KR102385392B1 - 표적화된 치료적 리소좀 효소 융합 단백질들 및 그들의 용도들 - Google Patents

표적화된 치료적 리소좀 효소 융합 단백질들 및 그들의 용도들 Download PDF

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Abstract

본 발명은 일반적으로 리소좀 축적 질환들을 치료하는 데 유용한 치료적 융합 단백질들 및 이러한 질환들을 치료하는 방법들에 관한 것이다. 대표적인 치료적 융합 단백질들은 리소좀 효소, 리소좀 표적화 분체, 예컨대, IGF-Ⅱ 펩타이드, 및 스페이서 펩타이드를 포함한다. 또한 알파-N-아세틸글루코사미니다제(Naglu), 리소좀 표적화 분체, 예컨대, IGF-Ⅱ 펩타이드, 및 스페이서 펩타이드를 포함하는 표적화된 치료적 융합 단백질을 포함하는 조성물들 그리고 점액다당류증 제ⅢB형(산필립포 B 증후군)을 치료하는 방법들이 제공된다.

Description

표적화된 치료적 리소좀 효소 융합 단백질들 및 그들의 용도들{Targeted therapeutic lysosomal enzyme fusion proteins and uses thereof}
본 출원은 미국 가출원 제61/730,378호(출원일: 2012년 11월 27일) 및 미국 가출원 제61/788,968호(출원일: 2013년 3월 15일)의 우선권의 이익을 주장하며, 이들 기초 출원은 그들의 전문이 참고로 본 명세서에 편입된다.
본 발명은 일반적으로 리소좀 축적 질환들을 치료하는 데 유용한 치료적 융합 단백질들 및 이러한 질환들을 치료하는 방법들에 관한 것이다. 대표적인 치료적 융합 단백질들은 리소좀 효소, 리소좀 표적화 분체(moiety), 예컨대, IGF-Ⅱ 펩타이드, 및 스페이서 펩타이드를 포함한다. 리소좀 효소는 알파-N-아세틸글루코사미니다제(Naglu)이고, 질환은 점액다당류증 제ⅢB형(산필립포 B 증후군)인 것으로 고려된다.
정상적으로, 포유동물의 리소좀 효소들은 세포질에서 합성되고, N-결합된 고-만노스 유형 탄수화물로 글리코실화되는 ER을 통과한다. 골지체에서, 고-만노스 탄수화물은 리소좀 효소들 위에서 리소좀으로 이들 단백질들을 표적화하는 만노스-6-포스페이트(M6P)의 첨가에 의해 변형된다. M6P-변형된 단백질은 M6P 수용체들 둘 중 하나와 상호작용에 의해 리소좀으로 전달된다. 가장 바람직한 형태의 변형은 두 개의 M6P가 고-만노스 탄수화물에 첨가될 때이다.
40가지 이상의 리소좀 축적 질환(LSD)은 리소좀에서 하나 이상의 리소좀 효소의 부재에 의해 직접 또는 간접적으로 유발된다. LSD들을 위한 효소 대체 요법(enzyme replacement therapy)이 활발하게 시도되고 있다. 치료법은 일반적으로 LSD 단백질들이 흡수되어 M6P-의존적 방식으로 다양한 세포 유형들의 리소좀들에 전달되는 것을 요구한다. 한 가지 가능한 접근법은 LSD 단백질을 정제하고 이를 M6P로 탄수화물 분체를 도입하도록 변형하는 단계가 관여한다. 이러한 변형된 물질은 세포 표면 위에서 M6P 수용체들과 상호작용으로 인해 미변형된 LSD 단백질들보다 더 효율적으로 세포들에 의해 섭취될 수 있다.
본 출원의 발명자들은 이전에 리소좀들에 치료적 효소들의 더욱 효율적인 전달을 허용하는 펩타이드 기반 표적화 기술을 개발하였다. 이러한 특허 기술은 펩타이드 태그가 리소좀들을 표적화하는 분체로서 M6P를 대체하기 때문에 글리코실화 비의존성 리소좀 표적화(GILT, Glycosylation Independent Lysosomal Targeting)라고 지칭된다. GILT 기술의 세부사항들은 미국 출원 공개들 제2003-0082176호, 제2004-0006008호, 제2003-0072761호, 제2005-0281805호, 제2005-0244400호, 및 국제 특허출원들 제WO 03/032913호, 제WO 03/032727호, 제WO 02/087510호, 제WO 03/102583호, 제WO 2005/078077호에 기술되고, 이들 모든 발명들이 본 명세서에 의해 참고문헌으로 통합되어 있다.
본 발명은 GILT 기술을 기초로 하는 효율적인 리소좀 표적화(lysosomal targeting)를 위한 더욱 개선된 조성물들 및 방법들을 제공한다.
무엇보다도, 본 발명은 리소좀 표적화 펩타이드들을 사용하여 리소좀 효소들을 리소좀들에 표적화하는 방법들 및 조성물들을 제공한다. 또한 본 발명은 IGF-Ⅱ 수용체에 대한 감소 또는 축소된 결합 친화도 및/또는 인슐린 수용체에 대한 감소 또는 축소된 결합 친화도를 가지고/거나, 퓨린 절단에 저항하는 리소좀 표적화 펩타이드를 사용하여 리소좀 효소들을 리소좀들에 표적화하는 방법들 및 조성물들을 제공한다. 본 발명은 또한 리소좀 효소들 및 IGF-Ⅱ 그리고 리소좀 효소 융합 단백질의 개선된 생산 및 리소좀들 내로 흡수를 제공하는 스페이서 펩타이드들을 포함하는 리소좀 효소 융합 단백질들(lysosomal enzyme fusion protein)을 제공한다. 소정의 구현예들에서, 리소좀 효소는 알파-N-아세틸글루코사미니다제(Naglu)이다.
한 가지 관점에서, 본 발명은 리소좀 효소, 성숙한 인간 IGF-Ⅱ의 8번 내지 67번 아미노산들과 적어도 70% 동일한 아미노산 서열을 가지는 펩타이드 태그 그리고 리소좀 효소와 IGF-Ⅱ 펩타이드 태그 사이의 스페이서 펩타이드를 포함하는 표적화된 치료적 융합 단백질을 제공한다. 다양한 구현예에서, 스페이서 펩타이드는 하나 이상의 GGGPS(서열번호 14) 또는 GGGSP(서열번호 15) 아미노산 서열들을 포함하고, 선택적으로 하나 이상의 (i) GAP(서열번호 9), (ii) GGGGS(서열번호 12), (iii) GGGS(서열번호 16), (iv) AAAAS(서열번호 17), (v) AAAS(서열번호 18), (vi) PAPA(서열번호 19), (vii) TPAPA(서열번호 20), (viii) AAAKE(서열번호 21) 또는 (ix) GGGGA(서열번호 60)를 더 포함한다.
본 명세서에서 고려된 예시적인 리소좀 효소들은 표 1에 나타낸 것들을 포함한다.
다양한 구현예에서, 표적화된 치료적 융합 단백질은 인간 α-N-아세틸글루코사미니다제(Naglu) 단백질과 적어도 85% 동일한 아미노산 서열(도 1, 서열번호 1), 성숙한 인간 IGF-Ⅱ의 8번 내지 67번 아미노산들과 적어도 70% 동일한 아미노산 서열을 가지는 펩타이드 태그 그리고 Naglu 아미노산 서열과 IGF-Ⅱ 펩타이드 태그 사이에 위치하는 스페이서 펩타이드를 포함한다. 다양한 구현예에서, 스페이서는 아미노산 서열 GAP(서열번호 9), GPS(서열번호 10), 또는 GGS(서열번호 11)를 포함한다. 다양한 구현예에서, 스페이서 서열은 성숙한 인간 IGF-Ⅱ의 아미노산들과 인간 Naglu의 아미노산들 사이에 아미노산들 Gly-Pro-Ser(GPS)(서열번호 10)을 포함한다.
다양한 구현예에서, 스페이서 펩타이드는 하나 이상의 GGGGS(서열번호 12) 또는 GGGS(서열번호 16) 아미노산 서열들을 포함한다. 다양한 구현예에서, 스페이서 펩타이드는 하나 이상의 GGGPS(서열번호 14) 또는 GGGSP(서열번호 15) 아미노산 서열들을 포함한다. 다양한 구현예에서, 스페이서 펩타이드는 하나 이상의 AAAAS(서열번호 17) 또는 AAAS(서열번호 18) 아미노산 서열들을 포함한다. 다양한 구현예에서, 스페이서 펩타이드는 하나 이상의 PAPA(서열번호 19) 또는 TPAPA(서열번호 20) 아미노산 서열들을 포함한다. 다양한 구현예에서, 스페이서 펩타이드는 하나 이상의 AAAKE(서열번호 21) 아미노산 서열들을 포함한다. 다양한 구현예에서, 스페이서 펩타이드는 하나 이상의 GGGGA(서열번호 60) 아미노산 서열들을 포함한다.
다양한 구현예에서, 스페이서 펩타이드는 (GGGGS)n(서열번호들 12, 56, 58, 91 내지 94), (GGGGS)n-GGGPS(서열번호들 36, 95 내지 100), GAP-(GGGGS)n-GGGPS(서열번호들 101 내지 107), GAP-(GGGGS)n-GGGPS-GAP(서열번호들 37, 108 내지 113), GAP-(GGGGS)n-GGGPS-(GGGGS)n-GAP(서열번호들 114 내지 162), GAP-GGGPS-(GGGGS)n-GAP(서열번호들 163 내지 169), GAP-(GGGGS)n-AAAAS-GGGPS-(GGGGS)n-AAAA-GAP(서열번호들 170 내지 218), GAP-(GGGGS)n-PAPAP-(Xaa)n-GAP(서열번호들 219 내지 267), GAP-(GGGGS)n-PAPAPT-(Xaa)n-GAP(서열번호들 268 내지 316), GAP-(GGGGS)n-(Xaa)n-PAPAP-(Xaa)n-(AAAKE)n-(Xaa)n-(GGGGS)n-GAP(서열번호들 544 내지 551), (GGGGA)n(서열번호들 60, 79, 81, 317 내지 320), (GGGGA)n-GGGPS(서열번호들 321 내지 326), GAP-(GGGGA)n-GGGPS(서열번호들 327 내지 333), GAP-(GGGGA)n-GGGPS-GAP(서열번호들 334 내지 340), GAP-(GGGGA)n-GGGPS-(GGGGA)n-GAP(서열번호들 341 내지 389), GAP-GGGPS-(GGGGA)n-GAP(서열번호들 390 내지 396), GAP-(GGGGA)n-AAAAS-GGGPS-(GGGGA)n-AAAA-GAP(서열번호들 397 내지 445), GAP-(GGGGA)n-PAPAP-(Xaa)n-GAP(서열번호들 446 내지 494), GAP-(GGGGA)n-PAPAPT-(Xaa)n-GAP(서열번호들 495 내지 543), GAP-(GGGGA)n-(Xaa)n-PAPAP-(Xaa)n-(AAAKE)n-(Xaa)n-(GGGGA)n-GAP(서열번호들 552 내지 559)(임)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하되; 여기서 n은 1 내지 7이다. 다양한 구현예에서, n은 1 내지 4이다.
다양한 구현예에서, 본 발명은 펩타이드 또는 펩타이드를 포함하는 융합 단백질을 포유동물의 리소좀으로 표적화하는 펩타이드 태그로서 사용하는 IGF-Ⅱ 펩타이드를 제공한다. 다양한 구현예에서, 본 발명은 IGF-Ⅱ 뮤테인을 제공한다. 다양한 구현예에서, 본 발명은 성숙한 인간 IGF-Ⅱ(AYRPSETLCGGELVDTLQFVCGDRGFYFSRPASRVSRRSRGIVEECCFRSCDLALLETYCATPAKSE)(서열번호 5)와 적어도 70% 동일한 아미노산 서열 및 적어도 하나의 퓨린 프로테아제 절단 부위를 없애는 돌연변이를 가지는 퓨린-저항성 IGF-Ⅱ 뮤테인을 제공한다.
일정 구현예들에서, 본 발명은 성숙한 인간 IGF-Ⅱ와 적어도 70% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 IGF-Ⅱ 뮤테인을 제공한다. 다양한 구현예에서, IGF-Ⅱ 뮤테인 펩타이드 태그는 성숙한 인간 IGF-Ⅱ의 8번 내지 67번 아미노산들을 포함한다. 다양한 구현예에서, IGF-Ⅱ 뮤테인은 야생형 인간 IGF-Ⅱ와 비교해서 인슐린 수용체에 대한 결합 친화도를 감소 또는 축소하는 돌연변이를 포함한다.
일정 구현예들에서, IGF-Ⅱ 뮤테인은 자연적으로-생기는 인간 IGF-Ⅱ의 IGF-I 수용체에 대한 친화도와 대비하여 IGF-I 수용체에 대한 축소된 결합 친화도를 가진다.
다양한 구현예에서, 본 발명은, 리소좀 효소 및 성숙한 인간 IGF-Ⅱ와 적어도 70% 동일한 아미노산 서열을 가지는 IGF-Ⅱ 뮤테인을 포함하는 표적화된 치료적 융합 단백질로서, IGF-Ⅱ 뮤테인은 퓨린 절단에 대한 저항성을 가지고 인간 양이온-비의존성 만노스-6-포스페이트 수용체와 만노스-6-포스페이트-비의존적 방식으로 결합하는, 표적화된 치료적 융합 단백질을 제공한다.
일정 구현예들에서, 본 발명은 리소좀 효소 및 성숙한 인간 IGF-Ⅱ와 적어도 70% 동일한 아미노산 서열을 가지고, 자연적으로-생기는 인간 IGF-Ⅱ의 인슐린 수용체에 대한 친화도와 대비하여 인슐린 수용체에 대한 축소된 결합 친화도를 가지는 IGF-Ⅱ 뮤테인을 포함하는 표적화된 치료적 융합 단백질을 제공한다. 관련된 구현예에서, IGF-Ⅱ 뮤테인은 퓨린 절단에 대한 저항성을 가지고 인간 양이온-비의존성 만노스-6-포스페이트 수용체와 만노스-6-포스페이트-비의존적 방식으로 결합한다.
다양한 구현예에서, 본 발명에 적합한 IGF-Ⅱ 뮤테인은 성숙한 인간 IGF-Ⅱ의 아미노산들 30번 내지 40번에 해당하는 영역 내에 돌연변이를 포함한다. 일정 구현예들에서, 본 발명에 적합한 IGF-Ⅱ 뮤테인은 성숙한 인간 IGF-Ⅱ의 아미노산들 34번 내지 40번에 해당하는 영역 내에 돌연변이를 포함함으로써, 돌연변이가 적어도 하나의 퓨린 프로테아제 절단 부위를 없앤다. 일정 구현예들에서, 적합한 돌연변이는 아미노산 치환, 결실 및/또는 삽입이다. 일정 구현예들에서, 돌연변이는 성숙한 인간 IGF-Ⅱ의 Arg 37번 또는 Arg 40번에 해당하는 위치에서 아미노산 치환이다. 일정 구현예들에서, 아미노산 치환은 Lys 또는 Ala 치환이다.
일정 구현예들에서, 적합한 돌연변이는 성숙한 인간 IGF-Ⅱ의 30번 내지 40번, 31번 내지 40번, 32번 내지 40번, 33번 내지 40번, 34번 내지 40번, 30번 내지 39번, 31번 내지 39번, 32번 내지 39번, 34번 내지 37번, 33번 내지 39번, 34번 내지 39번, 35번 내지 39번, 36번 내지 39번, 37번 내지 40번 및 그들의 조합들로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 위치들에 해당하는 아미노산 잔기들의 결실 또는 치환이다.
다양한 구현예에서, 본 발명에 따른 IGF-Ⅱ 뮤테인은 성숙한 인간 IGF-Ⅱ의 2번 내지 7번 위치들에 해당하는 아미노산들의 결실 또는 치환을 더 포함한다. 다양한 구현예에서, 본 발명에 따른 IGF-Ⅱ 뮤테인은 성숙한 인간 IGF-Ⅱ의 1번 내지 7번 위치들에 해당하는 아미노산들의 결실 또는 치환을 더 포함한다. 다양한 구현예에서, 본 발명에 따른 IGF-Ⅱ 뮤테인은 성숙한 인간 IGF-Ⅱ의 62번 내지 67번 위치들에 해당하는 아미노산들의 결실 또는 치환을 더 포함한다. 다양한 구현예에서, 본 발명에 따른 IGF-Ⅱ 뮤테인은 성숙한 인간 IGF-Ⅱ의 Tyr 27번, Leu 43번, 또는 Ser 26번에 해당하는 아미노산들의 결실 또는 치환을 더 포함한다. 다양한 구현예에서, 본 발명에 따른 IGF-Ⅱ 뮤테인은 적어도 Tyr 27번 Leu, Leu 43번 Val, Ser 26번 Phe 및 그들의 조합들로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 치환을 포함한다. 다양한 구현예에서, 본 발명에 따른 IGF-Ⅱ 뮤테인은 성숙한 인간 IGF-Ⅱ의 48번 내지 55번 위치들에 해당하는 아미노산들의 결실 또는 치환을 포함한다. 다양한 구현예에서, 본 발명에 따른 IGF-Ⅱ 뮤테인은 성숙한 인간 IGF-Ⅱ의 8번, 48번, 49번, 50번, 54번, 및 55번 위치들에 해당하는 아미노산들로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 적어도 세 개의 아미노산들을 포함한다. 다양한 구현예에서, 본 발명의 IGF-Ⅱ 뮤테인은 성숙한 인간 IGF-Ⅱ의 54번 및 55번 위치들에 해당하는 위치들에서, 각각이 pH 7.4에서 비하전되거나 음성적으로 하전되는 아미노산들을 포함한다. 다양한 구현예에서, IGF-Ⅱ 뮤테인은 자연적으로-생기는 인간 IGF-Ⅱ의 IGF-I 수용체에 대한 친화도와 대비하여 IGF-I 수용체에 대한 축소된 결합 친화도를 가진다. 다양한 구현예에서, IGF-Ⅱ 뮤테인은 IGF2 Δ8-67 R37A(예컨대, 성숙한 인간 IGF-Ⅱ의 37번 위치에서의 Arg이 Ala로 치환된 성숙한 인간 IGF-Ⅱ의 8번 내지 67번 아미노산들)이다.
다양한 구현예에서, 펩타이드 태그는 리소좀 효소의 N-말단 또는 C-말단에 부착되고, 따라서 각각 N-말단 태그 또는 C-말단 태그이다. 다양한 구현예에서, 펩타이드 태그는 C-말단 태그이다.
일정 구현예들에서, 본 발명에 적합한 리소좀 효소는 인간 알파-N-아세틸글루코사미니다제(Naglu)(도 1), 또는 그의 기능적 단편 또는 변이체이다. 일정 구현예들에서, 본 발명에 적합한 리소좀 효소는 인간 알파-N-아세틸글루코사미니다제의 1번 내지 743번 아미노산들 또는 신호 서열이 결여된 인간 알파-N-아세틸글루코사미니다제의 24번 내지 743번 아미노산들을 포함한다.
다양한 구현예에서, 본 발명의 표적화된 치료적 융합 단백질은 리소좀 효소와 IGF-Ⅱ 뮤테인 사이에 스페이서를 더 포함한다.
다양한 구현예에서, 스페이서는 알파-나선형 구조 또는 리지드 구조(rigid structure)를 포함한다.
다양한 구현예에서, 스페이서는 하나 이상의 Gly-Ala-Pro(GAP)(서열번호 9), Gly-Pro-Ser(GPS)(서열번호 10), 또는 Gly-Gly-Ser(GGS)(서열번호 11) 아미노산 서열들을 포함한다.
일정 구현예들에서, 스페이서는 EFGGGGSTR(서열번호 22), GAP(서열번호 9), GGGGS(서열번호 12), GPSGSPG(서열번호 23), GPSGSPGT(서열번호 24), GPSGSPGH(서열번호 25), GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPST(서열번호 26), GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSH(서열번호 27), GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGPS(서열번호 28), GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGPSGAP(서열번호 29), GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPS(서열번호 30), GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGAP(서열번호 31), GGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPS(서열번호 32), GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPSGAP(서열번호 33), GGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPS(서열번호 34), GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPSGAP(서열번호 35), GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPS(서열번호 36), GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGAP(서열번호 37), GGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGPS(서열번호 38), GAPGGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGPSGAP(서열번호 39), GGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGGSAAAASGGGPS(서열번호 40), GAPGGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGGSAAAASGGGPSGAP(서열번호 41), GGGGSGGGGSAAAASGGGPSGGGGSAAAASGGGPSGGGGSAAAASGGGPS(서열번호 42), GAPGGGGSGGGGSAAAASGGGPSGGGGSAAAASGGGPSGGGGSAAAASGGGPSGAP(서열번호 43), GGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPGPS(서열번호 44), GAPGGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPGPSGAP(서열번호 45), GGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTGPS(서열번호 46), GAPGGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTGPSGAP(서열번호 47), GGGSPAPTPTPAPTPAPTPAGGGPS(서열번호 48), GAPGGGSPAPTPTPAPTPAPTPAGGGPSGAP(서열번호 49), GGGSPAPAPTPAPAPTPAPAGGGPS(서열번호 50), GAPGGGSPAPAPTPAPAPTPAPAGGGPSGAP(서열번호 51), GGGSAEAAAKEAAAKEAAAKAGGPS(서열번호 52), GAPGGGSAEAAAKEAAAKEAAAKAGGPSGAP(서열번호 53), GGGSPAEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKAPSGGG(서열번호 54), GAPGGGSPAEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKAPSGGGGAP(서열번호 55), GGGGSGGGGSGGGGS(서열번호 56), GAPGGGGSGGGGSGGGGSGAP(서열번호 57), GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(서열번호 58), GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGAP(서열번호 59),GGGGA(서열번호 60), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPST(서열번호 61), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSH(서열번호 62), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGPS(서열번호 63), GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGPSGAP(서열번호 64), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPS(서열번호 65), GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGAP(서열번호 66), GGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPS(서열번호 67), GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPSGAP(서열번호 68), GGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPS(서열번호 69), GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPSGAP(서열번호 70), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPS(서열번호 71), GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGAP(서열번호 72), GGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGPS(서열번호 73), GAPGGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGPSGAP(서열번호 74), GGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGGAAAAASGGGPS(서열번호 75), GAPGGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGGAAAAASGGGPSGAP(서열번호 76), GGGGAGGGGAAAAASGGGPSGGGGAAAAASGGGPSGGGGAAAAASGGGPS(서열번호 77), GAPGGGGAGGGGAAAAASGGGPSGGGGAAAAASGGGPSGGGGAAAAASGGGPSGAP(서열번호 78), GGGGAGGGGAGGGGA(서열번호 79), GAPGGGGAGGGGAGGGGAGAP(서열번호 80), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGA(서열번호 81), GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGAP(서열번호 82), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPS[또는 (GGGGA)8GGGPS](서열번호 83), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSH[또는 (GGGGA)8GGGPSH](서열번호 84), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPS[또는 (GGGGA)9GGGPS](서열번호 85), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSH[또는 (GGGGA)9GGGPSH](서열번호 86), GGGGPAPGPGPAPGPAPGPAGGGPS(서열번호 87), GAPGGGGPAPGPGPAPGPAPGPAGGGPGGAP(서열번호 88), GGGGPAPAPGPAPAPGPAPAGGGPS(서열번호 89), 및 GAPGGGGPAPAPGPAPAPGPAPAGGGPGGAP(서열번호 90)로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
일정 구현예들에서, 스페이서는 GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPS(서열번호 36), GGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPGPS(서열번호 44), GAPGGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPGPSGAP(서열번호 45), GGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTGPS(서열번호 46), GAPGGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTGPSGAP(서열번호 47), GGGSPAPTPTPAPTPAPTPAGGGPS(서열번호 48), GAPGGGSPAPTPTPAPTPAPTPAGGGPSGAP(서열번호 49), GGGSPAPAPTPAPAPTPAPAGGGPS(서열번호 50), GAPGGGSPAPAPTPAPAPTPAPAGGGPSGAP(서열번호 51), GGGSAEAAAKEAAAKEAAAKAGGPS(서열번호 52), GAPGGGSAEAAAKEAAAKEAAAKAGGPSGAP(서열번호 53), GGGSPAEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKAPSGGG(서열번호 54), GAPGGGSPAEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKAPSGGGGAP(서열번호 55), 및 GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPS(서열번호 71)로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
일정 구현예들에서, 스페이서는 GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPS(서열번호 36), GAPGGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTGPSGAP(서열번호 47), GAPGGGSPAPAPTPAPAPTPAPAGGGPSGAP(서열번호 51), GAPGGGSPAEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKAPSGGGGAP(서열번호 55), 및 GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPS(서열번호 71)로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
다양한 구현예에서, 융합 단백질은 약제학적으로 허용가능한 담체, 희석제들 또는 부형제를 더 포함한다.
본 발명은 또한 상기 다양한 구현예에서 기술된 바와 같이 IGF-Ⅱ 뮤테인 또는 표적화된 치료적 융합 단백질을 인코딩하는 핵산들을 제공한다. 본 발명은 또한 본 발명의 핵산을 포함하는 다양한 세포를 제공한다.
본 발명은 본 발명의 표적화된 치료적 융합 단백질의 치료적 유효량을 포함하는 리소좀 축적 질환을 치료하는 데 적합한 약제학적 조성물을 제공한다. 본 발명은 또한 본 발명에 따른 표적화된 치료적 융합 단백질을 치료를 필요로 하는 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 리소좀 축적 질환들을 치료하는 방법들을 제공한다. 일정 구현예들에서, 리소좀 축적 질환은 점액다당류증 제ⅢB형(산필립포 B 증후군)이다.
또 다른 관점에서, 본 발명은, 표적화된 치료적 융합 단백질을 생산하는 방법으로서, 세포 배양 배지에서 포유동물 세포들을 배양하는 단계를 포함하고, 상세하게 본 명세서의 다양한 구현예에서 기술된 바와 같이 상기 포유동물 세포들은 본 발명의 핵산을 보유하고, 상기 배양은 표적화된 치료적 융합 단백질의 발현을 허용하는 조건들 하에서 수행되는, 방법을 제공한다.
보다 또 다른 관점에서, 본 발명은, 표적화된 치료적 융합 단백질를 생산하는 방법으로서, 세포 배양 배지에서 퓨린-결핍 세포들(예컨대, 퓨린-결핍 포유동물 세포들)을 배양하는 단계를 포함하고, 상기 퓨린-결핍 세포들은 리소좀 효소 및 성숙한 인간 IGF-Ⅱ와 적어도 70% 동일한 아미노산 서열을 가지는 IGF-Ⅱ 뮤테인을 포함하는 융합 단백질을 인코딩하는 핵산을 보유하고, IGF-Ⅱ 뮤테인은 인간 양이온-비의존성 만노스-6-포스페이트 수용체와 만노스-6-포스페이트-비의존적 방식으로 결합하며, 상기 배양은 표적화된 치료적 융합 단백질의 발현을 허용하는 조건들 하에서 수행되는, 방법을 제공한다.
다양한 구현예에서, 본 명세서에서 기술된 바와 같이 스페이서를 포함하는 소정의 표적화된 치료적 단백질들은 서로 다른 스페이서 펩타이드를 포함하는 표적화된 치료적 단백질들과 대비하여 재조합으로 발현될 때 활성을 가진 단백질의 증가된 발현을 나타내는 것으로 고려된다. 다양한 구현예에서, 본 명세서에서 기술된 표적화된 치료적 단백질들은 본 명세서에서 다른 표적화된 치료적 단백질들과 대비하여 증가된 활성을 가질 수 있는 점도 역시 고려된다. 서로 다른 스페이서 펩타이드를 포함하는 다른 표적화된 치료적 단백질들과 대비하여 활성을 가지는 단백질의 증가된 발현을 나타내고/거나 증가된 활성을 가지는 이들 표적화된 치료적 단백질들은 심화 실험법에 이용되는 점이 고려된다.
또 다른 관점에서, 본 발명은, 개체에서 리소좀 축적 질환을 치료하는 방법으로서, 개체에게 리소좀 효소, 성숙한 인간 IGF-Ⅱ의 8번 내지 67번 아미노산들과 적어도 70% 동일한 아미노산 서열을 가지는 펩타이드 태그 그리고 리소좀 효소 아미노산 서열과 IGF-Ⅱ 펩타이드 태그 사이에 위치하는 스페이서 펩타이드를 포함하는 융합 단백질을 포함하는 치료적 유효량의 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 방법을 제공한다. 다양한 구현예에서, 스페이서 펩타이드는 하나 이상의 GGGPS(서열번호 14) 또는 GGGSP(서열번호 15) 아미노산 서열들을 포함하고, 선택적으로 하나 이상의 (i) GAP(서열번호 9), (ii) GGGGS(서열번호 12), (iii) GGGS(서열번호 16), (iv) AAAAS(서열번호 17), (v) AAAS(서열번호 18), (vi) PAPA(서열번호 19), (vii) TPAPA(서열번호 20), (viii) AAAKE(서열번호 21) 또는 (ix) GGGGA(서열번호 60)를 더 포함한다.
다양한 구현예에서, 스페이서 펩타이드는 (GGGGS)n(서열번호들 12, 56, 58, 91 내지 94), (GGGGS)n-GGGPS(서열번호들 36, 95 내지 100), GAP-(GGGGS)n-GGGPS(서열번호들 101 내지 107), GAP-(GGGGS)n-GGGPS-GAP(서열번호들 37, 108 내지 113), GAP-(GGGGS)n-GGGPS-(GGGGS)n-GAP(서열번호들 114-162), GAP-GGGPS-(GGGGS)n-GAP(서열번호들 163 내지 169), GAP-(GGGGS)n-AAAAS-GGGPS-(GGGGS)n-AAAA-GAP(서열번호들 170 내지 218), GAP-(GGGGS)n-PAPAP-(Xaa)n-GAP(서열번호들 219 내지 267), GAP-(GGGGS)n-PAPAPT-(Xaa)n-GAP(서열번호들 268 내지 316), GAP-(GGGGS)n-(Xaa)n-PAPAP-(Xaa)n-(AAAKE)n-(Xaa)n-(GGGGS)n-GAP(서열번호들 544 내지 551), (GGGGA)n(서열번호들 60, 79, 81, 317 내지 320), (GGGGA)n-GGGPS(서열번호들 321 내지 326), GAP-(GGGGA)n-GGGPS(서열번호들 327 내지 333), GAP-(GGGGA)n-GGGPS-GAP(서열번호들 334 내지 340), GAP-(GGGGA)n-GGGPS-(GGGGA)n-GAP(서열번호들 341 내지 389), GAP-GGGPS-(GGGGA)n-GAP(서열번호들 390 내지 396), GAP-(GGGGA)n-AAAAS-GGGPS-(GGGGA)n-AAAA-GAP(서열번호들 397 내지 445), GAP-(GGGGA)n-PAPAP-(Xaa)n-GAP(서열번호들 446 내지 494), GAP-(GGGGA)n-PAPAPT-(Xaa)n-GAP(서열번호들 495 내지 543), GAP-(GGGGA)n-(Xaa)n-PAPAP-(Xaa)n-(AAAKE)n-(Xaa)n-(GGGGA)n-GAP(서열번호들 552 내지 559)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하되; 여기서 n은 1 내지 7, 선택적으로 n은 1 내지 4이다.
