CN104822701A - 靶向治疗性溶酶体酶融合蛋白及其用途 - Google Patents

靶向治疗性溶酶体酶融合蛋白及其用途 Download PDF

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Abstract

本发明一般涉及适用于治疗溶酶体储积疾病的治疗性融合蛋白及用于治疗此等疾病的方法。示范性治疗性融合蛋白包含溶酶体酶、溶酶体靶向部分(例如IGF-II肽)及间隔肽。也提供治疗IIIB型黏多糖病(B型山菲立普综合征(Sanfilippo B Syndrome))的组合物及方法，其包含含有α-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(Naglu)、溶酶体靶向部分(例如IGF-II肽)及间隔肽的靶向治疗性融合蛋白。

Description

靶向治疗性溶酶体酶融合蛋白及其用途
技术领域
本发明主张2012年11月27日申请的美国临时发明第61/730,378号及2013年3月15日申请的美国临时发明第61/788,968号的优先权益，所述临时发明以全文引用的方式并入本文中。
本发明一般是关于适用于治疗溶酶体储积疾病的治疗性融合蛋白及治疗此等疾病的方法。示范性治疗性融合蛋白包含溶酶体酶、溶酶体靶向部分(例如IGF-II肽)及间隔肽。意欲溶酶体酶为α-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(Naglu)且疾病为IIIB型黏多糖病(Mucopolysaccharidosis Type IIIB)(B型山菲立普综合征)。
技术背景
通常，哺乳动物溶酶体酶在胞质液中合成且横越ER，在ER中，其经N-连接的高甘露糖型碳水化合物糖基化。在高尔基体(golgi)中，藉由添加使此等蛋白质靶向溶酶体的甘露糖-6-磷酸(M6P)来修饰溶酶体酶上的高甘露糖碳水化合物。经由与两种M6P受体的任一者相互作用来使M6P修饰的蛋白质传递至溶酶体。最有利的修饰形式为当添加两个M6P至高甘露糖碳水化合物中时。
超过40种溶酶体储积疾病(LSD)是因在溶酶体中不存在一或多种溶酶体酶而直接或间接引起。正积极推行用于LSD的酶补充疗法。疗法通常需要LSD蛋白质以M6P依赖性方式被摄取且传递至多种细胞类型的溶酶体。一种可能的方法涉及纯化LSD蛋白质且用M6P对其进行修饰以并入碳水化合物部分。归因于与细胞表面上的M6P受体的相互作用，此经修饰物质可比未修饰LSD蛋白质更高效地由细胞摄取。
本发明的发明人先前已开发一种允许将治疗性酶更高效传递至溶酶体的肽基靶向技术。此专有技术称为糖基化非依赖性溶酶体靶向(GILT)，因为肽标签替代M6P作为靶向溶酶体的部分。GILT技术的详情描述于美国申请公开文本第2003-0082176号、第2004-0006008号、第2003-0072761号、第2005-0281805号、第2005-0244400号、及国际公开文本WO 03/032913、WO 03/032727、WO02/087510、WO 03/102583、WO 2005/078077中，所述所有公开文本的揭露内容据此以引用的方式并入本文中。
发明内容
本发明提供用于基于GILT技术达成高效溶酶体靶向的进一步改良组合物及方法。本发明尤其提供用于使用溶酶体靶向肽使溶酶体酶靶向溶酶体的方法及组合物。本发明也提供用于使用对IGF-I受体的结合亲和力降低或减弱及/或对胰岛素受体的结合亲和力降低或减弱及/或对弗林蛋白酶(furin)裂解具有抗性的溶酶体靶向肽使溶酶体酶靶向溶酶体的方法及组合物。本发明也提供包含溶酶体酶以及提供溶酶体酶融合蛋白的产生及向溶酶体中的摄取改良的IGF-II及间隔肽的溶酶体酶融合蛋白。在某些实施例中，溶酶体酶为α-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(Naglu)。
在一态样中，本发明提供一种靶向治疗性融合蛋白，其包含溶酶体酶、氨基酸序列与成熟人类IGF-II的氨基酸8-67至少70％一致的肽标签、及在该溶酶体酶与该IGF-II肽标签之间的间隔肽。在各种实施例中，间隔肽包含一个或多个GGGPS(SEQ ID NO:14)或GGGSP(SEQ ID NO:15)氨基酸序列，且任选地还包含以下一个或多个：(i)GAP(SEQ ID NO:9)、(ii)GGGGS(SEQ ID NO:12)、(iii)GGGS(SEQ ID NO:16)、(iv)AAAAS(SEQ ID NO:17)、(v)AAAS(SEQ ID NO:18)、(vi)PAPA(SEQ ID NO:19)、(vii)TPAPA(SEQ ID NO:20)、(viii)AAAKE(SEQID NO:21)或(ix)GGGGA(SEQ ID NO:60)。
本文涵盖的示范性溶酶体酶包括表1中所述者。
在各种实施例中，靶向治疗性融合蛋白包含与人类α-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(Naglu)蛋白质(图1，SEQ ID NO:1)至少85％一致的氨基酸序列、氨基酸序列与成熟人类IGF-II的氨基酸8-67至少70％一致的肽标签、及位于该Naglu氨基酸序列与该IGF-II肽标签之间的间隔肽。在各种实施例中，间隔子包含氨基酸序列GAP(SEQ ID NO:9)、GPS(SEQ ID NO:10)或GGS(SEQ ID NO:11)。在各种实施例中，间隔子序列包含在成熟人类IGF-II的氨基酸与人类Naglu的氨基酸之间的氨基酸Gly-Pro-Ser(GPS)(SEQ ID NO:10)。
在各种实施例中，间隔肽包含一个或多个GGGGS(SEQ ID NO:12)或GGGS(SEQ ID NO:16)氨基酸序列。在各种实施例中，间隔肽包含一个或多个GGGPS(SEQ ID NO:14)或GGGSP(SEQ ID NO:15)氨基酸序列。在各种实施例中，间隔肽包含一个或多个AAAAS(SEQ ID NO:17)或AAAS(SEQ ID NO:18)氨基酸序列。在各种实施例中，间隔肽包含一个或多个PAPA(SEQ ID NO:19)或TPAPA(SEQ ID NO:20)氨基酸序列。在各种实施例中，间隔肽包含一个或多个AAAKE(SEQ ID NO:21)氨基酸序列。在各种实施例中，间隔肽包含一个或多个GGGGA(SEQ ID NO:60)氨基酸序列。
在各种实施例中，间隔肽包含选自下组的氨基酸序列：(GGGGS)n(SEQ IDNO:12、56、58、91-94)、(GGGGS)n-GGGPS(SEQ ID NO:36、95-100)、GAP-(GGGGS)n-GGGPS(SEQ ID NO:101-107)、GAP-(GGGGS)n-GGGPS-GAP(SEQ ID NO:37、108-113)、GAP-(GGGGS)n-GGGPS-(GGGGS)n-GAP(SEQ ID NO:114-162)、GAP-GGGPS-(GGGGS)n-GAP(SEQ ID NO:163-169)、GAP-(GGGGS)n-AAAAS-GGGPS-(GGGGS)n-AAAA-GAP(SEQ ID NO:170-218)、GAP-(GGGGS)n-PAPAP-(Xaa)n-GAP(SEQ ID NO:219-267)、GAP-(GGGGS)n-PAPAPT-(Xaa)n-GAP(SEQ ID NO:268-316)、GAP-(GGGGS)n-(Xaa)n-PAPAP-(Xaa)n-(AAAKE)n-(Xaa)n-(GGGGS)n-GAP(SEQID NO:544-551)、(GGGGA)n(SEQ ID NO:60、79、81、317-320)、(GGGGA)n-GGGPS(SEQ ID NO:321-326)、GAP-(GGGGA)n-GGGPS(SEQ ID NO:327-333)、GAP-(GGGGA)n-GGGPS-GAP(SEQ ID NO:334-340)、GAP-(GGGGA)n-GGGPS-(GGGGA)n-GAP(SEQ ID NO:341-389)、GAP-GGGPS-(GGGGA)n-GAP(SEQ ID NO:390-396)、GAP-(GGGGA)n-AAAAS-GGGPS-(GGGGA)n-AAAA-GAP(SEQ ID NO:397-445)、GAP-(GGGGA)n-PAPAP-(Xaa)n-GAP(SEQ ID NO:446-494)、GAP-(GGGGA)n-PAPAPT-(Xaa)n-GAP(SEQ ID NO:495-543)、GAP-(GGGGA)n-(Xaa)n-PAPAP-(Xaa)n-(AAAKE)n-(Xaa)n-(GGGGA)n-GAP(SEQID NO:552-559)；其中n为1至7。在各种实施例中，n为1至4。
在各种实施例中，本发明提供一种用作使肽或包含肽的融合蛋白靶向哺乳动物溶酶体的肽标签的IGF-II肽。在各种实施例中，本发明提供一种IGF-II突变蛋白质。在各种实施例中，本发明提供一种具有与成熟人类IGF-II(AYRPSETLCGGELVDTLQFVCGDRGFYFSRPASRVSRRSRGIVEECCFRSCDLALLETYCATPAKSE)(SEQ ID NO:5)至少70％一致的氨基酸序列及消除至少一个弗林蛋白酶蛋白酶裂解位点的突变的弗林蛋白酶抗性IGF-II突变蛋白质。
在一些实施例中，本发明提供一种包含与成熟人类IGF-II至少70％一致的氨基酸序列的IGF-II突变蛋白质。在各种实施例中，IGF-II突变蛋白质肽标签包含成熟人类IGF-II的氨基酸8-67。在各种实施例中，IGF-II突变蛋白质包含相较于野生型人类IGF-II，降低或减弱对胰岛素受体的结合亲和力的突变。
在一些实施例中，相对于天然存在的人类IGF-II对IGF-I受体的亲和力，IGF-II突变蛋白质对IGF-I受体的结合亲和力减弱。
在各种实施例中，本发明提供一种含有溶酶体酶；及氨基酸序列与成熟人类IGF-II至少70％一致的IGF-II突变蛋白质的靶向治疗性融合蛋白，其中该IGF-II突变蛋白质对弗林蛋白酶裂解具有抗性且以甘露糖-6-磷酸非依赖性方式结合人类阳离子非依赖性甘露糖-6-磷酸受体。
在一些实施例中，本发明提供一种含有溶酶体酶；及氨基酸序列与成熟人类IGF-II至少70％一致，且相对于天然存在的人类IGF-II对胰岛素受体的亲和力，对胰岛素受体的结合亲和力减弱的IGF-II突变蛋白质的靶向治疗性融合蛋白。在一相关实施例中，IGF-II突变蛋白质对弗林蛋白酶裂解具有抗性且以甘露糖-6-磷酸非依赖性方式结合人类阳离子非依赖性甘露糖-6-磷酸受体。
在各种实施例中，适于本发明的IGF-II突变蛋白质在对应于成熟人类IGF-II的氨基酸30-40的区域内包括突变。在一些实施例中，适于本发明的IGF-II突变蛋白质在对应于成熟人类IGF-II的氨基酸34-40的区域内包括突变以使该突变消除至少一个弗林蛋白酶蛋白酶裂解位点。在一些实施例中，适合突变为氨基酸取代、缺失及/或插入。在一些实施例中，突变为在对应于成熟人类IGF-II的Arg37或Arg40的位置处的氨基酸取代。在一些实施例中，氨基酸取代为Lys或Ala取代。
在一些实施例中，适合突变为缺失或置换对应于选自下组的位置的氨基酸残基：成熟人类IGF-II的30-40、31-40、32-40、33-40、34-40、30-39、31-39、32-39、34-37、33-39、34-39、35-39、36-39、37-40及其组合。
在各种实施例中，本发明的IGF-II突变蛋白质进一步含有对应于成熟人类IGF-II的位置2-7的氨基酸的缺失或置换。在各种实施例中，本发明的IGF-II突变蛋白质进一步包括对应于成熟人类IGF-II的位置1-7的氨基酸的缺失或置换。在各种实施例中，本发明的IGF-II突变蛋白质进一步含有对应于成熟人类IGF-II的位置62-67的氨基酸的缺失或置换。在各种实施例中，本发明的IGF-II突变蛋白质进一步在对应于成熟人类IGF-II的Tyr27、Leu43或Ser26的位置处含有氨基酸取代。在各种实施例中，本发明的IGF-II突变蛋白质含有至少一个选自下组的氨基酸取代：Tyr27Leu、Leu43Val、Ser26Phe及其组合。在各种实施例中，本发明的IGF-II突变蛋白质含有对应于成熟人类IGF-II的位置48-55的氨基酸。在各种实施例中，本发明的IGF-II突变蛋白质含有至少三个选自下组的氨基酸：对应于成熟人类IGF-II的位置8、48、49、50、54及55的氨基酸。在各种实施例中，本发明的IGF-II突变蛋白质在对应于成熟人类IGF-II的位置54及55的位置处含有各自在pH 7.4下不带电荷或带负电荷的氨基酸。在各种实施例中，相对于天然存在的人类IGF-II对IGF-I受体的亲和力，IGF-II突变蛋白质对IGF-I受体的结合亲和力减弱。在各种实施例中，IGF-II突变蛋白质为IGF2Δ8-67R37A(也即成熟人类IGF-II的在成熟人类IGF-II的位置37处的Arg经Ala取代的氨基酸8-67)。
在各种实施例中，肽标签连接于溶酶体酶的N末端或C末端，因此其分别为N末端标签或C末端标签。在各种实施例中，肽标签为C末端标签。
在一些实施例中，适于本发明的溶酶体酶为人类α-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(Naglu)(图1)或其功能性片段或变异体。在一些实施例中，适于本发明的溶酶体酶包括人类α-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶的氨基酸1-743或人类α-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶的缺乏信号序列的氨基酸24-743。
在各种实施例中，本发明的靶向治疗性融合蛋白进一步在溶酶体酶与IGF-II突变蛋白质之间包括间隔子。
在各种实施例中，间隔子包含α螺旋结构或刚性结构。
在各种实施例中，间隔子包含一个或多个Gly-Ala-Pro(GAP)(SEQ ID NO:9)、Gly-Pro-Ser(GPS)(SEQ ID NO:10)或Gly-Gly-Ser(GGS)(SEQ ID NO:11)氨基酸序列。
在一些实施例中，间隔子是选自下组：EFGGGGSTR(SEQ ID NO:22)、GAP(SEQ ID NO:9)、GGGGS(SEQ ID NO:12)、GPSGSPG(SEQ ID NO:23)、GPSGSPGT(SEQ ID NO:24)、GPSGSPGH(SEQ ID NO:25)、GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPST(SEQ ID NO:26)、GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSH(SEQ ID NO:27)、GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGPS(SEQ ID NO:28)、GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGPSGAP(SEQ ID NO:29)、GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPS(SEQ ID NO:30)、GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGAP(SEQ ID NO:31)、GGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPS(SEQ ID NO:32)、GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPSGAP(SEQ ID NO:33)、GGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPS(SEQ ID NO:34)、GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPSGAP(SEQ ID NO:35)、GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPS(SEQ ID NO:36)、GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGAP(SEQ ID NO:37)、GGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGPS(SEQ ID NO:38)、GAPGGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGPSGAP(SEQ ID NO:39)、GGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGGSAAAASGGGPS(SEQ ID NO:40)、GAPGGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGGSAAAASGGGPSGAP(SEQ ID NO:41)、GGGGSGGGGSAAAASGGGPSGGGGSAAAASGGGPSGGGGSAAAASGGGPS(SEQ ID NO:42)、GAPGGGGSGGGGSAAAASGGGPSGGGGSAAAASGGGPSGGGGSAAAASGGGPSGAP(SEQ ID NO:43)、GGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPGPS(SEQ IDNO:44)、GAPGGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPGPSGAP(SEQ ID NO:45)、GGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTGPS(SEQID NO:46)、GAPGGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTGPSGAP(SEQ ID NO:47)、GGGSPAPTPTPAPTPAPTPAGGGPS(SEQ ID NO:48)、GAPGGGSPAPTPTPAPTPAPTPAGGGPSGAP(SEQ ID NO:49)、GGGSPAPAPTPAPAPTPAPAGGGPS(SEQ ID NO:50)、GAPGGGSPAPAPTPAPAPTPAPAGGGPSGAP(SEQ ID NO:51)、GGGSAEAAAKEAAAKEAAAKAGGPS(SEQ ID NO:52)、GAPGGGSAEAAAKEAAAKEAAAKAGGPSGAP(SEQ ID NO:53)、GGGSPAEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKAPSGGG(SEQ ID NO:54)、GAPGGGSPAEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKAPSGGGGAP(SEQ IDNO:55)、GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:56)、GAPGGGGSGGGGSGGGGSGAP(SEQ ID NO:57)、GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:58)、GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGAP(SEQ ID NO:59)、GGGGA(SEQ ID NO:60)、GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPST(SEQ ID NO:61)、GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSH(SEQ ID NO:62)、GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGPS(SEQ ID NO:63)、GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGPSGAP(SEQ ID NO:64)、GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPS(SEQ ID NO:65)、GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGAP(SEQ ID NO:66)、GGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPS(SEQ ID NO:67)、GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPSGAP(SEQ ID NO:68)、GGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPS(SEQ ID NO:69)、GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPSGAP(SEQ ID NO:70)、GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPS(SEQ IDNO:71)、GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGAP(SEQ ID NO:72)、GGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGPS(SEQ ID NO:73)、GAPGGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGPSGAP(SEQ ID NO:74)、GGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGGAAAAASGGGPS(SEQ ID NO:75)、GAPGGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGGAAAAASGGGPSGAP(SEQ ID NO:76)、GGGGAGGGGAAAAASGGGPSGGGGAAAAASGGGPSGGGGAAAAASGGGPS(SEQ ID NO:77)、GAPGGGGAGGGGAAAAASGGGPSGGGGAAAAASGGGPSGGGGAAAAASGGGPSGAP(SEQ ID NO:78)、GGGGAGGGGAGGGGA(SEQ ID NO:79)、GAPGGGGAGGGGAGGGGAGAP(SEQ ID NO:80)、GGGGAGGGGAGGGGAGGGGA(SEQ ID NO:81)、GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGAP(SEQ ID NO:82)、GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPS[或(GGGGA)8GGGPS](SEQ ID NO:83)、GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSH[或(GGGGA)8GGGPSH](SEQ ID NO:84)、GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPS[或(GGGGA)9GGGPS](SEQ ID NO:85)、GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSH[或(GGGGA)9GGGPSH](SEQ ID NO:86)、GGGGPAPGPGPAPGPAPGPAGGGPS(SEQ ID NO:87)、GAPGGGGPAPGPGPAPGPAPGPAGGGPGGAP(SEQ ID NO:88)、GGGGPAPAPGPAPAPGPAPAGGGPS(SEQ ID NO:89)及GAPGGGGPAPAPGPAPAPGPAPAGGGPGGAP(SEQ ID NO:90)。
在一些实施例中，间隔子是选自下组：GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPS(SEQ ID NO:36)、GGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPGPS(SEQ IDNO:44)、GAPGGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPGPSGAP(SEQ ID NO:45)、GGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTGPS(SEQID NO:46)、GAPGGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTGPSGAP(SEQ ID NO:47)、GGGSPAPTPTPAPTPAPTPAGGGPS(SEQ ID NO:48)、GAPGGGSPAPTPTPAPTPAPTPAGGGPSGAP(SEQ ID NO:49)、GGGSPAPAPTPAPAPTPAPAGGGPS(SEQ ID NO:50)、GAPGGGSPAPAPTPAPAPTPAPAGGGPSGAP(SEQ ID NO:51)、GGGSAEAAAKEAAAKEAAAKAGGPS(SEQ ID NO:52)、GAPGGGSAEAAAKEAAAKEAAAKAGGPSGAP(SEQ ID NO:53)、GGGSPAEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKAPSGGG(SEQ ID NO:54)、GAPGGGSPAEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKAPSGGGGAP(SEQ IDNO:55)及GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPS(SEQ ID NO:71)。
在一些实施例中，间隔子是选自下组：GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPS(SEQ ID NO:36)、GAPGGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTGPSGAP(SEQ ID NO:47)、GAPGGGSPAPAPTPAPAPTPAPAGGGPSGAP(SEQ ID NO:51)、GAPGGGSPAEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKAPSGGGGAP(SEQID NO:55)及GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPS(SEQ ID NO:71)。
在各种实施例中，融合蛋白还包含药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
本发明也提供编码如上在各种实施例中所述的IGF-II突变蛋白质或靶向治疗性融合蛋白的核酸。本发明进一步提供含有本发明的核酸的各种细胞。
本发明提供适于治疗溶酶体储积疾病的含有治疗有效量的本发明的靶向治疗性融合蛋白的药物组合物。本发明进一步提供治疗溶酶体储积疾病的方法，其包含向需要治疗的对象给予本发明的靶向治疗性融合蛋白。在一些实施例中，溶酶体储积疾病为IIIB型黏多糖病(B型山菲立普综合征)。
在另一态样中，本发明提供一种产生靶向治疗性融合蛋白的方法，其包括在细胞培养基中培养哺乳动物细胞的步骤，其中所述哺乳动物细胞携带特定言的如本文各种实施例中所述的本发明的核酸；且在允许表达该靶向治疗性融合蛋白的条件下进行培养。
在另一态样中，本发明提供一种产生靶向治疗性融合蛋白的方法，其包括在细胞培养基中培养缺乏弗林蛋白酶的细胞(例如缺乏弗林蛋白酶的哺乳动物细胞)，其中所述缺乏弗林蛋白酶的细胞携带编码包含溶酶体酶及氨基酸序列与成熟人类IGF-II至少70％一致的IGF-II突变蛋白质的融合蛋白的核酸，其中该IGF-II突变蛋白质以甘露糖-6-磷酸非依赖性方式结合人类阳离子非依赖性甘露糖-6-磷酸受体；且其中在允许表达该靶向治疗性融合蛋白的条件下进行培养。
在各种实施例中，意欲某些包含如本文所述之间隔子的靶向治疗性蛋白质相较于包含不同间隔肽的靶向治疗性蛋白质在重组表达时展现活性蛋白质的表达增加。在各种实施例中，也意欲本文所述的靶向治疗性蛋白质相较于本文其它靶向治疗性蛋白质可具有增加的活性。意欲相较于包含不同间隔肽的其它靶向治疗性蛋白质展现活性蛋白质的表达增加及/或具有增加的活性的彼等靶向治疗性蛋白质用于进一步实验。
在另一态样中，本发明提供一种治疗对象的溶酶体储积疾病的方法，其包含向该对象给予治疗有效量的包含融合蛋白的药物组合物，该融合蛋白包含溶酶体酶、氨基酸序列与成熟人类IGF-II的氨基酸8-67至少70％一致的肽标签及位于该溶酶体酶氨基酸序列与该IGF-II肽标签之间的间隔肽。在各种实施例中，间隔肽包含一个或多个GGGPS(SEQ ID NO:14)或GGGSP(SEQ ID NO:15)氨基酸序列，且任选地还包含以下一个或多个：(i)GAP(SEQ ID NO:9)、(ii)GGGGS(SEQ ID NO:12)、(iii)GGGS(SEQ ID NO:16)、(iv)AAAAS(SEQ IDNO:17)、(v)AAAS(SEQ ID NO:18)、(vi)PAPA(SEQ ID NO:19)、(vii)TPAPA(SEQ ID NO:20)、(viii)AAAKE(SEQ ID NO:21)或(ix)GGGGA(SEQID NO:60)。
