 함유하는 제2 가교제-변형 변이체 IGF-2 펩티드는 제1 가교제-변형 재조합 인간 리소좀 효소에의 접합에 앞서 겔 여과, 투석 또는 역상 크로마토그래피를 이용하여 정제될 수 있다. 짧은 링커를 함유하는 알데히드-변형 변이체 IGF-2 펩티드에의 히드라지드-변형 재조합 인간 리소좀 효소의 접합은 아닐린의 존재하에 약 pH 5.0의 산성 완충제에서 수행될 수 있다. 짧은 링커를 함유하는 아지드-변형 변이체 IGF-2 펩티드에의 포스핀- 또는 아세틸렌- 또는 시클로옥틴-변형 재조합 인간 리소좀 효소의 접합은 pH 5.0 내지 7.0 범위의 완충제에서 수행될 수 있다. 짧은 링커 접합체를 함유하는 재조합 인간 리소좀 효소-변형 IGF-2 펩티드는 크기 배제 크로마토그래피 또는 투석을 이용하여 정제될 수 있다.
접합 후, 짧은 링커를 함유하는 재조합 인간 리소좀 효소-변이체 IGF-2 펩티드는 크기 배제 크로마토그래피 또는 투석을 이용하여 정제될 수 있다.
약 pH 5.0의 산성 완충제에서 짧은 링커를 함유하는 제2 가교제(NHS-PEG4-아지드)-변형 변이체 IGF-2 펩티드에의 제1 가교제(NHS-PEG4-아세틸렌)-변형 재조합 인간 리소좀 효소의 접합은 구리(Cu+1)의 존재하에 수행될 수 있다. 당해 접합 단계 후, 짧은 링커 접합체를 함유하는 재조합 인간 리소좀 효소-변형 IGF-2 펩티드의 정제 단계는 크기 배제 크로마토그래피 또는 투석을 이용하여 수행될 수 있다.
짧은 링커를 함유하는 제2 가교제(NHS-PEG4-아지드)-변형 변이체 IGF-2 펩티드에의 제1 가교제(시클로옥틴, 예컨대 디플루오로시클로옥틴; DIFO)-변형 재조합 인간 리소좀 효소의 접합은 약 pH 6.0의 산성 완충제에서 수행될 수 있다. 당해 접합 단계 후, 짧은 링커 접합체를 함유하는 재조합 인간 리소좀 효소-변형 IGF-2 펩티드의 정제 단계는 크기 배제 크로마토그래피 또는 투석을 이용하여 수행될 수 있다.
효소 대체 요법을 위한 분자는 이종이관능성 가교제를 변이체 IGF-2 펩티드에 접합한 다음 이종이관능성 가교제-변형 변이체 IGF-2 펩티드를 재조합 인간 리소좀 효소에 접합함으로써 생성될 수 있다. 효소 대체 요법을 위한 분자는 또한 이종이관능성 가교제를 재조합 인간 리소좀 효소에 접합한 다음 이종이관능성 가교제-변형 재조합 인간 리소좀 효소를 변이체 IGF-2 펩티드에 접합함으로써 제조될 수 있다. 적합한 재조합 인간 리소좀 효소는 인간 산 α-글루코시다제(rhGAA), 인간 산 α-갈락토시다제 A(GLA), 인간 산 β-글루쿠로니다제(GUS), 인간 산 α-이두로니다제 A(IduA), 인간 산 이두로니데이트 2-술파타제(I2S), 인간 β-헥소스아미니다제 A(HexA), 인간 β-헥소스아미니다제 B(HexB), 인간 산 α-만노시다제 A, 인간 β-글루코세레브로시다제(GlcCerase), 인간 산 리파제(LPA), 또는 그들의 임의 조합을 포함한다. 적합한 이종이관능성 가교제는 m-말레이미도벤조일-N-히드록시숙신이미드 에스테르(MBS), 술포-m-말레이미도벤조일-N-히드록시숙신이미드 에스테르(술포-MBS) 또는 그들의 임의 조합을 포함한다. 변이체 IGF-2 펩티드-재조합 인간 리소좀 효소 접합체는 겔 여과 또는 투석을 이용하여 임의로 정제될 수 있다.
적합한 재조합 인간 리소좀 효소는 효모를 이용하여 제조될 수 있다. 효모로부터 제조된 재조합 인간 리소좀 효소는 N-글리칸 제거를 위하여 엔도글리코시다제 F(EndoF) 또는 엔도글리코시다제 H(EndoH)를 사용하여 처리될 수 있다. 또 다른 적합한 실시양태에서, 엔도글리코시다제 F(EndoF) 또는 엔도글리코시다제 H(EndoH)를 사용하는 처리는 산성 pH 완충제에서 수행할 수 있다. 적합한 산성 pH 완충제는 pH 5.0의 0.1M 나트륨 아세테이트를 포함한다. 반응은 약 실온에서 수행될 수 있다. 엔도글리코시다제 F(EndoF) 또는 엔도글리코시다제 H(EndoH)를 사용한 처리 후, 재조합 인간 리소좀 효소는 크기 배제 크로마토그래피 또는 투석을 이용하여 임의로 정제될 수 있다.
재조합 인간 리소좀 효소에 화학적으로 결합된 하나 이상의 변이체 IGF-2 펩티드의 접합체가 또한 제공된다. 이들 실시양태에서, 제1 가교제-변형 재조합 리소좀 효소는 재조합 인간 리소좀 효소일 수 있고, 재조합 인간 리소좀 효소는 하나 이상의 변형된 리신 잔기를 보유할 수 있으며, 예를 들어 N-말단은 화학적으로 변형될 수 있다. 적합한 변이체 IGF-2 펩티드는 IGF-2 펩티드 유사체 및 N-말단에서의 짧은 링커일 수 있다. 변이체 IGF-2 펩티드 중 적어도 하나는 적절하게는 짧은 링커내에 변형된 N-말단을 보유하는 IGF-2 펩티드이다. 적합한 변형된 IGF-2 펩티드는 약 pH 7.5의 완충제에서 N-말단에서 변형될 수 있음을 특징으로 한다. 적합한 변이체 IGF-2 펩티드는 적당한 반응성 화학기가 달린 N- 또는 C-말단에 짧은 링커를 함유하는 합성 IGF-2 펩티드 유사체를 포함한다. 적합한 변이체 IGF-2 펩티드는 IGF-2 펩티드 유사체를 포함하고, N-말단에서의 짧은 링커는 재조합 단백질로서 생성될 수 있으며 그 다음에 N-말단 아미노산은 이관능성 가교제로 화학적으로 변형될 수 있다.
적합한 재조합 인간 리소좀 효소는 인간 산 α-글루코시다제(rhGAA)를 포함한다. 이들 방법에 사용될 수 있는 다른 적합한 재조합 인간 리소좀 효소는 인간 산 α-갈락토시다제 A(GLA), 인간 산 β-글루쿠로니다제(GUS), 인간 산 α-이두로니다제 A(IduA), 인간 산 이두로니데이트 2-술파타제(I2S), 인간 β-헥소스아미니다제 A(HexA), 인간 β-헥소스아미니다제 B(HexB), 인간 산 α-만노시다제 A, 인간 β-글루코세레브로시다제(GlcCerase), 인간 산 리파제(LPA), 또는 그들의 임의 조합을 포함한다. 적합한 재조합 인간 리소좀 효소는 변형된 N-말단과 적어도 하나의 변형된 리신 잔기를 보유함을 특징으로 한다.
적합한 제1 가교제-변형 재조합 리소좀 효소는 아미노-반응성 이관능성 가교제에서 유래한 가교제를 보유함을 특징으로 할 수 있다. 적합한 제1 가교제-변형 재조합 리소좀 효소는 히드라지드 모이어티를 도입하기 위하여 숙신이미딜 6-히드라지노니코티네이트 아세톤(S-Hynic), 술포-숙신이미딜 6-히드라지노니코티네이트 아세톤(술포-S-Hynic), 또는 C6-숙신이미딜 6-히드라지노-니코틴아미드(C6-S-Hynic), 또는 숙신이미딜 4-히드라지도테레프탈레이트 히드로클로라이드(SHTH), 또는 숙신이미딜 4-히드라지늄 니코티네이트 히드로클로라이드(SHNH) 또는 그들의 임의 조합에서 유래한 가교제를 포함함을 특징으로 할 수 있다. 이와 달리, 리소좀 효소는 반응성 아지드기를 함유하는 표적화 펩티드에 이들 화학적으로 변형된 리소좀 효소를 커플링시키기 위하여 N-히드록시숙신이미드 에스테르-포스핀(NHS-포스핀), 술포-NHS-포스핀, N-히드록시숙신이미드 에스테르-테트라옥사펜타데칸 아세틸렌(NHS-PEG4-아세틸렌), 다른 NHS-(PEG)n-아세틸렌 이종이관능성 가교제(여기서, "n"은 3 내지 24개 불연속 PEG 단위 범위일 수 있다), 또는 절단가능한 이종이관능성 가교제, 예컨대 NHS-PEG3-S-S-아세틸렌, 또는 디플루오로시클로옥틴(DIFO) 및 디벤조시클로옥틴(DIBO)과 같은 시클로옥틴을 함유하는 이종이관능성 가교제 또는 그들의 임의 조합으로 변형될 수 있다. 재조합 인간 리소좀 효소상의 변형된 N-말단 및 리신 잔기는 1급 아민이 결여되어 있는 약 pH 7.3의 완충제에서 약 실온에서 약 30분 동안 변형된 첫 번째 (N-말단) 아미노산상의 1급 아민 및 리신 잔기에서 유래함을 특징으로 할 수 있다. 변이체 IGF-2 펩티드는 또한 제2 가교제에 커플링된 IGF-2 펩티드와 짧은 연장 링커를 포함할 수 있다. 적합한 제2 가교제는 숙신이미딜 6-히드라지노니코티네이트 아세톤(S-Hynic)-변형 리소좀 효소에의 접합을 위한 PEG4-펜타플루오로벤젠-4-포르밀벤조에이트(PEG4-PFB)일 수 있다. 상이한 실시양태에서, 제2 가교제는 포스핀-변형 리소좀 효소에의 접합을 위한 NHS-PEG4-아지드를 포함할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 제2 가교제는 아세틸렌-변형 리소좀 효소에의 접합을 위한 N-히드록시숙신이미드 에스테르-PEG4-아지드(NHS-PEG4-아지드)를 포함할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 제2 가교제는 시클로옥틴-변형 리소좀 효소에의 접합을 위한 N-히드록시숙신이미드 에스테르-PEG4-아지드(NHS-PEG4-아지드)를 포함할 수 있다.