다양한 구현예에서, 스페이서 펩타이드는 EFGGGGSTR(서열번호 22), GAP(서열번호 9), GGGGS(서열번호 12), GPSGSPG(서열번호 23), GPSGSPGT(서열번호 24), GPSGSPGH(서열번호 25), GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPST(서열번호 26), GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSH(서열번호 27), GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGPS(서열번호 28), GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGPSGAP(서열번호 29), GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPS(서열번호 30), GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGAP(서열번호 31), GGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPS(서열번호 32), GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPSGAP(서열번호 33), GGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPS(서열번호 34), GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPSGAP(서열번호 35), GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPS(서열번호 36), GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGAP(서열번호 37), GGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGPS(서열번호 38), GAPGGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGPSGAP(서열번호 39), GGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGGSAAAASGGGPS(서열번호 40), GAPGGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGGSAAAASGGGPSGAP(서열번호 41), GGGGSGGGGSAAAASGGGPSGGGGSAAAASGGGPSGGGGSAAAASGGGPS(서열번호 42), GAPGGGGSGGGGSAAAASGGGPSGGGGSAAAASGGGPSGGGGSAAAASGGGPSGAP(서열번호 43), GGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPGPS(서열번호 44), GAPGGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPGPSGAP(서열번호 45), GGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTGPS(서열번호 46), GAPGGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTGPSGAP(서열번호 47), GGGSPAPTPTPAPTPAPTPAGGGPS(서열번호 48), GAPGGGSPAPTPTPAPTPAPTPAGGGPSGAP(서열번호 49), GGGSPAPAPTPAPAPTPAPAGGGPS(서열번호 50), GAPGGGSPAPAPTPAPAPTPAPAGGGPSGAP(서열번호 51), GGGSAEAAAKEAAAKEAAAKAGGPS(서열번호 52), GAPGGGSAEAAAKEAAAKEAAAKAGGPSGAP(서열번호 53), GGGSPAEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKAPSGGG(서열번호 54), GAPGGGSPAEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKAPSGGGGAP(서열번호 55), GGGGSGGGGSGGGGS(서열번호 56), GAPGGGGSGGGGSGGGGSGAP(서열번호 57), GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(서열번호 58), GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGAP(서열번호 59), GGGGA(서열번호 60), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPST(서열번호 61), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSH(서열번호 62), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGPS(서열번호 63), GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGPSGAP(서열번호 64), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPS(서열번호 65), GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGAP(서열번호 66), GGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPS(서열번호 67), GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPSGAP(서열번호 68), GGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPS(서열번호 69), GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPSGAP(서열번호 70), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPS(서열번호 71), GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGAP(서열번호 72), GGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGPS(서열번호 73), GAPGGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGPSGAP(서열번호 74), GGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGGAAAAASGGGPS(서열번호 75), GAPGGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGGAAAAASGGGPSGAP(서열번호 76), GGGGAGGGGAAAAASGGGPSGGGGAAAAASGGGPSGGGGAAAAASGGGPS(서열번호 77), GAPGGGGAGGGGAAAAASGGGPSGGGGAAAAASGGGPSGGGGAAAAASGGGPSGAP(서열번호 78), GGGGAGGGGAGGGGA(서열번호 79), GAPGGGGAGGGGAGGGGAGAP(서열번호 80), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGA(서열번호 81), GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGAP(서열번호 82), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPS[또는 (GGGGA)8GGGPS](서열번호 83), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSH[또는 (GGGGA)8GGGPSH](서열번호 84), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPS[또는 (GGGGA)9GGGPS](서열번호 85), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSH[또는 (GGGGA)9GGGPSH](서열번호 86), GGGGPAPGPGPAPGPAPGPAGGGPS(서열번호 87), GAPGGGGPAPGPGPAPGPAPGPAGGGPGGAP(서열번호 88), GGGGPAPAPGPAPAPGPAPAGGGPS(서열번호 89), 및 GAPGGGGPAPAPGPAPAPGPAPAGGGPGGAP(서열번호 90)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열을 가진다.
다양한 구현예에서, 스페이서 펩타이드는 GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPS(서열번호 36), GGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPGPS(서열번호 44), GAPGGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPGPSGAP(서열번호 45), GGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTGPS(서열번호 46), GAPGGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTGPSGAP(서열번호 47), GGGSPAPTPTPAPTPAPTPAGGGPS(서열번호 48), GAPGGGSPAPTPTPAPTPAPTPAGGGPSGAP(서열번호 49), GGGSPAPAPTPAPAPTPAPAGGGPS(서열번호 50),GAPGGGSPAPAPTPAPAPTPAPAGGGPSGAP(서열번호 51), GGGSAEAAAKEAAAKEAAAKAGGPS(서열번호 52), GAPGGGSAEAAAKEAAAKEAAAKAGGPSGAP(서열번호 53), GGGSPAEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKAPSGGG(서열번호 54), GAPGGGSPAEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKAPSGGGGAP(서열번호 55), 및 GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPS(서열번호 71)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열을 가진다.
다양한 구현예에서, 스페이서 펩타이드는 GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPS(서열번호 36), GAPGGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTGPSGAP(서열번호 47), GAPGGGSPAPAPTPAPAPTPAPAGGGPSGAP(서열번호 51), GAPGGGSPAEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKAPSGGGGAP(서열번호 55), 및 GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPS(서열번호 71)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열을 가진다.
본 명세서의 방법들에 의해 고려되는 대표적인 리소좀 축적 질환들은 표 1에 나타낸 것들을 포함한다. 리소좀 축적 질환은 표 1에 또한 기재된 바와 같이, 리소좀 축적 질환에서 결핍되는 효소를 포함하는 표적화된 치료적 융합 단백질을 사용하여 치료된다.
다양한 구현예에서, 본 발명은, 개체에서 점액다당류증 제ⅢB형(산필립포 B 증후군)을 치료하는 방법으로서, 개체에게 인간 α-N-아세틸글루코사미니다제(Naglu) 단백질(서열번호 1)과 적어도 85% 동일한 아미노산 서열, 성숙한 인간 IGF-Ⅱ의 8번 내지 67번 아미노산들과 적어도 70% 동일한 아미노산 서열을 가지는 펩타이드 태그 그리고 Naglu 아미노산 서열과 IGF-Ⅱ 펩타이드 태그 사이에 위치하는 스페이서 펩타이드를 포함하는 융합 단백질을 포함하는 치료적 유효량의 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 다양한 구현예에서, 스페이서는 아미노산 서열 GAP(서열번호 9), GPS(서열번호 10), 또는 GGS(서열번호 11)를 포함한다.
다양한 구현예에서, 스페이서 서열은 성숙한 인간 IGF-Ⅱ의 아미노산들과 인간 Naglu의 아미노산들 사이에 아미노산들 Gly-Pro-Ser(GPS)(서열번호 10)을 포함한다.
다양한 구현예에서, 스페이서 펩타이드는 하나 이상의 GGGGS(서열번호 12) 또는 GGGS(서열번호 16) 아미노산 서열들을 포함한다. 다양한 구현예에서, 스페이서 펩타이드는 하나 이상의 GGGPS(서열번호 14) 또는 GGGSP(서열번호 15) 아미노산 서열들을 포함한다. 다양한 구현예에서, 스페이서 펩타이드는 하나 이상의 AAAAS(서열번호 17) 또는 AAAS(서열번호 18) 아미노산 서열들을 포함한다. 다양한 구현예에서, 스페이서 펩타이드는 하나 이상의 PAPA(서열번호 19) 또는 TPAPA(서열번호 20) 아미노산 서열들을 포함한다. 다양한 구현예에서, 스페이서 펩타이드는 하나 이상의 AAAKE(서열번호 21) 아미노산 서열들을 포함한다. 다양한 구현예에서, 스페이서 펩타이드는 하나 이상의 GGGGA(서열번호 60) 아미노산 서열들을 포함한다.
다양한 구현예에서, 스페이서 펩타이드는, (GGGGS)n(서열번호들 12, 56, 58, 91 내지 94), (GGGGS)n-GGGPS(서열번호들 36, 95 내지 100), GAP-(GGGGS)n-GGGPS(서열번호들 101 내지 107), GAP-(GGGGS)n-GGGPS-GAP(서열번호들 37, 108 내지 113), GAP-(GGGGS)n-GGGPS-(GGGGS)n-GAP(서열번호들 114 내지 162), GAP-GGGPS-(GGGGS)n-GAP(서열번호들 163 내지 169), GAP-(GGGGS)n-AAAAS-GGGPS-(GGGGS)n-AAAA-GAP(서열번호들 170 내지 218), GAP-(GGGGS)n-PAPAP-(Xaa)n-GAP(서열번호들 219 내지 267), GAP-(GGGGS)n-PAPAPT-(Xaa)n-GAP(서열번호들 268 내지 316), GAP-(GGGGS)n-(Xaa)n-PAPAP-(Xaa)n-(AAAKE)n-(Xaa)n-(GGGGS)n-GAP(서열번호들 544 내지 551), (GGGGA)n(서열번호들 60, 79, 81, 317 내지 320), (GGGGA)n-GGGPS(서열번호들 321 내지 326), GAP-(GGGGA)n-GGGPS(서열번호들 327 내지 333), GAP-(GGGGA)n-GGGPS-GAP(서열번호들 334 내지 340), GAP-(GGGGA)n-GGGPS-(GGGGA)n-GAP(서열번호들 341 내지 389), GAP-GGGPS-(GGGGA)n-GAP(서열번호들 390 내지 396), GAP-(GGGGA)n-AAAAS-GGGPS-(GGGGA)n-AAAA-GAP(서열번호들 397 내지 445), GAP-(GGGGA)n-PAPAP-(Xaa)n-GAP(서열번호들 446 내지 494), GAP-(GGGGA)n-PAPAPT-(Xaa)n-GAP(서열번호들 495 내지 543), GAP-(GGGGA)n-(Xaa)n-PAPAP-(Xaa)n-(AAAKE)n-(Xaa)n-(GGGGA)n-GAP(서열번호들 552 내지 559)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하되; 여기서 n은 1 내지 7, 선택적으로 n은 1 내지 4이다.
다양한 구현예에서, 본 발명은, 생체내에서 글리코사미노글리칸(GAG) 수준들을 감소시키는 방법으로서, 점액다당류증 제ⅢB형(산필립포 B 증후군)으로 고생하는 개체에게 i) 인간 α-N-아세틸글루코사미니다제(Naglu) 단백질(서열번호 1)과 적어도 85% 동일한 아미노산 서열, ii) 성숙한 인간 IGF-Ⅱ의 8번 내지 67번 아미노산들과 적어도 70% 동일한 아미노산 서열을 가지는 펩타이드 태그, 그리고 iii) Naglu 아미노산 서열과 IGF-Ⅱ 펩타이드 태그 사이에 위치하는 스페이서 펩타이드를 포함하는 융합 단백질의 유효량을 투여하는 단계를 포함하는, 방법을 제공한다.
다양한 구현예에서, 스페이서 서열은 성숙한 인간 IGF-Ⅱ의 아미노산들과 인간 Naglu의 아미노산들 사이에 아미노산들 Gly-Ala-Pro(GAP)(서열번호 9)의 하나 이상의 사본들을 포함한다.
다양한 구현예에서, 스페이서 펩타이드는 EFGGGGSTR(서열번호 22), GAP(서열번호 9), GGGGS(서열번호 12), GPSGSPG(서열번호 23), GPSGSPGT(서열번호 24), GPSGSPGH(서열번호 25), GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPST(서열번호 26), GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSH(서열번호 27), GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGPS(서열번호 28), GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGPSGAP(서열번호 29), GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPS(서열번호 30), GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGAP(서열번호 31), GGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPS(서열번호 32), GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPSGAP(서열번호 33), GGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPS(서열번호 34), GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPSGAP(서열번호 35), GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPS(서열번호 36), GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGAP(서열번호 37), GGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGPS(서열번호 38), GAPGGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGPSGAP(서열번호 39), GGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGGSAAAASGGGPS(서열번호 40), GAPGGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGGSAAAASGGGPSGAP(서열번호 41), GGGGSGGGGSAAAASGGGPSGGGGSAAAASGGGPSGGGGSAAAASGGGPS(서열번호 42), GAPGGGGSGGGGSAAAASGGGPSGGGGSAAAASGGGPSGGGGSAAAASGGGPSGAP(서열번호 43), GGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPGPS(서열번호 44), GAPGGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPGPSGAP(서열번호 45), GGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTGPS(서열번호 46), GAPGGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTGPSGAP(서열번호 47), GGGSPAPTPTPAPTPAPTPAGGGPS(서열번호 48), GAPGGGSPAPTPTPAPTPAPTPAGGGPSGAP(서열번호 49), GGGSPAPAPTPAPAPTPAPAGGGPS(서열번호 50), GAPGGGSPAPAPTPAPAPTPAPAGGGPSGAP(서열번호 51), GGGSAEAAAKEAAAKEAAAKAGGPS(서열번호 52), GAPGGGSAEAAAKEAAAKEAAAKAGGPSGAP(서열번호 53), GGGSPAEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKAPSGGG(서열번호 54), GAPGGGSPAEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKAPSGGGGAP(서열번호 55), GGGGSGGGGSGGGGS(서열번호 56), GAPGGGGSGGGGSGGGGSGAP(서열번호 57), GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(서열번호 58), GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGAP(서열번호 59), GGGGA(서열번호 60), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPST(서열번호 61), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSH(서열번호 62), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGPS(서열번호 63), GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGPSGAP(서열번호 64), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPS(서열번호 65), GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGAP(서열번호 66), GGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPS(서열번호 67), GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPSGAP(서열번호 68), GGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPS(서열번호 69), GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPSGAP(서열번호 70), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPS(서열번호 71), GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGAP(서열번호 72), GGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGPS(서열번호 73), GAPGGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGPSGAP(서열번호 74), GGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGGAAAAASGGGPS(서열번호 75), GAPGGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGGAAAAASGGGPSGAP(서열번호 76), GGGGAGGGGAAAAASGGGPSGGGGAAAAASGGGPSGGGGAAAAASGGGPS(서열번호 77), GAPGGGGAGGGGAAAAASGGGPSGGGGAAAAASGGGPSGGGGAAAAASGGGPSGAP(서열번호 78), GGGGAGGGGAGGGGA(서열번호 79), GAPGGGGAGGGGAGGGGAGAP(서열번호 80), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGA(서열번호 81), GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGAP(서열번호 82), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPS[또는 (GGGGA)8GGGPS](서열번호 83), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSH[또는 (GGGGA)8GGGPSH](서열번호 84), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPS[또는 (GGGGA)9GGGPS](서열번호 85), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSH[또는 (GGGGA)9GGGPSH](서열번호 86), GGGGPAPGPGPAPGPAPGPAGGGPS(서열번호 87), GAPGGGGPAPGPGPAPGPAPGPAGGGPGGAP(서열번호 88), GGGGPAPAPGPAPAPGPAPAGGGPS(서열번호 89), 및 GAPGGGGPAPAPGPAPAPGPAPAGGGPGGAP(서열번호 90)로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
다양한 구현예에서, 스페이서 펩타이드는 GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPS(서열번호 36), GGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPGPS(서열번호 44), GAPGGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPGPSGAP(서열번호 45), GGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTGPS(서열번호 46), GAPGGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTGPSGAP(서열번호 47), GGGSPAPTPTPAPTPAPTPAGGGPS(서열번호 48), GAPGGGSPAPTPTPAPTPAPTPAGGGPSGAP(서열번호 49), GGGSPAPAPTPAPAPTPAPAGGGPS(서열번호 50), GAPGGGSPAPAPTPAPAPTPAPAGGGPSGAP(서열번호 51), GGGSAEAAAKEAAAKEAAAKAGGPS(서열번호 52), GAPGGGSAEAAAKEAAAKEAAAKAGGPSGAP(서열번호 53), GGGSPAEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKAPSGGG(서열번호 54), GAPGGGSPAEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKAPSGGGGAP(서열번호 55), 및 GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPS(서열번호 71)로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
다양한 구현예에서, 스페이서 펩타이드는 GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPS(서열번호 36), GAPGGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTGPSGAP(서열번호 47), GAPGGGSPAPAPTPAPAPTPAPAGGGPSGAP(서열번호 51), GAPGGGSPAEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKAPSGGGGAP(서열번호 55), 및 GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPS(서열번호 71)로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
다양한 구현예에서, 리소좀 표적화 도메인 또는 IGF-Ⅱ 펩타이드 태그는 성숙한 인간 IGF-Ⅱ(서열번호 2 및 4)의 8번 내지 67번 아미노산들을 포함한다. 다양한 구현예에서, IGF-Ⅱ 펩타이드 태그는 Arg 37번 잔기에서 돌연변이를 포함한다. 다양한 구현예에서, 돌연변이는 아르기닌 대신 알라닌의 치환이다. 다양한 구현예에서, 리소좀 표적화 도메인 또는 IGF-Ⅱ 펩타이드 태그는 IGF2 Δ8-67 R37A를 포함한다.
다양한 구현예에서, 융합 단백질은 인간 Naglu의 1번 내지 743번 아미노산들을 포함한다(서열번호 1 및 3). 다양한 구현예에서, 융합 단백질은 인간 Naglu의 24번 내지 743번 아미노산들을 포함한다.
다양한 구현예에서, 융합 단백질의 유효량은 개체의 체중의 약 0.1 내지 1 mg/kg, 약 1 내지 5 mg/kg, 약 2.5 내지 20 mg/kg, 약 5 내지 20 mg/kg, 약 10 내지 50 mg/kg, 또는 20 내지 100 mg/kg의 범위를 가진다. 다양한 구현예에서, 융합 단백질의 유효량은 개체의 체중 킬로그램 당 약 2.5 내지 20 mg이다.
다양한 구현예에서, 융합 단백질은 경막내, 정맥내, 근육내, 비경구로, 피부내, 또는 경점막내로 투여된다. 다양한 구현예에서, 융합 단백질은 경막내로 투여된다. 다양한 구현예에서, 경막내 투여는 선택적으로 융합 단백질을 정맥내로 투여하는 것을 더 포함한다.
다양한 구현예에서, 경막내 투여는 융합 단백질을 뇌실, 요추 영역, 또는 대수공 내로 도입하는 것을 포함한다.
다양한 구현예에서, 융합 단백질은 격월로, 매월, 3주마다, 격주로, 매주, 매일, 또는 다양한 간격들로 투여된다.
다양한 구현예에서, 치료는 뇌 조직에서 글리코사미노글리칸(GAG) 수준들을 감소시키는 결과를 가져온다. 또한 치료는 뇌 조직에서 리소좀 축적 과립들을 감소시키는 결과를 가져오는 것으로 고려된다.
또한 리소좀 축적 질환들을 치료하는 데 사용하는 본 명세서에서 기술된 바와 같이 표적화된 치료적 융합 단백질들을 포함하는 조성물들이 고려된다. 대표적인 리소좀 축적 질환들은 표 1에 기재된 것들을 포함한다.
본 발명의 다른 특징들, 목적들, 및 장점들은 다음의 상세한 설명에서 명확하게 된다. 그러나 상세한 설명은 본 발명의 구현예들을 가리키면서, 제한이 아닌 단지 도시로서 주어지는 점이 이해되어야 한다. 본 발명의 범주 내의 다양한 변화들 및 변형들은 당업자들에게라면 상세한 설명으로부터 자명해질 것이다.
도면들은 제한이 아닌 단지 예시적 목적들을 위한 것이다.
도 1은 (A) Naglu 및 (B) IGF-Ⅱ의 8번 내지 67번 잔기들을 포함하고 37번 잔기에서 아미노산 치환, R37A(Arg 37번 Ala)를 가지는 IGF-Ⅱ 펩타이드를 포함하는 대표적인 치료적 융합 단백질 일부의 아미노산 서열들을 나타낸 것이다.
도 2는 (A) Naglu 및 (B) IGF-Ⅱ의 8번 내지 67번 잔기들을 포함하고 37번 잔기에서 아미노산 치환, R37A(Arg 37번 Ala)를 가지는 IGF-Ⅱ 펩타이드를 포함하는 대표적인 치료적 융합 단백질 일부의 뉴클레오타이드 서열들을 나타낸 것이다.
도 3은 치료적 융합 단백질에서 사용하기 위해 고려되는 대표적인 스페이서 서열들을 나타낸 것이다.
정의들
향상: 본 명세서에서 사용되는 바, 용어 "향상(amelioration)"은 개체의 상태의 예방, 감소 또는 완화, 또는 상태의 개선을 의미한다. 향상은 질환 병태의 완전한 회복 또는 완전한 예방을 포함하지만, 요구하지는 않는다. 일정 구현예들에서, 향상은 적절한 질환들 조직들의 리소좀들 내부에서 축적된 물질들의 감소를 포함한다.
퓨린-저항성 IGF-Ⅱ 뮤테인: 본 명세서에서 사용되는 바, 용어 "퓨린-저항성 IGF-Ⅱ 뮤테인"은 적어도 하나의 미경험 프로테아제 절단 부위를 없애거나 미경험 퓨린 프로테아제 절단 부위와 밀접하거나 인접한 서열을 변화시킴으로써 야생형 인간 IGF-Ⅱ 펩타이드와 비교해서 퓨린 절단이 방지되거나, 억제되거나, 감소되거나, 지연되는 변경된 아미노산 서열을 포함하는 IGF-Ⅱ-기초 펩타이드를 말한다. 본 명세서에서 사용되는 바, 퓨린-저항성 IGF-Ⅱ 뮤테인은 또한 퓨린에 대해 저항성을 가지는 IGF-Ⅱ 뮤테인을 말한다.
퓨린 프로테아제 절단 부위: 본 명세서에서 사용되는 바, 용어 "퓨린 프로테아제 절단 부위"("퓨린 절단 부위" 또는 "퓨린 절단 서열"이라고도 지칭함)는 퓨린 또는 퓨린-유사 프로테아제들에 의한 효소적 프로테아제 절단을 위한 인식 서열로서 작용하는 펩타이드 또는 단백질의 아미노산 서열을 말한다. 전형적으로, 퓨린 프로테아제 절단 부위는 공통 서열 Arg-X-X-Arg(서열번호 6)를 가지며, X는 임의의 아미노산이다. 절단 부위는 서열에서 카복시-말단 아르기닌(Arg) 잔기 이후에 위치한다. 일정 구현예들에서, 퓨린 절단 부위는 공통 서열 Lys/Arg-X-X-X-Lys/Arg-Arg(서열번호 7)를 가질 수 있고, X는 임의의 아미노산이다. 절단 부위는 서열에서 카복시-말단 아르기닌(Arg) 잔기 다음에 위치한다.
퓨린: 본 명세서에서 사용되는 바, 용어 "퓨린"은 퓨린 또는 퓨린-유사 프로테아제를 포함하여, 본 명세서에서 정의된 바와 같은 퓨린 프로테아제 절단 부위를 인식하고 퓨린 프로테아제 절단 부위를 절단할 수 있는 임의의 프로테아제를 말한다. 퓨린은 또한 쌍을 이룬 염기성 아미노산 절단 효소(paired basic amino acid cleaving enzyme: PACE)라고도 알려져 있다. 퓨린은 섭틸리신-유사 전구단백질 전환효소(proprotein convertase) 패밀리에 속한다. 퓨린을 인코딩하는 유전자는 FUR(FES 상류 영역)라고 알려져 있었다.
퓨린-결핍 세포들: 본 명세서에서 사용되는 바, 용어 "퓨린-결핍 세포들”은 퓨린 프로테아제 활성이 억제되거나, 감소되거나, 제거된 임의의 세포들을 말한다. 퓨린-결핍 세포들은 퓨린을 생산하지 않거나 감소된 양의 퓨린 또는 결함성 퓨린 프로테아제를 생산하는 포유동물 및 비-포유동물 세포들 둘 다를 포함한다.
글리코실화 비의존성 리소좀 표적화: 본 명세서에서 사용되는 바, 용어 "글리코실화 비의존성 리소좀 표적화"("GILT"라고도 지칭함)는 만노스-6-포스페이트 비의존적인 리소좀 표적화를 말한다.
인간 알파-N-아세틸글루코사미니다제: 본 명세서에서 사용되는 바, 용어 "인간 알파-N-아세틸글루코사미니다제"("Naglu"라고도 지칭함)는 포유동물 리소좀들에서 글리코사미노글리칸(GAG) 수준들을 감소시킬 수 있거나 하나 이상의 MPS ⅢB(산필립포 B 증후군) 증상들을 복구하거나 향상시킬 수 있는, 전구체(예컨대, 미경험 Naglu 신호 펩타이드 서열을 포함함) 또는 처리된(예컨대, 미경험 Naglu 신호 펩타이드 서열이 결여됨) 야생형 형태의 인간 알파-N-아세틸글루코사미니다제, 또는 그의 기능적 단편 또는 변이체를 말한다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, Naglu와 관련한 용어 "기능적”은, 포유동물 리소좀에 의해 흡수 가능하고 포유동물 리소좀에서 축적 물질, 즉, 글리코사미노글리칸(GAG)을 저감시키도록 충분한 효소 활성을 지니는 Naglu 효소를 지칭한다.
IGF-Ⅱ 뮤테인: 본 명세서에서 사용되는 바, "IGF-Ⅱ 뮤테인"은 변경된 아미노산 서열을 포함하는 IGF-Ⅱ-기초 펩타이드를 말한다. 본 명세서에서 사용하는 바, 용어 "퓨린-저항성 IGF-Ⅱ 뮤테인"은 적어도 하나의 미경험 프로테아제 절단 부위를 없애거나 미경험 퓨린 프로테아제 절단 부위와 밀접하거나 인접한 서열을 변화시킴으로써 야생형 인간 IGF-Ⅱ 펩타이드와 비교해서 퓨린 절단이 방지되거나, 억제되거나, 감소되거나, 지연되는 변경된 아미노산 서열을 포함하는 IGF-Ⅱ-기초 펩타이드를 말한다. 본 명세서에서 사용되는 바, 퓨린-저항성 IGF-Ⅱ 뮤테인은 또한 퓨린에 대해 저항성을 가지는 IGF-Ⅱ 뮤테인을 말한다.
개선하다, 증가시키다, 또는 감소시키다: 본 명세서에서 사용하는 바, 용어들 "개선하다", "증가시키다" 또는 "감소시키다", 또는 문법적 동의어들은 본 명세서 기술된 치료의 개시 이전에 동일한 개인에서의 측정치, 또는 본 명세서에서 기술된 치료의 부재 시 대조군 개인(또는 다수의 대조군 개인들)에서의 측정치와 같은 기저선 측정치와 대비한 값들을 가리킨다. "대조군 개인"은 치료될 개인과 대략 동일한 연령인 치료될 개인과 동일한 형태의 리소좀 축적 질환(예컨대, MPS ⅢB(산필립포 B 증후군))으로 고생하는 개인이다.
개인, 개체, 환자: 본 명세서에서 사용되는 바, "개체", "개인" 또는 "환자"는 인간 또는 비-인간 포유동물 개체를 말한다. 치료될 개인("환자" 또는 "개체"라고도 지칭됨)은 리소좀 축적 질환 예를 들면 MPS ⅢB(산필립포 B 증후군)(즉, 유아동-, 청소년-, 또는 성인-발병 또는 중증/전형적 유형 또는 약화된 유형의 MPS ⅢB(산필립포 B 증후군))으로 고생하거나 리소좀 축적 질환(예컨대, MPS ⅢB(산필립포 B 증후군))을 발생시킬 잠재력을 가지는 개인(예컨대, 태아, 유아, 아동, 청년, 또는 성인 인간)이다.
리소좀 축적 질환들: 본 명세서에서 사용되는 바. "리소좀 축적 질환들"은 리소좀들에서 거대분자들을 펩타이드들, 아미노산들, 단당류들, 핵산들 및 지방산들로 분해시키도록 요구되는 적어도 하나의 효소들(예컨대, 산 가수분해효소들)에서 결함으로부터 유발되는 유전병들의 그룹을 말한다. 그 결과, 리소좀 축적 질환들로 고생하는 개인들은 리소좀들에서 축적된 물질들을 가진다. 대표적인 리소좀 축적 질환들은 표 1에 나열된다.
리소좀 효소: 본 명세서에서 사용되는 바, 용어 "리소좀 효소"는 포유동물 리소좀들에서 축적된 물질들을 감소시킬 수 있거나 하나 이상의 리소좀 축적 질환 증상들을 복구하거나 개선할 수 있는 임의의 효소를 말한다. 본 발명에 적합한 리소좀 효소들은 야생형 또는 변형된 리소좀 효소들 둘 다를 포함하고 재조합 및 합성적 방법들을 사용하여 생산되거나 자연적 공급원들로부터 정제될 수 있다. 대표적인 리소좀 효소들은 표 1에 나열된다.
스페이서: 본 명세서에서 사용되는 바, 용어 "스페이서"("링커"라고도 지칭됨)는 융합 단백질에서 두 개의 단백질 분체들 사이의 펩타이드 서열을 말한다. 스페이서는 일반적으로 두 개의 단백질 분체들 사이에서 유연성이 있거나 알파-나선과 같은 구조를 중재하도록 설계된다. 스페이서는 예를 들면 서열 Gly-Ala-Pro(GAP)(서열번호 9), Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(GGGGS)(서열번호 12), Gly-Gly-Gly-Gly-Ala(GGGGA)(서열번호 60) 또는 Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Pro(GGGGGP)(서열번호 13)과 같이 비교적 짧을 수 있거나, 예를 들면 10개 내지 25개 아미노산들의 길이, 25개 내지 50개 아미노산들의 길이 또는 35개 내지 55개 아미노산들의 길이와 같이 더 길 수 있다. 대표적인 스페이서 서열들은 상세한 설명에서 더욱 자세하게 개시된다.
치료적 유효량: 본 명세서에서 사용되는 바, 용어 "치료적 유효량" 또는 "유효량"은 임의의 의학적 치료에 적용가능한 합리적인 유익/위험 비율로 치료된 개체에게 치료적 효과를 부여하는 표적화된 치료적 융합 단백질의 양을 말한다. 치료적 효과는 객관적(즉, 일정 테스트 또는 마커에 의해 측정가능함)이거나 주관적(즉, 개체가 효과의 조짐을 보이거나 효과를 느낌)일 수 있다. 상세하게, "치료적 유효량"은 원하는 질환 또는 병태를 치료하거나, 향상시키거나, 예방하는 데 또는 질환과 연관된 증상들을 향상시키고/거나, 질환의 발병을 예방하거나 지연시키고/거나, 질환의 증상들의 중증도 또는 빈도를 감축시키는 것에 의해서와 같은 검출가능한 치료적 또는 예방적 효과를 나타내는 데 효과적인 치료적 융합 단백질 또는 조성물의 양을 말한다. 치료적 유효량은 보편적으로 복수의 단위 용량을 포함할 수 있는 투여 섭생으로 투여된다. 임의의 특정한 치료적 융합 단백질의 경우, 치료적 유효량(및/또는 유효한 투여 섭생 내에서 적당한 단위 용량)은 예를 들면 투여의 경로, 다른 약제학적 제제들과의 조합에 의존하여 변화할 수 있다. 또한, 임의의 특정한 환자에 특이적인 치료적 유효량(및/또는 단위 용량)은, 의학적 분야들에서 잘 알려진 바와 같이, 치료될 환자의 장애 및 장애의 중증도; 채용된 특정 약제학적 제제의 활성; 채용된 특정 조성물; 환자의 연령, 체중, 일반적인 건강, 성별 및 식단; 투여 시간, 투여 경로, 및/또는 채용된 특이적 융합 단백질의 배출 또는 대사의 속도; 치료의 지속기간 등의 요소들을 포함하는 다양한 요소들에 의존할 수 있다.
치료: 본 명세서에서 사용되는 바, 용어 "치료"(또한 "치료하다" 또는 "치료하는")는 하나 이상의 증상들 또는 특정 질환, 장애, 및/또는 병태의 특징들을 부분적으로 또는 완전하게 완화하고/거나, 향상시키고/거나, 경감하고/거나, 억제하고/거나. 이의 발병을 지연하고/거나, 이의 중증도를 감소시키고/거나, 이의 발병을 감소시키는 치료적 융합 단백질 또는 상기 치료적 융합 단백질을 포함하는 약제학적 조성물의 임의의 투여를 말한다. 이러한 치료는 관련된 질환, 장애 및/또는 병태의 징후들을 나타내지 않는 개체 및/또는 질환, 장애, 및/또는 병태의 초기 징후들만을 나타내는 개체의 치료이다. 대안적으로 또는 추가적으로, 이러한 치료는 관련된 질환, 장애 및/또는 병태의 하나 이상의 확립된 징후들을 나타내는 개체의 치료일 수 있다. 예를 들면, 치료는 심장 상태(예컨대, 이완기말 및/또는 수축기말 부피들의 증가 또는 감소, 예컨대, 폼페병(Pompe disease)에서 전형적으로 발견되는 진행성 심장병의 향상 또는 예방) 또는 폐 기능(예컨대, 기저선 폐활량 대비 울음 폐활량의 증가 및/또는 우는 동안 산소 탈포화의 정상화)의 개선; 신경발달 및/또는 운동 능력들에서 개선(예컨대, AIMS 점수의 증가); 질환에 의해 침범된 개인의 조직에서 축적(예컨대, 글리코사미노글리칸(GAG)) 수준들의 감소; 또는 임의의 이들 효과들의 조합을 지칭할 수 있다. 일정 구현예들에서, 치료는 글리코사미노글리칸(GAG) 제거율의 개선, 상세하게는 MPS ⅢB(산필립포 B 증후군)-연관된 신경성 증상들의 감소 또는 예방을 포함한다.