在各种实施例中，间隔肽包含选自下组的氨基酸序列：(GGGGS)n(SEQ IDNO:12、56、58、91-94)、(GGGGS)n-GGGPS(SEQ ID NO:36、95-100)、GAP-(GGGGS)n-GGGPS(SEQ ID NO:101-107)、GAP-(GGGGS)n-GGGPS-GAP(SEQ ID NO:37、108-113)、GAP-(GGGGS)n-GGGPS-(GGGGS)n-GAP(SEQ ID NO:114-162)、GAP-GGGPS-(GGGGS)n-GAP(SEQ ID NO:163-169)、GAP-(GGGGS)n-AAAAS-GGGPS-(GGGGS)n-AAAA-GAP(SEQ ID NO:170-218)、GAP-(GGGGS)n-PAPAP-(Xaa)n-GAP(SEQ ID NO:219-267)、GAP-(GGGGS)n-PAPAPT-(Xaa)n-GAP(SEQ ID NO:268-316)、GAP-(GGGGS)n-(Xaa)n-PAPAP-(Xaa)n-(AAAKE)n-(Xaa)n-(GGGGS)n-GAP(SEQID NO:544-551)、(GGGGA)n(SEQ ID NO:60、79、81、317-320)、(GGGGA)n-GGGPS(SEQ ID NO:321-326)、GAP-(GGGGA)n-GGGPS(SEQ ID NO:327-333)、GAP-(GGGGA)n-GGGPS-GAP(SEQ ID NO:334-340)、GAP-(GGGGA)n-GGGPS-(GGGGA)n-GAP(SEQ ID NO:341-389)、GAP-GGGPS-(GGGGA)n-GAP(SEQ ID NO:390-396)、GAP-(GGGGA)n-AAAAS-GGGPS-(GGGGA)n-AAAA-GAP(SEQ ID NO:397-445)、GAP-(GGGGA)n-PAPAP-(Xaa)n-GAP(SEQ ID NO:446-494)、GAP-(GGGGA)n-PAPAPT-(Xaa)n-GAP(SEQ ID NO:495-543)、GAP-(GGGGA)n-(Xaa)n-PAPAP-(Xaa)n-(AAAKE)n-(Xaa)n-(GGGGA)n-GAP(SEQID NO:552-559)；其中n为1至7，任选地n为1至4。
在各种实施例中，间隔肽具有选自下组的氨基酸序列：EFGGGGSTR(SEQID NO:22)、GAP(SEQ ID NO:9)、GGGGS(SEQ ID NO:12)、GPSGSPG(SEQ IDNO:23)、GPSGSPGT(SEQ ID NO:24)、GPSGSPGH(SEQ ID NO:25)、GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPST(SEQ ID NO:26)、GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSH(SEQ ID NO:27)、GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGPS(SEQ ID NO:28)、GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGPSGAP(SEQ ID NO:29)、GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPS(SEQ ID NO:30)、GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGAP(SEQ ID NO:31)、GGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPS(SEQ ID NO:32)、GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPSGAP(SEQ ID NO:33)、GGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPS(SEQ ID NO:34)、GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPSGAP(SEQ ID NO:35)、GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPS(SEQ ID NO:36)、GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGAP(SEQ ID NO:37)、GGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGPS(SEQ ID NO:38)、GAPGGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGPSGAP(SEQ ID NO:39)、GGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGGSAAAASGGGPS(SEQ ID NO:40)、GAPGGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGGSAAAASGGGPSGAP(SEQ ID NO:41)、GGGGSGGGGSAAAASGGGPSGGGGSAAAASGGGPSGGGGSAAAASGGGPS(SEQ ID NO:42)、GAPGGGGSGGGGSAAAASGGGPSGGGGSAAAASGGGPSGGGGSAAAASGGGPSGAP(SEQ ID NO:43)、GGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPGPS(SEQ IDNO:44)、GAPGGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPGPSGAP(SEQ ID NO:45)、GGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTGPS(SEQID NO:46)、GAPGGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTGPSGAP(SEQ ID NO:47)、GGGSPAPTPTPAPTPAPTPAGGGPS(SEQ ID NO:48)、GAPGGGSPAPTPTPAPTPAPTPAGGGPSGAP(SEQ ID NO:49)、GGGSPAPAPTPAPAPTPAPAGGGPS(SEQ ID NO:50)、GAPGGGSPAPAPTPAPAPTPAPAGGGPSGAP(SEQ ID NO:51)、GGGSAEAAAKEAAAKEAAAKAGGPS(SEQ ID NO:52)、GAPGGGSAEAAAKEAAAKEAAAKAGGPSGAP(SEQ ID NO:53)、GGGSPAEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKAPSGGG(SEQ ID NO:54)、GAPGGGSPAEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKAPSGGGGAP(SEQ IDNO:55)、GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:56)、GAPGGGGSGGGGSGGGGSGAP(SEQ ID NO:57)、GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:58)、GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGAP(SEQ ID NO:59)、GGGGA(SEQ ID NO:60)、GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPST(SEQ ID NO:61)、GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSH(SEQ ID NO:62)、GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGPS(SEQ ID NO:63)、GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGPSGAP(SEQ ID NO:64)、GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPS(SEQ ID NO:65)、GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGAP(SEQ ID NO:66)、GGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPS(SEQ ID NO:67)、GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPSGAP(SEQ ID NO:68)、GGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPS(SEQ ID NO:69)、GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPSGAP(SEQ ID NO:70)、GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPS(SEQ IDNO:71)、GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGAP(SEQ ID NO:72)、GGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGPS(SEQ ID NO:73)、GAPGGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGPSGAP(SEQ ID NO:74)、GGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGGAAAAASGGGPS(SEQ ID NO:75)、GAPGGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGGAAAAASGGGPSGAP(SEQ ID NO:76)、GGGGAGGGGAAAAASGGGPSGGGGAAAAASGGGPSGGGGAAAAASGGGPS(SEQ ID NO:77)、GAPGGGGAGGGGAAAAASGGGPSGGGGAAAAASGGGPSGGGGAAAAASGGGPSGAP(SEQ ID NO:78)、GGGGAGGGGAGGGGA(SEQ ID NO:79)、GAPGGGGAGGGGAGGGGAGAP(SEQ ID NO:80)、GGGGAGGGGAGGGGAGGGGA(SEQ ID NO:81)、GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGAP(SEQ ID NO:82)、GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPS[或(GGGGA)8GGGPS](SEQ ID NO:83)、GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSH[或(GGGGA)8GGGPSH](SEQ ID NO:84)、GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPS[或(GGGGA)9GGGPS](SEQ ID NO:85)、GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSH[或(GGGGA)9GGGPSH](SEQ ID NO:86)、GGGGPAPGPGPAPGPAPGPAGGGPS(SEQ ID NO:87)、GAPGGGGPAPGPGPAPGPAPGPAGGGPGGAP(SEQ ID NO:88)、GGGGPAPAPGPAPAPGPAPAGGGPS(SEQ ID NO:89)及GAPGGGGPAPAPGPAPAPGPAPAGGGPGGAP(SEQ ID NO:90)。
在各种实施例中，间隔肽具有选自下组的氨基酸序列：GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPS(SEQ ID NO:36)、GGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPGPS(SEQ IDNO:44)、GAPGGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPGPSGAP(SEQ ID NO:45)、GGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTGPS(SEQID NO:46)、GAPGGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTGPSGAP(SEQ ID NO:47)、GGGSPAPTPTPAPTPAPTPAGGGPS(SEQ ID NO:48)、GAPGGGSPAPTPTPAPTPAPTPAGGGPSGAP(SEQ ID NO:49)、GGGSPAPAPTPAPAPTPAPAGGGPS(SEQ ID NO:50)、GAPGGGSPAPAPTPAPAPTPAPAGGGPSGAP(SEQ ID NO:51)、GGGSAEAAAKEAAAKEAAAKAGGPS(SEQ ID NO:52)、GAPGGGSAEAAAKEAAAKEAAAKAGGPSGAP(SEQ ID NO:53)、GGGSPAEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKAPSGGG(SEQ ID NO:54)、GAPGGGSPAEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKAPSGGGGAP(SEQ IDNO:55)及GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPS(SEQ ID NO:71)。
在各种实施例中，间隔肽具有选自下组的氨基酸序列：GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPS(SEQ ID NO:36)、GAPGGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTGPSGAP(SEQ ID NO:47)、GAPGGGSPAPAPTPAPAPTPAPAGGGPSGAP(SEQ ID NO:51)、GAPGGGSPAEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKAPSGGGGAP(SEQID NO:55)及GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPS(SEQ ID NO:71)。
由本文方法涵盖的示范性溶酶体储积疾病包括表1中所述者。意欲使用包含溶酶体储积疾病中缺乏的也揭露于表1中的酶的靶向治疗性融合蛋白治疗溶酶体储积疾病。
在各种实施例中，本发明提供一种治疗对象的IIIB型黏多糖病(B型山菲立普综合征)的方法，其包含向该对象给予治疗有效量的包含融合蛋白的药物组合物，该融合蛋白包含与人类α-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(Naglu)蛋白质(SEQ ID NO:1)至少85％一致的氨基酸序列、氨基酸序列与成熟人类IGF-II的氨基酸8-67至少70％一致的肽标签及位于该Naglu氨基酸序列与该IGF-II肽标签之间的间隔肽。在各种实施例中，间隔子包含氨基酸序列GAP(SEQ ID NO:9)、GPS(SEQ ID NO:10)或GGS(SEQ ID NO:11)。
在各种实施例中，间隔子序列包含在成熟人类IGF-II的氨基酸与人类Naglu的氨基酸之间的氨基酸Gly-Pro-Ser(GPS)(SEQ ID NO:10)。
在各种实施例中，间隔肽包含一个或多个GGGGS(SEQ ID NO:12)或GGGS(SEQ ID NO:16)氨基酸序列。在各种实施例中，间隔肽包含一个或多个GGGPS(SEQ ID NO:14)或GGGSP(SEQ ID NO:15)氨基酸序列。在各种实施例中，间隔肽包含一个或多个AAAAS(SEQ ID NO:17)或AAAS(SEQ ID NO:18)氨基酸序列。在各种实施例中，间隔肽包含一个或多个PAPA(SEQ ID NO:19)或TPAPA(SEQ ID NO:20)氨基酸序列。在各种实施例中，间隔肽包含一个或多个AAAKE(SEQ ID NO:21)氨基酸序列。在各种实施例中，间隔肽包含一个或多个GGGGA(SEQ ID NO:60)氨基酸序列。
在各种实施例中，间隔肽包含选自下组的氨基酸序列：(GGGGS)n(SEQ IDNO:12、56、58、91-94)、(GGGGS)n-GGGPS(SEQ ID NO:36、95-100)、GAP-(GGGGS)n-GGGPS(SEQ ID NO:101-107)、GAP-(GGGGS)n-GGGPS-GAP(SEQ ID NO:37、108-113)、GAP-(GGGGS)n-GGGPS-(GGGGS)n-GAP(SEQ ID NO:114-162)、GAP-GGGPS-(GGGGS)n-GAP(SEQ ID NO:163-169)、GAP-(GGGGS)n-AAAAS-GGGPS-(GGGGS)n-AAAA-GAP(SEQ ID NO:170-218)、GAP-(GGGGS)n-PAPAP-(Xaa)n-GAP(SEQ ID NO:219-267)、GAP-(GGGGS)n-PAPAPT-(Xaa)n-GAP(SEQ ID NO:268-316)、GAP-(GGGGS)n-(Xaa)n-PAPAP-(Xaa)n-(AAAKE)n-(Xaa)n-(GGGGS)n-GAP(SEQID NO:544-551)、(GGGGA)n(SEQ ID NO:60、79、81、317-320)、(GGGGA)n-GGGPS(SEQ ID NO:321-326)、GAP-(GGGGA)n-GGGPS(SEQ ID NO:327-333)、GAP-(GGGGA)n-GGGPS-GAP(SEQ ID NO:334-340)、GAP-(GGGGA)n-GGGPS-(GGGGA)n-GAP(SEQ ID NO:341-389)、GAP-GGGPS-(GGGGA)n-GAP(SEQ ID NO:390-396)、GAP-(GGGGA)n-AAAAS-GGGPS-(GGGGA)n-AAAA-GAP(SEQ ID NO:397-445)、GAP-(GGGGA)n-PAPAP-(Xaa)n-GAP(SEQ ID NO:446-494)、GAP-(GGGGA)n-PAPAPT-(Xaa)n-GAP(SEQ ID NO:495-543)、GAP-(GGGGA)n-(Xaa)n-PAPAP-(Xaa)n-(AAAKE)n-(Xaa)n-(GGGGA)n-GAP(SEQID NO:552-559)；其中n为1至7，任选地其中n为1至4。
在各种实施例中，本发明提供一种使糖胺聚糖(GAG)体内水平降低的方法，其包含向罹患IIIB型黏多糖病(B型山菲立普综合征)的对象给予有效量的融合蛋白，该融合蛋白包含i)与人类α-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(Naglu)蛋白质(SEQ IDNO:1)至少85％一致的氨基酸序列，ii)氨基酸序列与成熟人类IGF-II的氨基酸8-67至少70％一致的肽标签，及iii)位于该Naglu氨基酸序列与该IGF-II肽标签之间的间隔肽。
在各种实施例中，间隔子序列包含在成熟人类IGF-II的氨基酸与人类Naglu的氨基酸之间的氨基酸Gly-Ala-Pro(GAP)(SEQ ID NO:9)的一个或多个复本。
在各种实施例中，间隔肽是选自下组：EFGGGGSTR(SEQ ID NO:22)、GAP(SEQ ID NO:9)、GGGGS(SEQ ID NO:12)、GPSGSPG(SEQ ID NO:23)、GPSGSPGT(SEQ ID NO:24)、GPSGSPGH(SEQ ID NO:25)、GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPST(SEQ ID NO:26)、GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSH(SEQ ID NO:27)、GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGPS(SEQ ID NO:28)、GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGPSGAP(SEQ ID NO:29)、GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPS(SEQ ID NO:30)、GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGAP(SEQ ID NO:31)、GGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPS(SEQ ID NO:32)、GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPSGAP(SEQ ID NO:33)、GGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPS(SEQ ID NO:34)、GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPSGAP(SEQ ID NO:35)、GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPS(SEQ ID NO:36)、GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGAP(SEQ ID NO:37)、GGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGPS(SEQ ID NO:38)、GAPGGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGPSGAP(SEQ ID NO:39)、GGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGGSAAAASGGGPS(SEQ ID NO:40)、GAPGGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGGSAAAASGGGPSGAP(SEQ ID NO:41)、GGGGSGGGGSAAAASGGGPSGGGGSAAAASGGGPSGGGGSAAAASGGGPS(SEQ ID NO:42)、GAPGGGGSGGGGSAAAASGGGPSGGGGSAAAASGGGPSGGGGSAAAASGGGPSGAP(SEQ ID NO:43)、GGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPGPS(SEQ IDNO:44)、GAPGGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPGPSGAP(SEQ ID NO:45)、GGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTGPS(SEQID NO:46)、GAPGGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTGPSGAP(SEQ ID NO:47)、GGGSPAPTPTPAPTPAPTPAGGGPS(SEQ ID NO:48)、GAPGGGSPAPTPTPAPTPAPTPAGGGPSGAP(SEQ ID NO:49)、GGGSPAPAPTPAPAPTPAPAGGGPS(SEQ ID NO:50)、GAPGGGSPAPAPTPAPAPTPAPAGGGPSGAP(SEQ ID NO:51)、GGGSAEAAAKEAAAKEAAAKAGGPS(SEQ ID NO:52)、GAPGGGSAEAAAKEAAAKEAAAKAGGPSGAP(SEQ ID NO:53)、GGGSPAEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKAPSGGG(SEQ ID NO:54)、GAPGGGSPAEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKAPSGGGGAP(SEQ IDNO:55)、GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:56)、GAPGGGGSGGGGSGGGGSGAP(SEQ ID NO:57)、GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:58)、GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGAP(SEQ ID NO:59)、GGGGA(SEQ ID NO:60)、GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPST(SEQ ID NO:61)、GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSH(SEQ ID NO:62)、GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGPS(SEQ ID NO:63)、GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGPSGAP(SEQ ID NO:64)、GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPS(SEQ ID NO:65)、GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGAP(SEQ ID NO:66)、GGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPS(SEQ ID NO:67)、GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPSGAP(SEQ ID NO:68)、GGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPS(SEQ ID NO:69)、GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPSGAP(SEQ ID NO:70)、GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPS(SEQ IDNO:71)、GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGAP(SEQ ID NO:72)、GGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGPS(SEQ ID NO:73)、GAPGGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGPSGAP(SEQ ID NO:74)、GGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGGAAAAASGGGPS(SEQ ID NO:75)、GAPGGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGGAAAAASGGGPSGAP(SEQ ID NO:76)、GGGGAGGGGAAAAASGGGPSGGGGAAAAASGGGPSGGGGAAAAASGGGPS(SEQ ID NO:77)、GAPGGGGAGGGGAAAAASGGGPSGGGGAAAAASGGGPSGGGGAAAAASGGGPSGAP(SEQ ID NO:78)、GGGGAGGGGAGGGGA(SEQ ID NO:79)、GAPGGGGAGGGGAGGGGAGAP(SEQ ID NO:80)、GGGGAGGGGAGGGGAGGGGA(SEQ ID NO:81)、GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGAP(SEQ ID NO:82)、GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPS[或(GGGGA)8GGGPS](SEQ ID NO:83)、GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSH[或(GGGGA)8GGGPSH](SEQ ID NO:84)、GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPS[或(GGGGA)9GGGPS](SEQ ID NO:85)、GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSH[或(GGGGA)9GGGPSH](SEQ ID NO:86)、GGGGPAPGPGPAPGPAPGPAGGGPS(SEQ ID NO:87)、GAPGGGGPAPGPGPAPGPAPGPAGGGPGGAP(SEQ ID NO:88)、GGGGPAPAPGPAPAPGPAPAGGGPS(SEQ ID NO:89)及GAPGGGGPAPAPGPAPAPGPAPAGGGPGGAP(SEQ ID NO:90)。