재조합 인간 리소좀 효소에 접합된 이종이관능성 가교제-변형 변이체 IGF-2 펩티드가 또한 제공된다. 적합한 이종이관능성 가교제-변형 변이체 IGF-2 펩티드는 변이체 IGF-2 펩티드에 접합된 이종이관능성 가교제에서 유래함을 특징으로 한다. 적합한 재조합 인간 리소좀 효소는 인간 산 α-글루코시다제(rhGAA), 인간 산 α-갈락토시다제 A(GLA), 인간 산 β-글루쿠로니다제(GUS), 인간 산 α-이두로니다제 A(IduA), 인간 산 이두로니데이트 2-술파타제(I2S), 인간 β-헥소스아미니다제 A(HexA), 인간 β-헥소스아미니다제 B(HexB), 인간 산 α-만노시다제 A, 인간 β-글루코세레브로시다제(GlcCerase), 인간 산 리파제(LPA)일 수 있다. 적합한 이종이관능성 가교제는 m-말레이미도벤조일-N-히드록시숙신이미드 에스테르(MBS) 및 술포-m-말레이미도벤조일-N-히드록시숙신이미드 에스테르(술포-MBS), 술포숙신이미딜-4-(N-말레이미도메틸)시클로헥산-1-카르복실레이트(술포-SMCC)를 포함한다. 접합체는 유리 비-접합 IGF2 펩티드가 10% 미만으로 실질적으로 순수할 수 있다. 접합체의 순도는 크기 배제 크로마토그래피로부터의 분획 중 리소좀 단백질에 대한 280 nm에서의 흡광도 및 유리 IGF2 펩티드에 대한 214 nm에서의 흡광도에 의하여 또는 나트륨 도데실술페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE)을 이용하여 염색된 단백질 겔에 의하여 또는 SDS-PAGE 후의 웨스턴 블로팅과 리소좀 효소 또는 IGF2 펩티드의 검출을 위한 특이적 항체에 의하여 측정될 수 있다. 접합체는 또한 유리 비-접합 IGF2 펩티드 또는 기타 오염물질이 0.1% 미만으로 실질적으로 순수할 수 있다. 재조합 인간 리소좀 효소는 고-만노스 또는 복합형 N-글리칸을 보유한 효모로부터 적절히 유래될 수 있다. 복합형 N-글리칸을 보유한 효모로부터 유래한 적합한 재조합 인간 리소좀 효소는 IGF2 펩티드에의 접합에 직접 사용될 수 있다. 고-만노스형 N-글리칸을 보유한 적합한 재조합 인간 리소좀 효소는 또한 화학적 접합 전이나 후에 이들 외래 N-글리칸의 제거를 위해 엔도글리코시다제 F(EndoF) 또는 엔도글리코시다제 H(EndoH)를 사용하여 처리될 수 있다. 재조합 인간 리소좀 효소는 곤충 세포, 식물 세포, 진균, 트랜스제닉 동물 및 시험관내 번역 시스템을 비롯한 그 밖의 단백질 발현 시스템으로부터 적절히 유래될 수 있다.
리소좀 축적증을 앓고 있는 대상체를 치료하는 방법은 화학적으로 변형된 재조합 인간 리소좀 효소에 화학적으로 접합된 하나 이상의 변이체 IGF-2 펩티드의 접합체를 대상체에게 투여함으로써 수행된다. 하기 질환중 적어도 하나를 포함하여 다양한 리소좀 축적증중 어느 것이 이렇게 하여 치료될 수 있다: 폼페병, 파브리병, 및 고셔병, MPS I, MPS II, MPS VII, 테이-삭스병, 샌드호프병, α-만노시드축적증, 및 월만병.
리소좀 축적증을 앓고 있는 대상체를 치료하는 방법은 재조합 인간 리소좀 효소에 접합된 이종이관능성 가교제-변형 변이체 IGF-2 펩티드의 접합체를 대상체에게 투여함으로써 수행된다. 하기 질환중 적어도 하나를 포함하여 다양한 리소좀 축적증중 어느 것이 이렇게 하여 치료될 수 있다: 폼페병, 파브리병, 및 고셔병, MPS I, MPS II, MPS VII, 테이-삭스병, 샌드호프병, α-만노시드축적증, 및 월만병.
재조합 리소좀 효소에 화학적으로 접합된 하나 이상의 변이체 IGF-2 펩티드와 제약상 허용되는 담체의 조성물을 폼페병, 파브리병, 고셔병, MPS I, MPS II, MPS VII, 테이-삭스병, 샌드호프병, α-만노시드축적증, 또는 월만병의 치료에 충분한 양으로 그의 치료를 필요로 하는 환자에게 투여함에 의한, 상기 질환을 앓고 있는 환자를 치료하는 방법이 또한 제공된다. 적합한 변형된 재조합 인간 리소좀 효소는 폼페병의 치료를 위한 산 α-글루코시다제를 포함한다. 변형된 재조합 인간 리소좀 효소는 또한 파브리병의 치료를 위한 산 α-갈락토시다제 A일 수 있다. 변형된 재조합 인간 리소좀 효소는 고셔병의 치료를 위한 산 β-글루코세레브로시다제일 수 있다. 변형된 재조합 인간 리소좀 효소는 뮤코폴리사카라이드증 I(MPS I)의 치료를 위한 산 α-이두로니다제일 수 있다. 변형된 재조합 인간 리소좀 효소는 뮤코폴리사카라이드증 II(MPS II)의 치료를 위한 산 이두로니데이트 2-술파타제일 수 있다. 변형된 재조합 인간 리소좀 효소는 또한 뮤코폴리사카라이드증 VII(MPS VII)의 치료를 위한 산 β-글루쿠로니다제일 수 있다. 이와 달리, 변형된 재조합 인간 리소좀 효소는 GM2 강글리오시드증(테이-삭스병)의 치료를 위한 β-헥소스아미니다제 A일 수 있다. 또 다른 적합한 실시양태에서, 변형된 재조합 인간 리소좀 효소는 GM2 강글리오시드증(샌드호프병)의 치료를 위한 β-헥소스아미니다제 B일 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 변형된 재조합 인간 리소좀 효소는 월만병의 치료를 위한 산 리파제일 수 있다. 변형된 재조합 인간 리소좀 효소는 또한 α-만노시드축적증의 치료를 위한 산 α-만노시다제일 수 있다. 본원에서 제공되는 조성물은 1 개월 당 환자의 1 킬로그램 당 재조합 리소좀 효소에 화학적으로 접합된 하나 이상의 변이체 IGF-2 펩티드 약 0.1 내지 약 1000 밀리그램의 양으로 투여될 수 있다. 또 다른 적합한 실시양태에서, 조성물은 개월 당 환자의 1 킬로그램 당 재조합 리소좀 효소에 화학적으로 접합된 하나 이상의 변이체 IGF-2 펩티드 약 1 내지 약 500 밀리그램의 양으로 투여될 수 있다.
재조합 인간 리소좀 효소에 접합된 이종이관능성 가교제-변형 변이체 IGF-2 펩티드와 제약상 허용되는 담체의 조성물을 폼페병, 파브리병, 고셔병, MPS I, MPS II, MPS VII, 테이-삭스병, 샌드호프병, α-만노시드축적증, 또는 월만병의 치료에 충분한 양으로 그의 치료를 필요로 하는 환자에게 투여함에 의한, 상기 질환을 앓고 있는 환자를 치료하는 방법이 또한 제공된다. 조성물은 1 개월 당 환자의 50 킬로그램 당 재조합 인간 리소좀 효소에 접합된 이종이관능성 가교제-변형 변이체 IGF-2 펩티드 약 0.1 내지 약 1000 밀리그램의 양으로 투여될 수 있다. 또 다른 적합한 실시양태에서, 조성물은 1 개월 당 환자의 50 킬로그램 당 재조합 인간 리소좀 효소에 접합된 이종이관능성 가교제-변형 변이체 IGF-2 펩티드 약 1 내지 약 500 밀리그램의 양으로 투여될 수 있다.
이. 콜라이에서의 발현에 최적화되는 변이체 IGF-2 펩티드를 코딩하는 적합한 DNA 서열이 서열 1로서 제공된다. 변이체 IGF-2 펩티드를 나타내는 적합한 아미노산 서열이 서열 2로서 제공된다. 연장 링커를 나타내는 적합한 아미노산 서열이 서열 3으로서 제공된다. 방법에 사용되는 변이체 IGF2 펩티드는 서열 2의 아미노산 서열을 가질 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 접합체중 변이체 IGF2 펩티드는 서열 2의 아미노산 서열을 가질 수 있다.
실시예 및 기타 예시적 실시양태
다양한 리소좀 축적 장애(LSD)의 치료를 위한 신규의 우수한 ERT의 개발을 위하여 리소좀 효소에 변이체 인간 IGF-2 펩티드를 접합시키는 데 화학적 가교 방법이 채용된다. 이러한 전략은 IGF-2/CI-MPR에 대한 IGF2 펩티드-접합 ERT의 결합 친화도를 증대시키고 이들 재조합 효소의 세포 흡수와 리소좀에로의 전달을 개선할 것으로 기대된다. 그렇게 함으로써, 이들 IGF2 펩티드-접합 ERT은 병적 세포(affected cell)내 축적 기질의 제거에 좀더 효과적일 것으로 기대된다.