본 출원에서 사용하는 바, 용어들 "약" 및 "대략"은 동의어로서 사용된다. 본 출원에서 약/대략과 함께 혹은 없이 사용되는 임의의 숫자들은 당업자에 의해 이해되는 임의의 정상적인 변동들을 포괄하도록 의미한다.
본 발명의 상세한 설명
본 발명은 글리코실화-비의존성 리소좀 표적화(GILT) 기술을 기초로 하여 리소좀 효소들을 표적화하는 개선된 방법들 및 조성물들을 제공한다. 무엇보다도, 본 발명은 퓨린에 대해 저항성을 가지고/거나 인슐린 수용체에 대해 감소된 또는 축소된 결합 친화도를 가지고/거나 IGF-I 수용체에 대해 감소된 또는 축소된 결합 친화도를 가지는 IGF-Ⅱ 뮤테인들, 그리고 본 발명의 IGF-Ⅱ 뮤테인을 포함하는 표적화된 치료적 융합 단백질들을 제공한다.
본 발명의 다양한 관점들은 다음의 부문들에서 자세하게 기술된다. 부문들의 사용은 본 발명을 제한하도록 의미하지 않는다. 각각의 부문은 임의의 본 발명의 관점에 적용할 수 있다. 본 출원에서 "또는"의 사용은 달리 진술되지 않은 한 "및/또는"을 의미한다.
리소좀 효소들
본 발명에 적합한 리소좀 효소는 포유동물 리소좀들에서 축적된 물질들을 감소시킬 수 있거나 하나 이상의 리소좀 축적 질환 증상들을 복구하거나 향상시킬 수 있는 임의의 효소를 포함한다. 적합한 리소좀 효소들은 야생형 또는 변형된 리소좀 효소들 둘 다를 포함하고 재조합 또는 합성적 방법들을 사용하여 생산되거나 천연의 공급원들로부터 정제될 수 있다. 대표적인 리소좀 효소들은 표 1에 나열된다. 표 1은 리소좀 축적 질환들 및 연관된 효소 결함들을 나타낸다.
A. 글리코겐증 장애들
질환 명칭 효소 결함 축적 물질
폼페병 산-αl, 4- 글리코시다제 글리코겐 αl-4 결합 올리고당류
B. 당지질증 장애들
질환 명칭 효소 결함 축적 물질
GM1 갱글리오사이드 축적증 β-갈락토시다제 GM1 갱글리오사이드들
테이삭스병 β-헥소스아미니다제 A GM2 갱글리오사이드
GM2 갱글리오사이드 축적증: AB 변형체 GM2 활성인자 단백질 GM2 갱글리오사이드
샌드호프병 β-헥소스아미니다제 A＆B GM2 갱글리오사이드
파브리병 α-갈락토시다제 A 글로보사이드 (Globosides)
가우셔병 글루코세레브로시다제 글루코실세라마이드
이염색성 백색질 장애 아릴셀파타제 A 설파타이드들
크래브병 갈락토실세라미다제 갈락토세레브로사이드
니만피크병, A ＆ B 형 산 스핑고마이엘리나제 스핑고마이엘린
니만피크병, C 형 콜레스테롤 에스터화 결함 스핑고마이엘린
니만피크병, D 형 미지 스핑고마이엘린
파버병 산 세라미다제 세라마이드
울만병 산 리파제 콜레스테릴 에스테르들
C. 점액다당질 장애들
질환 명칭 효소 결함 축적 물질
헐러 증후군 (MPS IH) α-L-이듀로니다제 헤파란 및 더마탄 설페이트들
쉬에 증후군 (MPS IS) α-L-이듀로니다제 헤파란 및 더마탄 설페이트들
헐러-쉬에 (MPS IH/S) α-L-이듀로니다제 헤파란 및 더마탄 설페이트들
헌터 증후군 (MPS II) 이듀로네이트 설파타제 헤파란 및 더마탄 설페이트들
산필립포 증후군 A 형 (MPS IIIA) 헤파란 N-설파타제 헤파란 설페이트
산필립포 증후군 B 형 (MPS IIIB) α-N-아세틸글리코사미니다제 헤파란 설페이트
산필립포 증후군 C 형 (MPS IIIC) 아세틸-CoA-글리코사미나이드 아세틸전이효소 헤파란 설페이트
산필립포 증후군 D 형 (MPS IIID) N-아세틸글루코사민-6-설파타제 헤파란 설페이트
모르퀴오병 A 형 (MPS IVA) 갈락토사민-6-설파타제 케라탄 설페이트
모르퀴오병 B 형 (MPS IVB) β-갈락토시다제 케라탄 설페이트
마로토-라미병 (Maroteaux-Lamy) (MPS VI) 아릴설파타제 B 더마탄 설페이트
슬라이 증후군 (MPS VII) β-글루쿠로니다제
D. 올리고당/당단백질 장애들
질환 명칭 효소 결함 축적 물질
α -만노사이드증 α -만노시다제 만노스/ 올리고당류
β -만노사이드증 β-만노시다제 만노스/ 올리고당류
퓨코사이드증 α -L-퓨코시다제 퓨코실 올리고당류
아스파틸글루코사민뇨증 N-아스파틸- β-글리코사미니다제 아스파틸글루코사민 아스파라진들
시알산증 (점액지질증 I 형) α -뉴라미다제 시알산올리고당류
갈라토시알산증
(골드버그 증후군)		 리소좀 보호 단백질 결핍 시알산올리고당류
쉰들러병 α -N-아세틸-갈락토사미다제
E. 리소좀 효소 운반 장애들
질환 명칭 효소 결함 축적 물질
점액지질증 II 형 (I-세포 질환) N-아세틸글루코사민-1- 포스포전이효소 헤파란 설페이트
점액지질증 III 형 (유사-헐러 다중장애) ML II와 동일
F. 리소좀 막 운반 장애들
질환 명칭 효소 결함 축적 물질
시스틴증 시스틴 운반 단백질 자유 시스틴
살라병 시알산 운반 단백질 자유 시알산 및 글루쿠론산
소아 시알산 축적병 시알산 운반 단백질 자유 시알산 및 글루쿠론산
G. 기타
질환 명칭 효소 결함 축적 물질
배튼병
(청소년 신경 세로이드 지질갈색소증)		 미지 리포퓨신들
소아 신경 세로이드 지질갈색소증 팔리토일-단백질 티오에스터라제 리포퓨신들
아동 신경 세로이드 지질갈색소증 트리펩티딜 펩티다제 I 리포퓨신들
점액지질증 IV 형 미지 갱글리오사이드들 및 하이알루론산
프로사포신 사포신들 A, B, C 또는 D
일정 구현예들에서, 본 명세서에서 고려된 리소좀 효소는, 기능적인, 즉, 포유동물 리소좀들에서 축적된 물질들, 예컨대, 글리코사미노글리칸(GAG)을 감소시킬 수 있거나 하나 이상의 리소좀 축적 질환 증상들을 복구하거나 향상시킬 수 있는, 여전히 단백질을 인코딩하는 한편, 표 1에 나타낸 인간 효소의 자연적으로-생기는 폴리뉴클레오타이드 서열과 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 및 100%를 포함하는 50 내지 100%의 서열 동일성을 가지는 폴리펩타이드 서열을 포함한다.
리소좀 효소 서열들에 관하여 "아미노산 서열 동일성 백분율(%)"은 서열들을 정렬하고, 필요한 경우라면 최대의 서열 동일성 백분율을 달성하도록 갭들을 도입한 이후에 서열 동일성의 일부로서 임의의 보존적인 치환들을 고려하지 않으면서, 자연적으로-생기는 인간 효소 서열에서 아미노산 잔기들과 동일한 후보 서열에서 아미노산 잔기들의 백분율로서 정의된다. 아미노산 서열 동일성 백분율을 결정할 목적들을 위한 정렬은 예를 들면 BLAST, ALIGN 또는 Megalign(DNASTAR) 소프트웨어와 같은 공개적으로 입수가능한 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여 당해 기술분야에 속하는 다양한 방식들로 달성될 수 있다. 당업자들이라면 비교될 서열의 전장 대비 최대의 정렬을 달성하는 데 필요한 임의의 알고리즘들을 포함하여, 정렬을 측정하기 위한 적당한 매개변수들을 결정할 수 있다. 바람직하게, WU-BLAST-2 소프트웨어가 아미노산 서열 동일성을 결정하는 데 사용된다(Altschul et al., Methods in Enzymology 266, 460-480 (1996)). WU-BLAST-2는 다수의 탐색 매개변수들을 사용하고, 이들 대부분은 디폴트 값으로 설정된다. 조정가능한 매개변수들은 다음의 값들과 함께 설정된다: 중복 범위 = 1, 중복 분획 = 0.125, 세계 역치(T) = 11. HSP 점수(S) 및 HSP S2 매개변수들은 역동적 값들이고, 특정한 서열의 조성에 의존하여 프로그램 자체에 의해 확립되지만, 최소의 값들은 조정될 수 있고 상기에 표시된 바와 같이 설정된다.
알파-N-아세틸글루코사미니다제
알파-N-아세틸글루코사미니다제, Naglu는 성숙한 형태로 가공되는 전구체 분자로서 생산된다. 이러한 과정은 일반적으로 단백질이 세포질내망을 진입하면서 23개 아미노산의 신호 펩타이드를 제거하여 일어난다. 전형적으로, 전구체 형태는 743개의 아미노산들(서열번호 1)을 포함하는, 전장의 전구체 또는 전장의 Naglu 단백질이라고도 지칭된다. N-말단의 23개 아미노산들은 전구체 단백질이 세포질내망을 진입하면서 절단되고, 처리된 또는 성숙한 형태를 유도한다. 따라서, N-말단의 23개 아미노산들은 일반적으로 Naglu 단백질 활성을 위해 요구되지 않는 것으로 고려된다. 전형적인 야생형 또는 자연적으로-생기는 인간 Naglu 단백질의 성숙한 형태 및 전장의 전구체 형태의 아미노산 서열들은 도 1에 나타내고 서열번호 1에 개시된다. 인간 Naglu의 코딩 영역의 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 3에 기재된다. 인간 Naglu의 mRNA 서열은 진뱅크 기탁번호 제NM_000263호로 기술된다. 다양한 구현예에서, Naglu는 신호 서열의 존재(1번 내지 743번 아미노산들) 또는 부재(24번 내지 743번 아미노산들) 시의 인간 Naglu이다.
미국 특허 제6,255,096호는 정제된 인간 알파-N-아세틸글루코사미니다제의 분자량(즉, 82 kDa 및 77 kDa) 및 CHO 세포들에서 생산된 재조합 포유동물 알파-N-아세틸글루코사미니다제의 분자량(즉, 89 kDa 및 79 kDa)은 Naglu 폴리펩타이드의 추론된 분자량(즉, 70 kDa)보다 더 크며, 이것은 정제된 및 재조합 폴리펩타이드는 번역-후에 변형되는 것을 시사한다. 또한 문헌[Weber et al., Hum Mol Genet 5: 771-777, 1996] 참조.
점액다당류증 ⅢB(산필립포 B 증후군)
한 가지 대표적인 리소좀 축적 질환은 산필립포 유형 B 증후군이라고도 역시 알려져 있는 점액다당류증 제ⅢB형(MPS ⅢB) 질환이다. MPS ⅢB, 산필립포 B 증후군은 효소 알파-N-아세틸-글루코사미니다제(Naglu)의 결핍을 특징으로 하는 희귀한 상염색체 열성 유전병이다. 본 효소의 부재 시, 글리코사미노글리칸들(GAG), 예를 들면 GAG 헤파란 설페이트 및 부분적으로 분해된 GAG 분자들은 신체로부터 제거될 수 없고 다양한 조직의 리소좀들에 축적되어 광범위한 진행성 체세포 기능부전을 유발한다(Kakkis et al., N Engl J Med. 344(3): 182-8, 2001). GAG들은 뉴런들 및 교아세포들의 리소좀들에서 축적되고, 뇌 외부에는 더 적게 축적되는 것으로 드러났다.
MPS ⅢA, B, C 및 D로 명명되는 MPS Ⅲ의 4가지 구별된 형태들이 확인되었다. 각각은 GAG 헤파란 설페이트의 분해에 관여하는 4가지 효소들 중 하나에서 결핍을 나타낸다(표 1). 모든 형태들은 조잡한 얼굴 특징들, 간비장 비대증, 각막 혼탁 및 골격 변형들을 포함하는, 동일한 임상적 증상들의 다양한 정도들을 포함한다. 그러나 가장 현저하게는 인지 능력의 중증 및 진행성 소실이고, 이는 뉴런들에서 헤파란 설페이트의 축적뿐만 아니라 일차적인 GAG 축적에 의해 유발되는 갱글리오사이드들 GM2, GM3 및 GD2의 연속적인 증가와도 연관되어 있다(Walkley et al.,Ann N Y Acad Sci. 845: 188-99, 1998).
산필립포 B 증후군의 특징적인 임상적 특징은 중추신경계(CNS) 퇴화이고, 이는 주요한 발달 이정표들의 소실, 또는 이를 획득하는 데 실패를 유발한다. 진행성 인지 저하는 치매 및 미성숙한 치사에 이른다. 질환은 전형적으로 어린 아동들에서 그 자체로 소견을 보이고, 병에 걸린 개인의 수명은 일반적으로 십대 후반 내지 이십대 전반을 넘지 못한다.
MPS Ⅲ 질환들 모두는 전형적으로 어린 아동들에서 소견을 보이는 유사한 증상들을 가진다. 병에 걸린 유아들은 일정 약간의 얼굴 이상형태가 두드러지기는 하지만 외관상으로는 정상적이다. 다른 점액다당류증들의 전형적인 경직된 관절들, 과다한 털 및 조잡한 머리털이 보통 질환의 후기에 도달하기까지 나타나지 않는다. 초기 무-증상 간격 이후에 환자들은 보통 발달의 지연 및 행동적 문제들을 보이고, 중증 치매 및 진행성 운동 질환을 유발하는 진행성 지능 저하로 이어진다. 언어 능력의 획득이 종종 느리고 불완전하다. 질환은 분노들, 과다 활동성, 파괴성, 공격적 행동, 이식증 및 수면 장애를 포함하는 행동적 장애를 증가시키는 것으로 진행한다. 병에 걸린 아동들은 정상적인 근육 강도 및 운동성을 가지기 때문에, 행동적 장애들은 다루는 데 매우 어렵다. 질병의 후반기에는, 아동들은 점차 고정화되고 미반응적이 되며, 종종 휠체어들을 요구하고 삼키기 곤란들 및 발작들을 발생시킨다. 병에 걸린 아동의 수명은 보통 십대 후반 내지 이십대 전반을 넘지 못한다.
MPS ⅢB(산필립포 B 증후군)를 치료하는 데 적합한 알파-N-아세틸글루코사미니다제 효소는 야생형 인간 알파-N-아세틸글루코사미니다제(서열번호 1 또는 3) 또는 포유동물의 리소좀들 내로 흡수되고 선형의 올리고당류의 말단 N-아세틸-D-글루코사민 잔기에서 알파 1,4 결합들을 가수분해시키는 능력을 보유하는 그들의 기능적 단편 또는 서열 변이체를 포함한다.
본 명세서에서 기술된 바와 같이 재조합 표적화된 치료적 융합 단백질을 사용하는 MPS ⅢB(산필립포 B 증후군)의 치료의 효능은 당해 기술분야에서 알려진 기법들을 사용하여, 뿐만 아니라 리소좀 및 신경성 바이오마커들의 분석에 의해 측정될 수 있다. 초기의 실험들은 Naglu-녹아웃 동물들 상에서 시행된다(Li et al., Proc Natl Acad Sci USA 96: 14505-510, 1999 참조). Naglu 녹아웃들은 간 및 신장에서 많은 양의 헤파란 설페이트 및 뇌에서 갱글리오사이드들의 증가를 나타낸다.
검정법들은 외인성 효소의 활성 및 생체분포, 리소좀들에서 상세하게는 뇌 세포들에서 GAG 축적의 감소, 그리고 별교아세포들 및 미세교아세포들의 활성화의 분석을 포함한다. 다양한 리소좀 또는 신경성 바이오마커들의 수준들은, 제한되는 것은 아니지만, 리소좀-연관된 막 단백질 1(LAMP1), 글리피칸(glypican), 갱글리오사이드들, 콜레스테롤, 미토콘드리아 ATP 합성효소의 소단위체 c(SCMAS), 유비퀴틴, P-GSK3b, 베타 아밀로이드 및 P-타우를 포함한다. 생존 및 행동적 분석도 역시 당해 기술분야에서 알려진 기법들을 사용하여 수행된다.
실험들은 미토콘드리아 ATP 합성효소의 소단위체 c(SCMAS) 단백질이 MPS ⅢB 동물들의 리소좀들에서 축적되는 것을 보여주었다(Ryazantsev et al., Mol Genet Metab. 90(4): 393-401, 2007). LAMP-1 및 GM130도 역시 MPS ⅢB 동물들에서 증가되는 것으로 확인되었다(Vitry et al., Am J Pathol. 177(6): 2984-99, 2010).
다양한 구현예에서, 리소좀 축적 질환의 치료는 다양한 조직에서 감소된 리소좀 축적(예컨대, GAG의 축적)을 말한다. 다양한 구현예에서, 치료는 뇌 표적 조직들, 척수 뉴런들 및/또는 말단 표적 조직들에서 감소된 리소좀 축적을 말한다. 소정의 구현예들에서, 리소좀 축적은 대조군과 비교해서 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 100% 이상으로 감소된다. 다양한 구현예에서, 리소좀 축적은 대조군과 비교해서 적어도 1배, 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 또는 10배 이상으로 감소된다.
다양한 구현예에서, 치료는 다양한 조직에서 증가된 효소 활성을 말한다. 다양한 구현예에서, 치료는 뇌 표적 조직들, 척수 뉴런들 및/또는 말단 표적 조직들에서 증가된 효소 활성을 말한다. 다양한 구현예에서, 효소 활성은 대조군과 비교해서 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500%, 600%, 700%, 800%, 900%, 또는 1,000% 이상으로 증가된다. 다양한 구현예에서, 효소 활성은 대조군과 비교해서 적어도 1배, 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 또는 10배 이상으로 증가된다. 다양한 구현예에서, 증가된 효소 활성은 적어도 대략 10 nmol/시간/mg, 20 nmol/시간/mg, 40 nmol/시간/mg, 50 nmol/시간/mg, 60 nmol/시간/mg, 70 nmol/시간/mg, 80 nmol/시간/mg, 90 nmol/시간/mg, 100 nmol/시간/mg, 150 nmol/시간/mg, 200 nmol/시간/mg, 250 nmol/시간/mg, 300 nmol/시간/mg, 350 nmol/시간/mg, 400 nmol/시간/mg, 450 nmol/시간/mg, 500 nmol/시간/mg, 550 nmol/시간/mg, 또는 600 nmol/시간/mg 이상이다. 다양한 구현예에서, 리소좀 효소는 Naglu이다.
효소 대체 요법
효소 대체 요법(ERT)은 결손된 효소를 혈류 내로 주입하여 효소 결핍을 교정하는 치료적 전략이다. 혈액이 환자의 조직들을 관류하면서, 효소가 세포들에 의해 흡수되고 리소좀으로 운반되며, 이때 상기 효소는 효소 결핍으로 인해 리소좀들에 축적되었던 물질을 제거하도록 작용을 한다. 효과적인 리소좀 효소 대체 요법의 경우라면, 치료적 효소가 축적 결함의 소견을 보이는 조직들에서 적당한 세포들의 리소좀들로 운반되어야 한다. 통상적인 리소좀 효소 대체 치료제들은 표적 세포들의 표면 위의 특이적 수용체들을 결합하도록 단백질과 자연적으로 부착된 탄수화물들을 사용하여 운반된다. 한 가지 수용체, 양이온-비의존성 M6P 수용체(CI-MPR)는 CI-MPR가 대부분의 세포 유형들의 표면 위에 존재하기 때문에 대체 리소좀 효소들을 표적화하는 데 특히 유용하다.
용어들 "양이온-비의존성 만노스-6-포스페이트 수용체(CI-MPR)", "M6P/IGF-Ⅱ 수용체", "CI-MPR/IGF-Ⅱ 수용체", "IGF-Ⅱ 수용체" 또는 "IGF2 수용체" 또는 그들의 약어들은 본 명세서에서 상호교환적으로 사용되고, M6P 및 IGF-Ⅱ 둘 다와 결합하는 세포 수용체를 지칭한다.
개체를 효소 대체 요법에 대해 내성화하는 조합 요법
재조합 단백질들 및 기타 치료적 제제들과 같은 제제들의 투여기간 동안, 개체는 이들 제제들에 대한 면역 반응을 유도할 수 있고, 결합하여 치료적 활성을 간섭할 뿐ㅜㅁ만 아니라 급성 또는 만성 면역학적 반응들을 초래하는 항체들의 생산을 유도하는 것으로 확인되었다. 이러한 문제점들은 단백질들이 복잡한 항원들이고, 많은 사례에서 개체는 항원들에 대해 면역학적으로 경험이 없기 때문에, 단백질 치료제들의 경우에 가장 중요하다. 따라서 본 발명의 소정의 관점들에서, 치료적 효소를 수여받은 개체를 효소 대체 요법에 대해 내성을 가지도록 만드는 것은 유용할 수 있다. 이러한 맥락에서, 효소 대체 요법은 개체에게 내성화 섭생과 조합 요법으로서 주어질 수 있다.
미국 특허 제7,485,314호(본 명세서에서 참고문헌으로 통합됨)는 면역 내성 유도를 사용하여 리소좀 축적 장애들의 치료를 기재하고 있다. 간략하게, 이러한 내성화 섭생의 사용은 개체가 효소 대체 요법에 대한 면역 반응을 증가시킴으로써, 사용하지 않은 경우라면 비효과적으로 될 효소 대체 요법의 잠재적인 유익한 효과들을 감소시키는 것을 방지하는 데 유용할 수 있다.
한 가지 방법에서, 본 발명은 예를 들면 리소좀 축적 장애, 예를 들면 점액다당류증 제ⅢB형(MPS ⅢB 또는 산필립포 B 증후군)을 치료하는 데 사용되는 Naglu를 포함하고, 경막내로 투여되는 재조합 치료적 융합 단백질에 대한 임상적으로 유의한 항원-특이적 면역 반응을 감소시키거나 방지하는 단계를 고려한다. 본 방법은 낮은 용량의 효소, 예컨대, Naglu의 매주 경막내 주입들과 조합되는, 사이클로스포린 A(CsA)와 같은 T-세포 면역억제제 및 아자티오프린(Aza)과 같은 항증식제의 초기 30일 내지 60일 섭생을 채용한다. 효소의 매주 주입들에 대한 전형적인 강한 IgG 반응은, 낮은 용량의 효소를 포함하는 융합 단백질의 매주 경막내 또는 정맥내 주입들과 조합되는 면역억제 약물들, 사이클로스포린(CsA) 및 아자티오프린(Aza)의 60일 섭생을 사용하여 크게 감소되거나 방지된다. 이러한 내성화 섭생들을 사용하여, Naglu 또는 리소좀 축적 질환의 효소 대체에 사용될 수 있는 임의의 다른 효소에 대한 항체 역가의 증가 없이도 6개월까지 동안 치료적 융합 단백질의 더 높은 치료적 용량에 대해 내성이 되도록 개체를 만드는 것이 가능할 것이다. 이러한 내성화 섭생들은 미국 특허 제7,485,314호에 기술되었다.
글리코실화 비의존성 리소좀 표적화
글리코실화 비의존성 리소좀 표적화(GILT) 기술은 치료적 효소들을 리소좀들에게로 표적화하도록 개발되었다. 상세하게, GILT 기술은 리소좀 표적화를 위해 CI-MPR을 결합하도록 M6P 대신에 펩타이드 태그를 사용한다. 전형적으로, GILT 태그는 만노스-6-포스페이트-비의존적 방식으로 CI-MPR을 결합시키는 단백질, 펩타이드 또는 다른 분체이다. 유익하게, 이러한 기술은 리소좀 효소들의 흡수를 위한 정상적인 생물학적 기작을 모방하지만, 아직까지 만노스-6-포스페이트의 비의존적 방식으로 그렇게 한다.
바람직한 GILT 태그는 인간 인슐린-유사 성장인자 Ⅱ(IGF-Ⅱ)로부터 유래된다. 인간 IGF-Ⅱ는 IGF-Ⅱ 수용체라고도 지칭되는 CI-MPR에 대한 높은 친화도 리간드이다. M6P/IGF-Ⅱ 수용체와 GILT-태그화 치료적 효소들의 결합은 세포내 경로를 통해 리소좀에 단백질을 표적화시킨다. 이러한 방법은 일단 단백질이 분리되면 추가 변형들이 만들어질 필요가 전혀 없기 때문에, 글리코실화가 관여하는 방법들을 능가하는 단순성 및 비용 효율성을 포함하는 수많은 장점을 가진다.
GILT 기술 및 GILT 태그의 상세한 설명은 미국 특허 공개 제20030082176호, 제20040006008호, 제20040005309호, 및 제20050281805호에서 찾을 수 있고, 이들 모두의 제안들은 본 명세서에 의해 그들의 전부가 참고문헌으로 통합된다.
퓨린-저항성 GILT 태그
리소좀 축적 질환을 치료하기 위한 GILT-태그화 리소좀 효소들의 개발 과정 동안, IGF-Ⅱ 유래된 GILT 태그는 포유동물 세포들에서 생산과정 동안 퓨린에 의한 단백질분해 절단에 취약할 수 있는 점이 분명해졌다(실시예들 부문 참조). 퓨린 프로테아제는 전형적으로 공통 서열 Lys/Arg-X-X-X-Lys/Arg-Arg(서열번호 6)(X는 임의의 아미노산임)을 가지는 절단 부위를 인식하고 절단한다. 절단 부위는 서열에서 카복시-말단 아르기닌(Arg) 잔기 다음에 위치한다. 일정 구현예들에서, 퓨린 절단 부위는 공통 서열 Lys/Arg-X-X-X-Lys/Arg-Arg(서열번호 7)을 가지며, X는 임의의 아미노산이다. 절단 부위는 서열에서 카복시-말단 아르기닌(Arg) 잔기 다음에 위치한다. 본 명세서에서 사용되는 바, 용어 "퓨린"은 본 명세서에서 정의된 바와 같이 퓨린 프로테아제 절단 부위를 인식하고 절단할 수 있는, 퓨린 또는 퓨린-유사 프로테아제를 포함하는 임의의 프로테아제를 말한다. 퓨린은 쌍을 이룬 염기성 아미노산 절단 효소(PACE)로서도 역시 알려져 있다. 퓨린은 췌장샘 세포들에서 전구인슐린의 성숙을 부여하는 프로테아제인 PC3를 포함하는 섭틸리신-유사 전구단백질 전환효소 패밀리에 속한다. 퓨린을 인코딩하는 유전자는 FUR(FES 상류 영역)로서 알려졌다.
성숙한 인간 IGF-Ⅱ 펩타이드 서열은 하기에 나타낸다.
AYRPSETLCGGELVDTLQFVCGDRGFYFSRPAS RVSR↑RSR↑ GIVEECCFRSCDLALLETYC ATPAKSE(서열번호 5)
관찰될 수 있는 바와 같이, 성숙한 인간 IGF-Ⅱ는 34번 내지 40번(굵고 밑줄침) 사이에 두 개의 잠재적인 중복되는 퓨린 절단 부위들을 포함한다. 화살표들이 두 개의 잠재적인 퓨린 절단 위치들에서 삽입된다.
퓨린에 의한 절단에 대한 저항성을 가지고 여전히 만노스-6-포스페이트 비의존적 방식으로 CI-MPR과 결합하는 능력을 보유하는 변형된 GILT 태그들은 미국 특허 공개 제US 20110223147호에 기재된다. 상세하게, 퓨린-저항성 GILT 태그들은 적어도 하나의 퓨린 절단 부위들에서 아미노산 서열을 돌연변이화하여 돌연변이가 적어도 하나의 퓨린 절단 부위를 없애도록 설계될 수 있다. 따라서 일정 구현예들에서, 퓨린-저항성 GILT 태그는 적어도 하나의 퓨린 프로테아제 절단 부위를 없애거나 퓨린 프로테아제 절단 부위와 인접한 서열을 변화시킴으로써 야생형 IGF-Ⅱ 펩타이드(예컨대, 야생형 인간 성숙한 IGF-Ⅱ)와 비교해서 퓨린 절단이 방지되거나, 억제되거나, 감소되거나, 지연되는 돌연변이를 포함하는 퓨린-저항성 IGF-Ⅱ 뮤테인이다. 전형적으로, 적합한 돌연변이는 퓨린-저항성 GILT 태그가 인간 양이온-비의존성 만노스-6-포스페이트 수용체와 결합하는 능력에 영향을 주지 않는다. 상세하게, 본 발명에 적합한 퓨린-저항성 IGF-Ⅱ 뮤테인은 인간 양이온-비의존성 만노스-6-포스페이트 수용체와 10-7 M 이하(예컨대, 10-8, 10-9, 10-10 또는 10-11 이하)의 해리 상수로 pH 7.4에서 만노스-6-포스페이트 비의존적 방식으로 결합한다. 일정 구현예들에서, 퓨린-저항성 IGF-Ⅱ 뮤테인은 성숙한 인간 IGF-Ⅱ의 아미노산들 30번 내지 40번(예컨대, 30-40, 31-40, 32-40, 33-40, 34-40, 30-39, 31-39, 32-39, 34-37, 33- 39, 34-39, 35-39, 36-39, 37-40)에 해당하는 영역 내의 돌연변이를 포함한다. 일정 구현예들에서, 적합한 돌연변이는 적어도 하나의 퓨린 프로테아제 절단 부위를 없앤다. 돌연변이는 아미노산 치환들, 결실들, 삽입들일 수 있다. 예를 들면, 서열번호 5의 잔기들 30번 내지 40번(예컨대, 30번 내지 40번, 31번 내지 40번, 32번 내지 40번, 33번 내지 40번, 34번 내지 40번, 30번 내지 39번, 31번 내지 39번, 32번 내지 39번, 34번 내지 37번, 33번 내지 39번, 34번 내지 39번, 35번 내지 39번, 36번 내지 39번, 37번 내지 40번)에 해당하는 영역 내의 임의의 아미노산이 임의의 다른 아미노산으로 치환되거나 결실될 수 있다. 예를 들면, 34번 위치에서의 치환들은 첫 번째 절단 부위의 퓨린 인식에 영향을 줄 수 있다. 각각의 인식 부위 내에서 하나 이상의 추가적인 아미노산들의 삽입은 하나 또는 둘 다의 퓨린 절단 부위들을 없앨 수 있다. 중복(degenerate) 위치들에서 하나 이상의 잔기들의 결실은 둘 다의 퓨린 절단 부위들을 역시 없앨 수 있다.
다양한 구현예에서, 퓨린-저항성 IGF-Ⅱ 뮤테인은 성숙한 인간 IGF-Ⅱ의 Arg 37번 또는 Arg 40번에 해당하는 위치들에서 아미노산 치환들을 포함한다. 일정 구현예들에서, 퓨린-저항성 IGF-Ⅱ 뮤테인은 Arg 37번 또는 Arg 40번 위치들에서 Lys 또는 Ala 치환을 포함한다. 37번 및 40번 위치들 둘 다에서 Lys 및/또는 Ala 돌연변이들의 조합들, 또는 Lys 또는 Ala 이외의 아미노산들의 치환들을 포함하는 다른 치환들이 가능하다.
다양한 구현예에서, 본 명세서에서 사용에 적합한 IGF-Ⅱ 뮤테인은 추가적인 돌연변이들을 포함한다. 예를 들면, 서열번호 1의 30% 이상까지의 잔기들이 변화될 수 있다(예컨대, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29% 또는 30% 이상의 잔기들이 변화될 수 있다). 따라서 본 명세서에서 사용에 적합한 IGF-Ⅱ 뮤테인은 성숙한 인간 IGF-Ⅱ와 적어도 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상을 포함하는 적어도 70% 동일한 아미노산 서열을 가질 수 있다.