在各种实施例中，间隔肽是选自下组：GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPS(SEQ ID NO:36)、GGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPGPS(SEQ IDNO:44)、GAPGGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPGPSGAP(SEQ ID NO:45)、GGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTGPS(SEQID NO:46)、GAPGGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTGPSGAP(SEQ ID NO:47)、GGGSPAPTPTPAPTPAPTPAGGGPS(SEQ ID NO:48)、GAPGGGSPAPTPTPAPTPAPTPAGGGPSGAP(SEQ ID NO:49)、GGGSPAPAPTPAPAPTPAPAGGGPS(SEQ ID NO:50)、GAPGGGSPAPAPTPAPAPTPAPAGGGPSGAP(SEQ ID NO:51)、GGGSAEAAAKEAAAKEAAAKAGGPS(SEQ ID NO:52)、GAPGGGSAEAAAKEAAAKEAAAKAGGPSGAP(SEQ ID NO:53)、GGGSPAEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKAPSGGG(SEQ ID NO:54)、GAPGGGSPAEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKAPSGGGGAP(SEQ IDNO:55)及GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPS(SEQ ID NO:71)。
在各种实施例中，间隔肽是选自下组：GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPS(SEQ ID NO:36)、GAPGGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTGPSGAP(SEQ ID NO:47)、GAPGGGSPAPAPTPAPAPTPAPAGGGPSGAP(SEQ ID NO:51)、GAPGGGSPAEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKAPSGGGGAP(SEQID NO:55)及GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPS(SEQ ID NO:71)。
在各种实施例中，溶酶体靶向域或IGF-II肽标签包含成熟人类IGF-II(SEQID NO:2、4)的氨基酸8-67。在各种实施例中，IGF-II肽标签在残基Arg37处包含突变。在各种实施例中，突变为丙氨酸被取代成精氨酸。在各种实施例中，溶酶体靶向域或IGF-II肽标签包含IGF2Δ8-67R37A。
在各种实施例中，融合蛋白包含人类Naglu(SEQ ID NO:1、3)的氨基酸1-743。在各种实施例中，融合蛋白包含人类Naglu的氨基酸24-743。
在各种实施例中，融合蛋白的有效量在每千克对象体重约0.1-1mg、约1-5mg、约2.5-20mg、约5-20mg、约10-50mg、或20-100mg的范围内。在各种实施例中，融合蛋白的有效量为每千克对象体重约2.5-20mg。
在各种实施例中，融合蛋白是鞘内、静脉内、肌肉内、非经肠、经皮或经黏膜给予。在各种实施例中，融合蛋白是鞘内给予。在各种实施例中，鞘内投药任选地还包含静脉内给予融合蛋白。
在各种实施例中，鞘内投药包含将融合蛋白引入脑室、腰区或大池中。
在各种实施例中，融合蛋白是每两月、每月、每三周、每两周、每周、每日或在可变间隔下给予。
在各种实施例中，治疗导致脑组织中的糖胺聚糖(GAG)水平降低。进一步意欲治疗导致脑组织中的溶酶体储积颗粒降低。
也涵盖用于治疗溶酶体储积疾病的包含如本文所述的靶向治疗性融合蛋白的组合物。示范性溶酶体储积疾病包括表1中所述者。
本发明的其它特征、目标及优势在以下详细描述中显而易知。然而，应了解尽管指示本发明的实施例，但详细描述仅藉由说明而非限制方式给出。在本发明的范畴内的各种变化及修改将根据详细描述而变得为熟习此项技术者显而易知。
附图简要说明
图式仅出于说明目的而非出于限制目的。
图1描述包含(A)Naglu及(B)包含IGF-II的残基8-67且在残基37处具有氨基酸取代R37A(Arg37Ala)的IGF-II肽的示范性治疗性融合蛋白的一部分的氨基酸序列。
图2描述包含(A)Naglu及(B)包含IGF-II的残基8-67且在残基37处具有氨基酸取代R37A(Arg37Ala)的IGF-II肽的示范性治疗性融合蛋白的一部分的核苷酸序列。
图3揭露意欲用于治疗性融合蛋白中的示范性间隔子序列。
实施方式
定义
改善：如本文所用，术语“改善”意谓预防、减轻或缓解对象的状态或改良对象的状态。改善包括但不需要使疾病状况完全恢复或完全预防。在一些实施例中，改善包括降低相关疾病组织的溶酶体内部的物质累积。
弗林蛋白酶抗性IGF-II突变蛋白质：如本文所用，术语“弗林蛋白酶抗性IGF-II突变蛋白质”是指基于IGF-II的肽，其含有消除至少一个天然弗林蛋白酶蛋白酶裂解位点或改变接近或邻近于天然弗林蛋白酶蛋白酶裂解位点的序列以使相较于野生型人类IGF-II肽，弗林蛋白酶裂解得以阻止、抑制、降低或减缓的经改变氨基酸序列。如本文所用，弗林蛋白酶抗性IGF-II突变蛋白质也称为对弗林蛋白酶具有抗性的IGF-II突变蛋白质。
弗林蛋白酶蛋白酶裂解位点：如本文所用，术语“弗林蛋白酶蛋白酶裂解位点”(也称为“弗林蛋白酶裂解位点”或“弗林蛋白酶裂解序列”)是指充当由弗林蛋白酶或弗林蛋白酶样蛋白酶进行酶促蛋白酶裂解的识别序列的肽或蛋白质。通常，弗林蛋白酶蛋白酶裂解位点具有共同序列Arg-X-X-Arg(SEQ IDNO:6)，X为任何氨基酸。裂解位点位于序列中的羧基末端精氨酸(Arg)残基的后。在一些实施例中，弗林蛋白酶裂解位点可具有共同序列Lys/Arg-X-X-X-Lys/Arg-Arg(SEQ ID NO:7)，X为任何氨基酸。裂解位点位于序列中的羧基末端精氨酸(Arg)残基的后。
弗林蛋白酶：如本文所用，术语“弗林蛋白酶”是指可识别且裂解如本文定义的弗林蛋白酶蛋白酶裂解位点的任何蛋白酶，包括弗林蛋白酶或弗林蛋白酶样蛋白酶。弗林蛋白酶也称为成对碱性氨基酸裂解酶(paired basic amino acidcleaving enzyme，PACE)。弗林蛋白酶属于枯草杆菌蛋白酶(subtilisin)样原蛋白转化酶家族。编码弗林蛋白酶的基因称为FUR(FES上游区域)。
缺乏弗林蛋白酶的细胞：如本文所用，术语“缺乏弗林蛋白酶的细胞”是指弗林蛋白酶蛋白酶活性受抑制、降低或消除的任何细胞。缺乏弗林蛋白酶的细胞包括不产生弗林蛋白酶或产生降低量的弗林蛋白酶或缺陷性弗林蛋白酶蛋白酶的哺乳动物细胞与非哺乳动物细胞两者。
糖基化非依赖性溶酶体靶向：如本文所用，术语“糖基化非依赖性溶酶体靶向”(也称为“GILT”)是指甘露糖-6-磷酸非依赖性溶酶体靶向。
人类α-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶：如本文所用，术语“人类α-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶”(也称为“Naglu”)是指能够降低哺乳动物溶酶体中的糖胺聚糖(GAG)含量或可救助或改善一或多种MPS IIIB(B型山菲立普综合征)症状的前驱体(也即含有天然Naglu信号肽序列)或经加工(也即缺乏天然Naglu信号肽序列)野生型形式的人类α-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶或其功能性片段或变异体。如本文所用，术语“功能性”在其涉及Naglu时是指Naglu酶能够由哺乳动物溶酶体摄取且具有足以降低哺乳动物溶酶体中的储积物质(也即糖胺聚糖(GAG))的酶活性。
IGF-II突变蛋白质：如本文所用，术语“IGF-II突变蛋白质”是指含有经改变氨基酸序列的基于IGF-II的肽。如本文所用，术语“弗林蛋白酶抗性IGF-II突变蛋白质”是指基于IGF-II的肽，其含有消除至少一个天然弗林蛋白酶蛋白酶裂解位点或改变接近或邻近于天然弗林蛋白酶蛋白酶裂解位点的序列以使相较于野生型人类IGF-II肽，弗林蛋白酶裂解得以阻止、抑制、降低或减缓的经改变氨基酸序列。如本文所用，弗林蛋白酶抗性IGF-II突变蛋白质也称为对弗林蛋白酶具有抗性的IGF-II突变蛋白质。
改良、增加或降低：如本文所用，术语“改良”、“增加”或“降低”或语法等效形式指示相对于基线量测结果的值，该基线量测结果诸如同一个体中在启始本文所述的治疗的前的量测结果或对照个体(或多个对照个体)中在不存在本文所述的治疗下的量测结果。“对照个体”为受与所治疗个体相同形式的溶酶体储积疾病(例如MPS IIIB(B型山菲立普综合征))折磨的个体，其年龄与所治疗个体近似相同(以确保所治疗个体及对照个体的疾病阶段类似)。
个体/对象、患者：如本文所用，术语“个体/对象”或“患者”是指人类或非人类哺乳动物对象。所治疗对象(也称为“患者”)为罹患溶酶体储积疾病，例如MPS IIIB(B型山菲立普综合征)(也即婴儿、青少年或成年发作或重度/经典类型或减弱类型MPS IIIB(B型山菲立普综合征))或有可能显现溶酶体储积疾病(例如MPS IIIB(B型山菲立普综合征))的对象(胎儿、婴儿、儿童、青少年或成年人类)。
溶酶体储积疾病：如本文所用，“溶酶体储积疾病”是指一组由溶酶体中缺乏至少一种为使巨分子断裂成肽、氨基酸、单醣、核酸及脂肪酸所需的酶(例如酸水解酶)引起的遗传病症。因此，罹患溶酶体储积疾病的对象在溶酶体中具有累积物质。示范性溶酶体储积疾病列于表1中。
溶酶体酶：如本文所用，术语“溶酶体酶”是指能够降低哺乳动物溶酶体中的累积物质或可救助或改善一或多种溶酶体储积疾病症状的任何酶。适于本发明的溶酶体酶包括野生型或经修饰溶酶体酶两者且可使用重组及合成方法产生或自天然来源纯化。示范性溶酶体酶列于表1中。
间隔子：如本文所用，术语“间隔子”(也称为“连接子”)是指融合蛋白中的两个蛋白质部分之间的肽序列。间隔子通常经设计以具有可挠性或插入两个蛋白质部分之间的结构，诸如α螺旋。间隔子可相对较短，例如序列Gly-Ala-Pro(GAP)(SEQ ID NO:9)、Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(GGGGS)(SEQ ID NO:12)、Gly-Gly-Gly-Gly-Ala(GGGGA)(SEQ ID NO:60)或Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Pro(GGGGGP)(SEQ ID NO:13)，或可较长，诸如长度为10-25个氨基酸、25-50个氨基酸或35-55个氨基酸。示范性间隔子序列更详细揭露于详细描述中。
治疗有效量：如本文所用，术语“治疗有效量”或“有效量”是指靶向治疗性融合蛋白的在可适用于任何医学治疗的合理效益/风险比下对所治疗对象赋予治疗效应的量。治疗效应可为客观的(也即可藉由某一测试或标记物量测)或主观的(也即对象指示或感受效应)。特定言的，“治疗有效量”是指治疗性融合蛋白或组合物的有效治疗、改善或预防所要疾病或病状，或诸如藉由改善与疾病相关的症状，预防或延迟疾病发作及/或也减小疾病症状的严重性或频率来展现可侦测治疗或预防效应的量。通常以可包含多个单位剂量的给药方案给予治疗有效量。对于任何特定治疗性融合蛋白，治疗有效量(及/或有效给药方案内的适当单位剂量)可例如视投药途径、与其它医药药剂的组合而变化。此外，用于任何特定患者的特定治疗有效量(及/或单位剂量)可取决于多种因素，包括所治疗病症及病症的严重性；所用特定医药药剂的活性；所用特定组合物；患者的年龄、体重、一般健康状况、性别及膳食；投药时间、投药途径及/或所用特定融合蛋白的排泄或代谢速率；治疗的持续时间；及如医学技术中所熟知的类似因素。
治疗：如本文所用，术语“治疗”是指治疗性融合蛋白或包含该治疗性融合蛋白的药物组合物的部分或完全缓和、改善、减轻、抑制特定疾病、病症及/或病状的一或多种症状或特征、延迟该一或多种症状或特征的发作、减轻该一或多种症状或特征的严重性及/或降低该一或多种症状或特征的发生率的任何投药。此治疗可针对不展现相关疾病、病症及/或病状的征象的对象及/或针对仅展现疾病、病症及/或病状的早期征象的对象。或者或另外，此治疗可针对展现相关疾病、病症及/或病状的一或多种确立征象的对象。举例而言，治疗可是指改良心脏状态(例如增加舒张末期及/或收缩末期容积、或减轻、改善或预防通常见于例如蓬佩病(Pompe disease)中的进行性心肌病)或肺功能(例如使啼哭肺活量增加超过基线量及/或使啼哭期间的氧去饱和正常化)；改良神经发育及/或运动技能(例如增加AIMS计分)；降低储积(例如受疾病影响的对象的组织中的糖胺聚糖(GAG)含量)；或此等效应的任何组合。在一些实施例中，治疗包括改良糖胺聚糖(GAG)清除率，特定言的减轻或预防MPS IIIB(B型山菲立普综合征)相关的神经性症状。
如本发明中所用，术语“约”及“近似”作为等效物加以使用。与或不与约/近似一起用于本发明中的任何数字皆意欲涵盖由一般熟习相关技术者所了解的任何正常波动。
发明的详细描述
本发明提供用于基于糖基化非依赖性溶酶体靶向(GILT)技术达成靶向溶酶体酶的改良方法及组合物。本发明尤其提供对弗林蛋白酶具有抗性及/或对胰岛素受体的结合亲和力降低或减弱及/或对IGF-I受体的结合亲和力降低或减弱的IGF-II突变蛋白质及含有本发明的IGF-II突变蛋白质的靶向治疗性融合蛋白。本发明也提供其制备及使用方法。
本发明的态样详述于以下章节中。使用所述章节不意欲限制本发明。各章节可适用于本发明的任何态样。在本发明中，除非另外陈述，否则使用“或”意谓“及/或”。
溶酶体酶
适于本发明的溶酶体酶包括能够降低哺乳动物溶酶体中的累积物质或可救助或改善一或多种溶酶体储积疾病症状的任何酶。适合溶酶体酶包括野生型或经修饰溶酶体酶两者且可使用重组及合成方法产生或自天然来源纯化。示范性溶酶体酶列于表1中。
表1.溶酶体储积疾病及相关酶缺陷
在一些实施例中，本文涵盖的溶酶体酶包括以下多肽序列：与表1中所示的人类酶的天然存在的聚核苷酸序列具有50-100％，包括50％、55％、60％、65％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％及100％序列一致性，同时仍然编码具有功能性，也即能够降低哺乳动物溶酶体中的累积物质(例如糖胺聚糖(GAG))或可救助或改善一或多种溶酶体储积疾病症状的蛋白质。
关于溶酶体酶序列的“氨基酸序列一致性百分比(％)”定义为在比对序列且必要时引入间隙以达成最大序列一致性百分比，且不考虑任何保守性取代作为序列一致性的一部分的后，候选序列中与天然存在的人类酶序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比。出于确定氨基酸序列一致性百分比的目的的比对可以属于此项技术中的技能的多种方式达成，所述方式例如使用可公开获得的计算机软件，诸如BLAST、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。熟习此项技术者可确定适用于量测比对的参数，包括为历经所比较序列的全长，达成最大对准所需的任何算法。较佳地，WU-BLAST-2软件用于确定氨基酸序列一致性(Altschul等人,Methods in Enzymology 266,460-480(1996)。WU-BLAST-2使用若干搜寻参数，其中大多数被设置成内定值。可调整参数设为以下值：重迭间距＝1，重迭分数＝0.125，字临限值(T)＝11。HSP计分(S)及HSP S2参数为动态值且由程序自身视特定序列的组成来确定，然而，最小值可经调整且如上所指示加以设置。
α-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶
α-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶Naglu是以加工成成熟形式的前驱体分子形式产生。此过程通常在蛋白质进入内质网时藉由移除具有23个氨基酸的信号肽来进行。通常，前驱体形式也称为全长前驱体或全长Naglu蛋白质，其含有743个氨基酸(SEQ ID NO:1)。当前驱体蛋白质进入内质网时，N末端23个氨基酸经裂解，从而产生经加工或成熟形式。因此，意欲N末端23个氨基酸通常不为Naglu蛋白质活性所需。典型野生型或天然存在的人类Naglu蛋白质的成熟形式及全长前驱体形式的氨基酸序列显示于图1中且阐述于SEQ ID NO:1中。人类Naglu的编码区的核苷酸序列阐述于SEQ ID NO:3中。人类Naglu的mRNA序列用Genbank登录号NM_000263加以描述。在各种实施例中，Naglu为具有(氨基酸1-743)或不具有(氨基酸24-743)信号序列的人类Naglu。
美国专利第6,255,096号描述纯化人类α-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(也即82kDa及77kDa)及于CHO细胞中产生的重组哺乳动物α-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(也即89kDa及79kDa)的分子量大于Naglu多肽的推演分子量(也即70kDa)，表明纯化及重组多肽经转译后修饰。也参见Weber等人,Hum Mol Genet 5:771-777,1996。
IIIB型黏多糖病(B型山菲立普综合征)
一种示范性溶酶体储积疾病为IIIB型黏多糖病(MPS IIIB)，也称为B型山菲立普综合征。MPS IIIB B型山菲立普综合征为一种特征在于缺乏酶α-N-乙酰基-葡萄胺糖苷酶(Naglu)的罕见体染色体隐性遗传病症。在不存在此酶下，糖胺聚糖(GAG)，例如GAG硫酸乙酰肝素及部分降解的GAG分子不能自身体清除且累积在各种组织的溶酶体中，从而导致进行性广布体细胞功能障碍(Kakkis等人,NEngl J Med.344(3):182-8,2001)。已显示GAG累积在神经元及神经胶细胞的溶酶体中，且较少积累在脑外部。
已鉴别四种不同形式的MPS III，称为MPS IIIA、B、C及D。各自表示缺乏GAG硫酸乙酰肝素的降解中涉及的四种酶的一(表1)。所有形式皆包括相同临床症状的不同程度，包括面部特征粗糙、肝脾肿大、角膜浑浊及骨骼变形。然而，最值得注意的是重度及进行性丧失认知能力，其不仅与硫酸乙酰肝素在神经元中积累相关，而且也与由原发性GAG积累引起的随后神经节苷脂GM2、GM3及GD2升高相关(Walkley等人,Ann N Y Acad Sci.845:188-99,1998)。
B型山菲立普综合征的一特征性临床特征为中枢神经是统(CNS)退化，其导致损失或不能实现主要发育转折点。进行性认知衰退以痴呆及过早死亡为顶点。疾病通常在幼小儿童中显现其自身，且受影响对象的寿命通常不延长超过接近20岁至20岁出头。
MPS III疾病皆具有通常在幼小儿童中显现的类似症状。受影响婴儿表面上正常，但某一轻微面部形态异常可为显而易见的。其它黏多糖病所典型的关节僵硬、多毛及毛发粗糙通常直至疾病晚期方才存在。在初始无症状间隔的后，患者通常呈现有发育及/或行为缓慢问题，继的以导致重度痴呆及进行性运动疾病的进行性智力衰退。言语的获得常为缓慢及不完全的。疾病进展至行为障碍增加，包括暴躁发脾气、活动过度、破坏、攻击行为、异食癖及睡眠障碍。因为受影响儿童具有正常肌肉强度及运动性，所以行为障碍极难以管理。在疾病的末期，儿童变得日益不动及无反应，常需要轮椅，且显现吞咽困难及癫痫发作。受影响儿童的寿命通常不延长超过接近20岁至20岁出头。
适于治疗MPS IIIB(B型山菲立普综合征)的α-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶包括野生型人类α-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(SEQ ID NO:1或3)或其保留被摄取至哺乳动物溶酶体中且在直链寡醣中的末端N-乙酰基-D-葡糖胺残基处水解α,1,4键的能力的功能性片段或序列变异体。
可使用此项技术中已知的技术以及藉由分析溶酶体及神经性生物标记物来量测使用如本文所述的重组靶向治疗性融合蛋白治疗MPS IIIB(B型山菲立普综合征)的功效。对Naglu基因剔除动物进行初始实验(参见Li等人,Proc NatlAcad Sci USA 96:14505-510,1999)。Naglu基因剔除物呈现有在肝及肾中的大量硫酸乙酰肝素及脑中的神经节苷脂升高。
分析包括分析外源性酶的活性及生物分布、溶酶体(特定言的脑细胞中的溶酶体)中的GAG储积降低、及星形细胞及小神经胶质细胞的活化。各含量的各种溶酶体或神经性生物标记物包括但不限于溶酶体相关的膜蛋白1(LAMP1)、磷脂酰肌醇蛋白聚糖(glypican)、神经节苷脂、胆固醇、粒线体ATP合成酶的次单元c(SCMAS)、泛素(ubiquitin)、P-GSK3b、β淀粉状蛋白(beta amyloid)及P-tau。也使用此项领域中已知的技术进行存活及行为分析。
实验已显示粒线体ATP合成酶的次单元c(SCMAS)蛋白质累积在MPS IIIB动物的溶酶体中(Ryazantsev等人,Mol Genet Metab.90(4):393-401,2007)。LAMP-1及GM130也已显示在MPS IIIB动物中升高(Vitry等人,Am J Pathol.177(6):2984-99,2010)。
在各种实施例中，治疗溶酶体储积疾病涉及各种组织中的溶酶体储积(例如GAG的储积)降低。在各种实施例中，治疗涉及脑目标组织、脊髓神经元及/或周边目标组织中的溶酶体储积降低。在某些实施例中，相较于对照，溶酶体储积降低约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％或100％以上。在各种实施例中，相较于对照，溶酶体储积降低至少1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍或10倍以上。
在各种实施例中，治疗涉及各种组织中的酶活性增加。在各种实施例中，治疗涉及脑目标组织、脊髓神经元及/或周边目标组织中的酶活性增加。在各种实施例中，相较于对照，酶活性增加约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、200％、300％、400％、500％、600％、700％、800％、900％、1000％或1000％以上。在各种实施例中，相较于对照，酶活性增加至少1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍或10倍以上。在各种实施例中，增加的酶活性为至少约10nmol/h/mg、20nmol/h/mg、40nmol/h/mg、50nmol/h/mg、60nmol/h/mg、70nmol/h/mg、80nmol/h/mg、90nmol/h/mg、100nmol/h/mg、150nmol/h/mg、200nmol/h/mg、250nmol/h/mg、300nmol/h/mg、350nmol/h/mg、400nmol/h/mg、450nmol/h/mg、500nmol/h/mg、550nmol/h/mg、600nmol/h/mg或600nmol/h/mg以上。在各种实施例中，溶酶体酶为Naglu。
酶补充疗法
酶补充疗法(ERT)为一种用以藉由将丢失酶输注至血流中来矫正酶缺乏的治疗策略。当血液灌注患者组织时，酶由细胞摄取且转运至溶酶体，在溶酶体中，酶起消除已由于酶缺乏而累积在溶酶体中的物质的作用。为使溶酶体酶补充疗法有效，治疗性酶必须传递至显现储积缺陷所处的组织中的适当细胞中的溶酶体。习知溶酶体酶补充治疗剂是使用用以啮合目标细胞表面上的特定受体的天然连接于蛋白质的碳水化合物来传递。一种受体阳离子非依赖性M6P受体(CI-MPR)特别适用于靶向补充溶酶体酶，因为CI-MPR存在于大多数细胞类型的表面上。
术语“阳离子非依赖性甘露糖-6-磷酸受体(CI-MPR)”、“M6P/IGF-II受体”、“CI-MPR/IGF-II受体”、“IGF-II受体”或“IGF2受体”或其缩写可在本文中互换使用，其是指结合M6P与IGF-II两者的细胞受体。
使对象对酶补充疗法耐受的组合疗法
已发现在给予诸如重组蛋白质及其它治疗剂的药剂期间，对象可发动针对此等药剂的免疫反应，从而导致产生结合且干扰治疗活性以及引起急性或慢性免疫反应的抗体。此问题对于蛋白质治疗剂而言最为显著，因为蛋白质为复杂抗原且在许多情况下，对象就抗原而言为免疫未处理的。因此，在本发明的某些态样中，可能适用的是使接受治疗性酶的对象耐受酶补充疗法。在此情形下，酶补充疗法可用耐受性方案以组合疗法形式给与对象。
美国专利7,485,314(以引用的方式并入本文中)揭露使用免疫耐受性诱导治疗溶酶体储积病症。简言的，使用该种耐受方案可适用于防止对象发动针对酶补充疗法的免疫反应且藉此降低酶补充疗法的潜在有益效应或另外致使酶补充疗法的潜在有益效应无效。
在一种方法中，本发明涵盖降低或防止针对用于治疗溶酶体储积病症，例如IIIB型黏多糖病(MPS IIIB或B型山菲立普综合征)的例如包含Naglu的重组治疗性融合蛋白的临床显著抗原特异性免疫反应，其中融合蛋白是鞘内给予。该方法采用与每周鞘内输注低剂量酶(例如Naglu)组合的T细胞免疫抑制剂(诸如环孢素A(cyclosporin A，CsA))及抗增生剂(诸如咪唑硫嘌呤(azathioprine，Aza))的初始30-60天方案。使用与每周鞘内或静脉内输注低剂量的包含酶的融合蛋白组合的免疫抑制药物环孢素A(CsA)及咪唑硫嘌呤(Aza)的60天方案，针对每周输注酶的典型强烈IgG反应得以极大降低或防止。使用此等耐受方案，将有可能使对象耐受较高治疗剂量的治疗性融合蛋白多达6个月而无针对Naglu或实际上可用于溶酶体储积疾病的酶补充的任何其它酶的抗体效价增加。此等耐受方案已描述于美国专利第7,485,314号中。
糖基化非依赖性溶酶体靶向
开发糖基化非依赖性溶酶体靶向(Glycosylation Independent LysosomalTargeting，GILT)技术以使治疗性酶靶向溶酶体。详言的，GILT技术使用肽标签替代M6P来啮合CI-MPR以达成溶酶体靶向。通常，GILT标签为以甘露糖-6-磷酸非依赖性方式结合CI-MPR的蛋白质、肽或其它部分。有利的是此技术模拟摄取溶酶体酶的正常生物机制，但以不依赖于甘露糖-6-磷酸方式进行。
一较佳GILT标签源于人类胰岛素样生长因子II(IGF-II)。人类IGF-II为一种对也称为IGF-II受体的CI-MPR具有高亲和力的配体。具有GILT标签的治疗性酶与M6P/IGF-II受体结合会经由胞吞路径使蛋白质靶向溶酶体。此方法具有超过涉及糖基化的方法的众多优势，包括简单及成本效益，因为一旦分离蛋白质，即无需进行进一步修饰。
对GILT技术及GILT标签的详细描述可见于美国公开文本第20030082176号、第20040006008号、第20040005309号及第20050281805号中，所述所有公开文本的教义据此以全文引用的方式并入本文中。
弗林蛋白酶抗性GILT标签
在开发治疗溶酶体储积疾病的具有GILT标签的溶酶体酶的过程期间，已变得显而易知的是IGF-II源性GILT标签可在于哺乳动物细胞中产生期间经受由弗林蛋白酶进行的蛋白水解裂解(参见实施例章节)。弗林蛋白酶蛋白酶通常识别且裂解具有共同序列Arg-X-X-Arg(SEQ ID NO:6)的裂解位点，X为任何氨基酸。裂解位点位于序列中的羧基末端精氨酸(Arg)残基的后。在一些实施例中，弗林蛋白酶裂解位点具有共同序列Lys/Arg-X-X-X-Lys/Arg-Arg(SEQ ID NO:7)，X为任何氨基酸。裂解位点位于序列中的羧基末端精氨酸(Arg)残基的后。如本文所用，术语“弗林蛋白酶”是指可识别且裂解如本文定义的弗林蛋白酶蛋白酶裂解位点的任何蛋白酶，包括弗林蛋白酶或弗林蛋白酶样蛋白酶。弗林蛋白酶也称为成对碱性氨基酸裂解酶(PACE)。弗林蛋白酶属于包括PC3(一种负责使胰岛细胞中的胰岛素原(proinsulin)成熟的蛋白酶)的枯草杆菌蛋白酶样原蛋白转化酶家族。编码弗林蛋白酶的基因称为FUR(FES上游区域)。
以下显示成熟人类IGF-II肽序列。
AYRPSETLCGGELVDTLQFVCGDRGFYFSRPASRVSR↑RSR↑GIVEECCFRSCDLALLETYC ATPAKSE(SEQ ID NO:5)
如可见，成熟人类IGF-II在残基34-40之间含有两个潜在重迭弗林蛋白酶裂解位点(粗体且加底线)。箭头插入在两个潜在弗林蛋白酶裂解位置处。
对由弗林蛋白酶进行的裂解具有抗性且仍然保留以甘露糖-6-磷酸非依赖性方式结合CI-MPR的能力的经修饰GILT标签揭露于US 20110223147中。详言的，弗林蛋白酶抗性GILT标签可藉由在一个或多个弗林蛋白酶裂解位点处使氨基酸序列突变以使突变消除至少一个弗林蛋白酶裂解位点加以设计。因此，在一些实施例中，弗林蛋白酶抗性GILT标签为含有消除至少一个弗林蛋白酶蛋白酶裂解位点或改变邻近于弗林蛋白酶蛋白酶裂解位点的序列以使相较于野生型IGF-II肽(例如野生型人类成熟IGF-II)，弗林蛋白酶裂解得以阻止、抑制、降低或减缓的突变的弗林蛋白酶抗性IGF-II突变蛋白质。通常，适合突变不影响弗林蛋白酶抗性GILT标签结合人类阳离子非依赖性甘露糖-6-磷酸受体的能力。特定言的，适于本发明的弗林蛋白酶抗性IGF-II突变蛋白质以甘露糖-6-磷酸非依赖性方式结合人类阳离子非依赖性甘露糖-6-磷酸受体，其中在pH 7.4下的解离常数为10-7M或10-7M以下(例如10-8、10-9、10-10、10-11或10-11以下)。在一些实施例中，弗林蛋白酶抗性IGF-II突变蛋白质在对应于成熟人类IGF-II的氨基酸30-40(例如30-40、31-40、32-40、33-40、34-40、30-39、31-39、32-39、34-37、33-39、34-39、35-39、36-39、37-40)的区域内含有突变。在一些实施例中，适合突变消除至少一个弗林蛋白酶蛋白酶裂解位点。突变可为氨基酸取代、缺失、插入。举例而言，在对应于SEQ ID NO:5的残基30-40(例如30-40、31-40、32-40、33-40、34-40、30-39、31-39、32-39、34-37、33-39、34-39、35-39、36-39、37-40)的区域内的任一氨基酸皆可经任何其它氨基酸取代或皆可经缺失。举例而言，在位置34处的取代可影响弗林蛋白酶认识第一裂解位点。在各识别位点内插入一个或多个其它氨基酸可消除一个或两个弗林蛋白酶裂解位点。缺失简并位置中的一个或多个残基也可消除两个弗林蛋白酶裂解位点。
在各种实施例中，弗林蛋白酶抗性IGF-II突变蛋白质在对应于成熟人类IGF-II的Arg37或Arg40的位置处含有氨基酸取代。在一些实施例中，弗林蛋白酶抗性IGF-II突变蛋白质在位置Arg37或Arg40处含有Lys或Ala取代。其它取代为可能的，包括在位置37与40两者处的Lys及/或Ala突变的组合、或除Lys或Ala以外的氨基酸的取代。
在各种实施例中，适用于本文中的IGF-II突变蛋白质可含有其它突变。举例而言，可改变SEQ ID NO:1的多达30％或30％以上的残基(例如可改变多达1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％或30％以上的残基)。因此，适用于本文中的IGF-II突变蛋白质可具有与成熟人类IGF-II至少70％，包括至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99％以上一致的氨基酸序列。