인간 IGF-2 펩티드의 몇몇 상이한 변이체가 합성 또는 발현(포유동물 세포에서 또는 다른 유기체에서), 정제된 다음 후속하여 리소좀 효소에의 접합을 위해 이종이관능성 가교제로 화학적으로 변형될 수 있다. 변이체 IGF-2 펩티드는 하기 변형중 하나 또는 그들의 조합을 함유할 수 있다: 위치 6에서 글루탐산 → 아르기닌으로의 치환; 아미노산 1-4 및 6의 결실; 아미노산 1-4 및 6, 7의 결실; 아미노산 1-4 및 6의 결실 및 위치 7에서 트레오닌 → 리신으로의 치환; 아미노산 1-4의 결실 및 위치 6에서 글루탐산 → 글리신으로의 치환 및 위치 7에서 트레오닌 → 리신으로의 치환; 위치 27에서 타이로신 → 루이신으로의 치환; 위치 43에서 발린 → 루이신으로의 치환; 위치 65에서 리신 → 아르기닌으로의 치환. 이들 변형의 대부분은 IGF-2/CI-MPR에 대한 고-친화도를 유지하면서 인슐린과 IGF-1 수용체에 대한 및 혈청 IGF 결합 단백질(IGFBP)에 대한 IGF-2 펩티드의 결합 친화도를 감소시키도록 설계된다. 변형된 IGF-2 펩티드는 또한 변형된 IGF-2 펩티드의 고속 정제를 위한 친화성 태그(예를 들어, 폴리히스티딘; His 태그)를 함유할 수 있고, 친화성 태그의 제거를 위한 프로테아제 부위(예를 들어, 증진된 담배 식각 바이러스(TEV) 프로테아제 부위)인 가용성 단백질 파트너 또는 IGF-2에 선행하는 적어도 5개 아미노산으로 된 링커 연장 영역인 융합 단백질 파트너와의 융합 단백질로서 발현될 수 있다.
변이체 IGF-2 펩티드와 재조합 리소좀 효소는 두 주요 전략에 의하여 화학적으로 커플링될 수 있다. (A) 독립적으로 IGF-2 펩티드를 이종이관능성 가교제로, 재조합 리소좀 효소를 상이한 이종이관능성 가교제로 (실시예 1 내지 3에 기재된 바와 같이) 변형한다. 과량의 비-접합 가교제와 화학적 부산물 제거를 위한 정제 후, 화학적으로 변형된 IGF2 펩티드와 화학적으로 변형된 리소좀 효소를 후속하여 최종 화학 반응에서 함께 접합시켜 IGF2 펩티드-리소좀 효소 접합체를 형성한 다음 정제하여 산성 pH 완충제에 저장하여 효소 활성을 유지한다. (B) IGF2 펩티드와 리소좀 효소를 단일 이종이관능성 가교제를 사용하여 (실시예 4에 기재된 바와 같이) 화학적으로 접합한다. IGF-2 펩티드를 하나의 pH 반응 조건에서 이종이관능성 가교제로 화학적으로 변형한다. 이어서 화학적으로 변형된 리소좀 효소를 가한 다음 pH를 두 번째 pH 반응 조건으로 조정하여 IGF2 펩티드를 리소좀 효소에 접합시킨다. 이어서 접합체를 정제하여 과량의 비-접합 이종이관능성 가교제와 화학적 부산물을 제거하고 산성 pH 완충제에 저장하여 효소 활성을 유지한다.
상기 화학적 커플링법은 리소좀 효소 대체 요법에 대한 단백질 표적화를 개선하는 명백한 이점이 있다. 첫 번째, 변형된 IGF-2 펩티드의 접합은 특수화한 M6P 탄수화물 구조를 요구함이 없이 IGF-2/CI-MPR에 대한 리소좀 효소의 결합 친화도를 증가시킨다. 두 번째, 리소좀 효소당 단일 IGF-2 펩티드를 함유하는 IGF-2 융합 단백질과 달리, 당해 전략은 IGF-2/CI-MPR에 대한 더 높은 친화도를 위해 리소좀 효소에 다수의 변형된 IGF-2 펩티드를 첨부할 수 있다. 세 번째, 당해 접근법은 타 조직(예를 들어, 뇌)에의 약물 표적화를 개선하기 위하여 혼합 펩티드(IGF2 펩티드와 다른 펩티드)의 접합에 사용될 수 있다. 네 번째, 당해 접근법은 포유동물 세포, 효모, 곤충 세포, 식물 세포, 트랜스제닉 동물(예를 들어, 계란, 우유 등에서)을 포함한(이에 한정되지 않음) 대부분의 진핵생물 발현 시스템으로부터 생성된 재조합 리소좀 효소를 사용할 수 있다. 복합형 N-글리칸(즉, 포유동물 발현 시스템, 복합 N-글리칸을 산출하는 변형된 N-글리칸 프로세싱을 보유하는 효모, 트랜스제닉 동물 등으로부터 유래한)을 함유하는 재조합 리소좀 효소는 커플링에 직접 사용될 수 있다. 고-만노스형 N-글리칸(즉, 효모, Lec1 포유동물 세포주 등으로부터 유래한)을 보유하는 효소는 변형된 IGF-2 펩티드에의 화학적 커플링 전이나 후에(실시예 5에 기재된 바와 같이) 탈글리코실화(엔도글리코시다제, 예컨대 EndoF 또는 EndoH을 통해)에 투입될 수 있다. 다섯 번째, 변형된 IGF-2 펩티드는 과정의 일정비율에 따른 규모 확대를 위한 비용 효과적인 접근법을 가능케 하는 박테리아, 효모 또는 기타 진균 시스템을 포함한 대부분의 발현 시스템에서 제조될 수 있다. 여섯 번째, 동일한 변형된 IGF-2 펩티드를 임의의 리소좀 효소에 접합시켜 IGF2-리소좀 효소의 개별 융합 단백질을 생성해야할 필요없이 단백질 표적화를 개선할 수 있다. 일곱 번째, 당해 전략은 잠재적으로 약물 요구를 줄이고, 주입시간을 단축하고 면역원성을 감소시킬 수 있는 신규의 우수한 ERT 조성물을 생성할 수 있다.
실시예 1
대부분의 포유동물 세포 제조 시스템에서 유래하는 재조합 인간 산 α-글루코시다제(rhGAA)는 극소량의 M6P을 함유하며 IGF-2/CI-MPR에의 rhGAA의 고-친화도 결합에 적절치 않은 복합형 N-글리칸이 대부분이다. 이러한 N-글리칸 프로파일은 혈청 단백질에 대한 것과 닮았으며, 그에 따라 rhGAA로 하여금 순환중에 호적한 약물동태 프로파일(즉, 더 느린 제거)을 갖도록 해준다. 따라서 rhGAA을 변형된 IGF-2 펩티드에의 접합에 사용하여 개선된 단백질 표적화와 세포 흡수를 위해 IGF-2/CI-MPR에 대한 그의 친화도를 증가시켜 우수한 rhGAA ERT을 개발할 수 있다. 구체적으로, rhGAA는 8 내지 10 mg/ml의 단백질 농도로 농축 및 1급 아민이 결여되어 있는 약 pH 7.3의 완충제(예를 들어, 50 mM 나트륨 포스페이트, pH 7.3/100 mM NaCl)중으로 교환된 다음 후속하여 12배 내지 20배 몰 과량의 이종이관능성 가교제 숙신이미딜 6-히드라지노니코티네이트 아세톤(S-Hynic)으로 실온에서 약 30 min 동안 변형될 수 있다. 당해 반응에서, S-Hynic으로부터의 화학 반응성 N-히드록시숙신이미드 에스테르(NHS)기는 rhGAA상 아미노 (N)-말단에서의 첫 번째 아미노산 잔기의 α-아미노기 및 리신의 ε-아미노기와 반응하여 이들 변형된 아미노산 잔기에 신규의 화학적 활성 히드라지드기를 도입하였다. S-Hynic-변형 rhGAA을 이어서 크기 배제 크로마토그래피 또는 투석을 통해 산성 완충제(예를 들어, 50 mM NaOAc, pH 4.8/100 mM NaCl/0.05% 폴리소르베이트-80)중으로 신속히 교환시켜 과량의 가교제와 화학적 부산물을 제거하고 효소 활성을 보존하였다. 당해 화학 반응은 rhGAA상에 1 내지 4개 화학적 활성 히드라지드기를 재현가능하게 산출하는 S-Hynic:rhGAA의 비율을 이해하기 위하여 다양한 양의 S-Hynic(예를 들어, 5-40X 몰 과량)으로 적정될 수 있다. 이어서 최적 조건을 rhGAA의 S-Hynic 변형 반응의 일정비율에 따른 규모 확대에 사용하였다.