다양한 구현예에서, 본 명세서에서 사용에 적합한 IGF-Ⅱ 뮤테인은 특이적으로 CI-MPR에게로 표적화된다. 상세하게는, CI-MPR을 높은 친화도(예컨대, pH 7.4에서 10-7 M 이하의 해리 상수)로 결합시키는 한편 미경험 IGF-Ⅱ와 대비하여 감소된 친화도로 IGF-Ⅱ에 의해 결합되는 것으로 알려진 다른 수용체들과 결합하는 단백질을 결과로 가져오는 IGF-Ⅱ 폴리펩타이드의 돌연변이들이 유용하다. 예를 들면, 본 발명에 적합한 퓨린-저항성 IGF-Ⅱ 뮤테인은 자연적으로-생기는 인간 IGF-Ⅱ의 IGF-I 수용체에 대한 친화도와 대비하여 IGF-I에 대한 축소된 결합 친화도를 가지도록 변형될 수 있다. 예를 들면, IGF-Ⅱ 잔기들 Tyr 27번의 Leu으로, Leu 43번의 Val으로 또는 Ser 26번의 Phe으로 치환은 각각 94배, 56배 및 4배로 IGF-Ⅱ의 IGF-I에 대한 친화도를 축소시킨다(Torres et al. (1995) J. Mol. Biol. 248(2): 385-401). 인간 IGF-Ⅱ의 잔기들 1번 내지 7번의 결실은 인간 IGF-I 수용체에 대한 친화도에서 30배 감소 및 래트 IGF-Ⅱ 수용체에 대한 친화도에서 동시적인 12배 감소의 결과를 가져왔다(Hashimoto et al. (1995) J. Biol. Chem. 270(30): 18013-8). IGF-Ⅱ의 NMR 구조는 Thr 7번이 잔기들 Phe 48번 Phe 및 Ser 50번 근처에, 뿐만 아니라 Cys 9번 - Cys 47번 다이설파이드 결합 근처에 위치하는 점을 보여준다. Thr 7번의 이들 잔기들과 상호작용은 IGF-I 수용체 결합을 위해 요구되는 유연한 N-말단 헥사펩타이드를 안정화할 수 있는 것으로 여겨진다(Terasawa et al. (1994) EMBO J. 13(23): 5590-7). 동시에 이러한 상호작용은 IGF-Ⅱ 수용체와 결합을 조정할 수 있다. IGF-Ⅱ의 C-말단의 절단(잔기들 62번 내지 67번)도 역시 IGF-Ⅱ의 IGF-I 수용체에 대한 친화도를 5배까지로 낮추는 것으로 보인다(Roth et al. (1991) Biochem. Biophys. Res. Commun. 181(2): 907-14).
IGF-I 및 양이온-비의존성 M6P 수용체들을 위한 결합 표면들은 IGF-Ⅱ의 별도의 면들 위에 존재한다. 구조적 및 돌연변이 데이터를 기초로 하여, 기능적 양이온-비의존성 M6P 결합 도메인들은 인간 IGF-Ⅱ보다 실질적으로 더 작은 것이 작제될 수 있다. 예를 들면, 아미노 말단 아미노산들(예컨대, 1번 내지 7번 또는 2번 내지 7번) 및/또는 카복시 말단 잔기들 62번 내지 67번이 결실되거나 대체될 수 있다. 추가적으로, 아미노산 29번 내지 40번은 마찬가지로 폴리펩타이드의 나머지의 접힘 또는 양이온-비의존성 M6P 수용체와 결합을 변경하지 않고도 제거되거나 대체될 수 있다. 따라서, 8번 내지 28번 및 41번 내지 61번 아미노산을 포함하는 표적화 분체가 작제될 수 있다. 이들 아미노산들의 연결물들은 아마도 직접적으로 결합되거나 링커에 의해 분리될 수 있다. 대안적으로, 8번 내지 28번 및 41번 내지 61번 아미노산들은 별도의 폴리펩타이드 사슬들 위에 제공될 수 있다. IGF-Ⅱ와 상동적이고 IGF-Ⅱ의 구조와 밀접하게 관련된 삼차 구조를 가지는 인슐린의 비슷한 도메인들은, 심지어 별도의 폴리펩타이드 사슬들에 존재할 때도 적당한 삼차 구조 내로 적절한 재접힘을 허용하기에 충분한 구조적 정보를 가진다(Wang et al. (1991) Trends Biochem. Sci. 279-281). 따라서 예를 들면, 8번 내지 28번 아미노산들, 또는 그의 보존적인 치환 변이체는 리소좀 효소와 융합될 수 있고; 결과로 얻은 융합 단백질은 41번 내지 61번 아미노산들, 또는 그의 보존적인 치환 변이체와 혼합되고, 환자에게로 투여될 수 있다.
IGF-Ⅱ는 또한 혈청 IGF-Ⅱ-결합 단백질들과 결합을 최소화하여 IGF-Ⅱ/GILT 작제물들의 격리를 피하도록 변형될 수 있다(Baxter (2000) Am. J. Physiol Endocrinol Metab. 278(6): 967-76). 많은 연구는 IGF-결합 단백질과 결합에 필요한 IGF-Ⅱ에서 잔기들을 지정하였다. 이들 잔기들에서 돌연변이들을 가진 작제물들은 M6P/IGF-Ⅱ 수용체와 결합하는 높은 친화도의 보유 및 IGF-결합 단백질들에 대한 감소된 친화도에 관하여 검색될 수 있다. 예를 들면, IGF-Ⅱ의 Phe 26번을 Ser으로 대체하는 것은 IGFBP-1 및 -6에 대한 IGF-Ⅱ의 친화도를 M6P/IGF-Ⅱ 수용체와 결합에 미치는 영향이 전혀 없이도 감소시키는 것으로 보고되어 있다(Bach et al. (1993) J. Biol. Chem. 268(13): 9246-54). Glu 9번으로 Lys과 같은 다른 치환들도 역시 유리할 수 있다. IGF-Ⅱ와 함께 높게 보존되는 IGF-I의 부위에서 유사한 돌연변이들은 개별적으로 또는 조합으로 IGF-BP 결합에서 큰 감소를 가져온다(Magee et al. (1999) Biochemistry 38(48): 15863-70).
대안의 접근법은 M6P/IGF-Ⅱ 수용체와 높은 친화도로 결합할 수 있는 IGF-Ⅱ의 최소 부위들을 확인하는 것이다. M6P/IGF-Ⅱ 수용체와 IGF-Ⅱ 결합에서 관련되었던 잔기들은 대부분 IGF-Ⅱ의 한 면 위에 밀집된다(Terasawa et al. (1994) EMBO J. 13(23): 5590-7). IGF-Ⅱ 삼차 구조가 정상적으로 세 개의 분자내 다이설파이드 결합들에 의해 유지되더라도, IGF-Ⅱ의 M6P/IGF-Ⅱ 수용체 결합 표면 위의 아미노산 서열을 삽입한 펩타이드는 적절하게 접히고 결합 활성을 가지도록 설계될 수 있다. 이러한 최소의 결합 펩타이드는 매우 바람직한 리소좀 표적화 도메인이다. 예를 들면, 바람직한 리소좀 표적화 도메인은 인간 IGF-Ⅱ의 8번 내지 67번 아미노산들이다. 48번 내지 55번 아미노산들 주변의 부위를 기초로 하여, M6P/IGF-Ⅱ 수용체와 결합하도록 설계된 펩타이드들도 역시 바람직한 리소좀 표적화 도메인들이다. 대안적으로, 펩타이드들의 무작위 라이브러리는 효모 이중 하이브리드 검정법 또는 파지 디스플레이 유형 검정법 둘 중 하나에 의해, M6P/IGF-Ⅱ 수용체를 결합시키는 능력에 관하여 검색될 수 있다.
인슐린 수용체에 대한 결합 친화도
본 명세서에서 기술된 퓨린-저항성 IGF-Ⅱ 뮤테인들을 포함하는 많은 IGF-Ⅱ 뮤테인은 인슐린 수용체들에 대한 감소된 또는 감축된 결합 친화도를 가진다. 따라서 일정 구현예들에서, 본 발명에 적합한 펩타이드 태그는 자연적으로-생기는 인간 IGF-Ⅱ의 인슐린 수용체에 대한 친화도와 대비하여 인슐린 수용체에 대한 감소된 또는 감축된 결합 친화도를 가진다. 일정 구현예들에서, 본 발명에 적합한 인슐린 수용체에 대한 감소된 또는 감축된 결합 친화도를 가지는 펩타이드 태그는 야생형 성숙한 인간 IGF-Ⅱ의 친화도보다 1.5배, 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 12배, 14배, 16배, 18배, 20배, 30배, 40배, 50배, 60배, 70배, 80배, 90배 또는 100배 이상 더 낮은 인슐린 수용체에 대한 결합 친화도를 가지는 펩타이드 태그들을 포함한다. 인슐린 수용체에 대한 결합 친화도는 당해 기술분야에서 알려진 다양한 시험관내 및 생체내 검정법들을 사용하여 측정될 수 있다. 대표적인 결합 검정법들은 실시예들 부문들에서 기술된다.
돌연변이화
IGF-Ⅱ 뮤테인들은 IGF-Ⅱ DNA 내로 적당한 뉴클레오타이드 변화들을 도입하는 것에 의해, 또는 바람직한 IGF-Ⅱ 폴리펩타이드의 합성에 의해 제조될 수 있다. IGF-Ⅱ 서열에서 변화들은 예를 들면 미국 특허 제5,364,934호에서 기재된, 예를 들면 보존적 및 비-보존적 돌연변이들을 위한 임의의 기법들 및 지침들을 사용하여 만들어질 수 있다. 변화들은 성숙한 인간 IGF-Ⅱ의 자연적으로 생기는 서열과 비교해서 IGF-Ⅱ의 아미노산 서열에서 변화를 가져오는 IGF-Ⅱ를 인코딩하는 하나 이상의 코돈들의 치환, 결실 또는 삽입일 수 있다. 아미노산 치환들은, 하나의 아미노산을, 루이신의 세린으로 대체, 예컨대, 보존적인 아미노산 대체들과 같은 유사한 구조적 및/또는 화학적 성질들을 가지는 또 다른 아미노산으로 대체하는 것의 결과일 수 있다. 아미노산 치환들은 또한 하나의 아미노산을, 유사하지 않은 구조적 및/또는 화학적 성질들을 가지는 또 다른 아미노산으로 대체하는 것, 예컨대, 비-보존적인 아미노산 대체들의 결과일 수 있다. 삽입들 또는 결실들은 선택적으로 1개 내지 5개 아미노산들의 범위에 있을 수 있다. 허용된 변화는 서열에서 아미노산들의 삽입들, 결실들 또는 치환들을 체계적으로 만들고 결과로 얻은 변이체들을 당해 기술분야에서 알려진 생체내 또는 시험관내 검정법들(CI-MPR과의 결합 검정법들 또는 퓨린 절단 검정법들과 같음)에서 활성에 대해 테스트하여 결정될 수 있다.
스캐닝 아미노산 분석도 역시 연속적 서열을 따라 하나 이상의 아미노산들을 확인하도록 채용될 수 있다. 그 중에 바람직한 스캐닝 아미노산들은 비교적 작고 중성인 아미노산들이다. 이러한 아미노산들은 알라닌, 글리신, 세린 및 시스테인을 포함한다. 알라닌은 이러한 그룹 중에서 이것이 베타-탄소를 넘는 측쇄를 제거하고 변이체의 주요-사슬 입체형태를 덜 변경할 수 있기 때문에 전형적으로 바람직한 스캐닝 아미노산이다. 알라닌은 또한 전형적으로 이것이 가장 보편적인 아미노산이기 때문에 바람직하다. 또한, 이것은 묻히고 노출된 위치들 둘 다에서 빈번하게 발견된다[Creighton, The Proteins, (W. H. Freeman ＆ Co., N.Y.); Chothia, J. Mol. Biol., 150: 1 (1976)]. 알라닌 치환이 적당량들의 변이체를 수득하지 못하는 경우라면, 이소테릭(isoteric) 아미노산이 사용될 수 있다.
변화들은 올리고뉴클레오타이드-매개된(부위-유도된) 돌연변이화, 알라닌 스캐닝, 및 PCR 돌연변이화와 같은 당해 기술분야에서 알려진 방법들을 사용하여 만들어질 수 있다. IGF-Ⅱ 뮤테인들을 생산하도록 부위-유도된 돌연변이화[Carter et al., Nucl. Acids Res., 13: 4331 (1986); Zoller et al., Nucl. Acids Res., 10: 6487 (1987)], 카세트 돌연변이화 [Wells et al., Gene, 34: 315 (1985)], 제한효소 선택 돌연변이화[Wells et al., Philos. Trans. R. Soc. London SerA, 317: 415 (1986)] 또는 다른 기지의 기법들이 클론된 DNA 상에서 수행될 수 있다.
스페이서
GILT 태그는 리소좀 효소의 N-말단 또는 C-말단과 융합될 수 있다. GILT 태그는 리소좀 효소와 직접적으로 융합될 수 있거나 링커 또는 스페이서에 의해 리소좀 효소로부터 분리될 수 있다. 아미노산 링커 또는 스페이서는 일반적으로 두 가지 단백질 분체들 사이에 경직(rigid)되거나 유연하거나 알파-나선과 같은 구조를 중재하도록 설계된다. 링커 또는 스페이서는, 예를 들면 서열 Gly-Ala-Pro(GAP)(서열번호 9), Gly-Gly-Gly-Gly-Ala(GGGGA)(서열번호 60) 또는 Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(GGGGS)(서열번호 12)과 같이 비교적 짧을 수 있거나, 예를 들면 10개 내지 25개 아미노산들의 길이, 25개 내지 50개 아미노산들의 길이 또는 35개 내지 55개 아미노산들의 길이와 같이 더 길 수 있다. 융합 연결부의 부위는 융합 파트너들 둘 다의 적절한 접힘 및 활성을 촉진하고, 리소좀 효소, 예컨대, 알파-N-아세틸글루코사미니다제로부터 펩타이드 태그의 미성숙한 분리를 방지하도록 조심스럽게 선택되어야 한다.
다양한 구현예에서, 스페이서 펩타이드는 하나 이상의 GGGPS(서열번호 14) 또는 GGGSP(서열번호 15) 아미노산 서열들을 포함하고, 선택적으로 하나 이상의 (i) GAP(서열번호 9), (ii) GGGGS(서열번호 12), (iii) GGGS(서열번호 16), (iv) AAAAS(서열번호 17), (v) AAAS(서열번호 18), (vi) PAPA(서열번호 19), (vii) TPAPA(서열번호 20), (viii) AAAKE(서열번호 21) 또는 (ix) GGGGA(서열번호 60)를 더 포함한다. 다양한 구현예에서, 스페이서는 아미노산 서열 GAP(서열번호 9), GPS(서열번호 10), 또는 GGS(서열번호 11)를 포함한다.
다양한 구현예에서, 스페이서 펩타이드는 하나 이상의 GGGGS(서열번호 12) 또는 GGGS(서열번호 16) 아미노산 서열들을 포함한다. 다양한 구현예에서, 스페이서 펩타이드는 하나 이상의 GGGPS(서열번호 14) 또는 GGGSP(서열번호 15) 아미노산 서열들을 포함한다. 다양한 구현예에서, 스페이서 펩타이드는 하나 이상의 AAAAS(서열번호 17) 또는 AAAS(서열번호 18) 아미노산 서열들을 포함한다. 다양한 구현예에서, 스페이서 펩타이드는 하나 이상의 PAPA(서열번호 19) 또는 TPAPA(서열번호 20) 아미노산 서열들을 포함한다. 다양한 구현예에서, 스페이서 펩타이드는 하나 이상의 AAAKE(서열번호 21) 아미노산 서열들을 포함한다. 다양한 구현예에서, 스페이서 펩타이드는 하나 이상의 GGGGA(서열번호 60) 아미노산 서열들을 포함한다.
다양한 구현예에서, 스페이서 펩타이드는: (GGGGS)n(서열번호들 12, 56, 58, 91 내지 94), (GGGGS)n-GGGPS(서열번호들 36, 95 내지 100), GAP-(GGGGS)n-GGGPS(서열번호들 101 내지 107), GAP-(GGGGS)n-GGGPS-GAP(서열번호들 37, 108 내지 113), GAP-(GGGGS)n-GGGPS-(GGGGS)n-GAP(서열번호들 114 내지 162), GAP-GGGPS-(GGGGS)n-GAP(서열번호들 163 내지 169), GAP-(GGGGS)n-AAAAS-GGGPS-(GGGGS)n-AAAA-GAP(서열번호들 170 내지 218), GAP-(GGGGS)n-PAPAP-(Xaa)n-GAP(서열번호들 219 내지 267), GAP-(GGGGS)n-PAPAPT-(Xaa)n-GAP(서열번호들 268 내지 316), GAP-(GGGGS)n-(Xaa)n-PAPAP-(Xaa)n-(AAAKE)n-(Xaa)n-(GGGGS)n-GAP(서열번호들 544 내지 551), (GGGGA)n(서열번호들 60, 79, 81, 317 내지 320), (GGGGA)n-GGGPS(서열번호들 321 내지 326), GAP-(GGGGA)n-GGGPS(서열번호들 327 내지 333), GAP-(GGGGA)n-GGGPS-GAP(서열번호들 334 내지 340), GAP-(GGGGA)n-GGGPS-(GGGGA)n-GAP(서열번호들 341 내지 389), GAP-GGGPS-(GGGGA)n-GAP(서열번호들 390 내지 396), GAP-(GGGGA)n-AAAAS-GGGPS-(GGGGA)n-AAAA-GAP(서열번호들 397 내지 445), GAP-(GGGGA)n-PAPAP-(Xaa)n-GAP(서열번호들 446 내지 494), GAP-(GGGGA)n-PAPAPT-(Xaa)n-GAP(서열번호들 495 내지 543), GAP-(GGGGA)n-(Xaa)n-PAPAP-(Xaa)n-(AAAKE)n-(Xaa)n-(GGGGA)n-GAP(서열번호들 552 내지 559)임)로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하되; 여기서 n은 1 내지 7이다. 다양한 구현예에서, n은 1 내지 4이다.
다양한 구현예에서, 스페이서는 EFGGGGSTR(서열번호 22), GAP(서열번호 9), GGGGS(서열번호 12), GPSGSPG(서열번호 23), GPSGSPGT(서열번호 24), GPSGSPGH(서열번호 25), GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPST(서열번호 26), GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSH(서열번호 27), GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGPS(서열번호 28), GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGPSGAP(서열번호 29), GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPS(서열번호 30), GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGAP(서열번호 31), GGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPS(서열번호 32), GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPSGAP(서열번호 33), GGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPS(서열번호 34), GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPSGAP(서열번호 35), GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPS(서열번호 36), GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGAP(서열번호 37), GGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGPS(서열번호 38), GAPGGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGPSGAP(서열번호 39), GGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGGSAAAASGGGPS(서열번호 40), GAPGGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGGSAAAASGGGPSGAP(서열번호 41), GGGGSGGGGSAAAASGGGPSGGGGSAAAASGGGPSGGGGSAAAASGGGPS(서열번호 42), GAPGGGGSGGGGSAAAASGGGPSGGGGSAAAASGGGPSGGGGSAAAASGGGPSGAP(서열번호 43), GGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPGPS(서열번호 44), GAPGGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPGPSGAP(서열번호 45), GGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTGPS(서열번호 46), GAPGGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTGPSGAP(서열번호 47), GGGSPAPTPTPAPTPAPTPAGGGPS(서열번호 48), GAPGGGSPAPTPTPAPTPAPTPAGGGPSGAP(서열번호 49), GGGSPAPAPTPAPAPTPAPAGGGPS(서열번호 50), GAPGGGSPAPAPTPAPAPTPAPAGGGPSGAP(서열번호 51), GGGSAEAAAKEAAAKEAAAKAGGPS(서열번호 52), GAPGGGSAEAAAKEAAAKEAAAKAGGPSGAP(서열번호 53), GGGSPAEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKAPSGGG(서열번호 54), GAPGGGSPAEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKAPSGGGGAP(서열번호 55), GGGGSGGGGSGGGGS(서열번호 56), GAPGGGGSGGGGSGGGGSGAP(서열번호 57), GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(서열번호 58), GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGAP(서열번호 59), GGGGA(서열번호 60), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPST(서열번호 61), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSH(서열번호 62), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGPS(서열번호 63), GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGPSGAP(서열번호 64), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPS(서열번호 65), GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGAP(서열번호 66), GGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPS(서열번호 67), GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPSGAP(서열번호 68), GGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPS(서열번호 69), GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPSGAP(서열번호 70), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPS(서열번호 71), GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGAP(서열번호 72), GGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGPS(서열번호 73), GAPGGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGPSGAP(서열번호 74), GGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGGAAAAASGGGPS(서열번호 75), GAPGGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGGAAAAASGGGPSGAP(서열번호 76), GGGGAGGGGAAAAASGGGPSGGGGAAAAASGGGPSGGGGAAAAASGGGPS(서열번호 77), GAPGGGGAGGGGAAAAASGGGPSGGGGAAAAASGGGPSGGGGAAAAASGGGPSGAP(서열번호 78), GGGGAGGGGAGGGGA(서열번호 79), GAPGGGGAGGGGAGGGGAGAP(서열번호 80), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGA(서열번호 81), GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGAP(서열번호 82), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPS[또는 (GGGGA)8GGGPS](서열번호 83), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSH[또는 (GGGGA)8GGGPSH](서열번호 84), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPS[또는 (GGGGA)9GGGPS](서열번호 85), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSH[또는(GGGGA)9GGGPSH](서열번호 86), GGGGPAPGPGPAPGPAPGPAGGGPS(서열번호 87), GAPGGGGPAPGPGPAPGPAPGPAGGGPGGAP(서열번호 88), GGGGPAPAPGPAPAPGPAPAGGGPS(서열번호 89), 및 GAPGGGGPAPAPGPAPAPGPAPAGGGPGGAP(서열번호 90)로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
다양한 구현예에서, 스페이서는 GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPS(서열번호 36), GGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPGPS(서열번호 44), GAPGGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPGPSGAP(서열번호 45), GGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTGPS(서열번호 46), GAPGGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTGPSGAP(서열번호 47), GGGSPAPTPTPAPTPAPTPAGGGPS(서열번호 48), GAPGGGSPAPTPTPAPTPAPTPAGGGPSGAP(서열번호 49), GGGSPAPAPTPAPAPTPAPAGGGPS(서열번호 50), GAPGGGSPAPAPTPAPAPTPAPAGGGPSGAP(서열번호 51), GGGSAEAAAKEAAAKEAAAKAGGPS(서열번호 52), GAPGGGSAEAAAKEAAAKEAAAKAGGPSGAP(서열번호 53), GGGSPAEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKAPSGGG(서열번호 54), GAPGGGSPAEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKAPSGGGGAP(서열번호 55), 및 GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPS(서열번호 71)로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
다양한 구현예에서, 스페이서는 GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPS(서열번호 36), GAPGGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTGPSGAP(서열번호 47), GAPGGGSPAPAPTPAPAPTPAPAGGGPSGAP(서열번호 51), GAPGGGSPAEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKAPSGGGGAP(서열번호 55), 및 GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPS(서열번호 71)로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
본 발명의 방법들 및 조성물들에서 사용될 수 있는 GILT-태그화 알파-N-아세틸글루코사미니다제 단백질들은 미국 특허 공개 제20050244400호 및 제20050281805호에 자세하게 기술되고, 이들 기재의 전부는 본 명세서에서 참고문헌으로 통합된다.
세포들
세포 배양 및 폴리펩타이드들의 발현을 허용하는 임의의 포유동물 세포 또는 세포 유형이 예를 들면 인간 배아 신장(HEK) 293, 중국 햄스터 난소(CHO), 원숭이 신장(COS), HT1080, C10, HeLa, 새끼 햄스터 신장(BHK), 3T3, C127, CV-1, HaK, NS/0, 및 L-929 세포들과 같이 본 발명에 따라 사용될 수 있다. 본 발명에 따라 사용될 수 있는 포유동물 세포들의 비-제한적인 예들은, 제한되는 것은 아니지만, BALB/c 마우스 골수종 계열(NS0/1, ECACC 번호: 85110503); 인간 망막아세포들 PER.C6(크루셀사(CruCell), 네덜란드 레이덴)), SV40에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 계열(COS-7, ATCC CRL 1651); 인간 배아 신장 계열(293 세포 또는 현탁 배양에서 성장을 위해 서브클론된 293 세포들(Graham et al., J. Gen Virol., 36: 59 (1977)); 새끼 햄스터 신장 세포들(BHK, ATCC CCL 10); 중국 햄스터 난소 세포들 +/-DHFR(CHO, Urlaub and Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 4216 (1980)); 마우스 세르톨리 세포들(TM4, Mather, Biol. Reprod., 23: 243-251 (1980)); 원숭이 신장 세포들(CV1 ATCC CCL 70); 아프리카 녹색원숭이 신장 세포들(VERO-76, ATCC CRL-1 587); 인간 자궁경부 암종 세포들(HeLa, ATCC CCL 2); 고양이 신장 세포들(MDCK, ATCC CCL 34); 버팔로 래트 간 세포들(BRL 3A, ATCC CRL 1442); 인간 폐 세포들(W138, ATCC CCL 75); 인간 간 세포들(Hep G2, HB 8065); 마우스 유방 종양(MMT 060562, ATCC CCL51); TRI 세포들(Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci., 383: 44-68 (1982)); MRC 5 세포들; FS4 세포들; 및 인간 간암 계열(Hep G2)을 포함한다. 일정 구현예들에서, 본 발명의 융합 단백질은 CHO 세포주들로부터 생산된다.
본 발명의 융합 단백질은 예를 들면 곤충(예컨대, Sf-9, Sf-21, Hi5), 식물(예컨대, 레구미노사(Leguminosa), 곡류 또는 담배), 효모(예컨대, 사카로마이에스 세레비시애(S. cerivisae), 피키아 파스토리스(P. pastoris)), 원핵생물(예컨대, 이. 콜라이(E. Coli), 바실러스 서브틸리스(B. subtilis) 및 기타 바실러스종(Bacillus spp.), 슈도모나스종(Pseudomonas spp.), 스트렙토마이세스종(Streptomyces spp.)), 또는 곰팡이와 같은 다양한 비-포유동물 숙주 세포들에서 역시 발현될 수 있다.
일정 구현예들에서, 퓨린-저항성 GILT 태그가 존재 또는 부재하는 융합 단백질은 퓨린-결핍 세포들에서 생산될 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 바, 용어 "퓨린-결핍 세포들"은 퓨린 프로테아제 활성이 억제되거나, 감소되거나, 제거된 임의의 세포들을 말한다. 퓨린-결핍 세포들은 퓨린을 생산하지 않거나 감소된 양의 또는 결함성 퓨린 프로테아제를 생산하는 포유동물 및 비-포유동물 세포들 둘 다를 포함한다. 대표적인 퓨린 결핍 세포들은, 제한되는 것은 아니지만, FD11 세포들(Gordon et al (1997) Infection and Immunity 65(8): 3370 3375), 및 문헌[Moebring and Moehring (1983) Infection and Immunity 41(3): 998 1009]에서 기술된 이들의 돌연변이체 세포들을 포함하여, 당업자에게 알려져 있고 입수가능하다. 대안적으로, 퓨린 결핍 세포들은 상기 기술된 포유동물 및 비-포유동물 세포들을 돌연변이화 처리, 예컨대, 방사선 조사, 에티디움 브로마이드, 브롬화된 우리딘(BrdU) 등, 바람직하게 화학적 돌연변이화, 더욱 바람직하게는 에틸 메탄 설포네이트 돌연변이화에 노출시키고 그 처리로부터 생존한 세포들을 회수하여 슈도모나스 외독소 A의 독성에 대해 저항성을 가지는 것으로 확인된 이들 세포들을 선별하는 단계에 의해 획득될 수 있다(믄헌[Moehring and Moehrin (1983) Infection and Immunity 41(3): 998-1009] 참조).
다양한 구현예에서, 본 명세서에서 기술된 바와 같이 스페이서를 포함하는 소정의 표적화된 치료적 단백질들은 서로 다른 스페이서 펩타이드를 포함하는 표적화된 치료적 단백질들과 비교하여 재조합적으로 발현될 때 활성을 가진 단백질의 증가된 발현을 나타낼 수 있는 것으로 고려된다. 다양한 구현예에서, 본 명세서에서 기술된 표적화된 치료적 단백질들은 본 명세서에서 다른 표적화된 치료적 단백질들과 비교하여 증가된 활성을 가질 수 있는 것으로도 역시 고려된다. 다양한 구현예에서, 서로 다른 스페이서 펩타이드를 포함하는 다른 표적화된 치료적 단백질들과 비교하여 활성을 가진 단백질의 증가된 발현을 나타내고/거나 증가된 활성을 가지는 이들 표적화된 치료적 단백질들은 심화 실험법에 사용되는 것으로 고려된다.
치료적 단백질들의 투여
본 발명에 따르면, 본 발명의 치료적 단백질은 본 명세서에서 기술된 바와 같이 전형적으로 개인에게 단독으로 또는 치료적 단백질을 포함하는 조성물들 또는 약제들로 (예컨대, 질환의 치료를 위한 약제의 제조에) 투여된다. 조성물들은 약제학적 조성물을 제조하도록 생리학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제로 제형화될 수 있다. 담체 및 조성물은 무균일 수 있다. 제형화는 투여의 방식에 적합하여야 한다.
적합한 약제학적으로 허용가능한 담체들은, 제한되는 것은 아니지만, 물, 염 용액들(예컨대, NaCl), 식염수, 완충된 식염수, 알코올들, 글리세롤, 에탄올, 아라비아 검, 식물성 오일들, 벤질 알코올들, 폴리에틸렌 글리콜들, 젤라틴, 락토스, 아밀로스 또는 전분과 같은 탄수화물들, 만니톨, 슈크로스 또는 기타와 같은 당들, 덱스트로스, 마그네슘 스테아레이트, 탈크, 규산, 점성 파라핀, 방향 오일, 지방산 에스테르들, 하이드록시메틸셀룰로스, 폴리비닐 피롤리딘 등뿐만 아니라 그들의 조합들을 포함한다. 약제학적 조제물들은 원하는 경우 활성 화합물들과 유해하게 반응하지 않거나 그들의 활성과 개입하지 않는 보조제들(예컨대, 윤활제들, 보존제들, 안정화제들, 습윤화제들, 에멀전화제들, 삼투압에 영항을 주는 염들, 완충액들, 채색, 미각 및/또는 방향 물질들 등)과 혼합될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 정맥내 투여에 적합한 물-용해성 담체가 사용된다.
조성물 또는 약제는 원하는 경우 적은 양들의 습윤화 또는 에멀전화 제제들, 또는 pH 완충화제들도 역시 포함할 수 있다. 조성물은 액체 용액, 현탁액, 에멀전, 정제, 환제, 캡슐, 서방성 제형물, 또는 분말일 수 있다. 조성물은 또한 통상적인 결합제들 및 트리글리세라이드들과 같은 담체들과 함께 좌약으로서 제형화될 수 있다. 경구적 제형물은 약제학적 등급들의 만니톨, 락토스, 전분, 마그네슘 스테아레이트, 폴리비닐 피롤리돈, 소듐 사카린, 셀룰로스, 마그네슘 카보네이트 등과 같은 표준 담체들을 포함할 수 있다.
조성물 또는 약제는 인간들에게 투여를 위해 적응된 약제학적 조성물로서 일상적인 절차들에 따라 제형화될 수 있다. 예를 들면, 바람직한 구현예에서, 정맥내 투여를 위한 조성물은 전형적으로 무균의 등장성 수용성 완충액에서 용액이다. 필요한 경우, 조성물은 주사 부위에서 통증을 완화하도록 용해화 제제 및 국소적 마취제를 또한 포함할 수 있다. 일반적으로, 성분들은 예를 들면 정량의 활성 성분을 지시하는 앰풀 또는 사케트와 같은 밀봉된 용기에 넣은 건조 동결건조된 분말 또는 무수 농축물로서, 개별적으로 공급되거나 단위 용량 형태로 다함께 혼합될 수 있다. 조성물이 주입에 의해 투여될 경우, 이것은 무균의 약제학적 등급의 물, 식염수 또는 덱스트로스/물을 포함하는 주입 병으로 조제될 수 있다. 조성물이 주사에 의해 투여되는 경우, 성분들이 투여 이전에 혼합될 수 있도록 무균의 주사용수 또는 식염수의 앰풀이 제공될 수 있다.