在各种实施例中，适用于本文中的IGF-II突变蛋白质经特异性靶向CI-MPR。特别适用的是IGF-II多肽中的导致蛋白质相对于天然IGF-II以高亲和力(例如在pH 7.4下，解离常数为10-7M或10-7M以下)结合CI-MPR，同时以降低的亲和力结合已知由IGF-II所结合的其它受体的突变。举例而言，适于本发明的弗林蛋白酶抗性IGF-II突变蛋白质可经修饰以相对于天然存在的人类IGF-II对IGF-I受体的亲和力，对IGF-I受体的结合亲和力减弱。举例而言，用Leu、Val或Phe取代IGF-II残基Tyr 27、Leu 43或Ser 26分别使IGF-II对IGF-I受体的亲和力减弱94倍、56倍及4倍(Torres等人(1995)J.Mol.Biol.248(2):385-401)。缺失人类IGF-II的残基1-7导致对人类IGF-I受体的亲和力降低30倍及相伴对大鼠IGF-II受体的亲和力增加12倍(Hashimoto等人(1995)J.Biol.Chem.270(30):18013-8)。IGF-II的NMR结构显示Thr-7位于残基Phe-48Phe及Ser-50附近以及Cys-9-Cys-47二硫桥键附近。认为Thr-7与此等残基的相互作用可使为IGF-I受体结合所需的可挠性N末端六肽稳定(Terasawa等人(1994)EMBO J.13(23)5590-7)。同时，此相互作用可调节与IGF-II受体的结合。截短IGF-II的C末端(残基62-67)也似乎使IGF-II对IGF-I受体的亲和力降低5倍(Roth等人(1991)Biochem.Biophys.Res.Commun.181(2):907-14)。
IGF-I及阳离子非依赖性M6P受体的结合表面在IGF-II的各别面上。基于结构及突变数据，可构筑实质上小于人类IGF-II的功能性阳离子非依赖性M6P结合域。举例而言，可缺失或置换胺基末端氨基酸(例如1-7或2-7)及/或羧基末端残基62-67。另外，氨基酸29-40可有可能经消除或置换而不改变多肽的其余部分的折迭或与阳离子非依赖性M6P受体的结合。因此，可构筑包括氨基酸8-28及41-61的靶向部分。此等氨基酸链段可或许直接接合或由连接子分开。或者，氨基酸8-28及41-61可提供在各别多肽链上。与IGF-II同源且具有与IGF-II的结构密切相关的三级结构的胰岛素的类似域具有即使当存在于各别多肽链中时也足以允许适当再折迭成适当三级结构的结构信息(Wang等人(1991)TrendsBiochem.Sci.279-281)。因此，举例而言，氨基酸8-28或其保守性取代变异体可融合于溶酶体酶；所得融合蛋白可与氨基酸41-61或其保守性取代变异体混合，且向患者给予。
IGF-II也可经修饰以使与血清IGF结合蛋白的结合最小(Baxter(2000)Am.J.Physiol Endocrinol Metab.278(6):967-76)以避免螯合IGF-II/GILT构筑体。许多研究已定位IGF-II中为结合IGF结合蛋白所必需的残基。可筛检保留与M6P/IGF-II受体的高亲和力结合且对IGF结合蛋白的亲和力降低的在此等残基处具有突变的构筑体。举例而言，报导用Ser置换IGF-II的Phe-26会降低IGF-II对IGFBP-1及IGFBP-6的亲和力而对与M6P/IGF-II受体的结合无影响(Bach等人(1993)J.Biol.Chem.268(13):9246-54)。诸如Lys取代Glu-9的其它取代也可为有利的。IGF-I的与IGF-II高度保守的区域中的单独或组合类似突变会导致IGF-BP结合大大降低(Magee等人(1999)Biochemistry 38(48):15863-70)。
一替代性方法为鉴别IGF-II的可以高亲和力结合M6P/IGF-II受体的最小区域。已牵涉于IGF-II结合M6P/IGF-II受体中的残基主要丛集在IGF-II的一个面上(Terasawa等人(1994)EMBO J.13(23):5590-7)。尽管IGF-II三级结构通常由三个分子内二硫键维持，但并有IGF-II的M6P/IGF-II受体结合表面上的氨基酸序列的肽可经设计以适当折迭且具有结合活性。该种最小结合肽为高度较佳溶酶体靶向域。举例而言，一较佳溶酶体靶向域为人类IGF-II的氨基酸8-67。所设计的基于氨基酸48-55附近的区域的结合M6P/IGF-II受体的肽也为合乎需要的溶酶体靶向域。或者，可经由酵母双杂交分析或经由噬菌体呈现型分析针对结合M6P/IGF-II受体的能力筛检随机肽文库。
对胰岛素受体的结合亲和力
本文所述的许多IGF-II突变蛋白质(包括弗林蛋白酶抗性IGF-II突变蛋白质)对胰岛素受体的结合亲和力降低或减弱。因此，在一些实施例中，相对于天然存在的人类IGF-II对胰岛素受体的亲和力，适于本发明的肽标签对胰岛素受体的结合亲和力降低或减弱。在一些实施例中，适于本发明的对胰岛素受体的结合亲和力降低或减弱的肽标签包括对胰岛素受体的结合亲和力小于野生型成熟人类IGF-II对胰岛素受体的结合亲和力超过1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、12倍、14倍、16倍、18倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍或100倍的肽标签。可使用此项技术中已知的各种活体外及体内分析量测对胰岛素受体的结合亲和力。示范性结合分析描述于实施例章节中。
突变诱发
IGF-II突变蛋白质可藉由将适当核苷酸变化引入IGF-II DNA中，或藉由合成所要IGF-II多肽来制备。可例如使用例如于美国专利第5,364,934号中所述的针对保守性及非保守性突变的任何技术及指导方针使IGF-II序列变化。变化可为一个或多个编码IGF-II的密码子的导致IGF-II的氨基酸序列相较于天然存在的成熟人类IGF-II序列发生变化的取代、缺失或插入。氨基酸取代可由用具有类似结构及/或化学性质的另一氨基酸置换一个氨基酸，诸如用丝氨酸置换白氨酸，也即保守性氨基酸置换所致。氨基酸取代也可由用具有不类似结构及/或化学性质的另一氨基酸置换一个氨基酸，也即非保守性氨基酸置换所致。插入或缺失可任选地在1至5个氨基酸的范围内。所允许的变化可可藉由是统进行序列中的氨基酸的插入、缺失或取代且在此项技术中已知的体内或活体外分析(诸如与CI-MPR的结合分析或弗林蛋白酶裂解分析)中测试所得变异体的活性来确定。
扫描氨基酸分析也可用于沿连续序列鉴别一个或多个氨基酸。尤其较佳的扫描氨基酸为相对较小的中性氨基酸。此等氨基酸包括丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸及半胱氨酸。丙氨酸通常为此组中的较佳扫描氨基酸，因为其消除超出β-碳的侧链且使变异体的主链构形改变的可能性较小。丙氨酸也通常较佳，因为其为最常见氨基酸。此外，其常见于包埋位置与暴露位置两者中[Creighton,TheProteins,(W.H.Freeman&Co.,N.Y.)；Chothia,J.Mol.Biol.,150:1(1976)]。若丙氨酸取代不产生足量变异体，则可使用电子等排氨基酸。
可使用此项技术中已知的方法，诸如寡核苷酸介导的(定点)突变诱发、丙氨酸扫描及PCR突变诱发作出变化。可对选殖的DNA进行定点突变诱发[Carter等人,Nucl.Acids Res.,13:4331(1986)；Zoller等人,Nucl.Acids Res.,10:6487(1987)]、卡匣突变诱发[Wells等人,Gene,34:315(1985)]、限制选择突变诱发[Wells等人,Philos.Trans.R.Soc.London SerA,317:415(1986)]或其它已知技术以产生IGF-II突变蛋白质。
间隔子
GILT标签可融合于溶酶体酶的N末端或C末端。GILT标签可直接融合于溶酶体酶或可由连接子或间隔子与溶酶体酶分开。氨基酸连接子或间隔子通常经设计以具有刚性、可挠性或插入两个蛋白质部分之间的结构，诸如α螺旋。连接子或间隔子可相对较短，诸如序列Gly-Ala-Pro(GAP)(SEQ ID NO:9)、Gly-Gly-Gly-Gly-Ala(GGGGA)(SEQ ID NO:60)或Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(GGGGS)(SEQ ID NO:12)，或可较长，诸如长度为10-25个氨基酸、25-50个氨基酸或35-55个氨基酸。应小心选择融合接合位点以促进两种融合搭配物的适当折迭及活性且防止肽标签自溶酶体酶(例如α-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶)过早分离。
在各种实施例中，间隔肽包含一个或多个GGGPS(SEQ ID NO:14)或GGGSP(SEQ ID NO:15)氨基酸序列，且任选地还包含以下一个或多个：(i)GAP(SEQ ID NO:9)、(ii)GGGGS(SEQ ID NO:12)、(iii)GGGS(SEQ ID NO:16)、(iv)AAAAS(SEQ ID NO:17)、(v)AAAS(SEQ ID NO:18)、(vi)PAPA(SEQ IDNO:19)、(vii)TPAPA(SEQ ID NO:20)、(viii)AAAKE(SEQ ID NO:21)或(ix)GGGGA(SEQ ID NO:60)。在各种实施例中，间隔子包含氨基酸序列GAP(SEQ ID NO:9)、GPS(SEQ ID NO:10)或GGS(SEQ ID NO:11)。
在各种实施例中，间隔肽包含一个或多个GGGGS(SEQ ID NO:12)或GGGS(SEQ ID NO:16)氨基酸序列。在各种实施例中，间隔肽包含一个或多个GGGPS(SEQ ID NO:14)或GGGSP(SEQ ID NO:15)氨基酸序列。在各种实施例中，间隔肽包含一个或多个AAAAS(SEQ ID NO:17)或AAAS(SEQ ID NO:18)氨基酸序列。在各种实施例中，间隔肽包含一个或多个PAPA(SEQ ID NO:19)或TPAPA(SEQ ID NO:20)氨基酸序列。在各种实施例中，间隔肽包含一个或多个AAAKE(SEQ ID NO:21)氨基酸序列。在各种实施例中，间隔肽包含一个或多个GGGGA(SEQ ID NO:60)氨基酸序列。
在各种实施例中，间隔肽包含选自下组的氨基酸序列：(GGGGS)n(SEQ IDNO:12、56、58、91-94)、(GGGGS)n-GGGPS(SEQ ID NO:36、95-100)、GAP-(GGGGS)n-GGGPS(SEQ ID NO:101-107)、GAP-(GGGGS)n-GGGPS-GAP(SEQ ID NO:37、108-113)、GAP-(GGGGS)n-GGGPS-(GGGGS)n-GAP(SEQ ID NO:114-162)、GAP-GGGPS-(GGGGS)n-GAP(SEQ ID NO:163-169)、GAP-(GGGGS)n-AAAAS-GGGPS-(GGGGS)n-AAAA-GAP(SEQ ID NO:170-218)、GAP-(GGGGS)n-PAPAP-(Xaa)n-GAP(SEQ ID NO:219-267)、GAP-(GGGGS)n-PAPAPT-(Xaa)n-GAP(SEQ ID NO:268-316)、GAP-(GGGGS)n-(Xaa)n-PAPAP-(Xaa)n-(AAAKE)n-(Xaa)n-(GGGGS)n-GAP(SEQID NO:544-551)、(GGGGA)n(SEQ ID NO:60、79、81、317-320)、(GGGGA)n-GGGPS(SEQ ID NO:321-326)、GAP-(GGGGA)n-GGGPS(SEQ ID NO:327-333)、GAP-(GGGGA)n-GGGPS-GAP(SEQ ID NO:334-340)、GAP-(GGGGA)n-GGGPS-(GGGGA)n-GAP(SEQ ID NO:341-389)、GAP-GGGPS-(GGGGA)n-GAP(SEQ ID NO:390-396)、GAP-(GGGGA)n-AAAAS-GGGPS-(GGGGA)n-AAAA-GAP(SEQ ID NO:397-445)、GAP-(GGGGA)n-PAPAP-(Xaa)n-GAP(SEQ ID NO:446-494)、GAP-(GGGGA)n-PAPAPT-(Xaa)n-GAP(SEQ ID NO:495-543)、GAP-(GGGGA)n-(Xaa)n-PAPAP-(Xaa)n-(AAAKE)n-(Xaa)n-(GGGGA)n-GAP(SEQID NO:552-559)；其中n为1至7。在各种实施例中，n为1至4。
在各种实施例中，间隔子是选自下组：EFGGGGSTR(SEQ ID NO:22)、GAP(SEQ ID NO:9)、GGGGS(SEQ ID NO:12)、GPSGSPG(SEQ ID NO:23)、GPSGSPGT(SEQ ID NO:24)、GPSGSPGH(SEQ ID NO:25)、GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPST(SEQ ID NO:26)、GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSH(SEQ ID NO:27)、GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGPS(SEQ ID NO:28)、GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGPSGAP(SEQ ID NO:29)、GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPS(SEQ ID NO:30)、GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGAP(SEQ ID NO:31)、GGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPS(SEQ ID NO:32)、GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPSGAP(SEQ ID NO:33)、GGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPS(SEQ ID NO:34)、GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPSGAP(SEQ ID NO:35)、GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPS(SEQ ID NO:36)、GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGAP(SEQ ID NO:37)、GGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGPS(SEQ ID NO:38)、GAPGGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGPSGAP(SEQ ID NO:39)、GGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGGSAAAASGGGPS(SEQ ID NO:40)、GAPGGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGGSAAAASGGGPSGAP(SEQ ID NO:41)、GGGGSGGGGSAAAASGGGPSGGGGSAAAASGGGPSGGGGSAAAASGGGPS(SEQ ID NO:42)、GAPGGGGSGGGGSAAAASGGGPSGGGGSAAAASGGGPSGGGGSAAAASGGGPSGAP(SEQ ID NO:43)、GGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPGPS(SEQ IDNO:44)、GAPGGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPGPSGAP(SEQ ID NO:45)、GGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTGPS(SEQID NO:46)、GAPGGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTGPSGAP(SEQ ID NO:47)、GGGSPAPTPTPAPTPAPTPAGGGPS(SEQ ID NO:48)、GAPGGGSPAPTPTPAPTPAPTPAGGGPSGAP(SEQ ID NO:49)、GGGSPAPAPTPAPAPTPAPAGGGPS(SEQ ID NO:50)、GAPGGGSPAPAPTPAPAPTPAPAGGGPSGAP(SEQ ID NO:51)、GGGSAEAAAKEAAAKEAAAKAGGPS(SEQ ID NO:52)、GAPGGGSAEAAAKEAAAKEAAAKAGGPSGAP(SEQ ID NO:53)、GGGSPAEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKAPSGGG(SEQ ID NO:54)、GAPGGGSPAEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKAPSGGGGAP(SEQ IDNO:55)、GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:56)、GAPGGGGSGGGGSGGGGSGAP(SEQ ID NO:57)、GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:58)、GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGAP(SEQ ID NO:59)、GGGGA(SEQ ID NO:60)、GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPST(SEQ ID NO:61)、GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSH(SEQ ID NO:62)、GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGPS(SEQ ID NO:63)、GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGPSGAP(SEQ ID NO:64)、GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPS(SEQ ID NO:65)、GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGAP(SEQ ID NO:66)、GGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPS(SEQ ID NO:67)、GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPSGAP(SEQ ID NO:68)、GGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPS(SEQ ID NO:69)、GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPSGAP(SEQ ID NO:70)、GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPS(SEQ IDNO:71)、GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGAP(SEQ ID NO:72)、GGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGPS(SEQ ID NO:73)、GAPGGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGPSGAP(SEQ ID NO:74)、GGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGGAAAAASGGGPS(SEQ ID NO:75)、GAPGGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGGAAAAASGGGPSGAP(SEQ ID NO:76)、GGGGAGGGGAAAAASGGGPSGGGGAAAAASGGGPSGGGGAAAAASGGGPS(SEQ ID NO:77)、GAPGGGGAGGGGAAAAASGGGPSGGGGAAAAASGGGPSGGGGAAAAASGGGPSGAP(SEQ ID NO:78)、GGGGAGGGGAGGGGA(SEQ ID NO:79)、GAPGGGGAGGGGAGGGGAGAP(SEQ ID NO:80)、GGGGAGGGGAGGGGAGGGGA(SEQ ID NO:81)、GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGAP(SEQ ID NO:82)、GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPS[或(GGGGA)8GGGPS](SEQ ID NO:83)、GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSH[或(GGGGA)8GGGPSH](SEQ ID NO:84)、GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPS[或(GGGGA)9GGGPS](SEQ ID NO:85)、GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSH[或(GGGGA)9GGGPSH](SEQ ID NO:86)、GGGGPAPGPGPAPGPAPGPAGGGPS(SEQ ID NO:87)、GAPGGGGPAPGPGPAPGPAPGPAGGGPGGAP(SEQ ID NO:88)、GGGGPAPAPGPAPAPGPAPAGGGPS(SEQ ID NO:89)及GAPGGGGPAPAPGPAPAPGPAPAGGGPGGAP(SEQ ID NO:90)。
在各种实施例中，间隔子是选自下组：GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPS(SEQ ID NO:36)、GGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPGPS(SEQ IDNO:44)、GAPGGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPGPSGAP(SEQ ID NO:45)、GGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTGPS(SEQID NO:46)、GAPGGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTGPSGAP(SEQ ID NO:47)、GGGSPAPTPTPAPTPAPTPAGGGPS(SEQ ID NO:48)、GAPGGGSPAPTPTPAPTPAPTPAGGGPSGAP(SEQ ID NO:49)、GGGSPAPAPTPAPAPTPAPAGGGPS(SEQ ID NO:50)、GAPGGGSPAPAPTPAPAPTPAPAGGGPSGAP(SEQ ID NO:51)、GGGSAEAAAKEAAAKEAAAKAGGPS(SEQ ID NO:52)、GAPGGGSAEAAAKEAAAKEAAAKAGGPSGAP(SEQ ID NO:53)、GGGSPAEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKAPSGGG(SEQ ID NO:54)、GAPGGGSPAEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKAPSGGGGAP(SEQ IDNO:55)及GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPS(SEQ ID NO:71)。
在各种实施例中，间隔子是选自下组：GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPS(SEQ ID NO:36)、GAPGGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTGPSGAP(SEQ ID NO:47)、GAPGGGSPAPAPTPAPAPTPAPAGGGPSGAP(SEQ ID NO:51)、GAPGGGSPAEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKAPSGGGGAP(SEQID NO:55)及GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPS(SEQ ID NO:71)。
可用于本发明的方法及组合物中的具有GILT标签的α-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶蛋白质的其它构筑体详述于美国公开文本第20050244400号及第20050281805号中，所述公开文本的全部揭露内容以引用的方式并入本文中。
细胞
可根据本发明利用易经受细胞培养及多肽表达的任何哺乳动物细胞或细胞类型皆，诸如人类胚肾(HEK)293细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、猴肾(COS)细胞、HT1080细胞、C10细胞、HeLa细胞、幼小仓鼠肾(BHK)细胞、3T3细胞、C127细胞、CV-1细胞、HaK细胞、NS/0细胞及L-929细胞。可根据本发明使用的哺乳动物细胞的非限制性实施例包括但不限于BALB/c小鼠骨髓瘤株是(NS0/1，ECACC编号：85110503)；人类视网膜母细胞(PER.C6(CruCell,Leiden,The Netherlands))；由SV40转型的猴肾CV1株是(COS-7，ATCC CRL 1651)；人类胚肾株是(293细胞或经次选殖以达成悬浮培养生长的293细胞，Graham等人,J.Gen Virol.,36:59(1977))；幼小仓鼠肾细胞(BHK，ATCC CCL 10)；中国仓鼠卵巢细胞+/-DHFR(CHO，Urlaub及Chasin,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77:4216(1980))；小鼠赛托利细胞(TM4，Mather,Biol.Reprod.,23:243-251(1980))；猴肾细胞(CV1ATCC CCL 70)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76，ATCC CRL-1587)；人类宫颈癌细胞(HeLa，ATCC CCL 2)；犬肾细胞(MDCK，ATCC CCL 34)；水牛大鼠肝细胞(BRL 3A，ATCC CRL 1442)；人类肺细胞(W138，ATCC CCL 75)；人类肝细胞(Hep G2，HB 8065)；小鼠乳腺肿瘤(MMT 060562，ATCC CCL51)；TRI细胞(Mather等人,Annals N.Y.Acad.Sci.,383:44-68(1982))；MRC 5细胞；FS4细胞；及人类肝细胞瘤株是(Hep G2)。在一些实施例中，本发明的融合蛋白是自CHO细胞株产生。
本发明的融合蛋白也可在多种非哺乳动物宿主细胞中表达，所述宿主细胞诸如昆虫(例如Sf-9、Sf-21、Hi5)、植物(例如豆科(Leguminosa)、谷类(cereal)或烟草(tobacco))、酵母(例如酿酒酵母(S.cerivisae)、毕赤酵母(P.pastoris))、原核生物(例如大肠杆菌(E.Coli)、枯草杆菌(B.subtilis)及其它杆菌属(Bacillusspp.)、假单胞菌属(Pseudomonas spp.)、链霉菌属(Streptomyces spp))或真菌。
在一些实施例中，可在缺乏弗林蛋白酶的细胞中产生有或无弗林蛋白酶抗性GILT标签的融合蛋白。如本文所用，术语“缺乏弗林蛋白酶的细胞”是指弗林蛋白酶蛋白酶活性受抑制、降低或消除的任何细胞。缺乏弗林蛋白酶的细胞包括不产生弗林蛋白酶或产生降低量的弗林蛋白酶或缺陷性弗林蛋白酶蛋白酶的哺乳动物细胞与非哺乳动物细胞两者。为熟练技术人员已知且可用的示范性缺乏弗林蛋白酶的细胞包括但不限于FD11细胞(Gordon等人(1997)Infectionand Immunity 65(8):33703375)以及Moebring及Moehring(1983)Infection andImmunity 41(3):9981009中所述的彼等突变细胞。或者，缺乏弗林蛋白酶的细胞可藉由以下方式获得：使上述哺乳动物及非哺乳动物细胞暴露于突变诱发处理，例如辐射、溴化乙锭、溴化尿苷(BrdU)及其它处理，较佳化学突变诱发，且更佳甲烷磺酸乙酯突变诱发，使在处理中存活的细胞恢复且选择发现对假单胞菌外毒素A(Pseudomonas exotoxin A)的毒性具有抗性的彼等细胞(参见Moehring及Moehrin(1983)Infection and Immunity 41(3):9981009)。
在各种实施例中，意欲某些包含如本文所述之间隔子的靶向治疗性蛋白质相较于包含不同间隔肽的靶向治疗性蛋白质在重组表达时可展现活性蛋白质的表达增加。在各种实施例中，也意欲本文所述的靶向治疗性蛋白质相较于本文其它靶向治疗性蛋白质可具有增加的活性。意欲相较于包含不同间隔肽的其它靶向治疗性蛋白质展现活性蛋白质的表达增加及/或具有增加的活性的彼等靶向治疗性蛋白质用于进一步实验。
治疗性蛋白质的投药