개별 반응에서, (N-말단에) 짧은 연장 링커 영역을 함유하는 [del(1-4), Arg6, Leu27, Arg65] IGF-2와 같은 변이체 IGF2 펩티드를 이종이관능성 가교제 PEG4-펜타플루오로벤젠-4-포르밀벤조에이트(PEG4-PFB)를 사용하여 pH 약 7.5, 실온에서 2 내지 3시간 동안 화학적으로 변형하였다. 당해 반응에서, PEG4-PFB는 짧은 연장 링커 영역으로부터의 첫 번째 아미노산인 글리신의 α-아미노기를 변형하여 아미노 말단에 신규의 반응성 알데히드 화학기를 도입하였다. 변이체 IGF2 펩티드의 화학적 변형을 C4 역상 크로마토그래피로 모니터링하여 도 5에 도시된 바와 같이 화학적 변형의 진행과 완전성을 평가할 수 있다. 이어서 PEG4-벤즈알데히드-변형 IGF-2 펩티드를 겔 여과 크로마토그래피 또는 투석에 의하여 정제하여 접합을 위한 적당한 완충제(예를 들어, 50 mM NaOAc, pH 4.8/100 mM NaCl/0.05% 폴리소르베이트-80)에서 과량의 가교제와 화학적 부산물을 제거하였다. 이어서 최종 반응을 수행하여 50 mM NaOAc, pH 4.8/100 mM NaCl/0.05% 폴리소르베이트-80 완충제에서 24 hr 기간에 걸쳐서 실온에서 S-Hynic-변형 rhGAA을 PEG4-벤즈알데히드-변형 IGF-2 펩티드에 접합시켰다. 당해 화학반응은 S-Hynic-변형 rhGAA로부터의 히드라지드기를 PEG4-벤즈알데히드-변형 IGF2 펩티드로부터의 화학적 활성 알데히드기와 커플링시켜 안정한 공유 (히드라존) 결합을 형성하였다. 당해 반응은 커플링을 최적화하기 위하여 아닐린의 존재하에(예를 들어, 10 mM) 다양한 양의 PEG4-벤즈알데히드-변형 IGF-2 펩티드(예를 들어, 1-10X 몰 과량)로 수행될 수 있다. IGF-2 펩티드-접합 rhGAA은 이어서 50 mM 나트륨 포스페이트, pH 6.2/100 mM NaCl/0.05% 폴리소르베이트-80에 대하여 크기 배제 크로마토그래피 또는 투석으로 정제하여 과량의 PEG4-벤즈알데히드-변형 IGF-2 펩티드를 제거하고 변이체 IGF2 펩티드-접합 rhGAA(vIGF2-rhGAA)을 동일한 완충제중 4℃에서 저장하거나 -20℃ 또는 -70℃에서 동결하였다.
실시예 2
포유동물 제조 시스템에서 유래한 재조합 인간 산 α-글루코시다제(rhGAA)를 변이체 IGF-2 펩티드에의 접합에 사용하여 개선된 단백질 표적화와 세포 흡수를 위해 IGF-2/CI-MPR에 대한 친화도를 증가시켜 우수한 rhGAA ERT을 개발하였다. 구체적으로, 스타우딩거 연결 (아지드-포스핀) 반응 화학을 이용하여 IGF2 펩티드를 rhGAA에 커플링시켜 개선된 약물 표적화를 위한 IGF2 펩티드-rhGAA 접합체를 생성하였다. 당해 실시예에서, rhGAA(5 내지 10 mg/ml)을 1급 아민이 결여되어 있는 약 pH 7.3의 완충제(예를 들어, 50 mM 나트륨 포스페이트 (pH 7.3)/100 mM NaCl)중으로 교환시킨 다음 후속하여 10배 내지 20배 몰 과량의 이종이관능성 가교제 술포-N-히드록시숙신이미드 에스테르-포스핀(술포-NHS-포스핀)으로 실온에서 약 30 min 동안 변형하였다. 당해 화학 반응에서, 술포-NHS-포스핀으로부터의 화학 반응성 NHS기는 rhGAA상 N-말단에서의 첫 번째 아미노산 잔기의 α-아미노기 및 리신의 ε-아미노기와 반응하여 이들 변형된 아미노산 잔기에 신규의 화학적 활성 포스핀기를 도입하였다. 이어서 포스핀-함유 rhGAA을 크기 배제 크로마토그래피 또는 투석을 통해 약산성 완충제(예를 들어, 50 mM 나트륨 포스페이트, pH 6.5/100 mM NaCl)중으로 신속히 교환시켜 과량의 가교제와 화학적 부산물을 제거하고 효소 활성을 보존하였다. 당해 화학 반응은 rhGAA상에 1 내지 4개 화학적 활성 포스핀기를 재현가능하게 산출하는 술포-NHS-포스핀:rhGAA의 비율을 이해하기 위하여 다양한 양의 술포-NHS-포스핀(예를 들어, 5-40X 몰 과량)으로 적정될 수 있다. 최적 조건은 rhGAA의 술포-NHS-포스핀 변형 반응의 일정비율에 따른 규모 확대에 사용될 수 있다.
개별 반응에서, (N-말단에) 짧은 연장 링커 영역을 함유하는 [del(1-4), Arg6, Leu27, Arg65] IGF-2와 같은 변이체 IGF-2 펩티드를 30배 몰 과량의 이종이관능성 가교제 N-히드록시숙신이미드 에스테르-PEG4-아지드(NHS-PEG4-아지드)를 사용하여 1급 아민이 결여되어 있는 pH 약 7.5 완충제(예를 들어, 50 mM 나트륨 포스페이트/50 mM NaCl, pH 7.5)중 실온에서 1 내지 3 hr 동안 화학적으로 변형하였다. 당해 반응에서, NHS-PEG4-아지드의 반응성 NHS기를 짧은 연장 링커 영역으로부터의 글리신의 α-아미노기와 반응시켜 N-말단에 신규의 아지드 화학기를 도입하였다. 변이체 IGF2 펩티드의 화학적 변형을 C4 역상 크로마토그래피로 모니터링하여 화학적 변형의 진행과 완전성을 평가할 수 있다. PEG4-아지드-변형 IGF-2 펩티드를 이어서 C4 역상 크로마토그래피로 정제하고 변형된 펩티드를 동결건조하여 용매를 제거한 다음 건조 분말로서 저장하였다.
이어서, 포스핀-변형 rhGAA을 (50 mM 나트륨 포스페이트, pH 6.5/100 mM NaCl 완충제에서) 동결건조 PEG4-아지드-변형 IGF-2 펩티드에 1부 rhGAA:5부 IGF2 펩티드의 몰비로 직접 첨가하고 실온에서 24 hr 기간에 걸쳐서 인큐베이션으로 최종 반응을 수행하여 포스핀-변형 rhGAA을 PEG4-아지드-변형 IGF-2 펩티드에 접합시켰다. 당해 화학반응은 아지드-변형 IGF-2 펩티드로부터의 아지드 화학기를 포스핀-변형 rhGAA와 커플링시켜 안정한 공유 (아미드) 결합을 형성하였다. 변이체 IGF-2 펩티드-접합 rhGAA(vIGF2-rhGAA)을 이어서 크기 배제 크로마토그래피 또는 투석에 의하여 정제하여 과량의 PEG4-아지드-변형 IGF-2 펩티드를 제거한 다음 약산성 pH 완충제(50 mM 나트륨 포스페이트, pH 6.5/100 mM NaCl 완충제)에 4℃에서 저장하였다.
실시예 3
포유동물 제조 시스템에서 유래한 재조합 인간 산 이두로니데이트 2-술파타제(I2S)를 변이체 IGF-2 펩티드에의 접합에 사용하여 개선된 단백질 표적화와 세포 흡수를 위해 IGF-2/CI-MPR에 대한 효소 친화도를 증가시켜 우수한 I2S ERT을 개발하였다. 구체적으로, 스타우딩거 연결 (아지드-포스핀) 반응 화학을 이용하여 변이체 IGF2 펩티드를 I2S에 커플링시켜 개선된 약물 표적화를 위한 IGF2 펩티드-I2S 접합체를 생성하였다. 당해 실시예에서, I2S(대략 3 mg/ml)을 20배 몰 과량의 이종이관능성 가교제 술포-N-히드록시숙신이미드 에스테르-포스핀(술포-NHS-포스핀)으로 1급 아민이 결여되어 있는 pH 약 7.3 완충제(예를 들어, 50 mM 나트륨 포스페이트/100 mM NaCl, pH 7.3)중 실온에서 약 30 min 동안 변형하였다. 당해 화학 반응에서, 술포-NHS-포스핀으로부터의 화학 반응성 NHS기는 I2S상 N-말단에서의 첫 번째 아미노산 잔기의 α-아미노기 및 리신의 ε-아미노기와 반응하여 이들 변형된 아미노산 잔기에 신규의 화학적 활성 포스핀기를 도입하였다. 이어서 포스핀-함유 I2S을 크기 배제 크로마토그래피 또는 투석을 통해 약산성 완충제(예를 들어, 50 mM 나트륨 포스페이트, pH 6.5/100 mM NaCl)중으로 신속히 교환시켜 과량의 가교제와 화학적 부산물을 제거하고 효소 활성을 보존하였다. 당해 화학 반응은 I2S상에 1 내지 4개 화학적 활성 포스핀기를 재현가능하게 산출하는 술포-NHS-포스핀:I2S의 비율을 이해하기 위하여 다양한 양의 술포-NHS-포스핀(예를 들어, 5-40X 몰 과량)으로 적정될 수 있다. 최적 조건은 I2S의 술포-NHS-포스핀 변형 반응의 일정 비율에 따른 규모 확대에 사용될 수 있다.
개별 반응에서, (N-말단에) 짧은 연장 링커 영역을 함유하는 [del(1-4), Arg6, Leu27, Arg65] IGF-2와 같은 변이체 IGF-2 펩티드를 30배 몰 과량의 이종이관능성 가교제 N-히드록시숙신이미드 에스테르-PEG4-아지드(NHS-PEG4-아지드)로 1급 아민이 결여되어 있는 pH 약 7.5 완충제(예를 들어, 50 mM 나트륨 포스페이트/50 mM NaCl, pH 7.5)중 실온에서 1 내지 3 hr 동안 화학적으로 변형하였다. 당해 반응에서, NHS-PEG4-아지드의 반응성 NHS기를 짧은 연장 링커 영역으로부터의 글리신의 α-아미노기와 반응시켜 N-말단에 신규의 아지드 화학기를 도입하였다. 변이체 IGF2 펩티드의 화학적 변형을 C4 역상 크로마토그래피에 의하여 모니터링하여 화학적 변형의 진행과 완전성을 평가할 수 있다. 이어서 PEG4-아지드-변형 IGF-2 펩티드를 C4 역상 크로마토그래피로 정제하고 펩티드를 동결건조한 다음 건조 분말로서 저장하였다.