치료적 단백질은 중성 또는 염 형태들로서 제형화될 수 있다. 약제학적으로 허용가능한 염들은 염산, 인산, 아세트산, 옥살산, 타르타르산 등으로부터 유래된 것들과 같은 자유 아미노기들, 및 소듐, 포타슘, 암모늄, 칼슘, 수산화철들, 이소프로필아민, 트리에틸아민, 2-에틸아미노 에탄올, 히스티딘, 프로케인 등으로부터 유래된 것들과 같은 자유 카복실기들로 형성된 것들을 포함한다.
치료적 단백질(또는 치료적 단백질을 포함하는 조성물 또는 약제)은 임의의 적당한 경로에 의해 투여된다. 다양한 구현예에서, 치료적 단백질은 정맥내로 투여된다. 다른 구현예들에서, 치료적 단백질은 심장 또는 근육(예컨대, 근육내), 또는 신경계(예컨대, 뇌 내로의 직접 주사, 뇌실내로, 경막내로)와 같은 표적 조직으로 직접 투여에 의해 투여된다. 다양한 구현예에서, 치료적 단백질은 경막내로 투여된다. 대안적으로, 치료적 단백질(또는 치료적 단백질을 포함하는 조성물 또는 약제)은 비경구로, 경피로, 또는 경점막으로(예컨대, 경구적으로 또는 비강으로) 투여될 수 있다. 하나 이상의 경로가 원하는 경우라면 동시에 사용될 수 있고, 예컨대, 치료적 단백질은 정맥내로 및 경막내로 투여된다. 동시적인 정맥내 및 경막내 투여는 동시일 필요는 없고 연속적일 수 있다.
치료적 단백질(또는 치료적 단백질을 포함하는 조성물 또는 약제)은 단독으로 또는 항히스타민들(예컨대, 다이펜하이드라민) 또는 면역억제제들 또는 항-GILT-태그화 리소좀 효소 항체들을 막는 기타 면역치료제들과 같은 다른 제제들과 결합하여 투여될 수 있다. 용어 "결합하여"는 제제가 치료적 단백질(또는 치료적 단백질을 포함하는 조성물 또는 약제) 이전에, 거의 동시에 또는 이어서 투여되는 것을 가리킨다. 예를 들면, 제제는 치료적 단백질을 포함하는 조성물 내로 혼합됨으로써, 치료적 단백질과 동시적으로 투여될 수 있고; 대안적으로 제제는 혼합 없이도 (예컨대, 치료적 단백질이 또한 투여되는 정맥내 선 위에 제제의 "피기백(piggybacking)" 전달에 의해 또는 그의 역으로) 동시적으로 투여될 수 있다. 또 다른 예에서, 제제는 개별적으로(예컨대, 혼합되지 않고) 그러나 치료적 단백질 투여의 짧은 시간 범위 이내(예컨대, 24시간 이내)에 투여될 수 있다.
치료적 단백질(또는 치료적 단백질을 포함하는 조성물 또는 약제)은 치료적 유효량(즉, 위에서 기술된 바와 같이 규칙적인 간격들로 투여될 때 질환과 연관된 증상들을 향상시키거나, 질환의 발병을 예방하거나 지연시키고/거나 질환의 증상들의 중증도 또는 빈도를 감축시키는 것에 의해서와 같이 질환을 치료하는 데 충분한 투약량)으로 투여된다. 질환의 치료를 위해 치료적으로 유효할 용량은 질환의 효과들의 특성 및 정도에 의존할 것이고, 표준 임상적 기법들에 의해 결정될 수 있다. 또한, 시험관내 또는 생체내 검정법들은 선택적으로 당해 기술분야에서 알려진 방법들을 사용하여 최적의 용량 범위들을 확인하는 것을 돕도록 채용될 수 있다. 채용될 정확한 용량은 또한 투여의 경로 및 질환의 중증도에 의존할 것이고, 의사의 판단 및 각각의 환자의 상황들에 따라 결정되어야 한다. 유효 용량들은 시험관내 또는 동물 모델 테스트 시스템들로부터 유래된 용량-반응 곡선들로부터 외삽될 수 있다. 치료적으로 유효한 투약량은 예를 들면 약 0.1 내지 1 mg/체중 kg, 약 1 내지 5 mg/kg, 약 2.5 내지 20 mg/kg, 약 5 내지 20 mg/kg, 약 20 내지 50 mg/kg, 약 20 내지 100 mg/kg, 약 50 내지 200 mg/kg, 또는 약 2.5 내지 20 mg/kg일 수 있다. 특정한 개인을 위한 유효한 용량은 시간 경과 시 개인의 필요들에 의존하여 변화(예컨대, 증가 또는 감소)될 수 있다. 예를 들면, 신체적 질병 또는 스트레스의 시기에 또는 질환 증상들이 악화되는 경우라면, 투약량은 증가될 수 있다.
치료적 단백질(또는 치료적 단백질을 포함하는 조성물 또는 약제)의 치료적 유효량은 질환의 효과들의 특성 및 정도에 의존하여, 그리고 진행을 기초로 하여 규칙적인 간격들로 투여된다. 본 명세서에서 사용되는 바, "간격"으로 투여는 치료적 유효량이 정기적으로 (일회 용량과 구별되는 바) 투여되는 것을 가리킨다. 간격은 표준 임상적 기법들에 의해 결정될 수 있다. 일정 구현예들에서, 치료적 단백질들은 격월로, 매월, 매월 두 번, 3주마다, 격주로, 매주, 매주 두 번, 매주 세 번, 또는 매일 투여된다. 단일 개인을 위한 투여 간격은 고정된 간격일 필요는 없지만, 개인의 필요들에 의존하여 시간 경과에 따라 변화될 수 있다. 예를 들면, 신체적 병 또는 스트레스의 시기에 또는 질환 증상들이 악화된 경우라면, 용량들 간의 간격이 감소될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바, 용어 "격월로"는 2개월 당 한 번 투여를 의미하고(예컨대, 2개월마다 한 번); 용어 "매월"은 개월 당 한 번 투여를 의미하며; 용어 "3주마다"는 3주 당 한 번 투여를 의미하고(예컨대, 3주마다 한 번); 용어 "격주로"는 2주 당 한 번 투여를 의미하며(예컨대, 2주마다 한 번); 용어 "매주"는 주 당 한 번 투여를 의미하고; 용어 "매일"은 일 당 한 번 투여를 의미한다.
본 발명은 추가적으로 본 명세서에서 기술된 방법들에 의해서와 같은 점액다당류증 제ⅢB형(산필립포 B 증후군)의 치료를 위한 조성물의 투여를 위한 지침들을 포함하는 라벨을 가진 용기(예컨대, 바이알, 병, 정맥내 투여를 위한 백, 주사기 등)에 넣은 본 명세서에서 기술된 바와 같이 치료적 단백질을 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.
약제학적으로 허용가능한 제형물들의 경막내 투여
다양한 구현예에서, 효소 융합 단백질은 개체의 중추신경계 내로, 예컨대, 개체의 뇌척수액 내로 도입에 의해 투여된다. 본 발명의 소정의 관점들에서, 효소는 경막내로, 예컨대, 요추 부위 또는 대수공 내로 또는 뇌실내로(또는 뇌측실내로) 뇌측실 공간 내로 도입된다. 리소좀 효소를 경막내로 투여하는 방법들은 본 명세서에서 그의 전부가 참고문헌으로 통합되는 미국 특허 제7,442,372호에 기술된다.
당업자들이라면 치료적 조성물의 경막내 투여를 시행하는 데 사용될 수 있는 장치들을 인식하고 있다. 예를 들면, 요법은 뇌막 암종증을 위해 약물들을 경막내로 투여하는 데 보편적으로 사용하는 옴마야 리저버(Ommaya reservoir)를 사용하여 주어질 수 있다(Ommaya AK, Lancet 2: 983-84, 1963). 보다 상세하게, 본 방법에서 뇌실 튜브는 전방 돌기에 형성된 구멍을 통해 삽입되고 두피 아래에 장착된 옴마야 리저버와 연결되며, 수조는 피하로 천공되어 리저버 내로 주사되는 대체될 효소를 경막내로 전달한다. 개인에게 치료적 조성물들의 경막내 투여를 위한 다른 장치들은 본 명세서에서 참고문헌으로 통합되는 미국 특허 제6,217,552호에 기술된다. 대안적으로, 조성물은 예를 들면 일회 주사 또는 계속적인 주입에 의해 경막내로 주어질 수 있다. 투약 처치는 일회 용량 투여 또는 다회 용량의 형태일 수 있는 것으로 이해되어야 한다.
본 명세서에서 사용되는 바, 용어 "경막내 투여"는 약제학적 조성물을 천두공 또는 수조 또는 요추 천공 등을 통하여 뇌측실 주사(예컨대, 뇌실내로)를 포함하는 기법들에 의해 개체의 뇌척수액 내로 직접 전달하는 것을 포함하도록 의도된다(본 명세서에서 그들의 내용들이 참고문헌으로 통합되어 있는 문헌[Lazorthes et al. Advances in Drug Delivery Systems and Applications in Neurosurgery, 143-192 및 Omaya et al., Cancer Drug Delivery, 1: 169-179]에 기술됨). 용어 "요추 부위"는 세 번째 및 네 번째 허리(등 하부) 척추 사이의 영역을, 더욱 상세하게는 척추의 L2-S1 부위를 포함하도록 의도된다. 용어 "대수공"은 두개골 및 척추의 첨단 사이의 구멍을 통해 소뇌 주변 및 아래의 공간으로 접근을 포함하도록 의도된다. 용어 "뇌실"은 척수의 중앙관과 연결되는 뇌의 공동들을 포함하도록 의도된다. 본 발명에 따른 약제학적 조성물의 임의의 상기 언급된 부위들로 투여는 조성물의 직접 주사에 의해 또는 주입 펌프들의 사용에 의해 달성될 수 있다. 주사의 경우 본 발명의 조성물은 액체 용액들에서, 바람직하게는 행크 용액, 링거 용액 또는 포스페이트 완충액과 같은 생리학적으로 적합한 완충액들에서 제형화될 수 있다. 또한, 효소는 고체 형태로 제형화되고 사용 전에 바로 재용해되거나 현탁될 수 있다. 동결건조된 형태들도 역시 포함된다. 주사는 예를 들면 효소의 일회 주사 또는 계속적 주입(예컨대, 주입 펌프들을 사용함)의 형태로 일 수 있다.
본 발명의 다양한 구현예에서, 효소는 개체의 뇌 내로 뇌측실 주사에 의해 투여된다. 주사는 예를 들면 개체의 두개골에 만들어진 천두공을 통하여 시행될 수 있다. 또 다른 구현예에서, 효소 및/또는 다른 약제학적 제형물은 개체의 뇌실 내로 외과적으로 삽입된 션트를 통하여 투여된다. 예를 들면, 주사는 세 번째 및 네 번째의 더 작은 뇌실들 내로 주사도 역시 시행될 수 있더라도, 더 큰 뇌측실 내로 시행될 수 있다.
다양한 구현예에서, 본 발명에서 사용된 약제학적 조성물들은 개체의 대수공 또는 요추 영역 내로의 주사에 의해 투여된다. 본 발명의 방법의 또 다른 구현예에서, 약제학적으로 허용가능한 제형물은 개체에게 본 발명에서 사용된 효소 또는 다른 약제학적 조성물의 유지된 전달, 예컨대, "느린 방출"을, 약제학적으로 허용가능한 제형물이 개체에게 투여된 이후 적어도 1주, 2주, 3주, 4주 또는 더 긴 기간들 동안 제공한다.
다양한 구현예에서, 치료적 융합 단백질은 뇌 또는 척수의 하나 이상의 표면 또는 얕은 조직들로 전달된다. 예를 들면 다양한 구현예에서, 치료적 융합 단백질은 소뇌 또는 척수의 하나 이상의 표면 또는 얕은 조직들로 전달된다. 일정 구현예들에서, 소뇌 또는 척수의 표적화된 표면 또는 얕은 조직들은 소뇌의 표면으로부터 4 mm 이내에 위치한다. 일정 구현예들에서, 소뇌 또는 척수의 표적화된 표면 또는 얕은 조직들은 연질막 조직들, 대뇌 피질 리본 조직들, 해마, 버코우 로빈 공간, VR 공간 내의 혈관들, 해마, 뇌의 아래면 위의 해마의 부분들, 시각 신경들 및 관들, 후각 망울 및 돌기들 그리고 그들의 조합들로부터 선택된다.
일정 구현예들에서, 치료적 융합 단백질은 소뇌 또는 척수의 하나 이상의 깊은 조직들로 전달된다. 일정 구현예들에서, 소뇌 또는 척수의 표적화된 표면 또는 얕은 조직들은 소뇌의 표면 아래(또는 내부) 4 mm(예컨대, 5 mm, 6 mm, 7 mm, 8 mm, 9 mm, 또는 10 mm)에 위치한다. 일정 구현예들에서, 소뇌의 표적화된 깊은 조직들은 간뇌(예컨대, 시상하부, 시상, 시상전부, 시상저부 등), 후뇌, 렌즈핵, 기저 신경절, 미상엽, 조가비핵, 편도핵, 창백핵, 및 그들의 조합들의 하나 이상을 포함한다.
다양한 구현예에서, 척수의 표적화된 표면 또는 얕은 조직은 연질막 및/또는 백질의 관들을 포함한다. 다양한 구현예에서, 척수의 표적화된 깊은 조직은 척수 회색질 및/또는 뇌실막 세포들을 포함한다. 일정 구현예들에서, 치료적 융합 단백질은 척수의 뉴런들로 전달된다.
다양한 구현예에서, 치료적 융합 단백질은 소뇌의 하나 이상의 조직들로 전달된다. 소정의 구현예들에서 소뇌의 표적화된 하나 이상의 조직들은 분자층의 조직들, 퍼킨제 세포층의 조직들, 과립 세포층의 조직들, 소뇌다리들 및 그들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 일정 구현예들에서, 치료적 제제들(예컨대, 효소)은, 제한되는 것은 아니지만, 퍼킨제 세포층의 조직들, 과립 세포층의 조직들, 깊은 소뇌의 백색질 조직(예컨대, 과립 세포층 대비 깊음) 및 깊은 소뇌의 핵 조직을 포함하는 소뇌의 하나 이상의 깊은 조직들로 전달된다.
다양한 구현예에서, 치료적 융합 단백질은 뇌줄기의 하나 이상의 조직들로 전달된다. 일정 구현예들에서, 뇌줄기의 표적화된 하나 이상의 조직들은 뇌줄기 백색질 조직 및/또는 뇌줄기 핵 조직을 포함한다.
다양한 구현예에서, 치료적 융합 단백질은, 제한되는 것은 아니지만, 회색질, 백색질, 뇌실주변 영역들, 거미막, 뇌막들, 신피질, 소뇌, 대뇌 피질의 깊은 조직, 분자층, 미상엽/조가비핵 부위, 중뇌, 교뇌 또는 연수의 깊은 부위들 및 그들의 조합들을 포함하는 다양한 뇌 조직들로 전달된다.
다양한 구현예에서, 치료적 융합 단백질은, 제한되는 것은 아니지만, 뉴런들, 교아세포들, 혈관주변 세포들 및/또는 뇌막 세포들을 포함하는 뇌의 다양한 세포들로 전달된다. 일정 구현예들에서, 치료적 단백질은 깊은 백질의 희소돌기교아세포들로 전달된다.
본 발명의 방법들에서 사용하는 키트들
본 발명의 방법들에서 사용되는 제제들은 키트로 제공될 수 있고, 키트는 사용을 위한 지침들을 더 포함할 수 있다. 이러한 키트는 본 명세서에서 기술된 바와 같은 리소좀 축적 질환의 치료에서 사용하는 효소 및 리소좀 표적화 분체를 포함하는 융합 단백질을, 보통 숙주에게 투여하기 적합한 용량 및 형태로 포함할 것이다. 다양한 구현예에서, 키트는 보통 효소를 경막내로 전달하는 기구를 포함할 것이다.
키트는 또한 치료적 조성물을 생성하기 위하여 항원 상세하게는 폴리펩타이드 항원의 고흡수 분체와 결합이 제공될 수 있다. 예를 들면, 상기 기술된 바와 같이 폴리펩타이드를 연결하는 데 적합한 링커와 결합된, IGF-Ⅱ 뮤테인과 같은 분체가 제공될 수 있다. 고흡수 분체는 또한 적합한 링커 및 사용을 위한 지침들과 조합하여, 미결합된 형태로 제공될 수 있다.
또 다른 키트는 치료적 조성물들에 추가하여, 본 발명의 치료적 조성물들의 경막내 투여를 위한 지침들을 포함할 수 있다. 소정의 구현예들에서, 본 발명의 키트들은 본 발명의 치료적 조성물들과 사전 로딩되는 효소 대체 요법의 경막내 투여를 위한 카테터들 또는 기타 기구들을 포함할 수 있다. 예를 들면, 상세하게는 0.001 내지 0.01 mg, 0.01 내지 0.1 mg, 0.1 내지 1.0 mg, 1.0 내지 10 mg, 또는 10 내지 100 mg 이상의 리소좀 효소 및 Naglu 및 IGF-Ⅱ 뮤테인과 같은 리소좀 표적화 분체를 약제학적으로 허용가능한 제형물로 포함하는 치료적 융합 단백질로 사전 로딩된 카테터들이 고려된다. 대표적인 카테터들은 사용 후에 버려질 수 있는 일회용 카테터들일 수 있다. 대안적으로, 사전 로딩된 카테터들은 재충전 가능하고 이러한 카테터들을 재충전할 적당한 양들의 효소들을 가지는 키트들로 주어질 수 있다.
본 발명은 다음의 실시예들에 의해 상기에 더하여 보다 상세하게 기술될 것이다. 그러나, 실시예들은 제한이 아닌 예시적 목적들을 위해 포함된다.
실시예 1 - 스페이서 서열들의 생산
GILT 태그들 및 스페이서들을 포함하는 리소좀 효소들은 미국 특허 공개 제20030082176호, 제20040006008호, 제20040005309호 및 제20050281805호에 기재되었다. 스페이서 펩타이드를 포함하는 알파-N-글루코사미니다제(Naglu) 융합 단백질들은 미국 특허 공개 제201120232021호에 기재된다. 리소좀 효소 및 GILT 태그를 포함하는 표적화된 치료적 융합 단백질에 사용하는 추가적인 스페이서 펩타이드들은 하기에 기술된 바와 같이 개발되었다.
스페이서들은 IGF-Ⅱ 뮤테인들 및 퓨린-저항성 IGF-Ⅱ 뮤테인들 둘 다를 연결하도록 개발될 수 있다. 대표적인 스페이서들은 다음의 아미노산 서열들을 포함한다: EFGGGGSTR(서열번호 22), GAP(서열번호 9), GGGGS(서열번호 12), GGGGA(서열번호 60), GPSGSPG(서열번호 23), GPSGSPGT(서열번호 24), GPSGSPH(서열번호 25), GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPS(서열번호 36), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPS(서열번호 71), GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPST(서열번호 26), GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSH(서열번호 27) 및 GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSH(서열번호 62).
스페이서 서열(EFGGGGSTR 스페이서(서열번호 22), GAP 스페이서(서열번호 9), GGGGS 스페이서(서열번호 12), GPSGSPG 스페이서(서열번호 23), 또는 GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPS 스페이서(서열번호 36))이 전장의 Naglu와 IGF2 8-67 R37A(서열번호들 560 내지 564) 사이에 삽입되었던, 스페이서, 전장의 Naglu(신화 펩타이드 포함) 및 IGF-Ⅱ 펩타이드를 포함하는 작제물들이 생성되었다.
추가적인 링커들은 쉘렌버거 등(Schellenberger et al., Nat Biotech 27: 1186-1190, 2009)에서 기술된 바와 같은 XTEN 방법을 기초로 하여 만들어졌다. XTEN-유사 링커들은 다른 링커들과 비교해서 생성된 융합 단백질을 위해 더 긴 반감기를 제공할 수 있다. 대표적인 스페이서들은 아미노산 서열들 GGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPGPS(서열번호 44), GAPGGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPGPSGAP(서열번호 45), GGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTGPS(서열번호 46) 및 GAPGGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTGPSGAP(서열번호 47)을 가진다. 스페이서는, Naglu와 IGF-2 뮤테인 사이에, 선택적으로 작제물들 상의 AscI 부위들을 통해 삽입될 수 있다.
단백질 발현은 특정한 아미노산을 인코딩하는 데 사용되는 DNA 코돈과 연관되어 왔고, 예컨대, 아미노산을 위한 코돈을 변화시키는 것은 단백질의 아미노산 서열을 변화하지 않고도 단백질의 발현을 증가시킬 수 있다(Trinh et al, Mol. Immunol 40:717-722, 2004). 펩타이드를 인코딩하는 코돈을 변경하는 것은 재조합 융합 단백질 생산의 증가된 수준들을 유도하였다. 이러한 기법을 사용하여, GGGGSGGGGSGGGGS(서열번호 56), GAPGGGGSGGGGSGGGGSGAP(서열번호 57), GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(서열번호 58) 및 GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGAP(서열번호 59)와 같은 추가적인 스페이서 서열들이 리소좀 효소를 가진 치료적 융합 단백질에서 사용을 위해 개발되었다. 추가적인 스페이스 서열들은 GGGGAGGGGAGGGGA(서열번호 79), GAPGGGGAGGGGAGGGGAGAP(서열번호 80), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGA(서열번호 81) 및 GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGAP(서열번호 82)이다. 이들 스페이서들의 임의의 하나는, Naglu 및 IGF-Ⅱ 뮤테인 사이에, 선택적으로 작제물들 상의 AscI 부위들을 통해 삽입된다.
리지드성(rigidity)에 기여하도록 복수의 프롤린들을 포함하는 대표적인 리지드 링커(rigid linker)는 다음의 서열 GGGSPAPTPTPAPTPAPTPAGGGPS(서열번호 48), GAPGGGSPAPTPTPAPTPAPTPAGGGPSGAP(서열번호 49), GGGSPAPAPTPAPAPTPAPAGGGPS(서열번호 50), 또는 GAPGGGSPAPAPTPAPAPTPAPAGGGPSGAP(서열번호 51)를 가지는 한편, 대표적인 나선형 링커는 다음의 서열 GGGSAEAAAKEAAAKEAAAKAGGPS(서열번호 52), GAPGGGSAEAAAKEAAAKEAAAKAGGPSGAP(서열번호 53), GGGSPAEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKAPSGGG(서열번호 54) 또는 GAPGGGSPAEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKAPSGGGGAP(서열번호 55)를 가진다. 이들 스페이서들의 임의의 하나는, Naglu 및 IGF-Ⅱ 뮤테인 사이에, 선택적으로 작제물들 상의 AscI 부위들을 통해 삽입된다.
추가적인 스페이서들은 DNA 2.0(캘리포니아주의 멘로파크시에 소재)에 의해 개발된 기술을 사용하는 코돈 최적화를 이용하여 생성될 수 있다. 고려된 스페이서들은 GGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPS(서열번호 32),GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPSGAP(서열번호 33),GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGPS(서열번호 28), GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGPSGAP(서열번호 29), GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPS(서열번호 30), GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGAP(서열번호 31), GGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPS(서열번호 34), GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPSGAP(서열번호 35), GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPS(서열번호 36), GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGAP(서열번호 37), GGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGPS(서열번호 38), GAPGGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGPSGAP(서열번호 39), GGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGGSAAAASGGGPS(서열번호 40), GAPGGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGGSAAAASGGGPSGAP(서열번호 41), GGGGSGGGGSAAAASGGGPSGGGGSAAAASGGGPSGGGGSAAAASGGGPS(서열번호 42), GAPGGGGSGGGGSAAAASGGGPSGGGGSAAAASGGGPSGGGGSAAAASGGGPSGAP(서열번호 43), GGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPS(서열번호 67), GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPSGAP(서열번호 68), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGPS(서열번호 63), GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGPSGAP(서열번호 64), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPS(서열번호 65), GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGAP(서열번호 66), GGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPS(서열번호 69), GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPSGAP(서열번호 70), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPS(서열번호 71), GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGAP(서열번호 72), GGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGPS(서열번호 73), GAPGGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGPSGAP(서열번호 74), GGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGGAAAAASGGGPS(서열번호 75), GAPGGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGGAAAAASGGGPSGAP(서열번호 76), GGGGAGGGGAAAAASGGGPSGGGGAAAAASGGGPSGGGGAAAAASGGGPS(서열번호 77), GAPGGGGAGGGGAAAAASGGGPSGGGGAAAAASGGGPSGGGGAAAAASGGGPSGAP(서열번호 78), GGGGPAPGPGPAPGPAPGPAGGGPS(서열번호 87), GAPGGGGPAPGPGPAPGPAPGPAGGGPGGAP(서열번호 88), GGGGPAPAPGPAPAPGPAPAGGGPS(서열번호 89) 및 GAPGGGGPAPAPGPAPAPGPAPAGGGPGGAP(서열번호 90)을 포함한다. 이들 스페이서들의 임의의 하나는, Naglu와 IGF-Ⅱ 뮤테인 사이에, 선택적으로 작제물들 상의 AscI 부위들을 통해 삽입된다.
소정의 구현예들에서, BM-40 세포외 기질 단백질 신호 펩타이드 서열(Nischt et al., Eur J. Biochem 200: 529-536, 1991)이 사용된 경우라면, 작제물에서 Naglu는 그 자체 신호 펩타이드 서열을 포함하지 않는다. 스페이서는 Naglu 서열과 IGF-Ⅱ 뮤테인 서열(예컨대, IGF2 8-67 R37A) 사이에 삽입된다. 대표적인 BM-40 신호 펩타이드 서열은 MRAWIFFLLCLAGRALA(서열번호 8)이다. GAP 펩타이드는 AscI 클로닝 부위의 클로닝 및 첨가를 용이하게 하도록 스페이서로 첨가될 수 있다. 소정의 구현예들에서, 미경험 Naglu 신호 펩타이드 서열(Weber et al., Hum Mol Genet. 5: 771-777, 1996)이 사용되는 경우라면, Naglu는 전장의 Naglu이고 스페이서는 전장의 Naglu와 IGF-Ⅱ 뮤테인 서열(예컨대, IGF2 8-67 R37A) 사이에 삽입된다. GAP 펩타이드는 AscI 클로닝 부위의 클로닝 및 첨가를 용이하게 하도록 스페이서로 첨가될 수 있다.
대표적인 작제물들에서, 인간 Naglu는 DNA 2.0 기술을 사용하여 "코돈 최적화"되었다. Naglu는 인간 Naglu의 1번 내지 743번 아미노산들 또는 24번 내지 743번 아미노산들을 포함하는 것으로 고려된다. 대표적인 작제물에서, 스페이서는 선택적으로 GAP 스페이서(클로닝에 사용되는 AscI 제한효소 부위) 또는 임의의 다음의 서열들: EFGGGGSTR(서열번호 22), GAP(서열번호 9), GGGGS(서열번호 12), GPSGSPG(서열번호 23), GPSGSPGT(서열번호 24), GPSGSPGH(서열번호 25), GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPST(서열번호 26), GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSH(서열번호 27), GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGPS(서열번호 28), GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGPSGAP(서열번호 29), GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPS(서열번호 30), GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGAP(서열번호 31), GGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPS(서열번호 32), GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPSGAP(서열번호 33), GGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPS(서열번호 34), GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPSGAP(서열번호 35), GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPS(서열번호 36), GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGAP(서열번호 37), GGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGPS(서열번호 38), GAPGGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGPSGAP(서열번호 39), GGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGGSAAAASGGGPS(서열번호 40), GAPGGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGGSAAAASGGGPSGAP(서열번호 41), GGGGSGGGGSAAAASGGGPSGGGGSAAAASGGGPSGGGGSAAAASGGGPS(서열번호 42), GAPGGGGSGGGGSAAAASGGGPSGGGGSAAAASGGGPSGGGGSAAAASGGGPSGAP(서열번호 43), GGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPGPS(서열번호 44), GAPGGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPGPSGAP(서열번호 45), GGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTGPS(서열번호 46), GAPGGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTGPSGAP(서열번호 47), GGGSPAPTPTPAPTPAPTPAGGGPS(서열번호 48), GAPGGGSPAPTPTPAPTPAPTPAGGGPSGAP(서열번호 49), GGGSPAPAPTPAPAPTPAPAGGGPS(서열번호 50), GAPGGGSPAPAPTPAPAPTPAPAGGGPSGAP(서열번호 51), GGGSAEAAAKEAAAKEAAAKAGGPS(서열번호 52), GAPGGGSAEAAAKEAAAKEAAAKAGGPSGAP(서열번호 53), GGGSPAEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKAPSGGG(서열번호 54), GAPGGGSPAEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKAPSGGGGAP(서열번호 55), GGGGSGGGGSGGGGS(서열번호 56), GAPGGGGSGGGGSGGGGSGAP(서열번호 57), GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(서열번호 58), GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGAP(서열번호 59), GGGGA(서열번호 60), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPST(서열번호 61), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSH(서열번호 62), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGPS(서열번호 63), GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGPSGAP(서열번호 64), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPS(서열번호 65), GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGAP(서열번호 66), GGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPS(서열번호 67), GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPSGAP(서열번호 68), GGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPS(서열번호 69), GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPSGAP(서열번호 70), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPS(서열번호 71), GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGAP(서열번호 72), GGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGPS(서열번호 73), GAPGGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGPSGAP(서열번호 74), GGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGGAAAAASGGGPS(서열번호 75), GAPGGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGGAAAAASGGGPSGAP(서열번호 76), GGGGAGGGGAAAAASGGGPSGGGGAAAAASGGGPSGGGGAAAAASGGGPS(서열번호 77), GAPGGGGAGGGGAAAAASGGGPSGGGGAAAAASGGGPSGGGGAAAAASGGGPSGAP(서열번호 78), GGGGAGGGGAGGGGA(서열번호 79), GAPGGGGAGGGGAGGGGAGAP(서열번호 80), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGA(서열번호 81), GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGAP(서열번호 82), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPS[또는 (GGGGA)8GGGPS](서열번호 83), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSH[또는 (GGGGA)8GGGPSH](서열번호 84), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPS[또는 (GGGGA)9GGGPS](서열번호 85), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSH[또는 (GGGGA)9GGGPSH](서열번호 86), GGGGPAPGPGPAPGPAPGPAGGGPS(서열번호 87), GAPGGGGPAPGPGPAPGPAPGPAGGGPGGAP(서열번호 88), GGGGPAPAPGPAPAPGPAPAGGGPS(서열번호 89) 및 GAPGGGGPAPAPGPAPAPGPAPAGGGPGGAP(서열번호 90)를 포함한다. 상기 스페이서들은 선택적으로 DNA 2.0 기술을 사용하여 "코돈 최적화"된다.
본 명세서에서 기술된, 선택적으로 DNA 2.0 기술을 사용하여 "코돈 최적화"된 임의의 IGF-Ⅱ뮤테인들은 본 발명의 작제물들에서 유용하다. 대표적인 작제물들에서, IGF-Ⅱ뮤테인은 퓨린-저항성 IGF-Ⅱ뮤테인, IGF2 Δ8-67 R37A이다.
실시예 2 - 작제물들의 발현 및 정제
상기 스페이서들, Naglu 효소 및 IGF-Ⅱ 표적화 펩타이드를 포함하는 작제물들이 만들어지고 재조합으로 발현된다. 소정의 구현예들에서, 작제물들은 신호 펩타이드를 포함한다. 대표적인 신호 펩타이드는 예를 들면, 제한되는 것은 아니지만 전장의 Naglu의 아미노산들 1번 내지 23번을 포함하는 Naglu 신호 펩타이드(Weber et al., Hum Mol Genet 5: 771-777, 1996) 또는 BM-40 세포외 기질 단백질로부터 유래된 신호 펩타이드(Nischt et al., Eur J Biochem 200: 529-536, 1991)를 포함한다.