根据本发明，通常单独或以包含如本文所述的治疗性蛋白质的组合物或药剂形式(例如在制造治疗疾病的药剂时)向对象给予本发明的治疗性蛋白质。组合物可与生理可接受的载体或赋形剂一起调配以制备药物组合物。载体及组合物可为无菌的。调配物应适合投药模式。
适合药学上可接受的载体包括但不限于水、盐溶液(例如NaCl)、生理食盐水、缓冲生理食盐水、醇、甘油、乙醇、阿拉伯胶(gum arabic)、植物油、苯甲醇、聚乙二醇、明胶、碳水化合物(诸如乳糖、直链淀粉或淀粉、糖(诸如甘露糖醇、蔗糖或其它糖、右旋糖))、硬脂酸镁、滑石、硅酸、黏稠石蜡、芳香油、脂肪酸酯、羟甲基纤维素、聚乙烯吡咯啶酮等以及其组合。必要时，医药制剂可与不有害地与活性化合物反应或干扰其活性的助剂(例如润滑剂、防腐剂、稳定剂、湿润剂、乳化剂、用于影响渗透压的盐、缓冲剂、着色剂、调味剂及/或芳族物质及其类似物)混合。在一较佳实施例中，使用适于静脉内投药的水溶性载体。
必要时，组合物或药剂也可含有少量湿润剂或乳化剂或pH值缓冲剂。组合物可为液体溶液、悬浮液、乳液、锭剂、丸剂、胶囊、持续释放调配物或散剂。组合物也可用传统黏合剂及载体(诸如三酸甘油酯)调配成栓剂。经口调配物可包括标准载体，诸如医药级甘露糖醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、聚乙烯吡咯啶酮、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。
可根据常规程序将组合物或药剂调配成适合于向人类给予的药物组合物。举例而言，在一较佳实施例中，用于静脉内投药的组合物通常为于无菌等张水性缓冲液中的溶液。必要时，组合物也可包括增溶剂及局部麻醉剂以减轻注射部位的疼痛。通常，分开或以单位剂型混合在一起来将成分供应于诸如安瓿或药囊的指示活性药剂的量的气密容器中，该单位剂型例如呈干燥冻干粉末或无水浓缩物形式。当组合物欲藉由输注给予时，其可用含有无菌医药级水、生理食盐水或右旋糖/水的输注瓶分配。当组合物是藉由注射给予时，可提供含无菌注射用水或生理食盐水的安瓿以使成分可在投药的前加以混合。
治疗性蛋白质可调配成中性形式或盐形式。药学上可接受的盐包括以游离胺基形成的盐，诸如源于盐酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸等者；及以游离羧基形成的盐，诸如源于钠、钾、铵、钙、氢氧化铁、异丙胺、三乙胺、2-乙胺基乙醇、组氨酸、普鲁卡因(procaine)等者。
藉由任何适当途径给予治疗性蛋白质(或含有治疗性蛋白质的组合物或药剂)。在各种实施例中，静脉内给予治疗性蛋白质。在其它实施例中，藉由直接向目标组织，诸如心脏或肌肉(例如肌肉内)或神经是统(例如直接注射至脑中；室内；鞘内)投药来给予治疗性蛋白质。在各种实施例中，鞘内给予治疗性蛋白质。或者，可非经肠、经皮或经黏膜(例如经口或经鼻)给予治疗性蛋白质(或含有治疗性蛋白质的组合物或药剂)。必要时可并行使用一种以上途径，例如静脉内及鞘内给予治疗性蛋白质。并行静脉内及鞘内投药无需为同时的，但可为连续的。
治疗性蛋白质(或含有治疗性蛋白质的组合物或药剂)可单独或连同其它药剂一起给予，所述其它药剂诸如抗组胺剂(例如苯海拉明(diphenhydramine))或免疫抑制剂或抵抗抗具有GILT标签的溶酶体酶抗体的其它免疫治疗剂。术语“连同…一起”指示药剂在治疗性蛋白质(或含有治疗性蛋白质的组合物或药剂)的前、近似同时或的后给予。举例而言，药剂可混入含有治疗性蛋白质的组合物中，且藉此与治疗性蛋白质同时给予；或者，药剂可在不混合的情况下同时给予(例如藉由在给予治疗性蛋白质也所用的静脉内管在线“借道(piggybacking)”传递药剂，或反的也然)。在另一实施例中，药剂可分开(例如不混合)，但在给予治疗性蛋白质的短时段内(例如在24小时内)给予。
治疗性蛋白质(或含有治疗性蛋白质的组合物或药剂)是以治疗有效量(也即在规则间隔下给予时，足以诸如藉由如上所述改善与疾病相关的症状，预防或延迟疾病发作及/或也减小疾病的症状的严重性或频率来治疗疾病的剂量)给予。对治疗疾病而言将为治疗有效的剂量将取决于疾病影响的性质及程度，且可藉由标准临床技术加以确定。此外，活体外或体内分析可任选地用于帮助使用此项技术中已知的方法鉴别最佳剂量范围。欲采用的准确剂量也将取决于投药途径及疾病的严重性，且应根据从业者的判断及各患者的情况来决定。有效剂量可自由活体外或动物模型测试是统获得的剂量-反应曲线外推。治疗有效剂量可为例如每千克体重约0.1-1mg、约1-5mg、约2.5-20mg、约5-20mg、约20-50mg、或约20-100mg或约50-200mg、或约2.5至20mg。视对象的需要而定，用于特定对象的有效剂量可随时间变化(例如增加或降低)。举例而言，在身体疾病或应激时，或若疾病症状恶化，则可增加剂量。
视疾病影响的性质及程度而定且在持续基础上，在规则间隔下给予治疗有效量的治疗性蛋白质(或含有治疗性蛋白质的组合物或药剂)。如本文所用，在某一“间隔”下投药指示定期给予(不同于一次性给药)治疗有效量。可藉由标准临床技术确定间隔。在一些实施例中，每两月、每月、每月两次、每三周、每两周、每周、每周两次、每周三次或每日给予治疗性蛋白质。视对象的需要而定，用于单一对象的投药间隔无需为固定间隔，但可随时间变化。举例而言，在身体疾病或应激时，或若疾病症状恶化，则可减小剂量之间之间隔。
如本文所用，术语“每两月”意谓每两个月给予一次(也即每两个月一次)；术语“每月”意谓每个月给予一次；术语“每三周”意谓每三周给予一次(也即每三周一次)；术语“每两周”意谓每两周给予一次(也即每两周一次)；术语“每周”意谓每周给予一次；且术语“每日”意谓每天给予一次。
本揭露内容另外是关于一种于容器(例如小瓶、瓶、用于静脉内投药的袋、注射器等)中的包含如本文所述的治疗性蛋白质的药物组合物，该容器伴有含有诸如藉由本文所述的方法给予治疗IIIB型黏多糖病(B型山菲立普综合征)的组合物的说明书的标签。
药学上可接受的调配物的鞘内投药
在各种实施例中，藉由引入对象的中枢神经是统中，例如引入对象的脑脊髓液中来给予酶融合蛋白。在本发明的某些态样中，以鞘内方式将酶引入例如腰区或大池中或以室内方式(或以脑室内方式)将酶引入脑室间隙中。鞘内给予溶酶体酶的方法描述于美国专利7,442,372中，该专利以全文引用的方式并入本文中。
熟习此项技术者了解可用于实现鞘内给予治疗性组合物的装置。举例而言，疗法可使用常用于鞘内给予用于脑膜癌病的药物的Ommaya储集囊给与(Ommaya AK,Lancet 2:983-84,1963)。更详言的，在此方法中，将脑室管穿过前角中形成的孔插入且连接至安装在头皮下方的Ommaya储集囊，且储集囊经皮下穿刺以鞘内传递注射至储集囊中的所补充的特定酶。用于向对象鞘内给予治疗性组合物的其它装置描述于美国专利第6,217,552号中，该专利以引用的方式并入本文中。或者，可例如藉由单次注射或连续输注来鞘内给与组合物。应了解剂量治疗可呈单次剂量投药或多次剂量形式。
如本文所用，术语“鞘内投药”意欲包括藉由包括经由钻孔或池或腰椎穿刺或其类似方式进行侧向脑室注射(也即脑室内)(描述于Lazorthes等人Advances in Drug Delivery Systems and Applications in Neurosurgery,143-192及Omaya等人,Cancer Drug Delivery,1:169-179中，所述文献的内容以引用的方式并入本文中)的技术直接传递药物组合物至对象的脑脊髓液中。术语“腰区”意欲包括第三腰椎与第四腰椎(下背)之间的区域，且还包括脊柱的L2-S 1区域。术语“大池”意欲包括经由头骨与脊柱顶部之间的开口到达小脑附近及下部间隙的通路。术语“脑室”意欲包括脑中与脊髓的中心管相连的空腔。向以上提及的部位给予本发明的药物组合物可藉由直接注射组合物或藉由使用输注泵达成。对于注射，本发明的组合物可于液体溶液中调配，较佳于生理相容缓冲液，诸如亨克氏溶液(Hank's solution)、林格氏溶液(Ringer's solution)或磷酸盐缓冲液中调配。此外，酶可以固体形式调配且在使用的前即刻再溶解或悬浮。也包括冻干形式。注射液可例如呈酶的团式注射液或连续输液(例如使用输注泵)形式。
在本发明的各种实施例中，藉由侧向脑室注射至对象的脑中来给予酶。可例如经由在对象的头骨中产生的钻孔进行注射。在另一实施例中，酶及/或其它医药调配物是经由将分路以手术方式插入对象的脑室中来给予。举例而言，可向较大的侧脑室中进行注射，尽管也可向第三及第四较小脑室中进行注射。
在各种实施例中，藉由注射至对象的大池或腰区中来给予本发明中使用的药物组合物。在本发明的方法的另一实施例中，在向对象给予药学上可接受的调配物的后，药学上可接受的调配物提供本发明中使用的酶或其它药物组合物持续至少1周、2周、3周、4周或4周以上时期向对象持续传递，例如“缓慢释放”。
在各种实施例中，使治疗性融合蛋白传递至脑或脊髓的一个或多个表面或浅表组织。举例而言，在各种实施例中，使治疗性融合蛋白传递至大脑或脊髓的一个或多个表面或浅表组织。在一些实施例中，大脑或脊髓的靶向表面或浅表组织位于离大脑的表面4mm内。在一些实施例中，大脑的靶向表面或浅表组织是选自软膜组织、脑皮层条带组织、海马、维乔罗宾间隙(Virchow Robinspace)、VR间隙内的血管、海马、下视丘的在脑的下表面上的部分、视神经及视束、嗅球及突出部分及其组合。
在一些实施例中，使治疗性融合蛋白传递至大脑或脊髓的一或多种深层组织。在一些实施例中，大脑或脊髓的靶向表面或浅表组织位于大脑的表面下方(或内部)4mm(例如5mm、6mm、7mm、8mm、9mm或10mm)。在一些实施例中，大脑的靶向深层组织包括脑皮层条带。在一些实施例中，大脑的靶向深层组织包括以下一或多种：间脑(例如下视丘、视丘、腹视丘、丘脑底部等)、后脑、豆状核、基底神经节、尾状核、壳、杏仁核、苍白球及其组合。
在各种实施例中，脊髓的靶向表面或浅表组织含有软膜及/或白质束。在各种实施例中，脊髓的靶向深层组织含有脊髓灰质及/或室管膜细胞。在一些实施例中，使治疗性融合蛋白传递至脊髓的神经元。
在各种实施例中，使治疗性融合蛋白传递至小脑的一或多种组织。在某些实施例中，小脑的靶向一或多种组织是选自由分子层的组织、浦肯尼亚细胞层(Purkinje cell layer)的组织、颗粒细胞层的组织、小脑脚及其组合组成的群。在一些实施例中，使治疗剂(例如酶)传递至小脑的一或多种深层组织，包括但不限于浦肯尼亚细胞层的组织、颗粒细胞层的组织、深层小脑白质组织(例如相对于颗粒细胞层较深)及深层小脑核组织。
在各种实施例中，使治疗性融合蛋白传递至脑干的一或多种组织。在一些实施例中，脑干的靶向一或多种组织包括脑干白质组织及/或脑干核组织。
在各种实施例中，使治疗性融合蛋白传递至各种脑组织，包括但不限于灰质、白质、室周区域、软膜蜘蛛膜、脑脊髓膜、新皮质、小脑、脑皮质中的深层组织、分子层、尾状核/壳区域、中脑、桥脑或髓质的深层区域及其组合。
在各种实施例中，使治疗性融合蛋白传递至脑中的各种细胞，包括但不限于神经元、神经胶细胞、血管周细胞及/或脑膜细胞。在一些实施例中，使治疗性蛋白质传递至深层白质的寡树突细胞。
用于本发明方法中的套组
本发明的方法中使用的药剂可提供于套组中，该套组可进一步包括使用说明书。该种套组将包含如本文所述的包含用于治疗溶酶体储积疾病的酶及溶酶体靶向部分的融合蛋白，其通常呈适于向宿主给予的剂量及形式。在各种实施例中，套组将通常包含用于鞘内传递酶的装置。
也可提供用于使抗原(特定言的多肽抗原)结合于高摄取部分以产生治疗性组合物的套组。举例而言，可提供或者结合于如上所述的适于连接多肽的连接子的部分，诸如IGF-II突变蛋白质。也可与适合连接子及使用说明书组合提供呈未结合形式的高摄取部分。
除治疗性组合物的外，另一套组也可包含鞘内给予本发明的治疗性组合物的说明书。在某些实施例中，本发明的套组可包含用于鞘内给予酶补充疗法的用本发明的治疗性组合物预装载的导管或其它装置。举例而言，明确涵盖用呈药学上可接受的调配物形式的0.001-0.01mg、0.01-0.1mg、0.1-1.0mg、1.0-10mg、10-100mg或100mg以上治疗性融合蛋白预装载的导管，该治疗性融合蛋白包含溶酶体酶及溶酶体靶向部分，诸如Naglu及IGF-II突变蛋白质。示范性导管可为可在使用的后丢弃的单次使用导管。或者，预装载导管可再填充且提供于具有用于再填充此等导管的适量酶的套组中。
本发明将藉由以下实施例进一步且更明确加以描述。然而，实施例是出于说明而非限制目的被包括。
实施例1-产生间隔子序列
包含GILT标签及间隔子的溶酶体酶已揭露于美国专利公开文本第20030082176号、第20040006008号、第20040005309号及第20050281805号中。包含间隔肽的α-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(Naglu)融合蛋白揭露于美国专利公开文本第201120232021号中。如下所述开发用于包含溶酶体酶及GILT标签的靶向治疗性融合蛋白中的其它间隔肽。
可开发用以连接IGF-II突变蛋白质与弗林蛋白酶抗性IGF-II突变蛋白质两者之间隔子。示范性间隔子包括以下氨基酸序列：EFGGGGSTR(SEQ ID NO:22)、GAP(SEQ ID NO:9)、GGGGS(SEQ ID NO:12)、GGGGA(SEQ ID NO:60)、GPSGSPG(SEQ ID NO:23)、GPSGSPGT(SEQ ID NO:24)、GPSGSPH(SEQ IDNO:25)、GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPS(SEQ ID NO:36)、GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPS(SEQ ID NO:71)、GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPST(SEQ ID NO:26)、GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSH(SEQ ID NO:27)及GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSH(SEQ ID NO:62)。
产生包含间隔子、全长Naglu(包括信号序列)及IGF-II肽的构筑体，其中间隔子序列(EFGGGGSTR间隔子(SEQ ID NO:22)、GAP间隔子(SEQ ID NO:9)、GGGGS间隔子(SEQ ID NO:12)、GPSGSPG间隔子(SEQ ID NO:23)或GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPS间隔子(SEQ ID NO:36))插入在全长Naglu与IGF28-67R37A(SEQ ID NO:560-564)之间。
基于如Schellenberger等人(Nat Biotech 27:1186-1190,2009)中所述的XTEN方法制备其它连接子。相较于其它连接子，XTEN样连接子可提供所产生的融合蛋白的较长半衰期。示范性间隔子具有氨基酸序列GGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPGPS(SEQ IDNO:44)、GAPGGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPGPSGAP(SEQ ID NO:45)、GGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTGPS(SEQID NO:46)及GAPGGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTGPSGAP(SEQ ID NO:47)。间隔子可任选地经由构筑体上的AscI位点插入在Naglu与IGF-2突变蛋白质之间。
蛋白质表达已与用于编码特定氨基酸的DNA密码子相关联，例如改变氨基酸的密码子可增加蛋白质的表达而不改变蛋白质的氨基酸序列(Trinh等人,Mol.Immunol 40:717-722,2004)。改变编码肽的密码子导致重组融合蛋白产生量增加。使用此技术，开发用于具有溶酶体酶的治疗性融合蛋白中的其它间隔子序列，诸如GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:56)、GAPGGGGSGGGGSGGGGSGAP(SEQ ID NO:57)、GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:58)及GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGAP(SEQ ID NO:59)。其它间隔子序列为GGGGAGGGGAGGGGA(SEQ ID NO:79)、GAPGGGGAGGGGAGGGGAGAP(SEQ ID NO:80)、GGGGAGGGGAGGGGAGGGGA(SEQ ID NO:81)及GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGAP(SEQ ID NO:82)。此等间隔子的任一者任选地经由构筑体上的AscI位点插入在Naglu与IGF-II突变蛋白质之间。
包含多个脯氨酸以有助于刚性的一示范性刚性连接子具有以下序列：GGGSPAPTPTPAPTPAPTPAGGGPS(SEQ ID NO:48)、GAPGGGSPAPTPTPAPTPAPTPAGGGPSGAP(SEQ ID NO:49)、GGGSPAPAPTPAPAPTPAPAGGGPS(SEQ ID NO:50)或GAPGGGSPAPAPTPAPAPTPAPAGGGPSGAP(SEQ ID NO:51)，而一示范性螺旋连接子具有以下序列：GGGSAEAAAKEAAAKEAAAKAGGPS(SEQ ID NO:52)、GAPGGGSAEAAAKEAAAKEAAAKAGGPSGAP(SEQ ID NO:53)、GGGSPAEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKAPSGGG(SEQ ID NO:54)或GAPGGGSPAEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKAPSGGGGAP(SEQ IDNO:55)。此等间隔子的任一者任选地经由构筑体上的AscI位点插入在Naglu与IGF-II突变蛋白质之间。
可利用由DNA 2.0(Menlo Park,CA)开发的技术，使用密码子最佳化产生其它间隔子。涵盖之间隔子包括GGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPS(SEQ ID NO:32)、GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPSGAP(SEQ ID NO:33)、GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGPS(SEQ ID NO:28)、GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGPSGAP(SEQ ID NO:29)、GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPS(SEQ ID NO:30)、GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGAP(SEQ ID NO:31)、GGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPS(SEQ ID NO:34)、GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPSGAP(SEQ ID NO:35)、GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPS(SEQ ID NO:36)、GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGAP(SEQ ID NO:37)、GGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGPS(SEQ ID NO:38)、GAPGGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGPSGAP(SEQ ID NO:39)、GGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGGSAAAASGGGPS(SEQ ID NO:40)、GAPGGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGGSAAAASGGGPSGAP(SEQ ID NO:41)、GGGGSGGGGSAAAASGGGPSGGGGSAAAASGGGPSGGGGSAAAASGGGPS(SEQ ID NO:42)、GAPGGGGSGGGGSAAAASGGGPSGGGGSAAAASGGGPSGGGGSAAAASGGGPSGAP(SEQ ID NO:43)、GGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPS(SEQ ID NO:67)、GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPSGAP(SEQ ID NO:68)、GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGPS(SEQ ID NO:63)、GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGPSGAP(SEQ IDNO:64)、GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPS(SEQ ID NO:65)、GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGAP(SEQ ID NO:66)、GGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPS(SEQ ID NO:69)、GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPSGAP(SEQ ID NO:70)、GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPS(SEQ IDNO:71)、GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGAP(SEQ ID NO:72)、GGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGPS(SEQ ID NO:73)、GAPGGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGPSGAP(SEQ ID NO:74)、GGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGGAAAAASGGGPS(SEQ ID NO:75)、GAPGGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGGAAAAASGGGPSGAP(SEQ ID NO:76)、GGGGAGGGGAAAAASGGGPSGGGGAAAAASGGGPSGGGGAAAAASGGGPS(SEQ ID NO:77)、GAPGGGGAGGGGAAAAASGGGPSGGGGAAAAASGGGPSGGGGAAAAASGGGPSGAP(SEQ ID NO:78)、GGGGPAPGPGPAPGPAPGPAGGGPS(SEQ ID NO:87)、GAPGGGGPAPGPGPAPGPAPGPAGGGPGGAP(SEQ ID NO:88)、GGGGPAPAPGPAPAPGPAPAGGGPS(SEQ ID NO:89)及GAPGGGGPAPAPGPAPAPGPAPAGGGPGGAP(SEQ ID NO:90)。此等间隔子的任一者任选地经由构筑体上的AscI位点插入在Naglu与IGF-II突变蛋白质之间。
在某些实施例中，若使用BM-40细胞外基质蛋白质信号肽序列(Nischt等人,Eur J.Biochem 200:529-536,1991)，则构筑体中的Naglu不包含其自身信号肽序列。间隔子插入在Naglu序列与IGF-II突变蛋白质序列(例如IGF28-67R37A)之间。一示范性BM-40信号肽序列为MRAWIFFLLCLAGRALA(SEQ ID NO:8)。GAP肽可添加至间隔子中以有助于选殖及添加AscI选殖位点。在某些实施例中，若使用天然Naglu信号肽序列(Weber等人,Hum Mol Genet.5:771-777,1996)，则Naglu为全长Naglu且间隔子插入在全长Naglu与IGF-II突变蛋白质序列(例如IGF28-67R37A)之间。GAP肽可添加至间隔子中以有助于选殖及添加AscI选殖位点。
在示范性构筑体中，已使用DNA 2.0技术使人类Naglu经“密码子最佳化”。意欲Naglu包含人类Naglu的氨基酸1-743或氨基酸24-743。在一示范性构筑体中，间隔子任选地包含GAP间隔子(用于选殖的AscI限制酶位点)或任何以下序列：EFGGGGSTR(SEQ ID NO:22)、GAP(SEQ ID NO:9)、GGGGS(SEQ ID NO:12)、GPSGSPG(SEQ ID NO:23)、GPSGSPGT(SEQ ID NO:24)、GPSGSPGH(SEQID NO:25)、GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPST(SEQ ID NO:26)、GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSH(SEQ ID NO:27)、GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGPS(SEQ ID NO:28)、GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGPSGAP(SEQ ID NO:29)、GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPS(SEQ ID NO:30)、GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGAP(SEQ ID NO:31)、GGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPS(SEQ ID NO:32)、GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPSGAP(SEQ ID NO:33)、GGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPS(SEQ ID NO:34)、GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPSGAP(SEQ ID NO:35)、GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPS(SEQ ID NO:36)、GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGAP(SEQ ID NO:37)、GGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGPS(SEQ ID NO:38)、GAPGGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGPSGAP(SEQ ID NO:39)、GGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGGSAAAASGGGPS(SEQ ID NO:40)、GAPGGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGGSAAAASGGGPSGAP(SEQ ID NO:41)、GGGGSGGGGSAAAASGGGPSGGGGSAAAASGGGPSGGGGSAAAASGGGPS(SEQ ID NO:42)、GAPGGGGSGGGGSAAAASGGGPSGGGGSAAAASGGGPSGGGGSAAAASGGGPSGAP(SEQ ID NO:43)、GGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPGPS(SEQ IDNO:44)、GAPGGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPGPSGAP(SEQ ID NO:45)、GGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTGPS(SEQID NO:46)、GAPGGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTGPSGAP(SEQ ID NO:47)、GGGSPAPTPTPAPTPAPTPAGGGPS(SEQ ID NO:48)、GAPGGGSPAPTPTPAPTPAPTPAGGGPSGAP(SEQ ID NO:49)、GGGSPAPAPTPAPAPTPAPAGGGPS(SEQ ID NO:50)、GAPGGGSPAPAPTPAPAPTPAPAGGGPSGAP(SEQ ID NO:51)、GGGSAEAAAKEAAAKEAAAKAGGPS(SEQ ID NO:52)、GAPGGGSAEAAAKEAAAKEAAAKAGGPSGAP(SEQ ID NO:53)、GGGSPAEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKAPSGGG(SEQ ID NO:54)、GAPGGGSPAEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKAPSGGGGAP(SEQ IDNO:55)、GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:56)、GAPGGGGSGGGGSGGGGSGAP(SEQ ID