이어서, 포스핀-변형 I2S(50 mM 나트륨 포스페이트, pH 6.5/100 mM NaCl 완충제중)을 동결건조 PEG4-아지드-변형 IGF-2 펩티드에 1부 I2S:5부 IGF2 펩티드의 몰비로 직접 첨가하고 실온에서 24 hr 기간에 걸쳐서 인큐베이션으로 최종 반응을 수행하여 포스핀-변형 I2S을 PEG4-아지드-변형 IGF-2 펩티드에 접합시켰다. 당해 화학반응은 아지드-변형 IGF-2 펩티드로부터의 반응성 아지드 화학기를 포스핀-변형 I2S에 커플링시켜 안정한 공유 (아미드) 결합을 형성하였다. 변이체 IGF-2 펩티드-접합 I2S(vIGF2-I2S)을 이어서 크기 배제 크로마토그래피 또는 투석에 의하여 정제하여 과량의 PEG4-아지드-변형 IGF-2 펩티드를 제거한 다음 약산성 pH 완충제(50 mM 나트륨 포스페이트, pH 6.5/100 mM NaCl 완충제)중 4℃에서 저장하였다.
실시예 4
포유동물 제조 시스템에서 유래한 재조합 인간 산 α-글루코시다제(rhGAA)는 변형된 IGF-2 펩티드에의 접합에 사용되어 개선된 단백질 표적화와 세포 흡수를 위해 IGF-2/CI-MPR에 대한 친화도를 증가시켜 우수한 rhGAA ERT을 개발할 것이다. 당해 실시예에서, N-말단에 시스테인 잔기가 달린 짧은 연장 링커 영역을 함유하는 [del(1-4), Arg6, Leu27, Arg65] IGF-2와 같은 변이체 IGF2 펩티드를 이종이관능성 가교제 m-말레이미도벤조일-N-히드록시숙신이미드 에스테르(MBS)로 약 pH 6 및 실온에서 30 내지 60 min 동안 변형하였다. 당해 반응에서, MBS로부터의 화학 반응성 말레이미드기는, rhGAA에의 커플링을 위한 N-히드록시숙신이미드 에스테르 반응기를 보존하면서, N-말단 시스테인으로부터의 유리 술프히드릴기와 반응할 것이다. MBS-변형 IGF-2 펩티드는 겔 여과 크로마토그래피 또는 투석에 의하여 신속히 정제되어 과량의 MBS을 제거할 것이다. 이어서, 실온에서 pH 7.3의 비-아민 함유 완충제중 30 min 동안 MBS-변형 IGF-2 펩티드에의 커플링을 위하여 rhGAA을 첨가하였다. 당해 화학 반응에서, (MBS-변형 IGF-2 펩티드로부터의) 화학 반응성 N-히드록시숙신이미드 에스테르기는 rhGAA상 N-말단에서의 첫 번째 아미노산 잔기의 α-아미노기 및 리신의 ε-아미노기와 반응하여 안정한 공유 결합을 형성하였다. 당해 반응은 rhGAA상에 1 내지 4개의 IGF-2 펩티드를 커플링시키기 위한 MBS-변형 IGF-2 펩티드의 몰 과량을 측정하기 위하여 다양한 양의 MBS-변형 IGF-2 펩티드(예를 들어, 1-20X 몰 과량)를 사용하여 적정될 것이다. 이어서 최적 커플링 조건을 당해 과정의 일정비율에 따른 규모 확대에 사용하였다. IGF-2-접합 rhGAA은 겔 여과 크로마토그래피 또는 투석에 의하여 정제되어 과량의 IGF-2 펩티드를 제거하고 산성 pH 완충제(0.1M 나트륨 시트레이트, pH 5.5 완충제)에 저장될 것이다.
실시예 5
고-만노스형 N-글리칸 구조(효모, GNT-1 결손 Lec1 포유동물 세포 등에서 유래한)를 보유한 rhGAA와 같은 재조합 인간 리소좀 효소를 변이체 IGF-2 펩티드에의 접합에 사용하여 개선된 단백질 표적화와 세포 흡수를 위해 IGF-2/CI-MPR에 대한 친화도를 증가시켜 우수한 rhGAA ERT을 개발할 수 있다. 당해 실시예에서, rhGAA(8 내지 10 mg/ml)을 1급 아민이 결여되어 있는 약 pH 7.3의 완충제(예를 들어, 50 mM 나트륨 포스페이트(pH 7.3)/100 mM NaCl)중으로 교환시키고 후속하여 1급 아민이 결여되어 있는 pH 약 7.3 완충제(예를 들어, 50 mM 나트륨 포스페이트/0.1 M NaCl, pH 7.3)중 실온에서 30 min 동안 N-숙신이미딜 6-히드라지노니코티네이트 아세톤(S-Hynic)과 같은 이종이관능성 가교제로 변형하였다. 이어서 히드라지드-변형 rhGAA을 크기 배제 크로마토그래피 또는 투석을 통해 산성 완충제(예를 들어, 50 mM NaOAc, pH 4.8/100 mM NaCl/0.05% 폴리소르베이트-80)중으로 신속히 교환시켜 과량의 가교제와 화학적 부산물을 제거하고 효소 활성을 보존하였다.
개별 반응에서, (N-말단에) 짧은 연장 링커 영역을 함유하는 [del(1-4), Arg6, Leu27, Arg65] IGF-2와 같은 변이체 IGF-2 펩티드를 30배 몰 과량의 이종이관능성 가교제 PEG4-펜타플루오로벤젠-4-포르밀벤조에이트(PEG4-PFB)를 사용하여 1급 아민이 결여되어 있는 pH 약 7.5 완충제(예를 들어, 50 mM 나트륨 포스페이트/50 mM NaCl, pH 7.5)중 실온에서 1 내지 3 hr 동안 화학적으로 변형하였다. 당해 반응에서, PEG4-PFB은 짧은 연장 링커 영역으로부터의 글리신의 α-아미노기를 변형하여 N-말단에 신규의 알데히드 화학기를 도입하였다. 변이체 IGF2 펩티드의 화학적 변형을 C4 역상 크로마토그래피에 의하여 모니터링하여 화학적 변형의 진행과 완전성을 평가할 수 있다. 이어서 PEG4-벤즈알데히드-변형 IGF-2 펩티드를 겔 여과 크로마토그래피 또는 투석에 의하여 정제하여 접합을 위한 적당한 완충제(예를 들어, 50 mM NaOAc, pH 4.8/100 mM NaCl/0.05% 폴리소르베이트-80)에서 과량의 가교제와 화학적 부산물을 제거하였다.
이어서, 50 mM NaOAc, pH 4.8/100 mM NaCl/0.05% 폴리소르베이트-80 완충제중 24 hr 기간에 걸쳐서 실온에서 최종 반응을 수행하여 S-Hynic-변형 rhGAA을 PEG4-벤즈알데히드-변형 IGF-2 펩티드에 접합시켰다. 당해 화학반응은 S-Hynic-변형 rhGAA으로부터의 히드라지드기를 PEG4-벤즈알데히드-변형 IGF2 펩티드로부터의 화학적 활성 알데히드기와 커플링시켜 안정한 공유 (히드라존) 결합을 형성하였다. 당해 반응은 커플링을 최적화하기 위하여 아닐린의 존재하에(예를 들어, 10 mM) 다양한 양의 PEG4-벤즈알데히드-변형 IGF-2 펩티드(예를 들어, 1-10X 몰 과량)로 수행될 수 있다. 이어서 변이체 IGF-2 펩티드-접합 rhGAA(vIGF2-rhGAA)을 크기 배제 크로마토그래피 또는 투석에 의하여 정제하여 산성 pH 완충제(50 mM NaOAc, pH 4.8/100 mM NaCl/0.05% 폴리소르베이트-80)에서 과량의 PEG4-아지드-변형 IGF-2 펩티드를 제거하였다.
rhGAA상의 고-만노스형 N-글리칸은 문제의 소지가 있는데 그 이유는 이들 탄수화물은 단백질이 마크로파지 및 비장 만노스 수용체를 통해 순환으로부터 신속히 제거되게한다고 생각되기 때문이다. 그러나, 고-만노스형 N-글리칸은 산성 pH 완충제(예를 들어, 50 mM NaOAc, pH 4.8/100 mM NaCl/0.05% 폴리소르베이트-80)중 실온에서 엔도글리코시다제 F(EndoF) 또는 엔도글리코시다제 H(EndoH)를 사용하여 천연 조건(즉, 촉매 활성을 보존하는 비-변성 조건)하에서 rhGAA로부터 제거될 수 있다. rhGAA은 가용성인 채로 잔류하는 것으로 실험적으로 밝혀졌으며 N-글리칸의 제거 후에 완전히 활성을 띠었다(데이터 제시하지 않음). rhGAA의 탈글리코실화는 효소를 S-Hynic으로 변형하고 (과량의 가교제를 제거하기 위하여 크기 배제 크로마토그래피 또는 투석을 통해) 정제한 후에 수행될 수 있다. 이러한 전략은 효소 활성에 영향을 미침이 없이 EndoF 또는 EndoH을 사용하여 1 내지 5일에 걸쳐서 rhGAA의 완전한 탈글리코실화를 가능케 해준다. 이어서 탈글리코실화된 히드라지드-변형 rhGAA을 PEG4-벤즈알데히드-변형 IGF-2 펩티드에 접합시켰다. 이와 달리, rhGAA 탈글리코실화는 고농도의 EndoF 또는 EndoH을 사용하여 히드라지드-변형 rhGAA에의 PEG4-벤즈알데히드-변형 IGF-2 펩티드의 접합중에 동시에 수행될 수 있다. 이어서 탈글리코실화된 IGF2 펩티드-접합 rhGAA을 겔 여과 크로마토그래피 또는 투석에 의하여 정제하여 과량의 포스핀-변형 IGF-2 펩티드를 제거하고 산성 pH 완충제(50 mM 나트륨 포스페이트, pH 6.2/100 mM NaCl/0.05% 폴리소르베이트-80)에 저장하였다. 효모-유래 rhGAA로부터 고-만노스 N-글리칸을 제거하는 이상적인 방법은 rhGAA의 단백질 정제에 앞서 생체내에서의 탈글리코실화를 위해 EndoH을 리소좀 효소와 공발현시키는 것일 것이다. 이렇게 하면 어떠한 부가적인 프로세싱도 없이 바로 변형하여 변이체 표적화 펩티드에 커플링될 수 있는 탈글리코실화된 rhGAA이 생성되게 된다.