Naglu 서열, IGF-Ⅱ 뮤테인 및 스페이서 펩타이드를 인코딩하는 DNA는 pEE 및 pXC GS 발현 벡터들(Lonza Biologics, Berkshire, UK) 및 pC3B(BioMarin, 자체 작제) 발현 벡터와 같은 적당한 발현 벡터 내로 삽입된다. AscI 제한효소 부위(ggcgcgcc(서열번호 570))는 본 명세서에서 기술된 치료적 융합 단백질들을 클로닝에서 조력하도록 벡터 내로 삽입될 수 있다.
대표적인 작제물은 신호 펩타이드, 스페이서 펩타이드(도 3), 그리고 8번 내지 67번 잔기들을 포함하고 잔기 Arg 37번에서 퓨린의 IGF-Ⅱ 펩타이드에 대한 저항성을 부여하는 Ala 아미노산 치환을 가지는 IGF-Ⅱ 펩타이드 R37A(도 1 및 도 2)를 포함하는, 전장의 Naglu 서열(도 1 및 도 2)을 포함한다.
Naglu 및 IGF-Ⅱ 펩타이드를 연결하는, 실시예 1에서 기술된 다양한 링커 또는 스페이서 서열들은 처음에 일시적 발현 시스템을 사용하여 평가되었다. GILT-태그화 Naglu 플라스미드(pXC17.4, 론자사)는 현탁액 CHOK1SV GS KO 세포들(론자사) 내로 형질주입된다. 15 μg의 플라스미드 DNA가 전기천공법을 사용하여 106개 세포들 내로 형질주입된다. 배지는 형질주입 후 24시간에 완전하게 교환된다. 형질주입된 세포들은 선별 없이 1.5 × 106개 세포들/mL로 진탕 플라스크들에 접종된다. 세포 성장, 생존도, 역가 및 특이적 생산도가 세포들이 30℃에서 14일까지 동안 성장되면서 결정된다.
GILT-태그화 Naglu 플라스미드들은 현탁액 CHOK1 SV 세포들(론자사)내로 형질주입된다. 세포들은 6mM 글루타민을 넣은 CDCHO 배지(인비트로겐사)에서 진탕 플라스크들로 37℃ 및 8% CO2에서 성장된다. 30 μg의 선형화된 플라스미드 DNA가 1 × 107개 세포들에서 전기천공법을 사용하여 세포들 내로 형질주입된다. 세포들은 형질주입 이후 48시간에 CDCHO 배지 + 40 μM MSX에서 5,000개 세포들/웰로 도말된다. 플레이트들은 콜론 성장을 확인하기 위하여 대략 4 내지 6주 동안 37℃ 및 8% CO2에서 배양된다. 다음에, 콜로니들은 Naglu에 대해 4MU 활성 검정법에 의해 선별되고(실시예 3 참조) 최고로 발현하는 콜로니들은 CDCHO 배지 + 40 μM MSX를 넣은 24웰 플레이트로 옮겨지고, 이어서 최고로 발현하는 클론들을 6월 플레이트들로 계속하여 계대 배양한 다음, 플라스크들을 진탕하고 최고로 발현하는 클론들이 GILT-태그화 Naglu 융합 단백질들을 생산하는 것을 확인한다.
정제는 표준 단백질 정제 기법들을 사용하여 수행된다. 예를 들면, 대표적인 정제 방법에서 상기에서 기술된 바와 같이 포유동물 세포 배양 상청액의 시작 물질은 -80℃에서 보관으로부터 해동된다. 물질은 최종 농도 1M을 도달하도록 NaCl로 조정되고, 이후 0.2 μm 무균의 여과가 이어진다.
여과된 물질은 부틸 소수성 상호작용 칼럼 위에 로딩되고, 부틸 로딩 완충액(20mM 트리스, 1M NaCl, pH 7.5)으로 사전 평형화된다. 결합된 물질들은 부틸 용출 완충액(20mM 트리스, pH 7.5)을 사용하여 10개 칼럼 부피를 거치는 선형 구배로 용출된다. 용출 피크들로부터 얻은 시료들은 풀로 만들어지고, 완충액은 20mM 트리스, pH 7.5 내에서 교환되고 Q 음이온 교환 칼럼 위에 로딩된다. 다음으로 결합된 단백질들은 Q 용출 완충액(20mM 트리스, 1M NaCl, pH 7.5)을 사용한 선형 구배(10개 칼럼 부피)로 용출된다. 다음으로 정제된 시료들은 원심분리 회전 농축기들을 사용하여 완충액 교환되고 보관을 위해 무균-여과된다.
대표적인 Naglu 단백질의 작제, 발현, 생산, 정제 및 제형화: Naglu-(GGGGS) 4 GGGPS-IGF-Ⅱ(서열번호 568). Naglu-(GGGGS)4GGGPS-IGF-Ⅱ(서열번호 568)를 인코딩하는 DNA 작제물은 표준 재조합 DNA 방법들에 의해 생성되었다. Naglu는 전장의 인간 Naglu의 1번 내지 743번 아미노산들에 해당하고 IGF-Ⅱ는 퓨린-저항성을 부여하는 R37A 아미노산 치환을 가진 성숙한 인간 IGF-Ⅱ의 8번 내지 67번 아미노산들을 포함하는 IGF-Ⅱ 뮤테인에 해당한다. CHOK1SV 세포들은 DNA 작제물로 형질주입되었고, 안정한 GILT-태그화 Naglu-IGF-Ⅱ 융합 단백질을 발현하는 클론은 상기 기술된 바와 같이 분리되었다.
Naglu-(GGGGS)4GGGPS-IGF-Ⅱ(서열번호 568)를 발현하는 세포들은 생물반응기에서 배양되었고, Naglu 융합 단백질은 다음과 같이 배양 배지로부터 정제되었다. 수확물은 1M NaCl로 염-조정되었고, 다음으로 부틸 세파로스 4 FF 칼럼(Butyl Sepharose 4 FF column) 위에 로딩되었다. Naglu 융합 단백질은 부틸 세파로스 4 FF 칼럼으로부터 염-용출되었고, 수집되었고 투석된 다음, 헤파린 세파로스 6FF 칼럼 상에 로딩되었다. Naglu 융합 단백질은 유동-통과 분획에서 수집되었고, Q 세파로스 HP 컬럼 상에 로딩되었다. Naglu 융합 단백질은 Q 세파로스 HP 칼럼으로부터 염-용출되었고, 농축된 다음 제조용 세파크릴(Sephacryl) S300 크기 배제 크로마토그래피에 의해 연마되었다.
이러한 정제 절차를 사용하여, 매우 정제되고 효소적으로 활성을 가진 Naglu 융합 단백질 Naglu-(GGGGS)4GGGPS-IGF-Ⅱ(서열번호 568)가 생산되었다. 정제된 Naglu 융합 단백질은 인공 CSF(1mM 소듐 포스페이트, 148mM 염화나트륨, 3mM 염화칼륨, 0.8mM 염화마그네슘, 1.4mM 염화칼슘, pH 7.2)에서 20 mg/mL로 제형화되었다.
대표적인 Naglu 융합 단백질들의 작제, 발현, 생산, 정제 및 제형화. Naglu-(GGGGA)4GGGPS-IGF-Ⅱ(서열번호 569), Naglu-리지드-IGF-Ⅱ(서열번호 566), Naglu-나선형-IGF-Ⅱ(서열번호 567), 및 Naglu-XTEN-IGF-Ⅱ(서열번호 565)를 인코딩하는 DNA 작제물들은 표준 재조합 DNA 방법들에 의해 생성되었다. Naglu는 전장의 인간 Naglu의 1번 내지 743번 아미노산들에 해당하고 IGF-Ⅱ는 퓨린-저항성을 부여하는 R37A 아미노산 치환을 가진 성숙한 인간 IGF-Ⅱ의 8번 내지 67번 아미노산들을 포함하는 IGF-Ⅱ 뮤테인에 해당한다. 대표적인 리지드, 나선형 및 XTEN 링커들이 실시예 1에 기술된다. CHOK1SV 세포들이 DNA 작제물들로 형질주입되고, 안정한 GILT-태그화 Naglu-IGF-Ⅱ 융합 단백질을 발현하는 클론들이 상기에 기술된 바와 같이 분리되었다.
Naglu-IGF-Ⅱ 융합 단백질들을 발현하는 세포들이 생물반응기에서 성장되었다. 전형적인 유가식 생산(fed-batch production)의 진행(10일 내지 16일)에서, 다양한 링커를 가진 Naglu-IGF-Ⅱ 작제물들 모두는 80% 초과의 높은 세포 생존도로 30 mg/L 초과의 역가들에 도달하였다.
Naglu 융합 단백질들은 상기에 기술된 바와 같이 배양 배지로부터 정제되었다. 이러한 정제 절차를 사용하여, Naglu-리지드-IGF-Ⅱ(서열번호 566), Naglu-나선형-IGF-Ⅱ(서열번호 567), Naglu-XTEN-IGF-Ⅱ(서열번호 565) 및 Naglu-(GGGGA)4GGGPS-IGF-Ⅱ(서열번호 569)와 같은 효소적으로 활성을 가진 태그화된 Naglu 및 Naglu-IGF-Ⅱ 융합 단백질들이 역상 HPLC에 의해 결정된 바 ~99% 순도로 정제되었다. 정제된 미태그화된 Naglu 융합 단백질은 인공 CSF(1mM 소듐 포스페이트, 148mM 염화나트륨, 3mM 염화칼륨, 0.8mM 염화마그네슘, 1.4mM 염화칼슘, pH 7.2)에서 20 mg/mL로 제형화되었다.
본 명세서에서 기술된 바와 같이, 서로 다른 스페이서 펩타이드를 포함하는 융합 단백질들과 비교하여 활성을 가진 단백질의 더 높은 수준의 재조합 발현 및/또는 증가된 효소적 활성을 보이는 융합 단백질들은 하기에 더 기술된 바와 같이 활성 검정법들, 결합 검정법들, 흡수 점정법들 및 시험관내 활성 검정법들과 같은 심화 실험법에 사용될 수 있다.
실시예 3 - 활성 검정법들
Naglu 융합 단백질들의 효소적 활성을 결정하기 위하여, 시험관내 Naglu 검정법이 형광 표지된 합성 기질을 사용하여 수행되었다.
검정법에 사용된 재료들은 다음을 포함한다: 4-메틸엄벨리페릴-N-아세틸-α-D-글루코사미나이드(4MU-NaGlu 기질)(캘바이오켐사(Calbiochem), 카탈로그 번호 474500)는 검정 완충액(0.2M 소듐 아세테이트, 1 mg/mL BSA의 존재 또는 부재, 및 0.005% 트윈 20, pH 4.3 내지 4.8)에 녹인 10% DMSO에서 최종 20mM 농도로 제조되고 -80℃에서 보관된다. 4-메틸엄벨리페론(4-MU 표준)(시그마사, 카탈로그 번호 M1381)의 스톡 용액은 DMSO에서 10mM로 제조되고 작은 분량들로 -20℃에서 보관된다. rhNaglu-His6 대조군(0.5 mg/ml, R＆D 시스템사, Cat #7096-GH)은 25mM 트리스, 125mM NaCl, 0.001% 트윈 20, pH 7.5에서 10 μg/mL로 희석되고 작은 분량들로 -80℃에서 보관된다.
투명한 96웰 희석 플레이트(Granger) 상에서, 희석 완충액(1× PBS, 1 mg/ml BSA 존재 또는 부재, 0.005% 트윈 20, pH 7.4)에서 표준들의 2배 일련의 희석물이 하나의 공시험(blank)을 더하여 200μM부터 1.563μM까지 사용된다. 투명한 희석 플레이트 상에서, 시료들이 표준 곡선에 속하는 점을 확인하도록 여러 희석물로 (희석 완충액에서) 제조된다.
10 μL의 표준품(200μM 내지 1.563μM), 대조군 및 작동 시료들이 검은색 미-처리된 폴리스티렌 96웰 플레이트(코스타사, 카탈로그 번호 3915)로 옮겨진다. 75 μL의 기질(2mM)이 각각의 웰에 첨가되고, 이어서 37℃에서 30분 동안 배양이 시행된다. 다음으로 반응은 200 μL의 정지 완충액(0.5M 글리신/NaOH, pH 10.7)의 첨가에 의해 정지된다. 플레이트들은 96웰 형광 플레이트 해독기 위의 455 컷오프로 Ex355 Em460 위에서 해독된다.
이러한 검정법을 사용하여, Naglu-(GGGGS)4GGGPS-IGF-Ⅱ(서열번호 568), Naglu-(GGGGA)4GGGPS-IGF-Ⅱ(서열번호 569), Naglu-리지드-IGF-Ⅱ(서열번호 566), Naglu-나선형-IGF-Ⅱ(서열번호 567) 및 Naglu-XTEN-IGF-Ⅱ(서열번호 565)를 포함하는 대표적인 Naglu 융합 단백질들은 ~ 175,000부터 ~ 220,000 nmol/시간/mg까지의 범위를 가지는 합성 4MU-Naglu 기질로의 특이적 활성으로 시험관내 효소적 활성을 가지는 것으로 관찰되었다. Naglu 융합 단백질들의 효소적 활성은 미태그된 Naglu 단백질(~190,000 nmol/시간/mg)의 효소적 활성과 비슷하다. 대표적인 Naglu 융합 단백질들에 대한 효소적 활성 데이터는 표 2에서 제공된다. 표 2는 Naglu 융합 단백질들의 활성을 나타낸다.
Figure 112021064159754-pat00001
1미태그된 Naglu 및 Naglu 융합 단백질들은 실시예 2에서 기술된 바와 같이 작제되고, 발현되고, 정제되었고; 대표적인 리지드, 나선형 및 XTEN 링커들은 실시예 1에서 기술된다.
2서열번호: 실시예들 3 내지 5에서 테스트된 Naglu 융합 단백질에서 링커들의 서열번호.
3Naglu 단백질들의 특이적 활성(nmol/시간/mg)은 실시예 3에서 기술된 바와 같이 측정되었다.
4IGF2R 경쟁적 결합을 위한 Naglu 단백질들의 IC50은 실시예 4에서 기술된 바와 같이 측정되었다.
5MPS-ⅢB 섬유모세포들에서의 Naglu 단백질들의 K흡수 및 반감기(t1/2)는 실시예 5에서 기술된 바와 같이 측정되었다.
실시예 4 - 결합 검정법들
Naglu 융합 단백질들의 IGF-I, IGF-Ⅱ 및 인슐린 수용체들과 결합을 결정하는 결합 검정법들은 일반적으로 미국 특허 공개 제20120213762호에 기술된 바와 같이 수행된다. 간략하게, 융합 단백질 작제물들은 바이오틴화 인슐린 결합 대비 플레이트-결합된 인슐린의 경쟁을 측정하는 검정법에서 인슐린 수용체에 대한 결합 친화도에 관하여 테스트된다. 인슐린 수용체 결합 검정법은 인슐린, IGF-Ⅱ 및 융합 단백질을 인슐린 수용체(인슐린-R)와 결합하는 바이오틴화-인슐린을 경쟁시켜서 시행된다.
상세하게, 흰색 리액티-바인드 플레이트들은 1 ug/웰/100 uLl(38.4nM)의 농도에서 인슐린-R로 코팅된다. 코팅된 플레이트들은 상온에서 밤샘 배양된 다음 세척 완충액(300 μL/웰)으로 3번 세척되었다. 다음으로 플레이트들은 차단 완충액(300 μL/웰)으로 1시간 동안 차단된다. 세척 단계들이 반복되고 플레이트들에서 미량의 용액도 버려진다. 바이오틴화-인슐린은 20 nM로 서로 다른 농도들의 인슐린, IGF-Ⅱ 또는 융합 단백질과 일련의 희석에 의해 혼합된다. 20 nM 인슐린-바이오틴에서 희석된 인슐린, IGF-Ⅱ 또는 Naglu 융합 단백질의 100 μL가 코팅된 플레이트들 내로 첨가되고 플레이트들은 상온에서 2시간 동안 배양된다. 다음으로 플레이트들은 세척 완충액으로 3번 세척된다. 100 μL의 스트렙타비딘-HRP 작동 용액(10 mL 차단 완충액에 넣은 50 μL 스트렙타비딘-HRP)이 플레이트들 내로 첨가되고 플레이트들은 상온에서 30분 동안 배양된다. 엘라이자-피코(Elisa-Pico) 화학발광성 지질을 포함하는 100μL의 엘라이자-피코 작동 용액이 첨가되고 화학발광이 425 nm에서 측정된다.
IGF2R 경쟁적 결합 검정법
IGF-Ⅱ 수용체와 결합하는 Naglu 융합 단백질의 능력을 측정하기 위하여, 경쟁적 결합 검정법이 수행된다. IGF-Ⅱ 결합에 관여하는 IGFⅡR 단편(단백질 1288로 명명된 도메인들 10번 내지 13번)은 96웰 플레이트들 위에서 코팅된다. 바이오틴화 IGF-Ⅱ는 증가하는 양들의 경쟁인자들: 대조군 IGF-Ⅱ(비-바이오틴화), 또는 융합 단백질 시료(IGF-Ⅱ-유래 GILT 에피토프 태그 포함) 둘 중 하나의 존재 시 수용체와 배양된다. 수용체-결합된 바이오틴화된 IGF-Ⅱ는 호스래디쉬 과산화효소(HRP)와 접합된 스트렙타비딘 및 화학발광성 HRP 기질로 검출된다. 바이오틴화 IGF-Ⅱ의 IGFⅡR과의 결합을 억제하는 융합 단백질의 능력은 억제 곡선들로부터 계산되고 IC50값(50% 결합 억제를 달성하는 데 요구되는 농도)으로서 보고된다.
검정법을 위해, IGFⅡR은 흰색 리액티-바인드 플레이트(피어스사(Pierce), 카탈로그 번호 437111)에서 코팅 완충액으로 100μL 부피의 0.5 μg/웰로 코팅된다(69.6 nM/웰). 플레이트는 밀봉되고 상온에서 밤샘 배양된다. 다음으로 플레이트는 세척 완충액으로 3번 세척되고 차단 완충액으로 차단된 다음 세척 완충액(300 μL/웰)으로 다시 3번 세척된다.
다음 순서로, 8nM IGF-Ⅱ-바이오틴이 서로 다른 농도들의 경쟁인자들, IGF-Ⅱ(비-바이오틴화), 기준 단백질 또는 Naglu 융합 단백질 시료들과 혼합되고 IGF-ⅡR-코팅된 플레이트 내로 2배 일련의 희석들로 첨가된다.
플레이트는 상온에서 2시간 동안 배양되고, 이어서 세척 완충액으로 3번 세척된다. 스트렙타비딘-HRP이 차단 완충액(1:200 희석)으로 준비되고 100 μL/웰이 플레이트로 첨가된다. IGF-Ⅱ-바이오틴 결합 활성은 피코-엘라이자 시약들을 사용하여 스트렙타비딘-HRP를 통해 검출된다. 간략하게, 준비된 피코-엘라이자 작동 용액은 웰 당 첨가(100 μL/웰)되고, 상온에서 5분 동안 가만히 흔들면서 배양되고, 다음으로 425 nm에서 화학발광이 측정된다.
시료들의 IC50는 각각의 억제제 농도에 대하여 결합된 IGF-Ⅱ-바이오틴 백분율을 사용하여 계산된다.
이러한 경쟁적 IGFⅡR 결합 검정법을 사용하여, Naglu-(GGGGS)4GGGPS-IGF-Ⅱ(서열번호 568), Naglu-(GGGGA)4GGGPS-IGF-Ⅱ(서열번호 569), Naglu-리지드-IGF-Ⅱ(서열번호 566), Naglu-나선형-IGF-Ⅱ(서열번호 567) 및 Naglu-XTEN-IGF-Ⅱ(서열번호 565)를 포함하는 대표적인 Naglu 융합 단백질들은 0.23 내지 0.36nM의 IC50값을 가지는 것으로 관찰되었다. 미태그된 Naglu 단백질은 이러한 검정법에서 검출가능한 결합을 전혀 가지지 않는다. 대표적인 Naglu 융합 단백질들의 IGF2R 경쟁적 결합 데이터는 표 1에서 제공된다.
실시예 5 - 흡수 검정법들
수용체-매개된 세포내입을 통해 세포들에 진입하는 리소좀 축적 질환 효소의 능력을 측정하기 위하여, 래트 근육모세포 L6 세포들 또는 인간 MPS ⅢB 섬유모세포들에서 CI-MPR 수용체를 사용하여 효소 흡수를 측정하는 흡수 검정법이 수행된다. 만노스-6-포스페이트(M6P) 및 IGF-Ⅱ가 CI-MPR 수용체와 결합하는 부위를 결정하는 억제제들로서 사용된다. 데이터는 효소 흡수에 대한 포화 곡선을 생성하고 이 과정의 역학적 매개변수 K흡수를 결정하도록 수집된다.
흡수 검정법 이전에(24시간), L6 세포들(L6 래트 근육모세포들, ATCC# CRL-1458) 또는 인간 MPS ⅢB 섬유모세포들은 24웰 플레이트(VWR #62406-183)에서 웰 당 1 × 105개 세포들의 밀도로 도말되고 웰 당 0.5 mL가 접종되었다. 검정일의 아침에, 효소가 흡수 배지(1L DMEM, 1.5g 소듐 바이카보네이트. 0.5 g 소혈청 알부민, 20 mL의 L-글루타민(200mM(집코사(Gibco) #25030-081)), 20 mL의 1M HEPES(집코사 #1563080))(최종 20mM), pH 7.2)와 조직 배양 후드에서 혼합된다. 효소량들은 2 내지 500nM의 범위를 가질 수 있다. 흡수 배지 + 효소의 최종 부피는 웰 당 0.5 mL이다. M6P(5mM 최종 농도) 및/또는 IGF-Ⅱ(2.4μM 또는 18 μg/mL 최종 농도)가 적당한 시료들에 첨가된다. 흡수 억제를 위해, 흡수 배지 mL 당 18 μL IGF-Ⅱ 스톡(1 mg/mL, 133.9 μM)이 첨가된다.
성장 배지는 세포들로부터 흡인되고 흡수 완충액에 넣은 0.450 mL의 효소가 각각의 웰에 첨가된다. 시간을 확인하고 세포들을 배양기로 18시간 동안 복귀시킨다. 플레이트는 배양기로부터 제거되고, 흡수 완충액은 세포들로부터 흡인되어 버려진다. 플레이트들은 0.5 mL의 둘베코 PBS의 첨가에 의해 4번 세척되고 흡인된다. 200 μL의 CelLytic M 용해 완충액(시그마사)가 플레이트들로 첨가되고 상온에서 20 내지 30분 동안 진탕된다. 용출물은 세포들로부터 제거되고 검정이 준비될 때까지 테입으로 가려진 투명한 96-웰 플레이트(VWR)에서 -80℃에서 보관된다.
효소 검정법을 위해, 5 μL의 각각의 용출물은 검은색 96웰 플레이트(VWR)(상기 참조)에 있는 15 μL의 효소 반응 믹스(예컨대, Naglu + 4MU 검정법들)에 두 벌로 첨가되고, 각각의 용출물에서 효소/단위/mL/시간이 결정된다.
용출물 단백질 검정법을 위해, 10 μL의 각각의 용출물은 제조사의 지침들에 따라 피어스사 BCA 단백질 검정 키트를 사용하여 두 벌로 검정된다. 흡광도를 측정하도록, 흡광도가 플레이트 해독기(BMG FluoStar 옵티마 플레이트 해독기)로 562 nm에서 해독되고 μg/mL 농도가 결정된다.
각각의 효소 부하를 위해, 흡수는 효소 활성/mg 용출물의 단위들이다. 흡수를 결정하기 위하여, 효소 단위/mL는 단백질 μg/mL로 나누고 1,000을 곱한다(공시험 웰들로부터의 흡수가 차감됨). 억제제들의 존재 유무에 따른 검정법들의 결과들은 수용체 흡수 특이도를 결정하도록 비교된다.
포화 곡선들을 위해, 0.2 내지 100nM의 범위의 10개 효소 부하 농도들이 상기에 기술된 검정법들을 사용하는 포화 곡선을 생성하는 데 사용된다.
이러한 검정법을 사용하여, 대표적인 Naglu 융합 단백질, Naglu-(GGGGS)4GGGPS-IGF-Ⅱ(서열번호 568)가 MPS-ⅢB 섬유모세포들에서 7 내지 9 nM의 K흡수를 가지는 것으로 관찰되었다.
대안적으로, 흡수 검정법 이전에(24시간), L6 세포들 또는 인간 MPS ⅢB 섬유모세포들은 24-웰 플레이트들에서 웰 당 0.5 mL 당 1 × 105개 세포들의 밀도로 도말되었다. 1.6 내지 50nM의 효소 시료들은 흡수 배지: 1 L DMEM, 1.5g 소듐 바이카보네이트. 0.5 g 소혈청 알부민, 20 mL의 200 mL L-글루타민, 20 mL의 1 M HEPES, pH 7.2에서 준비된다. 흡수 억제를 위해, M6P(최종 농도 5.0mM까지) 및/또는 IGF-Ⅱ(최종 농도 1.0μM까지)가 적당한 시료들로 첨가된다.
성장 배지는 세포들로부터 흡인되고 흡수 완충액에 넣은 효소 제조물의 웰 당 0.5 mL로 대체된다. 4시간 배양 이후에, 플레이트들은 0.5 mL의 둘베코 PBS로 2번 세척된다. 100 μL의 M-PER 용해 완충액(피어스사)이 플레이트들에 첨가되고 상온에서 10분 동안 진탕된다. 용출물은 검정이 준비될 때까지 -80℃에서 보관된다.
효소 검정법을 위해, 10 μL의 각각의 용출물은 두 벌로 검은색 96웰 플레이트에 첨가된다(상기 참조).
용출물 단백질 검정법을 위해, 10μL의 각각의 용출물은 제조사의 지침들에 따라 피어스사 BCA 단백질 검정 키트를 사용하여 두 벌로 검정된다. 흡광도는 플레이트 해독기(BMG FluoStar 옵티마 플레이트 해독기)로 562 nm에서 해독되고 μg/mL 농도가 BCA를 표준으로서 사용하여 결정된다.
각각의 효소 부하를 위해, 흡수는 30분 경과 시 방출된 4-MU의 나노몰(nmole)로서 표현된다. 포화 곡선들을 위해, 1.6 내지 50nM 범위의 효소 농도가 상기에 기술된 검정법들을 사용하는 포화 곡선을 생성하는 데 사용된다.
Naglu 융합 단백질들의 세포 안정도는 ~ 8일의 기간 동안 세포내 Naglu 활성을 모니터링하여 결정되었다. 24월 플레이트(VWR #62406-183)에서 웰 당 1×105개 세포들의 밀도로 도말된 인간 MPS ⅢB 섬유모세포들은 Naglu 융합 단백질로 20nM의 최종 농도에서 4시간 동안 처리되었다. 4시간 배양 이후에, 세포들은 Naglu 융합 단백질이 없는 성장 배지로 전환되었다. 각각의 시간대(4시간, 28시간, 4일, 6일 및 8일)에 대해서, 세포들은 100 μL의 M-PER 용해 완충액(피어스사)으로 상온에서 10분 동안 용해되었고, 4-MU 표지된 기질을 사용하여 효소 활성에 대해 검정되었다. 8일 시료 기간에 걸친 Naglu 활성의 감소는 1차 역동학에 맞추어져 단백질의 세포 반감기를 가늠할 수 있다.
이러한 검정법을 사용하여, Naglu-(GGGGS)4GGGPS-IGF-Ⅱ(서열번호 568), Naglu-(GGGGA)4GGGPS-IGF-Ⅱ(서열번호 569), Naglu-리지드-IGF-Ⅱ(서열번호 566), Naglu-나선형-IGF-Ⅱ(서열번호 567) 및 Naglu-XTEN-IGF-Ⅱ(서열번호 565)를 포함하는 대표적인 Naglu 융합 단백질들은 ~ 2.3 내지 6.3nM의 K흡수값들로 MPS ⅢB 섬유모세포들 내로 내재화되는 것으로 관찰되었다. 대조적으로, 미태그화된 Naglu 단백질은 이들 실험 조건 하에 세포들에 의해 흡수되지 않았다. 또한, Naglu 융합 단백질의 관찰된 흡수는 IGF-Ⅱ에 의해 억제되었지만 M6P에 의해서는 그렇지 않았다. 흡수 이후에, 대표적인 Naglu 융합 단백질들은 세포 용출물들에서 측정된 효소적 활성(4-MU 기질)을 기초로 하여, ~ 9.5일의 추정된 반감기로 안정한 것으로 확인되었다. 대표적인 Naglu 융합 단백질들에 대한 흡수 및 반감기 데이터는 표 1에 제공된다.
실시예 6 - 생체내 Naglu 융합 단백질 활성
Naglu 융합 단백질들의 생체내 활성을 결정하기 위하여, 융합 단백질들은 Naglu 녹아웃 동물들에게 투여된다(Li et al., Proc Natl Acad Sci USA 96: 14505-510, 1999 참조). Naglu 녹아웃 동물들은 뇌, 간 및 신장에서 많은 양의 헤파란 설페이트, 베타-헥소스아미니다제 활성의 증가 및 뇌에서 리소좀-연관된 막 단백질 2(LAMP-2) 염색, 및 뇌에서 갱글리오사이드들의 증가를 나타낸다.
외인성 효소의 활성 및 생체분포는 2주 기간에 걸쳐서 재조합 인간(rh) Naglu-IGF2의 4번 ICV (뇌실내) 주사(100 μg/주사) 이후에 결정된다. 영구 삽관이 마우스에 이식되고(n = 12/gp, 시작 시 8 내지 12주령), 삽관이 뇌실에 없는 이들 마우스를 해결하도록 조정된다. 종결점 측정들은 Naglu 생체분포, GAG, 예컨대, 헤파란 설페이트의 감소, 뇌 세포들의 리소좀들에서 축적, 및 별교아세포들 및 미세교아세포들의 활성화를 포함한다. 처리된 및 대조군 그룹들 수준들에서 측정된 다양한 리소좀 또는 신경성 바이오마커들의 수준들(Ohmi et al., PLoS One 6:e27461, 2011)은, 제한되는 것은 아니지만, 리소좀-연관된 막 단백질 1(LAMP-1), LAMP-2, 글리피칸 5, Naglu-특이적 헤파란 설페이트의 비-환원 말단들(NREs), 갱글리오사이드들, 콜레스테롤, 미토콘드리아 ATP 합성효소의 소단위체 c(SCMAS), 유비퀴틴, P-GSK3 베타, 베타 아밀로이드, P-타우 (포스포릴화-타우), GFAP(별교아세포 활성화) 및 CD68(미세교아세포 활성화)을 포함한다.
생존 및 행동적 분석을 결정하는 추가적인 실험들이 rhNaglu-IGF2의 4번 ICV 주사들을 2주 동안 수여받은 마우스들을 사용하여 수행된다(n = 12/gp, 시작 시 5개월형, 100 μg/주사). 측정될 종결점은 생존 시간, 야외 활성, Naglu 생체분포, GAG, 예컨대, 헤파란 설페이트의 감소, 리소좀들에서 축적, LAMP-1, LAMP-2, 글리피칸 5, 갱글리오사이드들, 콜레스테롤, SCMAS, 유비퀴틴, P-GSK3 베타, 베타 아밀로이드, P-타우, GFAP 및 CD68과 같은 리소좀 또는 신경성 바이오마커들의 수준들을 포함한다.
naglu 유전자의 엑손 6번에서 돌연변이를 가지는 Naglu 녹아웃 마우스들(Naglu -/-)이 개발되었다(Li et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 96: 14505-10, 1999). 엑손 6번 부위는 이것이 인간들에서 많은 돌연변이의 부위이기 때문에 선택되었다. Naglu 활성은 동형접합 마우스들에서는 전혀 검출되지 않고 이형접합체들에서는 감소된 Naglu 활성이 존재한다. Naglu -/- 마우스들은 감소된 생존 시간들을 가지고(6 내지 12개월), 감소된 활성 수준들과 같은 다른 기능적 표현형들을 가질 수 있다. Naglu -/- 마우스들에게 미치는 Naglu 융합 단백질들의 효과들이 검정된다.