NO:57)、GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:58)、GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGAP(SEQ ID NO:59)、GGGGA(SEQ ID NO:60)、GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPST(SEQ ID NO:61)、GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSH(SEQ ID NO:62)、GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGPS(SEQ ID NO:63)、GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGPSGAP(SEQ ID NO:64)、GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPS(SEQ ID NO:65)、GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGAP(SEQ ID NO:66)、GGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPS(SEQ ID NO:67)、GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPSGAP(SEQ ID NO:68)、GGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPS(SEQ ID NO:69)、GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPSGAP(SEQ ID NO:70)、GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPS(SEQ IDNO:71)、GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGAP(SEQ ID NO:72)、GGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGPS(SEQ ID NO:73)、GAPGGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGPSGAP(SEQ ID NO:74)、GGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGGAAAAASGGGPS(SEQ ID NO:75)、GAPGGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGGAAAAASGGGPSGAP(SEQ ID NO:76)、GGGGAGGGGAAAAASGGGPSGGGGAAAAASGGGPSGGGGAAAAASGGGPS(SEQ ID NO:77)、GAPGGGGAGGGGAAAAASGGGPSGGGGAAAAASGGGPSGGGGAAAAASGGGPSGAP(SEQ ID NO:78)、GGGGAGGGGAGGGGA(SEQ ID NO:79)、GAPGGGGAGGGGAGGGGAGAP(SEQ ID NO:80)、GGGGAGGGGAGGGGAGGGGA(SEQ ID NO:81)、GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGAP(SEQ ID NO:82)、GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPS[或(GGGGA)8GGGPS](SEQ ID NO:83)、GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSH[或(GGGGA)8GGGPSH](SEQ ID NO:84)、GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPS[或(GGGGA)9GGGPS](SEQ ID NO:85)、GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSH[或(GGGGA)9GGGPSH](SEQ ID NO:86)、GGGGPAPGPGPAPGPAPGPAGGGPS(SEQ ID NO:87)、GAPGGGGPAPGPGPAPGPAPGPAGGGPGGAP(SEQ ID NO:88)、GGGGPAPAPGPAPAPGPAPAGGGPS(SEQ ID NO:89)及GAPGGGGPAPAPGPAPAPGPAPAGGGPGGAP(SEQ ID NO:90)。任选地使用DNA 2.0技术使以上间隔子经“密码子最佳化”。
本文所述的任选地使用DNA 2.0技术加以“密码子最佳化”的任何IGF-II突变蛋白质皆适用于本发明构筑体中。在示范性构筑体中，IGF-II突变蛋白质为弗林蛋白酶抗性IGF-II突变蛋白质IGF2Δ8-67R37A。
实施例2-表达及纯化构筑体
制备且重组表达包含以上间隔子、Naglu酶及IGF-II靶向肽的构筑体。在某些实施例中，构筑体包含信号肽。示范性信号肽包括例如且不限于包含全长Naglu的氨基酸1-23的Naglu信号肽(Weber等人,Hum Mol Genet 5:771-777,1996)或源于BM-40细胞外基质蛋白质的信号肽(Nischt等人,Eur J Biochem200:529-536,1991)。
将编码Naglu序列、IGF-II突变蛋白质及间隔肽的DNA插入适当表达载体，诸如pEE及pXC GS表达载体(Lonza Biologics,Berkshire,UK)及pC3B(BioMarin，内部)表达载体中。AscI限制位点(ggcgcgcc(SEQ ID NO:570))可插入载体中以有助于选殖本文所述的治疗性融合蛋白。
一示范性构筑体包含包括信号肽的全长Naglu序列(图1及图2)、间隔肽(图3)及包含残基8-67且在残基Arg-37处具有对IGF-II肽赋予弗林蛋白酶抗性的Ala氨基酸取代R37A的IGF-II肽(图1及2)。
初始使用短暂表达是统评估实施例1中所述的连接Naglu与IGF-II肽的各种连接子或间隔子序列。将具有GILT标签的Naglu质体(pXC17.4，Lonza)转染至悬浮CHOK1SV GS KO细胞(Lonza)中。使用电穿孔使15μg质体DNA转染至106个细胞中。在转染后24小时完全交换培养基。将经转染细胞在不经选择下在1.5×106个细胞/毫升下接种于振荡器烧瓶中。当细胞在30℃下生长直至14天时，测定细胞生长、活力、效价及比生产力。
使具有GILT标签的Naglu质体转染至悬浮CHOK1SV细胞(Lonza)中。使细胞在37℃及8％CO2下在振荡烧瓶中于含6mM麸酰氨酸的CDCHO培养基(Invitrogen)中生长。使用电穿孔使1×107个细胞中的30μg线性化质体DNA转染至细胞中。在转染的后48小时将细胞于CDCHO培养基+40μM MSX中在5000个细胞/孔下接种。在37℃及8％CO2下培育各盘约4-6周以鉴别纯是生长。接着藉由针对Naglu的4MU活性分析(参见实施例3)筛检菌落且将最高表达性菌落于CDCHO培养基+40μM MSX中转移至24孔盘中，且接着继续使最高表达性纯是继代至6孔盘中，接着振荡烧瓶以鉴别最高表达性纯是来产生具有GILT标签的Naglu融合蛋白。
使用标准蛋白质纯化技术进行纯化。举例而言，在一示范性纯化方法中，自-80℃下储积物解冻如上所述的哺乳动物细胞培养上清液起始物质。用NaCl调整物质以达到最终浓度1M，随后进行0.2μm无菌过滤。
将经过滤物质装载于用丁基装载缓冲液(20mM Tris、1M NaCl，pH 7.5)预平衡的丁基疏水性相互作用管柱上。使用丁基溶离缓冲液(20mM Tris，pH7.5)，用历经10管柱体积的线性梯度溶离结合物质。汇合来自溶离峰的样品，经缓冲液交换至20mM Tris(pH 7.5)中，且装载于Q阴离子交换管柱上。接着使用Q溶离缓冲液(20mM Tris、1M NaCl，pH 7.5)，用线性梯度(10管柱体积)溶离结合蛋白质。接着使用离心旋转浓缩器使纯化样品经缓冲液交换且无菌过滤以供储积。
构筑、表达、产生、纯化及调配一示范性Naglu融合蛋白：Naglu-(GGGGS)4GGGPS-IGF-II(SEQ ID NO:568)。藉由标准重组DNA方法产生编码Naglu-(GGGGS)4GGGPS-IGF-II(SEQ ID NO:568)的DNA构筑体。Naglu对应于全长人类Naglu的氨基酸1-743且IGF-II对应于包含成熟人类IGF-II的氨基酸8-67，且具有赋予弗林蛋白酶抗性的R37A氨基酸取代的IGF-II突变蛋白质。用DNA构筑体转染CHOK1SV细胞，且如上所述分离稳定的具有GILT标签的Naglu-IGF-II融合蛋白表达性纯是。
使表达Naglu-(GGGGS)4GGGPS-IGF-II(SEQ ID NO:568)的细胞在生物反应器中生长，且如下自培养基纯化Naglu融合蛋白。用盐调整收集物至1M NaCl，接着装载于丁基琼脂糖4FF管柱上。用盐自丁基琼脂糖4FF管柱溶离Naglu融合蛋白，收集并透析，且接着装载于肝素琼脂糖6FF管柱上。Naglu融合蛋白收集于流过(flow-through)溶离份中，且装载于Q琼脂糖HP管柱上。用盐自Q琼脂糖HP管柱溶离Naglu融合蛋白，浓缩，且接着藉由制备型聚丙烯酰胺葡聚糖S300粒径排阻层析精制。
使用此纯化程序，产生高度纯化的酶活性Naglu融合蛋白Naglu-(GGGGS)4GGGPS-IGF-II(SEQ ID NO:568)。以20mg/mL将纯化Naglu融合蛋白调配于人工CSF(1mM磷酸钠、148mM氯化钠、3mM氯化钾、0.8mM氯化镁、1.4mM氯化钙，pH 7.2)中。
构筑、表达、产生、纯化及调配示范性Naglu融合蛋白。藉由标准重组DNA方法产生编码Naglu-(GGGGA)4GGGPS-IGF-II(SEQ ID NO:569)、Naglu-刚性-IGF-II(SEQ ID NO:566)、Naglu-螺旋-IGF-II(SEQ ID NO:567)及Naglu-XTEN-IGF-II(SEQ ID NO:565)的DNA构筑体。Naglu对应于全长人类Naglu的氨基酸1-743且IGF-II对应于包含成熟人类IGF-II的氨基酸8-67，且具有赋予弗林蛋白酶抗性的R37A氨基酸取代的IGF-II突变蛋白质。示范性刚性、螺旋及XTEN连接子描述于实施例1中。用DNA构筑体转染CHOK1SV细胞，且如上所述分离稳定的具有GILT标签的Naglu-IGF-II融合蛋白表达性纯是。
使表达Naglu-IGF-II融合蛋白的细胞在生物反应器中生长。在典型馈料批式产生操作(10～16天)中，具有各种连接子的Naglu-IGF-II构筑体皆达到高于30mg/L的效价及高于80％的高细胞活力。
如上所述自培养基纯化Naglu融合蛋白。使用此纯化程序，酶活性未加标签的Naglu及Naglu-IGF-II融合蛋白，诸如Naglu-刚性-IGF-II(SEQ ID NO:566)、Naglu-螺旋-IGF-II(SEQ ID NO:567)、Naglu-XTEN-IGF-II(SEQ ID NO:565)及Naglu-(GGGGA)4GGGPS-IGF-II(SEQ ID NO:569)经纯化至约99％纯度，如藉由逆相HPLC所测定。以20mg/mL将纯化未加标签的Naglu及Naglu融合蛋白调配于人工CSF(1mM磷酸钠、148mM氯化钠、3mM氯化钾、0.8mM氯化镁、1.4mM氯化钙，pH 7.2)中。
意欲如本文所述的相较于包含不同间隔肽的融合蛋白，显示较高重组活性蛋白质表达量及/或酶活性增加的融合蛋白可用于如下进一步所述的进一步实验，诸如活性分析、结合分析、摄取分析及体内活性分析中。
实施例3-活性分析
为测定Naglu融合蛋白的酶活性，使用荧光标记的合成受质进行活体外Naglu活性分析。
分析中使用的物质包括：于含10％DMSO的分析缓冲液(0.2M乙酸钠，有或无1mg/ml BSA，及0.005％吐温20(Tween 20)，pH 4.3-4.8)中制备成最终20mM浓度且储积在-80℃下的4-甲基伞酮-N-乙酰基-α-D-葡萄胺糖苷(4MU-NaGlu受质)(Calbiochem，目录号474500)。以10mM在DMSO中制备4-甲基伞酮(4-MU标准物)(Sigma，目录号M1381)的储备溶液且以小等分试样储积在-20℃下。rhNaglu-His6对照(0.5mg/ml，R&D Systems，目录号7096-GH)于25mM Tris、125mM NaCl、0.001％吐温20(pH 7.5)中稀释至10μg/ml且以小等分试样储积在-80℃下。
在透明96孔稀释盘(Granger)上，使用标准物于稀释缓冲液(1×PBS，有或无1mg/ml BSA，0.005％吐温20，pH 7.4)中的2×连续稀释液，自200μM至1.563μM，加一个空白。在透明稀释盘上，以若干稀释度(于稀释缓冲液中)制备样品以确保其在标准曲线内。
将10μl标准物(200μM至1.563μM)、对照及操作样品转移至黑色非处理聚苯乙烯96孔盘(Costar，目录号3915)中。添加75μl受质(2mM)至各孔中，随后在37℃下培育30分钟。接着藉由添加200μl终止缓冲液(0.5M甘氨酸/NaOH，pH10.7)来淬灭反应。在96孔荧光盘读取器上在Ex355Em460，以455为截断值下读取各盘。
使用此分析，显示示范性Naglu融合蛋白，包括Naglu-(GGGGS)4GGGPS-IGF-II(SEQ ID NO:568)、Naglu-(GGGGA)4GGGPS-IGF-II(SEQ ID NO:569)、Naglu-刚性-IGF-II(SEQ IDNO:566)、Naglu-螺旋-IGF-II(SEQ ID NO:567)及Naglu-XTEN-IGF-II(SEQ IDNO:565)具有活体外酶活性，其中对合成4MU-Naglu受质的比活性在约175,000至约220,000nmol/h/mg的范围内。Naglu融合蛋白的酶活性与未加标签的Naglu蛋白质的酶活性(约190,000nmol/h/mg)类似。示范性Naglu融合蛋白的酶活性数据提供于表1中。
表2.Naglu融合蛋白的活性
1如实施例2中所述构筑、表达且纯化未加标签的Naglu及Naglu融合蛋白；示范性刚性、螺旋及XTEN连接子描述于实施例1中
2实施例3至5中测试的Naglu融合蛋白中的连接子的SEQ ID NO:
3如实施例3中所述量测Naglu蛋白质的比活性(nmol/h/mg)
4如实施例4中所述量测Naglu蛋白质对IGF2R竞争性结合的IC50
5如实施例5中所述量测Naglu蛋白质在MPS-IIIB纤维母细胞中的K摄取及半衰期(t1/2)
实施例4-结合分析
一般如US 20120213762中所述进行用以测定Naglu融合蛋白与IGF-I、IGF-II及胰岛素受体的结合的结合分析。简言的，在量测生物素化胰岛素结合盘结合的胰岛素的竞争的分析中测试融合蛋白构筑体对胰岛素受体的结合亲和力。藉由使胰岛素、IGF-II及融合蛋白与生物素化胰岛素竞争结合胰岛素受体(胰岛素-R)来进行胰岛素受体结合分析。
详言的，白色Reacti-Bind盘用胰岛素-R在1μg/孔/100μl(38.4nM)的浓度下涂布。将经涂布盘在室温下培育隔夜，接着用洗涤缓冲液(300μl/孔)洗涤3次。接着用阻断缓冲液(300μl/孔)阻断各盘1小时。重复洗涤步骤且取出各盘中任何痕量的溶液。使生物素化胰岛素在20nM下与藉由连续稀释获得的不同浓度的胰岛素、IGF-II或融合蛋白混合。添加100μl含稀释胰岛素、IGF-II或Naglu融合蛋白的20nM胰岛素-生物素至经涂布盘中且在室温下培育各盘2小时。接着用洗涤缓冲液洗涤各盘3次。添加100μl抗生蛋白链菌素(strepavidin)-HRP操作溶液(50μl抗生蛋白链菌素-HRP于10ml阻断缓冲液中)至各盘中且在室温下培育各盘30分钟。添加100μl含有Elisa-Pico化学发光受质的Elisa-Pico操作溶液且在425nm下量测化学发光。
IGF2R竞争性结合分析
为量测Naglu融合蛋白构筑体结合IGF-II受体的能力，进行竞争性结合分析。将IGFIIR的涉及IGF-II结合的片段(域10-13，称为蛋白质1288)涂布在96孔盘上。将生物素化IGF-II与受体一起在递增量的竞争剂：对照IGF-II(非生物素化)或融合蛋白样品(含有IGF-II源性GILT抗原决定基标签)存在下培育。用结合于辣根过氧化酶(HRP)的抗生蛋白链菌素及化学发光HRP受质侦测受体结合的生物素化IGF-II。由抑制曲线计算融合蛋白抑制生物素化IGF-II结合IGFIIR的能力且报导为IC50值(为达成50％结合抑制所需的浓度)。
对于分析，将IGFIIR于涂布缓冲液中在0.5μg/孔下以100μl体积(69.6nM/孔)涂布于白色Reacti-bind盘(Pierce，目录号437111)中。将盘密封且在室温下培育隔夜。接着用洗涤缓冲液将盘洗涤3次，用阻断缓冲液阻断且接着再次用洗涤缓冲液(300μl/孔)洗涤3次。
接着，使8nM IGF-II-生物素与不同浓度的竞争剂(IGF-II(非生物素化)、参照蛋白或Naglu融合蛋白样品)混合，且以2倍连续稀释度添加至IGFIIR涂布的盘中。
在室温下将盘培育2小时，随后用洗涤缓冲液将盘洗涤3次。于阻断缓冲液中制备抗生蛋白链菌素-HRP(1:200稀释)，且添加每孔100μl至盘中。使用Pico-Elisa试剂，经由抗生蛋白链菌素-HRP侦测IGF-II-生物素结合活性。简言的，每孔添加制备的Pico-Elisa操作溶液(100μl/孔)，且在室温下在温和摇动下培育5分钟，接着量测425nm下的化学发光。
使用在各抑制剂浓度下结合的IGF-II-生物素的百分比来计算样品的IC50。
使用此竞争性IGFIIR结合分析，显示示范性Naglu融合蛋白，包括Naglu-(GGGGS)4GGGPS-IGF-II(SEQ ID NO:568)、Naglu-(GGGGA)4GGGPS-IGF-II(SEQ ID NO:569)、Naglu-刚性-IGF-II(SEQ IDNO:566)、Naglu-螺旋-IGF-II(SEQ ID NO:567)及Naglu-XTEN-IGF-II(SEQ IDNO:565)具有0.23-0.36nM的IC50值。未加标签的Naglu蛋白质在此分析中不具有可侦测结合。示范性Naglu融合蛋白的IGF2R竞争性结合数据提供于表1中。
实施例5-摄取分析
为量测溶酶体储积疾病酶经由受体介导的胞吞作用进入细胞的能力，进行使用CI-MPR受体量测大鼠肌母细胞L6细胞或人类MPS IIIB纤维母细胞中的酶摄取的摄取分析。甘露糖-6-磷酸(M6P)及IGF-II用作抑制剂以确定结合CI-MPR受体的位点。收集数据以产生酶摄取的饱和曲线且确定过程的动力学参数K摄取。
在摄取分析的前(24小时)，在每孔1×105个细胞的密度下将L6细胞(L6大鼠肌母细胞，ATCC#CRL-1458)或人类MPS IIIB纤维母细胞接种于24孔盘(VWR#62406-183)中且每孔接种0.5ml。在分析的早晨，在组织培养通风橱中使酶与摄取培养基(1L DMEM、1.5g碳酸氢钠、0.5g牛血清白蛋白、20ml L-麸酰氨酸(200mM(Gibco#25030-081))、20ml 1M HEPES(Gibco#1563080)(20mM最终)，pH 7.2)混合。酶量可在2-500nM的范围内。摄取培养基+酶的最终体积为每孔0.5ml。添加M6P(5mM最终浓度)及/或IGF-II(2.4μM或18μg/ml最终浓度)至适当样品中。对于摄取抑制，每毫升摄取培养基添加18μl IGF-II储备物(1mg/ml，133.9μM)。
自细胞吸出生长培养基且添加0.450ml含酶的摄取缓冲液至各孔中。注意时间且使细胞返回至培育箱持续18小时。自培育箱移除盘且自细胞吸出摄取缓冲液。藉由添加0.5ml杜贝卡氏PBS(Dulbecco’s PBS)且吸出来将各盘洗涤4次。添加200μl CelLytic M溶解缓冲液(Sigma)至各盘中且在室温下振荡20-30分钟。自细胞移除溶解产物且在-80℃下储积于经胶带覆盖的透明96孔盘(VWR)中直至准备分析。
对于酶分析，藉由一式两份添加至于黑色96孔盘(VWR)(参见上文)中的15μl酶反应混合物(例如Naglu+4MU分析物)中来添加5μl各溶解产物且测定各溶解产物中的酶/单位/ml/h。
对于溶解产物蛋白质分析，根据制造商说明书使用Pierce BCA蛋白质分析套组分析一式两份10μl各溶解产物。为量测吸光度，用盘读取器(BMG FluoStarOptima盘读取器)在562nm下读取吸光度且测定ug/ml浓度。
对于各酶装载量，摄取量为每毫克溶解产物的酶活性单位数。为测定摄取量，每毫升的酶单位数除以ug/ml蛋白质且乘以1000(减去来自空白孔的摄取量)。比较有或无抑制剂的分析的结果以测定受体摄取特异性。
对于饱和曲线，在0.2-100nM的范围内的10个酶装载浓度用于使用上述分析产生饱和曲线。
使用此分析，显示示范性Naglu融合蛋白Naglu-(GGGGS)4GGGPS-IGF-II(SEQ ID NO:568)在MPS-IIIB纤维母细胞中的K摄取为7-9nM。
或者，在摄取分析的前(24小时)，在1×105个细胞/0.5ml/孔的密度下将L6细胞或人类MPS IIIB纤维母细胞接种于24孔盘中。于摄取培养基：1L DMEM、1.5g碳酸氢钠、0.5g牛血清白蛋白、20ml 200mM L-麸酰氨酸及20ml 1MHEPES(pH 7.2)中制备1.6～50nM的酶样品。对于摄取抑制，添加M6P(直至最终5.0mM)及/或IGF-II(直至最终1.0μM)至适当样品中。
自细胞吸出生长培养基且用每孔0.5ml含酶制剂的摄取缓冲液替换。在培育4小时的后，用0.5ml杜贝卡氏PBS洗涤各盘2次。添加100μl M-PER溶解缓冲液(Pierce)至各盘中且在室温下振荡10分钟。溶解产物储积在-80℃下直至准备分析。
对于酶分析，一式两份添加10μl各溶解产物至黑色96孔盘(参见上文)中。
对于溶解产物蛋白质分析，根据制造商说明书使用Pierce BCA蛋白质分析套组分析一式两份10μl各溶解产物。用盘读取器(BMG FluoStar Optima盘读取器)在562nm下读取吸光度且使用BSA作为标准物测定μg/ml浓度。
对于各酶装载量，摄取量表示为30分钟内释放的4-MU的奈摩尔数。对于饱和曲线，在1.6-50nM的范围内的酶浓度用于使用上述分析产生饱和曲线。
藉由历经约8天的时期监测细胞内Naglu活性来测定Naglu融合蛋白的细胞稳定性。在每孔1×105个细胞的密度下接种于24孔盘(VWR#62406-183)中的人类MPS IIIB纤维母细胞用Naglu融合蛋白在20nM最终浓度下处理4小时。在培育4小时的后，使细胞切换至无Naglu融合蛋白的生长培养基中。对于各时间点(4小时、28小时、4天、6天及8天)，在室温下于100μl M-PER溶解缓冲液(Pierce)中溶解细胞10分钟，且使用4-MU标记的受质分析酶活性。历经8天取样时期的Naglu活性降低可相对于一级动力学加以拟合以估计蛋白质的细胞半衰期。
使用此分析，显示示范性Naglu融合蛋白，包括Naglu-(GGGGS)4GGGPS-IGF-II(SEQ ID NO:568)、Naglu-(GGGGA)4GGGPS-IGF-II(SEQ ID NO:569)、Naglu-刚性-IGF-II(SEQ IDNO:566)、Naglu-螺旋-IGF-II(SEQ ID NO:567)及Naglu-XTEN-IGF-II(SEQ IDNO:565)以K摄取值约2.3-6.3nM内化至MPS IIIB纤维母细胞中。相反，在此等实验条件下，未加标签的Naglu蛋白质未由细胞摄取。此外，Naglu融合蛋白的观测摄取量受IGF-II而非受M6P抑制。在摄取的后，发现示范性Naglu融合蛋白为稳定的，基于在细胞溶解产物中量测的酶活性(4-MU受质)的估计半衰期为约9.5天。示范性Naglu融合蛋白的摄取及半衰期数据提供于表1中。
实施例6-体内NAGLU融合蛋白活性
为测定Naglu融合蛋白体内活性，向Naglu基因剔除动物给予融合蛋白(参见Li等人,Proc Natl Acad Sci USA 96:14505-510,1999)。Naglu基因剔除物呈现有在脑、肝及肾中的大量硫酸乙酰肝素、脑中β-己醣胺酶活性及溶酶体相关的膜蛋白2(LAMP-2)染色增加、及脑中的神经节苷脂升高。
在历经两周时期ICV(脑室内)注射重组人类(rh)Naglu-IGF24次(每次注射100μg)的后测定外源性酶的活性及生物分布。将永久导管植入小鼠(n＝12/组，开始时为8-12周龄)中且调整以覆盖导管不在脑室中的彼等小鼠。终点量测结果包括Naglu生物分布、脑细胞的溶酶体中的GAG(例如硫酸乙酰肝素)储积降低、及星形细胞及小神经胶质细胞的活化。在治疗及对照组层面上量测的各含量的各种溶酶体或神经性生物标记物(Ohmi等人,PLoS One 6:e27461,2011)包括但不限于溶酶体相关的膜蛋白1(LAMP-1)、LAMP-2、磷脂酰肌醇蛋白聚糖5、硫酸乙酰肝素的Naglu特异性非还原性末端(NRE)、神经节苷脂、胆固醇、粒线体ATP合成酶的次单元c(SCMAS)、泛素、P-GSK3β、β淀粉状蛋白及P-tau(磷酸化Tau)、GFAP(星形细胞活化)及CD68(小神经胶质细胞活化)。
使用历经两周时期接受4次rhNaglu-IGF2ICV注射的小鼠(n＝12/组，开始时为5个月大，每次注射100μg)进行测定存活及行为分析的其它实验。欲量测的终点包括存活时间、开放场地活动性、Naglu生物分布、溶酶体中的GAG(例如硫酸乙酰肝素)储积降低、溶酶体或神经性生物标记物(诸如LAMP-1、LAMP-2、磷脂酰肌醇蛋白聚糖5、神经节苷脂、胆固醇、SCMAS、泛素、P-GSK3β、β淀粉状蛋白、P-tau、GFAP及CD68)的含量。
已开发在naglu基因的外显子6中具有突变的Naglu基因剔除小鼠(Naglu-/-)(Li等人,Proc Natl Acad Sci U S A.96:14505-10,1999)。选择外显子6位点，因为此为人类中的许多突变的位点。在同型接合小鼠中未侦测到Naglu活性，且在异型接合子中存在Naglu活性降低。Naglu-/-小鼠具有降低的存活时间(6-12个月)，且可具有其它功能性表型，如活动性程度降低。分析Naglu融合蛋白对Naglu-/-小鼠的影响。
历经2周向Naglu-/-小鼠(n＝8)及8只Naglu-/-小鼠(n＝8个同窝异型接合子)给予4次ICV剂量(每剂100μg Naglu-IGF2)。在第-2天时，使小鼠麻醉且将导管插入左侧脑室。使小鼠恢复。在第1、5、10及14天，在ICV给药的前15分钟使小鼠麻醉(苯乃尔(Benedryl)，5mg/kg IP)。历经15分钟经由导管输注5μl体积的ICV剂量，且使小鼠恢复。在第15天，处死小鼠，放血且冷冻血清。收集脑且将IR染料注射至导管中并使导管成像。
进行以下分析以测定Naglu融合蛋白的影响：体重评估、导管置放的NIR成像、使用免疫组织化学评估脑中的Naglu-IGF2、GFAP、LAMP-1及LAMP-2含量、针对Naglu活性、β-己醣胺酶含量及活性的生物化学分析、用以侦测累积糖胺聚糖(GAG)的为IIIb型黏多糖病(MPS-IIIb)所特有的非还原性末端的SensiPro分析(WO 2010/078511A2)、如藉由生物化学分析量测的GM3神经节苷脂含量、以及对内侧内嗅皮质中的SCMAS、A-β、磷脂酰肌醇蛋白聚糖5、CD68、GFAP及Naglu的免疫染色(Li等人,上文)。
预期用Naglu-IGF2有效治疗会导致LAMP-1、LAMP-2、GFAP、CD68、SCMAS、A-β、磷脂酰肌醇蛋白聚糖5、β-己醣胺酶、GM3神经节苷脂及MPS-IIIb特异性GAG的含量降低。
示范性Naglu融合蛋白在小鼠MPS IIIb模型中的体内功效。历经两周时期向Naglu-/-小鼠(n＝8)给予4次ICV剂量(每剂100μg)的Naglu-IGF-II融合蛋白Naglu-(GGGGS)4GGGPS-IGF-II(SEQ ID NO:568)或Naglu-刚性-IGF-II(SEQ IDNO:566)。对Naglu-/-小鼠(n＝8)及8个异型接合或野生型同窝出生者(n＝8)给与单独媒剂作为对照。在第-5天时，使小鼠麻醉；将导管插入脑的左侧脑室。使小鼠恢复。在第1、5、10及14天，用吸入异氟烷使小鼠麻醉。在ICV给药的前15分钟向各小鼠给予苯乃尔(5mg/kg IP)以降低反应于Naglu-IGF-II治疗的任何潜在组胺释放。历经15-20分钟经由植入导管输注5μl体积的ICV剂量，且使小鼠恢复。在最终剂量的后1、7、14及28天，处死小鼠。收集脑且径向分成5段以分配给各种分析。
进行以下分析以测定Naglu-IGF-II融合蛋白的影响：免疫化学评估脑中的Naglu、LAMP-2、GFAP及CD68含量、针对Naglu及β-己醣胺酶活性的生物化学分析、用以侦测总硫酸乙酰肝素及硫酸乙酰肝素的为所IIIB型黏多糖病(MPS-IIIB)特有的NRE的SensiPro分析(Deakin等人,Glycobiology 18:483,2008；Lawrence等人,Nat Chem Biol.8:197,2012；Lawrence等人,J Biol Chem.283:33674,2008)(WO 2010/078511A2)、及对内侧内嗅皮质中的SCMAS、β-淀粉状蛋白(A-β)、p-Tau、P-GSK3β、磷脂酰肌醇蛋白聚糖5、GFAP及CD68的免疫荧光染色(Li等人,上文)。
当在最终剂量的后24小时评估时，用Naglu-(GGGGS)4GGGPS-IGF-II(SEQID NO:568)或Naglu-刚性-IGF-II(SEQ ID NO:566)融合蛋白治疗导致Naglu酶活性显著增加，伴有β-己醣胺酶活性及总硫酸乙酰肝素、硫酸乙酰肝素的Naglu特异性NRE以及LAMP-2的含量降低。Naglu酶可易于在脑组织中侦测，不仅在皮质、海马、齿状回及视丘中，而且也在远程地理位置，包括杏仁核、鼻周皮质及下视丘中可侦测。在用Naglu-IGF-II治疗后，也观测到Naglu-/-脑中的CD68、SCMAS、β-淀粉状蛋白(A-β)、p-Tau、P-GSK3β及磷脂酰肌醇蛋白聚糖5的含量显著降低。截至末次剂量后24小时，GFAP染色不变化。免疫组织化学显示在脑的许多区域中，在神经元及神经胶细胞内部存在与LAMP-2共定位的Naglu酶。
历经末次剂量后7、14及28天时间点，硫酸乙酰肝素含量、Naglu特异性NRE含量及β-己醣胺酶活性程度持续降低。在28天，所有分析物皆处于或接近正常小鼠对照值。