상기 전략은 IGF2 펩티드-접합 리소좀 효소의 개선된 단백질 표적화와 세포 흡수를 위해 IGF-2/CI-MPR에 대한 결합 친화도를 현저히 개선하면서 rhGAA로부터 바람직하지 못한 N-글리칸의 제거를 가능케 하여 알레르기 반응을 방지하고 고속 단백질 제거를 방지한다. 중요하게는, 당해 전략은 비-포유동물 시스템으로부터 생성된 리소좀 효소를 활용할 수 있고 우수한 ERT 개발을 위한 훨씬 더 비용 효과적인 접근법을 나타낼 수 있다.
상기 실시예는 변형된 IGF-2 펩티드의 화학적 접합을 통해 IGF-2/CI-MPR에 대한 상이한 리소좀 효소의 친화도를 증가시키기 위하여 설계되었다. 당해 전략은 LSD에 대한 우수한 치료법 개발을 위하여 현행 및 장래 ERT에 대한 단백질 표적화를 개선한다.
실시예 6
IGF2/CI-MPR 수용체 결합 검정을 이용하여 리소좀 효소 rhGAA와 I2S에 대한 수용체 친화도에 미치는 IGF2 펩티드의 화학적 접합의 영향을 평가하였다. 비-결합 리소좀 효소는 프로세싱중에 씻겨져 나가므로 당해 검정은 IGF2/CI-MPR에 대하여 높은 결합 친화도를 보유한 리소좀 효소를 낮은 결합 친화도 내지 보통의 결합 친화도를 보유한 것들과 구별하도록 설계되었다. 더욱이, 다양한 단백질 농도의 리소좀 효소를 사용하여 결합을 평가하므로, 당해 검정은 각 리소좀 효소 제제에 대한 결합 친화도의 산정에 사용될 수 있는 수용체 결합에 요구되는 단백질 농도를 측정할 수 있다. 구체적으로, 비-변형 리소좀 효소 및 IGF2 펩티드-접합 리소좀 효소를 40 mM HEPES(pH 6.7)/150 mM NaCl/10 mM EDTA에서 연속 희석하고 이어서 IGF2/CI-MPR 수용체로 코팅한 96-웰 ELISA 플레이트(포스페이트-완충 염수중 6 ㎍/ml로 50 ㎕/웰의 수용체; 이어서 포스페이트-완충 염수중 2% BSA로 블로킹)중 30℃에서 1 hr 동안 인큐베이션하였다. 그 다음에 플레이트를 0.1% 트윈-20을 함유하는 동일한 완충제로 3회 세척하여 비-결합 단백질을 제거하였다. 이어서, 결합된 리소좀 효소를 검정 완충제(50 mM NaOAc, pH 4.8/2% BSA/0.02% 트리톤 X-100)중 37℃에서 1 hr 동안 적당한 형광발광성 기질(예를 들어, rhGAA에 대하여 4-메틸움벨리페릴-α-D-글루코피라노시드(4-MU-α-Glc))을 사용하여 효소 활성에 의하여 측정하였다. 이어서 샘플을 미사용 96-웰 플레이트로 옮기고, 0.1M NaOH을 가하여 용액의 pH을 대략 10.5로 상승시킨 다음, 플레이트를 형광 플레이트 판독기로 적당한 여기 및 발광 파장(즉, 4-MU에 대해 370 nm 여기 & 460 nm 발광)에서 판독하였다. 본 발명자들의 결과는 도 6A에 도시된 바와 같이 시험된 모든 단백질 농도에서 비-접합 rhGAA보다는 vIGF2-rhGAA에 대하여 훨씬 더 많은 양의 결합된 효소 활성이 관찰되었음을 보여준다. 유리 WT 인간 IGF2 펩티드를 포함시킴으로써 IGF2/CI-MPR 플레이트에의 vIGF2-rhGAA 결합이 현저히 감소하였으며, 이는 이러한 결합이 IGF2 펩티드에 좌우되었음을 표시한다. IGF2/CI-MPR에로의 vIGF2-rhGAA의 완전한 차단을 위해서는 훨씬 더 많은 양의 유리 WT 인간 IGF2 펩티드가 요구되는 듯하다. I2S에의 IGF2 펩티드의 화학적 접합은 또한 IGF2/CI-MPR에 대한 그 효소의 결합 친화도를 실질적으로 증가시키는 것으로 나타났다(도 7A). 더욱이, IGF2 펩티드-접합 I2S(vIGF2-I2S)에 대하여 1 및 3 ㎍/ml에서 유사량의 결합된 I2S 활성이 관찰되었으며, 이는 수용체 결합이 포화되었음을 표시한다.
이들 종합적인 데이터는 변이체 IGF2 펩티드 접합법의 몇 가지 중요한 특징을 밝혀주었다. (1) 변이체 IGF2 펩티드의 단백질 구조는 IGF2/CI-MPR 수용체에의 고-친화도 결합에 적당하다. 이러한 기능 평가는 야생형 및 변이체 IGF2 펩티드가 도 5에 도시된 바와 같이 거의 동일한 조건에서 결합하고 용출함을 보여주는 본 발명자들의 C4 역상 크로마토그래피 데이터와 일치한다. 이들 두 IGF2 펩티드의 "지문(fingerprint)"은 C4 역상 크로마토그래피상에서 사실상 구별할 수 없으며, 그들은 그들의 단백질 구조에 있어서 매우 유사함이 틀림없다. (2) 변이체 IGF2 펩티드의 화학적 접합은 rhGAA 또는 I2S에 대한 효소 활성에 영향을 미치지 않았다(데이터 제시하지 않음). 리소좀 효소에의 펩티드의 화학적 커플링을 위한 연장 링커 영역의 이용은 효소 활성을 유지하면서 십중팔구 IGF2 펩티드 결합에 충분한 테더(tether)를 제공하였다. (3) 접합된 변이체 IGF2 펩티드는 안정하며 리소좀 효소 활성 유지에 요구되는 산성 완충제에서 적합한 단백질 구조를 유지한다.
따라서 종합적인 데이터는 리소좀 효소(예를 들어, rhGAA 및 I2S)에의 IGF2 펩티드의 화학적 접합이 실제로 IGF2/CI-MPR 수용체에 대한 그들의 결합 친화도를 현저히 증가시킬 수 있음을 보여준다. 당해 접근법은 이론적으로 IGF2/CI-MPR에 대한 결합 친화도 개선을 위하여 임의의 리소좀 단백질 및 그 밖의 비-리소좀 단백질에의 변이체 IGF2 펩티드의 화학적 접합에 광범위하게 적용가능함에 틀림없다.
실시예 7
외인성 리소좀 효소의 세포 흡수에 대한 IGF2 펩티드의 기능적 효과를 평가하기 위하여, IGF2-접합 rhGAA(vIGF2-rhGAA)의 내재화를 L6 래트 골격근 근모세포에서 평가하였다. 간단히 말하면, L6 근모세포를 T-75 플라스크내에서 10% 우태 혈청(FBS)을 함유하는 DMEM 배지중 37℃ 및 5% CO2 환경에서 융합상태(confluence)로 되게 팽창시켰다. 세포를 트립신/EDTA을 통해 수확한 다음 6-웰 조직배양 플레이트에 3 x 105 세포/웰의 세포 밀도로 플레이팅하고 DMEM/10% FBS 배지에서 인큐베이션하였다. 리소좀 효소의 첨가 2시간 전에, 소모된 DMEM/10% FBS 배지를 2.5 ml 흡수 배지(햄(Ham) F-12/10% FBS/2 mM PIPES, pH 6.7)로 교체하였다. 비-접합 rhGAA와 vIGF2-rhGAA을 50 mM 나트륨 포스페이트, pH 6.5/100 mM NaCl/0.05% 폴리소르베이트-80로 0.5 mg/ml이 되도록 희석하고 0.2 ㎛ 필터 스핀 장치(코스타, Costar)를 통해 멸균하였다. 비-접합 rhGAA을 개개의 웰에 10 내지 200 nM의 최종 단백질 농도로 가한 반면에 vIGF2-rhGAA는 2 내지 25 nM로 가하였다. 모든 웰이 동일한 용적과 정확한 단백질 농도를 갖도록 보장하기 위하여, 50 mM 나트륨 포스페이트, pH 6.5/100 mM NaCl/0.05% 폴리소르베이트-80 완충제를 첨가하여 효소와 완충제의 총 용적이 각 샘플에 대해 0.2 ml이 되게 하였다. 도 6B에 도시된 바와 같이, vIGF2-rhGAA의 내재화는 시험된 모든 단백질 농도에서 비-접합 rhGAA보다 현저히 더 양호하였다. 이들 결과는 vIGF2-rhGAA에 관한 몇몇 중요한 측면을 밝혀주었다: (1) 변이체 IGF2 펩티드의 단백질 구조는 세포 표면 IGF2/CI-MPR 수용체에의 고-친화도 결합에 충분하다; (2) 세포내 소기관이 당해 프로토콜로 단리되었으므로, vIGF2-rhGAA은 L6 근모세포에서 효율적으로 내재화되어 리소좀으로 전달되었다; (3) 변이체 IGF2 펩티드는 예상대로 혈청 IGF 결합 단백질(IGFBP)에 대한 낮은 결합 친화도를 보유하는데, 그 이유는 vIGF2-rhGAA가 배지중 IGFBP에 결합되기보다는 L6 근모세포에 내재화되었기 때문이다; (4) 변이체 IGF2 펩티드의 화학적 커플링은 rhGAA 효소 활성을 변경하지 않았다.