Naglu -/- 마우스들 (n = 8) 및 8마리 운반체 대조군 Naglu -/- 마우스들(n = 8 한배새끼 이형접합체들)이 2주 동안 4회 ICV 용량(100 μg Naglu-IGF2/용량)으로 투여된다. 2일째, 마우스들은 마취되고 좌측 뇌실은 삽관된다. 마우스들은 회복되도록 허용된다. 1일, 5일, 10일 및 14일째, 마우스들은 ICV 투약 이전에 15분 동안 마취된다(베네드릴, 5 mg/kg IP). ICV 용량이 삽관들을 통해 15분에 걸쳐서 5 μL 부피로 주입되고 마우스들은 회복되도록 허용된다. 15일째, 마우스들이 희생되고, 채혈되며 혈청은 냉동된다. 뇌들은 수확되고 IR 염색약이 삽관으로 주사되고 삽관이 촬영된다.
다음의 검정법들이 Naglu 융합 단백질들의 효과들을 결정하도록 수행된다: 체중 평가, 삽관 위치를 위한 NIR 촬영, 면역조직화학법을 사용하여 뇌에서 Naglu-IGF2, GFAP, LAMP-1 및 LAMP-2 수준들의 평가, Naglu 활성에 대한 생화학적 검정법, β-헥소스아미니다제 수준들 및 활성, 점액다당류증 ⅢB(MPS ⅢB)(국제특허출원 공개 제2010/078511A2호)에 특이적인 축적된 글리코사미노글리칸(GAG들)의 비-환원 말단들을 검출하는 SensiPro 검정법, 생화학적 검정법에 의해 측정되는 GM3 갱글리오사이드 수준들, 뿐만 아니라 내측 엔토리날 피질(medial entorrhinal cortex)에서 SCMAS, A-베타, 글리피칸 5, CD68, GFAP 및 Naglu를 위한 면역스타틴(상기 Li et al.,).
Naglu-IGF2로의 효과적인 치료는 LAMP-1, LAMP-2, GFAP, CD68, SCMAS, A-베타, 글리피칸 5, β-헥소스아미니다제, GM3 갱글리오사이드, 및 MPS-Ⅲb-특이적 GAG들의 수준들에서 감소를 가져올 것으로 예상된다.
MPS Ⅲb 마우스 모델에서 대표적인 Naglu 단백질들의 생체내 효능. Naglu-IGF-Ⅱ 융합 단백질인 Naglu-(GGGGS)4GGGPS-IGF-Ⅱ(서열번호 568) 또는 Naglu-리지드-IGF-Ⅱ(서열번호 566) 둘 중 하나의 4회 ICV 용량(100 μg/용량)이 2주 기간에 걸쳐서 Naglu -/- 마우스들(n = 8)에게 투여되었다. Naglu -/- 마우스들(n = 8) 및 8마리의 한배새끼 이형접합체들 또는 야생형 한배새끼들(n = 8)에는 대조군으로서 비히클이 단독으로 부여되었다. -5일째, 마우스들은 마취되었고, 뇌의 좌측 뇌실은 삽관되었다. 마우스들은 회복하도록 허용되었다. 1일, 5일, 10일 및 14일째, 마우스들은 흡입된 이소플루오란으로 마취되었다. 베나드릴(5 mg/kg IP)이 Naglu-IGF-Ⅱ 처치와 반응하여 임의의 잠재적인 히스타민 방출을 감소시키도록 ICV 투약 이전 15분에 각각의 마우스로 투여되었다. ICV 용량은 15 내지 20분에 걸쳐서 5 μL 부피로 이식된 삽관들을 통해 주입되었고 마우스들은 회복하도록 허용되었다. 최종 투약 이후 1일, 7일, 14일 및 28일째, 마우스들은 희생되었다. 뇌들은 수확되었고 다양한 검정법들로 배분을 위해 시상 절단으로 5개 절편들로 나누었다.
다음의 검정법들은 Naglu-IGF-Ⅱ 융합 단백질의 효과들을 결정하도록 수행되었다: 뇌에서 Naglu, LAMP-2, GFAP 및 CD68 수준들의 면역조직화학적 평가, Naglu 및 베타-헥소스아미니다제 활성의 생화학적 검정들, 전체 헤파란 설페이트 및 점액다당류증 ⅢB(MPS ⅢB)에 특이적인 헤파란 설페이트의 NRE들을 검출하는 SensiPro 검정법(Deakin et al., Glycobiology 18: 483, 2008; Lawrence et al., Nat Chem Biol. 8: 197, 2012; Lawrence et al., J Biol Chem. 283: 33674, 2008)(WO 2010/078511A2), 그리고 내측 엔토리날 피질에서 SCMAS, 베타-아밀로이드(A-베타), p-타우, P-GSK3베타, 글리피칸 5, GFAP 및 CD68(Li et al., 상기 참조)을 위한 면역형광 염색법.
최종 투약 이후 24시간에 평가한 바, Naglu-(GGGGS)4GGGPS-IFG-Ⅱ(서열번호 568) 또는 Naglu-리지드-IFG-Ⅱ(서열번호 566) 융합 단백질 둘 중 하나로의 처치는 베타-헥소스아미니다제 활성 그리고 전체 헤파란 설페이트, 헤파란 설페이트의 Naglu-특이적 NRE들, 및 LAMP-2의 수준들의 동시적인 감소와 함께, Naglu 효소 활성에서 현저한 증가를 가져왔다. Naglu 효소는 뇌 조직들에서, 피질, 해마, 치상회 및 시상뿐만 아니라 편도핵, 비강 주변 피질 및 시상하부와 같은 거리상 먼 위치들에서 쉽게 검출가능하다. CD68, SCMAS, 베타-아밀로이드(A-베타), p-타우, P-GSK3베타, 및 글리피칸 5의 수준들에서 유의한 감소들도 역시 Naglu-IFG-Ⅱ로의 처치 시 Naglu -/- 뇌들에서 관찰되었다. GFAP 염색은 마지막 투약 이후 24시간까지 변화하지 않았다. 면역조직화학법은 뇌의 많은 영역에서, LAMP-2와 공동-정착하는 뉴런들 및 교아세포들 내부에서 Naglu 효소의 존재를 보여주었다.
헤파란 설페이트, Naglu-특이적 NRE들 및 베타-헥소스아미니다제 활성의 수준들은 마지막 투약 시점 이후 7일, 14일 및 28일에 걸쳐서 계속해서 감소하였다. 28일째, 모든 분석물은 정상적인 마우스 대조군 값들에 또는 그 부근에 있었다.
등가물들
당업자들이라면 단지 일상적인 실험을 사용하여 본 명세서에서 기술된 본 발명의 특정한 구현예들에 대한 많은 등가물을 인식하거나 확인할 수 있을 것이다. 본 발명의 범주는 상기 상세한 설명에 제한되도록 의도되지 않고, 오히려 첨부된 청구항들에서 기재된 바와 같다. 본 명세서에서 사용되는 바, 용어 표현들 "하나의(a)", "하나의(an)" 및 "그(the)"는 본 명세서에서 그리고 청구항들에서 분명하게 상반되게 나타내지 않는 한 복수의 대상들을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 그룹의 하나 이상의 구성원들 간에 "또는(or)"를 포함하는 청구항들 또는 상세한 설명들은, 하나, 하나 이상, 또는 그룹 구성원들 모두가 존재하거나 채용되는 경우, 또는 달리 상반되게 표시되지 않는 한 주어진 산물 또는 방법에 적절한 경우, 또는 달리 문맥으로부터 명백한 경우라면 만족된 것으로 고려된다. 본 발명은 정확하게 그룹의 한 구성원이 존재하거나 채용되거나, 또는 달리 주어진 산물 또는 방법에 적절한 구현예들을 포함한다. 또한 본 발명은 그룹의 하나 이상 또는 구성원 전부가 존재하거나 적용되거나, 달리 주어진 산물 또는 방법에 적절한 구현예들도 포함한다. 또한, 본 발명은 달리 표시되지 않는 한 또는 반박이나 불일치가 나올 수 있는 기술분야의 당업자에게 자명하지 않은 한 나열된 청구항들로부터 나온 하나 이상의 제한들, 요소들, 조항들, 기술적 용어들 등이 동일한 기초 청구항(또는 적절한 다른 청구항)에 의존하는 또 다른 청구항 내로 도입되는 모든 변형들, 조합들, 및 순열들을 포괄하는 것으로 이해된다. 요소들이 리스트로서 표현되는 곳에서는, 예컨대, 마쿠쉬(Markush) 그룹 또는 유사한 형식, 요소들의 각각의 소그룹도 역시 기재되고 또한 요소(들)이라면 모두가 그룹으로부터 삭제될 수 있는 것으로 이해된다. 일반적으로, 본 발명, 또는 본 발명의 관점은 특정한 요소들, 특징들 등을 포함하는 것으로서 언급되는 곳에서는, 본 발명의 소정의 구현예들 또는 본 발명의 관점들은 이러한 요소들, 특징들 등으로 구성되거나 이들로 필수적으로 구성되는 것으로 이해되어야 한다. 간략하게 기술하기 위해, 이들 구현예들은 모든 경우에 본 명세서에서 매우 많은 단어로 상세하게 설명되지 않았다. 또한 본 발명의 구현예 또는 관점이라면 모두는 상세한 배제가 본 명세서에 열거되는지의 여부와는 상관없이, 청구항들로부터 명확하게 배제될 수 있는 것으로 이해되어야 한다.
또한 분명하게 상반되게 표시되지 않는 한, 하나 이상의 행위를 포함하는 본 명세서에서 청구된 임의의 방법에서 방법의 행위의 순서는 반드시 방법의 행위들이 열거된 순서로 제한되지 않지만, 본 발명은 순서가 그렇게 제한된 구현예들을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 또한, 청구항들이 조성물을 열거할 경우, 본 발명은 조성물을 사용하는 방법들 및 조성물을 제조하는 방법들을 포괄한다. 청구항들이 조성물을 열거할 경우, 본 발명은 조성물을 사용하는 방법들 및 조성물을 제조하는 방법들을 포괄하는 것으로 이해해야 한다.
본 출원에서 인용된 출판물들, 및 특허 문서들은 모두 마치 각각의 개별 출판물 또는 특허 문서의 내용이 본 명세서에서 통합된 것과 동일한 정도로 그들의 전부가 참고문헌으로 통합된다.
SEQUENCE LISTING <110> BIOMARINE PHARMACEUTICAL INC. <120> TARGETED THERAPEUTIC LYSOSOMAL ENZYME FUSION PROTEINS AND USES THEREOF <130> 30610/47159A <150> US-61/788,968 <151> 2013-03-15 <150> US-61/730,378 <151> 2012-11-27 <160> 571 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 743 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> SIGNAL <222> (1)..(23) <400> 1 Met Glu Ala Val Ala Val Ala Ala Ala Val Gly Val Leu Leu Leu Ala 1 5 10 15 Gly Ala Gly Gly Ala Ala Gly Asp Glu Ala Arg Glu Ala Ala Ala Val 20 25 30 Arg Ala Leu Val Ala Arg Leu Leu Gly Pro Gly Pro Ala Ala Asp Phe 35 40 45 Ser Val Ser Val Glu Arg Ala Leu Ala Ala Lys Pro Gly Leu Asp Thr 50 55 60 Tyr Ser Leu Gly Gly Gly Gly Ala Ala Arg Val Arg Val Arg Gly Ser 65 70 75 80 Thr Gly Val Ala Ala Ala Ala Gly Leu His Arg Tyr Leu Arg Asp Phe 85 90 95 Cys Gly Cys His Val Ala Trp Ser Gly Ser Gln Leu Arg Leu Pro Arg 100 105 110 Pro Leu Pro Ala Val Pro Gly Glu Leu Thr Glu Ala Thr Pro Asn Arg 115 120 125 Tyr Arg Tyr Tyr Gln Asn Val Cys Thr Gln Ser Tyr Ser Phe 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atcagccaga acgaagtggt ctattccctc 1440 atggctgagc tgggctggcg aaaggaccca gtgccagatt tggcagcctg ggtgaccagc 1500 tttgccgccc ggcggtatgg ggtctcccac ccggacgcag gggcagcgtg gaggctactg 1560 ctccggagtg tgtacaactg ctccggggag gcctgcaggg gccacaatcg tagcccgctg 1620 gtcaggcggc cgtccctaca gatgaatacc agcatctggt acaaccgatc tgatgtgttt 1680 gaggcctggc ggctgctgct cacatctgct ccctccctgg ccaccagccc cgccttccgc 1740 tacgacctgc tggacctcac tcggcaggca gtgcaggagc tggtcagctt gtactatgag 1800 gaggcaagaa gcgcctacct gagcaaggag ctggcctccc tgttgagggc tggaggcgtc 1860 ctggcctatg agctgctgcc ggcactggac gaggtgctgg ctagtgacag ccgcttcttg 1920 ctgggcagct ggctagagca ggcccgagca gcggcagtca gtgaggccga ggccgatttc 1980 tacgagcaga acagccgcta ccagctgacc ttgtgggggc cagaaggcaa catcctggac 2040 tatgccaaca agcagctggc ggggttggtg gccaactact acacccctcg ctggcggctt 2100 ttcctggagg cgctggttga cagtgtggcc cagggcatcc ctttccaaca gcaccagttt 2160 gacaaaaatg tcttccaact ggagcaggcc ttcgttctca gcaagcagag gtaccccagc 2220 cagccgcgag gagacactgt ggacctggcc aagaagatct tcctcaaata ttacccccgc 2280 tgggtggccg gctcttgg 2298 <210> 4 <211> 180 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 4 ctgtgcggcg gggagctggt ggacaccctc cagttcgtct gtggggaccg cggcttctac 60 ttcagcaggc ccgcaagccg tgtgagcgct cgcagccgtg gcatcgttga ggagtgctgt 120 ttccgcagct gtgacctggc cctcctggag acgtactgtg ctacccccgc caagtccgag 180 <210> 5 <211> 67 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Ala Tyr Arg Pro Ser Glu Thr Leu Cys Gly Gly Glu Leu Val Asp Thr 1 5 10 15 Leu Gln Phe Val Cys Gly Asp Arg Gly Phe Tyr Phe Ser Arg Pro Ala 20 25 30 Ser Arg Val Ser Arg Arg Ser Arg Gly Ile Val Glu Glu Cys Cys Phe 35 40 45 Arg Ser Cys Asp Leu Ala Leu Leu Glu Thr Tyr Cys Ala Thr Pro Ala 50 55 60 Lys Ser Glu 65 <210> 6 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa is any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> Xaa is any amino acid <400> 6 Arg Xaa Xaa Arg 1 <210> 7 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 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Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 50 55 60 Gly Gly Gly Ser Ala Ala Ala Ala Gly Ala Pro 65 70 75 <210> 198 <211> 50 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 198 Gly Ala Pro Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 1 5 10 15 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Ala Ala Ala 20 25 30 Ser Gly Gly Gly Pro Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Ala Ala Ala Gly 35 40 45 Ala Pro 50 <210> 199 <211> 55 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 199 Gly Ala Pro Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 1 5 10 15 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Ala Ala Ala 20 25 30 Ser Gly Gly Gly Pro Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 35 40 45 Ala Ala Ala Ala Gly Ala Pro 50 55 <210> 200 <211> 60 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 200 Gly Ala Pro Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 1 5 10 15 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Ala Ala Ala 20 25 30 Ser Gly Gly Gly Pro Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 35 40 45 Gly Gly Gly Gly Ser Ala Ala Ala Ala Gly Ala Pro 50 55 60 <210> 201 <211> 65 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 201 Gly Ala Pro Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 1 5 10 15 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Ala Ala Ala 20 25 30 Ser Gly Gly Gly Pro Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 35 40 45 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Ala Ala Ala Gly Ala 50 55 60 Pro 65 <210> 202 <211> 70 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 202 Gly Ala Pro Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 1 5 10 15 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Ala Ala Ala 20 25 30 Ser Gly Gly Gly Pro Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 35 40 45 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala 50 55 60 Ala Ala Ala Gly Ala Pro 65 70 <210> 203 <211> 75 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Gly Ser Gly Gly Gly 1 5 10 15 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 20 25 30 Ser Ala Ala Ala Ala Ser Gly Gly Gly Pro Ser Gly Gly Gly Gly Ser 35 40 45 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 50 55 60 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Ala Ala Ala Gly Ala Pro 65 70 75 80 <210> 211 <211> 85 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 211 Gly Ala Pro Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 1 5 10 15 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 20 25 30 Ser Ala Ala Ala Ala Ser Gly Gly Gly Pro Ser Gly Gly Gly Gly Ser 35 40 45 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 50 55 60 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Ala 65 70 75 80 Ala Ala Gly Ala Pro 85 <210> 212 <211> 60 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 212 Gly Ala Pro Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 1 5 10 15 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 20 25 30 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Ala Ala Ala Ser Gly Gly Gly Pro Ser 35 40 45 Gly Gly Gly Gly Ser Ala Ala Ala Ala Gly Ala Pro 50 55 60 <210> 213 <211> 65 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 213 Gly Ala Pro Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 1 5 10 15 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 20 25 30 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Ala Ala Ala Ser Gly Gly Gly Pro Ser 35 40 45 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Ala Ala Ala Gly Ala 50 55 60 Pro 65 <210> 214 <211> 70 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 214 Gly Ala Pro Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 1 5 10 15 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 20 25 30 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Ala Ala Ala Ser Gly Gly Gly Pro Ser 35 40 45 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala 50 55 60 Ala Ala Ala Gly Ala Pro 65 70 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Gly Ala Pro Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 1 5 10 15 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 20 25 30 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Ala Ala Ala Ser Gly Gly Gly Pro Ser 35 40 45 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 50 55 60 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Ala 65 70 75 80 Ala Ala Gly Ala Pro 85 <210> 218 <211> 90 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 218 Gly Ala Pro Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 1 5 10 15 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 20 25 30 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Ala Ala Ala Ser Gly Gly Gly Pro Ser 35 40 45 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 50 55 60 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 65 70 75 80 Gly Gly Ser Ala Ala Ala Ala Gly Ala Pro 85 90 <210> 219 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> misc_feature <222> (14)..(14) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 219 Gly Ala Pro Gly Gly Gly Gly Ser Pro Ala Pro Ala Pro Xaa Gly Ala 1 5 10 15 Pro <210> 220 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> misc_feature <222> (14)..(15) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 220 Gly Ala Pro Gly Gly Gly Gly Ser Pro Ala Pro Ala Pro Xaa Xaa Gly 1 5 10 15 Ala Pro <210> 221 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> misc_feature <222> (14)..(16) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 221 Gly Ala Pro Gly Gly Gly Gly Ser Pro Ala Pro Ala Pro Xaa Xaa Xaa 1 5 10 15 Gly Ala Pro <210> 222 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> misc_feature <222> (14)..(17) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 222 Gly Ala Pro Gly Gly Gly Gly Ser Pro Ala Pro Ala Pro Xaa Xaa Xaa 1 5 10 15 Xaa Gly Ala Pro 20 <210> 223 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> misc_feature <222> (14)..(18) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 223 Gly Ala Pro Gly Gly Gly Gly Ser Pro Ala Pro Ala Pro Xaa Xaa Xaa 1 5 10 15 Xaa Xaa Gly Ala Pro 20 <210> 224 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> misc_feature <222> (14)..(19) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 224 Gly Ala Pro Gly Gly Gly Gly Ser Pro Ala Pro Ala Pro Xaa Xaa Xaa 1 5 10 15 Xaa Xaa Xaa Gly Ala Pro 20 <210> 225 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> misc_feature <222> (14)..(20) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 225 Gly Ala Pro Gly Gly Gly Gly Ser Pro Ala Pro Ala Pro Xaa Xaa Xaa 1 5 10 15 Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Ala Pro 20 <210> 226 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> misc_feature <222> (19)..(19) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 226 Gly Ala Pro Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Pro Ala Pro 1 5 10 15 Ala Pro Xaa Gly Ala Pro 20 <210> 227 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 227 Gly Ala Pro Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Pro Ala Pro 1 5 10 15 Ala Pro Xaa Xaa Gly Ala Pro 20 <210> 228 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> misc_feature <222> (19)..(21) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 228 Gly Ala Pro Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Pro Ala Pro 1 5 10 15 Ala Pro Xaa Xaa Xaa Gly Ala Pro 20 <210> 229 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> misc_feature <222> (19)..(22) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 229 Gly Ala Pro Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Pro 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<210> 233 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> misc_feature <222> (24)..(24) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 233 Gly Ala Pro Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 1 5 10 15 Gly Ser Pro Ala Pro Ala Pro Xaa Gly Ala Pro 20 25 <210> 234 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> misc_feature <222> (24)..(25) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 234 Gly Ala Pro Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 1 5 10 15 Gly Ser Pro Ala Pro Ala Pro Xaa Xaa Gly Ala Pro 20 25 <210> 235 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> misc_feature <222> (24)..(26) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 235 Gly Ala Pro Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 1 5 10 15 Gly Ser Pro Ala Pro Ala Pro Xaa Xaa Xaa Gly Ala Pro 20 25 <210> 236 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial 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<213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> misc_feature <222> (29)..(31) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 242 Gly Ala Pro Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 1 5 10 15 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Pro Ala Pro Ala Pro Xaa Xaa Xaa Gly 20 25 30 Ala Pro <210> 243 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> misc_feature <222> (29)..(32) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 243 Gly Ala Pro Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 1 5 10 15 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Pro Ala Pro Ala Pro Xaa Xaa Xaa Xaa 20 25 30 Gly Ala Pro 35 <210> 244 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> misc_feature <222> (29)..(33) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 244 Gly Ala Pro Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 1 5 10 15 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Pro Ala Pro Ala Pro Xaa Xaa Xaa Xaa 20 25 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Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 20 25 30 Ser Pro Ala Pro Ala Pro Xaa Xaa Gly Ala Pro 35 40 <210> 256 <211> 44 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> misc_feature <222> (39)..(41) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 256 Gly Ala Pro Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 1 5 10 15 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 20 25 30 Ser Pro Ala Pro Ala Pro Xaa Xaa Xaa Gly Ala Pro 35 40 <210> 257 <211> 45 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> misc_feature <222> (39)..(42) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 257 Gly Ala Pro Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 1 5 10 15 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 20 25 30 Ser Pro Ala Pro Ala Pro Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Ala Pro 35 40 45 <210> 258 <211> 46 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> misc_feature <222> (39)..(43) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 258 Gly Ala Pro Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 1 5 10 15 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 20 25 30 Ser Pro Ala Pro Ala Pro Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Ala Pro 35 40 45 <210> 259 <211> 47 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> misc_feature <222> (39)..(44) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 259 Gly Ala Pro Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 1 5 10 15 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 20 25 30 Ser Pro Ala Pro Ala Pro Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Ala Pro 35 40 45 <210> 260 <211> 48 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> misc_feature <222> (39)..(45) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 260 Gly Ala Pro Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 1 5 10 15 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 20 25 30 Ser Pro Ala Pro Ala Pro Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Ala Pro 35 40 45 <210> 261 <211> 47 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> misc_feature <222> (44)..(44) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 261 Gly Ala Pro Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 1 5 10 15 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 20 25 30 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Pro Ala Pro Ala Pro Xaa Gly Ala Pro 35 40 45 <210> 262 <211> 48 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> misc_feature <222> (44)..(45) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 262 Gly Ala Pro Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 1 5 10 15 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 20 25 30 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Pro Ala Pro Ala Pro Xaa Xaa Gly Ala Pro 35 40 45 <210> 263 <211> 49 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> misc_feature <222> (44)..(46) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 263 Gly Ala Pro Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 1 5 10 15 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 20 25 30 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Pro Ala Pro Ala Pro Xaa Xaa Xaa Gly Ala 35 40 45 Pro <210> 264 <211> 50 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> misc_feature <222> (44)..(47) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 264 Gly Ala Pro Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 1 5 10 15 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 20 25 30 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Pro Ala Pro Ala Pro Xaa Xaa Xaa Xaa Gly 35 40 45 Ala Pro 50 <210> 265 <211> 51 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> misc_feature <222> (44)..(48) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 265 Gly Ala Pro Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 1 5 10 15 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 20 25 30 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Pro Ala Pro Ala Pro Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 35 40 45 Gly Ala Pro 50 <210> 266 <211> 52 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> misc_feature <222> (44)..(49) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 266 Gly Ala Pro Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 1 5 10 15 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 20 25 30 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Pro Ala Pro Ala Pro Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 35 40 45 Xaa Gly Ala Pro 50 <210> 267 <211> 53 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> misc_feature <222> (44)..(50) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 267 Gly Ala Pro Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 1 5 10 15 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 20 25 30 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Pro Ala Pro Ala Pro Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 35 40 45 Xaa Xaa Gly Ala Pro 50 <210> 268 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> misc_feature <222> (15)..(15) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 268 Gly Ala Pro Gly Gly Gly Gly Ser Pro Ala Pro Ala Pro Thr Xaa Gly 1 5 10 15 Ala Pro <210> 269 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> misc_feature <222> (15)..(16) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 269 Gly Ala Pro Gly Gly Gly Gly Ser Pro Ala Pro Ala Pro Thr Xaa Xaa 1 5 10 15 Gly Ala Pro <210> 270 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> misc_feature <222> (15)..(17) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 270 Gly Ala Pro Gly Gly Gly Gly Ser Pro Ala Pro Ala Pro Thr Xaa Xaa 1 5 10 15 Xaa Gly Ala Pro 20 <210> 271 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> misc_feature <222> (15)..(18) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 271 Gly Ala Pro Gly Gly Gly Gly Ser Pro Ala Pro Ala Pro Thr Xaa Xaa 1 5 10 15 Xaa Xaa Gly Ala Pro 20 <210> 272 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> misc_feature <222> (15)..(19) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 272 Gly Ala Pro Gly Gly Gly Gly Ser Pro Ala Pro Ala Pro Thr Xaa Xaa 1 5 10 15 Xaa Xaa Xaa Gly Ala Pro 20 <210> 273 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> misc_feature <222> (15)..(20) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 273 Gly Ala Pro Gly Gly Gly Gly Ser Pro Ala Pro Ala Pro Thr Xaa Xaa 1 5 10 15 Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Ala Pro 20 <210> 274 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> misc_feature <222> (15)..(21) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 274 Gly Ala Pro Gly Gly Gly Gly Ser Pro Ala Pro Ala Pro Thr Xaa Xaa 1 5 10 15 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Ala Pro 20 <210> 275 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> misc_feature <222> (20)..(20) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 275 Gly Ala Pro Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Pro Ala Pro 1 5 10 15 Ala Pro Thr Xaa Gly Ala Pro 20 <210> 276 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 276 Gly Ala Pro Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Pro Ala Pro 1 5 10 15 Ala Pro Thr Xaa Xaa Gly Ala Pro 20 <210> 277 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> misc_feature <222> (20)..(22) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 277 Gly Ala Pro Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Pro Ala Pro 1 5 10 15 Ala Pro Thr Xaa Xaa Xaa Gly Ala Pro 20 25 <210> 278 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial 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misc_feature <222> (20)..(26) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 281 Gly Ala Pro Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Pro Ala Pro 1 5 10 15 Ala Pro Thr Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Ala Pro 20 25 <210> 282 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> misc_feature <222> (25)..(25) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 282 Gly Ala Pro Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 1 5 10 15 Gly Ser Pro Ala Pro Ala Pro Thr Xaa Gly Ala Pro 20 25 <210> 283 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> misc_feature <222> (25)..(26) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 283 Gly Ala Pro Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 1 5 10 15 Gly Ser Pro Ala Pro Ala Pro Thr Xaa Xaa Gly Ala Pro 20 25 <210> 284 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> misc_feature <222> (25)..(27) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 284 Gly Ala Pro Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 1 5 10 15 Gly Ser Pro Ala Pro Ala Pro Thr Xaa Xaa Xaa Gly Ala Pro 20 25 30 <210> 285 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> misc_feature <222> (25)..(28) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 285 Gly Ala Pro Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 1 5 10 15 Gly Ser Pro Ala Pro Ala Pro Thr Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Ala Pro 20 25 30 <210> 286 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> misc_feature <222> (25)..(29) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 286 Gly Ala Pro Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 1 5 10 15 Gly Ser Pro Ala Pro Ala Pro Thr Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Ala Pro 20 25 30 <210> 287 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> misc_feature <222> (25)..(30) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 287 Gly Ala Pro Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 1 5 10 15 Gly Ser Pro Ala Pro Ala Pro Thr Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Ala 20 25 30 Pro <210> 288 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> misc_feature <222> (25)..(31) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 288 Gly Ala Pro Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 1 5 10 15 Gly Ser Pro Ala Pro Ala Pro Thr Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gly 20 25 30 Ala Pro <210> 289 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> misc_feature <222> (30)..(30) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 289 Gly Ala Pro Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 1 5 10 15 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Pro Ala Pro Ala Pro Thr Xaa Gly Ala 20 25 30 Pro <210> 290 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> misc_feature <222> (30)..(31) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 290 Gly Ala Pro Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 1 5 10 15 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Pro Ala Pro Ala Pro Thr Xaa Xaa Gly 20 25 30 Ala Pro <210> 291 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> misc_feature <222> (30)..