等效物
熟习此项技术者将仅使用常规实验即会认识到或能够确定本文所述的本发明的特定实施例的许多等效物。本发明的范畴不意欲限于以上描述，而是如随附权利要求中所述。除非明确相反地指示，否则如本文在说明书及权利要求中所用的冠词“一”及“该”应理解成包括复数个指示物。除非相反地指示或另外根据上下文显而易知，否则若一个、一个以上或全部群组成员存在于、用于既定产品或过程中或另外与既定产品或过程相关，则在某一群组的一个或多个成员之间包括“或”的权利要求或描述被视为符合。本发明包括群组的恰好一个成员存在于、用于既定产品或过程中或另外与既定产品或过程相关的实施例。本发明也包括一个以上或全部群组成员存在于、用于既定产品或过程中或另外与既定产品或过程相关的实施例。此外，应了解除非另外指示或除非将为一般技艺人士显而易知将出现矛盾或不一致，否则本发明涵盖来自一个或多个权利要求的一个或多个限制、要素、条款、描述性术语等的变化形式、组合及排列引入依赖于同一基础权利要求(或当相关时任何其它权利要求)的另一权利要求中。当要素以清单形式，例如以马库西(Markush)群组或类似形式呈现时，应了解也揭露所述要素的各子组，且可自群组移除任何要素。应了解一般而言，当本发明或本发明的态样被提及为包含特定要素、特征等时，本发明的某些实施例或本发明的某些态样由或基本上由此等要素、特征等组成。出于简化目的，彼等实施例尚未在每一情况下皆在本文中明确阐述。也应了解本发明的任何实施例，例如见于现有技术内的任何实施例可明确自权利要求排除，无论是否在说明书中叙述特定排除。
也应了解除非明确相反地指示，否则在本文主张的包括一个以上举动的任何方法中，方法的举动的顺序不必限于叙述方法的举动所依的顺序，但本发明包括如此限制顺序的实施例。此外，当权利要求叙述组合物时，本发明涵盖使用该组合物的方法及制备该组合物的方法。当权利要求叙述组合物时，应了解本发明涵盖使用该组合物的方法及制备该组合物的方法。
本发明中引用的所有公开文本及专利文件皆以全文引用的方式并入本文中，该引用的程度就如同将各个别公开文本或专利文件的内容并入本文中一般。

Claims (61)

1.一种靶向治疗性融合蛋白，其包含(a)溶酶体酶、(b)肽标签，所述肽标签的氨基酸序列与成熟人类IGF-II的氨基酸8-67具有至少70％的相同性，和(c)间隔肽，所述间隔肽在该溶酶体酶与该IGF-II肽标签之间，其中该间隔肽包含一个或多个GGGPS(SEQ ID NO:14)或GGGSP(SEQ ID NO:15)氨基酸序列，且任选地还包含以下一个或多个序列：(i)GAP(SEQ ID NO:9)、(ii)GGGGS(SEQ ID NO:12)、(iii)GGGS(SEQ ID NO:16)、(iv)AAAAS(SEQ ID NO:17)、(v)AAAS(SEQ ID NO:18)、(vi)PAPA(SEQ ID NO:19)、(vii)TPAPA(SEQ ID NO:20)、(viii)AAAKE(SEQ IDNO:21)或(ix)GGGGA(SEQ ID NO:60)。
2.如权利要求1所述的靶向治疗性融合蛋白，其特征在于，所述间隔肽包含选自下组的氨基酸序列：(GGGGS)n(SEQ ID NO:12、56、58、91-94)、(GGGGS)n-GGGPS(SEQ ID NO:36、95-100)、GAP-(GGGGS)n-GGGPS(SEQ ID NO:101-107)、GAP-(GGGGS)n-GGGPS-GAP(SEQ ID NO:37、108-113)、GAP-(GGGGS)n-GGGPS-(GGGGS)n-GAP(SEQ ID NO:114-162)、GAP-GGGPS-(GGGGS)n-GAP(SEQ ID NO:163-169)、GAP-(GGGGS)n-AAAAS-GGGPS-(GGGGS)n-AAAA-GAP(SEQ ID NO:170-218)、GAP-(GGGGS)n-PAPAP-(Xaa)n-GAP(SEQ ID NO:219-267)、GAP-(GGGGS)n-PAPAPT-(Xaa)n-GAP(SEQ ID NO:268-316)、GAP-(GGGGS)n-(Xaa)n-PAPAP-(Xaa)n-(AAAKE)n-(Xaa)n-(GGGGS)n-GAP(SEQ IDNO:544-551)、(GGGGA)n(SEQ ID NO:60、79、81、317-320)、(GGGGA)n-GGGPS(SEQ ID NO:321-326)、GAP-(GGGGA)n-GGGPS(SEQ ID NO:327-333)、GAP-(GGGGA)n-GGGPS-GAP(SEQ ID NO:334-340)、GAP-(GGGGA)n-GGGPS-(GGGGA)n-GAP(SEQ ID NO:341-389)、GAP-GGGPS-(GGGGA)n-GAP(SEQ ID NO:390-396)、GAP-(GGGGA)n-AAAAS-GGGPS-(GGGGA)n-AAAA-GAP(SEQ ID NO:397-445)、GAP-(GGGGA)n-PAPAP-(Xaa)n-GAP(SEQ ID NO:446-494)、GAP-(GGGGA)n-PAPAPT-(Xaa)n-GAP(SEQ ID NO:495-543)、GAP-(GGGGA)n-(Xaa)n-PAPAP-(Xaa)n-(AAAKE)n-(Xaa)n-(GGGGA)n-GAP(SEQ IDNO:552-559)；其中n为1至7。
3.如权利要求2所述的靶向治疗性融合蛋白，其特征在于，n为1至4。
4.如权利要求1所述的靶向治疗性融合蛋白，其特征在于，所述间隔肽包含选自下组的氨基酸序列：EFGGGGSTR(SEQ ID NO:22)、GAP(SEQ ID NO:9)、GGGGS(SEQ ID NO:12)、GPSGSPG(SEQ ID NO:23)、GPSGSPGT(SEQ ID NO:24)、GPSGSPGH(SEQ ID NO:25)、GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPST(SEQID NO:26)、GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSH(SEQ ID NO:27)、GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGPS(SEQ ID NO:28)、GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGPSGAP(SEQ ID NO:29)、GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPS(SEQ ID NO:30)、GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGAP(SEQ ID NO:31)、GGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPS(SEQ ID NO:32)、GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPSGAP(SEQ ID NO:33)、GGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPS(SEQ ID NO:34)、GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPSGAP(SEQ ID NO:35)、GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPS(SEQ ID NO:36)、GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGAP(SEQ ID NO:37)、GGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGPS(SEQ ID NO:38)、GAPGGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGPSGAP(SEQ ID NO:39)、GGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGGSAAAASGGGPS(SEQ ID NO:40)、GAPGGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGGSAAAASGGGPSGAP(SEQ ID NO:41)、GGGGSGGGGSAAAASGGGPSGGGGSAAAASGGGPSGGGGSAAAASGGGPS(SEQ ID NO:42)、GAPGGGGSGGGGSAAAASGGGPSGGGGSAAAASGGGPSGGGGSAAAASGGGPSGAP(SEQ ID NO:43)、GGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPGPS(SEQ ID NO:44)、GAPGGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPGPSGAP(SEQID NO:45)、GGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTGPS(SEQ IDNO:46)、GAPGGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTGPSGAP(SEQ ID NO:47)、GGGSPAPTPTPAPTPAPTPAGGGPS(SEQ ID NO:48)、GAPGGGSPAPTPTPAPTPAPTPAGGGPSGAP(SEQ ID NO:49)、GGGSPAPAPTPAPAPTPAPAGGGPS(SEQ ID NO:50)、GAPGGGSPAPAPTPAPAPTPAPAGGGPSGAP(SEQ ID NO:51)、GGGSAEAAAKEAAAKEAAAKAGGPS(SEQ ID NO:52)、GAPGGGSAEAAAKEAAAKEAAAKAGGPSGAP(SEQ ID NO:53)、GGGSPAEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKAPSGGG(SEQ ID NO:54)、GAPGGGSPAEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKAPSGGGGAP(SEQ ID NO:55)、GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:56)、GAPGGGGSGGGGSGGGGSGAP(SEQ ID NO:57)、GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:58)、GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGAP(SEQ ID NO:59)、GGGGA(SEQ ID NO:60)、GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPST(SEQ ID NO:61)、GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSH(SEQ ID NO:62)、GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGPS(SEQ ID NO:63)、GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGPSGAP(SEQ ID NO:64)、GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPS(SEQ ID NO:65)、GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGAP(SEQ ID NO:66)、GGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPS(SEQ ID NO:67)、GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPSGAP(SEQ ID NO:68)、GGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPS(SEQ ID NO:69)、GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPSGAP(SEQ ID NO:70)、GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPS(SEQ ID NO:71)、GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGAP(SEQ ID NO:72)、GGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGPS(SEQ ID NO:73)、GAPGGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGPSGAP(SEQ ID NO:74)、GGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGGAAAAASGGGPS(SEQ ID NO:75)、GAPGGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGGAAAAASGGGPSGAP(SEQ ID NO:76)、GGGGAGGGGAAAAASGGGPSGGGGAAAAASGGGPSGGGGAAAAASGGGPS(SEQ ID NO:77)、GAPGGGGAGGGGAAAAASGGGPSGGGGAAAAASGGGPSGGGGAAAAASGGGPSGAP(SEQ ID NO:78)、GGGGAGGGGAGGGGA(SEQ ID NO:79)、GAPGGGGAGGGGAGGGGAGAP(SEQ ID NO:80)、GGGGAGGGGAGGGGAGGGGA(SEQ ID NO:81)、GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGAP(SEQ ID NO:82)、GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPS[或(GGGGA)8GGGPS](SEQ ID NO:83)、GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSH[或(GGGGA)8GGGPSH](SEQ ID NO:84)、GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPS[或(GGGGA)9GGGPS](SEQ ID NO:85)、GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSH[或(GGGGA)9GGGPSH](SEQ ID NO:86)、GGGGPAPGPGPAPGPAPGPAGGGPS(SEQ ID NO:87)、GAPGGGGPAPGPGPAPGPAPGPAGGGPGGAP(SEQ ID NO:88)、GGGGPAPAPGPAPAPGPAPAGGGPS(SEQ ID NO:89)和GAPGGGGPAPAPGPAPAPGPAPAGGGPGGAP(SEQ ID NO:90)。
5.如权利要求4所述的靶向治疗性融合蛋白，其特征在于，所述间隔肽包含选自下组的氨基酸序列：GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPS(SEQ ID NO:36)、GGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPGPS(SEQ ID NO:44)、GAPGGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPGPSGAP(SEQID NO:45)、GGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTGPS(SEQ IDNO:46)、GAPGGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTGPSGAP(SEQ ID NO:47)、GGGSPAPTPTPAPTPAPTPAGGGPS(SEQ ID NO:48)、GAPGGGSPAPTPTPAPTPAPTPAGGGPSGAP(SEQ ID NO:49)、GGGSPAPAPTPAPAPTPAPAGGGPS(SEQ ID NO:50)、GAPGGGSPAPAPTPAPAPTPAPAGGGPSGAP(SEQ ID NO:51)、GGGSAEAAAKEAAAKEAAAKAGGPS(SEQ ID NO:52)、GAPGGGSAEAAAKEAAAKEAAAKAGGPSGAP(SEQ ID NO:53)、GGGSPAEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKAPSGGG(SEQ ID NO:54)、GAPGGGSPAEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKAPSGGGGAP(SEQ ID NO:55)及GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPS(SEQ ID NO:71)。
6.如权利要求5所述的靶向治疗性融合蛋白，其特征在于，该间隔肽包含选自下组的氨基酸序列：GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPS(SEQ ID NO:36)、GAPGGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTGPSGAP(SEQ ID NO:47)、GAPGGGSPAPAPTPAPAPTPAPAGGGPSGAP(SEQ ID NO:51)、GAPGGGSPAEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKAPSGGGGAP(SEQ ID NO:55)及GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPS(SEQ ID NO:71)。
7.一种靶向治疗性融合蛋白，其包含与人类α-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(Naglu)蛋白具有至少85％相同性的氨基酸序列、氨基酸序列与成熟人类IGF-II的氨基酸8-67具有至少70％相同性的肽标签，和位于所述Naglu氨基酸序列与所述IGF-II肽标签之间的间隔肽，其中该间隔子包含氨基酸序列GAP(SEQ ID NO:9)、GPS(SEQ IDNO:10)或GGS(SEQ ID NO:11)。
8.如权利要求7所述的靶向治疗性融合蛋白，其特征在于，所述间隔子序列包含位于成熟人类IGF-II的氨基酸与人类Naglu的氨基酸之间的氨基酸Gly-Pro-Ser(GPS)(SEQ ID NO:10)。
9.如权利要求7-8中任一项所述的靶向治疗性融合蛋白，其特征在于，所述间隔肽包含一个或多个GGGGS(SEQ ID NO:12)、GGGGA(SEQ ID NO:60)或GGGS(SEQ ID NO:16)氨基酸序列。
10.如权利要求7-9中任一项所述的靶向治疗性融合蛋白，其特征在于，所述间隔肽包含一个或多个GGGPS(SEQ ID NO:14)或GGGSP(SEQ ID NO:15)氨基酸序列。
11.如权利要求7-10中任一项所述的靶向治疗性融合蛋白，其特征在于，所述间隔肽包含一个或多个AAAAS(SEQ ID NO:17)或AAAS(SEQ ID NO:18)氨基酸序列。
12.如权利要求7-11中任一项所述的靶向治疗性融合蛋白，其特征在于，所述间隔肽包含一个或多个PAPA(SEQ ID NO:19)或TPAPA(SEQ ID NO:20)氨基酸序列。
13.如权利要求7-12中任一项所述的靶向治疗性融合蛋白，其特征在于，所述间隔肽包含一个或多个AAAKE(SEQ ID NO:21)氨基酸序列。
14.如权利要求7-8中任一项所述的靶向治疗性融合蛋白，其特征在于，所述间隔肽包含选自下组的氨基酸序列：(GGGGS)n(SEQ ID NO:12、56、58、91-94)、(GGGGS)n-GGGPS(SEQ ID NO:36、95-100)、GAP-(GGGGS)n-GGGPS(SEQ ID NO:101-107)、GAP-(GGGGS)n-GGGPS-GAP(SEQ ID NO:37、108-113)、GAP-(GGGGS)n-GGGPS-(GGGGS)n-GAP(SEQ ID NO:114-162)、GAP-GGGPS-(GGGGS)n-GAP(SEQ ID NO:163-169)、GAP-(GGGGS)n-AAAAS-GGGPS-(GGGGS)n-AAAA-GAP(SEQ ID NO:170-218)、GAP-(GGGGS)n-PAPAP-(Xaa)n-GAP(SEQ ID NO:219-267)、GAP-(GGGGS)n-PAPAPT-(Xaa)n-GAP(SEQ ID NO:268-316)、GAP-(GGGGS)n-(Xaa)n-PAPAP-(Xaa)n-(AAAKE)n-(Xaa)n-(GGGGS)n-GAP(SEQ IDNO:544-551)、(GGGGA)n(SEQ ID NO:60、79、81、317-320)、(GGGGA)n-GGGPS(SEQ ID NO:321-326)、GAP-(GGGGA)n-GGGPS(SEQ ID NO:327-333)、GAP-(GGGGA)n-GGGPS-GAP(SEQ ID NO:334-340)、GAP-(GGGGA)n-GGGPS-(GGGGA)n-GAP(SEQ ID NO:341-389)、GAP-GGGPS-(GGGGA)n-GAP(SEQ ID NO:390-396)、GAP-(GGGGA)n-AAAAS-GGGPS-(GGGGA)n-AAAA-GAP(SEQ ID NO:397-445)、GAP-(GGGGA)n-PAPAP-(Xaa)n-GAP(SEQ ID NO:446-494)、GAP-(GGGGA)n-PAPAPT-(Xaa)n-GAP(SEQ ID NO:495-543)、GAP-(GGGGA)n-(Xaa)n-PAPAP-(Xaa)n-(AAAKE)n-(Xaa)n-(GGGGA)n-GAP(SEQ IDNO:552-559)；其中n为1至7。
15.如权利要求14所述的靶向治疗性融合蛋白，其特征在于，n为1至4。
16.如权利要求7所述的靶向治疗性融合蛋白，其特征在于，所述间隔肽包含选自下组的氨基酸序列：EFGGGGSTR(SEQ ID NO:22)、GAP(SEQ ID NO:9)、GGGGS(SEQ ID NO:12)、GPSGSPG(SEQ ID NO:23)、GPSGSPGT(SEQ ID NO:24)、GPSGSPGH(SEQ ID NO:25)、GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPST(SEQID NO:26)、GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSH(SEQ ID NO:27)、GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGPS(SEQ ID NO:28)、GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGPSGAP(SEQ ID NO:29)、GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPS(SEQ ID NO:30)、GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGAP(SEQ ID NO:31)、GGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPS(SEQ ID NO:32)、GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPSGAP(SEQ ID NO:33)、GGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPS(SEQ ID NO:34)、GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPSGAP(SEQ ID NO:35)、GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPS(SEQ ID NO:36)、GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGAP(SEQ ID NO:37)、GGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGPS(SEQ ID NO:38)、GAPGGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGPSGAP(SEQ ID NO:39)、GGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGGSAAAASGGGPS(SEQ ID NO:40)、GAPGGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGGSAAAASGGGPSGAP(SEQ ID NO:41)、GGGGSGGGGSAAAASGGGPSGGGGSAAAASGGGPSGGGGSAAAASGGGPS(SEQ ID NO:42)、GAPGGGGSGGGGSAAAASGGGPSGGGGSAAAASGGGPSGGGGSAAAASGGGPSGAP(SEQ ID NO:43)、GGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPGPS(SEQ ID NO:44)、GAPGGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPGPSGAP(SEQID NO:45)、GGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTGPS(SEQ IDNO:46)、GAPGGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTGPSGAP(SEQ ID NO:47)、GGGSPAPTPTPAPTPAPTPAGGGPS(SEQ ID NO:48)、GAPGGGSPAPTPTPAPTPAPTPAGGGPSGAP(SEQ ID NO:49)、GGGSPAPAPTPAPAPTPAPAGGGPS(SEQ ID NO:50)、GAPGGGSPAPAPTPAPAPTPAPAGGGPSGAP(SEQ ID NO:51)、GGGSAEAAAKEAAAKEAAAKAGGPS(SEQ ID NO:52)、GAPGGGSAEAAAKEAAAKEAAAKAGGPSGAP(SEQ ID NO:53)、GGGSPAEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKAPSGGG(SEQ ID NO:54)、GAPGGGSPAEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKAPSGGGGAP(SEQ ID NO:55)、GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:56)、GAPGGGGSGGGGSGGGGSGAP(SEQ ID NO:57)、GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:58)、GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGAP(SEQ ID NO:59)、GGGGA(SEQ ID NO:60)、GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPST(SEQ ID NO:61)、GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSH(SEQ ID NO:62)、GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGPS(SEQ ID NO:63)、GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGPSGAP(SEQ ID NO:64)、GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPS(SEQ ID NO:65)、GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGAP(SEQ ID NO:66)、GGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPS(SEQ ID NO:67)、GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPSGAP(SEQ ID NO:68)、GGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPS(SEQ ID NO:69)、GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPSGAP(SEQ ID NO:70)、GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPS(SEQ ID NO:71)、GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGAP(SEQ ID NO:72)、GGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGPS(SEQ ID NO:73)、GAPGGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGPSGAP(SEQ ID NO:74)、GGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGGAAAAASGGGPS(SEQ ID NO:75)、GAPGGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGGAAAAASGGGPSGAP(SEQ ID NO:76)、GGGGAGGGGAAAAASGGGPSGGGGAAAAASGGGPSGGGGAAAAASGGGPS(SEQ ID NO:77)、GAPGGGGAGGGGAAAAASGGGPSGGGGAAAAASGGGPSGGGGAAAAASGGGPSGAP(SEQ ID NO:78)、GGGGAGGGGAGGGGA(SEQ ID NO:79)、GAPGGGGAGGGGAGGGGAGAP(SEQ ID NO:80)、GGGGAGGGGAGGGGAGGGGA(SEQ ID NO:81)、GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGAP(SEQ ID NO:82)、GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPS[或(GGGGA)8GGGPS](SEQ ID NO:83)、GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSH[或(GGGGA)8GGGPSH](SEQ ID NO:84)、GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPS[或(GGGGA)9GGGPS](SEQ ID NO:85)、GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSH[或(GGGGA)9GGGPSH](SEQ ID NO:86)、GGGGPAPGPGPAPGPAPGPAGGGPS(SEQ ID NO:87)、GAPGGGGPAPGPGPAPGPAPGPAGGGPGGAP(SEQ ID NO:88)、GGGGPAPAPGPAPAPGPAPAGGGPS(SEQ ID NO:89)及GAPGGGGPAPAPGPAPAPGPAPAGGGPGGAP(SEQ ID NO:90)。