이들 결과는 rhGAA에의 변이체 IGF2 펩티드의 화학적 커플링이 IGF2/CI-MPR에 대한 그의 결합 친화도를 현저히 개선할 수 있으며 이는 표적 세포에서 리소좀 효소의 실질적으로 개선된 세포 흡수로 직접 반영됨을 명백히 보여준다. 이들 데이터는 vIGF2-rhGAA가 폼페병의 치료를 위한 우수한 ERT가 될 것임을 시사한다.
실시예 8
다수의 IGF2 펩티드가 리소좀 효소에 화학적으로 접합되었는지 여부를 측정하기 위하여, 나트륨 도데실술페이트 폴리아크릴아미드 단백질 겔 전기영동(SDS-PAGE)을 이용하여 단백질을 그들의 크기에 기초하여 분리하고 그 다음에 겔을 단백질 밴드의 가시화를 위해 수정된 쿠마시 블루 염색으로 염색하였다. 도 7B에 도시한 바와 같이, 재조합 야생형 인간 이두로니데이트 2-술파타제(I2S)의 분자량은 변이체 IGF2 펩티드의 화학적 접합 후에 약 80 kDa에서 대략 120 kDa으로 현저히 증가하였다. 이들 데이터는, 변이체 IGF2 펩티드의 분자량이 대략 겨우 8 kDa에 불과하므로, 다수의 변이체 IGF2 펩티드가 I2S에 커플링되었음이 틀림없음을 명백히 보여준다. 염색된 SDS-PAGE 겔은 다양한 양의 부착된 변이체 IGF2 펩티드를 갖는 vIGF2-I2S 종의 분포가 존재함을 보여주는데 I2S 1분자당 평균 5개의 부착된 펩티드를 갖는다(겔상에서 대략 120 kDa 분자량을 달성하기 위하여 대략 40 kDa의 증가에 상응하는). 중요하게는, 이들 데이터는 또한 다수의 상이한 펩티드를 동일한 리소좀 효소에 커플링시키기 위한 당해 접근법의 가능성을 강조한다. 예를 들어, 변이체 IGF2 펩티드 및 그 밖의 표적화 펩티드(예를 들어, 혈액-뇌 장벽(BBB)을 가로질러 수송되는 것으로 알려져 있는 펩티드)가 리소좀 효소를 내장 조직으로 (IGF2 펩티드를 통해) 및 뇌와 중추신경계로 (BBB-투과성 펩티드를 통해) 표적화하기 위하여 동일한 리소좀 효소에 화학적으로 커플링될 수 있다. 따라서 당해 접근법은 현행 ERT의 주요 한계점을 극복할 가능성이 있다.
실시예 9
서열 1은 N-말단 연장 링커 영역과 TEV 프로테아제 인식 부위를 보유한 8XHis-태그 [(del 1-4)-Arg6-Leu27-Arg65] IGF-2 펩티드에 대한 cDNA 서열을 나타낸다(이. 콜라이에서의 발현에 최적화됨).
서열 1:
Figure 112013117488670-pct00002
서열 2는 연장 서열을 구비한 변이체 IGF2 펩티드에 대한 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 2:
Figure 112013117488670-pct00003
서열 2는 TEV 프로테아제를 통한 N-말단 8X His 태그의 제거 후 변이체 IGF2 펩티드에 해당한다. 당해 변이체 IGF2 펩티드는 잔기 1 내지 4번이 결여되어 있어서 N-말단 세린 잔기가 WT IGF2의 잔기 5번에 해당한다. 위치 6에서 글루탐산을 치환한 아르기닌은 혈청 IGF 결합 단백질(IGFBP)에 대한 IGF2 펩티드의 결합 친화도를 실질적으로 낮추는 것으로 알려져 있다. 위치 27에서 타이로신 → 루이신으로의 치환은 인슐린과 IGF1 수용체에 대한 IGF2 펩티드의 결합 친화도를 실질적으로 낮추는 것으로 알려져 있다. 위치 65에서 리신 → 아르기닌으로의 보존적 치환을 이용하여 리소좀 효소에의 접합을 위해 N-말단에서 연장 링커 영역만의 화학적 변형을 가능케 하였다. N-말단 연장 영역을 서열 3으로 나타내었다.
서열 3:
Figure 112013117488670-pct00004
서열 3에서의 N-말단 글리신 잔기를 리소좀 효소에의 커플링을 위한 화학적 변형에 사용한다.
SEQUENCE LISTING <110> CALLIDUS BIOPHARMA, INC. <120> METHODS FOR COUPLING TARGETING PEPTIDES ONTO RECOMBINANT LYSOSOMAL ENZYMES FOR IMPROVED TREATMENTS OF LYSOSOMAL STORAGE DISEASES <130> CALL-0017 <140> PCT/US2012/039705 <141> 2012-05-25 <150> 61/490,957 <151> 2011-05-27 <160> 4 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 282 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 1 atgggcagcc accaccacca tcatcaccac cacactagtg ccggcgagaa tctgtacttt 60 cagggcggtg gtggtagcgg cggtggtggt agccgtaccc tgtgtggtgg cgaattggtt 120 gatacgctgc aattcgtctg tggtgaccgc ggtttcctgt tctctcgtcc ggcgtcccgc 180 gtgagccgtc gcagccgtgg tatcgttgaa gagtgctgtt ttcgtagctg cgacctggct 240 ctgctggaaa cctattgcgc gaccccggca cgtagcgagt ga 282 <210> 2 <211> 72 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 2 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Arg Thr Leu Cys Gly Gly 1 5 10 15 Glu Leu Val Asp Thr Leu Gln Phe Val Cys Gly Asp Arg Gly Phe Leu 20 25 30 Phe Ser Arg Pro Ala Ser Arg Val Ser Arg Arg Ser Arg Gly Ile Val 35 40 45 Glu Glu Cys Cys Phe Arg Ser Cys Asp Leu Ala Leu Leu Glu Thr Tyr 50 55 60 Cys Ala Thr Pro Ala Arg Ser Glu 65 70 <210> 3 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 3 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 1 5 <210> 4 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic 8xHis tag <400> 4 His His His His His His His His 1 5

Claims (114)

  1. 제1 가교제-변형 재조합 인간 리소좀 효소를 하나 이상의 제2 가교제-변형 변이체 IGF-2 펩티드에 접합시키는 것을 포함하는, 재조합 리소좀 효소에 접합된 표적화 펩티드를 제조하는 방법이며,
    여기서 제1 가교제-변형 재조합 리소좀 효소는 화학적으로 변형된 N-말단 및 하나 이상의 변형된 리신 잔기를 보유함을 특징으로 하는 재조합 리소좀 효소를 포함하고;
    하나 이상의 제2 가교제-변형 변이체 IGF-2 펩티드는 아미노 (N)-말단에서 짧은 연장 링커 내에 변형된 아미노산을 포함하는 하나 이상의 변이체 IGF-2 펩티드를 포함하고,
    여기서 재조합 인간 리소좀 효소는 인간 산 α-글루코시다제, 인간 산 α-갈락토시다제 A, 인간 산 β-글루쿠로니다제, 인간 산 α-이두로니다제 A, 인간 산 이두로니데이트 2-술파타제, 인간 β-헥소스아미니다제 A, 인간 β-헥소스아미니다제 B, 인간 산 α-만노시다제 A, 인간 β-글루코세레브로시다제, 인간 산 리파제, 및 이들의 임의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되고,
    하나 이상의 변이체 IGF-2 펩티드는 서열 2의 아미노산 서열을 포함하며, 야생형 인간 IGF-2 펩티드에 대하여 하기 변형:
    위치 6에서 글루탐산 → 아르기닌으로의 치환;
    아미노산 1-4 및 6의 결실;
    아미노산 1-4, 6 및 7의 결실;
    아미노산 1-4 및 6의 결실 및 위치 7에서 트레오닌 → 리신으로의 치환;
    아미노산 1-4의 결실 및 위치 6에서 글루탐산 → 글리신으로의 치환 및 위치 7에서 트레오닌 → 리신으로의 치환;
    위치 27에서 타이로신 → 루이신으로의 치환;
    위치 43에서 발린 → 루이신으로의 치환;
    위치 65에서 리신 → 아르기닌으로의 치환
    중 하나 이상을 갖고,
    변이체 IGF-2 펩티드는 친화성 태그 또는 IGF-2에 선행하는 적어도 5개 아미노산으로 된 링커 연장 영역을 포함하는 것인, 재조합 리소좀 효소에 접합된 표적화 펩티드를 제조하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 짧은 연장 링커가 5 내지 20개의 아미노산 잔기를 포함하는 것인 방법.
  3. 제1항에 있어서, 재조합 인간 리소좀 효소가 인간 산 α-글루코시다제 (rhGAA)인 방법.
  4. 제1항에 있어서, 재조합 인간 리소좀 효소 상에서 두 개의 리신 잔기가 변형되는 것인 방법.
  5. 제1항에 있어서, 제1 가교제가 N-숙신이미딜 6-히드라지노니코티네이트 아세톤 (S-Hynic)을 포함하는 것인 방법.
  6. 제1항에 있어서, 제2 가교제가 PEG4-펜타플루오로벤젠-4-포르밀벤조에이트 (PEG4-PFB)를 포함하는 것인 방법.