(32) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 291 Gly Ala Pro Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 1 5 10 15 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Pro Ala Pro Ala Pro Thr Xaa Xaa Xaa 20 25 30 Gly Ala Pro 35 <210> 292 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> misc_feature <222> (30)..(33) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 292 Gly Ala Pro Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 1 5 10 15 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Pro Ala Pro Ala Pro Thr Xaa Xaa Xaa 20 25 30 Xaa Gly Ala Pro 35 <210> 293 <211> 37 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> misc_feature <222> (30)..(34) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 293 Gly Ala Pro Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 1 5 10 15 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Pro Ala Pro Ala Pro Thr Xaa Xaa Xaa 20 25 30 Xaa Xaa Gly Ala Pro 35 <210> 294 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> misc_feature <222> (30)..(35) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 294 Gly Ala Pro Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 1 5 10 15 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Pro Ala Pro Ala Pro Thr Xaa Xaa Xaa 20 25 30 Xaa Xaa Xaa Gly Ala Pro 35 <210> 295 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> misc_feature <222> (30)..(36) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 295 Gly Ala Pro Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 1 5 10 15 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Pro Ala Pro Ala Pro Thr Xaa Xaa Xaa 20 25 30 Xaa Xaa 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<222> (35)..(40) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 301 Gly Ala Pro Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 1 5 10 15 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Pro Ala Pro Ala 20 25 30 Pro Thr Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Ala Pro 35 40 <210> 302 <211> 44 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> misc_feature <222> (35)..(41) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 302 Gly Ala Pro Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 1 5 10 15 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Pro Ala Pro Ala 20 25 30 Pro Thr Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Ala Pro 35 40 <210> 303 <211> 43 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> misc_feature <222> (40)..(40) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 303 Gly Ala Pro Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 1 5 10 15 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 20 25 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(45)..(46) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 311 Gly Ala Pro Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 1 5 10 15 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 20 25 30 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Pro Ala Pro Ala Pro Thr Xaa Xaa Gly Ala 35 40 45 Pro <210> 312 <211> 50 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> misc_feature <222> (45)..(47) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 312 Gly Ala Pro Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 1 5 10 15 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 20 25 30 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Pro Ala Pro Ala Pro Thr Xaa Xaa Xaa Gly 35 40 45 Ala Pro 50 <210> 313 <211> 51 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> misc_feature <222> (45)..(48) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 313 Gly Ala Pro Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 1 5 10 15 Gly Ser Gly Gly Gly 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(14)..(14) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 446 Gly Ala Pro Gly Gly Gly Gly Ala Pro Ala Pro Ala Pro Xaa Gly Ala 1 5 10 15 Pro <210> 447 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> misc_feature <222> (14)..(15) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 447 Gly Ala Pro Gly Gly Gly Gly Ala Pro Ala Pro Ala Pro Xaa Xaa Gly 1 5 10 15 Ala Pro <210> 448 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> misc_feature <222> (14)..(16) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 448 Gly Ala Pro Gly Gly Gly Gly Ala Pro Ala Pro Ala Pro Xaa Xaa Xaa 1 5 10 15 Gly Ala Pro <210> 449 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> misc_feature <222> (14)..(17) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 449 Gly Ala Pro Gly Gly Gly Gly Ala Pro Ala Pro Ala Pro Xaa Xaa Xaa 1 5 10 15 Xaa Gly Ala Pro 20 <210> 450 <211> 21 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(15)..(18) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 498 Gly Ala Pro Gly Gly Gly Gly Ala Pro Ala Pro Ala Pro Thr Xaa Xaa 1 5 10 15 Xaa Xaa Gly Ala Pro 20 <210> 499 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> misc_feature <222> (15)..(19) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 499 Gly Ala Pro Gly Gly Gly Gly Ala Pro Ala Pro Ala Pro Thr Xaa Xaa 1 5 10 15 Xaa Xaa Xaa Gly Ala Pro 20 <210> 500 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> misc_feature <222> (15)..(20) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 500 Gly Ala Pro Gly Gly Gly Gly Ala Pro Ala Pro Ala Pro Thr Xaa Xaa 1 5 10 15 Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Ala Pro 20 <210> 501 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> misc_feature <222> (15)..(21) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 501 Gly Ala Pro Gly Gly Gly Gly Ala Pro Ala Pro Ala Pro Thr Xaa Xaa 1 5 10 15 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Ala Pro 20 <210> 502 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> misc_feature <222> (20)..(20) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 502 Gly Ala Pro Gly Gly Gly Gly Ala Gly Gly Gly Gly Ala Pro Ala Pro 1 5 10 15 Ala Pro Thr Xaa Gly Ala Pro 20 <210> 503 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 503 Gly Ala Pro Gly Gly Gly Gly Ala Gly Gly Gly Gly Ala Pro Ala Pro 1 5 10 15 Ala Pro Thr Xaa Xaa Gly Ala Pro 20 <210> 504 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> misc_feature <222> (20)..(22) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 504 Gly Ala Pro Gly Gly Gly Gly Ala Gly Gly Gly Gly Ala Pro Ala Pro 1 5 10 15 Ala Pro Thr Xaa Xaa Xaa Gly Ala Pro 20 25 <210> 505 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial 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misc_feature <222> (20)..(26) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 508 Gly Ala Pro Gly Gly Gly Gly Ala Gly Gly Gly Gly Ala Pro Ala Pro 1 5 10 15 Ala Pro Thr Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Ala Pro 20 25 <210> 509 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> misc_feature <222> (25)..(25) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 509 Gly Ala Pro Gly Gly Gly Gly Ala Gly Gly Gly Gly Ala Gly Gly Gly 1 5 10 15 Gly Ala Pro Ala Pro Ala Pro Thr Xaa Gly Ala Pro 20 25 <210> 510 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> misc_feature <222> (25)..(26) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 510 Gly Ala Pro Gly Gly Gly Gly Ala Gly Gly Gly Gly Ala Gly Gly Gly 1 5 10 15 Gly Ala Pro Ala Pro Ala Pro Thr Xaa Xaa Gly Ala Pro 20 25 <210> 511 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> misc_feature <222> (25)..(27) <223> Xaa 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be any naturally occurring amino acid <400> 514 Gly Ala Pro Gly Gly Gly Gly Ala Gly Gly Gly Gly Ala Gly Gly Gly 1 5 10 15 Gly Ala Pro Ala Pro Ala Pro Thr Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Ala 20 25 30 Pro <210> 515 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> misc_feature <222> (25)..(31) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 515 Gly Ala Pro Gly Gly Gly Gly Ala Gly Gly Gly Gly Ala Gly Gly Gly 1 5 10 15 Gly Ala Pro Ala Pro Ala Pro Thr Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gly 20 25 30 Ala Pro <210> 516 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> misc_feature <222> (30)..(30) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 516 Gly Ala Pro Gly Gly Gly Gly Ala Gly Gly Gly Gly Ala Gly Gly Gly 1 5 10 15 Gly Ala Gly Gly Gly Gly Ala Pro Ala Pro Ala Pro Thr Xaa Gly Ala 20 25 30 Pro <210> 517 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> misc_feature <222> (30)..(31) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 517 Gly Ala Pro Gly Gly Gly Gly Ala Gly Gly Gly Gly Ala Gly Gly Gly 1 5 10 15 Gly Ala Gly Gly Gly Gly Ala Pro Ala Pro Ala Pro Thr Xaa Xaa Gly 20 25 30 Ala Pro <210> 518 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> misc_feature <222> (30)..(32) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 518 Gly Ala Pro Gly Gly Gly Gly Ala Gly Gly Gly Gly Ala Gly Gly Gly 1 5 10 15 Gly Ala Gly Gly Gly Gly Ala Pro Ala Pro Ala Pro Thr Xaa Xaa Xaa 20 25 30 Gly Ala Pro 35 <210> 519 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> misc_feature <222> (30)..(33) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 519 Gly Ala Pro Gly Gly Gly Gly Ala Gly Gly Gly Gly Ala Gly Gly Gly 1 5 10 15 Gly Ala Gly Gly Gly Gly Ala Pro Ala Pro Ala Pro Thr Xaa Xaa Xaa 20 25 30 Xaa Gly Ala Pro 35 <210> 520 <211> 37 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> misc_feature <222> (30)..(34) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 520 Gly Ala Pro Gly Gly Gly Gly Ala Gly Gly Gly Gly Ala Gly Gly Gly 1 5 10 15 Gly Ala Gly Gly Gly Gly Ala Pro Ala Pro Ala Pro Thr Xaa Xaa Xaa 20 25 30 Xaa Xaa Gly Ala Pro 35 <210> 521 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> misc_feature <222> (30)..(35) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 521 Gly Ala Pro Gly Gly Gly Gly Ala Gly Gly Gly Gly Ala Gly Gly Gly 1 5 10 15 Gly Ala Gly Gly Gly Gly Ala Pro Ala Pro Ala Pro Thr Xaa Xaa Xaa 20 25 30 Xaa Xaa Xaa Gly Ala Pro 35 <210> 522 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> misc_feature <222> (30)..(36) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 522 Gly Ala Pro Gly Gly Gly Gly Ala Gly Gly Gly Gly Ala Gly Gly Gly 1 5 10 15 Gly Ala Gly Gly Gly Gly Ala Pro Ala Pro Ala Pro Thr Xaa Xaa Xaa 20 25 30 Xaa Xaa 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Gly Gly 1 5 10 15 Gly Ala Gly Gly Gly Gly Ala Gly Gly Gly Gly Ala Pro Ala Pro Ala 20 25 30 Pro Thr Xaa Xaa Xaa Gly Ala Pro 35 40 <210> 526 <211> 41 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> misc_feature <222> (35)..(38) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 526 Gly Ala Pro Gly Gly Gly Gly Ala Gly Gly Gly Gly Ala Gly Gly Gly 1 5 10 15 Gly Ala Gly Gly Gly Gly Ala Gly Gly Gly Gly Ala Pro Ala Pro Ala 20 25 30 Pro Thr Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Ala Pro 35 40 <210> 527 <211> 42 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> misc_feature <222> (35)..(39) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 527 Gly Ala Pro Gly Gly Gly Gly Ala Gly Gly Gly Gly Ala Gly Gly Gly 1 5 10 15 Gly Ala Gly Gly Gly Gly Ala Gly Gly Gly Gly Ala Pro Ala Pro Ala 20 25 30 Pro Thr Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Ala Pro 35 40 <210> 528 <211> 43 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> misc_feature <222> (35)..(40) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 528 Gly Ala Pro Gly Gly Gly Gly Ala Gly Gly Gly Gly Ala Gly Gly Gly 1 5 10 15 Gly Ala Gly Gly Gly Gly Ala Gly Gly Gly Gly Ala Pro Ala Pro Ala 20 25 30 Pro Thr Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Ala Pro 35 40 <210> 529 <211> 44 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> misc_feature <222> (35)..(41) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 529 Gly Ala Pro Gly Gly Gly Gly Ala Gly Gly Gly Gly Ala Gly Gly Gly 1 5 10 15 Gly Ala Gly Gly Gly Gly Ala Gly Gly Gly Gly Ala Pro Ala Pro Ala 20 25 30 Pro Thr Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Ala Pro 35 40 <210> 530 <211> 43 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> misc_feature <222> (40)..(40) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 530 Gly Ala Pro Gly Gly Gly Gly Ala Gly Gly Gly Gly Ala Gly Gly Gly 1 5 10 15 Gly Ala Gly Gly Gly Gly Ala Gly Gly Gly Gly Ala Gly Gly Gly Gly 20 25 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(45)..(46) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 538 Gly Ala Pro Gly Gly Gly Gly Ala Gly Gly Gly Gly Ala Gly Gly Gly 1 5 10 15 Gly Ala Gly Gly Gly Gly Ala Gly Gly Gly Gly Ala Gly Gly Gly Gly 20 25 30 Ala Gly Gly Gly Gly Ala Pro Ala Pro Ala Pro Thr Xaa Xaa Gly Ala 35 40 45 Pro <210> 539 <211> 50 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> misc_feature <222> (45)..(47) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 539 Gly Ala Pro Gly Gly Gly Gly Ala Gly Gly Gly Gly Ala Gly Gly Gly 1 5 10 15 Gly Ala Gly Gly Gly Gly Ala Gly Gly Gly Gly Ala Gly Gly Gly Gly 20 25 30 Ala Gly Gly Gly Gly Ala Pro Ala Pro Ala Pro Thr Xaa Xaa Xaa Gly 35 40 45 Ala Pro 50 <210> 540 <211> 51 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> misc_feature <222> (45)..(48) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 540 Gly Ala Pro Gly Gly Gly Gly Ala Gly Gly Gly Gly Ala Gly Gly Gly 1 5 10 15 Gly Ala Gly Gly Gly Gly Ala Gly Gly Gly Gly Ala Gly Gly Gly Gly 20 25 30 Ala Gly Gly Gly Gly Ala Pro Ala Pro Ala Pro Thr Xaa Xaa Xaa Xaa 35 40 45 Gly Ala Pro 50 <210> 541 <211> 52 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> misc_feature <222> (45)..(49) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 541 Gly Ala Pro Gly Gly Gly Gly Ala Gly Gly Gly Gly Ala Gly Gly Gly 1 5 10 15 Gly Ala Gly Gly Gly Gly Ala Gly Gly Gly Gly Ala Gly Gly Gly Gly 20 25 30 Ala Gly Gly Gly Gly Ala Pro Ala Pro Ala Pro Thr Xaa Xaa Xaa Xaa 35 40 45 Xaa Gly Ala Pro 50 <210> 542 <211> 53 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> misc_feature <222> (45)..(50) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 542 Gly Ala Pro Gly Gly Gly Gly Ala Gly Gly Gly Gly Ala Gly Gly Gly 1 5 10 15 Gly Ala Gly Gly Gly Gly Ala Gly Gly Gly Gly Ala Gly Gly Gly Gly 20 25 30 Ala Gly Gly Gly Gly Ala Pro Ala Pro Ala Pro Thr Xaa Xaa Xaa Xaa 35 40 45 Xaa Xaa Gly Ala Pro 50 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<220> <223> Synthetic peptide <220> <221> misc_feature <222> (14)..(15) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (21)..(22) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (33)..(34) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 545 Gly Ala Pro Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Xaa Xaa Pro 1 5 10 15 Ala Pro Ala Pro Xaa Xaa Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu 20 25 30 Xaa Xaa Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Ala Pro 35 40 45 <210> 546 <211> 65 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> misc_feature <222> (19)..(21) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (27)..(29) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (45)..(47) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 546 Gly Ala Pro Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 1 5 10 15 Gly Ser Xaa 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misc_feature <222> (33)..(36) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (57)..(60) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 555 Gly Ala Pro Gly Gly Gly Gly Ala Gly Gly Gly Gly Ala Gly Gly Gly 1 5 10 15 Gly Ala Gly Gly Gly Gly Ala Xaa Xaa Xaa Xaa Pro Ala Pro Ala Pro 20 25 30 Xaa Xaa Xaa Xaa Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala 35 40 45 Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Gly Gly Gly 50 55 60 Ala Gly Gly Gly Gly Ala Gly Gly Gly Gly Ala Gly Gly Gly Gly Ala 65 70 75 80 Gly Ala Pro <210> 556 <211> 101 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> misc_feature <222> (29)..(33) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (39)..(43) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (69)..(73) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 556 Gly Ala Pro Gly Gly Gly Gly Ala Gly Gly Gly Gly Ala Gly 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Glu Ala Val Ala Val Ala Ala Ala Val Gly Val Leu Leu Leu Ala 1 5 10 15 Gly Ala Gly Gly Ala Ala Gly Asp Glu Ala Arg Glu Ala Ala Ala Val 20 25 30 Arg Ala Leu Val Ala Arg Leu Leu Gly Pro Gly Pro Ala Ala Asp Phe 35 40 45 Ser Val Ser Val Glu Arg Ala Leu Ala Ala Lys Pro Gly Leu Asp Thr 50 55 60 Tyr Ser Leu Gly Gly Gly Gly Ala Ala Arg Val Arg Val Arg Gly Ser 65 70 75 80 Thr Gly Val Ala Ala Ala Ala Gly Leu His Arg Tyr Leu Arg Asp Phe 85 90 95 Cys Gly Cys His Val Ala Trp Ser Gly Ser Gln Leu Arg Leu Pro Arg 100 105 110 Pro Leu Pro Ala Val Pro Gly Glu Leu Thr Glu Ala Thr Pro Asn Arg 115 120 125 Tyr Arg Tyr Tyr Gln Asn Val Cys Thr Gln Ser Tyr Ser Phe Val Trp 130 135 140 Trp Asp Trp Ala Arg Trp Glu Arg Glu Ile Asp Trp Met Ala Leu Asn 145 150 155 160 Gly Ile Asn Leu Ala Leu Ala Trp Ser Gly Gln Glu Ala Ile Trp Gln 165 170 175 Arg Val Tyr Leu Ala Leu Gly Leu Thr Gln Ala Glu Ile Asn Glu Phe 180 185 190 Phe Thr Gly Pro Ala Phe Leu Ala Trp Gly Arg Met Gly Asn Leu His 195 200 205 Thr Trp Asp Gly Pro Leu Pro Pro Ser Trp His Ile Lys Gln Leu Tyr 210 215 220 Leu Gln His Arg Val Leu Asp Gln Met Arg Ser Phe Gly Met Thr Pro 225 230 235 240 Val Leu Pro Ala Phe Ala Gly His Val Pro Glu Ala Val Thr Arg Val 245 250 255 Phe Pro Gln Val Asn Val Thr Lys Met Gly Ser Trp Gly His Phe Asn 260 265 270 Cys Ser Tyr Ser Cys Ser Phe Leu Leu Ala Pro Glu Asp Pro Ile Phe 275 280 285 Pro Ile Ile Gly Ser Leu Phe Leu Arg Glu Leu Ile Lys Glu Phe Gly 290 295 300 Thr Asp His Ile Tyr Gly Ala Asp Thr Phe Asn Glu Met Gln Pro Pro 305 310 315 320 Ser Ser Glu Pro Ser Tyr Leu Ala Ala Ala Thr Thr Ala Val Tyr Glu 325 330 335 Ala Met Thr Ala Val Asp Thr Glu Ala Val Trp Leu Leu Gln Gly Trp 340 345 350 Leu Phe Gln His Gln Pro Gln Phe Trp Gly Pro Ala Gln Ile Arg Ala 355 360 365 Val Leu Gly Ala Val Pro Arg Gly Arg Leu Leu Val Leu Asp Leu Phe 370 375 380 Ala Glu Ser Gln Pro Val Tyr Thr Arg Thr Ala Ser Phe Gln Gly Gln 385 390 395 400 Pro Phe Ile Trp Cys Met Leu His Asn Phe Gly Gly Asn His Gly Leu 405 410 415 Phe Gly Ala Leu Glu Ala Val Asn Gly Gly Pro Glu Ala Ala Arg Leu 420 425 430 Phe Pro Asn Ser Thr Met Val Gly Thr Gly Met Ala Pro Glu Gly Ile 435 440 445 Ser Gln Asn Glu Val Val Tyr Ser Leu Met Ala Glu Leu Gly Trp Arg 450 455 460 Lys Asp Pro Val Pro Asp Leu Ala Ala Trp Val Thr Ser Phe Ala Ala 465 470 475 480 Arg Arg Tyr Gly Val Ser His Pro Asp Ala Gly Ala Ala Trp Arg Leu 485 490 495 Leu Leu Arg Ser Val Tyr Asn Cys Ser Gly Glu Ala Cys Arg Gly His 500 505 510 Asn Arg Ser Pro Leu Val Arg Arg Pro Ser Leu Gln Met Asn Thr Ser 515 520 525 Ile Trp Tyr Asn Arg Ser Asp Val Phe Glu Ala Trp Arg Leu Leu Leu 530 535 540 Thr Ser Ala Pro Ser Leu Ala Thr Ser Pro Ala Phe Arg Tyr Asp Leu 545 550 555 560 Leu Asp Leu Thr Arg Gln Ala Val Gln Glu Leu Val Ser Leu Tyr Tyr 565 570 575 Glu Glu Ala Arg Ser Ala Tyr Leu Ser Lys Glu Leu Ala Ser Leu Leu 580 585 590 Arg Ala Gly Gly Val Leu Ala Tyr Glu Leu Leu Pro Ala Leu Asp Glu 595 600 605 Val Leu Ala Ser Asp Ser Arg Phe Leu Leu Gly Ser Trp Leu Glu Gln 610 615 620 Ala Arg Ala Ala Ala Val Ser Glu Ala Glu Ala Asp Phe Tyr Glu Gln 625 630 635 640 Asn Ser Arg Tyr Gln Leu Thr Leu Trp Gly Pro Glu Gly Asn Ile Leu 645 650 655 Asp Tyr Ala Asn Lys Gln Leu Ala Gly Leu Val Ala Asn Tyr Tyr Thr 660 665 670 Pro Arg Trp Arg Leu Phe Leu Glu Ala Leu Val Asp Ser Val Ala Gln 675 680 685 Gly Ile Pro Phe Gln Gln His Gln Phe Asp Lys Asn Val Phe Gln Leu 690 695 700 Glu Gln Ala Phe Val Leu Ser Lys Gln Arg Tyr Pro Ser Gln Pro Arg 705 710 715 720 Gly Asp Thr Val Asp Leu Ala Lys Lys Ile Phe Leu Lys Tyr Tyr Pro 725 730 735 Arg Trp Val Ala Gly Ser Trp Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 740 745 750 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Pro Ser 755 760 765 Leu Cys Gly Gly Glu Leu Val Asp Thr Leu Gln Phe Val Cys Gly Asp 770 775 780 Arg Gly Phe Tyr Phe Ser Arg Pro Ala Ser Arg Val Ser Ala Arg Ser 785 790 795 800 Arg Gly Ile Val Glu Glu Cys Cys Phe Arg Ser Cys Asp Leu Ala Leu 805 810 815 Leu Glu Thr Tyr Cys Ala Thr Pro Ala Lys Ser Glu 820 825 <210> 569 <211> 828 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 569 Met Glu Ala Val Ala Val Ala Ala Ala Val Gly Val Leu Leu Leu Ala 1 5 10 15 Gly Ala Gly Gly Ala Ala Gly Asp Glu Ala Arg Glu Ala Ala Ala Val 20 25 30 Arg Ala Leu Val Ala Arg Leu Leu Gly Pro Gly Pro Ala Ala Asp Phe 35 40 45 Ser Val Ser Val Glu Arg Ala Leu Ala Ala Lys Pro Gly Leu Asp Thr 50 55 60 Tyr Ser Leu Gly Gly Gly Gly Ala Ala Arg Val Arg Val Arg Gly Ser 65 70 75 80 Thr Gly Val Ala Ala Ala Ala Gly Leu His Arg Tyr Leu Arg Asp Phe 85 90 95 Cys Gly Cys His Val Ala Trp Ser Gly Ser Gln Leu Arg Leu Pro Arg 100 105 110 Pro Leu Pro Ala Val Pro Gly Glu Leu Thr Glu Ala Thr Pro Asn Arg 115 120 125 Tyr Arg Tyr Tyr Gln Asn Val Cys Thr Gln Ser Tyr Ser Phe Val Trp 130 135 140 Trp Asp Trp Ala Arg Trp Glu Arg Glu Ile Asp Trp Met Ala Leu Asn 145 150 155 160 Gly Ile Asn Leu Ala Leu Ala Trp Ser Gly Gln Glu Ala Ile Trp Gln 165 170 175 Arg Val Tyr Leu Ala Leu Gly Leu Thr Gln Ala Glu Ile Asn Glu Phe 180 185 190 Phe Thr Gly Pro Ala Phe Leu Ala Trp Gly Arg Met Gly Asn Leu His 195 200 205 Thr Trp Asp Gly Pro Leu Pro Pro Ser Trp His Ile Lys Gln Leu Tyr 210 215 220 Leu Gln His Arg Val Leu Asp Gln Met Arg Ser Phe Gly Met Thr Pro 225 230 235 240 Val Leu Pro Ala Phe Ala Gly His Val Pro Glu Ala Val Thr Arg Val 245 250 255 Phe Pro Gln Val Asn Val Thr Lys Met Gly Ser Trp Gly His Phe Asn 260 265 270 Cys Ser Tyr Ser Cys Ser Phe Leu Leu Ala Pro Glu Asp Pro Ile Phe 275 280 285 Pro Ile Ile Gly Ser Leu Phe Leu Arg Glu Leu Ile Lys Glu Phe Gly 290 295 300 Thr Asp His Ile Tyr Gly Ala Asp Thr Phe Asn Glu Met Gln Pro Pro 305 310 315 320 Ser Ser Glu Pro Ser Tyr Leu Ala Ala Ala Thr Thr Ala Val Tyr Glu 325 330 335 Ala Met Thr Ala Val Asp Thr Glu Ala Val Trp Leu Leu Gln Gly Trp 340 345 350 Leu Phe Gln His Gln Pro Gln Phe Trp Gly Pro Ala Gln Ile Arg Ala 355 360 365 Val Leu Gly Ala Val Pro Arg Gly Arg Leu Leu Val Leu Asp Leu Phe 370 375 380 Ala Glu Ser Gln Pro Val Tyr Thr Arg Thr Ala Ser Phe Gln Gly Gln 385 390 395 400 Pro Phe Ile Trp Cys Met Leu His Asn Phe Gly Gly Asn His Gly Leu 405 410 415 Phe Gly Ala Leu Glu Ala Val Asn Gly Gly Pro Glu Ala Ala Arg Leu 420 425 430 Phe Pro Asn Ser Thr Met Val Gly Thr Gly Met Ala Pro Glu Gly Ile 435 440 445 Ser Gln Asn Glu Val Val Tyr Ser Leu Met Ala Glu Leu Gly Trp Arg 450 455 460 Lys Asp Pro Val Pro Asp Leu Ala Ala Trp Val Thr Ser Phe Ala Ala 465 470 475 480 Arg Arg Tyr Gly Val Ser His Pro Asp Ala Gly Ala Ala Trp Arg Leu 485 490 495 Leu Leu Arg Ser Val Tyr Asn Cys Ser Gly Glu Ala Cys Arg Gly His 500 505 510 Asn Arg Ser Pro Leu Val Arg Arg Pro Ser Leu Gln Met Asn Thr Ser 515 520 525 Ile Trp Tyr Asn Arg Ser Asp Val Phe Glu Ala Trp Arg Leu Leu Leu 530 535 540 Thr Ser Ala Pro Ser Leu Ala Thr Ser Pro Ala Phe Arg Tyr Asp Leu 545 550 555 560 Leu Asp Leu Thr Arg Gln Ala Val Gln Glu Leu Val Ser Leu Tyr Tyr 565 570 575 Glu Glu Ala Arg Ser Ala Tyr Leu Ser Lys Glu Leu Ala Ser Leu Leu 580 585 590 Arg Ala Gly Gly Val Leu Ala Tyr Glu Leu Leu Pro Ala Leu Asp Glu 595 600 605 Val Leu Ala Ser Asp Ser Arg Phe Leu Leu Gly Ser Trp Leu Glu Gln 610 615 620 Ala Arg Ala Ala Ala Val Ser Glu Ala Glu Ala Asp Phe Tyr Glu Gln 625 630 635 640 Asn Ser Arg Tyr Gln Leu Thr Leu Trp Gly Pro Glu Gly Asn Ile Leu 645 650 655 Asp Tyr Ala Asn Lys Gln Leu Ala Gly Leu Val Ala Asn Tyr Tyr Thr 660 665 670 Pro Arg Trp Arg Leu Phe Leu Glu Ala Leu Val Asp Ser Val Ala Gln 675 680 685 Gly Ile Pro Phe Gln Gln His Gln Phe Asp Lys Asn Val Phe Gln Leu 690 695 700 Glu Gln Ala Phe Val Leu Ser Lys Gln Arg Tyr Pro Ser Gln Pro Arg 705 710 715 720 Gly Asp Thr Val Asp Leu Ala Lys Lys Ile Phe Leu Lys Tyr Tyr Pro 725 730 735 Arg Trp Val Ala Gly Ser Trp Gly Gly Gly Gly Ala Gly Gly Gly Gly 740 745 750 Ala Gly Gly Gly Gly Ala Gly Gly Gly Gly Ala Gly Gly Gly Pro Ser 755 760 765 Leu Cys Gly Gly Glu Leu Val Asp Thr Leu Gln Phe Val Cys Gly Asp 770 775 780 Arg Gly Phe Tyr Phe Ser Arg Pro Ala Ser Arg Val Ser Ala Arg Ser 785 790 795 800 Arg Gly Ile Val Glu Glu Cys Cys Phe Arg Ser Cys Asp Leu Ala Leu 805 810 815 Leu Glu Thr Tyr Cys Ala Thr Pro Ala Lys Ser Glu 820 825 <210> 570 <211> 8 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AscI restriction site <400> 570 ggcgcgcc 8 <210> 571 <211> 60 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 571 Leu Cys Gly Gly Glu Leu Val Asp Thr Leu Gln Phe Val Cys Gly Asp 1 5 10 15 Arg Gly Phe Tyr Phe Ser Arg Pro Ala Ser Arg Val Ser Arg Arg Ser 20 25 30 Arg Gly Ile Val Glu Glu Cys Cys Phe Arg Ser Cys Asp Leu Ala Leu 35 40 45 Leu Glu Thr Tyr Cys Ala Thr Pro Ala Lys Ser Glu 50 55 60

Claims (61)

  1. (a) 리소좀 효소, (b) 서열번호 5로 표시되는 성숙한 인간 IGF-Ⅱ의 8번 내지 67번 아미노산들과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 가지는 IGF-Ⅱ펩타이드 태그 및 (c) 상기 리소좀 효소와 상기 IGF-Ⅱ펩타이드 태그 사이의 스페이서 펩타이드를 포함하는 표적화된 치료적 융합 단백질로서, 상기 스페이서 펩타이드는 GGGPS(서열번호 14) 및 GGGSP(서열번호 15) 중 하나 이상의 아미노산 서열들을 포함하는, 표적화된 치료적 융합 단백질.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 스페이서 펩타이드는, GAP(서열번호 9), GGGGS(서열번호 12), GGGS(서열번호 16), AAAAS(서열번호 17), AAAS(서열번호 18), PAPA(서열번호 19), TPAPA(서열번호 20), AAAKE(서열번호 21) 및 GGGGA(서열번호 60) 중 하나 이상의 아미노산 서열들을 더 포함하는, 표적화된 치료적 융합 단백질.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 스페이서 펩타이드는, GGGPS(서열번호 14) 아미노산 서열, 및 GAP(서열번호 9), GGGGS(서열번호 12), GGGGA(서열번호 60) 및 TPAPA(서열번호 20) 중 하나 이상의 아미노산 서열들을 포함하는, 표적화된 치료적 융합 단백질.
  4. 제2항에 있어서,
    상기 스페이서 펩타이드는, GGGSP(서열번호 15) 아미노산 서열, 및 GAP(서열번호 9), TPAPA(서열번호 20) 및 AAAKE(서열번호 21) 중 하나 이상의 아미노산 서열들을 포함하는, 표적화된 치료적 융합 단백질.
  5. 제2항에 있어서,
    상기 스페이서 펩타이드는, GGGPS(서열번호 14) 및 GGGGS(서열번호 12) 아미노산 서열들을 포함하는, 표적화된 치료적 융합 단백질.
  6. 제2항에 있어서,
    상기 스페이서 펩타이드는, GGGPS(서열번호 14) 및 GGGGA(서열번호 60) 아미노산 서열들을 포함하는, 표적화된 치료적 융합 단백질.
  7. 제2항에 있어서,
    상기 스페이서 펩타이드는, GGGPS(서열번호 14), GGGSP(서열번호 15), GAP(서열번호 9) 및 TPAPA(서열번호 20) 아미노산 서열들을 포함하는, 표적화된 치료적 융합 단백질.
  8. 제2항에 있어서,
    상기 스페이서 펩타이드는, GGGSP(서열번호 15), GAP(서열번호 9) 및 AAAKE(서열번호 21) 아미노산 서열들을 포함하는, 표적화된 치료적 융합 단백질.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 스페이서 펩타이드는 GAP(서열번호 9) 아미노산 서열을 더 포함하는, 표적화된 치료적 융합 단백질.
  10. 제1항에 있어서,
    상기 리소좀 효소는, 서열번호 1의 1번 내지 743번 또는 24번 내지 743번 아미노산들과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 인간 α-N-아세틸글루코사미니다제(Naglu) 단백질을 포함하는, 표적화된 치료적 융합 단백질.
  11. 제1항에 있어서,
    상기 IGF-Ⅱ 펩타이드 태그는 N-말단 태그 또는 C-말단 태그인, 표적화된 치료적 융합 단백질.
  12. 제1항에 있어서,
    상기 IGF-Ⅱ 펩타이드 태그는 서열번호 5의 8번 내지 67번 아미노산들과 적어도 98% 동일한 아미노산 서열을 가지는, 표적화된 치료적 융합 단백질.
  13. 제1항에 있어서,
    상기 IGF-Ⅱ펩타이드 태그는 서열번호 5의 잔기 Arg 37번에 해당하는 위치에서 아르기닌에 대한 알라닌으로의 치환을 포함하는, 표적화된 치료적 융합 단백질.
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  15. 제1항에 있어서,
    상기 표적화된 치료적 융합 단백질은 서열번호 566의 아미노산 서열과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 가지는, 표적화된 치료적 융합 단백질.
  16. 제1항에 있어서,
    상기 표적화된 치료적 융합 단백질은 서열번호 566의 아미노산 서열을 가지는, 표적화된 치료적 융합 단백질.
  17. 제1항 내지 제13항, 제15항 및 제16항 중 어느 한 항의 표적화된 치료적 융합 단백질을 인코딩하는 핵산.
  18. 제17항의 핵산을 포함하는 세포.
  19. 표적화된 치료적 융합 단백질을 생산하는 방법으로서, 세포 배양 배지에서 제17항의 핵산을 포함하는 포유동물 세포를 배양하는 단계를 포함하고, 상기 배양은 상기 표적화된 치료적 융합 단백질의 발현을 허용하는 조건들 하에서 수행되는, 방법.
  20. 제1항의 표적화된 치료적 융합 단백질을 포함하는, 점액다당류증 제IIIB형 (산필립포 증후군 B형) 환자에서 글리코사미노글리칸 수준들을 감소하기 위한 약제학적 조성물.
  21. 제1항의 표적화된 치료적 융합 단백질을 유효량으로 포함하는, 점액다당류증 제IIIB형 (산필립포 증후군 B형) 치료용 약제학적 조성물.
  22. 제20항 또는 제21항에 있어서, 상기 약제학적 조성물은 경막내(intrathecal) 투여용으로 제형화되는, 약제학적 조성물.
  23. 제22항에 있어서
    상기 경막내 투여는 상기 융합 단백질을 뇌실, 요추 부위 또는 대수공 (cisterna magna)으로 도입하는 것을 포함하는, 약제학적 조성물.
  24. 제20항에 있어서, 약제학적으로 허용가능한 담체, 희석제 또는 부형제를 더 포함하는, 약제학적 조성물.
  25. 제1항 내지 제13항, 제15항 및 제16항 중 어느 한 항의 표적화된 치료적 융합 단백질, 및 소듐 포스페이트, 염화나트륨, 염화칼륨, 염화마그네슘 및 염화칼슘을 포함하는, 약제학적 조성물.
  26. 제1항 내지 제13항, 제15항 및 제16항 중 어느 한 항의 표적화된 치료적 융합 단백질, 및 1mM의 소듐 포스페이트, 148mM의 염화나트륨, 3mM의 염화칼륨, 0.8mM의 염화마그네슘, 및 1.4mM의 염화칼슘을 포함하며, pH가 7.2인, 약제학적 조성물.
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