17.如权利要求16所述的靶向治疗性融合蛋白，其特征在于，所述间隔肽包含选自下组的氨基酸序列：GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPS(SEQ ID NO:36)、GGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPGPS(SEQ IDNO:44)、GAPGGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPGPSGAP(SEQID NO:45)、GGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTGPS(SEQ IDNO:46)、GAPGGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTGPSGAP(SEQ ID NO:47)、GGGSPAPTPTPAPTPAPTPAGGGPS(SEQ ID NO:48)、GAPGGGSPAPTPTPAPTPAPTPAGGGPSGAP(SEQ ID NO:49)、GGGSPAPAPTPAPAPTPAPAGGGPS(SEQ ID NO:50)、GAPGGGSPAPAPTPAPAPTPAPAGGGPSGAP(SEQ ID NO:51)、GGGSAEAAAKEAAAKEAAAKAGGPS(SEQ ID NO:52)、GAPGGGSAEAAAKEAAAKEAAAKAGGPSGAP(SEQ ID NO:53)、GGGSPAEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKAPSGGG(SEQ ID NO:54)、GAPGGGSPAEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKAPSGGGGAP(SEQ ID NO:55)及GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPS(SEQ ID NO:71)。
18.如权利要求17所述的靶向治疗性融合蛋白，其特征在于，所述间隔肽包含选自下组的氨基酸序列：GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPS(SEQ ID NO:36)、GAPGGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTGPSGAP(SEQ ID NO:47)、GAPGGGSPAPAPTPAPAPTPAPAGGGPSGAP(SEQ ID NO:51)、GAPGGGSPAEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKAPSGGGGAP(SEQ ID NO:55)及GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPS(SEQ ID NO:71)。
19.如前述权利要求中任一项所述的靶向治疗性融合蛋白，其特征在于，所述肽标签为N末端标签或C末端标签。
20.如权利要求19所述的靶向治疗性融合蛋白，其特征在于，该肽标签为C末端标签。
21.如前述权利要求中任一项所述的靶向治疗性融合蛋白，其特征在于，所述间隔子包含Gly-Ala-Pro(GAP)(SEQ ID NO:9)或Gly-Pro-Ser(GPS)(SEQ ID NO:10)氨基酸序列。
22.如前述权利要求中任一项所述的靶向治疗性融合蛋白，其特征在于，所述溶酶体靶向域包含成熟人类IGF-II的氨基酸8-67。
23.如前述权利要求中任一项所述的靶向治疗性融合蛋白，其特征在于，所述间隔子包含α螺旋结构或刚性结构。
24.如前述权利要求中任一项所述的靶向治疗性融合蛋白，其特征在于，所述IGF-II肽标签在残基Arg37处包含突变。
25.如权利要求23所述的靶向治疗性融合蛋白，其特征在于，所述突变是丙氨酸被取代成精氨酸。
26.如前述权利要求中任一项所述的靶向治疗性融合蛋白，其还包含药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
27.一种适于治疗溶酶体储积疾病的药物组合物，其包含如前述权利要求中任一项所述的靶向治疗性融合蛋白。
28.一种核酸，其编码如前述权利要求中任一项所述的靶向治疗性融合蛋白。
29.一种细胞，其含有如权利要求27所述的核酸。
30.一种产生靶向治疗性融合蛋白的方法，所述方法包含如下步骤：在细胞培养基中培养哺乳动物细胞，其中所述哺乳动物细胞携带如权利要求28所述的核酸；且所述培养在允许表达该靶向治疗性融合蛋白的条件下进行。
31.一种治疗对象的溶酶体储积疾病的方法，所述方法包括向该对象给予治疗有效量的包含融合蛋白的药物组合物，所述融合蛋白包含溶酶体酶、氨基酸序列与成熟人类IGF-II的氨基酸8-67至少70％一致的肽标签及位于该溶酶体酶氨基酸序列与该IGF-II肽标签之间的间隔肽，其中所述间隔肽包含一个或多个GGGPS(SEQID NO:14)或GGGSP(SEQ ID NO:15)氨基酸序列，且任选地还包含以下一个或多个序列：(i)GAP(SEQ ID NO:9)、(ii)GGGGS(SEQ ID NO:12)、(iii)GGGS(SEQ ID NO:16)、(iv)AAAAS(SEQ ID NO:17)、(v)AAAS(SEQ ID NO:18)、(vi)PAPA(SEQ ID NO:19)、(vii)TPAPA(SEQ ID NO:20)、(viii)AAAKE(SEQ ID NO:21)或(ix)GGGGA(SEQID NO:60)。
32.如权利要求31的方法，其特征在于，所述间隔肽包含选自下组的氨基酸序列：(GGGGS)n(SEQ ID NO:12、56、58、91-94)、(GGGGS)n-GGGPS(SEQ ID NO:36、95-100)、GAP-(GGGGS)n-GGGPS(SEQ ID NO:101-107)、GAP-(GGGGS)n-GGGPS-GAP(SEQ ID NO:37、108-113)、GAP-(GGGGS)n-GGGPS-(GGGGS)n-GAP(SEQ ID NO:114-162)、GAP-GGGPS-(GGGGS)n-GAP(SEQ ID NO:163-169)、GAP-(GGGGS)n-AAAAS-GGGPS-(GGGGS)n-AAAA-GAP(SEQ ID NO:170-218)、GAP-(GGGGS)n-PAPAP-(Xaa)n-GAP(SEQ ID NO:219-267)、GAP-(GGGGS)n-PAPAPT-(Xaa)n-GAP(SEQ ID NO:268-316)、GAP-(GGGGS)n-(Xaa)n-PAPAP-(Xaa)n-(AAAKE)n-(Xaa)n-(GGGGS)n-GAP(SEQ IDNO:544-551)、(GGGGA)n(SEQ ID NO:60、79、81、317-320)、(GGGGA)n-GGGPS(SEQ ID NO:321-326)、GAP-(GGGGA)n-GGGPS(SEQ ID NO:327-333)、GAP-(GGGGA)n-GGGPS-GAP(SEQ ID NO:334-340)、GAP-(GGGGA)n-GGGPS-(GGGGA)n-GAP(SEQ ID NO:341-389)、GAP-GGGPS-(GGGGA)n-GAP(SEQ ID NO:390-396)、GAP-(GGGGA)n-AAAAS-GGGPS-(GGGGA)n-AAAA-GAP(SEQ ID NO:397-445)、GAP-(GGGGA)n-PAPAP-(Xaa)n-GAP(SEQ ID NO:446-494)、GAP-(GGGGA)n-PAPAPT-(Xaa)n-GAP(SEQ ID NO:495-543)、GAP-(GGGGA)n-(Xaa)n-PAPAP-(Xaa)n-(AAAKE)n-(Xaa)n-(GGGGA)n-GAP(SEQ IDNO:552-559)；其中n为1至7。
33.如权利要求32所述的方法，其特征在于，n为1至4。
34.一种治疗对象的IIIB型黏多糖病(B型山菲立普综合征)的方法，所述方法包括：向该对象给予治疗有效量的包含融合蛋白的药物组合物，所述融合蛋白包含与人类α-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(Naglu)蛋白质至少85％一致的氨基酸序列、氨基酸序列与成熟人类IGF-II的氨基酸8-67至少70％一致的肽标签及位于该Naglu氨基酸序列与该IGF-II肽标签之间的间隔肽，其中所述间隔子包含氨基酸序列GAP(SEQID NO:9)、GPS(SEQ ID NO:10)或GGS(SEQ ID NO:11)。
35.如权利要求34所述的方法，其特征在于，所述间隔子序列包含位于成熟人类IGF-II的氨基酸与人类Naglu的氨基酸之间的氨基酸Gly-Pro-Ser(GPS)(SEQ IDNO:10)。
36.如权利要求34-35中任一项所述的方法，其特征在于，所述间隔肽包含一个或多个GGGGS(SEQ ID NO:12)、GGGGA(SEQ ID NO:60)或GGGS(SEQ IDNO:16)氨基酸序列。
37.如权利要求34-36中任一项所述的方法，其特征在于，所述间隔肽包含一个或多个GGGPS(SEQ ID NO:14)或GGGSP(SEQ ID NO:15)氨基酸序列。
38.如权利要求34-37中任一项所述的方法，其特征在于，所述间隔肽包含一个或多个AAAAS(SEQ ID NO:17)或AAAS(SEQ ID NO:18)氨基酸序列。
39.如权利要求34-38中任一项所述的方法，其特征在于，所述间隔肽包含一个或多个PAPA(SEQ ID NO:19)或TPAPA(SEQ ID NO:20)氨基酸序列。
40.如权利要求34-39中任一项所述的方法，其特征在于，所述间隔肽包含一个或多个AAAKE(SEQ ID NO:21)氨基酸序列。
41.如权利要求31-34中任一项所述的方法，其特征在于，所述间隔肽包含选自下组的氨基酸序列：(GGGGS)n(SEQ ID NO:12、56、58、91-94)、(GGGGS)n-GGGPS(SEQ ID NO:36、95-100)、GAP-(GGGGS)n-GGGPS(SEQ ID NO:101-107)、GAP-(GGGGS)n-GGGPS-GAP(SEQ ID NO:37、108-113)、GAP-(GGGGS)n-GGGPS-(GGGGS)n-GAP(SEQ ID NO:114-162)、GAP-GGGPS-(GGGGS)n-GAP(SEQ ID NO:163-169)、GAP-(GGGGS)n-AAAAS-GGGPS-(GGGGS)n-AAAA-GAP(SEQ ID NO:170-218)、GAP-(GGGGS)n-PAPAP-(Xaa)n-GAP(SEQ ID NO:219-267)、GAP-(GGGGS)n-PAPAPT-(Xaa)n-GAP(SEQ ID NO:268-316)、GAP-(GGGGS)n-(Xaa)n-PAPAP-(Xaa)n-(AAAKE)n-(Xaa)n-(GGGGS)n-GAP(SEQ IDNO:544-551)、(GGGGA)n(SEQ ID NO:60、79、81、317-320)、(GGGGA)n-GGGPS(SEQ ID NO:321-326)、GAP-(GGGGA)n-GGGPS(SEQ ID NO:327-333)、GAP-(GGGGA)n-GGGPS-GAP(SEQ ID NO:334-340)、GAP-(GGGGA)n-GGGPS-(GGGGA)n-GAP(SEQ ID NO:341-389)、GAP-GGGPS-(GGGGA)n-GAP(SEQ ID NO:390-396)、GAP-(GGGGA)n-AAAAS-GGGPS-(GGGGA)n-AAAA-GAP(SEQ ID NO:397-445)、GAP-(GGGGA)n-PAPAP-(Xaa)n-GAP(SEQ ID NO:446-494)、GAP-(GGGGA)n-PAPAPT-(Xaa)n-GAP(SEQ ID NO:495-543)、GAP-(GGGGA)n-(Xaa)n-PAPAP-(Xaa)n-(AAAKE)n-(Xaa)n-(GGGGA)n-GAP(SEQ IDNO:552-559)；其中n为1至7。
42.如权利要求41所述的方法，其特征在于，n为1至4。
43.一种使糖胺聚糖体内水平降低的方法，所述方法包括向罹患IIIB型黏多糖病(B型山菲立普综合征)的对象给予有效量的融合蛋白，所述融合蛋白包含：i)与人类α-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(Naglu)蛋白至少85％一致的氨基酸序列，ii)氨基酸序列与成熟人类IGF-II的氨基酸8-67至少70％一致的肽标签，和iii)位于该Naglu氨基酸序列与该IGF-II肽标签之间的间隔肽。
44.如权利要求31、34或43中任一项所述的方法，其特征在于，所述间隔肽包含选自下组的氨基酸序列：EFGGGGSTR(SEQ ID NO:22)、GAP(SEQ ID NO:9)、GGGGS(SEQ ID NO:12)、GPSGSPG(SEQ ID NO:23)、GPSGSPGT(SEQ ID NO:24)、GPSGSPGH(SEQ ID NO:25)、GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPST(SEQID NO:26)、GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSH(SEQ ID NO:27)、GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGPS(SEQ ID NO:28)、GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGPSGAP(SEQ ID NO:29)、GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPS(SEQ ID NO:30)、GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGAP(SEQ ID NO:31)、GGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPS(SEQ ID NO:32)、GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPSGAP(SEQ ID NO:33)、GGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPS(SEQ ID NO:34)、GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPSGAP(SEQ ID NO:35)、GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPS(SEQ ID NO:36)、GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGAP(SEQ ID NO:37)、GGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGPS(SEQ ID NO:38)、GAPGGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGPSGAP(SEQ ID NO:39)、GGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGGSAAAASGGGPS(SEQ ID NO:40)、GAPGGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGGSAAAASGGGPSGAP(SEQ ID NO:41)、GGGGSGGGGSAAAASGGGPSGGGGSAAAASGGGPSGGGGSAAAASGGGPS(SEQ ID NO:42)、GAPGGGGSGGGGSAAAASGGGPSGGGGSAAAASGGGPSGGGGSAAAASGGGPSGAP(SEQ ID NO:43)、GGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPGPS(SEQ ID NO:44)、GAPGGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPGPSGAP(SEQID NO:45)、GGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTGPS(SEQ IDNO:46)、GAPGGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTGPSGAP(SEQ ID NO:47)、GGGSPAPTPTPAPTPAPTPAGGGPS(SEQ ID NO:48)、GAPGGGSPAPTPTPAPTPAPTPAGGGPSGAP(SEQ ID NO:49)、GGGSPAPAPTPAPAPTPAPAGGGPS(SEQ ID NO:50)、GAPGGGSPAPAPTPAPAPTPAPAGGGPSGAP(SEQ ID NO:51)、GGGSAEAAAKEAAAKEAAAKAGGPS(SEQ ID NO:52)、GAPGGGSAEAAAKEAAAKEAAAKAGGPSGAP(SEQ ID NO:53)、GGGSPAEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKAPSGGG(SEQ ID NO:54)、GAPGGGSPAEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKAPSGGGGAP(SEQ ID NO:55)、GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:56)、GAPGGGGSGGGGSGGGGSGAP(SEQ ID NO:57)、GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:58)、GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGAP(SEQ ID NO:59)、GGGGA(SEQ ID NO:60)、GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPST(SEQ ID NO:61)、GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSH(SEQ ID NO:62)、GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGPS(SEQ ID NO:63)、GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGPSGAP(SEQ ID NO:64)、GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPS(SEQ ID NO:65)、GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGAP(SEQ ID NO:66)、GGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPS(SEQ ID NO:67)、GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPSGAP(SEQ ID NO:68)、GGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPS(SEQ ID NO:69)、GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPSGAP(SEQ ID NO:70)、GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPS(SEQ ID NO:71)、GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGAP(SEQ ID NO:72)、GGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGPS(SEQ ID NO:73)、GAPGGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGPSGAP(SEQ ID NO:74)、GGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGGAAAAASGGGPS(SEQ ID NO:75)、GAPGGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGGAAAAASGGGPSGAP(SEQ ID NO:76)、GGGGAGGGGAAAAASGGGPSGGGGAAAAASGGGPSGGGGAAAAASGGGPS(SEQ ID NO:77)、GAPGGGGAGGGGAAAAASGGGPSGGGGAAAAASGGGPSGGGGAAAAASGGGPSGAP(SEQ ID NO:78)、GGGGAGGGGAGGGGA(SEQ ID NO:79)、GAPGGGGAGGGGAGGGGAGAP(SEQ ID NO:80)、GGGGAGGGGAGGGGAGGGGA(SEQ ID NO:81)、GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGAP(SEQ ID NO:82)、GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPS[或(GGGGA)8GGGPS](SEQ ID NO:83)、GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSH[或(GGGGA)8GGGPSH](SEQ ID NO:84)、GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPS[或(GGGGA)9GGGPS](SEQ ID NO:85)、GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSH[或(GGGGA)9GGGPSH](SEQ ID NO:86)、GGGGPAPGPGPAPGPAPGPAGGGPS(SEQ ID NO:87)、GAPGGGGPAPGPGPAPGPAPGPAGGGPGGAP(SEQ ID NO:88)、GGGGPAPAPGPAPAPGPAPAGGGPS(SEQ ID NO:89)及GAPGGGGPAPAPGPAPAPGPAPAGGGPGGAP(SEQ ID NO:90)。
45.如权利要求44所述的方法，其特征在于，所述间隔子包含选自下组的氨基酸序列：GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPS(SEQ ID NO:36)、GGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPGPS(SEQ ID NO:44)、GAPGGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPGPSGAP(SEQID NO:45)、GGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTGPS(SEQ IDNO:46)、GAPGGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTGPSGAP(SEQ ID NO:47)、GGGSPAPTPTPAPTPAPTPAGGGPS(SEQ ID NO:48)、GAPGGGSPAPTPTPAPTPAPTPAGGGPSGAP(SEQ ID NO:49)、GGGSPAPAPTPAPAPTPAPAGGGPS(SEQ ID NO:50)、GAPGGGSPAPAPTPAPAPTPAPAGGGPSGAP(SEQ ID NO:51)、GGGSAEAAAKEAAAKEAAAKAGGPS(SEQ ID NO:52)、GAPGGGSAEAAAKEAAAKEAAAKAGGPSGAP(SEQ ID NO:53)、GGGSPAEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKAPSGGG(SEQ ID NO:54)、GAPGGGSPAEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKAPSGGGGAP(SEQ ID NO:55)及GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPS(SEQ ID NO:71)。
46.如权利要求45所述的方法，其特征在于，所述间隔肽包含选自下组的氨基酸序列：GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPS(SEQ ID NO:36)、GAPGGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTGPSGAP(SEQ ID NO:47)、GAPGGGSPAPAPTPAPAPTPAPAGGGPSGAP(SEQ ID NO:51)、GAPGGGSPAEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKAPSGGGGAP(SEQ ID NO:55)及GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPS(SEQ ID NO:71)。
47.如权利要求31-46中任一项所述的方法，其特征在于，所述间隔子序列包含氨基酸Gly-Ala-Pro(GAP)(SEQ ID NO:9)序列。
48.如权利要求31-47中任一项所述的方法，其特征在于，所述肽标签是N末端标签或C末端标签。
49.如权利要求48所述的方法，其特征在于，所述肽标签是C末端标签。
50.如权利要求31-49中任一项所述的方法，其特征在于，所述间隔子包含α螺旋结构或刚性结构。
51.如权利要求31-50中任一项所述的方法，其特征在于，所述溶酶体靶向域包含成熟人类IGF-II的氨基酸8-67。
52.如权利要求31-51中任一项所述的方法，其特征在于，所述IGF-II肽标签在残基Arg37处包含突变。
53.如权利要求52所述的方法，其特征在于，所述突变是丙氨酸被取代成精氨酸。
54.如权利要求31-53中任一项所述的方法，其特征在于，所述融合蛋白包含人类Naglu的氨基酸1-743或氨基酸24-743(图1)。
55.如权利要求31-54中任一项所述的方法，其特征在于，所述有效量在2.5-20mg/千克对象体重的范围内。
56.如权利要求31-55中任一项所述的方法，其特征在于，所述融合蛋白经鞘内给予，任选地还包含静脉内给予该融合蛋白。
57.如权利要求56所述的方法，其特征在于，所述给予包括将该融合蛋白引入脑室、腰区或大池中。
58.如权利要求31-55中任一项所述的方法，其特征在于，所述融合蛋白经静脉内给予。
59.如权利要求31-58中任一项所述的方法，其特征在于，所述融合蛋白是每两月、每月、每三周、每两周、每周、每日或在可变间隔下给予。
60.如权利要求31-59中任一项所述的方法，其特征在于，所述治疗导致脑组织中的糖胺聚糖(GAG)水平降低。
61.如权利要求31-60中任一项所述的方法，其特征在于，所述治疗导致脑组织中的溶酶体储积颗粒减少。
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