  7. 제1항에 있어서, 재조합 인간 리소좀 효소 상의 N-말단 및 하나 이상의 리신 잔기가 1급 아민이 결여되어 있는 pH 7.3의 완충제 내에서 실온에서 30분 동안 변형되는 것인 방법.
  8. 제1항에 있어서, 짧은 링커를 함유하는 제2 가교제-변형 변이체 IGF-2 펩티드에 제1 가교제-변형 재조합 인간 리소좀 효소를 접합시키기 전에, 짧은 연장 링커를 함유하는 제2 가교제-변형 변이체 IGF-2 펩티드를 정제하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  9. 제1항에 있어서, 제1 가교제가 술포-N-히드록시숙신이미드 에스테르-포스핀 (술포-NHS-포스핀)을 포함하는 것인 방법.
  10. 제1항에 있어서, 제1 가교제가 N-히드록시숙신이미드 에스테르-테트라옥사펜타데칸 아세틸렌 (NHS-PEG4-아세틸렌)을 포함하는 것인 방법.
  11. 제1항에 있어서, 제1 가교제가 디플루오로시클로옥틴 (DIFO) 및 디벤조시클로옥틴 (DIBO)으로부터 선택되는 이종이관능성 가교제를 포함하는 것인 방법.
  12. 제1항에 있어서, 제2 가교제가 N-히드록시숙신이미드 에스테르-PEG4-아지드 (NHS-PEG4-아지드)를 포함하는 것인 방법.
  13. 이종이관능성 가교제를 변이체 IGF-2 펩티드에 접합시키고;
    이종이관능성 가교제-변형 변이체 IGF-2 펩티드를 재조합 인간 리소좀 효소에 접합시키거나; 또는
    이종이관능성 가교제를 재조합 인간 리소좀 효소에 접합시키고;
    이종이관능성 가교제-변형 재조합 인간 리소좀 효소를 변이체 IGF-2 펩티드에 접합시키는 것
    를 포함하는, 효소 대체 요법에 적합한 분자를 제조하는 방법이며,
    여기서 재조합 인간 리소좀 효소는 인간 산 α-글루코시다제, 인간 산 α-갈락토시다제 A, 인간 산 β-글루쿠로니다제, 인간 산 α-이두로니다제 A, 인간 산 이두로니데이트 2-술파타제, 인간 β-헥소스아미니다제 A, 인간 β-헥소스아미니다제 B, 인간 산 α-만노시다제 A, 인간 β-글루코세레브로시다제, 인간 산 리파제, 및 이들의 임의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되고,
    변이체 IGF-2 펩티드는 서열 2의 아미노산 서열을 포함하며, 야생형 인간 IGF-2 펩티드에 대하여 하기 변형:
    위치 6에서 글루탐산 → 아르기닌으로의 치환;
    아미노산 1-4 및 6의 결실;
    아미노산 1-4, 6 및 7의 결실;
    아미노산 1-4 및 6의 결실 및 위치 7에서 트레오닌 → 리신으로의 치환;
    아미노산 1-4의 결실 및 위치 6에서 글루탐산 → 글리신으로의 치환 및 위치 7에서 트레오닌 → 리신으로의 치환;
    위치 27에서 타이로신 → 루이신으로의 치환;
    위치 43에서 발린 → 루이신으로의 치환;
    위치 65에서 리신 → 아르기닌으로의 치환
    중 하나 이상을 갖고,
    변이체 IGF-2 펩티드는 친화성 태그 또는 IGF-2에 선행하는 적어도 5개 아미노산으로 된 링커 연장 영역을 포함하는 것인, 효소 대체 요법에 적합한 분자를 제조하는 방법.
  14. 제13항에 있어서, 재조합 인간 리소좀 효소가 인간 산 α-글루코시다제 (rhGAA)인 방법.
  15. 제13항에 있어서, 이종이관능성 가교제가 m-말레이미도벤조일-N-히드록시숙신이미드 에스테르 (MBS)를 포함하는 것인 방법.
  16. 재조합 인간 리소좀 효소에 화학적으로 접합된 하나 이상의 변이체 IGF-2 펩티드를 포함하는 접합체이며,
    여기서 재조합 인간 리소좀 효소는 인간 산 α-글루코시다제, 인간 산 α-갈락토시다제 A, 인간 산 β-글루쿠로니다제, 인간 산 α-이두로니다제 A, 인간 산 이두로니데이트 2-술파타제, 인간 β-헥소스아미니다제 A, 인간 β-헥소스아미니다제 B, 인간 산 α-만노시다제 A, 인간 β-글루코세레브로시다제, 인간 산 리파제, 및 이들의 임의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되고,
    하나 이상의 변이체 IGF-2 펩티드는 서열 2의 아미노산 서열을 포함하며, 야생형 인간 IGF-2 펩티드에 대하여 하기 변형:
    위치 6에서 글루탐산 → 아르기닌으로의 치환;
    아미노산 1-4 및 6의 결실;
    아미노산 1-4, 6 및 7의 결실;
    아미노산 1-4 및 6의 결실 및 위치 7에서 트레오닌 → 리신으로의 치환;
    아미노산 1-4의 결실 및 위치 6에서 글루탐산 → 글리신으로의 치환 및 위치 7에서 트레오닌 → 리신으로의 치환;
    위치 27에서 타이로신 → 루이신으로의 치환;
    위치 43에서 발린 → 루이신으로의 치환;
    위치 65에서 리신 → 아르기닌으로의 치환
    중 하나 이상을 갖고,
    변이체 IGF-2 펩티드는 친화성 태그 또는 IGF-2에 선행하는 적어도 5개 아미노산으로 된 링커 연장 영역을 포함하는 것인 접합체.
  17. 제16항에 있어서, 재조합 인간 리소좀 효소가 하나 이상의 변형된 리신 잔기, 화학적으로 변형된 N-말단, 또는 이들의 조합을 포함하는 것인 접합체.
  18. 제16항에 있어서, 변이체 IGF-2 펩티드가 IGF-2 펩티드 유사체 및 N-말단에 변형된 아미노산 잔기를 보유하는 짧은 연장 링커를 포함하는 것인 접합체.
  19. 제16항에 있어서, 재조합 인간 리소좀 효소가 인간 산 α-글루코시다제 (rhGAA)인 접합체.
  20. 제16항에 있어서, 화학적 접합이 아미노-반응성 이관능성 가교제에서 유래한 가교제를 통해 이루어지는 것인 접합체.
  21. 제16항에 있어서, 화학적 접합이 N-숙신이미딜 6-히드라지노니코티네이트 아세톤 (S-Hynic)에서 유래한 가교제를 통해 이루어지는 것인 접합체.
  22. 제16항에 있어서, 화학적 접합이 술포-N-히드록시숙신이미드 에스테르-포스핀 (술포-NHS-포스핀)에서 유래한 가교제를 통해 이루어지는 것인 접합체.
  23. 제16항에 있어서, 화학적 접합이 N-히드록시숙신이미드 에스테르-테트라옥사펜타데칸 아세틸렌 (NHS-PEG4-아세틸렌)에서 유래한 가교제를 통해 이루어지는 것인 접합체.
  24. 제16항에 있어서, 화학적 접합이 디플루오로시클로옥틴 (DIFO) 및 디벤조시클로옥틴 (DIBO)으로부터 선택되는 이종이관능성 가교제에서 유래한 가교제를 통해 이루어지는 것인 접합체.
  25. 제16항에 있어서, 재조합 인간 리소좀 효소에 접합된 이종이관능성 가교제-변형 변이체 IGF-2 펩티드를 포함하는 접합체.
  26. 제16항의 접합체를 리소좀 축적증을 치료하기에 충분한 양으로 포함하는, 리소좀 축적증을 치료하기 위한 제약 조성물.
  27. 제26항에 있어서, 리소좀 축적증이 폼페(Pompe)병, 파브리(Fabry)병 및 고셔(Gaucher)병, MPS I, MPS II, MPS VII, 테이-삭스(Tay-Sachs)병, 샌드호프(Sandhoff)병, α-만노시드축적증 및 월만(Wolman)병 중 적어도 하나인 제약 조성물.
  28. 제1항에 있어서, 변이체 IGF-2 펩티드를 코딩하는 DNA 서열이 서열 1을 포함하는 것인 방법.
  29. 제1항에 있어서, 연장 링커가 서열 3의 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
  30. 제1 가교제-변형 재조합 인간 리소좀 효소를 하나 이상의 제2 가교제-변형 변이체 IGF-2 펩티드에 접합시키는 것을 포함하는, 재조합 리소좀 효소에 접합된 표적화 펩티드를 제조하는 방법이며,
    여기서 제1 가교제-변형 재조합 리소좀 효소는 화학적으로 변형된 N-말단 및 하나 이상의 변형된 리신 잔기를 보유함을 특징으로 하는 재조합 리소좀 효소를 포함하고;
    하나 이상의 제2 가교제-변형 변이체 IGF-2 펩티드는 아미노 (N)-말단에서 짧은 연장 링커 내에 변형된 아미노산을 포함하는 하나 이상의 변이체 IGF-2 펩티드를 포함하고,
    여기서 재조합 인간 리소좀 효소는 인간 산 α-글루코시다제, 인간 산 α-갈락토시다제 A, 인간 산 β-글루쿠로니다제, 인간 산 α-이두로니다제 A, 인간 산 이두로니데이트 2-술파타제, 인간 β-헥소스아미니다제 A, 인간 β-헥소스아미니다제 B, 인간 산 α-만노시다제 A, 인간 β-글루코세레브로시다제, 인간 산 리파제, 및 이들의 임의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되고,
    하나 이상의 변이체 IGF-2 펩티드는 서열 2의 아미노산 서열을 포함하는 것인, 재조합 리소좀 효소에 접합된 표적화 펩티드를 제조하는 방법.
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